Đột biến mất đoạn CCR5-∆32 hiếm gặp ở người Việt Nam

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013<br /> <br /> ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN CCR5-∆32 HIẾM GẶP Ở<br /> NGƢỜI VIỆT NAM<br /> Nghiêm Xuân Hoàn*; Lê Hữu Song*<br /> TÓM TẮT<br /> Đột biến mất đoạn 32 bp trên gen CCR5 (CCR5-∆32) có liên quan đến nhiều bệnh lý như nhiễm<br /> HIV, bệnh tự miễn… Tuy nhiên, đột biến này chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam. Nghiên cứu<br /> này được tiến hành nhằm khảo sát đột biến CCR5-∆32 trên 100 bệnh nhân (BN) nhiễm virut viêm<br /> gan B (HBV), bao gồm 50 BN viêm gan B mạn tính, 25 BN xơ gan, 25 BN ung thư gan và 100 người<br /> khỏe mạnh làm nhóm chứng. Xác định đột biến CCR5-∆32 bằng kỹ thuật PCR. Kết quả cho thấy:<br /> không phát hiện đột biến này ở 100 người khỏe mạnh và 100 BN nhiễm HBV, đột biến CCR5-∆32<br /> hiếm gặp ở người Việt Nam.<br /> * Từ khóa: CCR5; Đột biến CCR5-∆32.<br /> <br /> CCR5-∆32 deletion is rare in Vietnamese population<br /> summary<br /> The CCR5 deletion mutation (CCR5-∆32) is associated with many diseases such as HIV, autoimmune<br /> diseases… However, it is still lack of data in Vietnamese population. This study was investigated the<br /> prevalence of the CCR5 deletion mutation (CCR5- ∆32) in 100 patients infected with hepatitis B virus<br /> (HBV) including 50 patients with chronic hepatitis B, 25 patients with live cirrhosis, 25 patients with<br /> heppatocellular carcinoma and 100 healthy control. The CCR5-∆32 was identified by using PCR<br /> assay. The CCR5- ∆32 was identified by using PCR assay. The result showed that there is not any<br /> case carried this mutation in our study and the CCR5-∆32 is rare in Vietnamese population.<br /> * Key words: CCR5; CCR5-∆32 deletion.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Chemokine (C-C motif) Receptor 5 (CCR5)<br /> là thụ cảm thể hóa ứng động bạch cầu<br /> thuộc họ các thụ cảm thể protein G xuyên<br /> màng, tất cả các thụ cảm thể này đều có 7<br /> domain xuyên màng (seven - transmembrane<br /> G-protein coupled receptors - GPCRs) [1,<br /> 2]. Gen mã hóa cho CCR5 nằm trên cánh<br /> ngắn của nhiễm sắc thể số 3, nơi tập hợp<br /> các gen mã hóa cho nhiều thụ cảm thể hóa<br /> ứng động khác [2]. Chemokine và các dạng<br /> <br /> thụ cảm thể của chúng hình thành một<br /> mạng lưới kiểm soát, hoạt hóa tế bào<br /> lympho, đại thực bào và tế bào hình sao. Vì<br /> vậy, thụ cảm thể hóa ứng động đóng một<br /> vai trò trung tâm trong đáp ứng miễn dịch<br /> chống lại nhiều tác nhân gây bệnh, đặc biệt<br /> trong đáp ứng viêm. CCR5 là một đồng thụ<br /> cảm thể giúp HIV xâm nhập vào tế bào<br /> TCD4 và đại thực bào, đây là cơ sở cho lây<br /> nhiễm HIV [2].<br /> <br /> * Bệnh viện TWQĐ 108<br /> Người phản hồi (Corresponding): Lê Hữu Song<br /> lehuusongdr108@yahoo.com.vn<br /> <br /> 45<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013<br /> Cho đến nay, có khoảng 74 đột biến trên<br /> gen này đã được mô tả và tìm hiểu, trong<br /> đó, đột biến CCR5-delta32 (CCR5-∆32) được<br /> quan tâm nhiều nhất [3, 4]. Đột biến CCR5∆32 xuất hiện nhiều hơn ở chủng tộc người<br /> da trắng với 10 - 20% người mang kiểu gen<br /> dị hợp tử (CCR5/CCR5-∆32) và 1% người<br /> mang kiểu gen đồng hợp tử (CCR5∆32/CCR5-∆32), nhưng lại không được<br /> phát hiện hoặc rất hiếm ở người châu Á,<br /> châu Phi, Trung Đông và người Mỹ gốc Ấn<br /> [3, 4, 5]. Sự khác nhau về tần suất xuất<br /> hiện alen CCR5-∆32 giữa các chủng tộc<br /> được giải thích, đây là một đột biến thích<br /> nghi có lợi của loài người đối với các tác<br /> nhân gây bệnh truyền nhiễm từ môi trường<br /> sống, nhưng lại là yếu tố bất lợi đối với sự<br /> phát triển một số bệnh truyền nhiễm, trong<br /> đó có HIV [3]. Theo Faure và Royer-Carenzi<br /> (2008), phân bố của alen đột biến này phụ<br /> thuộc vào tính đa dạng di truyền vật chủ<br /> và/hoặc nhiều yếu tố môi trường cũng như<br /> các nguồn bệnh trong tự nhiên, bởi vậy đã<br /> tạo ra bất lợi hoặc có lợi đối với vật chủ<br /> mang đột biến này [5].<br /> Đột biến này được đặc trưng bởi mất<br /> đoạn 32 bp trong vùng gen mã hóa cho<br /> vùng nội bào thứ 2 của thụ cảm thể CCR5<br /> và tạo ra một bộ ba mã hóa kết thúc sớm<br /> dẫn đến một protein không chức năng [4].<br /> Người ta cho rằng đột biến CCR5-∆32 đóng<br /> vai trò ức chế HIV xâm nhập vào tế bào<br /> lympho T do thay đổi đáp ứng miễn dịch và<br /> số lượng phân tử trình diện kháng nguyên<br /> trên bề mặt tế bào liên quan đến nhiễm và<br /> tiến triển đến giai đoạn AIDS ở BN nhiễm<br /> HIV [6].<br /> Việt Nam là một trong những nước trong<br /> khu vực có khí hậu nhiệt đới gió mùa, tỷ lệ<br /> bệnh truyền nhiễm và nhiệt đới cao như<br /> <br /> HIV, viêm gan B, C… Tuy nhiên, cho đến<br /> nay chưa có nhiều công trình nghiên cứu<br /> về đột biến gen này. Do đó, chúng tôi tiến<br /> hành nghiên cứu nhằm: Khảo sát tỷ lệ đột<br /> biến gen CCR5-∆32 trên quần thể người<br /> Việt Nam khỏe mạnh và BN nhiễm HBV.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 100 BN viêm gan B, trong đó, 50 BN<br /> viêm gan B mạn tính, 25 BN xơ gan, 25 BN<br /> ung thư gan và 100 người khỏe mạnh.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Tách chiết ADN từ máu ngoại vi có chống<br /> đông EDTA bằng phenol chloroform, tủa<br /> ADN bằng isopropanol. Thực hiện đột biến<br /> mất đoạn 32 nucleotide bằng kỹ thuật PCR<br /> (Gero Hütter và CS) [7]. Các thành phần<br /> phản ứng như sau: GoTaq Green Master Mix<br /> (Promega), bộ mồi đặc hiệu khuếch đại gen<br /> CCR5 với trình tự CCR5-32F: 5′-CTCCCA<br /> GGAATCATCTTTACC-3′, CCR5’-32R: 5′-TCA<br /> TTTCGACACCGAAGCAG-3′. Chu trình nhiệt:<br /> 940C trong 4 phút, sau đó 35 chu kỳ (940C/30<br /> giây; 530C/30 giây; 720C/40 giây) và 720C<br /> trong 7 phút.<br /> Nguyên lý của phương pháp này được<br /> tóm tắt như sau: bộ mồi (mồi xuôi và mồi<br /> ngược) đặc hiệu cho gen CCR5 được thiết<br /> kế bao ngoài đoạn 32 bp dự kiến bị mất.<br /> Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose<br /> 3,5% để phân biệt kích thước các băng<br /> ADN khuếch đại. Trong trường hợp gen<br /> CCR5 không bị mất đoạn (dạng hoang dại wild type), sản phẩm PCR sẽ có kích thước<br /> 200 bp, trong đó nếu bị mất đoạn 32 bp<br /> (dạng đột biến - mutation type) có kích thước<br /> 168 bp (hình 1) [7].<br /> <br /> 47<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013<br /> <br /> Hình 1: Hình ảnh kết quả phân tích đột biến CCR5-∆32 (theo Gero Hütter và CS).<br /> (Ghi chú: Marker = thang chuẩn; CCR5 (+/+) = thể hoang dại; CCR5 (+)/CCR5-∆32 = thể<br /> đột biến mất đoạn 32 bp dạng dị hợp tử; CCR5-∆32 (+/+) = thể đột biến mất đoạn 32 bp<br /> dạng đồng hợp tử).<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Kết quả tối ƣu hóa điều kiện PCR.<br /> <br /> Hình 2: Hình ảnh minh họa kết quả một số mẫu sau khi điện di sản phẩm PCR trên<br /> thạch agarose 3,5%. Hình ảnh điện di cho băng rõ nét, không có băng phụ,<br /> kích thước b»ng đúng như dự kiến, có 1 băng với kích thước 200 bp.<br /> (M = thang chuẩn; N = chứng âm).<br /> 2. Kết quả giải trình tự.<br /> <br /> Hình 3: Hình giải trình tự đoạn gen CCR5 bằng cặp mồi CCR5-32F, R của một mẫu bệnh phẩm.<br /> Không thấy đột biến mất đoạn 32 bp trên mẫu bệnh phẩm này. Tuy nhiên, tại vị trí nt 649<br /> (NM_001100168.1) có một thay đổi bằng chèn thêm adenine.<br /> <br /> 48<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013<br /> <br /> Hình 4: So sánh kết quả giải trình tự gen CCR5 với ngân hàng gen.<br /> Kết quả cho thấy đoạn gen thu được có độ tương đồng cao (98%) với ngân hàng gen.<br /> <br /> Hình 5: Hình ảnh một số thay đổi trên đoạn gen thu được so với ngân hàng gen.<br /> So với ngân hàng gen, mẫu bệnh phẩm thu được có 3 điểm khác biệt.<br /> 3. Kết quả phân tích trên các nhóm nghiên cứu.<br /> Tất cả 200 mẫu, bao gồm 100 mẫu BN nhiễm HBV và 100 người khỏe mạnh không<br /> thấy trường hợp nào mang gen CCR5 đột biến mất đoạn 32 bp.<br /> BÀN LUẬN<br /> Bên cạnh vai trò của đột biến CCR5-∆32<br /> trong sinh bệnh học bệnh nhiễm trùng,<br /> người ta cũng đã chứng minh vai trò quan<br /> trọng trong sinh bệnh học các bệnh tự miễn<br /> và gần đây được cho là yếu tố điều biến<br /> trong miễn dịch cấy ghép, trong bệnh mô<br /> ghép chống chủ (graft-versus-host disease -<br /> <br /> GVHD) [8, 9]. Một kết quả nằm ngoài mong<br /> đợi trong điều trị căn bệnh thế kỷ HIV/AIDS<br /> đã đưa các nhà khoa học quan tâm hơn đến<br /> đột biến này. Đó là nghiên cứu của Hutter G<br /> và CS cho thấy một trường hợp điều trị HIV<br /> thành công đầu tiên bằng phương pháp ghép<br /> tế bào gốc từ một người cho có alen đột biến<br /> dạng đồng hợp tử CCR5-∆32/CCR5-∆32<br /> [10]. Trường hợp đầu tiên chữa khỏi HIV<br /> <br /> 49<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013<br /> ở trên thực chất là thay thế hệ miễn dịch của<br /> người bệnh bằng hệ miễn dịch của người<br /> cho có tế bào gốc mang gen đột biến dạng<br /> đồng hợp tử CCR5-∆32/CCR5-∆32 có khả<br /> năng miễn dịch tự nhiên với HIV, thông qua<br /> ghép tủy của người cho để tạo ra tế bào<br /> máu mới có tính năng đặc biệt này.<br /> <br /> đáng quan tâm, vì gần đây một số nghiên<br /> cứu trên BN HIV/AIDS tại Việt Nam cũng đã<br /> đề cập đến biến đổi này. Trong những nghiên<br /> cứu đó, người ta thấy đột biến gen CCR5 tại<br /> các vị trí S272P, G106R, C178R, W153C,<br /> R223Q và S336I [11].<br /> <br /> Từ những cơ sở khoa học thú vị mà thế<br /> giới đã tìm thấy, chúng tôi hy vọng sẽ tìm<br /> được một vài đối tượng trong nhóm nghiên<br /> cứu có đột biến này. Tuy nhiên, với 200 đối<br /> tượng, bao gồm cả BN nhiễm HBV và người<br /> khỏe mạnh, không tìm thấy đột biến mất<br /> đoạn này. Kết quả này tương tự như những<br /> nghiên cứu khác về phân bố của elen CCR5∆32 trên thế giới. Người ta cho rằng đột biến<br /> CCR5-∆32 xuất hiện ở phần lớn chủng tộc<br /> người da trắng với tỷ lệ 10 - 20% người<br /> mang kiểu gen dị hợp tử (CCR5/CCR5-∆32)<br /> và chỉ 1% người mang kiểu gen đồng hợp<br /> tử (CCR5-∆32/CCR5-∆32). Trong khi đó, nó<br /> không được phát hiện hoặc rất hiếm ở<br /> chủng người châu Á, châu Phi, Trung Đông<br /> và người Mỹ gốc Ấn [3, 4, 5]. Đây thực sự<br /> là một điều đáng tiếc, vì ngày nay, y học<br /> phát triển, việc điều trị BN ung thư máu và<br /> ngay cả BN HIV/AIDS bằng phương pháp<br /> ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài là điều<br /> hoàn toàn có thể thực hiện được, nhưng vấn<br /> đề là tìm được người cho tủy phù hợp hệ<br /> thống HLA đã khó thì việc tìm ra người cho<br /> có kiểu gen đồng hợp tử CCR5-∆32/CCR5∆32 dường như còn khó khăn hơn nữa trên<br /> quần thể người Việt Nam.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Nhưng dù sao, với một số ít số liệu giải<br /> trình tự đoạn gen quan tâm chúng tôi cũng<br /> thấy có một số thay đổi nucleotid đơn. Do<br /> số liệu còn hạn chế, chúng tôi không bàn<br /> luận ở đây. Tuy nhiên, đó là một kết quả rất<br /> <br /> Phương pháp phát hiện đột biến CCR5∆32 bằng kỹ thuật PCR đã được xây dựng<br /> thành công tại Khoa Sinh học phân tử,<br /> Bệnh viện TWQĐ 108. Trong 200 đối tượng<br /> nghiên cứu, chúng tôi không phát hiện trường<br /> hợp nào mang đột biến CCR5-∆32 này.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Allen SJ, C.S, Handel TM. Chemokine:<br /> receptor structure, interactions, and antagonism.<br /> Annu Rev Immunol. 2007, (25), pp.787-820.<br /> 2. Alkhatib, G. The biology of CCR5 and<br /> CXCR4. Current Opinion in HIV and AIDS.<br /> 2009, 4, pp.96-103.<br /> 3. Alison P. Galvani, J.N. The evolutionary<br /> history of the CCR5-D32 HIV-resistance mutation.<br /> Microbes and Infection. 2005, 7, pp.302-309.<br /> 4. Gero Hütter. M.N, Daniel Nowak, Stefan<br /> Klein, Harald Klüter and Wolf-K Hofmann. The<br /> effect of the CCR5-delta32 deletion on global<br /> gen expression considering immune response<br /> and inflammation. Journal of Inflammation. 2011,<br /> 8 (29), pp.1-8.<br /> 5. Eric Faure, M.R.-C. Is the European spatial<br /> distribution of the HIV-1-resistant CCR5-D32 allele<br /> formed by a breakdown of the pathocenosis due<br /> to the historical Roman expansion?. Infection,<br /> Genetics and Evolution. 2008, 8, pp.864-874.<br /> 6. P. Schliekelman. C.G, M. Slatkin, Natural<br /> selection and resistance to HIV. Nature. 2001, 411,<br /> pp.545-546.<br /> 7. Hutter, G. et al. Long-term control of HIV<br /> by<br /> CCR5<br /> Delta32/Delta32<br /> stem-cell<br /> <br /> 50<br /> <br />