Đột biến vùng khởi động của gen TERT trong u thần kinh đệm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đột biến vùng khởi động của gen TERT được phát hiện với tỷ lệ cao trong u thần kinh đệm (UTKĐ) và ảnh hưởng đến kết quả đáp ứng với điều trị. Việc xác định đột biến này trong UTKĐ giúp phân nhóm tiên lượng và chọn lựa bệnh nhân chính xác hơn cho chỉ định điều trị. Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình giải trình tự DNA để áp dụng vào việc xác định tỷ lệ đột biến vùng khởi động gen TERT trong UTKĐ trên bệnh nhân Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đột biến vùng khởi động của gen TERT trong u thần kinh đệm

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 ĐỘT BIẾN VÙNG KHỞI ĐỘNG CỦA GEN TERT TRONG U THẦN KINH ĐỆM Hồ Quốc Chương*, Lê Thái Khương**, Trần Kim Tuyến***, Hoàng Anh Vũ** TÓM TẮT Mở đầu - mục tiêu: Đột biến vùng khởi động của gen TERT được phát hiện với tỷ lệ cao trong u thần kinh đệm (UTKĐ) và ảnh hưởng đến kết quả đáp ứng với điều trị. Việc xác định đột biến này trong UTKĐ giúp phân nhóm tiên lượng và chọn lựa bệnh nhân chính xác hơn cho chỉ định điều trị. Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình giải trình tự DNA để áp dụng vào việc xác định tỷ lệ đột biến vùng khởi động gen TERT trong UTKĐ trên bệnh nhân Việt Nam. Đối tượng - phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang trên 33 bệnh phẩm UTKĐ. DNA được tách chiết từ các tế bào u bằng Wizard® Genomic DNA Purification Kit. Thiết lập phản ứng PCR và giải trình tự vùng khởi động gen TERT bằng phương pháp Sanger. Kết quả: Thiết kế thành công cặp mồi dùng nhân bản vùng khởi động gen TERT. Giải trình tự cho tín hiệu tốt, phát hiện đột biến gen TERT tại vị trí c.-124C>T và c.-146C>T ở 14/33 mẫu (chiếm tỷ lệ 42,42%). Kết luận: Bước đầu thiết lập thành công quy trình giải trình tự vùng khởi động gen TERT ở bệnh nhân mắc UTKĐ. Từ khóa: U thần kinh đệm, đột biến gen, TERT. ABSTRACT TERT PROMOTER MUTATION IN GLIOMAS Ho Quoc Chuong, Le Thai Khuong, Tran Kim Tuyen, Hoang Anh Vu * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 22 - No 2- 2018: 59 - 63 Background and objectives: Mutations in TERT promoter are frequently found in gliomas and predict response to treatment. The mutation plays a role in identification of different prognostic groups as well as in selection of patients for suitable therapeutic strategies. This study aimed to establish a procedure of DNA sequencing for detection of TERT promoter mutation from Vietnamese patients with glioma. Methods: A descriptive cross-sectional study was conducted on 33 glioma samples. DNA was extracted from tumor cells using Wizard® Genomic DNA Purification Kit. The TERT promoter region was amplified with PCR and sequenced with Sanger technique. Results: A specific primer pair was successfully designed for amplification and sequence analysis of TERT promoter region. From 33 glioma samples, we detected c.-124C>T and c.-146C>T mutations in 14 samples (42.42%). Conclusion: We successfully established a procedure for detection of mutation in the TERT promoter from glioma. Keywords: Glioma, gene mutation, TERT. Trường Đại học Mở TP.HCM** Trung tâm Y Sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TP.HCM *** Khoa Ngoại Thần kinh, Bệnh viện Chợ Rẫy Tác giả liên lạc: TS.BS. Hoàng Anh Vũ, ĐT: 01222993537 Email: hoangvuxinh@yahoo.com 60
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học ĐẶT VẤN ĐỀ Chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện đột biến trên vùng khởi U thần kinh đệm (UTKĐ) là một loại u động gen TERT trong bệnh nhân UTKĐ nhằm nguyên phát của hệ thần kinh trung ương, góp phần hoàn thiện quy trình chẩn đoán phân chiếm 80% các trường hợp u não ác tính và 30% tử trong u thần kinh đệm, từ đó giúp phân các trường hợp u của hệ thần kinh trung ương nhóm tiên lượng và chọn lựa bệnh nhân chính nói chung. Tỷ lệ mắc UTKĐ trong các khối u não xác hơn cho chỉ định điều trị. là 2 – 3/100000 người trưởng thành, và chiếm khoảng 52% tất cả các khối u não nguyên phát. ĐỐITƯỢNG –PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU UTKĐ có thể gặp ở mọi lứa tuổi; tuy nhiên, 75% Đối tượng nghiên cứu bệnh nhân được chẩn đoán bệnh dưới 20 tuổi. Khảo sát đột biến vùng khởi động gen TERT Thời gian sống thêm của bệnh nhân nếu không được tiến hành trên 33 bệnh nhân UTKĐ được điều trị thường chỉ vài tháng kể từ khi chẩn phẫu thuật lấy u, xạ trị và hóa trị bổ sung với đoán. Nếu được điều trị thích hợp thì 37% bệnh temozolomide tại Bệnh viện Chợ Rẫy. nhân sống sót sau 1 năm, 20% sống sót sau 2 Phương pháp nghiên cứu năm và 13% sau 3 năm(11). Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Y Hiện nay, cơ chế sinh bệnh của UTKĐ vẫn Sinh học Phân tử – Đại học Y Dược TP.HCM. còn chưa được biết rõ ràng và đang tiếp tục Các mẫu bệnh phẩm được tách chiết DNA và nghiên cứu. Trong UTKĐ, đột biến vùng khởi giải trình tự vùng khởi động của gen TERT bằng động gen TERT (Telomerase Reverse kỹ thuật Sanger. Transcriptase) được phát hiện với tỷ lệ cao và là một yếu tố tiên lượng độc lập hoặc kết hợp Tách chiết genomic DNA từ mẫu mô tươi và với các yếu tố khác như đột biến gen IDH1/2 mẫu mô vùi nến và tình trạng đồng mất đoạn nhiễm sắc thể Mẫu mô tươi 1p/19q để phân nhóm bệnh nhân với tiên Cho khoảng 0,1g mẫu mô u tươi vào tube 1,5 lượng khác nhau(3). ml. DNA từ tế bào mô u được tách chiết bằng Gen TERT nằm ở vị trí 5p15.33, gồm 16 Wizard® Genomic DNA Purification Kit theo exon. Gen TERT mã hóa cho các tiểu đơn vị hướng dẫn của nhà sản xuất. enzyme xúc tác bảo vệ đầu mút nhiễm sắc Mẫu mô vùi nến thể(7). Đột biến ở vùng khởi động gen TERT Thu hoạch tế bào ung thư từ mô vùi nến sau được xác định là một cơ chế để kích hoạt khi đã được chẩn đoán giải phẫu bệnh vào tube telomerase trong ung thư. Tế bào khối u có đột 1,5 ml. Tách chiết genomic DNA bằng Wizard® biến vùng khởi động gen TERT có telomerase Genomic DNA Purification Kit theo hướng dẫn dài hơn so với của tế bào không mang đột biến của nhà sản xuất. này(5). Những đột biến vùng khởi động gen Thiết kế mồi cho PCR và sequencing TERT xảy ra chủ yếu ở vị trí c.-124 và c.-146, Cặp mồi nhân bản vùng khởi động gen tạo liên kết với các yếu tố phiên mã như TERT được thiết kế dựa trên trình tự chuẩn của EST1/2, GABP và P52 (NFκB2) dẫn đến tăng gen TERT mang accession number NG_009265 biểu hiện telomerase(13). Tình trạng đột biến bằng phần mềm CLC Main Workbench v5.5. vùng khởi động gen TERT trong UTKĐ trở Mồi xuôi là TERT-F (5’- thành một yếu tố tiên lượng quan trọng. Sự GTCCTGCCCCTTCACCTT-3’) và mồi ngược là hiện diện đột biến vùng khởi động gen TERT TERT-R (5’- AGCACCTCGCGGTAGTGG-3’). làm thuốc temozolomide không có tác dụng Các đoạn mồi được tổng hợp bởi Integrated điều trị u(7). DNA Technologies (Mỹ). 61
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Thiết lập điều kiện PCR phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan Mỗi phản ứng (20 µl) bao gồm các thành trong Hi-Di foemamide, biến tính ở 95oC trong 2 phần: 0,2 µl Taq DNA polymerase (5U) của phút trước khi làm lành đột ngột. Trình tự DNA Takara; 2 µl đệm 10X; 2 µl dNTPs (2,5mM); 1 µl được đọc bằng máy ABI PRISM 3500 Genetic mỗi loại mồi (10 µM); 1,5 µl DNA tổng số (100 Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả ng/µl) và 12,3 µl H2O. Kỹ thuật PCR được tiến được phân tích bằng phần mềm CLC Main hành trên máy luân nhiệt Mastercycler@Pro S Workbench v5.5. (Eppendorf, Đức) với chu trình nhiệt như sau: KẾT QUẢ 98oC trong 3 phút, 40 chu kỳ (98oC trong 10 giây, Kết quả thiết kế mồi 58oC trong 20 giây, 72oC trong 40 giây), 72oC trong Cặp mồi được thiết kế bằng phần mềm CLC 5 phút. Các phản ứng luôn kèm theo một chứng Main Workbench v5.5. Đây là phần mềm chuyên âm không chứa DNA để kiểm soát ngoại nhiễm. dụng cho phép thiết kế mồi cho phản ứng PCR Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di từ trình tự gen sẵn có. Các phần mềm Oligo Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di Analyzer 3.1 trên thạnh agarose 1,5% có nhuộm ethidium (https://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoA bromide và quan sát dưới hệ thống chụp ảnh nalyzer),Primer-BLAST GelDoc-It TS 310 (UVP, Mỹ). (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) Tinh sạch sản phẩm PCR được sử dụng để kiểm tra các thông số lý thuyết Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit về chiều dài, nhiệt độ nóng chảy Tm, thành phần ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup (Thermo (%) GC, năng lượng tự do hình thành hetero- Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. dimer, năng lượng tự do hình thành cấu trúc thứ cập (hairpin), khả năng tự bắt cặp mồi (self- Thực hiện giải trình tự: Sản phẩm PCR đã dimer) và độ đặc hiệu của mồi. Các thông số lý được tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng cycle thuyết và độ đặc hiệu của mồi đã được kiểm tra sequencing với BigDye Terminator v3.1 Cycle đảm bảo yêu cầu phản ứng PCR để nhân bản Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ), theo 2 vùng khởi động gen TERT. chiều xuôi và ngược cho mỗi đoạn cần đọc. Sản Kết quả PCR Hình 1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản vùng khởi động gen TERT. Các giếng từ 1 – 8: sản phẩm PCR từ mẫu gDNA được tách chiết từ các khối u thần kinh đệm, Giếng 8: chứng âm, Giếng M: thang chuẩn 62
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học Việc nhân bản thành công đoạn gen đặc hiệu bộ Kit ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup cần khảo sát đột biến bằng phản ứng PCR là (Thermo Scientific). Sản phẩm PCR sau tinh khâu quan trọng nhất trong toàn bộ quy trình sạch đã đủ điều kiện sử dụng cho bước giải chẩn đoán đột biến gen. Sản phẩm PCR sau khi trình tự. Hầu hết các mẫu đều được giải trình kết thúc chu trình luân nhiệt sẽ được kiểm tra tự trên cả 2 chiều xuôi và ngược. Kết quả giải bằng điện di trên thạch agarose 1,5%. Kết quả trình tự cho thấy các đỉnh cao, có sự phân tách điện di sản phẩm PCR cho thấy các băng sản rõ ràng giữa các đỉnh. Điều này chứng minh phẩm mục tiêu sáng rõ nét, không có băng ký rằng kết quả giải trình tự tốt, kết quả cũng cho sinh (Hình 1). Đối với phản ứng PCR, việc xây thấy toàn bộ quy trình bao gồm thiết kế mồi dựng một chu trình nhiệt độ phù hợp là một đặc hiệu, quá trình PCR cũng như thao tác tinh trong những yếu tố quyết định, bởi vì nhiệt độ sạch đều đạt yêu cầu. thích hợp sẽ đảm bảo cho sự tháo xoắn, tách Trình tự DNA nhận được sẽ được so sánh mạch của phân tử DNA, cũng như việc bắt cặp với trình tự DNA chuẩn của gen TERT lưu trong mồi và kéo dài chuỗi DNA. Chu trình nhiệt tối ngân hàng gen với mã số NG_009265. Bằng kỹ ưu đã được trình bày bên trên. thuật giải trình tự, trong 33 mẫu mô u, đã phát Kết quả phân tích kết quả giải trình tự hiện đột biến ở 14 mẫu (chiếm tỷ lệ 42,42%), Sản phẩm PCR sau phản ứng vẫn còn lẫn trong đó 9 mẫu mang đột biến c.-124C>T (Hình mồi và các thành phần phản ứng còn dư. Do 2A), 4 mẫu mang đột biến c.-146C>T (Hình 2B) đó, để có lượng DNA đảm bảo cho việc giải và 1 mẫu mang cả 2 đột biến tại vị trí kể trên. trình tự, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Hình 2: Kết quả giải trình tự DNA. (A) mẫu không đột biến (WT) và có đột biến (Mut) tại vị trí c.-124. (B) mẫu không đột biến (WT) và có đột biến (Mut) tại vị trí c.-146. Mặc dù cỡ mẫu nghiên cứu của chúng tôi hay liệt nửa người, mất chức năng thăng bằng, còn nhỏ, kết quả bước đầu cho thấy đột biến phản ứng châm chạp, hay quên, …(11) Ngày nay, vùng khởi động của gen TERT trên bệnh nhân tỷ lệ mắc và tử vong do UTKĐ ngày càng gia UTKĐ có tỷ lệ tương đồng với hầu hết các tăng, bệnh nhân thường được phát hiện muộn nghiên cứu trên thế giới, vốn dao động trong nên việc điều trị chỉ giúp cải thiện chất lượng khoảng 28 – 85% (4,5,8,9,10,14,15). cuộc sống, kéo dài thời gian sống thêm. Do đó, BÀN LUẬN sự hiểu biết rõ ràng hơn về cơ chế gây bệnh của UTKĐ là một trong những bệnh lý u nguyên UTKĐ có thể dự đoán một tiên lượng chính xác phát thuộc hệ thần kinh trung ương. Đây là loại và liệu pháp điều trị hiệu quả hơn(4). u não có tiên lượng xấu, tiến triển nhanh và rất Gen TERT mã hóa cho các tiểu đơn vị xúc tác ác tính. Nếu không được điều trị kịp thời, bệnh enzyme bảo vệ đầu mút của nhiễm sắc thể. Các nhân sớm rơi vào tình trạng diễn biến bệnh nặng enzyme này gồm protein với hoạt động phiên với các dấu hiệu như đau đầu, buồn nôn, yếu mã ngược (reverse transcription) và một thành 63
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 phần RNA giữ vai trò như khuôn mẫu cho sự mutations in tumors. New England Journal of Medicine;372(26):2499-2508. lặp lại của telomerase. Biểu hiện telomerase 4. Gao K, Li G, Qu Y, Wang M, Cui B, Ji M, Shi B, Hou P (2016). đóng vai trò quan trọng trong quá trình lão hóa TERT promoter mutations and long telomere length predict poor survival and radiotherapy resistance in gliomas. tế bào, sự thiếu hụt hoạt động của telomerase Oncotarget;7(8):8712. làm rút ngắn telomere dẫn đến các bệnh liên 5. Heidenreich B, Rachakonda PS, Hosen I, et al (2015). TERT quan đến lão hóa tế bào. Ngược lại, tăng biểu promoter mutations and telomere length in adult malignant gliomas and recurrences. Oncotarget;6(12):10617. hiện telomerase trong các tế bào sinh dưỡng có 6. Horn S, Figl A, Rachakonda PS, et al (2013). TERT promoter thể liên quan đến sự hình thành gen sinh ung mutations in familial and sporadic melanoma. (oncogene). Telomerase hoạt động rộng trong Science;339(6122):959-961. 7. Johanns TM, Fu Y, Kobayashi DK, et al (2016). High incidence các bệnh ung thư của người và hoạt động của of TERT mutation in brain tumor cell lines. Brain tumor enzyme được phát hiện trong 90% các khối u ác pathology;33(3):222-227. 8. Killela PJ, Pirozzi CJ, Healy P, et al (2014). Mutations in IDH1, tính(1,12). Đột biến vùng khởi động gen TERT dẫn IDH2, and in the TERT promoter define clinically distinct đến tăng biểu hiện telomerase. Những đột biến subgroups of adult malignant gliomas. Oncotarget;5(6):1515. này đã được phát hiện trong hơn 80% khối u não 9. Labussiere M, Di Stefano A, Gleize V, et al (2014). TERT promoter mutations in gliomas, genetic associations and ác tính cũng như các ung thư khác như ung thư clinico-pathological correlations. British journal of đại tràng, ung thư da, u mỡ… điều này cho thấy cancer;111(10):2024. vai trò quan trọng của telomerase trong sự phát 10. Mosrati MA, Malmström A, Lysiak M, et al (2015). TERT promoter mutations and polymorphisms as prognostic factors triển và duy trì khối u(6). Tình trạng đột biến in primary glioblastoma. Oncotarget;6(18):16663. vùng khởi động gen TERT trong UTKĐ trở 11. Nguyễn Phong, Nguyễn Quang Hiền, Trương Văn Việt (2002). U não: đặc điểm dịch tễ học (tổng kết 1864 ca đã mổ có thành một yếu tố tiên lượng quan trọng(2). kết quả mô bệnh học tại Khoa PTTK Bệnh viện Chợ Rẫy, TP KẾT LUẬN Hồ Chí Minh từ 1994 - 2000. Chuyên đề ngoại thần kinh(Nhà xuất bản Y học):279-290. Nghiên cứu đã thiết kế thành công cặp mồi 12. Ozturk MB, Li Y, Tergaonkar V (2017). Current Insights to dùng để nhân bản vùng khởi động gen TERT, Regulation and Role of Telomerase in Human Diseases. Antioxidants;6(1):17. đồng thời cũng thiết lập được quy trình phát 13. Park C-K, Lee S-H, Kim JY, et al (2014). Expression level of hiện đột biến gen TERT trên 33 bệnh nhân hTERT is regulated by somatic mutation and common single UTKĐ với tỷ lệ đột biến là 42,42%. Kết quả nucleotide polymorphism at promoter region in glioblastoma. Oncotarget;5(10):3399. nghiên cứu này làm cơ sở cho việc ứng dụng 14. Simon M, Hosen I, Gousias K, et al (2014). TERT promoter quy trình vào chẩn đoán và phân nhóm tiên mutations: a novel independent prognostic factor in primary glioblastomas. Neuro-oncology;17(1):45-52. lượng cho bệnh nhân trên lâm sàng. 15. Spiegl-Kreinecker S, Lötsch D, Ghanim B, et al (2015). TÀI LIỆU THAM KHẢO Prognostic quality of activating TERT promoter mutations in glioblastoma: interaction with the rs2853669 polymorphism 1. Blackburn EH (2010). Telomeres and telomerase: the means to and patient age at diagnosis. Neuro-oncology;17(9):1231-1240. the end (Nobel lecture). Angewandte Chemie International Edition;49(41):7405-7421. 2. Chen C, Han S, Meng L, Li Z, Zhang X, Wu A (2014). TERT Ngày nhận bài báo: 10/11/2017 promoter mutations lead to high transcriptional activity under hypoxia and temozolomide treatment and predict poor Ngày phản biện nhận xét bài báo: 11/11/2017 prognosis in gliomas. PloS one;9(6):e100297. Ngày bài báo được đăng: 10/03/2018 3. Eckel-Passow JE, Lachance DH, Molinaro AM, et al (2015). Glioma groups based on 1p/19q, IDH, and TERT promoter 64