Giá trị kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán một số bất thường lệch bội nhiễm sắc thể

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017<br /> <br /> GIÁ TRỊ KỸ THUẬT QF-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN MỘT SỐ<br /> BẤT THƢ NG LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ<br /> Hoàng Thị Ngọc Lan*; Lê Việt Dũng*<br /> Bùi Đức Thắng**; Lê Phương Thảo**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: So sánh độ chính xác của kỹ thuật QF-PCR và kỹ thuật di truyền tế bào trong chẩn<br /> đoán lệch bội nhiễm sắc thể (NST) 13, 18, 21, X và Y. Đồng thời, đánh giá giá trị của từng<br /> marker của kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán lệch bội NST 13, 18, 21, X và Y. Đối tượng và<br /> phương pháp: nghiên cứu hồi cứu, cắt ngang mô tả 500 mẫu xét nghiệm từ tế bào ối hoặc bạch<br /> cầu máu ngoại vi. Mỗi mẫu xét nghiệm được tiến hành đồng thời 2 phương pháp: xét nghiệm<br /> QF-PCR và xét nghiệm NST từ tế bào ối hoặc từ tế bào máu ngoại vi. Kết quả QF-PCR được<br /> phân tích trên máy đọc trình tự tự động ABI 3130. Kết quả: khi so sánh kết quả QF-PCR với di<br /> truyền tế bào về số lượng các NST 13, 18, 21, X và Y theo 2 phương pháp cho thấy sự phù<br /> hợp với kết quả karyotype là 448/500 (99,6%), nhưng QF-PCR cho chẩn đoán đúng 99,8%. 2<br /> trường hợp không phù hợp đều liên quan đến NST giới tính: trong đó 1 trường hợp QF-PCR là<br /> XY, karyotype là XX: Kết quả QF-PCR phù hợp với hình ảnh lâm sàng (người nam, có tinh<br /> hoàn nhưng không có tinh trùng); trường hợp thứ 2: QF-PCR là XY, karyotype là XX/XY. Các<br /> marker có độ chính xác cao nhất trong kỹ thuật QF-PCR là SRY (100%), HPRT (85,2%),<br /> D13S258 (83%), D18S386 (80,6%), D21S1442 (84%). Một số marker có giá trị chẩn đoán thấp<br /> dưới 70% như D13S797 (55,2%), D18S390 (52,8%), D21S1446 (60%), X22 (54,6%)… nhưng<br /> tập hợp các marker chẩn đoán cho từng NST có độ chính xác rất cao: 100% với các NST 13,<br /> 18, 21 và 99,8% với NST giới tính. Kết luận: kỹ thuật QF-PCR cho chẩn đoán nhanh và chính<br /> xác đối với lệch bội NST 13, 18, 21 và đặc biệt cho NST giới tính.<br /> * Từ khóa: Nhiễm sắc thể; QF- PCR; Trisomy 21; Trình tự lặp ngắn STR.<br /> <br /> Value of QF-PCR in the Diagnosis of Chromosomes Aneuploidies<br /> Summary<br /> Objectives: To compare the accuracy of quantitative fluorescent PCR (QF-PCR) technique<br /> and cytogenetic technique for the prenatal diagnosis of chromosome aneuploidies 13, 18, 21, X<br /> and Y. Also, evaluate the value of each marker of QF-PCR technique for the diagnosis of<br /> chromosomes aneuploidies 13, 18, 21, X and Y. Subjects and methods: A cross-sectional<br /> descriptive, retrospective study was conducted on 500 amniotic fluid samples or peripheral<br /> blood leukocytes. Each sample was applied for both QF- PCR and cytogenetic techniques.<br /> * Trường Đại học Y Hà Nội<br /> ** Bệnh viện Phụ Sản Trung ương<br /> Người phản hồi (Corresponding): Hoàng Ngọc Lan (hoangngoclancdts@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 04/09/2017<br /> <br /> 238<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Results: 448/500 (99.6%) of QF-PCR results were matched to cytogenetic results on the<br /> number of chromosomes 13, 18, 21, X and Y. The QF-PCR for the correct diagnosis was<br /> 99.8%. Two unsuitable cases related to sex chromosomes: one case was 46,XY by QF-PCR,<br /> but it was 46,XX by cytogenetics. The QF-PCR results were consistent with the clinical (male,<br /> testicular but not have sperm); Case 2: QF-PCR is XY, choromosome mosaicism was XX/XY.<br /> The most accurate markers in the QF-PCR technique were SRY (100%), HPRT (85.2%),<br /> D13S258 (83%), D18S386 (80.6%), D21S1442 (84%). Some markers have diagnostic values<br /> below 70%, such as D13S797 (55.2%), D18S390 (52.8%), D21S1446 (60%), X22 (54.6%)...<br /> The set of diagnostic markers of each chromosome is highly accurate: 100% with chromosomes<br /> 13, 18, 21 and 99.8% with sex chromosomes. Conclusion: Diagnosis of aneuploidies of<br /> chromosome 13, 18, and 21, especially for sex chromosomes are highly accurate.<br /> * Keywords: Chromosome; QF-PCR; Trisomy 21; Short tandem repeat; Aneuploidies.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Lệch bội nhiễm sắc thể (NST) là một<br /> trong những nguyên nhân gây dị tật bẩm<br /> sinh, chậm phát triển tâm thần, thể chất.<br /> Việc chẩn đoán sớm các lệch bội NST<br /> thời kỳ phôi thai là cần thiết để hạn chế<br /> trẻ bị bất thường bẩm sinh. Gần đây, kỹ<br /> thuật di truyền phân tử QF-PCR<br /> (quantitative fluorescence - polymerase<br /> chain reaction) được gọi là phản ứng<br /> chuỗi polymer huỳnh quang định lượng<br /> dùng để khuếch đại các trình tự lặp ngắn<br /> (STR-short tandem repeat) để chẩn đoán<br /> nhanh các bất thường số lượng NST<br /> bằng định lượng trình tự lặp ngắn STR có<br /> tính đa hình cao ở một số locus nhất định<br /> trên NST 13, 18, 21, X và Y, bằng các<br /> cặp mồi huỳnh quang. Trong chẩn đoán<br /> trước sinh, xét nghiệm bằng QF-PCR chỉ<br /> cần từ 0,5 - 1 ml dịch ối, không cần qua<br /> nuôi cấy tăng sinh tế bào. Thời gian trả<br /> kết quả nhanh (khoảng 5 giờ sau lấy<br /> mẫu). Trong kỹ thuật QF-PCR, người ta<br /> sử dụng các marker để chẩn đoán số<br /> lượng các NST. Mỗi marker có độ chính<br /> xác khác nhau. Do vậy, chúng tôi thực<br /> hiện đề tài này nhằm:<br /> <br /> - So sánh độ chính xác của kỹ thuật<br /> QF-PCR và kỹ thuật di truyền tế bào trong<br /> chẩn đoán một số bất thường lệch bội<br /> NST 13, 18, 21, X và Y;<br /> - Đánh giá giá trị của từng marker của<br /> kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán một số<br /> bất thường lệch bội NST 13, 18, 21, X<br /> và Y.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng và địa điểm nghiên<br /> cứu.<br /> 500 mẫu tế bào ối hoặc bạch cầu máu<br /> ngoại vi. Xét nghiệm thực hiện tại Trung<br /> tâm Chẩn đoán Trước sinh Bệnh viện<br /> Phụ Sản Trung ương từ tháng 1 - 2015<br /> đến tháng 5 - 2017.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Nghiên cứu cắt ngang mô tả, hồi cứu.<br /> Mỗi mẫu xét nghiệm được tiến hành<br /> đồng thời 2 phương pháp: xét nghiệm<br /> QF-PCR và phương pháp phân tích NST<br /> lập karyotype từ mẫu tế bào ối nuôi cấy<br /> hoặc mẫu máu ngoại vi. So sánh 2 kết<br /> quả xét nghiệm đó.<br /> 239<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017<br /> * Phương pháp QF-PCR:<br /> - Kết quả thu được từ hệ thống điện di<br /> mao quản của máy đọc trình tự tự động<br /> ABI 3130 XL sẽ phân tích bằng phần<br /> mềm chuyên dụng Genmapper ID 3.2.<br /> - Khi xác định số alen thông qua số<br /> lượng đỉnh (peak), dựa vào tỷ lệ đỉnh<br /> STR thu được. Từ 0,8 - 1,4:1: bình<br /> thường, ≤ 0,6:1 hoặc ≥ 1,8:1: lệch bội<br /> NST; từ 1,6:1: đối với các alen ≥ 20 base<br /> pair bình thường. Các mẫu trisomy sẽ tạo<br /> ra kiểu 3 alen hay 2 alen không cân xứng<br /> ở marker trên vùng một NST. Chẩn đoán<br /> trisomy được chấp nhận khi có ít nhất 2<br /> marker ở trên cùng một NST có dạng 3<br /> alen hay 2 alen không cân xứng tỷ lệ.<br /> * Phương pháp di truyền tế bào: nuôi<br /> cấy tế bào ối hoặc tế bào máu ngoại vi và<br /> phân tích NST, lập karyotype theo tiêu<br /> chuẩn của Hội nghị Quốc tế về Di truyền<br /> (2015 - ISCN).<br /> TM<br /> <br /> Bộ kit Aneufast QF-PCR gồm có 36<br /> marker, trong đó: 8 marker chẩn đoán<br /> cho NST số 21: D21S1414, D21S1411,<br /> D21S1446,<br /> D21S1437,<br /> D21S1809,<br /> D21S1412, D21S1435, D21S1442. 8<br /> marker chẩn đoán cho NST số 18:<br /> D18S391, D18S390, D18S535, D18S386,<br /> D18S858, D18S499, D18S1002, D18S976.<br /> 7 marker chẩn đoán cho NST số 13:<br /> D13S631, D13S634, D13S258, D13S305,<br /> D13S628, D13S742, D13S797. 13 marker<br /> chẩn đoán cho NST giới tính. Trong đó,<br /> marker SRY chẩn đoán riêng cho NST Y;<br /> các marker TAF9L, HPRT, DXS6803,<br /> DXS6809, DXS8377, DXS981, DXS1187<br /> 240<br /> <br /> chẩn đoán riêng cho NST X; các marker<br /> AMXY, X22, DXYS267, DXYS218,<br /> DXYS156 chẩn đoán cho cả X và Y. Chia<br /> các marker thành các lọ S1+S2, gồm 21<br /> marker (6 marker cho NST X,Y, và mỗi<br /> NST 13, 18, 21 có 5 marker). Ngoài ra,<br /> còn lại chia vào 4 lọ extra marker cho<br /> NST giới (7 marker), NST 13 (2 marker),<br /> 18 (3 marker), 21 (3 marker).<br /> Khi tiến hành kỹ thuật QF-PCR,<br /> thường chỉ cần marker ở lọ S1 và S2.<br /> Trong một số trường hợp nghi ngờ kết<br /> quả, sử dụng các lọ khác (lọ MXY, lọ<br /> M13, lọ M18, lọ M21), ở những lọ này,<br /> ngoài marker trong S1, S2, còn có thêm<br /> một số marker gọi là extra marker.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. So sánh kết quả QF-PCRv i kết<br /> quả karyotype.<br /> Phù hợp với kết quả karyotype ở 56 mẫu<br /> lệch bội (100%), trong đó 33 trường hợp<br /> trisomy 21, 11 thai trisomy 18, 5 thai<br /> trisomy 13, 1 trường hợp 47,XXX, 4<br /> Klinefelter (47,XXY), 1 hội chứng Turner<br /> (45,X), 1 thai hội chứng siêu nam (47, XYY);<br /> 442 trường hợp bình thường phù hợp<br /> giữa 2 kết quả, trong đó 247 trường hợp<br /> là 46,XY và 195 trường hợp là 46,XX.<br /> 2 trường hợp không phù hợp giữa 2 kết<br /> quả: 1 trường hợp QF-PCR chẩn đoán<br /> 46,XY kết quả karyotype thể khảm 46,XX/<br /> 46,XY; 1 trường hợp QF-PCR chẩn đoán<br /> là XY karyotype là XX. Như vậy, sử dụng<br /> kỹ thuật QF-PCR phù hợp chung cho tất<br /> cả trường hợp là 498/500 = 99,6%.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> 2. Đ chính xác của marker của kỹ<br /> thuật QF-PCR.<br /> * Các marker chẩn đoán cho NST<br /> số 13:<br /> Trong 5 marker dùng phổ biến<br /> (S1+S2) để chẩn đoán cho NST 13, độ<br /> phù hợp với karyotype của marker<br /> D13S258, D13S305, D13S631, D13S634,<br /> D13S797 lần lượt là 83%, 77,2%, 75%,<br /> 72,2%, 55,2%. Các extra marker chẩn<br /> đoán cho NST 13, D13S742 có độ phù<br /> hợp 76,5%, D13S628 có độ phù hợp<br /> 58,8%. Chỉ có 17 BN được làm extra<br /> marker này nên cỡ mẫu chưa đủ lớn để<br /> đánh giá có ý nghĩa thống kê.<br /> * Các marker chẩn đoán cho NST<br /> số 18:<br /> Trong 5 marker dùng phổ biến<br /> (S1+S2) để chẩn đoán cho NST 18, độ<br /> phù hợp với karyotype của marker<br /> D18S386, D18S976, D18S535, D18S391,<br /> D18S390 theo thứ tự là 80,6%, 77,8%,<br /> 76,2%, 63%, 52,8%. Các extra marker<br /> chẩn đoán cho NST 18, D18S1002 có độ<br /> phù hợp 100%, sau đó D18S499 có độ<br /> phù hợp 76,2% và D18S858 có độ phù<br /> hợp 61,9%. Tuy nhiên, chỉ có 21 BN<br /> được làm extra marker của NST 18, nên<br /> cỡ mẫu chưa đủ lớn để đánh giá có ý<br /> nghĩa thống kê.<br /> * Các marker chẩn đoán cho NST<br /> số 21:<br /> Trong 5 marker dùng phổ biến<br /> (S1+S2) để chẩn đoán cho NST 21, độ<br /> phù hợp với karyotype của marker<br /> D21S1442,<br /> D21S1411,<br /> D21S1414,<br /> D21S1435, D21S1446 theo thứ tự là<br /> <br /> 84%, 83,8%, 80,6%, 73,8%, 60%. Các<br /> extra marker chẩn đoán cho NST 21 thấy<br /> marker D21S1412 có độ phù hợp cao<br /> nhất (73,3%), sau đó là marker<br /> D21S1437 có độ phù hợp 66,7% và<br /> marker D21S1809 có độ phù hợp 60%.<br /> Tuy nhiên, chỉ 15 BN được làm extra<br /> marker của NST 21, nên cỡ mẫu chưa đủ<br /> lớn để đánh giá có ý nghĩa thống kê.<br /> * Các marker chẩn đoán cho NST giới<br /> tính:<br /> Marker SRY chẩn đoán cho NST Y có<br /> độ chính xác 100%, nhưng độ phù hợp<br /> với kết quả karyotype 99,8%, vì có 1 bệnh<br /> nhân kiểu hình nam (kết quả QF-PCR có<br /> gen SRY, nhưng kết quả NST là 46,XX).<br /> Marker HPRT chẩn đoán cho NST X là<br /> 85,2%. Các marker chẩn đoán cho cả<br /> NST X và Y, trong chẩn đoán lệch bội liên<br /> quan đến NST giới tính, những marker<br /> này có độ phù hợp gần như nhau, trong<br /> khoảng 55 - 72%. Trong chẩn đoán mẫu<br /> XX, marker AMXY có độ phù hợp rất thấp<br /> (10,6%), marker DXYS267 có độ phù hợp<br /> cao nhất (68,3%). Trong chẩn đoán mẫu<br /> XY, marker AMXY có độ phù hợp cao<br /> nhất 100%, thấp nhất là marker X22<br /> (56,6%). Nói chung, trong tất cả trường<br /> hợp, 4 marker này đều có độ phù hợp là:<br /> DXYS267 (71%), DXYS218 (63,8%),<br /> AMXY (60,4%), X22 (54,6%).<br /> Các extra marker của NST giới tính,<br /> trong chẩn đoán mẫu lệch bội liên quan<br /> đến NST giới tính, marker TAF9L chẩn<br /> đoán cho NST X có độ phù hợp cao nhất<br /> (83,3%). Trong chẩn đoán mẫu XX,<br /> marker DXS8377 có độ phù hợp cao nhất<br /> (80%). Nói chung marker DXS8377 có độ<br /> 241<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017<br /> phù hợp cao (77,8%) trong chẩn đoán<br /> các trường hợp được làm extra marker.<br /> Tuy nhiên, chỉ có 18 bệnh nhân được làm<br /> extra marker NST giới tính nên cỡ mẫu<br /> chưa đủ lớn để đánh giá có ý nghĩa thống<br /> kê.<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Đ phù hợp của kỹ thuật QF-PCR<br /> so v i kỹ thuật di truyền tế bào.<br /> Hiện nay, kỹ thuật di truyền tế bào (lập<br /> karyotype) vẫn được coi là tiêu chuẩn<br /> vàng để chẩn đoán chính xác bất thường<br /> số lượng NST. Do vậy, chúng tôi so sánh<br /> kết quả QF-PCR với kết quả NST để<br /> đánh giá độ chính xác của kỹ thuật QFPCR. Trong nghiên cứu này, khi dùng kỹ<br /> thuật QF-PCR đã phát hiện 56 mẫu bất<br /> thường lệch bội NST (13, 18, 21, X và Y)<br /> đều trùng với 56 mẫu của kỹ thuật di<br /> truyền tế bào, tỷ lệ phù hợp 100%, tương<br /> tự kết quả của Nguyễn Khắc Hân Hoan<br /> (2013) [1] và You Jung Shin (2016) [6]<br /> đưa ra. Với 7 mẫu lệch bội NST giới tính<br /> đều phù hợp giữa hai kỹ thuật QF-PCR<br /> và di truyền tế bào (tỷ lệ đúng 100%),<br /> giống với kết quả của Nagy B. (2015)<br /> thấy 50 mẫu lệch bội NST giới tính trong<br /> tổng số 20.173 mẫu ối [7].<br /> Trong 444 mẫu không lệch bội (443<br /> mẫu bình thường và 1 mẫu khảm), kỹ<br /> thuật QF-PCR chẩn đoán 442 mẫu giống<br /> với kỹ thuật di truyền tế bào (99,6%),<br /> nhưng tỷ lệ chẩn đoán đúng là 99,8%,<br /> phù hợp với nghiên cứu của You Jung<br /> Shin (2016) [6]. Trong nghiên cứu, có 2<br /> trường hợp cho kết quả không phù hợp<br /> giữa hai kỹ thuật. Kỹ thuật QF-PCR có kết<br /> quả phù hợp với NST là 498/500 (99,6%),<br /> 242<br /> <br /> tương tự với nghiên cứu của Hoàng Thị<br /> Ngọc Lan (2016) [2]. Sau đây là hai<br /> trường hợp mà kết quả QF-PCR trả lời<br /> khác với kết quả karyotype.<br /> Ở trường hợp thứ nhất, kết quả<br /> karyotype là 46,XX mà bệnh nhân có kiểu<br /> hình nam. Bệnh nhân này đã được làm kỹ<br /> thuật QF-PCR phát hiện có gen SRY<br /> (hiện 1 đỉnh của marker SRY- như vậy có<br /> 1 NST Y), marker HPRT hiện 1 đỉnh, 4<br /> marker còn lại AMXY, X22, DXYS218,<br /> DXYS267 đều có tỷ lệ 1:1. Các NST 13,<br /> 18, 21 đều đọc bình thường. Tổng hợp lại<br /> kết quả QF-PCR trả lời là nam vì có gen<br /> biệt hóa tinh hoàn SRY. Kết hợp với kết<br /> quả NST 46,XX, đây là 1 trường hợp mà<br /> gen biệt hóa tinh hoàn SRY nằm trên<br /> nhánh ngắn NST Y đã chuyển sang NST<br /> X trong quá trình giảm phân tạo giao tử.<br /> Vì vậy, người này có 2 NST X, nhưng<br /> thực ra 1 NST X đã chứa gen SRY, nên<br /> người này có kiểu hình nam, nhưng<br /> không có các gen trên nhánh dài NST Y,<br /> không có tinh trùng trong tinh dịch. Kỹ<br /> thuật QF-PCR đã giúp phát hiện một số<br /> đột biến cấu trúc nhỏ mà karyotype không<br /> xác định được, để có kết luận di truyền<br /> chính xác hơn. Tương tự với nghiên cứu<br /> của Liu X. (2015), 1 trường hợp bất<br /> thường cấu trúc NST X trong 2436 mẫu ối<br /> [8].<br /> Ở trường hợp thứ hai là một thai có<br /> kết quả QF-PCR bình thường 46,XY, điều<br /> này gợi ý một thai nam bình thường. Khi<br /> đối chứng với kết quả phân tích<br /> karyotype, lúc đầu thấy đa số các cụm<br /> đọc 46,XX là một thai nữ bình thường,<br /> nhưng do tính chất gợi ý từ kết quả QFPCR, tiếp tục đọc thêm nhiều cụm nữa và<br /> <br />