Hệ thốngprotein dung hợp với GST (HỌ VECTOR pGEX)

Chia sẻ: Nguyen Phuonganh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:18

Thêm vào BST

Báo xấu

113
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đặc điểm của họ vector pGEX: · Có chứa promoter tac điều khiển sự biểu hiện vượt mức của gen nằm ở hạ lưu được cảm ứng bằng IPTG hoặc các chất có cấu trúc tương tự. · Vùng gen lacIq là dạng đột biến của gen lacI tạo ra lượng lớn repressor của lac operon (lacO) trong tế bào chủ E.coli. · Điểm khởi đầu sao chép Ori: là vị trí DNA polymerase của tế bào vi khuẩn gắn vào và bắt đầu quá trình sao chép plasmid. ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Hệ thốngprotein dung hợp với GST (HỌ VECTOR pGEX)

HỆ THỐNG PROTEIN DUNG HỢP VỚI GST (HỌ VECTOR pGEX) I. Đặc điểm của họ vector pGEX: · Có chứa promoter tac điều khiển sự biểu hiện vượt mức của gen nằm ở hạ lưu được cảm ứng bằng IPTG hoặc các chất có cấu trúc tương tự. · Vùng gen lacIq là dạng đột biến của gen lacI tạo ra lượng lớn repressor của lac operon (lacO) trong tế bào chủ E.coli. · Điểm khởi đầu sao chép Ori: là vị trí DNA polymerase của tế bào vi khuẩn gắn vào và bắt đầu quá trình sao chép plasmid.
· Gen kháng Ampicillin làm nhân tố sàng lọc các tế bào không có plasmid trong quá trình biến nạp khi trải lên môi trường chọn lọc có ampicillin. · Việc tách rửa cho phép thu nhận protein dung hợp ra khỏi cột ái lực trong điều kiện ôn hoà để đảm bảo tính kháng nguyên và hoạt tính chức năng của protein. · Có vị trí nhận biết cho enzyme protease PreScission™, thrombin, or factor Xa đểcắt protein mục tiêu ra khỏi sản phẩm protein dung hợp. · Có vị trí kết thúc phiên mã nằm sau vùng MCS. Hệ thống pGEX có tất cả 13 vectors. Trong đó có 9 vectors là có vùng MCS mở rộng giúp dễ dàng trong việc dòng hoá, chứa 6 vị trí nhận biết cho enzyme cắt giới hạn: · pGEX-6P-1, pGEX-6P-2, and pGEX- 6P- mã hoá cho trình tự nhận biết vị trí cắt
đặc hiệu của protease PreScission™ giữa domain GST và MCS. · pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, and pGEX- 4T-3 bắt nguồn từ pGEX-2T và chứa vị trí nhận biết cho thrombin. · pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, and pGEX5X-3 là các dẫn xuất của pGEX- 3X và có vị trí nhận biết cho factor Xa. II. Đặc tính của các vector pGEX: · Cảm ứng: promoter tac được cảm ứng bởi IPTG (1-5 mM). · Biểu hiện: protein được biểu hiện là protein dung hợp với protein GST (26 kDa). Gen GST chứa 1 codon khởi đầu ATG và vị trí kết hợp với ribosome, và chịu sự kiểm soát của promoter tac. Mỗi ORF đều có codon kết thúc quá trình dịch mã. Protein dung hợp được tinh sạch bởi kit tinh sạch protein dung hợp với GST. · Vị trí cắt của protease PreScission™: pGEX-6P-1, -2, -3 cho phép loại bỏ
protein GST ra khỏi protein dung hợp bởi enzyme cắt PreScission™. Bởi vì PreScission™ đã được xử lý với tag GST. Tag GST sẽ được loại bỏ đồng thời với protein GST ra khỏi protein dung hợp. · Vị trí cắt của enzyme thrombin: pGEX-1λT, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, -2, -3 cho phép loại bỏ protein GST ra khỏi protein dung hợp bởi thrombin. · Vị trí cắt cho fator Xa: pGEX-3X, pGEX-5X-1, -2, -3 cho phép loại bỏ protein GST ra khỏi protein dung hợp bởi factor Xa. · Đánh dấu trực tiếp trong điều kiện in vitro: pGEX-2TK cho phép đánh dấu P32protein dung hợp trong điều kiện in vitro bởi tiểu phần xúc tác protein kinase phụ thuộc cAMP. · Tế bào chủ: E.coli. plasmid mang gen ức chế lacIq.
· Marker chọn lọc: plasmid chứa gen kháng ampicillin 100 µg/ml. II.1. pGEX-2T: · Vùng gen GST: promoter tac:-10: 205- 211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn kết ribosome: 244; codon khởi đầu ATG: 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935. · MCS:930-945. · Vùng gen cho beta-lactamase: Promoter: -10: 1309-1314; -35: 1286- 1291; codon khởi đầu (ATG): 1356; codon kết thúc (TAA): 2214. · Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3297; codon kết thúc (TGA): 4377. · Vùng sao chép của plasmid: vị trí khởi đầu sao chép: 2974; vùng cấn thiết cho sao chép: 2281-2977. · Trình tự primer: 5’ pGEX trình tự primer kết hợp ở nucleotide 869-891; 3’
pGEX trình tự primer kết hợpơơ3 nucleotides 1020-998. II.2. pGEX-2TK: · Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217- 237; vị trí gắn ribosome cho GST:244; codon khởi đầu (ATG) cho GST: 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918- 935; · Vùng mã hoá cho vị trí cắt kinase: 936-950. · Vùng MCS: 951-966. · Vùng gen beta-lactamase: promoter: - 10: 1330-1335; -35: 1307-1312; codon khởi đầu (ATG): 1377; codon kết thúc (TAA): 2235. · Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3318; codon Stop (TGA): 4398. · Vùng sao chép plasmid: vị trí khởi đầu sao chép: 2995; vùng cần thiết cho sao chép: 2302-2998.
· Trình tự primers: trình tự primer 5' pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; trình tự primer 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1041- 1019. II.3. pGEX-3X: · Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217- 237; vị trí gắn kết với ribosome cho GST: 244; codon khởi đầu (ATG) cho GST: 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt của Factor Xa: 921-932. · Vùng MCS: 934-949. · Vùng gen Beta-lactamase: Promoter: - 10: 1313-1318; -35: 1290-1295; codon khởi đầu (ATG): 1360; codon kết thúc (TAA): 2218. · Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3301; codon kết thúc (TGA): 4381.
· Vùng sao chép của plasmid: vị trí khởi đầu sao chép: 2978; vùng cần thiết cho sao chép: 2285-2981. · Trình tự primers: trình tự Primer 5' pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; trình tự Primer 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1024- 1002. II.4. pGEX-1λT: · Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217- 237; vị trí gắn với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935. · Vùng MCS: 930-944. · Vùng gen beta-lactamase: promoter: - 10: 1308-1313; -35: 1285-1290; codon khởi đầu (ATG): 1355; codon kết thúc (TAA): 2213. · Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3296; codon kết thúc (TGA): 4376.
· Vùng sao chép của plasmid: vị trí khởi đầu sao chép: 2973; vùng cần thiết cho sao chép: 2280-2976. · Trình tự primers: trình tự primers 5' pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; trình tự primer 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1019-997. II.5. pGEX-4T-1: · Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217- 237; Vị trí gắn với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935. · Vùng MCS: 930-966. · Vùng gen beta-lactamase: promoter: - 10: 1330-1335; -35: 1307-1312; codon khởi đầu (ATG): 1377; codon kết thúc (TAA): 2235. · Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3318; codon kết thúc (TGA): 4398.
· Vùng sao chép plasmid: vị trí khởi đầu sao chép: 2995; vùng cần thiết cho sao chép: 2302-2998. · Trình tự primers: trình tự primer 5' pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; trình tự primer 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1041- 1019. II.6. pGEX-4T-2: · Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217- 237; vị trí gắn kết với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935. · Vùng MCS: 930-967. · Vùng gen Beta-lactamase: promoter: - 10: 1331-1336; -35: 1308-1313; codon khởi đầu (ATG): 1378; codon kết thúc (TAA): 2236. · Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3319; codon kết thúc (TGA): 4399.
· Vùng sao chép: vị trí khởi đầu sao chép 2996; vùng cần thiết cho sao chép: 2303-2999. · Trình tự primers: 5' pGEX bắt cặp bổ sung ở vị trí 869-891; 3' pGEX bắt cặp bổ sung ở vị trí 1042-1020. II.7. pGEX-4T-3: · Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217- 237; vị trí gắn với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935. · Vùng MCS: 930-965. · Vùng gen Beta-lactamase: Promoter: - 10: 1329-1334; -35: 1306-1311; codon khởi đầu (ATG): 1376; codon kết thúc (TAA): 2234. · Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3317; codon kết thúc (TGA): 4397.
· Vùng sao chép: vị trí khởi đầu sao chép: 2994; vùng cần thiết cho sao chép:2301-2997. · Trình tự primers: 5' pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1040- 1018. II.8. pGEX-5X-1: · Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217- 237; vị trí gắn ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vịt rí cắt của factor Xa: 921-932. · Vùng MCS: 934-969. · Vùng gen beta-lactamase: promoter: - 10: 1333-1338; -35: 1310-1315; codon khởi đầu (ATG): 1380; codon kết thúc (TAA): 2238. · Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3321; codon kết thúc (TGA): 4401.
· Vùng sao chép: vị trí khởi đầu sao chép: 2998; vùng cần thiết sao chép: 2305- 3001. · Trình tự primers: 5’ pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; 3’ pGEX bắt cặp ở vị trí 1044- 1022. II.9. pGEX-5X-2: · Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217- 237; vị trí gắn ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt factor Xa: 921-932. · Vùng MCS: 934-970. · Vùng gen beta-lactamase: promoter: - 10: 1334-1339; -35: 1311-1316; codon khởi đầu (ATG): 1381; codon kết thúc (TAA): 2239. · Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3322; codon kết thúc (TGA): 4402.
· Vùng sao chép: vị trí khởi đầu sao chép: 2999; vùng cần thiết cho sao chép: 2306-3002. · Trình tự primers: 5' pGEX bắt ở vị trí 869-891; 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1045- 1023. II.10. pGEX-5X-3: · Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217- 237; vị trí gắn ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt của factor Xa: 921-932. · Vùng MCS: 934-971. · Vùng gen beta-lactamase: Promoter: - 10: 1335-1340; -35: 1312-1317; codon khởi đầu (ATG): 1382; codon kết thúc (TAA): 2240. · Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3323; codon kết thúc (TGA): 4403.
· Vùng sao chép: vị trí khởi đầu sao chép: 3000; vùng cần thiết cho sao chép: 2307-3003. · Trình tự primers: 5' pGEX bắt cặp ở vị trí 869-891; 3' pGEX bắt cặp ở vị trí 1046- 1024.
Hình 1: Sơ đồ vectors dung hợp GST cho thấy các ORFs và những đặc điểm chính.