Hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ lá cây trứng cá Muntingia calabura L.

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC từ lá cây trứng cá được sử dụng để đánh giá sơ bộ hoạt tính hóa học, định tính một số thành phần hóa học cơ bản bằng phương pháp LC-MS/MS, khả năng chống oxy quét gốc tự do DPPH và hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả định tính cho thấy có nhiều hợp chất như phenolic, flavonoid, tannin và steroid.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ lá cây trứng cá Muntingia calabura L.

Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (2), 2018 HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA CALABURA L. Phạm Hữu Tuấn*, Nguyễn Ngọc Hồng Trường Đại học Công nghệ TP.HCM *Tác giả liên lạc: huutuanpro93@yahoo.com (Ngày nhận bài: 03/4/2018; Ngày duyệt đăng: 25/5/2018) TÓM TẮT Cây trứng cá (Muntingia Calabura L.) được trồng nhiều ở miền Nam Việt Nam và thường dùng để làm bóng mát nhưng hoạt tính sinh học ít được nghiên cứu. Trong nghiên cứu này dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC từ lá cây trứng cá được sử dụng để đánh giá sơ bộ hoạt tính hóa học, định tính một số thành phần hóa học cơ bản bằng phương pháp LC-MS/MS, khả năng chống oxy quét gốc tự do DPPH và hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả định tính cho thấy có nhiều hợp chất như phenolic, flavonoid, tannin và steroid trong các dịch chiết EMC70 và EMC90, trong khi AME chứa saponin và amino acid tự do. Khả năng chống oxy hóa của EMC70 và EMC90 là gần bằng nhau với giá trị tương đương là (16,70±0,10 μg/ml và 16,49±0,03 μg/ml tương ứng) và thấp hơn khoảng 3,10 lần so với axit ascorbic (IC50=5,38±0,12 μg/ml). Phân tích HPLC-MS của cao chiết tổng ethanol cho thấy sự hiện diện của Chrysoeriod, 8-Methoxygalangin và một số chất khác thuộc nhóm flavonoid. Khả năng kháng khuẩn của EMC70 và EMC90 là tương đương nhau đối với các chủng Enterotoxigenic E.coli-ETEC, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus và Shigella flexneri. Kết quả tổng hợp cho thấy cây Muntingia Calabura có hoạt tính chống oxy hóa, cùng với tiềm năng kháng khuẩn đối với một số chủng vi sinh gây bệnh đường ruột. Từ khóa: Chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, quét gốc tự do DPPH. ANTIOXIDANT AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF EXTRACTS FROM MUNTINGIA CALABURA L. Pham Huu Tuan*, Nguyen Ngoc Hong Ho Chi Minh City University of Technology *Corresponding Author: huutuanpro93@yahoo.com ABSTRACT Muntingia Calabura L. was grown in southern Vietnam. Until now there are not many scientific articles published on the bio-activity of Muntingia calabura leaves. In this study, EMC70, EMC90 and AMC extract from Muntingia calabura are used to test phytochemical, HPLC profiling, DPPH radical-scavenging and antimicrobial activity. The result screening for phytochemical analysis of Muntingia calabura showed that phenolics, flavonoids, tannins and steroids in EMC70 and EMC90. AMC with saponin and amino acid at large. In antioxidant activity, IC50 of EMC70 (16.70±0.10 μg/ml) and EMC90 (16.49±0.03 μg/ml) weren’t different in statistics and less than 3.10 times as much as axit ascorbic (IC50=5.38±0.12 μg/ml). The HPLC/MS analysis revealed the presence of chrysoeriol, 8-Methoxygalangin and some flavonoid compounds in total ethanol extract of Muntingia calabura. In antibacterial activity, EMC70 and EMC90 had the same activity with Enterotoxigenic E.coli-ETEC, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Shigella flexneri. Conclusion Muntingia Calabura has antioxidant activity and intestinal antibacterial activity. Keywords: Antioxidant activity, antimicrobial activity, DPPH radical-scavenging. 19
Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (2), 2018 MỞ ĐẦU chloride từ BDH Labs (Cambridge, Muntingia Calabura L. thuộc họ England), TSB (Tryptone casein soy Elaeocarpaceae. Cây rất dễ trồng và phân broth), TSA (Tryptone casein soy agar) từ bố rộng. Lá, vỏ cây và hoa có giá trị làm New Delhi (India). thuốc chữa bệnh. Theo y học cổ truyền, lá Chủng vi sinh vật chỉ thị Muntingia. Calabura khi nấu lên hoặc sắc Các chủng vi sinh vật gây bệnh sử dụng thuốc có thể giảm loét dạ dày, giảm sưng bao gồm: Escherichia coli, tuyến tiền liệt hay giảm bớt cơn đau đầu. Enterotoxigenic E.coli-ETEC, Listeria Những minh chứng khoa học gần đây cho monocytogenes, Salmonella typhi, thấy cây Muntingia Calabura có hoạt tính Pseudomonas aeruginosa, giảm đau, kháng viêm và hạ sốt (Yusof và Staphylococcus aureus, Shigella flexneri ctv, 2011). Trong những báo cáo nghiên và Shigella boydii được cung cấp bởi Viện cứu khác thì dịch chiết lá Muntingia Vệ sinh Y tế công cộng, trường đại học Calabura L. có hoạt tính chống loét dạ dày Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh. (Balan và ctv, 2013). Muntingia Calabura Phương pháp xác định thành phần hóa L. đã được nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế học giới nhưng tại Việt Nam vẫn chưa có nhiều Phương pháp xác định thành phần hóa học nghiên cứu về loài này. Mục đích của dựa theo phương pháp của Yadav và ctv nghiên cứu này là nhằm định tính một số (2013) nhằm định tính các nhóm chất hữu thành phần hóa học cơ bản bằng phương cơ trong thành phần cao chiết từ cây pháp HPLC/MS, khả năng chống oxy quét Muntingia Calabura. gốc tự do DPPH và hoạt tính kháng khuẩn Khả năng chống oxy hóa quyết gốc tự từ dịch chiết lá cây Muntingia Calabura L. do DPPH Hoạt tính chống oxy hóa quét gốc tự do VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP DPPH của cây Muntingia Calabura được Thu hái và xử lý mẫu xác định dựa theo mô tả của Nur Alam và Mẫu lá cây Muntingia Calabura L. được ctv (2012). Khả năng chống oxy hóa được thu thập ở TP. Hồ Chí Minh và được định xác định dựa trên nồng độ IC50 mà tại đó danh bởi PGS.TS Trần Hợp trường Đại có khả năng ức chế 50% gốc tự do. Khả học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh. năng quét được đo bằng máy T70 UV- Mẫu sau khi được thu nhận được xử lý và visible spectrometer ở bước sóng λ=517 xay với kích thước 0,2-1 mm mẫu cây bảo nm. quản nơi khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời. Hoạt tính quét gốc tự do (%) = 50 g mẫu cây được ngâm trong dung môi AC - AS x 100% AC ethanol 70, ethanol 90 và nước theo tỷ lệ 1/20 (w/v). Sau 24 giờ các dịch chiết được Ac và As tương ứng là mẫu đối chứng lọc thu dịch. Cao chiết có được bằng cách (DPPH trong methanol) và các mẫu thí sử dụng máy cô quay chân không tại 400C nghiệm axit ascorbic đã được sử dụng như để thu được dịch chiết thô ethanol 70 đối chứng dương. Các thử nghiệm được (EMC70) ethanol 90 (EMC90) và dịch tiến hành trong ba lần lặp. chiết nước (AMC). Định lượng flavonoid Thuốc thử và hóa chất Hàm lượng flavonoid được xác định theo Folin-Ciocalteu (Darmstadt, Germany), phương pháp của Woisky and Salatino DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) và (1998) 2 ml mẫu (mg/ml) được thêm vào axit ascorbic từ MP Biomedicals (Illkirch, 2 ml AlCl3 2%, ủ ở nhiệt độ phòng trong France), axit gallic, rutin từ Riedel-de- 45 phút rồi đo quang ở bước sóng λ = 420 Haen (Seelze, Germany) aluminum nm. Hàm lượng flavonoid được tính toán chloride, sodium carbonate, iron(III) dựa vào đường chuẩn rutin. 20
Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (2), 2018 Định lượng phenolic Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng Hàm lượng phenolic được xác định bởi khuẩn của cao chiết dựa trên phương pháp phương pháp Folin-Ciocalteu theo Von khuếch tán trên đĩa thạch (Aibinu và ctv, Gadow và ctv (1997) sử dụng axit gallic là 2007). 0,1 ml dịch vi khuẩn chỉ thị có mật chất chuẩn. Cho nồng độ mẫu (mg/ml) vào độ 106 cfu/ml được hút từ môi trường tăng ống nghiệm. Thêm 2,5 ml thuốc thử Folin- sinh Tryptone casein soy broth (TSB) để Ciocateau (1/10). Sau khoảng 5 đến 8 phút cấy trang trên đĩa thạch chứa môi trường bổ sung thêm 2 ml Na2CO3 7,5%, lắc đều, Tryptone casein soy agar (TSA) tiệt trùng. ủ ở 400C ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, Sử dụng ống kim loại tiệt trùng có đường tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 765 kính 6 mm đục các lỗ trên đĩa thạch. Hút nm. Hàm lượng phenolic tổng số được tính 100 µl dịch chiết cần khảo sát nhỏ vào mỗi toán dựa vào đường chuẩn axit gallic. lỗ trên đĩa thạch vừa trang vi khuẩn chỉ thị. Phương pháp HPLC-MS Các đĩa petri sau đó được đem ủ trong tủ Phân tích dịch trích ly cồn từ lá cây ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24 giờ. Hoạt Muntingia Calabura bằng phương pháp tính kháng khuẩn của các dịch chiết từ cây sắc ký cao áp (HPLC) được thực hiện Muntingia Calabura được xác định bằng trong cột C18 (kích thước 4,6 x 150 mm, cách đo đường kính vòng ức chế. 3,5 μm) được cung cấp bởi Weber Xử lý số liệu Consulting Ltd., Hungary. Pha động gồm Tất cả các số liệu được xử lý bằng phần nước – axit formic (A; 100:0,1, v/v) – mềm Microsoft® Excel® 2016 methanolic- axit formic (B; 100:0.1, v/v). (16.0.7070.2022), phần mềm SAS (r) 9.4 A và B được cho theo khoảng thời gian TS Level 1M1 với trắc nghiệm Tukey. như sau: 0 min, A: B = 90:10; 35 min, A: B = 0:100; 60 min, A: B = 0:100. Tốc độ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN dòng chảy là 0,5 ml/phút và nhiệt độ cột Thành phần hóa học có trong cây sắc ký giữ ở 400C. Tất cả các dung môi Muntingia Calabura được lọc qua bộ lọc 0,45 µm và khử khí Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học bằng siêu âm trong buồng siêu âm trước của cây Muntingia Calabura cho thấy khi sử dụng. Tình trạng MS như sau ion nhóm hợp chất phenolic cụ thể là hóa tia điện ESI; ion dương âm; pin đối flavonoid chứa nhiều trong cả ba loại dịch RF: với tốc độ 250,0 vòng/phút; khí khô chiết (bảng 1). Điều này giống với nghiên 9,0 l/phút, chất làm nóng khô 200C; van cứu trước đó của Ogunleye và Ibitoye điều chỉnh: nguồn; áp lực máy phun (2003). Trong đó dịch chiết EMC70 và sương: 1,2 bar; bộ mao dẫn: 4500V; tấm EMC90 cho thấy sự hiện diện của nhóm Offset: -500V; quét từ 50 – 3000 m/z; cài hợp chất flavonoid, phenolic, tannin và đặt thông số thông minh: không hoạt động. steroid. Trong khi dịch chiết AMC có sự Dùng phần mềm Chemstation để thu thập hiện diện của flavonoid, phenolic, tannin, dữ liệu (Agilent Corporation, MA, USA). saponin và amino acid tự do. Alkaloid đều Thử hoạt tính kháng khuẩn không hiện diện trên cả ba loại dịch chiết. Bảng 1. Định tính thành phần hóa học có trong Muntingia Calabura Saponi Anthra- Amino Alkaloid n quinone acid Drag- Mar- Ma- Ha- Wag Foam endro BonTrager Ninhydrin quis yer Ger -ner Test f EMC70 ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ + EMC90 ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ 21
Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (2), 2018 AMC ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ++ ‒ ++ Phenolic Flavonoid Tannin Steroid compound Shi- Lead Salk- Alka Ferric Gela Ferric Lead nod acet -line clorid -tin clorid acetate owski a a-te Triterpenoi EMC 70 ‒ +++ ++++ +++ ++ ++++ +++ d Triterpenoi EMC 90 ‒ +++ ++++ +++ +++ ++++ +++ d AMC + + +++ +++ ++ +++ +++ ‒ Ghi chú: ‒ không có + có ít ++ có +++ có nhiều ++++ có rất nhiều Khả năng chống oxy hóa quét gốc tự do 3,10 lần so với (IC50=5,38±0,12 μg/ml). Phương pháp DPPH được dùng phổ biến AMC có khả năng chống oxy hóa kém hơn trong các nghiên cứu về chống oxy hóa vì khoảng 4,60 lần so với axit ascorbic nó đơn giản, nhanh chóng và ổn định. Do (IC50=5,38±0,12 μg/ml). đó, phương pháp này được sử dụng rộng So với các nghiên cứu trước đó thì khả rãi để sàng lọc các chất chống oxy hóa. Kết năng chống oxy hóa của dịch chiết EMC70 quả được trình bày ở hình 1. Trong đó, khả và EMC90 thấp hơn khoảng 1,69 lần so năng chống oxy hóa của EMC70 và với dịch chiết methanol (Premakumari và EMC90 là gần bằng nhau với giá trị IC50 ctv 2010) và cao hơn khoảng 3,96 lần so lần lược là 16,70±0,10 μg/ml và với dịch chiết petroleum ether trên cùng 16,49±0,03 μg/ml và thấp hơn khoảng cây Muntingia Calabura. Hình 1. Hoạt tính quét gốc tự do ở các nồng độ Muntingia Calabura L Định lượng flavonoid và phenolic Muntingia Calabura L. được trình bày ở Hàm lượng polyphenol tổng số và bảng 2 như sau. flavonoid tổng số từ các dịch chiết của cây Bảng 2. Hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số Hàm lượng polyphenol tổng số Hàm lượng flavonoid tổng số EMC70 120,77 ± 0,54 mg GAE/g 90,94 ± 2,12 mg RE/g EMC90 43,18 ± 0,30 mg GAE/g 35,48 ± 1,23 mg RE/g AMC 60,60 ± 0,93 mg GAE/g 20,25 ± 1,39 mg RE/g 22
Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (2), 2018 EMC70 có hàm lượng polyphenol cao với các mẫu khảo sát (90,94 ± 2,12 mg nhất (120,77 ± 0,54 mg GAE/g), tương tự RE/g). hàm lượng flavonoid cũng đạt cao nhất so Bảng 3. Hệ số tương quan Pearson Hàm lượng polyphenol tổng số Hàm lượng flavonoid tổng số IC50 DPPH -0,45667 -0,78111 Dựa vào kết quả định lượng polyphenol và -0,45667 (p>0,05) chứng tỏ khi hàm lượng flavonoid cũng như kết quả chống oxy hóa flavonoid càng tăng thì số lượng gốc tự do có thể thấy rằng chúng có liên hệ với nhau. DPPH càng giảm chứng tỏ khả năng chống Giá trị IC50 loại gốc tự do DPPH của các oxy hóa càng cao. cao chiết có tương quan ngược với kết quả Hoạt tính kháng khuẩn quét gốc tự do DPPH với hệ số pearson là Bảng 4. Hoạt tính kháng khuẩn từ cây Muntingia Calabura Hoạt tính kháng khuẩn Chủng vi sinh EMC70 EMC90 AMC Ciprofloxacin (µg/ml) vật (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) 100 50 25 100 50 25 100 50 25 125 63 32 Escherichia ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ coli E. Coli-ETEC ++ + ‒ + + + ‒ ‒ ‒ +++++ +++++ +++++ L. ++ + + +++ ++ + +++ ++ + +++++ ++++ ‒ monocytogenes S. typhi ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ +++++ ++++ ‒ S. aureus +++ ++ + ++ + ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ Shi. flexneri ++ + ‒ +++ ++ + ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ Shi. boydii ++ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ Ghi chú: IZ = vùng ức chế (mm) ‒ không có + IZ≤9,0 mm ++ 9,0 mm
Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (2), 2018 ciprofloxacin (125 µg/ml) không có khả quan trọng trong việc duy trì sức khỏe con năng ức chế (bảng 4). người (Sani và ctv 2012). Như vậy việc Phân tích sắc ký HPLC-MS nghiên cứu các thành phần hợp chất có Kết quả định tính thành phần hóa học cũng trong cây trứng cá cho khả năng chống oxy như định lượng chỉ ra rằng dịch chiết cồn hóa cũng như kháng khuẩn bằng phân tích EMC70 chứa một lượng đáng kể các chất sắc kí HPLC-MS là cần thiết. Kết quả có khả năng chống oxy hóa như phenolic, được thể hiện ở bảng 5. flavonoid và tannin và đóng một vai trò Bảng 5. Xác định hợp chất trong dịch chiết ethanol từ cây Muntingia Calabura bằng phương pháp HPLC-MS Công thức Mũi Rt MS (m/z) Định danh phân tử 2 3,7 C16H13O6 301,0720 Chrysoeriol 3 3,9 C17H15O7 331,0838 3,8-Dimethylherbacetin 2,3-dihydroxy-4,3’,4’,5’- 4 4,0 C19H23O7 363,1471 tetramethoxydihydrochalcone 5 4,4 C16H12NaO6 323,0553 8-Methoxygalangin Các chất được xác định nhờ phương pháp khuẩn trên cùng một chủng vi khuẩn với HPLC-MS được so sánh với dữ liệu chuẩn mức độ mạnh yếu là khác nhau. Đồng thời trên phần mềm Bruker 4.0. Một số chất hàm lượng của chúng cũng có sự khác biệt được tìm thấy trong cây bao gồm đáng kể về hàm lượng chiết suất. Trong chrysoeriod một flavonoid được cho là có khi EMC70 có hàm lượng chiết 18,21% thì khả năng giúp tế bào tạo xương chống lại EMC90 có hàm lượng là 7,31%. các tác nhân oxy hóa bảo vệ gan khỏi các tác nhân gây độc. Chrysoeriol còn có khả KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ năng kháng khuẩn khá tốt hơn hẳn so với Từ những kết quả trên có thể thấy cây capsaicin và dihydrocapsaicin trên 3 trứng cá có hoạt tính chống oxy hóa khá chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus cao và tương quan với hàm lượng phenolic subtillis, Staphylococcus aureus (Patrícia và flavonoid. Cả hai dịch chiết EMC70 và ctv 2014). 8-Methoxygalangin có khả cho hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất. Các năng chống lại tế bào ung thư bạch cầu chất chrysoeriol, 8-Methoxygalangin và (Adila và ctv 2013). Ngoài ra 3,8- một số hợp chất thuộc nhóm flavonoid Dimethylherbacetin và 2,3-dihydroxy- được tìm thấy trong cây trứng cá nhờ 4,3’,4’,5’-tetramethoxydihydrochalcone HPCL/MS. cũng hiện hiện trong cây trứng cá. Đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu sau Sự khác biệt về thành phần hóa học như này để khảo sát các hoạt tính sinh học trên phenol, flavonoid, saponin và tannin có thể các hệ dung môi không phân cực như là nguyên nhân dẫn tới hoạt tính kháng acetylen, chloroform, ethyl acetate. Xác khuẩn khác nhau, cũng như ảnh hưởng của định hàm lượng một số chất có hoạt tính nó đến khả năng chống oxy hóa. Dịch chiết sinh học như chrysoeriol và 8- EMC70 và EMC90 tuy chỉ khác nhau về Methoxygalangin. Khảo sát thêm một số tỷ lệ dịch chiết nhưng khả năng kháng hoạt tính sinh học khác có liên quan. 24
Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (2), 2018 TÀI LIỆU THAM KHẢO AIBINU, IBUKUN E, ODUNAYO R, AKINSULIRE, TAYO A, TOYIN A, TOLU O (2007) In vitro antimicrobial activity of crude extracts from plants Bryophyllum pinnatum and Kalanchoe crenata. Afr. J. Traditional. 4 (3): 338 – 344. ADILA S. SUFIAN, KALAVATHY R, NORIZAN A, ZAKARIA Z A, YUSOF M. I M (2013). “Isolation and identification of antibacterial and cytotoxic compounds from the leaves of Muntingia calabura L”. Journal of Ethnopharmacology, 146(1):198-204. ARUNA S M, YADAV D, BODKE, CHANDRASHEKAR A (2013) Antioxidant and in vivo anti-hyperglycemic activity of Muntingia calabura L. leaves extracts. Der Pharmacia Lettre, 5 (3): 427-435. BALAN T, MOHD S MH, SUPPAIAH V, MOHTARRUDIN N, SUHAILI Z, AHMAD Z, ZAKARIA ZA (2013) Antiulcer activity of Muntingia calabura L. leaves involves the modulation of endogenous nitric oxide and nonprotein sulfhydryl compounds. Pharm Biol 52: 410-418. PREMAKUMARI KB, AYESHA S, ROKEYA S,VITHYA, SAVITHA (2010) Antioxidant activity and estimation of total phenolic content of Muntingia calabura by colorimetry. International Journal of ChemTech Research. Vol.2, No.1, pp 205-208. OGUNLEYE, D.S, S.F. IBITOYE (2003) Studies of antimicrobial activity and chemical cosntituents of Ximenia americana. Trop. J. Pharm. Res., 2: 239-241. PATRÍCIA L. A, TALITA N, NATÁLIA R, GIRLIANE R. S, JOSÉ EGG, ROSÂNGELA EF, KEILA A, MOREIRA A, ANA L. PORTO F, TANIA MS. SILVA (2014). “Quantification, antioxidant and antimicrobial activity of phenolics isolated from different extracts of Capsicum frutescens (Pimenta Malagueta)”. Molecules, 19(4):5434-5447. SANI MH, ZAKARIA ZA, BALAN T, THE LK, SALLEH MZ (2012). Antinociceptive activity of methanol extract of Muntingia calabura leaves and the mechanisms of action involved. Evid Based Comp Altern. VON GADOW A., JOUBERT E. AND HANSMANN C. F., (1997). “Comparison of antioxidant activity of aspalanthin with that of orther plant phenols of Rooibos tea (Aspalathus linearis), α-tocopherol, BHT, and BHA”, Journal of Agricultural and Food Chemistry 45 632-638. 25