Khác biệt trong sự mẫn cảm với Novirhabdo virus của Zebrafish dòng hoang dại và đột biến và vai trò của Lymphocytes

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:16

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Để nghiên cứu sự đóng góp của miễn dịch sơ cấp và lymphocyte dựa trên miễn dịch kháng lại virus nhiễm trên cá, hai dòng zebrafish hoang dại (wild-type) và đột biến (Rag1 mutant, không có tế bào lymphocyte T và B) được cảm nhiễm với Snakehead Rhabdovirus (SHRV), thuộc novirhabdovirus, bằng cách tiêm xoang bụng (IP) vào cá ở các độ tuổi khác nhau và nhiệt độ khác nhau.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khác biệt trong sự mẫn cảm với Novirhabdo virus của Zebrafish dòng hoang dại và đột biến và vai trò của Lymphocytes

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II KHÁC BIỆT TRONG SỰ MẪN CẢM VỚI NOVIRHABDO VIRUS CỦA ZEBRAFISH DÒNG HOANG DẠI VÀ ĐỘT BIẾN VÀ VAI TRÒ CỦA LYMPHOCYTES Nguyễn Ngọc Du1*, Lorelei Ford2, Lora Petri- Hanson2, Larry Hanson2 TÓM TẮT Để nghiên cứu sự đóng góp của miễn dịch sơ cấp và lymphocyte dựa trên miễn dịch kháng lại virus nhiễm trên cá, hai dòng zebrafish hoang dại (wild-type) và đột biến (Rag1 mutant, không có tế bào lymphocyte T và B) được cảm nhiễm với Snakehead Rhabdovirus (SHRV), thuộc novirhabdovirus, bằng cách tiêm xoang bụng (IP) vào cá ở các độ tuổi khác nhau và nhiệt độ khác nhau. Cả hai dòng đều mẫn cảm cao với SHRV. Cá bệnh có biểu hiện lồi mắt, xuất huyết gốc vây và thân, vảy dựng. Dòng hoang dại có sự mẫn cảm với virus giảm dần theo độ tuổi. Cá ở 2 tháng tuổi chết nhiều hơn cá 4 và 7 tháng tuổi khi cho cảm nhiễm với virus. Nhiệt độ cũng gây ảnh hưởng quan trọng trong sự mẫn cảm của chủng hoang dại. Ở 24°C, tỷ lệ cá chết cao hơn ở 28°C. Trong nuôi cấy tế bào, SHRV có đường cong tăng trường tương tự nhau ở 20°C, 24°C, và 28°C, cho thấy sự tăng sinh của virus không bị ảnh hưởng ở nhiệt độ thấp. Ngược lại, độ tuổi và nhiệt độ không cho thấy có sự ảnh hưởng ở chủng đột biến (Rag1 mutant). Tỷ lệ chết cũng khác nhau giữa dòng hoang dại và đột biến. Dòng hoang dại bắt đầu chết từ ngày thứ 3 sau khi gây nhiễm và kéo dài đến ngày thứ 10, trong khi dòng đột biến tiếp tục chết trong vòng một tuần tiếp sau đó. Sự khác nhau trong đáp ứng miễn dịch của tế bào natural killer (NK) và tế bào T ở chủng đột biến và hoang dại được đánh giá thông qua mức biểu hiện của interferon gamma (IFNγ) gene từ mẫu thận trước bằng kỹ thuật quantitative reverse transcriptase PCR (qRT PCR). Gene biểu hiện mức thấp ở lô đối chứng âm nhưng tăng mạnh ở cả hai dòng khi được cảm nhiễm với SHRV. IFNγ tăng 400 lần và 100 lần ở Rag1 mutant tại nhiệt độ 24°C và 28°C; tăng 40 lần và 80 lần ở dòng hoang dại tại nhiệt độ 24°C và 28°C. Sự gia tăng mạnh mẽ của IFNγ trong dòng đột biến khuyết lymphocyte chứng tỏ có sự hoạt động của tế bào NK. Sự biểu hiện của MxA (Myxovirus Resistance gene A) gene cũng gia tăng ở cả nhóm không gây nhiễm (ngày thứ 8) và nhóm có gây nhiễm với virus (ngày thứ 2 và ngày thứ 8). Ngoài ra, sự biểu hiện của Blimp- 1 và CD40L gene cũng được đánh giá ở các ngày thứ 8, thứ 1 và thứ 7 sau khi công cường độc, tuy nhiên không có sự khác biệt. Kết quả cho thấy tầm quan trọng của miễn dịch sơ cấp trong việc kiểm soát sự xâm nhiễm của virus trong thời gian đầu, sau đó hệ miễn dịch thứ cấp tiêu diệt sự xâm nhiễm này. Hơn nữa, độ tuổi và nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn đến hệ miễn dịch thứ cấp. Các kết quả này có thể giúp cho việc giải thích nhiệt độ và lứa tuổi có liên quan đến sự kháng lại bệnh do novirhabdovirus trên cá. Từ khóa: Zebrafish, Rag1, T and B lymphocyte deficient, Snakehead Rhabdovirus, interferon gamma, MxA, Blimp-1, CD40 ligand. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Ở cá mang xanh và cá nheo, tế bào T nhạy cảm Hệ miễn dịch của cá và sự đáp ứng miễn với nhiệt độ thấp trong khi tế bào B có khả dịch đã được biết ở cá trưởng thành. Nhiệt độ năng chịu được nhiệt độ (Cuchens & Clem, cũng gây ảnh hưởng đến hệ miễn dịch của cá. 1977), (Miller & Clem, 1984). Ở 10°C, tỷ lệ 1 Trung tâm Quan trắc Môi trường & Bệnh thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. 2 Mississippi State University. *Email: ngocduaqua@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 67
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II của các tế bào miễn dịch lớn như lymphocytes, sinh nằm trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho granulocytes, và macrophages gia tăng ở cá sự phát triển của zebrafish. Hơn nữa, chúng tôi chép, trong khi tế bào lymphocyte nhỏ bị giảm đánh giá sự biểu hiện của một số gene chọn lọc đi khi so sánh tỷ lệ các tế bào này của cá nuôi có liên quan đến sự đáp ứng miễn dịch nhằm ở 25°C(Kurata et al., 1995). Nhiệt độ cao xác định cách zebrafish trả lời lại sự xâm nhiễm làm gia tăng immunoglobulins và kháng thể của novirhabdovirus vào cơ thể. tự nhiên trong cá tuyết Atlantic, nhưng giảm II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP tổng protein huyết thanh và hoạt tính kháng protease (Magnadóttir et al., 1999). Ở cá vược 2.1. Chuẩn bị dịch gốc SHRV sọc, số lượng của leukocytes, lymphocytes, và SHRV có nguồn gốc từ ATCC được nuôi monocytes thấp hơn khi nuôi cá ở 10ºC so với trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified cá nuôi ở 18ºC, 24ºC, và 29ºC (Hrubec, 1997). Eagle’s Medium, Sigma- Aldrich Co., MO) bổ Gần đây, cá zebrafish được sử dụng như một sung thêm 10% FCS (Fetal calf serum, Biowest, mô hình quan trọng cho nghiên cứu về đáp ứng Nuaille, France), 100 đơn vị Penicillin/ 100 miễn dịch (Yoder et al., 2002) và thể hiện là một µg of Streptomycin (Gibco, Thermo Fisher mô hình tin cậy trong nghiên cứu miễn dịch ở Scientific Inc, MA), 4mM Glutamine (Gibco, động vật có xương (Trede et al., 2004). Rag1-/- Thermo Fisher Scientific Inc, MA), nuôi cấy mutant zebrafish là dòng cá đột biến bị khuyết ở 28°C cho đến khi quan sát được 80% hiện lymphocytes. Ở dòng đột biến, thành phần của tượng bệnh lý tế bào (CPE). Thu hoạch tế bào lymphocytes gồm có các tế bào không gây độc có chứa virus và ly tâm ở 200 xg trong 5 phút. (non-cytotoxic cells) và tế bào NK (natural Dịch nổi có chứa virus được chia đều vào các killer cells), nhưng không có những tế bào chức ống và giữ ở -80°C cho đến khi sử dụng. Dùng năng T và B vì không có T cell receptor và biểu 1 ống để chuẩn độ, sử dụng điã 96 giếng chứa hiện sao mã immunoglubulin ở cá (Lora Petrie- tế bào EPC (Epithelioma Papulosum Cyprini). Hanson et al., 2009). Dòng cá đột biến khi được Quan sát CPE và xác định nồng độ nhiễm tế bào gây nhiễm với Edwardsiella ictaluri có sự bảo 50% (TCID50) bằng phương pháp Reed Muench hộ miễn dịch, chứng tỏ tế bào NK có vai trò (Reed & Muench, 1938). quan trọng trong việc bảo vệ vật chủ (Hohn & 2.2. Zebrafish và thí nghiệm cảm nhiễm Petrie-Hanson, 2012). Cá dùng cảm nhiễm là dòng Tubingen Vì miễn dịch thứ cấp chưa phát triển trong hoang dại hoặc đột biến Rag1 mutant có xuất cá ở giai đoạn nhỏ (Petrie-Hanson & Ainsworth, xứ từ một tế bào duy nhất nên gene mang tính 2001) (Petrie-Hanson & Ainsworth, 1999) đồng nhất (L. Petrie-Hanson et al., 2009). Tất cả (Lam et al., 2004) và sự xâm nhiễm của virus cá được cho sinh sản và chăm sóc tại trại nuôi cá rất phổ biến trên cá giai đoạn nhỏ, chúng tôi với hệ thống kiểm soát không có mầm bệnh đặc mong muốn xác định xem thành phần tế bào biệt (SPF) tại đại học bang Mississippi, khoa lympho nào trong hệ thống miễn dịch có vai thú y. trò trong sự đề kháng với sự xâm nhiễm của Tất cả các thí nghiệm cảm nhiễm đều được virus ở các độ tuổi khác nhau. Hơn nữa, sự liên thực hiện trong bể nhựa 40 lít hình trụ, hệ thống quan của việc đề kháng virus và nhiệt độ cũng nước chảy liên tục. Cá được quan sát hàng ngày đã được mô tả ở cá hồi. Do đó chúng tôi mong và cho ăn vừa đủ bằng thức ăn viên. Để gây muốn xác định xem việc đề kháng virus ở cá nhiễm hoặc xử lý, cá được gây mê trong100 có liên quan đến nhiệt độ có phải do sự điều mg/L MS222 và tiêm với 10µL huyền dịch bằng hòa của lymphocytes hay không. Trong nghiên kim tiêm syringe. Cá hấp hối hoặc chết được vớt cứu này, chúng tôi dùng SHRV làm mô hình ra và đếm. Theo dõi thí nghiệm cho đến khi cá cho novirhabdovirus vì virus này rất nhạy trên ngừng chết. Cá hấp hối được lấy mẫu phân lập zebrafish và nhiệt độ thích hợp để virus tăng 68 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II lại SHRV trên dòng tế bào EPC. Não cá được nhóm đối chứng được tiêm với môi trường nuôi cấy trên thạch máu, ủ ở nhiệt độ phòng để kiểm cấy. Thu mẫu thận của 5 cá ở mỗi nhóm vào tra, loại trừ tác nhân gây chết cá do vi khuẩn. các ngày 0, 2, 4, 8 sau khi gây nhiễm. Mẫu thận 2.3. Thí nghiệm về liên quan độ tuổi được sử dụng cho tách chiết RNA. Mẫu được Zebrafish 2, 4, và 7 tháng tuổi được dùng giữ trong tri-reagent và được đồng nhất bằng cho các thí nghiệm cảm nhiễm. Thí nghiệm chày nghiền mẫu Kont. Dịch đồng nhất được được thực hiện trong các bể hình trụ 40 lít có hệ dùng để tách chiết RNA bằng Zymo kit theo thống nước chảy liên tục. Cá thí nghiệm được hướng dẫn của nhà sản xuất (Zymo Research cho sinh sản cùng thời gian để cả hai dòng cá Corp., CA). Mẫu được giữ ở -80°C cho đến khi hoang dại và đột biến có cùng độ tuổi, 15 cá/ bể. dùng để tổng hợp cDNA. Trong suốt thời gian thí nghiệm, cá được duy Cũng phương pháp này, một số lượng cá trì ở 24°C. Cá được cảm nhiễm bằng cách tiêm dòng hoang dại được bổ sung thêm để lấy mẫu xoang bụng với 10µL SHRV ở các liều khác sau khi cá được vaccine với 100,5 TCID50 và sau nhau 100,5,101,5, 102,5, 103,5, 104,5 TCID50. Nhóm đó tiêm lần 2 với 102,5 TCID50 SHRV ở ngày 14. đối chứng được tiêm với môi trường nuôi cấy. Mẫu thận được lấy riêng cho mỗi cá (6 cá mỗi 2.4. Thí nghiệm liên quan đến nhiệt độ nhóm) 7 ngày sau khi tiêm lần 2. Sử dụng cá có cùng độ tuổi ở 4 tháng tuổi 2.7. Tổng hợp cDNA và kỹ thuật qPCR đối với cả hai dòng cá (hoang dại và đột biến). 200 ng RNA tổng được dùng để tổng Nhiệt độ môi trường được duy trì ở 24°C, 28°C hợp cDNA bằng SuperScript III First Strand ± 0.5°C một tuần trước khi tiến hành cảm Synthesis (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific nhiễm. Cá được bố trí thí nghiệm tương tự như Inc., MA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, thí nghiệm trên và được duy trì ở các nhiệt độ dùng mồi ngẫu nhiên hexamer. cDNA được giữ theo yêu cầu của thí nghiệm. ở -20° C. Mồi và mẫu dò trong thử nghiệm biểu 2.5. Đường cong tăng trưởng của SHRV hiện gene được ghi trong bảng 1, trong đó mồi và mẫu dò cho interferon γ (IFN γ) và acidic SHRV được tăng sinh trong tế bào EPC ở ribosomal protein (ARP- dùng làm gene tham MOI 10 trong đĩa 24 giếng. Một giờ sau khi hấp khảo) đã được công bố (Vojtech et al., 2009), phụ ở 4°C, tế bào được rửa ba lần với 1X PBS. mồi và mẫu dò cho SHRV, Myxovirus resistance 1mL môi trường nuôi cấy được bổ sung vào mỗi gene A (MxA) được thiết kế bằng phần mềm giếng và ủ ở các nhiệt độ khác nhau 20°C, 24°C, Beacon designer (Premier Biosoft, CA). Mồi và 28°C. Mẫu được lấy ở các thời điểm khác và mẫu dò Blimp-1 dùng từ TaqMan Gene nhau 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 72, và 96 h. Lặp lại expression assays (AB applied biosystems, CA), 4 lần ở mỗi thời điểm lấy mẫu. Toàn bộ tế bào CD40 ligand dùng từ PrimePCR probe assays có chứa virus và dịch nuôi cấy trong mỗi giếng và SsoAdvanced universal probes supermix được thu, đông lạnh ở -80°C sau đó rã đông, (Biorad, CA), với mẫu PCR chuẩn cho CD40 lặp lại 3 lần để phá vỡ hết các tế bào. Ly tâm ở ligand. 500 xg/ 3 phút. Dịch nổi thu được được dùng cho chuẩn độ. Dịch virus được pha loãng 10 Phản ứng Real-time PCR được thực hiện lần theo dãy nồng độ, sau đó cấy ủ trong tế bào bằng máy Stratagene MX 3005P theo chu trình: EPC trên đĩa 96 giếng ở 28°C. Theo dõi CPE 1 chu kỳ ở 50ºC trong 2 phút, 1 chu kỳ ở 95 ºC cho đến ngày thứ 5. Tính TCID50 bằng phương trong 10 phút, 40 chu kỳ ở 95 ºC trong 15 giây pháp Reed - Muench (Reed & Muench, 1938). và 61ºC trong 1 phút (đối với ARP, IFNγ, MxA). Chu trình cho Blimp-1 (1 chu kỳ ở 50ºC trong 2.6. Tinh sạch RNA 2 phút, 1 chu kỳ ở 95ºC trong 10 phút, 40 chu Mỗi dòng cá được chia ra làm 3 nhóm. Mỗi kỳ ở 95ºC trong 15 giây và 60ºC trong 1 phút) nhóm được cảm nhiễm với 100,5 TCID50 SHRV, và CD40 ligand (1 chu kỳ ở 95ºC trong 2 phút, TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 69
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 40 chu kỳ ở 95ºC trong 5 giây và 60ºC trong bằng phương pháp Pfaffl dùng cho định lượng 30 giây). Mức độ biểu hiện gene được đánh giá real-time PCR (Pfaffl, 2001). Bảng 1. Mồi và mẫu dò dùng trong qPCR qPCR primers and probes Gene Primers/ Sequence (5’ → 3’) GenBank accession no. Probes ARP Forward CTG CAA AGA TGC CCA GGG A NM_131580 Reverse TTG GAG CCG ACA TTG TCT GC Probe TTC TGA AAA TCA TCC AAC TGC TGG ATG ACT ACC IFNγ Forward CTT TCC AGG CAA GAG TGC AGA NM_212864 Reverse TCA GCT CAA ACA AAG CCT TTC G Probe ACC GCT ATG GGC GAT CAA GGA AAA CGA C SHRV Forward CATCCCTGTCCCGTTGATTCTC NC_000903.1 Reverse TACCAATGCCCTCTATGCTTTCC Probe CCTGGCTCCTTGCTGGGTCTCTGGC MxA Forward GCATCATTAGTTCAGACAGTCG NM_182942.4 Reverse AAATTATCGATAGTGTCGATACAAG Probe TGCTGACTGAACGTGTAACTCAACT 2.8. Phân tích thống kê Điều này không xảy ra ở dòng đột biến, thậm Sử dụng ANCOVA trong SPSS phiên bản chí cá chết nhiều hơn ở 28°C so với ở 24°C. 22 (IBM corp., NY) để so sánh sự chuyển động 3.2. Thí nghiệm về khác biệt độ tuổi của đường cong tăng trưởng của SHRV ở những Khi so sánh giữa hai dòng đột biến và hoang thời điểm khác nhau bằng Bonferroni’s test. dại 2 tháng tuổi ở 24°C ± 0,5°C, cá chết tương Biểu hiện của gene cũng được so sánh bằng two- tự nhau. Tỷ lệ chết ở dòng đột biến là 76% và way ANOVA với Bonferroni’s test. Sự khác biệt hoang dại là 73,4%, so sánh không có sự khác có ý nghĩa giữa các nhóm khi giá trị p < 0,05. biệt (p > 0,05) (Hình 2). Ở cá 4 tháng tuổi, dòng III. KẾT QUẢ đột biến vẫn giữ tỷ lệ chết cao (66,8%), nhưng dòng hoang dại đã giảm chết đáng kể (7,8%) 3.1. Thí nghiệm cảm nhiễm về nhiệt độ với sự khác biệt có ý nghĩa (p = 0,012) (Hình 3). Cả hai dòng cá đều nhạy cảm với SHRV. Cá Kết quả tương tự ở cá 7 tháng tuổi, với tỷ lệ chết bệnh có biểu hiện lồi mắt, xuất huyết gốc vây và cao ở dòng đột biến (86%), nhưng chỉ có 10% ở thân, vảy dựng. Ở dòng hoang dại, cá chết bắt dòng hoang dại, sự khác biệt này có ý nghĩa (p đầu vào ngày thứ 3 sau khi tiêm và kéo dài đến = 0,004) (Hình 4). ngày thứ 10. Ở dòng đột biến, cá tiếp tục chết Ở dòng đột biến, độ tuổi cá không ảnh sau đó ít nhất 1 tuần. Cá chết diễn ra có sự khác hưởng đến sự nhạy cảm khi cảm nhiễm với biệt ở hai dòng cá tùy thuộc vào độ tuổi và nhiệt virus. Không có sự liên quan giữa tuổi cá với độ của môi trường nuôi (Hình 1). Điều đáng chú liều lượng SHRV gây nhhiễm (p = 0,295) và ý là ở dòng hoang dại, cá mẫn cảm với SHRV ở không có sự khác biệt thống kê giữa các nhóm 2, 24°C nhưng cá có sức đề kháng tốt hơn ở 28°C. 4, và 7 tháng tuổi (Hình 2; 3; 4). Hơn nữa, việc 70 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II so sánh theo từng cặp giữa cá 2 và 4 tháng tuổi, lệ chết của cá (p= 0,032). Hơn nữa, sự khác biệt 2 và 7 tháng tuổi, 4 và 7 tháng tuổi không cho trong cơ số (độ tuổi) thể hiện cá chết có sự khác thấy sự khác biệt có ý nghĩa (p =1, p = 0,727, p biệt ở độ tuổi khác nhau (p = 0,009). So sánh = 0,267, tương ứng). từng cặp cho thấy tỷ lệ chết khác biệt giữa cá Ở dòng hoang dại, độ tuổi có ảnh hưởng hoang dại ở 2 và 4 tháng tuổi, 2 và 7 tháng tuổi quan trọng đến sự nhạy cảm với SHRV (Hình (p < 0,01) nhưng không khác biệt ở cá 4 và 7 2; 3; 4) và có sự tương quan giữa độ tuổi và tỷ tháng (p = 1). Hình 1: Đường cong sống sót của dòng đột biến và hoang dại sau cảm nhiễm với SHRV 102,5TCID50. Cá thí nghiệm 4 tháng tuổi, được duy trì ở 24°C (hình trái) và 28°C (hình phải) cho thấy ở dòng hoang dại cá ngưng chết nhưng ở dòng đột biến cá vẫn tiếp tục chết thêm một thời gian. Hình 2: Cá chết liên quan đến độ tuổi. Tỷ lệ chết Hình 3: Cá chết liên quan đến độ tuổi. Tỷ lệ chết gia tăng khi tăng liều gây nhiễm ở cá 2 tháng gia tăng khi tăng liều gây nhiễm ở cá 4 tháng tuổi, tuổi, nhiệt độ môi trường 24°C. Dòng đột biến nhiệt độ môi trường 24°C. Dòng đột biến (xanh (xanh biển), dòng hoang dại (xanh lá cây). LD50 biển), dòng hoang dại (xanh lá cây). LD50 của dòng của dòng đột biến là 100,9 TCID50, LD50 của dòng đột biến là 100,9 TCID50, LD50 của dòng hoang dại lớn hoang dại là 101,11 TCID50. hơn 104,5 TCID50. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 71
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 4: Cá chết liên quan đến độ tuổi. Tỷ lệ chết gia tăng khi tăng liều gây nhiễm ở cá 7 tháng tuổi, nhiệt độ môi trường 24°C. Dòng đột biến (xanh biển), dòng hoang dại (xanh lá cây). LD50 của dòng đột biến là 100,3 TCID50, LD50 của dòng hoang dại lớn hơn 104,5 TCID50. 3.3. Nhiệt độ dại, tỷ lệ chết là 7,8% và 1,2% ở 24ºC và 28ºC Không có sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên (Hình 6). Tỷ lệ chết có sự khác biệt đáng kể khi sự nhạy cảm với SHRV của dòng đột biến ở 4 cá được duy trì ở 24ºC và 28ºC (p = 0,009) sau tháng tuổi (Hình 5). Tỷ lệ chết là 66,8% và 84% khi cảm nhiễm với virus ở các nồng độ khác ở 24°C và 28°C, tương ứng sự tương quan giữa nhau. So sánh từng cặp cũng cho sự khác biệt có nhiệt độ và sự nhạy cảm với SHRV tương tự ý nghĩa ở hai nhiệt độ (p = 0,005). nhau ở dòng đột biến (p > 0,05). Ở dòng hoang Hình 5: Cá chết liên quan đến nhiệt độ. Dòng đột Hình 6: Cá chết liên quan đến nhiệt độ. Dòng biến ở 4 tháng tuổi, thí nghiệm thực hiện ở 24ºC hoang dại ở 4 tháng tuổi, thí nghiệm thực (màu vàng) và 28ºC (màu đỏ). hiện ở 24ºC (màu vàng) và 28ºC (màu đỏ). 3.4. Đường cong tăng trưởng độ lên sự sao chép của SHRV (Hình 7). Không Đường cong tăng trưởng được theo dõi có sự khác biệt trong tương tác giữa thời gian và trong 96 giờ để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt nhiệt độ (p = 0,977). 72 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 7: Đường tăng trưởng của SHRV trên dòng tế bào EPC ở 20ºC, 24ºC, và 28ºC. 3.5. Biểu hiện gene 24°C, sự biểu hiện của IFNγ cao hơn so với biểu Để đánh giá sự hoạt hóa của cơ chế bảo hiện của gene này ở 28°C (trên 400 lần ở 24°C vệ, mức độ biểu hiện của IFNγ và MxA được và trên 100 lần ở 28°C). Nhiệt độ và thời gian xác định. Hơn nữa, Blimp-1 được dùng để đánh xâm nhiễm có ảnh hưởng lên mức biểu hiện giá sự biệt hóa tế bào plasma và CD40 ligand của IFNγ (p = 0,004 và p < 0,001). Ngoài ra, được thăm dò để đánh giá sự hoạt hóa của tế không có sự khác biệt trong biểu hiện của IFNγ bào CD4+T. Mẫu thận của 5 cá thể cá trong mỗi ở những cá không cảm nhiễm với virus. nhóm được thu riêng rẽ ở các ngày thứ 0, 2, 4, Tương tự như dòng đột biến, ở dòng hoang 8 sau khi vaccine với SHRV và ở ngày thứ 1, 7 dại sự biểu hiện của IFNγ cũng gia tăng ở ngày sau gây nhiễm (lần thứ nhất cách lần thứ 2 14 thứ 2 sau vaccine, sau đó giảm nhanh ở những ngày). Two- way ANOVA SPSS được dùng để ngày kế tiếp. Ngược lại với dòng đột biến, sự phân tích biểu hiện gene. biểu hiện của gene ở 28°C cao hơn ở 24°C. Mức 3.6. Interferon gamma độ biểu hiện tăng 40 lần ở 24°C và hơn 80 lần ở Ở dòng đột biến, biểu hiện của IFNγ xảy 28°C. Không có sự khác biệt trong thay đổi mức ra cao nhất ở ngày thứ 2 sau vaccine và nhanh độ biểu hiện gene ở nhiệt độ môi trường nuôi chóng giảm ở những ngày tiếp theo (Hình 8). Ở khác nhau (p > 0,05) (Hình 8). Hình 8: Biểu hiện của IFNγ trong dòng độ biến và dòng hoang dại 8 ngày sau khi cá được vaccine với SHRV và sau khi cảm nhiễm lần 2. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 73
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.7. B lymphocyte- induced maturation nhiễm lần 2, tuy nhiên không có sự khác biệt protein - 1 (Blimp-1) đáng kể (Hình 9). Sự gia tăng của Blimp-1 liên quan đến 3.8. CD40 ligand tế bào plasma và có thể là chỉ thị cho sự hoạt Sự tương tác giữa CD40- CD40 ligand là hóa của hệ miễn dịch thứ cấp, vì vậy chúng tôi rất quan trọng trong việc phát triển đáp ứng đánh giá sự biểu hiện của Blimp-1 ở ngày thứ miễn dịch. CD40 ligand chỉ thị cho việc tế bào 4 và 8 sau vaccine và ngày thứ 1, 7 sau cảm CD40+ T được hoạt hóa. Trong nghiên cứu này, nhiễm để đánh giá xem sự biểu hiện của gene chúng tôi mong nuốn xác định xem có sự biểu này có tương quan với sự kháng virus xảy ra ở hiện của CD40L trong dòng hoang dại sau khi dòng hoang dại khi duy trì cá ở 28°C và 24°C gây nhiễm với SHRV ở ngày thứ 1 và ngày thứ hay không. Không có sự khác biệt có ý nghĩa 7 sau lần gây nhiễm thứ 2 hay không. Sự biểu trong biểu hiện của gene Blimp-1 trong dòng hiện của gene này có thể chỉ thị cho sự phát triển đột biến không cảm nhiễm với virus ở 24°C. Ở của đáp ứng miễn dịch thứ cấp trong cơ thể cá. 28°C, sự biểu hiện gene có gia tăng ở ngày 4 và Ở dòng đột biến không gây nhiễm với virus, sự ngày 8 (4,1 và 3,5 lần) so với ngày 0, tuy nhiên biểu hiện của CD40L gia tăng ở ngày thứ 8 sau không có sự khác biệt có ý nghĩa. Nhiệt độ cao gây nhiễm (p < 0,01) (14,1 và 7,5 lần ở 24°C và có ảnh hưởng đến sự biểu hiện của Blimp-1 (p 28°C). Ở lô có gây nhiễm với SHRV, CD40L = 0,044). Ở dòng đột biến có gây nhiễm với cũng gia tăng đáng kể ở ngày thứ 8 (13,7 và SHRV, sự biểu hiện của Blimp-1 không rõ ràng. 6,2 ở 24°C và 28°C). Tương tự đối với dòng Đối với dòng hoang dại, không có sự khác biệt hoang dại, CD40L tăng biểu hiện ở ngày thứ 8 (11 và 6,6 lần ở 24°C và 28°C). Tuy nhiên, trong biểu hiện gene Blimp-1 ở cá không gây CD40L giảm biểu hiện ở ngày 1 và ngày 7 sau nhiễm. Ở cá gây nhiễm với SHRV, Blimp-1 có cảm nhiễm lần 2 (Hình 10). biểu hiện giảm nhẹ ở ngày thứ 4 (0,4 ở 24°C và 0,3 ở 28°C) và gia tăng ở ngày thứ 7 sau cảm 74 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 9: Biểu hiện của Blimp-1 ở dòng đột biến và hoang dại không gây nhiễm với virus (hình trên) và có gây nhiễm với SHRV (hình dưới) sau 2 lần cảm nhiễm. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 75
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 10: Biểu hiện của CD40 ligand ở dòng đột biến và hoang dại khi không gây nhiễm virus (hình trên) và có gây nhiễm virus (hình dưới) sau 2 lần cảm nhiễm. 3.9. MxA Khi so sánh sự biểu hiện của MxA gene ở cảm nhiễm SHRV, MxA gia tăng mạnh từ ngày cá không cảm nhiễm, MxA tăng đáng kể ở cả thứ 2 (mean_mutant = 11,2, mean_WT = 13,9) hai dòng vào ngày thứ 8 (mean_mutant 7,46, ở 24°C, sau đó giảm dần nhưng vẫn ở mức cao mean_WT = 8,49 at 24°C; mean_mutant = 8,21, (Hình 11). mean_WT = 9,33 at 28°C) (p < 0,01). Ở cá có 76 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 11: Biểu hiện của MxA ở dòng đột biến và hoang dại khi không gây nhiễm virus (hình trên) và có gây nhiễm virus (hình dưới) sau 2 lần cảm nhiễm. IV. THẢO LUẬN biến khuyết lymphocytes không cho thấy có Zebrafish được dùng như một mô hình trong sự nhạy cảm khác biệt khi cá ở những nhiệt độ nghiên cứu bệnh vi khuẩn và virus. Hơn nữa, khác nhau, và sự tăng sinh của virus trong tế bào những công bố gần đây cho thấy dòng zebrafish không có sự khác biệt đáng kể ở những nhiệt đột biến Rag1 là một mô hình động vật phù hợp độ khác nhau. Việc kết hợp những dữ liệu này cho nghiên cứu đáp ứng miễn dịch khuyết tế bào cho thấy sự đề kháng virus liên quan đến yếu tố T và B lymphocytes (Hohn & Petrie-Hanson, nhiệt độ ở cá là do chức năng của thành phần 2012). Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận lymphocytes trong hệ thống miễn dịch của cá. thấy zebrafish khuyết lymphocytes có cách chết Độ tuổi được công bố có liên quan đến đáp tương tự như dòng cá hoang dại ở những ngày ứng miễn dịch ở cá vược sọc lai (Hrubec et al., đầu bị xâm nhiễm virus, nhưng sau đó dòng 2004). Độ tuổi ảnh hưởng đến thông số huyết hoang dại hồi phục được còn dòng đột biến thì học và sinh hoá ở cá hồi vân Oncorhynchus không. Điều này có thể giải thích do độ trễ của mykiss (Charoo, 2014). Những nghiên cứu về hệ miễn dịch trong trả lời miễn dịch mắc phải ảnh hưởng của độ tuổi đến miễn dịch thứ cấp do phải nhận biết kháng nguyên đặc hiệu. Ở ở chuột cho thấy kích cỡ và động năng của các dòng hoang dại, cá 2 tháng tuổi có sự nhạy cảm nhóm tế bào B gia tăng cùng với tuổi (Cancro & với SHRV tương tự như ở dòng đột biến Rag1. Smith, 2003). Điều này bổ sung cho những nghiên cứu khác Nhiệt độ có ảnh hưởng đến đáp ứng miễn cho thấy miễn dịch dựa trên lymphocytes hoạt dịch ở cá nheo (Ainsworth et al., 1991). Tổng động yếu ở giai đoạn đầu của sự phát triển. Hơn số B và T lymphocyte bị giảm trong mẫu thận nữa, chúng tôi nhận thấy dòng hoang dại nhạy trước khi cá được nuôi ở 10°C. Tế bào T được cảm với SHRV ở 24°C hơn ở 28°C. Ở dòng đột thấy nhạy cảm với nhiệt độ thấp hơn tế bào B TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 77
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ở cá mang xanh và cá nheo (Cuchens & Clem, biểu hiện ở tế bào CD4 T được hoạt hoá và ở 1977), (Miller & Clem, 1984). Các công bố cho một số tế bào miễn dịch khác (van Kooten & thấy cấu trúc protein thay đổi khi cá được nuôi ở Banchereau, 2000). Trong thí nghiệm này, sự nhiệt độ khác với nhiệt độ cho sự sản xuất kháng biểu hiện của CD40L không như mong đợi, thể (Fields, 2001) (Somero, 2004). Proteins và thậm chí cả ở miễn dịch thứ cấp. Điều này có glucides, thành phần của màng plasma trong thể do tế bào T helper trưởng thành (mature Th tế bào, có thể bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ môi cells) hiện diện rất ít ở mô thận. trường (Sharon & Lis, 1989). Nghiên cứu trên Sự biểu hiện của gene MxA gia tăng ở cá leukocytes ở cá chép cho thấy glucides nhạy sau hai ngày gây nhiễm cá, ở dòng hoang dại cảm với nhiệt độ, dẫn đến việc làm thay đổi cấu hơi cao hơn so với dòng đột biến. MxA được trúc và chức năng của màng plasma (Le Morvan biết có vai trò kháng virus ởngười và phụ et al., 1998). thuộc chặt chẽ vào biểu hiện của interferon Tế bào NK là một nhóm thuộc lymphocytes dạng I hoặc dạng III (Haller et al., 1980). Ở cá có khả năng nhận biết và tiêu diệt những tế bào Selegalese sole, phân tử Mx có mức biểu hiện nhiễm virus hoặc những tế bào bị biến đổi. cao nhất tại thời điểm 48 giờ sau khi gây nhiễm Trong nghiên cứu này, chúng tôi quan tâm đến với sole aquabirnavirus (Fernandez-Trujillo et sự trả lời của các thành phần tế bào đối với cá bị al., 2008). Mx gene cũng gia tăng ở cá hồi khi nhiễm virus ở giai đoạn nhỏ. Vì IFNγ được sản cho nhiễm với virus (Saint-Jean & Perez-Prieto, xuất bởi tế bào NK và cytotoxic T lymphocytes, 2007). Điều này có thể giải thích kết quả của việc đánh giá mức biểu hiện của gene này có chúng tôi trong đó MxA gia tăng biểu hiện sau thể được dùng để đánh giá sự hoạt động của khi cảm nhiễm với virus và giúp cơ thể cá tiêu những tế bào lymphocytes này trong cá. Kết diệt virus. quả nghiên cứu cho thấy IFNγ gene tăng biểu V. KẾT LUẬN hiện ở cả dòng đột biến và hoang dại sau khi gây nhiễm với virus. Sự gia tăng biểu hiện của Dòng cá hoang dại và đột biến khuyết IFNγ ở dòng đột biến khuyết lymphocyte chứng lymphocyte được sử dụng như một mô hình tỏ có sự hoạt động của tế bào NK. Do đó, chúng để nghiên cứu bệnh do novirhabdovirus trên cá tôi kết luận miễn dịch sơ cấp đóng vai trò quan và để đánh giá vai trò của lymphocyte. Ở thí trọng trong việc tiêu diệt virus ở giai đoạn đầu nghiệm cảm nhiễm, cá chết tương tự ở hai dòng của sự xâm nhiễm. cá vào giai đoạn đầu nhưng sau 7 ngày, dòng hoang dại có khả năng kháng với virus trong khi Blimp-1 có vai trò quan trọng trong biệt cá dòng đột biến tiếp tục chết. Độ tuổi và nhiệt hoá tế bào plasma (Turner et al., 1994) (Lin et độ môi trường nuôi ảnh hưởng đến sự phát triển al., 2000) (Shapiro-Shelef et al., 2003). Trong của bệnh ở dòng hoang dại nhưng không có ảnh thí nghiệm này, chúng tôi mong đợi Blimp-1 có hưởng lên dòng đột biến. Dòng hoang dại nhạy biểu hiện gene mạnh ở dòng cá hoang dại sau cảm với virus ở 24°C nhưng đề kháng ở 28°C. khi nhiễm với SHRV. Tuy nhiên điều này không Sự khác biệt này không phải do sự tăng sinh của xảy ra, có thể do mô thận không phải là nơi phát virus thay đổi ở những nhiệt độ khác nhau vì triển tế bào plasma ở zebrafish mà có thể là mô đường cong tăng trưởng của virus là như nhau lách. ở nhiệt độ 20°C, 24°C, và 28°C. Nhiệt độ liên Sự tương tác giữa CD40- CD ligand quan đến cách phát triển bệnh ở dòng hoang dại (CD40L ha CD154) có vai trò rất quan trọng cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng đến khả năng trong sự đáp ứng miễn dịch của tế bào T (Noelle tiêu diệt virus của tế bào T và B. Trong những thí et al., 1992) (Lane et al., 1992). CD40L có chức nghiệm liên quan đến độ tuổi, tỷ lệ chết cao xảy năng truyền tín hiệu cho tế bào T helper để hoạt ra ở dòng hoang dại 2 tháng tuổi, nhưng thấp ở hoá tế bào B (Noelle et al., 1992). CD40 ligand cá 4 và 7 tháng tuổi, tuy nhiên không có sự khác 78 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II biệt này ở dòng đột biến. Điều này chứng tỏ ở của IFNγ cho thấy tế bào NK đã hoạt hóa trong giai đoạn nhỏ, hệ miễn dịch ở dòng hoang dại dòng đột biến do đó ở giai đoạn đầu của sự xâm chưa phát triển đầy đủ để bảo vệ cá khỏi sự tấn nhiễm, miễn dịch sơ cấp có vai trò quan trọng công của tác nhân gây bệnh, nhưng khi cá hơn trong việc bảo vệ vật chủ khỏi sự tấn công của 4 tháng tuổi, hệ miễn dịch đã phát triển đủ để virus. Thêm vào đó, MxA, một protein kháng phản ứng lại sự xâm nhiễm bên ngoài. Ngược virus, cũng có biểu hiện cao trong cả hai dòng lại, dòng đột biến không có tế bào B và T do đó cá sau khi gây nhiễm với SHRV. không có khả năng miễn dịch ở giai đoạn nhỏ và Biểu hiện của gene mã hóa cho Blimp-1 và lớn, mặc dù các thành phần tế bào khác là tương CD40 ligand, những gene chỉ thị cho sự hoạt tự ở cả hai dòng cá. hóa của đáp ứng miễn dịch thứ cấp, cũng được Các gene liên quan đến đáp ứng miễn dịch kiểm tra. Các gene này được kiểm tra 7 ngày sau được khảo sát ở hai dòng cá. Mức độ biểu hiện khi cảm nhiễm virus vào cá. Đây là thời gian của IFNγ tăng cao ở cả hai dòng 2 ngày sau khi lượng cá chết giảm dần ở dòng hoang dại, từ đó cảm nhiễm với virus và sau đó giảm dần. Ở đánh giá xem sự kháng virus ở cá có liên quan dòng đột biến, biểu hiện của IFNγ khi cá nuôi đến sự hoạt hóa của lymphocyte hay không. Tuy ở nhiệt độ 24°C cao hơn ở 28°C (trên 400 lần nhiên sự gia tăng biểu hiện của các gene chỉ thị ở 24°C và trên 100 lần ở 28° C), nhưng ở dòng này không có nhiều khác biệt. Điều này có thể hoang dại, IFNγ biểu hiện cao hơn ở 28° C so do những lymphocyte này chỉ chiếm một lượng với 24°C (40 lần ở 24°C so với 84 lần ở 28°C). nhỏ trong mẫu thận dùng kiểm tra (có thể mô Điều này giải thích cho việc ở 24°C, dòng đột lách sẽ cho kết quả tốt hơn) hoặc thời gian lấy biến có tỷ lệ chết thấp hơn ở 28°C. Sự gia tăng mẫu hơi sớm so với đáp ứng miễn dịch ở cá. TÀI LIỆU THAM KHẢO Differential effects of temperature on fish Ainsworth, A. J., Dexiang, C., Waterstrat, P. R., T-like and B-like cells. Cell Immunol, 34(2), & Greenway, T. (1991). Effect of temperature 219-230. doi: http://dx.doi.org/10.1016/0008- on the immune system of channel catfish 8749(77)90245-3 (Ictalurus punctatus)--I. Leucocyte distribution Degli-Esposti, M. A., & Smyth, M. J. (2005). Close and phagocyte function in the anterior kidney at encounters of different kinds: dendritic cells and 10 degrees C. Comp Biochem Physiol A Comp NK cells take centre stage. Nat Rev Immunol, Physiol, 100(4), 907-912. 5(2), 112-124. doi: 10.1038/nri1549 Alter, G., Malenfant, J. M., Delabre, R. M., Burgett, Dexiang, C., & Ainsworth, A. J. (1991). Effect of N. C., Yu, X. G., Lichterfeld, M., . . . Altfeld, temperature on the immune system of channel M. (2004). Increased natural killer cell activity catfish (Ictalurus punctatus)--II. Adaptation in viremic HIV-1 infection. J Immunol, 173(8), of anterior kidney phagocytes to 10 degrees 5305-5311. C. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol, Bryceson, Y. T., & Long, E. O. (2008). Line of 100(4), 913-918. attack: NK cell specificity and integration of Doody, G. M., Stephenson, S., & Tooze, R. M. signals. Curr Opin Immunol, 20(3), 344-352. (2006). BLIMP-1 is a target of cellular stress and doi: 10.1016/j.coi.2008.03.005 downstream of the unfolded protein response. Cancro, M. P., & Smith, S. H. (2003). Peripheral Eur J Immunol, 36(6), 1572-1582. doi: 10.1002/ B cell selection and homeostasis. Immunol Res, eji.200535646 27(2-3), 141-148. doi: 10.1385/ir:27:2-3:141 Fernandez-Trujillo, A., Ferro, P., Garcia-Rosado, Charoo, Samina Qadir; Salman Rauoof; Qureshi, E., Infante, C., Alonso, M. C., Bejar, J., . . . T.A. (2014). Rainbowtrout (Oncorhynchus Manchado, M. (2008). Poly I:C induces Mx mykiss). Journal of Science and Technology, transcription and promotes an antiviral state 9(2), 29. against sole aquabirnavirus in the flatfish Senegalese sole (Solea senegalensis Kaup). Cuchens, Marvin A., & Clem, L. William. (1977). Fish Shellfish Immunol, 24(3), 279-285. doi: Phylogeny of lymphocyte heterogeneity: II. 10.1016/j.fsi.2007.11.008 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 79
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Fields, Peter A. (2001). Review: Protein function 129(1–4), 421-424. doi: http://dx.doi. at thermal extremes: balancing stability and org/10.1016/0044-8486(94)00282-S flexibility. Comparative Biochemistry and Lam, S.H., Chua, H.L., Gong, Z., Lam, T.J., & Sin, Physiology Part A: Molecular & Integrative Y.M. (2004). Development and maturation of Physiology, 129(2–3), 417-431. doi: http:// the immune system in zebrafish, Danio rerio: a dx.doi.org/10.1016/S1095-6433(00)00359-7 gene expression profiling, in situ hybridization Garcia, J. F., Roncador, G., Garcia, J. F., Sanz, A. I., and immunological study. Dev Comp Immunol, Maestre, L., Lucas, E., . . . Piris, M. A. (2006). 28, 9-28. PRDM1/BLIMP-1 expression in multiple B and Lane, P., Traunecker, A., Hubele, S., Inui, S., T-cell lymphoma. Haematologica, 91(4), 467-474. Lanzavecchia, A., & Gray, D. (1992). Activated Gong, Y. F., Xiang, L. X., & Shao, J. Z. (2009). CD154- human T cells express a ligand for the human CD40 interactions are essential for thymus- B cell-associated antigen CD40 which dependent antibody production in zebrafish: participates in T cell-dependent activation of insights into the origin of costimulatory pathway B lymphocytes. Eur J Immunol, 22(10), 2573- in helper T cell-regulated adaptive immunity in 2578. doi: 10.1002/eji.1830221016 early vertebrates. J Immunol, 182(12), 7749- Le Morvan, C., Troutaud, D., & Deschaux, P. 7762. doi: 10.4049/jimmunol.0804370 (1998). Differential effects of temperature on Gray, D., Siepmann, K., van Essen, D., Poudrier, specific and nonspecific immune defences in J., Wykes, M., Jainandunsing, S., . . . Dullforce, fish. J Exp Biol, 201(Pt 2), 165-168. P. (1996). B-T lymphocyte interactions in Lin, K. I., Lin, Y., & Calame, K. (2000). Repression the generation and survival of memory cells. of c-myc is necessary but not sufficient for Immunol Rev, 150, 45-61. terminal differentiation of B lymphocytes in Gyory, Ildiko, Wu, Jian, Fejer, Gyorgy, Seto, vitro. Mol Cell Biol, 20(23), 8684-8695. Edward, & Wright, Kenneth L. (2004). PRDI- Magnadóttir, Bergljót, Jónsdóttir, Halla, Helgason, BF1 recruits the histone H3 methyltransferase Sigurður, Björnsson, Björn, Jørgensen, Trond G9a in transcriptional silencing. Nat Immunol, Ø, & Pilström, Lars. (1999). Humoral immune 5(3), 299-308. parameters in Atlantic cod (Gadus morhua L.): Haller, O., Arnheiter, H., Lindenmann, J., & Gresser, I. The effects of environmental temperature. I. (1980). Host gene influences sensitivity to Comparative Biochemistry and Physiology interferon action selectively for influenza virus. Part B: Biochemistry and Molecular Biology, Nature, 283(5748), 660-662. 122(2), 173-180. doi: http://dx.doi.org/10.1016/ Hilleman, M. R. (2004). Strategies and mechanisms S0305-0491(98)10156-6 for host and pathogen survival in acute and Miller, N. W., & Clem, L. W. (1984). Temperature- persistent viral infections. Proc Natl Acad Sci mediated processes in teleost immunity: U S A, 101 Suppl 2, 14560-14566. doi: 10.1073/ differential effects of temperature on catfish in pnas.0404758101. vitro antibody responses to thymus-dependent Hohn, C., & Petrie-Hanson, L. (2012). Rag1- and thymus-independent antigens. J Immunol, /- mutant zebrafish demonstrate specific 133(5), 2356-2359. protection following bacterial re-exposure. Montoya, C. J., Velilla, P. A., Chougnet, C., Landay, PLoS One, 7(9), e44451. doi: 10.1371/journal. A. L., & Rugeles, M. T. (2006). Increased IFN- pone.0044451 gamma production by NK and CD3+/CD56+ Hrubec, T. C., Ward, D., Smith, S. A., & Robertson, cells in sexually HIV-1-exposed but uninfected J. L. (2004). Age related changes in humoral individuals. Clin Immunol, 120(2), 138-146. immune response of hybrid striped bass doi: 10.1016/j.clim.2006.02.008 (Morone chrysops x Morone saxatilis). Vet Noelle, R. J., Roy, M., Shepherd, D. M., Immunol Immunopathol, 101(1-2), 103-108. Stamenkovic, I., Ledbetter, J. A., & Aruffo, A. doi: 10.1016/j.vetimm.2004.04.020 (1992). A 39-kDa protein on activated helper T Kurata, Osamu, Okamoto, Nobuaki, Suzumura, cells binds CD40 and transduces the signal for Eri, Sano, Natsumi, & Ikeda, Yayoi. (1995). cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Accommodation of carp natural killer-like cells Sci U S A, 89(14), 6550-6554. to environmental temperatures. Aquaculture, O’Leary, J, Mahmoud, G, Drayton, D, & Andrian, 80 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Uv. (2006). T cell- and B cell-independent formation of immunoglobulin secreting plasma adaptive immunity mediated by natural killer cells and pre-plasma memory B cells. Immunity, cells. Nat Immunol, 7, 507 - 516. 19(4), 607-620. Page, D. M., Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Lewis, Sharon, N., & Lis, H. (1989). Lectins as cell K. L., Pratt, D. N., Delgado, N., . . . Traver, D. recognition molecules. Science, 246(4927), (2013). An evolutionarily conserved program 227-234. of B-cell development and activation in Somero, George N. (2004). Adaptation of enzymes zebrafish. Blood, 122(8), e1-11. doi: 10.1182/ to temperature: searching for basic “strategies”. blood-2012-12-471029 Comparative Biochemistry and Physiology Part Paust, S., Senman, B., & von Andrian, U. H. (2010). B: Biochemistry and Molecular Biology, 139(3), Adaptive immune responses mediated by natural 321-333. doi: http://dx.doi.org/10.1016/j. killer cells. Immunol Rev, 235(1), 286-296. doi: cbpc.2004.05.003 10.1111/j.0105-2896.2010.00906.x Son, B. K., Roberts, R. L., Ank, B. J., & Stiehm, Petrie-Hanson, L., & Ainsworth, A. J. (2001). E. R. (1996). Effects of anticoagulant, serum, Ontogeny of channel catfish lymphoid organs. and temperature on the natural killer activity Vet Immunol Immunopathol, 81(1-2), 113-127. of human peripheral blood mononuclear cells Petrie-Hanson, L., & Ainsworth, A.J. (1999). stored overnight. Clin Diagn Lab Immunol, Humoral immune responses of channel catfish 3(3), 260-264. (Ictalurus punctatus) fry and fingerlings Sun, J. C., Beilke, J. N., & Lanier, L. L. (2009). exposed to Edwardsiella ictaluri.Fish and Adaptive immune features of natural killer cells. Shellfish Immunology, 9, 579-589. Nature, 457(7229), 557-561. doi: 10.1038/ Petrie-Hanson, L., Hohn, C., & Hanson, L. (2009). nature07665 Characterization of rag1 mutant zebrafish Trede, NS, Langenau, DM, Traver, D, Look, AT, & leukocytes. BMC Immunol, 10(1), 8. doi: 1471- Zon, LI. (2004). The use of zebrafish to understand 2172-10-8 [pii] immunology. Immunity, 20, 367 - 379. 10.1186/1471-2172-10-8 Turner, C. A., Jr., Mack, D. H., & Davis, M. M. Petrie-Hanson, Lora, Hohn, Claudia, & Hanson, (1994). Blimp-1, a novel zinc finger-containing Larry. (2009). Characterization of rag1 mutant protein that can drive the maturation of B zebrafish leukocytes. BMC Immunology, 10(1), 8. lymphocytes into immunoglobulin-secreting cells. Cell, 77(2), 297-306. Pfaffl, Michael W. (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time van Kooten, C., & Banchereau, J. (2000). CD40- RT–PCR. Nucleic Acids Research, 29(9), CD40 ligand. J Leukoc Biol, 67(1), 2-17. e45-e45. Vojtech, L. N., Sanders, G. E., Conway, C., Ostland, Reed, L.J., & Muench, H. (1938). A simple method V., & Hansen, J. D. (2009). Host immune of estimating fifty per cent endpoints. American response and acute disease in a zebrafish model Journal of Epidemiology, 27(3), 493-497. of Francisella pathogenesis. Infect Immun, 77(2), 914-925. doi: 10.1128/IAI.01201-08 Reusch, J. A., Nawandar, D. M., Wright, K. L., Kenney, S. C., & Mertz, J. E. (2015). Cellular Wang, R., Jaw, J. J., Stutzman, N. C., Zou, Z., & differentiation regulator BLIMP1 induces Sun, P. D. (2012). Natural killer cell-produced Epstein-Barr virus lytic reactivation in epithelial IFN-gamma and TNF-alpha induce target cell and B cells by activating transcription from both cytolysis through up-regulation of ICAM-1. the R and Z promoters. J Virol, 89(3), 1731- J Leukoc Biol, 91(2), 299-309. doi: 10.1189/ 1743. doi: 10.1128/jvi.02781-14 jlb.0611308 Saint-Jean, S. R., & Perez-Prieto, S. I. (2007). Wienholds, E., Schulte-Merker, S., Walderich, Effects of salmonid fish viruses on Mx gene B., & Plasterk, R. H. (2002). Target-selected expression and resistance to single or dual viral inactivation of the zebrafish rag1 gene. Science, infections. Fish Shellfish Immunol, 23(2), 390- 297(5578), 99-102. 400. doi: 10.1016/j.fsi.2006.11.012 Yoder, J. A., Nielsen, M. E., Amemiya, C. T., Shapiro-Shelef, M., Lin, K. I., McHeyzer-Williams, & Litman, G. W. (2002). Zebrafish as an L. J., Liao, J., McHeyzer-Williams, M. G., & immunological model system. Microbes Infect, Calame, K. (2003). Blimp-1 is required for the 4(14), 1469-1478. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 81
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II DIFFERENTIAL SUSCEPTIBILITY OF WILD-TYPE AND T AND B LYMPHOCYTE DEFICIENT ZEBRAFISH INFECTED WITH A NOVIRHABDO VIRUS REVEALS THE ROLE OF LYMPHOCYTES Nguyen Ngoc Du1*, Lorelei Ford2, Lora Petri- Hanson2, Larry Hanson2 ABSTRACT In order to study the contribution of innate defenses and lymphocyte based immunity in protection against a primary viral infection in fish, wild-type and Rag1 mutant zebrafish (T and B lymphocyte deficient) were infected with a novirhabdovirus, Snakehead Rhabdovirus (SHRV), by intraperitoneal (IP) injection at different ages and temperatures. Both strains of fish were highly susceptible to SHRV. Diseased fish demonstrated exophthalmia, hemorrhaged fin bases and protruding scales. The susceptibilities of the wild-type decreased as the fish aged; 2-month post hatch fish had significantly more losses than 4 month old and 7 month old fish. Also, temperature had a significant effect on the susceptibility of the wild-type. The wild-type zebrafish held at 24°C had significantly higher mortality than those held at 28°C. In cell culture, SHRV had similar growth kinetics at 20°C, 24°C, and 28°C suggesting that reduced virus replication was not a factor in the lower mortality. The age and temperature effects were not seen with the Rag1 mutants. There was a difference in mortality pattern between the wild-type and Rag1 mutant. All mortalities in the wild-type occurred between day 3 and 10 post-infection, whereas the Rag1 mutant fish continued to die for at least one more week. To assess differences in the response of NK and T-cells of Rag1 mutant and wild-type zebrafish we evaluated transcript levels of the interferon gamma (IFNγ) gene in the posterior kidney by quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). Expression was low in un-exposed fish but increased substantially in both strains at day 2 after exposure to SHRV. IFNγ over 400-fold and 100-fold in Rag1 mutant at 24°C and 28°C, respectively; and over 40-fold and 80-fold in wild-type at 24°C and 28°C, respectively. The strong IFNγ response in lymphocyte deficient fish suggests Natural Killer cell activation. MxA (Myxovirus Resistance gene A) expression also increased in non- infected zebrafish (at day 8) and in SHRV- infected fish (both strains) at day 2 and day 8. We attempted to evaluate the initial activation of the acquired responses by evaluating of Blimp-1 and CD40 ligand expression at day 8, and at day 1 and day 7 after a second challenge, but no significant induction was detected at this early time point. The infection data suggest that innate immunity is important in controlling virus infection early during the infection, but then the acquired immune system clears the infection. Furthermore, age and the environmental temperature have a strong effect on this acquired immune response. These results may help explain the temperature and age associated resistance observed in other novirhabdovirus diseases in fish. Keywords: Zebrafish, Rag1, T and B lymphocyte deficient, Snakehead Rhabdovirus, interferon gamma, MxA, Blimp-1, CD40 ligand. Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 11/12/2017 Ngày thông qua phản biện: 25/12/2017 Ngày duyệt đăng: 30/12/2017 1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No.2. 2 Mississippi State University *Email: ngocduaqua@yahoo.com 82 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017