Khảo sát kiểu gen Cytochrome P450 3A4 Subtype 1B (CYP3A4*1B) trên bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> KHẢO SÁT KIỂU GEN CYTOCHROME P450 3A4 SUBTYPE 1B<br /> (CYP3A4*1B) TRÊN BỆNH NHÂN VIÊM LOÉT DẠ DÀY TÁ TRÀNG<br /> Vũ Diễm My*, Hoàng Thị Phương Chi**, Bùi Hữu Hoàng***, ĐỗThị Thanh Thuỷ *<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Giới thiệu: Helicobacter Pylori (Hp) là nguyên nhân gây viêm dạ dày mãn tính, loét dạ dày tá tràng và đã<br /> được ghi nhận là tác nhân gây ung thư dạ dày loại I (1, 2). Tuy nhiên, các nghiên cứu thống kê gần đây cho thấy tỉ<br /> lệ thất bại trong tiệt trừ Hp ngày càng có xu hướng tăng. Tính đa hình kiểu gen Cytochrome P450 3A4<br /> (CYP3A4) đã được ghi nhận là có sự ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính sinh học và khả năng tiệt trừ của các<br /> kháng sinh. Đồng thời, các thuốc ức chế bơm proton (proton pump inhibitor - PPI) được sử dụng nhằm duy trì<br /> pH dạ dày trung tính, giúp tăng hiệu quả tiệt trừ Hp;cũng được chuyển hoá một phần bởi enzyme này. Chính vì<br /> vậy, việc xác định kiểu gen CYP3A4 là hết sức cần thiết nhằm cải thiện tỉ lệ tiệt trừ Hp.<br /> Mục đích: Khảo sát kiểu gen CYP3A4*1B của bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng do Hp bằng phương<br /> pháp giải trình tự.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang mô tả. Tối ưu hoá phản ứng PCR và giải trình tự. Sử<br /> dụng các phần mềm tin sinh học xác định kiểu gen CYP3A4*1B. Tiến hành thu nhận mẫu sinh thiết dạ dày của<br /> bệnh nhân viêm loét, ly trích thu DNA, thực hiện phản ứng PCR và giải trình tự, phân tích kết quả và xác định<br /> kiểu gen.<br /> Kết quả: Áp dụng thành công quy trình PCR và giải trình tự xác định kiểu gen CYP3A4*1B trên bệnh<br /> nhân. Thực hiện khảo sát trên 50 bệnh nhân, ghi nhận có 1 trường hợp bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử. Các<br /> bệnh nhân còn lại mang kiểu gen đồng hợp tử.<br /> Kết luận: Nghiên cứu áp dụng thành công quy trình PCR và giải trình tự nhằm xác định kiểu gen<br /> CYP3A4*1B trên bệnh nhân.<br /> Từ khoá: CYP3A4*1B, Helicobacter pylori, giải trình tự, thất bại điều trị.<br /> ABSTRACT<br /> CHARACTERISTIC OF CYTOCHROME P450 3A4 SUBTYPE1B (CYP3A4*1B) POLYMOPHISMS BY<br /> USING MULTIPLEX REAL-TIME PCR<br /> Vu Diem My, Hoang Thi Phuong Chi, Bui Huu Hoang, Do Thi Thanh Thuy<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 1 - 2016:319 - 323<br /> <br /> Background: Helicobacter Pylori (Hp) causes chronic gastritis, gastric and duodenal ulcer. It also has been<br /> recognized as class I gastric carcinogen. Unfortunately, the recent stastistics have shown that Hp eradication<br /> efficacy seems lower. The antibiotic resistance is reported for affecting to unresponded treatment. Many antibiotics<br /> used in Hp eradiacation that calalyzed by the Cytochrome P450 (CYP) system. CYP3A4 enzyme is the main path<br /> among them, as well as has been recorded for greatly contribution to variations in bioavailability and clearance of<br /> many antibiotics. CYP3A4 catalyzes proton pump inhibitors (PPIs), one of the most necessary drugs, as well.<br /> Therefore, the determination of CYP3A4 will help to enhancethe treatment.<br /> <br /> <br /> <br /> * Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược Tp. HCM<br /> ** Đại học Khoa học tự nhiên Tp. HCM *** Bệnh viện Đại học Y Dược Tp. HCM<br /> Tác giả liên lạc: CN. Vũ Diễm My ĐT: 0919 789 811 Email: diemmyvu@ump.edu.vn<br /> <br /> Tiêu Hóa 319<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> Objectives: Characterized CYP3A4*1B genotype of patients by using sequencing technique.<br /> Methods: This is a cross section study. PCR and Sanger sequencing procedures were optimized. Using the<br /> bioinformatics for analyzing sequencing results. The biopsy of ulcer patients was collected for DNA extraction,<br /> PCR and sequencing to define the genotypes.<br /> Results: Successfully applied PCR and sequencing techniques for determining CYP3A4*1B genotype of 50<br /> patients. The results recorded one case what had heterozygeous genotype while remaining cases with homozygeous<br /> genotype.<br /> Conclusions: Successfully optimized PCR and sequencing proceduresfor identifying CYP3A4*1B<br /> polymorphism.<br /> Keywords: Real-time PCR, CYP2C19 polymorphism, Helicobacter pylori, eradicative treatment.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ CYP3A4 là enzyme có tính đa hình cao thuộc<br /> hệ thống Cytochrome P450 (CYP), chịu trách<br /> Nhiễm Hp là một trong những nguy cơ gây<br /> nhiệm chuyển hoá khoảng 50% các loại thuốc<br /> ung thư dạ dày được biết rõ nhất (10). Có khoảng<br /> được thương mại hoá(5). Gen CYP3A4 bao gồm<br /> 90% các trường hợp viêm dạ dày có sự hiện diện<br /> 13 exon và nằm trên nhiễm sắc thể số 7 tại vị trí<br /> của vi khuẩn Hp. Tương tự, tỷ lệ này chiếm từ 75<br /> 7q22.1. Tính đến nay, đã có khoảng 23 biến thể<br /> - 85% trong bệnh loét dạ dày; 95 - 100% ở bệnh<br /> CYP3A4 được ghi nhận<br /> loét tá tràng; còn trong biến chứng thủng loét dạ<br /> (http://www.ebmconsult.com/articles/genetic-<br /> dày tá tràng thì sự hiện diện của loại vi khuẩn<br /> polymorphisms-cytochrome-p450-cyp3a4-<br /> này chiếm từ 80 - 95% các trường hợp. Chính vì<br /> enzyme). Sự tương tác giữa các loại thuốc (drug -<br /> vậy, việc điều trị tiệt trừ Hp là rất cần thiết nhằm<br /> drug interactions) sử dụng trong tiệt trừ Hp như<br /> ngăn ngừa các biến chứng như xuất huyết; loét<br /> clarithromycin, amoxicillin với PPI cũng chịu<br /> thủng dạ dày; và nặng hơn nữa là ung thư dạ<br /> ảnh hưởng bởi enzyme này. Mặt khác, tỷ lệ kiểu<br /> dày, tá tràng.<br /> gen CYP3A4 thay đổi tùy mỗi quần thể. Do đó,<br /> Hp là xoắn khuẩn có dạng hình cánh én, với nếu sử dụng cùng một liều thuốc cho tất cả bệnh<br /> kích thước dao động từ 0,5 - 1µm. Nhờ có các nhân sẽ dẫn đến tỷ lệ thành công trong tiệt trừ<br /> đặc tính sinh lý, sinh hóa chúng có thể tồn tại Hp không đồng nhất. Vì vậy, việc xác định tính<br /> trong môi trường pH acid thấp ở dạ dày và gây đa hình kiểu gen CYP3A4 sẽ giúp tối ưu hoá<br /> bệnh(10). Trên 50% dân số thế giới nhiễm Hp(3,6). hiệu quả tiệt trừ Hp.<br /> Tỷ lệ nhiễm Hp tăng theo lứa tuổi và chiếm tỉ lệ<br /> cao ở các nước đang phát triển. Điển hình ở ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> Canada và Mỹ tỷ lệ nhiễm Hp ở người trưởng Thiết kế nghiên cứu<br /> thành khoảng 30%, trong khi đó ở Ethiopia tỷ lệ Nghiên cứu cắt ngang mô tả.<br /> này lên đến 95% (6). Ở nước ta khoảng 70% người<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> trưởng thành nhiễm Hp.<br /> 50 bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng đến<br /> Hiện nay, phác đồ điều trị tiệt trừ Hp là sử<br /> thăm khám và điều trị tại Bệnh viện Đại học Y<br /> dụng thuốc ức chế bơm proton (proton pump<br /> dược Tp.HCM từ tháng 01/2015 đến tháng<br /> inhibitor - PPI) kết hợp hai loại kháng sinh khác<br /> 10/2015.<br /> nhau (4). Tuy nhiên, sự giảm tiết acid dịch vị do<br /> PPI có thể gây ảnh hưởng đến sự hấp thụ các Phương pháp nghiên cứu<br /> kháng sinh này(7). Đồng thời, tỷ lệ kháng thuốc Ly trích DNA từ mẫu mô: mẫu mô sau khi tiến<br /> cao cũng là một trong những nguyên nhân chính hành xét nghiệm CLO test sẽ được thu nhận và<br /> dự báo thất bại điều trị. xử lý với proteinase K, sau đó ly trích bằng bộ kit<br /> <br /> <br /> 320 Chuyên Đề Nội Khoa I<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Boom (Nam Khoa) theo hướng dẫn của nhà sản giả A Sapone, phản ứng PCR được thực hiện<br /> xuất. bằng bộ kit TaKaRa Taq™ Hot Start Version<br /> Khảo sát và tối ưu hoá phản ứng PCR: mồi của (Takara) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.<br /> phản ứng được tham khảo từ công trình của tác<br /> Bảng 1: Trình tự mồi dùng trong phản ứng PCR và giải trình tự (8)<br /> Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) Kích thước Nhiệt độ bắt cặp Kích thước sản phẩm<br /> (base pair) (base pair)<br /> CYP3A4 3B CTCTGTCTGTCTGGGTTTGG 20<br /> o<br /> CYP3A4 2B CCTTTCAGCTCTGTGTTGCTC 21 54 C 501<br /> <br /> Giải trình tự và phân tích kết quả: phản ứng Các thành phần của phản ứng PCR bao gồm:<br /> giải trình tự được thực hiện bằng bộ kit Big Dye 1,5l PCR 10X buffer, 1,5l dNTPs, 0,75l mồi<br /> Terminator V3.1 (ABI) theo hướng dẫn của nhà CYP3A4 3B, 0,75l mồi CYP3A4 2B, 0,1l Takara<br /> sản xuất. Sử dụng phần mềm CLC Main Taq Hotstart Polymerase, 3l genomic DNA (20 -<br /> Workbench để phân tích kết quả. 50ng/ul), 8,4l nước cất hai lần khử ion.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết quả giải trình tự và phân tích kết quả xác<br /> định kiểu gen CYP3A4*1B: sử dụng phần mềm<br /> Kết quả thu nhận mẫu bệnh phẩm: tổng số mẫu CLC Main Work Bench để phân tích dữ liệu thô,<br /> thu nhận là 50. Đặc điểm các mẫu được thể hiện<br /> kết quả giải trình tự được thể hiện qua những<br /> trong bảng sau:<br /> đỉnh sóng màu khác nhau, nucleotide A được<br /> Bảng 2: Đặc điểm các mẫu bệnh thu nhận mã hoá bằng đỉnh sóng màu xanh lá, nucleotide<br /> Tuổi 28 - 72 C được mã hoá bằng đỉnh sóng màu xanh<br /> Tỷ lệ nam/nữ 19/31<br /> dương, nucleotide T được mã hoá bằng đỉnh<br /> Pylori test dương/âm 43/7<br /> sóng màu đỏ, nucleotide G được mã hoá bằng<br /> Kết quả tối ưu phản ứng PCR: tiến hành khảo đỉnh sóng màu xanh đen.<br /> sát nhiệt độ bắt cặp (50oC, 52oC, 54oC, 56oC,58oC)<br /> và các thành phần khác của phản ứng. Kết quả<br /> thu nhận nhiệt độ tối ưu của phản ứng là 54oC.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Trường hợp bệnh nhân mang kiểu CYP3A4 đồng hợp (GG) sẽ cho một đỉnh sóng G màu<br /> bình thường (AA) sẽ cho một đỉnh sóng A màu đen. Kết quả khảo sát trên 50 mẫu bệnh, ghi<br /> xanh lá, nếu bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp nhận có một mẫu mang kiểu gen dị hợp<br /> CYP3A4*1B (GA) sẽ cho tín hiệu sóng đôi, nếu CYP3A4*1B các mẫu còn lại mang kiểu gen bình<br /> bệnh nhân mang kiểu gen biến đổi CYP3A4*1B thường.<br /> <br /> <br /> Tiêu Hóa 321<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> BÀN LUẬN Như đã đề cập ở trên, gen CYP3A4 có<br /> khoảng 23 biến thể được ghi nhận, trong đó kiểu<br /> Trong những năm gần đây, việc điều trị tiệt<br /> gen CYP3A4*1B là dạng phổ biến nhất.<br /> trừ Hp trong các bệnh lý viêm, loét dạ dày tá<br /> CYP3A4*1B nằm tại vị trí -392 vùng promoter<br /> tràng đang phải đối mặt với nhiều thách thức, do<br /> gen CYP3A4, đây là dạng có đột biến thay đổi<br /> tỷ lệ thất bại ngày càng có xu hướng tăng. Đã có<br /> nucleotide A thành G dẫn đến tạo các protein<br /> nhiều yếu tố được xác định là nguyên nhân làm<br /> khiếm khuyết làm giảm hoạt tính enzyme. Có<br /> giảm hiệu quả điều trị Hp. Trong đó, hai yếu tố<br /> khoảng 53% người Mỹ gốc Phi được ghi nhận<br /> quan trọng là việc sử dụng kháng sinh không<br /> mang kiểu biến thể này, ở người da trắng tỉ lệ<br /> hiệu quả và ức chế toan không tốt do dùng PPI<br /> này là 9% và chưa được ghi nhận trên người<br /> không đủ liều lượnglà nguyên nhân chủ yếu.<br /> châu Á (http://www.ebmconsult.com/<br /> articles/genetic-polymorphisms-cytochrome-<br /> p450-cyp3a4-enzyme). Tuy nhiên, theo kết quả<br /> khảo sát trên 50 bệnh nhân ghi nhận 1 trường<br /> hợp mang kiểu gen dị hợp CYP3A4*1B, cho thấy<br /> cần phải tiến hành khảo sát với số mẫu lớn hơn<br /> để xác định tỉ lệ phân bố kiểu biến thể này trên<br /> dân số Việt Nam.<br /> KẾT LUẬN<br /> Nghiên cứu đã thành công trong việc tối ưu<br /> quy trình PCR và giải trình tự xác định kiểu biến<br /> thể CYP3A4*1B, quy trình này có thể được sử<br /> dụng để khảo sát vai trò của CYP3A4*1B trong<br /> Hình 2: Các yếu tố dẫn đến thất bại trong điều trị tiệt<br /> việc chuyển hoá các loại thuốc khác trên nhiều<br /> trừ Hp<br /> nhóm bệnh lý khác nhau.<br /> Sự chuyển hoá các loại kháng sinh sử dụng<br /> trong điều trị Hp như: clarithromycin, TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Amieva MR, et al (2008). "Host-bacterial interactions in<br /> metronidazole được thực hiện chủ yếu bởi<br /> Helicobacter pylori infection", Gastroenterology. 134(1), 306-<br /> enzyme CYP3A4. Các kháng sinh khác như 323.<br /> amoxicillin tuy không được chuyển hoá trực tiếp 2. Anzenbacher P, et al (2003). "Cytochromes P450: review on<br /> their basic principles"Proceedings-indian national science<br /> bằng enzyme này nhưng cũng chịu sự tác động. academy part B. 69(6), 883-892.<br /> Do đó, hoạt động của enzyme CYP3A4 có ảnh 3. Billard A, et al (2012). "The allele-specific probe and primer<br /> hưởng lớn đến hiệu quả điều trị Hp(8). Các PPI amplification assay, a new real-time PCR method for fine<br /> quantification of single-nucleotide polymorphisms in pooled<br /> cũng được chuyển hoá một phần thông qua con DNA", Applied and environmental microbiology. 78(4), 1063-<br /> đường này. Sự giảm tiết acid dịch vị của PPI đã 1068.<br /> 4. Chaudhry AS, et al (2008). "Genetic polymorphism of<br /> được ghi nhận là gây ảnh hưởng đến sự hấp thu<br /> CYP2C19 and therapeutic response to proton pump<br /> của các thuốc khác. Độ hòa tan thuốc có thể giảm inhibitors", Indian J Med Res. 127(6), 521-530.<br /> ở pH trung tính so với điều kiện có tính acid. 5. Ekroos M, et al (2006). Structural basis for ligand promiscuity<br /> in cytochrome P450 3A4. PNAS. vol. 103, no. 37, 13682 - 13687.<br /> Khoảng 10 - 20% bệnh nhân sử dụng PPI không 6. Hunt RH, et al. (2011), "Helicobacter pylori in developing<br /> ghi nhận hiệu quả kháng tiết acid mà nguyên countries. World Gastroenterology Organisation global<br /> nhân chủ yếu là do sự chuyển hoá thuốc bị ảnh guideline", J Gastrointestin Liver Dis. 20(3), 299-304.<br /> 7. Ogawa R, Echizen H (2010). Drug - drug interaction profiles of<br /> hưởng bởi tính đa hình kiểu gen(9). Chính vì vậy, proton pump inhibitors. Clin. Pharmacokinet. 49(8), 509-533.<br /> việc xác định kiểu biến thể CYP3A4 là rất cần<br /> thiết nhằm tối ưu hiệu quả tiệt trừ Hp.<br /> <br /> <br /> 322 Chuyên Đề Nội Khoa I<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 8. Sapone A, et al (2003). The Clinical Role of Cytochrome P450 10. Wroblewski LE, et al (2010). "Helicobacter pylori and gastric<br /> Genotypes in Helicobacter pylori Management. The American cancer: factors that modulate disease risk", Clinical<br /> Journal of Gastroenterology. Vol. 98, No. 5, 1010-1015. microbiology reviews. 23(4), 713-739.<br /> 9. Shimatani T, et al (2006). Acid-suppressive effects of<br /> rabeprazole, omeprazole, and lansoprazole at reduced and<br /> Ngày nhận bài báo: 20/11/2015<br /> standard doses: a crossover comparative study in<br /> homozygous extensive metabolizers of cytochrome P450 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2015<br /> 2C19. Clin. Pharmacol. Ther. 79(1), 144-152.<br /> Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Tiêu Hóa 323<br />