Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Khảo sát xoắn khuẩn Leptospira và Leptospirosis trên chó ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP

NGUYỄN THỊ BÉ MƯỜI

KHẢO SÁT XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA VÀ LEPTOSPIROSIS TRÊN CHÓ Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

MÃ SỐ: 62640102

2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP

NGUYỄN THỊ BÉ MƯỜI

KHẢO SÁT XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA VÀ LEPTOSPIROSIS TRÊN CHÓ Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

MÃ SỐ: 62640102

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS. TS. HỒ THỊ VIỆT THU

2019

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban Giám hiệu

Trường Đại học Cần Thơ, khoa Sau đại học, ban Chủ nhiệm Khoa Nông Nghiệp, Bộ môn Thú y, các Quý thầy, cô đã giảng dạy, hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực

hiện luận án.

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô hướng

dẫn PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu đã động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu, chăm bồi kiến thức và

hoàn thành luận án. Xin cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Trần Đình Từ và PGS.

TS. Cao Thị Bảo Vân đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi

cho tôi thực hiện nuôi cấy xoắn khuẩn tại Viện Vệ Sinh Dịch Tễ. Xin cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Nhựt Xuân Dung và PGS.TS Nguyễn Trọng

Ngữ đã động viên và giúp đỡ trong việc xử lý số liệu và phân tích trình tự

gene.

Xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Hạnh Lan đã tận tình hướng dẫn

trực tiếp kỹ thuật nuôi cấy xoắn khuẩn tại phòng Sinh Học Phân Tử 3 của

Viện Vệ Sinh Dịch Tễ (Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh) và em Trần Văn

Bé Năm phòng Sinh Học Phân Tử, Viện Công Nghệ Sinh Học Trường ĐHCT.

Xin được bày tỏ lòng biết ơn các Quý thầy, cô trong hội đồng

chấm luận án đã đóng góp cho tôi những ý kiến vô cùng quý giá để tôi có thể hoàn thiện hơn bản luận án của mình.

Xin gởi lời cám ơn chân thành đến các bạn bè, đồng nghiệp của tôi đang

công tác tại Bộ môn Thú y, Trường Đại học Cần Thơ, các anh chị em lớp NCS

khóa 1 (2013-2017) đã động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình

thực hiện và hoàn thành luận án.

Tôi xin dành tất cả sự yêu thương và lời cám ơn tới gia đình, người thân yêu của tôi đã luôn ủng hộ, chia sẻ những buồn vui trong cuộc sống để tôi có

thể an tâm và có thêm nghị lực hoàn thành luận án.

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Bé Mười

TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát xoắn khuẩn Leptospira và Leptospirosis trên chó ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long” được thực hiện từ năm 2013 đến 2017, sử dụng phương pháp khảo sát huyết thanh học (MAT), lấy mẫu cắt ngang được thực hiện trên 4 tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long, An Giang và Cà Mau với 18 nhóm huyết thanh Leptospira phổ biến.

Tổng số mẫu kiểm tra huyết thanh chó 1.433, chia thành: giống chó nội và giống chó ngoại; 3 nhóm tuổi: 4 tháng - 12 tháng tuổi, ≤ 1-6 năm và ≥ 6 năm tuổi; giới tính đực và cái; nuôi thả rong và nuôi nhốt. Tổng số mẫu huyết thanh chuột 647, với 3 loại chuột: chuột cống, chuột xạ và chuột nhắt. Đề tài thực hiện trên 4 nội dung là: (1) Điều tra tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó và chuột; (2) Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu bằng kỹ thuật PCR và nuôi cấy, giải trình tự đoạn gene 16S rRNA của xoắn khuẩn Leptospira; (3) Khảo sát những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis trên chó thông qua xét nghiệm máu và nước tiểu và (4) nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis với 3 phác đồ điều trị bằng Shoptapen, Amoxicillin và Doxycycline.

Việc phát hiện xoắn khuẩn Leptospira được thực hiện trên 63 mẫu nghi ngờ có Leptospira từ 111 mẫu nước tiểu của chó có MAT ≥ 1: 400. Các biến đổi về bệnh lý thực hiện trên 13 chó (6 con không có và 7 có triệu chứng lâm sàng) dương tính với Leptospira bằng kỹ thuật PCR và điều trị được thực hiện tại 3 phòng mạch thú y tại TPCT.

Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira trung bình trên chó là 23,1%; cao nhất ở TP Vĩnh Long là 26,59%, kế đến là Cần Thơ (24,46%), An Giang (20,15%) và thấp nhất là Cà Mau (18,94%). Serogroup phổ biến là L. icteroheamorrhagiae (35,05%), L. canicola (18,34%), L. hurstbridge (12,69%), L. bataviae (12,08%) và L. grypptophosa (12,08%). Tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira giữa nhóm giống chó nội (23,71%) và chó ngoại (22,24%) (P=0,51) cũng như các lứa tuổi chó khác nhau, từ 4 tháng đến 12 tháng tuổi (22,51%), ≤ 1-6 năm tuổi (22,52%) và ≥ 6 năm tuổi (26,04%) (P=0,32). Tỷ lệ nhiễm Leptospira giữa chó đực (24,20%) và con cái (22,01%) (P=0,33). Tuy nhiên, phương thức nuôi có ảnh hưởng rất có ý nghĩa đến tỷ lệ nhiễm Leptospira, chó thả rong là 25,92% trong khi nuôi nhốt là 17,56% (P<0,01). Chuột có tỷ lệ nhiễm Leptospira khá cao, chuột cống 46,32%, trong khi chuột xạ và chuột nhắt lần lượt là 26,32 và 27,14% (P<0,01). Serogroup nổi trội là L. icteroheamorrhagiae (40,61%), L. canicola (20,52%), L. bataviae (13,97%), L. panama (10,92%) và L. hurstbridge (10,92%). Tỷ lệ dương tính với Leptospira giữa chuột và chó có tương quan rất chặc chẻ (R2= 0,90).

Kỹ thuật PCR đã phát hiện 13/63 mẫu nước tiểu dương tính với Leptospira (20,63%) và đã nuôi cấy thành công Leptospira từ 3/63 mẫu nước tiểu này (4,76%). Kết quả định danh xác định các mẫu phát hiện thuộc hai loài Leptospira interrogans (L. interrogans serovar icterohaemorrhagie) thuộc nhóm Leptospira gây bệnh và loài Leptospira fainei (L. fainei serovar hurstbridge) thuộc nhóm xoắn khuẩn trung gian gây bệnh cơ hội hiện diện trong nước tiểu chó ở TPCT.

Mười ba chó dương tính với Leptospira có bạch cầu tổng số, bạch cầu trung tính, lâm ba cầu, urea, creatinin, AST, ALT và bilirubin tăng cao, trong khi hồng cầu, hemoglobin, hematocrit và tiểu cầu giảm so với chỉ số bình thường, ngoài ra trong nước tiểu còn xuất hiện hồng cầu và protein cao. Bảy chó có triệu chứng lâm sàng như lừ đừ, ăn ít hoặc bỏ ăn (100%), niêm mạc nhợt màu (85,71%) và tiêu chảy (14,28%). Sáu mươi ba chó được điều trị với ba phác đồ, kết quả Doxycycline có tỷ lệ khỏi bệnh cao nhất (61,90%), kế đến là Amoxicilline (50%) và thấp nhất Shotapen (40%) (P=0,37).

Kết quả của đề tài chỉ rằng chó và chuột là hai động vật có mắc bệnh Leptospirois, tỷ lệ nhiễm Leptospira giữa chúng có quan hệ tuyến tính rất cao. Các số liệu thu được của đề tài là những dữ liệu cần thiết cho công tác phòng và chống bệnh trên chó cũng như góp phần làm hạn chế bệnh trên các động vật khác và trên người.

Từ khóa: chó, chuột, Leptospira, serogroup, tỷ lệ nhiễm, điều trị.

iii

ABSTRACT

The study of “Survey of Leptospira and Leptospirosis in dogs in some provinces in the Mekong Delta" was carried out from 2013 to 2017, using for a cross-sectional sero survey of the Leptospira prevalence by microscopic agglutination test (MAT) on four provinces: Can Tho, Vinh Long, An Giang and Ca Mau with live antigens of 18 common serogroups.

A total of serum samples was 1,433, in which dogs were divided two breeds group: domestic and exotic dog’s breeds; three age groups, 4 months to 12 months, ≤ 1-6 years and ≥ 6 years-old dogs; male and female; free-raising dogs and captive dogs. A total of the tested serum samples was 647: three rat species: Rattus norvegicus, Suncus murinus and Mus musculus. The study consisted of four contents (1) Investigation the prevalence of Leptospira in dogs and rats; (2) Detection of Leptospira from urine by PCR technique and by culturing methods, sequence of the 16S rRNA of Leptospira; (3) Survey of the pathological changes of Leptospirosis on dogs through blood and urine tests and (4) examination of three antimicrobial therapies with Shoptapen, Amoxicillin and Doxycycline in the treatment of Leptospira on dogs.

The detection of Leptospira was examined on 63 clinical suspicion cases of Leptospira from 111 urine samples of dogs, all were tested by MAT ≥ 1: 400. The pathological changes were conducted on 13 dogs (6 without and 7 had clinical symptoms) that were positive for Leptospira by PCR technique and the treatments were conducted at 3 veterinary clinics in Cantho city.

Results showed that the average prevalence of Leptospira in dogs was 23.10%, the highest rate was reported in Vinh Long province (26.95%), followed by Can Tho city (24.46%), An Giang province (20.15%) and the lowest was in Ca Mau city (18.94%). The common serogroups were L. icterohaemorrhagiae (35.05%), L. canicola (18.43%), L. hurstbridge (12.69%), L. bataviae (12.08%) and L. gryppotyphosa (12.08%). The seroprevalence of Leptospira between domestic dog’s breeds group was (23.71%) and exotic dog’s breeds group (22.24%) (P=0.51) as well as among age groups of dogs: from 4 months to 12 months (21.51%), ≤ 1-6 years old (22.52%) and ≥ 6 year-old dogs (26.04%) (P=0.32). The prevalence of Leptospira between males dogs was 24.20% and 22.01% in female (P=0.33). Howerver, keeping methods had significantly influenced on the prevalence of Leptospira with 25.92% found in free-raising dogs, while in captive dogs was 17.56% (P<0.01). There was high positive prevalence of Leptospira observed in rats (35.40%), in which the highest percentage found in Rattus norvegicus (46.32%), while Suncus murinus and Mus musculus were 26.32% and 27.14%, respectively (P<0.01). The common serogroups were L. icterohaemorrhagiae iv

(40.61%), L. canicola (20.52%), L. bataviae (13.97%), L. panama (10.92%), and L. hurstbridge (10.92%). The positive prevalence Leptospira between rats and dogs was highly correlated (R2=0.90).

The PCR technique detected 13/63 Leptospira positive urine samples (20.63%) and Leptospira was successfully cultured from 3/63 urine samples (4.76%). Identification results based on homology and comparison of 16S rNRA gene nucleotic sequences had identified the Leptospira detected samples belonged to two species of Leptospira interrogans (L. interrogans serovar icterohaemorrhagiae), which is pathogenic Leptospira species and L. fainei (Leptospira fainei serovar hurstbridge) is the associated pathogenic spirochetes, occurred in dog urine in Can Tho city.

Thirteen dogs positive for Leptospira had the white blood cell, neutrophil, lymphocyte counts, urea, creatinine, AST, ALT and bilirubin levels higher than normal ranges, whereas the red blood cell, hemoglobin, hematocrit and platelet counts were lower than those of normal; and there were the presence of red blood cell and protein in urine. Seven dogs with clinical symptoms of Leptospirosis included lethargy, reluctant to eat and anorexia (100%), colorless mucus (85.71%) and diarrhea (14.28%). Sixty- three infected dogs treated with Doxycycline had the highest recovery rate (61.90%), followed by Amoxicillin (50%) and the lowest was Shoptapen (40%) (P=0.37).

The study indicated that canine and rodent were two infected animal species with Leptospirosis. There was a high linearly correlated in the prevalence of Leptospira between dogs and rats. This research is necessary for the prevention, against as well as contributes to limit the bacteria potential exposure of rodent to domestic animals and human.

Keywords: dog, rat, Leptospira, serogroup, prevalence, treatment.

LỜI CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả

nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa

từng dùng để bảo vệ ở bất kỳ nơi đâu. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ

cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Cán bộ hướng dẫn Tác giả luận án

PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu Nguyễn Thị Bé Mười

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ ..................................................................................................... i

TÓM TẮT .......................................................................................................... ii

ABSTRACT ...................................................................................................... iii

LỜI CAM KẾT KẾT QUẢ .............................................................................. vi

MỤC LỤC ....................................................................................................... vii

DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................... x

DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................... xii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ xiii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU................................................................................ 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3

2.1 Lịch sử phát hiện bệnh Leptospirosis và xoắn khuẩn Leptospira .............. 3

2.2 Đặc điểm vi sinh vật học của xoắn khuẩn Leptospira ....................................... 3

2.2.1 Phân loại học ............................................................................................. 3

2.2.2 Cấu trúc hình thái ...................................................................................... 7

2.2.3 Đặc tính nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira ................................................. 7

2.2.4 Sức đề kháng của mầm bệnh ................................................................... 9

2.4.5 Tính sinh miễn dịch ................................................................................. 9

2.3 Đặc điểm dịch tễ học ................................................................................ 10

2.3.1 Nguồn bệnh ............................................................................................. 10

2.3.2 Đường xâm nhập của mầm bệnh ........................................................... 11

2.3.3 Đặc tính gây bệnh của xoắn khuẩn Leptospira ..................................... 12

2.4 Đặc điểm bệnh học và lâm sàng ................................................................ 13

2.4.1 Bệnh Leptospirosis trên chó ................................................................... 13

2.4.2.Bệnh Leptospirosis trên người ................................................................ 18

2.5 Tình hình nghiên cứu Leptospirosis trên thế giới ..................................... 19

2.6 Tình hình nghiên cứu Leptospirosis trên gia súc và người ở Việt Nam ... 22

vii

2.7 Một số phương pháp chẩn đoán Leptospira .............................................. 24

2.7.1 Phương pháp kiểm tra xoắn khuẩn bằng kính hiển vi nền đen .............. 25

2.7.2 Phương pháp nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira ..................................... 25

2.7.3 Chẩn đoán huyết thanh học .................................................................... 26

2.8 Các biện pháp phòng và trị Leptospirosis.................................................. 29

2.8.1 Các biện pháp phòng ............................................................................. 29

2.8.2 Điều trị bệnh Leptospirosis .................................................................... 31

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 33

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 33

3.2 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 34

3.3 Vật liệu thí nghiệm .................................................................................... 36

3.3.1 Phương tiện và dụng cụ dùng trong phản ứng huyết thanh học ............ 36

3.3.2 Phương tiện và dụng cụ dùng trong kỹ thuật PCR ................................. 38

3.4 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 39

3.4.1 Nội dung 1: Xác định tình hình nhiễm xoắn khuẩn Leptospira trên chó

và chuột ở 4 tỉnh ĐBSCL................................................................................. 39

3.4.2 Nội dung 2: Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu ................... 45

3.4.3 Nội dung 3: Khảo sát những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis ......... 53

3.4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis ............. 55

3.5 Phân tích và xử lý số liệu .......................................................................... 56

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 57

4.1 Kết quả khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên chó và chuột ............... 57

4.2 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu.. ........................................ 81

4.3. Khảo sát những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis trên chó ................. 92

4.4. Nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis trên chó .................... 99

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................... 103

5.1 Kết luận .................................................................................................... 103

5.2 Đề nghị ..................................................................................................... 103

viii

DANH MỤC LIỆT KÊ CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ..................... 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 105

PHỤ LỤC MẪU PHIẾU ĐIỀU TRA ............................................................ 121

PHỤ LỤC THUỐC SỬ DỤNG ..................................................................... 122

PHỤ LỤC THỐNG KÊ ................................................................................. 124

KẾT QUẢ MỔ KHÁM BỆNH TÍCH .......................................................... 136

PHỤ LỤC HÌNH ........................................................................................... 143

ĐẶC ĐIỂM PHÂN BIỆT BA LOÀI CHUỘT .............................................. 146

PHỤ LỤC GIẢI TRÌNH TỰ GENE ............................................................. 148

DANH SÁCH BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

Bảng 2.1 Nhóm huyết thanh và một số serovar của L. interrogans ............. 5

Bảng 3.1 Danh mục bộ kháng nguyên dùng trong phản ứng MAT ........... 37

Bảng 3.2 Số lượng mẫu huyết thanh chó trong nghiên cứu ....................... 40

Bảng 3.3 Phân bố mẫu huyết thanh chuột trong nghiên cứu ...................... 43

Bảng 3.4 Phân loại chuột trong nghiên cứu................................................ 43

Bảng 3.5 Số mẫu nước tiểu dùng cho kỹ thuật PCR .................................. 45

Bảng 3.6 Trình tự nucleotide cặp mồi dùng khuếch đại vùng gene .......... 47

Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR ........................................................ 47

Bảng 3.8 Quy trình nhiệt trong phản ứng PCR .......................................... 48

Bảng 3.9 Số mẫu nước tiểu dùng cho nuôi cấy .......................................... 49

Bảng 3.10 Phân bố mẫu khảo sát tại 3 địa điểm trên địa bàn TPCT ............ 53

Bảng 3.11 Các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa máu ........................................... 54

Bảng 3.12 Các chỉ tiêu sinh lý nước tiểu ...................................................... 54

Bảng 3.13 Số lượng chó được bố trí điều trị ................................................ 55

Bảng 3.14 Bố trí thí nghiệm ......................................................................... 56

Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó ................................................. 57

Bảng 4.2 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh ....... 61

Bảng 4.3 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó ................. 64

Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo giống chó ..................................... 65

Bảng 4.5 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh ...... 66

Bảng 4.6 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo lứa tuổi chó .................................. 67

Bảng 4.7 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh ...... 69

Bảng 4.8 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo giới tính ................................. 70

Bảng 4.9 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh ....... 71

Bảng 4.10 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo phương thức nuôi .................. 71

Bảng 4.11 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh ....... 73

Bảng 4.12 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột ở một số tỉnh ĐBSCL .......... 74

Bảng 4.13 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh ...... 76

Bảng 4.14 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chuột .............. 78

Bảng 4.15 Tỷ lệ dương tính các serogroup Leptospira trên chuột và chó ... 79

Bảng 4.16 Tỷ lệ phát hiện Leptospira trực tiếp từ nước tiểu ....................... 81

Bảng 4.17 Tỷ lệ Leptospira phát hiện được theo các địa điểm lấy mẫu ..... 82

Bảng 4.18 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo độ tuổi, giới tính.................... 83

Bảng 4.19 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo hiệu giá ngưng kết ................. 86

Bảng 4.20 Kết quả định danh loài xoắn khuẩn Leptospira phát hiện .......... 87

Bảng 4.21 Xác định loài xoắn khuẩn Leptospira ........................................ 89

Bảng 4.22 Các chỉ tiêu sinh lý máu trên chó nhiễm Leptospira ................. 92

Bảng 4.23 Các chỉ tiêu sinh hóa máu trên chó nhiễm Leptospira ............... 94

Bảng 4.24 Các chỉ sinh lý nước tiểu trên chó nhiễm Leptospira ................ 96

Bảng 4.25 Triệu chứng lâm sàng trên chó dương tính với Leptospira ........ 98

Bảng 4.26 Tỷ lệ điều trị khỏi bệnh ............................................................ 100

Bảng 4.27 Các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trước và sau .... 101

DANH SÁCH HÌNH

Hình Tên hình Trang

Hình 2.1 Hình dạng Leptospira interrogans dưới kính hiển vi ................... 7

Hình 2.2 Leptospira interrogans dưới KHV nền đen (x400) ..................... 8

Hình 2.3 Sơ đồ lây truyền Leptospira ...................................................... 12

Hình 2.4 Hoại tử đầu lưỡi với bệnh Leptospira cấp tính .......................... 14

Hình 2.5 Vàng niêm mạc mắt ở chó bệnh Leptospira ............................. 15

Hình 2.6 Vàng niêm mạc miệng ở chó bệnh Leptospira ......................... 15

Hình 2.7 Hiện tượng vàng da ở người bệnh Leptospira ........................... 19

Hình 2.8 Đáp ứng kháng thể kháng của Leptospira trong máu ............... 28

Hình 3.1 Các ống môi trường EMJH đang nuôi cấy ................................. 50

Hình 3.2 Xoắn khuẩn Leptospira đã phát triển trong môi trường EMJH . 50

Hình 4.1 Quan hệ tuyến tính giữa tỷ lệ dương tính Leptospira ................. 80

Hình 4.2 Leptospira soi dưới kính hiển vi nền đen (X40) ......................... 84

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% .............. 84

Hình 4.4 Cây phả hệ phát sinh loài các serogroup Leptospira .................. 90

Hình 4.5 Xuất huyết da ............................................................................. 93

Hình 4.6 Vàng da ở chó bệnh Leptospirosis ............................................. 95

Hình 4.7 Màu sắc các ống nước tiểu ......................................................... 97

xii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nguyên văn Nghĩa tiếng việt

Aspartate aminotransferase AST

Alanine aminotransferase ALT

DNA Deoxyribonucleic acid

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu

Long

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Phản ứng hấp phụ

miễn dịch liên kết men Assay

EMJH Ellinghausen McCullough & Johnson Môi trường nuôi cấy

Harris

Immuno Fluorescent Test. Phản ứng miễn dịch IFT

huỳnh quang

Kính hiển vi KHV

Microscopic Agglutination Test Phản ứng vi ngưng kết MAT

Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi nhân PCR

gene

Số lượng tiểu cầu Platelet count PLT

Ribonucleic acid RNA

Thành phố Cần Thơ TPCT

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

xiii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh xoắn khuẩn là bệnh truyền nhiễm chung cho nhiều loài gia súc và

người gây ra bởi một số loài xoắn khuẩn gây bệnh (Pathogenic Leptospira species). Bệnh xảy ra phổ biến khắp thế giới, nhất là những vùng nhiệt đới có

khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho sự tồn tại của xoắn khuẩn ở bên ngoài cơ thể

(Evangelista and Coburn, 2010). Xoắn khuẩn gây bệnh tồn tại trong ống thận

và bài thải qua nước tiểu làm vấy nhiễm môi trường (Adler and Moctezuma,

2010) và trong tự nhiên chuột cống là nguồn tàng trữ xoắn khuẩn và là nguồn truyền lây bệnh cho chó, con người và các loài động vật khác (Sykes et al.,

2011).

Ở Việt Nam trong thời gian qua có nhiều nghiên cứu về tình hình nhiễm

Leptospira trên các loài động vật và kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm Leptospira

khá biến động, phụ thuộc vào động vật khảo sát, thời gian và địa điểm khảo

sát như một số tác giả Vũ Đình Hưng (1995), Nguyễn Thị Ngân (2000), Lê

Huỳnh Thanh Phương (2001), Hoàng Mạnh Lâm (2002) và Hoàng Kim Loan

(2013) đã khảo sát. Tuy nhiên nghiên cứu về bệnh này trên chó rất ít, đặc biệt

là khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long chưa có nghiên cứu nào về Leptospira

và bệnh Leptospirosis trên chó.

Chó được xem là loài động vật cảm nhiễm nhất sau bò. Leptospira lây

truyền qua tiếp xúc trực tiếp với nước tiểu bị nhiễm bệnh, qua đường sinh dục,

qua những vết cắn trầy xước hay truyền gián tiếp thông qua thức ăn hay nước

uống bị nhiễm xoắn khuẩn. Xoắn khuẩn Leptospira xuyên qua màng nhầy và

nhân lên nhanh chóng khi vào hệ thống mạch máu, lây lan đến các mô khác

làm ảnh hưởng đến các cơ quan như thận, gan, lách, hệ thống thần kinh, mắt

và đường sinh dục (Sykes et al., 2011). Bệnh do Leptospira gây ra có rất nhiều triệu chứng lâm sàng phức tạp dễ nhầm lẫn với các bệnh khác như sốt, run,

đau cơ, nôn mửa và mất nước nhanh chóng (Levett, 2001). Ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long chưa có nghiên cứu nào về tình hình nhiễm Leptospira trên chó do đó đề tài nghiên cứu “Khảo sát xoắn khuẩn Leptospira và

Leptospirosis trên chó ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long” được

thực hiện, để cung cấp thêm những thông tin khoa học về tình hình nhiễm

cũng như khả năng gây bệnh của các serogroup này trên chó. Những hiểu biết

này giúp xây dựng các biện pháp phòng bệnh cho chó và góp phần hạn chế lây

nhiễm sang người.

Từ những vấn đề nói trên cho thấy nghiên cứu này rất có ý nghĩa khoa học trong lĩnh vực vi sinh vật học thú y, đồng thời góp phần bảo vệ đàn chó và sức khỏe cộng đồng ở khu vực ĐBSCL

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Khảo sát sự lưu hành của xoắn khuẩn Leptospira trên chó và chuột.

- Nghiên cứu những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis trên chó.

- Nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis trên chó.

1.3 Những đóng góp mới của luận án

Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện 2 loài Leptospira

interrogans và Leptospira fainei hiện diện trên chó chưa tiêm phòng

Leptospirosis ở một số tỉnh ĐBSCL.

1.4 Ý nghĩa khoa học của luận án

Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về tình hình dịch tễ bệnh

Leptospirosis trên chó, là cơ sở khoa học cho việc xây dựng qui trình phòng và

trị bệnh trên chó, hạn chế bệnh trên người và các loài động vật khác.

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2. 1 Lịch sử phát hiện bệnh Leptospirosis và xoắn khuẩn Leptospira

Leptospirosis là bệnh truyền nhiễm chung giữa nhiều loài động vật và người

(Zoonosis), do xoắn khuẩn Leptospira thuộc họ Spirochetaceae gây ra. Năm

1886 lần đầu tiên Adolph Weil đã miêu tả những triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh, trong đó đặc biệt có một số bệnh nhân bị nhiễm Leptospira dạng cấp

tính là vàng da nên bệnh được xếp vào bệnh truyền nhiễm. Sau công trình nghiên

cứu của Adolph Weil, một số nhà nghiên cứu khác đã phát hiện ra nhiều ổ dịch

có triệu chứng lâm sàng giống như Adolph Weil đã mô tả và từ đó gọi là

Weil’s disease. Những năm sau này bệnh lại được phát hiện trên các loài gia súc và con người ở nhiều nước trên thế giới.

Dựa theo tài liệu của Adler (2015), từ những nghiên cứu về lâm sàng và

dịch tễ học, Vasiliep người Nga đã phân biệt được bệnh vàng da do nhiễm

khuẩn với bệnh vàng da do những nguyên nhân khác như viêm gan hay rối

loạn chuyển hóa sắc tố mật. Năm 1916, hai nhà nghiên cứu người Nhật là Do

and Inada đã phát hiện được Leptospira gây bệnh cho người ở Nhật Bản. Đến

năm 1917, Noguchi đã tìm thấy serovar Leptospira trên chuột hoang ở Mỹ có

hình thái và đặc tính miễn dịch giống như các serovar Leptospira ở Nhật Bản

và năm 1918 ông tiếp tục mô tả hình thái của serovar Leptospira này và gọi là

Leptospira icterohaemorrhagiae.

2.2 Đặc điểm vi sinh vật học của xoắn khuẩn Leptospira

2.2.1 Phân loại học

Theo khóa phân loại khoa học Leptospira được xếp vào

Giới: Bacteria

Ngành: Spirochaetes

Lớp: Spirochaetes

Bộ: Spirochaetales

Họ: Leptospiraceae

Giống: Leptospira.

Dựa trên sự tương đồng của bộ gene, các xoắn khuẩn thuộc giống

Leptospira spp. đã được chia thành 20 loài khác nhau (Nalam et al., 2010),

bao gồm những loài gây bệnh và không gây bệnh (hoại sinh):

Những loài xoắn khuẩn gây bệnh: L. interrogans, L. kirschneri, L. borgpetersenii, L. santarosai, L. noguchii, L. weilii, L. alexanderi và L. alstonii.

Những loài hoại sinh (không gây bệnh): L. biflexa, L. wolbachii, L.

kmetyi, L. meyeri, L. vanthielii, L. terpstrae và L. yanagawae.

Trước năm 1989, chi Leptospira được chia thành hai loài Leptospira

interrogans bao gồm tất cả các chủng gây bệnh và Leptospira biflexa gồm các chủng hoại sinh (không gây bệnh). Sự phân chia này dựa trên các đặc tính kiểu

hình và sự sinh trưởng của chúng như các chủng hoại sinh có khả năng mọc được ở nhiệt độ 11-13oC và sinh trưởng với sự có mặt của 8-azaguanine (225 μg/ml) (Sykes et al., 2011).

Một số loài trung gian gây bệnh hoặc hoại sinh: L. inadai, L. broomii, L.

fainei, L. wolffii và L. Licerasiae (Levett, 2001; Bharti et al., 2003). Tuy

nhiên, cũng có một số loài lại bao gồm cả các chủng xoắn khuẩn gây bệnh và

không gây bệnh. Ngày nay hệ thống phân loại mới dựa vào kỹ thuật sinh học

phân tử và khác hẳn với hệ thống phân loại trước đây dựa trên khảo sát huyết

thanh học (Saito et al., 2013).

Các serovar Leptospira gây bệnh được xếp vào các nhóm khác nhau dựa

vào mối quan hệ kháng nguyên, thông qua việc xác định bằng phản ứng ngưng kết hay theo kiểu hấp phụ ngưng kết chéo với kháng nguyên tương đồng

(Levett, 2001). Mặc dù không dựa vào nhóm huyết thanh để phân loại

Leptospira nhưng chúng có rất ý nghĩa về mặt dịch tễ học. Các nhóm huyết

thanh của L. interrogans và một số phân loài phổ biến được thể hiện qua Bảng 2.1

Bảng 2.1 Nhóm huyết thanh và một số serovar của L. interrogans

Số TT

Nhóm huyết thanh

Serovar (s)

Icterohaemorrhagiae

icterohaemorrhagiae, copenhageni, lai, zimbabwe

Hebdomadis

hebdomadis, jules, kremastos

autumnalis, fortbragg, bim, weerasinghe

Autumnalis

Pyrogenes

pyrogenes

Bataviae

bataviae

Gryppotyphosa

gryppotyphosa, canalzonae, ratnapura

Canicola

canicola

Australis

australis, bratislava, lora

Pomona

pomona

Javanica

javanica

Sejroe

sejroe, saxkoebing, hardjo

Panama

panama, mangus

Cynopteri

cynopteri

Djasiman

djasiman

Sarmin

sarmin

Mini

mini, georgia

Tarassovi

tarassovi

Ballum

ballum, aroborea

Celledoni

celledoni

Louisiana

louisiana, lanka

Ranarum

ranarum

Manhao

manhao

Shermani

shermani

Hurstbridge

hurstbridge

(Levett, 2001).

Theo các nhà nghiên cứu huyết thanh học, hiện nay có trên 260 serovar

gây bệnh được xếp vào 24 serogroup huyết thanh và 60 serovar thuộc nhóm

hoại sinh (Cerquerira and Picardeau, 2009). Các serovar gây bệnh được phân chia thành các serogroup dựa trên mối quan hệ kháng nguyên được xác định bằng phản ứng ngưng kết và tiếp theo được chia thành các serovar theo kiểu hấp thụ ngưng kết.

Việc phân loại kiểu hình của Leptospira đã được thay thế bằng kiểu

gene, trong đó gene phổ biến bao gồm tất cả các serovar của cả L. interrogans

và L. biflexa. Hiện tại, các serovar gây bệnh còn được tìm thấy trong 10 loài

Leptospira interrogans, L. noguchii, L. santarosai, L. meyeri, L. borgpetersenii, L. kirschneri, L. weilii, L. inadai, L. fainei và L. alexanderi.

Trong đó, có loài một loài và serovar mới được bổ sung L. fainei serovar

hurstbridge (Pérolat et al., 1998), Hệ thống phân loại mới dễ bị lẫn lộn bởi vì

nhiều serovar và serogroup gây bệnh cũng như không gây bệnh có thể nằm

trong cùng một loài, ngược lại một serovar hoặc serogroup cũng có thể nằm

trong nhiều loài khác nhau. Điều này cho thấy không có sự tương đồng giữa

hệ thống phân loại dựa trên cấu trúc kháng nguyên bề mặt và hệ thống phân

loại dựa trên cấu trúc gene. Sự nhận dạng và phân loại đến loài trong chi

Leptospira là rất quan trọng, bởi vì chúng có tính gây bệnh trên các loải động

vật khác nhau. Việc tái phân loại Leptospira dựa trên nền tảng kiểu gene là

chính xác về mặt danh pháp và cung cấp cơ sở vững chắc cho định loại xoắn

khuẩn này trong tương lai. Bên cạnh đó, việc phân loại dựa vào cơ sở phân tử cũng gặp một số khó khăn đối với các nhà nghiên cứu lâm sàng, bởi vì hệ

thống này không tương hợp rõ ràng với hệ thống serovar (chủng)/serogroups

(nhóm huyết thanh) lâu nay đã được sử dụng trong chẩn đoán xác định xoắn

khuẩn Leptospira và trong các nghiên cứu về dịch tễ học (Albert et al., 2009).

Hiện nay một số kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để xác định và mô tả đặc điểm của Leptospira spp. đến nay đã xác định được 20 loài

Leptospira spp. trong đó có 9 loài Leptospira gây bệnh (Cerqueira and Picardeau, 2009). Việc phân loại này dựa trên kết quả phân tích phát sinh loài gene 16S rRNA được xem như thử nghiệm sàng lọc ban đầu để xác định Leptospira trong các mẫu lâm sàng nghi ngờ nhiễm Leptospira (La Scola et

al., 2006; Morey et al., 2006).

2.2.2 Cấu trúc hình thái

Leptospira là những vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, có hình móc câu, xoắn,

chuyển động của Leptospira rất đa dạng không theo qui luật nào, có thể di chuyển thẳng, xoay tròn, theo hình sóng… Leptospira có kích thước: khoảng rộng 0,1-0,2 µm; dài 6-20 µm, khoảng cách giữa các vòng xoắn là 0,5 µm (Levett, 2001).

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, Leptospira có hình ống xoắn tròn

xung quanh một trục dọc theo chiều dài thân và uốn cong thành móc ở hai đầu,

bộ phận di động của vi khuẩn gồm một trục ở giữa và thân xoắn như lò xo

quanh trục. Ngoài cùng có một vỏ mềm co giãn được, chứa nhiều kháng nguyên, tiếp theo là màng bao bọc tế bào chất bao gồm 3-5 lớp, ở giữa là nhân

không có màng ngăn cách với nguyên sinh chất đảm nhận chức năng di

truyền. Do có cấu trúc đặc biệt như vậy nên Leptospira vận động rất uyển

chuyển và có khả năng co giãn dễ dàng, chúng có thể chui qua da, niêm mạc

của gia súc hoặc của người khi ngâm nước hoặc có vết trầy xước. Khi cho qua

lọc Seitz với kích thước lổ lọc 0,1-0,45 µm, hầu hết các vi khuẩn đều bị giữ lại

Hình 2.1. Hình dạng Leptospira interrogans dưới kính hiển vi (KHV) điện tử quét (Levett, 2015)

nhưng chỉ có xoắn khuẩn Leptospira có thể chui qua được dễ dàng.

2.2.3 Đặc tính nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira

Điều kiện nuôi cấy tối ưu để Leptospira sinh trưởng: môi trường đặc hiệu, hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ khoảng 28-300C, pH từ 6,8-7,4 (Bharti et al., 2003) và thời gian phân chia của mỗi thế hệ kéo dài khoảng 7-10 ngày đối với các chủng mới phân lập, do vậy khó phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy thông thường ở phòng thí nghiệm. Leptospira có thể sống được trong môi

trường ẩm ướt (đất, bùn, đầm lầy, suối và sông), trong các cơ quan và mô sống

hoặc động vật chết hoặc trong sữa pha loãng (Adler and Moctezuma, 2010).

Xoắn khuẩn có thể phát triển trong môi trường Ellinghausen-

McCullough-Johnson-Harris (EMJH), nhưng sự phát triển của Leptospira rất chậm, có đôi khi kéo dài đến 3 tháng. Ở nhiệt độ 28-300C có thể nhận thấy được sự phát triển của các chủng gây bệnh sau 4-7 ngày nuôi cấy, còn sự phát triển của các chủng hoại sinh chỉ sau 2-3 ngày ở nhiệt độ 11-130C. Do đó có thể dựa vào khả năng phát triển ở 130C để phân biệt các loài Leptospira hoại sinh hay loài Leptospira gây bệnh (Levett, 2001).

Trong cùng một điều kiện môi trường nuôi cấy những loài hoại sinh sẽ

phát triển nhanh hơn các loài gây bệnh do chúng thường sống trong môi trường nước đọng hay hòa lẫn trong đất ẩm cho nên khi nuôi cấy phải thường

xuyên kiểm tra, ít nhất mỗi tuần 1 lần dưới kính hiển vi nền đen để có được

Hình 2.2 Leptospira interrogans dưới KHV nền đen (x400) (Lee et al., 2000)

kết quả chính xác (Ganoza et al., 2006).

Trong quá trình nuôi cấy Leptospira, để tránh sự vấy nhiễm của các vi khuẩn trong giai đoạn đầu nuôi cấy, đặc biệt các mẫu có nguồn gốc từ động vật bệnh có biểu hiện triệu chứng lâm sàng hoặc từ môi trường, cần bổ sung

thêm kháng sinh 5-fluorouracil vào môi trường nuôi cấy, làm hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn vấy nhiễm khác nhưng không làm giảm sự tăng trưởng

của Leptospira (Levett, 2001; Adler and Moctezuma, 2010).

2.2.4 Sức đề kháng của mầm bệnh

Sự tồn tại của Leptospira gây bệnh trong môi trường phụ thuộc vào

nhiều yếu tố như pH hay nhiệt độ môi trường. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, Leptospira trong nước ở nhiệt độ phòng vẫn duy trì được trong nhiều tháng ở pH=7,2 đến pH=8,0. Trong nước thải cống rãnh Leptospira có thể sống được trong vài tuần lễ. Ở trong đất có tính acid (pH= 6,2) Leptospira

serovar australis có thể sống sau 7 tuần và đất ngập nước mưa sống được ít

nhất 3 tuần. Trong đất ẩm ướt Leptospira có thể tồn tại 180 ngày và nhiều

tháng trong nước mặt và khi đất bị ô nhiễm nước tiểu từ chuột nhiễm

Leptospira, Leptospira sống được khoảng 2 tuần (Levett, 2001).

2.2.5 Tính sinh miễn dịch

Miễn dịch đối với Leptospira là miễn dịch đặc hiệu cho từng nhóm huyết thanh, một số trường hợp cho thấy có miễn dịch chéo giữa L. sejroe và L. hardjo. Khi mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể gia súc, xoắn khuẩn có tác động lên hệ miễn dịch của cơ thể ký chủ, kích thích cơ thể tạo ra kháng thể. Kháng thể là một globulin miễn dịch có phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên. Globulin miễn dịch đuợc chia làm 5 nhóm IgA, IgG, IgE, IgM, và IgD, trong đó IgG và IgM là quan trọng nhất. Thường thì khi có tác động của kháng nguyên, sau 7 ngày trong cơ thể đã xuất hiện IgM và đạt cao nhất vào ngày thứ 10, trong khi IgG xuất hiện sau khi nhiễm mầm bệnh vài tuần và đạt cao nhất vào ngày thứ 20-30. Sau đó hàm lượng kháng thể này giảm dần. Kháng thể IgM không đặc hiệu, có thể ngưng kết với nhiều chủng huyết thanh, trong khi IgG có đặc tính đặc hiệu cao đối với từng chủng huyết thanh gây bệnh. Việc xuất hiện kháng thể IgM và IgG cho phép ta suy diễn về các giai đoạn của bệnh. Thời gian tồn tại của kháng thể động vật dài hay ngắn tùy thuộc từng loại kháng thể và tính chất cùa bệnh. Tuy nhiên, do Leptospira thuờng khu trú ở hệ thống ống lượn của thận, dịch não tủy, dịch của mắt và trong lòng ống cơ quan sinh dục cho nên tác động của kháng thể ở những nơi này rất hạn chế. Điều này giải thích cho sự tồn tại dai dẳng của mầm bệnh ở con vật bị nhiễm (Krawczyk, 2005).

Việc chủng ngừa Leptospira bằng vaccine có hiệu quả làm giảm tỷ lệ nhiễm, nhưng không bảo vệ hoàn toàn chống lại sự nhiễm do có nhiều chủng huyết thanh gây bệnh khác nhau. Thú được tiêm vaccine có thể nhiễm

mầm bệnh mà không thể hiện triệu chứng lâm sàng, chúng có thể bài thải mầm bệnh ở mức độ thấp và thời gian bài thải ngắn hơn thú không tiêm vaccine. Tuy vậy, việc tiêm vaccine cho thú cái trước khi phối giống sẽ bảo vệ

được chúng trong suốt quá trình mang thai, thú non có thể được bảo hộ sau khi

được sinh ra 3-4 tháng. Việc phòng bệnh do Leptospira trên chó tuy hiệu quả

không hoàn toàn nhưng có tác dụng làm giảm bớt bệnh xảy ra trên người (Pedro and Boris, 2001).

2.3. Đặc điểm dịch tễ học

2.3.1 Nguồn bệnh

Những nghiên cứu về dịch tễ học đã xác định gia súc mắc bệnh

Leptospirosis là nơi chứa xoắn khuẩn và thải xoắn khuẩn ra ngoài qua nước tiểu

và từ đây sẽ lây lan mầm bệnh cho con người. Trong tự nhiên loài vật mang xoắn

khuẩn chủ yếu là loài gặm nhấm, chuột là loài vật có mặt khắp mọi nơi và có tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn rất cao và thay đổi tùy theo từng nước, theo tập quán chăn

nuôi và tùy thuộc vào điều kiện vị trí địa lý. Chuột chứa xoắn khuẩn với tỷ lệ cao

là chuột cống (Rattus norvegicus), kế đến là chuột nhà (Rattus flavipectus), chuột

đồng (Rattus argentiventer) và chuột nhắt (Mus musculus) (Levett, 2001).

Tính chất dịch tễ học của Leptospirosis rất đa dạng và phong phú, gia súc

và người có thể nhiễm bất kỳ một serovar gây bệnh, chính vì vậy Leptospira

có thể dễ dàng lây truyền từ gia sức này sang gia súc khácvà mức độ bệnh phụ

thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như cường độ nhiễm, tỷ lệ nhiễm và sức đề

kháng của con vật. Mỗi vùng hay mỗi quốc gia khác nhau có một số serovar

Leptospira gây bệnh khác nhau như chó thường mang Leptospira serovar

canicola, chuột mang Leptospira serovar icterohaemorrhagiae và Leptospira

serovar copenhageni, heo thường mang Leptospira serovar pomona Leptospira serovar tarassovi và có thể truyền lây Leptospira lẫn nhau (Bharti

et al., 2003.)

Trong tự nhiên Leptospira gây bệnh chủ yếu cho bò, chó, ngựa, cừu, dê,

heo, mèo và các loài hoang dã khác như báo, chồn, khỉ,… Leptospira có thể

gây nhiễm cho người do lây nhiễm từ sức vật (Mayer-Scholl et al., 2013). Tuy nhiên, mức độ biểu hiện bệnh có thể khác nhau giữa các loài động vật và chuột

là ổ chứa serovar icterohaemorrhagiae trong khi đó chó là ổ chứa serovar canicola (Klaasen et al., 2003; Miraglia et al., 2012).

Thời gian mang khuẩn và mức độ bài thải xoắn khuẩn qua nước tiểu thay

đổi tùy theo loài mang xoắn khuẩn và serovar Leptospira, có thể từ vài tháng

đến 1 năm hoặc nhiều hơn như chó khi bị nhiễm bệnh serovar canicola có thể

thải vi khuẩn qua nước tiểu trong nhiều tháng (Paul et al., 2009).

Ổ chứa mầm bệnh không thường xuyên chủ yếu là gia súc, nhưng không

phải bất cứ con vật nào cũng mang Leptospira. Khi gia súc mang Leptospira,

nó không mang suốt đời như loài gặm nhấm nên mầm bệnh thải ra ngoài qua nước tiểu lúc có lúc không. Khi cơ thể gia súc nhiễm Leptospira sẽ thải xoắn khuẩn ra bên ngoài qua nước tiểu, làm ô nhiễm môi trường xung quanh và nguồn nước. Khi Leptospira sống trong nước, đặc biệt là nơi nước đọng chúng

sống và giữ nguyên đặc tính gây bệnh. Khi gặp điều kiện thuận lợi như độ ẩm

thích hợp, pH trung tính hoặc kiềm mầm bệnh sẽ tồn tại lâu hơn và bệnh

Leptospira xảy ra trên người thường có tính chất nghề nghiệp, những công

nhân làm vệ sinh cống rãnh, người chăn nuôi, những người làm công tác địa chất, lâm nghiệp,…là những người thường mắc bệnh này (Levett, 2001).

2.3.2 Đường xâm nhập của mầm bệnh

Leptospira xâm nhập trực tiếp vào cơ thể qua vết cắt hoặc vết trầy xước

trên da hoặc qua da còn nguyên vẹn khi ngâm nhiều giờ trong nước hoặc qua

niêm mạc mắt, mũi, họng hay bộ phận sinh dục (Levett, 2001). Bệnh sẽ khởi

phát từ 1 đến 4 tuần sau khi tiếp xúc và có thể kéo dài nhiều tháng. Mức độ

biểu hiện lâm sàng của bệnh phụ thuộc vào loại serovar Leptospira nhiễm

cũng như tình trạng sức khỏe, miễn dịch và độ tuổi của vật nhiễm bệnh (Plank

and Dean, 2000).

Leptospira xâm nhập vào gia súc khỏe thông qua đường giao phối; nếu

con đực (hoặc cái) nhiễm Leptospira sẽ truyền trực tiếp mầm bệnh qua giao

phối. Gia súc mẹ bị nhiễm Leptospira sẽ truyền cho con qua nhau thai, qua sữa đầu làm cho con sơ sinh mắc bệnh (Nguyễn Thị Ngân, 2000).

Có rất nhiều loài động vật có vú là loài mang xoắn khuẩn Leptospira và

bài thải mầm bệnh liên tục ra môi trường bên ngoài thông qua nước tiểu trong

nhiều tháng hoặc nhiều năm thậm chí cả đời. Con người là vật chủ ngẫu nhiên của Leptospira spp. và khu trú ở ống thận của con người, có thể thải Leptospira ra môi trường qua nước tiểu trong nhiều tuần hay nhiều tháng

(Albert et al., 2009). Động vật hoặc người bị nhiễm có thể do tiếp xúc trực tiếp với nguồn bệnh như mô động vật, chất bài tiết cơ thể (đặc biệt là nước tiểu) hay tiếp xúc gián tiếp như đất hoặc nước bị ô nhiễm nước tiểu của động vật mang xoắn khuẩn Leptospira (Musso and Scola, 2013). Bên cạnh đó,

chuột là loài gặm nhấm thường nhiễm các serovar icterohaemorrhagiae và

ballum; bò sữa thường nhiễm serovar hardjo, pomona và gryppotyphosa; heo

có thể mang mầm bệnh pomona, tarassovi, hoặc bratislava; cừu có thể chứa

hardjo và pomona và chó có thể canicola (Bolin, 2000).

Nhiễm trùng Leptospira có thể xảy ra trên người thông qua mức độ tiếp

xúc nghề nghiệp, các khu giải trí hay những yếu tố phơi nhiễm, trong đó nghề nghiệp là yếu tố nguy cơ đáng kể cho con người. Ví dụ như những nghề tiếp xúc trực tiếp với động vật nhiễm bệnh: nông dân, bác sĩ thú y, công nhân lò mỏ hay tiếp xúc gián tiếp là những công nhân ống rãnh, thợ mỏ hay người

sống ở những khu vực có tình trạng vệ sinh kém có nguy cơ nhiễm Leptospira

hơn (Levett, 2001).

Bên cạnh đó, một rũi ro có thể xảy ra ở các khu giải trí ngoài trời như các

Hình 2.3 Sơ đồ lây truyền Leptospira ((https://www.microbiologybytes.wordpress.com)

môn thể thao dưới nước: bơi lội, chèo thuyền, câu cá,.. đặc biệt là các vùng nhiệt đới có bệnh Leptospirosis đang lưu hành (Levett, 2001; Lau et al., 2010).

2.3.3 Đặc tính gây bệnh của xoắn khuẩn Leptospira

Sau khi Leptospira xâm nhập vào cơ thể, 12 giờ có thể phát hiện một lượng lớn Leptospira trong gan, xoắn khuẩn tập trung ở đây cho đến lúc gia súc có triệu chứng sốt. Ngoài ra còn phát hiện Leptospira ở tuyến thượng thận

và cơ tim. Một, hai ngày sau khi cảm nhiễm con vật xuất hiện triệu chứng sốt cao do nhiễm trùng huyết, Leptospira có nhiều trong máu, dịch não tủy với số lượng lớn và có thể kéo dài đến 1 tuần. Sau khi nhiễm từ 5 đến 10 ngày, cơ thể

động vật bắt đầu sản sinh kháng thể (Andre´-Fontaine, 2006) và hàm lượng

kháng thể trong máu cao nhất sau 3 tuần (Levett, 2001).

Triệu chứng của bệnh còn phụ thuộc vào độc lực của serovar gây nhiễm, số lượng xoắn khuẩn, tuổi tác, sức khỏe và khả năng miễn dịch của con vật. Ở động vật, các dấu hiệu lâm sàng thường nhẹ hoặc không có biểu hiện triệu chứng. Tuy nhiên, một số trường hợp nhiễm trùng có thể xuất hiện các triệu

chứng lâm sàng từ nhẹ đến nặng, đặc biệt ở động vật non bệnh nặng hơn so

với các động vật lớn tuổi. Một số triệu chứng lâm sàng của bệnh Leptospirosis

thân nhiệt cao, lơ mơ, chán ăn, lông xù, viêm kết mạc mắt và đôi khi xuất hiện

tiêu chảy. Những trường hợp bệnh nặng có thể thấy dấu hiệu xuất huyết da, hemoglobin niệu và vàng da, sau khi khỏi bệnh con vật có thể sụt cân và suy

thận mãn (Sykes et al., 2011).

Các biểu hiện lâm sàng về bệnh Leptospirosis ở người có từ không triệu

chứng đến tử vong, với nhiều triệu chứng lâm sàng khác nhau (Levett, 2001).

Các triệu chứng chung khởi phát được ghi nhận bao gồm sốt, nhức đầu, đau

cơ, viêm kết mạc mắt, buồn nôn và phát ban nhẹ trong thời gian ngắn. Những

trường hợp bệnh nặng dẫn đến các biến chứng như suy thận, suy gan, xuất

huyết phổi, viêm màng não và viêm cơ tim (Bharti et al., 2003). Phần lớn các

trường hợp thường có các triệu chứng rất nhẹ và không phải điều trị (Plank

and Dean, 2000), đôi khi có triệu chứng lâm sàng giống triệu chứng của những

bệnh khác như sốt phát ban, bệnh cúm, nhiễm khuẩn Hantavirus (Levett,

2001). Do đó, bệnh thường bị chẩn đoán nhầm với các bệnh khác, gây khó khăn trong việc xác định bệnh do Leptospira gây ra.

2.4 Đặc điểm lâm sàng của bệnh Leptospirosis

Ở các loài gia súc khác nhau giai đoạn nung bệnh sẽ khác nhau, thường

giao động từ 2 đến 20 ngày. Triệu chứng bệnh cũng rất đa dạng và đặc trưng cho mỗi loài gia súc, điển hình ở thể bệnh cấp tính.

2.4.1 Bệnh Leptospirosis trên chó

Bệnh Leptospirosis trên chó có nhiều mức độ bệnh nghiêm trọng khác nhau, tùy thuộc vào chủng gây bệnh, vị trí địa lý và đáp ứng miễn dịch của vật chủ (Sykes et al., 2011). Thời gian nung bệnh từ 4-12 ngày, nhưng cũng có

thể ngắn khoảng 2 ngày (Andre´-Fontaine, 2013). Triệu chứng chung gồm

sốt, nôn mửa, lưng cong, bỏ ăn, lười vận động, đầu lưỡi bị loét và hoại tử

(hình 2.4) (Francey and Schweighauser, 2012).

Bệnh xảy ra trên chó ở mọi lứa tuổi, rất khó nhận biết triệu chứng ban

đầu vì không có các triệu chứng đặc trưng, rất dễ nhầm lẫn với dấu hiệu

của nhiều bệnh khác. Thậm chí vài trường hợp, lúc đầu chó cũng không hề có triệu chứng bệnh (Levett, 2001).

Thể cấp tính: hiện tượng bại huyết phát triển nhanh sau vài giờ nhiễm, cơn sốt cao 40-41°C và suy nhược nặng nề. Bệnh Leptospirosis trên chó có hai

dạng vàng da và không vàng da, hình thức vàng da được xem là nghiêm trọng

hơn và bệnh tiến triển nhanh hơn (Levett, 2001).

Thể không vàng da: bệnh xảy ra trên chó trưởng thành. Vật bệnh có biểu

hiện xuất huyết trầm trọng, viêm kết mạc mắt với những điểm xuất huyết ở niêm mạc và da, ói ra máu và phân sậm màu, do niêm mạc bị lở nên thú thở

ra mùi hôi, thú bị mất nước rất nhanh và chết trong 2-4 ngày khi thân nhiệt

Hình 2.4 Hoại tử đầu lưỡi với bệnh Leptospira cấp tính

(Francey and Schweighauser, 2012).

giảm thấp (36-36,5°C).

Thể hoàng đản: thường thấy ở chó con, một số trường hợp bệnh phát triển bất thình lình, phát triển từ từ cho đến khi vàng da, thân nhiệt lúc đầu 39,5°C-40°C, khi xuất hiện vàng da thì thân nhiệt giảm còn 36-36,5oC và mức độ vàng da thường tương ứng với mức độ nghiêm trọng của hoại tử gan, thông thường chó nhỏ hơn sáu tháng tuổi dễ bị suy gan hơn chó lớn (Langston and

Heuter, 2003). Nếu chó bệnh có biểu hiện viêm kết mạc mắt, hoàng đản (vàng da và niêm mạc), nước tiểu sậm màu, kém ăn, ói mửa, khó thở, hơi thở hôi và tiêu chảy thì chó có thể chết trong khoảng từ 5 đến 8 ngày mắc bệnh.

Thể bán cấp tính và mãn tính

Thể này tương ứng với sự phát triển hội chứng sinh urê huyết hậu quả

của viêm thận mà một trong những biểu hiện là chứng tiểu nhiều, khát nước rất nhiều cùng với ói mửa và tiêu chảy. Bệnh ở giai đoạn này sẽ gây ra những biến chứng về thận và gan, và sau đó xoắn khuẩn khu trú trên bề mặt của ống thận và thải Leptospira ra môi trường qua nước tiểu, con người hoặc các động

Hình 2.5 Vàng niêm mạc mắt ở chó bệnh Leptospira (Francey and Schweighauser, 2012)

Hình 2.6 Vàng niêm mạc miệng ở chó bệnh Leptospira (Francey and Schweighauser, 2012)

vật khác có thể nhiễm Leptospira (Medeiros et al., 2010).

Cơ chế sinh bệnh

Sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua nước tiểu hoặc gián tiếp từ

nước, đất bị ô nhiễm, xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh có thể lẫn tránh được khả năng phòng vệ của cơ thể vật chủ (Fraga et al., 2011), Leptospira có thể hiện diện trong máu đến 10 ngày sau khi nhiễm bệnh và phát triển nhanh chóng, hướng vào các cơ quan và mô và có thể tránh được phản ứng miễn dịch

của vật chủ (Albert et al., 2009). Sau giai đoạn ở trong máu, Leptospira đi

xuống ống thận và được bài thải qua nước tiểu, thời gian và cường độ bài thải

khác nhau ở mỗi chó và các serovar lây nhiễm. Nếu chó nhiễm serovar

canicola thường thải xoắn khuẩn trong nước tiểu kéo dài cho đến hai năm và nhiễm serovar khác thì thời gian ngắn hơn (Goldstein et al., 2006). Khi vào

máu Leptospira sản xuất nội độc tố lipopolysaccharide kích thích sự kết dính

của bạch cầu trung tính và kích hoạt tiểu cầu, những độc tố này gây viêm

mạch và tổn thương nội mô và kết quả làm tổn thương mạch, gây phù, xuất

huyết và rối loạn đông máu và gây suy thận. Khi mô thận sưng sẽ làm giảm sự

lưu thông của máu tại thận, giảm khả năng lọc của cầu thận, thiếu oxy huyết

và dẫn đến suy thận cấp (Langston and Heuter, 2003).

Các biểu hiện lâm sàng của chó nhiễm xoắn khuẩn Leptospira

Nhiễm trùng Leptospira không phải lúc nào cũng gây ra những dấu hiệu

lâm sàng. Nếu dấu hiệu lâm sàng này phát triển thành bệnh thì mức độ bệnh sẽ

thay đổi và mức độ bệnh thay đổi tùy thuộc vào một số yếu tố như tuổi, phản

ứng miễn dịch của vật chủ, các yếu tố môi trường và tính độc hại của các serovar lây nhiễm. Thông thường thời gian ủ bệnh khoảng từ 5 đến 15 ngày.

Trong giai đoạn cấp tính Leptospira hiện diện trong máu và có thể làm cho

chó chết đột ngột với các triệu chứng viêm màng phổi cấp tính như sốt, run,

yếu cơ, nôn mửa, mất nước (Langston and Heuter, 2003).

Dấu hiệu lâm sàng của bệnh Leptospirosis trên chó không đặc trưng một số chó có biểu hiện bệnh nhẹ và tự qua khỏi, một số chó phát triển bệnh nặng

hơn và tử vong do suy thận cấp (Levett, 2001). Khi chó bị suy thận cấp những triệu chứng có thể xảy ra nôn mửa, tiêu chảy, mất nước, lừ đừ, đa niệu hay thiểu niệu và những dấu hiệu lâm sàng có thể nghi ngờ bệnh Leptospirosis gây suy gan, vàng da, viêm kết mạc mắt, viêm màng bồ đào, thở nhanh hoặc khó

thở do hội chứng suy hô hấp cấp tính hoặc hội chứng xuất huyết phổi (Kohn et

al., 2010). Đôi khi có thể xảy ra máu khó đông do liên quan đến gan hoặc

viêm mạch máu ngoại biên và tràn dịch màng phổi, có thể do máu ứ lại trong

gan và gây hoại tử gan và cuối cùng phát triển thành viêm gan mãn tính. Một

số chó có thể xảy ra ho, khó thở và viêm kết mạc mắt và chứng đa niệu, thiểu

niệu hay khát nước nhiều, nước tiểu vàng sẫm có khi có máu do sự suy giảm chức năng thận, suy gan (Claus et al., 2008). Phần lớn các trường hợp bệnh Leptospirosis xảy ra trên chó ở mức độ nhẹ với các dấu hiệu như sốt, tiêu chảy và nôn mửa giống như triệu chứng chung của một số bệnh nhiễm trùng khác

nên thường ít được chú ý đến bệnh (Levett, 2001).

Những yếu tố rủi ro có liên quan đến chó nhiễm Leptospirosis: sau khi

Leptospira xâm nhiễm vào máu rồi khu trú ở ống thận và thải ra môi trường

ngoài qua nước tiểu. Động vật nhiễm bệnh là do tiếp xúc trực tiếp với nước tiểu bị ô nhiễm qua niêm mạc da bị trầy xước (Albert et al., 2009). Tỷ lệ chó

mắc bệnh Leptospirosis cao nhất là chó thả rong, chó sống gần các khu vực

nước thải sẽ có nguy cơ mắc bệnh Leptospirosis cao hơn và loài gặm nhấm

cũng có thể lây nhiễm cho những chó này (Meeyam et al., 2006), những chó

nhỏ tuổi ít có cơ hội tiếp xúc với môi trường bên ngoài hơn nên nguy cơ mắc

bệnh ít hơn và tỷ lệ mắc bệnh không phụ thuộc vào độ tuổi hay giống chó

(Adler et al., 2002).

Những serovar thường gây bệnh Leptospirosis ở chó là L. canicola và L.

icterohaemorrhagiae có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cộng đồng đang diễn ra

ở các nước đang phát triển và lây nhiễm cho con người trên toàn thế giới

(Brod et al., 2005; Maciel et al., 2008). Ngoài ra, trên chó còn nhiễm một số

serovar L. autumnalis (Saravanan et al., 1999), serovar L. pomona (Sonrier et al., 2001), serovar L. gryppotyphosa (Greenlee et al., 2004), serovar L.

bratislava (Greenlee et al., 2005).

Những bất thường về lâm sàng ở chó bệnh Leptospirosis: viêm thận kẽ

cấp tính và rối loạn chức năng ống thận, có thể gây viêm gan và hoại tử tế bào

gan (Albert et al., 2009). Xét nghiệm máu phát hiện những bất thường như

tăng bạch cầu trung tính, giảm tiểu cầu (chiếm 58%/tổng số chó nhiễm), tăng

nồng độ ure huyết thanh và creatinine (chiếm 80-90%/tổng số chó nhiễm),

tăng hoạt tính các enzym gan AST, ALT huyết thanh và nồng độ bilirubin

tổng số (Mastrorilli et al., 2007). Xét nghiệm nước tiểu có thể phát hiện

glucose niệu, protein niệu, bilirubin niệu và hồng cầu xuất hiện trong nước

tiểu (Goldstein et al., 2006).

2.4.2 Bệnh Leptospirosis trên người

Bệnh do Leptospira gây ra ở người nguy hiểm nhất là do các chủng

huyết thanh L. icterohaemorrhagiae và L. copenhageni nhưng cũng có chủng huyết thanh khác gây bệnh nặng như L. gryppotyphosa và L. p yrogenes có thể gây tử vong (Vũ Đình Hưng, 1995).

Thời gian ủ bệnh ở người từ 3 đến 21 ngày (thường từ 3-14 ngày). Bệnh

xảy ra với các triệu chứng rất đa dạng, tùy thuộc vào tuổi, sức đề kháng của

cơ thể, chủng vi khuẩn cũng như số lượng vi khuẩn xâm nhập. Người bệnh

thường có biểu hiện theo hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: sốt đột ngột (>39oC), kéo dài trong vài ba ngày; sau đó có các triệu chứng giống như bị cúm. Người bệnh mệt mỏi, đau đầu (>90% trường hợp), mắt có màu đỏ, đau cơ (đặc biệt cơ vùng lưng và bắp chân), buồn nôn, da nổi mần đỏ (30% trường hợp) giống như sốt xuất huyết (Zaki and

Shanbag, 2010). Người bệnh bị rối loạn tâm lý: chán nản, mệt mỏi hoặc trở

nên hung hãn, dễ bị kích thích, mắc chứng ảo giác, và bệnh kéo dài trong 3-5

ngày, người bệnh có thể dần dần hồi phục. Trong giai đoạn này xoắn khuẩn

nhân lên trong máu nên có thể sử dụng các xét nghiệm để phát hiện.

Giai đoạn 2: ở các trường hợp nhẹ, giai đoạn này không biểu hiện hoặc

kéo dài trong một thời gian ngắn rồi qua khỏi; ở một số trường hợp nặng, bệnh

tiến triển rất nhanh, người bệnh bị sốt trở lại, đau vùng bụng và đau ngực, rối

loạn hệ tiết niệu và rối loạn tâm lý; có các triệu chứng của viêm màng não như

cứng cổ, nôn mửa; đau họng, ho khan và ho ra máu. Nếu điều trị có thể khỏi

sau vài tuần; ở trường hợp nặng, các cơ quan bị tổn thương và xuất huyết và

trong giai đoạn này xoắn khuẩn hiện diện trong nước tiểu nên có thể sử dụng

kỹ thuật sinh học phân tử để xét nghiệm (Chu et al., 1998).

Hội chứng Weil: là bệnh có biểu hiện lâm sàng nặng nhất của bệnh nhiễm Leptospira, có thể xảy ra sau giai đoạn cấp của bệnh đặc trưng bởi tổn thương gan và thận. Nhiều trường hợp nặng bệnh tiến triển rất nhanh, sốt cao trên 40°C và khởi phát nhanh các biểu hiện suy gan và vàng da, suy thận, viêm phổi xuất huyết, loạn nhịp tim hay trụy tim mạch. Tỷ lệ chết ở những người bệnh nặng khoảng 5-40% và một số huyết thanh thuộc serogroup L.

icterohaemorrhagiae liên quan đến vàng da, tăng bilirubin và suy thận và gây bệnh nặng trên người (Katz et al., 2001).

Hình 2.7 Hiện tượng vàng da ở người bệnh Leptospira (Adler, 2015)

2.5 Tình hình nghiên cứu Leptospirosis trên thế giới

Tại Hoa Kỳ, số ca bệnh Leptospirosis trên chó đã tăng lên từ những năm

1990, chủ yếu là serovar gryppotyphosa. Đến năm 2002, serovar gây bệnh chủ yếu là serovar gryppotyphosa và pomona. Năm 2003 là serovar bratislava và

pomona. Hiện nay, vaccine ở Hoa Kỳ phòng Leptospirosis chứa 4 serovar là

L. canicola, L. gryppotyphosa, L. icterohemorrhagiae và L. pomona

(Greenlee, 2003; Ward et al., 2004).

Trong năm 2007 và 2008, Barmettler et al. (2011) thực hiện cuộc khảo

sát huyết thanh học cắt ngang đối với đội ngũ nhân viên thú y và chủ nuôi chó

có tiếp xúc với chó bệnh Leptospirosis cấp tính, tổng số người tham gia trong

khảo sát gồm bác sĩ thú y, nhân viên kỹ thuật, nhân viên hành chính và chủ

nuôi chó có tiếp xúc với chó bệnh Leptospirosis vào bệnh xá thú y Đại học

Bern Vetsuisse (Thụy Sĩ). Kết quả chó bị nhiễm bệnh Leptospirosis có huyết

thanh dương tính với kháng thể kháng Leptospira serovar bratislava, australis,

gryppotyphosa và tất cả nhân viên và chủ nuôi chó đều âm tính với kháng thể

kháng Leptospira.

Bệnh Leptospirosis trên chó có thể truyền lây cho con người và tỷ lệ bệnh sẽ khác nhau tùy theo vị trí địa lý. Ở các nước đang phát triển, chó nuôi thả rong và loài gặm nhấm (chuột) là yếu tố nguy cơ lớn nhất (Brod et al., 2005; Strugnell et al., 2009). Ở các nước phát triển, hầu hết các trường hợp bệnh Leptospirosis xảy ra trên người có liên quan đến các hoạt động giải trí (Maciel et al., 2008; Reis et al., 2008). Ngoài ra, bệnh có liên quan đến tính chất nghề nghiệp, khoảng 10% bệnh Leptospirosis xảy ra trên người là do tiếp xúc với vật nuôi (Benschop et al., 2009).

Năm 2011, tại bang Minas của Brazil có xảy ra một trận lụt, đã làm gia

tăng tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó, đặc biệt là các khu vực bãi rác có chứa

nhiều rác thải làm lây làm mầm bệnh rất nhanh chủ yếu các serogroup L. autumnalis, L. tarassovi và L. canicola. Tác giả cho rằng tỷ lệ dương tính với xoắn khuẩn Leptospira trên chó ở khu vực này cao nhưng không biểu hiện triệu chứng lâm sàng (Castro et al., 2011). Ngoài ra, những loài động vật được

nuôi trong cùng một khu vực cũng có thể lây truyền Leptospira spp. cho nhau

(Jorge et al., 2011).

Việc nuôi chó bằng hình thức thả rong cũng là yếu tố nguy cơ lây truyền

Leptospira cho con người và làm ô nhiễm môi trường sống hơn những chó nuôi nhốt (Fonzar and Langoni, 2012; Márcia et al., 2013; Martins và

Lilenbaum, 2013) và những chó khỏe mạnh chưa tiêm phòng Leptospirosis

cũng có thể nhiễm xoắn khuẩn Leptospira với các serogroups phổ biến L.

canicola và L. icterohaemorrhagiae (Lavinsky et al., 2012). Ở Tây Ban Nha,

Tuemmers et al. (2013) và ở Mexico (Blum et al., 2013) chó nuôi thả rong có

tỷ lệ nhiễm Leptospira cao hơn chó nuôi nhốt với hai serogroup phổ biến L.

canicola và L. icterohaemorrhagiae. Những chó có biểu hiện nghi ngờ nhiễm

xoắn khuẩn Leptospira sẽ có tỷ lệ nhiễm Leptospira cao hơn những chó nuôi

thả rong khi chưa thể hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Leptospirosis

(Suepaul et al., 2014; Ayral et al., 2014).

Ngoài phương pháp khảo sát huyết thanh học để phát hiện kháng thể

kháng Leptospira còn có phương pháp nuôi cấy và phát hiện xoắn khuẩn Leptospira bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Julio et al. (2004) thu thập 14 mẫu

nước tiểu chó tại phòng khám thú y của Brazil và quan sát dưới kính hiển vi tụ

quang nền đen có sự hiện diện xoắn khuẩn Leptospira trong nước tiểu, sau đó

các mẫu nước tiểu này được nuôi cấy trong môi trường EMJH và kết quả phát hiện được 11 mẫu có xoắn khuẩn Leptospira phát triển, chiếm tỷ lệ 78,57%. Một nghiên cứu khác ở Brazil, Oliveira et al. (2012) đã khảo sát 253 chó bằng

kỹ thuật PCR để phát hiện xoắn khuẩn Leptospira hiện diện trong nước tiểu tại 3 địa điểm: bệnh viện thú y, sở thú và chó nuôi trong khu phố có người bị bệnh Leptospirosis. Kết quả khảo sát cho thấy trong nước tiểu chó có sự hiện L. canicola, L. icterohaemorrhagiae và L. copenhageni, hay khảo sát của

Calderón et al. (2014) đã ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện được 2 serovar từ

nước tiểu chó.

Để so sánh sự khác nhau về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó giữa khu vực

thành thị và khu vực nông thôn, Dhliwayo et al. (2012) đã khảo sát 250 mẫu

huyết thanh chó và kết quả xét nghiệm cho thấy những chó sống ở khu vực thành thị có tỷ lệ nhiễm Leptospira cao hơn chó sống ở khu vực nông thôn, tuy nhiên tỷ lệ nhiễm này không có sự khác biệt theo giới tính. Khi xét nghiệm các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu cho thấy những chó dương tính

với Leptospira và có xuất hiện triệu chứng bệnh Leptospirosis đều suy gan và

thận, giảm tiểu cầu, rối loạn đông máu, protein niệu hay glucose niệu

(Tangeman and Littman, 2013). Ở Chile, Thomé et al. (2014) và Maud et al.

(2015) khảo sát chó nuôi ở các khu vực khác nhau và kết quả chó nuôi ở thành thị có tỷ lệ nhiễm Leptospira cao nhất kế đến là chó nuôi khu vực nông thôn

và chó nuôi trang trại, trong đó chủ yếu là nhóm huyết thanh L. interrogans

(serovar icterohaemorrhagiae và copenhageni), L. pomona và L.

gryppotyphosa. Như vậy chó ở thành thị có tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn cao hơn so

với chó nuôi ở khu vực nông thôn có thể là do mật độ nuôi chó cao hơn, nhiều

loài động vật gặm nhấm hơn, làm tăng nguy cơ tiếp xúc giữa chó với các loài

gặm nhấm này. Hơn nữa, những chó sống vùng ven đô thị, nơi các điều kiện

vệ sinh kém, hỗn hợp rác thải sinh học, hệ thống cống rãnh và gần gũi với các

loài động vật khác tạo thành một quần thể đặc biệt có nguy cơ lây truyền bệnh

Leptospirosis cho con người.

Bên cạnh việc khảo sát tỷ lệ dương tính xoắn khuẩn Leptospira trên chó,

một số tác giả còn khảo sát đồng thời tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira trên loài gặm nhấm (chuột) để biết được vai trò của chuột đối với sự lưu hành của

xoắn khuẩn Leptospira trên chó. Trong tất cả các loài gặm nhấm thì chuột là

loài mang xoắn khuẩn Leptospira với tỷ lệ rất cao, đặc biệt là chuột cống như

khảo sát Claudia et al. (2013) có 20,3% mẫu huyết thanh chuột dương tính với Leptospira hay khảo sát của Roqueplo et al. (2013) có 100%, Desvars et al. (2013) có 80% chuột có kháng thể kháng Leptospira, với các serogroups chủ

yếu là L. icterohaemorrhagiae, L. australis và L. canicola.

Năm 2010, Roach et al. đã khảo sát tỷ lệ nhiễm Leptospira của những chó sống chủ yếu ở các vùng ven biển của Nam Phi, và serovar xuất hiện nhất là canicola và pyrogenes. Hiện nay các loại vaccine ở Nam Phi chứa serovar

canicola, icterohaemorrhagiae, pomona và gryppotyphosa. Tuy nhiên, sự hiện

diện của serovar pyrogenes trong vài con chó, có thể mở cuộc điều tra rộng

hơn để có thể đưa serovar pyrogenes vào trong vaccine phòng bệnh

Leptospirosis cho chó ở Nam Phi. Theo khảo sát của Benkirane et al. (2014),

ở khu vực Rabat-Temara, Sidi Kacem và Oulmes, nhóm huyết thanh phổ biến

nhất trên chó là australis, ballum và canicola.

Để biết được sự lưu hành Leptospira có khác nhau giữa các giống chó và độ tuổi hay không, tác giả Harland et al. (2013) đã khảo sát tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó ở phía Bắc và phía Nam của New Zealand và tác giả

Anabel et al. (2013) khảo sát ở Mexico cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ

nhiễm Leptospira giữa các giống chó, và tuổi nhiễm Leptospira cao nhất từ 6

đến 10 năm tuổi, kế đến từ 1 đến 5 năm tuổi và thấp nhất là nhóm chó < 1 năm

tuổi nhưng khác biệt không ý nghĩa thống kê (Mayer-Scholl et al., 2013).

Ở Nhật, Koizumi et al. (2013) thực hiện cuộc khảo sát 283 mẫu huyết

thanh chó nghi ngờ bệnh Leptospirosis được thu thập từ 2007 đến tháng 3 năm

2011, kết quả chó cái nhiễm Leptospira cao hơn chó đực với nhóm huyết

thanh chủ yếu là hebdomadis, tiếp theo là australis và autumnalis. Ngày xưa

nhóm huyết thanh L. canicola và L. icterohaemorrhagiae được xem là serovar

gây bệnh chủ yếu trên chó, nhưng ngày nay L. hebdomadis đã trở thành

serovar chủ yếu gây tử vong cao trên chó ở Nhật Bản.

Tình hình nhiễm Leptospira trên người: nghiên cứu bệnh Leptospirosis

trên người của Laras et al. (2002), ở các thành phố thuộc khu vực Đông Nam

Á, bao gồm Indonesia, Lào, Irian, Campuchia và Việt Nam. Chủng huyết

thanh chiếm ưu thế là L. hurstbridge, L. bataviae và L. icterohaemorrhagiae. Sau

đó năm 2003, Karande et al. đã xác định trẻ lớn hơn 5 năm tuổi ở Mumbai có tỷ lệ nhiễm Leptospira cao hơn trẻ từ 1 đến 5 năm tuổi.

2.6 Tình hình nghiên cứu Leptospirosis trên gia súc và người ở Việt

Nam

Ở Việt Nam, năm 1934 Vaucel là người đầu tiên phát hiện bệnh

Leptospirosis với triệu chứng của bệnh Weil’s và đến năm 1937 ông đã phát hiện được mầm bệnh từ nhiều ổ dịch được phát hiện ở Hà Nội, Hải Phòng,

Phú Thọ và Tuyên Quang. Đến năm 1953, Viện Pasteur Sài Gòn xét nghiệm và thu được kết quả 30/30 mẫu huyết thanh trâu dương tính với các serovar L. mitis, L. pomona, L. canicola, 29/39 mẫu huyết thanh chó dương tính chủ yếu

với L. bataviae, L. canicol và L. pomona. Đến năm 1965, Đào Trọng Đạt và

ctv. tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó ở một số địa phương phía Bắc là 25%

(trích Lê Huỳnh Thanh Phương, 2001).

Lê Thanh Hải (1988), nghiên cứu về tình hình nhiễm Leptospira ở đàn

chó nghiệp vụ trong các trại giam ở Hải Phòng, kết quả cho thấy đàn chó ở trại V21 có tỷ lệ dương tính với Leptospira cao hơn trại T24 và chó nghiệp vụ của công an Hải Phòng cũng dương tính với Leptospira và chủ yếu là chó đực trên 1 tuổi (trích Lê Huỳnh Thanh Phương, 2001).

Theo Vũ Đạt và Lê Huỳnh Thanh Phương (1999), chó ở các địa phương

vùng phụ cận Hà Nội cũng dương tính Leptospira và các serovar nhiễm chủ

yếu là L. bataviae, L. canicola, L. gryppotyphosa và L. icterohaemorrhagiae.

Giống chó ngoại có tỷ lệ nhiễm Leptospira cao hơn giống chó Việt Nam (chó

nội) và chó đực có nhiễm cao hơn chó cái. Đến năm 2001, Lê Huỳnh Thanh Phương đã nghiên cứu tình hình nhiễm Leptospira trên chó ở một số địa

phương phía Bắc Việt Nam, cho thấy chó nuôi ở vùng chiêm trũng (Nam Định

và Hải Dương) có tỷ lệ nhiễm cao nhất so với vùng trung du và miền núi (Hà

Tây, Phú Thọ và Vĩnh Phúc) và thành phố và phụ cận (Hà Nội và Hải Phòng).

Các serogroup chiếm chủ yếu là L. canicola, L. bataviae, L. gryppotyphosa và

L. icterohaemorrhagiae.

Sau đó Hoàng Mạnh Lâm (2002), khảo sát ở khu vực Tây Nguyên

(ĐakLak), xác định chuột nhiễm Leptospira cao nhất kế đến chó và người.

Với 4 serovar mới công bố lần đầu ở Việt Nam trên chuột là L. cellendoni, L.

panama, L. sejroe và L. semaranga. Ở chó có 3 serovar mới phát hiện là L.

pyrogenes, L. mini và L. javanica và trên người với 4 serovar mới phát hiện

là L. panama, L. sejroe, L. tarassovi và L. semaranga.

Wagenaar et al. (2004) nghiên cứu sự hiện diện của kháng thể IgM chống

lại Leptospira trên người ở tỉnh Bình Thuận, là một tỉnh nằm ở phía nam của Việt Nam có nhiều điều kiện thuận lợi cho Leptospira bùng phát. Kết quả có 35% mẫu huyết thanh của những người khỏe mạnh và 40% mẫu huyết thanh

của những người bị sốt đã có sự hiện diện của kháng thể IgM chống Leptospira.

Ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long, Lý Thị Liên Khai (2012), điều tra về tình hình nhiễm khuẩn Leptospira trên đàn bò sữa, trên chó và trên chuột tại Công ty cổ phần thủy sản sông Hậu Cần Thơ, kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm

Leptospira trên chuột cao nhất, kế đến là chó và đàn bò sữa là thấp nhất. Tỷ lệ

nhiễm này không phụ thuộc vào lứa tuổi và giới tính, với 6 serogroup phổ biến

L. bataviae, L. ballum, L. pyrogenes, L. icterohaemorrhagiae, L. sejroe và L.

tarassovi. Chuột có thể là nguồn làm lây nhiễm Leptospira cho bò và chó 23

trong trại bò sữa với hệ số tương quan rất chặt chẽ.

Hoàng Kim Loan et al. (2013) điều tra tình hình nhiễm Leptospira trên

người từ 2004 đến 2013 và trên động vật gặm nhấm từ 2005 đến 2013 ở Miền Nam Việt Nam. Dựa trên sự chỉ định của bác sĩ lâm sàng, kết quả có 4,4% người dương tính với Leptospira với các serogroup chiếm tỷ lệ nhiễm cao là L. bataviae, L. hurstbridge, L. canicola, L. cynopterie và L. gryppotyphosa và

động vật gặm nhấm là 7,14% với các serogroup: L. bataviae, L. hurstbridge,

L. pantoc và L. javanica.

Năm 2014, ở huyện Châu Thành A, tỉnh Hậu Giang có một trường hợp

dương tính với Leptospira, với những triệu chứng ban đầu lúc nhập viện vàng da toàn thân, vàng mắt, lừ đừ, đau cơ và phù hai chi dưới. Hai ngày trước khi

nhập viện, bệnh nhân có triệu chứng sốt nhẹ, ăn uống kém, nôn ói và tiêu

chảy. Đây là trường hợp đầu tiên ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long, con

người nhiễm Leptospira, nguyên nhân có thể từ nước tiểu chuột. Do đây là nơi

thường xuyên bị ngập nước và người dân có thói quen đi chân đất nên dễ có

nguy cơ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira từ môi trường ẩm ướt hay tiếp xúc gần

với súc vật như heo, chuột (https://tuoitre.vn/nhiem-xoan-khuan-Leptospira-

tu-nuoc-tieu-chuot-644155.htm).

Tóm lại, ở Việt Nam bệnh Leptospirosis trên chó rất ít được nghiên cứu

và chẩn đoán chính xác do bệnh không có triệu chứng đặc trưng, đặc biệt bệnh

lây truyền cho người cho nên khi bệnh cần phải được quan tâm và còn nhiều

vấn đề chưa được giải quyết như: (1) tình hình nhiễm Leptospira trên chó và chuột, (2) phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu và (3) những biến đổi

bệnh lý trên chó bệnh Leptospirosis. Nghiên cứu này sẽ góp phần giải quyết

các câu hỏi trên, tập trung chủ yếu ở thành phố Cần Thơ và một số tỉnh của

Đồng Bằng Sông Cửu Long.

2.7 Một số phương pháp chẩn đoán Leptospira

Leptospirosis là bệnh có nhiều triệu chứng lâm sàng và giống như bệnh “cảm cúm", ở người bệnh Leptospirosis ít khi được chẩn đoán phân biệt trước khi điều trị hoặc chẩn đoán nhầm với các bệnh khác như hội chứng sốt của một số bệnh như viêm màng não, bệnh cúm, bệnh gan, bệnh do Hantavirus (Plank and Dean, 2000; Levett, 2001). Ở gia súc, hầu hết các trường hợp đều

khó chẩn đoán nếu chỉ dựa vào các dấu hiệu lâm sàng, do các triệu chứng của bệnh Leptospirosis biểu hiện đặc trưng không rõ ràng (Adler et al., 2010). Do đó, để chẩn đoán được bệnh Leptospirosis ở cả người và động vật phải được

thực hiện trong các phòng thí nghiệm (O'Keefe, 2002).

2.7.1 Phương pháp kiểm tra xoắn khuẩn Leptospira bằng kính hiển

vi nền đen

Dựa theo tài liệu của WHO (2003), việc kiểm tra xoắn khuẩn Leptospira bằng kính hiển vi nền đen có một số ưu và nhược điểm, nhưng rất cần thiết

trong quá trình quan sát.

Ư điểm: khi quan sát dưới kính hiển vi nền đen xoắn khuẩn Leptospira di

chuyển rất nhanh, và hữu ích quan sát khi nuôi cấy Leptospira hay trong phản

ứng MAT.

Nhược điểm: đòi hỏi phải có kinh nghiệm và kỹ thuật xem kính hiển vi

nền đen. Đặc biệt khi số lượng xoắn khuẩn Leptospira trong mẫu ít.

Cách lấy bệnh phẩm: tùy theo thời gian và thể bệnh, có thể lấy các bệnh

phẩm khác nhau: khi con bệnh còn sống: tốt nhất lấy máu trong những ngày

đầu của thời kỳ sốt hoặc lấy nước tiểu lúc 10 ngày sau khi hết sốt. Nếu con bệnh chết nên lấy mẫu gan, thận, lách, nước tiểu.

Kiểm tra xoắn khuẩn bằng kính hiển vi nền đen: các chất dịch cơ thể như

máu, nước tiểu, dịch não tủy có thể được sử dụng để phát hiện nhanh sự hiện

diện của Leptospira.

Phương pháp xem tươi: lấy máu gia súc mới sốt, trộn với citrat natri 5%,

để lắng rồi hút lớp dịch trên nhỏ lên phiến kính và soi bằng kính hiển vi nền

đen để tìm Leptospira.

Nếu bệnh phẩm là nước tiểu, cần đem ly tâm hoặc để lắng rồi lấy cặn

phía dưới đáy phết lên kính soi trên kính hiển vi tụ quang nền đen để tìm

Leptospira phải xem ngay không để quá 12 giờ (Levett, 2001).

Trong điều kiện phòng thí nghiệm bị hạn chế, thiếu các thiết bị hiện đại

thì có thể sử dụng kính hiển vi nền đen để phát hiện kháng nguyên Leptospira (O'Keefe, 2002). Tuy nhiên, phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp (Levett, 2001). Điều kiện mẫu phải được lấy vô trùng và gửi đến phòng thí nghiệm không được chậm trễ, đòi hỏi nhân viên có trình độ chuyên môn và kỹ năng cao và phương pháp này không phân biệt về sự lây nhiễm serovar (Bharti et al., 2003).

2.7.2 Phương pháp nuôi cấy Leptospira

Việc phát hiện Leptospira bằng cách nuôi cấy được coi là phương pháp chẩn đoán chính xác bệnh Leptospirosis (Adler and Moctezuma, 2010). Trong

tuần đầu tiên của bệnh, Leptospira có thể được phát hiện từ máu, dịch não tủy

(Ahmad et al., 2005). Sang tuần thứ hai, Leptospira có thể được phát hiện

trong nước tiểu và tỷ lệ thành công cao nhất từ 14 đến 28 ngày sau khi nhiễm bệnh (Bharti et al., 2003).

Những bệnh phẩm phải được xử lý sơ bộ như phương pháp xem kính, ly tâm nước tiểu và lấy phần dưới đáy của ống nghiệm và đem cấy vào môi

trường chuyên biệt dùng nuôi cấy Leptospira là môi trường Ellinghausen-

McCulloughJohnson-Harris (EMJH). Môi trường cần được bổ sung kháng

sinh 5- fluorouracil, hoặc gentamicin hoặc rifampicin để ức chế sự vấy nhiễm của vi khuẩn khác (Levett, 2001). Để ở nhiệt độ 28-30oC, pH tối ưu cho Leptospira là 6,8-7,4, sau 5-7 ngày lấy canh khuẩn làm tiêu bản đem soi dưới

kính hiển vi tụ quang nền đen để theo dõi hiện tượng xoắn khuẩn mọc hoặc

quan sát sự thay đổi độ đục của môi trường nuôi cấy và theo dõi đến 13 tuần

(Levett, 2001; Bharti et al., 2003).

Do nước tiểu của người và nước tiểu của động vật có tính acid nên sau

khi lấy phải ly tâm ngay hay pha loãng với dung dịch đệm để trung hòa pH

nếu chưa xử lý mẫu kịp thời (Levett, 2001). Đối với các trường hợp con vật

chết do bệnh Leptospirosis, việc nuôi cấy Leptospira có thể được thực hiện từ

các mẫu mô như gan, thận và não, không nên đông lạnh mẫu trước khi nuôi

cấy (Bharti et al., 2003). Do đó, phương pháp này chỉ thích hợp cho chẩn đoán

hồi cứu để xác định bệnh mà không đóng góp vào việc quản lý dịch bệnh

(Levett, 2001). Nếu có sử dụng kháng sinh trước khi lấy mẫu thì Leptospira bị loại ra khỏi máu và không hiện diện trong nước tiểu (Picardeau, 2013) làm cho

nuôi cấy không thành công. Mặc dù nuôi cấy rất khó khăn, tốn thời gian và tỷ

lệ thành công thấp nhưng các chủng phát hiện được từ nuôi cấy có thể xác

định chính xác tới mức serovar và góp phần vào nghiên cứu dịch tễ học (Wuthiekanun et al., 2007).

2.7.3 Chẩn đoán huyết thanh học

Đây là phương pháp có ý nghĩa trong điều tra cơ bản, trong nghiên cứu dịch tễ học và trong thực tiễn sản xuất, nó không những cho kết quả nhanh chính xác mà còn xác định được serovar gây bệnh. Trong chẩn đoán huyết thanh học, kháng nguyên chuẩn được sử dụng để phát hiện kháng thể nghi

ngờ: sau khi nhiễm bệnh khoảng 1 tuần, kháng thể xuất hiện trong máu và

hàm lượng kháng thể đạt mức cao nhất đến tuần thứ 3 rồi sau đó giảm dần.

Ngoài ra cũng có thể dùng kháng thể đã biết để phát hiện kháng nguyên nghi

ngờ, thông thường người ta sử dụng kháng nguyên là các serovar đã biết để

phát hiện kháng thể nghi ngờ (Toyokawa et al., 2011).

2.7.3.1 Phản ứng vi ngưng kết (Microscopic Agglutination Test:

MAT)

MAT là phương pháp có thể áp dụng cho chẩn đoán huyết thanh học của bệnh Leptospirosis đối với cả người và động vật hiện nay (Picardeau, 2013).

Khoảng 7 đến 10 ngày sau khi nhiễm bệnh, kháng thể có thể được phát hiện

bởi phản ứng MAT. Đối với người và động vật, tiêu chuẩn để xác định các

trường hợp lâm sàng bệnh Leptospirosis bởi MAT là chuyển đổi huyết thanh

giữa hai lần kiểm tra. Nếu huyết thanh được kiểm tra lần đầu khi xuất hiện các triệu chứng bệnh Leptospirosis rõ ràng thì 3 đến 5 ngày sau kháng thể tăng rất

cao, tuy nhiên thông thường là 2 đến 3 tuần vì không biết chính xác ngày bắt

đầu bệnh (Levett, 2001).

Nguyên lý MAT: khi trộn huyết thanh của động vật nghi nhiễm bệnh với

canh khuẩn Leptospira, nếu trong huyết thanh có kháng thể kháng Leptospira

sẽ ngưng kết thành cụm như hình sao, hình nhện hay cụm nhỏ. Mẫu kháng

huyết thanh nào cho phản ứng ngưng kết mạnh nhất thì chủng xoắn khuẩn

này thuộc vào nhóm đó. Còn mẫu kháng huyết thanh nào mà cũng cho phản

ứng ngưng kết nhưng yếu hơn thì đó chỉ là hiện tượng ngưng kết chéo giữa

chủng này với kháng huyết thanh chuẩn của các chủng khác (Tiêu chuẩn Việt

Nam, 2011).

2.7.3.2 Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbert Assay)

Đây là một phương pháp cho kết quả nhanh chóng và an toàn mà không

cần đến nuôi cấy (Bharti et al., 2003). ELISA là phản ứng miễn dịch để phát

hiện kháng thể kháng Leptospira, dùng kháng nguyên biết trước (có thể dùng

kháng nguyên chết để làm giảm nguy cơ lây nhiễm cho người) để tìm kháng

thể và thường được sử dụng thay thế cho phương pháp MAT (Aslantaş, 2005). Kháng nguyên đã biết là serovar Leptospira phổ biến gây bệnh cho gia súc và

người. Đây là phản ứng có độ chính xác cao, có ý nghĩa trong nghiên cứu dịch tễ học và chẩn đoán bệnh.

Ưu điểm của phương pháp ELISA có thể phát hiện bệnh rất sớm vì

kháng thể IgM có thể phát hiện được rất sớm, từ ngày thứ 2 của bệnh, kháng

thể IgM tăng dần đến tuần thứ hai, thứ ba sau đó giảm dần, và kháng thể IgG

phát hiện muộn hơn thường vào ngày thứ 7 sau khi nhiễm bệnh và kháng thể

Hình 2.8 Đáp ứng kháng thể kháng Leptospira trong máu (Picardeau, 2013)

IgG tồn tại lâu hơn (O'Keefe, 2002).

Như vậy độ nhạy của xét nghiệm ELISA nhạy hơn so với MAT và sử dụng để phát hiện nhiễm trùng cấp tính trên người và động vật, có ý nghĩa rất lớn đối với việc quản lý bệnh bởi vì phát hiện bệnh sớm và dùng kháng sinh

điều trị sớm, rút ngắn thời gian bệnh và hạn chế thải Leptospira ra môi trường

ngoài qua nước tiểu (Katz et al., 2001; Bharti et al., 2003).

2.7.3.3 Chẩn đoán bằng kỹ thuật gene (Polymerase Chain Reaction:

PCR)

Việc áp dụng kỹ thuật gene vào chẩn đoán phát hiện DNA của

Leptospira từ những năm 1990 (Adler and Moctezuma, 2010). Xét nghiệm

dựa trên các primer đặc hiệu để khuếch đại một đoạn DNA của các chủng

Leptospira gây bệnh. Gravekamp et al. (1993) sử dụng hai cặp mồi G1/G2 và

B64-I/B64-II phát hiện được 7 loài Leptospira gây bệnh. Việc áp dụng hai cặp

mồi này phát hiện được Leptospira spp. hiện diện trong huyết thanh, trong

nước tiểu, trong dịch âm đạo.

So với nuôi cấy thì kỹ thuật PCR dùng phát hiện Leptospira spp. trên

người và động vật có độ nhạy cao, có thể phát hiện được cả vi khuẩn sống và vi khuẩn chết (O'Keefe, 2002), thường thời gian xét nghiệm ngắn hơn (5 giờ) giúp phát hiện bệnh nhanh hơn, trong khi nuôi cấy đòi hỏi phải đủ số lượng vi khuẩn còn sống và thời gian nuôi cấy rất dài (Ooteman et al., 2006).

Ưu điểm của kỹ thuật PCR là phát hiện được DNA Leptospira trong trong máu sớm nhất là 2 ngày sau khi nhiễm bệnh, cho kết quả chính xác nhất,

có khả năng chẩn đoán sớm bệnh Leptospirosis (trước khi kháng thể kháng Leptospira xuất hiện trong máu), thích hợp cho chẩn đoán bệnh ở giai đoạn cấp tính và phát hiện được xoắn khuẩn Leptospira trong nước tiểu ở tuần thứ

hai của bệnh và đây là một tiện ích của PCR để chẩn đoán Leptospira trong

nước tiểu (Bal et al., 1994).

Đối với động vật nói chung, PCR có nhiều lợi thế hơn các xét nghiệm huyết thanh học (MAT, ELISA), biết được tình trạng nhiễm trùng của con vật, có giá trị ứng dụng trong lâm sàng và trong nghiên cứu (Rojas et al., 2010).

Như vậy, có rất nhiểu xét nghiệm để chẩn đoán xoắn khuẩn Leptospira

spp. trên người và động vật nhưng không có phương pháp nào thỏa mãn được

cho tất cả các mục đích. Vì vậy khi xét nghiệm cần lựa chọn phương pháp phù

hợp với mục đích thí nghiệm và loại mẫu vật sẵn có.

2.8 Các biện pháp phòng và trị Leptospirosis

Để phòng trị bệnh hiệu quả cần nghiên cứu kỹ sinh thái loài mang trùng

và phương thức lây lan. Đặc biệt, mầm bệnh được dự trữ ở chuột, vì vậy việc

thanh toán bệnh rất khó. Song nếu chúng ta có biện pháp phòng, cụ thể là ngăn

chặn, cắt đứt khâu truyền lây sẽ hạn chế được thiệt hại.

2.8.1 Các biện pháp phòng

Leptospirosis là một bệnh có thể lây truyền từ động vật sang người, khi

động vật nhiễm bệnh thì phải được xử lý cẩn thận vì bệnh có thể lây lan qua

tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với nước tiểu của chó. Chó nghi ngờ bệnh,

hoặc được chẩn đoán là bệnh Leptospirosis thì phải chăm sóc tích cực và giám

sát thường xuyên vì bệnh có thể lây lan cho các động vật khác và cho con

người. Chuột là vật mang Leptospira nên thường xuyên tiêu diệt chuột để

tránh phát tán mầm bệnh.

Phòng bệnh bằng vaccine

Trước năm 1960, vaccine phòng bệnh Leptospirosis gồm 2 serovar Leptospira (serovar canicola và serovar icterohaemorrhagiae) được sử dụng rộng rãi trên thế giới trong nhiều năm qua và hiện nay vaccine phòng Leptospirosis chứa 4 serovar Leptospira: canicola, icterohaemorrhagiae, pomona và gryppotyphosa hay canicola, icterohaemorrhagiae, gryppotyphosa

và bratislava đã có mặt tại một số nước ở châu Âu. Liệu trình tiêm chủng 2 lần cách nhau 3-4 tuần và chủng ngừa nhắc lại hàng năm (Klaasen et al.,

2003).

Ở Việt Nam, trên thị trường có rất nhiều loại vaccine dùng để phòng

bệnh xoắn khuẩn Leptospira cho chó.

- Nobivac Lepto (Intervet): phòng bệnh xoắn khuẩn trên chó gồm serovar

L. canicola và L. icterohaemorrhagiae.

- Nobivac RL (Intervet): phòng bệnh dại, bệnh do xoắn khuẩn ở chó gồm

2 serovar L. canicola và L. icterohaemorrhagiae.

- Vanguard Plus 5/L (Pfizer): phòng bệnh Caré, bệnh ho do para-

influenza, bệnh viêm ruột do Parvovirus, bệnh hô hấp type 2, bệnh do xoắn

khuẩn Leptospira ở chó (gồm serovar L. canicola và L. icterohaemorrhagiae).

- Vanguard Plus 5/CV-L (Pfizer): phòng bệnh Caré, bệnh ho do para- influenza, bệnh viêm ruột do Parvovirus, viêm ruột do Coronavirus, bệnh hô

hấp type 2, bệnh do xoắn khuẩn ở chó (gồm serovar L. canicola và L.

icterohaemorrhagiae).

- Tetradog (Merial): phòng bệnh Caré, bệnh do Adenovirus, bệnh viêm

ruột do Parvovirus, bệnh do xoắn khuẩn gồm 2 serovar L. canicola, L.

icterohaemorrhagiae.

- Hexadog (Merial): phòng bệnh Caré, bệnh do Adenovirus, bệnh viêm

ruột do Parvovirus, bệnh do xoắn khuẩn gồm 2 serovar L. canicola, L.

icterohaemorrhagiae và bệnh dại.

- Eurican DHPPI (CHPPI2-L) (Merial): phòng bệnh Caré, do

Adenovirus, bệnh viêm ruột do Parvovirus, para-influenza type 2, bệnh do

xoắn khuẩn gồm 2 serovar L. canicola và L. icterohaemorrhagiae.

- Eurican DHPPI (CHPPI2-LR) (Merial): phòng bệnh Caré, do

Adenovirus, bệnh viêm ruột do Parvovirus, para-influenza type 2, bệnh do xoắn khuẩn gồm 2 serovar L. canicola, L. icterohaemorrhagiae và bệnh dại.

- Recombitek C6/CV: (Merial): phòng bệnh Caré, bệnh do Adenovirus, bệnh viêm ruột do Parvovirus, bệnh viêm ruột do Coronavirus, para-influenza và bệnh do xoắn khuẩn gồm 2 serovar L. canicola và L. icterohaemorrhagiae.

- Canigen (Virbac) phòng bệnh Caré, do Adenovirus, Parvovirus, Para-

influenza và bệnh do xoắn khuẩn gồm 2 serovar L. canicola và L.

icterohaemorrhagiae.

- Hipradog-7 (Hipra): phòng bệnh Caré, bệnh viêm ruột do Parvovirus,

bệnh viêm gan, viêm thanh khí quản, viêm khí phế quản, bệnh do xoắn khuẩn

gồm 2 serovar L. canicola và L. icterohaemorrhagiae.

- Duramune Max 5/4L (Fort dodge animal heath): phòng bệnh Caré, bệnh do Adenovirus Type 1, Adenovirus Type 2, Parainfluenza, bệnh viêm ruột do Pavovirus và bệnh do xoắn khuẩn gồm 4 serovar L. canicola, L. icterohaemorrhagiae, L. gryppotyphosa và L. pomona.

Các biện pháp phòng ngừa khác

- Giảm tiếp cận các nguồn lây nhiễm như nơi nước đọng, giảm tiếp xúc

với các loài gặm nhấm.

- Biện pháp vệ sinh tại các phòng mạch thú y dựa theo hướng dẫn của

Sykes et al. (2011)

+ Sử dụng các chất tẩy trùng bệnh viện thường xuyên tại nơi bị nhiễm

nước tiểu vật bệnh Leptospirosis.

+ Rửa tay trước và sau khi xử lý những chó mắc bệnh này.

+ Mang găng tay, áo choàng, mặt nạ.

+ Khử trùng nước tiểu bằng dung dịch nước tẩy javel pha loãng (với tỷ lệ

1:1).

+ Những người có tiếp xúc gần gũi với những con chó bị nhiễm bệnh

hoặc phân của chúng có thể dùng thuốc kháng sinh để phòng như uống

doxycycline trong 7 ngày (Maele et al., 2008).

Tuyên truyền vận động trong nhân dân và người chăn nuôi để có hiểu

biết cơ bản về bệnh do Leptospira gây ra cho gia súc và sự nguy hại của bệnh có thể lây cho người, vệ sinh môi trường xung quanh, vệ sinh nơi ở và dụng cụ

đựng thức ăn, nước uống.

2.8.2 Điều trị bệnh Leptospirosis

Việc điều trị bệnh Leptospirosis bao gồm cả chăm sóc hỗ trợ và điều trị bệnh gan hoặc thận. Liệu pháp sử dụng kháng sinh phải bắt đầu ngay khi có dấu hiệu nghi ngờ bệnh hay lúc lấy mẫu (nếu thực hiện bằng PCR) để loại trừ

nhiễm khuẩn huyết và bài thải xoắn khuẩn qua nước tiểu có nguy cơ lây

truyền sang người (Langston and Heuter, 2003; Goldstein, 2010). Do đó, bệnh

nên được chẩn đoán điều trị càng sớm càng tốt và tốt hơn là 5 ngày trước khi

xuất hiện các triệu chứng lâm sàng, ức chế được sự nhân lên của vi khuẩn và

làm giảm các tổn thương các cơ quan như gan và thận. Nếu dùng kháng sinh

sau 7 ngày mắc bệnh thì không thể quản lý được mầm bệnh.

Kháng sinh là thuốc đặc hiệu để điều trị bệnh Leptospirosis. Khi có dấu hiệu nghi ngờ Leptospirosis, nên bắt đầu kháng sinh càng sớm càng tốt ngay cả trước khi chẩn đoán chính xác.

Một số thuốc có thể sử dụng để điều trị bệnh Leptospirosis:

- Doxycycline: 5 mg/kg P, uống 2 lần/ngày hoặc tiêm tĩnh mạch trong 2

đến 3 tuần (Francey and Schweighauser, 2012).

- Ampicillin: 20-30 mg/kg P, uống 2 lần/ngày.

- Amoxicillin: 22 mg/kg P, uống 2 lần/ngày.

- Shoptapen (Penicillin G và Streptomycin): 0,2 mg/kg P, tiêm bắp/dưới

da, 1 lần/cách 3 ngày

- Penicilline G: 25000-40000 MU /kg, truyền tĩnh mạch 2 lần/ngày (nếu

những chó có biểu hiện bệnh đường tiêu hóa) (Schuller et al., 2015).

Đối với những chó có tổn thương thận (creatinin huyết thanh > 440

µmol/L) thì giảm liều kháng sinh và thời gian sử dụng thuốc kéo dài hơn

(Schuller et al., 2015). Sau khi sử dụng kháng sinh trong vòng 24 giờ mầm

bệnh sẽ được loại khỏi cơ thể, giảm đáng kể nguy cơ lây lan mầm bệnh cho

người và các con chó khác (Goldstein, 2010).

Do đó, nếu có nghi ngờ về bệnh Leptospirosis, quy trình chung cho sử

dụng là uống doxycycline (5 mg/kg mỗi 12 giờ trong 3 tuần) cho tất cả các

động vật (Goldstein, 2010). Nếu bệnh Leptospirosis dạng cấp tính nếu được điều trị bằng kháng sinh và kết hợp với truyền dịch thì bệnh sẽ phục hồi nhanh

hơn. Tuy nhiên trong giai đoạn cấp tính này, xoắn khuẩn ký sinh nội bào, tránh được những tác động của kháng sinh, vài tuần sau chúng có thể nhân lên một lần nữa, mặc dù chỉ ở mức độ thấp và có thể xảy ra những tổn thương ở gan hoặc thận và dẫn đến rối loạn mãn tính (Andre´-Fontaine, 2006).

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian

Đề tài được nghiên cứu và thực hiện từ tháng 10 năm 2013 đến 07 năm

2017.

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

3.1.2.1 Địa điểm thu thập mẫu

- Mẫu máu chó và chuột được thu thập tại nhà của một số hộ dân thuộc 4

tỉnh của Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL): Cần Thơ, Vĩnh Long, An

Giang và Cà Mau và 3 phòng khám thú y trên địa bàn thành phố Cần Thơ.

- Địa điểm nghiên cứu khi được chọn để khảo sát phải đại diện cho một

số tỉnh ĐBSCL như tỉnh Cần Thơ và Vĩnh Long là 2 trung tâm thành phố lớn

nhất khu vực ĐBSCL, số lượng chó được nuôi ngày càng tăng, do đời sống

người dân ngày càng được nâng cao, nhu cầu nuôi thú cưng để giải trí cũng tăng theo. Tỉnh An Giang là tỉnh đại diện cho ĐBSCL vừa có sông rạch vừa có

địa hình đồi núi (huyện Tịnh Biên), phía Đông và Đông Nam giáp biên giới

Campuchia. Cà Mau là tỉnh đại diện có nguồn nước mặn, với nhiều sông rạch,

có địa hình thấp, bằng phẳng và thường xuyên bị ngập nước. Nguồn nước mặt

chủ yếu là nước lợ và nước mặn, đây là nguồn nước được đưa vào từ biển,

hoặc pha trộn với nguồn nước mưa.

- Ba phòng mạch thú y trên địa bàn thành phố Cần Thơ (TPCT)

+ Bệnh xá Thú y, Trường Đại học Cần Thơ. Cổng C, khu 2, đường 3/2,

phường Xuân Khánh, quận Ninh Kiều, TPCT.

+ Phòng mạch Thú y Liên Quận Ninh Kiều - Bình Thủy. Số 24 Nguyễn

Trãi, phường An Hội, quận Ninh Kiều, TPCT.

+ Phòng mạch Thú y, số 50 đường Võ Văn Kiệt, phường An Hòa,quận

Ninh Kiều, TPCT.

3.1.2.2 Địa điểm phân tích mẫu

a. Xét nghiệm huyết thanh học

Xét nghiệm huyết thanh học (thực hiện phản ứng vi ngưng kết) được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh, Bộ môn Thú y, Khoa Nông Nghiệp, Đại học Cần Thơ.

b. Phân tích máu và nước tiểu

Phân tích chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và nước tiểu tại khoa Xét

nghiệm, Bệnh viện Đa Khoa Vạn Phước Cửu Long, TPCT.

c. Nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira

Nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira được thực hiện tại Viện Vệ Sinh Dịch

Tễ (Viện Pasteur Tp. HCM).

d. Thực hiện phản ứng PCR và giải trình tự gene

Phát hiện xoắn khuẩn trong nước tiểu được kiểm tra bằng PCR và giải

trình tự gene tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc).

3.2 Đối tượng nghiên cứu

3.2.1 Giống chó

Trong nghiên cứu này giống chó được chia làm hai nhóm giống chính:

nhóm giống chó nội và nhóm giống chó ngoại dựa vào đặc điểm, hình dáng

chó được mô tả bởi Lê Văn Thọ (2006) hoặc hỏi chủ nuôi.

Nhóm giống chó nội bao gồm giống chó ta (chó cỏ) và giống chó Phú

Quốc. Giống chó ta khi trưởng thành có thể trọng trung bình 9,83-11,01 kg.

Bộ lông thường có màu vàng, đen, trắng sữa, nâu, xám, lông vá và lông vện. Kiểu đuôi hình vòng, dựng đứng, lưỡi kiếm hoặc vài kiểu khác. Chó Phú Quốc

thường có màu lông nâu, vàng, xám, đen, lông vện, bụng thon. Điểm đặc biệt trên lưng lông mọc có hình xoắn (xoáy lưng), hay lật theo kiểu rẽ ngôi, có các đường kẻ nhạt chạy dọc thân. Chó trưởng thành có chiều cao 60-65 cm, nặng 12-25 kg.

Nhóm giống chó ngoại bao gồm những giống chó được thích nuôi trong

gia đình như chó Chihuahua, chó Bắc Kinh, chó Nhật, Berger, Boxer, Greyhound, Doberman và các giống chó ngoại này lai với nhau được gom

thành một nhóm.

3.2.2 Nhóm tuổi

Trong nghiên cứu này, tuổi chó được chia làm 3 nhóm tuổi theo quá

trình phát triển của chó (Ward et al., 2002).

- Nhóm I: từ 4 tháng < 12 tháng tuổi.

- Nhóm II: ≤ 1 tuổi < 6 năm tuổi.

- Nhóm III: ≥ 6 năm tuổi.

Định tuổi

Chó ở tất cả các lứa tuổi được xác định bằng phương pháp hỏi chủ nuôi

hoặc căn cứ vào sự thay đổi của răng để ước lượng tuổi của chó:

- Chó 4-6 tháng tuổi: răng sữa bắt đầu rụng và thay thế dần bằng răng

vĩnh viễn.

- Chó từ 7 đến < 12 tháng tuổi: răng vĩnh viễn mọc đồng đều bằng nhau.

- Chó từ >12 đến 24 tháng: răng cửa có hình hoa huệ, đồng đều, màu

trắng bóng, răng bắt đầu đóng bựa khi chó được 18 tháng tuổi, phần răng cửa

hàm dưới bị mòn dần đến 24 tháng tuổi.

- Chó trên 24 tháng tuổi: răng cửa hàm dưới mòn và răng cửa hàm trên

đã bắt đầu mòn.

- Chó 6 năm tuổi: tất cả các răng cửa đều mòn.

3.2.3 Cách chọn chó khảo sát

- Chó có dáng vẻ khỏe mạnh: chó nuôi có lông mượt, không có bệnh

ngoài da, dáng vẻ bên ngoài khỏe mạnh, lanh lợi, ăn uống bình thường (Huỳnh

Thị Bạch Yến, 2006) chưa tiêm phòng Leptospirosis được đưa đến phòng mạch thú y để tẩy giun, tiêm ngừa hay làm đẹp.

- Chó được nuôi dưỡng tại các hộ dân ở 4 tỉnh thuộc ĐBSCL: Cần Thơ,

Vĩnh Long, An Giang và Cà Mau.

- Chó bệnh được khám và điều trị bệnh ở Bệnh xá Thú y, Đại học Cần Thơ, phòng khám Thú y số 50 đường Võ Văn Kiệt, TPCT và phòng khám Thú y Liên quận Ninh Kiều – Bình Thủy, số 24 Nguyễn Trãi, TPCT.

3.2.4 Biến số nghiên cứu

- Nhóm giống là biến định tính được chia làm 2 nhóm giống bao gồm

nhóm giống chó nội và nhóm giống chó ngoại (mục 3.2.1).

- Biến tuổi là biến số định tính được tính bằng năm và chia ra 3 nhóm

(mục 3.2.2).

- Giới tính: là biến số định tính với 2 giá trị là đực và cái.

- Phương thức nuôi: là biến định tính với 2 giá trị nuôi thả và nuôi nhốt.

+ Nuôi thả: chó được thả vận động tự do trong khuôn viên nhà.

+ Nuôi nhốt: chó được nhốt trong chuồng hoặc lồng riêng.

3.3 Vật liệu thí nghiệm

3.3.1 Phương tiện và dụng cụ dùng trong phản ứng huyết thanh học

và nuôi cấy

Bộ kháng nguyên chuẩn dùng trong phản ứng MAT

Kháng nguyên chuẩn là xoắn khuẩn Leptospira sống gồm 24 serovar thuộc 18 serogroup Leptospira phổ biến đang được sử dụng để chẩn đoán

bệnh do Leptospira ở Việt Nam do phòng thí nghiệm Leptospira của Viện Vệ

Sinh Dịch Tễ thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.

Bảng 3.1 Danh mục bộ kháng nguyên dùng trong phản ứng MAT

STT Species

Serogroups

Serovar

Strain

australis

Australis

Ballico

L. interrogans

autumnalis

Autumnalis

Akyiami A

bataviae

Bataviae

Van Tienen

Canicola

Hond utrecht IV

L. interrogans

canicola

Canicola

Chiffon

L. borgpetersenii

ballum

Castellionis

Castellon 3

Copenhageni

Wijenberg

L. interrogans

icterohaemorrhagiae

Tonkini

LT 9668

Icterohaemorrhagiae Verdun

L. interrogans

pyrogenes

Pyrogenes

Salinem

L. kirchneri

cynopterie

Cynopterie

3522 C

L. interrogans

gryppotyphosa

Gryppotyphosa

Moskva V

10 L. interrogans

hebdomadis

Hebdomadis

Veldrat

L. borgpetersenii

javanica

Javanica

bataviae 46

CZ 214 K

12 L. noguchii

panama

Panama

Patoc I

13 L. biflexa

semaranga

Patoc

Pomona

14 L. interrogans

pomona

Pomona

Tarassovi

Mitis johnson

tarassovi

L. borgpetersenii

LT 0968

Vughia

Hardjoprajitno

Hardjo

Saxcoebing

Mus 24

L. interrogans

sejroe

Hardjo

Hardjo bovis

17 L. noguchii

louisiana

Louisiana

LSU 1945

18 L. fainei

hurstbridge

Hurstbridge

Môi trường nuôi cấy EMJH

Môi trường được sử dụng để nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira là

Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) do Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh cung cấp.

Dụng cụ và thiết bị

- Thùng trữ lạnh để vận chuyển mẫu.

- Găng tay cao su, khẩu trang, kính bảo hộ.

- Hóa chất: chất kháng đông EDTA, Heparin.

- Đĩa nhựa 96 giếng đáy tròn.

- Bộ micropipet.

- Bộ pipet từ 0,5 ml đến 10 ml.

- Kính hiển vi tụ quang nền đen.

- Máy ly tâm, tủ lạnh, tủ ấm.

- Tủ cấy vô trùng (Bio Clean Bench, SANYO Electric Biomedical Co.,

Ltđ).

- Tủ sấy (Memmert GmbH + Co.KG).

- Máy lắc (Vortex, VELP Scientifica s.r.l, Italy)

3.3.2 Phương tiện và dụng cụ dùng trong kỹ thuật PCR

- Bộ điện di DNA và bộ nguồn điện di (Bio-Rad, Mỹ).

- PCR Thermal Cycler (Bio-Rad C1000).

- Bộ máy chụp gel sản phẩm điện di PCR.

- Cặp mồi: M-27F /M-1492R (Weisburg et al., 1991).

- Thạch agarose (Trần Nhân Dũng, 2011).

- Thang chuẩn 100 bp (công ty Fermentas).

- Nước cất 2 lần.

3.4 Nội dung nghiên cứu

3.4.1 Nội dung 1

Xác định tình hình nhiễm xoắn khuẩn Leptospira trên chó và chuột ở 4

tỉnh ĐBSCL.

3.4.1.1. Mục tiêu nội dung 1

- Khảo sát sự lưu hành xoắn khuẩn Leptospira trên chó chưa tiêm phòng

Leptospirosis.

- Khảo sát sự lưu hành xoắn khuẩn Leptospira trên chuột.

- Xác định hệ số tương quan (R2) về tỷ lệ dương tính giữa các serogroup

Leptospira trên chuột và chó.

3.4.1.2 Phương pháp thực hiện trên mẫu huyết thanh chó

a. Phương pháp lấy máu

Điều tra huyết thanh học cắt ngang 1.433 mẫu huyết thanh chó khỏe

mạnh chưa tiêm phòng Leptospirosis theo giống, lứa tuổi, giới tính và phương

thức nuôi ở 4 tỉnh ĐBSCL.

Cỡ mẫu: cỡ mẫu ước lượng cần phải lấy dựa theo công thức dịch tễ của

Fosgate (2009) cho mỗi tỉnh khảo sát:

P (1-P). Z2 0,2 (1-0,2). 1,962

n = = = 245

d2 0,052

Trong đó n: cỡ mẫu.

Z: trị số từ bảng phân phối chuẩn, Z = 1,96

d: sai số cho phép, chọn d = 0,05.

P: tỷ lệ nhiễm Leptospira ước tính (qua kết quả thăm dò 135

mẫu huyết thanh chó ở thành phố Cần Thơ vào năm 2013 có tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira là 20%).

Như vậy cỡ mẫu cần phải lấy ở mỗi tỉnh là 245 mẫu huyết thanh chó và

được thể hiện qua Bảng 3.2.

Bảng 3.2 Số lượng mẫu huyết thanh chó trong nghiên cứu

Địa điểm lấy mẫu (tỉnh)

Số mẫu lượng huyết thanh chó kiểm tra (con)

Cần Thơ

650

Vĩnh Long

256

An Giang

263

Cà Mau

264

Tổng

1.433

Phương pháp thực hiện: máu chó được lấy từ tĩnh mạch chân bằng ống và kim tiêm vô trùng, trước khi lấy sát trùng bằng cồn 70o khu vực cần lấy, rút 4-6 ml máu cho vào ống nghiệm không chứa kháng đông được chiết lấy huyết

thanh dùng cho phản ứng vi ngưng kết (MAT). Mỗi ống nghiệm chứa máu đều có ghi chép số thứ tự mẫu, giới tính, độ tuổi, phương thức nuôi, địa điểm

và thời gian lấy mẫu. Máu được để đông và chuyển về phòng thí nghiệm ly

tâm với vận tốc 2.000 vòng/phút trong 5 phút để chiết lấy huyết thanh. Các mẫu huyết thanh được bảo quản ở -20oC cho đến khi tiến hành phản ứng vi ngưng kết (MAT), với 18 serogroup được thể hiện qua Bảng 3.1.

b. Phương pháp tiến hành gồm các bước sau

Bước 1 Chuẩn bị phiến kính

Mỗi mẫu huyết thanh cần dùng 4 phiến kính, mỗi phiến kính chia làm 6

ô, mỗi ô dùng cho một chủng kháng nguyên, những phiến kính này phải thật

sạch, không mốc, không bị xước, trước khi dùng phải dùng bông tẩm cồn lau

sạch sau đó để khô.

Bước 2 Kiểm tra kháng nguyên

Kiểm tra kháng nguyên bằng mắt thường: soi từng ống nghiệm chứa kháng nguyên lên trước nguồn sáng, nếu thấy kháng nguyên trong, không có kết tủa, khi lắc nhẹ nó vẩn đục như làn khói là những chủng kháng nguyên mọc tốt.

Kiểm tra kháng nguyên bằng kính hiển vi: lắc đều từng ống kháng

nguyên, pha loãng kháng nguyên với dung dịch đệm (1/3) bằng cách cho thêm

vào từng ống kháng nguyên 2ml dung dịch đệm, lắc đều, sau đó nhỏ lần lượt

từng chủng kháng nguyên lên phiến kính xem qua kính hiển vi có tụ quang

nền đen, kháng nguyên đạt yêu cầu phải mọc tốt, phân tán đều trong môi

trường.

Bước 3 Chuẩn bị huyết thanh

Huyết thanh nếu trữ lạnh thì rã đông trong 30 phút, đưa lên máy lắc ống trộn đều, sau đó bắt đầu pha loãng với hiệu giá pha loãng khởi đầu là 1: 50 (4,9 ml dung dịch đệm pha với 0,1 ml huyết thanh).

Bước 4 Tiến hành phản ứng vi ngưng kết

Trên mỗi ô của đĩa nhựa (96 giếng) ta dùng pipet hút 50 μl huyết thanh

đã pha loãng ở nồng độ 1: 50, nhỏ lần lượt vào mỗi ô một giọt, sau đó dùng

pipet hút 50 μl kháng nguyên vào 24 ô huyết thanh, mỗi ô một chủng tương ứng 24 chủng kháng nguyên. Tính chung huyết thanh đã pha loãng ở nồng độ

1: 100. Dùng mỗi đầu pipet cho một mẫu huyết thanh và mỗi chủng kháng nguyên. Sau đó lắc nhẹ, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ.

Hút một giọt ở mỗi ô nhỏ lên phiến kính. Đọc kết quả dưới kính hiển vi

nền đen có độ phóng đại 100 lần. Lần lượt quan sát kết quả ở 24 ô tương ứng

với 24 chủng kháng nguyên.

Tiến hành đối chứng âm

Trên mỗi ô của đĩa nhựa nhỏ 50 μl dung dịch đệm và 50 μl kháng

nguyên sống tương ứng với 1 chủng Leptospira. Dưới kính hiển vi nền đen

Leptospira xuất hiện trên vi trường, không tự ngưng kết và chuyển động tốt.

Đánh giá kết quả

Dưới kính hiển vi nền đen, độ phóng đại 100 lần, mức độ ngưng kết

được ghi nhận như sau:

Âm tính (-): xoắn khuẩn không ngưng kết, di động tự do như đối chứng

âm.

Dương tính (+): trên vi trường xuất hiện những cụm hay mảng ngưng kết trắng đục, rìa có tua do xoắn khuẩn Leptospira dính vào nhau, số Leptospira tự do ít so với đối chứng âm.

Đánh giá kết quả dựa theo hướng dẫn của Boutilier et al. (2003);

Langston and Heuter, (2003) và TCVN 8400-15:2011, phản ứng được xem là

dương tính khi mẫu huyết thanh có hiệu giá ngưng kết ≥ 1: 200 và hiệu giá

ngưng kết 1: 100 được xem là nghi ngờ.

4+: Tất cả Leptospira ngưng kết, cụm ngưng kết lớn, không có xoắn

khuẩn tự do.

3+: Trên 75% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, ít xoắn khuẩn tự do.

2+: Từ 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, có 1/2 số xoắn khuẩn tự do.

1+: Từ 25% đến dưới 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, nhiều xoắn

khuẩn tự do.

Hiệu giá ngưng kết đầu tiên là 1: 100 (50 μl kháng nguyên với 50 μl

huyết thanh đã pha loãng 1: 50).

Nâng cao hiệu giá

Tiếp tục thực hiện phản ứng với những chủng kháng nguyên dương tính. Nếu mẫu huyết thanh xét nghiệm ở mức ngưng kết 2+ trở lên thì tiếp tục nâng

hiệu giá bằng cách pha loãng huyết thanh lên 1: 200, 1: 400,…cho đến khi phản ứng ngưng kết âm tính hoặc dương tính nhưng mức độ ngưng kết ở mức

dưới 2+ thì mẫu huyết thanh được xem là xét nghiệm hoàn tất.

Cách pha loãng huyết thanh: lấy 1ml huyết thanh ở nồng độ 1: 50 pha

với 1 ml dung dịch đệm, ta có độ pha loãng 1: 100, cứ như vậy pha loãng

huyết thanh đến mức cần thiết (chỉ thực hiện pha loãng huyết thanh với những

mẫu có ngưng kết từ 2+ trở lên).

3.4.1.3 Phương pháp thực hiện trên mẫu huyết thanh chuột

a. Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang và phân tích

b. Phân bố mẫu khảo sát

Điều tra huyết thanh cắt ngang các mẫu huyết thanh chuột tại 4 tỉnh

ĐBSCL bằng cách đặt bẫy lồng tại các địa điểm có lấy huyết thanh chó: khu

dân cư, khu nhà ở hộ dân, khu vực chợ và bệnh viện.

Cỡ mẫu: cỡ mẫu ước lượng cần phải lấy dựa theo công thức

P (1-P). Z2 0,071 (1-0,071). 1,962

n = = = 101

d2 0,052

Trong đó n: cỡ mẫu

Z: trị số từ bảng phân phối chuẩn, Z = 1,96

d: sai số cho phép, chọn d = 0,05.

P: tỷ lệ nhiễm Leptospira ước tính (qua kết quả thăm dò 84 mẫu huyết thanh chuột ở thành phố Cần Thơ vào năm 2013 có tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira là 7,1%).

Như vậy cỡ mẫu cần phải lấy ở mỗi tỉnh là 101 mẫu huyết thanh chuột và

Bảng 3.3 Phân bố mẫu huyết thanh chuột trong nghiên cứu

Địa điểm lấy mẫu (tỉnh)

Số lượng huyết thanh chuột kiểm tra (con)

195

Cần Thơ

140

Vĩnh Long

185

An Giang

127

Cà Mau

647

Tổng

được thể hiện qua Bảng 3.3.

c. Phân loại chuột khảo sát

Những chuột bẫy được sẽ được phân loại dựa vào khóa phân loại chuột

Bảng 3.4 Phân loại chuột trong nghiên cứu

của Đào Văn Tiến (1985) và Nguyễn Văn Đĩnh (2005).

Phân loại chuột Số lượng (con)

Chuột cống (Rattus norvegicus) 285

Chuột xạ (Suncus murinus) 152

Chuột nhắt (Mus musculus) 210

647 Tổng

d. Phương pháp thực hiện

Cách lấy và bảo quản mẫu huyết thanh chuột

Chuột sau khi bẫy được ở các địa phương khảo sát (cùng nơi có lấy huyết thanh chó) được gây mê bằng thuốc mê Acepromazine để lấy máu trực tiếp từ tim, mỗi chuột lấy 2-4 ml cho vào các ống nghiệm vô trùng để đông và chuyển về phòng thí nghiệm ly tâm với vận tốc 2.000 vòng/phút trong 5 phút để chiết lấy huyết thanh. Các mẫu huyết thanh được bảo quản ở -20oC để thực hiện phản ứng MAT.

Mỗi ống nghiệm chứa mẫu đều có ghi chép số thứ tự mẫu và địa

phương khảo sát.

Các bước thực hiện phản ứng MAT trên chuột tương tự như các bước

thực hiện trên chó (ở mục 3.4.1.2, tiểu mục b).

Đánh giá kết quả dựa theo hướng dẫn của Boutilier et al. (2003) và

Langston and Heuter, (2003). Phản ứng được xem là dương tính khi mẫu

huyết thanh có hiệu giá ngưng kết ≥ 1: 20 chứa một lượng kháng thể gây

ngưng kết ít nhất 50% xoắn khuẩn (2+) và hiệu giá ngưng kết 1: 10 được

xem là nghi ngờ.

d. Chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó và chuột theo các địa điểm khảo sát.

Số mẫu huyết thanh dương tính

Tỷ lệ nhiễm (%) = x 100

Tổng số mẫu huyết thanh khảo sát

- Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó theo theo giống, độ tuổi, giới tính và

phương thức nuôi chó.

- Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó và chuột

- Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó và chuột.

- Khảo sát vai trò của chuột trong sự lưu hành Leptospira trên chó bằng cách phân tích mối tương quan dựa trên kết quả tỷ lệ huyết thanh dương tính

với Leptospira giữa chuột và chó dựa theo phương trình hồi qui tuyến tính là y= a + bx

Trong đó : y là biến phụ thuộc

x: biến độc lập

a: hằng số

b: hệ số của x

R: hệ số tương quan giữa biến x và biến y

3.4.2. Nội dung 2: Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu

3.4.2.1 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu bằng kỹ thuật

PCR

a. Phân bố mẫu khảo sát: việc phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ

nước tiểu được thực hiện trên cùng 63 chó nghi nhiễm Leptospira (soi bằng KHV nền đen) đã khảo sát các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu từ

111 chó có MAT ≥ 1: 400 tại 3 phòng mạch thú y trên địa bàn thành phố Cần

Bảng 3.5. Số mẫu nước tiểu dùng cho kỹ thuật PCR

Tổng số mẫu nước tiểu khảo

Số mẫu nghi nhiễm Leptospira (soi bằng KHV nền đen)

Địa điểm

sát

Bệnh xá Thú y, ĐHCT.

Phòng mạch Thú y Liên Quận

Ninh Kiều - Bình Thủy, TPCT.

Phòng mạch Thú y, 50 đường Võ Văn Kiệt, TPCT.

Tổng

111

Thơ.

b. Cách lấy nước tiểu

Phương pháp thực hiện: nước tiểu được lấy giữa dòng bằng ống thông qua niệu đạo hoặc thu trực tiếp lúc thú đi tiểu với lượng nước tiểu cần lấy 6-20 ml, chia làm 3 phần để phân tích.

Phần 1: dùng để phân tích các chỉ tiêu sinh lý nước tiểu: cho 6 ml nước tiểu vào ống nghiệm vô trùng để phân tích các chỉ tiêu sinh lý nước tiểu bằng máy phân tích nước tiểu (U120, Mỹ) tại Khoa xét nghiệm, bệnh viện Đa Khoa Vạn Phước Cửu Long, thành phố Cần Thơ.

Phần 2: lấy 3 ml nước tiểu nghi ngờ có xoắn khuẩn khi soi dưới kính

hiển vi tụ quang nền đen (ở phần 2), ly trích DNA (theo quy trình của Trần

Nhân Dũng, 2011) sử dụng cho phản ứng PCR.

Phần 3: dùng để nuôi cấy: cho 10 ml nước tiểu vào ống nghiệm vô trùng, ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong 10 phút và loại bỏ phần nước trong, lấy phần cặn lắng bên dưới soi bằng kính hiển vi tụ quang nền đen, nếu nghi ngờ có

xoắn khuẩn thì lấy 3 ml nước tiểu sau khi ly tâm cho qua lọc Seitz (Sartorius

Stedim Biotech, Việt Nam) với kích thước lổ lọc là 0,22 μm để tránh tạp

khuẩn và tiến hành nuôi cấy xoắn khuẩn trên môi trường Ellinghausen-

McCullough-Johnson (EMJH) theo hướng dẫn của WHO (2003).

c. Thực hiện phản ứng PCR - Ly trích DNA

Lấy 111 mẫu nước tiểu chó ly tâm và kiểm tra sự hiện diện của xoắn

khuẩn trong nước tiểu bằng KHV nền đen, nếu có xoắn khuẩn thì ly trích

DNA theo quy trình sử dụng cho vi khuẩn Gram âm (Trần Nhân Dũng, 2011),

qui trình này được thực hiện theo các bước:

Bước 1 Phá vỡ tế bào

+ Hút 500 µl dung dịch xoắn khuẩn nuôi cấy qua đêm cho vào tube 1,5

ml.

+ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó bỏ dịch nổi.

+ Thêm 100 µl dung dịch lysis buffer, trộn đều.

Bước 2 Phân tách DNA

+ Làm nóng lên ở 95oC trong 10 phút, chuyển sang ủ trong thùng đá để

giữ lạnh trong 5 phút.

+ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút.

Bước 3 Kết tủa DNA

+ Hút 600 µl dung dịch trong bên trên (ở bước 2) cho vào tube 1,5 ml

mới (tránh chạm vào phần cặn bên dưới).

+ Cho một lượng tương đương cồn 95o vào tube có chứa dịch vừa thu

được. Tiếp tục ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Sau đó ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút để

kết tủa DNA. Loại bỏ phần dung dịch bên trên, chú ý giữ phần tủa.

Bước 4 Rửa DNA

+ Cho 500 µl cồn 70o vào tube.

+ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ phần dung dịch bên

trên.

+ Sấy khô trong chân không khoảng 10-15 phút sao cho lượng cồn bốc

hơi hoàn toàn.

Bước 5 Hòa tan DNA

Hòa tan khối DNA vừa thu được trong 100 µl TE 0,1X và trữ ở tủ -20oC

ít nhất là 2 giờ đến khi tiến hành PCR.

- Tiến hành phản ứng PCR

Phản ứng PCR dựa trên cơ sở khuếch đại gene 16S rRNA của xoắn

khuẩn và giải trình tự gene được thực hiện tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc).

Trình tự nucleotide của đoạn mồi được thể hiện qua Bảng 3.6, hỗn hợp

Bảng 3.6 Trình tự nucleotide cặp mồi dùng khuếch đại vùng gene 16S rRNA

Gen Mồi tổng

Trình tự nucleotide

M-27F

5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’

1500bp

16S

M-1492R 5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’

phản ứng PCR ở Bảng 3.7 và quy trình luân nhiệt được thể hiện qua Bảng 3.8.

Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR

Mồi tổng dựa theo nghiên cứu của Weisburg et al. (1991).

Thành phần

Nồng độ / 1 phản

Thể tích /1 phản ứng

ứng

2X Master Mix

25X

Primer M-27F (10 µM)

2 µL

0,4 µM

Primer M-1492R (10 µM)

2 µL

0,4 µM

DNA tách chiết

1-2 µL

50-100 ng

Đủ 50 µL

Bi.H20

Bảng 3.8 Quy trình nhiệt trong phản ứng PCR

Nhiệt độ

Thời gian

Chu kỳ

95oC

5 phút

95oC

30 giây

55oC

30 giây

72oC

1 phút 45 giây

72oC

5 phút

- Các bước điện di sản phẩm PCR

Bước 1 Chuẩn bị gel (1,5%) cho quá trình điện di

Hòa tan 0,60 g agarose vào 40 ml TAE 1X. Nấu gel khoảng 7-10 phút sao cho agarose tan hoàn toàn trong dung dịch. Lấy ra để nguội khoảng 50oC (cầm vừa ấm tay). Cho 2 µl SafeView (thuốc nhuộm) vào và lắc đều. Chú ý

tránh tạo bọt.

Bước 2 Thực hiện điện di sản phẩm PCR trên gel agarose

Trộn 10 µl sản phẩm PCR với 2 µl dung dịch Loading Dye 6X cho vào

giếng trên gel. Bắt đầu điện di trong 45 phút với cường độ dòng điện là 400

mA và hiệu điện thế là 90V.

Bước 3 Quan sát kết quả điện di

Kết quả điện di được quan sát dưới tia UV của máy chụp ảnh gel nhờ

vào phần mềm Quantity One và chụp ảnh lưu giữ mẫu và giải trình tự gene.

Chọn sản phẩm trên phổ điện di cho băng rõ và tương đồng có kích

thước 1.500 bp ở thang chuẩn plus 100 của công ty Fermentas và tiến hành

giải trình tự gene 16S rRNA tự động trên máy ABI 3130 Sequencer.

3.4.2.2. Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ mẫu nuôi cấy

a. Phân bố mẫu khảo sát: việc nuôi cấy xoắn khuẩn Leptospira được

thực hiện trên cùng 63 chó nghi nhiễm Leptospira trong nước tiểu khi soi dưới KHV nền đen đã khảo sát các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu và có

hiệu giá kháng thể kháng Leptospira MAT ≥ 1: 400.

Bảng 3.9. Số mẫu nước tiểu dùng cho nuôi cấy

Số mẫu nghi nhiễm Leptospira

Địa điểm

(soi bằng KHV nền đen)

Bệnh xá Thú y, ĐHCT.

Phòng mạch Thú y Liên Quận Ninh Kiều -

Bình Thủy, TPCT. Phòng mạch Thú y, 50 đường Võ Văn Kiệt,

TPCT.

Tổng

b. Cách lấy nước tiểu: thực hiện giống như mục 3.4.2.1, tiểu mục b,

phần 3.

c. Phương pháp nuôi cấy xoắn khuẩn

- Mỗi mẫu nước tiểu sau khi qua lọc Seitz, lấy 1,5 ml cho vào 2 ống

nghiệm có sẵn 6 ml môi trường Ellinghausen-McCullough-Johnson (EMJH)

có bổ sung kháng sinh 5-fluorouracil 100 µg/ml để ức chế sự phát triển của

các vi khuẩn gây tạp nhiễm theo hướng dẫn của WHO (2003).

- Trộn hỗn hợp này trong 10 giây bằng máy vortex và để trong tủ ấm ở nhiệt độ 28oC (Hình 3.1) và kiểm tra đều đặn 2 lần/tuần bằng kính hiển vi tụ quang nền đen tại phòng Sinh học Phân tử của Viện Vệ Sinh Dịch Tễ (Viện

Pasteur) thành phố Hồ Chí Minh.

- Quan sát các ống môi trường nuôi cấy có hiện tượng vẫn đục (Hình 3.2)

như làn khói chứng tỏ có xoắn khuẩn phát triển và được cấy chuyển sang ống

mới chứa môi trường EMJH để tiếp tục theo dõi đến 3 tháng.

- Các mẫu nuôi cấy nào đã có xoắn khuẩn phát triển khi quan sát dưới

kính hiển vi nền đen thì thực hiện ly trích DNA theo quy trình của Trần Nhân Dũng (2011) và giải trình tự gene.

Hình 3.1 Các ống môi trường EMJH đang nuôi cấy

Hình 3.2 Xoắn khuẩn Leptospira đã phát triển trong môi trường EMJH lúc 17

ngày nuôi cấy

- Kỹ thuật PCR được thực hiện như mục 3.4.2.1.

d. Giải trình tự đoạn gene 16S rRNA của xoắn khuẩn

Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và được giải mã trình tự nucleotide

tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc).

- Mẫu được giải trình tự gene 16S rRNA tự động trên máy ABI 3130

Sequencer với 2 phản ứng sử dụng mồi 27F và 1492R. Trình tự thu được từ các phản ứng này được lắp ráp lại thành công dựa trên vùng gối đầu của các

trình tự giải được bằng chương trình SeqMan và đối chiếu kết quả lắp ráp với dữ liệu giải trình tự ABI (Applied Biosystem) để hiệu chỉnh các nucleotide không khớp.

- Trình tự 16S rRNA sau khi lắp ráp loại bỏ khoảng 100 nucleotide ở hai

đầu do tín hiệu giải trình tự ở vùng này không chính xác, đọc kết quả giải trình

tự dựa vào phần mềm BioEdit và ClustalX, so sánh các trình tự gene thu được

với các trình tự gene công bố trong GenBank bằng chương trình BLAST. Các

xoắn khuẩn nào có giá trị E thấp nhất và vùng Querry Coverage cao nhất là

tương đối gần nhất với các chủng giải trình tự.

- Nếu mức độ đồng nhất của trình tự nucleotide trong đoạn gene 16S rRNA đạt ≥ 95% thì có thể xác định tới chi (genus) và ≥ 99% thì có thể xác định tới loài (species) (dựa theo mô tả mức độ tương đồng của La Scola et al., 2006).

e. Xác định loài xoắn khuẩn Leptospira trên chó phát hiện được.

Mục tiêu: xác định mối quan hệ loài xoắn khuẩn Leptospira phát hiện

được trên chó dựa vào mức độ tương đồng và so sánh trình tự nucleotide của

gene 16S rRNA với các trình tự gene của vi khuẩn đã công bố trên GenBank.

Tổng số 16 mẫu có DNA Leptospira được giải trình tự (bao gồm 13 mẫu

phát hiện trực tiếp từ nước tiểu bằng kỹ thuật PCR ở mục 3.4.2.1 và 3 mẫu từ

nuôi cấy xoắn khuẩn đã phát triển ở mục 3.4.2.2) dựa trên cơ sở khuếch đại

gene 16S rRNA của xoắn khuẩn và giải mã trình tự nucleotide được thực hiện

tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc).

Phương pháp thực hiện

- Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên các trình tự nucleotide bằng

cách sử dụng phần mềm MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016). Tra cứu kết quả trên

BLAST SEARCH và so sánh các vi khuẩn sẵn có từ GenBank, cơ sở dữ liệu

trên NCBI để xác định được loài phát hiện và hai loài xoắn khuẩn Leptospira

tham chiếu được dùng để so sánh trong phân tích phát sinh loài:

>Icterohaemorrhagiae NR_116542.1 Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae strain RGA 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.

>Hurstbridge NR_043049.1 Leptospira fainei serovar hurstbridge strain

BUT 6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.

3.4.3 Nội dung 3

Khảo sát những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis trên chó.

Mục tiêu: khảo sát những biến đổi bệnh lý ở chó bệnh dựa trên chỉ tiêu

sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu.

3.4.3.1. Phân bố mẫu khảo sát: nội dung này được thực hiện trên 13 chó dương tính với Leptospira bằng kỹ thuật PCR từ 63 chó nghi nhiễm

Leptospira trong nước tiểu khi soi dưới KHV nền đen đã khảo sát các chỉ tiêu

sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu và có hiệu giá kháng thể kháng Leptospira

MAT ≥ 1: 400 tại 3 phòng mạch thú y trên địa bàn thành phố Cần Thơ, số

Bảng 3.10 Phân bố mẫu khảo sát tại 3 địa điểm trên địa bàn TPCT

Số mẫu dương tính

Địa điểm

Số mẫu nghi nhiễm Leptospira (soi bằng KHV nền đen)

Bệnh xá Thú y- Đại học Cần Thơ.

Phòng mạch Thú y liên quận Ninh

Kiều-Bình Thủy.

Phòng mạch Thú y, số 50 đường Võ Văn Kiệt, TPCT.

Tổng

lượng mẫu được trình bày qua Bảng 3.10.

a. Xét nghiệm máu

Xét nghiệm các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu dựa theo tiêu chuẩn của

The Merck (2010) được thể hiện qua Bảng 3.11

Phương pháp thực hiện

Máu được lấy trực tiếp từ tĩnh mạch chân bằng bơm tiêm vô trùng, lượng máu cần lấy tối thiểu 4 ml máu và được chia ra 2 phần để phân tích các chỉ

tiêu sinh lý và sinh hóa máu tại Khoa xét nghiệm, bệnh viện Đa Khoa Vạn Phước Cửu Long, thành phố Cần Thơ.

Phần 1: cho khoảng 2 ml vào ống xét nghiệm có chất kháng đông EDTA

để phân tích các chỉ tiêu sinh lý máu bằng máy huyết học (Cell Dyn 3200,

Mỹ).

Phần 2: cho lượng máu còn lại vào ống nghiệm với chất kháng đông

Heparin để phân tích các chỉ tiêu sinh hóa máu bằng máy sinh hóa (AU604,

Bảng 3.11 Các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa máu

Nhật).

SINH LÝ MÁU

Sinh lý bình thường

Kết quả

Bạch cầu

6-17 (109/L)

Neutrophile %

60-70 %

Lymphocytes %

8-21%

Hồng cầu

5,5-8,5 (1012/L)

Hemoglobin

12-18 (g/dL)

Hematocrit

35-57 %

Tiểu cầu

170-400 (109/L)

SINH HÓA MÁU

Sinh lý bình thường

Kết quả

Ure

2,9-10 µmol/L

Creatinin

44-150 µmol/L

AST

8,9-48,5 U/L

ALT

8,2-57,3 U/L

Bilirubin

0-17 U/L

b. Xét nghiệm nước tiểu

Xét nghiệm các chỉ tiêu sinh lý nước tiểu dựa theo tiêu chuẩn của The

Bảng 3.12 Các chỉ tiêu sinh lý nước tiểu

Merck (2010) và Khorami et al. (2010) được thể hiện qua Bảng 3.12

SINH LÝ NƯỚC TIỂU

Sinh lý bình thường

Kết quả

Hồng cầu

0-5 tế bào/µL

Bạch cầu

5-40 tế bào/µL

Protein

0,1-0,3 g/L Albumin

Bilibrubin

8,6-17 µmol/L

c. Chỉ tiêu khảo sát

- Sự thay đổi các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trên chó bệnh

Leptospirosis.

- Những dấu hiệu lâm sàng trên chó nghi bệnh Leptospirosis: sốt, bỏ ăn,

nôn mửa, xuất huyết da.

3.4.4 Nội dung 4

Nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis trên chó.

Mục tiêu: theo dõi hiệu quả điều trị bệnh Leptospirosis trên chó.

3.4.4.1 Bố trí khảo sát

Đối tượng nghiên cứu

- Chó được nuôi dưỡng tại thành phố Cần Thơ.

- Bố trí phác đồ điều trị có sự hợp tác tham gia nghiên cứu giữa chủ nuôi

và bác sĩ thú y.

- Sáu mươi ba chó nghi nhiễm Leptospira trong nước tiểu khi soi dưới

KHV nền đen đã khảo sát các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu và có

hiệu giá kháng thể kháng Leptospira ≥ 1: 400 được bố trí điều trị ngẫu nhiên.

Trong đó 32 chó không biểu hiện triệu chứng lâm sàng (TCLS) và 31 chó có

một số biểu hiện triệu chứng lâm sàng nghi nhiễm bệnh Leptospirosis (ói, ăn

ít, buồn, lười vận động, suy thận, suy gan, báng bụng, xuất huyết da và vàng

Bảng 3.13 Số lượng chó được bố trí điều trị

Triệu chứng lâm sàng

Số mẫu nước tiểu kiểm tra

Số mẫu dương tính bằng kỹ thuật PCR

Số chó không biểu hiện TCLS

Số chó có biểu hiện TCLS nghi nhiễm Leptospira

Tổng

da) được trình bày qua Bảng 3.13

Phác đồ 1: sử dụng Shoptapen (Penicillin G và Streptomycin): liều 0,2

mg/kg P, gồm 20 chó trong đó 10 chó chưa biểu hiện lâm sàng và 10 chó có triệu chứng lâm sàng nghi nhiễm Leptospira.

Phác đồ 2: sử dụng Amoxicillin, liều 22 mg/kg P, gồm 22 chó trong đó

12 chó không biểu hiện lâm sàng và 10 chó có triệu chứng lâm sàng nghi

nhiễm Leptospira.

Phác đồ 3: sử dụng Doxycycline, liều 5 mg/kg P, gồm 21 chó trong đó 10 chó không biểu hiện lâm sàng và 11 chó có triệu chứng lâm sàng nghi nhiễm Leptospira.

Bố trí thí nghiệm theo dõi hiệu quả điều trị bệnh Leptospirosis trên chó

được trình bày trong Bảng 3.14 và những theo dõi hiệu quả điều trị dựa vào

theo hướng dẫn của Goldstein, (2010); Sykes et al. (2011); Francey and

Bảng 3.14 Bố trí thí nghiệm

Liều lượng

Đường cấp Liệu trình

Thuốc sử dụng

(ngày)

Số chó điều trị

(con)

Phác đồ 1: Shoptapen

7–14 ngày

(Penicillin G và Streptomycin)

Tiêm dưới da/ bắp

0,2 mg/kg P, cách 3 ngày

Phác đồ 2: Amoxicillin

Uống

7–14 ngày

22 mg/kg P, ngày 2 lần

Phác đồ 3: Doxycycline

Uống

5 mg/kg P, ngày

7–14 ngày

2 lần

Schweighauser, (2012) và Schuller et al. (2015).

3.5 Phân tích và xử lý số liệu

- Nhập số liệu và xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2013.

- Các chỉ tiêu sinh lý máu, sinh hóa máu, sinh lý, sinh hóa nước tiểu

được trình bày dưới dạng ±SE.

- Khảo sát các yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm Leptospira bao gồm nhóm giống, nhóm tuổi, giới tính và phương thức nuôi bằng phép trắc nghiệm χ2 trong phần mềm Minitab 16.0

- Hệ số tương quan (R2) dùng phân tích mối tương quan về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó và chuột, với phương trình có dạng: y = a+ bx, trong đó a và b là hằng số, y và x là tỷ lệ dương tính trên chó và chuột.

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên chó và chuột

4.1.1 Tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira trên chó ở một số tỉnh

Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó

Tỉnh

Số mẫu huyết thanh kiểm tra

Số mẫu huyết thanh dương tính

Tỷ lệ dương tính (%)

650

159

24,46a

Cần Thơ

256

26,95a

Vĩnh Long

263

20,15a

An Giang

264

18,94b

Cà Mau

1.433

331

23,10

Tổng

Những số liệu trong cùng một cột với chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05).

ĐBSCL

Trong tổng số 1.433 mẫu huyết thanh chó kiểm tra có 331 mẫu dương

tính với Leptospira chiếm tỷ lệ 23,10%. Tất cả những chó trong xét nghiệm

này đều chưa được tiêm phòng Leptospirosisvà lớn hơn 4 tháng tuổi nên

không còn kháng thể thụ động từ mẹ truyền sang. Do đó, sự hiện diện của

kháng thể đặc hiệu kháng Leptospira trong máu chó là kết quả của nhiễm xoắn

khuẩn trong tự nhiên. Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó cao nhất ở tỉnh Vĩnh

Long (26,95%), kế đến là tỉnh Cần Thơ (24,46%), An Giang (20,15%) và thấp

nhất là tỉnh Cà Mau (18,94%). Khi chó bắt đầu bị nhiễm Leptospira, 5-10

ngày sau cơ thể bắt đầu sản sinh kháng thể (André-Fontaine, 2013), kháng thể

này hiện diện trong máu và hàm lượng kháng thể cao nhất xác định được 3 tuần sau khi gia súc có biểu hiện sốt (Levett, 2001). Do đó, kết quả trên phản ánh sự tích lũy về tỷ lệ nhiễm Leptospira trong quần thể chó. Nhìn chung số liệu trên có ý nghĩa về mặt dịch tễ học, tỷ lệ dương tính trong nghiên cứu này cho thấy chó đã bị nhiễm xoắn khuẩn Leptospira và tình trạng miễn dịch của

đàn chó chứ không xác định chó vừa mới bị nhiễm bệnh hoặc mang trùng.

Nếu so sánh tỷ lệ nhiễm trên chó giữa các địa phương khảo sát, tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira giữa Cần Thơ và Vĩnh Long, Cần Thơ và An

Giang, Cần Thơ và Cà Mau, Vĩnh Long và An Giang, An Giang và Cà Mau

sai khác không ý nghĩa thống kê, ngoại trừ tỉnh Vĩnh Long và tỉnh Cà Mau tỷ

lệ dương tính với Leptospira có khác nhau về mặt thống kê (P=0,03). Điều này có thể được giải thích do Cà Mau là tỉnh có diện tích đất tự nhiên là đất ngập mặn và do Leptospira có đặc điểm rất mẫn cảm với muối, dung dịch nước muối có thể giết chết Leptospira trong 15 phút và điều này gây bất lợi cho sự

phát triển của Leptospira ngoài tự nhiên. Đối với Vĩnh Long và Cần Thơ là

tỉnh trong khu vực ĐBSCL, nước ngọt quanh năm và chó nuôi chủ yếu là nuôi

thả rong. Bên cạnh đó Vĩnh Long có rất nhiều gia đình chăn nuôi heo và bò,

chủ yếu là nuôi nhỏ lẻ, chuồng trại được dựng đơn giản, điều kiện vệ sinh kém, hệ thống thoát nước chưa tốt, đây là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển

của xoắn khuẩn Leptospira vì xoắn khuẩn Leptospira có thể sống dai dẳng

hàng tháng trong môi trường ẩm ướt, đặc biệt ở các vùng đầm lầy, ao hồ hoặc

đồng cỏ thoát nước kém. Hơn nữa, mầm bệnh Leptospira tồn tại trong cơ thể

thú bệnh và những động vật mang trùng như chuột với thời gian dài, chuột có

thể lây truyền xoắn khuẩn Leptospira sang cho chó thông qua việc bài thải

nước tiểu ra môi trường làm cho tỷ lệ nhiễm Leptospira cao hơn (Bharti et al.,

2003.

So sánh tỷ lệ nhiễm Leptospira trung bình trên chó ở các tỉnh ĐBSCL

với các tỉnh khác ở Việt Nam thì kết quả nghiên cứu này thấp hơn nghiên cứu

của Vũ Đình Hưng (1995), khảo sát tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó ở các tỉnh

miền Nam: Long An, Cần Thơ, Đồng Nai và các vùng phụ cận thành phố Hồ Chí Minh là 44,44%. Lê Huỳnh Thanh Phương (2001) khảo sát tại các tỉnh

phía Bắc Việt Nam với tỷ lệ nhiễm Leptospira trung bình trên chó 25,27%; ở

Đắk Lắk tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó 19,15% (Hoàng Mạnh Lâm, 2002) và

kết quả nghiên cứu của Lý Thị Liên Khai (2012) tại Công ty cổ phần thủy sản Sông Hậu Cần Thơ tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó 40,47%. So với nghiên cứu ở các nước trong khu vực Đông Nam Á và các nước trên thế giới như

Nhật Bản tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó 29,3% (Koizumi et al., 2013); ở Brazil 28,4% (Castro et al., 2011); ở Colombia có nhiều khảo sát về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó, năm 2011 là 47,14%, (Leonardo et al., 2011), năm 2013 là 22,9% (Claudia et al., 2013) và năm 2014 là 35,2% (Calderón et al., 2014) và 27,5% (Thomé et al. (2014). Ở Island có 47% (Desvars et al., 2013)

và ở Chile tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó là 25,1% (Maud et al., 2015). Điều

này cho thấy những kết quả nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó

giữa các quốc gia có khác nhau có thể do khác nhau về khí hậu, thời tiết, điều

kiện địa lý của mỗi quốc gia nên tỷ lệ nhiễm khác nhau và do tính thích nghi

của mỗi chó khác nhau cho nên tình hình dịch tễ ở mỗi địa phương khảo sát sẽ

khác nhau (Levett, 2001; Ellis, 2010).

4.1.2 Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên

chó ở một số tỉnh ĐBSCL

4.1.2.1 Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó

Kết quả ở Bảng 4.2 chứng minh gián tiếp có sự lưu hành 18/18

serogroup Leptospira trên chó ở các tỉnh ĐBSCL. Ở Cần Thơ có sự lưu hành

của 15/18 serogroup Leptospira dao động từ 1,26% đến 30,82%; Vĩnh Long

có sự lưu hành của 16/18 serogroup. An Giang có sự lưu hành của 11/18 sergroup và tại tỉnh Cà Mau có sự lưu hành của 14/18 serogroup Leptospira.

Nhìn chung, chó ở 4 tỉnh ĐBSCL nhiễm với tỷ lệ cao các serogroup L.

icterohaemorrhagiae (35,05%), L. canicola (18,43%), L. hurstbridge

(12,69%), L. bataviae (12,08%) và L. gryppotyphosa (12,08%). Dựa theo một

số nghiên cứu trên thế giới đã khảo sát về tình hình nhiễm xoắn khuẩn

Leptospira trên chó ở các quốc gia khác nhau có tỷ lệ dương tính với xoắn

khuẩn Leptospira khác nhau và khác nhau về tỷ lệ nhiễm giữa các serogroup.

Khảo sát của Ayral et al. (2014), phát hiện có sự lưu hành serogroup L.

gryppotyphosa (9%) và L. sejroe (6%) trên chó, nghiên cứu của Roach et al.

(2010) có sự lưu hành của serogroup L. canicola với tỷ lệ nhiễm 68%;

Barmettler et al. (2011) tỷ lệ nhiễm serogroup L. gryppotyphosa 35% và

Leonardo et al. (2011) tỷ lệ nhiễm serogroup L. gryppotyphosa 37,14%, hay khảo sát của Thomé et al. (2014) serogroup L. icterohaemorrhagiae chiếm tỷ

lệ 86,7% và Maud et al. (2015) tỷ lệ serogroup L. canicola nhiễm 50%.

Tóm lại, mỗi nghiên cứu ở những quốc gia khác nhau có tỷ lệ nhiễm

Leptospira và serogroup Leptospira trên chó khác nhau. Kết quả nghiên cứu

đã chứng minh được ở 4 tỉnh ĐBSCL đã có sự lưu hành các serogroup Leptospira và tương tự trong nghiên cứu của Vũ Đạt và Lê Huỳnh Thanh

Phương (1999) đã chứng minh được trên chó ở vùng phụ cận Hà Nội cũng có nhiễm các serogroup L. bataviae, L. canicola, L. gryppotyphosa và L. icterohaemorrhagiae và các serogroup này đã có trong vaccine phòng bệnh

trên chó. Tuy nhiên, tùy theo tình hình dịch tễ ở mỗi quốc gia mà có vaccine

phòng bệnh Leptospirosis khác nhau.

Leptospirosis trên chó như Vanguards plus 5/cv-L, Recombitek, Eurican hay

Ở Việt Nam, một số vaccine đã và đang được sử dụng để tiêm phòng

Hipradog. Ở Châu Âu, vaccine phòng được 2 nhóm huyết thanh gồm L. icterohaemorrhagiae và L. canicola (Kohn et al., 2010); và vaccine phòng được 3 nhóm huyết thanh: L. icterohaemorrhagiae, L. canicola và L. gryppotyphosa hay 4 nhóm huyết thanh gây bệnh L. icterohaemorrhagiae, L.

canicola, L. pomona và L. gryppotyphosa (Maele et al., 2008) và tiêm chủng

hai, ba lần cách nhau 4 tuần sẽ bảo vệ cho chó ít nhất là 12 tháng (Klaasen et

al., 2013).

Bảng 4.2 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh Leptospira trên chó

Cần Thơ (650 mẫu huyết

Vĩnh Long (256 mẫu huyết

An Giang (263 mẫu huyết

Cà Mau (264 mẫu huyết

Tính chung (1.433 mẫu huyết thanh)

thanh)

Các serogroup

Số lượt

Tỷ lệ

Số lượt

Tỷ lệ

Số lượt

Tỷ lệ

STT

Leptospira

nhiễm

(%)

L. australis L. autumnalis

6,92 -

11 -

1 2

- 7,55

- 4

8 6

11,59 8,70

- 4,00

19 12

5,74 3,63

- 2

L. bataviae L. canicola

17,61 23,27

28 37

3 4

5,66 9,43

3 5

5 7

7,25 10,14

8,00 24,00

40 61

12,08 18,43

4 12

L. ballum L. icterohaemorrhagiae

2,52 30,82

4 49

5 6

- 88,68

- 47

- 7

- 10,14

6,00 26,00

7 116

2,11 35,05

3 13

L. pyrogenes L. cynopterie L. gryppotyphosa

8,18 3,77 21,38

13 6 34

7 8 9

7,55 - 5,66

4 - 3

8 2 3

11,59 2,90 4,35

10,00 2,00 -

30 9 40

9,06 2,72 12,08

5 1 -

L. hebdomadis L. javanica

1,89 6,29

3 10

10 11

- 3,77

- 2

7 7

10,14 10,14

4,00 6,00

12 22

3,63 6,65

2 3

L. panama L. semaranga

5,66 -

9 -

12 13

28,30 -

15 -

3 1

4,35 1,45

4,00 4,00

29 3

8,76 0,91

2 2

L. pomona L. tarassovi

1,26 -

2 -

14 15

3,77 -

2 -

3 1

4,35 1,45

4,00 -

9 1

2,72 0,30

2 -

L. sejroe L. louisiana

3,14 5,66

5 9

16 17

7,55 -

4 -

20 -

28,99 -

4,00 -

31 9

9,37 2,72

2 -

L. hurstbridge

7,55

2,90

16,00

12,69

17,61

159

331

Tổng số mẫu dương tính

4.1.2.2 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó

Kết quả Bảng 4.3 cho thấy trong 1.433 mẫu huyết thanh chó kiểm tra, có

331 mẫu ngưng kết với các serogroup Leptospira. Ở hiệu giá ngưng kết 1:

200, chó nhiễm 18/18 serogroup Leptospira, chủ yếu serogroup L. autumnalis, L. ballum, L. semaranga, L. tarassovi và L. sejroe với tỷ lệ từ 83,87% đến

100%. Ở hiệu giá ngưng kết 1: 400, chó nhiễm 16/18 serogroup Leptospira,

chủ yếu L. bataviae, L. canicola, L. pyrogenes, L. panama và L. louisiana, với tỷ lệ từ 22,50% đến 33,33%. Ở hiệu giá ngưng kết 1: 800, chó nhiễm 7/18

serogroup Leptospira, chủ yếu L. canicola, L. icterohaemorrhagiae, L.

cynopterie, L. gryppotyphosa và L. panama, với tỷ lệ từ 4,92% đến 11,11%. Ở

hiệu giá ngưng kết 1: 1600, chó nhiễm 3/18 serogroup Leptospira: L. canicola, L. icterohaemorrhagiae và L. gryppotyphosa, với tỷ lệ từ 1,72% đến 3,28% và

ở hiệu giá ngưng kết 1: 3200, chó nhiễm 1/18 serogroup Leptospira với tỷ lệ

thấp đó là L. canicola (1,64%). Nhìn chung chó nhiễm serogroup Leptospira ở

các khu vực khảo sát tập trung chủ yếu ở hiệu giá 1: 200 đến 1: 800. Hiệu giá

kháng thể phản ánh hàm lượng kháng thể có trong máu chó. Hàm lượng kháng

thể còn tùy thuộc vào tính chất kháng nguyên, số lượng mầm bệnh xâm nhập,

sức đề kháng của cơ thể và thời gian lấy máu kiểm tra sau khi chó bị nhiễm

mầm bệnh (Sykes et al., 2011).

So với kết quả nghiên cứu của Vũ Đình Hưng (1995) thì kết quả nghiên

cứu về cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó ở ĐBSCL thấp hơn,

ở hiệu giá ngưng kết 1: 800 là 56,39% và 1: 1600 - 1: 3200 là 41,23%,

serogroup Leptospira chủ yếu là L. bataviae và L. canicola và nghiên cứu của

Lê Huỳnh Thanh Phương (2001), ở hiệu giá ngưng kết chủ yếu từ 1: 800 đến

1: 1600 với 4 serogroup Leptospira phổ biến là L. canicola (44,44%), L. bataviae (42,35%), L. gryppotyphosa (39,66%) và L. icterohaemorrhagiae (39,47%). Theo khảo sát của Mayer-Scholl et al. (2013), vào 1950s tại Đức, serogroup L. canicola và L. icterohaemorrhagiae là hai nhóm gây bệnh phổ biến trên chó và đến nay có thêm hai serogroup L. gryppotyphosa và L. pomona gây nhiễm với tỷ lệ cao. Ở Anh, chó nhiễm chủ yếu nhóm L. australis với tỷ lệ cao (80%) và ở Mỹ nhóm huyết thanh gây nhiễm phổ biến trên chó là L. icterohaemorrhagiae (Claudia et al., 2013).

Dựa vào hiệu giá kháng thể kháng các serogroup Leptospira ở kết quả Bảng 4.3 cho thấy serogroup L. canicola và L. icterohaemorrhagiae trên chó ở ĐBSCL từ 1: 1600 đến 1: 3200, mức hiệu giá này khá cao. Hiệu giá kháng thể 62

cao chứng tỏ mức độ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira cao. Tuy nhiên, còn tùy

vào mỗi vùng, mỗi khu vực, mỗi quốc gia có thể nhiễm các serogroup

Leptospira với cường độ khác nhau và còn tùy thuộc vào thời điểm lấy mẫu và

tình trạng sức khỏe của con vật lúc lấy huyết thanh và điều kiện nuôi dưỡng của chó.

Bảng 4.3 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chó trong số mẫu dương tính

Hiệu giá ngưng kết Leptospira

1: 400

1: 3200

Số lượt nhiễm

1: 200 Số lượt

1: 800 Số lượt

Tỷ lệ

1: 1600 Số lượt

Tỷ lệ

Số lượt

Tỷ lệ

Số lượt

Tỷ lệ

Các serogroup

STT

Leptospira

serogroup

nhiễm

(%)

nhiễm

(%)

nhiễm

(%)

nhiễm

(%)

L. australis

21,05

78,95

0,00

L. autumnalis L. bataviae

2 3

12 40

8,33 22,50

11 31

91,67 77,50

1 9

0 0

0,00 0,00

0 0

0,00 0,00

L. canicola L. ballum

4 5

61 7

22,95 14,29

41 6

67,21 85,71

14 1

3 0

4,92 0,00

2 0

1 0

3,28 0,00

1,64 0,00

L. icterohaemorrhagiae L. pyrogenes

116 30

6 7

18,97 23,33

86 22

74,14 73,33

22 7

6 1

5,17 3,33

2 0

0 0

1,72 0,00

0,00 0,00

L. cynopterie L. gryppotyphosa

8 9

9 40

22,22 17,50

6 30

66,67 75,00

2 7

1 2

11,11 5,00

0 1

0 0

0,00 2,50

0,00 0,00

10 L. hebdomadis 11 L. javanica

12 22

41,67 27,27

7 15

58,33 68,18

5 6

0 1

0,00 4,55

0 0

0,00 0,00

12 L. panama 13 L. semaranga

29 3

31,03 0,00

17 3

58,62 100,00

9 0

3 0

10,34 0,00

0 0

0,00 0,00

14 L. pomona 15 L. tarassovi

9 1

22,22 0,00

7 1

77,78 100,00

2 0

0 0

0,00 0,00

0 0

0,00 0,00

16 L. sejroe 17 L. louisiana

31 9

16,13 33,33

26 6

83,87 66,67

5 3

0 0

0,00 0,00

0 0

0,00 0,00

18 L. hurstbridge

21,43

78,57

0,00

Tổng lượt

3,46

1,02

0,2

492

363/492

73,78

106/492

21,54

17/492

5/492

1/492

Giống chó

Tỷ lệ (%)

Số mẫu huyết thanh kiểm tra

Số mẫu huyết thanh dương tính

835

198

Chó nội

23,71a

598

133

22,24a

Chó ngoại

4.1.3 Tình hình nhiễm Leptospira theo giống chó 4.1.3.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo giống chó Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo giống chó

Qua kiểm tra nhóm giống chó nội, tổng số 835 mẫu huyết thanh chó có 198 mẫu dương tính với Leptospira chiếm tỷ lệ 23,71% và nhóm giống chó

ngoại 598 mẫu huyết thanh có 133 mẫu dương tính với Leptospira chiếm tỷ lệ 22,24%. Sự sai khác giữa hai nhóm giống không có ý nghĩa thống kê. Kết quả

cho thấy tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó không ảnh hưởng bởi yếu tố giống.

Điều này có thể được giải thích do những chó khảo sát sống trong cùng điều

kiện môi trường về vị trí địa lý, khí hậu, nhiệt độ, ẩm độ nên có nhiều khả

năng chó tiếp xúc với mầm bệnh đặc biệt là loài gặm nhấm như nhau nên tỷ lệ

nhiễm Leptospira không khác biệt giữa hai nhóm chó nội và chó ngoại.

So sánh với nghiên cứu trên thế giới bằng phương pháp khảo sát mẫu

huyết thanh chó cắt ngang và kết quả cho thấy không có sự khác nhau về tỷ lệ

nhiễm Leptospira giữa các giống chó (Harland et al., 2013) hay nhận xét của

Maele et al. (2008), yếu tố giống không ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm Leptospira

và sự lây nhiễm của Leptospira trên chó không phụ thuộc vào giống chó.

4.1.3.2 Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira theo giống chó

Nhóm giống chó nội nhiễm 18/18 serogroup Leptospira và giống chó

ngoại nhiễm 17/18 serogroup Leptospira. Nhóm giống chó nội nhiễm các

serogroup Leptospira với tỷ lệ cao: serogroup L. icterohaemorrhagiae

(35,86%), L. canicola (20,20%), L. pyrogenes và L. sejroe (12,63%) và L. bataviae (10,61). Nhóm giống chó ngoại nhiễm chủ yếu các serogroup Leptospira: L. icterohaemorrhagiae (33,83%), L. hurstbridge (16,54%), L. canicola (15,79%), L. gryppotyphosa (15,04%) và L. bataviae (14,29). Ba

nhóm huyết thanh Leptospira đồng nhiễm trên hai nhóm giống chó nội và nhóm giống chó ngoại là L. icterohaemorrhagiae, L. canicola và L. bataviae.

Kết quả nghiên cứu này tương tự nghiên cứu của Harland et al. (2013), một số

serogroup Leptospira dương tính trên giống chó nội cũng dương tính trên

nhóm giống chó ngoại, và tỷ lệ dương tính Leptospira không phân biệt giống

chó.

Bảng 4.5 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh Leptospira theo giống chó

Chó giống nội (835 mẫu huyết thanh) Chó giống ngoại (598 mẫu huyết thanh)

STT

Các serogroup Leptospira

Số lượt nhiễm

Tỷ lệ (%)

Số lượt nhiễm

Tỷ lệ (%)

L. australis

7,07

3,76

2 3

L. autumnalis L. bataviae

8 21

4,04 10,61

4 19

3,01 14,29

4 5

L. canicola L. ballum

40 3

20,20 1,52

21 4

15,79 3,01

6 7

L. icterohaemorrhagiae L. pyrogenes

71 25

35,86 12,63

45 5

33,83 3,76

8 9

L. cynopterie L. gryppotyphosa

5 20

2,53 10,10

4 20

3,01 15,04

10 L. hebdomadis 11 L. javanica

6 14

3,03 7,07

6 8

4,51 6,02

12 L. panama 13 L. semaranga

16 1

8,08 0,51

13 2

9,77 1,50

14 L. pomona 15 L. tarassovi

6 1

3,03 0,51

3 0

2,26 0,00

16 L. sejroe 17 L. louisiana

25 5

12,63 2,53

6 4

4,51 3,01

18 L. hurstbridge

10,10

16,54

Tổng số mẫu dương tính

198

133

4.1.4 Tình hình nhiễm Leptospira trên chó theo lứa tuổi

Bảng 4.6 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo lứa tuổi chó

Số mẫu huyết

Số mẫu huyết thanh

Độ tuổi

Tỷ lệ (%)

thanh kiểm tra

dương tính

4 tháng < 12 tháng tuổi

358

21,51a

≤ 1-6 năm tuổi

737

166

22,52a

26,04a

338

4.1.4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó theo lứa tuổi

≥ 6 năm tuổi

Qua kết quả Bảng 4.6 cho thấy, chó lớn hơn 6 năm tuổi có tỷ lệ dương tính với Leptospira cao nhất là (26,04%), kế đến chó từ ≤ 1 tuổi đến 6 năm

tuổi, có tỷ lệ dương tính Leptospira là 22,52% và chó từ 4 tháng đến dưới 12

tháng tuổi nhiễm thấp nhất (21,51%), sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Điều này có thể được giải thích do những chó từ 4 tháng đến < 12 tháng

tuổi là những chó còn nhỏ, phạm vi hoạt động hẹp cho nên mức độ tiếp xúc

với môi trường bên ngoài ít nên tỷ lệ dương tính thấp (Levett, 2001). Chó ở độ

tuổi từ 1 đến 6 năm tuổi là giai đoạn thành thục về sinh sản, phạm vi hoạt

động rộng hơn để tìm bạn tình, tiếp xúc với môi trường sống nhiều hơn, đặc

biệt là môi trường có nhiễm nước tiểu của loài gặm nhấm làm tăng thêm nguy

cơ lây nhiễm Leptospira, kháng thể kháng Leptospira hiện diện trong cơ thể

chó do tiếp xúc với mầm bệnh từ môi trường tự nhiên. Tỷ lệ nhiễm Leptospira

cao nhất ở chó lớn hơn 6 năm tuổi, đây là giai đoạn chó bước sang tuổi già,

sức đề kháng kém, ở giai đoạn này có thể do sự tích lũy về tỷ lệ nhiễm trong

quần thể chó, tỷ lệ nhiễm cao hơn chủ yếu là miễn dịch mang trùng. Điều này

cho thấy Leptospira có thể gây bệnh cho chó ở mọi lứa tuổi, chó càng lớn tuổi có tỷ lệ nhiễm càng cao (Harland et al., 2013).

So với kết quả nghiên cứu của Lê Huỳnh Thanh Phương (2001), tỷ lệ nhiễm Leptospira trung bình trên chó trên 1 năm tuổi (27,13%) cao hơn chó dưới 1 năm tuổi (24,41%) và nghiên cứu của Vũ Đình Hưng (1995), chó trên 1 năm tuổi (32,49%) có tỷ lệ nhiễm Leptospira cao hơn chó dưới 1 năm tuổi

(14,28%). So với kết quả nghiên cứu của Mayer-Scholl et al. (2013) tại Berlin (Đức) chó lớn hơn 6 năm tuổi nhiễm Leptospira với tỷ lệ cao nhất (50%) và

thấp nhất chó dưới 1 năm tuổi (12%). Như vậy tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó

xảy ra ở mọi độ tuổi và chó lớn tuổi có tỷ lệ dương tính Leptospira cao hơn.

4.1.4.2 Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira theo lứa tuổi chó

Qua Bảng 4.7 cho thấy tỷ lệ nhiễm Leptospira có khác nhau giữa 3 lứa tuổi. Chó từ 4 tháng đến < 12 tháng tuổi và chó ≤ 1-6 năm tuổi phát hiện được

17/18 serogroup kháng thể kháng Leptospira và chó ≥ 6 tuổi phát hiện được

18/18 serogroup Leptospira và tỷ lệ nhiễm từng serogroup Leptospira của mỗi lứa tuổi chó có khác nhau.

Trong 18 serogroup Leptospira phát hiện được 2 serogroup L. canicola

và L. icterohaemorrhagiae có tỷ lệ dương tính cao ở độ tuổi: chó từ 4 tháng

đến < 12 tháng tuổi với tỷ lệ nhiễm tương ứng là: 20,78% và 40,26%, chó ≤ 1-6 năm tuổi: 19,28% và 39,76% và 2 serogroup L. bataviae và L.

icterohaemorrhagiae đối với chó ≥ 6 năm tuổi 15,91% và 21,59%. Từ năm

1981, Hathway cho rằng L. canicola được coi là serogroup gây bệnh chính cho

chó và bệnh từ chó truyền sang các loài gia súc khác. Đến 1984, Hartman

khẳng định ngoài nhóm L. canicola còn có thêm nhóm L.

icterohaemorrhagiae là serogroup gây bệnh cho chó trên khắp thế giới. Khi cơ

thể nhiễm bệnh, Leptospira sẽ được bài thải ra ngoài theo nước tiểu kéo dài từ

vài tháng hoặc vài năm, trong đó L. icterohaemorrhagiae gây bệnh nặng nhất

cho chó chưa trưởng thành, còn L. canicola gây bệnh cho cả chó non và chó

chưa trưởng thành (Lê Huỳnh Thanh Phương, 2001).

Bảng 4.7 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh Leptospira theo lứa tuổi

Chó ≥ 6 năm tuổi (338 mẫu huyết thanh)

Chó ≤ 1-6 năm tuổi (737 mẫu huyết thanh)

Chó từ 4 tháng đến < 12 tháng tuổi (358 mẫu huyết thanh)

STT

Các serogroup Leptospira

Tỷ lệ (%)

Số lượt nhiễm

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

L. australis L. autumnalis L. bataviae L. canicola L. ballum L. icterohaemorrhagiae L. pyrogenes L. cynopterie L. gryppotyphosa L. hebdomadis L. javanica L. panama L. semaranga L. pomona L. tarassovi L. sejroe L. louisiana L. hurstbridge

Tổng số mẫu dương tính

5 2 14 16 2 31 5 4 7 6 3 9 1 4 1 13 3 12 77

10 7 12 32 2 66 18 3 23 1 13 15 1 4 0 13 2 18

6,49 2,60 18,18 20,78 2,60 40,26 6,49 5,19 9,09 7,79 3,90 11,69 1,30 5,19 1,30 16,88 3,90 15,58

6,02 4,22 7,23 19,28 1,20 39,76 10,84 1,81 13,86 0,60 7,83 9,04 0,60 2,41 0,00 7,83 1,20 10,84 166

4 3 14 13 3 19 7 2 10 5 6 5 1 1 0 5 4 12 88

4,55 3,41 15,91 14,77 3,41 21,59 7,95 2,27 11,36 5,68 6,82 5,68 1,14 1,14 0,00 5,68 4,55 13,64

4.1.5 Tình hình nhiễm Leptospira trên chó theo giới tính

Bảng 4.8 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo giới tính

Số mẫu huyết thanh

Giới tính

Tỷ lệ (%)

kiểm tra

dương tính

Chó đực

715

173

24,20a

Chó cái

718

158

22,01a

4.1.5.1 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo giới tính

Theo kết quả trình bày Bảng 4.8, cho thấy chó đực dương tính với

Leptospira (24,20%) và chó cái (22,01%) và khác biệt không có ý nghĩa thống

kê. Theo kết quả nghiên cứu của Senthil et al. (2013), tỷ lệ nhiễm

Leptospira trên chó đực (20,9%) và chó cái (21%) là tương đương nhau và

nghiên cứu của Anabel et al. (2013) chó đực và chó cái có huyết thanh dương

tính với Leptospira không khác nhau và nhận xét Dhliwayo et al. (2012) tỷ lệ

chó dương tính với Leptospira không phụ thuộc theo giới tính.

4.1.5.2 Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira theo giới tính

Qua kết quả trình bày ở Bảng 4.9, trong 18 serogroup xét nghiệm, chó

đực nhiễm 18/18 serogroup và chó cái nhiễm 17/18 serogroup Leptospira,

trong đó có 2 serogroup nhiễm cao trên chó đực và chó cái là: serogroup L.

icterohaemorrhagiae và L. canicola (35,26% và 16,18% tương ứng trên chó

đực và 34,81% và 20,89% tương ứng trên chó cái). Ngoài ra, có thêm L.

bataviae (12,72%) nhiễm cao trên chó đực và L. hurstbridge (13,92%) nhiễm

cao trên chó cái.

So với khảo sát của Lê Huỳnh Thanh Phương (2001) ở các tỉnh thành

phía Bắc Việt Nam, có 5 serogroup Leptospira chiếm tỷ lệ dương tính cao trên chó đực và chó cái là L. canicola, L. icterohaemorrhagiae, L. bataviae, L. gryppotyphosa và L. pomona. Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira ở chó đực và chó cái không có sự sai khác nhau. Trong nghiên cứu này cho thấy những serogroup nào có tỷ lệ nhiễm cao ở chó đực cũng có tỷ lệ nhiễm cao ở chó cái, rõ nhất là serogroup L. bataviae, L. icterohaemorrhagiae, L. canicola,

L. gryppotyphosa và L. hurstbridge.

Bảng 4.9 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh Leptospira theo giới tính

Chó đực (715 mẫu huyết thanh)

Chó cái (718 mẫu huyết thanh)

STT Các serogroup

Số lượt

Tỷ lệ

nhiễm

Tỷ lệ (%)

nhiễm

(%)

Leptospira

L. australis

5,20

6,33

L. autumnalis L. bataviae

2 3

9 22

5,20 12,72

3 18

1,90 11,39

L. canicola L. ballum

4 5

28 2

16,18 1,16

33 5

20,89 3,16

L. icterohaemorrhagiae L. pyrogenes

6 7

61 18

35,26 10,40

55 12

34,81 7,59

L. cynopterie L. gryppotyphosa

8 9

6 21

3,47 12,14

3 19

1,90 12,03

10 L. hebdomadis 11 L. javanica

7 11

4,05 6,36

5 11

3,16 6,96

12 L. panama 13 L. semaranga

17 2

9,83 1,16

12 1

7,59 0,63

14 L. pomona 15 L. tarassovi

5 1

2,89 0,58

4 0

2,53 0,00

16 L. sejroe 17 L. louisiana

15 7

8,67 4,05

16 2

10,13 1,27

18 L. hurstbridge

11,56

13,92

Tổng số mẫu dương tính

173

158

4.1.6 Tình hình nhiễm Leptospira trên chó theo phương thức nuôi

Bảng 4.10 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo phương thức nuôi

Số mẫu huyết

Phương thức nuôi

Tỷ lệ (%)

thanh kiểm tra

thanh dương tính

Nuôi thả

949

246

25,92a

Nuôi nhốt

484

17,56b

Những số liệu trong cùng một cột với chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05).

4.1.6.1 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo phương thức nuôi

Qua kết quả Bảng 4.10 cho thấy chó nuôi thả rong có tỷ lệ dương tính

với Leptospira (25,92%) cao hơn chó nuôi nhốt (17,56%) và sai khác có ý

nghĩa thống kê. Điều này có thể giải thích do chó nuôi thả rong có nhiều cơ

hội tiếp xúc với mầm bệnh hơn như thông qua hoạt động tìm kiếm thức ăn hằng ngày, tiếp xúc với nước tiểu chuột hoặc uống nước bẩn, ăn thức ăn có

nhiễm Leptospira hơn chó nuôi nhốt (Garde, 2013).

So với kết quả nghiên cứu Jiminez-Coello et al. (2008), Blum et al. (2013), Tuemmers et al. (2013) và Suepaul et al. (2014) khẳng định chó nuôi

thả rong có tỷ lệ dương tính với Leptospira cao hơn chó nuôi nhốt. Điều này

có thể do chó nuôi thả rong ít được quan tâm chăm sóc, điều kiện vệ sinh kém,

đôi khi phải tự tìm kiếm thức ăn cho nên có nhiều cơ hội tiếp xúc với mầm bệnh hơn, đặc biệt là môi trường có nhiều loài gặm nhấm sinh sống sẽ truyền

xoắn khuẩn Leptospira sang cho chó (Garde, 2013).

4.1.6.2 Tỷ lệ chó nhiễm các serogroup Leptospira theo phương thức

nuôi

Trong các serogroup xét nghiệm, chó được nuôi thả rong nhiễm 18

serogroup và chó nuôi nhốt nhiễm 15 serogroup, trong đó dương tính với 3

serogroup có tỷ lệ cao L. canicola, L. icterohaemorrhagiae và L.

gryppotyphosa ở chó nuôi thả rong và serogroup L. canicola, L.

icterohaemorrhagiae và L. hurstbridge ở chó nuôi nhốt. Theo Paul et al.

(2009), chó thường nhiễm L. canicola và bài thải xoắn khuẩn qua nước tiểu

trong nhiều tháng, và chuột thường nhiễm L. icterohaemorrhagiae và bài thải

xoắn khuẩn qua nước tiểu suốt đời. Dựa vào kết quả khảo sát cho thấy chó

nuôi thả rong và nuôi nhốt đều nhiễm L. canicola và L. icterohaemorrhagiae,

có thể có sự tiếp xúc giữa chó và chuột, khi gặp điều kiện thuận lợi như độ ẩm thích hợp, pH trung tính hoặc kiềm mầm bệnh sẽ tồn tại lâu hơn nên dễ lây lan mầm bệnh (Levett, 2001).

Kết quả nghiên cứu này tương tự như kết quả của Blum et al. (2013), chó nuôi thả và nuôi nhốt đều có tỷ lệ dương tính cao với serogroup Leptospira canicola và L. icterohaemorrhagiae; đặc biệt chó nuôi thả nhiễm chủ yếu với serogroup Leptospira icterohaemorrhagiae (Suepaul et al., 2014). Điều này

chứng tỏ chó nuôi thả rong và chó nuôi nhốt có thể truyền lây các serogroup Leptospira cho nhau và động vật gặm nhấm cũng là nguồn truyền lây.

Bảng 4.11 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh Leptospira theo phương thức nuôi

Nuôi thả (949 mẫu huyết thanh) Nuôi nhốt (484 mẫu huyết thanh)

STT

Các serogroup Leptospira

Số lượt nhiễm

Tỷ lệ (%)

Số lượt nhiễm

Tỷ lệ (%)

L. australis L. autumnalis

1 2

14 12

5,69 4,88

5 0

5,88 0,00

L. bataviae L. canicola

3 4

25 45

10,16 18,29

15 16

17,65 18,82

L. ballum L. icterohaemorrhagiae

5 6

5 87

2,03 35,37

2 29

2,35 34,12

7 8

L. pyrogenes L. cynopterie

16 7

6,50 2,85

14 2

16,47 2,35

L. gryppotyphosa

9 10 L. hebdomadis

34 8

13,82 3,25

6 4

7,06 4,71

11 L. javanica 12 L. panama

16 24

6,50 9,76

6 5

7,06 5,88

13 L. semaranga 14 L. pomona

3 8

1,22 3,25

0 1

0,00 1,18

15 L. tarassovi 16 L. sejroe

1 25

0,41 10,16

0 6

0,00 7,06

17 L. louisiana 18 L. hurstbridge

4 22

1,63 8,94

5 20

5,88 23,53

Tổng số mẫu dương tính

246

Tóm lại tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó

- Tỷ lệ nhiễm Leptospira tính chung trên chó ở một số tỉnh ĐBSCL là

23,10%.

- Các serogroup chiếm tỷ lệ cao L. icterohaemorrhagiae (35,05%), L. canicola (18,43%), L. bataviae (12,08%), L. gryppotyphosa (12,08%) và L.

hurstbridge (12,69%).

- Cường độ nhiễm tập trung chủ yếu ở hiệu giá ngưng kết 1: 200 đến 1: 800. Ở hiệu giá 1: 200, chó nhiễm 18/18 serogroup Leptospira. Ở hiệu giá 1:

400, 1: 800, 1: 1600 và 1: 3200 chó nhiễm 16/18, 7/18, 3/18 và 1/18 serogroup

Leptospira tương ứng.

- Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó không phụ thuộc vào nhóm giống, lứa

tuổi, giới tính nhưng phụ thuộc vào phương thức nuôi.

4.1.7 Kết quả khảo sát sự lưu hành Leptospira trên chuột và vai trò

của chuột trong sự lưu hành Leptospira trên chó

4.1.7.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột

Trong tổng số 647 mẫu huyết thanh chuột kiểm tra có 229 mẫu dương

tính với Leptospira chiếm tỷ lệ 35,40%. Trong đó tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn

Leptospira cao nhất là chuột cống 46,32%, kế đến là chuột nhắt (27,14%) và

tỷ lệ nhiễm thấp nhất là chuột xạ (26,32%). Chuột cống có tỷ lệ dương tính với

Leptospira cao hơn chuột xạ và chuột nhắt, sai khác nhau có ý nghĩa thống kê

Bảng 4.12 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột ở một số tỉnh ĐBSCL

Loại chuột

Số mẫu huyết

Tỷ lệ

(%)

thanh kiểm tra

thanh dương tính

Chuột cống (Rattus norvegicus)

46,32a

132

285

Chuột xạ (Suncus murinus)

26,32b

152

27,14b

210

Chuột nhắt (Mus musculus)

Tổng

35,40

229

647

Những số liệu trong cùng một cột với chữ mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05).

(P<0,05).

So với khảo sát về tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột của các tác giả khác

nhau sẽ có tỷ lệ nhiễm Leptospira khác nhau như nghiên cứu của Vũ Đình

Hưng (1995) tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột ở Hà Nội 34,01%, Nguyễn Thị

Ngân (2000) và Lê Huỳnh Thanh Phương (2001) khảo sát tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam liên tục 2 năm (2000-

2001) có tỷ lệ nhiễm là 63%, hay khảo sát của Lý Thị Liên Khai (2012) tại

Công ty cổ phần thủy sản Sông Hậu Cần Thơ, tỷ lệ chuột dương tính với Leptospira là 55,55%) và đến năm 2015, Loan et al. khảo sát tỷ lệ nhiễm

Leptospira trên chuột ở 5 tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, kết quả tỷ lệ chuột

dương tính trung bình là 18,3%, trong đó loại chuột cống chiếm tỷ lệ cao nhất

(33%). Tóm lại, tỷ lệ chuột dương tính với Leptospira ở các địa điểm khảo sát khác nhau có thể do khác nhau về vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên và chuột là

loài gặm nhấm thường sống trong cống rãnh, các khu vực rác thải nên tỷ lệ

dương tính với Leptospira trên chuột giữa các nghiên cứu cũng khác nhau

(Suepaul et al., 2014).

4.1.7.2 Tỷ lệ nhiễm các serogroup Leptospira trên chuột ở một số

tỉnh ĐBSCL

Kết quả ở Bảng 4.13 chứng minh gián tiếp có sự lưu hành 18/18

serogroup Leptospira trên chuột ở 4 tỉnh ĐBSCL. Trong đó các serogroup

chiếm tỷ lệ cao như: serogroup L. icterohaemorrhagiae (40,61%), L.

canicola (20,52%), L. bataviae (13,97%), L. panama (10,92%) và

serogroup L. hurstbridge (10,92%). So với kết quả nghiên cứu của Vũ

Đình Hưng (1995) chuột nhiễm chủ yếu là L. bataviae và L. pomona hay

nghiên cứu của Hoàng Kim Loan et al. (2013) về tỷ lệ nhiễm Leptospira

trên các loài gặm nhấm ở miền Nam Việt Nam có 2 serogroup chiếm tỷ lệ cao trên chuột gồm L. bataviae và L. hurstbridge. Kết hợp với kết quả

giám định huyết thanh của chó ngay tại các địa phương bẫy chuột, nghiên cứu cho thấy 5 serogroup có tỷ lệ nhiễm cao trên chuột thì có 4 serogroup nhiễm cao ở chó (Bảng 4.2).

Bảng 4.13 Tần suất xuất hiện kháng thể kháng các nhóm huyết thanh Leptospira trên chuột

Cần Thơ (195 mẫu huyết thanh)

Vĩnh Long (140 mẫu huyết thanh)

An Giang (185 mẫu huyết thanh)

Cà Mau (127 mẫu huyết thanh)

STT

Các serogroup Leptospira

L. australis L. autumnalis L. bataviae L. canicola L. ballum L. icterohaemorrhagiae L. pyrogenes L. cynopterie L. gryppotyphosa

2 3 4 5 6 7 8 9 10 L. hebdomadis 11 L. javanica 12 L. panama 13 L. semaranga 14 L. pomona 15 L. tarassovi 16 L. sejroe 17 L. louisiana 18 L. hurstbridge Tổng số mẫu dương tính

Số lượt nhiễm 6 - 19 15 - 17 15 - 3 - - 12 - 9 - 7 2 16 76

Tỷ lệ (%) 7,89 - 25,00 19,74 - 22,37 19,74 - 3,95 - - 15,79 - 11,84 - 9,21 2,63 21,05

Số lượt nhiễm 3 5 6 8 1 25 1 2 6 2 3 1 - - 4 6 4 3 56

Tỷ lệ (%) 5,36 8,93 10,71 14,29 1,79 44,64 1,79 3,57 10,71 3,57 5,36 1,79 - - 7,14 10,71 7,14 5,36

Số lượt nhiễm 2 3 2 15 - 35 1 6 8 4 8 8 1 6 1 5 4 2 60

Tỷ lệ (%) 3,33 5,00 3,33 25,00 - 58,33 1,67 10,00 13,33 6,67 13,33 13,33 1,67 10,00 1,67 8,33 6,67 3,33

Số lượt nhiễm 1 1 5 9 3 16 2 2 1 - 2 4 - 2 2 4 - 4 37

Tính chung (647 mẫu huyết thanh) Tỷ lệ (%) 5,24 3,93 13,97 20,52 1,75 40,61 8,30 4,37 7,86 2,62 5,68 10,92 0,44 7,42 3,06 9,61 4,37 10,92

Số lượt nhiễm 12 9 32 47 4 93 19 10 18 6 13 25 1 17 7 22 10 25 229

Tỷ lệ (%) 2,70 2,70 13,51 24,32 8,11 43,24 5,41 5,41 2,70 - 5,41 10,81 - 5,41 5,41 10,81 - 10,81

4.1.7.3 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chuột

Kết quả trình bày ở Bảng 4.14 cho thấy chuột dương tính với các serogroup Leptospira chủ yếu tập trung ở hiệu giá kháng thể thấp từ 1: 20 đến

1: 40, dao động trung bình từ 66,76% (247/370 lượt ngưng kết) và 21,35%

(79/370 lượt ngưng kết). Ở hiệu giá ngưng kết 1: 20 và 1: 40 chuột nhiễm

18/18 serogroup Leptospira. Ở hiệu giá ngưng kết 1: 80 chiếm 8,92% (33/370 lượt ngưng kết), chuột nhiễm 10/18 serogroup Leptospira. Ở hiệu giá ngưng kết 1: 160 chiếm 2,70 % (10/370 lượt ngưng kết), chuột nhiễm 7/18 serogroup

Leptospira và ở hiệu giá ngưng kết 1: 320 chiếm 0,27 % (1/370 lượt ngưng

kết), chuột nhiễm 1/18 serogroup Leptospira. Hiệu giá kháng thể phản ánh

hàm lượng kháng thể có trong máu chuột, nếu hiệu giá càng cao chứng tỏ mức

độ nhiễm xoắn khuẩn càng cao và ngược lại (Levett, 2001). Trong nghiên cứu

cho thấy chuột nhiễm Leptospira chủ yếu tập trung ở hiệu giá thấp từ 1: 20

đến 1: 40. Điều này chứng tỏ chuột ở các địa điểm khảo sát nhiễm xoắn khuẩn

Leptospira ở mức độ thấp, chuột vẫn còn đang trong giai đoạn mang trùng dẫn

đến hàm lượng kháng thể trong huyết thanh thấp. Ngoài ra, loài chuột có thể

nhiễm thêm một số chủng Leptospira, tuy chúng không gây thành dịch bệnh,

không biểu hiện triệu chứng lâm sàng nhưng có thể truyền mầm bệnh cho các

loài vật khác, kể cả con người (Levett, 2001).

So với khảo sát của Hoàng Mạnh Lâm (2002), chuột nhiễm Leptospira

chủ yếu tập trung ở hiệu giá ngưng kết 1: 40 và 1: 80 và nghiên cứu của Lê

Huỳnh Thanh Phương (2001), từ 1: 80 đến 1: 160. Như vậy tùy thuộc vào thời

gian, địa điểm và vị trí địa lý của các địa phương thu thập mẫu huyết thanh

chuột khác nhau sẽ có hiệu giá ngưng kết kháng thể khác nhau, chủ yếu chuột

chỉ nhiễm Leptospira ở giai đoạn mang trùng chưa bọc phát thành dịch.

Bảng 4.14 Cường độ nhiễm các serogroup Leptospira trên chuột trong số mẫu dương tính

Hiệu giá kháng thể Leptospira

1: 20

1: 40

1: 80

1: 160

1: 320

Các serogroup Leptospira L. australis L. autumnalis L. bataviae L. canicola L. ballum L. icterohaemorrhagiae L. pyrogenes L. cynopterie L. gryppotyphosa

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L. hebdomadis 11 L. javanica 12 L. panama 13 L. semaranga 14 L. pomona 15 L. tarassovi 16 L. sejroe 17 L. louisiana 18 L. hurstbridge

Số lượt nhiễm 12 9 32 47 4 93 19 10 18 6 13 25 1 17 7 22 10 25

Số nhiễm 9 6 18 36 4 54 11 9 13 4 10 17 1 10 7 16 8 14

Tỷ lệ (%) 75,00 66,67 56,25 76,60 100,00 58,06 57,89 90,00 72,22 66,67 76,92 68,00 100,00 58,82 100,00 72,73 80,00 56,00

Số nhiễm 1 0 4 4 0 13 2 0 1 0 0 1 0 2 0 2 0 3

Tỷ lệ (%) 8,33 0,00 12,50 8,51 0,00 13,98 10,53 0,00 5,56 0,00 0,00 4,00 0,00 11,76 0,00 9,09 0,00 12,00

Số nhiễm 0 1 2 1 0 2 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 2

Tỷ lệ (%) 0,00 11,11 6,25 2,13 0,00 2,15 5,26 0,00 0,00 0,00 0,00 4,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 8,00

Số nhiễm 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tỷ lệ (%) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,08 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Tỷ lệ (%) 16,67 22,22 25,00 12,77 0,00 24,73 26,32 10,00 22,22 50,00 15,38 24,00 0,00 29,41 0,00 18,18 20,00 24,00

Số nhiễm 2 2 8 6 0 23 5 1 4 3 2 6 0 5 0 4 2 6

0,27

21,35

Tổng lượt dương tính

370

247

66,76

8,92

2,70

4.1.7.4. Mối tương quan về tỷ lệ dương tính giữa các serogroup

Bảng 4.15 Tỷ lệ dương tính các serogroup Leptospira trên chuột và chó

Tỷ lệ dương

Các serogroup

tính trên chuột

tính trên chó

STT

Leptospira

(%)

L. australis

5,24

5,74

L. autumnalis

3,93

3,63

L. bataviae

13,97

12,08

L. canicola

20,52

18,43

L. ballum

1,75

2,11

L. icterohaemorrhagiae

40,61

35,05

L. pyrogenes

8,30

9,06

L. cynopterie

4,37

2,72

L. gryppotyphosa

7,86

12,08

L. hebdomadis

2,62

3,63

L. javanica

5,68

6,65

L. panama

10,92

8,76

L. semaranga

0,44

0,91

L. pomona

7,42

2,72

L. tarassovi

3,06

0,30

L. sejroe

9,61

9,37

L. louisiana

4,37

2,72

L. hurstbridge

10,92

12,69

R2 = 0,90; P<0,01

Leptospira trên chuột và chó

Qua Bảng 4.15 cho thấy có 18/18 serogoup Leptospira được phát hiện

đồng thời trên chuột và chó tại 4 tỉnh thuộc ĐBSCL. Trong đó có 4 serogoup nhiễm với tỷ lệ cao trên cả chuột và chó gồm serogoup L. bataviae (13,97% và (20,52% và 18,43%), serogoup L. 12,08%), serogoup L. canicola

icterohaemorrhagiae (40,61% và 35,05%) và serogoup L. hurstbridge

(10,92% và 12,69%). Như vậy serogroup nào nhiễm cao trên chó đều nhiễm

cao trên chuột ngoại trừ hai serogroup L. gryppotyphosa và L. panama thì

ngược lại. Điều này có thể do nhóm này hiện diện trên chó và gây bệnh trên chó nhưng không phải gây nhiễm chính trên chuột nên mức kháng thể kháng

Leptospira ngay thời điểm khảo sát sẽ khác nhau và có sự lây truyền qua lại

giữa chuột và chó.

So với kết quả nghiên cứu của Hoàng Mạnh Lâm (2002) khi nghiên cứu

tình hình nhiễm Leptospira trên gia súc và người ở tỉnh Đaklak, các serogoup

cùng được phát hiện trên chuột và chó là serogroup L. icterohaemorrhagiae;

Lê Huỳnh Thanh Phương (2001), các chủng huyết thanh gây nhiễm cao ở chuột và chó gồm serogroup L. bataviae, L. canicola, L. gryppotyphosa, L.

icterohaemorrhagiae và L. pomona.

Phân tích phương trình hồi qui thể hiện mối liên quan giữa tỷ lệ nhiễm

Hình 4.1 Quan hệ tuyến tính giữa tỷ lệ dương tính Leptospira trên chuột (x) và chó (y) 80

Leptospira trên chuột và trên chó là khá chặt chẽ, với hệ số tương quan R2=0,90 thể hiện mức độ tương quan cao và phương trình hồi qui: Y= 0,466 + 0,868x.

Tóm lại tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột

- Tỷ lệ nhiễm Leptospira tính chung trên chuột ở một số tỉnh ĐBSCL

chiếm tỷ lệ 35,40%, trong đó chuột cống nhiễm Leptospira cao nhất (46,32%),

kế đến là chuột nhắt (27,14%) và tỷ lệ nhiễm thấp nhất là chuột xạ (26,32%).

- Các serogroup chiếm tỷ lệ cao như: serogroup L. icterohaemorrhagiae

(40,61%), L. canicola (20,52%), L. bataviae (13,97%), L. panama (10,92%)

và L. hurstbridge (10,92%).

- Cường độ nhiễm chủ yếu tập trung ở hiệu giá kháng thể từ 1: 20 đến 1:

40, chuột nhiễm 18/18 serogroup Leptospira. Ỏ hiệu giá 1: 80, chuột nhiễm

10/18 serogroup Leptospira. Ở hiệu giá ngưng kết 1: 160 và 1: 320 chuột

nhiễm 7/18 và 1/18 serogroup Leptospira tương ứng.

- Tỷ lệ dương tính Leptospira giữa chó và chuột với hệ số tương quan R2=0,90 có thể kết luận rằng giữa tỷ lệ dương tính các nhóm huyết thanh Leptospira trên chó và trên chuột có mối quan hệ rất cao.

4.2 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu

4.2.1 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ nước tiểu bằng kỹ thuật

Bảng 4.16 Tỷ lệ phát hiện Leptospira trực tiếp từ nước tiểu

Tỷ lệ (%)

Triệu chứng lâm sàng

Số mẫu nước tiểu kiểm tra

Số mẫu dương tính

Số chó không biểu hiện triệu

18,75a

chứng lâm sàng

Số chó có biểu hiện lâm sàng

22,58a

nghi nhiễm Leptospira

Tổng

20,63

PCR

Từ Bảng 4.16 cho thấy trong 63 mẫu nước tiểu có xoắn khuẩn hiện diện được kiểm tra dưới kính hiển vi nền đen (ở mục 4.2.1, Bảng 4.14), trong đó 32

chó không biểu hiện triệu chứng lâm sàng và 31 chó có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ nhiễm Leptospira, kết quả có 13 mẫu dương tính, chiếm tỷ lệ

20,63%. Trong đó 18,75% (6/32) mẫu dương tính từ những chó không biểu hiện triệu chứng lâm sàng và 22,58% (7/31) mẫu dương tính từ những chó có

biểu hiện nghi ngờ nhiễm Leptospira và sai khác không có ý nghĩa thống kê.

Những chó khảo sát không biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh có thể đã

mắc bệnh trước đó cho nên sau khi nhiễm bệnh, Leptospira vào máu và khu

trú trong thận và thải Leptospira qua nước tiểu trong một thời gian dài mà

không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh.

So sánh với kết quả nghiên cứu của một số tác giả trên thế giới sử dụng

kỹ thuật PCR để phát hiện sự hiện diện của Leptospira trực tiếp trong nước

tiểu, như khảo sát của Harkin et al. (2003) ở Hoa Kỳ có 8,2% chó có Leptospira trong nước tiểu mà không biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh.

Tương tự ở Ireland có 7,05% (Rojas et al., 2010), ở Iran là 22% (Zakeri et al.,

2010), ở Nhật (Khorami et al., 2010) có 31% chó có sự hiện diện của xoắn

khuẩn Leptospira trong nước tiểu hay ở Pakistan (Chetta et al., 2014), có 14,21% nước tiểu chó nhiễm Leptospira được phát hiện bằng kỹ thuật PCR.

Như vậy có thể sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện DNA của xoắn khuẩn

Leptospira hiện diện trong nước tiểu nhanh hơn khi nuôi cấy, giúp cho việc

chẩn đoán và điều trị sớm hơn, mang lại hiệu quả cao hơn.

Bảng 4.17 Tỷ lệ Leptospira phát hiện được theo các địa điểm lấy mẫu

Tổng số mẫu

Địa điểm

nước tiểu

Số mẫu nghi nhiễm Leptospira (soi bằng

Số xoắn khuẩn phát

khảo sát

KHV nền đen)

hiện được

14 (50%)

0 (0%)

Bệnh xá Thú y, ĐHCT.

Phòng mạch Thú y Liên

2 (18,18%)

0 (0%)

Quận Ninh Kiều - Bình Thủy, TPCT.

47 (65,27%)

3 (6,38%)

Phòng mạch Thú y, 50 đường Võ Văn Kiệt,

TPCT.

Tổng

111

63 (56,76%)

3 (4,76%)

4.2.2 Phát hiện xoắn khuẩn Leptospira từ mẫu nuôi cấy

Từ kết quả Bảng 4.17 cho thấy tổng số 111 mẫu nước tiểu chó được kiểm tra từ những chó có hiệu giá kháng thể kháng 18 serogroup Leptospira MAT ≥ 1: 400. Kết quả có 63 chó nghi nhiễm Leptospira trong nước tiểu khi

soi dưới KHV nền đen đã khảo sát các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu, chiếm tỷ lệ 56,76%, những mẫu này được cấy vào môi trường EMJH, theo dõi đến 3 tháng và có 3 mẫu xoắn khuẩn phát triển vào thời điểm 17

ngày, chiếm tỷ lệ 4,76%. Thời gian nuôi cấy kéo dài và phát hiện được 3 mẫu

có xoắn khuẩn phát triển, tỷ lệ này thấp. Do đặc tính Leptospira rất khó nuôi

cấy và dễ tạp nhiễm các vi khuẩn khác cho nên đòi hỏi khi nuôi cấy phải có

nhiều kinh nghiệm và kỹ năng thao tác phòng thí nghiệm nếu không thì Leptospira không sống được. Ngoài ra sau khi nhiễm, Leptospira vào máu và

nhân lên nhanh chóng ở gan và sau đó cư trú ở ống thận và được thải ra ngoài

qua nước tiểu, và trong nước tiểu cũng có rất nhiều vi sinh vật gây ô nhiễm sẽ nhân lên nhanh chóng, làm cản trở sự phát triển của Leptospira. Một yếu tố

nữa có thể làm giảm tỷ lệ sống sót của xoắn khuẩn Leptospira là thời gian thu

thập và xử lý mẫu nước tiểu ảnh hưởng đến sự tồn tại của Leptospira, nếu thu

Bảng 4.18 Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo độ tuổi, giới tính và phương thức

nuôi

Các chỉ tiêu khảo

Tổng số mẫu nước

Số mẫu nghi nhiễm

Số mẫu phát

sát

hiện có

tiểu khảo sát (n=111)

Leptospira (soi bằng KHV nền đen) (n=63)

Leptospira

(n=3) (%)

(%)

4 tháng < 12

7 (36,84%)

0 (0%)

tháng tuổi

≤ 1-6 năm

31 (60,78%)

2 (6,45%)

≥ 6 năm

25 (60,98%)

1 (4,00%)

Đực

35 (57,38%)

2 (5,71%)

Cái

28 (56,00%)

1 (3,57%)

Nuôi thả

38 (65,52%)

2 (5,26%)

1 (4,00%)

Nuôi nhốt

25 (47,17%)

thập và xử lý nước tiểu sau 3 giờ thì pH acid trong nước tiểu sẽ làm giảm sự sống của Leptospira (Thiermann, 1980).

Qua số liệu ở Bảng 4.18 cho thấy trong 63 mẫu nước tiểu (có MAT ≥ 1: 400) được kiểm tra sự hiện diện xoắn khuẩn trong nước tiểu bằng cách quan

sát dưới kính hiển vi nền đen, kết quả chó ở độ tuổi ≥ 6 năm và chó ≤ 1-6 năm nghi nhiễm Leptospirosis chiếm tỷ lệ cao hơn và số mẫu phát hiện có Leptospira chiếm tỷ lệ cao hơn ở độ tuổi từ 4 tháng đến 12 tháng tuổi. Chó

nuôi thả có tỷ lệ nhiễm xoắn khuẩn nhiều hơn chó nuôi nhốt và nhóm chó đực

Hình 4.2 Leptospira soi dưới kính hiển vi nền đen (X40) lúc nuôi cấy 17 ngày

nhiễm tương đương với chó cái.

4 5

1000bp 500bp

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%, với điện thế 90V, thời gian 45 phút. Mẫu 1, 2 là mẫu âm tính. Các mẫu 3, 4 và 5 là mẫu dương tính.

1400bp

Từ kết quả định danh xoắn khuẩn Leptospira đối với 3 mẫu nuôi cấy

bằng kỹ thuật PCR khuếch đại gene 16S rRNA cho thấy mẫu số 3 với tổng số nucleotide (nt) là 1374nt và mẫu số 5 với tổng số nucleotide là 1369nt tương

đồng với chủng xoắn khuẩn tham chiếu Leptospira interrogans serovar

icterohaemorrhagiae strain RGA có mã số trên GeneBank là NR 116542.1 ở

mức tương đồng ≥ 99%. Do đó có thể xác định hai mẫu xoắn khuẩn phát hiện

được từ nước tiểu chó ở Cần Thơ thuộc loài xoắn khuẩn gây bệnh Leptospira

interrogans. Mẫu số 4 với tổng số nucleotide được giải trình tự là 1393nt, khi

so sánh với chủng xoắn khuẩn tham chiếu Leptospira fainei serovar hurstbridge strain BUT6 có mã số trên GeneBank là NR 043049.1 cũng đạt

mức độ tương đồng ≥ 99% và có thể xác định thuộc loài trung gian gây bệnh

Leptospirosisđã có sự lưu hành của xoắn khuẩn Leptospira và bài thải ra ngoài

cơ hội Leptospira fainei (intermediate pathogenic Leptospira). Kết quả nghiên cứu này chứng minh chó nuôi tại các hộ dân chưa được tiêm ngừa bệnh

qua nước tiểu.

So với một số nghiên cứu trên thế giới Julio et al. (2004), kiểm tra dưới kính hiển vi nền đen phát hiện 14 mẫu nước tiểu chó có nhiễm xoắn khuẩn

Leptospira, sau đó nuôi cấy có 11 mẫu có xoắn khuẩn phát triển, chiếm tỷ lệ

78,57%. Alongkorn et al. (2017), đã nuôi cấy 58 mẫu nước tiểu chó chưa tiêm

phòng bệnh Leptospirosis, kết quả 4 mẫu có xoắn khuẩn phát triển thuộc loài

Leptospira interrogans, chiếm tỷ lệ 6,89% và 2 mẫu thuộc loài Leptospira

weilii. Sự nuôi cấy và phát hiện trực tiếp xoắn khuẩn trong nước tiểu là

phương pháp lý tưởng để xác định bệnh, có thể nuôi cấy trực tiếp từ máu hoặc

nước tiểu được xem là tiêu chuẩn vàng (Goldstein, 2010). Tuy nhiên, việc này

không được áp dụng trong thú y khi điều trị, do Leptospira tăng trưởng chậm

và rất khó khi nuôi cấy (Evangelista and Coburn, 2010), đòi hỏi trang thiết bị

phải phù hợp và bệnh phẩm phải được lấy trước khi sử dụng kháng sinh.

Bảng 4.19. Tỷ lệ chó nhiễm Leptospira theo hiệu giá ngưng kết và serogroup Leptospira

Hiệu giá kháng thể kháng Leptospira

Chỉ tiêu khảo sát

1: 400

1: 800

1: 1600

1: 3200

41 (65,07%)

13 (20,63%)

8 (12,69%)

1 (1,59%)

Số mẫu nước tiểu có xoắn khuẩn qua khảo sát dưới KHV nền đen (n=63)

1 (7,69%)

Số mẫu nước tiểu có xoắn khuẩn Leptospira, không biểu hiện lâm sàng (n=32; 50,79%)

hurstbridge

Kết quả khảo sát MAT dương tính với serogroup Leptospira phát hiện được

1 (12,5%)

1 (100%)

Số mẫu nước tiểu có xoắn khuẩn Leptospira, có biểu hiện lâm sàng của bệnh (n=31; 49,2%)

icterohaemorrhagiae

Kết quả khảo sát MAT dương tính với serogroup Leptospira phát hiện được

Từ kết quả Bảng 4.19 cho thấy trong 63 chó nghi nhiễm Leptospira trong

nước tiểu khi soi dưới KHV nền đen đã khảo sát các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa

máu và nước tiểu có 32 mẫu nước tiểu thu được từ chó không biểu hiện triệu

chứng lâm sàng (50,79%) và 31 mẫu từ chó có triệu chứng lâm sàng của bệnh (49,2%). Trong đó những chó có hiệu giá ngưng kết 1: 400 chiếm tỷ lệ cao

nhất (65,07%), kế đến ở hiệu giá 1: 800, 1: 1600 và tỷ lệ thấp nhất ở hiệu giá

1: 3200 (1,59%). Serogroup Leptospira phát hiện được ở chó không biểu hiện lâm sàng với hiệu giá 1: 800 là serogroup L. hurstbridge và chó có biểu hiện

Những chó nhiễm Leptospira trong nghiên cứu này cho thấy rất khó có thể chẩn

lâm sàng ở hiệu giá 1: 600 và 1: 3200 là serogroup L. icterohaemorrhagiae.

Bảng 4.20 Kết quả định danh loài xoắn khuẩn Leptospira phát hiện từ nuôi cấy

Các dòng so sánh

Mã gene

Ký hiệu

Tên loài xoắn khuẩn

Mức độ

mẫu

được xác định

tương đồng

Leptospira interrogans

NR 116542.1

99%

serovar icterohemorrhagiae strain RGA 16S ribosomal

Leptospira interrogans

gene Leptospira fainei serovar

NR 043049.1

99% Leptospira fainei

hurstbridge strain BUT6 16S ribosomal gene

NR 116542.1

Leptospira interrogans serovar icterohemorrhagiae

99% Leptospira interrogans

strain RGA 16S ribosomal gene

đoán phát hiện được bệnh Leptospirosisnếu chỉ dựa hoàn toàn vào lâm sàng như Vasconcellos, (1979) đã nhận xét (trích Julio et al., 2004).

Theo cách định danh các loài xoắn khuẩn trong họ Leptospiraceae vào năm 1993 đã được Hookey et al. miêu tả, dựa vào mức độ tương đồng và so sánh trình tự nucleotide của gene 16S rRNA, từ kết quả Bảng 4.20 với mức độ tương đồng 99%, nghiên cứu đã xác định được tên 3 loài xoắn khuẩn Leptospira, có mã gene NR 116542.1 và NR 043049.1. Việc sử dụng gene 16S rRNA để định danh xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh cho người và các động vật nuôi đã được một số nhà nghiên cứu trên thế giới áp dụng từ rất sớm

(Morey et al., 2006; Balamurugan et al., 2013; Backstedt et al., 2015). Do đó

việc giải và so sánh trình tự nucleotide của gene 16S rRNA là một công cụ

quan trọng trong định danh phân loại các loài xoắn khuẩn. Trên GenBank, có

sẵn các dữ liệu về trình tự nucleotide của gene 16S rRNA của các loài xoắn khuẩn Leptospira, tuy nhiên trong nhiều trường hợp chỉ một phần gene này

được giải trình tự. Trong kết quả nghiên cứu này số lượng nucleotide được

giải khá cao (1369-1393 nucleotide), chiếm gần hết độ dài của gene 16S rRNA. Do vậy có cơ sở để tin chắc rằng kết quả so sánh định danh loài

Leptospira trong nghiên cứu là phù hợp.

Kết hợp kết quả định danh loài xoắn khuẩn với kết quả giám định huyết

thanh học bằng phương pháp vi ngưng kết đã được thực hiện đồng thời trên cùng mẫu chó đã xác định xoắn khuẩn gây nhiễm ba chó nói trên thuộc

serovar icterohaemorrhagiae (Leptospira interrogans serovar

icterohaemorrhagiae) và hurstbridge (Leptospira fainei serovar hurstbridge).

Tóm lại: bằng phương pháp định danh phân tử, nghiên cứu phát hiện

được 2 loài xoắn khuẩn Leptospira interrogans và Leptospira fainei bài thải

qua nước tiểu chó nuôi tại Cần Thơ mà từ trước tới nay ở Việt Nam chưa có

nghiên cứu nào khảo sát. Đặc biệt, Leptospira fainei là một loài xoắn khuẩn

gây bệnh cơ hội lần đầu tiên được xác định gây nhiễm trên chó ở Việt Nam.

Cả hai loài xoắn khuẩn này đều có thể truyền lây sang người, việc phát hiện

hai loài xoắn khuẩn gây nhiễm trên chó này không những chỉ có ý nghĩa rất

lớn đối với khoa học thú y mà còn đưa ra cảnh báo mối nguy cơ tiềm ẩn đang

đe dọa sức khỏe cộng đồng cư dân trong khu vực cho nên vấn đề này cần được

tiếp tục nghiên cứu trong thời gian tới (Levett, 2001; Adler and Moctezuma,

2010).

Nghiên cứu xác định loài xoắn khuẩn Leptospira phát hiện được trên

Bảng 4.21 Xác định loài xoắn khuẩn Leptospira dựa vào mức độ tương đồng

của gene 16S rRNA

STT Ký hiệu

Số nt và mã gene

Mức độ tương đồng

Loài xoắn khuẩn Leptospira

mẫu

1374 nt, NR 116542.1

99%

1369 nt, NR 116542.1

99%

1385 nt, NR 116542.1

93%

181

1392 nt, NR 116542.1

99%

204

1412 nt, NR 116542.1

98%

Leptospira

307

1391 nt, NR 116542.1

99%

interrogans

308

1408 nt, NR 116542.1

99%

310

1390 nt, NR 116542.1

99%

312

1394 nt, NR 116542.1

99%

313

1390 nt, NR 116542.1

99%

490

1393 nt, NR 116542.1

99%

493

1390 nt, NR 116542.1

99%

494

1396 nt, NR 116542.1

98%

1393 nt, NR 043049.1

99%

Leptospira fainei

328

1391 nt, NR 043049.1

99%

330

1413 nt, NR 043049.1

99%

(nt: nucleotide)

chó

Trong Bảng 4.21, tổng số 16 mẫu có DNA của Leptospira (13 mẫu phát hiện trực tiếp từ nước tiểu và 3 mẫu từ nuôi cấy xoắn khuẩn), trong đó 13 mẫu

thuộc về nhóm Leptospira interrogans (308, 307, 5, 313, 312, 3, 181, 490, 310, 493, 494, 204, 97 và 3 mẫu thuộc về nhóm Leptospira fainei (4, 328 và 330) (Hình 4.4).

Trên thế giới đã có công trình nghiên cứu chứng minh có DNA của

Leptospira hiện diện trong nước tiểu chó. Ở Argentina, Lofflera et al. (2014),

đã phát hiện được 6 mẫu có DNA của Leptospira hiện diện trong nước tiểu

chó đều thuộc nhóm Leptospira interrogans và một nghiên cứu ở Thái Lan, Alongkorn et al. (2017) đã phát hiện được 4/58 mẫu nước tiểu, trong đó 2 mẫu

thuộc nhóm Leptospira interrogans. Bên cạnh đó, nghiên cứu của Petersen et

al. (2001) lần đầu tiên đã phát hiện được Leptospira fainei (serovar hurstbridge) từ hai bệnh nhân mắc hội chứng Weil’s và theo nhận định của

Arzouni et al. (2002) Leptospira fainei là một tác nhân gây bệnh cho con

Hình 4.4 Cây phả hệ phát sinh loài các serogroup Leptospira

người ở miền nam châu Âu.

Phân tích phát sinh loài đối với 16 mẫu có DNA Leptospira phát hiện dựa trên trình tự nucleotide, các trình tự này tương đồng với hai chuỗi xoắn

khuẩn tham chiếu trên GenBank (ký hiệu NR 116542.1 và NR 043049.1) và

cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm MEGA 7.0. Kết quả cho

thấy có 13 mẫu phát hiện được thuộc nhánh thứ nhất L. interrogans, mẫu số

308 có mối quan hệ gần với Leptospira interrogans, kế đến là mẫu 307, 5, 313

và xa nhất là mẫu 97 và 3 mẫu thuộc nhánh thứ hai Leptospira fainei, mẫu số

4 có quan hệ gần với Leptospira fainei, kế đến là mẫu 330 và 328.

Qua phân tích mức độ tương đồng của các mẫu phát hiện được dựa theo mô tả của La Scola et al. (2006), Leptospira interrogans là loài phổ biến nhất

trong số các mẫu được xét nghiệm và có trình tự nucleotide với mức độ tương

đồng rất cao 99%, thuộc nhóm Leptospira gây bệnh (ngoại trừ mẫu 97 và mẫu 204, 494 mức độ tương đồng 93% và 98%) và Leptospira fainei thuộc nhóm

xoắn khuẩn trung gian gây bệnh cơ hội hiện diện trong nước tiểu chó tại thành

phố Cần Thơ. Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng phát sinh loài dựa trên gene

16S rRNA để phát hiện Leptospira trên chó ở ĐBSCL.

Tóm lại

- Nghiên cứu đã phát hiện được 13 mẫu có DNA Leptospira trực tiếp từ

KHV nền đen đã được kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu,

nước tiểu trong tổng số 63 chó nghi nhiễm Leptospira trong nước tiểu khi soi dưới

chiếm tỷ lệ 20,63%. Trong đó, 6/32 (18,75%) mẫu dương tính từ những chó

không biểu hiện triệu chứng lâm sàng và 7/31 (22,58%) mẫu dương tính từ

những chó có biểu hiện nghi ngờ nhiễm Leptospira.

- Đã nuôi cấy thành công 3 mẫu xoắn khuẩn Leptospira trong môi trường

EMJH và định danh xoắn khuẩn Leptospira, tham chiếu với chủng xoắn khuẩn

trên GeneBank có mã số NR 116542.1 và NR 043049.1, ở mức dộ tương đồng

≥ 99%, nghiên cứu đã phát hiện được hai loài Leptospira interrogans thuộc

nhóm xoắn khuẩn gây bệnh và Leptospira fainei thuộc loài gây bệnh cơ hội

hiện diện trong nước tiểu chó tại thành phố Cần Thơ.

4.3. Khảo sát những biến đổi bệnh lý bệnh Leptospirosis trên chó

Bảng 4.22 Các chỉ tiêu sinh lý máu trên chó nhiễm Leptospira

Giới hạn bất thường

Giới hạn bình thường

Chỉ số theo dõi

Tổng số mẫu sinh lý máu (n=13) ( ±SE)

Có triệu chứng lâm sàng (%)

Số mẫu có chỉ số sinh lý máu bất thường (%)

Không có triệu chứng lâm sàng (%)

Bạch cầu (109 /L)

33,50±3,29

13/13 (100)

6/6 (100)

7/7 (100)

(6-17)

Neutrophil %

74,52 ±2,34

10/13 (76,92)

4/6 (66,67)

6/7 (85,71)

2/6 (33,33)

1/7 (14,29)

(60-70)

Lymphocyte %

36,43±6,78

7/13 (53,85)

3/6 (50)

4/7 (57,14)

3/6 (50)

3/7 (42,86)

5,44±0,82

9/13 (69,23)

3/6 (50)

6/7 (85,71)

3/6 (50)

1/7 (14,29)

(8-21) Hồng cầu (1012/L)

(5,5-8,5)

Hemoglobin (g/dL)

11,98±1,34

7/13 (53,85)

3/6 (50)

4/7 (57,14)

3/6 (50)

3/7 (42,86)

(12-18)

Hematocrit %

35,75±3,92

7/13 (53,85)

3/6 (50)

4/7 (57,14)

3/6 (50)

3/7 (42,86)

106,4±19,2

9/13 (69,23)

2/6 (33,33)

7/7 (100)

4/6 (66,67)

(35-57) Tiểu cầu (109/L) (170-400)

4.3.1 Sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học trên chó nhiễm Leptospira

Dựa vào Bảng 4.22 cho thấy giá trị trung bình của bạch cầu, phần trăm

neutrophil và lymphocyte cao hơn thông số bình thường. Bạch cầu là thành

phần quan trọng của máu, với chức năng tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể,

loại bỏ những yếu tố có hại và tham gia vào quá trình tạo miễn dịch. Dựa vào kết quả xét nghiệm cho thấy số lượng bạch cầu tăng cao chứng tỏ chó có hiện

tượng nhiễm trùng. Do đó những chó nhiễm Leptospira có số lượng bạch cầu,

phần trăm neutrophil và lymphocyte cao hơn thông số bình thường.

Giá trị trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit và tiểu

cầu trong nghiên cứu này thấp hơn thông số bình thường, chứng tỏ chó nhiễm

Leptospira có xảy ra thiếu máu, nguyên nhân thiếu máu có thể do sau khi

Leptospira xâm nhập vào cơ thể tiết ra độc tố làm phá vỡ hồng cầu, gây ra tình trạng thiếu máu và thiếu máu cũng có thể do mất máu qua đường tiêu hóa

hoặc do hiện tượng tán huyết. Độc tố phá vỡ thành mao mạch và mô liên kết

dưới da gây ra hiện tượng xuất huyết và phù nề (Lee et al., 2000). Mức độ

giảm tiểu cầu trong khảo sát 69,23% có thể do viêm mạch máu ở giai đoạn

nhiễm trùng cấp tính hay do sự phá hủy tiểu cầu ở máu ngoại vi hay tủy xương

Hình 4.5 Xuất huyết da

giảm sản xuất tiểu cầu (Geisen et al., 2007).

Bảng 4.23 Các chỉ tiêu sinh hóa máu trên chó nhiễm Leptospira

Giới hạn bất thường

Giới hạn bình thường

Chỉ số theo dõi

Có triệu chứng lâm sàng (%)

Số mẫu có chỉ số sinh hóa máu bất thường (%)

Không có triệu chứng lâm sàng (%)

33,37±4,91

12/13 (92,31)

5/6 (83,33)

7/7 (100)

1/6 (16,67)

Ure (µmol/L)

(2,9-10)

Creatinin (µmol/L)

458,2±92,7

11/13 (84,62)

5/6 (83,33)

6/7 (85,71)

1/6 (16,67)

1/7 (14,29)

(44-150)

299±109

10/13 (76,92)

3/6 (50)

7/7 (100)

3 (50)

AST (U/L)

(8,9-48,5)

183,2 ±50,9

10/13 (76,92)

5/6 (83,33)

5/7 (71,43)

1/6 (16,67)

2/7 (28,57)

ALT (U/L)

(8,2-57,3)

Bilirubin TP (U/L)

390±170

6/13 (46,15)

1/6 (16,67)

5/7 (71,43)

5/6 (83,33)

2/7 (28,57)

(0-17)

Tổng số mẫu sinh hóa máu (n=13) ( ±SE)

Dựa vào kết quả Bảng 4.23 xét nghiệm các chỉ tiêu sinh hóa máu 13 chó

nhiễm Leptospira (có MAT ≥ 1: 400 và PCR dương tính) cho thấy hàm lượng

ure huyết, creatine, AST, ALT và bilirubin toàn phần tăng cao hơn so với chỉ

số bình thường, đặc biệt ở nhóm chó có biểu hiện lâm sàng của bệnh. Do bệnh Leptospirosis là bệnh đa hệ thống, ảnh hưởng đến nhiều cơ quan, đặc biệt là

gan và thận. Trong giai đoạn cấp tính của bệnh do Leptospira sẽ gây ra những

tổn thương tế bào thận, viêm thận kẽ cấp tính, làm giảm thể tích máu tới thận dẫn đến hoại tử ống thận và giảm chức năng lọc của thận (Levett, 2001;

Geisen et al., 2007). Gan cũng là cơ quan lớn bị ảnh hưởng, sau khi vào cơ thể

Leptospira sẽ đến gan, gây viêm gan ứ mật toàn bộ lá gan hay một phần gan,

hoại tử tế bào gan và gây phù nề có thể dẫn đến viêm gan cấp hay mãn tính. Mặt khác, khi bilirubin toàn phần trong máu tăng cao có thể có sự hoại tử tế

bào gan, gây vàng da (hình 4.6), nước tiểu sậm màu (Nally et al., 2004; Brito

et al., 2006). Những chó bệnh Leptospirosis có 80-90% là ure và creatine tăng,

rối loạn chức năng gan và tăng nồng độ bilirubin huyết thanh giống như Sykes

Hình 4.6 Vàng da ở chó bệnh Leptospirosis

et al. (2011) nhận xét.

Bảng 4.24 Các chỉ sinh lý nước tiểu trên chó nhiễm Leptospira

Giới hạn bất thường

Giới hạn bình thường

Chỉ số theo dõi

Có triệu chứng lâm sàng (%)

Số mẫu có chỉ số sinh lý nước tiểu bất thường (%)

Không có triệu chứng lâm sàng (%)

Hồng cầu (tế bào/µL)

8,54±2,3

8/13 (61,54)

3/6 (50)

5/7 (71,43)

3/6 (50)

2/7 (28,57)

(0-5)

17,15±5,01

2/13 (15,38)

1/6 (16,67)

1/7 (14,29)

5/6 (83,33)

6/7 (85,71)

Bạch cầu (tế bào/µL) (5-40)

Protein (g/L Albumin)

1,24±0,3

8/13 (61,54)

3/6 (50)

5/7 (71,43)

3/6 (50)

2/7 (28,57)

(0,1-0,3)

Bilirubin (µmol/L)

14±4,33

4/13 (30,77)

4/7 (57,14)

6/6 (100)

3/7 (42,86)

(8,6-17)

Tổng số mẫu sinh lý nước tiểu (n=13) ( ±SE)

Từ kết quả Bảng 4.24, cho thấy chó nhiễm Leptospira xuất hiện 8 trường

hợp có hồng cầu và protein trong nước tiểu nằm ngoài mức sinh lý bình

thường, chiếm tỷ lệ 61,54%. Hồng cầu xuất hiện trong nước tiểu có thể do tổn

thương hệ tiết niệu, có thể do tổn thương thận hoặc bàng quang và niệu đạo (Sykes et al., 1011).

Protein niệu (tiểu đạm) có ý nghĩa rất lớn cho chẩn đoán. Protein trong

nước tiểu thường có nguồn gốc từ thận, có thể do rò rỉ ở quản cầu hoặc do hấp thu kém ở ống lượn gần hoặc cả hai hay khi có những rối loạn về chức

năng của thận, kèm theo những bất thường về rối loạn đông máu và giảm tiểu

2001; Goldstein et al., 2006). Những chó có triệu chứng vàng da do ảnh hưởng của gan, có thể do hoại tử tế bào gan hay tế bào hồng cầu bị vỡ sẽ phóng thích

cầu cũng có thể có hồng cầu và protein xuất hiện trong nước tiểu (Katz et al.,

bilirubin vào máu và thải ra ngoài qua nước tiểu nên nước tiểu có nhiều màu

Hình 4.7 Màu sắc các ống nước tiểu

sắc khác nhau (hình 4.7) (Geisen et al., 2007).

4.3.2. Những triệu chứng lâm sàng trên chó dương tính với

Bảng 4.25 Triệu chứng lâm sàng trên chó dương tính với Leptospira

Triệu chứng lâm sàng

Chó có PCR dương tính

Tỷ lệ (%)

với Leptospira (n=7)

Lừ đừ, lười vận động

100

Leptospira bằng kỹ thuật PCR

7

Ăn ít và bỏ ăn

7

100 71,43

Vàng da và niêm mạc

Nước tiểu màu vàng sậm, có lẫn máu

Nôn ói

71,43

Sốt

57,14

Niêm mạc nhợt màu

85,71

Tích nước xoang bụng

42,85

Xuất huyết da

28,57

Tiêu chảy

14,28

71,43

Quan sát trực tiếp 7 chó dương tính với Leptospira bằng kỹ thuật PCR,

kết quả cho thấy chó có các biểu hiện triệu chứng lâm sàng lừ đừ, lười vận động và ăn ít và bỏ ăn chiếm 100%, niêm mạc nhợt màu (85,71%), vàng da và

nhất là tiêu chảy (14,28%). Những triệu chứng lâm sàng lừ đừ, lười vận động,

niêm mạc, nước tiểu màu vàng sậm và có lẫn máu, nôn ói (71,43%) và thấp

ăn ít và bỏ ăn là triệu chứng biểu hiện phổ biến chung cho nhiều bệnh truyền

nhiễm (Goldstein et al., 2006; Naiari et al., 2011) nhưng triệu chứng vàng da

và nước tiểu nâu sậm là những triệu chứng lâm sàng điển hình rõ nhất đối với

nhiễm xoắn khuẩn Leptospira (Geisen et al., 2007). Như vậy, trong mỗi một nghiên cứu về triệu chứng lâm sàng chó nhiễm Leptospira không phải lúc nào cũng có các dấu hiệu lâm sàng giống nhau bởi vì mức độ bệnh có thể thay đổi phụ thuộc vào độ tuổi và phản ứng miễn dịch của cơ thể con vật, tính chất kháng nguyên và số lượng mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể. Do đó để xác định được bệnh thì cần phải kết hợp thêm các xét nghiệm cận lâm sàng khác như kỹ

thuật PCR.

Tóm lại

- Khảo sát các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trên chó nhiễm

xoắn khuẩn Leptospira cho thấy giá trị trung bình của bạch cầu, phần trăm

neutrophil và lymphocyte cao hơn thông số bình thường. Các chỉ tiêu hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit và tiểu cầu thấp. Hàm lượng ure

huyết, creatine, AST, ALT và bilirubin toàn phần tăng cao và có sự xuất hiện

hồng cầu (máu) và protein trong nước tiểu.

- Những triệu chứng lâm sàng trên chó dương tính với Leptospira ghi

nhận được trong quá trình nghiên cứu lừ đừ, lười vận động và ăn ít và bỏ ăn

chiếm 100%, niêm mạc nhợt màu (85,71%), vàng da và niêm mạc, nước tiểu

màu vàng sậm và có lẫn máu, nôn ói (71,43%) và thấp nhất là tiêu chảy (14,28%).

4.4 Nghiên cứu biện pháp điều trị bệnh Leptospirosis trên chó

4.4.1 Kết quả điều trị Leptospirosis

Việc điều trị bệnh Leptospirosis trên chó không giống như điều trị các

bệnh khác trên cùng đối tượng, khi biết được chó mắc bệnh Leptospirosis, có

thể chủ nuôi không đồng ý hợp tác điều trị với bác sĩ thú y do tính lây nhiễm

của mầm bệnh. Cho nên hiệu quả điều trị bệnh Leptospirosis trên chó phụ

thuộc vào nhiều yếu tố.

- Con vật: chất lượng cuộc sống của con thú như môi trường sống và tâm

lý của con vật.

- Chủ nuôi: có sự hợp tác tích cực của người chủ nuôi với bác sĩ thú y.

- Kỹ năng và lòng yêu nghề của bác sĩ thú y.

Hiện nay chưa có một nghiên cứu thực nghiệm nào hướng dẫn cụ thể phác đồ sử dụng kháng sinh để điều trị Leptospirosis trên chó một cách có hiệu quả. Nếu có nghi ngờ nhiễm xoắn khuẩn Leptospira thì sử dụng kháng sinh để điều trị do Leptospira rất nhạy cảm với các loại kháng sinh (https://www.merckvetmanual/Leptospirosis/Leptospirosis in Dogs).

Tổng số 63 chó nghi nhiễm Leptospira trong nước tiểu khi soi dưới KHV

nền đen đã khảo sát các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu và có hiệu giá ngưng kết MAT ≥ 1: 400 được bố trí vào 3 phác đồ điều trị và kết quả được thể hiện ở Bảng 4.26

Bảng 4.26 Tỷ lệ điều trị khỏi bệnh

Thuốc điều trị Số chó Liều lượng Liệu trình Kết quả điều trị

khỏi bệnh

được điều trị điều trị (ngày) Tỷ lệ

Số con khỏi (%)

20 12 8 40,00a Phác đồ 1 tiêm 1 lần / 3 ngày Shoptapen

(Penicillin G +

Streptomycin)

Phác đồ 2 22 uống 2 lần/ 11 50,00a 9

Amoxicillin ngày

Phác đồ 3 21 uống 2 lần/ 13 61,90a 7

Doxycycline ngày

Tổng 63 32 50,80

Dựa vào kết quả Bảng 4.26 tỷ lệ khỏi bệnh của phác đồ 1 là 40,00%

(8/20) với thời gian là 12 ngày, phác đồ 2 có tỷ lệ khỏi bệnh là 50% (11/22)

với thời gian là 9 ngày và phác đồ 3 có tỷ lệ khỏi bệnh là 61,90% (13/21) với

thời gian là 7 ngày. Ngay thời điểm kết thúc quá trình điều trị, những chó khỏi

bệnh được kiểm tra không còn xoắn khuẩn hiện diện trong nước tiểu. Do

Leptospira dễ mẫn cảm với hầu hết các loại kháng sinh cho nên tỷ lệ khỏi

bệnh ở 3 phác đồ khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Như vậy sử dụng 3

loại kháng sinh này để điều trị Leptospira trên chó có hiệu quả như nhau.

Bên cạnh sử dụng kháng sinh điều trị, có thể bổ sung thêm chất điện giải hay các acid amin đối với chó lừ đừ lười vận động, bỏ ăn, ói trong khi đang điều trị (Levett, 2001). Tuy nhiên, hiệu quả điều trị còn lệ thuộc vào tình trạng sức khỏe của con vật, nếu phát hiện bệnh muộn, chó đã chuyển sang giai đoạn bệnh nặng hơn và kết quả xét nghiệm máu cho thấy chức năng gan và thận

tăng nhiều lần so với bình thường thì hiệu quả điều trị khỏi bệnh sẽ thấp hơn

(Sykes et al., 2011).

100

Bảng 4.27 Các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trước và sau điều trị

Trước điều

SINH LÝ MÁU

Sinh lý bình

Sau điều trị

±SE

thường

trị

±SE

25,33±1,73

15,13±0,71

Bạch cầu

6-17 (109/L)

74,50 ±1,68

69,53±1,94

Neutrophile %

60-70 %

31,42±4,85

18,89±1,01

Lymphocytes %

8-21%

5,79±0,41

5,89±0,30

Hồng cầu

5,5-8,5 (1012/L)

12,42±0,77

14,48±0,46

Hemoglobin

12-18 (g/dL)

34,36±2,71

37,15±1,64

Hematocrit

35-57 %

130,80±7,82

303,40±47,20

Tiểu cầu

170-400 (109/L)

Trước điều

SINH HÓA MÁU Sinh lý bình

Sau điều trị

±SE

thường

trị

±SE

22,83±3,13

7,22±1,24

Ure

2,9-10 µmol/L

220,2±46,2

90,63±5,00

Creatinin

44-150 µmol/L

109,00±23,1

56,78±9,52

AST

8,9-48,5 U/L

143,00 ±26,3

54,56±5,15

ALT

8,2-57,3 U/L

23,63±9,26

10,00±0,61

Bilirubin TP

0-17 U/L

Trước điều

SINH LÝ NƯỚC

Sinh lý bình

Sau điều trị

±SE

thường

TIỂU

trị

±SE

3,53±1,07

0,00±0,00

Hồng cầu

0-5 tế bào/µL

11,63±2,63

7,97±2,16

Bạch cầu

5-40 tế bào/µL

0,84±0,19

0,15±0,09

Protein

0,1-0,3 g/L Albumin

6,24±1,82

0,54±0,37

Bilibrubin

8,6-17 µmol/L

Những chó được bố trí điều trị một cách ngẫu nhiên, có hiệu giá ngưng kết MAT ≥ 1: 400, trước khi điều trị có chỉ số bạch cầu tổng số, bạch cầu trung tính, lâm ba cầu tăng cao hơn chỉ số bình thường, trong khi đó

hematocrit và tiểu cầu lại giảm. Sau điều trị các chỉ số sinh lý máu trở về mức sinh lý bình thường. Những thay đổi này không đặc hiệu cho bệnh Leptospirosis trên chó, tuy nhiên giảm tiểu cầu từ mức độ nhẹ đến trung bình có thể xảy ra. Các chỉ số AST, ALT và bilirubin toàn phần tăng cao hơn các 101

chỉ số sinh lý bình thường do khi chó nhiễm Leptospira thì hoạt động của các

enzyme này tăng lên do có sự tổn thương của tế bào gan, sau điều trị các chỉ

số này trở về mức sinh lý bình thường ngoại trừ AST vẫn còn ở mức cao. Chỉ

số ure và creatinin tăng lên do rối loạn chức năng thận, độ lọc cầu thận giảm nên protein thoát ra ngoài qua nước tiểu (Sykes et al., 2011).

Tóm lại:

- Hiệu quả điều trị bệnh Leptospirosis trên chó bằng 3 loại kháng sinh: Shoptapen đạt tỷ lệ khỏi bệnh 40,00% với thời gian là 12 ngày, Amoxicillin có

tỷ lệ khỏi bệnh là 50% với thời gian là 9 ngày và Doxycycline có tỷ lệ khỏi

bệnh là 61,90% với thời gian là 7 ngày. Do đó có thể sử dụng 3 loại kháng

sinh này để điều trị bệnh Leptospirosis trên chó vì 3 phác đồ khác nhau không có ý nghĩa thống kê.

- Những chó sau điều trị các chỉ số sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trở

về gần mức sinh lý bình thường ngoại trừ AST vẫn còn ở mức cao, nên cần

tiếp tục theo dõi.

102

CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận

(1) Có sự lưu hành 18/18 serogroup Leptospira trên chó ở ĐBSCL, tỷ lệ cao nhất được ghi nhận là serogroup L. icterohaemorrhagiae, L. canicola, L.

bataviae, L. gryppotyphosa và L. hurstbridge. Chó nuôi thả rong có tỷ lệ

nhiễm Leptospira (25,92%) cao hơn chó nuôi nhốt (17,56%), (P<0,01). Có sự lưu hành 18/18 serogroup Leptospira trên chuột ở ĐBSCL, chuột cống nhiễm

cao nhất so với chuột xạ và chuột nhắt (P<0,01). Nhóm huyết thanh gây nhiễm

chủ yếu trên chuột ở ĐBSCL là L. icterohaemorrhagiae, L. canicola, L.

bataviae, L. panama và L. hurstbridge. Tỷ lệ dương tính với Leptospira giữa chuột và chó có mối tương quan rất chặt chẽ (R2=0,90).

(2) Phát hiện được 2 loài Leptospira interrogans thuộc nhóm Leptospira

gây bệnh và Leptospira fainei thuộc nhóm xoắn khuẩn gây bệnh cơ hội với

mức độ tương đồng cao hiện diện trong nước tiểu chó tại thành phố Cần Thơ.

(3) Những chó bệnh Leptospirosis có thể có hoặc không biểu hiện triệu

chứng lâm sàng của bệnh và có những thay đổi bất thường về các chỉ tiêu sinh

lý sinh hóa máu và nước tiểu.

(4) Ba loại kháng sinh Shoptapen, Amoxcillin và Doxycycline có hiệu

quả điều trị khỏi bệnh Leptospirosis trên chó như nhau.

5.2 Đề nghị

- Sử dụng vaccine để phòng bệnh Leptospirosis trên chó với 4 serogroup

L. icterohaemorrhagiae, L. canicola, L. bataviae và L. gryppotyphosa.

- Nghiên cứu tiếp về tính gây bệnh của Leptospira fainei serovar

hurstbridge trên chó trong thời gian tới.

- Nên vệ sinh các dụng cụ đựng thức ăn hàng ngày, tiêu diệt chuột trong

khu vực nuôi chó để hạn chế mầm bệnh lây lan.

103

DANH MỤC LIỆT KÊ

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ

Phần 1: Các bài báo đã công bố

Nguyễn Thị Bé Mười, Trần Đình Từ và Hồ Thị Việt Thu, 2015. Sự lưu

1. hành của kháng thể kháng Leptospira trên chó và chuột cống ở thành phố Cần

Thơ. Tạp chí Khoa học Kỹ Thuật Thú Y, ISBN: 1859-4751 (4), 2015, trang

36-42.

2. Nguyễn Thị Bé Mười, Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Vũ Phong, 2016. Khảo sát huyết thanh học Leptospira trên chó và chuột tại tỉnh Cà Mau. Tạp

chí Khoa học Kỹ Thuật Thú Y, ISBN: 1859-4751 (4), 2016, trang 19-25.

3. Nguyễn Thị Bé Mười, Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Châu Nguyệt Anh, 2016. Sự lưu hành của kháng thể kháng Leptospira trên chó tại tỉnh An Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số chuyên đề: Nông nghiệp

(2016) (2), trang 91-94.

4. Nguyễn Thị Bé Mười, Hồ Thị Việt Thu và Trần Đình Từ, 2018. Phân lập và định danh Leptospira từ nước tiểu chó nghi mắc bệnh Leptospirosis ở thành

phố Cần Thơ. Tạp chí Khoa học Kỹ Thuật Thú Y, ISBN: 1859-4751 (4), 2018,

trang 42-48.

Phần 2: Các chứng nhận tham dự hội nghị khoa học

1. Giấy chứng nhận tham dự Hội nghị Khoa học-Công nghệ Nông nghiệp

“Hướng tới nền nông nghiệp công nghệ cao và xây dựng nông thôn mới” được

tổ chức ngày 21/11/2014 tại Cần Thơ.

2. Giấy chứng nhận tham dự Hội nghị Khoa học toàn quốc Chăn nuôi – Thú

y được tổ chức ngày 28-29/4/2015 tại Cần Thơ.

3. Giấy chứng nhận tham dự Hội nghị Khoa học toàn quốc Chăn nuôi – Thú y được tổ chức ngày 11-12/3/2017 tại Cần Thơ.

104

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

1. Đào Văn Tiến, 1985. Định loại chuột (Rodentia: Muridae) ở Việt Nam. Tạp chí sinh học, 7 (1): 9-11.

2. Hoàng Mạnh Lâm, 2002. Tình hình nhiễm Leptospira ở gia súc và người tỉnh Đaklak và biện pháp phòng, trị. Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Viện Thú y

Quốc gia, Hà Nội.

3. Huỳnh Thị Bạch Yến, 2006. Xác định một số hằng số sinh hóa - sinh lý máu và nước tiểu của chó. Luận án tiến sĩ nông nghiệp, chuyên ngành bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí

Minh.

4. Hoàng Kim Loan, Đậu Thị Việt Liên, Vũ Thị Quê Hương, Lạc Ngọc Thêm, Phan Ngọc Thảo, Lê Nhi, Bùi Chí Tâm, Phan Công Trung, Lê Thanh

Tùng, Bùi Xuân Bảng, Vũ Đình Luân, Nguyễn Viêt Chánh, Lê Thị Thanh Hà

và Cao Thị Bảo Vân, 2013. Leptospira: 10 năm (2004-2013) khảo sát tình

hình nhiễm trên người và đông vật gặm nhấm ở miền Nam Việt Nam. Tạp chí

Y học dự phòng, 13 (10): 41-46.

5. Hoàng Kim Loan, Nguyễn Văn Cường, R. Takhampunya., B.T. Kiet., J. Campbell., L. N. Them., J.E. Bryant., B. Tippayachai., Nguyen Van Hoang.,

S. Morand., V.B. Hien and J.J. Carrique-Mass, 2015. How Important Are Rats

As Vectors of Leptospirosis in the Mekong Delta of Vietnam? Vector-borine

and zoonotic diseases, 15 (1): 56-64.

6. Lê Huỳnh Thanh Phương, 2001. Tình hình nhiễm Leptospira ở chó tại một số địa phương phía Bắc Việt Nam và biện pháp phòng trị bệnh. Luận văn

tiến sĩ Khoa học nông nghiệp, Trường Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội.

7. Lê Văn Thọ, 2006. Những điều người nuôi chó cần biết. Nhà xuất bản Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh.

8. Lý Thị Liên Khai, 2012. Điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn Leptospira trên đàn bò sữa, chó và chuột tại công ty cổ phần thủy sản Sông Hậu. Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 21b: 87-96.

9. Nguyễn Thị Ngân, 2000. Tình hình nhiễm Leptospira của dê và những động vật có liên quan tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam và biện pháp phòng trị. Luận án Tiến sĩ nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia, Hà Nội.

105

10. Nguyễn Văn Đĩnh, 2005. Giáo trình động vật hại nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Hà Nội: 146-163.

11. Phạm Sỹ Lăng và Hoàng Văn Năm, 2012. Bệnh truyền nhiễm lây từ động vật sang người. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.

12. Tiêu chuẩn Việt Nam, 2011. Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán – Phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira. TCVN 8400-15: 2011.

13. Trần Nhân Dũng, 2011. Sổ tay thực hành sinh học phân tử, Nhà xuất bản Trường Đại học Cần Thơ: 7-9.

14. Vũ Đình Hưng, 1995. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh Leptospirosis ở gia súc Việt Nam và đặc tính sinh học của mầm bệnh, Luận án

PTS Khoa học nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia, Hà Nội.

15. Vũ Đạt và Lê Huỳnh Thanh Phương, 1999. Tình hình nhiễm Leptospira ở chó vùng phụ cận Hà Nội. Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Khoa Chăn

nuôi - Thú y: 74-77.

16. https://tuoitre.vn/nhiem-xoan-khuan-Leptospira-tu-nuoc-tieu-chuot- 644155.htm).

106

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH

1. Adler, H., S. Vonstein., P. Deplazes and C. Stieger, 2002. Prevalence of Leptospira spp. in various species of small mammals caught in an inner-city area in Switzerland. Epidemiology Infection, 128 (1): 107-109.

2. Adler, B and A de la Pena Moctezuma, 2010. Leptospira and Leptospirosis. Veterinary Microbiology, 140: 287-296.

3. Adler, B., 2015. Leptospira and Leptospirosis. Current Topics in Microbiology and Immunology, 387: 1-10.

4. Ahmad S.N., S. Shah and F.M.H. Ahmad, 2005. Laboratory Diagnosis of Leptospirosis. Journal of Postgraduate Medicine, 51 (3): 195-200.

5. Albert, I. Ko., C. Goarant and M. Picardeau, 2009. Leptospira: the dawn of the molecular genetics era for an emerging zoonotic pathogen. Nature

Reviews Microbiology, 7: 736-747.

6. Alongkorn, K., P. Chanchaithonga., K. Lugsomyaa., W. Niyomthama., V. Wuthiekanunband and N. Prapasarakula, 2017. Molecular detection and isolation of pathogenic Leptospira from asymptomatic humans, domestic

animals and water sources in Nan province, a rural area of Thailand. Research

in Veterinary Science, 115: 146-154.

7. Anabel, C.R., R.S. Dora., A.A. Concepción., A.D. Mariel and B.P. Christian, 2013. Frequency of canine Leptospirosis in dog shelters in

Veracruz, Mexico. African Journal of Microbiology Research, 7 (16): 1518-

1521.

8. André-Fontaine G, 2006. Canine Leptospirosis -Do we have a problem? Veterinary Microbiology, 117: 19-24.

9. André-Fontaine, G., 2013. Diagnosis algorithm for Leptospirosis in dogs: disease and vaccination effects on the serological results. Veterinary Record, 172: 502.

10. Aslantaş, Ö, 2005. Determination of the seroprevalence of Leptospirosis in cattle by MAT and ELISA in Hatay, Turkey. Turkish Journal of Veterinary

and Animal Sciences, 29: 1019-1024.

107

11. Arzouni, J.P., P. Parola., B.L. Scola., D. Postic., P. Brouqui and D. Raoult, 2002. Human Infection Caused by Leptospira fainei. Emerging

Infectious Diseases, 8 (8): 865-868.

12. Ayral, F.C., D.J. Bicout., H. Pereira., M. Artois and A. Kodjo, 2014. Distribution of Leptospira Serogroups in Cattle Herds and Dogs in France.

American Journal Tropical Medicine Hygiene, 91 (4): 756-759.

13. Backstedt, B. T., O. Buyuktanir., J. Lindow., E A. Wunder., Jr. M. G. Reis., S. Usmani-Brown., M. Ledizet., A. Ko and U. Pal, 2015. Efficient

Detection of Pathogenic Leptospira Using 16S Ribosomal RNA. PlosOne

June, 19: 1-18.

14. Bal, A.E., C. Gravekamp., R.A. Hartskeerl., J. Demezabrewster., H. Korver and W.J. Terpstra, 1994. Detection of Leptospira in urine by PCR for

early diagnosis of Leptospirosis. Journal of Clinical Microbiology, 32, 1894-

1898.

15. Barmettler, R., A. Schweighauser., S. Bigler., A.M. Grooters and T. Francey, 2011. Assessment of exposure to Leptospira serovars in veterinary

staff and dog owners in contact with infected dogs. Journal of the American

Veterinary Medical Association, 238 (2): 183-188.

16. Balamurugan, V., N.L. Gangadhar., N. Mohandoss, S.R., A. Thirumalesh., M. Dhar., R. Shome., P. Krishnamoorthy., K. Prabhudas and H.

Rahman, 2013. Characterization of Leptospira isolates from animals and

humans: phylogenetic analysis identifies the prevalence of intermediate

species in India. SpringerPlus, 2: 1-9.

17. Benschop, J., C. Heuer., P. Jaros., J. Collins-Emerson., A. Midwinter and P. Wilson, 2009. Sero-prevalence of Leptospirosis in workers at a New Zealand slaughterhouse. New Zealand Medical Journal, 122 (1307): 39-47.

in Domestic Animals

18. Benkirane, A., S. Noury., R.A. Hartskeerl., M.G. Goris., A. Ahmed and J.E. Nally, 2014. Preliminary Investigations on the Distribution of Leptospira Serovars in North-west Morocco. Transboundary Emerging Diseases, 1-7.

19. Bharti, A.R., J.E. Nally., J.N. Ricaldi., M.A. Matthias., M.M. Diaz., M.A Lovett., P.N. Levett., R.H. Gilman., M.R. Willig., E. Gotuzzo and J.M. Vinetz,

108

2003. Leptospirosis: a zoonotic disease of global importance. The Lancet

Infectious Diseases, 3: 757-771.

20. Blum, D.SC., M.Y.C. Dzib., M.G.M. Velazquez., L.A.N. Oreza., M.I.G. Solano., R.I.C. Poot and P.T. Segovia, 2013. Detection of reactive canines to Leptospira in Campeche City, Mexico. Revista Argentina Microbiologia, 45:

34-38.

21. Bolin, C., 2000. Leptospirosis. In: C. Brown and C. Bolin, editors. Emerging diseases of animals. Washington: 185-200.

22. Boutilier, P., A. Carr and R.L. Schulman, 2003. Leptospirosis in Dogs: A Serologic Survey and Case Series 1996 to 2001. Veterinary Therapeutics, 4

(2): 178-187.

23. Brod, C.S., J.A. Aleixo., S.D.D. Jouglard., C.P.H. Fernandes., J.L.R. Teixeira and O.A. Dellagostin, 2005. Evidence of dog as a reservoir for human

Leptospirosis: A serovar isolation, molecular characterization and its use in a

serological survey. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 38

(4): 294-300.

24. Brito, T.D., L.F. Menezes and D.M Lima, 2006. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of the liver and kidney in human

Leptospirosis. Virchows Archiv, 448: 576-583.

25. Castro, J.R., S.R. Salaberry., M.A Souza and A.M. Lima-Ribeiro, 2011. Predominant Leptospira spp. serovars in serological diagnosis of canines and

humans in the City of Uberlândia, State of Minas Gerais, Brazil, 44 (2): 217-

222.

26. Calderón, A., V. Rodríguez., S. Máttar and G. Arrieta, 2014. Leptospirosis in pigs, dogs, rodents, humans and water in an area of the Colombian tropics. Tropical Animal Health Prodoction, 45 (7).

27. Cerqueira, G.M. and M. Picardeau, 2009. A century of Leptospira strain typing. Infectious genetics evolutionary, 9 (5): 760-768.

28. Chetta, M., D Vicari., S. Agnello., M. Percipalle., V. Ferrantelli and M. Vitale, 2014. Canine Leptospirosis cases and molecular screening for

Leptospira interrogans infection. Pakistan Veterinary Journal, 34 (2): 260- 262.

109

29. Chu, K.M., R. Rathinam., P. Namperumalsamy and D. Dean, 1998. Identification of Leptospira species in the pathogenesis of uveitis and

determination of clinical ocular characteristics in South India. Journal

Infectious Diseases, 177: 1314-1321.

30. Claus, A., I.V. de Maele., F. Pasmans., K. Gommeren and S. Daminet, 2008. Leptospirosis in dogs: a retrospective study of seven clinical cases in

Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift, 77: 259-263.

31. Claudia, M.E., Romero-Vivas., M. Cuello-Pérez., P. Agudelo-Flórez., D. Thiry., P.N. Levett and K.I.A. Falconar, 2013. Cross-Sectional study

of Leptospira seroprevalence in Humans, Rats, Mice, and Dogs in a Main

Tropical Sea-Port City. American Journal Tropical Medicine Hygiene, 88 (1): 178-183.

32. Desvars, A., A. Michault and P. Bourhy, 2013. Leptospirosis in the western Indian Ocean islands: what is known so far? Veterinary Research, 40

(80): 1-11.

33. Dhiwayo, S., G. Matope., L. Marabini., K. Dutlow and D.M. Pfukenyi, 2012. Seroprevalence of Leptospirosis in dogs in urban Harare and selected

rural communities in Zimbabwe. Onderstepoort Journal Veterinay Research,

79 (1): 1-6.

34. Dziezyc, J., 2000. Canine systemic bacterial infections. Veterinary Clinics North Ameri: Small Animal Practice, 30 (5): 1103-1117.

35. Ellis W.A, 2010. Control of canine Leptospirosis in Europe: time for a change? Veterinary Record, 167 (16): 602-605.

36. Evangelista, K.V and J. Coburn, 2010. Leptospira as an emerging pathogen: a review of its biology, pathogenesis and host immune responses. Future Microbiol, 5: 1413-1425.

37. Fang, F., 2014. Leptospirosis diagnostics and exposure at the human and animal interface in New Zealand. In chapter 1: General Introduction: 1-11.

38. Fosgate, G.T., 2009. Practical sample size calculations for surveillance and diagnostic investigations. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,

21: 3-14.

110

39. Fonzar, U.J. and H. Langoni, 2012. Geographic analysis on the occurrence of human and canine Leptospirosis in the city of Maringa. State of

Parana, Brazil, 45 (1): 100-105.

40. Fraga, T.R., A.S. Barbosa and L. Isaac, 2011. Leptospirosis: aspects of innate immunity, immunopathogenesis and immune evasion from the

complement system. Scandinavian Journal of Immunology, 73: 408-419.

41. Francey, T. and A. Schweighauser, 2012. Treatment of Leptospirosis. Pratique veterinaire, 47: 470-473.

42. Ganoza, C.A., M.A .Matthias., D. Collins-Richards., K.C. Brouwer., C.B. Cunningham., E.R. Segura., R.H. Gilman., E. Gotuzzo and J.M. Vinetz,

2006. Determining risk for severe Leptospirosis by molecular analysis of environmental surface waters for pathogenic Leptospira. PLoS Med, 3, e308.

43. Garde, E., G. Acosta-Jamett and B.M. Bronsvoort, 2013. Review of the Risks of Some Canine Zoonoses from Free-Roaming Dogs in the Post-

Disaster Setting of Latin America. Animals, 3: 855-865.

44. Geisen, V., C. Stengel., S. Brem., W. Muller., C. Greene and K. Hartmann, 2007. Canine Leptospirosis infections–clinical signs and outcome

with different suspected Leptospira serogroups (42 cases). Journal of Small

Animal Practice, 48: 324-328.

45. Goldstein, R.E., R.C. Lin., C.E. Langston., P.V. Scrivani., H.N. Erb and S.C. Barr, 2006. Influence of infecting serogroup on clinical features of

Leptospirosis in dogs. Journal Veterinary Internal Medicine, 20 (3): 489-494.

46. Goldstein, R.E, 2010. Canine Leptospirosis. Veterinary Clinical Small Animal, 40: 1091-1101.

47. Gravekamp, C., H. Van de Kemp., M. Franzen., D. Carrington., G.J. Schoone., G.J. Van Eys., C.O. Everard., R.A. Hartskeerl and W.J. Terpstra, 1993. Detection of seven species of pathogenic Leptospira by PCR using two sets of primers. Journal General Microbiology, 139: 1691-1700.

48. Greenlee, J.J., 2003. Pathologic and hematologic alterations caused by Leptospira kirschneri serovar gryppotyphosa and Leptospira interrogans

serovar pomona. In chapter 1: General Introduction. Retrospective Theses and Dissertations, 1-23.

111

49. Greenlee, J.J., C.A. Bolin., D.P. Alt., N.F. Cheville and C.B. Andreasen, 2004. Clinical and pathologic comparison of acute Leptospirosis in dogs

caused by two strains of Leptospira kirschneri serovar gryppotyphosa.

American Journal of Veterinary Research, 65 (8): 1100-1107.

50. Greenlee, J.J., D.P. Alt., C.A. Bolin., R.L. Zuerner and C.B. Andreasen, 2005. Experimental canine Leptospirosis caused by Leptospira interrogans

serovars pomona and bratislava. American Journal of Veterinary Research, 66 (10): 1816-1822.

51. Harkin, K.R., Y.M. Roshto, J.T. Sullivan, T.J. Purvis and M.M. reaction assay, Chengappa, 2003. Comparison of polymerase chain

bacteriologic culture, and serologic testing in assessment of prevalence of urinary shedding of Leptospira in dogs. Journal of the American Veterinary

Medical Association, 222 (9): 1230-1233.

52. Harland, A.L., N.J. Cave., B.R. Jones., J. Benschop., J.J. Donald., A.C. Midwinter., R.A. Squires and J.M. Collins-Emerson, 2013. A serological

survey of Leptospira antibodies in dogs in New Zealand. New Zealand

Veterinary Journal, 61 (2): 98-106.

53. Hookey J.V., J. Bryden and L. Gatehouse, 1993. The use of 16s Leptospiraceae rDNA sequence analysis to investigate the phylogeny of and

related spirochaetes. Journal of General Microbiology, 139: 2585-2590.

54. Jimines-Coello, M., I. Vado-Solis., M.F. Cárdenas-Marrufo., J.C Rodriguezbeunfil and A. Ortega-Pacheco, 2008. Serological survey of canine

Leptospirosis in the tropics of Yucutan Mexico using two different tests. Acta

Tropica, 106: 22-26.

55. Jorge, R.S., F. Ferreira., J.S.N. Ferreira., S. Vasconcellos., S.E. Lima., Z.M. Morais and G.O. Souza, 2011. Exposure of free-ranging wild carnivores, horses and domestic dogs to Leptospira spp. in the northern Pantanal, Brazil, 106 (4): 441-444.

56. Julio, C.D. F., F.G.D. Silva., R.C.D. Oliveira., C.B.D. Ádina., E.M. Ernst., A.A. Lucimara and S.T. Paulo, 2004. Isolation of Leptospira spp. from

dogs, bovine and swine naturally infected. Ciência Rural, Santa Maria, 34 (3): 853-856.

112

57. Katz, A.R., V.E. Ansdell., P.V. Effler., C.R. Middleton and D.M. Sasaki, 2001. Assessment of the clinical presentation and treatment of 353 cases of

laboratory-confirmed Leptospirosis in Hawaii, 1974-1998. Clinical Infectious

Diseases, 33: 1834-1841.

58. Karande, S., M. Bhatt., A. Kelkar., M. Kulkami., A. De and A. Varaiya, 2003. An observational study to detect Leptospirosis in Mumbai, India, 88:

1070-1075.

59. Khorami, N., A. Malmasi, S. Zakeri, T.Z. Salehi, G. Abdollahpour, S.M. Nassiri and A. Nejati, 2010. Screening urinalysis in dogs with urinary

shedding of Leptospira. Comparative Clinical Pathology, 19: 271-274.

60. Klaasen, H.L.B.M., M.J.C.H Molkenboer., M.P. Vrijenhoek and M.J. in dogs vaccinated against Kaashoek., 2003. Duration of immunity

Leptospirosis with a bivalent inactivated vaccine. Veterinary Microbiology, 95

(1-2): 121-132.

61. Ko, A.I., C. Goarant and M. Picardeau, 2009. Leptospira: the dawn of the molecular genetics era for an emerging zoonotic pathogen. Nature Reviews

Microbiology, 7 (10): 736-747.

62. Kohn, B., K. Steinicke., G. Arndt., A.D. Gruber., B. Guerra A. Jansen.,

B. Kaser‐Hotz R. Klopfleisch., F. Lotz., E. Luge and K. Nöckler, in dogs with Leptospirosis. Journal of 2010. Pulmonary abnormalities

Veterinary Internal Medicine, 24, 1277-1282.

63. Koizumi, N., M.M. Muto., S. Akachi., S. Okano., S. Yamamoto., K. Horikawa., S. Harada., S. Funatsumaru and M. Ohnishi, 2013. Molecular and

serological investigation of Leptospira and Leptospirosis in dogs in Japan.

Journal Medicine Microbiology, 62 (4): 630-636.

64. Krawczyk, M., 2005. Serological evidence of Leptospirosis in animals in northern Poland. Veterinary Record, 156: 88-89.

65. Kumar, S., G. Stecher and K. Tamura, 2016. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution, 33 (7): 1870-1874.

66. Laras, K., B.V. Cao., K. Bounlu., T.K. Nguyen., J.G. Olson., S. Thongchanh., N.V. Tran., K.L. Hoang., N. Punjabi., B.K. Ha., S.A. Ung., S.

Insisiengmay., D.M. Watts., H.J. Beecham and A.L. Corwin, 2002. The

113

importance of Leptospirosis in Southeast Asia. American Journal of Tropical

Medicine and Hygiene, 67 (3): 278-286.

67. La Scola B., L.T Bui., G. Baranton., A. Khamis and D. Raoult, 2006. Partial rpoB gene sequencing for identification of Leptospira species. FEMS Microbiol Lett, 263 (2):142-147.

68. Langston, C.E. and K.J. Heuter, 2003. Leptospirosis. A re-emerging zoonotic disease. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, 33: 791-807.

69. Lau, C., L. Smythe and P. Weinstein, 2010. Leptospirosis: an emerging disease in travellers. Travel Medicine and Infectious Disease, 8: 33-39.

70. Lavinsky, O.M., R.A. Said., G.M. Strenzel and H. Langoni, 2012. Seroprevalence of anti-Leptospira spp. antibodies in dogs in Bahia, Brazil.

Preventive Veterinary Medicine, 106 (1): 79-84.

71. Lee, S.H., K.A. Kim., Y.G. Park., I.W. Seong., M.J. Kim and Y.J. Lee, 2000. Identification and partial characterization of a novel hemolysin from

Leptospira interrogans serovar lai. Gene 254 (1-2): 19-28.

72. Levett, P.N., 2001. Leptospirosis. Clinical Microbiology Review, 14 (2): 296-326.

73. Leonardo, A., A. Calderon., V. Rodriguez and Arrieta, 2011. Seroprevalence of canine Leptospirosis in a rural community in the

municipality of Cienaga De Oro, Cordoba (Colombia), Revista U.D.C.A

Actualidad and Divulgación Científica, 14 (2): 75-81.

74. Loffler, S.G., D. Passaro., L. Samartino., A. Soncini., G. Romero and B. Brihuega, 2014. Genotypes of Leptospira spp. strains isolated from dogs in

Buenos Aires, Argentina. Revista Argentina Microbiology, 46 (3): 201-204.

75. Levett, P.N., 2015. Leptospira and Leptospirosis. Systematics of Leptospiraceae: Current Topics Microbiology Immunology, 387: 11-20.

76. Mastrorilli, C., F. Dondi., C. Agnoli., M. E. Turba., E. Vezzali and F. Gentilini, 2007. Clinicopathologic features and outcome predictors of

Leptospira interrogans Australis serogroup infection in dogs: a retrospective study of 20 cases (2001-2004). Journal of Veterinary Internal Medicine, 21: 3- 10.

114

77. Maele, V.D.I., A. Claus., F. Haesebrouck and S. Daminet, 2008. Leptospirosis in dogs: a review with emphasis on clinical aspects. Veterinary

Record, 163: 409-413.

78. Maciel, E.A., A.L.F.D. Carvalho., S.F. Nascimento., R.B.D. Matos., E.L. Gouveia., M.G. Reis and A.I. Ko, 2008. Household transmission of Leptospira

infection in urban slum communities. PLoS Neglected Tropical Diseases, 2

(1): e154.

79. Mayer-Scholl, A., E. Luge., A. Draeger., K. Nockler and B. Kohn, 2013. Distribution of Leptospira Serogroups in Dogs from Berlin, Germany. Vector

Borne Zoonotic Diseases, 13 (3): 200-202.

80. Márcia, K.D.P.D., D.G. Daniela., C.D.S.C. Isabel., G. Edson., H.M. E. Paulo., B. Danilo., M.R.L.M. Fabiana., B. Aline., C.D.F. Julio.,

Fernanda., T.N. Italmar and D.A.M. Lisiane, 2013. Toxoplasmosis,

Leptospirosis and brucellosis in stray dogs housed at the shelter in Umuarama

municipality, Paraná, Brazil. Journal of Venomous Animals and Toxins

including Tropical Diseases, 19: 23.

81. Martins, G. and W. Lilenbaum, 2013. The panorama of animal Leptospirosis in Rio de Janeiro, Brazil, regarding the seroepidemiology of the

infection in tropical regions. BioMed Central Veterinary Research, 9: 237.

82. Maud, L., C. Muñoz-Zanzi., B. Higgins and R.Galloway, 2015. Seroepidemiology of Leptospirosis in dogs from rural and slum communities

of Los Rios Region, Chile. BioMed Central Veterinary Research, 11: 31.

83. Meeyam, T., P. Tablerk., B. Petchanok., D. Pichpol and P. Padungtod, 2006. Seroprevalence and risk factors associated with Leptospirosis in dogs.

Southeast Asian Journal of Tropical Medicine Public Health, 37 (1): 148-153.

84. Medeiros, F.R., A. Spichler and D.A. Athanazio, 2010. Leptospirosis- associated disturbances of blood vessels, lungs and hemostasis. Acta Tropica, 115: 155-162.

85. Merck Veterinary Manual, 2010. "Leptospirosis". Merck Animal Health USA.

86. Miraglia, F., Z.M. de Morais., O.A. Dellagostin., F.K. Seixas., J.C. Freitas., F.G. Zacarias., A.C. Delbem., T.S. Ferreira., G.O. Souza and R.A. Hartskeerl, 2012. Molecular and serological characterization of Leptospira

115

interrogans serovar Canicola isolated from dogs, swine, and bovine in Brazil.

Tropical Animal Health Production, 45: 117-121.

87. Morey, R.E., R. L. Galloway., S. L. Bragg., A. G. Steigerwalt., L. W. Mayer and P. N. Levett, 2006. Species-Specific Identification of Leptospiraceae by 16S rRNA Gene Sequencing. Journal of Clinical

Microbiology, 44 (10): 3510-3516.

88. Musso, D and B. La Scola, 2013. Laboratory diagnosis of Leptospirosis: a challenge. Journal Microbiology Immunology Infection, 46 (4): 245-252.

89. Nally, J.E., C. Chantranuwat., X.Y. Wu., M.C. Fishbein., M.M. Pereira., J.J.P.D. Salva., D.R. Blanco and M.A. Lovett, 2004. Alveolar septal

deposition of immunoglobulin and complement parallels pulmonary hemorrhage in a guinea pig model of severe pulmonary Leptospirosis.

American Journal of Pathology, 164 (3): 1115-1127.

90. Nalam, K., A. Ahmed and S.M. Devi, 2010. Genetic affinities within a large global collection of pathogenic Leptospira: Implications for strain

identification and molecular epidemiology. PLoS ONE, 5: e12637.

91. Naiari D.C.M., J.R.D. Castro., A.V. Mundim., J.E.D. Bastos., F.A. Ferrira., M.A. Souza; S.R.S. Salaberry and A.M.C. Limaribeima--Ribeiro,

2011. Clinical and hematological aspects of dogs naturally infected with

Ehrlichia spp. and Leptospira interrogans. Bioscience Journal Uberlandia, 27

(3): 452-459.

92. O'Keefe, J.S., 2002. A brief review on the laboratory diagnosis of Leptospirosis. New Zealand Veterinary Journal, 50: 9-13.

93. Ooteman, M.C., A.R. Vago and M.C. Koury, 2006. Evaluation of MAT, IgM ELISA and PCR methods for the diagnosis of human Leptospirosis. Journal of Microbiological Methods, 65: 247-257.

94. Oliveira, S.T., B.M. Joanne, W.B. Alexander., P.D.S. Andrea, S. Rafael., L.D. Magnus., M.D.S.G. Ana., S.M. Ahmed., N.R Irina and H.D.G. Félix, 2012. Exposure to Leptospira spp. in Sick Dogs, Shelter Dogs and Dogs from an Endemic Area: Points to Consider. Acta Scientiae Veterinariae, 40 (3):

1056.

95. Paul, B., L. Katharine and Y. Philippa, 2009. Current perspectives on canine Leptospirosis. In Practice. Companion Animal Practice, 31: 98-102.

116

96. Pedro, N.A. and S. Boris, 2001. Leptospirosis. Zoonoses and communicable diseases common to man and animals. 3nd ed., Volumen I.

Bacteriosis y Micosis: 175-186.

97. Pérolat, P., R.J Chappel., B. Adler., G. Baranton., D.M. Bulach., M.L. Billinghurst., M. Letocart., F. Merien and M. S. Serrano, 1998. Leptospira

fainei sp. nov., isolated from pigs in Australia. International journal

systematic bacteriology, 48: 851-858.

98. Petersen, A.N., K. Boye., J. Blom., P. Schlichting and K.A. Krogfelt, 2001. First isolation of Leptospira fainei serovar hurstbridge from two human

patients with Weil’s syndrome. Journal Medicine Microbiology, 96-100.

99. Reis, R.B., G.S. Ribeiro., R.D.M. Felzemburgh., F.S. Santana., S. Mohr., A.X.T.O. Melendez., A. Queiroz., A.C. Santos., R.R. Ravines., W.S.

Tassinari., M.S. Carvalho., M.G. Reis and A.I. Ko, 2008. Impact of

environment and social gradient on Leptospira infection in urban slums. PLoS

Neglected Tropical Diseases, 2 (4): e228.

100. Picardeau, M., 2013. Diagnosis and epidemiology of Leptospirosis. Médecine Maladies Infectieuses, 43: 1-9.

the epidemiology,

101. Plank, R. and D. Dean, 2000. Overview of microbiology and pathogenesis of Leptospira spp. in humans. Microbes

Infection, 2: 1265-1276.

102. Roach, J.M., M.V. Vuuren and J.A. Picard, 2010. A serological survey of antibodies to Leptospira species in dogs in South Africa. Journal of the

South African Veterinary Association, 81 (3): 156-159.

103. Rojas, P., A.M. Monahan., S. Schuller., I.S. Miller., B.K. Markey and J.E. Nally, 2010. Detection and quantification of Leptospira in urine of dogs: a maintenance host for the zoonotic disease Leptospirosis. European Journal Clinical Microbiology Infectious Diseases, 29: 1305-1309.

104. Roqueplo, C., O. Cabre., B. Davoust and A. Kodjo, 2013. Epidemiological study of animal Leptospirosis in New Caledonia. Veterinay Medicine International, Published online, 1-10.

105. Saravanan, R., P. Rajendra and S.P. Garajan, 1999. Clinical, bacteriologic and histopathologic studies on induced Leptospirosis in stray dog pups. Indian Journal of Pathology Microbiology, 42 (4): 463-469.

117

106. Saito, M., S.Y.A.M. Villanueva., Y. Kawamura., K. Iida., J. Tomida and T. Kanemaru., E. Kohno., S. Miyahara., A. Umeda., K. Amako., N.G. Gloriani

and S. Yoshida, 2013. Leptospira idonii sp. nov., isolated from environmental

water. International journal systematic evolutionary microbiology, 63: 2457- 2462.

107. Schuller, S., T. Francey., K. Hartmann., M. Hugonnard., B. Kohn., J.E. Nally and J. Sykes, 2015. European consensus statement on Leptospirosis in dogs and cats. Journal Small Animal Practice, 56 (3): 159-179.

108. Senthil N.R., K.M. Palanivel and R. Rishikesavan, 2013. Seroprevalence of Leptospiral antibodies in canine population in and around Namakkal.

Journal Veterinary Medicine, 97: 1-7.

109. Sonrier, C., C. Branger., V. Michel., N. Ruvoën-Clouet., J.P. Ganière and G. André-Fontaine, 2001. Evidence of cross-protection within Leptospira

interrogans in an experimental model. Vaccine, 19 (1): 86-94.

110. Stokes, J. E. and S. D. Forrester, 2004. New and unusual causes of acute renal failure in dogs and cats. Veterinary Clinics of North America: Small

Animal Practice, 34: 909-922.

111. Strugnell, B.W., C. Featherstone., M. Gent., P. Lister., G. Evans., E. Okereke., D. Mawer., H. McGann., R. Marchewka., J. Errington., J. Fenner

and G. Pritchard, 2009. Weil's disease associated with the adoption of a feral

rat. Veterinary Record, 164: 186.

112. Suepaul, S.M., C.V. Carrington., M. Campbell., G. Borde and A.A. Adesiyun, 2014. Seroepidemiology of Leptospirosis in dogs and rats in

Trinidad. Tropical Biomedicine, 31 (4): 853-861.

113. Sykes, J.E., K. Hartmann and K.F. Lunn, 2011. ACVIM small animal consensus statement of Leptospirosis: Diagnosis, Epidemiology, Treatment, and Prevention. Journal Veterinary Internal Medicine, 25 (1): 1-13.

114. Tangeman, L.E. and M. Littman, 2013. Clinicopathologic and atypical features of naturally occurring Leptospirosis in dogs: 51 cases (2000-2010). Journal of the American Veterinary Medical Association, 243 (9): 1316-1322.

115. Thiermann, A.B., 1980. Canine Leptospirosis in Detroit. American Journal of Veterinary Research, 41 (10): 1659-1661.

118

116. Thomé, S., C. Lessa-Aquino, I.Ko. Albert., L. Walter and M.M. Alberto, 2014. Identification of immunodominant antigens in canine Leptospirosis by

Multi-Antigen Print ImmunoAssay (MAPIA). BioMed Central Veterinary

Research, 10 (288): 1-14.

117. Toyokawa, T., M. Ohnishi and N. Koizumi, 2011. Diagnosis of acute Leptospirosis. Expert Review Anti-Infective Therapy, 9 (1): 111-121.

118. Tuemmers, C., C. Lüders., C. Rojas., M. Serri., R. Espinoza and C. Castillo, 2013. Prevalence of Leptospirosis in vague dogs captured in

Temuco City, 2011. Revista Chilena Infectologia, 30 (3): 252-257.

119. Wagenaar, J.F.P., T.H.F. Falke., N.V. Nam, T.Q. Binh., H.L. Smits., F.G.J. Cobelens and P.J.de Vries, 2004. Rapid serological assays for Leptospirosis are limited value in Southern Vietnam. Animals of Tropical

Medicine and Parasitology, 98 (8): 843-850.

120. Ward, M.P. and L.F. Guptill, 2002. Prevalence and risk factors for Leptospirosis among dogs in the United States and Canada: 677 cases (1970-

1998). Journal of the American Veterinary Medical Association, 220: 53-58.

121. Ward, M.P., L.F. Guptill and C.C. Wu, 2004. Evaluation of environmental risk factors for Leptospirosis in dogs. Journal of the American

Veterinary Medical Association, 255: 72-77.

122. Weisburg, W.G., S.M. Barns., D.A. Pelletier and D.J. Lane, 1991. 16S for Phylogenetic Study. Journal of Ribosomal DNA Amplification

Bacteriology, 173 (2): 697-703.

123. WHO, 2003. Human Leptospirosis: guidance for diagnosis, surveillance and control. Isolation and culture of Leptospira: 81-82.

124. Wuthiekanun, V., W. Chierakul., D. Limmathurotsakul., L.D. Smythe., M.L. Symonds., M.F. Dohnt., A.T. Slack., R. Limpaiboon., Y. Suputtamongkol., N.J. White., N.P. Day and S.J. Peacock, 2007. Optimization of culture of Leptospira from humans with Leptospirosis. Journal of Clinical Microbiology, 45: 1363-1365.

125. Zakeri, S., N. Khorami., Z.F. Ganji., N. Sepahian., A.A. Malmasi., M.M. Gouya and N.D. Djadid, 2010. Leptospira wolffii, a potential new pathogenic Leptospira species detected in human, sheep and dog. Infection, Genetics and Evolution, 10 (2): 273-277.

119

126. Zaki, S.A. and P. Shanbag, 2010. Clinical manifestations of dengue and Leptospirosis in children in Mumbai: an observational study. Infection, 38:

285-291.

127. https://www.merckvetmanual.com/Generalized- conditions/Leptospirosis/Leptospirosis in Dogs.

128. https://www.microbiologybytes.wordpress.com.

120

PHỤ LỤC MẪU PHIẾU ĐIỀU TRA

PHIẾU LẤY MẪU CHÓ

(TỈNH)

Số thứ tự:……

Ngày lấy mẫu:………...…......

Tên chủ gia súc:……………………….

Địa chỉ: ………............................................. Điện thoại: ………………

Tên chó: ………… Tuổi: ……….

Giống: chó nội  chó ngoại  Giới tính: đực  cái 

Phương thức nuôi: nuôi thả  nuôi nhốt 

PHIẾU LẤY MẪU CHUỘT

(TỈNH)

Số thứ tự:……

Ngày lấy mẫu: …………

Địa điểm lấy mẫu: ……………………………………………………………...

Loài chuột:……………..

121

PHỤ LỤC THUỐC SỬ DỤNG

1. Shotapen Long Active (LA): shotapen sản xuất bởi viện bào chế Virbac của

Pháp, do công ty liên doanh Việt Nam phân phối.

Thành phần

- Benzathine Penicillin G 100000 UI

- Procain Penicillin G 100000 UI

- Dihydrostreptomycine sulfate 200mg

Đặc tính: shotapen là một huyễn dịch dùng tiêm cho tác dụng kéo dài chứa 2 loại

kháng sinh là Penicillin G và Dihydrostreptomycine.

Penicillin G trong sản phẩm hiện diện dưới 2 dạng: Penicillin G Procain tạo hiệu quả nhanh chóng tức thời trong khi Penicillin G Benzathine cho tác động chậm

hơn và kéo dài trên 3 ngày.

Sự kết hợp Penicillin G với Dihydrostreptomycine sulfate tạo cho Shotapen

LA một phổ tác động rộng lớn và một hiệu quả diệt khuẩn hữu hiệu trên các vi

khuẩn gram dương và âm, vi khuẩn đường ruột và xoắn khuẩn.

Chỉ định

Chỉ định trong điều trị rất nhiều bệnh do vi khuẩn nhạy cảm, các bệnh đường

hô hấp và đặc biệt cho các bệnh: nhiễm trùng huyết, viêm khớp, viêm ruột, viêm

phổi, viêm tử cung, xoắn khuẩn Leptospira và các chấn thương.

Liều dùng

mg/kg P).

Tiêm bắp 1ml/10 kg thể trọng, một mũi tiêm duy nhất cho 72 giờ (hay 0,2

2. Amoxicilin 250 mg

Thành phần: mỗi viên nén chứa

- Amoxicilin trihydrat tương đương Amoxicilin khan…. 250 mg. - Tá dược: .…vừa đủ 1 viên nén.

Dạng bào chế: hộp 10 vỉ x10viên nén.

Chỉ định:

- Nhiễm khuẩn đường hô hấp trên, hô hấp dưới do liên cầu khuẩn, phế cầu

khuẩn và tụ cầu khuẩn.

122

- Nhiễm khuẩn đường tiết niệu, sinh dục.

- Nhiễm khuẩn đường mật.

- Nhiễm khuẩn da, cơ do liên cầu khuẩn,.. nhạy cảm với amoxicilin

Liều dùng: amoxicillin, liều 22 mg/kg P, uống 2 lần/ngày.

3. Doxycyclin

Thành phần:

– Doxycycline hyclate tương đương Doxycycline................ 100 mg.

– Tá dược vừa đủ……………………………….…………….1 viên

Dạng bào chế: hộp 10 vỉ x 10 viên nén

Chỉ định:

Doxycycline là kháng sinh phổ rộng, có phạm vi kháng khuẩn rộng với vi khuẩn ưa khí và kỵ khí Gram dương và Gram âm, và cả với một số vi sinh vật

kháng thuốc tác dụng trên thành tế bào.

Liều dùng: doxycycline 5 mg/kg, uống 2 lần/ngày.

123

PHỤ LỤC THỐNG KÊ

Tỉnh

Số mẫu huyết thanh kiểm tra

Số mẫu huyết thanh dương tính

Cần Thơ

650

159

Vĩnh Long

256

An Giang

263

Cà Mau

264

Tổng

1.433

331

1. Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó ở tỉnh

Chi-Square Test: So sánh tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó giữa 4 tỉnh Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Huyết thanh Huyết không thanh nhiễm nhiễm Total 1 491 159 650 499.86 150.14 0.157 0.523 2 187 69 256 196.87 59.13 0.495 1.647 3 210 53 263 202.25 60.75 0.297 0.988 4 214 50 264 203.02 60.98 0.594 1.977 Total 1102 331 1433 Chi-Sq = 6.677, DF = 3, P-Value = 0.083 Chi-Square Test: So sánh tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó giữa tỉnh Cần Thơ và Vĩnh Long Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Huyết thanh Huyết không thanh nhiễm nhiễm Total

124

1 491 159 650 486.42 163.58 0.043 0.128 2 187 69 256 191.58 64.42 0.109 0.325 Total 678 228 906 Chi-Sq = 0.605, DF = 1, P-Value = 0.437 Chi-Square Test: So sánh tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó giữa tỉnh Cần Thơ và

An Giang Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Huyết thanh Huyết không thanh nhiễm nhiễm Total 1 491 159 650 499.07 150.93 0.130 0.431 2 210 53 263 201.93 61.07 0.322 1.066 Total 701 212 913 Chi-Sq = 1.950, DF = 1, P-Value = 0.163 Chi-Square Test: So sánh tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó giữa tỉnh Cần Thơ và

Cà Mau Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Huyết thanh Huyết không thanh nhiễm nhiễm Total 1 491 159 650 501.37 148.63 0.214 0.723 2 214 50 264 203.63 60.37 0.528 1.781 Total 705 209 914 Chi-Sq = 3.246, DF = 1, P-Value = 0.072

125

Chi-Square Test: So sánh tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó giữa tỉnh Vĩnh Long

và An Giang Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Huyết thanh Huyết không thanh nhiễm nhiễm Total 1 187 69 256 195.82 60.18 0.398 1.294 2 210 53 263 201.18 61.82 0.387 1.259 Total 397 122 519 Chi-Sq = 3.337, DF = 1, P-Value = 0.068 Chi-Square Test: So sánh tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó giữa tỉnh Vĩnh Long

và Cà Mau Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Huyết thanh Huyết không thanh nhiễm nhiễm Total 1 187 69 256 197.42 58.58 0.550 1.852 2 214 50 264 203.58 60.42 0.533 1.796 Total 401 119 520 Chi-Sq = 4.730, DF = 1, P-Value = 0.030 Chi-Square Test: So sánh tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó giữa tỉnh An Giang và Cà Mau Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Huyết thanh Huyết không thanh nhiễm nhiễm Total 1 210 53 263 211.60 51.40 0.012 0.050

126

2 214 50 264 212.40 51.60 0.012 0.049 Total 424 103 527 Chi-Sq = 0.123, DF = 1, P-Value = 0.726

Giống chó

Số huyết thanh kiểm tra Số huyết thanh dương tính

Giống chó nội

835

198

Giống chó ngoại

598

133

2. Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo giống chó

Chi-Square Test: Giống chó nội, Giống chó ngoại Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Giống Giống chó nội chó ngoại Total 1 198 133 331 192.87 138.13 0.136 0.190 2 637 465 1102 642.13 459.87 0.041 0.057 Total 835 598 1433 Chi-Sq = 0.425, DF = 1, P-Value = 0.514

Độ tuổi

Số mẫu kiểm tra

Số mẫu dương tính

4 tháng < 12 tháng tuổi

358

≤ 1-6 năm tuổi

737

166

338

≤ 6 năm tuổi

Chi-Square Test: < 1 năm tuổi, ≤ 1-6 năm, ≤ 6 năm Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts < 1 năm 1-6 năm <6 năm tuổi tuổi Total 1 77 166 88 331 82.69 170.24 78.07 0.392 0.105 1.262 2 281 571 250 1102 275.31 566.76 259.93 0.118 0.032 0.379

3. Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo độ tuổi chó

127

Total 358 737 338 1433 Chi-Sq = 2.288, DF = 2, P-Value = 0.319

Số huyết thanh dương tính

Giới tính

Số huyết thanh kiểm tra

Chó đực

715

173

Chó cái

718

158

4. Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo giới tính chó

Chi-Square Test: Chó đực, Chó cái Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Chó đực Chó cái Total 1 173 158 331 165.15 165.85 0.373 0.371 2 542 560 1102 549.85 552.15 0.112 0.112 Total 715 718 1433 Chi-Sq = 0.967, DF = 1, P-Value = 0.325

Phương thức nuôi Số huyết thanh kiểm tra

Số huyết thanh dương tính

Nuôi thả

949

246

Nuôi nhốt

484

5. Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo phương thức nuôi

Chi-Square Test: chó nuôi thả, chó nuôi nhốt Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts chó nuôi chó nuôi thả nhốt Total 1 246 85 331 219.20 111.80 3.276 6.423 2 703 399 1102 729.80 372.20 0.984 1.929 Total 949 484 1433 Chi-Sq = 12.611, DF = 1, P-Value = 0.000

128

6. Tỷ lệ phát hiện Leptospira từ nước tiểu Chi-Square Test: Chó không biểu hiện LS, Chó có biểu hiện LS Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Chó không Chó có biểu hiện biểu LS hiện LS Total 1 26 6 32 25.40 6.60 0.014 0.055 2 24 7 31 24.60 6.40 0.015 0.057 Total 50 13 63 Chi-Sq = 0.141, DF = 1, P-Value = 0.707

7. Các chỉ tiêu sinh lý máu trên chó nhiễm Leptospira Descriptive Statistics: B Cầu, Neu, Lym, Hcầu, HGB, HCT, PLT Variable N N* Mean SE Mean StDev Minimum Q1 Median Q3 Maximum B Cầu 13 0 33.50 3.29 11.85 17.40 21.70 36.80 44.05 50.90 Neu 13 0 74.52 2.34 8.44 52.70 70.70 75.00 80.10 86.90 Lym 13 0 36.43 6.78 24.45 2.40 16.70 33.10 60.55 81.00 Hcầu 13 0 5.447 0.822 2.963 1.250 4.135 4.760 5.855 12.520 HGB 13 0 11.98 1.34 4.82 5.30 9.70 10.60 14.05 21.50 HCT 13 0 35.75 3.92 14.14 10.20 28.40 33.90 44.00 62.00 PLT 13 0 106.4 19.2 69.1 10.0 42.0 99.0 176.5 195.0

8. Các chỉ tiêu sinh hóa máu trên chó nhiễm Leptospira Descriptive Statistics: Ure, Creatinin, AST, ALT, Bili TP Variable N N* Mean SE Mean StDev Minimum Q1 Median Q3 Ure 13 0 33.37 4.91 17.70 3.10 17.20 35.30 51.00 Creatinin 13 0 458.2 92.7 334.1 50.0 212.5 403.0 632.5 AST 13 0 299 109 394 25 54 79 461 ALT 13 0 183.2 50.9 183.5 27.0 56.0 137.0 210.5 Bili TP 13 0 390 170 613 4 8 17 834 Variable Maximum Ure 56.20 Creatinin 1132.0 AST 1156 ALT 616.0 Bili TP 1624

129

9. Các chỉ sinh lý nước tiểu trên chó nhiễm Leptospira Descriptive Statistics: Hồng cầu, Protein, Bilirubin, B. Cầu Variable N N* Mean SE Mean StDev Minimum Q1 Median Q3 Maximum H.Cầu 13 0 8.54 2.30 8.30 0.00 0.00 10.00 13.50 25.00 Protein 13 0 1.246 0.307 1.106 0.000 0.300 1.000 2.250 3.000 Bili 13 0 14.00 4.33 15.60 0.00 0.00 10.00 32.50 40.00 B.cầu 13 0 17.15 5.01 18.06 0.00 0.00 15.00 37.00 46.00

Loại chuột

10. Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chuột ở các tỉnh ĐBSCL

Chuột cống (Rattus norvegicus)

285

132

Chuột xạ (Suncus murinus)

152

210

Chuột nhắt (Mus musculus)

Tổng

647

229

Số mẫu huyết thanh kiểm tra Số mẫu huyết thanh dương tính

Chi-Square Test: Tỷ lệ nhiễm Leptospira giữa ba loại chuột Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Số huyết Số huyết thanh âm thanh tính dương tính Total 1 153 132 285 184.13 100.87 5.262 9.605 2 112 40 152 98.20 53.80 1.939 3.539 3 153 57 210 135.67 74.33 2.213 4.040 Total 418 229 647 Chi-Sq = 26.598, DF = 2, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: Tỷ lệ nhiễm Leptospira giữa chuột cống và chuột xạ Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Số huyết Số huyết thanh âm thanh tính dương tính Total 1 153 132 285 172.83 112.17 2.274 3.504 2 112 40 152 92.17 59.83 4.264 6.570 Total 265 172 437

130

Chi-Sq = 16.613, DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: Tỷ lệ nhiễm Leptospira giữa chuột cống và chuột nhắt Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Số huyết Số huyết thanh âm thanh tính dương tính Total 1 153 132 285 176.18 108.82 3.050 4.938 2 153 57 210 129.82 80.18 4.140 6.702 Total 306 189 495 Chi-Sq = 18.831, DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: Tỷ lệ nhiễm Leptospira giữa chuột xạ và chuột nhắt Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Số huyết Số huyết thanh âm thanh tính dương tính Total 1 112 40 152 111.27 40.73 0.005 0.013 2 153 57 210 153.73 56.27 0.003 0.009 Total 265 97 362 Chi-Sq = 0.031, DF = 1, P-Value = 0.861

131

Tỷ lệ dương tính trên chuột

Tỷ lệ dương tính trên chó

Các serogroup

(x)

(y)

STT

Leptospira

(%)

L. australis

5,24

5,74

2 3

L. autumnalis L. bataviae

3,93 13,97

3,63 12,08

4 5

L. canicola L. ballum

20,52 1,75

18,43 2,11

6 7

L. icterohaemorrhagiae L. pyrogenes

40,61 8,30

35,05 9,06

8 9

L. cynopterie L. gryppotyphosa

4,37 7,86

2,72 12,08

10 11

L. hebdomadis L. javanica

2,62 5,68

3,63 6,65

12 13

L. panama L. semaranga

10,92 0,44

8,76 0,91

14 15

L. pomona L. tarassovi

7,42 3,06

2,72 0,30

16 17

L. sejroe L. louisiana

9,61 4,37

9,37 2,72

L. hurstbridge

10,92

12,69

11. Mối tương quan tỷ lệ dương tính Leptospira giữa chuột và chó

Phân tích mối tương quan Regression Analysis: Tỷ lệ dương tính Leptospira trên chó (y) versus tỷ lệ dương tính Leptospira trên chuột (x) The regression equation is y = 0.466 + 0.868 x Predictor Coef SE Coef T P Constant 0.4663 0.6860 0.68 0.506 x 0.86797 0.05391 16.10 0.000 S = 2.06269 R-Sq = 94.2% R-Sq(adj) = 93.8% Analysis of Variance Source DF SS MS F P Regression 1 1103.1 1103.1 259.26 0.000 Residual Error 16 68.1 4.3 Total 17 1171.2 Unusual Observations Obs x y Fit SE Fit Residual St Resid

132

6 40.6 35.050 35.715 1.773 -0.665 -0.63 X 9 7.9 12.080 7.289 0.490 4.791 2.39R 14 7.4 2.720 6.907 0.493 -4.187 -2.09R 12. Tỷ lệ điều trị khỏi bệnh

Thuốc điều trị

Số chó được điều trị

Số chó khỏi bệnh

Phác đồ 1 (Shoptapen: Penicillin G + Streptomycin)

Phác đồ 2 (Amoxicillin)

Phác đồ 3 (Doxycycline)

Chi-Square Test: Phác đồ 1, phác đồ 2, phác đồ 3 Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts

Phác đồ 1 Phác đồ 2 Phác đồ 3 Total

1 8 11 13 32

10.16 11.17 10.67

0.459 0.003 0.510

2 12 11 8 31

9.84 10.83 10.33

0.474 0.003 0.527

Total 20 22 21 63

Chi-Sq = 1.975, DF = 2, P-Value = 0.372

Thuốc điều trị

Số chó được điều trị

Số chó khỏi bệnh

Phác đồ 1 (Shoptapen:

Penicillin G + Streptomycin)

Phác đồ 2 (Amoxicillin)

Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Phác đồ 1 Phác đồ 2 Total 1 8 11 19 9.05 9.95 0.121 0.110 2 12 11 23 10.95 12.05 0.100 0.091

Chi-Square Test: phác đồ 1, phác đồ 2

133

Total 20 22 42 Chi-Sq = 0.423, DF = 1, P-Value = 0.516 Chi-Square Test: phác đồ 1, phác đồ 3

Thuốc điều trị

Số chó được điều trị

Số chó khỏi bệnh

Phác đồ 1 (Shoptapen:

Penicillin G + Streptomycin)

Phác đồ 3 (Doxycycline)

Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Phác đồ 1 Phác đồ 3 Total 1 8 13 21 10.24 10.76 0.492 0.468 2 12 8 20 9.76 10.24 0.516 0.492 Total 20 21 41 Chi-Sq = 1.967, DF = 1, P-Value = 0.161

Thuốc điều trị

Số chó được điều trị

Số chó khỏi bệnh

Phác đồ 2 (Amoxicillin)

Chi-Square Test: phác đồ 2, phác đồ 3

Phác đồ 3 (Doxycycline) Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Phác đồ 2 Phác đồ 3 Total 1 11 13 24 12.28 11.72 0.133 0.140 2 11 8 19 9.72 9.28 0.168 0.176 Total 22 21 43 Chi-Sq = 0.617, DF = 1, P-Value = 0.432 13. Kết quả xét nghiệm máu và nước tiểu Kết quả các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu trước điều trị Descriptive Statistics: B Cầu, Neu, Lym, Hcầu, HGB, HCT, PLT, Ure, Variable N N* Mean SE Mean StDev Minimum Q1 Median Q3 B Cầu 32 0 25.33 1.73 9.80 6.80 18.41 21.95 31.68 Neu 32 0 74.50 1.68 9.52 54.80 67.78 72.30 80.45 Lym 32 0 31.42 4.85 27.46 1.27 7.28 20.70 57.37 Hcầu 32 0 5.792 0.407 2.303 1.890 4.305 5.520 7.238 HGB 32 0 12.417 0.769 4.352 4.700 9.692 12.800 14.750 HCT 32 0 34.36 2.71 15.33 0.31 24.33 35.05 44.87

134

PLT 32 0 130.80 7.82 44.21 40.10 102.25 126.50 170.50 Ure 32 0 22.83 3.13 17.73 2.40 8.57 16.45 37.25 Creatinin 32 0 220.2 46.2 261.3 40.0 77.0 127.0 245.3 AST 32 0 109.0 23.1 130.7 10.0 39.8 65.5 118.3 ALT 32 0 143.0 26.3 148.5 10.0 38.5 108.5 181.3 Bili TP 32 0 23.63 9.26 52.38 4.10 7.12 10.10 13.75 Hồng cầu 32 0 3.53 1.07 6.04 0.00 0.00 0.00 7.25 Bạch cầu 32 0 11.63 2.63 14.89 0.00 0.00 10.00 15.00 Protein 32 0 0.841 0.194 1.096 0.000 0.300 0.300 1.000 Bili 32 0 6.24 1.82 10.32 0.00 0.00 2.00 8.67 Variable Maximum B Cầu 47.80 Neu 93.70 Lym 92.00 Hcầu 12.520 HGB 21.500 HCT 62.00 PLT 195.00 Ure 56.20 Creatinin 1132.0 AST 609.0 ALT 636.0 Bili TP 262.00 Hồng cầu 20.00 Bạch cầu 55.00 Protein 3.000 Bili 55.00 Kết quả các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa máu và nước tiểu sau điều trị Descriptive Statistics: B Cầu, Neu, Lym, Hcầu, HGB, HCT, PLT, Ure, Variable N N* Mean SE Mean StDev Minimum Q1 Median B Cầu 32 0 15.126 0.715 4.045 6.800 11.850 15.250 Neu 32 0 69.53 1.94 10.98 28.60 65.43 70.00 Lym 32 0 18.89 1.01 5.72 12.00 13.90 17.75 Hcầu 32 0 5.889 0.299 1.690 3.600 4.777 5.650 HGB 32 0 14.481 0.468 2.649 10.200 12.425 14.250 HCT 32 0 37.15 1.64 9.26 20.00 31.00 37.75 PLT 32 0 303.4 47.2 267.0 49.0 86.3 166.5 Ure 32 0 7.22 1.24 6.99 2.00 3.30 5.20 Creatinin 32 0 90.63 5.00 28.30 40.00 65.00 88.00 AST 32 0 56.78 9.52 53.88 12.00 24.25 38.50 ALT 32 0 54.56 5.15 29.14 12.00 31.50 49.00 Bili TP 32 0 10.003 0.610 3.449 4.200 8.125 9.500 Hồng cầu 32 0 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 Bạch cầu 32 0 7.97 2.16 12.23 0.00 0.00 0.00 Protein 32 0 0.1469 0.0975 0.5518 0.0000 0.0000 0.0000 Bili 32 0 0.537 0.374 2.115 0.000 0.000 0.000 Variable Q3 Maximum B Cầu 18.175 25.000 Neu 76.15 88.00 Lym 21.80 31.70 Hcầu 6.565 12.800 HGB 16.775 18.900 HCT 41.50 58.60 PLT 482.0 921.0 Ure 7.08 38.70 Creatinin 116.00 138.00 AST 78.00 288.00 ALT 74.00 113.00 Bili TP 11.075 19.900 Hồng cầu 0.000000 0.000000 Bạch cầu 16.50 40.00 Protein 0.0000 3.0000 Bili 0.000 8.600

135

KẾT QUẢ MỔ KHÁM BỆNH TÍCH MỘT SỐ CHÓ CHẾT

DO LEPTOSPORA

Trường hợp 1:

- Một con chó đực, 6 năm tuổi.

- Triệu chứng lâm sàng lúc nhập viện: bỏ ăn 3 ngày, ói 5 lần/ngày, nước tiểu vàng sậm, 39,5oC, vàng da và tiêu chảy sệt.

- Xét nghiệm cận lâm sàng, tất cả các chỉ tiêu huyết học đều cao hơn bình thường: ure 54 mmol/L, creatinin 403 µmol/L, AST 1.156 U/L, ALT 523 U/L, bilirubin 1.542 µmol/L, bạch cầu 50,9x109/L, hồng cầu 7,59x1012/L, tiểu cầu 10x109/L.

- Xét nghiệm nước tiểu: có xuất hiện hồng cầu 13 tế bào/µL, protein 1 g/L Albumin

và bilirubin 35µmol/L.

- Kết quả phản ứng huyết thanh học (MAT): dương tính với Leptospira interrogans

serovar icterohaemorrhagiae ở hiệu giá 1: 1600.

- Kết quả nuôi cấy phát hiện và giải trình tự là Leptospira interrogans

- Kết quả khảo sát bệnh tích:

Hình Chó bị tiêu chảy

136

Hình Chó bệnh Leptospirosis mỡ bị vàng

Hình Phổi xuất huyết, gan sưng ngã màu vàng

Hình Thận xuất huyết

Trường hợp 2:

- Một con chó cái, 4 năm tuổi.

- Triệu chứng lâm sàng lúc nhập viện: là bỏ ăn 4 ngày, ói 6 lần/ngày, nước tiểu

vàng sậm, nhiệt độ 39,5oC, vàng da, xuất huyết một vài chỗ trên da.

- Xét nghiệm cận lâm sàng: tất cả các chỉ tiêu huyết học đều cao hơn bình thường: ure 10,2 mmol/L, creatinin 426 µmol/L, AST 61 U/L, ALT 49 U/L, bilirubin 996 µmol/L, bạch cầu 46 x109/L, hồng cầu 5,5x1012/L, tiểu cầu 144x109/L.

137

- Xét nghiệm nước tiểu: bilirubin 34 µmol/L.

- Kết quả phản ứng huyết thanh học (MAT): dương tính với Leptospira

interrogans serovar icterohaemorrhagiae ở hiệu giá 1: 3200.

- Kết quả nuôi cấy phát hiện và giải trình tự là Leptospira interrogans.

Hình Vàng da ở chó bệnh Leptospirosis

Hình Vàng da chân ở chó bệnh Leptospirosis

Hình Vàng niêm mạc miệng ở chó bệnh Leptospirosis

- Kết quả khảo sát bệnh tích:

138

Hình Gan sưng và phổi xuất huyết ở chó bệnh Leptospirosis

Trường 3:

- Chó cái, 10 năm tuổi.

- Triệu chứng lâm sàng: ăn ít, bỏ ăn sau đó ăn lại vài ngày, triệu chứng này

kéo dài rất lâu (chủ không nhớ rõ thời gian), lừ đừ lười vận động, ói 3 lần/ngày, bụng to, nước tiểu vàng sậm, nhiệt độ lúc nhập viện 39,5oC, vàng da nhẹ.

- Xét nghiệm cận lâm sàng, tất cả các chỉ tiêu huyết học đều cao hơn bình

thường: ure 13,6 mmol/L, creatinin 499 µmol/L, AST 79 U/L, ALT 63 U/L, bilirubin 157 µmol/L, bạch cầu 21,4 x109/L, hồng cầu 6,1x1012/L, tiểu cầu 60 x109/L.

- Xét nghiệm nước tiểu: có xuất hiện máu 10 tế bào/µL và bilirubin 40

µmol/L.

- Kết quả phản ứng huyết thanh học (MAT): dương tính với Leptospira

interrogans serovar icterohaemorrhagiae ở hiệu giá 1: 400.

- Kết quả phát hiện trực tiếp từ nước tiểu và giải trình tự là Leptospira

interrogans.

Hình Tích nước xoang bụng ở chó bệnh Leptospirosis

- Kết quả khảo sát bệnh tích:

139

Hình Xơ gan ở chó bệnh Leptospirosis

Hình Thận xuất huyết

Trường hợp 4:

- Chó cái, 10 năm tuổi.

- Triệu chứng lâm sàng: bỏ ăn, lừ đừ lười vận động, ói 3 lần/ngày, nước tiểu

vàng sậm, nhiệt độ lúc nhập viện 40oC, vàng da toàn thân.

- Xét nghiệm cận lâm sàng: tất cả các chỉ tiêu huyết học đều cao hơn bình thường: ure 48 mmol/L, creatinin 454 µmol/L, AST 158 U/L, ALT 226 U/L, bilirubin 671,3 µmol/L, bạch cầu 27,8 x109/L, hồng cầu 2,96x1012/L, tiểu cầu 146 x109/L.

- Xét nghiệm nước tiểu: có xuất hiện máu 200 tế bào/µL và protein 1 g/L

Albumin.

140

- Kết quả phản ứng huyết thanh học (MAT): dương tính với Leptospira

interrogans serovar icterohaemorrhagiae ở hiệu giá 1: 800.

- Kết quả phát hiện trực tiếp từ nước tiểu và giải trình tự là Leptospira

interrogans.

Hình Vàng da ở chó bệnh Leptospirosis

Hình Phổi xuất huyết

Hình Gan có đóm hoại tử

- Kết quả mổ khám bệnh tích:

141

Hình Thận xuất huyết

142

PHỤ LỤC HÌNH

Hình Xuất huyết da

Hình Vàng da vùng bụng chó bệnh Leptospirosis

MỘT SỐ HÌNH ẢNH THU THẬP KHI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Hình Tích nước xoang bụng

143

Hình Tích nước xoang bụng

Hình Xuất huyết phổi

Hình Thận xuất huyết

144

Hình Gan sưng và bỡ

Hình Hồng cầu xuất hiện trong nước tiểu

145

ĐẶC ĐIỂM PHÂN BIỆT BA LOÀI CHUỘT

Đặc điểm nhận dạng chuột cống (Rattus norvegicus)

Chuột cống có thân hình khá lớn, thân và đuôi mập. Kích thước cơ thể có chiều dài thân từ 20,5-26,7 cm, chiều dài đuôi từ 19-25 cm, chiều dài tai

từ 1,9-2,6 cm, chiều dài bàn chân sau từ 3,9-4,8 cm; trọng lượng cơ thể từ

230-586,8 g. Đuôi luôn ngắn chỉ khoảng 75% chiều dài thân. Mõm tù và rộng. Vành

tai ngắn, hơi tròn và có lông bao phủ. Khi gấp tai về phía trước không bao giờ tới

mắt. Màu lông ở lưng thay đổi từ màu xám đến xám đen. Bộ lông có nhiều lông cứng và dài, mọc dài hơn lông thường, có màu ánh thép; mặt bụng trắng đục. Gốc

lông bụng màu ghi; mu bàn chân sau trắng. Đuôi hai màu không rõ lắm, phía trên

màu đen, phía dưới màu xám bạc, các vảy ở đuôi xếp thành vòng hoàn chỉnh. Gốc

vảy có lông màu nâu nhỏ. Mặt trên đuôi có nhiều lông nên có màu nâu thẫm. Chuột cái có 10-12 vú; sọ to hẹp và bằng, xương mũi dài, gờ trên ổ mắt rõ, kéo về phía sau

dưới xương chẩm, cung gò má thô; khẩu cái dài, vượt 1/2 chiều dài chẩm mũi, lỗ

khẩu cái dài, gờ xương đỉnh thẳng, chạy song song, đây là đặc điểm của loài. Răng cửa khoẻ, nhẵn, không nhô ra phía trước. Chúng hoạt động vào ban đêm, ban ngày

ngủ, khả năng leo trèo kém hơn chuột nhà. Có khả năng bơi và đào hang. Khi kiếm

ăn thường làm bẩn lương thực thực phẩm, lan truyền nhiều bệnh truyền nhiễm cho

người như dịch tả, thương hàn, phó thương hàn, dịch hạch, bệnh sán lá… và đặc

biệt là bệnh Leptospirosis (Đào Văn Tiến, 1985).

Đặc điểm nhận dạng chuột xạ (Suncus murinus)

Thú gặm nhấm có kích thước nhỏ, chiều dài đầu - thân: 90-145 mm, chiều dài

đuôi: 46-85 mm, dài bàn chân sau: 17-23 mm. Toàn thân màu xám đen, có tuyến

hôi. Mắt rất nhỏ, mõm dài và râu mép dài.

Chuột sinh sống ở các khu dân cư, nương rẫy. Sống ở các khu nhà gần rừng hay vùng ven thành phố. Hoạt động tìm kiếm thức ăn vào ban đêm, thường phát ra tiếng kêu nhỏ khi kiếm mồi. Ban ngày sống trong các hang hốc ẩm ướt. Thức ăn là các loài côn trùng, giun sống trong khu vực và các loài thức ăn thải loại của con người (Nguyễn Văn Đĩnh, 2005).

Đặc điểm nhận dạng chuột nhắt (Mus musculus)

Chuột nhắt phân bố rộng mang tính toàn cầu, khu vực sống phổ biến ở trong nhà và ngoài đồng, chuột có thể ẩn nấp trong các khe tường, khe tủ, đống gỗ, đống rơm rạ, hoặc có thể đào hang ở bờ ruộng, hoặc sử dụng hang của những loài khác

146

để làm nơi ở. Chuột thích ở những nơi khô ráo, thoáng, hang chuột nông và có một

vài cửa. Chuột nhắt nhà sống ở tầng dưới của các công trình kiến trúc, khi bị dồn

ép, chúng có thể sống cả ở tầng trên.

Hình dạng: cỡ bé, đuôi dài hơn thân. Mõm ngắn, vành tai lớn dài. Bộ lông mềm. Mặt lưng nâu thẫm, mặt bụng xám. Đuôi hoàn toàn tối nhạt, bàn chân ngắn,

mặt trên trắng đục, với ngón chân trắng. Khi còn nhỏ giống loài chuột nhà (Rattus

rattus) (Nguyễn Văn Đĩnh, 2005).

147

PHỤ LỤC GIẢI TRÌNH TỰ GENE

1. Mẫu số 3

NR: 116542.1 Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae strain RGA 16S ribosomal RNA gene, S=2582 E=0