Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại một số tỉnh Đông Nam Bộ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN ĐỨC THÀNH

NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN

(Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP, NĂM 2016

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN ĐỨC THÀNH

NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN

(Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ

Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Mã số: 62 62 01 12

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. HÀ VIẾT CƢỜNG

2. TS. TRỊNH XUÂN HOẠT

HÀ NỘI, NĂM 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là

trung thực, khách quan và chƣa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cảm ơn,

các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận án

Nguyễn Đức Thành

LỜI CẢM ƠN

Luận án có sử dụng một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh chổi rồng và bệnh thán thƣ hại sắn” do Bộ Nông nghiệp và PTNT cấp kinh phí

thực hiện cho TS. Trịnh Xuân Hoạt làm chủ nhiệm đề tài và đã đƣợc cho phép sử dụng trong luận án.

Để hoàn thành bản luận án này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận đƣợc

rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy, quý cô và ngƣời thân.

Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Hà Viết Cƣờng và TS. Trịnh Xuân Hoạt đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành

luận án này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt

Nam, Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ Viện Bảo vệ thực vật, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Trung tâm Nghiên

cứu Bệnh cây nhiệt đới, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hƣng Lộc.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học đã nhiệt tình trao đổi, góp ý cho các

vấn đề, giải pháp, trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ kỹ thuật và bà con nông dân tại nhiều nơi đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, tôi xin gửi

lời tri ân tới tất cả ngƣời thân trong gia đình, những ngƣời luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận án

Nguyễn Đức Thành

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục ký hiệu và chữ viết tắt vi

Danh mục bảng viii

Danh mục hình x

Trích yếu luận án xii

Thesis abstract xiv

PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1

1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2. Mục tiêu của đề tài 2

1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2

1.4. Những đóng góp mới của đề tài 3

1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1. Cây sắn 5

2.1.1. Lƣợc sử nguồn gốc và phân loại cây sắn 5

2.1.2. Giá trị sử dụng và giá trị dinh dƣỡng 5

2.1.3. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới 5

2.1.4. Tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam 6

2.2. Phytoplasma hại thực vật 7

2.2.1. Lịch sử phát hiện phytoplasma 7

2.2.2. Phân loại phytoplasma 7

2.2.3. Tầm quan trọng của phytoplasma 12

2.2.4. Đặc điểm hình thái phytoplasma 13

2.2.5. Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây ra 14

2.2.6. Cơ chế gây bệnh của phytoplasma 14

2.2.7. Sự đa dạng của phytoplasma 15

2.2.8. Lan truyền của phytoplasma 16

iii

2.2.9. Phƣơng pháp chẩn đoán phytoplasma 20

2.2.10. Biện pháp phòng chống 26

2.3. Một số nghiên cứu về bệnh phytoplasma hại sắn 27

2.4. Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật ở Việt Nam 32

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

3.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 36

3.1.1. Vật liệu nghiên cứu 36

3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37

3.2. Nội dung nghiên cứu 37

3.2.1. Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 37

3.2.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 37

3.2.3. Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 38

3.2.4. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII

hại sắn 38

3.2.5. Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do

phytoplasma gây ra 38

3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 39

3.3.1. Phƣơng pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 39

3.3.2. Phƣơng pháp phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử,

nhuộm mô và PCR 40

3.3.3. Phƣơng pháp định danh phân tử và phân tích phả hệ 44

3.3.4. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII

hại sắn 46

3.3.5. Phƣơng pháp xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ

hại sắn do phytoplasma gây ra 47

3.4. Phƣơng pháp tính và xử lý số liệu 49

PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51

4.1. Mô tả triệu chứng và điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ

hại sắn 51

4.1.1. Mô tả triệu chứng bệnh 51

4.1.2. Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 53

4.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 54

4.2.1. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử 54

4.2.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô 57

4.2.3. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR 59

4.3. Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 65

4.3.1. Kết quả định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR 65

4.3.2. Kết quả định danh bằng kỹ thuật RFLP 75

4.3.3. Kết quả định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide 84

4.3.4. Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide 86

4.4. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII

hại sắn 96

4.4.1. Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 96

4.4.2. Đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma của bộ mồi LAMP 101

4.5. Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do

phytoplasma gây ra 104

4.5.1. Ảnh hƣởng của đất và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh 104

4.5.2. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép cây 108

4.5.3. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng 109

4.5.4. Khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn qua một số loài côn trùng 112

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 120

5.1. Kết luận 120

5.2. Kiến nghị 121

Danh mục các công trình công bố 122

Tài liệu tham khảo 123

Phụ lục 141

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Diễn giải ký hiệu, nghĩa tiếng Việt/tiếng Anh

Ký hiệu, chữ viết tắt

Cộng sự cs.

Công thức CT

Microliter µl

A. laidlawii Acholeplasma laidlawii

Backward internal primer (Mồi ngƣợc dòng bên trong) BIP

Basic local alignment search tool BLAST

(Công cụ tìm kiếm chuỗi tƣơng đồng cơ bản cục bộ)

bp Base pair (Cặp bazơ)

Ca. Phytoplasma Candidatus Phytoplasma

Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) CRD

Cetyl trimethyl ammonium bromide CTAB

4‟,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride DAPI

Deoxy nucleic acid DNA

Ethylene diamine tetraacetic acid EDTA

Ethanol EtOH

Food and agriculture organization FAO

(Tổ chức Nông nghiệp và Lƣơng thực của Liên hiệp Quốc)

Forward internal primer (Mồi xuôi dòng bên trong) FIP

International research project for comparative mycoplasmology IRPCM

(Dự án Nghiên cứu Quốc tế về Mycoplasma)

kb Kilo base

LAMP-PCR Loop mediated isothermal amplification - PCR

(Kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt)

M. esculenta Manihot esculenta

ml Mililiter

nm Nanometer

nts Nucleotides

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RFLP Restriction fragment length polymorphism

(Đa hình chiều dài của đoạn cắt giới hạn)

rRNA ribosomal ribonucleic acid

TAE Tris-acetate acid EDTA

TEM Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua)

UPGMA Unweighted pair group method with arithmetic mean (Phƣơng pháp

vii

ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng)

DANH MỤC BẢNG

Tên bảng Trang STT

Phân loại phytoplasma dựa trên phân tích gen 16S RNA ribosome 2.1. 8

Thành phần các nhóm côn trùng bộ Hemiptera là môi giới truyền 2.2.

phytoplasma 17

2.3. Một số mồi PCR phát hiện phytoplasma đã đƣợc công bố 23

2.4. Danh sách các nhóm phytoplasma hại sắn đã đƣợc xác định dựa vào phân

tích phân tử 32

3.1. Các cặp mồi đƣợc sử dụng để phát hiện phytoplasma trên cây sắn 42

4.1. Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại các điểm điều tra ở

một số tỉnh (năm 2011) 53

4.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử 55

4.3. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm DAPI (năm 2014) 57

4.4. Kết quả PCR phát hiện phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7-

R16F2n/R16R2 60

4.5. Kết quả PCR phát hiện phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7 -

R16mF2/R16mR1 63

4.6. Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi

R16F2n/R16R2 66

4.7. Kết quả tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc của sản phẩm PCR lồng

dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 67

4.8. Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR dùng cặp mồi

R16mF2/R16mR1 70

4.9. Kết quả tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc của sản phẩm PCR lồng

dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 71

4.10. Danh sách các mẫu phytoplasma hại sắn đã đƣợc đăng ký trên Ngân hàng

Gen 74

4.11. Danh sách các mẫu dùng trong phân tích RFLP mô phỏng 77

4.12. Mức tƣơng đồng di truyền dựa trên mô hình cắt RFLP mô phỏng vùng

gen mã hóa 16S RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn 83

4.13. So sánh mức đồng nhất trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome

viii

của các mẫu phytoplasma hại sắn 85

4.14. Đại diện 28 nhóm phytoplasma dùng trong phân tích phả hệ 86

4.15. Đại diện các nhóm phụ nhóm 16SrI dùng trong phân tích phả hệ 89

4.16. Đại diện các nhóm phụ nhóm 16SrII dùng trong phân tích phả hệ 92

4.17. Các nhóm/nhóm phụ 16S RNA ribosome của phytoplasma hại sắn tại

Việt Nam 94

4.18. Đặc điểm 8 trình tự phù hợp trên gen mã hóa 16S RNA ribosome để thiết

kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 99

4.19. Trình tự các mồi LAMP cải tiến đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 100

4.20. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số

chiết từ cây 101

4.21. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ sản phẩm PCR

tinh sạch 102

4.22. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma từ các loại mẫu sắn khác nhau bị

bệnh chổi phù thuỷ 103

4.23. Ảnh hƣởng của đất trồng và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh

chổi phù thuỷ hại sắn (Đồng Nai, năm 2012) 105

4.24. Ảnh hƣởng của nguồn vật liệu hom giống đến tỷ lệ bệnh chổi phù thuỷ

(Đồng Nai, năm 2013) 107

4.25. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua phƣơng pháp

ghép (Đồng Nai, năm 2012) 108

4.26. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng (Đồng

Nai, năm 2012) 110

4.27. Kết quả bẫy đèn thu thập một số loài rầy trên vùng trồng sắn bị nhiễm

bệnh chổi phù thuỷ (Đồng Nai, năm 2012) 113

4.28. Xác định khả năng lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn của côn trùng

thí nghiệm 116

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

2.1. Hình thái và kích thƣớc phytoplasma trong tế bào ống rây của mạch

phloem đƣợc chụp dƣới kính hiển vi điện tử 13

2.2. Minh họa sự phân bố của phytoplasma trong cơ thể côn trùng môi giới

lan truyền bệnh 18

2.3. Sơ đồ các mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng LAMP-PCR 24

2.4. Sơ đồ nguyên lý phản ứng LAMP-PCR 25

2.5. Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ 29

2.6. a) Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ ở vùng São Paulo, Brazil; b) cây sắn bị

bệnh biến vàng ở vùng Kuwanda, Uganda 29

2.7. Bệnh da cóc hại sắn 29

2.8. Một số hình ảnh xác định phytoplasma bằng phƣơng pháp hiển vi điện tử

tại Việt Nam 34

3.1. Lƣợc đồ cụm gen rDNA của phytoplasma, vị trí của các mồi và kích

thƣớc sản phẩm PCR 42

4.1. Triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ hại sắn trên đồng 52

4.2. Xác định phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử (đợt 1, năm 2011) 56

4.3. Xác định phyttoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử (đợt 2, năm 2011) 56

4.4. Kết quả thí nghiệm nhuộm DAPI 58

4.5. Minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR lồng dùng 2 cặp mồi P1/P7-

R16F2n/R16R2 62

4.6. Minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR lồng dùng 2 cặp mồi P1/P7-

R16mF2/R16mR1 64

4.7. Phân tích sản phẩm PCR bằng kỹ thuật RFLP 75

4.8. Phân tích đa hình mô phỏng trình tự nucleotide bằng pDRAW32 81

4.9. Phân tích cụm dựa trên số liệu RFLP mô phỏng vùng gen mã hóa 16S

RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam 82

4.10. Cây phả hệ xác định nhóm phytoplasma hại sắn đƣợc vẽ theo phƣơng

pháp Neighbor-Joining 88

4.11. Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI 91

4.12. Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrII 93

4.13. Minh họa một phần vùng gen 16S RNA ribosome chứa các trình tự

phytoplasma nhóm 16SrII với các nhóm còn lại 97

4.14. Vị trí các trình tự trên vùng gen mục tiêu và các mồi tƣơng ứng trong kỹ

thuật LAMP cải tiến 98

4.15. Tám đoạn trình tự đƣợc lựa chọn để thiết các mồi LAMP cải tiến đặc

hiệu nhóm 16SrII 98

4.16. Kết quả điện di sản phẩm LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ

DNA tổng số chiết từ cây 101

4.17. Kết quả điện di sản phẩm LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ

sản phẩm PCR tinh sạch 102

4.18. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma từ các loại mẫu sắn bị bệnh chổi

phù thuỷ khác nhau 103

4.19. Ảnh thí nghiệm ảnh hƣởng của đất trồng đến khả năng lan truyền của

bệnh chổi phù thuỷ sắn trong thí nghiệm nhà lƣới (năm 2012) 106

4.20. Ảnh thí nghiệm xác định khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại

sắn qua phƣơng pháp ghép 109

4.21. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng 110

4.22. Một số loài rầy thu thập trên vùng trồng sắn có cây bị bệnh chổi phù thuỷ

tại Đồng Nai (năm 2012) 114

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Nguyễn Đức Thành

Tên luận án: Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại một số tỉnh Đông Nam Bộ.

Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật

Mã số: 62 62 01 12

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Chẩn đoán và phân loại đƣợc phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh

Đông Nam Bộ; đánh giá đƣợc một số đặc điểm sinh học chính nhƣ tính gây bệnh và khả năng lan truyền của chúng.

Phƣơng pháp nghiên cứu

* Vật liệu: Hom sắn KM94, KM419 và SM937-26 đã bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ đƣợc lấy từ ruộng sản xuất của hộ nông dân. Hom sắn giống KM94 khoẻ.

* Nội dung nghiên cứu:

- Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn.

- Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR.

- Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn.

- Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn.

- Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do

phytoplasma gây ra.

* Phương pháp nghiên cứu:

- Phát hiện phytoplasma trên sắn bằng kính hiển vi điện tử truyền qua trên máy

JEOL 1010 và nhuộm với DAPI.

- DNA tổng số đƣợc tách chiết bằng CTAB theo tài liệu mô tả của Doyle and Doyle (1990). Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp đƣợc thực hiện theo tài liệu của Deng

and Hiruki (1991), Lee et al. (1994), Schneider et al. (1995), Gundersen and Lee (1996).

- Tinh chiết sản phẩm PCR dùng QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) theo

hƣớng dẫn của nhà sản xuất.

xii

- Phân tích RFLP thực hiện mô phỏng bằng chƣơng trình pDRAW32.

- Sử dụng các phần mềm tin sinh học nhƣ ClustalW2, BioEdit 7.0. Cây phả hệ

đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor-Joining trong MEGA 5.0.

- Số liệu thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê theo phƣơng pháp phân tích phƣơng sai

bằng chƣơng trình IRRISTAT 4.0.

Kết quả chính và kết luận

- Xác định đƣợc phytoplasma hại sắn tại Đông Nam Bộ thuộc ít nhất 2 nhóm gồm

16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A).

- Thiết kế và thử nghiệm đƣợc bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu cho phytoplasma

nhóm 16SrII nhằm chẩn đoán bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại Đông Nam Bộ.

- Xác định đƣợc một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra, trong đó bệnh lan truyền chủ yếu qua việc sử dụng hom giống đã bị

xiii

nhiễm bệnh.

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Nguyen Duc Thanh

Thesis title: Study on phytoplasma disease on cassava (Manihot esculenta Crantz) in South-eastern provinces.

Major: Plant Protection

Code: 62 62 01 12

Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA).

Research objectives

Diagnosis and identification of phytoplasma disease on cassava in South-eastern provinces; evaluation of some biological characteristics including the pathogenicity and

transmission ability of identified phytoplasma.

Materials and Methods

* Materials: Cassava varieties KM94, KM419 and SM937-26.

* Research content:

- Investigation of the prevalence of witches‟ broom disease on the cassava fields

in south of Vietnam.

- Detection of phytoplasma in cassava tissues by transmission electron

microscopy and DAPI staining technique.

- Molecular identification and phylogenetic analysis of the phytoplasma on

cassava Vietnam.

- Application of loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for

detection of the phytoplasma 16SrII group on cassava.

- Evaluation of biological characteristics of phytoplasma disease on cassava under

screen house conditions.

* Methods:

- The presence of phytoplasma in cassava tissues was identified by transmission

electron microscopy and DAPI staining technique.

- Total DNAs were extracted by CTAB method as previously described by Doyle

and Doyle (1990). Polymerase chain reactions were followed the methods of Deng and Hiruki (1991), Lee et al. (1994), Schneider et al. (1995), Gundersen and Lee (1996).

- PCR products from agarose gel were purified by QIAquick gel extraction kit

xiv

(Qiagen) according to manufacturer‟s instructions.

- Virtual-restriction fragment length polymorphism analysis of 16S rRNA gene

was conducted by pDRAW32 program.

- Phylogenetic trees were constructed by Neighbor-Joining method in MEGA 5.0

software.

- Statistical analysis was conducted by IRRISTAT 4.0 software.

Main findings and conclusions

- The study identified two different phytoplasma groups belonging to the 16SrI (subgroup B) and the 16SrII (subgroup A) from witches‟ broom cassava plants grown in

south-eastern provinces of Vietnam.

- The study designed loop mediated isothermal amplification (LAMP) primers based on the 16S ribosomal RNA gene. LAMP-PCR using these primers demonstrated

to be efficient to detect the phytoplasma 16SrII group on cassava.

- The study provided new scientific data on biological characteristics of phytoplasma disease on cassava. This disease is mainly transmitted by cutting through

vegetative propagation using diseased cassava plants.

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) đƣợc trồng rộng khắp ở các tỉnh trong cả nƣớc với nhiều vùng trồng tập trung, đem lại nguồn thu nhập cho ngƣời dân, góp phần ổn định tình hình kinh tế - xã hội. Sắn là cây lƣơng thực, đồng thời cung cấp nguyên liệu phục vụ cho công nghiệp chế biến, xuất khẩu và làm nguyên liệu sinh học. Sắn đã trở thành 1 trong 10 mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng, có giá trị kinh tế cao của Việt Nam và là một trong những loại cây trồng đƣợc ƣu tiên phát triển trong tầm nhìn chiến lƣợc đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.

Ở nƣớc ta trong những năm gần đây, trên cây sắn xuất hiện một loại bệnh mới đƣợc gọi là bệnh chổi phù thuỷ (hay bệnh chổi rồng) với biểu hiện triệu chứng đặc trƣng do bị nhiễm phytoplasma, nhƣ cây mọc nhiều chồi phụ ở ngọn và phần thân chính, lá biến vàng. Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn đƣợc ghi nhận xuất hiện rải rác từ năm 2005 trên giống sắn KM94 tại một số huyện của tỉnh Quảng Ngãi và đã trở thành dịch nghiêm trọng tại nhiều vùng trồng sắn thuộc một số tỉnh Đông Nam Bộ nhƣ Bà Rịa-Vũng Tàu và Đồng Nai.

Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, năng suất giảm 10 - 30%, hàm lƣợng tinh bột giảm 20 - 30% (Nguyên Khê, 2011). Ở các khu vực tiến hành trồng lại hay trồng mới thuộc các tỉnh Đông Nam Bộ, bệnh chổi phù thuỷ sắn vẫn xuất hiện, gây quan ngại cho nông dân và chính quyền địa phƣơng. Do nguyên nhân gây bệnh chƣa đƣợc xác định chính xác nên việc quản lý bệnh gặp nhiều lúng túng. Ở một số vùng trồng sắn, nông dân đã tiến hành thử nghiệm các loại thuốc trừ nấm để xử lý hom và phun cho cây sắn khi xuất hiện bệnh chổi phù thuỷ. Tuy nhiên, các biện pháp này đều không có hiệu quả phòng chống bệnh.

Cây sắn bị nhiều bệnh gây hại khác nhau, trong đó có bệnh phytoplasma. Bệnh phytoplasma hại sắn đã đƣợc ghi nhận ở một số vùng trồng sắn trên thế giới nhƣ quần đảo Wallis-Futuna, Uganda, Cuba, một số nƣớc thuộc châu Mỹ và châu Á. Phytoplasma gây hại trên cây sắn xác định đƣợc liên quan đến bệnh biến vàng lá, bệnh chổi phù thuỷ và bệnh da cóc. Ở Brazil, tại một số vùng trồng sắn thuộc phía đông bắc nƣớc này, tỷ lệ cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ lên đến 85% và năng suất củ giảm đến 70% (Flôres et al., 2013), thậm chí năng suất củ giảm sút đến 90% cũng đã đƣợc ghi nhận (Lozano, 1992).

Phytoplasma là một tác nhân đặc biệt gây bệnh trên cây trồng. Phytoplasma không thể nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo, tế bào thiếu lớp vách bên ngoài do bộ gen của chúng đã bị suy thoái mạnh. Con đƣờng lan truyền của phytoplasma ngoài tự nhiên là qua nhân giống vô tính và qua côn trùng môi giới. Do phytoplasma không nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo nên chẩn đoán và phân loại nhóm tác nhân gây bệnh này chủ yếu dựa trên phân tích một số vùng gen, quan trọng nhất là gen mã hóa 16S RNA ribosome (Bertaccini et al., 2014).

Trên thế giới, phytoplasma gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác nhau và số lƣợng bệnh mới do phytoplasma gây ra tăng theo từng năm (Bertaccini et al., 2014). Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh phytoplasma trên cây trồng còn hạn chế. Các kết quả điều tra cơ bản trƣớc đây đều chƣa phát hiện ra bệnh phytoplasma ở Việt Nam. Gần đây, dựa trên đánh giá triệu chứng và chẩn đoán phân tử, nguyên nhân gây bệnh chồi cỏ mía và trắng lá mía đã đƣợc xác định là do phytoplasma gây ra (Hoat et al., 2012, 2013). Hai bệnh này đã gây thành dịch nghiêm trọng tại một số vùng trồng mía trọng điểm của Việt Nam.

Phòng chống hiệu quả bệnh cây nói chung và bệnh chổi phù thuỷ hại sắn nói riêng phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó, đầu tiên là phải xác định chính xác tác nhân gây bệnh và các đặc điểm sinh học của bệnh. Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn là một bệnh mới ở Việt Nam nên cần phải thực hiện nghiên cứu về bệnh, đặc biệt tại các tỉnh trọng điểm có dịch ở Đông Nam Bộ.

1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Chẩn đoán và phân loại đƣợc phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số

tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá đƣợc một số đặc điểm sinh học chính nhƣ tính gây

bệnh và khả năng lan truyền của chúng.

1.3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Phytoplasma gây hại trên cây sắn, tập trung vào lĩnh vực chẩn đoán, phân

loại và một số đặc điểm sinh học.

1.3.2. Phạm vi nghiên cứu

Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thủy hại sắn ở Đông Nam Bộ, xác định nguyên nhân phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn. Nghiên cứu biện pháp chẩn đoán, xác định và phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn và khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn ở điều kiện chậu vại trong nhà lƣới.

1.3.3. Địa điểm thời gian nghiên cứu

Điều tra trên đồng, thu thập mẫu đƣợc thực hiện tại một số tỉnh Đông Nam

Bộ gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dƣơng, Bình Phƣớc, Tây Ninh và

một số tỉnh khác, bao gồm Phú Thọ, Yên Bái, Quảng Ngãi, Kon Tum.

Các nghiên cứu liên quan tới xác định đặc điểm sinh học đƣợc thực hiện tại

Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hƣng Lộc; nghiên cứu chẩn

đoán, phân loại phytoplasma hại sắn đƣợc thực hiện tại Viện Bảo vệ thực vật và

Trung tâm Nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới.

Thời gian thực hiện các thí nghiệm trong đề tài từ năm 2011 đến năm 2014.

1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài đã xác định đƣợc bệnh chổi phù thủy hại sắn tại Việt Nam do

phytoplasma gây ra. Phytoplasma hại sắn tại Việt Nam thuộc 2 nhóm gồm 16SrI

(nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A). Riêng mẫu phytoplasma hại

sắn YB-01 (KM360166) ở Yên Bái thuộc nhóm 16SrI nhƣng nằm trong nhóm

phụ hoàn toàn mới, chƣa đƣợc công bố.

Áp dụng thành công kỹ thuật nhuộm mô cây bằng DAPI để phát hiện

phytoplasma hại sắn tại Việt Nam.

Thiết kế thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu để xác định phytoplasma

nhóm 16SrII hại sắn tại Đông Nam Bộ. Đề xuất đƣợc quy trình chẩn đoán

phytoplasma hại sắn cho một số tỉnh Đông Nam Bộ.

Cung cấp dẫn liệu khoa học về một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù

thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra. Xác định đƣợc con đƣờng lan truyền chính

của bệnh là qua nhân giống vô tính đã bị nhiễm bệnh.

1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1. Ý nghĩa khoa học

Đã xác định đƣợc phytoplasma là nguyên nhân gây bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại Đông Nam Bộ, phân loại đƣợc phytoplasma hại sắn ở Việt Nam thuộc 2 nhóm 16SrI và 16SrII. Đã ứng dụng thành công các kỹ thuật để chẩn đoán, phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn nhƣ kính hiển vi điện tử, kỹ thuật nhuộm mô cây bằng DAPI, kỹ thuật PCR lồng, kỹ thuật RFLP và kỹ thuật LAMP-PCR. Xác định đƣợc con đƣờng lan truyền của phytoplasma gây bệnh

chổi phù thủy trên sắn tại Đông Nam Bộ là chủ yếu qua nhân giống vô tính.

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn

Xác định đƣợc phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn, cũng nhƣ xác

định đƣợc con đƣờng lan truyền chủ yếu của phytoplasma hại sắn đã góp phần

đƣa ra biện pháp quản lý bệnh chổi phù thuỷ một cách có hiệu quả trong điều kiện sản xuất tại một số tỉnh Đông Nam Bộ. Biện pháp quan trọng nhất để quản

lý bệnh là phát hiện bệnh sớm và sử dụng giống sạch bệnh.

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. CÂY SẮN

2.1.1. Lƣợc sử nguồn gốc và phân loại cây sắn

Cây sắn có nguồn gốc vùng nhiệt đới của châu Mỹ và đƣợc trồng cách đây

5.000 - 7.000 năm trƣớc Công nguyên (Allem, 2002). Cây sắn đƣợc ngƣời Bồ

Đào Nha đƣa đến châu Phi vào khoảng giữa thế kỷ XVI, nhƣng việc trồng và tiêu

thụ sắn ở châu Phi mới thực sự phát triển từ cuối thế kỷ XIX (FAO, 2005).

Ở vùng Ấn Độ Dƣơng, sắn đƣợc du nhập vào các đảo thuộc trong vùng này,

từ đó sắn đƣợc đƣa sang Sri Lanka và một số nƣớc phía Đông thuộc châu Phi. Ở

châu Á, sắn đƣợc du nhập vào từ vùng Ấn Độ Dƣơng do ngƣời Tây Ban Nha, Bồ

Đào Nha đƣa vào trồng. Sự phát triển nghề trồng sắn ở châu Á chỉ trở lên quan

trọng từ cuối thế kỷ XIX. Ở châu Đại Dƣơng, sắn đƣợc đem trồng ở Ốt-xtrây-li-a

từ thế kỷ XX. Ở châu Âu hầu nhƣ không phát triển nghề trồng sắn (Howeler et

al., 2013).

Về phân loại, cây sắn có tên khoa học là Manihot esculenta Crantz, thuộc

chi Manihot, họ Euphorbiaceae (Howeler et al., 2013).

2.1.2. Giá trị sử dụng và giá trị dinh dƣỡng

Tuy có nhiều quan điểm khác nhau về giá trị sử dụng và giá trị dinh dƣỡng,

nhƣng sắn vẫn là cây trồng đƣợc quan tâm phát triển.

Sắn có nhiều công dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn gia súc và

lƣơng thực - thực phẩm. Củ sắn chứa nhiều tinh bột nên thƣờng đƣợc chế biến

thành bột sắn khô. Trong củ sắn tƣơi có chứa đến 80% hàm lƣợng carbonhydrate,

canxi (50 mg/100 g), phốtpho (40 mg/100 g), vitamin (25 mg/100 g) và các chất dinh dƣỡng khác. Lá sắn là một nguồn cung cấp protein, có chứa nhiều axít amin cần thiết nhƣng thiếu lysine, methionine và tryptophan (Ravindran, 1992). Ở nhiều nƣớc, việc nghiên cứu, đánh giá sử dụng sắn nhƣ là một nguyên liệu nhiên

liệu sinh học ethanol đang đƣợc chú ý (Howeler et al., 2013).

2.1.3. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới

Sắn đƣợc trồng ở nhiều nƣớc có khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới. Sắn là

nguồn thực phẩm của hơn 800 triệu ngƣời, là một trong những cây lƣơng thực

quan trọng và chiếm diện tích lớn nhất trong sản xuất nông nghiệp của loài ngƣời. Ở nhiều nƣớc có khí hậu nhiệt đới ẩm, sắn là cây lƣơng thực có vị trí hàng

đầu (Howeler et al., 2013).

Theo số liệu thống kê của Tổ chức Nông Lƣơng thế giới (Food and

agriculture organization, FAO), diện tích, năng suất và sản lƣợng sắn của toàn

thế giới trong giai đoạn 10 năm từ năm 1999 đến năm 2009 đều tăng, các chỉ số

này vào năm 1999 lần lƣợt là 16,85 triệu ha; 10,09 tấn/ha và 170,01 triệu tấn, đến

năm 2009 các chỉ số này lần lƣợt là 18,92 triệu ha; 12,36 tấn/ha và 233,80 triệu

tấn (FAOSTAT, 2014). Vào năm 2009, diện tích trồng sắn của thế giới tập trung

chủ yếu ở các nƣớc châu Phi với 12,26 triệu ha và sản lƣợng đạt 11,89 triệu tấn.

Các chỉ số này ở châu Á lần lƣợt là 4,05 triệu ha và 8,16 triệu tấn; ở châu Mỹ

Latinh là 2,59 triệu ha và 3,32 triệu tấn. Các nƣớc thuộc châu Đại Dƣơng cũng có

trồng sắn rãi rác nhƣng không đáng kể. Nigeria là nƣớc có diện tích trồng sắn lớn

nhất thế giới với hơn 3,12 triệu ha và sản lƣợng đạt 36,80 triệu tấn vào năm 2009

(FAOSTAT, 2014).

Năng suất sắn củ tƣơi bình quân của thế giới đạt 12,38 tấn/ha vào năm

2009. Ấn Độ là nƣớc có năng suất sắn củ tƣơi đạt cao nhất thế giới (34,36

tấn/ha), kế tiếp là Thái Lan (22,68 tấn/ha) và Indonesia (18,74 tấn/ha). Thái Lan

là nƣớc xuất khẩu sắn khô lớn nhất, chiếm 77% sản lƣợng xuất khẩu của thế giới

trong năm 2005. Nƣớc xuất khẩu sắn khô lớn thứ hai là Việt Nam (13,6%), tiếp

theo là In-đô-nê-xi-a (5,8%) và Costa Rica (2,1%) (FAOSTAT, 2014).

2.1.4. Tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam

Theo số liệu của Tổng cục Thống kê (2015), diện tích cây sắn ở Việt Nam

vào năm 1995 có khoảng 277,4 nghìn ha với sản lƣợng là 2211,5 nghìn tấn; các

chỉ số này đến năm 2014 lần lƣợt là 551,9 nghìn ha và 10.255,3 nghìn tấn. Năm

2011, diện tích trồng sắn là cao nhất (558,4 nghìn ha), với sản lƣợng cũng đạt cao

nhất (9897,9 nghìn tấn). Diện tích và sản lƣợng sắn tăng lên do nhu cầu của một

số ngành thực phẩm và công nghiệp chế biến. Các vùng gồm Trung du và miền

núi phía Bắc, vùng Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung, vùng Đông Nam Bộ

là những vùng trồng sắn chủ lực và có sản lƣợng sắn đạt cao nhất của cả nƣớc.

Vùng đồng bằng sông Hồng và vùng đồng bằng sông Cửu Long có diện tích

trồng sắn và sản lƣợng sắn thấp hơn cả.

2.2. PHYTOPLASMA HẠI THỰC VẬT

2.2.1. Lịch sử phát hiện phytoplasma

Năm 1967, phytoplasma gây hại thực vật lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở

Nhật Bản với hiện tƣợng cây trồng bị bệnh biến vàng. Lúc đó, phytoplasma đƣợc phát hiện trong tế bào ống rây của mạch phloem cây bệnh có tên gọi là vi sinh

vật giống mycoplasma (mycoplasma like organisms, MLOs) (Doi et al., 1967).

Từ năm 1967 - 1993, tên gọi MLOs đƣợc sử dụng để nghiên cứu tác nhân của

nhiều bệnh biến vàng cây trồng. Đến năm 1994, tên gọi phytoplasma đƣợc công nhận, thay cho tên gọi MLOs tại Hội nghị các Tổ chức Quốc tế ngành

Mycoplasma học (Lee et al., 2000). Cho đến năm 2007, trên thế giới đã phát hiện

hơn 300 loại bệnh khác nhau do phytoplasma gây ra ở hàng trăm loài cây trồng

quan trọng khác nhau (Hoshi et al., 2007).

2.2.2. Phân loại phytoplasma

Việc nghiên cứu tìm hiểu về phytoplasma đƣợc bắt đầu vào những năm

cuối thập niên 80 và đầu thập niên 90 của thế kỷ XX. Đầu tiên các phân tích phả

hệ dựa trên các chuỗi gen mã hóa 16S RNA ribosome (16S ribosomal ribonucleic

acid gene) và gen mã hóa protein ribosome (ribosomal protein gene) đã xác định

chính xác phytoplasma là thành viên của lớp dịch khuẩn bào (Mollicutes).

Hiện nay, về phân loại, tất cả phytoplasma đƣợc xếp vào chi „Candidatus

Phytoplasma‟ („Ca. Phytoplasma‟), bộ Acholeplasmatales, lớp Mollicutes, ngành

Firmucutes (IRPCM, 2004; Hogenhout et al., 2008). Dựa trên cơ sở so sánh

chuỗi gen mã hóa 16S RNA ribosome, các loài thuộc chi „Ca. Phytoplasma‟

đƣợc xếp vào 33 nhóm phả hệ khác nhau (ký hiệu từ 16SrI đến 16SrXXXIII) với

hơn 116 nhóm phụ nhƣ trình bày ở bảng 2.1 (Lee et al., 1998; Lee et al., 2004;

Arocha et al., 2005; Al-Saady et al., 2008; Bertaccini and Duduk, 2009;

Bertaccini et al., 2014).

Theo Nhóm nghiên cứu phân loại phytoplasma của Dự án Nghiên cứu Quốc tế về Mycoplasma (International Research Project for Comparative Mycoplasmology, IRPCM), một loài phytoplasma đƣợc coi là một loài mới thuộc „Ca. Phytoplasma‟ khi so sánh dựa trên trình tự vùng gen mã hóa 16S

RNA ribosome (trình tự nucleotide  1,2 kb) có mức đồng nhất trình tự

nucleotide thấp hơn 97,5% so với các loài „Ca. Phytoplasma‟ đã đƣợc công bố

trƣớc đó (IRPCM, 2004).

Bảng 2.1. Phân loại phytoplasma dựa trên phân tích gen 16S RNA ribosome

Nhóm 16Sr RNA Bệnh liên quan đến phytoplasma (tên viết tắt) Mã truy cập Ngân hàng Gen

Aster yellows witches‟ broom (AYWB) Tomato big bud (BB) Onion yellows mild strain (OY-M) Aster yellows (MAY) Clover phyllody (CPh) Paulownia witches‟ broom (PaWB) Blueberry stunt (BBS3) Aster yellows apricot (A-AY) Strawberry witches‟ broom (STRAWB1) Strawberry witches‟ broom (STRAWB2) Aster yellows (AV2192) Aster yellows (AVUT) Aster yellows (IoWB) Soybean purple stem (SPS) Aster yellows from Populus (PopAY) Cherry little leaf (ChLL) Strawberry phylloid fruit (StrawbPhF) Mexican potato purple top (COAH10) Mexican potato purple top (JAL6) Mexican potato purple top (SON18) Peach rosette-like disease (PRU0382) Brote grande of tomato NC_007716 L33760 NC_005303 M30790 AF222065 AY265206 AY265213 AY265211 U96614 U96616 AY180957 AY265209 AY265205 AF268405 AF503568 AY034089 AY102275 FJ914654 FJ914650 FJ914642 HQ450211 EF199549

Peanut witches‟ broom (PnWB) Lime witches‟ broom (WBDL) Faba bean phyllody (FBP) Papaya mosaic (PpM) Pichris echioides phyllody (PEY) Cotton phyllody (CoP) L33765 U15442 X83432 Y10096 Y16393 EF186827

16SrI: Aster yellows I-A I-A I-B I-B I-C I-D I-E I-F I-I I-K I-L I-M I-N I-O I-P I-Q I-R I-S I-U I-V I-W I-Y 16SrII: Peanut witches‟ broom II-A II-B II-C II-D II-E II-F 16SrIII: X-disease III-A III-B III-C III-D Peach X-disease (PX11CT1) Clover yellow edge (CYE) Pecan bunch (PB) Goldenrod yellows (GR1) JQ044393 AF173558 GU004371 GU004372

Nhóm 16Sr RNA Bệnh liên quan đến phytoplasma (tên viết tắt)

Spiraea stunt (SP1) Milkweed yellows (MW1) Walnut witches‟ broom (WWB) Poinsettia branch-inducing (PoiBI) Virginia grapevine yellows (VGYIII) Chayote witches‟ broom (ChWBIII) Strawberry leafy fruit (SLF) Cassava frog skin disease (CFSD) Potato purple top (MT117) Potato purple top (AKpot6) Dandelion virescence (DanV) Black raspberry witches‟ broom (BRWB7) Sweet and sour cherry (ChD) Cirsium white leaf (CWL) Passion fruit phytoplasma (PassWB-Br4) Mã truy cập Ngân hàng Gen AF190228 AF510724 AF190227 AF190223 AF060875 AF147706 AF274876 EU346761 FJ226074 GU004365 AF370119 AF302841 FJ231728 AF373105 GU292082

Coconut lethal yellowing (LYJ-C8) Yucatan coconut lethal decline (LDY) Tanzanian coconut lethal decline (LDT) AF498307 U18753 X80117

Elm yellows (EY) Jujube witches‟ broom (JWB-G1) Flavescence dorée (FD-C) Flavescence dorée (FD-D) Rubus stunt (RuS) Balanite witches‟ broom (BltWB) AY197655 AB052876 X76560 AJ548787 AY197648 AB689678

Clover proliferation (CP) Strawberry multiplier disease (MC) Illinois elm yellows (EY-IL1) Periwinkle little leaf (PLL-Bd) Centarurea solstitialis virescence (CSVI) Catharanthus phyllody phytoplasma (CPS) Portulaca little leaf phytoplasma (PLL-Ind) Passionfruit (WB-Br4) AY390261 AF190224 AF409069 AF228053 AY270156 EF186819 EF651786 GU292081

III-E III-F III-G III-H III-I III-J III-K III-L III-M III-N III-P III-Q III-T III-U III-V 16SrIV: Coconut lethal yellows IV-A IV-B IV-C 16SrV: Elm yellows V-A V-B V-C V-D V-E V-F 16SrVI: Clover proliferation VI-A VI-B VI-C VI-D VI-E VI-F VI-H VI-I 16SrVII: Ash yellows VII-A Ash yellows (AshY) AF092209

Nhóm 16Sr RNA Bệnh liên quan đến phytoplasma (tên viết tắt)

Erigeron witches‟ broom (ErWB) Argentinian alfalfa witches‟ broom (ArAWB)

Loofah witches‟ broom (LufWB) Mã truy cập Ngân hàng Gen AY034608 AY147038 AF086621

Pigeon pea witches‟ broom (PPWB) Almond witches‟ broom (AlWB) Naxos periwinkle virescence (NAXOS) Almond witches‟ broom (AlWB) Juniperus witches‟ broom Almond and stone fruit witches‟ broom (N27-2) Almond and stone fruit witches‟ broom (A1-1) AF248957 AF515636 HQ589191 AF515637 GQ925918 HQ407532 HQ407514

Apple proliferation (AP) European stone fruit yellows (ESFY) Pear decline (PD) Spartium witches‟ broom (SpaWB) Black alder witches‟ broom (BAWB) AJ542541 AJ542544 AJ542542 X92869 X76431

Rice yellow dwarf (RYD) Sugarcane white leaf (SCWL) Leafhopper-borne (BVK) AB052873 X76432 X76429

Stolbur (STOL11) Australian grapevine yellows (AUSGY) Strawberry lethal yellows (StrawLY) Japanese hydrangea phyllody Yellows diseased strawberry (StrawY) Bois noir (BN-Op30) Bois noir (BN-Fc3) Bindweed yellows (BY-S57/11) AF248959 L76865 AJ243045 AB010425 DQ086423 EU836630 EU836647 JN833705

Mexican periwinkle virescence (MPV) Strawberry green petal (SGP) AF248960 U96616

VII-B VII-C 16SrVIII: Loofah witches‟ broom VIII-A 16SrIX: Pigeon pea witches‟ broom IX-A IX-B IX-C IX-D IX-E IX-F IX-G 16SrX: Apple proliferation X-A X-B X-C X-D X-E 16SrXI: Rice yellow dwarf XI-A XI-B XI-C 16SrXII: Stolbur XII-A XII-B XII-C XII-D XII-E XII-F XII-G XII-H 16SrXIII: Mexican periwinkle virescence XIII-A XIII-B 16SrXIV: Bermudagrass white leaf XIV-A XIV-B Bermudagrass white leaf (BGWL) Bermudagrass white leaf Iran AJ550984 EF444485

Nhóm 16Sr RNA Bệnh liên quan đến phytoplasma (tên viết tắt) Mã truy cập Ngân hàng Gen

Hibiscus witches‟ broom (HibWB) Guazuma witches‟ broom (GWB) AF147708 HQ258882

Sugarcane yellow leaf syndrome AY725228

Papaya bunchy top AY725234

American potato purple top wilt DQ174122

Chestnut witches‟ broom AB054986

Rhamnus witches‟ broom AJ583009

Pinus phytoplasma (PinP) AJ310849

Lethal yellow disease Mozambique (LYDM) Cape St. Paul wilt disease (CSPW) KF751387 JQ868442

AY083605

Sorghum bunchy shoot AF509322

Weeping tea witches‟ broom AF521672

Sugarcane phytoplasma D3T1 AJ539179

Sugarcane phytoplasma D3T2 AJ539180

Derbid phytoplasma AY744945

Cassia witches‟ broom (CaWB) EF666051

Salt cedar witches‟ broom FJ432664

Soybean stunt (SoyST1c1) HQ225630

16SrXV: Hibiscus witches‟ broom XV-A XV-B 16SrXVI: Sugarcane yellow leaf syndrome XVI-A 16SrXVII: Papaya bunchy top XVII-A 16SrXVIII: American potato purple top wilt XVIII-A 16SrXIX: Chestnut witches‟ broom XIX-A 16SrXX: Rhamnus witches‟ broom XX-A 16SrXXI: Pinus phytoplasmas XXI-A 16SrXXII: - XXII-A XXII-B 16SrXXIII: - 16SrXXIII-A Buckland valley grapevine yellows 16SrXXIV: - XXIV-A 16SrXXV: - XXV-A 16SrXXVI: - XXVI-A 16SrXXVII: - XXVII-A 16SrXXVIII: - XXVIII-A 16SXXIX: Cassia witches‟ broom XXIX-A 16SXXX: Salt cedar witches‟ broom XXX-A 16SXXXI: Soybean stunt XXXI-A 16SXXXII: Malaysian periwinkle virescence and phyllody

Nhóm 16Sr RNA Bệnh liên quan đến phytoplasma (tên viết tắt)

Malaysian periwinkle virescence (MaPV) Malayan yellow dwarf phytoplasma (MYD) Malayan oil palm phytoplasma (MOP) Mã truy cập Ngân hàng Gen EU371934 EU498727 EU498728

XXXII-A XXXII-B XXXII-C 16SXXXIII: Allocasuarina muelleriana phytoplasma XXXIII-A Allocasuarina phytoplasma

AY135523 Nguồn: Lee et al. (1998), Bertaccini et al. (2014)

2.2.3. Tầm quan trọng của phytoplasma

Bệnh phytoplasma gây ra là một trong những yếu tố hạn chế đầu tiên cho

sản xuất của nhiều cây trồng quan trọng trên toàn thế giới. Phytoplasma gây ra

rất nhiều bệnh trên cây lƣơng thực, cây rau, cây ăn quả, cây hoa và cây bóng mát với mức thiệt hại kinh tế là khác nhau (Al-Saady et al., 2008; Al-Subhi et al.,

2011). Ví dụ, phytoplasma thuộc nhóm gây bệnh biến vàng cây cúc tây (16SrI)

làm giảm lợi nhuận kinh tế của nhiều loại cây trồng (cần tây, rau diếp xoăn,...) ở

các nƣớc thuộc bắc Mỹ và một số nƣớc châu Âu, thiệt hại kinh do bệnh gây ra ở

mức 10 - 25%, có khi đến tới 80 - 90%. Bệnh phytoplasma gây hại trên cây đào

(nhƣ bệnh biến vàng, bệnh X) làm giảm chất lƣợng quả, gây thất thu ở Hoa Kỳ

(Bertaccini and Duduk, 2009; Duduk et al., 2009).

Bệnh lùn cây lúa miến, bệnh lùn cây ngô ở châu Âu và châu Mỹ (Duduk

and Bertaccini, 2006). Bệnh biến vàng, lùn cây lúa ở vùng trồng ở Đông Nam Á,

Ấn Độ có dạng do phytoplasma gây ra làm giảm sản lƣợng thóc (Jung et al.,

2003; Valarmathi et al., 2013).

Bệnh trắng lá mía, bệnh chồi cỏ gây hại trên cây mía ở các nƣớc châu Á

làm giảm sản lƣợng mía, có lúc trở thành vấn đề nghiêm trọng tại một số nƣớc

(Marcone, 2002; Rao et al., 2005; Ariyarathna et al., 2007). Bệnh chổi phù thuỷ,

bệnh biến vàng ở cây khoai lang, cây khoai tây làm giảm sản lƣợng khoai ở châu Á, châu Âu (Munyaneza, 2010). Bệnh hóa gỗ quả táo tây gây thiệt hại khoảng 25

- 100 triệu Euro tại các nƣớc Italia và Đức (Strauss, 2009).

Bệnh vàng lá nho, đu đủ, bệnh cây lê còi cọc, hoá xanh vỏ quả cam, chổi phù thuỷ táo ta, chổi phù thuỷ sơ-ri, chổi phù thuỷ chanh tây và nhiều cây ăn quả khác làm giảm sản lƣợng, chất lƣợng quả ở nhiều vùng trên thế giới (Davis et al., 1998; Paltrinieri et al., 2006; Chen et al., 2009; Gajardo et al., 2009; Contaldo et

al., 2011; Gonzalez et al., 2011; Mardi et al., 2011).

Bệnh phytoplasma gây hại trên cây trồng thuộc cây họ đậu, cây họ vừng làm giảm sản lƣợng ở nhiều vùng trên thế giới (Khan et al., 2007; Sertkaya et al., 2007;

Teixeira et al., 2008; Akhtar et al., 2009; Win et al., 2010; Kumar et al., 2011).

Cũng có trƣờng hợp đặc biệt, bệnh phytoplasma gây hại trên cây trồng lại có lợi cho sự phát triển của cây, từ đó làm tăng giá trị của cây trồng, ví dụ nhƣ

bệnh phytoplasma gây lùn cây trạng nguyên (Bertaccini et al., 1996).

2.2.4. Đặc điểm hình thái phytoplasma

Do thiếu vách tế bào nên tế bào phytoplasma gây bệnh cây thông thƣờng có

hình dạng không cố định. Khi quan sát dƣới kính hiển vi điện tử, phytoplasma có

hình bầu dục, hình ovan, hình tròn, dạng hình sợi ngắn, đôi khi ở dạng không

định hình; thông thƣờng có kích thƣớc đƣờng kính nhỏ hơn 1 m (hình 2.1).

Phytoplasma không có màng vững chắc nhƣ vi khuẩn nhƣng cơ thể của

phytoplasma đƣợc bao bọc bằng hai lớp màng, có tính đàn hồi (Bertaccini and

Duduk, 2009).

Hình 2.1. Hình thái và kích thƣớc phytoplasma trong tế bào ống rây của mạch phloem đƣợc chụp dƣới kính hiển vi điện tử

Nguồn: Marcone (2014)

2.2.5. Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây ra

Phytoplasma xâm nhập vào bó mạch phloem và gây ra hiện tƣợng biến

vàng ở cây bệnh. Hầu hết, các cây bị nhiễm phytoplasma đều có lá màu nhạt,

hàm lƣợng chlorophyl, carotenoid đều giảm (Bertamini and Nedunchezhian, 2001). Cây nhiễm phytoplasma thƣờng biểu hiện dạng triệu chứng sau (Lee et

al., 2000; Christensen et al., 2005): (i) Lá biến màu, thƣờng biến dạng lá màu

vàng hoặc đỏ; (ii) Hiện tƣợng diệp hóa: một phần hoa phát triển thành cấu trúc

lá; (iii) Hiện tƣợng lục hóa: hoa phát triển có màu xanh giống lá hoặc mất màu; (iv) Cây biến dạng, thấp lùn, còi cọc; (v) Đốt thân, ngọn cành, ngọn chính rụt

ngắn lại; (vi) Biến dạng chổi phù thuỷ (hay chổi rồng): mọc nhiều chồi phụ ở

cành, thân chính.

2.2.6. Cơ chế gây bệnh của phytoplasma

Phytoplasma là ký sinh bắt buộc trong tế bào ống rây của mạch phloem cây bệnh và trong cơ thể nhiều loài côn trùng (Bai et al., 2006). Vì ký sinh trong tế bào ống rây của mạch phloem nên phytoplasma đã ức chế quá trình vận chuyển các sản phẩm đồng hóa, chủ yếu là carbonhydrate, từ mô sản xuất nhƣ lá trƣởng thành, tới các mô tiêu thụ nhƣ rễ, củ và lá non. Hậu quả là các mô sản xuất đã tích lũy lƣợng lớn bất thƣờng các sản phẩm đồng hóa, còn các mô tiêu thụ lại bị thiếu hụt nghiêm trọng các chất này. Việc cản trở quá trình vận chuyển các sản phẩm đồng hóa thông qua mạch phloem sẽ dẫn tới suy giảm một loạt các chức năng sinh lý của cây và do đó có thể gây ra triệu chứng. Tuy nhiên, cơ chế chính xác của tác động này đến biểu hiện triệu chứng cây vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ (Marcone, 2014).

Trong những năm gần đây, dựa trên các nghiên cứu sinh học phân tử, cơ chế gây bệnh của phytoplasma trên thực vật đã dần đƣợc sáng tỏ. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, giống nhƣ virus, một số protein của phytoplasma đã can thiệp vào một loạt các đƣờng hƣớng sinh học liên quan đến sinh trƣởng, phát triển và biệt hóa mô của thực vật. Một số protein gây bệnh của phytoplasma đã đƣợc nghiên cứu bao gồm:

(i) SAP11. SAP11 là một protein do „Ca. Phytoplasma asteris‟ chủng AY- WB tạo ra. Cây Arabidopsis thaliana đƣợc chuyển gen SAP11 biểu hiện một loạt các triệu chứng giống hệt nhƣ bị nhiễm phytoplasma AY-WB. Protein SAP11 có dấu hiệu nhập nhân ở đầu amin cho phép nó liên kết với một α-importin - một protein có chức năng vận chuyển các protein từ tế bào chất vào trong nhân tế

bào. Do đó, SAP11 có thể di chuyển vào trong nhân tế bào ký chủ. Trong nhân, SAP11 tƣơng tác với một số protein điều khiển phiên mã (transcription factors)

nhƣ TEOSINTE BRANCHED 1, CYCLOYDEA và PROLIFERATING CELL

FACTOR 1, 2. Cả 3 protein điều khiển phiên mã này chịu trách nhiệm điều khiển

biểu hiện một loạt các gen liên quan đến phát triển thực vật. Đặc biệt, protein SAP11 làm mất tính ổn định của protein điều khiển phiên mã CINCINNATA-

chịu trách nhiệm điều khiển sự thành thục và già hóa của mô. Protein SAP11 do phytoplasma tạo ra trong tế bào ống rây có thể di chuyển hệ thống trong cây tới

các tế bào của mô tiêu thụ và xâm nhập vào nhân tế bào (Sugio and Hogenhout,

2012; Marcone, 2014).

(ii) SAP54. SAP54 cũng là một protein do „Ca. Phytoplasma asteris‟ chủng AY-WB tạo ra. Cây A. thaliana đƣợc chuyển gen SAP54 biểu hiện triệu chứng

diệp hóa điển hình giống nhƣ bị nhiễm phytoplasma. Protein SAP54 tƣơng tác

với protein RADIATION SENSITIVE23 (RAD23) của tế bào ký chủ, dẫn tới

phân hủy 2 protein điều khiển phiên mã là APETALA1 (AP1)/CAULIFLOWER

và LEAFY - là 2 protein đóng vai trò chủ chốt trong quá trình biệt hóa hoa của

cây (MacLean et al., 2011).

(iii) TENGU. TENGU là một protein do „Ca. Phytoplasma asteris‟ chủng

M tạo ra. Cây A. thaliana đƣợc chuyển gen mã hóa TENGU biểu hiện triệu

chứng chổi phù thuỷ và lùn cây điển hình giống nhƣ bị nhiễm phytoplasma.

TENGU là một protein đƣợc phytoplasma tiết vào tế bào mạch phloem và di

chuyển hệ thống trong cây và xâm nhập đƣợc vào các tế bào khác, kể cả tế bào

của mô tiêu thụ ở phần ngọn cây. Khác với 2 protein ở trên, TENGU hoạt động

trong tế bào chất chứ không phải trong nhân của tế bào đích. Trong tế bào chất,

TENGU ức chế sinh tổng hợp auxin. Hậu quả là sự phát triển của chồi đỉnh bị ức

chế dẫn tới kích thích phát triển của chồi bên tạo ra triệu chứng chổi phù thuỷ

(Hoshi et al., 2009; Sugio and Hogenhout, 2012; Sugawara et al., 2013).

2.2.7. Sự đa dạng của phytoplasma

Phytoplasma là tác nhân gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác nhau và số lƣợng bệnh mới phát hiện đƣợc tăng theo từng năm. Phytoplasma có khả năng gây bệnh cho một loại cây trồng do cùng một chủng, hoặc phytoplasma cũng có thể gây ra cùng một loại bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Hơn

nữa, côn trùng môi giới và cây trồng đều là những ký chủ tự nhiên của

phytoplasma (Lee et al., 2000; Bertaccini and Duduk, 2009; Sugio et al., 2011). Sự thay đổi về mặt di truyền của một số nhóm phytoplasma thƣờng liên quan đến

vùng sinh thái, mặc dù đối với một số nhóm phụ lại liên quan đến phổ ký chủ cây

trồng và côn trùng môi giới. Côn trùng môi giới truyền phytoplasma gây bệnh

chổi phù thuỷ trên cây hông, bệnh lùn cây ngô hoàn toàn khác so với các côn trùng môi giới truyền một số bệnh khác trong cùng nhóm 16SrI (McCoy et al.,

1989; Gundersen et al., 1996). Trong tự nhiên, tính đa dạng sinh học của các nhóm phytoplasma liên quan chặt chẽ đến côn trùng môi giới, phổ ký chủ, hoặc

cả hai yếu tố này (Lee et al., 1998).

2.2.8. Lan truyền của phytoplasma

2.2.8.1. Lan truyền của phytoplasma qua nhân giống vô tính

Phytoplasma là tác nhân gây bệnh nhiễm hệ thống, giới hạn trong mạch

phloem, nên truyền qua nhân giống vô tính nhƣ ghép, củ giống, hom giống, thân

ngầm là con đƣờng lan truyền quan trọng, có thể đƣợc xem là quan trọng nhất

đối với các loài cây đƣợc nhân giống vô tính. Tuy nhiên, phytoplasma không

truyền đƣợc qua tiếp xúc cơ học vì khi phytoplasma đƣợc đƣa vào tế bào biểu bì

hoặc nhu mô thì chúng cũng không có khả năng di chuyển xuống tế bào ống rây

của mạch phloem (Lee et al., 2000).

2.2.8.2. Lan truyền của phytoplasma qua tơ hồng

Tơ hồng (Cuscutas spp.) là loại thực vật không có diệp lục ký sinh trên thực

vật. Khi sợi tơ hồng tiếp xúc với cây ký chủ, chúng hình thành đĩa áp

(prehaustoria) gắn chặt bề mặt cây. Tiếp theo, đĩa áp phát triển thành vòi hút

(haustorium) và xâm nhập vào trong cây. Sau khi xâm nhập vào trong cây, đỉnh

vòi hút phát triển thành các sợi tìm kiếm (searching hyphae) để tiếp cận mạch

xylem và mạch phloem của cây. Sau khi tiếp xúc với mạch phloem của cây, sợi tìm kiếm dung hợp thành tế bào của chúng với thành tế bào mạch phloem và tạo

thành một cầu nối thông suốt để tiếp nhận dinh dƣỡng và nƣớc của cây ký chủ

(Kaiser et al., 2015). Đặc điểm ký sinh này dẫn tới tơ hồng có thể truyền dễ dàng phytoplasma và do đó thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ một loại vector hiệu quả để

truyền phytoplasma sang cây thí nghiệm (Přibylová and Špak, 2013).

2.2.8.3. Lan truyền của phytoplasma qua hạt giống

Cấu tạo của hạt giống cho thấy mạch phloem của cây chỉ kéo dài tới vỏ hạt mà không nối trực tiếp vào phôi của hạt (Finch-Savage, 2013). Do đặc điểm cấu

tạo của hạt nhƣ trên nên, về lý thuyết, phytoplasma không thể tiếp cận tới phôi của hạt. Chính vì vậy, phytoplasma không đƣợc xem là tác nhân gây bệnh truyền

qua hạt (Lee et al., 2000). Một số nghiên cứu gần đây đã phát hiện thấy

phytoplasma trên hạt và cả cây con cỏ 3 lá (Khan et al., 2002), cải dầu, cà chua,

ngô (Calari et al., 2011), thậm chí cả ở phôi hạt cọ dầu (Nipah et al., 2007). Tuy nhiên, các nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng, phytoplasma có thể phát hiện thấy ở

vỏ hạt nhƣng không thể truyền sang cây con (Faghihi et al., 2011).

2.2.8.4. Lan truyền của phytoplasma qua côn trùng môi giới

Các nghiên cứu lan truyền đã chứng tỏ côn trùng chích hút là môi giới quan

trọng nhất của các bệnh phytoplasma nhiễm trên cây trồng từ hạt.

Tất cả côn trùng môi giới của phytoplasma đều thuộc bộ Hemiptera. Các

loài côn trùng thuộc bộ Hemiptera có hành vi chích hút khá đa dạng, có nhóm

chích hút ở mạch phloem, có nhóm chích hút ở mạch xylem. Do phytoplasma chỉ

giới hạn ở mạch phloem nên chỉ nhóm côn trùng chích hút ở loại mô này mới có

khả năng truyền chúng (Wilson and Weintraub, 2007). Hiện có ít nhất 102 loài

côn trùng chích hút bộ Hemiptera đã đƣợc xác định là côn trùng môi giới của

phytoplasma, phần lớn thuộc họ Rầy xanh (Cicadellidae) (bảng 2.2).

Côn trùng môi giới truyền phytoplasma theo kiểu bền vững tái sinh

(propagative persistant). Quá trình chích nạp xảy ra ở mạch phloem của cây ký

chủ. Thời gian chích nạp (acquisition feeding time) có thể ngắn khoảng vài phút

nhƣng nhìn chung khoảng vài giờ và thời gian chích nạp càng dài thì khả năng

nạp phytoplasma càng tăng.

Bảng 2.2. Thành phần các nhóm côn trùng bộ Hemiptera là môi giới truyền phytoplasma*

Bộ phụ Siêu họ Họ Số loài

Membracoidea Rầy xanh (Cicadellidae) 80

Rầy đốm gân (Cixiidae) 7

Auchenorrhyncha

Fulgoridea ( = Fulgoromorpha) Rầy nâu (Delphacidae) Rầy cánh dài (Derbidae) 4 1

Ve sầu bƣớm (Flatidae) 1

Sternorrhyncha Rầy nhảy (Psyllidae) 7

Heteroptera Bọ xít 5 cạnh (Pentatomidae) Bọ xít lƣới (Tingidae) 1 1

Nguồn: Weintraub and Beanland (2006), Weintraub (2007)

Hình 2.2. Minh họa sự phân bố của phytoplasma trong cơ thể côn trùng môi giới lan truyền bệnh

Ghi chú: Não (Br); hạch thần kinh hỗn hợp (Cng); ống bơm nƣớc bọt (Sp); vòi hút (St); Thực quản (Es); ruột trƣớc (Amg); ruột giữa (Mmg); buồng lọc (Fc); ruột sau (Hg); ống Malpighi (Mt); chất Hemolymph (He); tuyến nƣớc bọt (Sg); ống dẫn nƣớc bọt (Sd); mạch xylem của cây (xylem); mạch phloem của cây (Ph); thể phytoplasma đƣợc chỉ rõ bằng mũi tên.

Nguồn: Hogenhout et al. (2008)

Sau khi nạp phytoplasma, côn trùng cần thời gian tiềm ẩn (latent period = incubation period) trƣớc khi có thể truyền phytoplasma. Thời gian tiềm ẩn phụ

thuộc nhiệt độ và thay đổi từ vài ngày tới thậm chí 80 ngày. Trong thời gian tiềm

ẩn, phytoplasma di chuyển theo ruột trƣớc tới ruột giữa - là vị trí chủ yếu để

phytoplasma xâm nhập. Ngoài cùng thành ruột giữa có một lớp tế bào biểu mô (epithelial cells) dạng cột đƣợc ngăn cách với ống ruột bởi 1 lớp màng đỉnh

(apical membrane). Do cấu tạo của lớp tế bào biểu mô nên thành ruột giống nhƣ có một lớp lông (microvilii), phytoplasma có thể xâm nhập vào lớp tế bào biểu

mô và tái sinh tại đây, sau đó vƣợt qua lớp màng thứ 2 là lớp màng đáy

(basement membrane), xâm nhập sinh sản tại mô cơ ruột. Tiếp theo, phytoplasma

xâm nhập vào xoang cơ thể (hemocoel). Tại xoang cơ thể, phytoplasma có thể

tiếp tục xâm nhiễm và sinh sản ở một loạt các cơ quan khác nhƣ ống Malpighi, thể béo, não hoặc cơ quan sinh sản. Tiếp theo, phytoplasma xâm nhập và sinh sản

tại màng đáy của tuyến nƣớc bọt (salivary gland), tiếp tục di chuyển qua lớp

màng đỉnh của tuyến nƣớc bọt để vào ống dẫn của tuyến nƣớc bọt và theo dòng

nƣớc bọt để xâm nhập vào cây khi côn trùng chích hút trên cây. Nhƣ vậy, trong

cơ thể côn trùng, phytoplasma phải sinh sản ở nhiều loại mô và phải vƣợt qua

một loạt các rào cản ở thành ruột và thành tuyến nƣớc bọt (hình 2.2) (Weintraub

and Beanland, 2006; Hogenhout et al., 2008).

Tính đặc hiệu giữa phytoplasma và côn trùng môi giới khá phức tạp. Một

loài côn trùng môi giới có thể truyền một hoặc nhiều loài phytoplasma khác

nhau, hoặc một loài phytoplasma có thể đƣợc truyền bởi một hoặc nhiều loài côn

trùng khác nhau. Phytoplasma gây bệnh biến vàng cây đu Mỹ (16SrV-A), bệnh

trắng lá mía (16SrXI-B), bệnh chổi phù thuỷ khoai lang (16SrII-A) và bệnh chổi

phù thuỷ mƣớp (16SrVIII-A) có thể chỉ đƣợc truyền bởi một hoặc vài loài côn

trùng (Tsai, 1979). Trong khi đó, phytoplasma gây bệnh biến vàng cúc tây California (16SrI-B) đƣợc truyền bởi 24 loài rầy, còn phytoplasma gây bệnh X

trên cây đào (16SrIII-A) đƣợc truyền bởi ít nhất 15 loài rầy (Toth, 1994). Một số chủng phytoplasma có thể đƣợc lan truyền bởi một loài côn trùng đa thực, từ loài thực vật này sang nhiều loài thực vật khác. Ví dụ, phytoplasma gây bệnh biến vàng cúc tây bắc Mỹ (16SrI-A, 16SrI-B) chủ yếu đƣợc lan truyền bởi loài rầy Macrosteles fascifrons sang 191 loài thực vật thuộc 42 họ khác nhau; phytoplasma gây bệnh X miền đông (16SrIII-A) đƣợc lan truyền bởi một vài loài rầy sang 59 loài thực vật thuộc hơn 10 họ thực vật khác nhau (Golino et al.,

1989; McCoy et al., 1989). Ngƣợc lại, phytoplasma gây bệnh chết khô cây đào đƣợc lan truyền bởi loài côn trùng đơn thực Cacopsylla pyricola có phổ ký chủ

hẹp hơn (Tedeschi et al., 2006).

Bản chất tính đặc hiệu giữa phytoplasma và côn trùng môi giới phần lớn chƣa đƣợc hiểu rõ. Nhƣ trình bày ở trên, phytoplasma, để có thể truyền đƣợc qua

một côn trùng môi giới buộc phải vƣợt qua một loạt các rào cản tế bào trong cơ

thể côn trùng. Sự nhận biết và tƣơng tác giữa các thụ thể của phytoplasma và của

côn trùng đóng vai trò quan trọng trong quyết định tính đặc hiệu giữa chúng. Một nghiên cứu trƣớc đó đã phát hiện một protein xuyên màng có hoạt tính kháng

nguyên (antigenic membrane protein) của „Ca. Phytoplasma asteris‟, chủng OY,

có khả năng tƣơng tác đặc hiệu và hình thành một phức hợp với các vi sợi nhƣ actin và myosin của mô cơ bao quanh ruột ở tất cả các loài rầy là côn trùng môi

giới của phytoplasma này (Suzuki et al., 2006). Tƣơng tự, gần đây hơn, protein

Amp của „Ca. P. asteris‟, chủng CY, cũng đƣợc chứng minh tƣơng tác và liên kết

đặc hiệu với actin và 2 tiểu phần α và β của enzym ATP synthase của loài rầy

Euscelidius variegatus - là côn trùng môi giới của phytoplasma này. Cần chú ý

rằng tiểu phần β của enzym ATP synthase có mặt trên màng tế bào ruột giữa và

màng tế bào tuyến nƣớc bọt của phytoplasma (Galetto et al., 2011).

2.2.9. Phƣơng pháp chẩn đoán phytoplasma

Phytoplasma không thể nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo nên chẩn

đoán loại tác nhân gây bệnh này khá phức tạp. Bệnh phytoplasma tạo triệu chứng

khá khác biệt so với các nhóm tác nhân gây bệnh cây khác nên triệu chứng

thƣờng là căn cứ đầu tiên để chẩn đoán nhóm bệnh này. Tuy nhiên, nhiều nhóm vi sinh vật khác cũng có thể tạo một trong các triệu chứng đặc trƣng giống nhƣ

nhiễm phytoplasma là triệu chứng chổi phù thuỷ. Đã có công bố cho thấy nhóm

nhện nhỏ (eriophyoid) có thể cảm ứng tạo triệu chứng chổi phù thuỷ trên rất nhiều loại cây (Lindquist et al., 1996). Một số loài nấm, chẳng hạn nấm đảm

Moniliophthora perniciosa gây bệnh chổi phù thuỷ trên ca cao (Aime and Phillips-Mora, 2005), nấm Aciculosporium take/Heteroepichloë sasae gây bệnh chổi phù thuỷ trên tre, nứa (Tanaka, 2010), nấm Fusarium mangiferae gây bệnh

chổi phù thuỷ trên xoài (Crespo et al., 2012). Chính vì vậy, đối với bệnh phytoplasma, ngoài triệu chứng, nhiều biện pháp chẩn đoán khác thƣờng đƣợc sử dụng gồm 2 nhóm chính là (i) chẩn đoán trực tiếp phytoplasma trong tế bào bằng hiện vi điện tử hoặc nhuộm mô bằng thuốc nhuộm huỳnh quang; và (ii) chẩn

đoán gián tiếp bằng các phân tích phân tử nhƣ phản ứng trùng hợp chuỗi axít

nucleic (polymerase chain reaction, PCR), giải trình tự...

2.2.9.1. Nhuộm mô bằng thuốc nhuộm huỳnh quang

Phát hiện sự có mặt của phytoplasma trong tế bào ống rây của mạch phloem

cây bệnh có thể đƣợc thực hiện bằng nhuộm mô cây với thuốc nhuộm huỳnh

quang, phổ biến nhất là 4‟,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Cơ sở khoa học

của phƣơng pháp này là do thuốc nhuộm này có khả năng liên kết mạnh với vùng

giàu AT của DNA. Bộ gen của phytoplasma đã đƣợc chứng minh có hàm lƣợng AT (72 - 79%) cao hơn nhiều so với CG (21 - 28%), và do đó rất nhạy với thuốc

nhuộm DAPI. Sau khi nhuộm với DAPI, mô đƣợc quan sát bằng kính hiển vi

huỳnh quang với tia cực tím (450 - 490 nm) đƣợc sử dụng làm nguồn kích hoạt.

Do thuốc nhuộm DAPI sẽ phát huỳnh quang khi đƣợc kích hoạt nên tế bào

phytoplasma có thể đƣợc quan sát thấy trong các tế bào bị nhiễm. Do sự đơn giản

và khá chính xác nên nhuộm DAPI là một kỹ thuật chẩn đoán phytoplasma khá

phổ biến (Arismendi et al., 2010; Andrade and Arismendi, 2013).

2.2.9.2. ELISA

Phƣơng pháp thử nghiệm miễn dịch liên kết men (enzyme linked immuno

sorbent assay, ELISA) là kỹ thuật khá phổ biến trong chẩn đoán bệnh cây, đặc

biệt đối với các bệnh virus. Thành phần quan trọng nhất của phản ứng ELISA (và

các kỹ thuật dựa trên miễn dịch học khác) là phải có một kháng thể đặc hiệu đối

tƣợng cần chẩn đoán. Do phytoplasma không thể nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng

nhân tạo nên nguồn kháng nguyên là phytoplasma phải đƣợc chuẩn bị từ cây ký

chủ nhiễm bệnh. Việc tinh chiết phytoplasma từ cây rất khó, thƣờng liên quan tới

một bƣớc ủ kháng thể đƣợc chuẩn bị từ protein của cây khỏe với dịch chiết của

cây bệnh. Bằng cách này, kháng thể đặc hiệu phytoplasma đã đƣợc tạo ra nhằm

chẩn đoán một số bệnh phytoplasma hại táo tây, cỏ linh lăng (Loi et al., 2002;

Salehi et al., 2011).

2.2.9.3. Lai phân tử

Kỹ thuật lai DNA (southern hybridization) và phân tích đa hình của đoạn cắt giới hạn (restriction fragment length polymorphism, RFLP) sử dụng đoạn dò

DNA có thể phân biệt đƣợc một số chủng phytoplasma. Tuy nhiên, phƣơng pháp

sử dụng đoạn dò DNA là quá trình bao gồm nhiều khâu phức tạp, ngƣời thực

hiện phải có trình độ và tay nghề cao (Martini et al., 2007).

2.2.9.4. PCR

Vì phytoplasma không thể nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo nên

phƣơng pháp phổ biến nhất hiện nay để phát hiện và xác định phytopasma là sử

dụng phản ứng PCR kết hợp giải trình tự.

Trong chẩn đoán bằng PCR, việc có đƣợc các cặp mồi đặc hiệu (mức chi và

mức loài) là rất quan trọng. Đối với phytoplasma, nhiều cặp mồi đã đƣợc thiết kế

và sử dụng rộng rãi, chủ yếu dựa trên vùng bảo thủ của gen rDNA mã hóa RNA

ribosome. Nghiên cứu đầu tiên ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán phytoplasma là vào năm 1992, khi Ahrens and Seemüller (1992) thiết kế một cặp

mồi chung nhân một đoạn khoảng 558 bp của gen mã hóa 16S RNA ribosome và

dùng 2 enzym cắt giới hạn AluI và HincII phân tích sản phẩm PCR bằng kỹ thuật

đa hình các đoạn cắt giới hạn để phân biệt các loài phytoplasma khác nhau.

Cho đến nay, gen mục tiêu phổ biến nhất cho chẩn đoán và phân loại

phytoplasma là gen 16S RNA ribosome và hàng chục cặp mồi chung hoặc mồi

đặc hiệu nhóm đã đƣợc công bố dựa trên gen này (bảng 2.3).

Nhằm tăng tính đặc hiệu và độ nhạy để phát hiện phytoplasma, một kỹ thuật

gọi là PCR lồng (nested PCR) đã đƣợc thử nghiệm. Trong phản ứng PCR lồng, 2

cặp mồi phải đƣợc thiết kế gồm một cặp bên ngoài và một cặp bên trong của

chuỗi đích. Phản ứng PCR đƣợc lồng đƣợc thực hiện qua 2 vòng, trong đó sản

phẩm PCR dùng cặp mồi bên ngoài đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR

dùng cặp mồi bên trong (Gundersen and Lee, 1996).

Cho tới nay, 2 cặp mồi chung đƣợc sử dụng nhiều nhất để phát hiện

phytoplasma bằng PCR lồng là P1/P7 hoặc R16mF2/R16mR1 (bƣớc 1) và

R16F2n/R16R2 (bƣớc 2). PCR lồng sử dụng các cặp mồi trên đã chứng tỏ có khả

năng phát hiện nhiều phytoplasma thuộc các nhóm khác nhau và đƣợc sử dụng bởi nhiều tác giả để phát hiện phytoplasma trên một loạt bệnh nhƣ bệnh vàng cây

cúc tây, bệnh cây lê còi cọc… kể cả côn trùng môi giới (Deng and Hiruki, 1991;

Lee et al., 1994; Lorenz et al., 1995; Schneider et al., 1995; Gundersen and Lee,

1996; Khan et al., 2004; Duduk et al., 2013).

Phƣơng pháp phân tích đa hình thực hiện mô phỏng trên gel ảo cũng đƣợc

sử dụng rộng rãi nhằm đánh giá mức độ tƣơng đồng giữa các cặp trình tự

nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome của phytoplasma gây bệnh cây thuộc

các nhóm khác nhau (Wei et al., 2007; Zhao et al., 2009).

Bảng 2.3. Một số mồi PCR phát hiện phytoplasma đã đƣợc công bố

Mồi

Loại mồi

Trình tự

Tham khảo

Mồi chung

AAGAATTTGATCCTGGCTCAGGATT Deng and Hiruki, 1991

Mồi chung

CGTCCTTCATCGGCTCTT

Schneider et al., 1995

Mồi chung

GGATGGATCACCTCCTT

Schneider et al., 1995

Mồi chung

GAAGTCTGCAACTCGACTTC

Schneider et al., 1995

Mồi chung

CGGCAATGGAGGAAACT

Schneider et al., 1995

R16F2n

Mồi chung

GAAACGACTGCTAAGACTGG

Gundersen and Lee, 1996

R16R2

Mồi chung

TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG Gundersen and Lee, 1996

R16mF2

Mồi chung

CATGCAAGTCGAACGGA

Gundersen and Lee, 1996

R16mR2

Mồi chung

CTTAACCCCAATCATCGA

Gundersen and Lee, 1996

fU5

Mồi chung

CGGCAATGGAGGAAACT

Lorenz et al., 1995

rU3

Mồi chung

TTCAGCTACTCTTTGTAACA

Lorenz et al., 1995

SN910601 Mồi chung

GTTTGATCCTGGCTCAGGATT

Namba et al., 1993

SN910502 Mồi chung

AACCCCGAGAACGTATTCACC

Namba et al., 1993

Đặc hiệu nhóm I,

Lee et al., 1994

R16(I)F1

TAAAAGACCTAGCAATAGG

II, XII, XV

Đặc hiệu nhóm I,

Lee et al., 1994

R16(I)R1

VCAATCCGAACTAAGACTCT

II, XII, XV

R16(III)F2 Đặc hiệu nhóm III

AAGAGTGGAAAAACTCCC

Lee et al., 1994

R16(III)R1 Đặc hiệu nhóm III

TTCGAACTGAGATTGA

Lee et al., 1994

R16(V)F1 Đặc hiệu nhóm V

TTAAAAGACCTTCTTCGG

Lee et al., 1994

R16(V)R1 Đặc hiệu nhóm V

TTCAATCCGTACTGAGACTACC

Lee et al., 1994

R16(X)F1 Đặc hiệu nhóm X

GACCCGCAAGTATGCTGAGAGATG

Lee et al., 1994

R16(X)R1 Đặc hiệu nhóm X

CAATCCGAACTGAGAGTCT

Lee et al., 1994

fO1

Đặc hiệu nhóm X

CGGAAACTTTTAGTTTCAGT

Lorenz et al., 1995

rO1

Đặc hiệu nhóm X

AAGTGCCCAACTAAATGAT

Lorenz et al., 1995

Nguồn: Deng and Hiruki (1991), Namba et al. (1993), Lee et al. (1994), Schneider et al. (1995), Lorenz et al. (1995), Gundersen and Lee (1996),

2.2.9.5. LAMP-PCR

Phƣơng pháp nhân gen đẳng nhiệt (loop mediated isothermal amplification,

LAMP-PCR) là phƣơng pháp nhân bản DNA nhanh, đƣợc công bố lần đầu bởi

(Notomi et al., 2000). Kỹ thuật LAMP-PCR điển hình sử dụng sử dụng 4 mồi

khác nhau, đƣợc thiết kế dựa trên 6 trình tự của vùng gen đích. Hai mồi bên

ngoài, thƣờng đƣợc ký hiệu là F3 (mồi xuôi dòng: forward) và B3 (mồi ngƣợc

dòng: backward). Hai mồi bên trong đƣợc thiết kế rất đặc biệt, thƣờng đƣợc ký

hiệu là FIP (mồi xuôi dòng bên trong: forward internal primer) và BIP (mồi

ngƣợc dòng bên trong: backward internal primer) (hình 2.3).

Hình 2.3. Sơ đồ các mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng LAMP-PCR

Trình tự 6 vùng thiết kế mồi đƣợc ký hiệu từ đầu 5‟ là F3, F2, F1c, B1c, B2 và B3. Bốn mồi bao gồm 2 mồi bên ngoài là F3 và B3 (lần lƣợt tƣơng ứng với trình tự vùng F3 và B3), 2 mồi bên trong là FIP (tƣơng ứng với trình tự vùng F2 và F1c) và BIP (tƣơng ứng trình tự vùng B2 và B1c)

tiên, mồi FIP sẽ tổng hợp sợi đầu tiên trên khuôn DNA sợi kép; tiếp theo mồi

F3 sẽ tiếp tục hoạt động trên khuôn sợi kép mới hình thành và đẩy ra một sợi

đơn chứa 1 đầu là mồi FIP. Trên khuôn sợi đơn này, mồi BIP sẽ tổng hợp sợi

mới để hình thành sợi kép, và trên khuôn sợi kép này, mồi B3 sẽ hoạt động, tổng hợp sợi kép mới và đẩy ra một sợi đơn có trình tự 2 đầu là mồi FIP và BIP.

Do cấu tạo đặc biệt của mồi FIP và BIP, 2 đầu của sợi đơn sẽ tự bắt cặp (F1/F1c, B1/B1c) để tạo ra cấu trúc thòng lọng (hình 2.4A); (ii) Tạo sản phẩm

LAMP cuối cùng: trên khuôn đƣợc tạo ra ở bƣớc trên, 2 mồi FIP và BIP sẽ tham gia tổng hợp DNA và tạo ra một hỗn hợp các sản phẩm tổng hợp cuối cùng có kích thƣớc khác nhau (hình 2.4.B). Phƣơng pháp này cho hiệu quả nhân gen cao với lƣợng DNA đƣợc khuếch đại đến 109 - 1010 lần trong thời gian từ 15 - 60 phút (Tomita et al., 2008).

Nguồn: Obura et al. (2011) Phản ứng LAMP-PCR đƣợc hoàn thành chỉ trong một bƣớc bằng cách ủ khuôn DNA, các cặp mồi, enzym Bst DNA polymerase (có hoạt tính thay thế mạch) và đệm ở nhiệt độ cố định (khoảng 60 - 65oC). Phản ứng LAMP-PCR bao gồm 2 giai đoạn chính: (i) Tạo khuôn có cấu trúc thòng lọng 2 đầu: đầu

Hình 2.4. Sơ đồ nguyên lý phản ứng LAMP-PCR

Nguồn: Tomita et al. (2008)

Do tính đặc hiệu và độ nhạy rất cao đồng thời không quá đắt nên kỹ thuật

LAMP đã đƣợc phát triển rất mạnh trong những năm gần đây, chủ yếu cho mục

đích chẩn đoán nhiều bệnh trên ngƣời, động vật cũng nhƣ thực vật (Parida et al.,

2008; Mori and Notomi, 2009; Gandelman et al., 2011; Dhama et al., 2014;

Saharan et al., 2014; Kinoshita et al., 2015; Niessen, 2015; Okuda et al., 2015;

Palacio-Bielsa et al., 2015).

Tƣơng tự, kỹ thuật LAMP-PCR cũng đƣợc phát triển và ứng dụng trong

chẩn đoán phytoplasma gây bệnh cây (Bekele et al., 2011; Obura et al., 2011;

Yankey et al., 2011; Sugawara et al., 2012; Kogovšek et al., 2015).

2.2.10. Biện pháp phòng chống

Phƣơng pháp truyền thống sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ côn trùng

môi giới đƣợc xem là chƣa đủ để quản lý bệnh do phytoplasma gây ra (Wally et

al., 2004; Weintraub and Beanland, 2006). Sử dụng lƣới chống côn trùng bao

phủ toàn bộ cây là biện pháp hữu hiệu nhất. Tuy nhiên, biện pháp này không khả

thi đối với những phạm vi rộng lớn (Walsh et al., 2006; Weintraub, 2007).

Bressan and Purcell (2005) tiến hành phun hoạt chất kích kháng thực vật

(tên gọi là benzothiadiazole) lên cây Arabidopsis thaliana trƣớc khi nhiễm bệnh

X đã làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh. Nghiên cứu của Weintraub (2007) cho biết,

phòng chống côn trùng môi giới bằng việc sử dụng hợp chất carbohydrate có khả

năng kết hợp với lectin thực vật và có thể hạn chế sự chích hút của côn trùng môi

giới vào mô thực vật. Các chất kháng sinh, các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc

hữu cơ và vô cơ đƣợc sử dụng để phòng chống bệnh phytoplasma hại cây trồng.

Tuy nhiên, biện pháp này mới chỉ áp dụng trong điều kiện in vitro trong phòng

thí nghiệm và chậu vại (Hayat et al., 2010).

Trong những năm gần đây, sử dụng nấm ký sinh vùng rễ (arbuscular

mycorrhiza, AM) nhằm tăng cƣờng khả năng sức đề kháng của cây với bệnh

phytoplasma cũng đã đƣợc áp dụng trên nhiều loại cây trồng. Ví dụ, sử dụng loài

nấm Glomus intraradices, nấm Epicoccum nigrum có tác dụng tăng khả năng

chống chịu đối với bệnh vàng lá cà chua do phytoplasma thuộc nhóm 16SrXII

gây ra (Lingua et al., 2002), bệnh vàng lá cây dừa cạn do „Ca. Phytoplasma

asteris‟ thuộc nhóm 16SrI gây ra (Kaminska et al., 2010), và bệnh chết lụi cây lê

do „Ca. Phytoplasma mali‟ gây ra (Musetti et al., 2011).

Biện pháp xử lý hom giống bằng nƣớc nóng có hiệu quả rõ rệt trong phòng chống bệnh phytoplasma hại mía bị bệnh trắng lá tại Thái Lan và Đài Loan

(Marcone, 2002; Kaewmanee et al., 2011).

Để phòng chống bệnh phytoplasma gây hại trên cây trồng, các biện pháp sau thƣờng đƣợc áp dụng trong sản xuất (Lee et al., 2000; Firrao et al., 2006;

Weintraub, 2007): i) Chọn giống chống bệnh, sử dụng cây sạch bệnh; ii) Nhổ bỏ,

tiêu hủy tàn dƣ cây bệnh, kết hợp với vệ sinh đồng; iii) Không vận chuyển, trao

đổi hom giống từ các vùng bị bệnh đến các vùng chƣa bị bệnh, hay vùng trồng mới. Tổ chức sản xuất và kiểm tra giống sạch bệnh trƣớc khi trồng; iv) Tiêu diệt

côn trùng môi giới truyền bệnh (nếu có) và trong một số trƣờng hợp, có thể xử lý

hom giống bằng nƣớc nóng hoặc hơi nƣớc nóng.

2.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH PHYTOPLASMA HẠI SẮN

Bệnh phytoplasma hại sắn đƣợc phát hiện thấy tại nhiều vùng trên thế giới

nhƣ vùng Wallis-Futuna, Uganda, Cuba; một số nƣớc thuộc châu Mỹ nhƣ Bra-

xin, Cô-lôm-bia, Costa Rica, Peru, Panama, Venezuela; một số nƣớc thuộc châu

Á nhƣ Việt Nam, Thái Lan, Cam-pu-chia và Trung Quốc. Phytoplasma hại sắn

xác định đƣợc liên quan đến bệnh chổi phù thuỷ (Frison and Feliu, 1991; Davis

et al., 2005; Flôres et al., 2013; Alvarez et al., 2013, 2014), bệnh biến vàng lá

(Arocha et al., 2009a, 2009b) và bệnh da cóc (Alvarez et al., 2009; Souza et al.,

2014; Oliveira et al., 2014).

Cho đến hiện nay, có 3 dạng triệu chứng bệnh do phytoplasma hại sắn trên

thế giới đã đƣợc mô tả, bao gồm:

i) Bệnh chổi phù thuỷ (witches‟ broom): Cây nhiễm bệnh biểu hiện triệu

chứng chổi phù thuỷ nhƣ mọc nhiều chồi, nhánh phụ ở phần thân chính, đốt thân

ngắn, lá biến vàng và co nhỏ lại. Cây mọc từ hom sắn bị bệnh có sức nảy mầm yếu. Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phát triển thuận lợi ở điều kiện nhiệt độ 13 - 20oC, khi nhiệt độ cao thì triệu chứng bệnh không xuất hiện (hình 2.5 và hình 2.6a).

ii) Bệnh biến vàng lá (yellowing): Cây sắn bị bệnh biểu hiện triệu chứng lá

co nhỏ lại, lá biến vàng và cây còi cọc (hình 2.6b).

iii) Bệnh da cóc (frog skin): Triệu chứng bệnh da cóc hại sắn chủ yếu gây

hại phần rễ và củ sắn. Ở phần vỏ củ cây nhiễm bệnh có các đƣờng gân gồ ghề

dạng lƣới, hoặc dạng tổ ong và có màu nâu nhạt, thậm chí vết bệnh ăn sâu vào

trong phần thịt củ của cây bệnh. Ở trên nhiều giống sắn khác nhau, triệu chứng

bệnh da cóc chỉ quan sát thấy ở giai đoạn thu hoạch củ; bệnh làm cho kích thƣớc

củ, trọng lƣợng củ sắn tƣơi giảm sút; ở nhiều giống sắn khác còn thấy xuất hiện

triệu chứng khảm lá, cuốn lá hoặc mép lá bị quăn lại. Khi điều kiện nhiệt độ > 30oC thì triệu chứng bệnh da cóc hại sắn ở dạng ẩn (hình 2.7).

Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn đƣợc ghi nhận lần đầu ở các bang Ceara,

Pernambuco, Sao Paula thuộc Brazil và phía nam Mê-hi-cô. Lúc đó, tác nhân gây

bệnh đƣợc xác định là do MLOs gây ra (Costa and Kitajima, 1972). Bệnh đƣợc

xác định lan truyền qua hom giống nhƣng không lan truyền qua tiếp xúc cơ học.

Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phát triển thuận lợi ở điều kiện nhiệt độ 13 - 20oC (Frison and Feliu, 1991). Ở Brazil, tại một số vùng trồng sắn thuộc phía đông bắc nƣớc này, tỷ lệ cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ lên đến 85% và năng suất

củ bị giảm đến 70% (Flôres et al., 2013), thậm chí năng suất củ giảm sút đến

90% cũng đã đƣợc ghi nhận (Lozano, 1992). Nguyên nhân gây bệnh đƣợc xác

định là do phytoplasma gây ra.

Tiếp theo là nghiên cứu của Davis et al. (2005), cây sắn có biểu hiện triệu

chứng bệnh chổi phù thuỷ nhƣ mọc nhiều chồi phụ ở thân chính, lá biến vàng và

co nhỏ lại đƣợc thu thập tại các đảo Wallis-Futuna (thuộc Pháp) ở Thái Bình

Dƣơng vào năm 2004. Kết quả kiểm tra bằng PCR cho thấy mẫu sắn phản ứng

PCR dƣơng tính, trình tự nucleotide của phytoplasma hại sắn đƣợc đăng ký lên

Ngân hàng Gen với mã truy cập AY787139. Kết quả phân tích tính đa hình bằng

kỹ thuật RFLP và phân tích phả hệ cho thấy phytoplasma hại sắn ở Wallis-

Futuna thuộc nhóm 16SrI-A.

Theo kết quả nghiên cứu của Arocha et al. (2009a), cây sắn bệnh biểu hiện

triệu chứng vàng lá, lá nhỏ và mọc nhiều chồi phụ ở đốt thân chính đƣợc thu thập

ở vùng Kuwanda của Uganda; sử dụng cặp mồi R16mF2/R16mR1 và fU5/rU3

trong kỹ thuật PCR lồng đã phát hiện phytoplasma gây hại trong các mẫu thu

thập. Kết quả giải trình tự, phân tích đa hình bằng kỹ thuật RFLP với các enzym

cắt giới hạn gồm Sau3AI, HpaII, HaeIII và kết quả phân tích phả hệ cho thấy

phytoplasma hại sắn tại Uganda (mã truy cập EU315317) có phần trăm đoạn so

sánh 100%, mức đồng nhất trình tự nucleotide giống 99% với nhiều loài

phytoplasma thuộc nhóm 16SrII. Phytoplasma hại sắn ở Uganda thuộc nhóm

16SrII-C.

Hình 2.5. Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ a) ở Brazil; b) ở Wallis-Futuna

Nguồn: a- Lozano (1992) và b- Davis et al. (2005)

Hình 2.6. a) Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ ở vùng São Paulo, Brazil; b) cây sắn bị bệnh biến vàng ở vùng Kuwanda, Uganda

Nguồn: a- Flôres et al. (2013) và b- Arocha et al. (2005)

Hình 2.7. Bệnh da cóc hại sắn a) cây ghép bị bệnh; b) củ cây bị bệnh

Nguồn: Costa and Kitajima (1972)

Cũng theo kết quả nghiên cứu của Arocha et al. (2009b), cây sắn nhiễm phytoplasma cũng đƣợc phát hiện thấy tại Cuba. Cây sắn bị bệnh biểu hiện triệu

chứng lá nhỏ, biến vàng và cây còi cọc, sử dụng cặp mồi R16mF2/R16mR1 và

fU5/rU3 trong kỹ thuật PCR lồng, tác giả đã phát hiện phytoplasma hại sắn ở

Cuba. Kết quả giải trình tự, phân tích đa hình bằng kỹ thuật RFLP với các enzym cắt giới hạn gồm Sau3AI, HpaII, HaeIII và phân tích phả hệ cho thấy

phytoplasma hại sắn tại Cuba (mã truy cập EU328256) có phần trăm đoạn so sánh 100%, mức đồng nhất trình tự nucleotide giống 99% với phytoplasma thuộc

nhóm 16SrI. Phytoplasma gây hại sắn tại Cuba thuộc nhóm 16SrI.

Theo Alvarez et al. (2009), bệnh da cóc hại sắn ở các nƣớc thuộc Nam Mỹ

nhƣ Cô-lôm-bi-a, Bra-xin, Venezuela, Peru, Costa Rica và Panama đều do tác nhân phytoplasma gây ra. Đây đƣợc coi là bệnh hại quan trọng trên cây sắn tại

các nƣớc này. Bệnh da cóc gây hại chủ yếu ở phần rễ và củ sắn, làm cho kích

thƣớc củ, trọng lƣợng củ sắn tƣơi giảm sút, ở nhiều cây bệnh còn thấy xuất hiện

triệu chứng khảm lá, cuốn lá và úa vàng. Các cặp mồi P1/P7 hoặc

R16mF2/R16mR1 và R16F2n/R16R2 đƣợc dùng trong kỹ thuật PCR có khả

năng phát hiện phytoplasma gây hại trên cây sắn bị bệnh da cóc thu thập tại một

số vùng trồng của Cô-lôm-bi-a. Kết quả giải trình tự cho thấy, phytoplasma gây

bệnh da cóc (mã truy cập AY737646, AY737647) thuộc nhóm 16SrIII, nhóm

phụ 16SrIII-L. Kết quả xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh da cóc hại

sắn tại Cô-lôm-bi-a cho thấy, bệnh lan truyền qua tơ hồng (Cuscuta spp.) và lan

truyền qua phƣơng pháp ghép cây.

Theo kết quả nghiên cứu của Flôres et al. (2013), cây sắn bị bệnh chổi phù

thuỷ có biểu hiện triệu chứng nhiễm phytoplasma nhƣ lá úa vàng, co nhỏ, chùn

ngọn, cây phát búi dạng chổi phù thuỷ đƣợc phát hiện thấy tại vùng São Paulo

của Bra-xin. Tác giả dựa vào kỹ thuật PCR lồng sử dụng cặp mồi P1/Tint và

R16F2n/R16R2, kỹ thuật RFLP sử dụng với các enzym cắt giới hạn gồm AluI,

BstUI, HhaI, kết hợp với giải trình tự đã xác định bệnh do phytoplasma gây ra. Phytoplasma hại sắn tại vùng São Paulo của Bra-xin thuộc nhóm 16SrIII-B (mã

truy cập GU193977).

Phytoplasma gây bệnh da cóc hại sắn, bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại Nam Mỹ thuộc nhiều nhóm phụ khác nhau gồm 16SrIII-A, 16SrIII-B và 16SrIII-L (Alvarez et al., 2009; Flôres et al., 2013; Souza et al., 2014; Oliveira et

al., 2014).

Theo kết quả nghiên cứu của Alvarez et al. (2014), cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ đƣợc phát hiện vào năm 2012 tại các tỉnh Kampong Cham, Kratie và

Prey Veng ở Cam-pu-chia; cây sắn bị nhiễm bệnh giảm sút 50% năng suất củ.

Dựa vào kỹ thuật PCR lồng và RFLP, tác giả đã xác định đƣợc phytoplasma gây

hại trên các mẫu cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, giải trình tự và phân tích phả hệ cho thấy, phytoplasma hại sắn ở Cam-pu-chia thuộc nhóm 16SrI.

Tác giả Mejia (2014) sử dụng cặp mồi các cặp mồi chung và cặp mồi đặc

hiệu đã phát hiện phytoplasma trên các mẫu cây sắn bị nhiễm bệnh da cóc ở các nƣớc Costa Rica, Paraguay (thuộc châu Mỹ Latinh) và bệnh chổi phù thuỷ ở các

nƣớc Thái Lan, Việt Nam (thuộc Đông Nam Á). Kết quả phân tích đa hình RFLP

bằng kỹ thuật thông thƣờng, phân tích đa hình RFLP mô phỏng và kết hợp với giải trình tự, phân tích phả hệ đã xác định sự đa dạng của phytoplasma gây hại

sắn trong các mẫu bệnh thu thập ở châu Mỹ Latinh và Đông Nam Á.

Trong tổng số 57 mẫu bệnh sắn bị bệnh hại sắn thu thập tại Nam Mỹ đã xác

định đƣợc 4 nhóm phytoplasma khác nhau, trong đó có nhóm 16SrI (64%), nhóm

16SrIII (14%) và nhóm 16SrXII (22%) trên các mẫu bệnh thu thập ở Costa Rica;

trong khi đó trên các mẫu bệnh thu thập ở Paraguay có nhóm 16SrI (75%) và 16SrXII (25%). Trong tổng số 92 mẫu bệnh sắn bị bệnh chổi phù thuỷ thu thập

tại Đông Nam Á đã xác định đƣợc 7 nhóm phytoplasma khác nhau, trong đó có

nhóm 16SrI (38%), nhóm 16SrIII (3%), nhóm 16SrV và nhóm 16SrVI (cùng

chiếm 13%), nhóm 16SrX (8%), nhóm 16SrXII (14%) và nhóm 16SrXV (11%)

trên các mẫu bệnh thu thập ở Việt Nam; trong khi đó có các nhóm 16SrI (8%),

16SrIII (8%), 16SrVI (23%) và 16SrXV (21%) trên các mẫu bệnh thu thập ở

Thái Lan. Kết quả xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại

sắn tại Đông Nam Á cho thấy, bệnh lan truyền qua tơ hồng (Cuscuta spp.) từ cây

sắn nhiễm bệnh lên cây dừa cạn khỏe nhƣng không lan truyền bệnh từ cây dừa

cạn khỏe lên cây dừa cạn khỏe (Mejia, 2014).

Các nhà khoa học, các chuyên gia về bệnh cây tại Trung tâm Nông nghiệp nhiệt đới Quốc tế (CIAT), trƣờng Đại học Bologna (I-ta-li-a), và ở các nƣớc khác nhƣ Bra-xin, Cuba, Cô-lôm-bi-a, Ốt-xtrây-li-a,...đều xác định phytoplasma hại

sắn bằng các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR, phân tích RFLP, giải trình tự và phân tích phả hệ; xác định một số đặc trƣng sinh học của bệnh vẫn còn rất hạn chế, trong 43 năm qua (từ năm 1972 đến 2015), xác định loài côn trùng có khả

năng lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn vẫn chƣa đƣợc tìm thấy.

Bảng 2.4. Danh sách các nhóm phytoplasma hại sắn đã đƣợc xác định dựa vào phân tích phân tử

STT Nhóm 16S Bệnh liên quan Nguồn gốc Nguồn tác giả

mẫu thu thập

RNA ribosome

Chổi phù thuỷ hại sắn Walis-Futuna Davis et al. (2005)

Biến vàng lá sắn Cuba Arocha et al. (2009b)

Costa Rica Da cóc hại sắn Mejia (2014) Paraguay 1 16SrI Cam-pu-chia Alvarez et al. 2013, Chổi phù thuỷ hại sắn Thái Lan 2014 Việt Nam

Chổi phù thuỷ hại sắn Thái Lan Klinkong et al. (2015)

Biến vàng lá sắn Uganda Arocha et al. (2009a)

2 16SrII Chổi phù thuỷ hại sắn Trung Quốc Zheng (2013)

Chổi phù thuỷ hại sắn Thái Lan Moonjuntha et al. (2015)

Da cóc hại sắn Cô-lôm-bi-a Alvarez et al. (2009)

Chổi phù thuỷ hại sắn Bra-xin Flôres et al. (2013)

Da cóc hại sắn Bra-xin Souza et al. (2014)

Da cóc hại sắn Bra-xin Oliveira et al. (2014) 3 16SrIII Chổi phù thuỷ hại sắn Việt Nam Mejia (2014) Chổi phù thuỷ hại sắn Thái Lan

Da cóc hại sắn Costa Rica Mejia (2014) Da cóc hại sắn Paraguay

4 16SrV Chổi phù thuỷ hại sắn Việt Nam Mejia (2014)

Việt Nam 5 16SrVI Chổi phù thuỷ hại sắn Mejia (2014) Thái Lan

6 16SrX Chổi phù thuỷ hại sắn Việt Nam Mejia (2014)

Costa Rica Da cóc hại sắn Paraguay 7 16SrXII Mejia (2014) Thái Lan Chổi phù thuỷ hại sắn Việt Nam

Thái Lan 8 16SrXV Chổi phù thuỷ hại sắn Mejia (2014) Việt Nam

Nguồn: Davis et al. (2005), Alvarez et al. (2009, 2014), Arocha et al. (2009a, 2009b), Flôres et al. (2013), Zheng (2013), Mejia (2014), Oliveira et al. (2014), Souza et al. (2014), Klinkong et al. (2015), Moonjuntha et al. (2015)

2.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU BỆNH PHYTOPLASMA HẠI THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh phytoplasma gây hại trên cây trồng

vẫn còn rất hạn chế. Tác giả Hà Minh Trung (1985) cho biết rằng, bệnh vàng héo

lá lúa do phytoplasma (mycoplasma) gây ra đƣợc bắt đầu ghi nhận từ năm 1980

tại các vùng trồng lúa ở huyện Tràng Định, Cao Lộc, Lộc Bình và thị xã Lạng

Sơn thuộc tỉnh Lạng Sơn.

Theo kết quả nghiên cứu của Ngô Vĩnh Viễn (1993), bằng phƣơng pháp

chụp hiển vi điện tử tại Viện Vệ sinh dịch tễ đã phát hiện đƣợc hình thái

phytoplasma có dạng hình cầu, không đều nhau trong các mẫu lúa nhiễm bệnh

vàng héo lá. Các thí nghiệm năm 1982 - 1983 tại Lạng Sơn đã xác định bệnh

không truyền qua hạt giống, đất ruộng bị bệnh và qua tiếp xúc giữa cây bị bệnh

và cây lúa khoẻ. Bệnh đƣợc xác định là do phytoplassma gây ra và rầy xanh đuôi

đen, gồm 2 loài Nephotettix virescens và Nephotettix nigropictus là môi giới

truyền bệnh. Các loài rầy khác nhƣ rầy nâu (Nilaparvata lugens), rầy điện quang

(Recilia dorsalis) và rầy lƣng trắng (Sogatella furcifera) không có khả năng lan

truyền bệnh. Loài rầy xanh đuôi đen có khả năng lan truyền bệnh ở cả giai đoạn

ấu trùng và trƣởng thành, tuy nhiên, rầy trƣởng thành có tỷ lệ truyền bệnh cao

hơn. Khi rầy xanh đuôi đen đã nhiễm bệnh, rầy có khả năng lan truyền bệnh đến

chết, lột xác không làm mất đi khả năng truyền bệnh, nguồn bệnh không truyền

qua trứng. Trên ruộng lúa, có tới 26,6% số rầy mang bệnh và truyền đƣợc bệnh,

rầy qua đông chính là nguồn cung cấp bệnh cho vụ lúa tiếp theo, còn lúa chét

không đóng vai trò quan trọng trong việc lƣu giữ nguồn bệnh.

Phƣơng pháp lát cắt siêu mỏng và quan sát dƣới kính hiển vi điện tử đã

đƣợc sử dụng để xác định phytoplasma gây bệnh trắng lá mía, lùn bụi ngô, khảm

lá cà phê, bệnh khảm gân lá khoai sọ, khoai môn, bệnh chồi cỏ mía, trắng lá mía,

bệnh diệp hóa vừng (Vũ Triệu Mân và cs., 2002, 2005; Trần Thị Thanh Bình và

cs., 2011; Nguyễn Đức Thành và cs., 2012; Huỳnh Đăng Sang và cs., 2014). Các

cấu trúc của phytoplasma phát hiện đƣợc có dạng hình tròn, hình ovan, hình bầu

dục với kích thƣớc từ 20 - 800 nm, phổ biến là 100 nm trong tế bào ống rây của

mạch phloem cây bệnh.

A) Cây mía bị bệnh trắng lá và phytoplasma trong tế bào mạch dẫn của cây bệnh ở độ phóng đại 100.000 lần

Nguồn: Vũ Triệu Mân và cs. (2005)

B) Cây mía bị bệnh chổi cỏ và phytoplasma trong tế bào mạch dẫn của cây bệnh. Thanh bar: 500 nm

Nguồn: Hoat et al. (2012)

Nguồn: Nguyễn Đức Thành và cs. (2012)

C) Cây vừng bị bệnh diệp hóa và phytoplasma trong tế bào mạch dẫn của cây bệnh. Thanh bar: 500 nm

Hình 2.8. Một số hình ảnh xác định phytoplasma bằng phƣơng pháp hiển vi điện tử tại Việt Nam

Ở Việt Nam, nghiên cứu ở mức giải trình tự gen đầu tiên đối với

phytoplasma là một nghiên cứu của các nhà khoa học Anh và Mỹ thực hiện trên

cây xoan ta (Melia azedarach) bị bệnh biến vàng thu thập tại Huế năm 2003. Dựa

vào kỹ thuật PCR, RFLP, kết hợp với giải trình tự, các tác giả đã xác định đƣợc

tác nhân gây bệnh là do phytoplasma thuộc nhóm 16SrI gây ra (mã truy cập

AY863003) (Harrison et al., 2006).

Đến nay, một số phytoplasma đƣợc xác định ở mức giải trình tự gen do các

nhà nghiên cứu Việt Nam thực hiện, phát hiện tác nhân gây bệnh chồi cỏ mía,

bệnh trắng lá mía đều do phytoplasma gây ra (Hoat et al., 2012, 2013); bệnh diệp

hóa cây vừng, bệnh chổi phù thuỷ đậu tƣơng và một số bệnh trên một số loài cây

khác do phytoplasma gây ra (Nguyễn Đức Thành và cs., 2012, 2013, 2014). Đây

là những cơ sở dữ liệu quan trọng, giúp nghiên cứu định hƣớng phát hiện và định

loại tác nhân gây bệnh là phytoplasma gây hại trên cây trồng tại Việt Nam. Do

đó, việc nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật tại Việt Nam là cần thiết giúp

các nhà nghiên cứu, quản lý hiểu rõ về đối tƣợng gây hại là phytoplasma, có định

hƣớng nghiên cứu ngắn hạn và dài hạn về đối tƣợng này nhằm đƣa ra đƣợc

những biện pháp quản lý bệnh có hiệu quả.

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.1.1. Vật liệu nghiên cứu

3.1.1.1. Giống sắn thí nghiệm

Giống sắn KM94, KM419 và SM937-26 đã bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ

đƣợc lấy từ ruộng sản xuất của hộ nông dân tại huyện Trảng Bom của tỉnh Đồng

Nai. Giống sắn trồng phổ biến này đƣợc hộ nông dân lấy từ nguồn giống tự lƣu

trữ của vụ trƣớc và sử dụng liên tục trong nhiều năm liền. Hom sắn giống KM94

khỏe trồng từ hạt của cây không bị bệnh chổi phù thuỷ, đƣợc kiểm tra bằng PCR cho kết quả âm tính với cặp mồi sử dụng phát hiện phytoplasma, tiếp tục đƣợc

nhân giống vô tính bằng các đoạn hom cắt trồng trong nhà lƣới chống côn trùng.

3.1.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hoá chất dùng trong nghiên cứu

 Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR, máy huỳnh quang, máy li tâm để bàn,

máy cắt tiêu bản, cân điện tử, bể nhiệt.

 Dụng cụ nghiên cứu: Ống đong, bình thuỷ tinh, giấy thấm, chày, cối sứ. Các khay, túi nhựa để gieo và trồng cây thí nghiệm. Các dụng cụ khác nhƣ găng

tay, bút viết, sổ ghi chép, v.v...

 Hóa chất dùng trong phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain

reaction, PCR): 10x Taq buffer, dNTPs, Taq polymerase (5U/l), nƣớc cất vô

trùng (Invitrogen).

 Đệm CTAB để tách chiết DNA tổng số: 5M NaCl; 0,5M EDTA (pH 8,0); 1M Tris-HCl (pH 8,0); polyvinyl pyrrolidone (MW 40.000); 0,8% CTAB

(cetyl trimethyl ammonium bromide).

 Đệm TE 1x để hòa tan cặn chứa DNA tổng số: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)

và 1 mM EDTA (pH 8,0).

 Đệm TAE 1x để chạy điện di: 10 mM Tris-acetate và 0,5 mM EDTA

(pH 7,8).

 Ethidium bromide (EtBr) dùng để nhuộm bản gel: 2 l EtBr (10 mg/ml)

trong 100 ml đệm TAE lX.

 Thuốc nhuộm DAPI 1x: 0,1 ml DAPI 1.000X trong 100 ml nƣớc cất.

 Hóa chất dùng

trong phản ứng LAMP-PCR: 10x Isothermal amplification, Betaine 5M, Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, Hoa Kỳ),...

 Các hóa chất khác: Agarose, glutaraldehyde, chloroform/isoamyl alcohol

(24/1),…có nguồn gốc từ các hãng Wako (Nhật Bản), Fermentas (Đức).

3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.2.1. Địa điểm nghiên cứu

Điều tra, thu thập mẫu cây sắn có biểu hiện bệnh chổi phù thuỷ tại vùng Đông Nam Bộ và tại một số địa phƣơng khác. Những nghiên cứu thực nghiệm, chẩn đoán và giám định liên quan đến nội dung của đề tài đƣợc thực hiện tại:

 Viện Bảo vệ thực vật, Bắc Từ Liêm, thành phố Hà Nội.

 Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt

Nam - Trâu Quỳ, huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội.

 Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hƣng Lộc - xã Hƣng

Thịnh, huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai.

3.1.2.2. Thời gian nghiên cứu

Đề tài đƣợc thực hiện từ năm 2011 đến năm 2014.

3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.2.1. Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn

- Mô tả triệu chứng bệnh, điều tra mức độ bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại trên một số giống sắn tại Đồng Nai, Bình Phƣớc, Quảng Ngãi và Kon Tum trong năm 2011. Thu thập mẫu cây sắn và côn trùng.

3.2.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô

và PCR

3.2.2.1. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử

- Hình thái, kích thƣớc của phytoplasma hại sắn.

3.2.2.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô với DAPI

- Màu sắc của thể phytoplasma hại sắn. Bộ phận của cây sắn phát hiện đƣợc

thể phytoplasma.

3.2.2.3. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR

- Sử dụng một số cặp mồi nhằm phát hiện phytoplasma hại sắn trong phản

ứng PCR (bƣớc 1) và PCR lồng (bƣớc 2).

3.2.3. Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn

3.2.3.1. Định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR

- Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự gen vùng 16S RNA ribosome

của phytoplasma hại sắn.

- Tìm kiếm các chuỗi tƣơng đồng trên Ngân hàng Gen.

3.2.3.2. Định danh bằng kỹ thuật RFLP

- Phân tích sản phẩm PCR bằng kỹ thuật đa hình chiều dài của đoạn cắt giới

hạn (RFLP).

- Phân tích trình tự sản phẩm PCR thực hiện mô phỏng trên chƣơng trình

pDRAW32.

- So sánh mức đồng nhất trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome.

3.2.3.3. Phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn

- Xác định danh tính nhóm/nhóm phụ phytoplasma vùng gen 16S RNA

ribosome của các mẫu có chất lƣợng trình tự tốt, đã đăng ký trên Ngân hàng Gen.

- Tìm kiếm các chuỗi gen tƣơng đồng, phân tích phả hệ phytoplasma hại

sắn ở Việt Nam.

3.2.4. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm

16SrII hại sắn

- Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII.

- Đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma của bộ mồi LAMP.

3.2.5. Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do

phytoplasma gây ra

- Ảnh hƣởng của đất trồng và hom giống sắn đến khả năng lan truyền bệnh

chổi phù thuỷ hại sắn trên giống sắn KM94 tại tỉnh Đồng Nai trong năm 2012.

- Khả năng lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn trên giống sắn KM94

bằng phƣơng pháp ghép tại tỉnh Đồng Nai trong năm 2012.

- Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng

(Cuscutas spp.) tại tỉnh Đồng Nai trong năm 2012.

- Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua một số loài

côn trùng.

3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1. Phƣơng pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn

3.3.3.1. Điều tra mức độ phổ biến

Lựa chọn tuyến điều tra đại diện cho các vùng trồng sắn phía nam Việt Nam bao gồm các tỉnh Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu, Bình Phƣớc, Tây Ninh,

Quảng Ngãi và Kon Tum. Thời gian điều tra, giai đoạn sinh trƣởng phát triển của

cây sắn trên đồng không xác định. Tiến hành điều tra một lần tại thuộc địa điểm

điều tra theo phƣơng pháp 5 điểm trên đƣờng chéo góc, mỗi điểm điều tra ít nhất

50 cây. Ruộng điều tra cách bờ một hàng cây sắn. Điều tra 3 ruộng trồng sắn tại

một địa điểm trồng sắn

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ cây sắn nhiễm bệnh chổi phù thuỷ (%).

3.3.3.2. Thu thập mẫu cây và côn trùng

a) Phương pháp thu mẫu cây sắn bị bệnh

Thu mẫu trên các cây sắn biểu hiện rõ triệu chứng của bệnh chổi phù thuỷ

mọc nhiều chồi ở phần thân chính; lá cây nhỏ lại, biến vàng, lá thô cứng; đốt thân

ngắn lại, ở nhiều cây thấy phần trong thân có các vết hoại màu nâu đen, phần lõi có màu nâu nhạt, chồi bị chết khô. Thu thập mẫu cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù

thuỷ tại các điểm điều tra. Mô tả triệu chứng bệnh, giai đoạn sinh trƣởng phát triển của cây, ghi rõ địa điểm, thời gian. Chụp ảnh cây nhiễm bệnh và cây khoẻ.

b) Xử lý và bảo quản mẫu

 Đối với cách bảo quản tƣơi: chọn bộ phận (lá, thân cành) có biểu hiện triệu chứng điển hình của bệnh chổi phù thuỷ đƣợc giữ ẩm bằng giấy thấm ƣớt và

bọc trong giấy báo, hoặc bọc trong tấm vải rồi đựng vào trong thùng xốp.

 Đối với cách bảo quản khô: chọn bộ phận (lá, gân lá, thân cành) rồi cho vào túi nilon có chứa các hạt silicagel tự chỉ thị. Thay hạt silicagel tự chỉ thị cho đến khi mẫu bảo quản khô, giòn là đƣợc. Ghi thông tin mẫu cây thu thập. Cất giữ, bảo quản mẫu cây ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh sâu –20oC.

Phƣơng pháp tuyển chọn và nhân giống cây khỏe: Hom sắn giống KM94 khỏe đƣợc trồng từ hạt của cây không bị bệnh chổi phù thuỷ. Hom sắn đƣợc kiểm tra bằng PCR cho kết quả âm tính với cặp mồi sử dụng nhằm phát hiện phytoplasma, tiếp tục đƣợc nhân giống vô tính bằng các đoạn hom cắt trồng

trong nhà lƣới chống côn trùng.

Thu thập các loài rầy tại ruộng trồng sắn và vùng xung quanh bằng phƣơng pháp vợt tay/bẫy ánh sáng. Dụng cụ gồm có: cột tre, tấm vải trắng, dây buộc cố

định cột tre, đèn pin, đèn compact 50W (Rạng Đông), ống hút, ống nhựa, lọ đựng

mẫu, bút ghi, cồn,... Mẫu côn trùng thu thập đƣợc bảo quản trong cồn 90% - 96%

nhằm giám định tên loài, đồng thời kiểm tra bằng PCR nhằm phát hiện phytoplasma trong cơ thể các loài rầy thu thập. Côn trùng còn sống ở pha sâu non

hoặc pha trƣởng thành đƣợc phân loại bằng đặc điểm hình thái và thả lên cây thí

nghiệm nhằm xác định khả năng lan truyền bệnh.

3.3.2. Phƣơng pháp phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện

tử, nhuộm mô và PCR

3.3.2.1. Phương pháp phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử

Mẫu cây sắn đƣợc bảo quản còn tƣơi cho đến khi làm thí nghiệm. Mẫu thu

thập đại diện cho các vùng trồng sắn, tập trung vào giống sắn KM94 là giống

nhiễm bệnh trồng chủ lực tại nhiều địa phƣơng. Mẫu cây sắn khỏe đƣợc dùng

làm đối chứng. Sử dụng phƣơng pháp kính hiển vi điện tử truyền qua

(transmission electron microscopy, TEM) nhằm phát hiện thể phytoplasma trong

mẫu cây sắn thu thập trên đồng.

Kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử đƣợc thực hiện đợt 1 vào tháng 4 năm

2011, trong đó có 3 mẫu cây sắn biểu hiện triệu chứng bệnh của chổi phù thuỷ

đƣợc thu thập trên giống sắn KM94 tại một số vùng trồng của các tỉnh Đồng Nai

(huyện Trảng Bom và huyện Thống Nhất), tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu (huyện Tân

Thành) thuộc vùng Đông Nam Bộ và 1 mẫu cây sắn KM94 không bị bệnh đƣợc

thu thập tại huyện Trảng Bom (tỉnh Đồng Nai) sử dụng làm đối chứng.

Kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử đƣợc thực hiện đợt 2 vào tháng 11 năm

2011, gồm 2 mẫu cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ và 1 mẫu cây sắn không bị bệnh thu thập tại tỉnh Đồng Nai. Các mẫu sắn thí nghiệm của cả 2 đợt đƣợc phân tích,

chụp ảnh hiển vi điện tử tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng, sử dụng phƣơng

pháp kính hiển vi điện tử truyền qua bằng máy JEOL ở nguồn điện HV 80,0 kV.

3.3.2.2. Phương pháp phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô với DAPI

Áp dụng kỹ thuật nhuộm mô cây bệnh, cây khỏe bằng DAPI (4‟,6-

diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) dựa theo tài liệu mô tả của Andrade

and Arismendi (2013) đƣợc thực hiện vào tháng 02 năm 2014 nhằm phát hiện

phytoplasma trên giống sắn KM94 bị bệnh chổi phù thuỷ (4 mẫu) và giống sắn

KM94 không bị bệnh (4 mẫu) thu thập trên đồng tại tỉnh Đồng Nai.

Các bƣớc thực hiện nhƣ sau: Chọn gân chính của lá sắn non ở phần đỉnh

ngọn và vỏ củ còn tƣơi. Cắt phần gân lá, vỏ củ thành đoạn dài khoảng 1cm, rồi

cho vào đĩa petri có chứa nƣớc cất để tránh bị khô. Tiếp theo, nhúng phần gân lá

đã cắt vào trong dung dịch glutaraldehyde 5% trong thời gian 20 phút. Sau đó,

rửa mẫu bằng dung dịch đệm 0,1M PBS, pH 6,9 trong 5 phút. Đúc mẫu phân tích

bằng bộ đúc mẫu. Cắt mẫu bằng máy cắt tiêu bản (TBS CUT4055) theo chiều

dọc, với độ dày 10 - 15 µm. Đặt mẫu cắt vào dung dịch nhuộm DAPI (nồng độ

1µg/ml), trong thời gian 25 phút. Rửa lại mẫu cắt bằng trong nƣớc cất vô trùng.

Đặt mẫu cắt trên lam kính, nhỏ nƣớc cất vô trùng vào giữa rồi cố định tiêu bản

bằng lamen, cần chú ý giữ lam trong tối nếu chƣa quan sát vì ánh sáng sẽ phân

hủy dung dịch nhuộm DAPI. Quan sát bằng kính huỳnh quang + 3 bộ lọc ở vật

kính 10x, 4x và 100x + 1,2 dầu (Carl Zeiss, Gottingen, Đức). Điều chỉnh bộ lọc 2

tại mức Pb450-490, FT 510, LP 520. Chụp ảnh mẫu phân tích bằng máy ảnh có

kết nối máy tính Remote Capture DC (Canon, Nhật Bản). Nếu có, thể

phytoplasma sẽ phát huỳnh quang, tụ tập ở tế bào ống rây của mạch phloem.

3.3.2.3. Phương pháp phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR

a) Tách chiết DNA tổng số từ mô cây, cơ thể côn trùng

Tách chiết DNA tổng số từ mô cây, cơ thể côn trùng thu thập bằng phƣơng

pháp CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) dựa theo tài liệu mô tả của

Doyle and Doyle (1990).

Các bƣớc thực hiện: (i) Ủ đệm CTAB + β-mecarpto ethanol (β-ME) (10 ml CTAB + 100 µl β-ME) ở 65oC trong 5 phút. Chỉ cho β-ME vào dung dịch đệm CTAB ngay trƣớc khi dùng; (ii) Cho đệm CTAB đã ủ với β-ME, theo tỷ lệ 0,1 g

mô cây/1 ml, đối với rầy 3 con/1 ml đệm CTAB + β-ME. Nghiền nhỏ mẫu tạo thành dạng hồ vữa nhỏ mịn là đƣợc. Lắc nhẹ tuýp. Ủ tuýp trong điều kiện 65oC trong thời gian 30 - 60 phút; (iii) Sau đó, ly tâm tuýp trong 7 phút. Lấy dịch trên tủa (khoảng 400 µl). Chiết thể tích tƣơng đƣơng (400 µl) với dung dịch

chloroform/isoamyl alcohol (24/1); (iv) Ly tâm tuýp trong 7 phút. Lấy dịch trên tủa (khoảng 300 µl), rồi để tuýp trong tủ lạnh –20oC trong 5 phút. Chiết lần thứ hai với chloroform/isoamyl alcohol (24/1); (v) Để lạnh 5 phút. Ly tâm tuýp trong 7 phút. Lấy dịch trên tủa (khoảng 200 µl) cho vào tuýp trắng loại 1,5 ml đã đƣợc hấp khử trùng. Bổ sung một thể tích tƣơng đƣơng (khoảng 200 µl) 2-propanol

(isopropanol) đã đƣợc làm lạnh; (vi) Để tuýp ở nhiệt độ –20oC trong 60 phút. Lắc đều, ly tâm trong 15 phút. Loại bỏ dịch trên tủa, giữ lại cặn. Ly tâm trong 15 giây

để hút hết dịch trong tuýp ra. Rửa cặn DNA hai lần với EtOH 70% (khoảng 700

µl); (vii) Làm khô cặn ở điều kiện nhiệt độ phòng ở trong buồng cấy. Hòa cặn

DNA tổng số với 50 - 100 µl TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 và 1 mM EDTA, pH 8,0), búng nhẹ để cặn DNA tan hết. Bảo quản tuýp có chứa DNA tổng số ở điều kiện nhiệt độ –20oC cho đến khi sử dụng.

b) Kiểm tra DNA tổng số bằng kỹ thuật PCR

 Các cặp mồi và thành phần phản ứng:

Sử dụng các cặp mồi phát hiện phytoplasma trên cây sắn, nƣớc cất vô trùng

đƣợc dùng làm đối chứng âm (bảng 3.1, hình 3.1).

Bảng 3.1. Các cặp mồi đƣợc sử dụng để phát hiện phytoplasma trên cây sắn

STT Tên mồi Trình tự 5‟- 3‟

AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT

Số chữ Nguồn gốc tham khảo

1 P1 25 Deng and Hiruki

CGTCCTTCATCGGCTCTT

(1991),

2 P7 18

CATGCAAGTCGAACGGA

Schneider et al. (1995)

3 R16mF2

GAAACGACTGCTAAGACTGG

17 Gundersen and Lee (1996) 4 R16mR1 CTTAACCCCAATCATCGAC 19

5 R16F2n

TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG

20 Gundersen and Lee (1996) 6 R16R2 25

Nguồn: Deng and Hiruki (1991), Schneider et al. (1995), Gundersen and Lee (1996)

Hình 3.1. Lƣợc đồ cụm gen rDNA của phytoplasma, vị trí của các mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR. Spacer region: vùng đệm; 1kb = 100 bp

Phản ứng PCR (bƣớc 1) đƣợc thực hiện với tổng thể tích là 25,0 µl trong đó

có chứa: 20,2 µl H2O; 2,5 µl 10x Taq buffer; 0,5 µl dNTPs 20 mM; 0,5 µl mồi xuôi 20 µM; 0,5 µl mồi ngƣợc 20 µM; 0,5 µl Taq DNA polymerase 5U/µl; 0,5 µl

DNA tổng số.

Sau khi phản ứng PCR kết thúc, sản phẩm PCR trực tiếp (bƣớc 1) đƣợc pha

loãng 30 lần (1l : 29 l) với nƣớc cất vô trùng đã đƣợc khử ion. Lấy 1l đã pha

loãng này để làm khuôn mẫu trong phản ứng PCR lồng (bƣớc 2).

Phản ứng PCR lồng (bƣớc 2) đƣợc thực hiện với tổng thể tích là 25,0 µl trong đó có chứa: 19,5 µl H2O; 2,5 µl 10x Taq buffer; 0,5 µl dNTPs 20 mM; 0,5 µl mồi xuôi 20 µM; 0,5 µl mồi ngƣợc 20 µM; 0,5 µl Taq DNA polymerase 5U/µl; 1,0 µl sản phẩm PCR trực tiếp (đã đƣợc pha loãng 30 lần).

 Quy trình thực hiện phản ứng:

Quy trình thực hiện trong phản ứng PCR trực tiếp (bƣớc 1) và phản ứng

PCR lồng (bƣớc 2) đƣợc thực hiện trên máy PCR với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở (94oC - 3 phút) 1 chu kỳ; tiếp theo là chu trình (94oC - 1 phút; 52oC - 2 phút; 94oC - 3 phút) 35 chu kỳ; phản ứng kết thúc ở (72oC - 10 phút) 1 chu kỳ.

 Chạy điện di sản phẩm PCR:

Pha agarose 1% (1 g/100 ml) trong đệm TAE 1x (tris base - acetic acid -

ethylene diamine tetra-acetate) đun sôi trong lò vi sóng để dung dịch đồng nhất.

Sau đó, bổ sung ethidium bromide vào dung dịch gel agarose 1%. Khi dung dịch gel agarose 1% nằm trong khoảng 50 - 60oC thì đổ vào khuôn. Để khuôn gel ở nhiệt độ phòng trong thời gian 45 phút. Sau đó, tiến hành rút lƣợc. Đặt cả khay

khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE 1x phủ ngập khuôn gel. Dùng

pipét hút lƣợng 5 l mẫu cần kiểm tra vào các giếng của khuôn gel. Nhỏ 1 mẫu/1

giếng của khuôn gel và nhỏ một giếng gồm thang DNA 1 kb (Fermentas) làm chuẩn. Gel đƣợc chạy trên thiết bị điện di là Mini-SubCell (Biorad). Chạy điện di

ở hiệu điện thế 50 Vols trong thời gian 60 phút. Sau 60 phút, tắt máy điện di, đặt bản gel lên máy phát tia cực tím, quan sát vệt DNA. Kết quả PCR đƣợc đánh giá là có phản ứng PCR dƣơng (+) tức là mẫu nhiễm bệnh khi vạch băng xuất hiện trên bản điện di đúng với kích thƣớc của cặp mồi sử dụng và đƣợc coi là có phản ứng PCR âm (-) tức là mẫu không nhiễm bệnh khi không xuất hiện vạch băng trên bản điện di với kích thƣớc của cặp mồi sử dụng. Chụp ảnh bản điện di bằng

máy ảnh kỹ thuật số.

3.3.3. Phƣơng pháp định danh phân tử và phân tích phả hệ

3.3.3.1. Phương pháp định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR

a) Tinh chiết sản phẩm PCR

Tinh chiết sản phẩm PCR trong phản ứng PCR (bƣớc 1) hoặc trong phản

ứng PCR lồng (bƣớc 2) trên bản điện di gel agarose dùng QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, GmbH).

Các bƣớc tiến hành bao gồm: (i) Cắt gel agarose (khoảng 100 mg) chứa đoạn vạch băng quan tâm cho vào tuýp màu trắng 1,5 ml. Cho 600 µl dung dịch QG vào tuýp chứa sản phẩm PCR. Ủ tuýp ở 50oC trong 10 phút để hoà tan gel; (ii) Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dung dịch phía dƣới. Cho tiếp 600 µl dung dịch QG vào tuýp để rửa lần 2; (iii) Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dung dịch phía dƣới. Thêm 700 µl PE đã bổ sung EtOH 70% vào cột. Để ổn định nhiệt độ phòng trong 5 phút; (iv) Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dung dịch phía dƣới. Ly tâm lại một lần nữa để loại bỏ dung dịch PE còn dƣ. Đƣa vào cột tuýp 1,5 ml; (v) Thêm 50 µl đệm EB để hòa tan cặn, ổn định ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút. Thu sản phẩm sau khi tinh chiết và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ –20oC.

b) Giải trình tự sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR sau khi tinh chiết đƣợc giải trình tự trực tiếp. Sản phẩm giải

trình tự đƣợc gửi đọc tại Công ty Bioneer của Hàn Quốc.

3.3.3.2. Phương pháp định danh bằng kỹ thuật RFLP

a) Phân tích RFLP dựa trên sản phẩm PCR

Phân tích bằng kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) đối với sản phẩm PCR trong phản ứng PCR lồng dùng với cặp mồi R16F2n/R16R2. Sản phẩm PCR dùng với cặp mồi trong phản ứng PCR lồng đƣợc tách chiết từ mẫu cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ đƣợc cắt với enzym cắt giới hạn thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phytoplasma gây bệnh cây gồm EcoRI, HhaII, HpaI và TaqI (Fermentas), thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.

 Với enzym cắt giới hạn EcoRI: Thành phần phản ứng dùng trong tuýp màu trắng 0,2 ml có chứa: 18,0 µl H2O-DEPC; 2,0 µl 10x buffer EcoRI; 2,0 µl EcoRI; 10,0 µl sản phẩm PCR. Đặt tuýp có chứa hỗn hợp vào trong khay nƣớc cất và ủ ở điều kiện 65oC trong thời gian 10 giờ.

 Với các enzym cắt giới hạn HhaII, HpaI và TaqI: Thành phần phản ứng dùng trong tuýp màu trắng 0,2 ml có chứa: 18,0 µl H2O-DEPC; 2,0 µl 10x buffer Tango; 2,0 µl HhaII/HpaI/TaqI; 10,0 µl sản phẩm PCR. Đặt tuýp có chứa hỗn hợp vào trong khay nƣớc cất và ủ ở điều kiện 37oC trong thời gian 10 giờ.

Sau khi ủ xong, kiểm tra sản phẩm PCR với các enzym cắt giới hạn trên bản

điện di gel agarose 1,5% (1,5 g agarose/100 ml TAE) trong đệm TAE 1x.

b) Phân tích RFLP mô phỏng dựa trên trình tự sản phẩm PCR

Phân tích RFLP mô phỏng đƣợc thực hiện bằng phần mềm pDRAW32 theo

mô tả của Wei et al. (2007) với 17 enzym cắt giới hạn gồm AluI, BamHI, BfaI,

BstUI, DraI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI, HpaI, HpaII, KpnI, MseI, RsaI, Sau96I,

SspI và TaqI. Sử dụng gel điện di 3% với thang DNA chuẩn là 174DNA-HaeIII

với kích thƣớc cặp bazơ (base pair) từ trên xuống dƣới lần lƣợt là 1.353, 1.078,

872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118 và 72 bp. Ngoài ra, 7 mẫu tham khảo gồm

2 mẫu nhóm 16SrI (CWB-WF, MAY), 2 mẫu nhóm 16SrII (CWB-TQ, PnWB), 1

mẫu nhóm 16SrIII (CWB-Br02), 1 mẫu nhóm 16SrXV (HibWB) và 1 mẫu không

phải là phytoplasma (A. laidlawii) sẵn có trên Ngân hàng Gen cũng đƣợc sử dụng

trong phân tích làm mẫu tham khảo.

Dựa trên mức tƣơng đồng di truyền của các mẫu, mối quan hệ di truyền của

các mẫu cũng đƣợc xác định dùng phần mềm NTSYSpc 2.0 với khoảng cách di

truyền đƣợc xác định theo phƣơng pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung

bình số học ngang bằng (unweighted pair group method with arithmetic mean,

UPGMA). Các băng DNA đƣợc xác định từ kết quả chạy điện di trên gel ảo và

đƣợc ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng (Nei and Li, 1979).

c) Định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide

So sánh mức đồng nhất trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome của 26 mẫu thử nghiệm, bao gồm 19 mẫu phytoplasma hại sắn tại Việt Nam đã

đƣợc giải trình tự thành công. Có 7 mẫu tham khảo gồm 2 mẫu nhóm 16SrI

(CWB-WF, MAY), 2 mẫu nhóm 16SrII (CWB-TQ, PnWB), 1 mẫu nhóm 16SrIII (CWB-Br02), 1 mẫu nhóm 16SrXV (HibWB) và 1 mẫu không phải là phytoplasma (A. laidlawii) sẵn có trên Ngân hàng Gen cũng đƣợc sử dụng trong phân tích làm mẫu tham khảo. Các trình tự nucleotide đƣợc căn trình tự đa chuỗi và đƣợc tính toán bằng phần mềm BioEdit 7.0 (Hall, 1999), ClustalW2

(McWilliam et al., 2013).

3.3.3.3. Phương pháp phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn dựa trên trình tự

nucleotide

Trƣớc khi phân tích phả hệ, các trình tự nucleotide đƣợc căn trình tự đa

chuỗi bằng phần mềm BioEdit 7.0 (Hall, 1999), ClustalW2 (McWilliam et al., 2013) và dùng chƣơng trình trực tuyến (basic local alignment search tool,

BLAST) để tìm kiếm các chuỗi nucleotide tƣơng đồng có sẵn trên Ngân hàng

Gen (GenBank) của Trung tâm Thông tin công nghệ quốc gia Hoa Kỳ.

Cây phả hệ đƣợc xây dựng dựa trên các chuỗi nucleotide chỉ chứa đoạn gen 16S RNA ribosome của phytoplasma gây bệnh cây đã đƣợc công bố trên Ngân

hàng Gen; cây phả hệ đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor-Joining với

khoảng cách di truyền giữa các chuỗi đƣợc xác định dựa trên mô hình thay thế

Kimura 2 tham số, giá trị thống kê bằng kỹ thuật bootstrap (%) với 1.000 lần lặp

lại trong MEGA 5.0 (Tamura et al., 2011). Loài Acholeplasma laidlawii (mã truy

cập M23932) nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo, thuộc chi Acholeplasma,

bộ Acholeplasmatales, lớp Mollicutes đƣợc đƣa vào làm đối chứng.

3.3.4. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm

16SrII hại sắn

3.3.4.1. Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII

Dựa trên các chuỗi trình tự nucleotide của phytoplasma gây hại sắn tại Việt

Nam và trên thế giới đã đƣợc đăng ký trên Ngân hàng Gen, các mồi LAMP-PCR

đƣợc thiết kế sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4 trong thí nghiệm này nhằm

chẩn đoán phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh Đông Nam Bộ. Các

mồi LAMP-PCR thiết kế gồm CWB-F3, CWB-B3, CWB-FIP, CWB-BIP, CWB-

F-loop, CWB-B-loop đƣợc tổng hợp bởi hãng Macrogen (Hàn Quốc).

3.3.4.2. Đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma của bộ mồi LAMP

Độ nhạy, khả năng phát hiện trên mẫu cây bệnh của các mồi LAMP-PCR

đƣợc đánh giá. Các mẫu thử nghiệm bao gồm: nƣớc cất (Invitrogen), sản phẩm

PCR, DNA tổng số của cây sắn bệnh và DNA tổng số của cây sắn khỏe.

Phản ứng LAMP-PCR đƣợc thực hiện với tổng thể tích là 10,0 µl trong đó

có chứa: 1,8 l nƣớc cất vô trùng; 1,0 l 10x Isothemal amplification buffer

(New England Biolabs); 1,6 l MgSO4 25 mM; 0,8 l dNTPs 10 mM; 1,6 l Betaine 5M; 0,1 l CWB-F3 20 M; 0,1 l CWB-B3 20 M; 0,4 l CWB-FIP

20 M; 0,4 l CWB-BIP 20 M; 0,4 l CWB-F-loop 20 M; 0,4 l CWB-B-

loop 20 M; 0,5 l Hydroxyl napthol blue 0,12 mM; 0,4 l Bst 2.0 WarmStart

DNA polymerase (8U/1 l); 0,5 l DNA.

Quy trình thực hiện trong phản ứng LAMP-PCR đƣợc thực hiện trên máy PTC-100 (M.J Research Inc.) với điều kiện sau: bắt đầu ở điều kiện (63oC - 90 phút) 1 chu kỳ và kết thúc ở điều kiện (80oC - 5 phút) 1 chu kỳ. Kiểm tra sản phẩm LAMP-PCR trên bản điện di gel agarose 1,5% (1,5 g agarose/100 ml TAE

1x) trong đệm TAE 1x.

3.3.5. Phƣơng pháp xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù

thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra

3.3.5.1. Chuẩn bị giá thể để gieo trồng cây thí nghiệm

Đất dùng làm giá thể trồng cây đƣợc hấp khử trùng trong nồi hấp, ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 30 phút để tiêu diệt các nguồn bệnh vi sinh vật và các sinh vật khác có trong đất thí nghiệm. Cây thí nghiệm đƣợc gieo trồng, chăm sóc

cẩn thận và đặt trong nhà lƣới chống côn trùng.

3.3.5.2. Ảnh hưởng của đất trồng và hom giống sắn

a) Thí nghiệm chậu vại trong nhà lưới

Khử trùng đất (hấp khử trùng bằng hơi nƣớc nóng 121oC trong thời gian 30 phút) và lấy đất ở ruộng trồng có cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ ở ngay

phần gốc cây. Sử dụng hom sắn giống KM94 đã bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ

trong thí nghiệm. Hom sắn KM94 khỏe đƣợc lấy từ cây đã mọc từ hạt không

nhiễm bệnh đƣợc dùng làm đối chứng. Hom sắn thí nghiệm đƣợc trồng trên đất

đã hấp khử trùng. Thiết kế thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD).

Thí nghiệm chậu vại trong nhà lƣới gồm có 4 công thức (CT):

CT1: Trồng hom sắn bị bệnh chổi phù thuỷ trên đất đã hấp khử trùng.

CT2: Trồng hom sắn khoẻ trên đất trồng có cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ.

CT3: Trồng hom sắn bị bệnh trên đất trồng có cây sắn bị bệnh chổi

phù thuỷ.

CT4: Trồng hom sắn khỏe trên đất đã hấp khử trùng.

Cây thí nghiệm đặt trong nhà lƣới chống côn trùng. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ

bệnh (%) sau 9 tháng trồng.

b) Thí nghiệm đồng

Sử dụng hom sắn KM94, KM419, SM937-26 từ cây đã bị bệnh chổi phù

thuỷ. Nguồn gốc các giống sắn dùng trong thí nghiệm đƣợc chỉ rõ ở mục 3.1.1.1.

Bố trí thí nghiệm theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD).

Cách gieo trồng: Làm đất không lên luống, rạch hàng cách nhau 1 m. Trƣớc

khi trồng, vệ sinh đồng, nhặt bỏ tàn dƣ cây sắn trồng vụ trƣớc. Đặt hom nằm

ngang so với mặt đất, lấp đất sâu 3 - 4 cm. Khoảng cách trồng: 0,8 m x 1,0 m.

Mật độ trồng 12.500 cây/ha. Dải bảo vệ xung quanh: 1,5 m trồng giống sắn KM419 đã bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ. Bón phân theo mức (80 kg N + 40 kg P2O5 + 80 kg K2O)/ha tại vùng đất đỏ tỉnh Đồng Nai.

Địa điểm: Xã Hƣng Thịnh, huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai.

3.3.5.3. Phương pháp xác định khả năng lan truyền qua ghép cây

Sử dụng giống sắn KM94 trong thí nghiệm. Hom sắn KM94 khỏe đƣợc lấy

từ cây đã mọc từ hạt không nhiễm bệnh chổi phù thuỷ đƣợc dùng làm đối chứng.

Chọn các cành phía ngọn của cây bị bệnh chổi phù thuỷ và gốc ghép, cành ghép

cây khỏe cũng có kích thƣớc, độ tuổi tƣơng đƣơng nhau. Áp dụng kỹ thuật ghép

vát, cành ghép đƣợc cắt vát hình chữ V theo hƣớng từ phía trên xuống, còn gốc

ghép đƣợc cắt theo hƣớng ngƣợc lại với cành ghép; sau đó áp hai mặt ghép vào

nhau rồi buộc cố định lại chỗ ghép bằng nilon màu trắng thƣờng đƣợc sử dụng

trong kỹ thuật ghép cây trồng. Phủ túi nilon bao bọc cả cây ghép để qua một

đêm. Cây thí nghiệm đặt trong lồng lƣới ở nhà lƣới có mái che chống côn trùng. Cây thí nghiệm đƣợc trồng trên đất đã hấp khử trùng (mục 3.3.3.1). Thí nghiệm

chậu vại trong nhà lƣới gồm có 2 công thức:

CT1: Cành ghép KM94 khỏe/gốc ghép KM94 bệnh.

CT2: Cành ghép KM94 khỏe/gốc ghép KM94 khỏe.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%) sau 9 tháng.

3.3.5.4. Phương pháp xác định khả năng lan truyền qua tơ hồng

Tơ hồng (Cuscutas spp.) đƣợc thu thập từ hạt và gieo trong khay đĩa đến khi mọc mầm đƣa lên cây thí nghiệm. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) đƣợc trồng từ hạt để thu nguồn cây sạch bệnh. Thí nghiệm chậu vại trong nhà lƣới

gồm có 3 công thức:

CT1: KM94 bệnh chổi phù thuỷ - Tơ hồng - KM94 khỏe.

CT2: KM94 bệnh chổi phù thuỷ - Tơ hồng - Cây dừa cạn khỏe.

CT3: KM94 khỏe - Tơ hồng - KM94 khỏe.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%) sau 9 tháng.

3.3.5.5. Phương pháp xác định khả năng lan truyền qua côn trùng

Dùng ống hút, bẫy đèn để bắt rầy tại ruộng sắn bị bệnh chổi phù thuỷ gây

hại và các ruộng xung quanh. Quan sát bằng đặc điểm hình thái để phân loại loài

rầy khác nhau. Thả trực tiếp rầy lên cây sắn non đƣợc trồng từ hạt và một số cây

họ hòa thảo khác nhƣ lúa, ngô để thu rầy non và rầy trƣởng thành. Sử dụng cây

sắn khỏe giống KM94 mọc từ hạt làm vật liệu thí nghiệm.

Đối với thí nghiệm xác định khả năng lan truyền bệnh của một số loài rầy:

Rầy trƣởng thành thu thập từ đồng đƣợc nhân nuôi trên lúa, ngô. Sau đó thu lấy

pha rầy non và cả rầy trƣởng thành thả lên cây sắn non sạch bệnh và cây sắn đã

nhiễm bệnh chổi phù thuỷ. Năm 2012, đối với 15 loại rầy ký hiệu từ TF1 đến

TF15, thả 15 cá thể rầy/5 cây trong ống nhựa trắng x 3 lần lặp. Năm 2013, đối

với 6 loại rầy ký hiệu TF2, TF3, TF4, TF5, TF8 và TF12, thả 15 cá thể rầy/7 cây

trong ống nhựa trắng x 1 lần lặp và 32 - 40 cá thể rầy/5 cây trong ống nhựa trắng

x 1 lần lặp.

Đối với một số loài sâu hại khác nhƣ rệp sáp (Paracoccus marginatus), bọ

phấn (Aleurodicus dispersus): Rệp sáp và bọ phấn đƣợc thu thập trực tiếp trên

cây sắn nhiễm bệnh chổi phù thuỷ ngoài đồng đƣợc thả trực tiếp lên cây sắn non

(cây có 7 - 10 lá thật). Dùng bút lông có thấm nƣớc nhẹ nhàng chuyển toàn bộ số

lƣợng rệp sáp, bọ phấn thu đƣợc lên cây thí nghiệm. Năm 2011, thả 20 cá thể rệp

sáp hoặc bọ phấn/1 cây x 3 lần lặp. Năm 2012, thả 20 cá thể rệp sáp hoặc bọ

phấn/5 cây x 3 lần lặp. Năm 2013, thả 15 cá thể rệp sáp hoặc bọ phấn/7 cây x 1

lần lặ và 35 cá thể/5 cây x 1 lần lặp.

Cây thí nghiệm chậu vại đƣợc đặt trong nhà lƣới cách ly côn trùng. Theo

dõi sự biến đổi trên cây và tính tỷ lệ cây nhiễm bệnh bằng triệu chứng (%) sau 9 -

12 tháng và kiểm tra một số mẫu đại diện bằng kỹ thuật PCR lồng sử dụng cặp

mồi phát hiện phytoplasma hại sắn.

3.4. PHƢƠNG PHÁP TÍNH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

- Tỷ lệ cây sắn nhiễm bệnh chổi phù thuỷ (%) đƣợc tính theo công thức:

Tỷ lệ bệnh (%) =

Trong đó: a: Tổng số cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ.

b: Tổng số cây sắn điều tra/thí nghiệm.

- Tính hệ số tƣơng đồng (F) cho từng cặp mẫu phytoplasma đƣợc tính theo

công thức của Nei and Li (1979):

Trong đó:

Nxy: số băng DNA chung có ở cả hai mẫu x và y,

Nx: số băng DNA của mẫu x,

Ny: số băng DNA của mẫu y.

Số liệu thu thập đƣợc xử lý trong Microsoft Office Excel. Số liệu thí

nghiệm đƣợc tính toán, xử lý thống kê theo phƣơng pháp phân tích phƣơng sai

bằng chƣơng trình IRRISTAT 4.0.

Phƣơng sai mẫu tính theo công thức:

Giới hạn sai khác có ý nghĩa nhỏ nhất đƣợc tính theo công thức:

LSD = t x sd

Trong đó:

t: giá trị t lý thuyết,  = 0,05.

: sai số chuẩn (sai số trung bình).

r: số lần nhắc lại,

MSE: bình phƣơng trung bình của sai số.

PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1. MÔ TẢ TRIỆU CHỨNG VÀ ĐIỀU TRA MỨC ĐỘ PHỔ BIẾN CỦA BỆNH CHỔI PHÙ THUỶ HẠI SẮN

4.1.1. Mô tả triệu chứng bệnh

Trong nghiên cứu bệnh hại, việc quan sát, mô tả triệu chứng bệnh trên đồng

là điều cần thiết. Kết quả điều tra cho thấy, cây sắn (M. esculenta) bị bệnh chổi

phù thuỷ đƣợc quan sát thấy có biểu hiện triệu chứng đặc trƣng do bệnh

phytoplasma gây ra ở các giai đoạn sinh trƣởng phát triển nhƣ sau:

Giai đoạn trồng - cây con: Cây nhiễm bệnh ở giai đoạn này sinh trƣởng

kém, cây còi cọc, lá nhỏ lại, lá biến màu vàng, phía trong vỏ thân có các vết hoại

màu nâu, phần lõi có màu nâu nhạt, chồi bị chết khô, lá biến vàng rụng xuống,

nhiều cây bị thấp lùn lại so với cây không bị nhiễm bệnh. Cây sinh trƣởng kém

có thể dẫn đến bị chết toàn cây (hình 4.1A).

Giai đoạn phát triển thân lá - củ: Cây nhiễm bệnh ở giai đoạn này thƣờng

không biểu hiện triệu chứng đặc trƣng của bệnh chổi phù thuỷ. Trong một số

trƣờng hợp, mặc dù trên cùng một hom giống, có nhánh bị nhiễm bệnh thì dần

tàn lụi đi do đã nhiễm bệnh từ giai đoạn cây con nhƣng cũng có nhánh lại phát

triển bình thƣờng, không biểu hiện rõ triệu chứng ra bên ngoài mặc dù đã nhiễm

bệnh ở dạng tiềm ẩn. Cây nhiễm bệnh ở giai đoạn này vẫn cho thu hoạch củ

nhƣng có thể năng suất và chất lƣợng thấp hơn so với cây không bị nhiễm bệnh

(hình 4.1B).

Giai đoạn chờ thu hoạch - thu hoạch: Triệu chứng của cây nhiễm bệnh ở

giai đoạn này biểu hiện rất đặc trƣng và dễ quan sát thấy nhƣ cây mọc nhiều chồi

ở phần thân chính 1/3 chiều cao cây từ phía ngọn trở xuống, lá cây nhỏ lại, biến

màu vàng hoặc tím nhạt và thô cứng, đốt thân ngắn lại, ở nhiều cây thấy phía

trong vỏ thân hoặc vỏ củ sắn có các vết hoại màu nâu, phần lõi có màu nâu nhạt,

chồi bị chết khô, lá biến vàng rụng xuống. Năng suất thân lá, năng suất củ tƣơi và

năng suất tinh bột của cây nhiễm bệnh đều sai khác có ý nghĩa thống kê so với

cây không bị nhiễm bệnh (hình 4.1C-F).

Hình 4.1. Triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ hại sắn trên đồng

A) Giai đoạn cây con; B) Giai đoạn phát triển thân lá; C) và D) Giai đoạn chờ thu hoạch; E) Thân cây bị bệnh chổi phù thuỷ có màu thâm nâu so với thân cây khỏe; F) Củ cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ có màu thâm nâu so với củ cây khỏe.

Kết quả điều tra đƣợc thực hiện từ năm 2011 - 2013 cho thấy, bệnh chổi phù thuỷ gây hại trên nhiều giống sắn khác nhau nhƣ KM94, KM140, KM419,

v.v…. tại các vùng trồng sắn thuộc Đông Nam Bộ bao gồm các tỉnh Bà Rịa-

Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dƣơng, Bình Phƣớc và Tây Ninh. Loại hình triệu

chứng bệnh chổi phù thuỷ gây hại trên cây sắn là giống nhau tại các điểm điều tra.

Triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ gây hại trên cây sắn Việt Nam cũng gần

giống với triệu chứng đã đƣợc mô tả bởi các tác giả khác (Davis et al., 2005;

Arocha et al., 2009a, 2009b) với cây sắn có biểu hiện triệu chứng bệnh nhƣ mọc nhiều chồi phụ ở thân chính, lá biến vàng, lá co nhỏ và cây còi cọc đƣợc thu thập

ở Wallis-Futuna, Uganda và Cuba nhƣng khác hẳn khi so sánh với triệu chứng đã

đƣợc mô tả của bệnh da cóc hại sắn, bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại một số nƣớc thuộc Nam Mỹ (Alvarez et al., 2009; Flôres et al., 2013; Souza et al., 2014;

Oliveira et al., 2014).

4.1.2. Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn

Bệnh chổi phù thuỷ gây hại trên cây sắn là loại bệnh mới xuất hiện ở Việt

Nam, nhƣng rất nguy hiểm bởi tốc độ lây lan nhanh, mức độ gây hại trầm trọng,

hơn nữa những hiểu biết về bệnh lý học chƣa nhiều. Điều tra mức độ phổ biến

của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn đƣợc thực hiện trong năm 2011 tại một số tỉnh

(bảng 4.1).

Bảng 4.1. Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại các điểm điều tra ở một số tỉnh (năm 2011)

STT Địa điểm điều tra Tên giống

Giai đoạn sinh trƣởng phát triển Tỷ lệ bệnh (%) (huyện, tỉnh)*

1 Trảng Bom, Đồng Nai KM94 Chờ thu hoạch 18,0

2 Trảng Bom, Đồng Nai KM140 Chờ thu hoạch 22,0

3 TP. Kon Tum, Kon Tum KM94 Chờ thu hoạch 12,1

4 Kon Rẫy, Kon Tum KM94 Chờ thu hoạch 29,4

5 Sơn Hà, Quảng Ngãi KM94 Chờ thu hoạch 5,7

6 Đồng Phú, Bình Phƣớc KM60 Phát triển thân lá 10,8

7 Trảng Bom, Đồng Nai KM60 Phát triển thân lá 12,2

Ghi chú: * Điều tra trên 3 cánh đồng khác nhau tại mỗi địa điểm.

8 Trảng Bom, Đồng Nai KM419 Cây con 60,2

Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn với triệu chứng đặc trƣng đƣợc phát hiện thấy trên nhiều giống sắn khác nhau, không chỉ riêng giống sắn KM94 hiện đang đƣợc

trồng phổ biến ở các tỉnh phía Nam, bệnh còn xuất hiện gây hại trên các giống

sắn trồng khác nhau nhƣ KM60, KM140 và KM419. Bệnh chổi phù thuỷ gây hại

ở các giai đoạn sinh trƣởng phát triển của cây sắn từ giai đoạn cây con đến giai đoạn chờ thu hoạch. Tỷ lệ cây nhiễm bệnh chổi phù thuỷ ở giai đoạn chờ thu

hoạch thấp nhất trên giống sắn KM94 (5,7%) tại huyện Sơn Hà, tỉnh Quảng Ngãi và tỷ lệ bệnh chổi phù thuỷ trên giống sắn KM419 ở giai đoạn cây con tại huyện

Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai lên tới 60,2%.

4.2. PHÁT HIỆN PHYTOPLASMA HẠI SẮN BẰNG KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ, NHUỘM MÔ VÀ PCR

Hiện tƣợng chổi phù thuỷ trên cây trồng, mặc dù đƣợc xem là một trong các triệu chứng chính gây ra bởi phytoplasma, cũng có thể đƣợc tạo ra bởi nhiều

nguyên nhân, cả sinh vật và phi sinh vật. Thuốc trừ cỏ glyphosate có thể tạo triệu

chứng chổi phù thuỷ trên cây cà phê (Nelson, 2008). Một số nấm, chẳng hạn nấm

đảm Moniliophthora perniciosa (Crinipellis perniciosa) gây bệnh chổi phù thuỷ

trên cây ca cao (Rincones et al., 2003; Aime and Phillips-Mora, 2005; Mondego

et al., 2008; Souza et al., 2009). Đặc biệt, nhóm nhện nhỏ eryophyid cũng

thƣờng gây bệnh chổi phù thuỷ trên nhiều loại cây trồng (Keifer et al., 1982).

Mục tiêu của phần nghiên cứu này là ứng dụng các kỹ thuật chẩn đoán

truyền thống và hiện đại để xác định chính xác nguyên nhân phytoplasma gây

bệnh chổi phù thuỷ trên cây sắn tại Đông Nam Bộ.

4.2.1. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử

Phytoplasma gây bệnh cây đƣợc chẩn đoán bằng phân tích triệu chứng

bệnh, hay bằng cây chỉ thị với phƣơng pháp ghép. Sử dụng kính hiển vi điện tử

truyền qua để phát hiện phytoplasma đã đƣợc áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu

phytoplasma gây bệnh cây tại nhiều nƣớc trên thế giới. Bằng kỹ thuật nhuộm âm

bản hoặc lát cắt siêu mỏng và soi dƣới kính hiển vi điện tử có thể nhận dạng hình

thái, kích thƣớc siêu cấu trúc của phytoplasma. Đây có thể coi là phƣơng pháp hỗ

trợ, định hƣớng cho các kỹ thuật khác nhƣ PCR, real-time PCR,... nhằm xác định

chính xác tác nhân gây bệnh. Mặc dù phƣơng pháp kính hiển vi điện tử có ƣu

điểm, tuy nhiên, phƣơng pháp này thƣờng không phổ biến sử dụng cho các loại

cây trồng ít có ý nghĩa kinh tế, hơn nữa, phƣơng pháp này đòi hỏi phải có trang

thiết bị đắt tiền, chi phí còn cao, đối với mẫu bệnh thực vật thì cần phải còn tƣơi,

gây khó khăn trong lúc vận chuyển ở khoảng cách xa.

Việc sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua đƣợc thực hiện vào hai đợt

trong năm 2011 nhằm phát hiện phytoplasma trên cây sắn bị nhiễm bệnh chổi

phù thuỷ tại vùng Đông Nam Bộ. Đợt 1 (tháng 4 năm 2011) thử nghiệm 3 mẫu

cây sắn giống KM94 bị bệnh chổi phù thuỷ đƣợc thu thập trên đồng và 1 mẫu cây sắn khỏe. Đợt 2 (tháng 11 năm 2011) thử nghiệm 2 mẫu cây sắn giống KM94 bị

bệnh chổi phù thuỷ đƣợc thu thập trên đồng và 1 mẫu cây sắn khỏe.

Kết quả thí nghiệm của cả 2 đợt đƣợc trình bày ở bảng 4.2.

Bảng 4.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử

STT Bộ phận kiểm tra Địa điểm thu thập Kết quả

(huyện, tỉnh) hiển vi điện tử

Gân lá cây bệnh Tân Thành, Bà Rịa - Vũng Tàu 1 +

(đợt 1; tháng 4)

2 Gân lá cây bệnh Thống Nhất, Đồng Nai +

(đợt 1; tháng 4)

3 Gân lá cây bệnh Trảng Bom, Đồng Nai +

(đợt 1; tháng 4)

4 Gân lá cây khỏe Trảng Bom, Đồng Nai 

(đợt 1; tháng 4)

5 Gân lá cây bệnh Trảng Bom, Đồng Nai +

(đợt 2; tháng 11)

6 Gân lá cây bệnh Trảng Bom, Đồng Nai +

(đợt 2; tháng 11)

7 Gân lá cây khỏe Trảng Bom, Đồng Nai 

Ghi chú: (+) có phytoplasma; () không có phytoplasma.

Kết quả kính hiển vi điện tử vào đợt 1 (tháng 4 năm 2011) chỉ quan sát, phát hiện đƣợc các thể phytoplasma với dạng hình tròn, hình ovan với kích thƣớc từ 108 - 199 nm trong tế bào tế bào ống rây của mạch phloem cây sắn biểu hiện triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ nhƣng không thấy sự hiện diện của chúng trong tế bào ống rây của mạch phloem cây sắn không bị bệnh. Ngoài ra, không phát

hiện thấy tác nhân gây bệnh nào khác trong tế bào ống rây của mạch phloem cây

sắn bị bệnh chổi phù thuỷ và cây không bị bệnh (hình 4.2).

(đợt 2; tháng 11)

Hình 4.2. Xác định phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử (đợt 1, năm 2011)

A) Mẫu cây sắn dùng trong phân tích bằng kính hiển vi điện tử; B) Thể phytoplasma trong tế bào ống rây của mạch phloem cây sắn nhiễm bệnh chổi phù thuỷ (độ phóng đại 25.000 lần). Thanh bar: 500 nm.

Hình 4.3. Xác định phyttoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử (đợt 2, năm 2011)

A) Thể phytoplasma (mũi tên) đƣợc tìm thấy trong tế bào ống rây của mạch phloem cây sắn nhiễm bệnh chổi phù thuỷ; B) cây sắn khỏe. Thanh bar: 500 nm

Kết quả kính hiển vi điện tử vào đợt 2 (tháng 11 năm 2011) cũng chỉ phát hiện các thể phytoplasma với dạng hình tròn, hình ovan trong tế bào ống rây của mạch phloem và cũng không phát hiện thấy tác nhân gây bệnh nào khác (hình 4.3). Kết quả kính hiển vi điện tử của hai đợt thí nghiệm đều cho kết quả tƣơng

tự nhau và chỉ phát hiện thấy thể phytoplasma trên cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ.

Tại Việt Nam, phƣơng pháp kính hiển vi điện tử cũng đã đƣợc sử dụng để xác định phytoplasma gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau (Vũ Triệu

Mân, 2002; Nguyễn Đức Thành và cs., 2012; Hoat et al., 2012). Phytoplasma gây bệnh cây thông thƣờng có hình dạng bên ngoài không cố định. Khi quan sát

dƣới kính hiển vi điện tử, phytoplasma có hình bầu dục, hình ovan, hình tròn,

dạng hình sợi ngắn, đôi khi ở dạng không định hình, và thông thƣờng có kích

thƣớc đƣờng kính nhỏ hơn 1 µm (Bertaccini and Duduk, 2009). Trên thế giới, phƣơng pháp kính hiển vi điện tử đƣợc sử dụng để xác định phytoplasma gây hại

trên nhiều loại cây trồng khác nhau (Al-Awadhi et al., 2002; Devonshire, 2013).

So sánh với các kết quả đã công bố cho thấy, các thể phytoplasma trong mô cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ tại Việt Nam cũng giống với các mô tả trƣớc đó.

Phƣơng pháp kính hiển vi điện tử đã xác định sự có mặt của phytoplasma trong tế

bào ống rây của mạch phloem cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ tại các tỉnh

Bà Rịa - Vũng Tàu và Đồng Nai thuộc Đông Nam Bộ.

4.2.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô

Xác định tác nhân gây bệnh là phytoplasma có nhiều phƣơng pháp khác

nhau, trong đó có kỹ thuật nhuộm mô cây bằng 4‟,6-diamidino-2-phenylindole

dihydrochloride (DAPI) (Arismendi et al., 2010; Andrade and Arismendi, 2013).

Kỹ thuật nhuộm mô bằng DAPI đƣợc thực hiện vào tháng 02 năm 2014 dựa theo

tài liệu mô tả của (Andrade and Arismendi, 2013) nhằm phát hiện phytoplasma

trên giống sắn KM94 bị bệnh chổi phù thuỷ (4 mẫu) và giống sắn KM94 không

bị bệnh (4 mẫu) thu thập trên đồng tại tỉnh Đồng Nai. Nhuộm mẫu cắt bằng dung

dịch DAPI (nồng độ 1µg/1 ml), quan sát dƣới kính huỳnh quang và chụp ảnh

mẫu phân tích bằng Remote Capture DC (Canon, Nhật Bản). Kết quả thí nghiệm

đƣợc trình bày ở bảng 4.3 và hình 4.4.

Bảng 4.3. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm DAPI (năm 2014)

STT Bộ phận kiểm tra Tên bệnh cây ký chủ Kết quả nhuộm DAPI

1 2 Gân lá - cây bệnh 1 Gân lá - cây bệnh 2 Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn + +

3 4 Gân lá - cây bệnh 3 Vỏ củ - cây bệnh 1 Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn 

5 Gân lá - cây khỏe 1 Cây sắn không bị bệnh 

6 Gân lá - cây khỏe 2 Cây sắn không bị bệnh 

7 Gân lá - cây khỏe 3 Cây sắn không bị bệnh 

Ghi chú: (+) có phytoplasma; () không có phytoplasma.

8 Vỏ củ - cây khỏe 1 Cây sắn không bị bệnh 

Hình 4.4. Kết quả thí nghiệm nhuộm DAPI

A) Gân lá cây sắn khỏe; B) Thể phytoplasma trong gân lá cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ (mũi tên màu trắng). Quan sát dƣới vật kính 100x. C) Cuống lá cây Ugni monilae khỏe; D) Thể phytoplasma trong cuống lá cây U. monilae bị bệnh (mũi tên màu trắng)

mạch phloem gân lá cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ (hình 4.4-B), còn trong tế bào ống rây của mạch phloem gân lá cây sắn khỏe thì không phát hiện thấy (hình 4.4- A). Kết quả nghiên cứu này cũng giống với kết quả nghiên cứu của Arismendi et al. (2010) đã đƣợc công bố trƣớc đó, khi tác giả dùng kỹ thuật nhuộm mô bằng DAPI để phát hiện phytoplasma trên cây U. monilae bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ

(hình 4.4-D) tại vùng Valdivia, Chi-lê. Trong kỹ thuật nhuộm mô bằng DAPI, các mô nhƣ xylem và nhu mô ruột sẽ bắt màu xanh của thuốc nhuộm, còn thể

Nguồn ảnh (C) và (D): Arismendi et al. (2010) Kết quả thí nghiệm nhuộm DAPI cho thấy khi quan sát dƣới kính huỳnh quang ở vật kính 100x, thể phytoplasma màu đỏ nhạt trong tế bào ống rây của

phytoplasma sẽ bắt màu hồng hoặc đỏ nhạt nằm trong mạch phloem của cây

nhiễm bệnh (Arismendi et al., 2010; Andrade and Arismendi, 2013).

Kết quả thí nghiệm nhuộm mô cây bằng kỹ thuật DAPI đã phát hiện đƣợc

các thể phytoplasma trong mẫu cây bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ nhƣng không phát hiện thấy trên mẫu cây khỏe. Kỹ thuật này dễ áp dụng, thực hiện đơn giản

và ít tốn kém, tuy nhiên kỹ thuật nhuộm DAPI không định danh đƣợc tác nhân

gây bệnh là phytoplasma, để biết chính xác cây sắn có bị nhiễm phytoplasma hay

không thì cần phải kiểm tra bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự.

4.2.3. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR

4.2.3.1. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR lồng với cặp mồi

R16F2n/R16R2

Cùng với phƣơng pháp kính hiển vi điện tử và nhuộm DAPI, phản ứng PCR

cũng đƣợc thực hiện để phát hiện phytoplasma trên cây sắn bị bệnh chổi

phù thuỷ. Trong giai đoạn đầu của đề tài, phản ứng PCR sử dụng 7 tổ hợp mồi

(cặp mồi) bao gồm P1/P7, SN910601/SN011119, Phy1F/P7, Ph1F/Spacer1R,

Ph1F/Spacer2, Phy1F/SN011119 và P1/SN011119 đã đƣợc thực hiện nhằm phát

hiện phytoplasma trên cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ thu tại Đông Nam Bộ và

một số tỉnh khác. Tuy nhiên, tất cả 7 tổ hợp mồi này đều không tạo sản phẩm

PCR có kích thƣớc mong muốn trên cây sắn. Đáng chú ý, các tổ hợp mồi

SN910601/SN011119, Phy1F/P7 và Ph1F/Spacer2R có tạo ra các vạch băng có

kích thƣớc mong muốn (~ 1,67 kb; ~ 1,8 kb) đối với một số mẫu, bao gồm mẫu

cây đậu tƣơng bị bệnh chổi phù thuỷ, mẫu mía bị bệnh vàng lá và bệnh trắng lá

thu thập tại vùng Đông Nam Bộ (phụ lục 3). Giải trình tự các băng 1,67 kb; 1,8

kb này về sau đã chứng tỏ chúng đƣợc nhân lên từ gen mã hóa 16S RNA

ribosome của phytoplasma. Kết quả kiểm tra PCR với mẫu sắn bệnh và các mẫu

tham khảo có thể giải thích đƣợc lý do tại sao các phản ứng PCR dùng các cặp mồi trên không thể phát hiện đƣợc phytoplasma trên sắn. Lý do có thể gồm: (i)

kích thƣớc sản phẩm PCR của các tổ hợp mồi này đều khá lớn (xấp xỉ từ 1,6 đến 1,8 kb) nên phản ứng PCR khó thực hiện, (ii) hàm lƣợng phytoplasma trong cây sắn bệnh có thể thấp tới mức vƣợt quá khả năng phát hiện bằng PCR.

Để tăng khả năng phát hiện phytoplasma trên sắn bằng PCR, phản ứng PCR lồng (nested PCR) đƣợc áp dụng. Phản ứng PCR lồng đƣợc thực hiện với các mồi đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay trên thế giới nhằm phát hiện phytoplasma,

bao gồm P1 (Deng and Hiruki, 1991), P7 (Schneider et al., 1995), R16F2n, R16R2, R16mF2 và R16mR1 (Gundersen and Lee, 1996). Vị trí các mồi này

đƣợc trình bày ở hình 3.1. Đầu tiên, phản ứng PCR lồng đƣợc thực hiện dùng 2

tổ hợp mồi là P1/P7 (bƣớc 1) và R16F2n/R16R2 (bƣớc 2). Tổng hợp kết quả

kiểm tra PCR dùng 2 tổ hợp mồi này đƣợc trình bày ở bảng 4.4 và hình 4.5.

Bảng 4.4. Kết quả PCR phát hiện phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7-R16F2n/R16R2

STT Mẫu thử*

Địa điểm thu mẫu

Năm

Bộ phận

Kết quả

PCR

(xã, huyện, tỉnh)

thu thập

kiểm tra

BRVT-01

Tóc Tiên, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu

Gân lá

2011

BRVT-02

Tóc Tiên, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu

Gân lá

2011

BRVT-03

Tóc Tiên, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu

Gân lá

2011

BRVT-04

Tóc Tiên, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu

Gân lá

2011

QNg-01

Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi

Gân lá

2011

QNg-02

Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi

Gân lá

2011

QNg-03

Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi

Gân lá

2011

QNg-04

Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi

Gân lá

2011

ĐN-01

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

Gân lá

2011

10 ĐN-02

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

Gân lá

2011

11 ĐN-03

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

Gân lá

2011

12 ĐN-04

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

Gân lá

2011

13 KT-01

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum

Gân lá

2011

14 KT-02

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum

Gân lá

2011

–

15 KT-03

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum

Gân lá

2011

16 KT-04

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum

Gân lá

2011

–

17 ĐN-04

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

Gân lá

2011

Sắn khỏe

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

Gân lá

2011

–

BD-01.09 Bình Dƣơng

Không rõ

2009

–

BD-02.09 Bình Dƣơng

Không rõ

2009

–

BR-5

Châu Pha, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu

Gân lá

2011

BR-7.2

Bình Ba, Châu Đức, Bà Rịa-Vũng Tàu

Gân lá

2011

BR-9.1

Suối Nghệ, Châu Đức, Bà Rịa-Vũng Tàu

Gân lá

2011

24 H2T-1

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

Vỏ thân chính

–

25 H2T-2

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Lõi thân chính

–

26 ĐN-04.2

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Vỏ củ

–

STT Mẫu thử*

Địa điểm thu mẫu

Năm

Bộ phận

Kết quả

PCR

(xã, huyện, tỉnh)

thu thập

kiểm tra

27 ĐN-05.1

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Lõi thân chính

–

28 ĐN-05.2

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Vỏ củ

–

29 ĐN-06

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Vỏ thân chính

–

30 ĐN-07

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Gân lá

31 ĐN-08

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Gân lá

32 ĐN-09

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Gân lá

–

33 ĐN-10

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Gân lá

34 ĐN-11

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Gân lá

35 ĐN-12

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Gân lá

36 ĐN-13

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Vỏ củ

–

37 ĐN-14

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Vỏ củ

–

38 ĐN-15

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Lõi củ

–

39 KT-12.1

Đăk Bla, TP. Kon Tum, Kon Tum

2011

Gân lá

40 KT-12.2

Đăk Bla, TP. Kon Tum, Kon Tum

2011

Gân lá

–

41 KT-13.1

Đăk Bla, TP. Kon Tum, Kon Tum

2011

Gân lá

42 KT-13.2

Đăk Bla, TP. Kon Tum, Kon Tum

2011

Gân lá

2011

–

43 KT-13.3

Đăk Bla, TP. Kon Tum, Kon Tum

Lá ngọn

44 KT-13.4

Đăk Bla, TP. Kon Tum, Kon Tum

2011

Vỏ củ

–

45 KT-17

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum

2011

Gân lá

46 QNg-19(2) Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi

2011

Gân lá

47 QNg-02.1

Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi

2011

Vỏ củ

–

48 QNg-04.1

Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi

2011

Vỏ củ

–

49 YB-01

Mậu A, Văn Yên, Yên Bái

2011

Gân lá

50 YB-02

Mậu A, Văn Yên, Yên Bái

2011

Gân lá

51 ĐN-34

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2012

Gân lá

52 ĐN-35

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2012

Gân lá

BD-01

Phú An, Bến Cát, Bình Dƣơng

2012

Gân lá

–

BD-02

Phú An, Bến Cát, Bình Dƣơng

2012

Gân lá

–

BP-01

Đồng Phú, Bình Phƣớc

2012

Gân lá

BP-02

Đồng Phú, Bình Phƣớc

2012

Gân lá

BP-03

Đồng Phú, Bình Phƣớc

2012

Gân lá

Cổ Tiết, Tam Nông, Phú Thọ

Gân lá

2012

PhT-01 Ghi chú: * Tên viết tắt và nguồn gốc các mẫu thử nghiệm đƣợc chỉ rõ ở phần phụ lục 2; (–) là phản ứng PCR âm tính; (+) là phản ứng PCR dƣơng tính.

Hình 4.5. Minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR lồng dùng 2 cặp mồi P1/P7-R16F2n/R16R2

M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ 1 đến 18: các mẫu thử nghiệm ở bảng 4.4; Kích thƣớc sản phẩm đƣợc chỉ rõ bằng mũi tên.

Kết quả kiểm tra PCR lồng dùng hai cặp mồi P1/P7 - R16F2n/R16R2 cho thấy, có 35/57 (61,4%) mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ thu tại 7 tỉnh gồm Bà Rịa -

Vũng Tàu, Quảng Ngãi, Đồng Nai, Kon Tum, Bình Phƣớc, Phú Thọ và Yên Bái

đều tạo sản phẩm PCR với kích thƣớc mong muốn ~1,2 kb. Các mẫu thử này đều

là gân lá của cây sắn nhiễm bệnh, trong khi đó, các mẫu thử là lõi thân chính, vỏ

thân chính, vỏ củ và lá ngọn của cây sắn nhiễm bệnh đều không tạo sản phẩm

PCR trên bản điện di (22/57 mẫu thử, chiếm 38,6%).

4.2.3.2. Phát hiện phytoplasma bằng kỹ thuật PCR lồng với cặp mồi

R16mF2/R16mR1

Một thí nghiệm PCR lồng bổ sung nhằm phát hiện phytoplasma trên các

mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ đƣợc thu thập tại một số tỉnh khác nhau trong đó

có các tỉnh thuộc Đông Nam Bộ. Phản ứng PCR lồng đƣợc thực hiện dùng 2 tổ

hợp mồi là P1/P7 (bƣớc 1) và R16mF2/R16mR1 (bƣớc 2) cũng đƣợc sử dụng

nhằm phát hiện phytoplasma gây hại trên cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ (bảng

4.5). Hai cặp mồi này đã đƣợc sử dụng để phát hiện phytoplasma trên một số cây

trồng, trong đó có phytoplasma hại sắn (Alvarez et al., 2009).

Kết quả kiểm tra PCR lồng dùng hai cặp mồi P1/P7 - R16mF2/R16mR1 trên 26 mẫu sắn bệnh cho thấy 20/26 (76,9%) mẫu thử đã tạo sản phẩm PCR với kích thƣớc mong muốn ~1,4 kb. Cần chú ý là có 14 mẫu kiểm tra trong thí

nghiệm này (gồm các mẫu: BRVT-01, BRVT-02, BRVT-03, QNg-01, QNg-02,

QNg-03, ĐN-01, ĐN-02, ĐN-03, KT-01, KT-02, KT-03, YB-01 và YB-02) đều

là các mẫu đã đƣợc kiểm tra với 2 cặp mồi P1/P7-R16F2n/R16R2 ở trên.

Bảng 4.5. Kết quả PCR phát hiện phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7 - R16mF2/R16mR1

STT Mẫu thử*

Địa điểm thu thập

Năm

Bộ phận

Kết quả

(xã, huyện, tỉnh)

thu thập

kiểm tra

PCR

BRVT-01 Tóc Tiên, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu

2011

Gân lá

BRVT-02 Tóc Tiên, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu

2011

Gân lá

BRVT-03 Tóc Tiên, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu

2011

Gân lá

QNg-01

Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi

2011

Gân lá

QNg-02

Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi

2011

Gân lá

–

QNg-03

Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi

2011

Gân lá

ĐN-01

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Gân lá

ĐN-02

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Gân lá

ĐN-03

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Gân lá

–

10 KT-01

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum

2011

Gân lá

–

11 KT-02

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum

2011

Gân lá

12 KT-03

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum

2011

Gân lá

13 YB-01

Mậu A, Văn Yên, Yên Bái

2011

Gân lá

14 YB-02

Mậu A, Văn Yên, Yên Bái

2011

Gân lá

Sắn khỏe Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

2011

Gân lá

–

T7-ĐN

Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai

2013

Gân lá

T8-ĐN

Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai

2013

Gân lá

T14-ĐN

Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai

2013

Gân lá

T15-ĐN

Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai

2013

Gân lá

T20-ĐN

Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai

2013

Gân lá

–

T11-QNg Quảng Ngãi

Không rõ Không rõ

T17-BD

Phú An, Bến Cát, Bình Dƣơng

2012

Gân lá

–

T18-TN

Tân Hội, Tân Châu, Tây Ninh

2013

Gân lá

T19-BRVT Bà Rịa-Vùng Tàu

Không rõ Không rõ

TN-01

Tân Hội, Tân Châu, Tây Ninh

2013

Gân lá

TN-02

Tân Hội, Tân Châu, Tây Ninh

2013

Gân lá

–

TN-03

Tân Hội, Tân Châu, Tây Ninh

2013

Gân lá

Ghi chú: * Tên viết tắt và nguồn gốc các mẫu thử nghiệm đƣợc chỉ rõ ở phần phụ lục 2; (–) là phản ứng PCR âm tính; (+) là phản ứng PCR dƣơng tính.

M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ 1 đến 14: các mẫu thử nghiệm ở bảng 4.5; Kích thƣớc sản phẩm đƣợc chỉ rõ bằng mũi tên.

Khi so sánh khả năng phát hiện phytoplasma của 2 thí nghiệm cho thấy tổ

hợp 2 cặp mồi P1/P7 - R16mF2/R16mR1 phát hiện đƣợc phytoplasma ở mẫu

KT-02 nhƣng lại không phát hiện đƣợc phytoplasma ở mẫu QNg-02, ĐN-03 và

KT-01 (bảng 4.5), trong khi cả 3 mẫu này đều dƣơng tính với tổ hợp 2 cặp mồi

P1/P7 - R16F2n/R16R2 (bảng 4.4). Kết quả này gợi ý đã có sự sai khác về trình

tự gen của các phytoplasma nhiễm trên 4 mẫu sẵn QNg-2, ĐN-03, KT-01 và KT-

02, ít nhất tại các vị trí tƣơng ứng với 4 mồi R16F2n, R16R2, R16mF2, R16mR1.

Phytoplasma là tác nhân gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác nhau.

Phát hiện tác nhân gây bệnh là phytoplasma cần nhiều cách khác nhau, nhƣ việc

quan sát, mô tả ban đầu về triệu chứng bệnh trên đồng là điều cần thiết. Các kỹ

thuật khác nhƣ nhuộm DAPI, kính hiển vi điện tử đƣợc coi là phƣơng pháp

nhanh và chính xác để định vị phytoplasma trong tế bào ống rây của mạch

phloem cây bệnh. Cùng với các phƣơng pháp truyền thống ở trên thì PCR, đặc

biệt là PCR lồng, đƣợc xem là công cụ rất hiệu quả, đƣợc áp dụng phổ biến trên

thế giới để phát hiện phytoplasma trong cây bệnh.

Nghiên cứu của phần này, dựa trên cả các kỹ thuật chẩn đoán truyền thống

cũng nhƣ PCR, đã lần đầu tiên xác định đƣợc sự có mặt của phytoplasma trong

cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ ở Việt Nam, đặc biệt ở vùng trồng sắn trọng điểm

bị dịch bệnh chổi phù thuỷ tại Đông Nam Bộ. Kết quả kiểm tra PCR cũng gợi ý

có sự đa dạng về trình tự gen mã hóa 16S RNA ribosome của các phytoplasma

nhiễm trên các mẫu này.

Hình 4.6. Minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR lồng dùng 2 cặp mồi P1/P7-R16mF2/R16mR1

4.3. ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHYTOPLASMA

HẠI SẮN

4.3.1. Kết quả định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR

Kết quả kính hiển vi điện tử, nhuộm DAPI, PCR đã cho thấy sự có mặt của

phytoplasma trên cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ. Tuy nhiên, để xác định

chính xác danh tính của phytoplasma, cần phải phân tích sản phẩm PCR thu

đƣợc. Ngoài ra, trong một số trƣờng hợp, đặc biệt đối với phytoplasma, phản ứng

PCR có thể tạo ra các phản ứng dƣơng tính giả vì các mồi trên có khả năng nhân

các gen 16S RNA ribosome của vi khuẩn nhiễm tạp trong mẫu chiết DNA bao

gồm vi khuẩn cộng sinh, vi khuẩn gây bệnh cây, hoặc nhân các gen ty thể hoặc

lục lạp của cây (vốn có nguồn gốc là từ vi khuẩn nội sinh). Tác giả Wally et al.

(2008) cho biết, khi kiểm tra PCR phát hiện phytoplasma từ 900 mẫu cây cà rốt

và gần 2.000 mẫu rầy thì có tới 30% các phản ứng PCR tạo phản ứng dƣơng tính

giả. Do đó, để xác định phytoplasma bằng PCR với các cặp mồi chung thì cần

phải tiến hành giải trình tự để có kết luận chính xác.

Trong phần nghiên cứu này, tiến hành giải trình tự sản phẩm thu đƣợc bằng

PCR lồng dùng các cặp mồi ở bƣớc 2 là R16F2n/R16R2 hoặc R16mF2/R16mR1.

4.3.1.1. Giải trình tự sản phẩm PCR dùng cặp mồi R16F2n/R16R2

Kết quả điện di sản phẩm PCR lồng sử dụng cặp mồi ở bƣớc 2 là

R16F2n/R16R2 cho thấy các vạch băng xuất hiện rõ nét với kích thƣớc là ~ 1,2

kb. Sản phẩm PCR đƣợc làm tinh sạch từ gel agarose. Sản phẩm PCR tinh sạch

của các mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ đƣợc giải trình tự trực tiếp. Trong phần

kết quả này, chỉ trình bày các mẫu giải trình tự có chất lƣợng tốt, không bị nhiễu,

sau khi loại bỏ các đoạn có chất lƣợng xấu ở 2 đầu, 14 mẫu giải trình tự bằng cặp

mồi R16F2n/R16R2 từ cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ thu tại 6 tỉnh gồm Bà Rịa -

Vũng Tàu, Quảng Ngãi, Đồng Nai, Kon Tum, Bình Phƣớc và Yên Bái đƣợc trình

bày ở bảng 4.6.

Kết quả giải trình tự cho thấy tất cả 14 mẫu giải trình tự đều có chất lƣợng

tốt, có kích thƣớc từ 795 nts (mẫu BRVT-01) đến 1.156 nts (mẫu BP-01). Trình

tự gen 16S RNA ribosome dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 của 14 mẫu giải trình

tự này đều đƣợc đăng ký trên Ngân hàng Gen (phụ lục 1).

Bảng 4.6. Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2

STT Mẫu Địa điểm thu thập Mồi Trình tự

giải trình tự* đọc đƣợc (huyện, tỉnh)

(nts)

1 BRVT-01 Tân Thành, Bà Rịa - Vũng Tàu R16F2n 795

2 QNg-01 Sơn Hà, Quảng Ngãi R16F2n 870

3 ĐN-01 Trảng Bom, Đồng Nai R16F2n 869

4 KT-01 Kon Rẫy, Kon Tum R16F2n 798

5 KT-17 Kon Rẫy, Kon Tum R16F2n/R16R2 1.106

6 ĐN-34 Trảng Bom, Đồng Nai R16F2n/R16R2 1.105

7 BP-01 Đồng Phú, Bình Phƣớc R16F2n/R16R2 1.156

8 ĐN-02 Trảng Bom, Đồng Nai R16F2n/R16R2 1.083

9 YB-02 Văn Yên, Yên Bái R16F2n/R16R2 1.052

10 BRVT-02 Tân Thành, Bà Rịa - Vũng Tàu R16F2n/R16R2 1.114

11 QNg-19.2 Sơn Hà, Quảng Ngãi R16F2n/R16R2 1.047

12 BR-05 Tân Thành, Bà Rịa - Vũng Tàu R16F2n/R16R2 1.052

13 BR-7.2 Châu Đức, Bà Rịa - Vũng Tàu R16F2n/R16R2 1.048

* Chỉ trình bày các trình tự rõ ràng, không bị nhiễu.

Dựa trên trình tự nucleotide thu đƣợc, tiến hành tìm kiếm các chuỗi gần gũi

với 14 mẫu thu đƣợc bằng công cụ trực tuyến BLAST (bảng 4.7).

Kết quả tìm kiếm BLAST trên Ngân hàng Gen cho thấy trình tự nucleotide

từ sản phẩm PCR của cả 14 mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, BRVT-01, QNg-01,

ĐN-01, KT-01, KT-17, ĐN-34, BP-01, ĐN-02, YB-02, BRVT-02, QNg-19.2,

BR-05, BR-7.2 và BR-9.1, đƣợc nhân bằng cặp mồi R16F2n/R16R2 trong phản

ứng PCR lồng, đều là các chuỗi mã hóa ribosome RNA của phytoplasma gây

bệnh cây. Cả 14 mẫu của Việt Nam đều khá giống nhau và gần gũi nhất với các

mẫu phytoplasma gây bệnh trên cây bạch đàn, bông, cải lông, đậu rựa, dừa cạn,

gai chống, khoai tây, liễu, súp lơ, vừng ở Iran, Ấn Độ, Cuba, Trung Quốc, Ấn Độ

và Lít va.

14 BR-9.1 Châu Đức, Bà Rịa - Vũng Tàu R16F2n/R16R2 1.105

Bảng 4.7. Kết quả tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc của sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2

STT

Mẫu

Nguồn gốc (ký chủ, quốc gia)

Trình tự nucleotide gần gũi nhất trên Ngân hàng Gen*

Nhóm 16S RNA ribosome

Mã truy cập Ngân hàng Gen KC117310

Phần trăm đoạn so sánh (%) 100

Mức đồng nhất trình tự (%) 99

Cây liễu (Salix tetradenia), Trung Quốc

Cây bạch đàn (Eucalyptus sp.), Iran

KT626569

100

16SrI

BRVT-01 (Bà Rịa - Vũng Tàu) 795 nts

Cây cải lông (Eruca sativa), Iran

KT626568

100

Cây bạch đàn (Eucalyptus sp.), Iran

KT626569

100

6 7

Cây cải lông (Eruca sativa), Iran

KT626568

100

16SrI

QNg-01 (Quảng Ngãi) 870 nts

KP662136

100

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus), Trung Quốc Cây bạch đàn (Eucalyptus sp.), Iran

KT626569

100

Cây cải lông (Eruca sativa), Iran

KT626568

100

16SrI

ĐN-01 (Đồng Nai) 869 nts

KP662136

100

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus), Trung Quốc Cây bạch đàn (Eucalyptus sp.), Iran

KT626569

100

Cây cải lông (Eruca sativa), Iran

KT626568

100

16SrI

KT-01 (Kon Tum) 798 nts

KP662136

100

„Salix tetradenia‟ witches'-broom phytoplasma strain YM-3 „Eucalyptus sp.‟ little leaf phytoplasma isolate Firuzabad 5 „Eruca sativa‟ phyllody phytoplasma isolate Abarkooh 6 „Eucalyptus sp.‟ little leaf phytoplasma isolate Firuzabad 5 „Eruca sativa‟ phyllody phytoplasma isolate Abarkooh 6 Periwinkle virescence phytoplasma strain PeV-hnhk „Eucalyptus sp.‟ little leaf phytoplasma isolate Firuzabad 5 „Eruca sativa‟ phyllody phytoplasma isolate Abarkooh 6 Periwinkle virescence phytoplasma strain PeV-hnhk „Eucalyptus sp.‟ little leaf phytoplasma isolate Firuzabad 5 „Eruca sativa‟ phyllody phytoplasma isolate Abarkooh 6 Periwinkle virescence phytoplasma strain PeV-hnhk

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus), Trung Quốc

STT

Mẫu

Nguồn gốc (ký chủ, quốc gia)

Trình tự nucleotide gần gũi nhất trên Ngân hàng Gen*

Nhóm 16S RNA ribosome

Mã truy cập Ngân hàng Gen HM467914 HM449958

Phần trăm đoạn so sánh (%) 100 100

Mức đồng nhất trình tự (%) 99 99

Indian cotton little leaf phytoplasma clone CT1 Cây bông (Gossypium hirsutum), Ấn Độ Cây vừng (Sesamum indicum), Ấn Độ

16SrI

KT-17 (Kon Tum) 1.106 nts

Cây bạch đàn (Eucalyptus sp.), Iran

KT626569

100

Cây bạch đàn (Eucalyptus sp.), Iran

KT626569

100

Cây cải lông (Eruca sativa), Iran

KT626568

100

16SrI

ĐN-34 (Đồng Nai) 1.105 nts

KR232799

100

Cây đậu rựa (Canavalia ensiformis), Cuba Cây vừng (Sesamum indicum), Ấn Độ

KF728956

100

6 8

Cây bạch đàn (Eucalyptus sp.), Iran

KT626569

100

16SrI

BP-01 (Bình Phƣớc) 1.156 nts

Cây cải lông (Eruca sativa), Iran

KT626568

100

Côn trùng (Aphrodes sp.), Lít va

KC283215

100

Indian sesame phyllody phytoplasma clone SP08 „Eucalyptus sp.‟ little leaf phytoplasma isolate Firuzabad 5 „Eucalyptus sp.‟ little leaf phytoplasma isolate Firuzabad 5 „Eruca sativa‟ phyllody phytoplasma isolate Abarkooh 6 „Canavalia ensiformis‟ yellows phytoplasma isolate CYP Sesame phyllody phytoplasma isolate Gopalganj-1 „Eucalyptus sp.‟ little leaf phytoplasma isolate Firuzabad 5 „Eruca sativa‟ phyllody phytoplasma isolate Abarkooh 6 Maryland aster yellows phytoplasma strain AY1

16SrI

ĐN-02 (Đồng Nai) 1.083 nts

JX448401 JX448400 KT626569

100 100 100

99 99 99

Cây cải lông (Eruca sativa), Iran

KT626568

100

16SrI

YB-02 (Yên Bái) 1.052 nts

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus), Trung Quốc

KP662136

100

Sesame phyllody phytoplasma clone MW Cây vừng (Sesamum indicum), Ấn Độ Sesame phyllody phytoplasma clone KJ Cây vừng (Sesamum indicum), Ấn Độ Cây bạch đàn (Eucalyptus sp.), Iran „Eucalyptus sp.‟ little leaf phytoplasma isolate Firuzabad 5 „Eruca sativa‟ phyllody phytoplasma isolate Abarkooh 6 Periwinkle virescence phytoplasma strain PeV-hnhk

STT

Mẫu

Nguồn gốc (ký chủ, quốc gia)

Trình tự nucleotide gần gũi nhất trên Ngân hàng Gen*

Nhóm 16S RNA ribosome

Mã truy cập Ngân hàng Gen KM212951

Phần trăm đoạn so sánh (%) 99

Mức đồng nhất trình tự (%) 98

KJ873878

16SrII

BRVT-02 (Bà Rịa - Vũng Tàu) 1.114 nts

KC953000

KM212951

100

KJ873878

100

16SrII

QNg-19.2 (Quảng Ngãi) 1.047 nts

KC953000

100

KM212951

100

6 9

KJ873878

100

16SrII

BR-5 (Bà Rịa - Vũng Tàu) 1.052 nts

KC953000

100

KM212951

100

KJ873878

100

16SrII

BR-7.2 (Bà Rịa - Vũng Tàu) 1.048 nts

KC953000

100

KM212951

100

KJ873878

100

16SrII

KC953000

100

BR-9.1 (Bà Rịa - Vũng Tàu) 1.051 nts

Candidatus Phytoplasma australiense strain GD32 „Pedalium murex‟ phyllody phytoplasma clone PDL2 Cauliflower phyllody phytoplasma strain CauPh-YNym1 Candidatus Phytoplasma australiense strain GD32 „Pedalium murex‟ phyllody phytoplasma clone PDL2 Cauliflower phyllody phytoplasma strain CauPh-YNym1 Candidatus Phytoplasma australiense strain GD32 „Pedalium murex‟ phyllody phytoplasma clone PDL2 Cauliflower phyllody phytoplasma strain CauPh-YNym1 Candidatus Phytoplasma australiense strain GD32 „Pedalium murex‟ phyllody phytoplasma clone PDL2 Cauliflower phyllody phytoplasma strain CauPh-YNym1 Candidatus Phytoplasma australiense strain GD32 „Pedalium murex‟ phyllody phytoplasma clone PDL2 Cauliflower phyllody phytoplasma strain CauPh-YNym1

Cây khoai tây (Solanum tuberosum), Trung Quốc Cây gai chống (Pedalium murex), Ấn Độ Cây súp lơ (Brassica oleracea var. botrytis), Trung Quốc Cây khoai tây (Solanum tuberosum), Trung Quốc Cây gai chống (Pedalium murex), Ấn Độ Cây súp lơ (Brassica oleracea var. botrytis), Trung Quốc Cây khoai tây (Solanum tuberosum), Trung Quốc Cây gai chống (Pedalium murex), Ấn Độ Cây súp lơ (Brassica oleracea var. botrytis), Trung Quốc Cây khoai tây (Solanum tuberosum), Trung Quốc Cây gai chống (Pedalium murex), Ấn Độ Cây súp lơ (Brassica oleracea var. botrytis), Trung Quốc Cây khoai tây (Solanum tuberosum), Trung Quốc Cây gai chống (Pedalium murex), Ấn Độ Cây súp lơ (Brassica oleracea var. botrytis), Trung Quốc

Ghi chú: *Chỉ trình bày 03 trình tự nucleotide gần gũi nhất trên Ngân hàng Gen.

4.3.1.2. Giải trình tự sản phẩm PCR dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1

Kết quả phản ứng PCR lồng đã phát hiện thấy sự có mặt của phytoplasma

trong một mẫu cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, thu thập ở Bà Rịa-Vũng Tàu,

Quảng Ngãi, Đồng Nai, Tây Ninh và Yên Bái khi dùng với cặp mồi P1/P7 - R16mF2/R16mR1 cho thấy các vạch băng xuất hiện rõ nét trên bản điện di với

kích thƣớc là ~ 1,4 kb. Để khẳng định chắc chắn hơn, tiến hành giải trình tự trực

tiếp sản phẩm PCR dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1, chỉ trình bày các mẫu giải

trình tự có chất lƣợng tốt, không bị nhiễu, sau khi loại bỏ các đoạn có chất lƣợng

xấu ở 2 đầu. Kết quả giải trình tự đƣợc trình bày ở bảng 4.8.

Bảng 4.8. Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1

STT Mẫu Địa điểm thu thập

Mồi giải trình tự* Trình tự đọc đƣợc (huyện, tỉnh)

(nts)

1 YB-01 Văn Yên, Yên Bái R16mF2/R16mR1 1.231

T7-ĐN Thống Nhất, Đồng Nai R16mF2/R16mR1 1.340 2

T11-QNg Sơn Hà, Quảng Ngãi R16mF2/R16mR1 1.330 3

T18-TN Tân Châu, Tây Ninh R16mF2/R16mR1 1.341 4

* Chỉ trình bày các trình tự rõ ràng, không bị nhiễu.

Kết quả giải trình tự cho thấy 5 mẫu giải trình tự dùng cặp mồi

R16mF2/R16mR1 đều có chất lƣợng tốt, có kích thƣớc từ 1.231 nts (mẫu YB-01) đến 1.341 nts (mẫu T18-TN). Trình tự gen 16S RNA ribosome của 5 mẫu giải

trình tự này đều đƣợc đăng ký trên Ngân hàng Gen (phụ lục 1).

Dựa trên trình tự nucleotide thu đƣợc, tiến hành tìm kiếm các chuỗi gần gũi

với 5 mẫu thu đƣợc bằng công cụ trực tuyến BLAST (bảng 4.9).

Kết quả tìm kiếm BLAST trên Ngân hàng Gen cho thấy trình tự nucleotide

từ sản phẩm PCR của cả 5 mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ gồm YB-01, T7-ĐN,

T11-QNg, T18-TN và T19-BRVT, đƣợc nhân bằng cặp mồi R16mF2/R16mR1

trong phản ứng PCR lồng, đều là các chuỗi mã hóa 16S RNA ribosome của

phytoplasma gây bệnh cây.

T19-BRVT Tân Thành, Bà Rịa Vũng Tàu R16mF2/R16mR1 1.340 5

Bảng 4.9. Kết quả tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc của sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1

STT Mẫu Nguồn gốc (ký chủ, quốc gia) Nhóm 16S

Trình tự nucleotide gần gũi nhất trên Ngân hàng Gen*

RNA ribosome Mã truy cập Ngân hàng Gen Phần trăm đoạn so sánh (%) Mức đồng nhất trình tự (%)

KT626569 100 99

KT626568 100 99 16SrI 1 YB-01 (Yên Bái), 1.231 nts KP662136 100 99

7 1

GU113152 100 99

EU650181 100 99 16SrII 2 „Eucalyptus sp.‟ little leaf phytoplasma isolate Firuzabad 5 „Eruca sativa‟ phyllody phytoplasma isolate Abarkooh 6 Periwinkle virescence phytoplasma strain PeV-hnhk „Desmodium ovalifolium‟ witches'- broom phytoplasma strain DeOWB Crotalaria witches' - broom phytoplasma strain CrWB-Hnsy1 Cây bạch đàn (Eucalyptus sp.), Iran Cây cải lông (Eruca sativa), Iran Cây dừa cạn (Catharanthus roseus), Trung Quốc Cây hàn the (Desmodium ovalifolium), Trung Quốc Cây lục lạc (Crotalaria sp.), Trung Quốc T7-ĐN (Đồng Nai), 1.340 nts DQ452417 100 99

Sweet potato witches'-broom phytoplasma strain WPWB Cây khoai lang (Ipomoea batatas), Đài Loan

GU113152 100 100

„Desmodium ovalifolium‟ witches'- broom phytoplasma strain DeOWB Cây hàn the (Desmodium ovalifolium), Trung Quốc

DQ452417 100 100 16SrII 3

T11-QNg (Quảng Ngãi), 1.330 nts AF028813 100 100

Sweet potato witches'-broom phytoplasma strain WPWB Chinese pigeon pea witches'-broom phytoplasma Cây khoai lang (Ipomoea batatas), Đài Loan Cây đậu triều (Cajanus cajan), Hoa Kỳ

STT Mẫu Nguồn gốc (ký chủ, quốc gia) Nhóm 16S

Trình tự nucleotide gần gũi nhất trên Ngân hàng Gen* Mã truy cập Ngân hàng Phần trăm đoạn so Mức đồng nhất trình tự RNA

ribosome Gen sánh (%) (%)

GU113152 100 99

„Desmodium ovalifolium‟ witches'- broom phytoplasma strain DeOWB Cây hàn the (Desmodium ovalifolium), Trung Quốc

4 DQ452417 100 99 16SrII Sweet potato witches'-broom phytoplasma strain WPWB Cây khoai lang (Ipomoea batatas), Đài Loan

7 2

T18-TN (Tây Ninh), 1.341 nts AF028813 100 99

Chinese pigeon pea witches'-broom phytoplasma Cây đậu triều (Cajanus cajan), Hoa Kỳ

GU113152 100 99

„Desmodium ovalifolium‟ witches'- broom phytoplasma strain DeOWB Cây hàn the (Desmodium ovalifolium), Trung Quốc

EU650181 100 99 16SrII 5 Crotalaria witches'- broom phytoplasma strain CrWB-Hnsy1 Cây lục lạc (Crotalaria sp.), Trung Quốc

T19-BRVT (Bà Rịa-Vũng Tàu), 1.340 nts DQ452417 100 99

Ghi chú: *Chỉ trình bày 03 trình tự nucleotide gần gũi nhất trên Ngân hàng Gen.

Sweet potato witches'-broom phytoplasma strain WPWB Cây khoai lang (Ipomoea batatas), Đài Loan

Trong đó, trình tự nucleotide của sản phẩm PCR trên cây sắn tại Yên Bái

(YB-01) có phần trăm đoạn so sánh 100%, mức đồng nhất trình tự nucleotide

99%, gần gũi nhất với các mẫu phytoplasma gây bệnh trên cây bạch đàn

(Eucalyptus sp.) ở Iran, cây bông (Gossypium hirsutum) ở Ấn Độ và cây dừa cạn

(Catharanthus roseus) ở Trung Quốc.

Trình tự nucleotide của sản phẩm PCR trên cây sắn (T7-ĐN, T18-TN và

T19-BRVT) tại Bà Rịa-Vũng Tàu, Đồng Nai và Tây Ninh đều khá giống nhau,

có phần trăm đoạn so sánh 100%, mức đồng nhất trình tự nucleotide 99%, gần

gũi nhất với các mẫu phytoplasma gây bệnh trên cây lục lạc (Crotalaria sp.) ở

Trung Quốc, cây khoai lang (Ipomoea batatas) ở Đài Loan, cây hàn the

(Desmodium ovalifolium) ở Trung Quốc và cây đậu triều (Cajanus cajan) ở Hoa

Kỳ. Có điều cần chú ý là mẫu T18-QNg (Quảng Ngãi) có phần trăm đoạn so sánh

100%, mức đồng nhất trình tự nucleotide 100% với phytoplasma gây bệnh trên

cây hàn the (D. ovalifolium) ở Trung Quốc, cây khoai lang (I. batatas) ở Đài

Loan, và cây đậu triều (C. cajan) ở Hoa Kỳ.

Trình tự gen 16S RNA ribosome dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 của 5

mẫu giải trình tự này đều đƣợc đăng ký trên Ngân hàng Gen (phụ lục 1).

Nhƣ vậy trong tổng số 83 sản phẩm PCR từ 67 mẫu sắn bị bệnh chổi phù

thuỷ thu tại 8 tỉnh đƣợc giải trình tự, cuối cùng thu đƣợc 19 mẫu có chất lƣợng

trình tự tốt.

Tìm kiếm trình tự tƣơng đồng trên Ngân hàng Gen bằng phần mềm BLAST

cho thấy tất cả 19 mẫu này có trình tự trùng khớp với trình tự gen mã hóa 16S

RNA ribosome của phytoplasma gây bệnh cây. Do đó, khẳng định nguyên nhân

gây bệnh chổi phù thuỷ sắn tại Việt Nam là do phytoplasma gây ra.

Ngoài ra, kết quả giải trình tự và tìm kiếm BLAST cũng cho thấy các mồi

chung P1, P7, R16F2n, R16R2, R16mF2 và R16mR2 có tính đặc hiệu cao trong

chẩn đoán bệnh phytoplasma trên sắn tại Việt Nam.

Trình tự của 19 mẫu này có độ dài phù hợp, đủ để phân tích định danh dựa

trên so sánh trình tự, phân tích đa hình RFLP và phả hệ, do vậy đã đƣợc đăng ký

trên Ngân hàng Gen (bảng 4.10).

Bảng 4.10. Danh sách các mẫu phytoplasma hại sắn đã đƣợc đăng ký trên Ngân hàng Gen

STT Mẫu Cặp mồi PCR* Mồi giải trình tự

Địa điểm thu thập (xã, huyện, tỉnh) Trình tự (nts) Mã truy cập Ngân hàng Gen

1 BRVT-01 2 QNg-01 Tóc Tiên, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 R16F2n R16F2n 795 870 JN381547 JN381548

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum 3 ĐN-01 4 KT-01 R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 R16F2n R16F2n 869 798 JN381549 JN381550

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai 5 KT-17 6 ĐN-34 R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 1.106 1.105 JQ973105 JQ973106

7 4

Đồng Phú, Bình Phƣớc Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai BP-01 7 8 ĐN-02 R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 1.156 1.083 KC295284 KM360168

9 BRVT-02 10 QNg-19.2 Tóc Tiên, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 1.114 1.047 KC295285 KM360169

11 BR-5 12 BR-7.2 Châu Pha, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu Bình Ba, Châu Đức, Bà Rịa-Vũng Tàu R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 1.052 1.048 KM360170 KM360171

13 BR-9.1 14 YB-02 Suối Nghệ, Châu Đức, Bà Rịa-Vũng Tàu R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 Mậu A, Văn Yên, Yên Bái R16F2n/R16R2 R16F2n/R16R2 1.051 1.052 KM360172 KM360167

15 YB-01 16 T7-ĐN Mậu A, Văn Yên, Yên Bái Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai R16mF2/R16mR1 R16mF2/R16mR1 R16mF2/R16mR1 R16mF2/R16mR1 1.231 1.340 KM360166 KM280679

* Cặp mồi sử dụng trong bƣớc 2 của phản ứng PCR lồng

17 T11-QNg Sơn Hà, Quảng Ngãi Tân Hội, Tân Châu, Tây Ninh 18 T18-TN 19 T19-BRVT Tân Thành, Bà Rịa-Vùng Tàu R16mF2/R16mR1 R16mF2/R16mR1 R16mF2/R16mR1 R16mF2/R16mR1 R16mF2/R16mR1 R16mF2/R16mR1 1.330 1.341 1.340 KM280680 KM280681 KM280682

4.3.2. Kết quả định danh bằng kỹ thuật RFLP

4.3.2.1. Phân tích RFLP dựa trên sản phẩm PCR

Đối với phytoplasma, một phƣơng pháp truyền thống nhằm định danh và

phân loại các nhóm là dựa trên phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

(restriction fragment length polymorphism, RFLP) của sản phẩm PCR vùng gen mã hóa 16S RNA ribosome (Lee et al., 2000). Dựa trên cơ sở này, đầu tiên, phân

tích sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 của các mẫu cây sắn bị

bệnh chổi phù thuỷ bằng 4 enzym cắt giới hạn là EcoRI, HhaII, HpaI và TaqI.

Kết quả phân tích cho thấy tất cả 9 mẫu thí nghiệm, BRVT-01, BRVT-02, QNg-01, QNg-02, KT-01, TN-01, ĐN-01, ĐN-02 và BP-01, đều tạo các băng

giống nhau đối với cả 4 enzym này (hình 4.7), cả 4 enzym cắt giới hạn này chƣa đủ để phân biệt các nhóm phytoplasma, tuy nhiên, do giới hạn về nguồn enzym,

đã không thể phân tích RFLP dùng các enzym khác.

Hình 4.7. Phân tích sản phẩm PCR bằng kỹ thuật RFLP

M: thang DNA 1kb (Fermentas). Từ 1 đến 9: các mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ gồm 1: BRVT-01, 2: BRVT-02, 3: QNg-01, 4: QNg-02, 5: KT-01, 6: TN-01, 7: ĐN-01, 8: ĐN-02, 9: BP-01.

4.3.2.2. Phân tích RFLP mô phỏng dựa trên trình tự sản phẩm PCR

Phân tích RFLP mô phỏng (virtual RFLP) là công cụ phân loại và định

danh rất hữu hiệu đối với phytoplasma. Kỹ thuật này, đƣợc thực hiện bởi một số phần mềm nhƣ pDRAW32 và iPhyClassifier, cho phép so sánh mô hình cắt của 1

bộ gồm 17 enzym cắt giới hạn khác nhau trên trình tự gen mã hóa 16S RNA

ribosome (Lee et al., 2000).

Dựa trên trình tự gen của 19 mẫu phytoplasma hại sắn tại Việt Nam đã đƣợc giải trình tự thành công, tiến hành phân tích RFLP mô phỏng dùng chƣơng

trình pDRAW32 với 17 loại enzym cắt nhằm xác định các nhóm phytoplasma.

Ngoài ra, 7 mẫu tham khảo gồm 2 mẫu nhóm 16SrI (CWB-WF, MAY), 2 mẫu

nhóm 16SrII (CWB-TQ, PnWB), 1 mẫu nhóm 16SrIII (CWB-Br02), 1 mẫu

nhóm 16SrXV (HibWB) và 1 mẫu không phải là phytoplasma (A. laidlawii) sẵn

có trên Ngân hàng Gen cũng đƣợc sử dụng trong phân tích làm mẫu tham khảo

(bảng 4.11 và hình 4.8).

Kết quả điện di trên gel mô phỏng (hình 4.11) cho thấy, mô hình cắt của 19

mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam là giống nhau khi cắt với 8 enzym cắt

(BamHI, BstUI, DraI, EcoRI, HhaI, HinfI, HpaI và SspI) và chúng cũng giống

với mô hình cắt của phytoplasma hại sắn ở Wallis-Futuna (AY787139, nhóm

16SrI-A), ở Trung Quốc (JQ957931, nhóm 16SrII-A), ở Bra-xin, GU193977,

nhóm 16SrIII-B); hại cúc tây ở Hoa Kỳ (AY787139, nhóm 16SrI-A); hại lạc ở

Đài Loan (L33765, nhóm 16SrII-A); hại bông bụp ở Bra-xin (AF147708, nhóm

16SrXV-A).

Mô hình cắt của 10 mẫu gồm BRVT-01 (JN381547), QNg-01 (JN381548),

ĐN-01 (JN381549), KT-01 (JN381550), KT-17 (JQ973105), ĐN-34 (JQ973106),

BP-01 (KC295284), ĐN-02 (KM360168), YB-01 (KM360166) và YB-02 (KM360167) là giống nhau với 17 enzym cắt. Kết quả gợi ý rằng 10 mẫu này

thuộc cùng một nhóm phytoplasma và chúng giống với mô hình cắt của

phytoplasma hại sắn ở Wallis-Futuna (AY787139), trên cúc tây ở Hoa Kỳ

(M30790) cùng thuộc nhóm 16SrI.

Mô hình cắt của 9 mẫu gồm BRVT-02 (KC295285), QNg-19.2

(KM360169), BR-5 (KM360170), BR-7.2 (KM360171), BR-9.1 (KM360172),

T7-ĐN (KM280679), T11-QNg (KM280680), T18-TN (KM280681) và T19- BRVT (KM280682) là giống nhau với 17 loại enzym cắt. Do đó, 10 mẫu này

thuộc cùng một nhóm phytoplasma và chúng giống với mô hình cắtcủa phytoplasma hại sắn ở Trung Quốc (JQ957931) và trên cây lạc ở Đài Loan

(L33765) đã đƣợc công bố và cùng thuộc nhóm 16SrII, nhƣng sai khác hẳn so

với các mô hình cắt của phytoplasma thuộc nhóm 16SrI, 16SrIIII và nhóm

16SrXV.

Bảng 4.11. Danh sách các mẫu dùng trong phân tích RFLP mô phỏng

STT Mẫu Nguồn gốc (ký chủ, quốc gia) Nhóm- Mã truy

nhóm phụ 16S RNA cập Ngân hàng Gen

ribosome

JN381547 1 BRVT-01 Cây sắn (M. esculenta), Bà Rịa-Vũng Tàu

Nghiên cứu JN381548 JN381549 JN381550 JQ973105 2 QNg-01 3 ĐN-01 4 KT-01 5 KT-17 Cây sắn (M. esculenta), Quảng Ngãi Cây sắn (M. esculenta), Đồng Nai Cây sắn (M. esculenta), Kon Tum Cây sắn (M. esculenta), Kon Tum

này

JQ973106 KC295284 6 ĐN-34 BP-01 7 Cây sắn (M. esculenta), Đồng Nai Cây sắn (M. esculenta), Bình Phƣớc

KM360168 KM360166 8 ĐN-02 9 YB-01 Cây sắn (M. esculenta), Đồng Nai Cây sắn (M. esculenta), Yên Bái

KM360167 10 YB-02 Cây sắn (M. esculenta), Yên Bái

11 CWB-WF Cây sắn (M. esculenta), Wallis - Futuna 16SrI-A AY787139

12 MAY Cây cúc tây (Aster sp.), Hoa Kỳ 16SrI-B M30790

KC295285 KM360169 KM360170 13 BRVT-02 Cây sắn (M. esculenta), Bà Rịa-Vũng Tàu 14 QNg-19.2 Cây sắn (M. esculenta), Quảng Ngãi 15 BR-5 Cây sắn (M. esculenta), Bà Rịa-Vũng Tàu

KM360171 KM360172 16 BR-7.2 17 BR-9.1 Cây sắn (M. esculenta), Bà Rịa-Vũng Tàu Cây sắn (M. esculenta), Bà Rịa-Vũng Tàu Nghiên cứu này Cây sắn (M. esculenta), Đồng Nai

KM280679 KM280680 18 T7-ĐN 19 T11-QNg Cây sắn (M. esculenta), Quảng Ngãi

Cây sắn (M. esculenta), Tây Ninh

KM280681 KM280682 20 T18-TN 21 T19-BRVT Cây sắn (M. esculenta), Bà Rịa-Vũng Tàu

22 CWB-TQ Cây sắn (M. esculenta), Trung Quốc 16SrII-A JQ957931

Cây lạc (Arachis hypogaea), Đài Loan L33765

23 PnWB 24 CWB-Br02 Cây sắn (M. esculenta), Bra-xin 16SrII-A 16SrIII-B GU193977

Cây bông bụp (Hibiscus rosa-sinensis), Bra-xin 16SrXV-A AF147708

25 HibWB 26 A. laidlawii Đối chứng ngoài nhóm phytoplasma - M23932

Hình 4.8. Phân tích đa hình mô phỏng trình tự nucleotide bằng pDRAW32

M: Thang DNA chuẩn 174DNA-HaeIII với kích thƣớc cặp bazơ (base pair) từ trên xuống dƣới

lần lƣợt là 1.353, 1.078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118 và 72 bp. Số thứ tự ở hàng trên cùng tƣơng ứng với các mẫu phân tích đƣợc chỉ rõ ở bảng 4.11.

Có 9 enzym cắt gồm AluI, BfaI, HaeIII, HpaII, KpnI, MseI, RsaI, Sau96I và

TaqI cho kết quả sai khác, phân biệt đƣợc rõ ràng giữa các mô hình cắt của

phytoplasma thuộc nhóm 16SrI (12/25 mẫu) so với nhóm 16SrII (11/25 mẫu), so

với nhóm 16SrIIII (1/25 mẫu) và so với nhóm 16SrXV (1/25 mẫu).

Enzym KpnI, MseI RsaI và đƣợc coi là enzym khóa để phân biệt các nhóm

phytoplasma khác nhau. Đối với mô hình cắt của phytoplasma thuộc nhóm 16SrI,

enzym KpnI tạo ra 3 vạch băng có kích thƣớc khoảng 42, 188 và 473 bp trên bản

điện di. Còn enzym MseI tạo ra 5 vạch băng có kích thƣớc khoảng 41, 45, 56,

265 và 288 bp trên bản điện di; enzym RsaI tạo ra 6 vạch băng có kích thƣớc khoảng 16, 44, 55, 73, 131 và 336 bp đối với các trình tự thuộc nhóm 16SrI sai

khác hẳn so với nhóm 16SrII, 16SrIII và 16SrXV (hình 4.8).

Dựa trên mức tƣơng đồng di truyền của các mẫu, mối quan hệ di truyền của các mẫu cũng đƣợc xác định dùng phần mềm NTSYSpc với khoảng cách di truyền đƣợc xác định theo phƣơng pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung

bình số học ngang bằng (unweighted pair group method with arithmetic mean,

UPGMA) (hình 4.9).

Hình 4.9. Phân tích cụm dựa trên số liệu RFLP mô phỏng vùng gen mã hóa 16S RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam. Cây đƣợc vẽ theo phƣơng pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng (UPGMA)

Dựa trên mô hình cắt của các mẫu, mức tƣơng đồng di truyền của 26 mẫu đã đƣợc xác định dựa trên phân tích hệ số tƣơng đồng của Nei and Li (1979)

(bảng 4.12).

Kết quả phân tích cho thấy 9 mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam, BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17 ĐN-34, BP-01, ĐN-02 và YB-02, có hệ số tƣơng đồng gần gũi nhất với 2 mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrI (mã

truy cập M30790 và AY787139), từ 77% đến 100%. Trên cây UPGMA, cả 9

mẫu này cũng phân khác nhóm với phytoplasma thuộc nhóm 16SrII (mẫu CWB-

TQ và PnWB), sai khác so với các nhóm còn lại (16SrIII, 16SrXV) và đối chứng.

Bảng 4.12. Mức tƣơng đồng di truyền dựa trên mô hình cắt RFLP mô phỏng vùng gen mã hóa 16S RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn

8 3

1 1,00 0,94 1,00 0,89 0,95 1,00 0,94 1,00 0,95 1,00 0,82 0,88 0,88 0,88 1,00 0,91 0,97 0,94 0,97 0,91 1,00 0,90 0,92 0,89 0,92 0,85 0,89 1,00 0,94 0,95 0,90 0,95 0,85 0,92 0,96 1,00 0,72 0,73 0,68 0,73 0,63 0,69 0,75 0,78 1,00 0,89 0,95 0,90 0,95 0,86 0,93 0,92 0,95 0,73 1,00

0,94 0,95 0,91 0,95 0,86 0,92 0,98 1,00 0,77 0,95 1,00 1,00

0,40 0,38 0,37 0,38 0,37 0,38 0,39 0,40 0,38 0,37 0,40 0,41 1,00 1,00 1,00 0,40 0,38 0,37 0,38 0,37 0,38 0,39 0,40 0,38 0,37 0,40 0,41 1,00 1,00 1,00 1,00 0,40 0,38 0,37 0,38 0,37 0,38 0,39 0,40 0,38 0,37 0,40 0,41 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,40 0,38 0,37 0,38 0,37 0,38 0,39 0,40 0,38 0,37 0,40 0,41 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,40 0,38 0,37 0,38 0,37 0,38 0,39 0,40 0,38 0,37 0,40 0,41 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,40 0,38 0,37 0,38 0,37 0,38 0,39 0,40 0,38 0,37 0,40 0,41 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

0,40 0,38 0,37 0,38 0,37 0,38 0,39 0,40 0,38 0,37 0,40 0,41 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,94 0,97 1,00

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

0,51 0,52 0,48 0,52 0,48 0,51 0,50 0,52 0,42 0,51 0,52 0,53 0,60 0,60 0,60 0,60 0,60 0,60 0,60 0,60 0,64 0,64 0,60 0,71 1,00

STT Mẫu* 1 BRVT-01 2 QNg-01 3 ĐN-01 4 KT-01 5 KT-17 6 ĐN-34 7 BP-01 8 ĐN-02 9 YB-01 10 YB-02 11 CWB-WF 0,94 0,95 0,90 0,95 0,85 0,92 0,96 1,00 0,78 0,95 1,00 12 MAY 13 BRVT-02 0,40 0,38 0,37 0,38 0,37 0,38 0,39 0,40 0,38 0,37 0,40 0,41 1,00 14 QNg-19.2 0,40 0,38 0,37 0,38 0,37 0,38 0,39 0,40 0,38 0,37 0,40 0,41 1,00 1,00 15 BR-5 16 BR-7.2 17 BR-9.1 18 T7-ĐN 19 T11-QNg 20 T18-TN 21 T19-BRVT 0,45 0,43 0,42 0,43 0,42 0,43 0,44 0,45 0,40 0,42 0,45 0,46 0,94 0,94 0,94 0,94 0,94 0,94 0,94 0,94 1,00 22 CWB-TQ 0,42 0,40 0,40 0,40 0,40 0,41 0,41 0,43 0,38 0,40 0,43 0,44 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,98 1,00 23 PnWB 24 CWB-Br02 0,59 0,57 0,53 0,57 0,53 0,56 0,57 0,59 0,52 0,55 0,59 0,61 0,58 0,58 0,58 0,58 0,58 0,58 0,58 0,58 0,64 0,61 0,58 1,00 25 HibWB 26 A.laidlawii 0,27 0,27 0,27 0,27 0,29 0,28 0,26 0,27 0,20 0,27 0,27 0,28 0,26 0,26 0,26 0,26 0,26 0,26 0,26 0,26 0,24 0,26 0,26 0,32 0,29 1,00

Ghi chú: Các mẫu phân tích đƣợc chỉ rõ ở bảng 4.11; Số thứ tự ở hàng trên cùng tƣơng ứng với tên mẫu phân tích ở cột phía bên tay trái.

Phân tích cũng cho thấy 9 mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam, BRVT- 02, QNg-19.2, BR-5, BR-7.2, BR-9.1, T7-ĐN, T11-QNg, T18-TN và T19-

BRVT, có hệ số tƣơng đồng gần gũi nhất với 2 mẫu phytoplasma thuộc nhóm

16SrII, nhóm phụ 16SrII-A (mã truy cập JQ957931 và L33765), với giá trị từ

94% đến 100%. Tƣơng tự, trên cây UPGMA, cả 9 mẫu này cũng phân khác nhóm với phytoplasma thuộc nhóm 16SrI (mẫu CWB-WF và MAY, mã truy cập

M30790 và AY787139), sai khác so với các nhóm còn lại (16SrIII, 16SrXV) và

đối chứng A. laidlawii (mã truy cập M23932) (hình 4.9).

Đáng chú ý, mẫu phytoplasma hại sắn YB-01 ở Yên Bái mặc dù có quan hệ

gần gũi với các mẫu nhóm 16SrI nhƣng có hệ số tƣơng đồng khá thấp với các

mẫu phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI, từ 63% đến 78%. Phân tích mẫu này bằng phần mềm iPhyClassifier đã cho thấy mẫu này thuộc một nhóm phụ mới

trong nhóm 16SrI.

Nhƣ vậy, phân tích RFLP mô phỏng dùng 17 enzym cắt giới hạn đã xác

định phytoplasma hại sắn tại Việt Nam gồm ít nhất 2 nhóm, 16SrI và 16SrII.

4.3.3. Kết quả định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide

Ngoài phân tích RFLP mô phỏng, tiến hành so sánh mức đồng nhất trình tự

nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome của 26 mẫu thử nghiệm (bảng 4.13).

Kết quả phân tích cho thấy 9 mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam,

BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17 ĐN-34, BP-01, ĐN-02 và YB-02, có

mức đồng nhất trình tự nucleotide gần gũi nhất với 2 mẫu phytoplasma thuộc

nhóm 16SrI (mã truy cập M30790 và AY787139), với giá trị từ 98% đến 100%.

Phân tích cũng cho thấy 9 mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam, BRVT-

02, QNg-19.2, BR-5, BR-7.2, BR-9.1, T7-ĐN, T11-QNg, T18-TN và T19-

BRVT, có mức đồng nhất trình tự nucleotide gần gũi nhất với 2 mẫu phytoplasma thuộc nhóm 16SrII, nhóm phụ 16SrII-A (mã truy cập JQ957931 và

L33765), với giá trị từ 99% đến 100%.

Mẫu phytoplasma hại sắn YB-01 ở Yên Bái mặc dù có quan hệ gần gũi với các mẫu nhóm 16SrI nhƣng có mức đồng nhất trình tự nucleotide khá thấp so với các mẫu phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI, từ 98% đến 99%. Phân tích mẫu này bằng phần mềm iPhyClassifier đã cho thấy mẫu này thuộc một nhóm phụ

mới trong nhóm 16SrI.

Bảng 4.13. So sánh mức đồng nhất trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn

8 5

2 1 ID 0,99 ID 0,99 1,00 ID 0,99 0,99 1,00 ID 0,98 0,99 0,99 0,99 ID 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID 0,99 0,99 0,99 0,99 1,00 0,99 ID 0,99 1,00 1,00 1,00 0,99 0,99 0,99 ID 0,98 0,98 0,98 0,98 0,98 0,98 0,98 0,98 ID 0,99 0,99 1,00 0,99 0,99 0,99 0,99 1,00 0,98 ID 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,98 0,99 ID 0,99 1,00 1,00 1,00 0,99 0,99 0,99 1,00 0,98 1,00 1,00 ID 0,89 0,89 0,89 0,89 0,88 0,88 0,89 0,89 0,88 0,89 0,89 0,89 ID 0,89 0,89 0,90 0,90 0,89 0,89 0,89 0,90 0,88 0,89 0,89 0,90 0,99 ID 0,88 0,89 0,89 0,89 0,88 0,88 0,88 0,89 0,88 0,89 0,88 0,89 0,99 0,99 ID 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,88 0,89 0,89 0,90 0,99 1,00 0,99 ID 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,88 0,89 0,89 0,89 1,00 1,00 0,99 1,00 ID 0,89 0,90 0,90 0,90 0,89 0,89 0,89 0,90 0,88 0,90 0,89 0,90 0,99 1,00 0,99 1,00 1,00 ID 0,89 0,90 0,90 0,90 0,89 0,89 0,89 0,90 0,88 0,90 0,89 0,90 0,99 1,00 0,99 1,00 1,00 1,00 ID 0,89 0,89 0,90 0,90 0,89 0,89 0,89 0,90 0,88 0,89 0,89 0,90 0,99 1,00 0,99 1,00 0,99 1,00 1,00 ID

0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,88 0,89 0,89 0,89 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 1,00 1,00 0,99 1,00 ID 0,89 0,89 0,90 0,90 0,89 0,89 0,89 0,90 0,88 0,89 0,89 0,90 0,99 1,00 0,99 1,00 0,99 1,00 1,00 1,00 1,00 0,99 ID

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,88 0,89 0,89 0,90 0,96 0,97 0,96 0,96 0,96 0,97 0,97 0,97 0,97 0,96 0,97 0,91 ID

STT Mẫu* 1 BRVT-01 2 QNg-01 3 ĐN-01 4 KT-01 5 KT-17 6 ĐN-34 7 BP-01 8 ĐN-02 9 YB-01 10 YB-02 11 CWB-WF 12 MAY 13 BRVT-02 14 QNg-19.2 15 BR-5 16 BR-7.2 17 BR-9.1 18 T7-ĐN 19 T11-QNg 20 T18-TN 21 T19-BRVT 0,89 0,90 0,90 0,90 0,89 0,89 0,89 0,90 0,88 0,90 0,89 0,90 0,99 1,00 0,99 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 ID 22 CWB-TQ 23 PnWB 24 CWB-Br02 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,91 0,90 0,91 0,91 0,92 0,92 0,92 0,91 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 0,92 ID 25 HibWB 26 A.laidlawii 0,89 0,90 0,90 0,90 0,89 0,89 0,89 0,90 0,88 0,90 0,89 0,90 0,86 0,86 0,85 0,86 0,86 0,86 0,86 0,86 0,86 0,86 0,86 0,88 0,86 ID Ghi chú: Các mẫu phân tích đƣợc chỉ rõ ở bảng 4.11; ID: tức là đồng nhất trình tự 100%; Số thứ tự ở hàng trên cùng tƣơng ứng với tên mẫu phân tích ở cột phía bên tay trái.

Nhƣ vậy, 19 trình tự nucleotide của phytoplasma gây hại sắn ở Việt Nam trong nghiên cứu này thuộc nhóm 16SrI và nhóm 16SrII sai khác hẳn với trình tự

nucleotide của phytoplasma hại sắn ở Bra-xin (nhóm 16SrIII-B, mã truy cập

GU193977), cũng sai khác hẳn với trình tự nucleotide của đối chứng là

A. laidlawii (mức đồng nhất trình tự nucleotide rất thấp, từ 85% đến 90%).

4.3.4. Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide

4.3.4.1. Phân tích phả hệ các nhóm phytoplasma hại sắn

Nhằm hiểu rõ hơn mối quan hệ của các mẫu phytoplasma hại sắn của Việt

Nam với các phytoplasma khác, tiến hành phân tích phả hệ dựa trên trình tự

nucleotide gen 16S RNA ribosome đã xác định đƣợc.

Trƣớc khi xây dựng quan hệ phả hệ, các trình tự nucleotide đƣợc căn trình

tự đa chuỗi bằng phần mềm ClustalX. Khoảng cách di truyền giữa các trình tự

phytoplasma đƣợc xác định dựa trên mô hình thay thế Kimura 2-Parameter trong

MEGA 5.0. Cây phả hệ đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp Neighbor-Joining và

độ tin cậy của các mối quan hệ phả hệ đƣợc tính toán bằng kỹ thuật “bootstrap”

với 1.000 lặp. Đầu tiên, quan hệ phả hệ của 19 mẫu trong nghiên cứu này đƣợc

phân tích với đại diện của 28 nhóm phytoplasma đƣợc ghi nhận cho tới nay (bảng

4.14 và hình 4.10).

Bảng 4.14. Đại diện 28 nhóm phytoplasma dùng trong phân tích phả hệ

Nhóm 16S Bệnh liên quan Tên Nguồn gốc

rRNA viết tắt

Chổi phù thuỷ hại sắn CWB-WF Mã truy cập Ngân hàng Gen* AY787139 I Wallis –

I Chổi phù thuỷ cúc tây AYWB NC_007716 Futuna Hoa Kỳ

I II Biến vàng cúc tây Chổi phù thuỷ hại sắn MAY CWB-TQ M30790 JQ957931 Hoa Kỳ Trung Quốc

II II Chổi phù thuỷ lạc Chổi phù thuỷ cây chanh PnWB WBDL L33765 U15442 Đài Loan Ô-man

II III Chổi phù thuỷ đậu Hà Lan Chổi phù thuỷ hại sắn FBP CWB-Br02 X83432 GU193977 Không rõ Bra-xin

III IV IV V Da cóc hại sắn Vàng gân lá dừa Vàng lá dừa Yucatan Biến vàng cây đu CFSD LYJ-C8 LDY EY EU346761 AF498307 U18753 AY197655 Bra-xin Ja-mai-ca Mê-hi-cô Hoa Kỳ

Nhóm 16S Bệnh liên quan Nguồn gốc Tên

rRNA viết tắt

Chổi phù thuỷ táo ta JWB-G1 V Mã truy cập Ngân hàng Gen* AB052876 Nhật Bản

VI Phát búi tam giác mạch CP AY390261 Ca-na-da

VI Bệnh hại dâu tây MC AF190224 Ca-na-da

VII Chổi phù thuỷ đinh hƣơng AshY AF092209 Hoa Kỳ

VII Chổi phù thuỷ ngải dại ErWB AY034608 Bra-xin

VIII Chổi phù thuỷ mƣớp AF086621 Đài Loan LufWB

IX Chổi phù thuỷ đậu triều PPWB AF248957 Hoa Kỳ

IX Chổi phù thuỷ hạnh nhân AlWB AF515636 Li-băng

X Phát búi táo tây AP AJ542541 Đức

X Hóa đá táo tây ESFY AJ542544 Đức

XI Vàng lụi lúa RYD AB052873 Thái Lan

XI Trắng lá mía SCWL X76432 Không rõ

XII Biến vàng nho AUSGY L76865 Ốt-xtrây-li-a

XIV Trắng lá cỏ chỉ BGWL AJ550984 I-ta-li-a

XV Chổi phù thuỷ thục địa GWB HQ258882 Costa Rica

XVI Biến vàng đi động lá mía SYLS AY725228 Cu-ba

XVII Chùn ngọn đu đủ PBT AY725234 Cu-ba

XVIII Đốm héo ngọn khoai tây PPPT DQ174122 Hoa Kỳ

XIX Chổi phù thuỷ cây dẻ CheWB AB054986 Hàn Quốc

XXI Biến vàng lá thông PinP AJ310849 Đức

XXII Héo vàng lá dừa LYDM KF751387 Mô-zăm-bíc

XXII Héo vàng lá dừa CSPW JQ868442 Gha-na

XXIII Biến vàng lá nho BVGY AY083605 Ốt-xtrây-li-a

XXIV Chùn ngọn lúa miến SBS AF509322 Ốt-xtrây-li-a

XXV Chổi phù thuỷ liễu nhỏ WTWB AF521672 Ốt-xtrây-li-a

XXVI Vàng lá mía D3T1 AJ539179 Mauritius

XXVII Vàng lá mía D3T2 AJ539180 Mauritius

XXIX Chổi phù thuỷ cốt khí CaWB EF666051 Ô-man

XXX Chổi phù thuỷ liễu bách SCWB FJ432664 Trung Quốc

XXXI Lùn bụi đậu tƣơng SoyST1c1 HQ225630 Costa Rica

XXXII Lục hóa dừa cạn MaPV EU371934 Ma-lay-xi-a

XXXIII Biến vàng lá thông AlP AY135523 Ốt-xtrây-li-a

Ghi chú: * Tham khảo trên Ngân hàng Gen và dựa theo tài liệu của Bertaccini et al. (2014)

A. laidlawii Đối chứng - M23932 -

Hình 4.10. Cây phả hệ xác định nhóm phytoplasma hại sắn đƣợc vẽ theo phƣơng pháp Neighbor-Joining

 Trình tự của phytoplasma hại sắn ở Việt Nam xác định đƣợc trong nghiên cứu này. Giá trị bootstrap (%) đƣợc chỉ rõ ở gốc các nhánh. Tên viết tắt, mã truy cập trên Ngân hàng Gen nằm trong dấu ngoặc đơn đƣợc chỉ rõ ở bảng 4.14. Tên của nhóm phytoplasma ở phía bên tay phải.

Kết quả phân tích phả hệ cho thấy có 10/19 (52,6%) mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam trong nghiên cứu này, BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-

17 ĐN-34, BP-01, ĐN-02, YB-01 và YB-02, phân nhóm rõ rệt (giá trị bootstrap

97%) với tất cả 3 mẫu phytoplasma nhóm 16SrI gồm phytoplasma hại sắn

(AY787139) ở Wallis - Futuna, hại cúc tây (NC_007716, M30790) ở Hoa Kỳ. Tƣơng tự nhƣ kết quả phân tích RFLP mô phỏng ở trên, mẫu YB-01 hình thành

một nhánh riêng biệt trong cụm nhóm 16SrI.

Cả 9/19 (47,4%) mẫu phytoplasma hại sắn của Việt Nam còn lại đã phân nhóm rõ rệt (giá trị bootstrap 97%) với các đại diện của phytoplasma nhóm 16SrII gồm phytoplasma hại sắn tại Trung Quốc (JQ957931), hại lạc tại Đài Loan (L33765). Nhƣ vậy, phân tích phả hệ dựa trên trình tự cho kết quả tƣơng tự với các phân tích RFLP mô phỏng và so sánh trình tự. Các mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam đƣợc xếp vào 2 nhóm phytoplasma gồm nhóm 16SrI và 16SrII trong hệ thống phân loại phytoplasma (Lee et al., 1998; Bertaccini et al., 2014). Cả 2 nhóm phytoplasma này khác so với nhóm phytoplasma 16SrIII hại sắn đƣợc phát hiện ở một số nƣớc thuộc châu Mỹ nhƣ Bra-xin, Cô-lôm-bi-a, Costa Rica, Peru, Panama và Venezuela.

4.3.4.2. Phân tích phả hệ nhóm phụ của phytoplasma thuộc nhóm 16SrI

Tiếp theo, nhằm làm rõ hơn vị trí phân loại, xác định nhóm phụ của các mẫu

phytoplasma nhóm 16SrI hại sắn, sử dụng 10 mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt

Nam thuộc nhóm 16SrI trong nghiên cứu này đã đƣợc phân tích với 29 mẫu đại

diện của 16 nhóm phụ đƣợc xác định cho tới nay (bảng 4.15 và hình 4.11).

Bảng 4.15. Đại diện các nhóm phụ nhóm 16SrI dùng trong phân tích phả hệ

Bệnh liên quan Tên viết tắt Mã truy cập Nguồn gốc

Nhóm-nhóm phụ 16S rRNA Ngân hàng Gen

Nghiên cứu này

Chổi phù thuỷ hại sắn BRVT-01 QNg-01 Chổi phù thuỷ hại sắn ĐN-01 Chổi phù thuỷ hại sắn KT-01 Chổi phù thuỷ hại sắn KT-17 Chổi phù thuỷ hại sắn ĐN-34 Chổi phù thuỷ hại sắn BP-01 Chổi phù thuỷ hại sắn ĐN-02 Chổi phù thuỷ hại sắn YB-01 Chổi phù thuỷ hại sắn YB-02 Chổi phù thuỷ hại sắn JN381547 Bà Rịa-Vũng Tàu JN381548 JN381549 JN381550 JQ973105 JQ973106 KC295284 KM360168 KM360166 KM360167 Quảng Ngãi Đồng Nai Kon Tum Kon Tum Đồng Nai Bình Phƣớc Đồng Nai Yên Bái Yên Bái

Nhóm-nhóm Bệnh liên quan Tên viết tắt Mã truy cập Nguồn gốc

phụ 16S rRNA Ngân hàng Gen

I-A Chổi phù thuỷ cúc tây AYWB NC_007716 Hoa Kỳ

I-A Biến vàng cúc tây NJAY HM590622 Hoa Kỳ

I-A Lục hóa cây mã đề AY265216 PVM Đức

I-A Biến vàng cà rốt EU215424 Séc-bi-a CYP

I-A Chổi phù thuỷ sắn CWB-WF AY787139 Wallis - Futuna

I-B Biến vàng cúc tây MAY M30790 Hoa Kỳ

I-B NA HM590621 Lục hóa dừa cạn I-ta-li-a

I-B PrG HM590623 Biến vàng gân báo xuân Anh

I-B RV HM590625 Lục hóa cải dầu Pháp

I-B CY Biến vàng cúc tây EU215426 Séc-bi-a

I-B Lục hóa cây anh thảo PRIVC AY265210 Đức

I-B AY-J HM590616 Biến vàng cúc tây Pháp

I-C CA Biến vàng cà rốt HM448473 I-ta-li-a

I-C KVE AY265217 Diệp hóa cỏ ba lá Pháp

I-C KVF HQ530150 Diệp hóa cỏ ba lá Pháp

I-C PPT HQ530151 Thối ngọn khoai tây Pháp

I (chƣa rõ) Biến vàng lá sắn CWB-Cuba EU328256 Cuba

I-D Chổi phù thuỷ cây hông PaWB AY265206 Hoa Kỳ

I-E Lùn bụi việt quất BBS3 AY265213 Hoa Kỳ

I-F Biến vàng lá mơ ACLR-AY AY265211 Hoa Kỳ

I-I Chổi phù thuỷ dâu tây STRAWB1 U96614 Hoa Kỳ

I-K Chổi phù thuỷ dâu tây STRAWB2 U96616 Hoa Kỳ

I-N Biến vàng cây bìm mờ IOWB AY265205 Hoa Kỳ

I-P Biến vàng cây dƣơng PopAY AF503568 Croatia

I-R Diệp hóa dâu tây StrawbPhF AY102275 Hoa Kỳ

I-S Đốm ngọn khoai tây COAH10 FJ914654 Mê-hi-cô

I-U Đốm ngọn khoai tây JAL6 FJ914650 Mê-hi-cô

I-V Đốm ngọn khoai tây SON18 FJ914642 Mê-hi-cô

I-Y Hóa gỗ cà chua BGT EF199549 Bô-li-vi-a

III-B Chổi phù thuỷ sắn CWB-Br02 GU193977 Bra-xin

Ghi chú: * Tham khảo trên Ngân hàng Gen và dựa theo tài liệu của Bertaccini et al. (2014)

A. laidlawii Đối chứng M23932 - -

Hình 4.11. Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI

 Trình tự của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI ở Việt Nam. Giá trị bootstrap (%) đƣợc chỉ rõ ở gốc các nhánh. Tên viết tắt, mã truy cập trên Ngân hàng Gen nằm trong dấu ngoặc đơn và các chữ cái chỉ nhóm phụ 16S rRNA đƣợc chỉ rõ ở bảng 4.15. Tên của nhóm phytoplasma ở phía bên tay phải.

Kết quả phân tích phả hệ cho thấy, có 9/10 mẫu (90%) gồm BRVT-01, QNg-01, ĐN-01, KT-01, KT-17, ĐN-34, BP-01, ĐN-02 và YB-02, phân nhóm rõ rệt, cùng cụm với phytoplasma gây bệnh biến vàng cúc tây (M30790, EU215426, AY265210), lục hóa dừa cạn (HM590621), biến vàng gân báo xuân (HM590623), lục hóa cải dầu (HM590625), lục hóa cây anh thảo (HM590616) và chúng đều thuộc nhóm phụ B (16SrI-B). Chúng sai khác so với các nhóm phụ khác thuộc nhóm 16SrI và sai khác so với đối chứng là A. laidlawii (M23932). Tƣơng tự nhƣ kết quả phân tích RFLP mô phỏng và phân tích phả hệ ở trên, mẫu YB-01 hình thành một nhánh riêng biệt trong cụm nhóm 16SrI. Nhƣ vậy, mẫu YB-01 thu tại Yên Bái thuộc 1 nhóm phụ mới trong nhóm 16SrI.

4.3.4.3. Phân tích phả hệ nhóm phụ của phytoplasma thuộc nhóm 16SrII

Tiếp theo, nhằm làm rõ hơn vị trí phân loại, xác định nhóm phụ của các mẫu phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn, sử dụng 9 mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam thuộc nhóm 16SrII trong nghiên cứu này đã đƣợc phân tích với 9 mẫu đại diện của 5 nhóm phụ đƣợc xác định cho tới nay trong hệ thống phân loại phytoplasma của (Lee et al., 1998; Bertaccini et al., 2014). Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.16 và hình 4.12.

Bảng 4.16. Đại diện các nhóm phụ nhóm 16SrII dùng trong phân tích phả hệ

Bệnh liên quan Tên viết tắt Nguồn gốc

Nhóm-nhóm phụ 16S rRNA Mã truy cập Ngân hàng Gen

Quảng Ngãi

Nghiên cứu này Đồng Nai

Quảng Ngãi Tây Ninh

Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Chổi phù thuỷ sắn Lục hóa màn màn Chổi phù thuỷ lạc Chổi phù thuỷ chanh Chổi phù thuỷ đậu Chổi phù thuỷ sắn Diệp hóa hoa mơ Diệp hóa bông Chổi phù thuỷ sắn II-A II-A II-A II-B II-C II-C II-E II-F III-B

BRVT-02 QNg-19.2 BR-5 BR-7.2 BR-9.1 T7-ĐN T11-QNg T18-TN T19-BRVT CWB-TQ ClWB-Hnsy PnWB WBDL FBP CWB-Ug PEY CoP CWB-Br02 M23932 KC295285 Bà Rịa-Vũng Tàu KM360169 KM360170 Bà Rịa-Vũng Tàu KM360171 Bà Rịa-Vũng Tàu KM360172 Bà Rịa-Vũng Tàu KM280679 KM280680 KM280681 KM280682 Bà Rịa-Vũng Tàu JQ957931 EU513212 L33765 U15442 X83432 EU315317 Y16393 EF186827 GU193977 - Trung Quốc Trung Quốc Đài Loan Ô-man không rõ Uganda I-ta-li-a Burkina Faso Bra-xin - A. laidlawii Đối chứng

Hình 4.12. Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrII

 Trình tự của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrII ở Việt Nam. Giá trị bootstrap (%) đƣợc chỉ rõ ở gốc các nhánh. Tên viết tắt, mã truy cập trên Ngân hàng Gen nằm trong dấu ngoặc đơn và các chữ cái chỉ nhóm phụ 16S rRNA đƣợc chỉ rõ ở bảng 4.16. Tên của nhóm phytoplasma ở phía bên tay phải. Kết quả phân tích phả hệ (hình 4.12) cho thấy, tất cả 9/9 phytoplasma hại

sắn của Việt Nam, gồm BRVT-02, QNg-19.2, BR-5, BR-7.2, BR-9.1, T7-ĐN,

T11-QNg, T18-TN và T19-BRVT, đã phân nhóm rõ rệt (giá trị bootstrap 99%) với các đại diện của phytoplasma nhóm 16SrII gồm phytoplasma hại sắn tại

Trung Quốc (JQ957931), hại lạc tại Đài Loan (L33765), và chúng đều thuộc nhóm phụ A (16SrII-A). Chúng sai khác so với các nhóm phụ khác thuộc nhóm

16SrII và sai khác so với đối chứng là A. laidlawii (M23932).

Dựa trên các kết quả định danh bằng kỹ thuật RFLP, xác định mức tƣơng đồng di truyền dựa trên phân tích hệ số tƣơng đồng, định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide và phân tích phả hệ phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide, nghiên cứu này đã xác định phytoplasma hại sắn tại Việt Nam gồm ít

nhất 2 nhóm, 16SrI và 16SrII.

Tổng hợp kết quả xác định nhóm và nhóm phụ 16S RNA ribosome của 19

mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam đƣợc trình bày ở bảng 4.17.

Bảng 4.17. Các nhóm/nhóm phụ 16S RNA ribosome của phytoplasma hại sắn tại Việt Nam

STT

Mẫu

Địa điểm

(xã, huyện, tỉnh)

Mã truy cập Ngân hàng Gen

Nhóm 16S RNA ribosome

Nhóm phụ 16S RNA ribosome

BRVT-01

Tóc Tiên, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu

JN381547

2 QNg-01

Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi

JN381548

3 ĐN-01

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

JN381549

4 KT-01

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum

JN381550

5 KT-17

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum

JQ973105

6 ĐN-34

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

JQ973106

BP-01

Đồng Phú, Bình Phƣớc

KC295284

8 ĐN-02

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

KM360168

BRVT-02 Tóc Tiên, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu KC295285

10 QNg-19.2

Sơn Nham, Sơn Hà, Quảng Ngãi

KM360169

11 BR-5

Châu Pha, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu KM360170

12 BR-7.2

Bình Ba, Châu Đức, Bà Rịa-Vũng Tàu KM360171

13 BR-9.1

Suối Nghệ, Châu Đức, Bà Rịa-Vũng Tàu KM360172

14 YB-01

Mậu A, Văn Yên, Yên Bái

KM360166

Mới*

15 YB-02

Mậu A, Văn Yên, Yên Bái

KM360167

16 T7-ĐN

Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai

KM280679

17 T11-QNg

Sơn Hà, Quảng Ngãi

KM280680

18 T18-TN

Tân Hội, Tân Châu, Tây Ninh

KM280681

19 T19-BRVT Tân Thành, Bà Rịa-Vùng Tàu

KM280682

Ghi chú: * Mới: nhóm phụ 16SrI chƣa có tên trong hệ thống phân loại phytoplasma.

Kết quả (bảng 4.17) cho thấy, có 9/19 mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam

thuộc nhóm 16SrI, nhóm phụ B (16SrI-B) phân bố ở các tỉnh Đông Nam Bộ nhƣ

Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Phƣớc và ở các tỉnh khác nhƣ Yên Bái,

Quảng Ngãi, Kon Tum. Mẫu phytoplasma hại sắn YB-01 (KM360166) ở Yên

Bái thuộc nhóm phụ 16SrI hoàn toàn mới, chƣa đƣợc công bố trƣớc đó.

Bên cạnh đó, 9/19 mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam thuộc nhóm 16SrII,

nhóm phụ A (16SrII-A) phân bố ở các tỉnh Đông Nam Bộ nhƣ Bà Rịa - Vũng

Tàu, Đồng Nai, Tây Ninh và ở các tỉnh khác nhƣ Yên Bái, Quảng Ngãi. So với

kết quả nghiên cứu khác cho thấy, phytoplasma hại sắn ở Wallis-Futuna thuộc

nhóm 16SrI-A (Davis et al., 2005), ở Trung Quốc thuộc nhóm 16SrII-A (mã truy

cập JQ957931); còn ở Uganda thuộc nhóm 16SrII-C (Arocha et al., 2009a) và có

ít nhất là 3 nhóm phụ phytoplasma hại sắn tại Nam Mỹ đã đƣợc xác định gồm

nhóm 16SrIII-A, 16SrIII-B và 16SrIII-L (Alvarez et al., 2009; Souza et al., 2014;

Flôres et al., 2013; Oliveira et al., 2014). Tác giả Mejia (2014), Đại học Bologna

(I-ta-li-a), đã xác định đƣợc 8 nhóm phytoplasma khác nhau, gồm 16SrI, 16SrIII,

16SrV, 16SrVI, 16SrVI, 16SrX, 16SrXII và 16SrXV, trong tổng số 92 mẫu bệnh

sắn bị bệnh chổi phù thuỷ thu thập tại Đông Nam Á gồm Thái Lan và Việt Nam.

Trong đó, các nhóm chiếm chủ yếu, lần lƣợt là nhóm 16SrI, 16SrVI, 16SrXV và 16SrXII.

Dựa vào định danh phân tử nhƣ giải trình tự sản phẩm PCR, tìm kiếm các

chuỗi tƣơng đồng, phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn và phân tích phả

hệ, đã xác định chính xác tác nhân gây bệnh là phytoplasma trên cây sắn bị bệnh

chổi phù thuỷ ở Việt Nam, đặc biệt ở vùng trồng sắn trọng điểm bị dịch bệnh

chổi phù thuỷ tại Đông Nam Bộ. Phytoplasma hại sắn ở Việt Nam sai khác hẳn

so với phytoplasma thuộc nhóm 16SrIII gây bệnh da cóc hại sắn, bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại một số nƣớc thuộc châu Mỹ.

Hai nhóm phytoplasma khác nhau gây hại trên cùng một loại cây trồng đã

đƣợc phát hiện tại nhiều nơi trên thế giới. Ở Hy Lạp, tác giả (Vellios and

Lioliopoulou, 2007) sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi chung và cặp mồi đặc

hiệu cho các nhóm phytoplasma khác nhau đã xác định đƣợc phytoplasma gây

bệnh hóa gỗ hại cà chua gồm hỗn hợp 2 nhóm thuộc nhóm 16SrI và 16SrXII-A.

Nasare et al. (2007) đã phát hiện hỗn hợp hai nhóm phyoplasma khác nhau thuộc

nhóm 16SrXI và 16SrXII gây hại trên cây mía (Saccharum officinarum) bị bệnh

chồi cỏ ở Ấn Độ. Ở Nga, có hai nhóm phytoplasma khác nhau thuộc nhóm

16SrI-A/B và nhóm 16SrXII-A gây hại trên cây khoai tây ở vùng sông Volga và

Caucasia (Girsova et al., 2008).

Cho đến thời điểm hiện tại đã phát hiện đƣợc 2 loài phytoplasma thuộc

nhóm 16SrI và nhóm 16SrII hại sắn trên một số mẫu thu thập. Điều này góp phần vào việc xác định phổ ký chủ của bệnh, nhất là đối với cây sắn hiện nay đang bị

bệnh chổi phù thuỷ gây hại ở nhiều nơi tại Đông Nam Bộ.

4.4. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAMP-PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN PHYTOPLASMA NHÓM 16SRII HẠI SẮN

Gần đây, kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt (LAMP-PCR) đã đƣợc ứng dụng

nhiều trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh cây.

Nhƣ đã trình bày ở trên, phytoplasma hại sắn tại Đông Nam Bộ thuộc 2

nhóm 16SrI và 16SrII. Do các bộ mồi LAMP đặc hiệu cho phytoplasma nhóm

16SrI đã đƣợc công bố và chứng tỏ rất hiệu quả trong phát hiện và chẩn đoán

nhóm này trên một loạt cây trồng (Tomlinson et al., 2010; Sugawara et al., 2012),

trong nghiên cứu này tiến hành thiết kế bộ mồi LAMP đặc hiệu cho phytoplasma

nhóm 16SrII hại sắn tại Đông Nam Bộ.

4.4.1. Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII

Thiết kế mồi LAMP là nhiệm vụ khó khăn và thƣờng phải đƣợc thực hiện

bằng phần mềm. Để thiết kế mồi, sử dụng phần mềm thiết kế trực tuyến Primer

Explorer V4 của công ty Eiken, Nhật Bản (Eiken, 2014).

Trƣớc khi thiết kế mồi LAMP, một bộ số liệu trình tự gen 16S RNA

ribosome của 13 mẫu nhóm 16SrI, 16 mẫu nhóm 16SrII và 63 mẫu đại diện cho

các nhóm khác đã đƣợc căn trình tự đa chuỗi (phụ lục 4). Dựa trên kết quả so

sánh trình tự đã xác định đƣợc một vùng gen khoảng 300 nucleotide nằm phía

đầu 3‟ của các chuỗi gen. Vùng này khá bảo thủ trong nhóm 16SrII nhƣng có thể

phân biệt đƣợc với các nhóm khác (hình 4.13).

Phản ứng LAMP truyền thống yêu cầu 4 mồi đƣợc thiết kế trên 6 trình tự

riêng biệt trên đoạn gen quan tâm (mục 2.2.9.5). Tuy nhiên gần đây, một cải tiến

(Nagamine et al., 2002) đã chứng tỏ bổ sung thêm một cặp mồi đƣợc thiết kế ở 2

vùng thòng lọng, gọi là mồi thòng lọng xuôi và mồi thòng lọng ngƣợc (Loop F,

Loop B), có thể làm tăng tốc độ cũng nhƣ độ nhạy của phản ứng LAMP. Nhƣ

vậy trong phản ứng LAMP cải tiến, có tổng số 6 mồi đƣợc thiết kế trên 8 trình tự

của vùng gen đích (hình 4.17). Hiện nay, phản ứng LAMP cải tiến đƣợc sử dụng

phổ biến hơn so với LAMP truyền thống.

Sau khi xác định đƣợc vùng phù hợp để thiết kế mồi, sử dụng trình tự gen

16S RNA ribosome của mẫu phytoplasma đại diện nhóm 16SrII làm khuôn để

thiết kế mồi. Mẫu sử dụng là mẫu phytoplasma phân lập từ sắn thu tại Đồng Nai

(T7-ĐN, mã truy cập KM280679).

9 7

Hình 4.13. Minh họa một phần vùng gen 16S RNA ribosome chứa các trình tự phytoplasma nhóm 16SrII với các nhóm còn lại. Các mẫu đƣợc căn trình tự đa chuỗi bằng phần mềm ClustalX

Hình 4.14. Vị trí các trình tự trên vùng gen mục tiêu và các mồi tƣơng ứng trong kỹ thuật LAMP cải tiến

nhất trên vùng gen đích của mẫu T7-ĐN (KM280679) (hình 4.15).

Nguồn: Mori and Notomi (2009) Dựa trên 4 yếu tố chủ chốt là nhiệt độ tách mồi (melting temparature, Tm), độ ổn định đầu 3‟, hàm lƣợng GC và cấu trúc thứ cấp, đã chọn đƣợc 8 trình tự tốt

Hình 4.15. Tám đoạn trình tự đƣợc lựa chọn để thiết các mồi LAMP cải tiến đặc hiệu nhóm 16SrII. Các trình tự đƣợc lựa chọn bằng phần mềm trực tuyến PrimerExplorer V4 dùng trình tự của mẫu phytoplasma T7-ĐN làm khuôn. Ký hiệu các đoạn trình tự tƣơng ứng với sơ đồ hình 4.14.

Các đặc điểm quan trọng của các đoạn trình tự (bảng 4.18) cho thấy chúng

rất phù hợp để thiết kế các mồi LAMP.

Bảng 4.18. Đặc điểm 8 trình tự phù hợp trên gen mã hóa 16S RNA ribosome để thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII

S TT Vùng

Trình tự (5‟-3‟)

Vị trí* Độ dài (nst)

Nhiệt độ tách sợi (oC)

Mấu GC đầu 3‟

Số liên kết tự mồi hóa

Hàm lƣợng GC (%)

Năng lƣợng tự do đầu 3‟ (kcal/mol)

Năng lƣợng tự mồi (kcal/mol)

Số liên kết tự tạo cấu trúc kẹp tóc

Xếp hạng (thang 100 điểm)

Năng lƣợng tự tạo cấu trúc kẹp tóc (kcal/mol)

1 F3

CCTTACCAGGTCTTGACATG

868

60,0

50,0

93,3

- 0,1

2 B3

TGTAACAGCCATTGTATCACG

1.137

60,7

42,9

86,4

- 1,5

9 9

3 Loop F GACAACCATGCACCACCT

949

62,4

55,6

- 1,3

- 1,1

89,8

4 Loop B GGACTTTAACGAGACTGCCA

1.031

62,1

50,0

86,6

- 1,2

5 F2

GTAATATCGTGGAGGTTACCAG

904

60,1

45,5

93,3

0,8

6 F1c

CCTAACATCTCACGACACGAGC

975

65,2

54,5

92,2

- 2,0

7 B2

TCCTCACCTTCCTCCAATT

1.075

60,0

47,4

93,3

0,3

8 B1c

TTAGTTGCCAGCACGTTATGGT

1.007

64,9

45,5

92,0

0,3

-1

* Vị trí trên trình tự mẫu T7-ĐN (mã truy cập KM280679)

Nhiệt độ tách sợi Tm của F1c và B1c lần lƣợt là từ 65,2oC và 64,9oC (nằm trong khoảng tối ƣu 64 - 66oC) và cao hơn so với Tm của F2, B2, F3, B3 với giá trị lần lƣợt là 60,1oC; 60,0oC; 60,0oC và 60,7oC (nằm trong khoảng tối ƣu 59 - 61°C). Nhiệt độ Tm của 2 trình tự thòng lọng Loop F và Loop lần lƣợt là 62,4oC và 62,1oC (hơi thấp hơn so với nhiệt độ tối ƣu 64 - 66oC).

Năng lƣợng tự do đầu G của các trình tự (đầu 3‟ hay nội bộ trình tự) đều

thấp, từ 0,1 đến 0,8 kcal/mol, thấp hơn so với khuyên cáo (nhỏ hơn 4

kcal/mol) và thiếu các liên kết trong nội bộ mồi hoặc giữa các mồi dẫn tới chúng

khó hoặc không thể hình thành các sản phẩm tự mồi hóa hoặc tạo các cấu trúc

thứ cấp dạng kẹp tóc (hairpin).

Hàm lƣợng GC của các đoạn trình tự từ 42,9% đến 55,6%, nằm trong

khoảng cho phép từ 40% đến 65%.

Các thông số trên đã dẫn tới điểm của các trình tự khá cao, từ 86,4 đến 93,3

điểm (theo thang điểm 100 của phần mềm).

Dựa trên 8 trình tự lựa chọn trên, một bộ 8 mồi LAMP đƣợc thiết kế nhƣ

trình bày ở bảng 4.19.

Bảng 4.19. Trình tự các mồi LAMP cải tiến đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII

Tên mồi Loại mồi Trình tự mồi 5‟- 3‟

Kích thƣớc (nts)

CWBII-F3 F3 CTTTACCAGGTCTTGACATG 20

CWBII-B3 B3 TGTAACAGCCATTGTATCACG 21

CWBII-FIP FIP 44

CTTAACATCTCACGACACGAGC GTAATATCGTAGAGGTTACCAG

CWBII-BIP BIP 38

TTAGTTGCCAGCACGTTATGGTT CCTCACCTTCCTCTT

18 CWBII-LoopF Loop F GACAACCATGCACCACCT

Các mồi LAMP-PCR thiết kế gồm CWB-F3, CWB-B3, CWB-FIP, CWB- BIP, CWB-F-loop, CWB-B-loop đƣợc tổng hợp bởi hãng Macrogen (Hàn Quốc) và chúng đƣợc ứng dụng để đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma thuộc

nhóm 16SrII hại sắn tại Đông Nam Bộ.

100

17 CWBII-LoopB Loop B GGACTTTAACGATGACA

4.4.2. Đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma của bộ mồi LAMP

4.4.2.1. Khả năng phân biệt nhóm 16SrI và 16SrII của bộ mồi LAMP

Trƣớc tiên, thử nghiệm khả năng phân biệt 2 nhóm phytoplasma gây hại trên sắn của bộ mồi LAMP tự thiết kế. DNA tổng số của 4 mẫu cây sắn bệnh

chổi phù thuỷ với phytoplasma gây bệnh đƣợc xác định trƣớc bằng PCR và giải

trình tự đã đƣợc sử dụng để kiểm tra bộ mồi LAMP (bảng 4.20 và hình 4.16).

Bảng 4.20. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số chiết từ cây

STT Mẫu thử Nhóm Kết quả

phytoplasma* LAMP**

1 DNA tổng số cây sắn bệnh chổi phù thuỷ 1 16SrII +

2 DNA tổng số cây sắn bệnh chổi phù thuỷ 2 16SrI –

3 DNA tổng số cây sắn bệnh chổi phù thuỷ 3 16SrII +

4 DNA tổng số cây sắn bệnh chổi phù thuỷ 4 16SrII +

5 DNA tổng số cây sắn khỏe (đối chứng) –

Ghi chú: * Nhóm của mẫu kiểm tra đã đƣợc xác định bằng PCR lồng và giải trình tự ** (–) là phản ứng âm tính; (+) là phản ứng dƣơng tính.

6 Nƣớc siêu sạch Invitrogen (đối chứng) –

Hình 4.16. Kết quả điện di sản phẩm LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số chiết từ cây

M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ 1 đến 6: các mẫu thử nghiệm ở bảng 4.20.

Kết quả kiểm tra cho thấy bộ mồi LAMP đã cho kết quả dƣơng tính trên 3 mẫu DNA tổng số đƣợc chiết bằng CTAB từ các cây sắn bị nhiễm với phytoplasma nhóm 16SrII. Các mồi này cho kết quả âm tính đối với mẫu cây bị nhiễm phytoplasma nhóm 16SrI và cả đối chứng cây khỏe cũng nhƣ nƣớc siêu

sạch (Invitrogen).

101

Tƣơng tự, cũng thử nghiệm bộ mồi LAMP tự thiết kế với các mẫu thử là sản phẩm PCR đã tinh sạch (dùng QIAquick gel extraction kit, GmbH) đƣợc

nhân lên từ nguồn cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ. Các mẫu kiểm tra đã đƣợc xác

định thuộc nhóm 16SrII bằng giải trình tự. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở

bảng 4.21 và hình 4.17.

Bảng 4.21. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ sản phẩm PCR tinh sạch

STT Mẫu thử* Nhóm Kết quả

phytoplasma** LAMP***

1 Sản phẩm PCR tinh sạch 1 16SrII +

2 Sản phẩm PCR tinh sạch 2 16SrII +

3 Sản phẩm PCR tinh sạch 3 16SrII +

4 Sản phẩm PCR tinh sạch 4 16SrII +

5 DNA tổng số cây sắn khỏe (đối chứng) –

Ghi chú: * Phản ứng PCR lồng đƣợc thực hiện dùng cặp mồi R16mF1/R16mR1; **Nhóm của mẫu kiểm tra đã đƣợc giải trình tự; *** (–) là phản ứng âm tính; (+) là phản ứng dƣơng tính.

6 Nƣớc siêu sạch Invitrogen (đối chứng) –

Hình 4.17. Kết quả điện di sản phẩm LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ sản phẩm PCR tinh sạch

M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ 1 đến 6: các mẫu thử nghiệm ở bảng 4.21.

Kết quả kiểm tra cho thấy bộ mồi LAMP đã cho kết quả dƣơng tính trên 4 mẫu sản phẩm PCR tinh sạch từ các cây sắn bị nhiễm với phytoplasma nhóm 16SrII. Các mồi này cho kết quả âm tính đối với đối chứng cây khỏe cũng nhƣ

nƣớc siêu sạch (Invitrogen).

Nhƣ vậy, bộ mồi LAMP đều có khả năng phát hiện phytoplasma nhóm

16SrII từ DNA tổng số và từ sản phẩm PCR đã tinh sạch.

102

4.4.2.2. Khả năng phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII của bộ mồi LAMP trên

các loại mẫu bệnh khác nhau

Từ kết quả trên, tiến hành thử khả năng phát hiện phytoplasma từ các bộ

phận khác nhau (gân lá, vỏ thân, lá ngọn) cũng nhƣ cách bảo quản mẫu (tƣơi và bảo quản khô bằng silicagel). Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 4.22 và

hình 4.18.

Bảng 4.22. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma từ các loại mẫu sắn khác nhau bị bệnh chổi phù thuỷ

STT Mẫu thử* Nguồn gốc Loại mẫu Kết quả

LAMP**

1 DNA tổng số 1 Gân lá tƣơi +

Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai, 7/12/2013 2 DNA tổng số 2 3 DNA tổng số 3 Phiến lá ngọn tƣơi Vỏ thân tƣơi – –

4 DNA tổng số 1 5 DNA tổng số 2 Gân lá khô Gân lá khô + +

– – 6 DNA tổng số 3 7 DNA tổng số 4 Châu Pha, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu, 24/4/2011 Phiến lá ngọn khô Phiến lá ngọn khô

8 DNA tổng số 5 9 DNA tổng số 6 Gân lá khô Gân lá khô – –

10 DNA tổng số 2 Gân lá tƣơi +

Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai, 7/12/2013

– 11 Nƣớc siêu sạch Invitrogen

Ghi chú: * (–) là phản ứng âm tính; (+) là phản ứng dƣơng tính.

+ 12 T7 - ĐN Sản phẩm PCR tinh sạch

Hình 4.18. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma từ các loại mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ khác nhau

M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ 1 đến 12: các mẫu thử nghiệm ở bảng 4.22.

103

Kết quả kiểm tra (bảng 4.22) cho thấy phản ứng bộ mồi LAMP có thể phát hiện phytoplasma trên cây sắn bị bệnh ở cả mẫu bảo quản tƣơi hoặc mẫu bảo

quản khô, các mẫu sắn khỏe và nƣớc cất vô trùng cho kết quả âm tính. Bộ mồi

LAMP đã cho kết quả dƣơng tính 4 mẫu DNA tổng số đƣợc chiết bằng CTAB từ

các gân lá tƣơi hoặc gân lá khô của cây sắn bị nhiễm với phytoplasma nhóm 16SrII. Các bộ phận thử nghiệm khác nhƣ vỏ thân, phiến lá ngọn ở cả mẫu bảo

quản tƣơi hoặc mẫu bảo quản khô đều cho kết quả âm tính đối với đối với bộ mồi

LAMP này.

Nhƣ vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy bộ mồi LAMP thiết kế hoàn toàn có

thể phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII gây hại trên cây sắn ngoài đồng. Đây là

kết quả đầu tiên sử dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm

16SrII hại sắn tại Việt Nam.

Từ các kết quả nhƣ đã trình bày ở các phần trên, đề xuất quy trình chẩn

đoán, giám định phytoplasma hại sắn cho một số tỉnh Đông Nam Bộ

(phụ lục 5).

4.5. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BỆNH CHỔI PHÙ THUỶ HẠI SẮN DO PHYTOPLASMA GÂY RA

Tiến hành xác định một số đặc trƣng sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn

do phytoplasma gây ra trong năm 2011 - 2013 trong điều kiện thí nghiệm tại vùng

Đông Nam Bộ.

4.5.1. Ảnh hƣởng của đất và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh

Bằng phƣơng pháp nhân giống vô tính, sắn chủ yếu đƣợc lấy từ phần thân

để làm hom giống. Việc sử dụng hom giống không bị bệnh là điều rất quan trọng,

điều này góp phần kiểm soát đƣợc nguồn vật liệu giống ban đầu, tránh cho bệnh

lây lan nhanh trên đồng. Hom giống sắn KM94 nhiễm bệnh (kiểm tra PCR cho kết

quả dƣơng tính với phytoplasma) và hom giống sắn KM94 khoẻ đƣợc dùng trong thí nghiệm, tiến hành khử trùng đất bằng hơi nƣớc nóng 121oC trong thời gian 30 phút và lấy đất ở ruộng trồng có cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ ở ngay

phần gốc cây. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 4.23.

Kết quả thí nghiệm cho thấy, chỉ có cây sắn mọc từ hom sắn đã bị bệnh mới phát triệu chứng đặc trƣng của bệnh chổi phù thuỷ, trong khi đó cây sắn mọc từ hom sắn khỏe không thấy bị nhiễm bệnh. Trong điều kiện chậu vại trong nhà lƣới, chế độ chăm sóc là nhƣ nhau, sắn KM94 mọc từ hom đƣợc lấy từ phần phía gần

104

ngọn của cây sắn đã bị bệnh chổi phù thuỷ thì thời gian mọc mầm muộn hơn so với hom giống khoẻ từ 3-5 ngày, hom sắn KM94 khoẻ có thời gian mọc mầm là

11 ngày.

Bảng 4.23. Ảnh hƣởng của đất trồng và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn (Đồng Nai, năm 2012)

STT Công thức thí nghiệm*

Tỷ lệ cây phát bệnh Kiểm tra PCR (số cây Kết luận về

PCR

sau 9 tháng (%) nhiễm/số cây thử)

1 43,3 5/5 +

CT1: Trồng hom sắn bị bệnh chổi phù thuỷ trên đất đã hấp khử trùng

2 0,0 0/5 

3 56,7 5/5 +

CT2: Trồng hom sắn khoẻ trên đất trồng có cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ CT3: Trồng hom sắn bị bệnh chổi phù thuỷ trên đất trồng có cây sắn bị bệnh chổi

4 phù thuỷ CT4: Trồng hom sắn khỏe trên đất đã 0,0 0/5 

Ghi chú: * n = 30 cây; (–) phản ứng âm tính; (+) phản ứng dƣơng tính; LSD0,05 = 7,12.

Từ hom sắn KM94 đã bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ khi trồng trong chậu vại,

triệu chứng bệnh ban đầu có thể quan sát thấy đƣợc khoảng 2 tuần sau khi hom

mọc mầm lên khỏi mặt đất với triệu chứng cây sinh trƣởng kém, cây còi cọc, lá

nhỏ lại, biến vàng. Triệu chứng bệnh điển hình thƣờng quan sát thấy rõ sau 2

tháng, ngoài triệu chứng lá nhỏ lại, biến vàng còn thấy phía trong vỏ thân và phần lõi thân xuất hiện các vết chết hoại màu nâu nhạt, trong nhiều trƣờng hợp

cây thí nghiệm bị nhiễm bệnh nặng nên cây rất yếu ớt và có thể chết đi (hình

4.19-B).

Trong thí nghiệm này còn cho thấy rằng, ở giai đoạn từ mọc - cây con, các

đoạn hom lấy từ phần sát gốc không có triệu chứng vết chết hoại phía trong vỏ thân mặc dù của cùng một cây sắn KM94 nhiễm bệnh chổi phù thuỷ nhƣng thời gian xuất hiện triệu chứng bệnh muộn hơn, thậm chí triệu chứng còn ở dạng tiềm ẩn so với hom đƣợc lấy từ phần phía gần ngọn của cây sắn KM94 đã bị bệnh chổi

phù thuỷ. Sau 9 tháng theo dõi, tƣơng ứng với giai đoạn chờ thu hoạch của giống

sắn KM94 trên đồng, triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ xuất hiện điển hình nhƣ cây mọc nhiều chồi ở phần thân chính, lá cây nhỏ lại, biến màu vàng hoặc tím nhạt

105

hấp khử trùng

và thô cứng, đốt thân ngắn lại, ở nhiều cây thấy phía trong vỏ thân hoặc vỏ củ sắn có các vết hoại màu nâu, phần lõi có màu nâu nhạt. Điều này hoàn toàn phù

hợp với kết quả điều tra, theo dõi bệnh ở trên đồng.

Hom sắn KM94 bệnh trồng trên đất đã hấp khử trùng và đất trồng có cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ đều thể hiện triệu chứng chổi phù thuỷ xuất hiện gây

hại, ngƣợc lại hom sắn KM94 khỏe khi trồng trên cả hai loại đất này đều không

xuất hiện triệu chứng bệnh. Tỷ lệ bệnh cao nhất ở công thức 3 (17/30 cây), tiếp

theo là công thức 1 (13/30 cây). Để khẳng định chắc chắn hơn nữa, sử dụng kỹ thuật PCR lồng bằng các cặp mồi phát hiện phytoplasma gây hại trên sắn nhƣ các

phần đã trình bày ở trên, mỗi 1 công thức kiểm tra đại diện 5 cây, kết quả kiểm

tra cho thấy rằng, chỉ có hom sắn KM94 khoẻ trồng trên đất đã hấp khử trùng (5/5) và đất trồng có cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ (5/5) mới cho kết quả PCR

dƣơng tính. Các kết quả nghiên cứu đã cho biết rằng, do phytoplasma là tác nhân

gây bệnh nhiễm hệ thống, giới hạn trong mạch phloem, nên truyền qua nhân

giống vô tính nhƣ ghép, củ giống, hom giống, thân ngầm là con đƣờng lan truyền

quan trọng, có thể đƣợc xem là quan trọng nhất đối với các loài cây đƣợc nhân

giống vô tính (Lee et al., 2000; Christensen et al., 2005; Duduk and Bertaccini,

2006). Nhƣ vậy, bệnh phytoplasma gây hại sắn KM94 chỉ lan truyền qua nhân

giống vô tính từ cây đã bị nhiễm bệnh trong thí nghiệm chậu vại.

Hình 4.19. Ảnh thí nghiệm ảnh hƣởng của đất trồng đến khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ sắn trong thí nghiệm nhà lƣới (năm 2012)

A) Cây sắn giống KM94 khỏe trồng trên đất đã hấp khử trùng (công thức 4); B) Cây sắn giống KM94 nhiễm bệnh chổi phù thuỷ sắn trồng trên đất đã hấp khử trùng (công thức 1).

Trong sản xuất, phƣơng pháp nhân giống sắn trồng chủ yếu là qua hom. Trong năm 2013, các giống sắn gồm KM94, KM419 và KM937-26 đã bị nhiễm

106

bệnh chổi phù thuỷ do phytoplasma gây ra đƣợc đánh giá phản ứng biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh trên ruộng sản xuất tại vùng có áp lực bệnh cao của tỉnh Đồng Nai (bảng 4.24).

Bảng 4.24. Ảnh hƣởng của nguồn vật liệu hom giống đến tỷ lệ bệnh chổi phù thuỷ (Đồng Nai, năm 2013)

STT Công thức thí nghiệm

1 CT1: KM94

2 CT2: KM419

Ghi chú: Kết quả xử lý thống kê LSD0,05 = 2,95.

Kết quả thí đánh giá ảnh hƣởng của nguồn gốc vật liệu hom giống ở trên đồng cho thấy rằng, hom sắn KM94, KM419 và SM937-26 đã bị nhiễm bệnh

chổi phù thuỷ khi trồng ngoài đồng chịu ảnh hƣởng của nhiều điều kiện ngoại

cảnh khác nhau, triệu chứng bệnh ban đầu có thể quan sát thấy đƣợc khoảng 2

tuần và triệu chứng bệnh điển hình thƣờng quan sát thấy rõ sau 2 tháng khi hom

mọc mầm lên khỏi mặt đất. Cây nhiễm bệnh có lá nhỏ lại, biến vàng, phía trong

vỏ thân và phần lõi thân xuất hiện các vết chết hoại màu nâu nhạt, trong nhiều

trƣờng hợp cây thí nghiệm bị nhiễm bệnh nặng nên cây rất yếu ớt và có thể chết

đi. Tuỳ thuộc vào giống và điều kiện ngoại cảnh, thời gian mọc mầm của các giống có thể khác nhau nhƣng triệu chứng nhiễm bệnh chổi phủ thuỷ ở giai đoạn

từ mọc - cây con là giống nhau.

Trong thí nghiệm này cũng cho thấy rằng, ở giai đoạn từ mọc - cây con, các

đoạn hom lấy từ phần sát gốc không có triệu chứng vết chết hoại phía trong vỏ

thân mặc dù của cùng một cây sắn đã bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ nhƣng thời

gian xuất hiện triệu chứng bệnh muộn hơn, thậm chí triệu chứng còn ở dạng tiềm ẩn so với hom đƣợc lấy từ phần phía gần ngọn của cùng cây sắn đã bị bệnh chổi

phù thuỷ. Sau 9 tháng theo dõi, tƣơng ứng với giai đoạn chờ thu hoạch của giống sắn KM94 trên đồng, triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ xuất hiện điển hình nhƣ cây

mọc nhiều chồi ở phần thân chính, lá cây nhỏ lại, biến màu vàng hoặc tím nhạt và thô cứng, đốt thân ngắn lại, ở nhiều cây thấy phía trong vỏ thân hoặc vỏ củ sắn có các vết hoại màu nâu, phần lõi có màu nâu nhạt. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả điều tra, theo dõi bệnh ở điều kiện chậu vại trong nhà lƣới và điều tra trên đồng. Sau gần 9 tháng trồng, đánh giá bằng quan sát triệu chứng

bệnh cho thấy tỷ lệ bệnh chổi phù thuỷ trên giống sắn KM419 là cao nhất

107

3 CT3: SM937-26 Tỷ lệ bệnh (%) 7,36b 19,20a 6,08b

(19,20%), tiếp theo là giống sắn SM937-26 (6,08%). Kết quả điều tra, theo dõi bệnh ở trên đồng cũng cho thấy giống sắn KM419 có mức độ mẫn cảm cao nhất

đối với bệnh chổi phù thuỷ do phytoplasma gây ra. Kết quả thí nghiệm đã cho

thấy rằng, không phải tất cả các hom sắn trồng từ giống đã bị bệnh chổi phù thuỷ

đều biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh, nhiều cây mặc dù đã bị nhiễm bệnh nhƣng triệu chứng bệnh ở dạng tiềm ẩn, đây là mối nguy cơ tiềm ẩn chính để bệnh lây

lan và phát thành dịch khi gặp các điều kiện thuận lợi. Do cây sắn chủ yếu đƣợc nhân giống vô tính bằng hom nên việc kiểm soát hom giống khoẻ mạnh trƣớc khi

đƣa vào trong sản xuất là điều thiết yếu.

4.5.2. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép cây

Nhằm bổ sung cho những nghiên cứu về lan truyền của bệnh phytoplasma gây hại sắn, thí nghiệm ghép đƣợc thực hiện ở điều kiện chậu vại trong nhà lƣới, giống sắn KM94 nhiễm bệnh (kiểm tra PCR cho kết quả dƣơng tính với phytoplasma) và giống sắn KM94 khoẻ đƣợc dùng trong thí nghiệm. Áp dụng kỹ thuật ghép vát, cành ghép đƣợc cắt vát hình chữ V theo hƣớng từ phía trên xuống, còn gốc ghép đƣợc cắt theo hƣớng ngƣợc lại với cành ghép. Cây thí nghiệm đƣợc trồng trên đất đã hấp khử trùng (bảng 4.25).

Bảng 4.25. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua phƣơng pháp ghép (Đồng Nai, năm 2012)

STT Công thức thí nghiệm*

Kết luận về PCR

Số cây biểu hiện triệu chứng/số cây ghép thành công (cây) 6/20 Kiểm tra PCR (số cây nhiễm/số cây thử) 6/6 1 ghép KM94 +

2 ghép KM94 0/22 0/6 

Ghi chú: * n = 30 cây; (–) là phản ứng âm tính; (+) là phản ứng dƣơng tính.

Kết quả thí nghiệm ghép cho thấy, ở công thức ghép cành KM94 khỏe lên gốc cây ghép KM94 khỏe thì cây không biểu hiện triệu chứng bệnh ở những ghép nối thành công (0/22 cây). Sử dụng kỹ thuật PCR lồng bằng các cặp mồi phát hiện phytoplasma gây hại trên sắn để kiểm tra đại diện 6 cây ghép nối thành

công đều cho kết quả âm tính () tức là cây không bị nhiễm bệnh. Ở công thức

ghép cành KM94 khỏe lên gốc cây ghép KM94 bị bệnh chổi phù thuỷ mới quan sát thấy cây biểu hiện triệu chứng (6/20 cây), cây mới biểu hiện triệu chứng vàng

108

CT1: Cành khỏe/gốc ghép KM94 bệnh CT2: Cành khỏe/gốc ghép KM94 khỏe

lá, lá nhỏ lại, chƣa phát búi đặc trƣng của bệnh chổi phù thuỷ hại trên cây sắn ngoài đồng, kết hợp kiểm tra PCR lồng để kiểm tra các cây ghép nối thành công

đều cho kết quả dƣơng tính (+) với phytoplasma.

So với kết quả nghiên cứu của Alvarez et al. (2009) cho biết, tỷ lệ bệnh lan truyền từ cành ghép của cây sắn giống SM909-25 bị bệnh da cóc tại Cô-lôm-bi-a

lên gốc ghép của cây sắn khỏe là 83,3% (5/6 cây bị nhiễm bệnh) và từ cành ghép

của cây sắn giống SM909-25 bị bệnh da cóc lên gốc ghép của cây dừa cạn

khỏe cũng đạt 83,3% (5/6 cây bị nhiễm bệnh). Nhƣ vậy, bệnh chổi phù thuỷ hại

sắn do phytoplasma gây ra có khả năng lan truyền qua phƣơng pháp ghép cây.

Hình 4.20. Ảnh thí nghiệm xác định khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua phƣơng pháp ghép

A) Cành ghép KM94 khỏe ghép lên gốc ghép KM94 bị nhiễm bệnh; B) Cành ghép KM94 khỏe ghép lên gốc ghép KM94 khỏe. C) Kết quả kiểm tra PCR lồng đối với mẫu cành ghép KM94 khỏe ghép lên gốc ghép KM94 bị nhiễm bệnh; D) Kết quả kiểm tra PCR lồng đối với mẫu cành ghép KM94 khỏe ghép lên gốc ghép KM94 khỏe.

4.5.3. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng

Tơ hồng (Cuscutas spp.) đƣợc dùng làm vật liệu thí nghiệm trong nghiên

cứu bệnh hại thực vật, cây tơ hồng đƣợc coi là vật trung gian để xác định bệnh

hại, trong đó có bệnh phytoplasma. Tơ hồng có thể truyền dễ dàng phytoplasma

và do đó thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ một loại vector hiệu quả để truyền phytoplasma sang cây thí nghiệm (Přibylová and Špak, 2013). Trong thí nghiệm

này, tơ hồng đƣợc thu thập từ hạt và gieo trong khay đĩa đến khi mọc mầm đƣa lên cây thí nghiệm. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) đƣợc coi là cây chỉ thị trong nghiên cứu bệnh do phytoplasma gây ra vì loài cây này mẫn cảm với tác nhân gây bệnh phytoplasma và đƣợc dùng làm cây duy trì, cây nhân nguồn trong nghiên cứu bệnh cây. Cây dừa cạn đƣợc trồng từ hạt để thu nguồn cây sạch làm thí nghiệm. Sử dụng giống sắn KM94 bị bệnh chổi phù thuỷ thu thập tại Đồng

Nai làm nguồn bệnh (bảng 4.26).

109

Bảng 4.26. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng (Đồng Nai, năm 2012)

STT Công thức thí nghiệm* Tỷ lệ cây phát Kiểm tra PCR Kết luận

về PCR

bệnh sau 9 tháng (%) (số cây nhiễm/số cây thử)

1 CT1: KM94 bệnh chổi phù 13,3 2/5 +

thuỷ - Tơ hồng - KM94 khỏe CT2: KM94 bệnh chổi phù thuỷ 2 26,7 4/5 +

- Tơ hồng - Cây dừa cạn khỏe CT3: KM94 khỏe - Tơ hồng – 3 0,0 0/5 

Ghi chú: * n = 15 cây; (–) là phản ứng âm tính; (+) là phản ứng dƣơng tính; LSD0,05 = 2,80.

KM94 khỏe

Hình 4.21. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng

A) Tơ hồng bám dính lên cây dừa cạn (CT2); B) Triệu chứng bệnh trên cây dừa cạn sau khi cắt ngọn (CT2); C) Tơ hồng (Cuscutas spp.) bám dính lên cây sắn khỏe (CT3); D) So với triệu chứng bệnh trên cây dừa cạn sau khi cắt ngọn

110

Nguồn ảnh (D): Mejia (2014)

Kết quả thí nghiệm cho thấy tơ hồng bám dính tốt lên các cây thí nghiệm.

Tuy nhiên, triệu chứng bệnh lâu xuất hiện (9 tháng) và tỷ lệ cây nhiễm bệnh thấp,

trong đó lan truyền từ cây sắn bệnh qua tơ hồng lên cây sắn khỏe là 13,3% (2/15

cây bị nhiễm bệnh), còn lan truyền từ cây sắn bệnh qua tơ hồng lên cây dừa cạn

(C. roseus) khỏe là 26,7% (4/15 cây bị nhiễm bệnh) và đều cho kết quả PCR

dƣơng tính (+).

Triệu chứng bệnh quan sát rõ nhất ở trên cây dừa cạn với triệu chứng lá

biến vàng, khi cắt phần ngọn thì cây dừa cạn nhiễm bệnh có triệu chứng lá biến

vàng, bề mặt lá gồ ghề, triệu chứng của cây nhiễm bệnh cũng giống với kết quả

thí nghiệm của Mejia (2014). Tác giả Mejia (2014) cho lan truyền từ cây sắn

nhiễm bệnh chổi phù thuỷ thu thập tại Việt Nam qua tơ hồng lên cây dừa cạn

(C. roseus) khỏe, cây dừa cạn cắt ngọn cũng có triệu chứng lá biến vàng và lá co

nhỏ lại, tỷ lệ bệnh khi lây nhiễm bằng phƣơng pháp này là 33,3% (2/6 cây bị

nhiễm bệnh), kết hợp kiểm tra PCR lồng đều cho kết quả dƣơng tính. So với kết

quả nghiên cứu của Alvarez et al. (2009) phytoplasma gây bệnh da cóc hại sắn

tại Cô-lôm-bi-a cho biết, tỷ lệ bệnh lan truyền từ cây sắn bị bệnh da cóc trên

(giống SM909-25) qua tơ hồng lên cây sắn khỏe là 16,7%, còn lan truyền từ cây

sắn bị bệnh da cóc qua tơ hồng lên cây dừa cạn khỏe là 33,3%.

Tiến hành giải trình tự mẫu cây sắn nhiễm bệnh (công thức 1) và mẫu cây

dừa cạn nhiễm (công thức 2) đối với sản phẩm PCR lồng (R16F2n/R16R2) và

tìm kiếm các chuỗi tƣơng đồng bằng công cụ trực tuyến BLAST trên Ngân hàng

Gen cho thấy trình tự nucleotide từ sản phẩm PCR của các mẫu bệnh phân lập

trên cây sắn và cây dừa cạn đều là các chuỗi mã hóa 16S RNA ribosome của

phytoplasma gây bệnh cây. Phytoplasma trên cây sắn và cây dừa cạn trong thí

nghiệm này có phần trăm đoạn so sánh 100%, mức đồng nhất trình tự nucleotide

giống 99% với phytoplasma thuộc nhóm 16SrI, trong đó có các mẫu

phytoplasma gây hại sắn xác định tại Thái Lan và quần đảo Wallis-Futuna.

Trình tự nucleotide từ sản phẩm PCR của các mẫu bệnh phân lập trên cây

sắn có kích thƣớc 916 bp và trên cây dừa cạn có kích thƣớc 914 bp (xem chi tiết

ở phụ lục 1 - mục 5). Nhƣ vậy, phytoplasma gây hại sắn tại Đông Nam Bộ có khả

năng lan truyền từ cây sắn bệnh qua tơ hồng lên cây sắn khỏe và từ cây sắn bệnh

qua tơ hồng lên cây dừa cạn khỏe.

111

4.5.4. Khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn qua một số loài

côn trùng

4.5.4.1. Thành phần côn trùng trên sắn

Tất cả côn trùng môi giới của phytoplasma đều thuộc bộ Hemiptera. Các

loài côn trùng thuộc bộ Hemiptera có hành vi chích hút khá đa dạng, có nhóm

chích hút ở mạch phloem, có nhóm chích hút ở mạch xylem. Do phytoplasma chỉ

giới hạn ở mạch phloem nên chỉ nhóm côn trùng chích hút ở loại mô này mới có

khả năng truyền chúng (Wilson and Weintraub, 2007). Hiện có ít nhất 102 loài côn trùng chích hút bộ Hemiptera đã đƣợc xác định là côn trùng môi giới của

phytoplasma, phần lớn thuộc họ Rầy xanh (Cicadellidae).

Nhằm xác định loài côn trùng có khả năng lan truyền bệnh phytoplasma hại

sắn, các đợt điều tra thành phần côn trùng chích hút đƣợc thực hiện trên các

ruộng trồng sắn ở các giai đoạn sinh trƣởng phát triển khác nhau từ năm 2011

đến năm 2013 tại Đông Nam Bộ, kết quả điều tra cho thấy vẫn chƣa phát hiện

thấy loài rầy hoặc loài bọ xít sống trực tiếp và gây hại trên cây sắn ở cả ruộng sắn

bị bệnh chổi phù thuỷ và ruộng sắn không có cây bị bệnh chổi phù thuỷ. Mới chỉ

điều tra thấy loài rệp sáp Paracoccus marginatus và bọ phấn lớn Aleurodicus

dispersus gây hại trực tiếp trên cây sắn ngoài đồng. Tại vùng trồng sắn của các

nƣớc thuộc Đông Nam Á, các tác giả đã xác định đƣợc 7 loài rệp sáp, 3 loài rệp

vảy, 2 loài bọ phấn và 13 loài nhện nhỏ gây hại trên cây sắn, chƣa phát hiện ra

loài rầy hoặc bọ xít sống và gây hại trực tiếp trên cây sắn ngoài đồng (Graziosi et

al., 2016).

4.5.4.2. Kết quả thu thập rầy bằng bẫy đèn

Do không phát hiện thấy loài côn trùng chích hút trên cây sắn trồng ngoài

ruộng, phƣơng pháp bẫy đèn đã đƣợc sử dụng để thu thập rầy (bảng 4.27).

Kết quả cho thấy, tuy chƣa phát hiện thấy loài rầy nào sống, gây hại trực

tiếp trên cây sắn nhƣng dùng phƣơng pháp bẫy đèn đã thu thập đƣợc 15 loài rầy khác nhau. Dựa vào đặc điểm hình thái, 9 loài rầy đã đƣợc định danh tên loài. Tổng số rầy vào bẫy đèn chỉ đạt 405 con, trong đó loài rầy xanh N. nigropictus,

N. virescens chiếm tỷ lệ cao hơn cả lần lƣợt là 26,9% và 15,1%.

Điều đáng chú ý là, có 5/9 loài rầy đã đƣợc định danh tên loài gồm

C. unimaculata, N. virescens, N. nigropictus R. dorsalis và A. atkinsoni đƣợc xác

định là côn trùng môi giới của phytoplasma gây bệnh cây trên thế giới.

112

Bảng 4.27. Kết quả bẫy đèn thu thập một số loài rầy trên vùng trồng sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ (Đồng Nai, năm 2012) Tên khoa học*

Số rầy vào Tên Tỷ lệ Ký

bẫy (con) hiệu tiếng Việt (%)

TF1 Rầy sọc trắng Chƣa xác định 11 2,7

TF2 Rầy xanh lớn TF3 Rầy vân nâu Cofana unimaculata (Signoret) Athysanus atkinsoni (Distant) 8 49 2,0 12,1

TF4 Rầy xanh TF5 Rầy xanh Nephotettix virescens (Distant) Nephotettix nigropictus 61 109 15,1 26,9

TF6 Rầy xám TF7 Rầy xanh lớn Bythoscopes sp. Cofana unimaculata (Signoret) 14 10 3,5 2,5

TF8 Rầy điện quang Recilia dorsalis (Motschulsky) TF9 Rầy vân Chƣa xác định 56 2 13,8 0,5

TF10 Rầy TF11 Rầy xanh Chƣa xác định Parabolocratus rusticusthalia 34 6 8,4 1,5

TF12 Rầy cỏ TF13 Rầy vân nâu Chƣa xác định Athysanus fusconervosus 23 13 5,7 3,2

TF14 Rầy xanh TF15 Rầy đầu vàng Chƣa xác định Chƣa xác định 4 5 1,0 1,2

Tổng số 100%

Các kết quả nghiên cứu trên thế giới đã cho biết rằng, loài rầy điện quang (R. dorsalis) đƣợc xác định là côn trùng môi giới lan truyền phytoplasma nhóm

16SrI gây bệnh vàng lá da cam hại lúa (rice orange leaf phytoplasma) ở

Philippines, Trung Quốc (Hibino et al., 1987; Weintraub and Beanland, 2006; Li

et al., 2015). Hai loài rầy xanh gồm N. virescens và N. nigropictus đƣợc xác định

là côn trùng môi giới lan truyền phytoplasma nhóm 16SrXI gây bệnh vàng lụi lúa

(rice yellow dwarf phytoplasma) ở nhiều nƣớc châu Á (Nakashima and Murata, 1993; Jung et al., 2003; Weintraub and Beanland, 2006). Loài rầy vân nâu

(A. atkinsoni) còn có tên khoa học khác là Exitianus indicus Distant (Duan and Zhang, 2013; Zahniser and Dietrich, 2013). Loài rầy vân nâu này đƣợc xác định là côn trùng môi giới lan truyền phytoplasma nhóm 16SrXIV gây bệnh trắng lá cỏ chỉ (Cynodon dactylon) thuộc họ hoà thảo Poaceace ở Ấn Độ (Kumar et al., 2015). Loài rầy xanh lớn (C. unimaculata) là 1 trong 2 loài côn trùng môi giới lan truyền phytoplasma nhóm 16SrXI gây bệnh chồi cỏ mía (sugarcane grassy

shoot phytoplasma) ở Ấn Độ (Tiwari et al., 2016).

113

405 con Ghi chú: *Tên khoa học đƣợc giám định tại Viện Bảo vệ thực vật (năm 2012).

Hình 4.22. Một số loài rầy thu thập trên vùng trồng sắn có cây bị bệnh chổi phù thuỷ tại Đồng Nai (năm 2012)

Từ (a) đến (o): Ký hiệu mẫu từ TF1 đến TF15 (đƣợc chỉ rõ ở bảng 4.27).

114

Tiếp theo, các loài rầy thu thập tại vùng trồng sắn, tập trung vào 5 loài rầy là côn trùng môi giới của phytoplasma gây bệnh cây, đƣợc nhân nuôi và thả lên

cây sắn nhằm xác định khả năng lan truyền bệnh phytoplasma gây hại sắn.

4.5.4.4. Thí nghiệm xác định khả năng lan truyền của côn trùng thu thập

Thí nghiệm lây nhiễm bệnh nhân tạo cho sắn bằng 15 loài rầy, 1 loài bọ phấn

và 1 loài rệp sáp đã đƣợc thực hiện. Cây sắn giống KM94 khỏe đƣợc lấy từ cây đã

mọc từ hạt không nhiễm bệnh đƣợc dùng làm thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm

loài côn trùng có khả năng lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn qua các năm

khác nhau (2011 - 2013) đƣợc trình bày ở bảng 4.28.

Kết quả thí nghiệm lây nhiễm bệnh nhân tạo cho sắn bằng 15 loài rầy, 1 loài

bọ phấn và 1 loài rệp sáp cho thấy, sau 8 - 9 tháng, thậm chí là 12 tháng trên các

cây thí nghiệm không xuất hiện triệu chứng bệnh. Các loài bọ phấn (A. dispersus),

rệp sáp (P. marginatus) đều có khả năng sống sót và hình thành quần thể trên cây

thí nghiệm nhƣng không có khả năng truyền bệnh, cây không biểu hiện triệu

chứng bệnh. Ở các công thức thí nghiệm thả bọ phấn, rệp sáp với số lƣợng 10

con/1 cây (năm 2011) hoặc 20 con/5 cây (năm 2012), không thấy cây sắn KM94

có biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh chổi phù thuỷ do phytoplasma gây ra. Để

khẳng định chắc chắn hơn nữa, sắn KM94 lây bệnh đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật

PCR lồng với các cặp mồi phát hiện phytoplasma gây hại trên sắn nhƣ các phần

đã trình bày ở trên đều cho kết quả âm tính (). Các kết quả nghiên cứu trên thế

giới cũng cho biết rằng, bọ phấn (A. dispersus), rệp sáp (P. marginatus) không

phải côn trùng môi giới lan truyền phytoplasma gây bệnh cây.

Trong tổng số 15 loài rầy thí nghiệm, rầy đƣợc nhân nuôi trên cây đƣợc trên

các cây họ hoà thảo hoặc rầy đƣợc thu trực tiếp trên đồng rồi chuyển lên cây sắn

KM94 bị bệnh hoặc cây sắn KM94 khoẻ còn non nhƣng rầy chết nhanh, thƣờng 1

- 3 ngày sau khi thả. Ở các công thức thí nghiệm thả 15 rầy khác nhau với số lƣợng

15 con/3 cây (năm 2012), 15 con/7 cây và 32 - 40 con/5 cây (năm 2013), sau 8 - 9

tháng, thậm chí là 12 tháng, không thấy cây sắn KM94 lây nhiễm có biểu hiện

triệu chứng nhiễm bệnh chổi phù thuỷ do phytoplasma gây ra. Để khẳng định chắc

chắn hơn nữa, sắn KM94 lây bệnh đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật PCR lồng với các

cặp mồi phát hiện phytoplasma gây hại trên sắn nhƣ các phần đã trình bày ở trên

đều cho kết quả âm tính ().

115

Bảng 4.28. Xác định khả năng lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn của côn trùng thí nghiệm

Loài côn trùng thí nghiệm Thời gian Số rầy thả/cây Tổng số Tổng số Tổng số cây Kết quả

PCR thí nghiệm

côn trùng thả cây thí nghiệm kiểm tra PCR

Rệp sáp - P. marginatus 10 con/1 cây 90 9 9 – Năm 2011

Bọ phấn - A. dispersus 10 con/1 cây 90 9 9 –

Rệp sáp - P. marginatus Bọ phấn - A. dispersus Năm 2012 20 con/5 cây 20 con/5 cây 60 60 15 15 6 6 – –

1 1 6

Rầy sọc trắng (TF1)* Rầy xanh lớn (TF2) - C. unimaculata 15 con/3 cây 15 con/3 cây 45 45 9 9 9 9 – –

Rầy vân nâu (TF3) - A. atkinsoni Rầy xanh (TF4) - N. virescens 15 con/3 cây 15 con/3 cây 45 45 9 9 9 9 – –

Rầy xanh (TF5) - N. nigropictus Rầy xám (TF6) - Bythoscopes sp. 15 con/3 cây 15 con/3 cây 45 45 9 9 9 9 – –

Rầy xanh lớn (TF7) - C. unimaculata Rầy điện quang (TF8) - R. dorsalis 15 con/3 cây 15 con/3 cây 45 45 9 9 9 9 – –

Rầy vân (TF9)* Rầy (TF10)* 15 con/3 cây 15 con/3 cây 45 45 9 9 9 9 – –

Rầy xanh (TF11) - P. rusticusthalia Rầy cỏ (TF12)* Rầy vân nâu (TF13) - A. fusconervosus Rầy xanh (TF14)* Rầy đầu vàng (TF15)* 15 con/3 cây 15 con/3 cây 15 con/3 cây 15 con/3 cây 15 con/3 cây 45 45 45 45 45 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 – – – – –

Loài côn trùng thí nghiệm Thời gian Số rầy thả/cây Tổng số Tổng số Tổng số cây Kết quả

thí nghiệm PCR

côn trùng thả cây thí nghiệm kiểm tra PCR

Rầy xanh lớn (TF2) - C. unimaculata Lần 1 35 con/5 cây 35 5 5 –

Rầy vân nâu (TF3) - A. atkinsoni năm 2013 32 con/5 cây 32 5 5 –

Rầy xanh (TF4) - N. virescens 40 40 con/5 cây 5 5 –

Rầy xanh (TF5) - N. nigropictus 30 30 con/5 cây 5 5 –

Rầy điện quang (TF8) - R. dorsalis 35 35 con/5 cây 5 5 –

Rầy cỏ (TF12)* 35 35 con/5 cây 5 5 –

Rệp sáp - P. marginatus 35 35 con/5 cây 5 5 –

1 1 7

Bọ phấn - A. dispersus 35 35 con/5 cây 5 5 –

Rầy xanh lớn (TF2) - C. unimaculata Lần 2 15 con/7 cây 15 7 7 –

năm 2013 Rầy vân nâu (TF3) - A. atkinsoni 15 con/7 cây 15 7 7 –

15 15 con/7 cây 7 Rầy xanh (TF4) - N. virescens 7 –

15 15 con/7 cây 7 Rầy xanh (TF5) - N. nigropictus 7 –

15 15 con/7 cây 7 Rầy điện quang (TF8) - R. dorsalis 7 –

15 15 con/7 cây 7 Rầy cỏ (TF12)* 7 –

15 15 con/7 cây 7 Rệp sáp - P. marginatus 7 –

Ghi chú: * Chƣa định danh đƣợc tên loài.

117

15 15 con/7 cây 7 Bọ phấn - A. dispersus 7 –

Kết quả nghiên cứu trên thế giới đã cho biết rằng, loài rầy điện quang (R. dorsalis), rầy xanh (N. virescens và N. nigropictus), rầy vân nâu (A. atkinsoni) và

rầy xanh lớn (C. unimaculata) đƣợc xác định là côn trùng môi giới lan truyền

phytoplasma gây hại trên lúa, mía và cỏ chỉ (Cynodon dactylon) đều thuộc họ

hoà thảo Poaceace (Hibino et al., 1987; Nakashima and Murata, 1993; Weintraub and Beanland, 2006; Jung et al., 2003; Li et al., 2015; Kumar et al.,

2015; Tiwari et al., 2016). Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu trong thí nghiệm này

chƣa thấy 5 loài rầy trên có khả năng lan truyền phytoplasma gây hại trên cây sắn.

Nhƣ vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy tất cả 17 loài côn trùng đều không

phải môi giới truyền phytoplasma gây hại sắn tại Đông Nam Bộ. Sự có mặt của

phytoplasma trong cơ thể rầy (đƣợc phát hiện bằng PCR) có thể do phytoplasma tồn tại trong dịch cây trong ruột đƣợc rầy chích hút trên cây ký chủ ƣa thích

nhiễm phytoplasma và không đảm bảo rằng nó có thể truyền đƣợc sang cây khỏe

(Vega et al., 1993). Khi phytoplasma đƣợc nhân lên với số lƣợng đạt mức xâm

nhiễm trong tuyến nƣớc bọt, nếu côn trùng môi giới chích hút vào cây khỏe thì

phytoplasma có thể đƣợc truyền lan sang cây khỏe hay không còn phụ thuộc vào

cây ký chủ của côn trùng môi giới. Vì phytoplasma truyền qua côn trùng môi

giới rầy theo kiểu bền vững tuần hoàn nên để có thể truyền đƣợc qua côn trùng

môi giới, phytoplasma phải vƣợt qua nhiều lớp rào cản gồm lớp tế bào thành

ruột, lớp tế bào thành tuyến nƣớc bọt (Weintraub and Beanland, 2006;

Hogenhout et al., 2008). Trong vòng 43 năm qua (từ năm 1972 đến 2015), việc

xác định loài côn trùng có khả năng lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn trên thế

giới vẫn chƣa đƣợc tìm thấy (Costa and Kitajima, 1972; Frison and Feliu, 1991;

Lozano, 1992; Davis et al., 2005; Alvarez et al., 2009; Flôres et al., 2013; Souza

et al., 2014; Mejia, 2014).

Qua kết quả nghiên cứu đã cho thấy rằng, triệu chứng chổi phù thuỷ hại sắn

biểu hiện đặc trƣng nhất ở giai đoạn chờ thu hoạch-thu hoạch nhƣ cây mọc nhiều

chồi phụ ở ngọn và phần thân chính, lá cây nhỏ lại, biến vàng hoặc tím nhạt và thô cứng, đốt thân ngắn lại. Vì ký sinh trong tế bào ống rây của mạch phloem nên phytoplasma đã ức chế quá trình vận chuyển các sản phẩm đồng hóa, chủ yếu là carbonhydrate, từ mô sản xuất nhƣ lá trƣởng thành, tới các mô tiêu thụ nhƣ rễ, củ và lá non. Hậu quả là các mô sản xuất đã tích lũy lƣợng lớn bất thƣờng các sản phẩm đồng hóa, còn các mô tiêu thụ lại bị thiếu hụt nghiêm trọng các chất này. Một số protein của phytoplasma đã can thiệp vào một loạt các đƣờng hƣớng sinh

118

học liên quan đến sinh trƣởng, phát triển và biệt hóa mô của thực vật; nhƣ protein SAP11 làm mất tính ổn định của protein điều khiển phiên mã CINCINNATA-

chịu trách nhiệm điều khiển sự thành thục và già hóa của mô, protein SAP54

tƣơng tác với protein RAD23 của tế bào ký chủ, dẫn tới phân hủy 2 protein điều

khiển phiên mã là AP1 và LEAFY - là 2 protein đóng vai trò chủ chốt trong quá trình biệt hóa hoa của cây và ptotein TENGU ức chế sinh tổng hợp auxin. Hậu

quả là sự phát triển của chồi đỉnh bị ức chế dẫn tới kích thích phát triển của chồi bên tạo ra triệu chứng chổi phù thuỷ trên cây sắn (là hiện tƣợng ức chế chồi sinh

trƣởng, kích thích chồi bên, mọc nhiều chồi phụ ở cành, thân chính). Đối với các

tác nhân gây bệnh thuộc nhóm ký sinh chuyên tính nhƣ nấm gây bệnh rỉ sắt, phấn

trắng, than đen, sƣơng mai, vi khuẩn biệt dƣỡng (Greening), phytoplasma và

virus thì nói chung không cần phải thực hiện đầy đủ qui trình Koch vì chúng là ký sinh chuyên tính. Phytoplasma là một nhóm tác nhân gây bệnh đã đƣợc

nghiên cứu nhiều, cơ chế gây bệnh đã đƣợc hiểu rõ, ngoài ra, trong nghiên cứu

này, lây nhiễm bằng tơ hồng (Cuscutas spp.) từ cây sắn KM94 bị bệnh chổi phù

thuỷ lên cây sắn/dừa cạn khoẻ thì cây sắn/dừa cạn khoẻ biểu hiện triệu chứng

bệnh. Điều này chứng tỏ bệnh chổi phù thuỷ trên sắn là do phytoplasma gây ra.

119

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

1) Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra đƣợc phát hiện tại 9 tỉnh gồm Bà Rịa-Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dƣơng, Bình Phƣớc, Tây Ninh,

Quảng Ngãi, Kon Tum, Phú Thọ và Yên Bái. Triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ

xuất hiện ở các giai đoạn sinh trƣởng phát triển của cây sắn trên nhiều giống sắn

khác nhau gồm KM60, KM94, KM140 và KM419. Loại hình triệu chứng bệnh

chổi phù thuỷ gây hại trên cây sắn là giống nhau tại các điểm điều tra. Cây nhiễm bệnh ở giai đoạn cây con thƣờng sinh trƣởng kém, thậm chí dẫn đến chết cây.

Cây nhiễm bệnh ở giai đoạn muộn hơn đều có năng suất củ tƣơi, năng suất tinh

bột thấp hơn so với cây không nhiễm bệnh.

Tỷ lệ cây nhiễm bệnh chổi phù thuỷ đạt thấp nhất (5,7%) trên giống sắn

KM94 ở giai đoạn chờ thu hoạch tại huyện Sơn Hà, tỉnh Quảng Ngãi và tỷ lệ

bệnh cao nhất (60,2%) trên giống sắn KM419 ở giai đoạn cây con tại huyện

Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai.

2) Sử dụng các phƣơng pháp kính hiển vi điện tử, kỹ thuật nhuộm mô cây

với DAPI hay phƣơng pháp PCR lồng với cặp mồi P1/P7 - R16mF2/R16mR1

hoặc cặp mồi P1/P7-R16F2n/R16R2 đều đã phát hiện, chẩn đoán đƣợc

phytoplasma gây bệnh chổi phủ thủy trên sắn.

3) Bằng kỹ thuật RFLP, phân tích trình tự nucleotide và phân tích phả hệ

dựa trên gen 16S RNA ribosome đã xác định đƣợc phytoplasma hại sắn tại Đông

Nam Bộ thuộc 2 nhóm gồm 16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ

16SrII-A). Mẫu phytoplasma hại sắn YB-01 (KM360166) ở Yên Bái thuộc nhóm

16SrI nhƣng nằm trong nhóm phụ hoàn toàn mới, chƣa đƣợc công bố.

4) Thiết kế đƣợc bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu để chẩn đoán phytoplasma

nhóm 16SrII hại sắn, bộ mồi này có thể áp dụng để phát hiện phytoplasma nhóm

16SrII trên cây sắn bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ ở ngoài đồng.

5) Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra lan truyền chủ yếu thông qua việc sử dụng hom giống đã bị nhiễm bệnh làm vật liệu nhân giống vô tính, đồng thời, bệnh cũng truyền qua phƣơng pháp ghép cây và qua tơ hồng,

chƣa phát hiện thấy loài côn trùng có khả năng lan truyền bệnh.

120

5.2. KIẾN NGHỊ

Sử dụng bộ mồi LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại

sắn. Không dùng cây sắn đã bị nhiễm bệnh để làm vật liệu nhân giống vô tính;

cần nghiên cứu tuyển chọn các giống sắn có khả năng kháng bệnh phytoplasma

và có tiềm năng năng suất cao.

121

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

1. Trịnh Xuân Hoạt, Nguyễn Đức Thành, Ngô Gia Bôn, Mai Văn Quân và Vũ Duy Hiện

(2012). Phát hiện và xác định phytoplasma liên quan đến bệnh chổi rồng hại sắn tại

một số tỉnh phía Nam Việt Nam. Tạp chí Bảo vệ thực vật. 2. tr. 10-14.

2. Nguyễn Đức Thành, Mai Văn Quân, Ngô Gia Bôn, Nguyễn Hữu Hỷ, Hà Viết Cƣờng

và Trịnh Xuân Hoạt (2014). Đặc điểm sinh học của bệnh chổi rồng sắn tại Đồng

Nai năm 2011-2013. Tạp chí Khoa học và Phát triển. 12 (3). tr. 325-333.

3. Nguyễn Đức Thành, Trịnh Xuân Hoạt, Mai Văn Quân và Hà Viết Cƣờng (2015). Xác

định phytoplasma nhóm 16SrII-A gây hại trên cây sắn tại Đông Nam Bộ bằng kỹ

122

thuật PCR, RFLP. Tạp chí Bảo vệ thực vật. 2. tr. 42-49.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A) Tiếng Việt

1. Hà Minh Trung (1985). Bệnh hại lúa ở các tỉnh phía Nam. Tạp chí Khoa Học và

Kỹ Thuật Nông nghiệp. 12. tr. 40-46.

2. Huỳnh Đăng Sang, Phạm Đức Toàn và Bùi Cách Tuyến (2014). Bƣớc đầu nhận

diện Phytoplasma trên cây vừng (Sesamum indicum L.) ở Việt Nam bằng nested

PCR. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. 4. tr. 44-47.

3. Ngô Vĩnh Viễn (1993). Một số bệnh virút và mycoplasma gây triệu chứng vàng lá

lúa ở Việt Nam. Luận án Phó tiến sĩ, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam.

4. Nguyên Khê (2011). Giải pháp trị bệnh chổi phù thuỷ hại sắn. Trong mục: Khuyến

nông. Báo Nông nghiệp Việt Nam. Số 64, ra ngày 31/3/2011.

5. Nguyễn Đức Thành, Trịnh Xuân Hoạt và Ngô Gia Bôn (2012). Phát hiện

phytoplasma liên quan đến bệnh diệp lục hóa cây vừng (Sesamum indicum L.) tại

Hà Nội. Tạp chí Bảo vệ thực vật. 4. tr. 26-29.

6. Nguyễn Đức Thành, Mai Văn Quân, Vũ Duy Hiện, Ngô Gia Bôn, Trần Nguyễn

Hà, Hà Viết Cƣờng và Trịnh Xuân Hoạt (2013). Phát hiện, xác định bệnh chổi phù

thuỷ đậu tƣơng tại Đồng Nai. Tạp chí Bảo vệ thực vật. 6. tr. 26-30.

7. Nguyễn Đức Thành, Trịnh Xuân Hoạt, Mai Văn Quân và Hà Viết Cƣờng (2014).

Phát hiện phytoplasma gây bệnh trên một số cây trồng và cỏ dại bằng PCR và giải

trình tự. Tạp chí Bảo vệ thực vật. 4. tr. 28-33.

8. Tổng cục Thống kê (2015). Số liệu thống kê Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy

sản. Trong: Niên giám thống kê 2014. Nhà xuất bản Thống kê, Hà Nội, 759 tr.

9. Trần Thị Thanh Bình, Nguyễn Thanh Thuỷ và Vũ Triệu Mân (2011). Chẩn đoán

virus và phytoplasma gây bệnh trên ngô vùng Hà Nội bằng hiển vi điện tử. Hội

thảo Quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. tr

44-47.

10. Vũ Triệu Mân, Nguyễn Kim Giao Nguyễn Thị Minh Liên, Nguyễn Thanh Thuỷ,

Đặng Ngọc Diệp và Cao Anh Đƣơng (2002). Một số nghiên cứu bệnh trắng lá mía.

Hội thảo Bệnh cây và Sinh học phân tử lần thứ 1 tại Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí

Minh, ngày 21/12/2002. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. tr. 23-25.

123

11. Vũ Triệu Mân, Nguyễn Kim Giao, Nguyễn Thị Minh Liên và C. Kerlan (2005).

Dùng phƣơng pháp kính hiển vi điện tử chẩn đoán nhanh một số bệnh virus và

phytoplasma hại thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

B) Tiếng Anh

12. Ahrens U. and E. Seemüller (1992). Detection of DNA of plant pathogenic

mycoplasma like organisms by a polymerase chain reaction that amplifies a

sequence of the 16S rRNA gene. Phytopathology. Vol 82. pp. 828-832.

13. Aime M. C. and W. M. Phillips (2005). The causal agents of witches‟ broom and

frosty pod rot of cacao (chocolate, Theobroma cacao) form a new lineage of

Marasmiaceae. Mycologia. Vol 97. pp. 1012-1022.

14. Akhtar K., S. Ghulam, M. Dickinson, M. Ahmad and A. H. Muhammad (2009).

Sesame phyllody disease: its symptomatology, etiology and transmission in

Pakistan. Turkish Journal of Agriculture and Forestry. Vol 33. pp. 477-486.

15. Al-Awadhi H., F. A. Hani and M. Suleman (2002). Molecular and microscopical

detection of phytoplasma associated with yellowing disease of date palm Phoenix

dactylifera L. Kuwait Journal of Science. Vol 29. pp. 87-109.

16. Al-Saady N. A., A. J. Khan, A. Calari, A. M. Al-Subhi and A. Bertaccini (2008).

„Candidatus Phytoplasma omanense‟, associated with witches‟ broom of Cassia

italica (Mill.) Spreng. in Oman. International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology. Vol 58. pp. 461-466.

17. Al-Subhi A., N. Al-Saady, A. Khan and M. Deadman (2011). First report of a

group 16SrII phytoplasma associated with witches‟ broom of eggplant in Oman.

Plant Disease. Vol 95. pp. 360-361.

18. Allem A. C. (2002). The origins and taxonomy of cassava. In: Cassava: biology,

production and utilization. (eds) Hillocks R. J., J. M. Thresh and A. C. Bello.

CABI Publishing, Wallingford, United Kingdom. pp. 1-16.

19. Alvarez E., J. F. Mejía, G. A. Llano, J. B Loke, A. Calari, B. Duduk and A.

Bertaccini (2009). Characterization of a phytoplasma associated with frog skin

disease in cassava. Plant Disease. Vol 93. pp. 1139-1145.

20. Alvarez E., J. M. Pardo, J. F. Mejia, A. Bertaccini, N. D. Thanh and T. X. Hoat

(2013). Detection and identification of „Candidatus Phytoplasma asteris‟ related

phytoplasmas associated with a witches‟ broom disease of cassava in Vietnam.

124

Phytopathogenic Mollicutes. Vol 3. pp. 77-81.

21. Alvarez E., J. Pardo and M. Truke (2014). Detection and identification of „Candidatus

Phytoplasma asteris‟ related phytoplasma associated with a witches‟ broom disease of

cassava in Cambodia. American Phytopathological Society. pp. 181-O.

22. Andrade N. M and N. L. Arismendi (2013). DAPI staining and fluorescence

microscopy techniques for phytoplasmas. In: Phytoplasma. Springer Press, USA.

pp. 115-121.

23. Arismendi N., N. Andrade, R. Riegel and R. Carrillo (2010). Presence of a

phytoplasma associated with witches‟ broom disease in Ugni molinae Turcz. and

Gaultheria phillyreifolia (Pers.) Sleumer determined by DAPI, PCR and DNA

sequencing. Chilean Journal of Agricultural Research. Vol 70. pp. 26-33.

24. Ariyarathna H., J. Everard and E. Karunanayake (2007). Diseased sugarcane in Sri

Lanka is infected with sugarcane grassy shoot and/or sugarcane white leaf

phytoplasma. Australasian Plant Disease Notes. Vol 2. pp. 123-125.

25. Arocha Y., M. Lopez, B. Pinol, M. Fernandez, B. Picornell, R. Almeida, I.

Palenzuela, M. R. Wilson and P. Jones (2005). „Candidatus Phytoplasma graminis‟

and „Candidatus Phytoplasma caricae‟, two novel phytoplasmas associated with

diseases of sugarcane, weeds and papaya in Cuba. International Journal of

Systematic and Evolutionary Microbiology. Vol 55. pp. 2451-2463.

26. Arocha Y., R. Echodu, D. Talengera, J. Muhangi, E. Rockefeller, O. Asher, R.

Nakacwa, R. Serugga, G. Gumisiriza and J. Tripathi (2009a). Occurrence of

„Candidatus Phytoplasma aurantifolia‟ (16SrII group) in cassava and four other

species in Uganda. Plant Pathology. Vol 58. pp. 390.

27. Arocha Y., B. Piñol, R. Almeida, K. Acosta, M. Quiñones, T. Zayas, M. Varela, Y.

Marrero, E. Boa and J. Lucas (2009b). First report of phytoplasmas affecting

organoponic crops in central and eastern Cuba. Plant Pathology. Vol 58. pp. 793.

28. Bai X., J. Zhang, A. Ewing, S. A. Miller, A. J. Radek, D. V. Shevchenko, K.

Tsukerman, T. Walunas, A. Lapidus and J. W. Campbell (2006). Living with

genome instability: the adaptation of phytoplasmas to diverse environments of

their insect and plant hosts. Journal of Bacteriology. Vol 188. pp. 3682-3696.

29. Bekele B., J. Hodgetts, J. Tomlinson, N. Boonham, P. Nikolić, P. Swarbrick and M.

Dickinson (2011). Use of a real-time LAMP isothermal assay for detecting 16SrII

125

and XII phytoplasmas in fruit and weeds of the Ethiopian Rift Valley. Plant

Pathology. Vol 60. pp. 345-355.

30. Bertaccini A., M. Vibio and M. Bellardi (1996). Virus diseases of ornamental

shrubs. X. Euphorbia pulcherrima Willd. infected by viruses and phytoplasmas.

Phytopathologia Mediterranea. Vol 35. pp. 129-132.

31. Bertaccini A. and B. Duduk (2009). Phytoplasma and phytoplasma diseases: a

review of recent research. Phytopathologia Mediterranea. Vol 48. pp. 355-378.

32. Bertaccini A., B. Duduk, S. Paltrinieri and N. Contaldo (2014). Phytoplasmas and

phytoplasma diseases: a severe threat to agriculture. American Journal of Plant

Sciences. Vol 5. pp. 1763-1788.

33. Bertamini M. and N. Nedunchezhian (2001). Effects of phytoplasma (stolbur-

subgroup bois noir-BN) on photosynthetic pigments, saccharides, ribulose 1,5-

bisphosphate carboxylase, nitrate and nitrite reductases, and photosynthetic

activities in field-grown gapevine (Vitis vinifera L. cv. Chardonnay) leaves.

Photosynthetica. Vol 39. pp. 119-122.

34. Bressan A. and A. H. Purcell (2005). Effect of benzothiadiazole on transmission of

X-disease phytoplasma by the vector Colladonus montanus to Arabidopsis

thaliana, a new experimental host plant. Plant Disease. Vol 89. pp. 1121-1124.

35. Calari A., S. Paltrinieri, N. Contaldo, D. Sakalieva, N. Mori, B. Duduk and A.

Bertaccini (2011). Molecular evidence of phytoplasmas in winter oilseed rape,

tomato and corn seedlings. Bulletin of Insectology. Vol 5. pp. S157-S158.

36. Chen J., X. Pu, X. Deng, S. Liu, H. Li and E. Civerolo (2009). A phytoplasma

related to „Candidatus Phytoplasma asteris‟ detected in citrus showing

huanglongbing (yellow shoot disease) symptoms in Guangdong, China.

Phytopathology. Vol 99. pp. 236-242.

37. Christensen, N. M., K. B. Axelsen, M. Nicolaisen and A. Schulz (2005).

Phytoplasmas and their interactions with hosts. Trends in Plant Science. Vol 10. pp.

526-535.

38. Contaldo N., Z. Soufi and A. Bertaccini (2011). Preliminary identification of

phytoplasmas associated with grapevine yellows in Syria. Bulletin of Insectology.

Vol 64. pp. S217-S218.

39. Costa A. and E. Kitajima (1972). Studies on virus and mycoplasma diseases of the

126

cassava plant in Brazil. Proceedings of the workshop on cassava mosaic virus,

International Institute of Tropical Agriculture, Ibadan. pp. 18-36.

40. Crespo M., F. Cazorla, J. Hermoso, E. Guirado, M. Maymon, J. Torés, S. Freeman

and A. de Vicente (2012). First report of mango malformation disease caused by

Fusarium mangiferae in Spain. Plant Disease. Vol 96. pp. 286.

41. Davis R., R. Jomantiene, E. Dally and T. Wolf (1998). Phytoplasmas associated

with grapevine yellows in Virginia belong to group 16SrI, subgroup A (tomato big

bud phytoplasma subgroup), and group 16SrIII, new subgroup I. Vitis. Vol 37. pp.

131-137.

42. Davis R., Y. Arocha, P. Jones and A. Malay (2005). First report of the association

of phytoplasmas with plant diseases in the territory of Wallis and Futuna.

Australasian Plant Pathology. Vol 34. pp. 417-418.

43. Deng S. and C. Hiruki (1991). Amplification of 16S rRNA genes from culturable

and nonculturable mollicutes. Journal of Microbiological Methods. Vol 14. pp. 53-

61.

44. Devonshire B. J. (2013). Visualization of phytoplasmas using electron microscopy.

In: Phytoplasma. Springer Press, USA. pp. 123-138.

45. Dhama K., K. Karthik, S. Chakraborty, R. Tiwari, S. Kapoor, A. Kumar and P.

Thomas (2014). Loop-mediated isothermal amplification of DNA (LAMP), a new

diagnostic tool lights the world of diagnosis of animal and human pathogens: a

review. Pakistan Journal of Biological Sciences. Vol 17. pp. 151-159.

46. Doi Y., M. Teranaka, K. Yora and H. Asuyama (1967). Mycoplasma-or PLT

group-like microorganisms found in the phloem elements of plants infected with

mulberry dwarf, potato witches‟ broom, aster yellows, or paulownia witches‟

broom. Japanese Journal of Phytopathology. Vol 33. pp. 259-266.

47. Doyle J. J. and J. J. Doyle (1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus.

48. Duan, Y., and Y. Zhang (2013). Review of the grassland leafhopper genus

Vol 12. pp. 13-15.

Exitianus Ball (Hemiptera, Cicadellidae, Deltocephalinae, Chiasmini) from

China. ZooKeys. Vol 333. pp. 31-38.

49. Duduk B. and A. Bertaccini (2006). Corn with symptoms of reddening: new host

of stolbur phytoplasma. Plant Disease. Vol 90. pp. 1313-1319.

127

50. Duduk B., A. Calari, S. Paltrinieri, N. Duduk and A. Bertaccini (2009). Multigene

analysis for differentiation of aster yellows phytoplasmas infecting carrots in

Serbia. Annals of Applied Biology. Vol 154. pp. 219-229.

51. Duduk B., S. Paltrinieri, I. M. Lee and A. Bertaccini (2013). Nested PCR and

RFLP analysis based on the 16S rRNA gene. In: Phytoplasma. Springer Press,

USA. pp. 159-171.

52. Eiken Company (2014). Loop mediated isothermal amplification. Retrieved on 19

February 2014 at http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/primer.html

53. Faghihi M., A. Bagheri, H. Bahrami, H. Hasanzadeh, R. Rezazadeh, M. Siampour,

S. Samavi, M. Salehi and K. Izadpanah (2011). Witches‟ broom disease of lime

affects seed germination and seedling growth but is not seed transmissible. Plant

Disease. Vol 95. pp. 419-422.

54. Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO (2005). A review

of cassava in Africa with country case studies on Nigeria, Ghana, the United

Republic of Tanzania, Uganda and Benin. Proceedings of the validation forum on

the global cassava development strategy. Vol 2. The International Fund for

Agricultural Development Publishing Management Service, Roma, Italia. 66 p.

55. Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAOSTAT (2014).

Statistical database. Retrieved on 19 February 2014 at

http://faostat.fao.org/site/567/DesktopDefault.aspx?PageID=567#ancor.

56. Finch-Savage B. (2013). Seeds: Physiology of development, germination and

dormancy. Springer, New York-Heidelberg-Dordrecht-London. pp. 4614-4692.

57. Firrao G., M. C. Garcia and C. Marzachì (2006). Phytoplasmas: genetics, diagnosis

and relationships with the plant and insect host. Frontiers in Bioscience. Vol 12. pp.

1353-1375.

58. Flôres D., I. C. Haas, M. C. Canale and I. P. Bedendo (2013). Molecular

identification of a 16SrIII-B phytoplasma associated with cassava witches‟ broom

disease. European Journal of Plant Pathology. Vol 137. pp. 237-242.

59. Frison E. and E. Feliu (1991). Technical guidelines for the safe movement of

cassava germplasm. Food and Agriculture Organization of the United Nations,

Rome/International Board for Plant Genetic Resources, Rome, Italia. 48 p.

60. Gajardo A., N. Fiore, S. Prodan, S. Paltrinieri, S. Botti, A. Pino, A. Zamorano, J.

128

Montealegre and A. Bertaccini (2009). Phytoplasmas associated with grapevine

yellows disease in Chile. Plant Disease. Vol 93. pp. 789-796.

61. Galetto L., D. Bosco, R. Balestrini, A. Genre, J. Fletcher and C. Marzachì (2011).

The major antigenic membrane protein of „Candidatus Phytoplasma asteris‟

selectively interacts with ATP synthase and actin of leafhopper vectors. PLoS One.

Vol 6. pp. e22571.

62. Gandelman O., R. Jackson, G. Kiddle and L. Tisi (2011). Loop-mediated

amplification accelerated by stem primers. International Journal of Molecular

Sciences. Vol 12. pp. 9108-9124.

63. Girsova N., K. Bottner, K. Mozhaeva, T. Kastalyeva, R. Owens and I. M. Lee

(2008.) Molecular detection and identification of group 16SrI and 16SrXII

phytoplasmas associated with diseased potatoes in Russia. Plant Disease. Vol 92.

64. Graziosi, I., N. Minato, E. Alvarez, D. T. Ngo, T. X. Hoat, T. M. Aye and K. A.

pp. 654-655.

Wyckhuys (2016). Emerging pests and diseases of South-east Asian cassava: a

comprehensive evaluation of geographic priorities, management options and

research needs. Pest Management Science. Vol 72 (6). pp. 1071-1089.

65. Golino D., G. Oldfield and D. Gumpf (1989). Experimental hosts of the beet

leafhopper-transmitted virescence agent. Plant Disease. Vol 73. pp. 850-854.

66. Gonzalez F., A. Zamorano, A. M. Pino, S. Paltrinieri, A. Bertaccini and N. Fiore

(2011). Identification of phytoplasma belonging to X-disease group in cherry in

Chile. Bulletin of Insectology. Vol 7. pp. S235-S236.

67. Gundersen D. E. and I. M. Lee (1996). Ultrasensitive detection of phytoplasmas by

nested-PCR assays using two universal primer pairs. Phytopathologia Mediterranea.

Vol 35. pp. 144-151.

68. Gundersen D. E., I. M. Lee, D. Schaff, N. Harrison, C. Chang, R. Davis and D.

Kingsbury (1996). Genomic diversity and differentiation among phytoplasma

strains in 16S rRNA groups I (aster yellows and related phytoplasmas) and III (X-

disease and related phytoplasmas). International Journal of Systematic

Bacteriology. Vol 46. pp. 64-75.

69. Hall T. A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor

and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium. Vol 7.

129

pp. 95-98.

70. Harrison N., M. Carpio and E. Boa (2006). First report of „Candidatus

Phytoplasma asteris‟ related strains infecting chinaberry trees with leaf yellowing

symptoms in Vietnam. Plant Disease. Vol 90. pp. 527-528.

71. Hayat Q., S. Hayat, M. Irfan and A. Ahmad (2010). Effect of exogenous salicylic

acid under changing environment: a review. Environmental and Experimental

72. Hibino, H., G. B. Jonson and F. C. Stacruz (1987). Association of mycoplasma-

Botany. Vol 68. pp. 14-25.

like organisms with rice orange leaf in the Philippines. Plant Disease. Vol 71. pp.

792-794.

73. Hoat T. X., N. G. Bon, M. V. Quan, V. D. Hien, N. D. Thanh and M. Dickinson

(2012). Detection and molecular characterization of sugarcane grassy shoot

phytoplasma in Vietnam. Phytoparasitica. Vol 40. pp. 351-359.

74. Hoat T. X., D. V. T Thanh, N. G. Bon, C. A. Duong, T. N. Ha and N. C.

Kumasaringhe (2013). Molecular detection and identification of sugarcane white leaf

disease phytoplasma in Vietnam. International Sugar Journal. Vol 4. pp. 505-511.

75. Hogenhout S. A., K. Oshima, E. D. Ammar, S. Kakizawa, H. N. Kingdom and S.

Namba (2008). Phytoplasmas: bacteria that manipulate plants and insects.

Molecular Plant Pathology. Vol 9. pp. 403-423.

76. Hoshi A., Y. Ishii, S. Kakizawa, K. Oshima and S. Namba (2007). Host-parasite

interaction of phytoplasmas from a molecular biological perspective. Bulletin of

Insectology. Vol 60 (2). pp. 105-107.

77. Hoshi A., K. Oshima, S. Kakizawa, Y. Ishii, J. Ozeki, M. Hashimoto, K. Komatsu,

S. Kagiwada, Y. Yamaji and S. Namba (2009). A unique virulence factor for

proliferation and dwarfism in plants identified from a phytopathogenic bacterium.

Proceedings of the National Academy of Sciences. Vol 106. pp. 6416-6421.

78. Howeler R., N. Lutaladio and G. Thomas (2013). Save and grow cassava: a guide

to sustainable production intensification. Food and Agriculture Organization of the

United Nations, Rome, Italia. 142 p.

79. International research project for comparative mycoplasmology, IRPCM (2004).

„Candidatus Phytoplasma‟, a taxon for the wall-less, non-helical prokaryotes that

colonize plant phloem and insects. Journal of Systematic and Evolutionary

130

Microbiology. Vol 54. pp. 1243-1255.

80. Jung H. Y., T. Sawayanagi, P. Wongkaew, S. Kakizawa, H. Nishigawa, W. Wei, K.

Oshima, S. I. Miyata, M. Ugaki and T. Hibi (2003). „Candidatus Phytoplasma

oryzae‟, a novel phytoplasma taxon associated with rice yellow dwarf disease.

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. Vol 53. pp. 1925-

1929.

81. Kaewmanee C., Y. Hanboonsong, A. Bertaccini and S. Maini (2011). Evaluation

of the efficiency of various treatments used for sugarcane white leaf phytoplasma

control. Bulletin of Insectology. Vol 5. pp. S197-S198.

82. Kaiser B., G. Vogg, U. B. Fürst and M. Albert (2015). Parasitic plants of the genus

Cuscuta and their interaction with susceptible and resistant host plants. Frontiers in

Plant Science. Vol 6. pp. 7-12.

83. Kaminska M., K. Klamkowski, H. Berniak and W. Treder (2010). Effect of

arbuscular mycorrhizal fungi inoculation on aster yellows phytoplasma-infected

tobacco plants. Scientia Horticulturae. Vol 125. pp. 500-503.

84. Keifer H. H., E. W. Baker, T. Kono, M. Delfinado and W. E. Styer (1982). An

illustrated guide to plant abnormalities caused by eriophyid mites in North

America. Agriculture Handbook No. 573. Agricultural Research Service, United

States Department of Agriculture, USA. 178 p.

85. Khan A., S. Botti, S. Paltrinieri, A. Al-Subhi and A. Bertaccini (2002). Phytoplasmas in alfalfa seedlings: infected or contaminated seeds. 14th International Organization

of Mycoplasmology Conference. Vienna, Austria. pp. 148.

86. Khan J., P. Srivastava and S. Singh (2004). Efficacy of nested-PCR for the

detection of phytoplasma causing spike disease of sandal. Current Science. Vol 86.

pp. 1530-1538.

87. Khan M., S. Raj and S. Snehi (2007). First report of „Candidatus Phytoplasma

asteris‟ affecting sesame cultivation in India. Journal of Plant Pathology. Vol 7. pp.

301-305.

88. Kinoshita Y., H. Niwa and Y. Katayama (2015). Use of loop-mediated isothermal

amplification to detect six groups of pathogens causing secondary lower

respiratory bacterial infection in horses. Microbiology and Immunology. Vol 1. pp.

5-9.

89. Klinkong, S., K. Reanwarakorn W. Rungsawang and C. Khwantongyim (2015).

131

Molecular detection and characterization of phytoplasma associated with cassava

disease in Thailand. Unpublished. Retrieved on 05 September 2015 at

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KP054297.1.

90. Kogovšek P., J. Hodgetts, J. Hall, N. Prezelj, P. Nikolić, N. Mehle, R. Lenarčič, A.

Rotter, M. Dickinson and N. Boonham (2015). LAMP assay and rapid sample

preparation method for on site detection of flavescence dorée phytoplasma in

grapevine. Plant Pathology. Vol 64. pp. 286-296.

91. Kumar L., K. Sharma, S. Boahen, H. Tefera and M. Tamo (2011). First report of

soybean witches‟ broom disease caused by group 16SrII phytoplasma in soybean

92. Kumar, S., V. Jadon, A. K. Tiwari and G. P. Rao (2015). Exitianus indicus

in Malawi and Mozambique. Plant Disease. Vol 95. pp. 492-493.

(Distant): a putative vector for „Candidatus Phytoplasma cynodontis‟ in India,

Phytopathogenic Mollicutes. Vol 5 (1s). pp S51-S52.

93. Lee I. M., D. E. Gundersen, R. Hammond and R. Davis (1994). Use of

mycoplasmalike organism (MLO) group-specific oligonucleotide primers for

nested-PCR assays to detect mixed-MLO infections in a single host plant.

Phytopathology. Vol 84. pp. 559-566.

94. Lee I. M., D. E. Gundersen, R. E. Davis and I. M. Bartoszyk (1998). Revised

classification scheme of phytoplasmas based on RFLP analyses of 16S rRNA and

ribosomal protein gene sequences. International Journal of Systematic

Bacteriology. Vol 48. pp. 1153-1169.

95. Lee I. M., R. E. Davis and D. E. Gundersen (2000). Phytoplasma: Phytopathogenic

Mollicutes. Annual Reviews in Microbiology. Vol 54. pp. 221-255.

96. Lee I. M., D. E. Gundersen, R. Davis, K. Bottner, C. Marcone and E. Seemüller

(2004). „Candidatus Phytoplasma asteris‟, a novel phytoplasma taxon associated

with aster yellows and related diseases. International Journal of Systematic and

97. Li, S., W. Hao, G. Lu, J. Huang, C. Liu and G. Zhou (2015). Occurrence and

Evolutionary Microbiology. Vol 54. pp. 1037-1048.

Identification of a new vector of rice orange leaf phytoplasma in south China. Plant

Disease. Vol 99 (11). pp. 1483-1487.

98. Lindquist E. E., J. Bruin and M. Sabelis (1996). Eriophyoid mites: their biology,

natural enemies and control. Vol 6. Elsevier Press, United Kingdom. 83 p.

132

99. Lingua G., G. D‟Agostino, N. Massa, M. Antosiano and G. Berta (2002).

Mycorrhiza-induced differential response to a yellow disease in tomato.

Mycorrhiza. Vol 12. pp. 191-198.

100. Loi N., P. Ermacora, L. Carraro, R. Osler and T. A. Chen (2002). Production of

monoclonal antibodies against apple proliferation phytoplasma and their use in

serological detection. European Journal of Plant Pathology. Vol 108. pp. 81-86.

101. Lorenz K., B. Schneider, U. Ahrens and E. Seemüller (1995). Detection of the

apple proliferation and pear decline phytoplasmas by PCR amplification of

ribosomal and non ribosomal DNA. Phytopathology. Vol 85. pp. 771-776.

102. Lozano J. (1992). Overview of integrated control of casava diseases. Fitopatologia

Brasileira. Vol 17. pp. 18-22.

103. MacLean A. M., A. Sugio, O. V. Makarova, K. C. Findlay, V. M. Grieve, R. Toth,

M. Nicolaisen and S. A. Hogenhout (2011). Phytoplasma effector SAP54 induces

indeterminate leaf-like flower development in arabidopsis plants. Plant Physiology.

Vol 157. pp. 831-841.

104. Marcone C. (2002). Phytoplasma diseases of sugarcane. Sugar Tech. Vol 4. pp. 79-85.

105. Marcone C. (2014). Molecular biology and pathogenicity of phytoplasmas. Annals

of Applied Biology. Vol 165. pp. 199-221.

106. Mardi M., S. K. Nekouei, L. K. Farsad, F. Ehya, M. Shabani, M. Shafiee, M.

Tabatabaei, M. R. Safarnejad, G. S. Jouzani and S. G. Hosseini (2011). Witches‟

broom disease of Mexican lime trees: disaster to be addressed before it will be too

late. Bulletin of Insectology. Vol 9. pp. S205-S206.

107. Martini M., I. M. Lee, K. Bottner, Y. Zhao, S. Botti, A. Bertaccini, N. Harrison, L.

Carraro, C. Marcone and A. Khan (2007). Ribosomal protein gene-based

phylogeny for finer differentiation and classification of phytoplasmas. International

Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. Vol 57. pp. 2037-2051.

108. McCoy R., A. Caudwell, C. Chang, T. Chen, L. Chiykowski, M. Cousin, J. Dale, G.

de Leeuw, D. Golino, K. Hackett, B. Kirkpatrick, R. Marwitz, H. Petzold, R. Sinha,

M. Sugiura, F. Whitcomb, I. Yang, B. Zhu and E. Seemüller (1989). Plant diseases

associated with mycoplasma-like organisms. Academic Press. USA. pp. 546-623.

109. McWilliam H., W. Li, M. Uludag, S. Squizzato, Y. M. Park, N. Buso, A. P.

Cowley and R. Lopez (2013). Analysis tool web services from the EMBL-EBI.

133

Nucleic Acids Research. Vol 41. pp. 597-600.

110. Mejia J. F. (2014). Identification and genetic diversity in phytoplasmas associated

with diseases of cassava and other agronomic relevant crops in south-east Asia and

Latin America. PhD thesis. Bologna University, Italia, 139 p.

111. Mondego J. M., M. F. Carazzolle, G. G. Costa, E. F. Formighieri, L. P. Parizzi, J.

Rincones, C. Cotomacci, D. M. Carraro, A. F. Cunha, H. Carrer, R. O. Vidal, R. C.

Estrela, O. Garcia, D. P. Thomazella, B. V. de Oliveira, A. B. Pires, M. C. Rio, M.

R. Araujo, M. H. de Moraes, L. A. Castro, K. P. Gramacho, M. S. Goncalves, J. P.

Neto, A. G. Neto, L. V. Barbosa, M. J. Guiltinan, B. A. Bailey, L. W. Meinhardt, J.

C. Cascardo and G. A. Pereira (2008). A genome survey of Moniliophthora

perniciosa gives new insights into witches‟ broom disease of cacao. BMC

Genomics. Vol 9. pp. 548-552.

112. Mori Y. and T. Notomi (2009). Loop-mediated isothermal amplification (LAMP):

a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases.

Journal of Infection and Chemotherapy. Vol 15. pp. 62-69.

113. Moonjuntha, P., A. Athipunyakom, N. Kositcharoenkul, R. Thongkreng, K.

Waravichanee, T. Kanhayat, P. Wongtiem, S. Lankaew and K. Wyckhuys (2015).

Detection of cassava witches'-broom disease phytoplasma associated with cassava

witches' broom disease of cassava in Thailand. Unpublished. Retrieved on 05

September 2015 at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/LN897456.1.

114. Munyaneza J. E. (2010). Emerging leafhopper-transmitted phytoplasma diseases of

potato. Southwestern Entomologist. Vol 35. pp. 451-456.

115. Musetti R., S. Grisan, R. Polizzotto, M. Martini, C. Paduano and R. Osler (2011).

Interactions between „Candidatus Phytoplasma mali‟ and the apple endophyte

Epicoccum nigrum in Catharanthus roseus plants. Journal of Applied Microbiology.

Vol 110. pp. 746-756.

116. Nagamine K., T. Hase and T. Notomi (2002). Accelerated reaction by loop-

mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular

117. Nakashima, K. and N. Murata (1993). Destructive plant diseases caused by

Probes. Vol 16. pp. 223-229.

mycoplasma-like organisms in Asia. Outlook on Agriculture. Vol 22. pp. 53-58.

118. Namba S., S. Kato, S. Iwanami, H. Oyaizu, H. Shiozawa and T. Tsuchizaki (1993).

134

Detection and differentiation of plant-pathogenic mycoplasmalike organisms using

polymerase chain reaction. Phytopathology. Vol 83. pp. 786-791.

119. Nasare K., A. Yadav, A. K. Singh, K. Shivasharanappa, Y. Nerkar and V. Reddy

(2007). Molecular and symptom analysis reveal the presence of new phytoplasmas

associated with sugarcane grassy shoot disease in India. Plant Disease. Vol 91. pp.

1413-1418.

120. Nei M. and W. Li (1979). Mathematical model for studying genetic variation in

terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America. Vol 76. pp. 5269-5273.

121. Nelson S. (2008). Glyphosate injury to coffee plants. In: Plant Disease.

Cooperative Extension Service, University of Hawaii at Manoa, College of

Tropical Agriculture and Human Resources. 5 p.

122. Niessen L. (2015). Current state and future perspectives of loop-mediated

isothermal amplification (LAMP)-based diagnosis of filamentous fungi and yeasts.

Applied Microbiology and Biotechnology. Vol 99. pp. 553-574.

123. Nipah J., P. Jones and M. Dickinson (2007). Detection of lethal yellowing

phytoplasma in embryos from coconut palms infected with Cape St Paul wilt

disease in Ghana. Plant Pathology. Vol 56. pp. 777-784.

124. Notomi T., H. Okayama, H. Masubuchi, T. Yonekawa, K. Watanabe, N. Amino

and T. Hase (2000). Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic

Acids Research. Vol 28. pp. e61-e63.

125. Obura E., D. Masiga, F. Wachira, B. Gurja and Z. Khan (2011). Detection of

phytoplasma by loop-mediated isothermal amplification of DNA (LAMP). Journal

of Microbiological Methods. Vol 84. pp. 312-316.

126. Okuda M., S. Okuda and H. Iwai (2015). Detection of Cucurbit chlorotic yellows

virus from Bemisia tabaci captured on sticky traps using reverse transcription loop-

mediated isothermal amplification (RT-LAMP) and simple template preparation.

Journal of Virological Methods. Vol 221. pp. 9-14.

127. Oliveira S., E. Abreu, T. Araújo, E. Oliveira, E. Andrade, J. Garcia and E. Alvarez

(2014). First report of a 16SrIII-L phytoplasma associated with frog skin disease in

cassava (Manihot esculenta Crantz) in Brazil. Plant Disease. Vol 98. pp. 151-153.

128. Palacio-Bielsa A., P. López-Soriano, A. Bühlmann, J. van Doorn, K. Pham, M. A.

135

Cambra, I. M. Berruete, J. F. Pothier, B. Duffy and A. Olmos (2015). Evaluation of

a real-time PCR and a loop-mediated isothermal amplification for detection of

Xanthomonas arboricola pv. pruni in plant tissue samples. Journal of

Microbiological Methods. Vol 112. pp. 36-39.

129. Paltrinieri S., A. Bertaccini and C. Lugaresi (2006). Phytoplasmas in declining cherry plants. 20th International symposium on virus and virus-like diseases of

temperate fruit crops-fruit tree diseases. Vol 781. pp. 409-416.

130. Parida M., S. Sannarangaiah, P. K. Dash, P. Rao and K. Morita (2008). Loop-

mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene

amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases.

Reviews in Medical Virology. Vol 18. pp. 407-421.

131. Přibylová J. and J. Špak (2013). Dodder transmission of phytoplasmas. In:

Phytoplasma: methods and protocol. Springer Publishing House. pp. 41-46.

132. Rao G., A. Singh, H. Singh and S. Sharma (2005). Phytoplasma diseases of

sugarcane: characterization, diagnosis and management. Indian Journal of Plant

Pathology. Vol 23 (1). pp. 1-21.

133. Ravindran V. (1992). Preparation of cassava leaf products and their use as animal

feeds. FAO Animal Production and Health Paper. Vol 7. pp. 111-125.

134. Rincones J., L. W. Meinhardt, B. C Vidal and G. A. Pereira (2003).

Electrophoretic karyotype analysis of Crinipellis perniciosa, the causal agent of

witches‟ broom disease of Theobroma cacao. Mycology Research. Vol 107. pp.

452-458.

135. Saharan P., S. Dhingolia, P. Khatri, J. S. Duhan and S. K. Gahlawat (2014). Loop-

mediated isothermal amplification (LAMP) based detection of bacteria: A review.

African Journal of Biotechnology. Vol 13. pp. 1920-1928.

136. Salehi M., K. Izadpanah, M. Siampour, S. A. Esmailzadeh, A. Bertaccini and S.

Maini (2011). Polyclonal antibodies for the detection and identification of Fars

alfalfa witches‟ broom phytoplasma. Bulletin of Insectology. Vol 7. pp. S59-S60.

137. Schneider B., E. Seemueller, C. D. Smart, and B. C. Kirkpatrick (1995). Phylogenetic

classification of plant pathogenic mycoplasma-like organisms orphytoplasmas. In:

Molecular and diagnostic procedures in mycoplasmology. Vol 1. Razinand S. and J. G.

Tully (ed.). Academic Press, San Diego, USA. pp. 369-380.

138. Sertkaya G., M. Martini, R. Musetti and R. Osler (2007). Detection and molecular

136

characterization of phytoplasmas infecting sesame and solanaceous crops in

Turkey. Bulletin of Insectology. Vol 60. pp. 141-142.

139. Souza C. S., B. M. Oliveira, G. G. Costa, A. Schriefer, S. A Selbach, A. P. T.

Uetanabaro, C. P. Pirovani, G. A Pereira, A. G. Taranto and J. M. Cascardo (2009).

Identification and characterization of a class III chitin synthase gene of

Moniliophthora perniciosa, the fungus that causes witches‟ broom disease of cacao.

Journal of Microbiology. Vol 47. pp. 431-440.

140. Souza A. N., F. N. Silva, I. P. Bedendo and C. M. Carvalho (2014). A

phytoplasma belonging to a 16SrIII-A subgroup and dsRNA virus associated with

cassava frog skin disease in Brazil. Plant Disease. Vol 98. pp. 771-779.

141. Strauss E. (2009). Phytoplasma research begins to bloom. Science. Vol 325. pp.

388-390.

142. Sugawara K., M. Himeno, T. Keima, Y. Kitazawa, K. Maejima, K. Oshima and S.

Namba (2012). Rapid and reliable detection of phytoplasma by loop-mediated

isothermal amplification targeting a housekeeping gene. Journal of General Plant

Pathology. Vol 78. pp. 389-397.

143. Sugawara K., Y. Honma, K. Komatsu, M. Himeno, K. Oshima and S. Namba

(2013). The alteration of plant morphology by small peptides released from the

proteolytic processing of the bacterial peptide TENGU. Plant Physiology. Vol 162.

pp. 2005-2014.

144. Sugio A., A. M. MacLean, V. M. Grieve and S. A. Hogenhout (2011).

Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by

manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proceedings of

the National Academy of Sciences. Vol 108. pp. 1254-1263.

145. Sugio A. and S. A. Hogenhout (2012). The genome biology of phytoplasma:

modulators of plants and insects. Current Opinion in Microbiology. Vol 15. pp.

247-254.

146. Suzuki S., K. Oshima, S. Kakizawa, R. Arashida, H. Y. Jung, Y. Yamaji, H.

Nishigawa, M. Ugaki and S. Namba (2006). Interaction between the membrane

protein of a pathogen and insect microfilament complex determines insect-vector

specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States

of America. Vol 103. pp. 4252-4257.

147. Tamura K., D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei and S. Kumar (2011).

137

MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,

evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and

Evolution. Vol 28. pp. 2731-2739.

148. Tanaka E. (2010). Mechanisms of bamboo witches‟ broom symptom development

caused by endophytic/epiphytic fungi. Plant Signaling and Behavior. Vol 5. pp. 415-418.

149. Tedeschi R., V. Ferrato, J. Rossi and A. Alma (2006). Possible phytoplasma

transovarial transmission in the psyllids Cacopsylla melanoneura and Cacopsylla

pruni. Plant Pathology. Vol 55. pp. 18-24.

150. Teixeira D., N. Wulff, E. Martins, E. Kitajima, R. Bassanezi, A. Ayres, S.

Eveillard, C. Saillard and J. Bové (2008). A phytoplasma closely related to the

pigeon pea witches‟ broom phytoplasma (16SrIX) is associated with citrus

huanglongbing symptoms in the state of São Paulo, Brazil. Phytopathology. Vol 98.

151. Tiwari, A. K., S. Kumar, Mall, V. Jadon and G. P. Rao (2016). New efficient

pp 977-984.

natural leafhopper vectors of sugarcane grassy shoot phytoplasma in India. Sugar

Tech. Vol 1. pp. 1-7.

152. Tomita N., Y. Mori, H. Kanda and T. Notomi (2008). Loop-mediated isothermal

amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.

Nature Protocols. Vol 3. pp. 877-882.

153. Tomlinson J., N. Boonham and M. Dickinson (2010). Development and evaluation

of a one hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay

for rapid detection of phytoplasmas. Plant Pathology. Vol 59. pp. 465-471.

154. Toth K. F., N. A. Harrison and B. B. Sears (1994). Phylogentic relationships

among members of the class Mollicutes deduced from rps3 gene sequences.

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. Vol 44. pp.

119-124.

155. Tsai J. (1979). Vector transmission of mycoplasmal agents of plant diseases. In:

The mycoplasmas. Vol. III. Plant and insect mycoplasmas. (Eds) Whitcomb R. F.

and J. G. Tully. Academic Press, New York. pp. 265-307.

156. Valarmathi P., R. Rabindran, R. Velazhahan, S. Suresh and S. Robin (2013). First

report of rice orange leaf disease phytoplasma (16SrI) in rice (Oryza sativa) in

India. Australasian Plant Disease Notes. Vol 8. pp. 141-143.

157. Vega F. E., R. E. Davis, P. Barbosa, E. L. Dally, A. H. Purcell and I. Lee (1993).

138

Detection of a plant pathogen in a nonvector insect species by the polymerase

chain reaction. Phytopathology. Vol 83. pp. 621-624.

158. Vellios E. and F. Lioliopoulou (2007). Detection and characterization of phytoplasmas

infecting tomato plants in Greece. Bulletin of Insectology. Vol 60. pp. 157.

159. Wally O., F. Daayf, M. Iranpour, L. Adam, B. Elliott, C. T. Shinners, P. Northover,

S. Keyworth and A. Khadhair (2004). Incidence and molecular detection of

yellows-type disease in carrots, associated with leafhoppers in southern Manitoba,

Canada. Canadian Journal of Plant Pathology. Vol 26. pp. 498-505.

160. Wally O., E. A. Hadrami, A. Khadhair, L. Adam, C. T. Shinners, B. Elliott and F.

Daayf (2008). DNA sequencing reveals false positives during the detection of aster

yellows phytoplasmas in leafhoppers. Scientia Horticulturae. Vol 116. pp. 130-137.

161. Walsh K. B., J. N. Guthrie and D. White (2006). Control of phytoplasma diseases of

papaya in Australia using netting. Australasian Plant Pathology. Vol 35. pp. 49-54.

162. Wei W., R. E. Davis, M. Lee and Y. Zhao (2007). Computer-simulated RFLP

analysis of 16S rRNA genes: identification of ten new phytoplasma groups.

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. Vol 57. pp.

1855-1867.

163. Weintraub P. G. and L. Beanland (2006). Insect vectors of phytoplasmas. Annual

Review of Entomology. Vol 51. pp. 91-111.

164. Weintraub P. G. (2007). Insect vectors of phytoplasmas and their control-an update.

Bulletin of Insectology. Vol 60. pp. 169.

165. Wilson M. R. and P. G. Weintraub (2007). An introduction to Auchenorrhyncha

phytoplasma vectors. Bulletin of Insectology. Vol 60. pp. 177.

166. Win N. K. K., C. G. Back and H. Y. Jung (2010). Phyllody phytoplasma infecting

sesame (Sesamum indicum) in Myanmar. Tropical Plant Pathology. Vol 35. pp. 310-313.

167. Yankey E. N., P. Swarbrick, M. Dickinson, J. Tomlinson, N. Boonham, J. O.

Nipah and R. N. Quaicoe (2011). Improving molecular diagnostics for the

detection of lethal disease phytoplasma of coconut in Ghana. Bulletin of

Insectology. Vol 64. pp. S47-S48.

168. Zahniser, J. N., and C. Dietrich (2013). A review of the tribes of Deltocephalinae

(Hemiptera: Auchenorrhyncha: Cicadellidae). European Journal of Taxonomy. Vol

45. pp. 10-19.

169. Zhao Y., W. Wei, M. Lee, J. Shao, X. Suo and R. E. Davis (2009). Construction of an

139

interactive online phytoplasma classification tool, iPhyClassifier, and its application in

analysis of the peach X-disease phytoplasma group (16SrIII). International Journal of

Systematic and Evolutionary Microbiology. Vol 59. pp. 2582-2593.

170. Zheng, W. (2013). Molecular Identification of the pathogeny of Arachis

duranensis yellow disease. Unpublished. Retrieved on 19 February 2014 at

140

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/388895506.

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1. Trình tự nucleotide đăng ký trên Ngân hàng Gen

1) Trình tự nucleotide của phytoplasma gây bệnh chổi phù thuỷ hại đậu tƣơng dùng cặp

mồi SN910601/SN011119

phytoplasma

>gi|459926473|gb|KC508646.1| Soybean witches‟-broom isolate NDT&HTT7879 16S ribosomal RNA gene, partial sequence; 16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer, complete sequence; and 23S ribosomal RNA gene, partial sequence 2) Trình tự nucleotide của phytoplasma gây bệnh trắng lá mía (SCWL-01, Định Quán-

Đồng Nai) dùng cặp mồi Phy1F/Spacer2R

>gi|584458897|gb|KF958187.1| Sugarcane white leaf phytoplasma strain SCWL-01 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 3) Trình tự nucleotide của phytoplasma gây bệnh biến vàng lá mía (SCWL-02, Định

Quán- Đồng Nai) dùng cặp mồi Phy1F/P7

>gi|584458898|gb|KJ001296.1| Sugarcane white leaf phytoplasma isolate TK.SCWL-02 16S ribosomal RNA gene, partial sequence; 16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer, complete sequence; and 23S ribosomal RNA gene, partial sequence 4) Trình tự nucleotide của phytoplasma gây bệnh chổi phù thuỷ hại sắn

141

>gi|344055815|gb|JN381547.1| Cassava witches'-broom phytoplasma clone AHTB31 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|344055816|gb|JN381548.1| Cassava witches‟-broom phytoplasma clone AHTB20-1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|344055817|gb|JN381549.1| Cassava witches‟-broom phytoplasma clone AHTB20-2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|344055818|gb|JN381550.1| Cassava witches‟-broom phytoplasma clone AHTB12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|387151845|gb|JQ973105.1| Vietnamese cassava phytoplasma isolate Kon Tum-17 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|387151846|gb|JQ973106.1| Vietnamese cassava phytoplasma isolate Dong Nai-34 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|442736175|gb|KC295284.1| Cassava witches‟-broom phytoplasma strain KT-TT1.7 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

142

>gi|442736176|gb|KC295285.1| Cassava witches‟-broom phytoplasma strain BRVT-02 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|691192041|gb|KM280679.1| Cassava witches‟-broom disease phytoplasma isolate T7-DN 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|691192042|gb|KM280680.1| Cassava witches‟-broom disease phytoplasma isolate T11-QNg 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|691192043|gb|KM280681.1| Cassava witches‟-broom disease phytoplasma isolate T18-TN 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|691192044|gb|KM280682.1| Cassava witches‟-broom disease phytoplasma isolate T19-BRVT 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|686985450|gb|KM360166.1| Cassava witches‟-broom phytoplasma 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|686985451|gb|KM360167.1| Cassava witches‟-broom phytoplasma isolate YB- 02.14 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|686985452|gb|KM360168.1| Cassava witches‟-broom phytoplasma isolate DN-02 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|686985453|gb|KM360169.1| Cassava witches‟-broom disease phytoplasma isolate cwb-QNg19.2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|686985454|gb|KM360170.1| Cassava witches‟-broom disease phytoplasma isolate cwb-BR5 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|686985455|gb|KM360171.1| Cassava witches‟-broom disease phytoplasma isolate cwb-BR7.2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence >gi|686985456|gb|KM360172.1| Cassava witches‟-broom disease phytoplasma isolate cwb-BR9.1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 5) Trình tự nucleotide của phytoplasma trên cây sắn và cây dừa cạn trong thí nghiệm xác định khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng >cwb_KM94-916bp (cây sắn bị nhiễm bệnh trong thí nghiệm) ACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACA CGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGCAATGGAGGAAACTCTGA CCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGA AGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACTA TGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTA AAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGAT GCTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGG

143

TAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTAC TGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG CCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGT ACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAGTACGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCA CAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAACCTCACCAGGTCTTGAC ATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATG GTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTT ATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTG GAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCAT >Dua_can-914bp (cây dừa cạn bị nhiễm bệnh trong thí nghiệm) ACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGAC ACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGCAATGGAGGAAACTCTG ACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGG AAGAATAAATGATGGAAAAATCATTCTGACGGTACCTAATGAATAAGCCCCGGCTAACT ATGTGCCAGCAGCCGGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTA AAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATG CTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGT AAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACT GACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC CGTAAACGATGAGCTAAACGTTGGGTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACT CCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACA AGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAACCCACCAGGTCTTGACAT GCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGTGGAGGTTATCAGTTGCACAGGTGGTGCATGGT TGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAT TGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCCAGTGATAAATTGGA GGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCAT

Triệu chứng bệnh

Ghi khác

Địa điểm thu thập

Thời gian thu thập

Tên bệnh (cây ký chủ)-giống

Mã mẫu thu thập BD-01.09 Bình Dƣơng

19/8/2009 Chổi phù thuỷ (sắn)

Giai đoạn STPT Không rõ

DNA tổng số lƣu lại

BD-02.09 Bình Dƣơng

19/8/2009 Chổi phù thuỷ (sắn)

Không rõ

DNA tổng số lƣu lại

BRVT-01 Tóc Tiên, Tân Thành,

24/4/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Thu hoạch củ

Tự để giống

Bà Rịa-Vũng Tàu

KM94

BRVT-02 Tóc Tiên, Tân Thành,

24/4/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Thu hoạch củ

Tự để giống

Bà Rịa-Vũng Tàu

KM94

BRVT-03 Tóc Tiên, Tân Thành,

24/4/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Thu hoạch củ

Tự để giống

Bà Rịa-Vũng Tàu

KM94

1 4 4

BRVT-04 Tóc Tiên, Tân Thành,

24/4/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Thu hoạch củ

Tự để giống

Bà Rịa-Vũng Tàu

KM94

BR-5

24/4/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Thu hoạch củ

Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ. Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ. Thân chính mọc nhiều chồi phụ. Lá co nhỏ, biến vàng, xếp sít vào nhau. Thân chính mọc nhiều chồi phụ. Lá co nhỏ, biến vàng, xếp sít vào nhau. Thân chính mọc nhiều chồi phụ. Lá co nhỏ, biến vàng, xếp sít vào nhau. Thân chính mọc nhiều chồi phụ. Lá co nhỏ, biến vàng, xếp sít vào nhau. Nhƣ trên

Tự để giống

KM94

BR-7.2

23/4/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Thu hoạch củ

Nhƣ trên

Châu Pha, Tân Thành, Bà Rịa-Vũng Tàu Bình Ba, Châu Đức, Bà Rịa-Vũng Tàu

KM94

BR-9.1

23/4/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Thu hoạch củ

Nhƣ trên

Mua giống tại đại lý bán giống cây trồng trên địa bàn tỉnh Tự để giống

KM94

TN-01

Thu hoạch củ

Suối Nghệ, Châu Đức, Bà Rịa-Vũng Tàu Tân Hội, Tân Châu, Tây Ninh

22/3/2013 Chổi phù thuỷ (sắn)- KM419

TN-02

Thu hoạch củ

Thân chính mọc nhiều chồi phụ. Lá co nhỏ, biến vàng. Lõi thân có màu nâu nhạt. Nhƣ trên

Hộ sản xuất sắn với diện tích lớn. Đất cát pha. Trồng tập trung. Tự để giống.

Tân Hội, Tân Châu, Tây Ninh

22/3/2013 Chổi phù thuỷ (sắn)- KM419

PHỤ LỤC 2. Danh sách các mẫu bệnh thu thập năm 2011-2013

Thu hoạch củ

Nhƣ trên

TN-03

22/3/2013 Chổi phù thuỷ (sắn)- KM419 10/01/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Thân chính mọc nhiều chồi

Mẫu gửi ra

H2T-1

phụ. Lá biến vàng,

KM94

10/01/2011 Chổi phù

thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Lá co nhỏ, biến vàng, Lõi

Mẫu gửi ra

H2T-2

thân có màu nâu nhạt.

KM140 21/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

ĐN-01

KM94

Tân Hội, Tân Châu, Tây Ninh Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

Chờ thu hoạch Thân chính mọc nhiều chồi phụ. Lá co nhỏ, biến vàng. Lõi thân có màu nâu nhạt.

21/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

ĐN-02

KM94

21/02/2011 Biến vàng

lá

(sắn)-

ĐN-03

KM94

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

Chờ thu hoạch Lá khảm vàng dọc phần gân chính. Cây không bị phát búi dạng chổi phù thuỷ.

ĐN-04

21/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

KM94

Chờ thu hoạch Thân chính mọc nhiều chồi phụ. Lá co nhỏ, biến vàng. Lõi thân có màu nâu nhạt.

1 4 5

ĐN-04.2 Hƣng Thịnh, Trảng

21/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Củ cây sắn bị bệnh. Thịt củ

có các vết sọc màu đen.

KM94

Bom, Đồng Nai

ĐN-05.1 Hƣng Thịnh, Trảng

21/02/2011 Chổi phù

thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Lá co nhỏ, biến vàng. Lõi

thân có màu nâu nhạt.

KM140

Bom, Đồng Nai

ĐN-05.2 Hƣng Thịnh, Trảng

21/02/2011 Chổi phù

thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Củ cây sắn bị bệnh. Củ nhỏ

có các vết sọc màu đen.

ĐN-06

KM140 21/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

KM94

Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

Vùng sắn trồng tập nắng trung. Trời nóng. Đất khô cằn. Vùng đất đỏ bazan. Trung tâm Nông nghiệp thực nghiệm. Giống sắn trồng khảo nghiệm, đánh giá nhiều năm.

Chờ thu hoạch Thân chính mọc nhiều chồi phụ. Lá co nhỏ, biến vàng. Lõi thân có màu nâu nhạt.

ĐN-07

21/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

KM94

ĐN-08

21/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

ĐN-09

KM94 21/02/2011 KM94

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

Chờ thu hoạch Cây không có triệu chứng của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn.

145

ĐN-10

21/02/2011 KM94

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

Chờ thu hoạch Cây không có triệu chứng của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn.

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

ĐN-11

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

KM94

Chờ thu hoạch Thân chính mọc nhiều chồi phụ. Lá co nhỏ, biến vàng. Lõi thân có màu nâu nhạt.

ĐN-12

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

KM94

ĐN-13

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

KM94

Chờ thu hoạch Củ cây sắn bị bệnh. Củ nhỏ, phía trong lớp áo vỏ củ màu nâu đen, thịt củ có các vết sọc màu đen.

ĐN-14

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

KM94

ĐN-15

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai

KM94

KT-12.1 Đăk Bla, TP. Kon

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Tum, Kon Tum

KM94

1 4 6

Chờ thu hoạch Thân chính mọc nhiều chồi phụ. Lá biến dạng, mất thùy lá, biến vàng.

KT-12.2 Đăk Bla, TP. Kon

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

Tum, Kon Tum

KM94

KT-13.1 Đăk Bla, TP. Kon

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Thân chính mọc nhiều chồi

Tum, Kon Tum

phụ. Lá co nhỏ, biến vàng

KM94

KT-13.2 Đăk Bla, TP. Kon

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

Tum, Kon Tum

KM94

KT-13.3 Đăk Bla, TP. Kon

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Thân, cành của cây sắn bị

Tum, Kon Tum

bệnh chổi phù thuỷ.

KM94

KT-13.4 Đăk Bla, TP. Kon

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Trời nắng nóng. Đất đồi dốc. Trồng rải rác của hộ nông dân. Không rõ nguồn hom giống sử dụng.

KM94

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

KT-01

Chờ thu hoạch Củ của cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ. Chờ thu hoạch Lá biến vàng. Lá co hẹp, kéo

dài. Cây thấp lùn.

KM94

KT-02

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Lá biến vàng. Lá co hẹp, kéo

Tum, Kon Tum Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum

dài. Cây thấp lùn.

KM94

146

KT-03

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum

KM94

Chờ thu hoạch Thân chính mọc nhiều chồi phụ. Lá biến dạng, mất thùy lá, biến vàng.

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

KT-04

KM94

23/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

KT-17

KM94

QNg-01

24/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum Đăk Tờre, Kon Rẫy, Kon Tum Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi

KM94

QNg-02

24/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Lá co nhỏ, biến vàng. Thân gỗ màu đen, lõi giữa màu nâu nhạt. Chờ thu hoạch Nhƣ trên

Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi

KM94

QNg-02.1 Sơn Nham,Sơn Hà,

24/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

KM94

QNg-03

24/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Trời nắng nóng. Đất đồi núi đá dốc. Trồng rải rác của hộ nông dân. Tự để hom giống.

Chờ thu hoạch Củ của cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ. Chờ thu hoạch Lá co nhỏ, biến vàng. Thân gỗ màu đen.

KM94

QNg-04

24/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

Quảng Ngãi Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi

KM94

1 4 7

QNg-04.1 Sơn Nham,Sơn Hà,

24/02/2011 Chổi phù thuỷ (sắn)-

03/4/2012

Chờ thu hoạch Củ của cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ. Chờ thu hoạch Thân chính mọc nhiều chồi

ĐN-34

phụ. Lá co nhỏ, biến vàng.

03/4/2012

Chờ thu hoạch Thân chính mọc nhiều chồi

ĐN-35

Ruộng trồng sắn tập rõ trung. Không nguồn gốc.

KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)- KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)- KM94

06/04/2012 Chổi phù

thuỷ (sắn)-

BD-01

KM140

phụ. Lá co nhỏ, biến vàng. Lá co nhỏ, biến vàng. Lõi thân có màu nâu nhạt.

Không rõ nguồn hom giống sử dụng.

06/04/2012 Chổi phù

thuỷ (sắn)-

Phát triển thân lá Phátriển thân lá Nhƣ trên

BD-02

KM140

Quảng Ngãi Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Phú An, Bến Cát, Bình Dƣơng Phú An, Bến Cát, Bình Dƣơng Đồng Phú, Bình Phƣớc 25/8/2012 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

BP-01

KM60

BP-02

Phú, Bình

25/8/2012 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

Trồng rải rác của hộ nông dân. Không rõ nguồn hom giống sử dụng.

Đồng Phƣớc

KM60

147

BP-03

Phú, Bình

25/8/2012 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

KM60

07/12/2013 Chổi phù thuỷ (sắn)-

T7-ĐN

Đồng Phƣớc Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai

KM94

Chờ thu hoạch Cây phát búi. Lá co nhỏ, biến vàng. Thân gỗ màu đen, lõi giữa màu nâu nhạt.

07/12/2013 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

T8-ĐN

KM94

07/12/2013 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

T14-ĐN

KM94

Trồng rải rác của hộ nông dân. Không rõ nguồn hom giống sử dụng. Vùng đất đỏ bazan.

07/12/2013 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

T15-ĐN

KM94

07/12/2013 Chổi phù thuỷ (sắn)-

Chờ thu hoạch Nhƣ trên

Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai

T20-ĐN T11-QNg

KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)

Không rõ 06/04/2012 Chổi phù

thuỷ (sắn)-

DNA tổng số lƣu lại

T17-BD T18-TN

Không rõ Không rõ

KM140 Chổi phù thuỷ (sắn) Chổi phù thuỷ (sắn)

Không rõ Phát triển thân lá Không rõ Không rõ

Không rõ Lá co nhỏ, biến vàng. Lõi thân có màu nâu nhạt. Không rõ Không rõ

DNA tổng số lƣu lại DNA tổng số lƣu lại

1 4 8

T19-BRVT PhT-01

9/2012

Chổi phù thuỷ (sắn)

Chờ thu hoạch Lá co nhỏ, biến vàng. Thân

gỗ màu đen.

Quảng Ngãi Phú An, Bến Cát, Bình Dƣơng Tây Ninh Tân Thành, Bà Rịa- Vùng Tàu Cổ Tiết, Tam Nông, Phú Thọ YB-01 Mậu A, Văn Yên,

2011

Chờ thu hoạch Lá co nhỏ, biến vàng. Thân

Yên Bái

gỗ màu đen.

YB-02 Mậu A, Văn Yên,

2011

Chờ thu hoạch Lá co nhỏ, biến vàng. Thân

ĐT-01

2011

thuỷ đậu

ĐT-02

2011

thuỷ đậu

gỗ màu đen. Cây phát búi dạng chổi phù thuỷ. Lá biến dạng. Nhƣ trên

Chổi phù thuỷ (sắn)- KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)- KM94 Chổi phù tƣơng Chổi phù tƣơng Trắng lá mía

Cây ra hoa-đậu quả Cây ra hoa-đậu quả Cây con

Yên Bái Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai SCWL-01 Định Quán, Đồng Nai 2011

Lá có màu trắng kem sữa. Cây thấp lùn xuống.

Không rõ nguồn hom giống sử dụng. Không rõ nguồn hom giống sử dụng. Không rõ nguồn hom giống sử dụng. Trồng rải rác của hộ nông dân. Trồng rải rác của hộ nông dân. Trồng rải rác của hộ nông dân. Trồng rải rác.

Biến vàng lá

Cây vƣơn lóng Gân, thịt lá biên vàng

SCWL-02 Định Quán, Đồng Nai 2011

148

PHỤ LỤC 3. Một số cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR trực tiếp nhằm phát hiện phytoplasma gây hại trên cây sắn

Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi P1/P7 M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ 1 đến 7: các mẫu thử nghiệm gồm 1. QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; 2. KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; 3. ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; 4. BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; 5. YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; 6. ĐT-01: chổi phù thuỷ đậu tƣơng Trảng Bom - Đồng Nai; 7. Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai.

Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi SN910601/SN011119 M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ 1 đến 7: các mẫu thử nghiệm gồm 1. QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; 2. KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; 3. ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; 4. BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; 5. YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; 6. Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai; 7. ĐT-01: chổi phù thuỷ đậu tƣơng Trảng Bom - Đồng Nai.

149

Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi A) Phy1F/SN011119 và B) P1/SN011119 M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ 1 đến 7: các mẫu thử nghiệm gồm 1. QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; 2. KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; 3. ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; 4. BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; 5. YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; 6. ĐT-01: chổi phù thuỷ đậu tƣơng Trảng Bom - Đồng Nai; 7. Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai.

Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi Phy1F/P7 M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ 1 đến 7: các mẫu thử nghiệm gồm 1. QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; 2. KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; 3. ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; 4. BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; 5. YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; 6. SCWL-02: biến vàng lá mía Định Quán- Đồng Nai; 7. Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai.

Hình 5. Kết quả điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi Phy1F/Spacer1R M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ 1 đến 7: các mẫu thử nghiệm gồm 1. QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; 2. KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; 3. ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; 4. BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; 5. YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; 6. SCWL-01: trắng lá mía Định Quán- Đồng Nai; 7. Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai.

STT

Sắn KM94 Sắn KM937-26 Thầu dầu Dừa cạn Kiểm tra PCR – – – – 1 2 3 4

Bảng 1. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tiếp xúc cơ học (Đồng Nai, 2013) Thời kỳ Tỷ lệ cây phát Cây tiềm dục bệnh (%) thí nghiệm 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Ghi chú: n 30 cây; (–) tức là phản ứng PCR âm tính.

150

STT

PHỤ LỤC 4. Danh sách mẫu phytoplasma dùng để lựa chọn vùng gen thiết kế mồi LAMP đặc hiệu nhóm 16SrII Bảng 2. Danh sách 92 mẫu trình tự 16S RNA ribosome dùng để lựa chọn vùng gen thiết kế mồi LAMP đặc hiệu nhóm 16SrII Mẫu* Nhóm

1 16SrI Số mẫu 13

2 16SrII 16

3 16SrIII 9

16SrIV 4 3

16SrV 5 6

6 16SrVI 7

16SrVII 7 3

16SrVIII 16SrIX 8 9 2 4

16SrX 3

10 16SrXI 3

11 16SrXII 4

151

12 13 16SrXIII 16SrXIV 1 2 I-Y-EF199549; I-D-AY265206-PaWB; I-B-M30790- MAY; I-N-AY265205-IoWB; I-B-NC005303-OY-M; I- M-AY265209-AVUT; I-L-AY180957-AV2192; I-E- AY265213-BBS3; I-A-NC007716-AYWB; I-F- AY265211-A-AY; I-C-AF222065-CPh; I-A-L33760-BB; I-P-AF503568-PopAY II-A-L33765-PnWB; II-KM280680-CWBT11.QNg; II- KM280681-CWBT18.TN; II-C-X83432-FBP; II-B- U15442-WBDL; II-D-Y10096-PpM; II-KM280682- CWBT19.BRVT; II-KM280679-CWBT7.DN; II- KC295285-CWB.BR02; II-KM360172-CWB.BR9.1; II- KM360171-CWB.BR7.2; II-KM360170-CWB.BR5; II- KM360169-CWB.QNg19.2; II-JQ957931-Alp4; II-F- EF186827-CoP; II-E-Y16393-PEY III-L-EU346761-CFSD; III-J-AF147706-ChWBIII; III-P- AF370119-DanV; III-V-GU292082-PassWB-Br4; III-M- FJ226074-PPT-MT117; III-F-AF510724-MW1; III-B- AF173558-CYE; III-N-GU004365-PPT-AK6; III-A- JQ044393-PX11Ct1 IV-A-AF498307-LYJ-C8; IV-B-MOU18753-LDY; IV-C- X80117-LDT V-C-X76560-FDC; V-D-AJ548787-FD1487; V-F- AB689678-BltWB; V-B-AB052876-JWBG1; V-A- AY197655-EY; V-E-AY197648-RusS VI-D-AF228053-PLLBd; VI-E-AY270156-CSVI; VI-A- AY390261-CP; VI-B-AF190224-MC; VI-C-AF409069- EY-Il1; VI-F-EF186819-CPS; VI-I-GU292081-PassWB VII-B-AY034608-ErWB; VII-A-AF092209-AshY; VII-C- AY147038-ArAWB VIII-A-AF086621-LufWB; VIII-A-AF086621-LufWB IX-C-HQ589191-NAXOS: IX-A-AF248957-PPWB; IX- B-AF515636-CPPA4; IX-D-AF515637-AlWB X-D-X92869-SpaWB; X-E-X76431-BAWB; X-A- AJ542541-AP15 XI-B-X76432-SCWL; XI-A-AB052873-RYD; XI-C- X76429-BVK XII-A-AF248959-STOL11; XII-C-AJ243045-StrawLY; XII-H-JN833705-BYS57; XII-D-AB010425-JHP XIII-A-AF248960-MPV XIV-A-AJ550984-BGWL-C1; XIV-B-EF444485- F.BGWL

STT

Nhóm Mẫu*

XV-A-AF147708-HibWB; XV-B-HQ258882-GWB XVI-A-AY725228-SYLS XVII-A-AY725234-PBT

XIX-A-AB054986-CPC XX-JQ868449-RhCa XXI-A-AJ310849-PinP; XXI-A-AJ310849-PinP XXII-A-KF751387-LYDM178; XXII-B-JQ868442-CLYP

Các mẫu đƣợc trình bày theo thứ tự Nhóm – Nhóm phụ - Mã truy cập

Ngân hàng gen-Mẫu

152

16SrXV 16SrXVI 16SrXVII 16SrXVIII XVIII-A-DQ174122-APPTW 16SrXIX 16SrXX 16SrXXI 16SrXXII 16SrXXIII XXIII-A-AY083605-BVGY 16SrXXV XXV-A-AF521672-WTTW 16SrXXVIII XXVIII-A-AY744945-DP XXX-A-FJ432664-SaCW 16SrXXX 16SrXXXI XXXI-A-HQ225630SST1 16SrXXXII XXXII-A-EU371934-MaPV Tổng 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Số mẫu 2 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 92

PHỤ LỤC 5. Đề xuất quy trình chẩn đoán, giám định phytoplasma hại sắn 1. Thu thập và bảo quản mẫu bệnh a. Thu thập mẫu bệnh

Thu thập, chụp ảnh, mô tả triệu chứng những cây sắn nghi ngờ nhiễm bệnh có biểu hiện các triệu chứng đặc trƣng nhƣ mọc nhiều chồi ngọn và chồi thân ở phần thân chính; lá cây nhỏ lại, biến màu vàng nhạt, hoặc tím nhạt và thô cứng, đốt thân ngắn lại, thân sắn ngả mầu thâm đen, phần lõi có màu nâu nhạt, chồi bị chết khô, nhiều cây bị thấp lùn lại. b. Xử lý và bảo quản mẫu cây

Đối với cách bảo quản tƣơi: chọn bộ phận (lá, thân cành) có biểu hiện triệu chứng điển hình của bệnh chổi phù thuỷ đƣợc giữ ẩm bằng giấy thấm ƣớt và bọc trong giấy báo, hoặc bọc trong tấm vải ẩm rồi đựng vào trong thùng xốp.

Đối với cách bảo quản khô: chọn bộ phận (lá, gân lá, thân cành) rồi cho vào túi nilon có chứa các hạt silicagel tự chỉ thị. Thay hạt silicagel tự chỉ thị cho đến khi mẫu bảo quản khô, giòn là đƣợc. Cất giữ bảo quản mẫu cây ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh sâu –20oC. 2. Chẩn đoán, giám định bệnh a. Chẩn đoán

Chẩn đoán bệnh bằng kỹ thuật nhuộm mô với DAPI (4‟,6-diamidino-2-

phenylindole dihydrochloride) hoặc bằng phƣơng pháp kính hiển vi điện tử.

Chẩn đoán bệnh bằng kỹ thuật LAMP-PCR.

b. Giám định bệnh

Áp dụng kỹ thuật PCR lồng bằng các cặp mồi P1/P7, hoặc R16mF2/R16mR1 và

R16F2n/R16R2.

Phân tích bằng kỹ thuật phân tích đa hình thông thƣờng (RFLP) đối với các sản phẩm PCR, phân tích đa hình RFLP thực hiện mô phỏng trình tự nucleotide trên chƣơng trình pDRAW32. c. Giải trình tự và phân tích phả hệ

Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ Kit theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Gửi đọc

trình tự các mẫu phân tích ở các cơ sở trong nƣớc hoặc nƣớc ngoài.

153

Trình tự nucleotide đƣợc so sánh mức độ tƣơng đồng với nhau bằng các chƣơng trình tin sinh học ClustalW2, BioEdit 7.0.0, và dùng chƣơng trình trực tuyến BLAST để tìm kiếm các chuỗi nucleotide tƣơng đồng có sẵn trên Ngân hàng Gen của NCBI tại địa chỉ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Cây phả hệ đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor-Joining (N-J) với khoảng cách di truyền giữa các chuỗi đƣợc xác định dựa trên mô hình thay thế Kimura 2 tham số, giá trị thống kê bằng kỹ thuật bootstrap (%) với 1.000 lần lặp lại trong MEGA 5.0. Sau đó, xác định danh tính loài phytolasma gây hại trên cây sắn bị bệnh.

Anh huong cua dat trong den kha nang lan truyen cua benh choi rong hai san - thi nghiem chau vai trong nha luoi (Dong Nai, nam 2012)

VARIATE V003 TLB aye Cu chuoi ah LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 7769.34 2589.78 181.23 0.000 2 * RESIDUAL 8 114.320 14.2900 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 7883.66 716.696 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF1 19/12/** 9:07 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2

Anh huong cua dat trong den kha nang lan truyen cua benh choi rong hai san - thi nghiem chau vai trong nha luoi (Dong Nai, nam 2012)

MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLB CT1 3 43.3000 CT2 3 0.000000 CT3 3 56.7000 CT4 3 0.000000 SE(N= 3) 2.18251 5%LSD 8DF 7.11693 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF1 19/12/** 9:07 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3

Anh huong cua dat trong den kha nang lan truyen cua benh choi rong hai san - thi nghiem chau vai trong nha luoi (Dong Nai, nam 2012)

154

PHỤ LỤC 6. Kết quả xử lý thống kê 1) Tỷ lệ bệnh cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ (%) - thí nghiệm xác định khả năng lan truyền qua hom trong chậu vại, Hƣng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, năm 2012 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE THANHF1 19/12/** 9:07 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1

Kha nang lan truyen cua benh choi phu thuy hai san qua to hong(%)

VARIATE V003 TLB ndthanhf LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 1077.74 538.870 273.54 0.000 2 * RESIDUAL 6 11.8201 1.97001 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 1089.56 136.195 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NDT 19/12/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2

Kha nang lan truyen cua benh choi phu thuy hai san qua to hong(%)

MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLB CT1 3 11.3000 CT2 3 26.7000 CT3 3 0.000000 SE(N= 3) 0.810352 5%LSD 6DF 2.80314 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NDT 19/12/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3

Kha nang lan truyen cua benh choi phu thuy hai san qua to hong(%)

155

2) Thí nghiệm xác định khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng (Đồng Nai, năm 2012) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE NDT 19/12/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1

Ty le benh choi rong san (%) tren 04 giong thi nghiem tai thoi diem thu hoach Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013

VARIATE V003 TLB aye, Cu chuoi ah LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 GIONG$ 3 580.301 193.434 78.71 0.000 2 * RESIDUAL 8 19.6608 2.45760 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 599.962 54.5420 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF7 4/12/** 9:39 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2

Ty le benh choi rong san (%) tren 04 giong thi nghiem tai thoi diem thu hoach Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013

MEANS FOR EFFECT GIONG$ ----------------------------------------------------------------------------- GIONG$ NOS TLB KM94 3 7.36000 KM419 3 19.2000 SM937-26 3 6.08000 SE(N= 3) 0.905097 5%LSD 8DF 2.95143 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF7 4/12/** 9:39 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3

Ty le benh choi rong san (%) tren 04 giong thi nghiem tai thoi diem thu hoach Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013

156

3) Tỷ lệ bệnh chổi phù thuỷ sắn (%) tại thời điểm thu hoạch, Hƣng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, tháng 12 năm 2013 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE THANHF7 4/12/** 9:39 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1

VARIATE V003 CCC aye, cu chuoi ah LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 GIONG$ 3 37.7048 12.5683 124.12 0.000 2 * RESIDUAL 116 11.7464 .101262 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 119 49.4513 .415557 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF 4/12/** 9:39 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Anh huong cua benh choi rong san den chieu cao cay cua 04 giong san thi nghiem tai thoi diem thu hoach, Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013

MEANS FOR EFFECT GIONG$ ----------------------------------------------------------------------------- GIONG$ NOS CCC KM94 30 3.33067 KM419 30 1.78567 SM937-26 30 2.75933 HL-S11 30 2.84533 SE(N= 30) 0.580983E-01 5%LSD 116DF 0.162717 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF 4/12/** 9:39 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Anh huong cua benh choi rong san den chieu cao cay cua 04 giong san thi nghiem tai thoi diem thu hoach, Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013

4) Ảnh hƣởng của bệnh chổi phù thuỷ sắn đến chiều cao cây tại thời điểm thu hoạch, Hƣng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, tháng 12 năm 2013 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCC FILE THANHF 4/12/** 9:39 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Anh huong cua benh choi rong san den chieu cao cay cua 04 giong san thi nghiem tai thoi diem thu hoach, Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |GIONG$ | (N= 120) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CCC 120 2.6802 0.64464 0.31822 11.9 0.0000

157

Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013)

VARIATE V003 NSTL anh nho em nhieu ndt LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 2.16365 1.08182 0.25 0.786 3 2 CT$ 3 805.085 268.362 62.58 0.000 3 * RESIDUAL 6 25.7294 4.28823 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 832.978 75.7253 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSCT FILE TFK 7/12/** 9:34 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2

Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013)

VARIATE V004 NSCT cu chuoi LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 127.042 63.5212 4.12 0.075 3 2 CT$ 3 845.280 281.760 18.28 0.003 3 * RESIDUAL 6 92.4868 15.4145 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 1064.81 96.8009 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTB FILE TFK 7/12/** 9:34 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3

Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013)

VARIATE V005 NSTB ndt LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 8.23852 4.11926 3.84 0.084 3 2 CT$ 3 90.7119 30.2373 28.17 0.001 3 * RESIDUAL 6 6.44142 1.07357 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 105.392 9.58108 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HLTB FILE TFK 7/12/** 9:34 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4

Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013)

VARIATE V006 HLTB aye, Cu Chuoi LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 1.82000 .910000 0.46 0.656 3 2 CT$ 3 32.9767 10.9922 5.53 0.037 3 * RESIDUAL 6 11.9333 1.98889 -----------------------------------------------------------------------------

158

5) Năng suất, chỉ số thu hoạch và hàm lƣợng tinh bột của các giống sắn tại thời điểm thu hoạch (Hƣng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, tháng 12 năm 2013) BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTL FILE TFK 7/12/** 9:34 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1

* TOTAL (CORRECTED) 11 46.7300 4.24818 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CSTH FILE TFK 7/12/** 9:34 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5

Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013)

VARIATE V007 CSTH ndthtt7879 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 65.0964 32.5482 8.38 0.019 3 2 CT$ 3 135.067 45.0222 11.59 0.007 3 * RESIDUAL 6 23.3076 3.88461 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 223.471 20.3155 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TFK 7/12/** 9:34 ---------------------------------------------------------------- PAGE 6

Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013)

MEANS FOR EFFECT NLAI ----------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS NSTL NSCT NSTB HLTB 1 4 26.8125 32.5650 8.68750 26.2000 2 4 26.1875 28.5950 7.40000 25.8000 3 4 27.2200 36.5650 9.40250 25.2500 SE(N= 4) 1.03540 1.96306 0.518066 0.705140 5%LSD 6DF 3.58162 6.79055 1.79207 2.43919 NLAI NOS CSTH 1 4 54.9700 2 4 52.1475 3 4 57.8525 SE(N= 4) 0.985470 5%LSD 6DF 3.40890 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS NSTL NSCT NSTB HLTB KM94 3 24.8333 34.9633 8.83000 25.2667 KM419 3 18.2100 25.3333 6.42333 25.5000 SM937-26 3 23.6667 24.7100 5.88000 23.8333 HL-S11 3 40.2500 45.2933 12.8533 28.4000 SE(N= 3) 1.19558 2.26675 0.598211 0.814225 5%LSD 6DF 4.13570 7.84105 2.06931 2.81654 CT$ NOS CSTH KM94 3 58.4867 KM419 3 58.0533 SM937-26 3 50.7367 HL-S11 3 52.6833 SE(N= 3) 1.13792 5%LSD 6DF 3.93626 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TFK 7/12/** 9:34 ---------------------------------------------------------------- PAGE 7

159

Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013)

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | NSTL 12 26.740 8.7020 2.0708 7.7 0.7862 0.0002 NSCT 12 32.575 9.8387 3.9261 12.1 0.0747 0.0026 NSTB 12 8.4967 3.0953 1.0361 12.2 0.0843 0.0010 HLTB 12 25.750 2.0611 1.4103 5.5 0.6564 0.0373 CSTH 12 54.990 4.5073 1.9709 3.6 0.0189 0.0073

160

PHỤ LỤC 7. Một số hình ảnh trong thí nghiệm

Điều tra, thu thập mẫu cây sắn

Theo dõi, thu thập rầy tại ruộng trồng sắn bằng bẫy ánh sáng bị bệnh chổi phù thuỷ trên đồng

Cây dừa cạn sạch bệnh mọc từ hạt Cây sắn sạch bệnh mọc từ hạt

161

Máy điện di bản gel agarose Nồi hấp khử trùng đất thí nghiệm