Luận án tiến sĩ Sinh học: Sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α-amylase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ ĐÀ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA

ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU ĐẾN KHẢ

NĂNG TIẾT α – AMYLASE TÁI TỔ HỢP TRONG BACILLUS SUBTILIS

Hà Nội, 2017

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ ĐÀ

SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA

ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU ĐẾN

KHẢ NĂNG TIẾT α – AMYLASE TÁI TỔ HỢP TRONG BACILLUS SUBTILIS

Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Trần Đình Mấn

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2017

Lời cảm ơn

Trƣớc tiên, tôi xin gửi lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS Trần

Đình Mấn, Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn

lâm KH&CN Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình

nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Kim Thoa cùng toàn thể các anh

chị và các bạn đồng nghiệp phòng Công nghệ vật liệu sinh học đã động viên, giúp đỡ

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện công nghệ sinh học,

các anh chị phòng Vi sinh vật đất, phòng Công nghệ lên men, Trung tâm bảo tàng

giống, phòng Vi sinh phân tử và ThS. Bùi Thị Hải Hà đã giúp đỡ, hợp tác và tạo mọi

điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này.

Đây là công trình đƣợc thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của đề tài “Nghiên cứu

sản xuất enzyme -amylase bền nhiệt tái tổ hợp ứng dụng trong công nghiệp dệt”

thuộc Đề án Phát triển và Ứng dụng CNSH trong công nghiệp chế biến, Mã số:

CNSHCB/2010-5 và đề tài cán bộ trẻ của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam:“Nghiên cứu ảnh hưởng của trình tự peptide tín hiệu lên khả năng tiết  -

amylaza ngoại bào ở Bacillus”.

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè, những ngƣời luôn bên tôi,

quan tâm, động viên, tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn nhất

trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành nhiệm vụ đƣợc

giao.

Hà Nội, ngày 16 tháng 01 năm 2018

NCS. Nguyễn Thị Đà

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các

cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc

công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các

đồng tác giả;

Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 16 tháng 01 năm 2018

Tác giả

NCS. Nguyễn Thị Đà

iii

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................. vii

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... ix

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... xi

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3

1.1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT ................................. 3

1.1.1. Quá trình tiết protein ở tế bào Eucaryotes .......................................................... 3

1.1.2. Quá trình tiết protein ở E. coli ............................................................................ 3

1.1.3. Quá trình tiết protein trong Bacillus ................................................................... 4

1.1.4. Enzyme phân cắt peptide tín hiệu của Sec/P..................................................... 16

1.2. HỆ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở VI SINH VẬT .............................. 18

1.2.1. Vai trò của Bacillus trong công nghiệp sản xuất enzyme ................................. 18

1.2.2. Hệ thống biểu hiện ở Bacillus ........................................................................... 20

1.2.3. Đặc điểm di truyền của Bacillus subtilis ........................................................... 20

1.2.4. Hệ biểu hiện ở E. coli và vi sinh vật khác ......................................................... 21

1.3. CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN BIỂU HIỆN GEN Ở Bacillus subtilis ......... 22

1.3.1. Lựa chọn promoter ............................................................................................ 23

1.3.2. Các vector biểu hiện ở Bacillus subtilis ............................................................ 24

1.3.3. Chọn trình tự peptide tín hiệu. .......................................................................... 25

1.3.4. Đột biến peptide tín hiệu ................................................................................... 25

1.3.5. Sử dụng chủng chủ đã đƣợc cải biến di truyền ................................................. 28

1.4. α - AMYLASE ..................................................................................................... 29

1.4.1. Cấu trúc của α – amylase .................................................................................. 29

1.4.2. α-Amylase từ Bacillus ....................................................................................... 30

1.4.3. α-Amylase từ các vi sinh vật khác .................................................................... 32

1.4.4. α-Amylase tái tổ hợp trong vi sinh vật .............................................................. 35

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................... 38

2.1. CHỦNG VI SINH VẬT VÀ PLASMID ............................................................. 38

2.1.1. Các chủng dại .................................................................................................... 38

2.1.2. Chủng chủ dùng trong nghiên cứu .................................................................... 38

2.1.3. Plasmid .............................................................................................................. 39

2.2. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VÀ CÁC CHẤT BỔ SUNG ................................. 40

2.2.1. Môi trƣờng nuôi cấy .......................................................................................... 40

2.2.2. Chất bổ sung ...................................................................................................... 40

2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ................................................................................. 41

2.3.1. Thiết bị .............................................................................................................. 41

2.3.2. Hóa chất và Kit.................................................................................................. 41

2.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 42

2.4.1. Phân lập chủng .................................................................................................. 42

2.4.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính α – amylase ................................................... 42

2.4.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein hòa tan theo Lowry ........................ 43

2.4.4. Phƣơng pháp thu amylase trong tế bào ............................................................. 43

2.4.5. Phƣơng pháp phân loại chủng chọn lọc ............................................................ 44

2.4.6. Phƣơng pháp tách chiết DNA ........................................................................... 44

2.4.7. Biến nạp DNA plasmid vào chủng chủ ............................................................. 46

2.4.8. Kỹ thuật PCR .................................................................................................... 46

2.4.9. Cắt enzyme giới hạn và ligation DNA .............................................................. 49

2.4.10. Phản ứng loại đầu 5’ - Phosphat (Dephosphorylation) ................................... 50

2.4.11. Phân lập đoạn gen mã hóa peptide tín hiệu ..................................................... 50

2.4.12. Phƣơng pháp megaprimer ............................................................................... 50

2.4.13. Phƣơng pháp tinh sạch DNA từ gel agarose ................................................... 52

2.4.14. Phƣơng pháp điện di DNA .............................................................................. 52

2.4.15. Nghiên cứu điều kiện thu nhận α-amylase của chủng tái tổ hợp .................... 53

2.4.16. Điện di SDS – PAGE ...................................................................................... 54

2.4.17. Xác định hoạt tính α – amylase trên gel polyacrylamid ................................. 55

2.4.18. Xử lý số liệu .................................................................................................... 55

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................................... 56

3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS CÓ KHẢ

NĂNG TIẾT ALPHA AMYLASE MẠNH RA MÔI TRƢỜNG ..................... 56

3.1.1. Phân lập và tuyển chọn sơ bộ các chủng Bacillus có hoạt tính amylase ........ 56

3.1.2. Sàng lọc bộ chủng phân lập thu các chủng thuộc chi Bacillus có hoạt tính

amylase cao ........................................................................................................ 57

3.1.3. Nghiên cứu đặc điểm phân loại của các chủng ................................................. 59

3.2. PHÂN LẬP CÁC ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO TRÌNH TỰ PEPTIDE TÍN

HIỆU CỦA ALPHA AMYLASE TỪ CÁC CHỦNG CHỌN LỌC .................. 62

3.3. SÀNG LỌC THU PEPTIDE TÍN HIỆU MẠNH CỦA GEN α - AMYLASE ... 67

3.3.1. Tách các peptide tín hiệu và tạo tổ hợp với gen đích ........................................ 70

3.3.2. Tạo vector mang tổ hợp gen đích ...................................................................... 72

3.3.3. Đánh giá khả năng tiết của các tổ hợp gen đích trong chủng chủ B. subtilis

168M................................................................................................................... 75

3.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TIẾT AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG TÁI TỔ

HỢP MANG VECTOR BIỂU HIỆN CÓ CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU ĐỘT

BIẾN ĐƢỢC THIẾT KẾ ................................................................................... 83

3.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN ALPHA AMYLASE CỦA

CHỦNG TÁI TỔ HỢP ....................................................................................... 91

3.5.1. Xác định động thái sinh trƣởng và sinh tổng hợp α - amylase của chủng

168MpHVC1 ...................................................................................................... 91

3.5.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase

của chủng 168MpHVC1 ..................................................................................... 92

3.5.3. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết amylase của chủng

168MpHVC1 ...................................................................................................... 93

3.5.4. Ảnh hƣởng của nguồn N, C lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase của

chủng 168MpHVC1 ........................................................................................... 95

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ ........................................................... 97

4.1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN ............................................................................ 97

4.1.1. Phân lập và thu các chủng tuyển chọn có hoạt tính α – amylase ...................... 97

4.1.2. Protein ngoại bào và hoạt tính α – amylase của các chủng tuyển chọn ............ 98

4.1.3. Tách dòng các peptide tín hiệu ở Bacillus và đánh giá vai trò của các axit

amin trong trình tự này với quá trình tiết protein ............................................. 101

4.2. KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN α–AMYLASE VỚI CÁC PROMOTER KHÁC

NHAU............................................................................................................... 105

4.3. SÀNG LỌC CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG

BIỂU HIỆN TRONG B. subtilis 168M ............................................................ 107

4.4. NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TIẾT PROTEIN ĐÍCH

CỦA CHÚNG .................................................................................................. 113

4.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TĂNG TIẾT ENZYME.................. 119

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 123

NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ TRONG THỜI GIAN THỰC HIỆN

125 LUẬN ÁN ................................................................................................................

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ....................................................... 126

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 132

PHỤ LỤC

vii

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

APS Ammonium persulphate

BLAST Basic local alignment search tool

Bp Base pair – cặp bazơ

BSA Bovine serum albumin

CM Cell membrane

Cs Cộng sự

CTAB hexadecyltrimethyl ammonium bromide

DNA Deoxyribonucleic acid

DTT Dithiothreitol

Mạng lƣới nội chất/ endoplasmic reticulum

Vi khuẩn Gram âm

ER G- G+ Vi khuẩn Gram dƣơng

GRAS Generally recognized as safe – đƣợc coi là an toàn

HAc Axit axetic

Kb kilobase

mg Milligram

mg/ml

mM Milligram/millilitre Milli (10-3) Molar

NCBI National Centre for Biotechnology Information

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis

PCR Polymerase chain reaction

PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride

rDNA Ribosomal deoxynucleic acid

SDS Sodiumdodecylsulfat

Sec/P Sec pathway/ Secretion pathway – con đƣờng tiết

SP Peptide tín hiệu (SP)

SPase SPase

viii

SRP Signal recognition particle

STT Số thứ tự

TAE Tris-acetic acid-EDTA

Twin-arginine translocation pathway TAT/P

TEMED Tetramethylethylenediamine

TIM Triose phosphate Isomerase

Tm Melting temperature

U Unit

VSV Vi sinh vật

MeOH Methanol

TRAM Translocating chain-associating membrane protein

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh sự khác biệt của các peptide tín hiệu ở G+ và G- theo

Sec/P ............................................................................................... 9

10 Bảng 1.2 Các nhân tố tham gia vận chuyển protein theo Sec/P ....................

Bảng 1.3 Một số enzyme có nguồn gốc vi khuẩn và ứng dụng của chúng ... 19

Bảng 2.1 Các mẫu đất và ký hiệu sử dụng khi nghiên cứu ........................... 38

Bảng 2.2 Các chủng chủ trong nghiên cứu .................................................... 38

Bảng 2.3 Các plasmid đặt theo hãng sử dụng trong nghiên cứu ................... 40

Bảng 2.4 Các chất bổ sung sử dụng cho môi trƣờng chọn lọc ...................... 41

Bảng 2.5 Các primer sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 47

Bảng 3.1 Số lƣợng khuẩn lạc phân lập trên môi trƣờng LB tinh bột ............ 56

Bảng 3.2 Hoạt tính và hàm lƣợng α- amylase của một số chủng chọn lọc ... 60

Bảng 3.3 Đặc điểm của các peptide tín hiệu chọn lọc ................................... 66

Bảng 3.4 Các thành phần của tổ hợp Megaprimer ........................................ 68

Bảng 3.5 Hoạt tính tiết enzyme của các chủng tái tổ hợp ............................. 77

Bảng 3.6 Các plasmid thiết kế ....................................................................... 80

Bảng 3.7 Ảnh hƣởng của các peptide tín hiệu khác nhau lên khả năng

biểu hiện và tiết protein của α-amylase B. licheniformis 3BT2 ..... 81

Bảng 3.8 Đặc điểm của các peptide tín hiệu đột biến .................................... 84

Bảng 3.9 Thành phần của plasmid mang tổ hợp gen đột biến ....................... 85

Bảng 3.10 Khả năng tiết α - amylase và protein tổng số của các chủng tái

tổ hợp .............................................................................................. 87

94 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết amylase của

chủng 168MpHVC1 ....................................................................... 94

Bảng 3.12 Ảnh hƣởng của nguồn C lên khả năng sinh trƣởng và sinh

amylase của chủng 168MpHVC1 .................................................. 95

Bảng 3.13 Ảnh hƣởng của nguồn N lên khả năng sinh trƣởng và sinh

amylase của chủng 168MpHVC1 .................................................. 96

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Các con đƣờng tiết protein của vi khuẩn .......................................... 5

Hình 1.2 Sơ đồ cơ chế tiết protein ngoại bào theo Sec/P ở B. subtilis ............ 6

Hình 1.3 Các yếu tố liên quan đến biểu hiện gen ở B. subtilis ........................ 22

Hình 2.1 Các vector sử dụng trong nghiên cứu…………………………….. 39

Hình 2.2 Sơ đồ phƣơng pháp Megaprimer tạo tổ hợp gen giữa peptide tín

hiệu quan tâm và đoạn gen đích ....................................................... 51

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tạo tổ hợp promoter - signal – mature 3BT2

amylase gen bằng T4-lygase từ Pgrac và tổ hợp gen đích đã phân

lập ..................................................................................................... 52

Hình 3.1 Hoạt tính amylase của một số chủng sàng lọc.................................. 58

Hình 3.2 Hình thái tế bào và hình ảnh một số khuẩn lạc Bacillus phân lập .... 58

Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S rRNA của một số chủng

nghiên cứu ........................................................................................ 60

Hình 3.4 Cây phát sinh loài của các chủng chọn lọc ....................................... 61

Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm gen mang peptide tín hiệu của các chủng

nghiên cứu ........................................................................................ 63

Hình 3.6 Điểm phân cắt trong peptide tín hiệu gen α-amylase của chủng

DA23 ................................................................................................ 64

Hình 3.7 Điểm phân cắt trong peptide tín hiệu gen α-amylase của chủng

D5-2 .................................................................................................. 64

Hình 3.8 Điểm phân cắt trong peptide tín hiệu gen α-amylase của chủng

CN1-5 ............................................................................................... 64

Hình 3.9 Hình ảnh logo trình tự peptide tín hiệu của các chủng nghiên cứu .. 65

Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide của ba peptide tín hiệu chọn lọc ........... 65

Hình 3.11 So sánh trình tự protein mã hóa cho SP của cả ba chủng nghiên

cứu .................................................................................................... 65

Hình 3.12 Sơ đồ thí nghiệm tăng khả năng tiết α-amylase trong Bacillus

subtilis ............................................................................................... 68

Hình 3.13 Sơ đồ điểm cắt enzyme giới hạn của các peptide tín hiệu chọn

lọc ..................................................................................................... 69

Hình 3.14 Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn mature gen α amylase của chủng

3BT2, các đoạn peptide tín hiệu quan tâm, sản phẩm megaprimer

giữa peptide tín hiệu quan tâm và đoạn gen trƣởng thành của α –

amylase 3BT2 ................................................................................... 71

Hình 3.15 Sản phẩm tách DNA plasmid và cắt kiểm tra bằng BamHI và

XbaI của các dòng mang đoạn sản phẩm megaprimer

DASsub3BT2Mature trong pTZ57R/T .............................................. 71

71 Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại các gen quan tâm .................

Hình 3.17 Sơ đồ thí nghiệm tạo vector pHVgracAmy mới từ vector pHV33

gốc .................................................................................................... 74

Hình 3.18 Điện di đồ DNA plasmid pHVSusig5.2 tách dòng và xử lý EcoRI . 75

Hình 3.19 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính cũng nhƣ khả

năng sinh tổng hợp enzym của chủng B. subtilis 168M mang

vector pHV33-promoter Pgrac - α-amylase 3BT2 .......................... 78

Hình 3.20 Ảnh hƣởng của promoter lên khả năng tiết enzym của chủng tái

tổ hợp ................................................................................................ 78

Hình 3.21 So sánh biểu hiện tiết α-amylase các peptide tín hiệu khác nhau .... 82

Hình 3.22 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trƣởng và sinh tổng 82

xii

hợp amylase của chủng 168MSusigD52 ..........................................

Hình 3.23 Sơ đồ cấu trúc và trình tự axit amin 3 vùng trên SP gen α -

amylase chủng D5-2 ......................................................................... 84

85 Hình 3.24 So sánh trình tự axit amin của các peptide đột biến .........................

Hình 3.25 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại đoạn peptide tín hiệu mang

trình tự đột biến…………………………………………………... 86

Hình 3.26 Điện di đồ sản phẩm PCR các cụm tổ hợp và cắt kiểm tra

plasmid ............................................................................................. 89

Hình 3.27 Sàng lọc các dòng mang vector thiết kế thu các chủng có hoạt

tính amylase ...................................................................................... 89

Hình 3.28 Khả năng tiết amylase ngoại bào của các peptide tín hiệu đột

biến ................................................................................................... 89

Hình 3.29 Động thái sinh trƣởng và sinh tổng hợp α - amylase của chủng

168MpHVC1 .................................................................................... 91

Hình 3.30 Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng và

sinh amylase của chủng 168MpHVC1 ............................................. 93

Hình 3.31 Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết α - amylase của

chủng tái tổ hợp B. subtilis 168MpHVC1 ........................................ 94

MỞ ĐẦU

Protein là sản phẩm của gene, đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực của đời

sống đặc biệt là trong công nghiệp dƣợc phẩm, công nghiệp enzyme, công nghiệp

chế biến các sản phẩm nông nghiệp… Protein đƣợc tế bào sinh vật sinh ra tồn tại ở

hai dạng chính là protein nội bào (intracellular) và protein ngoại bào (extracellular)

tùy theo chức năng của chúng. Protein là một trong những sản phẩm quan trọng

trong công nghệ DNA tái tổ hợp, đƣợc biểu hiện trong tế bào chủng chủ cả ở

Eucaryote và Procaryote. Ở chủng tái tổ hợp mục tiêu cần đạt là tăng cƣờng quá

trình biểu hiện protein đƣợc ở mức độ cao. Tuy nhiên, khi protein ở trong tế bào

quá lớn sẽ tạo ra áp lực cho tế bào dẫn đến tế bào bị phá vỡ. Tăng quá trình tiết

protein ngoại bào sẽ giúp giảm áp lực cho tế bào làm tăng khả năng biểu hiện của

protein tái tổ hợp. Các protein ngoại bào đƣợc vi sinh vật tiết ra môi tƣờng theo

nhiều cơ chế khác nhau và phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có vai trò của trình

tự peptide tín hiệu. Xây dựng một hệ thống biểu hiện tốt và tăng cƣờng khả năng

tiết protein nhằm cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm đƣợc tạo ra

nhiều hơn, giảm giá thành để có thể ứng dụng trong sản xuất và đời sống đã đƣợc

quan tâm nghiên cứu.

Amylase là một trong những protein - enzyme tái tổ hợp đầu tiên đƣợc thu

nhận. Thị trƣờng tiêu thụ enzyme thế giới ƣớc tính đạt 1.6 tỷ USD cho các ngành:

công nghiệp thực phẩm (29%), thức ăn gia súc (15%) và các ngành công nghiệp

khác (56%). Trong đó, amylase chiếm khoảng 30% sản phẩm enzyme trên toàn thế

giới. Vai trò ứng dụng của amylase đặc biệt là α-amylase đƣợc biết đến trong rất

nhiều ngành công nghiệp nhƣ: thực phẩm, rƣợu - bia, lên men, dệt, tẩy, giấy, dƣợc

phẩm và công nghiệp hóa học, lâm sàng, y học và phân tích hóa học… vì vậy nhu

cầu về amylase nói chung và α-amylase nói riêng không ngừng tăng lên. Ở vi sinh

vật, α-amylase có mặt ở rất nhiều nhóm nhƣ trong vi khuẩn cổ, nấm men, nấm mốc,

vi khuẩn…Trong đó, đƣợc quan tâm nhiều nhất là các chủng thuộc nhóm Bacillus

vì chúng có khả năng tiết protein trong đó có α-amylase ra ngoài môi trƣờng và có

thể đạt đến tới nồng độ cao nên thuận tiện cho việc thu hồi sau lên men. Hoạt tính

của enzyme tiết ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy, phụ thuộc vào thời gian cảm ứng,

loại peptide tín hiệu và khối lƣợng phân tử của enzyme. Sử dụng kỹ thuật gen để đi

sâu nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế tiết enzyme ra ngoài môi trƣờng cũng nhƣ tạo

đột biến trong trình tự peptide tín hiệu đã tạo đƣợc chủng tái tổ hợp có khả năng

tăng cƣờng biểu hiện hoạt tính α–amylase.

Với mong muốn xây dựng đƣợc hệ biểu hiện enzyme có hiệu quả ở Bacillus

dựa trên sàng lọc các peptide tín hiệu của gen α-amylase từ các chủng thuộc chi

Bacillus hoang dại phân lập ở Việt Nam, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Sàng lọc và

nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết

α-amylase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis”

Mục tiêu nghiên cứu:

- Có đƣợc cơ sở dự liệu về trình tự peptide tín hiệu của gene α–amylase từ các

chủng thuộc chi Bacillus.

- Tạo đƣợc hệ biểu hiện mang trình tự peptide tín hiệu đột biến làm tăng khả năng

tiết α-amylase ngoại bào ở chủng Bacillus tái tổ hợp.

- Phân lập tuyển chọn các chủng Bacillus có khả năng sinh α-amylase ngoại bào

1. Nội dung luận án:

- Tách các trình tự peptide tín hiệu của gen α-amylase từ chủng chọn lọc

- Gây đột biến hoặc thay thế các peptide tín hiệu đã đƣợc đột biến định hƣớng

- Tạo các chủng tái tổ hợp với các peptide tín hiệu đột biến và sàng lọc các chủng

cao.

- Nghiên cứu điều kiện biểu hiện α-amylase của chủng tái tổ hợp thu đƣợc.

có khả năng tiết α-amylase cao.

2. Những đóng góp mới của luận án

- Đã xác định đƣợc dữ liệu khoa học về peptide tín hiệu của gen α --amylase từ 3 chủng điển hình trong số 130 chủng Bacillus phân lập tại Việt Nam. - Tạo đƣợc các đột biến điểm và xác định đƣợc đột biến A31V giúp tăng cƣờng tiết α - amylase trong Bacillus subtilis.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT

1.1.1. Quá trình tiết protein ở tế bào Eucaryotes

Các preprotein hình thành trong nấm men ít nhất có hai con đƣờng vận chuyển

một đƣờng qua SRP trung gian và một con đƣờng độc lập khác. Vận chuyển protein

qua SRP trung gian vẫn chƣa đƣợc mô tả rõ ràng nhƣng phức hợp vận chuyển

protein của S. cerevisiae xuất hiện 5 polypeptide khác nhau: Sec61, Sec62, Sec63,

và 2 protein phát hiện thêm gần đây. Protein Sec61 có một số trình tự kỵ nƣớc liên

kết với ER và liên kết trực tiếp với protein tiết trong quá trình vận chuyển, tƣơng tự

nhƣ TRAM trong tế bào động vật có vú nhƣng trình tự của Sec61 không có bất kỳ

điểm tƣơng đồng nào với TRAM mà chúng lại có một số điểm tƣơng đồng với

protein SecY ở E. coli (Simonen & Palva, 1993).

Trong suốt hoặc ngay sau khi vận chuyển protein trong tế bào động vật có vú

và trong S. cerevisiae, các peptide tín hiệu đƣợc loại bởi SPase. Hai phức hợp chuỗi

các enzyme phân cắt tín hiệu (SPase) của động vật có vú và nấm men có tƣơng

đồng với Sec11 (YaDeau et al., 1991). Trong khoang lƣới nội chất của ER của cả tế

bào nấm men và động vật có vú đều có BiP (Binding immunoglobulin protein), một

loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình gấp cuộn của các protein tiết.

BiP của S. cerevisiae (Kar2) tƣơng tác với protein trong bƣớc sớm quá trình vận

chuyển protein qua màng. BiP rất cần thiết cho sự sinh trƣởng của tế bào nấm men

(Simonen & Palva, 1993)

1.1.2. Quá trình tiết protein ở E. coli

Trong E. coli, khoảng 50% protein của tế bào đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng

với hơn 90% protein đƣợc vận chuyển thông qua Sec/P (Low et al., 2013). Các SP

đƣợc cho là hỗ trợ liên kết với các nhân tố tham gia quá trình tiết nhƣ: SecB,

GroEL, DnaK và DnaJ và trong đó SecB đóng vai trò là nhân tố chính. Liên kết của

SecB ngăn preprotein gấp cuộn khi chƣa thể hiện chức năng. GroEL, DnaK, và

DnaJ còn có một số chức năng khác trong tế bào E. coli ngoài vai trò trong quá trình

tiết protein. Phức hợp preprotein với các nhân tố tiết đƣợc vận chuyển đến màng tế

bào bởi ái lực của SecA với SP và SecB. SecA là protein màng ngoại vi và có ái lực

đối với với phần protein trƣởng thành của preprotein (Simonen & Palva, 1993).

Ngoài chức năng vận chuyển, SecA còn tham gia liên kết và thủy phân ATP nhằm

cung cấp năng lƣợng cho quá trình chuyển vận qua màng. Một số protein trên màng

SecY, SecE cùng với SecA hình thành nên hệ vận chuyển ở E. coli. Chuỗi

polypeptide có thể trƣợt qua màng tế bào trên bề mặt của phức hợp SecY/E. Phần

xúc tác của các enzyme phân cắt peptide tín hiệu nằm ở phía bào chất và quá trình

phân cắt SP có thể xảy ra trong hoặc ngay sau quá trình vận chuyển. Chức năng của

2 protein SecD và SecF trên màng chƣa đƣợc biết rõ, tuy nhiên chúng có thể đóng

vai trò trong việc hỗ trợ quá trình gấp cuộn của protein khi mới đƣợc vận chuyển

lên periplasmic tƣơng tự với protein BiP của động vật có vú và của tế bào nấm men

(Simonen & Palva, 1993).

1.1.3. Quá trình tiết protein trong Bacillus

1.1.3.1. Các con đường vận chuyển protein trong Bacillus

Quá trình tiết protein ở Bacillus là hệ thống tiết protein của vi khuẩn đầu tiên đƣợc nghiên cứu. Bacillus là vi khuẩn G+ nên có cơ chế tiết điển hình đƣợc biết đến

là khác so với E. coli, S. cerevisiae và động vật có vú. Tế bào của Bacillus đƣợc bao

quanh bởi màng tế bào chất, đƣợc bao phủ bởi một thành tế bào dày (10 đến 50 nm)

bao gồm chủ yếu là các chuỗi peptidoglycan và teichoic hoặc teichuronic acid (Chu

H.H., 2001). Theo Tjalsma et al., 2004; Fu et al., 2007, bốn con đƣờng tiết protein

đƣợc biết có mặt trong vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng đó là: Sec-SRP, Tat, qua

nhân tố vận chuyển ATP binding cassette (ABC- transporter) và con đƣờng

Pseudopillin (Com pathway). Các SP của Bacillus đã có rất nhiều công trình công

bố (Kolkman et al., 2008; Igarashi et al., 1998; Borchert & Nagarajan, 1991a; Heng

et al., 2005b; Low et al., 2012; Tjalsma et al., 2000a; Jonet et al., 2012; Sakakibara

et al., 1993). Các con đƣờng tiết protein trong Bacillus cũng nhƣ các enzym phân

cắt tín hiệu tham gia trong các con đƣờng này đƣợc thể hiện trên Hình 1.1, Cơ chế

tiết đƣợc thể hiện trên hình 1.2.

Hình 1.1. Các con đƣờng tiết protein của vi khuẩn

(Nguồn: Tjalsma et al., 2000a, 2004)

Trong Sec/P, ribosome liên kết với đầu N của SP nhờ Ffh protein. Protein

Ffh, Hbsu và scRNA là các hợp phần trong phức hợp SRP (signal recognition

particle) tham gia trong quá trình vận chuyển, sau đó phức hợp SRP-precusor sẽ

tƣơng tác với SecA nhờ các liên kết với SP. Cụm liên kết SRP – Precusor – SecA

đƣợc đƣa tới vị trí màng tế bào và tƣơng tác với các yếu tố protein vận chuyển trên

màng SecYEG, SecE, SecG và các protein hỗ trợ SecDF, SpoIIIJ và YqjG. Sau đó,

SP sẽ đƣợc phân cắt bởi một enzyme trên màng là SPase I (SipS-W), Precusor

protein đƣợc đƣa ra qua các Sec-pore bởi SecA chủ yếu nhờ vào nguồn năng lƣợng

ATP và các điện tử trên kênh dẫn truyền. Đoạn SP bị phân cắt bởi 2 SPase là SppA

và TepA, các exoprotein sẽ đƣợc vận chuyển qua màng tế bào do đó nó đƣợc điều

khiển bởi WprA, một protease trên màng tế bào và đƣợc tăng cƣờng tạo ra nhờ xúc

tác của PrsA, một lipoprotein trên màng tế bào. BdbB và BdbC là các protein tham

gia giúp cho việc hình thành các cầu nối disulfide (prophage-derived disulfide bond

formation protein) trong quá trình hình thành cấu trúc protein. Một số protease ở thành tế bào tích điện âm chính vì vậy các ion Ca2+ và Fe3+ rất cần thiết cho việc ổn

định hoạt tính của một số exoprotein.

Hình 1.2.Sơ đồ cơ chế tiết protein ngoại bào theo Sec/P ở B. subtilis

(Nguồn: Brockmeier, 2006)

1.1.3.2. Đích vận chuyển protein trong Bacillus

Cấu trúc của lớp màng tế bào của Bacilli không có lớp màng ngoài (OM -

Outer membrane) cho nên sau khi tổng hợp các protein có thể đƣợc giữ lại trong tế

bào chất hoặc vận chuyển vào CM hoặc chúng sẽ đƣợc vận chuyển qua CM vào

thành tế bào, sau đó protein có thể vẫn giữ trên thành hoặc tiết ra môi trƣờng nuôi

cấy (Tjalsma et al., 2000a). Thông qua các con đƣờng tiết khác nhau sản phẩm

protein có thể đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy (nhƣ trong: Sec/P, Tat/P, ABC

transporter), có thể là tồn tại ở mặt bên của màng tế bào (Sec/P, Com) và cũng có

thể nằm trên thành tế bào (Sec/P) (Tjalsma et al., 2000a, 2004; Brockmeier, 2006).

Đối với chi Bacillus, các protein chủ yếu đƣợc tiết theo Sec/P-SRP.

Trong quá trình vận chuyển, các protein thiếu các tín hiệu vận chuyển sẽ

đƣợc giữ lại trong tế bào chất và đƣợc gấp cuộn cần hoặc không cần sự có mặt của

các chaperone và đại diện cho nhóm này nhƣ các protein: GroEL-GroES và DnaK-

DnaJ-GrpE (Tjalsma et al., 2000; Chu., 2001).

Thành tế bào của B. subtilis tƣơng tự nhƣ periplasm ở vi khuẩn Gram âm và

nó chiếm khoảng 9% tổng khối lƣợng của protein tế bào và các protein đƣợc giữ lại

trong thành tế bào bao gồm các enzyme nhƣ: DNases, Rnases (Merchante, et al.,

1995), protease (Margot & Karamata, 1996, Msadek, et. al., 1998), enzyme tham

gia vào quá trình tổng hợp peptidoglycan (penicillin-binding protein) và các

hydrolases có liên quan đến quá trình tăng trƣởng tế bào, phân chia tế bào, sự hình

thành bào tử, và sự nảy mầm (Tjalsma, et. al., 2000). Hầu hết các protein đƣợc vận

chuyển qua màng tế bào chất đều đƣợc tổng hợp với một SP. Giống nhƣ các vi

khuẩn Gram dƣơng khác, B. subtilis thiếu lớp màng ngoài nên nhiều protein đƣợc

tiết trực tiếp ra môi trƣờng nuôi cấy trong quá trình sinh trƣởng trong đó chủ yếu là

các enzyme nhƣ: proteases, lipase, carbohydrase, DNases và Rnases nhằm thực hiện

vai trò giúp vsv có thể thích ứng với điều kiện môi trƣờng bằng việc sử dụng nguồn

dinh dƣỡng sẵn có. Ngoài các enzyme ra, một nhóm protein thứ hai đƣợc tiết là

thành viên của nhóm phosphatase (PhrA và PhrK) đóng vai trò nhận biết mật độ tế

bào, điều chỉnh sự phát triển và sự hình thành bào tử (Tjalsma, et.al., 2000; Chu H.

H., 2001). Ngƣợc lại với các enzyme phân hủy cơ chất và các Phr protein, hầu hết

các protein không đƣợc tiết, bao gồm cả các protein tham gia quá trình giống nhƣ

tạo thành tế bào, liên kết cơ chất, hoặc tiết protein, đều phải đƣợc giữ lại trên màng

tế bào với đầy đủ chức năng và nhằm để ngăn việc mất hoạt tính của các protein này

khi ở dạng tự do trong tế bào chất. Chúng chứa các SP tƣơng tác với màng hoặc với

thành tế bào nhƣng không bị phân cắt bởi các enzyme tham gia vào quá trình tiết

protein. Ngoài ra, một số protein tiết còn có thể hình thành lên các cấu trúc like –

pilin ở trên bề mặt tế bào (Tjalsma, et. al., 2000; Chu , 2001)

1.1.3.3. Vai trò của peptide tín hiệu

Các SP đƣợc biết đến gồm 5 loại và phân biệt dựa trên điểm nhận biết phân

cắt bao gồm: peptide tín hiệu của con đƣờng tiết chung (Sec/P), peptide tín hiệu

Twin-arginine, peptide tín hiệu Lipoprotein, peptide tín hiệu pilin-like protein và

cuối cùng là các peptide tín hiệu tham gia trong quá trình tiết bacteriocin và

pheromones (Tjalsma, et al., 2000; Tjalsma, et al., 2004). Peptide tín hiệu đƣợc biết

đến có ít nhất 3 chức năng chính (van Roosmalen et al., 2004): Đầu tiên, nhận biết

thụ thể trong bộ máy tiết và chuyển tới bộ máy xúc tác vận chuyển protein qua

màng; Thứ hai, các SP nhƣ một yếu tố quyết định cho xác định preprotein trên

màng và bắt đầu di chuyển đến các vùng ƣa nƣớc ở đầu cuối C của các preprotein

trong khi phần N vẫn đƣợc định vị ở phía cis của tế bào; Thứ ba, các SP có thể ức

chế quá trình gấp cuộn của các protein mới hình thành vì vậy tránh đƣợc việc kích

hoạt các enzyme có hại cho bộ máy tiết của enzyme bên trong tế bào và giúp cho

quá trình tiết đƣợc xảy ra hoàn toàn.

1.1.3.4. Peptide tín hiệu Sec/P

Quá trình vận chuyển ra bên ngoài tế bào của khoảng 300 protein thuộc chi

Bacillus chủ yếu đƣợc tiết qua Sec/P (secretory pathway) vì thế Sec/P đƣợc coi là

con đƣờng tiết chung cho chi này (Tjalsma, et. al., 2000a). Các peptide tín hiệu của

con đƣờng này luôn gồm ba vùng với chức năng riêng: vùng N (tích điện dƣơng),

vùng kỵ nƣớc H và vùng đầu cuối C (Leite, 2011; Brockmeier et al., 2006b; Low et

al., 2013). Sự khác biệt của SP ở vi khuẩn G(+) và G(-) đƣợc so sánh trong Bảng

1.1 (Dalbey&Heijne, 2002). Sec/P đƣợc xem nhƣ con đƣờng tiết chung cho hầu hết

protein của Bacillus với bộ máy tiết tham gia gồm 5 thành phần chính: (1) Các

chaperon của tế bào chất (cytosolic chaperones); (2) Bộ máy vận chuyển (SecA,

SecY, SecE, SecG, và SecDF-YajC); (3) Các enzyme phân cắt peptide tín hiệu

(SPase) phân cắt SP của preprotein tạo thành đoạn trƣởng thành; (4) Các enzyme

phân cắt (hay còn gọi là SPase) cắt SP khỏi preprotein trên màng; (5) Các nhân tố

gấp cuộn (folding factors). Trung bình SP loại I của Bacillus dài hơn SP trong E.

coli từ 5 – 7 axit amin. Trong vi khuẩn Gram dƣơng, vị trí phân cắt của SPase

khoảng 7 - 9 axit amin trong khi ở E. coli vị trí phân cắt xảy ra tại vị trí 3 - 7 (Leite,

2011). Vị trí +1 sau điểm phân cắt của SPase thƣờng là Ala (27%) còn lại là các axit

amin khác ngoại trừ proline và cysteine (Tjalsma et al., 2000). Các nhân tố tham gia

vận chuyển protein theo Sec/P đƣợc trình bày trong bảng 1.2 (Tjalsma et al., 2000).

Bảng 1.1.So sánh sự khác biệt của các peptide tín hiệu ở G+ và G- theo Sec/P

STT

Chỉ tiêu so sánh

Gram dƣơng

Gram âm

Độ dài SP trung bình(axit amin)

Vùng N

Tích điện dƣơng cao, giàu Lys/Arg

Tích điện dƣơng (thấp), giàu Lys/Arg

Vùng H

Kỵ nƣớc, có cấu trúc xoắn α dài

Kỵ nƣớc, có cấu trúc xoắn α ngắn hơn

Vùng C

Phân cực/trung tính, kéo dài hình thành cấu trúc β, dài hơn, giàu Pro/Thr

Phân cực/trung tính, kéo dài hình thành cấu trúc β, ngắn hơn, giàu Ser/Ala

Chủ yếu Ala, đôi khi đƣợc thay bằng Ser/Gly

Vị trí -1 & -3 theo trình tự Ala – X - Ala

(Nguồn: Dalbey & Heijne, 2002).

Vùng N (N – region) mang điện tích dƣơng của chuỗi preprotein trong SP theo

Sec/P có chứa trung bình khoảng 1 – 5 axit amin, trong đó chứa 2 axit amin Lysine

và Arginine (Low et al., 2013; Leite, 2011). Một preprotein không mang điện tích

dƣơng vẫn đƣợc nhận biết bởi bộ máy vận chuyển tuy nhiên chúng sẽ đƣợc tiết rất

chậm. Vùng N sẽ tƣơng tác với các ATPase, SecA và với các phospholipid tích điện

âm (Dalbey & Von Heijne, 2002).

Bảng 1.2. Các nhân tố tham gia vận chuyển protein theo Sec/P

Thành phần

B. subtilis

E. coli

S. cerevisiae

Chaperone riêng

Ffh, FtsY, scRNA CsaA (?)

Ffh, FtsY, 4.5S RNA, SecB YgjH (?)

Phức hợp SRP (gồm scR1 RNA, Srp72p, Srp68p, Srp54p, Sec65p, Srp21p, Srp14p, và Srp7p), DPα/β

Chaperone chung

Hsp70, Ydj1

GroEL, GroES DnaK, DnaJ, GrpE, yếu tố kích hoạt

Nhân tố vận chuyển

SecA

Ribosome, Kar2 (Bip)

Kênh chuyển vị

SecY, SecG, SecE, SecDF, YrbF

SecY, SecG, SecE, SecD/F, YajC

Sec61, Ssh1 (Sec61α),Sbh1, Sbh2 (Sec61β), Sss1 (Sec61γ) Sec62/63, Sec66/67

SPases

LepB, LspA

Sec11

SipS/T/U/V/P, SipW, LspA

SPPases

SppA, TepA

SppA, OpdA

Foldases

PrsA, BdbA/B/C

SurA, PpiD, RotA, FkpA, DsbA/B/C/D/E/G

CPR2, CPR4, CPR5, CPR8, FPR2, PDI, Ero1, Eug1. Kar2 (BiP),Lhs1, (Hsp70)

(Nguồn: Tjalsma et al., 2000)

Vùng H (hydrophobic H- region) là vùng tâm kị nƣớc có chứa khoảng 19 axit

amin và có cấu trúc xoắn α đƣợc hình thành do tƣơng tác của vùng N tích điện

dƣơng với các phospholipid tích điện âm. Thông thƣờng hai axit amin Glycine và

Proline sẽ đƣợc tìm thấy nằm giữa vùng này với khoảng 60% vùng H của SP ở

Bacillus chứa Glycine ở giữa và 50% chứa Prolin hoặc Glycine ở điểm bẻ gãy cấu

trúc xoắn -7 và -4 (Tjalsma, et. al., 2000., Leite, 2011). Hai axit amin này đƣợc xem

là vị trí bẻ gãy các liên kết của xoắn α và hình thành nên cấu trúc kẹp tóc tại vị trí

chèn của các SP trên màng hay trên kênh vận chuyển. Vùng N và vùng H đều cần

cho quá trình nhận biết SP bởi SecA (Leite, 2011).

Vùng C (carboxyl – terminal) có chứa từ 3 – 7 axit amin và phải có cấu trúc

chuỗi β có chứa vị trí phân cắt bởi SPase (van Roosmalen et al., 2004). Vị trí này

thƣờng nằm ở -3 ÷ -1 (Dalbey & Von Heijne, 2002; Nielsen et al., 1997a; von

Heijne & Abrahmsèn, 1989) và thông thƣờng đặc trƣng bằng các axit amin Ala-X-

Ala với X là axit amin bất kỳ. Vị trí -3 có thể đƣợc thay thế bằng các axit amin nhƣ:

Valine, Threonine, Leucin và Isoleucin. Trong các nghiên cứu về điểm nhận biết

phân cắt của SPase trên các SP trong Sec/P ở Bacillus có tới 71% là A-X-A, 18% là

V–X–A còn lại là một số axit amin khác. Đặc biệt vị trí -1 của điểm phân cắt của

SPase loại I đặc trƣng cho điểm phân cắt SP của preprotein trong B. subtilis (van

Roosmalen et al., 2004).

Các SP loại II giống với SP loại I nhƣng chứa một vùng đƣợc gọi là

“lipoprotein box” với trình tự bảo thủ Leu-Ala-Gly-Cys. Trong màng tế bào chất,

cystein trong trình tự này liên kết cộng hóa trị với lipid. Quá trình phân cắt các

lipoprotein diễn ra khi SP đƣợc phân cắt bởi SPase loại II. Sau đó, nhóm acyl ( )

sẽ đƣợc liên kết với cystein.

1.1.3.5. Peptide tín hiệu Tat/P (Twin Arginine Translocation pathway).

Vận chuyển protein theo Tat/P có sự tham gia của các cofactor là các ion kim

loại đóng vai trò trong các phản ứng oxi hóa khử và các SP cũng đƣợc phân cắt bởi

SPase I. TAT/P đƣợc phát hiện trong Thylakoit và sau đó đƣợc phát hiện có mặt

trong tất cả các vi khuẩn, vi khuẩn cổ (Berks et al., 2003; Kolkman et al., 2008).

Ngày nay, số lƣợng lớn các vi khuẩn đƣợc biết có trình tự Tat mang dạng motif Z –

R - R - X– Φ - Φ, trong đó, Z có thể thay thế bằng axit amin phân cực bất kỳ và Φ

đại diện cho các axit amin kỵ nƣớc và motif này cũng phù hợp với cơ chất cắt của

hệ thống Tat trong hầu hết các Thylakoid ở thực vật (Tjalsma et al., 2004; van Dijl

et al., 2002; Tjalsma et al., 2000b).

Trong B. subtilis đƣợc phát hiện có khoảng 27 protein tiết theo con đƣờng

này. Trong số đó, 14 SP có điểm nhận biết phân cắt tín hiệu bởi SPaseI, 5 SP ở

lipoprotein có dạng RR-motif (một dang SP bao gồm hai Arginine tồn tại ở vùng

đầu N) và 8 SP không cho thấy tồn tại điểm nhận biết phân cắt tín hiệu nào của cả

SPaseI lẫn SPase II. Độ dài trình tự trung bình của SP trong Tat/P dài hơn so với độ

dài của SP trong Sec/P. Trong procaryote, vùng N có thể chứa từ 2 – 30 axit amin,

trung bình là 13 axit amin

Vùng H có thể chứa từ 13 -20 axit amin không tích điện. Chiều dài vùng H

trong SP của Tat/P có thể dài hơn hoặc ngắn hơn hoặc không khác nhiều so với

vùng này trong Sec/P tuy nhiên ở RR-motif trong E. coli thì vùng H dài hơn và kỵ

nƣớc hơn so với vùng H của SP trong Sec/P ở vi khuẩn Gram âm. Vùng này có

chứa một điểm Proline bẻ gãy cấu trúc xoắn ở vị trí -6.

Vùng C chứa các axit amin cơ bản không đƣợc ƣu tiên trong Sec/P và thông

thƣờng có tồn tại axit amin mang điện tích dƣơng (Arginine or Lysine – tín hiệu

tránh Sec) vì vậy không đƣợc nhận biết bởi bộ máy tiết chung theo Sec/P (Tjalsma

et al., 2000). Twin arginine có sự bảo thủ rất cao tuy nhiên trong tự nhiên cũng một

số SP của con đƣờng này có Arginine đầu tiên có thể đƣợc thay thế bằng Lysin

(Dalbey & Von Heijne, 2002). Protein đƣợc tiết theo Tat/P khi ra ngoài môi trƣờng

đã có cấu trúc gấp cuộn trong khi đó, ở Sec/P vận chuyển protein ra màng tế bào

vẫn chƣa có cấu trúc này (Laskin et al., 2007). PhoD và YwbN là hai protein đƣợc

tiết theo con đƣờng này ở B. subtilis (Kolkman et al., 2008)

1.1.3.6. Peptide tín hiệu lipoprotein

Lipoprotein của vi khuẩn là nhóm protein đƣợc liên kết với màng tế bào hoặc

lớp màng ngoài bằng các liên kết lipid và chịu phân cắt bởi SPase loại II (LspA)

(Bron et al., 1998; Vitikainen, 2004; Leite, 2011; Kakeshita & Kageyama, 2004).

Các SP của lipoprotein ở B. subtilis về mặt cấu trúc có sự bảo thủ hơn SP chung

trong Sec/P. Con đƣờng vận chuyển protein cho tín hiệu này có thể đƣợc tiết theo

Sec/P hoặc Tat/P, tuy nhiên tồn tại 2 axit amin RR trong trình tự của SP này nên có

thể protein sẽ nghiêng về giả thuyết đƣợc tiết theo Tat/P (Tjalsma et al., 2000). Các

SP của lipoprotein của vi khuẩn đƣợc biết cũng có cấu trúc gồm 3 vùng:

Vùng N tích điện dƣơng và trung bình có chứa khoảng 4 axit amin. Vùng H

giống nhƣ trong cấu trúc của SP trong Sec/P, có chứa khoảng 12 axit amin ngắn

hơn so với các nonlipoprotein SP trong khi cần ít nhất 14 axit amin ở vùng H để

protein có thể kéo dài trên màng qua kênh vận chuyển. Vì vậy, không phải

lipoprotein nào sau khi đƣợc tổng hợp cũng xuyên ra ngoài mặt của tế bào từ đó dự

đoán SPase II cũng nằm trên màng cytoplamic nhƣ SPaseI (Tjalsma et al., 2000).

Vùng C của SP thuộc lipoprotein ngắn hơn so với vùng C của các SP khác và axit

amin Cys. luôn ở cuối của điểm phân cắt và đôi khi Glycine đƣợc thay thế bởi

Alanine. Trong các vị trí của Leu và Ala đôi khi đƣợc thay bởi các axit amin nhƣ:

Ser., Thr., Val., Ile. và thậm chí cả Gln. Vùng phân chứa cấu trúc gọi là “lipobox”

với sự bảo thủ về điểm nhận biết SPaseII là LeuAlaGly ↓ Cys (Dalbey & Von

Heijne, 2002). Cystein là đích cho lipid biến đổi và là điểm khởi đầu cho một

protein trƣởng thành và protein sau khi vận chuyển ra màng tế bào chất đƣợc neo

trên màng bằng chính axit amin này (Tjalsma et al., 2000).

Lipoprotein trƣởng thành của các vi khuẩn gram âm có axit Aspartic ở vị trí

+2 để ngăn việc chuyển các protein này ra màng ngoài. Tuy nhiên, axit Aspartic đã

vắng mặt ở vị trí + 2 của các lipoprotein trƣởng thành ở Bacillus cho thấy tín hiệu

phân loại này đã phát triển độc lập với vi khuẩn gram âm. Thay vào đó Glycine,

Phenylalanine, hoặc Tryptophan có thể đƣợc tìm thấy ở vị trí +2 này trong các

lipoprotein khác nhau của B. subtilis. Cả 3 axit amin này đều đóng vai trò nhƣ Cys

trong E. coli. Vì vậy, dù B. subtilis không có lớp màng ngoài nhƣng axit amin chức

năng vẫn đƣợc tìm thấy trong lipoprotein trƣởng thành của chúng vì các axit amin

này tham gia vào việc vận chuyển các lipoprotein đến vị trí cụ thể trên màng tế

bàoB. subtilis (Tjalsma et al., 2000).

Chuỗi lipoprotein ở các loài Bacillus khác với chuỗi lipoprotein SP ở E. coli

và ngắn hơn so với các SP khác đƣợc so sánh. Tâm kỵ nƣớc và vùng phân cắt của

chúng có chiều dài tƣơng tự nhau. Chỉ có vùng đầu N của một số lipoprotein ở vi

khuẩn hình que dài hơn và tích điện dƣơng cao hơn so với chuỗi tƣơng tự trong

E.coli (Simonen & Palva, 1993). Cả E. coli và Bacillus đều có rất nhiều các

lipoprotein khác nhau đặc trƣng nhất là chuỗi Braun’s lipoprotein ở E. coli và trong

β–lactamase của B. licheniformis

1.1.3.7. Peptide tín hiệu pseudopilins

Một loại SP khác đƣợc biết có mặt trong Bacillus đó là pseudopilins hay loại

IV protein like-pilin, chịu sự phân cắt của enzyme pseudopilin-SPase ở mặt bên của

màng tế bào (ở Bacillus là protein ComC) và không phụ thuộc vào bộ máy Sec/P.

Trình tự cuối của pseudopilin SP đƣợc bảo thủ với motif đƣợc xác định với trình tự axit amin -2KG-1↓F+1X3E+5(Meima & van Dijl, 2003). Điểm nhận biết phân cắt nằm

giữa vùng N và vùng H. Sau khi bị cắt bởi ComC vùng H sẽ gắn với các đoạn pilin

protein trƣởng thành. Protein ComG đƣợc mã hóa bởi các gen comGC, comGD,

comGE, and comGG không tiết theo Sec/P mà đƣợc vận chuyển phụ thuộc vào việc

phân cắt ở mặt bên màng tế bào chất (phía màng trong tế bào chất). Enzyme phân

cắt tín hiệu ComC của B. subtilis là một protein neo trên màng có chứa 8 vùng vận

chuyển màng và có mức độ tƣơng đồng cao với các prepilin peptidase của nhiều vsv

khác. Hai protein shock lạnh là CspB và CspC cùng với 1 protein giả định YqaF

cũng có thể đƣợc tiết theo con đƣờng này (Tjalsma et al., 2000).

1.1.3.8. Peptide tín hiệu tham gia trong quá trình tiết bacteriocin và pheromone

Các SP này không đƣợc dự đoán là SP vì thiếu vùng H chỉ có vùng N và C.

Chúng đƣợc phân cắt tạo đoạn trƣởng thành nhờ vào các transport protease của

ABC transporter (bacteriocin và pheromone). Một số loài Bacillus có khả năng sinh

kháng sinh peptide. Các kháng sinh này có thể đƣợc tổng hợp ở ribosome hoặc cơ

quan khác không phải ở ribosome. Một số các peptide kháng khuẩn đƣợc tổng hợp

ribosome chứa các SP cho sự vận chuyển qua màng nhờ nhân tố ABC chuyên dụng.

Trong B. subtilis, có ba SP loại này đƣợc biết đến trong bacteriocin là sublancin

168, subtilosin và pheromone ComX. Trong B. subtilis 168, các operon sunS - sunT

chứa gen mã hóa lantibiotic sublancin 168 và ABC transporter SunT. Nhân tố vận

chuyển ABC nhƣ SunT có vai trò kép trong quá trình tiết vì vừa giúp loại bỏ các SP

và vừa vận chuyển các lantibiotic trƣởng thành qua màng tế bào chất. Một số

peptide kháng khuẩn khác của Bacillus nhƣ subtilin (B. subtilis ATCC 6633),

subtilosin, hai ericins mới đƣợc phát hiện ở B. subtilis A1/3 có trình tự peptide khác

với sublancin nhƣng chúng lại đều đƣợc phân cắt theo cùng một cách thức.

Pheromone ngoại bào ComX, protein tham gia vào việc kiểm soát mật độ tế bào, sự

sao mã của các gen chức năng cũng đƣợc tiết ra nhờ nhân tố vận chuyển ABC.

Ngoài ra, việc xác định tồn tại khoảng 77 nhân tố ABC transporter ở B. subtilis có

thể đƣa ra gợi ý rằng một vài protein không xác định có thể cũng đƣợc vận chuyển

qua các hệ thống này (Tjalsma et al., 2000).

1.1.3.9. Propeptide

Một số protein tiết của vi khuẩn có chứa propeptide là một đoạn axit amin

nằm giữa SP và protein trƣởng thành với vai trò chủ yếu cho quá trình gấp cuộn, thể

hiện hoạt tính và ổn định cấu trúc của protein. Đoạn propeptide đƣợc loại bỏ khỏi

các protein sau quá trình vận chuyển (Harwood & Cranenburgh, 2008). Protein tiết

trong Bacillus có thể bao gồm hai loại của propeptide dài và propeptide ngắn với

vai trò: (1) Chúng đã đƣợc đề xuất để đóng một vai trò trong quá trình tiết, mặc dù

không có bằng chứng trực tiếp cho các chức năng nhƣ đã đƣợc trình bày; (2) Ngăn

chặn hoạt tính thủy phân của các enzyme này trong quá trình tiết gây hại cho tế bào

chủng sản nếu biểu hiện không đúng; (3) Propeptides tích điện cao sẽ giúp các

protease đƣợc vận chuyển tới màng thông qua tƣơng tác ion; (4) Một số nghiên cứu

chỉ ra rằng propeptides có một vai trò quan trọng trong việc gấp và hoạt hóa các

protease sau khi vận chuyển chúng qua màng tế bào.

Propeptide dài đƣợc đặc trƣng trong protease của vi khuẩn và chiều dài của

nó có thể đạt đƣợc 60 – 200 axit amin và nó có khả năng tự xúc tác phân cắt và có

chứa các chaperone có hoạt tính trong nội bào, ví dụ nhƣ AprE của B. subtilis

(Harwood & Cranenburgh, 2008). Propeptide của subtilisin ở B. amyloliquefacien

chứa 77 axit amin trong khi đó protease của B. subtilis (natto) có chứa 164 axit

amin.

Đoạn propeptide ngắn là các đoạn có ít hơn 60 axit amin, đƣợc phân cắt bởi

một protein chƣa rõ chức năng (Kakeshita et al., 2012) và chúng có mặt trong một

số ít protein tiết ra ngoài môi trƣờng nhƣ propeptide của α-amylase ở B. subtilis

(AmyE), β-lactamase ở B. licheniformis (16 aa). Không có protease đặc hiệu cho sự

phân cắt các propeptides ngắn mà thay vào đó chúng có thể đƣợc phân cắt bởi một

số protease không đặc hiệu đƣợc tiết ra bởi chi Bacillus. Rất ít dữ liệu đƣa ra về

chức năng của các propeptides ngắn và có thể chúng không đóng một vai trò hoạt

động trong quá trình tiết. Trong thực tế, tất cả các protease ngoại bào của Bacillus

đƣợc tổng hợp nhƣ preproenzymes có chứa cả một SP và một propeptide (Simonen

& Palva, 1993)

1.1.4. Enzyme phân cắt peptide tín hiệu của Sec/P

1.1.4.1. Peptidase phân cắt tín hiệu loại I trong Gram âm

Đặc trƣng nhất của peptidase loại I trong E. coli đƣợc gọi là các leader

peptidase (Lep). Gen mã hóa cho SPase là gen lepB là một protein dài 323 axit amin

(35,9 kDa) với 2 vùng N (4 -28 và 58 - 76) gần với vùng tế bào chất nhỏ (axit amin

29 -57) và đứng trƣớc vùng xúc tác C ( gồm các a.a. 77- 323). Gen LepB chỉ có mặt

trong E. coli và cần thiết cho sự sinh trƣởng và biến đổi của tế bào. Sự có mặt của

SPase loại I trong nhiễm sắc thể (NST) đặc trƣng cho một số vi khuẩn Gram âm

nhƣ: E. coli, Haemophilus influenzae, Pseudomonas fluorescens, Rhodobacte

sphaeroides, Salmonella typhimurium và Yersinia pestis. Có một số loài vi khuẩn

Gram âm có 2 loại SPase nhƣ Pseudomonas aeruginosa, và có 3 loại SPase nhƣ

Bradyrhizobium japonicum (van Roosmalen et al., 2004).

1.1.4.2. Enzyme peptidase loại I trong Bacillus và vi khuẩn Gram dương

Trong vi khuẩn Gram dƣơng, thông thƣờng SPase loại I đƣợc phổ biến trong

hệ thống tiết protein (Tjalsma et al., 2000) và ngày nay có rất nhiều SPase loại I

đƣợc phân lập trong vi khuẩn Gram dƣơng. Đã có những phân tích về chức năng và

đặc tính sinh hóa của SPase loại I của các vi khuẩn Gram dƣơng trong B. subtilis, B.

cereus, B. anthracis, B. amyloliquefaciens, S. lividans, S. pneumoniae... B.

anthracis có chứa 6 và B. subtilis có chứa 5 gen mã hóa cho SPase loại I trên NST.

Gen mã hóa cho SPase trong B. subtilis đã đƣợc giải mã bao gồm: SipS, SipT,

SipU, SipV và SipW (van Wely et al., 2001; Fu et al., 2007; Harwood &

Cranenburgh, 2008; Tjalsma et al., 1997; Song et al., 2015). Tjalsma và cộng sự đã

chứng minh SipS và SipT là hai gen quan trọng nhất trong SPase của B. subtilis

trong khi SipU, SipV và SipW ít có vai trò hơn trong quá trình tiết protein (Tjalsma

et al., 1997). Trong các vi khuẩn gram dƣơng bao gồm: Streptomyces lividans, S.

coelicolor, C. perfringens có 4 gen mã hóa cho SPase loại I đƣợc tìm thấy bao gồm:

SipW, SipX, SipY, SipZ và SipS, SipT, SipV và SipW trong B. amyloliquefaciens

(van Roosmalen et al., 2004). Trong L. plantarum, L. monocytogenes và

Staphylococcus epidermidis có ba gen mã hóa cho SPase. Trong khi đó, B.

halodurans, S. aureus (spsA và spsB) và S. carnosus (sipA và sipB) có hai gen mã

hóa cho SPase., Streptococcus pneumoniae, S. mitis, L. lactis, Mycobacterium

leprae, Mycobacterium tuberculosis và Aquifex aeolicus chỉ có một gen mã hóa cho

SPase (van Roosmalen et al., 2004)

1.1.4.3. Lipoprotein peptidase

Các tín hiệu peptidase lipoprotein (Tín hiệu peptidase II) ở E. coli là một

protein nhỏ có kích thƣớc khoảng 18-kDa nằm trong CM. Loại II SPase có thể đƣợc

chia làm hai loại. Major SPase bao gồm SipS(S), SipT(T) và Sip(P) rất cần thiết cho

quá trình biến đổi tế bào. Các minor SPase bao gồm SipU(U), SipV(V) và

SipW(W). SipP mã hóa cho gen sinh plasmid pTA1015 và pTA1040 có mặt trong

B. subtilis nato. Tất cả các SPase còn lại nằm trên NST. SipW là loại SPase chỉ có

trên mạng lƣới nội chất, có tƣơng đồng cao với SPase của eucaryote và vi khuẩn cổ.

SipP của procaryote có thụ thể gắn trên màng ở đầu N trong khi đó SipW lại có thụ

thể gắn trên đầu C. B. subtilis chỉ có một gen lspA mã hóa cho SPase loại II với 4

thụ thể trên màng cần thiết cho quá trình phân cắt của 114 lipoproten (Tjalsma et

al., 2004; Rey et al., 2004). Tín hiệu peptidase lipoprotein của vi khuẩn gram dƣơng

đƣợc phát hiện ở S. aureus và SPase II của loài này có sự tƣơng đồng thấp với

peptidase lipoprotein của vi khuẩn gram âm đã công bố (Dalbey & Von Heijne,

2002; Fu et al., 2007)

1.2. HỆ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở VI SINH VẬT

1.2.1. Vai trò của Bacillus trong công nghiệp sản xuất enzyme

Các loài thuộc chi Bacillus đã, đang và ngày càng trở thành những vi sinh vật

quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Các ứng dụng của nhóm này bao trùm hàng

loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men

hiện đại, đến sinh học phân tử, y - duợc học chữa các bệnh hiểm nghèo, chế phẩm

xử lý ô nhiễm môi truờng, thu hồi bạc kim loại từ các phế liệu. Chính vì lẽ đó nên

đã có ngày càng nhiều các nghiên cứu sâu về chi Bacillus này cũng nhƣ mở rộng

ứng dụng của chúng đối với đời sống con nguời. Từ đầu những năm 60 một số loài

Bacillus đã đƣợc sử dụng và cải tiến để lên men sản xuất các enzyme thủy phân

tƣơng ứng. Năm 2004, thị trƣờng enzyme công nghiệp trên thế giới ƣớc tính là 1,6

tỷ đô la Mỹ và có xu hƣớng ngày càng tăng. Khoảng 50 - 60% các enzyme thƣơng

mại đƣợc sản xuất bởi các loài thuộc Bacillus. Hai trong số các enzyme chiếm vị trí

quan trọng nhất là protease kiềm (subtilisins) đƣợc sử dụng trong chất tẩy rửa gia

dụng và amylase đƣợc sử dụng trong các ứng dụng công nghiệp có nguồn gốc từ chi

này. Các enzyme đƣợc sản xuất bởi B. subtilis và B. licheniformis đƣợc sử dụng

rộng rãi làm chất phụ gia trong các chất tẩy rửa (bột giặt). Chất tẩy rửa đầu tiên có

chứa enzyme vi khuẩn đƣợc sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-40. Đến năm 1963,

Novo A/S đã giới thiệu acalase dƣới tên thƣơng mại là BIOTEX đƣợc chiết xuất từ

B. licheniformis. Đến gần đây, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị

trƣờng đều là serine protease đƣợc sản xuất từ các chủng Bacillus (Reddy et al.,

2003; Maarel et al., 2002; Alkando & Ibrahim, 2011) và chủ yếu là từ B. subtilis.

Trên thế giới, mỗi năm ngƣời ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công

nghiệp chất tẩy rửa. Trong đó, hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor

Intematinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lƣợng enzyme protease từ

loài này (Gupta et al., 2008)

Bảng 1.3. Một số chất có nguồn gốc vi khuẩn và ứng dụng của chúng

Sản phẩm

Ứng dụng

Protease kiềm

Chất tẩy rửa

Amylase kiềm

Chất tẩy rửa

Nguồn tách chiết B.subtilis/ B.lichenifomis B. lichenifomis

Vi khuẩn chủ B.subtilis/ lichenifomis B. lichenifomis

Phân cắt tinh bột

B. lichenifomis

α-amylase

Phân cắt tinh bột

B. haloduran

Pullulanase

B. haloduran

Glucose isomerase

Chế biến tinh bột

B. coaluglans

B. fimus

CGTase

B. fimus

Chuyển hóa tinh bột thành dextrin

Β-glucanase

Biến đổi glucan

B. subtilis

Thực phẩm

Xylanase

B. subtilis

Phân cắt cellulose

B. subtilis

Cellulase

B. subtilis

Chitinase

Phân cắt chitin

B. thuringiensis

Levansucrase

B. circulans

Xúc tác hoạt động Hydrolase/trasferlase

Esterase

Phân hủy lypolytic

B. circulans

Hormon sinh trƣởng Dƣợc phẩm

Ngƣời

B. subtilis

Interleukin-1beta

Dƣợc phẩm

Ngƣời

B. subtilis

Proinsulin

Dƣợc phẩm

Ngƣời

B. subtilis

Penicillin G acylase Dƣợc phẩm

B. megaterium

B. subtilis

Cyclic oligopeptides Kháng sinh

B. lichenifomis

Basic peptides

Kháng sinh

B. reviBacillus brevis

endotoxin

Thuốc trừ sâu sinh học B. thuringiensis

B. lichenifomis B. reviBacillus brevis B. thuringiensis

Purine nucleotides

B. subtilis

Dƣợc phẩm, nâng cao mùi vị

Riboflavin

Nâng cao mùi vị

D-ribose

Cấu thành vitamin

2-acetyl 1-pyrroline Gia vị popcom

B. subtilis B. subtilis, B. pumilus B. cereus

Polyhydroxybutyrate Chất dẻo sinh học

Vi khuẩn

B. megaterium

Streptavidin

Protein liên kết biotin

Streptomyces

B. subtilis

(Nguồn: Brockmeier, 2006)

1.2.2. Hệ thống biểu hiện ở Bacillus

Đây là chi đƣợc sử dụng chủ yếu để thu nhận các enzyme nhƣ protease (cho

công nghiệp giặt tẩy), amylase (cho công nghiệp tinh bột, chế biến bánh…). Một số

ƣu điểm của việc sử dụng hệ thống biểu hiện của Bacillus trong sản xuất protein tái

tổ hợp: các loài thuộc chi này có hệ thống di truyền đặc trƣng, có khả năng biến nạp

cao, tốc độ sinh trƣởng mạnh, không có lipopolysacharide chứa bên ngoài màng,

trao đổi chất mạnh mẽ, bộ gen của vi khuẩn B. subtilis và B. licheniformis đã đƣợc

giải trình tự và chúng đƣợc biết không sinh ra các nội hoặc ngoại độc tố đƣợc FDA

công nhận là an toàn. Các protein của các loài này lại đƣợc tiết vào môi trƣờng lên

men làm cho quá trình thu nhận dễ dàng, thu hồi sản phẩm hiệu quả và giảm chi phí

sản xuất. Chủng chủ cho biểu hiện thƣờng thuộc các loài B. megaterium, B. subtilis,

B. licheniformis, B. brevis. Sản phẩm protein tái tổ hợp ở B. subtilis thu đƣợc lên tới

25g/l. B. licheniformis là chủng chủ biểu hiện tốt nhất interleukin-3 khi đƣợc so

sánh với sự biểu hiện protein này trong E. coli, S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis

và tế bào động vật có vú C127 (Vitikainen, 2004; van Dijl et al., 2002). Các protein

tái tổ biểu hiện thành công trong Bacillus bao gồm interleukin-3EGF, esterase (của

Pseudomonas), xylanase, naproxen esterase, amylase và rất nhiều loại protease khác

(Demain & Vaishnav, 2009).

1.2.3. Đặc điểm di truyền của Bacillus subtilis

Hệ gen của B. subtilis bao gồm khoảng 4.2 Mb. và số lƣợng các cặp base của

loài này có hơi khác nhau B. subtilis subsp. subtilis RO-NN-1 là 4,011,949 bp. trong khi đó B. subtilis subsp. BSn5 và TU-B-10T chứa 4,207,222 bp. (Earl et al., 2012).

Trong đó có tới 87% gen mã hóa cho 4100 ORF (Wipat & Harwood, 1999). Các

protein của các ORF này đã đƣợc 25 phòng thí nghiệm của các nƣớc thuộc Cộng

đồng châu Âu và Nhật Bản phân tích chức năng trong đó có tới 40% ORF chƣa xác

định đƣợc vai trò nào đối với chính B. subtilis. Với đặc điểm này, nhiều gen của các

vi sinh vật khác đƣợc phiên mã và dịch mã ở B. subtilis. Vì vậy, chúng đƣợc sử

dụng rộng rãi làm chủng chủ để biểu hiện gen trong công nghệ DNA tái tổ hợp.

1.2.4. Hệ biểu hiện ở E. coli và vi sinh vật khác

1.2.4.1. Hệ biểu hiện ở E. coli

E. coli là chủng chủ đƣợc sử dụng sớm nhất và rộng rãi nhất trong công nghệ

sản xuất các protein tái tổ hợp. Những tiến bộ ngày nay về hiểu biết di truyền trong

quá trình phiên mã, dịch mã và quá trình gấp cuộn protein trong E. coli cùng với các

công cụ cải thiện di truyền đƣa loài này có nhiều thuận lợi và ƣu thế hơn so với hệ

biểu hiện protein phức tạp trong eukaryote (Terpe, 2006). Hệ thống này có sự biểu

hiện nhanh, hiệu suất thu hồi cao, dễ dàng nuôi cấy và biến đổi gen, giá thành rẻ và

thu hồi sinh khối nhanh nhƣng có nhiều nhƣợc điểm: khi protein tái tổ hợp có các

liên kết disulfide rất khó biểu hiện, sinh các protein không glycosyl, sinh protein

cùng với nội độc tố, hình thành acetate gây độc tế bào (điều này có thể tránh đƣợc

bằng cách kiểm soát mức độ oxy), protein sản xuất ở trong tế bào thƣờng ở dạng thể

vùi và để có hoạt tính cần tái gấp cuộn protein. Hiệu suất thu hồi có thể đạt tới

5.5g/l α – interferone trong dịch nuôi cấy (Demain & Vaishnav, 2009). Để tăng hiệu

suất thu hồi sản phẩm, cần phải có một hệ thống promoter mạnh (có các gen lac,

tac, trc). Hệ thống biểu hiện trong E. coli đã đƣợc sử dụng nhằm thu các protein lạ:

phoA (alkaline phosphatase) với hàm lƣợng protein đạt 5.2 g/l trong periplasm, LFT

(levanfructotransferase) với hàm lƣợng đạt 4 g/l trong môi trƣờng, hGCSF (human

granulocyte colony-stimulatory factor) với hàm lƣợng 3.2 g/l trong periplasm; IGF-

1 (insulin-like growth factor) với hàm lƣợng 2.5 g/l trong periplasm; cholera toxin

B với nồng độ 1 g/l trong môi trƣờng (Mergulhão et al., 2005).

1.2.4.2. Hệ thống biểu hiện của vi sinh vật khác

Vi khuẩn Gram âm Ralstonia eutropha đƣợc sử dụng làm vật chủ trong công

nghệ DNA tái tổ hợp (Demain & Vaishnav, 2009; Terpe, 2006). Hệ thống biểu hiện

của loài này có nhiều ƣu điểm hơn E. coli. Hệ thống Pfenex của Pseudomonas

ﬂuorescens có thể thu đƣợc 4 g/l TNF-α. Staphylococcus carnosus có khả năng sinh

tổng hợp khoảng 2 g/l protein của động vật có vú trong khi ở Streptomyces lividans

thì lƣợng tổng hợp này là 0.2 g/l (Demain & Vaishnav, 2009).

1.3. CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN BIỂU HIỆN GEN Ở Bacillus subtilis

Có năm yếu tố đƣợc biết đến có ảnh hƣởng đến quá trình biểu hiện và tiết của

một protein lạ trong hệ thống biểu hiện của B. subtilis (Hình 1.3) bao gồm: quá trình

phiên mã, sự gấp cuộn của protein, quá trình vận chuyển protein qua màng, quá

trình phân cắt các peptide tín hiệu và proteolysis (sự phân hủy của protease).

Hình 1. 3. Các yếu tố liên quan đến biểu hiện gen ở B. subtilis

(Nguồn: Li et al., 2004)

Thông qua sự hiểu biết về các yếu tố này, các nhà nghiên cứu có thể tăng

cƣờng mức độ biểu hiện protein trong hệ thống biểu hiện ở B. subtilis. Để đạt đƣợc

hiệu suất tổng hợp protein cao nói chung và α-amylase nói riêng ở chủng B. subtilis

tái tổ hợp, các biện pháp cơ bản sau đƣợc sử dụng nhƣ: dùng các promoter mạnh,

chọn trình tự SP phù hợp cho khả năng tiết enzyme, nâng cao biểu hiện bằng việc

sủ dụng chủng chủ đã đƣợc cải biến di truyền (cắt bỏ các gen gây ảnh hƣởng đến

biểu hiện), tối ƣu hóa các điều kiện nuôi cấy...

1.3.1. Lựa chọn promoter

Promoter của vi khuẩn nằm ngay trƣớc vị trí khởi đầu phiên mã và chứa hai

đoạn ngắn tƣơng đối bảo thủ, mỗi đoạn gồm 6 nucleotide cách vị trí khởi đầu

khoảng 35 bp. (trình tự TTGACA) và 10 bp. (trình tự TATAAT). Một promoter

mạnh là promoter phải có khả năng làm tăng cƣờng mức độ biểu hiện gen. Promoter

dùng cho hệ biểu hiện ở B. subtilis bao gồm:

- Pspac promoter: đƣợc tạo thành từ đoạn đầu 5’ từ phage SPOI ở B. subtilis

và đầu 3’ của lacZ promoter từ E. coli và đƣợc cảm ứng bởi IPTG (1 ÷ 10 mM)

(Vavrová et al., 2010).

- Promoter XylR của B. subtilis (Ming et al., 2010) và B. megaterium

(Naturwissenschaften, 2007, 2010) cảm ứng bằng xylose dùng điều hòa biểu hiện

gen trong B. subtilis cũng nhƣ E. coli.

- Promoter của sacB cảm ứng bằng sucrose (1 ÷ 30 mM). Rất nhiều hệ biểu

hiện đƣợc thiết kế trên cơ sở của promoter sacB (Heng et al., 2005a).

- Promoter cảm ứng bằng phosphat (Qi et al., 1997).

- Promoter cảm ứng bằng citrate (Vavrová et al., 2010).

- Promoter cảm ứng tự động bao gồm các promoter cảm ứng trực tiếp mức

độ biểu hiện thấp trong pha lag và pha log và có mức độ biểu hiện cao hơn khi ở

pha nghỉ (stationary) nhƣ: aprE (Nijland & Kuipers, 2008) và gsiB (Eymann &

Hecker, 2001; Petersohn et al., 1999). Hệ thống promoter cảm ứng tự động không

đƣợc dùng trong nghiên cứu cơ bản nhƣng lại đƣợc dùng trong công nghiệp bởi

chúng không yêu cầu chất cảm ứng. Hiện nay mới phát triển thêm hệ thống cảm

ứng mới rẻ hơn, an toàn hơn cho hệ thống promoter cảm ứng của công nghiệp là

Pglv cảm ứng bằng maltose (Ming et al., 2010).

- Hệ biểu hiện với vector phage nhƣ phage 105 và pBSX (ở B. subtilis 168).

Hệ biểu hiện này đƣợc cảm ứng bởi nhiệt độ và đƣợc sử dụng để điều hòa biểu hiện

gen rất tốt.

- Promoter Pgrac với kích thƣớc khoảng 182 bp của vector pHT43 cho phép

biểu hiện protein tái tổ hợp trong Bacillus ở mức độ cao trong tế bào chất. Promoter này đƣợc xây dựng dựa trên promoter mạnh phụ thuộc σA của operon groESL từ B.

subtilis dung hợp với yếu tố điều hòa lac operator (lacO) từ E. coli và cảm ứng bằng

IPTG của lac operator. Sử dụng promoter này cho hiệu quả biểu hiện rất cao (Phan

et al., 2012; Huỳnh Kiều Thanh và cs., 2014)

Ngoài các promoter đƣợc mô tả ở trên, trong công nghiệp ngƣời ta đã thiết

kế các promoter đặc biệt cho năng suất protein ngoại bào tới 20 g/l, nhƣng vì lí do

thƣơng mại mà trình tự đƣợc giữ bí mật. Trong nhiều trƣờng hợp các promoter của

chủng chủ nhƣ spoVG (promoter điều hòa sự hình thành bào tử ở Bacillus),

promoter của gen α-amylase (pAmy), promoter của gen protease… đƣợc sử dụng để

biểu hiện gen α-amylase tạo sự đồng nhất giữa RNA-polymerase của chủng chủ với

promoter ở vectơ tái tổ hợp (Li et al., 2004)

1.3.2. Các vector biểu hiện ở Bacillus subtilis

Vector biểu hiện có thể đƣợc thiết kế để tối đa hóa quá trình khởi đầu dịch

mã nhƣ có mang một trình tự RBS bảo thủ, một mã bộ ba khởi đầu ATG ở vị trí tối

ƣu (cách 8 bp) về phía sau của RBS, một gene chọn lọc (thƣờng là kháng một kháng

sinh nào đó), một promoter mạnh, sau vị trí đƣa gene vào là hai hay ba trình tự kết

thúc phiên mã mạnh để ngăn việc phiên mã các gene khác trong plasmid. Một số

plasmid nội sinh đƣợc phát hiện có mặt trong Bacillus. Tuy nhiên, khi sử dụng các

plasmid này không thể lựa chọn trực tiếp các khuẩn lạc đã đƣợc biến nạp trong một

số loài thuộc chi này và không kiểm soát đƣợc chức năng của tế bào chủ bởi cấu

trúc của các plasmid này chƣa đƣợc làm rõ. Vị vậy, các plasmid ngoại lai đƣợc sử

dụng biểu hiện trong Bacillus là pUB110, pE194, pC194, pBSMuL, pAL vector,

vector cảm ứng lạnh, pHT (pHT01, pHT43), vector tích hợp NST của B. subtilis ...

1.3.3. Chọn trình tự peptide tín hiệu.

Các nghiên cứu tác động đến quá trình vận chuyển protein qua màng, đặc

biệt là yếu tố SP đƣợc quan tâm hơn cả. Cũng theo hƣớng này, Eggert và cộng sự đã

đƣa ra chỉ ra rằng mức độ tiết protein tái tổ hợp quan tâm phụ thuộc vào loại SP mà

gen đó đƣợc gắn (Eggert et al., 2003). Sàng lọc SP để đánh giá khả năng tiết

enzyme bằng cách gắn các SP quan tâm với một gen đích là đoạn gen mã hóa cho

protein trƣởng thành của một đối tƣợng enzyme quan tâm là phƣơng pháp hữu hiệu

trong sàng lọc tăng cƣờng hoạt tính của chủng tái tổ hợp. Từ đó đánh giá khả năng

tiết enzyme và có thể thấy đƣợc tầm quan trọng của SP trong quá trình tiết

(Brockmeier, 2006; Ying et al., 2012; Fan et al., 2011). Hiện nay, có rất nhiều các

công trình nghiên cứu của các tác giả khắp nơi trên thế giới về ảnh hƣởng của SP

lên khả năng tiết enzyme (Itoh et al., 1990; Yarimizu et al., 2015; Nakamura &

Takase, 1990; Pechsrichuang et al., 2016; Jonet et al., 2012; Borchert & Nagarajan,

1991a; Chen & Nagarajan, 1994; Brockmeier, 2006; Sakakibara et al., 1993; Song

et al., 2015; Low et al., 2013; Saengkerdsub et al., 2013; Goethe-universita, 1996)

1.3.4. Đột biến peptide tín hiệu

Enzyme là chất xúc tác sinh học cho nhiều ngành công nghiệp khác nhau:

hóa chất nông nghiệp, chất tẩy rửa, tinh bột, hàng dệt, chăm sóc cá nhân, bột giấy

và giấy, chế biến thực phẩm và thức ăn gia súc... Dựa trên việc ứng dụng của các

enzyme trong quy trình công nghiệp khác nhau, rất nhiều cải tiến trong sản xuất thu

hồi hồi enzyme đã đƣợc thực hiện nhằm nâng cao hiệu suất của quá trình, tính kinh

tế và tính khả thi. Để thực hiện đƣợc điều này các enzyme trong công nghiệp cần

phải có một số cải biến nhằm đáp ứng đƣợc nhu cầu về số lƣợng, tính chất của

enzyme. Một số phƣơng pháp có thể đƣợc cải thiện nhằm tăng lƣợng enzyme thu

hồi nhƣ: tạo enzyme tái tổ hợp, tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy hoặc có thể can thiệp

vào quá trình vận chuyển protein bằng cách tác động vào một số yếu tố tham gia

trong con đƣờng tiết của enzyme quan tâm. Yêu cầu việc cải thiện tính chất của

enzyme trong công nghiệp nhƣ: Độ đặc hiệu bề mặt, mức biểu hiện, tính hòa tan,

tính ổn định, độ hoạt động, tính chọn lọc, hoặc độ bền nhiệt, sự dung nạp đối với

các dung môi hữu cơ…. Dựa trên trình tự gen, trình tự axit amin của một enzyme

nhiều phƣơng pháp đƣợc áp dụng nhằm cải thiện các đặc tính khác nhau của các

enzyme mục tiêu bằng cách tạo ra các đột biến trình tự DNA mã hóa cho enzyme

đó. Các phƣơng pháp có thể đƣợc áp dụng nhƣ đột biến điểm và đột biến ngẫu

nhiên…. Đột biến thêm / bớt hoặc thay thế các axit amin cụ thể. Đột biến ngẫu

nhiên là một đột biến đƣợc tạo dọc theo chiều dài gen ở vị trí bất kỳ nhờ ep – PCR

hay error prone PCR (Rabbani et al., 2011)

Đối với các trình tự SP đã biết, có thể nghiên cứu sử dụng đột biến định

hƣớng để có thể đánh giá tác động hay ảnh hƣởng đến quá trình tiết của một

enzyme (Borchert & Nagarajan, 1991a; Simonen & Palva, 1993; Caspers et al.,

2010b, Ismail et al., 2011; Han et al., 2017 ). Các SP tiết trong Sec/P luôn có cấu

trúc 3 vùng với các chức năng khác nhau đƣợc biết đến với độ dài đoạn SP của gen

α–amylase từ chi Bacillus bao gồm khoảng 25 - 40 aa. Những đột biến tạo thành

đƣợc thiết kế dựa trên SP ban đầu đồng thời có thế áp dụng các phƣơng pháp nhƣ:

đột biến điểm (SDM – site directed mutagenenesis) hay sử dụng error prone PCR,

đột biến thêm đoạn, đột biến mất đoạn... hoặc có thể tạo đột biến bằng các con

đƣờng tổng hợp hóa học nhằm thay thế vị trí mong muốn trƣớc khi ghép trở lại gen.

Phƣơng pháp gây đột biến ở mức bão hòa là một phƣơng pháp đƣợc sử dụng rất

nhiều và là công cụ hữu hiệu để có thể thực hiện đƣợc mục đích này bằng việc thay

thế các axit amin thông qua PCR. Quá trình tiết tự nhiên của sản phẩm trong chủng

chủ là không cao, do đó, việc biểu hiện ở mức cao các enzyme công nghiệp mong

muốn có thể dẫn tới lỗi trong sự gấp cuộn các protein (Schallmey et al., 2004) và có

thể gây lỗi trong sự biểu hiện từ đó không thu đƣợc các protein mong muốn

(Harwood & Cranenburgh, 2008). Nhằm mục đích đánh giá tác động cũng nhƣ vai

trò của các vùng trên SP đối với quá trình tiết enzyme quan tâm (Borchert &

Nagarajan, 1991a; Simonen & Palva, 1993; Caspers et al., 2010b) và để tăng cƣờng

khả năng tiết enzyme ngoại bào, đoạn SP của gen thƣờng đƣợc gây đột biến bằng

cách thêm đoạn vào vị trí nào đó hoặc thay đổi các axit amin nhằm biến đổi điện

tích trên đoạn SP ở vùng này (Suominen et al., 1990; Itoh et al., 1990; Southgate et

al., 1993; Yamabhai et al., 2008).

Theo Brockmeier và các nghiên cứu của các tác giả khác có thể sử dụng

peptide tự nhiên, thông qua quá trình nghiên cứu gây đột biến tạo ra các peptide tín

hiệu mạnh tăng cƣờng tiết enzyme. Tăng tiết enzyme quan tâm thì có thể làm tăng

lƣợng enzyme thu hồi, vì vậy, phƣơng pháp chiếm ƣu thế và sử dụng rộng rãi hiện

nay để tăng hoạt tính enzyme đó là can thiệp vào quá trình tiết enzyme. Ở đây cho

thấy rõ tầm quan trọng của các nhân tố tiết mà SP lại là nhân tố chính (Brockmeier

et al., 2006b; Caspers et al., 2010a; Brockmeier et al., 2006a,c; Caspers et al.,

2010b). Với các đột biến mong muốn bao gồm: đột biến thay đổi điện tích đầu N

bằng việc bổ sung một axit amin tích điện âm hoặc không mang điện tích; đột biến

làm tăng hoặc giảm tính kỵ nƣớc của vùng H, rút ngắn cấu trúc vùng H làm chậm

động học của quá trình; đột biến trên vùng C hay thay đổi axit amin tại vị trí nhận

biết phân cắt của SP nhằm tăng cƣờng khả năng tiết enzyme mong muốn.

Mặc dù vùng N không đóng vai trò quan trọng cho quá trình tiết nhƣ vùng H,

nhƣng khi SP có chứa 1 vùng N –acidic, protein sẽ đƣợc tiết chậm hơn. Xem xét

các tác động của biến đổi điện tích đầu N, có thể kết luận rằng sự hiện diện của các

điện tích dƣơng điển hình không hoàn toàn cần thiết để quá trình tiết xảy ra mặc dù

các điện tích dƣơng thấp hoặc bằng không dẫn đến làm giảm bài tiết protein. Điều

này phù hợp với các công bố trƣớc đó cho các sinh vật khác nhƣ nghiên cứu của

Gennity và cs ở E. coli (Gennity et al., 1990) và công bố của Chen và Nagarajan ở

Bacillus (Chen & Nagarajan, 1994). Loại SP duy nhất hoàn toàn đòi hỏi một điện

tích dƣơng (mặc dù có thể làm giảm hoạt tính) để trực tiếp tiết là SP tiết

levansucrase trong Bacillus (Borchert & Nagarajan, 1991a). Trong nghiên cứu đột

biến ở vùng H, việc thêm một axit amin không tích điện, phân cực trong vùng này

hoặc rút ngắn các axit amin luôn có ảnh hƣởng tiêu cực đến khả năng tiết. Điều này

chỉ ra rằng, cần phải duy trì một chuỗi các axit amin kỵ nƣớc liên tục ở mức độ nhất

định và không bị gián đoạn trong các SP. Từ thí nghiệm của các tác giả đã công bố

với các SP khác nhau, Page và cộng sự đã đƣa ra kết luận về sự tƣơng quan giữa

chiều dài của lõi kỵ nƣớc và mức tiết xylanase trong S. lividans (Pagé et al., 1996).

Izard và Kendall đã đƣa ra đánh giá về SP của E. coli, tính kỵ nƣớc của các đột biến

tại lõi kỵ nƣớc có thể làm rối loạn quá trình vận chuyển các chuỗi polypeptide làm

cho chúng không xảy ra hoặc sự tƣơng tác quan trọng trong quá trình vận chuyển

không đƣợc hoàn thành (Izard et al., 1996). Hiệu quả của việc tạo các các đột biến ở

cấp độ phiên mã có vẻ là một chủ đề gây tranh cãi. Đột biến SP có ảnh hƣởng mức

độ phiên mã của mRNA và hiệu suất dịch mã ở cả E. coli và Bacillus (Nakamura et

al., 1989; Gennity et al., 1990; Itoh et al., 1990). Vùng đầu C là nhân tố quan trọng

trong quá trình, nó đƣợc sử dụng để nghiên cứu đột biến trình tự SP làm tăng tổng

hợp enzyme. Các phƣơng pháp đột biến SP đƣợc sử dụng có thể là đột biến ngẫu

nhiên hoặc đột biến điểm (Borchert & Nagarajan, 1991a; Chen & Nagarajan, 1994;

Monroy-Lagos et al., 2006). Tác giả Borchert và Nagarajan (Borchert and

Nagarajan., 1991) sử dụng levansucrase của B. amyloliquefacien nhƣ một protein

mô hình nhằm nghiên cứu cấu trúc và chức năng của 3 vùng trong cấu trúc của SP

trong Bacillus (Borchert and Nagarajan, 1991a; Simonen & Palva, 1993)

1.3.5. Sử dụng chủng chủ đã đƣợc cải biến di truyền

Một nhân tố chính ảnh hƣởng đến quá trình biểu hiện protein trong chủng

chủ đƣợc phát hiện nữa chính là do quá trình biểu hiện một lƣợng lớn protease của

chính loài này vì thế chủng B.subtilis WB600 (cắt bỏ 6 gen ), B. subtilis WB700

(cắt bỏ 7 gen mã hóa protease), B. subtilis W800 (cắt bỏ 8 gen mã hóa protease)…

đƣợc sử dụng làm tăng hiệu suất biểu hiện. Các nghiên cứu gần đây cho thấy không

chỉ các protease đƣợc tiết mới ảnh hƣởng đến khả năng tiết enzyme của các chủng

tái tổ hợp mà còn có một protease liên kết màng nhƣ CWBP52 và CWBP53 là sản

phẩm của gen wprA. Mặc dù 2 protein này không thể hiện hoạt tính serin protease

nhƣng khi bất hoạt gen wprA của chủng B.subtilis WB800 lại cho thấy tăng tiết

protein. WprA có thể phân hủy protein biểu hiện bao gồm cả staphylokinase và α-

amylase (Lee et al., 2000; Stephenson et al., 1998).

1.4. ALPHA AMYLASE

Alpha-Amylase (Endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase - EC3.2.1.1) xúc tác

thủy phân ngẫu nhiên các liên kết α-1,4 glycoside trong phân tử tinh bột. Sản phẩm

cuối cùng của quá trình phân cắt là các đoạn oligosacharide với liên kết α–glucoside

nhƣ: glucose, maltose, maltotriose và dextrin. Do có thể hoạt động ở bất kỳ vị trí α-

1,4 nào trên cơ chất nên hoạt động phân cắt của α-amylase nhanh hơn β-amylase vì

vậy α -amylase giữ vai trò quan trọng nhất cho sự khởi đầu của quá trình thủy phân

(Zhang et al., 2017; Ray, 2015; KiroMojsov, 2012). Với vai trò to lớn của enzyme

này, các nhà nghiên cứu không ngừng tìm kiếm các α-amylase nhƣ tạo những chủng

tái tổ hợp mới mang các gen α amylase mới thu đƣợc từ việc sàng lọc thƣ viện

metagenomic ở các vùng cực hạn vi khuẩn không thể nuôi cấy (Schmeisser et al.,

2007; Vester et al., 2014; Sathya & Mahejibin, 2014).

1.4.1. Cấu trúc của α – amylase

Alpha-amylase là enzyme có chứa ion Ca2+ và có cấu trúc đa vùng với 3

vùng chính A, B, C. Trong đó, vùng A giữ vai trò trung tâm chứa siêu cấu trúc

(β/α)8 điển hình hoặc vùng xúc tác TIM (triose phosphate isomerase) với một cấu

trúc cuộn đa đối xứng của 8 chuỗi β bao quanh bởi 8 vòng xoắn, một dạng cấu trúc

đƣợc biết đến trong ít nhất là ở 9 họ của enzyme glycosyl hydrolase (Rivera et al.,

2003). Mặc dù có sự đa dạng về hoạt động xúc tác nhƣng vị trí hoạt động luôn đƣợc

định vị ở vị trí đầu cuối Cacbon. Vùng B và C thông thƣờng ở vị trí đối diện của

cấu trúc này. Vòng liên kết của xoắn liền kề mang axit amin ở vị trí hoạt động.

Thông thƣờng vùng B đƣợc hình thành giữa vùng cấu trúc nhô ra giữa sợi bậc ba và

xoắn bậc 3 của TIM barrel, đƣợc nằm giữa hai vùng A - C và đƣợc liên kết với

vùng A bằng liên kết disulphide (Henrissat & Bairoch, 1993; Ramachandran, 2005).

Vùng C có cấu trúc gấp nếp β liên kết với các vùng A bởi một chuỗi đơn

polypeptide và tham gia vào sự ổn định cấu trúc cho vùng TIM bằng việc bảo vệ

vùng A khỏi dung môi. Vị trí tâm hoạt động của α -amylase nằm ở giữa carboxyl cuối của 2 vùng A và B. Canxi (Ca2 +) nằm giữa vùng A và B và có thể đảm bảo

hoạt động ổn định của cấu trúc bậc ba và là chất hoạt hóa allosteric (Souza &

Magalhães, 2010; Zhang et al., 2017). Một số enzyme có thêm vùng D chức năng

chƣa đƣợc xác định và vùng E có khả năng liên kết với tinh bột sống (SBD) (đặc

biệt cyclodextrin glucanotransferase) và cả 2 vùng này nằm ngay sau vùng C. Tuy

nhiên, trong một số trƣờng hợp nhƣ glucoamylase (EC3.2.1.3) vùng liên kết tinh bột

có mặt tại đầu N của protein (Ramachandran, 2005; Souza & Magalhães, 2010).

Vùng liên kết tinh bột (SBD) dài khoảng 100 axit amin và gắn tại đầu cuối C trừ

trƣờng hợp SBD ở đầu N của glucoamylase ở Rhizopus oryzae. Chỉ có các vi sinh

vật nhƣ: một số nấm sợi, vi khuẩn G dƣơng, proteobacteria, vi khuẩn cổ, xạ khuẩn

đƣợc biết đến có khả năng sinh α - amylase chứa vùng này (Janeček, 2005;

Ramachandran, 2005). Sự cần thiết có mặt SBD của các enzyme là khác nhau.

Trong trƣờng hợp glucoamylase ở A. niger khi loại bỏ vùng SBD, hoạt tính đối với

tinh bột sống thì giảm hẳn trong khi đó vẫn giữ hoạt tính tốt đối với tinh bột tan.

Vùng SBD hoặc vùng E của CGTases khi bị cắt bỏ sẽ làm mất chức năng thủy phân

của enzyme này. Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu về SBD và vai trò trong liên kết

với tinh bột, tuy nhiên mối liên kết của SBD và vùng xúc tác vẫn chƣa đƣợc nghiên

cứu rõ ràng (Ramachandran, 2005).

1.4.2. α-Amylase từ Bacillus

Trong số các vi sinh vật sinh α-amylase, Bacillus dƣờng nhƣ có số loài lớn

nhất và đa dạng nhất. Hầu nhƣ các loài thuộc chi này đều có thể tìm thấy các chủng

sinh α-amylase. Phần lớn các chủng Bacillus sinh truởng và phát triển ở nhiệt độ

bình thuờng nhƣ các vi sinh vật ƣa ấm và α-amylase đƣợc tổng hợp bởi các loài B.

subtilis, B. stearothermophilus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. circulans,

B. coagulan, B. caldoliticus, B. acidocodaricus, B. megaterium…, trong đó B.

subtilis , B. stearothermophilus, B. licheniformis và B. amyloliquefaciens, đƣợc biết

đến là những loài sản xuất amylase tốt và đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất

thƣơng mại cho các ứng dụng khác nhau (Mobini-dehkordi & Javan, 2012; Naidu,

2013; Souza & Magalhães, 2010; Sundarram & Murthy, 2014; Ray, 2015). Theo

quy luật thì những chủng sinh truởng ở nhiệt độ cao thì sinh α-amylase bền ở nhiệt

độ cao hơn nhƣng trong giống Bacillus lại thuờng gặp rất nhiều chủng sinh truởng,

phát triển ở nhiệt độ không cao nhƣng lại sinh α-amylase bền nhiệt. Chính tính chất

đặc biệt này của Bacillus đã làm cho nó trở thành một đối tuợng đuợc quan tâm

nghiên cứu để thu nhận các loại enzyme công nghiệp. Nhóm tác giả Trần Đình Mấn

và cs đã có nhiều nghiên cứu phân lập, tách dòng cũng nhƣ biểu hiện gen mã hóa

cho α-amylase từ Bacillus đặc biệt là đối tƣợng B. licheniformis và còn nhiều loài

khác thuộc chi này phân bố ở biển cũng nhƣ ở suối nƣớc nóng trải dài trên cả nƣớc:

Mỹ lâm, Bình Châu, Đảnh Thạnh, La Phù…(Nguyễn Thanh Huyền và cs., 2004;

Trần Đình Mấn và cs., 2011) nhằm tìm và phát hiện các gen mã hóa cho enzyme

này ở các nguồn đặc trƣng (Trần Đình Mấn và cs., 2004; Trần Đình Mấn, 2001;

Trần Đình Mấn và Schweder, 1999).

α-Amylase từ B. licheniformis: Các chủng thuộc loài B. licheniformis chính

là đại diện quan trọng nhất trong nhóm Bacillus sinh α-amylase bền nhiệt. Một ví

dụ điển hình là enzyme α-amylase bền nhiệt Termamyl nổi tiếng của hãng Novo

cũng đã đuợc thu nhận từ loài này. Mặc dù các chủng thuộc loài này phát triển ở

nhiệt độ không cao lắm (37 ÷ 50˚C), nhƣng α-amylase của các chủng này lại có

t˚opt rất cao (75 ÷ 90˚C) và rất bền nhiệt. Cho đến nay có lẽ đây là loài có α-

amylase bền nhiệt cao nhất trong nhóm Bacillus (Pandey et al., 2000). B.

licheniformis NH1 thu đƣợc enzyme α - amylase có kích thƣớc 58kDa, hoạt động ở dải pH rộng 4-9 ở nhiệt độ tối ƣu là 90oC (Sharma & Satyanarayana, 2013). B. licheniformis 3BT2 tiết α - amylase có kích thƣớc 58kDa, nhiệt độ tối ƣu là 80oC

(Trần Đình Mấn và cs., 2004; Trần Đình Mấn, 2001; Trần Đình Mấn và Schweder,

1999)

Alpha- amylase từ B. subtilis: α-amylase của các chủng này thƣờng hoạt

động ở nhiệt độ tối ƣu chỉ từ 40 ÷ 55˚C và pH hoạt động 5 ÷ 7. Tuy nhiên, có một

số chủng B. subtilis đƣợc tìm thấy có khả năng sinh α – amylase có trọng lƣợng phân tử đạt 54 – 57kDa, pH tối ƣu 5.4 – 6.5, và nhiệt độ tối ƣu 50 – 80oC (Pandey et

al., 2000). Bukhari và cộng sự đã phân lập đƣợc chủng B. subtilis 10-R từ đất sinh

tổng hợp α- amylase hoạt động ở dải pH rộng từ 5.0 – 9.0 với dãy nhiệt độ tƣơng

đối lớn 25 – 80oC và chỉ mất 38% hoạt tính khi đƣợc xử lý ở 80OC (Bukhari &

Rehman, 2015).

α - Amylase từ các loài khác thuộc chi Bacillus: α - amylase của B. lentus có

khối lƣợng phân tử khoảng 42 kDa và hoạt động ở pH từ 6.1 và nhiệt độ tối ƣu 70oC; B. megaterium (KLPT của enzyme đạt 59 kDa). Một số loài thuộc chi

Bacillus còn đƣợc biết đến với khả năng sinh α - amylase có trọng lƣợng phân tử rất

lớn 97 – 150 kDa và enzyme α - amylase thu đƣợc từ các loài này đạt độ hoạt động tốt ở pH 5.5 – 12.0 và dải nhiệt độ hoạt động cũng rất đa dạng, từ 37 – 90oC. α -

amylase của các chủng thuộc B. amyloliquefaciens có khả năng hồ hoá tinh bột rất

mạnh, nhƣng độ bền nhiệt của enzyme không cao chỉ có một số ít chủng có khả

năng sinh α-amylase bền nhiệt (Nusrat & Rahman, 2007). B. amyloliquefaciens P-

001 hoạt động ở pH 5.5 – 8.0 và nhiệt độ hoạt động của enzyme trong dải 37 – 70oC. Ngoài ra, α amylase còn đƣợc tìm thấy có trong B. methylotrophicus P11-2 có kích thƣớc khoảng 44kDa nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động tƣơng ứng 70oC và

7.0 (Xie et al., 2014).

1.4.3. α-amylase từ các vi sinh vật khác

Amylase là enzyme có trong: thực vật, động vật và vi sinh vật. Ngày nay, số

lƣợng lớn các enzyme amylase từ vi sinh vật đã đƣợc ứng dụng trong các quá trình

công nghiệp và các enzyme này đã thay thế hoàn toàn cho việc sử dụng hóa chất để

thủy phân tinh bột trong công nghiệp chế biến tinh bột trƣớc đây (KiroMojsov,

2012; Mobini-dehkordi & Javan, 2012; Naidu, 2013; Souza & Magalhães, 2010;

Sundarram & Murthy, 2014; Ray, 2015).

Vi sinh vật ƣa nhiệt và siêu ƣa nhiệt, vi khuẩn cổ có ở những nơi có nhiệt độ

rất cao 80 ÷ 100˚C. Nhiệt độ phát triển cao nhất của những chủng này có thể lên tới

110˚C. Vi sinh vật cổ là nhóm nằm ở đỉnh rễ của cây di truyền và là đối tƣợng

nghiên cứu ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới về cấu trúc và chức năng của

protein siêu bền nhiệt. Các enzyme α-amylase bền nhiệt hiện nay còn thu đƣợc từ các loài: Geobacillus thermoleovorans có nhiệt độ hoạt động tối ƣu ở 70oC, pH 7

(Souza & Magalhães, 2010; Yavuz et al., 2004), Pyrococcus woesei (Pandey et al.,

2000), Pyrococcus furiosus (Wang et al., 2016b), và Thermococcus profundus

(Chung et al., 1995; Pandey et al., 2000; Nguyen, 2003), ngoài ra enzyme này còn

đƣợc phát hiện có mặt trong một số vi khuẩn siêu ƣa nhiệt đƣợc tìm thấy nhƣ

Thermococcale (Landry et al., 2003) và Sulfolobus (Worthington et al., 2003). Nhiệt độ hoạt động tối ƣu của các enzyme này là ở 100 oC và 80oC. Gen mã hóa cho các

α-amylase ngoại bào từ P. furiosus gần đây dã đƣợc tách dòng, tái tổ hợp và biểu

hiện trong B. subtilis và E. coli. Các enzyme ngoại bào α-amylase bền nhiệt cao ở 1300C của Pyrococcus rất phù hợp cho việc ứng dụng trong công nghiệp

(Padayachee, 2006). α - Amylase bền nhiệt của vi sinh vật cổ đã đuợc tìm thấy ở

các chủng Pyrococcus sp. KOD1; P. woesei DSM 3773; P. furiosus; Thermococcus

sp. RT3; T. profundus; T. litoralis; Dictyolglomus thermophilum; Fervidobacterium

sp.; Natronococcus amylolyticus; Thermotoga maritima …(Pandey et al., 2000).

Hầu hết các α-amylase của các loài này có t˚opt 90 ÷ 100˚C.Nhiệt độ hoạt động tối

đa có thể cao hơn 120˚C, có loại ở 130˚C vẫn còn 20% hoạt tính nhƣ α-amylase của

P. woesei ở 120˚C sau 8h mới bị bất hoạt hoàn toàn.

Các loài thuộc chi Clostridium nhƣ: C. acetobutylicum, C. butricum, C.

thermohydrosulfuricum, C. thermosulfurogenes (Pandey et al., 2000) và

Thermoanaerobacter (Hobel, 2004) cũng có khả năng sinh tổng hợp α-amylase.

Phần lớn α-amylase của nhóm này có t˚opt 75 ÷ 90˚C và pHopt 5,5 ÷ 6,5. Tuy

nhiên, α - amylase của C. acetobutylicum đƣợc biết đến có khối lƣợng phân tử khoảng 84.000 Da và hoạt động ở pH 5,6 với nhiệt độ tối ƣu cho enzyme là 45oC,

của C. perfingenes có khối lƣợng phân tử khoảng 76.000Da, hoạt động ở pH 6,5 và nhiệt độ rất thấp chỉ khoảng 30oC (Pandey et al., 2000).

α-Amylase của xạ khuẩn mới chỉ đuợc thu nhận ở một số chủng thuộc các

giống Streptomyces nhƣ S. albus (Chinna Narasaiah et al., 2014), S. griseus

IMRU3570, S. thermocyaneoviolaceus và đã có một số công bố về tách dòng gen

mã hóa cho α-amylase ngoại bào của các loài này (Sevillano et al., 2016; Cadenas

RF et al., 1992). Ngoài ra, hoạt tính α-amylase còn đƣợc tìm thấy trong

Thermoactinomyces (Yokota et al., 2001; Haki, 2003). Thermoactinomyces vulgaris

đƣợc biết đến có khả năng sinh α - amylase có kích thƣớc khoảng 53 kDa, pHopt 4.8 – 6.0 và topt = 62.5oC (Pandey et al., 2000).

Nấm Aspergillus spp. (A. niger, A. oryzae, A. awamori, A. fumigatus

(Sundarram & Murthy, 2014)), Thermomyces lanuginosus (Padayachee, 2006;

Pandey et al., 2000), Penicillium expansum, P. brunneum, P. fellutanum, P.

chrysogenum và cả một số loài thuộc chi Mucor (Domsch et al., 1995; Petruccioli &

Federici, 1992) đã đƣợc sử dụng phổ biến nhất để sản xuất α-amylase. Nấm mốc

đƣợc biết đến chủ yếu sinh α - amylase hoạt động ở nhiệt độ trung bình khoảng từ 30 – 55oC và pH từ axit đến trung tính nhƣ: A. flavus (kích thƣớc 52 - 75 kDa, pHopt 6.0 – 7.0 và topt = 30 - 55oC), A. fumigatus (kích thƣớc 65 kDa, pHopt 5.5 và topt = 40oC), A. oryzae (kích thƣớc 50 - 52 kDa, pHopt 4 – 5.3 và topt = 44 - 50oC) (Pandey et al., 2000). Chỉ có một số ít chủng nấm mốc sinh α-amylase bền nhiệt nhƣ

Aspergillus sp.K-27 (Abeet al., 1988); Myceliophthora therrmophila D14

(Sahukhan et al., 1993) và Talaromyces helicus (Olagoke, 2014). Các α-amylase

này có ƣu điểm là thuỷ phân tinh bột sâu hơn các α-amylase từ vi khuẩn và bền ở

vùng pH thấp khoảng 4,0÷5,0.

Đại diện của α-amylase bền nhiệt từ nấm men là α-amylase của chủng

Cryptococcus sp.S-2 có khả năng thuỷ phân tinh bột sống. Cryptococcus flavus có hoạt tính α - amylase hoạt động ở 50oC, pH 5.5 (Souza & Magalhães, 2010;

Wanderley et al., 2004). Lypomyces kononenkoae đƣợc biết có khả năng sinh α -

amylase của ngoại bào đạt 0.8g/l và enzyme thu đƣợc có kích thƣớc khoảng 76 kDa, pHopt cho hoạt động của enzyme khoảng từ 4.5 - 5.0, và topt = 70oC (Pandey et al.,

2000). Saccharomyces kluyveri YKM5 đƣợc biết đến có khả năng sinh α - amylase có nhiệt độ tối ƣu ở 30oC, pH 5.0. Ở Việt Nam, có một số các công trình nghiên cứu

về α-amylase ở nấm men và tách dòng trình tự gen mã hóa cho enzyme này của

chủng Saccharomyces fibuligena (Lê Văn Trƣờng và cs., 1995; Trƣơng Nam Hải và

Nông Văn Hải, 1996; Trƣơng Nam Hải và Plelizer, 1997).

α-Amylase còn đƣợc tìm thấy tiết ngoại bào ở L. plantarum A6, L. brevis.

Một loạt các vi khuẩn có trong dạ cỏ của bò nhƣ: Bacteroides ruminicola,

Ruminobacter amylophilus, Butyrivibrio fibrisolvens, Selenomonas ruminantium, và

Streptococcus bovis, Chromohalobacter sp., HaloBacillus sp., Haloarcula

hispanica, Halomonas meridiana, và B.dipsosauri (Sundarram & Murthy, 2014)

cũng đều có khả năng sử dụng tinh bột. Αmylase còn đƣợc tìm thấy trong Aeromonas cavie, B. acidocaldarius (hoạt động ở 75oC với kích thƣớc khoảng

160kDa, pH tối ƣu là 3), Alteromonas haloplanctis, Halobacterium (H. halobium,

H. salinarum…), Micrococus luteus (trọng lƣợng phân tử của enzyme đạt khoảng 56 kDa, pHopt 6.0, topt = 30oC), M. varians (trọng lƣợng phân tử của enzyme đạt khoảng 14 – 56 kDa, pHopt 7.0 và topt = 45oC). Pseudomonsa stutzeri, Pycnoporus

sanguineus, Rhizopus sp., schizophyllum commune, Filobasidium capsuligenum (có

khả năng tiết α - amylase khoảng 2mg/ml, trọng lƣợng của enzyme đạt khoảng 56 kDa, pHopt 5.6 và topt = 45oC)…(Pandey et al., 2000)

1.4.4. α-amylase tái tổ hợp trong vi sinh vật

1.4.4.1. Hệ biểu hiện α-amylase ở Bacillus và B. subtilis

Các loài sử dụng cho biểu hiện là B. megaterium, B. subtilis, B. licheniformis,

B. brevis tuy nhiên B. licheniformis và nhiều loài khác của chi này các vector chỉ có

thể biến nạp biểu hiện vào tế bào trần hoặc bằng xung điện. Trong khi đó, B. subtilis

có thể biến nạp vào tế bào trần, biến nạp bằng xung điện, tiếp hợp, tải nạp nên

chúng đƣợc sử dụng rộng rãi với vai trò là chủng chủ tách dòng và biểu hiện gen. B.

subtilis tiết ít nhất 7 protease ngoại bào bao gồm: alkaline protease (subtilisin,

aprE), neutral proteases (nprE và nprB), metalloprotease E (mpr), và 3 serine

proteases (epr, bpf, vpr). Các protein tự nhiên của chi Bacillus đều có khả năng

chống lại tác dụng của các protease này, tuy nhiên các protein tái tổ hợp lại cho thấy

rất nhạy cảm với sự có mặt của chúng. Hai enzyme đầu tiên là aprE, nprE chiếm

khoảng 96 – 98% hoạt tính protease của tế bào. Các chủng công nghiệp dùng để

biểu hiện protein tái tổ hợp thƣờng đƣợc xóa bỏ 6-8 loại protease ngoại bào (Terpe,

2006). Wu và cs (1991) đã loại bỏ 6 enzyme ngoại bào và chỉ giữ lại 0.32% hoạt

tính. Khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy 2mM PMSF, hoạt tính protease của

chủng nghiên cứu sẽ bị mất. Gen mã hóa α amylase kiềm B. alcalophilus JN21

(CCTCC NO.M 2011229) đƣợc tách dòng và biểu hiện trong B. subtilis W600 bằng

vector biểu hiện pMA5 hoạt tính enzyme thu đƣợc là 415U/ml, pH hoạt động 7,0- 11, t < 40oC; pHopt= 9,0; topt = 50oC. Khi lên men trong hệ thống 3l, hiệu suất thu

hồi đạt 441 U/ml cao hơn 79 lần so với chủng gốc B. alcalophilus JN21 ban đầu

(Yang et al., 2011).

1.4.4.2. Hệ biểu hiện α-amylase ở vi sinh vật khác

Do tính bền nhiệt cao và sự đa dạng của α-amylase từ các chủng vi sinh vật cổ,

các chủng thuộc giống Pyrococcus đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất, đã có khá

nhiều gen α-amylase bền nhiệt của Pyrococcus đƣợc tách dòng và xác định trình tự

(Tachibana et al., 1996; Wang et al., 2016b). Các gen α-amylase từ các vi khuẩn kị

khí cũng đƣợc quan tâm nhiều, đặc biệt là các chủng thuộc chi Clostridium. Mặc dù

xạ khuẩn ít đƣợc sử dụng để thu nhận α-amylase do thời gian lên men kéo dài,

nhƣng các gen α-amylase của chúng cũng đƣợc chú ý vì tính đa dạng của nó. Hiện

nay có hàng trăm gen α-amylase đã tách dòng và xác định trình tự trong ngân hàng

dữ liệu gen (EMBL/Gen Bank và SWISSPROT). Các chủng E. coli sử dụng để làm

chủng chủ hiện gen là C650, HB101, JM109…Chủng tái tổ hợp mang gen α-

amylase ở E. coli thƣờng sử dụng các vectơ biểu hiện nhƣ pET-8C, pRSET-A (B,C)

với T7 promoter và T7 Terminator từ Bacteriophage. Trong nhiều trƣờng hợp các

promoter của gen lacZ đƣợc cải biến để tăng cƣờng biểu hiện gen ở chủng E. coli

tái tổ hợp. Lee và cộng sự đã tạo ra chủng E. coli tái tổ hợp mang gen α-amylase

của chủng Thermococcus profundus có khả năng tổng hợp α-amylase cao hơn 155

lần so với chủng gốc. Gen α–amylase ƣa lạnh của Pseudoalteromonas haloplanktis

TAB23 phân lập từ bắc cực đã đƣợc tách dòng và biểu hiện trong E. coli. Đây là

một gen mới đƣợc phát hiện với cấu trúc bao gồm vùng SP chứa 24 axit amin, vùng

protein trƣởng thành chứa 453 amino acids, kích thƣớc 49 kDa, và một vùng đầu C

là đoạn propeptide dài chứa 192 axit amin có kích thƣớc khoảng 21 kDa (Tutino et

al., 2002). Tuy nhiên, nhƣợc điểm của các chủng E. coli đó là số bản sao của

plasmid lớn, gen biểu hiện mạnh, protein lại nằm ở màng tế bào, dễ gây độc đối với

chủng chủ, đặc biệt là trong các trƣờng hợp sử dụng các promoter mạnh và α -

amylase sinh ra chủ yếu ở dạng nội bào (90 ÷ 95%) nên phải phá tế bào khi thu

nhận α-amylase (Tachibana et al., 1996). Gen mã hóa cho α-amylase kiềm của B.

alcalophilus cũng đƣợc biểu hiện trong E. coli với hiệu suất thu hồi là 52U/ml

(Hagihara et al., 2001; Muraki et al., 2007). Bên cạnh đó, hệ biểu hiện gen của

Pichia đƣợc sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây và đã thu đƣợc thành công

trong biểu hiện gen α amylase từ Pyrococcus furiosus, Alicyclobacillus

acidocaldarius (Zeng et al., 2011), Sulfolobus solfataticus P2 (Zeng et al., 2011).

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. CHỦNG VI SINH VẬT VÀ PLASMID

2.1.1. Các chủng dại

Các chủng nghiên cứu thuộc chi Bacillus đƣợc phân lập từ các mẫu đất khác

nhau bằng phƣơng pháp pha loãng liên tục và đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB có

bổ sung tinh bột 1%.

Bảng 2.1. Các mẫu đất và ký hiệu sử dụng khi nghiên cứu

Nơi thu thập mẫu đất

Địa chỉ

Ký hiệu

Đất vƣờn

Xóm 10 - Cổ Nhuế - Từ Liêm – Hà Nội

CN1

Đất vƣờn

Xóm 10 - Cổ Nhuế - Từ Liêm – Hà Nội

CN2

Đất vƣờn

Tân hội- Đan phƣợng – Hà Nội

Đất vƣờn

Tây Tựu- Từ Liêm – Hà Nội

Đất vƣờn

Gia Lâm – Hà Nội

Đất vƣờn

Phú Đô – Mễ trì – Từ Liêm – Hà Nội

Đất ruộng rau muống

Hồng Hà - Đan phƣợng – Hà Nội

RRM

Đất khu xả trấu xay xát

Hồng Hà - Đan phƣợng – Hà Nội

Đất nơi thải tinh bột làm bún Hồng Hà - Đan phƣợng – Hà Nội

2.1.2. Chủng chủ dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.2. Các chủng chủ trong nghiên cứu

Chủng chủ

Genotype

E. coli JM109

e14-(McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rK- mK+) supE44

E. coli DH5α

recA1

thi-1

relA1 gyrA96 deoR nupG

relA1 D(lac-proAB) [F’ traD36 proAB lacIqZDM15] F- endA1 glnV44

+), λ–

Φ80dlacZΓM15 Γ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK

- mK

E. coli TOP10F

F- mcrA Γ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΓM15 ΓlacX74 nupG recA1 araD139 Γ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ-

B. subtilis 168M

trpC2

Chủng B. licheniformis 3BT2 phân lập tại vùng khai thác dầu biển Vũng Tàu

có khả năng sinh α-amylase bền nhiệt hiện đang đƣợc lƣu trữ trong phòng Công

nghệ vật liệu sinh học. Enzym α-amylase của chủng này hoạt động tốt ở pH 6.5 và nhiệt độ 70 – 80oC.

2.1.3. Plasmid

Trong nghiên cứu này có sử dụng các plasmid đƣợc cung cấp bởi các hãng

uy tín và đƣợc lƣu giữ tại phòng Công nghệ vật liệu sinh học. Bên cạnh đó, còn có

một số các plasmid đƣợc tạo ra bằng công nghệ tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu

này.

Hình 2.1. Các vector sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.3. Các plasmid đặt theo hãng sử dụng trong nghiên cứu

Plasmids gốc Đặc điểm

Hãng cung cấp

pTZ57R/T

2886bp, Rep pMB1 ampR

Thermo

pHV33

ĐH Greifwald, CHLB Đức

6900bp, Vector pHV33 bao gồm ORI E. coli pMB1 (Rep pMB1-ColE1 và pBR322), các vị trí cắt của HindIII-EcoRI-PstI-SalI, cùng với gen chỉ thị kháng kháng sinh ampR, cmlR, tetR

pHT43

8057bp, Pgrac ColE1 SPamyQ, ampR,cmlR

MoBiTec

2.2. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VÀ CÁC CHẤT BỔ SUNG

2.2.1. Môi trƣờng nuôi cấy

2.2.1.1. Môi trường cho nuôi cấy E.coli, B. subtilis 168M và phân lập

Môi trƣờng cơ bản cho nuôi cấy các chủng vi sinh vật là môi trƣờng Luria Bertani

(LB g/l): Pepton: 10; Cao men: 5; NaCl: 5; pH=7-7.2, môi trƣờng LB đặc: LB lỏng

và agar 15g/l (Sambrook & Russell, 2001). Các chủng thuộc chi Bacillus đƣợc phân

lập bằng môi trƣờng LB có bổ sung tinh bột 1%

2.2.1.2. Môi trường cho tạo tế bào trần B. subtilis

Tế bào trần của B. subtilis 168M đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp nuôi cấy trên môi

trƣờng Paris (Brockmeier, 2006) với thành phần: K2HPO4 (60mM); KH2PO4

(40mM), Trisodium acetate (3mM); Kali glutamate (20mM); Fe(III)-NH4-citrate

(2.2mg/l); Casamino acid (0.1%); Glucose (1%); Tryptophan (20mg); MgSO4

(3mM).

2.2.2. Chất bổ sung

Các môi trƣờng dinh dƣỡng đƣợc pha bằng nƣớc cất và sau khi pha đƣợc khử trùng 20 phút ở 121oC, 1atm. Đối với các môi trƣờng để chọn lọc khuẩn lạc,

kháng sinh đƣợc bổ sung vào sau khi môi trƣờng đƣợc làm nguội còn khoảng 40 – 50oC. Để chọn lọc khuẩn lạc xanh/trắng, môi trƣờng thạch đặc chọn lọc ngoài

kháng sinh còn đƣợc bổ sung thêm 40µg/ml X-Gal và 40 µg/ml IPTG. Kháng sinh

các chất bổ sung cần thiết trong nghiên cứu này đƣợc pha theo khuyến cáo của các

hãng cung cấp đƣa ra và đƣợc trình bày trong bảng 2.4

Bảng 2.4. Các chất bổ sung sử dụng cho môi trƣờng chọn lọc

Cơ chất Dung dịch pha Nồng độ stock Nồng độ cuối

dung dịch cùng

50mg/1ml 60 µg/ml Ampicillin

100mg/1ml 20 µg/ml Chloramphenicol

IPTG

H2O deion Ethanol 70%(V/V) H2O deion Dimethylformamide 1M 20mg/ml 40 µg/ml Xgal

2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.3.1. Thiết bị

Một số thiết bị chính đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: máy PCR

(Đức), máy ly tâm Eppendorf, máy điện DNA (Bio-Rad, Mỹ), máy Speed-Vac, máy

điện di protein (Bio-Rad), tủ cấy vô trùng, máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ), máy

ly tâm lạnh cỡ lớn (Sorvall RC5B, Mỹ), máy đo pH (Metler, Thụy Sỹ), máy khử

trùng, tủ nuôi cấy....

2.3.2. Hóa chất và Kit

Hóa chất chính: SDS, Tris-HCl, EDTA, tricine, cao nấm men, peptone

(Mecrk, Đức); isoamylalcohol, chloroform (Roth, Đức); phenol, EtBr (Ethidium

bromide), glycerol, agarose (Gribco, Mỹ); ethanol, agar (Fluka, Đức); methanol,

ethanol, K2HPO4, KH2PO4, (Merk, Đức); cao nấm men, peptone, d-NTPs (Promega,

Mỹ); MgSO4 (BioLabs, Anh); NaOH, NaCl, potassium acetate, acetic acid, glucose,

hóa chất trong bộ kit tinh sạch ADN (Qiagen, Đức); yeast nitrogen base (YNB,

Difco), IPTG, triton X-100, ammonium sulfate, polyacrylamide, Bis-acryamide

(Sigma), Tris – base, Tris-HCl (Merch), glucose (Việt Nam), amoni citrat(Trung

Quốc), agar(Việt Nam), MgSO4.7H2O (Trung Quốc), MnSO4.H2O (Trung Quốc),

K2HPO4.3H2O (Trung Quốc), CH3COONa (Trung Quốc), NaCl (Trung Quốc).

Các enzyme: Dream Taq-ADN polymerase (Fermentas), Pfu – polymerase

(Thermo), Hot taq-ADN polymerase (canada), Proteinase K, RNAase (Fermentas),

lysozyme, T4 ligase, DpnI, XhoI, EcoRI, XbaI, KpnI (New England BioLabs, Mỹ)

Kit API 50 CHB (BioMérieux, Pháp), GeneJet plasmid Miniprep kit,

GeneJet gel extraction kit (Thermo), Marker 1 kb DNA(NEB), marker protein

(Thermo), Ethidium bromide (Sigma), Safeview (Canada)...

2.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1. Phân lập chủng

Các mẫu đất đƣợc thu thập từ các nguồn khác nhau sau khi đƣợc lấy về sẽ

tiến hành phân lập sàng lọc nhanh các chủng thuộc chi Bacillus: Cân 5 g đất/mẫu,

bổ sung 50ml nƣớc muối sinh lý cho vào bình tam giác lắc ở 37ºC trong 2 giờvà sau

đó xử lý nhiệt ở 85ºC trong 15 phút(Souza et al., 2001). Pha loãng liên tục giới hạn

các mẫu và hút 200µl/ độ pha loãng/ 1đĩa petri có chứa môi trƣờng LB tinh bột,

chang đều trên mặt đĩa đến khi dung dịch pha loãng khô trên mặt thạch. Gói đĩa cho

vào tủ 37ºC nuôi trong 36h và kiểm tra kết quả.

2.4.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính α – amylase

2.4.2.1. Phương pháp định tính

Sử dụng môi trƣờng gồm 1% tinh bột cùng với agar (15g/ml) để thử hoạt

tính của chủng giống. Dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm 12000 vòng/ phút trong 30 phút.

Sau đó dùng pipet 200 μl hút 25 μl trên mỗi giếng đã đƣợc đục sẵn trên đĩa Peptri có chứa môi trƣờng thử hoạt tính. Ủ đĩa ở 45oC đối với chủng phân lập và 70 oC đối

với các enzyme tái tổ hợp trong 8h rồi tiến hành đổ dung dịch lugol để quan sát

vòng phân giải.

2.4.2.2. Phương pháp định lượng enzyme bằng DNSA (Miller, 1959)

Nguyên tắc phản ứng: Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc có mặt của nhóm

carbonyl tự do (C=O). Màu phản ứng phụ thuộc vào chính xác lƣợng đƣờng khử

trong dung dịch. Một đơn vị α-amylase là lƣợng enzyme cần thiết để thủy phân tinh

bột thành 1 μM đƣờng tính theo glucose ở nhiệt độ và pH tối ƣu trong 1 phút. Phản

ứng kéo dài 10 phút sau đó bổ sung 3ml thuốc thử DNSA (3,5-Dinitrosalicylic

acid ). Đun sôi trong nƣớc 10 phút sau đó để dừng phản ứng bằng cách làm lạnh

nhanh trên đá và bổ sung 6ml nƣớc cất trƣớc khi tiến hành đo độ hấp thụ ở bƣớc

sóng 540nm kết quả tính toán dựa trên đƣờng chuẩn glucose đã xây dựng (Phụ lục

6).

2.4.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein hòa tan theo Lowry

Hàm lƣợng protein trong dịch nuôi cấy đƣợc xác định dựa trên phƣơng pháp

Lowry (Lowry et al., 1951). Thành phần các dung dịch và đƣờng chuẩn protein sử

dụng trong nghiên cứu này đƣợc nêu trong Phụ lục 5.

Cách thực hiện thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm

lƣợng thích hợp cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 0,7ml dung dịch D, lắc đều trong

thời gian ngắn, làm nhƣ vậy 3-4 lần rồi để yên 20 phút trong buồng tối. Sau đó thêm

vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,1ml dung dịch E, lắc đều ngay lập tức và để yên

trong 30 phút. Lúc này mầu của hỗn hợp chuyển sang màu xanh da trời và đạt đên

cƣờng độ màu cực đại. Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang phổ ở

bƣớc sóng 750nm. Xác định đƣợc trị số mật độ quang học của dung dịch nghiên

cứu. Hàm lƣợng protein tiết đƣợc xác định dựa theo đƣờng chuẩn protein (Phụ lục

2.4.4. Phƣơng pháp thu amylase trong tế bào

Các tế bào chủng nuôi cấy sau 48h đƣợc ly tâm 12000 vòng/phút trong thời

gian 5 phút, loại bỏ dịch và thu sinh khối. Cặn sinh khối sẽ đƣợc hòa trong 50 mM

đệm muối – photphat (4.3 mM Na2HPO4.7H2O, 137 mM NaCl, 1.4 mM KH2PO4 và 2.7mM KCl (pH7.2)) và 0.5% TritonX-100, ly tâm 8000v/p trong 10 phút ở 4oC

nhằm loại bỏ các mảnh tế bào sau khi bị phá vỡ (Ying et al., 2012). Xác định hoạt

tính amylase bằng phƣơng pháp DNSA và hàm lƣợng protein tiết của dịch phá tế

bào theo phƣơng pháp Lowry.

2.4.5. Phƣơng pháp phân loại chủng chọn lọc

2.4.5.1. Phân loại bằng kit API CHB 50

Các chủng chọn lọc đƣợc phân loại bằng kit API 50 CHB của bioMérieux và

sử dụng theo hƣớng dẫn của hãng.

2.4.5.2. Phân loại chủng nghiên cứu theo trình tự gen 16S rRNA

Các chủng nghiên cứu tách DNA tổng số và đƣợc chạy PCR gen 16S rRNA

bằng cặp mồi DAPri16SF/R đã thiết kế. Thành phần PCR bao gồm: Dream Taq

buffer (5 µl), dNTP 5mM (2 µl), PriF16S/ PriR16S 10pmol (1 µl), DNA khuôn, Taq polymerase (0.25 µl) trong 50 µl phản ứng và chu kỳ chạy PCR: 95oC, 5 phút; (95oC, 1 phút; 55oC, 1phút 20’’; 72 oC, 2 phút) × 30 lần; 72 oC, 7 phút; 4 oC-∞.

2.4.6. Phƣơng pháp tách chiết DNA

2.4.6.1. Tách chiết DNA tổng số

Chuẩn bị thí nghiệm: thành phần của các dung dịch dƣợc sử dụng trong tách

DNA tổng số đƣợc nêu trong Phụ lục 7. Để có thể thu sinh khối tế bào cho thí

nghiệm này, chủng nghiên cứu đƣợc nuôi qua đêm trên môi trƣờng LB sau đó ly

tâm thu sinh khối và tiến hành tách chiết DNA tổng số. Ly tâm thu sinh khối tế bào

trong 5 phút ở tốc độ 5000 vòng/phút. Tế bào đƣợc hòa tan đều trong hỗn hợp dung dịch A và đƣợc ủ ở 37oC trong 1h. Sau khi ủ, bổ sung 100 µl NaCl 5M rồi trộn đều.

Sau bƣớc này, 80 µl dung dịch CTAB/NaCl đƣợc bổ sung, trộn đều và mẫu đƣợc ủ trong 10 phút ở 65oC. Bổ sung 2V (v/v) dung dịch Chloroform: isoamyl alcohol

(24:1), đảo đều và ly tâm thu pha nổi phía trên sang Eppendoff mới, tiếp tục lặp lại

bƣớc này lần 2. DNA đƣợc thu bằng cách tủa với isopropanol (0,6 thể tích (v/v)) trong khoảng 1h ở -20oC và đƣợc rửa lại bằng 500 µl ethanol (70%). DNA đƣợc rửa, làm khô và hòa tan trong 100 µl TE. Dịch DNA đƣợc bảo quản ở -20oC để

dùng cho các nghiên cứu tiếp theo (Ausubel et al., 2003)

2.4.6.2. Tách chiết DNA plasmid E. coli

- Tách plasmid từ E. coli theo phƣơng pháp Alkaline của Sambrook với các

bƣớc tiến hành: Dịch tế bào nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc (18-24h) đƣợc ly tâm

6000v/p trong 10 phút thu tủa tế bào và hòa tan trong 100μl sol I sau đó bổ sung

thêm 200μl sol II, đảo nhẹ 5-10 lần rồi ủ trong đá 15 phút. Tiếp tục bổ sung 150μl

sol III, đảo nhẹ 5-10 lần rồi ủ trong đá 15 phút sau đó ly tâm 13000v/p trong 15

phút và thu dịch nổi sang ống Eppendoff mới. Bổ sung 500μl dung dịch Chloroform

: Isoamylalcohol đƣợc pha theo tỷ lệ 24 : 1 vào dich nổi, votex nhẹ nhàng sau đó ly

tâm 13000v/p trong 15 phút (2 lần) và hút dịch nổi sang Eppendoff mới, bổ sung 2V

cồn tuyệt đối hoặc 1V isopropanol, đem ủ ở tủ -20°C từ 30-60 phút, ly tâm 13.000

v/p trong 20 phút thu cặn DNA. DNA kết tủa đƣợc rửa hai lần bằng cồn 70° (200μl)

và ly tâm 13000 v/p trong 15 phút. DNA thu đƣợc đƣợc làm khô và hòa tan kết tủa

trong 30-50μl nƣớc hoặc TE và bảo quản ở -20°C (Sambrook & Russell, 2001).

- Tách plasmid theo GeneJET Plasmid Miniprep Kit: DNA plasmid E. coli

đƣợc tách bằng GeneJET Plasmid Miniprep Kit của Thermo và các phƣơng pháp

đƣa ra bởi hãng.

2.4.6.3. Tách chiết DNA plasmid Bacillus

Chủng nghiên cứu đƣợc nuôi cấy qua đêm (16 – 20h) trên môi trƣờng chọn lọc

sau đó tiến hành ly tâm 6000v/p, 10 phút, loại dịch thu sinh khối tế bào. Bổ sung 200µl SET (Phụ lục 7) có bổ sung 5 mg/ml vào sinh khối và votex đều và ủ 37oC

trong 10 phút. Bổ sung 350 µl Sol II đảo nhẹ, ủ 5 phút sau đó tiếp tục bổ sung 350

µl Na-acetate 3M trong đá, votex trong 30 giây và ly tâm 10 phút, 12.000v/phút.

Hút 750 µl dịch nổi sang ống Eppendoff mới, bổ sung 650 µl P : C : I (25:24:1),

votex trong 1 phút và ly tâm 15 phút ở 12.000v/p và hút dịch nổi (Pha I) sang ống

Eppendoff mới tiếp tục bổ sung 620 µl C : I (24:1), votex trong 1 phút sau đó ly tâm

15 phút ở 12.000v/p và hút tiếp 550 µl dịch nổi sang Eppendoff mới. Để kết tủa

plasmid, bổ sung 550 µl Isopropanol lạnh, đảo nhẹ một vài lần, ly tâm 30 phút loại dịch. Bổ sung 500 µl cồn 70o để rửa kết tủa, ly tâm 15 phút thu DNA. DNA đƣợc

làm khô và hòa trong 50 µl TE và bảo quản ở tủ - 20oC để dùng cho nghiên cứu tiếp

theo (Voskuil & Chambliss, 1993).

2.4.7. Biến nạp DNA plasmid vào chủng chủ

2.4.7.1. E. coli

DNA plasmid đƣợc biến nạp vào chủng chủ E. coli theo phƣơng pháp biến

nạp pha tiềm phát (Lag Phase) với các thành phần dung dịch, môi trƣờng đƣợc sử

dụng theo protocol của Thermo. Chuẩn bị tế bào khả biến: Tế bào chủng chủ đƣợc

chuẩn bị mới trong 24h bằng cách cấy vạch lên đĩa Petri đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng C đã đƣợc làm ấm 37oC, hòa tan tế bào và ủ 37oC, 2h, lắc 100 v/phút. Sau đó

ly tâm 1 phút ở 10.000/p, loại dịch và hòa tan tế bào trong 300 µl T – sol, ủ đá trong

5 phút. Tiếp tục tiến hành ly tâm 1 phút ở 10.000/p, loại dịch và hòa cặn tế bào

trong 120 µl T-sol, ủ trên đá 5 phút lần 2 sau đó bổ sung 2.5 µl vector đã ligate, để

lạnh trên đá 2 phút rồi bổ sung 50 µl tế bào khả biến, trộn đều, ủ trên đá 5 phút.

Dịch tế bào đƣợc gạt lên đĩa môi trƣờng LB có kháng sinh, Xgal, IPTG sau đó ủ qua đêm 37oC và quan sát kết quả

2.4.7.2. Bacillus

Nuôi B. subtilis 168M trên môi trƣờng Paris đến khi OD580 - 1 hút 0,5ml dịch nuôi cấy vào các ống và bổ sung 0,1 - 1µg DNA plasmid và ủ từ 1-3h ở 37oC sau đó chang trên đĩa LB + Chloramphenicol và nuôi ở 37oC qua đêm. Quan sát và thu kết

quả (Brockmeier, 2006).

2.4.8. Kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR trong nghiên cứu đƣợc thực hiện dƣới điều kiện PCR tiêu

chuẩn với các thành phần phản ứng gồm DNA hoặc plasmid DNA (≈1ng) làm

khuôn, mồi (20 pmol), dNTP (0,2mM mỗi loại), Taq-polymerase (2,5U) hoặc Pfu –

polymerase (2,5U), đệm chạy PCR có chứa MgCl2 hoặc MgSO4 tùy theo khuyến

nghị của nhà sản xuất đối với mỗi loại polymerase.

Bảng 2.5. Các primer sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi

Ký hiệu

Trình tự 5’ → 3’

Mục đích khuếch đại đoạn trình tự

DAPri16SF

AGAGTTTGATCCTGGCTC AG

Gen 16S rRNA

DAPri16SR

TACGGTTACCTTGTTACC GACTT

DABlisigaF

ATGAAACAACAMAAACG GCTT

Khởi đầu gen α – amylase của B. licheniformis, (điểm suy biến M = A + C)

DABlisigaR

GTGGTTGATGACYACATC CCC

Vùng bảo thủ I của gen α – của amylase B. licheniformis, (Điểm suy biến Y = C + T)

DABsusigaF

ATGTTTAMAAAACGATTC AAAAC

Khởi đầu gen α – amylase của B. subtilis (điểm suy biến M = A + C)

DABsusigaR

GTATGATTGATRACCGCT C

Vùng bảo thủ I của gen α – amylase của B. subtilis (điểm suy biến R = A + G)

DABcesigaF

ATGTTTAAAAAAGTAACA ATAG

Khởi đầu gen α – amylase của B.cereus

DABcesigaR

TTATGATTCATAACTACA TC

Vùng bảo thủ I của gen α – amylase của B.cereus

PribaliRsig- SacII

AGCGTCCCATTAAGACTT GCCCGCGGCGCCGCTGCT GACAGAATGA

P10

PribasuRsig- SacII

AGCGTCCCATTAAGACTT GCCCGCGGAGCGTTTGCA GCCGCCGGG

P11

Mồi mega giữa đoạn khởi đầu gen α – amylase trƣởng thành (in nghiêng, gạch dƣới) và đoạn cuối peptide tín hiệu gen này của B. licheniformis/ B. subtilis/ B. cereus có mang trình tự phân cắt của SacII(nét đứt)

PribaceRsig- SacII

AGCGTCCCATTAAGACTT GCCCGCGGTGCATATGCT TTACTCCC

P12

Pri2BaliMatur 3bt2

GCAAGTCTTAATGGGACG CTGA

Trình tự khởi đầu đoạn α – amylase trƣởng thành của B. licheniformis 3BT2

P3BL-XbaI

P13

TTAATCTAGACAAAGAAA TTTTATAAGAAG

Trình tự cuối của gen α – amylase có mang điểm cắt của XbaI (in nghiêng, gạch dƣới)

P14

P3BL – EcoRI:

GAGGAAGAATTCCAAAGA AATTTTATAAGA

Trình tự cuối của gen α – amylase có mang điểm cắt của EcoRI (in nghiêng, gạch dƣới)

P15

FprimerPgrac – EcoRI-KpnI

GGCCGAATTCTTAGCTTGG TACCAGCTATTG

Đoạn khởi đầu của Pgrac Promoter của pHT43 mang trình tự cắt của EcoRI (nghiêng, gạch dƣới) và KpnI (nghiêng, gạch dƣới nét đứt)

P16

RPgrac = 3’ XhoI

TCATCTCGAGTTCCTCCTT TAATTGGGA

Mồi ngƣợc khuếch đại đoan Pgrac của pHT43 có mang trình tự nhận biết của XhoI

P17

F3BT2mature – SacII:

GCTCCGCGGGCAAGTCTT AATGGGA

Trình tự khởi đầu đoạn α – amylase trƣởng thành của B. licheniformis 3BT2 có mang trình tự nhận biết của SacII

P18

DABsusigaF XhoI

GAGGAACTCGAGATGTTT AAAAAACGATTCA

Trình tự khởi đầu đoạn SP của α – amylase ở B. subtilis D5-2 có mang trình tự nhận biết của XhoI

P19

DABcesigaF – XhoI

GAGGAACTCGAGATGTTT AAAAAAGTAACA

Trình tự khởi đầu đoạn SP của α – amylase ở B. cereus CN1-5 có mang trình tự nhận biết của XhoI

P20

DABlisigaF – XhoI

GAGGAACTCGAGATGAAA CAACAAAAACG

Trình tự khởi đầu đoạn SP của α – amylase ở B. có licheniformis DA23 mang trình tự nhận biết của XhoI

FgraclinkerSig

P21

CCCAATTAAAGGAGGAA CTCGAGATGTTTAAA

Trình tự cuối của Pgrac có mang đoạn gen khởi đầu của SP ở α - amylase chủng B. subtlis D5-2 có mang trình tự nhận biết của XhoI

P22

FSK3Q

GAGGAACTCGAGATGTTT CAAAAACG

Mồi khuếch đại đoạn đầu mang đột biến tại một điểm ở vùng N (thay axit amin K tại vị trí 3 bằng Q) của peptide tín hiệu α - amylase chủng B. subtilis D5-2 có mang trình tự nhận biết của XhoI

P23

FSK3QK4I

GAGGAACTCGAGATGTTT CAAATCCGAT

Mồi khuếch đại đoạn đầu mang đột biến tại một điểm ở vùng N (thay axit amin K tại vị trí 3 bằng Q và K 4 bằng I) của peptide tín hiệu - amylase chủng B. α subtilis D5-2 có mang trình tự nhận biết của XhoI

Hcore

SPHcore

GAGGAACTCGAGATGTTT AAAAAACGATTCAAAAC CTCTTTACTGCTGTTATTG CTCGGATTATTATTGCTGT TACTTTTGCTTTTGTCAGG CCCGGCGGCTGCAAACGC TCCGCGGGCAAGTCTTAA TGGGA

Trình tự peptide tín hiệu của chủng D5-2 đƣơc thiết kế đột biến tại vùng tâm kỵ nƣớc H với các axit amin bị thay thế P12 = L; F14=L; A15=L; F17=L; F21=L; H22=L; V24=L có mang trình tự nhận biết của XhoI và SacII

P25

RSA31V-SacII

AGACTTGCCCGCGGAGCG TTTACAGC

Mồi khuếch đại mang đột biến tại một điểm ở vùng C (thay axit amin A tại vị trí 31 bằng V) của peptide tín hiệu α - amylase chủng B. subtilis D5-2

P26

RSA31G-SacII

AGACTTGCCCGCGGAGCG TTTCCAGC

Mồi khuếch đại mang đột biến tại một điểm ở vùng C (thay axit amin A tại vị trí 31 bằng G) của peptide tín hiệu α - amylase chủng B. subtilis D5-2

P27

RSA31C-SacII

AGACTTGCCCGCGGAGCG TTACAAGCCG

Mồi khuếch đại mang đột biến tại một điểm ở vùng C (thay axit amin A tại vị trí 31 bằng C) của peptide tín hiệu α - amylase chủng B. subtilis D5-2

Trong đó: Các nucleotide in đậm riêng lẻ là các vị trí suy biến, các nucleotide in nghiêng gạch dƣới đơn ( ) và ( )là các điểm cắt enzyme giới hạn; các nucleotide in đậm, nghiêng và gạch dƣới kép là các vị trí đột biến trên SP – flank ( )

2.4.9. Cắt enzyme giới hạn và ligation DNA

Phản ứng cắt enzyme giới hạn và các phản ứng ligation DNA đƣợc thực hiện

với các enzyme đƣợc cung cấp bởi New England Biolab hoặc các enzyme của

Thermo theo hƣớng dẫn của hãng sản xuất. Các phản ứng với enzyme giới hạn có

thể thực hiện lên đến 16h và trong một số trƣờng hợp enzyme giới hạn đƣợc bất hoạt trong 20 phút ở 65oC (NEB).

2.4.10. Phản ứng loại đầu 5’ - Phosphat (Dephosphorylation)

Đây là phản ứng loại nhóm phosphat khỏi đầu 5’ của vector để tránh cho

vector tự đóng vòng sau khi cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn. Enzyme CIP (Calf

Intestinal Alkaline Phosphatase) đƣợc cung cấp bởi NEB. Phản ứng loại nhóm

phosphat đƣợc thực hiện: Cusmart buffer: 5 µl; DNA: 1 pmol; CIP: 0.1 µl; H2O bổ sung sao cho tổng thể tích bằng 50 µl. Phản ứng đƣợc ủ ở 37oC trong 60 phút sau đó

điện di gel agarose cắt băng quan tâm và sản phẩm sẽ đƣợc tinh sạch và giữ bảo

quản dùng cho các thí nghiệm khác nhau.

2.4.11. Phân lập đoạn gen mã hóa peptide tín hiệu

Các trình tự peptide tín hiệu nghiên cứu đƣợc tách thu từ chủng dại bằng

phƣơng pháp PCR với các cặp mồi suy biên sử dụng cho trình tự tín hiệu đƣợc thiết

kế từ điểm khởi đầu của gen α – amylase quan tâm và vùng bảo thủ I của gen này

dựa trên các trình tự đã công bố trên NCBI đã đƣợc nêu ở Bảng 2.8. Các đoạn gen

khuếch đại đƣợc sẽ tinh sạch sau đó gắn vào vector tách dòng pTZ57R và biến nạp

vào E. coli DH5α. Plasmid tái tổ hợp đƣợc tách và gửi đọc trình tự bằng cặp mồi

M13/pUC. Nồng độ các chất tham gia phản ứng và chu trình PCR sử dụng cho phân

lập các trình tự tín hiệu đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp PCR tiêu chuẩn.

2.4.12. Phƣơng pháp megaprimer

Megaprimer là phƣơng pháp dựa trên hai vòng PCR khuếch đại sử dụng hai

mồi “chầu” và hai mồi nội bộ nhằm thiết kế để tạo ra các đột biến mong muốn.

Trong luận án này, Megaprimer là phƣơng pháp đƣợc sử dụng để ghép các SP quan

tâm vào một gen đích nhằm thay thế SP của gen chủ từ đó có thể đánh giá đƣợc

mức độ tiết enzyme của các SP khác nhau trên cùng một đoạn gen đích. Phƣơng

pháp này đƣợc thực hiện bằng PCR với các cặp mồi thiết kế cho megaprimer đã

đƣợc nêu ở bảng 2.5. Từ các cặp mồi thiết kế, khuêch đại thu sản phầm mồi mega

(mồi lớn) bằng PCR và tiến hành khuếch đại cả gen đích. Dung dịch phản ứng

Megaprimer (50 µl ) bao gồm: 5 µl dung dịch đệm (pfu buffer), 30pmol đoạn gen

mang trình tự kép, 10 – 100ng khuôn gốc cần thực hiện ghép nối, 2,5 mM dNTP và

0,8 µl Pfu DNA polymerase.

Chu kỳ PCR đƣợc thực hiện: (95oC – 3’, 72oC – 3’); (95oC – 1’, toC – 1’20’’,72oC – 2’) x 5; Sau 5 chù kỳ này, PCR đƣợc dừng lại và bổ sung hai mồi

trong đó một mồi là trình tự khởi đầu của mồi mega và mồi cuối của gen đích; (95oC – 1’, toC – 1’20’’,72oC – 2’) x 25 chu kỳ; 72o – 10’, 4oC-∞ (ở đây toC là nhiệt

độ bắt cặp phù hợp cho từng mồi ghép)

Hình 2. 2. Sơ đồ phƣơng pháp Megaprimer tạo tổ hợp gen giữa peptide tín hiệu quan tâm và đoạn gen đích.

Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tạo tổ hợp promoter - signal – mature 3BT2 amylase gen bằng T4-lygase từ Pgrac và tổ hợp gen đích đã phân lập

2.4.13. Phƣơng pháp tinh sạch DNA từ gel agarose

Sản phẩm DNA đƣợc chạy điện di trên gel agarose sau đó cắt băng sản phẩm

cần quan tâm và tiến hành thôi gel bằng kit thôi gel GeneJET Gel extraction Kit

theo protocol đƣợc cung cấp của hãng sản xuất.

2.4.14. Phƣơng pháp điện di DNA

DNA đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Đầu tiên, 1gram

agarose đƣợc hòa tan và đun sôi trong 100ml đệm TAE 1X. Sau khi để nguội đến khoảng 40oC, agarose sẽ đƣợc đổ vào khay đổ gel có gắn lƣợc để tạo giếng. Khi gel

nguội, lƣợc đƣợc lấy ra và bản gel sẽ đƣợc đặt trong bể điện di có chứa dung dịch

đệm TAE 1X. 5 µl DNA đƣợc hòa với 1 µl đệm màu và nhỏ vào giếng. Sau đó tiếp

tục nhỏ 2 µl marker để làm thang so sánh kết quả. Điện di 30 phút với hiệu điện thế

70mV. Mẫu gel đƣợc lấy ra và nhuộm ethidium bromide và quan sát kết quả dƣới

kính soi gel

2.4.15. Nghiên cứu điều kiện thu nhận α-amylase của chủng tái tổ hợp

2.4.15.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Chủng tái tổ hợp đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung

chloramphenicol 20µg/ml qua đêm sau đó dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn mới

và bổ sung vào LB lỏng có chloramphenicol 20µg/ml và tiến hành lắc ở các nhiệt độ 30, 37, 45, và 55oC đến khi OD đạt 0,6-0,8 bổ sung IPTG 0,01mM và tiếp tục

nuôi ở các nhiệt độ này trong 36 - 48h. Thời điểm bố sung IPTG đƣợc tính là 0h.

Khả năng sinh trƣởng và sinh hoạt tính enzyme đƣợc xác định bằng phƣơng pháp

đo OD và phƣơng pháp xác định hoạt tính DNSA.

2.4.15.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Chủng tái tổ hợp đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung

chloramphenicol 20µg/ml qua đêm sau đó dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn mới

và bổ sung vào LB lỏng có chloramphenicol 20µg/ml và tiến hành lắc ở các nhiệt độ 37oC đến khi OD đạt 0,6 – 0,8 bổ sung IPTG 0,01mM và tiếp tục nuôi ở các

nhiệt độ này trong 4, 12, 18, 24, 30, 36 và 48 h. Khả năng sinh trƣởng và sinh hoạt

tính enzyme đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo OD và phƣơng pháp xácđịnhhoạt

tính DNSA.

2.4.15.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng

Chủng tái tổ hợp đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung

chloramphenicol 20µg/ml qua đêm sau đó dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn mới

và bổ sung vào LB lỏng có chloramphenicol 20µg/ml và tiến hành lắc ở các nhiệt độ 37oC đến khi OD đạt 0.6-0.8 bổ sung IPTG nồng độ khác nhau: 0,005; 0,01; 0,1;

1; 2 mM và tiếp tục nuôi ở các nhiệt độ này trong 36 h tính từ thời điểm bố sung

IPTG. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của chủng đƣợc kiểm tra thông qua

phƣơng pháp đo OD, hoạt tính apha amylase đƣợc kiểm tra theo phƣơng pháp

DNSA và khuếch tán thạch, hàm lƣợng protein tiết đƣợc xác định theo Lowrry.

2.4.15.4. Ảnh hưởng nguồn C, N đến khả năng sinh trưởng và sinh hoạt tính

enzyme

Chủng nghiên cứu đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc LB +

Chloramphenicol 20µg/ml có bổ sung riêng lẻ từng nguồn cacbon (tinh bột,

glucose, saccharose, galactose, lactose) với nồng độ 1% và 5g/l các mỗi muối N

khác nhau (NH4NO3, (NH4)2HPO4, NH4H2PO4, (NH4)3PO4, NH4Cl) đến khi OD đạt 0,6-0,8 bổ sung 0,01mM IPTG và tiếp tục lắc chủng 150v/p ở 370C trong 36h, xác

định mật độ quang OD và hoạt tính enzyme.

2.4.16. Điện di SDS – PAGE

Dịch nuôi cấy của chủng nghiên cứu đƣợc ly tâm, loại sinh khối và kết tủa

bằng Ethanol với tỷ lệ 1:3 (1 dịch nuôi cấy: 3 ethanol). Kết tủa thu bằng ly tâm

13.000v/p trong 20 phút và đƣợc hòa lại trong đệm acetate pH 6.5 với thể tích bằng 1/10 thể tích ban đầu. Mẫu thu đƣợc sẽ đƣợc bảo quản trong tủ -20oC cho các thí

nghiệm tiếp theo. Trọng lƣợng phân tử đƣợc xác định bằng việc điện di trên gel

SDS – PAGE. Sử dụng gel 12% có bổ sung cơ chất 1% với 30µl dịch protein mẫu sẽ đƣợc đun 95oC, 5 phút trong thuốc nhuộm có chứa mecarptoethanol và DTT để

làm biến tính protein và tiến hành điện di với cƣờng độ 30mA; 2,5h. Sau khi điện

di, tiến hành nhuộm protein theo phƣơng pháp nhuộm bạc có cải tiến với các bƣớc

tiến hành: lắc bản gel trong dung dịch MeOH 50% và HAc 5% trong 20 phút với

tốc độ 100v/p sau đó loại dịch và rửa lại bằng nƣớc sạch rồi tiếp tục bổ sung dung

dịch MeOH 50% lắc trong 20 phút cũng với tốc độ lắc ở trên. Gel thu đƣợc lại đƣợc

tiếp tục rứa bằng nƣớc sạch và lắc trong nƣớc khử ion (deH2O) trong 1h. Sau đó

bản gel sẽ đƣợc lắc trong 1 phút với dung dịch Na2S2O3 1% và rửa lại 2 lần bằng

nƣớc sạch sau đó bổ sung dung dịch AgNO3 0,1% lạnh và lắc tiếp trong 20 phút.

Bản gel sẽ đƣợc chuyển sang một khay khác và bổ sung dung dịch Formalin

0,4%+Na2CO3 2% và lắc nhẹ cho tới khi hiện màu các băng protein. Khi màu

nhuộm các băng quan sát rõ, rửa sạch bản gel và giới hạn màu nhuộm bằng HAc

5%. Bản gel sau khi nhuộm hoàn tất đƣợc bảo quản trong dung dịch HAc 1%

(Holtzhauer, 2006).

2.4.17. Xác định hoạt tính α – amylase trên gel polyacrylamid

Sau khi điện di gel đƣợc rửa 2 lần với 0,5%(v/v) Triton X – 100 trong 20’ để loại SDS. Sau đó gel đƣợc ủ trong đệm ở 70oC, trong 20 phút và nhuộm với dung

dịch lugol (0,3% I2, 3% KI) trong 3’. Quan sát hoạt tính enzyme trên gel (Bano et

al., 2011)

2.4.18. Xử lý số liệu

Các trình tự DNA đƣợc đọc bởi máy đọc trình tự của viện công nghệ sinh

học. Kết quả xử lý các trình tự DNA, axit amin thu đƣợc bằng các chƣơng trình

Serial cloner, MEGA 5.0, BioEdit, Chromas, DNADynamo, SigmaPlot.... Các trình

tự bắt cặp, dữ liệu DNA, trình tự a.a. đƣợc phân tích trực tuyến trên các trang web:

http://ncbi.nlm.nih.gov; http://www.ebi.ac.uk/clustalw/; http://web.expasy.org/….

Phân tích trình tự peptide tín hiệu đƣợc sử dụng trực tuyến SignalP tại địa chỉ

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/; logo hóa các trình tự peptide trên

http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi. Các sơ đồ thí nghiệm đƣợc minh họa

bằng Correl X6. Số liệu thí nghiệm đƣợc xử lý trên Excel.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS CÓ KHẢ NĂNG

TIẾT ALPHA AMYLASE MẠNH RA MÔI TRƢỜNG

3.1.1. Phân lập và tuyển chọn sơ bộ các chủng Bacillus có hoạt tính amylase

Các mẫu đất thu tại những nơi có nguồn thải tinh bột cao nhƣ: xƣởng bún, xƣởng xay xát …đƣợc xử lý nhiệt 80oC trong 15 phút sau đó đã tiến hành phân lập

trên môi trƣờng LB có bổ sung tinh bột 1%. Sau 48h nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C các

khuẩn lạc xuất hiện trên bề mặt môi trƣờng nuôi cấy với nhiều hình thái khác nhau

(Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Số lƣợng khuẩn lạc phân lập trên môi trƣờng LB tinh bột

STT Đặc điểm, hình dạng

Màu sắc

Số lƣợng Tỷ lệ (%)

1 Hình tròn, bề mặt nhẵn khô Màu trắng sữa 50 9,5

2 357 67,9 Hình tròn, viền có răng cƣa, bề mặt có nếp nhăn Màu trắng sữa, đỏ tía

3 Hình tròn, bề mặt nhầy 31 5,9 Màu trắng sữa, màu da

4 Màu trắng sữa 37 7,0 Khuẩn lạc dài, hình trứng bề mặt nhầy

5 44 8,4 Hình tròn, bề mặt sần sùi, viền hơi răng cƣa nhẹ Màu trắng sữa/trắng hơi trong

6 7 1,3 Khuẩn lạc tròn, bề mặt khô, dẹt Màu hơi vàng/màu nâu cà phê

Tổng 526 100%

Phân tích thống kê hình dạng sơ bộ dựa vào bảng trên cho thấy các khuẩn lạc

có hình tròn, bề mặt nhăn và màu trắng sữa/nâu đỏ chiếm tỷ lệ cao nhất trong tổng

số khuẩn lạc thu đƣợc: 67,9%. Các khuẩn lạc có hình tròn, bề mặt nhẵn khô, màu

trắng sữa chiếm tỷ lệ 9,5%. Khuẩn lạc hình tròn, bề mặt sần sùi, viền hơi răng cƣa

nhẹ, màu trắng sữa/trắng hơi trong chiếm tỷ lệ cao thứ 3 khoảng 8,4%. Ngoài ra, có

một số loại khuẩn lạc khác nhƣng với những tỷ lệ thấp hơn.

3.1.2. Sàng lọc bộ chủng phân lập thu các chủng thuộc chi Bacillus có hoạt tính

amylase cao

Bộ sƣu tập 526 chủng phân lập ở trên, đƣợc sàng lọc tuyển chọn sơ bộ bằng

quan sát vòng phân giải tinh bột của các khuẩn lạc nuôi cấy chấm điểm trên môi trƣờng có tinh bột ở 37oC, trong 48h. Đã tuyển chọn đƣợc 130 chủng có khả năng

thủy phân tinh bột phân lập từ các mẫu đất khác nhau. Các chủng này đƣợc tiếp tục nuôi lắc 150 vòng/phút trên môi trƣờng LB lỏng có bổ sung tinh bột ở 37o C, trong

36 h, dịch nuôi cấy đƣợc li tâm với tốc độ 12.000v/p, trong 7 phút loại tế bào để thu

dịch enzyme thô. Hoạt tính amylase đƣợc xác định bằng phƣơng pháp khuếch tán

thạch (Hình 3.1) và sử dụng DNSA với đƣờng chuẩn đã đƣợc xây dựng (phụ lục 6).

Protein tổng số tiết ra môi trƣờng nuôi cấy của 130 chủng chọn đƣợc xác định theo

phƣơng pháp Lowry (OD tại bƣớc sóng 750nm) dựa trên đƣờng chuẩn protein (phụ

lục 5). Hoạt tính α- amylase cũng nhƣ lƣợng protein tiết tổng số của 130 chủng

phân lập đƣợc trình bày ở bảng 3.2 và ở phụ lục 2. Hình thái khuẩn lạc, tế bào, khả

năng sinh bào tử, đặc điểm Gram, tổng hợp catalase của130 chủng tuyển chọn đƣợc

trình bày ở Hình 3.2 và Phụ lục 1. Kết quả cho thấy chúng đều thuộc chi Bacillus do

có tế bào hình que và bắt màu tím đặc trƣng cho vi khuẩn Gram dƣơng. Quan sát

dƣới kính hiển vi còn cho thấy tất cả các chủng này đều có khả năng sinh bào tử,

catalase dƣơng tính. Các đặc điểm này phù hợp với các đặc điểm chung điển hình

của chi Bacillus đã biết.

Kết quả xác định hoạt tính amylase và hàm lƣợng protein tiết của các chủng

nghiên cứu (Bảng 3.2 và phụ lục 2) cho thấy, 130 chủng thuộc chi Bacillus có hoạt

tính amylase đo đƣợc thấp nhất là CN1-6 cho hoạt tính đạt 1,52±0.47 U/ml đến cao

nhất đạt 14,23 ±0,52 U/ml ở chủng DA23. Khả năng tiết protein tổng số của các

chủng tuyển chọn là rất khác nhau: Thấp nhất là chủng TT2-3 với hàm lƣợng

protein tiết đạt 1016,60±4,35 µg/ml và cao nhất là chủng TT2-10 với hàm lƣợng

protein tiết đạt 2129,44±9,96 µg/ml. Chủng CN1-6 cho thấy có tỷ lệ hoạt tính

amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số thấp nhất với 1,30 U/mg. Trong khi đó,

chủng D5-2 lại cho thấy tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số

cao nhất đƣợc xác định 9,29 U/ml

Dựa trên hoạt tính amylase, khả năng tiết protein ngoại bào và đặc điểm hình

thái các chủng tuyển chọn cho mục đích phân loại để sử dụng cho các nghiên cứu

phân loại tiếp theo bao gồm: CN1-5, D1-17, D2-8, D5-2, D7-4, D8-5, DA23,

DA24, GL1-5, RRM3-2, RRM4, RRM5-4, TB1-1, TB2-1, TR4-1, TR5-2, GL2-3.

Hình 3.1.Hoạt tính amylase của một số chủng sàng lọc

Hình 3.2. Hình thái tế bào và hình ảnh một số khuẩn lạc Bacillus phân lập

Chú thích: A. Hình ảnh nhuộm Gram của các tế bào chủng D5-2, D2-8, GL2-3. B. Hình thái tế bào của các chủng D5-2, D9-1, RRM4 trên môi trƣờng LB

Bảng 3.2. Hoạt tính và hàm lƣợng α - amylase của một số chủng chọn lọc

STT

Ký hiệu chủng

Hoạt tính amylase (U/ml)

Hàm lƣợng protein tiết tổng số (µg/ml)

Tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số, U/mg

6,93±0,21

1368,06±15,38

CN1-5

5,07

6,97±0,33

1215,86±16,83

D1-17

5,73

10,21±0,25

1479,20±17,53

D2-8

6,90

14,12±0,99

1520,47±7,51

D5-2

9,29

11,03±0,25

1529,35±6,68

D7-4

7,21

12,82±1,03

1441,92±6,17

D8-5

8,89

14,23±0,92

1563,87±6,69

DA23

9,10

11,23±0,52

1445,53±6,18

DA24

7,77

11,24±0,79

1303,03±5,57

GL1-5

8,63

11,83±0,69

1504,74±6,44

GL2-3

7,86

RRM3-2

11,33±0,59

1475,03±7,59

7,68

RRM4

12,84±0,74

1608,76±6,88

7,98

RRM5-4

11,00±0,71

1488,60±6,37

7,39

10,05±0,66

1380,96±6,76

TB1-1

7,28

5,75±0,39

1511,34±7,75

TB2-1

3,80

12,72±0,86

1658,04±7,09

TR4-1

7,67

11,79±0,61

1562,93±7,54

TR5-2

7,54

3.1.3. Nghiên cứu đặc điểm phân loại của các chủng

Các chủng đƣợc phân loại bằng Kit sinh hóa API 50 – CHB (Một số hình

ảnh phân loại đƣợc thể hiện trong Phụ lục 3) và xác định trình tự 16S rRNA (hình

3.3) đƣợc sử dụng với các chủng chọn lọc có hoạt tính amylase và khả năng tiết cao

để phân loại đến loài đối với các chủng tuyển chọn.

Để xác định trình tự 16S rRNA, các chủng nghiên cứu đƣơc tách chiết DNA

tổng số theo phƣơng pháp CTAB/NaCl của Ausubel và cs, 1994. Sản phẩm PCR

thu đƣợc từ các chủng cho thấy, bắt cặp đặc hiệu với gen 16S rRNA tại một băng

vạch duy nhất có kích thƣớc 1500bp (Hình 3.3).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1500 bp

Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S rRNA của một số chủng nghiên cứu.

Chú thích:Sản phẩm khuếch đại 16S rRNA các chủng: CN1-5 (1), D7-4 (2), thang DNA 1kb của Thermo (3, 11), TB2-1 (4), D1-17 (5), DA23 (6), RRM4 (7), TR4-1 (8), D5-2 (9), Gl2-3(11)

Kết quả đọc trình tự gen 16S rRNA của các chủng đã đƣợc xử lý bằng phần

mềm xử lý trình tự MEGA6.0, DNADynamo và một số trang web trực tuyến chúng

tôi đã ghép nối đƣợc các đoạn gen 16S rRNA và so sánh với dữ liệu về gen này đã

đƣợc cung cấp trên Genbank. Dựa trên trình tự gen 16S rRNA đã xây dựng đƣợc

cây phát sinh chủng loài của 17 chủng Bacillus tuyển chọn bằng phần mềm

MEGA6 (Hình 3.4).

Kết quả cho thấy, trong tổng số 17 chủng đƣợc phân loại có 1 chủng RRM3-

2 có độ trƣơng đồng cao 99% về trình tự gen phân tích với chủng B.

methylotrophicus Kk6-3 (JF460729), 1 chủng TR5-2 có độ tƣơng đồng gen 16S là

99% với chủng B. tequilensis SH145. Năm chủng TB1-1, D2-8, GL1-5, D8-5,

RRM4 thuộc loài B. amyloliquefaciens với độ tƣơng đồng về trình tự với loài này

đã công bố trên ngân hàng gen từ 99 ÷ 99,7%. Bốn chủng GL 2-3, D5-2, TR4-1,

D7-4 đƣợc phân loại thuộc loài B. subtilis cũng với tỷ lệ tƣơng đồng về trình tự gen

16S đạt từ 99 – 99,8%. Chủng DA23 và DA 24 đƣợc phân loại thuộc vào loài B.

licheniformis với sự tƣơng đồng 99 và 99,7%. Các chủng CN1-5, D1-17, TB2-1 và

RRM5-4 thuộc vào loài B. cereus độ tƣơng đồng đạt 98 – 99,5%.

Hình 3.4. Cây phát sinh loài của các chủng chọn lọc dựa trên phần mềm MEGA 6

3.2. PHÂN LẬP CÁC ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO TRÌNH TỰ PEPTIDE TÍN HIỆU

CỦA ALPHA AMYLASE TỪ CÁC CHỦNG CHỌN LỌC

Đoạn SP của gen mã hóa cho α – amylase đƣợc xác định từ mã khởi đầu cho

đến điểm phân cắt của SP trƣớc khi tiết ra ngoài môi trƣờng. Dựa trên kết quả phân

loại đến loài có thể thiết kế đƣợc bộ mồi nhằm khuếch đại đƣợc gen mã hóa cho SP

trên cơ sở các dữ liệu về gen quan tâm đã đƣợc công bố trên các ngân hàng gen. Bộ

mồi nhằm khuếch đại đoạn gen chứa SP gen quan tâm của các chủng nghiên cứu

đƣợc thiết kế với mục đích tạo cặp mồi chung cho một nhóm loài nhằm hạn chế số

mồi sử dụng mà vẫn có thể thu đƣợc nhiều kết quả mong muốn. Các mồi xuôi bắt

đầu từ điểm khởi đầu ATG tiến vào trong khung đọc mở của gen khoảng 25

nucleotide và có suy biến ở một số điểm. Trong khi đó, mồi ngƣợc đƣợc thiết kế

dựa trên vùng bảo thủ I của gen α-amylase bởi vùng đƣơc cho là khá bảo toàn về

mặt trình tự ở các loài thuộc chi này. Trong đó, 3 chủng B. cereus CN1-5, B.

subtilis D5-2, B. licheniformis DA23 với đặc điểm nổi trội về khả năng tiết protein

ngoại bào và hoạt tính amylase đại diện cho từng nhóm loài đƣợc sử dụng để tiến

hành nghiên cứu tách trình tự SP (Hình 3.5).

Kết quả PCR đoạn gen đích trên hình 3.5 cho thấy bằng các cặp mồi

DABsusig (F+R), DABcesig (F+R), và DABlisig (F+R) đã khuếch đại đƣợc đoạn

gen quan tâm có kích thƣớc khoảng 0,3 kb từ mã khởi đầu cho đến vùng bảo thủ I

của gen α– amylase thuộc B. subtilis D5-2 và B. licheniformis DA23, B.cereus

CN1-5 (Hình 3.5). Các đoạn gen này đã đƣợc tinh sạch và gắn vào vector tách dòng

pTZ57R (Fermentas) và biến nạp vào E. coli DH5α sau đó tách plasmid và gửi đọc

trình tự bằng cặp mồi M13/pUC. Trình tự đoạn gen đích có chứa SP cho gen α-

amylase và vị trí phân cắt của các SP cho gen này khi phân tích bằng chƣơng trình

SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0) của các chủng DA23, D5-2 và

của chủng CN1-5 lần lƣợt thể hiện trên hình đƣợc thể hiện trên Hình 3.6, 3.7 và 3.8.

1 2 3 4

Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm gen mang peptide tín hiệu của các chủng nghiên cứu

Chú thích:Băng 1, 2, 3: Đoạn peptide tín hiệu gen α amylase chủng B.subtilis D5-2, B. cereus CN1-5, B. licheniformis DA23. 4, Marker 1 Kb.

Kết quả trên hình 3.6 đoạn gen amylase của chủng B. licheniformis DA23 có

chứa SP với chiềuc dài 30 axit amin và có điểm nhận biết của enzyme phân cắt tín

hiệu SPase loại I là A-A-A. Hình 3.7 cho thấy, đoạn gen amylase của chủng B.

subtilis D5-2 có chứa SP với chiều dài 33 axit amin và có điểm nhận biết của

enzyme phân cắt tín hiệu SPase loại I là A-N-A. Peptide tín hiệu gen α - amylase

của chủng B. cereus CN1-5 là ngắn nhất với 27 axit amin và có điểm nhận biết phân

cắt là A-Y-A (Hình 3.8).

Các đoạn trình tự peptide của các chủng nghiên cứu sẽ đƣợc bắt cặp và so

sánh với các đoạn trình tự peptide của gen α-amylase của các loài tƣơng ứng đã

công bố trên ngân hàng gen để logo hóa nhằm đánh giá sự khác biệt so với những

kết quả đã công bố và đánh giá mức độ bảo thủ bằng Chƣơng trình weblogo trình

tự, một công cụ rất hữu ích cho các nhà sinh học, đƣợc phát minh bởi Tom

Schneider và Mike Stephens (Schneider & Stephens, 1990). Trong kết quả đầu ra

phân tích, các axit amin đƣợc thể hiện trong các ngăn xếp có chiều cao nhƣ nhau,

do đó, mỗi chiều cao chữ sẽ tỷ lệ thuận với tần số xuất hiện của các axit amin tƣơng

ứng. Hình ảnh thể hiện trên Hình 3.9. là trình tự peptide đƣợc logo hóa trên trang

http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi.

Hình 3.6. Điểm phân cắt trong SP của gen α-amylase từ chủng DA23

Hình 3.7. Điểm phân cắt trong SP của gen α-amylase từ chủng D5-2

Hình 3.8. Điểm phân cắt trong SP gen α- amylase của chủng CN1-5

Chú thích: Mũi tên chỉ vị trí phân cắt. Đƣờng xanh lá cây chỉ giá trị S. Đƣờng xanh lam chỉ giá trị Y và đƣờng đỏ chỉ giá trị C. Màu đỏ tăng cao là điểm có khả năng phân cắt của SPase. Điểm giao giữa S – Y sát gần C ƣu thế là điểm phân cắt của SPase

Hình 3. 9. Hình ảnh logo trình tự peptide tín hiệu của các chủng nghiên cứu

Chú thích: Màu sắc của các axit amin dựa trên đặc tính hóa học của các axit amin đó. Các axit amin phân cực (G, S, T, Y, C) sẽ có màu xanh lá cây. Các axit amin trung tính (Q, N) sẽ có màu tím. Các axit amin cơ bản( K, R, H) sẽ đƣợc thể hiện bằng màu xanh. Các axit amin axit (D, E) sẽ có màu đỏ. Các axit amin kỵ nƣớc (A, V, L, I, P, W, F, M) sẽ có màu đen.

Đặc điểm chính của cả 3 peptide nghiên cứu sẽ đƣợc trình bày tổng hợp

trong Bảng 3.3. Khi tiến hành so sánh trình tự axit amin và trình tự nucleotide mã

hóa cho các đoạn petide tín hiệu gen α - amylase của B. cereus CN1-5, B.

licheniformis DA23 và B. subtis D5-2 bằng phần mềm MEGA6.0 có sự khác biệt

khá lớn và điều này cũng phù hợp với các công bố đƣa ra về đoạn SP của gen này

(Hình 3.10 và 3.11).

Hình 3. 10. So sánh trình tự nucleotide của ba peptide tín hiệu chọn lọc

Hình 3. 11. So sánh trình tự protein mã hóa cho SP của cả ba chủng nghiên cứu

Bảng 3.3. Đặc điểm của các peptide tín hiệu chọn lọc

Đặc điểm SP

Ký hiệu chủng

MFKKVTIVGLSVVMFLPSIYEGSKAYA

CN1-5

nhận

biết

A - Y - A

Trình tự SP Độ dài SP* Vùng N(axit amin) ** Vùng H(axit amin) ** Vùng C(axit amin) ** Điện tích đầu N*** Độ kỵ nƣớc****(%) Điểm SPase***** Trình tự SP

MFKKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLSGPAAANA

Độ dài SP Vùng N(axit amin) Vùng H(axit amin)

D5-2

Vùng C(axit amin)

Điện tích đầu N

Độ kỵ nƣớc(%)

Điểm nhận biết SPase

A - N - A

Trình tự SP

MKQQKRLYARFCCRLLFALIFLLPHSAAAA

Độ dài SP Vùng N(axit amin) Vùng H(axit amin)

DA23

Vùng C(axit amin)

Điện tích đầu N

Độ kỵ nƣớc

Điểm nhận biết SPase

A - A - A

Chú thích: *, ***: Độ dài axit amin và điểm nhận biết SPase đƣợc xác định bằng chƣơng trình SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ). : Số lƣợng axit amin của cả 3 vùng đƣợc phân tích trên http://phobius.sbc.su.se/. *: Đƣợc tính toán điện tích với quy ƣớc D, E là -1; R, K là +1, các axit amin còn lại là 0.**: Phần trăm các axit amin kỵ nƣớc trong mỗi peptide tín hiệu đƣợc xác định dựa trên đặc tính các axit amin G, A, V, L, I, M, F, W và P là kỵ nƣớc và các axit amin còn lại là ƣa nƣớc

Kết quả trên bảng 3.3 cho thấy, trình tự peptide tín hiệu gen α - amylase của

các chủng chọn lọc khác nhau về độ dài, trình tự và điện tích đầu N của gen α-

amylase ở các chủng cũng có sự khác biệt. Vùng N chủng DA23 và D5-2 mang

điện tích +4 trong khi vùng N của chủng CN1-5. Khi phân tích tính toán độ kỵ nƣớc

của các peptide tín hiệu, chủng D5-2 cho thấy có chứa các axit amin kỵ nƣớc là cao

nhất chiếm 73%. Các peptide tín hiệu này đƣợc sàng lọc và tiếp tục đánh giá khả

năng tiết. Nghiên cứu sẽ đƣợc tiến hành trên một gen đích là đoạn gen α-amylase

trƣởng thành của chủng B. licheniformis 3BT2.

3.3. SÀNG LỌC THU PEPTIDE TÍN HIỆU MẠNH CỦA GEN α - AMYLASE

Trong nghiên cứu này 3 SP từ gen α-amylase của các chủng B. subtilis D5.2,

B. cereus CN15, B. licheniformis DA23 đƣợc tái tổ hợp nhằm hợp nhất với cùng

một gen mục tiêu là đoạn gen trƣởng thành của α-amylase chủng B. licheniformis

3BT2 tính từ sau điểm phân cắt của SPaseI trong Sec/P và đánh giá khả năng tăng

tiết. Chủng chủ đƣợc sử dụng cho nghiên cứu này là B. subtilis 168M. Mục đích thí

nghiệm đã đƣợc sơ đồ hóa trong Hình 3.12. Bản đồ enzyme cắt giới hạn của các gen

nghiên cứu đƣợc thể hiện trên Hình 3.13

Dựa trên sơ đồ trên, các thí nghiệm đã đƣợc thiết lập phù hợp với mục tiêu

nghiên cứu. Trƣớc hết, nhằm tạo thuận lợi cho hệ biểu hiện enzyme sau này các

đoạn gen đích đƣợc khuếch đại bằng các cặp mồi có mang trình tự nhận biết của

enzyme giới hạn. Các đoạn gen mã hóa cho trình tự SP quan tâm đƣợc gắn với đoạn

trƣởng thành của gen α-amylase chủng B. licheniformis 3BT2 bằng phƣơng pháp

Megaprimer (tổ hợp gen 1). Tổ hợp gen ghép này lại tiếp tục đƣợc gắn với promoter

Pgrac tách từ vector pHT43 có mang điểm cắt enzyme giới hạn EcoRI tạo tổ hợp

gen 2 sau đó đƣa vào pHV33 đã cắt mở vòng tại vị trí cắt enzyme tƣơng ứng. Tổ

hợp vector đƣợc biến nạp và nghiên cứu đánh giá khả năng tiết ở B. subtilis 168M.

Các tổ hợp tạo thành đƣợc trình bày trong bảng 3.4.

Hình 3.12. Sơ đồ thí nghiệm tăng khả năng tiết α-amylase trong Bacillus subtilis.

Chú thích: A, Ba pepide tín hiệu của B. subtilis D5-2, B. licheniformis DA23và B. cereus CN1-5 đã đƣợc nhân dòng bằng PCR1. (B), đoạn trƣởng thành gen α-amylase của chủng B. licheniformis 3BT2 đƣợc sử dụng làm mục tiêu và khuếch đại bằng PCR2. Các peptide tín hiệu quan tâm đƣợc nối với gen đích bằng phƣơng pháp Megeprimer 1 (PCR3). Promoter Pgrac tách từ vector pHT43 bằng phản ứng PCR4. Cụm gen tái tổ hợp giữa SP của chủng chọn lọc và gen α - amylase đíchđƣợc tiếp tục tái tổ hợp bằng phƣơng pháp megaprimer với PCR4. C, Các cụm tái tổ hợp tạo thành đƣợc gắn vào vector pHV33sau đó biến nạp vào B. subtilis 168M để sàng lọc các thƣ viện peptide tín hiệu và đánh giá mức độ tiết α-amylase của gen tái tổ hợp.

Bảng 3.4. Các thành phần của tổ hợp megaprimer

Chủng Gen đích 1 Tổ hợp gen 11 Gen đích Tổ hợp gen 22 2

B. subtilis D5.2 Pgrac-DASsub3BT2 Mature DASsub3BT2 Mature

B. cereus CN15 DAScere3BT2 Mature Pgrac-DAScere3BT2 Mature Mature α- amylase B.licheniformis 3BT2

Promoter Pgrac của vector pHT43 B. licheniformis DA23 DASliche3BT2 Mature Pgrac-DASliche3BT2 Mature

α-amylase DA3BT2full3 Pgrac-DA3BT2full B.licheniformis 3BT2

Chú thích: (1)Tổ hợp gen tạo thành bằng phƣơng pháp megaprimer giữa peptide tín hiệu quan tâm và gen đích là đoạn gen α-amylase trƣởng thành của chủng 3BT2. (2)Tổ hợp megaprimer đƣợc nối với promoter Pgraccủa pHT43 tạo nên tổ hợp gen ghép mới. (3) Toàn bộ gen mã hóa cho α-amylase cuả chủng 3BT2 đƣợc tách bằng cặp mồi Flich-XhoI và P3BL-EcoRI.

Hình 3.13. Sơ đồ điểm cắt enzyme giới hạn của các peptide tín hiệu chọn lọc

3.3.1. Tách các peptide tín hiệu và tạo tổ hợp với gen đích

Từ các trình tự peptide xác định đƣợc, cặp mồi gồm một mồi xuôi của tín

hiệu đích và một mồi ngƣợc kép đƣợc sử dụng nhằm khuếch đại đoạn SP quan tâm.

Phƣơng pháp Megaprimer là một phƣơng pháp rất phổ biến trong nghiên cứu gen

(Fieschi et al., 1996; Priyadharshini et al., 2010; Liu & Naismith, 2008; Sambrook

& Russell, 2006). Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện nhằm ghép đƣợc các gen tín

hiệu quan tâm với gen đích của chủng 3BT2.

Kết quả điện di đoạn SP quan tâm, đoạn gen α-amylase trƣởng thành của B.

licheniformis 3BT2 và sản phẩm megaprimer ghép tạo tổ hợp đƣợc thể hiện trên

hình 3.14. cho thấy, đã thực hiện thành công việc phân lập các đoạn SP quan tâm,

gen đích là đoạn mã hóa cho mature α-amylase của chủng 3BT2 và sản phẩm của

phƣơng pháp Megaprimer. Các đoạn gen đƣợc ghép có kích thƣớc phù hợp với tính

toán lý thuyết khi đƣợc thể hiện trên ảnh điện di đồ. Từ các trình tự peptide xác

định đƣợc, cặp mồi gồm một mồi xuôi của tín hiệu đích và một mồi ngƣợc kép

đƣợc sử dụng nhằm khuếch đại đoạn SP quan tâm. Các trình tự SP của B. subtilis

D5-2, B. cereus CN1-5, B. licheniformis DA23 đƣợc phân lập bằng PCR với cặp

mồi xuôi là trình tự khởi đầu của gen hoàn chỉnh và trình tự cuối là đoạn gen cuối

của SP có mang trình tự kép (Hình 3.14B). Đoạn trình tự kép này (PCR1) chính là

trình tự khởi đầu đoạn trƣởng thành của gen α-amylase 3BT2 (gen đích – mature

3BT2). Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại đƣợc sử dụng làm mồi trong phƣơng

pháp Megaprimer (đoạn khuếch đại này đƣợc gọi là Flank primer). Chúng tôi đã

phân lập đƣợc đoạn gen mã hóa cho protein trƣởng thành cho gen α-amylase của

chủng 3BT2 Cặp mồi sử dụng là hai mồi F3BT2mature –SacII và RP3BL-XbaI. Các đoạn

gen mã hóa cho protein trƣởng thành tách đƣợc thành công và có kích thƣớc tƣơng

ứng với lý thuyết sau khi đã tính toán loại bỏ đoạn trình tự tín hiệu gốc của gen này

(≈1400bp).

Hình 3.14. Điện di đồ sản phẩm PCR của các gen đích

Chú thích: A, Đoạn gen α amylase trƣởng thành của chủng B. licheniformis3BT2. B, SP quan tâm.C, Sản phẩm megaprimer giữa SP quan tâm và đoạn gen trƣởng thành của α – amylase 3BT2.

Hình 3. 15. Điện di đồ sản phẩm tách DNA plasmid (A) và cắt kiểm tra bằng BamHI và XbaI (B)của các dòng tế bào E. coli mang sản phẩm megaprimer DASsub3BT2Mature trong vector pTZ57R/T

Bằng phƣơng pháp Megaprimer, các tổ hợp đã đƣợc tạo thành bao gồm: SP

của gen α-amylase của chủng B. subtilis D5-2 và đoạn gen mã hóa cho α-amylase

trƣởng thành của chủng B. licheniformis 3BT2 và tổ hợp này đƣợc ký hiệu là

DASsub3BT2Mature; SP của gen α-amylase của chủng B. licheniformis DA23 và

đoạn gen mã hóa cho α-amylase trƣởng thành của chủng B. licheniformis 3BT2 và

tổ hợp này đƣợc ký hiệu là DASliche3BT2Mature; SP của gen α-amylase của chủng

B. cereus CN1-5 và đoạn gen mã hóa cho α-amylase trƣởng thành của chủng B.

licheniformis 3BT2 và tổ hợp này đƣợc ký hiệu là DAScere3BT2Mature (Hình

3.14C). Tổ hợp gen tạo thành bằng phƣơng pháp megaprimer đƣợc gắn vào vector

pTZ57R/T. Sau khi đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli bằng phƣơng pháp

biến nạp pha lag, tế bào đƣợc trải trên môi trƣờng LB chứa Amp, Xgal và nuôi qua

đêm. Các dòng khuẩn lạc đƣợc chọn đƣợc nuôi cấy tách thu plasmid (Hình 3.15A)

và xử lý với hai enzyme giới hạn của vector này là BamHI và XbaI (Hình 3.15 B).

Kết quả cho thấy có hai băng DNA với kích thƣớc khoảng 1,5 kb (cụm gen

megaprimer) và 3 kb (vector pTZ57R/T) trên gel agarose. Nhƣ vậy, đã tái tổ hợp

thành công đoạn sản phẩm megaprimer của gen cần nghiên cứu trong vector

pTZ57R/T.

3.3.2. Tạo vector mang tổ hợp gen đích

3.3.2.1. Tổ hợp Pgrac với các đoạn peptide tín hiệu đã ghép với gen đích 3BT2

Sử dụng Pgrac promoter của pHT43 để có đƣợc promoter mạnh gắn với gen

đã đƣợc ghép bằng phƣơng pháp Megaprimer giữa các SP quan tâm: gen mã hóa tín

hiệu α-amylase củachủng B. subtilis D5-2, gen mã hóa tín hiệu α-amylase của

chủng B. cereus CN1-5 và gen mã hóa tín hiệu α-amylase của chủng B.

licheniformis DA23 với đoạn trình tự trƣởng thành của gen α-amylase của chủng B.

licheniformis 3BT2. Trình tự Pgrac promoter đƣợc tách từ pHT43 bằng phƣơng

pháp PCR với cặp mồi thiết kế riêng có treo hai đầu cắt enzyme giới hạn. Promoter

Pgrac của vector pHT43 đƣợc biết có kích thƣớc khoảng 182 bp và đƣợc nằm trƣớc

vị trí khởi đầu ATG của peptide tín hiệu AmyQ trong vector này. Phía trƣớc của

promoter trong pHT43 đã có sẵn điểm cắt của enzyme giới hạn KpnI nhƣng vì mục

đích đƣa sang vector biểu hiện pHV33 nên trong mồi thiết kế thêm vị trí enzym giới

hạn EcoRI. Kết quả PCR với kích thƣớc tƣơng ứng cho thấy đã tách thành công

đoạn gen mã hóa cho promoter này (Hình 3.16A). Đoạn promoter khuếch đại đƣợc

sẽ đƣợc tinh sạch và bảo quản để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại các gen quan tâm

Chú thích: A, Đoạn Pgrac tách từ vector pHT43. B, Sản phẩm megaprimer giữa SP quan tâm và đoạn gen trƣởng thành của α – amylase 3BT2 khuêch đại bằng cặp mồi có mang điểm cắt enzyme giới hạn. C, tổ hợp gen đích tạo thành của Promoter Pgrac với SP quan tâm và đoạn gen mã hóa cho protein α - amylase trƣởng thành của chủng B. licheniformis 3BT2.

Trƣớc tiên để tạo tổ hợp kép, các đoạn gen đích là sản phẩm PCR megarimer

(DASsub3BT2Mature, DASliche3BT2Mature, DAScere3BT2Mature, 3BT2 α-amylase)

đƣợc tạo thêm đầu cắt enzyme giới hạn bằng cặp mồi mới (Bảng 2.5) có chứa điểm

cắt enzyme giới hạn XhoI và EcoRI để thuận tiện cho quá trình thiết kế vector biểu

hiện trong B. subtilis ở thí nghiệm tiếp theo (hình 3.16B). Tổ hợp kép giữa Pgrac và

SP chọn lọc – gen đích đƣợc thực hiện bằng megaprimer hoặc cắt gắn enzyme bằng

các enzyme giới hạn và enzyme T4 lygase. Sản phẩm sau khi gắn gen đƣợc sử dụng

làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại cả đoạn gen này với cặp mồi đƣợc sử

dụng chính là mồi xuôi của Pgrac và mồi ngƣợc chính là mồi P3BL-EcoRI. Kết quả

PCR sản phẩm megaprimer tạo cụm gen tổ hợp kép bao gồm Pgrac-Peptide tín hiệu

chọn lọc-gen α-amylase trƣởng thành của chủng 3BT2.đƣợc thể hiện trên hình

3.16C cho thấy đã tạo đƣợc 3 cụm gen tổ hợp kép bao gồm Pgrac-SP chọn lọc-gen α-

amylase trƣởng thành của chủng B. licheniformis 3BT2 với kích thƣớc khoảng

1800bp.

3.3.2.2. Gắn các tổ hợp gen đích vào vector pHV33

Hình 3.17. Sơ đồ thí nghiệm tạo vector pHVgracAmy mới từ vector pHV33 gốc

Các vector tái tổ hợp pHVgracAmy mới từ vector pHV33 gốc đƣợc thực

hiện theo sơ đồ Sơ đồ thí nghiệm tạo vector trên Hình 3.17. Các cụm tổ hợp tạo

thành bao gồm: Pgrac- DASsub3BT2Mature, Pgrac- DAScere3BT2Mature, Pgrac-

DASliche3BT2Mature, Pgrac-3BT2amy đƣợc nhân dòng bằng PCR với cặp mồi xuôi

là trình tự khởi đầu của Pgrac (FprimerPgrac- EcoRI) và mồi ngƣợc là P3BL – EcoRI

(Hình 3.16) đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI và sau đó đƣợc tinh sạch rồi gắn

vào vector pHV33 đã đƣợc cắt mở vòng bằng enzyme tƣơng ứng. Từ các đoạn tái tổ

hợp này, các plamid tƣơng ứng tạo thành đƣợc ký hiệu dựa trên tên của vector và

tên của cụm tái tổ hợp gắn với SP của các loài nhƣ: pHVSuSig5.2, pHVCeSig15,

pHVLiSig23, pHVLi3BT2full. Sản phẩm tách plasmid đƣợc thể hiện trên hình 3.18

A và cắt kiểm tra đoạn gen đã chèn bằng enzyme giới hạn EcoRI (Hình 3.18B)

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4

pHV33 vector 6.9 kb

Pgrac-DASsub3BT2 Mature

1.8 kb

Hình 3.18. Điện di đồ DNA plasmid pHVSusig5.2 (A) và xử lý EcoRI (B)

Chú thích: A: giếng 1, 2, 3, 5, 6 kết quả tách plasmid pHVSusig5.2 từ các dòng đƣợc biến nạp; 4, Marker. B: 1, Sản phẩm cắt EcoRI của plasmid đã tách; 3,4 plasmid đối chứng; 2, Marker

3.3.3. Đánh giá khả năng tiết của các tổ hợp gen đích trong chủng chủ Bacillus

subtilis 168M

Tất cả các tế bào sống đều tổng hợp ra protein mới nhằm đảm bảo cho hoạt

động của tế bào. Với các protein ngoại bào, các protein đƣợc vận chuyển ra ngoài

màng tế bào thông qua con đƣờng tiết. Trong vi khuẩn, rào cản chính cho quá trình

tiết protein chính là lớp màng tế bào chất. Trong mấy thập kỷ qua, đã có nhiều

nghiên cứu về protein và các con đƣờng tiết của chúng và thông qua các nghiên cứu

này, bức màn bí mật về quá trình làm sao protein vận chuyển ra đƣợc ngoài màng

và tiết vào môi trƣờng cũng nhƣ các nhân tố tham gia trong quá trình vận chuyển đã

dần đƣợc sáng tỏ. Những nghiên cứu về quá trình tiết protein của vi khuẩn tập chung chủ yếu trên hai đối tƣợng đó là E. coli, đại diện của G-, và B. subtilis, đại diện cho các chủng vi khuẩn G+. Không giống nhƣ E. coli, protein của vi khuẩn G+

đƣợc vận chuyển ra ngoài màng để giải phóng vào môi trƣờng hoặc và tiết qua lớp màng tế bào chất ra thẳng môi trƣờng nuôi cấy. Do đó, các chủng G+ là đối tƣợng

nghiên cứu hấp dẫn để sử dụng làm chủng chủ cho quá trình tiết lƣợng lớn các

enzyme công nghiệp. Để đánh giá khả năng tiết của các peptide tín hiệu của một

gen có nguồn gốc từ Bacillus thì phải chọn chính một chủng cũng có nguồn gốc từ

chi này làm chủng tái tổ hợp. Thông qua quá trình tiết α - amylase tái tổ hợp trong

chủng chủ Bacilus có thể sàng lọc đƣợc các peptide mạnh và đánh giá mức độ biểu

hiện cũng nhƣ xác định hàm lƣợng protein tiết đƣợc ra môi trƣờng sẽ có tính chính

xác cao hơn. Trong đó, B. subtilis là đối tƣợng đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong

nhóm vi khuẩn gram dƣơng nói chung và trong chi Bacillus nói riêng bởi vì trình tự

gen của loài này đã đƣợc xác định toàn bộ, không tiết độc tố, có hiệu quả thu hồi

cao, khả năng tiết các protein tái tổ hợp trong loài này đƣợc biết đến khoảng 25g/l

đây chính là một bộ máy tiết enzyme hoàn hảo nhằm ứng dụng trong công nghiệp

thực phẩm, dƣợc phẩm, công nghệ sinh học, và trong lĩnh vực nông nghiệp

(Schallmey et al., 2004; Westers et al., 2004; Nijland & Kuipers, 2008). Một số

chủng thuộc loài B. subtilis đƣợc thiết kế và phát triển thành các chủng sản xuất

thƣơng mại: 168M, WB800, WB700, WB600, BG2054, DB104, DB105... và chủng

chủ đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu này là B. subtilis 168M. Hệ thống biểu hiện có

sử dụng vector con thoi pHV33 có thể biểu hiện đƣợc ở cả E. coli và B. subtilis. Hệ

thống vector biểu hiện tạo thành bao gồm:

- Vector pHV33 gốc

- Promoter tách từ pHT43

- SP gen α - amylase đã tách từ các chủng tuyển chọn

- Đoạn gen trƣởng thành của gen α - amylase từ chủng 3BT2

3.3.3.1. Ảnh hưởng của promoter Pgrac lên khả năng tiết và biểu hiện amylase

trong Bacillus subtilis 168M

Trong 5 nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình biểu hiện của một gen trong chủng

tái tổ hợp, nhân tố promoter là yếu tố đƣợc xét đến trƣớc tiên. Tổ hợp PHV33 mang

gen mã hóa cho α-amylase của chủng B. licheniformis 3BT2 và promoter Pamy của

chủng chủ đã đƣợc bảo quản trong bộ sƣu tập gen và chủng giống của phòng Công

nghệ vật liệu sinh học (Trần Đình Mấn, 2001). Promoter Pgrac là một promoter

mạnh đƣợc cảm ứng bằng IPTG và sử dụng trong vector thƣơng mại của hãng

MoBiTec. Do đó chúng tôi đã lựa chọn làm promoter chính cho nghiên này và so

sánh với sự biểu hiện của cụm gen tái tổ hợp mang promoter Pamy trong vector

pHV33. Để xác định ảnh hƣởng của 2 promoter: promoter của chính gen α-amylase

của chủng chủ B. subtilis 168M và promoter Pgrac lên khả năng tiết amylase, trƣớc

tiên cần tạo đƣợc tổ hợp gen mới bao gồm Pgrac – tách từ pHT43, pHV33 và gen α-

amylase 3BT2 sau đó tái tổ hợp và biến nạp trong B. subtilis 168M

Chủng tái tổ hợp mang cụm vector pHV33-Pgrac-Amy3BT2 sau khi biến nạp

đƣợc sàng lọc hoạt tính amylase trên môi trƣờng LB có bổ sung Chloramphenicol

20µg/ml và chất cảm ứng IPTG. Cả hai chủng tái tổ hợp B. subtilis 168M mang hệ

vector pHV33–PgracAmy3BT2 (ký hiệu 168MPgrac) và B. subtilis 168M mang hệ

vector pHV33–PamyAmy3BT2 (ký hiệu 168MPamy) tiếp tục đƣợc nghiên cứu đánh

giá khả năng tiết protein và hoạt tính amylase. 168MPgrac đƣợc nuôi cấy trong môi

trƣờng LB + Chloramphenicol đến khi OD đạt 0.6-0.8, bổ sung IPTG 0.01mM và

bắt đầu tính thời gian nuôi cấy tại thời điểm bổ sung IPTG đƣợc coi là 0h và nuôi

tiếp tục đến thời điểm 48h. Chủng 168MPamy đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB

+chloramphenicol + glucose trong khoảng 60h sau đó xác định hoạt tính enzyme và

khả năng tiết protein tổng. Hoạt tính của các chủng tái tổ hợp đƣợc đánh giá với đối

chứng chính là chủng B. subtilis 168M mang vector pHV33 gốc không chứa cụm

gen quan tâm.

Bảng 3. 5. Hoạt tính tiết enzyme của các chủng tái tổ hợp

Amylase

Hoạt tính Ký hiệu chủng

Khuếch tán thạch (mm)

Hoạt tính α - amylase (U/ml)

Hàm lƣợng Protein tiết tổng số (µg/ml)

Tỷ lệ hoạt tính enzyme/ hàm lƣợng protein tiết tổng số (U/mg)

168MPamy

53,2±5,5

1763,5±15

30,17

168MPgrac

71,4±6,3

1876,4±25

38,05

168M

2,1±0,3

1798,7±30

1,17

Hình 3.19. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính cũng nhƣ khả năng sinh

tổng hợp enzym của chủng Bacillus subtilis168M mang vector pHV33-promoter

Pgrac - α-amylase 3BT2

Hình 3.20. Ảnh hƣởng của promoter lên khả năng tiết enzyme của chủng tái tổ hợp.

Chú thích: A, Điện di đồ SDS – PAGE sản phẩm protein thu đƣợc của chủng các chủng tái tổ hợp 168MPamy, 168MPgrac và chủng đối chứng 168M. Băng điện di đậm và đƣợc chỉ bằng mũi tến là amylase với kích thƣớc khoảng 58 kDa. B, Hoạt tính amylase trên bản điện di protein có bổ sung tinh bột tan 1% của các chủng tái tổ hợp nghiên cứu. Hoạt tính enzyme trên bản điện di thể hiện qua vùng không bắt màu iot.

Hoạt tính enzyme đều đƣợc tiết ra môi trƣờng nuôi cấy ở cả 2 chủng nghiên

cứu cho thấy, α - amylase của B. licheniformis 3BT2 đã đƣợc tiết trong tế bào

chủng B. subtilis 168M. Với 168MPamy, hoạt tính α – amylase đạt đƣợc 53,2±5,5

U/ml sau 60h nuôi cấy. Chủng 168MPgrac, hoạt tính α – amylase đạt đƣợc 71,4

±6,3 U/ml sau 48h nuôi cấy tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng

số của enzyme đạt 38,05 U/ml. Các peptide tín hiệu gốc gen α-amylase của 3BT2

đã có hiệu quả hoạt động tốt khi đƣợc điều khiển bởi cả 2 loại promoter trong B.

subtilis. Trong khi kết quả trên Bảng 3.5 cho thấy, promoter Pgrac của pHT43 cho

hiệu quả biểu hiện amylase cao hơn khi đƣợc tổ hợp với pHV33.

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng và sinh α -

amylase của chủng tái tổ hợp B. subtilis 168MpHV33–PgracAmy3BT2 (168MPgrac)

trên môi trƣờng LB có bổ sung IPTG 0,01mM và chloramphenicol 20 µg/ml đƣợc

trình bày trong Hình 3.19 cho thấy, chủng này sinh trƣởng và sinh enzyme tốt nhất

trong khoảng 30 - 48h nuôi cấy tính từ sau khi bổ sung IPTG, đạt OD cực đại

3,69±0,11 và hoạt tính amylase đạt 73,4±3,61 sau 48h nuôi cấy.

Điện di SDS-PAGE đƣợc thực hiện với gel 12% và đƣợc nhuộm bằng

AgNO3. Quan sát băng điện di protein và zymogram cho thấy kích thƣớc băng

amylase có hoạt tính khoảng 58 kDa (Hình 3.20) phù hợp với kích thƣớc chung của

enzyme α-amylase từ các chủng thuộc loài B. licheniformis đã đƣợc công bố

(Pandey et al., 2000). Thông qua kết quả này, promoter Pgrac đƣợc sử dụng làm

promoter cho plasmid khung pHV33 trong nghiên cứu biểu hiện hoạt tính amylase

của các peptide khác nhau trên đoạn gen đích α-amylase 3BT2 trƣởng thành.

3.3.3.2. Ảnh hưởng của các peptide tín hiệu khác nhau lên khả năng biểu hiện và

tiết protein của α-amylase B. licheniformis 3BT2

Một hệ thống biểu hiện tốt là protein quan tâm phải đƣợc tiết ra một lƣợng

lớn để thu hồi và mặc dù có một số protein đã đƣợc thu thành công trong B. subtilis

nhƣng hiệu suất không cao, đôi khi lƣợng enzyme thu đƣợc vẫn không đủ đáp ứng

yêu cầu vì vậy cần tìm hiểu thêm sâu hơn về cơ chế của quá trình vận chuyển

protein ra ngoài màng nhằm cải thiện hiệu quả. Đi sâu nghiên cứu nâng cao lƣợng

sản phẩm thu hồi chính là nghiên cứu về các con đƣờng tiết tham gia trong quá trình

vận chuyển protein và các nhân tố của bộ máy vận chuyển để có thể tìm quá trình

tác động nhằm nâng cao lƣợng enzyme tiết thu hồi. Ở vi khuẩn, hầu hết các protein

đƣợc tiết theo Sec/P đƣợc tổng hợp nhƣ các tiền chất có chứa SP và đoạn protein

trƣởng thành. Mặc dù không có sự bảo thủ về mặt trình tự nhƣng SP luôn cấu tạo

gồm: vùng N tích điện dƣơng, vùng H chứa các axit amin kỵ nƣớc và vùng cuối C

trung tính hoặc tích điện âm có chứa vị trí phân cắt cho các Spase. Tuy nhiên, SP của vi khuẩn G+ đƣợc biết đến dài hơn so với các SP của gram âm (Nielsen et al.,

1997b) cho nên một SP của gram âm có thể sẽ không có chức năng đƣợc thể hiện

trong tiết protein nhƣ ở gram dƣơng (Collier, 1994). Tác động của việc thay thế SP

gen α-amylase của chủng B. licheniformis 3BT2 bằng các SP của gen α-amylase

của các loài khác trong cùng chi Bacillus nhƣ: B. cereus, B. subtilis, B.

licheniformis trong việc tiết α-amylase đƣợc đánh giá bằng protein tổng, hoạt tính

tổng và kết quả điện di protein. Các SP khác nhau đƣợc đánh giá ảnh hƣởng lên khả

năng biểu hiện hoạt tính amylase và tiết protein của gen đích 4 tổ hợp gen đã đƣợc

tạo thành bao gồm: pHV33-Pgrac-3BT2Amyfull (pHVAmy3BT2), pHV33 – Pgrac

– ScereusCN15 - 3BT2mature (pHVCeSig15), pHV33 – Pgrac – SsubtilisD5.2-3BT2mature

(pHVSuSig5.2), pHV33 – Pgrac – SlicheniformisDA23 - 3BT2mature (pHVLiSig23)

trong B. subtilis 168M (Bảng 3.6).

Bảng 3.6. Các plasmid thiết kế

Đặc điểm gen

Chủng tái tổ hợp

Plasmids thiết kế

168MSubsig52

pHVSubsig5.2

pHV33+Pgrac+SP gen α – amylase của chủng B. subtilis D5.2+3BT2 Mature α – amylase gen

168MCeSig15

pHVCesig15

pHV33+Pgrac+ SP gen α – amylase của chủng B. cereus CN1-5+3BT2 Mature α – amylase gen

168MLisig23

pHVLisig23

pHV33+Pgrac+ SP gen α – amylase của chủng B. licheniformis DA23+3BT2 Mature α – amylase gen

168M3BT2

pHVLi3BT2full

pHV33+Pgrac + α-amylase 3BT2 gen

Các chủng tái tổ hợp thu đƣợc đƣợc ký hiệu theo tổ hợp gen mà chúng đƣợc

tạo thành: 168MSubsig52, 168MCeSig15, 168MLisig23, 168M3BT2. Chủng tái tổ

hợp đƣợc nuôi cấy trong 48h trên môi trƣờng LB + chloramphenicol có bổ sung

IPTG để cảm ứng sau khi OD đạt 0,7 – 0,8. Kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 3.7.

Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của các SP khác nhau lên khả năng biểu hiện và tiết protein của α-amylase B. licheniformis 3BT2

Hoạt tính α – amylase (U/ml)

Chủng

Khuếch tán thạch (mm)

Dịch phá tế bào

Dịch nuôi cấy

Hàm lƣợng protein tiết tổng số (µg/ml)

Tỷ lệ hoạt tính enzyme/ hàm lƣợng protein tiết tổng số (U/mg)

168MSubsig52

23±1,5

3,1±0,3

76,4±3,7

1896,4±35,0

40,9±3,13

168MCeSig15

16,5±2

4,9±0,7

47,7±4,6

1767,2±21,6

26,9±2,23

168MLisig23

21±1,5

6,3±0,6

71,3,±3,2 1824,7±27,1

38,7±0,72

168M3BT2

20,5±2

4,1±0,4

68,6±5,1

1787,3±20,2

37,5±1,42

Kết quả trên bảng này cho thấy, khi nuôi cấy cả 4 chủng tái tổ hợp trên môi

trƣờng LB có bổ sung IPTG 0,01M đều có khả năng sinh α-amylase điều này chứng

tỏ cả promoter Pgrac lẫn 3 SP hoạt động tốt khi tái tổ hợp với gen đích là đoạn gen

mã hóa cho α-amylase trƣởng thành của chủng 3BT2. Trong đó, chủng tái tổ hợp B.

subtilis 168M mang cụm gen pHV33 – Pgrac – SsubtilisD5.2-3BT2mature cho hoạt tính

α-amylase mạnh nhất đạt 76,4 ± 3,7 U/ml và tổ hợp gen với trình tự SP của B.

subtilis CN1-5 (B. subtilis 168M - pHV33 – Pgrac – ScereusCN15 - 3BT2mature) cho

hoạt tính amylase là thấp nhất, chỉ đạt 47,7 ± 4,6 U/ml.

Để khảo sát khả năng tiết α-amylase ra môi trƣờng nuôi cấy, dịch sau nuôi

cấy của 4 chủng tái tổ hợp sẽ đƣợc ly tâm loại bỏ tế bào và đƣợc kết tủa với ethanol

và hòa lại trong đệm thích hợp. Mẫu kết tủa sẽ đƣợc xử lý để điện di SDS-PAGE.

Cả 4 plasmid khảo sát đều xuất hiện vạch protein có kích thƣớc tƣơng ứng với lý

thuyết khoảng 58kDa (Hình 3.21).

Kết quả trên hình 3.21 cho thấy, sau 36h nuôi cấy, các chủng tái tổ hợp cho

thấy có sự khác biệt về hàm lƣợng enzyme quan tâm trên băng điện di thông qua

mức độ đậm nhạt của băng. Kết quả điện di protein cho thấy tƣơng ứng với các kết

quả phân tích ở trên. Dựa vào kết quả trên Bảng 3.7 và Hình 3.21, chủng tái tổ hợp

168MSubsig52 (B. subtilis 168M- pHV33–Pgrac –SsubtilisD5.2-3BT2mature) đƣợc

chọn lọc và trình tự SP của B. subtilis D5-2 đƣợc sử dụng cho nghiên cứu gây đột

biến trình tự SP nhằm đánh giá ảnh hƣởng của các đột biến này lên khả năng biểu

hiện hoạt tính enzyme.

Hình 3.21. So sánh biểu hiện tiết α-amylase các peptide tín hiệu khác nhau

Chú thích: 1. Thang protein chuẩn, 2: 168MCesig15; 3: 168MSusig52; 4, 168M3BT2;

5: 168Mlisig23

Hình 3.22. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trƣởng và sinh tổng hợp amylase của chủng B. subtilis 168MSusig52

Chủng tái tổ hợp 168MSubsig52 (B. subtilis 168M- pHV33 – Pgrac –

trên môi trƣờng LB có bổ sung SsubtilisD5.2-3BT2mature) đƣợc nuôi cấy

Chloramphenicol và IPTG 0,01 mM và xác định ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy

lên khả năng sinh trƣởng và sinh hoạt tính amylase. Mật độ quang của mẫu đƣợc

xác định tại bƣớc sóng λ = 600 nm. Hoạt tính đƣợc xác định bằng phƣơng pháp

DNSA. Kết quả nghiên cứu trên hình 3.22 cho thấy, khoảng thời gian sinh trƣởng

và sinh tổng hợp amylase của chủng tái tổ hợp tốt nhất sau 18 ÷ 36h nuôi cấy đạt.

Hoạt tính enzyme đo đƣợc cao nhất sau 36h với giá trị đạt 73,7±6,36 U/ml ở thời

điểm này.

3.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TIẾT AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG TÁI TỔ HỢP

MANG VECTOR BIỂU HIỆN CÓ CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU ĐỘT BIẾN ĐƢỢC

THIẾT KẾ

Bên cạnh các nghiên cứu thay thế các SP mã hóa cho các protein khác nhau

trong cùng loài hay khác loài để tăng cƣờng khả năng tiết enzyme, các nhà khoa học

trên thế giới còn sử dụng phƣơng pháp tạo đột biến trên chính các peptide này nhằm

đánh giá đƣợc khả năng tiết. Từ cái nhìn tổng quan tài liệu hiện nay về tác động của

đột biến các SP của gen từ Bacillus thì phƣơng pháp thay đổi các SP có thể là một

công cụ có giá trị để tăng cƣờng sản xuất các protein trong chi này hoặc các tế bào

chủ khác nhƣng đối với mỗi sự kết hợp của SP và một đoạn gen đích trƣởng thành

đều có sự biến đổi và cần đƣợc minh chứng bằng thực nghiệm. Trong nghiên cứu

này, SP đƣợc gắn với gen đích 3BT2 tuy tiết tốt nhất trong các peptide đƣợc so sánh

nhƣng khả năng tiết vẫn còn là hạn chế. Chính vì vậy, việc đột biến SP gen α -

amylase của B. subtilis D5-2 thu đƣợc này nhằm tìm khả năng để có thể tăng cƣờng

tính tiết enzyme. Đánh giá khả năng tiết của các SP thông qua một gen đích chung

là 3BT2 α - amylase mature qua B. subtilis 168M cho thấy, đoạn SP của chủng B.

subtilis D5-2 với 33 axit amin là cho hàm lƣợng protein tiết cao nhất đƣợc chọn cho

nghiên cứu tiếp theo. SP mã hóa cho gen α - amylase của chủng này đƣợc biết đến

gồm có 33 axit amin đƣợc chia thành 3 vùng N-(axit amin thứ 1-9), H (axit amin

thứ 10-25) và vùng C (axit amin thứ 26-33) (hình 3.23).

Hình 3.23. Sơ đồ cấu trúc và trình tự axit amin trên SP gen α-amylase chủng D5-2

Có nhiều phƣơng pháp đột biến peptide tín hiện khác nhau đƣợc sử dụng

trong nghiên cứu tăng tiết enzyme nhƣ: error-prone PCR, đột biến điểm định

hƣớng…Trong khuôn khổ luận án này, SP α – amylase đƣợc gây đột biến định

hƣớng một số điểm chọn lọc dựa trên cấu trúc SP của α – amylase chủng B. subtilis

D5-2. Dựa trên chính trình tự ban đầu của SP gen α - amylase của chủng D5-2, các

đột biến tại các vị trí mong muốn trên SP này đã đƣợc thiết kế. Bằng các cặp mồi

mang trình tự đột biến mong muốn (Bảng 2.5), các đoạn SP đã đƣợc khuếch đại

bằng PCR sau đó gắn vào vector pHVSusig5.2 đã đƣợc loại bỏ đoạn SP tƣơng ứng.

Các điểm đột biến thiết kế (Hình 3.24) và đặc tính các peptide tính hiệu thiết kế trên

Bảng 3.8. Các vị trí đột biến và tổ hợp gen cũng nhƣ plasmid tạo thành đƣợc trình

bày trong bảng 3.9.

Bảng 3.8. Đặc điểm của các SP đột biến

Ký hiệu SP

Điện tích vùng N*

Độ kỵ nƣớc**(%)

Điểm nhận biết SPase

72,7

A-N-A

SPD 5-2

72,7

A-N-A

SP K3Q

75,8

A-N-A

SPK3QK4I

75,8

A-N-A

SPP12LF14LA15LF17LF21LH22LV24L

72,7

V-N-A

SPA31V

72,7

G-N-A

SPA31G

69,7

C-N-A

SPA31C

Chú thích: * Đƣợc tính toán điện tích với quy ƣớc D, E là -1; R, K là +1, các axit amin còn lại là 0.** Phần trăm các axit amin kỵ nƣớc đƣợc xác định dựa trên đặc tính các axit amin G, A, V, L, I, M, F, W và P là kỵ nƣớc và các axit amin còn lại là ƣa nƣớc

Hình 3.24. So sánh trình tự axit amin của các peptide đột biến.

Chú thích: Những axit amin đƣợc đánh dấu vàng là các vị trí đột biến đƣợc thiết kế

Bảng 3.9. Thành phần của plasmid mang tổ hợp gen đột biến

Plasmid

Đặc điểm gen

Vị trí axit amin thay đổi của SP

Chủng tái tổ hợp

168MpHVD52

pHVN1

Vùng N: K3Q

pHV33+Pgrac+ SP gen α – amylase của chủng B. subtilis D5.2 +3BT2 Mature α – amylase gen

168MpHVN1

pHVN2

Vùng N: K3QK4I

pHV33+Pgrac+SP B. subtilis D5.2K3QK4I+3BT2 Mature α – amylase gen

pHVHcore

168MpHV HCore

Vùng H: P12LF14LA15LF17LF21LH22LV24L

pHV33+Pgrac+SP B. subtilis D5.2+3BT2 Mature α – amylase gen

168MpHVC1

pHVC1

Vùng C: A31G

pHV33+Pgrac+SP B. subtilis D5.2+3BT2 Mature α – amylase gen

168MpHVC2

pHVC2

Vùng C: A31V

pHV33+Pgrac+Signal B. subtilis D5.2+3BT2 Mature α – amylase gen

168MpHVC3

pHVC3

Vùng C: A31C

pHV33+Pgrac+SP B. subtilis D5.2+3BT2 Mature α – amylase gen

Đột biến lựa chọn đƣợc tiến hành trên cả 3 vùng N, H, C của SP gen α -

amylase của chủng dại B. subtilis D5-2. Đột biến trên vùng N, vùng C của SP gen

quan tâm đƣợc tiến hành thông qua phƣơng pháp đột biến điểm có định hƣớng

nhằm thay thế các axit amin ở cả hai vùng này. Trong đó, đột biến axit amin ở vùng

N của SP đƣợc tiến hành bằng việc thay thế hai axit amin K ở vị tri 3 bằng axit

amin Q, axit amin K ở vị trí 4 bằng I nhằm đánh giá hiệu quả tiết thu đƣợc khi làm

giảm điện tích đầu N của SP từ +4 xuống +3 và +2. Đột biến ở đầu N đƣợc tạo bằng

PCR với hai cặp mồi P22 – P10 và P23 – P10 mang đột biến điểm đã thiết kế cho

đoạn sản phẩm PCR khoảng 100 bp (Hình 3.25 A)

Riêng đối với đột biến thiết kế trên vùng H của SP gen α - amylase chủng

B.subtilis D5-2, DNA khuôn dùng để khuếch đại chính là đoạn SPHcore đã đƣợc tổng

hợp bằng con đƣờng hóa học có chứa các điểm đột biến mong muốn đƣợc khuếch

đại với cặp mồi P18 (DABsusigaFXhoI) và P10 (PribasuRsigSacII). Sản phẩm PCR

đƣợc thể hiện trên Hình 3.25B cho thấy đã khuếch đại đƣợc đoạn sản phẩm có chứa

điểm đột biến mong muốn với kích thƣớc khoảng 100 bp tƣơng ứng với kích thƣớc

đoạn SP gen α - amylase của chủng B. subtilis D5-2 đã xác định.

A B

Hình 3.25. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại đoạn peptide tín hiệu mang

trình tự đột biến

Chú thích: 1, Sản phẩm PCR đoạn SP mang đột biến vùng N với vị trí K3Q; 2, Sản phẩm PCR đoạn SP mang đột biến vùng N với vị trí K3QK4I; 4, Sản phẩm PCR đoạn SP mang đột biến vùng tâm H; 5, Sản phẩm PCR đoạn SP mang đột biến vùng C với vị trí A31V; 6, 7 Sản phẩm PCR đoạn gen kép Pgrac- SP mang đột biến vùng C lần lƣợt với vị trí A31G, A31C; 3, 9

Để tiến hành tạo SP mang đột biến điểm định hƣớng ở điểm nhận biết phân

cắt của các SPase I trên vùng C, các cặp mồi đƣợc thiết kế mang một số đột biến tại

điểm cần quan tâm (Bảng 2.5) đƣợc sử dụng. Cặp mồi P18 (DABsusigaFXhoI ) - P25

(RSA31V-SacII ) đƣợc sử dụng để khuếch đại dựa trên DNA khuôn chính là SP đích

nhằm thay thế axit amin A ở vị trí 31 bằng axit amin V với sản phẩm PCR thu đƣợc

có kích thƣớc khoảng 100 bp (Hình 3.25B). Trong khi đó, hai SP mang đột biến tại

vị trí A31G và A31C đƣợc khuếch đại bằng PCR với hai cặp mồi P15 - P26 (RSA31G-

SacII ) và P15 – P27 (RSA31C-SacII ) thu đƣợc có kích thƣớc khoảng 300 bp (Hình

3.25B). Sau khi đƣợc khuếch đại bằng PCR, tất cả các đoạn gen thu đƣợc đều đƣợc

xử lý bằng enzyme cắt giới hạn phù hợp, đƣợc tinh sạch và tiến hành ghép nối với

đoạn vector tạo các plasmid mang SP mong muốn.

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và cắt bằng 2 enzyme XhoI, SacII sau đó

đƣợc ghép vào vector pHVSusigD5.2 và biến nạp vào E. coli. Sàng lọc tìm các

dòng có chứa các vector mang điểm đột biến có hoạt tính amylase (hình 3.27) và

tách plasmid sau đó biến nạp vào B. subtilis 168M. Kết quả PCR cụm gen tái tổ hợp

có chứa các SP đột biến đƣợc thể hiện trên hình 3.26A, Sản phẩm DNA plasmid và

cắt kiểm tra bằng EcoRI của các plasmid có chứa điểm đột biến đƣợc thể hiện trên

hình 3.26B, 3.26C. Mức độ tiết cũng nhƣ hoạt tính amylase của các chủng tái tổ hợp

đƣợc thể hiện Bảng 3.10. Hàm lƣợng protein tiết tổng số của các chủng đột biến

đƣợc thể hiện trên Hình 3.28.

Bảng 3. 10. Khả năng tiết α - amylase và protein tổng số của các chủng tái tổ hợp

Điểm đột biến

Chủng tái tổ hợp

Hoạt tính amylas, U/ml

Hiệu quả tiết (%)

Hàm lƣợng protein tiết tổng số (µg/ml)

Tỷ lệ hoạt tính enzyme/ hàm lƣợng protein tiết tổng số (U/mg)

100

168MpHVD52

Chủng gốc

70,6±3,3 1830,23±20,5

38,57

108,6

168MpHVN1

K3Q

76,7±4,1 1854,17±22,9

41,37

81,3

168MpHVN2

K3QK4I

57,4±4,5 1803,56±10,1

31,83

35,9±3,7 1797,77±21,2

19,97

50,8

168MpHVHC ore

P12LF14LA15LF17LF21 LH22LV24L

A31V

80,1±3,1 1851,29±21,1

43,27

113,5

168MpHVC1

A31G

74,3±2,5 1837,13±24,3

40,44

105,2

168MpHVC2

A31C

56,4±2,3 1809,89±15,0

31,16

79,9

168MpHVC3

Hình 3. 25. Điện di đồ sản phẩm PCR các cụm tổ hợp và cắt kiểm tra plasmid

Chú thích: Pgrac – SP đột biến – đoạn gen α - amylase trƣởng thành của B. licheniformis 3BT2 (A) và sản phẩm tách DNA plasmid mang các tổ hợp đột biến (B) và cắt kiểm tra tổ hợp Pgrac – SP đột biến vùng C (vị trí axit amin A31 thay bằng V)– đoạn gen α - amylase trƣởng thành của B. licheniformis 3BT2 (C)

Hình 3.26. Sàng lọc các dòng mang vector thiết kế thu các chủng có hoạt tính amylase

α-amylase

Hình 3.27. Khả năng tiết amylase ngoại bào của các đoạn peptide tín hiệu đột biến.

Chú thích: 1, 168MpHVD52. 2, 168MpHVN1; 168MpHVN2; 4, Thang protein chuẩn; 5, 168MpHVHcore; 6, 168MpHVC1; 7, 168MpHVC2; 8, 168MpHVC3; 9, 168MpHV33

Kết quả trên Bảng 3.10 cho thấy, có sự khác biệt trong hoạt động tiết enzyme

amylase của các chủng tái tổ hợp. Từ peptide ban đầu, các peptide đột biến tại các

điểm mong muốn đã đƣợc thiết kế và đƣa vào vector pHVSubsig5.2 đã loại bỏ gen

α- amylase ghép giữa SP gen α - amylase của chủng D5.2 và đoạn gen mã hóa cho

α- amylase trƣởng thành của 3BT2 tạo thành hệ vector biểu hiện pHV mới. Vector

biểu hiện pHV bao gồm các thành phần: bộ khung gen của pHV33 và đƣợc bổ sung

thêm Pgrac promoter với một SP chọn lọc và gen mã hóa cho enzyme đích.

Tại điểm đột biến ở đầu N của peptide tín hiệu, các axit amin đƣợc thay thế

nhằm làm giảm điện tích đầu N và từ đó xét sự ảnh hƣởng đến khả năng tiết α-

amylase. Kết quả cho thấy, khi đột biến peptide tín hiệu tại K ở vị trí 3 nhằm thay

thế bằng Q, điện tích đầu N chỉ còn là +3 nhƣng lại làm tăng hoạt tính lên đạt

108,6% so với hoạt tính enzyme tiết đo đƣợc của chủng gốc (76,7±4,1 U/ml) so với

khả năng tiết của SP ban đầu (70,6±3,3 U/ml). Khi làm giảm điện tích đầu N thì

hoạt động tiết giảm xuống, hoạt tính enzyme đo đƣợc ít hơn so với chủng gốc và chỉ

còn khoảng 57,4±4,5 U/ml. Vùng H cũng có ảnh hƣởng đến khả năng tiết enzyme

của chủng vì vậy khi chủng tái tổ hợp 168MpHVHcore mang đột biến thay toàn bộ

các axit amin ở vùng H bằng L chỉ trừ vị trí G ở tâm kỵ nƣớc hoạt tính amylase tiết

giảm xuống còn 50,8% so với khả năng tiết amylase của SP ban đầu. Tại vùng C,

nơi có chứa vị trí nhận biết phân cắt của SPase, có 3 đột biến đƣợc thiết kế đó là lần

lƣợt thay axit amin Ala ở vị trí 31 bằng G, V và C. Kết quả cho thấy, hoạt tính tiết

enzyme ngoại bào thu đƣợc cũng có sự biến động. Tại vị trí G31 và V31 hoạt tính

enzyme đo đƣợc cao hơn so với đối chứng. Hiệu quả tiết amylase của các chủng tái

tổ hợp cao nhất đạt 113,5% so với đối chứng. Đột biến tại C31 cho thấy làm giảm

hẳn khả năng tiết enzyme xuống chỉ còn 79.9% so với đối chứng. Từ những kết quả

trên chủng tái tổ hợp B.subtilis 168MpHVC1 mang tổ hợp vector pHV33 + Pgrac

promoter + SPD5-2 amylase đột biến tại vị trí A31 thay bằng V31 và đoạn gen mã

hóa cho protein amylase trƣởng thành của chủng 3BT2 đƣợc lựa chọn nhằm nghiên

cứu nâng cao hoạt tính tiết enzyme.

3.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN ALPHA AMYLASE CỦA CHỦNG

TÁI TỔ HỢP

Khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme tái tổ hợp của Bacillus đƣợc

biết chịu ảnh hƣởng của một số yếu tố nhƣ: chủng chủ sử dụng, thành phần môi

trƣờng nuôi cấy, phƣơng pháp nuôi cấy, giai đoạn tăng trƣởng tế bào, nhu cầu dinh

dƣỡng, pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy và nồng độ chất cảm ứng…Vì vậy, để có

thể tăng cƣờng hoạt tính amylase của chủng tái tổ hợp, một số điều kiện nuôi cấy cơ

bản đã đƣợc xác định.

3.5.1. Xác định động thái sinh trƣởng và sinh tổng hợp α - amylase của chủng

168MpHVC1

Thí nghiệm xác định động thái sinh trƣởng và sinh tổng hợp α- amylase của

chủng tái tổ hợp 168MpHVC1 đƣợc tiến hành trên môi trƣờng LB lỏng có bổ sung

IPTG 0,01mM và chloramphenicol 20µg/ml, tỷ lệ giống bổ sung là 5%, nuôi cấy ở 37oC trong 48h (0h là thời điểm bắt đầu bổ sung IPTG). Xác định khả năng sinh

trƣởng và hoạt tính tiết α - amylase bằng phƣơng pháp DNSA, hàm lƣợng protein

tiết theo phƣơng pháp Lowry. Kết quả đƣợc trình bày trong Hình 3.29.

Hình 3.28. Động thái sinh trƣởng và sinh tổng hợp α - amylase của chủng

168MpHVC1

Kết quả xác định động thái cho thấy quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp

amylase của chủng tái tổ hợp diễn ra đồng thời. Tốc độ sinh trƣởng của chủng tăng

nhanh và đạt cực đại tại 24h nuôi cấy với OD = 3,78±0,11 và sau đó tiếp tục duy trì

pha cân bằng cho đến 36h thì giá trị OD thu đƣợc bắt đầu giảm đáng kể, đạt

3,67±0,28. Trong khi đó, chủng tái tổ hợp tiết amylase tốt nhất sau 36h nuôi cấy,

đạt 77,3±5,09 U/ml và đến 48h giờ thì hoạt tính tiết đo đƣợc 74,8±4,59 U/ml nhỏ

hơn so với thời điểm 36h. Vì vậy, thời gian tốt cho tiết α - amylase của chủng tái tổ

hợp thích hợp trong khoảng từ 30 – 40h nuôi cấy.

3.5.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng và sinh

amylase của chủng 168MpHVC1

Nhiệt độ nuôi cấy đƣợc biết là một trong những yếu tố ảnh hƣởng rất mạnh

mẽ đến khả năng sinh trƣởng và sinh enzyme của các chủng VSV đặc biệt là các

chủng tái tổ hợp. Chúng là yếu tố rất quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu suất, chất

lƣợng protein tái tổ hợp và tính ổn định của plasmid. Để lựa chọn đƣợc nhiệt độ phù

hợp, chủng nghiên cứu đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB có chloramphenicol

20µg/ml tỷ lệ giống bổ sung là 5%, khi OD600 đạt khoảng 0,6 – 0,8 bổ sung IPTG 0.01mM và tiếp tục đƣợc nuôi ở 28, 30, 37, 45, 50 và 55oC trong 36h. Kết quả cho

thấy, chủng tái tổ hợp cho thấy chịu ảnh hƣởng mạnh mẽ của nhiệt độ đến khả năng

tiết enzyme (Hình 3.30).

Khảo sát khả năng biểu hiện ở dải nhiệt độ này cho thấy, chủng tái tổ hợp sinh trƣởng và tiết enzym quan tâm tốt nhất khi đƣợc nuôi ở nhiệt độ 37oC. Hoạt

tính enzyme đo đƣợc khi nuôi cấy chủng tại nhiệt độ này đạt 72,3±5,66U/ml trong khi đó, ở 55oC, hoạt tính enzyme tiết đo đƣợc chỉ đạt 5,3±1,63U/ml, bằng 7 % so với hoạt tính tiết đƣợc khi nuôi cấy ở 37oC.

Hình 3.30. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1

3.5.3. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết amylase của chủng

168MpHVC1

Chủng 168MpHVC1 mang plasmid tái tổ hợp pHV mới tạo thành có chứa

promoter Pgrac cảm ứng bằng IPTG của vector pHT43 và vì vậy, IPTG cũng chính

là nhân tố cảm ứng cho sinh tổng hợp và tiết α - amylase của chủng này. IPTG đƣợc

bổ sung vào môi trƣờng chọn lọc với các nồng độ sử dụng đa dạng, 0,005; 0,01; 0,1;

1; 2 mM. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết enzyme

của chủng đƣợc thể hiện trên bảng 3.11 và hình 3.31.

Thông qua kết quả trên bảng 3.11 với các nồng độ IPTG khác nhau đƣợc bổ

sung kết quả biểu hiện và tiết amylase cũng khác nhau. Với nồng độ IPTG bổ sung

là 0,01mM, hàm lƣợng amylase xác định đƣợc đạt 78,1±4,81U/ml trong khi càng

tăng dần nồng độ IPTG lên 0,1; 1 và 2mM hoạt tính amylase đo đƣợc thể hiện giá

trị giảm dần chỉ còn khoảng 54% hoạt tính so với khi bổ sung 0,01 mM IPTG

(41,9±3,18 U/ml). Bên cạnh đó, tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết

tổng số của enzyme thu đƣợc cao nhất đạt 42,79 U/mg khi chủng tái tổ hợp đƣợc

nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung chất cảm ứng ở nồng độ này. Tỷ lệ

hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số của enzyme thu đƣợc thấp

nhất 22,85 U/mg khi bổ sung IPTG với nồng độ 2 mM. Chính vì vậy, nồng độ

IPTG tốt nhất để cảm ứng tiết α - amylase của chủng tái tổ hợp là 0.01mM.

Bảng 3. 11. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết amylase của chủng 168MpHVC1

STT Nồng độ IPTG bổ sung, mM Hoạt tính amylase, U/ml Hàm lƣợng Protein tiết tống số, mg/ml

1 2 3 4 5 6 0,005 0,01 0,1 1 2 ĐC 72,3±7,91 78,1±4,81 56,7±1,41 44,5±2,12 41,9±3,18 0 1,813±0,11 1,825±0,13 1,774±0,14 1,816±0,16 1,834±0,18 1,794±0,25 Tỷ lệ hoạt tính enzyme/ hàm lƣợng protein tiết tổng số (U/mg) 39,88 42,79 31,96 24,50 22,85 0

Hình 3. 29. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết α - amylase của chủng tái tổ hợp B. subtilis 168MpHVC1.

Để kiểm tra hàm lƣợng protein tái tổ hợp của các mẫu, tiến hành thu dịch

nuôi cấy kết tủa bằng ethanol và hòa vào cùng một thể tích đệm. Protein tái tổ hợp

đƣợc kiểm tra trên gel polyacrylamide. Kết hợp giữa kết quả trên bảng 3.11 và hình

3.31 thì nồng độ IPTG thích hợp cho biểu hiện gen α - amylase tái tổ hợp trong B.

subtilis 168M là 0,01mM.

3.5.4. Ảnh hƣởng của nguồn N, C lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase

của chủng 168MpHVC1

Để đánh giá ảnh hƣởng của nguồn C, N khác nhau lên khả năng sinh trƣởng

và sinh tổng hợp α - amylase của chủng 168MpHVC1, chủng đƣợc nuôi cấy trên

môi trƣờng LB lỏng, IPTG 0,01 mM, 20 µg/ml chloramphenicol có bổ sung nguồn

C đƣợc sử dụng: tinh bột, glucose, lactose, sucrose, galactose với hàm lƣợng 1% và

nguồn Nitơ nhƣ: NH4NO3, (NH4)2HPO4, NH4H2PO4, (NH4)3PO4, NH4Cl đƣợc bổ

sung riêng lẻ từng chất vào môi trƣờng chọn lọc và nuôi cấy trong 36h, tốc độ lắc 150 V/p ở 37oC. Protein đo đƣợc bằng phƣơng pháp Lowry và hoạt tính enzyme xác

định bằng phƣơng pháp DNSA.

Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của nguồn C lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1

STT Nguồn C

Hoạt tính amylase, U/ml

Mật độ quang, OD600

Hàm lƣợng protein tiết tổng số, mg/ml

Tỷ lệ hoạt tính enzyme/ hàm lƣợng protein tiết tổng số (U/mg)

Tinh bột

3,57±0,12

72,6±1,06

1,857±0,17

39,10

Glucose

3,74±0,2

75,4±3,46

1,824±0,16

41,34

Saccharose

3,79±0,1

73,1±1,77

2,013±0,15

36,31

Galactose

3,61±0,11

77,8±3,11

1,815±0,22

42,87

Lactose

3,47±0,24

81,1±2,97

1,796±0,1

45,16

Kết quả đƣợc thể hiện trên Bảng 3.12 cho thấy, khi môi trƣờng có bổ sung

1% lactose, hoạt tính amyase đo đƣợc là cao nhất đạt 81,1±2,97 U/ml với tỷ lệ hoạt

tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số đạt 45.16 U/mg trên môi trƣờng

chọn lọc có bổ sung sucrose 1%. Đối với các C còn lại, hoạt tính enzyme thu đƣợc

cũng có sự khác nhau khi nguồn C đƣợc sử dụng là khác nhau.

Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của nguồn N vô cơ lên khả năng sinh trƣởng và

sinh tổng hợp amylase của các chủng tái tổ hợp trên Bảng 3.13 cho thấy nguồn N vô

cơ cũng cho thấy có khả năng ảnh hƣởng lên sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp cũng

nhƣ tiết enzyme đích. Với 5 nguồn N sử dụng kết quả cho thấy hàm lƣợng protein

tổng số tiết đạt 1,792±0,11 trong khi hoạt tính amylase đo đƣợc cao nhất 77,3±4,38

U/ml khi sử dụng nguồn N là NH4H2PO4. Tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng

protein tiết tổng số của enzyme tiết bởi chủng tái tổ hợp đạt 43,14 U/mg cao nhất

cũng trên nguồn nitơ này.

Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn N lên khả năng sinh trƣởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1

STT

Nguồn N

Hoạt tính amylase, U/ml

Mật độ quang, OD600

Hàm lƣợng protein tiết tổng số, mg/ml

Tỷ lệ hoạt tính enzyme/ hàm lƣợng protein tiết tổng số (U/mg)

3,77±0,38

70,5±2,97

1,773±0,19

39,76

NH4NO3,

3,63±0,12

75,2±2,75

1,77±0,33

42,49

(NH4)2HPO4

3,55±0,27

77,3±4,38

1,792±0,11

43,14

NH4H2PO4,

(NH4)3PO4,

3,78±0,24

71,7±1,56

1,784±0,12

40,19

3,66±0,02

73,8±2,12

1,819±0,1

40,57

NH4Cl

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ

4.1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN

4.1.1. Phân lập và thu các chủng tuyển chọn có hoạt tính α – amylase

Việc sản xuất của α - amylase bằng cách sử dụng một sinh vật thích hợp và

một môi trƣờng phù hợp cho sản xuất là một thành tích đáng tự hào trong lĩnh vực

công nghệ sinh học. Phân lập và tuyển chọn đƣợc các vi sinh vật tiết α - amylase

ngoại bào thích hợp cho sản xuất là rất cần thiết. Bacillus là một nhóm vi sinh vật

rất phổ biến trong tự nhiên và đặc biệt là trong môi trƣờng đất và đây là nguồn mẫu

thích hợp để có thể thu thập các loài thuộc chi này cho nhiều mục đích nghiên cứu

khác nhau (Xavier et al., 2017; Hassan and Amr., 2009; Mansour et al., 2015;

Patcharaporn et al., 2017). Các thành viên của chi Bacillus đƣợc tìm thấy có khả

năng sinh α - amylase rất đa dạng và đồng thời cũng có khả năng tiết enzym này rất

cao. Luận án này đã tiến hành phân lập 50 mẫu đất khác nhau và thu đƣợc một bộ

sƣu tập với 526 chủng có hoạt tính amylase và từ đó đã sàng lọc đƣợc 130 chủng

thuộc Bacillus có hoạt tính amylase cao. Trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, cũng

có rất nhiều nghiên cứu phân lập thu các chủng thuộc chi Bacillus ở các nguồn khác

nhau (Xavier et al., 2017; Hassan and Amr., 2009; Mansour et al., 2015;

Patcharaporn et al., 2017; Trần Đình Mấn và cs., 2001., Trần Đình Mấn., 2001;

Trần Đình Mấn và cs., 2004; Ngô Xuân Mạnh và cs., 2008, Zhou et al., 2008,

Mathew and Rathnayake ., 2014 ).

Các chủng đã đƣợc thử nghiệm để sản xuất α - amylase bằng nuôi cấy trong

môi trƣờng LB lỏng có bổ sung tinh bột và kết quả cho hoạt tính rất đa dạng. Trong

khuôn khổ luận án này, các mẫu nghiên cứu đƣợc phân lập thu chủng theo phƣơng

pháp phân lập định hƣớng bằng việc xử lý nhiệt và sử dụng môi trƣờng có bổ sung

tinh bột. Mẫu đất phân lập đƣợc xử lý qua nhiệt độ 80°C trong 15 phút có số lƣợng

vi sinh vật sẽ ít hơn do nhiều loài không có bào tử sẽ bị tiêu diệt và chủng phân lập

đƣợc sẽ có khả năng là Bacillus cao hơn do bảo tử có thể chịu nhiệt (Nunes De

Souza et al., 2001; Berendsen et al, 2016). Các chủng có hoạt tính amylase tiết ra

ngoài môi trƣờng cũng có thể quan sát bằng vòng phân giải tinh bột tạo thành.

Bacillus ATCC 27380 đƣợc phân lập từ đất chỉ bị tiêu diệt 90% ở nhiệt độ 125°C

trong 139 giờ và 13-17 giờ ở 138°C. Bào tử của nhiều loài khác đƣợc biết có thể

chịu nhiệt độ đến 125°C từ 5-100 phút (Bond & Favero, 1975). Kết quả phân lập

thu đƣợc các chủng có sự đa dạng về hình thái, màu sắc, chủng loại trong các mẫu

đất là tƣơng tự với sự phân bố của Bacillus trong tự nhiên. Các chủng thuộc chi

Bacillus phân lập ở trên đƣợc đánh giá khả năng sinh α- amylase, đa dạng về tính

chất và mức độ tiết enzyme này vào môi trƣờng nuôi cấy

4.1.2. Protein ngoại bào và hoạt tính α – amylase của các chủng tuyển chọn

130 chủng chọn lọc trong nghiên cứu này đã đƣợc đánh giá hoạt tính enzyme

bằng phƣơng pháp DNSA và xác định hàm lƣợng protein tiết tổng số bằng phƣơng

pháp Lowry. Kết quả phân tích hoạt tính (Bảng 3.2 và Phụ lục 2) của 130 chủng cho

thấy hoạt tính và hàm lƣợng protein tiết của bộ chủng sàng lọc rất đa dạng với phổ

phân bố rộng. Hoạt tính enzyme thu đƣợc thấp nhất 1,52±0.47 U/ml đến cao nhất

đạt 14,23 ±0,52 U/ml. Trong khi hàm lƣợng protein tiết thấp nhất đạt 1016,60±4,35

µg/ml và cao nhất đạt 2129,44±9,96 µg/ml. Tuy nhiên, có sự khác biệt trong mối

tƣơng quan giữa hàm lƣợng protein tiết cũng nhƣ hoạt tính enzyme đo đƣợc bởi có

những chủng lƣợng protein tiết đạt rất cao nhƣ TT2-10 đạt 2129,44±9,96 mg/ml

nhƣng hoạt tính amylase đo đƣợc lại rất thấp chỉ đạt 4,71±0,44 U/ml. Kết quả

nghiên cứu xác định chủng đạt hoạt tính amylase > 10U/ml chiếm 22,31 % (29

chủng) trong khi đó hoạt tính enzyme đƣợc xác định với hàm lƣợng < 5U/ml là

34,62 % (45 chủng) và chiếm ƣu thế nhất vẫn là các chủng có hoạt tính từ 5 ÷ <

10U/ml chiếm 43.07% (56 chủng). Tỷ lệ protein tiết tổng số của các chủng trên

2mg/ml chiếm 2.31 % (3 chủng), tỷ lệ tiết protein tổng số đạt giá trị trong khoảng 1-

2mg chiếm chủ yếu với 97,69 %. Tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein

tiết tổng số của chủng đƣợc xác định cao nhất là D5-2 với 9,29 U/mg. Nhóm chủng

có tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số > 7 U/mg là 15 chủng

chiếm 11,54 %; 39 chủng có tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng

số nằm trong khoảng từ 5 đến dƣới 7 U/mg chiếm 30 % tổng số chủng. Hoạt tính

α-amylase của chủng Bacillus GM8901 khi xác định bằng đƣờng khử là 0,75 U/ml

sau 24h nuôi cấy (Sundarram & Murthy, 2014). Parmar và Ajit Pandya khi phân lập

thu các chủng thuộc chi Bacillus từ đất (vùng Gujarat vidyapith, sadra, Ấn Độ) và

xác định hoạt tính phân giải tinh bột bằng pháp DNSA thì sau 48 h nuôi cấy hoạt

tính chủng dại thu đƣợc mới chỉ đạt trong khoảng 0,045-1,35 U/mL (Parmar &

Pandya, 2012).

Sàng lọc từ bộ chủng phân lập tự nhiên nhằm thu các chủng vừa có hoạt tính

amylase cao, lại vừa có hàm lƣợng protein tiết lớn, hơn nữa lại cần phải có sự đa

dạng về hình thái, đa dạng về chủng loại nhằm đánh giá tốt hơn về ảnh hƣởng của

các peptide đến quá trình tiết của một enzyme gốc sau này. Dựa trên đặc điểm hình

thái cũng nhƣ mối tƣơng quan giữa hoạt tính amylase và hàm lƣợng protein tiết, từ

130 chủng ban đầu đã sàng lọc và xác định phân loại 17 chủng: CN1-5, D1-17, D2-

8, D5-2, D7-4, D8-5, DA23, DA24, GL1-5, RRM3-2, RRM4, RRM5-4, TB1-1,

TB2-1, TR4-1, TR5-2, GL2-3. Trong đó, chủng RRM3-2 thuộc loài B.

methylotrophicus, 1 chủng TR5-2 thuộc loài B. tequilensis. Năm chủng TB1-1, D2-

8, GL1-5, D8-5, RRM4 thuộc loài B. amyloliquefaciens. Chủng GL2-3, D5-2, TR4-

1, D7-4 đƣợc phân loại thuộc loài B. Subtilis. 2 chủng DA23 và DA24 đƣợc phân

loại thuộc vào loài B. licheniformis. Các chủng còn lại là CN1-5, D1-17, TB2-1 và

RRM5-4 thuộc vào loài B. cereus.

Kết quả xác định hoạt tính cũng nhƣ protein tiết tổng số của 17 chủng chọn

lọc đƣợc thể hiện Bảng 3.2 cho thấy, 17 chủng chọn lọc có sự đa dạng về hình thái,

hoạt tính enzyme cũng nhƣ khả năng tiết protein tổng số. Chủng D5-2 có tỷ lệ hoạt

tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số amylase tiết tổng số cao nhất với

9,29 U/mg sau đó đến chủng DA23 với 9,1 U/mg. Số lƣợng chủng tiết tỷ lệ hoạt

tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số tổng số đạt từ 7 U/mg đến dƣới 9

U/mg chiếm chủ yếu với 10 chủng. Khả năng tiết amylase riêng tổng số thấp nhất là

chủng TB2-1 với 3,8U/mg. Trong luận án này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu

ảnh hƣởng của các peptide tín hiệu gen α –amylase của các chủng B. subtilis D 5-2,

100

B. licheniformis DA23, B. cereus CN1-5 lên quá trình tiết α –amylase của chủng B.

licheniformis 3BT2 tái tổ hợp trong B. subtilis 168M. Các đoạn peptide tín hiệu gen

α –amylase của các chủng này đƣợc tách, xác định trình tự axit amin, sự phân bố

của ba vùng N-H-C, độ kỵ nƣớc, điện tích, cũng nhƣ trình tự nhận biết phân cắt của

enzyme phân cắt tín hiệu trên từng chủng

Phần lớn các protein của vi khuẩn đƣợc tổng hợp ở ribosome và khoảng 25 –

30% của các protein này hoạt động bên ngoài tế bào do đó chúng phải đƣợc vận

chuyển tới màng tế bào hoặc thành tế bào để thực hiện đƣợc chức năng. Vỏ ngoài tế

bào phải cho phép và kiểm soát sự tiết của các protein cũng nhƣ các hoạt động nhƣ

một hàng rào bảo vệ để duy trì việc vận chuyển của các phân tử tế bào chất tới

ngoại bào (Leite, 2011; Low et al., 2013). Chúng ta biết rằng, Bacillus là vi khuẩn G+ nên có cơ chế tiết đƣợc biết đến là khác so với E.coli, S. cerevisiae và động vật

có vú. Cho đến nay, có bốn con đƣờng tiết protein đƣợc biết có mặt trong vi khuẩn

Gram âm và Gram dƣơng: Sec-SRP, Tat, qua nhân tố vận chuyển ATP binding

cassette(ABC- transporter) đây là con đƣờng tiết thông qua SP thiếu vùng H (nisin

và pheromone) và con đƣờng Pseudopillin (Tjalsma et al., 2004; Ling Lin Fu et al.,

2007). Sản phẩm protein có thể đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy (Sec/P,

Tat/P, ABC transporter), có thể là tồn tại ở mặt bên của màng tế bào ( Sec/P, Com)

và cũng có thể nằm trên thành tế bào (Sec/P) (Tjalsma et al., 2000a, 2004.). Các

protein ở Bacillus đƣợc tiết vào môi trƣờng nuôi cấy có thể là có SP, hoặc đôi khi

có tồn tại cả những protein không tiết theo con đƣờng cổ điển (non-classically

secreted proteins) vì nó có mặt trong môi trƣờng nhƣng lại không tìm thấy bất kỳ

dấu hiệu tiết nào có liên quan và con đƣờng cụ thể tiết các protein này (Wang et al.,

2016a). Haike và cộng sự đã phát hiện đƣợc 17 protein trong tế bào chất đƣợc tiết

mà không có SP. Tƣơng tự nhƣ vậy, Tjalsma và cộng sự đã liệt kê 24 protein đƣợc

tìm thấy tiết ra ngoại bào mà không có tín hiệu cổ điển và giả thuyết rằng có thể các

protein tiết độc lập trong vi khuẩn có thể phổ biến hơn trƣớc đây (Tjalsma et al.,

2004). Các protein của B.subtilis tiết không theo con đƣờng cổ điển nhƣ: PrsA

101

(Vitikainen et al., 2004), RocA và RocF(Antelmann et al., 2006; Chen et al., 2016).

α – amylase của Bacillus là protein đƣợc tiết theo Sec/P vì vậy nó tuân thủ về cấu

trúc cũng nhƣ hoạt động chung của các SP theo con đƣờng này. Tế bào của Bacillus

có cấu trúc đơn giản và tiết một số loại enzyme ra môi trƣờng nhƣ: proteases,

amylases, levansucrases, RNases,…

Vì thu nhận α – amylase của Bacillus là sản phẩm ngoại bào theo cơ chế tiết

đƣợc biết đến theo Sec/P-SRP. Quá trình tiết protein của Bacillus phụ thuộc vào các

yếu tố: (1) các chaperon của tế bào chất (cytosolic chaperones); (2) bộ máy vận

chuyển (SecA, SecY, SecE, SecG, và SecDF-YajC); (3) các enzyme phân cắt

peptide tín hiệu (SPase) phân cắt SP của preprotein tạo thành đoạn trƣởng thành;

(4) các enzyme phân cắt các enzym phân cắt tín hiệu (hay còn gọi là SPPase) phân

cắt các SPase sau khi SP đã bị cắt khỏi preprotein trên màng; (5) các nhân tố gấp

cuộn (folding factors). Có rất nhiều công trình nghiên cứu đã công bố về SP của

Bacillus (Kolkman et al., 2008; Igarashi et al., 1998; Borchert & Nagarajan, 1991a;

Heng et al., 2005b; Low et al., 2012; Tjalsma et al., 2000a; Jonet et al., 2012;

Sakakibara et al., 1993).

4.1.3. Tách dòng các peptide tín hiệu ở Bacillus và đánh giá vai trò của các axit

amin trong trình tự này với quá trình tiết protein

Các SP của gen α - amylase từ 3 chủng tự nhiên đã phân loại đến loài B.

licheniformis DA23, B. subtilis D5-2, B. cereus CN1-5 đã đƣợc tách và xác định

trình tự thành công. Các trình tự SP thu đƣợc cần đƣợc phân tích làm sáng tỏ cấu

trúc 3 phần của chúng và để thực hiện điều này, có rất nhiều chƣơng trình xử lý cho

trình tự SP nhƣ: SignalP, PrediSi, SPEPlip, Signal-CF, Signal-3L, Phobius, SIG-

Pred, OCTOPUS, Signal-BLAST và SPdb (Low et al., 2013). Tuy nhiên, hiệu quả

nhất vẫn là SignalP3.0 và hiện nay đã đƣợc nâng cấp lên phiên bảng SignalP4.1

(Zhang et al., 2017). SignalP là chƣơng trình đƣợc sử dụng để dự đoán các SP thực

tế và vị trí phân cắt của các tín hiệu peptidase I (SPase I). Khi phân tích tìm chuỗi

SP từ SignalP kết quả bao thu đƣợc gồm ba điểm khác nhau C, S và Y. S-score

dùng để dự báo tín hiệu peptide đƣợc báo cáo. Đối với mỗi lớp sinh vật có hai mạng

102

lƣới khác nhau đƣợc sử dụng trong SignalP: một cho việc dự đoán các SP thực tế và

một cho việc dự đoán vị trí phân cắt của các tín hiệu peptidase I (SPase I). Chƣơng

trình phân tích tìm chuỗi SP từ SignalP kết quả bao gồm ba điểm khác nhau C, S và

Y. Hai điểm bổ sung đƣợc báo cáo trong kết quả phân tích của SignalP là S-mean

và D-score là những kết quả giá trị số. S-score dùng để dự báo tín hiệu peptide đƣợc

báo cáo cho từng vị trí amino acid trong chuỗi cần phân tích và với số điểm cao chỉ

ra rằng các axit amin tƣơng ứng là một phần của một SP, và điểm số thấp chỉ ra

rằng các axit amin là một phần của một protein trƣởng thành. C-score là vị trí phân

cắt của SP và đối với mỗi vị trí trong chuỗi phân tích tại nơi cắt của chuỗi SP C-

Score sẽ tăng cao. Y-max cùng với C-score và S-score giúp chúng ta dự đoán vị trí

phân cắt của SP tốt hơn khi ta chỉ sử dụng C-score riêng lẻ bởi đôi khi C-score có

thể có nhiều điểm đạt đỉnh cao trong một chuỗi axit amin. Các vị trí phân cắt đƣợc

gán từ Y-score max và nơi độ dốc của S-score là dốc kết hợp củng C-score cao. S-

mean là trị số trung bình của các S - score, từ các axit amin N-terminal để các axit

amin đƣợc giao với số điểm Y-max cao nhất, do đó số điểm S-trung bình đƣợc tính

cho chiều dài của các SP dự đoán. Các D-score trong phiên bản SignalP này đƣợc

thực hiện nhƣ một giá trị trung bình của S-mean và Y-max nhằm thể hiện protein

tiết và không tiết. Đối với protein không tiết tất cả các điểm biểu diễn trong đầu ra

SignalP rất thấp.

Đối với chủng B. licheniformis DA23, kết quả đọc trình tự gen cho thấy,

đoạn gen đích của chủng này tƣơng đồng 99% với đoạn gen α-amylase của chủng

B. licheniformis RH 101 (DQ517496.1) trên ngân hàng gen. Đoạn peptide tín hiệu

bao gồm 30 axit amin và điểm phân cắt có trình tự A-A-A nằm giữa aa 30 và 31

trong trình tự peptide tín hiệu của chủng này sau đó đến đoạn α-amylase trƣởng

thành (mature protein) và điểm khởi đầu của đoạn mature protein sẽ là axit amin thứ

31 trong chuỗi axit amin đích. Điều này rất tƣơng đồng với vị trí nhận biết A – X –

A cho Spase type I của Bacillus và phù hợp với công bố về vị trí phân cắt của

peptide tín hiệu gen α-amylase của B. licheniformis đã công bố (Stephens et al.,

1984).

103

Chủng B. subtilis D5-2 có chứa trình tự đoạn gen từ mã khởi đầu đến vùng

bảo thủ 1 tƣơng đồng 98% với đoạn gen mã hóa cùng vị trí của gen α-amylase của

B. subtilis B1 (AIU77970.1). SP gen α - amylase của B. subtilis D5-2 có chứa 33

axit amin tƣơng tự với những công bố trƣớc đây về vị trí cắt của enzyme phân cắt

SP của loài này (Sakakibara et al., 1993). SP cho gen α - amylase của B. subtilis

đƣợc biết đến bao gồm 33 axit amin và sau điểm phân cắt -1 ở gen α-amylase

(AmyE) của B. subtilis đƣợc biết là tồn tại một propeptide ngắn và đoạn này hiện

chƣa rõ đƣợc chức năng (Kakeshita et al., 2012).

Đoạn gen đích của chủng B. cereus CN1-5 thu đƣợc tƣơng đồng 98% với

đoạn gen mã hóa cùng vị trí của gen α– amylase của chủng B. cereus

(|EU380314.1|). Kết quả phân tích bằng SignalP cho thấy, gen α-amylase của chủng

CN1-5 có SP với độ dài 27 axit amin. Vị trí phân cắt của chuỗi peptide tại axit amin

thứ 27 và 28 với trình tự nhận biết là A-Y-A.

Cả ba đoạn gen có chứa trình tự tín hiệu cho gen α - amylase của D5-2,

DA23 và CN1-5 đã đƣợc đăng ký trên NCBI với mã số lần lƣợt là KU214589

(protein ID: AND80846.1), KU214590 (protein ID: AND80847.1), KU214591

(protein ID: AND80848.1). Vị trí cắt enzyme SPase I trên màng tế bào đối với B.

subtilis thông thƣờng là A-X-A tại vị trí -3 và -1. Những vùng này cho thấy vai trò

nhân tố quan trọng của trong quá trình phân cắt của các cơ chất đặc trƣng nhƣ kiểu

“A – X – A” và cả ba chủng đều tuân theo cơ chế cắt này vì đều có điểm nhận biết

đặc trƣng cho SPaseI. Vị trí phân cắt của enzyme SPase I là A-Y-A (chủng CN1-5),

A-A-A (DA23) và A-N-A (chủng D5-2), và vị trí này vẫn theo sự bảo thủ A-X-A

của Bacillus. Các SP của Bacillus có độ dài rất đa dạng, khoảng từ 18 – 40 axit

amin và không có sự bảo thủ về trình tự. Các protein ngoại bào tiết trƣớc khi tiết ra

ngoài môi trƣờng đƣợc một enzyme trên màng nhận biết phân cắt đoạn SP (SPase I)

nằm tại vùng C (Duffy et al., 2010; Pechsrichuang et al., 2016; Low et al., 2013;

Borchert &Nagarajan, 1991b; Tjalsma et al., 2000b; Leite, 2011). Vị trí axit amin -3

có thể đƣợc thay thế bằng: Valine, Threonine, Leucin và Isoleucin. Về trình tự tại

điểm nhận biết, trình tự bảo thủ A - X – A đƣợc xem nhƣ điểm nhận biết chính cho

104

con đƣờng này chiếm khoảng 71% trong các SP. Ngoài ra, 18% các SP có điểm

nhận biết để phân cắt có trình tự V – X – A (van Roosmalen et al., 2004; Tjalsma et

al., 2000b).

Trình tự SP là nhân tố giữ vai trò quan trọng quyết định nhất đến quá trình

vận chuyển và tiết protein. Chính vì vậy có thể nghiên cứu quá trình tiết và thay đổi

khả năng tiết protein dựa vào các trình tự peptide khác nhau. Giữa các SP không có

sự bảo thủ về trình tự và chúng cũng có sự sai khác về độ dài. Tuy nhiên, chúng

đƣợc nhận biết và vận chuyển bởi một số con đƣờng cụ thể.

Khi tiến hành so sánh các đoạn peptide tín hiệu của 3 loài này, kết quả cho

thấy có sự khác biệt về trình tự peptide của gen α - amylase của chúng, trong trƣờng

hợp này là B. cereus, B. licheniformis và B. subtis và điều này cũng tƣơng đồng với

các công bố đƣa ra về đoạn SP của gen này. Dựa trên nghiên cứu cho thấy, cả 3

peptide tín hiệu mã hóa cho gen α-amylase của 3 loài thuộc chi Bacillus đa dạng về

số lƣợng cũng nhƣ trình tự axit amin. Số lƣợng axit amin lần lƣợt là 27, 30, 33 axit

amin ở đoạn SP của chủng CN1-5, DA23, D5-2. Khi phân tích tính toán độ kỵ nƣớc

của các SP, chủng D5-2 cho thấy có chứa các axit amin kỵ nƣớc là cao nhất 24

trong tổng số 33 axit amin, chiếm 73%. Độ kỵ nƣớc của SP gen α-amylase từ chủng

DA23 là thấp nhất (60%).

Trong ngân hàng gen thế giới, số lƣợng các gen α –amylase của các loài

cũng nhƣ của chi Bacillus là rất lớn. Tuy nhiên, dữ liệu công bố của các nghiên cứu

chỉ tách riêng các trình tự peptide tín hiệu của các gen này thì lại không nhiều bởi

các nghiên cứu công bố chủ yếu là trình tự gen đầy đủ mã hóa cho α –amylase

nhằm mục đích tái tổ hợp nên các trình tự SP của gen này không đƣợc phân tích kỹ

lƣỡng và ít đƣợc đề cập đến. Trong luận án này, chúng tôi chủ yếu chỉ tập chung

vào phân tích các trình tự SP của gen α –amylase ở các loài thuộc chi Bacillus phân

bố trong các nguồn đất tự nhiên của một số vùng địa phƣơng khác nhau ở Việt

Nam. Thông qua nghiên cứu này, bƣớc đầu tạo nên bức tranh đánh giá đầy đủ về

peptide tín hiệu gen α –amylase ở ba loài B. subtilis, B. licheniformis và B. cereus

105

thông qua ba chủng chọn lọc B. subtilis D 5-2, B. licheniformis DA23, B. cereus

CN1-5.

Dựa trên tất cả các phân tích của 03 trình tự peptide tín hiệu thu đƣợc khẳng

định α - amylase của cả ba chủng chọn lọc thuộc ba loài khác nhau của chi Bacillus

đã đƣợc tiết theo Sec/P với điểm nhận biết phân cắt của enzyme phân cắt tín hiệu

đặc trƣng của SPase loại I với trình tự A – X – A. Ngoài ảnh hƣởng bởi yếu tố SP

trong quá trình tiết protein của Bacillus trong nghiên cứu này, các yếu tố khác nhƣ

SPPase, bộ máy tiết… cũng đƣợc biết ảnh hƣởng rất nhiều đến lƣợng protein thu

đƣợc trong các con đƣờng tiết đƣợc thể hiện trong các công trình đã công bố (Chu

H. H., 2001; Brockmeier , 2006).

4.2. KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN α–AMYLASE VỚI CÁC PROMOTER KHÁC NHAU

Promoter giúp khởi động cho quá trình biểu hiện protein vì vậy chúng đóng

vai trò rất lớn trong quá trình biểu hiện một protein tái tổ hợp. Nhiệm vụ của các

nhà nghiên cứu khi thiết lập hệ thống chủng chủ - vectơ – gen α-amylase là phải

đảm bảo đƣợc sự phù hợp cho gen mã hóa protein đƣợc biểu hiện tốt ở chủng tái tổ

hợp. Để gen biểu hiện đƣợc thì việc lựa chọn đƣợc loại promoter thích hợp và đủ

mạnh là yếu tố cần thiết. Sự biểu hiện của các protein khác nhau phụ thuộc rất nhiều

vào chất cảm ứng và nồng độ của các chất cảm ứng này. Nhìn chung có ba loại

promoter đƣợc sử dụng để điều hòa biểu hiện gen trong đó có gen α-amylase:

Promoter nhạy cảm với các tác nhân vật lý (nhiệt độ hoặc oxy hòa tan), Promoter

nhạy cảm với các tác nhân hóa học, Promoter đƣợc điều hòa bằng thành phần dinh

dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy chủng chủ mang gen ngoại lai. Tùy thuộc bào loại

promoter đƣợc tổ hợp với gen ngoại lai, các yếu tố thƣờng đƣợc sử dụng để điều

hòa có hiệu quả quá trình biểu hiện gen α-amylase: chất cảm ứng, nồng độ của cơ

chất, nhiệt độ, nồng độ oxy hòa tan, các acid amin và các tác nhân khác.

Vector lựa chọn cho nghiên cứu này là vector pHV33 và để có một hệ biểu

hiện tốt cần có promoter mạnh mà vector này lại không mang promoter. Chính vì

vậy, hai promoter đã đƣợc so sánh khả năng tiết enzyme tái tổ hợp trong luận án

này là promoter Pgrac và PAmy. Với việc sử dụng hai promoter này cho thấy mức độ

106

biểu hiện khác nhau. Khi sử dụng promoter Pamy không cần sử dụng chất cảm ứng vì

có sẵn trong tế bào bản địa nhƣng Promoter Pgrac đƣợc thiết kế cảm ứng bằng IPTG.

Pgrac là promoter cho phép điều hòa biểu hiện vƣợt mức protein nội bào lên đến

16% protein tổng (Huỳnh Kiều Thanh và cs., 2014) và đƣợc sử dụng làm promoter

gốc để nghiên cứu cải tiến các promoter mới cho khả năng biểu hiện cao hơn nhƣ

Promoter Pgrac100 (Phan et al., 2015) và Pgrac212 (Huỳnh Kiều Thanh và cs.,

2014).

Khi nghiên cứu đánh giá ảnh hƣởng của các promoter khác nhau lên khả

năng biểu hiện tiết α - amylase của chủng ở luận án này cho thấy, với promoter

PAmyvà Pgrac thì promoter Pgrac cho thấy có khả năng biểu hiện tiết enzyme trong B.

subtilis 168M mạnh hơn so với promoter PAmy khi cùng đƣợc đƣa vào vector

pHV33. Chủng B. subtilis 168MPgrac (mang tổ hợp pHV33–PgracAmy3BT2) cho

hoạt tính α - amylase sau 36h nuôi cấy đạt 71,4±6,3 U/ml trong khi biểu hiện ở B.

subtilis 168MPamy (mang tổ hợp pHV33–PamyAmy3BT2) chỉ đạt 53,2±5,5 U/ml.

Với promoter Pgrac, chủng tái tổ hợp biểu hiện enzyme mạnh hơn và cho thấy tiết

hàm lƣợng amylase với tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số

đạt 38 U/mg cao hơn khi biểu hiện enzyme này với hệ vector sử sụng promoter

PAmy. Điều này cho thấy rõ ràng là Pgrac là promoter biểu hiện mạnh hơn so với

PAmy bởi hoạt tính enzyme đo đƣợc ở thí nghiệm trên khi sử dụng vector này cao

hơn 1,3 lần so với hoạt tính enzyme đo đƣợc khi sử dụng PAmy.

Tác giả Huỳnh Kiều Thanh và nhóm nghiên cứu đã nghiên cứu sử dụng

promoter Pgrac212 đƣợc chọn lọc từ thƣ viện với hơn 80 promoter cải biên từ

promoter Pgrac ban đầu để tạo plasmid pHT1200 (Pgrac212- amyQ) nhằm khảo sát

khả năng tăng cƣờng sự biểu hiện tiết của protein chỉ thị AmyQ. Kết quả cho thấy,

thiết kế Pgrac212-amyQ cho khả năng biểu hiện tiết α-amylase hiệu quả hơn Pgrac-

amyQ ở cả hai chủng B. subtilis 1012-có biểu hiện protease ngoại bào và B. subtilis

WB800N-mang đột biến bất hoạt tám protease ngoại bào. Nghiên cứu này chứng tỏ

Pgrac212 là một promoter mạnh có tiềm năng ứng dụng để biểu hiện các protein tiết

khác trong B. subtilis (Huỳnh Kiều Thanh và cs., 2014).

107

Ying và cs cũng đã sử dụng phƣơng pháp thay thế các promoter khác nhau

trên một vector biểu hiện để có thể đánh giá ảnh hƣởng của các promoter này lên sự

biểu hiện hoạt tính amylase siêu bền nhiệt và đã đánh giá thành công các promoter

khác nhau cũng có sự ảnh hƣởng khác nhau đến quá trình biểu hiện và tiết enzyme.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của các promoter khác nhau lên khả năng biểu hiện enzyme

α - amylase siêu bền nhiệt của Thermococcus sp. HJ21 trong B. subtilis DB104.

Nhóm tác giả đã sử dụng 4 promoter: Pgrac , PxylA , Phag và P43 đƣợc sử dụng để đánh

giá khả năng tiết của enzyme này trong các vector pHTPxylA – Amy, pHTPhag-

Amy, pHT01-Amy (Pgrac) và pHTP43. Kết quả cho thấy trong 4 promoter thì

PxylA là mạnh nhất (Ying et al., 2012).

Điện di đồ protein SDS-PAGE sản phẩm α - amylase của 2 chủng tái tổ hợp

cho thấy, gen α - amylase nghiên cứu khi thu hồi bằng chủng tái tổ hợp 168M có sử

dụng vector pHV33 với hai promoter khác nhau đều cho sản phẩm α - amylase có

kích thƣớc nhƣ nhau chỉ khác nhau về hàm lƣợng. Kết quả điện di SDS-PAGE và

zymogram của enzyme này, có thể kết luận gen α - amylase của chủng B.

licheniformis 3BT2 đƣợc tái tổ hợp trong B. subtilis 168M có kích thƣớc khoảng

58kDa. Gen α - amylase B. licheniformis đƣợc biết đến có khối lƣợng phân tử

khoảng 58 – 64 kDa và hoạt động ở pH từ 6.0 – 8.0 và nhiệt độ tối ƣu trong khoảng từ 50 – 90oC tùy thuộc vào từng chủng và chúng có tính chất rất khác nhau, có loại

kiềm tính, có loại chịu axit và có loại lại hoạt động ở pH trung tính (Pandey et al.,

2000). Bên cạnh đó cũng có những chủng B. licheniformis sinh ra α-amylase có tính

chất rất khác biệt nhƣ chủng TRBF 14 có pHopt ở vùng kiềm 7,5 ÷ 9,5; chủng AK-

2 có t˚opt ở 80˚C và đặc biệt là có vùng pH rất rộng 6,5 ÷ 10. Một số α-amylase của

các chủng thuộc B. licheniformis đã đuợc xác định trình tự và nghiên cứu cấu trúc

để xác định cơ chế bền nhiệt của α-amylase (Nakajima et al., 1985).

4.3. SÀNG LỌC CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU

HIỆN TRONG B. subtilis 168M

Trong khuôn khổ luận án, chúng tôi đã sàng lọc đƣợc 3 peptide tín hiệu gen

α - amylase của ba chủng B. licheniformis DA23, B. subtilis D5-2, B. cereus CN1-5

108

và đã đƣợc đăng ký trên NCBI với mã số lần lƣợt là KU214589 (protein ID:

AND80846.1), KU214590 (protein ID: AND80847.1), KU214591 (protein ID:

AND80848.1). Trình tự SP của cả 3 chủng khi phân tích trên trang

http://phobius.sbc.su.se/ cho thấy: Chủng DA23 có đoạn trình tự SP gồm 3 vùng:

Vùng N bao gồm các axit amin từ vị trí thứ 1 đến axit amin thứ 11, vùng H có 12

axit amin và kéo dài từ axit amin thứ 12 đến axit amin 23 và vùng C là 7 axit amin

còn lại (vị trí thứ 24 đến 30) và mang điện tích +4. Trong khi đó, kết quả phân tích

trình tự SP của chủng D5-2 lại cho thấy SP gồm 33 axit amin với 3 vùng: N dài 9

axit amin (axit amin thứ 1-9), vùng H có 16 axit amin từ vị trí thứ 10 đến axit amin

thứ 25 và vùng C dài 8 axit amin từ axit amin thứ 26 đến axit amin 33. Riêng đối

với chủng CN1-5, đoạn SP của gen α - amylase chỉ bao gồm 27 aa trong đó vùng N

rất ngắn mang điện tích +2 chỉ bao gồm có 4 axit amin (từ axit amin thứ 1-4), vùng

H có 12 axit amin (từ axit amin thứ 5-16) và cuối cùng là vùng C gồm 11 axit amin

(từ axit amin thứ 17 - 27). Điều này cho thấy rằng sự khác biệt giữa trình tự axit

amin cũng nhƣ trình tự nucleotide mã hóa cho SP trong α –amylase của các loài

thuộc chi Bacillus là không giống nhau. Kết luận này không chỉ phù hợp với

enzyme nghiên cứu mà nó còn cho thấy đúng đối với các enzyme khác đƣợc tiết

theo Sec/P và đƣợc kiểm chứng bằng phân tích so sánh dựa trên trình tự enzyme đã

đăng ký trên ngân hàng gen. Đây là sự đa dạng về trình tự SP và là cơ sở cho việc

nghiên cứu đánh giá ảnh hƣởng của các SP gen α - amylase của các loài khác nhau

đến khả năng tiết enzyme này trên cùng một gen α - amylase đích của một loài nào

đó thuộc chi Bacillus. SP đóng một vai trò rất quan trọng trong sự vận chuyển của

các protein tiết bởi Sec/P. Các SP tƣơng tác với các protein SecA, điểm nhận biết

tín hiệu (SRP), và các Spase (Harwood & Cranenburgh, 2008). Sự tƣơng tác giữa

các SP và protein trƣởng thành cũng đƣợc biết là ảnh hƣởng đến quá trình tiết

protein (Low et al., 2013; Harwood & Cranenburgh, 2008). Vì vậy, sự lựa chọn một

SP hiệu quả cho quá trình tiết protein mục tiêu bất kỳ đặt ra là vô cùng quan trọng,

và một vài phƣơng pháp để xác định các trình tự tín hiệu hiệu quả cho các protein

đích khác nhau đã đƣợc thực hiện (Borchert & Nagarajan, 1991a; Brockmeier et al.,

109

2006a; Caspers et al., 2010a). Chúng tôi đã tiến hành tái tổ hợp các SP trên cùng

một gen đích để loại trừ ảnh hƣởng của hoạt tính riêng đến hoạt tính amylase tổng.

Hoạt tính riêng của α – amylase ở B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus là khác

nhau do sự khác nhau của các enzyme này trên các chủng là khác nhau vì vậy trong

nghiên cứu này sử dụng một đoạn gen đích chung là đoạn gen α-amylase trƣởng

thành của chủng B. licheniformis 3BT2. Hơn nữa, trong cùng một loài, hiệu quả tiết

của protein với các SP khác nhau là khác nhau và quá trình tiết có thể bị ảnh hƣởng

bởi các SP này (Fan et al., 2011; Heng et al., 2005). Chính vì vậy, hệ thống phức

hợp biểu hiện đƣợc phát triển dựa trên việc sàng lọc SP phù hợp cho protein đích

của gen α - amylase của B. licheniformis 3BT2 từ các trình tự SP của các gen α - từ

bộ chủng dại ban đầu đƣợc đƣa vào hệ thống biểu hiện trong nghiên cứu này. Để

đánh giá khả năng tiết của các SP của một gen có nguồn gốc từ Bacillus thì phải

chọn chính một chủng cũng có nguồn gốc từ chi này làm chủng tái tổ hợp và chủng

chủ đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu này là B. subtilis 168M. Thông qua quá trình

tiết α - amylase tái tổ hợp trong chủng chủ Bacilus có thể sàng lọc đƣợc các peptide

mạnh và đánh giá mức độ biểu hiện cũng nhƣ xác định hàm lƣợng protein tiết đƣợc

ra môi trƣờng sẽ có tính chính xác cao hơn. Trong 3 SP gen α - amylase của các

chủng D5-2, CN1-5, DA23 đƣợc sàng lọc đánh giá khả năng tiết trên đối tƣợng đích

là α - amylase của chủng 3BT2, 4 tổ hợp gen đã đƣợc tạo thành bao gồm: pHV33-

Pgrac-3BT2Amyfull (pHVAmy3BT2), pHV33 – Pgrac – ScereusCN15 - 3BT2mature

(pHVCeSig15), pHV33 – Pgrac – SsubtilisD5.2-3BT2mature (pHVSuSig5.2), pHV33 –

Pgrac – SlicheniformisDA23 - 3BT2mature (pHVLiSig23) đƣợc biến nạp trong B. subtilis

168M. Hiệu quả biểu hiện hoạt tính amylase của các chủng 168MSubsig52,

168MCeSig15, 168Mlisig23, 168M3BT2 có mang các SP khác nhau là khác nhau.

Trong 3 trình tự peptide sử dụng, SP có nguồn gốc từ gen α - amyalse của chủng B.

subtilis D5-2 trong chủng tái tổ hợp 168MSubsig52 cho hiệu quả tiết amylase cao

hơn cả đạt 76,4 ± 3,7 U/ml với tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết

tổng số của enzyme đạt 40,9±3,13 U/mg. Tổ hợp gen với trình tự SP của B. cereus

CN1-5 (B. subtilis 168M - pHV33 – Pgrac – ScereusCN15 - 3BT2mature) cho hoạt

110

tính amylase là thấp nhất, chỉ đạt 47,7 U/ml với tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm

lƣợng protein tiết tổng số đạt 26,9±2,23 U/mg. Hiệu quả tiết α - amylase đích của

các chủng tái tổ hợp mang SP Samy D5-2 , Samy DA23, Samy CN1-5 lần lƣợt đạt 112%,

104% và 70% so với hoạt tính amylase đo đƣợc của chủng 168M3BT2 mang petide

tín hiệu α - amylase tự nhiên Samy 3BT2 của chủng gốc B. licheniformis 3BT2. Với

việc thay thế SP tiết phù hợp cho gen, hiệu quả tiết đã đƣợc nâng lên bằng chứng là

hoạt tính của chủng nghiên cứu tăng 1,1 lần so với khả năng tiết enzyme trên SP

gốc. Ngƣợc lại, nếu SP không phù hợp cũng sẽ làm giảm hoạt tính tiết enzyme nhƣ

trƣờng hợp SP gen α-amylase của chủng CN1-5 (hoạt tính giảm từ 68,6 U/ml xuống

còn 47,7 U/ml).

Để tăng sản phẩm protein thu hồi điều quan trọng trƣớc tiên phải hiểu đƣợc

chìa khóa nhằm kiểm soát mức độ biểu hiện gen. Từ DNA – RNA – Protein là cả

một quá trình. Các protein tạo ra có thể ở dạng thể vùi hoặc bị phân hủy bởi các

protease. Để có thể tiết các protein ra môi trƣờng nuôi cấy, cần phải có các yếu tố:

sự tƣơng tác của các preprotein với các chaperon để hình thành lên kênh vận chuyển

và và liên kết với bộ máy vận chuyển; sự vận chuyển các protein qua màng tế bào

chất thông qua nhân tố vận chuyển; quá trình phân cắt các SP của SPase, và sự gấp

cuộn của các protein sau khi đƣợc giải phóng (Simonen & Palva, 1993; Li et al.,

2004). Có năm yếu tố đƣợc biết đến có ảnh hƣởng đến quá trình biểu hiện và tiết

của một protein trong hệ thống biểu hiện của B. subtilis bao gồm: quá trình phiên

mã, sự gấp cuộn của protein, quá trình vận chuyển protein qua màng, quá trình phân

cắt các SP và proteolysis (sự phân hủy của protease). Thông qua sự hiểu biết về các

yếu tố này, các nhà nghiên cứu có thể tăng cƣờng mức độ biểu hiện protein trong hệ

thống biểu hiện của B. subtilis. Rất nhiều công trình đã nghiên cứu tăng tiết enzyme

tái tổ hợp bằng việc sàng lọc thƣ viện SP từ B. subtilis và đem lại kết quả khả quan

với hoạt tính enzyme cũng nhƣ protein tiết thu đƣợc tăng lên rất nhiều lần

(Degering et al., 2010a; Ying et al., 2012; Fan et al., 2011; Zhang et al., 2016).

Degering et al đã nghiên cứu tăng tiết enzyme tái tổ hợp bằng việc sàng lọc

thƣ viện SP từ B. subtilis và B. licheniformis từ hơn 400 SP cho quá trình tiết

111

subtilisin BPN’ của B. amyloliquefaciens trong B. subtilis. Và kết quả cho thấy, các

enzyme tái tổ hợp tiết nhiều hơn khi sử dụng các SP của B. licheniformis. Trong đó,

có 8 SP cho lƣợng enzyme biểu hiện tăng 350 – 750 lần so với tiết của SP tự nhiên

trong B. amyloliquefacien. 8 tổ hợp SP và subtilisin này đƣợc chuyển vào biểu hiện

trong 2 chủng B. licheniformis. Kết quả biểu hiện đƣợc so sánh giữa 2 chủng B.

licheniformis với các chủng B. subtilis và giữa 2 chủng B. licheniformis với nhau

(Degering et al., 2010). Fan và cộng sự (Fan et al., 2011) đã chứng minh sàng lọc

các SP là cách hiệu quả để tối ƣu hóa việc tiết protein ở B. subtilis. Dựa trên nghiên

cứu này, một vector sàng lọc đƣợc xây dựng cho các SP từ B.subtilis. Gen đích

kháng xylanase kiềm (XynA từ vi khuẩn B. pumilus đƣợc biến nạp vào E. coli và B.

subtilis bằng vector pGJ148 có promoter Pglv cảm ứng maltose và gen kháng kháng

sinh. Tổng số 24 loại SP tiết theo Sec/P đƣợc khuếch đại từ B. Subtilis 1A747 và

đƣợc đƣa vào vector sàng lọc cho sự biểu hiện của xynA trong B. subtilis WB700

và xylanase đã đƣợc phát hiện trong dịch nuôi cấy sau khi ủ 24h. Việc kiểm tra của

các SP cho thấy sự khác biệt trong hoạt động tiết xylanase trong môi trƣờng nuôi

cấy, và chủng tái tổ hợp chứa SP YnfF cho thấy có hoạt tính tiết xylanase cao nhất

(37,2 IU / mL). Nghiên cứu ảnh hƣởng của SP khác nhau lên khả năng tiết α -

amylase siêu bền nhiệt của Thermococcus sp. H21 trong B. subtilis của Ying và

cs(Ying et al., 2012) khi sử dụng vector pHT01 đƣợc thay thế Pgrac bằng PxylA và sử

dụng 4 loại SP khác nhau: SAmyQ , SEpr, SYncM và SP của chính gen amylase của

Thermococcus HJ21 (Samy) cho thấy SAmyQ là SP tiết mạnh nhất trong 4 trình tự SP

nghiên cứu. Hiệu quả tiết α - amylase của các SP SAmyQ, SEpr, SYncM lần lƣợt đạt

110%, 93% và 103% so với khả năng tiết enzyme này với SP - Samy của chủng dại.

Cai Heng và cộng sự năm 2005 cũng đã nghiên cứu ảnh hƣởng của SP và promoter

lên biểu hiện α - amylase của B. licheniformis trong B. subtilis. Kết quả nghiên cứu

của nhóm tác giả này cho thấy trong hai hệ vector thì vector chứa promoter và trình

tự tín hiệu của SacB cho hiệu quả biểu hiện enzyme đạt 2012 U/ml sau 21 h nuôi

cấy cao gấp đôi so biểu hiện enzyme amylase B. licheniformis (1001 U/ml) dƣới sự

điều khiển của promoter SacB nhƣng chỉ thay bằng trình tự tín hiệu tự nhiên của

112

chính gen này (Heng et al., 2005b). Trong nghiên cứu nỗ lực nhằm tăng cƣờng khả

năng tiết subtilisin của B. amyloliquefaciens trong B. subtilis và B. licheniformis,

nhóm tác giả Degering đã sử dụng 173 SP có nguồn gốc từ B. subtilis và 220 SP từ

B.licheniformis. Kết quả từ 1800 clone đã thu đƣợc 900 clone có hoạt tính protease

và từ đó chọn đƣợc 8 SP làm tăng tiết protein quan tâm. Với các SP này, protein

đích đƣợc biết đến tăng tiết ở cả 2 chủng chủ B. subtilis và B. licheniformis

(Degering et al., 2010). Tối ƣu hóa khả năng tiết của xylanase chịu kiềm trong B.

subtilis bằng sàng lọc thƣ viện SP của nhóm tác giả Zhang và cs năm 2016 cho thấy

kết quả khả quan khi tiến hành sàng lọc với 114 SP của Sec/P và 24 SP của Tat/P

với 2 promoter khác nhau nhằm tối ƣu hoạt động gen mã hóa xylanase kiềm từ B.

pumilus BYG trong tế bào chủ là B. subtilis. Các SP của Sec/P cho thấy có ảnh

hƣởng mạnh mẽ hơn Tat/P trong quá trình tiết XynBYG. Hơn nữa, SP tối ƣu PhoD

cho tiết XynBYG đƣợc tìm thấy khác nhiều so với các peptide tối ƣu cho tiết

cutinase và esterase đã báo cáo.

Phân tích hồi quy một số biến nghiên cứu cho thấy các SP cho các enzyme

khác nhau thì khác nhau về: đặc tính xoắn, axit amin thành phần, và số điểm phân

biệt trong SP. Khi phân tích cho thấy tỷ lệ 23% khác biệt trong năng suất tiết

XynBYG bởi các SP khác nhau. Kết quả cũng cho thấy xu hƣớng xoắn của một SP

đóng một vai trò quan trọng trong xylanase giàu cấu trúc beta, nhƣng không phải

trong cutinase giàu xoắn,và cho thấy một sự kết hợp phù hợp giữa các SP và protein

đích nhằm tối ƣu cho khả năng tiết (Zhang et al., 2016).

Không chỉ có nghiên cứu thay thế SP ở Bacillus, việc sàng lọc các SP của vi

khuẩn Gram dƣơng còn đƣợc tiến hành trong Lactobacillus planatarum (Mathiesen

et al., 2009), G. stearothermophilus (Watanabe et al., 2009). Le Loir và cs cũng đã

thay trình tự SP tự nhiên của gen mã hóa nuclease trong Staphylococus bằng trình

tự SP của protein Usp45 của L. lactis và cho thấy hiệu quả tiết của enzyme này tăng

lên đáng kể trong L. lactis. Quá trình tiết của Nuclease này ở L. lactis là 60% và

tăng lên 95% khi nghiên cứu thay đổi SP. Ngoài ra, nhóm tác này còn nghiên cứu

đánh giá ảnh hƣởng cũng nhƣ tối ƣu hóa SP và propeptide lên quá trình tiết protein

113

của L. lactis (Le Loir et al., 2001). Hemmerichvà cs đã sử dụng 66 SP của Sec/P ở

B. subtilis nhằm tối ƣu hóa khả năng tiết cutinase từ Fusarium solani pisi ở

Corynebacterium glutamicum. Tác giả có so sánh khả năng tiết của một hệ thống

các thƣ viện peptide đƣợc sàng lọc giữa biểu hiện cutinase ở Corynebacterium

glutamicum với khả năng biểu hiện của tổ hợp gen này trong B. subtilis. Kết quả

cho thấy khả năng biểu hiện hoạt tính rất đa dạng có rất nhiều tổ hợp không biểu

hiện hoạt tính tiết ra môi trƣờng của enzyme nghiên cứu khi sử dụng chủng chủ là

B. subtilis nhƣng khi vẫn cụm tổ hợp này đƣợc biểu hiện trong Corynebacterium

glutamicum với hoạt tính cao hơn rất nhiều (cao nhất gấp khoảng 10 lần)

(Hemmerich et al., 2016).

4.4. NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TIẾT PROTEIN ĐÍCH CỦA CHÚNG

Trong luận án này chúng tôi phân tích trình tự axit amin và đánh giá vai trò

của chúng trong quá trình tiết protein. Từ đó lựa chọn đƣợc các điểm nhằm tạo đột

biến định hƣớng bằng PCR với các cặp mồi có mang điểm đột biến thiết kế sẵn

hoặc tổng hợp hóa học với đột biến sâu trong trình tự. Trình tự 33 axit amin ở đầu N

của chuỗi SP chọn lọc có sự tƣơng đồng với SP tiết theo Sec/P với vùng N gồm 4

axit amin mang điện tích dƣơng (K3,K4, R5 và K7) đóng vai trò liên kết với màng tế

bào. Để tăng cƣờng khả năng tiết enzyme có rất nhiều phƣơng pháp đã đƣợc sử

dụng. Proline (P) hoặc Glycine (G) là hai axit amin thƣờng đƣợc tìm thấy nằm ở

giữa vùng H với chức năng tạo cấu trúc xoắn α trên màng trong trƣờng hợp này

Glycine đóng vai trò trung tâm của vùng H. Vùng C có mang điểm nhận biết đặc

trƣng cho enzyme phân cắt SPaseI (A-X-A). Để nâng cao hoạt tính tiết α - amylase

tái tổ hợp, một số thử nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của điện tích đầu N, thay đổi

vùng kỵ nƣớc H và điểm nhận biết vị trí phân cắt của SPase trên SP gen α - amylase

của chủng B. subtilis D5-2 trong tổ hợp pHV33-Pgrac-Subsig3BT2 mature đƣợc

tiến hành. Thông qua đó, chúng tôi đã thu đƣợc một số chủng mang các đột biến

định hƣớng và đánh giá khả năng tiết protein cũng nhƣ xác định hoạt tính enzyme

tiết của các chủng tái tổ hợp này.

114

Trình tự peptide đột biến thay đổi điện tích đầu N từ +4 xuống còn +3, +2,

thì chỉ có đột biến tại K ở vị trí 3 đƣợc thay thế bằng Q (điện tích đầu N là +3) làm

tăng hoạt tính lên 8,6%, đạt 108,6% so với hoạt tính enzyme tiết đo đƣợc của chủng

gốc (76,7±4,1 U/ml, 1854,17±22,9 µg/ml) với tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm

lƣợng protein tiết tổng số của enzyme đạt 41,37 U/mg so với khả năng tiết của SP

ban đầu (70,6±3,3 U/ml, 1830,23±20,5 µg/ml) với tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm

lƣợng protein tiết tổng số xác định đƣợc là 38,57 U/mg. Tuy nhiên, khi tiếp tục làm

giảm điện tích đầu N thì hoạt động tiết giảm hẳn, hàm lƣợng amylase tái tổ hợp thể

hiện qua băng điện di protein cũng giảm và hoạt tính enzyme đo đƣợc chỉ còn

khoảng 57,4±4,5U/ml và tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số

là 31,83 U/mg, hiệu quả tiết thu đƣợc chỉ đạt 81,3% so với chủng gốc. Điều này cho

thấy, điện tích đầu N của SP trong gen rõ ràng có ảnh hƣởng đến hoạt động tiết

enzyme tái tổ hợp. Tuy nhiên dựa trên những kết quả thu đƣợc không thể kết luận

rằng điện tích càng cao thì hoạt động tiết sẽ càng mạnh bởi khi giảm điện tích

xuống +3 thì hoạt tính enzyme đo đƣợc là cao hơn.

Điện tích dƣơng của SP cho thấy vai trò quan trọng cho các preprotein của

quá trình tiết trong E. coli. Nghiên cứu in vivo và in vitro cho thấy chúng có vai trò

quan trọng trong mối tƣơng tác của preprotein và SecA. Vì vậy, sự khác nhau về

điện tích vùng N của E. coli và Bacillus có thể liên quan đến sự khác nhau của

protein SecA (Simonen and Palva, 1993). Đột biến SP của Bacillus đã đƣợc nghiên

cứu bởi Borchert và Nagarajan (Borchert and Nagarajan., 1991). Chen và Nagarajan

cũng nghiên cứu ảnh hƣởng của đột biến vùng N của SP lên khả năng tiết protein

của B. subtilis cho thấy, khi tiến hành đột biến giảm điện tích vùng N làm giảm hoạt

tính tiết của enzyme này trong môi trƣờng nuôi cấy (Chen and Nagarajan., 1994).

Caspers và cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp gây đột biến ở mức bão hòa gây

đột biến trên vùng N của SP amyE của B. subtilis nhằm tối ƣu hóa khả năng tiết

enzyme ngoại bào cũng nhƣ cutinase. Kết quả cho thấy hoạt tính cutinase tăng từ 20

lên 400% (Caspers et al., 2010).

115

Ismail và cs đã sử dụng SP của L-asparaginase II nhằm tiết cyclodextrin

glucanotransferase (CGTase) vào không gian chu chất của E. coli. Có 5 peptide đột

biến đƣợc tạo thành tăng cƣờng tiết CGTase trong tế bào trong đó N1R3 là peptide

đƣợc đột biến với việc tăng cƣờng điện tích của vùng N lên + 5 gây giảm 1.7 lần

hoạt tính CGTase trong periplasm và làm giảm 7.8 % hoạt tính thu đƣợc khi ly giải

tế bào so với chủng dại và phát hiện sự có mặt của enzyme này bên ngoài dịch nuôi

cấy. Ngoài ra, tác giả còn cho thấy thể vùi đƣơc hình thành cũng giảm khi đánh giá

thông qua điện di SDS-PAGE (Ismail et al., 2011).

Với SP của gen α - amylase D5-2 khi đƣợc thay toàn bộ các axit amin ở vùng

H (168MpHVSP12LF14LA15LF17LF21LH22LV24L) bằng L chỉ trừ vị trí G ở

tâm kỵ nƣớc đã làm hoạt tính amylase thu đƣợc chỉ đạt 35,9±3,7 U/ml với hàm

lƣợng protein tiết tổng số đo đƣợc là 1797,77±21,2 µg/ml và tỷ lệ hoạt tính amylase

trên hàm lƣợng protein tiết tổng số của enzyme đạt 19.97 U/mg. Hiệu qua tiết

enzyme của chủng tái tổ hợp mang độ biến này chỉ còn 50.8% so với khả năng tiết

amylase của chủng gốc mang trình tự SP ban đầu. Tăng độ kỵ nƣớc của vùng H

bằng việc thêm L cũng làm tăng biểu hiện alkaline phosphatase ở E. coli (Izard et

al., 1996) và Interlleukin - 2 ở B. brevis tuy hiệu qủa tăng tiết enzyme là không

nhiều nhƣng đã cho thấy có tác dụng tích cực trong việc cải thiện hoạt tính enzyme

tiết bằng việc biến đổi tâm kỵ nƣớc H của SP của gen đích (Takimura et al., 1997).

Sự có mặt của Glycine ở tâm vùng H ảnh hƣởng đến hiệu quả tiết enzyme

không chỉ ở E. coli, Bacillus mà còn ở cả SP Gsp của Streptococcus (Lemberg and

Martoglio, 2002; Bensing et al., 2007). Để tăng cƣờng hiệu quả tiết enzyme

CMCase của Bacillus trong S. cerevisiae bằng sử dụng SP gen mã hóa

glucoseamylase của S. diastaticus (GSP) cho thấy, khi tạo đột biến tăng kỵ nƣớc ở

vùng H (m1, Pro (-18) -> Leu (-18); m2 , Tyr (-13) -> Leu (-13); m3, Ser (-9) ->

Leu (-9)) đã làm tăng hiệu quả tiết enzyme. Đặc biệt, khi đột biến thay thế Ser (-9)

thành Leu (-9) đã cho thấy khả năng tiết gấp đôi CMCase. Và khi đột biến phá vỡ

cấu trúc xoắn α - của GSP đã làm giảm hẳn hiệu quả tiết enzyme này (Lee et al.,

2000).

116

Nakamura và cs, năm 1989 đã nghiên cứu thay đổi về độ dài, đặc tính kỵ

nƣớc và điện tích của SP gen α - amylase của B. subtilis và đánh giá ảnh hƣởng của

các yếu tố này lên khả năng tiết α - amylase bến nhiệt và cả β-lactamase trong cả

hai đối tƣợng G âm và G dƣơng mà đại diện là E. coli và B. subtilis. Đoạn SP α -

amylase có độ dài 33 axit amin và các axit amin Lys(K), Glu(E), Leu(L),Leu-Leu,

Leu-Leu-Leu đƣợc chèn vào giữa vị trí 28 và 29 của SP này bằng đột biến điểm.

Kết quả cho thấy, quá trình tiết β-lactamase ở E. coli bị ức chế nhiều hơn so với sự

tiết enzyme này ở B. subtilis khi tiến hành các đột biến trên. Trong khi đó, quá trình

tiết α - amylase bền nhiệt không cho thấy khác biệt ở cả hai chủng trừ trƣờng hợp

chèn Glu vào giữa axit amin thứ 28 và 29 trên SP của α - amylase cho thấy ức chế

tổng hợp 2 enzyme ở cả B. subtilis và E. coli (Nakamura et al., 1989).

Trong khi đó, vùng H của SP của levansucrase đƣợc biết là ảnh hƣởng rất

nhiều đến hoạt động tiết khi tiến hành đột biến. Khi đột biến ở vùng này chỉ phát

hiện đƣợc lƣợng rất ít enzyme (chỉ có khoảng 1%) cũng nhƣ đoạn protein trƣởng

thành đƣợc tạo ra điều này chứng tỏ khi thay đổi mức độ kỵ nƣớc của SP sẽ làm

thay đổi hoạt tính tiết và làm giảm lƣợng enzyme tiết trong dịch nuôi cấy. Vùng β-

turn khi bị đột biến (G22G23 thành L22L23) không gây ảnh hƣởng đến quá trình

tiết levansucrase (Chen and Nagarajan., 1994).

Trong tế bào prokaryote điểm nhận biết phân cắt nằm giữa aa -3 và -1 trong

đó, 80% aa ở vị trí -1 là A, 44% SP có cấu trúc vùng C với vị trí -3 và -1 là A-X-A

và 9% là V-X-A/Thr-X-A (Zhou et al., 2016). Riêng đối với Bacillus, vị trí -3 có

thể đƣợc thay thế bằng các axit amin nhƣ: Valine, Threonine, Leucin và Isoleucin.

Khoảng 71% các SP của chi này có chứa trình tự bảo thủ Ala - X – Ala và 18% có

điểm nhận biết để phân cắt có trình tự V – X – A. Những vùng này cho thấy vai trò

nhân tố quan trọng của trong quá trình phân cắt của các cơ chất đặc trƣng nhƣ kiểu

“A – X – A” tại vị trí -1 tới -3 và cả ba chủng đều tuân theo cơ chế cắt này vì đều có

điểm nhận biết đặc trƣng cho SPaseI (Tjalsma et al., 2000b; van Roosmalen et al.,

2004).

117

Có 3 đột biến đƣợc thiết kế trên vùng C của SP trên gen α - amylase của D5-

2 đó là lần lƣợt thay axit amin Ala ở vị trí 31 bằng G, V và C. Kết quả cho thấy,

hoạt tính tiết enzyme ngoại bào của chủng tái tổ hợp 168MpHVC1 (thay axit amin

A ở vị trí 31 bằng G); 168MpHVC1 (thay axit amin A ở tại vị trí 31 bằng V);

168MpHVC3 (thay axit amin A ở vị trí 31 bằng C) thu đƣợc cũng có sự biến động.

Tại vị trí G31 và V31 hoạt tính enzyme đo đƣợc đạt 74,3±2,5 U/ml và 80,1±3,1

U/ml và hiệu suất tiết amylase của các chủng đạt 105,2% và 113,5% cao hơn so với

đối chứng. Chủng tái tổ hợp cho thấy có tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng

protein tiết tổng số đạt 43,27U/mg cao nhất trong ba vị trí đột biến ở vùng C khi

thay A31 bằng V. Trong khi đó, đột biến C31 cho thấy làm giảm hẳn khả năng tiết

enzyme xuống chỉ còn 79,9%, tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết

tổng số protein thu đƣợc là 31,16 U/mg và hoạt tính amylase đo đƣợc chỉ đạt

56,4±2,3 U/ml so với đối chứng.

Trong nghiên cứu đột biến vùng C của levansucrase, Chen và Nagarajan đã

thay đổi vị trí A(-3) đƣợc thay thế bằng V(-3) hoặc G(-3) làm cho hoạt tính tiết của

enzyme tăng lên 120% so với tiết levansucrase của chủng dại (Chen and Nagarajan.,

1994). Tại vị trí A(-1) đƣợc đột biến thành T29 hoạt tính tiết cho thấy tăng lên

120% trong khi cũng tại ví trí này đƣợc đột biến thành Ser(- 1) và Val (-1), hoạt tính

enzyme ngoại bào không có sự thay đổi, song các đột biến còn lại làm giảm hoạt

tính enzyme ngoại bào và vùng +1 không có ảnh hƣởng đến hoạt động tiết enzyme

của SP khi đƣợc đột biến để thay thế các axit amin khác nhau tại vị trí này (Chen &

Nagarajan, 1994). Sakakibara và cs đã nghiên cứu cấu trúc cần thiết của một SP để

cho quá trình phân cắt thuận lợi của các SPase có thể xảy ra trong Sec/P ở B.

subtilis. Đối tƣợng sử dụng của nghiên cứu này chính là SP của gen α --amylase ở

B. subtilis gồm 33 axit amin và đoạn gen mã hóa cho α - amylase trƣởng thành của

B. sterothermophilus A631. Hai đối tƣợng này đƣợc tái tổ hợp với nhau và đƣa vào

vector biểu hiện trong B. subtilis. Tác giả tiến hành các nghiên cứu nhƣ: đột biến

vùng C tại từng vị trí chọn lọc nhƣ đột biến Ala tại các vị trí axit amin 29, 31, 33

thành Val, đột biến Cys ở (vị trí 0) nằm trong vùng đệm của giữa SP amylase và

118

gen trƣởng thành của B. sterothermophilus A631 thành Ala, cũng nhƣ sử dụng các

trình tự SP dài 29, 31, 33 axit amin. Kết quả cho thấy trong B. subtilis, vị trí phân

cắt hiệu quả nhất đã đƣợc đặt tại các liên kết peptit giữa Ala-33 và axit amin X ở vị

trí 34. Tuy nhiên, điểm nhân biết phân cắt sẽ xảy ra giữa Ala 31 và axit amin X khi

Ala 33 bị xóa và sẽ ở aa Ala 35 khi Ala 33 bị đột biến thành Val. Ngoài ra, kết quả

của nghiên cứu này còn cho thấy, khi SP bị cắt ngắn có độ dài nhỏ hơn 33 axit amin

thì hiệu quả tiết sẽ giảm hẳn trong quá trình tiết α - amylase tái tổ hợp ở B. subtilis.

Ngƣợc lại, ở E. coli, quá trình phân cắt của SP tại axit amin Ala 31 lại cho hiệu quả

tiết cao hơn các vị trí khác. Các tác giả cho thấy, ngoài sự cần thiết có mặt của Ala

ở vị trí -1 thì độ dài của các SP là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến quá trình phân

cắt của các SP từ đó ảnh hƣởng đến hiệu quả tiết enzyme (Sakakibara et al., 1993).

Trong nghiên cứu tối ƣu hóa SP gen CGTase (cyclodextrin

glucanotransferase) của Bacillus sp. G1 nhằm tăng cƣờng khả năng tiết enzyme này

trong E. coli, Kheng Oh Low và cs cho thấy, nghiên cứu điện tích vùng N và độ kỵ

nƣớc của vùng H chính là hai nhân tố quan trọng nhằm thiết kế một SP mạnh tối ƣu

cho quá trình tiết enzyme này. Có 8 SP đột biến đƣợc xây dựng việc sƣ dụng đột

biến điểm làm tăng hoạt tính tiết CGTase tái tổ hợp. M5 đƣợc đột biến SP bằng

việc thay thế 1 axit amin isoleucin trong vùng H thành Glycin tạo nên liên kết cho

bẻ gãy xoắn helix hoặc tạo motif G-turn với việc làm giảm độ kỵ nƣớc. Đột biến

này cho thấy kết quả làm tăng hoạt tính lên 110% và 94% trong tế bào chất và tiết

CGTase tái tổ hợp khi so sánh với SP của chủng dại. Việc hình thành thể vùi khi

phân tích SDS-PAGE cũng cho thấy giảm xuống hẳn khi sử dụng SP đột biến. Bổ

xung thêm một lƣợng rất thấp 0,08% Glycine khi bắt đầu nuôi cấy tế bào cho thấy

tăng khả năng sinh trƣởng của tế bào E.coli chủ. Sản phẩm tiết của các protein khác

nhƣ mannosidase cũng cho thấy kết quả tăng hoạt tính tiết giống nhƣ CGTase, từ

đó, đƣa ra giả thuyết rằng tổ hợp của peptide đột biến tối ƣu và phù hợp ở mức độ

hóa học do đó làm tăng protein ngoại bào cũng nhƣ sinh trƣởng tế bào. Phát hiện

này rất có giá trị cho việc nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli (Low

et al., 2012).

119

Ngoài ra, một số công trình nghiên cứu khác về đột biến trên cả ba vùng N,

H, C của SP và đánh giá khả năng tiết ở E. coli (Jonet et al., 2012) và nấm men

(Allison DS, 1989) cũng đƣợc thực hiện. Các đột biến trên vùng N (tăng điện tích),

vùng H (giảm kỵ nƣớc, tạo điểm nhận biết G-motif) và đột biến ở vùng C thay A (-

3) bằng S hoặc G. Kết quả cho thấy, khi tăng điện tích đầu N làm giảm hiệu quả tiết

CGTase so với peptide ban đầu của chủng dại trong E. coli. Trong khi đó, đột biến

vùng H, F(-12) thành G(-12), Ile(-14) thành G(-14) làm tăng hiệu quả tiết enzyme

này trên màng đạt 110% và 140% trong E. coli. Hiệu quả tiết ngoại bào cũng tăng

94%, đạt 170U/ml sau 12h cảm ứng cao gấp 1.9 lần so với chủng dại khi đột biến

Ile(-14) thành G(-14) (Jonet et al., 2012). Trong khi đó, nghiên cứu của nhóm tác

giả Allison và Young năm 1989 đã sử dụng thay đổi axit amin trong trình tự của SP

của prepro α - factor ở nấm men. Kết quả nghiên cứu này cho thấy khi đột biến năm

axit amin riêng lẻ trong trình tự SP này, kết quả cho thấy ảnh hƣởng đến quá trình

vận chuyển protein lên màng lƣới nội chất. Đột biến SP làm giảm khoảng 25 lần tốc

độ vận chuyển của nhân tố này vào mạng lƣới nội chất. Ít nhất một trƣờng hợp đột

biến cho thấy phân tử prepro – α - đã đƣợc vận chuyển và phân cắt hoàn toàn sau

dịch mã. 4 trong 5 đột biến còn lại cho thấy làm giảm tốc độ phân cắt của SPase

trong vivo, mặc dù những đột biến này không nằm gần vị trí phân cắt. Nghiên cứu

này đã chứng minh một đột biến axit amin đơn trong SP có thể gây ảnh hƣởng lên

cả quá trình vận chuyển cũng nhƣ phân cắt protein trong điều kiện thí nghiệm và có

thể rút ra kết luận là trình tự mã hóa cho quá trình vận chuyển và phân cắt của chuỗi

protein nằm ngay trong đoạn SP của protein đó (Allison, 1989).

4.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TĂNG TIẾT ENZYME

Trong công nghệ sinh học quá trình tiết protein hiệu quả là rất quan trọng bởi

nó cung cấp các enzyme hoạt động và ổn định, một điều kiện tiên quyết cho thành

công của sự xúc tác tổng hợp sinh học. vì vậy, tối ƣu hóa các chủng vi khuẩn sản

xuất enzyme là một thách thức lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học và sản xuất

protein. Trong nghiên cứu này, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 168M đƣợc tối ƣu

hóa cho sản xuất protein của gen α - amylase thu từ Bacillus licheniformis 3BT2 với

120

trình tự tín hiệu đƣợc sàng lọc từ gen α - amylase của B. subtilis D5-2 (SPD5-2).

Chủng tái tổ hợp B.subtilis 168MpHVC1 mang tổ hợp vector pHV33 + Pgrac

promoter + SPD5-2 amylase đột biến tại vị trí A31 thay bằng V31 và đoạn gen mã

hóa cho protein amylase trƣởng thành của chủng 3BT2 đƣợc lựa chọn nhằm nghiên

cứu nâng động học cũng nhƣ ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng tiết enzyme

amylase ngoại bào của chủng tái tổ hợp. Xác định động thái sinh tổng hợp enzyme

amylase của chủng cho thấy chủng tái tổ hợp sinh trƣởng tốt nhất sau 24h đạt OD

3,78±0,11 và tiết amylase tốt nhất sau 36h nuôi cấy, đạt 77,3±5,09 U/ml và đến 48h

giờ thì hoạt tính tiết đo đƣợc 74,8±4,59 U/ml nhỏ hơn so với thời điểm 36h. Vì vậy,

thời gian tốt cho tiết α-amylase của chủng tái tổ hợp thích hợp trong khoảng từ 30 –

40h nuôi cấy.

Nhiệt độ nuôi cấy đƣợc biết là một trong những yếu tố ảnh hƣởng rất mạnh

mẽ đến khả năng sinh trƣởng và sinh enzyme của các chủng VSV đặc biệt là các

chủng tái tổ hợp. Chủng tái tổ hợp sinh trƣởng và tiết enzyme quan tâm tốt nhất khi đƣợc nuôi ở nhiệt độ 37oC, hoạt tính enzyme đo đƣợc đạt 72,3±5,66U/ml trong khi đó, ở 55oC, hoạt tính enzyme tiết đo đƣợc chỉ đạt 5,3±1,63U/ml, bằng 7% so với hoạt tính tiết đƣợc khi nuôi cấy ở 37oC.

Hiệu suất thu hồi protein mục tiêu thƣờng tăng lên khi sử dụng chất cảm ứng

với nồng độ thích hợp (Grabski et al., 2005). Khi điều chỉnh nồng độ IPTG trong

quá trình đánh giá biểu hiện tiết protein tái tổ hợp với các nồng độ 0.005 – 2 mM,

hoạt tính enzyme thu đƣợc có sự biến đổi đáng kể. Ở nồng độ IPTG cảm ứng 0,005

mM mối tƣơng quan giữa tỷ lệ hoạt tính enzyme và hàm lƣợng protein tiết tổng số

đạt 39.88U/mg. Nồng độ IPTG thích hợp cho sinh tổng hợp tăng tiết amylase của

chủng tái tổ hợp là 0,01mM tại nồng độ này hoạt tính enzyme đo đƣợc cao nhất đạt

78,1±4,81U/ml với tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số đạt

42,79 U/mg. Tuy nhiên, khi bổ sung chất cảm ứng với nồng độ quá cao có thể là

nguyên nhân gây giảm mạnh hoạt tính tiết của enzyme tái tổ hợp nghiên cứu. cụ thể

trong luận án này, nồng độ IPTG cảm ứng đạt 2 mM hiệu quả tiết giảm mạnh. Hoạt

tính thu đƣợc chỉ bằng 53% so với khả năng biểu hiện của chủng khi ở nồng độ

121

IPTG tối ƣu 0.01 mM. Với các enzyme tái tổ hợp khác nhau thì nồng độ ITPG cần

thiết cho biểu hiệu là khác nhau (Low et al., 2012; Sadeghi et al., 2011)

Trong quá trình nuôi cấy các chủng tái tổ hợp việc bổ sung các chất dinh

dƣỡng phù hợp tạo thuận lợi cho sự biểu hiện tối ƣu của các promoter phiên mã và

sự tiết ra hiệu quả các protein dị hợp bởi B. subtilis (Pohl and Harwood, 2008). Các

nguồn carbon thƣờng đƣợc sử dụng nhằm hỗ trợ sự tăng trƣởng của chủng và có thể

cải thiện đáng kể mức độ biểu hiện của protein. Đối với nghiên cứu này, với năm

nguồn C sử dụng thì khi môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung lactose hoạt tính amylase

đo đƣợc là cao nhất đạt 81,1±2,97 và tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein

tiết tổng số đạt U/ml 45,16 U/mg. Khi bổ sung tinh bột vào môi trƣờng làm nguồn

C thì hoạt tính amylase thu đƣợc là thấp nhất trong năm chất sử dụng với hoạt tính

đạt 72,6±1,06 U/ml chỉ bằng 89.5% so với hoạt tính thu đƣợc khi bổ sung lactose và

tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số tổng số đạt 39,10 U/mg.

Nguồn saccharose tốt nhất cho sự tăng trƣởng tế bào (OD đạt 3,79±0,1) và làm tăng

tiết protein tổng số nhƣng không làm tăng hoạt tính amylase đáng kể vì vậy tỷ lệ

hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số tổng số thu đƣợc nhỏ nhất là

36,31 U/mg. Khi sử dụng glucose hoạt tính amylase thu đƣợc đạt 75,4±3,46 U/ml

cũng không có cải thiện nhiều so với khi sử dụng nguồn tinh bột và saccharose làm

nguồn C. Đối với chủng B. subtilis 168 mut-16# , một biến thể đột biến của B.

subtilis 168 bằng phƣơng pháp sử dụng máy đột biến thế hệ mới ARTP

(atmospheric and room temperature plasma) thì nguồn glucose cũng không phải là

nguồn thích hợp cho sinh tổng hợp α - amylase của chủng này (Ma et al., 2016).

Khi biểu hiện hoạt tính amylase bền nhiệt tái tổ hợp của B. licheniformis trong

chủng B. licheniformis CBBD302 thì lactose cũng cho thấy là nguồn C cho hoạt

tính biểu hiện cao nhất. Chủng tái tổ hợp B. licheniformis CBBD302 nuôi cấy trên

môi trƣờng có bổ sung các nguồn C: glucose, tinh bột tan và bột ngô cho hoạt tính

amylase bền nhiệt chỉ bằng 70 – 80% khi nuôi cấy chủng tái tổ hợp trên môi trƣờng

có bổ sung lactose (Niu et al., 2009).

122

Bản chất tự nhiên và nồng độ tƣơng đối của các nguồn nitơ khác nhau trong

môi trƣờng nuôi cấy đều rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp amylase của

chủng tái tổ hợp. Nồng độ N cao hơn hoặc thấp hơn yêu cầu của chủng tái tổ hợp

đều có thể gây ra bất lợi đối với quá trình sinh tổng hợp enzyme. Trong nghiên cứu

này, các nguồn N đã đƣợc bổ sung riêng biệt trên môi trƣờng chung nhằm đánh giá

hiệu quả của chúng đối với hoạt tính enzyme thu đƣợc. Các nguồn N vô cơ có chứa

muối gốc ammonium có thể đƣợc đánh giá ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất

amylase. Kết quả cho thấy nguồn N vô cơ có tác dụng tích cực làm tăng hoạt tính

enzyme chính là NH4H2PO4với hàm lƣợng amylase xác định đƣợc là 77,3±4,38

U/ml và tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số của enzyme tiết

bởi chủng tái tổ hợp đạt cao nhất 43,14 U/mg. Theo công bố của Swain và cs

(Swain et al., 2006) cũng nhƣ Deb và cs (Deb et al., 2013) thì trong các muối amoni

vô cơ sử dụng thì ure không tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp α - amylase của B.

subtilis. Tuy nhiên, trong công trình của Simair và cộng sự (Simair et al., 2017)

nguồn N vô cơ tốt nhất làm tăng hoạt tính α - amylase của Bacillus sp. BCC 01-50

là ure. Nguồn N hữu cơ có trong cao nấm men, tryptone, peptone trong môi trƣờng

LB là nguồn N hữu cơ tốt cho sinh tổng hợp amylase của B. amyloliquefacien

(Sharma et al., 2012; Deb et al., 2013). Một số nghiên cứu chỉ ra rằng các nguồn vô

cơ vô cơ đặc biệt là các muối amoni đã cho hiệu suất sinh tổng hợp amylase tƣơng

đối của B. amyloliquefaciens P-001 cao hơn các nguồn nitơ hữu cơ (Deb et al.,

2013). Theo Coleman và Elliott (1962) muối amoni là chất kích thích của tổng hợp

B. subtilis amylase (Coleman and Elliott, 1962). Cũng có báo cáo rằng ammonium

nitrate và natri nitrat là nguồn nitơ tốt nhất cho sản xuất amylase tối đa (Kundu et

al., 1973; Mahmood and Rahman, 2008). Amoni clorua, amoni sulfat cho thấy tác

động kích thích lên sản xuất amylase. Quá trình sinh tổng hợp α-amylase của B.

subtilis DM-03 đạt tối đa khi muối NH4Cl đƣợc dùng làm nguồn cung cấp Nitơ

(Das et al., 2004).

123

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Đã xác định hoạt tính amylase và hàm lƣợng protein tổng số trong môi

trƣờng nuôi cấy của 130 chủng trên tổng số 526 chủng thuộc chi Bacillus phân lập

đƣợc từ các mẫu đất khác nhau. Đã phân loại đến loài và xây dựng cây phát sinh

chủng loại của 17/130 chủng có đặc tính đa dạng về hình thái, khả năng tiết protein

tổng số và hoạt tính amylase cao: 4 chủng B. cereus; 5 chủng B. amyloliquefacien, 4

chủng B. subtilis, 2 chủng B. licheniformis,1 chủng B. methylotrophicus và 1 chủng

B. tequiilensis.

2. Đã tách dòng và xác định đƣợc trình tự gen mã hóa SP α- amylase của 3

chủng: B. subtilis D5-2 gồm 33 axit amin, B. licheniformis DA23 gồm 30 axit amin,

B. cereus CN1-5 gồm 27 axit amin và đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với các mã

số lần lƣợt là KU214589 (protein ID: AND80846.1), KU214590 (protein ID:

AND80847.1), KU214591(protein ID: AND80848.1).

3. Đã tạo đƣợc chủng tái tổ hợp mang vector pHV33 và promoter Pgrac để

biểu hiện gen α – amylase từ chủng B. licheniformis 3BT2 đạt 71,4U/ml ± 6,3 U/ml

cao hơn 1,3 lần so với chủng tái tổ hợp mang vector pHV33 và promoter Pamy ở

chủng B. subtilis 168M.

4. Đã thay thế SP gen của chủng B. licheniformis 3BT2 bằng các SP của gen

α - amylase của chủng khác cùng loài và các loài khác trong cùng chi Bacillus nhƣ

B. cereus, B. subtilis và B. licheniformis để nghiên cứu đánh giá việc tiết α -

amylase đích. Trong đó, chủng tái tổ hợp B. subtilis 168M- pHV33 – Pgrac –

SsubtilisD5.2-3BT2mature có hoạt tính α-amylase cao nhất đạt 76,4 ± 3,7 U/ml tăng 1,1

lần so với đối chứng.

5. Đã thu đƣợc chủng tái tổ hợp B. subtilis 168MpHVC1 mang tổ hợp vector

pHV33 + Pgrac promoter + SPD5-2 amylase đột biến tại vị trí A31 thay bằng V31 và

đoạn gen mã hóa cho protein amylase trƣởng thành của chủng B. licheniformis

124

3BT2 có hoạt tính α-amylase đạt 80,1±3,1 U/ml đạt hiệu quả tiết 113,5% so với

chủng tái tổ hợp mang cụm vector gốc.

6. Đã xác định đƣợc một số yếu tố thích hợp ảnh hƣởng đến biểu hiện α-

81,1±2,97 U/ml.

amylase đối với chủng tái tổ hợp 168MpHVC1gồm: thời gian nuôi cấy từ 30 – 40h ở nhiệt độ 37oC với nồng độ IPTG 0,01mM, nguồn cơ chất lactose cho hoạt tính đạt

KIẾN NGHỊ

Nghiên cứu đánh giá hiệu quả tiết enzyme của hệ biểu hiện này đối với một

số enzyme khác ngoài amylase để có thể sử dụng nhƣ một hệ biểu hiện chung ở B.

subtilis tái tổ hợp.

125

NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ TRONG THỜI GIAN THỰC

HIỆN LUẬN ÁN

1. Nguyen Thi Da, Nguyen Kim Thoa, Tran Dinh Man (2018) Constitution of different signal peptides for enhanced thermostable alpha amylase secretion in Bacillus subtilis. Vietnam Journal of Science and Technology 56 (1): 7-16.

2. Nguyễn Thị Đà, Nguyễn Kim Thoa, Trần Đình Mấn (2017) Nghiên cứu sàng lọc thu một số chủng thuộc chi Bacillus có hoạt tính amylase từ các mẫu đất

khác nhau. Báo cáo khoa học về sinh thái và tài nguyên sinh vật Hội nghị Khoa

học toàn quốc lần thứ 7: 1570 – 1577.

3. Nguyễn Thị Đà, Nguyễn Kim Thoa, Trần Đình Mấn (2013) Phân Loại và tách dòng đoạn peptid tín hiệu của gen α - amylase từ chủng Bacillus sp. CN1-5

Phân lập từ đất. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 51(3): 293-301.

4. Nguyễn Thị Đà, Nguyễn Kim Thoa, Trần Đình Mấn (2013) Xác định trình tự peptide tín hiệu của gen α - amylase từ chủng Bacillus subtilis D5-2 và Bacillus licheniformis DA23 phân lập từ đất. Báo cáo khoa học Proceedings Hội nghị

Khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2: 99 – 103

5. Trần Đình Mấn, Nguyễn Kim Thoa, Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Thị Đà (2010) Tách dòng và biểu hiện gen α – amylase bền nhiệt trong

Bacilllus subtilis 168M. Hội nghị Khoa học Kỷ niệm 35 năm Viện KH&CN Việt

Nam: 330 – 339

126

THE SUMMARY OF Ph.D THESIS

SCREENING AND THE EFFECT OF POINT MUTATIONS IN SIGNAL PEPTIDES ON EFFICIENCY SECRETION OF RECOMBINANT α-AMYLASE IN BACILLUS SUBTILIS

Amylases are important hydrolase enzymes which have been widely used

since the last century. Among the amylase familly, α – amylase is an industrially

important one because of the ubiquitous nature, ease of production and broad

spectrum of application. This enzyme has potential application in a wide number of

industrial processes such as food, fermentation, textile, paper, detergent and

pharmaceutical industries as representing approximately 30% of the world enzyme

production. This enzyme randomly cleaves α-1,4- internal glycosidic linkages in

starch molecules to hydrolyze them to yield glucose, maltose, dextrins and

oligosaccharides. α-amylase can be obtained from animals, plants and

microorganisms. Especially, the enzyme from fungal and bacterial sources have

been focused upon and preferred to other sources for applications in industrial

sectors. α-amylase is mainly derived from the genus Bacillus for commercial

applications. It is estimated that Bacillus sp. enzymes make up about 50% of the

total global enzyme market. These organisms not only produce an appropriate range

of enzymes but also have the capacity to secrete them into culture media at high

concentrations. The purification from culture media rather than from the cytoplasm

considerably reduces downstream processing costs. In recent years, considerable

effort has been aimed at developing B. subtilis as a host for the production of

heterologous proteins. Bacillus genus is Gram-positive bacteria that secrete a large

number of extracellular proteins of industrial relevance. B.subtilis, B.licheniformis,

B.amyloliquefaciens, B.megaterium...are known to be good producers of α-amylase.

From many soil samples in different places, 526 strains had found amylase

activity and 130 strains of which were selected as activated high amylase. Their

collection was identified based on either enzyme’s activity by DNSA or the

127

secretion of total protein by Lowrry’s method. Therefore, 130 strains had been

collected and preserved in a refrigerator for use. Amylase activities of these strains

were measured using DNSA method which showed very diverse with a range of

different results reached about 5-10U/ml (56 strains), 29 strains reached more than

10U/ml and 45 strains were found the content of level less than 5U/ml. Their

secretions of extracellular proteins were determined. The obtained results showed

that three strains had high level secretion of total protein with 2mg/ml. The largest

number as 127 strains secreted total proteins about 1 - 2 mg. Based on

morphological, biochemical characterization using API 50 CHB Kit and 16S rRNA

gene, 17 isolated strains were identified belong to 6 species as B. cereus, B.

amyloliquefacien, B. subtilis, B. licheniformis, B. methylotrophicus,B. tequilensis

Most proteins are transported across the cytoplasmic membrane and secreted

directly into growth media of Gram positive bacteria. They are generally

synthesized as precursors with a cleavable signal peptide, that is removed by signal

peptidases during or shortly after translocation. The secretion of protein in Bacillus

genus is synthesized by four pathways as Sec, Tat, Com and ABC transporter. Sec

pathway is major secretion for approximately 300 proteins in Bacillus genus

therefore called the general secretion pathway in this genus. There are two classes

of signal peptide identified in Sec pathway in Bacillus, i.e., the general secretion

signal peptides (SP type I) and lipoprotein signal peptides (SP type II).

Three signal peptides α - amylase genes of three isolated strains B.

licheniformis DA23, B. subtilis D5-2, B. cereus CN1-5 were successfully

sequenced. 03 predicted “Sec – type” signal peptides have a length varying from 27

(CN1-5) to 33 residues (D5-2). These signal peptides had been analyzed by SignalP.

The results showed that, the signal peptide of α - amylase of CN1-5 charged +2 had

27 residues and was divided into three domains as N-terminal with 4 residues from position the first to the fourth, H domain from the fifth to the 16th residue and final

C domain. Meanwhile, SP α - amylase of DA23 contained on four positively

charged amino acids in its N – domain which has 11 amino acids. The hydrophobic

128

core of signal peptide α - amylase of strain DA23 had 12 amino acids. Similarly,

signal peptide of α - amylase gene of B. subtilis D5-2, charged +4, which consists of

33 amino acids, had three domains: N region sequence of signal peptide α - amylase

of D5-2 consisted of 9 amino acids from the first to the ninth position charges +4

and H region had 16 amino acids and 8 residues in C-region, finally. The C –

domain of the predicted signal peptides carried a SPase types I cleavage site with A-

Y-A (strain CN1-5), A-A-A (DA23) and A-N-A (strain D5-2). These positions are

conserved with consensus sequence A-X-A at position -3 to -1 relative to the SPase

I cleavage site for signal peptide type I in Bacillus genus. Genetic sequences of

signal peptide of predicted strains D5-2, DA23 and CN1-5 had been registered in

the NCBI with KU214589 codes (protein ID: AND80846.1), KU214590 (protein

ID: AND80847.1), KU214591 (protein ID: AND80848.1), respectively.

The thermophilic α-amylase from B. licheniformis 3BT2 possessed unique

traits that made it a great potential candidate for use in the industry. However, this

strain produced only small amounts of α-amylase. To solve these problems, the α-

amylase gene was cloned and expressed in B. subtilis 168M. which is an ideal food-

grade host for heterologous protein expression. The promoters Pgrac , PAmy were used

to construct 2 different expression vectors for testing to secrete high levels of this α-

amylase with initial pHV33 vector to express in B. subtilis 168M. The results

showed that secretion efficiency of the constructed pHV33 vector with promoter

Pgrac was higher than that of this vector with promoter Pamy. To compare the activity

of α - amylase of the recombination B. subtilis 168MPgrac strain (pHV33–

PgracAmy3BT2) and B. subtilis 168MPamy strain (pHV33–PamyAmy3BT2,

recombinant vector construction of pHV33 containing the Pamy promoter of B.

subtilis 168M and α - amylase gene of B. licheniformis 3BT2 was noticed a little

activity of 53.2±5,5 U/ml after 36h. It was less 1.3 fold than activity of the

recombination strain containing gene cluster of Pgrac promoter and target gene (71.4

±6,3 U/ml) at the same time. These results indicated that, Pgrac promoter in this

study might be useful for the expression and secretion of target gene in B. subtilis

129

and so it was chosen for further research. Zymogram analysis and amylase activity

of two recombination trains showed that the crude extracts of α - amylase by

ethanol were analyzed by PAGE. The α - amylase was clearly detected in both

strains with the same molecular weight nearly 58kDa. Ying et al (2012) expressed

high levels of the hyperthermophilic α-amylase from Thermococcus sp. HJ21 in B.

subtilis, the promoters Pgrac, PxylA , P43, and P hag were used to construct four

different expression vectors for testing.

It is estimated about 50% proteins of E. coli secreted into culture medium

with approximately 90% proteins that are secreted by Sec pathway. The expression

of recombinant protein in E. coli may be damaged if ORF region of target gene has

rare codons. Four combination genes, DASsub3BT2Mature, DAScere3BT2Mature,

DASliche3BT2Mature, 3BT2 α - amylase expressed in E. coli JM109 by construction

vector pHVSuSig5.2, pHVCeSig15, pHVLiSig23, pHVLi3BT2full were analyzed

by Rare Codon Calculator - http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACCand rare codon

analysis software (http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_ analysis).

Recombinant proteins’s not expressed with high efficiency in E. coli because of rare

codons in these combination target genes. Therefore, B. subtilis 168M was used to

host strain for expression of combinative α - amylase targets isolated from Bacillus.

There are many methods to improve secretion of α - amylase activity, but

method that used in this report is replaced by signal peptide of wild α - amylase of

by isolated signal peptide α - amylase genes from three Bacillus strains. Because

the most exported proteins are transported through the Sec pathway in B. subtilis,

three different Sec-type signal peptides of 3 α - amylase genes (Signal peptide of

gene α - amylase of B. subtilis D5-2 (SsubtilisD5.2), B. cereus CN1-5 (ScereusCN15), B.

licheniformis DA23 (SlicheniformisDA23) were cloned and fused to the α-amylase gene

of B. licheniformis 3BT2 (lacking its native signal peptide) by megaprimer method

that exhibit high secretion efficiency in B. subtilis pHV33-Pgrac-3BT2Amyfull

(pHVAmy3BT2). Four recombinant construction vectors: pHVAmy3BT2, pHV33–

(pHVCeSig15), Pgrac–ScereusCN15–3BT2mature pHV33–Pgrac–SsubtilisD5.2–

130

3BT2mature (pHVSuSig5.2), pHV33–Pgrac – SlicheniformisDA23 –3BT2mature

(pHVLiSig23) were transformed into B. subtilis 168M to form four transformed

strains as 168MSubsig52, 168MCeSig15, 168MLisig23, 168M3BT2. These strains

could efficiently secrete proteins into the culture medium. Secretion of target gene

in recombinant strains was estimated by total protein, activity of α-amylase and

protein electrophoresis. Efficiency expression of α - amylase of four signal peptides

was dissimilarity among these strains. The extracellular amylase activity of signal

peptide SsubtilisD5.2 in recombinant 168MSubsig52 was highest with 76.4 ± 3.7 U/ml

and that of signal peptide Scereus CN1-5in 168MCeSig15 was the lowest in four strains

with 47.7 ± 4.6 U/ml. The secretion efficiency of 168MSubsig52, 168MCeSig15,

168Mlisig23 containing three signal peptides Samy D5-2, Samy DA23 and Samy CN1-5 were

approximately 112%, 104% and 70% α - amylase activity of 168M3BT2,

respectively. The optimal signal peptide SsubtilisD5.2 was used for further experiment.

SPs play a very important role in the transport of secretion proteins by the Sec

pathway because they interact with SecA proteins, the signal recognition

particle (SRP) and they have recognise site for signal peptidases. The interaction

between SP and mature protein is also known to affect the secretion of proteins.

Therefore, an effective signal peptide for the secretion of any target protein is the

most important choice. Several reports were done for identifying effective signal

sequences. In the same species, the secretion efficiency of proteins with different

signal peptides was different effects and the secretion process might be affected by

these SPs.

The role of positively charged residues at the N termini of signal peptides,

in protein export had been studied in B. subtilis 168M bring vector pHVD5.2. The

effects of the various alterations on the export of amylase in B. subtilis were

determined. The replacement of positively charged neutral residue (K3 = Q)

resulted in a slight defect to improve 8.6% activity in the export of amylase reached

76.7±4.1U/ml and specific activity of enzyme reached 41.37 U/mg from

168MpHVN1 strain. Replacement of amino acid K at site 3 by amino acid I in the

131

N terminus of D5-2 signal peptide decreased activity of this enzyme to

57.4±4.5U/ml. The hydrophobic core was from the 10th to 25th residues in SP

amylase of D5-2 strain. This the hydrophobic core could be replaced effectively by

consecutive single repeated amino acids in 7 sites P12, F14, A15, F17, F21, H22

V24 by L and the activities of amylase from recombinant strains is 35.9±3.7 U/ml

reached 50.8% which decreased than that of control. In B. subtilis, the most

efficient cleavage site is located at the peptide bond between Ala-33 and amino acid

X at position 34. To analyze the structural requirements for efficient processing of

the signal peptide, the recombinant strains 168MpHVC1 (with A31 site (Ala – X –

Ala) was replacement by V31 to form Val-X-Ala)) increased the activity to more

than 1.13-fold than that of wild type and the efficiency secretion of amylase was

increased to 113.5% (80.1±3.1U/ml) and this strain was chosen for next experiment.

Because the inducible expression system of B. subtilis 168MpHVC1 (A31V) based

on the Pgrac promoter with IPTG, we compared this system in B. subtilis expression

systems with different concentrations of induction: 0.005; 0.01; 0.1; 1 and 2 mM of

IPTG. The obtained result indicates that the highest activity of amylase was

observed up to 78.1±4.81U/ml when induction IPTG was used with concentration

as 0.01 mM. This recombinant strain was grown under optimal condition temperature 37O C, 30 – 40h with induction IPTG 0.01mM and addition of lactose

1% and 5g/l NH4H2PO4 .

132

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Abe JI, Nagano H, Hizukuri S, Obata K (1988) Properties of the raw-starch digesting amylase of Aspergillus sp. K-27: a synergistic action of glucoamylase and

alpha-amylase. Carbohydr. Res 175: 85–92.

2. Alkando A, Ibrahim HM (2011) A potential new isolate for the production of a thermostable extracellular α - amylase. J. of Bacteriology Research 3: 129–137. 3. Allison DS YE (1989) Mutations in the signal sequence of prepro-alpha-factor inhibit both translocation into the endoplasmic reticulum and processing by signal

peptidase in yeast cells. Mol. Cell. Biol. 9: 4977–4985.

4. Antelmann H, van Dijl J.M, Bron S, Hecker M. Proteomic Survey through

Secretome of Bacillus subtilis. John Wiley & Sons, Inc.: 179–208.

5. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, Wiley CJ, Allison RD, Bittner M, Blackshaw S (2003) Current Protocols in

Molecular Biology. John Wiley & Sons

6. Bano S, Ul Qader SA, Aman A, Syed MN, Azhar A (2011) Purification and characterization of novel α-amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS. AAPS

Pharm.Sci.Tech. 12: 255–261.

7. Becker M, Lapouge K, Segnitz B, Wild K, Sinning I (2017) Structures of human SRP72 complexes provide insights into SRP RNA remodeling and ribosome

interaction. Nucleic acids research 45: 470–481.

8. Bensing BA, Siboo IR, Sullam PM (2007) Glycine residues in the hydrophobic core of the GspB signal sequence route export toward the accessory sec pathway. J. of

Bacteriology 189: 3846–3854.

9. Berks BC, Palmer T, Sargent F (2003) The Tat protein translocation pathway and its role in microbial physiology. Advances in Microbial Physiology 47: 187-254 10. Bond WW, Favero MS (1975) Bacillus Species (ATCC 27380) Extremely. Appl.

Microbilogy 29: 859–860.

11. Borchert TV, Nagarajan V (1991) Effect of signal sequence alterations on export of

levansucrase in Bacillus subtilis. J. of bacteriology173: 276–282.

12. Brockmeier U (2006) New strategies to optimize the secretion capacity for heterologous proteins in Bacillus subtilis. Doctoral Dissertation. Biowissenschaften

der Ruhr-Universität Bochum. Institut für Molekulare Enzymtechnologie.

133

13. Brockmeier U, Caspers M, Freudl R, Jockwer A, Noll T, Eggert T (2006a) Systematic screening of all signal peptides from Bacillus subtilis: a powerful

strategy in optimizing heterologous protein secretion in Gram-positive bacteria. J. Mol. Biol. 362: 393–402.

14. Brockmeier U, Wendorff M, Eggert T (2006) Versatile expression and secretion

vectors for Bacillus subtilis. Current Microbiology 52: 143–148.

15. Bron S, Bolhuis a, Tjalsma H, Holsappel S, Venema G, van Dijl JM (1998) Protein secretion and possible roles for multiple signal peptidases for precursor processing in bacilli. J. of Biotechnology 64: 3–13.

16. Bukhari DA, Rehman A (2015) Purification and Characterization of α -Amylase from Bacillus subtilis Isolated from Local Environment. African J. of Biotechnology

47: 905–911.

17. Cadenas RF, Gil JA, Martín JF (1992) Expression of Streptomyces genes encoding extracellular enzymes in Brevibacterium lactofermentum: secretion proceeds by

removal of the same leader peptide as in Streptomyces lividans. Appl. Microbiol.

Biotechnol. 38: 362–369.

18. Caspers M, Brockmeier U, Degering C, Eggert T, Freudl R (2010) Improvement of Sec-dependent secretion of a heterologous model protein in Bacillus subtilis by

saturation mutagenesis of the N-domain of the AmyE signal peptide. Appl.

Microbiol. Biotechnol.86: 1877–1885.

19. Chen J, Zhao L, Fu G, Zhou W, Sun Y, Zheng P, Sun J, Zhang D (2016) A novel strategy for protein production using non-classical secretion pathway in Bacillus

subtilis. Microbial. Cell Factories 15: 69-85.

20. Chen M, Nagarajan V (1994) Effect of alteration of charged residues at the N termini of signal peptides on protein export in Bacillus subtilis. J. of Bacteriology

176: 5796–5801.

21. Chinna Narasaiah B, Leelavathi V, Manne AK, Swapna G, Paul MJ, Dasu PM (2014) Screening of Streptomyces Albus CN-4 For Enzyme Production and Optimization of L-Asparaginase. International Journal of Scientific and Research Publications 5: 2250–3153.

22. Chu H. H., (2001).“Identification and functions of type I signal peptidases of B. amyloliquefaciens”. Dissertation PhD. Naturwissenschaftlich Technischen Fakultätder Martin Luther, Universität Halle Wittenberg.

134

23. Chung YC, Kobayashi T, Kanai H, Akiba T, Kudo T (1995) Purification and Properties of Extracellular Amylase from the Hyperthermophilic Archaeon

Thermococcus profundus DT5432. Appl. & Environ. Microbiol. 61 (4): 1502–1506. 24. Coleman G, Elliott WH (1962) Studies on alpha-amylase formation by Bacillus

subtilis. Biochem J. 83: 256-263.

25. Collier DN (1994) Escherichia coli Signal Peptides Direct Inefficient Secretion of an Outer Membrane Protein (OmpA) and Periplasmic Proteins and Alkaline

Phosphatase) in Bacillus subtilis. Journal of Bacreriology 176 (10): 3013–3020. 26. Dalbey RE, Von Heijne SG. (2002) Protein targeting, transport & translocation. Academic Press An Elsevier Science Imprint 525 B Street, Suite 1900, San Diego, California 92101-4495,USA

strain isolated from the traditional food of India. Biotechnol Appl Biochem. 40: 291– 298.

27. Das K, Doley R, Mukherjee AK (2004) Purification and biochemical characterization of thermostable, alkaliphilic, extracellular α-amylase from Bacillus subtilis DM-03, a

28. Deb P, Talukdar SA, Mohsina K, Sarker PK, Sayem SA (2013) Production and from Bacillus extracellular characterization of amylase enzyme partial

amyloliquefaciens P-001. SpringerPlus 2: 154 - 166.

29. Degering C, Eggert T, Puls M, Bongaerts J, Evers S, Maurer KH, Jaeger KE (2010) Optimization of protease secretion in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis by

screening of homologous and heterologous signal peptides. Appl. Environ.

Microbiol.76 (19): 6370–6376.

30. Demain AL, Vaishnav P (2009) Production of recombinant proteins by microbes

and higher organisms. Biotechnology Advances 27: 297–306.

31. van Dijl JM, Braun PG, Robinson C, Quax WJ, Antelmann H, Hecker M, Müller J, Tjalsma H, Bron S, Jongbloed JDH (2002), Functional genomic analysis of the B. subtilis Tat pathway for protein secretion. J. of Biotechnol. 98: 243–254.

32. Duffy J, Patham B, Mensa-Wilmot K (2010) Discovery of functional motifs in h-

regions of trypanosome signal sequences. Biochem. J. 426: 135–145.

33. Earl AM, Eppinger M, Florian Fricke W, Rosovitz MJ, Rasko DA, Daugherty S, Losick R, Kolter R, Ravel J (2012) Whole-genome sequences of B. subtilis and close relatives. J. of Bacteriology 194: 2378–2379.

135

34. Eggert T, Brockmeier U, Dröge MJ, Quax WJ, Jaeger KE (2003) Extracellular lipases from B. subtilis: regulation of gene expression and enzyme activity by

amino acid supply and external pH. FEMS Microbiol. Lett. 225: 319-324.

35. Eymann C, Hecker M (2001) Induction of sigma(B)-dependent general stress genes by amino acid starvation in a spo0H mutant of B. subtilis. FEMS Microbiol. Lett.

199: 221–227.

36. Fan X, Yang M, Cao P, Zhang W, Zhang W, Song X, Gong Y (2011) Screening of optimal signal peptide for heterologous xylanase secretion by B. subtilis. Wei Sheng Wu Xue Bao 51: 979–983.

37. Fass, SH, and EngelsJW (1996) Influence of specific signal peptide mutations on the expression and secretion of the alpha-amylase inhibitor tendamistat in

Streptomyces lividans. J. Biol. Chem. 271:15244-15252.

38. Fieschi J, Niccoli P, Camilla C, Chames P, Chartier M, Baty D (1996) Polymerase chain reaction-based site-directed mutagenesis using magnetic beads. Analytical

Biochemistry 234: 210–214.

39. Gennity J, Goldstein J, Inouye M. (1990) Signal peptide mutants of Escherichia

coli. J. of Bioenergetics and Biomembranes 22: 233–269.

40. Grabski A, Mehler M, Drott D (2005) The overnight express autoinduction system: high density cell growth and protein expression while you sleep. Nat Meth. 2: 233–

235.

41. Gomes J, Steiner W (2004) The Biocatalytic Potential of Extremophiles and

Extremozymes.Food Technol. Biotechnol. 42(4): 223–235.

42. Gupta A, Gupta V, Modi D, Yadava L (2008) Production and characterization of

the α-amylase from Aspergillus niger, Biotechnology 7: 551–556.

43. Han S, Machhi S, Berge M, Xi G, Linke T, and Schoner R (2017) Novel signal peptides improve the secretion of recombinant Staphylococcus aureus Alpha toxin H35L in Escherichia coli. AMB Expr 7: 93-107.

44. Trƣơng Nam Hải, Nông Văn Hải (1996) Tổng hợp gen α-amylaza của nấm men Saccharomycopsis fibuligera bằng phản ứng chuỗi ADN-polymeraza. Di truyền học và ứng dụng 1: 1–4.

45. Trƣơng Nam Hải, Plelizer JF (1997) Thiết kế vectơ đặc hiệu để chuyển gen alpha- amylaza Saccharomyces fibuligena vào các chủng nấm men công nghiệp. Di truyền học và ứng dụng 3: 42–48.

136

46. Hagihara H, Igarashi K, Hayashi Y, Endo K, Ikawa-Kitayama K, Ozaki K, Kawai S, Ito S (2001) Novel α-amylase that is highly resistant to chelating reagents and

chemical oxidants from the alkaliphilic Bacillus isolate KSM-K38. Applied and Environmental Microbiology 67: 1744–1750.

47. Haki G (2003) Developments in industrially important thermostable enzymes: a

review. Bioresource Technology 89: 17–34.

48. Dƣơng Thị Ngọc Hạnh và Nguyễn Minh Thủy (2014) Sử dụng enzyme -amylase

trong thủy phân tinh bột từ gạo huyết rồng. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần

Thơ (1): 61-67

49. Harwood CR, Cranenburgh R (2008) Bacillus protein secretion: an unfolding story.

Trends in Microbiology 16: 73–79.

50. Hassan E. Abd-Elsalam and Amr A. El-Hanafy (2009) Lignin Biodegradation with Ligninolytic Bacterial Strain and Comparison of B. subtilis and Bacillus sp. Isolated

from Egyptian Soil. Amer.-Eur. J. Agric. & Environ. Sci 5 (1): 39-44

51. von Heijne G, Abrahmsèn L. (1989) Species-specific variation in signal peptide design Implications for protein secretion in foreign hosts. FEBS Letters 244: 439–

446.

52. Hemmerich J, Rohe P, Kleine B, Jurischka S, Wiechert W, Freudl R, Oldiges M (2016) Use of a Sec signal peptide library from Bacillus subtilis for the optimization of cutinase secretion in Corynebacterium glutamicum. Microbial Cell Factories 15:

208 - 219.

53. Heng C, Chen Z, Du L, Lu F (2005) Expression and secretion of an acid-stable α- amylase gene in Bacillus subtilis by SacB promoter and signal peptide.

Biotechnology Letters 27: 1731–1737.

54. Henrissat B, Bairoch A (1993) New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. The Biochemical Journal 293: 781–788.

55. Hobel CFV (2004) Access to Biodiversity and New Genes from Thermophiles by Special Enrichment Methods. Doctoral Dissertation. Faculty of Sciences University of Iceland.

56. Holtzhauer M (2006) Basic Methods for the Biochemical Lab., First. Springer-

Verlag BerlinHeidelberg.

137

57. Nguyễn Thanh Huyền, Kiều Hữu Ảnh, Trần Đình Mấn, Nguyễn Kim Thoa (2004) Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn sinh alpha amylaza phân lập ở suối nƣớc

nóng Bình Châu, Báo cáo khoa học, Hội nghị Những vấn đề NCCB trong Khoa học sự sống: 127–130.

58. Phạm Trần Thùy Hƣơng, Đỗ Thị BíchThủy (2012) Ảnh hƣởng của một số yếu tố lên quá trình thu nhận chế phẩm amylase ngoại bào từ Bacillus subtilis DC5 Phạm.

Tạp Chí Khoa Học, Đại Học Huế 71: 189–201.

59.

Ian Humphery-Smith, Michael Hecker (2006), Microbial Proteomics: Functional Biology of Whole Organisms.

60.

Igarashi K, Hatada Y, Hagihara H, Saeki K, Takaiwa M, Uemura T, Ara K, Ozaki K, Kawai S, Kobayashi T, Ito S (1998), Enzymatic properties of a novel liquefying

alpha-amylase from an alkaliphilic Bacillus isolate and entire nucleotide and amino acid sequences. Appl. and Environ. Microbiol. 64: 3282–3289.

61. Ismail NF, Hamdan S, Mahadi NM, Murad AM, Rabu A, Bakar FD, Klappa P,

Illias RM (2011) A mutant L-asparaginase II signal peptide improves the secretion

of recombinant cyclodextrin glucanotransferase and the viability of Escherichia

coli. Biotechnol. Lett. 33: 999–1005.

62. Itoh Y, Kanoh K, Nakamura K, Takase K, Yamane K (1990) Artificial insertion of

peptides between signal peptide and mature protein: effect on secretion and

processing of hybrid thermostable α-amylases in Bacillus subtilis and E. colicells. J.

of General Microbiology 136: 1551–1558.

63. Janeček Š (2009) Amylolytic enzymes - forcus on the alpha amylase from archaea

and plants. Nova Biotechnologica 9: 5–25.

64. Janeček Š (2005) Amylolytic families of glycoside hydrolases: focus on the family

GH-57. Biologia, Bratislava 16: 177–184.

65. Janecek S, Svensson B, Macgregor EA (2001), Relationship of sequence and structure to specificity in the alpha-amylase family of enzymes. Biochim. Biophys. Acta. 1546: 1–20.

66. Jonet MA, Mahadi NM, Murad AMA, Rabu A, Bakar FDA, Rahim RA, Low KO, Illias RM (2012) Optimization of a heterologous signal peptide by site-directed mutagenesis for improved secretion of recombinant proteins in E. coli. J. of Molec. Microbiol. and Biotechnol. 22: 48–58.

138

67. Kakeshita H, Kageyama Y, Ozaki K, Nakamura K, Ara K., Improvement of Heterologous Protein Secretion by Bacillus subtilis. World’s largest Science,

Technology & Medicine Open Access book publisher: 288.

68. KiroMojsov (2012) Microbial α-amylase and their inductrial applycations: A

review. International J. of Management, IT and Engineering 2: 583–609.

69. Kolkman MB, van der Ploeg R, Bertels M, van Dijk M, van der Laan J, van Dijl J.M, Ferrari E (2008) The twin-arginine signal peptide of Bacillus subtilis YwbN

can direct either Tat- or Sec-dependent secretion of different cargo proteins: secretion of active subtilisin via the B. subtilis Tat pathway. Applied and

environmental microbiology 74: 7507–7513.

70. Kuddus R, Saima M (2013) Cold-active detergent-stable extracellular α-amylase from Bacillus cereus GA6: Biochemical characteristics and its perspectives in laundry detergent formulation. J. Biochem. Tech 4: 636–644.

Ferment. Technol. 51:142–150

71. Kundu AK, Das S, Gupta TK (1973) Influence of culture and nurtitional conditions on the production of amylase by the submerged culture of Aspergillus oryzae. J.

72. Landry TD, Chew L, Davis JW, Frawley N, Foley HH, Stelman SJ, Thomas J, Wolt J, Hanselman DS (2003) Safety evaluation of an α-amylase enzyme preparation

derived from the archaeal order Thermococcales as expressed in Pseudomonas

fluorescens biovar I. Regulatory Toxicology and Pharmacology 37: 149–168. 73. Laskin A, Sariaslani I, Dundee S, Gadd GM (2007) Advances in Applied

Microbiology. Academic Press.

74. Lee JW, Kang DO, Kim BY, Oh WK, Mheen TI, Pyun YR, Ahn JS (2000) Mutagenesis of the glucoamylase signal peptide of Saccharomyces diastaticus and

functional analysis in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiology Letters 193:

7–11.

75. Leite KC (2011) Construction of an efficient secretion system for recombinant proteins in B. subtilis. Doktors der Naturwissenschaften. Universität Bayreuth. 76. Lemberg MK, Martoglio B (2002) Requirements for signal peptide peptidase-

catalyzed intramembrane proteolysis. Molecular. Cell. 10: 735–744.

77. Li W, Zhou X, Lu P (2004) Bottlenecks in the expression and secretion of

heterologous proteins in Bacillus subtilis. Res. in Microbiol. 155: 605–610.

139

78. Ling Lin Fu, Zi Rong Xu, Wei Fen Li, Jiang Bing Shuai, Ping Lu, Chun Xia Hu (2007) Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: Implication for optimization

of heterologous protein secretion. Biotechnol. Adv. 25: 1–12.

79. Liu H, Naismith JH (2008) An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8: 91-101. 80. Le Loir Y, Nouaille S, Commissaire J, Brétigny L, Langella P (2001) Signal Peptide and Propeptide Optimization for Heterologous Protein Secretion in

Lactococcus lactis. Appl. and Environ. Microbiol. 67: 4119–4127.

81. Low KO, Jonet MA, Ismail NF, Illias RM (2012), Optimization of a Bacillus sp signal peptide for improved recombinant protein secretion and cell viability in Escherichia coli: Is there an optimal signal peptide design?. Bioengineered, 3: 334–

338.

82. Low KO, Mahadi NM, Illias RM (2013),.Optimization of signal peptide for recombinant protein secretion in bacterial hosts. Applied Microbiology and

Biotechnology 97: 3811–3826.

83. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measurement with

the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem 193: 265–275.

84. Ma Y, Shen W, Chen X, Liu L, Zhou Z, Xu F,Yang H (2016) Significantly in Bacillus subtilis by recombinant alkaline amylase production enhancing

integration of a novel mutagenesis-screening strategy with systems-level

fermentation optimization. Journal of Biological Engineering 10: 13 - 24.

85. Maarel V. Der, Der B. Van, Joost CM (2002) Properties and applications of starch- converting enzymes of the α -amylase family. J. of Biotechnology 94: 137–155. 86. Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, Harvey LM (2005), Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system, Yeast, 22: 249–270. 87. MacGregora EA, Janečekb Š, Svensson B (2001), Relationship of sequence and structure to specificity in the α-amylase family of enzymes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molec. Enzymol., 1546: 1–20. 88. Ngô Xuân Mạnh, Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Võ Nhân Hậu, Ngô Xuân Dũng (2008), chọn lựa điều kiện nuôi cấy tối ƣu vi khuẩn B. licheniformis (chủng BCRP) để sinh tổng hợp alpha amylase chịu nhiệt. TC Khoa học và Phát triển, 5: 460–466.

89. Mahmood S, Rahman SR (2008), Production and partial characterization of extracellular α-amylase by Trichoderma viride. Bangladesh J Microbiol., 25(2):99–

103

140

90. Mansour A, Zeinab R, Amanollah ZA (2015), Research Article Isolation and Identification of Bacillus Species From Soil and Evaluation of Their Antibacterial

Properties. Avicenna. J. Clin. Microb. Infec. 2(1): e23233. DOI: 10.17795/ajcmi- 23233

91. Mathiesen G, Sveen A, Brurberg MB, Fredriksen L, Axelsson L, Eijsink VG (2009) Genome-wide analysis of signal peptide functionality in Lactobacillus plantarum

WCFS1. BMC Genom, 10.

92. Mathew CD and Rathnayake S (2014) Isolation and characterization of alpha amylase isolated from a hot water spring in Sri Lanka. International Research

Journal of Microbiology (IRJM) 5(4): 50-61.

93. Trần Đình Mấn (2001) Nghiên cứu thu nhận α-amylase bền nhiệt bằng chủng Bacillus subtilis tái tổ hợp mang gen α-amylase của vi khuẩn phân lập ở Việt Nam. Luận án tiến sĩ, Đại học Bách Khoa Hà Nội.

94. Trần Đình Mấn, Nguyễn Kim Thoa, Lƣơng Đức Phẩm, Lê Văn Nhƣơng (2004) Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp alpha-amylaza chịu nhiệt

của chủng tái tổ hợp Bs168M{pHV33-BL.Amy.BSpr}. KH&CN 42: 7–12.

95. Trần Đình Mấn, Nguyễn Thế Trang Nguyễn Kim Thoa, Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Thị Đà, Trần Thị Hoa, Lại Thị Hồng Nhung (2011) Đặc điểm sinh học của

một số chủng ƣa nhiệt phân lập ở suối nƣớc nóng Mỹ Lâm – Tuyên quang, Hội

Nghị khoa học toàn quốc lần thứ 4 về Sinh thái và Tài nguyên sinh vật: 1713 – 1719 96. Trần Đình Mấn, Schweder T. (1999) Khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm alpha- amylaza chịu nhiệt của chủng vi khuẩn 3BT2. Tuyển tập báo cáo khoa học Hội nghị

CNSH toàn quốc: 592–598.

97. Meima R, van Dijl JM. (2003) Protein Secretion in Gram - Positive Bacteria, In Protein Secretion Pathways in Bacteria, Ed B. Oudega. Springer-science and

Business media, B.V.

98. Mergulhão FJM, Summers DK, Monteiro G (2005) Recombinant protein secretion

in Escherichia coli. Biotechnology advances 23: 177–202.

99. Miller GL (1959) Use of DinitrosaIicyIic Acid Reagent for Determination of

Reducing Sugar. Analytical chemistry 31: 426–428.

100. Ming YM, Wei ZW, Lin CY, Sheng GY (2010) Development of a Bacillus subtilis expression system using the improved Pglv promoter. Microbial cell factories 9 (55): 1-8.

141

101. Mobini-dehkordi M, Javan FA (2012) Review Article: Application of alpha-

amylase in biotechnology. Journal of Biology and today’s world 1: 39–50.

102. Monroy-Lagos O, Soberon X, Gaytan P, Osuna J (2006) Improvement of an unusual twin-arginine transporter leader peptide by a codon-based randomization

approach. Appl. and Environ. Microbiology 72: 3797–3801.

103. Morrow K (2007) Improving protein production processes. Gen. Eng. News 27: 41–

50.

104. Muraki S, Nishimoto H, Toyama Y, Shimamoto E, Takenaka S, Kaulpiboon J, Prousoontorn M, Limpaseni T, Pongsawasdi P, Aoki K. (2007) Purification and

Characterization of Two Alkaline, Thermotolerant α-Amylases from Bacillus halodurans 38C-2-1 and Expression of the Cloned Gene in E. coli. Bioscience,

Biotechnology and Biochemistry 71: 2393–2401.

105. Naidu MA (2013) Bacterial Amylase A Review. International Journal of

Pharmaceutical & Biological Archive 4: 274–287.

106. Nakajima R, Imanaka T, Aiba S (1985) Nucleotide Sequence of the Bacillus

stearothermophilus.Journal of Bacteriology 163(1): 401-406.

107. Nakamura K, Fujita Y, Itoh Y, Yamane K (1989) Modification of length, hydrophobic properties and electric charge of Bacillus subtilis alpha-amylase signal

peptide and their different effects on the production of secretory proteins in B.

subtilis and Escherichia coli cells. Mol. Gen. Genet 216: 1–9.

108. Nakamura K, Takase K (1990) Artificial insertion of peptides between signal peptide and mature protein: effect on secretion and processing of hybrid

thermostable a-amylases in Bacillus subtilis and Escherichia coli cells.Journal of

General Microbiology 136: 1551-1558.

109. Naturwissenschaften D. Der (2010) Genetic tools for high yield protein production

with Bacillus megaterium. Lebenswissenschaften, PhD.

110. Naturwissenschaften D Der (2007) Production and secretion of recombinant proteins using Bacillus megaterium.Doktorin der Naturwissenschaften. Von der Fakultät für Lebenswissenschaften der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina 111. Nguyen Q.D (2003) Studies on some carbohydrolases with nutrition potential. PhD

school of food science, Szent István University.

112. Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S, von Heijne G (1997a) A neural network method for identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and

prediction of their cleavage sites. Int. J. Neural. Syst. 8:581–599

142

113. Nielsen H, Engelbrecht J, Søren B, von Heijne G (1997b) Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites

Artificial neural networks have been used for many biological. Protein Engineering 10: 1–6.

114. Nijland R, Kuipers O (2008) Optimization of Protein Secretion by Bacillus subtilis.

Recent Patents on Biotechnology, 2, 79–87.

115. Niu D, Zuo Z, Shi GY, Wang, ZX (2009) High yield recombinant thermostable α- amylase production using an improved B. licheniformis system. Microbial Cell Factories 8: 58-65.

116. Nunes De Souza A, Lelis M, Martins L (2001), Isolation, Properties and Kinetics of Growth of a Thermophilic Bacillus. Brazilian J. of Microbiology 32: 271–275. 117. Nusrat A, Rahman SR (2007), Comparative Studies on the Production of Extracellular α-Amylase by Three Mesophilic Bacillus Isolates. Bangladesh J.

Microbiol. 24: 129–132.

118. Olagoke OA (2014) Mycelial growth and cellulase activities of some thermophilic fungi isolated from municipal solid wastes and palm-kernel stacks in Nigeria.

American Journal of Microbiology and Biotechnology, 1 (1): 27–35.

119. Padayachee T (2006), Application of Thermostable α-amylase from Thermomyces lanuginosus ATCC 58157 to nutritionally enhance starch based food. Doctorate of

Technology (Biotechnology). Department of Biotechnology, Durban University of

Technology.

120. Pagé N, Kluepfel D, Shareck F, Morosoli R (1996) Effect of signal peptide alterations and replacement on export of xylanase A in Streptomyces lividans.

Applied and Environmental Microbiology, 62: 109–114.

121. Pandey A, Nigam P, Soccol C.R, Soccol V.T, Singh D, Mohan R (2000) Advances

in microbial amylases. Biotechnol. Appl. Biochem., 31, 135–152.

122. Parmar D, Pandya A (2012) Characterization of Amylase Producing Bacterial

Isolates. Bull. Environ. Pharmacol. Life Sci., 1: 42–47. 123. Patcharaporn B, Chotima P, Julian GH and Rasana WS

(2017), Secondary metabolites from Bacillus amyloliquefaciens isolated from soil can kill Burkholderia pseudomallei. AMB Express. 7: 16. Published online

124. Pechsrichuang P, Songsiriritthigul C, Haltrich D, Roytrakul S, Namvijtr P, Bonaparte N, Yamabhai M. (2016), OmpA signal peptide leads to heterogenous

143

secretion of B. subtilis chitosanase enzyme from E. coli expression system. Springer

Plus, 5: 1200–1210.

125. Petersohn A, Bernhardt J, Gerth U, Höper D, Koburger T, Völker U, Hecker M, Bernhardt RG, Gerth ULF (1999) Identification of B -Dependent Genes in Bacillus

subtilis Using a Promoter Consensus-Directed Search and Oligonucleotide

Hybridization Identification of B -Dependent Genes in Bacillus subtilis Using a

Promoter Consensus-Directed Search and Oligonucleo. J .Bacteriol. 181: 5718–

5724.

126. Phan Thi PT, Tran LT, Schumann W, Nguyen HD (2015), Development of P grac 100-based expression vectors allowing high protein production levels in Bacillus subtilis and relatively low basal expression in Escherichia coli. Microbial. Cell

Factories, 14: 1–9.

127. Phan TTP, Nguyen H D, Schumann W (2012), Development of a strongintracellular expression system for Bacillus subtilis by optimizing promoter elements. J.

Biotechnol., 157(1): 167-172.

128. Priyadharshini R, Manoharan S, Hemalatha D, Gunasekaran P (2010), Repeated

random mutagenesis of α-amylase from Bacillus licheniformis for improved pH performance. J. of Microbiol. and Biotechnol.,20: 1696–1701.

the cradle to the grave. Adv. Appl. Microbiol., 73:1–25

129. Pohl S, Harwood CR (2010), Heterologous protein secretion by Bacillus species from

130. Qi Y, Kobayashi Y, Hulett FM (1997), The pst operon of Bacillus subtilis has a phosphate-regulated promoter and is involved in phosphate transport but not in

regulation of the Pho regulon. Journal of Bacteriology, 179: 2534–2539.

131. Rabbani M, Sadeghi HM , Moazen F, Rahimi M, and Salehi G (2011) Cloning and Expression of Randomly Mutated Bacillus subtilis-Amylase Genes in HB101.

Biotechnology Research International: 1-6.

132. Ramachandran N (2005) Development of improved α -amylases. Doctoral degree.

Sciences at Stellenbosch.

133. Ray RR (2015) Microbial Avicelase : an Overview. Bull. Env.Pharmacol. Life Sci.,

4: 3–13.

134. Reddy NS, Nimmagadda A, Rao KRSS, Nagar N (2003), An overview of the

microbial α-amylase family. Afr. J. of Biotechnol., 2 (12): 645–648.

135. Rey MW, Ramaiya P, Nelson B. a, Brody-Karpin SD, Zaretsky EJ, Tang M, Lopez de Leon A, Xiang H, Gusti V, Clausen IG, Olsen PB, Rasmussen MD, Andersen

144

JT, Jørgensen PL, Larsen TS, Sorokin A, Bolotin A, Lapidus A, Galleron N, Ehrlich

SD, Berka RM (2004) Complete genome sequence of the industrial bacterium

Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species. Genome Biology, 5 (10): 77-99.

136. Rivera MH, López-Munguía A, Soberón X, Saab-Rincón G (2003), Alpha-amylase from Bacillus licheniformis mutants near to the catalytic site: effects on hydrolytic

and transglycosylation activity. Protein engineer. 16: 505–514.

137. van Roosmalen ML, Geukens N, Jongbloed JDH, Tjalsma H, Dubois JYF, Bron S, van Dijl JM, Anné J. (2004) Type I signal peptidases of Gram-positive bacteria.

Biochimica et Biophysica Acta 1694: 279–297.

138. Sadeghi, H. M. M., Rabbani, M., Rismani, E., Moazen, F., Khodabakhsh, F., Dormiani K, & Khazaei, Y (2011) Optimization of the expression of reteplase in Escherichia coli. Research in Pharmaceutical Sciences. 6(2). 87–92.

139. Saengkerdsub S, Liyanage R, Oliver J (2013), Suitability of Various Prepeptides and Prepropeptides for the Production and Secretion of Heterologous Proteins by

Bacillus megaterium or Bacillus licheniformis. Agriculture, Food and Analytical

Bacteriology 3: 230-248

140. Sahukhan R, Roy SK, SLC (1993) Immobilization of α-amylase from Myceliophthora thermophila D-14 (ATCC 48104). Enzyme and Microbial.

Technology. 15: 801–804.

141. Sakakibara Y, Tsutsumi K, Nakamura K (1993), Structural requirements of Bacillus

subtilis alpha-amylase signal peptide for efficient processing : in vivo pulse-chase experiments with mutant signal peptides. Structural Requirements of Bacillus

subtilis α-Amylase Signal Peptide for Efficient Process. J Bacteriol 175 (13): 4203–

4212.

142. Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular cloning: a Laboratory Manual. Cold

Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

143. Sambrook J, Russell DW(2006) Rapid and Efficient Site-directed Mutagenesis by the Single-tube Megaprimer PCR Method. Cold Spring Harbor Protocols 3467. 144. Sathya TA, Mahejibin K (2014) Diversity of glycosyl hydrolase enzymes from metagenome and their application in food industry. J. Food Sci., 79: 2149–2156. 145. Schallmey M, Singh A, Ward OP (2004) Developments in the use of Bacillus

species for industrial production. Can. J. Microbiol., 50(1):1-17.

145

146. Schmeisser C, Steele H, Streit WR (2007), Metagenomics, biotechnology with non-

culturable microbes. Appl. Microbiol. and Biotechnol., 75: 955–962.

147. Schneider TD, Stephens RM (1990), Sequence logos: a new way to display

consensus sequences. Nucleic Acids Res. 18: 6097–6100.

148. Sevillano L, Vijgenboom E, van Wezel GP, Díaz M, Santamaría RI (2016), New approaches to achieve high level enzyme production in Streptomyces lividans.

Microbial Cell Factories 15: 28-38.

149. Sharma A, Satyanarayana T (2013), Microbial

acid-stable α-amylases: Characteristics, genetic engineering and applications. Process Biochemistry 48: 201–211.

Pharm Sci Res.,3 (4):1161–1163.

150. Sharma N, Vamil R, Ahmad S, Agarwal R. (2012), Effect of different carbon and nitrogen sources on α-amylase production from Bacillius amyloliquefaciens. Int J

151. Simair AA, Qureshi AS, Khushk I, Ali CH, Lashari S, Bhutto MA, Lu C enzyme (2017)Production characterization of α-amylase partial and

from Bacillus sp. BCC 01-50 and potential applications. BioMed Research

International, 9173040.

152. Simonen M, Palva I (1993), Protein secretion in Bacillus species. Microbiological

reviews 57: 109–137.

153. Sivaramakrishnan S, Gangadharan D, Madhavan K, Soccol CR, Pandey A (2006) α- Amylases from Microbial Sources – An Overview on Recent Developments. Food

Technol. Biotechnol., 44: 173–184.

154. Society A (1993), Structural Requirements of Bacillus subtilis α-Amylase Signal

Peptide for Efficient Processing : In Vivo Pulse-Chase Experiments with Mutant Signal Peptides.J. Bacteriol. 175: 4203–4212.

155. Song Y, Nikoloff JM, Zhang D (2015), Improving protein production on the level of regulation of both expression and secretion pathways in Bacillus subtilis. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25: 963–977.

156. Southgate VJ, Steyn AJC, Pretorius IS, van Vuuren HJJ (1993), Expression and Secretion of Bacillus amyloliquefaciens α-Amylase by Using the Yeast Pheromone CL-Factor Promoter and Leader Sequence in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 59 (4): 1253–1258.

157. Souza PM de, Magalhães P de O (2010), Application of microbial α-amylase in

industry - a review. Brazilian J. of Microbiology, 41: 850–861.

146

158. Stephens MA, Ortlepp SA, Ollington JF, McConnell DJ (1984), Nucleotide

sequence of the 5’ region of the Bacillus licheniformis α-amylase gene: Comparison with the B. amyloliquefaciens gene. J. of Bacteriology158: 369–372.

159. Stephenson K, Carter NM, Y CRH (1998) The influence of protein folding on late stages of the secretion of K-amylases from Bacillus subtilis. FEBS Letters 430: 385–389.

160. Sundarram A, Murthy T.P.K (2014) α -Amylase Production and Applications : A

Review. Journal of Appl.& Env. Microbiology 2: 166–175.

161. Suominen L, Meyer P, Tilgmann C, Glumoff T, Glumoff V, Kapyla J, Mantsalal P.

(1990) Bacillus stearothermophilus. Microbiology 69: 154–158.

162. Swain MR, Kar S, Padmaja G, Ray RC (2006) Partial characterization and optimization of production of extracellular α-amylase from Bacillus subtilis isolated

from culturable cow dung microflora. Pol. J. Microbiol. 55 (4): 289–296

163. Tachibana Y,Leclere MM, Fujiwara S, Takagi M (1996) Cloning and expression of the alpha-amylase gene from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus sp.

KOD1, and characterization of the enzyme. Journal of Fermentation and

Bioengineering 82: 224–232.

164. Takata H, Kurikis T, Okadas S, Takesadall Y, Minamiurall N, Imanaka T (1992)

Action of Neopullulanase. J. of Biological.Chem 267: 18447–18452.

165. Takimura Y, Kato M, Ohta T (1997) Secretion of human interleukin-2 in biologically active form by Bacillus brevis directly into cultute medium. Bioscience,

Biotechnology, and Biochemistry 61: 1858–1861.

166. Terpe K (2006) Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.

Applied Microbiology and Biotechnology 72: 211–222.

167. Huỳnh Kiều Thanh, Phan Thị Phƣợng Trang, Trần Linh Thƣớc, Nguyễn Đức Hoàng (2014) Sử dụng promoter mạnh Pgrac212 để tăng cƣờng sự biểu hiện tiết alpha amylase chỉ thị ở Bacillus subtilis. Tạp chí Sinh học 36: 90–96.

168. Tjalsma H, Antelmann H, Jongbloed JDH, Braun PG, Darmon E, Dorenbos R, Dubois F, Westers H, Zanen G, Quax WJ, Kuipers OP, Bron S, Hecker M, Dubois

JF, Dijl JM (2004) Proteomics of Protein Secretion by Bacillus subtilis : Separating the Secrets of the Secretome Proteomics of Protein Secretion by Bacillus subtilis.

Microbiol. Mol. Biol. Rev 68: 207–233.

147

169. Tjalsma H, Bolhuis A, Jongbloed J.D., Bron S,van Dijl JM (2000a) Signal peptide- dependent protein transport in Bacillus subtilis: a genome-based survey of the

secretome. Microb. and Molec.Biology Reviews 64: 515–547.

170. Tjalsma H, Noback MA, Bron S, Venema G, Yamane K,van Dijl JM (1997) Bacillus subtilis Contains Four Closely Related Type I Signal Peptidases with

Overlapping Substrate Specificities. J. Biol. Chem. 272 (41): 25983–25992.

171. Tutino M.L, Parrilli E, Giaquinto L, Duilio A, Sannia G, Feller G, Marino G, Ii F, Universitario C (2002) Secretion of α- amylase from Pseudoalteromonas

haloplanktis TAB23 : Two Different Pathways in Different Hosts. J.Bacteriol. 184

(20): 5814–5817.

172. Lê Văn Trƣờng, Nguyễn Thanh Thủy, Trƣơng Nam Hải (1995) Biến nạp các gen

amylaza vào nấm men S. cerevisiae. Kỷ yếu Viện CNSH: 25–32.

173. Vavrová Ľ, Muchová K, Barák I (2010) Comparison of different Bacillus subtilis

expression systems. Research in Microbiology 161: 791–797.

174. Vester JK, Glaring MA, Stougaard P (2014) Discovery of novel enzymes with industrial potential from a cold and alkaline environment by a combination of

functional metagenomics and culturing. Microb Cell Fact13 (72): 1–14.

175. Vitikainen M (2004) PrsA Lipoprotein and postranslocational folding of secretory proteins in Bacillus subtilis. The National Public Health Institute. Julkaisija-

Utgivare-Publisher.

176. Vitikainen M, Lappalainen I, Seppala R, Antelmann H, Boer H, Taira S, Savilahti H, Hecker M, Vihinen M, Sarvas M, Kontinen VP (2004) Structure-function

analysis of prsa reveals roles for the parvulin-like and flanking N- and C-terminal

domains in protein folding and secretion in Bacillus subtilis. Journal of Biological

Chemistry 279: 19302–19314.

177. Voskuil MI, Chambliss GH (1993) Rapid isolation and sequencing of purified plasmid DNA from Bacillus subtilis. Appl Environ Microbiol 59 (4): 1138–1142. 178. Wanderley KJ, Torres FAG, Moraes LMP, Ulhoa CJ (2004) Biochemical characterization of alpha-amylase from the yeast Cryptococcus flavus. FEMS Microbiology Letters 231: 165–169.

179. Wang G, Xia Y, Song X, Ai L (2016a) Common non-classically secreted bacterial

proteins with experimental evidence. Curr. Microbiol.72: 102–111.

148

180. Wang P, Wang P, Tian J, Yu X, Chang M, Chu X, Wu N (2016b) A new strategy to in Bacillus the extracellular α-amylase from Pyrococcus furiosus express

amyloliquefaciens. Scientific Reports 6: 22229-22239.

181. Watanabe K, Tsuchida Y, Okibe N, Teramoto H, Suzuki N, Inui M, Yukawa H (2009) Scanning the Corynebacterium glutamicum R genome for high-efficiency

secretion signal sequences. Microbiology 155:741–750.

182. van Wely KH, Swaving J, Freudl R, Driessen J (2001) Translocation of proteins across the cell envelope of Gram-positive bacteria. FEMS Microbiology Reviews 25: 437–454.

183. Westers H, Darmon E, Zanen G, Veening JW, Kuipers OP, Bron S, Quax WJ, Van Dijl JM (2004) The Bacillus secretion stress response is an indicator for α-amylase

production levels. Lett. in Appl. Microbiol 39: 65–73.

184. Wipat A, Harwood CR (1999) The Bacillus subtilis genome sequence: the molecular blueprint of a soil bacterium. FEMS Microbiology Ecology 28: 1–9. 185. Worthington P, Hoang V, Perez-pomares F, Blum P (2003) Targeted Disruption of the Hyperthermophilic Archaeon Sulfolobus the alpha-Amylase Gene in

solfataricus. Journal of Bacteriology 185: 482–488.

186. Xie F, Quan S, Liu D, Ma H, Li F, Zhou F, Chen G (2014) Purification and

from a newly isolated Bacillus

characterization of a novel α-amylase methylotrophicus strain P11-2. Process Biochemistry 49: 47–53.

187. Xavier AREO, Lima ER, Oliveira AME, Cardoso L, Santos J, Cangussu CHC, Leite LN, Quirino MCL, Júnior IGC, Oliveira DA, Xavier MAS (2017) Genetic diversity of

Bacillus sp. producers of amylase isolated from the soil. Genet Mol Res. 16(3). doi:

10.4238/gmr16039771

188. YaDeau JT, Klein C, Blobel G (1991) Yeast signal peptidase contains a glycoprotein and the Sec11 gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88: 517–521.

189. Yamabhai M, Emrat S, Sukasem S, Pesatcha P, Jaruseranee N, Buranabanyat B (2008) Secretion of recombinant Bacillus hydrolytic enzymes using E. coli expression systems. Jof biotechnol 133: 50–57.

190. Yang H, Liu L, Li J, Du G, Chen J (2011) Heterologous expression, biochemical characterization, and overproduction of alkaline α-amylase from Bacillus

alcalophilus in Bacillus subtilis. Microbial.Cell Factories 10: 77-86.

149

191. Yarimizu T, Nakamura M, Hoshida H, Akada R (2015) Synthetic signal sequences that enable efficient secretory protein production in the yeast Kluyveromyces

marxianus. Microbial.Cell Factories 14: 20-34.

192. Yavuz E, Gunes H, Harsa S, Yenidunya F (2004) Identification of extracellular enzyme producing thermophilic bacilli from Balcova (Agamemnon) geothermal site

by ITS rDNA RFLP. J. of Applied Microbiology 97: 810– 817.

193. Ying Q, Zhang C, Guo F, Wang S, Bie X, Lu F, Lu Z (2012) Secreted expression of

a hyperthermophilic α-amylase gene from Thermococcus sp. HJ21 in B. subtilis. J. of Molec. Microbiol. and Biotechnol 22: 392–398.

194. Yokota T, Tonozuka T, Shimura Y, Ichikawa K, Kamitori S, Sakano Y (2001) Structures of Thermoactinomyces vulgaris R-47 α-amylase II complexed with substrate analogues. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 65: 619–626. 195. Zeng Q, Wei C, Jin J, Wu C, Huang B (2011) Cloning of the gene encoding acid- stable alpha-amylase from Aspergillus niger and its expression in Pichia pastoris.

African Journal of Food Science 5 (12): 668–675.

196. Zhang J, Robinson D, Salmon P (2006) A novel function for selenium in biological system: selenite as a highly effective iron carrier for Chinese hamster ovary cell

growth and monoclonal antibody production. Biotechnol. Bioeng 95: 1188–1197. 197. Zhang Q, Han Y, Xiao H (2017) Microbial α-amylase: A biomolecular overview.

Process Biochemistry 53: 88–101.

198. Zhang W, Yang M, Yang Y, Zhan J, Zhou Y, Zhao X (2016) Optimal secretion of alkali-tolerant xylanase in Bacillus subtilis by signal peptide screening. Appl.

Microbiology and Biotechnology 100: 8745–8756.

199. Zhou Y, Liu P, Gan Y, Sandoval W, Katakam AK, Reichelt M, Rangell L, Reilly D (2016) Enhancing full-length antibody production by signal peptide engineering.

Microbial Cell Factories 15: 47-58.

200. Zhou Y, Wei W, Che Q, Xu Y, Wang X, Huang X, Lai R (2008) Bacillus pallidus sp. nov., isolated from forest soil. Int J Syst Evol Microbiol. 58: 2850-2854.

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC I.

Hình dạng tế bào, hoạt tính catalase và khả năng sinh bảo tử của các

chủng đƣợc tuyển chọn

STT

Hình dạng khuẩn lạc

Gram Catalase

Kí hiệu Chủng

Khả năng sinh bào tử

CN1-1

Nhỏ, không tròn, mép gọn, bề mặt hơi lồi, có nếp nhăn to

CN1-2 Tròn, màu trắng đục, mép hơi răng cƣa, có viền ở tâm

CN1-3

Trắng, mép sần sùi, có nhiều chấm nhỏ, bề mặt khô, lan rộng

CN1-5

Trắng, mép sần sùi, có nhiều chấm nhỏ, bề mặt khô, lan rộng

CN1-6 Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

CN2-1 Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

CN2-7 Đa dạng, Màu nâu đỏ, bề mặt khô, mép răng cƣa

CN2-8 Hình trứng, trắng đục hoặc màu kem nhẹ, hơi lồi

CN3-1

Trắng, mép sần sùi, có nhiều chấm nhỏ, bề mặt khô, lan rộng

CN3-2

Trắng, mép sần sùi, có nhiều chấm nhỏ, bề mặt khô, lan rộng

CN3-7 Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

CN3-8

Nhỏ, không tròn, mép gọn, bề mặt hơi lồi, có nếp nhăn to

D1-1

Tròn, nhỏ, màu trắng, mép răng cƣa, bề mặt hơi ƣớt, bóng

D1-2

Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

D1-17 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, hơi lồi

D1-33

nhỏ, không tròn, mép gọn, bề mặt hơi lồi, có nếp nhăn to

D1-35 Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

D2-1

Tròn, nhỏ, màu trắng, mép răng cƣa, bề mặt hơi ƣớt, bóng

D2-2

Đa dạng, Màu nâu đỏ, bề mặt khô, mép răng cƣa

D2-7

Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

D2-8

Tròn, màu kem bề mặt nhăn, hơi lồi

D2-9

Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

D2-10

nhỏ, trắng trong, bề mặt khô, mép hơi lan

D2-11 Tròn, trắng, bề mặt khô, nhăn sóng nhỏ

D2-12 Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

D2-13 Tròn, trắng, bề mặt khô, nhăn sóng nhỏ

D2-15 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, hơi lồi

D2-17

Tròn, màu trắng hơi ánh nâu, bề mặt khô, mép gọn màu trong

D2-20

Tròn, màu trắng hơi ánh nâu, bề mặt khô, mép gọn màu trong

D2-22 Tròn, bề mặt khô, hơi nhăn sóng to, mép gọn

Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

D5-2

Đa dạng, Màu nâu đỏ, bề mặt khô, mép răng cƣa

D6-1

Tròn, màu trắng hơi ánh nâu, bề mặt khô, mép gọn màu trong

D6-3

Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

D6-6

Nhỏ, tròn, tâm màu vàng hơi nâu, viền trắng trong, bề mặt hơi khô

D6-8

tròn, màu trắng, bề mặt khô, nhăn, sóng to

D6-9

Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

D6-10 Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

D6-11 Nhỏ, màu trắng trong, hơi nâu, bề mặt khô, dẹt

D6-12 Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

D6-14 Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

D6-19 Tròn, trắng, bề mặt khô, nhăn sóng nhỏ

Tròn, trắng, bề mặt khô, nhăn sóng nhỏ

D7-1

Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

D7-4

Tròn, trắng, bề mặt khô, nhăn sóng nhỏ, mép răng cƣa

D7-5

Tròn, trắng, bề mặt khô, nhăn sóng nhỏ

D7-6

Tròn, trắng, bề mặt khô, nhăn sóng nhỏ

D7-10 Màu nâu đỏ, bề mặt khô, mép răng cƣa

D7-11 Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

D8-1

Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

D8-2

Trắng, bề mặt nhẵn, trơn, hơi bóng

D8-4

Tròn nhỏ, màu trắng, bề mặt khô, khi khuẩn lạc già có nếp nhăn nhẹ

D8-5

Tròn, màu kem bề mặt nhăn, hơi lồi

D8-6

Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

D8-11 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn

D8-12 Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

D9-1

Tròn, nhỏ, màu kem khuẩn lạc chuyển màu cà phê khi nuôi cấy thời gian dài

D9-2

Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn

D9-3

Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

D9-4

Tròn, màu trắng hơi ánh nâu, bề mặt khô, mép gọn màu trong

D9-5

tròn không đều, màu nâu, có đƣờng viền phân tâm, tâm có nếp nhăn

D9-7

Tròn, màu trắng hơi ánh nâu, bề mặt khô, mép gọn màu trong

D9-11 Trắng, bề mặt khô, mép xù sì

D9-12

Nhỏ, màu trắng, bề mặt khô, khi mọc dính chặt vào thạch, mép hơi lan

D9-13 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn

D9-14 Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

DP1-1

To, màu trắng, hơi ánh nâu đỏ, mặt hơi bóng, bề mặt có nếp nhăn

DP1-2

To, màu trắng, hơi ánh nâu đỏ, mặt hơi bóng, bề mặt có nếp nhăn

DP2

Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

DP3

Tròn, màu trắng hơi ánh nâu, bề mặt khô, mép gọn màu trong

Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

DP4

Trắng đục, bề mặt khô, mép xù sì

DP5

DA23

Nhỏ, màu trắng, bề mặt khô, khi mọc dính chặt vào thạch, mép hơi lan

DA24

Nhỏ, màu trắng, bề mặt khô, khi mọc dính chặt vào thạch, mép hơi lan

GL1-1 Màu trắng, bề mặt khô, mép xù sì

GL1-2 To, màu trắng, bề mặt nhẵn, mép răng cƣa

GL1-4 To, màu trắng, bề mặt khô, có viền tâm, mép xù sì

GL1-5 Tròn, màu kem bề mặt nhăn, hơi lồi

GL1-7 Nhỏ, bề mặt nhẵn, tâm vàng chanh viền trắng

GL1-8 To, màu trắng đục, mép xù sì, ở giữa nhăn

GL2-1 To, màu trắng đục, mép xù sì, ở giữa nhăn

GL2-2 Tròn nhỏ, màu vàng chanh, bề mặt khô, hơi bóng

GL2-3

To, màu trắng, hơi ánh nâu đỏ, mặt hơi bóng, bề mặt có nếp nhăn

GL2-4 Trắng, mép sần sùi, có nhiều chấm nhỏ, bề mặt khô

GL2-6 Trắng, bề mặt bóng, mép có tia lan rộng

GL2-7 Trắng, mép sần sùi, có nhiều chấm nhỏ, bề mặt khô

GL2-8 To, màu trắng, bề mặt nhẵn, mép răng cƣa

91 ML1-3 Khuẩn lạc màu vàng chanh, bề mặt khô, mép gọn

92 ML1-4

Trắng đục, bề mặt khô, có nhiều nếp nhăn với sóng to, mép gọn

93 ML1-5 Khuẩn lạc nhẵn, màu trắng, bề mặt khô, mép xù sì

tròn, bề mặt khô, màu trắng, mép xù sì

RRM1- 1

To, màu trắng đục, mép xù sì, ở giữa nhăn

RRM1- 2

tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to

RRM1- 3

RRM2 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, lồi

tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to

RRM3- 1

ovan, màu trắng, bề mặt khô, mép gọn

RRM3- 2

100 RRM4 Tròn, màu kem bề mặt nhăn, hơi lồi

101

Tròn, màu trắng, bề mặt hơi nhăn, khô, mép gọn

RRM5- 2

102

Tròn, màu trắng, bề mặt hơi nhăn, khô, mép gọn

RRM5- 3

103

RRM5- 4

Nhỏ, trắng đục, bề mặt khô, mép có hình răng cƣa màu trong, hơi xù sì

104 RRM8 To, màu trắng sáng, bề mặt khô

105

TB1-1

Tròn, màu kem và hơi nâu cà phê khi khuẩn lạc già, bề mặt nhăn, hơi lồi

106

TB1-2

tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to

107

TB2-1

Trắng đục, bề mặt khô, mép có hình răng cƣa màu trong, hơi xù sì

108

TB2-2 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, hơi lồi

109

TH1-1

Nhỏ, trắng, bề mặt khô, mỏng khi mọc sát thạch, mép gọn, có nếp nhăn

110

TH1-2

tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to

111

TH2

tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to

112

TH5-1 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, hơi lồi

113

TH5-2 Tròn, màu trắng, bề mặt hơi nhăn, khô, mép gọn

114

TR1

To, tròn, trắng, mép hơi xù sì

115

TR4-1 Bề mặt khô, màu trắng trong, nhiều nếp nhăn

116

TR4-2 Tròn, màu trắng, bề mặt hơi nhăn, khô, mép gọn

117

TR4-3 Tròn, màu trắng, bề mặt hơi nhăn, khô, mép gọn

118

TR5-1 Tròn, màu trắng đục, mép hơi răng cƣa, có viền ở tâm

119

TR5-2 Tròn, màu hơi vàng, bề mặt nhẵn bóng

120

TR5-3 Nhỏ, màu trắng, bề mặt khô, mép hơi lan

121

TT2-1

nhỏ, trắng đục, bề mặt khô, mép có hình răng cƣa màu trong, hơi xù sì

122 TT2-10 Tròn, màu trắng, bề mặt hơi nhăn, khô, mép gọn

123

TT2-2 Tròn, màu trắng, bề mặt hơi nhăn, khô, mép gọn

124

TT2-3 Nhỏ, bề mặt khô, hơi bóng, có mép hình răng cƣa

125

TT2-4

nhỏ, trắng đục, bề mặt khô, mép có hình răng cƣa màu trong, hơi xù sì

126

TT2-5 To, tròn, trắng, mép hơi xù sì

127

TT2-6

To, màu trắng, hơi ánh nâu đỏ, mặt hơi bóng, bề mặt có nếp nhăn

128

TT2-7 To, tròn, trắng, mép hơi xù sì

129

TT2-8

Nhỏ, trắng đục, bề mặt khô, mép có hình răng cƣa màu trong, hơi xù sì

130

TT2-9 Tròn, màu trắng, bề mặt hơi nhăn, khô, mép gọn

PHỤ LỤC II.

Hoạt tính và hàm lƣợng α amylase của các chủng chọn lọc

Ký hiệu chủng

Hoạt tính amylase (U/ml)

Hàm lƣợng protein tiết (µg/ml)

Hoạt tính amylase (U/ml)

Hàm lƣợng protein tiết (µg/ml)

Tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số, U/mg

CN1-1 5,70±0,40 1441,64±6,11

D9-11 6,28±0,67 1085,19±4,64

5,79

3,95

CN1-2 2,53±0,76 1553,18±6,14

D9-12 2,79±0,59 1293,53±5,53

2,16

1,63

CN1-3 3,51±0,52 1179,57±13,10

D9-13 7,33±0,57 1617,70±6,92

4,53

2,98

CN1-5 6,93±0,21 1368,06±15,38

D9-14 3,93±0,43 1690,31±7,23

2,33

5,07

CN1-6 1,52±0,47 1167,37±12,96

DP1-1 8,01±0,65 1412,87±4,76

5,67

1,30

CN2-1 2,24±0,92 1631,07±18,11

DP1-2 7,81±0,65 1770,99±7,57

4,41

1,37

CN2-7 6,50±0,56 1269,36±14,09

DP2

3,82±0,54 1348,03±4,05

2,83

5,12

CN2-8 8,41±0,37 1750,91±19,44

4,80

DP3

7,58±0,98 1591,55±3,81

4,76

CN3-1 3,40±0,27 1171,43±13,01

DP4

3,90±0,65 1347,41±5,76

2,89

2,90

CN3-2 6,50±0,44 1540,13±17,10

DP5

4,01±0,27 1879,92±8,04

2,13

4,22

CN3-7 4,48±0,44 1285,33±14,27

3,49

DA23 14,23±0,92 1563,87±6,69

9,10

CN3-8 5,31±0,36 1548,03±16,08

DA24 11,23±0,52 1445,53±6,18

7,77

3,43

D1-1

5,64±0,15 1220,24±13,55

GL1-1

5,34±0,7 1069,05±4,57

5,00

4,62

D1-2

2,53±0,32 1232,45±13,68

GL1-2

6,89±0,5 1190,08±5,09

5,79

2,05

D1-17 6,97±0,33 1215,86±16,83

GL1-4 7,86±0,55 1274,79±5,45

6,17

5,73

D1-33 8,54±0,21 1532,45±13,68

GL1-5 11,24±0,79 1303,03±5,57

8,63

5,57

D1-35 3,14±0,31 1476,50±16,39

GL1-7 3,66±0,26 1625,76±6,95

2,25

2,13

D2-1

6,21±0,26 1675,81±18,61

GL1-8

4,9±0,92 1133,59±4,58

4,32

3,71

D2-2

8,61±0,1 1830,37±20,32

GL2-1 5,82±0,84 1420,02±6,07

4,10

4,70

D2-7

3,98±0,33 1460,23±16,21

GL2-2 10,61±1,2 1573,32±6,73

6,74

2,73

D2-8 10,21±0,25 1479,20±17,53

GL2-3 11,83±0,69 1504,74±6,44

7,86

6,90

D2-9

3,50±0,36 1374,51±9,71

GL2-4 3,17±0,57 1609,63±6,88

1,97

2,55

D2-10 4,39±0,27 1696,14±18,83

GL2-6 5,09±0,78 1940,43±8,30

2,62

2,59

D2-11 7,70±1,13 1754,09±17,25

GL2-7 4,48±0,89 1936,39±8,28

2,31

4,39

D2-12 3,90±0,26 1651,40±18,33

GL2-8 6,34±0,47 1435,31±5,71

4,42

2,36

D2-13 10,33±0,5 1618,87±17,97

6,38 ML1-3 8,55±0,74 1433,59±4,85

5,96

D2-15 5,35±0,56 1600,17±6,99

3,34 ML1-4 4,92±0,67 1641,90±7,02

3,00

D2-17 4,49±0,56 1517,19±6,62

2,96 ML1-5 5,18±0,59 1276,27±4,18

4,06

D2-20 8,65±0,61 1845,18±8,49

4,69

RRM1-1 3,65±0,47 1084,33±4,21

3,37

D2-22 2,48±0,56 1145,80±5,00

2,16

RRM1-2 7,97±0,51 1675,41±3,74

4,76

4,65±0,65 1402,62±6,12

3,32

RRM1-3 5,34±1,31 1355,24±3,66

3,94

2,07±0,96 1328,49±4,05

1,56

RRM2 10,52±1,21 1504,74±6,44

6,99

D5-2 14,12±0,99 1520,47±7,51

9,29

RRM3-1 10,38±1,01 1584,57±6,35

6,55

10,09±0,67 1473,73±6,44

6,85

RRM3-2 11,33±0,59 1475,03±7,59

7,68

D6-1

7,62±0,62 1343,35±5,87

5,67

RRM4 12,84±0,74 1608,76±6,88

7,98

D6-3

2,25±1,03 1031,22±4,50

2,18

RRM5-2 8,59±0,45 1242,52±5,31

6,91

D6-6

5,28±0,17 1210,10±4,19

4,36

RRM5-3 7,59±0,68 1702,41±7,28

4,46

D6-8

3,14±0,77 1213,91±3,55

2,59

RRM5-4 11,00±0,71 1488,60±6,37

7,39

D6-9

3,07±0,45 1173,46±5,12

RRM8 10,76±0,79 1549,11±6,62

6,95

2,62

D6-10 7,53±0,31 1841,18±8,04

TB1-1 10,05±0,66 1380,96±6,76

7,28

4,09

D6-11 6,43±0,08 1248,53±5,45

TB1-2 7,94±0,42 1473,08±4,59

5,39

5,15

D6-12 8,53±0,23 1054,92±4,61

TB2-1 5,75±0,39 1511,34±7,75

3,80

8,09

D6-14 3,87±0,14 1036,39±4,09

TB2-2 5,70±0,92 1334,67±3,14

4,27

3,73

D6-19 10,61±0,46 1556,71±6,80

TH1-1 6,28±0,86 1054,21±4,51

5,96

6,82

8,16±0,15 1536,68±5,4

TH1-2 11,03±0,78 1889,16±8,08

5,84

5,31

D7-1

6,48±0,13 1260,38±5,50

TH2

7,84±0,68 1379,23±3,76

5,68

5,14

D7-4 11,03±0,25 1529,35±6,68

TH5-1 6,22±0,33 2119,67±9,07

2,93

7,21

D7-5 11,49±0,36 1805,62±7,88

TH5-2

7,1±0,56 1932,36±8,26

3,67

5,81

D7-6

8,90±0,72 2086,15±9,11

TR1

3,63±0,65 1311,10±5,61

2,77

4,27

D7-10 5,22±0,62 1608,07±7,02

TR4-1 12,72±0,86 1658,04±7,09

7,67

3,25

D7-11 4,90±0,46 1149,75±5,02

TR4-2

8,50±0,3 1488,60±6,37

5,71

4,26

D8-1

4,09±0,77 1683,53±2,98

TR4-3 10,74±0,71 1590,93±5,52

6,75

2,43

D8-2

4,61±0,44 1879,45±3,76

TR5-1

8,60±0,4 1698,38±7,26

5,06

2,45

D8-4

9,55±0,58 1658,04±7,09

TR5-2 11,79±0,61 1562,93±7,54

7,54

5,76

D8-5 12,82±1,03 1441,92±6,17

TR5-3 10,27±0,69 1460,36±6,25

7,03

8,89

D8-6

4,25±0,85 1508,77±6,45

TT2-1 4,04±0,37 1137,63±4,87

3,55

2,82

D8-11 5,94±0,74 1078,59±3,33

TT2-2 12,23±0,48 1764,86±5,41

6,93

5,51

D8-12 2,95±0,62 1024,68±4,38

TT2-3 2,71±0,71 1016,60±4,35

2,67

2,88

3,61±0,56 1097,29±4,69

TT2-4 3,54±0,63 1101,33±4,71

3,21

3,29

D9-1 11,18±1,05 1469,30±6,28

TT2-5 4,18±0,71 1637,86±7,00

2,55

7,61

D9-2

3,83±0,59 1444,22±6,18

TT2-6 8,98±0,63 1415,99±6,06

6,34

2,65

D9-3

3,99±0,32 1149,73±4,92

TT2-7 5,90±0,78 1391,78±5,95

4,24

3,47

D9-4 11,15±0,99 1615,99±6,06

TT2-8 9,66±0,63 1658,34±7,09

5,83

6,90

D9-5

9,46±0,57 1359,51±5,81

TT2-9 5,60±0,68 1407,69±3,88

3,98

6,96

D9-7 10,17±0,79 1767,16±5,42

TT2-10 4,71±0,44 2129,44±9,96

2,21

5,75

PHỤ LỤC III

Kết quả thử kit API 50 CHB của một số chủng vi khuẩn chọn lọc

PHỤ LỤC IV. ĐIỂM XỬ LÝ PHÂN CẮT CỦA CÁC ĐOẠN SP

Trình tự nucleotide, protein và vị trí phân cắt peptide tín hiệu gen α-amylase

của chủng DA23

Trình tự nucleotide, protein và vị trí phân cắt peptide tín hiệu gen α-amylase

của chủng D5-2

Trình tự nucleotide, protein và vị trí phân cắt peptide tín hiệu gen α-amylase

của chủng CN1-5.

PHỤ LỤC V PHÂN TÍCH PROTEIN THEO LOWRY

Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp

photphomolipden- photphovonphramat (thuốc thử Folin- ciocalteu) tạo phức chất

màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 750nm. Cƣờng độ màu của hỗn

hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Dựa vào

mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định đƣợc hàm lƣợng

protein trong mẫu nghiên cứu

Dung dịch dùng cho phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Lowry

+ Dung dịch A: 2,85g NaOH và 14,31g Na2CO3 pha trong 500ml nƣớc cất.

+ Dung dịch B: 1,42g CuS04.5H2O pha trong 100ml nƣớc cất.

+ Dung dịch C: 2,85g Na2 Tartrate.2H2O pha trong 100ml nƣớc cất.

+ Dung dịch D (Lowry solution; 0,7mL/mẫu): trộn dung dịch A, dung dịch B, dung

dịch C theo tỉ lệ 100:1:1

+ Dung dich E: Thuốc thử folin (0,1 ml/mẫu): 5ml thuốc thử Folin - Ciocalteu’s

Phenol + 5ml nƣớc đề ion.

Đồ thị đƣờng chuẩn protein

PHỤ LỤC VI PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH BẰNG DNSA

Nguyên tắc phản ứng: Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc có mặt của

nhóm carbonyl tự do (C=O). Phản ứng này ôxi hóa nhóm chức aldehyt có mặt trong

glucose hoặc nhóm ketone trong fructose. 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) bị khử

thành 3-amino,5-nitrosalicylic acid dƣới điều kiện môi trƣờng kiềm. Màu phản ứng

phụ thuộc vào chính xác lƣợng đƣờng khử trong dung dịch.

Nồng độ các chất bổ sung trong mẫu thí nghiệm đƣờng khử

Tên đối Thể tích dịch Thể tích dịch tinh bột Đệm/nƣớc Thể tích

tƣợng mẫu enzyme (ml) trong đệm (ml) DNSA (ml) cất

Đối chứng 1 0 1 3 0

Đối chứng 2 0 0.5 3 0.5

Đối chứng 3 0.5 0.5 3 0

Mẫu 0.5 0 3 0.5

Đồ thị đƣờng chuẩn glucose

PHỤ LỤC VII.

CHUẨN BỊ CÁC DUNG DỊCH NGHIÊN CỨU

Pha IPTG: + 1.2g IPTG pha vào 50ml nƣớc sau đó lọc qua filter-sterilise và bảo quản ở

4ºC. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside (2ml): + 100mg X-Gal hòa trong 2ml N, N’-dimethylformamide. Bảo quản ở -

20ºC, tránh ánh sáng. TE (Tris/EDTA) buffer pH 8.0 : + Tris/HCl pH 8.0 10mM EDTA pH 8.0 10mM

10% SDS (sodium dodecyl sulphate):

+ 10g SDS trong 100ml nƣớc deion khử trùng và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

CTAB/NaCl

+ Cân 10% cetyltrimethylammonium bromide và 0.7 M NaCl và bổ sung

nƣớc đến 100ml.

Dung dịch A Tách chiết DNA tổng số

+ 567 µl 1xTE, 30 µl SDS 10% và 3 µl proteinase K 20 mg/ml

Tách plasmid của E.coli

+ Sol I: 50mM glucose, 25mM Tris – HCl (pH 8), 10mM EDTA(pH 8)

+ Sol II: 0.2N NaOH, 1% SDS

+ Sol III: 60.0 ml potassium acetate 5M; 11.5 ml acetic acid; H2O, 28.5 ml.

Tách chiết DNA plasmid Bacillus

+ SET: 25% sucrose, 50mM EDTA, 50mM Tris – HCl pH 8

+ Sol II: 0.2N NaOH; 1% SDS

LOCUS KU214590 366 bp DNA linear BCT 17- MAY-2016 DEFINITION Bacillus licheniformis strain DA23 alpha amylase gene, partial cds. ACCESSION KU214590 VERSION KU214590.1 KEYWORDS . SOURCE Bacillus licheniformis ORGANISM Bacillus licheniformis Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus. REFERENCE 1 (bases 1 to 366) AUTHORS Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K TITLE Signal peptide sequences of alpha amylase gene of bacillus sp. d5-2 and bacillus sp. da23 isolated from soil JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 366) AUTHORS Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (01-DEC-2015) Biomaterial, IBT, VAST, 18, Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Ha Noi 084, Viet Nam FEATURES Location/Qualifiers source 1..366 /organism="Bacillus licheniformis" /mol_type="genomic DNA" /strain="DA23" /isolation_source="soil" /db_xref="taxon:1402" /country="Viet Nam" /collection_date="22-Nov-2010" /collected_by="Da, N T" CDS 1..>366 /EC_number="3.2.1.1" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="alpha amylase" /protein_id="AND80847.1"

/translation="MKQQKRLYARFCCRLLFALIFLLPHSAAAAANLKGTLMQYFEWY MPNDGQHWKRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYKGTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGT VRTKYGTKGELQSAIKSLHT"

ORIGIN 1 atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttttgctgcc gcctgttatt tgcgctcatc 61 ttcttgctgc ctcattctgc agcagcggcg gcaaatctta aagggacgct gatgcagtat 121 tttgaatggt acatgcccaa tgacggccaa cattggaagc gcttgcaaaa cgactcggca 181 tatttggctg aacacggtat tactgccgtc tggattcccc cggcatataa gggaacgagc 241 caagcggatg tgggctacgg tgcttacgac ctttatgatt taggggagtt tcatcaaaaa 301 gggacggttc ggacaaagta cggcacaaaa ggagagctgc aatctgcgat caaaagtctt 361 catacc //

LOCUS KU214591 352 bp DNA linear BCT 17- MAY-2016 DEFINITION Bacillus cereus strain CN1-5 alpha amylase gene, partial cds. ACCESSION KU214591 VERSION KU214591.1 KEYWORDS . SOURCE Bacillus cereus ORGANISM Bacillus cereus Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus; Bacillus cereus group. REFERENCE 1 (bases 1 to 352) AUTHORS Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K TITLE Signal peptide sequences of alpha amylase gene of bacillus sp. d5-2 and bacillus sp. da23 isolated from soil JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 352) AUTHORS Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (01-DEC-2015) Biomaterial, IBT, VAST, 18, Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Ha Noi 084, Viet Nam FEATURES Location/Qualifiers source 1..352 /organism="Bacillus cereus" /mol_type="genomic DNA" /strain="CN1-5" /isolation_source="soil" /db_xref="taxon:1396" /country="Viet Nam" /collection_date="31-Oct-2010" /collected_by="Da, N T" CDS 1..>352 /EC_number="3.2.1.1" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="alpha amylase" /protein_id="AND80848.1" /translation="MFKKVTIVGLSVVMFLPSIYEGSKAYADTVNNGTLMQYFEWYAP NDGNHWNRLRTDVENLAEKGITSVWIPPAYKGTTQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVR TKYGTKAQLKSAIDA" ORIGIN 1 atgtttaaaa aagtaacaat agtcggattg tcggttgtta tgtttttacc tagtatatat 61 gaggggagta aagcatatgc agacacagtt aacaatggaa cgttaatgca gtattttgag 121 tggtatgctc cgaatgatgg gaatcattgg aatcgtttgc gtactgatgt tgaaaattta 181 gcggaaaaag gaattacatc tgtttggata ccacctgcat ataaaggaac tacgcaaaat 241 gacgtaggat atggagcata tgatttatat gatctggggg aattcaatca aaagggcaca 301 gtgcggacga aatatgggac gaaagcacaa ttgaaatctg caattgacgc tt //

LOCUS KU214589 397 bp DNA linear BCT 17- MAY-2016 DEFINITION Bacillus subtilis strain D5-2 alpha amylase gene, partial cds. ACCESSION KU214589 VERSION KU214589.1 KEYWORDS . SOURCE Bacillus subtilis ORGANISM Bacillus subtilis Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus. REFERENCE 1 (bases 1 to 397) AUTHORS Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K TITLE Signal peptide sequences of alpha amylase gene of bacillus sp. d5-2 and bacillus sp. da23 isolated from soil JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 397) AUTHORS Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (01-DEC-2015) Biomaterial, IBT, VAST, 18, Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Ha Noi 084, Viet Nam FEATURES Location/Qualifiers source 1..397 /organism="Bacillus subtilis" /mol_type="genomic DNA" /strain="D5-2" /isolation_source="soil" /db_xref="taxon:1423" /country="Viet Nam" /collection_date="22-Nov-2010" /collected_by="Da, N T" CDS 1..>397 /EC_number="3.2.1.1" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="alpha amylase" /protein_id="AND80846.1" /translation="MFKKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLSGPAAANAETANKSNKVTA SSVKNGTILHAWNWSFNTLTQNMKDIRDAGYAAIQTSPINQVKEGNQGDKSMRNWYWL YQPTSYQIGNRYLGTEQEFKDMWQPRIKYG" ORIGIN 1 atgtttaaaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgccggatt tttattgctg 61 tttcatttgg ttttgtcagg cccggcggct gcaaacgctg aaactgcaaa caaatcgaat 121 aaggtgaccg cgtcatcggt caaaaacggg accatccttc atgcatggaa ttggtcgttc 181 aatacgttaa cacaaaatat gaaagatatt cgtgatgcgg gctatgcagc cattcagacg 241 tctccgatta accaagtaaa ggaagggaac caaggagata aaagcatgag gaactggtac 301 tggctgtatc agccgacatc gtaccaaatc ggcaaccgtt acttaggcac tgaacaagaa 361 tttaaggaca tgtggcagcc gcggataaag tatggcg //