Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase và a-amylase của loài dây thìa canh - Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Sm. và dây thìa canh lá to – Gymnema latifolium Wall. Ex Wight

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Dương Thị Hải Yến

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

ỨC CHẾ ENZYM -GLUCOSIDASE VÀ -AMYLASE CỦA

LOÀI DÂY THÌA CANH - Gymnema sylvestre (RETZ.) R.BR.

EX SM. VÀ DÂY THÌA CANH LÁ TO - Gymnema latifolium

WALL. EX WIGHT

Hà Nội - 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Dương Thị Hải Yến

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

ỨC CHẾ ENZYM -GLUCOSIDASE VÀ -AMYLASE CỦA

LOÀI DÂY THÌA CANH - Gymnema sylvestre (RETZ.) R.BR.

EX SM. VÀ DÂY THÌA CANH LÁ TO - Gymnema latifolium

WALL. EX WIGHT

Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ

Mã số: 9.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS. TS. Phan Văn Kiệm

Hà Nội – 2021

PGS. TS. Nguyễn Xuân Nhiệm

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự

hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Phan Văn Kiệm và PGS. TS. Nguyễn Xuân

Nhiệm. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 22 tháng 7 năm 2021

Tác giả luận án

Dương Thị Hải Yến

ii

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được sự

giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia

đình

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS.

TS. Phan Văn Kiệm - người Thầy đã định hướng, tận tâm hướng dẫn khoa học, động

viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Xuân Nhiệm - người

Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học và truyền đạt cho tôi rất nhiều kinh nghiệm quý

giá

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ,

đồng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán bộ của Viện đã quan

tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và

nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển

về sự quan tâm giúp đỡ, với những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong

việc thực hiện và hoàn thiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Dược, Trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc đã

giúp đỡ tôi thực hiện các phép đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng phân

giải cao hiện các phép thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và enzyme α-

amylase.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm tiên tiến và hóa sinh hữu cơ, Viện Hóa

sinh biển đã giúp đỡ tôi đã giúp đỡ tôi thực hiện các phép thử hoạt tính ức chế enzyme

α-glucosidase và enzyme α- amylase.

Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Việt Nam

(NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí theo mã số đề tài 104.01-2017.25

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình,

bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt

quá trình học tập và nghiên cứu.

Xin trân trọng cảm ơn!

iii

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về chi Gymnema ........................................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Gymnema ..................................................................... 3 1.1.2. Giới thiệu về loài Gymnema sylvestre và Gymnema latifolium ........................... 5

1.1.2.1. Loài Gymnema sylvestre .................................................................................. 5 1.1.2.2. Loài Gymnema latifolium ................................................................................ 6 1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Gymnema ........................ 6

1.1.3.1. Các hợp chất steroid ......................................................................................... 6 1.1.3.2. Các hợp chất triterpenoid ................................................................................. 9 1.1.3.3. Phenolic và các hợp chất khác ....................................................................... 17 1.1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Gymnema ................................... 19

1.1.4.1. Hoạt tính trị bệnh tiểu đường ......................................................................... 19 1.1.4.2. Hoạt tính chống béo phì ................................................................................. 21 1.1.4.3. Hoạt tính chống oxi hóa ................................................................................. 21 1.1.4.4. Tác dụng bảo vệ gan ....................................................................................... 23 1.1.4.5. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định .......................................................... 23 1.1.5. Tình hình nghiên cứu về chi Gymnema ở Việt Nam ............................................ 24 1.2. Khái quát về bệnh tiểu đường ..................................................................... 26 1.3. Khái quát về vai trò của enzyme α-glucosidase và enzyme α-amylase .... 28 1.3.1. Khái niệm về enzyme ............................................................................................. 28 1.3.2. Enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1) ............................................................................ 28 1.3.3. Enzyme α-glucosidase (EC 3.2.1.20).................................................................... 29 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ................................................... 31

2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 31 2.1.1. Loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Sm ....................................................... 31 2.1.2. Loài Gymnema latifolium Wall. ex Wight ........................................................... 31 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 32 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất ................................................................... 32

2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................................................. 32 2.2.1.2. Sắc ký cột (CC) ............................................................................................... 32 2.2.1.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................................................... 32 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc ............................................................................ 32

2.2.2.1. Phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS) .................. 32 2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............................................................ 32 2.2.2.3. Độ quay cực ..................................................................................................... 33 2.2.2.4. Phương pháp xác định đường ........................................................................ 33 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ........................................................... 34

iv

2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α -glucosidase ................ 34 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α -amylase ...................... 35 2.3. Phân lập các hợp chất .................................................................................. 36 2.3.1. Các hợp chất phân lập từ loài G. sylvestre .......................................................... 36 2.3.2. Các hợp chất phân lập từ loài G. latifolium ........................................................ 39 2.4. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được ........ 42 2.4.1. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre .......... 42

2.4.1.1. Hợp chất GS1: gymsyloside A (hợp chất mới) ........................................... 42 2.4.1.2. Hợp chất GS2: gymsyloside B (hợp chất mới) ............................................ 42 2.4.1.3. Hợp chất GS3: gymsyloside C (hợp chất mới) ............................................ 42 2.4.1.4. Hợp chất GS4: gymsyloside D (hợp chất mới) ........................................... 42 2.4.1.5. Hợp chất GS5:gymsyloside E (hợp chất mới) ............................................. 42 2.4.1.6. Hợp chất GS6: gymnepregoside R (hợp chất mới) ..................................... 43 2.4.1.7. Hợp chất GS7: gymnepregoside T (hợp chất mới) ..................................... 43 2.4.1.8. Hợp chất GS8: vetircilloside M ..................................................................... 43 2.4.1.9. Hợp chất GS9: verticilloside D ..................................................................... 43 2.4.1.10. Hợp chất GS10: gymnepregoside F............................................................ 43 2.4.1.11. Hợp chất GS11: 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside F ........................ 44 2.4.1.12. Hợp chất GS12: stephanoside I ................................................................... 44 2.4.1.13. Hợp chất GS13:3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester .......................................................... 44 2.4.1.14. Hợp chất GS14: gymnemoside-W1 ........................................................... 44 2.4.1.15. Hợp chất GS15: 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester .......... 44 2.4.1.16. Hợp chất GS16: alternoside XIX ................................................................ 45 2.4.2. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài G. latifolium ........ 45

2.4.2.1. Hợp chất GL1: gymlatifoside A (hợp chất mới) ......................................... 45 2.4.2.2. Hợp chất GL2: gymlatifoside B (hợp chất mới) ......................................... 45 2.4.2.3. Hợp chất GL3: gymlatifoside C (hợp chất mới) ......................................... 45 2.4.2.4. Hợp chất GL4: gymlatifoside D (hợp chất mới) ......................................... 45 2.4.2.5. Hợp chất GL5: verticilloside J ...................................................................... 46 2.4.2.6. Hợp chất GL6: lucyoside H ........................................................................... 46 2.4.2.7. Hợp chất GL7: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (xem hợp chất GS13) .................... 46 2.4.2.8. Hợp chất GL8: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester .......... 46 2.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được ............. 46 2.5.1. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất ................................. 46 2.5.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất ....................................... 47 CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ ................................................................ 49

v

3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được .................................. 49 3.1.1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất pregnane glycoside đã phân lập được ........................................................................................................................................... 50 3.1.1.1. Đặc điểm phổ 1H NMR của các hợp chất pregnane glycoside phân lập từ G. latifolium và G. sylvestre.............................................................................................. 51 3.1.1.2. Đặc điểm phổ 13C NMR của các hợp chất pregnane glycoside phân lập từ G. latifolium và G. sylvestre ........................................................................................ 52 3.1.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre ........... 53

3.1.2.1. Hợp chất GS1: gymsyloside A ...................................................................... 53 3.1.2.2. Hợp chất GS2: gymsyloside B ...................................................................... 62 3.1.2.3. Hợp chất GS3: gymsyloside C ...................................................................... 64 3.1.2.4. Hợp chất GS4: gymsyloside D ...................................................................... 66 3.1.2.5. Hợp chất GS5: gymsyloside E ...................................................................... 68 3.1.2.6. Hợp chất GS6: gymnepregoside R ............................................................... 70 3.1.2.7. Hợp chất GS7: gymnepregoside T ................................................................ 73 3.1.2.8. Hợp chất GS8: Vetircilloside M ................................................................... 75 3.1.2.9. Hợp chất GS9: verticilloside D ..................................................................... 77 3.1.2.10. Hợp chất GS10: gymnepregoside F............................................................ 79 3.1.2.11. Hợp chất GS11: 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside F ........................ 81 3.1.2.12. Hợp chất GS12: stephanoside I ................................................................... 83 3.1.2.13. Hợp chất GS13: 3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl acid oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester .......................................................... 84 3.1.2.14. Hợp chất GS14: gymnemoside-W1 ........................................................... 87 3.1.2.15. Hợp chất GS15: 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester .......... 89 3.1.2.16. Hợp chất GS16: alternoside XIX ................................................................ 91 3.1.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài G. latifolium .......... 93

3.1.3.1. Hợp chất GL1: gymlatifoside A ................................................................... 93 3.1.3.2. Hợp chất GL2: gymlatifoside B .................................................................... 95 3.1.3.3. Hợp chất GL3: gymlatifoside C .................................................................... 98 3.1.3.4. Hợp chất GL4: gymlatifoside D ................................................................. 100 3.1.3.5. Hợp chất GL5: verticilloside J .................................................................... 102 3.1.3.6. Hợp chất GL6: lucyoside H ......................................................................... 104 3.1.3.7. Hợp chất GL7:3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl acid oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester ................................................................ 106 3.1.3.8. Hợp chất GL8: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester ........ 106 3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được ............................... 108 3.2.1. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất ............................... 108 3.2.2. .Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất .................................... 110 KẾT LUẬN ............................................................................................................ 112

vi

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ..................................................... 114

KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 115

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ........................................... 116

vii

Kí hiệu Tiếng Anh

Diễn giải

13C NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

spectroscopy

1H NMR Proton nuclear magnetic resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

spectroscopy

2-NBDG 2-Deoxy-2-[ (7-nitro-2,1,3-

2-Deoxy-2-[ (7-nitro-2,1,3-

benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose

benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose

3T3-L1

Tế bào mô mỡ

ABTS

2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-

2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-

6-sulfonic acid

6-sulfonic acid

All

6-Deoxy-3-oxymethylallopyranose

Đường 6-deoxy-3-

oxymethylallopyranose

ALP Alkaline phosphatase

Enzymme alkaline phosphatase

ALT Alanine aminotransferase

Enzymme alanine aminotransferase

BHT

Butylated hydroxytoluene

Butylated hydroxytoluene

C.C

Chromatography column

Sắc ký cột

Can

Canaropyranose

Đường canaropyranose

COSY Correlation spectroscopy

Phổ COSY

Cym

Cymaropyranose

Đường cymanopyranose

DEPT Distortionless enhancement by

Phổ DEPT

polarization transfer

DMSO Dimethylsulfoxide

Dimethylsulfoxide

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

Glc

Glucose

Đường glucose

HDL

High density lipoprotein cholesterol

Lipoprotein mật độ cao

HL7702

Tế bào gan ở người

HMBC Heteronuclear mutiple bond correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều

liên kết

HPLC High pressure liquid chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSQC Heteronuclear singlequantum

Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết

correlation

Inhibitory concentration at 50%

Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử

IC50

nghiệm

LDH

Lactate dehydrogenase

Enzyme lactate dehydrogenase

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

LDL

Low density lipoprotein

lipoprotein mật độ thấp

MIC Minimum inhibitory concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide

diphenyltetrazolium bromide

ROESY Rotating frame Overhause Effect

Phổ ROESY

Spectroscopy

Optical density

OD

Mật độ quang

Oleandropyranose

Ole

Đường oleandropyranose

pNPG

4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside

4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside

TBARS Thiobarbituric acid reactive substances Các chất phản ứng với axit

thiobarbituric

Triglyceride

TGs

Triglyceride

Thv

Thevetopyranose

Đường thevetopyranose

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

TLTK

Tài liệu tham khảo

VLDL Very low density lipoprotein

Lipoprotein mật độ rất thấp

viii

ix

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Danh sách và nơi phân bố các loài thuộc chi Gymnema ............................................... 4

Bảng 1.2. Danh sách các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam ................................................... 5

Bảng 1.3. Các hợp chất pregnane glycoside từ chi Gymnema ........................................................ 7

Bảng 1.4. Các hợp chất triterpennoid khung oleanane từ chi Gymnema ......................... 9

Bảng 1.5. Các hợp chất khung dammarane và lupane từ chi Gymnema .................... 16

Bảng 1.6. Phenolic và một số hợp chất khác từ chi Gymnema ..................................................... 17

Bảng 2.1. Giá trị độ quay cực riêng của các đường đơn sau thủy phân ...................................... 34

Bảng 2.2. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các hợp chất từ G.sylvestre ................................ 47

Bảng 2.3. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các hợp chất từ G. latifolium ............................. 47

Bảng 2.4. Hoạt tính ức chế α-amylase của các hợp chất phân lập từ G. sylvestre ..................... 47

Bảng 2.5. Hoạt tính ức chế α-amylase của các hợp chất từ loài G. latifolium ............................ 48

Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS1 ................................................................................ 57

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS2 và hợp chất tham khảo ...................................... 63

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS3 và chất tham khảo .............................................. 65

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS4 và chất tham khảo .............................................. 67

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS5 và chất tham khảo .............................................. 69

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS6 và chất tham khảo .............................................. 71

Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS7 ................................................................................ 74

Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS8 ................................................................................ 76

Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS9 và hợp chất tham khảo ...................................... 78

Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS10 và hợp chất tham khảo .................................. 80

Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS11 và hợp chất tham khảo .................................. 82

Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS12 và hợp chất tham khảo .................................. 84

Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS13 và hợp chất tham khảo .................................. 86

Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS14 và hợp chất tham khảo .................................. 88

Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS15 và hợp chất tham khảo .................................. 90

Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS16 và hợp chất tham khảo .................................. 92

Bảng 3.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL1 ............................................................................. 94

Bảng 3.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL2 ............................................................................. 97

Bảng 3.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL3 ............................................................................. 99

Bảng 3.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL4 ........................................................................... 101

Bảng 3.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL5 và hợp chất tham khảo .................................. 103

Bảng 3.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL6 và hợp chất tham khảo .................................. 105

Bảng 3.23. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL8 và hợp chất tham khảo .................................. 107

x

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Gymnema ....................................................................... 3

Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất pregnane glycoside từ chi Gymnema ......................................... 9

Hình 1.3. Cấu trúc các hợp chất khung oleanane từ chi Gymnema ................................. 15

Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất khung dammarane và lupane từ chi Gymnema ...... 17

Hình 1.5. Cấu trúc các phenolic và một số hợp chất khác từ chi Gymnema ............................... 19

Hình 1.6. Ý nghĩa của việc ức chế enzyme α-glucosidase và enzyme α-amylase trong giảm

đường huyết ........................................................................................................................................... 27

Hình 2.1. Dây thìa canh (G. sylvestre) .............................................................................................. 31

Hình 2.2. Dây thìa canh lá to (G. latifolium) ................................................................................... 31

Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G. sylvestre ........................................................... 38

Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G.latifolium ........................................................... 41

Hình 3.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài G. sylvestre ............................. 49

Hình 3.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài G. latifolium. .......................... 50

Hình 3.3. Cấu trúc khung pregnane .................................................................................................. 51

Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS1 ................................................................................ 53

Hình 3.5. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất GS1 ........................... 55

Hình 3.6. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS1 ................................................................................. 58 Hình 3.7. Phổ 1H NMR của hợp chất GS1 ....................................................................................... 58 Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của hợp chất GS1 ..................................................................................... 59

Hình 3.9. Phổ DEPT-135 của hợp chất GS1 ................................................................................... 59

Hình 3.10. Phổ HSQC của hợp chất GS1 ........................................................................................ 60

Hình 3.11. Phổ HMBC của hợp chất GS1 ....................................................................................... 60

Hình 3.12. Phổ COSY của hợp chất GS1 ......................................................................................... 61

Hình 3.13. Phổ ROESY của hợp chất GS1 ...................................................................................... 61

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS2 .............................................................................. 62

Hình 3.15. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GS2 ............................................. 63

Hình 3.16. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS3 .............................................................................. 64

Hình 3.17. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS3 ......................................... 65

Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS4 .............................................................................. 66

Hình 3.19. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS4 ......................................... 66

Hình 3.20. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS5 .............................................................................. 68

Hình 3.21. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS5 ......................................... 70

Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS6 .............................................................................. 70

Hình 3.23. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS6 ......................................... 72

xi

Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS7 .............................................................................. 73

Hình 3.25. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS7 ......................................... 75

Hình 3.26. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS8 .............................................................................. 75

Hình 3.27. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS8 ......................................... 77

Hình 3.28. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS9 ....................... 77

Hình 3.29. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS10 .................... 79

Hình 3.30. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS11 .................... 81

Hình 3.31. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS12 .................... 83

Hình 3.32. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS13 .................... 84

Hình 3.33. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS14 .................... 87

Hình 3.34. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS15 .................... 89

Hình 3.35. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS16 .................... 91

Hình 3.36. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL1 ............................................................................. 93

Hình 3.37. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL1 ............................................. 95

Hình 3.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL2 ............................................................................. 95

Hình 3.39. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL2 ............................................. 96

Hình 3.40. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL3 ............................................................................. 98

Hình 3.41. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL3 ............................................. 98

Hình 3.42. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL4 ........................................................................... 100

Hình 3.43. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL4 ........................................... 102

Hình 3.44. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GL5 .................... 102

Hình 3.45. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GL6 .................... 104

Hình 3.46. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GL8 .................... 106

Hình 3.47. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G.

sylvestre ................................................................................................................................................ 109

Hình 3.48. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. latifolium

............................................................................................................................................................... 109

Hình 3.49. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. sylvestre ..... 110

Hình 3.50. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. latifolium

............................................................................................................................................................... 110

1

MỞ ĐẦU

Tiểu đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat, mỡ và

protein khi hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể,

biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao. Trong giai đoạn mới phát bệnh

bệnh nhân thường đi tiểu nhiều, tiểu ban đêm và do đó làm khát nước, về lâu dài

gây phá hủy các hệ thống trên cơ thể, đặc biệt là các mạch máu và dây thần kinh.

Theo thời gian, bệnh tiểu đường có thể dẫn đến mù, suy thận và tổn thương thần

kinh. Tiểu đường cũng là một trong những yếu tố quan trọng thúc đẩy quá trình

hình thành xơ vữa động mạch, dẫn đến đột quỵ, bệnh tim mạch. Các biến chứng

mãn tính xảy ra sớm hay muộn, nặng hay nhẹ rất khác biệt ở từng bệnh nhân.

Nhưng nói chung, nếu kiểm soát tốt đường huyết, chúng ta có thể ngăn ngừa hoặc

làm chậm hay nhẹ đi các biến chứng mãn tính của bệnh tiểu đường [1].

Xu hướng sử dụng nguồn dược liệu tự nhiên nói chung, đặc biệt là các hợp

chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật để chữa trị một số bệnh nhiệt đới và

những bệnh hiểm nghèo đã và đang là mối quan tâm không chỉ của ngành dược ở

nước ta mà còn của các nước trong khu vực cũng như các nước trên thế giới. Nhiều

cây thuốc bản địa đã được phát hiện có tác dụng làm hạ đường huyết. Đây là một

lợi thế vì khả năng cung cấp nguyên liệu để điều trị cũng như ít tác dụng phụ. Theo

thống kê, trên thế giới có khoảng 800 loài được cho là có khả năng điều trị bệnh

tiểu đường [2]. Tiêu biểu trong số đó là các loài: dây thìa canh (G. sylvestre), mướp

đắng (Momordica charantia), cải bẹ xanh (Brassica Juncea), bồ công anh

(Elephantopus scaber), cỏ tóc tiên (Liriope spicata), thầu dầu (Ricinus communis),

khoai sâm (Smallanthus sonchifolius), trạch lan (Vernonia anthelmintica), …

Các loài thuộc chi Gymnema thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae) đã nhận được rất

nhiều quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Các loài thuộc chi Gymnema

được coi như là nguồn cung cấp các hoạt chất và thể hiện các hoạt tính sinh học

(hạ đường huyết, kháng tế bào ung thư, chống oxi hóa, kháng viêm, …). Đặc biệt,

loài G. sylvestre được sử dụng rộng rãi như là một loại thảo dược chuyên trị bệnh

tiểu đường từ trên 2000 năm ở Ấn Độ. Loài này còn được dùng để điều trị hen

suyễn, đau mắt, viêm và rắn cắn. Bên cạnh đó, G. sylvestre có tính kháng khuẩn

và bảo vệ tế bào gan. Tuy nhiên ở Việt Nam chỉ mới có một vài nghiên cứu về

thành phần hóa học và dược học của loài Gymnema sp. Xuất phát từ điểm đó,

2

chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym

α-glucosidase và α-amylase của loài dây thìa canh - Gymnema sylvestre (Retz.)

R.Br. ex Sm. và dây thìa canh lá to - Gymnema latifolium Wall. ex Wight”.

Mục tiêu của luận án:

Mục tiêu của luận án là xác định được thành phần hóa học chủ yếu của thân và lá của

hai loài Gymnema sylvestre và Gymnema latifolium ở Việt Nam và đánh giá được

tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase in vitro của các hợp chất phân

lập được.

Nội dung luận án bao gồm:

1. Phân lập các hợp chất từ thân và lá loài G. sylvestre và G. latifolium ở Việt Nam.

2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp

vật lý, hóa học.

3. Đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase của các hợp chất

phân lập được từ loài G. sylvestre và G. latifolium.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về chi Gymnema

1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Gymnema

Chi Gymnema (chi Lõa ti) thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae), bộ Long đởm

(Gentianales), phân lớp Bạc hà (Lamiidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành

Ngọc lan (Magnoliophyta). Các cây thuộc chi này là cây leo, không có rễ phụ trên

thân, lá mọc đối, không nạc, cụm hoa xim, tán hoặc chùm, hoa nhỏ, có thùy đài

nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, tràng hình bánh xe, thùy tràng không

gập trong nụ, tiền khai hoa vặn phải. Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ đính ở tràng,

thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng. Chỉ nhị dính nhau, bao phấn 2 ô,

thường có phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài

vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh, cơ quan truyền phấn có gót dính

và 2 chuôi, khối phấn hướng lên, chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Đầu

nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy. Cột nhị-

nhụy hình ống nhọn đầu.

Gymnema sylvestre [3] Gymnema reticulatum[3]

Gymnema inodorum[4] Gymnema foetidum [3]

Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Gymnema

Theo thống kê của hiệp hội các nhà thực vật học thế giới

“http://www.theplantlist.org”, thư viện trực tuyến về danh mục các loài thực vật

học trên thế giới, chi Gymnema hiện nay có 52 loài được công nhận (xem Bảng

1.1).

4

Phân bố

TT Tên khoa học 1 G. acuminatum Wall. Nepal, Ấn Độ,

TT Tên khoa học 27 G.

Phân bố Trung Quốc

Malaysia

longiretinaculatum Tsian g

2 G. albidum Decne.

Timor

28 G.lushaiense M.A.Rahm

Assam

an & Wilcock

Sulawesi Malacca Philippin

3 G. albiflorum Costantin Việt Nam 4 G. brevifolium Benth. Úc 5 G. calycinum Schltr. 6 G. chalmersii Schltr. 7 G. cumingii Schltr. 8 G. cuspidatum

29 G. macrothyrsa Warb. 30 G. maingayi Hook.f. 31 G. mariae Schltr. 32 G. micradenium Benth. Queenland 33 G. molle Wall. ex Wight Myanmar 34 G. montanum Hook.f.

Ấn Độ

Luzon New Guinea Philippin Ấn Độ, Sri Lanka Tamil Nadu

(Thunb.) Kuntze 9 G. decaisneasum

35 G. montanum var. beddo

mei Hook.f.

Úc

Úc

36 G. muelleri Benth. 37 G. pachyglossum Schltr. Luzon

10 G. dissitiflorum Ridl. Malaysia 11 G. dunnii (Maiden & Betche) P.I.Forst. 12 G. elegans Wight &

Tamil Nadu

38 G. piperii Schltr.

Mindanao

Arn.

13 G. erianthum Decne. New

39 G. pleiadenium F.Muell. Queenland

14 G. foetidum Tsiang

40 G. recurvifolium Blume New Guinea

15 G. glabrum Wight 16 G. griffithii Craib

41 G. rotundatum Thwaites Sri Lanka 42 G. rufescens Decne.

Madagasca

Caledonia Việt Nam, Trung Quốc Myanmar Thái Lan, Việt Nam

17 G. hainanense Tsiang Trung Quốc

43 G.

Philippin

schlechterianum Warb.

18 G. hirtum Ridl. 19 G. inodorum (Lour.)

44 G. spirei Costantin 45 G.

Lào New Guinea

Decne.

suborbiculare K.Schum.

Malaysia Trung Quốc, Ấn Độ, Đông Nam Á Java

20 G. javanicum Koord.

46 G. sylvestre (Retz).R.Br.

ex Sm.

21 G.

Maharashtra

khandalense Santapau

22 G.

Ấn Độ

47 G. syringaefolium (Decne.) Costantin 48 G. thorelii Costantin

Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ Việt Nam, Timor Lào

kollimalayanum A.Ram ach & M.B.Viswan

23 G. lacei Craib

49 G. tricholepis Schltr.

New Guinea

24 G. lactiferum (L.) R.Br.

50 G. trinerve R.Br.

Úc

ex Schult.

25 G. latifolium Wall. ex

51 G. uncarioides Schltr.

Luzon

Wight

26 G. littorale Blume

52 G. yunnanense Tsiang

Trung Quốc

Myanma, Bangladesh Ân Độ, Siriranka Trung Quốc, Việt Nam Java

Bảng 1.1. Danh sách và nơi phân bố các loài thuộc chi Gymnema

5

Theo danh lục các loài thực vật Việt Nam [2], chi Gymnema tại Việt Nam hiện có

8 loài là G. albiflorum Cost, G. alternifolium (Lour.) Merr., G. foetidum Tsiang,

G. griffithii Craib, G. inodorum (Lour.) Decne, G. latifolium Wall ex Wight, G.

reticulatum (Moon) Alston và G. sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult.

Bảng 1.2. Danh sách các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam

TT Tên khoa học 1 G. albiflorum Cost 2 G. alternifolium (Lour.) Tên thường dùng Phân bố Lõa ti hoa trắng Lõa ti xen Hà Tây Ninh Thuận Merr

3 G. foetidum Tsiang Lõa ti thối

4 G. griffithii Craib 5 G. inodorum (Lour.) Rau mỏ Decne

6 G. latifolium Wall ex Thìa canh lá to Wight

7 G. reticulatum (Moon) Đắc Lắc, các tỉnh phía bắc Kon Tum Bắc Kạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Ninh Bình, Hòa Bình, Ninh Bình, Kon Tum Bà Rịa-Vũng Tàu Alston

8 G. sylvestre (Retz) R. Br. ex Sm Lõa ti mạng, Dây gân canh thìa mạng Lõa ti rừng, Dây thìa canh, Dây muôi. Bắc Giang, Hải Phòng, Hải Dương, Ninh Bình, Thanh Hóa, Kon Tum

1.1.2. Giới thiệu về loài Gymnema sylvestre và Gymnema latifolium

1.1.2.1. Loài Gymnema sylvestre

Tên khoa học: Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex. Sm

Tên thường gọi: Dây thìa canh, Dây muôi

Chi: Gymnema

Họ: Apocynaceae

Mô tả về thực vật: Loài G. sylvestre, tên tiếng Việt là Dây thìa canh, Dây muôi, là

loại dây leo cao 6-10m, nhựa mủ màu vàng, thân có lông dài 8-12 cm, to 3 mm,

có lỗ bì thưa. Lá có phiến bầu dục thon ngược xoan dài 6-7 cm, rộng 2.5-5 cm,

đầu nhọn, có mũi, gân bên 4-6 đôi, rõ ở mặt dưới, nhăn lúc khô, cuống dài 5-8

mm. Hoa nhỏ màu vàng, xếp thành xim dạng tán ở nách lá, cao 8 mm, rộng 12-15

mm, đài có lông mịn và rìa lông, tràng không lông ở mặt ngoài, tràng phụ là 5

răng. Quả đại dài 5.5 cm, rộng ở nửa dưới, hạt dẹt, lông mào dài 3 cm [3].

Sinh thái : mọc leo lên các bờ bụi, hàng rào.

6

Công dụng trong y học cổ truyền: trị tiểu đường, rắn cắn. Ngoài ra, phần trên mặt

đất còn có thể dùng để trị phong thấp tê bại, chữa các vết thương do dao, đạn [3].

Phân bố: Bắc Giang, Hải Phòng, Hải Dương, Ninh Bình, Thanh Hóa, Kon Tum.

1.1.2.2. Loài Gymnema latifolium

Tên khoa học: G. latifolium Wall. ex Wight

Tên thường gọi: Lõa ty lá rộng, Thìa canh lá to

Chi: Gymnema

Họ: Apocynaceae

Mô tả về thực vật: Loài G. latifolium có tên tiếng Việt là Lõa ti lá rộng, Thìa canh

lá to, là loại cây thân leo, có thể dài tới 6 m. Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều

lông tơ. Cuống lá 1.5-4 cm. Lông dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp.

Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày đặc. Một cụm mang rất

nhiều hoa, mùi thơm, cuống cụm hoa 1-1.5 cm, cuống hoa 3-8 mm. Đài hình trứng,

phủ lông măng. Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài. Ống hoa có 5 cặp

gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, phủ lông dày đặc hướng trục,

ngắn hơn so với ống tràng [5].

Phân bố: Hòa Bình, Ninh Bình, Kon Tum.

1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Gymnema

Các loài thuộc chi Gymnema đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập

trung nghiên cứu. Đặc biệt, các nhà khoa học chủ yếu tập trung vào loài G.

sylvestre. Số còn lại ít được nghiên cứu về hóa học (chủ yếu là G. tingens, G.

griffithii, G. montanum, G. inodorum và G. alternifolium). Các nghiên cứu về

thành phần hóa học của loài này đã chỉ ra sự có mặt của các hợp chất steroid,

terpenoid, phenolic, flavonoid. Các hợp chất này thể hiện hoạt tính hạ đường

huyết, chống béo phì, kháng khuẩn, bảo vệ gan và chống oxy hóa.

1.1.3.1. Các hợp chất steroid

Steroid là một nhóm chất đặc trưng của chi Gymnema, các hợp chất steroid xuất

hiện chủ yếu dưới dạng khung pregnane với các chuỗi phần tử giả đường, bao gồm

cymarose (cym), 6-deoxy-3-oxymethylallopyranose (all), D-thevetopyranose

(thv), oleandropyranose (ole) và canaropyranose (can) và digitoxose (dig).

7

Bảng 1.3. Các hợp chất pregnane glycoside từ chi Gymnema

Tên chất TT Gymnepregoside A 1 Gymnepregoside B 2 Gymnepregoside C 3 Gymnepregoside D 4 Gymnepregoside E 5 Gymnepregoside F 6 Stephanoside O 7 Stephanoside J 8 9 Gymnepregoside G 10 Gymnepregoside H 11 Gymnepregoside I 12 Gymnepregoside J 13 Gymnepregoside K 14 Gymnepregoside L 15 Gymnepregoside M 16 Gymnepregoside N 17 Gymnepregoside O 18 Gymnepregoside P 19 Gymnepregoside Q 20 Stephanoside J 21 Gymsylvestrosides A 22 Gymsylvestrosides B 23 Gymsylvestrosides C 24 Gymsylvestrosides D 25 Gymnemogriffithoside A 26 Gymnemogriffithoside B 27 Gymnemogriffithoside C 28 Gymnemogriffithoside D 29 Gymnemogriffithoside E 30 Gymnemogriffithoside F 31 Gymnemogriffithoside G 32 Gymnemogriffithoside H Bộ phận Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Thân Thân Thân Thân Quả Quả Quả Quả Quả Quả Quả Quả Loài G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. alternifolium G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. griffithii G. griffithii G. griffithii G. griffithii G. griffithii G. griffithii G. griffithii G. griffithii TLTK [6] [6] [6] [6] [6] [6] [6] [6] [7] [7] [7] [7] [7] [7] [7] [7] [7] [7] [7] [7] [8] [8] [8] [8] [5] [5] [5] [5] [5] [5] [5] [5]

8

9

Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất pregnane glycoside từ chi Gymnema

1.1.3.2. Các hợp chất triterpenoid

Triterpennoid là lớp chất chính và chiếm số lượng chất lớn nhất được tìm thấy

trong chi Gymnema, xuất hiện dưới dạng oleane saponin, các dẫn xuất khung

damarane và lupane.

Triterpennoid khung oleanane

Các oleanane phân lập từ chi Gymnema phần lớn có nối đôi ở vị trí C-12, chỉ có một

trường hợp đặc biệt là hợp chất 3β,16β,23,28-tetrahydroxyolean-13 (18)-ene (40).

Các oleanane phân lập từ chi Gymnema chủ yếu là từ loài G. sylvestre (46 hợp chất)

và G. alterifolium (21 hợp chất) (Bảng 1.4)

Bảng 1.4. Các hợp chất triterpennoid khung oleanane từ chi Gymnema

10

Bộ phận Loài TT Tên chất 33 Gymnemagenin Thân lá G. sylvestre 34 3β,16β,21β,28-Tetrahydroxyolean-12-ene Thân lá G. sylvestre 35 3β,16β,22α,28-Tetrahydroxyolean-12-ene Thân lá G. sylvestre 36 3β,23,28-Trihydroxyolean-12-ene Thân lá G. sylvestre 37 3β,16β,21β,23-Tetrahydroxyolean-12-ene Thân lá G. sylvestre Thân lá G. sylvestre 38 3β,16β,21β,23,28-Pentahydroxyolean-12- TL [9] [9] [9] [9] [9] [9] ene

39 3β,16β,21α,23,28-Pentahydroxy olean-12- Thân lá G. sylvestre [9] ene

40 3β,16β,23,28-Tetrahydroxy olean-13 (18)- Thân lá G. sylvestre [9] ene

41 16β,23,28-Trihydroxyolean-12-en-3-one Thân lá G. sylvestre Thân lá G. sylvestre 42 16β,21β,23,28-Tetrahydroxyolean-12-en- [9] [9] 3-one

43 16β,21β,22α,23,28-Pentahydroxyolean- Thân lá G. sylvestre [9] 12-en-3-one

44 3β,16β,22β,28-Tetrahydroxyolean-12-en- Lá G. sylvestre [10] 30-oic acid

45 3β,16β,23,28-Tetrahydroxyolean-12-ene Thân lá G. sylvestre Thân lá G. sylvestre 46 3β,16β,23,28-Tetraacetateolean-12-ene Thân lá G. sylvestre 47 3β,16β,21β,22α-Pentahydroxyolean-12- [11] [11] [11] en-21-yl 2S-2-methylbutanoate

Thân lá G. sylvestre [11]

48 3β,16β,21β,22α-28-Acetyloxy-3,16,22,23- tetrahydroxyolean-12-en-21-yl-(2S)-2- methylbutanoate

49 3β,16β,21β,22α-Pentakis Thân lá G. sylvestre [11]

(acetyloxy)olean-12-en-21-yl-(2S)-2- methylbutanoate

50 3β,16β,21β,22α-3,16,22,23,28- Thân lá G. sylvestre [11]

Pentahydroxyolean-12-en-21-yl-(2E)-2- methylbut-2-enoate

51 28-Acetyl-21-tigloylgymnemagenin 52 Gymnemic acid I 53 Gymnemic acid II 54 Gymnemic acid III 55 Gymnemic acid IV 56 Gymnemic acid V 57 Gymnemic acid VI 58 Gymnemic acid VII 59 Gymnemic acid VIII 60 Gymnemic acid XIX 61 Gymnemic acid X 62 Gymnemic acid XI 63 Gymnemic acid XII 64 Gymnemic acid XV 65 Gymnemic acid XVI Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá [12] [13] [13] [13] [13] [14] [14] [14] [15] [15] [15] [15] [15] [16] [16] G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre

11

66 Gymnemic acid XVII 67 Gymnemic acid XVIII 68 Gymnemasin A 69 Gymnemasin B 70 Gymnemasin C 71 Gymnemasin D 72 Gymnemoside A 73 Gymnemoside B 74 Gymnemoside C 75 Gymnemoside D 76 Gymnemoside E 77 Gymnemoside F 78 Gymnemoside-W1 79 Gymnemoside-W2 80 3β,16β,22α- G. sylvestre Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre Lá Lá G. sylvestre Thân lá G. sylvestre [16] [16] [17] [17] [17] [17] [18] [18] [19] [19] [19] [19] [20] [20] [21] 3-O-β-D-

Trihydroxy-olean-12-ene xylopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucuronic acid

81 Longispinogenin-3-O-β-D-glucuronic acid Lá Lá 82 21β-Benzoylsitakisogeni-3-O-β-D- G. sylvestre G. sylvestre [22] [22] glucuronic acid

83 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D- Lá G. sylvestre [22]

glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D- glucuropyranosyl ester

G. sylvestre [22] Lá

G. sylvestre [22] 85 Lá

84 Oleanolic acid 3-O-β-D-xylopyranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranoside 3-O-β-D-Xylopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D- glucopyranosyl ester

86 3-O-β-D-Glucopyranosyl-(1→6)-β-D- Lá G. sylvestre [22]

glucopyranosyl oleanolic acid 28-β-D- glucopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosyl ester

3-O-β-D- Lá G. sylvestre [23]

87 21β-O-benzoylsitakisogenin glucopyranosyl-(1→3)-β-D- glucuronopyranoside

Lá G. sylvestre [23]

88 Muối kali của Longispinogenin-3-O-β-D- glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronic acid 89 Muối của 29- Lá G. sylvestre [23]

(1→3)-β-D-glucuronic kali hydroxylongispinogenin-3-O-β-D- glucopyranosyl acid

12

90 Muối natri của alternoside II 91 Gymnemasaponin I 92 Gymnemasaponin II 93 Gymnemasaponin III 94 Gymnemasaponin IV 95 Gymnemasaponin V 96 Sitakososide X 97 Sitakososide XVII 98 Alternoside I 99 Alternoside II 100 Alternoside III 101 Alternoside IV 102 Alternoside V 103 Alternoside VI 104 Alternoside VII Lá Lá Lá Lá Lá Lá Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ

105 Alternoside VIII 106 Alternoside IX 107 Alternoside X 108 Alternoside XI 109 Alternoside XII 110 Alternoside XIII 111 Alternoside XIV 112 Alternoside XV 113 Alternoside XVI 114 Alternoside XVII 115 Alternoside XVIII 116 Alternoside XIX Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ

[23] G. sylvestre [24] G. sylvestre [24] G. sylvestre [24] G. sylvestre [24] G. sylvestre G. sylvestre [24] G. alternifolium [25] G. alternifolium [25] G. alternifolium [26] G. alternifolium [26] G. alternifolium [26] G. alternifolium [26] G. alternifolium [26] G. alternifolium [26] [26] G. alternifolium G. sylvestre [20] G. alternifolium [26] G. alternifolium [26] G. alternifolium [26] G. alternifolium [25] G. alternifolium [25] G. alternifolium [25] G. alternifolium [25] G. alternifolium [25] G. alternifolium [25] G. alternifolium [25] G. alternifolium [25] [25] G. alternifolium [20] G. sylvestre [27] G. inodorum 117 2α,3β-Dihydroxyolean-12-ene-23,28-dioic Lá

118 Lá G. inodorum [27] acid-3-O-β-D-glucopyranoside 2α,3β,15β-Trihydroxyolean-12-ene- 23,28-dioic acid-3-O-β-D-glucopyranoside

13

14

15

Hình 1.3. Cấu trúc các hợp chất khung oleanane từ chi Gymnema

Triterpennoid khung dammarane và lupane

Bên cạnh các oleanane saponin, các ngiên cứu về thành phần hóa học của chi

Gymnema còn cho thấy sự xuất hiện của một số ít các triterpenoid dạng

dammarane saponin (119-133) và lupane (134-136). Các hợp chất này được tìm

thấy ở loài G. sylvestre (Bảng 1.5)

16

Bộ phận Loài

Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá

TT Tên chất 119 Gymnemaside I 120 Gymnemaside II 121 Gymnemaside III 122 Gymnemaside IV 123 Gymnemaside V 124 Gymnemaside VI 125 Gymnemaside VII 126 Gypenoside XXVIII 127 Gypenoside LXXIV 128 Gypenoside V 129 Gypenoside XLV 130 Gypenoside XIII 131 Gypenoside LV 132 Gypenoside LXIII 133 Gypenoside XXVII 134 135 136

3β,16β,23,28-Tetrahydroxylup-20-ene 3β,16β,29-Trihydroxylup-20 (30)-ene 3β,16β,20,23,28-Pentahydroxylupane

G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre G. sylvestre Thân lá G. sylvestre Thân lá G. sylvestre Thân lá G. sylvestre

TLTK [28] [28] [28] [28] [28] [28] [28] [14] [14] [14] [14] [14] [28] [28] [28] [9] [9] [11]

Bảng 1.5. Các hợp chất khung dammarane và lupane từ chi Gymnema

17

Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất khung dammarane và lupane từ chi Gymnema

(Các ký hiệu Glc, S1- S7 như Hình 1.3)

1.1.3.3. Phenolic và các hợp chất khác

Bên cạnh triterpenoid và steroid là các lớp chất đặc trưng, các loài thuộc chi Gymnema

còn có một số ít các phenolic, flavonoid, lignan và các hợp khác (Bảng 1.6).

Bảng 1.6. Phenolic và một số hợp chất khác từ chi Gymnema

Tên chất Loài TLTK TT

Bộ phận Thân G. tingens Thân G. tingens Thân G. tingens Thân G. tingens Thân G. tingens Thân G. tingens Thân G. tingens Thân G. tingens Thân G. tingens

137 Gymnetinoside A 138 Gymnetinoside B 139 Gymnetinoside C 140 Gymnetinoside D 141 Gymnetinoside E 142 Gymnetinoside F 143 Sequinoside K 144 Khaephuoside B 145 Albibrissinoside A 146 Phenethyl 𝛽-D-glucoside

Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre [29] [29] [29] [29] [29] [29] [29] [29] [29] [12] [30] 3-O-β-D-glucopyranosyl- 147 Kaempferol (1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D- galactopyranoside

Lá G. sylvestre Lá G. sylvestre

148 Dihydroxy gymnemic triacetat 149 Conduritol A 150 Gymnefuranol A 151 Gymnefuranol B

Thân G. tingens Thân G. tingens Thân G. tingens [31] [32] [33] [33] [33] 152 (7′S,8S,8′R)-4,4′-Dihydroxy-3,3′,5,5- tetramethoxy-7′,9-epoxylignan-9′′-ol-7-one

[33] [33] [33] [33] [33] 153 Alangilignoside D Thân G. tingens (–)-Lariciresinol-9-O-β-D-glucopyranoside Thân G. tingens 154 Thân G. tingens (–)-Lariciresinol 155 Thân G. tingens 156 5′-Methoxylariciresinol Thân G. tingens 157 5,5′-Dimethoxylariciresinol

18

OCH3

OCH3

H3CO

O

O

OH

HO

OH

O

OCH3

151

150

HO

H3CO

OH

R2

OCH3

H3CO

O

O

OH

HO

OH

O

OCH3

R3O

152

R1

OH

R3 R2 R1 OCH3 Glc 153 H Glc H 154 H H H 155 H 156 H OCH3 H 157 OCH3 OCH3 H

19

Hình 1.5. Cấu trúc các phenolic và một số hợp chất khác từ chi Gymnema

1.1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Gymnema

1.1.4.1. Hoạt tính trị bệnh tiểu đường

Tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết saponin cùng với 5 triterpene

saponin gymnemic acid I (52) – IV (55) và gymnemasaponin V (95) từ loài G.

sylvestre đã được thông báo. Hợp chất gymnemic acid IV (3,4/13,4 mg/kg) được

phát hiện có tác dụng hạ đường huyết từ 14-60% trong vòng 6 h khi so sánh với

glibenclamide. Thêm vào đó, hợp chất này cũng làm tăng lượng insulin khi cho

chuột bị tiểu đường uống ở nồng độ 13,4 mg/kg [34].

Nghiên cứu khác về tác dụng hạ đường huyết của lá loài G. sylvestre thông qua

kiểm soát hàm lượng glucose trong máu và lipid trên chuột Wistar ở nồng độ 200

mg/kgP đã cho thấy dịch chiết loài này làm giảm đáng kể đường trong huyết tương

và mỡ máu (thông qua các thông số cholesterol VLDL, LDL) [35].

Hợp chất dihydroxy gymnemic triacetat (148) được Pitchai Daisy và cộng sự phân

lập từ lá loài G. sylvestre (liều 20 mg/kgP bằng đường uống trong 45 ngày) cho

kết quả tác động tích cực lên tất cả các thông số sinh hóa trên nhóm chuột mang

bệnh tiểu đường [31]. Các thông số đánh giá bao gồm đường huyết, insulin,

hemoglobin glycated (HbA1c), mô glycogen, các thông số lipid như triglycerid,

20

cholesterol tổng, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol và hoạt tính của các enzym

gan đánh dấu, như aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase

(ALT), alkaline phosphatase (ALP) và phosphatase acid (ACP). Bên cạnh đó, các

gymnemic acid từ lá loài G. sylvestre làm tăng đáng kể sự tái sinh các tế bào β

tuyến tụy ở chuột mắc bệnh tiểu đường [36].

Một nghiên cứu ở cấp độ lâm sàng về tác dụng tăng cường tiết insulin của dịch

chiết ethanol của loài G. sylvestre thông qua đường uống (500 mg/ngày) trong 60

ngày cho thấy nồng độ glucose trong máu lúc đói giảm từ 162 mg/L xuống 119

mg/L, nồng độ glucose trong máu sau ăn giảm từ 291 mg/L xuống 236 mg/L; tăng

nồng độ insulin huyết thanh từ 24 đến 32 μU/mL, tăng nồng độ C-peptide huyết

thanh từ 298 đến 447 pmol/L, nhưng không ảnh hưởng đến cân nặng [37].

Năm 2003, một nhóm các nhà khoa học Ấn Độ đã nghiên cứu khả năng hạ đường

huyết của dịch chiết nước của lá loài G. montanum, thử nghiệm trên chuột mắc

bệnh tiểu đường bằng cách tiêm alloxan, cho thấy dịch chiết này có tác dụng hạ

glucose máu tốt nhất ở liều 200 mg/kg [38].

Tác dụng hạ lipid máu của lá cây G. montanum trên chuột Wistar đực mắc

bệnh tiểu đường do tiêm alloxan đã được thông báo. Theo đó, cặn chiết ethanol

của lá G. montanum (GME) được dùng bằng đường uống với các liều điều trị khác

nhau là 50, 100 và 200 mg/kgP. Kết quả cho thấy với liều tối ưu 200 mg/kgP, nồng

độ glucose trong máu của chuột giảm về mức bình thường sau 3 tuần điều trị, bên

cạnh đó nồng độ insulin cũng tăng đáng kể. Vì thế, liều 200 mg/kgP tiếp tục được

sử dụng cho các thử nghiệm đánh giá về mức độ peroxide hóa lipid, hoạt động của

glutathione, glucose-6-phosphatase và hexokinase sau đó. Kết quả là sau khi dùng

GME, các chỉ số TBARS, hydroperoxide và hoạt động glucose-6-phosphatase đã

giảm đáng kể, trong khi nồng độ của glutathione và hexokinase tăng lên giữa nhóm

chuột được điều trị và nhóm không được điều trị. Hiệu quả của GME trong thử

nghiệm gần tương đương với glibenclamide 600 µg/kg [39].

Năm 2010, Ramkumar và cộng sự đã đánh giá tác dụng ức chế enzym α-

glucosidase và α-amylase của cặn chiết lá G. montanum với các nồng độ sàng lọc

từ 1-10 µg/ml. Theo đó ở nồng độ 10 µg/ml, khả năng ức chế của cặn chiết này

lên tới 96% với giá trị IC50 lần lượt là 5 và 7 µg/ml (tương ứng với α-amylase và

α-glucosidase), chất đối chứng dương là acarbose [40].

21

1.1.4.2. Hoạt tính chống béo phì

Phân đoạn giầu saponin từ dịch chiết nước của lá loài G. sylvestre đã được

phát hiện có tác dụng chống béo phì tương đương với orlistat, một loại thuốc tổng

hợp dùng để điều trị bệnh béo phì [41]. Dịch chiết nước loài G. sylvestre đã phát

hiện có khả năng chống béo phì trên chuột thông qua giảm nồng độ serum lipid,

leptin, insulin, glucose, apolipoprotein B và LDH trong khi tăng nồng độ HDL-

cholesterol, apolipoprotein A1 [42]. Trong một nghiên cứu khác, phần giàu

saponin của lá loài G. sylvestre (GSA) đã được nghiên cứu in vivo trên chuột béo

phì để đánh giá tác dụng chống béo phì thông qua biến đổi trọng lượng cơ thể và

các chỉ số lipid huyết tương. Kết quả cho thấy nhóm chuột được dùng GSA với

liều 100 mg/kg/ngày, sau 8 tuần trọng lượng cơ thể cũng như khối lượng các cơ

quan nội tạng (gan, mô thận, tim, mô mỡ) giảm gần bằng khối lượng chuột ở lô

đối chứng (chế độ dinh dưỡng bình thường). Các chỉ số cholesterol toàn phần,

TGs, VLDL-cholesterol, LDL-cholesterol giảm mạnh và HDL-cholesterol tăng,

Hiệu quả tương đương với orlistat [43].

Trong một thử nghiệm trên chuột béo phì Otsuka Long-Evans Tokushima

(OLETF) - các nhà khoa học Nhật Bản đã cho thấy hiệu quả giảm cân của hỗn hợp

các gymnemate (hợp chất triterpene glucronide) lên chuột thí nghiệm. Kết quả cho

thấy với liều điều trị Gymnemate 62mg/kgP, trọng lượng cơ thể giảm lần lượt 57,2

± 6,4 và 75,5 ± 6,3 g trong 1 và 2 tuần. Tổng lượng cholesterol đã giảm 1/3, hơn

nữa tổng lượng LDL + VLDL cholesterol giảm 1/2. Tỷ lệ cholesterol HDL tăng.

Triglyceride huyết thanh đã giảm xuống còn 1/4. Mức cholesterol và chất béo

trung tính trong huyết thanh không có sự khác biệt đáng kể trong nhóm dùng

Gymnemate với nhóm thông thường [44].

1.1.4.3. Hoạt tính chống oxi hóa

Năm 2014, RhitaJit Sarkar và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống oxy

hóa của cặn chiết 70% methanol lá loài G. sylvestre thông qua các thử nghiệm in

vitro đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH, hydroxyl, superoxide, nitric oxide,

axit hypochlorous (HOCl) và ức chế peroxide hóa lipid. Kết quả cho thấy dịch

chiết này thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh trong thử nghiệm quét gốc

hydroxyl (IC50 = 185,0 µg/ml, mạnh hơn đối chứng dương mannitol IC50 = 571,5

µg/ml), superoxide (IC50 = 15,6 µg/ml, mạnh hơn đối chứng dương quecertin IC50=

22

42,0 µg/ml) và nitric oxide (IC50 = 65,4 µg/ml, mạnh hơn đối chứng dương

curcumin IC50 = 90,8 µg/ml) [45].

Trong một nghiên cứu khác, Naik và cộng sự đã thông báo hoạt tính chống

oxy hóa của tinh dầu G. sylvestre. Các thông số đánh giá bao gồm khả năng quét

gốc tự do DPPH (IC50 = 28 µg/ml, xấp xỉ chất đối chứng dương BHT với IC50= 20

µg/ml), ABTS (ức chế 97 % ABTS ở nồng độ 1000 µg/ml), ức chế sự hình thành

peroxide trong thí nghiệm oxy hóa β-carotene-linoleic với tỉ lệ 90,74 % ở nồng độ

1000 µg/ml. Như vậy có thể thấy bên cạnh dịch nước, thì chiết xuất tinh dầu từ lá

của loài G. sylvestre cũng là một nguồn cung cấp các chất chống oxi hóa từ thiên

nhiên [46].

Cặn chiết giàu gymnemic acid từ lá loài G. sylvestre cũng đã được nghiên

cứu khả năng chống oxi hóa. Kết quả cho thấy cặn chiết này có hiệu quả cao đối

với việc quét gốc tự do DPPH (IC50 = 39,2 µg/ml, mạnh hơn đối chứng dương acid

ascorbic IC50 = 59,5 µg/ml) và bảo vệ đường deoxyribose chống lại gốc tự do

hydroxyl OH (IC50 = 76,0 µg/ml, mạnh hơn đối chứng dương acid ascorbic IC50 =

192,1 µg/ml) [47].

Năm 2014, RhitaJit Sarkar và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống oxy

hóa của cặn chiết 70% methanol lá loài G. sylvestre thông qua các thử nghiệm in

vitro đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH, hydroxyl, superoxide, nitric oxide,

axit hypochlorous (HOCl) và ức chế peroxide hóa lipid. Kết quả cho thấy dịch

chiết này thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh trong thử nghiệm quét gốc

hydroxyl (IC50 = 185,0 µg/ml, mạnh hơn đối chứng dương mannitol IC50 = 571,5

µg/ml), superoxide (IC50 = 15,6 µg/ml, mạnh hơn đối chứng dương quercetin IC50=

42,0 µg/ml) và nitric oxide (IC50 = 65,4 µg/ml), mạnh hơn đối chứng dương

curcumin (IC50 = 90,8 µg/ml) [45]. Trong một nghiên cứu khác, Naik và cộng sự

đã thông báo hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu G. sylvestre. Các thông số đánh

giá bao gồm khả năng quét gốc tự do DPPH (IC50 = 28 µg/ml, xấp xỉ chất đối

chứng dương BHT với IC50= 20 µg/ml), ABTS (ức chế 97 % ABTS ở nồng độ

1000 µg/ml), ức chế sự hình thành peroxide trong thí nghiệm oxy hóa β-carotene-

linoleic với tỉ lệ 90,74 % ở nồng độ 1000 µg/ml. Như vậy có thể thấy bên cạnh

dịch nước, tinh dầu chiết từ lá của loài G. sylvestre cũng là một nguồn cung cấp

các chất chống oxi hóa từ thiên nhiên [46]. Cặn chiết giàu gymnemic acid từ lá

23

loài G. sylvestre cũng đã được nghiên cứu khả năng chống oxi hóa. Kết quả cho

thấy cặn chiết này có hiệu quả cao đối với việc quét gốc tự do DPPH (IC50 = 39,2

µg/ml, mạnh hơn đối chứng dương acid ascorbic (IC50 = 59,5 µg/ml) và bảo vệ

đường deoxyribose chống lại gốc tự do hydroxyl OH (IC50 = 76,0 µg/ml, mạnh

hơn đối chứng dương acid ascorbic (IC50 = 192,1 µg/ml) [47].

1.1.4.4. Tác dụng bảo vệ gan

Tian và cộng sự đã đánh giá tác dụng bảo vệ gan của các hợp chất phân lập

từ loài G. tingen. Theo đó, tất cả các hợp chất thử nghiệm đều cải thiện tỉ lệ sống

sót của tế bào gan người HL7702, gây độc bởi D-galactosamine. Nổi bật là các

hợp chất gymnetinoside A (137, IC50 = 9,1 µM), E (141, IC50 = 11,1 µM) và F

(142, IC50 = 9,1 µM) tương đương với chất đối chứng dương là bicyclol (IC50 =

11,6 µM), một loại thuốc bảo vệ gan [29]. Tiếp đó vào năm 2015, cũng từ loài

này, Tian và cộng sự đã phân lập 8 hợp chất (150-157) từ G. tingen và đánh giá

tác dụng bảo vệ tế bào gan HL7702 bị gây độc bởi D-galactosamine trong thí

nghiệm MTT. Các hợp chất 150, 151, 155, 156 có % ức chế tương đương với chất

đối chứng dương, bicyclol. Các hợp chất gymnefuranol A (150, 59,5 %) và (–)-

lariciresinol (155, 92,8 %) được phát hiện có tác dụng ức chế lớn hơn bicyclol

(56,4%) ở nồng độ thử nghiệm 10 µM [33].

1.1.4.5. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Các cặn chiết phân cực khác nhau (ete dầu hỏa, ethanol và nước) cùng với các

gymnemic acid từ lá của loài G. sylvestre được thông báo có tác dụng diệt khuẩn rõ

rệt trên 6 loài vi khuẩn thử nghiệm là Escherichia coli, Vibrio cholera, Streptococcus

mutans, Staphylococcus aureus, Aspergillus negier và Candida albicans, thể hiện

hoạt tính tương đương chất đối chứng dương fluoroquinolone ciprofloxacin trên cả 6

loài vi khuẩn thử nghiệm [48]. Ở một nghiên cứu khác, Naik và cộng sự đã thông

báo tinh dầu G. sylvestre ức chế sự phát triển của 5 loại vi khuẩn Pseudomonas

aeruginosa, Pseudomonas asplenii, Bacillus subtilis, Proteus mirabilis,

Escherichia coli và nấm Candida albicans với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

thay đổi từ 22 mg/ml đến 28 mg/ml, đường kính vòng kháng khuẩn xấp xỉ chất đối

chứng dương gentamycin [46]. Cặn chiết methanol từ quả và rễ G. sylvestre đã thể

hiện hoạt tính ức chế 5 loài vi khuẩn: Bacillus subtilis (với đường kính vòng kháng

khuẩn lần lượt là D = 11,7 và 10,7 mm), Staphylococcus aureus (8,7 và 11,5 mm),

Escherichia coli (13,0 và 15,5mm), Klebsiella aerogenes (12,0 mm và 11,3 mm)

24

và nấm Aspergillus niger (10,8 và 10,0 mm) khi so sánh với chloramphenicol (10,0

mm)-chất kháng sinh được sử dụng để điều trị một số bệnh nhiễm trùng do vi

khuẩn [49].

1.1.5. Tình hình nghiên cứu về chi Gymnema ở Việt Nam

Nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Trần Văn Ơn đã công bố phân lập một hợp chất

mới (158) và tám hợp chất đã biết (159-166) từ loài G. latifolium [50]. Cũng nhóm

nghiên cứu này đã thử nghiệm tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết G. latifolium.

Theo đó, trên mô hình chuột bị gây tiểu đường bằng streptozocin liều 150 mg/kg, sau

7 ngày uống các phân đoạn cặn chiết cành lá của loài G. latifolium (tương đương 10 g

dược liệu khô/kgP/ngày) cho thấy tác dụng hạ đường huyết trên chuột của dịch chiết

ethyl acetate và butanol lần lượt là 42,38 % và 38,43 % [51]. Nguyễn Quyết Tiến và

cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học loài G. sylvestre, cho biết sự có mặt của bốn

hợp chất, bao gồm: stigmasterol, 3β-O-stigmasterol glucopyranoside (167), lupeol

(168), 3β-O-cinnamoyl-β-amyrin (169) [52].

25

Hà Thị Bích Ngọc đã phát hiện cao chiết nước của loài dây thìa canh G. sylvestre

có tác dụng hạ đường huyết trên chuột [53]. Năm 2017, NCS Hoàng Minh Châu

phân lập được 13 hợp chất từ loài G. sylvestre, trong đó có 9 hợp chất mới là

gymnemoside ND1-ND9 (170-178) và 4 hợp chất đã biết (179-182). Các hợp chất

176-178 được thử nghiệm in vitro về độ hấp thu 2-NBDG trên tế bào mô mỡ 3T3-

L1. Kết quả cho thấy ở nồng độ 20 µM, độ hấp thu glucose của dung dịch các chất

này có hiệu quả cao tương đương khi điều trị bằng insulin 10 nM [54].

26

Như vậy: Ở Việt Nam, các nghiên cứu thành phần hóa học cũng như hoạt tính

sinh học về các loài thuộc chi Gymnema còn khá hạn chế.

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu trong nước và trên thế giới, chúng tôi đã lựa

chọn 2 loài là G. sylvestre và G. latifolium để nghiên cứu thành phần hóa học và đánh

giá tác dụng sinh học, góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học cũng như kinh nghiệm

sử dụng cây thuốc này trong dân gian, định hướng cho những nghiên cứu y dược tiếp

theo.

1.2. Khái quát về bệnh tiểu đường

Tiểu đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat, mỡ và protein

khi hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện

bằng mức đường trong máu luôn cao. Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) năm 2019

bệnh tiểu đường được chia làm ba tuýp chính sau:

- Tiểu đường tuýp 1 (còn gọi là tiểu đường phụ thuộc insulin): cơ thể ngừng

sản xuất insulin. Thường gặp ở trẻ em hoặc thiếu niên. Những bệnh nhân bị tiểu

đường type 1 cần phải được điều trị bằng insulin mỗi ngày để duy trì cuộc sống.

- Tiểu đường tuýp 2: là một chứng bệnh mạn tính phát triển khi tuyến tụy

không sản xuất đủ insulin hoặc khi các mô trong cơ thể không thể sử dụng insulin

một cách bình thường. Tiểu đường tuýp 2 rất phổ biến (chiếm trên 90% số trường

hợp mắc bệnh), thường gặp ở người trên 40 tuổi trong đó người bị bệnh tiểu đường

thường dễ bị một số bệnh đi kèm như tăng huyết áp, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim,

đục thuỷ tinh thể... và thường có tuổi thọ ngắn hơn những người khác.

- Tiểu đường thai kỳ: đây là một tình trạng rối loại dung nạp glucose trong quá

trình mang thai. Bệnh này làm tăng đường huyết trong thai nhi dẫn đến nguy cơ gây

sảy thai, thai lưu, dị tật…

Ngoài ra, còn có một số thể khác ít gặp như: các bệnh tiể đường đơn gen

(MODY),tiểu đươgf do bệnh tụy ngoại tiết, rối loạn nội tiết, dothuốc hoặc hóa chất,

tiểu đường qua trung gian tự miễn và liên quan đến các hội chứng di truyền [55] .

Bệnh tiểu đường thường gây ra những biến chứng nguy hiểm. Những biến

chứng cấp tính của bệnh này có thể là hôn mê do tăng đường huyết, hạ đường huyết

và tăng keto-axit máu. Các biến chứng lâu dài do bệnh tiểu đường gây ra gồm có các

tổn thương thần kinh, tim mạch, thị giác, nguy cơ nhiễm trùng. Nguyên nhân là do

27

lượng đường trong máu quá cao lâu ngày gây thương tổn các mạch máu nhỏ với hậu

quả là mù mắt, suy thận, đồng thời thúc đẩy xơ mỡ động mạch (atherosclerosis) làm

hẹp các động mạch lớn gây tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim... Ngoài ra, bệnh

tiểu đường còn có ảnh hưởng xấu lên dây thần kinh, cơ tim, da, chân và răng lợi. Các

biến chứng mãn tính xảy ra sớm hay muộn, nặng hay nhẹ rất khác biệt ở từng bệnh

nhân.

Để kiểm soát được đường huyết và các biến chứng của bệnh tiểu đường, các

bệnh nhân thường kết hợp chế độ ăn phù hợp với dùng thuốc. Thuốc cho bệnh nhân

tiểu đường có 2 loại cơ bản là thuốc dùng đường tiêm và thuốc viên uống.

- Nhóm thuốc tiêm gồm insulin và amyrin [56].

- Nhóm thuốc dùng đường uống gồm: các thuốc nhóm dẫn xuất biguanide, các thuốc

nhóm dẫn xuất sulfamide, các thuốc nhóm ức chế enzyme α- glucosidase, các thuốc

nhóm meglitinide và các thuốc nhóm thiazolidinedione [57]. Trong đó, các thuốc ức

chế enzyme α-glucosidase và α-amylase (acarbose, miglitol, ...) hoạt động theo cơ

chế chung là chúng liên kết với các enzyme này, do đó làm chậm quá trình thủy phân

tinh bột và glycogen giải phóng các đường đơn, dẫn đến kết quả làm giảm sự gia tăng

Ức chế

Sucrose

Lactose

Tinh bột

α-amylase

Dextrin Oligosaccarit

α-amylase

Maltose

α-glucosidase

Glucose

Glucose

Glucose

Glucose

Fructose

Galactose

Tăng tiết glucagon

Rối loạn tiết insulin

của glucose sau bữa ăn [58, 59].

Đường huyết tăng

Tăng ly giải mô mỡ

Giảm hiệu ứng incretin

Cơ thể ngưng/sản xuất ít insulin

Đề kháng insulin ở các cơ quan

Hình 1.6. Ý nghĩa của việc ức chế enzyme α-glucosidase và enzyme α-amylase

trong giảm đường huyết

28

1.3. Khái quát về vai trò của enzyme α-glucosidase và enzyme α-amylase

1.3.1. Khái niệm về enzyme

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự trao đổi

chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp

của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Các phản ứng này có liên quan chặt chẽ

với nhau và điều chỉnh lẫn nhau. Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho các phản

ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định

và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp

nhàng trong cơ thể sống. Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống.

Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là

các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa

học [60].

1.3.2. Enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1)

Enzyme amylase là một hệ enzyme phổ biến trong hệ sinh vật, có tên hệ thống

là 1,4-α-D-glucan glucanohydrolase [61]. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy

phân [61, 62], xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với

sự tham gia của nước [61].

RR’ + H-OH →RH + R’OH

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và

dextrin phân tử lượng thấp. Các enzyme amylase có trong nước bọt (còn được gọi là

ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nẩy mầm, nấm sợi, xạ

khuẩn, nấm men và vi khuẩn [63]. Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá

trình này hoàn tất ở ruột non nhờ amylase của tuyến tụy.

Có 6 loại enzyme được chia vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) và

exoamylase (enzyme ngoại bào).

+ Endoamylase gồm: α-amylase, pullulanase (hay α-dextrin 6-glucosidase),

transglucosilase (hay oligo-1,6-glucosidase), amylo-1,6-glucosidase. Các enzyme

này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaacharide.

+ Exoamylase gồm: β -amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy

phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.

Enzyme α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm bên

29

trong của phân tử cơ chất (tinh bột và glycogen) một cách ngẫu nhiên và vì thế gọi

là enzyme nội bào. Enzyme α-amylase còn có các tên đồng nghĩa (synonym) khác

như glycogenase, endeamylase, clarase, maxamyl,… Enzyme α-amylase không chỉ

có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy các hạt tinh bột

nguyên vẹn song với tốc độ rất chậm.

Quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme α-amylase là quá trình đa giai đoạn:

+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy

phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin).

+ Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị

thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không màu với iode. Các chất này bị

thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới

tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm

6-7 gốc glucose.

+ Sau đó, các polyglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch

polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải tới maltotetrose, maltotriose và

maltose.

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành

maltotetrose, maltose và dextrin phân tử thấp.

1.3.3. Enzyme α-glucosidase (EC 3.2.1.20)

Enzyme α-glucosidase còn có những tên gọi khác như maltase,

transglucosidase, glucoinvertase, nitrophenyl α-D-glucosidase, glucosidosucrase, α-

glucopyranosidase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase,

thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân).

Enzyme α-glucosidase là một enzyme hoạt động theo cơ chế exohydrolysis,

xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α-1,4-glycoside giải phóng các phân tử α-D-

glucose [64]. Chất nền đặc trưng của enzyme α-glucosidase là các disaccharide,

oligosaccharide, các aryl- và akyl-α-glucopyranoside khác [61], [65].

Enzyme α-glucosidase là một trong những enzyme thuộc lớp glycoside

hydrolase, glycoside hydrolase là một lớp các enzyme thường tách liên kết glycoside

giữa 2 phân tử carbohydrate, một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy ở các

polymer tự nhiên. Các enzyme này có khả năng bẻ gãy các liên kết glycoside nhanh

hơn 1017 lần so với phản ứng không có enzyme xúc tác [66]. Khi thức ăn được hấp

30

thu vào cơ thể thì các carbohydrate trong thức ăn được thủy phân thành những phân

tử đường nhỏ hơn bởi những enzyme ở ruột non. Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy

tạng phải tiết ra enzyme α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành

oligosaccharid. Enzyme α-glucosidase ở màng ruột non lại tiếp tục phân hóa các

olisaccharid thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu vào máu [60,

67, 68].

31

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Sm

Thân và lá loài dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Sm.) được

thu hái tại xã Hải Lộc, huyện Hải Hậu, Nam Định, Việt Nam vào tháng 11 năm 2015.

Tên khoa học được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

giám định. Mẫu tiêu bản NCCT-P20 được lưu tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện

Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.1. Dây thìa canh (G. sylvestre)

2.1.2. Loài Gymnema latifolium Wall. ex Wight

Thân và lá loài lõa ty lá rộng, hay còn gọi là dây thìa canh lá to (G. latifolium

Wall. ex Wight.) được thu hái tại Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc

Hà Nội vào tháng 4 năm 2017. Tên khoa học được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện

Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định. Mẫu tiêu bản NCCT-P76 được lưu tại

Phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

Hình 2.2. Dây thìa canh lá to (G. latifolium)

32

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (0,25 mm, Merck), RP-18 F254s (0,25 mm, Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử

ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm và dùng thuốc thử là dung dịch sulfuric

acid 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.

2.2.1.2. Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel có cỡ hạt là 0,040 –

0,063 mm (230 - 400 mesh), pha đảo sử dụng loại RP-18 (30 - 50 m, Fuji Silysia

Chemical Ltd.); Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.).

2.2.1.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao được thực hiện trên máy AGILENT 1200, khoa

Dược, trường đại học Yonsei, Hàn Quốc.

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định trên cơ sở sử dụng các phép

xác định thông số vật lý và các phương pháp đo phổ bằng các thiết bị hiện đại đồng

thời kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo. Các phương pháp đo được

sử dụng gồm có:

2.2.2.1. Phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS)

Phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy

Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS tại trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc.

2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc. Chất nội chuẩn là TMS (Tetramethyl Silan).

Phổ NMR được đo trên máy đo trên máy Varian 400 MHz của Khoa Dược,

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H NMR, 13C NMR và DEPT.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và ROESY.

Dung môi được sử dụng là CD3OD. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào

bản chất của từng mẫu, theo nguyên tắc dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử.

33

2.2.2.3. Độ quay cực

Độ quay cực ([α]D) được đo trên máy JASCO P-2000 polarimeter của Viện

Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.2.4. Phương pháp xác định đường

Như đã trình bày ở phần tổng quan, thành phần hóa học chính của chi Gymnema là

các saponin với chuỗi đường từ 2-6 đơn vị monosaccarit. Ngoài các đường quen thuộc

như D-glucose, D-xylose thì còn có sự xuất hiện của một bộ phận lớn các đơn vị giả

đường trong đó một số nhóm hydroxyl bị chuyển hóa thành CH2 hoặc methyl hóa.

Do đó, việc xác định loại đường, chuỗi đường, cấu hình đường và vị trí gắn là phần

vô cùng quan trọng trong quá trình xây dựng cấu trúc hóa học của các hợp chất phân

lập được. Trình tự xác định đường được thực hiện như sau:

 Nhận dạng loại đường bằng phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

- Nhận dạng đường đơn thông qua giá trị độ chuyển dịch hóa học cacbon và

proton, đặc biệt là xác định cấu hình α/β của nhóm OH-hemiacetal thông

qua hằng số tương tác của proton anome (J1-2) cũng như xác định lập thể

các vị trí trong từng phân tử đường bằng dạng tín hiệu và hằng số tương

tác J của các proton trong từng phân tử đường.

- So sánh độ chuyển dịch hóa học δC của các đường thu được với các tài liệu

tham khảo về chi và loài.

- Kiểm tra lại cấu trúc hóa học của từng phân tử đường đơn bằng phổ HSQC

kết hợp với phổ 1H-1H COSY để nối mạch cacbon cũng như gán chính xác

các giá trị độ dịch chuyển hóa học của từng vị trí, trong đó có sự hỗ trợ

thêm của phổ HMBC. Việc xác định chuỗi đường và vị trí gắn thông qua

phổ tương tác 2 chiều HMBC.

Tuy nhiên, với việc sử dụng phổ NMR, chúng ta chưa khẳng định được

cấu hình D/L của từng phân tử đường.

 Xác định đường D và L: Trước hết thủy phân cắt đứt mạch đường thành các

đường đơn, sau đó tinh chế bằng các phương pháp sắc ký kết hợp để thu được

các đường đơn. Tiến hành đo độ quay cực từng đường đơn rồi so sánh kết quả

độ quay cực riêng với các dữ liệu đã công bố. Từ đó xác định được cấu hình

D/L của đường.

34

Các bước được tiến hành cụ thể như sau: mỗi hợp chất (GS1-GS8 và GL1-

GL5, 3,0 mg) được hòa tan trong 1 mL HCl 1,0 N (dioxane-H2O, 1:1, v/v) và

đun nóng đến 80°C trong 3h. Hỗn hợp phản ứng sau đó được chiết với CHCl3,

lớp nước tiếp tục được thổi khô bằng khí N2 cho cặn chiết nước (A). Cặn chiết

A được phân tách bằng cột sắc ký silica gel rửa giải bằng CH2Cl2–MeOH

(10:1, v/v), sau đó tiếp tục cho qua cột pha đảo sử dụng dung môi rửa giải

MeOH–H2O với độ phân cực tăng dần (6:4, 7:3 và 8:2, v/v) thu được các

đường đơn, đo độ quay cực riêng và so sánh giá trị thu được với độ quay cực

riêng của các đường chuẩn đã công bố.

Kết quả như sau:

Hợp chất GS1, GS3: D-cymarose, D-oleandrose, D-thevetose

D-allose

Hợp chất GS2, GS4, GS7: D-cymarose, D-oleandrose, 6-deoxy-3-O-methyl-

Hợp chất GS5, GL1, GL2, GL3, GL4: D-cymarose, D-oleandrose, D-

thevetose, D-glucose

D-allose, D-glucose

Hợp chất GS6, GS8, GL5: D-cymarose, D-oleandrose, 6-deoxy-3-O-methyl-

Đường đơn

Bảng 2.1. Giá trị độ quay cực riêng của các đường đơn sau thủy phân

D-cymarose (cym)

[α]D thực nghiệm [α]D tham khảo

D-oleandrose (ole)

+51,8 [69] +50,1 (c 0,4, H2O)

D-thevetose (thv)

−11,7 [69] −12,1 (c 0,4, H2O)

+42,3 [5] +40,3 (c 0,4, H2O)

6-deoxy-3-O-methyl-D-allose (all) +10,9 (c 0,4, H2O)

D-glucose (glc)

+10,0 [70]

+48,0 [70] + 49,2 (c 0,4, H2O)

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α -glucosidase

Nguyên tắc: Hoạt tính ức chế α-glucosidase được thực hiện dựa vào phản ứng

thủy phân 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) thành đường glucose và p-

nitrophenol, hợp chất có màu vàng, dưới xúc tác của enzyme α-glucosidase. Khi mẫu

thử có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, sự tạo thành hợp chất p-nitrophenol sẽ

giảm, do vậy mật độ quang (OD) của p-nitrophenol so với mẫu đối chứng, không bị

35

ức chế sẽ giảm theo. Mật độ quang (OD) của p-nitrophenol sinh ra sau phản ứng được

đo ở bước sóng 405 nm và được dùng để đánh giá hoạt động ức chế enzyme của mẫu

thử.

Cách tiến hành: Sử dụng phiến 96-giếng, trong mỗi giếng chứa mẫu nghiên cứu (20

L mẫu hòa tan trong DMSO), sau đó thêm enzyme α-glucosidase (40 L) và 120

L đệm phosphate buffe. Sau 5 phút thêm 40 L 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside

5 mM rồi ủ trong 30 phút ở 37oC. Đo độ hấp thụ quang OD ở bước sóng 405 nm

[71].

Đối chứng dương: Acarbose.

(OD + c

)OD - b

x 100

Kết quả được tính theo công thức sau:

(OD - )OD - -c s OD - OD +c -c

% Ức chế =

Trong đó:

ODc+: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu thử, có α-

glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 0%).

ODc-: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng âm (không có mẫu thử và α-

glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%).

ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử.

ODb: Mật độ quang trung bình mẫu trắng (có mẫu thử, không có α-glucosidase).

Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm.

Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm

Graphpad Prism 8.0.

2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α -amylase

Nguyên tắc: Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase được thực hiện dựa vào phản ứng

thủy phân tinh bột khoai tây trong nước với sự có mặt của enzyme α-amylase . Dung

dịch tinh bột hòa tan dưới xúc tác của enzyme α-amylase tạo ra một hỗn hợp phản

ứng tạo màu xanh với i ốt, đo độ giảm màu ở bước sóng 650 nm để đánh giá hoạt tính

ức chế enzyme của mẫu nghiên cứu.

Cách tiến hành: Đun sôi 100 mg tinh bột khoai tây trong 5 mL đệm phosphate trong

5 phút, sau đó làm nguội về nhiệt độ phòng. Tiếp đó mẫu thử (20 µL) và tinh bột (50

µL) được trộn lẫn với 30 µL đệm phosphate 0,1 M. Sau 5 phút thêm vào 20 µL dung

dịch α-amylase 5 mg/mL. Hỗn hợp phản ứng sau đó được ủ ở 37°C trong vòng 15

36

phút. Phản ứng kết thúc bằng việc thêm 50 µL HCl 1 M và sau đó là 50 µL dung dịch

iốt. Đo độ hấp thụ quang của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng 650 nm và tính %

ức chế [71].

- Đối chứng dương: Acarbose.

(OD + c

)OD - b

x 100

- Kết quả được tính theo công thức sau:

(OD - )OD - -c s OD - OD +c -c

% Ức chế =

Trong đó:

ODc+: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu thử, có α-

amylase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 0%);

ODc-: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng âm (không có mẫu thử và α-amylase;

trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%);

ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử.

ODb: Mật độ quang trung bình mẫu trắng (có mẫu thử, không có α-amylase).

Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm.

Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm

Graphpad Prism 8.0

2.3. Phân lập các hợp chất

2.3.1. Các hợp chất phân lập từ loài G. sylvestre

Thân và lá loài Gymnema sylvestre được thái nhỏ, phơi khô, nghiền mịn thu

được 4,0 kg bột khô. Bột này được ngâm chiết với methanol (3 lần x 10 L) bằng thiết

bị chiết siêu âm (mỗi lần 3 giờ). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất

thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 450,0 g cặn chiết methanol. Cặn chiết

này được hòa vào 2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane,

dichloromethane và ethyl acetate, loại bỏ dung môi bằng máy cô quay dưới áp suất giảm

thu được các phân đoạn n-hexane (GSL1, 47,0 g), CH2Cl2 (GSL2, 60,0 g), ethyl acetate

(GSL3, 87 g) và lớp nước (GSL4). Phân đoạn GSL2 được sắc ký trên cột silica gel

rửa giải bằng dung môi n-hexane:acetone (40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2,5:1, 1:1, và 0:1,

v:v) cho bảy phân đoạn, GS2A-GS2G. Phân đoạn GS2F được sắc ký trên cột silica

gel pha thường rửa giải bằng CHCl3: MeOH (11:1, v:v) cho bốn phân đoạn nhỏ hơn,

GS2F1-GS2F4. GS2F1 được sắc ký trên cột RP-18 sử dụng hệ dung môi rửa giải

MeOH: H2O (4:1, v:v) cho năm phân đoạn, GS2F1A-GS2F1E. Các hợp chất GS1

37

(17,0 mg, tR 38,5 phút), GS2 (9,0 mg, tR 42,1 phút) và GS7 (14,0 mg, tR 41,1 phút)

thu được từ phần GS2F1B sử dụng hệ thống sắc lý lỏng hiệu năng cao (HPLC): cột

J_sphere H-80 (150 × 20 mm), điều kiện dung môi acetonitrile 40%. Các hợp chất

GS3 (5,0 mg, tR 44,7 phút) và GS4 (5,0 mg, tR 49,4 phút) được thu được từ phần

GS2F1D trên cột J-sphere H-80 (150 × 20 mm), điều kiện dung môi là 40%

acetonitrile. Phân đoạn GS2F1E được phân tách trên cột J-sphere H-80 (150 × 20

mm), điều kiện dung môi acetonitrile 35% cho các hợp chất GS10 (5,0 mg, tR 37,8

phút) và GS12 (12,0 mg, tR 35,7 phút). Hợp chất GS11 (72,0 mg, tR 34,3 phút) được

tinh chế từ phân đoạn GS2F1C bằng hệ thống HPLC: cột J-sphere H-80 (150 × 20

mm), điều kiện dung môi acetonitrile 35%. Phân đoạn GS2G được sắc ký trên cột

RP-18 bằng hệ dung môi rửa giải MeOH: H2O (4:1, v:v) cho bốn phân đoạn nhỏ hơn,

GS2G1-GS2G4. GS2G3 được tinh chế trên cột J-sphere H-80 (150 × 20 mm), điều

kiện dung môi acetonitrile 35% cho hợp chất GS5 (14,0 mg, tR 39,7 phút) và GS9

(20,0 mg, tR 44,7 phút). Phân đoạn GS2G4 được tinh chế trên cột J-sphere H-80 (150

× 20 mm), điều kiện dung môi acetonitrile 35%, thu được hợp chất GS6 (30,0 mg, tR

31,5 phút) và GS8 (19,0 mg, tR 33,4 phút). Lớp nước GSL4 được cho qua cột Diaion-

HP20, sử dụng hệ dung môi rửa giải methanol : nước lần lượt là 25%, 50% và 100%

thu được ba phân đoạn GS4A, GS4B và GS4C. Phân đoạn GS4C cho chạy sắc ký

trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải CHCl3: MeOH (20:1, 10:1, 5:1, 1:1, v:v)

cho bốn phân đoạn nhỏ hơn, GS4C1, GS4C2, GS4C3 và GS4C4. GS4C4 được sắc

ký trên cột rửa giải RP-18 sử dụng hệ dung môi rửa giải methanol:nước (2:1, v:v) cho

năm phân đoạn GS4C4A, GS4C4B, GS4C4C, GS4C4C và GS4C4E. Các hợp chất

GS14 (5,0 g) và GS16 (40,0 mg) thu được từ phân đoạn GS4C4B trên cột rửa giải

RP-18 bằng hệ dung môi acetone: nước (0,8:1, v:v). Các hợp chất GS13 (100,0 mg)

và GS15 (5,0 mg) được tinh chế từ phân đoạn GS4C4E trên cột RP-18 rửa giải bằng

hệ dung môi acetone:nước (1:1, v:v).

Gymnema sylvestre (thân và lá, 4,0 kg)

ACN

: acetonitrile

A

: acetone

C

: chloroform

: n-hexane

H

Chiết với methanol (3 lần, mỗi lần 10L trong 3h)

Silica gel c.c

: sắc ký cột pha thường

: methanol

M

Cặn methanol (450,0 g )

Bổ sung 2L nước và chiết phân lớp với các dung môi theo tỉ lệ 1:1

HPLC RP-18 c.c

: săc ký lỏng hiệu năng cao : săc ký cột pha đảo

: water : thời gian lưu (phút)

W tR

n-hexane

Nước

EtOAc

CH2Cl2

GSL4

GSL3 (27,0 g)

GSL1 (47,0 g)

GSL2 (60,0 g)

Diaion HP20 M:W 0%→100%

Silica gel c.c H:A gradident 40:1→0:1

M 100%

MW:25%

MW: 50%

GS4B

GS4A

GS4C

H:A 20:1 H:A 10:1

H:A 5:1

H:A 2,5:1

H:A 1:1

H:A 40:1

HA 0:1

GS2G

GS2A

GS2F

GS2D

GS2E

GS2B GS2C

Silica gel c.c, C:M gradident 20:1→1:1

C:M 11:1

RP-18, M:W 4:1

C:M 20:1

C:M 5:1

C:M 1:1

C:M 10:1

GS4C2

GS4C4

GS4C1

GS2F3

GS2F2

GS2G1

GS2F1

GS2G2

GS2F4

GS2G3

GS2G4

GS4C3 RP-18 c.c, M:W 2:1

RP-18 c.c, M:W 4:1

HPLC, 35% ACN

HPLC, 35% ACN

GS4C4A GS4C4B GS4C4C GS4C4D GS4C4E

tR 39,7

tR 44,7

tR 31,5

tR 33,4

GS2F1A

GS2F1C

GS2F1B

GS9 (20,0 mg)

GS6 (30,0 mg)

GS5 (14,0 mg)

GS8 (19,0 mg)

RP-18 c.c A:W 0,8:1

RP-18 c.c A:W 1:1

GS2F1D HPLC 40% ACN

GS2F1E HPLC 35% ACN

HPLC 40% ACN

HPLC 35% ACN

tR 49,4

tR 44,7

tR 34,3

tR 42,1

tR 41,1

tR 38,5

tR 37,8

tR 35,7

GS11 (72,0 mg)

GS2 (9,0 mg)

GS7 (14,0 mg)

GS3 (5,0 mg)

GS1 (17,0 mg)

GS4 (5,0 mg)

GS12 (12,0 mg)

GS10 (5,0 mg)

GS16 (40,0 mg)

GS14 (5,0 mg)

GS15 (5,0 mg)

GS13 (100 mg)

38

Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G. sylvestre

39

2.3.2. Các hợp chất phân lập từ loài G. latifolium

Thân và lá loài G. latifolium được thái nhỏ, phơi khô, nghiền mịn thu được 4,0 kg bột

khô. Bột này được ngâm chiết với methanol (3 lần x 8 L) bằng thiết bị chiết siêu âm

(ở 50oC, mỗi lần 3 giờ). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi

dung môi dưới áp suất giảm thu được 400 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được

hòa vào 2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane,

dichloromethane và ethyl acetate, loại bỏ dung môi bằng máy cô quay dưới áp suất giảm

thu được các phân đoạn n-hexane (GLL1, 50,0 g), CH2Cl2 (GLL2, 52,0 g), ethyl acetate

(GLL3, 30,0 g) và lớp nước (GLL4).

Cặn chiết GLL2 được tiến hành sắc ký trên cột silica gel rửa giải bằng dung môi

gradient n-hexan:acetone (40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1 và 0:1, v:v) cho sáu phân đoạn,

kí hiệu từ GL2A-GL2F. Phân đoạn GL2D được sắc ký trên cột silica gel rửa giải bằng

chloroform: MeOH (11:1, v:v) cho bốn phân đoạn, GL2D1-GL2D4. GL2D1 được

sắc ký trên cột RP-18 sử dụng hệ dung môi methanol:nước (3:1, v:v) thu được bốn

phân đoạn nhỏ hơn, kí hiệu từ GL2D1A đến GL2D1D. Hợp chất GL1 (15,0 mg, tR

34,2 phút ) thu được từ phân đoạn GL2D1B bằng hệ thống sắc ký HPLC: J-sphere,

cột H-80 (150 x 20 mm), điều kiện dung môi 48% acetonitrile. Các hợp chất GL3

(13,3 mg, tR 39,1 phút) và GL5 (14,2 mg, tR 41,9 phút) thu được từ phần GL2D1C

bằng hệ thống HPLC sử dụng hệ dung môi rửa giải 48% acetonitrile. Phần GL2D3

được sắc ký trên cột pha đảo bằng cách sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH: H2O

(4:1, v:v), cho các phân đoạn GL2D3A, GL2D3B và GL2D3C. Hợp chất GL4 (16,0

mg, tR 42,2 phút) thu được từ GL2D3A sử dụng hệ thống HPLC, điều kiện dung môi

48% acetonitrile. Phân đoạn GL2E được sắc ký trên cột rửa giải RP-18 với MeOH:

H2O (3:1, v:v) cho bốn phân đoạn GL2E1 - GL2E4. Phân đoạn GL2E1 được sắc ký

bằng HPLC, điều kiện dung môi 48% acetonitrile cho hợp chất GL2 (17,0 mg, tR 53,6

phút) và GL6 (11,6 mg, tR 32,6 phút). Lớp nước GLL4 được cho qua cột Diaion-

HP20, sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O lần lượt là 25%, 50%, 75% và 100%

thu được bốn phân đoạn GL4A, GL4B, GL4C và GL-4D. Phân đoạn GL4C được tiến

hành sắc ký trên cột silica gel rửa giải bằng dung môi gradient dichloromethane:

methanol (20:1, 10:1, 5:1 và 0:1, v:v) cho bốn phân đoạn, kí hiệu từ GL4C1-GL4C4.

Phân đoạn GL4C4 được sắc ký trên cột silica gel rửa giải bằng chloroform:

methanol:nước (4:1:0,1, v:v:v) cho ba phân đoạn, GL4C4A-GL4C4C. Phân đoạn

40

GL4C4C được sắc ký trên cột RP-18 sử dụng hệ dung môi acetone:nước (0,8:1, v:v)

thu được ba phân đoạn nhỏ hơn, GL4C4C1, GL4C4C2 và GL4C4C3. Hợp chất GL8

(20,3 mg, tR 54,0 phút) thu được bằng cách tinh chế phân đoạn GL4C4C1 trên hệ

thống HPLC: J-sphere, cột H-80 (150x20 mm), điều kiện dung môi 30% acetonitrile.

Hợp chất GL7 (12,5 mg, tR 39,1 phút) thu được bằng cách tinh chế phân đoạn

GL4C4C3 trên hệ thống HPLC: J-sphere, cột H-80 (150x20 mm), điều kiện dung môi

35% acetonitrile.

ACN

: acetonitrile

A

: acetone

Gymnema latifolium (thân và lá, 4,0 kg)

C

: chloroform

: n-hexane

H

Chiết siêu âm với methanol (3 lần, mỗi lần 8L trong 3h)

Silica gel c,c

: sắc ký cột pha thường

: methanol

M

Cặn chiết methanol GLL, (400 g )

HPLC RP-18 c,c

: săc ký lỏng hiệu năng cao : săc ký cột pha đảo

: water : thời gian lưu (phút)

W tR

Bổ sung 2L nước và chiết phân lớp với các dung môi theo tỉ lệ 1:1

n-hexane

cặn nước

dichloromethane

ethyl acetate

GLL4

GLL1 (50,0 g)

GLL2 (52,0 g)

GLL3 (30,0 g)

Diaion HP-20 M:W, 0%→100%

Silica gel c.c H:A gradient 10:1→0:1

H:A 20:1

H:A 10:1

H:A 5:1

H:A 40:1

MW: 50%

MW:75%

MW:25%

M 100%

HA 1:1

Acetone

GL4D

GL2E

GL2F

GL4A

GL2D

GL2C

GL4C

GL2B

GL4B

GL2A

Silica gel c.c, C:M gradient 20:1→0:1

RP-18 c,c M:W 3:1

Silica gel c.c C:M 11:1

C:M 1:1

C:M 20:1

C:M 10:1

C:M 5:1

GL2D3

GL2D2

GL2D4

GL2E4

GL2E1 GL2E2 GL2E3

GL2D1

GL4C1

GL-4C2

GL-4C3

GL-4C4

RP18 c, c M:W 4:1

HPLC 42%ACN

RP-18 c,c M:W 3:1

Silica gel c, c, CMW 4/1/0,1

tR 32,8

tR 53,6

GL2D1A

GL2D1B

GL2D3B GL2D3C

GL2D1C

GL2D1D

GL2D3A

GL6 11,6 mg

GL2 17,0 mg

HPLC 48%ACN

GL4C4A (1,5 g)

GL4C4B (1,0 g)

HPLC 48%ACN

GL4C4C (1,4 g)

RP-18 c.c,, A:W 0,8:1

tR 34,2

HPLC, 48%ACN tR 42,2

tR 41,9

tR 39,1

GL1 (15,0 mg)

GL3 (13,3 mg)

GL5 (14,2 mg)

GL-4C4C1

GL-4C4C2 GL-4C4C3

GL4 (16,0 mg)

HPLC 30%ACN tR 54,0

HPLC 35%ACN tR 39,1

GL8 (20,3 mg)

GL7 (15,0 mg)

41

Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G.latifolium

42

2.4. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được

2.4.1. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre

2.4.1.1. Hợp chất GS1: gymsyloside A (hợp chất mới)

[

] - 20,0o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS: m/z 935,4986 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C47H76O17Na]+ : 935,4975).

Công thức phân tử: C47H76O17; M = 912.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.1.

2.4.1.2. Hợp chất GS2: gymsyloside B (hợp chất mới)

[

] + 35,0o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 935,4996 [M+Na]+, (tính toán lý thuyết [C47H76O17Na]+:

935,4975).

Công thức phân tử: C47H76O17, M = 912.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.2.

2.4.1.3. Hợp chất GS3: gymsyloside C (hợp chất mới)

[

] + 80,0o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 1079,5769 [M+Na]+, (tính toán lý thuyết [C54H88O20Na]+:

1079,5767).

Công thức phân tử: C54H88O20; M = 1056.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.3.

2.4.1.4. Hợp chất GS4: gymsyloside D (hợp chất mới)

[

] + 58,7 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 1079,5778 [M+Na]+, tính toán lý thuyết [C54H88O20Na]+:

1079,5769).

Công thức phân tử: C54H88O20; M = 1056.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.4.

2.4.1.5. Hợp chất GS5:gymsyloside E (hợp chất mới)

[

] +54,0 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 1097,5530 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C54H88O20Na]+:

1097,5503).

43

Công thức phân tử: C54H88O20; M = 1074.

Số liệu phổ 1H- và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.5.

2.4.1.6. Hợp chất GS6: gymnepregoside R (hợp chất mới)

[

] +110,0 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 1241,6309 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C60H98O25Na]+:

1241,6289).

Công thức phân tử: C60H98O25; M = 1218.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.6.

2.4.1.7. Hợp chất GS7: gymnepregoside T (hợp chất mới)

[

] +31,0 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 1037,5299 [M+Na]+, (tính toán lý thuyết cho công thức

[C51H82O20Na]+: 1037,5292).

Công thức phân tử: C51H82O20; M = 1014.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.7.

2.4.1.8. Hợp chất GS8: vetircilloside M

[

] +105,7 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 1263,6148 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C62H96O25Na]+:

1263,6133).

Công thức phân tử: C62H96O25; M = 1240.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.8

2.4.1.9. Hợp chất GS9: verticilloside D

[

] + 30,5 (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực

Công thức phân tử: C57H92O25; M = 1176.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.9.

2.4.1.10. Hợp chất GS10: gymnepregoside F

[

] +12,0 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 997,5318[M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức

[C49H82O19Na]+ : 997,5343).

Công thức phân tử: C49H82O19; M = 974.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.10.

44

2.4.1.11. Hợp chất GS11: 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside F

[

] +15,0 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 1127,5766 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C58H88O20Na]+ :

1127,5761).

Công thức phân tử: C58H88O20; M = 1104.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.11.

2.4.1.12. Hợp chất GS12: stephanoside I

[

] +30,0 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 1127,5771[M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C58H88O20Na]+

1127,5761).

Công thức phân tử: C58H88O20; M = 1104.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.12.

2.4.1.13. Hợp chất GS13:3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl

oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester

[

] -8.0 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 965,5094 [M+H]+ (tính toán lý thuyết [C48H78O18H]+ : 965,5080).

Công thức phân tử: C48H78O18; M = 942.

Số liệu phổ 1H và 13H NMR (CD3OD): xem Bảng 3.13.

2.4.1.14. Hợp chất GS14: gymnemoside-W1

[

] -45.0 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 967,5236 [M+Na]+, (tính toán lý thuyết cho công thức

[C48H80O18Na]+: 967,5237).

Công thức phân tử: C48H80O18; M = 944.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.14.

2.4.1.15. Hợp chất GS15: 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-

(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester

[

] -10.0 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 1097,5521 [M+H]+ (tính toán lý thuyết [C53H86O22Na]+:

1097,5503).

Công thức phân tử: C53H86O22; M = 1074.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.15.

45

2.4.1.16. Hợp chất GS16: alternoside XIX

[

] -52.0 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 1099,5658 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết [C53H88O22Na]+:

1099,5659).

Công thức phân tử: C53H88O22; M = 1076.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.16.

2.4.2. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài G. latifolium

2.4.2.1. Hợp chất GL1: gymlatifoside A (hợp chất mới)

[

] +18,8 o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

35Cl]-:

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

HR-ESI-MS tại m/z 1262,5528 [M + 35Cl]- (tính toán lý thuyết [C63H89NO23

1262,5514).

Công thức phân tử: C63H89NO23; M = 1227.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.17

2.4.2.2. Hợp chất GL2: gymlatifoside B (hợp chất mới)

[

] +29,01o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

37Cl]-: 1426,6013).

HR-ESI-MS tại m/z 1424,6061 [M + 35Cl], 1426,6067 [M + 37Cl]-, (tính toán lý thuyết

35Cl]-: 1424,6042, [C69H99NO28

[C69H99NO28

Công thức phân tử: C69H99NO28; M = 1389.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.18.

2.4.2.3. Hợp chất GL3: gymlatifoside C (hợp chất mới)

[

] 46,5o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

37Cl]-: 1255,6056).

HR-ESI-MS tại m/z 1253,6050 [M + 35Cl]- và 1255,5982 [M + 37Cl]- (tính toán lý

35Cl]-: 1253,6086, [C60H98O25

thuyết [C60H98O25

Công thức phân tử: C60H98O25; M = 1218.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.19.

2.4.2.4. Hợp chất GL4: gymlatifoside D (hợp chất mới)

[

] +73,0o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

37Cl]-: 1173,5638).

HR-ESI-MS tại m/z 1171,5676 [M + 35Cl]- và 1173,5676 [M + 37Cl]- (tính toán lý

35Cl]-: 1171,5667, [C55H92O24

thuyết [C55H92O24

Công thức phân tử: C53H88O22; M = 1076.

46

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.20..

2.4.2.5. Hợp chất GL5: verticilloside J

[

] 22,0o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

Công thức phân tử: C53H88O22; M = 1104.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.21.

2.4.2.6. Hợp chất GL6: lucyoside H

[

] -7,5° (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

Công thức phân tử: C42H68O13; M = 780.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.22.

2.4.2.7. Hợp chất GL7: 3-O-β-D- glucopyranosyl (1→6)-β-D- glucopyranosyl

oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (xem hợp chất GS13)

2.4.2.8. Hợp chất GL8: 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl

oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl ester

[

] -13.5o (c 0,1, MeOH).

2 5 D

Chất bột vô định hình màu trắng. Độ quay cực

Công thức phân tử: C54H88O23; M = 1104.

Số liệu phổ 1H và 13C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.23

2.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

2.5.1. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất

Tất cả các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre và G. latifolium đã được

thử hoạt tính in vitro ức chế enzyme α-glucosidase (

Bảng 2.2). Acarbose, một loại thuốc trị tiểu đường phổ biến đã được sử dụng

làm chất đối chứng dương. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

của 23 hợp chất (GS1-GS16 và GL1-GL8) được thể hiện trong bảng dưới đây. Trong

đó các chất sạch được thử ở nồng độ ở nồng độ 200 µM, cặn chiết ở nồng độ 500

µg/ml và đối chứng dương acarbose ở nồng độ 500 µg/ml.

Các chất có phần trăm ức chế lớn hơn 50% được tiếp tục tiến thành thử nghiệm

để tìm giá trị IC50. Theo đó hợp chất GS8 có giá trị IC50 = 173,8 ± 0,7 µM, đối chứng

dương acarbose có IC50 = 580,3 ± 0,5 µM.

47

Bảng 2.2. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các hợp chất từ G.sylvestre

Hợp chất % Ức chế Hợp chất % Ức chế

GS1 GS2 GS3 GS4 GS5 GS6 GS7 GS8 GS9 2,50 ±1,43 2,5 0± 2,25 4,35 ± 3,08 16,41 ± 2,32 3,45 ± 3,15 37,8 ± 1,51 3,06 ± 2,08 65,06 ± 2,13 19,72 ± 3,61 GS10 GS11 GS12 GS13 GS14 GS15 GS16 Cặn MeOH Acarbose 2,69 ± 1,35 2,24 ± 1,77 2,50 ± 1,12 4,50 ± 3,20 1,51 ± 2,78 3,65 ± 2,03 1,51 ± 2,05 94,98 ± 1,11 57,86 ± 0,06

Bảng 2.3. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các hợp chất từ G. latifolium

% Ức chế Hợp chất Hợp chất % Ức chế

GL1 GL2 GL3 GL4 GL5 30,11 ± 1,01 10,84 ± 0,70 23,61 ± 0,84 7,03 ± 1,07 37,83 ± 0,90 GL6 GL8 Cặn MeOH Acarbose 8,28 ± 0,23 17,92 ±1,92 27,02 ± 0,99 57,86 ± 0,06

2.5.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất

Tất cả các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre và G. latifolium đã được

thử hoạt tính in vitro ức chế enzyme α-amylase. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế

enzyme α-amylase của 23 hợp chất ở nồng độ 200 µM được thể hiện trong bảng dưới.

Acarbose được sử dụng làm chất đối chứng dương thử nghiệm ở nồng độ 100 µg/ml.

Hợp chất

% Ức chế

Hợp chất

% Ức chế

Bảng 2.4. Hoạt tính ức chế α-amylase của các hợp chất phân lập từ G. sylvestre

GS1 GS2 GS3 GS4 GS5 GS6 GS7 GS8 GS9 39,44 ± 2,07 57,90 ± 0,38 66,80 ± 0,19 59,76 ± 1,88 18,73 ± 1,31 16,60 ± 0,94 39,18 ± 0,56 46,22 ± 0,75 5,44 ± 3,94 GS10 GS11 GS12 GS13 GS14 GS15 GS16 Cặn MeOH Acarbose 2,69 ± 1,35 48,50 ± 1,31 39,18 ± 0,56 41,83 ± 1.92 45,95 ± 0,15 41,83 ± 2,82 49,27 ±1,31 34,93 ± 2,44 91,24 ±1,31

48

Các chất GS2, GS3, GS4 có phần trăm ức chế lớn hơn 50% được tiếp tục tiến

thành thử nghiệm để tìm giá trị IC50. Các hợp chất này tiếp tục được thử nghiệm để

tìm ra giá trị IC50 tương ứng là 175,8 ± 2,3, 162,2 ± 2,7 và 113,0 ± 0,7 μM đối chứng

dương acarbose có giá trị IC50 = 72,4 ± 0,8 µM.

Hợp chất

% Ức chế

Hợp chất

% Ức chế

Bảng 2.5. Hoạt tính ức chế α-amylase của các hợp chất từ loài G. latifolium

GL1 GL2 GL3 GL4 GL5 29,21 ± 1,13 8,24 ± 0,21 1,59 ± 1,46 21,32 ± 1,25 16,5 ± 0,83 GL6 GL8 Cặn MeOH Acarbose 6,47 ± 1,04 27,06 ± 1,04 17,65 ± 0,21 91,24 ±1,31

49

CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ

3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được

Tổng số 23 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ hai loài

G.sylvesre và G. latifolium, trong đó có:

16 hợp chất từ loài G. sylvestre

Từ loài G. sylvestre, phân lập được 16 hợp chất, trong đó có 7 hợp chất mới

và 9 hợp chất đã biết. Tám hợp chất mới gồm: gymsyloside A (GS1), gymsyloside

B, (GS2), gymsyloside C (GS3), gymsyloside D (GS4), gymsyloside E (GS5),

gymnepregoside R (GS6) và gymnepregoside T (GS7). Chín hợp chất đã biết gồm:

vetircilloside M (GS8), verticilloside D (GS9), 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside

F (GS10), gymnepregoside F (GS11), stephanoside I (GS12), 3β-O-β-D-

glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyrano-syloleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl

ester (GS13), gymnemoside-W1 (GS14), 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-

glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl

ester (GS15) và alternoside XIX (GS16).

Hình 3.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài G. sylvestre

50

* 8 hợp chất từ loài G. latifolium

Từ loài G. latifolium, phân lập được tám hợp chất. Trong đó có bốn hợp chất mới và

bốn hợp chất cũ. Bốn hợp chất mới gồm: gymlatifoside A (GL1), gymlatifoside B

(GL2), gymlatifoside C (GL3), gymlatifoside D (GL4) và bốn hợp chất đã biết là

verticilloside J (GL5), lucyoside H (GL6), 3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-

glucopyranosyloleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (GL7 trùng với hợp

chất GS13), 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic aciD-

28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester (GL8).

Hình 3.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài G. latifolium.

3.1.1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất pregnane glycoside đã phân lập được

Các pregnane glycoside đã phân lập được từ hai loài G. latifolium và G.

sylvestre đều là các steroid có aglycone 21 nguyên tử cacbon (C21) hoàn toàn giống

như các hợp chất pregnane glycoside đã được công bố cho chi Gymnema.

Cấu trúc của các pregnane glycoside này bao gồm 2 phần:

- Khung pregnane: dẫn xuất 10β,13β-dimethyl-17β-ethyl của hệ vòng gonane (được

tạo thành bởi sự sắp xếp đặc trưng của bốn vòng cycloalkane, trong đó có 3 vòng 6

(A, B, và C) và 1 vòng 5 (D). Các pregnane glycoside xuất hiện liên kết đôi ở vị trí

51

C-5 và thường bị hydroxyl hóa ở vị trí C-3, C-8, C-14, C-17 và C-20. Cấu hình của

nhóm thế tại vị trí C-3 luôn là β, một cấu hình phổ biến nhất của các steroid thiên

nhiên. Vị trí tương đối của vòng A/B luôn là trans, vòng C/D luôn là cis [72].

Hình 3.3. Cấu trúc khung pregnane

- Phần đường: Các đường được nối ở C-3 thông qua một liên kết acetal. Các pregnane

glycoside thường chứa từ một đến sáu đơn vị đường xuất hiện ở dạng tuyến tính,

được tạo thành từ các đường đơn là đường deoxy (deoxy sugar) và đường β-D-

glucopyranose. Các đường được phát hiện từ hai loài nêu trên cũng giống như các

đường rất đặc trưng thường thấy trong chi Gymnema là cymarose (cym), 6-deoxy-

3-oxymethylallopyranose (all), D-thevetopyranose (thv) và D-oleandropyranose

(ole).

3.1.1.1. Đặc điểm phổ 1H NMR của các hợp chất pregnane glycoside phân lập từ G.

latifolium và G. sylvestre

Phổ 1H NMR của các hợp chất pregnane glycoside xuất hiện tín hiệu đặc trưng

của một proton olefin với độ chuyển dịch hóa học δH 5,0 < δH < 5,5 với dạng tín hiệu

là br s. Ở vùng trường cao là 2 nhóm methyl singlet (H-18, H-19) và một nhóm methyl

doublet (H-21, có thể có) đặc trưng cho khung pregnane. Bên cạnh đó là sự xuất hiện

của một loạt các tín hiệu methyl doublet với hằng số tương tác J = 6,0–6,5 Hz thuộc

về các nhóm methyl vị trí số 6 trong các đường deoxy. Ngoài ra, còn xuất hiện tín

hiệu của các proton anome tại δH 4,0-5,5. Các chuỗi oligosaccarit của chi Gymnema

thường bao gồm các đường β với hằng số tương tác 1-2J khá lớn (8,5-10 Hz). Phổ 1H-

NMR của các hợp chất này cũng xuất hiện tín hiệu của các proton vùng đường trong

khoảng δH 3,0-4,0 . Một dấu hiệu quan trọng khác cho sự có mặt của các đường deoxy

là sự xuất hiện các proton methoxy (OCH3) trong khoảng δH 3,5-3,9. Bên cạnh khung

chính và các đường deoxy, các pregnane glycoside này thường được gắn thêm một

52

số hợp phần khác như cinamoyloxy, benzoyloxy, tigloyloxy hoặc acetyloxy vào vị trí

C-12 hoặc C-21 hoặc cả hai. Đặc trưng phổ 1H NMR của các hợp phần này như sau:

- Nhóm acetyl: proton acetyl xuất hiện đặc trưng ở vùng δH 2,0-2,2.

- Nhóm benzoyl: các proton thơm xuất hiện trong khoảng δH 7,0-8,0.

- Nhóm cinnamoyl: các proton xuất hiện trong vùng δH 6,0-8,0. Trong đó có một cặp

proton của liên kết đôi ngoài vòng với hằng số tương tác đặc trưng cho cấu hình (E):

J ⁓ 15,0-16,0 Hz.

- Nhóm tigloyl (Tig): một proton ở vùng 6,0-7,0 ppm (H-3), dạng tín hiệu là quartet

(q), 2 nhóm methyl gắn với nối đôi xuất hiện ở vùng trường cao với độ chuyển dịch

⁓ δH 1,8 -2,0, trong đó có một nhóm methyl singlet (H-5) và một nhóm methyl doublet

(H-4, J ⁓ 6,0-7,0 Hz)

3.1.1.2. Đặc điểm phổ 13C NMR của các hợp chất pregnane glycoside phân lập từ G.

latifolium và G. sylvestre

- Phổ 13C NMR của các hợp chất pregnane glycoside xuất hiện tín hiệu các nhóm

methyl thuộc khung pregnane (C-18, C-19, C-21) và C-6 của các đường deoxy trong

khoảng 18-19 ppm.

- Ở vùng trường thấp xuất hiện 2 tín hiệu đặc trưng của nối đôi Δ5 . Cacbon anome

của các đường deoxy xuất hiện trong khoảng δC 95,0-105,0. Đi kèm với đó là tín hiệu

53

của nhóm methoxy trong khoảng δC 58,0-61,0 và cacbon oximethine trong khoảng

70,0-80,0 ppm.

- Các hợp chất pregnane glycoside thường được gắn thêm hợp phần benzoyl,

cinnamoyl, tigloyl, acetyl và nicotiloyl. Đặc trưng phổ 13C-NMR của các nhóm này

như sau:

 Nhóm acetyl: 1 píc khoảng δC 165,0-170,0 ppm (O - C = O) và 1 píc trong

vùng δC 20,0-25,0 ppm (cacbon methyl).

 Nhóm benzoyl: 1 cacbon cacbonyl δC 165,0-170,0 ( O - C = O) và 4 cacbon

vùng thơm, δC 100,0 – 150,0. Trong đó C-2 và C-6 chập tín hiệu, C-3 và C-5

chập tín hiệu, do đó đặc thù sẽ có 2 píc có cường độ cao gấp đôi các píc còn

lại của vùng thơm.

 Nhóm cinnamoyl: Có các píc tương tự như benzoyl. Khác biệt duy nhất là

xuất hiện thêm 2 píc của nối đôi ngoài vòng trong khoảng δC 110,0 -130,0.

 Nhóm tigloyl (Tig): 1 cacbon cacbonyl 165,0-170,0 ppm ( O - C = O), 1 nối

đôi ngoài vòng với hai tín hiệu trong khoảng 120,0-140,0 ppm và 2 nhóm

methyl.

3.1.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre

3.1.2.1. Hợp chất GS1: gymsyloside A

Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS1

Hợp chất GS1 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công thức phân tử

của hợp chất GS1 được xác định là C47H76O17 bởi sự xuất hiện của píc ion giả phân

54 tử m/z 935,4986 [M + Na]+ trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (tính toán

lý thuyết cho công thức [C47H76O17Na]+ là 935,4975). Kết quả trên cho thấy độ bất

bão hòa của phân tử là 10. Phổ 1H NMR của GS1 cho tín hiệu của ba nhóm methyl ở

δH 1,13 (3H, s), 1,53 (3H, s) và 1,05 (3H, d, J = 6,4 Hz); một proton olefin ở δH 5,32

(1H, br s), gợi ý đây là một aglycone pregnane, một khung chất chính và phổ biến

nhất xuất hiện trong thành phần hóa học của chi Gymnema [5-7]; hai nhóm methyl ở

δH 1,80 (3H, d, J = 7,2 Hz) và 1,85 (3H, s) và một proton olefin ở δH 6,98 (1H, q, J =

7,2 Hz) gợi ý sự có mặt của một gốc tigloyl; ba proton anome xuất hiện tại δH 4,84

(br d, J = 9,6 Hz), 4,57 (br d, J = 9,2 Hz) và 4,41 (br d, J = 8,0 Hz) cho thấy sự có

mặt của 3 phân tử đường. Các giá trị hằng số tương tác J nêu trên khá lớn cho thấy

các phân tử đường đều có liên kết β-glycoside. Ba nhóm methoxy có độ dịch chuyển

hóa học khá thấp tại δH 3,39 (3H, s), 3,42 (3H, s) và 3,60 (3H, s) cùng với ba nhóm

methyl bậc 2 tại δH 1,19 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,25 (d, J = 6,0 Hz) và 1,35 (d, J = 6,0

Hz) cho thấy ba phân tử đường nêu trên là ba đơn vị đường deoxy, một loại đường

rất đặc trưng có mặt trong các hợp chất phân lập từ chi Gymnema [5, 8, 10]. Các dữ

liệu phổ 1H NMR gợi ý hợp chất GS1 là một pregnane glycoside. Phổ 13C NMR và

DEPT cho thấy hợp chất GS1 chứa 47 nguyên tử cacbon, trong đó có 21 nguyên tử

cacbon rất đặc trưng thuộc khung pregnane (δC 39,8 × 2, 30,2, 79,2, 140,0, 120,0,

35,2, 74,9, 44,7, 38,0, 26,0, 75,1, 57,6, 89,3, 34,3, 33,5, 89,1, 11,2, 18,5, 71,5 và 18,9)

[6-8], [73], [74], 5 cacbon của gốc tigloyl (δC 169,1, 130,0, 139,5, 14,8 và 12,2) và 21

cacbon cũng rất đặc trưng cho ba phân tử đường cymaropyranose (Cym),

oleandropyranose (Ole) và thevetopyranose (Thv) có mặt trong chi Gymnema. Các

giá trị độ dịch chuyển hóa học cụ thể của ba phân tử đường nêu trên như sau: cym (δC

97,2 36,6, 78,5, 83,8, 69,9, 18,5, 58,5), Ole (102,6, 37,6, 80,2, 84,1, 72,5, 18,9, 57,6),

thv (104,3, 75,6, 87,7, 76,6, 73,2, 18,1 và 61,0) (Bảng 3.1). Tiến hành thủy phân hợp

chất GS1 trong môi trường axit thu được các đường đơn. Chúng được xác định là D-

cymarose, D-oleandrose và D-thevetose bởi sự phù hợp về giá trị độ quay cực riêng

của chúng với các dữ liệu tương ứng đã được công bố (xem mục 2.2.2.4). Kết quả

này cũng hoàn toàn phù hợp với các đường đơn có mặt trong chi Gymnema [5, 8, 10].

Để xác định vị trí của các nhóm thế cũng như trật tự liên kết của các phân tử đường,

phổ HSQC, 1H-1H COSY và HMBC đã được thực hiện (Hình 3.5). Phổ HSQC để xác

định các proton liên kết trực tiếp với cacbon, phổ HMBC để xác định tương tác xa 2J

55 và 3J giữa các proton và cacbon. Trên phổ HSQC, các tương tác giữa các proton và

cacbon của các phân tử đường đã được xác định bao gồm Cym: H-1 (δH 4,84)/C-1 (δC

97,2), H-2 (δH 1,52 và 2,05)/C-2 (δC 36,6), H-3 (δH 3,82)/C-3 (δC 78,5), H-4 (δH

3,24)/C-4 (δC 83,8), H-5 (δH 3,79)/C-5 (δC 69,9), H-6 (δH 1,19)/C-6 (δC 18,5), OCH3

(δH 3,42)/C-6 (δC 58,5); Ole: H-1 (δH 4,57)/C-1 (δC 102,6), H-2 (δH 1,40 và 2,30)/C-2

(δC 37,6), H-3 (δH 3,36)/C-3 (δC 80,2), H-4 (δH 3,18)/C-4 (δC 84,1), H-5 (δH 3,36)/C-

5 (δC 72,5), H-6 (δH 1,35)/C-6 (δC 18,9), OCH3 (δH 3,39)/C-6 (δC 57,6); Thv: H-1 (δH

4,41)/C-1 (δC 104,3), H-2 (δH 3,18)/C-2 (δC 75,6), H-3 (δH 3,00)/C-3 (δC 87,7), H-4

(δH 3,00)/C-4 (δC 76,6), H-5 (δH 3,25)/C-5 (δC 73,2), H-6 (δH 1.25)/C-6 (δC 18.1),

OCH3 (δH 3,60)/(δC 61,0). Trên phổ 1H-1H COSY, các tương tác COSY giữa các

proton của các phân tử đường đã được xác định cho phép xác định các giá trị độ dịch

chuyển hóa học của cả proton và cacbon trong từng phân tử đường.

Hình 3.5. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất GS1

Mặt khác, tương tác HMBC giữa H-19 (δH 1,13) và C-1 (δC 39,8)/C-5 (δC 140,0)/C-

9 (δC 44,7)/C-10 (δC 38,0), giữa H-6 (δH 5,32) với C-8 (δC 74,9)/C-10 (δC 38,0) khẳng

định vị trí của liên kết đôi tại C-5/C-6; tương tác HMBC giữa H-18 (δH 1,53) với C-

13 (δC 57,6)/C-14 (δC 89,3)/C-17 (δC 89,1); giữa H-21 (δH 1,05) với C-17 (δC 89,1)/C-

20 (δC 71,5) và giữa H-6 (δH 5,32)/H-7 (δH 2,11)/H-9 (δH 1,49) với C-8 (δC 74,9)

chứng minh vị trí của các nhóm hydroxyl tại C-8, C-14, C-17, C-20. Tương tác

56

HMBC giữa Tig H-5 (δH 1,85) và Tig C-1 (δC 169,1)/Tig C-2 (δC 130,0)/Tig C-3 (δC

139,5) và giữa Tig H-4 (δH 1,80) với Tig C-2/Tig C-3 xác định hợp phần tigloyl. Và

tương tác ROESY giữa Tig H-4 (δH 1,80) và Tig H-5 (δH 1,85) cho thấy hợp phần

tigloyl này có cấu hình (E). Ngoài ra, vị trí của nhóm tigloyl này tại C-12 (OH) đã

được khẳng định bởi tương tác HMBC từ H-12 (δH 4,68) đến Tig C-1 (δC 169,1).

Tương tác HMBC giữa Thv H-1 (δH 4,41) và Ole C-4 (δC 84,1); giữa Ole H-1 (δH

4,57) và Cym C-4 (δC 83,8); Cym H-1 (δH 4,84) và aglycone C-3 (δC 79,2) chỉ ra các

liên kết của chuỗi đường là β-D-thevetopyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranosyl-

(1→4)-β-D-cymaropyranoside và vị trí của các liên kết đường tại C-3 của aglycone.

Kết quả phân tích chi tiết các giá trị độ dịch chuyển hóa học của proton và cacbon

của phần aglycon cũng như các tương tác giữa các proton và hằng số tương tác proton

của hợp chất GS1 với các hợp chất pregnane thuộc chi Gymnema cho thấy sự phù

hợp hoàn toàn với các dữ liệu đã được công bố về aglycon (20S)-

3β,8β,12β,14β,17β,20-hexahydroxypregn-5-ene, khung sarcostin đặc trưng, cũng

như cấu hình D-cymarose, D-oleandrose và D-thevetose của tất cả các đường có mặt

trong chi này. Đây là một đặc điểm thú vị về quá trình sinh tổng hợp của các hợp chất

thứ cấp có khung pregnane glycoside của chi Gymnema [6, 7]. Ngoài ra, cấu hình

tương đối của GS1 được khẳng định thêm một lần nữa bằng phân tích phổ ROESY.

Tương tác NOESY giữa Hβ-1 (δH 1,80) với H-19 (δH 1,13) đã xác định được proton

Hβ-1, suy ra được Hα-1 (δH 1,09), tương tác giữa Hα-1 (δH 1,09) với H-3 (δH 3,50)

khẳng định Hα-3, suy ra nhóm 3-OHβ, tương tác giữa Hα-12 (δH 4,68) với Hα-9 (δH

1,49) khẳng định nhóm thế tại C-12 chiếm vị trí β. Bên cạnh đó, hằng số tương tác

lớn Jaa Ha-12 và Ha-11 (J = 11,6 Hz) cho thấy H-12 chiếm vị trí axial, tương tác giữa

Hα-12/axial với H-15 (δH 1,88) chứng tỏ cacbon CH2 tại C-15 cùng chiếm vị trí

α/axial, tức là nhóm OH tại C-14 sẽ chiếm vị trí β (Hình 3.5). Ngoài ra tương tác

NOESY giữa H-12 và H-20 (δH 3,45) xác định nhóm OH tại C-20 chiếm vị trí β.

Nhóm OH tại C-17 được đề xuất có cấu hình β dựa trên kết quả công bố của tất cả

các pregnan đã được phân lập từ chi Gymnema đều có nhóm 17-OHβ. Đây cũng là

một đặc điểm về sinh tổng hợp các hợp chất pregnane từ chi này mà đã được các nhà

khoa học trên thế giới đều khẳng định [5, 8, 10]. Bằng các phân tích phổ trên, cấu

trúc của GS1 đã được làm sáng tỏ là (20S)-12β-tigloyloxy-3β,8β,14β,17β,20-

pentahydroxypregn-5-ene 3-O-β-D-thevetopyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranosyl-

57

(1→4)-β-D-cymaropyranoside. Đây là một hợp chất mới và được đặt tên là

gymsyloside A.

C

δC

a,b δH

a,c (độ bội, J = Hz)

δC

a,b δH

a,c (độ bội, J = Hz)

C

39,8 1,09 (m, α)/1,80 (m, β)

12,2 1,85 (s)

5

1

2

30,2 1,57 (m, β)/1,84 (m, α) Cym

79,2 3,50 (m)

97,2 4,84 (br d, 9,6)

1

3

2

4

39,8 2,20 (m, β)/2,33 (m, α)

36,6 1,52 (m)/2,05 (m)

78,5 3,82, m

140,0 -

3

5

83,8 3,24, m

120,0 5,32 (br s)

4

6

69,9 3,79, m

35,2 2,11 (m)

5

7

18,5 1,19 (d, 6,0)

74,9 -

6

8

44,7 1,49 (m)

3-OMe

58,5 3,42, s

9

38,0 -

Ole

10

26,0 1,63 (m, α)/2,00 (m, β)

102,6 4,57 (br d, 9,2)

1

11

75,1 4,68 (dd, 4,0, 11,6)

37,6 1,40 (m)/2,30 (m)

2

12

57,6 -

80,2 3,36 (m)

3

13

89,3 -

84,1 3,18 (m)

4

14

34,3 1,83 (m, β)/1,88 (m, α)

72,5 3,36 (m)

5

15

33,5 1,74 (m)

18,9 1,35 (d, 6,0)

6

16

89,1 -

3-OMe

57,6 3,39 (s)

17

11,2 1,53 (s)

Thv

18

18,5 1,13 (s)

104,3 4,41 (br d, 8,0)

1

19

71,5 3,45 (m)

75,6 3,18 (m)

2

20

18,9 1,05 (d, 6,4)

87,7 3,00 (t, 6,8)

3

21

Tig

76,6 3,00 (t, 6,8)

4

169,1 -

73,2 3,25 (m)

5

1

130,0 -

6

2

18,1 1,25, d (6,0)

139,5 6,98 (q, 7,2)

3-OMe

61,0 3,60 (s)

3

4

14,5 1,80 (d, 7,2)

a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS1

58

Hình 3.6. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS1

Hình 3.7. Phổ 1H NMR của hợp chất GS1

59

Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của hợp chất GS1

Hình 3.9. Phổ DEPT-135 của hợp chất GS1

60

Hình 3.10. Phổ HSQC của hợp chất GS1

Hình 3.11. Phổ HMBC của hợp chất GS1

61

Hình 3.12. Phổ COSY của hợp chất GS1

Hình 3.13. Phổ ROESY của hợp chất GS1

62

3.1.2.2. Hợp chất GS2: gymsyloside B

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS2

Công thức phân tử của hợp chất GS2 được xác định là C47H76O17 bởi sự xuất hiện píc

ion giả phân tử m/z 935,4996 [M + Na]+ trên phổ HR-ESI-MS (tính toán lý thuyết cho

công thức [C47H76O17Na]+, 935,4975). Phổ 1H NMR và 13C NMR của GS2 khá tương

tự như các phổ của hợp chất GS1 với sự có mặt của của một aglycone pregnane, một

đơn vị tigloyl và ba đơn vị đường. Tuy nhiên, khi so sánh trực tiếp các giá trị phổ

NMR của hai hợp chất này cho thấy chỉ có sự khác biệt của đơn vị đường, trong đó

đường D-thevetose của GS1 đã được thay thế bằng 6-deoxy-3-O-methyl-D-allose (δC

102,2, 73,6, 83,8, 75,0, 71,2, 18,5, 62,5). Tương tự hợp chất GS1, các giá trị hằng số

tương tác lớn của các proton anome (J = 8,0 – 9,6 Hz) cho thấy các đường đều đã tạo

liên kết β-glycoside. Thêm vào đó, kết quả thủy phân hợp chất GS2 trong môi trường

allose (xem mục 2.2.2.4). Trật tự liên kết của các đường này được xác định bằng phổ

axit thu được các đường đơn D-cymarose, D-oleandrose và 6-deoxy-3-O-methyl-D-

HSQC và HMBC. Tương tác HMBC giữa All H-1 (δH 4,70) và Ole C-4 (δC 84,0);

Ole H-1 (δH 4,56) và Cym C-4 (δC 83,8); và giữa Cym H-1 (δH 4,85) và aglycone C-

3 (δC 79,3) đã xác nhận các liên kết đường là 3-O-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-

allopyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside. Do đó,

cấu trúc hóa học của hợp chất GS2 được xác định là (20S)-12β-tigloyloxy-3β,8β,

14β,17β,20-pentahydroxypregn-5-ene 3-O-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-allopyranosyl-

(1→4)-β-D-oleandropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside, một hợp chất mới

được đặt tên là gymsyloside B.

63

Hình 3.15. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GS2

δC

a,c (độ bội, J=Hz)

a,b δH

a,b δH

# δC

δC 12,1 1,85 (s)

C 5

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS2 và hợp chất tham khảo

# δC 12,2 97,2 36,6 78,5 83,8 69,9 18,5 58,5

97,2 4,85 (br d, 9,6) 36,7 1,53 (m)/2,04 (m) 78,5 3,83 (m) 83,8 3,24 (m) 70,0 3,79 (m) 18,5 1,19 (d, 6,0) 58,5 3,42 (s)

1 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe 102,6 102,6 4,56 (br d, 6,8) 37,6 80,2 84,1 72,5 18,9 57,6 Thv 37,5 1,39 (m)/2,30 (m) 80,4 3,36 (m) 84,0 3,17 (m) 72,6 3,35 (m) 19,0 1,34 (d, 6,0) 57,5 3,39 (s) All

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tig 1 2 3 4

a,c (độ bội, J=Hz) 39,8 39,8 1,09 (m)/1,79 (m) 30,2 30,2 1,56 (m)/1,84 (m) Cym 79,2 79,3 3,50 (m) 39,8 39,8 2,20 (m)/2,33 (m) 140,0 140,0 - 120,0 120,0 5,32 (br s) 35,2 35,2 2,12 (m) 74,9 75,0 - 44,7 44,7 1,48 (m) 38,0 38,0 - 26,0 26,0 1,62 (m)/2,00 (m) 75,1 75,2 4,68 (m) 57,6 57,6 - 89,3 89,3 - 34,3 34,3 1,82 (m)/1,91 (m) 33,5 33,5 1,75 (m) 89,1 89,2 - 11,2 11,2 1,53 (s) 18,5 18,5 1,14 (s) 71,5 71,5 3,44 (m) 18,9 18,9 1,04 (d, 6,4) 169,1 169,2 - 130,0 130,1 - 139,5 139,6 6,98 (q, 7,2) 14,5 14,5 1,80 (d, 7,2)

δC

73,6 3,29 (m) 83,8 3,60 (m) 75,0 3,16 (m) 71,2 3,64 (m) 18,5 1,21 (d, 6,0) 62,5 3,58 (s) 104,3 102,2 4,70 (br d, 7,6) 75,6 87,7 76,6 73,2 18,1 61,0 1 2 3 4 5 6 3-OMe của gymsyloside A (GS1), a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz #

64

3.1.2.3. Hợp chất GS3: gymsyloside C

Hình 3.16. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS3

Phổ 1H và 13C NMR của GS3 gần tương tự như các phổ tương ứng của GS1

với sự có mặt của khung pregnane giống hợp chất GS1 có nối đôi C-5 (δC 140,0)/C-

6 (δC 119,9) và một nhóm tigloyl. Điểm khác biệt trên phổ NMR của hai hợp chất

này là sự xuất hiện thêm các tín hiệu của một đơn vị đường [δH (4,78)/δC (101,2), δH

(1,55), 2,10/δC (36,4), δH (3,82)/δC (78,6), δH (3,23)/δC (83,9), δH (3,79)/δC (69,9), δH

(1,21)/δC (18,6), δH (3,42)/δC (58,4). Các dữ liệu này hoàn toàn phù hợp cho một phân

tử đường Cym trong đó có liên kết glycoside tại C-4 [74] [75, 76]. Điểm khác biệt

này được chứng minh rõ ràng hơn bằng phổ khối lượng phân giải cao. Phổ HR-ESI-

MS của hợp chất GS3 cho píc ion giả phân tử tại m/z 1079,5769 [M + Na]+, tương

ứng với công thức phân tử C54H88O20, với độ bất bão hòa là 11. Kết quả phổ khối

lượng nêu trên so với hợp chất GS1 đã tăng thêm 144 đvC, tương ứng với sự tăng

thêm một đơn vị C7H12O3 - một đơn vị Cym nêu trên. Các giá trị hằng số tương tác

khá lớn (J =8,0-9,6 Hz) của các proton anome của các phân tử đường chứng tỏ sự tồn

tại của các liên kết β-glycoside giữa các phân tử đường. Ngoài ra, thủy phân hợp chất

GS3 trong môi trường axit thu được các đường đơn D-cymarose, D-oleandrose và D-

thevetose. Trật tự nối giữa các phân tử đường được xác định bằng phổ HSQC, H-H

COSY và HMBC. Các tương tác HMBC giữa Thv H-1 (δH 4,42) và Ole C-4 (δC 84,1);

Ole H-1 (δH 4,58) và Cym II C-4 (δC 83,9); giữa Cym II H-1 (δH 4,78) và Cym I C-4

(δC 83,8) và giữa Cym I H-1 (δH 4,84) và aglycone C-3 (δC 79,3) khẳng định chuỗi

bốn đường β-D-thevetopyranosyl-(14)-β-D-oleandropyranosyl-(14)-β-D-

cymaropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranoside gắn vào vị trí C-3 của aglycone. Do

đó cấu trúc của hợp chất GS3 được làm sáng tỏ là (20S)-12β-tigloyloxy-

3β,8β,14β,17β,20-pentahydroxypregn-5-ene 3-O-β-D-thevetopyranosyl-(14)-β-D-

65

oleandropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranoside,

một hợp chất mới được đặt tên là gymsyloside C.

Hình 3.17. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS3

a,c (độ bội, J=Hz)

a,c (độ bội, J=Hz)

# δC

a,b δH

# δC

a,b δH

δC 78,5 78,5 3,82 (m) 83,8 83,8 3,23 (m) 69,9 70,1 3,79 (m) 18,5 18,5 1,18 (d, 6,4) 58,5 58,5 3,42 (s)

101,2 4,78 (br d, 9,6) 36,4 1,55 (m)/2,10 (m) 78,6 3,82 (m) 83,9 3,23 (m) 69,9 3,79 (m) 18,6 1,21 (d, 6,0) 58,4 3,42 (s) 102,6 102,6 4,58 (br d, 8,4) 37,6 37,6 1,40 (m)/2,30 (m) 80,2 80,2 3,36 (m) 84,1 84,1 3,18 (m) 72,5 72,5 3,35 (m) 18,9 18,9 1,36 (d, 5,6) 57,6 57,5 3,41 (s)

δC 39,8 39,8 1,09 (m)/1,80 (m) 30,2 30,1 1,57 (m)/1,83 (m) 79,2 79,3 3,49 (m) 39,8 39,8 2,19 (m)/2,33 (m) 140,0 140,0 - 120,0 119,9 5,33 (br s) 35,2 35,2 2,12 (m) 74,9 75,0 - 44,7 44,7 1,49 (m) 38,0 38,0 - 26,0 25,9 1,62 (m)/2,00 (m) 75,1 75,2 4,70 (dd, 4,0, 9,6) 57,6 57,6 - 89,3 89,2 - 34,3 34,3 1,81 (m)/1,89 (m) 33,5 33,5 1,74 (m) 89,1 89,3 - 11,2 11,2 1,52 (s) 18,5 18,5 1,14 (s) 71,5 71,6 3,46 (m) 18,9 18,9 1,06 (d, 6,4) 169,1 169,1 - 130,0 130,1 - 139,5 139,6 7,00 (q, 6,8) 14,5 14,5 1,81 (d, 6,8) 12,2 12,1 1,87 (s)

C 3 4 5 6 3-OMe Cym II 1 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe Thv 1 2 3 4 5 6

104,3 104,3 4,42 (d, 8.0) 75,6 75,6 3,18 (m) 87,7 87,7 3,00 (m) 76,6 76,6 3,00 (m) 73,2 73,2 3,25 (m) 18,1 18,1 1,27 (d, 6,0)

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tig 1 2 3 4 5 Cym I 1 2

3-OMe 61,0 61,1 3,60 (s)

của gymsyloside A (GS1), a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHzz

97,2 97,2 4,84 (br d, 9,6) 36,6 36,6 1,55 (m)/2,05 (m) # δC

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS3 và chất tham khảo

66

3.1.2.4. Hợp chất GS4: gymsyloside D

Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS4

Hợp chất GS4 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công thức phân

tử của hợp chất GS4 được xác định chính xác là C54H88O20 bằng phổ HR-ESI-MS với píc ion giả phân tử tại m/z 1079,5778 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C54H88O20Na]+, 1079,5769), sai số Δ+0,8 ppm, với độ bất bão hòa là 11. Các dữ kiện phổ 1H và 13C NMR cho thấy cấu trúc hóa học của hợp chất GS4 tương tự hợp chất

GS3. So sánh một cách chi tiết các giá trị phổ NMR của 4 và 3 có sự kết hợp của phổ

HSQC và HMBC cho thấy chúng rất giống nhau ở phần aglycon và chuỗi ba phân tử

đường Ole→Cym→Cym và có khác biệt rõ ràng ở đơn vị đường thứ tư. Sự khác biệt

đó là là xuất hiện bộ tín hiệu của một đơn vị đường Allose [δH (4,70)/δC (102,2), δH

(3,29)/δC (73,5), δH (3,60)/δC (83,9), δH (3,16)/δC (75,0), δH (3,63)/δC (71,2), δH

(1,21)/δC (18,6), δH (3,58)/δC (62,5) của hợp chất 4 đã thay thế bộ tín hiệu của đường

Thevetose trong hợp chất 3. Như vậy hai hợp chất này phải có cùng công thức phân

tử (vì đường Thv và All có cùng công thức và khối lượng phân tử). Kết quả phổ khối

lượng HR-ESI-MS đã chứng minh điều nhận xét nêu ở trên.Thêm vào đó, kết quả

D-oleandrose và 6-deoxy-3-O-methyl-D-allose.

thủy phân hợp chất GS4 trong môi trường axit thu được các đường đơn D-cymarose,

Hình 3.19. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS4

67

a,c (độ bội, J=Hz)

a,b δH

# δC

a,c (độ bội,J=Hz)

# δC

a,b δH

39,8 1,07 (m)/1,79 (m) 30,2 1,57 (m)/1,83 (m) 79,3 3,50 (m) 39,8 2,18 (m)/2,33 (m)

δC 78,5 78,5 3,82 (m) 83,8 83,8 3,24 (m) 70,1 69,8 3,78 (m) 18,5 18,3 1,17 (d, 6,4) 58,5 58,4 3,41 (s)

101,2 101,2 4,77 (br d, 9,6) 36,4 36,4 1,54 (m)/2,04 (m) 78,6 78,4 3,82 (m) 83,9 83,8 3,24 (m) 69,9 69,9 3,78 (m) 18,6 18,6 1,19 (d, 5,6) 58,4 58,5 3,40 (s)

35,2 2,11 (m) 74,9 - 44,7 1,49 (m) 38,0 - 26,0 1,63 (m)/2,00 (m) 75,1 4,67 (m) 57,6 - 89,3 - 34,3 1,80 (m)/1,88 (m) 33,5 1,74 (m) 89,1 - 11,2 1,53 (s) 18,6 1,13 (s) 71,5 3,46 (m) 19,0 1,05 (d, 6,0)

C 3 4 5 6 3-OMe Cym II 1 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe

δC 39,8 30,1 79,3 39,8 140,0 140,0 - 119,9 120,0 5,32 (br s) 35,2 75,0 44,7 38,0 25,9 75,2 57,6 89,2 34,3 33,5 89,3 11,2 18,5 71,6 18,9

102,6 102,6 4,56 (br d, 9,2) 37,6 37,5 1,40 (m)/2,30 (m) 80,2 80,3 3,35 (m) 84,1 83,7 3,18 (m) 72,5 72,5 3,35 (m) 18,9 18,9 1,35 (d, 6,0) 57,5 57,4 3,39 (s) Thv All

104,3 102,2 4,70 (d, 8,0) 75,6 73,5 3,29 (m) 87,7 83,9 3,60 (m) 76,6 75,0 3,16 (m) 73,2 71,2 3,63 (m) 18,1 18,6 1,21 (d, 6,0) 61,1 62,5 3,58 (s)

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tig 1 2 3 4 5 Cym I 1 2

97,2 4,84 (br d, 9,6) 36,6 1,55 (m)/2,05 (m)

1 2 3 4 5 6 3-OMe

169,1 169,1 - 130,1 130,1 - 139,6 139,5 6,98 (q, 7,2) 14,6 1,81 (d, 7,2) 14,5 12,1 12,2 1,85 (s) 97,2 36,6 # δC

của gymsyloside C (GS3), a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS4 và chất tham khảo

Việc gán các dữ liệu phổ NMR của các proton và cacbon được xác định dựa trên các

phổ HSQC, 1H-1H COSY, và tham khảo với các giá trị tương ứng đã được công bố

D-allopyranosyl-(14)-β-D-oleandropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranosyl-

[7, 8, 76]. Thêm vào đó, chuỗi đường được xác định là 3-O-6-deoxy-3-O-methyl-β-

(14)-β-D-cymaropyranoside thông qua tương tác HMBC từ All H-1 (δH 4,70) đến

Ole C-4 (δC 83,7); từ Ole H-1 (δH 4,56) đến Cym II C-4 (δC 83,8); và từ Cym II H-1

(δH 4,77) đến Cym I C-4 (δC 83,8). Do đó, cấu trúc của hợp chất GS4 được làm rõ là

(20S)-12β-tigloyloxy-3β,8β,14β,17β,20-pentahydroxypregn-5-ene 3-O-6-deoxy-3-

O-methyl-β-D-allopyranosyl-(14)-β-D-oleandropyranosyl-(14)-β-D-

cymaropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranoside, đây cũng là một hợp chất mới và

được đặt tên là gymsyloside D.

68

3.1.2.5. Hợp chất GS5: gymsyloside E

Hình 3.20. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS5

Hợp chất GS5 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công thức phân

tử của hợp chất GS5 được xác định là C53H86O22 bởi có sự xuất hiện píc ion giả phân

tử tại m/z 1097,5530 [M + Na]+, tính toán lý thuyết cho công thức [C54H88O20Na]+

thu được kết quả là 1097,5503. Như vậy, sai số giữa thực tế và lý thuyết là Δ+2,4

ppm hoàn toàn phù hợp. Khối lượng phân tử này tăng thêm so với hợp chất GS1 là

162 đvc, hoàn toàn phù hợp với 1 đơn vị đường glucose (C6H10O5). Dự đoán này

được khẳng định rõ hơn bằng sự xuất hiện thêm các tín hiệu đặc trưng của đường D-

glucose trên phổ NMR của hợp chất GS5 [δH (4,41)/δC (104,3), δH (3,15)/δC (75,6), δH

(3,23)/δC (78,3), δH (3,20)/δC (71,8), δH (3,31)/δC (77,9), δH (3,62, 3,84))/δC (63,2)] so

với các dữ kiện phổ NMR của GS1 và kết quả thủy phân hợp chất GS5 trong môi

trường axit (thu được các đường đơn D-cymarose, D-oleandrose, D-thevetose và D-

glucose). Ngoài ra, phân tích chi tiết sự thay đổi các giá trị phổ NMR với sự hỗ trợ

của phổ H-H COSY và HSQC của GS5 so với GS1 còn phát hiện có sự dịch chuyển

về phía trường thấp hơn của tín hiệu cacbon C-4 Thv của hợp chất GS5 (δC-Thv C-4

76,6 của GS1/ δC-Thv C-4 83,9 của GS5) gợi ý sự xuất hiện thêm 1 đơn vị đường glucose

nối vào vị trí C-4 của đường thevetose. Điều này còn được khẳng định chính xác bằng

kết quả phân tích các tương tác trên phổ HMBC. Vị trí các nhóm thế và trật tự chuỗi

đường được gán thông qua phổ hai chiều HSQC, 1H-1H COSY và HMBC. Tương tác

HMBC giữa H-12 (δH 4,68) và Tig C-1 (δC 169,1) xác định nhóm tigloyl ở vị trí C-

12. Các tương tác HMBC giữa Glc H-1 (δH 4,41) và Thv C-4 (δC 82,9); Thv H-1 (δH

4,43) và Ole C-4 (δC 84,1); Ole H-1 (δH 4,57) và Cym C-4 (δC 83,8); Cym H-1 (δH

4,84) và aglycone C-3 (δH 79,3) khẳng định chuỗi đường là 3-O-β-D-glucopyranosyl-

69

(1→4)-β-D-thevetopyranosyl-(14)-β-D-oleandropyranosyl-(14)-β-D-

cymaropyranoside và gắn vào vị trí C-3 của aglycone.

# δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

# δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz) 39,8 1,08, (m) /1,80 (m) 30,2 1,58 (m)/1,84 (m) 79,3 3,50 (m) 39,8 2,20 (m)/2,33 (m)

δC 36,6 36,7 1,53 (m)/2,05 (m) 78,5 78,5 3,81 (m) 83,8 83,8 3,24 (m) 69,9 69,9 3,80 (m) 18,5 18,4 1,19 (d, 6,4) 58,5 58,5 3,42 (s)

102,6 102,6 4,57 (br d, 9,2) 37,6 37,6 1,40 (m)/2,30 (m) 80,2 80,3 3,35 (m) 84,1 84,1 3,18 (m) 72,5 72,6 3,38 (m) 18,9 18,8 1,36 (d, 6,0) 57,6 57,6 3,39 (s)

35,2 2,11 (m) 74,9 - 44,7 1,49 (m) 38,0 - 25,9 1,63 (m)/2,00 (m) 75,1 4,68 (m) 57,6 - 89,3 - 34,3 1,83 (m)/1,90 (m) 33,5 1,75 (m) 89,1 - 11,2 1,53 (s) 18,6 1,12 (s) 71,5 3,45 (m) 18,9 1,05 (d, 6,4)

δC 39,8 30,2 79,2 39,8 140,0 140,0 - 120,0 120,0 5,32 (br s) 35,2 74,9 44,7 38,0 26,0 75,1 57,6 89,3 34,3 33,5 89,1 11,2 18,5 71,5 18,9

104,3 104,2 4,43 (d, 7,6) 75,6 75,2 3,23 (m) 87,7 86,3 3,17 (m) 76,6 82,9 3,30 (m) 73,2 72,5 3,38 (m) 18,1 18,5 1,36 (d, 7,2) 61,0 61,2 3,60 (s)

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tig 1 2 3 4 5 Cym 1

97,2 4,84 (br d, 9,6)

C 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe Thv 1 2 3 4 5 6 3-OMe 1 2 3 4 5 6

Glc 104,3 4,41 (d, 7,6) 75,6 3,15 (m) 78,3 3,23 (m) 71,8 3,20 (m) 77,9 3,31 (m) 63,2 3,62 (m)/3,84 (m)

169,1 169,1 - 130,0 130,1 - 139,5 139,5 6,98 (q, 7,2) 14,5 1,80 (d, 7,2) 14,5 12,2 1,85 (s) 12,2 97,2 # δC

của gymsyloside A (GS1),a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS5 và chất tham khảo

Do đó, cấu trúc của hợp chất GS5 được kết luận là (20S)-12β-tigloyloxy-

3β,8β,14β,17β,20-pentahydroxypregn-5-ene 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-

thevetopyranosyl-(14)-β-D-oleandropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranoside, đây

là một hợp chất mới được đặt tên là gymsyloside E.

70

Hình 3.21. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS5

3.1.2.6. Hợp chất GS6: gymnepregoside R

Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS6

Hợp chất GS6 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng. So sánh

các dữ liệu phổ NMR của hợp chất GS6 và các dữ liệu tương ứng của hợp chất GS4

nhận thấy sự tương đồng với nhau. Các tín hiệu của khung pregn-5-ene dễ dàng nhận

ra bởi có sự xuất hiện 3 nhóm methyl singlet tại δH 1,05, 1,13, 1,52, một proton olefin

tại δH 5,32 và hai cacbon olefin tại δC 119,9 và 140,0. Một gốc tigloyl cũng được nhận

biết qua proton olefin của nối đôi tại δH 6,98 cùng với 2 cacbon olefin ở δC 130,0 và

139,5 và 1 cacbon cacbony ở δC 169,0. Khung aglycon của GS6 được xác định là

tương tự như GS4 bởi sự trùng khít của bộ số liệu NMR của hai hợp chất này. Ở

chuỗi đường có sự xuất hiện của 5 đơn vị đường được nhận biết thông qua bộ dữ liệu

của 5 cặp proton và cacbon anome: Cym I (δH (4,87)/δC (97,2)), Cym II (δH (4,77)/δC

(101,2)), Ole (δH (4,56)/δC (102,6)) và All (δH (4,69)/δC (102,2)), Glc (δH (4,33)/δC

106,2).

71

a,c (độ bội,J=Hz)

# δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

# δC

a,b δH δC 18,3 18,5 1,17 (d, 6,4) 58,4 58,4 3,40 (s)

101,2 101,2 4,77 (br d, 9,6) 36,4 36,4 1,54 (m)/2,05 (m) 78,4 78,4 3,82 (m) 83,8 83,8 3,24 (m) 69,9 69,9 3,79 (m) 18,6 18,5 1,20 (d, 6,0) 58,5 58,5 3,40 (s)

102,6 102,6 4,56 (br d, 10,8) 37,5 37,6 1,40 (m)/2,30 (m) 80,3 80,4 3,35 (m) 83,7 83,9 3,17 (m) 72,5 72,5 3,34 (m) 18,9 18,9 1,34 (d, 6,0) 57,4 57,5 3,39 (s)

102,2 102,1 4,69 (d, 8,0) 73,5 72,9 3,30 (m) 83,9 83,2 3,93 (m) 75,0 83,9 3,30 (m) 71,2 70,2 3,79 (m) 18,6 18,1 1,28 (d, 6,0) 62,5 62,0 3,58 (s)

δC 39,8 39,8 1,09 (m)/1,78 (m) 30,2 30,2 1,57 (m)/1,83 (m) 79,3 79,3 3,50 (m) 39,8 39,8 2,20 (m)/2,33 (m) 140,0 140,0 - 120,0 119,9 5,32 (br s) 35,2 35,2 2,10 (m) 74,9 74,9 - 44,7 44,7 1,49 (m) 38,0 38,0 - 26,0 26,0 1,62 (m)/1,98 (m) 75,1 75,1 4,68 (m) 57,6 57,6 - 89,3 89,3 - 34,3 34,3 1,83 (m)/1,90 (m) 33,5 33,5 1,76 (m) 89,1 89,1 - 11,2 11,2 1,52 (s) 18,6 18,6 1,13 (s) 71,5 71,5 3,45 (m) 19,0 19,0 1,05 (d, 5,6) 169,1 169,0 - 130,1 130,0 - 139,5 139,5 6,98 (q, 7,2) 14,6 14,5 1,80 (d, 7,2) 12,2 12,1 1,85 (s)

C 6 3-OMe Cym II 1 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe All 1 2 3 4 5 6 3-OMe Glc 1 2 3 4 5

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tig 1 2 3 4 5 Cym I 1 2 3 4 5

97,2 97,2 4,84 (br d, 9,6) 36,6 36,6 1,54 (m)/2,05 (m) 78,5 78,5 3,82 (m) 83,8 83,8 3,24 (m) 69,8 69,8 3,79 (m)

106,2 4,33 (d, 7,2) 75,4 3,16 (m) 78,0 3,26 (m) 71,8 3,22 (m) 77,9 3,32 (m) 63,1 3,63 (dd, 6,0 11,8)

6

3,89 (d, 11,8)

δC

# của hợp chất GS4,

a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS6 và chất tham khảo

So với hợp chất GS4 thì thấy rằng hợp chất GS6 có thêm một đơn vị đường glucose

(δC 106,2, 75,4, 78,0, 71,8, 77,9 (5 x CH) và 63,1 (CH2). Điều này được xác nhận

thêm thông qua kết quả đo phổ khối lượng phân giải cao. Trên phổ HR-ESI-MS xuất

hiện píc ion giả phân tử tại m/z 1241,6309 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết cho công

72 thức [C60H98O25Na]+ là 1241,6289), tương ứng với công thức phân tử của GS6 là

C60H98O25. Khối lượng phân tử này lớn hơn so với hợp chất GS4 là 162 đvc

(C6H10O5), phù hợp hoàn toàn với giả thiết một đơn vị đường glucose. Ngoài ra, thủy

phân hợp chất GS6 trong môi trường axit thu được các đường đơn D-cymarose, D-

oleandrose và 6-deoxy-3-O-methyl-D-allose và D-glucose.

Trật tự các đường được xác định thông qua phổ HSQC, H-H COSY và HMBC tương

tự các hợp chất GS1-GS5. Các tương tác HMBC giữa Glc H-1 (δH 4,33) và All C-4

(δC 83,9); All H-1 (δH 4,69) và Ole C-4 (δC 83,9); Ole H-1 (δH 4,56) và Cym II C-4

(δC 83,8); Cym II H-1 (δH 4,77) và Cym I C-4 (δC 83,8) khẳng định chuỗi đường là

D-oleandropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranoside.

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-allopyranosyl-(14)-β-

Do đó, cấu trúc của hợp chất GS6 được làm rõ là 12β-tigloyloxy-3β,8β,14β,17β,20S-

D-allopyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-

pentahydroxypregn-5-ene 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-6-deoxy-3-O-methyl-β-

(1→4)-β-D-cymaropyranoside - một hợp chất mới được đặt tên là gymnepregoside

R.

Hình 3.23. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS6

73

3.1.2.7. Hợp chất GS7: gymnepregoside T

Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS7

Hợp chất GS7 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công thức phân

tử của hợp chất GS7 được xác định là C51H82O20 dựa theo píc ion giả phân tử tại m/z

1037,5299 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C51H82O20Na]+là

1037,5292). Phổ 1H NMR của hợp chất GS7 cho thấy sự xuất hiện của 3 nhóm methyl

singlet tại 1,12, 1,47, và 2,20 , 1 proton olefin tại δH 5,32 (1H, br s) và 5 proton anome

tại [δH 4,83 (br d, J = 9,6 Hz), 4,77 (br d, J = 9,6 Hz), 4,57 (br d, J = 8,4 Hz), 4,69 (br

d, J = 8,0 Hz) gợi ý cấu trúc GS7 là 1 pregnane pentasaccarit. Tuy nhiên khác với các

hợp chất trước đó, GS7 không còn tín hiệu của nhóm tigloyl cũng như benzoyl, lại

xuất hiện thêm 2 nhóm methyl singlet tại δH 1,90 và 2,20 cùng với 2 cacbon cacbonyl

tại δC 171,8 và 212,2 và gợi ý về sự có mặt của hai gốc acetyl. Ngoài ra, việc mất đi

tín hiệu methyl doublet như các pregnane trước đó tại δH 1,02-1,05 cho phép dự đoán

nhóm hydroxy ở C-21 đã bị oxy hóa thành xeton, sinh ra 1 gốc acetyl ở đây. Mặt

khác, 4 proton anome tại [δH 4,83 (br d, J = 9,6 Hz), 4,77 (br d, J = 9,6 Hz), 4,56 (br

d, J = 8,4 Hz), 4,70 (br d, J = 8,0 Hz), cùng với 4 nhóm methoxy [δH 3,39, 3,41×2,

3,58] và 4 nhóm methyl bậc 2 tại δH 1,16 (d, J = 6,0 Hz), 1,19 (d, J = 6,0 Hz), 1,21

(d, J = 6,0 Hz), 1,35 (d, J = 6,4 Hz) xác nhận sự tồn tại của 4 đơn vị đường deoxy.

Các dữ diện phổ 13C NMR và DEPT của GS7 cho thấy sự phù hợp với cấu trúc của

1 khung pregnane (δC 39,8, 30,1, 79,2, 39,8, 140,2, 119,7, 35,1, 74,9, 45,1, 38,1, 25,2,

74,9, 57,4, 89,9, 34,2, 33,1, 93,1, 10,2, 18,6, 212,2 và 27,7 ), 1 nhóm acetyl (2 cacbon)

và 4 đơn vị đường deoxy (28 carbon) [77]. Vị trí của các nhóm thế cũng như trật tự

sắp xếp các đường cũng được nhận định thông qua phổ HMBC. Vị trí của nhóm acetyl

74

Ở vị trí C-12 được xác định thông qua tương tác HMBC từ H-12 (δH 4,46) đến Ac C-

1 (δC 171,8). Vị trí nhóm acetyl ở C-17 được xác định thông qua tương tác HMBC từ

H-20 (δH 2,20) đến C-17 (δC 93,1)/C-20 (δC 212,2). Các tương tác HMBC giữa All

H-1 (δH 4,70) và Ole C-4 (δC 84,0); Ole H-1 (δH 4,56) và Cym II C-4 (δC 83,8); Cym

II H-1 (δH 4,77) và Cym I C-4 (δC 83,8) và Cym H-1 (δH 4,83) với C-3 (δC 79,3) xác

định chuỗi đường 3-O-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-allopyranosyl-(14)-β-D-

oleandropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranoside

gắn vào vị trí C-3 của aglycone. Kết hợp các luận điểm trên, cấu trúc của hợp chất

GS7 được làm rõ là 12β-acetyloxy-3β,8β,14β,17β-tetrahydroxypregn-5-en-20-one 3-

D-cymaropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranoside, một hợp chất mới được đặt tên là

O-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-allopyranosyl-(14)-β-D-oleandropyranosyl-(14)-β-

gymnepregoside T.

a,c (độ bội, J=Hz)

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

a,b δH

δC 83,8 3,22 (m) 69,8 3,78 (m) 18,3 1,16 (d, 6,0) 58,5 3,41 (s)

101,2 4,77 (br d, 9,6) 36,4 1,54 (m)/2,10 (m) 78,5 3,82 (m) 83,8 3,22 (m) 70,0 3,78 (m) 18,5 1,19 (d, 6,0) 58,5 3,41 (s)

102,6 4,56 (br d, 8,4) 37,5 1,39 (m)/2,29 (m) 80,4 3,36 (m) 84,0 3,18 (m) 72,6 3,35 (m) 19,0 1,35 (d, 6,4) 58,4 3,39 (s)

δC 39,8 1,08 (m)/1,78 (m) 30,1 1,56 (m)/1,83 (m) 79,2 3,50 (m) 39,8 2,20 (m)/2,33 (m) 140,2 - 119,7 5,32 (br s) 35,1 2,10 (m) 74,9 - 45,1 1,47 (m) 38,1 - 25,2 1,68 (m)/1,84 (m) 74,4 4,46 (dd, 3,2, 10,8) 57,4 - 89,8 - 34,2 1,85 (m)/1,95 (m) 33,1 1,69 (m)/2,81 (m) 93,1 - 10,2 1,47 (s) 18,6 1,12 (s) 212,2 - 27,7 2,20 (s) 171,8 - 20,8 1,90 (s)

97,2 4,83 (br d, 9,6) 36,6 1,54 (m)/2,10 (m) 78,5 3,82 (m)

C 4 5 6 3-OMe Cym II 1 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe All 1 2 3 4 5 6 3-OMe

102,2 4,70 (d, 8,0) 73,6 3,29 (m) 83,8 3,60 (m) 75,0 3,16 (m) 71,2 3,63 (m) 18,5 1,21 (d, 6,0) 62,5 3,58 (s)

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 12-OAc 1 2 Cym I 1 2 3

Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS7

75 a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

Hình 3.25. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS7

3.1.2.8. Hợp chất GS8: vetircilloside M

Hình 3.26. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS8

Hợp chất GS8 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công thức phân tử

của hợp chất GS8 được xác định là C62H96O25 dựa theo píc ion tại m/z 1263,6148 [M

+ Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C62H96O25Na]+ là 1263,6133). Tương tự

như hợp chất GS6, phổ 1H và 13C NMR của hợp chất GS8 cho thấy sự tồn tại của

khung pregnane và 5 đơn vị đường Cym I (δH (4,83)/δC (97,2)), Cym II (δH (4,77)/δC

(101,2)), Ole (δH (4,56)/δC (102,6)) All (δH (4,69)/δC (102,1)) và Glc ((δH (4,33)/δC

(106,2)). Tuy nhiên tín hiệu nhóm tigloyl của GS6 đã không còn trên phổ NMR của

GS8 mà thay vào đó là sự xuất hiện của vòng thơm rất đặc trưng tại δC 131,8 (C),

130,9 x 2CH, 129,5 x 2CH và 134,2 (C) và δH 7,46-8,12 (5H). Các tín hiệu nêu trên

cùng với sự có mặt của một cacbon cacbonyl (δC 167,8) gợi ý sự tồn tại của một gốc

76

benzoyl. Dự đoán này được khẳng định thêm thông qua các tương tác trên phổ

HMBC.

a,c (độ bội, J=Hz)

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

a,b δH

δC 18,5 1,17 (d, 6,4) 58,4 3,40 (s)

101,2 4,77 (br d, 9,6) 36,4 1,54 (m)/2,07 (m) 78,4 3,82 (m) 83,8 3,22 (m) 69,9 3,80 (m) 18,6 1,20 (d, 6,0) 58,4 3,41 (s)

102,6 4,56 (br d, 7,2) 37,6 1,40 (m)/2,30 (m) 80,5 3,34 (m) 83,9 3,17 (m) 72,5 3,34 (m) 18,9 1,35 (d, 6,0) 57,7 3,40 (s)

δC 39,8 1,11 (m)/1,82 (m) 30,2 1,58 (m)/1,84 (m) 79,3 3,51 (m) 39,8 2,20 (m)/2,33 (m) 140,0 - 120,0 5,33 (br s) 35,2 2,14 (m) 74,9 - 44,8 1,56 (m) 38,0 - 26,0 1,77 (m)/2,10 (m) 75,9 4,68 (m) 57,7 - 89,3 - 34,4 1,84 (m)/1,96 (m) 33,5 1,78 (m) 89,1 - 11,3 1,52 (s) 18,5 1,13 (s) 71,6 3,54 (m) 19,0 1,02 (d, 6,0)

167,8 - 131,8 - 130,9 8,12 (d, 7,6) 129,5 7,46 (t, 7,6) 134,2 7,58 (t, 7,6)

102,1 4,69 (d, 8,0) 72,9 3,30 (m) 83,2 3,93 (m) 83,9 3,32 (m) 70,1 3,80 (m) 18,2 1,28 (d, 6,4) 61,9 3,57 (s)

C 6 3-OMe Cym II 1 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe All 1 2 3 4 5 6 3-OMe Glc 1 2 3 4 5 6

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Bz 1 2 3,5 4,6 5 Cym I 1 2 3 4 5

97,2 4,84 (br d, 9,6) 36,6 1,54 (m)/2,05 (m) 78,5 3,82 (m) 83,8 3,24 (m) 69,8 3,79 (m)

106,2 4,33 (d, 7,2) 75,5 3,16 (m) 78,0 3,20 (m) 71,8 3,22 (m) 77,8 3,31 (m) 63,0 3,63 (dd, 6,0, 11,8) 3,89 (d, 11,8)

a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS8

Các tương tác HMBC giữa bezoyl H-2/H-6 (δH 8,12) và C-1 (δC 131,8)/C-4

(δC 134,2)/C-7 (δC 167,8); giữa H-12 (δH 4,68) và bezoyl C-7 (δC 167,8) đề xuất nhóm

benzoyl gắn vào vị trí C-12 của khung pregnane. Chuỗi đường được khẳng định là

1H, 13C NMR cũng như các tương tác trên phổ HMBC và COSY. Từ đó, cấu trúc của

giống với hợp chất gymnepregoside R (GS6) thông qua việc so sánh các dữ liệu phổ

77

hợp chất GS8 được khẳng định là vetircilloside M, một hợp chất được phân lập trước

đó từ loài Asclepias verticillata [78].

Hình 3.27. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS8

3.1.2.9. Hợp chất GS9: verticilloside D

Hình 3.28. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS9

Phổ 1H NMR của GS9 cho thấy sự xuất hiện của 3 nhóm methyl singlet tại δH

1,12, 1,47, 2,22, 1 proton olefin tại δH 5,32 (1H, br s) và 5 proton anome tại [δH 4,83

(br d, J = 9,6 Hz), 4,77 (br d, J = 9,6 Hz), 4,57 (br d, J = 8,4 Hz), 4,69 (br d, J = 8,0 Hz) gợi ý cấu trúc GS9 là 1 pregnane pentasaccarit. Đối chiếu các dữ kiện phổ 1H, 13C NMR cho thấy cấu trúc GS9 tương tự như hợp chất GS7 ngoại trừ việc xuất hiện

thêm 1 đơn vị đường được dự đoán là D-glucopyranose dựa vào nhóm tín hiệu δC

107,0, 75,8, 78,8, 72,2, 78,7 và 63,3 và proton anome tại δH 4,33 (d, J = 8,0 Hz). Thêm

vào đó, chuỗi đường được cho là tương tự như hợp chất GS6 và GS8 bởi các tương

78

tác HMBC giữa Glc H-1 (δH 4,33) và All C-4 (δC 83,9); All H-1 (δH 4,69) và Ole C-

4 (δC 83,9); Ole H-1 (δH 4,57) và Cym II C-4 (δC 83,8); Cym II H-1 (δH 4,77) và Cym

I C-4 (δC 83,8). Kết hợp các luận điểm trên, cấu trúc của hợp chất GS9 được làm rõ

là 12β-acetyloxy-3β,8β,14β,17β-tetrahydroxypregn-5-en-20-one 3-O-β-D-

glucopyranosyl-(1→4)-3-O-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-allopyranosyl-(14)-β-D-

oleandropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranoside, hay

còn gọi là verticilloside D, một hợp chất được phân lập năm 2012 từ loài Asclepias

verticillata bởi Juan J. Araya và cộng sự [78].

a,c (độ bội, J=Hz)

# δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

δC

# δC

a,b δH 100,8 101,2 4,77 (d, 10,0) 37,3 36,4 1,52 (m)/2,04 (m) 78,0 78,4 3,81 (m) 83,5 83,8 3,24 (m) 69,2 69,9 3,80 (m) 18,9 18,5 1,20 (d, 6,4) 59,2 58,5 3,40 (s)

102,2 102,6 4,57 (d, 8,8) 38,0 37,5 1,39 (m)/2,30 (m) 79,6 80,4 3,35 (m) 83,3 83,9 3,17 (m) 72,3 72,5 3,35 (m) 19,2 19,0 1,34 (d, 6,0) 57,8 57,5 3,39 (s)

δC 39,3 39,8 1,08 (m)/1,78 (m) 30,2 30,2 1,57 (m)/1,83 (m) 78,0 79,2 3,50 (m) 39,6 39,8 2,20 (m)/2,33 (m) 139,6 140,2 - 119,5 119,7 5,32 (br s) 35,0 35,2 2,11 (m) 74,6 74,9 - 44,8 45,1 1,47 (m) 37,7 38,1 - 25,2 25,2 1,68 (m)/1,83 (m) 73,9 74,4 4,45 (m) 58,2 58,4 - 89,8 89,9 - 34,1 34,1 1,84 (m)/1,97 (m) 33,2 33,1 1,69 (m) 92,8 93,0 - 10,8 10,2 1,47 (s) 18,5 18,5 1,12 (s) 210,6 212,2 - 28,0 27,7 2,22 (s)

170,3 171,8 - 21,1 20,8 1,90 (s)

102,3 102,2 4,69 (d, 8,0) 73,0 72,9 3,29 (m) 83,5 83,2 3,93 (m) 83,6 83,9 3,31 (m) 69,9 70,2 3,80 (m) 18,2 18,1 1,28 (d, 6,0) 62,1 62,0 3,58 (s)

107,0 106,2 4,33 (d, 8,0) 75,8 75,4 3,16 (m) 78,8 78,0 3,24 (m) 72,2 71,8 3,23 (m) 78,7 77,8 3,30 (m) 63,3 63,1 3,63 (m)/3,88 (m)

96,7 97,2 4,83 (*) 37,6 36,6 1,52 (m)/2,04 (m) 78,4 78,5 3,81 (m) 83,7 83,8 3,24 (m) 69,4 69,8 3,80 (m) 18,8 18,6 1,16 (d, 6,4) 59,3 58,5 3,40 (s)

C Cym II 1 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe All 1 2 3 4 5 6 3-OMe Glc 1 2 3 4 5 6

# của verticilloside D [78] đo trong pyrydine-d5, a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ac 1 2 Cym I 1 2 3 4 5 6 3-OMe δC

Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS9 và hợp chất tham khảo

79

3.1.2.10. Hợp chất GS10: gymnepregoside F

Hình 3.29. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS10

Hợp chất GS10 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ HR-ESI-

MS của GS10 cho pic ion giả phân tử tại m/z 997,5318 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết

cho công thức [C49H82O19Na]+ là 997,5343), tương ứng với công thức phân tử

C49H82O19. Phổ 1H NMR của GS10 cho tín hiệu của 1 proton olefin tại δH 5,31 (br s),

một nhóm methyl bậc 2 tại δH 1,14 (d, J = 7,0 Hz), cùng với 2 nhóm methyl bậc 4 tại

δH 1,16 và 1,31 thuộc về 1 khung pregnane. Ngoài ra 4 proton anome tại δH 4,56 (br

d, J = 10,0 Hz), 4,70 (d, J = 8,4 Hz), 4,77 (br d, J = 8,8 Hz), 4,83 (tín hiệu bị chồng

lấp), cho thấy sự xuất hiện của 4 đơn vị đường. Phổ 13C NMR và DEPT của GS10 cho

tín hiệu của 49 cacbon, trong đó có 6 cacbon không liên kết với hydro, 20 nhóm methine,

10 nhóm methylene, và 11 cacbon methyl. Nhóm dữ liệu 13C NMR của 4 đường (δC

97,2, 36,6, 78,4, 83,8, 69,9, 18,6, và 58,6; 101,2, 36,4, 78,5, 83,8, 69,8, 18,7 và 58,6;

102,6, 37,5, 80,3, 83,7, 72,5, 18,9, và 57,4; và 102,2, 73,5, 83,7, 75,0, 71,2, 18,7, và 62,5)

cùng với các proton anome (δH 4,56 (br d, J = 10,0 Hz), 4,70 (d, J = 8,4 Hz), 4,77 (br d,

J = 8,8 Hz), 4,83( br d, J = 9,6 Hz)xác nhận sự tồn tại của đường β-D-cymaropyranosyl,

β-D-oleadropyranosyl và β-D-allomethylpyranosyl. Các tương tác HMBC giữa All H-1

(δH 4,70) và Ole C-4 (δC 83,7); Ole H-1 (δH 4,56) và Cym C-4 (δC 83,8); Cym II H-1 (δH

4,77) và Cym C-4 (δC 83,8) cho thấy chuỗi đường là 3-O-6-deoxy-3-O-methyl-(1→4)-

β-D-oleadropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl.

Thêm vào đó, chuỗi đường được gắn vào C-3 của thông qua tương tác HMBC giữa

80

Cym I H-1 (δH 4,83) và C-3 (δC 79,3). Cuối cùng, cấu trúc hóa học của hợp chất GS10

được khẳng định là gymnepregoside F, một hợp chất đã được phân lập trước đó từ

loài G. alternifolium[6].

C

δC

# δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

δC

# δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

C

38,6 39,8 1,07 (m)/1,86 (m)

18,7 18,6 1,16 (d, 6,0)

6

1

29,8 30,2 1,59 (m)/1,85 (m)

3-OMe

59,0 58,6 3,41 (s)

2

78,0 79,3 3,49 (m)

Cym II

3

39,3 39,8 2,20 (m)/2,33 (m)

100,5 101,2 4,77 (br d, 8,8)

1

4

139,2 140,1 -

37,2 36,4 1,56 (m)/2,09 (m)

2

5

119,8 119,9 5,31 (br s)

78,0 78,5 3,82 (m)

3

6

34,8 35,4 2,08 (m)

83,5 83,8 3,18 (m)

4

7

74,3 74,7 -

69,1 69,8 3,79 (m)

5

8

44,7 45,1 1,40 (m)

18,8 18,7 1,20 (d, 6,0)

6

9

3-OMe

59,1 58,6 3,41 (s)

37,6 38,0 -

10

29,3 29,1 1,59 (m)/2,00 (m)

Ole

11

73,4 73,7 3,94 (d, 7,0)

102,0 102,6 4,56 (br d, 10,0)

1

12

58,8 59,0 -

37,7 37,5 1,40 (m)/2,30 (m)

2

13

89,1 89,1 -

79,4 80,3 3,36 (m)

3

14

32,4 34,2 1,81 (m)

83,0 83,7 3,23 (m)

4

15

34,4 34,5 1,79 (m)/2,08 (m)

72,2 72,5 3,35 (m)

5

16

89,0 89,5 -

18,8 18,9 1,35 (d, 6,4)

6

17

11,7 10,7 1,31 (s)

3-OMe

57,4 57,4 3,39 (s)

18

18,0 18,6 1,16 (s)

All

19

71,1 71,4 3,56 (m)

102,1 102,2 4,70 (d, 8,4)

1

20

19,1 17,0 1,14 (d, 7,0)

73,3 73,5 3,30 (m)

2

21

Cym I

84,1 83,7 3,60 (m)

3

96,5 97,2 4,83 (br d, 9,6)

74,7 75,0 3,15 (m)

4

1

37,4 36,6 1,56 (m)/2,09 (m)

71,0 71,2 3,63 (m)

5

2

78,2 78,4 3,82 (m)

18,6 18,7 1,21 (d, 6,0)

6

3

83,2 83,8 3,18 (m)

3-OMe

62,3 62,5 3,58 (s)

4

69,2 69,9 3,79 (m)

a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

5 # của gymnepregoside F [6] trong pyridin-d5,

δC

Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS10 và hợp chất tham khảo

81

3.1.2.11. Hợp chất GS11: 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside F

Hình 3.30. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS11

Hợp chất GS11 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ NMR

của GS11 tương tự như hợp chất gymnepregoside F (GS10), nhưng có sự khác biệt

dễ dàng nhận thấy ở phần aglycon, đó là sự xuất hiện thêm các tín hiệu của một nhóm

cacbonyl (δC 168,4), một nối đôi có cấu hình trans (δC 6,62 (d, J = 16,0 Hz) và 7,76

(d, J = 16,0 Hz) và một vòng benzene (129,4 x 2, 129,9 x 2 và 131,5). Các tín hiệu

này hoàn toàn phù hợp với một nhóm cinamoyl. Điều này được khẳng định lại bằng

phổ HR-ESI-MS. Công thức phân tử của GS11 là C58H88O20 dựa theo píc ion giả phân tử tại m/z 1127,5766 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C58H88O20Na]+ là

1127,5761). Công thức phân tử của GS11 (C58H88O20) khi so sánh với hợp chất GS10

(C49H82O19) được dự đoán là thêm một gốc cinamoyl (C9H6O). Nhóm cinamoyl này cũng được thấy rõ trên phổ 1H và 13C NMR của hợp chất GS11: C-1 (δC 168,4), H/C-

2[ (δH 6,62 (d, J = 16,0 Hz), δC 119,2], H/C-3[ (δH 7,76 (d, J = 16,0 Hz), δC 146,8],

C-4 (δC 135,8), H/C-5 (9) [ (δH 7,60 (d, J = 7,6 Hz), δC 129,4], H/C-6 (8) [ (δH 7,38

(m), δC 129,9], và H/C-7 [ (δH 7,38 (m), δC 131,5]. Mặt khác, vị trí của nhóm cinamoyl

ở vị trí C-12 được gắn dựa vào tương tác HMBC giữa H-12 (δH 3,94) và Cin C-1 (δC 168,4). Thêm vào đó, so sánh các dữ kiện phổ 1H và 13C NMR của GS11 và hợp chất

82

12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside F [6] thấy khá tương đồng về các vị trí. Kết hợp

các dữ kiện phổ NMR và so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc hóa học của hợp

chất GS11 được khẳng định là 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside F, một hợp chất

được phân lập trước đó từ loài G. alternifolium[6].

C

δC

#

δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

C

δC

#

δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

39,8 1,10 (m)/1,82 (m) 30,2 1,58 (m)/1,84 (m) 79,3 3,50 (m) 39,8 2,20 (m)/2,34 (m)

1 2 3 4 5 6

97,2 4,84 (br d, 9,6) 36,4 1,54 (m)/2,07 (m) 78,5 3,82 (m) 83,8 3,18 (m) 69,8 3,80 (m) 18,6 1,15 (d, 6,8) 58,5 3,41 (s)

96,4 37,2 78,0 83,1 69,0 18,5 3-OMe 58,8 Cym II 1 2 3 4 5 6

100,4 101,2 4,77 (br d, 8,8) 36,9 77,7 83,8 68,6 18,5 3-OMe 58,8

36,6 1,54 (m)/2,07 (m) 78,6 3,82 (m) 83,8 3,18 (m) 70,0 3,80 (m) 18,5 1,19 (d, 6,0) 58,4 3,41 (s)

35,2 2,13 (m) 75,0 - 44,8 1,53 (m) 38,0 - 26,0 1,72 (m)/2,05 (m) 75,5 4,75 (m) 57,5 - 89,3 - 33,6 1,78 (m) 34,3 1,83 (m)/1,91 (m) 89,1 - 11,2 1,57 (s) 18,6 1,14 (s) 71,7 3,53 (m) 18,8 1,07 (d, 6,8)

38,8 29,8 77,7 39,2 139,1 140,0 - 119,6 119,9 5,33 (br s) 35,0 74,1 44,1 37,2 25,6 74,8 56,9 88,8 32,8 34,2 88,6 11,6 18,1 70,9 19,2

37,5 1,39 (m)/2,30 (m) 80,4 3,36 (m) 83,7 3,23 (m) 72,5 3,34 (m) 19,0 1,35 (d, 6,0)

101,8 102,6 4,56 (br d, 10,0) 37,4 79,7 82,8 72,0 18,8

167,0 168,4 - 119,6 119,2 6,62 (d, 16,0) 145,3 146,8 7,76 (d, 16,0) 135,1 135,8 - 128,6 129,4 7,60 (d, 7,6) 129,2 129,9 7,38 (m) 130,6 131,5 7,38 (m)

Ole 1 2 3 4 5 6 All 1 2 3 4 5 6

101,9 102,2 4,70 (d, 8,0) 73,2 83,9 74,5 70,9 18,4 3-OMe 62,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Cin 1 2 3 4 5, 9 6, 8 7 Cym I δC # của 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside F [6] đo trong pyridine,

73,5 3,28 (m) 83,9 3,60 (m) 75,0 3,15 (m) 71,2 3,63 (m) 18,2 1,22 (d, 6,0) 62,5 3,58 (s) a đo trong methanol-d4, b100

MHz, c400 MHz

Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS11 và hợp chất tham khảo

83

3.1.2.12. Hợp chất GS12: stephanoside I

Hình 3.31. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS12

Hợp chất GS12 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H và 13C

NMR của GS12 xuất hiện tín hiệu của bộ khung pregnane, một nhóm cinamoyl và

bốn đơn vị đường. Dữ liệu phổ 13C NMR của hợp phần đường (δC 97,2, 36,6, 78,5,

83,8, 69,9, 18,6 và 58,5; 101,2, 36,4, 78,6, 83,8, 70,0, 18,5, và 58,4; 102,6, 37,6, 80,2,

84,1, 72,5, 18,9 và 57,6; 104,3, 75,6, 87,7, 76,7, 73,2, 18,1, và 61,1) cùng với các tín

hiệu của 4 proton anome trên phổ 1H NMR (δH 4,41 (br d, J = 8,8 Hz), 4,57 (d, J =

10,0 Hz), 4,77 (br d, J = 8,8 Hz), 4,84 (br d, 9,6) cho thấy cấu trúc của hợp chất GS12

giống với hợp chất stephanoside I [79].

Các tương tác HMBC giữa Thv H-1 (δH 4,41) và Ole C-4 (δC 84,1); Ole H-1

(δH 4,57) và Cym C-4 (δC 83,8); Cym H-1′′ (δH 4.77) và Cym C-4′ (δC 83,8); và giữa

Cym H-1 và C-3 (δC 79,3) chứng minh thứ tự chuỗi đường là β-D-thevetopyranosyl-

(1→4)-β-D-oleadropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D

cymaropyranosyl và gắn vào vị trí C-3 của aglycone pregnane. Vì vậy, hợp chất GS12

chính là stephanoside I [79], một hợp chất đã được phân lập trước đó từ loài G.

alternifolium [7].

84

a,c (độ bội, J=Hz)

# δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

a,b δH

δC 36,6 1,53 (m)/2,06 (m) 78,5 3,82 (m) 83,8 3,20 (m) 69,9 3,78 (m) 18,6 1,19 (d, 6,4) 58,5 3,41 (s)

101,2 4,77 (br d, 8,8) 36,4 1,53 (m)/2,06 (m) 78,6 3,82 (m) 83,8 3,20 (m) 70,0 3,78 (m) 18,5 1,20 (d, 6,0) 58,4 3,41 (s)

102,6 4,57 (br d, 10,0) 37,6 1,40 (m)/2,30 (m) 80,2 3,36 (m) 84,1 3,62 (m) 72,5 3,36 (m) 18,9 1,35 (d, 6,0) 57,6 3,40 (s)

δC 39,0 39,8 1,11 (m)/1,82 (m) 30,0 30,2 1,58 (m)/1,84 (m) 77,8 79,3 3,50 (m) 39,4 39,8 2,19 (m)/2,35 (m) 139,2 140,1 - 119,7 119,9 5,33 (br s) 35,2 35,2 2,14 (m) 74,3 74,9 - 44,2 44,9 1,54 (m) 37,4 38,0 - 25,7 26,0 1,72 (m)/2,05 (m) 74,9 75,5 4,74 (m) 57,0 58,4 - 89,0 89,3 - 33,0 33,6 1,77 (m) 34,4 34,4 1,82 (m)/1,93 (m) 88,7 89,1 - 11,9 11,2 1,57 (s) 18,3 18,5 1,14 (s) 71,1 71,8 3,53 (m) 19,5 18,8 1,07 (d, 6,4) 167,1 168,4 - 119,7 119,3 6,62 (d, 15,6) 145,4 146,8 7,76 (d, 15,6) 135,1 135,8 -

104,3 4,41 (d, 8,8) 75,6 3,19 (m) 87,7 3,00 (m) 76,7 3,00 (m) 73,2 3,25 (m) 18,1 1,25 (d, 6,4) 61,1 3,60 (s)

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Cin 1 2 3 4 5,9 128,8 129,4 7,60 (d, 7,6) 6,8 129,3 129,9 7,38 (m) 7 130,6 131,5 7,38 (m) Cym I 1

96,4 97,2 4,84 (br d, 9,6)

C 2 3 4 5 6 3-OMe Cym II 1 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe Thv 1 2 3 4 5 6 3-OMe

# δC 37,2 78,1 83,4 69,1 18,6 58,9 100,5 37,0 77,8 83,4 69,0 18,6 59,0 101,9 37,6 79,3 83,2 72,1 18,9 57,3 104,2 75,3 88,2 76,1 72,9 18,6 61,0

δ#

C của hợp chất stephanoside I [79] đo trong pyridin-d5,

a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS12 và hợp chất tham khảo

3.1.2.13. Hợp chất GS13: 3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl

Hình 3.32. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS13

acid oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester

85

Hợp chất GS13 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công thức

phân tử của GS13 được xác định là C48H78O18 bởi píc ion giả phân tử trên phổ HR-

ESI-MS ở m/z 965,5094 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức

[C48H78O18Na]+, 965,5080). Phổ 1H NMR của GS13 cho tín hiệu của một proton

olefine tại δH 5,23 (br s) và bảy nhóm methyl bậc ba tại δH 0,77, 0,82, 0,89, 0,91, 0,93,

1,03 và 1,14 gợi ý về sự tồn tại của khung oleanane. Ngoài ra ba proton anome ở δH

4,31 (d, J = 7,2 Hz), 4,38 (d, J = 7,6 Hz) và 5,36 (d, J = 8,0 Hz) cho thấy sự hiện diện

của ba gốc đường. Phổ 13C NMR và DEPT của GS13 cho thấy tín hiệu của 48 nguyên

tử cacbon, bao gồm một carbon carboxyl ở δC 178,1; bảy nguyên tử cacbon không

liên kết với hydro ở δC 31,5, 37,9, 40,2, 40,7, 42,9, 48,0 và 144,8; hai mươi cacbon

methine ở δC 42,6, 49,0, 57,0, 71,1, 71,5, 71,6, 73,9, 75,1, 75,6, 76,9, 78,0, 78,1 × 2,

78,3, 78,7, 90,9, 95,7, 104,8, 106,7, và 123,9; mười ba methylen ở δC 19,3, 24,0, 24,6,

27,1, 28,9, 32,5, 34,0, 34,9, 39,9, 47,2, 62,4, 62,8, và 69,8, bảy cacbon methyl ở δC

16,0, 17,0, 17,8, 24,0, 26,3, 28,5, và 33,5. Các tín hiệu này cho thấy sự hiện diện của

aglycone oleanane bị cacboxyl hóa. Ngoài ra, nhóm tín hiệu 13C NMR (δC 106,7,

73,9, 78,1, 71,6, 76,9, 69,8; 104,8, 75,1, 78,1, 71,5, 78,3, 62,4; 95,7, 75,6, 78,7, 71,1,

78,0, 62,8) cùng với các proton anome (δH 4,31, d, J = 7,2 Hz; 4,38, d, J = 7,6 Hz và

5,36, d, J = 8,0 Hz) đã xác nhận sự hiện diện của ba đơn vị đường β-D-glucopyranosyl.

Các tương tác HMBC giữa H-23 (δH 1,03)/H-24 (δH 0,82) và C-3 (δC 90,7)/C-4 (δC

40,2)/C-5 (δC 57,0) đề xuất nhóm hydroxy ở C-3 và hai nhóm methyl tại C-4. Tương

tác HMBC giữa H-25 (δH 0,93) và C-1 (δC 39,9)/C-5 (δC 57,0)/C-9 (δC 49,0)/C-10 (δC

37,9); giữa H-26 (δH 0,78) và C-7 (δC 34,0)/C-8 (δC 40,7)/C-9 (δC 49,0)/C-14 (δC

42,9); giữa H-27 (δH 1,14) và C-8 (δC 40,7)/C-13 (δC 144,8)/C-14 (δC 42,9)/C-15 (δC

28,9) cho phép gán các nhóm methyl tại C- 8/C-10/C-14 cũng như liên kết đôi tại C-

12/C-13. Mặt khác, các tương tác HMBC từ H-29 (δH 0,89)/H-30 (δH 0,91) đến C-19

(δC 47,2)/C-20 (δC 31,5)/C-21 (δC 34,9) cho phép gán hai nhóm methyl ở C-20. Tương

tác HMBC giữa H - 1ʺ (δH 4,38) và C-6′ (δC 69,8); giữa H-1′ (δH 4,31) và C-3 (δC

90,8) chỉ ra chuỗi liên kết đường là β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl

tại C-3 của aglycone. Các tương tác HMBC từ H-16/H-18/H-22 đến C-28 và từ H-

1ʹʹʹ đến C-28 đã chứng minh nhóm cacbonyl ở C-17 và gốc đường β-D-

glucopyranosyl còn lại ở C-28. Do đó, cấu trúc của GS13 đã được làm sáng tỏ là 3β-

86

O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl axit oleanolic 28-O-β-D-

glucopyranosyl este, một hợp chất đã được phân lập từ loài G. sylvestre [22].

δC

δC

δC

C

# δC

a,b δH

a,c (độ bội,J=Hz)

#

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

C

Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS13 và hợp chất tham khảo

38,8 39,9 0,99 (m)/1,60 (m) 26,0 26,3 1,14 (s) 27 1

26,6 27,1 1,64 (m)/1,90 (m) 176,4 178,1 - 28 2

88,9 90,7 3,16 (m) 33,1 33,5 0,89 (s) 29 3

39,4 40,2 - 23,6 24,0 0,91 (s) 30 4

55,7 57,0 0,75 (br d, 10,0) 3-Glc 5

18,4 19,3 1,43 (m)/1,58 (m) 106,9 106,7 4,31 (d, 7,2) 1′ 6

33,0 34,0 1,29 (m)/1,45 (m) 75,1 73,9 3,20 (m) 2′ 7

39,8 40,7 - 78,4 78,1 3,34 (m) 3′ 8

47,9 49,0 1,57 (m) 71,6 71,6 3,30 (m) 4′ 9

10 36,9 37,9 - 77,0 76,9 3,41 (m) 5′

11 23,7 24,6 1,88 (m) 70,4 69,8 3,76 (dd, 5,2, 11,2)/ 6′

4,08 (d, 11,2)

12 122,9 123,9 5,23 (br s) 6′-Glc

13 144,0 144,8 - 105,4 104,8 4,38 (d, 7,6) 1′

42,0 42,9 - 75,5 75,1 3,18* 2′′ 14

28,2 28,9 1,07 (m)/1,78 (m) 78,5 78,1 3,34 (m) 3′′ 15

23,3 24,0 1,69 (m)/2,01 (m) 71,7 71,5 3,31 (m) 4′′ 16

46,9 48,0 - 78,4 78,3 3,32 (m) 5′′ 17

41,6 42,6 2,83 (d, 11,3) 62,7 62,4 3,65 (m)/3,78 (m) 6′′ 18

46,2 47,2 1,08 (m)/1,69 (m) 28-Glc 19

30,7 31,5 - 95,7 95,7 5,36 (d, 8,0) 1′′′ 20

33,9 34,9 1,19 (m)/1,37 (m) 74,1 75,6 3,18* 2′′′ 21

32,5 32,5 1,59 (m)/1,70 (m) 78,8 78,7 3,34 (m) 3′′′ 22

28,8 28,5 1,03 (s) 71,0 71,1 3,32 (m) 4′′′ 23

17,7 17,0 0,82 (s) 79,3 78,0 3,24 (m) 5′′′ 24

15,5 16,0 0,93 (s) 62,1 62,8 3,65 (m)/3,83 (m) 6′′′ 25

# của hợp chất 3β-O-β-D-glucopyranosyl (1 →6)-β-D-glucopyranosyl axit oleanolic 28-O-β- δC D-glucopyranosyl este [22] đo trong pyridine-d5, a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

17,4 17,8 0,78 (s) 26

87

Hình 3.33. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS14

3.1.2.14. Hợp chất GS14: gymnemoside-W1

Hợp chất GS14 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công thức

phân tử của GS14 được xác định là C48H80O18 từ píc ion giả phân tử trên phổ HR- ESI-MS ở m/z 967,5236 [M + H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C48H80O18Na]+, 967,5236). Phổ 1H NMR của GS14 cho tín hiệu của một proton olefine δH 5,22 (br s)

và bảy nhóm methyl bậc ba tại δH 0,84, 0,88, 0,91, 0,96, 1,03, 1,05 và 1,23 gợi ý về

sự tồn tại của khung oleanane tương tự như GS13. Ngoài ra ba proton anome ở δH

4,31 (d, J = 7,2 Hz), 4,38 (d, J = 7,6 Hz) và 5,36 (d, J = 8,0 Hz) cho thấy sự hiện diện của ba đơn vị đường. Phổ 13C NMR và DEPT của GS14 cho thấy tín hiệu của 48

nguyên tử cacbon, trong đó 30 nguyên tử cacbon được gán cho aglycone triterpene

loại oleanane; 18 cacbon đã được được gán cho ba gốc đường, được xác định là β-D-

glucopyranosyl dựa trên các hằng số tương tác lớn giữa các proton anome và glc H-2 (J = 7,2, J = 7,6 Hz và J = 8,0 Hz) và dữ liệu 13C NMR (δC 106,7, 75,1, 78,0, 71,6,

76,8, 69,8; 104,8, 75,6, 78,1, 71,5, 77,9, 62,7; 105,1, 74,8, 78,2, 71,5, 77,8, 62,7). So sánh dữ liệu 1H và 13C NMR của GS14 với hợp chất gymnemoside-W1 [20] cho thấy

sự tương đồng về độ chuyển dịch hóa học tại các vị trí. Để khẳng định cấu trúc cũng

như làm rõ vị trí gắn của các nhóm thế, phổ HSQC và HMBC đã được đo. Tương tác

HMBC giữa H-23 (δH 1,03)/H-24 (δH 0,82) và C-3 (δC 90,8)/C-4 (δC 40,2)/C-5 (δC

57,0) xác định nhóm oxy ở C-3. Chuỗi đường được xác định là β-D-glucopyranosyl-

(1→ 6)-β-D-glucopyranosyl và tại C-3 của aglycone bằng tương tác HMBC giữa H-

1ʺ (δH 4,38) và C- 6′ (δC 69,8) và giữa H - 1′ (δH 4,32) và C - 3 (δC 90,7). Các tương

tác HMBC từ H-16 (δH 4,20)/H-18 (δH 2,18) / H-22 (δH 1,40 và 2,20) đến C-28 (δC

77,9); từ H - 1ʺ′ (δH 4,18) đến C - 28 (δC 77,9) đã chứng minh gốc đường thứ ba (β-

D – glucopyranosyl) gắn tại C-28. Hơn nữa, vị trí của nhóm hydroxyl tại C-16 đã

88

được xác nhận bởi tương tác HMBC giữa H-15 (δH 1,38 và 1,81)/H-18 (δH 2,18) và

C-16 (δC 67,5). Do đó, cấu trúc của GS14 đã được làm sáng tỏ là 28-O-β-D-

glucopyranosyl-16β-hydroxyolean-12-en-3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-

glucopyranoside) hay còn có tên là gymnemoside-W1. Hợp chất này đã được phân lập

trước đó từ loài từ loài G. sylvestre [20].

δC

# δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

C

δC

# δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

C

27,0 27,4 1,23 (s) 77,9 77,9 3,65 (m)/3,75 (m) 33,3 33,7 0,88 (s) 24,0 24,3 0,91 (s)

38,7 39,9 1,00 (m)/1,61 (m) 26,6 27,1 1,65 (m)/1,90 (m) 88,9 90,7 3,17* 39,4 40,2 - 55,6 56,9 0,80 (br d, 10,0) 18,3 19,3 1,43 (m)/1,58 (m) 32,6 33,7 1,35 (m)/1,58 (m) 40,0 41,1 - 47,0 48,1 1,56 (m) 37,7 37,7 - 23,7 24,6 1,88 (m)

27 28 29 30 3-Glc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′

106,9 106,7 4,32 (d, 7,6) 75,2 75,1 3,30 (m) 78,3 78,0 3,31 (m) 71,6 71,6 3,30 (m) 76,9 76,8 3,42 (m) 70,4 69,8 3,76 (dd, 5,2, 11,2)/

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

4,08 (d, 11,2) 105,3 104,8 4,38 (d, 7,6) 75,5 75,6 3,30 (m) 78,5 78,1 3,31 (m) 71,7 71,5 3,30 (m) 76,9 77,9 3,32 (m) 62,7 62,7 3,65 (m)/3,83 (m)

105,7 105,1 4,18 (d, 8,0) 74,9 74,8 3,12 (m) 78,3 78,2 3,31 (m) 71,7 71,5 3,30 (m) 76,9 77,8 3,22 (m) 62,7 62,7 3,65 (m)/3,83 (m)

6′-Glc 1′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ 28-Glc 1′′′ 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 6′′′

a đo trong

12 123,0 124,2 5,22 (br s) 13 143,3 143,9 - 43,8 44,8 - 14 36,8 36,9 1,38 (m)/1,81 (m) 15 66,1 67,5 4,20 (m) 16 41,2 41,8 - 17 44,6 45,6 2,18 (m) 18 46,7 47,6 1,07 (m)/1,71 (m) 19 30,9 31,7 - 20 34,0 34,7 1,18 (m)/1,40 (m) 21 26,5 26,7 1,40 (m)/2,20 (m) 22 28,1 28,5 1,05 (s) 23 17,0 17,0 0,84 (s) 24 15,7 16,2 0,96 (s) 25 17,0 17,6 1,03 (s) 26 số liệu phổ 13C NMR của hợp chất gymnemoside-W1[20] đo trong Pyridine-d5, #

δC

methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz, * tín hiệu bị chồng lấp

Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS14 và hợp chất tham khảo

89

3.1.2.15. Hợp chất GS15: 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-

(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester

Hình 3.34. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS15

Hợp chất GS15 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công thức

phân tử của hợp chất GS15 là C53H86O22 từ píc ion giả phân tử trên phổ HR-ESI-MS

tại m/z 1097,5521 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C53H86O22Na]+ là

1097.5503). So sánh công thức phân tử của GS15 và GS13 (C48H78O18) dễ nhận thấy

ở hợp chất GS15 đã xuất hiện thêm 1 đơn vị đường pentose (C5H8O4). Phổ 1H NMR

của GS15 xuất hiện tín hiệu của 1 proton olefin, 7 nhóm methyl bậc 4, 4 proton

anome. Phổ 13C NMR và DEPT của GS15 cho tín hiệu của 53 carbon, trong đó có 30

cacbon của khung oleanane và 23 cacbon cho 4 đơn vị đường. Phân tích các dữ kiện

phổ 1H và 13C NMR của GS15 cho thấy một cấu trúc gần giống với hợp chất GS13

ngoại trừ một đơn vị đường pentose gắn vào vị trí C-6′′. Đơn vị đường pentose này

được xác định là β-D-xylopyranosyl bằng việc quan sát tín hiệu trên phổ 13C NMR

(δC 105,4, 74,7, 77,5, 71,0, 66,8) và proton anome xyl H-1ʹʹʹ 4,29 (d, J = 7,6 Hz) trên

phổ 1H NMR. Các tương tác HMBC giữa H-1′′′ (δH 4,29) và C-6′′ (δC 69,7); H-1′′ (δH

4,37) và C-6′ (δC 70,0); H-1′ (δH 4,32) và C-3 (δC 90,8) chứng minh chuỗi đường là

β-D-xylopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl ở vị trí C-

3 của aglycone. Ngoài ra vị trí của nhóm β-D-glucopyranosyl ở carboxyl C-28 được

gắn dựa theo tương tác HMBC từ H-1ʹʹʹʹ (δH 5,36) đến C-28 (δC 178,0). Do đó cấu

trúc của hợp chất GS15 được làm rõ là 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-

glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl

ester, một hợp chất trước đó đã từng được phân lập từ loài G. sylvestre [22].

90

δC

δC

δC

# δC

a,b δH

#

a,b δH

a,c (độ bội,J=Hz)

Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS15 và hợp chất tham khảo

23,7 24,0 0,91 (s)

- 107,0 106,6 4,32 (d, 8,0) 75,0 74,9 3,20 (m) 78,3 77,7 3,34 (m) 71,5 71,3 3,34 (m) 77,0 76,6 3,42 (m) 70,4 70,0 3,77 (m)/4,08 (m)

-

105,4 104,7 4,37 (d, 7,6) 75,6 75,4 3,20 (m) 78,5 77,9 3,42 (m) 71,6 71,4 3,34 (m) 76,9 76,7 3,34 (m) 69,8 69,7 3,71 (m)/4,08 (m)

-

106,0 105,4 4,29 (d, 7,6) 74,9 74,7 3,20 (m) 78,1 77,5 3,34 (m) 71,1 71,0 3,50 (m) 67,1 66,8 3,19 (m)/3,86 (m)

a,c (độ bội, J=Hz) 38,7 39,8 1,61 (m)/1,95 (m) 26,7 27,0 1,63 (m)/1,90 (m) 89,0 90,8 3,16* - 39,5 40,1 55,8 57,0 0,75 (br d, 10,0) 18,5 19,3 1,37 (m)/1,51 (m) 33,1 33,9 1,29 (m)/1,43 (m) 39,9 40,6 48,0 49,0 1,55 (m) 37,0 37,9 23,8 24,5 1,88 (m) 123,0 123,8 5,23 (br s) 144,0 144,7 - 42,1 42,9 - 28,2 28,8 1,04 (m)/1,76 (m) 23,4 23,9 1,69 (m)/2,01 (m) - 47,0 47,2 41,7 42,5 2,82 (d, 12,0) 46,2 47,2 1,13 (m)/1,68 (m) 30,8 31,5 34,0 34,8 1,20 (m)/1,39 (m) 32,5 33,0 1,60 (m)/1,69 (m) 28,2 28,6 1,03 (s) 17,0 17,1 0,82 (s) 15,6 16,1 0,93 (s) 17,5 17,7 0,77 (s) 26,4 26,4 1,14 (s) 176,5 178,0 - 33,2 33,6 0,89 (s)

C 30 3-Glc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 6′-Glc 1′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ 6′′-Xyl 1′′′ 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 28-Glc 1′′′′ 2′′′′ 3′′′′ 4′′′′ 5′′′′ 6′′′′

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

#của 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic δC acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester [22] đo trong Pyridine-d5, a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz, * tín hiệu bị chồng lấp

95,8 95,6 5,36 (d, 8,0) 74,1 73,8 3,32 (m) 78,9 78,1 3,42 (m) 71,1 71,1 3,34 (m) 79,3 78,5 3,34 (m) 62,2 62,3 3,67 (m)/3,80 (m)

91

3.1.2.16. Hợp chất GS16: alternoside XIX

Hình 3.35. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS16

Công thức phân tử của hợp chất GS16 là C53H88O22 dựa theo píc ion giả phân

tử trên phổ HR-ESI-MS tại m/z 1099,5658 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức

[C53H88O22Na]+ là 1099,5659). Phân tích phổ 1H- và 13C NMR của GS16 cho thấy

aglycone của GS16 giống với GS14 ngoại trừ việc thêm vào 1 đơn vị đường ở vị trí

C-6′′. Đơn vị đường này được xác định là β-D-xylopyranosyl bằng các tín hiệu đặc

trưng trên phổ 13C NMR, DEPT (δC 105,4, 74,7, 77,5, 71,0, 66,8) và proton anome

tại δH H-1ʹʹʹ 4,28 (d, J = 7,6 Hz) trên phổ 1H NMR.

Các tương tác HMBC giữa H-1′′′ (δH 4,28) và C-6′′ (δC 69,8); H-1′′ (δH 4,36)

và C-6′ (δC 70,2); H-1′ (δH 4,32) và C-3 (δC 90,7) chứng minh chuỗi đường là β-D-

xylopyranosyl-(1→6) -β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl và được gắn

ở vị trí C-3 của aglycone. Vị trí của đường β-D-glucopyranosyl ở C-28 được gán

thông qua tương tác HMBC giữa H-1ʹʹʹʹ (δH 4,16) và C-28 (δC 77,9). Bằng các suy

luận trên, cấu trúc của hợp chất GS16 được làm rõ là alternoside XIX [25], một

oleanane saponin được báo cáo trước đó từ loài Gymnema sylvestre [20].

92

δC

δC

δC

#

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

C

# δC

a,b δH

a,c (độ bội,J=Hz)

C

Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS16 và hợp chất tham khảo

24,0 24,3 0,91 (s)

106,9 106,6 4,32 (d, 8,0) 74,9 74,9 3,32 (m) 78,4 77,8 3,31 (m) 71,5 71,5 3,29 (m) 76,9 76,8 3,42 (m) 70,3 70,2 3,69 (m)/4,07 (m)

39,9 0,99 (m)/1,63 (m) 27,1 1,65 (m)/1,93 (m) 90,7 3,18* 40,1 - 57,0 0,79 (d, 10,0) 19,3 1,43 (m)/1,57 (m) 33,7 1,38 (m)/1,58 (m) 41,1 - 48,1 1,56 (m) 37,7 - 24,7 1,90 (m)

105,3 104,9 4,36 (d, 8,0) 75,5 75,6 3,19 (m) 78,7 78,1 3,31 (m) 71,5 71,5 3,29 (m) 76,9 76,9 3,42 (m) 69,8 69,8 3,76 (m)/4,07 (m)

106,2 105,5 4,28 (d, 7,6) 74,8 74,8 3,32 (m) 78,0 77,6 3,31 (m) 71,1 71,2 3,47 (m) 67,0 66,9 3,17 (m)/3,89 (m)

105,3 105,1 4,16 (d, 8,0) 75,0 75,1 3,19 (m) 78,5 78,0 3,31 (m) 71,5 71,5 3,29 (m) 78,7 78,2 3,20 (m) 62,6 62,7 3,66 (m)/3,83 (m)

δC

của alternoside XIX [25] đo trong pyridine-d5, a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz, #

* tín hiệu bị chồng lấp

38,7 26,5 89,0 39,4 55,6 18,5 32,6 40,0 47,0 36,7 23,7 123,9 124,2 5,22 (br s) 143,4 143,9 - 44,8 - 43,8 36,9 1,39 (m)/1,81 (m) 37,0 67,5 4,20 (m) 66,1 41,8 - 41,2 45,6 2,18 (m) 44,6 47,6 1,06 (m)/1,72 (m) 46,7 31,7 - 30,9 34,7 1,18 (m)/1,39 (m) 34,0 26,7 1,41 (m)/2,20 (m) 26,5 28,5 1,05 (s) 28,1 17,0 0,84 (s) 16,9 17,6 0,97 (s) 15,7 16,2 1,04 (s) 16,9 27,4 1,23 (s) 27,0 77,9 3,66 (m)/3,75 (m) 78,3 33,7 0,88 (s) 33,3 30 3-Glc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 6′-Glc 1′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ 6′′-Xyl 1′′′ 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 28-Glc 1′′′′ 2′′′′ 3′′′′ 4′′′′ 5′′′′ 6′′′′ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

93

3.1.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài G. latifolium

3.1.3.1. Hợp chất GL1: gymlatifoside A

Hình 3.36. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL1

Hợp chất GL1 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công thức

phân tử của GL1 được xác định là C63H89NO23 dựa theo píc ion giả phân tử tại m/z

37Cl]- là 1264,5484). Phổ 1H NMR

1262,5528 [M + 35Cl]- và 1264,5432 [M + 37Cl]- (tính toán lý thuyết cho công thức

35Cl]- là 1262,5514 và [C63H89NO23

[C63H89NO23

của GL1 cho tín hiệu của hai nhóm methyl singlet tại δH 1,10 và 1,61, một methyl

doublet tại δH 1,33 (J = 6,4 Hz) và một proton olefin tại δH 5,33 (br s) cùng với 4

proton anome tại δH 4,83 (br d, J = 9,6 Hz), 4,57 (d, J = 10,0 Hz), 4,42 (d, J = 8,4

Hz), và 4,39 (d, J = 8,0 Hz) đề xuất cấu trúc của một pregnane gắn 4 đơn vị đường.

Thủy phân hợp chất GL1 thu được các đường đơn D-cymarose, D-oleandrose, D-

thevetose và D-glucose. Ngoài ra nhóm các proton thơm tại δH 7,23 (2H), 7,32 (2H),

7,36 (1H) và 2 tín hiệu doublet tại δH 6,10 (1H, J = 16,0 Hz) và 7,26 (1H, J = 16,0

Hz) gợi ý sự tồn tại của nhóm trans-cinnamoyl. Bên cạnh đó, cụm tín hiệu các proton

thơm tại δH 9,07 (s), 8,62 (d, J = 4,8 Hz), 7,30 (m), và 8,23 (d, J = 8,0 Hz) cho phép

dự đoán cấu trúc của đơn vị nicotinoyl. Phổ 13C NMR của GL1 cho tín hiệu của 2

cacbon olefin tại δC 140,1 (C) và 120,0 (CH), 3 cacbon oximethine tại δC 79,2, 75,2,

và 77,1 và 3 cacbon bậc 3 liên kết với oxi tại δC 74,9, 89,6, và 88,4 đặc trưng cho

aglycone pregnane. Ngoài ra tín hiệu tại δC 167,8, 119,8 và 145,3 giúp khẳng định

thêm sự có mặt của gốc cinamoyl. Tương tự như vậy, các tín hiệu của vòng nicotinoyl

được thể hiện rõ tại δC 128,0, 151,4, 153,9, 125,5 và 139,2.

94

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

a,b

δC δH 153,9 8,62 (d, 4,8) 125,5 7,30 (m) 139,2 8,23 (d, 8,0)

Bảng 3.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL1

97,2 36,7 78,5 83,8 69,9 18,5 58,5 4,83 (br d, 9,6) 1,50 (m)/2,03 (m) 3,82 (m) 3,22 (m) 3,79 (m) 1,18 (d, 6,4) 3,41 (s)

a,c (độ bội, J=Hz) δC 39,8 1,10 (m)/1,78 (m) 30,1 1,55 (m)/1,83 (m) 79,2 3,50 (m) 39,7 2,18 (m)/2,34 (m) 140,1 - 120,0 5,33 (br s) 35,2 2,15 (m) 74,9 - 44,7 1,53 (m) 38,0 - 26,1 1,63 (m)/2,00 (m) 75,2 4,85 (m) 57,8 - 89,6 - 34,4 1,93 (m)/2,00 (m) 34,0 1,77 (m) 88,4 - 11,4 1,61 (s) 18,5 1,10 (s) 77,1 4,82 (m) 15,2 1,33 (d, 6,4)

102,6 4,57 (d, 10,0) 37,6 80,2 84,3 72,5 18,8 57,6 1,40 (m)/2,30 (m) 3,36 (m) 3,18 (m) 3,38 (m) 1,38 (d, 5,6) 3,39 (s)

104,3 4,42 (d, 8,4) 75,2 86,3 82,9 72,6 18,5 61,2 3,21 (m) 3,17 (m) 3,32 (m) 3,40 (m) 1,36 (d, 5,6) 3,61 (s)

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Cin 1 2 3 4 5,9 6,8 7 Nic 1 2 3 167,8 - 119,8 6,10 (d, 16,0) 145,3 7,26 (d, 16,0) 135,4 - 129,1 7,23 (m) 130,0 7,32 (m) 131,5 7,36 (m) 165,3 - 128,0 - 151,4 9,07 (s) C 4 5 6 Cym 1 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe Thv 1 2 3 4 5 6 3-OMe Glc 1 2 3 4 5 6 3,16 (m) 3,23 (m) 3,18 (m) 3,32 (m) 3,60 (m)/3,85 (m) 104,3 4,39 (d, 8,0) 75,7 78,4 71,8 77,9 63,2 a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

Liên kết đôi tại C-5/C-6 được xác định bởi tương tác HMBC từ H-19 (δH 1,11)

đến C-1 (δC 39,8)/C-5 (δC 140,1)/C-9 (δC 44,7)/C-10 (δC 38,0). Tương tác HMBC từ

H-18 (δH 1,61) đến C-12 (δC 75,2)/C-13 (δC 57,8)/C-14 (δC 89,6)/C-17 (δC 88,4), từ

H-21 (δH 1,33) to C-17 (δC 88,4)/C-20 (δC 77,1) và từ H-6 (δH 5,33)/H-7 (δH 2,15)/H-

9 (δH 1,53) đến C-8 (δC 74,9) xác định vị trí của nhóm hidroxi tại C-8, C-12, C-14,

C-17 và C-20. Tương tác HMBC từ H-12 (δH 4,85) cacbon cacbony của nhóm

cinamoyl (δC 167,8) và từ H-20 (δH 4,82) đến cacbon cacbonyl của nhóm nicotinoyl

95

(δC 169,1) cho phép gắn chính xác vị trí của nhóm cinnamoyl và nicotinoyl tại C-12

và C-20 tương ứng.

Hình 3.37. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL1

Các tương tác HMBC từ Glc H-1 (δH 4,39) đến Thv C-4 (δC 82,9), Thv H-1 (δH

4,42) đến Ole C-4 (δC 84,3), từ Ole H-1 (δH 4,57) đến Cym C-4 (δC 83,8) và từ Cym

H-1 (δH 4,83) đến aglycone C-3 (δC 79,2), cũng như từ H-3 (δH 3,50) đến Cym C-1

(δC 97,2), từ Cym H-4 (δH 3,24) đến Ole C-1 (δC 102,6), từ Ole H-4 (δH 3,18) đến Thv

C-1 (δC 104,3) và từ Thv H-4 (δH 3,32) đến Glc C-1 (δC 104,3) chỉ ra chuỗi đường là

β-D-glucopyranosyl-(14)-β-D-thevetopyranosyl-(14)-β-D-oleandropyranosyl-

(14)-β-D-cymaropyranoside và nối vào vị trí C-3 của aglycone. Cuối cùng, cấu trúc

D-glucopyranosyl-(14)-β-D-thevetopyranosyl-(14)-β-D-oleandropyranosyl-

của hợp chất GL1 được làm rõ là 12-O-cinnamoyl-20-O-nicotinoylsarcostin 3-O-β-

(14)-β-D-cymaropyranoside, một hợp chất mới được đặt tên là gymlatifoside A.

3.1.3.2. Hợp chất GL2: gymlatifoside B

Hình 3.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL2

96

Hợp chất GL2 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng với công

thức phân tử C69H99NO28 xác định bởi píc ion HR-ESI-MS tại m/z 1424,6061 [M + 35Cl]- 35Cl]- và 1426,6067 [M + 37Cl]- (tính toán lý thuyết cho công thức [C69H99NO28 37Cl]- là 1426,6013). So với công thức phân tử của GL1 là 1424,6042 và [C69H99NO28

(C63H89NO23) đã tăng thêm 1 đơn vị (C6H10O5), tương ứng với 1 phân tử đường

glucose. Điều này gợi ý cấu trúc của hợp chất GL2 tương tự như GL1, chỉ khác nhau

là thêm một đường glucose. Dự đoán này được thêm phần chắc chắn hơn khi so sánh và loại trừ các phần giống nhau của phổ 1H, 13C NMR của GL2 và GL1 thì dễ dàng

quan sát thấy các tín hiệu đặc trưng của đường glucose thứ 2 tại [ (δH 4,37/ δC104,6),

(δH 3,48/ δC 76,4), (δH 3,31/ δC 78,1), (δH 3,29/ δC 71,4), (δH 77,9/ δC 3,31) và (δH 3,60

và 3,84/ δC 62,5)]. Bên cạnh đó, các tín hiệu của nhóm cinamoyl, nicotinoyl và khung

pregnane thì tương đồng hoàn toàn với hợp chất GL1. Trật tự đường và vị trí của

nhóm cinamoyl cũng như nicotinoyl được xác nhận lại thông qua phổ HSQC, H-H

COSY và HMBC. Các tương tác HMBC từ H-12 (δH 4,85) đến Cin C-1 (δC 167,9) và

H-20 (δH 4,44) đến Nic C-1 (δC 165,3) cho thấy nhóm cinamoyl ở vị trí C-12 và nhóm

nicotinoyl ở vị trí C-20. Các tương tác HMBC từ Glc II H-1 (δH 4,37 đến Glc I C-2

(δC 81,1), từ Glc H-1 (δH 4,44) đến Thv C-4 (δC 83,2), từ Thv H-1 (δH 4,42) to Ole C-

4 (δC 84,3), từ Ole H-1 (δH 4,56) đến Cym C-4 (δC 83,9) và từ Cym H-1 (δH 4,85) đến

aglycone C-3 (δC 79,3) chỉ ra thứ tự chuỗi đường là 3-O-β-D-glucopyranosyl-(12)-

β-D-glucopyranosyl-(14)-β-D-thevetopyranosyl-(14)-β-D-oleandropyranosyl-

(14)-β-D-cymaropyranoside và được gắn vào C-3 của aglycone. Do đó cấu trúc của

hợp chất GL2 được xác định là 12-O-cinnamoyl-20-O-nicotinoylsarcostin 3-O-β-D-

D-oleandropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranoside, một hợp chất mới được đặt tên

glucopyranosyl-(12)-β-D-glucopyranosyl-(14)-β-D-thevetopyranosyl-(14)-β-

Hình 3.39. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL2

là gymlatifoside B.

97

δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

a,b δH

Bảng 3.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL2

97,2 4,85 (br d, 9,6) 36,7 1,50 (m)/2,03 (m) 78,5 3,82 (m) 83,9 3,23 (m) 70,0 3,79 (m) 18,5 1,18 (d, 6,4) 58,5 3,41 (s)

a,c (độ bội, J=Hz) δC 39,7 1,11 (m)/1,78 (m) 30,1 1,55 (m)/1,83 (m) 79,3 3,50 (m) 39,7 2,18 (m)/2,33 (m) - 140,0 120,0 5,33 (br s) 35,2 2,16 (m) - 74,9 44,7 1,54 (m) 38,0 - 26,1 1,63 (m)/2,00 (m) 75,2 4,85 (m) - 57,8 - 89,6 34,4 1,94 (m)/2,00 (m) 34,0 1,77 (m) 88,4 - 11,4 1,62 (s) 18,5 1,15 (s) 77,0 4,83 (m) 15,2 1,33 (d, 6,0)

102,6 4,56 (d, 9,6) 37,6 1,40 (m)/2,30 (m) 80,2 3,36 (m) 84,3 3,18 (m) 72,5 3,38 (m) 18,6 1,36 (d, 5,2) 57,6 3,39 (s)

-

104,3 4,42 (d,7,2) 75,4 3,20 (m) 86,3 3,16 (m) 83,2 3,32 (m) 72,6 3,40 (m) 18,6 1,36 (d, 5,2) 61,0 3,60 (s)

104,2 4,44 (d, 7,2) 81,1 3,48 (m) 78,1 3,31 (m) 71,4 3,29 (m) 77,9 3,31 (m) 62,3 3,78 (m)/3,93 (m)

167,9 120,0 6,11 (d, 16,0) 145,3 7,26 (d, 16,0) 135,4 - 129,1 7,22 (m) 130,0 7,32 (m) 131,5 7,37 (m) - 165,3 128,1 - 151,4 9,07 (s) 153,9 8,62 (d, 4,8) 125,2 7,30 (m) 139,2 8,23 (d, 8,0)

a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

C Cym 1 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe Thv 1 2 3 4 5 6 3-OMe Glc I 1 2 3 4 5 6 Glc II 1 2 3 4 5 6 104,6 4,37 (d, 8,0) 76,4 3,48 (m) 78,1 3,31 (m) 71,4 3,29 (m) 77,9 3,31 (m) 62,5 3,60 (m)/3,84 (m) C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Cin 1 2 3 4 5,9 6,8 7 Nic 1 2 3 4 5 6

98

3.1.3.3. Hợp chất GL3: gymlatifoside C

Hình 3.40. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL3

Hợp chất GL3 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. So sánh chi tiết phổ 1H và 13C NMR của hợp chất GL3 và hợp chất GS6 thấy sự giống nhau khá lớn

với các tín hiệu đặc trưng của bộ khung pregnane, nhóm tigloyl và 5 đơn vị đường.

35Cl]- là 1253,6086 và [C60H98O25

Bên cạnh đó, công thức phân tử của hợp chất GL3 được xác định là C60H98O25 căn cứ vào píc ion HR-ESI-MS tại m/z 1253,6050 [M + 35Cl]- và 1255,5982 [M + 37Cl]- 37Cl]- (tính toán lý thuyết cho công thức [C60H98O25

là 1255,6056). Dễ dàng nhận thấy hợp chất GL3 có cùng công thức phân tử với hợp

chất GS6. Do vậy có thể suy đoán sự khác nhau là do sự thay đổi trong chuỗi đường,

cụ thể là thay thế Cym bằng Ole hoặc Thv bởi All. Bên cạnh đó cụm tín hiệu của

nhóm cinnamoyl và nicotinoyl đã biến mất, thay vào đó là các tín hiệu δH 7,00 (1H,

q, J = 6,8 Hz), 1,81 (3H, d, J = 6,8 Hz), 1,87 (3H, s), và δC 169,1, 130,1, 139,6, 14,5,

và 12,1 trên phổ NMR đặc trưng cho gốc tigloyl quen thuộc. Tương tác HMBC từ H-

12 (δH 4,70) đến cacbon carbonyl của gốc tigloyl (δC 169,1) nhận định nhóm này gắn

vào vị trí C-12 bởi liên kết este.

Hình 3.41. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL3

99

Các tương tác HMBC từ Glc H-1 (δH 4,43) đến Thv C-4 (δC 82,9), từ Thv H-1

(δH 4,40) đến Ole C-4 (δC 84,3), từ Ole H-1 (δH 4,57) đến Cym II C-4 (δC 83,8), từ

Cym II H-1 (δH 4,77) đến Cym I C-4 (δC 83,8) và từ Cym I H-1 (δH 4,84) đến aglycone

C-3 (δC 79,3) chỉ ra thứ tự chuỗi đường là 3-O-β-D-glucopyranosyl-(14)-β-D-

thevetopyranosyl-(14)-β-D-oleandropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranosyl-

(14)-β-D-cymaropyranoside tại vị trí C-3 của aglycone.

a,c (độ bội, J=Hz)

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

a,b δH

δC 18,5 1,17 (d, 6,0) 58,4 3,41 (s)

δC 39,8 1,09 (m)/1,80 (m) 30,1 1,57 (m)/1,83 (m) 79,3 3,49 (m) 39,8 2,19 (m)/2,33 (m)

101,2 4,77 (d, 9,6)

36,6 1,54 (m)/2,02 (m) 78,4 3,82 (m) 83,8 3,22 (m) 69,9 3,79 (m) 18,6 1,20 (d, 6,4) 58,6 3,41 (s)

102,6 4,57 (d, 9,6)

37,6 1,40 (m)/2,30 (m) 80,2 3,36 (m) 84,3 3,18 (m) 72,5 3,36 (m) 18,9 1,36 (d, 6,0) 57,6 3,40 (s)

140,0 - 119,9 5,33 (br s) 35,2 2,11 (m) 75,0 - 44,7 1,49 (m) 38,0 - 25,9 1,62 (m)/2,00 (m) 75,2 4,70 (4,0, 11,2) 57,6 - 89,2 - 34,3 1,81 (m)/1,89 (m) 33,5 1,74 (m) 89,3 - 11,2 1,52 (s) 18,5 1,14 (s) 71,6 3,46 (m) 18,9 1,06 (d, 6,4)

104,3 4,40 (d, 7,2) 75,2 3,22 (m) 86,3 3,16 (m) 82,9 3,33 (m) 72,6 3,39 (m) 18,5 1,36 (d, 6,0) 61,3 3,61 (s)

169,1 - 130,1 - 139,6 7,00 (q, 6,8) 14,5 1,81 (d, 6,8) 12,1 1,87 (s)

97,2 4,84 (br d, 9,6) 36,4 1,54 (m)/2,02 (m) 78,5 3,82 (m) 83,8 3,22 (m) 69,8 3,79 (m)

C 6 3-OMe Cym 1 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe Thv 1 2 3 4 5 6 3-OMe Glc 1 2 3 4 5 6

104,3 4,43 (d, 8,0) 75,7 3,15 (m) 78,4 3,22 (m) 71,8 3,19 (m) 78,0 3,32 (m) 63,2 3,60 (m)/3,85 (m)

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tig 1 2 3 4 5 Cym 1 2 3 4 5

a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

Bảng 3.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL3

100

Bằng những nhận định trên, cấu trúc của hợp chất GL3 được khẳng định là 12-O-

tigloylsarcostin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(14)-β-D-thevetopyranosyl-(14)-β-D-

oleandropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranoside,

một hợp chất mới được đặt tên là gymlatifoside C.

3.1.3.4. Hợp chất GL4: gymlatifoside D

Hình 3.42. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL4

Hợp chất GL4 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H và 13C NMR

của GL4 cho thấy đây cũng là một pregnane tương tự như hợp chất GL3 với 3 nhóm

methyl singlet (δH 1,31, 1,15, 1,17), một proton olefin tại δH 5,31 (s), 2 cacbon olefin

tại δC 140,1 và 119,9 cùng với 5 đơn vị đường Cym I (δH 4,84/ δC 97,2), Cym II (δH

4,77/ δC 101,2), Ole (δH 4,57/ δC 102,6), Thv (δH 4,43/ δC 104,3) và Glc (δH 4,40/ δC

104,3)]. Sự khác nhau duy nhất là ở hợp chất GL4 đã mất đi tín hiệu của nhóm tigloyl.

Công thức phân tử của hợp chất GL4 được xác định là C55H92O24 căn cứ vào píc ion

37Cl]- là 1173,5638.

HR-ESI-MS tại m/z 1171,5676[M + 35Cl]- và 1173,5676 [M + 37Cl]- (tính toán lý

35Cl]- là 1171,5667 và [C55H92O24

thuyết cho công thức [C55H92O24

Công thức phân tử này so với hợp chất GL3 đã bị giảm đi 1 đơn vị là (C5H6O), phù

hợp với công thức phân tử của một nhóm tigloyl. Trật tự đường và vị trí nối của chuỗi

đường vào aglycone được xác nhận lại thông qua phổ HMBC. Các tương tác HMBC

từ Glc H-1 (δH 4,40) đến Thv C-4 (δC 82,9), từ Thv H-1 (δH 4,43) đến Ole C-4 (δC

84,3), từ Ole H-1 (δH 4,57) đến Cym II C-4 (δC 83,8), từ Cym II H-1 (δH 4,77) đến

Cym I C-4 (δC 83,9) và từ Cym I H-1 (δH 4,84) đến aglycone C-3 (δC 79,3) xác nhận

chuỗi đường 3-O-β-D-glucopyranosyl-(12)-β-D-glucopyranosyl-(14)-β-D-

thevetopyranosyl-(14)-β-D-oleandropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranoside gắn

vào C-3 của aglycone. Vì vậy, cấu trúc của hợp chất GL4 được khẳng định là

101

sarcostin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(14)-β-D-6-deoxy-3-O-methyl-D-allopyranoyl-

(14)-β-D-oleandropyranosyl-(14)-β-D-cymaropyranosyl-(14)-β-D-

cymaropyranoside, một hợp chất mới được đặt tên là gymlatifoside D.

δC

δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

Bảng 3.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL4

C C

101,2 4,77 (d, 10,0) 36,6 1,54 (m)/2,02 (m) 78,5 3,82 (m) 83,8 3,24 (m) 70,0 3,79 (m) 18,6 1,20 (d, 6,0) 58,5 3,41 (s)

- -

102,6 4,57 (d, 10,0) 37,6 1,40 (m)/2,30 (m) 80,3 3,36 (m) 84,3 3,18 (m) 72,5 3,36 (m) 18,9 1,36 (d, 5,6) 57,6 3,40 (s)

39,8 1,07 (m)/1,87 (m) 30,2 1,60 (m)/ 1,84 (m) 79,3 3,50 (m) 39,8 2,20 (m)/2,33 (m) 140,1 - 119,9 5,31 (br s) 35,4 2,08 (m) - 74,8 45,1 1,43 (m) 38,1 - 29,2 1,60 (m)/ 2,00 (m) 71,5 3,56 (dd, 4,0, 11,6) 59,0 89,6 34,7 1,77 (m)/1,83 (m) 34,5 1,77 (m)/1,83 (m) 89,1 - 10,6 1,31 (s) 18,6 1,17 (s) 73,7 3,94 (q, 6,4) 17,0 1,15 (d, 6,4)

104,3 4,43 (d, 8,0) 75,2 3,20 (m) 86,3 3,17 (m) 82,9 3,33 (m) 72,6 3,40 (m) 18,5 1,36 (d, 5,6) 61,2 3,61 (s)

a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

97,2 4,84 (br d, 9,6) 36,4 1,55 (m)/2,02 (m) 78,6 3,82 (m) 83,9 3,22 (m) 69,9 3,79 (m) 18,5 1,16 (d, 6,4) 58,4 3,41 (s) 1 2 3 4 5 6 3-OMe Ole 1 2 3 4 5 6 3-OMe Thv 1 2 3 4 5 6 3-OMe Glc 1 2 3 4 5 6 104,3 4,40 (d, 8,0) 75,7 3,16 (m) 78,4 3,22 (m) 71,8 3,19 (m) 78,0 3,32 (m) 63,2 3,61 (m)/3,85 (m) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Cym I 1 2 3 4 5 6 3-OMe Cym II

102

Hình 3.43. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL4

3.1.3.5. Hợp chất GL5: verticilloside J

Hình 3.44. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GL5

Hợp chất GL5 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. So sánh các

dữ kiện phổ NMR của GL5 nhận thấy có nét tương đồng với hợp chất

gymnepregoside F (GS10) ngoại trừ xuất hiện thêm tín hiệu đường D glucose tại

106,2, 75,4, 78,0, 71,9, 77,9, 63,1 và proton anome tại δH 4,33 (d, 7,2), tương tự như

chuỗi đường của các hợp chất GS6, GS8 và GS9. So sánh các dữ kiện phổ 1H, 13C

NMR của hợp chất GL5 và các pregnane glycoside đã phân lập trước đó, hợp chất

GL5 được xác định là verticilloside J, một hợp chất phân lập từ loài Asclepias

verticillata [78].

103

C

δC

#

δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz) C

δC

# δC

a,b δH

a,c (độ bội, J=Hz)

39,4

39,9 1,07 (m)/1,86 (m)

100,8 101,2 4,77 (d, 9,6)

1

1

30,3

30,2 1,85 (m)

37,3 36,6 1,55 (m)/2,04 (m)

2

2

78,1

79,3 3,49 (m)

78,7 78,4 3,82 (m)

3

3

39,7

39,8 2,20 (m)/2,33 (m)

83,4 83,8 3,19 (m)

4

4

139,5 140,1 -

69,2 69,9 3,79 (m)

5

5

120,1 119,9 5,31 (br s)

18,9 18,6 1,20 (d, 6,0)

6

6

35,6

35,4 2,08 (m)

3-OMe 59,2 58,6 3,41 (s)

7

74,1

74,8 -

Ole

8

44,9

45,1 1,42 (m)

102,2 102,6 4,56 (d, 8,8)

1

9

37,7

38,0 -

38,0 37,6 1,40 (m)/2,30 (m)

2

10

29,5

29,1 1,60 (m)/2,00 (m)

79,6 80,4 3,35 (m)

3

11

71,1

71,5 3,56 (m)

83,3 83,9 3,17 (m)

4

12

58,4

59,0 -

72,3 72,5 3,35 (m)

5

13

89,2

89,5 -

19,2 18,9 1,34 (d, 6,0)

6

14

34,9

34,7 1,77 (m)/1,82 (m)

3-OMe 57,8 57,6 3,40 (s)

15

34,6

34,5 1,77 (m)/1,82 (m)

All

102,3 102,2 4,69 (d, 8,4)

16

89,4

89,0 -

73,0 72,9 3,30 (m)

1

17

11,8

10,6 1,31 (s)

83,5 83,2 3,93 (m)

2

18

18,7

18,6 1,17 (s)

83,6 83,9 3,31 (m)

3

19

73,5

73,7 3,94 (q, 7,2)

69,8 70,2 3,79 (m)

4

20

18,2

17,0 1,15 (d, 7,2)

18,2 18,1 1,28 (d, 6,0)

5

21

Cym I

62,0 62,0 3,57 (s)

6

96,7

97,2 4,83 (br d, 9,6)

3-OMe 102,3 102,2 4,69 (d, 8,4)

1

37,5

36,4 1,55 (m)/2,04 (m)

Glc

2

78,4

78,5 3,82 (m)

107,0 106,2 4,33 (d 7,2)

1

3

83,7

83,8 3,18 (m)

75,8 75,4 3,16 (m)

2

4

69,4

69,8 3,79 (m)

78,8 78,0 3,26 (m)

3

5

18,8

18,5 1,16 (d, 6,0)

72,2 71,9 3,21 (m)

4

6

3-OMe

59,2

58,4 3,41 (s)

78,8 77,9 3,32 (m)

5

Cym II

63,3 63,1 3,63 (dd, 6,0, 11,6)

6

3,89 (dd, 2,0, 11,6)

δC

của verticilloside J [78]đo trong pyriddine-d5, a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz #

Bảng 3.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL5 và hợp chất tham khảo

104

3.1.3.6. Hợp chất GL6: lucyoside H

Hình 3.45. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GL6

1H-NMR của hợp chất GL6 cho thấy tín hiệu của 7 nhóm methyl singlet tại δH 0,78,

Hợp chất GL6 được phân lập được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Trên phổ

0,83, 0,89, 0,91, 0,94, 1,03 và 1,14; một proton olefin tại δH 5,23 (1H, br s), 2 proton

anome tại δH 4,30 (1H, d, J = 7,6 Hz) và 5,36 (1H, d, J = 8,0 Hz) và sự xuất hiện một

số lượng lớn các tín hiệu proton ở vùng trường cao (δH 0,78 – 2,83) cho phép dự đoán

đây là một hợp chất triterpene có gắn 2 đơn vị đường. Phổ 13C-NMR của hợp chất

GL6 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của 42 nguyên tử carbon. Các số liệu phổ proton

13C NMR và HSQC cho phép xác định sự tồn tại cấu trúc bộ khung olean-12-ene với

và carbon tương ứng được xác định thông qua phổ HSQC. Phân tích số liệu phổ 1H,

các tín hiệu đặc trưng: 7 nhóm methyl tại δC 33,5 (δH 0,89, H-29), 28,6 (δH 1,03, H-

23), 26,4 (δH 1,14, H-27), 24,0 (δH 0,91, H-30), 17,7 (δH 0,78, H-26),17,0 (δH 0,83,

H-24) và 16,1 (δH 0,94, H-25); 2 cacbon olefin tại δC 123,6 (δH 5,23, 1H, br s, H-12)

và δC 144,8 cho thấy sự có mặt của một liên kết đôi C=C đã bị thế ba proton. Kết hợp

so sánh số liệu phổ của hợp chất GL6 với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất này

giống hợp chất oleanolic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside

[80]. Các tương tác trên phổ HMBC cho phép gắn chính xác các nhóm thế vào

aglycone. Tương tác HMBC từ H-23 (δH 1,03), H-24 (δH 0,83) tới C-3 (δC 90,8)/ C-4

(δC 40,2)/ C-5 (δC 57,0) và từ H-3 (δH 3,15) tới C-4 (δC 40,2)/ C-23 (δC 28,6)/ C-24

(δC 17,0) cho thấy liên kết C-O tại C-3 và có 2 nhóm methyl tại C-4.

a,c (độ bội, J=Hz)

# δC 39,6 26,7 90,7 40,6 56,7 19,3 33,1 40,1 48,0 37,7 24,4 123,6 144,8 42,6 28,2 26,2 47,8 42,3 47,2 31,5 34,7 33,2 28,2 16,4 16,7 17,7 26,1 178,3 33,5 23,8 105,8 73,8 78,5 71,6 78,1 62,4 95,6 74,9 78,8 71,4 78,3 62,6

δH 0,96 (m)/1,60 (m) 1,66 (m)/1,91 (m) 3,15 (m) - 0,75 (*) 1,39 (m)/1,52 (m) 1,30 (m)/1,46 (m) - 1,55 (m) - 1,71 (m)/2,00 (m) 5,23 (br s) - - 1,08 (m)/1,77 (m) 1,88 (m) - 2,83 (dd, 4,0, 10,2) 1,13 (m)/1,70 (m) - 1,18 (m)/1,38 (m) 1,60 (m)/1,70 (m) 1,03 (s) 0,83 (s) 0,94 (s) 0,78 (s) 1,14 (s) - 0,89 (s) 0,91 (s) 4,30 (d, 7,6) 3,18 (m) 3,38 (m) 3,32 (m) 3,28 (m) 3,65 (m)/3,80 (m) 5,36 (d, 8,0) 3,30 (m) 3,32 (m) 3,25 (m) 3,22 (m) 3,65/3,80

a,b δC 39,8 27,0 90,8 40,2 57,0 19,3 33,9 40,2 49,0 37,8 24,0 123,8 144,8 42,9 28,9 24,6 48,0 42,6 47,2 31,5 34,9 33,1 28,6 17,0 16,1 17,7 26,4 178,0 33,5 24,0 106,7 75,6 78,2 71,1 78,3 62,4 95,7 73,8 78,7 71,6 77,6 62,7

δC

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3-Glc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 28-Glc 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ # của lucyoside H [80] đo trong pyridin-d5 ,a) đo trong methanol-d4, b)100 MHz, c)400 MHz, * tín hiệu bị chồng lấp

105 Bảng 3.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL6 và hợp chất tham khảo

Tương tác HMBC từ H-25 (δH 0,94) tới C-1 (δC 39,8)/ C-5 (δC 57,0)/ C-9 (δC 49,0)/

C-10 (δC 37,8), từ H-26 (δH 0,78) tới C-7 (δC 33,9)/ C-8 (δC 40,2)/ C-9 (δC 49,0)/ C-

106

14 (δC 42,9) và từ H-27 (δH 1,14) tới C-8 (δC 40,2)/ C-13 (δC 144,8)/ C-14 (δC 42,9)/

C-15 (δC 28,9) cho thấy 3 nhóm methyl lần lượt tại C-10 , C-8 và C-14. Các tương

tác HMBC từ H-29 (δH 0,89) và H-30 (δH 0,91) tới C-19 (δC 47,2), C-20 (δC 31,5), C-

21 (δC 34,9) cho thấy 2 nhóm methyl tại C-20. Tương tác HMBC từ H-12 (δH 5,23)

tới C-10 (δC 37,8)/ C-11 (δC 24,0)/ C-14 (δC 42,9) và từ H-18 (δH 2,83) tới C-12 (δC

123,8)/ C-13 (δC 144,8) cho thấy có nối đôi tại C-12 và C-13. Các tương tác HMBC

từ H-18 (δH 2,83) và H-22 (δH 1,60) tới C-28 (δC 178,0) cho thấy có nhóm cacboxyl

tại C-28. Tương tác H-1′ (δH 4,30) tới C-3 (δC 90,8) và H-1′′ (δH 5,36) tới C-28 (δC

178,0) cho phép xác định đơn vị đường β-D-glucopyranosyl nằm ở vị trí C-3 và C-

28. Kết hợp các phân tích phổ 1 chiều, 2 chiều và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp

chất GL6 được xác định là oleanolic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-

glucopyranoside, hay còn gọi là lucyoside H, hợp chất này lần đầu tiên được phân lập

từ loài Luffa cylindrica năm 1983 bởi Takemoto và cộng sự [81].

3.1.3.7. Hợp chất GL7:3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl acid

oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester

Xem hợp chất GS13

3.1.3.8. Hợp chất GL8: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl

oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester

Hình 3.46. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GL8 Hợp chất GL8 phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H và 13C NMR

của hợp chất GL8 cho các tín hiệu khá tương đồng với hợp chất GL6 với 7 nhóm

methine, 14 cacbon methylen, 4 cacbon anome, 2 cacbon olefin và nhóm cacbon vùng

107

đường. Sự khác biệt duy nhất là trên phổ NMR của GL8 xuất hiện thêm tín hiệu của

hai proton anome tại δH 4,31 và 4,38 cho thấy phân tử hợp chất GL8 có thêm hai đơn

vị đường so với hợp chất GL6. Bên cạnh đó, hai tín hiệu δC 69,5 và 69,8 (CH2) trên

phổ 13C NMR và HSQC của GL8 cho phép dự đoán có 2 đơn vị đường β-D

glucopyranose bị thế ở vị trí C-6.

#

a,b

# δC

a,b δH

a,c (độ bội,J=Hz)

a,c (độ bội,J=Hz)

C 1 2 3 4 5 6 7

δC 38,7 26,7 89,0 39,5 55,8 18,5 33,1

39,8 0,95 (m)/1,60 (m) 27,0 1,65 (m)/1,90 (m) 90,8 3,16 (m) 40,2 - 57,0 0,77 (m) 19,4 1,37 (m)/1,51 (m) 33,9 1,29 (m)/1,45 (m)

C 3-Glc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′

δC δC 106,9 106,7 75,2 75,1 78,4 77,7 71,5 71,5 77,0 78,1 70,5 69,8

40,7 - 48,0 1,55 (m) 37,9 - 24,6 1,88 (m)

8 9 10 11 12 13 14

39,9 48,0 37,0 23,7 122,9 123,9 5,23 (br s) 144,1 144,8 - 42,9 -

42,1

6′-Glc 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′

105,4 104,8 75,6 75,5 78,6 77,9 71,7 71,5 78,5 76,8 62,6 62,7

15 16 17 18 19 20 21

28,2 23,4 47,0 41,7 46,3 30,8 34,0

28,9 1,08 (m)/1,76 (m) 24,0 1,69 (m)/2,03 (m) 47,2 - 42,5 2,82 (d, 12,0) 47,2 1,13 (m)/1,68 (m) 31,5 - 34,9 1,19 (m)/1,37 (m)

28-Glc 1′′′ 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 6′′′

95,7 95,7 73,9 73,8 78,7 78,1 70,9 71,6 78,0 78,1 69,3 69,5

33,2 1,59 (m)/1,69 (m) 28,5 0,83 (s) 17,1 1,03 (s) 16,3 0,94 (s) 17,8 0,77 (s) 26,3 1,14 (s)

22 23 24 25 26 27 28

32,5 28,3 17,6 15,1 17,5 26,4 176,5 178,0 -

6′′′-Glc 1′′′′ 2′′′′ 3′′′′ 4′′′′ 5′′′′ 6′′′′

105,3 104,6 75,2 75,6 78,5 77,9 71,7 71,6 78,4 76,8 62,7 62,7

δH 4,33 (d, 7,6) 3,21 (m) 3,23 (m) 3,34 (m) 3,34 (m) 3,76 (m)/4,08 (dd, 6,4, 10,4) 4,38 (d, 7,6) 3,21 (m) 3,34 (m) 3,34 (m) 3,42 (m) 3,65 (dd, 4,8, 12,0)/3,83 (m) 5,33 (d, 8,0) 3,31 (m) 3,34 (m) 3,49 (m) 3,42 (m) 3,76 (m)/4,08 (dd, 6,4, 10,4) 4,31 (*) 3,21 (m) 3,23 (m) 3,49 (m) 3,41 3,65 (dd, 4,8, 12,0)/3,83 (m)

33,2 23,7

33,5 0,89 (s) 24,1 0,92 (s)

29 30 # của hợp chất 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-28- δC O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester[22] đo trong pyridine-d5, a đo trong methanol-d4, b100 MHz, c400 MHz

Bảng 3.23. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL8 và hợp chất tham khảo

Qua phân tích số liệu phổ và tham khảo tổng quan thành phần hóa học chính của chi

Gymnema, hợp chất GL8 được dự đoán là 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-

108

glucopyranosyl oleanolic acid-28-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl

ester [22]. Cấu trúc của hợp chất GL8 được khẳng định lại bằng phổ hai chiều HMBC

tương tự như ở hợp chất GL6. Nhóm cacbonyl được xác định ở vị trí C-28 dựa vào

tương tác HMBC giữa H-18 (δH 2,82) với C-28 (δC 178,0). Tương tác giữa H-1′ (δH

4,33) và C-3 (δC 90,8), H-1′′ (δH 4,38) và C-6′ (δC 69,8), H-1′′′ (δH 5,33) và C-28 (δC

178,0), H-1′′′′ (δH 4,33) và C-28 (δC 178,0) xác định các gốc đường lần lượt được gán

vào các vị trí C-3, C-6′, C-28 và C-6′′′ tương ứng. Qua phân tích phổ 1H, 13C NMR,

HSQC, HMBC, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, GL8 được xác định là 3-O-

β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-O-β-D-

glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester [22].

3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

Tất cả các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre và G. latifolium đã được

thử hoạt tính in vitro ức chế enzyme α-glucosidase và enzyme α-amylase. Acarbose,

một loại thuốc trị tiểu đường phổ biến đã được sử dụng làm chất đối chứng dương.

Acarbose là một phân tử được tổng hợp từ Actiplanes (vi khuẩn) bằng kỹ thuật sinh

học. Hoạt động của nó làm chậm tiêu hóa đường bằng cách ức chế cạnh tranh enzyme

 -glucosidase ruột và các yếu tố enzyme ở ruột non có nhiệm vụ tách các đường

phức thành các đường đơn. Kết quả là kéo dài thời gian thủy phân các đường đôi dẫn

đến việc tiêu hóa các đường này bị chậm lại. Thuốc có tác dụng ức chế enzyme α-

glucosidase ở rìa bàn chải niêm mạc ruột non. Ngoài ra còn ức chế các enzym thuỷ

phân đường đa ở ruột, do vậy làm giảm hấp thu glucose.

3.2.1. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất

Các hợp chất GS1-GS16 và GL1-GL8 được tiến hành thử nghiệm in vitro khả năng

ức chế enzyme α-glucosidase. Kết quả được hiển thị trong Hình 3.47. Theo đó, chỉ

có hợp chất GS8 thể hiện hoạt tính ức chế α-glucosidase đáng kể (65,1 ± 2,1%), giá

trị IC50 của GS8 là 173,8 ± 0,7 µM, mạnh hơn đối chứng dương acarbose (IC50 =

580,3 ± 0,5 µM). Các hợp chất GS4, GS6 và GS9 cho thấy khả năng ức chế enzyme

α-glucosidase ở mức độ yếu với phần trăm ức chế dao động từ 16,9% đến 37,4% (

nồng độ 200 μM). Đối chứng dương acarbose có phần trăm ức chế là 57,8% (nồng

độ 500µg/ml).

109

Hình 3.47. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. sylvestre

Trong khi đó, với các hợp chất phân lập từ loài G. latifolium, chỉ có hợp chất GL5

thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ở mức trung bình với tỉ lệ phần trăm

ức chế là 37,8 ± 1,5%, so sánh với đối chứng dương acarbose (có phần trăm ức chế

47,9 ± 0,1%). Các hợp chất còn lại gần như không có biểu hiện ức chế

Hình 3.48. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. latifolium

.

110

3.2.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất

Từ loài G. sylvestre, các hợp chất GS2, GS3, GS4 cho thấy hoạt động ức chế

α-amylase đáng kể với tỉ lệ ức chế trong khoảng 57,9 đến 66,8% ( nồng độ 200µM).

Các hợp chất này tiếp tục được thử nghiệm để tìm ra giá trị IC50 tương ứng là 175,8

± 2,3, 162,2 ± 2,7 và 113,0 ± 0,7 μM, đối chứng dương acarbose có giá trị IC50 = 72,4

± 0,8 µM.

Hình 3.49. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. sylvestre

Ngược lại, các pregnane glycoside GL1 và GL4 từ loài G. latifolium chỉ thể

hiện hoạt tính ức chế enzyme α-amylase ở mức trung bình trong khi các hợp chất

G L

G L2

G L4

G L1

G L3

G L6

G L8

G L5

A carbose

GL2, GL3 và GL5 gần như không thể hiện khả năng ức chế enzyme α-amylase.

Hình 3.50. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. latifolium

111

Các báo cáo trước đây đã chỉ ra rằng các pregnane phân lập từ loài G. griffithii

cho thấy hoạt tính ức chế α-glucosidase ở mức độ trung bình [5]. Tuy nhiên, đây là

báo cáo đầu tiên về hoạt tính ức chế α-glucosidase và α-amylase của các hợp chất từ

loài G. sylvestre.

112

KẾT LUẬN

Từ thân và lá của 2 loài G. sylvestre và G. latifolium sau khi xử lý ngâm, chiết và tiến

hành phân lập bằng các phương pháp sắc ký và các phương pháp phổ hiện đại, có sự

so sánh các số liệu phổ với các hợp chất tương tự trong tài liệu tham khảo, chúng tôi

đã phân lập và xác định cấu trúc 23 hợp chất và nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính sinh

học của các hợp chất này.

1. Từ loài G. sylvestre, phân lập được 16 hợp chất, trong đó có 7 hợp chất mới và 9

hợp chất đã biết. Bảy hợp chất mới gồm: gymsyloside A (GS1), gymsyloside B

(GS2), gymsyloside C (GS3), gymsyloside D (GS4), gymsyloside E (GS5),

gymnepregoside R (GS6) và gymnepregoside T (GS7). Chín hợp chất đã biết gồm:

verticilloside M (GS8), verticilloside D (GS9), 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside

F (GS10), gymnepregoside F (GS11), stephanoside I (GS12), 3β-O-β-D-

glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyrano-syloleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl

ester (GS13), gymnemoside-W1 (GS14), 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-

glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl

ester (GS15) và alternoside XIX (GS16).

2. Từ loài G. latifolium, phân lập được 8 hợp chất. Trong đó có 4 hợp chất mới và 4

hợp chất đã biết. Bốn hợp chất mới gồm: gymlatifoside A (GL1), gymlatifoside B

(GL2), gymlatifoside C (GL3), gymlatifoside D (GL4) và bốn hợp chất đã biết gồm

verticilloside J (GL5), lucyoside H (GL6), 3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-

glucopyranosyloleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (GL7, trùng với hợp

chất GS13), 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-

28-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl ester (GL8).

3. Đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của 23 hợp chất

phân lập được. Kết quả cho thấy, hợp chất GS8 thể hiện hoạt tính ức chế α-

glucosidase khá tốt, giá trị IC50 của GS8 là 173,8 ± 0,7 µM, mạnh hơn đối chứng

dương acarbose ( IC50 = 580,3 ± 0,5 µM). Các hợp chất GS4, GS6 và GS9 cho thấy

khả năng ức chế enzyme α-glucosidase ở mức độ yếu với phần trăm ức chế dao động

từ 16,9% đến 37,4% ở nồng độ 200 μM. Đối chứng dương acarbose có phần trăm ức

chế là 47,8% (nồng độ 500 µg/ml). Hợp chất GL5 thể hiện hoạt tính ức chế enzyme

113

α-glucosidase ở mức trung bình là 37,8 ± 1,5 %. Các hợp chất còn lại gần như không

có biểu hiện ức chế.

4. Đã nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của 23 hợp chất phân lập được.

Kết quả cho thấy, các hợp chất GS2, GS3, GS4 thể hiện hoạt động ức chế α-amylase

đáng kể với tỉ lệ ức chế trong khoảng 57,9 đến 66,8% (nồng độ 200 μM). Các hợp

chất này tiếp tục được thử nghiệm để tìm ra giá trị IC50 tương ứng là 175,8 ± 2,3,

162,2 ± 2,7 và 113,0 ± 0,7 μM, đối chứng dương acarbose có giá trị IC50 = 72,4 ± 0,8

µM.

114

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Về thành phần hóa học

Từ loài dây thìa canh Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Sm. thu tại vùng trồng

Hải Hậu, Nam Định, Việt Nam đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của:

- Bảy hợp chất mới được đặt tên là gymsyloside A, gymsyloside B, gymsyloside C,

gymsyloside D gymsyloside E, gymnepregoside R và gymnepregoside T.

- Ba hợp chất verticilloside D, verticilloside M và stephanoside I lần đầu tiên phân

lập từ chi Gymnema.

Từ loài dây thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall. ex Wight thu tại trung

tâm trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội, đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa

học của:

- Bốn hợp chất mới được đặt tên là gymlatifoside A, gymlatifoside B,

gymlatifoside C và gymlatifoside D.

- Hai hợp chất verticilloside J và lucyoside H lần đầu tiên phân lập từ chi

Gymnema.

2. Về tác dụng sinh học

-glucosidase và -amylase của các hợp chất và dịch chiết methanol của 2 loài

Lần đầu tiên tại Việt Nam tiến hành thử nghiệm in vitro khả năng ức chế enzyme

Kết quả cho thấy hợp chất verticilloside M có khả năng ức chế enzyme -

glucosidase mạnh hơn chất đối chứng dương acarbose.

Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Sm và Gymnema latifolium Wall. ex Wight.

115

KIẾN NGHỊ

Các kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy hợp chất verticilloside M thể hiện hoạt tính

ức chế ức chế enzyme α-glucosidase khá tốt, mạnh hơn chất đối chứng dương là

acarbose nên có thể tiếp tục tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

trên động vật để định hướng về khả năng ứng dụng của hợp chất này.

116

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Phan Van Kiem, Duong Thi Hai Yen, Nguyen Van Hung, Nguyen Xuan

Nhiem, Bui Huu Tai, Do Thi Trang, Pham Hai Yen, Hoang Duc Manh, Chau Van

Minh, SeonJu Park, Jae Hyuk Lee, Sun Yeou Kim, Seung Hyun Kim, The anti-

glycative potentials of pregnane glycosides from Gymnema sylvestre, Phytochemistry

Letters, 38, (2020) 19–24

2. Phan Van Kiem, Duong Thi Hai Yen, Nguyen Van Hung, Nguyen Xuan

Nhiem, Bui Huu Tai, Do Thi Trang, Pham Hai Yen, Tran Minh Ngoc, Chau Van

Minh, SeonJu Park, Jae Hyuk Lee, Sun Yeou Kim and Seung Hyun Kim, Five new

pregnane glycosides from Gymnema sylvestre and their α-glucosidase and α-amylase

inhibitory activities, Molecules, 2020, 25, 2525.

3. Duong Thi Hai Yen, Do Thi Trang, Bui Huu Tai, Vu Van Doan, Pham Hai

Yen, Nguyen Xuan Nhiem, Chau Van Minh, Manh Hoang Duc, SeonJu Park, Jae

Hyuk Lee, Sun Yeou Kim, Seung Hyun Kim & Phan Van Kiem, Four new pregnane

glycosides from Gymnema latifolium and their α-glucosidase and α-amylase

inhibitory activities, Natural Product Research, 2020. DOI:

https://doi.org/10.1080/14786419.2020.1729153

4. Duong Thi Hai Yen, Nguyen Van Toan, Bui Huu Tai, Pham Hai Yen, Nguyen

Xuan Nhiem, Phan Van Kiem, Oleananesaponins from Gymnema sylvestre, Vietnam

Journal of Chemistry, 2019, 57 (1), 39-45.

5. Duong Thi Hai Yen, Vu Kim Thu, Bui Huu Tai, Pham Hai Yen, Nguyen Xuan

Nhiem, Phan Van Kiem, Pregnane glycosides from Gymnema sylvestre, Vietnam

Journal of Chemistry, 2019, 57 (2), 208-212..

117

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Hội nghị đánh giá hoạt động của Dự án phòng chống đái tháo đường, các rối

loạn thiếu hụt i-ôt năm 2010 và triển khai kế hoạch hoạt động năm 2011 (khu

vực phía Bắc) - Bắc Ninh, 3/2011.

2. N.T. Bân, Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Nhà xuất bản nông nghiệp,

2005, 3, 64-65.

3. V.V. Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 2012, 1, 776-778.

4. V.V. Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 2012, 2, 525.

5. S. Srisurichan, S. Puthong, S. Pornpakakul, Pregnane-type steroidal

glycosides from Gymnema griffithii Craib, Phytochemistry, 2014, 106, 197-

206.

6. K. Yoshikawa, K. Matsuchika, S. Arihara, H.-C. Chang, J.-D. Wang,

Pregnane glycosides, gymnepregosides A-F from the roots of Gymnema

alternifolium, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1998, 46, 1239-1243.

7. K. Yoshikawa, K. Matsuchika, K. Takahashi, M. Tanaka, S. Arihara, H.-C.

Chang, J.-D. Wang, Pregnane glycosides, gymnepregosides G-Q from the

roots of Gymnema alternifolium, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1999,

47, 798-804.

8. R. Xu, Y. Yang, Y. Zhang, F. Ren, J. Xu, N. Yu, Y. Zhao, New pregnane

glycosides from Gymnema sylvestre, Molecules, 2015, 20, 3050-3066.

9. A. Zarrelli, M. DellaGreca, A. Ladhari, R. Haouala, L. Previtera, New

triterpenes from Gymnema sylvestre, Helvetica Chimica Acta, 2013, 96, 1036-

1045.

10. S.L. Peng, X.M. Zhu, M.K. Wang, L.S. Ding, A novel triterpenic acid from

Gymnema sylvestre, Chinese Chemical Letters, 2005, 16, 223-224.

11. A. Zarrelli, A. Ladhari, R. Haouala, G. Di Fabio, L. Previtera, M. DellaGreca,

New acylated oleanane and lupane triterpenes from Gymnema sylvestre,

Helvetica Chimica Acta, 2013, 96, 2200-2206.

118

12. J.K. Malik, F.V. Manvi, B.R. Nanjware, D.K. Dwivedi, P. Purohit, S.

Chouhan, Anti-arthritic activity of leaves of Gymnema sylvestre R.Br. leaves

in rats Der Pharmacia Lettre, 2010, 336-341.

13. K. Yoshikawa, K. Amimoto, S. Arihara, K. Matsuura, Structure studies of new

antisweet constituents from Gymnema sylvestre, Tetrahedron Letters, 1989,

30, 1103-1106.

14. K. Yoshikawa, K. Amimoto, S. Arihara, K. Matsuura, Gymneic acid V, VI and

VII from gurma, the leaves of Gymnema sylvestre R. Br., Chemical and

Pharmaceutical Bulletin, 1989, 37, 37.

15. K. Yoshikawa, M. Nakagawa, R. Yamamoto, S. Arihara, K. Matsuura,

Antisweet natural products. V. Structures of gymnemic acids VIII-XII from

Gymnema sylvestre R. Br, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1992, 40,

1779-1782.

16. K. Yoshikawa, Y. Kondo, S. Arihara, K. Matsuura, Antisweet natural

products. IX. Structures of gymnemic acids XV-XVIII from Gymnema sylvestre

R. Br. V, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1993, 41, 1730-1732.

17. N.P. Sahu, S.B. Mahato, S.K. Sarkar, G. Poddar, Triterpenoid saponins from

Gymnema sylvestre, Phytochemistry, 1996, 41, 1181-1185.

18. N. Murakami, T. Murakami, M. Kadoya, H. Matsuda, J. Yamahara, M.

Yoshikawa, New hypoglycemic constituents in "gymnemic acid" from

Gymnema sylvestre, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1996, 44, 469-

471.

19. M. Yoshikawa, T. Murakami, H. Matsuda, Medicinal foodstuffs. X. Structures

of new triterpene glycosides, gymnemosides C, D, E, and F, from the leaves of

Gymnema sylvestre R. Br.: influence of Gymnema glycosides on glucose

uptake in rat small intestinal fragments, Chemical and Pharmaceutical

Bulletin, 1997, 45, 2034-2038.

20. X.-M. Zhu, P. Xie, Y.-T. Di, S.-L. Peng, L.-S. Ding, M.-K. Wang, Two new

triterpenoid saponins from Gymnema sylvestre, Journal of Integrative Plant

Biology, 2008, 50, 589-592.

119

21. M.-Q. Zhang, Y. Liu, S.-X. Xie, T.-H. Xu, T.-H. Liu, Y.-J. Xu, D.-M. Xu, A

new triterpenoid saponin from Gymnema sylvestre, Journal of Asian Natural

Products Research, 2012, 14, 1186-1190.

22. W.-C. Ye, Q.-W. Zhang, X. Liu, C.-T. Che, S.-X. Zhao, Oleanane saponins

from Gymnema sylvestre, Phytochemistry, 2000, 53, 893-899.

23. W. Ye, X. Liu, Q. Zhang, C.-T. Che, S. Zhao, Antisweet saponins from

Gymnema sylvestre, Journal of Natural Products, 2001, 64, 232-235.

24. K. Yoshikawa, S. Arihara, K. Matsuura, A new type of antisweet principles

occurring in Gymnema sylvestre, Tetrahedron Letters, 1991, 32, 789-792.

25. K. Yoshikawa, K. Takahashi, K. Matsuchika, S. Arihara, H.-C. Chang, J.-D.

Wang, Antisweet natural products. XIV. Structures of alternosides XI-XIX

from Gymnema alternifolium, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1999,

47, 1598-1603.

26. K. Yoshikawa, H. Ogata, S. Arihara, H.-C. Chang, J.-D. Wang, Antisweet

natural products. XIII. Structures of alternosides I-X from Gymnema

alternifolium, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1998, 46, 1102-1107.

27. D. Wang, G. Li, Y. Feng, S. Xu, Two new oleanane triterpene glycosides from

Gymnema inodorum, Journal of Chemical Research, 2008, 655-657.

28. K. Yoshikawa, S. Arihara, K. Matsuura, T. Miyase, Dammarane saponins

from Gymnema sylvestre, Phytochemistry, 1991, 31, 237-241.

29. J. Tian, Q.-G. Ma, J.-B. Yang, A.-G. Wang, T.-F. Ji, Y.-G. Wang, Y.-L. Su,

Hepatoprotective phenolic glycosides from Gymnema tingens, Planta Medica,

2013, 79, 761-767.

30. X. Liu, W. Ye, B. Yu, S. Zhao, H. Wu, C. Che, Two new flavonol glycosides

from Gymnema sylvestre and Euphorbia ebracteolata, Carbohydrate

Research, 2004, 339, 891-895.

31. P. Daisy, J. Eliza, K.A.M. Mohamed Farook, A novel dihydroxy gymnemic

triacetate isolated from Gymnema sylvestre possessing normoglycemic and

hypolipidemic activity on STZ-induced diabetic rats, Journal of

Ethnopharmacology, 2009, 126, 339-344.

120

32. K. Miyatake, S. Takenaka, T. Fujimoto, G. Kensho, S. Priya Upadhaya, M.

Kirihata, I. Ichimoto, Y. Nakano, Isolation of conduritol A from Gymnema

sylvestre and its effects against intestinal glucose absorption in rats,

Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1993, 57, 2184-2185.

33. J. Tian, Y.-G. Wang, J. Ma, J.-B. Yang, L. Zhou, T.-F. Ji, A.-G. Wang, Y.-L.

Su, Hepatoprotective benzofurans and furanolignans from Gymnema tingens,

Journal of Asian Natural Products Research, 2015, 17, 268-273.

34. Y. Sugihara, H. Nojima, H. Matsuda, T. Murakami, M. Yoshikawa, I. Kimura,

Antihyperglycemic effects of gymnemic acid IV, a compound derived from

Gymnema sylvestre leaves in streptozotocin-diabetic mice, Journal of Asian

Natural Products Research, 2000, 2, 321-327.

35. A.B.A. Ahmed, A.S. Rao, M.V. Rao, Role of in vivo leaf and in vitro callus of

Gymnema sylvestre in maintaining the normal levels of blood glucose and

lipid profile in diabetic Wistar rats, Biomedicine, 2008, 28, 134-138.

36. A.B.A. Ahmed, A.S. Rao, M.V. Rao, In vitro callus and in vivo leaf extract of

Gymnema sylvestre stimulate β-cells regeneration and anti-diabetic activity in

Wistar rats, Phytomedicine, 2010, 17, 1033-1039.

37. A. Al-Romaiyan, B. Liu, H. Asare-Anane, C.R. Maity, S.K. Chatterjee, N.

Koley, T. Biswas, A.K. Chatterji, G.C. Huang, S.A. Amiel, S.J. Persaud, P.M.

Jones, A novel Gymnema sylvestre extract stimulates insulin secretion from

human islets in vivo and in vitro, Phytotherapy Research, 2010, 24, 1370-1376.

38. R. Ananthan, C. Baskar, V. NarmathaBai, L. Pari, M. Latha, K.M. Ramkumar,

Antidiabetic effect of Gymnema montanum leaves: effect on lipid peroxidation

induced oxidative stress in experimental diabetes, Pharmacological Research,

2003, 48, 551-556.

39. R. Ananthan, M. Latha, K.M. Ramkumar, L. Pari, C. Baskar, B.V. Narmatha,

Effect of Gymnema montanum leaves on serum and tissue lipids in alloxan

diabetic rats, Experimental diabesity research, 2003, 4, 183-189.

40. K.M. Ramkumar, B. Thayumanavan, T. Palvannan, P. Rajaguru, Inhibitory

effect of Gymnema montanum leaves on α-glucosidase activity and α-amylase

121

activity and their relationship with polyphenolic content, Medicinal Chemistry

Research, 2010, 19, 948-961.

41. R.M. Reddy, P.B. Latha, T. Vijaya, D.S. Rao, The saponin-rich fraction of a

Gymnema sylvestre R. Br. aqueous leaf extract reduces cafeteria and high-fat

diet-induced obesity, Zeitschrift fur Naturforschung C: Journal of Biosciences,

2012, 67, 39-46.

42. V. Kumar, U. Bhandari, C.D. Tripathi, G. Khanna, Anti-obesity effect of

Gymnema sylvestre extract on high fat diet-induced obesity in Wistar rats,

Drug Research, 2013, 63, 625-632.

43. M.R.I. Rama, T. Vijaya, L.B. Pushpa, R.S. Dattatreya, Saponins rich aqueous

extract of Gymnema sylvestre R.Br reduces high fat diet induced obesity in

Wistar rats, Journal of Pharmacy Research, 2011, 4, 1237-1239.

44. H. Luo, A. Kashiwagi, T. Shibahara, K. Yamada, Decreased bodyweight

without rebound and regulated lipoprotein metabolism by gymnemate in

genetic multifactor syndrome animal, Molecular and Cellular Biochemistry,

2007, 299, 93-98.

45. S. Nirmala, V. Ravichandiran, Evaluation of free radical scavenging capacity

of gymnemic acid isolated from Gymnema sylvestre leaves, International

Journal of ChemTech Research, 2016, 9, 248-254.

46. D.G. Naik, C.N. Dandge, S.V. Rupanar, Chemical examination and evaluation

of antioxidant and antimicrobial activities of essential oil from Gymnema

sylvestre R. Br. leaves, Journal of Essential Oil Research, 2011, 23, 12-19.

47. B.H. Rhitajit Sarkar, Santanu Biswas and Nripendranath Mandal, Evaluation

of the in vitro antioxidant and iron chelating activity of Gymnema sylvestre,

Pharmacologyonline, 2009, 3, 851-865.

48. R.B.P. Gupta, P. Singh, Antimicrobial activity of gymnemic acid on

pathogens-Gymnema sylvestre, International Journal of Current Microbiology

and Applied Sciences, 2014, 3, 40-45.

122

49. S.S. Pingale, S.V. Rupanar, M.G. Chaskar, Evaluation of antimicrobial

activity of Gymnema sylvestre, International Research Journal of Pharmacy,

2017, 8, 10-12.

50. P.H.T.T. Trần Văn Ơn, Nguyễn Ngọc Hiếu, Nguyễn Thị Ái Nghĩa, Nguyễn

Hữu Đức, Một số hợp chất tự nhiên phân lập từ cây Dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium wall. ex wight) thu hái ở Việt Nam, Tạp chí Nghiên cứu

dược và Thông tin thuốc, 2016, 4+5, 73-78.

51. Đ.T.Á. Nghĩa, Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng hạ đường huyết

của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. Ex Wight), Luận văn thạc

sỹ Dược học, ĐH Dược Hà Nội, 2014.

52. N.Q. Tiến, P.T.H. Minh, N.Q. An, T.T.T. Nga, N.N. Tuấn, V.Đ. Doanh, P.H.

Điển, Một số kết quả nghiên cứu mới về thành phần hóa học của cây dây thìa

canh Gymnema sylvestre, Tạp chí Dược liệu, 2011, 16, 230-234.

53. H.T.B. Ngọc, Điều tra, nghiên cứu một số thực vật Việt Nam có tác dụng hỗ

trợ điều hòa lượng đường trong máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo

đường type 2. 2012, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

54. H.T.T. Pham, M.C. Hoang, T.K.Q. Ha, L.H. Dang, V.O. Tran, T.B.T. Nguyen,

C.H. Lee, W.K. Oh, Discrimination of different geographic varieties of

Gymnema sylvestre, an anti-sweet plant used for the treatment of type 2

diabetes, Phytochemistry, 2018, 150, 12-22.

55. Classification of diabetes mellitus, World Health Organization, 2019, 4.

56. T.V. Bình, Người bệnh đái tháo đường cần biết, Nhà xuất bản y học Hà Hội,

2002, 9-54.

57. Bài giảng bệnh học nội khoa, Trường đại học Y Hà nội, 1981, tập 2, 78-80.

58. F.A. van de Laar, P.L. Lucassen, R.P. Akkermans, E.H. van de Lisdonk, G.E.

Rutten, C. van Weel, α-Glucosidase Inhibitors for Patients With Type 2

Diabetes, Diabetes Care, 2005, 28, 154.

59. F. Conforti, G. Statti, M.R. Loizzo, G. Sacchetti, F. Poli, F. Menichini, In Vitro

Antioxidant Effect and Inhibition of alpha Amylase of Two Varieties of

123

Amaranthus caudatus Seeds, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2005,

28, 1098-1102.

60. Đ.Q. Hai, Giáo trình công nghệ sinh học enzyme, Đại học khoa học- Đại

học Huế., 2006.

61. D.a.M.S. Schomburg, Enzyme handbook, Springer Verlag Berlin Heidelberg,

1991, 4, 115-123.

62. T. Komoda, T. Matsunaga, Chapter 3 - Constituents of the Human Body, in

Biochemistry for Medical Professionals, T. Komoda and T. Matsunaga,

Editors. 2015, Academic Press: Boston. p. 7-24.

63. R. Sindhu, P. Binod, A. Pandey, α-Amylases, in Current Developments in

Biotechnology and Bioengineering. 2017, Elsevier. p. 3-24.

64. S. Chiba, Molecular mechanism in alpha-glucosidase and glucoamylase,

Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1997, 61 8, 1233-1239.

65. S.a.I.S.M. Uzma, Probing ligand binding interactions of human alpha

glucosidase by homology modeling and molecular clocking., International

journal of integrative biology, 2008, 2, 116-121.

66. V.L.a.S.G.W. Yip, Nature’s many mechanisms for the degration of

oligosaccharide., Org Biomol Chem, 2004, 2, 2707-2713.

67. a.S.M.K. Nguyen H.T., Three compounds with potent α-glucosidase

inhibitory activity purified from sea cucumber Stichopus japonicus, Summer program

In Sensory Evaluation, 2009, 112-122.

68. P.T.T.C.v.P.T. Nghĩa, Enzyme và ứng dụng, Nhà xuất bản giáo dục, 2009, 56-

80.

69. T. Warashina, T. Noro, Steroidal glycosides from the aerial part of Asclepias

incarnata, Phytochemistry, 2000, 53, 485-498.

70. F. Abe, H. Okabe, T. Yamauchi, K. Honda, N. Hayashi, Pregnane Glycosides

from Marsdenia tomentosa, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1999, 47,

869-875.

124

71. H.H. Tran, M.C. Nguyen, H.T. Le, T.L. Nguyen, T.B. Pham, V.M. Chau, H.N.

Nguyen, T.D. Nguyen, Inhibitors of α-glucosidase and α-amylase from

Cyperus rotundus, Pharm Biol, 2014, 52, 74-77.

72. D. Deepak, A. Khare, M.P. Khare, Plant pregnanes, Phytochemistry, 1989,

28, 3255-3263.

73. N. Panda, N.B. Mondal, S. Banerjee, N.P. Sahu, K. Koike, T. Nikaido, M.

Weber, P. Luger, Polyhydroxy pregnanes from Dregea volubilis, Tetrahedron,

2003, 59, 8399-8403.

74. N.T.K. Thuy, P.T. Phuong, N.T.T. Hien, D.T. Trang, N.V. Huan, P.T.L. Anh,

B.H. Tai, N.X. Nhiem, N.T. Hung, P.V. Kiem, Pregnane glycosides from the

leaves of Dregea volubilis and their α-glucosidase and α-amylase inhibitory

activities, Natural Product Research, 2020, 1-8.

75. X. Li, H. Sun, Y. Ye, F. Chen, J. Tu, Y. Pan, Four new immunomodulating

steroidal glycosides from the stems of Stephanotis mucronata, Steroids, 2006,

71, 683-690.

76. Y. Ye, X. Li, H. Sun, F. Chen, Y. Pan, Immunomodulating Steroidal

Glycosides from the Roots of Stephanotis mucronata, Helvetica Chimica Acta,

2004, 87, 2378-2384.

77. R. Aquino, G. Peluso, N. De Tommasi, F. De Simone, C. Pizza, New

polyoxypregnane ester derivatives from Leptadenia hastata, Journal of

Natural Products, 1996, 59, 555-564.

78. J.J. Araya, F. Binns, K. Kindscher, B.N. Timmermann, Verticillosides A–M:

Polyoxygenated pregnane glycosides from Asclepias verticillata L.,

Phytochemistry, 2012, 78, 179-189.

79. K. Yoshikawa, N. Okada, Y. Kann, S. Arihara, Steroidal glycosides from the

fresh stem of Stephanotis lutchuensis var. japonica (Asclepiadaceae).

Chemical structures of stephanosides A-J, Chemical and Pharmaceutical

Bulletin, 1996, 44, 1790-1796.

80. L. Rastrelli, R. Aquino, S. Abdo, M. Proto, F. De Simone, N. De Tommasi,

Studies on the Constituents of Amaranthus caudatus Leaves:  Isolation and

125

Structure Elucidation of New Triterpenoid Saponins and Ionol-Derived

Glycosides, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46, 1797-1804.

81. T. Takemoto, S. Arihara, K. Yoshikawa, K. Kusumoto, I. Yano, T. Hayashi,

Studies on the constituents of Cucurbitaceae plants. VI. On the saponin

constituents of Luffa cylindrica Roem., Yakugaku Zasshi, 1984, 104, 246-255.

PHỤ LỤC

MỤC LỤC PHỤ LỤC

1. Phụ lục phổ của hợp chất GS1 ............................................................................. 1

2. Phụ lục phổ của hợp chất GS2 ............................................................................. 6

3. Phụ lục phổ của hợp chất GS3 ........................................................................... 12

4. Phụ lục phổ của hợp chất GS4 ........................................................................... 17

5. Phụ lục phổ của hợp chất GS5 ........................................................................... 22

6. Phụ lục phổ của hợp chất GS6 ........................................................................... 26

7. Phụ lục phổ của hợp chất GS7 ........................................................................... 31

8. Phụ lục phổ của hợp chất GS8 ........................................................................... 35

9. Phụ lục phổ của hợp chất GS9 ........................................................................... 40

10. Phụ lục phổ của hợp chất GS10 ....................................................................... 43

11. Phụ lục phổ của hợp chất GS11 ....................................................................... 47

12. Phụ lục phổ của hợp chất GS12 ....................................................................... 52

13. Phụ lục phổ của hợp chất GS13 ....................................................................... 56

14. Phụ lục phổ của hợp chất GS14 ....................................................................... 60

15. Phụ lục phổ của hợp chất GS15 ....................................................................... 64

16. Phụ lục phổ của hợp chất GS16 ....................................................................... 68

17. Phụ lục phổ của hợp chất GL1 ........................................................................ 72

18. Phụ lục phổ của hợp chất GL2 ........................................................................ 77

19. Phụ lục phổ của hợp chất GL3 ........................................................................ 82

20. Phụ lục phổ của hợp chất GL4 ........................................................................ 87

21. Phụ lục phổ của hợp chất GL5 ........................................................................ 92

22. Phụ lục phổ của hợp chất GL6 ........................................................................ 95

23. Phụ lục phổ của hợp chất GL7 ........................................................................ 98

24. Phụ lục phổ của hợp chất GL8 ...................................................................... 101

1

1. Phụ lục phổ của hợp chất GS1

Gymsyloside A

CTPT: C47H76O17

KLPT: 912

- Phổ giãn 1H NMR

- Phổ giãn13C NMR

- Phổ giãn HSQC

- Phổ giãn HMBC

- Phổ giãn ROESY

2

1.1. Phổ giãn 1H NMR của hợp chất GS1

3

1.2. Phổ giãn 13C NMR của hợp chất GS1

4

1.3. Phổ giãn HSQC của hợp chất GS1

5

1.4. Phổ giãn HMBC của hợp chất GS1

6

1.5. Phổ giãn ROESY của hợp chất GS1

2. Phụ lục phổ của hợp chất GS2

Gymsyloside B

CTPT: C47H76O17

KLPT: 912

7

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ COSY

- Phổ ROESY

8

2.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS2

2.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS2

9

2.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GS2

2.4. Phổ HSQC của hợp chất GS2

10

2.5. Phổ HMBC của hợp chất GS2

2.6. Phổ COSY của hợp chất GS2

11

2.7. Phổ ROESY của hợp chất GS2

12

3. Phụ lục phổ của hợp chất GS3

Gymsyloside C

CTPT: C54H88O20

KLPT: 1056

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ COSY

- Phổ ROESY

13

3.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS3

3.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS3

14

3.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GS3

3.4. Phổ HSQC của hợp chất GS3

15

3.5. Phổ HMBC của hợp chất GS3

3.6. Phổ COSY của hợp chất GS3

16

3.7. Phổ ROESY của hợp chất GS3

17

4. Phụ lục phổ của hợp chất GS4

Gymsyloside D

CTPT: C54H88O20

KLPT: 1056

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ COSY

- Phổ ROESY

18

4.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS4

4.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS4

19

4.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GS4

4.4. Phổ HSQC của hợp chất GS4

20

4.5. Phổ HMBC của hợp chất GS4

4.6. Phổ COSY của hợp chất GS4

21

4.7. Phổ ROESY của hợp chất GS4

22

5. Phụ lục phổ của hợp chất GS5

Gymsyloside E

CTPT: C54H88O20

KLPT: 1074

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ COSY

23

5.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS5

5.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS5

24

5.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất GS5

5.4. Phổ HSQC của hợp chất GS5

25

5.5. Phổ HMBC của hợp chất GS5

5.6. Phổ COSY của hợp chất GS5

26

6. Phụ lục phổ của hợp chất GS6

Gymnepregoside R

CTPT: C60H98O25

KLPT: 1218

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ COSY

- Phổ ROESY

27

6.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS6

6.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS6

11

28

6.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GS6

6.4. Phổ HSQC của hợp chất GS6

29

6.5. Phổ HMBC của hợp chất GS6

6.6. Phổ COSY của hợp chất GS6

30

6.7. Phổ ROESY của hợp chất GS6

31

7. Phụ lục phổ của hợp chất GS7

Gymnepregoside T

CTPT: C51H82O20

KLPT: 1014

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

32

7.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS7

7.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS7

33

7.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GS7

7.4. Phổ HSQC của hợp chất GS7

34

7.5. Phổ HMBC của hợp chất GS7

35

8. Phụ lục phổ của hợp chất GS8

Verticilloside M

CTPT: C62H96O25

KLPT: 1240

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ COSY

- Phổ ROESY

36

8.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS8

8.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS8

37

8.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GS8

8.4. Phổ HSQC của hợp chất GS8

38

8.5. Phổ HMBC của hợp chất GS8

8.6. Phổ COSY của hợp chất GS8

39

8.7. Phổ ROESY của hợp chất GS8

40

9. Phụ lục phổ của hợp chất GS9

Verticilloside D

CTPT: C57H92O25

KLPT: 1176

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

41

9.1. Phổ 1H NMR của hợp chất GS9

9.2. Phổ 13C NMR của hợp chất GS9

42

9.3. Phổ HSQC của hợp chất GS9

9.4. Phổ HMBC của hợp chất GS9

43

10. Phụ lục phổ của hợp chất GS10

Gymnepregoside F

CTPT: C49H82O19

KLPT: 974

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

44

10.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS10

10.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS10

45

10.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GS10

10.4. Phổ HSQC của hợp chất GS10

46

10.5. Phổ HMBC của hợp chất GS10

47

11. Phụ lục phổ của hợp chất GS11

12-O-(E)-Cinnamoylgymnepregoside F

CTPT: C58H88O20

KLPT: 1104

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ COSY

- Phổ ROESY

48

11.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS11

11.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS11

49

11.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất GS11

11.4. Phổ HSQC của hợp chất GS11

50

11.5. Phổ HMBC của hợp chất GS11

11.6. Phổ COSY của hợp chất GS11

51

11.7. Phổ ROESY của hợp chất GS11

52

12. Phụ lục phổ của hợp chất GS12

Stephanoside I

CTPT: C58H88O20

KLPT: 1104

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ COSY

53

12.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS12

12.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất GS12

54

12.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất GS12

12.4. Phổ HSQC của hợp chất GS12

55

12.5. Phổ HMBC của hợp chất GS12

12.6. Phổ COSY của hợp chất GS12

56

13. Phụ lục phổ của hợp chất GS13

3β-O-β-D-Glucopyranosyl (1 →6)-β-D-glucopyranosyl axit oleanolic 28-O-β-D-

glucopyranosyl ester

CTPT: C48H78O18

KLPT: 942

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

57

13.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS13

13.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS13

58

13.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GS13

13.4. Phổ HSQC của hợp chất GS13

59

13.5. Phổ HMBC của hợp chất GS13

60

14. Phụ lục phổ của hợp chất GS14

Gymnemoside-W1

CTPT: C48H80O18

KLPT: 944

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

61

14.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS14

14.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS14

62

14.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GS14

14.4. Phổ HSQC của hợp chất GS14

63

14.5. Phổ HMBC của hợp chất GS14

64

15. Phụ lục phổ của hợp chất GS15

3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl

oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester

CTPT: C53H86O22

KLPT: 1074

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

65

15.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS15

15.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS15

66

15.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GS15

15.4. Phổ HSQC của hợp chất GS15

67

15.5. Phổ HMBC của hợp chất GS15

68

16. Phụ lục phổ của hợp chất GS16

Alternoside XIX

CTPT: C53H88O22

KLPT: 1076

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

69

16.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS16

16.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GS16

70

16.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GS16

16.4. Phổ HSQC của hợp chất GS16

71

16.5. Phổ HMBC của hợp chất GS16

72

17. Phụ lục phổ của hợp chất GL1

Gymlatifoside A

CTPT: C63H89NO23

KLPT: 1227

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ COSY

- Phổ ROESY

73

17.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GL1

17.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GL1

74

17.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GL1

17.4. Phổ HSQC của hợp chất GL1

75

17.5. Phổ HMBC của hợp chất GL1

17.6. Phổ COSY của hợp chất GL1

76

17.7. Phổ ROESY của hợp chất GL1

77

18. Phụ lục phổ của hợp chất GL2

Gymlatifoside B

CTPT: C69H99NO28

KLPT: 1389

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ COSY

- Phổ ROESY

78

18.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GL2

18.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GL2

79

18.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GL2

18.4. Phổ HSQC của hợp chất GL2

80

18.5. Phổ HMBC của hợp chất GL2

18.6. Phổ COSY của hợp chất GL2

81

18.7. Phổ ROESY của hợp chất GL2

82

19. Phụ lục phổ của hợp chất GL3

Gymlatifoside C

CTPT: C60H98O25

KLPT: 1218

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ COSY

- Phổ ROESY

83

19.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GL3

19.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GL3

84

19.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GL3

19.4. Phổ HSQC của hợp chất GL3

85

19.5. Phổ HMBC của hợp chất GL3

19.6. Phổ COSY của hợp chất GL3

86

19.7. Phổ ROESY của hợp chất GL3

87

20. Phụ lục phổ của hợp chất GL4

Gymlatifoside D

CTPT: C53H88O22

KLPT: 1104

- Phổ HR-ESI-MS

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

- Phổ COSY

- Phổ ROESY

88

20.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GL4

20.2. Phổ 1H NMR của hợp chất GL4

89

20.3. Phổ 13C NMR của hợp chất GL4

20.4. Phổ HSQC của hợp chất GL4

90

20.5. Phổ HMBC của hợp chất GL4

20.6. Phổ COSY của hợp chất GL4

91

20.7. Phổ ROESY của hợp chất GL4

92

21. Phụ lục phổ của hợp chất GL5

Verticilloside J

CTPT: C53H88O22

KLPT: 1104

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

93

21.1. Phổ 1H NMR của hợp chất GL5

21.2. Phổ 13C NMR của hợp chất GL5

94

21.3. Phổ HSQC của hợp chất GL5

21.4. Phổ HMBC của hợp chất GL5

95

22. Phụ lục phổ của hợp chất GL6

Lucyoside H

CTPT: C42H68O13

KLPT: 780

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

96

22.1. Phổ 1H NMR của hợp chất GL6

22.2. Phổ 13C NMR của hợp chất GL6

97

22.3. Phổ HSQC của hợp chất GL6

22.4. Phổ HMBC của hợp chất GL6

98

23. Phụ lục phổ của hợp chất GL7

3β-O-β-D-Glucopyranosyl (1 →6)-β-D-glucopyranosyl axit oleanolic 28-O-β-D-

glucopyranosyl ester

CTPT: C48H78O18

KLPT: 942

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

99

23.1. Phổ 1H NMR của hợp chất GL7

23.2. Phổ 13C NMR của hợp chất GL7

100

23.3. Phổ HSQC của hợp chất GL7

23.4. Phổ HMBC của hợp chất GL7

101

24. Phụ lục phổ của hợp chất GL8

3-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-β-D-

glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl ester

CTPT: C54H88O23

KLPT: 1104

- Phổ 1H NMR

- Phổ 13C NMR

- Phổ HSQC

- Phổ HMBC

102

24.1. Phổ 1H NMR của hợp chất GL8

24.2. Phổ 13C NMR của hợp chất GL8

103

24.3. Phổ HSQC của hợp chất GL8

24.4. Phổ HMBC của hợp chất GL8