Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật môi trường: Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ Dioxin của vi sinh vật sinh Enzyme Laccase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

PHÙNG KHẮC HUY CHÚ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM

HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN

CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE

LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

Hà Nội, 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

PHÙNG KHẮC HUY CHÚ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM

HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN

CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE

Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường

Mã số: 9.52.03.20 LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS. TS Đặng Thị Cẩm Hà

Hà Nội, 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Luận án tiến sỹ “Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính

và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzyme laccase” là công

trình nghiên cứu do chính tôi tự thực hiện. Các kết quả nghiên cứu trong luận án là

hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu

nào khác. Các trích dẫn sử dụng trong luận án đã được ghi rõ tên tác giả tài liệu

tham khảo.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

TÁC GIẢ LUẬN ÁN NCS Phùng Khắc Huy Chú

Lời cảm ơn

Để hoàn thành được luận án, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà, Phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người thầy đã tận tâm, tận tình và nhiệt thành đã hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện thuận lợi và kịp thời trong những lúc khó khăn, vất vả để giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi chân thành cảm ơn các đồng chí lãnh đạo, chỉ huy Binh chủng Hóa học; các đồng chí lãnh đạo, chỉ huy, các đồng chí, đồng nghiệp công tác tại Phòng Khoa học quân sự và Viện Hóa học - Môi trường quân sự, Bộ Tư lệnh Hóa học đã hết sức giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi và tối đa về mặt tinh thần và một phần vật chất cho tôi khi tôi tham gia học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình. Bên cạnh đó, để có thể hoàn thành được luận án này, tôi chân thành cảm ơn ThS Đào Thị Ngọc Ánh, ThS Lê Việt Hưng, ThS Nguyễn Hải Vân cùng toàn thể các đồng nghiệp trong phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường,Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, làm việc nhóm một cách có hiệu quả để thực hiện một số nội dung liên quan đến luận án. Để hoàn thành chương trình nghiên cứu sinh đến được đích cuối cùng, tôi chân thành cảm ơn lãnh đạo, các thầy, các cô và các anh chị phụ trách đào tạo của Học viện Khoa học và Công nghệ, đặc biệt là lãnh đạo, các thầy, cô của Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình truyền đạt, chỉ dạy những kiến thức, kinh nghiệm và chia sẽ những khó khăn của bản thân tôi trong những năm tháng đã qua. Hoàn thành được luận án nghiên cứu này, tôi đã liên tục nhận được sự động viên to lớn của gia đình, dòng họ và đặc biệt là của “đồng chí vợ” đã luôn ở bên, chủ động khắc phục mọi khó khăn của gia đình nhỏ bé của tôi để động viên và tạo điểu kiện thuận lợi nhất để tôi yên tâm hoàn thành chương trình đào tạo tiến sỹ này. Tôi rất cảm ơn sự động viên, khích lệ của các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài đơn vị đã dành cho tôi. Luận án được thực hiện với sự tài trợ về kinh phí của Đề tài độc lập cấp Nhà nước: "Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gene, các enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin", Mã số DTDLCN.13/14 do PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà làm chủ nhiệm Đề tài.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

NGHIÊN CỨU SINH

Phùng Khắc Huy Chú

MỤC LỤC

Mục lục

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ và đồ thị

1

4 MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4 4 4 5 6 7 8 12 13 17 17 17 18 19 19 20 21 26 26 28 30 31

33 1.1. Laccase, laccase-like và vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-like 1.1.1. Giới thiệu chung về laccase 1.1.1.1. Cấu trúc phân tử của laccase 1.1.1.2. Cơ chế xúc tác của laccase 1.1.1.3. Một số đặc tính sinh hóa của laccase 1.1.1.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp laccase 1.1.1.5. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ 1.1.1.6. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ có clo 1.1.2. Giới thiệu về laccase-like 1.2. Đặc điểm ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và công nghệ xử lý 1.2.1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm và nước thải dệt nhuộm 1.2.1.1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm 1.2.1.2. Đặc điểm chủng của nước thải dệt nhuộm 1.2.2. Các phương pháp xử lý màu thuốc nhuộm 1.2.2.1. Phương pháp hóa lý 1.2.2.2. Phương pháp oxy hóa nâng cao 1.2.2.3. Phương pháp sinh học 1.3. Hiện trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam và các công nghệ xử lý 1.3.1. Hiện trạng ô nhiễm 1.3.2. Công nghệ xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm 1.3.3. Phương pháp phân hủy sinh học xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ 1.3.3.1. Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T, dioxin và các hợp chất tương tự bởi laccase 1.3.3.2. Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T, dioxin và các hợp chất tương tự bởi nấm sinh tổng hợp enzym ngoại bào

CHƯƠNG 2 40 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu để phân lập vi sinh vật và các chủng nấm kế thừa 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu xử lý 2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 2.1.4. Thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập, nuôi cấy vi sinh vật 2.2.1.1. Phân lập chủng nấm 2.2.1.2. Phân lập xạ khuẩn 2.2.1.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm sinh tổng hợp laccase cao 40 40 40 41 41 42 43 43 43 43

43

44 44 44 45 45 46 48 49 49 51 52 52

54

55 55

2.2.1.4. Nuôi cấy xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase-like trên các nguồn chất hữu cơ vòng thơm khác nhau 2.2.2. Phân loại vi sinh vật 2.2.2.1. Phân loại VSV theo hình thái khuẩn lạc 2.2.2.2. Phân loại VSV theo phương pháp sinh học phân tử 2.2.3. Phương pháp hóa - sinh 2.2.3.1. Xác định hoạt tính laccase, laccase-like sử dụng ABTS 2.2.3.2. Tinh sạch, nhận diện protein của laccase, laccase-like 2.2.3.3. Xác định đặc tính protein của laccase, laccase-like tinh sạch 2.2.4. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm 2.2.4.1. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like 2.2.4.2. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi chủng nấm 2.2.5. Xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 2.2.5.1. Thực nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng laccase thô 2.2.5.2. Thực nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng chủng nấm sinh tổng hợp laccase 2.2.5.3. Phương pháp phân tích để xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 2.3. Phương pháp xử lý số liệu CHƯƠNG 3 57

57

57

60

65

68 68 70 71 71 78 79 81 84 84 84 89 96

97

98 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng nấm và xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like 3.1.1. Phân lập và lựa chọn để phân loại nấm đảm có hoạt tính laccase cao 3.1.2. Phân lập và phân loại xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa chất diệt cỏ/dioxin và sinh tổng hợp laccase-like 60 3.1.2.1. Phân lập xạ khuẩn 3.1.2.2. Phân loại chủng xạ khuẩn XKBHN1 và XKBiR929 61 3.1.3. Môi trường để chủng nấm, chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase, laccase-like 64 3.1.3.1. Môi trường thích hợp để chủng nấm FBV40 sinh tổng hợp laccase 64 3.1.3.2. Khả năng sinh tổng hợp laccase-like của XKBHN1 và XKBiR929 trên môi trường chứa các chất hữu cơ clo khác nhau 3.2. Đặc điểm hóa-lý của laccase, laccase-like tinh sạch 3.2.1. Tinh sạch laccase của nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 3.2.2. Tinh sạch laccase-like của xạ khuẩn Streptomycese sp. XKBiR929 3.2.3. Đặc tính hóa-lý của laccase và laccase-like tinh sạch 3.2.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến laccase tinh sạch 3.2.3.2. Đặc điểm động học của laccase tinh sạch 3.2.3.3. Đặc tính hóa-lý của laccase thô 3.2.3.4. Đặc tính hóa - lý của laccase-like tinh sạch 3.3. Loại màu thuốc nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ chứa dioxin 3.3.1. Loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like 3.3.1.1. Loại màu thuốc nhuộm tổng hợp bởi laccase thô của chủng nấm FBV40 3.3.1.2. Loại màu hoạt tính sử dụng trong quân đội bởi laccase thô 3.3.1.3. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi Lac1 tinh sạch 3.3.1.4. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi laccase-like tinh sạch của chủng xạ khuẩn XKBiR929 3.3.2. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi Rigidoporus sp.FBV40

98

3.3.2.1. Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng để nhuộm vải may quân trang 3.3.2.2. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN ở các nồng độ khác nhau 3.3.2.3. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt D-glucose 3.3.2.4. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các loại đường khác nhau 3.3.2.5. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các nguồn nitơ khác nhau 3.3.3. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase và nấm sinh tổng hợp laccase 3.3.3.1. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase thô 3.3.3.2. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi nấm sinh tổng hợp laccase 101 102 103 106 108 108 112 121

123

124 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

Danh mục các chữ viết tắt

2,3,7,8-TCDD 2,4,5-T 2,4,5-TCP 2,4-D 2,4-DCP ABTS BH CDD CGK DBF DCĐ DD DBP đtg HBT HCHC LiP LMCO MN.FBN MnP MR.EBR MT.BES MY.BES MY.EG MCDD NN.SG NY.FN2R NY.S3R NY1 NY5 NY7 PAH PCB PCDDs PCDFs POPs ppm ppt RBBR TBP VA ViO VK VSV 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-trichlorophenol 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2,4-dichlorophenol 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) Sân bay Biên Hòa Chất diệt cỏ chứa dioxin Chất gắn kết Dibenzofuran Dịch chiết đất Dibenzo-p-dioxin Dibromophenol Đồng tác giả 1-Hydroxybenzotriazole Hợp chất hữu cơ Lignin peroxidase Laccase multicopper oxidase Megafix navy FBN Mangan peroxidase Megafix red EBR Megafix turquoise BES Megafix yellow BES Megafix yellow EG Mono chlorodibenzo-p-dioxin Nova navy SG Nova yellow RN2R Nova yellow S3R acid red 299 acid blue 281 acid red 266 Polycyclic Aromatic Hydrocacbon = hydrocacbon đa nhân Polychlorinatedbiphenyl Polychlorinated dibenzo-p-dioxin Polychlorinated dibenzofuran Các hợp chất hữu cơ khó phân hủy Parts per million (mg/kg) Parts per trillion (ng/kg) Remazol Brilliant Blue R Tribromophenol Valli anilin Violuric acid Vi khuẩn Vi sinh vật

Danh mục bảng

Bảng Trang

Bảng 1.1 9

Bảng 1.2 10

Bảng 1.3 Bảng 1.4 Bảng 1.5 12 17 20

Bảng 1.6 23

Bảng 1.7 Bảng 1.8 30 36

Bảng 2.1 49

Bảng 2.2 52

Bảng 3.1 Bảng 3.2 58 61

Bảng 3.3 61

Bảng 3.4 75

Bảng 3.5 Bảng 3.6 76 78

Bảng 3.7 79

Bảng 3.8 87

Bảng 3.9 89

Bảng 3.10 104

Bảng 3.11 109

Bảng 3.12 110

Bảng 3.13 112

Bảng 3.14 113

Bảng 3.15 117 Tên bảng Ứng dụng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm Khả năng sinh laccase và hiệu suất phân hủy PAH, thuốc bảo vệ thực vật ở Việt Nam Ứng dụng của laccase trong phân hủy các chất hữu cơ có clo Phân loại màu và tính chất các màu thuốc nhuộm Các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm Ứng dụng của laccase trong phân hủy sinh học thuốc nhuộm Các công nghệ có thể xử lý đất, trầm tích ô nhiễm dioxin Phân hủy các đồng loại dioxin bởi nấm đảm Tổng hợp các thực nghiệm nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi nấm đảm sinh tổng hợp laccase Đặc điểm mẫu nấm đã phân lập được Hoạt tính laccase-like của các chủng xạ khuẩn Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hai chủng xạ khuẩn XKBHN1 và XKBiR929 Ảnh hưởng của chất ức chế lên hoạt tính Lac1, Lac2 của FBV40 Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính Lac1 và Lac2 Quan hệ giữa nồng độ ABTS với hoạt tính laccase tinh sạch Các yếu tố môi trường ảnh hưởng tới hoạt tính laccase thô của FBV40 So sánh hiệu suất loại màu thuốc nhuộm sử dụng laccase từ FBV40 và các chủng nấm đảm khác Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm và biến động hoạt tính laccase theo thời gian (%) Biến động hoạt tính laccase trong quá trình loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bởi FBV40 trong môi trường chứa các loại đường khác nhau Khả năng phân hủy 2,4,5-T tinh khiết bằng laccase thô chủng FBV40 Khả năng phân hủy chất diệt cỏ và các chất ô nhiễm khác bằng laccase thô Khả năng phân hủy 2,4,5-T trong đất ô nhiễm bởi chủng FBV40 Khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T trong đất bởi đơn chủng FBV40 và hỗn hợp chủng FBV40, FBD154 và FNBLa1 Khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD bởi đơn chủng và hỗn hợp chủng

Danh mục hình

Tên hình Hình Hình 1.1 Trang 5

22 Hình 1.2

Hình 2.1 42

Hình 3.1 58

Hình 3.2 60

Hình 3.3. 62

Hình ảnh cấu trúc không gian ba chiều của laccase Cơ chế giả định sự phân hủy 3-(2-hydroxy-1-naphthylazo) benzenesulfonic Acid bởi laccase Sơ đồ thực hiện nghiên cứu Hỉnh ảnh sợi, bào tử dưới kính hiển vị điện tử và ảnh phân lập mặt trước, mặt sau của chủng FBV40 Cây phát sinh chủng loài chủng nấm FBV40 Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử chủng XKBHN1 (A, C) và chủng XKBiR929 (B, D) Cây phát sinh chủng loài 2 chủng XKBHN1 và XKBiR929 Hoạt tính laccase thô chủng FBV40 ở các môi trường nuôi cấy Khả năng sinh tổng hợp laccase-like theo thời gian Hoạt tính laccase tinh sạch của chủng FBV40

Hoạt tính laccase-like tinh sạch của chủng XKBiR929

Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Diện di protein chủng FBV40 Hình 3.9 Hình 3.10 Phản ứng oxy hóa của laccase-like tinh sạch với ABTS Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH lên Lac 1, Lac 2/FBV40 Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ bền nhiệt lên hoạt tính Hình 3.13 Cơ chất đặc hiệu đối với Lac1 (A) và Lac 2 (B) 63 65 67 69 69 70 71 72 73 74

Hình 3.14 76 Ảnh hưởng của chất ức chế lên Lac 1 (A), Lac 2 (B) của chủng FBV40 Hình 3.15 Ảnh hưởng của ion kim loại lên Lac 1, Lac 2/FBV40 77

Hình 3.16 78

Hình 3.17 81

Hình 3.18 82

Hình 3.19 85

Hình 3.20 85

Hình 3.21 86

Hình 3.22 91

Hình 3.23 93

Hình 3.24 95 Mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất với hoạt tính Lac1 (A) và Lac2 (B) Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính (A) và độ bền pH (B); ảnh hưởng của nhiệt độ (C, D); động học xúc tác (E, G) và ảnh hưởng của chất ức chế và ion kim loại (H, K) lên hoạt tính laccase thô của chủng FBV40 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính (A) và độ bền (B); động học xúc tác (C, D) và ảnh hưởng của chất ức chế (E) và ion kim loại (G) lên laccase-like tinh sạch của XKBiR929 Khả năng loại màu NY1 (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase theo thời gian (B) Khả năng loại màu NY5 (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase theo thời gian (B) Khả năng loại màu NY7 (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase theo thời gian (B) Phổ UV-Vis và hình ảnh loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính thương mại của Nhà máy X20/TCHC Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt ViO ở các nồng độ khác nhau Khả năng loại màu và hoạt tính laccase theo thời gian đối với thuốc nhuộm MN.FBN Hình 3.25 Khả năng loại màu và hoạt tính laccase theo thời gian đối với 95

Hình Tên hình Trang

Hình 3.26 96 thuốc nhuộm NN.SG Khả năng loại màu và thay đổi hoạt tính laccase theo thời gian loại màu MN.FBN khi có mặt D-glucose Hình 3.27 Loại màu MN.FBN bởi Lac1 97

Hình 3.28 97

Hình 3.29 99

Hình 3.30 100

Hình 3.31 100

Hình 3.32 101

Hình 3.33 102

Hình 3.34 102

Hình 3.35 104

Hình 3.36 104

Hình 3.37 105

Hình 3.38 106

Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng laccase-like của chủng XKBiR929 Khả năng loại màu và sự biến động hoạt tính laccase theo thời gian trong loại màu thuốc nhuộm MY.EG, MY. BES, MN.FBN Phổ UV-Vis của thuốc nhuộm MN.FBN sau khi nuôi cấy bằng FBV40 sau 1 ngày (A) và sau 4 ngày (B) Khả năng loại màu MN.FBN bằng chủng FBV40 sau 1 ngày (A) và sau 4 ngày nuôi cấy (B) Khả năng loại màu MN.FBN và hoạt tính laccase của chủng FBV40 Sự thay đổi màu MN.FBN bằng chủng FBV40 ở các nồng độ thuốc nhuộm 50, 100 và 200 mg/L sau 1 ngày (A), 2 ngày (B) và sau 3 ngày (C) Khả năng loại màu bằng chủng FBV40 với nồng độ D-glucose khác nhau Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng chủng FBV 40 (A) và hoạt tính laccase (B) theo thời gian trong môi trường nuôi cấy chứa các loại đường khác nhau Phổ UV-Vis của màu thuốc nhuộm MN.FBN được loại bằng chủng FBV40 trong môi trường chứa các loại đường sau 4 ngày nuôi cấy Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng chủng FBV40 trong môi trường chứa các loại đường khác nhau sau 2 ngày (A), 3 ngày (B) và sau 7 ngày (C) Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng chủng FBV 40 (A) và hoạt tính laccase (B) theo thời gian khi sử dụng các hợp chất chứa nitơ 109 Hình 3.39 Hoạt tính laccase theo thời gian xử lý DCĐ

Hình 3.40 110

Hình 3.41 111

Hình 3.42 113

Hình 3.43 114

Hình 3.44 116 Hàm lượng và hiệu suất phân hủy 2,4,5-T (A), hoạt tính laccase thô theo thời gian (B) Hiệu suất phân hủy 2,4,5-T trong đất (A) và sự biến động hoạt tính laccase thô theo thời gian (B) Khả năng phân hủy 2,4,5-T trong đất (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase thô theo thời gian (B) Khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T trong đất (A) và sự biến động hoạt tính laccase thô theo thời gian (B) Khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD (A) và quá trinh sinh tổng hợp laccase theo thời gian (B)

1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, ô nhiễm bởi các loại hóa chất trong đó có các chất

hữu cơ khó phân hủy (POPs) do con người tạo ra ngày càng được phát hiện nhiều, mức

độ ngày càng nghiêm trọng và hậu quả gây nên rất nhiều hệ lụy cho sức khỏe con

người, môi trường và hệ sinh thái. Các chất gây ô nhiễm môi trường phổ biến trong

nước thải công nghiệp hiện nay ở Việt Nam gồm các hợp chất của phenol, các hợp chất

đa vòng thơm chứa halogen và thuốc nhuộm, v.v. Ở các nước đang phát triển như Việt

Nam, việc sử dụng và xả thải hóa chất trong nông nghiệp, công nghiệp, y dược và các

ngành sản xuất khác không có khả năng kiểm soát đã gây nên những hậu quả nghiêm

trọng với môi trường và con người. Nhiều chất ô nhiễm được thải ra môi trường có độc

tính cao, thời gian bán hủy dài, khả năng tích lũy cao ở các dạng khác nhau trong hệ

sinh thái dẫn đến giảm đa dạng sinh học và xuất hiện nhiều loại bệnh hiểm nghèo.

Ngoài ra, ô nhiễm thuốc bảo vệ thực vật, các chất diệt cỏ chứa dioxin có nguồn gốc từ

chiến tranh hoặc nước thải ngành dệt nhuộm vẫn hàng ngày âm thầm gây tác động lớn

tới môi trường và sức khỏe con người. Những chất ô nhiễm này đều là những chất rất

bền vững và khó bị phân hủy bằng các công nghệ, giải pháp đơn giản nên để tiến tới xử

lý triệt để ô nhiễm cần tính tới các giải pháp tích hợp các công nghệ, giải pháp để xử lý

và quản lý bền vững. Với các thành tựu khoa học công nghệ ngày càng được nâng cao

và hướng tiếp cận sử dụng tổ hợp các chuỗi công nghệ, giải pháp thì khả năng xử lý

triệt để hoàn toàn các chất ô nhiễm trên ngày càng có tính khả thi cao hơn.

Đến nay, di chứng của dioxin tới nạn nhân chất độc màu da cam đã đến thế hệ

thứ 4. Trong hai thập kỷ qua các nghiên cứu ở quy mô khác nhau đều nhằm tìm kiếm

các công nghệ khả thi để xử lý khử độc ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong môi trường

phù hợp với điều kiện Việt Nam. Nhiều nghiên cứu từ năm 1999 trong phòng thí

nghiệm, quy mô pilot và hiện trường sử dụng công nghệ phân hủy sinh học

(bioremediation) đã chứng minh là một trong các giải pháp có hiệu quả cao về công

nghệ, kinh tế và môi trường. Ở quy mô hiện trường, sử dụng công nghệ phân hủy sinh

học đã xử lý hoàn toàn 3.384m3 đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin, kết quả đã được Hội

đồng khoa học độc lập cấp Nhà nước của Bộ Khoa học và Công nghệ đánh giá, sau 40

tháng xử lý tổng độ độc trung bình trong các lô xử lý sinh học tại sân bay Biên Hòa chỉ

còn 14,12 ngTEQ/kg đất khô (99,6% độ độc đã bị loại bỏ), thấp dưới ngưỡng quy định

cho đất sử dụng trồng cây hàng năm theo QCVN45:2012 (40 ng TEQ/kg) [29].

2

Cho đến thời điểm này, chưa có thông báo nào liên quan đến xử lý chất diệt

cỏ/dioxin ở các quy mô khác nhau bằng các vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào,

enzyme thô do chúng sinh ra nói chung và laccase nói riêng. Trong khi đó, Việt Nam

là một nước nhiệt đới có đa dạng sinh học cao nằm trong top 10 của thế giới, đặc biệt

là đa dạng vi sinh vật. Có nhiều loài vi sinh vật sinh tổng hợp các loại enzyme khác

nhau, trong đó có hai họ oxidoreductase và peroxidase với nhiều ứng dụng mang hiệu

quả cao trong các lĩnh vực kinh tế, bảo vệ sức khỏe con người và môi trường.

Laccase thuộc nhóm oxidoreductase có khả năng hoạt động mạnh chỉ cần oxy tự do

để oxy hóa nhiều loại hợp chất hữu cơ vòng thơm trong thời gian ngắn. Chúng đã trở

thành tâm điểm của nhiều nghiên cứu sàng lọc, sản xuất công nghiệp của hàng trăm

phòng thí nghiệm và công ty trên toàn thế giới.

Chính vì vậy, đề tài nghiên cứu của nghiên cứu sinh với tên “Nghiên cứu khả

năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh

vật sinh enzyme laccase” đã được tiến hành với mục đích tìm kiếm các chủng vi sinh

vật có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like để có thể sử dụng trong phân hủy

các chất ô nhiễm đa vòng thơm chứa và không chứa clo, cụ thể là hỗn hợp chất diệt

cỏ/dioxin và thuốc nhuộm hoạt tính. Kết quả thu được sẽ giúp chúng ta hiểu sâu sắc

thêm về tiềm năng của laccase, laccase-like và bản thân chủng vi sinh vật sinh tổng

hợp chúng nhằm hướng tới nghiên cứu tạo công nghệ khả thi để xử lý các chất ô

nhiễm hữu cơ tồn tại trong môi trường.

Mục tiêu:

- Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh laccase, laccase-like từ khu vực

rừng Quốc gia Ba Vì, trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa;

- Đánh giá khả năng phân hủy các chất diệt cỏ chứa dioxin và loại màu thuốc

nhuộm hoạt tính bởi laccase, laccase-like và chủng VSV được lựa chọn nhằm định

hướng áp dụng trong hoạt động quốc phòng.

Nội dung chính của luận án cần thực hiện:

 Phân lập, phân loại nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh laccase và laccase-like có tiềm

năng cao từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì và đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin

khu vực Z1 và khu vực mới Tây Nam (Pacer Ivy) sân bay Biên Hòa, Đồng Nai;

 Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh tổng

hợp laccase, laccase-like cao;

3

 Chiết tách và tinh sạch laccase, laccase-like từ đại diện nấm, xạ khuẩn có hoạt

tính enzyme cao đã được phân lập;

 Nghiên cứu đặc tính hóa-lý, hóa-sinh cơ bản của laccase, laccase-like tinh sạch;

 Đánh giá hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp, thuốc nhuộm hoạt tính bởi

laccase, laccase-like và bản thân chủng VSV sinh tổng hợp laccase, laccase-like;

 Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T tinh khiết và có

trong đất ô nhiễm (dịch chiết đất -DCĐ) tại sân bay Biên Hòa bởi laccase,

đơn chủng và hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase;

 Đánh giá hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD bằng đơn chủng và hỗn

hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase;

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Công trình đầu tiên nghiên cứu tinh sạch và đặc tính laccase-like được sinh

tổng hợp bởi chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. XKBiR929 và khả năng của laccase-like

trong loại màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại MN.FBN;

2. Chứng minh được nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 có hoạt tính laccase

thô lên tới 107.708 U/L và tiềm năng cao trong loại màu thuốc nhuộm tổng hợp gốc

azo, anthraquinone và đặc biệt là màu thuốc nhuộm thương mại được sử dụng trong

quân đội;

3. Khẳng định nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 đồng thời có khả năng phân

hủy được các chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T và đồng loại độc nhất của dioxin là

2,3,7,8-TCDD. Bên cạnh đó, đã làm sáng tỏ hỗn hợp các loài nấm khác nhau (nấm

đảm và nấm sợi) có khả năng sinh tổng hợp laccase phân lập từ thiên nhiên Việt Nam

không chỉ phân hủy được 2,4-D, 2,4,5-T mà còn phân hủy được cả đồng loại 2,3,7,8-

TCDD đạt hiệu suất cao hơn gấp 2 lần khi chỉ sử dụng đơn chủng với tổng độ độc ban

đầu tới 2000 ng TEQ/L;

Hy vọng với kết quả ban đầu của công trình nghiên cứu này sẽ góp phần định

hướng tiếp cận trong triển khai các nghiên cứu tiếp theo, để sáng tạo nên các chuỗi

công nghệ mang tính đột phá trong sử dụng hỗn hợp vi sinh vật và các chất có hoạt tính

sinh học do chúng sinh tổng hợp như laccase, laccase-like đều có tiềm năng cao để giải

quyết vấn đề ô nhiễm màu thuốc nhuộm trong hoạt động quốc phòng và xử lý các chất

ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy (POPs) trong đó có chất diệt cỏ chứa dioxin.

4

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Laccase, laccase-like và vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-like

1.1.1. Giới thiệu chung về laccase

Laccase ngày càng được quan tâm nhiều hơn trong những năm gần đây do

tiềm năng của chúng trong việc phân hủy, khử độc các chất ô nhiễm là các hợp chất

của phenol và các chất đa vòng thơm [142]. Laccase thuộc nhóm oxidoreductase là

một trong số ít các enzyme đã được nghiên cứu từ thế kỷ thứ 19. Năm 1883,

Yoshida là người đầu tiên mô tả laccase từ dịch chiết thân cây Rhus vernicifera ở

Nhật Bản [52]. Laccase có hiệu quả oxy hóa với phổ cơ chất rộng và do chỉ sử dụng

oxy là tác nhân nhận điện tử cuối cùng nên nó được áp dụng trong nhiều ngành

công nghiệp với những mục đích khác nhau như dệt nhuộm, chế biến thức ăn, nhiên

liệu sinh học, tổng hợp hữu cơ, xử lý môi trường, giấy và nước thải, dược phẩm và

công nghiệp mỹ phẩm. Thực tế, đã có một số sản phẩm laccase thương mại để ứng

dụng trong các lĩnh vực chế biến thức ăn, giấy, dệt nhuộm và các ngành công

nghiệp khác [89, 155].

1.1.1.1. Cấu trúc phân tử của laccase

Một loài sinh vật có thể sinh tổng hợp có nhiều loại laccase khác nhau (các

isozyme) và các isozyme thường khác nhau về trình tự axit amin và tính chất động

học xúc tác. Isozyme laccase khác nhau ở mức độ glycosyl hóa và thành phần các

gốc carbonhydrat. Loài nấm đảm Trametes versicolor có 5 loại isozyme chỉ khác

nhau về thành phần carbonhydrate, thành phần carbonhydrat của chúng thay đổi từ

10-45% so với khối lượng của protein. Phân tử laccase có khối lượng phân tử dao

động trong khoảng 60-100 kDa. Phần lớn laccase của nấm có bản chất là

glycoprotein với hàm lượng carbonhydrate chiếm khoảng 10-25% [72].

Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4

nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này được chia thành ba nhóm: loại 1 (T1),

loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế

điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ

điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện

tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh.

5

Hình 1.1. Hình ảnh cấu trúc 3 chiều của laccase (A) của chủng Bacillus subtilis 168. Ion màu xanh là 4 nguyên tử đồng. (B) số lượng nghiên cứu công bố về các loại enzyme trong giai đoạn 1940 - 2013 [9] Cấu trúc 3 chiều của laccase bao gồm 3 tiểu phần (vùng A: màu đỏ, vùng B:

màu vàng và vùng C: màu xanh lá cây) có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần

đều đóng vai trò trong quá trình xúc tác. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng

B và vùng C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử

đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C [147]. Trung tâm đồng một chỉ chứa

một nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc

cystein. Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng

hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh

nước biển đặc trưng. Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp

nguyên tử đồng T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ trong khi

các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ (Hình 1.1) [99].

1.1.1.2. Cơ chế xúc tác của laccase

Cơ chất khi bị oxy hóa bởi laccase sẽ nhường một electron cho nguyên tử

đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có

cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase

dạng khử, thông qua hợp chất trung gian peroxy và peroxy bị khử thành nước. Một số

nhà nghiên cứu cho rằng, sự oxy hóa hợp chất peroxy trung gian hình thành laccase ở

trạng thái bị oxy hoạt hóa, trong đó cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái oxy hóa.

Sau đó, enzyme nhanh chóng tham gia vào chu trình xúc tác mới [99].

Ngoài ra, cơ chế xúc tác có thể diễn ra theo cách khác đó là khi các cơ chất bị

oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm. Các phân

6

tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế oxi hóa khử quá lớn, vì vậy

chúng không thể tiếp cận được trung tâm xúc tác của laccase. Trong trường hợp này

cần một chất gắn kết (mediator) hoặc hệ chất gắn kết để tiếp xúc với trung tâm phản

ứng của laccase để bị laccase oxy hóa, sau đó mediator ở dạng oxy hóa nhận một điện

tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác [117]. Ngược

lại, laccase sau khi cho mediator một điện tử thì trở thành dạng khử, sau đó bị oxy

hóa thành dạng oxy hóa và tiếp tục tham gia vào chu trình xúc tác tiếp theo. Các

mediator thường phù hợp cho laccase là 3-hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2’-

azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic axit) (ABTS), N-hydroxybenzo-

trialzone (HOBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid (ViO) v.v. Sự có mặt của

mediator đã góp phần làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất

của laccase.

1.1.1.3. Một số đặc tính sinh hóa của laccase

Đến nay, đã có khoảng 100 loại laccase khác nhau đã được tinh sạch và xác

định đặc điểm sinh hóa với các cơ chất là ABTS, 2,6-DMP và SGZ. Gene laccase

đặc biệt mã hoá cho một protein khoảng 500 - 600 amino acid và trọng lượng phân

tử trong khoảng 60 đến 90 kDa khi được xác định bằng SDS-PAGE [156]. Đến

tháng 9 năm 2017, có khoảng 112.000 kết quả tra cứu các tiêu đề bài báo khoa học

có từ khóa laccase (https://scholar.google.com.vn).

Đã có một vài hệ gene của các chủng nấm có chứa hơn một gene laccase [36].

Mức độ biểu hiện của các gene điển hình khác nhau phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy

[145]. Với hàm lượng nitơ cao trong môi trường đã giảm sự dịch mã của gene laccase

trong chủng Basidiomycete sp. I-62 (CECT 20197) và loài Pleurotus sajorcaju [18].

Có nhiều bước được sử dụng trong quá trình tinh sạch protein laccase như siêu lọc

(lọc thẩm thấu màng), kết tủa với amoni sulfat hoặc với dung môi hữu cơ và trao đổi ion

cũng như sắc ký khối lượng. Laccase đại diện của nấm là các protein có khối lượng trong

khoảng 50 đến 90 kDa, điểm đẳng điện xung quanh giá trị 4.0. Một số loài nấm sinh tổng

hợp laccase đã được nghiên cứu bao gồm Coprinus plicatilis, Fomes fomentarius,

Heterobasidion annosum, Hypholoma fasciculare, Kuehneromyces mutabilis, Leptoporus

litschaueri, Panus stipticus, Phellinus igniarius, Pleurotus corticatus, P. ostreatus,

Polyporus brumalis, Stereum hirsutum, Trametes gibbosa, T. hirsuta, và T. versicolor có

hơn một isozyme và điểm đẳng điện (pI) trong khoảng từ 3 đến 5 [4].

7

Khả năng xúc tác của enzyme đã được mô tả thông qua định lượng bằng hằng

số Michaelics Km và hằng số hiệu quả xúc tác Kcat. Những hằng số này đã được công

bố với một lượng lớn laccase và có sự khác biệt trong số chúng. Hằng số Km của

laccase nhìn chung dao động xung quanh giá trị 2,5 𝜇M phụ thuộc vào nguồn gốc

enzyme và cơ chất. Giá trị Km của laccase được xác định với cơ chất là 2,6-

dimethoxyphenol nhìn chung là cao hơn khi xác định với syringadazine (sự trùng hợp

của hai phân tử là 2,6-dimethoxyphenol được liên kết với nhau bằng cầu azide) [117].

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và các điều kiện nhiệt độ lên hoạt tính

laccase đã được thực hiện. Theo đó, sự biến động hoạt tính của laccase theo pH

thường có hình chuông và khoảng tối ưu xung quanh giá trị 4,6 khi sử dụng cơ

chất có nguồn gốc phenol [139]. Hoạt tính laccase giảm trong điều kiện pH trung

tính hoặc kiềm là do tăng anion - OH, anion này có kích thước nhỏ nên là tác

nhân gây ức chế hoạt tính của laccase. Khi pH tăng thế khử của cơ chất có bản

chất phenol giảm dẫn đến cơ chất này nhạy cảm hơn với quá trình oxy hoá bởi

laccase [47, 48]. Sự ổn định hoạt tính laccase đối với pH nhìn chung trong

khoảng từ 8-9 [175] và sự ổn định hoạt tính của laccase theo nhiệt độ thay đổi

phụ thuộc lớn vào nguồn gốc vi sinh vật, nhìn chung nằm trong khoảng từ 30 đến

50oC và hoạt tính giảm nhanh chóng ở nhiệt độ trên 60oC [114, 94].

1.1.1.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp laccase

Laccase từ thực vật được tìm thấy trong xylem nơi chúng có thể oxy hóa các

monoligno ở trạng thái ban đầu của quá trình lignin hóa và cũng tham gia trong các

cơ chế gốc cơ bản của sự hình thành lignin cao phân tử [79]. Thêm vào đó laccase

đã được nghiên cứu về khả năng tham gia vào bước đầu tiên của quá trình hàn gắn

vết thương trên lá [133]. Hiện tại, nghiên cứu về laccase thực vật bậc cao còn rất

hạn chế so với laccase từ các chủng nấm [113, 147].

Thực tế, một số nghiên cứu về hoạt tính laccase ở vi khuẩn không giống

laccase ở các nhóm nhân sơ [24]. Protein laccase của vi khuẩn là protein nội bào

hoặc ở khoang chu chất [4]. Chủng Bacillus subtilis đã sinh ra loại laccase CotA ổn

định nhiệt tham gia vào sự hình thành màu ở màng nội bào [88].

Laccase cũng đã được tìm thấy từ loài Streptomyces cyaneus [3] và S.

lavendulae. Laccase đã được nghiên cứu khá chi tiết ở nhiều chủng nấm thuộc nấm sợi

(Ascomycetes) và nấm đảm (Basidiomycetes) và chúng đã được tinh sạch từ nhiều

8

chủng khác nhau. Có nhiều nghiên cứu về sản phẩm laccase tinh sạch của các loài nấm

Ascomycetes như loài Melanocarpus albomyces [69], Cerrena unicolor [70],

Magnaporthe grisea [19], Trametes versicolor, Trichoderma reesei [81] và Xylaria

polymorpha [102].

Nấm men là nhóm riêng biệt có thể thuộc cả Ascomycetes và Basidiomycetes.

Hiện nay, laccase được tinh sạch từ chủng Cryptococcus (Filobasidiella)

neoformans gây bệnh cho người, chủng nấm men này sinh ra laccase thật có khả

năng oxy hóa phenol và aminophenol và cũng có thể oxy hóa tyrosine [34]. Ngoài

ra, laccase còn có thể tìm thấy trong một số côn trùng nơi mà chúng được cho là thể

kích hoạt quá trình hình thành biểu bì [35].

Ngày này, các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực nghiên cứu sàng lọc từ tự

nhiên các chủng nấm sinh tổng hợp laccase với mong muốn tìm được chủng có

hoạt tính cao và có đặc tính mới. Hoạt tính laccase thay đổi phụ thuộc vào các

loài, các chủng vi sinh vật, vì ở điều kiện tự nhiên hoạt tính laccase rất thấp.

Việc lựa chọn, sàng lọc các chủng có khả năng sinh tổng hợp laccase từ tự nhiên

là bước rất quan trọng sau đó là tối ưu các điều kiện môi trường nuôi cấy để

chúng sinh tổng hợp laccase cao hơn với các đặc tính vượt trội hơn [112].

1.1.1.5. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm

Ứng dụng của chủng nấm và enzyme trong xử lý các chất ô nhiễm môi trường

đã được nghiên cứu. Trong đó, laccase có khả năng phân hủy và khử độc có hiệu quả

các hợp chất hữu cơ khó phân hủy đã nhận được nhiều sự quan tâm trong lĩnh vực công

nghệ sinh học [16] và chúng cũng đã được sử dụng như các sensor sinh học trong quan

trắc, xử lý ô nhiễm môi trường trong các lĩnh vực công nghiệp dệt, thức ăn, xử lý gỗ,

dược và hoá chất [125].

Laccase có khoảng cơ chất đặc hiệu rộng nên có thể oxy hoá với phạm vi lớn

các chất độc sinh học ngoại lai bao gồm các hợp chất phenol có clo [151], thuốc trừ

sâu [120], các hợp chất hữu cơ đơn và đa vòng thơm được khai thác từ các nhiên

liệu hoá thạch [10].

Laccase tinh sạch từ loài Coriolopsis gallica oxy hoá carbozole, N-

ethylcarbozole, fluorine và dibenzothiophene khi có mặt 1-hydroxybenzotriazole và

2.2-azinobis (3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid như là một chất gắn kết [8].

9

Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã chứng minh rằng phenol và các

amin thơm có thể bị loại bỏ khỏi nước khi sử dụng laccase. Cơ chế của quá trình

này là sự oxy hoá của enzyme với các chất ô nhiễm thành các cấu tử tự do hoặc

quinone và sau đó là quá trình kết tủa từng phần [164].

Bảng 1.1. Ứng dụng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm

Hợp chất Nguồn gốc laccase Cơ chất Hình thức

Phenols

- Nuôi cấy Chlorophenols, cresols, nitrophenols

Laccase tái tổ hợp Trametes sanguineus biểu hiện trong Trichoderma atroviride Technical nonylphenol Phoma sp. UHH 5-1-03 Tự do

P. ostreatus Tự do Oxybenzone, pentachlorophenol SA ABTS, HBT, HPI, TEMPO, SA,

SA Nuôi cấy 4-tert-butylphenol, 4- tert-octylphenol

2,4-dichlorophenol Tự do - Laccase tái tổ hợp Myceliophthora biểu hiện trong Aspergillus oryzae Pycnoporus sanguineus CS43

Các chất làm hỏng hệ miễn dịch

Bisphenol A (BPA) HBT Tự do

BPA Nuôi cấy -

BPA ABTS Nuôi cấy Coriolopsis gallica, Bjerkandera adusta, T. versicolor Laccase tái tổ hợp T. sanguineus biểu hiện trong T.atroviride Laccase tái tổ hợp T. versicolor biểu hiện trong S.cerevisiae

Các hợp chất hydrocarbon (PAHs)

ABTS Tự do 15 loại PAHs (theo US EPA) Laccase tái tổ hợp B. subtilis CotA biểu hiện trong E. coli

- T. versicolor (Sigma- Aldrich) Naphthalene, phenanthrene Cố định lên đất sét hoạt tính

Tự do - Benzo[a]pyrene, phenanthrene Laccase tái tổ hợp T. sanguineus biểu hiện trong T.atroviride

Laccase được tinh sạch từ chủng nấm đảm trắng Basidiomycete, Trametes

villosa có khả năng phân huỷ bisphenol A, đây là một chất gây biến đổi hệ nội tiết

[123]. Các chất phenol đang thu hút nhiều sự quan tâm vì khả năng gây tác động tới

10

các hormon tự nhiên ở các động vật có xương sống. Chúng là sản phẩm từ sự phân

huỷ sinh học không triệt để của các nonylphenol polyethoxylates (NPEOs) được sử

dụng rộng rãi trong các chất hoạt động bề mặt không ion trong các quá trình công

nghiệp. Cả nonyphenol và NPEOs được thải vào môi trường chủ yếu từ quá trình xử

lý nước thải không triệt để [85]. Laccase từ các thực vật thuỷ sinh Clavariopsis

aquatica đã được chứng minh là có khả năng phân huỷ các chất nonylphenol gây

các triệu trứng thay đổi nội tiết tố [12]. Một số ứng dụng của laccase trong phân hủy

các hợp chất hữu cơ trên thế giới được trình bày ở Bảng 1.1 [173].

Như vậy có thể thấy có rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh về khả năng của

laccase được sinh tổng hợp từ nhiều loài vi sinh vật hay tái tổ hợp trong phân hủy

các hợp chất hữu cơ khác nhau với sự có mặt hay không có mặt của các chất gắn kết

và ở các dạng tồn tại tự do hoặc được cố định lên các loại vật liệu khác nhau. Qua

đó cho thấy sự đa dạng của chủng loại, cách thức sử dụng của laccase trong xử lý

các hợp chất hữu cơ.

Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về laccase và ứng dụng của nó

trong loại màu thuốc nhuộm và xử lý các hợp chất hữu cơ, các hợp chất của phenols.

Khả năng sinh laccase và hiệu suất phân hủy dịch chiết đất (DCĐ) ô nhiễm chất diệt

cỏ chứa chủ yếu đồng loại dioxin 2,3,7,8-TCDD, PAH, thuốc bảo vệ thực vật thuộc

POPs từ một số công trình có liên quan được trình bày ở Bảng 1.2. Loại laccase được

sinh bởi các chủng liệt kê ở Bảng 1.2 đã thể hiện sự khác biệt so với laccase thật bởi

khi đun vài giờ chúng vẫn phân hủy được các chất hữu cơ đa vòng thơm. Những kết

quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng và khả năng rất cao của chủng vi sinh vật sinh tổng

hợp laccase từ thiên nhiên của Việt Nam trong việc xử lý các chất ô nhiễm có vòng

thơm.

STT Tham khảo

1

Đặng Thị Cẩm Hà et al., 2009 [30]

2

Bảng 1.2. Khả năng sinh laccase và hiệu suất phân hủy PAH, thuốc bảo vệ thực vật ở Việt Nam Nghiên cứu Vi khuẩn Achromobacter sp. BQNT2 được phân lập từ nước thải chứa 1600 mg/L TNT. Chủng BQNT2 sinh laccase với hoạt tính 15 U/L trên môi trường muối khoáng chứa 100 mg/L TNT Nấm sợi Aspergillus sp. FNA33 phân lập từ đất đang xử lý khử độc ô nhiễm hỗn hợp các thuốc trừ sâu trong bioreactor hiếu khí. Chủng nấm sợi này có khả năng sinh Đặng Thị Cẩm Hà et al., 2009 [31]

11

STT Tham khảo

3

Đào Thị Ngọc Ánh et al., 2011 [32]

4

Nguyễn Thị Lan Anh et al., 2011 [109]

5

Trần Thị Thu Hiền et al., 2013 [152]

6

Hoàng Thị Nhung et al., 2012 [58]

7

Nguyễn Quang Huy et al., 2012 [108]

8

Đàm Thúy Hằng et al., 2012 [28]

Nghiên cứu tổng hợp mangan peroxidase với hoạt tính 434,5 U/L và laccase với hoạt tính 4,3 U/L trên môi trường muối khoáng bổ sung 0,5% glucose và chứa 300 ppm HCH. Nấm sợi Aspergillus sp. FNA1 được phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu. Ngoài khả năng phân hủy DDT, FNA1 còn sinh enzyme laccase với hoạt tính cao nhất sau 1 ngày nuôi cấy là 1.608 U/L trên môi trường Czapek nghèo bổ sung 0,2% Tween 80, ở pH 5, nhiệt độ 30°C, 0,1% NaCl và trên nguồn chất độc là DDT. Xạ khuẩn Streptomyces sp. XKDNP22 được phân lập trong lô xử lý đất diệt cỏ/dioxyn tại sân bay Đà Nẵng. Chủng XKDNP22 được nuôi trên môi trường GauseM 1/5 bổ sung 4g dịch chiết malt, DCĐ và 6 g/L KNO3 cho hoạt tính laccase là 4.688 U/L Nấm sợi Myrothecium sp. FNBLa1 phân lập từ rơm mục ở Ninh Bình. Chủng FNBLa1 có khả năng sinh laccase cao với hoạt tính là 30.016 U/L sau 96h ở pH 6,5, chất cảm ứng là 0,1 mM CuSO4, 12 g/L glucose, hỗn hợp1 g/L casein và 3 g/L NaNO3. Hoạt tính laccase cao nhất khi nuôi cấy bằng bioreactor có dung tích 15 lít là 10.410 U/L sau 57 giờ. Nấm sợi Trichoderma sp. FCP3 phân lập từ rừng Quốc gia Cúc Phương, sinh laccase hoạt tính là 2.000 U/L ở pH 5,5; chất cảm ứng là CuSO4, glucose, nguồn nitơ là hỗn hợp KNO3 và NaNO3. Tế bào sống và dịch enzyme thô của chủng FCP3 loại bỏ pyrene với hiệu suất 33% và 41%; anthracene với hiệu suất 41% và 54% (nồng độ ban đầu mỗi chất là 100 mg/L). Xạ khuẩn Streptomyces sp. XKBH1 đã được phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ tại sân bay Biên Hòa. Sau 7 ngày nuôi lắc, chủng này có khả năng phân hủy 72 % pyren; 48,3 % anthracen trên môi trường KG và 63,3 % pyren; 55,8 % anthracen trên môi trường SH1 với nồng độ ban đầu của mỗi chất là 100 mg/L. Chủng này cũng sinh tổng hợp laccase hoạt tính laccase cao nhất (1.073 U/L) trong môi trường KG chứa veratryl alcohol nồng độ ban đầu 0,5 mM. Xạ khuẩn Streptomyces sp. XKBH13 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxyn tại sân bay Biên Hòa. Trong môi trường nuôi cấy chứa dịch chiết malt, 1 mM catechol và sử dụng DCĐ ô nhiễm chứa dioxyn và các chất chứa clo khác làm nguồn cacbon, XKBH13 sinh laccase cao nhất sau 24 giờ với hoạt tính 3.747 U/L. Sau 7 ngày nuôi cấy, chủng XKBH913 loại bỏ được 67,07% pyrene với nồng độ ban

12

STT Nghiên cứu Tham khảo

đầu lớn hơn 76 mg/L.

1.1.1.6. Khả năng của laccase phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm có clo

Độc tính, độ bền và khả năng bị phân hủy sinh học của các hợp chất clophenol

phụ thuộc vào số lượng và vị trí của nguyên tố clo trên vòng thơm. Các hợp chất clo

vòng thơm khó bị phân hủy hơn các hợp chất clo mạch thẳng và khả năng phân hủy

sinh học giảm khi số lượng nhóm clo tăng. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng loại

clo của enzyme là pH, nồng độ cơ chất ban đầu, lượng enzyme, thời gian phản ứng và

nhiệt độ. Laccase đã loại được 79,74% clo của 2,4,5-TCP ở các điều kiện tối ưu như

pH 5, nồng độ cơ chất là 400 µM, thời gian phản ứng là 30 phút, với lượng enzyme là

4ml và nhiệt độ phản ứng là 50ºC. Laccase của loài nấm Rhizoctonia praticola đã

được sử dụng để phân hủy các chất ô nhiễm phenolic như o-chlorophenol, p-

chlorophenol, 2,4-DCP, 2,4,5-TCP, 4-chloro-2-methylphenol. Tuy nhiên, độc tính

của p-chlorophenol và 2,4,5-TCP không giảm. Xử lý chất đa vòng thơm chứa clo

bằng laccase có thể không phải lúc nào cũng đạt hiệu quả triệt để, có thể laccase nên

được sử dụng để xử lý sau quá trình loại clo các hợp chất trên [73]. Khả năng phân

hủy các hợp chất vòng thơm chứa clo bởi laccase được trình bày ở Bảng 1.3 [173].

Bảng 1.3. Ứng dụng của laccase trong phân hủy các chất hữu cơ có clo

Hợp chất Nguồn gốc laccase Cơ chất Ở dạng

Thuốc trừ sâu

Atrazine P. ostreatus Tự do ABTS, HBT, HPI, TEMPO, SA,VA, VAN

Chlorpyrifos - Nuôi cấy

Laccase tái tổ hợp từ chủng vi khuẩn WD biểu hiện trong Pseudomonas putida

T. versicolor Tự do Atrazine, chlorothalonil, chlorpyrifos, isoproturon, pyrimethani ABTS, AS, guaiacol, HBT, SA, VA, VAN

Atrazine, isoproturon - Trong quá trình nuôi cấy

SA Cố định lên màng Ametryn, atrazine, clofibric acid, fenoprop, pentachlorophenol, propoxur Laccase tái tổ hợp từ chủng O. sativa biểu hiện trong P.pastoris Laccase tái tổ hợp từ chủng M. thermophila biểu hiện trong Aspergillus oryzae

13

Chú thích: (Tự do) - Là hình thức enzyme được sử dụng ở trạng thái dung dịch; (Cố định) - Là hình thức enzyme được cố định lên các loại vật liệu; (Trong quá trình nuôi cấy) - Enzyme được hình thành trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật.

Kết quả từ các nghiên cứu trong và ngoài nước được trình bày ở trên cho

thấy khả năng phân hủy các chất vòng thơm có clo (các thuốc trừ sâu) bởi laccase

tái tổ hợp, laccase tự nhiên từ chủng nấm, vi khuẩn và ở các dạng tồn tại khác nhau,

bên cạnh đó là vai trò của chất gắn kết phù hợp với từng loại laccase.

Nhận xét:

Tổng quan tài liệu liên quan đến laccase và các ứng dụng cho thấy, laccase là

đối tượng đã được nghiên cứu khá chi tiết trên các phương diện: vi sinh vật sinh

tổng hợp laccase, cấu tạo phân tử, cơ chế hoạt động xúc tác, nghiên cứu phân tử về

gene, protein và đặc điểm hóa - lý của laccase.

Đến thời điểm hiện nay, có ít công trình sử dụng tổ hợp của nhiều chủng vi

sinh vật sinh tổng hợp laccase trong xử lý các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy vì

việc lựa chọn được tổ hợp của nhiều vi sinh vật sinh tổng hợp laccase có khả năng

cao không đơn giản và nghiên cứu đòi hỏi nhiều công sức. Đây là cơ hội cho các

nghiên cứu nhằm tìm kiếm công nghệ xử lý ô nhiễm môi trường do nước thải dệt

nhuộm và chất diệt cỏ/dioxin gây ra. Các nghiên cứu về khả năng của laccase cần tiếp

tục thực hiện để bổ sung cơ sở khoa học, cơ sở dữ liệu về mức độ đa dạng của chủng

vi sinh vật sinh tổng hợp laccase và tiềm năng ứng dụng theo phân bố của Việt Nam.

1.1.2. Giới thiệu về laccase-like

Laccase là các enzyme oxy hóa 3 thành phần có chứa đồng, enzyme này có

thể lấy một điện tử của 4 phân tử cơ chất và khử oxy nguyên tử thành nước. Ngày

nay, có nhiều enzyme đã được xác định có cấu tạo và cơ chế hoạt động sử dụng oxy

giống laccase nhưng nó không thể hiện cơ chất đặc hiệu hướng tới quá trình

benzendiol (quá trình gắn gốc OH vào vòng benzen). Những enzyme này thường có

hoạt tính không ổn định và không dễ để phân loại vì việc phân loại laccase thường

dựa trên loại phản ứng hóa học và tính chất vật lý của cơ chất, nên thuật ngữ oxy

hóa laccase-like đa nhân chứa đồng đã được đề xuất (laccase multicopper oxidase-

LMCO) [128].

Cấu trúc phân tử của laccase-like (LMCO) đã được nghiên cứu bởi

Messerschmidt và cộng sự trong rất nhiều công bố từ năm 1989 đến 1993 [91]. Tới

tháng 7 năm 2014 đã có khoảng 30 cấu trúc tinh thể laccase-like khác nhau đã được

14

đăng ký trong ngân hàng protein trong đó có cấu trúc laccase của loài B. subtills CotA.

Tuy nhiên, cấu trúc phân tử laccase-like này vẫn có bản chất là protein. Laccase-like

thường ổn định nhiệt độ với nhiệt độ phản ứng tối ưu trên 450C, có thể kể đến laccase-

like được sinh tổng hợp từ Pycnoporus cinnabarinus khi ủ ở 2h ở nhiệt độ 800C thì

hoạt tính giảm đi một nửa và khi ủ ở 370C sau 245 ngày vẫn còn hoạt tính [9].

Gần đây việc nghiên cứu ứng dụng các hoạt chất sinh học được sinh tổng

hợp bởi chủng nấm trên toàn thế giới để ứng dụng trong công nghiệp chế biến thức

ăn và dược phẩm ngày càng được tăng lên, các sản phẩm này đã trở thành lĩnh vực

quan trọng của công nghệ sinh học hiện nay. Các hoạt chất này là các protein,

polysacharide hoặc hỗn hợp polysacharide và protein có nguồn gốc nội và ngoại

bào có khối lượng phân tử thấp (LMS Low Molecular Weight). Khi phân tích thành

phần hóa học của các chất này thì thấy có sự xuất hiện của các loại đường và các

hợp chất phenolic. Trong quá trình nuôi cấy chủng Cerena unicolor trên môi trường

lỏng phát hiện thấy hoạt chất có khối lượng phân tử thấp khoảng 10kDa, chất này có

tính oxy hóa mạnh, bằng hoặc cao hơn khi so sánh với trolox và ascorbic acid.

Một số nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả quá trình phân hủy sinh học

lignin không cao nếu chỉ có vai trò enzyme thuộc họ lignin, mà ở đó có sự tham gia

của một số hoạt chất có kích thước nhỏ có khả năng thể khuếch và đóng vai trò khởi

động quá trình phân hủy lignin. Glycopeptides có khối lượng 1 đến 5 kDa được sinh

tổng hợp từ chủng Phanerochaete chrysosporium, gọi là tác nhân Pc, chất này có

thể xúc tác phản ứng khử để tạo thành gốc OH* và khử Fe3+ thành Fe2+. Hiện nay,

những nghiên cứu về mối quan hệ giữa tác nhân Pc với các enzyme ligninolytic và

vai trò trong quá trình phân hủy lignin đang được tiếp tục nghiên cứu [93]. Quá

trình tinh sạch tác nhân Pc được thực hiện như sau: dịch enzyme ngoại bào thô của

chủng P. Chrysosporium ME-446 ATCC 34541 được siêu lọc qua màng 5 kDa, các

thành phần sau quá trình lọc được tinh sạch qua cột Sephadex G-10, sau đó được

tinh sạch tiếp theo qua thiết bị HPLC TSK với cột GEL G2500PW. Sau đó tác nhân

Pc tinh sạch được xác định cấu trúc với hàng loạt peptides bằng phương pháp

MALDI-TOF cũng như phân tích acid amin. Qua đó khối lượng phân tử của tác

nhân Pc được xác định trong khoảng 0,5 đến 1,0 kDa [93].

Tác nhân Pc của loài P. Chrysosporium có thể oxy hóa chất 2,6-DMP mà

không có sự tham gia của Mn2+ và H2O2 trong khi MnP được sinh tổng hợp bởi

15

chủng này thì không thể oxy hóa được 2,6-DMP nếu không có Mn2+ và H2O2. Phần

hoạt tính này của chủng P. Chrysosporium có khối lượng phân tử dưới 5 kDa,

chứng tỏ vai trò trong phản ứng oxy hóa của các chất trao đổi chất từ loài P.

Chrysosporium không chỉ là MnP hoặc laccase [59].

Tác nhân Pc có thể oxy hóa 2,6-DMP ở nhiệt độ trong khoảng từ 30 đến

800C và nó rất bền nhiệt, nó có thể không mất hoạt tính nếu đun ở 1000C trong 30

phút, tính chất này là rất khác so với enzyme. Tác nhân Pc có hoạt tính oxy hóa

trong môi trường pH khoảng từ 3-9 và hoạt tính vẫn duy trì ổn định trong khoảng

pH kiềm yếu. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại, theo đó hoạt tính oxy

hóa của tác nhân Pc được tăng lên khi có mặt các ion Cu2+, Mn2+, Co2+ và Fe2+ và

nồng độ của các cation này ảnh hưởng lên hoạt tính của tác nhân Pc là khác nhau.

Theo đó ở nồng độ rất thấp ion Cu2+ và Fe2+ thì làm tăng hoạt tính của tác nhân Pc,

nhưng khi nồng độ tăng lên thì gây ức chế hoạt tính của nó [59].

Theo một nghiên cứu khác, một loại peptide đặc biệt có khối lượng phân tử

thấp được đặt tên là tác nhân Gt được phân lập và tinh sạch từ dịch chiết nuôi cấy

loài nấm nâu Gloeophyllum trabeum trên thiết bị HPLC. Tác nhân này có ái lực cao

và khả năng tạo phức với Fe3+ và khử Fe2+. Khi có oxy phân tử nó có thể tạo thành

OH*. Tác nhân Gt có thể bẻ gãy liên kết hydro bên trong và bên ngoài chuỗi

cellulose bằng cơ chế liên kết của gốc OH*, kết quả tạo thành các sản phẩm khử,

không khử và làm cho cellulose dễ bị phân hủy hơn ở các giai đoạn tiếp theo. Quá

trình này tương đối khác với quá trình thủy phân bởi các enzyme cellulase và tác

nhân Gt này đóng vai trò Như vậy, các tác nhân Gt, Pc được đặt tên xuất phát từ tên

của loài nấm sinh tổng hợp ra nó. Ngoài ra, còn có tác nhân SFGF được sinh tổng

hợp trong quá trình hình thành sợi nấm, tác nhân này có một số tính chất giống tác

nhân Pc và Gt như khả năng oxy hóa tăng lên khi có mặt của các ion Fe2+, Cu2+ và

bị ức chế bởi EDTA và N2, tuy nhiên nó cũng có sự khác biệt khi nào cần H2O2 để

tạo ra gốc OH* trong quá trình oxy hóa trong khi tác nhân Pc không tạo ra gốc

OH*. Khả năng oxy hóa của tác nhân Pc vẫn được duy trì ở các pH kiềm yếu trong

khi tác nhân SFGF và Gt thì không có khả năng oxy hóa này [59].

Một số nghiên cứu ở Việt Nam cũng đã chỉ ra sự tồn tại của hoạt chất sinh học

có tính chất giống laccase, chúng không có bản chất protein được thể hiện ở khả năng

bền nhiệt cao, oxy hóa ABTS chuyển thành màu xanh, oxy hóa guaniancol sang màu

16

đỏ giống laccase thật, chúng được sinh tổng hợp từ các chủng xạ khuẩn được phân

lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa [28, 108, 109]. Tuy nhiên,

chưa có nghiên cứu chi tiết về bản chất hóa học như chiết tách, làm sạch, xác định

hoạt tính và các đặc điểm sinh học khác của nhóm chất mới rất lý thú này.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng có khoảng 57 loài nấm phân hủy lignin

thuộc 34 chủng nấm trắng, nâu và nấm mềm có thể sinh tổng hợp các peptides có

khối lượng phân tử thấp (<5kDa) có hoạt tính oxy hóa. Tuy nhiên các công bố về cơ

chế hoạt động của những peptides này còn ở mức rất hạn chế do rất khó để tinh sạch

và hoạt tính oxy hóa không ổn định [59].

Nhiều nghiên cứu đã không triển khai tiếp được bởi tính không ổn định của

các chất có khối lượng phân tử thấp từ nấm phân hủy lignin [70]. Các chất có hoạt

tính sinh học với khối lượng phân tử thấp như mô tả ở trên được gọi là các tác nhân

Pc, Gt, SFGF. Hiện nay, chưa có thêm thông tin liên đến đặc tính cũng như cấu trúc

phân tử và thành phần cấu tạo của chúng [86].

Nhận xét:

Trong quá trình sinh trưởng, các chủng nấm nói riêng và các chủng VSV nói

chung ngoài khả năng sinh tổng hợp các enzyme có bản chất protein thì chúng còn có

khả năng khác nữa là sinh tổng hợp một số tác nhân sinh học (chất xúc tác sinh học)

có khối lượng phân tử thấp, tên gọi các chất này phụ thuộc vào nguồn gốc nó được

sinh ra. Các tác nhân này có khả năng oxy hóa giống laccase nhưng đặc điểm hóa-

sinh khác xa với laccase thật. Các hợp chất này không có cấu tạo protein mà chỉ là

các đoạn peptides có hoạt tính oxy hóa cao. Một số nghiên cứu ở Việt Nam đã chỉ ra

sự tồn tại của chất có hoạt tính sinh học như trên được sinh tổng hợp bởi các chủng xạ

khuẩn, nấm sợi được phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên

Hòa, Đà Nẵng. Tuy nhiên, nghiên cứu chi tiết để tìm hiểu đặc tính hóa-sinh cũng như

khả năng ứng dụng của chúng trong loại màu thuốc nhuộm, phân hủy các hợp chất

hữu cơ mạch vòng còn rất hạn chế. Vì vậy, để phân biệt với những tên gọi và thuật

ngữ của các nghiên cứu trước đây và thuận tiện trong việc gọi tên trong nghiên cứu

của Luận án, hoạt chất này sẽ được gọi là laccase-like. Cũng có thể sau này khi có đủ

minh chứng thì sẽ được đặt tên mới. Ví dụ: là SDL (từ Streptomyces, phân lập từ đất

nhiễm Dioxin và sinh chất giống Laccase).

17

1.2. Đặc điểm ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và công nghệ xử lý

1.2.1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm và nước thải dệt nhuộm

1.2.1.1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm

Thuốc nhuộm dùng trong công nghiệp dệt thường có nguồn gốc từ tự nhiên

hoặc tổng hợp. Tuy nhiên, ngày nay trong công nghiệp dệt hầu như chỉ sử dụng các

loại thuốc nhuộm tổng hợp. Đặc điểm nổi bật của loại thuốc nhuộm này là độ bền

màu cao và khó bị phân hủy. Màu của thuốc nhuộm phụ thuộc vào cấu trúc hóa học

của nó bao gồm nhóm mang màu và nhóm trợ màu. Nhóm mang màu là nhóm có

chứa các nối đôi liên hợp với điện tử π không cố định như: >C = C<; >C = N-; -N =

N-; -NO2. Nhóm trợ màu là những nhóm thế cho hoặc nhận điện tử như -NH2, -

COOH, -SO3H, -OH v.v, Thuốc nhuộm được phân loại dựa trên cấu tạo của nhóm

mang màu, theo đó thuốc nhuộm được phân thành 20-30 họ khác nhau. Trong đó,

các màu thuốc nhuộm azo (monoazo, disazo, triazo, polyazo), anthraquinone,

phthalocyanine và triarylmethane là các chất màu quan trọng nhất [21]. Ngoài ra,

còn các họ thuốc nhuộm khác ít phổ biến, ít quan trọng hơn như thuốc nhuộm nitrozo,

nitro, polymetyl, arylamin, azometyn, thuốc nhuộm lưu huỳnh v.v.

Màu thương mại được phân loại theo thuật ngữ màu, cấu trúc hoặc phương

pháp ứng dụng màu vào trong các lĩnh vực khác nhau. Việc phân loại màu phụ

thuộc vào chỉ số màu (Color Index) và mỗi màu đều có một chỉ số màu khác nhau

(C.I). Sự phân loại màu và tính chất mỗi thuốc nhuộm được liệt kê trong Bảng 1.4.

Bảng 1.4. Phân loại màu và tính chất các màu thuốc nhuộm

Màu

Màu thuốc nhuộm axít (acid dye)

Màu thuốc nhuộm hoạt tính (reactive dye)

Màu thuốc nhuộm trực tiếp (direct dye) Tính chất của thuốc nhuộm Tan tốt trong nước do sự có mặt của nhóm chức sulphonic axit. Tạo tương tác giữa các nhóm chức mang điện tích dương của sợi +) và điện tích âm của màu nhuộm. Ngoài ra, chúng cũng (-NH3 liên kết với vật liệu bằng lực Van-der-Waals, liên kết hydro và liên kết phối trí. Theo cấu trúc hóa học, đa số thuốc nhuộm này thuộc nhóm azo, anthraquinone và triarylmetan. Tạo mối liên kết cộng hóa trị với các nhóm -OH, -NH và –SH trong vật liệu cotton, len, tơ tằm và nylon. Các vấn đề về nước thải có màu liên quan đến việc sử dụng thuốc nhuộm hoạt tính là do sự thủy phân của các nhóm chức hoạt tính xảy ra trong quá trình nhuộm. Các cấu trúc màu phổ biến của thuốc nhuộm này là azo, azo phức kim loại, anthraquinone và phthalocyanine. Hình dạng phẳng và dài cho phép chúng liên kết các sợi cellulose theo một chiều và tối đa hóa các liên kết Van-der-Waals, liên kết phối trí và liên kết hydro. Chỉ có 30% trong tổng số 1600 cấu trúc

18

Màu

Màu thuốc nhuộm phân tán (disperse dye)

Màu thuốc nhuộm hoàn nguyên (vat dye)

Tính chất của thuốc nhuộm vẫn được sản xuất do màu này thiếu độ bền trong quá trình giặt. Các cấu trúc phổ biến nhất là thuốc nhuộm azo được lưu hóa. Cấu trúc không ion với nhóm chức phân cực như –NO2 và –CN làm tăng khả năng tan trong nước thông qua các lực Van-der- Waals, lực phối trí và màu. Màu nhuộm này được sử dụng cho sợi polyester. Cấu trúc phổ biến là azo, nitro, anthraquinone, và azo phức kim loại. Màu nhuộm hoàn nguyên không tan trong nước nhưng có thể trở nên tan được khi khử kiềm (natri dithionite trong sự có mặt của NaOH). Dạng LEUCO tạo thành được hấp phụ bởi cellulose (lực Van-der-Waals) và có thể bị oxy hóa trở lại thành sạng không tan khi sử dụng H2O2. Cấu trúc phổ biến là anthraquinone và indigoids.

1.2.1.2. Đặc điểm chung của nước thải dệt nhuộm

Nước thải dệt nhuộm là tổng hợp nước thải phát sinh từ tất cả các công đoạn

hồ sợi, nấu tẩy, tẩy trắng, làm bóng sợi, nhuộm in và hoàn tất. Theo phân tích của các

chuyên gia, trung bình, một nhà máy dệt nhuộm sử dụng một lượng nước đáng kể,

trong đó, lượng nước được sử dụng trong các công đoạn sản xuất chiếm 72,3%, chủ

yếu là trong công đoạn nhuộm và hoàn tất sản phẩm (khoảng 50 đến 300 m3 nước cho

1 tấn hàng dệt) [132]. Xét hai yếu tố là lượng nước thải và thành phần các chất ô

nhiễm trong nước thải, ngành dệt nhuộm được đánh giá là ô nhiễm nhất trong số các

ngành công nghiệp [140]. Các chất ô nhiễm chủ yếu có trong nước thải dệt nhuộm là

các hợp chất hữu cơ khó phân hủy, thuốc nhuộm, các chất hoạt động bề mặt, các hợp

chất halogen hữu cơ (AOX- Adsorbable Organohalogens), muối trung tính làm tăng

tổng hàm lượng chất rắn, nhiệt độ cao (thấp nhất là 40°C) và pH của nước thải cao do

lượng kiềm trong nước thải lớn. Trong số các chất ô nhiễm có trong nước thải dệt

nhuộm, thuốc nhuộm là thành phần khó xử lý nhất, đặc biệt là thuốc nhuộm azo

không tan - loại thuốc nhuộm được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, chiếm 60-70%

thị phần. Lượng thuốc nhuộm dư sau công đoạn nhuộm có thể lên đến 50% tổng

lượng thuốc nhuộm được sử dụng ban đầu [140]. Đây chính là nguyên nhân làm cho

nước thải dệt nhuộm có độ màu cao và nồng độ chất ô nhiễm lớn.

Nước thải dệt nhuộm sẽ khác nhau khi sử dụng các loại nguyên liệu để

nhuộm khác nhau. Chẳng hạn như len và cotton thô sẽ thải ra chất bẩn tự nhiên của

sợi và nước thải ra có độ màu, độ kiềm, BOD và chất lơ lửng (SS) cao. Ở loại

nguyên liệu sợi tổng hợp, nước thải ra có thành phần chính là các hợp chất hóa học

do các loại hóa chất sử dụng trong giai đoạn tẩy và nhuộm như: hồ tinh bột, H2SO4,

19

CH3COOH, NaOH, NaOCl, H2O2, Na2CO3, Na2SO3 v.v. các loại thuốc nhuộm, các

chất trơ, chất ngấm, chất cầm màu, chất tẩy giặt.

Nước thải dệt nhuộm nhìn chung rất phức tạp và đa dạng, đã có hàng trăm

loại hóa chất đặc trưng như phẩm nhuộm, chất hoạt động bề mặt, chất điện ly, chất

tạo môi trường, tinh bột men, chất oxy hóa…được đưa vào sử dụng. Nước thải dệt

nhuộm ô nhiễm nặng cho môi trường sống bởi các yếu tố như độ màu, pH, độ đục,

chất lơ lửng, chất hữu cơ, chất hoạt động bề mặt, BOD, COD, nhiệt độ v.v. trong đó

pH dao động trong khoảng từ 9 đến 12, hàm lượng chất hữu cơ (COD thay đổi từ 80

đến 18.000 mg/l). Ðộ màu của nước thải khá lớn có thể lên tới 10.000 Pt-Co, hàm

lượng cặn lơ lửng đạt giá trị khoảng 2.000 mg/l.

Các thông số thường được sử dụng để đánh giá chất lượng nước thải dệt

nhuộm: Nhiệt độ; pH; BOD5; COD; hàm lượng cặn lơ lửng; oxi hòa tan; độ đục;

tổng N; tổng P; kim loại nặng; coliform

1.2.2. Các phương pháp xử lý màu thuốc nhuộm

Một vài kỹ thuật để xử lý màu thuốc nhuộm bằng hóa học, vật lý và sinh học

như hấp phụ, keo tụ, kết bông, lọc qua vách ngăn, ozon hóa, điện hóa, phân giải

bằng chiếu xạ, vi khuẩn, tảo, nấm và các quá trình oxy hóa bậc cao đã được biết đến

để loại màu nước thải dệt nhuộm [180]. Các phương pháp xử lý nước thải dệt

nhuộm được trình bày ở Bảng 1.5.

1.2.2.1. Phương pháp hóa lý

Các phương pháp hóa lý được biết đến là có hiệu quả trong loại màu nước thải

dệt nhuộm, trong đó phương pháp hấp phụ được quan tâm nhất do nó đơn giản và ít

nhạy cảm với các chất ô nhiễm độc hại. Mặc dù phương pháp này tạo ra nước thải sau

xử lý có chất lượng cao nhưng vấn đề là phải lựa chọn được chất hấp phụ phù hợp. Một

số chất hấp phụ được sử dụng phổ biến để xử lý màu thuốc nhuộm đó là: Chất hấp phụ

hóa học (Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) - nano TiO2; Nano-γ-alumina;

Poly vinyl alcohol (PVA) [180].

Các phương pháp hóa lý khác để loại màu thuốc nhuộm như kết tủa bông,

keo tụ. Sự keo tụ bằng điện hóa được áp dụng để loại màu từ dung dịch có chứa

hỗn hợp các màu bazơ và phân tán. pH tối ưu cho quá trình loại màu thuốc nhuộm

thường là 7, các thông số ảnh hưởng tới khả năng loại màu thuốc nhuộm cũng đã

được khảo sát [163].

20

Bảng 1.5. Các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm

Kỹ thuật STT

Phương pháp hóa-lý: 1 Quá trình lọc qua vách ngăn, thẩm thấu ngược, keo tụ/ kết bông

Phương pháp sinh học:

2 Phân hủy bằng vi khuẩn (hiếu khí và kị khí)

Phân hủy bởi nấm, phân hủy bởi enzyme

Quy trình oxy hóa nâng cao:

Ozon hóa, Ozon/ H2O2

Tia tử ngoại/ozon, Xúc tác quang hóa 3 Quy trình Fenton, Quang hóa-Fenton

Sự oxy hóa điện hóa

Tia tử ngoại/ozone/H2O2, tia tử ngoại/H2O2

1.2.2.2. Phương pháp oxy hóa nâng cao

Quá trình này gồm các kỹ thuật như oxy hóa màu bằng hệ Fenton (dung dịch

có chứa H2O2 và sắt), quang hóa bằng tia tử ngoại (UV) tại nhiệt độ và áp suất

thường. Quá trình oxy hóa nâng cao được sử dụng rộng rãi để loại màu nước thải

dệt nhuộm và các thành phần hữu cơ khó phân hủy có trong nước thải. Tính linh hoạt

của phương pháp oxy hóa nâng cao dựa vào sự tạo ra gốc tự do OH●. Phương pháp

thể hiện tính ưu việt hơn các phương pháp xử lý thông thường bởi vì chúng có thể

loại bỏ các hợp chất hữu cơ không/khó phân hủy sinh học [53].

a) Ozon hóa

Ozon hóa là phương pháp đã được sử dụng rộng rãi để xử lý nước thải có chứa

màu. Loại màu hoạt tính từ nước thải công nghiệp dệt nhuộm bằng phương pháp ozon

hóa được thực hiện trong thiết bị reactor theo mẻ tại 35oC với pH khác nhau đã được

nghiên cứu và kết quả cho thấy hiệu suất loại màu thu được khoảng 90% sau 6 giờ

phản ứng [169]. Ozon hóa được thực hiện trong reactor bán liên tục với hỗn hợp 8 màu

hoạt tính mà có nồng độ màu từ 50-500 mg/L. Màu và COD có trong nước thải bị loại

bỏ hoàn toàn khi sử dụng 4,33 mg/L ozon sau 30 phút. Với nồng độ ban đầu thấp thì

tốc độ loại bỏ màu và COD rất nhanh, nhưng khi nồng độ tăng từ 200-500 mg/L thì cần

nhiều thời gian hơn để loại màu. Các sản phẩm như clo, sunfat, nitrat được tạo ra là kết

quả của sự oxy hóa và cắt mạch của các nhóm thể có trong phân tử màu [137].

21

b) Oxy hóa điện hóa

Quá trình oxy hóa điện hóa dung dịch màu thuốc nhuộm tổng hợp và nước

thải dệt nhuộm thực tế là sử dụng các điện cực là titan- tantali- platin- iriđi để tiến

hành thử nghiệm loại màu đối với hỗn hợp của 16 loại thuốc nhuộm có nồng độ 361

mg/L và 281 mg/L COD, xử lý nước thải thực tế có chứa 404 mg/L COD. Quan sát

bằng mắt thường cho thấy màu bị loại trong vòng 10-15 phút. Kết quả nghiên cứu

cho thấy chỉ cần tiêu thụ một lượng nhỏ năng lượng thì mức độ loại màu đã đạt

được là 30-90% sau 180 phút. Độc tính sinh thái bị giảm đi với sự hình thành các

sản phẩm ít độc hại hơn. Hỗn hợp 9 loại thuốc nhuộm hoạt tính thuộc lớp màu azo,

anthraquinone và triazine bị phân hủy bởi sự oxy hóa điện hóa. Màu và COD bị loại

bỏ hoàn toàn sau 120 phút xử lý. Các kết quả trên đã chứng minh phương pháp oxy

hóa điện hóa phù hợp cho loại màu nước thải công nghiệp [20].

c) Xử lý bằng xúc tác quang hóa

Quá trình phân hủy quang hóa hỗn hợp hai màu thuốc nhuộm hoạt tính bằng

TiO2 có kích thước từ 1µm đến 1000 µm đã được tiến hành và cho hiệu quả tốt.

Điều đó khẳng định nano TiO2 là chất xúc tác tiềm năng trong xử lý nước thải dệt

nhuộm. Tương tự CuO-clinoptilolite cũng được sử dụng trong phản ứng quang hóa

để loại màu đối với hỗn hợp hai màu thuốc nhuộm methylene blue và bromophenol

blue [39].

1.2.2.3. Phương pháp sinh học

Loại màu thuốc nhuộm bằng phương pháp sinh học là giải pháp thân thiện

với môi trường và hứa hẹn sẽ được sử dụng nhiều trong tương lai. Các vi sinh vật

như vi khuẩn, nấm, tảo, nấm men và enzyme có thể được sử dụng thành công để

loại màu thông qua quá trình xử lý hiếu khí, kị khí hoặc kết hợp kị khí-hiếu khí.

a) Phương pháp sử dụng các chất hấp phụ sinh học

Để loại bỏ hỗn hợp các màu thuốc nhuộm bằng chất hấp phụ sinh học

Portulaca grandiflora, chất hấp phụ được cho vào một ống nhựa PVC cho nước

thải và hỗn hợp màu chảy qua, kết quả sau 60 và 96 giờ 87 và 97% màu bị loại [68].

Bên cạnh đó các chất hấp phụ sinh học Saccharomyces cerevisiae, Petunia

grandifloraJuss, Glandularia pulchella cũng đã được chứng minh là những chất

hấp phụ sinh học tốt trong việc loại bỏ hỗn hợp màu và nước thải màu thực tế [50].

Sinh khối nấm sợi Aspergillus niger đã chết là chất hấp phụ sinh học hiệu quả đối

22

với hỗn hợp các màu trong nước thải. Sự hấp phụ tối đa đạt được ở pH tối ưu là 5 và

trong vòng 10 phút, hiệu suất loại màu đạt cực đại ở nồng độ màu là 20 mg/L.

b) Phương pháp sử dụng laccase trong loại màu thuốc nhuộm

Phương pháp sử dụng laccase là giải pháp khá thú vị và có tiềm năng trong

việc loại màu thuốc nhuộm có cấu trúc hoá học đa dạng và phức tạp [129].

Laccase có khả năng loại màu thuốc nhuộm thông qua cơ chế gốc tự do

không đặc hiệu tạo ra các hợp chất phenol [22]. Con đường giả định về sự phân hủy

thuốc nhuộm azo, 3-(2-hydroxy-1-naphthylazo) benzenesulfonic acid bởi laccase

được trình bày ở Hình 1.2.

Dựa trên mô hình này, laccase oxy hóa nhóm phenol của thuốc nhuộm azo,

với sự tham gia của một điện tử tạo ra một gốc phenoxy, sau đó sẽ được oxy hóa

với ion carbonium. Vòng phenol có chứa carbon mang liên kết azo sẽ bị tấn công

bởi nước tạo ra 3-diazenyl-benzenesulfonic acid (III) và tiếp theo là 1, 2-

naphthoquinone [13]. Các gốc tự do được tạo thành bởi sự oxy hóa thuốc nhuộm do

laccase có xu hướng phản ứng với 1, 2-naphthoquinone. Các gốc tự do có thể trải

qua quá trình oxy hóa để tạo thành hợp chất VIII, sau đó tạo ra hợp chất X, hoặc

trùng hợp lại và oxy hóa tiếp tạo ra hợp chất IX [179].

Hình 1.2. Cơ chế giả định sự phân hủy 3-(2-hydroxy-1-naphthylazo) benzenesulfonic acid bởi laccase [179]

23

Với phổ cơ chất rộng, laccase có khả năng tham gia vào quá trình loại màu

hoặc phân hủy nhiều loại thuốc nhuộm có cấu trúc khác nhau. Tuy nhiên, một số

màu không dễ bị oxy hóa hoặc chỉ bị oxy hóa một phần do chúng có cấu trúc quá

cồng kềnh hoặc thế oxy hóa khử quá cao để có thể gắn kết với trung tâm hoạt động

của laccase. Trong trường hợp này chất gắn kết là điều kiện cần thiết để laccase thể

hiện vai trò xúc tác. Một vài hợp chất có chứa vòng phenol tự nhiên bao gồm

syringaldehyde và acetosyringone đã được chứng minh là các chất gắn kết phù hợp

để laccase thể hiện khả năng một cách có hiệu quả trong loại màu thuốc nhuộm [7].

Dựa trên kết quả phân tích LC-MS khi sử dụng laccase chủng nấm Polyporus

sp. S133 để phân hủy màu RBBR cho thấy hình thành hai sản phẩm nhỏ là sodium 1-

amino-10-dioxo-9,10-dihydroanthracene-2-sulfonate và sodium 2-((3-aminophenyl)

sulfonyl) ethyl sulfate. Tuy khối lượng phân tử của những sản phẩm phân hủy nhỏ

hơn nhưng độc tính không giảm đi so với hợp chất ban đầu [54]. Vì vậy, hiệu quả loại

màu có thể cao nhưng quá trình xử lý thuốc nhuộm vẫn cần được tiếp tục nghiên cứu

cho đến khi loại bỏ được hoàn toàn các sản phẩm trung gian vẫn có khả năng gây

nguy hại tới sức khỏe con người.

Một vài ứng dụng trong phân hủy các chất gồm phenols, polyphenols,

PCBs, PAHs, thuốc nhuộm và thuốc nhuộm azo bởi laccase được thể hiện ở

Bảng 1.6 [173]. Ở Việt Nam, nấm sợi Trichoderma sp. FCP3 đã được phân lập

từ rừng Quốc gia Cúc Phương sinh tổng hợp laccase thô có khả năng loại màu

một số thuốc nhuộm với hiệu suất như sau: NY3: 92%; RBBR: 86%; NY5: 64%;

NY1: 60%, NY7: 6% [58].

Bảng 1.6. Ứng dụng của laccase trong phân hủy sinh học thuốc nhuộm

Cơ chất Dạng

Tự do -

Nguồn gốc laccase laccase tái tổ hợp chủng T. sanguineus biểu hiện trong T. atroviride

- T. pubescens -

Hợp chất Bromophenol Blue, Congo Red, Coomassie Blue, Tripan Blue Acid Black 172, Congo Red, Crystal Violet, Direct Fast Blue FBL, Indigo Blue, Naphthol, Green B, Methylene Blue, Neutral Red, Reactive Brilliant Blue X-BR, Remazol Brilliant, Blue Reactive (RBBR)

24

Nguồn gốc laccase Cơ chất Dạng

HBT Tự do Paraconiothyrium variabile

P. sanguineus VA Tự do

Hợp chất Acid Orange 67, Basic Red 18, Basic Yellow 28, Direct Black 166, Direct Yellow 107, Disperse Yellow 79 Brilliant Blue G, Brilliant Blue R, Bromophenol Blue, Coomassie Blue R250, Crystal Violet, Malachite Green, Methylene Blue, Xylene Cyanol, RBBR RBBR RBBR T. versicolor Cerrena sp. HYB07 Cố định Cố định

Coomassie Blue R250 Cerrena sp. HYB07 Tự do HBT - ABTS,AS,H BT,SA, SYA

c) Phương pháp sử dụng chủng nấm sinh tổng hợp laccase để loại màu thuốc nhuộm

Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung và công nghệ sinh học nói

riêng việc sử dụng các vi sinh vật và enzyme từ vi sinh vật để giảm mức độ sử dụng

clo trong xử lý màu thuốc nhuộm đã được nhiều nhóm tác giả nghiên cứu và chứng

minh là giải pháp công nghệ có tính khả thi và mang lại hiệu quả kinh tế cao.

Trong số các chủng nấm sợi, đảm và nấm men có thể sinh tổng hợp laccase,

các chủng nấm đảm được coi là nhà sản xuất lignin và laccase. Loài nấm Pleurotus

ostreatus và Trametes versicolor được xem như các loài nấm điển hình trong nghiên

cứu sinh tổng hợp và nghiên cứu ứng dụng laccase. Ngoài ra, các loài nấm đảm

khác cũng được biết đến là có khả năng sinh tổng hợp laccase như Agaricus

bisporus, Cerrena unicolor, Coprinopsis cinerea, Coriolopsis gallica, Cryptococcus

neoformans, Cyathus bulleri, Fomes fomentarius, Ganoderma lucidum, Panus

rudis, Phlebia radiata, Polyporus brumalis, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus

sanguineus, Rigidoporus microporus, Schizophyllum commune [46].

Cộng đồng các nhà khoa học nghiên cứu tìm kiếm vi sinh vật sinh laccase

hay laccase-like thường sử dụng màu thuốc nhuộm tổng hợp để đánh giá khả năng

oxy hóa các chất vòng thơm tương đồng ở mức nào với hoạt tính xúc tác để phục vụ

cho các nghiên cứu ứng dụng ở các lĩnh vực khác nhau. Khả năng loại màu của một

số đại diện là nấm đảm đã được thông báo trong vài thập niên gần đây. Loài nấm

Trametes versicolor 2008001 với hoạt tính laccase là 20.000 U/L đã loại 98% màu

25

Reactive Blue 49 ở điều kiện pH 2,95; nồng độ màu ban đầu là 55,6 mg/L sau 46,91

phút [49]; Loài nấm L. polychrous có khả năng sinh laccase với hoạt tính 145 U/mL

sau 12 ngày nuôi cấy có khả năng loại 85% màu Acid Blue 80 tại pH 5 sau 120

phút [126]; Loài nấm đảm Pleurotus ostreatus sinh laccase hoạt tính 32.450 IU/g

loại được trên 80% hỗn hợp của 5 màu methyl orange, trypan blue, ramazol brilliant

red, ramazol brilliant blue và ramazol brilliant yellow [40]; khi sử dụng hỗn hợp 3

loại nấm Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor và Bjerkandera sp

BOL13 để loại màu thuốc nhuộm thuộc nhóm azo thì chủng Bjerkandera sp.BOL13

loại 89% màu Remazol Red RR sau 13 ngày [64].

Quá trình loại màu bởi chủng nấm cần phải phân biệt rõ thêm nguyên nhân là do

hấp phụ? hay phân hủy ? hay do xúc tác bởi enzyme. Hoạt động của các chủng nấm

thường hiếm khi dẫn đến quá trình khoáng hóa thuốc nhuộm vì cơ chế khoáng hóa phụ

thuộc rất nhiều vào cấu trúc hóa học của chúng. Sự khoáng hóa xảy ra mạnh hơn ở các loại

thuốc nhuộm chứa vòng thơm dễ bị thay thế hơn so với các vòng thơm không dễ bị thay

thế. Sự khoáng hóa tốt hơn xảy ra trong các điều kiện nghèo nitơ. Một số nghiên cứu đã

thông báo về khả năng các chủng nấm sử dụng thuốc nhuộm như là nguồn cacbon, khi đó

các liên kết trong phân tử thuốc nhuộm sẽ bị cắt đứt và được VSV sử dụng như nguồn

cacbon, cơ chế này thường xuất hiện ở quần xã vi sinh vật sống [72, 143].

Chủng nấm sợi Aspergillus sp. FBH11 phân lập từ đất nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin cũng có khả năng phân hủy các loại thuốc nhuộm nhóm azo và

anthraquinone như NY1, NY3, NY5, NY7, NY8 và RBBR với nồng độ ban đầu 100

mg/L. Hai màu thuốc nhuộm NY1 và NY5 bị loại màu lần lượt 88,7 và 90,8% bởi

tế bào sống sau 4 ngày. Trong khi đó dịch laccase thô với hoạt tính 550 U/L loại

màu được 36,8% NY1, 51,3% NY5 chỉ trong 6,5 h. Ngoài ra, nhiều loài nấm mục

trắng được chứng minh có khả năng loại bỏ các màu tổng hợp khác nhau, trong đó

nấm đảm Phanerochaete, Coriolus versicolor và Pleurotus là các loài chính được

nghiên cứu khá kỹ [107].

Các nghiên cứu trên cho thấy khả năng cũng như ứng dụng của nấm bậc cao

trong loại màu thuốc nhuộm tổng hợp được công bố rất nhiều. Tuy nhiên cho đến

thời điểm này chưa có nhiều thông tin quốc tế cũng như trong nước chứng minh

bằng thực nghiệm để chỉ ra tiềm năng to lớn của chủng nấm đảm nói chung và vi

khuẩn nói riêng trong loại màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại.

26

1.3. Hiện trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam và các công nghệ xử lý

1.3.1. Hiện trạng ô nhiễm

Trong thời gian chiến tranh ở Việt Nam, chất diệt cỏ/dioxin được quân đội Mỹ

sử dụng ở miền Nam Việt Nam bắt đầu từ ngày 10/8/1961 và kết thúc vào ngày

31/10/1971. Theo Young (2009) quân đội Mỹ đã rải tổng cộng 74.175.920 lit chất diệt

cỏ, trong đó: chất da cam là 43.332.640 lít; chất xanh lá mạ, chất hồng, chất tím là

2.944.240 lít; chất trắng là 21.798.400 lít; chất xanh da trời là 6.100.640 lít [160]. Các

chất diệt cỏ trên thùng có màu tím, da cam, v.v. chứa 2,3,7,8-TCDD và 1,2,3,7,8-

PeCDD được đánh giá có độ độc tương đương cao nhất với hệ số là 1. Ở Việt Nam có

3 "điểm nóng" được xác định và đánh giá có mức độ ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin

là nặng nề nhất đó là sân bay Đà Nẵng, sân bay Phù Cát và sân bay Biên Hòa. Trong

đó, sân bay Đà Nẵng, từ năm 2014 đến 2017 đã được Cơ quan phát triển quốc tế Hoa

kỳ tiến hành xử lý bằng công nghệ giải hấp nhiệt trong mố (IPTD) với khối lượng là

90.000 m3 đất và trầm tích ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Sân bay Phù Cát, đã được Văn

phòng Ban chỉ đạo 33/Bộ TN&MT tiến hành chôn lấp cô lập triệt để điểm ô nhiễm với

khối lượng trên 7.500 m3 để tránh việc phát tán ô nhiễm ra môi trường xung quanh.

Như vậy, về cơ bản hiện trạng ô nhiễm nặng dioxin ở Việt Nam hiện nay tập trung ở

sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai, mặc dù tại sân bay này Bộ Tư lệnh Hóa học đã tiến

hành chôn lấp cô lập triệt để trên 160.000 m3 từ năm 2009 đến 2016. Trong khối lượng

đã được chôn lấp cách ly triệt để thì chôn lấp” tích cực” 3.384 m3 đất ô nhiễm đã được

thực hiện. Đây là sự hợp tác của Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm khoa

học và Công nghệ Việt Nam với Binh chủng Hóa học/Bộ quốc phòng. Ở các lô xử lý

không chỉ chôn lấp mà khối lượng lớn đất trên đã được làm sạch bằng công nghệ kích

thích quần xã vi sinh vật bản địa phân hủy tất cả hỗn hợp chất độc trong đất, để sau 40

tháng tổng độ độc chỉ còn 14,12 ngTEQ/kg đất khô, dưới ngưỡng của qui chuẩn Việt

Nam (40ngTEQ/kg đất khô) cho đất sản xuất nông nghiệp thường xuyên.

Theo Báo cáo của Cơ quan phát triển Quốc tế Hoa Kỳ (USAID) thực hiện

năm 2014/2015 [5]. Sân bay Biên Hòa ước tính tổng lượng đất và trầm tích nhiễm

dioxin khoảng 408.500 - 495.300 m3. Trong đó có 315.700 - 377.700 m3 đất ô

nhiễm và 92.800 - 117.600 m3 trầm tích ô nhiễm. Diện tích ô nhiễm ước tính là

khoảng 522.400 m2, trong đó có khoảng 369.600 m2 diện tích đất và 152.800 m2

diện tích trầm tích. Trong số 408.500 m3 khối lượng nhiễm dioxin, có 42 % nằm ở

27

khu Pacer Ivy, 24% ở khu Z1 (bao gồm cả Bãi chôn lấp Z1), và 15% ở khu Tây

Nam. Phần 19% còn lại nằm ở các khu ZT, Tây bắc và Đông bắc. Khoảng 5%

tổng khối lượng nhiễm dioxin nằm ở ngoài khu vực sân bay. Các khu vực hiện bị

ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa bao gồm:

Khu Z1: Nồng độ dioxin tối đa trong đất ghi nhận được tại điểm Z1-16B là

901 ppt.

Khu ZT: Nằm ở phía bắc khu Z1. Nồng độ dioxin báo cáo theo Nghiên cứu

này của khu vực đạt khá thấp (dưới ngưỡng dioxin của BQP), trừ một vị trí tại điểm

ZT-2B (3.440 ppt).

Khu tây nam: Khu vực này có nồng độ dioxin cao nhất 110.000 ppt-TEQ tại

điểm SW-1A, độ sâu 30-60 cm.

Khu Pacer Ivy: Nồng độ dioxin trong đất cao nhất ghi nhận tại điểm PI-2 là

11.400 ppt, độ sâu 30-60 cm. Phạm vi ô nhiễm mở rộng ra cả ngoài sân bay, đặc

biệt là dọc theo kênh thoát nước ở phía tây khu Pacer Ivy (tối đa 3.370 ppt tại điểm

PI-15). Nguồn gây ô nhiễm dioxin là do đất/trầm tích ô nhiễm di chuyển trên tuyến

kênh mương từ khu Pacer Ivy chảy về phía tây qua một loạt các kênh rạch để đổ ra

sông Đồng Nai.

Khu Tây-Bắc: Nồng độ dioxin trong trầm tích cao hơn ngưỡng dioxin tại

điểm NW-4A (là 477 ppt, độ sâu 0-15 cm; 262 ppt, độ sâu 15-30 cm) và điểm NW-

3C (385 ppt, độ sâu 0-15 cm; 587 ppt, độ sâu 15-30 cm).

Khu rừng cây phía Bắc: Nồng độ dioxin đo được tại điểm NF-4A và B cao

nhất 465 ppt).

Khu Đông-Bắc: Mẫu trầm tích tại một số ao hồ tại khu vực này có nồng độ

dioxin trên ngưỡng dioxin. Nồng độ dioxin trong trầm tích cao nhất tại điểm NE-7

(1.300 ppt, độ sâu 0-15 cm; 765 ppt, độ sâu 30-45 cm).

Khu Đông-Nam: Mẫu đất tại khu vực này chỉ đo được nồng độ dioxin thấp

(cao nhất là 64,5 ppt tại điểm SE-2), dưới ngưỡng dioxin theo QCVN45:2012.

Bên ngoài khu vực sân bay (các ao hồ bên ngoài): Trầm tích mặt tại hồ

Cổng 2 (166 ppt) cao hơn tiêu chuẩn về ô nhiễm dioxin của Việt Nam đối với trầm

tích (150 ppt); trầm tích tại hồ Biên Hùng (83 ppt) thấp hơn tiêu chuẩn về ô nhiễm

dioxin của Việt Nam.

28

Nước ăn: Các mẫu lấy từ giếng nước ngầm ở bên ngoài và các nguồn nước

ăn tại chỗ không cho thấy nồng độ dioxin vượt ngưỡng cho phép của Cục Bảo vệ

Môi trường Hoa Kỳ (USEPA) hay của Việt Nam đối với nước ăn uống.

Các nguồn nước ngầm tại chỗ khác: Tiến hành khảo sát 5 giếng nước

ngầm tại độ sâu 3 - 15 m và một giếng tại độ sâu 2 - 6 m. Các mẫu này có nồng

độ dioxin vượt ngưỡng ô nhiễm tối đa (MCL) của USEPA và tiêu chuẩn xả thải

của Việt Nam đối với nước chưa qua lọc, cũng như có lượng kim loại chì vượt

ngưỡng MCL của ESEPA. Trong các mẫu nước giếng có qua lọc, nồng độ dioxin

đạt dưới ngưỡng MCL của USEPA, nhưng vẫn cao hơn tiêu chuẩn xả thải của

Việt Nam là 10 phần triệu tỉ (ppq).

Như vậy cho thấy mức độ ô nhiễm nặng dioxin hiện nay của Việt Nam tập

trung chủ yếu tại sân bay Biên Hòa với mức độ, pham vi và tính chất rất phức tạp và

tiếp tục cần nhiều nghiên cứu khác nhau để tìm kiếm được các giải pháp công nghệ

phù hợp với điều kiện Việt Nam đảm bảo các yếu tố xử lý triệt để, thân thiện với

môi trường và tiết kiệm chi phí.

1.3.2. Công nghệ xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm

Các công nghệ đã được nghiên cứu và ứng dụng trong xử lý ô nhiễm các chất

ô nhiễm đa vòng thơm, các chất diệt cỏ/dioxin trên thế giới và Việt Nam đã được

tổng hợp, nghiên cứu từ nhiều nguồn tài liệu khác nhau trên thế giới. Trong các hợp

chất hữu cơ khó phân huỷ (POPs) theo Công ước Stockhom là 21 chất so với trước

là chỉ có 12 chất, dioxin là một trong các chất đó. Để xử lý các chất này thế giới đã

có khoảng 40 loại hình công nghệ được giới thiệu [110].

Chương trình môi trường của Liên hợp quốc đã khuyến cáo các nước đang

phát triển về việc áp dụng các công nghệ không đốt để xử lý các chất hữu cơ ô

nhiễm khó phân huỷ và đề xuất 27 loại hình công nghệ [154].

Báo cáo của Cục bảo vệ môi trường Mỹ (US EPA) năm 2010 đã đề xuất phát

triển 3 loại hình công nghệ [157].

Tổ chức các nước công nghiệp phát triển của liên hợp quốc (UNIDO) đã

giới thiệu 14 công nghệ không đốt để xử lý các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân

huỷ và chúng thuộc 3 loại hình: đã được công nhận và áp dụng; đang được chứng

minh và mới nổi [83].

29

Trong các nhóm công nghệ được giới thiệu trên, các giải pháp công nghệ liên

quan đến sinh học được giới thiệu với 7 loại hình như phân huỷ DARAMEND;

phân huỷ bằng enzyme, chủng nấm; xử lý bằng thực vật; xử lý đất tại chỗ bằng

phương pháp sinh học; phân huỷ kỵ khí; nhóm công nghệ kết hợp (quang phân/vi

khuẩn; sinh học/fenton); nhóm công nghệ khác (biểu hiệu gene; đồng ruộng).

Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ US EPA (2010) đưa ra các tiêu chí để để đánh

giá xếp loại các loại hình công nghệ đã được nghiên cứu trong xử lý các hợp chất hữu cở

khó phân hủy đó là: khả năng thương mại; nồng độ chất ô nhiễm xử lý được; các loại

chất ô nhiễm đã được xử lý; giá thành và yêu cầu về năng lượng v.v. Kết quả, trong số 8

công nghệ được nghiên cứu đầy đủ có thử nghiệm với dioxin/furan có 2 công nghệ có

thể xử lý vật liệu ô nhiễm tại chỗ và chúng cũng có thể ứng dụng để xử lý các chất thuộc

nhóm thuốc trừ sâu. Khi xem xét tiêu chí về giá thành của các công nghệ thì có 4 loại

hình công nghệ chưa xác định được giá, 2 loại hình công nghệ giá thành phụ thuộc vào

cấu hình của hệ thống và 2 loại hình giá thành dựa trên tính toán khối lượng đất nhiễm

thự tế được xử lý (rẻ nhất là công nghệ giải hấp nhiệt tại chỗ với kinh phí 261 -

653USD/m3, công nghệ kiềm xúc tác 1.400 - 1.700 euro/tấn). Trong các công nghệ được

thống kê trên có 3 công nghệ liên quan đến sinh học nhưng không có loại hình công nghệ

nào được nghiên cứu đầy đủ đến xử lý dioxin [157].

Hiện nay, trong báo cáo đánh giá môi trường ô nhiễm dioxin tại sân bay Biên

Hòa do Cơ quan phát triển Quốc tế Hoa Kỳ thực hiện [5], dựa trên cơ sở kết quả các

nghiên cứu trước và các nghiên cứu khoa học mới đây đã liệt kê các công nghệ có

thể xử lý đất, trầm tích ô nhiễm dioxin, Bảng 1.7.

Các công nghệ xử lý bằng các phương pháp hóa học, lý học kể trên có khả

năng phân hủy dioxin và các hợp chất POPs nói chung rất hiệu quả, triệt để và thời

gian xử lý ngắn. Tuy nhiên, các công nghệ này có chi phí rất cao và hiện nay mới

chỉ được áp dụng ở các nước phát triển như Mỹ, Canada, Anh, Đức, Australia, New

Zealand, v.v. Điều kiện kinh tế và tình hình ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin của Việt

Nam hiện nay chưa cho phép áp dụng thực hiện những công nghệ có giá thành cao

trong việc xử lý khử độc đất nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ chứa dioxin. Các nhà khoa

học ở Việt Nam và thế giới đã nghiên cứu và phát triển các giải pháp phân hủy sinh

học đối với đất ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin, đây là phương pháp khả thi, thân

thiện với môi trường, giá thành công nghệ thấp và phù hợp với điều kiện kinh tế đặc

30

biệt là với các nước đang phát triển như nước ta. Một số vấn đề về phương pháp

phân hủy sinh học được giới thiệu để hiểu rõ hơn về công nghệ này.

Bảng 1.7. Các công nghệ có thể xử lý đất, trầm tích ô nhiễm dioxin

Công nghệ/giải pháp cô lập Công nghệ xử lý triệt để

Bãi chôn lấp thụ động Bãi chôn lấp chủ động Che phủ tại chỗ Hóa rắn/ổn định vật liệu

Lò đốt Khử bám nhiệt, Gia nhiệt truyền dẫn gồm: Khử bám nhiệt trong xử lý thô Gia nhiệt truyền dẫn tại chỗ Gia nhiệt truyền dẫn ngoài hiện trường Hồ quang plasma; nhiệt phân Phân hủy hóa cơ (nghiền bi) Khử bám xúc tác bazơ Xử lý nước trên cực hạn và dưới cực hạn Thuỷ tinh hoá Xối rửa đất/Chiết tách khí hóa lỏng Khử hóa chất pha khí Xử lý sinh học tại chỗ Khử hóa chất/Ôxy hóa ngoài hiện trường Ôxy hóa tăng cường Xử lý sinh hóa kết hợp Công nghệ electron xúc tác Phân hủy xúc tác đồng Quang phân tại chỗ Chưng hơi Phân hủy phân ly phóng xạ Xử lý thủy nhiệt Plasma không dùng nhiệt Xử lý thực vật học Cải tạo sinh học bằng nấm

1.3.3. Phương pháp phân hủy sinh học xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ

Phân hủy sinh học hay tái tạo môi trường (Bioremediation) là quá trình xử lý

sinh học có sử dụng các chủng vi sinh vật để phân hủy các chất ô nhiễm có trong

đất. Phân hủy sinh học bằng cách bổ sung các chủng vi sinh vật như vi khuẩn và

nấm để phân hủy các chất ô nhiễm được gọi là Bioaugumentation còn

Biostimulation (kích thích sinh học) là quá bổ sung dinh dưỡng, thay đổi các điều

kiện môi trường để tăng số lượng và hoạt tính của cộng đồng vi sinh vật bản địa tồn

tại trong đất để chúng phân hủy chất ô nhiễm. Khi sử dụng thực vật để tích lũy các

chất ô nhiễm trong đất gọi là Phytoremediation [58].

Phương pháp khử độc bằng phân hủy sinh học được xem là khắc phục được

các hạn chế của các phương pháp hóa học và lý học. Phương pháp này khử độc một

31

cách triệt để, không gây ô nhiễm thứ cấp cũng như không ảnh hưởng đến môi

trường sinh thái. Phương pháp này được gọi là “công nghệ xanh”. Tuy nhiên,

phương pháp này có nhược điểm là thời gian xử lý dài.

Phân hủy sinh học được tiến hành theo hai cách thức. Phân hủy sinh học in

situ và ex situ. Ex situ lấy chất ô nhiễm từ vùng ô nhiễm ban đầu để xử lý́ ở nơi

khác, còn in situ là xử lý ô nhiễm tại chỗ.

Phân hủy sinh học in situ sử dụng những kỹ thuật khác nhau để giảm tối đa

các tác động vào vùng ô nhiễm. Với các kỹ thuật này, không cần phải đào xúc vùng

ô nhiễm cũng như các hệ thống bơm xử lý phức tạp trên quy mô sâu và rộng, do đó

góp phần hạ giá thành và có thể giải quyết các vấn đề tồn tại trong những cách tiếp

cận khác. Hầu hết quá trình in situ kích thích quần xã VSV bản địa, hoạt hóa khả

năng trao đổi chất và khả năng phân hủy chất ô nhiễm của chúng. Có thể chia phân

hủy sinh học in situ làm ba nhóm chính là kích thích sinh học, làm giàu sinh học và

xử lý kỵ khí. Cách phân chia này chỉ có ý nghĩa tương đối, trên thực tế có thể tiến

hành kết hợp các phương pháp nhằm thu hiệu quả xử lý tối đa.

Trên thế giới, phương pháp khử độc bằng phân hủy sinh học đã thành công

trên các đối tượng khác nhau như tricloethylen, perchloroethylen, các hợp chất

polychlorinated biphenyl, benzen, toluen, ethylbenzen, xylen, các hợp chất

hydrocacbon đa nhân thơm, các loại thuốc trừ sâu v.v [131].

1.3.3.1. Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T, dioxin và các hợp chất tương tự bởi laccase

a) Phân hủy 2,4-D; 2,4,5-T và các chất tương tự

Enzym đã được nghiên cứu phân hủy và phân hủy sinh học PCB. Khi sử

dụng 2,5-Dichlorobiphenyl (PCB 9) và 2,2,5,5-tetrachlorobiphenyl (PCB 52) là các

chất điển hình để nghiên cứu hiệu quả và cơ chế phân hủy của các quá trình trên cho

thấy, khi sử dụng enzym horseradish peroxidase (HRP) cùng với một lượng vừa đủ

H2O2 đã phân hủy được tới 90% nồng độ ban đầu PCB9 và 55% nồng độ PCB 52

trong môi trường dịch sau 220 phút. Quá trình loại khử clo đã quan sát được ở bước

đầu của quá trình phân hủy. Mặc dù các chất trao đổi chất đã được xác định là các

chlorinated hydroxybiphenyls, benzoic acids và non-substituted 1,10-biphenyl cũng

xuất hiện với nồng độ cao các đồng loại chlorinated biphenyl [131].

Khi nghiên cứu khả năng của laccase trong việc phân hủy 2,4-DBP, 2,4,6-

TBP ở điều kiện bình thường, cho thấy OH-PBDEs (Hydroxylated polybrominated

32

diphenyl ethers) được tạo thành từ quá trình phân hủy 2,4-DBP và 2,4,6-TBP. Các

chất 2′-OH-BDE68, 2,2′-diOH-BB80 và 1,3,8-TrBDD được chứng minh là các sản

phẩm được hình thành từ quá trình phân hủy 2,4-DBP và 2′-OH-BDE121; 4′-OH-

BDE121 là sản phẩm từ quá trình phân hủy 2,4,6-TBP. Việc tạo thành các OH-

PBDEs gần như là kết quả gắn kết các gốc bromophenoxy được tạo thành từ quá

trình xúc tác oxy hóa của laccase đối với 2,4-DBP hoặc 2,4,6-TBP [76].

Laccase có thế oxy hóa khử thấp nên nó chỉ có thể phân hủy trực tiếp với các

hợp chất phenol, nó không thể oxy hóa hầu hết các hợp chất vòng thơm bền vững

gồm các loại thuốc diệt cỏ, do đó các chất gắn kết sẽ đóng vai trò như là electron kết

nối giữa laccase và các hợp chất mục tiêu qua đó mở rộng phổ cơ chất bị oxy hòa

bởi laccase. Hệ laccase-chất gắn kết (tự nhiên hoặc nhân tạo) đã được sử dụng để

phân hủy nhiều các chất ô nhiễm khác nhau. Khả năng phân hủy của laccase đối với

isoproturon chỉ đạt dưới 10% sau 24h ở 300C với hoạt tính laccase trong khoảng từ

0,1 đến 0,5 U/ml, kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đó về khả năng

của laccase trong việc phân hủy chất diệt cỏ. Theo nghiên cứu của Torres-Duarte và

cộng sự, không có phản ứng khi nghiên cứu phân hủy 12 loại thuốc trừ sâu chứa

halogen bởi laccase mà không có mặt chất gắn kết, số liệu thu được là do có sự tồn

tại của các nhóm halogen trong cấu trúc phân tử của chúng [79].

b) Phân hủy dioxin và các chất tương tự

Các enzyme ngoại bào trong đó có laccase đã nhận được sự quan tâm to lớn của

các nhà khoa học do khả năng của chúng có thể oxy hóa một số các chất ô nhiễm bền

vững trong môi trường. Chi tiết về khả năng phân hủy dioxin được xúc tác bởi laccase

còn hạn chế. Các nghiên cứu trước đây cho thấy, laccase của loài Polyporus versicolor

oxy hóa không đáng kể đồng loại 2,3,7,8-TCDD, trong khi đó laccase của loài

Trametes vesicolor và Pycnoporus cinnabarinus chuyển hóa được 2-hydroxy-

dibenzofuran. Hơn nữa, laccase của P. Cinnabarinusi chuyển hóa hydroxy diphenyl

ether; 2-hydroxybiphenyl và loại clo của các chlorinated hydroxy biphenyl [149].

Nhận xét:

Như vậy, đến thời điểm hiện nay việc sử dụng enzyme ngoại bào nói chung,

laccase nói riêng trong việc nghiên cứu phân hủy các chất diệt cỏ/dioxin cũng đã được

tiến hành và đã thu được những kết quả bước đầu khả quan, tuy nhiên các nghiên cứu

mới chỉ dừng lại ở phần ứng dụng một số enzyme nói chung và laccase nói riêng để

33

phân hủy các hợp chất chlorophenol. Còn đối với dioxin thì các nghiên cứu về mức độ,

cơ chế phân hủy chỉ mới dừng lại ở các đồng loại ít độc của PCDD và PCDF. Chưa có

nhiều nghiên cứu về sự phân hủy các đồng loại độc của dioxin như 2,3,7,8-TCDD, hơn

thế nữa chưa có nghiên cứu chi tiết về mức độ phân hủy hỗn hợp bởi dioxin, 2,4-D,

2,4,5-T, PAHs và các chất trao đổi chất do vi sinh vật bản địa tạo ra ở qui mô phòng thí

nghiệm và ở hiện trường ô nhiễm bởi laccase thật hay laccase-like.

1.3.3.2. Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T, dioxin và các hợp chất tương tự bởi nấm sinh tổng

hợp enzym ngoại bào

Các chủng nấm được sử dụng trong phân hủy sinh học thường là các chủng

nấm mục trắng và thuộc ngành nấm Basidiomycetes. Các chủng nấm này có khả

năng độc đáo mà không tìm thấy ở các chủng vi sinh vật khác đó là khả năng

khoáng hóa với phổ cơ chất rộng các chất ô nhiễm hữu cơ độc bằng việc sinh tổng

hợp các hệ enzyme ngoại bào không đặc hiệu. Chủng vi khuẩn có khả năng phân

hủy các chất ô nhiễm hữu cơ ngang với các chủng nấm nhưng ít có khả năng đặc

hiệu khi các chất ô nhiễm hữu cơ không phải là các chất dinh dưỡng để hấp thu.

Bên cạnh đó, các chủng vi khuẩn khó có thể hoạt động khi các chất ô nhiễm có độ

độc cao hoặc chất ô nhiễm có mức độ oxy hóa cao, như PCDD/F hoặc TNT do đó

rất khó để các hệ enzyme của vi khuẩn có thể phát huy khả năng. Chủng nấm mục

trắng sinh tổng hợp enzyme lignin có khả năng oxy hóa cao, hệ enzyme này phân

hủy, khoáng hóa lignin và các hợp chất tương tự lignin. Với đặc tính ưu việt thú vi

như vậy nên các hệ enzyme đại diện nấm đảm này được sử dụng để phân hủy các hợp

chất hữu cơ trong đất [58].

a) Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T và các chất tương tự bởi nấm sinh tổng hợp enzyme

Các chất phenoxyacetic axit chứa clo như 2,4-D và 2,4,5-T được sử dụng là

các chất diệt cỏ, kích thích sinh trưởng ở thực vật và chất làm rụng lá. Các chất này

còn là các chất gây đột biến và gây ra hàng loạt các biểu hiện liên quan đến hệ thần

kinh, hơn thế nữa các chất này còn gây tác động lên hệ miễn dịch làm gia tăng các

bệnh ung thư đối với động vật có vú [165].

Loài nấm trắng T. versicolor và P. chrysosporium có khả năng phân hủy một

số nhóm thuốc trừ sâu như simazine, dieldrin và trifluralin bởi khả năng sinh tổng

hợp các loại enzyme ngoại bào khác nhau. Tuy nhiên, loài P. chrysosporium có khả

năng phân hủy hỗn hợp thuốc trừ sâu trên không phụ thuộc vào hoạt tính laccase.

34

Các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào phân hủy các chất diệt cỏ

nhóm phenoxyalkanoic acid bởi vi khuẩn, mặc dù sinh khối nấm trong đất được

đánh giá là gần bằng với sinh khối của vi khuẩn và khả năng phân hủy các chất diệt

cỏ nhóm phenoxyalkanoic acid bởi một số chủng nấm đã được biết. Theo nghiên

cứu của Vroumsia và cộng sự về quá trình phân hủy 2,4-D và 2,4-dichlorophenol

bởi một số chủng nấm được phân lập từ đất, gỗ mục chỉ ra rằng có sự tương đồng

trong phân hủy 2,4-D bởi vi khuẩn với các giai đoạn chậm, giai đoạn tăng tốc và

giai đoạn ổn định. Phân hủy 2,4-D và MCPA bởi một số chủng nấm là quá trình bẻ

gãy liên kết ether để tạo thành các sản phẩm 2,4-dichlorophenol và 4-chloro-2-

methylphenol, tuy nhiên cơ chế phân hủy này là chưa chắc chắn. Tuy nhiên, theo

nghiên cứu của Faulkner và Woodcock, bước đầu tiêu trong quá trình phân hủy các

hợp chất vòng thơm có clo của loài Aspergillus niger là quá trình hydroxyl hóa clo

của vòng thơm. Theo nghiên cứu của Yadav và Reddy loài Dichomitus squalens và

Phanerochaete chrysosporium phân hủy 2,4-DCP là quá trình oxy hóa và tách clo

để tạo thành chloro-p-benzoquinone và sau đó các quá trình loại clo và các phản

ứng mở vòng được diễn ra, kết quả cuối cùng là tạo thành CO2 [118].

Khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T bởi các chủng đơn và hỗn hợp vi khuẩn

đã được nghiên cứu nhưng rất ít tài liệu nói về khả năng phân hủy sinh học bởi

chủng nấm đối với các chất ô nhiễm này [118].

Có sự khác biệt về khả năng phân hủy các chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T bởi

nấm và vi khuẩn, hiệu quả phân hủy của nấm thường thấp hơn vi khuẩn. Theo

nghiên cứu của Vroumsia và đtg đối với khoảng 90 chủng nấm thì có khoảng

52,2% trong số chúng là phân hủy 2,4-D với hiệu suất trên 10% (nồng độ ban đầu

là 100 mg/L) và chỉ 2,2% (ví dụ loài Mortierella isabellina và A. penicilloides)

phân hủy 2,4-D với hiệu suất trong khoảng 46 đến 52%, phân hủy 2,4-

dichlorophenol là 84,4% và 10% và 13,3% số chủng trên có khả năng phân hủy

đạt 40 đến 65%. Theo nghiên cứu của Itoh và cộng sự [118] khi nghiên cứu khả

năng phân hủy của các chủng nấm được phân lập từ 10 mẫu đất ở Việt Nam đối

với 2,4-D và 2,4,5-T, kết quả chỉ ra rằng trong số 69 chủng chỉ 11,6% trong số

chúng (8 chủng) phân hủy 2,4-D với hiệu quả trên 10% và chỉ 1,4% (ví dụ chủng

Eupenicillium sp.) là phân hủy đạt trên 40%. Trong số 8 chủng phân hủy 2,4-D thì

có 7 chủng thuộc nhóm Euroiales, do đó tác giả đã nhấn mạnh rằng chủng

35

Eupenicillium sp. có khả năng đặc biệt phân hủy các hợp chất phenoxyalkanoic

acid có nguồn gốc từ chất da cam.

b) Phân hủy dioxin và các hợp chất tương tự bởi nấm sinh tổng hợp enzyme

Enzyme cytochrome P-450 monooxygenase là một hemoprotein phân bố

rộng rãi trong các sinh vật nhân thật và tiền nhân. Enzyme này trong nấm men và

nấm sợi có thể hydroxyl hóa DBF. Gần đây, các nhà nghiên cứu đã quan tâm cải

biến P-450 nhằm nâng cao khả năng phân hủy xử lý dioxin. Sakaki và cộng sự đã

chứng minh được sự trao đổi chất đối với DD, MCDD, 2,7-DCDD và 2,3,7-TCDD

bởi tế bào nấm men tái tổ hợp biểu hiện P-450 chuột [134].

Hiện nay, có một số công bố về khả năng của các chủng nấm đất phân hủy

dioxin như chủng Acremonium sp. 622 (tên mới là Pseudallescheria boydii) sinh

trưởng ở điều kiện hiếu khí có khả năng phân hủy cao các đồng loại của dioxin chứa

4-8 clo bằng cách oxy hóa vòng thơm và loại clo. Các enzyme của chủng 622 bám

vào màng tham gia quá trình phân hủy dioxin chứa clo và có cơ chế khác với các

enzyme từ các chủng nấm chuẩn [61]. Kunichika và cộng sự cũng đã chứng minh

khả năng phân hủy đất nhiễm dioxin bởi nấm Acremonium sp. Gần đây con đường

phân hủy dioxin bằng phân hủy vòng ether bởi nấm Cordyceps sinensis A (nấm

đông trùng hạ thảo) đã được nghiên cứu. Nấm này có khả năng phân hủy DD, 2,3,7-

TriCDD và OCDD tạo thành catechol, chất này sau đó được trao đổi chất tiếp đến

cis-cis-muconate; trong khi đó phân hủy 2,3,7-TriCDD và OCDD dẫn đến catechol

chứa 1-3 clo và catechol không chứa clo. Tuy nhiên, các cơ chế phân hủy PCDD/F

của chủng nấm kể trên vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng [100].

Phương pháp sàng lọc các chủng nấm có khả năng phân hủy dioxin đã được

tiến hành từ sớm, chúng đã được nghiên cứu với các đồng loại dioxin là 2,7-DCDD,

2,8-DCDD, 2,4,8-TCDF và 2,7-DCDD, các chủng nấm này đã được sàng lọc từ tự

nhiên. Những nghiên cứu về phân hủy sinh học đồng loại của dioxin và furan như

2,7-DCDD, 2,3,7,8-TCDD và 2,4,8-TCDF có trong đất bởi các chủng nấm cũng đã

được tiến hành [135]. Có một số bài báo cung cấp dữ liệu về khả năng phân hủy

2,3,7,8-TCDD và thậm chí các chất có số lượng clo cao hơn bởi loài Phanerochaete

chrysosporium và Phanerochaete sordida. Sự phân hủy 2,7-DCDD bởi loài P.

chrysosporium đạt gần 50% sau 27 ngày nuôi cấy trong điều kiện hạn chế nitơ, tuy

nhiên chưa có công bố nào về việc chủng này có khả năng phân hủy PCDD và

36

PCDF [138]. Chủng P. sordida YK-624 và P. chrysosporium IFO31249 thực sự có

khả năng phân hủy hỗn hợp tetra đến OCDD và CDF khi xác định sự tồn tại của các

chất trong dung dịch sau quá trình phân hủy. Thêm vào đó sự phân hủy các đồng

loại 2,3,7,8-TCDD và OCDD bởi chủng YK-624 được chứng minh thông qua xác

định sự hình thành các chất chuyển hóa. Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa khi nhìn

nhận tiềm năng của nấm trắng với quá trình phân hủy dioxin trong môi trường

[138]. Phát hiện này có ý nghĩa đặc biệt do sự ô nhiễm bởi hỗn hợp các hóa chất

thường phổ biến hơn nhiều sơ với là ô nhiễm bởi một chất riêng lẻ.

Nấm sinh tổng hợp các enzyme như LiP, MnP như loài P. chrysosporium có

khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD và 2,7-DCDD. Một số chủng nấm trắng sinh tổng

hợp các hệ enzyme lignin thuộc các ngành Phlebia (Phl. brevispora, Phl.lindtneri)

và Phanerochaete (P. chysosporium, P. sordida) có khả năng phân hủy PCDD/F và

một số chủng nấm lại có khả năng phân hủy tất cả các đồng loại của PCDD/F. Sự

phân hủy PCDD/F bởi các chủng nấm thường diễn ra dưới dạng đồng trao đổi chất

khi bổ sung các nguồn carbon và trong điều kiện hiếu khí. Ngoài hệ enzyme lignin

trên cũng có hệ enyzme khác của nấm như cytochrome P450 cũng đóng vai trò

trong phân hủy PCDD/F, phát hiện này đã được Kasai công bố năm 2010 [58].

Bảng 1.8. Phân hủy các đồng loại dioxin bởi nấm đảm

Đồng loại dioxin 2-MCDD

2,7-DCDD

2,3,7-TrCDD

2,3,7,8-TCDD 1,3,6,8-TCDD 1,2,3,7,8-PCDD 1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,4,7,8,9-OCDD Nấm đảm P. chrysosporium Phl. lindtneri Phlebia spp. Phl. lindtneri Phlebia spp. P. chrysosporium P. sordida Phl. brevispora Phl. lindtneri Phlebia spp. P. sordida P. sordida

Từ bảng trên cho thấy các đồng loại dioxin khác nhau đã được nghiên cứu

phân hủy bởi các loài nấm trắng khác nhau. Qua đó cho thấy tiềm năng của nấm

đảm trong phân hủy các đồng loại của dioxin.

Ở Việt Nam, các nghiên cứu khử độc đất nhiễm chất độc hóa học được bắt

đầu từ năm 1999. Phòng công nghệ sinh học môi truờng (CNSHMT), Viện công

37

nghệ sinh học đã thực hiện nhiều nghiên cứu công nghệ và thực hiện xử lý hiện

trường ở các quy mô khác nhau: 0,5 m3; 1,5 m3; 2 m3; 10 m3, 100 m3 và 3.384 m3

tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa. Kết quả thu được cho thấy tổng độ độc đã giảm

từ 50 đến 70% và 99,6% sau 2 năm và hơn 3 năm xử lý. Hiện nay, trong bộ sưu tập

giống VSV phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở Đà Nẵng của Phòng

CNSHMT, một số chủng đã được định tên bằng cả hai phương pháp truyền thống

và xác định trình tự gene 16S rRNA, 18S rRNA bao gồm Streptomyces sp.

XKDN11, S. sp. XKDN12, S. sp. XKDN19, S. sp.XKDNR1, Brevibacillus sp.

XKDN13, B. sp. BDNR10, Bacillus sp. BDN6, B. sp. BU3, Pseudomonas sp.

BDN15, P. sp. BDNR1, P. sp. Setdn1, Aspergillus sp. FDN9, A. sp. FDN20, A. sp.

FDN21, A. sp. FDN41, Curvularia sp. FDN22, Trichoderma sp. FDNR40. Các trình

tự gene đều được đăng ký trên GenBank. Một số gene chức năng tham gia vào phân

hủy chất diệt cỏ/dioxin như tdfA, dioxin dioxygenase [104] v.v. cũng đã được

nghiên cứu và giải trình tự. Một số gene đã được đánh giá số lượng bản sao ngay

trong các lô xử lý tẩy độc như C230, tdfA. Các chủng VSV này đều có khả năng

phân hủy 2,3,4,7-TCDD hoặc 2,4,5-T, 2,4-D, DBF, PAH v.v. ở các mức độ khác

nhau như là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất hay theo cơ chế đồng trao đổi

chất [104].

Nghiên cứu tẩy độc dioxin trong đất tại sân bay Đà Nẵng theo 5 công thức

xử lý khác nhau, sau một tháng thí nghiệm, hàm lượng dioxin giảm từ 32,84% đến

71,04% [104]. Nghiên cứu cũng đã xác định sự đa dạng của VSV tham gia vào quá

trình phân hủy và khả năng sinh enzyme ngoại bào laccase, LiP và MnP. Các tác giả

cũng cho rằng hai laccase và MnP đóng một vai trò như là chất xúc tác trong quá

trình phân hủy sinh học các chất có trong đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin.

Trong Chương trình Khoa học và Công nghệ KHCN 33.02/11-15, Lâm Vĩnh

Ánh và cộng sự đã nghiên cứu giải pháp công nghệ tích hợp giữa công nghệ rửa đất

kết hợp với oxy hóa - khử, giải hấp và phân hủy nhiệt có xúc tác để xử lý đất, trầm

tích nhiễm dioxin tại sân bay Biên Hòa. Kết quả, sau công đoạn rửa đất đã loại được

75% các vật liệu ô nhiễm, dung dịch rửa được xử lý bằng oxy hóa - khử hiệu xuất

đạt 97,48%, bùn và vật liệu hấp phụ được xử lý bằng công nghệ xử lý nhiệt có xúc

tác hiệu suất phân hủy đạt 99,4% [78].

38

Nhận xét:

Các nghiên cứu được tổng quan ở Mục 1.3.3 chỉ ra rằng, ứng dụng chủng vi

sinh vật, đặc biệt là các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào

trong loại màu, phân hủy thuốc nhuộm, phân hủy dioxin và các hợp chất tương tư

cũng như phân hủy các chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T đã được nghiên cứu khá bài bản.

Những kết quả thu được đã góp phần chứng minh rõ ràng về khả năng phân hủy,

chuyển hóa, loại bỏ hoàn toàn hay từng phần các chất ô nhiễm đa vòng thơm của vi

sinh vật. Tuy nhiên, các nghiên cứu trên mới chỉ tập trung vào các màu tổng hợp cơ

bản, cũng như các chất mô phỏng giống với 2,4-D, 2,4,5-T, các đồng loại của dioxin

mà không phải là hỗn hợp 2,4-D, 2,4,5-T với các đồng loại độc nhất của dioxin thực

tế có trong đất, trầm tích hiện có tại các sân bay quân sự ở Việt Nam. Các nghiên cứu

cũng cho thấy con đường phân hủy với các đối tượng ô nhiễm là màu thuốc nhuộm,

chất diệt cỏ/dioxin bởi vi sinh vật chưa được nghiên cứu cụ thể mà mới chỉ dừng lại ở

giả định cơ chế và với đối tượng là đơn chất.

Đến thời điểm hiện tại chưa có công nghệ nào nghiên cứu tới việc sử dụng vi

sinh vật sinh laccase, laccase-like và bản thân chủng vi sinh vật để ứng dụng xử lý,

khử độc hỗn hợp chất diệt cỏ chứa dioxin trong đất ô nhiễm nói chung và trong đất

ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại Việt Nam nói riêng.

Tóm lại: Tổng quan tài liệu nghiên cứu đã được nghiên cứu sinh trình bày ở

trên cho thấy, laccase thật từ các nhóm vi sinh vật sinh tổng hợp laccase là đối

tượng đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu nhiều nhưng cho đến

nay vẫn là đề tài tiếp tục hấp dẫn bởi tính ứng dụng cao. Cho đến thời điểm này có

rất ít công trình nghiên cứu sử dụng tổ hợp của nhiều chủng vi sinh vật, đặc biệt là

vi sinh vật sinh tổng hợp laccase trong xử lý ô nhiễm môi trường nói chung và thuốc

nhuộm, các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy nói riêng.

Trong quá trình sinh trưởng, các loài nấm đảm và nấm sợi ngoài khả năng

sinh tổng hợp các enzyme có bản chất protein thì chúng còn có khả năng sinh tổng hợp

một số hoạt chất sinh học có trọng lượng phân tử thấp có khả năng oxy hóa mạnh các

chất hữu cơ vòng thơm. Các nghiên cứu bước đầu của quốc tế và ở Việt Nam đã đánh

giá là chúng không có cấu tạo protein mà chỉ là các đoạn peptide có hoạt tính oxy hóa

cao trong điều kiện môi trường bất lợi đối với vi sinh vật sống và hoạt động của các

enzyme thông thường khác. Hiện các công bố nghiên cứu liên quan trực tiếp hay giám

39

tiếp đến vấn đề mới đề cập ở trên còn ở mức rất hạn chế. Vì vậy, để phân biệt với

những tên gọi và thuật ngữ của các nghiên cứu đã được công bố và tạo thuận tiện

trong trong nghiên cứu lĩnh vực này, hoạt chất sinh học đầy tiềm năng năng không

phải là protein này sẽ được gọi là laccase-like (chất giống laccase).

Hiện nay, nghiên cứu sử dụng enzyme ngoại bào nói chung và laccase nói

riêng ở Việt Nam trong loại màu thuốc nhuộm, phân hủy, chuyển hóa các hợp chất

hữu cơ cũng đã thu được những kết quả khả quan. Trong đó, nghiên cứu loại màu

thuốc nhuộm và phân hủy các chất hữu cơ clo mới chỉ dừng lại ở nghiên cứu ứng

dụng laccase để loại các màu tổng hợp cơ bản, cũng như các chất mô phỏng giống

với 2,4-D, 2,4,5-T và các đồng loại khác của dioxin. Hiện chưa có nghiên cứu nào

công bố về việc sử dụng laccase, laccase-like và bản thân chủng vi sinh vật trong việc

loại màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại sử dụng nhuộm vải may quân trang phục

vụ cho quân đội. Hơn thế nữa, đặc thù ô nhiễm đất bao gồm hỗn hợp 2,4-D, 2,4,5-T

với các đồng loại độc nhất của dioxin cùng các chất trao đổi của chúng đang tồn tại

trong đất ô nhiễm tại các sân bay quân sự như ở Việt Nam nên cần thêm các giải

pháp công nghệ xử lý, khử độc mang tính hiệu quả cao hơn.

Các nghiên cứu cũng cho thấy con đường phân hủy màu thuốc nhuộm, chất

diệt cỏ/dioxin chưa bắt đầu nghiên cứu cơ chế mà mới chỉ dừng lại ở giả định cơ chế

và với đối tượng đơn chất. Đây là cơ hội cho các nhà nghiên cứu tiếp tục sàng lọc,

tìm hiểu về khả năng của laccase, laccase-like, cũng như bản thân chủng vi sinh vật

sinh tổng hợp ra chúng để bổ sung cơ sở dữ liệu, cơ sở khoa học về khả năng, vai

trò của laccase, laccaes-like và bản thân chủng vi sinh vật được phân lập từ các

vùng sinh thái ở Việt Nam. Đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin là các địa điểm lý tưởng để

tìm kiếm nguồn nguyên liệu di truyền phục vụ lại cho nghiên cứu công nghệ. Đây có

thể coi là bước đầu mở ra con đường nghiên cứu ứng dụng hướng đích rất rõ ràng,

từ các minh chứng được trình bày ở phần kết quả và thảo luận của luận án này. Bước

đầu cho chúng ta thấy việc khai thác đa dạng vi sinh vật bản địa ở nước ta để xử lý ô

nhiễm môi trường nói chung và ô nhiễm do hoạt động trong quân đội nói riêng sẽ

mang tính khả thi cả về kỹ nghệ và kinh tế.

40

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu để phân lập vi sinh vật và các chủng nấm kế thừa

 Nấm đảm được thu thập trên cây, cành gỗ mục, trong đất ở độ cao trên 600 m

của rừng Quốc gia Ba Vì và từ khu vực Ba Trại, huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội;

 Xạ khuẩn được phân lập từ đất ô nhiễm khu vực mới (Pacer Ivy, Tây Nam

sân bay) và từ lô xử lý sinh học đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin (khu vực Z1)

của sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai;

 Chủng nấm đảm FBD154 được phân lập từ khu vực rừng Quốc gia Bidoup -

Núi Bà, Lâm Đồng và nấm sợi FNBLa1 được phân lập từ rơm mục ở Ninh Bình

trong bộ sưu tập giống của nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học, 2

chủng nấm trên đã được đăng ký quyền Sở hữu trí tuệ.

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu và xử lý

 Các chất diệt cỏ 2,4-D; 2,4,5-T; DBF; PAHs tinh khiết đạt tiêu chuẩn phân

tích (PA) của Sigma và đồng loại dioxin độc nhất là 2,3,7,8-TCDD được

cung cấp bởi Công ty BE (Hà Lan) từ phòng Cung cấp hóa chất isotop

chuẩn, Vương Quốc Anh;

 Dịch chiết đất (DCĐ) chứa hỗn hợp 2,3,7,8-TCDD là đồng loại dioxin quyết

định chủ yếu tổng độ độc (chiếm hơn 90%) của đất ô nhiễm tại sân bay Biên

Hòa. Ngoài ra dịch chiết đất còn chứa một lượng lớn 2,4,5-T; 2,4-D; PAHs

và các chất trao đổi chất của các hỗn hợp dioxin, furan và 2 loại chất diệt cỏ

v.v. kể trên. Quy trình chuẩn bị DCĐ được mô tả ở phần Phụ lục.

 Đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin được thu thập từ khu vực ô nhiễm phía Tây-

Nam sân bay (khu Pacer Ivy) sân bay Biên Hòa, đất khu vực này có độ độc

vào khoảng 20.000 ng-TEQ/kg [78].

 Một số thuốc nhuộm tổng hợp là NY1, NY5, NY7 thuộc 2 nhóm azo và

thuộc nhóm anthraquinone tổng hợp sử dụng để đánh giá khả năng loại màu

thuốc nhuộm hoạt tính thường được sử dụng ở điều kiện phòng thí nghiệm

và các loại thuốc nhuộm hoạt tính thương mại được thu thập từ Nhà máy

X20/Tổng Cục Hậu cần (thông tin cơ bản về các loại thuốc nhuộm được trình

bày tại Bảng 1 và Bảng 2 phần Phụ lục.

41

2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

- Môi trường Gause M lỏng và thạch với các thành phần: KNO3 2 g/L; MgSO4

0,45 g/L; KH2PO4 0,15 g/L; Na2HPO4 0,35 g/L; NaCl 1 g/L; K2HPO4 0,25 g/L;

FeSO4 0,01 g/L; Cao nấm men 0,2 g/L; cao malt 3 g/L; tinh bột 3 g/L; thạch 15 g/L.

- Dịch chiết khoai tây (DCKT): dịch chiết bởi 200 g khoai tây tươi trong 1 lít

nước cất, đun sôi trong thời gian 2, sử dụng HCl 0,1N và NaOH 0,1N để điều chỉnh

về pH 7,0.

- Môi trường PDA gồm: dịch chiết khoai tây và agar 18 g/l, pH 7,0.

- Môi trường Czapeck: saccharose 30 g/l, MgSO4 0,5 g/l, KH2PO4 1 g/l,

NaCl 1 g/l, NaNO3 2 g/l, KCl 0,5 g/l, FeSO4 0,01 g/l, pH 7,0.

- Môi trường PDB: dịch chiết khoai tây và 10 g/l D-glucose; pH 7,0.

- Môi trường PDB-DT: dịch chiết khoai tây; 10 g/l D-glucose và 1 g bột đậu

tương; pH 7,0.

- Môi trường MEG: KH2PO4 1 g/l, Na2HPO4 4 g/l, NaCl 0,2 g/l, MgSO4 0,2

g/l, CaCO3 0,5 g/l, cao men 4 g/l, cao malt 2 g/l, glucose 4 g/l, pH 6,5.

- Môi trường Vis: pepton 3 g/l, glucose 10 g/l, KH2PO4 0,6 g/l, ZnSO4 0,001

g/l, K2HPO4 0,4 g/l, FeSO4 0,0005 g/l, MnSO4 0,05 g/l, MgSO4 0,5 g/l, pH 6,0.

- Môi trường TSH1: 100 ml dịch chiết khoai tây, 10 g/L glucose, 1 g/L cám

gạo, 5 g/L bột đậu tương, 100 µM Cu2+, pH 6,5.

- Toàn bộ môi trường sử dụng để nuôi cấy đều được khử trùng ở 115oC trong

30 phút, sau 1 đến 2 ngày để tĩnh trong phòng thí nghiệm sẽ được sử dụng để nuôi

cấy nấm đảm, nấm sợi và xạ khuẩn.

2.1.4. Thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu

- Thiết bị xác định OD/Jasco của Nhật Bản;

- Thiết bị sắc ký khí Agilent GC 7890A/Mỹ ghép khối phổ MSD 5975C tại

Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga/BQP;

- Thiết bị sắc ký khí Agilent GC 6890 ghép nối khối phổ MSD 5975 tại Viện

Hóa học - Môi trường quân sự/BTL Hóa học;

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent HP-1100/Mỹ tại Viện

Hóa học - Môi trường quân sự/BTL Hóa học;

- Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ ba lần tứ cực Agilent 6430 Triple Quad

LC/MS/MS (Mỹ) tại Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga/Bộ quốc phòng.

42

- Ngoài ra, rất nhiều hóa chất và dụng cụ thiết bị chuyên dung khác cũng đã được

sử dụng để thực hiện nguyên cứu này.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Do thực hiện nhiều thực nghiệm để xác định đặc tính, khả năng của laccase,

laccae-like và bản thân chủng vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccae-like trong loại

màu thuốc nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin nên sơ đồ thực nghiệm được mô tả

u ứ c n ê i h g n m ệ i h g n c ự h t ồ đ ơ S

. 1 . 2 h n ì H

bằng sơ đồ ở Hình 2.1.

43

2.2.1. Phân lập, nuôi cấy vi sinh vật

2.2.1.1. Phân lập chủng nấm

Nấm tươi được thu thập từ rừng Quốc gia Ba Vì, chuyển về phòng thí

nghiệm chụp ảnh. Trước khi phân lập hoạt tính enzyme thuộc oxidoreductase và

peroxidase đã được đánh giá sơ bộ bằng cách: cân 1 g nấm tươi, nghiền nhỏ và bổ

sung 10 ml nước cất 1 lần, lắc trong vòng 30 phút, sau đó tiến hành đo hoạt tính

laccase, MnP, LiP hỗn hợp in-situ. Tiến hành phân lập, làm sạch trên môi trường

PDA bổ sung guaniacol 1 % để nhận biết song song khả năng sinh tổng hợp

oxidoreductase và peroxidase (laccase, LiP và MnP) thông qua vòng có màu nâu đỏ

là sản phẩm oxy hóa guaniacol.

2.2.1.2. Phân lập xạ khuẩn

Xạ khuẩn được phân lập theo phương pháp cấy chuyển nhiều lần trên môi

trường Gause M thạch chứa DCĐ (là dịch chiết từ đất ô nhiễm nặng chất diệt

cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hoà và Đà Nẵng có chứa các chất 2,4,5-T; 2,4-D; TCP;

DCP và các đồng loại độc của dioxin trong đó có đồng loại 2,3,7,8-TCDD có tổng độ

độc ban đầu từ 10.000 đến 20.000 ng-TEQ/kg).

2.2.1.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm sinh tổng hợp laccase cao

Chủng nấm lựa chọn được nuôi trong bình trụ 250 ml với 100 ml môi trường

TSH1; PDB; PDB có bổ sung 1 % bột đậu tương; Czapeck; dịch chiết khoai tây;

MEG và Vis ở điều kiện nhiệt độ 30°C và lắc ở tốc độ 120 vòng/phút. Hàng ngày tiến

hành hút dịch để đo hoạt tính laccase đến thời điểm hoạt tính đạt giá trị cao nhất và

bắt đầu giảm thì dừng đo để thu dịch. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

2.2.1.4. Nuôi cấy xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase-like trên các nguồn chất hữu cơ

vòng thơm khác nhau

Các chủng xạ khuẩn được nuôi lắc trong bình tam giác 250 ml với 100 ml

môi trường nuôi cấy Gause M (thành phần giống Gause M thạch nhưng không có

thạch) chứa riêng biệt các chất DCĐ (4 đến 16% theo thể tích dung dịch nuôi cấy);

2,4-D; 2,4,5-T; DBF hoặc PAHs (hỗn hợp của anthracen và pyrence với tỷ lệ 1:1

theo thể tích) (tinh khiết của Sigma) có nồng độ từ 100 đến 400 ppm. Giống xạ

khuẩn được bổ sung 10% theo thể tích ở nhiệt độ 30°C, lắc trên máy lắc với tốc độ

150 vòng/phút. Hoạt tính laccase-like được xác định giống như phương pháp chuẩn

xác định như với laccase thật theo thời gian.

44

2.2.2. Phân loại vi sinh vật

2.2.2.1. Phân loại VSV theo hình thái khuẩn lạc

Để phân loại sơ bộ mẫu nấm thu thập được thuộc loài nấm đảm hay nấm sợi,

phương pháp phân loại theo hình thái khuẩn lạc đã được xác định. Các mẫu nấm sau

khi được làm sạch trên môi trường PDA có bổ sung guaniacol sẽ được mô tả hình

thái khuẩn lạc về màu sắc, kích thước và đặc điểm phát triển hệ sợi, khả năng sinh

tổng hợp oxidoreductase và peroxidase.

Hình thái khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn được quan sát sau 5 ngày nuôi cấy

trên môi trường Gause M thạch ở 30oC.

Hình thái, đặc điểm cuống sinh bào tử và bào tử của chủng nấm và xạ khuẩn

được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL-Nhật Bản (Viện 69/Bộ Tư lệnh

Lăng) với độ phóng đại 10.000 lần.

2.2.2.2. Phân loại VSV theo phương pháp sinh học phân tử

a) Phân loại chủng nấm dựa vào vùng ITS

DNA tổng số của nấm được tách chiết theo mô tả của Eric và Boehm. Sản

phẩm PCR được nhân lên từ DNA tổng số với cặp mồi ITS1 (5’-

TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’).

b) Phân loại chủng xạ khuẩn dựa vào trình tự gene 16SrRNA

ADN tổng số của chủng xạ khuẩn được tách chiết theo các bước sau:

Thu sinh khối xạ khuẩn vào ống eppendorf bằng cách ly tâm 6000 vòng/phút

trong 10 phút ở 4oC; Bổ sung dH2O để rửa sinh khối, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10

phút ở 4oC; Bổ sung 400 µl dung dịch đệm phân giải, vortex đều; Bố sung 50 µl lysozym

10 mg/ml, ủ ở 37oC trong 30-45 phút; Bổ sung 20 µl proteinaza K ủ ở 56oC trong 1 giờ;

Bổ sung C:I (24:1) với tỷ lệ 1:1 (v:v), vortex, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở

4oC; Hút phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới; Bổ sung isopropanol với tỉ lệ

1:1 về thể tích, ủ ở 4oC qua đêm; Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa;

Bổ sung etanol 100% tỷ lệ 1:1 (v:v); Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu

tủa, rửa tiếp bằng etanol 70%; Làm khô tủa; Hòa trong TE, bảo quản ở 4oC.

Sau khi thu được ADN tổng số, thực hiện khuếch đại đoạn gen mã hoá 16S

rARN bằng kỹ thuật PCR. Đoạn gen mã hóa 16S rARN được khuếch đại bằng cặp

mồi 27F (5’ – AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG – 3’) và 1492R (5’ – TAC

GGG TAC CTT GTT ACG ACT T– 3’) (Baker, 2003; Bourne, 2005).

45

Xạ khuẩn được phân loại dựa trên trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA. DNA tổng

số được tách chiết theo phương pháp của Vijay Kumar và cộng sự (Vijay 2010) và

làm sạch bằng kit Qiaquick® Mini Columns (Qiagen - Đức). Cặp mồi 27F và 1492R

được sử dụng để nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA từ DNA tổng số. Hỗn hợp phản

ứng PCR chứa: 3 µl buffer taq (5X); 3 µl Mg2+; 3 µl dNTP; 1 µl 27F; 1 µl 1492R;

0,15 µl taq polymerase; 1 µl DNA khuôn và bổ sung nước loại ion đến 30 µl.

Thành phần phản ứng PCR như sau:

Thành phần

Nồng độ cuối 1X 0,2 mM 2 mM 0,4 µM 0,4 µM 1 U/25 µl - - - Thể tích (µl) 2,5 Đệm Taq 10X 2,5 dNTPs 2 mM 2,5 MgSO4 20 mM 1 Mồi 27F 10 µM 1 Mồi 1492R 10 µM 0,2 Taq Polymeraza 5 U/ µl 1 ADN khuôn 14,3 ddH2O Tổng thể tích 25 µl Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR như sau:

Bước Số chu kỳ 1

30

Biến tính Biến tính Gắn mồi Kéo dài chuỗi Kéo dài chuỗi Ổn định 1 Giữ ổn định Nhiệt độ/thời gian 94˚C/5 phút 94˚C/1 phút 55˚C/1 phút 72˚C /1 phút 30 giây 72 ˚C /7 phút 4 ˚C Trình tự gene của chủng nghiên cứu được so sánh với dữ liệu trình tự gene

các chủng trên GenBank. Sử dụng phần mềm Finch TV và MEGA6 để xây dựng

cây phát sinh chủng loại.

2.2.3. Phương pháp hóa - sinh

2.2.3.1. Xác định hoạt tính laccase, laccase-like sử dụng ABTS

Nguyên tắc: Hoạt độ của laccase được xác định bằng sự tăng độ hấp thụ ánh

sáng của sản phẩm được tạo thành ở bước sóng 420 nm ở điều kiện phòng thí nghiệm.

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết để tạo thành

1 µM sản phẩm từ cơ chất ABTS trong thời gian 1 phút, ở điều kiện phòng thí nghiệm.

Phương pháp xác định:

Bước 1: Hút các thành phần phản ứng gồm 600 µl đệm natri acetate (20 mM,

pH 4), 200 µl dịch enzyme.

46

Bước 2: Xác định độ hấp thụ ánh sáng (AC) của dung dịch tại thời điểm τ = 0:

Hút 200 µl ABTS 1,5 mM vào ống nghiệm đã chứa các thành phần ở bước 1, voltex

đều và chuyển sang cuvet, xác định giá trị độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 420 nm.

Bước 3: Xác định giá trị độ hấp thụ ánh sáng (AM) của dung dịch phản ứng tại

thời điểm τ: Hút 200 µl ABTS 1,5 mM vào ống nghiệm đã chứa các thành phần ở bước

1, voltex đều, trong thời gian τ (thường là 2 phút). Xác định giá trị độ hấp thụ ánh sáng

ở bước sóng 420 nm. Lặp lại 2-3 lần để lấy giá trị độ hấp thụ ánh sáng trung bình.

Công thức tính:

Trong đó:

U: Hoạt độ enzyme (U/l)

ε: Hệ số hấp thụ ánh sáng của sản phẩm, ε420 = 36.000 (M-1 cm-1)

Vpu: Tổng thể tích phản ứng (1 ml)

VE: Thể tích enzyme (200 µl)

Aτ: Giá trị độ hấp thụ ánh sáng đo được tại thời điểm τ

A0: Giá trị độ hấp thụ ánh sáng đo được tại thời điểm τ = 0

Df: Độ pha loãng.

Tpu: Thời gian phản ứng (2 phút)

U = (CT1)

2.2.3.2. Tinh sạch, nhận diện protein của laccase, laccase-like

a) Tinh sạch bằng cột lọc gel

- Đối với dịch laccase thô thu từ quá trình nuôi cấy được ly tâm 4,000 vòng/phút

trong 15 phút ở 4ºC được cô đặc bằng màng lọc tiếp tuyến 10 kDa. Dịch enzyme sau

khi cô được đưa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-75 với thể tích 2 ml/lần. Cột có kích

thước 1,2 x 50 cm được cân bằng với đệm 20 mM sodium acetate; pH 5,5; tốc độ dòng

chảy là 20 ml/giờ. Thu 40 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 1 ml. Hàm lượng protein

và hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn.

- Đối với dịch laccase-like thô của chủng XKBiR929 được cô bằng thiết bị cất

quay ở nhiệt độ 80ºC và áp suất 0,8 atm. Dịch laccase-like sau khi cô được đưa lên

cột sắc kí lọc gel Sephadex G-10 với thể tích 2 ml/lần. Cột có kích thước 1,2x50 cm

được cân bằng với đệm 20 mM sodium acetate; pH 5,5; tốc độ dòng chảy là 20

ml/giờ. Thu 35 phân đoạn từ lúc dịch enzyme ở độ cao ½ cột, thể tích mỗi phân đoạn

1 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn.

47

b) Tinh sạch bằng cột trao đổi ion

Dịch enzyme sau khi qua cột sephadex G-75, G-10, chọn những phân đoạn

có hoạt tính laccase cao được đưa tiếp lên cột sắc ký trao đổi ion Q – anion với tổng

thể tích là 10 ml. Cột có kích thước 1 x 5 cm được cân bằng với đệm 20mM sodium

acetate pH 5,5. Thôi mẫu bằng muối 0,05-0,5 M NaCl, bước nhảy giữa các nồng độ

là 0,05 M; mỗi nồng độ thu 10 phân đoạn với thể tích 1 ml/phân đoạn. Tốc độ dòng

chảy là 1 ml/phút khi cân bằng cột và load mẫu; 1,5 ml/ phút khi thôi mẫu. Hàm

lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định ở mỗi phân đoạn.

c) Xác định hàm lượng protein tổng số

Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Bradford (1976).

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie

Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất

ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch.

Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch

BSA (Bovin Serum Albumin).

Dung dịch chuẩn BSA có nồng độ stock 100 µg/ml được sử dụng để xây

dựng đường chuẩn protein. Sử dụng nước khử ion để pha loãng các nồng độ BSA

khác nhau 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 và 70 µg/mL. Giá trị OD được xác định ở bước

sóng 595 nm. Thí nghiệm được tiến hành trong đĩa 96 giếng. Nồng độ protein được

xác định dựa trên đường chuẩn BSA.

d) Điện di SDS-PAGE [77]

Để xác định khối lượng phân tử và độ tinh sạch của laccase được xác định bằng

phương pháp điện di trên gel polyacrylamide. Quá trình điện di được thực hiện với

dòng điện có hiệu điện thế là 90V đối với bản điện di gel cô và 120 V đối với bản điện

di gel tách. Thành phần của gel điện di gồm:

Thành phần

H2O Tris HCl 1,5 M (pH 8,8) Tris HCl 0,5 M (pH 6,8) Glycerol 50% Bis/acrylamide SDS 10% APS TEMED Gel tách 12,5% 0,67 ml 1,375 ml - 1,1 ml 2,31 ml 55 μl 37 μl 4 μl Gel cô 4,5% 0,11 ml - 0,5 ml - 0,35 ml 10 μl 20 μl 3 μl

48

2.2.3.3. Xác định đặc tính protein của laccase, laccase-like tinh sạch

a) Ảnh hưởng pH thích hợp và độ bền pH: dịch enzyme tinh sạch được ủ với

cơ chất ABTS pha trong dải đệm có pH từ 2 đến 6, bao gồm đệm: glycine-HCl với

pH từ 2-3; sodium acetate với pH từ 4-5 và potassium phosphate với pH từ 6-7. Để

đánh giá độ bền pH, laccase được ủ với các đệm có pH thay đổi từ 2-7 trong thời

gian 7 giờ ở nhiệt độ 30oC.

b) Ảnh hưởng nhiệt độ thích hợp và độ bền nhiệt: hỗn hợp phản ứng bao gồm

dịch enzyme, cơ chất ABTS, đệm pH thích hợp được ủ ở các nhiệt độ khác nhau

trong khoảng từ 30 - 90ºC để tìm nhiệt độ phản ứng thích hợp. Để xác định độ bền

nhiệt của enzyme từ chủng nấm nghiên cứu, dịch enzyme đã tinh sạch được ủ ở các

nhiệt độ khác nhau từ 30 - 90ºC, sau các khoảng thời gian: 20, 60, 100, 140 và 180

phút. Hoạt tính còn lại của enzyme được xác định theo phương pháp đã nêu với thời

gian phản ứng là 2 phút ở nhiệt độ phản ứng tương ứng.

c) Cơ chất đặc hiệu: một số cơ chất đặc hiệu thường được sử dụng đối với

enzyme là ABTS; syringaldazine (syrin); 2, 6-DMP và guaiacol (Gua), được sử

dụng để kiểm tra khả năng phản ứng oxy hóa của laccase tinh sạch. Hỗn hợp phản

ứng gồm 600 µl đệm 20 mM sodium acetate pH 4, 200 µl enzyme tinh sạch và 200

µl cơ chất. Sự oxi hóa của cơ chất được xác định trong khoảng bước sóng từ 340-

700 nm. Tốc độ oxi hóa cơ chất bởi enzyme được xác định bằng sự tăng độ hấp thụ

ánh sáng tại bước sóng xác định. Mỗi phép đo được lặp lại 2 lần.

d) Xác định hằng số Michaelis-Menten (Km) và Vmax: Dịch enyzme tinh sạch

được cho phản ứng với cơ chất ABTS có nồng độ khác nhau: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4

và 0,5 mM. Ứng với mỗi nồng độ cơ chất được khảo sát ở thời gian 2 phút, phản

ứng được thực hiện ở 60oC, xác định hoạt tính laccase. Ở mỗi nồng độ cơ chất chọn

giá trị hoạt tính cao nhất làm giá trị V. Từ đó dùng phần mềm Excel để vẽ đồ thị

Lineweaver-Burk theo nồng độ cơ chất [S] và giá trị hoạt tính V tương ứng. Từ đó

xác định được Km và Vmax.

e) Ảnh hưởng của các chất ức chế và ion kim loại: dịch enzyme được ủ

cùng với muối của các kim loại: Ni2+, K+, Na+, Cu2+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, Co2+

ở nồng độ 0,5; 1, 2, 3, 4 và 5 mM. Một số chất ức chế (Cl-, EDTA, SDS, arginine)

được sử dụng ở nồng độ 2, 5 và 10 mM. Sau 30 phút, hoạt tính còn lại của enzyme

được xác định. Hỗn hợp phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 60oC và pH 4.

49

Mẫu đối chứng không có mặt của ion kim loại hoặc chất ức chế. Hoạt tính

được biểu diễn bằng phần trăm hoạt tính còn lại hoặc % bị ức chế. Hoạt tính

enzyme ở mẫu đối chứng được coi là 100%. Mỗi phép đo được lặp lại 2 lần.

2.2.4. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm

2.2.4.1. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like

a) Thực nghiệm

Để xác định khả năng loại màu của laccase, laccase-like với các đối tượng là

màu tổng hợp và màu hoạt tính thương mại được thu thập từ Nhà máy X20/TCHC,

các thí nghiệm được được trình bày tại Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Tổng hợp các thực nghiệm nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like

Thuốc nhuộm Nồng độ TN Nồng độ CGK Điều kiện TN Đối tượng đánh giá Thể tích nghiên cứu Bước sóng xác định (nm)

1. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm tổng hợp ở các nồng độ CGK khác nhau

NY1 NY5 520,0 580,6

5 ml 100 mg/l Đệm actate 20 mM pH4 NY7 467,8

0; 50; 100; 200; 300; 500; 600; 800 và 1000 µM ViO Laccase thô từ nấm đảm có hoạt tính ban đầu là 1000 U/L

5 ml 100 mg/l 200 µM ViO Đệm actate 20 mM pH4

Laccase thô từ nấm đảm có hoạt tính ban đầu là 1000 U/L

620 430 540 602 620 418 410 430

2. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính từ Nhà máy X20/TCHC 2.1. Đánh giá khả năng loại màu để lựa chọn thuốc nhuộm bị loại màu với hiệu suất cao nhất MT.BES MY.BES MR.EBR MN.FBN NN.SG NY.S3R MY.EG NY.FN2R 2.2. So sánh khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN và NN.SG MN.FBN 602

5 ml 100 mg/l NN.SG 620 Đệm actate 20 mM pH4 0; 50; 100; 200; 300; 400 và 500 µM ViO

Laccase thô từ nấm đảm có hoạt tính ban đầu là 1000 U/L 2.3. Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN. FBN được sử dụng để nhuộm vải may quân trang

50

Thuốc nhuộm Nồng độ TN Nồng độ CGK Điều kiện TN Đối tượng đánh giá Thể tích nghiên cứu Bước sóng xác định (nm) 2.3.1. Khả năng loại màu ở các nồng độ CGK khác nhau

MN.FBN 50 mg/l 5 ml 602 Đệm actate 20 mM pH4 0; 50; 100; 200; 300; 400 và 500 µM ViO

MN.FBN 50 mg/l 5 ml 602 Đệm actate 20 mM pH4 0; 100; 200; 300; 400; 500 µM ViO

MN.FBN 50 mg/l 5 ml 602

400 µM ViO và 400 µM HBT Đệm KCl-HCl 100 mM có pH 1

Laccase thô từ nấm đảm có hoạt tính ban đầu là 1000 U/L Laccase tinh sạch của nấm đảm có hoạt tính ban đầu 1000 U/L Laccase- like tinh sạch của chủng xạ khuẩn có hoạt tính ban đầu 1000 U/L

2.3.2. Khả năng loại màu ở các nồng độ thuốc nhuộm khác nhau

MN.FBN 5 ml 602 400 µM ViO Đệm actate 20 mM pH4 5; 10; 15; 20; 30; 40; 50 mg/l Laccase thô từ nấm đảm có hoạt tính ban đầu là 1000 U/L

2.3.3. Loại màu thuốc nhuộm khi sử dụng D-glucose

EFDg 1 50 mg/l 10 ml 602 - 0,1 g D- glucose Đệm actate 20 mM pH4

EFDg 2 50 mg/l - 10 ml 602 Đệm actate 20 mM pH4

EFDg 3 50 mg/l 10 ml 602 0,1 g D- glucose Đệm actate 20 mM pH4 Laccase thô từ nấm đảm có hoạt tính ban đầu là 1000 U/L Laccase thô từ nấm đảm có hoạt tính ban đầu là

51

Đối tượng đánh giá Thuốc nhuộm Nồng độ TN Nồng độ CGK Điều kiện TN Thể tích nghiên cứu Bước sóng xác định (nm)

EFDg 4 50 mg/l 10 ml 602 0,1 g D- glucose Đệm actate 20 mM pH4

DEF 5 50 mg/l 10 ml 602 0,1 g D- glucose Đệm actate 20 mM pH4

1000 U/L Laccase thô từ nấm đảm có hoạt tính ban đầu là 500 U/L Laccase thô từ nấm đảm có hoạt tính ban đầu là 1000 U/L

b) Phương pháp xác định

- Sau mỗi khoảng thời gian xác định, hút dung dịch mẫu và ly tâm 12.000

vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút và xác định khả năng loại màu theo nguyên

lý đo độ hấp thụ ánh sáng OD bằng thiết bị Jasco của Nhật Bản.

- Mẫu đối chứng: được bổ sung dịch laccase thô bất hoạt ở 80oC trong 10

phút.

- Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.

- Khả năng loại màu được xác định bằng phần trăm hấp thụ theo công thức:

D = 100 * (Ai - At)/Ai (CT2)

Trong đó:

D: phần trăm loại màu thuốc nhuộm (%);

Ai: Độ hấp thụ ban đầu;

At: Độ hấp thụ tại thời gian t

2.2.4.2. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi chủng nấm

a) Thực nghiệm

Xác định khả năng loại màu của chủng nấm sinh tổng hợp laccase với màu

hoạt tính thương mại được thu thập từ Nhà máy X20/TCHC, các thí nghiệm được

được trình bày tại Bảng 2.2.

52

Bảng 2.2. Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi nấm đảm sinh tổng hợp laccase

Môi trường nuôi cấy Thuốc nhuộm Nồng độ Thể tích nghiên cứu Bước sóng xác định (nm)

DCKT + 1 g D-glucose 100 ml 100 mg/L 410 430 602

1. Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính thương mại MY. EG MY. BES MN.FBN 2. Hiệu suất loại màu ở các nồng độ thuốc nhuộm MN.FBN

MN.FBN DCKT + 1 g D-glucose 100 ml 602 50, 100, 200mg/l

2.1. Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt D-glucose

100 ml MN.FBN 602 100 mg/L

MN.FBN 100 ml 602 100 mg/L

MN.FBN 100 ml 602 100 mg/L 100 ml nước cất và 0 g, 0,1 g, 0,3 g, 0,5 g, 0,7 g, 1 g, 2 g, 3 g D-glucose 2.2. Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt một số loại đường 100 ml nước cất và 1 g D- glucose; mannose; sacharose; lactose 2.3. Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt một số nguồn nitơ 100 ml nước cất và 1 g các nguồn nitơ KNO3; NH4NO3; (NH4)2SO4

b) Phương pháp xác định

- Điều kiện nuôi cấy: Chủng nấm được bổ sung 5% giống theo thể tích môi

trường nuôi cấy; bình được nuôi lắc ở 120 vòng/phút và nhiệt độ 30oC.

- Để xác định hiệu suất loại màu theo thời gian: hút dịch và ly tâm ở 12.000

vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, xác định khả năng loại màu theo thời gian

trên máy đo OD/Jasco Nhật Bản.

- Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.

- Khả năng loại màu được xác định bằng phần trăm hấp thụ ánh sáng theo CT2.

2.2.5. Xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin

2.2.5.1. Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng laccase thô

a) Phân hủy dịch chiết đất: Chủng nấm đảm đã được chọn nuôi cấy trong bình

trụ trên môi trường TSH1, sau 7 ngày nuôi cấy sau khi đo xác định được hoạt tích

laccase cao nhất sẽ tiến hành thu dịch, kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme

MnP, LiP, laccase và các enzyme khác như chitinase, protease. Dịch enzyme thô được

bảo quản lạnh ở 4oC để phục vụ cho các nghiên cứu của luận án. Trong nghiên cứu khả

53

năng phân hủy DCĐ, laccase thô từ chủng nấm đảm được chọn có hoạt tính ban đầu

22.000 U/L đã được sử dụng để tiến hành khảo sát khả năng phân hủy trực tiếp với

DCĐ trong môi trường đệm acetate 20 mM, pH 3 (Buff) và bổ sung chất gắn kết ViO 10

mM (CGK), thành phần phản ứng được thực hiện trong lọ penil với thể tích là 10 ml (lọ

được khử trùng khô ở 160oC trong 3 h). Thành phần các công thức thí nghiệm như sau:

Công thức

EFSE1 EFSE2 EFSE3 EFSE4 EFSE5 (đối chứng)

VSE (µL) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

V EF (µL) 2.000 2.000 2.000 2.000 0

VBuff (µL) 0 500 500 0 500

V CGK (µL) 0 0 500 500 0

Chú thích: VEF: Thể tích enzyme thô từ chủng FBV40;VSE: Thể tích DCĐ;VBuff:

Thể tích đệm acetate 20 mM, pH 3.

Sự biến động hoạt tính enzyme được xác định theo thời gian đến khi hoạt

tính enzyme mất hoàn toàn.

b) Phân hủy 2,4,5-Trichlorophenoxy acetic acid: sử dụng 5 g/L chất diệt cỏ

2,4,5-T tinh khiết để tiến hành thí nghiệm (chất T) (VT), laccase thô chủng nấm

nghiên cứu có hoạt tính ban đầu 29.500 U/L (VEF), môi trường cho phản ứng phân

hủy gồm 20 mM đệm acetate, pH 3 (Buff) (VBuff ), với sự có mặt của ViO (CGK)

(VCGK) tất cả được thực hiện trong lọ penil 10 ml. Thành phần các công thức nghiên

cứu như sau:

Công thức

EFT1 EFT2 EFT3 EFT4 EFT5 (đối chứng)

VT (µL) 500 500 500 500 500

V EF (µL) 2.000 2.000 2.000 2.000 0

V Buff (µL) 0 500 500 0 500

V CGK (µL) 0 0 500 500 0

Mỗi công thức nghiên cứu được lặp lại 2 lần. Trong quá trình đánh giá mức độ

phân hủy, sự biến động hoạt tính laccase được xác định theo thời gian.

c) Phân hủy 2,4-D; 2,4,5-T trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hoà ở quy mô

phòng thí nghiệm: Cân 100 g đất ô nhiễm lấy tại sân bay Biên Hòa vào bình trụ 250

ml và khử trùng ở 115oC trong 30 phút. Mẫu đất ô nhiễm được bổ sung 70 ml dịch

enzyme thô từ chủng nấm nghiên cứu có hoạt tính ban đầu là 11.561 U/L. Đối

chứng để xác định mức độ phân hủy thì bổ sung 70 ml dịch laccase thô bất hoạt ở

nhiệt độ 80oC trong 10 phút. Mẫu đối chứng để xác định sự biến động hoạt tính

laccase sử dụng 100 g cát đã được rửa sạch bằng nước, sấy ở 160oC, rửa bằng n-

54

hexan, để khô. Bổ sung 70 ml dịch laccase thô như trên. Xác định sự biến động hoạt

tính laccase theo thời gian.

2.2.5.2. Đánh giá phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng chủng nấm sinh tổng hợp laccase

a) Phân huỷ 2,4,5-T trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hoà bằng đơn chủng

FBV40: Cân 10 g đất ô nhiễm đã được nghiền nhỏ, sấy khô thu thập từ sân bay Biên Hòa

vào bình trụ 250 ml. Bổ sung 100 ml môi trường TSH1 và khử trùng ở 115oC trong 30

phút. Bổ sung 3% giống từ chủng nấm theo thể tích môi trường nuôi cấy. Mẫu đối chứng

không bổ sung chủng giống mà bổ sung thêm 3% nước cất khử trùng. Mẫu được nuôi lắc

với tốc độ 120 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC. Mẫu đối chứng để đánh giá sự biến động hoạt

tính laccase thì không chứa đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Khi hoạt tính laccase trong

mẫu phân hủy bị mất hoàn toàn, mẫu nghiên cứu được sấy khô ở 50oC và nghiền nhỏ.

b) Phân huỷ chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hoà

bằng đơn chủng FBV40 và hỗn hợp chủng (FBV40, FBD154 và FNBLa1): Cân 10 g

đất (bao gồm 2 g đất ô nhiễm nghiền nhỏ và 8g cát được rửa sạch bằng n-hexan và

nước). Bổ sung 100 ml môi trường nuôi cấy TSH1 đem khử trùng ở 115oC trong 15

phút. Bổ sung 15% đơn chủng nấm đảm đã chọn theo thể tích và hỗn hợp chủng nấm

đã chọn:FBD154:FNBLa1 (theo tỷ lệ 1:1:1). Đối chứng để đánh giá khả năng phân hủy

không bổ sung chủng giống mà chỉ có nước cất. Đối chứng nghiên cứu quá trình sinh

tổng hợp laccase và sự biến động hoạt tính theo thời gian không bổ sung đất ô nhiễm.

Mẫu được nuôi lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC. Khi hoạt tính laccase

trong mẫu nghiên cứu phân hủy mất hoàn toàn, mẫu nghiên cứu đem sấy khô ở 50oC

sau đó tiến hành phân tích bằng GC-MS.

c) Phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD bằng đơn chủng nấm đảm được chọn và

hỗn hợp chủng nấm ( nấm đảm được chọn, FBD154 và FNBLa1): Sử dụng môi trường

nuôi cấy TSH1 100 ml, khử trùng ở 115oC trong 15 phút. Bổ sung 2,3,7,8-TCDD hoà

tan trong DMSO đạt nồng độ cuối 2.000 ng TEQ/L. Bổ sung 15% theo thể tích môi

trường nuôi cấy dung dịch đơn chủng nấm được chọn và hỗn hợp chủng nấm được

chọn , FBD154 và FNBLa1 với tỷ lệ thể tích 1:1:1. Mẫu đối chứng để đánh giá khả

năng phân hủy bởi vi sinh vật nên đã không bổ sung chủng giống. Đối chứng để đánh

giá khả năng sinh tổng hợp laccase thì không bổ sung 2,3,7,8-TCDD. Mẫu nuôi lắc với

tốc độ 120 vòng/phút ở 30oC. Khi hoạt tính laccase trong mẫu mất hoàn toàn thì kết

thúc nuôi cấy và chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm để phân tích bằng GC-MS.

55

2.2.5.3. Phương pháp phân tích để xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin

a) Phân tích xác định các thành phần trong dung dịch sau phân hủy DCĐ

Thành phần của chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu nghiên cứu được chiết theo

quy trình sau: (1) Kiểm tra pH của dung dịch nuôi cấy (mẫu) bằng giấy chỉ thị pH,

chỉnh đến pH ~7 - 8. (2) Siêu âm mẫu trong bể siêu âm khoảng 15 phút. (3) Bổ

sung dichloromethane vào mẫu theo tỷ lệ 1:2 (v/v). Lắc hỗn hợp ở tốc độ lắc 300

vòng/phút trong 30 phút. Để lắng, tiếp tục lắc ở tốc độ lắc 300 vòng/phút trong 30

phút. Gạn lấy phần dung dịch và lọc lấy phần dichloromethane, để riêng. (4) Điều

chỉnh pH phần dung dịch đến pH<2 bằng H2SO4 6N. Tiếp tục bổ sung

dichloromethane và lắc như bước 3. Gạn, lọc lấy phần dichloromethane. (5) Gộp

toàn bộ phần dichloromethane và làm khan bằng Na2SO4. (6) Cô đuổi dung môi

trên máy cất quay đến V~0,5 ml. Chuyển phần còn lại vào ống nghiệm, làm bay

hơi đến khô phần dung môi còn lại bằng dòng không khí nóng. Định mức chính

xác bằng MeOH. (7) Chạy SIM trên thiết bị Sắc ký khí khối phổ để xác định thành

phần định tính mẫu nghiên cứu trên máy sắc ký khí Agilent GC 7890A ghép khối

phổ MSD 5975C tại Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga/BQP với chương trình: nhiệt

độ đầu 600C trong 1 phút, tăng nhiệt 80C/phút đến 3200C, giữ ở nhiệt độ này trong

5 phút. Nhiệt độ Injector 2800C, Interface 2800C. Bơm 1µl dung dịch mẫu theo

kiểu không chia dòng (Spliless). Detector hoạt động theo chế độ quét (scan) từ 35

đến 550 amu. Cột phân tích DB5-MS (60m x 250µm x 0,25µm).

b) Phân tích xác định 2,4,5-T trong dung dịch

Toàn bộ thể tích dung dịch thí nghiệm được đưa vào bình cầu 250 ml, cân

3,6 g KOH vào bình cầu, bổ sung một vài hạt sôi. Đun hồi lưu trong 2 h trên bếp

cách thủy. Để nguội đến nhiệt độ phòng và chuyển vào phễu chiết loại 250 ml.

Chiết với dichlometan 3 lần, tổng thể tích dichlometan trong 3 lần chiết là 100 ml,

bỏ phần dung môi chiết. Phần dung dịch còn lại thêm 25 ml H2SO4 18N lắc trong 2

phút, để yên 10 phút. Chiết 2,4,5-T sang pha hữu cơ bằng dietyl ete 3 lần, tổng thể

tích dietyl ete sau 3 lần chiết là 100 ml. Tráng rửa bình cầu và phễu chiết sử dụng 5

ml dietyl ete. Tập hợp dịch chiết dietyl ete vào bình nón dung tích 250 ml, cho 10 g

Na2SO4 khan vào bình nón, lắc nhẹ để bay hơi trong khoảng 2 h hoặc để qua đêm.

Lọc dịch lọc đã được làm khô qua phễu, tiếp tục rửa bình nón và Na2SO4 bằng 5 ml

dietyl ete. Tập hợp pha hữu cơ vào bình cầu loại 250 ml và cất quay tại 30oC đến 5

56

ml. Chuyển dịch cất quay sang bình quả nhót 25 ml, tráng bình. Lắp bình quả nhót và

cất quay để bay hơi còn 1 ml. Cho bay hơi tự nhiên trong tủ hút đến khô. Dùng 1 ml

axeton nitril để hòa tan cặn chiết, lọc qua màng siêu lọc và phân tích trên máy sắc ký

lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent HP-1100, detector UV-VIS, cột SB-C18 (4,5 x 150

mm, 5 µm) tại Viện Hóa học-Môi trường quân sự/BTL Hóa học với pha động

ACN:H20:axit, tốc độ dòng 1ml/phút. Nhiệt độ cột 300C, tín hiệu đo λ = 280 nm.

c) Phân tích xác định 2,4-D, 2,4,5-T trong đất

Cân 5g đất đã được đồng nhất vào túi đựng mẫu và đặt vào bộ chiết soxhlet. Cho

200 ml dung môi aceton vào bình cầu 500 ml và một ít hạt sôi. Chiết trong 8 h liên tục.

Để nguội, cất quay ở 40oC với áp suất chân không để đạt 1 ml. Bổ sung 50 ml dung dịch

KOH, đun hồi lưu trong 2 h trên bếp cách thủy. Các bước tiếp theo được thực hiện như

quy trình phân tích xác định 2,4,5-T trong dung dịch được mô tả ở trên. Hàm lượng 2,4-

D, 2,4,5-T trong đất được xác định theo TCVN 6134:2009 với detector UV-VIS, cột SB-

C18 (4,5 x 150 mm, 5 µm), pha động ACN:H20: axit, tốc độ dòng 1ml/phút, nhiệt độ cột

300C, tín hiệu đo λ = 280 nm trên máy HPLC Agilent HP-1100 của Viện Hóa học - Môi

trường quân sự/BTL Hóa học, hoặc trên máy sắc ký lỏng khối phổ ba lần tứ cực Agilent

6430 Triple Quad LC/MS tại Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga/Bộ quốc phòng.

d) Phân tích xác định đồng loại 2,3,7,8-TCDD trong dung dịch

Toàn bộ dung dịch nghiên cứu được thêm chất nội chuẩn 13C12-PCDD/PCDF lắc

nhẹ trong 30 giây, lọc mẫu qua phin lọc. Thu hồi phin lọc và phần dung dịch lỏng đi qua.

Quá trình phân tích được thực hiện trên cái lọc và trong pha lỏng. Cái lọc và phần cặn

trên cái lọc được chiết soxhlet trong vòng 24 h với dung môi toluen. Phần dung dịch lọc

được chiết bằng 60 ml dung môi diclomethane, quá trình chiết được lặp lại 3 lần. Gộp

dung dịch chiết từ hai quá trình trên vào làm một, thêm chất chuẩn làm sạch 37Cl4 -

2,3,7,8-TCDD tiến hành cô đặc về gần khô bằng cất quay. Hòa tan bằng 1 ml dung dịch

n-hexan. Làm sạch dung dịch trên qua cột silicagel đa lớp sau đó làm sạch qua cột than.

Thêm chất chuẩn 13C12-PCDD/PCDF. Cô đặc dung dịch về 1 ml, thêm 100 µl dung môi

nonan. Dùng dòng khí nitơ thổi nhẹ đưa dung dịch về 100 µl. Mẫu được phân tích trên

máy GC 6890, MS 5975 Agilent tại Viện Hóa học - Môi trường quân sự/BTL Hóa học.

2.3. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu phân tích được xử lý bằng phần mềm Microsolf excel/Microsoft office 10

57

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập, tuyển chọn và định tên các chủng nấm và xạ khuẩn có khả năng

sinh tổng hợp laccase, laccase-like

3.1.1. Phân lập và lựa chọn chủng nấm đảm có hoạt tính laccase cao

Mục đích của nội dung sàng lọc các chủng nấm phải hướng tới mục địch là

xác định các chủng nấm và enzyme do chúng tạo ra có khả năng hoạt động trong

các điều kiện công nghiệp [15].

Việc phát hiện các laccase mới với các phổ cơ chất đặc biệt khác và nâng cao

khả năng ổn định là quan trọng nhất để triển khai ứng dụng trong điều kiện công

nghiệp. Nấm sinh laccase, MnP hoặc LiP được sàng lọc trên cả hai loại môi trường

rắn có chứa các chất chỉ thị khi oxy hóa sẽ tạo mầu nâu đỏ để dễ quan sát và nhận

diện. Chúng có thể là laccase, MnP hay LiP và laccase được xác định bằng phương

pháp được trình bày ở phần sau [111] hoặc trong điều kiện nuôi cấy lỏng xác định

hoạt tính laccase bằng các phép đo các thông số chuẩn [84].

Sau khi thu thập được 45 mẫu nấm từ gỗ mục, đất tại rừng Quốc gia Ba Vì

và xã trồng chè Ba Trại thuộc huyện Ba Vì để tiến hành sàng lọc khả năng sinh tổng

hợp laccase, hai mươi hai chủng nấm có hệ sợi phát triển tốt, lan rộng trên bề mặt

môi trường, hệ sợi nấm bông xốp có màu trắng, mịn và tạo vòng nâu đỏ với cường

độ khác nhau trên môi trường có chứa chất chỉ thị guaiancol đã được phân lập sau 4

ngày nuôi cấy. Hoạt tính laccase in situ được xác định trước khi được phân lập. Kết

quả thu được chứng tỏ ở giai đoạn thu mẫu các chủng này đã sinh tổng hợp các

enzyme ngoại bào thuộc nhóm peroxidase (Mangan peroxidase-MnP và Lignin

peroxidase- LiP) hoặc oxidoreductase (laccase). Các mẫu không xác định được sau

khi nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu có chỉ thị guaiacol sẽ được tiếp tục khẳng

định khả năng sinh tổng hợp 2 loại enzyme trên. Danh sách và một số đặc điểm sinh

học của mẫu nấm được trình bày ở Bảng 3.1 và chi tiết hơn ở Bảng 1 Phụ lục. Kết

quả cho thấy có khoảng 16 mẫu nấm thu thập được ở rừng Quốc gia Ba Vì sinh tổng

hợp laccase. Ngay mẫu tươi (trước khi phân lập) đã có thể đo được hoạt tính

enzyme in situ giao động trong khoảng từ 3 đến 150 U/L. Dựa vào kết quả đo hoạt

tính laccase in situ và khả năng sinh trưởng nhanh, dễ nuôi cấy, chủng FBV40 đã

58

được lựa chọn để nghiên cứu phân loại, đặc tính enzyme, khả năng loại màu thuốc

nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin.

Sử dụng phương pháp truyền thống và so sánh độ tương đồng giữa trình tự

vùng ITS1-5,8S-ITS2 của FBV40 với các chủng đại diện trên GenBank, FBV40 đã

được định danh.

Hình 3.1. Hỉnh ảnh sợi, bào tử dưới kính hiển vị điện tử và ảnh phân lập mặt trước, mặt sau của chủng FBV40

Bảng 3.1. Đặc điểm mẫu nấm đã phân lập được

TT Mẫu Đặc điểm tự nhiên Đặc điểm phân lập Laccase in-situ (U/L)

1 A2 - Quả thể màu đen, có viền trắng, thân dày

2 A9 - Quả thể màu đen, có viền màu cam, thân mỏng

3 A14 20

4 A17 76

5 A19 3 Quả thể màu trắng, xốp và mềm Quả thể màu xanh xám, xốp và mềm Quả thể màu trắng, xốp và mềm Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, tâm lõm, và không tạo vòng nâu đỏ Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, xốp, tâm lồi, có màu đen, không tạo vòng nâu đỏ Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, xốp, dày, tâm lồi, tạo vòng nâu đỏ Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, xốp, sợi mỏng, tâm lồi, tạo vòng nâu đỏ Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, xốp, dày, tâm lồi, tạo vòng nâu đỏ

59

TT Mẫu Đặc điểm tự nhiên Đặc điểm phân lập Laccase in-situ (U/L)

6 A21 15

7 A22 -

8 A25 11

9 A27 - Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, xốp, dày, tâm lõm, tạo vòng nâu đỏ Khuẩn lạc có hệ sợi màu xám, xốp, tâm lồi, không tạo vòng nâu đỏ Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, xốp, tâm lồi, tạo vòng nâu đỏ Khuẩn lạc có hệ sợi màu xám, mỏng, dai, không tạo vòng nâu đỏ

10 A31 5 Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, răng cưa, xốp, lõm, tạo vòng nâu đỏ

11 A32 3

12 A36 24

thể màu đen, dày, 13 A44 10 Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, xốp, dày, lồi, tạo vòng nâu đỏ Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, xốp, lồi, tạo vòng xám đen Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, xốp, lồi, tạo vòng nâu đỏ

14 A46 35 Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, xốp, lồi, tạo vòng nâu đỏ

15 BT2 -

16 BT4 25

17 BT5 25

18 BT7 - Khuẩn lạc có hệ sợi màu xám trắng, lõm, tạo vòng nâu đỏ Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, tròn mỏng, lồi, tạo vòng nâu đỏ Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, tròn mỏng, lồi, tạo vòng nâu đỏ Khuẩn lạc có hệ sợi màu xám trắng, tròn dày, lồi, không tạo vòng nâu đỏ

19 BT8 5 Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, tròn mỏng, lồi, tạo vòng nâu đỏ

20 BT9 23 Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, tròn mỏng, lồi, tạo vòng nâu đỏ

21 BT10 11

22 FBV40 150 Quả thể màu vàng, to và mềm. Mọc trên đất Quả thể màu trắng, mềm, bóng ướt. Mọc trên thân cây Quả thể màu trắng, bé. Mọc trên thân cây măng Quả thể màu trắng, hình sợi. Mọc trên thân cây măng Quả thể màu đen xám, viền màu trắng, có lỗ, cứng. Mọc trên thân cây Quả thể đen, dày, cứng. Mọc trên thân cây Quả thể trắng, mỏng, mềm. Mọc trên thân cây Quả cứng. Mọc từ đất Quả thể màu cam, viền trắng, dày, mềm. Mọc trên cây Không có quả thể, màu xám, mềm. Mọc trên cây Quả thể trắng xám, xốp, có lỗ. Mọc trên cây Quả thể màu trắng xám, xốp, có lỗ. Mọc trên cây Quả thể màu trắng, tròn, xốp, có lỗ. Mọc trên cây Quả vàng, thể màu tròn,viền trắng, xốp, có lỗ. Mọc trên cây Quả thể vàng xám, viền trắng, xốp, có lỗ. Mọc trên cây Không có quả thể, màu xám trắng, mềm. Mọc trên cây. Không có quả thể, phân lập từ đất lẫn gỗ mục. Khuẩn lạc có hệ sợi màu vàng, dày, lồi, tạo vòng nâu vàng Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, dày, xốp, lồi, tạo vòng nâu đỏ

Chú thích: (-) không xác định được

Dựa vào các đặc điểm hình thái của nấm tự nhiên, khuẩn lạc trên đĩa thạch

và hệ sợi nấm dưới kính hiển vi quang học cho thấy chúng có khuẩn ty phân nhánh,

quấn chặt vào nhau tạo hình dáng giống rễ cây và có vách ngăn ngang. Bước đầu xác

60

định FBV40 là nấm đảm. Tuy nhiên để làm rõ thêm các kết quả phân loại truyền

thống, việc xác định và so sánh sự tương đồng giữa trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2

của chủng này và các chủng đại diện trên GenBank đã được tiến hành và đã được

đăng ký trình tự trên GenBank với mã số MG243365. Trên cơ sở đặc điểm mẫu,

hình thái khuẩn lạc, bào tử và trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng nấm FBV40 được

xét vào chi Rigidoporus và được định danh là Rigidoporus sp. FBV40. Từ vị trí của

chủng FBV40 trên cây phát sinh chủng loại cho thấy chủng này gần gũi nhất với chi

Rigidoporus cụ thể là tương đồng đến 99% với các chủng là R. Vinctus C1-9 được

phân lập từ rặng san hô của vùng biển Phúc Kiến và R. Vinctus FRIM 142 được phân

lập từ rừng nhiệt đới ở Malaysia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Hiện có rất ít thông

tin về những chủng nấm trên, đặc biệt thông tin về đặc điểm hình thái cũng như khả

năng sinh tổng hợp laccase của các chủng nấm trên.

Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của chủng nấm FBV40

3.1.2. Phân lập và phân loại xạ khuẩn

3.1.2.1. Phân lập xạ khuẩn

Từ nguồn đất ở 2 khu vực đã mô tả trong phần vật liệu và phương pháp nghiên

cứu, 8 chủng xạ khuẩn đã được phân lập trong đó có 2 chủng là XKBHN1, XKBHN2

từ đất khu vực Tây - Nam và 6 chủng là XKBiR1, XKBiR2, XKBiR3, XKBiR4,

61

XKBiR929 và XKBiR930 từ đất nguyên thủy (trước khi xử lý khu vực Z1) ô nhiễm

chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Biên Hòa. Các chủng này có dạng khuẩn lạc tròn,

bông mịn, khác nhau chủ yếu ở màu sắc và sắc tố giọt tiết tạo ra. Đây là những nguyên

liệu đầu vào để tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp laccase-like và từ đó lựa

chọn các chủng có hoạt tính cao để tiếp tục nghiên cứu. Hai chủng XKBHN1 và

XKBiR929 là đại diện 2 khu vực của sân bay Biên Hòa đã được chọn để phân loại bởi

chúng có khả năng sinh tổng hợp laccase-like nằm trong khoảng khá rộng và hoạt tính

cao nhất lần lượt là 200 và 720 U/L (Bảng 3.2).

Bảng 3.2. Hoạt tính laccase-like của các chủng xạ khuẩn

Nguồn phân lập Đất khu vực ô nhiễm Tây-Nam sân bay Biên Hòa

Đất khu vực ô nhiễm Z1 sân bay Biên Hòa

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 Chủng XKBHN1 XKBHN2 XKBiR1 XKBiR2 XKBiR3 XKBiR4 XKBiR929 XKBiR930 Hoạt tính (U/L) 200 - 7,15 0,97 - 1,18 720 606

Chú thích: (-) không xác định được

3.1.2.2. Phân loại chủng xạ khuẩn XKBHN1 và XKBiR929

Hai chủng xạ khuẩn được nuôi cấy và sau 4 ngày trên môi trường muối

khoáng Gause M chứa DCĐ (môi trường có màu vàng nhạt), các đặc điểm hình thái,

khuẩn lạc và hình thái bào tử của chúng được trình bày ở Bảng 3.3 và Hình 3.3.

Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của hai chủng xạ khuẩn XKBHN1 và XKBiR929

Đặc điểm

Hình thái Chủng XKBiR929 Bề mặt bông xốp, khuẩn lạc đều nhô cao, nhăn ở tâm, khuẩn ty khí sinh phát triển tốt

Kích thước

Màu sắc

Bào tử

Chủng XKBHN1 Bề mặt bông xốp, khuẩn lạc đều nhô cao, nhăn ở tâm, khuẩn ty khí sinh phát triển tốt, Đường kính khuẩn lạc 4-5 mm Đường kính khuẩn lạc 3-4 mm Khuẩn ty khí sinh có màu nâu, Khuẩn ty khí sinh có màu hồng khuẩn ty cơ chất không có màu. nhạt, khuẩn ty cơ chất có màu cam nâu nhạt Bào tử trần, hình trứng kết dính với nhau tạo thành các chuỗi dạng xoắn móc đường kính 0,6 - 0,9 µm Bào tử hình trứng, có gai, kết dính với nhau tạo thành hình xoắn móc, đường kính 1 đến 1,16 µm

Hình thái khuẩn lạc và hình thái bào tử của 2 chủng nghiên cứu cho thấy

chúng hoàn toàn khác nhau. Giải trình tự gene mã hóa 16S rRNA đã được tiến hành.

62

Trên cơ sở đó, cây phát sinh chủng loại của XKBHN1 và XKBiR929 đã được xây

dựng (Hình 3.5). Từ vị trí của 2 chủng trên cây phát sinh chủng loại cho thấy chúng

không gần gũi nhau về mặt di truyền. Khi so sánh trình tự đoạn gene mã hóa 16S

rRNA của XKBHN1 và XKBiR929 cho thấy chúng không có quan hệ gần gũi nhau

với trình tự gene 16S rRNA của chúng có độ tương đồng là 98%. Dựa trên các đặc

điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và so sánh trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA,

chủng XKBHN1, XKBiR929 được xếp vào chi Streptomyces và được định danh

Streptomyces sp. XKBHN1 và Streptomyces sp. XKBiR929.

(B) (A)

(C) (D)

Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử chủng XKBHN1 (A, C) và chủng XKBiR929 (B, D)

Trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng XKBHN1 và chủng XKBiR929 được

so sánh với các trình tự gene tương ứng của các vi sinh vật nhân sơ đã được công bố trên

GenBank. Chủng xạ khuẩn XKBHN1 tương đồng 99% với Streptomyces coelicoflavus

AHI2, S. diastaticus BKH2, S. fradiae S81 và tương đồng trên 94% với nhiều đại diện

khác thuộc chi Streptomyces. Hiện chưa có nhiều thông tin nghiên cứu công bố về nguồn

gốc cũng như đặc điểm sinh học của các chủng trên.

Chủng xạ khuẩn XKBiR929 có mức độ tương đồng 99% với loài xạ khuẩn S.

albogriseolus NBE40, đây là chủng được phân lập từ đất ô nhiễm của khu vực nhà

63

máy sản xuất giấy ở Ấn Độ [153]. Tương đồng 99% với chủng S. albogriseolus

NRRL B-1305T được phân lập từ trong đất và chủng này có khả năng sinh tổng hợp

enzym cellulase, 97% với chủng xạ khuẩn S. sp. C39 được phân lập từ đất ô nhiễm

các thuốc trừ sâu ở Argentina và chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển trên

môi trường chứa lindan và methoxychlor, 97% với chủng S. albogriseolus GhS-A9-1

chủng này được phân lập từ trầm tích rừng ngập mặn ở Hải Nam, Trung Quốc chủng

này có khả năng sinh hoạt tính để giết các loại giun sán có hại và 97% tương đồng với

chủng S. albogriseolus NBE40 hiện nay chủng này chưa có nhiều thông tin về nguồn

gốc phân lập cũng như đặc tính sinh học của các chủng đã đề cập ở trên.

Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loại 2 chủng XKBHN1 và XKBiR929

Chi Streptomyces là chi chiếm số lượng lớn trong đất và có vai trò quan

trọng đối với hệ sinh thái đất. Một số chủng thuộc chi Streptomyces có khả năng

sinh laccase-like đồng thời có khả năng sinh trưởng trên các môi trường chứa chất

diệt cỏ/dioxin. Chủng Streptomyces sp. XKDN12 đã được Nguyễn Bá Hữu và cộng

sự nghiên cứu từ mẫu đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Đà Nẵng. Chủng này có khả

năng sinh laccase-like và có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường chứa các chất

đa vòng thơm sau 7 ngày nuôi cấy và phân hủy được 32,72% phenanthrane, 39,01%

antharacen [103]. Một số chủng Streptomyces khác như Streptomyces sp. XKBH1,

Streptomyces sp. XKBH13, Streptomyces sp.XKDN12 đều được phân lập tại các

khu vực bị ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hoà và Đà Nẵng cũng có

khả năng sinh tổng hợp laccase-like [105]. Như vậy, chủng XKBHN1, XKBiR929

64

phân lập được trong nghiên cứu này từ mẫu đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại khu

vực ô nhiễm mới được phát hiện và đất đã được khử độc của sân bay Biên Hòa lại

càng khẳng định các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng phân bố

rộng và chúng có thể tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các chất diệt

cỏ/dioxin cũng như các hợp chất đa vòng thơm khác. Ngoài ra, những chủng này

còn có khả năng sinh laccase-like trong đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ /dioxin là đặc

tính mang nhiều ý nghĩa ứng dụng trong phân hủy sinh học. Kết quả nghiên cứu

một lần nữa xác định sự phân bố của các nhóm vi sinh vật ở lô xử lý khử độc đất ô

nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa, xạ khuẩn vẫn luôn có mặt ở hầu hết

các mẫu trên toàn bộ diện tích khu vực xử lý. Theo các nghiên cứu của Đặng Thị

Cẩm Hà và cộng sự cho thấy laccase-like được tổng hợp không phải là protein vì

sau khi đun sôi dịch sau nuôi cấy các chủng xạ khuẩn vài giờ thì nó vẫn có thể loại

bỏ được gần 60% hydrocacbon đa vòng thơm. Đây có thể là chất trao đổi có khả

năng tham gia phản ứng oxy hóa vòng thơm. Chính vì vậy, cần rất nhiều nghiên cứu

chi tiết về phát hiện lý thú này. Tóm lại đây là một trong các lợi thế mà các nhà

nghiên cứu khoa học có thể khai thác để xử lý chất ô nhiễm đa vòng thơm. Trong

nghiên cứu này sẽ tiếp tục tìm hiểu về phát hiện lý thú đã đề cập trên.

3.1.3. Môi trường thích hợp để chủng nấm, chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase, laccase-like 3.1.3.1. Môi trường thích hợp để chủng nấm FBV40 sinh tổng hợp laccase

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật có vai trò quan trọng để các chủng VSV có thể sinh tổng

hợp các loại enzyme khác nhau, đặc biệt là các chủng nấm. Để có môi trường thích hợp để nấm

đảm FBV40 sinh tổng hợp laccase cao nhất, nghiên cứu khảo sát khả năng sinh tổng hợp trên

các loại môi trường nuôi cấy nấm phổ biến được sử dụng tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh

học tái tạo môi trường/Viện công nghệ sinh học, các chủng được nuôi cấy ở điều kiện nuôi lắc

120 vòng/phút, nhiệt độ 300C. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.5. Môi trường để chủng nấm

FBV40 sinh tổng hợp hoạt tính laccase cao nhất là TSH1, sau 8 ngày hoạt tính laccase đạt được

là 107.708 U/L, hoạt tính trên môi trường PDB bổ sung 1% bột đậu tương là 41.431 U/L sau 6

ngày nuôi cấy, còn trên môi trường PDB hoạt tính là 6.134 U/L sau 9 ngày và hoạt tính thấp nhất

trên môi trường Czapeck chỉ xác định được trên 5 U/L. Như vậy, số liệu thu được cho thấy môi

trường TSH1 là phù hợp nhất để chủng nấm FBV40 sinh tổng hợp laccase cao và được lựa chọn

làm môi trường nuôi cấy để tiếp tục các nội dung nghiên cứu khác.

65

120000

100000

PDB

80000

) l /

Czapeck

U

60000

Dịch KT

MEG

40000

( h n í t t ạ o H

Vis

TSH1

20000

PDB-1%BDT

0

2ngày

3ngày

4ngày

5ngày

6ngày

7ngày

8 ngày

9ngày

10ngày

Thời gian

Hình 3.5. Hoạt tính laccase thô chủng FBV40 ở các môi trường nuôi cấy

Theo nghiên cứu của Praveen và cộng sự chỉ ra rằng laccase cao không phụ

thuộc vào sinh khối của chủng nấm. Nhưng sản phẩm laccase được chứng minh có

liên quan mật thiết với điều kiện và môi trường nuôi cấy, sinh khối cao không hẳn

sẽ cho hoạt tính laccase cao [122]. Buswell và cộng sự đã chỉ ra rằng sản phẩm

laccase bị ảnh hưởng lớn bởi hàm lượng dinh dưỡng, đặc biệt là các yếu tố vi lượng

và hàm lượng nitơ trong môi trường nuôi cấy. Nhìn chung laccase được tạo ra với

hoạt tính thấp, muốn nâng cao hoạt tính chỉ bằng cách bổ sung các chất cảm ứng, hệ

chất gắn kết và quan trong là chọn được các yếu tố dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, thời

gian nuôi cấy phù hợp cho chủng sinh trưởng [11].

Như vậy, kết quả khảo sát điều kiện môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp

laccase đối với chủng nấm FBV40 một lần nữa khẳng định vai trò của các thành phần

môi trường có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh tổng hợp laccase. Trên cơ sở đó đã

xác định được môi trường TSH1 từ 7 môi trường đã khảo sát với điều kiện nuôi cấy

pH là 6,5, nhiệt độ 30oC, lắc liên túc 120 vòng/phút khi đó chủng FBV40 sinh tổng

hợp laccase thô có hoạt tính rất cao là 107.708 U/L sau 8 ngày nuôi cấy, với giá trị

này, hoạt tính laccase của chủng FBV40 được xếp vào hạng rất cao. Sản phẩm

laccase được thu và bảo quản lạnh ở 40C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.3.2. Khả năng sinh tổng hợp laccase-like của XKBHN1 và XKBiR929 trên môi

trường chứa các chất hữu cơ clo khác nhau

Ngoài nguồn nấm đảm đã được phân lập từ rừng Quốc gia Ba Vì và các vùng

lân cận thì nguồn xạ khuẩn sinh laccase-like từ chính nơi đất ô nhiễm nặng chất diệt

66

cỏ/dioxin, đất đang được xử lý khử độc bằng công nghệ phân hủy sinh học tại sân bay

Biên Hòa cũng đã được chọn. Sau 7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30ºC, lắc với tốc độ

120 vòng/phút, 2 chủng XKBHN1 và XKBiR929 đều có khả năng sinh trưởng mạnh

trên môi trường Gauss M chứa các chất ô nhiễm DCĐ, 2,4,5-T; 2,4-D; DBF và

PAHs. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.6.

Cả hai chủng XKBHN1 và XKBiR929 đều có khả năng sinh trưởng và sinh

tổng hợp laccase-like trên môi trường Gause M có chứa từ 4% đến 16% theo thể tích

DCĐ. Hoạt tính laccase-like cao nhất tạo ra bởi XKBHN1 là 420 U/l ở ngày thứ 3 với

thể tích DCĐ bổ sung là 8%, còn ở thể tích DCĐ là 4% thì hoạt tính laccase-like là 384

U/l và giảm dần ở thể tích DCĐ bổ sung là 12% và 16%.

Chủng XKBiR929 sinh tổng hợp laccase-like với hoạt tính cao nhất là 803 U/l ở

ngày thứ 13 với thể tích DCĐ là 8% và cũng giảm dần ở các tỷ lệ bổ sung là 12 và 16%

trong môi trường nuôi cấy. Sau 4 ngày nuôi cấy, XKBHN1 sinh tổng hợp laccase-

like với hoạt tính cao đạt 227 U/l với 100 ppm 2,4,5-T trong môi trường nuôi cấy.

Hoạt tính laccase-like giảm dần khi nồng độ 2,4,5-T tăng từ 200 đến 400 ppm. Tuy

nhiên, chủng XKBiR929 sinh tổng hợp laccase-like với hoạt tính cao nhất là 803

U/l ở nồng độ 200 ppm 2,4,5-T sau 13 ngày nuôi cấy và cao gấp gần 4 lần chủng

XKBHN1, đặc biệt là hoạt tính cũng giảm dần khi nồng độ 2,4,5-T tăng dần. Chủng

XKBHN1 sinh tổng hợp laccase-like với hoạt tính cao nhất là 231 U/l sau 3 ngày

trong khi chủng XKBiR929 lại có hoạt tính cao nhất là 566 U/l sau 13 ngày nuôi

cấy ở 100 ppm và 200 ppm 2,4-D trong môi trường. Hoạt tính laccase-like giảm dần

theo thời gian khi nồng độ 2,4-D là 300 và 400 ppm. Trên môi trường Gauss M

chứa DBF, hoạt tính laccase-like do XKBHN1 và XKBiR929 sinh tổng hợp cao

nhất lần lượt là 398 U/l và 814 U/l ở nồng độ tương ứng là 300 ppm và 200 ppm với

thời gian nuôi cấy là 5 và 15 ngày. Trên môi trường Gauss M chứa 200 ppm PAHs,

hoạt tính laccase-like cao nhất thu được đối với XKBiR929 là 867 U/l sau 15 ngày nuôi

cấy, trong khi XKBHN1 sinh tổng hợp laccase-like với hoạt tính cao nhất là 379U/l

sau 5 ngày nuôi cấy.

67

450

4%

(F)

900

(A)

4%

400

8%

800

350

8%

12%

700

300

16%

600

12%l

) l /

250

) l /

500

U

U

(

16%l

(

200

400

150

300

h n í t t ạ o H

h n í t t ạ o H

200

100

100

50

0

0

1

2

3

4

5

10 11 12 13 14 15 16

7

9

1

2

3

4

5

6

7

8 6 Thời gian (ngày)

Thời gian (ngày)

900

100 ppm

450

(B)

(G)

800

400

700

100 ppm

200 ppm

350

) l /

600

200 ppm

U

300 ppm

) l /

300

(

U

500

(

300 ppm

250

400 ppm

400

200

400 ppm

h n í t t ạ o H

300

150

h n í t t ạ o H

200

100

100

50

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14 15 16

1

2

3

4

5

6

7

Thời gian (ngày)

Thời gian(ngày)

250

100 ppm

900

(H)

100 ppm

(C)

800

200

200 ppm

700

200 ppm

300 ppm

600

150

) l /

) l /

300 ppm

U

U

400 ppm

500

(

(

400 ppm

400

100

300

h n í t t ạ o H

h n í t t ạ o H

200

50

100

0

0

1

2

3

4

5

10 11 12 13 14 15 16

7

9

1

2

3

5

6

7

4 Thời gian (ngày)

6 8 Thời gian (ngày)

250

100 ppm

200 ppm

600

(I)

100 ppm

(D)

200

300 ppm

400 ppm

500

200 ppm

400

) l /

150

) l /

U

300 ppm

U

(

300

(

400 ppm

100

200

h n í t t ạ o H

h n í t t ạ o H

100

50

0

1

2

3

4

5

10 11 12 13 14 15 16

7

9

0

6 8 Thời gian (ngày)

1

2

3

4

5

6

7

Thời gian (ngày)

400

1000

(E)

100 ppm

(K)

900

350

100 ppm

800

200 ppm

300

700

200 ppm

300 ppm

250

) l /

) l /

600

U

U

400 ppm

300 ppm

(

(

500

200

400 ppm

400

150

h n í t t ạ o H

h n í t t ạ o H

300

100

200

100

50

0

0

1

2

3

4

5

10 11 12 13 14 15 16

8

7

9

1

2

3

5

6

7

6 Thời gian (ngày)

4 Thời gian (ngày)

Hình 3.6. Khả năng sinh tổng hợp laccase-like theo thời gian, của chủng XKBHN1 trên môi trường chứa DCĐ (A); DBF (B); 2,4,5-T (C); 2,4-D (D); PAHs (E) và của chủng XKBiR929 trên môi trường chứa DCĐ (F); DBF (G); 2,4,5-T (H); 2,4-D (I); PAHs (K)

68

Theo nghiên cứu nghiên cứu trước đây chủng xạ khuẩn XKDNR1 được phân lập

từ biorector xử lý chất diệt cỏ/dioxin trong đất tại "điểm nóng" Đà Nẵng nuôi cấy trên môi

trường có DCĐ, hoạt tính laccase-like cao nhất là 21,53 U/l sau 4 ngày nuôi cấy [103].

Như vậy có thể thấy rằng cả 2 chủng XKBHN1 và XKBiR929 đều có khả năng

sinh tổng hợp laccase-like với hoạt tính khá cao, tuy nhiên cần phải tiếp tục khảo sát các

điều kiện nuôi cấy phù hợp như nhiệt độ, chất cảm ứng, pH và các nguồn cơ chất bổ

sung khác v.v để thu được laccase-like với hoạt tính được nâng cao hơn. Bên cạnh đó,

nghiên cứu khả năng ứng dụng các chủng xạ khuẩn này trong phân hủy, chuyển hóa các

chất ô nhiễm hữu cơ chứa clo trong môi trường cũng cần được tiếp tục quan tâm.

Nhận xét:

Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu đề cập đến khả năng sinh tổng hợp

laccase-like, cũng như khả năng xúc tác phân hủy chuyển hóa của laccase-like từ

các đại diện thuộc vi khuẩn, xạ khuẩn và đặc biệt là đại diện thuộc chi Streptomyces

trong môi trường chứa các hợp chất ô nhiễm vòng thơm, quan trọng hơn cả là các

chất diệt cỏ/dioxin như đã được sử dụng trong nghiên cứu này. bên cạnh đó, nghiên

cứu tinh sạch và tìm hiểu đặc tính của laccase-like mà các chủng xạ khuẩn phân lập

được từ khu vực ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin sinh tổng hợp được là một đối

tượng nghiên cứu mới của luận án này. Chính vì vậy, nghiên cứu tiếp theo của luận

án sẽ tập trung vào đánh giá khả năng tinh sạch và tìm hiểu đặc tính hóa-lý của hoạt

chất sinh học này với các nội dung như laccase-like có khả năng tinh sạch không?

nó có bản chất protein? Các đặc tính riêng khác lần lượt cũng sẽ được làm rõ ở các

phần sau. Để dễ theo dõi NCS vẫn sẽ sử dụng các danh từ chung cho enzyme để thể

hiện các nghiên cứu thuộc nội dung nghiên cứu đã được đề cập trên.

3.2. Đặc tính hóa - lý, hóa - sinh của laccase và laccase-like tinh sạch

3.2.1. Tinh sạch laccase của nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40

Laccase thô sau khi lọc qua màng tiếp tuyến 10 kDa đã tăng hoạt tính gấp 4,7

lần và hoạt tính protein riêng đo được là 40,6 U/mg đạt hiệu suất 98,8%. Sau khi qua

cột sắc ký lọc gel hoạt tính enzyme tiếp tục tăng lên 5,6 lần và hoạt tính protein riêng là

218 U/mg với hiệu suất 40,8%. Hoạt tính laccase và hàm lượng protein của mỗi phân

đoạn khi qua cột sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion đều được xác định sau mỗi phân

đoạn (Hình 3.7). Phân đoạn sau quá trình sắc ký lọc gel có hoạt tính cao nhất tiếp tục

đưa qua cột sắc ký trao đổi ion Hitrap QHP. Kết quả, ở nồng độ 0,15 M NaCl, protein

69

thu được có hoạt độ riêng là 1.016 U/mg gấp 25 lần so với protein laccase thô ban đầu,

160000

160.00

protein(µg/ml)

Laccase (U/L)

100000

450.00

Laccase (U/L)

protein(µg/ml)

90000

140000

140.00

400.00

) l

80000

) l

350.00

120000

120.00

70000

300.00

/

100000

100.00

/

) L U

60000

) L U

(B)

250.00

80000

80.00

50000

200.00

40000

60000

60.00

150.00

( h n í t t ạ o H

30000

( h n í t t ạ o H

40000

40.00

m / g µ ( n i e t o r p g n ợ ư l

100.00

m / g µ ( n i e t o r p g n ợ ư l

20000

20000

20.00

m à H

50.00

10000

m à H

0.00

0

0.00

0

0

10

20

30

40

0

5

10

25

30

35

Phân đoạn

15 20 Phân đoạn

hiệu suất đạt 32,3%.

Hình 3.7. Hoạt tính laccase tinh sạch của chủng FBV40, qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G75 (A) và qua cột trao đổi ion trên hệ thống Hitrap QHP (B).

Trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của laccase đã được xác định bằng điện

di trên gel 12,5% polyacrylamide (SDS-PAGE). Từ ảnh điện di đồ cho ta thấy

enzyme được tinh sạch có chất lượng tốt, hình thành các băng đơn đồng nhất và có

hai băng protein thu được với kích thước 55 kDa và 60 kDa và gọi là isozyme Lac1

và isozyme Lac2.

Hiện nay, có rất ít công bố về số lượng isozyme laccase của các chủng nấm

thuộc chi Rigidoporus. Khi tinh sạch laccase chủng Rigidoporus microporus BCRC

35318 chỉ thu được 1 băng chính với trọng lượng phân tử là 55 kDa [121]. Khi

nghiên cứu về laccase ổn định nhiệt chủng Sporothrix carnis CPF-05 khi đã qua

tinh sạch bằng sắc ký ion và sắc ký lọc gel, chỉ xác định được 1 băng trên gel với

M

L1

L2

L3

L4

trọng lượng phân tử là 56kDa [45].

Hình 3.8. Diện di protein chủng FBV40. Land 1: laccase thô, Land 2: laccase đã qua cột lọc gel Sepadex G75; Land 3, Land 4 enzyme tinh sạch sau khi qua cột trao đổi ion, M: thang protein chuẩn.

Như vậy, khối lượng của hai isozyme laccase của chủng nấm thu được là

phù hợp với khoảng khối lượng đã được công bố về laccase và kết quả nghiên cứu

70

của luận án đã bổ sung thêm thông tin vào bộ sưu tập isozyme laccase của chủng

nấm thuộc chi Rigidoporus.

3.2.2. Tinh sạch laccase-like từ xạ khuẩn Streptomycese sp. XKBiR929

Laccase-like là một hoạt chất sinh học đã được mô tả ở một số nghiên cứu

trước đây ở Việt Nam, đây là một hoạt chất có đặc tính khá đặc biệt nên chưa có

quy trình chuẩn hoặc được mô tả chi tiết để tinh sạch. Chính vì vậy, trong nghiên

cứu này để có được những kết quả nghiên cứu, quy trình tinh sạch như đối với

laccase thật đã được thực hiện. Tuy nhiên, có một số công đoạn được thay đổi để

phù hợp với đặc tính của chất có nguồn gốc từ vi sinh vật trong đất ô nhiễm liên

quan đến chất diệt cỏ/dioxin. Quá trình tinh sạch, dịch laccase-like thô được đưa qua

cột sắc ký lọc gel, kết quả hoạt tính tăng lên 1,26 lần từ 3192 U/L đến 4.028 U/L, nồng

độ protein giảm đi từ 0,0357 mg/ml xuống còn 0,0116 mg/ml.

Hoạt tính laccase-like và hàm lượng “protein” của mỗi phân đoạn khi qua

cột sắc ký lọc gel đều được xác định và được trình bày ở Hình 3.9. Phân đoạn có

hoạt tính cao nhất sau quá trình sắc ký lọc gel sẽ được đưa qua cột sắc ký trao đổi

ion Hitrap QHP, “protein” được rửa giải ở nồng độ muối NaCl 0,1 M với hiệu suất

3000

450

4500

400

4000

(B)

2500

(A)

350

3500

) l

hoạt tính U/l

3000

2000

300

) l /

[P] µg/ml

/

U

2500

) L U

250

m / g µ (

1500

2000

200

1500

( h n i t t a o H

1000

150

( h n í t t ạ o H

P o d g n o N

1000

100

500

500

50

0

0

0

23

24

25

26

27

28

29

30

0

2

4

6

14

16

18

20

Phân đoạn

69,7% và nồng độ “protein” đạt 6,93 U/mg.

8 12 10 Phân đoạn

Hình 3.9. Hoạt tính laccase-like tinh sạch của chủng XKBiR929. Hoạt tính

qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G75 (A) và qua cột trao đổi ion trên hệ thống Hitrap QHP (B)

Tuy nhiên, khi xác định trọng lượng phân tử bằng điện di trên gel

polyacrylamide 15-20% (SDS-PAGE) để kiểm tra độ tinh sạch cũng như xác định

khối lượng của protein thì không thấy xuất hiện “protein” được tinh sạch. Như vậy,

phương pháp xác định sự tồn tại của laccase-like theo phương pháp tinh sạch

protein laccase thông thường đã không xác định được trọng lượng phân tử của

71

laccase-like. Số liệu thu được đưa ta đến nhận định trọng lượng phân tử của

laccase-like từ loài xạ khuẩn này nhỏ hơn 10 kDa.

Laccase-like kiểu mới này là sản phẩm được tạo ra bởi các chủng xạ khuẩn

không phải là protein. Vì, sau khi đun sôi dịch nuôi cấy vài giờ vẫn xác định được

khả năng oxy hóa ABTS thành sản phẩm có màu xanh (Hình 3.10). Đây có thể là

chất trao đổi có khả năng tham gia phản ứng oxy hóa các hợp chất hữu cơ vòng

thơm, để khẳng định điều này sẽ cần rất nhiều nghiên cứu chi tiết tiếp theo để tìm

hiểu rõ hơn về bản chất hóa học và hoạt động xúc tác của chất được sinh tổng hợp

bởi chủng xạ khuẩn XKBiR929.

(C) (B) (A)

Hình 3.10. Phản ứng oxy hóa của laccase-like tinh sạch với ABTS trong đệm KCl-HCl pH 1 sau 2 phút (A), 1 phút (B) và không có laccase-like (C)

3.2.3. Đặc tính hóa - lý của laccase và laccase-like tinh sạch

3.2.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến laccase tinh sạch

Laccase tinh sạch chủng FBV40 thu được bao gồm hai isozyme và được ký

hiệu là Lac1 và Lac2. Để hiểu được đặc tính của các isozyme này, các nghiên cứu

về ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, các chất cảm ứng, chất ức chế, động học enzyme và

ảnh hưởng của các cation đã được tiến hành.

a) Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính và độ bền của laccase

Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của các laccase tinh sạch từ chủng FBV40

được khảo sát trong khoảng từ 1,0 đến 9,0. Kết quả, được trình bày ở Hình 3.11.

Kết quả thu được cho thấy, ở pH 3 thì cả Lac1 và Lac2 đều đạt hoạt tính cao

nhất. Lac1 mất hoàn toàn mất hoạt tính ở giá trị pH bằng 1, 7, 8, và 9, trong khi đó

đối với Lac2 là ở pH 1 và 8. Về độ bền hoạt tính của laccase tinh sạch, đối với Lac1

ở pH 5 hoạt tính còn lại trên 50% và ở giá trị pH 3, 4 hoạt tính còn lại tương ứng

lần lượt là 21 và 29% sau 5 h. Trong khi đó, Lac2 ở pH 6 có hoạt tính còn lại trên

92% và ở pH 3, 4, 9 hoạt tính còn lại tương ứng lần lượt là 54, 55 và 78% sau 3 h.

72

Như vậy, đã thấy có sự khác nhau của pH môi trường lên hoạt tính laccase

của 2 isozyme từ chủng FBV40, đặc biệt là ảnh hưởng tới độ bền.

Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra rằng pH phù hợp để nuôi cấy chủng nấm

sinh tổng hợp laccase cao nằm trong khoảng từ 4 đến 6 [162, 51]. pH tối ưu để nấm

sinh tổng hợp laccase thường nằm trong khoảng 5 và 6 [94, 115]. Laccase tạo ra bởi

chủng Sporothrix carnis CPF-05 ở pH tối ưu là 7, hoạt tính tương đối ổn định trong

khoảng pH từ 3 đến 11 [60]. Một số thông tin về pH tối ưu để hoạt tính laccase tạo

ra từ chủng nấm khi sử dụng cơ chất là ABTS làm chất cảm ứng lại nằm trong

khoảng 2,2 đến 4,6 [1, 33]. Theo nghiên cứu của Zhu [178], laccase loài Pleurotus

nebrodensis và Lepista nuda với pH tối ưu là 3. Như vậy có nghĩa là laccase được

65000

80000

60000

(B)

70000

55000

(A)

pH 2

pH 3

pH 4

pH 5

50000

60000

45000

/

) l /

) L U

U

50000

40000

35000

40000

30000

30000

25000

( h n í t t ạ o H

20000

20000

15000

( i ạ l n ò c h n í t t ạ o H

10000

10000

5000

0

0

0

1

2

3

5

6

7

8

9

10

0

50

100

250

300

350

150

200

4 pH

Thời gian (phút)

4000

pH 1

pH 2

pH 3

pH 4

pH 5

4000

pH 6

pH 7

pH 8

pH 9

3500

3500

(C)

3000

3000

/

) L U

2500

) l /

2500

U

2000

2000

1500

1500

(D)

( h n i t t a o H

1000

1000

( i ạ l n ò c h n í t t ạ o H

500

500

0

0

0

15

30

45

60

75

90

105 120 135 150 165 180 195

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

pH

Thời gian (phút)

sinh tổng hợp bởi các chủng nấm đảm khác nhau với pH thuộc axit nhẹ.

Hình 3.11. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính (A) và độ bền (B) của Lac1, hoạt tính (C) và độ bền (D) của Lac2

Laccase tinh sạch chủng Rigidoporus microporus BCRC 35318 có hoạt tính

cao nhất ở pH 3 - 5 khi sử dụng ABTS làm chất cảm ứng. Độ bền pH của laccase tinh

sạch cao hơn ở pH dưới 6 [121]. Từ các kết quả nghiên cứu kể trên cho thấy giá trị

73

pH để laccase tinh sạch của chủng FBV40 có hoạt tính cao nhất là phù hợp với các

nghiên cứu đã được công bố.

b) Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền nhiệt

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền nhiệt của Lac 1, Lac 2 từ

chủng FBV40 đã được thực hiện trong khoảng từ 35 đến 70oC, thời gian khảo sát

đến 140 phút đối với Lac 1. Nhiệt độ từ 30 đến 900C và độ bền nhiệt đã được khảo

sát từ 35 đến 70oC với thời gian kéo dài đến 180 phút đối với Lac 2. Kết quả thu

được, cả Lac1 và Lac2 đạt hoạt tính cao nhất ở 60°C. Trong khoảng nhiệt độ từ 65

đến 70°C Lac1 giảm hoạt tính tương ứng lần lượt từ 15 đến 23%. Lac2 giảm hoạt

tính từ 20, 32 và 75% khi nhiệt độ tương ứng là 70, 80 và 90°C. Hoạt tính Lac1 bền

nhất ở 35oC khi vẫn còn 18% so với hoạt tính ban đầu sau 140 phút, trong khi đó

hoạt tính Lac2 đạt 92% và 90% ở ở 30oC và 40oC sau 180 phút.

Như vậy, Lac 1 và Lac2 bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ là khá tương ứng với

120

35°C

40°C

45°C

100

95000

50°C

60°C

70°C

)

%

80

(A)

90000

(B)

60

85000

) l /

U

40

( i ạ l n ò c h n ì t t ạ o H

80000

20

( h n í t t ạ o H

75000

0

0

10

20

30

40

50

90 100 110 120 130 140 150

70

80

60 Thời gian (phút)

70000

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

Nhiệt độ (oC)

120

120

30⁰C

40⁰C

50⁰C

60⁰C

70⁰C

80⁰C

90⁰C

100

100

(D)

(C)

) l /

80

80

)

U

%

60

60

( h n i t t a o H

40

40

20

20

( i ạ l n ò c h n i t t a o H

0

0

0

15

30

45

105 120 135 150 165 180

75

30

40

80

90

50

70

60 Nhiệt độ (oC)

60 90 Thời gian (phút)

nhau. Tuy nhiên, Lac2 có độ bền hoạt tính của cao hơn với Lac 1 (Hình 3.12).

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ bền nhiệt lên hoạt tính Lac1 (A, B) và Lac 2 (C, D)

74

Laccase được sinh tổng hợp từ chủng Sporothrix carnis CPF-05 đạt được hoạt

tính cao nhất ở nhiệt độ 50oC. Còn ở 80oC sau 180 phút, với chất cảm ứng là ABTS

hoạt tính còn lại 56% [60]. Hầu hết laccase chủng nấm có hoạt tính cao nhất ở nhiệt

độ từ 40 đến 70oC [161] và nhiệt độ thích hợp là 50oC đối với loài Lepista nuda [178]

Paraconiothyrium variabile [55], Trametes trogii và Ceriporiopsis subvermispora

[23]. Hoạt tính laccase của chủng Rigidoporus microporus BCRC 35318 cao nhất ở

nhiệt độ 70oC và độ bền nhiệt độ cao nhất lại ở dưới 50oC [121].

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính laccase của chủng FBV40 so với những

số liệu từ các công bố quốc tế đã đề cập ở trên cho thấy không có sự khác biệt lớn.

c) Cơ chất đặc hiệu

Một vài cơ chất đặc hiệu được sử dụng để đánh giá khả năng oxy hóa được

thể hiện qua hoạt tính đạt được của các isozyme laccase của chủng FBV40 ở điều

kiện pH 3 và nhiệt độ 60oC. Lac1 và Lac2 đều có thể oxy hóa 1,0 mM các cơ chất

đặc thù của laccase như ABTS, syringaldazine, 2, 6-DMP và guaiacol, trong đó Lac

1 và Lac2 có khả năng oxy hóa cao nhất đối với ABTS, với các cơ chất khác như

syringaldazine, 2, 6-DMP và guaiacol thì chúng thể hiện khả năng oxy hóa thấp,

thấp nhất là với syringaldazine. Cụ thể, hoạt tính Lac 1 với 2,6-DMP đạt 76,5%,

guaiancol đạt 0,54% và syringaldazine đạt 0,13% so với hoạt tính thu được khi oxy

hóa ABTS, trong khi hoạt tính tương ứng thu được của Lac 2 là 74% đối với 2,6-

DMP, 0,3% đối với guaiancol và 0,2% đối với syringaldazine (Hình 3.13).

Từ kết quả thu được ở trên, ABTS được sử dụng làm cơ chất trong nghiên cứu

60000

5000

(A)

(B)

4500

50000

4000

) l /

3500

) l /

40000

U

U

(

(

3000

30000

2500

h n i t t a o H

h n í t t ạ o H

2000

20000

1500

1000

10000

500

0

0

Guaicol

Syrinealdazine

ABTS

2,6-DMP

ABTS

Guaiacol

2,6DMP

Syringaldazine

Cơ chất

Cơ chất

động học của laccase tinh sạch chủng FBV40.

Hình 3.13. Cơ chất đặc hiệu đối với Lac1 (A) và Lac 2 (B)

75

d) Ảnh hưởng của các chất ức chế và ion kim loại

Một số chất ức chế protein đã được nhiều tác giả khảo sát cho enzyme và

laccase đã được sử dụng để đánh giá mức độ ảnh hưởng lên hoạt tính của Lac1, Lac

2 của chủng FBV40. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.4 và Hình 3.14.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của chất ức chế lên hoạt tính Lac1, Lac2 của FBV40

Nhận xét mức độ bị ức chế STT Chất ức chế

1 SDS Lac 1 Bị ức chế hoàn toàn ở bất kỳ nồng độ nào

2 EDTA

10 mM bị ức chế hoàn toàn; 5 mM hoạt tính bị ức chế 65,5% và 2 mM hoạt tính bị ức chế 28,5% Lac 2 Bị ức chế hoàn toàn ở bất kỳ nồng độ nào 10 mM hoạt tính bị ức chế 92%, 5 mM hoạt tính bị ức chế 58,4% và 2 mM hoạt tính bị ức chế 31,6%

3 Cl- Không nghiên cứu

4 L-cystein Không nghiên cứu 10 mM bị ức chế hoàn toàn; 5 mM hoạt tính bị ức chế 72%; 2 mM hoạt tính bị ức chế 9,4% 5 mM và 10 mM hoạt tính bị ức chế hoàn toàn; 2 mM hoạt tính bị ức chế 54,5%

5 Arginin Không nghiên cứu

10 mM hoạt tính bị ức chế 48%; 5 mM hoạt tính bị ức chế 36,5; 2 mM hoạt tính bị ức chế 28,5%.

Chú thích: "-" không thử nghiệm

Theo nghiên cứu của Po-Ting C và đtg, NaN3 là chất ức chế mạnh nhất đối

với laccase chủng Rigidoporus microporus BCRC 35318, ở nồng độ 0,1 mM ức chế

50% hoạt tính, còn các chất ức chế khác như EDTA, dithiothreitol (DTT), L-

Cysteine ít có ảnh hưởng lên hoạt tính laccase, ở các nồng độ từ 0,1 mM đến 25

mM hoạt tính còn lại dao động trong khoảng từ 91,8 đến 100% [121]. Theo một

nghiên cứu khác của Zhao và đtg, ảnh hưởng tới hoạt tính laccase bởi các chất ức

chế như SDS, EDTA, NaN3 ở các nồng độ 1 mM, 5 mM và 10 mM thì hoạt tính còn

lại dao động trong khoảng 60 đến 78%, kết quả này phù hợp với kết quả ức chế của

SDS và EDTA lên laccase loài Lentinus edodes và Fomitella fraxinea. Ảnh hưởng

của chất ức chế NaN3 tới hoạt tính laccase là do nó liên kết tạo phức với Cu2+ ở

trung tâm T2 và T3 qua đó ngăn cản quá trình chuyển electron gây ức chế hoạt tính

của nó [177].

76

120

120

SDS

Arginine

EDTA

100

EDTA Cl-

SDS L-cystein

100

)

80

%

80

)

%

60

60

(A)

40

40

(B)

( i ạ l n ò c h n í t t ạ o H

20

20

( i ạ l n ò c h n í t t ạ o H

0

0

0

2

4

8

10

12

0

2

4

8

10

12

6 Nồng độ chất ức chế (mM)

6 Nồng độ chất ức chế (mM)

Hình 3.14. Ảnh hưởng của chất ức chế lên Lac 1 (A), Lac 2 (B) của chủng FBV40

So với số liệu của các tác giả đã công bố cho thấy, EDTA và L-Cysteine đã

ảnh hưởng lớn đối với Lac1 và Lac2 của chủng Rigidoporus sp.FBV40. Như vậy,

đặc tính của Lac1 và Lac2 của chủng nấm nghiên cứu trong nghiên cứu này rất khác

với laccase của chủng nấm Rigidoporus microporus BCRC 35318.

Trung tâm hoạt động của laccase có chứa Cu2+ và ion Cu2+ là chất cảm ứng

quan trọng nhất. Vì vậy, ảnh hưởng của một số ion kim loại hóa trị hai lên hoạt tính

của Lac1 và Lac2 đã được khảo sát. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.5 và Hình 3.15.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính Lac1 và Lac2

Mức độ ảnh hưởng STT ion

1 Cu2+ Lac 1 Làm tăng 109% hoạt tính ở nồng độ 2 mM

2 Mg2+

Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động trong khoảng 21,5 đến 78,95% tương ứng từ 0,5 mM đến 5,0 mM Lac 2 Làm tăng 112% đến 184,6% hoạt tính ở nồng độ tương ứng từ 1,0 đến 5 mM Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động trong khoảng 11,6% đến 27% tương ứng với từ 0,5 mM đến 5,0 mM

3 Ni2+

Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 12,8% đến 30% với nồng độ từ 0,5 mM đến 5 mM Ở 1,0 mM làm tăng 100,6% hoạt tính, ở các nồng độ còn lại đều ức chế và dao động từ 5,3% đến 44,4% tương ứng 0,5 mM đến 5 mM

4 Mn2+

Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 21,1% đến 35% với nồng độ từ 0,5 đến 5,0 mM

5 Co2+

Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 15,5% đến 35,2% với nồng độ từ 0,5 đến 5,0 mM Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 11,6% đến 18,9% với nồng độ từ 0,5 đến 5,0 mM Gây ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 14,5% đến 32,3% với nồng độ từ 0,5 mM đến 5 mM

77

Mức độ ảnh hưởng STT ion Lac 1

6 Fe2+

Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 71,6% đến 93,3% với nồng độ từ 0,5 mM đến 5 mM

7 Ca2+ Làm tăng 107% và 128% hoạt tính ở nồng độ 0,5 và 2 mM Lac 2 Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 95,9% đến 100% với nồng độ tương ứng từ 0,5 mM đến 5 mM Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 16,2% đến 23,3% với nồng độ từ 0,5 mM đến 5 mM

và Ca2+ đều làm tăng hoạt tính của Lac1

Kết quả thu được cho thấy, ion Cu2+

và Lac2, trong đó, Cu2+ làm tăng hoạt tính của Lac2 lớn hơn Lac1 tương ứng là 112

đến 184% so với 109%. Với Ca2+ làm tăng hoạt tính của Lac1 cao nhất đến 128% ở

nồng độ 2 mM nhưng lại ức chế hoạt tính đối với Lac2 từ 16,2 đến 23,3% ở các

nồng độ từ 0,5 đến 5 mM. Ion Fe2+ đều gây ức chế hoạt tính với cả Lac1 và Lac2

nhưng mức độ ức chế đối với Lac2 lớn hơn Lac1. Còn các ion kim loại khác đều

gây ức chế với hoạt tính laccase và ở các mức độ khác nhau giữa Lac1, Lac2. Kết

12000

180,000

0,5 mM

1,0 mM

2,0 mM

3,0 mM

0,5mM

4,0 mM

5,0 mM

0 mM

160,000

10000

1mM

140,000

(A)

(B)

) l /

2mM

8000

120,000

U

3mM

100,000

/

6000

) L U

4mM

80,000

( h n i t t a o H

4000

5mM

60,000

( h n í t t ạ o H

40,000

2000

20,000

0

0

Cu2+

Fe2+ Ca2+ Co2+ Ni2+ Mg2+ Mn2+ Control

Ni

Co

Cu

Mn

Mg

Ion kim loai

Fe Ca Ions kim loại

quả cho thấy Lac1 và Lac2 có đặc điểm khác biệt rõ ràng với nhau.

Hình 3.15. Ảnh hưởng của ion kim loại lên Lac 1 (A), Lac 2 (B) của chủng FBV40.

Theo Zhao và đtg, các ion kim loại tồn tại phổ biến trong môi trường và

chúng có ảnh hưởng tới hoạt tính và mức độ ổn định của enzyme ngoại bào. Hoạt

tính laccase chủng S. carnis CPF-05 đã tăng lên 126,79% khi có mặt của Cu2+ (10

mM) và 148,2% và 251,79% với Mn2+ (5mM và 10 mM). Hoạt tính laccase của

chủng tăng lên khi bổ sung ion Cu2+ có thể là do sự gia tăng điểm liên kết đồng vở

vị trí T2 trong cấu trúc phân tử của laccase. Hoạt tính laccase chủng S. carnis CPF-

05 bị ức chế khi có mặt của Hg2+, Mg2+, Ca2+, Ba2+ ở nồng độ từ 1 đến 10 mM. Sự

78

ức chế hoạt tính laccase của chủng Myrothecium verrucaria NF-05 cũng bị ức chế

bởi Hg, Mg và Ba ở nồng độ 6,25 mM và 12,5mM [177]. Theo nghiên cứu Folasade

(2017), hoạt tính laccase chủng Sporothrix carnis CPF-05 được nâng cao với sự có

mặt của ion Cu2+ và Mn2+ nhưng bị ức chế bởi các ion Ca, Mg, Ba và Hg [60].

Kết quả thu được từ nghiên cứu này cho thấy, ảnh hưởng của các ion kim loại lên

hoạt tính laccase sinh tổng hợp bởi chủng FBV40 là tương đồng với các nghiên cứu đã

được công bố quốc tế, tuy nhiên có sự khác biệt về mức độ ức chế giữa Lac1 và Lac2.

3.2.3.2. Đặc điểm động học của laccase tinh sạch

Dựa vào kết quả nghiên cứu cơ chất đặc hiệu đối với khả năng oxy hóa của

laccase tinh sạch của FBV40, động học enzyme đã được khảo sát khi sử dụng cơ

chất là ABTS (Bảng 3.6). Qua đó giá trị hằng số động học (Km) mô tả khả năng oxy

hóa của Lac 1 là 0,3 µM và tốc độ oxy hóa cơ chất Vmax là 200.000 µM/phút.

Trong khi đó với Lac 2 là 0,4 µM và Vmax là 10.000 µM/phút. Như vậy có thể thấy tốc

độ và khả năng oxy hóa của Lac 2 kém hơn khoảng 20 lần so với Lac 1.

Hoạt tính (U/L)

1/S (1/mM)

Nồng độ ABTS (mM)

Lac2

Lac1

Lac2

Lac1 40.876,6 74.535,6 82.100,2 102.781,4 85.153,8

2.200 3.671 4.271 4.464 4.802

10 5 3,33 2,5 2,0

10 5 3,3 2,5 2

Lac2 4,5.10-4 2,7.10-4 2,4.10-4 2,2.10-4 2,0.10-4

Lac1 2,4.10-5 1,3.10-5 1,2.10-5 9,7.10-6 1,1.10-5

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Từ kết quả Bảng 3.6, ta có đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất

Bảng 3.6. Quan hệ giữa nồng độ ABTS với hoạt tính laccase tinh sạch 1/V (L/U)

0.0005

0.00003

(B)

(A)

0.00045

0.0004

0.000025

0.00035

y = 2E-06x + 5E-06 R² = 0.9838

0.00002

)

)

0.0003

/

0.00025

U / 1 (

0.000015

U L (

y = 3E-05x + 0.0001 R² = 0.9848

0.0002

V / 1

V / 1

0.00001

0.00015

0.0001

0.000005

0.00005

0

0

-4

-2

2

4

6

8

10

12

0

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

1/S (1/mM)

1/S (1/mM)

và hoạt tính laccase được trình bày ở Hình 3.16.

Hình 3.16. Mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất với hoạt tính Lac1 (A) và Lac2 (B)

Laccase chủng Sporothrix carnis CPF-05 khi sử dụng ABTS làm cơ chất thì

hằng số Km và Vmax của laccase tinh sạch tương ứng là 0,0316 mM và 7,94 mM/phút

79

[60]. Tương tự đối với chủng Rigidoporus microporus BCRC 35318 đạt được Km là

53µM và Vmax là 13,8 µM/s [121].

Kết quả thu được của nghiên cứu này cho thấy giá trị xúc tác của laccase

chủng Rigidoporus sp. FBV40 rất cao so với kết quả nghiên cứu về laccase các chủng

nấm thuộc chi Rigidoporus. Để định hướng nghiên cứu ứng dụng laccase trong xử lý

trong xử lý màu thuốc nhuộm hoạt tính và các chất diệt cỏ/dioxin thì yêu cầu khảo sát

các điều kiện môi trường ảnh hưởng tới laccse thô là rất quan trọng. Chính vì vậy

nghiên cứu ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường đã được thực hiện.

3.2.3.3. Đặc tính hóa-lý của laccase thô

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính laccase thô của chủng FBV40

cũng được tiến hành như đối với nghiên cứu laccase tinh sạch. Kết quả được trình

bày ở Bảng 3.7 và Hình 3.17.

Bảng 3.7. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng tới hoạt tính laccase thô của FBV40

Sự thay đổi hoạt tính laccase Các yếu tố ảnh hưởng Ảnh hưởng của pH

Hoạt tính cao nhất Mất hoạt tính Hoạt tính còn lại trên 65% sau 120 phút

pH 3 pH 2 pH 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 30 đến 40oC

50oC, 60 đến 70oC

Hoạt tính cao nhất Bị ức chế lần lượt là 15% sau 160 phút ở 50oC và 79% sau 40 phút ở 60oC và đến 98% sau 20 phút ở 70oC Sau 160 phút hoạt tính gần như không bị ức chế

30oC và 40oC Động học xúc tác

0,5 µM 25.000 µM/phút Km Vmax

Ảnh hưởng của chất ức chế

SDS L-lysis EDTA Với 5 mM bị ức chế hoàn toàn và 2 mM bị ức chế 79% Với 5 mM bị ức chế hoàn toàn và 2 mM ức chế 86% Với 5 mM bị ức chế là 92% và 2 mM bị ức chế 10%

Ảnh hưởng của các ion kim loại

Co2+

Mn2+

K+

Na+

Mg2+ Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 44,7% đến 79,5% với nồng độ từ 2 đến 10 mM Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 47,3% đến 80,2% với nồng độ từ 2 đến 10 mM Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 41,7% đến 80,7% với nồng độ từ 2 đến 10 mM. Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 75,5% đến 94% với nồng độ từ 2 đến 10 mM. Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 13,4% đến 79,1% với nồng độ từ 2 đến 10 mM.

80

Các yếu tố ảnh hưởng

Ca2+

Fe2+

Ni2+

Cu2+ Sự thay đổi hoạt tính laccase Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 41,5% đến 68,5% với nồng độ từ 2 đến 10 mM. Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 97% đến 97,9% với nồng độ từ 2 đến 10 mM. Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 2,7% đến 88,3% với nồng độ từ 2 đến 10 mM. Ức chế hoạt tính ở tất cả các nồng độ và dao động từ 48,1% đến 76,2% với nồng độ từ 2 đến 10 mM.

Như vậy, nhiệt độ phù hợp để nghiên cứu đánh giá khả năng của laccase thô

chủng FBV40 là 30 đến 40oC, chất ức chế mạnh nhất trong số các chất khảo sát là SDS

tiếp đến là L-lysis và cuối cùng là EDTA. Đối với laccase thô của chủng FBV40,

toàn bộ các ion kim loại khảo sát ở các nồng đều gây ức chế ở các mức độ khác

nhau, trong đó ion Cu2+ gây ức chế hoạt tính từ 48,1 đến 76,2% và Ca2+ gây ức chế

hoạt tính từ 41,5 đến 68,5% ở nồng độ khảo sát từ 2 đến 10 mM. Kết quả thu được

cho thấy, có sự tương đồng về khả năng nhưng có sự khác biệt lớn ở mức độ ảnh

hưởng của cùng một yếu tố lên hoạt tính laccase thô và laccase tinh sạch của chủng

FBV40. Kết quả nghiên cứu cho thấy, để ứng dụng laccase tinh sạch hay laccase thô

trong xử lý ô nhiễm môi trường cần phải nghiên cứu tổng thể và chi tiết để xác định các

yếu tố và mức độ ảnh hưởng để qua đó nâng cao hiệu quả xử lý của chúng.

81

12000

250

(A)

(B)

10000

200

8000

) l /

) l /

150

U

pH 2 pH 4

pH 3 pH 5

U

6000

100

4000

( h n í t t ạ o H

( h n i t t a o H

50

2000

0

0

20

40

100

120

140

0

1

2

3

4

6

7

8

9

10

60 80 Thời gian (phút)

5 pH

140

140

(D)

(C)

120

120

100

100

) l /

) l /

U

U

60độ C

80

80

70độ C

60

60

30độ C

( h n i t t a o H

( h n i t t a o H

40độ C

40

40

50độ C

20

20

0

0

20

25

0

5

10

15

35

40

45

20

40

60

140

160

180

30 Thoi gian (phut)

80 120 100 Thoi gian (phut)

0.0003

14000

(G)

(E)

12000

0.00025

10000

0.0002

) l /

)

U

8000

0.00015

U / 1 (

6000

y = 1764.8ln(x) + 10873 R² = 0.6565

0.0001

V / 1

4000

( h n i t t a o H

0.00005

y = 2E-05x + 4E-05 R² = 0.977

2000

0

0

-4

-2

0

2

6

8

10

12

0

0.2

0.4

0.8

1.2

1

1.4

1.6

1.8

-0.00005

4 1/S (1/mM)

0.6 Nong do ABTS (mM)

80

90

SDS

L-lys

EDTA

Control

2mM

5mM

10mM

70

80

70

60

60

(K)

50

) l /

(H)

50

U

) l /

U

40

40

30

30

20

( h n i t t a o H

20

( h n i t t a o H

10

10

0

0

2mM

5mM

Ion kim loai

Nồng độ chất ức chế

Hình 3.17. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính (A) và độ bền pH (B); ảnh hưởng của nhiệt độ (C, D); động học xúc tác (E, G) và ảnh hưởng của chất ức chế và ion kim loại (H, K) lên hoạt tính laccase thô của chủng FBV40

3.2.3.4. Đặc tính hóa - lý của laccase-like tinh sạch

Tương tự khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên laccase của chủng nấm FBV40

thì nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng lên laccase-like tinh sạch chủng xạ khuẩn

82

XKBiR929 đã được tiến hành để tìm ra sự khác biệt giữa chúng. Kết quả được trình

120

120

(A)

(B)

100

100

80

) l /

) l /

pH 1 pH 2

80

U

U

60

60

40

40

( h n i t t a o H

( h n i t t a o H

20

20

0

0

0

1

4

5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

2 3 Thoi gian (h)

3.5 pH

90

(D)

(C)

0.04

80

70

0.03

60

)

) l /

0.02

50

U

U / 1 (

40

y = 22.574ln(x) + 80.734 R² = 0.9926

0.01

V / 1

30

y = 0.0026x + 0.0098 R² = 0.9981

20

( h n i t t a o H

0

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11

10

-0.01

0

1/S (1/mM)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

1.4

-0.02

1 Nong do ABTS (mM)

120

70

(E)

(G)

100

60

80

50

) l /

) l /

2mM

U

U

40

60

5mM

SDS

30

10mM

40

L-lys

20mM

20

EDTA

( h n í t t ạ o H

( h n i t t a o H

20

10

Control

0

0

2mM

10mM

5mM Nồng độ cơ chất

Co2+ Mn2+ K+ Na+ Mg2+ Ca2+ Fe2+ Ni2+ Cu2+ đối Ion kim loai chứng

bày Hình 3.18.

Hình 3.18. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính (A) và độ bền (B); động học xúc tác (C, D) và ảnh hưởng của chất ức chế (E) và ion kim loại (G) lên laccase-like tinh sạch của XKBiR929

Số liệu thực nghiệm thu được cho thấy, laccase-like tinh sạch có hoạt tính

cao nhất ở pH 1, hoạt tính giảm nhanh và gần như không xác định được ở pH 3. Sau

4 h, hoạt tính laccase-like tinh sạch từ chủng XKBiR929 giảm 57,5% trong khi ở

pH 2, hoạt tính giảm 64,5%. Bên cạnh đó, hoạt tính của nó bền nhất ở pH 1. Đây là

một đặc tính của tác nhân sinh học rất khác biệt mà chủng xạ khuẩn XKBiR929

phân lập từ lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa tạo ra và lần đầu tiên

xác nhận được đặc tính của nó so với laccase của chủng nấm FBV40.

83

Hoạt tính của laccase-like tinh sạch của chủng XKBiR929 hầu như không

giảm khi được đun sôi trong thời gian tới 3 giờ. Thậm chí, khi chưng cất trên thiết

bị cất quay ở nhiệt độ 800C và áp suất 0,8 atm, hoạt tính laccase-like của chủng này

vẫn không thay đổi. Như vậy, laccase-like tạo ra từ chủng XKBiR929 rất bền nhiệt.

Dựa trên kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất lên khả năng oxy hóa

của laccase-like, tính toán được giá trị động học của nó với giá trị Vmax là 142.857

µM/phút và Km là 0,43 µM. Khi so sánh với giá trị động học của laccase chủng nấm

FBV40 thì thấy vận tốc phản ứng của laccase-like chỉ thấp hơn Lac1 (200.000

µM/phút) và cao hơn gấp khoảng 14 lần Lac2 (10.000 µM/phút) và hơn 5 lấn

laccase thô (25.000 µM/phút). Với giá trị Vmax và Km như vây cho thấy khả năng

oxy rất cao của laccase-like đặc biệt là ở giá trị pH rất thấp. Đây là một đặc tính rất

đáng lưu ý của hoạt chất này mà nghiên cứu sinh đã tìm thấy ở xạ khuẩn được trình

bày trong luận án này.

Chất ức chế hoạt tính laccase-like mạnh nhất là L-lys, ở nồng độ 10 mM hoạt

tính laccase-like chỉ còn lại 14%, tiếp đến là EDTA hoạt tính còn lại là 66,7% và

SDS có ảnh hưởng ít nhất đến hoạt tính laccase-like còn lại là 83,6%. Khi sử dụng

(NH4)2SO4 50% để kết tủa dịch laccase-like tinh sạch với mong muốn thu nhận

được protein, nhưng kết quả hoạt tính còn lại trong dung dịch vẫn còn tới 62%, như

vậy có thể thấy (NH4)2SO4 không có khả năng kết tủa được hoạt chất này. Từ minh

chứng này cho phép khẳng định sự khác biệt rất lớn của laccase-like so với laccase

thật từ nấm đảm. Tuy laccase-like có bản chất không là protein nhưng hoạt tính của

laccase-like cũng bị ức chế bởi các chất ức chế chung đối với protein.

Hoạt tính laccase-like bị ức chế bởi các ion kim loại Co2+, Mn2+, K+, Na+,

Mg2+, Ca2+, Ni2+ và Cu2+ ở nồng độ 2, 5 và 20 mM. Ở nồng độ 10 mM các ion kim

loại trên không ảnh hưởng thậm chí còn làm tăng hoạt tính của nó so với đối chứng.

Cụ thể, ion Co2+ làm tăng hoạt tính 110%, Mn2+ làm tăng 105%, Mg2+ làm tăng hoạt

tính 107%, Ca2+ làm tăng hoạt tính 107%, Ni2+ làm tăng hoạt tính 102% và Cu2+ làm

tăng hoạt tính laccase-like 103%. Trong số các cation kim loại thử nghiệm ảnh

hưởng đối với hoạt tính laccase-like, cation Fe2+ gây ra sự ức chế mạnh nhất với

hoạt tính laccase-like ở tất cả các nồng độ khảo sát. So với ảnh hưởng của các ion

kim loại của laccase thật từ chủng FBV40 trên cho thấy đây là một đặc tính hết sức

đặc biệt của laccase-like từ chủng XKBiR929.

84

Kết quả thu được của luận án liên quan đến các đặc tính của laccasee-like

được xạ khuẩn sinh tổng hợp được tinh sạch là những minh chứng đầu tiên về đặc

tính cơ bản của loại chất xúc tác hoạt động giống laccase nhưng không phải có bản

chất protein, có trọng lượng phân tử thấp. Lần đầu tiên chúng ta thấy những đặc điểm

mới mà luận án thu được về laccase-like của xạ khuẩn phân lập từ đất nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin. Vậy laccase-like tinh sạch có khả năng oxy hóa các hợp chất vòng thơm

không? câu hỏi này sẽ được phần nào làm rõ ở nội dung nghiên cứu tiếp theo.

3.3. Loại màu thuốc nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ chứa dioxin

3.3.1. Loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like

3.3.1.1. Loại màu thuốc nhuộm tổng hợp bởi laccase thô của chủng nấm FBV40

a) Loại màu thuốc nhuộm NY1

Có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh khi sử dụng chất gắn kết

(CGK) ViO trong phản ứng loại màu thuốc nhuộm bằng laccase thường cho hiệu

suất cao hơn so với các loại CGK khác. Couto và cộng sự [25] đã công bố laccase

từ loài Trametes hirsute loại được khoảng 90% màu thuốc nhuộm axit đỏ 97 với

nồng độ 50 mg/L chỉ trong 3 phút với sự có mặt của 2 mM và 5 mM ViO. Một

nghiên cứu khác của Hu và cộng sự [60] cho thấy khi có mặt ViO đã làm tăng hiệu

suất loại màu của laccase đối với thuốc nhuộm RBBR, Coomassie brilliant blue G-

250 và axit đỏ lên khoảng 70%. ViO cũng là CGK thích hợp để hiệu suất loại màu

tốt nhất đối với laccase để loại bỏ hoàn toàn màu RBBR trong 20 phút [144]. Kế

thừa kết quả đạt được của các nghiên cứu đã được công bố quốc tế và các công bố

từ nhóm nghiên cứu của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam, thì ViO là CGK được chọn để đánh giá khả năng loại màu

thuốc nhuộm tổng hợp và thương mại bằng laccase thô được sinh tổng hợp bởi

chủng FBV40 trong nghiên cứu của luận án.

Hiệu suất loại màu NY1 là thuốc nhuộm thuộc nhóm azo ở các nồng độ ViO

khác nhau được trình bày ở Hình 3.19. Laccase thô từ chủng FBV40 có khả năng

loại màu NY1 (màu mang 2 gốc azo) với hiệu suất cao nhất là 82% với sự có mặt

1,6 mM ViO sau 2,5 h. Số liệu thu được cho thấy khi tăng nồng độ CGK thì hiệu

suất loại màu tăng lên, tuy nhiên, hiệu suất loại màu tăng không đáng kể khi nồng

độ ViO trong khoảng từ 1,0 đến 1,6 mM. Khi không sử dụng CGK thì hiệu suất loại

màu chỉ đạt 4,6% sau 4h. Ngược lại, khi xác định hoạt tính enzyme thay đổi theo

85

thời gian cho thấy rõ vai trò của CGK đó là hoạt tính laccase giảm ít hơn khi không

có mặt của CGK. Sau 4h nếu có mặt 1,6 mM ViO thì hoạt tính laccase giảm 65% so

0 mM

0,1 mM

0,2 mM

0,4 mM

0 mM

0,1 mM

0,2 mM

90

0,6 mM

1,0 mM

1,2 mM

1,6 mM

0,4 mM

0,6 mM

1,0 mM

100

80

90

1,2 mM

1,6 mM

)

70

%

80

)

(A)

(B)

%

70

60

60

( u a m

50

50

40

40

30

i a o l g n ă n

30

20

20

ả h K

( h n í t t ạ o h m ả i g ộ đ c ứ M

10

10

0

0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

4

0

0,5

1

2

2,5

4

1,5 Thời gian (h)

Thời gian (h)

với 78% khi không có CGK.

Hình 3.19. Khả năng loại màu NY1 (A) và sự biến động hoạt tính laccase thô chủng FBV40 theo thời gian (B)

b) Loại màu thuốc nhuộm NY5

Thuốc nhuộm NY5 là thuốc nhuộm đại diện cho nhóm màu anthraquinone

có màu xanh. Khả năng loại màu NY5 ở các nồng độ ViO từ 0 đến 1,6 mM và sự

thay đổi hoạt tính laccase theo thời gian được trình bày ở Hình 3.20.

Laccase thô chủng FBV40 có khả năng loại màu thuốc nhuộm NY5 đạt hiệu

suất cao nhất là 70% ở 0,6 mM ViO. Tuy nhiên, khi không có CGK thì laccase thô

chủng FBV40 vẫn đạt hiệu suất loại màu 67,3% sau 48h, nhưng hoạt tính laccase

giảm từ 94 đến hơn 96% sau 1h ở hầu hết các công thức thí nghiệm. Kết quả cho

thấy khả năng ứng dụng rõ ràng của laccase thô từ chủng FBV40 trong loại màu

100

100

0,2 mM

0 mM

0,1 mM

90

90

0,8 mM

0,4 mM

0,6 mM

)

80

80

)

%

1,6 mM

1,0 mM

1,2 mM

%

70

70

60

60

( u a m

50

50

(B)

40

40

i a o l g n ă n

(A)

30

30

0 mM

0,1 mM

0,2 mM

ả h K

( h n í t t ạ o h m ả i g ộ đ c ứ M

20

20

0,4 mM

0,6 mM

0,8 mM

10

10

1,0 mM

1,2 mM

1,6 mM

0

0

0,25

0,5

0,75

1,0

0

0,25

0,5

0,75

1,0

24

48

Thời gian (h)

Thời gian (h)

thuốc nhuộm gốc anthraquinone.

Hình 3.20. Khả năng loại màu NY5 (A) và thay đổi hoạt tính laccase theo thời gian (B)

86

c) Loại màu thuốc nhuộm NY7

Thuốc nhuộm tổng hợp NY7 là đại diện cho nhóm màu gốc azo có màu đỏ,

đây là màu chuẩn thường được sử dụng để đánh giá khả năng oxy hóa các chất đa

nhân nói chung, loại màu trong các nghiên cứu cơ bản định lượng sử dụng laccase

nói riêng. Khả năng loại màu NY7 của lacccase thô chủng FBV40 được trình bày ở

Hình 3.21 (A, B). Laccase thô chủng FBV40 có khả năng loại màu thuốc nhuộm

nhóm azo NY7 đạt hiệu suất cao nhất là 89% ở 2,0 mM ViO sau 24 h. Khi không sử

dụng ViO, thì hiệu suất loại màu chỉ đạt 8% sau 24h. Khi ViO có mặt với nồng độ

càng cao thì hoạt tính laccase giảm càng ít theo thời gian. Cụ thể, hoạt tính laccase

giảm 77% khi không có ViO, còn ở 2,0 mM ViO thì hoạt tính chỉ giảm 59% sau

24h. Như vậy, đối với laccase thô từ chủng FBV40 trong loại màu thuốc nhuộm có

cấu tạo khác nhau thì vai trò của CGK, cụ thể là ViO cũng có vai trò khác nhau. Kết

quả thu được rất có ý nghĩa khi nghiên cứu hoàn thiện công nghệ xử lý nước bị ô

0 mM

0,1 mM

0,2 mM

0,4 mM

0 mM

0,1 mM

0,2 mM

0,6 mM

0,8 mM

1,0 mM

1,2 mM

100

0,4 mM

0,6 mM

0,8 mM

100

1,6 mM

2,0 mM

1,0 mM

1,2 mM

1,6 mM

90

90

)

2,0 mM

80

%

)

80

%

70

70

60

( u a m

60

(A)

50

50

40

40

i a o l g n ă n

30

30

ả h K

(B)

20

20

( h n í t t ạ o h m ả i g ộ đ c ứ M

10

10

0

0

0

0,5

1,0

2,0

4,0

24

0,5

1,0

2,0

4,0

1,5 Thoi gian (h)

1,5 Thời gian (h)

nhiễm loại màu thuốc nhuộm.

Hình 3.21. Khả năng loại màu NY7(A) và sự thay đổi hoạt tính laccase (B)

Sự có mặt của các CGK có thể làm tăng hoạt tính xúc tác của laccase đối với

các hợp chất có cấu trúc bền vững [38]. CGK đóng vai trò như chất trung gian cho -

nhận điện tử giữa các tâm hoạt động của laccase và các hợp chất hữu cơ có khối

lượng phân tử lớn như thuốc nhuộm, lignin, phenol, chất hữu cơ mạch vòng. Theo

nghiên cứu của Wang và cộng sự, khi khảo sát ảnh hưởng của chín loại CGK khác

nhau kết hợp với 3000 U/L laccase đối với khả năng loại màu Reative black 5 (RB5),

kết quả là khi có mặt acetosyringone (ACE) và syringaldehyde (SYR), laccase loại 40

mg/L màu thuốc nhuộm RB5 đạt tới 65% cao hơn khoảng 6 lần so với khi không có

mặt CGK sau 2 h [167]. Theo nghiên cứu khác của Moreira, sau 5 phút phản ứng,

87

SYR được xem là CGK tốt nhất trong phản ứng loại 140 µg/mL màu thuốc nhuộm

Reactive blue 19 bởi laccases sinh ra từ loài nấm Peniophora cinerea. Hiệu suất loại

màu đã tăng 3 lần so với khi không có mặt CGK [96]. Theo công bố của Daassi và

cộng sự (2014), laccase chủng nấm C. gallica BS54 cố định trên hạt Ca-alginate có

khả năng loại được khoảng 31% màu thuốc nhuộm Reactive black 5 (RB5) sau 8 giờ

khi không có CGK. Tuy nhiên, khi bổ sung thêm 1 mM HBT đã làm tăng hiệu suất

loại màu lên 2,5 lần đạt 78,2% sau 8 giờ bởi enzyme đã được cố định. Đối với màu

LG, laccase cố định từ chủng này có khả năng loại được 49% khi không có CGK và

loại được 86,5% màu thuốc nhuộm khi có mặt 1mM HBT sau 24 giờ [27].

Như vậy, từ các minh chứng của các nghiên cứu quốc tế về vai trò của CGK nêu

trên cho thấy mỗi loại laccase khác nhau đều có một số CGK phù hợp để làm tăng khả

năng loại màu cũng như hoạt tính của laccase. Nhiều công bố cũng đã cho thấy CGK

không chỉ một và đôi khi cần cả hệ CGK để làm tăng khả năng oxy hóa của laccase.

Tuy nhiên, trong luận án đã chưa thể khảo sát được vai trò của các chất gắn kết khác

hoạt động đơn lẻ hoặc hệ CGK đối với loại các màu thuốc nhuộm hoạt tính. Kết quả

khảo sát bước đầu có thể khẳng định laccase chủng FBV40 có khả năng rất cao trong

loại các màu gốc azo là NY1 và NY7 cũng như màu có gốc anthraquinon như NY5

ngay cả khi có mặt và không có mặt chất gắn kết. Kết quả này là những kết quả đầu

tiên về khả năng loại màu NY1, NY5 và NY7 của nấm thuộc chi Rigidoporus được

phân lập từ rừng tự nhiên ở Việt Nam. Để thẩy được sự khác nhau về khả năng loại

màu của chủng FBV40, kết quả được so sánh khả năng loại màu thuốc nhuộm với các

chủng nấm khác đã được công bố quốc tế và trong nước (Bảng 3.8).

Bảng 3.8. So sánh hiệu suất loại màu thuốc nhuộm sử dụng laccase từ FBV40 và các chủng nấm đảm khác

Hiệu suất loại màu Tham khảo Nồng độ thuốc nhuộm

25 μM Chủng/loài sinh tổng hợp laccase Pycnoporus sanguineus CS2 Martínez et al., 2013 [87]

Trametes versicolor 100 mg/L Li et al., 2014 [82]

40 mg/L Lentinus Polychrous 70% màu Methyl Red và 15% màu Reactive Black 5 sau 4 giờ ở 25ºC 91,5% Reactive Blue KN-R ở 40oC sau 16 giờ; 68,9% Acid Red 35 ở 50oC sau 24 giờ; 59,7% Direct Turquoise Blue 5B và 68,2% Direct Orange 7 sau 28 giờ ở 40oC 85% Acid Blue 80; 30% Water Blue; 20% Indigo Carmine; ít hơn Ratanaponglek, Phetsom, 2014

88

Hiệu suất loại màu Tham khảo Chủng/loài sinh tổng hợp laccase Nồng độ thuốc nhuộm [126]

10% đối với các màu thuộc nhóm azo (Reactive Black 5, Reactive Orange 16, Reactive Green 19) sau 120 phút.

Funalia trogii 74,96% Reactive Black 171; 78,14 Reactive Black 5 sau 5 phút ở 30oC 100 mg/L

Trametes trogii 96% màu xanh malachite sau 8 giờ 150 mg/L Yesilada et al., 2014 [85] Yan et al. 2014 [172]

98% màu reactive blue 49 sau 47 phút Gedikli et al., 2014 [49] 55,6 mg/L Trametes versicolor 2008001

75 mg/L Coriolopsis gallica BS54 Daassi et al., 2014 [27]

Pycnoporus sp. FBV234 100 mg/L

Lenzites. sp FBV256 100 mg/L

Nguyễn Mai Dương, 2016 [106] Coriolopsis sp. FPT5 100 mg/L

FBV267 100 mg/L

FBV238 100 mg/L

Rigidoporus sp. - Sridhar et al., 2013 [146]

Nghiên cứu này Rigidoporus sp. FBV40 100 mg/L 74,6% màu RBBR khi sử dụng laccase tự do và 90,3% khi sử dụng laccase được cố định trên hạt Ca- alginate sau 90 phút xử lý 85% RBBR; 76,9 Acid red 299 (NY1); 85,96 Acid red 266 (NY7); 80,27 acid blue 113 (IN13), 85% LF2B, 82,4% Megafix black CLS sau 24 giờ khi có bổ sung 200 µM VIO 77,8% RBBR; 34,7% Acid red 299 (NY1); 84,27% Acid red 266 (NY7); 79,61% acid blue 113 (IN13); 83,9% LF2B; 81% Megafix black CLS sau 24 giờ khi có bổ sung 200 µM VIO 96,1% RBBR; 83,9% NY1; 92,9% NY7; 83,8% IN13; 94,9% LF2B; 89,4% CLS; 89,7% BV sau 24 giờ khi có CGK VIO 200 µM 87,5% RBBR; 75,3% Acid red 299 (NY1); 91,26% Acid red 266 (NY7); 81,24% acid blue 113 (IN13); 90,4% LF2B; 88% Megafix black CLS 84,8% RBBR; 67,3% Acid red 299 (NY1); 89% Acid red 266 (NY7); 83,04% acid blue 113 (IN13); 85% LF2B; 82,4% Megafix black CLS 69,8% màu acid xanh 113 (IN13) sau 1 giờ khi không bổ sung CGK 82% NY1 (acid red 299); 70% NY5 (acid blue 281) và 89% NY7 (Acid red 266)

89

Từ bảng số liệu so sánh trên ta thấy, có nhiều chủng nấm có khả năng

sinh tổng hợp laccase với hiệu suất loại màu cao, tuy nhiên kết quả nghiên cứu

của luận án đã chứng minh khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính nhóm azo

và anthraquinone khá cao khi có mặt hoặc không có mặt của CGK bởi laccse

nấm Rigidoporus sp.FBV40 phân lập ở Việt Nam.

Nhận xét: Có sự khác biệt về hiệu suất loại màu thuốc nhuộm, vai trò của

CGK trong khả năng loại màu thuốc nhuộm tổng hợp bằng laccase thô của chủng

FBV40 đối với thuốc nhuộm thuộc 2 nhóm azo và anthraquinone. Đối với thuốc

nhuộm NY1 và NY7 (nhóm azo), khi không có mặt CGK thì hiệu suất loại màu thấp

chỉ là 25% và 8%, trong khi đó với NY5 (nhóm anthraquinone), hiệu suất loại màu là

67%. Chất gắn kết phù hợp đã làm tăng hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp, cụ

thể là khi có mặt CGK là ViO, hiệu suất loại màu cao nhất đối với thuốc nhuộm NY1,

NY7 lần lượt là 82%, 89%, còn đối với thuốc nhuộm NY5 là 70%.

3.3.1.2. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại sử dụng trong quân đội bởi

laccase thô từ FBV40

a) Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính thương mại

Để định hướng nghiên cứu công nghệ ứng dụng xử lý loại màu thuốc nhuộm

trong nước thải dệt nhuộm từ hoạt động quốc phòng, khảo sát hiệu suất loại màu một

số thuốc nhuộm hoạt tính thương mại được sử dụng trong quân đội bởi laccase thô

chủng FBV40 đã được tiến hành. Laccase sinh tổng hợp bởi chủng nấm FBV40 có

khả năng loại được các màu hoạt tính thương mại hiện đang được sử dụng để nhuộm

vài may quân trang cho quân đội, kết quả được trình bày ở Bảng 3.9 và Hình 3.22.

Bảng 3.9. Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm và biến động hoạt tính laccase theo thời gian (%)

Hiệu suất loại màu theo thời gian (h)

Màu

Công thức

0 0,19

0,25 0,31

0,5 0,64

0,75 0,83

1 1,27

3,5 2,97

24 3,56

Hoạt tính enzyme (U/l) 24h 0h 42 1000

MT- BES

0,27

0,45

3,79

4,15

5,04

6,76

8,49

1000

54

0,17

0,23

0,52

0,64

1,11

1,89

2,56

1000

48

MY- BES

0,23

0,37

2,51

3,15

3,78

3,98

4,22

1000

62

0,21

0,32

0,55

0,76

2,11

3,89

5,56

1000

36

MR- EBR

0,42 16,66 20,34 40,17 46,52 47,84 55,76

1000

53

MN-

Laccase Laccase+ Vio Laccase Laccase + Vio Laccase Laccase + Vio Laccase

0,59

0,95

1,24

2,13

2,66

2,77

4,06

1000

117

90

Hiệu suất loại màu theo thời gian (h)

Màu

Công thức

Hoạt tính enzyme (U/l) 24h 0h

0

0,25

0,5

0,75

1

3,5

24

FBN

1000

0,35 35,80 51,54 78,05 82,81 84,11 88,11

139

0,11

0,27

0,34

0,69

1,17

2,98

4,02

1000

28

NY- S3R

0,26

5,34

9,78 12,67 18,54 21,45 22,4

1000

52

0,19

0,29

0,57

0,73

1,57

2,14

3,12

1000

32

MY-EG

0,23

1,39

3,11

3,55

3,98

4,18

5,99

1000

61

0,28

0,49

0,77

0,89

1,97

3,24

4,12

1000

45

NY- FN2R

0,53

2,39

3,57

4,95

5,89

6,21

7,09

1000

76

0,22

0,77

0,94

1,44

2,04

2,64

3,89

1000

38

NN-SG

1000

25

0,11 11,72 33,67 50,83 63,15 70,33 77,05

Laccase + Vio Laccase Laccase + Vio Laccase Laccase + Vio Laccase Laccase + Vio Laccase Laccase + Vio

Từ số liệu của phản ứng loại màu thuốc nhuộm thương mại ở Bảng 3.9 cho

thấy, laccase thô của chủng FBV40 được phân lập từ Ba Vì có khả năng loại màu

thuốc nhuộm được sử dụng để nhuộm vải may quân trang cho quân đội với nồng độ

ban đầu là 100 mg/L. Hiệu suất loại màu ở mức độ khác nhau từ 2 đến 88% khi có

mặt ViO, hiệu suất cao nhất là loại màu thuốc nhuộm MN.FBN (đây là màu thuốc

nhuộm chủ yếu để nhuộm vải may quân trang).

C

MT-BES

T

C

T

MY- BES

C

T

MR- EBR

Màu Phổ UV-Vis Sự thay đổi màu thuốc nhuộm

91

C

T

MN- FBN

C

T

NY-S3R

C

MY-EG

T

T

C

NY- FN2R

C

NN-SG

T

Màu Phổ UV-Vis Sự thay đổi màu thuốc nhuộm

Chú thích: C- màu đối chứng;T- màu sau thí nghiệm.

Hình 3.22. Phổ UV-Vis và sự thay đổi màu một số thuốc nhuộm hoạt tính thương mại của Nhà máy X20/TCHC Kết quả nghiên cứu một lần nữa cho thấy laccase thô chủng FBV40 loại

được màu thuốc nhuộm có 2 gốc azo màu xanh lá cây hoặc xanh đen (đây là những

màu được sử dụng chính để nhuộm vải may quân trang cho quân đội hiện nay) với

hiệu suất cao. Đối với những màu azo gốc đơn màu vàng, đỏ hoặc xanh da trời,

laccase thô từ chủng FBV40 loại màu kém hơn rất nhiều (Hình 3.22).

Theo nghiên cứu của Nikhil Bhatt và cộng sự, khi sử dụng 9 chủng trong tập

đoàn HN1 đã loại được 83,89% đối với màu Reactive Blue 222 100 mg/L (RB 222,

MN.FBN) sau 15 h nuôi lắc [98]. Đối với màu thuốc nhuộm RB 222 bằng phản ứng

92

fenton màu đã được loại gần 90% và tăng lên tới 96,88% và hiệu suất loại màu là

95,23% sau khi xử lý hiếu khí bằng 2 chủng nấm đảm P. ostreatus IBL-02 và P.

chrysosporium IBL-03 [141]. Khi nghiên cứu khả năng loại màu của laccase tinh

sạch rLac15 có hoạt tính 20 U/L từ chủng vi khuẩn phân lập từ nước biển khi có

mặt của methylsyringate làm CGK, ở 45oC, pH 8,5 trong 1 h thì loại được 93% màu

thuốc nhuộm NN.SG/RB 194 [42].

So sánh với kết quả công bố liệt kê trên với số liệu thu được của luận án này

thấy laccase thô từ chủng Rigidoporus sp. FBV40 có hiệu suất loại màu tương

đương với khi sử dụng hỗn hợp chủng và chỉ kém hơn khi sử dụng phương pháp

hóa học, đây là kết quả đầu tiên khảo sát về khả năng loại màu bởi laccase thô của

chủng nấm thuộc chi Rigidoporus đối với màu thuốc nhuộm để nhuộn vải may quân

trang trong quân đội Việt Nam.

Bên cạnh việc nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm, sự biến động

hoạt tính laccase cũng được xác định để đánh giá mức độ giảm hoạt tính và độ bền

của laccase, đây là một yếu tố rất quan trọng khi tính toán tính khả thi của công

nghệ. Sau 24 giờ, hoạt tính laccase thô còn lại từ 2,5 % (25 U/L loại màu thuốc

nhuộm NN-SG) đến 13,5 % (139 U/L loại màu thuốc nhuộm MN.FBN).

Theo nghiên cứu của Mei Rong Hu và đtg, 65% hoạt tính laccase vẫn còn

trong quá trình loại màu RBBR và Indigo carmine, trong khi đó hoạt tính laccase

vẫn còn 35% khi loại màu Azure A và Acid red sau 12 h phản ứng. Khi có mặt chất

gắn kết thymol và ViO thì laccase giảm hoạt tính ít hơn [90], hiện nay, nhiều công

bố quốc tế và trong nước khi nghiên cứu về lacccase trong loại màu thuốc nhuộm

cho kết quả tương tự. Như vậy, với các loại thuốc nhuộm, chất gắn kết và nguồn

gốc laccase khác nhau có những ảnh hưởng ở mức độ không giống nhau lên hoạt

tính laccase trong quá trình loại màu.

Kết quả thu được của nghiên cứu này đã bổ sung thêm minh chứng cho nhận

định trên. Để làm sáng tỏ khả năng loại màu với từng loại thuốc nhuộm hoạt tính

thương mại được sử dụng nhuộm vải quân trang, cần có phải có thêm nhiều nghiên

cứu sâu sắc hơn nữa. Giải pháp sử dụng tổ hợp của laccase được sinh tổng hợp bởi

ít nhất 3-10 chủng nấm đảm khác nhau kết hợp với cố định lên chất mang phù hợp

cũng có thể là lựa chọn của nhóm nghiên cứu trong tương lai.

93

Đánh giá ảnh hưởng của ViO và thuốc nhuộm ở các nồng độ khác nhau lên

khả năng loại màu của laccase chủng FBV40 đã được tiến hành. Trong đó, ảnh

hưởng của nồng độ CGK lên khả năng loại màu của laccase thô chủng FBV40 đối

120

100

Vio 0µM

)

%

Vio 100µM

80

Vio 200µM

( u à m

60

Vio 400µM

Vio 600µM

i ạ o l g n ă n

40

ả h K

Vio 800µM

Vio 1000µM

20

0

0

0,25

0,5

1,75

3,3

24

1,0 Thời gian (h)

với thuốc nhuộm đại diện MN.FBN được trình bày ở Hình 3.23.

Hình 3.23. Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt ViO ở các nồng độ khác nhau

Hiệu suất loại màu MN.FBN tỷ lệ thuận với nồng độ ViO, tuy nhiên hiệu suất

loại màu tăng lên không đáng kể khi nồng độ ViO là 600, 800 và 1000 µM tương ứng

với 90,58%, 91,52% và 92,17% sau 3,5h phản ứng. Nồng độ CGK ViO phù hợp nhất

là 600 μM để loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng laccase thô từ chủng FBV40.

Kết quả của nghiên cứu thu được tương ứng với kết quả đã được công bố

về loại màu Indigo carmine bởi laccase chủng Pichia pastoris GS115 khi có mặt

ViO với nồng độ 200 µM đã làm tăng hiệu suất thêm 70% và ViO là chất gắn kết

mang lại hiệu quả tốt nhất trong loại các màu thuốc nhuộm RBBR, acid red và

CBB [90]. Theo Susana và đtg, khi nghiên cứu ảnh hưởng của các chất gắn kết

lên khả năng khả năng loại màu thuốc nhuộm của laccase từ loài P.

cinnabarinus, số liệu thực nghiệm chỉ ra rằng khi có mặt của các chất gắn kết

như acetosyringone và syringaldehyde thì hiệu suất loại màu tăng lên trên 80%,

tuy nhiên nếu sử dụng chất gắn kết là HBT hoặc ViO thì để đạt hiệu suất loại

màu tương tự thì nồng độ của chất gắn kết bổ sung phải thêm 250 μM. Khi có

mặt ViO, 4 màu thuốc nhuộm RBBR, anthraquinon, coomassie brilliant blue G-

250, triphenylmethane đã bị loại tới 70% bởi laccase [148].

94

Các kết quả nghiên cứu thu được và dữ liệu đã công bố được liệt kê trên cho

thấy khả năng loại màu của hệ laccase có liên quan đến bản chất hóa học của chất gắn

kết, cấu trúc phân tử của thuốc nhuộm và điều kiện tiến hành phản ứng loại màu.

b) Lựa chọn thuốc nhuộm hoạt tính có khả năng loại màu cao nhất

Với mục tiêu nghiên cứu của luận án là nghiên cứu khả năng loại màu một

loại thuốc nhuộm hoạt tính thương mại được sử dụng trong nhuộm vải may quân

trang và với hiệu suất loại màu thuốc nhuộm MN.FBN và NN.SG (Bảng 3.9) đều

đạt cao nhất trong số 8 thuốc nhuộm khảo sát, hơn nữa chúng đều là thuốc nhuộm

có 2 gốc azo chỉ khác nhau khối lượng phân tử và công thức cấu tạo khác nhau. Để

thực hiện mục tiêu của luận án, nghiên cứu lựa chọn một loại thuốc nhuộm có khả

năng bị loại màu nhiều nhất đã được tiến hành. Ở điều kiện xử lý loại màu, với nồng

độ thuốc nhuộm ban đầu 100 mg/L, ở pH 4, có mặt của CGK là ViO và hoạt tính

laccase ban đầu là 1.000 U/L, kết quả được trình bày ở Hình 3.24, Hình 3.25.

Khả năng loại màu của laccase thô từ FBV40 đối với thuốc nhuộm MN.FBN

cao hơn với thuốc nhuộm NN.SG ở tất cả các nồng độ CGK, thời gian loại màu và

suy giảm hoạt tính laccase. Ở nồng độ 500 µM ViO, laccase thô từ chủng FBV40

loại được 93% màu MN.FBN, cao hơn không nhiều so với loại 92% NN.SG. Thời

gian loại màu MN.FBN nhanh hơn đối với loại màu NN.SG. Laccase thô từ FBV40

mất 0,25h để loại 85% màu thuốc nhuộm MN.FBN, trong khi với thuốc nhuộm

NN.SG chỉ loại được 17%. Khi so sánh mức độ giảm hoạt tính laccase trong quá

trình loại màu, kết quả thu được cho thấy, mức độ giảm hoạt tính laccase khi loại

màu thuốc nhuộm MN.FBN thấp hơn NN.SG. Tới 63% hoạt tính laccase đã bị

giảm khi loại màu thuốc nhuộm MN.FBN và 91% đối với NN.SG sau 3,3 và 4h. Từ

những số liệu thu được cho thấy hiệu suất loại màu thuốc nhuộm MN.FBN cao hơn

NN.SG bởi laccase thô từ FBV40 cho nên MN.FBN được tiếp tục chọn để nghiên

cứu trong những nội dung tiếp theo.

95

100

100

90

90

)

80

80

)

%

%

70

70

60

60

( u à m

50

50

40

40

i ạ o l n g ă n

30

30

ả h K

( h n í t t ạ o h m ả i g ộ đ c ứ M

20

20

10

10

0

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Thời điểm

LM 0 µM

LM 50 µM

HT 50 µM

LM 100 µM

HT 100 µM

LM 200 µM

LM 300 µM

LM 400 µM

LM 500 µM

HT 0 µM

HT 200 µM

HT 300 µM

HT 400 µM

HT 500 µM

100

100

90

90

80

80

70

70

)

%

)

60

60

%

50

50

( u à m

40

40

30

30

i ạ o l n g ă n

20

20

ả h K

10

10

( h n í t t ạ o h m ả i g ộ đ c ứ M

0

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Thời điểm

LM 0 µM

LM 50 µM

HT 50 µM

LM 100 µM

HT 100 µM

LM 200 µM

HT 200 µM

LM 300 µM

LM 400 µM

LM 500 µM

HT 0 µM

HT 300 µM

HT 400 µM

HT 500 µM

Hình 3.24. Khả năng loại màu và biến động của hoạt tính laccase theo thời gian đối với thuốc nhuộm MN.FBN (LM- loại màu, HT- hoạt tính)

Hình 3.25. Khả năng loại màu và sự biến động hoạt tính laccase theo thời gian đối với thuốc nhuộm NN.SG (LM- loại màu, HT- hoạt tính) c) Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng laccase thô với sự có mặt

của D-glucose

Trong quá trình nghiên cứu của mình, nghiên cứu sinh nhận thấy D-glucose

có vai trò làm tăng quá trình sinh tổng hợp laccase của chủng nấm FBV40 trong quá

trình nuôi cấy. Trên cơ sở đó, nghiên cứu sinh tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của

D-glucose tới khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bởi laccase thô từ FBV40.

Kết quả được trình bày ở Hình 3.26. Sau 138 h phản ứng, laccase thô từ chủng FBV40

đã loại được 99% và 98% tương ứng với sự có mặt của 0,1g và 0,05g D-glucose màu

MN.FBN với nồng độ ban đầu 50 mg/L. Sự phụ thuộc giữa hiệu suất loại màu với hàm

96

lượng D-glucose được bổ sung vào phản ứng đã được phát hiện. Khi không có mặt D-

glucose khả năng loại màu MN.FBN của laccase thô từ chủng FBV40 chỉ đạt 44% trong

cùng thời gian. Hoạt tính laccase giảm nhanh khi hàm lượng D-glucose tăng. Như vậy,

nồng độ D-glucose có mối quan hệ tỷ lệ nghịch với hoạt tính lacccase và tỷ lệ thuận với

hiệu suất loại màu thuốc nhuộm MN.FBN của laccase thô chủng FBV40. Khi tăng hàm

1200

100

1000

80

)

800

/

%

) L U

60

( u à m

600

( h n í t t ạ o H

40

400

i ạ o l t ấ u s u ệ i H

20

200

0

0

7

0

1

2

3

4

5

6

Thời điểm

LM Dg 1

HT Dg 2

HT Dg 3

HT Dg 4

LM Dg 2

LM Dg 3

LM Dg4

lượng D-glucose, khả năng loại màu tăng và hoạt tính laccase giảm.

Hình 3.26. Khả năng loại màu MN.FBN và sự biến động hoạt tính laccase theo thời gian khi có mặt D-glucose (LM- loại màu, HT- hoạt tính)

Hiện nay, chưa có nhiều công bố về vai trò của D-glucose với khả năng loại

màu thuốc nhuộm của laccase. Kết quả của nghiên cứu này là bước đầu để thiết kế

những nghiên cứu cơ bản để tìm hiểu rõ hơn về mối quan hệ này.

3.3.1.3. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi Lac1 tinh sạch

Xác định màu hoạt tính thương mại sử dụng trong công nghiệp quốc

phòng có khả năng bị loại màu cao nhất bởi laccase thô từ FBV40, tiếp theo khảo

sát enzyme Lac1 tinh sạch từ FBV40 có mức độ loại màu như thế nào đã được

tiến hành. Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm MN.FBN và sự biến động hoạt tính

laccase theo thời gian phản ứng được trình bày ở Hình 3.27.

Sau 24h phản ứng, khi có mặt 500 µM ViO, Lac1 từ FBV40 đã loại được

91,14% màu thuốc nhuộm MN.FBN với nồng độ ban đầu là 50 mg/L. Hiệu suất loại

màu không có sự khác biệt nhiều ở các nồng độ ViO lần lượt là 200, 300, 400, 500

µM và giao động trong khoảng 88 đến trên 91%. Số liệu thực nghiệm thu được

không khác nhau xa với khi sử dụng laccase thô từ FBV40 ở cùng các điều kiện

97

phản ứng. Vai trò tiềm năng cao và khả năng của laccase từ chủng FBV40 trong

loại màu thuốc nhuộm nói chung và các màu hoạt tính thương mại của Nhà máy

100

160

80

)

%

120

/

60

) L U

( u à m

80

40

i ạ o l g n ă n

( h n í t t ạ o H

ả h K

40

20

0

0

0

1

2

3

6

7

8

4

5

9

Thời điểm

LM 0 µM

LM 100 µM

LM 200 µM

LM 300 µM

LM 400 µM

LM 500 µM

HT 0 µM

HT 100 µM

HT 200 µM

HT 300 µM

HT 400 µM

HT 500 µM

X20/Tổng cục Hậu cần nói riêng nhận được từ nội dung nghiên cứu này rất rõ ràng.

Hình 3.27. Hiệu suất loại màu MN.FBN bởi Lac1 tinh sạch (LM- loại màu,

HT- hoạt tính)

3.3.1.4. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi laccase-like tinh sạch của

chủng xạ khuẩn XKBiR929

Bên cạnh nghiên cứu đặc tính và khả năng sinh tổng hợp laccase-like của

chủng xạ khuẩn phân lập được. Để bước đầu đánh giá khả năng của laccase-like

trong phân hủy, chuyển hóa các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm, thì nghiên cứu loại

màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại MN.FBN cũng được tiến hành ở pH 1 với

90

80

70

)

%

60

( u à m

50

40

30

i ạ o l t ấ u s u ệ i H

20

VIO HBT Ez

10

0

0

1/6

1/3

1/2

2/3

5/6

1

2

3

4

5

6

20

21

22

23

24

Thời gian (h)

sự có mặt của các chất gắn kết ViO và HBT (Hình 3.28).

Hình 3.28. Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng laccase-like của chủng XKBiR929

98

Ở pH 1, laccase-like tinh sạch từ chủng XKBiR929 khi có mặt chất gắn kết

ViO đã loại được 76,3% màu MN.FBN sau 23h, nhưng chỉ sau 5 h laccase-like đã

loại được 75,8% với nồng độ thuốc nhuộm ban đầu là 100 mg/L. Trong khi đó, nếu

không có CGK thì hiệu suất loại màu trong cùng khoảng thời gian đạt 54,3% sau

23h và sau 5h đạt được 53,8%. Khi sử dụng CGK khác là HBT, khả năng loại màu

sau 23h đạt 54,7% và sau 5h đạt 54,0%. Như vậy, có thể thấy laccase-like chủng

XKBiR929 có thể loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN ở điều kiện môi trường

pH thấp và phản ứng loại màu xảy ra rất nhanh. Vai trò của CGK ViO đối với

laccase-like chủng XKBiR929 trong loại màu thuốc nhuộm là không lớn (chỉ tăng

hiệu suất thêm được 22%), với CGK HBT chỉ làm tăng hiệu suất loại màu không

đáng kể (0,2 đến 0,4%). Đây là kết quả đầu tiên đánh giá khả năng loại màu thuốc

nhuộm của laccase-like trong điều kiện môi trường pH thấp. Kết quả nghiên cứu đã

mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng laccase-like trong xử lý loại màu thuốc nhuộm

hoặc các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm khác trong điều kiện môi trường pH thấp.

3.3.2. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi Rigidoporus sp.FBV40

3.3.2.1. Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng để nhuộm vải

may quân trang

Hiện nay có một số quy trình có thể áp dụng để loại màu thuốc nhuộm hoạt

tính như sử dụng nấm đảm dạng sợi tạo nên màng sinh học mà ở đó nấm đảm hay

nấm sợi tạo ra các dạng sợi myceli sinh tổng hợp enzyme ngoại bào có vai trò loại

màu thuốc nhuộm khi cho nước thải chảy qua; sử dụng laccase thô được tạo ra từ các

loài VSV khác nhau để loại màu (thường dùng với các dạng reactor); cố định laccase

cùng với các enzyme đồng hành khác do nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn sinh tổng hợp có

hoạt tính cao và luôn ở dạng hỗn hợp tăng hiệu suất loại màu. Trong nghiên cứu này,

nuôi cấy chủng FBV40 trên môi trường chứa 100 mg/L thuốc nhuộm đã được sử

dụng để nuôi cấy đồng hành cùng với thuốc nhuộm để đánh giá khả năng loại màu

thuốc nhuộm hoạt tính được sử dụng ở Nhà máy X20 cũng như đánh giá khả năng

sinh tổng hợp laccase. Kết quả được trình bày ở Hình 3.29.

Chủng FBV40 có hiệu suất loại màu thuốc nhuộm MN.FBN cao nhất trên

99% sau 7 ngày nuôi. Đối với màu thuốc nhuộm MY.EG và MY.BES hiệu suất loại

màu thuốc nhuộm rất thấp chỉ xác định được từ 6 đến 8%. Quan sát quả thể nấm sinh

trưởng trong dung dịch màu thuốc nhuộm MY.EG và MY.BES thấy có sự hấp phụ

99

màu lên quả thể nấm, ngược lại đối với màu thuốc nhuộm MN.FBN không thấy sự

hấp phụ nêu trên. Từ hiện tượng trên có thể nhận định chủng FBV40 loại màu thuốc

nhuộm MN.FBN bằng cơ chế phân hủy, chuyển hóa nên khả năng loại màu đạt hiệu

suất rất cao trong khi với màu thuốc nhuộm MY.EG và MY.BES chỉ là sự hấp phụ

(Hình 3.31). Khả năng sinh tổng hợp laccase trong quá trình loại màu đã được xác

định và kết quả được trình bày ở Hình 3.29.

Từ kết quả sinh tổng hợp laccase chủng FBV40 cho thấy, hoạt tính laccase khi nuôi

cấy chủng với thuốc nhuộm đều cao hơn khi không có thuốc nhuộm. Cụ thể, hoạt tính

laccase khi chủng FBV40 được nuôi với thuốc nhuộm MN.FBN đạt cao nhất là 6.232 U/L

sau 7 ngày so với 5.503 U/L sau 8 ngày nuôi cấy khi không có thuốc nhuộm (tăng

13,24%). Với các thuốc nhuộm MY.EG và MY.BES hoạt tính laccase thu được cao nhất

lần lượt là 6.444 và 5.986 U/L sau 8 ngày tăng 17,1 và 8,8% so với khi không có thuốc

nhuộm. Kết quả thu nhận được cho thấy thuốc nhuộm hoạt tính mà Công ty 20, Tổng Cục

Công nghiệp Quốc phòng đang sử dụng có thể đóng vai trò là chất cảm ứng làm gia tăng

hoạt tính laccase của chủng FBV40 trong quá trình sinh trưởng. Tuy nhiên, nấm FBV40

cũng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác và chúng cũng có thể tham gia vào quá

trình phân hủy, loại màu thuốc nhuộm nhưng trong luận án này chưa có điều kiện để đánh

giá chi tiết. Chủng FBV40 có vai trò chính trong quá trình loại màu vì sau một ngày nuôi

cấy chủng đã loại được 79,1% trong khi hoạt tính laccase chỉ đạt 371 U/L, những ngày

nuôi cấy tiếp theo hiệu suất loại màu tăng và hoạt tính laccase cũng tăng. Theo các số liệu

đã thu nhận được trong các nghiên cứu trước, khi hiệu suất loại màu thuốc nhuộm

100

8000

80

)

6000

%

/

) L U

( u à m

60

4000

40

i ạ o l g n ă n

( h n í t t ạ o H

2000

ả h K

20

MN.FBN bằng laccase thô từ chủng FBV40 tăng lên thì hoạt tính laccase giảm.

0

0

0

2

4

6

8

10

Thời điểm

LM MY.EG

LM MY.BES

LM MN.FBN

HT MY.EG

HT MY.BES

HT MN.FBN

HT D-glu

HT Control

Hình 3.29. Khả năng loại màu và sự biến động hoạt tính laccase theo thời gian trong loại màu thuốc nhuộm MY.EG, MY. BES, loại MN.FBN (LM- màu, HT- hoạt tính)

100

0.8

0.8

0.7

0.65

0.6

0.5

0.5

s b A

s b A

0.4

0.35

0.3

0.2

0.2

300

400

500

600

700

800

300

400

500

700

800

600

nm

nm

Hình 3.30. Phổ UV-Vis của MN.FBN trong môi trường sau 1 ngày (A) và sau 4 ngày (B) nuôi cấy với FBV40

(A) (B)

Hình 3.31. Sự thay đổi màu MN.FBN trong môi trường nuôi cấy với FBV40 sau 1 ngày (A) và sau 4 ngày (B) Một số nghiên cứu của các tác giả trên thế giới và trong nước đã chứng minh,

các hợp chất vòng thơm với cấu trúc giống lignin như xylidine, ferulic acid và

veratric acid được bổ sung trong quá trình nuôi cấy các chủng nấm có khả năng làm

gia tăng quá trình sinh tổng hợp laccase [174, 124]. Gần đây các nhà khoa học đã

chỉ ra, trong quá trình phân huỷ lignin bởi laccase từ chủng nấm có khả năng tạo ra

các các hợp chất vòng thơm, các hợp chất này có thể làm gia tăng quá trình sinh

tổng hợp laccase [150]. Veratryl (3,4-dimethoxybenzyl) alcohol là hợp chất vòng

thơm được biết đến với vai trò quan trọng trong quá trình phân huỷ lignin. Sự bổ

sung chất này vào môi trường nuôi cấy của nhiều chủng nấm trắng đã làm tăng quá

trình sinh tổng hợp laccase [41]. Hoạt tính laccase cao nhất thu được khi nghiên cứu

đối với loài Botryosphaeria rhodina khi bổ sung veratryl alcohol vào môi trường

nuôi cấy khi quá trình nuôi cấy bắt đầu. Với loài R. lignosus hoạt tính laccase sinh ra

cao nhất khi bổ sung phenylhydrazine [14]. Trong nghiên cứu của Elisashvili và

Kachlishvili, TNT (2,4,6-trinitrotoluene) được bổ sung trong môi trường nuôi cấy với

nồng độ thích hợp làm tăng khả năng sinh tổng hợp laccase của loài Cerrena unicolor

và hoạt tính tăng lên gấp 4 lần so với môi trường nuôi cấy không có TNT [65].

Xylidine được chứng minh là có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp laccase đối

101

với hai loài Trametes villosa [174] và Trametes versicolor [136]. Sự bổ sung veratryl

alcohol trong môi trường nuôi cấy của nhiều chủng nấm trắng và kết quả cuối cùng là

đã làm tăng khả năng sinh tổng hợp laccase [6, 136].

Như vậy, với những minh chứng thực nghiệm thu được càng làm sáng tỏ khả

năng của thuốc nhuộm MN.FBN như là tác nhân làm tăng khả năng sinh tổng hợp

laccase ở chủng FBV40. Bên cạnh đó, khả năng loại màu bởi chủng nấm đảm này

rất cao tới 99% sau 7 ngày nuôi cấy và không có sự hấp phụ màu vào trong quả thể

nấm. Kết quả thu được này rất mới, có ý nghĩa để lựa chọn đúng trong nghiên cứu

công nghệ loại màu thuốc nhuộm tổng hợp nói chung và thuốc nhuộm hoạt tính

thương mại nói riêng ở qui mô công nghiệp.

3.3.2.2. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN ở các nồng độ khác nhau

Để tìm hiểu rõ hơn khả năng của chủng FBV40 trong việc loại màu thuốc

nhuộm MN.FBN, nghiên cứu loại màu ở các nồng độ thuốc nhuộm khác nhau đã

được tiến hành. Kết quả loại màu và sự thay đổi hoạt tính laccase thô sinh tổng hợp

trong quá trình nghiên cứu được trình bày ở Hình 3.32 và Hình 3.33.

Sau 1 đến 3 ngày nuôi cấy chủng FBV40 loại màu thuốc nhuộm MN.FBN có

nồng độ 100 mg/L đạt từ 52,7 % đến 97,3 %, trong khi ở nồng độ thuốc nhuộm 50 và

200 mg/L thì hiệu suất loại màu đạt tương ứng từ 49,8 % đến 94,3% và 35,2 % đến

97,1 %. Tương ứng, hoạt tính laccase được sinh tổng hợp trong quá trình nuôi cấy

chứa 100 mg/L thuốc nhuộm là 1.502 U/L sau 4 ngày. Như vậy, chủng nấm FBV40

100

3000

2500

80

)

%

2000

/

60

) L U

( u à m

1500

40

i ạ o l n g ă n

( h n í t t ạ o H

1000

ả h K

20

500

0

0

0

1

2

3

4

5

Thời điểm

LM 50 mg/L HT 50 mg/L

LM 100 mg/L HT 100 mg/L

LM 200 mg/L HT 200 mg/L

có khả năng loại màu cao nhất trong môi trường có nồng độ thuốc nhuộm 100 mg/l.

Hình 3.32. Hiệu suất loại MN.FBN và biến động hoạt tính laccase của FBV40 (LM- loại màu, HT- hoạt tính)

102

(A) (B) (C)

Hình 3.33. Sự thay đổi màu MN.FBN bằng chủng FBV40 ở các nồng độ thuốc nhuộm 50, 100 và 200 mg/L sau 1 ngày (A), 2 ngày (B) và sau 3 ngày (C)

3.3.2.3. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt D-glucose bằng nuôi cấy FBV40

Để tiếp tục nghiên cứu vai trò của D-glucose trong quá trình loại màu thuốc

nhuộm MN.FBN bằng chủng FBV40. Môi trường nuôi cấy sử dụng nước cất và có

bổ sung D-glucose với hàm lượng từ 0 đến 3 g/100 ml và 100 mg/L thuốc nhuộm

MN.FBN. Mức độ loại màu bởi chủng FBV40 được trình bày ở Hình 3.34. Sau 1

ngày nuôi cấy thì hiệu suất loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bởi FBV40 đạt rất cao từ

31 đến 97%, đối với môi trường không có D-glucose thì hiệu suất chỉ đạt 8%. Sau 5

ngày nuôi cấy thì hiệu suất loại màu đạt cao nhất đạt gần 100% ở 0,5 g/100 ml D-

glucose. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi hàm lượng D-glucose tăng từ 0,1 g/100 ml

đến 2 g/100 ml môi trường thì hiệu suất loại màu giảm đi sau 1 đến 2 ngày nuôi cấy.

Sự biến động hoạt tính laccase sinh ra bởi FBV40 cho thấy, khi không bổ

sung D-glucose hoạt tính laccase giảm không đáng kể trong quá trình nuôi cấy, sau

11 ngày hoạt tính vẫn còn 121 U/L so với 184,6 U/L (giảm 34,4%). Khi bổ sung D-

glucose vào môi trường nuôi cấy thì hoạt tính laccase giảm rất nhanh sau 1 ngày

100

200

90

0,0 g

80

)

0,1 g

%

150

70

0,3 g

0,5 g

0,0 g

60

/

( u à m

0,7 g

) L U

0,1 g

50

100

1,0 g

0,3 g

40

2,0 g

0,5 g

(B)

i ạ o l g n ă n

0,7 g

3,0 g

30

(A)

( h n í t t ạ o H

1,0 g

50

ả h K

20

2,0 g

3,0 g

10

0

0

1

2

4

5

7

11

1

2

3

4

5

7

11

3 Thời gian (ngày)

Thời gian (ngày)

nuôi cấy và gần như không thay đổi ở các ngày nuôi cấy tiếp theo.

Hình 3.34. Khả năng loại màu bằng nuôi cấy FBV40 với nồng độ D-glucose khác nhau (A) và sự biến động hoạt tính laccase (B)

Theo một số nghiên cứu, nguồn carbon được sử dụng phổ biến nhất đối với

các chủng nấm trắng là glucose. Ở hàm lượng 10 g/l glucose sẽ tăng cường sự sinh

trưởng và khả năng sinh laccase bởi loài Coriolus versicolor. Đối với loài Trametes

103

versicolor thì hàm lượng glucose cao hơn 20 g/L sẽ sinh tổng hợp laccase cao hơn

[94]. Đối với loài Ganoderma lucidum với 20 g/L glucose đã làm tăng sự sinh

trưởng của hệ sợi, nhưng với hàm lượng 10 g/L thì quá trình sinh tổng hợp laccase

tốt hơn [119]. Hàm lượng glucose tối ưu để sinh tổng hợp laccase ngoại bào ở các

loài Lentinula edodes và Grifola frondosa nuôi cấy trong môi trường lỏng là 10 g/L

[17, 124]. Với 5g/L glucose có trong môi trường lỏng nuôi cấy loài Trametes

gallica là phù hợp để sinh laccase đối với chủng [37].

Dhawan và Kuhad cũng đã công bố, khi bổ sung cồn vào trong môi trường

nuôi cấy đã làm tăng khả năng sinh tổng hợp laccase của loài nấm Trametes

versicolor. Hoạt tính laccase cũng được tăng lên khi sử dụng 2,5-xylidine và

veratryl alcohol. Nguyên nhân của hiện tượng được giả thuyết rằng, khi bổ sung

ethanol vào môi trường nuôi cấy làm giảm khả năng hình thành melanin, khi

melanin ở nồng độ thấp sẽ đóng vai trò như một chất cảm ứng đối với quá trình sinh

tổng hợp laccase còn khi nó ở nồng độ cao sẽ gây ức chế quá trình sinh tổng hợp

laccase [75]. Theo một nghiên cứu khác chứng minh rằng, ethanol đã nâng cao quá

trình sinh tổng hợp laccase loài Pycnoporus cinnabarinus khi được sử dụng như là

nguồn carbon. Các nghiên cứu chi tiết về chủng này đã chỉ ra rằng ethanol đã góp

phần biểu hiện gene ngăn cản các hoạt động phân huỷ protein và đóng vai trò quan

trọng trong việc sinh tổng hợp laccase [92]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hoạt

động của các chất cảm ứng có thể gây độc cho chủng nấm và khả năng sinh tổng

hợp laccase. Tuy nhiên, việc sử dụng các chất cảm ứng có thể ảnh hưởng đến sinh

trưởng của nấm như độ độc của chúng và tốn thêm chi phí [170].

Số liệu thu được của luận án cùng với công bố quốc tế thì D-glucose có thể là

nguồn carbon hoặc là chất cảm ứng hoặc là CGK thích hợp để quá trình loại màu thuốc

nhuộm MN.FBN bởi chủng nấm đảm FBV40 đạt hiệu quả cao hơn.

3.3.2.4. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các loại đường khác nhau

Để tiếp tục đánh giá vai trò của D-glucose trong phản ứng loại màu

MN.FBN bằng chủng FBV40. Môi trường nuôi cấy là nước cất có bổ sung 1 g/L

các loại đường D-glucose, sacharose, manos, lactose và 100 mg/L thuốc nhuộm

MN.FBN. Kết quả được trình bày ở Hình 3.35 và phổ UV-Vis ở Hình 3.36. Khi sử

dụng các loại đường làm nguồn carbon và năng lượng thì D-glucose đạt hiệu suất

loại màu cao nhất là 96% sau 8 ngày nuôi cấy, tiếp đến là lactose đạt 90%,

104

sacharose đạt 87%, mannose là 74% so với đối chứng thì hiệu suất chỉ đạt 28%

sau 9 ngày nuôi cấy.

Bảng 3.10. Biến động hoạt tính laccase trong quá trình loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bởi FBV40 trong môi trường nuôi cấy chứa các loại đường khác nhau

Loại đường

Ko bổ sung D-glucose Sacharose Mannose Lactose

Biến động hoạt tính laccase theo thời gian (U/L) (ngày) 6 127,5 2,0 1,0 2,0 29,2

7 122,0 2,0 1,0 2,0 46,0

3 168,0 9,8 10,0 62,1 15,0

2 133,6 28,2 17,5 71,7 47,0

8 90,0 1,0 1,0 3,0 44,6

1 131,0 128,8 137,1 130,2 130,7

9 74,0 1,0 1,0 2,0 60,9

Theo thời gian, hoạt tính laccase chủng FBV40 giảm nhanh trong môi trường

bổ sung D-glucose, kết quả thu được không có sự khác biệt với kết quả thu được ở

120

200

Ko bổ sung

(A)

(B)

180

D-gluco

100

)

160

Sacharose

%

Mannose

140

80

Lactose

( u à m

120

Ko bổ sung

60

) l /

D-gluco

100

U

Sacharose

80

i ạ o l g n ă n

Mannose

40

Lactose

60

ả h K

( h n í t t ạ o H

20

40

20

0

1

2

3

6

7

8

9

0

1

2

8

9

Thời gian (ngày)

3 7 6 Thời gian (ngày)

nghiên cứu trên (Bảng 3.10).

1

0.75

C1 C2 Mannose Sacharose D-gluco Lactose

0.5

s b A

0.25

0

300

400

500

700

800

900

600

nm

Hình 3.35. Khả năng loại màu MN.FBN bằng FBV40 (A) và hoạt tính laccase (B) theo thời gian trong môi trường nuôi cấy chứa các loại đường khác nhau

Hình 3.36. Phổ UV-Vis của MN.FBN trong môi trường nuôi cấy chứa các loại đường bởi FBV40 sau 4 ngày

105

(B) (C) (A)

Hình 3.37. Sự thay đổi MN.FBN trong môi trường nuôi cấy chứa các loại đường khác nhau với FBV40 sau 2 ngày (A), 3 ngày (B) và sau 7 ngày (C)

Theo D’Souza-Ticlo và đồng tác giả [26], ở hầu hết các loại nguồn carbon như

glucose, fructose, galactose, galacturonic acid, xylose, lactose, sucrose, mannitol,

pectin và inulin loài Botryo sphaeria đều sinh tổng hợp laccase cao trừ trường hợp

nuôi cấy trên môi trường chứa nguồn inulin và galacturonic acid. Trong nghiên cứu

của Revankar và Lele [80] đã chỉ ra rằng hoạt tính laccase cao nhất của chủng

Trametes versicolor MTCC 138 với các nguồn carbon khác nhau như glucose,

fructose, sucrose, lactose, tinh bột và glycerol. Hoạt tính laccase tăng lên gấp 3 lần

khi thay nguồn fructose bằng nguồn glucose và hoạt tính tăng lên 12% khi thay bằng

tinh bột. Hiệu suất loại màu 50 mg/L thuốc nhuộm True Blue bởi loài Aspergillus

niger cao nhất đạt 96,75% khi sử dụng maltose làm nguồn carbon và loài A. flavus

với hiệu suất loại màu cao nhất đạt 97,82% khi sử dụng cao men làm nguồn nitơ [95].

Nguồn sucrose là nguồn carbon phù hợp nhất cho các chủng nấm A. allhabadii và A.

sulphureus loại màu thuốc nhuộm tổng hợp với nồng độ 200 mg/L là 95,13% và

93,01% [101]. Parmar và đtg khi nghiên cứu hiệu suất loại màu với nồng độ ban đầu

100 - 120 mg/L của chủng Aspergillus khi môi trường chứa 1% glucose, sucrose đạt

hiệu suất loại màu 95 đến 98% sau 48 đến 72h nuôi cấy [116]. Loài Trametes

versicolor hiệu suất loại màu đạt 90% đối với 125 mg/L thuốc nhuộm Reactive Blue

4 trong môi trường chứa 3% glucose sau 384 h [176]. Khi nghiên cứu tổ hợp 4 loài A.

flavus, A.niger, A.oryzae và A. terrus để loại màu thuốc nhuộm Orange M2R, hiệu

suất đạt 89,35%, 83,08% trong môi trường lần lượt chứa sucrose và D-glucose. Riêng

loài A.niger loại màu đạt 81,37% trong môi trường chứa sucrose [130].

So sánh với kết quả thu được của luận án, cho thấy chủng FBV40 có khả

năng cao trong loại màu thuốc nhuộm hoạt tính khi có mặt các nguồn carbon

khác nhau. Một lần nữa các nghiên cứu trình bày trong luận án này khẳng định

rõ ràng về vai trò của nguồn carbon phù hợp nói chung cũng như chứng minh vai

trò của D-glucose trong phản ứng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi

chính chủng nấm đảm FBV40 trong môi trường nuôi cấy. Minh chứng thu dược

106

là cơ sở vững chắc để sử dụng chủng nấm này cố định lên vật liệu không phân

hủy sinh học để xử lý loại màu thuốc nhuộn hoạt tính thương mại ở qui mô công

nghiệp. Vì sau 9 ngày, quy trình công nghệ ứng dụng vi sinh vật sinh enzyme ngoại

bào laccase của chủng nấm Cerrena sp. FBV25 cố định trên vật liệu PP ở nhiệt độ

28-29oC trong hệ thống xử lý của nhà máy nhuộm Nam Định đã loại bỏ màu thuốc

nhuộm hoạt tính được hơn 70,6 % ở quy mô 50±3 m3 [106].

3.3.2.5. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các nguồn nitơ khác nhau

Bên cạnh đánh giá ảnh hưởng của D-glucose và các loại đường khác nhau

đến khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bởi chủng FBV40, khảo sát khả năng

loại màu thuốc nhuộm khi sử dụng các nguồn nitơ vô cơ cũng đã được tiến hành.

Nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4 đã mang đến hiệu suất loại màu thuốc nhuộm

cao nhất là 67%, KNO3 là 57% và NH4NO3 là 54% sau 9 ngày nuôi cấy. Trong môi

trường nuôi cấy không sử dụng nguồn nitơ thì hiệu suất loại màu chỉ đạt 29%.

Hoạt tính laccase đã được xác định theo thời gian nuôi cấy. Trong môi trường

nuôi cấy bổ sung 1g (NH4)2SO4 hoạt tính laccase giảm 85,4%, KNO3 giảm 23,9%,

NH4NO3 là 77,2% còn trong môi trường không bổ sung nguồn nitơ thì hoạt tính

600

80

Không N (NH4)2SO4

KNO3 NH4NO3

Không N (NH4)2SO4

KNO3 NH4NO3

70

500

60

)

%

400

/

) L U

50

( u à m

300

40

30

( h n í t t ạ o H

200

i ạ o l g n ă n

20

100

ả h K

10

0

0

1ngày

3ngày

7ngày

9ngày

1ngày

3ngày

7ngày

9ngày

4ngày Thời gian

4ngày Thời gian

laccase chỉ giảm có 11,7% sau 9 ngày. Kết quả được trình bày cụ thể ở Hình 3.38.

Hình 3.38. Khả năng loại màu MN.FBN bằng chủng FBV 40 (A) và hoạt tính laccase (B) theo thời gian khi sử dụng các hợp nitơ khác nhau

Một số nghiên cứu quốc tế về khả năng loại màu thuốc nhuộm của một số

chủng nấm đã chỉ ra rằng hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp với nồng độ ban

đầu 70 mg/l bởi loài Aspergillus proliferans đạt 76 đến 89% trong 6 ngày xử lý và

đạt 74% đối với nước thải công nghiệp trong 8 ngày. Khả năng loại màu được tăng

lên khi bổ sung nguồn carbon và nitơ [66]. Hiệu suất loại màu Malachite Green

nồng độ 50 mg/l bởi loài Penicillium ochrochloron đạt 93% trong môi trường nuôi

107

cấy Crapeck sau 14h [158]. Chủng nấm Cordyceps militaris MTCC 3936 loại 100%

màu thuốc nhuộm Reactive Black 18 sau 3 ngày, với thuốc nhuộm Reactive Red 31

mất 6 ngày, với thuốc nhuộm Reactive Black 8 mất 7 ngày và cần 11 ngày đối với

màu thuốc nhuộm Reactive Green 19 [67]. Mounguengui và cộng sự đã nghiên cứu

khả năng loại màu của chủng Perreniporia tephropora MUCL 47500 đối với

Reactive Blue 4 và Methyl Orange với nồng độ là 300 mg/L đạt 95,18% và 92,03%

ở 30oC và pH 5,5 [97]. Theo Kirk và đtg, giải thích laccase của chủng nấm trắng

thường được sinh ra ở quá trình trao đổi chất thứ cấp và được kích hoạt trong điều

kiện nghèo nitơ [71]. Nhưng một số nghiên cứu khác chỉ ra rằng nồng độ nitơ

không gây ảnh hưởng đến khả năng sinh hoạt tính laccase [63]. Trong nghiên cứu

của Buswell và đtg [11], laccase được sinh ra ở nồng độ nitơ cao, mặc dù tỷ lệ carbon

với nitơ được cho là quyết định đối với quá trình sinh tổng hợp laccase. Laccase cũng

được sinh tổng hợp sớm hơn khi chủng nấm được nuôi cấy trong môi trường có hàm

lượng nitơ cao. Theo nghiên cứu của Heinzkill và cộng sự [57], hoạt tính laccase cao

hơn khi sử dụng môi trường giàu nitơ hơn. Khi sử dụng pepton gấp 1,8 lần bình

thường làm nguồn nitơ thì quá trình sinh tổng hợp laccase sẽ diễn ra nhanh và có

hoạt tính cao. Revankar và Lele [80] thu được hoạt tính laccase cao nhất đối với

chủng Trametes versicolor MTCC 138 khi sử dụng nguồn nitơ hỗn hợp (cao men).

Kết quả thu được của luận án cho thấy, nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng lớn

tới khả năng loại màu và chúng đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng

hợp laccase của các chủng nấm. Những nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ khác

nhau lên đồng thời khả năng sinh tổng hợp laccase và khả năng loại màu thì hiện

nay có rất ít công bố. Kết quả của nghiên cứu được trình bày ở luận án này là bước

đầu để triển khai những nghiên cứu cơ bản tiếp theo để tìm hiểu rõ hơn về mối quan

hệ này nhằm nâng cao hiệu quả loại màu thuốc nhuộm ở các quy mô khác nhau.

Nghiên cứu này đã bổ sung và khẳng định vai trò của D-glucose và một số

nguồn nitơ vô cơ đối với khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại

được sử dụng trong quân đội. Số liệu thu được từ các nghiên cứu của các tác giả

trong và ngoài nước cho thấy, chủng nấm thuộc chi Rigidoporus được nghiên cứu

trong để tài của nghiên cứu sinh không bị trùng lặp. Nghiên cứu này đã góp thêm

vào cơ sở dữ liệu về nguồn nguyên liệu di truyền từ rừng Ba Vì, Việt Nam cũng như

108

thông tin chi tiết về khả năng loại màu tổng hợp hoạt tính và màu thương mại đang

được sử dụng để nhuộm vải may quân trang cho quân đội.

3.3.3. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase và nấm sinh tổng hợp laccase

3.3.3.1. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase thô

a) Phân hủy dịch chiết đất

Dịch chiết đất là dung dịch được chiết bằng dung môi với đất ô nhiễm nặng chất

diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa, trong đó có chứa các chất diệt cỏ, các đồng loại

của dioxin và các hợp chất hữu cơ khác. Mục đích của các nghiên cứu thuộc chuyên

ngành công nghệ môi trường là tìm được các tác nhân có khả năng phân hủy cao không

chỉ đơn chất ô nhiễm mà bài toán thật là tổ hợp các chất ô nhiễm. Chính vì vậy, DCĐ

được xác định là đối tượng phù hợp để xác định khả năng phân hủy của laccase. Khi

hoạt tính laccase trong mẫu giảm đi 98%, các mẫu nghiên cứu được phân tích bằng

thiết bị GC-MS ở chế độ chạy quét phổ để xác định các thành phần hợp chất có trong

mẫu, trong đó tập trung vào xác định khả năng phân hủy các chất diệt cỏ là 2,4-D và

2,4,5-T. Căn cứ sắc ký đồ, phổ khối lượng đã phân tích và trên cơ sở diện tích pick để

tính toán bán định lượng đối với 2,4-D và 2,4,5-T có trong các mẫu nghiên cứu. Sau 13

ngày, khả năng phân hủy 2,4-D và 2,4,5-T tương ứng đạt 65,46% và 85,71% ở công

thức thí nghiệm EFSE3 (gồm có DCĐ, laccase thô, đệm acetate 20 mM và ViO 10

mM) . Tại các công thức EFSE1 (gồm có DCĐ, laccase thô), EFSE2 (gồm có DCĐ,

laccase thô và đệm acetate 20 mM), EFSE4 (gồm có DCĐ, laccase thô và ViO 10 mM)

không xác định được 2,4-D cũng như 2,4,5-T.

Mức độ giảm hoạt tính laccase diễn ra nhanh ở công thức thí nghiệm EFSE3,

EFSE4 (Hình 3.39) . Sau 9 ngày, hoạt tính laccase đã giảm 96 - 97%, còn ở công thức thí

nghiệm EFSE1 và EFSE2 hoạt tính giảm từ 64 đến 25%. Như vậy, dựa trên kết quả thu

nhận được có thể xác định sơ bộ laccasae có khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T và vai trò

của chất gắn kết, môi trường (đệm) có ảnh hưởng tới khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4-

D và 2,4,5-T của laccase chủng FBV40. Kết quả thu nhận được là cơ sở để thực hiện các

nghiên cứu tiếp theo nhằm phân tích, đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4-D,

2,4,5-T nói riêng và các đồng loại của dioxin nói chung bởi laccase thô từ chủng FBV40.

109

25,000

20,000

EFSE1

EFSE2

EFSE3

15,000

EFSE4

/

) L U

EFSE5

10,000

( h n í t t ạ o H

5,000

0

13ngày

ban đầu

9ngày Thời gian

Hình 3.39. Hoạt tính laccase theo thời gian xử lý DCĐ

b) Phân huỷ 2,4,5-T tinh khiết

Trên cơ sở kết quả khảo sát mức độ phân hủy DCĐ được trình bày ở trên,

nghiên cứu đánh giá khả năng phân hủy 2,4,5-T tinh khiết với hàm lượng là 2,36

mg trong dung dịch phản ứng chứa 2 ml dịch laccase thô chủng FBV40. Kết quả

được trình bày ở Bảng 3.11.

Bảng 3.11. Khả năng phân hủy 2,4,5-T tinh khiết bằng laccase thô chủng FBV40

Công thức thí nghiệm

Hiệu suất phân hủy 2,4,5-T (%) 98,45 40,55 97,84 EFT1 (2,4,5-T + laccase thô) EFT2 (2,4,5-T + laccase thô + đệm acetate) EFT3 (2,4,5-T + laccase thô + đệm acetate + ViO10 mM)

Ở các công thức nghiên cứu, laccase thô chủng FBV40 đều có khả năng phân

hủy đối với 2,4,5-T ở mức độ khác nhau nằm trong khoảng từ 40,55 đến 98,45%

sau 20 ngày. Trong nghiên cứu này, thành phần của môi trường có bổ sung đệm

acetate 20 mM và CGK ViO 10 mM tương tự với thành phần khi nghiên cứu phân

hủy DCĐ. Kết quả cho thấy sự ảnh hưởng của các thành phần môi trường không

đáng kể tới khả năng phân hủy 2,4,5-T. Cụ thể là ở công thức EFT1 khi không có

mặt đệm và ViO thì khả năng phân hủy của laccase đạt hơn 98%, giá trị này cũng

gần tương tự với kết quả phân hủy 2,4,5-T trong mẫu có đệm và ViO ở công thức

EFT3 là 97,84%. Khi nghiên cứu sự biến động hoạt tính laccase thô theo thời gian ở

các công thức thí nghiệm. Sau 15 ngày, hoạt tính laccase giảm nhanh ở công thức

EFT3 và EFT4 lần lượt là 91 và 87%, trong khi đó ở công thức EFT1 hoạt tính giảm

chậm hơn với 85%. Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng của laccase chủng

FBV40 đã phân hủy 2,4,5-T với hiệu suất cao lên đến 98,45% tương ứng 2,32 mg

đã bị phân hủy sau 20 ngày xử lý (Hình 3.40).

110

100.00

2.500

35,000

80.00

2.00

(B)

(A)

30,000

)

%

60.00

1.500

25,000

/

) g m

(

) L U

20,000

EFHC1

i ạ l

40.00

1.00

n ò c

EFHC2

15,000

2,4,5-T (mg) % phân hủy

EFHC3

g n ợ ư l

( h n í t t ạ o H

20.00

.500

10,000

EFHC4

m à H

( y ủ h n â h p g n ă n n ả h K

5,000

.00

.00

1

2

3

4

5

0

2,4,5-T (mg)

.0365

1.4010

.0420

.0430

2.3565

2 ngày

5 ngày

10 ngày

15 ngày

20 ngày

ban đầu

% phân hủy

98.4511

40.5474

98.2177

98.1753

Thời gian

Hình 3.40. Hàm lượng và hiệu suất phân hủy 2,4,5-T (A), hoạt tính laccase thô theo thời gian (B)

c) Phân huỷ 2,4-D và 2,4,5-T có trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa

Để đánh giá khả năng phân hủy của laccase thô của chủng FBV40 đối với chất

diệt cỏ 2,4-D và 2,4,5-T có trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai.

Nghiên cứu xử lý đã được thực hiện trong 27 ngày, kết quả được trình bày ở Bảng 3.12.

Sau 27 ngày, 2,4-D có trong đất ô nhiễm đã bị phân hủy 49,5% và 2,4,5-T bị phân hủy

37,71% với nồng độ ban đầu trong đất ô nhiễm rất cao tương ứng là 556,92 và 981,89

ppm (Bảng 3.15). Ngoài ra các chất tạo thành như 2,4-DCP và 2,4,5-TCP là các sản

phẩm phân hủy tương ứng của 2,4-D cũng như 2,4,5-T cũng bị laccase thô phân hủy

đáng kể là 100% và 71,16%. Minh chứng này đã khẳng định laccase thô từ chủng

FBV40 đã phân hủy 2,4-D và 2,4,5-T có trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay

Biên Hòa với hiệu suất cao, hàm lượng đã bị phân hủy lần lượt là 275,65 mg/kg và

370,26 mg/kg.

Bảng 3.12. Khả năng phân hủy chất diệt cỏ và các chất ô nhiễm khác bằng laccase thô

Chỉ tiêu

Hiệu suất phân hủy (%)

Hàm lượng chất ô nhiễm trong đất đối chứng (mg/kg)

Hàm lượng chất ô nhiễm trong đất sau xử lý (mg/kg)

2,4-D 2,4,5-T 2,4-DCP 2,4,5-TCP

281,27 611,63 0 12,08

556,92 981,89 8,67 41,89

49,50 37,71 100 71,16 Nghiên cứu sự biến động hoạt tính laccase theo thời gian cho thấy, hoạt tính ở

công thức xử lý đất ô nhiễm giảm nhanh theo thời gian, trong khi hoạt tính laccase ở

mẫu đối chứng (không có đất ô nhiễm, chỉ có cát sạch) giảm ít hơn gần 3 lần. Sau 27

ngày hoạt tính laccase ở mẫu xử lý giảm 97% so với 34% ở công thức đối chứng. Như

vậy có thể khẳng định laccase thô từ chủng FBV40 đã tham gia vào phân hủy 2,4-D,

111

2,4,5-T trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa và laccase ở công thức chỉ có mặt cát

14000

1400

(A)

(B)

12000

1200

10000

1000

/

) L U

Control

8000

) g k / g m

800

HCEF40

HCEF40

6000

600

Control

( g n ợ ư l

( h n í t t ạ o H

4000

400

m à H

2000

200

0

0

Ban dau

1ngày

5ngày

15ngày

20 ngày

27ngày

2,4-D

2,4,5-T

2,4-DCP

2,4,5-TCP

10ngày Thời gian

sạch giảm không nhiều sau 27 ngày (Hình 3.41).

Hình 3.41. Hiệu suất phân hủy 2,4,5-T trong đất (A) và sự biến động hoạt tính laccase thô theo thời gian (B)

Theo Ron và đtg, khi sử dụng enzyme horseradish peroxidase (HRP) cùng với

một lượng vừa đủ H2O2 đã phân hủy được tới 90% PCB9 với nồng độ ban đầu và

55% với PCB 52 trong môi trường dịch thể sau thời gian phản ứng là 220 phút. Quá

trình loại clo được xác định là giai đoạn đầu của quá trình phân hủy sinh học PCB,

các chất trao đổi được tạo ra là các chlorinated hydroxybiphenyls, benzoic acids,

1,10-biphenyl và các đồng loại chlorinated biphenyl với nồng độ cao. Phân hủy sinh

học PCB 9 bằng loài nấm đảm trắng Trametes multicolor diễn ra trong 4 tuần và đã

loại bỏ được hơn 80%. Các chất trao đổi được tạo ra là dichlorobenzenes,

chlorophenols và alkylated benzenes, các chất này không giống với các chất được tạo

ra khi sử dụng HRP, như vậy chứng tỏ các quá trình phân hủy diễn ra không giống

nhau [131]. Khả năng phân hủy 2,4-DBP, 2,4,6-TBP bởi laccase ở điều kiện bình

thường đã chỉ ra rằng OH-PBDEs (Hydroxylated polybrominated diphenyl ethers)

được tạo thành từ quá trình phân hủy 2,4-DBP và 2,4,6-TBP. Các chất 2′-OH-

BDE68, 2,2′-diOH-BB80 và 1,3,8-TrBDD được chứng minh là các sản phẩm của quá

trình phân hủy 2,4-DBP trong khi 2′-OH-BDE121 và 4′-OH-BDE121 là sản phẩm

của sự phân hủy 2,4,6-TBP. Sự tạo thành các OH-PBDEs gần như là kết quả gắn kết

các gốc bromophenoxy được tạo thành từ quá trình xúc tác oxy hóa của laccase đối

với 2,4-DBP hoặc 2,4,6-TBP [76]. Nghiên cứu khác về việc sử dụng laccase và hệ

các chất gắn kết trong phân hủy các thuốc diệt cỏ, đó là phân hủy isoproturon bằng

laccase của loài Trametes versicolor và hệ chất gắn kết. Kết quả chỉ ra rằng laccase

chỉ tham gia phân hủy một lượng rất nhỏ isoproturon do trong cấu trúc phân tử của

thuốc diệt cỏ này có nhóm (NH-CO-N(CH3)2), đây là nhóm có lực hút electron rất

112

mạnh. Khi đánh giá khả năng phân hủy isoproturon với sự có mặt của chất gắn kết là

HBT 0,5 mM, sau 24h đã cho thấy hiệu suất phân hủy lên tới 90%, trong khi nếu sử

dụng 0,5mM ABTS thì hiệu suất phân hủy chỉ là 68,2%.

Hiện nay, chưa thấy có công trình nghiên cứu nào công bố về khả năng phân

hủy chất diệt cỏ 2,4-D và 2,4,5-T trong đất ô nhiễm thực tế bằng laccase từ các chủng

nấm nói chung và các chủng nấm thuộc Rigidoporus nói riêng. Chỉ có một số nghiên

cứu đánh giá phân hủy đối với một số hợp chất hữu cơ khó phân hủy chứa clo ở quy

mô phòng thí nghiệm và phát hiện được các chất trao đổi thứ cấp để tìm ra cơ chế và

con đường phân hủy. Kết quả nghiên cứu của đề tài do nghiên cứu sinh thực hiện sẽ

là tiền đề để định hướng nghiên cứu công nghệ và tiếp tục nghiên cứu cơ bản để tìm

hiểu sâu sắc hơn về vai trò và khả năng của laccase nói chung và laccase chủng

Rigidoporus sp. FBV40 nói riêng trong phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo.

3.3.3.2. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi nấm sinh tổng hợp laccase

a) Phân huỷ 2,4,5-T có trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa

Kết quả nghiên cứu khả quan về khả năng phân hủy 2,4-D và 2,4,5-T có trong

đất ô nhiễm ở sân bay Biên Hòa bởi laccase thô từ chủng FBV40 cho thấy tiềm năng

ứng dụng cao của laccase. Tuy nhiên, để triển khai ứng dụng chủng nấm (living

basidiomycete fungal strain) trong xử lý chất diệt cỏ thì nghiên cứu khả năng phân hủy

chất diệt cỏ bằng chủng nấm đảm FBV40 sinh tổng hợp laccase trên cũng đã được tiến

hành. Trong nghiên cứu này chỉ tập trung đánh giá khả năng phân hủy 2,4,5-T bằng

chủng FBV40. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.13.

Bảng 3.13. Khả năng phân hủy 2,4,5-T trong đất ô nhiễm bởi chủng FBV40

Công thức Hàm lượng 2,4,5-T (mg/kg) Khả năng phân hủy (%)

7,06 Chủng FBV40 Đất ô nhiễm không có nấm 437,5 473,5

Chủng FBV40 có khả năng sinh trưởng và phát triển ở điều kiện đất ô nhiễm hỗn

hợp chất diệt cỏ/dioxin thu thập tại sân bay Biên Hòa. Trong quá trình sinh trưởng, chủng

nấm vẫn có khả năng sinh tổng hợp laccase. Cụ thể, sau 3 ngày nuôi cấy hoạt tính laccse

thô ở mẫu thí nghiệm đạt cao nhất 5.534 U/L và sau đó hoạt tính giảm dần, trong khi ở

mẫu đối chứng (chủng được nuôi trên môi trường TSH1 không bổ sung đất ô nhiễm hỗn

hợp chất diệt cỏ/dioxin) sau 6 ngày nuôi cấy hoạt tính laccase thô cao nhất đạt 66.125 U/L

(Hình 3.42). Trong điều kiện thí nghiệm xử lý với hàm lượng 2,4,5-T cao tới 473,5 mg/kg

113

có trong đất, sau 8 ngày nuôi cấy ở điều kiện lắc 120 vòng/phút và nhiệt độ 30oC, chủng

FBV40 đã phân hủy hơn 7% tương ứng với 36 mg/kg, nếu tính hiệu suất xử lý/ngày thì

FBV40 đã xử lý được 45 µg 2,4,5-T/ngày. Kết quả này cho thấy khi sử dụng chủng nấm

đảm FBV40 sống để xử lý chất diệt cỏ/dioxin thực sự có tiềm năng cao. Đây là kết quả gợi

ý cũng như chứng minh rằng nấm đảm sinh tổng hợp laccase cao như FBV40 và nấm khác

có tiềm năng lớn để xử lý chất diệt cỏ 2,4,5-T nói riêng và các chất đa vòng thơm chứa clo

70000

FBV40.M5

FBV40

60000

Thí nghiệm

50000

/

) L U

40000

(A)

(B)

30000

( h n í t t ạ o H

Đối chứng

20000

10000

0

100

500

600

200

400

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

300 Hàm lượng (mg/kg)

Thời gian (ngày)

nói chung chắc chắn sẽ mang lại hiệu quả tại hiện trường ô nhiễm.

Hình 3.42. Khả năng phân hủy 2,4,5-T trong đất (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase thô theo thời gian (B)

b) Phân huỷ 2,4-D và 2,4,5-T trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa bằng đơn

chủng và hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase

Dựa vào kết quả nghiên cứu đã thực hiện trước đó cho thấy khả năng phân hủy

của đơn chủng vi sinh vật để xử lý ô nhiễm môi trường nói chung và xử lý đất ô nhiễm

chứa chất diệt cỏ/dioxin nói riêng đã cho hiệu suất phân hủy có triển vọng. Tuy nhiên

vẫn phải tiếp tục tìm hiểu và so sánh khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng đơn

chủng cũng như hỗn hợp các chủng nấm. Nghiên cứu này đã được tiến hành song song

và số liệu thực nghiệm được trình bày ở Bảng 3.14 và Hình 3.43.

Bảng 3.14. Khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T trong đất bởi đơn chủng FBV40 và hỗn hợp chủng FBV40, FBD154 và FNBLa1

Công thức thí nghiệm

FBV40/DBH (đơn chủng FBV40 với đất ô nhiễm Biên Hòa) MixF/DBH (hỗn hợp nấm với đất ô nhiễm Biên Hòa) Hiệu suất phân hủy (%) 2,4-D 11,44 56,08 2,4,5-T 12,13 36,06

Hiệu suất phân hủy của đơn chủng FBV40 đối với 2,4-D, 2,4,5-T trong đất ô

nhiễm tại sân bay Biên Hòa lần lượt là 11,44 và 12,13% sau 10 ngày xử lý với hàm

lượng ban đầu lần lượt là 62,95 mg/kg và 63,5 mg/kg. Khi sử dụng hỗn hợp chủng

114

FBV40, FBD154 và FNBLa1 với tỷ lệ 1:1:1 theo thể tích thì hiệu suất phân hủy 2,4-D,

2,4,5-T tăng lên đáng kể lần lượt đạt 56,08 và 36,06%. Sự biến động hoạt tính laccase

thô theo thời gian cho thấy hoạt tính laccase thô của đơn chủng FBV40 đo được là

18.979 U/L, cao hơn hoạt tính laccase của hỗn hợp chủng chỉ là 1.605 U/L (Hình 3.42).

Minh chứng thực nghiệm này cho thấy sử dụng hỗn hợp nấm để xử lý ô nhiễm môi

trường nói chung và xử lý chất diệt cỏ/dioxin nói riêng có tiềm năng cao và rõ ràng.

Như chúng ta đã biết mỗi loài nấm sinh tổng hợp ra mỗi loại laccase với đặc tính hoạt

động khác nhau cho nên tuy hoạt tính không cao bằng đơn chủng nhưng khả năng

xúc tác oxy hóa hỗn hợp chất diệt cỏ lại thể hiện tiềm năng cao hơn bởi nhiều loại

laccase được tạo ra từ cả nấm đảm và nấm sợi. Đây là cơ sở để tiếp tục các nghiên

cứu cơ bản cũng như công nghệ nhằm tạo ra công nghệ khả thi trong xử lý ô nhiễm

25000

Chủng đơn

FMi.M5

20000

Chủng hỗn hợp

/

15000

% phân hủy 2,4,5-T % phân hủy 2,4-D 2,4,5-T 2,4-D

) L U

(

FBV40.M5

10000

h n í t t ạ o H

(B)

m ệ i h g n í h t g n ủ h C

(A)

5000

M5

0

0

2

10

12

0

10

20

30

40

50

60

70

4 8 6 Thời gian (ngày)

Hàm lượng (mg/kg)

môi trường dựa vào enzyme ngoại bào do chúng sinh ra.

Hình 3.43. Khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T trong đất (A) và sự biến động hoạt tính laccase thô theo thời gian (B)

Có một số nghiên cứu về khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T bởi đơn chủng

và hỗn hợp chủng vi khuẩn trong đất nhưng rất ít tài liệu nói về khả năng phân hủy

sinh học bởi đơn chủng và hỗn hợp chủng nấm đảm sinh tổng hợp enzyme ngoại

bào laccase đối với các chất ô nhiễm này [56].

Theo nghiên cứu của Vroumsia và cộng sự đánh giá tiềm năng phân hủy 2,4-D

và 2,4-DCP bởi một số chủng nấm được phân lập từ đất, từ gỗ mục đã chỉ ra rằng quá

trình phân hủy 2,4-D có sự tương đồng với quá trình phân hủy bởi vi khuẩn [166] với

3 giai đoạn: chậm, tăng tốc và ổn định. Một số chủng nấm phân hủy 2,4-D và MCPA

thông qua sự phân hủy liên kết ether để tạo thành sản phẩm 2,4-DCP và 4-chloro-2-

methylphenol [62,166], tuy nhiên cơ chế phân hủy này ở mức độ không chắc chắn.

Theo nghiên cứu của Faulkner và Woodcock bước đầu tiêu trong quá trình phân hủy

115

2,4-D và MCPA bởi loài nấm sợi Aspergillus niger là thông qua quá trình hydroxyl

hóa clo của vòng thơm và các bước tiếp theo cũng giống như các bước phân hủy bởi

vi sinh vật khác [43]. Theo nghiên cứu của Yadav và Reddy [127, 171] đối với loài

Dichomitus squalens và Phanerochaete chrysosporium phân hủy 2,4-DCP là quá

trình oxy hóa và tách clo để tạo thành chloro-p-benzoquinone và sau đó các quá trình

loại clo, các phản ứng mở vòng được diễn ra, kết quả cuối cùng là tạo thành CO2 H2O

và sinh khối vi sinh vật. Sự khác biệt lớn nhất trong sự phân hủy bởi nấm so với vi

khuẩn là hiệu quả phân hủy của chúng thấp hơn vi khuẩn. Theo nghiên cứu của

Vroumsia và cộng sự đối với 90 chủng nấm phân lập được thì có khoảng 52,2% trong

số chúng là phân hủy được 100 mg/L 2,4-D với hiệu suất trên 10%; 2,2% tổng số

chủng phân hủy 2,4-D (ví dụ hai loài Mortierella isabellina và Aspergillus

penicilloides) với hiệu suất nằm trong khoảng 46 đến 52%; 84,4% số chủng phân hủy

2,4-DCP với hiệu suất trên 10% và 13,3% số chủng có khả năng phân hủy với hiệu

suất 40 đến 65% [166]. Theo nghiên cứu của Itoh và cộng sự khi nghiên cứu khả

năng phân hủy các chủng nấm được phân lập từ 10 mẫu đất bị ô nhiễm 2,4-D và

2,4,5-T ở Việt Nam thì trong số 69 chủng chỉ có 11,6% (8 chủng) phân hủy 2,4-D với

hiệu quả trên 10% và chỉ 1,4% (ví dụ chủng Eupenicillium sp.) phân hủy 2,4-D với

hiệu suất đạt trên 40%. Trong số 8 chủng phân hủy 2,4-D thì có 7 chủng thuộc nhóm

Euroiales, do đó tác giả cho rằng chủng Eupenicillium có khả năng đặc biệt phân hủy

các hợp chất phenoxyalkanoic acid, chất này có nguồn gốc từ chất diệt cỏ chứa dioxin

mà quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh ở Việt Nam [62].

Từ kết quả nghiên cứu phân hủy các chất tương tự hoặc mô phỏng 2,4-D cho

thấy khả năng phân hủy loại chất diệt cỏ này trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở

Việt Nam bởi đơn chủng nấm đảm FBV40 và hỗn hợp chủng nấm trong nghiên cứu

này thể hiện hiệu suất cao hơn so với các công bố quốc tế với đối tượng và điều

kiện tương tự. Trong khi các công bố về khă năng phân hủy 2,4,5-T trong đất ô

nhiễm chất diệt cỏ/dioxin cũng như chất mô phỏng bởi các đại diện thuộc cả nấm

đảm và nấm sợi cho đến thời điểm này còn hạn chế.

c) Phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD bằng đơn chủng và hỗn hợp chủng nấm

sinh tổng hợp laccase

Với bất kỳ nghiên cứu nào về công nghệ xử lý chất diệt cỏ/dioxin được sử dụng

trong chiến tranh ở Việt Nam, ngoài việc nghiên cứu khả năng phân hủy chất diệt cỏ thì

116

bắt buộc phải đánh giá khả năng phân hủy các đồng loại của dioxin, trong số các đồng

loại độc của dioxin thì 2 đồng loại là 2,3,7,8-TCDD và 1,2,3,7,8-PeCDD được Tổ chức

y tế thế giới (WHO) xác định là độc nhất với hệ số qui đổi là 1. Dựa vào kết quả phân

tích của hàng ngàn mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam thì đồng loại 2,3,7,8-

TCDD có độ độc chiếm từ 90 đến hơn 99,3% tổng độ độc của đất nhiễm do chất diệt

cỏ/dioxin do chiến tranh để lại. Như vậy, bài toán xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin

do cuộc chiến tranh hóa học do quân đội Mỹ thực hiện từ năm 1961 đến năm 1971 thật

ra là xử lý đồng loại 2,3,7,8-TCDD là chính. Tuy nhiên tác hại lên con người và động

thực vật thì hỗn hợp của chúng mới hây ra hậu quả nghiêm trọng gấp bội. Dựa trên số

liệu từ nghiên cứu khả năng phân hủy của laccase thô bởi nấm đảm FBV40 đối với

14000

Chủng đơn Hỗn hợp chủng

12000

Hỗn hợp chủng

92.89

10000

/

) L U

8000

(

(B)

6000

h n í t t ạ o H

(A)

4000

Chủng đơn

44.68

2000

0

0

2

4

6

8

10

12

Hiệu suất phân hủy (%)

Thời gian (ngày)

các chất diệt cỏ, cho nên đánh giá khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD đã được tiến hành.

Hình 3.44. Khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD (A) và hoạt tính laccase được sinh tổng hợp theo thời gian (B)

Phương pháp tiến hành thí nghiệm tương tự với nghiên cứu phân hủy 2,4,5-T

thuần khiết. Trong phần này của luận án, nghiên cứu sinh đã đánh giá khả năng phân

hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD thuần khiết bởi đơn chủng FBV40 và hỗn hợp 3 chủng

FBV40, FBD154 và FNBLa1. Kết quả, sau 10 ngày, đơn chủng và hỗn hợp chủng đều

có khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD với hiệu suất lần lượt là 44,68% và 92,89% khi

độ độc ban đầu là 2.000 ng-TEQ/L, như vậy hỗn hợp chủng có tiềm năng phân hủy cao

hơn so với đơn chủng (Bảng 3.15 và Hình 3.44). Sự biến động hoạt tính laccase vẫn

được đánh giá theo thời gian. Đơn chủng FBV40 sinh tổng hợp laccase cao nhất đạt

13.069 U/L sau 6 ngày nuôi cấy, trong khi đó hỗn hợp chủng với hoạt tính laccase

cao nhất chỉ là 3.600 U/L sau 8 ngày nuôi cấy. Minh chứng này chứng tỏ ở môi

trường độc như vậy mà FBV40 vẫn sinh tổng hợp được laccase với hoạt tính rất cao

nhưng hiệu suất phân hủy thấp hơn hỗn hợp 3 chủng mà trong đó có 1 chủng là nấm

sợi. Chắc chắn là laccase được tạo ra từ cả đơn chủng và đa chủng đều đã tham gia

117

vào phân hủy 2,3,7,8-TCDD. Cũng có thể laccase tạo ra từ 3 chủng có khả năng xúc

tác rất khác nhau và đã suy giảm hoạt tính ngay sau khi sinh tổng hợp được để tham

gia phân hủy, chuyển hóa 2,3,7,8-TCDD. Cho nên cần rất nhiều nghiên cứu về cơ chế

phân hủy đồng loại dioxin này thì mới có thể làm rõ được câu hỏi về cơ chế xúc tác.

Số liệu thực nghiệm thu được bước đầu chỉ ra rằng có rất nhiều con đường để

chúng ta có thể tiếp tục nghiên cứu nâng cao hiệu suất xử lý khử độc đất ô nhiễm

chất diệt cỏ/dioxin. Dựa vào số liệu từ nghiên cứu cơ bản này và các kết quả của các

công trình khác có thể sáng tạo nên những công nghệ xử lý chất diệt cỏ chứa dioxin

ở các điều kiện môi trường có sinh thái mini khác nhau và độ độc khác nhau.

Bảng 3.15. Khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD bởi đơn chủng và hỗn hợp chủng

Công thức thí nghiệm

Đơn chủng FBV40 và đồng loại 2,3,7,8-TCDD Hỗn hợp chủng nấm và đồng loại 2,3,7,8-TCDD Hiệu suất phân hủy (%) 44,68 92,89

Các công trình nghiên cứu đã được công bố quốc tế và Việt Nam về nghiên

cứu phân hủy sinh học dioxin cho thấy khả năng loại bỏ chất ô nhiễm có độ độc cao

này cũng có triển vọng.

Nghiên cứu cơ bản thực hiện bởi Takada và đtg đã chứng minh khả năng phân

hủy sinh học các PCDD/F có hàm lượng ban đầu là 50 ng bởi nấm mục trắng P.

Sordida YK-624 khi nuôi cấy trên môi trường nghèo nitơ thì 40 -76% các PCDD và

45-70% PCDF đã bị phân hủy [138].

Phân hủy 2,7-DCDD bởi loài P. chrysosporium đạt gần 50% sau 27 ngày

nuôi cấy trong điều kiện hạn chế nitơ. Trong khi đó loài P. sordida cũng đã được

nghiên cứu với khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ khó phân hủy như PCP và

PAHs, tuy nhiên chưa có công bố nào về việc chủng này có khả năng phân hủy

PCDD và PCDF, mặc dù sự phân hủy đối với tetra tới octa CDD và CDF bởi chủng

này cũng đã được quan sát thấy, nhưng cơ chế trao đổi chất vẫn chưa được làm sáng

tỏ [138]. Khi nghiên cứu khả năng 2 chủng nấm P. chrysosporium sp. 1 và 267 được

phân lập từ tự nhiên thì khả năng phân hủy dioxin trong đất (tính theo độ độc tương

đương là 61,5 pg-TEQ/g) đạt được là 20 đến 90% sau 15 đến 30 ngày, khả năng

phân hủy cao nhất đến 90% đạt được bởi chủng PL1 sau 30 ngày [135].

Một nghiên cứu khác về phân hủy PCDD và PCDF bởi chủng nấm P.

sordida YK-624. Toàn bộ PCDD và PCDF đã bị phân hủy và hiệu suất phân hủy

118

tăng lên khi bổ sung glucose, đối với PCDD, PCDF và HxCDD, HxCDF khả năng

phân hủy đạt tương ứng là 75 và 70%. Khả năng phân hủy thấp nhất đối với PCDD

cụ thể là TCDD là 40% và TCDF là 45% [138]. Khi xác định sự tồn tại của các chất

có trong dung dịch sau khi phân hủy bởi P. sordida YK-624 và P. chrysosporium

IFO31249 thấy rằng thực sự có tồn tại sự phân hủy hỗn hợp tetra đến octa CDD và

CDF. Kết quả nghiên cứu này rất có ý nghĩa khi nhìn nhận tiềm năng của chủng

nấm trắng với quá trình phân hủy dioxin trong môi trường [138].

Kunichika và đtg cũng đã chứng minh sự phân hủy đất nhiễm dioxin bởi nấm

sợi Acremonium sp. Gần đây con đường phân hủy dioxin mới của nấm đảm Cordyceps

sinensis A phân hủy vòng ether đã được nghiên cứu. Nấm này có khả năng phân hủy

DD, 2,3,7-TriCDD và OCDD, sản phẩm phân hủy DD là tạo thành catechol, chất này

sau đó được trao đổi chất tiếp đến cis-cis-muconate; trong khi đó phân hủy 2,3,7-

TriCDD và OCDD tạo thành catechol chứa 1-3 clo và catechol không chứa clo. Tuy

nhiên, các cơ chế phân hủy PCDD/F của chủng nấm kể trên vẫn chưa rõ ràng [100].

Khi nghiên cứu khả năng phân hủy PCDD/F trong đất ô nhiễm, hai loài

nấm G. luteofolius, P.velutina và S. rugosoannulata đã phân hủy được 61 và

70%, ở mẫu đối chứng (không có vi sinh vật) không thấy sự phân hủy PCDD/F.

Sự phân hủy của loài S. rugosoannulata đối với đồng loại 1,2,3,4,6,7,8 HpCDF

là 65% sau 10 đến 12 tuần, trong khi loài G.luteofolius và P. velutina phân hủy

đồng loại trên đạt 74 và 68%. Trong quá trình nghiên cứu đã xác định được sự

hình thành CO2 trong quá trình phân hủy, kết qủa thu được chứng tỏ chủng nấm

nghiên cứu đã sinh trưởng trong quá trình xử lý và đóng vai trò phân hủy

PCDD/F trong đất. Kết quả nghiên cứu đã cung cấp thêm bằng chứng về vai trò

của chủng nấm trong việc phân hủy PCDD/F trong đất [44]. Trong môi trường

lỏng, chủng Trametes versicolor U80 có khả năng phân hủy 2,4,8-TCDF với nồng

độ ban đầu 27 ppm đạt 46,52% sau 30 ngày, khi bổ sung 2,5% glucose và 2%

Tween 80 như là nguồn carbon thì khả năng phân hủy tăng lên đạt 59%. Khi sử

dụng gỗ mục như là nguồn bổ sung liginin thì khả năng phân hủy 2,4,8-TCDF 10

ppm trong đất đạt 46,06% sau 30 ngày nuôi cấy [2]. Rất nhiều nhà khoa học đã có

những nghiên cứu về khả năng phân hủy các hóa chất bởi chủng nấm với cơ chế tạo

thành các gốc tự do. Thực tế, gốc cation dibenzo-p-dioxin đã được phát hiện sau quá

trình oxy hóa bởi enzyme lignin [54]. Con đường phân hủy chính xác của 2,7-DCDD

119

bởi chủng P.chrysosporium đã được Valli et al [159] chứng minh khi bố trí thí

nghiệm với nồng độ DCDD là 25µM trong môi trường nuôi cấy 20ml, kết quả cho

thấy 4-chloro-1,2-benzoquinone và 2-hydroxy-1,4-benzoquinone hình thành là do

sự oxy hóa cắt vòng dioxin của 2,7-DCDD với sự xúc tác của LiP.

Khi sử dụng chế độ phân tích SIM (chế độ chạy quét các phổ khối lượng ion

đặc trưng) trên thiết bị phân tích HRGC-HRMS cho phép xác định mức độ dưới

picrogram của các hợp chất và cũng cho thông tin về cấu trúc và định lượng các chất.

Khi kiểm tra các chất chuyển hóa tương ứng khi phân hủy 2,3,7,8-TCDD và OCDD

bởi chủng P. sordida YK-624. Thí nghiệm này cho thấy sự phân hủy 2,3,7,8-TCDD

tạo ra chất chuyển hóa trung gian là 4,5-dichloro-1,2-benzoquinon và/hoặc 4,5-

dichlorocatechol. Còn khi phân hủy OCDD thì chất chuyển hóa trung gian là

tetrachloro-1,2-benzoquinone và/hoặc tetrachlorocatechol [74].

Các số liệu thu được đã công bố với hiệu suất phân hủy không cao hoặc có thể

phân hủy 100% nhưng hàm lượng ban đầu rất thấp. Chưa có một công trình nào đã

nghiên cứu như cách bố trí thí nghiệm như trong nghiên cứu này vì là nghiên cứu hướng

đích để nâng cao hiệu quả xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin cho nên phải chọn cả 2 đối

tượng là chất diệt cỏ và đồng loại của dioxin. Nghiên cứu không chỉ thực hiện trong

phòng thí nghiệm với 1 đơn chất mà đã khảo sát các chất chính cần xử lý bằng hỗn hợp

các chủng. Mặc dù ở Việt Nam đã thành công trong xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin

bằng phương pháp kích thích vi sinh vật bản địa nhưng còn cách tiếp cận khác như xử lý

bằng tổ hợp của các chủng VSV sinh enzyme ngoại bào như laccase, MnP, LiP và hàng

loạt enzyme nội bào, ngoại bào cho đến nay thì chưa có nghiên cứu nào thực hiện. Việc

nghiên cứu, sử dụng tổ hợp enzyme cũng như hỗn hợp VSV sinh tổng hợp enzyme có

khả năng phân hủy hàng loạt chất ô nhiễm như các đồng loại khác của dioxin trong đó có

đồng loại 2,3,7,8-TCDD, chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T cũng như các chất trao đổi của 2

nhóm chất ô nhiễm trên. Một trong những lý do chúng ta có thể nghĩ đến tính khả thi của

giải pháp là nếu tạo được môi trường thuận lợi về dinh dưỡng và độ ẩm nấm và xạ khuẩn

tạo myceli có thể chui lủi vào đất, trong quá trình sinh trưởng sẽ sinh tổng hợp các loại

enzyme để phân hủy chất ô nhiễm, còn vi khuẩn có lợi thế hoạt động tốt nhất ở trong môi

trường có độ ẩm cao. Đây là 2 yếu tố của công nghệ mà chúng ta cần lưu ý.

Những kết quả nghiên cứu công bố quốc tế về khả năng phân hủy chất diệt cỏ

và các đồng loại của PCDD và PCDF bởi các chủng nấm đảm, nấm sợi bằng đơn và

120

hỗn hợp chủng đã có những bước tiến triển rõ ràng. Tuy nhiên những số liệu phân hủy

chủ yếu tập trung vào các đồng loại ít clo, tổng độ độc trung bình không cao và nồng

độ thử nghiệm thấp và ở điều kiện phòng thí nghiệm.

Còn ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu khác ở chỗ sử dụng dịch chiết từ đất

ô nhiễm nặng, chất diệt cỏ và đồng loại 2,3,7,8-TCDD tinh khiết với hàm lượng cao

hơn, hướng đích rõ ràng và khả năng phân hủy chúng chủ yếu là vi khuẩn, xạ khuẩn và

một số nấm sợi. Chưa có công trình nào công bố nấm đảm từ rừng Việt Nam có khả

năng phân hủy được không chỉ chất diệt cỏ mà còn cả đồng loại dioxin độc nhất là

2,3,7,8-TCDD. Cho nên công trình đã chứng minh được chính bản thân nấm đảm và

khi kết hợp với nấm đảm khác cùng với nấm sợi đều sinh tổng hợp laccase với hoạt

tính cao sẽ có tiềm năng khử độc tốt hơn. Đề tài đã mở ra thêm một cách tiếp cận mới

để cuối cùng chúng ta có thể xử lý khử độc được ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và các

chất hữu cơ clo khác ở trong đất và nước.

121

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Đã lựa chọn chủng FBV40 từ 22 chủng phân lập được từ khu vực rừng

Quốc gia Ba Vì, Hà Nội với hoạt tính laccase thô cao nhất là 107.708U/l trên môi

trường TSH1 sau 8 ngày nuôi cấy. Chủng FBV40 được phân loại thuộc chi

Rigidoporus và tên là Rigidoporus sp. FBV40. Đã phân lập, và phân loại được hai

chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces được định danh là Streptomyces sp.

XKBHN1 và Streptomyces sp. XKBiR929 sinh tổng hợp laccase-like không có bản

chất là protein trong môi trường chứa PAHs, 2,4-D, 2,4,5-T và DCĐ.

2. Đã tinh sạch và xác định đặc tính laccase của chủng FBV40 với hoạt độ

riêng là 218 U/mg, gồm 2 isozyme Lac1 và Lac2 có khối lượng phân tử lần lượt là 55

kDa và 60 kDa, chúng có các đặc tính riêng khác nhau. Sau 24h phản ứng, Lac1 đã

loại được 91% màu thuốc nhuộm thương mại MN.FBN ở nồng độ 50 mg/L. Lần đầu

tiên đã tinh sạch được laccase-like từ Streptomyces sp. XKBiR929 với "hoạt độ

riêng" đạt 6,93 U/mg và rất bền nhiệt ngay cả ở 100oC, trong vòng 3 h hoạt tính

không thay đổi; sự ảnh hưởng bởi chất ức chế protein như L-lys, EDTA, SDS rất

khác so với laccase thật; loại được 76% màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN ở nồng

độ ban đầu 50 mg/L trong môi trường pH 1 khi có mặt của chất gắn kết ViO sau 5 h;

3. Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp bởi laccase thô của FBV40 ở

nồng độ 100 mg/L là 82% sau 2,5h, 85% sau 4h đối với thuốc nhuộm tổng hợp nhóm

azo NY1, NY7 và 70% sau 48h đối với thuốc nhuộm NY5 nhóm anthraquinone. Có

mối quan hệ tỷ nghịch lệ giữa mức độ giảm hoạt tính laccase với nồng độ chất gắn

kết trong quá trình loại màu thuốc nhuộm tổng hợp;

4. Sau 138 h với sự có mặt 0,1g D-glucose, laccase thô từ Rigidoporus sp.

FBV40 đã loại được 99% màu thuốc nhuộm MN.FBN và khi không có mặt D-

glucose thì chỉ loại 44%. Sau 1 ngày nuối cấy Rigidoporus sp. FBV40 ở môi trường

chứa 100 mg/L thuốc nhuộm MN.FBN và 0,5g D-glucose 97,2% màu đã bị loại;

5. Laccase thô của FBV40 phân hủy 40,55 đến 98,45% 2,4,5-T tinh khiết ở

các công thức thí nghiệm với hàm lượng 2,5 mg. Khi hàm lượng 2,4-D, 2,4,5-T lên

tới 556,92 mg/kg và 981,89 mg/kg, sau 27 ngày, laccase thô đã phân hủy 49,5 và

37,7%. Sau 7 đến 10 ngày nuôi cấy chủng Rigidoporus sp. FBV40 phân hủy

11,44% (7,2 mg/kg) chất diệt cỏ 2,4-D với hàm lượng ban đầu 62,95 mg/kg và

122

12,13% (7,7 mg/kg) 2,4,5-T với hàm lượng ban đầu là 63,5 mg/kg. Hỗn hợp nấm

đảm và nấm sợi FBV40, FBD154 và FNBLa1 phân hủy 56,07% (35,29 mg/kg) 2,4-

D và 36,06% (22,89 mg/kg) 2,4,5-T;

6. Sau 8 ngày nuôi cấy chủng FBV40 phân hủy 44,7% đồng loại 2,3,7,8-

TCDD với độ độc ban đầu 2000 ng TEQ/L, trong khi hỗn hợp các chủng nấm đảm

FBV40, FBD154 và nấm sợi FNBLa1 đều sinh tổng hợp laccase phân hủy gấp hơn

2 lần (92,9%) so với đơn chủng FBV40.

Kiến nghị

Kết quả nghiên cứu của luận án đã cung cấp cơ sở khoa học và mở ra định

hướng nghiên cứu ứng dụng khi sử dụng laccase, laccase-like, bản thân chủng vi

sinh vật và tổ hợp các loại chủng vi sinh vật để nghiên cứu, sáng tạo nên công nghệ

mới phục vụ cho mục đích xử lý ô nhiễm môi trường bởi các hợp chất hữu cơ khó

phân hủy nói chung, xử lý, khử độc môi trường ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin

nói riêng và trong xử lý nước thải dệt nhuộm trong quân đội có những nét đặc thù ở

các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Tuy nhiên, để đạt mục đích trên, một số

nghiên cứu cần tiếp tục tập trung nghiên cứu thực hiện đó là:

 Tiếp tục nghiên cứu mô hình ở các quy mô khác nhau trong phòng thí

nghiệm và ngoài thực tế để đánh giá khả năng sử dụng chủng nấm đặc biệt là tổ hợp

các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase trong việc phân hủy chất diệt cỏ

chứa dioxin trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa.

 Tiếp tục nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính thương

mại ở các quy mô thực tế khác nhau để có thể từng bước tiến tới nghiên cứu công

nghệ xử lý nước thải dệt nhuộm trong quân đội bằng việc sử dụng laccase hoặc

chủng nấm, xạ khuản có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like.

 Nghiên cứu cơ chế phân hủy (con đường chuyển hóa) màu thuốc nhuộm

tổng hợp cũng như màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại, chất diệt cỏ chứa dioxin

bằng laccase chủng nấm, laccase-like và bản thân các chủng vi sinh vật.

123

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Phùng Khắc Huy Chú, Đào Thị Ngọc Ánh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị

Cẩm Hà, Phân lập, phân loại và khảo sát khả năng sinh tổng hợp laccase-like của

một số chủng xạ khuẩn từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa, tỉnh

Đồng Nai.Tạp chí Khoa học đại học Huế, (2015), 110 (11): 29-41.

2. Phùng Khắc Huy Chú, Đào Thị Ngọc Ánh, Đặng Thị Cẩm Hà, Nấm đảm

sinh tổng hợp laccase có khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính được sử dụng

để nhuộm vải may quân trang, Tạp chí Khoa học và Công nghệ quân sự, (2017),

52:169-179.

3. Phung Khac Huy Chu, Nguyen Hai Van, Dang Thi Cam Ha, Purification

and characterization of laccase involved in the decolourization of synthetic dyes

and 2,3,7,8-TCDD congener degradation by the white rot fungus isolated from

bavi forest of Vietnam, Vietnam Journal of Science and Technology, (2017), 55

(4C), 180-185.

124

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.

2.

3.

4. laccases-occurrence and properties. FEMS.

5.

6.

7.

8.

9.

Ai M.Q, Wang F, Purification and characterization f a thermostable laccase from Trametes trogii and its ability in modification of kraft lignin, J. Microbiol. Biotechnol, (2015), 25, p.1361-1370. Ajeng A.S, Kazutaka. I, Sanro. T, Biodegradation optimization of 2,4,8- trichlorodibenzofuran by ligninolytic fungus, J. Lignocellulose Technol, (2016), 01,p.58-65. Arias M. E, Rodrıguez. J, Soliveri. J, Ball. A. S and Hern´andez. M., Kraft pulp biobleaching and mediated oxidation of a nonphenolic substrate by laccase from Streptomyces cyaneus CECT 3335. pplied and Environmental Microbiology, (2003). 69(4), p.1953-1958. Baldrian P, Fungal Microbiology Reviews, (2006). 30(2), p.215 - 242. Báo cáo đánh giá môi trường ô nhiễm dioxin tại sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai, (2016), Cơ quan phát triển Quốc tế Hoa Kỳ. Barbosa A. M, R.F.H.D and St. Hardy. G. E., Veratryl alcohol as an inducer of laccase by an ascomycete, Botryosphaeria sp., when screened on the polymeric dye Poly R-478 Letters in Applied Microbiology, (1996),23(2), p. 93–96. Bibi I., Bhatti H.N, Biodecolorization of Reactive Black 5 by laccase- mediator system. Afr. J. Biotechnol,(2012), 11(29): 7464-7471. Bollag J.D., Phenoloxidase-mediated interactions of phenols and anilines with humic materials. Journal of Environmental Quality, (2000). 29(3): p. 665–676. Brander S., Kepp K. P. and Mikkelsen J.D., Characterization of novel thermostable bacterial laccase-like multi-copper oxidases. DTU Chemistry, (2014).

10. Bressler D. C, P.M.F., and Pickard M.A., Oxidation of carbazole, N- laccase of the ethylcarbazole, fluorene, and dibenzothiophene by Coriolopsis gallica. Biotechnology Letters, (2000), 22(14): p. 1119–1125.

11. Buswell J. A, Y.C., and Chang S.T., Effect of nutrient nitrogen and manganese on manganese peroxidase and laccase production by Lentinula (Lentinus) edodes. FEMS Microbiology Letters, (1995). 128(1): p. 81–88.

12. Calvo A. M, J.L.C.P., Alonso O., and Gonz˜alez A. E., Studies of the production and characterization of laccase activity in the basidiomycete Coriolopsis gallica, an efficient decolorizer of alkaline effluents. Archives of Microbiology, (1998). 171(1): p. 31–36.

13. Camarero S., Ibarra D., Martínez M.J., Martínez A.T, Lignin-derived compounds as efficient laccase mediators for decolorization of different types of recalcitrant dyes. Appl. Environ. Microbiol, (2005), 71(4): 1775–1784. 14. Cambria M. T, S.R., Calabrese V., and Cambria A., Enhanced laccase production in white-rot fungus Rigidoporus lignosus by the addition of selected phenolic and aromatic compounds. Applied Biochemistry and Biotechnology Part A, (2011). 163(3): p. 415-422.

15. Carvalho M.C.M.a.M.E.A.D., Pulp bleaching using laccase from Trametes versacolor under high temperature and alkaline conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology Part A, (1998). vol. 70-72: p. 983-993.

125

16. Catherine H., Penninckx M., and Frédéric D, Product formation from phenolic compounds removal by laccases: a review. Environ. Technol. Innov,(2016), 5, 250-266.

17. Cavallazzi J. R. P, C.M.K., and Soares M. A, Screening of inducers for laccase production by Lentinula edodes in liquid medium. Brazilian Journal of Microbiology, (2005). 36(4): p. 383-387. 18. Chang J., Kuo T., Chao Y., Ho J., Lin P, Azo dye decolorization with a mutant Escherichia coli strain. Biotechnol. Lett, (2000), 22(9): 807-812.

19. Chattoo G.I.a.B.B., Purification and characterization of laccase from the rice blast fungus, Magnaporthe grisea. FEMS Microbiology Letters, (2003). 227(1): p. 121-126.

20. Chatzisymeon E., Xekoukoulotakis N.P.Coz A., Kalogerakis N., Mantzavinos D., Electrochemical treatment of textile dyes and dyehouse effluents. J. Hazard. Mater, (2006) (137), pp: 998-1007

21. Chaudhari K., Bhatt V., Bhargava A., Seshadri S., Combinational system for the treatment of textile waste water: a future perspective, Asian J. Water Environ. Pollut., (2011), (8), pp: 127-136 22. Chivukula M., Renganathan V, Phenolic Azo Dye Oxidation by Laccase from Pyricularia oryzae. Appl. Environ. Microbiol, (1995), 61(12)

23. Chmelová D, M. Ondrejovic, Purification and characterization of extracellular laccase produced by Ceriporiopsis subvermispora and decolorization of triphenylmethane dyes, J. Basic Microbiol. (2016) 24. Claus H., Laccases and their occurrence in prokaryotes. Archives of Microbiology, (2003), 179(3): p. 145 - 150. 25. Couto S., and Herrera J. Industrial and biotechnological applications of laccases: a review. Biotechnol. Adv, (2007), 24: pp. 500 - 513.

26. D’Souza-Ticlo D, A.K.V., Mathew M., and Raghukumar C., Effect of nutrient nitrogen on laccase production, its isozyme pattern and effluent decolorization by the fungus NIOCC2a, isolated from mangrove wood. Indian Journal of Marine Sciences, (2006). 35(4): p. 364 - 372.

27. Daassi D., Rodríguez-Couto S., Nasri M., Mechichi T. Biodegradation of textile dyes by immobilized laccase from Coriolopsis gallica into Ca- alginate beads. Int Biodeterior Biodegrad, (2014), 90: p. 71-78.

28. Đàm Thúy Hằng, Đào Thị Ngọc Ánh, Nguyễn Kim Giang, Đặng Thị Cẩm Hà, Phân loại, khả năng sinh tổng hợp laccase và phân hủy PAH của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. XKBH13 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin thuộc sân bay quân sự cũ biên hòa. Tạp chí công nghệ sinh học, (2012), 10(1), pp: 189-196

29. Đặng Thị Cẩm Hà, Báo cáo kết quả công trình khử độc đất nhiễm chất độc hóa học chứa dioxin tại sân bay Biên Hòa tỉnh Đồng Nai bằng công nghệ phân hủy sinh học”, Viện HLKHCNVN, (20120.

30. Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Thanh Thủy, Đặc điểm của vi khuẩn phân lập từ xử lý sinh học tẩy độc nước thải bị ô nhiễm 2,4,6- trinitrotoluene. Tạp chí Công nghệ Sinh học, (2009),7 (3), pp: 389-396 31. Đặng Thị Cẩm Hà, Phạm Quốc Hiệp, Nguyễn Nguyên Quang, Trần Thị Như Hòa, Nghiêm Ngọc Minh, Phân lập và đánh giá khả năng phân hủy hexachlorocyclohexane của chủng nấm sợi FNA33 từ đất xử lý khử độc

126

thuốc trừ sâu bằng bioreactor hiếu khí. Tạp chí Công nghệ Sinh học,(2009), 7(2), pp: 257-264.

32. Đào Thị Ngọc Ánh, Nguyễn Nguyên Quang, Đặng Thị Cẩm Hà, Điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp laccase và một số đắc điểm của laccase thô từ chủng Aspergillus sp. FNA1 phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu. Độc học, (2011), 20. p.5-18.

33. Davis M. W., Glaser J. A., Evans J. W., and Lamar R. T., Field evaluation of the lignin-degrading fungus Phanerochaete sordida to treat creosote- contaminated soil. Environ. Sci. Technol, (1993), 27. p. 2572-2576. 34. De Jesus M, A.M.N., Rodrigues M. L., Janbon G., and Casadevall A., Capsular localization of the Cryptococcus neoformans polysaccharide component galactoxylomannan. Eukaryotic cell, (2009). 8(1). p. 96-103.

35. Dittmer N. T, R.J.S., Jiang H., Characterization of cDNAs encoding putative laccase-like multicopper oxidases and developmental expression in the tobacco hornworm, Manduca sexta and the malaria mosquito, Anopheles gambiae. Insect Biochemistry andMolecular Biology, (2004), 34(1).p.29-41.

36. Dobson, P.J.C.a.A.D.W., Regulation of laccase gene transcription in Trametes versicolor. Applied and Environmental Microbiology, (1997), 63(9). p.3444-3450.

37. Dong J. L, Y.W.Z., Zhang R. H., Huang W. Z., and Zhang Y.Z., Influence of culture conditions on laccase production and isozyme patterns in the white-rot fungus Trametes gallica. Journal of Basic Microbiology, (2005), 45(3): p. 190-198.

38. Dwivedi U.N., Singh P., Pandey V.P., Kumar A. Structure-function relationship among bacterial, fungal and plant laccases. J. Mol. Catal. B: Enzym, (2011), 68, pp.117-128.

39. Ejhieh A.N., Mobarakeh H. Z, Heterogeneous photodecolorization of mixture of methylene blue and bromophenol blue using CuO-nano- clinoptilolite. J. Industrial Eng. Chem., (2014), (20), p.1421-31.

40. El-Batal A. I., ElKenawy N. M., Yassin A. S., Amin M. A. Laccase production by Pleurotus ostreatus and its application in synthesis of gold nanoparticles. Biotechnology Reports, (2015), 5, p.31-39

41. Eriksson, S.C.F.a.K.E., Purification and properties of Neurospora crassa laccase. Journal of Bacteriology, (1974), 120(1), p.458-465.

42. Fang W, F. Z., Chang F, Peng H, Zhang X, Xiao Y, Dye decolorization by bacterial laccase Lac15, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, (2012), 28(8), p 973-980. 43. Faulkner JK, Woodcock D, Metabolism of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) by Aspergillus niger van Tiegh. Nature, (1964), 203:865.

44. Festus A., Treatment of organic aromatic contaminants in soil with fungi and biochar. Faculty of Agriculture and Forestry of the University of Helsinki, (2017), ISSN, 2342-5431.

45. Folasade M,. Cornelius O. Fatokun, Biochemical characterization of an extremely stable pH-versatile laccase from Sporothrix carnis CPF-05, International Journal of Biological Macromolecules, (2017), 94. p.535-543. 46. Forootanfar H., and Faramarzi M.A, Insights into laccase producing and states, fermentation purification organisms, strategies,

127

biotechnological applications. Biotechnol. Prog, (2015), 31. p.1443-1463. 47. Gabriel, P.B.a.J., Copper and cadmium increase laccase activity in Pleurotus ostreatus. FEMS Microbiology Letters, (2002), 206(1), p.69-74.

48. Garzillo A.M., Buonocore V., Structural and kinetic characterization of native laccases from Pleurotus ostreatus, Rigidoporus lignosus, and Trametes trogii. Journal of Protein Chemistry, (2001), 20(3), p.191-201.

49. Gedikli S., Aytar P., Buruk Y., Apohan E., Çabuk A., Yeşilada Ö., Burnak N, Laccase production and dye decolorization by Trametes versicolor: application of Taguchi and Box-Behnken Methodologies. Turk J Biochem, (2014), 39(3), pp. 298-306.

50. Ghaedi M., Hajati S., Barazesh B., Karimi F., Ghezelbash G.,Saccharomyces cerevisiae for the biosorption of basic dyes from binary component systems and the high order derivat ive spect rophotometric method for simultaneous analysis of Brilliant green and Methyleneblue. J. Industrial Eng. Chem.,(2013), (19), p.227-233.

51. Gill, D.S.A.a.P.K., Laccase production by some white rot fungi under different nutritional conditions. Bioresource Technology, (2000), 73(3). p. 283-285.

52. Gonzalez J. C, S.C.M., Rodriguez A., Osma J.F., and Almeciga-Diaz C.J., Production of Trametes pubescens laccase under submerged and semi- Solid culture conditions on agro-Industrial wastes. PLoS ONE, (2013), 8(9).

53. Gupta V.K., Ali I., Saleh T.A., Nayak A., Agarwal S.,. Chemical treatment technologies for waste-water recycling-an overview. RSC Advances, (2012), (2), pp. 6380-6388.

54. Hadibarata T., Yusoff A.R.M., Kristanti R.A, Decolorization and meabolism of Anthraquionone-type dye by laccase of white-rot fungi Polporus sp. S133. Water Air Solid Pollut, (2012), 233. p.933-941.

55. Hamid F,. Ali F.M., Reza S.A., Tabatabaei Y.M., Purification and biochemical characterization of extracellular laccase from the ascomycete Paraconiothyrium variabile, Bioresour. Technol, (2011), 102. p.1808-1814.

56. Haugland R., Schlemm A., Lyons D.J., Sferra R.P., Chakrabarty P.R., Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4- dichlorophenoxyacetic acid and 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by pure and mixed bacterial cultures. Appl Environ Microbiol, (1990), 56, p.1357- 1362.

57. Heinzkill M.L.B., Halkier T., Schneider P., and Anke T., Characterization of laccases and peroxidases from woodrotting fungi (family Coprinaceae). Applied and Environmental Microbiology, (1998), 64(5), p.1601-1606. 58. Hoàng Thị Nhung, Nguyễn Quang Huy, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà, Sàng lọc chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase và phân hủy các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm, loại màu thuốc nhuộm. Tạp chí Công nghệ Sinh học, (2012), 10(3), pp.551-561.

59. Hu M., Zhang W., Lu X., and Gao P., Purification and characteristics of a low- molecular-weight peptide possessing oxidative capacity for phenol from Phanerochaete chrysosporium, Series C Life Sciences, (2006), 49 (3), p.243-250.

128

61.

62. K., Kinoshita M., Morishita S., Chida

63.

64.

60. Hu M.R., Chao Y.P., Zhang G.Q., Xue Z.Q., Qian S., Laccase-mediator system in the decolorization of different types of recalcitrant dyes. J Ind Microbiol Biotechnol, (2008), DOI 10.1007/s10295-008-0471-1. Ishii K., Furuichi T., Koike K., Kuboshima M., Purification of highly chlorinated dioxins degrading enzyme, Organohal Compo, (2004), 66, p. 1262-1266. Itoh M., Suyama K., Characterization of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid-degrading fungi in Vietnamese soils. FEMS Microbiol Ecol, (2013), 84, p.124-132. Janusz G., Barwi´nska M., and Szczodrak J., Effects of culture conditions on production of extracellular laccase by Rhizoctonia praticola, Polish Journal ofMicrobiology, (2006), 55(4). p.309-319. Jonstrup M., Kumar R., Naresh G,. Benoit M., Marika M., Decolorization of textile dyes by Bjerkandera sp. BOL 13 using waste biomass as carbon source, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, (2013), 88.

65. Kachlishvili V.E.a.E., Physiological regulation of laccase and manganese Journal of peroxidase production by white-rot Basidiomycetes. Biotechnology, (2009), 144(1). p.37-42.

66. Kanmani P., Satish K.R., Yuvaraj N., Paari KA., Pattukumar V., Aru V., Microbial decolorization of synthetic dyes and reactive dyes of industrial effluents by using a novel fungus Aspergillus proliferans, Water Environ Res, (2011), 83(11). p.2099-106.

67. Kaur B,. Kumar B., Garg N., Kaur N., Statistical Optimization of Conditions for Decolorization of Synthetic Dyes by Cordyceps militaris MTCC 3936 Using RSM, BioMed Research International, (2015), 2015. p.1-17.

68. Khandare R.V., Kabra A.N., Kurade M.B., Govindwar S.P., Phytoremediation potential of Portulaca grandiflora Hook. (Moss-Rose) in degrading a sulfonated diazo reactive dye Navy Blue HE2R (Reactive Blue 172). Bioresour.Technol., (2011), (102), p.6774-6777.

69. Kiiskinen L.L, and Kruus K, Purification and characterisation of a novel the ascomycete Melanocarpus albomyces. Applied from

laccase Microbiology and Biotechnology, (2002), 59(2-3), p.198-204.

70. Kim Y., and Shin W., Purification and characterization of a laccase from Cerrena unicolor and its reactivity in lignin degradation. Bulletin of the Korean Chemical Society, (2002), 23(7), p.985-989.

71. Kirk G.F.L., Regulation of ligninolytic activity by nutrient nitrogen in white- rot basidiomycetes. FEMS Microbiology Letters, (1983), 16(1), p.65-67. 72. Knapp J.S., Vantoch-Wood E.J., Zhang F, Use of wood – rotting fungi for the decolorization of dyes and industrial effluents. In: Fungi in Bioremediation. G. M. Gadd(Ed.), Cambridge University Press, Cambridge, (2001), 253-261.

73. Kolankaya, S.G, Enhancement with inducers of lacasse production by some strains and application of enzyme to dechlorination of 2,4,5-trichlorophenol. Journal of Biotechnology, (2010), 13(6).

74. Kondo, R., Harazono K., and Sakai K, Bleaching of hardwood kraft pulp with manganese peroxidase secreted from Phanerochaete sordida YK-624.

129

Appl. Environ. Microbiol, (1994), 60, p.4359-4363.

75. Kuhad, S.D., Effect of amino acids and vitamins on laccase production by the bird’s nest fungus Cyathus bulleri. Bioresource Technology, (2002). 84(1), p.35-38.

76. Kunde L, Shiyang Z, Xi C, Jiafeng D, Xiaoyan K, Jay G, Formation of hydroxylated polybrominated diphenyl ethers from laccase-catalyzed oxidation of bromophenols, Chemosphere, (2015), 138, p.806-813. 77. Laemmli., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, (1970), 227(5259). p.680-685.

78. Lâm Vĩnh Ánh, Nghiên cứu lựa chọn công nghệ xử lý triệt để dioxin trong đất và trầm tích phù hợp với điều kiện Việt Nam, Chương trình KHCN 33.02/11-15, Bộ Tài nguyên và Môi trường, 2015. 79. Larsen B.G, Molecular biology of plant laccases in relation to lignin formation. Physiologia Plantarum, (2002), 116(3), p.273-280.

80. Lele M.S.R, Increased production of extracellular laccase by the white rot fungus Coriolus versicolor MTCC 138. World Journal of Microbiology and Biotechnology, (2006), 22(9), p.921-926.

81. Levasseur A.M.S., Navarro D., Exploring laccase-like multicopper oxidase genes from the ascomycete Trichoderma reesei: a functional, phylogenetic and evolutionary study. BMC Biochemistry, (2010), 11(1).

82. Li Q, Ge L, Cai J, Pei J, Xie J, Zhao L, Comparison of two laccases from Trametes versicolor for application in the decolorization of dyes. J Microbiol Biotechnol, (2014), 24(4), pp.545-555. 83. Loretta L, Remediation treatment technologies: reference guide for developing countries facing persistent organic pollutants-UNIDO, (2009).

84. Luterek J.L.G., Wojta´s M, Wasilewska., Screening of the wood-rotting fungi for laccase production: induction by ferulic acid, partial purification, and immobilization of laccase from the high laccase-producing strain, Cerrena unicolor. Acta Microbiologica Polonica, (1997), 46(3), p.297-311. 85. Lyons J. I, Buchan A, Moran M. A, Diversity of ascomycete laccase gene sequences in a southeastern US salt marsh. Microbial Ecology, (2003), 45(3), p.270-281.

86. Magdalena J., Monika O.J., Grzegorz J., Anna M., Dawid S., Justyna S., Jolanta P., Marta R., Krzysztof G., and Anna J.W., New Bioactive Fungal Molecules with High Antioxidant and Antimicrobial Capacity Isolated fromCerrena unicolor Idiophasic Cultures, BioMed Research Internationa, (2013), 13. 87. Martínez S.M.S., Gutiérrez S.G., Garza C.F.R., Galván T.J.V., Cordero J.F.C., Luna C.E.H, Purification and partial characterization of a thermostable laccase from Pycnoporus sanguineus CS-2 with ability to oxidize high redox potential substrates and recalcitrant dyes. Agricultural and Biological Sciences, (2013).

88. Martins L.O, C.M.S., Pereira M.M., Molecular and biochemical characterization of a highly stable bacterial laccase that occurs as a structural component of the Bacillus subtilis endospore coat. Journal of Biological Chemistry, (2002), 277(21), p.18849-18859. 89. Mate D. M., and Alcalde M, Laccase: a multi-purpose biocatalyst at the forefront of biotechnology. Microb. Biotechnol, (2016).

130

90. Mei R.H., Guo Q.Z., Zhi Q.X., Shijun Q., Laccase-mediator system in the decolorization of different types of recalcitrant dyes. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, (2009), 36(1), p.45-51. 91. Messerschmidt A., Refined Crystal Structture of Ascorbate Oxidase at l.9 Å Resolution. J. Mol. Biol, (1992), 179, p.179205.

92. Meza J. C, Lomascolo A., Sigoillot J.C., and L.Casalot, Role of ethanol on growth, laccase production and protease activity in Pycnoporus cinnabarinus ss3. Enzyme and Microbial Technology, (2007), 41(1-2), p. 162-168.

93. Ming H., Weican Z., Ying W., Peiji G., Xuemei L., Characteristics and function of a low-molecular-weight compound with reductive activity from Phanerochaetechrysosporium in lignin biodegradation, Bioresource Technology, (2009), 100(6), p.2077-2081.

94. Minussi R. C., Silva J. A., Purification, characterization and application of laccase from Trametes versicolor for colour and phenolic removal of olive mill wastewater in the presence of 1-hydroxybenzotriazole. African Journal of Biotechnology Advances, (2007), 6(10). p.1248-1254.

95. Mohanadoss P., Pachamuthu J., Zambare V., Isolation and Optimization of Culture Conditions For Decolorization of True Blue Using Dye Decolorizing Fungi, Asain Journal of Experimental Biological Sciences, (2011), 2. p.270-277.

96. Moreira S., Milagres A.M.F., Mussatto S. I, Reactive dyes and textile effluent decolorization by a mediator system of salt-tolerant laccase from Peniophora cinerea. Separation and Purification Technology, (2014), 135, pp.183-189.

isolated 97. Mounguengui S., Atteke C., Saha T.J.B., Ndikontar M.K., Dumarçay S. and Gerardin P., Discoloration and biodegradation of two dyes by white-rot fungi Perreniporia in Gabon, tephropora MUCL 47500 Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci, (2014), 3(6), p.731-741.

98. Murty S.D., Soni R., and Bhatt N., Biodegradation study on Reactive Blue 222 by Bacterial Consortium." Chem Environl, (2012), 2(4), p.69-79. 99. Myers J.M.B., Detoxification of aquatic and terrestrial sites through the Total to humic substances. Science of

binding of pollutants Environment, (1992), 117-118, p.357-366.

100. Nakamiya K., Furuichi T., Ishii K., Isolation of a fugus from denitrifying activated sludge that degrades highly chlorinated dioxins, J Master Cycles Waste Manag, (2002), 4, pp.127-134.

activities esterase and and

101. Namdhari B.S., Rohilla S.K., Salar R.K, Gahlawat S.K, Bansal P and Saran A.K, Decolorization of Reactive Blue MR, using Aspergillus species Isolated from Textile Waste Water, ISCA J. Biological Sci, (2012), 1(1), p.24-29. 102. Nghi D. H, B.B., H. Kellner et al, The Wood Rot Ascomycete Xylaria polymorpha produces a novel GH78 glycoside hydrolase that exhibits L- feruloyl Rhamnosidase releases hydroxycinnamic acids lignocelluloses. Applied Environmental from Microbiology, (2012), 78(14). 103. Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà, Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học

phân tử của ba chủng vi khuẩn sử dụng 2,4-D phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại Đà Nẵng, Tạp chí Sinh học, (2007), 29(4), p.80-85.

131

104. Nguyễn Bá Hữu, Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật và một số gen liên quan đến khả năng phân hủy 2,4,5-T và dioxin trong đất nhiễm chất độc hóa học, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học, (2010).

105. Nguyễn Đương Nhã, Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Ngọc Bảo, Đặng Thị Cẩm Hà, Khả năng phân hủy hydrocacbon thơm đa nhân và dibenzofuran của chủng xạ khuẩn XKDN12, Tạp chí Công nghệ sinh học, (2005), 3(1), 123-132.

106. Nguyễn Mai Dương, Nghiên cứu giải pháp công nghệ tổ hợp để xử lý thuốc nhuộm, Luận án tiến sỹ, (2016), Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

107. Nguyễn Nguyên Quang, Nguyễn Thị Lệ, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà, Phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm và thuốc nhuộm của chủng nấm sợi FBH11 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại điểm nóng Biên Hòa. Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (2010), Hà Nội.

108. Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thị Thanh Ngân, Đặng Thị Cẩm Hà, Sinh enzim ngoại bào peroxidaza, laccaza và phân hủy các hợp chất vòng thơm của chủng xạ khuẩn XKBH1.Tạp chí Khoa học và Công nghệ, (2012), 50 (3), pp.285-295.

109. Nguyễn Thị Lan Anh, Đặng Thị Cẩm Hà, Phân loại và xác định hoạt tính laccase của chủng XKDNP22 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Tạp chí Công nghệ Sinh học, (2011), 9(4), pp.511-519.

110. Nguyễn Văn Minh, Các giải pháp tạm thời ngăn chặn lan toả dioxin và lựa chọn công nghệ xử lý dioxin ở sân bay Biên Hoà, Tuyển tập Báo cáo hội thảo “Chia sẻ kinh nghiệm đánh giá ô nhiễm dioxin/POPs và các công nghệ xử lý tại Việt Nam. Dự án “Xử lý dioxin tại các vùng ô nhiễm nặng ở Việt Nam”), Văn phòng Ban chỉ đạo 33, (2013).

111. Nishida T,. Mimura A., and Takahara Y., Lignin biodegradation by wood- rotting fungi I. Screening of lignindegrading fungi. Mokuzai Gakkaishi, (1988), 34, p.530-536.

112. Olajuyigbe F., and Fatokun C.O., Biochemical characterization of an extremely stable pH-versatile laccase from Sporothrix carnis CPF-05. Int. J. Biol. Macromol, (2017), 94, p.535-543. 113. Omar S.F.M., Laccase enzymes: purification, structure to catalysis and tailoring. Protein Peptide Letters, (2013), 20(12).

114. Palonen H.M.S., L. Viikari, and K. Kruus, Purification, characterization and sequence analysis of a laccase from the ascomycete Mauginiella sp. Enzyme and Microbial Technology, (2003), 33(6), p.854-862.

115. Papinutti V.L., and Forchiassin F., Production of laccase and manganese peroxidase by Fomes sclerodermeus grown on wheat bran. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology Advances, (2003), 30(3), p.157-160.

116. Parmar P.R., Decolorization of acridine red dye by the fungi Aspergillus species, Journal of Scientific and Innovative Research, (2014), 3(4), p.454-459 117. Parshetti G.K., Kalme S.D., Gomare S.S., Govindwar S.P., Biodegradation of Reactive blue - 25 by Aspergillus ochraceus NCIM–1146, Bioresource technology, (2007), (98), p.3638-3642. 118. Paszko T., Muszyński P., Materska M., Bojanowska M., Kostecka M., and

132

Jackowska I., Adsorption and degradation of phenoxyalkanoic acid herbicides in soils: A review. Environ Toxicol Chem, (2016), (35), 271-286. 119. Perumal K., Biochemical studies of lignolytic enzymes of Gonoderma lucidum, a white rot fungus and its application in treatment of paper mill effluent, (1997), University of Madras. 120. Pointing S.B., Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. Applied Microbiology and Biotechnology, (2001), 57(1-2), p.20-33. 121. Po-Ting C., Chii-Gong T., Tuan-Hua D.H., Su-May Y., Novel rigidoporus microporus laccase, (2010), US 20100184186 A1. 122. Praveen K., Usha K. Y., Lignolytic enzymes of a mushroom Stereum ostrea isolated from wood logs, Enzyme Research, (2011), p. 6 pages.

123. Raghukumar C., Fungi in

from marine habitats: an application bioremediation, Mycological Research, (2000), 104(10), p.1222-1226. 124. Rampal D.S., Laccase productionby some Phlebia species. Journal of BasicMicrobiology, (2002), 42, p.295-301.

125. Rao M. A., Scelza R., Acevedo F., Diez M.C., and Gianfreda L., Enzymes as useful tools for environmental purposes, Chemosphere, (2014), 107, 145-162. 126. Ratanapongleka K., Phetsom J., Decolorization of synthetic dyes by crude laccase from Lentinus polychrous Lev, International Journal of Chemical Engineering and Applications, (2014), 5(1), pp.26-30. 127. Reddy C.A., The potential for white-rot fungi in the treatment of pollutants. Curr. Opin. Biotechnol, (1995), 6, p.320-328.

128. Reiss R., Ihssen J., Richter M., Eichhorn E., Schilling B., Laccase versus Laccase-Like Multi-Copper Oxidase: A Comparative Study of SimilarEnzymes with Diverse Substrate Spectra, (2013), PLoS ONE 8(6).

129. Rodriguez C.S., and G´ubitz G. M., Influence of redox mediators and metal ions on synthetic acid dye decolourization by crude laccase from Trametes hirsuta. Chemosphere, (2005), 58(4), p.417-422.

130. Rohilla SK., Salar RK., Kumar B., Evaluation of different Aspergillus species for degradation of a reactive dye Orange M2R, Annals of Biological Research, (2012), 3 (9), p.4491-4496. 131. Ron M.D., Carol B., Bruce G., Review of emerging,

innovative technologies for the destruction and decontamination of POPs and the identification of promising technologies for use in developing countries, International Centre for Sustainability Engineering and Science Faculty of Engineering The University of Auckland Auckland New Zealand, (2004).

132. Rosli., Development of biological treatment system for reduction of COD from textile wastewater, Master Dessertation, University Technology Malaysia, 2006.

133. Roubelakis A., Laccase activity could contribute to cell-wall reconstitution in regenerating protoplasts, Phytochemistry, (1997), 46(3), p.421-425. 134. Sakaki T., Shinkyo R., Takita T., Ohta M., Inouye K., Biodegradation of polychlorinated dibenzo-p-dioxins by recombinant yeast expressing rat CYP1A subfamily, Arch Biochem Biophys, (2002), (401), pp.91-98. 135. Santo T., Yukinori K., and Michifusa K., Bioremediation of dioxin - contamiated soil by Fungi screened from nature, Pakistan Journal of Biological Science, (2007),10(3), p.486-491.

133

136. Saraiva J.A., and Xavier A.M.R.B., Effect of the inducers veratryl alcohol, xylidine, and ligninosulphonates on activity and thermal stability and inactivation kinetics of laccase from Trametes versicolor. Applied Biochemistry and Biotechnology Advances, (2012), 167(4), p.685-693. 137. Sarayu K., Swaminathan K., Sandhya S., Assessment of degradation of eight commercial reactive azo dyes individually and in mixture in aqueous solution by ozonation. Dyes and Pigments, (2007), (75), p.362-368 138. Satoshi T., Matayoshi N., Takahiko M., Ryuichiro K., and Kokki S., Degradation of Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins and Polychlorinated Dibenzofurans by the White Rot Fungus Phanerochaete sordida YK-624, Applied and Environmental Microbiology, (1996), 62(12), p.4323-4328.

139. Schneider P., Mondorf K., Characterization of a Coprinus cinereus laccase, Enzyme Microbial Technology, (1999), 25. p.502-508. 140. Sen S., Demirer G.N, Anaerobic treatment of real textile wastewater with a fluidized bed reactor, Water Research, (2003), 37. p.1868-1878.

141. Shumaila K., Muhammad A., Degradation and Mineralization of Azo Dye Reactive Blue 222 by Sequential Photo-Fenton’s Oxidation Followed by Aerobic Biological Treatment Using White Rot Fungi, Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, (2013), 90(2). p.208-215.

142. Singh G, A.B., Kaur P., Capalash N., and Sharma P., Laccase from prokaryotes: a newsource for an old enzyme, Reviews in Environmental Science and Biotechnology, (2011), 10(4). p.309-326. 143. Singh H., Mycoremediation-Fungal Bioremediation, Wiley Interscience, (2006), Hoboken.

144. Soares G.M., De Amorim M.T., Costa-Ferreira M, Use of laccase together with redox mediators to decolourize Remazol Brilliant Blue R, J. Biotechnol, (2001), 89. pp.123-129.

145. Song Z., Zhou J., Wang J., Yan B., Du C., Decolorization of azo dyes by Rhodobacter sphaeroides, Biotechnol. Lett, (2003), 25. p.1815-1818. 146. Sridhar S., Chinnathambi V., Arumugam P., Suresh P.K, In silico and in vitro physicochemical screening of Rigidoporus sp. crude laccase-assisted decolorization of synthetic dyes approaches for a cost-effective enzyme- based remediation methodology, Appl Biochem Biotechnol, (2013), 169(3). p.911-922. 147. Staples A.M.M.a.R.C., Laccase:new functions for an old enzyme, Phytochemistry, (2002), 60(6), p.551-565.

148. Susana C., María J.M., Ángel T.M., Lignin-Derived Compounds as Efficient Laccase Mdiators for Decolorization of Different Types of Recalcitrant Dyes, Appl Environ Microbiol, (2005), 71(4). p.1775-1784.

function of laccases, fungal 149. Takada S., Nakamura M., Matsuda T., Kondo R. and Sakai K, Degradation of polychlorinated dibenzo-p-dioxins and polychlorinated dibenzofurans by the white rot fungus Phanerochaete sordida YK-624, Appl. Environ. Microbiol, (1996), 62. p.4323-4328. 150. Thurston F.C., The structure and Microbiology, (1994), 140(1). p.19-26.

151. Torres E., and Le Borgne S., Potential use of oxidative enzymes for the detoxification of organic pollutants, Applied Catalysis B, (2003), 46(1), p.1-15.

134

152. Trần Thị Thu Hiền, Hoàng Thị Nhung, Nguyễn Hải Vân, Nguyễn Thị Lan Anh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà, Nghiên cứu phân lập và ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp laccase bởi chủng nấm thu thập từ rơm mục Ninh Bình, Tạp chí Công nghệ Sinh học, (2013), 11(2). p.265-274.

153. Tripathi B.M., Kumari P., Saxena A.K., Arora D.K., Genetic and metabolic diversity of streptomycetes in pulp and paper mill effluent treated crop fields, World J Microbiol Biotechnol, (2011), 27. p.603-1613.

154. UNEP, Review of emerging, innovative technologies for the destruction and decontamination of POPs and the identification of promissing technologies for use in developing countries, (2004).

155. Upadhyay P., Shrivastava R., and Agrawal P.K., Bioprospecting and biotechnological applications of fungal laccase, Biotech, (2016), 6.15p 156. Ursula K.,and Martin R., Multiple Multi-Copper Oxidase Gene Families in Basidiomycetes–What for, Current Genomics, (2011), 12. p72-94. 157. US.EPA., Reference

to non-combustion tollutent reference guide technologies for remediation of persistent organic pollutants in soil second edition-2010, http://www.epa.gov www.clu-in.org/POPs), 9-2010. 158. Utkarsha S., Jyoti P.J., Detoxification of malachite green and textile industrial effluent by Penicillium ochrochloron, Biotechnology and Bioprocess Engineering, (2011), 16(1), 196p.

159. Valli K., Wariishi H., and Gold M.H., Degradation of 2,7-dichlorodibenzo- basidiomycete Phanerochaete lignin-degrading the by p-dioxin chrysosporium, J. Bacteriol, (1992), 174. p.2131-2137.

160. Văn phòng ban chỉ đạo 33/Bộ Tài nguyên và môi trường, Báo cáo tổng thể về tình hình ô nhiễm dioxin tại 3 điểm nóng sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng và Phù Cát, T11/2013.

161. Vantamuri A.B., Kaliwal B.B., Purification and characterization of laccase from Marasmius species BBKAV79 and effective decolorization of selected textiledyes, Biotech, (2016), 6. p.189.

162. Vasconcelos A.F.D.A.M.B., Dekker R.F.H., Scarminio I.S., and Rezende M. I., Optimization of laccase production by Botryosphaeria sp. in the presence of veratryl alcohol by the response-surface method, Process Biochemistry, (2000), 35(10). p.1131-1138.

163. Verma A.K., Bhunia P., Dash R.R., Decolorization and COD reduction efficiency of magnesium over iron based salt for the treatment of textile wastewater containing diazo and anthraquinone dyes, Int. J. Chemi. Bio. Eng., (2012), (6). pp.116-123. 164. Viikari M.L.N., Enzymatic oxidation of alkenes, Journal of Molecular Catalysis B, (2000), 10(4). p.435-444.

165. Vijay B., Reddy G., Dinesh K., Joshi and Michael H.G, Degradation of chlorophenoxyacetic acids by the lignin-degrading fungus Dichornitus squalens, Micro biology, (1997), 143. p.2353-2360.

166. Vroumsia T,. Steiman R,. Seigle M.F, Benoit G.JL, Fungal bioconversion of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 2,4-dichlorophenol (2,4- DCP), Chemosphere, (2005), 60. p.1471-1480. 167. Wang T.N., Lu L., Li G.F, Li J., Xu T.F., and Zhao M, Decolorization of

135

the azo dye reactive black 5 using laccase mediator system, African Journal of Biotechnology, (2011), 10(75). p.17186-17191.

168. Wei W., Pei J.G., Function and mechanism of a low-molecular-weight peptide produced by Gloeophyllum trabeum in biodegradation of cellulose, Journal of Biotechnology, (2003), 101 (2). p.119-130.

169. Wijannarong S., Aroonsrimorakot S., Thavipoke P., Sangjan S., Removal of Reactive Dyes from Textile Dyeing Industrial Effluent by Ozonation, Process. APCBEE Procedia, (2013), (5). pp.279-282.

170. Xiao Y., S.Z., Hu Q., Jiang W., Pu Ch, and Shi Y., Immobilization of fungal laccase on chitosan and its use in phenolic effluents treatment, Weishengwu Xuebao, (2003), 43. p.245-250.

171. Yadav J.S, Reddy C.A, Mineralization of 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D) and mixtures of 2,4-D and 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by Phanerochaete chrysosporium, Appl Environ Microbiol, (1993), 59. p.2904-2908.

172. Yan J., Niu J., Chen D., Chen Y., Irbis C., Screening of Trametes strains for efficient decolorization of malachite green at high temperatures and ionic concentrations, Int Biodeterior Biodegrad, (2014), 87. p.109-115. 173. Yang J., Li W., Ng TB., Deng X., Lin J.Y.X., Laccases:Production, Pharmaceutical Regulation, and in Expression Applications Biodegradation, Front. Microbiol, (2017), 8. p.832.

laccase genes

174. Yaver D.S., F.X., Golightly E.J., Purification, characterization, molecular cloning, and expression of fromthe white rot two basidiomycete Trametes villosa, Applied and Environmental Microbiology, (1996), 62(3), p.834-841.

175. Yaver D.S., M.D.C.O., Xu F., Molecular characterization of laccase genes from the basidiomycete Coprinus cinereus and heterologous expression of the laccase Lcc1, Applied and Environmental Microbiology, (1999), 65(11), p. 4943-4948.

176. Yemendzhiev H,Z., Krastanov A., Decolorization of Synthetic Dye Reactive Blue 4 by Mycelial Culture of White-Rot Fungi Trametes Versicolor 1, (2014), 23. p.1337-1339.

177. Zhao D.X., Zhang D., Cui M.Z., Characterisation of a novel white laccase from the deuteromycete fungus Myrothecium verrucaria NF-05 and its decolourisation of dyes, PLoS One 7, (2012), 38817.

178. Zhu M., Zhang G. , Meng L., Wang H. , Gao K., T. Ng, Purification and characterization of a white laccase with pronounced dye decolorizing ability and HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activity from Lepista nuda, Molecules, (2016), 21, p.1-16.

179. Zille A., Górnacka B., Rehorek A., Cavaco-Paulo A, Degradation of azo dyes by Trametes villosa laccase over long periods of oxidative conditions. Appl. Environ. Microbiol, (2005), 71(11). p.6711-6718.

180. Zolgharnein J., Bagtash M., Asanjarani N., Hybrid central composi te design approach for simultaneous optimization of removal of alizarin red S and indigo carmine dyes using cetyltrimethylammonium bromidemodified TiO2 nanoparticles. J. Environ. Chem. Eng, (2014b),2, p.988-1000.