Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do Actinobaccilus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis và sử dụng vacxin phòng bệnh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

ĐỖ TẤT ĐẠT

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS VÀ SỬ DỤNG VACXIN PHÒNG BỆNH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

ĐỖ TẤT ĐẠT

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS VÀ SỬ DỤNG VACXIN PHÒNG BỆNH

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi

Mã số:

9 64 01 02

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. NGUYỄN BÁ HIÊN

2. PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ

HÀ NỘI, 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên

cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ

lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Tác giả luận án

Đỗ Tất Đạt

i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,

đồng nghiệp và gia đình.

Cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên và

PGS.TS. Cù Hữu Phú đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện

cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ

môn Vi sinh vật Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận

tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành

luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ Bộ môn Vi trùng, Viện Thú

y, Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Công ty CP thuốc thú y

Marphavet đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp và các cơ

quan đoàn thể đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên tôi

hoàn thành luận án./.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Tác giả luận án

Đỗ Tất Đạt

ii

MỤC LỤC

Lời cam đoan ..................................................................................................................... i

Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii

Mục lục .............................................................................................................................. i

Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................................. v

Danh mục bảng ............................................................................................................... vii

Danh mục hình ................................................................................................................. ix

Trích yếu luận án .............................................................................................................. x

Thesis abstract ................................................................................................................. xii

Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1

1.1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1

1.2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................................ 3

1.2.1. Mục tiêu chung ..................................................................................................... 3

1.2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................................... 3

1.3. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 3

1.3.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 3

1.3.2. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 3

1.4. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................ 4

1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 4

1.5.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................. 4

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................... 4

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 5

Tình hình nghiên cứu trên thế giới về bệnh viêm phổi ở lợn và vacxin 2.1.

phòng bệnh ............................................................................................................ 5

Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam về bệnh viêm phổi ở lợn và vacxin 2.2.

phòng bệnh .......................................................................................................... 12

2.3. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi ở lợn ............... 14

2.3.1. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae .......................................................................... 14

2.3.2. Bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra ở lợn ....................... 17

2.4. Vi khuẩn Pasteurella multocida và bệnh viêm phổi ở lợn ................................. 19

2.4.1. Vi khuẩn P. multocida ........................................................................................ 19

2.4.2. Bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn P. multocida gây ra ........................................ 21

i

2.5. Vi khuẩn Streptococcus suis và bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn ......................... 25

2.5.1. Vi khuẩn S. suis .................................................................................................. 25

2.5.2. Bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn ................................................................. 29

2.6. Các chất bổ trợ thường dùng trong sản xuất vacxin ........................................... 30

2.6.1. Chất bổ trợ của vacxin ........................................................................................ 30

2.6.2. Muối khoáng ....................................................................................................... 33

2.6.3. Chất nhũ tương ................................................................................................... 33

2.6.4. Cytokine .............................................................................................................. 35

2.6.5. Saponin ............................................................................................................... 35

2.6.6. Các chất cao phân tử ........................................................................................... 35

Phần 3. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu ........................................... 36

3.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................... 36

3.2. Thời gian nghiên cứu .......................................................................................... 36

3.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 36

3.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 37

3.4.1. Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do

vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra .......................... 37

3.4.2. Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của bộ giống sản

xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae,

P. multocida và S. suis gây ra ............................................................................ 37

3.4.3. Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh

viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis

gây ra ................................................................................................................... 37

3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 38

3.5.1. Phương pháp nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn

mắc bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. mutocida và S. suis gây ra ........ 38

3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của

giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae,

P. multocida và S. suis gây ra ............................................................................. 41

3.5.3. Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu

phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae,

P. multocida và S. suis gây ra ............................................................................. 43

ii

3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 50

Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 51

4.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc

bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra .................... 51

4.1.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc

bệnh do vi khuẩn A. pneumoniae gây ra ............................................................. 51

4.1.2. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc

bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra ................................................................ 54

4.1.3. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc

bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra ........................................................................... 56

4.2. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất

vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và

S. suis gây ra ....................................................................................................... 59

4.2.1. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất

vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra ............................ 59

4.2.2. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất

vacxin phòng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra .......................................... 65

4.2.3. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất

vacxin phòng bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra .................................................... 70

4.3. Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh

viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và

S. suis gây ra ....................................................................................................... 75

4.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng

bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis

gây ra ................................................................................................................... 75

4.3.2. Kết quả đánh giá chất lượng vacxin bán thành phẩm ........................................... 77

4.3.3. Kết quả so sánh khả năng sinh miễn dịch của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và

vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu chống lại vi khuẩn A. pleuropneumoniae,

P. multocida và S. suis .......................................................................................... 83

4.3.4. Kết quả xác định liều tiêm vacxin viêm phổi lợn ............................................... 90

4.3.5. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu

phòng bệnh viêm phổi ở lợn ............................................................................... 92

iii

4.3.6. Kết quả xây dựng quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu

phòng bệnh viêm phổi cho lợn............................................................................ 99

Phần 5. Kết luận và đề nghị ....................................................................................... 103

5.1. Kết luận ............................................................................................................. 103

5.2. Đề nghị .............................................................................................................. 104

Danh mục công trình khoa học đã công bố có liên quan đến luận án .......................... 105

Phụ lục.......................................................................................................117

Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 106

iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

Amino acid aa

A. pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae

Brain Heart Infusion BHI

BNNPTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

Base pair Bp

Confidence Interval CI

CHLB

Cộng hòa liên bang

Cộng sự cs

Deoxyribonucleic acide DNA

Deoxyribonucleoside triphosphate dNTP

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ELISA

Food and Agriculture Organization FAO

Huyết thanh HT

Khoa học kỹ thuật KHKT

M. hyopneumoniae Mycoplasma hyopneumoniae

NAD

Nicotinamide adenine dinucleotide

Nhà xuất bản NXB

Office International des Epizooties OIE

P. multocida Pasteurella multocida

Polymerase Chain Reaction PCR

Pleuropneumonia-like organism PLLO

Ribonucleic acid RNA

RT-PCR

Reverse transcription polymerase chain reaction

S. suis Streptococcus suis

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

THB Todd Hewitt Broth

TN Thí nghiệm

TSB Tryptic Soy Broth

TT Thông tư

v

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

TYE Tryptone Yeast Extract Broth

TW Tryptone water

USA United States of America

USD United States dollar

VNUA Vietnam National University of Agriculture

vi

DANH MỤC BẢNG

Thứ tự Tên bảng Trang

3.1. Trình tự mồi dùng để xác định gen omlA của A. pleuropneumoniae .................. 39

3.2. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định serotype A, D của Pasteurella

multocida ............................................................................................................... 40

3.3. Trình tự mồi dùng để xác định gen gdh của Streptococcus suis theo tiêu

chuẩn quốc gia- TCVN 8400-2:2010 ................................................................... 40

3.4. Thành phần phản ứng ........................................................................................... 40

3.5. Chu trình nhiệt ...................................................................................................... 40

3.6. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định gen quy định sản sinh ba loại độc tố

Apx của A. pleuropneumoniae ............................................................................. 41

3.7. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định một số gen mã hoá các yếu tố độc

lực của Streptococcus suis .................................................................................... 42

3.8. Trình tự các mồi dùng để xác định các serotype 1, 2, 7, 9 của Streptococcus

suis ........................................................................................................................ 42

4.1. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của vi khuẩn A. pleuropneumoniae ...... 51

4.2. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm

A. pleuropneumoniae ............................................................................................ 52

4.3. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của vi khuẩn P. multocida................ 54

4.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm

P. multocida .......................................................................................................... 55

4.5. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của vi khuẩn S. suis ......................... 56

4.6. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm S. suis ........ 58

4.7. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất A. pleuropneumoniae ..... 61

4.8. Kết quả xác định gen sản sinh độc tố của giống sản xuất A. pleuropneumoniae ....... 62

4.9. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn A. pleuropneumoniae ...... 65

4.10. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất P. multocida ................... 67

4.11. Kết quả xác định yếu tố độc lực của giống sản xuất P. multocida ....................... 68

4.12. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn P.multocida ............. 70

4.13. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất S. suis ............................. 72

4.14. Kết quả xác định yếu tố độc lực của giống sản xuất S. suis ................................. 73

4.15. Kết quả xác định serotype của các chủng S. suis ................................................. 74

vii

4.16. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn S. suis ...................... 74

4.17. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp lên men sục khí ........................... 76

4.18. Kết quả kiểm tra đậm độ, thuần khiết và vô trùng của lô giống đơn giá.............. 77

4.19. Kết quả kiểm tra thuần khiết và vô trùng của vacxin đa giá bán thành phẩm ...... 78

4.20. Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin bán thành phẩm trên chuột nhắt trắng ........ 79

4.21. Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin bán thành phẩm trên lợn ............................ 79

4.22. Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp

thay thế ................................................................................................................. 80

4.23. Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin trên lợn bằng phương pháp trọng tài ............... 82

4.24. Kết quả kiểm tra kháng thể trên lợn tiêm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng viêm

phổi lợn kháng lại vi khuẩn A. pleuropneumoniae (serotype 2, serotype 5a,

serotype 5b), P. multocida (serotype A, serotype B), và S. suis serotype 2 ......... 84

4.25. Kết quả so sánh hình thành kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae

của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu bằng

phương pháp ELISA ............................................................................................. 86

4.26. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P. multocida của vacxin

đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu ....................................... 88

4.27. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn S. suis của vacxin đa giá

bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu ................................................. 89

4.28. Kết quả xác định kháng thể ở lợn tiêm vacxin với liều tiêm khác nhau .............. 90

4.29. Kết quả thử hiệu lực của vacxin bảo quản ở nhiệt độ 18 - 25oC trên chuột

nhắt trắng bằng phương pháp thay thế (Canh trùng tiêm: A.pp + P. multocida

+ S. suis) ............................................................................................................. 101

4.30. Kết quả thử hiệu lực của vacxin bảo quản ở nhiệt độ 4o- 8oC trên chuột nhắt

trắng bằng phương pháp thay thế. ...................................................................... 102

viii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

3.1. Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin viêm phổi đa giá bổ trợ nhũ dầu .................... 44

4.1. Một số bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm A.pleuropneumoniae ............. 52

4.2. Sản phẩm của kỹ thuật PCR xác định vi khuẩn A. pleuropneumoniae ................ 53

4.3. Một số bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm P. multocida ......................... 55

4.4. Sản phẩm của kỹ thuật PCR xác định vi khuẩn P. multocida .............................. 56

4.5. Một số triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm S. suis ... 58

4.6. Sản phẩm của kỹ thuật PCR xác định S. suis ....................................................... 59

4.7. Khuẩn lạc A. pleuropneumoniae và thái vi khuẩn khi soi trên kính hiển vi ........ 60

4.8. Sản phẩm PCR xác định độc tố Apx của A. pleuropneumoniae .......................... 63

4.9. Vi khuẩn A1 là A. pleuropneumoniae và có chứa gen apxIICA, apxIIICA,

apxIBD và apxIIIBD ............................................................................................ 63

4.10. Vi khuẩn A2 là A. peuropneumoniae và có chứa gen apxICA, apxIICA và

apxIBD ................................................................................................................. 63

4.11. Vi khuẩn A3 là A. pleuropneumoniae và có chứa gen apxIIICA, apxIBD và

apxIIIBD ............................................................................................................... 64

4.12. Khuẩn lạc P. multocida và thái vi khuẩn khi soi trên kính hiển vi ...................... 66

4.13. Sản phẩm của phản ứng PCR xác định serotype của P. multocida ...................... 68

4.14. Mẫu P4 là vi khuẩn P. multocida thuộc Serotype A ............................................ 69

4.15. Mẫu P5 là vi khuẩn P. multocida thuộc Serotype D ............................................ 69

4.16. Khuẩn lạc S. suis và thái vi khuẩn khi soi trên kính hiển vi ................................ 71

4.17. Vi khuẩn St là vi khuẩn S. suis và có chứa gen sly, mrp và arcA ....................... 73

ix

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Đỗ Tất Đạt

Tên luận án: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis và sử dụng

vacxin phòng bệnh

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Xác định được đặc điểm biến đổi bệnh lý của lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra.

Xây dựng quy trình sản xuất và quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ

nhũ dầu đạt hiệu quả cao trong phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn Actinobacillus

pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra.

Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn và giám định đặc tính sinh hóa.

- Phương pháp PCR xác định Actinobacillus pleuropneumoniaevà các độc tố của

vi khuẩn.

- Phương pháp PCR xác định Pasteurella multocida và các serotype của vi khuẩn.

- Phương pháp PCR xác định Streptococcus suis serotype 2 và các độc tố của

vi khuẩn.

- Phương pháp đánh giá độc lực vi khuẩn trên chuột và lợn.

- Phương pháp chế tạo vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu.

- Phương pháp kiểm nghiệm vacxin.

- Phương pháp xử lý số liệu.

Kết quả chính và kết luận

Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh

viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và

Streptococcus suis gây ra

Các chủng vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và

Streptococcus suis được lựa chọn để gây bệnh thực nghiệm trên lợn đều có độc lực cao,

gây chết lợn trong thời gian ngắn. Các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn

gây nhiễm Actinobacillus pleuropneumoniae bao gồm: sốt, khó thở, ho, hắt hơi, bỏ ăn,

x

viêm dính phổi và thành ngực, bọt khí nhầy lẫn máu nhiều trong khí quản. Các triệu chứng

lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn gây nhiễm Pasteurella multocida bao gồm: sốt, ho,

thở khó, da đỏ tím và viêm phổi thùy. Các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của

lợn gây nhiễm Streptococcus suis bao gồm: sốt, ho, thở khó, có triệu chứng thần kinh,

viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não.

Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin

phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae,

Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra

Giống sản xuất của các chủng vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae,

Pasteurella multocida và Streptococcus suis được kiểm tra sự ổn định về đặc tính sinh học

và đều đạt tiêu chuẩn về đặc điểm nuôi cấy, hình thái, sinh hóa cũng như yếu tố độc lực.

Kết quả nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng

bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella

multocida và Streptococcus suis gây ra

Quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bao gồm các bước như sau:

- Sản xuất kháng nguyên Actinobacillus pleuropneumoniae

- Sản xuất kháng nguyên Pasteurella multocida

- Sản xuất kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus suis serotype 2

- Pha trộn các loại kháng nguyên với nhũ dầu IMS để chế tạo bán thành phẩm

- Kiểm nghiệm bán thành phẩm với các chỉ tiêu vô trùng, an toàn, hiệu lực

Quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn

như sau:

- Lợn từ 21 ngày tuổi, sau cai sữa: tiêm 1 mũi 1 duy nhất: 2 ml/con cho lợn 21 đến

28 ngày tuổi.

- Lợn nái chửa: 1 năm tiêm 2 lần, mỗi 1 lần tiêm cần tiêm 2 mũi khác nhau:

+ Mũi 1: 2 ml/con, tiêm cho lợn nái chửa trước khi đẻ 1 tháng

+ Mũi 2: 2 ml/con, sau mũi 1: 7 đến 10 ngày

- Lợn đực giống: 1 năm tiêm 2 lần, mỗi 1 lần tiêm cần tiêm 2 mũi khác nhau:

+ Mũi 1: 2 ml/con

+ Mũi 2: 2 ml/con cách mũi tiêm 1 từ 7 đến 10 ngày.

xi

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Do Tat Dat

Thesis title: Study on pathological features of swine pneumonia caused by Actinobaccilus

pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis and vaccine development.

Major: Veterinary pathology and therapeutics of the diseases of domestic animals

Code: 9.64.01.02

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

Identify pathological characteristics of pigs infected with Actinobacillus

pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Streptococcus suis.

Building the process of producing and using inactivated multiple oil-emulsion

vaccine with oil emulsions, which are the most effective.

Materials and Methods

- Bacterial culturing and biochemical characterization tests

- PCR for determining Actinobacillus pleuropneumoniaeand bacterial toxins

- PCR for determining Pasteurella multocida and bacterial serotypes

- PCR for determining Streptococcus suis serotype 2 and bacterial toxins

- Virulent tests in mice and pigs

- Producing inactivated multiple vaccine with oil emulsifiers

- Vaccine testing method

- Data analysis

Main findings and conclusions

Research results of clinical symptoms, gross lesions of pigs infected by

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Streptococcus suis

The strains of Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and

Streptococcus suis selected to cause experimental disease in pigs are highly pathogenic

and cause death in a short time. Clinical symptoms and general lesions of pigs infected

with Actinobacillus pleuropneumoniaeinclude: Fever, breathing difficulty, cough,

sneezing, anorexia, pleurisy, mucous and blood bubbles in the trachea. Clinical symptoms

and general lesions of pigs infected with Pasteurella multocida include fever, cough,

breathing difficulty, purple-red skin and lobar pneumonia. Clinical symptoms and general

xii

lesions of pigs infected with Streptococcus suis include fever, cough, breathing difficulty,

neurological symptoms, pneumonia, arthritis, meningitis.

Results of evaluating the stability of biological properties of the working seeds of

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Streptococcus suis

Working seeds of Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and

Streptococcus suis tested for biological stability all met the criteria of culture,

morphology, biochemistry as well as virulence factors.

Results of research on process of producing inactivated oil-emulsion polyvalent

vaccine to prevent respiratory disease in pigs caused by Actinobacillus

pleuropneumoniae, Pasteurella multocida and Streptococcus suis

The process of manufacturing inactivated multiple vaccines includes the following

steps:

- Producing antigen of Actinobacillus pleuropneumoniae

- Producing antigen of Pasteurella multocida

- Producing antigen of Streptococcus suis serotype 2

- Mix antigens with IMS oil emulsion to make semi-finished products

- Testing of semi-finished products for sterility, purity, safety and potency

The process of using inactivated oil emulsion multiple vaccines to prevent

pneumonia in pigs is as follows:

- Pigs from 21 days of age, after weaning: Only onetime injection: 2ml/pig of 21 to

28 days old.

- Pregnant sows: 2 injections a year, each is seperated into 2 different injections:

+ The 1st injection: 2 ml/pig, give pregnant sows a month before farrowing

+ The 2nd injection: 2 ml/pig after 7 - 10 days

- Boars: 2 injections a year, each is seperated into 2 different shots:

+ The 1st injection: 2 ml/pig

+ The 2nd injection: 2 ml/pig after 7 - 10 days

xiii

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Trong ngành công nghiệp chăn nuôi ở Việt Nam thì chăn nuôi lợn đóng

vai trò quan trọng. Tính đến đầu năm 2020, mặc dù ngành chăn nuôi lợn nước

ta đã phải trải qua đợt dịch tả lợn Châu Phi gây thiệt hại nặng nề, tổng số lợn

trong cả nước vẫn còn khoảng 20 triệu lợn (Tổng cục Thống kê, 2020). Tuy

nhiên, ngành chăn nuôi lợn vẫn luôn phải gánh chịu nhiều thiệt hại do những

bệnh truyền nhiễm khác gây ra, vì vậy việc phòng chống bệnh nhằm giảm thiệt

hại, nâng cao năng suất chăn nuôi luôn cần được coi trọng, phòng bệnh bằng

vacxin là một trong những giải pháp quan trọng.

Trong các bệnh thường gặp trên lợn, những bệnh về đường hô hấp được xếp

vào nhóm bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế. Bệnh đường hô hấp ở lợn hiện nay

nguyên nhân do nhiều mầm bệnh gây ra, trong đó có cả sự kết hợp của virus và vi

khuẩn gây bệnh, khiến việc điều trị bệnh gặp không ít khó khăn. Trong số những

vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp ở lợn, vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae

(A. pleuropneumoniae), Pasteurella multocida (P. multocida) và Streptococcus

suis (S. suis) thường gây viêm phổi kế phát, giết chết rất nhiều lợn ở các lứa

tuổi, đặc biệt quan trọng là lợn sau cai sữa, gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn

nuôi lợn ở nước ta (Cù Hữu Phú & cs., 2005).

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công ty khác nhau nghiên cứu chế tạo

vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn gây ra, như vacxin Porcilis

phòng bệnh phổi cho

lợn do vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae

(M. hyopneumoniae), P. multocida serotype A, D và Bordetella bronchiseptica

(B. bronchiseptica) gây ra của Intervet sản xuất, vacxin M+ PAC và vacxin Myco

Shield phòng bệnh do vi khuẩn M. hyopneumoniae gây ra của Intervet sản xuất,

vacxin Bayovac SuiShot của hãng Bayer chế tạo là vacxin vô hoạt phòng bệnh

viêm phổi cho lợn trên 5 tuần tuổi đã sử dụng 2 chủng A.pleuropneumoniae

serotype 2, 5 và 1 chủng P. multocida serotype D; Vacxin Coglapix phòng bệnh

viêm phổi cho lợn do A. pleuropneumoniae nhưng không ghi rõ là serotype sử

dụng chế vacxin; vacxin Hyogen phòng viêm phổi địa phương do M.

hyopneumoniae ... vv. Như vậy, các vacxin nhập ngoại đã và đang được sử dụng

tại các trang trại chăn nuôi lợn ở nước ta là vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn

1

được chế tạo từ chủng vi khuẩn Actinobacillus hoặc M. hyopneumoniae,

P. multocida nhưng các chủng vi khuẩn sử dụng chế vacxin chưa hoàn toàn phù

hợp với những nguyên nhân gây bệnh viêm phổi ở lợn tại thực địa, đồng thời

vacxin nhập ngoại lại có giá thành cao.

Tại Việt Nam vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh viêm

phổi cho lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, S. suis và P.multocida gây ra

là kế thừa và phát triển từ đề tài cấp Nhà nước kết quả nghiên cứu của Dự án

SXTN đã được nghiệm thu năm 2014 và đưa vào sản xuất của Viện Thú y. Hiện

nay ở nước ta duy nhất có công ty Marphavet sản xuất và được phép lưu hành

vacxin đa giá vô hoạt với bổ trợ keo phèn để phòng viêm phổi cho lợn từ 4 tuần

tuổi trở lên trên phạm vi cả nước. Vacxin được chế tạo là vacxin đa giá vô hoạt

bao gồm cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, S. suis và P. multocida là

nguyên nhân chủ yếu chủ yếu gây bệnh viêm phổi ở lợn. Tuy nhiên việc sử dụng

bổ trợ keo phèn trong chế tạo vacxin vẫn có những hạn chế nhất định về hiệu

lực, khả năng gây đáp ứng và độ dài miễn dịch chưa cao.

Hiện nay tại Việt Nam chưa có vacxin viêm phổi đa giá vô hoạt có bổ trợ

nhũ dầu phòng bệnh cho lợn được chế tạo gồm cả 3 loại vi khuẩn

A. pleuropneumoniae, P.multocida và S. suis. Vacxin đa giá có bổ trợ nhũ dầu

sẽ làm tăng hiệu lực phòng bệnh của vacxin, liều vacxin tiêm giảm, đặc biệt

là thời gian miễn dịch của vacxin được kéo dài hơn nhiều nhờ phức hợp nhũ

kháng nguyên. Trong quá trình điều tra nghiên cứu vi khuẩn gây viêm phổi ở

lợn của tác giả Cù Hữu Phú (2011), Nguyễn Thị Thu Hằng & cs. (2009), Lê

Văn Dương (2013) đã xác định được những vi khuẩn gây bệnh viêm phổi ở

lợn tại nước ta chủ yếu là do những vi khuẩn sau: (1) vi khuẩn

A. pleuropneumoniae gồm 3 chủng: 2, 5a, 5b; (2) vi khuẩn P. multocida gồm

2 chủng A, D và (3) vi khuẩn S. suis serotype 2.

Xuất phát từ tình hình thực tiễn của sản xuất, đáp ứng được cơ sở khoa

học cho việc phòng chống bệnh viêm phổi ở lợn, việc nghiên cứu một số đặc

điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do A. pleuropneumoniae, P. multocida và

S. suis và sử dụng vacxin phòng chống bệnh là yêu cầu cần thiết, nhằm đưa ra

các giải pháp phòng trị bệnh viêm phổi ở lợn hiệu quả cao, giảm thiệt hại cho

nghành chăn nuôi lợn.

2

1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1. Mục tiêu chung

Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý và xây dựng giải pháp phòng chống

bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis bằng vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu.

1.2.2. Mục tiêu cụ thể

- Xác định được đặc điểm biến đổi bệnh lý chủ yếu của lợn mắc bệnh viêm

phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.

- Xây dựng quy trình sản xuất và quy trình sử dụng, bảo quản vacxin viêm

phổi đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi có hiệu quả cao trên đàn lợn cho người chăn nuôi.

1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1. Đối tượng nghiên cứu

- Bộ giống vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b ; vi khuẩn

P. multocida serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2 được sử dụng làm giống

gốc (Master seed) lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin Công ty Marphavet.

- Lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida

và S. suis gây ra.

1.3.2. Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu các đặc tính vi sinh vật hóa học, cấu trúc

kháng nguyên, độc lực và khả năng sử dụng làm chủng giống sản xuất vacxin của các vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; vi khuẩn P. multocida

serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2 được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin Công ty Marphavet.

Địa điểm nghiên cứu gồm: Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia; Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam; Phòng thí nghiệm trọng điểm khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin; nhà máy sản xuất vacxin theo tiêu chuẩn GMP WHO thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavet và một số cơ sở chăn nuôi lợn.

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 6 năm 2020

3

1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Chế tạo thành công vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a, 5b; P. multocida serotype A, D và S. suis serotype 2 gây ra tại Việt Nam ở quy mô phòng thí nghiệm.

- Xây dựng được quy trình sản xuất, sử dụng và bảo quản vacxin đa giá vô

hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn lần đầu tiên tại Việt Nam ở quy mô phòng thí nghiệm. Vacxin đa giá phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn

A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra trên lợn, có chất bổ trợ nhũ

dầu đầu tiên được sản xuất tại Việt Nam, giúp tăng hiệu quả phòng bệnh, kéo dài thời gian miễn dịch và khả năng bảo hộ so với vacxin cùng loại có bổ trợ keo phèn.

1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã góp phần bổ sung thêm các thông tin về

quy trình sản xuất, sử dụng và bảo quản vacxin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm

phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra tại

Việt Nam tại quy mô phòng thí nghiệm. Kết quả này đồng thời là cơ sở cho việc

nghiên cứu sản xuất vacxin đa giá có chất bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn trên dây chuyền sản xuất vacxin quy mô công nghiệp.

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả gây bệnh thực nghiệm với các vi khuẩn A. pleuropneumoniae,

P. multocida và S. suis cùng với bệnh tích lâm sàng của lợn mắc bệnh được sử

dụng là phương pháp chẩn đoán lâm sàng bệnh viêm phổi do vi khuẩn

A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra cho lợn nhanh chóng, có hiệu quả kinh tế cao.

- Vacxin vô hoạt đa giá nhũ dầu sản xuất thành công sẽ được sử dụng rộng

rãi trong thực tế sản xuất, góp phần khống chế hiệu quả bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra ở lợn nuôi tại Việt Nam.

4

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ BỆNH VIÊM PHỔI Ở LỢN VÀ VACXIN PHÒNG BỆNH

Bệnh viêm phổi - màng phổi được Pattison phát hiện lần đầu tiên vào năm 1957 (Pattison & cs., 1957) và đã được Shope (1964) mô tả ca bệnh cấp tính với các triệu chứng tương tự ở đàn lợn nuôi tại một trang trại thuộc Argentina và gọi tên mầm bệnh là Haemophilus pleuroneumonia. Về sau, với kết quả nghiên cứu ADN, Haemophilus pleuroneumonia được xếp vào giống Actinobacillus và được đặt tên là Acitinobacillus pleuropneumoniae. Đây là một cầu trực khuẩn gram âm, có giáp mô. Hiện có 15 serotype được phân bố theo từng vùng. Mỗi serotype có thể tạo ra ngoại độc tố Apx I, II hoặc III. Các ngoại độc tố này chính là tác nhân chính gây thương tổn trên phổi và làm giảm năng suất của lợn (Herczeg & cs., 2014). Các serotype có độc lực cao là 1, 5, 9, 11 và 12 và các serotype có độc thấp là 3 và 6. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra thiệt hại rất lớn. Trong trường hợp cấp tính, tỉ lệ chết có thể lên đến 15% (Krejci & cs., 2011). Trong trường hợp mãn tính, A. pleuropneumoniae làm giảm 84g tăng trọng/ngày, tăng tiêu tốn thức ăn, đồng thời tăng thời gian xuất chuồng thêm 6 ngày (Rohrbach & cs., 1993). Trên thế giới, phòng chống và kiểm soát bệnh viêm phổi - màng phổi cho lợn có thể được thực hiện theo một số phương thức khác nhau. Các vacxin đã được nghiên cứu và phát triển cho căn bệnh này chủ yếu ở hai nhóm chính là vacxin chứa vi sinh vật chết (vô hoạt) và vacxin tiểu đơn vị. Tiêm chủng bằng các vi sinh vật chết cá biệt có thể cho miễn dịch và phản ứng chéo với các kiểu huyết thanh (Nielsen, 1985). Hầu hết các nghiên cứu đã được thử nghiệm trên lợn con, tuy nhiên tiêm chủng cho lợn nái và lợn cái hậu bị cũng đã được thực hiện và cho hiệu quả ở mức nhất định (Torremorell & cs., 1997). Các loại bổ trợ sử dụng trong vacxin có thể tạo ra các tổn thương u hạt không mong muốn tại vị trí tiêm (Straw & cs., 1985). Vacxin sống dựa trên việc sử dụng một đột biến không vỏ bọc của vi khuẩn A. pleuropneumoniae đã được thương mại hóa tại Hoa Kỳ trong những năm 1990 (Inzana & cs., 1993). Vào những năm đầu của thế kỷ 21, một thế hệ vacxin mới, vacxin tiểu đơn vị bao gồm ba ngoại độc tố RTX chính (ApxI, ApxII, và ApxIII) và một protein 42 kDa bên ngoài màng của A. pleuropneumoniae đã được nghiên cứu cho thấy có khả năng bảo vệ cao chống lại tất cả 12 kiểu huyết thanh chính (kiểu huyết thanh 1-12) trong điều kiện thí nghiệm cũng như trong các thử nghiệm thực tế (Van Den Bosch & Frey, 2003).

5

Bệnh viêm phổi do Pasteurella gây ra là kết quả của sự lây nhiễm của vi khuẩn P. multocida cho phổi. Bệnh thường thấy ở giai đoạn cuối của bệnh viêm phổi cục bộ hay ở những bệnh ghép ở đường hô hấp ở lợn (PRDC). Hội chứng này là một trong những bệnh gây thiệt hại cho lợn đặc biệt khi chúng sản sinh tăng lên. Những tài liệu đã công bố thừa nhận rằng những tổn thương ở bệnh viêm phổi khi giết mổ rất điển hình, thậm chí cả ở những đàn lợn được quản lý tốt. Những báo cáo qua nghiên cứu nhiều năm tập chung ở lợn với những bệnh tích viêm phổi tại lúc mổ khám dao động từ thấp là 30% đến cao nhất là 80%. Những số liệu gần đây tại Mỹ cho thấy trong 6634 mẫu lấy từ lợn để kiểm tra phổ biến là 74% lợn bị viêm phổi và 13 % với chứng viêm màng phổi.

Theo Bahnson (1994) với tất cả những đàn đã được nghiên cứu cho thấy một số những con vật với những bệnh tích nổi bật ở dạng viêm phổi khi giết mổ. Bệnh viêm phổi ở lợn trên thực tế là một bệnh gây thiệt hại về kinh tế mặc dù hiện nay việc tính toán những tổn thất gây ra thật khó khăn và đã có nhiều những kết quả đã được công bố trên diện rộng. Noyes & cs. (1990), đã thực hiện một nghiên cứu chụp ảnh X quang phổi lợn trong đàn lợn thương mại để đánh giá quá trình mang bệnh viêm phổi và đã tìm ra một sự tương giao quan trọng giữa phạm vi của thời gian tồn tại những tổn thương ở phổi và trọng lượng của những con vật đó ở 180 ngày tuổi. Bahnson (1994) đã so sánh những lô lợn đã đến hạn giết mổ được chuyển để giết thịt, lô mà được đánh giá cao nhất về bệnh viêm phổi đã có 7,8% thấp hơn tỷ lệ thực tế, sự khác biệt này có thể xem như sự tác động kinh tế.

Bệnh viêm phổi do Pasteurella xuất hiện rộng khắp trên thế giới và ở tất cả các điều kiện khí hậu và chăn nuôi. Hệ thống không mầm bệnh đặc biệt (SPF) ở cấp quốc gia đã đạt được mức độ kiểm soát triệt để loài Mycoplasma hyopneumoniae. Tuy nhiên vi khuẩn P. multocida thường cư trú ở đường hô hấp (mũi) của lợn do vậy thực sự rất khó tiêu diệt và nó có thể tìm thấy trong các đàn lợn có tình trạng sức khoẻ khá tốt, như vậy bằng SPF hay những đàn mắc bệnh thâp nhất. Từ đó vi khuẩn P. multocida gây bệnh kết hợp với những tác nhân khác, sự tiêu diệt tận gốc vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae cũng không mang lại điều kiện khống chế bệnh viêm phổi hoàn toàn.

Ở Đức và Hà Lan, P. multocida được coi là tác nhân gây bệnh khởi đầu quan trọng ở PAR (viêm teo mũi tiến triển). Điều trị bằng thuốc và vacxin, với những vacxin phòng Bordetella trong các đàn lợn bị PAR sẽ làm giảm B. bronchiseptica nhưng lại ảnh hưởng đến bệnh PAR. ở những đàn này P. multocida được tìm thấy

6

như là một tác nhân chính. Khi làm giảm P. multocida trong những đàn này là giảm bệnh PAR.

P. multocida phát triển trong chất nhầy bán dung dịch trên thành màng nhầy của mũi chứ không phải trên các biểu mô của mũi, bởi vậy những nghiên cứu này trực tiếp nghiên cứu từ việc gây bệnh. Gây bệnh thuần khiết của cả hai serotype A và D của P. multocida làm cho mũi yếu dần đi với nhiều con lợn thí nghiệm. Nhỏ dịch gây bệnh thuần khiết P. multocida vào mũi và nhỏ nhắc lại 4 ngày để tạo ra P. multocida mà đã cho kết quả PAR. Độc tố P. multocida vẫn gây ra bệnh teo, bao gồm cả những ảnh hưởng với lợn 12 và 16 tuần tuổi. Sự khác về sự tổn thương mũi làm giảm sự tăng trưởng của độc tố P. multocida.

Những ghi nhận đầu tiên về bệnh do S. suis gây ra ở lợn được Jansen và Van Dorssen mô tả ở Hà Lan vào năm 1951 và tại Anh vào năm 1954 (Field & cs., 1954). De Moor (1963) lần đầu tiên đã phân lập được vi khuẩn Streptococcus gây dung huyết dạng alpha, dựa vào kết quả giám định đặc tính sinh hóa và định serotype đã xếp vào nhóm Lancefield R, S, RS và T. Elliott & cs. (1966) thấy rằng các vi khuẩn nhóm S do Moor phân lập giống với PM Streptococcus mà ông phân lập đều thuộc nhóm Lancefield D và đề nghị gọi là S. suis serotype 1. Windsor & Elliott (1975) đã phân lập chủng S. suis tương ứng với nhóm R do Moor phân lập và đề nghị gọi là S. suis serotype 2. Clifton-Hadley (1984) thông báo phân lập được vi khuẩn S. suis thuộc nhóm T từ hạch amidan, dịch âm đạo và bao quy đầu của lợn và được Gottschalk & cs. (1989) gọi là S. suis serotype 15.

Theo Thacker (2006) dịch viêm phổi địa phương là kết quả của sự nhiễm vi

suis, Haemophilus parasuis hay A. pleuropneumoniae. Vi khuẩn

khuẩn M. hyopneumoniae và những vi khuẩn cộng phát khác như P. multocida, S. M. hyopneumoniae được tìm thấy chủ yếu trên bề mặt màng nhầy của khí quản, phế quản và phế nang. Dấu hiệu ban đầu của sự nhiễm bệnh chính là vi khuẩn này bám trên biểu mô nhung mao. Zhang & cs. (1995) đã xác định protein P97 của vi khuẩn là yếu tố bám dính vào vi nhung mao. Các yếu tố bám dính khác có thể kể đến gồm: glycoprotein 110 kDa, protein P159 được tách sau khi đồng hoán với các protein kDa 27, 51, và 110 và một protein 146kDa. M. hyopneumoniae tác động lên hệ thống làm sạch trên màng nhầy bằng cách phá vỡ hệ thống nhung mao trên bề mặt biểu mô, và làm biến đổi hệ miễn dịch trên đường hô hấp. Vì thế, M. hyopneumoniae khiến cho lợn dễ bị nhiễm các bệnh hô hấp khác như các vi khuẩn, kí sinh trùng và vi rút. Trên thế giới đã có một số nước sản xuất được vacxin phòng bệnh suyễn lợn như vacxin vô hoạt bổ trợ dầu Respisure của hãng Pfizer; vacxin M+PAC của hãng

7

Schering Plough Animal Health - Anh quốc và vacxin HYORESP của hãng Merial là loại vacxin vô hoạt bổ trợ Aluminium.

Cho đến nay, hầu hết các loại vacxin được sử dụng trong lĩnh vực thú y để chống lại các bệnh nhiễm khuẩn S. suis ở lợn là những chất bacterin thương mại đều cho những kết quả chưa cao (Reams & cs., 1996; Torremorell & cs., 1997; Halbur & cs., 2000). Nguyên nhân đến nay vẫn chưa được xác định rõ ràng, tuy nhiên các nhà khoa học cho rằng có thể là do sự thay đổi của các kháng nguyên bảo vệ hoặc mất tính kháng nguyên của vi khuẩn gây ra bởi nhiệt hoặc do xử lý bằng formalin (Holt & cs., 1990) và tính miễn dịch yếu của vi khuẩn có vỏ bọc (Del Campo Sepulveda & cs., 1996). Sự khác biệt về mức kháng thể có trong lợn con ở các nhóm tuổi có thể là do sự khác biệt về mức kháng thể từ mẹ và tỷ lệ hấp thu các kháng thể từ mẹ của lợn con. Ngoài ra, tá dược sử dụng cũng đóng một vai trò quan trọng (Wisselink & cs., 2001) cho thấy một bacterin với chất nhũ tương nước, trong dầu như một tá dược đã cho các kết quả tốt hơn so với cùng bacterin nhưng với tá dược là hydroxide nhôm.

Các nhà khoa học cũng đã chế tạo thử nghiệm nhiều loại vacxin khác nhau như vacxin toàn khuẩn, vacxin sống nhược độc, vacxin tiểu phần (chế từ kháng nguyên giáp mô hoặc các protein thành tế bào). Tuy nhiên, kết quả cho miễn dịch bảo hộ ở chuột hoặc lợn thí nghiệm được tiêm các loại vacxin này cũng rất thất thường và không ổn định. Trong trường hợp cần khống chế dịch bệnh lây lan thì việc lựa chọn dùng vacxin vẫn là phương thức tối ưu nhất để bảo vệ đàn lợn. Tại Trung Quốc, năm 1994 đã dùng vacxin đông khô chế từ chủng nhược độc của vi khuẩn S. suis chủng ST171, tiêm cho lợn từ cai sữa đến trưởng thành và nái có chửa ở thời kỳ đầu cho kết quả phòng bệnh cao. Khi sử dụng cho thêm nước muối sinh lý có bổ trợ keo phèn 20% hòa thành huyễn dịch tiêm dưới da hoặc tiêm bắp với liều 1ml/con. Sau khi tiêm 7 ngày đã sinh miễn dịch, miễn dịch cao nhất sau 14 ngày và thời gian miễn dịch kéo dài được 6 tháng. Sau đó vào năm 2005, tại Trung Quốc cũng đã kiểm soát được bệnh do S. suis gây ra ở lợn bằng vacxin vô hoạt chế từ các chủng S. suis serotype 2.

Do tầm quan trọng gây tổn thất kinh tế cao của bệnh viêm phổi - màng phổi trong ngành chăn nuôi lợn công nghiệp, đã kích thích các nhà khoa học nghiên cứu chuyên sâu trong những năm qua nhằm phát triển vacxin A. pleuropneumoniae để phòng bệnh. Nhiều nghiên cứu đã được thông báo và một số vacxin đã được đưa ra thị trường. Sự phát triển vacxin A. pleuropneumoniae bắt đầu từ vacxin vô hoạt toàn khuẩn, tiếp theo là vacxin tiểu phần (vacxin subunit), vacxin sống nhược độc

8

và hiện nay các nhà nghiên cứu đang phát triển vacxin ADN.

* Vacxin vô hoạt toàn khuẩn:

Vacxin A. pleuropneumoniae vô hoạt toàn khuẩn được coi là một vacxin thương mại “thế hệ đầu tiên” chống lại nhiễm trùng A. pleuropneumoniae, bao gồm vi khuẩn bị bất hoạt bằng nhiệt hoặc formalin. Vacxin vô hoạt có lợi thế là trình diện hết được các yếu tố quyết định kháng nguyên cho hệ thống miễn dịch và không có trường hợp bị cường độc hóa trở lại như vacxin nhược độc. Tuy nhiên, việc sử dụng vacxin A. pleuropneumoniae vô hoạt toàn khuẩn bị hạn chế khi công cường độc và vacxin chỉ có tác dụng bảo vệ được một phần và vẫn còn một tỷ lệ tử vong thấp (Jolie & cs., 1995; Furesz & cs., 1997). Hơn nữa, vacxin vô hoạt toàn khuẩn có miễn dịch bảo hộ chéo kém (Jolie & cs., 1995) và gần như không ngăn được tình trạng mang trùng ở lợn khỏe. Một trong những vấn đề lớn gặp phải trong việc sử dụng vacxin vô hoạt là chỉ có miễn dịch với các serotype tương đồng và thường không bảo vệ được với serotype khác khi công cường độc (Higgins & cs., 1985; Thacker & Mulks, 1988). Hiệu quả thấp của vacxin vô hoạt cũng có thể có liên quan đến miễn dịch dịch thể (Furesz & cs., 1997) và các tế bào bạch cầu hiển thị (Appleyard & cs., 2002; Fenwick & Henry, 1994). Trong thực tế, vacxin toàn khuẩn vô hoạt không để lại vi khuẩn trên đường hô hấp, một vị trí có tầm quan trọng trong kích thích miễn dịch.

* Vacxin vô hoạt toàn khuẩn không vật chất di truyền:

Một phát triển mới đối với vacxin vô hoạt toàn khuẩn đã mở ra một triển vọng cho vacxin A. pleuropneumoniae trên lĩnh vực miễn dịch kháng nguyên đó là vacxin "bóng" được bất hoạt di truyền học, chỉ còn vỏ tế bào trống rỗng, sản sinh bởi chiết xuất có điều khiển của thực khuẩn thể PhiX174 phân hủy gen E. Biểu hiện của gen này từ một plasmid ở vi khuẩn Gram âm dẫn đến việc hình thành một đường hầm E protein cụ thể mà sau đó kết quả là tế bào chất bên trong tế bào thoát ra mà không có bất kỳ một tác động vật lý hay hóa học làm biến đổi cấu trúc bề mặt của vi khuẩn (Witte & cs., 1992).

* Vacxin A. pleuropneumoniae tiểu phần

Các yếu tố độc lực và thành phần của vacxin tiểu phần

+ Vỏ vi khuẩn (capsule) và thành tế bào vi khuẩn (lipopolysaccharide) có tính không đồng nhất cao giữa các serotype theo Perry (1990); Dubreuil & cs. (2000). Vì vậy, tiêm phòng bằng các thành phần này của vi khuẩn không thể bảo hộ tốt chống lại các serotype khác. Do đó, việc nghiên cứu vacxin tiểu phần chủ

9

yếu tập trung vào việc tìm kháng nguyên bảo tồn như OMPs và lipoprotein. Tuy nhiên, các thí nghiệm đánh giá năng lực tiềm năng của OMPs và lipoprotein để gây miễn dịch bảo vệ cho thấy khả năng miễn dịch bị giới hạn khi phân tích bằng miễn dịch đánh dấu với huyết thanh đã miễn dịch theo Cruz & cs. (1996).

(Pleurostar Novartis) có chứa

transferin-binding protein B của

+ Vacxin tiểu phần với các thành phần là các protein trong hệ thống thu nạp sắt của A. pleuropneumoniae đã được chú ý và đánh giá cao như là vacxin tiểu phần A. pleuropneumoniae serotype 7. Kết quả thử nghiệm cho thấy lợn được tiêm vacxin, được bảo hộ một phần khi công cường độc bằng A. pleuropneumoniae serotype 9 (Van Overbeke & cs., 2001). Vacxin chứa FhuA và HgbA là protein bề mặt màng tế bào hấp thụ cho ferrichrome và hemoglobin tương ứng, đã được chứng minh cũng có khả năng bảo hộ miễn dịch với tất cả serotype và bioserotype của A. pleuropneumoniae (Mikael & cs., 2002; Srikumar & cs., 2004; Shakarji & cs., 2006). Ở những lợn gây bệnh thí nghiệm, HgbA đã được xác định như là một yếu tố quan trọng mà độc tính của chúng được quan tâm như một vacxin tiểu phần tiềm năng (Shakarji & cs., 2006).

+ Vacxin tiểu phần với các ngoại độc tố Apx: Apx là ngoại độc tố do

A. pleuropneumoniae sản sinh ra trong quá trình sống, thuộc thành viên của họ độc tố RTX. Apx đại diện cho các yếu tố độc tính chính của A. pleuropneumoniae và được coi là yếu tố miễn dịch mạnh nhất. Tầm quan trọng của độc tố Apx trong miễn dịch bảo vệ chống lại viêm phổi - màng phổi đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu như Inzana & cs. (1991). Kết quả thí nghiệm đã chứng minh lợn đã có miễn dịch trung hòa đối với độc tố Apx sau khi được tiêm Apx vacxin của tác giả Cruijsen Tl & cs. (1992); Jansen & cs. (1994). Hiện nay trên thị trường thế giới, hầu như tất cả các vacxin A. pleuropneumoniae với mục đích thương mại đều là vacxin tiểu phần được gọi là vacxin “thế hệ thứ hai” và có độc tố Apx (Chiers & cs., 1998; Van Overbeke & cs., 2001; Habrun & cs., 2002; Van Den Bosch & Frey, 2003; Tumamao & cs., 2004; Meeusen & cs., 2007).

Tuy nhiên, theo nhiều nghiên cứu thì vacxin tiểu phần có chứa độc tố có nhược điểm là có yếu tố độc tính rất nhiều (ví dụ như các chất độc ApxIV) và đôi khi chỉ được bộc lộ trong điều kiện in vivo (Schaller & cs., 1999). Các nghiên cứu hiện nay vẫn đang tiếp tục tìm kiếm mới trong tự nhiên (in vivo) biểu hiện kháng nguyên miễn dịch sử dụng công cụ mạnh mẽ về di truyền.

* Vacxin A. pleuropneumoniae sống nhược độc

Việc sử dụng các vi khuẩn sống nhược độc sản xuất vacxin có thể dẫn tới

10

việc vi khuẩn lây sang vật chủ trong cùng đàn không được tiêm vacxin, sự lưu hành của vi khuẩn nhược độc trong thực tế là khó kiểm soát và vì thế nếu đặc tính nhược độc không ổn định, vi sinh vật có thể trở lại cường độc hoặc đột biến. Cho dù có một số nhược điểm nhưng vacxin sống nhược độc và vacxin tiểu phần vẫn đại diện cho hướng nghiên cứu hứa hẹn nhất trong lĩnh vực phòng bệnh do A. pleuropneumoniae gây nên.

thuộc serotype 2

Lý do chủ yếu sử dụng vacxin nhược độc sống là một tiếp cận tốt trong phòng chống bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn vì lợn bị nhiễm bệnh sống sót trong tự nhiên có khả năng bảo vệ chống nhiễm trùng cùng loại và một phần với A. pleuropneumoniae khác loại (Nielsen, 1984; Cruijsen & cs., 1995; Haesebrouck & cs., 1996). Điều này cho thấy chỉ có vi khuẩn sống mới có khả năng miễn dịch bảo vệ chéo thông qua điều kiện tự nhiên sản sinh miễn dịch bảo vệ. Theo nghiên cứu của Prideaux & cs. (1998) khi sử dụng chủng A. pleuropneumoniae HS93C Amp sống (thuộc serotype 7 được chèn gen apxIIC bất hoạt) đã phát hiện thấy tiết ra độc tố ApxII không hoạt động và những lợn thí nghiệm đã được bảo hộ chéo với các serotype trước các thí nghiệm công cường độc. Susan & cs. (2005) đã tiến hành nghiên cứu việc tiêm phòng vacxin nhược độc sống đã bất hoạt sản sinh ApxII và đột biến các gen napA, hlyX, fur, tatA. Vacxin được đưa qua đường mũi, kết quả là các lợn thí nghiệm có đáp ứng miễn dịch cao. Park & cs. (2009) cũng sử dụng vacxin sống đã bất hoạt hai gen bài xuất độc tố là apxIIIB và apxIIID với thành chủng đột biến A. pleuropneumoniae 1536 (1536DeltaBDeltaD) cho lợn thí nghiệm, sau đó công cường độc bằng chủng độc ban đầu chưa gây đột biến. Kết quả lợn thí nghiệm có miễn dịch chống lại sau khi công. Như vậy, khi độc tố Apx bị bất hoạt bài xuất có thể làm giảm độc tính của A. pleuropneumoniae và đây có thể là chiến lược hiệu quả cho sự phát triển vacxin nhược độc sống cho A. pleuropneumoniae.

Nghiên cứu về hiệu quả của tiêm phòng vacxin, Ramjeet & cs. (2008b) đã cho thấy hiệu quả của tiêm phòng vacxin sống nhược độc A. pleuropneumoniae an toàn, hiệu quả, ổn định và chi phí sản xuất thấp. Tuy nhiên, việc sử dụng các vi khuẩn sống trong tiêm chủng thường mới chỉ được giới hạn trong các thử nghiệm. Chủng vi khuẩn dùng tiêm phòng thường vẫn tồn tại trong vật chủ cho đến khi giết mổ. Do đó, các nghiên cứu tiếp theo nhằm tăng tính an toàn của vacxin với mục đích cải thiện hiệu quả của vacxin tiểu phần hoặc ADN, sẽ đáp ứng cho nhu cầu của thị trường.

* Vacxin ADN và triển vọng phát triển

11

Với các dữ liệu gen và công nghệ ADN microarray của Ramjeet & cs. (2008a) đã tiến hành nghiên cứu xác định nhiều gen có trong A. pleuropneumoniae nhằm xác định nhân tố mới tiềm năng cho vacxin. Kết quả nghiên cứu gen cho phép xử lý một cách hiệu quả một trong những vấn đề khó khăn nhất gặp phải đối với A. pleuropneumoniae là sự tồn tại của 15 serotype khác biệt. Sử dụng DNA microarrays, các tác giả đã xác định gen được biểu hiện trong điều kiện sao chép giống hệt trong môi trường tự nhiên. Với những kết quả thu được, các tác giả đã xác định mục tiêu tiềm năng mới với serotype và bioserotype trong điều kiện tự nhiên, tiến tới có một vacxin thế hệ mới hoàn thiện cho việc phòng bệnh viêm phổi - màng phổi do A. pleuropneumoniae gây nên trong tương lai gần.

2.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM VỀ BỆNH VIÊM PHỔI Ở LỢN VÀ VACXIN PHÒNG BỆNH

Việt Nam là một nước có số đầu lợn đứng trong top 10 của thế giới, với đà tăng trưởng trong những năm gần đây tương đối khả quan. Tuy nhiên, chúng ta đang phải đối mặt với những vấn đề thách thức như ô nhiễm môi trường chăn nuôi, dịch bệnh… ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất và hiệu quả chăn nuôi lợn. Trong đó có các bệnh viêm phổi do các loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.

Các nghiên cứu ở trong nước cho thấy, khi lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản thường gặp các loại vi khuẩn gây bệnh kế phát trong đường hô hấp như A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis serotype 2, Bordetella bronchiseptica (Nguyễn Hữu Nam & Nguyễn Thị Lan 2007; Bùi Quang Anh & cs. 2008; Nguyễn Thị Kim Lan & cs. 2017; Cù Hữu Phú 2005) đã làm cho dịch trầm trọng với bệnh lý nặng, kéo dài và tỷ lệ chết cao. Theo Lê Văn Dương (2013) tại các ổ dịch lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản tại tỉnh Bắc Giang đã phân lập được các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis, trong đó cao nhất là S. suis (55,10%), tiếp sau là A. pleuropneumoniae (19,59%) và thấp nhất là P. multocida (17,44%). Các tác giả đã nghiên cứu chế tạo Autovaccine từ các chủng vi khuẩn trên phân lập được dùng để phòng bệnh viêm phổi cho lợn, kết quả cho thấy Autovaccine thử nghiệm có khả năng phòng bệnh viêm phổi cho lợn, cho đáp ứng miễn dịch trên bốn tháng và hiệu lực bảo hộ là 93,33%.

Bệnh do P. multocida gây ra thường được gọi là bệnh tụ huyết trùng ở lợn. Bệnh hay xảy ra ở thể cấp tính với biểu hiện sốt rất cao, khó thở, thở thể bụng, kiệt sức. Ở lợn chết và sắp chết có hiện tượng đỏ tím vùng bụng do trúng nội độc

12

tố (Nguyễn Bá Hiên & cs., 2013). Theo Nguyễn Thị Kim Lan & cs. (2017), vi khuẩn P. multocida phân lập tại Bắc Ninh thuộc serotype A và D, có khả năng mẫn cảm với các kháng sinh Ceftiofur, Amoxicillin và Flofeincol. Tại Việt Nam hiện đang lưu hành một số loại vacxin phòng bệnh này như vacxin tụ huyết trùng lợn vô hoạt (Công ty Vetvaco), vacxin tụ huyết trùng lợn (Công ty Hanvet) và vacxin kép tụ huyết trùng-phó thương hàn lợn của Phân viện Thú y miền Trung.

Bệnh viêm phổi - màng phổi gây tổn thất kinh tế nặng nề trong ngành công nghiệp chăn nuôi lợn. Tại Việt Nam, bệnh vẫn chưa được kiểm soát và vẫn xuất hiện ở nhiều nơi trong cả nước. Năm 2018, trong một nghiên cứu về bệnh tại tỉnh Bến Tre, các nhà khoa học đã phân lập được A. pleuropneumoniae với tỷ lệ dương tính là 24,62% thuộc các serotype 4, 6, 9, 10 và 11 (Phan Kim Thanh & cs., 2018). Tại Bắc Ninh theo Nguyễn Thị Kim Lan & cs. (2017) đã phân lập được A. pleuropneumoniae với tỷ lệ dương tính là 63,63% (serotype 2) và 36,36% (serotype 5). Trong những năm qua các nhà khoa học đã nghiên cứu chuyên sâu nhằm phát triển vacxin phòng bệnh này ra thị trường. Hiện đã có một số loại vacxin được nghiên cứu sản xuất gồm các vacxin vô hoạt và vacxin có chứa một số thành phần cấu tạo của vi khuẩn. Vacxin vô hoạt toàn khuẩn đặc hiệu theo chủng huyết thanh, có thể có miễn dịch chéo với các chủng huyết thanh khác. Các vacxin thử nghiệm chủ yếu là vacxin chuồng đơn giá được chế tạo từ vi khuẩn A. pleuropneumoniae bị làm yếu, giảm độc lực, hoặc các vi khuẩn đã chết hoặc các thành phần cấu tạo của chúng dùng theo đường khí dung hoặc đường uống đã cho thấy có tác dụng bảo vệ nhất định. Vacxin dùng tiêm cho lợn con khi kháng thể thụ động nhận được từ lợn mẹ đã giảm đi giúp đàn lợn giảm tỷ lệ tử vong, giảm thuốc điều trị và cải thiện hiệu quả chuyển hoá thức ăn, chất lượng thịt cũng được nâng cao, lợn ít bị viêm phổi. Tại Việt Nam đang lưu hành một số loại vacxin phòng bệnh viêm phổi - màng phổi như Polypleurosin (của hãng Bioveta); vacxin Pleurostar APP và Parapleuro Shield P (của hãng Novartis); vacxin Porcilis APP (của hãng Intervet).

Bệnh liên cầu ở lợn do S. suis gây ra được quan tâm nhiều do vi khuẩn có khả năng lây sang và gây bệnh cho người. Tại Thừa Thiên Huế Bùi Thị Hiền & cs. (2015) đã đánh giá sự lưu hành của liên cầu khuẩn lợn và thấy có 65,83% lợn khỏe mang trùng vi khuẩn Streptococcus và có 17,31% dương tính với S. suis. hiện nay chưa có vacxin đặc hiệu để tiêm phòng cho lợn. Hầu hết các loại vacxin vô hoạt được sản xuất trên thế giới là vacxin chuồng và hiệu quả bảo hộ của các loại vacxin này cũng chưa được xác định một cách rõ ràng. Có thể liệt kê ra một

13

số nguyên nhân của hiện tượng này như sự thoái hoá của kháng nguyên bảo hộ hoặc vi khuẩn bị mất tính kháng nguyên do quá trình xử lý bằng nhiệt hoặc formalin, do sự sản sinh kháng thể đối với các kháng nguyên mà không có liên quan đến độc lực của vi khuẩn và sự thiếu hụt các chủng S. suis hay serotype liên quan đến quá trình sinh bệnh. Ở Việt Nam, từ các kết quả nghiên cứu về bệnh do cầu khuẩn gây ra ở lợn, Khương Thị Bích Ngọc (1996) đã chế tạo vacxin cầu khuẩn chết có bổ trợ keo phèn tiêm phòng cho lợn nái, đạt hiệu quả bảo hộ tương đối cao 70-80%. Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng vacxin liên cầu khuẩn để tiêm phòng cho đàn lợn ở nước ta chưa được phổ biến rộng rãi, bệnh liên cầu khuẩn vẫn thường xuyên xảy ra ở lợn gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi.

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công ty khác nhau nghiên cứu chế tạo vacxin phòng viêm phổi cho lợn do vi khuẩn gây ra. Các vacxin nhập ngoại đã và đang được sử dụng tại các trang trại chăn nuôi lợn tại nước ta nhưng chưa hoàn toàn phù hợp với những nguyên nhân gây viêm phổi ở lợn tại thực địa mà giá thành lại cao. Trong quá trình điều tra nghiên cứu vi khuẩn gây viêm phổi ở lợn của tác giả Cù Hữu Phú (2005); Nguyễn Thị Thu Hằng (2009); Lê Văn Dương (2013) đã xác định được những vi khuẩn gây bệnh hô hấp phức hợp ở lợn tại nước ta chủ yếu là do những vi khuẩn sau: (1) vi khuẩn A. pleuropneumoniae gồm 3 chủng: 2, 5a, 5b; (2) vi khuẩn P. multocida gồm 2 chủng A, D và (3) vi khuẩn S. suis serotype 2.

Ở nước ta hiện tại duy nhất có công ty Marphavet sản xuất và được phép lưu hành vacxin đa giá vô hoạt với bổ trợ keo phèn để phòng viêm phổi cho lợn từ 4 tuần tuổi trở lên trên phạm vi cả nước. Vacxin được chế tạo là vacxin đa giá bao gồm cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a, 5b, P. multocida serotype A và D và S. suis serotype 2 chủ yếu gây viêm phổi ở lợn. Tuy nhiên dùng bổ trợ keo phèn vẫn có những hạn chế nhất định vì hiệu lực và khả năng gây đáp ứng và độ dài miễn dịch chưa cao. Để khắc phục những nhược điểm chủ yếu này việc nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt dùng bổ trợ nhũ dầu thay vì bổ trợ keo phèn là vấn đề đòi hỏi cần thiết hiện nay của sản xuất.

2.3. VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE VÀ BỆNH VIÊM PHỔI Ở LỢN

2.3.1. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae

Vi khuẩn A. pleuropneumoniae là một tác nhân quan trọng gây bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn. Theo Quinn & cs. (2015), bệnh viêm phổi - màng phổi

14

thường xuất hiện ở lợn giai đoạn dưới 6 tháng tuổi. Từ năm 1978, Kilian & cs. (1978) đã đặt tên là Haemophilus pleuropneumoniae, nhưng về sau đã được xếp vào giống Actinobacillus và đặt tên là A. pleuropneumoniae do đã xác định được chúng có sự tương đồng về ADN giữa H. pleuropneumoniae và A. ligrieressi (Pohl & cs., 1983).

A. pleuropneumoniae là loại cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, có vỏ, không có khả năng di động, có tới 95% vi khuẩn này gây dung huyết thạch máu, dung huyết

dạng . Vi khuẩn A. pleuropneumoniae không mọc trên môi trường thạch máu thông thường trừ khi thạch máu được bổ sung NAD và chúng mọc xung quanh các khuẩn lạc của tụ cầu do Staphylococcus aureus (S. aureus trong quá trình phát triển trên thạch máu đã phá huỷ hồng cầu có trong máu và sản sinh ra chất NAD). Vi khuẩn A. pleuropneumoniae hình thành khuẩn lạc 0,5 – 1 mm sau 24 h nuôi cấy trên thạch máu có cấy kèm tụ cầu và hình thành vùng dung huyết , nhất là khi sử dụng máu cừu.

Vi khuẩn A. pleuropneumoniae có 12 serotype, riêng serotype 5 lại được chia thành 5a và 5b. Một số serotype có tính tương đồng kháng nguyên như serotype 1 - 9 và 11, serotype 3, 6 và 8; serotype 4 và 7 (Perry, 1990). Sự phân bố các serotype ở các nước có sự khác nhau: serotype 2 thường gặp ở Thuỵ Điển, Đan Mạch; serotype 1, 5 ở Mỹ và Canada; serotype 1 - 9 ở Mexico; serotype 2, 9, 11 ở Newzealand. Các serotype khác nhau có độc lực khác nhau phụ thuộc vào khả năng sản sinh giáp mô, khả năng dung huyết và yếu tố gây độc tế bào. Các serotype 1, 2, 5, 9, 10 và 11 có độc lực cao hơn các serotype khác.

Ba sản phẩm ngoại tế bào được biết đến nhiều nhất là ba loại độc tố tế bào

thuộc họ RTX của độc tố và được Frey & cs. (1993) đặt tên:

+ ApX I có khả năng gây dung huyết mạnh có trọng lượng phân tử 105-110 kDa, có ở các chủng thuộc serotype 1, 5, 9, 10 và 11 và được mã hoá bởi nhóm gen apx bao gồm apX IC, apX IIA, apX IB và apX ID cho gen hoạt hoá, cấu trúc và 2 gen bài xuất.

+ ApX II là chất dung huyết có trọng lượng phân tử 103 - 105 kDa được thấy ở các chủng trên trừ serotype 10 và được điều khiển bằng những gen tương tự. Các gen bài suất protein được điều khiển bởi ApX I.

+ ApX III là độc tố không gây dung huyết có trọng lượng phân tử 120 kDa được thấy ở chủng thuộc serotype 2, 3, 4, 6 và 8 và quyết định bởi nhóm gen ApX III. Người ta đã xác định được nhiều gen và nhóm gen (ví dụ nhóm gen apx III).

15

Về dịch tễ học: bệnh viêm phổi truyền nhiễm của lợn có phân bố rộng rãi. Nó ngày càng trở nên quan trọng do việc chăn nuôi lợn ngày một phát triển. Bệnh có mặt và lan truyền ở hầu hết các nước châu Âu và một phần ở Mỹ, Canada, Mexico, Nhật Bản, Hàn Quốc và Úc. Mặc dù chỉ một vài chủng huyết thanh là thịnh hành trên những nước nhất định, như chủng huyết thanh 2 ở Thụy Điển, Đức và Thụy Sĩ và chủng huyết thanh 1 và 5 ở Mỹ và Canada nhưng cũng có thể thấy một số chủng huyết thanh ở cùng một nước. Một số chủng huyết thanh (serotype) được coi là ít độc (ví dụ: serotype 3) có độc lực rất thấp và về dịch tễ chúng không quan trọng ở một số nước nhất định nhưng lại có thể gây nên dịch ở một số nước khác (Desrosiers & cs., 1984; Brandreth & Smith, 1985). Mối liên quan quốc tế của các chủng huyết thanh có một ý nghĩa đặc biệt vì nó chỉ ra sự lan truyền bệnh trong quá trình xuất khẩu động vật.

Hofer & cs. (1996) đã tìm thấy ở Áo thường có các chủng huyết thanh 4 - 6 và 10. Clota & cs. (1996) đã thấy rằng một số khu vực của một số nước như Catalonia, Tây Ban Nha có 11 chủng huyết thanh nhưng phần nhiều là 1, 2, 4, 7, 9 và 11.

Thiệt hại kinh tế quan trọng của bệnh chủ yếu là do lợn chết, năng xuất giảm và giá thành cao trong các đợt bệnh bùng nổ. Ở các đàn lợn bị nhiễm khuẩn mãn tính, Hunneman (1996) thấy tốc độ tăng trọng hàng ngày không bị ảnh hưởng, mặc dù một nghiên cứu tiến hành bởi Harley & cs. (1988) cho thấy rằng sự viêm màng phổi khi giết thịt thấy ở các con lợn già hơn 1 ngày tuổi và những con lợn có biểu hiện lâm sàng được giết thịt chậm hơn 8 ngày. Rohrbach & cs. (1993) đã cho thấy rằng sự nhiễm khuẩn ở 1 đàn làm chậm 5,64 ngày sự mổ thịt ở cân nặng 113,6 kg.

A. pleuropneumoniae ký sinh ở đường hô hấp có tính đặc hiệu lớn với lợn. Trong nhiễm trùng tối cấp tính và cấp tính vi khuẩn không chỉ thấy ở các tổn thương ở phổi và ở máu mà còn ở chất tiết đường mũi. Các trường hợp sống sót sau nhiễm khuẩn cấp tính trở thành lợn lành mang bệnh, tác nhân gây bệnh thường thấy ở những vùng hoại tử ở phổi, amidan và ở mũi (Kume & cs., 1984). Thời gian ủ bệnh có thể hoàn toàn đa dạng, người ta thấy rằng tiếp xúc với số lượng lớn của vi khuẩn dẫn đến gây chết động vật sau một vài giờ hoặc sau vài ngày. Sự nhiễm trùng ở mức độ thấp có thể dẫn tới thể bệnh ẩn trên lâm sàng.

Tất cả lợn ở các lứa tuổi đều bị cảm nhiễm, nhưng nhờ có kháng thể trung hoà độc tố nên có sự thay đổi thể bệnh ở những đàn có tính chất bệnh dịch. Trong trường hợp cấp tính của bệnh thì tỷ lệ chết thường cao. Tỷ lệ chết cũng

16

phụ thuộc vào độc lực của vi khuẩn và sự lưu hành bệnh trong môi trường nhưng thường là cao.

thời

rằng việc nhiễm

trùng đồng

thấy

Cả thể bệnh và tỷ lệ tử vong sẽ bị trầm trọng hơn khi có mặt của các bệnh khác như bệnh Aujeszky và hội chứng sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS), mặc dù có nhiều nghiên cứu cho A. pleuropneumoniae và PRRSV không phải lúc nào cũng luôn làm bệnh trầm trọng hơn so với khi nhiễm trùng riêng rẽ (Pol & cs., 1997).

Con đường chính của lan tràn bệnh là do không khí và bệnh được truyền từ con lợn bệnh sang con lợn lành qua tiếp xúc trực tiếp hoặc qua các hạt nhỏ ở những khoảng cách gần. Trong trường hợp bệnh bùng nổ cấp tính, bệnh không nhất thiết xảy ra ở mọi chuồng trại, bởi vì vai trò của các hạt khí dung đã di chuyển theo không khí trong việc lan truyền bệnh ở các khoảng cách dài hơn trong những chuồng trại hoặc sự lây gián tiếp với các chất tiết bị nhiễm trùng từ các con lợn bị ốm cấp tính qua trung gian các công nhân làm việc ở trang trại. Chưa xác định được chắc chắn vai trò trong việc lây truyền bệnh qua các loài gặm nhấm nhỏ hoặc chim. Vi khuẩn này sống sót ở môi trường tự nhiên trong một thời gian ngắn. Tuy nhiên, khi được bảo vệ bởi chất nhầy hoặc các chất hữu cơ khác thì nó có thể sống trong ít ngày và nó có thể sống được 30 ngày ở nước sạch với nhiệt độ 4°C.

2.3.2. Bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra ở lợn

Vi khuẩn A. pleuropneumoniae là một tác nhân chính gây bệnh viêm phổi -

màng phổi ở lợn.

Viêm phổi - màng phổi là một bệnh nhiễm trùng quan trọng ở đường hô hấp của lợn và xảy ra ở hầu hết các nước có nền công nghiệp chăn nuôi lợn. Bệnh này quan trọng ở chỗ nó có thể gây viêm phổi mà kết quả là lợn bị chết hoặc có thể trở thành bệnh mãn tính hoặc các thể nhẹ trên nhiều lứa lợn dẫn đến thiệt hại do lợn chết hay giảm năng suất, tăng giá thành do việc dùng thuốc hoặc vacxin.

Thể quá cấp tính và cấp tính của bệnh có gây nên hiệu ứng toàn thân tương tự như nhiễm khuẩn máu ở trên người. Có sự khác nhau về độc lực giữa các serotype và thậm chí ở cùng một serotype. Sự khác nhau đó là do sự khác nhau ở cấu trúc vỏ, khác nhau về thành phần LPS hoặc chủng loại dung huyết. Trên thực tế những serotype 1, 5, 9, 10 và 11 có độc lực mạnh hơn các serotype khác.

Bệnh lý học của viêm phổi - màng phổi đã được nghiên cứu một cách kỹ lưỡng về cả vấn đề phát triển của các tổn thương lẫn mối liên quan giữa vi khuẩn và tổn thương tổ chức ở mức độ phân tử. Sự nhiễm trùng thường xảy ra do mầm

17

bệnh trong không khí hoặc do tiếp xúc, những nghiên cứu thực nghiệm cho thấy rằng vi khuẩn thường tồn tại ở các amidan, và dính bám vào biểu mô phế nang.

Vi khuẩn A. pleuropneumoniae ở phổi nhanh chóng bị thực bào hoặc dính lên đại thực bào của phế nang và sản sinh ra độc tố Apx I, Apx II, và Apx III. Hầu hết các độc tố có khả năng gây độc cho đại thực bào của phế nang, các tế bào nội mô, tế bào biểu mô phế nang, tế bào nội mô của mao mạch ở thành phế nang, nhất là Apx III rất có hoạt tính chống lại đại thực bào của phế nang. Các vi khuẩn có vỏ có khả năng chống lại được sự thực bào và dường như cũng kháng lại sự hoạt động của bổ thể. Sự hư hại do các độc tố và cytokines đi kèm với hiện tượng nhiễm trùng là nguyên nhân chủ yếu làm xuất hiện và tăng tổn thương.

Những tổn thương ở phổi là hậu quả của những sự thay đổi độc tố có thể được nhìn thấy sau 3 giờ nhiễm trùng thử nghiệm và trở nên dần dần rõ ràng hơn. Vách phế nang trở nên phù thũng và sự xung huyết các mao quản tăng lên. Mạch bạch huyết dãn ra cùng với dịch phù, fibrin và các tế bào viêm. Sự ngưng tập tiểu cầu và sự tập trung các tế bào bạch cầu trung tính cũng có thể được thấy ở vách phế nang bị tổn thương và cả huyết khối động mạch cùng sự hoại tử thành mạch có thể phát triển gây nhồi huyết. Những vi khuẩn có thể thấy ở các vách phế nang bị nhiễm trùng và cũng có thể xuất hiện nhiễm vi khuẩn huyết. Bờ của tổn thương trở lên bị lấp đầy bởi xác chết hoặc đại thực bào bị tổn thương hoặc những mảnh vụn của tế bào và nhanh chóng phân ranh giới rõ với vùng phổi xung quanh sau 4 ngày nhiễm bệnh. Có dịch mủ với những vi khuẩn ở các phế quản. Với thời gian những tổn thương ở vùng trung tâm trở lên hoại tử và sự lành bệnh xảy đến với sự xơ hóa.

Nhiễm trùng thực nghiệm hay nhiễm trùng tự nhiên đều kích thích tạo đáp ứng miễn dịch, kháng thể sản sinh và có hiệu quả sau khoảng 10 - 14 ngày nhiễm bệnh. Những kháng thể này ở mức cao trong vòng 4 - 6 tuần nhiễm bệnh và có thể tồn tại ở mức thấp sau một vài tháng hoặc thậm chí biến mất sau khi trị liệu vi khuẩn.

Các miễn dịch này sẽ được truyền thụ động cho con cái và kháng thể này có thể tồn tại khoảng 5 - 9 tuần nhưng sự phòng chống bệnh có thể chỉ ở khoáng dưới 3 tuần ở một vài trường hợp. Các kháng thể chống lại nhiều thành phần cấu trúc và sản phẩm của vi khuẩn, bao gồm vỏ, LPS kháng nguyên, độc tố (chúng có thể bị trung hoà), các thành phần Protein màng ngoài, Superoxide Dismustase và proteine mang sắt. Cả hai loại kháng thể tại chỗ IgA và kháng thể trong huyết thanh IgG đều được tạo thành.

18

2.4. VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ BỆNH VIÊM PHỔI Ở LỢN

2.4.1. Vi khuẩn P. multocida

Vi khuẩn P. multocida là loại cầu trực khuẩn nhỏ, ngắn, có hình trứng, bầu dục hay hình cầu, bắt màu gram âm, không lông, không di động, không hình thành nha bào. Rất nhiều nhóm vi khuẩn P. multocida tồn tại nội sinh trong động vật và gây bệnh khi động vật bị suy giảm sức đề kháng (Quinn & cs., 2015). Kích thước

vi khuẩn 0,25 - 0,4 m x 0,4 - 1,5 m, vi khuẩn thường đứng riêng lẻ, đôi khi ghép đôi hoặc tạo thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn phân lập từ lợn thì có dạng tròn hơn

0,8- 1,0 m. P. multocida là vi sinh vật yếm khí tuỳ tiện, mọc tốt trên hầu hết các môi trường thông thường giàu dinh dưỡng. Phản ứng Oxydaza, Indol dương tính, không di động, Ureaza âm tính, không mọc trên môi trường thạch MacConkey, không dung huyết và không đòi hỏi nhân tố X và V. Những đặc điểm này giúp phân biệt vi khuẩn P. multocida với các vi khuẩn cùng nhóm mà những nhóm này có liên quan trong những bệnh về phổi lợn có tên như: P. haemolytica, Actinobacillus suis và A. pleuropneumoniae.

Vi khuẩn P. multocida phát triển tốt ở nhiệt độ 370C với pH là 7,2- 7,6. Vi khuẩn mọc kém ở nhiệt độ phòng, pH< 6 và pH > 8,5. Vi khuẩn mọc tốt hơn nếu cho thêm 5 - 10% huyết thanh động vật.

Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn ở môi trường lỏng, người ta có thể dùng phương pháp sục khí để tăng cường sự phát triển của vi khuẩn P. multocida. Khi so sánh phương pháp nuôi cấy sục khí và nuôi cấy tĩnh thấy số lượng vi khuẩn tăng gấp 20 lần ở cùng loại môi trường. Người ta đã áp dụng phương pháp sục khí để tăng cường sự phát triển của vi khuẩn P. multocida và rút ngắn thời gian nuôi cấy trong sản xuất vacxin phòng bệnh.

Carter (1955) đã phân P. multocida thành 5 serotype kháng nguyên giáp mô khác nhau là serotype A, B, D, E và F. Theo Carter (1967) giáp mô của chủng serotype A có cấu tạo bởi axit Hyaluronic nhưng có một sự liên quan mật thiết với các thành phần khác như Polysaccharit, Protein và Lipit.

P. multocida có kháng nguyên rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Kháng nguyên của P. multocida có 2 loại chính là kháng nguyên vỏ (K) và kháng nguyên thân (O). P. multocida có 5 serotype kháng nguyên vỏ A, B, D, E và F. Trong đó A, B và D đã được xác định gây bệnh cho lợn, tuy nhiên serotype B cũng không phải là nguyên nhân chính ở những ổ dịch

19

cho lợn ngoài tự nhiên ở Bắc Mỹ và Châu Âu. Serotype phổ biến nhất được phân lập trong bệnh viêm phổi lợn là serotype A.

P. multocida cũng có 16 serotype kháng nguyên thân. Những chủng thuộc serotype 3 và 5 cũng đã được phát hiện là rất phổ biến ở lợn. Với những chủng A:3, A:5, D:5 và D:3. Việc xác định serotype của P. multocida gồm 2 hệ thống là: hệ thống dựa vào kháng nguyên giáp mô và hệ thống dựa vào kháng nguyên thân

- Yếu tố độc lực:

Độc tố của P. multocida không chiết tách được, đây là độc tố chủ yếu gây viêm teo mũi ở lợn. Độc lực của các chủng P. multocida từ phổi đã được Pijoan & cs. (1984) phát hiện lần đầu tiên vào năm 1984. Kielstein (1986) đã phát hiện ra rằng những chủng có độc lực thường được tìm thấy khi phân lập vi khuẩn từ các ca bệnh cấp tính chứ không phải từ phổi lấy ở lò giết mổ.

Kháng nguyên vỏ là nhân tố rất quan trọng trong yếu tố gây bệnh, đặc biệt ở serotype A. Điều này giúp vi khuẩn tránh được sự thực bào trong quá trình đại thực bào ở phổi. Theo Pijoan & Fuentes (1987), một số chủng P. multocida có thể gây ra chứng viêm màng phổi và các ổ áp xe trong thí nghiệm gây nhiễm ở lợn. Maheswaran & Thies (1979) đã thông báo rằng P. multocida bị hấp thu trong quá trình đại thực bào tại phổi lợn xảy ra rất chậm thậm chí trong sự hiện diện của Opsonin, tương tự như những kết quả đã tìm được của Fuentes & Pijoan (1987).

Gần đây có giả thuyết cho rằng kháng nguyên Capsule đã được bộc lộ khi vi khuẩn phát triển dưới điều kiện nghèo sắt (Jacques & cs., 1994). Những sự phát triển ở điều kiện này gần giống như những thí nghiệm đã được chứng minh trong phòng thí nghiệm. Vì thế sự liên quan của kháng nguyên capsule đến độc lực có thể đã được đánh giá cao từ trước kia.

Các yếu tố độc lực này khác nhau ở các chủng, ở những chủng có độc lực yếu trong phổi không xác định rõ tính chất. Tuy nhiên Iwamatsu & cs. (1991) đã tìm thấy những chủng thuộc serotype D hay những chủng gây độc (của cả 2 serotype) ở những ổ áp xe nhưng không có trong bệnh viêm màng phổi.

- Sự cư trú ở màng nhày:

Sự cư trú của vi khuẩn P. multocida là vấn đề quan trọng để hiểu được sự phát sinh bệnh của vi khuẩn này. Jacques & Foiry (1987) đã tìm được cả 2 serotype A và D cư trú rất ít khi phân lập ở tế bào biểu mô thuộc ống khí quản, nhưng chủng thuộc serotype A thì cư trú nhiều hơn. Sau đó ông chỉ ra rằng chủng thuộc serotype

20

A hầu hết đều bám ở lớp lông mao của tế bào biểu mô.

Pijoan & Trigo (1990) cũng đã phát hiện thấy sự bám rải rác của các chủng thuộc serotype A và D nhưng nhận thấy rằng những chủng serotype D thường bám ở những tế bào không có lông mao và sau đó đã thấy ở một số chủng gây độc đặc biệt phát hiện có lông trên bề mặt của chúng, tuy nhiên vai trò của những cấu trúc này trong việc bám dính vẫn là vấn đề phải xem xét từ trước đến nay. Ngược lại với sự gắn kết yếu với bề mặt tế bào biểu mô, vi khuẩn P. multocida đã thực sự gắn kết chặt chẽ ở niêm dịch nhầy ở mũi, nhiều câu hỏi được đặt ra như nơi gắn kết thông thường ở đâu và điểm nào là nơi cư trú.

Sự cư trú tại dịch nhày ở lợn con còn đang bú mẹ đang là vấn đề rất quan trọng trong các chương trình tách đàn cai sữa sớm (SEW). Pijoan (1995) đã giả định rằng những lợn mới được cai sữa sớm (ở 15 ngày tuổi hay ít hơn) thì không khu trú đồng nhất với những vi khuẩn như P. multocida, M. hyoneumoniae, kết quả là ở những lợn đã cai sữa được chia vào khu chăn nuôi các đàn đã nuôi lâu thì thấy rằng ở những đàn này có sự khác nhau về tỷ lệ mang trùng của những gia súc trong các đàn, những đàn có tỷ lệ mang trùng thấp thì có nguy cơ phát triển những triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng bởi vì một số lợn trong đàn đã có lây nhiễm rất muộn, đồng thời lúc đó gia súc không có sẵn kháng thể thụ động từ lợn mẹ. Điều này có thể giải thích tại sao trong hệ thống tách đàn cai sữa sớm (SEW) đôi khi vẫn thấy sự phát ra hội chứng bệnh đường hô hấp (PRDC) muộn.

2.4.2. Bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn P. multocida gây ra

Bệnh viêm phổi do Pasteurella gây ra là kết quả của sự lây nhiễm của vi khuẩn P. multocida cho phổi. Bệnh thường thấy ở giai đoạn cuối của bệnh viêm phổi cục bộ hay ở những bệnh ghép ở đường hô hấp ở lợn. Hội chứng này là một trong những bệnh gây thiệt hại cho lợn đặc biệt khi chúng sản sinh tăng lên. Nhiều nghiên cứu đã cho biết: ở đàn lợn bệnh, bệnh tích viêm phổi khi mổ khám dao động từ 30% đến 80%. Những số liệu gần đây tại Mỹ cho thấy trong 6634 mẫu lấy từ lợn để kiểm tra phổ biến là 74% lợn bị viêm phổi và 13 % với chứng viêm màng phổi.

Dịch tễ học của P. multocida đã không được hiểu cặn kẽ, hiện nay vi khuẩn này vẫn phát hiện thấy trong tất cả các đàn và có thể phân lập từ mũi và hạch hầu của những cá thể khoẻ mạnh bình thường. Sự lây truyền bệnh đã được giả định là qua không khí, nhưng dường như nó không quan trọng, Backbo & Nielsen (1988) đã cho rằng sự lây nhiễm P. multocida là qua không khí. Trong đàn đang bị mắc

21

bệnh viêm teo mũi người ta có thể phân lập vi khuẩn ở 29 đàn trong 44 đàn nghiên cứu, tuy nhiên số lượng vi khuẩn phân lập được thì thấp (144 CFU/ml) từ đó kết luận rằng không có mối quan hệ giữa vi khuẩn với tính nghiêm trọng của triệu chứng lâm sàng của bệnh. Mặc dù sự lây truyền bệnh qua không khí có thể có lúc xảy ra trong đàn, có thể sự tiếp xúc giữa mũi lợn với nhau là cách phổ biến nhất cho sự lây nhiễm, cả hai kiểu truyền dọc và truyền ngang của sự lây nhiễm xảy ra, mặc dù vậy ở trong các trang trại sự lây nhiễm chủ yếu là theo kiểu truyền ngang với chủng vi khuẩn chiếm ưu thế trong bệnh viêm phổi (Zhao & cs., 1993). Những giả thuyết về sự tồn tại của những chủng P. multocida có độc tính thay đổi thất thường với một trong nhiều chủng có độc tính cao gây ra hầu hết những bệnh trong quần thể, những nguồn lây nhiễm vi khuẩn từ bên ngoài bao gồm chuột và những loài gặm nhấm khác, mặc dù gà và phân gà cũng được coi là nguồn lây nhiễm. Tuy nhiên không ngoại trừ khả năng là không phổ biến nguồn vi khuẩn này trong các trang trại có qui mô hiện đại.

Sự lây nhiễm thí nghiệm đối với vi khuẩn P. multocida rất khó thực hiện, ở những lợn khoẻ khả năng chịu đựng những liều lớn khi lây nhiễm vào mũi lợn thậm chí trong khí quản. Sự làm sạch phổi rất có hiệu quả và không thể phân lập được vi khuẩn sau 30 phút lây nhiễm.

Phương pháp thí nghiệm với bệnh đó là sử dụng vi khuẩn serotype B (Farcing, 1986), lây nhiễm trước đó với Mycoplasma hay vi khuẩn khác (Fuentes & Pijoan, 1986; Ciprian & cs., 1988) hay sự tấn công ồ ạt vào trong phổi, từ đó đưa kết luận rằng P. multocida không phải là tác nhân đầu tiên gây ra bệnh viêm phổi nhưng lại là sự lây nhiễm kế phát sau các tác nhân khác.

Vi khuẩn kích thích phản ứng mưng mủ nhanh đặc trưng bởi sự có mặt các tế bào bạch cầu trung tính xuyên mạch, điều này có thể là phản ứng của cơ thể vật chủ với Lipopolysacharide của vi khuẩn. Phản ứng này kích thích giải phóng ra các tế bào ổ viêm, sự chết đột ngột có thể là do sốc nội độc tố và hoạt động hô hấp bị rối loạn.

Tính nghiêm trọng của triệu chứng lâm sàng rất khác nhau tuỳ thuộc vào từng chủng vi khuẩn P. multocida có liên quan cùng với tình trạng miễn dịch của con vật.

Thể cấp tính: ở thể này thông thường là do hầu hết các chủng thuộc serotype B, những chủng này rất ít, hay không gặp ở Châu âu và Bắc mỹ. Những con vật mắc bệnh thường thấy chứng khó thở, cố ra sức để thở, gõ vào bụng có âm đục “bịch, bịch”, hóp bụng vào để thở, sốt cao nhiệt độ lên tới 41-42oC, tỷ lệ chết cao

22

(5-40%). Trong trường hợp những con vật chết và hấp hối có thể thấy những vết đổi màu tím ở vùng bụng (có thể là do sốc nội độc tố).

Thể thứ cấp tính: thể này kết hợp với chủng vi khuẩn P. multocida gây bệnh viêm phổi, ở thể này hiện tượng ho và thở thể bụng thường thấy ở những lợn lớn hay những lợn đủ trọng lượng để xuất chuồng. Ho ở những lợn ở lứa tuổi này thường được coi là tiêu chuẩn bệnh nghiêm trọng. Triệu chứng lâm sàng của bệnh ở thể này giống như viêm màng phổi do A. pleuropneumoniae, nhưng những đặc điểm phân biệt chính là bệnh viêm phổi do Pasteurella thì hiếm khi gây ra chết bất ngờ, hơn nữa lợn mắc bệnh song có thể tồn tại một thời gian dài. Gần đây bùng nổ những vụ dịch do PRDC ở lợn đã đến hạn giết mổ (khoảng 16- 18 tuần tuổi) ở những trại đang sử dụng phương pháp tách đàn và cai sữa sớm (SEW) đã thấy xuất hiện những lợn có triệu chứng ho và thở thể bụng ở lợn nhưng không phải do bệnh viêm phổi (Dee, 1997).

Thể mãn tính: đây là thể đặc trưng thường thấy của bệnh, thỉnh thoảng xuất hiện ho, sốt nhẹ hoặc không. Những con vật bị ảnh hưởng thường ở giai đoạn cuối của giai đoạn nuôi dưỡng hay lớn hơn (10- 16 tuần tuổi). Những dấu hiệu không thể phân biệt được khi vi khuẩn lây nhiễm sau khi bội nhiễm M. hyopneumoniae, P. multocida thì tiếp tục và kịch liệt hơn khi tiền nhiễm Mycoplasmosis.

Bệnh tích do P. multocida: chủ yếu là ở phần xoang ngực và thường kèm với bệnh tích của M. hyopneumoniae. Đặc trưng của bệnh này là quan sát thấy ở thuỳ đỉnh và mặt sau của phổi, cùng với việc có bọt khí trong khí quản. Có sự phân ranh giới rõ ràng giữa vùng tổ chức phổi bị tổ thương và vùng tổ chức phổi bình thường. Phần bị ảnh hưởng của phổi sẽ có sự biến đổi mầu sắc từ mầu đỏ sang mầu xám xanh phụ thuộc vào giai đoạn của bệnh.

Các trường hợp bệnh nghiêm trọng có thể xuất hiện viêm phế mạc và apse ở các mức độ khác nhau. Trong các trường hợp này thường thấy phế mạc dính chặt vào thành xoang ngực, và phế mạc có vùng mờ đục, và khô. Đấy chính là bệnh tích chủ yếu để phân biệt được bệnh viêm phổi do Pasterella với viêm phổi do Actinobacillus, trong đó thường thấy mủ chảy ra có mầu vàng và dính cùng với rất nhiều sợi fibrin (Pijoan, 1989).

Dấu hiệu bệnh này cũng thể hiện mối liên quan giữa việc gây bệnh viêm phế quản do Pasterella với bệnh viêm cầu thận cũng do Pasterella (Buttenschon, 1991). Tác giả này cũng kết luận rằng hai bệnh này có liên quan với nhau bởi quá trình vi khuẩn phát tán từ những bệnh tích ở phổi.

23

Khi những bệnh tích của sự lây nhiễm P. multocida không có biểu hiện đặc trưng thì không thể sử dụng chỉ tiêu chuẩn để tiến hành chẩn đoán đúng. Lịch sử của ổ dịch, lịch sử của bệnh lý và sự phân lập vi khuẩn nên được sử dụng để củng cố cho lý thuyết chẩn đoán căn bản. Phương pháp huyết thanh học không chứng minh hiệu quả cho chẩn đoán và cũng không có Test huyết thanh nào co giá trị để chưng minh sự lây nhiễm P. multocida.

Vi khuẩn P. multocida là vi khuẩn dễ nuôi cấy từ những mẫu đưa đến phòng thí nghiệm, những mẫu được lấy tốt nhất cho sự phân lập vi khuẩn bao gồm: dịch khi quản và những mô tế bào phổi đã bị nhiễm bệnh được lấy từ khoảng giữa mô tế bào lây nhiễm và tế bào bình thường. Những mẫu lấy qua bông từ mũi cũng được xem là mẫu tốt cho việc phân lập P. multocida (Schos & Alt, 1995), những mẫu dịch thấm này nên được nhúng trong môi trường vận chuyển phù hợp như Stuarts. Những mẫu phổi phải được đưa đến càng nhanh càng tốt và tránh bị tạp, tất cả các mẫu phải được bảo quản lạnh (không đóng băng) cho đến khi cấy.

Việc nuôi cấy vi khuẩn P. multocida có thể đạt kết quả trong phòng thí nghiệm với những phương tiện tối thiểu nhất. Những mẫu đạt chất lượng tốt thì sẽ tìm thấy vi khuẩn khi cấy trực tiếp trên đĩa thạch máu hay thạch Glucose, nếu những mẫu khi đưa về mà bị nhiễm tạp khuẩn thì chúng có thể được pha loãng theo từng kỳ 10 lần một, cấy vào nước thịt BHI để qua đêm sau đó cấy ra đĩa thay thế dần cách chọn lựa sử dụng (Pijoan & cs., 1993b). Ackenman & cs. (1983b) đã phân lập thành công từ những hạch hầu và xương xoắn của những lợn trưởng thành, sử dụng bằng thạch máu có 3,75 U/ml Bacitracin; 5mg/ml Clindamycin; 0,75mg/ml Amphotericin B. Sự phân lập có thể tăng lên do việc tiêm truyền canh trùng vào xoang bụng của chuột bạch và sau đó cấy lại vi khuẩn P. multocida sau 24 giờ từ gan và dịch báng.

Việc điều trị bệnh lây nhiễm vi khuẩn P. multocida bằng thuốc kháng sinh thường khó khăn hoặc không thành công, điều này một phần là do tính kháng thuỗc rộng rãi ở vi khuẩn P. multocida được phân lập ở Mỹ và cũng khó khăn khi tập trung thuốc kháng sinh cho bệnh viêm phổi.

Kháng sinh rất đa dạng và sự kết hợp giữa các loại kháng sinh đã được sử dụng thường xuyên (Farvington, 1986), trong đó bao gồm kháng sinh ngoài đường tiêu hoá (kháng sinh không dùng bằng uông và ăn) như: Oxytetracyline 11mg/kg; oxytetracyline chậm: 20 mg/kg; Procaine penicilli 66.000 U/kg; Benzathine penicillin 32.000 U/kg và rất nhiều loại kháng sinh khác. Tuy nhiên việc sử dụng thuốc còn ít có hiệu quả do sự kháng thuốc của vi khuẩn.

24

Cole & cs. (1991) đã tìm thấy một số các Plasmid trung gian kháng thuốc với Streptomycin và Sulfonamid giữa 29 nông trường được điều tra, phân lập. Gutiewez Martin & Rodrigues Ferri (1993) đã phân lập trên 59 mẫu ở Tây ban nha, ông đã nhận thấy sự tác động tốt với Penicillin, Aminoglycoside, Tetracilin, Erthromycin, Colistin và Rifampicin với một số thì lại kháng với các loại kháng sinh Tylosin, Vancomycin và Tiamulin.

Những thuốc Tetracilin sử dụng đơn, Tetraciline hoặc Tetracilin kết hợp với Sulfamethazin hay Sulfathiazol hay penicillin và Tylosin kết hợp với Sulfamethazin đã được khuyến cao sử dụng cho mục đích điều trị. Có thể nói rằng phối hợp kháng sinh hiệu quả nhất là khi kết hợp. Tính kháng khuẩn của những kháng sinh này đã được tập trung xem xét qua sự tồn dư thuốc, bởi vì chính điều này nên việc sử dụng kháng sinh cần phỉa hạn chế nghiêm ngặt và theo dõi cẩn thận. Tiamulin (40 ppm trong thức ăn) trong một số thí nghiệm để cải thiện trọng lượng bình quân, tuy nhiên vì hiện tượng viêm phổi không giảm đi nhiều lại chính là do loại kháng sinh này (Pott & Edward, 1990) cách thức hoạt động bởi chính những sự cải thiện đạt được này không rõ ràng. Tiamulin đã được xem như là một loại kháng sinh cho kêt quả không ổn định để điều trị P. multocida, tuy vậy hiệu quả chính của nó trong bệnh viêm phổi là khống chế M. hyopneumoniae.

Noiyes & cs. (1986) đã nhận thấy sự giảm thông thoáng dưới mức tối thiểu được khuyến cáo (0,5 CFM/ lợn) không có kết quả ngăn chặn lợn con lây nhiễm với 2 bệnh do B. bronchiseptica và P. multocida, tương tự như vậy Rafai (1987) cũng cho rằng Stress lạnh thậm chí còn dẫn đến giảm chức năng miễn dịch của những lợn con đang bú, tương tự cũng không có kết quả đối với sự lây nhiễm P. multocida. Sự thay đổi môi trường thường xuyên dần mở rộng ra tuy nhiên rất tốn kém khi tiến hành và duy trì như vậy và không chắc chắn những thay đổi này mang lại kết quả tốt trong việc giảm những bệnh đường hô hấp, hay nói cách khác sự cải tiến và những thay đổi trong cách quản lý có thể làm giảm việc lây lan vi khuẩn.

2.5. VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS VÀ BỆNH DO VI KHUẨN GÂY RA Ở LỢN

2.5.1. Vi khuẩn S. suis

Vi khuẩn S. suis có hình cầu hoặc hình trứng, đường kính có khi đến 1 m, chúng thường đứng riêng lẻ, xếp thành đôi hoặc thành từng chuỗi ngắn như chuỗi hạt, có độ dài ngắn không đều nhau. Chiều dài của chuỗi tuỳ thuộc vào điều kiện

25

môi trường. Vi khuẩn bắt màu Gram dương, yếm khí tùy tiện và không di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, nhưng có khả năng hình thành giáp mô.

Các vi khuẩn được nuôi cấy sau 18 giờ chủ yếu có dạng hình cầu, kích thước 0,5 - 1 m, đứng thành dạng chuỗi 5 - 10 tế bào. Trong canh trùng già, sau 30 giờ nuôi cấy, vi khuẩn có thể thay đổi tính chất bắt màu, chuỗi cũng thấy dài hơn.

Vi khuẩn S. suis phát triển tốt trong điều kiện yếm khí tùy tiện.

- Trên môi trường thạch máu: sau 24 giờ nuôi cấy, hình thành khuẩn lạc nhỏ,

hơi vồng và sáng trắng. Có thể quan sát thấy các kiểu dung huyết gồm:

+ Dung huyết kiểu α: vùng dung huyết xung quanh khuẩn lạc thường có màu xanh (dung huyết từng phần hay dung huyết không hoàn toàn)

+ Dung huyết kiểu β: bao quanh khuẩn lạc là một vùng tan máu hoàn toàn

trong suốt, có bờ rõ ràng do Hemoglobin bị phân hủy hoàn toàn.

+ Dung huyết kiểu  (còn gọi là không dung huyết): không làm biến đổi thạch máu.

Vi khuẩn có khả năng lên men đường Glucose, Lactose, Succrose, Inulin, Trehaloza, Maltoza, Fructoza, không lên men các loại đường Ribose, Arabinose, Sorbitol, Mannitol, Dextrose và Xylose.

Vi khuẩn không chứa men Catalase và Oxidase, vì vậy phản ứng Catalase và

Oxidase âm tính.

Vi khuẩn dễ bị diệt bởi nhiều chất sát trùng như: phenol, iod, hypochloride, axit phenic 3%-5% diệt vi khuẩn trong vòng 3-15 phút, trong formol 1% vi khuẩn bị diệt trong vòng 60 phút, cồn nguyên chất không có tác dụng đối với vi khuẩn, cồn 70oC diệt vi khuẩn trong vòng 30 phút, tím gentian 1/300.000 cũng có tác dụng diệt vi khuẩn.

Các chất sát trùng thông thường dùng để vệ sinh chuồng trại có thể giết chết

S. suis serotype 2 trong vòng chưa đến 1 phút.

Các Streptococcus dung huyết kiểu Alpha từ các trường hợp nhiễm trùng huyết ở lợn được de Moor mô tả đặc tính sinh hoá và huyết thanh học lần đầu tiên vào giữa những năm 1956 và 1963 là các nhóm Lancefield mới R, S, RS và T (de Moor, 1963). Ở Anh Eliott (1966) cho rằng nhóm S của de Moor giống với PM Streptococcus của ông và cả 2 đều thuộc nhóm D của Lacefield, ông đề nghị gọi tên là S. suis serotype capsular 2. Năm 1975, Windor & Elliot đã phân lập được Streptococcus khác từ lợn tương ứng với nhóm R của Moor, và đặt tên chúng là S. suis serotype 2. Serotype 1 thường gây bệnh viêm màng não ở lợn sơ sinh, trong

26

khi đó serotype 2 gây ra cho tất cả mọi lứa tuổi. Các chủng phân lập được phản ứng với cả kháng huyết thanh serotype 1 và 2 được gọi là serotype capsular 1/2 (bắt nguồn từ nhóm RS).

Việc phân lập các Streptococcus thuộc nhóm T từ hạch ami đan, dịch âm đạo và bao qui đầu đã được thông báo bởi Clifton & Hadley năm 1984. Chủng tương ứng với nhóm T được gọi là S. suis serotype capsular 12 (Gottschalk, 1989).

Giữa những năm 1983 và 1995, tổng số có 32 serotype capsular đã được mô tả trong tổng số là 35 chủng (Perch & cs., 1983; Higgins & cs., 1995). Các chủng tương ứng bắt nguồn từ những lợn bệnh ngoại trừ serotype capsular 14 phân lập từ người, các serotype capsular 17, 18, 19 và 21 phân lập từ những lợn khoẻ. Serotype capsular 20 và 31 phân lập bê mắc bệnh và serotype 33 từ một con cừu bệnh (Gottschakc & cs., 1989; Higgins & cs., 1995). Năm 1987, Kilpper- Balz & Schleifer đã chính thức đặt tên S. suis như là một loài vi khuẩn mới, loài này có dáng vẻ riêng về tính di truyền và không có mối quan hệ đặc biệt nào với các loài Streptococcus khác đã xét nghiệm (Bently & cs., 1991). Sự đa dạng về di truyền trong số các thành viên của loài S. suis là rất quan trọng, điều này phải tính đến trong chẩn đoán, điều tra và phòng bệnh theo (Hampson & cs., 1993; Harel, 1994).

Những thông báo đầu tiên về sự lây nhiễm của S. suis đã được công bố bởi Jansen và Van dorssen ở Hà lan (1951) và Field (1954) ở Anh. Từ đó về sau S. suis đã được báo cáo ở tất cả các nước, có ngành công nghiệp chăn nuôi lợn quan trọng và trong hơn một thập kỷ qua sự lây nhiễm gắn với vi khuẩn này đã được theo dõi ở cả những hoạt động chăn nuôi lợn mạnh theo truyền thống và hiện đại.

Ở những lợn bị bệnh thì của serotype 2 chiếm ưu thế ở hầu hết các quốc gia, ở Scandinavia serotype 7 đã chiếm ưu thế trong vài năm (Perch & cs., 1983; Sihnonen & cs., 1988), nhưng vào những năm 1990 thì serotype 2 lại thịnh hành hơn serotype 7 (Nielsen & Pers, 1997). Ở Nhật serotype capsular 2 cũng là serotype thịnh hành nhất (28%) sau đó là serotype 7 (11%) (Kataoka & cs., 1993).

Hầu hết các vi khuẩn S. suis phân lập từ những lợn bệnh thường thuộc một số giới hạn các serotype capsular, thường là giữa serotype 1 và 8 (Galina & cs., 1992; Higgins & Gottschalk, 1996; Hoggvà cs., 1996; Katoka & cs., 1993; Prieto & cs., 1994; Reams & cs., 1996).

Một số chủng thuộc những serotype capsular ít phổ biến có liên quan đến những trường hợp nhiễm trùng nghiêm trọng. S. suis serotype capsular 9 có liên quan đến những ổ dịch nhiễm trùng huyết, viêm màng não và viêm phổi ở lợn cai sữa (Orr & cs., 1989; Gogolewski & cs., 1990). Maclennam & cs. (1996) đã thông

27

báo đã phân lập serotype 14 đầu tiên ở nước Anh. Họ đã chỉ ra rằng mặc dù serotype capsular 2 vẫn chiếm ưu thế (62%) nhưng 25% các chủng phân lập được thuộc về serotype 14 gây bệnh ở lợn con ở độ tuổi 2-4 tuần tuổi, gây bệnh về nhiễm trùng huyết, viêm màng não và viêm khớp. Cùng năm đó ở nước Anh, Helth & cs. (1996) công bố đã phân lập được serotype capsular 14 ở 22 trang trại có những dấu hiệu bệnh lý lâm sàng tương tự như của serotype 2.

Serotype capsular 2 cũng có thể được phân lập được từ những lợn khoẻ tỷ lệ lưu hành thấp. Các tác giả người Anh đã công bố rằng trong 4 đàn lợn không có bất kà lịch sử hay triệu chứng lâm sàng của bệnh có 2 đàn âm tính với serotype 2, 1 đàn có tỷ lệ nhiễm là 1,5% và 1 đàn khác có tỷ lệ nhiễm là 20% (Clifton- Hadley, 1984). Tỷ lệ này phù hợp với các tác giả người Canada, chứng minh sự có mặt của serotype này ở 12% những đàn lợn không có dấu hiệu lâm sàng của sự nhiễm trùng và 4% lợn con trong những đàn đó (Beiseboi & cs., 1990). Serotype 2 cũng đã được tìm thấy ở 8 trong 19 chuồng lợn con không có dấu hiệu lâm sàng của nhiễm trùng. Trong những đàn này chỉ có 1,5% lợn con mang trùng ở xoang mũi, trong khi đó serotype capsular 19 và 21 đã được phát hiện lần lượt ở lợn con với tỷ lệ 24% và 19% (Monter & cs., 1993)

Hogg & cs. (1996) đã ghi lại một tỷ lệ nhiễm các serotype 9- 34 từ dịch mũi và âm đạo cao hơn là từ các mô lấy từ những lợn bệnh. Đáng chú ý là một số serotype capsular có thể có mặt ở cùng một động vật. Trong 1 nghiên cứu của Monter & cs., 1993, 31% lợn chỉ có 1 seroserotype S. suis trong các xoang mũi của chúng, 38% có 2 hay 3 seroserotype và 6% có hơn 4 seroserotype. Sự phân lập nhiều seroserotype cũng phải được xem xét ở những động vật bệnh.

- Vi khuẩn S. suis có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp và có rất nhiều

kháng nguyên đã được tìm thấy đó là:

+ Kháng nguyên thân (Somatic antigen): kháng nguyên thân có ý nghĩa quan trọng trong việc quyết định độc lực của S. suis. Kháng nguyên thân nằm ở thành vi khuẩn (Cell wall) và được cấu tạo bởi các phân tử peptidoglycan ở lớp trong cùng (N-acetylglucosamine và N-acetylmuramic acid), tiếp đến là lớp giữa gồm các polysaccharide (N-acetylglucosamine và rhamnose), lớp ngoài cùng là các protein gồm M protein, lipoteichoic acid, R và T protein.

+ Kháng nguyên bám dính (Fimbriae antigen): vai trò của kháng nguyên bám dính của S. suis còn chưa được biết đến một cách rõ ràng, nhưng có ý kiến cho rằng chúng đóng vai trò quan trọng trong việc giúp vi khuẩn bám dính vào

28

tế bào biểu mô của vật chủ. Vi khuẩn S. suis là một trong số ít các loại vi khuẩn Gram dương có mang cấu trúc này. So với các loại vi khuẩn khác thì kháng nguyên

bám dính của vi khuẩn S. suis có cấu trúc mỏng, ngắn, đường kính khoảng 2 m,

và dài có khi tới 200 m (Jacques & cs., 1990).

+ Kháng nguyên giáp mô (Capsule antigen): kháng nguyên giáp mô có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ vi khuẩn, kháng lại khả năng thực bào của cơ thể vật chủ. Nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng các chủng S. suis có giáp mô thì có độc lực và có khả năng gây bệnh, còn các chủng không có giáp mô thì không có khả năng này (Higgins & Gottschalk, 2002).

2.5.2. Bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn

Streptococcus là một loại liên cầu khuẩn, có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên, trên cơ thể động vật và cả ở người. Vi khuẩn Streptococus đã trực tiếp hoặc gián tiếp gây bệnh cho gia súc nói chung và ở lợn nói riêng, kể cả người.

Vi khuẩn S. suis là một trong số các tác nhân gây bệnh quan trọng và gây ra những thiệt hại đáng kể trong công nghiệp chăn nuôi lợn. Các thông báo đầu tiên về bệnh do S. suis gây ra ở lợn đã được chính thức xác nhận lần đầu tiên ở Hà Lan vào năm 1951 và ở Anh vào năm 1954 (Field & cs., 1954). Kể từ đó, bệnh đã được thông báo là xảy ở hầu khắp các nước trên thế giới - nơi có ngành chăn nuôi lợn phát triển (Boucher & cs., 2002).

Các dạng bệnh do vi khuẩn này gây ra ở lợn rất đa dạng, bao gồm như viêm não, nhiễm trùng máu, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, viêm đa thanh mạc, viêm màng bụng, viêm phổi, và thường dẫn đến chết đột ngột (Boucher & cs., 2002; Lun & cs., 2007). Ngoài ra, vi khuẩn còn có thể phân lập được trong các trường hợp lợn bị viêm teo mũi và sảy thai. Bệnh xảy ra ở lợn mọi lứa tuổi, nhưng thường gặp nhất ở giai đoạn 3-16 tuần tuổi do lợn thời kỳ sau cai sữa trở nên đặc biệt mẫn cảm với vi khuẩn này (Lamont & cs., 1980). Tuy nhiên, các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn này gây ra là có sự sai khác nhau giữa các quốc gia (Boucher & cs., 2002).

Vi khuẩn S. suis serotype 1 thường gây bệnh cho lợn con theo mẹ (1-3 tuần tuổi), có khi tới 6 tuần tuổi và thường ở thể bại huyết hoặc các nhiễm trùng tại chỗ như viêm màng não, viêm não, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, đặc biệt là lợn con từ 1-7 ngày tuổi (Cook & cs., 1988). Đôi khi, nhóm vi khuẩn thuộc serotype 2 cũng gây bệnh cho lứa tuổi này, nhưng thường ít gặp hơn. Lợn con bị nhiễm bệnh là do lợn mẹ truyền qua đường hô hấp, đường tiêu hoá (do tiếp xúc với phân, các chất

29

thải hoặc các chất tiết khác), đường máu (do tiếp xúc trực tiếp hoặc qua kim tiêm nhiễm trùng). Trong khi đó, các chủng S. suis thuộc serotype 2 thường gây ra bệnh cho lợn giai đoạn sau cai sữa và vỗ béo (4-16 tuần tuổi) với rất nhiều thể bệnh như viêm não, viêm nội tâm mạc, ngoại tâm mạc, cơ tim hoại tử, viêm phổi, viêm khớp và bại huyết (John & cs., 1982; Vecht & cs., 1985; Sanford & Ernest, 1987; Gogolewski & cs., 1990). Bệnh thường xảy ra sau khi lợn khoẻ được nuôi hoặc nhốt chung với lợn bệnh và thường gây chết đột ngột với các biểu hiện như sốt, có triệu chứng thần kinh, viêm khớp.

Ngoài ra, vi khuẩn S. suis còn là nguyên nhân gây ra các thể bệnh như viêm phế quản - phổi, viêm màng phổi và viêm phổi ở các lứa tuổi của lợn (Sanford Se & Tilker, 1982; Erickson & cs., 1984).

Ở Anh, bệnh do S. suis serotype 2 chủ yếu là gây ra các triệu chứng như bại huyết và viêm não ở lợn cai sữa (Windsor & Elliott, 1975). Trong khi đó, ở các nước Bắc Mỹ, các báo cáo đều chỉ ra rằng S. suis là vi khuẩn chủ yếu phân lập được từ những lợn bị viêm phổi (Sanford & Tilker, 1982; Erickson & cs., 1984). Những năm sau đó Koehne & cs. (1979) lại kết luận rằng vi khuẩn này là nguyên nhân chính gây bại huyết, viêm não và viêm đa khớp và ít khi gây viêm phổi (Maclennan & cs., 1996; Heath & cs., 1996). Trong khi đó, các bệnh tích ở phổi vẫn là chủ yếu trong các trường hợp lợn bị bệnh tại Bắc Mỹ (Reams & cs., 1996; Hogg & cs., 1996). Tại Hà Lan, tỷ lệ S. suis serotype 2 có liên quan đến viêm phổi chiếm 42% các trường hợp mắc bệnh, tiếp đến là viêm não (18%), viêm nội tâm mạc (18%), và viêm đa thanh mạc (10%) (Vecht & cs., 1985). Một nghiên cứu ở Nhật giữa năm 1987 và năm 1991 đã cho biết kết quả là 38% số chủng S. suis phân lập được từ lợn bị viêm não và 33% từ lợn bị viêm phổi (Kataoka & cs., 1993).

2.6. CÁC CHẤT BỔ TRỢ THƯỜNG DÙNG TRONG SẢN XUẤT VACXIN

2.6.1. Chất bổ trợ của vacxin

Chất bổ trợ vacxin (Adjuvant) là một tác nhân dược lý hoặc miễn dịch làm thay đổi hiệu quả của các tác nhân khác. Bổ trợ vacxin có thể được thêm vào vacxin để thay đổi đáp ứng miễn dịch bằng cách thúc đẩy để tạo được lượng kháng thể cao hơn và kéo dài thời gian bảo vệ, nhờ đó giảm thiểu lượng chất ngoại sinh truyền vào cơ thể. Bổ trợ vacxin còn có thể dùng để nâng cao hiệu quả vacxin bằng cách thay đổi đáp ứng miễn dịch đối với từng loại tế bào miễn dịch cụ thể: ví dụ, hoạt hóa tế bào T thay vì tế bào B tiết kháng thể tùy thuộc vào mục đích của vacxin. Bổ trợ vacxin còn được dùng trong quá trình sản xuất kháng thể từ những động vật được gây miễn dịch. Có nhiều lớp bổ trợ vacxin có thể thúc đẩy

30

đáp ứng miễn dịch theo nhiều hướng khác nhau, nhưng dạng được sử dụng phổ biến nhất là nhôm hydroxit và dầu sáp.

Bổ trợ được thêm vào vacxin để kích thích hệ thống miễn dịch đáp ứng với kháng nguyên mục tiêu, nhưng tự chúng không tạo miễn dịch. Bổ trợ vacxin có thể hoạt động theo nhiều cách khác nhau trong việc trình diện kháng nguyên với hệ thống miễn dịch. Bổ trợ vacxin có thể hoạt động như một chất mang kháng nguyên, phóng thích kháng nguyên trong một thời gian dài, nhờ đó tối đa hóa đáp ứng miễn dịch đến khi cơ thể loại bỏ hoàn toàn kháng nguyên. Ví dụ một loại chất mang bổ trợ vacxin là nhũ tương. Bổ trợ vacxin còn có thể hoạt động như một chất kích thích, tham gia và khuếch đại phản ứng miễn dịch của cơ thể.

Cơ chế của bổ trợ vacxin: Bổ trợ vacxin cần thiết trong việc cải thiện về định hướng và thích ứng của đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên. Phản ứng này được trung gian bởi hai loại tế bào lympho chính, tế bào B và T. Bổ trợ vacxin thực hiện hiệu quả của chúng qua nhiều cơ chế khác nhau. Một vài loại bổ trợ vacxin, ví dụ như phèn, hoạt động như một hệ thống vận chuyển, tạo thành chất mang bắt giữ kháng nguyên ở vi trí tiêm, cung cấp sự phóng thích chậm và kéo dài để kích thích phản ứng miễn dịch. Giả thuyết này hiện còn gây tranh cãi, nhiều nghiên cứu cho thấy việc phẫu thuật loại bỏ các chất mang trên không làm ảnh hưởng đến cường độ của phản ứng IgG1.

Bổ trợ vacxin như một tác nhân tạo ổn định: Mặc dù các bổ trợ vacxin miễn dịch được nhìn nhận như các chất hỗ trợ cho phản ứng miễn dịch với kháng nguyên, các bổ trợ vacxin còn được phát triển như các chất hỗ trợ ổn đinh cấu trúc của kháng nguyên, nhất là các vacxin đã được chấp nhận trong ngành thú y.

Các loại bổ trợ vacxin bao gồm: Hợp chất vô cơ: phèn, nhôm hydroxit, nhôm phosphate, calci phosphate hydroxide; Dầu khoáng: dầu sáp; Các sản phẩm từ vi khuẩn: vi khuẩn Bordetella pertussis, Mycobacterium bovis chết, các biến độc tố; Các chất hữu cơ không nguồn gốc vi khuẩn: squalene; Hệ thống vận chuyển: các chất tẩy rửa (Quil A); Các saponin thực vật từ Quillaja, đậu tương, Polygala senega; Cytokin: IL-1, IL-2, IL-12; Hỗn hợp: bổ trợ vacxin Freund hoàn toàn, bổ trợ vacxin Freund không hoàn toàn; Thực phẩm từ dầu: Bổ trợ vacxin.

Cơ chế kích thích miễn dịch bởi bổ trợ vacxin: Bổ trợ vacxin có thể tăng cường đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên bằng những cách khác nhau: kéo dài sự hiện diện của kháng nguyên trong máu; giúp hấp thụ kháng nguyên trình diện

31

tế bào kháng nguyên; hoạt hóa đại thực bào và tế bào lympho; hỗ trợ sản xuất cytokine

Chất bổ trợ có thể hoạt động bằng sự kết hợp của nhiều cơ chế khác nhau bao gồm hình thành nơi lưu giữ kháng nguyên, cảm ứng cytokine và chemokine, kích thích các tế bào miễn dịch, tăng cường sự hấp thu và trình bày kháng nguyên, thúc đẩy vận chuyển kháng nguyên đến các hạch bạch huyết. Dường như chất bổ trợ kích hoạt các phản ứng miễn dịch bẩm sinh để tạo ra một môi trường có thẩm quyền miễn dịch tại chỗ vị trí tiêm. Tùy thuộc vào loại phản ứng bẩm sinh được kích hoạt, chất bổ trợ có thể thay đổi chất lượng và số lượng của các phản ứng miễn dịch thích ứng. Hiểu các cơ chế hoạt động của chất bổ trợ sẽ cung cấp thông tin quan trọng về cách ảnh hưởng của miễn dịch bẩm sinh sự phát triển của miễn dịch thích ứng, giúp xây dựng hợp lý các vacxin chống lại các bệnh.

Mục tiêu của tiêm chủng là tạo miễn dịch bảo vệ và trong một số loại vacxin, điều này có thể được tăng cường bằng cách bổ sung các chất bổ trợ. Chất bổ trợ (từ tiếng Latinh adjuvare, có nghĩa là "giúp đỡ hoặc hỗ trợ") lần đầu tiên được Ramon mô tả là “các chất được sử dụng kết hợp với một kháng nguyên cụ thể để tạo ra một đáp ứng miễn dịch hơn kháng nguyên đơn thuần” (Ramon, 1924). Nhiều các loại hợp chất đa dạng đã được đánh giá như là chất bổ trợ bao gồm muối khoáng, sản phẩm vi sinh vật, nhũ tương, saponin, cytokine, polyme, vi hạt và liposome (Guy, 2007).

Dựa trên cơ chế hoạt động, chất bổ trợ vacxin đã được chia rộng rãi thành hệ thống phân phối và chất bổ trợ kích thích miễn dịch (Singh và O’Hagan, 2003). Nói chung, hệ thống phân phối trước đây được cho là hoạt động bằng cách cung cấp kho trong khi các chất bổ trợ kích thích miễn dịch kích hoạt các tế bào của hệ thống miễn dịch bẩm sinh (Pashine & cs, 2005). Tuy nhiên, cách phân loại này không còn phù hợp vì hiện nay có bằng chứng cho thấy một số hệ thống phân phối có thể kích hoạt khả năng miễn dịch bẩm sinh. Những tiến bộ gần đây trong sinh học miễn dịch nghiên cứu đã tiết lộ một số cơ chế hoạt động của chất bổ trợ. Bằng chứng hiện có cho thấy rằng chất bổ trợ sử dụng một hoặc nhiều các cơ chế sau để tạo ra các phản ứng miễn dịch: (1) giải phóng kháng nguyên bền vững tại vị trí tiêm (hiệu ứng kho), (2) điều hòa các cytokine và chemokine, (3) tuyển dụng tế bào tại vị trí tiêm, (4) tăng hấp thu kháng nguyên và trình bày với các tế bào trình bày kháng nguyên (APC), (5) kích hoạt và sự trưởng thành của APC [tăng phức hợp tương hợp mô chính (MHC) lớp II và biểu hiện phân tử đồng kích thích] và di

32

chuyển đến các hạch bạch huyết, và (6) kích hoạt viêm nhiễm (Cox & Coulter, 1997; Hoebe & cs., 2004; Fraser & cs., 2007).

Trong nhiều các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phẫu thuật cắt bỏ kho kháng nguyên 14 ngày sau khi chủng ngừa không ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch (Schijns, 2000). Rõ ràng, sự hấp phụ của kháng nguyên đối với phèn không cần thiết cho hoạt tính của chất bổ trợ phèn (Iyer & cs., 2003; De Gregorio & cs., 2008). Loại bỏ vết tiêm 2 giờ sau khi kháng nguyên và sử dụng phèn chua không ảnh hưởng đến dịch thể hoặc qua trung gian tế bào miễn dịch (Hutchison & cs, 2012). Nhiều chất bổ trợ bao gồm phèn, nhũ tương gốc dầu và các vi hạt hoạt động bằng cách "nhắm mục tiêu" các kháng nguyên đến APC, dẫn đến tăng cường trình bày kháng nguyên của MHC (Guéry & cs., 1996; Schijns & Lavelle, 2011).

2.6.2. Muối khoáng

Nhôm hydroxit hay hỗn hợp muối nhôm (thường gọi là keo phèn), là một trong những chất bổ trợ đầu tiên được sử dụng trong vacxin. Nhôm saltcan tạo ra IgG bậc cao với khả năng miễn dịch tương đối lâu dài, dễ bào chế và được ghi nhận lâu dài về độ an toàn của gen. Các thí nghiệm ban đầu với phèn kali (KAl (SO4) 2: 12H2O) được sử dụng với độc tố đã chứng minh rằng phản ứng miễn dịch tăng cường ở thỏ chống lại độc tố (Glenny & cs., 1931).

Vacxin được cho thêm chất bổ trợ với mục đích giữ lâu kháng nguyên trong cơ thể động vật, tăng sức miễn dịch và kéo dài thời gian miễn dịch. Chất bổ trợ thường dùng là keo phèn và vacxin có keo phèn gọi là vacxin keo phèn.

2.6.3. Chất nhũ tương

Cũng như muối khoáng, nhũ tương đã được sử dụng như một loại chất bổ trợ trong vacxin động vật trong một thời gian dài. Nhũ tương được hình thành khi hai chất lỏng không thể trộn lẫn được với nhau, một trong số chúng có thể sắp xếp thành các giọt nhỏ, tách biệt bên trong hạt kia và được ổn định bởi một lớp siêu thực giao diện. Nhũ tương cũng là một lựa chọn tốt cho các loại vacxin dành cho động vật vì chúng dễ sản xuất, hiệu quả về chi phí và chứng tỏ hiệu quả tốt trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch (Cox & Coulter, 1997).

Công ty Seppic (Pháp) là công ty cung cấp các chất bổ trợ cho vacxin. Các chất bổ trợ gồm có: - Montanide ISA là chất bổ trợ dầu cho vacxin. Tăng cường và tập trung phản ứng miễn dịch.

- Montanide IMS: Chất bổ trợ nước tích hợp vi nhũ tương

- Montanide GEL: Các chất bổ trợ sử dụng polyme.

33

Chất bổ trợ Montanide đã được Ủy ban thú y đánh giá là an toàn cho các ứng

dụng thú y:

- Nhôm hydroxit

- Nhũ tương dầu (O / W và W / O / W) gồm: ISA 206 VG (50%); ISA 201

VG (50%); ISA 15A VG (15%) ISA 35 VG (25%); Dầu không khoáng (w / w)

- Vi nhũ tương (nano) gồm IMS 1313 VG (25-50%); IMS 1313 VG N (25-

50%);

- Chất bổ trợ polyme: GEL 01 (10-20%); GEL 02 (10-15%)

MONTANIDETM IMS là một loạt các chất bổ trợ sẵn sàng để pha loãng, có chứa sự kết hợp của vi nhũ tương và hợp chất kích thích miễn dịch được liệt kê là các chất GRAS (được công nhận là an toàn). Chất bổ trợ này, không có thành phần nguồn gốc động vật, có sẵn ở dạng vô trùng (ST) hoặc cấp bảo quản (PR, 0,01% thimerosal). MONTANIDETM IMS 1313 VG N dễ tạo công thức bằng cách pha loãng đơn giản với môi trường nước và tạo thành chất lỏng và vacxin dễ tiêm. Nó tương thích với các dung dịch đệm phốt phát (PBS). Chuẩn bị vacxin: Để chuẩn bị 100 g vacxin: - MONTANIDETM IMS 1313 VG N: 50 g - Môi trường nước kháng nguyên: 50 g Chế phẩm ổn định thu được bằng cách pha loãng tá dược MONTANIDETM IMS 1313 VG N vào môi trường nước, ở nhiệt độ phòng hoặc thấp hơn, dưới kích động vừa phải (ví dụ chân vịt biển, máy khuấy từ).

Chất bổ trợ MONTANIDE IMS 1313 VG N được khuyến cáo cho các vacxin tiêm và niêm mạc lợn. Chất bổ trợ MONTANIDE IMS 1313 VG N cũng được khuyên dùng cho vacxin niêm mạc gia cầm, gia súc và gia súc nhai lại nhỏ. Ưu điểm: MONTANIDETM IMS 1313 VG N cho phép sản xuất dễ dàng, ngay cả với môi trường PBS, vacxin dung nạp tốt với độ an toàn ngắn hạn tốt (không có phản ứng chung) và khả năng chịu đựng tại chỗ tuyệt vời (không có phản ứng tại chỗ tiêm sau khi giết mổ). Chất bổ trợ này có thể tạo ra các phản ứng miễn dịch mạnh mẽ và nhanh chóng với tính bền vững, đặc biệt trong trường hợp tiêm chủng hai mũi. An toàn và quy định: Các thử nghiệm độc tính được thực hiện trên phạm vi MONTANIDETM (thử nghiệm Berlin, LD 50 qua đường miệng, IP LD 50, thử nghiệm kích ứng mắt, thử nghiệm kích ứng da, khả năng gây sốt) kết luận về tính không độc và khả năng dung nạp thuận lợi của các chất bổ trợ này. Nó đã được chứng minh rằng nó là một chất bổ trợ tuyệt vời để kích thích phản ứng dịch thể. Sản phẩm này được khuyên dùng cho các loại kháng nguyên khác

34

nhau: vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng và cho vacxin sống bất hoạt, tiểu đơn vị hoặc biến đổi.

2.6.4. Cytokine

Cytokine là những chất đóng vai trò quan trọng trong các đáp ứng qua trung gian tế bào. Việc sử dụng các cytokine làm chất bổ trợ cho vacxin dành cho động vật đã được nghiên cứu (Lin R & cs., 1995). Ví dụ, IL-2, IL-12 và IFN-cf kích hoạt sự kích thích của các tế bào Th1 chịu trách nhiệm cho các phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào chống lại các mầm bệnh nội bào.

2.6.5. Saponin

Saponin là các hợp chất lưỡng tính bao gồm một hoặc nhiều phần tử glycoside ưa nước gắn với dẫn xuất triterpene lipo-philic. Hiện nay những chất có nguồn gốc tự nhiên này được sử dụng trong nhiều ứng dụng dược phẩm. Khả năng kích thích các phản ứng miễn dịch nên saponin đã được dùng như một chất bổ trợ trong sản xuất vacxin dành cho động vật. Chất bổ trợ thuộc loại saponin nổi bật nhất là Quil-A (Brenntag Biosector A / S, Đan Mạch).

2.6.6. Các chất cao phân tử

Những chất này thường được sử dụng trong bảo quản kháng nguyên trong vacxin và giải phóng có kiểm soát sau khi tiêm (Ferreira & cs., 2013). Ngoài ra, một số chất cũng có khả năng kích thích sản sinh miễn dịch. Theo Lai & cs. (2012), một số chất polyme tổng hợp và tự nhiên có hoạt tính miễn dịch làm chất bổ trợ cho vacxin trong thú y đang được xem xét ứng dụng.

Như vậy nhiều chất tự nhiên và tổng hợp có thể được sử dụng làm chất bổ trợ để cải thiện hiệu lực của vacxin động vật trong khi những chất khác (cytokine và polypho-sphazenes) vẫn được đánh giá bằng thực nghiệm. Một số tiêu chí cần được xem xét trong việc lựa chọn và phát triển chất bổ trợ cho vacxin động vật như sau: hiệu quả đối với các loài sinh vật đích, cảm ứng miễn dịch dự phòng nhanh chóng và lâu dài, an toàn cho động vật, tuân thủ quy định an toàn thực phẩm, tính khả thi để sản xuất quy mô và cuối cùng không kém phần hiệu quả về chi phí.

35

PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia.

- Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam.

- Phòng thí nghiệm trọng điểm khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp

Việt Nam.

- Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin; nhà máy sản xuất vacxin theo

tiêu chuẩn WHO thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavet và một số cơ sở chăn

nuôi lợn.

3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đề tài thực hiện từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 6 năm 2020.

3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Bộ vi khuẩn sử dụng làm giống gốc (Master seed) sản xuất vacxin viêm

phổi ở lợn lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin gồm có:

+ Vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b.

+ Vi khuẩn P. multocida serotype A và D.

+ Vi khuẩn S. suis serotype 2.

- Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu, sản xuất vacxin đa giá phòng

viêm phổi ở lợn.

+ Các loại môi trường dùng để nuôi cấy, lưu giữ vi khuẩn do hãng Oxoid

(Anh) và Merck (Pháp) sản xuất: môi trường nước thịt, thạch thường, thạch

máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate, BHI broth, BHI agar, TSB, PLLO

agar …

+ Các loại môi trường, hóa chất dùng để giám định, xác định các đặc tính

sinh hóa của vi khuẩn: môi trường đường các loại, dung dịch Kovac’s, dung dịch H2O2 3%, giấy thử Oxidase, nước muối 6,5%, ...

+ NAD do hãng Oxoid (Anh) sản xuất.

+ Chất bổ trợ nhũ dầu IMS 1313 do công ty Seppic- Pháp cung cấp.

- Động vật thí nghiệm:

+ Lợn sau cai sữa khỏe mạnh không tiêm vacxin có kháng nguyên

A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis.

36

+ Chuột nhắt trắng: 18- 20 g khỏe mạnh.

- Máy móc, dụng cụ thí nghiệm

+ Các máy móc, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm, các hoá chất sát trùng, tiêu độc, rửa dụng cụ ... để thực hiện các kỹ thuật như PCR, RT-PCR; ELISA, ....

+ Dây chuyền công nghệ chế tạo vacxin quy mô công nghiệp như bộ máy lên

men sục khí 15 lít và 120 lít SATORIUS của Đức; hệ thống ra chai tự động của Ý.

3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.4.1. Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh

viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra

- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do

vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra

- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do

vi khuẩn P. multocida gây ra

- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi

khuẩn S. suis gây ra

3.4.2. Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của bộ giống sản

xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae,

P. multocida và S. suis gây ra

- Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản

xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra

- Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản

xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra

- Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản

xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra.

3.4.3. Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra

- Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu

phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.

- Nghiên cứu đánh giá chất lượng vacxin bán thành phẩm.

- So sánh khả năng sinh miễn dịch của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và

37

vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn

A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis.

- Xây dựng quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm

phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.

- Xây dựng quy trình bảo quản vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm

phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.

3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1. Phương pháp nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của

lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. mutocida và S. suis gây ra

3.5.1.1. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm trên lợn bằng các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis

Chọn 24 con lợn sau cai sữa (4 tuần tuổi) khỏe mạnh không tiêm vacxin

viêm phổi có kháng nguyên A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. Trước

khi gây bệnh cho lợn, tiến hành lấy máu kiểm tra kháng thể (âm tính) có trong

máu lợn với A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. Lợn được chia làm 8 lô, mỗi lô có 3 con. Liều gây bệnh bằng 100 liều LD50, với đường gây bệnh dưới

da lợn. Lợn đối chứng được tiêm BHI broth vô trùng. Theo TCVN 8685.

- Lô 1: gây bệnh với vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2

- Lô 2: gây bệnh với vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 5

- Lô 3: gây bệnh với vi khuẩn P. multocida serotype A

- Lô 4: gây bệnh với vi khuẩn P. multocida serotype D

- Lô 5: gây bệnh với vi khuẩn S. suis serotype 2

- Lô đối chứng: 3 lô, mỗi lô 3 con lợn

Theo dõi lợn gây bệnh thực nghiệm biến đổi về triệu chứng lâm sàng, mổ

khám quan sát các biến đổi bệnh lý lâm sàng có so sánh với lợn bị mác bệnh viêm phổi do các vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây bệnh cho lợn ở các lứa tuổi tại thực địa.

3.5.1.2. Phương pháp PCR xác định các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập từ lợn gây bệnh thực nghiệm

a. Quy trình tách ADN tổng số

- Lấy một số khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch cho vào Eppendorf 2ml đã

bổ sung 200 µl nước cất đã qua khử trùng. Vortex trong 30 giây.

38

- Cho thêm 180 µl dung dịch Digestion Solution và 20 μL of Proteinase K

Solution, lắc bằng máy vortex trong 30 giây cho đến khi thành huyễn dịch đồng nhất rồi ủ ở 56oC trong 3 giờ, cứ 30 phút vortex 1 lần.

- Bổ sung 20 μL RNase-A, lắc trong 30 giây, để ở ủ ở 56 oC trong 30 phút.

- Thêm 200 μL of Lysis Solution, lắc trong 30 giây cho mẫu tan hoàn toàn.

- Thêm 400 μL Ethanol 50o, lắc trong 15 giây; ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút.

- Chuyển hỗn dịch sang cột có màng lọc, ly tâm, loại bỏ phần dung dịch phía

dưới.

- Cho 500 µl dung dịch Washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc để rửa DNA, ly

tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới.

- Cho 500 µl Washing buffer 2 (AW2) vào cột lọc để tiếp tục rửa DNA, ly

tâm 13.000 vòng/phút trong 1,5 phút, bỏ dịch bên dưới. Ly tâm lại 13.000

vòng/phút trong 2 phút làm khô màng.

- Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, cho 50 µl dung dịch Elution buffer

(EL), để ở nhiệt độ phòng trong 4 - 5 phút; sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong

2 phút. Bỏ cột, thu dịch bên dưới là ADN tổng số. Ghi ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 20 oC cho đến khi sử dụng.

b. Trình tự mồi xác định A. pleuropneumoniae

- Mồi sử dụng: cặp mồi của phản ứng được dựa vào chuỗi gen mã hóa omlA

(outer membrane lipoprotein) đặc trưng cho A. Pleuropneumoniae (Gram & cs.,

1998), gồm một mồi xuôi LPF và một mồi ngược LPR, trình tự nucleotitide của

cập mồi được trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Trình tự mồi dùng để xác định gen omlA của A. pleuropneumoniae

Nhiệt độ Ký hiệu Gen đích Trình tự nucleotide (5’-3’) Sản phẩm bắt cặp mồi

c. Trình tự mồi xác định P. mutocilda

Trình tự mồi xác định các serotype giáp mô A, B, D của vi khuẩn

P. multocida dựa trên phản ứng PCR được mô tả bởi Đỗ Ngọc Thúy & cs. (2007)

gồm các cặp mồi: CAPA-F và CAPA-R để xác định serotype A, CAPB-F và CAPB-R để xác định serotype B, CAPD-F và CAPD-R để xác định serotype D. Trình tự cặp mồi và kích cỡ sản phẩm được trình bày ở bảng 3.2.

AAGGTTGATATGTCCGCACC LPF OmlA 950 bp 63oC CACCGATTACGCCTTGCC LPR

39

Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định serotype A, D của P. multocida

Tên mồi Trình tự mồi Độ đặc hiệu Kích thước Nhiệt độ bắt cặp

Serotype A 1044 bp

Serotype B 720 bp 54oC 5’- TGCCAAAATCGCAGTGAG-3’ 5’- TTGCCATCATTGTCAGTG-3’ 5’-CATTTATCCAAGCTCCACC-3’ 5’-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3’

d. Trình tự mồi xác định S. suis

Mồi của phản ứng PCR: cặp mồi của phản ứng được thiết kế dựa vào chuỗi gen mã hoá glutamate dehydrogenase (gdh) đặc trưng cho vi khuẩn S. suis, gồm 1 mồi xuôi là Str2-F và 1 mồi ngược là Str2-R, được trình bày ở bảng 3.3.

Serotype D 657 bp CAPA-F CAPA-R CAPB-F CAPB-R CAPD-F 5’- TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC-3’ CAPD-R 5’- CATCTACCCACTCAACCATATCAG-3’

Bảng 3.3. Trình tự mồi dùng để xác định gen gdh của S. suis theo tiêu chuẩn quốc gia- TCVN 8400-2:2010

Ký hiệu mồi Trình tự cặp mồi (5’ - 3’) Gen đích Kích cỡ sản phẩm (bp) Nhiệt độ bắt cặp

e. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phương pháp PCR

gdh 688 58oC Str2 - F (mồi xuôi) 5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’ Str2 - R (mồi ngược) 5’-CCATGGACAGATAAAGATGG-3’

Bảng 3.4. Thành phần phản ứng

Thành phần

PCR Master Mix (Thermo) Mồi xuôi (10pmol/µl) Mồi ngược (10pmol/µl) DMSO Khuôn tổng số Nước tinh khiết (của kit)

Thể tích (µl) 25 2 2 2 3 16 50 Tổng

Bảng 3.5. Chu trình nhiệt

Số chu kỳ 1

35

1

Các giai đoạn phản ứng Khởi đầu Biến tính Gắn mồi Kéo dài Kết thúc Bảo quản Nhiệt độ 94 0C 94 0C Tùy cặp thuộc cặp mồi 72 0C 72 0C 40C Thời gian 5 phút 30 giây 30 giây 2 phút 10 phút Bảo quản tạm thời

40

f. Điện di kiểm tra trên Agarose 1%:

Sử dụng 10 µl sản phẩm PCR, chạy 30 phút ở hiệu điện thế 110V, 100mA,

nhuộm Ethidium Bromide 5 phút.

3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra

3.5.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn và kiểm tra đặc tính sinh vật, hoá học

Phương pháp giám định các đặc tính nuôi cấy trên các loại môi trường, đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nghiên cứu theo (Moller & cs., 1996; Quinn & cs., 2012) và theo TCVN- 8685. Bệnh phẩm là phổi, dịch ngoáy vùng hầu họng được cấy sơ cấp lên môi trường thạch máu hoặc môi trường thạch chọn lọc Colombia. Sau khi nuôi cấy trong tủ ấm có 5% CO2, có thể chọn 1-2 khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng để giám định vi khuẩn về mặt hình thái và đặc tính sinh hóa tùy theo loại vi khuẩn. Việc kiểm tra đặc tính sinh hóa theo TCVN 8685.

3.5.2.2. Phương pháp PCR kiểm tra yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn

a. Quy trình tách ADN tổng số:

Thực hiện theo mô tả ở phần 3.5.1.2.a

b. Trình tự mồi xác định yếu tố độc lực của A. pleuropneumoniae

- Xác định gen sản sinh độc tố (Apx) của vi khuẩn A. pleuropneumoniae bằng

kỹ thuật PCR theo (Frey & cs., 1995):

Bảng 3.6. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định gen quy định sản sinh ba loại độc tố Apx của A. pleuropneumoniae

Gen đích Trình tự nucleotide (5’- 3’) Sản phẩm (bp) Nhiệt độ bắt cặp

apxICA 2420

apxIICA 2088

apxIIICA 1755 62oC

apxIBD 1447

c. Trình tự mồi xác định yếu tố độc lực của P. multocida

Trình tự mồi được thông tin tương tự ở phần 3.5.1.2.c

apxIIIBD 968 Ký hiệu mồi XICA-F TTGCCTCGCTAGTTGCGGAT XICA-R TCCCAAGTTCGAATGGGCTT XIICA-F CCATACGATATTGGAAGGGCAAAT XIICA-R TCCCCGCCATCAATAACGGT XIIICA-F CCTGGTTCTACAGAAGCGAAAATC XIIICA-R TTTCGCCCTTAGTTGGATCGA XIBD-F GTATCGGCGGGATTCCGT XIBD-R ATCCGCATCGGCTCCCAA XIIIBD-F TCCAAGCATGTCTATGGAACG XIIIBD-R AACAGAATCAAAATCAGCTTGGTT

41

d. Trình tự mồi xác định yếu tố độc lực và serotype của S. suis

Việc xác định 4 yếu tố gây bệnh của S. suis được thực hiện bằng phản ứng Multiplex PCR. Về nguyên tắc, phương pháp này được thực hiện tương tự như phương pháp PCR để xác định vi khuẩn S. suis, chỉ khác về thành phần của phản ứng và các chu kỳ nhiệt.

Bảng 3.7. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định một số gen mã hoá các yếu tố độc lực của S. suis

Trình tự nucleotide (5 ’- 3 ’) Sản phẩm (bp) Nhiệt độ bắt cặp Gen đích Ký hiệu mồi

epf 744

sly 248

62oC

mrp 188

Bốn serotype S. suis gây bệnh thường gặp nhất ở lợn là serotype 1, 2, 7 và 9

được xác định bằng phản ứng PCR.

Mồi của phản ứng: các cặp mồi dùng để xác định các serotype 1, 2, 7 và 9 của S. suis được lựa chọn dựa vào chuỗi gen mã hoá quá trình sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giáp mô (cps), gồm 4 cặp mồi: cps1J-F và cps1J-R để xác định serotype 1, cps2J-F và cps2J-R để xác định serotype 2, cps7H-F và cps7H-R để xác định serotype 7, cps9H-F và cps9H-R để xác định serotype 9.

arc 118 epf-F epf-R sly-F sly-R mrp-F mrp-R arcA-F arcA-R CGCAGACAACGAAAGATTGA AAGAATGTCTTTGGCGATGG GCTTGACTTACGAGCCACAA CCGCGCAATACTGATAAGC ATTGCTCCACAAGAGGATGG TGAGCTTTACCTGAAGCGGT TGATATGGTTGCTGCTGGTC GGACTCGAGGATAGCATTGG

Bảng 3.8. Trình tự các mồi dùng để xác định các serotype 1, 2, 7, 9 của S. suis

Serotype Trình tự nucleotide (5 ’- 3 ’) Nhiệt độ bắt cặp Ký hiệu mồi Sản phẩm (bp)

1 637

2 498

7 379 62oC

9 303 cps1J-F cps1J-R cps2J-F cps2J-R cps7H-F cps7H-R cps9H-F cps9H-R TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC AAT GCC CTC GTG GAA TAC AG TCC TGA CAC CAG GAC ACG TA GGG ATG ATT GCT CGA CAG AT CCG AAG TAT CTG GGC TAC TGA

42

e. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phương pháp PCR:

Thực hiện theo thao tác đã mô tả ở phần 3.5.1.2.e

f. Điện di kiểm tra trên Agarose 1%:

Thực hiện như đã mô tả ở phần 3.5.1.2.f

3.5.2.3. Phương pháp kiểm tra yếu tố độc lực của vi khuẩn trên chuột và lợn

Độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trong nghiên cứu này, được xác định trên chuột nhắt trắng và trên lợn. Xác định độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nghiên cứu trên chuột nhắt trắng theo phương pháp của (Carter, 1995), tính liều LD50 theo (Reed & Muench, 1938). Với mỗi chủng vi khuẩn, sử dụng canh trùng được nuôi cấy ở 37◦C/24 giờ, riêng với A. pleuropneumoniae nuôi cấy trong điều kiện có 5% CO2 mỗi một chủng vi khuẩn được tiêm cho 2 chuột thí nghiệm vào dưới da với liều 0,2 ml/con. Với lợn, mỗi lợn được gây bệnh thực nghiệm ở liều 5 ml/con (Theo TCVN 8685).

3.5.3. Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra

3.5.3.1. Phương pháp chế tạo vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu

Giống gốc master seed được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển

vacxin gồm: vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; Vi khuẩn P. multocida serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2. Bộ giống gốc này đang được sử dụng để sản xuất vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh viêm phổi cho lợn, đã được phép lưu hành trên toàn quốc. Các vi khuẩn của bộ giống gốc này có cấu trúc kháng nguyên ổn định, kháng nguyên tính cao, sản sinh các loại độc tố và độc lực cao (Hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc thú y: Sản phẩm: MAR-APPSVAC - vacxin viêm phổi lợn đa giá, 2015).

Các chủng vi khuẩn được lưu giữ dưới dạng đông khô hay thạch lỏng

Glycerol (Phần phụ lục).

- Lấy vi khuẩn A. pleuropneumoniae từ thạch lỏng (hoặc ống giống đã đông

khô) nuôi cấy trên môi trường thạch PPLO có bổ sung NAD; Vi khuẩn P. multocida và S. suis nuôi cấy trên môi trường thạch máu, để ở 370C, với A. pleuropneumoniae trong điều kiện có 5% CO2 trong 24 giờ.

- Chọn khuẩn lạc A. pleuropneumoniae trên thạch PPLO; Vi khuẩn

P. multocida và S. suis trên môi trường thạch máu cấy vào môi trường TYE, BHI

43

hay TSB (giống nhỏ), nuôi cấy lắc ở 370C, trong 6 giờ. Chuyển canh trùng đã nuôi cấy lắc: từ 100 ml canh trùng chuyển vào bình có 200 ml TYE, nuôi cấy lắc ở 370C, trong 10 giờ…vv, tóm tắt ở sơ đồ (hình 3.1).

Bộ giống gốc

Thạch máu, thạch PPLO, BHI

Giống nhỏ: TYE, TSB, THB

Kiểm tra thuần khiết

Giống sản xuất: TYE, TSB, THB

Kiểm tra thuần khiết

Lên men sục khí: TW, TSB, THB

Đếm số và kiểm tra thuần

khiết Vô hoạt bằng formol 0,3%

Kiểm tra vô trùng

Bổ sung nhũ dầu 25%

Kiểm tra vô trùng

Ra chai bán thành phẩm

Kiểm tra vô trùng Kiểm tra an toàn Kiểm tra hiệu lực

Ghi chú: - TW: Tryptone Water

- TYE: Tryptone Yeast Extract Broth

- PLLO: Pleuropneumonia-like organism

- TSB: Tryptic Soy Broth

- BHI: Brain Heart Infusion

- THB: Todd Hewitt Broth

Dán nhãn thành phẩm

Hình 3.1. Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin viêm phổi đa giá bổ trợ nhũ dầu

44

3.5.3.2. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết, vô trùng

Kiểm tra cảm quan, đậm độ và vô trùng: vacxin được kiểm tra vô trùng (không tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc) theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685- 2017 và theo quy trình của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y quốc gia.

3.5.3.3. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn

Kiểm tra an toàn: vacxin được kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng bằng cách tiêm bắp đùi liều 0,5 ml/con. Bên cạnh đó vacxin cũng được kiểm tra an toàn trên lợn bằng cách tiêm vacxin liều gấp đôi (4 ml/con) cho lợn 4 tuần tuổi với đường tiêm bắp. Theo dõi các phản ứng của chuột nhắt và lợn để xem mức độ an toàn của vacxin thử nghiệm.

3.5.3.4. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực

a. Kiểm tra trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp thay thế:

Thí nghiệm được bố trí thành 3 lô:

- Lô 1: Chia 2 nhóm, nhóm thí nghiệm tiêm vacxin cho 15 chuột khỏe mạnh, mỗi chuột tiêm 0,2 ml vacxin vào dưới da, lặp lại mũi 2 sau 7 ngày và nhóm đối chứng gồm 15 chuột được tiêm nước thịt vô trùng. Sau 21 ngày, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae (LD50 = 4,8 x 107 CFU/0,2 ml) cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng.

- Lô 2: Chia 2 nhóm, cách tiêm như lô 1, nhóm thí nghiệm tiêm vacxin cho 10 chuột và nhóm đối chứng 10 chuột được tiêm nước thịt vô trùng. Sau 21 ngày, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn P. multocida (LD50 = 4,2 x 107 CFU/0,2 ml) cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng.

- Lô 3: Chia 2 nhóm, cách tiêm như ở lô 1 và 2, nhóm thí nghiệm tiêm vacxin cho 5 chuột, nhóm đối chứng 5 chuột được tiêm nước thịt vô trùng Sau 21 ngày, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn S. suis (LD50 = 4,4 x 107 CFU/0,2 ml) cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng.

b. Kiểm tra hiệu lực trên lợn bằng phương pháp trọng tài:

Vacxin được kiểm tra phải có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đạt hiệu lực ≥ 70% khi công cường độc. Lợn thí nghiệm là lợn khỏe mạnh, trên 4 tuần tuổi, không nhiễm mầm bệnh tự nhiên (âm tính với kháng thể kháng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis). Thí nghiệm được tiến hành chia lô và tiêm vacxin cho lợn như sau:

+ Lô thí nghiệm: 21 lợn, đánh số tai từ TN1 đến TN21, tiêm vacxin liều sử

dụng 2 ml/con, tiêm bắp.

45

+ Lô đối chứng: 14 lợn, đánh số tai ĐC1 đến ĐC14, tiêm nước thịt vô trùng,

liều tiêm và đường tiêm tương tự lô thí nghiệm.

Sau 21 ngày tiêm vacxin và nước thịt vô trùng, công cường độc cho lợn ở lô thí nghiệm và lô đối chứng bằng cách tiêm 7 chủng vi khuẩn cường độc tiêu chuẩn vào dưới da, mỗi chủng vi khuẩn cho 3 lợn ở lô thí nghiệm và 2 lợn ở lô đối chứng, liều 5ml/con, tương đương với liều gây bệnh thực nghiệm là 4,5 x 109 vi khuẩn/ml đối với từng loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis.

3.5.3.5. Phương pháp đánh giá kiểm tra kháng thể

Hiệu giá kháng thể chống vi khuẩn A. pleuropneumoniae (serotype 2, 5a, 5b); P. multocida (serotype A, serotype D) và S. suis serotype 2 được xác định dựa vào tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-15:2017, tiêu chuẩn ngành TCN 940-2006, tiêu chuẩn cơ sở TCCS 02VT-92/KNI và quy trình tại bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia. Hiệu giá kháng thể được biểu thị dưới dạng log2 và được xác định vào các thời điểm trước khi tiêm phòng, sau khi tiêm phòng 21 ngày, 2 tháng, 3 tháng, 4 tháng và 5 tháng.

a. Phương pháp xác định kháng thể A. pleuropneumoniae bằng ELISA

- Tên bộ Kit: ID Screen APP 2,5 Indirect;

- Hãng sản xuất: ID.vet Innovative Diagnostics

Hóa chất được cung cấp trong bộ Kit

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tên hóa chất Đĩa đã gắn kháng nguyên APP 2/5 Conjugate (10X) Đối chứng dương Đối chứng âm Dilution Buffer 2 Dilution Buffer 19 Đệm rửa (20X) Cơ chất Stop solution (0.5M)

Lưu ý: Conjugate, các ống đối chứng, cơ chất phải được giữ trong đá gel

hoặc đá bào (5oC ± 3 oC) trong quá trình thao tác.

Các hóa chất khác có thể giữ ở 2oC và 26oC.

Trong bộ Kit ELISA có tên là ID Screen APP 2,5 Indirect của Hãng ID, trong mỗi giếng đều gắn 1 số lượng kháng nguyên A.pp nhất định, khi gắn với kháng thể kháng A.pp serotype 2 hoặc 5 có trong huyết thanh lợn sẽ cho các kết quả khác

46

nhau phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể có trong huyết thanh lợn được tiêm vacxin. Khi các chỉ số OD và S/P cao chứng tỏ vacxin kích thích cơ thể lợn sinh kháng thể tốt hơn.

- Tiến hành:

Để các hóa chất và các mẫu huyết thanh ở nhiệt độ phòng (21oC ± 5oC) trong 30 phút trước khi tiến hành thí nghiệm. Các ống chứa mẫu huyết thanh và các ống đối chứng cần được trộn đều bằng máy vortex và spin nhanh trước khi tiến hành các phản ứng. Pha loãng Wash solution từ 20X xuống 1X.

Bước 1: Nhỏ 100 µl đối chứng âm, 100 µl đối chứng dương vào các giếng đối chứng. Nhỏ 250 µl dilution buffer 2 và 5 µl mỗi mẫu huyết thanh vào các giếng còn lại.

Bước 2: Ủ 30 phút ± 3 phút ở nhiệt độ phòng 21oC ± 5oC.

Bước 3: Chuẩn bị 1X Conjugate bằng cách pha loãng Conjugate 10X với tỉ

lệ 1/10 trong Dilution buffer 19.

Bước 4: Đổ bỏ dịch. Rửa mỗi giếng 3 lần bằng 1X Wash solution (300 µl/ giếng) sử dụng pipet đa kênh.Tránh để giếng khô giữa các lần rửa.Ở lần rửa cuối, đảo ngược giếng rồi vỗ mạnh vào giấy khô.

Bước 5: Bổ sung 100 µl 1X conjugate vào mỗi giếng. Ủ 30 phút ± 3 phút ở

nhiệt độ phòng 21oC ± 5oC.

Bước 6: Lặp lại bước 4

Bước 7: Bổ sung 100 µl cơ chất vào mỗi giếng. Ủ 15 phút ± 2 phút ở nhiệt

độ phòng 21oC ± 5oC trong tối (phủ giấy bạc kín các giếng).

Bước 8: Thêm 100 µl Stop solution vào mỗi giếng.

Đọc kết quả OD ở bước sóng 450 nm. Kết quả có ý nghĩa khi:

- Giá trị OD của đối chứng dương lớn hơn 0,35: OD(PC) > 0,350

- Tỉ số giá trị OD của đối chứng âm và đối chứng dương nhỏ hơn 0,3: OD

(NC)/OD (PC) < 0,3

- S/P % = [(OD mẫu – OD chứng âm)/ (OD chứng dương – OD chứng âm)] *100

S/P S/P % < 30 % 30% ≤ S/P % < 40 % S/P % ≥ 40 %

Kết quả Âm tính Nghi ngờ Dương tính

Lưu ý: - Conjugate, các ống đối chứng, cơ chất phải được giữ trong đá gel

47

hoặc đá bào (5oC ± 3 oC) trong quá trình thao tác. Các hóa chất khác có thể giữ ở 2oC và 26oC.

b. Phương pháp đánh giá hàm lượng kháng thể kháng P. multocida và S. suis bằng phản ứng ngưng kết chậm

- Chuẩn bị kháng nguyên thân (KNO - Somatic antigen- KN xử lý axít HCL 1N): Cấy 0,01 ml vi khuẩn P. multocida hay S.suis vào môi trường thạch máu, ủ ở tủ ấm 37°C trong 24 h. Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch rồi cấy vào môi trường nước thịt BHI hay TSB (ống 4 ml), rồi ủ ở tủ ấm 37°C trong 24h. Láng 4 ml canh trùng lên 2 đĩa thạch máu, hút bỏ dịch còn thừa đi, rồi ủ ở tủ ấm 37°C trong 24 h. Thu hoạch vi khuẩn sau khi láng trên mặt thạch máu bằng cách dùng 5ml PBS rửa bề mặt hai đĩa thạch, hút huyễn dịch vi khuẩn thu được vào ống nghiệm. Nhỏ 0,02 ml Formaldehyde solution 37% vào huyễn dịch vi khuẩn thu được rồi ủ ở tủ ấm 37°C trong 24 h, sau đó đem kiểm tra vô trùng huyễn dịch vi khuẩn. Huyễn dịch vi khuẩn đạt chỉ tiêu vô trùng sẽ được ly tâm bằng máy ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 20 phút ở nhiệt độ 4°C, thu lấy cặn, hoàn nguyên lại bằng 20 ml EDTA 1%, lắc đều rồi ủ ở tủ ấm 37°C trong 24 h. Sau đó tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn bằng máy ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 20 min ở nhiệt độ 4°C, cặn thu được sẽ rửa bằng 5 ml PBS có bổ sung 0,3% Formaldehyde solution, lặp lại 2 lần. Tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn bằng máy ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 20 phút ở nhiệt độ 4°C, cặn thu được sẽ được hoàn nguyên bằng 5 ml PBS để thu hoạch kháng nguyên. Kiểm tra kháng nguyên xem có tự ngưng kết không, kháng nguyên đạt yêu cầu khi không có hiện tượng ngưng kết.

- Chuẩn bị huyết thanh kiểm tra: Lấy máu động vật, chắt lấy huyết thanh. Sau

đó khử bổ thể bằng cách đun ở nồi cách thủy ở nhiệt độ 56°C trong 30 phút.

- Cách tiến hành: Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm với kháng nguyên

O (kháng nguyên Somatic) thực hiện trên đĩa 96 giếng đáy chữ U.

Thực hiện thí nghiệm theo sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm như sau.

48

+ Đối với các giếng thí nghiệm: cho dung dịch PBS vào các dãy giếng thí nghiệm trên đĩa 96 đáy chữ U (50 μl/giếng). Thêm vào giếng đầu tiên 50 μl huyết thanh và pha loãng huyết thanh theo cơ số 2. Nhỏ vào các giếng 50 μl kháng nguyên.

+ Đối chứng âm: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl kháng nguyên.

+ Đối chứng dương: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl huyết thanh tối miễn dịch

và pha loãng theo cơ số 2 + 50 μl kháng nguyên

+ Lắc nhẹ cho đều rồi dính băng dính để ở tủ ấm 37°C qua đêm

- Đọc kết quả: Phản ứng âm tính: kháng nguyên lắng tròn đáy giếng. Phản ứng dương tính: xảy ra hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng. Đọc hiệu giá ngưng kết: hiệu giá ngưng kết được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.

c. So sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu

Chúng tôi sử dụng 13 lợn không tiêm vacxin có kháng nguyên

A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis để tiến hành so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis của vacxin đa giá có bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá có bổ trợ nhũ dầu.

Lợn thí nghiệm được chia ra 3 lô:

Lô 1: có 5 lợn, được tiêm vacxin đa giá có bổ trợ keo phèn, với ký hiệu TN1 đến

TN5.

Lô 2: có 5 lợn, được tiêm vacxin đa giá có bổ trợ nhũ dầu, ký hiệu TN6 đến

TN10.

Lô 3: có 3 lợn đối chứng, được tiêm nước sinh lý, với ký hiệu TN11 đến TN13. Huyết thanh của lợn sau khi tiêm vacxin 21 ngày, sử dụng để xác định hàm lượng kháng thể hình thành trong máu sau khi tiêm vacxin 21 ngày

3.5.3.6. Phương pháp xác định liều vacxin đa giá phòng bệnh viêm phổi lợn

Nhằm xác định liều tiêm vacxin đa giá phòng bệnh viêm phổi ở lợn phù hợp để có hiệu lực bảo hộ đàn lợn sau khi tiêm vacxin cao nhất và có độ dài miễn dịch dài nhất như sau: Lô lợn thí nghiệm gồm 15 con, chia làm 3 nhóm khác nhau, mỗi nhóm lợn thí nghiệm có 5 lợn 6 tuần tuổi. Tiến hành tiêm cho lợn như sau:

- Nhóm 1: tiêm vacxin đa giá viêm phổi lợn 1 mũi với liều tiêm 2 ml/con

tiêm bắp.

49

- Nhóm 2: tiêm vacxin đa giá viêm phổi lợn 2 mũi với liều tiêm 1 ml/con/mũi

cách nhau 7 ngày, tiêm bắp.

- Nhóm 3: tiêm vacxin đa giá viêm phổi lợn 2 mũi, với liều tiêm 2 ml/con

/mũi cách nhau 7 ngày, tiêm bắp.

Lợn thí nghiệm được đánh số từ KT1 đến KT15. Trong đó: từ KT1 đến KT5 là lợn nhóm 1, từ KT6 đến KT10 là lợn nhóm 2 và từ KT11 đến KT15 là lợn thuộc nhóm 3. Trước khi tiêm vacxin tiến hành lấy máu kiểm tra kháng thể, sau khi tiêm 21 ngày, lấy máu lợn thí nghiệm để xác định hàm lượng kháng thể kháng lại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis có trong máu lợn được tiêm phòng vacxin. Dựa trên kết quả hàm lượng kháng thể có trong máu lợn ở 3 nhóm khác nhau, có thể xác định được liều tiêm vacxin cho 1 lợn phù hợp đạt hiệu lực phòng bệnh viêm phổi cho lợn cao nhất.

3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu thu được trong nghiên cứu được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2019 và phần mềm R phiên bản 4.0.2. Thông số trung bình và độ lệch chuẩn được tính toán bằng phần mềm Excel. So sánh hiệu giá kháng thể sau các thời điểm tiêm vacxin bằng phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ANOVA sử dụng phần mềm R 4.0.2. So sánh hiệu giá kháng thể sinh ra do tiêm vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu bằng kiểm định t- Test độc lập trung bình hai mẫu với phương sai không bằng nhau, sử dụng phần mềm R 4.0.

50

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG, BỆNH TÍCH ĐẠI

THỂ CỦA LỢN MẮC BỆNH DO VI KHUẨN A. PLEUROPNEUMONIAE,

P. MULTOCIDA VÀ S. SUIS GÂY RA

4.1.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc

bệnh do vi khuẩn A. pneumoniae gây ra

4.1.1.1. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên lợn

Dựa trên kết quả xác định độc lực và liều LD50 của vi khuẩn

A. pleuropneumoniae, chúng tôi đã xác định được liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm như sau: A. pleuropneumoniae serotype 2: 4,5 x 109 CFU/ml; A. pleuropneumoniae serotype 5a: 5 x 109 CFU/ml. Chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 5a và 5b có cấu trúc kháng nguyên và độc lực tương

đồng nhau, nên chúng tôi chọn chủng 5a đại diện cho 2 chủng 5a và 5b để gây

bệnh thực nghiệm cho lợn. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của giống vi khuẩn A. pleuropneumoniae được thể hiện ở bảng 4.1.

Bảng 4.1. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của vi khuẩn

A. pleuropneumoniae

Kết quả theo dõi

Số lợn thí Chủng vi khuẩn

Lô thí nghiệm gây bệnh nghiệm Tỷ lệ chết Liều gây bệnh (ml/con) Số con chết Thời gian chết (con) (%) Phân lập lại vi khuẩn

5 3 3/3 6 – 12 h 100 3/3 A. pleuropneumoniae serotype 2 Lô 1

5 3 2/3 6 – 20 h 66,7 3/3 A. pleuropneumoniae serotype 5a

Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy: ở lô thí nghiệm thứ nhất, với liều gây nhiễm A. pleuropneumoniae serotype 2 là 5 ml/con, cả 3 lợn thí nghiệm đều bị chết

trong khoảng thời gian từ 6-12 h và sau đó phân lập lại được vi khuẩn. Đối với A. pleuropneumoniae serotype 5a, số lợn chết trên số lợn thí nghiệm là 2/3 con trong khoảng thời gian từ 6-20 h và cũng phân lập lại được vi khuẩn. Như vậy có

0 3 Lô 2 Đối chứng 0 0

51

thể khẳng định các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae được lựa chọn để gây

bệnh thực nghiệm trên lợn đều có độc lực cao, gây chết lợn trong thời gian ngắn.

Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các kết quả của Cù Hữu Phú (2013) khi gây bệnh thực nghiệm với các chủng A. pleuropneumoniae phân lập được từ lợn mắc

bệnh viêm phổi được trình bầy trong báo cáo nghiệm thu dự án sản xuất thử

nghiệm cấp Nhà nước : “Hoàn thiện quy trình sản xuất vacxin phòng bệnh viêm

phổi lợn do Actinobaccilus pleuropneumoniae, Streptococcus và Pasteurella multocida gây ra”.

Sau khi gây bệnh, tất cả lợn ở lô tăng cường giống đều bị chết trong khoảng

thời gian từ 6 - 20 giờ. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của lợn gây nhiễm A. pleuropneumoniae được thể hiện ở bảng 4.2.

Bảng 4.2. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn được

gây nhiễm A. pleuropneumoniae

Số lợn Số lợn Biểu hiện Tỷ lệ gây bệnh (con) biểu hiện (con)

Sốt 6 6 6/6

Ho, thở khó 6 6 6/6

Chảy máu mũi 6 5 5/6

Khí quản chứa dịch nhày lẫn máu 6 5 5/6

Ghi chú: A: Lợn chảy máu mũi; B: Phổi viêm dính thành ngực

Viêm dính phổi và thành ngực 6 6 6/6

Hình 4.1. Một số bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm

A. pleuropneumoniae

52

4.1.1.2. Kết quả giám định lại vi khuẩn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng kỹ thuật PCR

Sau khi gây bệnh thực nghiệm, chúng tôi đã lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn

gây bệnh để khẳng định các chủng vi khuẩn nghiên cứu chính xác là

A. pleuropneumoniae. Chúng tôi đã sử dụng cặp mồi LPF và LPR đặc hiệu dùng

để xác định gen omlA (gen protein màng ngoài - outer membrane lipoprotein) đặc

trưng của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, với thành phần phản ứng và quy trình chạy PCR như đã mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu.

Hình ảnh 4.2 chụp kết quả điện di những sản phẩm PCR của 03 mẫu đã phân

lập đều cho sản phẩm với độ dài 950 bp, đặc hiệu với độ dài của gen omlA của vi khuẩn A. Pleuropneumoniae.

M 1 2 3

Ghi chú: -Giếng 1, 2, 3: Sản phẩm PCR xác

1000 bp

định gen omlA (950 bp) của A.

950 bp

pleuropneumoniae;

-Giếng M: 1000 bp marker

Hình 4.2. Sản phẩm của kỹ thuật PCR xác định vi khuẩn A. pleuropneumoniae

Kết quả cho thấy các mẫu vi khuẩn kiểm tra đều cho sản phẩm PCR đặc hiệu

và giống nhau sau khi điện di là 950 bp. Sản phẩm này hoàn toàn phù hợp với kích

cỡ sản phẩm của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi LPF và LPR tương ứng để xác

định gen omlA đặc trưng của vi khuẩn A. pleuropneumoniae như trình bày ở bảng

3.1 phần phương pháp nghiên cứu và cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của các

tác giả Gram & cs. (1998), Nguyễn Thị Thu Hằng & cs. (2009), Cù Hữu Phú & cs.

53

(2011) đã công bố. Vì vậy có thể khẳng định các chủng vi khuẩn nghiên cứu chính

xác là A. pleuropneumoniae.

4.1.2. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc

bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra

4.1.2.1. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên lợn

Dựa trên kết quả xác định độc lực và liều LD50 của vi khuẩn P. multocida,

chúng tôi đã xác định được liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm như sau: P. multocida serotype A: 4,5 x 109 CFU/ml và P. multocia serotype D: 4,5 x 109 CFU/ml. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của giống vi khuẩn P. multocida được thể hiện ở bảng 4.3.

Bảng 4.3. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của

vi khuẩn P. multocida

Kết quả theo dõi

Chủng vi khuẩn

Lô thí nghiệm gây bệnh Liều gây bệnh (ml/con) Số con chết Thời gian chết Số lợn thí nghiệm (con) Tỷ lệ chết (%) Phân lập lại vi khuẩn

P. multocida serotype A 5 3 3/3 20- 28 h 100 3/3 Lô 1 P. multocida serotype D 5 3 3/3 20- 24 h 100 3/3

Qua bảng 4.3 cho thấy các chủng vi khuẩn P. multocida được lựa chọn để

gây bệnh thực nghiệm trên lợn gây chết lợn với tỷ lệ chết 100%. Trong đó, chủng

vi khuẩn P. multocida serotype A gây chết lợn trong thời gian từ 20-28 giờ còn

chủng vi khuẩn P. multocida serotype D gây chết lợn trong khoảng thời gian từ 20-24 giờ. Triệu chứng lâm sàng của lợn trước khi chết bao gồm: sốt, ho, khó thở, bỏ ăn, da đỏ tím, viêm phổi thùy.

Các triệu chứng viêm phổi lâm sàng ở lợn được gây bệnh thực nghiệm khá điển hình (bảng 4.4) như sốt cao, ho, khó thở, da đỏ, tím tái, kèm theo bệnh tích viêm thùy phổi điển hình. Triệu chứng da đỏ tím được quan sát thấy ở 5/6 lợn thực nghiệm trong khi các triệu chứng còn lại xuất hiện ở toàn bộ lợn được gây nhiễm vi khuẩn P. multocida. Các triệu chứng lâm sàng này gần giống với lợn mắc bệnh trong tự nhiên, sẽ giúp cho việc chẩn đoán bệnh lâm sàng trong thực tiễn sản xuất.

Lô 2 Đối chứng 0 3 0 0

54

Bảng 4.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm P. multocida

Biểu hiện Tỷ lệ

Số lợn gây bệnh (con) Số lợn biểu hiện (con)

Sốt 6 6/6 6

Ho, thở khó 6 6/6 6

Da đỏ tím 6 5/6 5

Ghi chú: Viêm thùy phổi

Viêm phổi thùy 6 6/6 6

Hình 4.3. Một số bệnh tích đại thể của lợn được gây nhiễm P. multocida

Như vậy có thể khẳng định các chủng vi khuẩn P. multocida được lựa chọn

để gây bệnh thực nghiệm trên lợn đều có độc lực cao, gây chết lợn trong thời gian

ngắn, có thể lựa chọn để sử dụng là chủng vi khuẩn chế vacxin phòng bệnh viêm

phổi lợn.

4.1.2.2. Kết quả giám định lại vi khuẩn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng kỹ

thuật PCR

Sau khi gây bệnh, chúng tôi đã lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn gây bệnh thực

nghiệm và xác định các serotype giáp mô A, B, D của vi khuẩn P. multocida

dựa trên phản ứng PCR được mô tả bởi Đỗ Ngọc Thúy & cs. (2007) gồm các

cặp mồi: CAPA-F và CAPA-R để xác định serotype A, CAPB-F và CAPB-R

để xác định serotype B, CAPD-F và CAPD-R để xác định serotype D. Trình

tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm được trình bày như đã mô tả ở phần

55

phương pháp nghiên cứu. Kết quả PCR với 03 mẫu phân lập lại vi khuẩn

P. multocida được trình bày ở hình 4.4.

Ghi chú -Giếng M: 1000 bp marker -Giếng 1, 2, 3, 4: chủng phân lập serotype A (1044 bp) -Giếng 5: đối chứng dương serotype A (1044 bp); -Giếng 6: đối chứng dương serotype B (760 bp); -Giếng 7: đối chứng dương serotype D (657 bp)

Hình 4.4. Sản phẩm của kỹ thuật PCR xác định vi khuẩn P. multocida

Kết quả hình 4.4 cho thấy các mẫu vi khuẩn kiểm tra đều cho sản phẩm PCR:

serotype A sản phẩm là 1044 bp; serotype B là 760 bp và serotype D là 657 bp.

Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Cù Hữu Phú (2013).

Vì vậy có thể khẳng định các chủng vi khuẩn nghiên cứu chính xác là P. multocida

serotype A và D.

4.1.3. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc

bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra

4.1.3.1. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên lợn

Dựa trên kết quả xác định độc lực và liều LD50 của vi khuẩn S. suis, chúng

tôi đã xác định được liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm là: 4,5 x 109 CFU/ml.

Bảng 4.5. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của vi khuẩn S. suis

Kết quả theo dõi Số lợn Liều gây thí Lô thí Chủng vi khuẩn Tỷ lệ Phân lập bệnh Số con Thời nghiệm gây bệnh nghiệm chết lại vi (ml/con) chết gian chết (con) (%) khuẩn

Lô 1 S. suis serotype 2 3/3 36h 100 3/3 5 3

Lô 2 Đối chứng 0 0 0 3

56

Kết quả ở bảng 4.5 cho thấy: chủng vi khuẩn S. suis được lựa chọn để gây

bệnh thực nghiệm trên lợn đều có độc lực cao, gây chết lợn trong thời gian ngắn.

100% lợn được gây bệnh bằng vi khuẩn S. suis serotype 2 chết trong vòng 36 giờ. Kết quả này cho thấy cũng phù hợp với các kết quả của Cù Hữu Phú (2013) khi

gây bệnh thực nghiệm với các chủng S. suis serotype 2 phân lập được từ lợn mắc

bệnh viêm phổi được trình bầy trong báo cáo nghiệm thu dự án sản xuất thử nghiệm cấp Nhà nước.

Hình A: Lợn gây bệnh thực nghiệm

Hình B: Lợn sưng khớp

Hình C: Lợn viêm màng não

57

Hình D: Viêm khớp

Hình 4.5. Một số triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn được gây

nhiễm S. suis

Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi đã ghi chép lại những triệu chứng lâm

sàng, bệnh tích đại thể và thấy lợn bị gây bệnh thực nghiệm xuất hiện các triệu

chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể như: sốt, ho, khó thở, có triệu chứng thần kinh,

viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não. Riêng triệu chứng viêm khớp, chúng tôi

chỉ quan sát thấy 1/3 lợn thí nghiệm (Bảng 4.6).

Bảng 4.6. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn được

gây nhiễm S. suis

Biểu hiện Tỷ lệ Số lợn gây bệnh (con) Số lợn biểu hiện (con)

Sốt 3 3/3 3

Ho, thở khó 3 3/3 3

Triệu chứng thần kinh 3 3/3 3

Viêm phổi 3 3/3 3

Viêm khớp 1 1/3 3

Viêm màng não 3 3/3 3

4.1.3.2. Kết quả giám định lại vi khuẩn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng kỹ thuật PCR

Sau khi gây bệnh, chúng tôi đã lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn gây bệnh thực

nghiệm và xác định vi khuẩn với mồi của phản ứng PCR: cặp mồi của phản ứng

58

được thiết kế dựa vào chuỗi gen mã hoá glutamate dehydrogenase (gdh) đặc trưng

cho vi khuẩn S. suis, gồm 1 mồi xuôi là Str2-F và 1 mồi ngược là Str2-R, được

trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với 3 mẫu xác định vi khuẩn S. suis phân lập lại từ động vật thí nghiệm được trình

bày ở hình 4.6.

M 1 2 3

1000 bp 688 bp

Ghi chú: Giếng M: 1000 bp marker Giếng 1, 2, 3: sản phẩm PCR xác định gen gdh (688 bp) của S. suis

Hình 4.6. Sản phẩm của kỹ thuật PCR xác định S. Suis

Kết quả hình 4.6 cho thấy: chủng S. suis nghiên cứu, sau quá trình chạy

PCR và điện di đều cho một sản phẩm đặc hiệu và giống nhau là 688 bp. Sản

phẩm này hoàn toàn phù hợp với kích cỡ sản phẩm của phản ứng PCR sử dụng

cặp mồi Str2-F và Str2-R tương ứng để xác định gen gdh mã hóa cho quá trình

sinh tổng hợp glutamate dehydrogenase - 1 enzym của S. suis và cũng phù hợp

với kết quả nghiên cứu của (Đỗ Ngọc Thúy & Lê Thị Minh Hằng, 2009; Cù

Hữu Phú & cs., 2011). Như vậy, có thể kết luận rằng chủng vi khuẩn được kiểm tra đều là vi khuẩn S. suis.

4.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỔN ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA

GIỐNG SẢN XUẤT VACXIN PHÒNG BỆNH DO VI KHUẨN

A. PLEUROPNEUMONIAE, P. MULTOCIDA VÀ S. SUIS GÂY RA

4.2.1. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất

vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra

Sau khi lựa chọn các chủng A. pleuropneumoniae trong bộ giống sản xuất

vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ keo phèn được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu và

59

phát triển vacxin thuộc Công ty CP thuốc Thú y Marphavet, chúng tôi tiến hành

giám định lại các chủng vi khuẩn này qua các đặc tính nuôi cấy trên một số môi

trường đặc biệt, đặc tính sinh hóa, khả năng lên men đường, sau đó tiến hành xác

định serotype và một số yếu tố gây bệnh điển hình của các chủng vi khuẩn này.

Từ những lô giống sản xuất, chúng tôi kiểm tra khả năng ổn định đặc tính sinh

học của giống.

4.2.1.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái

Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn

A. pleuropneumoniae thể hiện ở hình 4.7.

Hình B: Vi khuẩn A.pp trên

kính hiển vi 1.000 lần (10 x 100)

Hình A: Khuẩn lạc của A.pp trên thạch PPLO

Hình 4.7. Khuẩn lạc A. pleuropneumoniae và hình thái vi khuẩn khi soi trên

kính hiển vi

4.2.1.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa

Sau khi nuôi cấy trên môi trường, chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra đặc tính

sinh hóa của giống sản xuất. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất

A. pleuropneumoniae được thể hiện ở bảng 4.7.

Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa cho thấy: 100% số chủng dương tính

với các phản ứng Oxidase, Catalase, Urease, CAMP, O.N.P.G và cần yếu tố V cho

quá trình phát triển, 100% số chủng đều âm tính với phản ứng Indol. Các chủng

A. pleuropneumoniae được kiểm tra có khả năng lên men các loại đường Glucose,

Maltose, Mannitol, Xylose và không có chủng nào lên men các loại đường:

Arabinose, Lactose, Raffinose, Sorbitol.

60

Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất

A. pleuropneumoniae

Số chủng Số chủng Theo Moller Tỷ lệ TT Một số đặc tính kiểm tra dương tính và cs. (1996) (%)

1 Dung huyết 3 100,0 3 +

2 MacConkey 3 0 0 -

3 CAMP 3 100,0 3 +

4 O.N.P.G 3 100,0 3 +

5 Yếu tố V 3 100,0 3 +

6 Indol 3 0 0 -

7 Oxidase 3 100,0 3 +

8 Catalase 3 100,0 3 +

9 Urease 3 100,0 3 +

10 Glucose 3 100,0 3 +

11 Xylose 3 100,0 3 +

12 Maltose 3 100,0 3 +

13 Mannitol 3 100,0 3 +

14 Lactose 3 0 0 -

15 Raffinose 3 0 0 -

16 Arabinose 3 0 0 -

17 Sorbitol 3 0 0 -

18 Sucrose 3 100,0 3 +

Như vậy có thể thấy, cả 3 chủng A. pleuropneumoniae được lựa chọn dùng

cho nghiên cứu đều mang các đặc tính sinh vật hóa học điển hình của vi khuẩn

A. pleuropneumoniae như mô tả của (Moller & cs., 1996), và cũng phù hợp với các nghiên cứu của (Trịnh Quang Hiệp & cs., 2004; Cù Hữu Phú & cs., 2005; Nguyễn Thị Thu Hằng, 2010).

19 Trehalose 3 0,0 0 -

4.2.1.3. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực bằng PCR

Sau khi kiểm tra sự ổn định về đặc tính sinh hóa của giống sản xuất vi khuẩn A. pleuropneumoniae, chúng tôi kiểm tra yếu tố độc lực của giống. Theo (Frey, 1995), đặc tính gây bệnh của A. pleuropneumoniae là do các thành phần cấu thành nên vi khuẩn bao gồm: polysaccharide vỏ, lipopolysaccharide (nội

61

độc tố), các protein màng, yếu tố bám dính và ngoại độc tố. Trong số những

thành phần cấu thành này, ngoại độc tố được xem là quan trọng nhất về độc lực

và gây nên các bệnh tích ở tổ chức (Inzana, 1991). A. pleuropneumoniae sản sinh ra protein ngoại bào ApxI, ApxII, ApxIII và ApxIV thuộc họ độc tố RTX.

Mức độ hoạt lực của các độc tố này tùy thuộc các serotype khác nhau. Cùng với

CPS vỏ và LPS màng, độc tố Apx đóng vai trò độc lực quan trọng của vi khuẩn A. pleuropneumoniae.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR

để xác định sự có mặt của các gen mã hóa độc tố Apx ở 3 chủng

A. pleuropneumoniae nghiên cứu. Tên và trình tự 5 cặp mồi dùng để xác định

các gen sản sinh độc tố là apxICA, apxIICA, apxIIICA, apxIBD và apxIIIBD, cũng như thành phần, các bước tiến hành phản ứng PCR và sản phẩm thu được

tương ứng với từng cặp mồi được trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả thể hiện ở bảng 4.8.

Bảng 4.8. Kết quả xác định gen sản sinh độc tố của giống sản xuất

A. pleuropneumoniae

Chủng mang gen độc tố Apx Số Ký hiệu chủng Serotype chủng apxICA apxIICA apxIIICA apxIBD apxIIIBD

A1 2 1 0 1 1 1 1

A2 5a 1 1 1 0 1 0

Kết quả cho thấy, các chủng A. pleuropneumoniae nghiên cứu đều có mang

từ 3 đến 4 gen quy định sản sinh độc tố Apx. Tất cả 2 chủng thuộc serotype 5 đều

mang ba loại gen mã hóa độc tố, trong đó chủng có serotype 5a mang tổ hợp gen apxICA/apxIICA/apxIBD, còn chủng có serotype 5b mang tổ hợp gen apxIIICA/apxIBD/apxIIIBD.

Chủng thuộc serotype 2 có: mang tổ hợp gen apxIICA/apxIIICA/apxIBD/apxIIIBD.

Từ kết quả thu được có thể thấy rằng các chủng A. pleuropneumoniae Master seed được dùng cho nghiên cứu đều chứa yếu tố gây bệnh quan trọng là độc tố Apx. Do vậy một lần nữa có thể khẳng định thêm về vai trò của các chủng vi khuẩn này đối với bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn.

A3 5b 1 0 0 1 1 1

62

1 2 3 M

Ghi chú: - Giếng 1: apxICA, apxIICA dương tính - Giếng 2: apxIICA, apxIIICA dương tính - Giếng 3: apxIBD, apxIIIBD dương tính - Giếng M: Thang ADN 1kb

Hình 4.8. Sản phẩm PCR xác định độc tố Apx của A. pleuropneumoniae

Ghi chú:

- Giếng 1: nhân gen apxICA cho kết quả âm tính.

- Giếng 2: nhân gen apxIICA, cho kích thước 2088 bp

- Giếng 3: nhân gen apxIIICA, cho kích thước 1755 bp

- Giếng 4: nhân gen apxIBD, cho kích thước 1447 bp

- Giếng 5: nhân gen apxIIIBD, cho kích thước 968 bp

- Giếng M: Thang ADN 1kb

Hình 4.9. Vi khuẩn A1 là A. pleuropneumoniae và có chứa gen apxIICA,

apxIIICA, apxIBD và apxIIIBD

Ghi chú:

- Giếng 1 nhân gen apxICA, kích thước 2420 bp

- Giếng 2 nhân gen apxIICA, kích thước 2088 bp

- Giếng 4 nhân gen apxIBD, kích thước 1447 bp

- Giếng 3 nhân gen apxIIICA và Giếng 5 nhân gen apxIIIBD đều cho kết quả âm tính.

- Giếng M: Thang ADN 1kb

Hình 4.10. Vi khuẩn A2 là A. peuropneumoniae và có chứa gen apxICA,

apxIICA và apxIBD

63

Ghi chú:

- Giếng 3 nhân gen apxIIICA, kích thước 1755 bp.

- Giếng 4 nhân gen apxIBD, kích thước 1447 bp.

- Giếng 5 nhân gen apxIIIBD, cho kích thước 968 bp.

- Giếng 1 nhân gen apxICA, PCR 2 nhân gen apxIICA đều cho kết quả âm tính.

- Giếng M: Thang ADN 1kb

Hình 4.11. Vi khuẩn A3 là A. pleuropneumoniae và có chứa gen apxIIICA,

apxIBD và apxIIIBD

4.2.1.4. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên chuột

Bất kỳ một loại vi khuẩn nào nếu muốn gây được bệnh cho động vật thì chúng

phải có đủ độc lực và khả năng gây bệnh cần thiết, kết hợp với các điều kiện cần

thiết khác như sức đề kháng của vật chủ giảm sút, môi trường sinh bệnh phù

hợp,...vv. Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn

A. pleuropneumoniae, nghiên cứu trên chuột nhắt trắng để đánh giá chúng có độc lực mạnh hay không thông qua khả năng gây chết chuột thí nghiệm.

Dubreuil & cs. (2000) đã chứng minh sự khác nhau về độc lực của các chủng

A. pleuropneumoniae liên quan đến cấu trúc và những sản phẩm do vỏ và các độc

tố tạo nên. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy những chủng có độc lực

cao thì kích thước lớn hơn và có lớp vỏ bám dính hơn những chủng ít độc (Inzana, 1991). Các kết quả này đã giải thích cho sự khác nhau về độc lực giữa các serotype.

Để làm rõ vai trò gây bệnh của các chủng A. pleuropneumoniae được sử dụng

trong nghiên cứu, sau khi đã xác định các đặc tính sinh hóa, xác định serotype và các yếu tố độc lực chính là ngoại độc tố Apx, thì việc kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm là rất cần thiết.

Để kiểm tra độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae trong nghiên cứu

này, chúng tôi tiến hành xác định độc lực trên chuột nhắt trắng của 3 chủng

A. pleuropneumoniae. Với mỗi chủng vi khuẩn, sử dụng canh trùng được nuôi cấy ở 37◦C/24 giờ trong điều kiện có 5% CO2 tiêm cho 2 chuột thí nghiệm vào dưới da với liều 0,2 ml/con. (theo TCVN 8685). Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.9.

64

Bảng 4.9. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn

A. pleuropneumoniae

Số chuột Liều Thời gian Phân lập Ký hiệu Đường Số chuột TT tiêm tiêm chết chuột lại vi chủng tiêm chết (con) (con) (ml) (giờ) khuẩn

1 A1 2 0,2 2 16 2/2

Dưới 2 A2 2 0,2 2 18 2/2 da

Kết quả ở bảng 4.9 cho thấy, cả 3 chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae được

kiểm tra đều có độc lực mạnh, gây chết chuột thí nghiệm trong vòng 16- 18 giờ sau

khi tiêm. Trong đó có 2 chủng gây chết chuột sau 16 giờ, 1 chủng gây chết chuột sau

18 giờ. Khi lấy máu tim của những chuột chết để kiểm tra thì đều phân lập lại được

vi khuẩn A. pleuropneumoniae tương ứng. Kết quả này chứng tỏ vi khuẩn

A. pleuropneumoniae dùng trong nghiên cứu có độc lực cao trên chuột nhắt trắng và có thể có khả năng gây bệnh cho lợn nếu có đủ điều kiện thích hợp tác động.

Kết quả thu được của chúng tôi tương đồng với kết quả nghiên cứu của các

tác giả Nguyễn Thị Thu Hằng (2010), Cù Hữu Phú & cs. (2011). Các tác giả cho

biết, khi kiểm tra độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae phân lập được trên chuột thí nghiệm, các chủng đều gây chết 100% chuột thí nghiệm.

Chúng tôi đã tiến hành xác định liều LD50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae nghiên cứu và đã xác định được liều LD50 của A. pleuropneumoniae serotype 2 là 4,3 x 107 CFU/0,2 ml và serotype 5 là 4,8 x 107 CFU/0,2 ml.

3 A3 2 0,2 2 16 2/2

4.2.2. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra

Giống Pasteurella trong bộ giống sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ keo phèn được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển vacxin thuộc Công ty CP thuốc Thú y Đức Hạnh Marphavet được chúng tôi tiến hành giám định lại qua các đặc tính nuôi cấy trên một số môi trường đặc biệt, đặc tính sinh hóa, khả năng

lên men đường. Sau đó tiến hành xác định serotype và một số yếu tố gây bệnh điển hình của các chủng vi khuẩn này. Từ những lô giống sản xuất, chúng tôi kiểm tra khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống.

65

4.2.2.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái

Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn

P. multocida thể hiện ở hình 4.12.

Kết quả kiểm tra cho thấy: các chủng vi khuẩn P. multocida nghiên cứu đều có dạng cầu trực khuẩn, nhỏ, ngắn, đứng riêng rẽ, đôi khi có ghép đôi, bắt màu gram âm. Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ nuôi cấy ở 37◦C, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S có mùi tanh đặc trưng, không gây dung huyết. Vi khuẩn không mọc trên môi trường thạch MacConkey.

Hình A: Khuẩn lạc của P. multocida

Hình B: Vi khuẩn P. multocida trên kính hiển vi 1.000 lần

Hình 4.12. Khuẩn lạc P. multocida và hình thái vi khuẩn khi soi trên kính hiển vi

4.2.2.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa

Tiến hành giám định đặc tính sinh hóa của 2 chủng P. multocida được lựa chọn dùng cho nghiên cứu, chúng tôi thu được kết quả như trình bày ở bảng 4.10.

Tất cả các chủng đều dương tính với phản ứng Indol, Oxidase, Catalase. 100% chủng có khả năng lên men các loại đường Glucose, Galactose, Mannitol, Saccharose, Fructose và không lên men các đường Lactose, Arabinose, Maltose.

66

Như vậy, tất cả các kết quả kiểm tra về đặc tính hình thái, nuôi cấy, đặc

tính sinh hóa và khả năng lên men các loại đường của các chủng vi khuẩn

P. multocida nghiên cứu đều phù hợp với những đặc điểm đặc trưng của giống

vi khuẩn P. multocida như mô tả của (Carter, 1984; Bergey, 1994). Do vậy, có

thể khẳng định rằng cả 2 chủng vi khuẩn này chính xác là P. multocida.

Bảng 4.10. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất P. multocida

TT Chỉ tiêu kiểm tra Tỷ lệ (%) Số chủng kiểm tra Số chủng dương tính Theo Carter (1984)

100,0 Gram âm 1 Gram âm 2 2

2 2 0 0 0,0 0,0 - -

2 Dung huyết 3 MacConkey 4 H2S Indol 5 6 Oxydase 2 2 2 0 2 2 0,0 100,0 100,0 - + +

7 Catalase 8 Di động 2 2 2 0 100,0 0,0 + -

9 Glucose 10 Galactose 2 2 2 2 100,0 100,0 + +

11 Mannitol 12 Saccarose 2 2 2 2 100,0 100,0 + +

13 Fructose 14 Lactose 2 2 2 0 100,0 0,0 + -

15 Maltose 16 Arabinose 2 2 0 0 0,0 0,0 - -

17 Sorbitol 18 Salicin 2 2 2 0 100,0 0,0 + -

19 Xylose 2 2 100,0 +

4.2.2.3. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR

Giáp mô là yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn P. multocida, nó đóng vai

trò quan trọng trong quá trình gây bệnh của vi khuẩn này. P. multocida được chia

làm 5 serotype giáp mô là A, B, D, E và F tùy thuộc vào cấu trúc của

polysaccharide bề mặt (Carter, 1952). Trong đó các serotype gây bệnh thường gặp

ở lợn được thông báo là A, B và D (Đỗ Ngọc Thúy & cs., 2007).

67

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phản ứng Multiplex PCR để

xác định các serotype giáp mô A, B, D của các chủng P. multocida được lựa

chọn dùng cho nghiên cứu theo quy trình đã được chuẩn hóa của Bộ môn Vi

trùng- Viện Thú y (Đỗ Ngọc Thúy & cs., 2007). Các cặp mồi được sử dụng là

CAPA-F và CAPA-R dùng để xác định serotype A, CAPB-F và CAPB-R để

xác định serotype B, CAPD-F và CAPD-R để xác định serotype D. Kích cỡ

sản phẩm tương ứng và các bước tiến hành phản ứng PCR như đã mô tả ở bảng

3.6 trong phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả thu được thể hiện ở bảng

4.11 và hình 4.13.

Bảng 4.11. Kết quả xác định yếu tố độc lực của giống sản xuất P. multocida

TT KH chủng Serotype A Serotype B Serotype D

1 P4 + -

2 P5 - +

M 1 2

1044 bp

657 bp

Ghi chú: - Giếng M:. 1000 bp marker - Giếng 1: P. multocida serotype A (1044 bp) - Giếng 2: P. multocida serotype D (657 bp)

Hình 4.13. Sản phẩm của kỹ thuật PCR xác định serotype của P. multocida

Kết quả xác định serotype cho thấy, 2 chủng P. multocida được lựa chọn dùng cho nghiên cứu đều thuộc về hai serotype là serotype A và serotype D và không có chủng nào thuộc serotype B. Serotype A và serotype D chính là hai

serotype P. multocida đã được một số tác giả nghiên cứu xác định là nguyên nhân

68

gây bệnh đường hô hấp thường gặp cho lợn ở nước ta như: Townsend & cs. (2000), Đỗ Ngọc Thúy & cs. (2007).

Ghi chú:

- Giếng 1: Kết quả dương tính với serotype A, cho kích thước 1044 bp.

- Giếng 2: Kết quả âm tính với

serotyppe B

- Giếng 3: Kết quả âm tính với

serotyppe D

- Giếng M: Thang ADN 1kb

Hình 4.14. Mẫu P4 là vi khuẩn P. multocida thuộc Serotype A

Ghi chú:

Giếng 1: Kết quả âm tính với

serotype A

Giếng 2: Kết quả âm tính với

serotyppe B

- Giếng 3: Kết quả dương tính với serotype D, cho kích thước 657 bp.

- Giếng M: Thang ADN 1kb

Hình 4.15. Mẫu P5 là vi khuẩn P. multocida thuộc Serotype D

4.2.2.4. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên chuột

Chúng tôi tiến hành xác định độc lực của 2 chủng vi khuẩn P. multocida

trên chuột nhắt trắng. Mỗi chủng P. multocida tiêm cho 2 chuột vào dưới da, với liều 0,2 ml canh trùng nuôi cấy ở 37◦C/24giờ (TCVN 8685). Kết quả được

trình bày ở bảng 4.12.

69

Bảng 4.12. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn

P. multocida

Ký Số chuột Liều Thời gian Phân lập Đường Số chuột TT hiệu tiêm tiêm chết chuột lại vi tiêm chết (con) chủng (con) (ml) (giờ) khuẩn

Kết quả ở bảng 4.12 cho thấy: 2 chủng P. multocida kiểm tra có độc lực mạnh

đối với chuột nhắt trắng, có khả năng gây chết chuột thí nghiệm trong vòng 20 -

24 giờ sau khi tiêm. Tiến hành mổ khám những chuột chết quan sát thấy có những

bệnh tích như: bao tim tích nước vàng, gan, phổi sưng, các phủ tạng xuất huyết.

Đây là bệnh tích thường gặp của chuột chết khi tiêm vi khuẩn P. multocida cường

độc. Tiến hành phân lập lại vi khuẩn P. multocida từ máu tim của những chuột

chết đều cho kết quả dương tính.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thu được cũng tương đồng với nghiên cứu

của một số tác giả như: Đỗ Quốc Tuấn (2008) cho biết vi khuẩn P. multocida phân

lập được từ lợn ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam có độc lực gây chết chuột

bạch từ 50 - 100% trong thời gian từ 20- 48 giờ;

Chúng tôi đã tiến hành xác định liều LD50 của vi khuẩn P. multocida nghiên cứu và đã xác định được liều LD50 của chủng P. multocida serotype A là 4 x 107 CFU/0,2 ml và serotype D là 4,2 x 107 CFU/0,2 ml.

1 P4 2 0,2 2 20 2/2 Dưới da 2 P5 2 0,2 2 24 2/2

4.2.3. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất

vacxin phòng bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra

Giống S. suis trong bộ giống sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ keo phèn

được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển vacxin thuộc Công ty CP

thuốc Thú y Marphavet được chúng tôi tiến hành giám định lại qua các đặc tính

nuôi cấy trên một số môi trường đặc biệt, đặc tính sinh hóa, khả năng lên men

đường. Sau đó tiến hành xác định serotype và một số yếu tố gây bệnh điển hình

của các chủng vi khuẩn này. Từ những lô giống sản xuất, chúng tôi kiểm tra khả

năng ổn định đặc tính sinh học của giống.

70

4.2.3.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái

Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn S. suis

thể hiện ở hình 4.16.

Hình B: Vi khuẩn S. suis trên kính

Hình A: Khuẩn lạc của S. suis

hiển vi 1.000 lần (10x100)

Hình 4.16. Khuẩn lạc S. suis và hình thái vi khuẩn khi soi trên kính hiển vi

Kết quả cho thấy: chủng vi khuẩn S. suis kiểm tra đều bắt màu gram dương,

vi khuẩn có hình cầu, hình bầu dục, xếp thành chuỗi như chuỗi hạt có độ dài ngắn

không đều nhau, có khi chúng đứng thành từng cặp, có chỗ xếp thành các chuỗi ngắn có 6 - 10 vi khuẩn hoặc dài hơn. 100% các chủng kiểm tra mọc tốt trên môi

trường thạch máu, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc nhỏ, hơi vồng và sáng trắng, gây dung huyết sau 24 giờ nuôi cấy.

4.2.3.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa

Kết quả giám định một số đặc tính nuôi cấy, hình thái, đặc tính sinh hóa và

khả năng lên men đường của chủng S. suis được lựa chọn dùng cho nghiên cứu, chúng tôi thu được kết quả như trình bày ở bảng 4.13.

- Chủng kiểm tra không phát triển trong môi trường NaCl 6,5% và âm tính với

phản ứng KOH 3%.

- Chủng đều âm tính với phản ứng Oxydase, Catalase, Indol.

- Chủng kiểm tra lên men các loại đường: Glucose, Galactose, Maltose,

Lactose và không có chủng nào lên men các đường Mannitol, Sorbitol.

Như vậy có thể thấy chủng vi khuẩn này đều mang các đặc điểm đặc trưng của

giống vi khuẩn S. suis như mô tả của Quinn & cs. (1994).

71

Bảng 4.13. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất S. suis

TT Chỉ tiêu kiểm tra

Số chủng kiểm tra 1 Số chủng dương tính 1 Tỷ lệ dương tính 1/1 Quinnvà cs. (2004) Gram dương 1 Gram dương

2 Dung huyết 1 1 1/1 +

3 KOH 3% 0 1 0/1 -

4 NaCl 6,5% 0 1 0/1 -

5 Indol 0 1 0/1 -

6 Oxidase 0 1 0/1 -

7 Catalase 0 1 0/1 -

8 Glucose 1 1 1/1 +

9 Galactose 1 1 1/1 +

10 Lactose 1 1 1/1 +

11 Maltose 1 1 1/1 +

12 Mannitol 0 1 0/1 -

Tổng hợp các kết quả kiểm tra ở trên, có thể kết luận chủng vi khuẩn kiểm

tra là S. suis. Tuy nhiên kết quả xác định S. suis dựa trên kết quả kiểm tra các đặc

tính sinh học là chưa đủ tin cậy tuyệt đối. Hiện nay kỹ thuật giám định chính xác nhất là sử dụng phương pháp PCR.

13 Sorbitol 0 1 0/1 -

4.2.3.3. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR

Thành phần Polysaccharide của giáp mô (Capsular Polysaccharide - CPS)

được chứng minh là yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn S. suis. Ngoài ra, các

yếu tố độc lực khác của giáp mô cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh

bệnh của vi khuẩn. Yếu tố gây dung huyết (Suilysin) được xem là yếu tố độc lực

quan trọng của vi khuẩn S. suis và được mã hoá bởi gen sly. Đối với một số chủng vi khuẩn S. suis, 2 loại protein cũng đã được xác định là đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh là protein giải phóng muramidase được gen mrp ghi lại và protein giải phóng yếu tố ngoại bào được gen epf ghi lại. Ngoài ra, các chủng S. suis còn có khả năng sản sinh ra enzym arginine deiminase được mã hoá bởi gen arcA có vai trò quan trọng trong sự sống sót của vi khuẩn trước những tác động của các yếu tố stress. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phản ứng Multiplex PCR để nhận biết 4 yếu tố độc lực nói trên của chủng vi khuẩn S. suis.

72

Bảng 4.14. Kết quả xác định yếu tố độc lực của giống sản xuất S. suis

TT Tổ hợp gen Serotype 2

1 arcA +

2 arcA/sly +

3 arcA/mrp +

4 arcA/epf 0

5 arcA/mrp/epf 0

6 arcA/mrp/sly +

Kết quả cho thấy: chủng S. suis được nghiên cứu mang tổ hợp gen dung huyết,

sly, mrp, arcA.

Ghi chú:

- Giếng 1: Kết quả dương tính với gen sly, cho kích thước 248 bp.

- Giếng 2: Kết quả dương tính với gen arcA, kích thước 118 bp

- Giếng 3: Kết quả dương tính với gen mrp, cho kích thước 188 bp.

- Giếng M: 1000 bp marker

7 arcA/mrp/sly/epf +

Hình 4.17. Vi khuẩn St là vi khuẩn S.suis và có chứa gen sly, mrp và arcA

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Đỗ Ngọc Thúy & cs. (2009) khi nghiên cứu về tổ hợp gen mã hóa các yếu tố độc lực của 211 chủng S. suis phân lập được từ lợn ở Việt Nam. Tác giả cho biết đã xác định được 7 tổ hợp gen, trong đó số chủng mang gen arcA chiếm tỷ lệ cao nhất với 71,1%, tiếp đến là mrp với 10,4%, epf với 10,4%, sly với 7,6%, tuy nhiên có 59 chủng không mang loại gen nào trong số 4 loại gen mã hóa các yếu tố độc lực được xác định trong nghiên cứu này.

73

4.2.3.4. Kết quả xác định serotype của các chủng S. suis nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành xác định serotype của các chủng S. suis nghiên cứu dựa vào phản ứng Multiplex PCR sử dụng các cặp mồi để nhận biết các serotype 1, 2,

7 và 9. Đây là những serotype gây bệnh chính thường gặp của vi khuẩn S. suis ở

lợn. Các cặp mồi sử dụng trong phương pháp Multiplex PCR được lựa chọn dựa

vào chuỗi gen mã hóa quá trình sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giáp

mô (cps), gồm có 4 cặp mồi sau: cps1J-F và cps1J-R (để xác định serotype 1), cps2J-F và cps2J-R (để xác định serotype 2), cps7H-F và cps7H-R (để xác định

serotype 7), cps9H-F và cps9H-R (để xác định serotype 9). Các cặp mồi này cho sản phẩm có kích cỡ tương ứng là 637 bp, 498 bp, 379 bp và 303 bp.

Kết quả xác định serotype của chủng S. suis nghiên cứu trình bày ở bảng 4.15.

Bảng 4.15. Kết quả xác định serotype của các chủng S. suis

Kết quả xác định serotype Chủng

S. suis kiểm tra Serotype 1 Serotype 2 Serotype 7 Serotype 9 Chưa xác định

Kết quả ở bảng 4.15 cho thấy: chủng vi khuẩn S. suis nghiên cứu đem định

serotype thuộc serotype 2.

1 0 1 0 0 0

4.2.3.5. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên chuột

Chúng tôi tiến hành chọn chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2 để tiến hành

kiểm tra độc lực trên chuột nhắt trắng. Chủng vi khuẩn tiêm cho 2 chuột, mỗi chuột

được tiêm 0,2 ml canh trùng nuôi cấy ở 37°C/24 giờ vào dưới da. Chuột được theo

dõi trong vòng 7 ngày. Chuột chết được tiến hành mổ khám, kiểm tra bệnh tích và phân lập lại vi khuẩn từ máu tim.

Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.16.

Bảng 4.16. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn S. suis

Đường TT Ký hiệu chủng Số chuột chết (con) tiêm Số chuột tiêm (con) Liều tiêm (ml) Thời gian chết chuột (giờ) Phân lập lại vi khuẩn

1 A6 2 0,2 Dưới da 2 20 2/2

74

Kết quả cho thấy: chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2 có độc lực mạnh,

gây chết chuột trong thời gian ngắn. Những chuột chết được mổ khám và quan

sát thấy có bệnh tích tương đối giống nhau như: phủ tạng bị xung huyết, tim sưng,

mềm, nhão, tích nước trong xoang bao tim, vùng xung quanh chỗ tiêm, đôi khi

có hiện tượng áp xe. Khi lấy máu tim nuôi cấy thì đều phân lập được vi khuẩn S.

suis thuần khiết.

Chúng tôi đã tiến hành xác định liều LD50 của vi khuẩn S. suis nghiên cứu và

đã xác định được liều LD50 của S. suis serotype 2 là 4,4 x 107 CFU/0,2 ml.

4.3. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACXIN ĐA GIÁ VÔ HOẠT

NHŨ DẦU PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI Ở LỢN DO VI KHUẨN

A. PLEUROPNEUMONIAE, P. MULTOCIDA VÀ S. SUIS GÂY RA

4.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu

phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S.

suis gây ra

4.3.1.1. Kết quả theo dõi các lô lên men sục khí

Chúng tôi đã chế tạo vacxin dạng vô hoạt có bổ trợ keo phèn và nhũ dầu

theo quy trình thường quy của Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia và quy trình

sản xuất vacxin theo dây chuyền sản xuất công nghiệp của nhà máy vacxin GMP -

WHO theo phương pháp lên men sục khí. Các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae,

P. multocida và S. suis được nuôi cấy riêng từng loại vi khuẩn, mỗi loại vi khuẩn

được nuôi cấy 3 lô khác nhau bằng phương pháp lên men sục khí. Sau 8- 10 giờ

lên men sục khí, lấy mẫu kiểm tra thuần khiết bằng phương pháp nhuộm Gram

và ria cấy trên các loại môi trường kiểm tra, đồng thời xác định đậm độ vi khuẩn

trong 1 ml canh trùng bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch,

sau đó tiến hành vô hoạt vi khuẩn bằng Formol với tỷ lệ 0,3%.

Vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn cần đảm

bảo đủ số lượng kháng nguyên có trong một liều vacxin tiêm cho lợn. Đối với

mỗi một loại vi khuẩn trong bộ giống chế tạo vacxin (gồm A. pleuropneumoniae;

P. multocida và S. suis), đều được sử dụng phương pháp lên men sục khí, xác

định đậm độ kháng nguyên có trong 1 ml canh trùng để làm cơ sở xác định được

tỷ lệ pha trộn canh trùng mỗi loại vi khuẩn phù hợp nhất nhằm đảm bảo được số

75

lượng kháng nguyên 3 loại vi khuẩn có trong 1 liều vacxin. Kết quả các lô lên

men sục khí thể hiện ở bảng 4.17

Chúng tôi đã tiến hành 3 lần nuôi cấy vi khuẩn A. pleuropneumoniae bằng

phương pháp lên men sục khí, có thay đổi chế độ cung cấp khí, môi trường nuôi

cấy…với 3 lần nuôi cấy khác nhau và đã cho kết quả là số lượng vi khuẩn đạt trung

bình 1 x 1010 vi khuẩn/ml.

Bảng 4.17. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp lên men sục khí

Số lượng vi khuẩn Loại vi khuẩn Số lần nuôi cấy trung bình (x 109 CFU/ml)

A. pleuropneumoniae 10,67 ± 0,52 CFU/ml 3

P. multocida 13,33 ± 1,37 CFU/ml 3

Tương tự như trên, sau nhiều lần nuôi cấy vi khuẩn P. multocida và S. suis

bằng phương pháp lên men sục khí, chúng tôi thu được kết quả là số lượng vi

khuẩn đạt cao nhất 1,1- 1,3 x 1010 CFU/ml.

S. suis 11,00 ± 0,89 CFU/ml 3

4.3.1.2. Chuẩn bị các loại kháng nguyên và bán thành phẩm

Sau khi vô hoạt vi khuẩn trong canh trùng thu được bằng cách sử dụng

formol với tỷ lệ 0,3%, tiến hành kiểm tra vô trùng trên các loại môi trường nước

thịt, thạch máu và nước thịt yếm khí. Các loại kháng nguyên sau khi kiểm tra

đảm bảo vô hoạt 100% sẽ được tiến hành pha trộn với bổ trợ nhũ dầu IMS-1313

theo hướng dẫn của Seppic với tỷ lệ 25% (3 phần canh trùng kháng nguyên + 1

phần nhũ dầu).

Dựa

trên kết quả

lên men sục khí mỗi

loại kháng nguyên

(A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; S. suis serotype 2 và P. multocida

serotype A và D), cần tiến hành pha trộn các loại kháng nguyên với nhũ dầu

(25%) để có trong mỗi một liều tiêm vacxin cho lợn (2ml vacxin/lợn) đảm bảo

như sau:

+ Kháng nguyên A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b có 4 - 4,5x109

CFU/liều tiêm.

76

+ Kháng nguyên S. suis serotype 2: 4- 4,5 x109 CFU/liều tiêm

+ Kháng nguyên P. multocida A và D: 4- 4,5 x109 CFU/liều tiêm.

Sau khi vacxin bán thành phẩm được sản xuất, chúng tôi đã tiến hành kiểm

tra độ thuần khiết của vi khuẩn bằng phương pháp làm tiêu bản quan sát vi sinh

vật chết và kiểm tra dưới kính hiển vi.

4.3.2. Kết quả đánh giá chất lượng vacxin bán thành phẩm

Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra vô trùng bằng phương pháp nuôi cấy trên các

loại môi trường như sau:

4.3.2.1. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng

Từ mỗi lô vacxin, tiến hành kiểm tra vô trùng trên các loại môi trường nuôi

cấy vi khuẩn thích hợp như môi trường thạch thường, thạch máu, thạch TSA (có

bổ trợ YE), thạch MacConkey, nước thịt thường, nước thịt TYE, nước thịt gan yếm khí, thạch nấm. Các ống môi trường, sau khi cấy được bồi dưỡng ở tủ ấm 370C có bổ

sung 5 % CO2, riêng thạch nấm thì để ở nhiệt độ phòng. Mỗi ngày đọc kết quả 1 lần.

Nếu sau 2 ngày đối với vi khuẩn và 7 ngày đối với nấm không có bất cứ một loại

vi khuẩn hay nấm nào mọc trên các môi trường thì vacxin được coi là đạt tiêu

chuẩn vô trùng. Kết quả tổng hợp được trình bày ở bảng 4.18.

Tất cả 3 lô mẫu kiểm tra ở mỗi loại canh trùng vacxin đơn giá đều đạt yêu

cầu về cảm quan, thuần khiết, vô hoạt và đạt yêu cầu về vô trùng (không tạp nhiễm

vi khuẩn cũng như không tạp nhiễm nấm mốc). Đậm độ vi khuẩn trung bình của

A. pleuropneumoniae là 10,67 ± 0,52 tỷ vi khuẩn/ml; của P. multocida là 13,33 ±

1,37 tỷ vi khuẩn/ml và của S. suis 11,00 ± 0,89 tỷ vi khuẩn/ml.

Bảng 4.18. Kết quả kiểm tra đậm độ, thuần khiết và vô trùng của

lô giống đơn giá

Chỉ tiêu kiểm tra Số lô thí Loại vi khuẩn Đậm độ Thuần khiết Vô trùng nghiệm (x 109 CFU/ml) n (%) n (%)

A. pleuropneumoniae 3 10,67 ± 0,52 3/3 (100) 3/3 (100)

P. multocida 3 13,33 ± 1,37 3/3 (100) 3/3 (100)

S. suis 3 11,00 ± 0,89 3/3 (100) 3/3 (100)

77

Những chỉ số này cho thấy quy trình lên men sục khí đã đạt yêu cầu và đậm

độ vi khuẩn ở mức cao, đảm bảo cho công đoạn phối trộn vacxin đa giá.

Bảng 4.19. Kết quả kiểm tra thuần khiết và vô trùng của vacxin đa giá bán

thành phẩm

Chỉ tiêu kiểm tra Lô thí nghiệm Thuần khiết Vô trùng

1 Đạt Đạt

2 Đạt Đạt

3 Đạt Đạt

Ba loại vacxin đơn giá trên được trộn lẫn với nhau theo tỷ lệ phù hợp để đạt

được một hỗn hợp đồng nhất, rồi bổ sung nhũ dầu IMS- 1313 với tỷ lệ 1/4, đảm

bảo trong 2 ml vacxin có chứa: ≥ 4 tỷ vi khuẩn kháng nguyên cho mỗi loại để được

vacxin bán thành phẩm đa giá. So sánh với vacxin Bayovac SuiShot của hãng

Bayer chế tạo là vacxin vô hoạt phòng bệnh hô hấp phức hợp cho lợn trên 5 tuần

tuổi, lượng kháng nguyên A. pleuropneumoniae và P. multocida cũng như vacxin

của chúng tôi.

Trong cả 3 lô lấy mẫu kiểm tra vacxin đa giá bán thành phẩm đều đạt chỉ tiêu

về đậm độ, thuần khiết và vô trùng. Theo TCVN 8684:2011; TCVN 8685-15:2017

và TCVN 8685-17:2017.

Tổng hợp 3/3 (100%) 3/3 (100%)

4.3.2.2. Kết quả đánh giá chỉ tiêu an toàn của vacxin bán thành phẩm trên chuột

nhắt trắng

Sau khi đã kiểm tra 3 lô canh trùng chế tạo được đều đạt các tiêu chuẩn chế

vacxin, tiến hành trộn lẫn các lô canh trùng với nhau theo tỷ lệ phù hợp để đạt được

một hỗn hợp canh trùng đồng nhất, rồi bổ sung nhũ dầu với tỷ lệ 1/4 để đảm bảo

trong 2 ml vacxin có chứa 4- 5 x 109 CFU.

Kiểm tra an toàn của vacxin trên chuột nhắt trắng: chọn mỗi lô 10 chuột, mỗi

con chuột tiêm vacxin với liều 0,5 ml/con vào bắp đùi. Theo dõi chuột trong vòng

10 ngày. Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.20.

78

Với liều tiêm 0,5 ml vacxin/con chuột, tất cả chuột được tiêm vacxin đều

sống khỏe mạnh, không con nào có biểu hiện phản ứng sau khi tiêm qua 10 ngày

theo dõi. Điều này khẳng định rằng vacxin được chế tạo đã đạt yêu cầu về chỉ tiêu

an toàn 100% trên chuột nhắt trắng. Theo TCVN 8684:2011; TCVN 8685-15:2017

và TCVN 8685-17:2017.

Bảng 4.20. Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin bán thành phẩm trên

chuột nhắt trắng

Tỷ lệ Thời gian Số chuột Đợt thí Liều tiêm và Số chuột theo dõi thí nghiệm sống Biểu hiện nghiệm đường tiêm sống (con) (ngày) (con) (%)

Chuột phát triển, 0,5 ml/con; 10 10 10 100 ăn uống bình 1 tiêm bắp đùi thường

Chuột phát triển, 0,5 ml/con; 10 10 10 100 ăn uống bình 2 tiêm bắp đùi thường

Chuột phát triển, 0,5 ml/con; 10 10 10 100 ăn uống bình 3 tiêm bắp đùi thường

4.3.2.3. Kết quả đánh giá chỉ tiêu an toàn của vacxin bán thành phẩm trên lợn

Để kiểm tra an toàn của vacxin chế tạo trên lợn, chúng tôi đã chọn mỗi lô 5

lợn khỏe mạnh, trên 4 tuần tuổi, mỗi con lợn được thử an toàn vacxin được tiêm

vacxin với liều gấp đôi liều sử dụng: 4 ml/con vào bắp sau tai. Theo dõi lợn thử an

toàn trong vòng 10 ngày. Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.21.

Lợn được kiểm tra an toàn với liều tiêm gấp đôi liều sử dụng theo tiêu chẩn

kiểm nghiệm vacxin vi khuẩn vô hoạt: tất cả 5 lợn trên 4 tuần tuổi được tiêm vacxin

theo mỗi lô đều sống khỏe mạnh, không con nào có biểu hiện phản ứng sau khi

tiêm qua 10 ngày theo dõi. Điều này khẳng định rằng vacxin chế tạo đã đạt yêu

cầu về chỉ tiêu an toàn 100% trên lợn.

79

Bảng 4.21. Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin bán thành phẩm trên lợn

Liều tiêm Thời gian Số lợn thí Số lợn Tỷ lệ Đợt thí và đường theo dõi nghiệm sống sống Biểu hiện nghiệm tiêm (ngày) (con) (con) (%)

Lợn khỏe mạnh, không có 4 ml/con; 1 10 5 5 100 phản ứng nơi tiêm và phản tiêm bắp ứng toàn thân

Lợn khỏe mạnh, không có 4 ml/con; phản ứng nơi tiêm và phản 2 10 5 5 100 tiêm bắp ứng toàn thân

Lợn khỏe mạnh, không có 4 ml/con; 3 10 5 5 100 phản ứng nơi tiêm và phản tiêm bắp ứng toàn thân

4.3.2.4. Kết quả đánh giá chỉ tiêu hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng bằng

phương pháp thay thế

Thí nghiệm chuột được bố trí thành 3 lô, mỗi lô chia thành 2 nhóm là thí

nghiệm và đối chứng, được trình bày ở phương pháp nghiên cứu. Kết quả thu được

trình bày ở bảng 4.22.

Kết quả thu được cho thấy: ở lô 1, công cường độc với canh trùng

A. pleuropneumoniae, sau khi công ở nhóm thí nghiệm tiêm vacxin có 1/15

chuột bị chết trong vòng 48 giờ, đạt tỷ lệ bảo hộ 93,33%. Trong khi đó, tất cả

15 chuột ở lô đối chứng không được tiêm vacxin, sau khi công cường độc với

liều tương tự đều bị chết trong vòng 24-72 giờ (tỷ lệ chết 100%). Tại lô 2,

công cường độc với canh trùng P. multocida, sau khi công ở nhóm thí nghiệm tiêm vacxin không có chuột bị chết và 10 chuột đều sống khỏe mạnh trong 10 ngày theo dõi, đạt tỷ lệ bảo hộ 100%. Trong khi đó, tất cả 10 chuột ở lô đối chứng sau khi công cường độc đều bị chết trong vòng 24-48 giờ (tỷ lệ chết 100%). Ở lô 3, sau khi công cường độc với canh trùng S. suis, tất cả 5 chuột ở nhóm thí nghiệm tiêm vacxin đều sống khỏe mạnh, không có chuột nào chết trong 10 ngày theo dõi, đạt tỷ lệ bảo hộ 100%; còn ở lô đối chứng không tiêm

vacxin, sau khi công cường độc với liều tương tự, cả 5 chuột đều bị chết trong vòng 72 giờ (tỷ lệ chết 100%).

80

Bảng 4.22. Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng bằng

phương pháp thay thế

Số lượng chuột Số lượng chuột Thời gian chết Lô chuột Loại canh trùng tiêm công cường độc chết (con) chuột (giờ)

APP serotype 2 0/5 5

APP serotype 5a 1/5 48 5

APP serotype 5b 0/5 5 Thí P. multocida serotype A 0/5 5 nghiệm P. multocida serotype D 0/5 5

S. suis serotype 2 0/5 5

Không tiêm 0/5 5

APP serotype 2 5/5 24 5

APP serotype 5a 5/5 48 5

APP serotype 5b 5/5 48-72 5 Đối chứng P. multocida serotype A 5/5 48 5

P. multocida serotype D 5/5 24 5

Theo quy trình kiểm nghiệm năm 2006 dành cho các vacxin vi khuẩn vô

hoạt có formalin của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, khi kiểm tra chỉ

tiêu an toàn bằng phương pháp thay thế trên chuột: vacxin được coi là an toàn

khi động vật thí nghiệm phải sống khỏe mạnh trong 10 ngày theo dõi sau khi tiêm

vacxin với liều sử dụng. Trường hợp thử hiệu lực bằng phương pháp công cường

độc trên động vật thí nghiệm thay thế: với số động vật thí nghiệm được công là

5, nhóm đối chứng là 5, sau 10 ngày theo dõi chuột đối chứng phải chết hết và

chuột thí nghiệm sống ít nhất 3 con thì vacxin có hiệu lực. Như vậy, so với quy

định trên, có thể đánh giá vacxin vô hoạt chế tạo được đạt chỉ tiêu an toàn và hiệu

lực khi thử trên động vật thí nghiệm, đủ tiêu chuẩn để tiến hành kiểm tra các bước

tiếp theo để đánh giá hiệu quả sử dụng của vacxin trên bản động vật.

S. suis serotype 2 5/5 72 5

4.3.2.5. Kết quả đánh giá chỉ tiêu hiệu lực của vacxin trên lợn bằng phương

pháp trọng tài

Vacxin để được sử dụng thực nghiệm cần phải đánh giá trên bản động vật. Vì

81

vậy chúng tôi đã kiểm tra hiệu lực của vacxin trên lợn bằng phương pháp trọng tài.

Thí nghiệm được bố trí thành 2 lô thí nghiệm và đối chứng, sau 21 ngày tiêm vacxin

với lô thí nghiệm và nước thịt với lô đối chứng, công cường độc lô thí nghiệm mỗi

loại vi khuẩn tiêm cho 3 lợn, với lô đối chứng mỗi loại vi khuẩn tiêm cho 2 lợn. Chi

tiết tiến hành như trình bày ở phương pháp nghiên cứu. Chúng tôi thu được kết quả

kiểm tra trình bày ở bảng 4.23.

Bảng 4.23. Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin trên lợn

bằng phương pháp trọng tài

Lô lợn Loại canh trùng tiêm Đường tiêm Số lợn chết (con) Thời gian chết (giờ) Liều tiêm (ml) Số lợn công cường độc (con)

3 0/3 A. pleuropneumoniae serotype 2

3 0/3 A. pleuropneumoniae serotype 5a

3 0/3 A. pleuropneumoniae serotype 5b Dưới da 5 ml Thí nghiệm 1/3 72 P. multocida serotype A 3

0/3 P. multocida serotype D 3

0/3 S. suis serotype 2 3

0/3 A. pleuropneumoniae + S. suis + P. multocida 3

2 2/2 24 A. pleuropneumoniae serotype 2

2 2/2 24 A. pleuropneumoniae serotype 5a

2 2/2 72 A. pleuropneumoniae serotype 5b Dưới da 5 ml Đối chứng 2/2 24 P. multocida serotype A 2

2/2 24 P. multocida serotype D 2

2/2 72 S. suis serotype 2 2

Ghi chú: LD50 của A. pleuropneumoniae serotype 2 là 4,3 x 107 CFU/0,2 ml và serotype 5 là 4,8 x 107 CFU/0,2 ml. LD50 của chủng P. multocida serotype A là 4 x 107 CFU/0,2 ml và serotype D là 4,2 x 107 CFU/0,2 ml. LD50 của S. suis serotype 2 là 4,4 x 107 CFU/0,2 ml

2/2 24 2 A. pleuropneumoniae + S. suis + P. multocida

82

Kết quả cho thấy: khi tiêm canh trùng chứa vi khuẩn cường độc

A. pleuropneumoniae cho lợn đã sử dụng vacxin 21 ngày, không có lợn nào bị chết.

Số liệu tương ứng đạt được ở cả 3 loại vi khuẩn cường độc trong canh trùng được

tiêm gồm A. pleuropneumoniae serotype 2, A. pleuropneumoniae serotype 5a và

A. pleuropneumoniae serotype 5b. Lợn được công cường độc với vi khuẩn

P. multocida serotype A và D, chỉ có 1 lợn tiêm canh trùng của P. multocida serotype

A bị chết (1/3 lợn thí nghiệm). Như vậy, với 6 lợn khi công cường độc với vi khuẩn

P. multocida serotype A và D, tỷ lệ bảo hộ chung là 83,3%. Lợn được công cường

độc với vi khuẩn S. suis serotype 2 với liều 5 ml/con đã không gây chết lợn, đạt tỷ lệ

bảo hộ đạt 100%. Với cả 3 lợn được công cường độc với hỗn hợp các loại vi khuẩn:

A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b + P. multocida serotype A và D + S. suis

serotype 2, liều 5 ml/con đã không gây chết lợn, đạt tỷ lệ bảo hộ chung là 100%.

Đối với lợn ở lô đối chứng (không được tiêm vacxin), khi công cường độc

với cùng liều tiêm như lô thí nghiệm, kết quả theo dõi cho thấy tất cả lợn đều chết

(14/14 con) trong vòng từ 24 đến 72 giờ với triệu chứng và bệnh tích đặc trưng

cho phức hợp hô hấp do những vi khuẩn này gây ra.

Như vậy vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn được

chế tạo từ 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2; 5a, 5b; P. multocida

serotype A, D và S. suis serotype 2, có hiệu lực bảo hộ cho lợn với bệnh tụ

huyết trùng do P. multocida từ 83,3% trở lên. Theo tiêu chuẩn Quốc gia TCVN

8685-15: 2017 và TCVN 8685-17:2017 của Bộ khoa học và Công nghệ, vacxin

chế tạo đã đạt yêu cầu của vacxin phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn

A. pleuropneumoniae serotype 2; 5a, 5b; P. multocida serotype A, D và S. suis

serotype 2 gây ra ở lợn.

4.3.3. Kết quả so sánh khả năng sinh miễn dịch của vacxin đa giá bổ

trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu chống lại vi khuẩn

A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis

4.3.3.1. Kết quả kiểm tra kháng thể của vacxin vô hoạt nhũ dầu

Vacxin bán thành phẩm đa giá đã đạt được chỉ tiêu về cảm quan, vô trùng, an

toàn và hiệu lực. Tuy nhiên, để biết được khả năng bảo hộ và thời gian bảo hộ của

vacxin với bản động vật, hiệu giá kháng thể theo thời gian cần được xác định.

83

Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của vacxin đa giá bảng 4.24 cho thấy:

trước thời điểm tiêm vacxin, những lợn thí nghiệm được kiểm tra và thấy đều

âm tính kháng thể trong máu. Tuy nhiên, vacxin đa giá đã giúp cho cơ thể lợn

sản sinh kháng thể ở mức cao. Vào thời điểm 21 ngày sau tiêm vacxin, hàm

lượng kháng thể chống A. pleuropneumoniae dao động từ 6,5 ± 0,71 log2 đến

7,4 ± 0,52 log2. Hàm lượng kháng thể chống P. multocida serotype A và D là

6,5 ± 0,53 và 6,4 ± 0,52 còn hàm lượng kháng thể chống S. suis serotype 2 là

6,0 ± 0,00 log2.

Với hiệu giá kháng thể ở những thời điểm sau đó (2 tháng, 3 tháng, 4 tháng,

5 tháng) đã cho thấy, hàm lượng kháng thể chống lại những mầm bệnh xét nghiệm

giảm dần (P < 0,05) tuy nhiên có một số điểm đáng chú ý trong diễn biến hàm

lượng kháng thể như sau:

Bảng 4.24. Kết quả kiểm tra kháng thể trên lợn tiêm vacxin vô hoạt nhũ dầu

phòng viêm phổi lợn kháng lại vi khuẩn A. pleuropneumoniae (serotype 2,

5a, 5b), P. multocida (serotype A, B), và S. suis serotype 2

Kết quả xác định hiệu giá kháng thể (log2)

Sau tiêm vacxin Chỉ tiêu theo dõi

6,7d ± 0,48 4,9c ± 0,57 4,6bc ± 0,52 4,0ab ± 0,00 3,4a ± 1,26

21 ngày 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng Trước tiêm vacxin

- A. pleuropneumoniae serotype 2

6,5c ± 0,71 5,0b ± 0,82 4,3ab ± 0,48 3,9a ± 0,32 3,6a ± 0,52

7,4d ± 0,52 5,8c ± 0,92 4,7b ± 0,67 4,1ab ± 0,32 3,8a ± 0,42

A. pleuropneumoniae - serotype 5a

6,5b ± 0,53 6,4b ± 0,52 6,2b ± 0,42 5,9b ± 0,32 5,2a ± 0,79

- A. pleuropneumoniae serotype 5b

6,4c ± 0,52 5,9bc ± 0,32 5,8b ± 0,42 5,7b ± 0,48 4,9a ± 0,32

- P. multocida serotype A

6,0c ± 0,00 5,9c ± 0,32 5,8c ± 0,42 4,9b ± 0,32 4,0a ± 0,00

- P. multocida serotype D

Ghi chú: a, b, c: Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05

Sau 4 tháng tiêm vacxin, hiệu giá kháng thể đối với tất cả những vi khuẩn

được kiểm tra đều đạt trên 4 log2 (trừ vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 5a).

Sau 5 tháng, hiệu giá kháng thể chống lại P. multocida và S. suis vẫn đạt trên 4

- S. suis serotype 2

84

log2 trong khi hiệu giá kháng thể của A. pleuropneumoniae đều dưới 4 log2. Sự

dao động về hiệu giá kháng thể chống A. pleuropneumoniae là từ 3,4 ± 1,26 log2

đến 3,8 ± 0,42 cho thấy ở một số lô thí nghiệm, hiệu giá kháng thể vẫn đạt được

trên 4 log2. Như vậy, để chắc chắn có hiệu giá kháng thể trên 4 log2 ở lợn đối với

vi khuẩn A. pleuropneumoniae thì vacxin đa giá nên được tiêm nhắc lại vào 4 tháng

sau khi tiêm lần 1. Hiệu giá kháng thể chống P. multocida và S. suis vẫn đạt ở mức

≥ 4log2 vào tháng thứ 5, cũng là lúc kết thúc đợt thí nghiệm. Vì vậy cần có thêm

thời gian để đánh giá khả năng duy trì hiệu giá kháng thể ở mức 4 log2 của vacxin

đa giá với hai mầm bệnh P. multocida và S. suis. Mặc dù vậy, để đảm bảo tính an

toàn của lợn được tiêm vacxin đa giá (chống lại cả A. pleuropneumoniae,

P. multocida và S. suis) thì thời điểm tiêm nhắc lại vacxin nên căn cứ vào lúc bắt

đầu xuất hiện sự giảm hiệu giá kháng thể xuống dưới 4 log2 ở bất cứ một loại mầm

bệnh nào nêu trên, ở đây là 4 tháng sau khi tiêm vacxin lần thứ nhất.

So sánh với hiệu lực phòng bệnh viêm phổi phức hợp của vacxin đa giá vô

hoạt keo phèn của Công ty Marphavet sản xuất và lưu hành trên toàn quốc, chúng

tôi thấy: sau 4 tháng tiêm vacxin có bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu, hiệu giá

kháng thể có trong máu lợn kháng lại với tất cả những vi khuẩn được kiểm tra đều

đạt trên 4 log2. Nhưng sau 5 tháng tiêm vacxin, với vacxin nhũ dầu hiệu giá kháng

thể chống lại P. multocida và S. suis vẫn đạt trên 4 log2, còn kháng lại

A. pleuropneumoniae đều trên 3 log2; Trong khi đó, lợn được tiêm vacxin viêm

phổi có bổ trợ keo phèn sau 5 tháng tiêm vacxin keo phèn hiệu giá kháng thể trong

máu lợn kháng lại A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis chỉ đạt ≤ 3

log2. (Hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc thú y (2015) Sản phẩm: MAR-APPSVAC).

Kết quả so sánh chất lượng vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ

dầu chế tạo phòng bệnh cho lợn, bằng phương pháp ELISA, cho thấy: khả năng

kích thích cơ thể lợn sản sinh kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae

serotype 2 và 5 ở lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ nhũ dầu tốt hơn

nhiều so với 5 lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ keo phèn (Cù Hữu Phú

& cs., 2019). Như vậy, bước đầu có thể đánh giá hiệu lực phòng bệnh và độ dài

miễn dịch của vacxin đa giá phòng bệnh viêm phổi phức hợp nhũ dầu cao hơn

vacxin bổ trợ keo phèn.

85

4.3.3.2. Kết quả so sánh hình thành kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu

Lợn thí nghiệm được chia ra 3 lô: lô 1 có 5 lợn được tiêm vacxin có bổ trợ

keo phèn; Lô 2 có 5 lợn, được tiêm vacxin có bổ trợ nhũ dầu; Lô 3 có 3 lợn đối

chứng, được tiêm nước sinh lý. Huyết thanh của lợn sau khi tiêm vacxin 21 ngày,

sử dụng để xác định hàm lượng kháng thể hình thành trong máu sau khi tiêm vacxin

21 ngày. Kết quả được thể hiện ở các bảng 4.25.

Bảng 4.25. Kết quả so sánh hình thành kháng thể kháng vi khuẩn

A. pleuropneumoniae của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá

bổ trợ nhũ dầu bằng phương pháp ELISA

Serotype 2

Serotype 5

Loại

Đường

Liều

Đánh

Đánh

Số

Số tai

vacxin

tiêm

tiêm

giá

giá

TT

OD450 S/P OD450 S/P

67,418 +

56,462 +

0,712 0,591 1 TN1

42,623 +

118,955 +

51,059 +

59,324 +

56,356 +

-

0,47 2 TN2 1,421 144,386 + Dưới 3 TN3 Keo phèn 2 ml 1,215 0,54 da 4 TN4 0,633 0,59

39,652 +

5,720

5 TN5 0,441 0,112

Trung bình 65,59a ± 31,98 62,80a ± 55,33

178,381 +

6 TN6 1,795 2,365 244,385 +

133,914 +

7 TN7 1,361 1,53 155,932 +

151,230 +

8 TN8 Nhũ dầu Bắp 2 ml 1,53 1,265 127,860 +

124,078 +

9 TN9 1,265 1,361 138,029 +

236,783 +

10 TN10 2,365 1,795 184,004 +

-

-

Trung bình 164,88b ± 45,17 170,04b ± 46,70

-1,127

-1,377

-

-

11 TN11 0,043 0,045

-0,717

-0,953

-

-

12 TN12 Nước thịt Dưới da 2 ml 0,047 0,049

-0,615

-0,636

13 TN13 0,048 0,052

14 Đối chứng dương 1,030 1,002

Ghi chú: a, b: Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05

15 Đối chứng âm 0,054 0,058

86

Kết quả ở bảng 4.25 cho thấy: trong 10 lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa

giá có 9/10 lợn dương tính với kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae

serotype 2 và 5. Trong khi đó 3 lợn đối chứng đều âm tính với kháng thể này. Với

vacxin keo phèn chỉ có 4/5 lợn tiêm vacxin cho kết quả dương tính, nhưng lợn tiêm

vacxin nhũ dầu cả 5/5 lợn đều cho kết quả dương tính.

Kết quả cũng cho thấy: các chỉ số OD và S/P đánh giá vacxin nhũ dầu kích

thích cơ thể lợn hình thành kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae

serotype 2 và 5 tốt hơn ở lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ

keo phèn.

Kết quả này bước đầu cho thấy sự khác biệt về khả năng kích thích cơ thể

lợn hình thành kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2 và 5 ở

lợn khi được tiêm hai loại vacxin bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu. Vacxin đa giá

bổ trợ nhũ dầu kích thích cơ thể lợn hình thành kháng thể tốt hơn so với vacxin

keo phèn. Mặc dù vậy, để đánh giá chính xác hơn hiệu lực của 2 loại vacxin này,

cần tiếp tục lặp lại với số lượng mẫu nhiều hơn, hiệu giá kháng thể, cũng như độ

dài miễn dịch để xác định thời gian kéo dài miễn dịch của 2 loại vacxin này trên

lợn sẽ đánh giá chính xác hơn về khả năng bảo hộ của 2 loại vacxin bổ trợ keo

phèn và bổ trợ nhũ dầu đối với vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2 và 5 ở

lợn được tiêm vacxin phòng bệnh.

4.3.3.3. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P. multocida của

vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu

Để so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P. multocida serotype A và

D hình thành trong máu lợn sau khi tiêm hai loại vacxin vô hoạt có bổ trợ keo

phèn và bổ trợ nhũ dầu khác nhau ở lợn sau 21 ngày được tiêm vacxin, chúng

tôi đã lấy máu lợn ở cả 3 lô khác nhau trước và sau khi tiêm 21 ngày, tiến hành

làm phản ứng ngưng kết nhằm so sánh hiệu giá khác thể được hình thành của 2

loại vacxin. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 4.26.

87

Bảng 4.26. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P. multocida

của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu

Số Liều Serotype Đánh Serotype Số tai Loại vacxin Đường tiêm Đánh giá TT tiêm A giá D

1 TN1 2 ml 3Log2 + 3Log2 +

2 TN2 + 3Log2 3Log2 +

3 TN3 Keo phèn Dưới da + 4Log2 4Log2 +

4 TN4 + 4Log2 4Log2 +

5 TN5 + 4Log2 4Log2 +

Trung bình 3,60 Log2 ± 0,55 3,60 Log2 ± 0,55

6 TN6 2 ml 4Log2 + 4Log2 +

7 TN7 + 4Log2 4Log2 +

8 TN8 Nhũ dầu Bắp + 5Log2 5Log2 +

9 TN9 + 4Log2 4Log2 +

10 TN10 + 5Log2 5Log2 +

Trung bình 4,40 Log2 ± 0,55 4,40 Log2 ± 0,55

11 TN11 - - - - 2 ml

- - - - 12 TN12 Nước thịt Dưới da

Kết quả ở bảng 4.26 cho thấy: tất cả 10 lợn được tiêm vacxin viêm phổi

đa giá đều dương tính với kháng thể kháng vi khuẩn Pasteurella multocida

serotype A và D. Trong khi đó lợn đối chứng đều âm tính với kháng thể này.

Kết quả cũng cho thấy: hàm lượng kháng thể kháng vi khuẩn P. multocida

serotype A và D ở lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ nhũ dầu

có cao hơn so với 5 lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ keo phèn.

Kết quả này bước đầu cho thấy sự khác biệt bước đầu khả năng hình thành

kháng thể ở lợn được tiêm hai loại vacxin bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu.

Do đó cần tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu nhiều hơn và thời gian miễn

dịch kéo dài hơn để đánh giá về khả năng bảo hộ của 2 loại vacxin bổ trợ keo

phèn và bổ trợ nhũ dầu đối với lợn được tiêm vacxin phòng bệnh.

13 TN13 - - - -

88

4.3.3.4. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn S. suis của vacxin

đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu

Tương tự như trên, để so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn S. suis

serotype 2 hình thành trong máu lợn sau khi tiêm hai loại vacxin vô hoạt có bổ

trợ keo phèn và bổ trợ hũ dầu khác nhau ở lợn sau 21 ngày được tiêm vacxin,

chúng tôi đã lấy máu lợn ở cả 3 lô khác nhau trước và sau khi tiêm 21 ngày,

tiến hành làm phản ứng ngưng kết nhằm so sánh hiệu giá khác thể được hình

thành của 2 loại vacxin. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 4.27.

Bảng 4.27. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn S. suis của

vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu

Số TT Số tai Loại vacxin Đường tiêm Liều tiêm Serotype 2 Đánh giá

1 TN1 3Log2 +

2 TN2 3Log2 +

TN3 Keo phèn Dưới da 2 ml 4Log2 3 +

4 TN4 4Log2 +

5 TN5 4Log2 +

Trung bình 3,60 Log2 ± 0,55

6 TN6 4Log2 +

7 TN7 4Log2 + Bắp 8 + TN8 Nhũ dầu 2 ml 4Log2

9 TN9 4Log2 +

10 TN10 5Log2 +

Trung bình 4,20 Log2 ± 0,55

11 TN11 - -

12 - - TN12 Nước thịt Dưới da 2 ml

13 TN13 - -

89

Kết quả ở bảng 4.27 cho thấy: tất cả 10 lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa

giá đều dương tính với kháng thể kháng vi khuẩn S. suis serotype 2. Trong khi

đó lợn đối chứng đều âm tính với kháng thể này.

Kết quả cũng cho thấy: hàm lượng kháng thể kháng vi khuẩn S. suis

serotype 2 ở lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ nhũ dầu không có

sự khác biệt lớn so với 5 lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ keo phèn.

Kết quả này bước đầu cho thấy không có sự khác biệt khả năng hình thành

kháng thể kháng vi khuẩn S. suis serotype 2 ở lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa

giá có bổ trợ nhũ dầu. Do đó cần tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu nhiều hơn

và thời gian miễn dịch kéo dài hơn để đánh giá về khả năng bảo hộ của 2 loại

vacxin bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu đối với lợn.

4.3.4. Kết quả xác định liều tiêm vacxin đa giá phòng bệnh viêm phổi lợn

Nhằm xác định liều tiêm vacxin viêm phổi lợn phù hợp để có hiệu lực bảo

hộ đàn lợn sau khi tiêm vacxin cao nhất và có độ dài miễn dịch dài nhất, chúng tôi

đã tiến hành bố trí thí nghiệm như trình bày ở phương pháp nghiên cứu trên đàn

lợn nuôi tại Công ty Marphavet. Kết quả được trình bày ở bảng 4.28.

Kết quả bảng 4.28 cho thấy cả 15 lợn ở lô thí nghiệm được tiêm vacxin khi

lấy mẫu máu kiểm tra trước khi tiêm vacxin đều âm tính và sau khi tiêm vacxin

đều có kháng thể tương ứng với các thành phần vi khuẩn A. pleuropneumoniae,

P. multocida và S. suis.

Kết quả cũng cho thấy: ở nhóm 1 tiêm 1 mũi duy nhất với liều tiêm 2 ml/con,

sau khi

tiêm vacxin 1

tháng, hiệu giá kháng

thể kháng vi khuẩn

A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis cao nhất chỉ đạt 5Log2.

Lợn ở nhóm 2: tiêm 2 mũi với liều tiêm 1ml/con, sau khi tiêm vacxin 1 tháng,

hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis

cao nhất chỉ đạt 5Log2 đến 6Log2.

Lợn ở nhóm 3: tiêm 2 mũi với liều tiêm 2 ml/con, sau khi tiêm vacxin 1 tháng,

hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis

cao nhất so với 2 nhóm trên và đạt hiệu giá từ 6Log2 đến 7Log2.

90

Bảng 4.28. Kết quả xác định kháng thể ở lợn tiêm vacxin

với liều tiêm khác nhau

Kết quả xác định hiệu giá kháng thể

TT Mẫu HT

Sau tiêm vacxin

Trước tiêm

vacxin

A. pleuropneumoniae P. multocida

S. suis

1

KT1

-

5Log2

5Log2

5Log2

2

KT2

-

5Log2

5Log2

5Log2

3

KT3

-

5Log2

5Log2

5Log2

4

KT4

-

5Log2

5Log2

5Log2

5

KT5

-

5Log2

5Log2

5Log2

6

KT6

-

5Log2

5Log2

6Log2

7

KT7

-

5Log2

5Log2

5Log2

8

KT8

-

5Log2

6Log2

5Log2

9

KT9

-

6Log2

6Log2

5Log2

10

KT10

-

6Log2

6Log2

6Log2

11

KT11

-

6Log2

6Log2

6Log2

12

KT12

-

7Log2

6Log2

6Log2

13

KT13

-

6Log2

6Log2

7Log2

14

KT14

-

6Log2

7Log2

6Log2

15

KT15

-

6Log2

6Log2

6Log2

Như vậy có thể đánh giá liều tiêm vacxin cho lợn đạt hiệu lực bảo hộ cao

nhất là tiêm vacxin viêm phổi lợn 2 mũi, với liều tiêm 2 ml/con /mũi cách nhau 7

ngày, tiêm dưới da sau hốc tai. Với hiệu giá kháng thể đạt được trong máu lợn sau

khi tiêm 1 tháng, có thể đánh giá sau khi tiêm vacxin 4 tháng vẫn có hiệu lực bảo

91

hộ đàn lợn 100% với vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây

bệnh viêm phổi ở lợn.

4.3.5. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ

dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn

Trên kết nghiên cứu chế tạo và đánh giá chất lượng vacxin đa giá vô hoạt

bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae;

P. multocida và S. suis gây ra ở lợn tại các lứa tuổi khác nhau, chúng tôi đã xây

dựng được quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu trên quy mô

sản xuất công nghiệp với các thiết bị lên men sục khí 10 lít và 120 lít của hãng

Sartorius- CHLB Đức. Chúng tôi đã tiến hành sản xuất thử nghiệm 3 lô vacxin

nhũ dầu trên quy mô sản xuất công nghiệp với các thiết bị lên men sục khí nêu

trên, với kết quả lặp lại thu được để đưa ra các thông số kỹ thuật theo từng bước

cụ thể, nên đã tối ưu hóa được quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu.

Quy trình này được viết theo thứ tự từng bước thực hiện với các trang thiết bị

phù hợp, có thể được áp dụng cho cơ sở được phép sản xuất vacxin phòng bệnh

cho gia súc, gia cầm. Với các trang thiết bị phù hợp để đảm bảo yêu cầu sản

xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi lợn là vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ nhũ

dầu như sau:

QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACXIN ĐA GIÁ VÔ HOẠT CÓ BỔ TRỢ NHŨ

DẦU PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI Ở LỢN

Quy trình này có thể được áp dụng cho cơ sở được phép sản xuất vacxin

phòng bệnh cho gia súc, gia cầm, với các trang thiết bị phù hợp để đảm bảo yêu

cầu sản xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi lợn là vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ

nhũ dầu. Vacxin chế tạo cần đảm bảo đủ số lượng kháng nguyên có trong một liều

vacxin tiêm cho lợn. Do đó đối với từng loại vi khuẩn có trong 1 liều tiêm vacxin

cho lợn phải gồm các vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a, 5b; vi khuẩn

P. multocida serotype A, D và S. suis serotype 2. Các vi khuẩn có trong bộ giống

chế tạo vacxin đều được nuôi cấy bằng phương pháp lên men sục khí.

92

1. Sản xuất kháng nguyên Actinobacillus pleuropneumoniae:

Bước 1. Chuẩn bị giống vi khuẩn:

- Vi khuẩn giống Actinobacillus pleuropneumoniae được bảo quản ở thạch

lỏng Glycerin, được cấy lên thạch PPLO, mỗi giống cấy lên 1 đĩa thạch, nuôi trong

tủ ấm 370C có khí CO2 với thời gian là 24 giờ.

- Kiểm tra thuần: giống vi khuẩn cấy trên đĩa thạch được làm tiêu bản,

kiểm tra trên kính hiển vi.

- Từ đĩa thạch cấy giống, (mỗi giống vi khuẩn cấy trên 10 đĩa thạch PPLO)

đã nuôi trong tủ ấm 370C có khí CO2 cấy chuyển sang giống nhỏ.

- Kiểm tra thuần khiết canh trùng: Làm tiêu bản, kiểm tra trên kính

hiển vi.

Bước 2. Lên men sục khí với Fermentor 10 lít:

- Môi trường sử dụng lên men sục khí: môi trường sục khí là Trypton

Wasser, có bổ sung Yeast Extract (3 lít).

- Các hóa chất bổ sung:

o Máu vỡ: 50 ml

o Huyết thanh ngựa: 100 ml

o Phá bọt (antifoam): 1 giọt

- Bổ trợ 12,5 ml NAD + 2,5 ml Glucose

- Chế độ chạy máy lên men sục khí:

o Tốc độ khuấy: 300 rpm

o Nhiệt độ: 370C

o pH: 7,2

o DO: khoảng 9%

- Theo dõi máy trong quá trình sục trong thời gian 11 giờ, có bổ sung axit,

bazơ tự động để điều chỉnh pH.

93

- Sau 8 giờ lên men sục khí: chuyển toàn bộ canh trùng từ bình Fermentor

10 lít sang Fermentor 100 lít.

Bước 3. Lên men sục khí với Fermentor 100 lít:

- Môi trường sử dụng lên men sục khí: môi trường sục khí là Trypton

Wasser, có bổ sung Yeast Extract (25 lít).

- Các hóa chất bổ sung:

o Máu vỡ: 500 ml

o Huyết thanh ngựa: 1000 ml

o Phá bọt (antifoam): 10 giọt

- Bổ trợ 125 ml NAD + 25 ml Glucose

- Chế độ chạy máy lên men sục khí:

o Tốc độ khuấy: 300 rpm

o Nhiệt độ: 370C

o pH: 7,2

o DO: khoảng 9%

- Theo dõi máy trong quá trình sục trong thời gian 10 giờ, có bổ sung axit,

bazơ tự động để điều chỉnh pH.

- Sau 10 giờ lên men sục khí: Thu hoạch canh trùng, lấy mẫu đếm số vi

khuẩn.

- Đếm số vi khuẩn: Sử dụng thạch PPLO, mỗi nồng độ pha loãng nhỏ lên

2 đĩa thạch (100 µl/đĩa). Nuôi cấy trong tủ ấm 370C có khí CO2 với thời gian là

24 giờ.

- Kết quả đếm số vi khuẩn: trên 7 tỷ vi khuẩn/1 ml canh trùng là đạt yêu

cầu.

2. Sản xuất kháng nguyên Pasteurella multocida:

Bước 1. Chuẩn bị giống vi khuẩn:

94

- Cấy các chủng P. multocida được bảo quản ở thạch lỏng Glycerin lên

thạch đĩa: Thạch BHI có bổ sung 5% máu cừu.

- Chọn 1 khuẩn lạc thuần khiết cấy lên môi trường thạch đĩa nuôi cấy ở

37oC với thời gian là 18- 20giờ. Ria cấy mỗi chủng vi khuẩn trên đĩa thạch.

- Cấy giống nhỏ: Thu hoạch khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch cấy vào 1 bình

môi trường TSB broth (100 ml).

Bổ sung huyết thanh ngựa 10% vào mỗi bình giống nhỏ (2 ml/ bình).

Nuôi cấy bình giống nhỏ có lắc: 200 rpm ở 38oC với thời gian 9 giờ (thời

gian bắt đầu: 9 giờ sáng, thời gian kết thúc: 18 giờ).

- Cấy giống nhỡ: Cấy chuyển canh trùng giống nhỏ (100 ml) sang bình

giống nhỡ (230ml) TSB broth (230ml x 6 bình) 6 x 230ml ≈ 1,4 lít.

Bổ sung huyết thanh ngựa 10% vào mỗi bình giống nhỡ.

Nuôi cấy có lắc: 200 rpm ở 38oC với thời gian 14 giờ (thời gian bắt đầu:

18 giờ, thời gian kết thúc: 8 giờ sáng ngày hôm sau).

Bước 2. Lên men sục khí với Fermentor 10 lít:

- Canh trùng giống nhỡ chuyển vào môi trường sục khí được sử dụng là

TSB broth 3 lít.

- Bổ sung chất bổ trợ:

o Bổ sung huyết thanh ngựa vào bình nuôi cấy: 100 ml

o Chất phá bọt- anti foam: 1 giọt

- Chế độ chạy máy:

o Nhiệt độ: 38oC

o pH: 7,20

o DO: 90- 96%

o Tốc độ khuấy: 500 rpm

- Thời gian bắt đầu: 8h30 sáng, thời gian kết thúc: sau 8 giờ.

95

- Sau 8 giờ lên men sục khí: chuyển toàn bộ canh trùng từ bình Fermentor

10 lít sang Fermeltor 100 lít.

Bước 3. Lên men sục khí với Fermentor 100 lít:

- Canh trùng giống lớn chuyển vào môi trường sục khí được sử dụng là

TSB broth 30 lít.

- Bổ sung chất bổ trợ:

o Bổ sung huyết thanh ngựa vào bình nuôi cấy: 1000 ml

o Chất phá bọt- anti foam: 10 giọt

- Chế độ chạy máy:

o Nhiệt độ: 38oC

o pH: 7,20

o DO: 90- 96%

o Tốc độ khuấy: 500 rpm

- Thời gian: 10 giờ.

- Sau 10 giờ lên men sục khí: Thu hoạch canh trùng, lấy mẫu đếm số vi

khuẩn.

- Đếm số vi khuẩn: Sử dụng thạch máu, mỗi nồng độ pha loãng nhỏ lên 2

đĩa thạch (100 µl/đĩa). Nuôi cấy ở 370C có khí CO2 với thời gian là 24 giờ.

- Kết quả đếm số vi khuẩn: trên 7 tỷ vi khuẩn/1 ml canh trùng là đạt yêu

cầu.

3. Sản xuất kháng nguyên Streptococcus

Bước 1. Chuẩn bị giống:

- Cấy chủng S. suis được bảo quản ở thạch lỏng Glycerin lên đĩa thạch

(thạch máu cừu). Ria cấy vi khuẩn S.suis lưu giữ từ thạch lỏng lên 1 đĩa môi trường

và nuôi cấy ở 37oC với thời gian 24 giờ.

- Lựa chọn khuẩn lạc thuần khiết để chuẩn bị giống: sử dụng thạch máu cừu.

Chọn khuẩn lạc thuần khiết cấy lên môi trường thạch đĩa (15 đĩa thạch), nuôi cấy

ở 37oC với thời gian 20- 24 giờ.

96

- Cấy giống nhỏ: Thu hoạch khuẩn lạc cấy vào môi trường THB (Todd

Hewitt Broth - 120ml), cấy chuyển khuẩn lạc S. suis từ đĩa thạch vào 1 bình 120

ml THB broth. Nuôi cấy có lắc 200 rpm ở 38oC với thời gian 9 giờ.

- Cấy giống nhỡ: Cấy chuyển canh trùng giống nhỏ sang bình giống nhỡ

THB broth.

Bổ sung huyết thanh ngựa 2% (4 ml/ bình).

Nuôi cấy có lắc 200 rpm ở 38oC với thời gian: 14 giờ.

Bước 2. Lên men sục khí với Fermentor 10 lít:

Canh trùng giống nhỡ cấy chuyển sang môi trường sục khí THB broth

(1,6 lít canh trùng + 5,4 lít môi trường THB = 7 lít);

- Bổ sung chất bổ trợ:

o Bổ sung huyết thanh ngựa: 100 ml

o Anti foam 2 giọt

o Máu vỡ 100 ml.

- Chế độ chạy máy:

o Nhiệt độ: 38oC

o pH: 7,3

o DO: 0

o Tốc độ khuấy: 500 rpm

o Thời gian 8 tiếng

- Sau 8 giờ lên men sục khí: chuyển toàn bộ canh trùng từ bình Fermentor

10 lít sang Fermeltor 100 lít.

Bước 3. Lên men sục khí với Fermentor 100 lít:

- Canh trùng giống từ Fermentor 10 lit chuyển sang môi trường sục khí

THB broth 30 lít.

- Bổ sung chất bổ trợ:

o Bổ sung huyết thanh ngựa: 1000 ml

97

o Anti foam 10 giọt

- Chế độ chạy máy:

o Nhiệt độ: 38oC

o pH: 7,3

o DO: 0

o Tốc độ khuấy: 500rpm

o Thời gian 10 giờ

- Sau 10 giờ lên men sục khí: Thu hoạch canh trùng, lấy mẫu đếm số

vi khuẩn.

- Đếm số vi khuẩn: Sử dụng thạch máu, mỗi nồng độ pha loãng nhỏ lên 2

đĩa thạch (100 µl/đĩa). Nuôi cấy ở 370C có khí CO2 với thời gian là 24 giờ.

- Kết quả đếm số vi khuẩn: trên 7 tỷ vi khuẩn/1 ml canh trùng là đạt

yêu cầu.

4. Chuẩn bị các loại kháng nguyên và bán thành phẩm:

Các loại kháng nguyên sau khi kiểm tra vô trùng đảm bảo 100% sẽ được

tiến hành pha trộn với nhũ dầu theo hướng dẫn của Seppic với tỷ lệ 25% (3

phần canh trùng kháng nguyên + 1 phần nhũ dầu MONTANIDETM IMS-1313

VG N).

Dựa

trên kết quả

lên men sục khí mỗi

loại kháng nguyên

(A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; Kháng nguyên S. suis serotype 2

và kháng nguyên P. multocida serotype C và D), cần tiến hành pha trộn các loại

kháng nguyên và nhũ dầu IMS (25%) để có trong mỗi một liều tiêm vacxin cho

lợn (2 ml vacxin/lợn) đảm bảo như sau:

+ Kháng nguyên A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b có 4 tỷ /liều tiêm

+ Kháng nguyên S. suis serotype 2: 4 tỷ /liều tiêm

+ Kháng nguyên P. multocida A và D: 4 tỷ /liều tiêm.

98

4.3.6. Kết quả xây dựng quy trình sử dụng vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ

dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn

Trên kết quả nghiên cứu sử dựng vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn tại

trại lợn thí nghiệm và trên thực địa, chúng tôi đã xây dựng được quy trình sử dụng

vacxin như sau:

QUY TRÌNH SỬ DỤNG VACXIN ĐA GIÁ VÔ HOẠT CÓ BỔ TRỢ NHŨ

DẦU PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI Ở LỢN

Quy trình này áp dụng cho nơi sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi cho

lợn: Các trại chăn nuôi lợn trang trại và nông hộ (lợn thịt, lợn giống, đặc biệt là

trại lợn giống ông bà và bố mẹ).

- Đối tượng sử dụng vacxin:

Lợn ở các lứa tuổi từ 21 ngày tuổi, sau cai sữa; lợn nái và lợn đực giống nuôi

tại các trang trại và nông hộ.

- Chuẩn bị vacxin:

- Vacxin được bảo quản tại kho lạnh, tủ lạnh ở nhiệt độ bảo quản 4o- 8oC,

trước khi tiêm cho lợn phải để ở nhiệt độ bên ngoài 30 phút.

- Vacxin được lắc kỹ trước khi tiêm cho lợn.

- Liều tiêm và đường tiêm vacxin:

Vacxin viêm phổi được tiêm bắp thịt với liều lượng như sau:

+ Lợn từ 21 ngày tuổi, sau cai sữa: tiêm 1 lần với 1 mũi tiêm 1 duy nhất: 2

ml/con cho lợn 21 đến 28 ngày tuổi

+ Lợn nái chửa: 1 năm tiêm 2 lần, mỗi 1 lần tiêm cần tiêm 2 mũi khác nhau:

- Mũi 1: 2 ml/con, tiêm cho lợn nái chửa trước khi đẻ 1 tháng

- Mũi 2: 2 ml/con, sau mũi 1: 7- 10 ngày

+ Lợn đực giống: 1 năm tiêm 2 lần, mỗi 1 lần tiêm cần tiêm 2 mũi khác nhau:

- Mũi 1: 2 ml/con

- Mũi 2: 2 ml/con cách mũi tiêm 1 từ 7 đến 10 ngày.

99

- Thời gian tiêm vacxin:

- Lợn thịt: từ sau cai sữa đến giết thịt chỉ tiêm 1 lần, với 1 mũi tiêm như trên.

- Lợn nái chửa và lợn đực giống: Tiêm 1 năm 2 lần, mỗi 1 lần tiêm tiêm 2

mũi như trên.

QUY TRÌNH BẢO QUẢN VACXIN ĐA GIÁ VÔ HOẠT CÓ BỔ TRỢ

NHŨ DẦU PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI Ở LỢN

Để xây dựng được quy trình bảo quản vacxin viêm phổi lợn, chúng tôi đã tiến

hành thí nghiệm lưu giữ vacxin sau khi sản xuất ở 2 điều kiện khác nhau là:

- Bảo quản vacxin ở nhiệt độ thường, nơi dâm mát 18 - 25oC

- Bảo quản vacxin tại kho lạnh, tủ lạnh ở nhiệt độ bảo quản 4o- 8oC.

Sau 5 tháng; 6 tháng vacxin được lưu giữ ở nhiệt độ thường, nơi râm mát 18

- 25oC và sau 7 tháng; 8 tháng vacxin lưu giữ tại tủ lạnh ở nhiệt độ bảo quản 4o-

8oC, chúng tôi đã tiến hành xác định hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trăng bằng

phương pháp thay thế nhằm xác định thời gian bảo quản vacxin viêm phổi được

sản xuất và thời gian bảo quản lưu giữ.

1. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin bảo quản ở nhiệt độ phòng trên chuột nhắt

trắng bằng phương pháp thay thế

Sau 5 tháng; 6 tháng vacxin được lưu giữ ở nhiệt độ thường, nơi râm mát 18

- 25oC chúng tôi tiến hành xác định hiệu lực của vacxin như sau:

Thí nghiệm được bố trí thành 2 lô:

- Lô 1 chuột thí nghiệm: tiêm vacxin cho 10 chuột khỏe mạnh, mỗi chuột

tiêm 0,2 ml vacxin vào dưới da, lặp lại mũi 2 sau 7 ngày

- Lô 2 chuột đối chứng: gồm 5 chuột được tiêm nước thịt vô trùng.

Sau 21 ngày, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi

khuẩn A. pleuropneumoniae, vi khuẩn P. multocida và vi khuẩn S. suis cho tất cả

chuột thí nghiệm và chuột đối chứng đường tiêm phúc xoang. Kết quả thu được

trình bày ở bảng 4.29.

100

Tương tự như vậy, kết quả ở bảng trên cũng cho thấy: vacxin sau thời gian

bảo quản ở nhiệt độ thường, khi tiến hành công cường độc, chuột ở lô thí nghiệm

có 1/10 chuột bị chết, đạt tỷ lệ bảo hộ 90,0%. Tại lô đối chứng, công cường độc với

canh trùng gồm cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis, sau

khi công cường độc tất cả chuột ở lô đối chứng không được tiêm vacxin, đều bị chết

trong vòng 18- 24 giờ (tỷ lệ chết 100%).

Bảng 4.29. Kết quả thử hiệu lực của vacxin bảo quản ở nhiệt độ 18 - 25oC

trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp thay thế

(Canh trùng tiêm: APP + P. Multocida + S. suis)

Thời gian bảo Số chuột tiêm Số lượng chuột Thời gian chết Lô chuột quản vacxin canh trùng chết (con) chuột (giờ)

Thí nghiệm Sau 5 tháng 10 0/10 0

Sau 6 tháng 10 1/10 48

Đối chứng Sau 5 tháng 5 5/5 24

Như vậy vacxin sau 6 tháng bảo quản ở nhiệt độ thường, nơi râm mát 18 -

25oC, đảm bảo hiệu lực phòng bệnh cho lợn được tiêm vacxin 90%.

Sau 6 tháng 5 5/5 24

12.2. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin bảo quản ở nhiệt độ 4o- 8oC trên chuột

nhắt trắng bằng phương pháp thay thế

Sau 7 tháng, 8 tháng vacxin được lưu giữ tại tủ lạnh ở nhiệt độ bảo quản 4 oC

- 8oC, chúng tôi tiến hành xác định hiệu lực của vacxin như sau:

Thí nghiệm được bố trí thành 2 lô:

- Lô 1 chuột thí nghiệm: tiêm vacxin cho 10 chuột khỏe mạnh, mỗi chuột

tiêm 0,2 ml vacxin vào dưới da, lặp lại mũi 2 sau 7 ngày.

- Lô 2 chuột đối chứng: gồm 5 chuột được tiêm nước thịt vô trùng.

Sau 21 ngày, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi

khuẩn A. pleuropneumoniae, vi khuẩn P. multocida và vi khuẩn S. suis cho tất cả

101

chuột thí nghiệm và chuột đối chứng đường tiêm phúc xoang. Canh trùng tiêm

cho chuột gồm có: A. pleuropneumoniae + P. multocida + S. suis). Kết quả thu

được trình bày ở bảng 4.30.

Kết quả thu được cho thấy: ở lô 1 thí nghiệm tiêm vacxin, công cường độc với

canh trùng của cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis sau

khi công ở nhóm thí nghiệm tiêm vacxin bảo quản sau 7 tháng ở 4o- 8oC, với đường

tiêm canh trùng là phúc xoang, lô thí nghiệm không bị chết, sống khoẻ mạnh 10/10

con sau 7 ngày tiêm canh trùng, tỷ lệ bảo hộ 100%; còn chuột ở lô đối chứng bị

chết 5/5 con sau 24 giờ công cường độc.

Bảng 4.30. Kết quả thử hiệu lực của vacxin bảo quản ở nhiệt độ 4o- 8oC trên

chuột nhắt trắng bằng phương pháp thay thế

Thời gian bảo Số chuột tiêm Số lượng chuột Thời gian chết Lô chuột quản vacxin canh trùng chết (con) chuột (giờ)

Thí Sau 7 tháng 10 0/10 0

nghiệm Sau 8 tháng 10 1/10 48

Đối chứng Sau 7 tháng 5 5/5 24

Tương tự như vậy, kết quả ở bảng trên cũng cho thấy: vacxin sau thời gian

bảo quản ở nhiệt độ thường, khi tiến hành công cường độc, chuột ở lô thí nghiệm

có 1/10 chuột bị chết, đạt tỷ lệ bảo hộ 90,0%. Tại lô đối chứng, công cường độc với

canh trùng gồm cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis, sau

khi công tất cả chuột ở lô đối chứng không được tiêm vacxin, đều bị chết trong vòng

18- 24 giờ (tỷ lệ chết 100%).

Như vậy vacxin sau 8 tháng bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4 - 8oC, đảm bảo hiệu

lực phòng bệnh cho lợn được tiêm vacxin 90%.

Sau 8 tháng 5 5/5 24

102

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

Dựa trên kết quả thu được của luận án, chúng tôi có 3 kết luận chính như sau:

1) Lợn thí nghiệm đã được gây bệnh bằng các chủng vi khuẩn có trong bộ

giống sử dụng sản xuất vacxin gồm: vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5;

vi khuẩn P. multocida serotype A, D và S. suis serotype 2 đều xuất hiện các triệu

chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể điển hình của lợn mắc bệnh viêm phổi do các vi

khuẩn này gây ra cho lợn trong thực tiễn.

2) Bộ giống vi khuẩn sử dụng sản xuất vacxin (Master seed) bao gồm 3 chủng

A. pleuropneumoniae, 2 chủng P. multocida và 1 chủng S. suis được lưu giữu dưới

dạng đông khô trong nhiều nam vẫn hoàn toàn ổn định về đặc tính sinh học, cấu

trúc kháng nguyên, cấu trúc gen, kháng nguyên tính và các yếu tố độc lực của

chúng. Các chủng vi khuẩn đã được lựa chọn làm master seed đảm bảo để sản xuất

vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi cho lợn.

3) Sử dụng bộ giống gốc vi khuẩn (Master seed) được kiểm tra, đã sản xuất

thành công vacxin đa giá vô hoạt có bổ bổ trợ nhũ dầu (IMS 1313) phòng bệnh

viêm phổi ở lợn.

- Vacxin được kiểm nghiệm đạt chất lượng tốt. Hiệu lực phòng bệnh của

vacxin chế tạo được thử nghiệm trên lợn với phương pháp công cường độc đạt tỷ lệ

bảo hộ trên 80,0% và đạt tỷ lệ an toàn 100,0% ở lợn trên 4 tuần tuổi khi thử nghiệm

tại thực địa. Vacxin gây đáp ứng miễn dịch tốt. Lợn sau khi tiêm vacxin 5 tháng,

hiệu giá kháng thể trong huyết thanh đạt ≥ 1/16 (4log2), đảm bảo kháng lại vi khuẩn

A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a, 5b; P. multocida serotype A, D và S. suis

serotype 2 gây viêm phổi ở lợn. Vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ nhũ dầu kích thích

lợn sản sinh kháng thể kháng 3 loại vi khuẩn trên tốt hơn so với vacxin đa giá vô

hoạt bổ keo phèn.

- Đã xây dựng và hoàn thiện được quy trình sản xuất, quy trình sử dụng và

bảo quản vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do 3 loại vi

khuẩn gây ra.

103

5.2. ĐỀ NGHỊ

1) Tiếp tục thử nghiệm vacxin đa giá vô hoạt với bổ trợ nhũ dầu (IMS 1313)

phòng viêm phổi ở lợn trên diện rộng nhằm đánh giá về hiệu lực và độ dài miễn

dịch của vacxin vô hoạt nhũ dầu lần đầu tiên chế tạo tại Việt Nam.

2) Khi đạt kết quả tốt, đề nghị cho phép sử dụng vacxin vô hoạt nhũ dầu (IMS

1313) phòng bệnh viêm phổi ở lợn đực và lợn nái tại các cơ sở lợn giống trên phạm

vi toàn quốc.

104

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CÓ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Cù Hữu Phú, Đỗ Tất Đạt & Lương Thị Hương Giang (2019). So sánh chất lượng

vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ keo phèn và bổ trợ nhũ dầu chế tạo phòng

bệnh viêm phổi cho lợn. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y. Tập XXVI, số

2, 2019. tr. 40.

2. Đỗ Tất Đạt, Cù Hữu Phú & Nguyễn Bá Hiên (2019). Chế tạo vacxin đa giá vô

hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn Actinobacillus

pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis gây ra.

Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. Tập 15, số 5, 2019. tr. 351.

105

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Bộ Khoa học và Công nghệ (1992a). TCCS 02VT-92/KNI. Quy trình kiểm tra vacxin

Tụ huyết trùng lợn.

2. Bộ Khoa học và Công nghệ (1992b). TCVN 10-160:1992. Quy trình lấy mẫu và sử

dụng mẫu trong kiểm nghiệm vacxin.

3. Bộ Khoa học và Công nghệ (2011). Tiêu chuẩn Quốc gia. TCVN 8684:2011. Vacxin

và chế phẩm sinh học dùng trong thú y – Phép thử độ thuần khiết.

4. Bộ Khoa học và Công nghệ (2017a). Tiêu chuẩn Quốc gia. TCVN 8685-17:2017.

Quy trình kiểm nghiệm - Phần 17: Vacxin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi

ở lợn.

5. Bộ Khoa học và Công nghệ (2017b). Tiêu chuẩn Quốc gia. TCVN 8685-15:2017.

Quy trình kiểm nghiệm - Phần 15: Vacxin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do

Pasteurella multocida serotype D gây ra ở lợn.

6. Bộ Khoa học và Công nghệ (2019). Tiêu chuẩn Quốc gia. TCVN 8685-XX:2019.

Quy trình kiểm nghiệm vacxin vô hoạt phòng bệnh Tụ huyết trùng lợn.

7. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2003) Tuyển tập Tiêu chuẩn Nông Nghiệp

Việt Nam, Tập 5. Tiêu chuẩn chăn nuôi phần 1 - Chăn nuôi Thú y.

8. Bùi Quang Anh, Hoàng Văn Năm, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long & Nguyễn Ngọc

Tiến (2008). Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS). NXB Nông

nghiệp, tr. 7-21.

9. Bùi Thị Hiền, Hồ Lê Quỳnh Châu, Hồ Trung Thông & Nguyễn Xuân Hòa (2015). Sự

lưu hành của liên cầu khuẩn lợn (Streptococcus suis) trên một số địa bàn thuộc tỉnh

Thừa Thiên Huế trong vụ xuân hè năm 2015. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 23

(2), 12-17.

10. Công ty Cổ phần Thuốc thú y Marphavet (2015). Hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc thú

y. Sản phẩm: MAR-APPSVAC (vacxin viêm phổi lợn đa giá).

11. Cù Hữu Phú (2011). Nghiên cứu mối liên quan giữa hội chứng rối loạn hô hấp, sinh

sản ở lợn (PRRS) với vi khuẩn gây bệnh kế phát và xác định biện pháp phòng, trị

bệnh. Báo cáo kết quả đề tài độc lập cấp Nhà nước năm 2011.

106

12. Cù Hữu Phú (2013). Xác đinh serotype và một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis

để chọn chủng chế tạo vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn. Tạp chí Khoa học

Kỹ thuật Thú y, số 7, tr. 24-33.

13. Cù Hữu Phú (2014). Lựa chọn chủng vi khuẩn để chế tạo thử nghiệm vacxin phòng

bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella

multocida và Streptococcus suis gây ra ở lợn. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú

y, số 2, tr. 33-42.

14. Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Nguyễn Thu Hằng, Âu Xuân Tuấn, Nguyễn Bích

Thuỷ, Vũ Ngọc Quý & Phạm Bảo Ngọc (2005). Xác định nguyên nhân gây bệnh

đường hô hấp của lợn nuôi tại một số tỉnh phía Bắc, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật

Thú y, 12 (4), tr. 23-32

15. Lê Văn Dương (2013). Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida trong hội chứng rối

loạn hô hấp và sinh sản ở lợn tại Bắc Giang, biện pháp phòng trị. Luận án tiến

sĩ. Đại học Thái Nguyên.

16. Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, Bạch Quốc

Thắng, Lê Văn Phan, Nguyễn Viết Không & Đặng Hữu Anh (2013). Bệnh truyền

nhiễm của động vật nuôi và biện pháp khống chế. NXB Nông nghiệp Hà Nội.

1. Nguyễn Hữu Nam & Nguyễn Thị Lan (2007). Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp

ở lợn. Hội thảo khoa học về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản và bệnh liên

cầu gây ra ở lợn 10/2007, Trường Đại học Nông nghiệp, Hà Nội.

17. Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Thị Ngân, Nguyễn Văn Quang, Phan Thị Hồng Phúc,

Lê Minh, Phạm Diệu Thùy, Trần Nhật Thắng & Dương Thị Hồng Duyên (2017).

Xác định Serotype, độc lực và tính kháng kháng sinh của 3 loại vi khuẩn gây

viêm phổi ở lợn tại tỉnh Bắc Ninh. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Trường Đại

học Thái Nguyên 164 (4): 109-114.

18. Nguyễn Thị Thu Hằng, Đỗ Ngọc Thúy, Cù Hữu Phú, Trương Văn Dung, Nguyễn Xuân

Huyên & Vũ Ngọc Quý (2009). Kết quả thiết lập phản ứng PCR để giám định nhanh

vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae phân lập được từ lợn nuôi tại một số

tỉnh phía Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, số 3, tr. 45-49.

107

19. Phan Kim Thanh, Huỳnh Văn Thẩm & Lý Thị Liên Khai (2018). Khảo sát bệnh viêm

phổi, màng phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniaetrên heo tại tỉnh

Bến Tre. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ. 54 (4B): 54-63.

20. Quốc hội (2015). Luật Thú y số 79/2015/QH13. Quốc hội nước cộng hòa xã hội chủ

nghĩa Việt Nam.

21. Tổng Cục Thống kê (2020). Thống kê chăn nuôi Việt Nam 01/01/2020. Về số lượng

đầu con và sản phẩm gia súc, gia cầm. Truy cập tại https://channuoivietnam.com/

thong-ke-chan-nuoi/, ngày 1/8/2020.

Tài liệu nước ngoài

22. Appleyard G., Furesz S. & Wilkie B. (2002). Blood lymphocyte subsets in pigs

vaccinated and challenged with Actinobacillus pleuropneumoniae. Veterinary

immunology and immunopathology. 86(3-4): 221-228.

23. Boucher C., Higgins R., Nadeau M. & Vincent C. (2002). Un cas de zoonose

associé à Streptococcus equi ssp. zooepidemicus. The Canadian Veterinary

Journal. 43(2): 123.

24. Brandreth S. & Smith I. (1985). Prevalence of pig herds affected by

pleuropneumonia associated with Haemophilus pleuropneumoniae in eastern

England. The Veterinary record. 117(7): 143-147.

25. Burakova, Y., Madera R., McVey S., Schlup J. R., & Shi J. (2018). Adjuvants for

animal vaccines. Viral immunology, 31(1), 11-22.

26. Carter G. (1955). Studies on Pasteurella multocida. I. A hemagglutination test for

the identification of serological serotypes. American journal of veterinary

research. 16(60): 481-484.

27. Carter G. (1967). Pasteurellosis: Pasteurella multocida and Pasteurella hemolytica.

Adv. Vet. Sci. 11: 321-379.

28. Carter G. (1984). Seroserotypeing of Pasteurella multocida. Methods in

microbiology. 16: 247-258.

29. Clifton-Hadley F. A. (1984). Studies of Streptococcus suis serotype 2 infection in

pigs. Veterinary research communications. 8(3): 217-227.

30. Cook R., Jackson A., Ross A., Philip V. & Nainar S. (1988). Streptococcus suis

serotype 1 infection of sucking pigs. Australian veterinary journal. 65(2): 64-

65.

108

31. Cox JC, & Coulter AR (1997). Adjuvants—a classification andreview of their

modes of action. Vaccine;15:248–256.

32. Cruijsen T., Van Leengoed L., Dekker-Nooren T., Schoevers E. & Verheijden J.

(1992). Phagocytosis and killing of Actinobacillus pleuropneumoniaeby

alveolar macrophages and polymorphonuclear leukocytes isolated from pigs.

Infection and immunity. 60(11): 4867-4871.

33. Cruijsen T., Van Leengoed L., Ham-Hoffies M. & Verheijden J. (1995).

Convalescent pigs are protected completely against infection with a homologous

Actinobacillus pleuropneumoniaestrain but incompletely against a heterologous-

serotype strain. Infection and immunity. 63(6): 2341-2343.

34. Cruz W. T., Nedialkov Y. A., Thacker B. J. & Mulks M. H. (1996). Molecular

characterization of a common 48-kilodalton outer membrane protein of

Actinobacillus pleuropneumoniae. Infection and immunity. 64(1): 83-90.

35. Chiers K., Van Overbeke I., De Laender P., Ducatelle R., Carel S. & Haesebrouck F.

(1998). Effects of endobronchial challenge with Actinobacillus

pleuropneumoniaeserotype 9 of pigs vaccinated with inactivated vaccines

containing the Apx toxins. Veterinary quarterly. 20(2): 65-69.

36. De Moor C. (1963). Septicaemic infections in pigs, caused by haemolytic

streptococci of new Lancefield groups designated R, S and T. Antonie van

Leeuwenhoek. 29(1): 272-280.

37. Del Campo Sepulveda E. M., Altman E., Kobisch M., D'allaire S. & Gottschalk M.

(1996). Detection of antibodies against Streptococcus suis capsular serotype 2

using a purified capsular polysaccharide antigen-based indirect ELISA.

Veterinary microbiology. 52(1-2): 113-125.

38. Desrosiers R., Mittal K. & Malo R. (1984). Porcine pleuropneumonia associated

with Haemophilus pleuropneumoniae serotype 3 in Quebec. The Veterinary

record. 115(24): 628.

39. Dubreuil J. D., Jacques M., Mittal K. R. & Gottschalk M. (2000). Actinobacillus

pleuropneumoniaesurface polysaccharides: their role in diagnosis and

immunogenicity. Animal Health Research Reviews. 1(2): 73-93.

40. Elliott S., Alexander T. & Thomas J. (1966). Streptococcal infection in young pigs.

II. Epidemiology and experimental production of the disease. Epidemiology và

Infection. 64(2): 213-220.

109

41. Erickson E., Doster A. R. & Pokorny T. (1984). Isolation of Streptococcus suis

from swine in Nebraska. Journal of the American Veterinary Medical

Association. 185(6): 666-668.

42. Fenwick B. & Henry S. (1994). Porcine pleuropneumonia. Journal of the American

Veterinary Medical Association (USA).

43. Ferreira SA, Gama FM & Vilanova M. Polymeric na-nogels as vaccine delivery

systems. Nanomedicine 2013;9:159–173.

44. Field H., Buntain D. & Done J. (1954). Studies on pig mortality I. Streptococcal

meningitis and arthritis. Veterinary Record66. 653.

45. Frey J., Bosse J., Chang Y.-F., Cullen J., Fenwick B., Gerlach G., Gygi D.,

Haesebrouck F., Inzana T. & Jansen R. (1993). Actinobacillus

pleuropneumoniae RTX-toxins: uniform designation of haemolysins,

cytolysins, pleurotoxin and their genes. Microbiology. 139(8): 1723-1728.

46. Furesz S. E., Mallard B., Bosse J., Rosendal S., Wilkie B. & Macinnes J. (1997).

Antibody-and cell-mediated immune responses of Actinobacillus

pleuropneumoniae-infected and bacterin-vaccinated pigs. Infection and

immunity. 65(2): 358-365.

47. Glenny AT, Buttle GAH & Stevens MF. (1931). Rate of dis-appearance of

diphtheria toxoid injected into rabbits andguinea—pigs: toxoid precipitated

with alum. J PatholBacteriol.34:267–275.

48. Gogolewski R., Cook R. & O'connell C. (1990). Streptococcus suis serotypes

associated with disease in weaned pigs. Australian veterinary journal. 67(6):

202-204.

49. Gottschalk M., Higgins R., Jacques M., Mittal K. & Henrichsen J. (1989).

Description of 14 new capsular serotypes of Streptococcus suis. Journal of

clinical microbiology. 27(12): 2633-2636.

50. Habrun B., Bilic V., Cvetnic Z., Humski A. & Benic M. (2002). Poreine

pleuropneumonia: the first evaluation of field efficacy of a subunit vaccine in

Croatia. VETERINARNI MEDICINA-PRAHA-. 47(8): 213-217.

51. Haesebrouck F., Van De Kerkhof A., Dom P., Chiers K. & Ducatelle R. (1996).

Cross-protection between Actinobacillus pleuropneumoniaebioserotypes-

serotypes in pigs. Veterinary microbiology. 52(3-4): 277-284.

110

52. Halbur P., Thanawongnuwech R., Brown G., Kinyon J., Roth J., Thacker E. &

Thacker B. (2000). Efficacy of antimicrobial treatments and vaccination

regimens for control of porcine reproductive and respiratory syndrome virus

and Streptococcus suis coinfection of nursery pigs. Journal of clinical

microbiology. 38(3): 1156-1160.

53. Heath P., Hunt B., Duff J. & Wilkinson J. (1996). Streptococcus suis serotype 14

as a cause of pig disease in the UK. The Veterinary record. 139(18): 450-451.

54. Herczeg J., Brunier E., Szalai T., Tenk M & Thevenon J. (2014). 3 week onset of

immunity of Coglapix® in swine originated from a farm naturally

contaminated with Actinobacillus pleuropneumoniae.

55. Higgins R., Lariviere S., Mittal K., Martineau G., Rousseau P. & Cameron J. (1985).

Evaluation of a killed vaccine against porcine pleuropneumonia due to

Haemophilus pleuropneumoniae. The Canadian Veterinary Journal. 26(2): 86.

56. Hogg A., Amass S., Hoffman L., Wu C. & Clark L. (1996). A survey of

Streptococcus suis isolations by serotype and tissue of origin. Proc. Am.

Assoc. Swine Pract. 79-81.

57. Holt M., Enright M. & Alexander T. (1990). Immunisation of pigs with killed

cultures of Streptococcus suis serotype 2. Research in veterinary science.

48(1): 23-27.

58. Inzana T. J., Todd J., Ma J. & Veit H. (1991). Characterization of a non-hemolytic

mutant of Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype 5: role of the 110

kilodalton hemolysin in virulence and immunoprotection. Microbial

pathogenesis. 10(4): 281-296.

59. Inzana T. J., Todd J. & Veit H. P. (1993). Safety, stability, and efficacy of

noncapsulated mutants of Actinobacillus pleuropneumoniaefor use in live

vaccines. Infection and immunity. 61(5): 1682-1686.

60. Iwamatsu S., Mukouhara Y. & Sawada T. (1991). Antibiotic susceptibility of

Pasteurella multocida isolated from swine from 1983 to 1986. Journal of the

Japan Veterinary Medical Association (Japan).

61. Jacques M. & Foiry B. (1987). Electron microscopic visualization of capsular

material of Pasteurella multocida serotypes A and D labeled with polycationic

ferritin. Journal of bacteriology. 169(8): 3470-3472.

111

62. Jansen R., Briaire J., Van Geel A., Kamp E. M., Gielkens A. & Smits M. A. (1994).

Genetic map of the Actinobacillus pleuropneumoniaeRTX-toxin (Apx) operons:

characterization of the ApxIII operons. Infection and immunity. 62(10): 4411-4418.

63. John V. S., Wilcock B. & Kierstead M. (1982). Streptococcus suis serotype 2

infection in swine in Ontario: A review of clinical and pathological

presentations. The Canadian Veterinary Journal. 23(3): 95.

64. Jolie R. A., Mulks M. H. & Thacker B. J. (1995). Cross-protection experiments in

pigs vaccinated with Actinobacillus pleuropneumoniaesubserotypes 1A and

1B. Veterinary microbiology. 45(4): 383-391.

65. Kataoka Y., Sugimoto C., Nakazawa M., Morozumi T. & Kashiwazaki M. (1993).

The epidemiological studies of Streptococcus suis infections in Japan from

1987 to 1991. Journal of Veterinary Medical Science. 55(4): 623-626.

66. Kielstein P. (1986). On the Occurrence of Toxin‐Producing Pasteurella‐multocida‐

Strains in Atrophic Rhinitis and in Pneumonias of Swine and Cattle. Journal of

Veterinary Medicine, Series B. 33(1‐10): 418-424.

67. Kilian M., Nicolet J. & Biberstein E. (1978). Biochemical and serological

characterization of Haemophilus pleuropneumoniae (Matthews and Pattison

1961) Shope 1964 and proposal of a neoserotype strain. International Journal

of Systematic and Evolutionary Microbiology. 28(1): 20-26.

68. Kobe K. (1933). Die Aetiologie der Ferkelgrippe (enzootische Pneumonie des

Ferkels). Z. Bakt. Parositenk. Abt. 1 Orig. 129: 161-76.

69. Koehne G., Maddux R. & Cornell W. (1979). Lancefield group R streptococci

associated with pneumonia in swine. American journal of veterinary research.

40(11): 1640-1641.

70. Krejci R., Newberry J. & Ceva Sante Animale F. (2011). Pleuropneumonia in pigs–

its importance and prevention. Mortality. 2(6.7): 0.0007.

71. Lai RPJ, Seaman MS & Tonks P. (2012). Mixed adjuvantformulations reveal a new

combination that elicit antibodyresponse comparable to Freund’s adjuvants (a

new potentadjuvant combination). PLoS One 2012;7:e35083.

adjuvants with vaccines to protect againstinfectious diseases. Clin Infect

Dis 1995;21:1439–1449.

72. Lin R, Tarr P. & Jones TC. (1995). Present status of the use ofcytokines as

112

73. Lun Z.-R., Wang Q.-P., Chen X.-G., Li A.-X. & Zhu X.-Q. (2007). Streptococcus

suis: an emerging zoonotic pathogen. The Lancet infectious diseases. 7(3):

201-209.

74. Maclennan M., Foster G., Dick K., Smith W. & Nielsen B. (1996). Streptococcus

suis serotypes 7, 8 and 14 from diseased pigs in Scotland. British Medical

Journal Publishing Group.

75. Maré C. & Switzer W. (1965). New species: Mycoplasma hyopneumoniae. A

causative agent of virus pig pneumonia. Veterinary Medicine60. 841.

76. Meeusen E. N., Walker J., Peters A., Pastoret P.-P. & Jungersen G. (2007). Current

status of veterinary vaccines. Clinical microbiology reviews. 20(3): 489-510.

77. Mikael L. G., Pawelek P. D., Labrie J., Sirois M., Coulton J. W. & Jacques M.

(2002). Molecular cloning and characterization of the ferric hydroxamate

uptake (fhu) operon in Actinobacillus pleuropneumoniae. The GenBank

accession number for the sequence of the fhuCDBA operon of Actinobacillus

pleuropneumoniaeserotype 1 reference strain 4074 described in this study is

AF351135. Microbiology. 148(9): 2869-2882.

78. Nielsen R. (1984). Haemophilus pleuropneumoniae serotypes--cross protection

experiments. Nordisk veterinaermedicin. 36(7-8): 221-234.

79. Nielsen R. (1985). Haemophilus pleuropneumoniae (Actinobacillus pleuropneumoniae).

Serotypes 8, 3 and 6. Serological response and cross immunity in pigs. Nordisk

veterinaermedicin. 37(4): 217-227.

80. Park C., Ha Y., Kim S., Chae C. & Ryu D.-Y. (2009). Construction and

characterization of an Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype 2 mutant

lacking the Apx toxin secretion protein genes apxIIIB and apxIIID. Journal of

Veterinary Medical Science. 71(10): 1317-1323.

81. Pattison I., Howell D. & Elliot J. (1957). A haemophilus-like organism isolated

from pig lung and the associated pneumonic lesions. Journal of Comparative

Pathology and Therapeutics. 67: 320-IN37.

82. Perry M. B. (1990). Structural analysis of the lipopolysaccharide of Actinobacillus

(Haemophilus) pleuropneumoniae serotype 10. Biochemistry and Cell

Biology. 68(4): 808-810.

83. Pijoan C. & Fuentes M. (1987). Severe pleuritis associated with certain strains of

Pasteurella multocida in swine. Journal of the American Veterinary Medical

Association. 191(7): 823-826.

113

84. Pijoan C., Lastra A., Ramirez C. & Leman A. (1984). Isolation of toxigenic strains

of Pasteurella multocida from lungs of pneumonic swine. Journal of the

American Veterinary Medical Association. 185(5): 522-523.

85. Pijoan C. & Trigo F. (1990). Bacterial adhesion to mucosal surfaces with special

reference to Pasteurella multocida isolates from atrophic rhinitis. Canadian

journal of veterinary research - Revue canadienne de recherche veterinaire. 54:

S16-21.

86. Pohl S., Bertschinger H., Frederiksen W. & Mannheim W. (1983). Transfer of

Haemophilus pleuropneumoniae and the Pasteurella haemolytica - like

organism causing porcine necrotic pleuropneumonia to the genus

Actinobacillus (Actinobacillus pleuropneumoniaecomb. nov.) on the basis of

phenoserotypeic and deoxyribonucleic acid relatedness. International Journal

of Systematic and Evolutionary Microbiology. 33(3): 510-514.

87. Prideaux C. T., Pierce L., Krywult J. & Hodgson A. L. (1998). Protection of mice

against challenge with homologous and heterologous serovars of

Actinobacillus pleuropneumoniaeafter live vaccination. Current microbiology.

37(5): 324-332.

88. Quinn, P. J., Markey, B. K., Leonard, F. C., FitzPatrick, E. S., và Fanning, S.

(2015). Concise review of veterinary microbiology. John Wiley và Sons.

89. Ramjeet M., Cox A. D., Hancock M. A., Mourez M., Labrie J., Gottschalk M. &

Jacques M. (2008a). Mutation in the LPS outer core biosynthesis gene, galU,

affects LPS interaction with the RTX toxins ApxI and ApxII and cytolytic

activity of Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype 1. Molecular

microbiology. 70(1): 221-235.

90. Ramjeet M., Deslandes V., Gouré J. & Jacques M. (2008b). Actinobacillus

pleuropneumoniaevaccines: from bacterins to new insights into vaccination

strategies. Animal Health Research Reviews. 9(1): 25-45.

91. Reams R. Y., Harrington D. D., Glickman L. T., Thacker H. L. & Bowersock T. L.

(1996). Multiple serotypes and strains of Streptococcus suis in naturally infected

swine herds. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 8(1): 119-121.

92. Rohrbach B., Hall R. & Hitchcock J. (1993). Effect of subclinical infection with

Actinobacillus pleuropneumoniaein commingled feeder swine. Journal of the

American Veterinary Medical Association. 202(7): 1095-1098.

114

93. Sanford S. & Tilker M. (1982). Streptococcus suis serotype II-associated diseases

in swine: observations of a one-year study. Journal of the American Veterinary

Medical Association. 181(7): 673-676.

94. Sanford S. E. (1987). Gross and histopathological findings in unusual lesions

caused by Streptococcus suis in pigs. I. Cardiac lesions. Canadian Journal of

Veterinary Research. 51(4): 481.

95. Schaller A., Kuhn R., Kuhnert P., Nicolet J., Anderson T. J., Maclnnes J. I., Segers

R. P. & Frey J. (1999). Characterization of apxlVA, a new RTX determinant of

Actinobacillus pleuropneumoniae. Microbiology. 145(8): 2105-2116.

96. Shakarji L., Mikael L. G., Srikumar R., Kobisch M., Coulton J. W. & Jacques M.

(2006). Fhua and HgbA, outer membrane proteins of Actinobacillus

pleuropneumoniae: their role as virulence determinants. Canadian journal of

microbiology. 52(4): 391-396.

97. Shope R. E. (1964). Porcine contagious pleuropneumonia: I. Experimental

Transmission, Etiology, and Pathology. The Journal of experimental medicine.

119(3): 357-368.

98. Srikumar R., Mikael L. G., Pawelek P. D., Khamessan A., Gibbs B. F., Jacques M.

& Coulton J. W. (2004). Molecular cloning of haemoglobin-binding protein

HgbA in the outer membrane of Actinobacillus pleuropneumoniae.

Microbiology. 150(6): 1723-1734.

99. Sriskandan S. & Slater J. D. (2006). Invasive disease and toxic shock due to zoonotic

Streptococcus suis: an emerging infection in the East? PLoS Medicine. 3(5).

100. Straw B., Maclachlan N. J., Corbett W., Carter P. & Schey H. (1985). Comparison

of tissue reactions produced by Haemophilus pleuropneumoniae vaccines

made with six different adjuvants in swine. Canadian journal of comparative

medicine. 49(2): 149.

101. Torremorell M., Pijoan C., Janni K., Walker R. & Joo H. S. (1997). Airborne

transmission of Actinobacillus pleuropneumoniaeand porcine reproductive and

respiratory syndrome virus in nursery pigs. American journal of veterinary

research. 58(8): 828-832.

102. Tumamao J., Bowles R., Van Den Bosch H., Klaasen H., Fenwick B., Storie G. &

Blackall P. (2004). Comparison of the efficacy of a subunit and a live

streptomycin‐dependent porcine pleuropneumonia vaccine. Australian

veterinary journal. 82(6): 370-374.

115

103. Thacker B. & Mulks M. (1988). Evaluation of commercial Haemophilus

pleuropneumoniae vaccines. Proc Int Pig Vet Soc. 87.

104. Van Den Bosch H. & Frey J. (2003). Interference of outer membrane protein PalA with

protective immunity against Actinobacillus pleuropneumoniaeinfections in

vaccinated pigs. Vaccine. 21(25-26): 3601-3607.

105. Van Overbeke I., Chiers K., Ducatelle R. & Haesebrouck F. (2001). Effect of

endobronchial challenge with Actinobacillus pleuropneumoniaeserotype 9 of

pigs vaccinated with a vaccine containing Apx toxins and transferrin‐binding

proteins. Journal of Veterinary Medicine, Series B. 48(1): 15-20.

106. Vecht U., Van Leengoed L. & Verheijen E. (1985). Streptococcus suis infections

in pigs in the Netherlands (Part I). Veterinary quarterly. 7(4): 315-321.

107. Windsor R. & Elliott S. (1975). Streptococcal infection in young pigs: IV. An

outbreak of streptococcal meningitis in weaned pigs. Epidemiology và

Infection. 75(1): 69-78.

108. Wisselink H., Vecht U., Smith H. & Stockhofe-Zurwieden N. (2001). Protection of

pigs against challenge with virulent Streptococcus suis serotype 2 strains by a

muramidase-released protein and extracellular factor vaccine. Veterinary

Record. 148(15): 473-477.

109. Witte A., Wanner G., Sulzner M. & Lubitz W. (1992). Dynamics of PhiX174 protein E-mediated lysis of Escherichia coli. Archives of microbiology. 157(4): 381-388.

110. Zhang Q., Young T. F. & Ross R. (1995). Identification and characterization of a

Mycoplasma hyopneumoniae adhesin. Infection and immunity. 63(3): 1013-

1019.

116

PHỤ LỤC

A. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI KHUẨN A. PLEUROPNEUMONIAE

CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH

I. Giữ giống bằng thạch lỏng

1. Môi trường giữ giống

Tryptone soy broth (TSB) bổ sung 20% glycerin

2. Phương pháp giữ giống

- Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae được nuôi cấy thuần trên môi trường

thạch PPLO ở 370C trong điều kiện có 5% CO2 trong 24 giờ.

- Lấy toàn bộ khuẩn lạc Actinobacillus pleuropneumoniaetrên thạch PPLO vào môi

trường giữ giống (khuẩn lạc trên 1 đĩa thạch đưa vào 1 ml môi trường)

- Chia ra các eppendorf

- Kiểm tra lại các ống giữ giống bằng cách nuôi cấy trên môi trường thạch PPLO

và thạch máu có cấy kèm Staphylococcus aureus, nếu đạt yêu cầu bảo quản ở - 800C.

II. Giữ giống bằng phương pháp đông khô

1. Môi trường giữ giống

Skim milk, hấp vô trùng, chia 1- 2ml môi trường vào lọ nhỏ có nắp vặn

2. Phương pháp giữ giống

- Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae được nuôi cấy thuần trên môi trường

thạch PPLO ở 370C trong điều kiện có 5% CO2 trong 24 giờ

- Lấy toàn bộ khuẩn lạc Actinobacillus pleuropneumoniae trên thạch PPLO vào môi

trường giữ giống (khuẩn lạc trên 3-4 đĩa thạch đưa vào 1 ml môi trường).

- Hút hỗn dịch trên vào các ống đông khô đã hấp vô trùng, sao cho lượng hỗn dịch

thấm ướt bông ở đáy ống. Lượng hỗn dịch còn lại dùng để kiểm tra lại các ống giữ giống

bằng cách cấy trên thạch PPLO và thạch máu có cấy kèm Staphylococcus aureus.

- Sử dụng máy đông khô hút hết không khí, tạo môi trường chân không trong các

ống đông khô.

- Hàn kín các ống đông khô, kiểm tra chân không.

- Bao gói cẩn thận, tránh làm nứt, vỡ các ống giống, bảo quản ở -200C hoặc -800C.

117

B. PHƯƠNG PHÁP TĂNG CƯỜNG GIỐNG VI KHUẨN

A. PLEUROPNEUMONIAE CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH

I. Tăng cường giống bằng phương pháp tiêm chuột

1. Chuẩn bị canh trùng

- Lấy vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae từ thạch lỏng (hoặc ống giống đã

đông khô) nuôi cấy trên môi trường thạch PPLO và thạch máu có cấy kèm Staphylococcus

aureus, nuôi cấy ở 370C trong điều kiện có 5% CO2 trong 24 giờ.

- Lấy toàn bộ khuẩn lạc Actinobacillus pleuropneumoniae trên thạch PPLO vào môi

trường TYE (khuẩn lạc trên 5 đĩa thạch đưa vào 100 ml TYE), nuôi cấy lắc ở 370C, trong

6 giờ.

- Chuyển canh trùng đã nuôi cấy lắc: từ 100 ml canh trùng chuyển vào bình có 200

ml TYE, nuôi cấy lắc ở 370C, trong 10 giờ.

- Chuyển canh trùng đã nuôi cấy lắc: từ 300 ml canh trùng chuyển vào bình có 500

ml TYE, nuôi cấy lắc ở 370C, trong 20 giờ.

- Đếm số vi khuẩn trước khi tiêm cho chuột (số lượng vi khuẩn trung bình sau khi

nuôi cấy lắc đạt khoảng 4 – 6 x 108 vi khuẩn/ml).

2. Tiêm chuột

- Sử dụng chuột nhắt trắng khỏe mạnh, mỗi giống vi khuẩn tiêm cho 5 chuột.

- Liều tiêm canh trùng: 0,5 ml.

- Đường tiêm: phúc xoang.

- Theo dõi chuột trong 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ sau khi tiêm.

- Phân lập lại vi khuẩn từ máu tim.

- Sau khi đã phân lập, nuôi cấy thuần vi khuẩn, tiến hành giữ giống theo phương

pháp như trên.

II. Tăng cường giống bằng phương pháp tiêm trên bản động vật (lợn)

1. Chuẩn bị canh trùng

Cách làm tương tự như tiêm chuột.

2. Tiêm lợn

- Sử dụng lợn 30- 45 ngày tuổi, khỏe mạnh, chưa tiêm vacxin phòng viêm phổi do

Actinobacillus gây ra.

- Liều tiêm: 6 ml

118

- Đường tiêm: vịnh tĩnh mạch cổ.

- Theo dõi lợn trong 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ sau khi tiêm.

- Phân lập lại vi khuẩn từ máu tim, gan, phổi, dịch họng lợn.

- Sau khi phân lập, nuôi cấy thuần vi khuẩn, tiến hành giữ giống theo phương pháp

như trên.

C. PHƯƠNG PHÁP TĂNG CƯỜNG GIỐNG VI KHUẨN

P. MULTOCIDA CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH

1. Tăng cường giống vi khuẩn Pasteurella multocida trên chuột bạch:

- Chuột bạch có trọng lượng 18-20 g/con, khỏe mạnh.

- Giống vi khuẩn: Chủng vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A và D thuần nhất

- Chủng vi khuẩn được giữ từ thạch lỏng được ria cấy lên 1 đĩa thạch BHI 5% máu

cừu, nuôi cấy ở 370C/ 24h, chọn khuẩn lạc điển hình đứng riêng lẻ.

- Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường nước BHI, bồi dưỡng 18 -20 giờ

ở nhiệt độ 370 C.

- Tiêm phúc xoang, liều tiêm canh trùng 0,2 ml/ 1 chuột mỗi chủng tiêm 2 chuột.

- Theo dõi thời gian chết chuột và số chuột chết của từng chủng vi khuẩn kiểm tra.

- Chuột chết được mổ khám, lấy máu tim nuôi cấy trên môi trường nước thịt BHI

và thạch BHI 5% máu cừu để phân lập lại vi khuẩn.

- Lựa chọn chủng vi khuẩn gây chết 100% chuột thí nghiệm trong thời gian ngắn

nhất để giữ giống vi khuẩn.

2. Tăng cường giống vi khuẩn Pasteurella multocida trên lợn thí nghiệm:

2.1. Vi khuẩn gây bệnh:

Chủng vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A và D có đầy đủ các đặc tính sinh

vật hóa học điển hình của vi khuẩn P. multocida, tính kháng nguyên ổn định, có độc lực

cao gây chết 100% động vật thí nghiệm, số lượng kháng nguyên đủ để tiến hành gây bệnh

bệnh thực nghiệm trên lợn.

2.2. Lợn thí nghiệm:

Lợn thí nghiệm có trọng lượng 12- 15kg/ con, chưa được tiêm loại vacxin nào có

chứa loại vi khuẩn Pasteurella multocida dùng để gây bệnh.

2.3. Chuẩn bị canh trùng gây bệnh:

- Chủng vi khuẩn Pasteurella multocida được giữ từ thạch lỏng được ria cấy lên 1 đĩa

thạch BHI 5% máu cừu, nuôi cấy ở 370C/ 24h, chọn khuẩn lạc điển hình đứng riêng lẻ.

119

- Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường nước BHI, để tủ ấm 370C /18 -20h.

- Xác định liều gây bệnh của các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida dùng để

gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp đếm số trên thạch đĩa.

2.4. Tiến hành thí nghiệm:

Mỗi chủng vi khuẩn cần gây bệnh được tiêm cho 02 lợn thí nghiệm với liều tiêm

6ml/ 1 lợn đường tiêm tĩnh mạch cổ. Và 05 lợn đối chứng không tiêm.

Theo dõi trong thời gian 7- 10 ngày.

- Các lợn thí nghiệm chết được mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy lấy máu tim nuôi

cấy trên môi trường nước thịt BHI và thạch BHI 5% máu cừu để phân lập lại vi khuẩn.

Lựa chọn chủng vi khuẩn gây chết 100% lợn thí nghiệm trong thời gian ngắn nhất để giữ

giống vi khuẩn.

D. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA

CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH

1. Chuẩn bị:

- Giống vi khuẩn Pasteurella multocida thuần nhất

- Thạch BHI 5% máu cừu

- Nước thịt BHI (Brain heart infusion)

- Effendorf vô trùng

- Pipet tip vô trùng

- Pipetman

- Glycerol vô trùng

2. Tiến hành

- Cấy giống vi khuẩn Pasteurella multocida cần giữ lên môi trường thạch BHI 5%

máu cừu (chú ý cấy tách khuẩn lạc riêng rẽ), nuôi trong tủ ấm 370C/18- 20h

- Chọn 1 khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn (đứng tách riêng) cấy vào môi trường nước

thịt BHI. Để trong tủ ấm 370C từ 8 – 10h

- Sau 8 – 10h bổ sung Glycerol (theo tỷ lệ BHI:85% và Glycerol: 15%) vào canh

trùng đã nuôi cấy.

- Lắc đều canh trùng với Glycerol

- Dùng pipetman hút canh trùng chia đều vào các Effendorf (1-1,5ml/tube)

- Dán nhãn

- Giữ ở nhiệt độ âm sâu – 20 đến – 800C

120

3. Kiểm tra độ thuần khiết và tính chất mọc của vi khuẩn giữ giống

Sau khi chia đều canh trùng vào Effendorf. Dùng que cấy chọc vào phần canh trùng

còn thừa trong lọ BHI, ria lại trên thạch máu, cất tủ ấm 370C/24h. Sau 24 h, kiểm tra trên

đĩa thạch vi khuẩn mọc thuần nhất thì quá trình giữ giống bằng thạch lỏng đảm bảo đạt yêu

cầu.

4. Quy trình đông khô giống vi khuẩn.

I. Chuẩn bị giống vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A và D thuần nhất

II. Chuẩn bị dụng cụ và môi trường để đông khô

1. Môi trường:

- Thạch BHI 5% máu bê hoặc cừu

- Skim milk (2gram/100ml nước cất)

2. Dụng cụ:

- Ống đông khô (có nút bông) vô trùng

- Pipet Pasteur

- Serotype có nút vặn

- Tăm bông vô trùng

- Đèn khò

- Máy hút chân không

- Máy kiểm tra chân không

3. Cách tiến hành:

1. Cấy các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida cần đông khô lên môi trường

thạch BHI 5% máu, với điều kiện các khuẩn lạc phải thuần nhất. (370C/ 18 giờ)

2. Pha Skim milk trong nước cất rồi chia nhỏ vào các serotype có nút vặn

(1ml/serotype), hấp vô trùng 1210C/15 phút.

3. Dùng tăm bông vô trùng thu hoạch hết khuẩn lạc có trong đĩa thạch máu, sau đó

gạt tăm bông vào serotype Skim milk (mỗi 1 chủng vi khuẩn sử dụng 1 serotype Skim

milk).

4. Dùng pipet Pasteur hút Skim milk vào từng ống đông khô, tùy mục đích sử dụng

mà dùng 1 hay nhiều serotype đông khô. Chú ý dùng pipet Pasteur hút lên hút xuống

Skim milk cho đến khi phần bông ở đáy ống thấm đều Skim milk.

5. Dùng kéo cắt phần bông thừa nút trên ống đông khô. Đồng thời dùng 1 que nhọn

đẩy nút bông xuống phía dưới, gần chạm vào phần bông ở đáy ống đông khô.

121

6. Bật đèn khò. Cho ngọn lửa đèn khò vào vị trí chính giữa của ống đông khô, xoay

tròn, cho đến nhiệt độ nóng chảy thích hợp, dùng hai tay kéo đều 2 bên của ống đông khô

7. Giữ ống đông khô trên ngăn đá của tủ lạnh trong 12 giờ.

8. Cắm các ống đông khô vào máy hút chân không, bật máy hút trong vòng 12 giờ.

9. Sau 12 giờ, thu hoạch ống đông khô.

4. Kiểm tra ống đông khô

Dùng máy kiểm tra chân không, nếu thấy ống đông khô có màu sáng xanh thì chứng

tỏ không có không khí trong ống. Ngược lại, ống đông khô vẫn có không khí bên trong,

ống đông khô không đảm bảo chất lượng.

5. Bảo quản:

Ống đông khô được bảo quản ở nhiệt độ thường, tránh để lẫn với các vật nặng hay

sắc nhọn.

E. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS

CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH

1. Quy trình giữ giống vi khuẩn bằng thạch lỏng

1.1. Chuẩn bị

- Giống vi khuẩn thuần nhất

- Thạch máu cừu 5%

- Nước thịt BHI (Brain heart infusion)

- Effendorf vô trùng

- Pipet tip vô trùng

- Pipetman

- Glycerol vô trùng

1.2. Tiến hành

- Cấy giống vi khuẩn cần giữ lên môi trường thạch máu cừu 5% (chú ý cấy tách khuẩn

lạc riêng rẽ), nuôi trong tủ ấm 370C/24h.

- Chọn 1 khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn (đứng tách riêng) cấy vào môi trường nước

thịt BHI.

- Để trong tủ ấm 370C từ 8 – 10h.

122

- Sau 8 – 10h bổ sung Glycerol (theo tỷ lệ BHI:85% và Glycerol: 15%) vào canh

trùng đã nuôi cấy.

- Lắc đều canh trùng với Glycerol.

- Dùng pipetman hút canh trùng chia đều vào các Effendorf (1-1,5ml/tube).

- Dán nhãn.

- Giữ ở nhiệt độ âm sâu

1.3. Kiểm tra độ thuần khiết và tính chất mọc của vi khuẩn giữ giống

Sau khi chia đều canh trùng vào Effendorf. Dùng que cấy chọc vào phần canh trùng

còn thừa trong lọ BHI, ria lại trên thạch máu, cất tủ ấm 370C/24h. Sau 24 h, kiểm tra trên

đĩa thạch vi khuẩn mọc thuần nhất thì quá trình giữ giống bằng thạch lỏng đảm bảo đạt

yêu cầu.

2. Quy trình đông khô giống vi khuẩn

III. Chuẩn bị giống vi khuẩn thuần nhất

IV. Chuẩn bị dụng cụ và môi trường để đông khô

3. Môi trường:

- Thạch máu bê hoặc cừu

- Skim milk (2 gram/100ml nước cất)

4. Dụng cụ:

- Ống đông khô (có nút bông) vô trùng

- Pipet Pasteur

- Serotype có nút vặn

- Tăm bông vô trùng

- Đèn khò

- Máy hút chân không

- Máy kiểm tra chân không

V. Cách tiến hành:

10. Cấy các chủng vi khuẩn cần đông khô lên môi trường thạch máu, với điều kiện các

khuẩn lạc phải thuần nhất.

11. Pha Skim milk trong nước cất rồi chia nhỏ vào các serotype có nút vặn

(1ml/serotype), hấp vô trùng 1210C/15 phút.

123

12. Dùng tăm bông vô trùng thu hoạch hết khuẩn lạc có trong đĩa thạch máu, sau đó gạt

tăm bông vào serotype Skim milk (mỗi 1 chủng vi khuẩn sử dụng 1 serotype Skim

milk).

13. Dùng pipet Pasteur hút Skim milk vào từng ống đông khô, tùy mục đích sử dụng mà

dùng 1 hay nhiều serotype đông khô. Chú ý dùng pipet Pasteur hút lên hút xuống

Skim milk cho đến khi phần bông ở đáy ống thấm đều Skim milk.

14. Dùng kéo cắt phần bông thừa nút trên ống đông khô. Đồng thời dùng 1 que nhọn đẩy

nút bông xuống phía dưới, gần chạm vào phần bông ở đáy ống đông khô.

15. Bật đèn khò. Cho ngọn lửa đèn khò vào vị trí chính giữa của ống đông khô, xoay

tròn, cho đến nhiệt độ nóng chảy thích hợp, dùng hai tay kéo đều 2 bên của ống đông

khô.

16. Giữ ống đông khô trên ngăn đá của tủ lạnh trong 12 giờ.

17. Cắm các ống đông khô vào máy hút chân không, bật máy hút trong vòng 12 giờ.

18. Sau 12 giờ, thu hoạch ống đông khô.

VI. Kiểm tra ống đông khô.

Dùng máy kiểm tra chân không, nếu thấy ống đông khô có màu sáng xanh thì chứng tỏ

không có không khí trong ống. Ngược lại, ống đông khô vẫn có không khí bên trong,

ống đông khô không đảm bảo chất lượng.

VII. Bảo quản:

Ống đông khô được bảo quản ở nhiệt độ thường, tránh để lẫn với các vật nặng hay

sắc nhọn.

124

G. PHƯƠNG PHÁP TĂNG CƯỜNG GIỐNG VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS

CHO KHÁNG NGUYÊN TÍNH CAO VÀ ỔN ĐỊNH

1. Tăng cường qua động vật thí nghiệm:

- Chuột bạch: trọng lượng 20gram/con

- Nước thịt BHI (Brain Heart Infusion) bổ sung 2% huyết thanh ngựa

- Vi khuẩn S. suis được cấy thuần nhất trên 1 đĩa thạch máu bê

- Vét khuẩn lạc vi khuẩn S. suis vào 10ml BHI đã bổ sung 2% huyết thanh ngựa

- Để tủ ấm 370C/24 giờ

- Tiêm phúc xoang chuột với liều tiêm 0,5ml/con, mỗi chủng vi khuẩn tiêm 02

chuột.

- Theo dõi chuột

- Nếu chuột chết, mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy bệnh phẩm là máu tim, ria cấy

lại trên thạch máu và nước thịt BHI. Để tủ ấm 370C/24 giờ. Kiểm tra hình thái khuẩn lạc,

làm phản ứng sinh hóa và các test để khẳng định lại là vi khuẩn S. suis

- Giữ giống vi khuẩn S. suis từ máu tim chuột

2. Tăng cường giống vi khuẩn S. suis trên bản động vật

- Lợn có trọng lượng 10-12kg/con

- Cấy giống S. suis đang giữ từ thạch lỏng ra thạch máu đĩa, để tủ ấm 370C/24 giờ.

Sau 24h, cấy chuyển sang thạch máu đĩa lần 2, mỗi chủng vi khuẩn cấy lên 3 đĩa thạch

máu.

- Chuẩn bị 200ml nước BHI đã bổ sung 2% huyết thanh ngựa

- Vét toàn bộ khuẩn lạc của vi khuẩn S. suis đã cấy trên 3 đĩa thạch máu vào 200ml

nước BHI

- Để tủ ấm 370C/24 giờ

- Sau 24h, đếm số lượng vi khuẩn S. suis có trong 1ml canh trùng nuôi cấy.

- Tiêm 30ml canh trùng/01 lợn với đường tiêm tĩnh mạch cổ

- Theo dõi triệu chứng bệnh của lợn sau khi tiêm canh trùng

- Lợn chết, mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy bệnh phẩm gồm: não, dịch khớp, máu

tim và phổi

- Ria cấy lại trên thạch máu và nước THB

- Phân lập lại vi khuẩn S. suis từ bệnh phẩm của lợn chết

- Giữ giống S. suis.

125