Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Lê Quốc Phong

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN

Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU

SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP Hồ Chí Minh – Năm 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Lê Quốc Phong

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN

Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU

SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TSKH. Ngô Kế Sương

TP Hồ Chí Minh – Năm 2021

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành chương trình Nghiên cứu sinh và Luận án Tiến sĩ, tôi đã nhận

được sự quan tâm, chia sẻ, hỗ trợ của rất nhiều thầy cô, anh chị, các bạn bè cùng khoá,

đồng nghiệp tại các đơn vị.

Xin trân trọng cám ơn PGS.TSKH Ngô Kế Sương, người thầy đáng kính đã

luôn động viên, hướng dẫn, góp ý kiến để tôi hoàn thiện Luận án. Trân trọng cám ơn

TS. Đinh Minh Hiệp đã hỗ trợ, giúp đỡ, chia sẻ trong suốt quá trình thực hiện Luận

án.

Xin trân trọng cám ơn các thầy cô giáo của Viện Sinh học Nhiệt đới, Học Viện

Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường

ĐH Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức,

góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Trân trọng cám ơn các bạn trong nhóm nghiên cứu (TS. Trần Minh Trang, ThS.

Nguyễn Tài Hoàng) đã dành nhiều tâm huyết, thời gian, hỗ trợ tôi hoàn thành Luận

án.

Trân trọng cám ơn Trung ương Đoàn TNCS Hồ Chí Minh, cơ quan tôi công tác

trong suốt thời gian thực hiện Luận án, đã chia sẻ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi

hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu.

Và cuối cùng, tôi xin dành tình cảm, sự biết ơn đối với gia đình, những người

luôn mong mỏi, âm thầm quan tâm, động viên, khích lệ để tôi hoàn thành Luận án.

Trân trọng cám ơn.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả trình bày trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác.

Người thực hiện

Lê Quốc Phong

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................... i

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... v

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ vii

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3

1.1. Nấm Cordyceps sinensis .................................................................................. 3

1.1.1. Đặc điểm, phân bố ...................................................................................... 3

1.1.2. Hoạt tính sinh học ....................................................................................... 4

1.2. Selen và vai trò sinh học của selen .................................................................. 6

1.2.1. Nguồn selen hiện nay ................................................................................. 6

1.2.2. Vai trò của selen đối với cơ thể .................................................................. 7

1.2.3. Con đường chuyển hóa selen ở nấm ......................................................... 11

1.3. Nuôi trồng nấm Cordyceps ............................................................................ 13

1.3.1 Nuôi trồng Cordyceps ................................................................................ 13

1.3.2. Các nghiên cứu về nuôi cấy Cordyceps bổ sung selen ............................. 15

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 17

2.1. Vật liệu ........................................................................................................... 17

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 17

2.1.2. Hóa chất .................................................................................................... 17

2.1.3. Thiết bị ...................................................................................................... 17

2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 18

2.3. Địa điểm và thời gian thực hiện ..................................................................... 18

2.3.1. Địa điểm thực hiện: .................................................................................. 18

2.3.2. Thời gian thực hiện ................................................................................... 18

2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 18

2.4.1. Chuẩn bị giống.......................................................................................... 18

2.4.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường PGA và môi

trường lỏng PS ...................................................................................................... 18

2.4.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường PGA

....................................................................................................................... 18

2.4.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến C. sinensis trên môi trường lỏng

PS .................................................................................................................. 19

2.4.3 Phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến ................................................. 19

2.4.4. Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy Cordyceps sinensis trên môi

trường lỏng bổ sung selen ..................................................................................... 20

2.4.3.1. Sàng lọc thành phần môi trường bằng Plackett – Burman .............. 20

2.4.3.2. Tối ưu hóa thành phần môi trường bổ sung selen bằng mô hình đáp

ứng bề mặt Box -Behnken ............................................................................. 21

2.4.3.3. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng mô hình đáp ứng bề mặt D-

optimal ........................................................................................................... 23

2.4.5. Phương pháp thu nhận cao chiết ............................................................... 24

2.4.5.1. Cao chiết tổng .................................................................................. 24

2.4.5.2. Cao chiết phân đoạn ......................................................................... 25

2.4.5.3. Cao chiết CPS .................................................................................. 25

2.4.5.4. Thu nhận EPS ................................................................................... 25

2.4.5.5. Thu nhận IPS .................................................................................... 26

2.4.6. Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết................................................. 26

2.4.6.1. Khả năng bắt gốc tự do ABTS ......................................................... 26

2.4.6.2. Khả năng bắt gốc tự do DPPH ......................................................... 26

2.4.6.3. Xác định năng lực khử ..................................................................... 27

2.4.6.4. Xác định khả năng bảo vệ DNA ...................................................... 27

2.4.6.5. Hoạt tính ức chế xanthine oxidase ................................................... 27

2.4.6.6. Đánh giá hoạt tính kháng viêm ........................................................ 28

2.4.6.7. Hoạt tính ức chế α-glucosidase ........................................................ 28

2.4.6.8. Khảo sát khả năng gây độc tế bào .................................................... 28

2.7. Định lượng selen trong nấm Cordyceps sinensis........................................... 29

2.7.1. Phân tích selen tổng .................................................................................. 29

2.7.2. Phân tích selen nguyên dạng .................................................................... 29

2.7.3. Phân tích FT-IR ........................................................................................ 30

2.8. Thử nghiệm độc tính cấp của sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen 30

2.9. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 30

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .............................................................. 31

3.1 Về ảnh hưởng của selen đến sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis ........ 31

3.1.1 Ảnh hưởng của selen đến sự phát triển của tơ nấm Cordyceps sinensis ... 31

3.1.2 Ảnh hưởng của selen đến sản xuất sinh khối của nấm Cordyceps sinensis

............................................................................................................................... 33

3.1.3 Về nâng cao khả năng phát triển và sản xuất sinh khối của nấm Cordyceps

sinensis trên môi trường bổ sung selenate bằng phương pháp nuôi cấy thích nghi

cải tiến ................................................................................................................... 36

3.2 Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy để nâng cao chuyển hóa selen

trong sinh khối nấm Cordyceps sinensis ............................................................... 41

3.2.1 Sàng lọc các thành phần môi trường ảnh hưởng đến sự sản xuất sinh khối

và tích lũy selen của nấm Cordyceps sinensis ...................................................... 41

3.2.2 Tối ưu hóa thành phần môi trường ............................................................ 48

3.2.3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ................................................................... 52

3.2.4 Thảo luận ................................................................................................... 57

3.3 Xác định thành phần hoạt chất và dạng selen chuyển hóa trong nấm Cordyceps

sinensis .................................................................................................................. 60

3.3.1 Thu nhận cao chiết từ sinh khối nấm và dịch nuôi cấy ............................. 60

3.3.2. Hàm lượng selen trong cao chiết .............................................................. 61

3.3.3 Sự hiện diện của selen trong các cao chiết chứa polysaccharide .............. 62

3.4 Về hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis giàu selen ....................... 64

3.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa ............................................................................ 64

3.4.1.1. Hoạt tính bắt gốc tự do ABTS ......................................................... 64

3.4.1.2. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH ......................................................... 66

3.4.1.3. Hoạt tính kháng oxy hóa thông qua năng lực khử ........................... 67

3.4.1.4. Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bảo vệ tính nguyên vẹn

của DNA ........................................................................................................ 68

3.4.2. Khả năng ức chế xanthine oxidase ........................................................... 69

3.4.3. Hoạt tính kháng viêm in vitro ................................................................... 70

3.4.4. Hoạt tính ức chế α–glucosidase ................................................................ 72

3.4.5. Hoạt tính ức chế tăng sinh của tế bào ung thư.......................................... 73

3.4.6 Thảo luận chung về hoạt tính sinh học ...................................................... 76

3.5 Đề xuất quy trình nuôi cấy sản xuất nấm Cordyceps sinensis giàu selen ...... 81

3.5.1 Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm .......................................... 81

3.5.2. Đánh giá độc tính cấp của sinh khối C. sinensis giàu Se trên chuột ........ 83

3.5.3 Đánh giá các chỉ tiêu an toàn thực phẩm ................................................... 84

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 89

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ......................................................... 90

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ......................................................... 91

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 93

PHỤ LỤC ................................................................................................................ 104

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt

ABTS 2,2 - azinobis - (3- 2,2 - azinobis - (3-

ethylbenzothiazoline - 6 - ethylbenzothiazoline - 6 -

sulphonate) sulphonate)

apoER2 apolipoprotein E receptor 2 apolipoprotein E receptor 2

BuOH Butanol Butanol

BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bê

CPT Camptothecin Camptothecin

DCF 2’,7’-dichlorofluorescein 2’,7’-dichlorofluorescein

DCFH Dichlorodihyddrofluorescein Dichlorodihyddrofluorescein

DCFH-DA Dichloro-Dihydro- Dichloro-Dihydro- Fluorescein

Fluorescein Diacetate

Diacetate

DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic acid

DPPH 2,2 - diphenyl - 1 - 2,2 - diphenyl - 1 -

picrylhydrazyl picrylhydrazyl Đối chứng ĐC

Exopolysaccharide Polysaccharide ngoại bào EPS

EtOAc Ethylacetate Ethylacetate

EtOH Ethanol Ethanol

FT-IR Fourier-transform infrared Quang phổ hồng ngoại

spectroscopy

Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt

Hep G2 Liver hepatocellular Tế bào ung thư gan Hep G2

carcinoma

Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% IC50

ICP-MS Inductively coupled plasma Khối phổ plasma ghép cảm ứng

Mass spectrometry

Jurkat Jurkat Cell Line Dòng tế bào Jurkat

IPS Intrapolysacharide Polysaccharide nội bào

MeOH Metanol Methanol MT Môi trường

MCF-7 Breast cancer cell line Tế bào ung thư vú

NK cells Natural Killer cells Tế bào sát thủ tự nhiên

NT Nghiệm thức

nrSSU và The partial small subunit of Tiểu đơn vị nhỏ và tiểu đơn vị lớn

dnrLSU rDNA (nrSSU) and the partial

large subunit of rDNA

(nrLSU)

Optical Density Mật độ quang OD

Phosphate buffer saline Đệm PBS PBS

Petroleum ether Ete dầu hỏa PE

PGA Potato glucose agar Môi trường PGA

Môi trường PG PG Potato glucose Môi trường PS PS

Phòng thí nghiệm PTN

Reactive oxygen species Gốc oxy hóa ROS

iii

Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt

RNI Recommended Nutrition Lượng dùng khuyến cáo hàng

Intakes ngày cho người

SOD Superoxide dismutase Superoxide dismutase

SRB Sulforhodamin B assay Thử nghiệm độc tính SRB

Se-EPS Seleno-exopolysaccharide Seleno-exopolysaccharide

Se-IPS Seleno-intracellular Seleno-intracellular

polysaccharide polysaccharide

Se-Pr Seleno-protein Seleno-protein

SeNPs Selenium nanoparticles Hạt nano selen

Sul1p/Sul2p Kênh vận chuyển Sul1p/Sul2p

MMP-2 Matrix Metalloproteinase-2 Matrix Metalloproteinase-2

MMP-9 Matrix Metalloproteinase -9 Matrix Metalloproteinase -9

uPA Urokinase-type plasminogen Urokinase-type plasminogen

activator activator

MAPK Mitogen-activated protein Mitogen-activated protein kinas

kinas

PDGF/ERK Platelet-derived growth Platelet-derived growth

factor/Extracellular signal- factor/Extracellular signal-

regulated kinase regulated kinase

TGF-β1 Transforming growth factor Transforming growth factor beta 1

beta 1

Reactive oxygen species Các chất oxy hóa mạnh ROS

protein kinase A protein kinase A PKA

protein kinase C protein kinase C PKC

Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt

TRAP The trp RNA-binding The trp RNA-binding attenuation

attenuation protein protein

T CD4+ T helper cells Tế bào hỗ trợ T

IFNγ Interferon gamma Interferon gamma

XO Xanthine oxidase Xanthine oxidase

DANH MỤC HÌNH

C. sinensis ngoài tự nhiên ........................................................................... 3

Một số cấu trúc của seleno-đường ............................................................. 8

Sơ đồ chuỗi phản ứng giữa selente và glutathione ...................................... 8

Con đường biến dưỡng chuyển hóa thành những dạng hợp chất Se khác

(A) Sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường PGA bổ sung

nhau ở Saccharomyces cerevisiae ............................................................................. 12

selenite và selenate từ 0 đến 40 mgSe/L ở thời điểm 15 ngày. (B) Đường kính lan tơ

của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường PDA có bổ sung selen từ 0 đến 40

(A) Sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường lỏng có bổ

mgSe/L sau 15 ngày. ................................................................................................. 32

sung selenite và selenate ở nồng độ 30 mgSe/L sau 40 ngày. (B) Sinh khối nấm

Cordyceps sinensis trên môi trường lỏng bổ sung selen từ 0 – 30 mgSe/L sau 40 ngày.

(A) So sánh sự sản xuất sinh khối (cột) và hấp thụ selen (đường gạch nối)

Ba nguồn selen tương ứng là selenite, selenate và selenoure. .................................. 35

bởi nấm Cordyceps sinensis giữa hai phương pháp nuôi cấy truyền thống và cải tiến

sau 40 ngày. (B) Hình thái sợi nấm phát triển trên môi trường thạch sau 14 ngày và

So sánh hàm lượng các hợp chất chứa selen (µg/g) trong sinh khối nấm

ứng sau 40 ngày......................................................................................................... 37

Bề mặt đáp ứng của sinh khối nấm Cordyceps sinensis theo hai yếu tố ... 51

Bề mặt đáp ứng của sinh khối C. sinensis theo hai yếu tố ........................ 55

So sánh hiệu suất chiết cao (%) giữa sinh khối nấm giàu selen (Se) và sinh

được nuôi bằng phương pháp truyền thống (PP1) và phương pháp cải tiến (PP2) .. 39

Hàm lượng selen trong các cao chiết từ nấm nuôi trên môi trường bổ sung

khối nấm đối chứng không có selen (ĐC) ................................................................ 61

Kết quả phân tích FTIR của các hợp chất Se-EPS, Se-IPS ....................... 64

selen ............................................................................................................... 62

Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bắt gốc tự do ABTS ......... 65

Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bắt gốc tự do DPPH ......... 67

Kết quả bảo vệ DNA của các mẫu cao chiết .......................................... 69

Hoạt tính kháng viêm dựa trên khả năng bảo vệ sự biến tính albumin bởi

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư MCF7 ................................................ 74

Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết trên tế bào fibroblast ........... 76

Quy trình công nghệ nuôi cấy nấm C. sinensis giàu Se .......................... 86

nhiệt độ ........................................................................................................... 71

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis ......................................... 5

Bảng 1.2. Lượng Se cần thiết cho cơ thể hàng ngày ................................................. 10

Bảng 1.3. Một số thành phần môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps ......................... 14

Bảng 2.1. Các biến trong ma trận Plackett-Burman .................................................. 21

Bảng 2.2. Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman ........................................ 21

Bảng 2.3. Nồng độ các yếu tố sử dụng trong Box – Behnken .............................. 22

Bảng 2.4. Thiết kế Box - Behnken ............................................................................ 22

Bảng 2.5. Thiết kế Box – Behnken ........................................................................... 24

Bảng 2.6. Mức khảo sát của các yếu tố sử dụng trong D-optimal ............................ 24

Bảng 3.1. Trọng lượng sinh khối nấm của các nghiệm thức theo Plackett – Burman ..

............................................................................................................... 44

Bảng 3.2. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình .................................................. 45

Bảng 3.3. Lượng Se tổng trong sinh khối của các nghiệm thức theo Plackett - Burman

............................................................................................................... 47

Bảng 3.4. Phân tích ANOVA về mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến lượng

Se tổng trong sinh khối nấm...................................................................................... 48

Bảng 3.5. Sản lượng sinh khối nấm Cordyceps sinensis (g/L) của các nghiệm thức

theo Box – Behnken. ................................................................................................. 49

Bảng 3.6. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình Box – Behnken ........................ 50

Bảng 3.7. Trọng lượng sinh khối C. sinensis ở các nghiệm thức theo D-optimal .... 53

Bảng 3.8. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình D-optimal ................................ 54

Bảng 3.9. Hàm lượng Se ở các nghiệm thức (µg/g) .................................................. 55

Bảng 3.10. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình D-optimal .............................. 56

Bảng 3.11. So sánh kết quả một số nghiên cứu về thành phần môi trường .............. 58

Bảng 3.12. Giá trị ∆OD của các cao chiết tại nồng độ 2000µg/mL.......................... 68

viii

Bảng 3.13. Giá trị IC50 trong khảo sát khả năng ức chế XO của một số cao chiết từ

sinh khối nấm C. sinensis .......................................................................................... 70

Bảng 3.14. Phần trăm ức chế α - glucosidase ở nấm C. sinensis .............................. 73

Bảng 3.15. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Jurkat của các mẫu cao chiết tại nồng độ

thử nghiệm 100g/mL............................................................................................... 75

Bảng 3.16. Thành phần hoạt chất trong sinh khối nấm C. sinensis giàu selen ......... 82

Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống của sinh khối nấm .............. 83

Bảng 3.18. Khối lượng (g) của chuột nhắt trên mô hình độc tính cấp ...................... 84

Bảng 3.19. Phân loại cấp độ độc dựa vào LD50 ........................................................ 84

Bảng 3.20. Các chỉ tiêu an toàn thực phẩm của nấm C. sinensis giàu Se ................. 85

MỞ ĐẦU

Nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps sinensis (đồng tên: Ophiocordyceps

sinensis) là loài nấm dược liệu quý được sử dụng phổ biến trong Y học cổ truyền

Trung Hoa. Adenosine và cordycepin là hai dược chất quý được xem là chất chỉ thị

về hoạt tính sinh học quan trọng cho loài nấm này. Các nghiên cứu hiện đại chứng

minh các hoạt chất từ C. sinensis có khả năng tăng cường miễn dịch, chống lão hóa,

kháng viêm, kháng ung thư và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến phổi, thận, và

các bệnh mạn tính khác như đái tháo đường. Hiện nay, C. sinensis tự nhiên ngày càng

hiếm do việc khai thác quá mức đi kèm với biến đổi khí hậu. Do đó, nghiên cứu nuôi

cấy nhân tạo loại nấm quý này nhận được nhiều quan tâm trong vài thập kỷ qua. Sử

dụng môi trường bán rắn tạo quả thể và môi trường lỏng nhân thu sinh khối loài nấm

này là hai hướng tiếp cận phổ biến. Trong đó, nhân nuôi sinh khối nấm mang tính

ứng dụng thực tiễn cao vì công nghệ này không chỉ sản xuất sinh khối nấm có thành

phần các hoạt chất tương tự như tự nhiên, mà còn có thể triển khai sản xuất ở quy mô

công nghiệp trong thời gian ngắn cùng với chi phí thấp hơn so với kỹ thuật nuôi cấy

quả thể. Nhiều phương pháp nuôi cấy lỏng cải tiến được thử nghiệm để nâng cao giá

trị hoạt chất và hoạt tính sinh học của sinh khối nấm C. sinensis. Nghiên cứu ảnh

hưởng của các nguyên tố khoáng vi lượng đến khả năng sản xuất sinh khối và các

hợp chất thứ cấp là một chủ đề nhận được nhiều quan tâm hiện nay. Trong đó, selen

(Se) được xem là một tiền chất đầy tiềm năng trong việc nâng cao dược tính sinh học

của nấm Đông trùng Hạ thảo này.

Hơn thế nữa, Se là thành phần của acid amin 21 gọi là selenocysteine. Nguyên

tố này còn tham gia vào cấu trúc của nhiều enzyme kháng oxy hóa như glutathione

peroxidase, iodothyronine deiodinases và thioredoxin reductase có chức năng sinh lý

quan trọng như kháng oxy hóa, kháng ung thư, tăng cường miễn dịch, ức chế HIV và

chống lão hóa. Sự tham gia của Se trong hệ thống miễn dịch có thể được kết hợp với

một số cơ chế, bao gồm cả các hoạt động gia tăng sản xuất tế bào miễn dịch NK

(Natural killer cell), các tế bào lympho T, lympho B, interferon C và làm thụ thể có

ái lực cao với interleukin-2, kích thích miễn dịch do vắc-xin gây ra. Bên cạnh đó, Se

còn có vai trò quan trọng trong chuyển hóa iốt, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng

độ Se trong huyết thanh ở những trẻ bị bướu cổ thường thấp hơn so với trẻ có kích

thước tuyến giáp bình thường. Như vậy, sự thiếu hụt Se có thể tác động xấu đến sức

khỏe.

Mặc dù nước ta có một số dược liệu chứa Se như: tỏi, nấm linh chi và quả nhàu

nhưng hàm lượng Se trong các loại dược liệu này thường thấp và không ổn định. Từ

năm 2003 – 2005, Bộ Y tế khuyến khích và định hướng những nghiên cứu sản xuất

Se hữu cơ có khả dụng sinh học cao. Đề án “Chiến lược quốc gia về dinh dưỡng giai

đoạn 2011-2020 và tầm nhìn đến năm 2030” (689/TH ngày 29/6/2011) nhấn mạnh

phòng chống thiếu vi chất dinh dưỡng hiện nay, trong đó có liên quan đến Se. Chính

vì lẽ đó, đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối

giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học” được thực hiện với:

Mục tiêu tổng quát của nghiên cứu:

Sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học được cải thiện

và tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao.

Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu:

(1) Xây dựng quy trình lên men sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se.

(2) Đánh giá một số hoạt tính sinh học của các hoạt chất chứa Se từ sinh khối

nấm C. sinensis giàu Se.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:

Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dữ liệu khoa học về

ảnh hưởng của Se đến sự sản xuất sinh khối và hoạt tính sinh học của sinh khối nấm

Cordyceps sinensis, khả năng tích lũy Se trong sinh khối nấm. Đồng thời, công trình

này sẽ giúp hiểu rõ thêm các dạng Se hữu cơ trong nấm.

Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả tạo tiền đề cơ sở kỹ thuật nhằm chuyển giao công

nghệ để sản xuất và ứng dụng sinh khối C. sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học cao

trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm bổ sung, bảo vệ sức khỏe.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Nấm Cordyceps sinensis

1.1.1. Đặc điểm, phân bố

Cordyceps sinensis là loài nấm kí sinh trên ấu trùng loài bướm đêm Thitarodes

(Hepialus) armoricanus thuộc họ Hepialidae sống dưới đất (hình 1.1) [1]. Đây là loài

nấm đặc hữu của vùng cao nguyên Tây Tạng và các vùng đồng cỏ núi cao xung quanh

khu vực dãy Himalaya như Bhutan, Trung Quốc và Nepal ở độ cao 3500-5000 m so

với mực nước biển [2]. Giá trị dược liệu của loài nấm này đã được ghi nhận cách đây

2000 năm ở Trung Quốc cũng như các nước phương Đông với những tác dụng như

cải thiện chức năng gan thận, chữa đổ mồ hôi đêm, bệnh tiểu đường, máu nhiễm mỡ,

các bệnh về tim, hồi phục sức khỏe, tăng tuổi thọ và nâng cao thể trạng cơ thể [3] [4].

C. sinensis ngoài tự nhiên. Hình có nguồn gốc từ công bố của

Shrestha và cộng sự (2013) [5]

Đến năm 2007, Sung và cộng sự đã tiến hành phân tích mối quan hệ giữa 162

loài Cordyceps bằng việc phân tích 5 - 7 locus bao gồm ribosome tiểu phần nhỏ và

tiểu phần lớn (nrSSU và dnrLSU), nhân tố kéo dài 1α (tef1), hai tiểu đơn vị lớn nhất

của RNA polymerase II (rpb1 và rpb2), β-tubulin (tub) và ti thể ATP6 (atp6) và xếp

Cordyceps sinensis vào chi Ophiocordyceps và đổi tên là Ophiocordyceps sinensis

[6], tuy là cùng tên song C. sinensis vẫn được sử dụng phổ biến trong giới khoa học

hiện nay.

1.1.2. Hoạt tính sinh học

Với sự phát triển của khoa học hiện nay, người ta đã tìm ra được những hợp

chất có trong nấm C. sinensis. Chính những hoạt chất này đóng vai trò quan trọng,

quyết định giá trị dược liệu của loài nấm này, chúng gồm có: (i) Các hợp chất nitơ:

adenine, adenosine, cordyceamides, cordycedipeptide, cordycepin, cordymin,

cordysinin, dideoxyadenosine, guanine, guanosine, hypoxanthine, inosine,

thymidine, thymine, uracil, uridine; (ii) Sterol: campesterol, cholesterol, daucosterol,

ergosterol, sitisterol, stigmasterol; (iii) Polysaccharide và dẫn xuất: cordysinocan,

glucan, heteroglycan, mannitol, mannoglucan; (iv) Các protein, acid amin:

cadaverine, carboline, cordymin, flazin, methylpyrimidine, perlolyrine, putrescine,

spermidine, spermine, tryptophan; (v) Acid phenolic: acetovanillone, acid

hydroxybenzoic, acid protocatechuic, acid salicylic, acid syringic, acid vanillic; (vi)

Isoflavone: daidzein, genistein, glycitein, orobol; (vii) Acid béo: acid docosanoic,

acid lauric, acid lignoceric, acid linoleic, acid myristic, acid oleic, acid palmitic, acid

palmitoleic, acid pentadecanoic, acid stearic, acid succinic; (viii) Các vitamin, các

hợp chất bay hơi và các loại khoáng như Zn, Mg, Mn, Fe, Se, …. [7].

Y học hiện đại đã chứng minh nấm Cordyceps có các hoạt tính như điều hòa

miễn dịch, kháng oxy hóa, ức chế hình thành khối u, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng

di căn và tìm ra được một số cơ chế tác động chính lên các con đường sinh hóa của

cơ thể. Do đó việc sử dụng Cordyceps không chỉ giới hạn trong tăng cường sức khỏe,

mà còn được sử dụng trong phòng trị các bệnh về hô hấp, bệnh về thận, gan, tim

mạch, tăng lipid máu, rối loạn miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư (bảng 1.1)

Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis [8]

Hoạt tính Cơ chế tác động

Miễn dịch Tăng cường hàm lượng IgG, IgG1 và IgG2b đặc hiệu ovalbumin.

Kích thích đại thực bào giải phóng IL-lβ, TNF-α và INF-γ bằng việc

kích thích con đường IkB–NF-kB. Cảm ứng sự sinh trưởng của tế bào

T và tiết IL-2, IL-6 và IL-8.

Kháng Giảm sự sản xuất NO, IL-12, TNF-α và các cytokine gây viêm. Khóa

viêm các NF-kB thông qua giảm biểu hiện tín hiệu điều hòa kinase nội bào.

Kháng oxy Duy trì GPx và hoạt động SOD trong tế bào. Kích thích sự hoạt hóa

hóa của GPx, CAT và SOD đồng thời giảm hàm lượng lactate

dehydrogenase và malondialdehyde. Tăng điều hòa hoạt động của

superoxide dismutase 1 chứa kẽm- đồng và ức chế sự tích lũy

lipofusin.

Gây ra Ức chế sự phosphoryl hóa tyrosine của Bcl-2 và Bcl-xL oncoprotein.

apoptosis Kích thích apoptosis thông qua con đường caspase/MAPK. Tăng

cường phosphoryl hóa và biểu hiện p53.

Kháng Bằng con đường miễn dịch và kháng oxy hóa. Kháng khối u bằng con

khối u đường apoptosis. Điều hòa con đường tín hiệu như con đường tín hiệu

MAPK có vai trò quan trọng trong quá trình xâm lấn và di cư của tế

bào ung thư, hoạt hóa con đường tín hiệu PKC có tác dụng kháng

khối u trực tiếp. Ức chế sự tiết các yếu tố liên quan đến xâm lấn và

di cư như MMP-2, MMP-9 và uPA.

Bảo vệ tim Ngăn chặn sự tích tụ cholesterol. Ức chế hoạt tính cholesterol

mạch esterase. Hỗ trợ chữa bệnh đột quỵ do thiếu máu cục bộ do thiếu oxy

và glucose. Tách chuỗi Aα của fibrinogen và chuỗi α của fibrin nhằm

ngăn chặn huyết khối.

Bảo vệ Ức chế sự tăng trưởng của tế bào mesangial ở thận thông qua con

thận đường PDGF/ERK và TGF-β1/Smad. Ức chế PDGF homodimer BB,

nguyên nhân gây ra viêm và sản xuất ROS. Ức chế sự tăng sinh của

tế bào trung mô cầu thận thông qua con đường PDGF/ERK và TGF-

β1/Smad.

Hoạt tính Cơ chế tác động

Sức khỏe Kích thích tế bào Leydig và tế bào hoàng thể hạt tiết ra steroid sinh

sinh sản dục. Tăng khả năng sản xuất E2, đây là hormone quan trọng nhất ảnh

hưởng đến noãn bào. Hoạt hóa con đường truyền tải tín hiệu PKA và

PKC và kết hợp với Ars hoạt hóa con đường cAMP-PKA-StAR để

tạo ra steroidogenesis.

Phòng Điều hòa steroidogene buồng trứng để ngăn ngừa mất xương và loãng

ngừa loãng xương do thiếu estrogen. Giảm hoạt tính alkaline phosphatase huyết

xương thanh, hoạt tính TRAP, hàm lượng CTX và IFN-γ.

1.2. Selen và vai trò sinh học của selen

1.2.1. Nguồn selen hiện nay

2−) và

Se được Jacob Berzelius Jöns phát hiện năm 1817 trong chất thải của quá trình

2−), một lượng nhỏ dạng hữu cơ do hoạt động của vi sinh vật và thực

khai thác quặng pyrit [9]. Trong đất, Se tồn tại chủ yếu ở dạng selenite (SeO3

selenate (SeO4

vật tạo ra [9]. Ngoài ra, Se còn tồn tại trong nước nhưng phụ thuộc vào hàm lượng Se

trong đất, đá nơi đó và hoạt động của vi sinh vật cũng như vi tảo ở trong nước [9].

Như đa phần các nguyên tố khác, Se tồn tại ở cả dạng vô cơ và hữu cơ. Ở dạng vô cơ,

Se ở các dạng oxy hóa như -2, 0, +4 và +6 như natri selenide, natri selenate, natri

selenite,…. Còn ở dạng hữu cơ, chúng gắn trực tiếp vào các hợp chất hữu cơ hoặc

liên kết cộng hóa trị với mạch carbon như selenomethionine, selenocysteine, dimethyl

selenide, selenodiglutathione,… [9] [10].

Hiện nay, con người sử dụng Se hữu cơ chủ yếu thông qua thực phẩm thường

ngày như rau, củ quả, thịt, trứng, sữa,… Ngoài ra, đối với những người thiếu Se có

thể bổ sung các loại thuốc hoặc thực phẩm chức năng giàu Se. Tùy từng khu vực địa

lý mà thực phẩm tại nơi đó có hàm lượng Se khác nhau. Một số thực vật như hành,

tỏi, cải wasabi, nấm có khả năng tích lũy Se tốt với hàm lượng Se dao động từ 0,01

đến 0,55μg/g. Đối với những loài động vật dưới nước như cá, sò cũng là nguồn cung

cấp Se đáng kể: cá biển (0,11 - 0,97μg/g), cá nước ngọt (0,18 - 0,68μg/g). Các sản

phẩm thịt có hàm lượng Se khoảng 0,08 đến 0,73μg/g. Trong sản phẩm sữa, hàm

lượng Se tỉ lệ nghịch với hàm lượng chất béo và dao động từ 0,01 đến 0,55μg/g [11].

1.2.2. Vai trò của selen đối với cơ thể

Hiện nay, 25 gen mã hóa seleno-protein đã được xác định ở genome người.

Selenoprotein có những chức năng khác nhau, bao gồm hoạt tính kháng oxy hóa, chức

năng miễn dịch, sự trao đổi chất hormon tuyến giáp, vận chuyển và cân bằng nội môi

Se và trao đổi chất ở xương và cơ tim [9] [12] [13]. Đối với hệ miễn dịch, nhiều

nghiên cứu đã cho thấy sự hiện diện của lượng lớn Se trong lách, gan và hạch bạch

huyết. Vì vậy, thiếu hụt Se sẽ gây ảnh hưởng xấu đến hệ miễn dịch. Se kích thích

hình thành kháng thể và hoạt hóa tế bào T hỗ trợ cùng với tế bào T gây độc và tế bào

NK. Hơn nữa, Se cũng có vai trò quan trọng trong điều trị bệnh nhân nhiễm HIV, một

số kết quả tích cực trong quá trình điều trị như làm chậm sự tiến triển bệnh, tăng tế

bào T CD4+ và giảm các triệu chứng bệnh đi kèm như tiêu chảy [12] [14] [15].

Ở não, Se đóng vai trò rất quan trọng, nếu thiếu hụt Se, mô não là nơi được ưu

tiên nhận Se trước tiên. Một số selenoprotein đặc trưng đã được chứng minh có khả

năng chống lại sự thoái hóa thần kinh bằng cách loại bỏ các gốc tự do (ROS) và tăng

cường kháng oxy hóa. Trong đó, selenoprotein P có vai trò đặc biệt trong việc vận

chuyển Se bằng cách gắn chúng lên các thụ thể bề mặt như apoER2 [13] [14].

Đối với vấn đề sinh sản ở nam giới, Se từ lâu đã được công nhận là cần thiết

để sinh tổng hợp testosterone, sự hình thành và phát triển bình thường của tinh trùng.

Trong pha sớm của quá trình hình thành tinh trùng, GPx4 có vai trò như là peroxidase

giúp bảo vệ tinh trùng khỏi những tác nhân oxy hóa, trong khi đó, ở pha muộn, có vai

trò trong sự hình thành phần đuôi giúp tinh trùng có thể di động. Đối với nam giới bị

hiếm muộn do vấn đề di chuyển của tinh trùng, bổ sung Se 100μg/ngày sẽ giúp tăng

khả năng hoạt động của tinh trùng và có khoảng 11% chúng có khả năng thụ tinh [14]

[15].

Đối với tuyến giáp, đây là cơ quan có hàm lượng Se cao nhất trong cơ thể. Do

đó, tuyến giáp không chỉ phụ thuộc vào iod mà còn cả Se. Se có vai trò khác nhau

trong tuyến giáp như iodothyronine deiodinase (Dio1, Dio2) phụ thuộc Se, sản xuất

hormon thyroid, triiodothyronine (T3) từ tiền chất của chúng và thyroxine (T4) [12]

[15].

Đối với bệnh về tim mạch, thiếu hụt Se, peroxit lipid có thể tích tụ trong máu

và gây tổn thương mạch máu và mô. Các nghiên cứu trước đây cho thấy Se có khả

năng chống lại sự oxy hóa lipid và giảm kết tụ tiểu cầu, kháng viêm từ đó giảm khả

năng mắc các bệnh về tim mạch [12] [14] [15].

Đối với ung thư, trong những năm gần đây, các nghiên cứu về Se trong việc

điều trị các loại ung thư ngày càng phổ biến, trên cả mô hình động vật, người và trên

hầu hết các cơ quan với nhiều loại ung thư khác nhau như phổi, bàng quang, đại trực

tràng, gan, tuyến giáp, tuyến tiền liệt [12] [14] [15].

Bên cạnh selenoprotein, Se còn được tích lũy vào polysaccharide. Các nghiên

cứu hiện nay chủ yếu tập trung vào selenopolysaccharide từ vi khuẩn hoặc nấm (hình

1.2).

Một số cấu trúc của seleno-đường [16]

Một số thử nghiệm trước đây cho thấy selenopolysaccharide có khả năng

kháng khối u như: Selenopolysaccharide (SeGLP-2B-1) từ nấm Ganoderma lucidum

có khả năng cảm ứng tế bào MCF-7 theo con đường apoptosis [17], seleno -

Sargassum fusiforme (Harv.) Setch. polysaccharide (Se-SFPSI) - cải thiện hoạt tính

CAT, SOD, GSH-Px trên chuột mang khối u S180 (dòng tế bào ung thư Sarcoma)

sau 10 ngày thử nghiệm [18], selenopolysaccharide (ISPS) từ nấm C. sinensis cũng

cho thấy khả năng kháng oxy hóa mạnh, giảm lượng glucose trong máu và tăng cường

khả năng miễn dịch trên mô hình chuột [19]. Năm 1988, tại Hội nghị về Se trong sinh

•- (hình 1.3). Kết quả là những

học và y dược được tổ chức ở Tubingen (Đức), Seko và cộng sự đã cho thấy selenite

phản ứng với glutathione và H2Se tạo ra superoxide O2

•-

4GSH GSSG GSH GSSG GSH GSSG O2 O2

GSSeSG

GSSeH

Seo(1)

SeO3

H2Se

gốc tự do này tấn công gây tổn thương tế bào [20].

Sơ đồ chuỗi phản ứng giữa selente và glutathione

Nếu sử dụng Se quá cao sẽ gây độc mãn tính với các biểu hiện đặc trưng như

rụng tóc, móng tay giòn, rối loạn tiêu hóa, phát ban, hơi thở có mùi tỏi và hoạt động

bất thường của hệ thống thần kinh. Ảnh hưởng xấu khác có liên quan là rối loạn chức

năng nội tiết, tổng hợp các hormon tuyến giáp và hormon tăng trưởng và sự chuyển

hóa các yếu tố tăng trưởng tương tự insulin. Đặc biệt là chế độ ăn uống với lượng Se

quá cao, liên quan đáng kể với sự suy giảm T3 (triiodothyronin), suy yếu các tế bào

sát thủ tự nhiên và nhiễm độc gan.

Bệnh Keshan lần đầu tiên được mô tả trong y học Trung Quốc cách đây hơn

100 năm. Năm 1935, người ta mới khám phá ra rằng sự thiếu hụt Se là yếu tố gây

bệnh chủ yếu. Biểu hiện điển hình là mệt mỏi sau khi vận động nhẹ, rối loạn nhịp tim,

hồi hộp, chán ăn, suy tim, tim phì đại. Có sự tương đồng địa lý trong sự phân bố bệnh

Keshan, các bệnh cơ trắng liên quan đến Se và vitamin E ở động vật [21] [22]. Bệnh

xương khớp (osteoarthropathy) có liên quan đến hàm lượng Se thấp đã được phát

hiện ở nhiều trẻ em từ 5-13 tuổi ở Trung Quốc và một số ít tại phía đông Siberia.

Bệnh có đặc trưng là hoại tử khớp, thoái hóa đầu xương của khớp cánh tay, ngón chân

dẫn đến rút cấu trúc ngón tay, các xương dài kéo theo sự tăng trưởng chậm và còi cọc

[21] [22]. WHO và FAO đã đưa ra hàm lượng Se cần sử dụng hàng ngày cho cơ thể,

tùy vào độ tuổi, giới tính và cân nặng mà có hàm lượng khác nhau, số liệu như trong

bảng 1.2. Ngoài ra, ngưỡng giới hạn trên được WHO khuyến nghị là khoảng

400μg/ngày đối với người lớn, với trẻ nhỏ là 45 - 280μg/ngày tùy theo độ tuổi [23].

Bảng 1.2. Lượng Se cần thiết cho cơ thể hàng ngày

Nhóm tuổi

Cân nặng (kg)

RNI* (μg/ngày)

Trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

0 - 6 tháng

7 - 12 tháng

1 - 3 tuổi

4 - 6 tuổi

7 - 9 tuổi

Thanh thiếu niên

Nữ, 10 - 18 tuổi

Nam, 10 - 18 tuổi

Người trưởng thành

Nữ, 19 - 65 tuổi 65+ tuổi

55 54

26 25

Nam, 19 – 65 tuổi 65+ tuổi

65 64

34 33

Phụ nữ có thai

Có thai từ 4-6 tháng Có thai từ 7-9 tháng

28 30

Phụ nữ cho con bú

0 – 6 tháng sau sinh 7 – 12 tháng sau sinh

35 42

*RNI: Lượng dùng khuyến cáo hằng ngày cho người

1.2.3. Con đường chuyển hóa selen ở nấm

Selen có cùng đặc tính lý hóa tương tự lưu huỳnh (S) do đó, trong quá trình

biến dưỡng ở nấm, kênh vận chuyển sulfate được sử dụng để Se có thể hấp thụ vào

tế bào và khả năng hấp thụ Se tỉ lệ nghịch với sự có mặt của S. Nghiên cứu cơ chế và

con đường chuyển hóa Se trong một số loài nấm còn hạn chế. Do vậy, những thông

tin về vai trò của các enzyme tham gia trong quá trình chuyển hóa Se trong các loại

nấm, đặc biệt là nấm C. sinensis vẫn chưa được tìm hiểu rõ. Tuy nhiên, vấn đề này

đã được ít nhiều làm rõ trên đối tượng là nấm men như Saccharomyces cerevisiae,

Candida utilis, Yarrowia lipolytica.

Cơ chế liên kết bên ngoài của Se

Liên kết ngoại bào của Se dựa trên sự hấp phụ hóa học, quá trình này phụ thuộc

vào các nối ion hoặc phức hợp Se và các polymer của vách tế bào protein,

phospholipid hoặc polysaccharide. Mức độ hấp thụ sinh học bị ảnh hưởng mạnh mẽ

bởi tính kỵ nước của bề mặt thành tế bào nấm men. Dựa trên những nghiên cứu trước

đây về sự hấp thụ Se trên vách tế bào nấm men và polysaccharide trên vách tế bào

cho thấy mannan và glucan đều có thể hấp thụ Se, đây cũng được xem là một cơ chế

bảo vệ tế bào không cho sự di chuyển quá nhiều Se vào chất nguyên sinh (hình 1.4)

[24].

Sự hấp thụ nội bào của Se

Sự vận chuyển Se thường thông qua các kênh vận chuyển chủ động, ở nấm

men 2 kênh Sul1p/Sul2p được sử dụng để vận chuyển Se [25]. Ngoài ra, một số

2-) được chuyển

nghiên cứu khác cho thấy các kênh vận chuyển phosphate và acid monocarboxylic

cũng có vai trò trong quá trình hấp thu Se [24]. Đầu tiên, Se+6 (SeO4

2-). Sau đó, sự khử Se+4 được xúc

thành APSe nhờ enzyme ATP sulfurylase. Sản phẩm được tạo thành trong phản ứng

được xúc tác bởi PAPSe reductase thành Se+4 (SeO3

tác bởi sulfate reductase sử dụng NADPH như một chất khử để tạo thành selenua

hydrogen (H2Se) (hình 1.4).

Con đường biến dưỡng chuyển hóa thành những dạng hợp chất

Se khác nhau ở Saccharomyces cerevisiae; A: Sulfurylase ATP; B: APSe Kinase; C:

PAPSe reductase; D: sulphate reductase; E: Homocysteine synthase; F:

Methioninesynthase; G: adenosylomethionine synthase; H: Methyltransferase; I:

adenosylhomocysteine hydrolase; K: Cystathionine-β-synthase; L: Cystathionine-γ-

lyase; M: Se-methyltransferase; N: Synthase γ-glu-Cys; O-Ac-Hser: O-

acetylhomoserine; SeHCys: Homoselenocysteine; Se-Cystathionine:

Selenocystathionine; SeCys: Selenocysteine; SeMeCys:Seleno-methyl-

selenocysteine; SeMet: Selenomethionine; SeMetoxđ: Selenomethionine dạng oxy hóa;

SeAM: Se-adenosyl-selenomethionine; SeAHCys: Adenosyl Homo-seleno Cysteine;

SAM: S-adenosylmethionine. Hình được mô phỏng từ Kieliszek và cộng sự (2015)

[24]

H2Se có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào một cách thụ động, là chất

chuyển hóa trung gian chính trong con đường sinh tổng hợp tất cả các hợp chất chứa

Se diễn ra trong tế bào vi sinh vật. Nó tiếp tục được chuyển hóa thành các hợp chất

hữu cơ bao gồm các seleno amino acid (hình 1.4) [24]. Tóm lại, quá trình tích lũy Se

ở nấm men là một tiến trình hình thành nhiều Se-protein khác nhau. SeMet là dạng

cơ bản của Se trong tế bào nấm men trong đó nó có thể cấu tạo hơn 90% tổng hàm

lượng Se trong nấm men. SeMet là dạng hấp thu nhiều nhất ở người và động vật. Nó

thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa, tăng cường miễn dịch của cơ thể và kích thích hoạt

động của một số enzyme sửa sai DNA [24]. Ngoài ra, SeMet kết hợp không đặc hiệu

thành protein thay thế cho methionine và được lưu giữ trong các mô. Ở nấm men,

methylselenocysteine là hợp chất được biết đến nhiều nhất bởi hoạt tính kháng ung

thư của chúng. Ở người và động vật, methylselenocysteine bị chuyển thành

methylselenol (CH3SeH) cũng là một chất kháng ung thư mạnh.

1.3. Nuôi trồng nấm Cordyceps

1.3.1 Nuôi trồng Cordyceps

Do nhu cầu sử dụng Cordyceps sinensis ngày càng lớn nên số lượng khai thác

ngoài tự nhiên ngày càng hạn chế. Chính vì vậy, để duy trì nguồn dược liệu quý hiếm

này, các nhà khoa học đã nỗ lực nghiên cứu nuôi cấy nhân tạo nấm Cordyceps sinensis

mang lại lợi ích lâu dài cho con người. Hiện nay, nuôi cấy Cordyceps sinensis có thể

tiến hành theo hai phương pháp là nuôi cấy lỏng và bán rắn. Nuôi cấy lỏng là phương

pháp chủ yếu dùng một lượng nhỏ bào tử Cordyceps sinensis cấy vào môi trường

lỏng đã khử trùng. Sinh khối Cordyceps sinensis dạng sợi được thu hoạch bằng cách

lọc dịch nuôi cấy, sau đó sấy khô. Phương pháp này tạo sản phẩm chất lượng tốt,

đồng nhất có chất lượng ít biến đổi, phù hợp sản xuất quy mô lớn và dễ kiểm soát các

thông số tăng trưởng trong các bồn nuôi cấy lớn. Tuy nhiên phương pháp này có thể

gây thất thoát một số hợp chất ngoại bào [26].

Nuôi cấy bán rắn được dùng để tạo quả thể Cordyceps sinensis. Bào tử

Cordyceps sinensis được đưa vào môi trường bán rắn đã khử trùng, thường là hạt ngũ

cốc hoặc hỗn hợp ngũ cốc, ấu trùng côn trùng với độ ẩm tương đối khoảng 45 - 50%.

Ưu điểm của phương pháp này là có thể giữ những hợp chất ngoại bào, giúp duy trì

được hoạt tính của Cordyceps sinensis và có hình thái tương đồng với tự nhiên nên

có giá trị cao [26] [27]. Hiện nay, nuôi cấy quả thể C. sinensis đã bước đầu thành

công, Cao và cộng sự (2015) đã nuôi cấy thành công quả thể C. sisnensis trên môi

trường bán rắn gạo, bột nhộng tằm và dịch dinh dưỡng; tuy nhiên, thời gian nuôi cấy

rất dài (140 ngày) [28]. Năm 2017, trung tâm Ligno Biotech Sdn. Bhd, Malaysia đã

nuôi cấy thành công quả thể C. sinensis [4]. Gần đây, năm 2019 Liu và cộng sự cũng

đã nuôi cấy thành công C. sinensis trên ấu trùng Thitarodes xiaojinensis trong điều

kiện nhân tạo [29]. Do quá trình nuôi cấy rất phức tạp, thời gian phát triển dài ngày

nên sản xuất C. sinensis bằng phương pháp nuôi cấy bán rắn tốn kém hơn nhiều so

với phương pháp nuôi cấy lỏng và vì thế phương pháp nuôi cấy lỏng vẫn được coi là

chiến lược tối ưu cho việc sản xuất loài nấm này.

Bảng 1.3. Một số thành phần môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps

Chủng nấm Thành phần môi trường Tham khảo

Cordyceps Maltose 20g/L, glycerol 8g/L, tryptone 5g/L, Xiao và cộng

jiangxiensis sự (2004) [30] cao nấm men 10g/L, KH2PO4 1g/L và CaCl2

JXPJ 0109 0,5g/L

Cordyceps Saccharose 6% (w/v), polypeptone 1% (w/v) Kim và cộng

militaris C738 sự (2003) [31] và K2HPO4 0,05% (w/v)

Cordyceps Saccharose 30g/L, cao chiết bò 4g/L, acid Singh và cộng

sinensis sự (2014) [32] folic 10mgSe/L, CaCl2 1g/L và ZnCl2 500g/L.

Cordyceps Saccharose 50g/L, peptone 10g/L và cao nấm Dong và cộng

sinensis men 3g/L. sự (2005) [33]

Cordyceps Saccharose 20g/L, bột đậu nành 4g/L, cao Lin và cộng sự

guangdongensis chiết bò 5g/L và KNO3 10g/L. (2010) [34]

Cordyceps Saccharose 24,7g/L, peptone 20g/L, Kang và cộng

militaris sự (2014) [35] K2HPO4.3H2O 1,11g/L, MgSO4.7H2O

0,90g/L, vitamin B1 10mgSe/L, hypoxanthine

5,45g/L và L-alanine 12,23g/L.

Nấm nói chung cũng như Cordyceps nói riêng khá linh hoạt trong việc hấp thu

các hợp chất carbon như polysaccharide, monosaccharide, acid hữu cơ, acid amin,

polycyclic, ligin, cellulose, glucose, saccharose, xylose, maltose, … Nguồn dinh

dưỡng carbon giữ vai trò quan trọng đối với sự hình thành cấu trúc cũng như cung

cấp năng lượng cho tế bào. Nấm sử dụng nguồn carbon bằng cách phân cắt chúng

thành những phân tử nhỏ hơn và đưa vào tế bào. Nitơ là nguyên tố cần thiết cho sự

tổng hợp protein, purine, pyrimidine và một số dẫn xuất của polysaccharide. Những

nguồn nitơ mà nấm sử dụng gồm: nitrat, amon, nitơ hữu cơ như peptone, cao nấm

men,... Ngoài ra, nguồn khoáng như KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, CaCl2 cũng như

vitamin góp phần vào quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm [36]. Để thu được

lượng sinh khối cũng như thành phần và hàm lượng các hợp chất mong muốn trong

nấm cao nhất thì các nhà nghiên cứu đã tiến hành các thí nghiệm để xác định thành

phần dinh dưỡng, nhiệt độ, pH,… tối ưu cho sự tăng trưởng của Cordyceps và tùy

vào từng loài mà có môi trường tối ưu khác nhau như trong bảng 1.3.

1.3.2. Các nghiên cứu về nuôi cấy Cordyceps bổ sung selen

Để tăng hoạt tính của C. sinensis cũng như giúp bổ sung lượng Se cần thiết

cho cơ thể, chiến lược nuôi cấy làm giàu Se hữu cơ đã được các nhà khoa học quan

tâm. Tuy nhiên, khi bổ sung Se ở nồng độ cao sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của

nấm, vì vậy, những nghiên cứu về khả năng thích nghi, tối ưu thành phần và điều kiện

môi trường nuôi cấy là vấn đề cấp thiết. Ji và cộng sự (2014) đã tiến hành nuôi cấy

C. sinensis trong môi trường có bổ sung Se. Kết quả cho thấy khi bổ sung 0,4% Se

thì lượng Se tích lũy trong sinh khối đạt 4789,26 ± 13,0𝜇g/g và có khả năng kháng

lại các khối u trong cổ tử cung trên chuột đồng thời cũng thấy các hoạt tính khác như

catalase, Na+/K+-ATPase và glutathion S transferase được phục hồi [37].

Kết quả nghiên cứu khác của Zheng và cộng sự năm 2014 trên C. sinensis SU-

1 cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa trên nấm được làm giàu Zn, Ge, Se được cải thiện.

Nuôi cấy được tiến hành với môi trường lỏng có chứa khoai tây 200g/L, glucose

30g/L, cao chiết nấm men 4g/L, KH2PO4 2g/L, MgSO4.7H2O 1g/L và CMC-Na 2g/L,

pH 6,5 đồng thời tối ưu hóa nồng độ Zn, Ge, Se. Ở nồng độ Zn, Ge, Se lần lượt là

100mgSe/L, 200mgSe/L, 20mgSe/L cho thấy khối lượng chất khô đạt cao nhất. Hoạt

tính của glutathione peroxidase (GSH-Px) và superoxide dismutase (SOD) trong thử

nghiệm in vivo cũng cao hơn so với đối chứng. Đồng thời phân tích hàm lượng Se

tích lũy trong sinh khối bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) thì

lượng Se đạt được 1260,16 ± 107,12µg/g [38]. Năm 2006, Yang và cộng sự đã tiến

hành nuôi cấy C. sinensis trong môi trường có bổ sung natri selenite với nồng độ

33,78mgSe/L thì hàm lượng selenopolysaccharide nội bào thu được là 197,35mg/g,

đồng thời cũng cải thiện rõ rệt một số hoạt tính sinh học như kháng oxy hóa, năng lực

khử và thử nghiệm thành công trên mô hình chuột đái tháo đường [19]. Zhang và

cộng sự (2014) đã báo cáo rằng điều kiện nuôi cấy tối ưu của C. militaris giàu Se cho

tỷ lệ chuyển hóa thành Se hữu cơ cao nhất là 20mgSe/L khi nuôi 5 ngày ở pH 7 trong

môi trường lỏng gồm (%w/v): saccharose 3, khoai tây 20, NaNO3 0,2 và KH2PO4 0,5.

Với điều kiện này, tỷ lệ chuyển hóa thành Se hữu cơ có thể đạt 18,44%. Kết quả cho

thấy, khi môi trường có nồng độ Se thấp có thể kích thích sợi nấm C. militaris phát

triển, trong khi Se ở nồng độ cao thì cản trở sự phát triển, do vậy làm giảm tỷ lệ

chuyển hóa thành Se hữu cơ [39]. Những nghiên cứu trước đây của Hu và cộng sự

(2018a, 2018b), Tie và cộng sự (2014) về làm giàu Se trên nấm Cordyceps militaris

cho thấy nấm có khả năng chuyển hóa các dạng Se vô cơ thành hữu cơ như

selenocystine, selenomethionine và những dạng Se hữu cơ khác thông qua phương

pháp HPLC-ICP-MS [40] [41] [42]. Và có một số nghiên cứu khác đã sử dụng kĩ

thuật pha loãng đồng vị phóng xạ để xác định các dạng hợp chất Se trong nấm [43]

[44].

Ngoài ra, tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy bằng phương pháp đáp

ứng bề mặt (RSM) cũng đã được nghiên cứu áp dụng để nâng cao sinh khối và tích

lũy Se qua đánh giá sự tương tác giữa các yếu tố để tìm được điểm cực trị hoặc vùng

tối ưu cho thí nghiệm. Phương pháp này còn giúp tiết kiệm tối đa thời gian và công

sức so với phương pháp tối ưu kinh điển. Do đó, nhiều công trình khoa học đã sử

dụng các mô hình tối ưu như Box-Behnken, D-optimal khi nuôi cấy làm giàu Se ở

nấm men [45] [46]. Zheng và cộng sự (2014) cũng đã nghiên cứu tối ưu hóa môi

trường để làm giàu Zn, Ge, Se ở nấm C. sinensis [38], tối ưu hóa môi trường để thu

nhận seleno-exopolysaccharide (Se-EPS) ở nấm Cordyceps sobolifera [47] và thu

nhận selenopolysaccharide ở nấm C. sinensis [19]. Năm 2016, Huỳnh Thị Diễm Phúc

và cộng sự đã sử dụng mô hình BCPharSoft để tối ưu hóa môi trường nuôi cấy C.

sinensis bổ sung Zn [48].

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Chủng nấm Cordyceps sinensis CS-YK2007 được cung cấp bởi TS. Trương

Bình Nguyên, Viện nghiên cứu và ứng dụng nông nghiệp công nghệ cao, Trường Đại

học Đà Lạt, Lâm Đồng.

2.1.2. Hóa chất

Na2SeO3.5H2O, Na2SeO4.12H2O, 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-

sulfonate) (ABTS), H2O2, FeSO4, Na2S2O8, đệm phosphate (Phosphate-buffered

saline), Trypsin, EDTA, xanthine oxidase, allopurinol, xanthine, α-glucosidase, 1,1-

diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), ascorbic acid (vitamin C), K3[Fe(CN)6], TCA,

FeCl3, CTAB, isopropropanol, Hs Taq, albumin (BSA), p-nitrophenyl-α-D-

glucopyranoside, Eagle’s Minimal Essential Medium (EMEM), FBS, L-glutamine,

HEPES, amphotericin B, penicillin G, streptomycin, acid trichloroacetic, SRB, acid

acetic, acid nitric (HNO3 65%), acid chlorhydric (HCl 37%), sodium carbonate,

ammonium acetate, dung dịch H2O2 30%, protease từ Streptomyces griseus, type

XIV, proteinase K từ Tritirachium album, methanol cho HPLC, acetonitrile cho

HPLC, selenocystine, methylselenocysteine, Selenocystamine dihydrochloride,

selenomethionine (Sigma Aldrich). Selen đồng vị làm giàu (77Se-enriched, Isoflex

USA), selen nguyên tố (BDH). Dung dịch Tris ba-zơ (Promega), Mueller Hinton agar

(Himedia), Acarbose (Fisher Scientific), camptothecin (Calbiochem). Thành phần

môi trường nuôi cấy: khoai tây, glucose, saccharose, agar (Việt Nam), cao nấm men,

peptone, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2 (Trung Quốc).

2.1.3. Thiết bị

Nồi hấp Jibimed (Trung Quốc); Tủ cấy Shinsaeng (Hàn Quốc); Máy quang

phổ Phoenix (Đức); Hệ thống ICP-MS Agilent 7700x (Mỹ); Kính hiển vi (Trung

Quốc); Máy đo độ ẩm AND MX–50 (Nhật Bản); Tủ sấy MEMMERT (Đức); Máy đo

pH HANNA (Romania); Máy ly tâm Micro 17R (Đức); Cân kỹ thuật PioneerTM

Ohaus (Mỹ); Hệ thống NexION 350X Perkin Elmer (Mỹ); Bể điều nhiệt Julabo F34

(Đức).

2.2. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của selen lên khả năng sản xuất sinh khối

của nấm Cordyceps sinensis

Nội dung 2: Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối

nấm Cordyceps sinensis giàu selen

Nội dung 3: Đánh giá hoạt tính sinh học của sinh khối nấm Cordyceps sinensis

giàu selen

2.3. Địa điểm và thời gian thực hiện

2.3.1. Địa điểm thực hiện:

Viện Sinh học Nhiệt đới

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh

Viện Y Tế Công Cộng TP. Hồ Chí Minh

2.3.2. Thời gian thực hiện

Tháng 01/2015 – tháng 6/2020

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Chuẩn bị giống

Giống cấp 1 được thực hiện trên môi trường PGA gồm khoai tây (200g/L),

glucose (20g/L), agar (15g/L). Sau đó, cấy chuyền 1 khoanh giống từ ống giống thạch

nghiêng, nuôi cấy ở 22 ± 2°C, trong 15 ngày. Giống cấp 2 được tiến hành trên môi

trường lỏng PG gồm khoai tây (200g/L), glucose (20g/L). Mỗi bình giống cấy 2

khoanh giống cấp 1 vào bình erlen chứa 200 mL môi trường. Ủ ở 22 ± 2°C, trong 10

ngày.

2.4.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của Se đến sự sinh trưởng C. sinensis trên môi

trường PGA và môi trường lỏng PS

2.4.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của dạng và nồng độ Se đến C. sinensis trên

môi trường PGA

Chuẩn bị môi trường PGA gồm khoai tây (200g/L), glucose (20g/L), KH2PO4

(0,5g/L), MgCl2 (0,1g/L), pepton (6g/L), cao nấm men (4g/L), agar (15g/L). Sau đó,

bổ sung muối selenite (Na2SeO3.5H2O), selenate (Na2SeO4.10H2O) và selenourea

(SeC(NH2)2) với các nồng độ từ 5 – 40mgSe/L (Nồng độ Se trong môi trường được

quy đổi dựa vào thành phần phần trăm của nguyên tố Se trong mỗi muối selenate,

selenite và selenourea) và đổ vào các đĩa petri. Tiến hành cấy 1 khoanh giống cấp 1

(đường kính 1 cm) vào tâm đĩa petri, ủ ở nhiệt độ 22 ± 2°C. Theo dõi tốc độ lan tơ

của sợi nấm ở các thời điểm 5, 10, 15 ngày và xác định đường kính sợi nấm qua kính

trắc vi thị kính.

2.4.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của dạng và nồng độ Se đến C. sinensis trên

môi trường lỏng PS

Chuẩn bị 2L môi trường lỏng PS gồm khoai tây (200g/L), saccharose (50g/L),

pepton (6g/L), cao nấm men (4g/L), KH2PO4 (0,5g/L) và MgCl2 (0,1g/L). Hấp khử

trùng 30 phút ở 121°C, pH 6 - 7. Sau đó, bổ sung muối selenite (Na2SeO3), selenate

(Na2SeO4) và selenourea (SeC(NH2)2) với các nồng độ từ 5 – 40mgSe/L. Tiếp theo,

đổ 200mL môi trường ra các hộp nhựa. Nuôi ở nhiệt độ 22 ± 2°C, theo dõi trong 40

ngày. Sinh khối được thu nhận bằng cách lọc qua rây và rửa nhiều lần với nước cất

nhằm loại bỏ hoàn toàn Se còn lại trong môi trường bám vào. Sấy khô ở 60°C. Phân

tích hàm lượng Se có trong sinh khối bằng phương pháp ICP -MS.

2.4.3 Phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng loại muối selenate đã chọn ở thí

nghiệm 2.4.2. Phương pháp cải tiến này được tiến hành bằng cách nuôi cấy thích nghi

nấm Cordyceps sinensis trong môi trường selenate từ thấp đến cao. Phương pháp

được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2014) [39] như sau: (i)

Kích hoạt hệ sợi nấm C. sinensis trong môi trường PGA với lượng selenate 5mgSe/L

trong 7 ngày. (ii) Sau đó, chuyển các sợi nấm sang môi trường PS lỏng với lượng

selenate tương tự và nuôi ở 22 ± 2°C, trong 10 ngày để thu được hệ sợi nấm. (iii)

Chuyển sợi nấm vào môi trường PS lỏng có lượng selenate 10mgSe/Lvà nuôi chúng

ở 22 ± 2°C, trong 10 ngày để có được hệ sợi. (iv) Sau đó, cho sợi nấm vào môi trường

PS lỏng chứa 7,5mgSe/L selenate cho phục hồi tăng sinh để thúc đẩy sợi nấm phát

triển ở 22 ± 2°C, trong 10 ngày. (v) Sau 10 ngày, chuyển chúng qua môi trường PGA

với 15mgSe/L Se và ủ 10 ngày với điều kiện tương tự. (vi) Sau đó, chuyển chúng

sang môi trường PS lỏng có chứa 15mgSe/L selenate trong 15 ngày cho việc phục

hồi. (vii) Tiếp tục lặp lại tương tự ở bước (iii) và (iv) cho đến nồng độ selenate

25mgSe/L. Sau đó, cấy chuyền sợi nấm ở nồng độ selenate 25mgSe/L qua ống thạch

nghiêng selenate-PGA và giữ ở 4°C. Giống nấm C. sinensis sau khi trải qua quá trình

thích nghi này được sử dụng nuôi cấy trên môi trường bổ sung selenate 25mgSe/L

như mục 2.4.2.1 và 2.4.2.2. Giống ban đầu được sử dụng như thí nghiệm đối chứng.

2.4.4. Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy Cordyceps sinensis trên môi

trường lỏng bổ sung selen

Phần này, chúng tôi sử dụng chủng nấm Cordyceps sinensis hoạt hóa trên môi

trường thạch như kết quả ở mục 2.4.3

2.4.3.1. Sàng lọc thành phần môi trường bằng thiết kế Plackett – Burman

Sử dụng thiết kế Plackett-Burman để sàng lọc các thông số chính trong một số

lượng lớn các yếu tố của quá trình tối ưu [49]. Sàng lọc thành phần môi trường ảnh

hưởng đến tổng hợp được tiến hành ở 2 mức (-1 và +1) (bảng 2.1). Các nghiệm thức

thiết kế theo Plackett – Burman với các yếu tố được lựa chọn là khoai tây, saccharose,

peptone, cao nấm men, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2 được liệt kê trong bảng 2.2, trong

đó X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 là các biến độc lập. Bố trí 12 thí nghiệm như bảng 2.2.

Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 2L môi trường, bổ sung 10% giống cấp 2 và

muối Se vào môi trường để đạt nồng độ cuối cùng theo thí nghiệm 2.3. Sau đó, đổ

200mL môi trường vào hộp nhựa. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 22 ± 2°C, theo dõi trong

40 ngày. Sinh khối thu nhận bằng cách lọc qua rây, rửa sạch nhiều lần với nước cất

và sấy khô ở 60°C. Phân tích hàm lượng Se trong sinh khối bằng phương pháp ICP-

MS.

Bảng 2.1. Các biến trong ma trận Plackett-Burman

Mức Yếu tố Đơn vị Ký hiệu Thấp (-1) Cao (+1)

g/L 150 250 Khoai tây X1

g/L 40 60 Saccharose X2

g/L 5 15 Peptone X3

g/L 5 15 Cao nấm men X4

g/L 0,5 1.5 X5 KH2PO4

g/L g/L 0,5 0,1 1,5 1 X6 X7 K2HPO4 MgCl2

Bảng 2.2. Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman

Các biến NT X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7

1 1 1 -1 -1 -1 -1 1

-1 1 1 1 1 1 -1 2

-1 -1 1 1 -1 1 -1 3

1 -1 -1 -1 1 1 -1 4

1 -1 1 -1 1 1 1 5

-1 1 1 -1 1 -1 1 6

1 1 -1 1 -1 1 1 7

-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 8

-1 -1 -1 1 1 -1 1 9

-1 1 -1 -1 -1 1 1 10

1 -1 1 1 -1 -1 1 11

1 1 -1 1 1 -1 -1 12

2.4.3.2. Tối ưu hóa thành phần môi trường bổ sung selen bằng mô hình Box -

Behnken

Dựa vào kết quả của thí nghiệm sàng lọc, mô hình Box – Behnken được sử

dụng để tối ưu hóa môi trường nuôi cấy nấm C. sinensis bổ sung Se [50]. Mô hình

thực hiện ở 3 mức (-1, 0 và +1) với 17 nghiệm thức (bảng 2.3, bảng 2.4). Mỗi nghiệm

thức được thực hiện với 2L môi trường, bổ sung 10% giống cấp 2 và muối Se vào

môi trường để đạt nồng độ cuối cùng theo thí nghiệm 2.3. Sau đó, đổ 200mL môi

trường vào hộp nhựa dung tích 650mL. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 22 ± 2°C, theo dõi

trong 40 ngày. Sinh khối được thu nhận và rửa sạch nhiều lần với nước cất và sấy khô

ở 60°C.

Bảng 2.3. Nồng độ các yếu tố sử dụng trong Box – Behnken

Yếu tố Đơn vị

-1 -1 -1 -1 Mức 0 0 0 0 +1 +1 +1 +1 g/L g/L g/L Y1 Y2 Y3

Bảng 2.4. Thiết kế Box - Behnken

Các biến

Nghiệm thức

Y1

Y2

Y3

-1

Hàm lượng Se được phân tích bằng phương pháp ICP-MS. Hàm đáp ứng được

chọn là sinh khối (g/L) hoặc hàm lượng Se (µg/g), mô hình hóa được biểu diễn bằng

2 +

phương trình hồi quy:

A = B0 + B1X1 + B2X2 + B3X3 + B12X1X2 + B13X1X3 + B23X2X3 + B11X1

2 + B33X3

2. Trong đó, B1, B2, B3 là các hệ số bậc 1; B11, B22 và B33 là hệ số bậc

B22X2

2; B12, B23 và B13 là các hệ số tương tác của từng cặp yếu tố; X1, X2, X3 là các biến

độc lập. Số liệu được phân tích bằng chương trình “Design Expert® 7.0" Stat-Ease,

Inc., Minneapolis, Hoa Kỳ.

2.4.3.3. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng mô hình đáp ứng bề mặt D-optimal

Tiến hành tối ưu hóa điều kiện môi trường bằng D-optimal được trình bày ở

bảng 2.5 và được lặp lại 3 lần, thí nghiệm được thực hiện ở 3 mức (-1, 0 và +1) (bảng

2.6) với cường độ ánh sáng trắng 8,618µmolphoton/m2/s, ánh sáng đỏ

6,617µmolphoton/m2/s, ánh sáng xanh dương 13,872µmolphoton/m2/s [46]. Môi

trường gồm khoai tây, saccharose, cao nấm men, peptone, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2

thu được từ thí nghiệm tối ưu 2.4.2. Muối Se được bổ sung vào môi trường để Se đạt

nồng độ cuối theo thí nghiệm 2.3. Sau đó, đổ 200mL môi trường ra hộp nhựa. Nuôi

ở nhiệt độ 22±2°C, theo dõi trong 40 ngày. Sinh khối thu nhận bằng cách lọc qua rây,

rửa sạch nhiều lần với nước cất 1 lần, sấy khô ở 60°C. Phân tích hàm lượng Se có

trong sinh khối bằng phương pháp HPLC ICP-MS.

Bảng 2.5. Thiết kế Box – Behnken

Nghiệm thức 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Nhiệt độ -1 1 -1 1 -1 0 1 0 0 -1 1 -1 1 0 -1 1 -1 1 0 pH -1 -1 1 1 0 0 0 -1 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 1 0 Ánh sáng -1 -1 -1 -1 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1

Bảng 2.6. Mức khảo sát của các yếu tố sử dụng trong D-optimal

Mức Yếu tố Ký hiệu -1 0 +1

Nhiệt độ 20 25 30 Z1

pH 6 7 8 Z2

Ánh sáng Đỏ Trắng Xanh Z3

2.4.5. Phương pháp thu nhận cao chiết

2.4.5.1. Cao chiết tổng

Tiến hành chiết cao tổng (cao EtOH) theo phương pháp chiết ngấm kiệt của

Nguyễn Kim Phi Phụng năm 2007 [51]. Sinh khối nấm được xay nhỏ, làm ẩm với

một lượng nhỏ ethanol (EtOH) 96%. Ngâm sinh khối với EtOH 96% theo tỷ tệ 1:10

trong 48 giờ. Dung dịch sau đó được chiết ngấm kiệt với tốc độ khoảng 1mL/phút,

rút dịch chiết cho đến khi dịch chiết trong. Cô quay chân không để đuổi EtOH thu lấy

cao EtOH thô và cao chiết được bảo quản trong chai tối màu ở 4°C. Hiệu suất được

tính như sau:

H% = Mcao/Msk*100%. Trong đó: Msk là khối lượng sinh khối ban đầu đã trừ

độ ẩm, Mcao là khối lượng cao EtOH thu được đã trừ độ ẩm.

2.4.5.2. Cao chiết phân đoạn

Cao EtOH thô được tiếp tục phân đoạn bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng [4].

Cho dung dịch cao EtOH vào bình lóng, thêm vào khoảng 100mL petroleum ether

(PE), lắc nhẹ, thu nhận pha PE phía trên. Phần dịch còn lại lần lượt chiết với dung

môi ethyl acetate (EtOAc), butanol (BuOH) và thu nhận pha nước cuối, loại dung

môi bằng hệ thống cô quay chân không và cao chiết được bảo quản trong chai tối màu

ở 4°C. Hiệu suất thu nhận được tính như sau:

H% = (Mcpd/Msk*x) * 100%; Trong đó: Msk là khối lượng sinh khối ban đầu

đã trừ độ ẩm; Mcpd là khối lượng cao phân đoạn thu được đã trừ độ ẩm; x là tỉ lệ giữa

lượng cao EtOH dùng phân đoạn và Msk.

2.4.5.3. Cao chiết CPS

Bã nguyên liệu sau khi chiết ngấm kiệt đem đi sấy khô. Sau đó chiết với nước

nóng ở 65°C, lọc lấy dịch chiết. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút để loại cặn. Cô

quay giảm thể tích dịch chiết, sau đó tủa với cồn 96o tỷ lệ 1 dịch : 4 ethanol (v/v), bỏ

dịch lấy tủa. Sấy khô mẫu ở 50°C, bảo quản trong chai tối màu ở 4°C.

2.4.5.4. Thu nhận EPS

Quy trình tách chiết EPS được thực hiện dựa trên nghiên cứu của Lê Thị Thúy

Hằng và cộng sự (2018) [52]. Dịch nuôi cấy nấm C. sinensis được thu nhận bằng cách

ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Cô đặc dịch nổi bằng cô quay chân không ở

60°C còn 1/10 thể tích ban đầu. Tủa với ethanol lạnh 96% theo tỷ lệ v/v (1 dịch: 4

ethanol), trong 24h ở 4°C. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi, thu

tủa và rửa tủa với ethanol 96%. Sấy khô tủa trong 48h thu được EPS và bảo quản

trong chai tối màu ở 4°C.

2.4.5.5. Thu nhận IPS

Quy trình tách chiết IPS được thực hiện dựa trên nghiên cứu của Li và cộng

sự 2013 [53]. 10g sinh khối bột nấm được chiết với 20mL NaOH 0,4M ở 60°C. Dịch

chiết được lọc qua giấy lọc Whatman. Lặp lại quá trình này từ 4 - 5 lần. Ly tâm dịch

chiết 5000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ cặn. Dịch được cô đặc giảm thể tích bằng

máy cô quay chân không ở 60°C. Bổ sung ethanol lạnh 96% vào dịch chiết theo tỉ lệ

(1 dịch : 5 ethanol), giữ qua đêm ở 4°C. Tủa polysaccharide được thu nhận bằng cách

ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, rửa tủa nhiều lần với ethanol 96% và hòa

trong nước cất 2 lần. Chuyển vào màng thẩm tách 1 - 2 kDa, thẩm tách với nước cất

trong 24h. Mẫu được sấy khô trong 24h và bảo quản trong chai tối màu ở 4°C.

2.4.6. Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết

2.4.6.1. Khả năng bắt gốc tự do ABTS

Phương pháp bắt gốc tự do ABTS được tiến hành theo nghiên cứu của Leung

và cộng sự (2009) [54]. Đầu tiên, trộn dung dịch ABTS 7mM với dung dịch K2S2O8

2,45mM tỷ lệ 1: 1 (v/v) trong đệm PBS, ủ trong tối 12 - 16 giờ, nhiệt độ phòng, thu

được gốc tự do ABTS+. Pha loãng trong đệm PBS pH 7,4 cho đến khi dung dịch có

OD734 = 0,70 ± 0,02 (dung dịch A). Cho 3000µL dung dịch A vào 100µL dung dịch

mẫu cần phân tích, ủ tối trong 30 phút và đo mật độ quang ở bước sóng 734nm. Khả

năng bắt gốc tự do ABTS+ được tính bằng công thức:

% bắt gốc tự do = (OD0-OD)/ OD0*100%. Trong đó: OD0: giá trị OD734 của

mẫu trắng; OD: giá trị OD734 của mẫu thử. Chứng dương sử dụng trong thí nghiệm là

vitamin C (acid ascorbic).

2.4.6.2. Khả năng bắt gốc tự do DPPH

Phương pháp bắt gốc tự do DPPH được tiến hành theo nghiên cứu của Xiao

và cộng sự (2014) [55]. Dung dịch DPPH 40µg/mL được pha trong methanol 80%.

Cho 0,5mL dung dịch mẫu vào 0,75mL dung dịch DPPH, vortex cho đều và ủ 30

phút trong tối ở nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang ở bước sóng 517nm. Khả năng bắt

gốc tự do DPPH được tính bằng công thức:

% bắt gốc tự do = (OD0-OD)/OD0*100%. Trong đó: OD0: giá trị OD517 của

mẫu trắng; OD: giá trị OD517 của mẫu thử. Chứng dương sử dụng trong thí nghiệm là

vitamin C (acid ascorbic).

2.4.6.3. Xác định năng lực khử

Năng lực khử của mẫu được xác định theo phương pháp của Huỳnh Thư và

cộng sự (2012) [56]. Cho 0,5mL dung dịch đệm phosphate 0,2M pH 6,0 vào 0,2mL

dung dịch mẫu. Thêm 0,5mL dung dịch K3[Fe(CN)6] 1% vào hỗn hợp trên, lắc đều,

ủ ở 50°C trong 20 phút. Thêm 0,5mL dung dịch TCA 10%, lắc đều. Cho 0,8mL dịch

nổi vào 2mL nước cất. Thêm vào 0,4mL FeCl3 1%. Đo mật độ quang ở bước sóng

700nm. Năng lực khử được tính theo công thức:

(OD0-OD)/OD0*100%. Trong đó: OD0: giá trị OD700 của mẫu trắng; OD: giá

trị OD700 của mẫu thử.

2.4.6.4. Xác định khả năng bảo vệ DNA

Phương pháp này đánh giá khả năng bảo vệ DNA trước sự tấn công của gốc

OH tự do tạo ra từ phản ứng fenton. Khảo sát được tiến hành trên đoạn gen ITS của

nấm sò trắng (Pleurotus pulmonarius) với quy trình dựa theo công bố của Huỳnh Thư

và cộng sự (2012) [57]. Tạo hỗn hợp phản ứng với 4µL DNA, 1µL cao chiết (nồng

độ 1500, 1000, 500µg/mL), 1µL H2O2 1M và 1µL FeSO4 140mM. Ủ 20 phút, bổ sung

1µL EDTA 0,5M. Đọc kết quả điện di trên gel agarose 1,5% bằng hệ thống Gel doc

và định dạng 3D bằng phần mềm UVITEC 1D.

2.4.6.5. Hoạt tính ức chế xanthine oxidase

Hoạt tính được tiến hành đánh giá theo phương pháp của Nguyen và cộng sự

(2004) [58]. Hỗn hợp phản ứng được tạo bởi 50µL cao chiết ở các nồng độ khác nhau,

35µL đệm phosphate 70mM, pH 7,5 và 30µL enzyme XO 0,01U/mL (pha trong đệm

phosphate). Hỗn hợp được ủ ở 25C trong 15 phút sau đó bổ sung 60µL xanthine

150µM. Tiến hành ủ hỗn hợp này ở 25C trong 30 phút. Sau khi ủ, bổ sung 25µL HCl

1N để dừng phản ứng và tiến hành đo độ hấp thụ bước sóng 290nm bằng máy UV

spectrophotometer. Allopurinol được sử dụng làm chứng dương. Khả năng ức chế

XO của cao chiết (% I) được tính theo công thức:

% I = (A – B)/A*100%. Trong đó, A là OD290 mẫu trắng, B là OD290 của mẫu thử.

2.4.6.6. Đánh giá hoạt tính kháng viêm

Thực hiện dựa trên phương pháp của Trần Quốc Tuấn và cộng sự (2014) [59].

Hút 2mL đệm acetate 0,025M (pH 5,5) vào các ống nghiệm, thêm 1mL albumin bò

0,2%, tiếp tục bổ sung thêm 1mL các mẫu cao thử nghiệm (0 –1500μg/mL), ủ ở 37°C

trong 30 phút. Đun cách thủy ở 67°C trong 4 phút, làm lạnh và đo OD ở bước sóng

660nm. Hoạt tính ức chế biến tính được tính:

Khả năng kháng viêm = (OD0-OD)/OD0*100%. Trong đó: OD0: giá trị OD660

của mẫu trắng; OD: giá trị OD660 của mẫu thử. Thuốc Diclofenac được sử dụng làm

chứng dương trong phản ứng.

2.4.6.7. Hoạt tính ức chế α-glucosidase

Thực hiện quy trình khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase nấm men được

tham khảo theo quy trình của Vũ Thị Bạch Phượng [60]. Bổ sung lần lượt 50µl mẫu

cao thử nghiệm (pha trong DMSO 5%) và 40µl enzyme 0,05UI/mL vào 50µl đệm

phosphate 0,1M (pH 6,9), ủ hỗn hợp ở 37°C trong 20 phút. Sau đó, thêm 40µl pNPG

5mM, ủ ở 37°C, 20 phút. p-nitrophenol được sinh ra sau phản ứng được đo ở bước

sóng 405nm sau khi thêm 130µl Na2CO3 0,2M. Acarbose được sử dụng làm chứng

dương. Phần trăm ức chế được tính theo công thức sau:

% Ức chế = [1 - (A)/(B)] x 100%. Trong đó: A giá trị OD405 của mẫu ; B giá

trị OD405 của mẫu trắng.

2.4.6.8. Khảo sát khả năng gây độc tế bào

Nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào ung thư MCF-7, Jurkat và dòng tế bào thường fibroblast được

nuôi trong môi trường EMEM có bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum) ở các điều

kiện 37°C và 5% CO2 đạt độ phủ khoảng 70-80% (sau 24 giờ nuôi cấy). MCF-7 và

Jurkat được sử dụng ở chu kì thứ 4-20, fibroblast được sử dụng ở chu kì 2 – 5. Các

dòng tế bào dùng trong thử nghiệm: tế bào ung thư vú MCF-7, tế bào ung thư máu

Jurkat được mua từ ATCC (Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ), dòng tế bào thường

fibroblast được phân lập từ bao quy đầu thu nhận tại bệnh viện Bình Dân và lưu giữ

tại bộ môn Di truyền – Khoa Sinh học - Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Khoa

Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

Thử nghiệm độc tính SRB (Sulforhodamin B assay)

Thử nghiệm được thực hiện theo quy trình của Nguyen và cộng sự (2017) [61].

Tế bào được ủ 24h vào các giếng với mật độ 10000 tế bào/giếng trong đĩa 96 giếng,

tiếp tục được ủ với các chất thử nghiệm (100µg/ml) trong 48h. Sau đó, tế bào được

cố định với 50μl TCA (trichloroacetic acid) 50% lạnh tại 4°C, 1-3 giờ. Rửa đĩa bằng

nước cất 1 lần và nhuộm với 100μl SRB 0,2% trong 20 phút. Rửa đĩa với acid acetic

1% để khô, bổ sung 100μl dung dịch Tris-base 10mM vào mỗi giếng khoảng 15 phút.

Đọc trên máy đọc 96 giếng (Synergy HT, Biotek Instruments) ở bước sóng 492 nm

và 620nm. Tỉ lệ gây độc tế bào được tính theo công thức sau: %I = (1 – ODTN/ODC)

x 100%. Trong đó: Giá trị ODTN và ODC được tính theo công thức chung: OD = OD492

– OD620 (1); OD492 (hoặc OD620) = ODtế bào – ODblank (2). ODblank: là giá trị OD của

giếng blank (không có tế bào). Camptothecin được sử dụng làm chứng dương.

2.7. Định lượng selen trong nấm Cordyceps sinensis

2.7.1. Phân tích selen tổng bằng phương pháp HPLC-ICP-MS

Cân chính xác 0,5g mẫu, ngâm với 5mL HNO3 68% trong 4h. Đun nhẹ ở 80°C

cho tan mẫu, sau đó đun ở 160°C cho đến hết khói nâu. Lấy mẫu ra để nguội, thêm

2mL HClO4 72% đun cho đến khi dung dịch trong và xuất hiện cột khói trắng. Lấy

mẫu ra để nguội, thêm 1mL H2SO4 98% đun cho đến khi còn 2mL dung dịch. Định

mức 100mL, sau đó rút 500µL pha loãng thành 25mL. Dung dịch được đo bằng

phương pháp ICP-MS. Sử dụng đồng vị Se78, nội chuẩn Ge74. Nồng độ mẫu được tính

theo theo phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất.

2.7.2. Phân tích selen nguyên dạng bằng phương pháp HPLC-ICP-MS

Quy trình phân tích được tham khảo theo Gergely và cộng sự (2006) [62]. Cân

0,0508g mẫu, thêm 5 hoặc 10mL nước cất siêu sạch, thêm vào 0,02g enzyme

proteinase K trộn đều, lắc và giữ ở 50oC trong 24h. Sau đó, thêm tiếp 0,03g enzyme

proteinase XIV lắc và giữ ở 50oC trong 24h. Ly tâm 20 phút với tốc độ 5000rpm, lọc

qua giấy lọc 0,45m, dung dịch sau lọc dùng để chạy HPLC-ICP/MS. Nồng độ các

Se nguyên dạng (selenite, selenate, selenocystine (SeCys2), selenomethylcystine

(SeMetCys), selenocystamine (SeCya), selenomethionine (Se-Met)) được tính theo

theo phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất.

2.7.3. Phân tích FT-IR

Phổ hồng ngoại IR là một kỹ thuật quan trọng trong hóa học hữu cơ, được sử

dụng để xác định sự hiện diện của các nhóm chức năng trong một phân tử chất. Mỗi

loại dao động trong phân tử hữu cơ như: dao động giãn đối xứng, giãn bất đối xứng,

uốn cong trong một mặt phẳng và uốn ngoài mặt phẳng sẽ hấp thụ ở một tần số xác

định, và phổ IR giúp xác định được các loại dao động đặc trưng của các liên kết hay

các nhóm chức có trong phân tử. Thí nghiệm này được thực hiện tại Viện Công nghệ

Hóa học, TP HCM.

2.8. Thử nghiệm độc tính cấp của sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen

Khảo sát độc tính cấp bằng đường uống cao chiết theo phương pháp của Bộ Y

tế [63]. Cho chuột uống bột sinh khối ở liều tối đa có thể qua kim (thể tích cho uống

0,2ml/10g thể trọng). Theo dõi và ghi nhận tình trạng chuột bình thường, hay các

triệu chứng quan trọng ở chuột không chết hoặc trước khi chết (gãi mõm liên tục,

chạy hoảng loạn, ngã xiêu vẹo, co giật, run rẩy, tím tái ở các bộ phận cơ thể, tư thế

nằm, đứng, …) và số chuột tử vong trong vòng 72h. Có 3 trường hợp có thể xảy ra:

Trường hợp 1: Sau khi cho chuột uống bột sinh khối, số chuột trong lô thử nghiệm

vẫn bảo toàn, xác định liều cao nhất có thể qua kim mà không làm chết chuột. Liều

này được ký hiệu là Dmax và liều tương đối an toàn dùng trong các thực nghiệm dược

lý có thể bằng 1/5 Dmax; Trường hợp 2: Sau khi cho chuột uống, tỉ lệ tử vong là 100%

thì đây là liều chết tuyệt đối – LD100. Tính toán và gây lô thử nghiệm để tiếp tục xác

định được liều không làm chết con vật nào – LD0. Từ đó, suy ra liều LD50 được tính

theo công thức Karber - Behrens. Trường hợp 3: Sau khi cho uống, tỉ lệ tử vong thấp

hơn 100%, không xác định được liều gây chết tuyệt đối. Đối với trường hợp này,

không thể suy ra liều LD50, nhưng có thể xác định được liều tối đa không gây chết

chuột, gọi là liều dưới liều chết – LD0. Liều tương đối an toàn dùng cho thực nghiệm

dược lý có giá trị bằng 1/5 hoặc 1/10 LD0.

2.9. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được thể hiện dưới dạng trung bình độ lệch chuẩn, các thí nghiệm được

lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm IBM SPSS Statistics 20.0,

Design Expert® 7.0 Stat-Ease. Giá trị có p < 0,05 được chấp nhận là có sự khác biệt

có ý nghĩa thống kê.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Về ảnh hưởng của selen đến sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis

3.1.1 Ảnh hưởng của selen đến sự phát triển của tơ nấm Cordyceps sinensis

Selen là một nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của

nấm; tuy nhiên khi lượng Se trong môi trường vượt quá mức chịu đựng của nấm

chúng sẽ gây độc và làm chết nấm. Do vậy, nghiên cứu khả năng lan tơ và sản xuất

sinh khối của nấm C. sinensis trên môi trường thạch PGA và môi trường lỏng có bổ

sung 0 - 40mgSe/L sử dụng 3 nguồn selen bao gồm selenate, selenite, và selenourea

là cần thiết để đánh giá mức độ ảnh hưởng của Se đến sự phát triển của nấm; đồng

thời chọn ra ngưỡng nồng độ Se thích hợp nằm trong giới hạn chịu đựng của nấm C.

sinensis. Từ đó định hướng nuôi cấy sinh khối C. sinensis giàu Se hữu cơ góp phần

nâng cao giá trị dược liệu của loài nấm này. Trong nghiên cứu này, nồng độ Se trong

môi trường được quy đổi dựa vào thành phần phần trăm của nguyên tố Se trong mỗi

muối selenate, selenite và selenourea.

Hình 3.1 thể hiện đường kính lan tơ của sợi nấm C. sinensis trên môi trường

PGA chứa Se từ 0 – 40mgSe/L sử dụng 3 muối Se selenite/selenate/selenourea ở thời

điểm 15 ngày. Nhìn chung, nấm C. sinensis có khả năng sinh trưởng trên môi trường

có bổ sung Se các nồng độ khảo sát. Đối với selenite, khi C. sinensis nuôi cấy ở nồng

độ Se thấp từ 5 - 25mgSe/L thì khả năng lan tơ không có sự khác biệt rõ rệt so với

đối chứng ở thời điểm 15 ngày. Tuy nhiên, sự phát triển của tơ nấm bắt đầu bị ức chế

khi nồng độ selenite > 25mgSe/L. Cụ thể, đường kính lan tơ của nấm ở nồng độ

40mgSe/L chỉ đạt 4,2 ± 0,2cm nhỏ hơn so với đối chứng 5,5 ± 0,1cm (p < 0,05). Bên

cạnh đó, màu sắc và hình thái của sợi nấm có sự thay đổi rõ rệt giữa các lô thí nghiệm

(Hình 3.1). Màu sắc mặt sau của tơ nấm trên môi trường PGA biến đổi từ màu trắng

sang màu đỏ sậm tương ứng với nồng độ Se tăng dần. Đồng thời, hình thái tơ nấm

cũng thay đổi, tơ nấm lan không tròn đều và có dấu hiệu lão hóa khi nuôi cấy trên

môi trường có selenite > 25mgSe/L. Điều này cho thấy, selenite thể hiện tác động gây

ức chế sự phát triển của nấm C. sinensis ở nồng độ > 25mgSe/L.

(A) Sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường PGA bổ

sung selenite và selenate từ 0 đến 40 mgSe/L ở thời điểm 15 ngày. (B) Đường kính

lan tơ của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường PDA có bổ sung selen từ 0 đến

40 mgSe/L sau 15 ngày. Ba nguồn selen tương ứng là selenite, selenate và selenoure.

Chữ cái trên mỗi cột thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê trong từng nhóm nghiệm

thức với giá trị α < 0,05.

Đối với selenourea, sự lan tơ của nấm bị ảnh hưởng nhiều bởi selenourea và

giảm dần khi tăng nồng độ selenourea từ 5 – 40mgSe/L, khi tăng lên nồng độ 35,

40mgSe/L sự phát triển của nấm hầu như bị ức chế hoàn toàn. Môi trường PGA cũng

đổi sang màu đỏ và càng đậm màu khi nồng độ Se tăng dần, các tơ nấm cũng mỏng

hơn so với đối chứng (hình 3.1). Trong khi đó, đường kính lan tơ của sợi nấm C.

sinensis trên môi trường chứa selenate từ 5 - 40mgSe/L thì không có sự khác biệt so

với môi trường đối chứng. Cụ thể, đường kính lan tơ ở nồng độ 40mgSe/L là 5,9 ±

0,9cm không có sự khác biệt so với đối chứng là 6,1 ± 0,5cm (p > 0,05). Hơn nữa,

màu sắc và hình thái của tơ nấm cũng không thay đổi so với đối chứng. Hình 3.1 cho

thấy, hầu hết các tơ nấm mọc tròn đều, màu trắng giống với đối chứng (ngoại trừ ở

nồng độ 25mgSe/L) và không có dấu hiệu bị lão hóa. Ngoài ra, đường kính lan tơ của

nấm trên các môi trường selenate đều cao hơn so với selenite và selenourea tương

ứng là 5,9 ± 0,9cm, 4,2 ± 0,6cm, 2,2 ± 0,03cm ở nồng độ 40mgSe/L, ở thời điểm 15

ngày (p < 0,05). Qua thí nghiệm này cho thấy, C. sinensis có khả năng thích nghi tốt

hơn trên môi trường selenate so với selenite và selenourea. Từ kết quả này, bước đầu

có thể nhận thấy selenite và selenourea có độc tính cao hơn so với selenate trong quá

trình nuôi cấy C. sinensis. Tuy nhiên, nhằm đánh giá rõ hơn độc tính của Se cũng như

khả năng tích lũy Se của nấm C. sinensis, đã tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của Se đến

sự phát triển của C. sinensis trên môi trường nuôi cấy lỏng.

3.1.2 Ảnh hưởng của selen đến sản xuất sinh khối của nấm Cordyceps sinensis

Trong thí nghiệm này, nấm C. sinensis cũng được nuôi trên môi trường lỏng

có bổ sung selenite/selenate/selenourea nồng độ từ 0 - 40mgSe/L. Dựa vào một số

kết quả như hình thái và kích thước sợi nấm, hiệu suất sinh khối và hàm lượng Se tích

lũy trong sinh khối, selenate vẫn thể hiện những đặc tính tốt hơn selenite và

selenourea, đặc biệt về hiệu suất sinh khối. Xét về đặc điểm hình thái của sinh khối

hệ sợi nấm C. sinensis, có sự khác biệt rõ rệt giữa môi trường selenite và selenate,

đặc biệt là ở nồng độ 30mgSe/L so với đối chứng (hình 3.2). Đối với môi trường bổ

sung selenourea, selenite, đặc điểm hình thái của sinh khối có sự thay đổi đáng kể so

với đối chứng. Khi tăng dần nồng độ Se, sinh khối mỏng và thưa dần, đặc biệt ở nồng

độ 30mgSe/L nấm có dấu hiệu bị ức chế phát triển và màu của môi trường bị chuyển

dần sang nâu đỏ. Trái lại, đối với selenate, đặc điểm sinh khối hệ sợi nấm C. sinensis

ít thay đổi so với đối chứng nhưng đến nồng độ 30mgSe/L sinh khối mọc yếu nhưng

khi so sánh với selenite thì vẫn có dấu hiệu phát triển tốt hơn (hình 3.2, phụ lục 1).

Đáng chú ý, khi tăng Se lên trên 35 - 40mgSe/L, hệ sợi nấm C. sinensis bị ức chế

hoàn toàn, không có khả năng tạo sinh khối hệ sợi. Quan sát cấu trúc sợi nấm dưới

kính hiển vi cho thấy các sợi nấm đều không có vách ngăn, thuôn đều, chắc khỏe,

không phân nhánh và không có những đặc điểm bất thường như đứt gãy hay phình

to, đường kính các sợi nấm khoảng 5 - 7,5µm (Phụ lục 3). Kết quả này chứng minh,

mặc dù Se ức chế sự phát triển của sợi nấm, nhưng dường như không ảnh hưởng

nhiều đến cấu trúc và kích thước sợi nấm trong quá trình phát triển của nấm.

Đối với khả năng sinh trưởng của sợi nấm C. sinensis khi nuôi trên môi trường

selenourea, selenite và selenate. Kết quả cho thấy, trọng lượng sinh khối thu nhận

giảm dần khi nồng độ Se tăng, trong đó trên môi trường bổ sung selenate trọng lượng

sinh khối cao hơn so với trên môi trường bổ sung selenite, selenourea (hình 3.2). Cụ

thể, ở môi trường bổ sung selenite, sinh khối giảm gần 80% so với đối chứng khi nuôi

ở nồng độ 30mgSe/L, từ 20,74 ± 1,58g/L (đối chứng) xuống còn 5,26 ± 0,37g/L,

tương tự đối với selenate, và giảm gần 95% khi nuôi cấy trên môi trường bổ sung

selenourea. Tuy nhiên, khi so sánh trọng lượng sinh khối giữa selenite và selenate ở

nồng độ từ 10 – 25mgSe/L, môi trường selenate có hiệu quả sản xuất sinh khối tốt

hơn selenite, cụ thể ở 25mgSe/L, tương ứng là 14,52 ± 0,82g/L và 11,85 ± 1,52g/L

(với p < 0,05). Qua đó chứng tỏ, Se có ảnh hưởng đáng kể đến sự sản xuất sinh khối

của nấm C. sinensis, trong đó selenite có độc tính cao hơn so với selenate, đáng chú

ý là khi tăng nồng độ Se lên 35mgSe/L nấm C. sinensis bị ức chế hoàn toàn.

Từ những kết quả trên, đã xác định được hàm lượng Se có trong sinh khốI,

đánh giá được khả năng tích lũy Se của sợi nấm C. sinensis trong quá trình nuôi cấy

có bổ sung selenourea, selenite và selenate. Nhìn chung, lượng Se tích lũy trong sinh

khối nấm C. sinensis tăng dần tương ứng với môi trường có chứa Se từ 0 - 30mgSe/L.

Cụ thể, môi trường selenite, lượng Se tăng từ 0,424 ± 0,017µg/g ở đối chứng lên đến

3812 ± 228µg/g, đối với selenate, từ 0,479 ± 0,053µg/g đến 2078 ± 124µg/g và đối

với sleneourea từ 383,76± 19,8µg/g đến 685,27± 28,9µg/g (hình 3.2).

(A) Sự phát triển của sinh khối nấm Cordyceps sinensis trên môi trường

lỏng có bổ sung selenite và selenate ở nồng độ 30 mgSe/L sau 40 ngày. (B) Sinh khối

nấm Cordyceps sinensis trên môi trường lỏng bổ sung selen từ 0 – 30 mgSe/L sau 40

ngày. Ba nguồn selen tương ứng là selenite, selenate và selenoure. Chữ cái trên mỗi

cột thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức trong từng loại selen

với giá trị α = 0,05.

Ngoài ra, hình 3.2 cũng cho thấy, lượng Se tích lũy trong sinh khối nấm khi

nuôi ở môi trường selenate từ 10 - 25mgSe/L đều cao hơn so với môi trường selenite,

selenourea có nồng độ tương ứng. Tuy nhiên, ở nồng độ 30mgSe/L Se, sinh khối nấm

nuôi trên môi trường chứa selenite lại có hàm lượng Se cao hơn so với môi trường

selenate, gấp 1,83 lần; nguyên nhân có thể do trong môi trường selenite sợi nấm đã

bị chết, hoặc các con đường vận chuyển Se bị rối loạn dẫn đến mất kiểm soát lượng

Se đi vào nội bào. Kết quả này lại cho thấy, nấm C. sinensis có khả năng tích lũy

selenate tốt hơn selenite, selenourea ở nồng độ < 30mgSe/L, đồng nghĩa với độc tính

của selenite và selenourea cao hơn so với selenate. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã

chứng minh, khi tăng hàm lượng Se trong môi trường sẽ ức chế sự sản xuất sinh khối

của nấm C. militaris hay C. sinensis [37], [38]. Do vậy trong nghiên cứu này, ngưỡng

Se 25mgSe/L selenate là nồng độ Se thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm C.

sinensis.

3.1.3 Về nâng cao khả năng phát triển và sản xuất sinh khối của nấm Cordyceps

sinensis trên môi trường bổ sung selenate bằng phương pháp nuôi cấy thích nghi

cải tiến

Kết quả ban đầu cho thấy, khi C. sinensis được nuôi trong môi trường chứa

25mgSe/L selenate hiệu suất sinh khối giảm khoảng 30% so với đối chứng. Do vậy,

trong phần này, phương pháp nuôi cấy thích nghi đã được sử dụng nhằm nâng cao

khả năng phát triển và sản xuất sinh khối nấm của C. sinensis trên môi trường bổ sung

selen.

(A) So sánh sự sản xuất sinh khối (cột) và hấp thụ selen (đường gạch

nối) bởi nấm Cordyceps sinensis giữa hai phương pháp nuôi cấy truyền thống và cải

tiến sau 40 ngày. Đối chứng: nấm được nuôi cấy bằng phương pháp truyền thống

không bổ sung selen; PP1 và PP2: nấm được nuôi cấy bằng phương pháp truyền thống

và cải tiến tương ứng có bổ sung selen. Nguồn selen sử dụng là selenate với nồng độ

bổ sung 25mgSe/L. Chữ cái trên mỗi cột và mỗi điểm trên đường gạch nối thể hiện

sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức với giá trị α = 0,05. (B) Hình thái

sợi nấm phát triển trên môi trường thạch sau 14 ngày và (C) sự sản xuất sinh khối của

nấm trên môi trường lỏng theo các nghiệm thức tương ứng sau 40 ngày.

Nấm C. sinensis nuôi cấy theo phương pháp cải tiến (PP2) có hiệu suất sinh

khối đạt cao hơn so với nấm nuôi cấy theo phương pháp truyền thống (PP1) (hình

3.3). Sợi nấm PP2 mọc đều, dày và phủ kín bề mặt hộp, trong khi sợi nấm PP1 mọc

yếu, chưa phủ kín bề mặt và rất mỏng. Hàm lượng sinh khối thu được từ PP2 đạt

17,31 ± 1,12g/L cao gấp 1,2 lần so với PP1 chỉ đạt 14,52 ± 0,82g/L (p < 0,05). So với

đối chứng, sinh khối PP2 giảm khoảng 16%, trong khi PP1 giảm gần 30% (hình 3.3).

Qua đó nhận thấy, PP2 cải thiện được gần 50% khả năng sản xuất sinh khối so với

PP1.

Đối với sự tích lũy Se giữa PP2 và PP1, nồng độ Se trong sinh khối PP2 thấp

hơn so với trong sinh khối PP1, tương ứng là 1354,97 ± 54,54µg/g và 1644,83 ±

116,45µg/g (Hình 3.3). Tuy nhiên, tổng Se có trong sinh khối ở PP2 tương đương so

với ở PP1 (23454,53 và 23882,93µg Se tương ứng). Qua kết quả này nhận thấy PP2

đã nâng cao khả năng sản xuất sinh khối của nấm trên môi trường giàu Se.

Phân tích hàm lượng selen nguyên dạng bằng phương pháp HPLC-ICP/MS

cho thấy, sinh khối nấm nuôi bằng phương pháp cải tiến (PP2) có chứa selenate

(SO42-) cao nhất với hàm lượng 991,9 µg/g, sau đó là selenomethionine (SE-MEET)

(383,9 µg/g) (hình 3.4). Một lượng nhỏ selenocystine (SE-CYS2) cũng được phát

hiện trong sinh khối của PP2. Trong khi đó, đối với sinh khối nuôi theo phương pháp

truyền thống (PP1), SE-MET là dạng selen nguyên dạng được tích lũy cao nhất với

645,6 µg/g, kế tiếp là SE-CYS2 (93,5 µg/g).

(A) Sắc ký đồ phân tích selen nguyên dạng của các mẫu sinh khối nấm

C. sinensis. (B) So sánh hàm lượng các hợp chất chứa selen (µgSe/g) trong sinh khối

nấm được nuôi bằng phương pháp truyền thống (PP1) và phương pháp cải tiến (PP2).

Selenite (SEO32-), selenate (SEO42-), selenocystine (SE-CYS2), selenocystamine

(SE-CYA), selenomethylcystein (SE-MECYS), và selenomethionine (SE-MET) là

các hợp chất được phát hiện có sự hiện diện của selen trong cấu trúc hay còn gọi là

các dạng selen nguyên dạng.

3.1.4 Thảo luận

Kết quả khảo sát mức độ ảnh hưởng của Se đối với sự phát triển của nấm C.

sinensis trên môi trường PGA bước đầu cho thấy nấm C. sinensis có khả năng phát

triển trên môi trường có bổ sung Se ở nồng độ cao. Khả năng lan tơ của chủng nấm

C. sinensis trên môi trường PGA bổ sung Se ở các nồng độ khác sau 15 ngày đạt 2,2

- 6,3cm và đều vượt trội hơn so với các nghiên cứu trước đây trên chủng C. sinensis

như Amin và cộng sự (2008) đạt 2,8cm tại thời điểm 24 ngày [64], Dong và cộng sự

(2011) đạt 2 - 3cm tại thời điểm 56 ngày [65], Sung và cộng sự (2010) thử nghiệm

trên chủng C. cardinalis đạt 2,66 cm tại thời điểm 21 ngày [66], Soltani và cộng sự

(2015) đánh giá trên chủng C. militaris đạt 4,8cm tại thời điểm 21 ngày [67]. Tuy

nhiên, sự khác biệt này có thể một phần do đặc tính của các chủng giống, điều kiện

nghiên cứu khác nhau như nhiệt độ, pH, thành phần môi trường. Nghiên cứu trước

đây của Rajashree và cộng sự (2013) và Nagodawithana (1985) cho thấy, khi tăng

nồng độ selenite trong nuôi cấy S. cerevisiae cũng làm giảm lượng sinh khối, thậm

chí ức chế đến 71,56% khi nuôi cấy ở 30mgSe/L [68] [69].

Môi trường PGA và môi trường lỏng bổ sung Se có sự tác động khác nhau đến

khả năng phát triển của nấm C. sinensis. Cụ thể, selenite, selenourea đều có tác động

ức chế khả năng lan tơ trên môi trường PGA cũng như sự sản xuất sinh khối trên môi

trường lỏng của nấm C. sinensis. Trong khi đó, selenate dường như không ảnh hưởng

đến khả năng lan tơ của sợi nấm trên PGA mà chỉ tác động đến sự sản xuất sinh khối

của sợi nấm C. sinensis trên môi trường lỏng. Điều này chứng tỏ, việc đánh giá khả

năng gây độc của Se trên môi trường PGA là chưa đủ cơ sở để kết luận độc tính của

Se đối với nấm vì khi C. sinensis được nuôi trên môi trường PGA thì sợi nấm chỉ tiếp

xúc với môi trường ở một phạm vi nhỏ trên bề mặt và do đó ảnh hưởng của Se là

không đáng kể. Trong khi, cùng một nồng độ Se trong môi trường lỏng, sợi nấm C.

sinensis chìm ngập trong môi trường nên sự tác động của Se đối với nấm sẽ lớn hơn.

Bên cạnh đó, các kết quả trên cho thấy selenite, selenourea có độc tính cao hơn

selenate đối với sự phát triển của nấm C. sinensis, các công bố trước đây cũng cho

thấy kết quả tương tự [25] [70]. Điều này thể hiện rõ qua màu sắc của môi trường

chứa selenite bị chuyển thành màu đỏ sẫm, cũng như thông qua kết quả đường kính

lan tơ, hiệu suất sinh khối và lượng Se tích lũy khi so sánh với selenate. Mặc dù, cơ

chế gây độc của Se đối với cơ thể sinh vật vẫn chưa được tìm hiểu rõ, nhưng một số

nghiên cứu cho thấy nguyên nhân gây độc của Se có thể do dư lượng của Se vô cơ

-. Gốc

2- (hay Se+4) phản ứng với các gốc thiol nội bào như GSH một cách tự nhiên để

trong môi trường hoặc lượng Se hữu cơ dư thừa dẫn đến tạo ra gốc tự do O2

SeO3

- tấn công gây chết tế bào. Đồng thời, quá trình khử tạo ra Se0, đây chính là

tạo ra O2

nguyên nhân làm cho môi trường chuyển thành đỏ. Tương tự các hợp chất hữu cơ

Se2- (như selenocystine và selenocystamine có thể chuyển hóa thành selenol (RSeH))

cùng với sự hiện diện của thiol (GSH, mercaptoethanol và L-cysteine) thì có khả năng

2- + 4 GSH  GSSeSG + GSSG

sinh ra các gốc tự do H2O2 gây độc cho tế bào [71].

SeO3

GSSeSG + GSH  GSSeH + GSSG

-

GSSeH + GSH  H2Se + GSSG

H2Se + O2  Se0 + O2

Zhang và cộng sự (2014) cũng chứng minh phương pháp nuôi cấy cải tiến này

[39].

đã làm tăng đáng kể hàm lượng Se trong sinh khối nấm C. militaris đạt 680,2µg/g Se

ở nồng độ 30mgSe/L Na2SeO3

3.2 Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy để nâng cao chuyển hóa selen

trong sinh khối nấm Cordyceps sinensis

3.2.1 Sàng lọc các thành phần môi trường ảnh hưởng đến sự sản xuất sinh khối

và tích lũy selen của nấm Cordyceps sinensis

Trong phần này, đã tiến hành tối ưu hóa thành phần môi trường và điều kiện

nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy cải tiến (PP2) có bổ sung selenate 25mgSe/L.

Đầu tiên, tiến hành sàng lọc các yếu tố có ảnh hưởng đến lượng sinh khối và tích lũy

Se của nấm C. sinensis bằng mô hình Plackett - Burman. Quá trình sinh trưởng của

nấm được ghi nhận ở các thời điểm 10, 20, 30 và 40 ngày để bước đầu đánh giá mức

độ ảnh hưởng ở các môi trường khác nhau. Nhìn chung, sự sinh trưởng của nấm có

sự khác biệt giữa các nghiệm thức tại thời điểm theo dõi (phụ lục 5, phụ lục 6, phụ

lục 7).

Ở thời điểm 10 ngày, nghiệm thức 1, 2, 3, 5, 7, 8, 9, 11, 12, đối chứng (ĐC)

tốc độ lan tơ nhanh hơn, sinh khối lấp đầy bề mặt nuôi cấy. Đặc biệt nghiệm thức 2,

3, 5, 7, 11 có tốc độ lan tơ vượt trội biểu hiện là bề mặt sinh khối dày và lan mạnh

cong lên quanh thành hộp. Ở các nghiệm thức còn lại quá trình lan tơ chậm, tơ mọc

yếu, sinh khối mỏng. Trong đó, nghiệm thức 4, 6 và 10, tơ chủ yếu tập trung quanh

viền môi trường, bề mặt sinh khối mỏng và phân mảng không đều. Bên cạnh đó, hầu

hết các nghiệm thức có môi trường bị biến đổi từ màu nâu sang nâu sẫm hoặc nâu đỏ.

Trong quá trình biến dưỡng của nấm, Se+6 bị khử thành Se+4 và tiếp tục được nấm

chuyển hóa về dạng Se0, nên môi trường sẽ có màu đỏ sẫm (Phụ lục 5). Ở thời điểm

20, 30 ngày, ở tất cả các nghiệm thức sinh khối đều phủ kín bề mặt nuôi cấy và dày

hơn thời điểm 10 ngày, tuy nhiên độ dày của sinh khối khác nhau ở các nghiệm thức.

Ở các nghiệm thức 2, 3, 5, 11, 12 hệ sợi sinh trưởng mạnh, dày và xốp, đặc biệt là

nghiệm thức 2, 5, 11. Hệ sợi của tất cả các nghiệm thức đều tăng lên, mặt dưới sần

sùi và có xu hướng sinh trưởng sâu trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, ở nghiệm

thức 4, 6, 8 và 10 lớp sinh khối mỏng, một số hộp nuôi cấy nấm chỉ sinh trưởng trên

mặt và xung quanh thành hộp. Sau 20 ngày, màu của môi trường đã có sự thay đổi rõ

rệt, màu môi trường đậm hơn, chuyển dần sang nâu đỏ và thể hiện rõ nhất ở các

nghiệm thức 2, 3, 8, 10 (Phụ lục 6). Cuối cùng, sau 40 ngày nuôi cấy, sinh khối được

thu nhận, ghi nhận sự khác biệt rõ rệt về độ dày sinh khối và màu môi trường. Các

nghiệm thức 1, 2, 3, 5, 11 có độ dày sinh khối và có trọng lượng tươi cao vượt trội so

với các nghiệm thức còn lại (Phụ lục 7), điều này chứng tỏ môi trường nghiệm thức

1, 2, 3, 5, 11 có ảnh hưởng tốt đến sự sinh trưởng của nấm. Đặc điểm của nấm sau

thu hoạch ở các nghiệm thức được mô tả trong phụ lục 8. Tóm lại, thông qua những

quan sát về độ dày sinh khối và sự sinh trưởng của hệ sợi cho thấy, các môi trường ở

nghiệm thức 1, 2, 3, 5, 11 có thể tác động tốt đến lượng sinh khối của C. sinensis. Để

đánh giá chính xác hơn, sinh khối khô được cân, phân tích và hàm lượng Se có trong

sinh khối của từng nghiệm thức.

Sau 40 ngày nuôi cấy, sinh khối được thu và rửa sạch bằng nước cất, sau đó

đem sấy khô ở 60°C đến khối lượng không đổi, kết quả được trình bày trong bảng

3.1. Sau đó, tiến hành phân tích ANOVA bằng phần mềm Design Expert (DE), kết

quả được ghi nhận theo bảng 3.2. Kết quả phân tích ANOVA (bảng 3.2) cho thấy,

mô hình có ý nghĩa thống kê (p < 0,005) với hệ số hồi quy R2 = 0,9844 > 0,75. Điều

này chứng tỏ có 93,85% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu tiên đoán theo

mô hình. Hơn nữa, giá trị R2 dự đoán là 0,8595 phù hợp với R2 điều chỉnh là 0,9571

(độ lệch 0,0976 < 0,2), tỷ lệ tín hiệu so với nhiễu (Adeq Precision) là 20,286 > 4 thể

hiện tín hiệu đã đầy đủ. Hệ số biến thiên CV trong thí nghiệm ở mức thấp đạt 3,93%

chứng minh mức độ phân tán trọng lượng sinh khối nấm ở mức thấp. Điều này cho

thấy mô hình đủ độ chính xác cho thí nghiệm sàng lọc. Qua kết quả xử lý của phần

mềm DE (bảng 3.2) cho thấy yếu tố nào có ảnh hưởng dương và lớn sẽ có tác động

mạnh đến trọng lượng sinh khối nấm C. sinensis. Trong đó bốn yếu tố bao gồm khoai

tây, saccharose, peptone, KH2PO4 có ảnh hưởng lớn nhất, lần lượt đạt 1,03; 3,28;

1,82; 1,19 với độ tin cậy p < 0,05. Đây là những nguồn dinh dưỡng chính trong sự

sinh trưởng và phát triển của nấm. Trong khi đó, các yếu tố cao nấm men, K2HPO4,

MgCl2 ảnh hưởng không đáng kể đến trọng lượng sinh khối C. sinensis ở độ tin cậy

p > 0,05.

Bảng 3.1. Trọng lượng sinh khối nấm (g/L) của các nghiệm thức theo Plackett –

Burman

Thành phần môi trường (g/L) Sinh khối

NT. KT. Sac. Pep. NM. KH2PO4 K2HPO4 MgCl2 TN. MH.

1 150 60 15 15 0,5 0,1 25,4 24,3 0,5

2 250 60 5 15 1,5 0,1 27,3 26,8 1,5

3 250 60 5 5 1,5 0,1 24,2 24,7 0,5

4 150 40 15 5 1,5 0,1 22,1 21,6 1,5

5 150 60 15 5 1,5 1 28,3 28,8 1,5

6 150 60 5 15 0,5 1 23,6 24,3 1,5

7 250 40 15 15 1,5 1 22,1 22,6 0,5

8 150 40 5 5 0,5 0,1 14,3 15,0 0,5

9 250 40 5 1 0,5 1 21,1 20,1 1,5

10 150 40 5 15 1,5 1 17,4 16,9 0,5

11 250 60 15 5 0,5 1 28,2 27,8 0,5

12 250 40 15 15 0,5 0,1 22,1 22,8 1,5

NT. Nghiệm thức; KT. Khoai tây; Sac. Saccharose; Pep. Peptone; NM. Cao nấm

men; TN. Thực nghiệm; MH. Mô hình

Bảng 3.2. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình

Mức Mức độ ảnh hưởng Kí Tên yếu tố Ảnh hiệu Thấp (-1) Cao (+1) Prob > F hưởng

Mô hình 0,0019

Khoai tây (g/L) 1,03a 250 0,0172 150 X1

Saccharose (g/L) 3,28a 60 0,0002 40 X2

Peptone (g/L) 1,82a 15 0,0023 5 X3

Cao nấm men (g/L) -0,13b 15 0,6518 5 X4

1,19a 1,5 0,0105 0,5 KH2PO4 (g/L) X5

X6 0,67b 1,5 0,0625 0,5 K2HPO4 (g/L)

0,56b 1 0,1006 0,1 MgCl2 (g/L) X7

R2 = 0,9844; CV = 3,93%; R2-điều chỉnh = 0,9571; R2-dự đoán = 0,8595,

Adeq Precision = 20,286; aCó ý nghĩa ở độ tin cậy α = 0,05; bKhông có ý nghĩa ở

độ tin cậy α = 0,05.

Trong khoai tây chứa nhiều dinh dưỡng như nguồn carbon, nitơ, khoáng và

vitamin nên nó thường được sử dụng làm môi trường nền trong nuôi cấy vi sinh vật.

Đối với saccharose, đây là disaccharide khi thủy phân sẽ tạo ra glucose và fructose

tốt cho sự phát triển của nấm và có giá thành thấp. Nhiều nghiên cứu về Cordyceps

cũng cho thấy khi sử dụng saccharose thì khối lượng sinh khối đạt cao nhất. Ngoài

ra, kết quả cho thấy peptone có ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối của nấm C. sinensis,

tuy nhiên một số nghiên cứu cho rằng cao nấm men hoặc cao thịt bò là nguồn nitơ

phù hợp. Sự khác biệt này có thể do chủng giống cũng như điều kiện nuôi cấy khác

nhau. Bên cạnh đó, sự sinh trưởng của nấm C. sinensis còn chịu ảnh hưởng bởi pH,

trong đó pH phù hợp khoảng 5,5 - 6,5. Do đó, khi bổ sung KH2PO4 ngoài việc cung

cấp nguồn K, P còn tạo ra hệ đệm cần thiết cho nấm sinh trưởng và phát triển. Từ kết

quả sàng lọc bằng Plackett – Burman, có thể thấy saccharose, peptone, khoai tây và

KH2PO4 là những yếu tố ảnh hưởng mạnh đến khả năng sản xuất sinh khối. Kết quả

này tạo tiền đề tối ưu môi trường nuôi cấy theo phương pháp đáp ứng bề mặt Box -

Behnken. Sau khi tiến hành đánh giá sự ảnh hưởng của môi trường đến lượng sinh

khối, tiếp tục đánh giá tác động của những yếu tố này đến khả năng tích lũy Se. Kết

quả được trình bày trong bảng 3.3. Lượng Se tổng tích lũy trong sinh khối nấm đều

cao vượt trội so với đối chứng (14,0µg) dao động từ 14145,0µg đến 23334,5µg (bảng

3.3), điều này chứng tỏ C. sinensis có khả năng tích lũy Se cao trong môi trường thực

nghiệm. Khi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng

tích lũy Se bằng mô hình Plackett - Burman cho thấy mô hình không có ý nghĩa thống

kê (p > 0,05) (bảng 3.4). Như vậy, những thành phần môi trường trong nuôi cấy gồm

khoai tây, saccharose, peptone, cao nấm men, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2 không ảnh

hưởng nhiều đến sự tích lũy Se trong sinh khối hệ sợi nấm C. sinensis.

Bảng 3.3. Lượng Se tổng (µg) trong sinh khối của các nghiệm thức theo Plackett - Burman

Thành phần môi trường (g/L) Selen*

TN. MH. NT. KT. Sac. Pep. NM. KH2PO4 K2HPO4 MgCl2

60 15 15 0,5 0,5 0,1 19837,4 17791,4 1 150

60 5 15 1,5 1,5 0,1 22159,5 19284,2 2 250

60 5 5 0,5 1,5 0,1 18571,4 21446,7 3 250

40 15 5 1,5 1,5 0,1 19333,3 20141,9 4 150

60 15 5 1,5 1,5 1 23334,5 22525,9 5 150

60 5 15 1,5 0,5 1 16857,5 19189,0 6 150

40 15 15 0,5 1,5 1 17023,6 15956,7 7 250

40 5 5 0,5 0,5 0,1 20320,1 18967,6 8 150

40 5 1 1,5 0,5 1 23155,9 21109,9 9 250

40 5 15 0,5 1,5 1 14145,0 15212,0 10 150

60 15 5 0,5 0,5 1 21573,0 22096,2 11 250

40 15 15 1,5 0,5 0,1 14959,9 17549,7 12 250

(*) Lượng Se tổng của sinh khối từ 1L môi trường nuôi cấy = hàm lượng Se (µg/g) *

trọng lượng sinh khối (g/L). NT. Nghiệm thức; KT. Khoai tây; Sac. Saccharose; Pep.

Peptone; NM. Cao nấm men; TN. Thực nghiệm; MH. Mô hình

Bảng 3.4. Phân tích ANOVA về mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến

lượng Se tổng trong sinh khối nấm

Mức độ ảnh hưởng Tên yếu tố Kí hiệu Ảnh hưởng Prob > F

Mô hình 0,6250

Khoai tây (g/L) 301,29 0,7655 X1

Saccharose (g/L) 1116,28 0,3023 X2

Peptone (g/L) 71,03 0,9436 X3

Cao nấm men (g/L) -1775,43 0,1330 X4

694,17 0,5027 KH2PO4 (g/L) X5

-178,04 0,8595 K2HPO4 (g/L) X6

75,68 0,9399 MgCl2 (g/L) X7

3.2.2 Tối ưu hóa thành phần môi trường

Việc tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng giúp chúng ta có thể đánh

giá được sự tương tác giữa các yếu tố và giảm đáng kể được số lượng thí nghiệm cần

thực hiện. Dựa vào thí nghiệm sàng lọc bằng Plackett - Burman, chọn được 3 yếu tố

là saccharose, peptone, KH2PO4 là 3 yếu tố có tác động mạnh nhất đến sinh khối nấm,

để tiến hành tối ưu hóa theo mô hình Box - Behnken gồm 17 nghiệm thức ở ba mức

-1, 0, +1 với môi trường nền gồm khoai tây (200g/L), cao nấm men (4g/L), K2HPO4

(0,5g/L), MgCl2 (0,1g/L). Sự sinh trưởng của nấm được quan sát và đánh giá theo

từng giai đoạn 10, 20, 30, 40 ngày. Nhìn chung, nấm đều có sự tăng trưởng tốt và

đồng đều giữa các nghiệm thức. Sau thời gian nuôi cấy lỏng tĩnh 10 ngày, các nghiệm

thức 1, 9, 13, 17 hệ sợi lan chậm, yếu và sinh khối mỏng, phân thành từng mảng, màu

môi trường vàng nhạt. Những nghiệm thức 3, 6, 7, 8, 14, 15, 16 có sự phát triển mạnh

hơn, sinh khối đã lan đầy bề mặt môi trường, hệ sợi tương đối dày tùy theo từng

nghiệm thức. Kết quả được tóm tắt trong phụ lục 9. Sau thời gian 20, 30 ngày nấm

tiếp tục tăng trưởng và hệ sợi phủ đầy bề mặt hộp và chủ yếu nấm tăng bề dày của

sinh khối và màu môi trường có sự thay đổi sang vàng đậm đến đỏ nâu. Đến thời

điểm 40 ngày, tiến hành thu sinh khối, đa số các nghiệm thức đều tăng trưởng tương

đối đồng đều, hệ sợi mọc dày, mạnh (phụ lục 10). Một số nghiệm thức 2, 3, 6, 7, 11,

14, 15, 17 sinh trưởng tốt hơn những nghiệm thức còn lại. Sau thời gian 40 ngày, tiến

hành thu sinh khối và sấy ở 60°C đến khi khối lượng không đổi, kết quả trình bày

như bảng 3.5. Trọng lượng sinh khối thực nghiệm không có sự chênh lệch đáng kể so

với kết quả dự đoán bằng phần mềm DE.

Bảng 3.5. Sản lượng sinh khối nấm Cordyceps sinensis (g/L) của các nghiệm thức

theo Box – Behnken và hàm lượng Se tổng (µg) trong sinh khối.

Thành phần môi trường (g/L) Sinh khối Se*

NT. Sacc. Pep. MH. TN. TN. KH2PO4

1,5 1 40 10 10627 18,9 19,0

1 2 50 10 21289 26,2 25,3

1 3 50 10 18286 26,2 26,1

0,5 4 50 15 24805 22,5 22,5

0,5 5 60 10 12115 22,2 22,1

1 6 50 10 20654 26,2 26,8

1 7 50 10 22916 26,2 26,6

1 8 40 15 16800 22,0 22,1

0,5 9 40 10 20626 17,8 17,6

1,5 10 60 10 19467 23,2 23,3

1 11 50 10 22721 26,2 26,2

1,5 12 50 5 21466 22,6 22,6

0,5 13 50 5 18000 22,3 22,5

1,5 14 50 15 17196 24,2 24,0

1 15 60 15 24101 24,7 24,8

1 16 40 5 14311 19,4 19,3

1 17 60 5 13622 25,4 25,3

Lượng selen tổng của sinh khối từ 1L môi trường nuôi cấy = hàm lượng Se

(µg/g) * trọng lượng sinh khối (g/L). NT. Nghiệm thức; Sac. Saccharose; Pep.

Peptone; TN. Thực nghiệm; MH. Mô hình

Kết quả tiếp tục được phân tích bằng ANOVA một chiều. Bảng 3.6 cho thấy

mô hình có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 với hệ số hồi quy R2 = 0,9879 > 0,75 chứng

tỏ mô hình tương thích với thực nghiệm. Hơn nữa, R2 dự đoán (0,9556) tương thích

với R2 hiệu chỉnh (0,9722) và Adeq Precision = 23,965 > 4 chứng tỏ mô hình đủ độ

chính xác cho thí nghiệm tối ưu hóa môi trường.

Bảng 3.6. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình Box – Behnken

Biến Tổng bình Bậc Bình phương Sai số F- p-value độc lập phương tự do trung bình chuẩn value

Mô hình 119,22 63,26 < 0,0001 9 13,25

38,00 1 0,16 181,46 < 0,0001 38,00 Y1

1,74 1 0,16 8,31 0,0235 1,74 Y2

2,11 1 0,16 10,05 0,0157 2,11 Y3

2,74 1 0,23 13,08 0,0085 2,74 Y1Y2

0,01 1 0,23 0,03 0,8616 0,01 Y1Y3

0,48 1 0,23 2.31 0,1722 0,48 Y2Y3

34,16 1 34,16 0,22 163,14 < 0,0001 Y1

0,87 1 0,87 0,22 4,16 0,0807 Y2

33,70 1 33,70 0,22 160,90 < 0,0001 Y3

R2 = 0,9879; CV = 1,96%; R2-điều chỉnh = 0,9722; R2-dự đoán = 0,9556;

C.V% = 1,96; Adeq Precision = 23,965

Phương trình hồi quy theo sinh khối như sau:

Sinh khối (g/L) = -80,854 + 3,342Y1 + 1,166Y2 + 22,476Y3 – 0,0166Y1Y2 –

2 – 0,014Y2

2 – 10,909Y3

0,008Y1Y3 + 0,058Y2Y3 – 0,029Y1

Trong đó: Y1: saccharose (g/L), Y2: peptone (g/L), Y3: KH2PO4 (g/L).

Bên cạnh đó, để xác định sự tương tác của mỗi biến cho trọng lượng sinh khối

nấm C. sinensis tối ưu, đồ thị tương tác bề mặt ba chiều được xây dựng với trục z thể

hiện trọng lượng sinh khối và hai biến độc lập bất kỳ trục x, y và biến còn lại duy trì

ở mức tối ưu. Quy luật của sự tương tác giữa các yếu tố được thể hiện qua hình 3.5.

Bề mặt đáp ứng của sinh khối nấm Cordyceps sinensis theo hai yếu tố.

(A) tương tác của peptone và saccharose với KH2PO4 cố định (1,05g/L); (B) tương

tác của KH2PO4 và peptone với saccharose cố định (53,48g/L); (C) KH2PO4 và

saccharose với peptone cố định (11,17g/L).

Chúng tôi tiếp tục đánh giá sự tích lũy Se của nấm C. sinensis trong các nghiệm

thức của mô hình tối ưu. Kết quả cho thấy lượng Se tổng trong sinh khối dao động từ

10627µg đến 24805µg (bảng 3.5). Sau khi phân tích các số liệu của mô hình Box –

Behnken, sử dụng phần mềm DE để dự đoán thành phần môi trường tối ưu cho sự

phát triển của nấm C. sinensis. Thông số được đưa ra như sau: saccharose 53,48g/L,

peptone 11,17g/L, KH2PO4 1,05g/L với trọng lượng sinh khối nấm C. sinensis và

lượng Se tổng tích lũy dự đoán đạt 25,4g/L và 24343,9µg (khoảng 960,3µg/g). Kết

quả này cao hơn so với kết quả trước khi tối ưu (23882,9µg). Điều này cho thấy môi

trường đã được tối ưu hóa nên nấm đã thích nghi và sinh trưởng tốt trong môi trường

có nồng độ Se cao và cơ chế chuyển hóa, hấp thụ Se cũng được cải thiện nên có khả

năng chuyển hóa selenate tốt hơn. Sau đó, đã tiến hành kiểm tra thực nghiệm công

thức môi trường do mô hình Box – Behnken dự đoán. Kết quả thu được như sau:

trọng lượng sinh khối đạt 24,9g/L lệch so với dự đoán 1,65%, hàm lượng Se đạt

1059µg/g lệch 9,3% so với dự đoán, từ đây có thể kết luận mô hình tối ưu hóa môi

trường nuôi cấy đã được thực hiện thành công. Tóm lại, môi trường tối ưu cho nuôi

cấy C. sinensis thu sinh khối giàu Se theo mô hình Box - Behnken gồm khoai tây

200g/L, saccharose 53,48g/L, cao nấm men 4g/L, peptone 11,17g/L, KH2PO4

1,05g/L, K2HPO4 0,5g/L, MgCl2 0,1g/L cho phép thu được 24,9g/L sinh khối C.

sinensis và lượng Se tổng tích lũy đạt 26400,8µg (1059µg/g).

3.2.3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

Kết quả tối ưu hóa thành phần môi trường cho thấy hàm lượng Se cũng như

trọng lượng sinh khối tăng đáng kể so với giai đoạn ban đầu sau khi thu nhận được

chủng thích nghi trên Se. Nhằm tối ưu, tăng thêm khả năng tăng sản xuất sinh khối

cũng như sự chuyển hóa Se sang dạng hữu cơ, tiến hành tối ưu hóa điều kiện nuôi

cấy C. sinensis trong môi trường đã tối ưu. Trong nghiên cứu này 3 yếu tố cần được

tối ưu hóa gồm: ánh sáng (trắng, xanh dương, đỏ), pH (6, 7, 8), nhiệt độ (20, 25,

30°C), theo mô hình D-optimal với 19 nghiệm thức ở ba mức -1, 0, +1. Sự tăng trưởng

của sinh khối nấm được đánh giá sau 10, 20, 30, và 40 ngày nuôi cấy. Nhìn chung,

nấm đều tăng trưởng tốt và có sự khác biệt giữa các nghiệm thức trong thực nghiệm.

Ở thời điểm sau 10 ngày nuôi cấy tĩnh trong môi trường lỏng nhận thấy ở điều kiện

nhiệt độ 20°C, 25°C nấm sinh trưởng tốt ở tất cả các nghiệm thức, sợi nấm lan tỏa

gần đầy bề mặt hộp, trong khi ở 30°C chỉ thấy xuất hiện vài mảng nhỏ tơ nấm. Sau

20, 30 ngày nuôi cấy nấm C. sinensis tiếp tục tăng trưởng và hệ sợi phủ đầy bề mặt

hộp, chủ yếu tăng bề dày của sinh khối và màu môi trường bắt đầu chuyển sang màu

vàng sậm hoặc đỏ nâu. Sau 40 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và nhận thấy có

sự khác biệt rõ rệt về hình thái giữa cái lô thí nghiệm như NT2, NT4, NT7, NT11,

NT13, NT16, NT18: sinh khối phát triển không mạnh, bề mặt nhăn, lớp sinh khối

mỏng (Phụ lục 11), đặc điểm của nấm sau thu hoạch ở các nghiệm thức trên đã được

mô tả (Phụ lục 12). Sau 40 ngày nuôi cấy, sinh khối được thu và rửa sạch bằng nước

cất, sau đó đem sấy khô ở 60°C đến khối lượng không đổi, kết quả được trình bày

trong bảng 3.7.

Môi trường ở các nghiệm thức 1, 3, 5, 6, 12, 15, 17 tác động tốt đến sự tích lũy

sinh khối của C. sinensis. Trọng lượng khô của sinh khối và hàm lượng Se có trong

đó ở từng nghiệm thức được xác định (bảng 3.7, bảng 3.9). Kết quả phân tích ANOVA

(bảng 3.8) cho thấy, mô hình có ý nghĩa thống kê (p < 0,005) với hệ số hồi quy R2 =

0,793 > 0,75, chứng tỏ 79,30% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu dự đoán

theo mô hình. Điều này cho thấy mô hình đủ độ chính xác cho thí nghiệm sàng lọc.

Bảng 3.7. Trọng lượng sinh khối C. sinensis ở các nghiệm thức theo D-optimal

Sinh khối (g/L) Nhiệt độ pH Ánh sáng Nghiệm thức Thực nghiệm Mô hình

20 6 24,00 24,45 Đỏ 1

30 6 21,34 21,77 Đỏ 2

20 8 22,14 23,05 Đỏ 3

30 8 18,06 18,03 Đỏ 4

20 7 24,7 23,75 Đỏ 5

25 7 22,64 21,83 Đỏ 6

30 7 21,22 22,34 Trắng 7

25 6 24,73 24,08 Trắng 8

25 8 22,61 23,14 Trắng 9

20 6 23,42 24,77 Trắng 10

30 6 24,65 23,39 Trắng 11

20 8 25,94 24,99 Trắng 12

30 8 20,72 21,28 Trắng 13

25 8 23,84 23,14 Trắng 14

20 6 20,97 20,41 Xanh 15

30 6 20,38 21,41 Xanh 16

20 8 21,82 22,85 Xanh 17

30 8 22,08 21,51 Xanh 18

25 7 22,45 21,54 Xanh 19

Bên cạnh đó, để xác định sự tương tác của mỗi biến cho trọng lượng sinh khối

nấm C. sinensis tối ưu, đồ thị tương tác bề mặt ba chiều được xây dựng với trục z thể

hiện trọng lượng sinh khối và hai biến độc lập bất kỳ trục x, y và biến còn lại là các

điều kiện ánh sáng. Quy luật của sự tương tác giữa các yếu tố được thể hiện qua hình

3.6.

Bảng 3.8. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình D-optimal

Biến độc lập p-value Ảnh hưởng

-1,095 Nhiệt độ 0,009

-0,373 pH 0,283

-0.498 Ánh sáng (Đỏ) 0,256

1,283 Ánh sáng (Trắng) 0,0087

-0,785 Ánh sáng (Xanh) 0,099

-0,584 Nhiệt độ*pH 0,132

-0,829 Nhiệt độ * Ánh sáng (Đỏ) 0,105

-0,180 Nhiệt độ * Ánh sáng (Trắng) 0,705

1,009 Nhiệt độ * Ánh sáng (Xanh) 0,066

-0,912 pH* Ánh sáng (Đỏ) 0,089

-0,096 pH* Ánh sáng (Trắng) 0,825

1,009 pH* Ánh sáng (Xanh) 0,065

Kết quả phân tích Se cho thấy lượng Se trong sinh khối dao động từ 743 đến

1415µg/g (bảng 3.9), đồng thời phân tích sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy

bằng mô hình D-optimal cho thấy R2 của mô hình 0,29 < 0,75, sự tương thích mô

hình rất thấp và các yếu tố không ảnh hưởng đến sự tích lũy Se trong sinh khối (bảng

3.10).

Bề mặt đáp ứng của sinh khối C. sinensis theo hai yếu tố. A: nhiệt độ

và pH trong điều kiện ánh sáng trắng; B: nhiệt độ và pH trong điều kiện ánh sáng đỏ;

C: nhiệt độ và pH trong điều kiện ánh sáng xanh

Bảng 3.9. Hàm lượng Se ở các nghiệm thức (µg/g)

Hàm lượng selen (µg/g) Nhiệt độ pH Ánh sáng Nghiệm thức Thực nghiệm Mô hình

1 20 6 1098 Đỏ 989,133

2 30 6 1105 Đỏ 1080,28

3 20 8 1042 Đỏ 1044,8

4 30 8 1283 Đỏ 1146,61

5 20 7 1072 Đỏ 1016,97

6 25 7 743 Đỏ 1065,21

7 30 7 1415 Trắng 1254,97

8 25 6 1226 Trắng 1204,67

9 25 8 1255 Trắng 1102,25

10 20 6 1173 Trắng 1105,83

11 30 6 1135 Trắng 1303,51

12 20 8 Trắng 802 998,08

13 30 8 Trắng 1086 1206,43

14 25 8 Trắng 1186 1102,25

15 20 6 Xanh 1016 1143,57

16 30 6 Xanh 1252 1112,23

17 20 8 Xanh 1159 1019,23

18 30 8 Xanh 871 998,567

19 25 7 1044 1068,4

Xanh

Bảng 3.10. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình D-optimal

Biến p-value Biến p-value

0,418 Nhiệt độ * Ánh sáng (Đỏ) 0,972 Nhiệt độ

0,626 Nhiệt độ * Ánh sáng (Trắng) 0,472 pH

0,658 Nhiệt độ * Ánh sáng (Xanh) 0,474 Ánh sáng (Đỏ)

0,379 pH* Ánh sáng (Đỏ) 0,481 Ánh sáng (Trắng)

0,703 pH* Ánh sáng (Trắng) 0,729 Ánh sáng (Xanh)

0,964 pH* Ánh sáng (Xanh) 0,684 Nhiệt độ*pH

R2 = 0,29

Dựa vào các phân tích, mô hình D-optimal đưa ra điều kiện nuôi cấy tối ưu

cho nấm C. sinensis giàu Se như sau: nhiệt độ 20°C, ánh sáng trắng, pH 6,1 với điều

kiện này, trọng lượng sinh khối và hàm lượng Se theo mô hình dự đoán đạt được lần

lượt 24,79g/L và 1097µg/g. Sau đó, tiến hành nuôi kiểm chứng tại điều kiện như trên

và thu được sinh khối 26,45g/L và hàm lượng Se đạt 1068µg/g. Tóm lại, điều kiện

tối ưu cho nuôi cấy C. sinensis giàu Se theo mô hình D-optimal gồm nhiệt độ 20°C,

ánh sáng trắng, pH 6,1 với điều kiện này, trọng lượng sinh khối và hàm lượng Se đạt

được lần lượt 26,45g/L và hàm lượng Se đạt 1068µg/g. Từ kết quả này, đã tiến hành

nuôi cấy ở quy mô pilot 50L (theo thông số của thành phần môi trường và điều kiện

tối ưu) để thu nhận sinh khối, các cao chiết và hợp chất giàu Se để đánh giá hoạt tính

sinh học của chúng.

3.2.4 Thảo luận

Kết quả tối ưu thành phần môi trường cho thấy saccharose 53,48g/L, peptone

11,17g/L, KH2PO4 1,05g/L là 3 yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến trọng lượng sinh khối.

Nghiên cứu trước đây trong môi trường lên men C. sobolifera, 3 yếu tố ảnh hưởng

đáng kể là khoai tây, KH2PO4 và peptone và với tỉ lệ tương ứng 40%, 0,4%, 0,5% đạt

sinh khối cao nhất [47]. Một nghiên cứu khác trên chủng C. militaris cho thấy đậu

nành, saccharose, KH2PO4 và thiamine có ảnh hưởng đến sự phát triển quả thể khi bổ

sung selenite và quả thể đạt cao nhất với thành phần môi trường tương ứng 30g/L,

40g/L, 1,5mgSe/L, 5µg/L [39]. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu làm giàu Se trên một

số đối tượng khác cho thấy saccharose, peptone, khoai tây và KH2PO4 luôn được sử

dụng trong môi trường lỏng nuôi cấy sinh khối hệ sợi nấm Cordyceps (bảng 3.11).

Từ kết quả tương tác giữa thành phần môi trường lên trọng lượng sinh khối nấm C.

sinensis, ngưỡng saccharose phù hợp cho nấm C. sinensis 50g/L, kết quả phù hợp với

nồng độ saccharose cần cho sự tăng trưởng của nấm vì nếu nồng độ saccharose quá

cao sẽ tạo thành môi trường ưu trương gây ức chế sự tăng trưởng [72]. Nhiều nghiên

cứu trước đây trên Cordyceps nói chung và C. sinensis nói riêng mặc dù có mục tiêu

khác nhau nhưng đa phần đều sử dụng saccharose trong quá trình nuôi cấy như nghiên

cứu của Kim và cộng sự trên C. militaris 50g/L [31], Singh và cộng sự trên C. sinensis

30g/L [27], Dong và cộng sự trên C. sinensis 50g/L [33], Lin và cộng sự trên C.

guangdongensis 20g/L [34], Zhang và cộng sự trên C. militaris 3% [39], Zhu và cộng

sự trên chủng C. gunnii 2% [73], Wang và cộng sự trên chủng C. sinensis 30g/L [74],

Smirnov và cộng sự cũng bổ sung 30g/L [75].

Bảng 3.11. So sánh kết quả một số nghiên cứu về thành phần môi trường

Sinh khối Đối tượng Thành phần môi trường Tác giả (g/L)

Saccharose 6% (w/v), C. militaris Kim và cộng sự peptone 1% (w/v) và 12,7 C738 (2003) [31] K2HPO4 0,05% (w/v)

Saccharose 3% (w/v), khoai Zang và cộng C. militaris 19,16 tây 20% (w/v), NaNO3 0,2% sự (2014) [39] (w/v) và KH2PO4 0,5% (w/v)

Khoai tây 200g/L, glucose

30g/L, cao nấm men 4g/L, Zheng và cộng C. sinensis 15,14 sự (2014) [38] KH2PO4 2g/L, MgSO4.7H2O

1g/L, Na2SeO3 60mgSe/L

Đối với peptone, đây là nguồn nitơ hữu cơ phổ biến trong các nghiên cứu nuôi

cấy nấm, với hàm lượng peptone dao động từ 5 đến 15g/L, trong nghiên cứu này hàm

lượng peptone theo môi trường tối ưu là 11,17g/L. Zhu và cộng sự trên chủng C.

gunnii cho thấy peptone là nguồn nitơ tốt cho sinh khối nấm cũng như sản xuất

polysaccharide (IPS) [73], trong nghiên cứu của Wang và cộng sự, bên cạnh cao nấm

men, peptone (2g/L) cũng là nguồn nitơ cho lượng sinh khối C. sinensis và IPS [74],

Smirnov và cộng sự cũng bổ sung peptone vào nuôi cấy 2g/L [75], Gang và cộng sự

bổ sung 3% [76], peptone trong quá trình nuôi cấy như nghiên cứu của Kim và cộng

sự trên C. militaris 10g/L cho sinh khối lớn nhất [31], Dong và cộng sự trên C.

sinensis 10g/L [33], Yin và cộng sự đã bổ sung 15g/L [77]. Đối với KH2PO4, ngoài

việc cung cấp nguồn K cũng như P cho quá trình sinh trưởng của nấm, KH2PO4 cũng

có vai trò tham gia vào hệ đệm giúp duy trì sự cân bằng pH trong môi trường nuôi

cấy, vì trong môi trường có Se sẽ tạo ra acid selenic gây acid hóa môi trường ảnh

hưởng đến sự tăng trưởng của nấm C. sinensis. Singh và cộng sự, Dong và cộng sự

(2005) cùng bổ sung 1g/L KH2PO4 trong quá trình nuôi cấy C. sinensis [78], [33],

Wang và cộng sự trên chủng C. sinensis 1g/L [74], Smirnov và cộng sự cũng bổ sung

1g/L [75], Gang và cộng sự bổ sung 2g/L [76].

Kết quả tối ưu điều kiện nuôi cấy (bảng 3.9) cho thấy yếu tố nào có p < 0,05

sẽ ảnh hưởng đến trọng lượng sinh khối nấm C. sinensis. Trong đó, nhiệt độ là yếu tố

ảnh hưởng âm đến sự sinh trưởng của nấm C. sinensis, nghĩa là nhiệt độ giảm sẽ giúp

nấm phát triển tốt. Trong nghiên cứu này, nhiệt độ 20°C cho thấy nấm phát triển tốt

nhất. Theo các nghiên cứu trước đây, nấm Cordyceps chủ yếu nuôi cấy ở điều kiện

nhiệt độ thấp 18 - 25°C [19] [38] [79]. Ánh sáng trắng vẫn ảnh hưởng mạnh nhất đến

sự phát triển hệ sợi (p < 0,05), trong khi đó ánh sáng đỏ và ánh sáng xanh hầu như

không tác động đến sự tích lũy sinh khối (p > 0,05). Nghiên cứu này khác với những

công bố trước đây, cho thấy ánh sáng đỏ kích thích sự phát triển sinh khối mạnh hơn

ánh sáng xanh và trắng [79], có thể do nghiên cứu này nuôi cấy sinh khối hệ sợ nên

ánh sáng màu không ảnh hưởng nhiều đến quá trình phát triển như trên các nghiên

cứu nuôi cấy thu nhận quả thể. pH ảnh hưởng không đáng kể đến trọng lượng sinh

khối (p> 0,05) (bảng 3.8), tuy nhiên về mặt hình thái, khi nuôi cấy ở pH cao tơ nấm

mọc mỏng và ít tơi xốp hơn so với pH thấp, đồng thời cũng ghi nhận giá trị pH ở các

nghiệm thức khảo sát có xu hướng điều chỉnh về 6,5-7,5, hiện tượng tương tự cũng

đã từng được ghi nhận trong các nghiên cứu trước đó. Năm 2011, chủng C. sinensis

được khảo sát ở các điều kiện pH khác nhau, trong đó nhận thấy nấm phát triển tốt ở

các mức pH từ 4,0 đến 8,0 (tốt nhất ở pH 6,0). Đồng thời pH dịch môi trường của các

thí nghiệm sau nuôi cấy cũng điều chỉnh về khoảng pH 7,0 [65]. Tương tự, trong

nghiên cứu của Sung và cộng sự năm 2010, chủng C. cardinalis phát triển tốt trong

khoảng pH 5,0 – 8,0 và môi trường sau nuôi cấy đều chuyển về pH khoảng 5,0 [66].

Điều này cho thấy một số chủng nấm Cordyceps có khả năng điều chỉnh pH môi

trường, tuy nhiên chưa có báo cáo nào giải thích rõ cơ chế của hiện tượng này.

Trong những nghiên cứu trước đây về ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến

sự hấp thụ Se, pH là yếu tố có nhiều nghiên cứu nhất và có những kết quả khác biệt.

Trong nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH trên tảo Chlamydomonas reinhardtii cho thấy

sự hấp thụ selenate không bị ảnh hưởng của pH, tuy nhiên khi tăng pH từ 7-9, khả

năng hấp thụ Se của tảo tăng lên [80]. Trong nghiên cứu của Wang (2016) trên nấm

Flammulina velutipes, khi tăng dần pH từ 5,5-7,5, kết quả lại cho thấy sự hấp thụ

selen lại giảm [81], ngược lại một nghiên cứu trên tảo Chlamydomonas reinhardtii

lại cho thấy sự hấp thụ selenate tăng dần khi tăng pH từ 5-9 [82]. Các kết quả này cho

thấy ở mỗi loài và ở mỗi điều kiện hoặc môi trường khác nhau sự ảnh hưởng của pH

đến hấp thụ Se là khác nhau, đối với nấm C. sinensis, chúng có khả năng điều chỉnh

giá trị pH về khoảng phù hợp với sự phát triển, do đó, có thể yếu tố pH sẽ không tác

động nhiều. Sau khi tối ưu thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy, trọng lượng

sinh khối của nấm C. sinensis vượt trội so với những chủng nấm khác đã nghiên cứu

trước đó của Dong và cộng sự (2005) trên C. sinensis 22,15g/L [33], Zheng và cộng

sự trên C. sinensis 17,81g/L [38], Xiao và cộng sự (2004) trên C. jiangxiensis 14,5g/L

[30], Kim và cộng sự (2003) trên C. militaris C738 12,7g/L [31]. Đối với hàm lượng

Se, ở nghiên cứu của Zheng và cộng sự (2014) trên chủng C. sinensis có hàm lượng

Se cao hơn 1260,16µg/g nhưng trọng lượng sinh khối lại thấp hơn (17,81g/L) [38].

So với các nghiên cứu khác trước đó, kết quả này cũng cao hơn một số loài nấm như

Pleurotus ostreatus 938,9 µg/g [83], Saccharomyces cerevisiae 1200 - 1400µg/g

[84], C. militaris 680,2µg/g [39], Lentinula edodes 748,0µg/g, chứng tỏ nấm C.

sinensis có khả năng tích lũy Se rất tốt.

3.3 Xác định thành phần hoạt chất và dạng selen chuyển hóa trong nấm

Cordyceps sinensis

Trong phần này, chúng tôi tiến hành nuôi cấy nấm trên quy mô pilot 50L sử

dụng các thông số tối ưu ở phần 3.2. Ở đó, thành phần môi trường tối ưu là khoai tây

200g/L, saccharose 53,48g/L, cao nấm men 4g/L, peptone 11,17g/L, KH2PO4

1,05g/L, K2HPO4 0,5g/L, MgCl2 0,1g/L và selenate 25g/L và các điều kiện tối ưu là

20°C, ánh sáng trắng, pH 6,1. Sinh khối nấm và dịch nuôi cấy thu hoạch sau 40 ngày

được sử dụng cho công đoạn chiết cao và thử hoạt tính sinh học. Bên cạnh đó, nấm

cũng được nuôi cấy trên môi trường không bổ sung selenate để sản xuất sinh khối đối

chứng.

3.3.1 Thu nhận cao chiết từ sinh khối nấm và dịch nuôi cấy

Hiệu suất chiết cao khác nhau ở từng phân đoạn cho thấy sinh khối nấm C.

sinensis giàu selen và nhóm C. sinensis đối chứng có hàm lượng các hợp chất có sự

khác biệt giữa các phân đoạn cao (hình 3.7). Điều này phụ thuộc vào hàm lượng và

độ phân cực của các hợp chất. Bên cạnh đó, ngoại trừ cao H2O, hiệu suất chiết cao

của tất cả các cao chiết khác nhóm Se đều cao hơn nhóm đối chứng, điều đó chứng

minh việc bổ sung Se vào quá trình nuôi cấy có thể làm gia tăng sự sinh tổng hợp các

chất trong C. sinensis điều này phù hợp với nghiên cứu của Zheng và cộng sự năm

2014 [38]. Ngoài ra, chúng tôi còn tách chiết các hoạt chất polysaccharide ngoại bào

(EPS) từ môi trường nuôi cấy với hiệu suất chiết cao là 1,62g/L đối với nấm nuôi

trong môi trường selen và 2,55g/L đối với nấm nuôi trên môi trường không có selen.

So sánh hiệu suất chiết cao (%) giữa sinh khối nấm giàu selen (Se) và

sinh khối nấm đối chứng không có selen (ĐC). Cao tổng (EtOH), 4 cao phân đoạn

được chiết từ cao tổng có dộ phân cực giảm dần gồm cao ether dầu hỏa (PE), cao

ethyl acetate (EtOAc), cao butanol (BuOH) và cao H2O (nước). Cao polysaccharide

chiết từ bã sinh khối sau khi chiết cao tổng (CPS), và cao polysaccharide chiết từ sinh

khối thô nguyên chất (IPS).

3.3.2. Hàm lượng selen trong cao chiết

Trong phần này, đã tiến hành phân tích hàm lượng selen có trong từng phân

đoạn cao chiết. Kết quả cho thấy, các cao chiết đều có chứa selen, tuy nhiên hàm

lượng selen chủ yếu tập trung ở nhóm các cao chiết phân cực cao, đặt biệt là các cao

chiết có chứa polysaccharide. Bằng chứng là, cao chiết polysaccharide chiết từ sinh

khối nguyên chất (IPS) có hàm lượng selen cao nhất đạt 2021µg/g. Cao chiết

polysaccharide từ bã sinh khối (CPS) cũng cho thấy chứa một lượng selen cao thứ

hai 1038µg/g. Tiếp đến là cao chiết exopolysaccharide từ dịch nuôi cấy có hàm lượng

selen đạt 12µg/g. Mặc dù, các cao chiết còn lại có hàm lượng selen thấp, nhưng dường

như hàm lượng selen tăng tỷ lệ thuận với mức độ phân cực của cao chiết (hình 3.8).

Hàm lượng selen trong các cao chiết từ nấm nuôi trên môi trường bổ

sung selen

3.3.3 Sự hiện diện của selen trong các cao chiết chứa polysaccharide

Trong phần này đã xác định được sự hiện diện của selen trong các cao chiết

EPS và IPS. Đây là 2 cao chiết có hàm lượng selen cao được phân tích ở kết quả trước

đó. Định lượng polysaccharide trong EPS và IPS bằng phương pháp định lượng

đường tổng hòa tan phenol - acid sulfuric, kết quả định lượng đường tổng hòa tan

trong IPS và EPS chiết từ sinh khối C. sinensis giàu selen lần lượt là 52,75% và

43,82%. Hàm lượng đường trong EPS và IPS tách chiết từ sinh khối C. sinensis giàu

Se khá cao. Khi so sánh với công trình nghiên cứu gần đây của Hà Bảo Châu và cộng

sự (2018), hàm lượng đường trong IPS của 2 nghiên cứu là tương đương 52,75% so

với 59,78% nhưng hàm lượng đường trong EPS cao hơn rất nhiều 43,82% so với

22,37% [85].

Đối với các mẫu IPS và EPS, phổ FT-IR được phân tích trong dải sóng 4000 -

400cm-1 để đánh giá Se có được chuyển hóa thành dạng hữu cơ gắn vào

polysaccharide hay không, kết quả được thể hiện ở hình 3.9. Nhìn chung, các mẫu

đều nằm trong vùng sóng 3500 - 3200cm-1 và 3000 - 2800cm-1 lần lượt là dao động

giãn O-H và C-H. Dải sóng từ 1300 – 400cm-1 thường xuất hiện các phân tử nhận

diện cho phép xác định các nhóm chức hóa học chính của polysaccharide hay protein:

vị trí và cường độ của dải đặc trưng cho từng loại phân tử [86] [87]. Đối với các mẫu

Se-EPS và Se-PS, phổ hồng ngoại FT-IR cho thấy các polysaccharide có đặc điểm

cấu trúc gần tương đồng nhau. Cụ thể, dải 1200 - 900cm-1 đặc trưng giãn dao động

đối xứng và bất đối xứng của liên kết glycosidic C-O-C và vùng 1100-1000cm-1 là

đặc điểm cho sự hiện diện của β-glucan. Ngoài ra, dải 1650 -1620cm-1 được đề nghị

1 có sự xuất hiện nhóm -OH của hợp chất phenolic [88] [89] [90]. Đáng chú ý, các

có sự hiện hiện của protein và nhóm chức thơm C=C cũng như vùng 1410 - 1400cm-

mẫu Se-EPS và Se-PS đều có đỉnh hấp thu trong khoảng 600 – 800cm-1, chúng thường

đánh dấu sự hiện diện của dao động giãn Se=O [19] [86] [91]. Điều này chứng minh,

có sự hiện diện của Se trong cấu trúc của exopolysaccharide và polysaccharide trong

nấm C. sinensis, tuy nhiên Se không làm ảnh hưởng nhiều đến cấu trúc chính của các

phân tử hợp chất này. Ngoài ra dựa vào kết quả phân tích FT-IR, có thể thấy dường

như hình dạng phổ đồ của hầu hết các mẫu Se-EPS và Se-PS gần giống nhau. Điều

này thể hiện, mặc dù hai hợp chất hữu cơ exopolysaccharide và polysaccharide được

nấm C. sinensis tiết ra ở hai vị trí khác nhau trong quá trình phát triển của chúng

nhưng thành phần và cấu trúc của chuỗi polysaccharide vẫn không có sự khác biệt

đáng kể. Như vậy, kết quả phân tích FT-IR đã chứng minh nguyên tố Se dường như

có hiện diện trong phân tử của các hợp chất hữu cơ bao gồm polysaccharide,

exopolysaccharide mà không gây ra nhiều ảnh hưởng đến cấu trúc chung của các

phân tử này.

ĐC-EPS

Se-EPS

ĐC-IPS

Se-IPS

Kết quả phân tích FTIR của các hợp chất Se-EPS, Se-IPS: mẫu

polysaccharide thu nhận từ nghiệm thức bổ sung selen; ĐC-EPS, ĐC-IPS: mẫu

polysaccharide thu nhận từ nghiệm thức không bổ sung Se

3.4 Về hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis giàu selen

3.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa

3.4.1.1. Hoạt tính bắt gốc tự do ABTS

Hoạt tính bắt gốc tự do ABTS của các cao chiết từ sinh khối nấm C. sinensis

giàu Se và ĐC được thể hiện qua giá trị IC50 ở hình 3.10. Chứng dương là vitamin C

có giá trị IC50 = 205,93 (µg/mL), đây là kết quả để đánh giá sự ổn định của quy trình.

Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bắt gốc tự do ABTS. Giá

trị IC50 càng thấp thể hiện hoạt tính càng cao. IC50 là nồng độ cao chiết tại đó 50%

gốc tự do ABTS được bắt giữ. Chữ cái khác nhau trên mỗi cột thể hiện sự khác biệt

về mặt thống kế trong mỗi cao chiết tại giá trị α = 0,05. VitC (vitamic C) sử dụng làm

đối chứng dương.

Kết quả trên hình 3.10 cho thấy, hoạt tính bắt gốc tự do ABTS của cao IPS,

EPS của nấm bổ sung Se và ĐC không có sự khác biệt (p > 0,05). Đối với các cao

còn lại gồm cao EtOH, cao EtOAc, cao BuOH, cao H2O, cao CPS từ sinh khối nấm

nuôi trong môi trường có bổ sung Se đều cho thấy thấy hoạt tính cao hơn hơn ĐC (p

< 0,05). Ở nhóm Se, hoạt tính bắt gốc tự do ABTS giảm dần từ cao đến thấp lần lượt

là (giá trị IC50 càng cao, hoạt tính càng thấp): cao EtOAc (2026 ± 23,45µg/mL) > cao

BuOH (2189 ± 24,5µg/mL) > cao EtOH (2346 ± 21,5µg/mL) > cao H2O (2749 ±

25,5µg/mL) > cao CPS (3096 ± 26,5µg/mL) > IPS (3323 ± 27,5µg/mL) > EPS (3543

± 28,5µg/mL) > cao PE (3707 ± 22,5µg/mL) thứ tự này tương tự ở nhóm ĐC. Nhìn

chung, hoạt tính bắt gốc tự do ABTS của C. sinensis giàu Se cao hơn nhóm ĐC. Đặc

biệt, cao EtOAc thể hiện hoạt tính cao nhất (IC50 = 2026 ± 23,45µg/mL).

3.4.1.2. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH

Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết từ nhóm C. sinensis giàu Se

và nhóm ĐC được thể hiện qua giá trị IC50 của chúng (hình 3.11). Các mẫu

polysaccharide gồm CPS, IPS và EPS không bao gồm trong khảo sát này vì chúng

không tan hoàn toàn trong methanol 80%. Chứng dương là vitamin C có giá trị IC50

= 8,63 (µg/mL), đây là kết quả để đánh giá sự ổn định của quy trình.

Hình 3.11 cho thấy, tất cả các cao đều thể hiện hoạt tính bắt gốc tự do DPPH,

trong đó, hoạt tính bắt gốc tự do DPPH đều tăng dần theo thứ tự: cao PE < cao EtOH

< cao H2O < cao BuOH < cao EtOAc. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao EtOH

và cao PE từ nấm C. sinensis giàu Se và C. sinensis không có sự khác biệt (p > 0,05).

Đối với cao EtOAc, cao BuOH, cao H2O, nhóm C. sinensis giàu Se thể hiện hoạt tính

mạnh hơn ĐC (giá trị IC50 thấp hơn) (p < 0,05). Tương tự với khả năng bắt gốc tự do

ABTS, cao EtOAc thể hiện hoạt tính cao nhất, đặc biệt với ở nấm giàu Se với giá trị

IC50 là 1200 ± 69,5µg/mL so với nấm đối chứng 1598 ± 17,5µg/mL.

Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bắt gốc tự do DPPH. Giá

trị IC50 càng thấp thể hiện hoạt tính càng cao. IC50 là nồng độ cao chiết tại đó 50%

gốc tự do DPPH được bắt giữ. Chữ cái khác nhau trên mỗi cột thể hiện sự khác biệt

về mặt thống kế trong mỗi cao chiết tại giá trị α = 0,05. VitC (vitamic C) sử dụng làm

đối chứng dương (IC50=8.63µg/mL).

3.4.1.3. Hoạt tính kháng oxy hóa thông qua năng lực khử

Năng lực khử là một trong những đặc tính quan trọng thể hiện khả năng kháng

oxy hóa của mẫu, với sự hiện diện của các chất khử, khả năng nhường nguyên tử

hydrogen tạo nên các sản phẩm ổn định hơn nhằm kết thúc phản ứng chuỗi điện tử tự

do. Khảo sát năng lực khử của các cao chiết của 2 nhóm C. sinensis giàu Se và ĐC

được thể hiện qua giá trị ∆OD tại nồng độ 2000µg/mL của mẫu (bảng 3.12). Chứng

dương là butylated hydroxyanisol (BHA) có giá trị ∆OD tại nồng độ 50µg/mL là

0,109, đây là kết quả để đánh giá sự ổn định của quy trình.

Bảng 3.12. Giá trị ∆OD của các cao chiết tại nồng độ 2000µg/mL

Cao chiết ∆OD

C. sinensis giàu Se C. sinensis ĐC

Cao EtOH 0,120 ± 0,003b 0,115 ± 0,003a

Cao PE 0,012 ± 0,003g 0,011 ± 0,002g

Cao EtOAc 0,137 ± 0,005a 0,089 ± 0,002c

Cao BuOH 0,091 ± 0,002d 0,079 ± 0,002d

0,102 ± 0,002c 0,097 ± 0,001b Cao H2O

Cao CPS 0,037 ± 0,003e 0,039 ± 0,001f

IPS 0,025 ± 0,003f 0,025 ± 0,004e

EPS 0,020 ± 0,004f 0,025 ± 0,001e

BHA (50µg/mL) 0,109

Chữ cái thể hiện sự khác nhau giữa các cao theo cột

Ở nấm C. sinensis giàu Se, cao chiết có năng lực khử cao nhất là cao EtOAc

(0,137) và cao EtOH (0,120) tiếp theo là cao H2O, cao BuOH, cao CPS, IPS, EPS và

cao PE. Ở nhóm ĐC thứ tự năng lực khử giảm dần theo thứ tự cao EtOH > cao H2O

> cao EtOAc > cao BuOH > EPS, IPS > CPS > cao PE. Nhìn chung, cao EtOAc, cao

EtOH đều thể hiện hoạt tính tốt còn cao PE cho thấy hoạt tính thấp nhất.

3.4.1.4. Hoạt tính kháng oxy hóa dựa trên khả năng bảo vệ tính nguyên vẹn của

DNA

Tiến hành khảo sát khả năng bảo vệ DNA của các cao chiết, IPS và EPS ở 3

mức nồng độ là 500µg/mL, 1000µg/mL, 1500µg/mL (hình 3.12). Kết quả này cho

thấy tất cả các cao chiết: cao tổng (EtOH), cao ethyl acetate (EtOAc), cao nước (H2O)

và cao butanol (BuOH) đều có khả năng bảo vệ sự nguyên vẹn của DNA ở nồng độ

1500µg/mL, khi giảm dần nồng độ cao chiết từ 1500µg/mL xuống 1000µg/mL và

500µg/mL mức độ nguyên vẹn của DNA cũng giảm theo.

Kết quả bảo vệ DNA của các mẫu cao chiết; A, C: Kết quả vạch điện

di; B, D kết quả ở định dạng 3D; (+): Mẫu DNA nguyên vẹn; (-): Mẫu chứng âm

(không có chất bảo vệ); Nồng độ tương ứng với mỗi cao từ trái qua phải: 1500µg/mL-

1000µg/mL-500µg/mL

3.4.2. Khả năng ức chế xanthine oxidase

Allopurinol là một chất ức chế xanthine oxidase (XO) được sử dụng làm chứng

dương trong thí nghiệm này. Kết quả cho thấy ở allopurinol có giá trị IC50 đạt

2,68µg/mL, kết quả này để đánh giá sự ổn định của quy trình. Các cao chiết từ sinh

khối nấm C. sinensis giàu Se và ĐC được đánh giá hoạt tính ức chế XO ở nồng độ

4000µg/mL (Phụ lục 18). Các cao có khả năng ức chế hơn 50% XO ở nồng độ

4000µg/mL sẽ được tính giá trị IC50 (bảng 3.13).

Bảng 3.13. Giá trị IC50 trong khảo sát khả năng ức chế XO của một số cao chiết từ

sinh khối nấm C. sinensis

IC50 (µg/mL)

Mẫu

C. sinensis giàu Se

C. sinensis ĐC

2558,49 ± 208,54

EtOAc

1979,96 ± 225,73

1938,13 ± 165,40

BuOH

3017,41 ± 195,25

Kết quả trên cho thấy việc bổ sung Se làm gia tăng đáng kể hoạt tính ức chế

enzyme XO của nấm C. sinensis ở một số phân đoạn như cao PE; cao BuOH với IC50

lần lượt 2558,49 ± 208,54, 3017,41 ± 195,25 (µg/mL), đối với cao IPS, EPS tuy

không xác định được IC50 nhưng kết quả vẫn cho thấy tăng khả năng ức chế XO ở

mẫu nấm C. sinensis giàu Se. Ở các cao còn lại, sự khác biệt giữa hai nhóm nấm là

không đáng kể. Ở cả hai nhóm nấm, cao có khả năng ức chế XO cao nhất là cao EA

với giá trị IC50 lần lượt 1979,96 ± 225,73, 1938,13 ± 165,40 (µg/mL) ở 2 mẫu giàu

Se và ĐC. Kết quả nhìn chung cho thấy hoạt tính ức chế XO tập trung chủ yếu vào

các cao phân đoạn có độ phân cực yếu đến trung bình.

3.4.3. Hoạt tính kháng viêm in vitro

Khả năng kháng viêm của các mẫu cao chiết được thể hiện bằng mô hình bảo

vệ sự biến tính albumin bởi nhiệt với khoảng nồng độ từ 0 - 1500µg/mL và diclofenac

(NSAIDS) làm chứng dương. Giá trị IC50 của diclofenac được xác định là 49,41 ±

0,68µg/mL, đây là kết quả để đánh giá sự ổn định của quy trình.

Hoạt tính kháng viêm dựa trên khả năng bảo vệ sự biến tính albumin

bởi nhiệt độ. Giá trị IC50 càng thấp thể hiện hoạt tính càng cao. IC50 là nồng độ cao

chiết tại đó 50% albumin không biến tính. Chữ cái khác nhau trên mỗi cột thể hiện

sự khác biệt về mặt thống kế trong mỗi cao chiết tại giá trị α = 0,05. Các cao chiết

không xác định được giá trị IC50 được bỏ trống.

Hình 3.13 cho thấy hầu hết các cao có hoạt tính kháng viêm ở nấm C. sinensis

giàu Se (giá trị IC50 đều thấp hơn so với ĐC), điều này cho thấy bổ sung Se đã làm

tăng cường hoạt tính kháng viêm của nấm. Ở các cao EtOH, PE, EtOAc, CPS, IPS

của C. sinensis giàu Se đều có hoạt tính tốt hơn so với các cao của mẫu nấm ĐC (p >

0,05), cụ thể, cao EtOH gấp 4,4 lần, cao PE gấp 3,1 lần, cao EtOAc gấp 1,72 lần, (các

mẫu CPS, IPS ĐC có IC50 >1500µg/mL). Trong khoảng nồng độ khảo sát các cao

như cao BuOH, cao H2O ức chế biến tính thấp hơn 50% nên không xác định được giá

trị IC50. Đối với các mẫu cao của nhóm giàu Se, cao PE thể hiện hoạt tính tốt nhất với

(IC50 = 64,19 ± 0,22µg/mL), tiếp theo là cao EtOH (195,58 ± 7,89µg/mL), cao EtOAc

(469,27 ± 16,57µg/mL), cao CPS (1259,28 ± 46,20µg/mL) và IPS (1280,33 ±

135,22µg/mL). Điều đó cho thấy các hợp chất không phân cực và phân cực trung

bình đều có tiềm năng kháng viêm, cao CPS, cao IPS và cao EPS có hoạt tính yếu

hơn so với các cao EtOH, PE, EtOAc trong việc ức chế biến tính albumin. Trong khi

đó cao phân đoạn phân cực trung bình BuOH hay phân cực cao như nước lại không

có khả năng bảo vệ albumin ở nồng độ khảo sát. Qua đó, nhận thấy khả năng ức sự

chế biến tính albumin các cao từ sinh khối tăng dần theo sự giảm phân cực của các

chất.

Đối với hoạt tính kháng viêm, do sự biến đổi cấu trúc hoặc không gấp cuộn

của cấu trúc bậc hai, bậc ba mà không phá vỡ liên kết hydro hoặc peptide dẫn đến sự

biến tính protein làm mất một số chức năng sinh học đồng thời làm tăng hoạt động

của đại thực bào ở vị trí protein bị biến tính trong mô dẫn đến một số bệnh thoái hóa

thần kinh và viêm [92]. Một số tác giả gần đây cũng cho rằng cơ chế kháng viêm của

các loại thuốc ảnh hưởng đến sự biến tính albumin có thể liên quan đến sự thay đổi

điện tích, liên kết hydro, liên kết kỵ nước và liên kết disulfide khi các chất kháng

viêm liên kết với các phân tử protein, nhờ đó có thể hạn chế sự thay đổi các đặc tính

lý hóa của các phân tử protein do nhiệt độ gây ra [93]. Dựa trên phổ cộng hưởng từ

hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D 1H NMR) để dự đoán về sự tương tác,

liên kết giữa các phân tử albumin với các hoạt chất kháng viêm trong thuốc kháng

viêm, chúng gắn rất nhiều với protein huyết tương, chủ yếu với albumin (99%).

William và cộng sự (2008) đã dự đoán rằng các chất kháng viêm liên kết với 2 vùng

giàu tyrosine thơm, vùng giàu threonine và lysine nhờ vậy có thể giúp ngăn cản sự

biến tính của albumin bởi nhiệt [94].

3.4.4. Hoạt tính ức chế α–glucosidase

Sau khi thực hiện thí nghiệm khảo sát ức chế α–glucosidase của chứng dương

và các mẫu cao chiết với kết quả lần lượt được thể hiện qua bảng 3.19. Giá trị IC50

của acarbose là 2134 ± 82µg/mL.

Bảng 3.14. Phần trăm ức chế α - glucosidase ở nấm C. sinensis

% Ức chế α–glucosidase

Mẫu

50 µg/mL 500 µg/mL 5000 µg/mL

Cao EtOH Cao PE Cao EtOAc Cao BuOH -8,25 -2,76 0,91 -0,37 -2,81 1,18 4,60 0,55 5,25 9,12 23,76 3,08

Nấm C. sinensis giàu Se 0,12 2,21 5,41 Cao H2O

Cao CPS Cao IPS Cao EPS Cao EtOH Cao PE Cao EtOAc Cao BuOH 0,73 5,38 2,73 1,00 -9,90 -0,15 -0,35 4,82 12,06 1,09 -3,65 2,66 1,69 1,75 6,72 4,25 3,22 -3,41 3,53 12,80 1,13 Nấm C. sinensis ĐC -3,02 -4,64 -2,85 Cao H2O

Cao CPS Cao IPS Cao EPS 0,03 3,14 -0,74 2,15 -0,5 4,44 3,17 1,07 -3,10

Bảng 3.14 thể hiện kết quả sàng lọc phần trăm khả năng ức chế enzyme của

các cao chiết tại nồng độ 50, 500 và 5000µg/mL từ nấm C. sinensis giàu Se cho thấy

phần trăm ức chế enzyme tăng dần theo nồng độ khảo sát nhưng giá trị này nhỏ hơn

50% nên không tính được giá trị IC50 nên kết quả dựa vào phần trăm ức chế enzyme

và nhận thấy có giá trị âm xuất hiện ở nồng độ 50 và 500µg/mL, phần trăm ức chế

enzyme cao nhất là ở cao EtOAc đạt 23,76% tại nồng độ 5000µg/mL và cao hơn ĐC

12,8%. Ở cao chiết nấm C. sinensis ĐC giá trị âm xuất hiện nhiều hơn, ở một số cao

như cao EtOH phần trăm ức chế enzyme giảm dần theo nồng độ khảo sát, giá trị phần

trăm ức chế enzyme cao nhất vẫn nằm ở cao EtOAc ở nồng độ 5000µg/mL đạt 12,8%.

Kết quả khảo sát này cho thấy các mẫu cao chiết từ nấm C. sinensis giàu Se và ĐC

đều không thể hiện hoạt tính ức chế enyme trên mô hình in vitro.

3.4.5. Hoạt tính ức chế tăng sinh của tế bào ung thư

Các mẫu cao chiết được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào

ung thư là MCF-7 và Jurkat, đồng thời trên dòng tế bào thường fibroblast bằng

phương pháp SRB. Các mẫu cao chiết được tiến hành sàng lọc ở nồng độ 100µg/mL

và từ đó xác định giá trị IC50, kết quả được thể hiện qua bảng 3.20. Chứng dương

được sử dụng là Camptothecin (CPT) với khả năng gây độc 58,75 ± 1,88% tại

0,05g/L.

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư MCF7. Giá trị IC50 càng thấp thể hiện

hoạt tính càng cao. IC50 là nồng độ cao chiết tại đó 50% tế bào MCF7 bị chết. Chữ

cái khác nhau trên mỗi cột thể hiện sự khác biệt về mặt thống kế trong mỗi cao chiết

tại giá trị α = 0,05

Kết quả cho thấy cao chiết nấm C. sinensis giàu Se và ĐC đều có khả năng

gây độc tế bào MCF7, cụ thể ở cao EtOH, PE và EtOAc, ở mẫu ĐC có thêm cao

BuOH (hình 3.14). Đối với cao EtOH, khi bổ sung Se giá trị IC50 thấp hơn 1,57 lần

so với ĐC (p < 0,05). Tương tự ở cao EtOAc, hoạt tính ở nấm giàu Se cũng rất tốt

với IC50 = 3,82 ± 0,12g/mL cao hơn mẫu ĐC 7,59 lần, điều này cho thấy Se có tác

động cộng gộp làm tăng họat tính của mẫu cao này. Theo chương trình tầm soát các

hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất tự nhiên của Viện Ung thư Quốc gia Hoa

Kỳ (National Cancer Institute – United States), những cao chiết có IC50 < 30 μg/ml

được coi là có hoạt tính gây độc tiềm năng đối với tế bào in vitro [95], [96] [97]. Như

vậy, kết quả cho thấy cao EtOAc (C. sinensis giàu Se) là cao chiết có hoạt tính gây

độc tế bào in vitro tiềm năng. Đối với mẫu cao PE, ở cả 2 nấm bổ sung Se và ĐC đều

không có sự khác biệt với IC50 lần lượt 35,14 ± 6,81g/mL, 30,14 ± 4,49g/mL (p >

0,05), đồng thời cao BuOH ở nấm C. sinensis giàu Se không có hoạt tính. Tuy nhiên,

ĐC cho thấy có hoạt tính gây độc tế bào với IC50 92,69 ± 3,41g/mL. Hơn nữa, ở

mẫu EPS tuy không xác định được giá trị IC50 nhưng kết quả cũng cho thấy chúng có

khả năng kháng phân bào với tỉ lệ 33,24 ± 5,79%.

Bảng 3.15. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Jurkat của các mẫu cao chiết tại nồng

độ thử nghiệm 100g/mL

Mẫu nấm

STT Cao chiết C. sinensis giàu Se (%) C. sinensis ĐC (%)

EtOH 36,01 ± 3,21 27,96 ± 4,42 1

PE 37,87 ± 6,39 31,25 ± 9,38 2

EtOAc 37,11 ± 3,84 36,25 ± 4,27 3

BuOH 7,85 ± 5,50 -0,53 ± 8,94 4

Nước -6,22 ± 3,91 -1,68 ± 1,89 5

CPS -0,60 ± 2,84 -12,06 ± 8,43 6

EPS 15,06 ± 7,12 25,69 ± 2,20 7

IPS -2,96 ± 2,53 -0,92 ± 8,74 8

Kết quả gây độc tế bào trên dòng ung thư Jurkat được thể hiện như bảng 3.15.

Mặc dù các mẫu cao chiết không xác định được giá trị IC50 song so với thử nghiệm

trên dòng tế bào MCF-7 kết quả cũng có điểm tương đồng, cao EtOH, PE, EtOAc

cũng cho hoạt tính gây độc cao nhất với khả năng gây độc lần lượt 36,87; 37,11; 7,85

(%). Ngoài ra, EPS từ nấm C. sinensis giàu Se cũng cho thấy khả năng gây độc tế bào

với 15,06 ± 7,12% ở nồng độ 100µg/mL.

Khả năng gây độc tế bào của các cao chiết trên tế bào fibroblast

Đối với những cao có hoạt tính gây độc tế bào, khả năng gây độc trên tế bào

thường fibroblast cũng được khảo sát. Kết quả được thể hiện ở hình 3.15. Tỉ lệ gây

độc tế bào thường fibroblast của cao EtOH, PE, EtOAc BuOH là rất thấp (-8.99 –

9,87%) chứng tỏ các cao chiết từ nấm C. sinensis không gây độc trên tế bào thường.

3.4.6 Thảo luận chung về hoạt tính sinh học

Từ những kết quả khảo sát về khả năng kháng oxy hóa gốc DPPH, ABTS,

năng lực khử và khả năng bảo vệ DNA, XO nhận thấy các cao chiết từ nấm C. sinensis

giàu Se và ĐC đều có khả năng kháng oxy rất tốt, trong đó cao EtOAc, cao BuOH,

cao EtOH thể hiện hoạt tính mạnh, cao PE thể hiện hoạt tính thấp nhất. Xiao và cộng

sự (2015) cũng cho thấy C. militaris nuôi cấy trên môi trường bán rắn hoạt tính ABTS,

DPPH, năng lực khử của các cao MeOH, EtOH, Ac rất tốt, bên cạnh đó khả năng bảo

vệ sự nguyên vẹn của DNA của các mẫu cao chiết cũng rất cao [98]. Một nghiên cứu

khác của Xiao và cộng sự (2017) đã đánh giá hoạt tính ABTS và năng lực khử của

các cao MeOH, EtOH, Ac từ C. militaris cũng cho thấy các cao này có hoạt tính

kháng oxy hóa, khả năng bảo vệ sự nguyên vẹn của DNA, trong đó cao H2O thể hiện

hoạt tính mạnh nhất [99]. Với nấm C. sinensis, Wang và cộng sự 2005 cho thấy các

phân đoạn R, F1, E từ cao EtOH có hoạt tính bắt gốc DPPH rất cao với phần trăm bắt

gốc tại 2mg/mL lần lượt là 93%, 75% và 66% [100]. Các kết quả nghiên cứu của

Huỳnh Thư và cộng sự chứng minh các cao chiết EtOAc và BuOH sinh khối của các

loài thuộc chi Cordyceps đều có khả năng bảo vệ DNA ở nồng độ 500µg/mL và các

cao chiết như EtOAc, Pe, BuOH, nước từ chủng Corydceps phân lập tại Việt Nam

đều cho thấy hoạt tính DPPH và năng lực khử cao [56] [57].

Việc bổ sung Se vào môi trường nuôi cấy C. sinensis nhằm nâng cao khả năng

kháng oxy hóa cũng đã được báo cáo rất nhiều trên thế giới. Wang và cộng sự (2011)

đã chứng minh bổ sung Se khi nuôi cấy sẽ làm gia tăng khả năng kháng oxy hóa của

cao IPS thu nhận từ sinh khối C. sinensis dựa trên khảo sát năng lực khử và khảo sát

khả năng bắt gốc tự do OH [101]. Năm 2016, Yang và cộng sự đã tách chiết

polysaccharide từ C. sinensis giàu Se và chúng có hoạt tính kháng oxy hóa như

hydroxyl, năng lực khử cải thiện rất nhiều so với nhóm ĐC [19]. Kết quả bắt gốc tự

do DPPH của cao H2O và EtOH từ nấm C. militaris giàu Se đều cao hơn ĐC, kết quả

này tương đồng với nghiên cứu này [102].

Những kết quả thu được đều cho thấy cao chiết có độ phân cực trung bình đều

có hoạt tính bắt gốc tự do rất mạnh, điều này chứng tỏ các hợp chất kháng oxy hóa

chủ yếu tập trung ở phân đoạn này. Cao PE có độ phân cực thấp nên có rất ít hợp chất

kháng oxy hóa, chủ yếu là các hợp chất béo. Các hợp chất có khả năng kháng oxy

hóa cao như polyphenol đều ít tan trong pha PE trong khi đó chúng lại có hàm lượng

lớn trong cao EtOAc [103]. Hơn nữa, Se cũng có vai trò quan trọng trong quá trình

kháng oxy hóa, nhưng nghiên cứu trước đây cho thấy Se góp phần giúp làm giảm các

ROS gây hại cho DNA, protein cũng như tham gia vào cấu trúc các enzyme kháng

oxy hóa như glutathione peroxidase (GPx), thioredoxin reductase (TrxR) và

iodothyronine deiodinases (IDD) [104].

Bên cạnh đó, hoạt tính ức chế XO của nấm C. sinensis giàu Se tập trung chủ

yếu ở các phân đoạn cao PE, EA và BuOH. Điều này chứng tỏ các hợp chất có khả

năng ức chế mạnh XO ở nấm bổ sung Se có độ phân cực từ yếu đến trung bình. Ngoài

ra, có sự gia tăng rõ rệt hoạt tính ức chế XO của nấm ở các cao PE và BuOH, như

vậy việc bổ sung Se có thể đã giúp gia tăng sự sinh tổng hợp các hợp chất có nhiều

trong các phân đoạn này dẫn tới việc gia tăng đáng kể hoạt tính sinh học của các cao

chiết. Bên cạnh đó, ngoài hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt tính ức chế XO còn có vai

trò quan trọng trong việc điều trị bệnh gout. Nghiên cứu của Huỳnh Thư và cộng sự

trên đối tượng C. sinensis cũng cho thấy các cao chiết như PE, EtOAc, EtOH của C.

sinensis có khả năng ức chế XO [105], nghiên cứu của Tran và cộng sự cũng cho thấy

cao EtOAc từ nấm C. militaris cho hoạt tính ức chế XO tốt nhất với 31,66% tại

100µg/mL [106], Ghaffari và cộng sự năm 2012 đã chứng minh việc bổ sung Se vào

khẩu phần ăn của chuột một lượng Se sẽ làm hạ acid uric máu và hoạt độ enzyme XO

trong mô hình chuột tiểu đường cảm ứng streptozotocin [107]. Kết quả nghiên cứu

này sẽ góp phần chứng tỏ việc bổ sung làm giàu Se trên nấm C. sinensis sẽ có thể làm

gia tăng hoạt tính ức chế XO, đồng thời có tiềm năng trong việc điều trị bệnh gout.

Đối với hoạt tính kháng viêm, Won và cộng sự (2005) đã đánh giá hoạt tính

kháng viêm của cao chiết ethanol 70% của hệ sợi nấm C. militaris (CME) trên tế bào

RAW 264.7, kết quả cho thấy cao chiết này có khả năng làm giảm lượng NO, nguyên

nhân gây ra viêm và tổn thương tế bào, hơn nữa nhóm nghiên cứu cũng đánh giá trên

mô hình gây phù bàn chân chuột cống bằng carrageenan, kết quả cho thấy CME có

khả năng làm giảm sưng bàn chân và cơn đau quặn của chuột [108]. Kim và cộng sự

cho thấy cao chiết methanol từ chủng C. pruinosa cũng có khả năng điều hòa IL-1,

TNF-, nitric oxide (NO), và prostaglandin E2 (PGE2) giúp làm giảm tình trạng viêm

in vivo và in vitro [109].

Một số nghiên cứu nhận thấy các hợp chất ít phân cực có khả năng kháng viêm

tốt. Khảo sát của Yang và cộng sự (2011) cho thấy ở các cao hexane, cao MeOH và

cao EtOAc cũng có hoạt tính kháng viêm cao nhờ các hợp chất như ergosteryl-3-O-

β-D-glucopyranoside, perlolyrine và cordysinin A - E [110]. Hợp chất ergosterol,

ergosterol peroxide và acid trametenolic có trong các cao PE, cao EtOAc từ nấm

Inonotus obliquus có khả năng kháng viêm thông qua ức chế sản xuất NO và yếu tố

nhân ƙB [111]. Tương tự, Rao và cộng sự (2007) cũng cho thấy khả năng kháng viêm

của các cao methanol, chloroform và butanol chiết từ quả thể C. sinensis [94].

Một số công bố trước đây cho thấy Se góp phần làm giảm tình trạng viêm

trong cơ thể thông qua việc làm giảm yếu tố hạt ƙB, đây được xem là kích thích các

yếu tố gây viêm IL-6 và TNF-α, ngoài ra Se còn giúp điều hòa L-selectin từ đó làm

giảm quá trình gây viêm [112] [113]. Tác động cộng gộp của Se đã giúp nâng cao

hoạt tính của các mẫu cao chiết ở nấm C. sinensis giàu Se so với ĐC, do đó, ở nấm

giàu Se không chỉ thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mà còn kháng viêm tốt.

Đối với hoạt tính ức chế α-glucosidase, các mẫu cao chiết không thể hiện hoạt

tính trên mô hình in vitro. Một số cao chiết thể hiện giá trị âm, điều này có thể do

hàm lượng p-NPG nội sinh từ cao chiết. Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2004) cho

thấy, tiểu phần α của α- glucosidase liên kết hình thành vùng domain kị nước, có chức

năng xúc tác. Sự hiện diện nhiều phân tử kị nước bao quanh vùng domain này sẽ giúp

bảo vệ vùng trung tâm hoạt tính [114]. Bên cạnh đó, qua kết quả chiết cao và tham

khảo các bài nghiên cứu trên thế giới, thấy được Cordyceps chứa một lượng các hợp

chất kị nước như lipid, acid béo và các hợp chất sterol. Chúng tôi giả thuyết rằng các

hợp chất kị nước có trong Cordyceps giúp hỗ trợ cho việc hình thành trung tâm hoạt

động của α-glucosidase. Do đó hoạt tính của enzyme đã được tăng cường, dẫn đến

hoạt tính ức chế của cao chiết thấp.

Mặc dù trên mô hình in vitro không thể hiện hoạt tính ức chế α-glucosidase

nhưng nhiều nghiên cứu trước đây trên mô hình chuột đái tháo đường đều cho thấy

hoạt tính điều hòa đường huyết trong máu. Lo và cộng sự (2006) cho thấy chuột bị

đái tháo đường khi sử dụng quả thể, hệ sợi của nấm C. sinensis đều có khả năng làm

giảm lượng đường trong máu. Hơn nữa, C. sinensis còn có thể tăng cường miễn dịch

của chuột [115]. Những nghiên cứu khác trên chuột cũng cho thấy tác dụng hạ đường

huyết của C. sinensis như Zhang và cộng sự [116], Li và cộng sự [117]; Một số nghiên

cứu về Se như SeNPs hoặc selenopolysaccharide từ nấm Catathelasma ventricosum

đều cho thấy khả năng hạ đường huyết trên chuột bị bệnh [118] [119].

Đối với hoạt tính gây độc tế bào, kết quả này tương đồng với những nghiên

cứu trước đây, Wu và cộng sự (2007) cho thấy cao chiết EtOH, EtOAc, PE có hoạt

tính gây độc đối với 4 dòng tế bào MCF-7, B16, HL-60, Hep G2 trong đó cao EtOAc

thể hiện hoạt tính mạnh nhất với IC50 lần lượt 44,17; 12,1; 21,7; 16,2 (g/mL) [120].

Nghiên cứu của Zhang và cộng sự cũng cho thấy cao EtOAc có khả năng gây độc tế

bào ung thư bạch cầu HL-60 với giá trị ED50 < 25g/mL [121]. Kou và cộng sự (1994)

đã thử nghiệm các phân đoạn EtOAc-MeOH (95:5) từ C. sinensis trên các dòng tế

bào ung thư K562, Raji, Calu-1, Vero, Wish cho thấy chúng có tiềm năng kháng ung

thư rất tốt với IC50 từ 2 – 68g/mL tùy từng dòng tế bào [122]. Báo cáo của Lee và

cộng sự cũng cho thấy, C. militaris có khả năng ức chế tế bào ung thư đại trực tràng

RKO [123]. Wang đã chứng minh cao EtOH từ nấm C. sinensis có hoạt tính gây độc

tế bào Hep G2 với IC50 là 27g/mL [100]. Nakamura và cộng sự (2003) cho thấy cao

chiết nước từ quả thể nấm C. sinensis có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung

thư B16 cũng như có khả năng ức chế khối u ở chuột [124]. Cao H2O từ chủng

Tolypocladium sp. phân lập từ C. sinensis cũng cho thấy khả năng ức chế tế bào ung

thư B16 in vitro và in vivo [125]. Tương tự cao H2O của C. militaris cũng cho thấy

hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô dạ dày (SNU-1), ung thư biểu mô tuyến trực

tràng (SUN-C4) và ung thư biểu mô tế bào gan (SNH-354) [126], cao H2O từ I.

cicadae cũng thể hiện khả năng ức chế tế bào ung thư gan MHCC97H [127]. Nghiên

cứu của Rao và cộng sự lại cho thấy cao BuOH phân đoạn từ cao tổng Me cho hoạt

tính gây độc tốt trên dòng tế bào Jurkat và MCF-7 với IC50 lần lượt là 8g/mL,

100g/mL [128]. Năm 2015, Lee và cộng sự đã tiến hành khảo sát khả năng gây độc

tế bào ung thư vú MCF-7, ung thư gan Hep G2 của nấm C. sinensis và kết quả thu

được là IC50 của chúng đạt 208,23g/mL, 84,7g/mL [129]. Theo những nghiên cứu

trước đây, polysaccharide và các sterol như ergosterol β-Sitosterol thường tập trung

vào phân đoạn cao EtOAC, đây là những chất có vai trò quan trọng trong hoạt tính

kháng ung thư, do đó, cao này thường thể hiện hoạt tính rất tốt [120] [130]. Tuy vậy

đối với polysaccharide cũng có nhiều ý kiến trái chiều về hoạt tính kháng ung thư

[120] [121] [125] [122]. Đối với adenosine, theo Wu và cộng sự [120], Leung và cộng

sự [125] cho rằng chúng không có hoạt tính kháng ung thư. Tuy nhiên, một số nghiên

cứu khác cho kết quả ngược lại, adenosine gây độc tế bào ung thư bằng cảm ứng con

đường apoptosis [131] hoặc khi kết hợp với chất khác như adrenomedullin (ADM)

sẽ có tác động cộng gộp giúp ức chế khối u [127].

Ngoài những hợp chất trên, Se cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tăng

cường hoạt tính, Ji và cộng sự cho thấy nấm C. sinensis bổ sung Se sẽ giảm tỉ lệ mắc

ung thư cổ tử cung trên chuột còn 40% so với nấm không bổ sung Se (70%), đồng

thời chúng còn giúp tăng cường hệ miễn dịch thông qua các chỉ số của tuyến ức và

lách [37]. Nghiên cứu của Milovanovic cho thấy cao chiết EtOH giàu Se từ nấm

Trametes hirsuta cho hoạt tính kháng ung thư tốt hơn ĐC trên 2 dòng tế bào Hela và

LS174 [132]. Tương tự, nấm Pleurotus streatus giàu Se và Zn cũng cho thấy khả

năng giảm khối u ở mô hình chuột ung thư phổi đồng thời tăng cường hoạt động một

số enzyme như glutathione peroxidase (GPx) và superoxide dismutase và giảm hàm

lượng malondialdehyde và ipofuscin [133]. Hơn nữa, tác dụng của Se trong kháng

khối u và điều trị ung thư đã được thực hiện và có kết quả tích cực [14] [134], do đó,

việc bổ sung Se đã giúp tăng cường hoạt tính kháng ung thư của nấm C. sinensis.

Nhìn chung, nấm C. sinensis bổ sung Se đều thể hiện hoạt tính tốt hơn so với ĐC, các

cao chiết thể hiện hoạt tính tốt nằm ở phân đoạn cao PE, EtOAc, các cao chiết có độ

phân cực mạnh như nước hay BuOH đa số đều cho thấy hoạt tính không mạnh, các

mẫu EPS, IPS, CPS đều không thể hiện được nhiều hoạt tính nổi trội trong nghiên

cứu này.

3.5 Đề xuất quy trình nuôi cấy sản xuất nấm Cordyceps sinensis giàu selen

3.5.1 Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm

Hàm lượng các hoạt chất có trong nấm C. sinensis được tiến hành phân tích,

kết quả được thể hiện như bảng 3.16.

Bảng 3.16. Thành phần hoạt chất trong sinh khối nấm C. sinensis giàu selen

Hoạt chất Hàm lượng

Adenosine (mg/kg) 116

Cordycepin (mg/kg) KPH

Béo (%) 6,08 ± 0,61

Protein (%) 34,41 ± 0,68

Đường tổng (%) 0,47 ± 0,07

Acid amin (%)

Cystein 0,21

Tryptophan* 0,29

Alanine 1,82

Arginine 1,86

Aspartic acid 1,99

Glutamic acid 3,81

Glycine 1,15

Histidine* 0,59

Isoleucine* 0,86

Leucine* 1,49

Lysine* 2,11

Methionine* 0,24

Phenilalanine* 0,8

Proline 0,84

Serine 1,42

Threonine* 1,2

Tyrosine 0,63

Valine* 1,24

Amino acid tổng số 22,563

Amino acid thiết yếu 8,82

Selenite (µgSe/g) 28,6

Selenate (µgSe/g) 573,0

Hoạt chất Hàm lượng

Selenocystine (µgSe/g) 232,6

Selenocystamine (µgSe/g) 153,8

Selenomethylcystein (µgSe/g) 0,0

Selenomethionine (µgSe/g) 105,5

*Acid amin tô đậm: các acid amin thiết yếu. Kết quả được phân tích tại Trung tâm

dich vụ phân tích thí nghiệm (CASE) thành phố Hồ Chí Minh (Phụ lục 27)

Hàm lượng adenosine trong sinh khối khô là 116 mg/kg. Bên cạnh các thành

phần dinh dưỡng protein, chất béo, đường, sinh khối nấm còn chứa nhiều loại acid

amin thiết yếu như tryptophan, histidine, leucine, methionine và phenylalanine. Đặc

biệt sinh khối nấm có sự tích lũy của selen bao gồm selenite, selenate, selenocystine,

selenocystamine và selenomethionine.

3.5.2. Đánh giá độc tính cấp của sinh khối C. sinensis giàu Se trên chuột

Liều 2500mg/kg là liều đậm đặc nhất có thể dung nạp được cho chuột nhắt

trắng thông qua đường uống bằng kim cho uống chuyên dụng. Kết quả cho thấy không

có hiện tượng gây chết động vật thử nghiệm, không có triệu chứng bất thường sau 1

giờ, 24 giờ sau khi cho uống (bảng 3.17). Chuột ở 2 lô thử nghiệm vẫn ăn uống, hoạt

động bình thường, phân và nước tiểu không có gì bất thường, quan sát thêm đến 7

ngày và 14 ngày chuột vẫn hoạt động bình thường, ăn khỏe, tăng thể trọng (bảng

3.18). Chứng tỏ, sinh khối nấm không tác động tiêu cực đến khối lượng chuột nhắt.

Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống của sinh khối nấm

Lô thí nghiệm Liều sinh khối (mg/kg) Số động vật thử nghiệm (con) Số ĐVTN chết sau 7 ngày

Lô 1 (chuột cái) 2500mg/kg 7 0

Lô 2 (chuột đực) 2500mg/kg 7 0

Bảng 3.18. Khối lượng (g) của chuột nhắt trên mô hình độc tính cấp

Thời gian Ban đầu 7 ngày

20,95±1,25a 26,49±2,10b Khối lượng trung bình của chuột (g)

a, b: thể hiện sự khác nhau với mức (p=0,05)

Theo quy định của Bộ Y tế số 141/QĐ-K2ĐT về “Hướng dẫn thử nghiệm tiền

lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu”, đã nghiên cứu độc tính cấp

để phân loại hóa chất theo mức độ độc dựa vào việc xác định LD50 gần đúng, được

trình bày trong bảng 3.19.

Bảng 3.19. Phân loại cấp độ độc dựa vào LD50

Nhóm Mức độ độc cấp Liều LD50 gần đúng

Cực kỳ độc >0 - 5mg/kg 1

Rất độc >5 - 50mg/kg 2

Độc > 50 - 300mg/kg 3

Độc vừa > 300 - 2000mg/kg 4

Độc thấp > 2000 - 5000mg/kg 5

Gần như không độc > 5000mg/kg 6

Với liều sinh khối 2500mg/kg thể trọng chuột mà không gây chết hay không

có triệu chứng gì bất thường trong thời gian khảo sát, theo bảng phân loại độ độc của

tổ chức OECD thì sinh khối giàu Se được xem như không có dấu hiệu gây độc. Với

kết quả này, không xác định được LD50, chuột đã uống đến liều 2500mg/kg thể trọng

mà không chết và 2500mg/kg được gọi là liều dùng tối đa Dmax, từ đó có thể suy ra

liều tương đối an toàn dùng cho thực nghiệm dược lý ban đầu khoảng 1/5 Dmax tức là

liều 500mg/kg.

3.5.3 Đánh giá các chỉ tiêu an toàn thực phẩm

Kết quả phân tích cho thấy nấm C. sinensis giàu Se đều đạt tiêu chuẩn an toàn

thực phẩm theo quy định của Bộ Y tế (bảng 3.20).

Bảng 3.20. Các chỉ tiêu an toàn thực phẩm của nấm C. sinensis giàu Se

STT Tên chỉ tiêu Kết quả Giới hạn

1 Aflatoxin B1 KPH 5mcg/kg

2 Aflatoxin tổng KPH 15mcg/kg

3 Cd 0,049 0,2mg/kg

4 Pb KPH 0,3mg/kg

5 As 0,08 1mg/kg

6 Hg KPH 0,05mg/kg

7 <10 104 TSVSVHK (trong 1g hay 1ml thực phẩm)

8 <10 10 Coliforms (trong 1g hay 1ml thực phẩm)

9 KPH KPH E. coli (trong 1g hay 1ml thực phẩm)

10 <10 10 Cl. Perfringens (trong 1g hay 1ml thực phẩm)

11 <10 102 B. cereus (trong 1g hay 1ml thực phẩm)

12 <10 102 TSBTNM-M (trong 1g hay 1ml thực phẩm)

Kết quả được phân tích tại Trung tâm dich vụ phân tích thí nghiệm (CASE)

thành phố Hồ Chí Minh (Phụ lục 27)

Bên cạnh việc thử độc tính cấp, các chỉ tiêu an toàn thực phẩm được tiến hành

theo các tiêu chuẩn 46/2007/QĐ-BYT, QCVN 8-2:2011/BYT, 46/2007/QĐ-BYT để

đảm bảo chất lượng sản phẩm của nấm C. sinensis, từ đó làm tiền đề để xây dựng quy

trình công nghệ sản xuất C. sinensis giàu Se hữu cơ. Quy trình nuôi cấy nấm giàu

selen như sau:

Quy trình công nghệ nuôi cấy nấm C. sinensis giàu Se

Thuyết minh quy trình (hình 3.16):

Chủng giống:

Giống C. sinensis từ phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến được lưu trữ

trên ống thạch nghiêng Se-PGA.

Thực hiện:

+ Chuẩn bị môi trường PGA: khoai tây (200g/L), glucose (20g/L), Na2SeO4

(25mgSe/L), agar (15g/L).

+ Lưu trữ ở 4 ± 2°C, 6 tháng sẽ được cấy chuyền 1 lần.

+ Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.

Giống cấp 1:

Mục đích: Nhằm nhân giống và hoạt hóa lại các đặc tính vốn có của chủng C.

sinensis trong quá trình nghiên cứu. Chủng C. sinensis sẽ được cấy chuyền từ ống

giống gốc sang môi trường PGA trước khi thực hiện nuôi trồng trên các môi trường

khác nhau.

Thực hiện:

+ Chuẩn bị môi trường PGA: khoai tây, glucose, Na2SeO4, agar.

+ Sau đó, cấy chuyền giống từ ống giống thạch nghiêng đến khi tơ nấm lan

đầy đĩa PGA.

+ Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.

Giống cấp 2:

Mục đích: Quá trình chuẩn bị giống cấp 2 được thực hiện bằng cách chuyển

giống cấp 1 từ môi trường thạch sang môi trường lỏng để nhân nhanh số lượng hệ sợi

nấm C. sinensis trước khi cấy giống vào môi trường nuôi cấy.

Thực hiện:

+ Chuẩn bị môi trường lỏng PG: khoai tây và glucose.

+ Sau đó, cấy chuyền giống cấp 1 vào các bình erlen chứa môi trường PG đã

hấp khử trùng.

Nuôi cấy quy mô pilot:

Mục đích: Nuôi cấy lỏng nhằm nhân sinh khối hệ sợi nấm C. sinensis là giải

pháp khả thi để sản xuất loài nấm dược liệu này. Nuôi cấy quy mô pilot giúp thu được

lượng lớn sinh khối cho các nghiên cứu hoặc ứng dụng khác.

Thực hiện:

+ Chuẩn bị bồn 10L môi trường lỏng PS gồm khoai tây, saccharose, cao nấm

men, peptone, KH2PO4, K2HPO4, MgCl2 và Na2SeO4theo công thức đã tối ưu.

+ Bổ sung giống cấp 2 bồn môi trường, khuấy đều và đổ vào hộp nhựa dung

tích 650mL.

+ Nuôi ở nhiệt độ 20 ± 2°C, ánh sáng trắng, pH 6,1 theo dõi trong 40 ngày.

Thu nhận sinh khối và bảo quản:

Thực hiện: Sinh khối được thu nhận bằng cách lọc qua rây và rửa nhiều lần

bằng nước cất nhằm loại bỏ hoàn toàn Se còn lại trong môi trường bám vào. Sấy khô

ở 60°C, với khối lượng trung bình 26,45g/L. Phân tích hàm lượng Se (Se tổng khoảng

1068µg/g), các chỉ tiêu an toàn thực phẩm có trong sinh khối nấm C. sinensis giàu

Se. Bảo quản sinh khối trong các túi hút chân không ở kho lạnh 4°C.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ những kết quả nghiên cứu thu được có thể rút ra được một số kết luận sau

đây:

1. Trong 3 loại muối Se: selenite, selenate và selenourea dùng trong nuôi cấy C.

sinensis, muối selenate nồng độ 25mgSe/L phù hợp cho qui trình nuôi cấy thu

sinh khối hệ sợi C. sinensis giàu selen.

2. Xác định được thành phần và điều kiện tối ưu nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi nấm

C. sinensis giàu Se như sau: môi trường nuôi cấy gồm: khoai tây 200g/L,

saccharose 53,48g/L, cao nấm men 4g/L, peptone 11,17g/L, KH2PO4 1,05g/L,

K2HPO4 0,5g/L, MgCl2 0,1g/L; muối selenate 25 mg/L và ở các điều kiện tối ưu

là: nhiệt độ 20°C, ánh sáng trắng, pH 6,1. Hiệu suất sinh khối đạt được 26,45 g/L

và hàm lượng Se tổng khoảng 1068 µgSe/g sinh khối.

3. Đã xác minh được một số dạng selen hữu cơ chuyển hóa từ selenate trong sinh

khối: selenomethylcystein 0,6µgSe/g, selenomethionine 383,9µgSe/g,

selenocystamine 3,2µgSe/g và selenocystine 85,6µgSe/g. Selen cũng được tích

lũy ở các cao chiết polysaccharide và cao chiết nước với hàm lượng tương ứng.

4. Hoạt tính sinh học của sinh khối nấm C. sinensis giàu selen cao hơn so với sinh

khối nấm đối chứng không bổ sung selen. Đặc biệt, cao chiết ethyl acetate từ sinh

khối nấm C. sinensis giàu selen thể hiện dược tính sinh học cao trong kháng oxy

hóa và hoạt tính gây độc đối với các dòng tế bào ung thư MCF7 và Jurkat.

5. Đã đề xuất quy trình công nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm C. sinensis giàu

selen ở qui mô pilot (10 L); hiệu suất sinh khối 26,45g/L; 1068 µgSe/g sinh khối.

Sinh khối hệ sợi nấm C. sinensis đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm theo qui định

của Bộ Y tế.

Cuối cùng, các nghiên cứu tiếp theo cần thực hiện như (1) tiếp tục tổ chức sản

xuất thử nghiệm hoạt tính khả năng kháng khối u, kháng viêm cũng như kháng oxy

hóa trên mô hình in vivo, và (2) phân tách, cô lập các hợp chất có trong các cao chiết

của nấm C. sinensis giàu Se có hoạt tính tiềm năng.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Lần đầu tiên xây dựng được quy trình sản xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis

giàu selen tại Việt Nam, nhằm nâng cao dược tính của loài nấm này hướng đến

ứng dụng, đồng thời có thể tạo ra các nguồn selen hữu cơ có khả dụng sinh học

cao.

2. Một số dạng selen protein được phát hiện như selenomethylcystein,

selenomethionine, selenocystamine và selenocystine trong sinh khối nấm có thể

là những dẫn liệu có giá trị giúp làm sáng tỏ thêm con đường chuyển hóa selen

từ dạng vô cơ sang hữu cơ trong điều kiện lên men bởi nấm Cordyceps sinensis.

3. Nghiên cứu cũng làm rõ hơn về ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng và điều

kiện môi trường đặc biệt là nhiệt độ (20°C), pH 6.1 và ánh sáng trắng trong sự

sinh trưởng và tích lũy selen của nấm Cordyceps sinensis.

4. Nghiên cứu cũng đã chứng minh sinh khối nấm giàu selen có hoạt tính kháng oxy

hóa được cải thiện. Đặc biệt chúng tôi phát hiện cao chiết ethyl acetate từ sinh

khối nấm này là cao chiết tiềm năng trong kháng phân bào tế bào ung thư vú.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

1. Trần Minh Trang, Phạm Tiến Dũng, Lê Quốc Phong, Đinh Minh Hiệp

(2016), Nghiên cứu khả năng hấp thu selenium của nấm Ophiocordyceps

sinensis trong nuôi cấy lỏng, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ (ISSN

1859-0128), Đại học Quốc gia TP.HCM, tập 19, số T6, trang 53-61

2. Lê Quốc Phong, Nguyễn Tài Hoàng, Phạm Thị Mỹ Ninh, Trần Minh

Trang, Đinh Minh Hiệp, Ngô Kế Sương (2017), Khảo sát sự ảnh hưởng của

thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sản xuất sinh khối nấm

Ophiocordyceps sinensis có bổ sung selen, Tạp chí Công nghệ Sinh học (ISSN

1811-4989), Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tập 15, số 3A,

trang 281-288

3. Lê Quốc Phong, Nguyễn Hoàng Đăng Khoa, Nguyễn Tài Hoàng, Đinh

Minh Hiệp, Ngô Kế Sương (2020), Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính

úc chế xanthine oxidase của nấm Ophiocordyceps sinensis giàu selen, Hội thảo

khoa học Công nghệ Sinh học ứng dụng (lần 2), Khoa Công nghệ, Trường Đại

học Văn Lang, tháng 7/2020, NXB Nông nghiệp trang 201-208 (ISBN 978-

604-60-3195-6)

4. Lê Quốc Phong, Nguyễn Hoàng Đăng Khoa, Nguyễn Tài Hoàng, Đinh

Minh Hiệp, Ngô Kế Sương (2020), Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và bảo

vệ DNA in vitro của nấm Ophiocordyceps sinensis giàu selen, Hội nghị Công

nghệ Sinh học toàn quốc năm 2020, Thành phố Huế, tháng 10/2020, chủ đề

“Công nghệ sinh học: Từ nghiên cứu cơ bản đến ứng dụng phục vụ công nghiệp

hóa, hiện đại hóa đất nước”; Kỷ yếu Hội nghị, trang 268-273, NXB Đại học

Huế (ISBN 978-604-974-562-1)

5. Lê Quốc Phong, Nguyễn Hoàng Đăng Khoa, Đặng Tú Quyên, Nguyễn

Tài Hoàng, Đinh Minh Hiệp, Ngô Kế Sương (2020), Đánh giá hoạt tính kháng

viêm, kháng khuẩn và ức chế enzyme α-glucosidase in vitro của nấm

Ophiocordyceps sinensis giàu selen, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam

(ISSN 1859-4794), Bộ Khoa học và Công nghệ, series B, tập 62, số 8, trang

19-24

6. Le, Q.P., Nguyen, T.H., Huynh, V.P., Nguyen, T.T.M., Tran, M.T.,

Dinh, M.H., Ngo, K.S. (2020), Optimization of culture parameters of selenium-

enriched Ophiocordyceps sinensis biomass by response surface methodology,

International Journal of Agricultural Technology (ISSN 2630-0192),

16(4):855-866

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. R. Singh, P.S. Negi, and S.K. Dwivedi, Ophiocordyceps sinensis: The medicinal caterpillar mushroom, in New Age Herbals. 2018, Springer. p. 115-133. 2. T. Belwal, I.D. Bhatt, D. Kashyap, K. Sak, H.S. Tuli, R. Pathak, R.S. Rawal, and S.M. Ghatnur, Ophiocordyceps sinensis, in Nonvitamin and Nonmineral Nutritional Supplements. 2019, Elsevier. p. 527-537.

3. S.J. Yu, Y. Zhang, and M.Z. Fan. Analysis of volatile compounds of mycelia of Hirsutella sinensis, the anamorph of Ophiocordyceps sinensis. in Applied Mechanics and Materials. 2012. Trans Tech Publ.

4. S.Y. Fung, S.S. Lee, N.H. Tan, and J. Pailoor, Safety assessment of cultivated fruiting body of Ophiocordyceps sinensis evaluated through subacute toxicity in rats. Journal of ethnopharmacology, 2017, 206, 236-244.

5. U.B. Shrestha and K.S. Bawa, Trade, harvest, and conservation of caterpillar fungus (Ophiocordyceps sinensis) in the Himalayas. Biological Conservation, 2013, 159, 514-520.

6. G.H. Sung, N.L. Hywel-Jones, J.M. Sung, J.J. Luangsa-ard, B. Shrestha, and J.W. Spatafora, Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi. Studies in mycology, 2007, 57, 5-59.

7. K. Jiraungkoorskul and W. Jiraungkoorskul, Review of naturopathy of medical mushroom, Ophiocordyceps sinensis, in sexual dysfunction. Pharmacognosy reviews, 2016, 10(19), 1.

8. J. Xu, Y. Huang, X.X. Chen, S.C. Zheng, P. Chen, and M.H. Mo, The mechanisms of pharmacological activities of Ophiocordyceps sinensis fungi. Phytotherapy Research, 2016, 30(10), 1572-1583.

9. Y. Mehdi, J.L. Hornick, L. Istasse, and I. Dufrasne, Selenium in the environment, metabolism and involvement in body functions. Molecules, 2013, 18(3), 3292- 3311.

10. M. Bodnar, P. Konieczka, and J. Namiesnik, The properties, functions, and use of selenium compounds in living organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part C, 2012, 30(3), 225-252.

11. M. Kieliszek and S. Błażejak, Current knowledge on the importance of selenium

in food for living organisms: a review. Molecules, 2016, 21(5), 609. 12. M.P. Rayman, Selenium and human health. The Lancet, 2012, 379(9822), 1256- 1268.

13. J.K. Wrobel, R. Power, and M. Toborek, Biological activity of selenium: revisited. IUBMB life, 2016, 68(2), 97-105.

14. M.P. Rayman, The importance of selenium to human health. The lancet, 2000, 356(9225), 233-241.

15. R. Brigelius-Flohé, Selenium in human health and disease: An overview, in Selenium. 2018, Springer. p. 3-26.

16. C.M. Weekley and H.H. Harris, Which form is that? The importance of selenium speciation and metabolism in the prevention and treatment of disease. Chemical Society Reviews, 2013, 42(23), 8870-8894.

17. D. Shang, Y. Li, C. Wang, X. Wang, Z. Yu, and X. Fu, A novel polysaccharide from Se-enriched Ganoderma lucidum induces apoptosis of human breast cancer cells. Oncology Reports, 2011, 25(1), 267-272.

18. Y.-B. Ji, F. Dong, M. Yu, L. Qin, and D. Liu, Optimization of synthesis of seleno- sargassum fusiforme (harv.) setch. Polysaccharide by response surface methodology, its characterization, and antioxidant activity. Journal of Chemistry, 2013, 2013.

19. S. Yang and H. Zhang, Production of intracellular selenium-enriched polysaccharides from thin stillage by Cordyceps sinensis and its bioactivities. Food & nutrition research, 2016, 60(1), 30153.

20. M. Mézes and K. Balogh, Prooxidant mechanisms of selenium toxicity–a review. Acta Biologica Szegediensis, 2009, 53(suppl. 1), 15-18.

21. C. Reilly, Selenium in food and health. 2nd ed. 2006: Springer Science &

Business Media.

22. S.J. Fairweather-Tait, Y. Bao, M.R. Broadley, R. Collings, D. Ford, J.E. Hesketh, and R. Hurst, Selenium in human health and disease. Antioxidants & redox signaling, 2011, 14(7), 1337-1383.

23. World Health Organization and Food and Agricultural Organization of the United Nations and Food and Agricultural Organization of the United Nations, Vitamin and Mineral Requirements in Human Nutrition. 2005.

24. M. Kieliszek, S. Błażejak, I. Gientka, and A. Bzducha-Wróbel, Accumulation and metabolism of selenium by yeast cells. Applied microbiology and biotechnology, 2015, 99(13), 5373-5382.

25. B.P. Rosen and Z. Liu, Transport pathways for arsenic and selenium: a minireview. Environment international, 2009, 35(3), 512-515.

26. J. Holliday and M. Cleaver, On the trail of the yak ancient Cordyceps in the modern world. Online Posting. June. 2004.

27. A. Mani, J. Patel, S. Kalam, R. Singh, and S.S. Sandhu, Evaluation of mycelial and exopolysaccharide production from Cordyceps militaris. International Journal of Applied Sciences and Engineering Research, 2015, 4, 609-619.

28. L. Cao, Y. Ye, and R. Han, Fruiting body production of the medicinal Chinese caterpillar mushroom, Ophiocordyceps sinensis (Ascomycetes), in artificial medium. International Journal of Medicinal Mushrooms, 2015, 17(11), 1107– 1112.

29. G. Liu, R. Han, and L. Cao, Artificial cultivation of the Chinese cordyceps from injected ghost moth larvae. Environmental Entomology, 2019, 48(5), 1088- 1094.

30. J. Xiao, D. Chen, J. Liu, Z. Liu, W. Wan, N. Fang, Y. Xiao, Y. Qi, and Z. Liang, Optimization of submerged culture requirements for the production of mycelial growth and exopolysaccharide by Cordyceps jiangxiensis JXPJ 0109. Journal of applied microbiology, 2004, 96(5), 1105-1116.

31. S.W. Kim, H.J. Hwang, C.P. Xu, J.M. Sung, J.W. Choi, and J.W. Yun, Optimization of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exo‐polysaccharides by Cordyceps militaris C738. Journal of Applied Microbiology, 2003, 94(1), 120-126.

32. S. Singh, S. Ranjan, P.S. Negi, and M. Arif, Optimization of nutritional necessities for in vitro culture of Ophiocordyceps Sinensis. International Journal of Science and Research, 2014, 3(5), 1523-1528.

33. C.H. Dong and Y.J. Yao, Nutritional requirements of mycelial growth of Cordyceps sinensis in submerged culture. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99(3), 483-492.

34. Q.Y. Lin, B. Song, H. Huang, and T.H. Li, Optimization of selected cultivation parameters for Cordyceps guangdongensis. Letters in applied microbiology, 2010, 51(2), 219-225.

35. C. Kang, T.C. Wen, J.C. Kang, Z.B. Meng, G.R. Li, and K.D. Hyde, Optimization of large-scale culture conditions for the production of cordycepin with Cordyceps militaris by liquid static culture. The scientific world journal, 2014, 2014.

36. P.G. Miles and S.T. Chang, Mushrooms: cultivation, nutritional value, medicinal effect, and environmental impact. 2004: CRC press.

37. J. Ji, J. Liu, H. Liu, and Y. Wang, Effects of fermented mushroom of Cordyceps sinensis, rich in selenium, on uterine cervix cancer. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2014, 2014.

38. L. Zheng, L. Hao, H. Ma, C. Tian, T. Li, X. Sun, M. Jia, and L. Jia, Production and in vivo antioxidant activity of Zn, Ge, Se-enriched mycelia by Cordyceps sinensis SU-01. Current microbiology, 2014, 69(3), 270-276.

39. H. Zhang, Zhang, H.M., Han, L., Wang, S.H.,, Cultivation Technique of Selenium-Enriched Cordyceps militaris. Applied Mechanics and Materials, 2014, 522–524, 1147–1150.

40. T. Hu, L. Liu, S. Chen, W. Wu, C. Xiang, and Y. Guo, Determination of selenium species in cordyceps militaris by high-performance liquid chromatography coupled to hydride generation atomic fluorescence spectrometry. Analytical Letters, 2018a, 51(14), 2316-2330.

41. T. Hu, Y. Liang, G. Zhao, W. Wu, H. Li, and Y. Guo, Selenium biofortification and antioxidant activity in Cordyceps militaris supplied with selenate, selenite, or selenomethionine. Biological Trace Element Research, 2018b, 187(2), 553-561.

42. M. Tie, B. Li, Y. Liu, J. Han, T. Sun, and H. Li, HPLC–ICP-MS analysis of selenium speciation in selenium-enriched Cordyceps militaris. RSC advances, 2014, 4(107), 62071-62075.

43. V.D. Huerta, M.L.F. Sánchez, and A. Sanz-Medel, Qualitative and quantitative speciation analysis of water soluble selenium in three edible wild mushrooms species by liquid chromatography using post-column isotope dilution ICP– MS. Analytica Chimica Acta, 2005, 538(1-2), 99-105.

44. S. McSheehy, L. Yang, R. Sturgeon, and Z. Mester, Determination of methionine and selenomethionine in selenium-enriched yeast by species-specific isotope dilution with liquid chromatography− mass spectrometry and inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Analytical chemistry, 2005, 77(1), 344-349.

45. H. Yin, G. Fan, and Z. Gu, Optimization of culture parameters of selenium- enriched yeast (Saccharomyces cerevisiae) by response surface methodology (RSM). LWT-Food Science and Technology, 2010, 43(4), 666-669.

46. H. Yin, Z. Chen, Z. Gu, and Y. Han, Optimization of natural fermentative medium for selenium-enriched yeast by D-optimal mixture design. LWT-Food Science and Technology, 2009, 42(1), 327-331.

47. S. Yang and H. Zhang, Optimization of the fermentation process of Cordyceps sobolifera Se-CEPS and its anti-tumor activity in vivo. Journal of biological engineering, 2016, 10(1), 8.

48. Huỳnh Thị Diễm Phúc, Đỗ Thị Vóc, Nguyễn Thoại Ân, Nguyễn Đỗ Thanh Phương, Đỗ Quang Dương, Đinh Minh Hiệp, and Ngô Kế Sương, Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy của Cordyceps sinensis nhằm tăng cường khả năng hấp thu kẽm. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2016, 4(1A), 343-350. 49. R.L. Plackett and J.P. Burman, The design of optimum multifactorial experiments. Biometrika, 1946, 33(4), 305-325.

50. S.L.C. Ferreira, R.E. Bruns, H.S. Ferreira, G.D. Matos, J.M. David, G.C. Brandao, E.G.P. da Silva, L.A. Portugal, P.S. Dos Reis, and A. Souza, Box- Behnken design: an alternative for the optimization of analytical methods. Analytica chimica acta, 2007, 597(2), 179-186.

51. Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. 2007: NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.

52. H. Thuy, C. Bao, T. Phuong, D. Lap, N. Hai, H. Minh, and T. Tien, Deproteinization in purification of exopolysaccharide from Ophiocordyceps sinensis olive oil–stimulated culture. International Journal of Agricultural Technology, 2018, 14(7 Special Issue), 2151-2162.

53. Q. Li and C. Zhang. A Study of Antioxidant Activity About Seleno-polysaccharide of Cordyceps militaris from different areas of China. in Advanced Materials Research. 2013. Trans Tech Publ.

54. P.H. Leung, S. Zhao, K.P. Ho, and J.Y. Wu, Chemical properties and antioxidant activity of exopolysaccharides from mycelial culture of Cordyceps sinensis fungus Cs-HK1. Food Chemistry, 2009, 114(4), 1251-1256.

55. Y. Xiao, G. Xing, X. Rui, W. Li, X. Chen, M. Jiang, and M. Dong, Enhancement of the antioxidant capacity of chickpeas by solid state fermentation with Cordyceps militaris SN-18. Journal of Functional Foods, 2014, 10, 210-222.

56. Huỳnh Thư, Ngô Đại Nghiệp, Võ Thị Xuyến, Đinh Minh Hiệp, and Trương Bình Nguyên, Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết từ một số chủng nấm Cordyceps sp. phân lập tại Việt Nam. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2012, 10(4A), 1041-1046.

57. Huỳnh Thư, Ngô Đại Nghiệp, Võ Thị Xuyến, Đinh Minh Hiệp, and Trương Bình Nguyên, Nghiên cứu tiềm năng của Cordyceps sp. trong việc bảo vệ tế bào Hep G2 chống lại tác nhân oxy hóa. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 2013, 51(5B), 339-343.

58. M.T.T. Nguyen, S. Awale, Y. Tezuka, Q. Le Tran, H. Watanabe, and S. Kadota, Xanthine oxidase inhibitory activity of Vietnamese medicinal plants. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2004, 27(9), 1414-1421.

59. Trần Quốc Tuấn, Lê Thị Oanh, Đinh Minh Hiệp, and Ngô Đại Nghiệp, Chuẩn hóa mô hình sàng lọc in vitro các hợp chất kháng viêm dựa trên khả năng ức chế biến tính albumin bò do nhiệt. Tạp chí Khoa học và công nghệ, 2014, 52(5B), 532-538.

60. Vũ Thị Bạch Phượng, Hoàng Thị Thanh Minh, Phạm Thị Ánh Hồng, and Quách Ngô Diễm Phương, Khảo sát hoạt tính sinh học và nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ cây cối xay Abutilon indicum (L.). Tạp chí phát triển KH&CN, 2016, 19(T5), 95-102.

61. M.-N.T. Nguyen and T.-D. Ho-Huynh, Selective cytotoxicity of a Vietnamese traditional formula, Nam Dia long, against MCF-7 cells by synergistic effects. BMC complementary and alternative medicine, 2016, 16(1), 220.

62. V. Gergely, K.M. Kubachka, S. Mounicou, P. Fodor, and J.A. Caruso, Selenium speciation in Agaricus bisporus and Lentinula edodes mushroom proteins using multi-dimensional chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2006, 1101(1-2), 94-102.

63. Đỗ Trung Đàm, Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc. 1996, Hà Nội: NXB Y Học

64. S.R. Amin, N. Alam, M. Tania, and M.A. Khan, Study of mycelial growth of Cordyceps sinensis in different media, at different PH level and temperature. Bangladesh J Mushroom, 2008, 2, 43-8.

65. C.H. Dong and Y.J. Yao, On the reliability of fungal materials used in studies industrial microbiology &

on Ophiocordyceps sinensis. Journal of biotechnology, 2011, 38(8), 1027-1035.

66. G.H. Sung, B. Shrestha, S.K. Han, S.Y. Kim, and J.M. Sung, Growth and cultural characteristics of Cordyceps cardinalis collected from Korea. Mycobiology, 2010, 38(4), 274-281.

67. M. Soltani, M. Al-Ali, N.Z. Othman, R. Malik, N. Elmarzugi, R. Aziz, and A. Hesham, Medium composition effects on growth kinetic of Cordyceps militaris cells using agar plate method. IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences, 2015, 10(1-1), 79-82.

68. K. Rajashree and T. Muthukumar, Preparation of selenium tolerant yeast Saccharomyces cerevisiae. Journal of Microbiology and Biotechnology Research, 2013, 3(3), 46-53.

69. T. Nagodawithana and F. Gutmanis, Method for the production of selenium yeast. 1985, Google Patents.

70. Z. Somogyi, I. Kiss, I. Kádár, and G. Bakonyi, Toxicity of selenate and selenite to the potworm Enchytraeus albidus (Annelida: Enchytraeidae): a laboratory test. Ecotoxicology, 2007, 16(4), 379-384.

71. M. Mézes and K. Balogh, Prooxidant mechanisms of selenium toxicity–a review. Acta Biologica Szegediensis, 2009, 53(suppl.), 15-18.

72. H.T. Hoa and C.L. Wang, The effects of temperature and nutritional conditions on mycelium growth of two oyster mushrooms (Pleurotus ostreatus and Pleurotus cystidiosus). Mycobiology, 2015, 43(1), 14-23.

73. Z.Y. Zhu, X.C. Liu, Y.L. Tang, F.Y. Dong, H.Q. Sun, L. Chen, and Y.M. Zhang, Effects of cultural medium on the formation and antitumor activity of polysaccharides by Cordyceps gunnii. Journal of bioscience and bioengineering, 2016, 122(4), 494-498.

74. L.Y. Wang, K.L. Cheong, D.T. Wu, L.Z. Meng, J. Zhao, and S.P. Li, Fermentation optimization for the production of bioactive polysaccharides from Cordyceps sinensis fungus UM01. International journal of biological macromolecules, 2015, 79, 180-185.

fungus Cordyceps sinensis 75. D.A. Smirnov, V.V. Shcherba, N.A. Bisko, and N.L. Poyedinok, Some biologically active substances from a mycelial biomass of medicinal caterpillar (Berk.) Sacc.(Ascomycetes). International Journal of Medicinal Mushrooms, 2009, 11(1).

76. J. Gang, H. Liu, and Y. Liu, Optimization of liquid fermentation conditions and protein nutrition evaluation of mycelium from the caterpillar medicinal mushroom, Cordyceps militaris (Ascomycetes). International journal of medicinal mushrooms, 2016, 18(8).

77. H.S. Yin, C.S. Qiao, S.Y. Qin, W.H. Tang, and S.R. Jia, Optimization of fermentation medium for Cordyceps sinensis. Food Research & Development, 2013, 34, 5-8.

78. S. Singh, S. Ranjan, P. Negi, and M. Arif. Optimization of Nutritional Necessities for in vitro Culture of Ophiocordyceps Sinensis. 2014.

79. J.Z. Dong, M.R. Liu, C. Lei, X.J. Zheng, and Y. Wang, Effects of selenium and light wavelengths on liquid culture of Cordyceps militaris Link. Applied biochemistry and biotechnology, 2012a, 166(8), 2030-2036.

80. D.E. Ponton, C. Fortin, and L. Hare, Organic selenium, selenate, and selenite accumulation by lake plankton and the alga Chlamydomonas reinhardtii at different pH and sulfate concentrations. Environmental toxicology and chemistry, 2018, 37(8), 2112-2122.

81. J. Wang, B. Wang, D. Zhang, and Y. Wu, Selenium uptake, tolerance and reduction in Flammulina velutipes supplied with selenite. PeerJ, 2016, 4, e1993.

82. G.F. Riedel and J.G. Sanders, The influence of pH and media composition on inorganic selenium by Chlamydomonas reinhardtii. the uptake of Environmental Toxicology and Chemistry, 1996, 15(9), 1577-1583.

83. I. Milovanović, I. Brčeski, M. Stajić, A. Korać, J. Vukojević, and A. Knežević, Potential of Pleurotus ostreatus mycelium for selenium absorption. The Scientific World Journal, 2014, 2014, 8.

84. S. Esmaeili and K. Khosravi-Darani, Selenium-enriched yeast: As selenium source for nutritional purpose. Current Nutrition & Food Science, 2014, 10(1), 49-56.

85. H.B. Chau, N.T. Hoang, N.T.T. My, B.L. Duy, Nam T.V.H., Hang H.T.B., Hang L.T.T., and Hiep D.M., Effect of rice bran oil on mycelial biomass production, biosynthesis and bioactivities of polysaccharides by Ophiocordyceps sinensis fungus. Vietnam Journal of Science and Technology, 2018, 56(4A), 74-82.

86. G.B. Ding, R.H. Nie, L.H. Lv, G.Q. Wei, and L.Q. Zhao, Preparation and biological evaluation of a novel selenium-containing exopolysaccharide from Rhizobium sp. N613. Carbohydrate polymers, 2014, 109, 28-34.

87. W. Zhang, Y. Lu, Y. Zhang, Q. Ding, S. Hussain, Q. Wu, W. Pan, and Y. Chen, Antioxidant and antitumour activities of exopolysaccharide from liquid‐ cultured Grifola frondosa by chemical modification. International Journal of Food Science & Technology, 2016, 51(4), 1055-1061.

88. W.L. Shi, H. Han, G.Z. Chen, X. Chen, Y.K. Hong, L.K. Chen, D. Chen, and Z. Lu, Extraction, characterization of the polysaccharide extracts from Se- enriched G. lucidum (Se-GLP) and its inhibition against oxidative damage in ischemic reperfusion mice. Carbohydrate polymers, 2010, 80(3), 774-778.

89. M. Jin, Z. Lu, M. Huang, Y. Wang, and Y. Wang, Effects of Se-enriched polysaccharides produced by Enterobacter cloacae Z0206 on alloxan-induced diabetic mice. International journal of biological macromolecules, 2012, 50(2), 348-352.

90. M. Kozarski, A. Klaus, M. Nikšić, M.M. Vrvić, N. Todorović, D. Jakovljević, chemical and L.J. Van Griensven, Antioxidative activities and characterization of polysaccharide extracts from the widely used mushrooms Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum, Lentinus edodes and Trametes versicolor. Journal of food composition and analysis, 2012, 26(1-2), 144-153. 91. Y. Guo, D. Pan, H. Li, Y. Sun, X. Zeng, and B. Yan, Antioxidant and immunomodulatory activity of selenium exopolysaccharide produced by Lactococcus lactis subsp. lactis. Food chemistry, 2013, 138(1), 84-89. 92. P. De, S. Sarkar, and M.J. Mukhophadhyay, Anti protein denaturation activity and bioactive compound screening of Piper betel aqueous and alcoholic leaf extract. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2017, 6(2), 52-55.

93. N.H. Grant, H.E. Alburn, and C. Kryzanauskas, Stabilization of serum albumin by anti-inflammatory drugs. Biochemical pharmacology, 1970, 19(3), 715- 722.

94. L. Williams, A. O'Connar, L. Latore, O. Dennis, S. Ringer, J. Whittaker, J. Conrad, B. Vogler, H. Rosner, and W. Kraus, The in vitro anti-denaturation effects induced by natural products and non-steroidal compounds in heat treated (immunogenic) bovine serum albumin is proposed as a screening assay for the detection of anti-inflammatory compounds, without the use of

100

animals, in the early stages of the drug discovery process. West Indian Medical Journal, 2008, 57(4), 327-331.

95. A.C.B.d.C. Rodrigues, F.P. de Oliveira, R.B. Dias, C.B. Sales, C.A. Rocha, M.B. Soares, E.V. Costa, F.M. da Silva, W.C. Rocha, and H.H. Koolen, In vitro and in vivo anti-leukemia activity of the stem bark of Salacia impressifolia (Miers) AC Smith (Celastraceae). Journal of ethnopharmacology, 2019, 231, 516-524. 96. G.A.A. Dória, P.P. Menezes, B.S. Lima, B.S. Vasconcelos, F.A. Silva, R.M. Henriques, M.G. Melo, Â.V. Alves, M.O. Moraes, and C.Ó. Pessoa, In vivo antitumor effect, induction of apoptosis and safety of Remirea maritima Aubl.(Cyperaceae) extracts. Phytomedicine, 2016, 23(9), 914-922.

97. M. Suffness, Assays related to cancer drug discovery. Methods in plant biochemistry: assays for bioactivity, 1990, 6, 71-133.

98. Y. Xiao, Q. Zhang, J. Miao, X. Rui, T. Li, and M. Dong, Antioxidant activity and DNA damage protection of mung beans processed by solid state fermentation with Cordyceps militaris SN-18. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2015, 31, 216-225.

99. Y. Xiao, B. Zhang, Y. Chen, J. Miao, Q. Zhang, X. Rui, and M. Dong, Solid‐ State Bioprocessing with Cordyceps militaris Enhanced Antioxidant Activity and DNA Damage Protection of Red Beans (Phaseolus angularis). Cereal Chemistry, 2017, 94(2), 177-184.

100. B.J. Wang, S.J. Won, Z.R. Yu, and C.L. Su, Free radical scavenging and apoptotic effects of Cordyceps sinensis fractionated by supercritical carbon dioxide. Food and Chemical Toxicology, 2005, 43(4), 543-552.

101. L. Wang, G. Wang, J. Zhang, G. Zhang, L. Jia, X. Liu, P. Deng, and K. Fan, Extraction optimization and antioxidant activity of intracellular selenium polysaccharide by Cordyceps sinensis SU-02. Carbohydrate Polymers, 2011, 86(4), 1745-1750.

102. T. Hu, Y. Liang, G. Zhao, W. Wu, H. Li, and Y. Guo, Selenium biofortification and antioxidant activity in Cordyceps militaris supplied with selenate, selenite, or selenomethionine. Biological Trace Element Research, 2019, 187(2), 553-561.

103. R. Paterson and M. Russell, Cordyceps–a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory? Phytochemistry, 2008, 69(7), 1469- 1495.

104. U. Tinggi, Selenium: its role as antioxidant in human health. Environmental health and preventive medicine, 2008, 13(2), 102-108.

105. H. Thư, V.A. Tùng, N.T. Hiếu, Đ.N.H. Cẩm, and Đ.M. Hiệp, Nghiên cứu hoạt tính ức chế xanthine oxidase của một số cao chiết từ nấm dược liệu.

106. T.N. Quy and T.D. Xuan, Xanthine oxidase inhibitory potential, antioxidant and antibacterial activities of Cordyceps militaris (L.) Link fruiting body. Medicines, 2019, 6(1), 20.

107. T. Ghaffari, M. Nouri, A.A. Saei, and M.R. Rashidi, Aldehyde and xanthine oxidase activities in tissues of streptozotocin-induced diabetic rats: effects of

101

vitamin E and selenium supplementation. Biological trace element research, 2012, 147(1-3), 217-225.

108. S.Y. Won and E.H. Park, Anti-inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris. Journal of ethnopharmacology, 2005, 96(3), 555-561.

109. K.-M. Kim, Y.-G. Kwon, H.-T. Chung, Y.-G. Yun, H.-O. Pae, J.-A. Han, K.- S. Ha, T.-W. Kim, and Y.-M. Kim, Methanol extract of Cordyceps pruinosa inhibits in vitro and in vivo inflammatory mediators by suppressing NF-κB activation. Toxicology and applied pharmacology, 2003, 190(1), 1-8. 110. M.L. Yang, P.C. Kuo, T.L. Hwang, and T.S. Wu, Anti-inflammatory principles from Cordyceps sinensis. Journal of Natural Products, 2011, 74(9), 1996- 2000.

111. J.J. Zhang, Y. Li, T. Zhou, D.P. Xu, P. Zhang, S. Li, and H.B. Li, Bioactivities and health benefits of mushrooms mainly from China. Molecules, 2016, 21(7), 16 https://doi.org/10.3390/molecules21070938.

112. L.H. Duntas, Selenium and inflammation: underlying anti-inflammatory mechanisms. Hormone and Metabolic Research, 2009, 41(06), 443-447. 113. A. Dominiak, A. Wilkaniec, H. Jęśko, G.A. Czapski, A.M. Lenkiewicz, E. Kurek, P. Wroczyński, and A. Adamczyk, Selol, an organic selenium donor, prevents lipopolysaccharide-induced oxidative stress and inflammatory reaction in the rat brain. Neurochemistry international, 2017, 108, 66-77.

114. Y. Wang, L. Ma, Z. Li, Z. Du, Z. Liu, J. Qin, X. Wang, Z. Huang, L. Gu, and A.S. Chen, Synergetic inhibition of metal ions and genistein on α‐glucosidase. FEBS letters, 2004, 576(1-2), 46-50.

115. H.C. Lo, T.H. Hsu, S.T. Tu, and K.C. Lin, Anti-hyperglycemic activity of natural and fermented Cordyceps sinensis in rats with diabetes induced by nicotinamide and streptozotocin. The American Journal of Chinese Medicine, 2006, 34(05), 819-832.

116. G. Zhang, Y. Huang, Y. Bian, J.H. Wong, T. Ng, and H. Wang, Hypoglycemic activity of the fungi Cordyceps militaris, Cordyceps sinensis, Tricholoma mongolicum, and Omphalia lapidescens in streptozotocin-induced diabetic rats. Applied microbiology and biotechnology, 2006, 72(6), 1152-1156. 117. S.P. Li, G.H. Zhang, Q. Zeng, Z.G. Huang, Y.T. Wang, T.T.X. Dong, and K.W.K. Tsim, Hypoglycemic activity of polysaccharide, with antioxidation, isolated from cultured Cordyceps mycelia. Phytomedicine, 2006, 13(6), 428- 433.

118. Y. Liu, J. Sun, S. Rao, Y. Su, J. Li, C. Li, S. Xu, and Y. Yang, Antidiabetic activity of mycelia selenium-polysaccharide from Catathelasma ventricosum in STZ-induced diabetic mice. Food and Chemical Toxicology, 2013, 62, 285- 291.

119. S. Al-Quraishy, M.A. Dkhil, and A.E.A. Moneim, Anti-hyperglycemic activity rats. streptozotocin-induced diabetic selenium nanoparticles in of International journal of nanomedicine, 2015, 10, 6741.

102

120. J.Y. Wu, Q.X. Zhang, and P.H. Leung, Inhibitory effects of ethyl acetate extract of Cordyceps sinensis mycelium on various cancer cells in culture and B16 melanoma in C57BL/6 mice. Phytomedicine, 2007, 14(1), 43-49.

121. Q. Zhang, J. Wu, Z. Hu, and D. Li, Induction of HL-60 apoptosis by ethyl acetate extract of Cordyceps sinensis fungal mycelium. Life sciences, 2004, 75(24), 2911-2919.

122. Y.C. Kuo, C.Y. Lin, W.J. Tsai, C.L. Wu, C.F. Chen, and M.S. Shiao, Growth inhibitors against tumor cells in Cordyceps sinensis other than cordycepin and polysaccharides. Cancer investigation, 1994, 12(6), 611-615.

123. H.H. Lee, S. Lee, K. Lee, Y.S. Shin, H. Kang, and H. Cho, Anti-cancer effect of Cordyceps militaris in human colorectal carcinoma RKO cells via cell cycle arrest and mitochondrial apoptosis. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 2015, 23(1), 35.

124. K. Nakamura, K. Konoha, Y. Yamaguchi, S. Kagota, K. Shinozuka, and M. Kunitomo, Combined effects of Cordyceps sinensis and methotrexate on hematogenic lung metastasis in mice. Receptors and Channels, 2003, 9(5), 329-334.

125. P.H. Leung, Q.X. Zhang, and J.Y. Wu, Mycelium cultivation, chemical composition and antitumour activity of a Tolypocladium sp. fungus isolated from wild Cordyceps sinensis. Journal of applied microbiology, 2006, 101(2), 275-283.

126. H.W. Lim, Y.M. Kwon, S.M. Cho, J.H. Kim, G.H. Yoon, S.J. Lee, H.W. Kim, and M.W. Lee, Antitumor activity of Cordyceps militaris on human cancer cell line. Korean Journal of Pharmacognosy, 2004, 35(4), 364-367.

127. J.-H. Hsu, B.-Y. Jhou, S.-H. Yeh, Y.-L. Chen, and C.-C. Chen, Healthcare functions of Cordyceps cicadae. J Nutr Food Sci, 2015, 5(6), 1-7.

128. Y.K. Rao, S.H. Fang, and Y.M. Tzeng, Evaluation of the anti-inflammatory and anti-proliferation tumoral cells activities of Antrodia camphorata, Cordyceps sinensis, and Cinnamomum osmophloeum bark extracts. Journal of ethnopharmacology, 2007, 114(1), 78-85.

129. E.J. Lee, K.H. Jang, S.Y. Im, Y.K. Lee, M. Farooq, R. Farhoudi, and D.J. Lee, Physico-chemical properties and cytotoxic potential of Cordyceps sinensis metabolites. Natural product research, 2015, 29(5), 455-459.

130. H. Matsuda, J. Akaki, S. Nakamura, Y. Okazaki, H. Kojima, M. Tamesada, and M. Yoshikawa, Apoptosis-inducing effects of sterols from the dried powder of cultured mycelium of Cordyceps sinensis. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2009, 57(4), 411-414.

131. Y. Ma, J. Zhang, Q. Zhang, P. Chen, J. Song, S. Yu, H. Liu, F. Liu, C. Song, and D. Yang, Adenosine induces apoptosis in human liver cancer cells through ROS production and mitochondrial dysfunction. Biochemical and biophysical research communications, 2014, 448(1), 8-14.

132. I. N Milovanovic, T. P Stanojkovic, M. M Stajic, I. D Brceskic, A. Z Knezevic, J. Lj Cilerdzic, and J. B Vukojevic, Effect of selenium enrichment of Lenzites betulinus and Trametes hirsuta mycelia on antioxidant, antifungal and

103

cytostatics potential. Current pharmaceutical biotechnology, 2015, 16(10), 920-926.

133. H. Yan and H. Chang, Antioxidant and antitumor activities of selenium-and zinc-enriched oyster mushroom in mice. Biological trace element research, 2012, 150(1-3), 236-241.

134. M. Navarro-Alarcon and C. Cabrera-Vique, Selenium in food and the human body: a review. Science of the total environment, 2008, 400(1-3), 115-141.

104

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Đặc điểm hình thái sinh khối hệ sợi nấm C. sinensis trên các môi trường

chứa Se (5-30mgSe/L) sau 40 ngày nuôi cấy.

Se+6 Se+4

Môi trường Sinh khối Môi trường

Nâu nhạt Nâu nhạt

Mặt trên màu trắng sữa, tơi xốp, mịn, độ dày đồng đều Mặt dưới xếp cuộn màu nâu TN. Sinh khối ĐC Mặt trên màu trắng sữa, tơi xốp, mịn, độ dày đồng đều. Mặt dưới xếp cuộn màu nâu

Giống đối chứng Giống đối chứng 10 Mỏng, không Giống đối chứng Môi trường và mặt dưới sinh khối giống với đối chứng đều Môi trường và mặt dưới sinh khối chuyển thành đỏ dần khi tăng nồng độ Se

Mỏng hơn so với 10mgSe/L

15 Mỏng hơn so với 10mgSe/L không đều 20 Mỏng, thưa dần, không đều Giống với môi trường 15mgSe/L

25 Mỏng, mọc yếu

Giống với môi trường 15mgSe/L và thưa dần, không đều

30 Đen, có dấu

Vẫn phát triển, nhưng thưa hơn và không đều hiệu không phát triển

Đối chứng (ĐC) không bổ sung Se. TN. Lô thí nghiệm.

105

Phụ lục 2: Đường kính sợi nấm C. sinensis trên các môi trường Se+4/Se+6 (cm)

Nồng độ Se (mgSe/L)

Lô TN Đối 5 10 15 20 25 30 chứng

5 5 5 7,5 5 5 7,5 Se+4

5 5 5 7,5 7,5 7,5 7,5 Se+6

Phụ lục 3: Hình thái và đường kính các sợi nấm dưới kính hiển vi trắc vi thị kính (vật

kính 100X)

A: đường kính sợi nấm C. sinensis trên môi trường PGA; B: đường kính sợi nấm C.

sinensis trên môi trường PGA bổ sung 25mgSe/L selenite; C: đường kính sợi nấm C.

sinensis trên môi trường PGA bổ sung 25mgSe/L selenate; D: đường kính sợi nấm C.

sinensis trên môi trường PGA bổ sung 25mgSe/L selenourea

106

Phụ lục 4: Mô tả sinh khối theo thiết kế Plackett - Burman ở 10 ngày tuổi

Nghiệm Đặc điểm sinh khối Màu môi trường

thức

Bề mặt môi trường phủ kín hệ sợi, lớp sinh Màu vàng nâu ĐC

khối mỏng

NT1 Bề mặt phủ kín hệ sợi, đều và có sự phân Màu nâu đỏ

mảnh. Sinh khối mỏng hơn đối chứng

NT2 Sinh khối sinh trưởng mạnh, dày và bị cong Màu vàng nâu

xung quanh tơ không phủ kín mặt

NT3 Bề mặt phủ kín tơ, đều và có sự phân mảnh. Màu vàng nâu

Quanh viền sinh khối cong và dày hơn ĐC

NT4 Bề mặt phủ kín hệ sợi nhưng mỏng, có sự Màu nâu sẫm

phân mảnh, sinh khối mỏng hơn ĐC

NT5 Hệ sợi sinh trưởng không đều, tạo mảng và Màu nâu

tập trung ở viền.

NT6 Hệ sợi sinh trưởng chậm, mỏng không kín bề Màu nâu đỏ

mặt, tập trung quanh viền

NT7 Bề mặt hệ sợi dày, sinh khối dày hơn ĐC và Màu nâu sẫm

cong ở quanh viền

Tương tự NT1 Màu vàng nâu NT8

Tương tự NT7 Màu vàng nâu NT9

Sinh khối mỏng hơn ĐC, hệ sợikhông phủ Màu nâu NT10

kín bề mặt nhưng đều.

Tương tự NT7 Màu nâu đỏ NT11

Hệ sợi dày, đều. sinh khối dày hơn đối chứng Màu nâu sẫm NT12

107

Phụ lục 5: Sự phát triển của sinh khối theo mô hình Plackett - Burman ở ngày thứ 10. Nghiệm thức từ 1 – 12 và đối chứng (ĐC)

108

Phụ lục 6: Sự phát triển của sinh khối theo thiết kế Plackett - Burman ở ngày thứ

20. Nghiệm thức từ 1 – 12 và đối chứng (ĐC).

109

Phụ lục 7: Đặc điểm sinh khối nấm theo thiết kế Plackett - Burman ở ngày thứ 40.

Nghiệm thức từ 1 – 12 và đối chứng (ĐC).

110

Phụ lục 8: Đặc điểm hình thái sinh khối C. sinensis sau 40 ngày theo thiết kế Plackett

- Burman.

Nghiệm thức Đặc điểm sinh khối Màu môi trường

ĐC Bề mặt phủ kín tơ trắng, tơi xốp, độ dày Màu vàng nâu

đồng đều và gợn sóng có mép cong. Bề mặt

dưới của nấm sinh trưởng mạnh và sần sùi.

NT 1 Lớp tơ dày, xốp và độ dày nấm đều và cao Màu nâu sẫm

hơn ĐC. Mặt dưới sần sùi, sinh trưởng mạnh

chạm đáy môi trường.

Tương tự NT 1 nhưng dày hơn Màu nâu NT2

Tương tự NT 1 Màu vàng nâu NT3

Bề mặt ít tơ, sinh khối mỏng và đều trên mặt Màu nâu sẫm NT4

môi trường.

Tương tự NT 2 Màu nâu sẫm NT5

Lớp tơ mỏng, không đều. Sinh khối dày hơn Màu nâu đỏ NT6

ĐC

Bề mặt tơ dày, xốp. sinh khối dày hơn ĐC Màu nâu sẫm NT7

Nấm mọc yếu, ít tơ, mỏng hơn ĐC Màu nâu đỏ NT8

Tương tự NT 6 Màu nâu NT9

NT10 Sinh khối mỏng hơn ĐC, màu vàng nhạt, tơ Màu nâu đỏ

không đều và không phủ kín bề mặt.

NT11 Tương tự NT 2 Màu nâu đỏ

NT12 Tương tự NT 7 Màu nâu sẫm

111

Phụ lục 9: Sự phát triển của sinh khối theo thiết kế Box - Behnken ở ngày thứ 10

112

Phụ lục 10: Sự phát triển của sinh khối theo thiết kế Box - Behnken

ở ngày thứ 40

113

Phụ lục 11: Sinh khối nấm sau 40 ngày nuôi cấy theo mô hình D-optimal

114

Phụ lục 12: Đặc điểm hình thái của sinh khối C. sinensis sau 40 ngày nuôi cấy theo

mô hình D-optimal

Nghiệm thức Đặc điểm sinh khối Màu môi trường

Vàng nâu ĐC Hệ sợi màu trắng, xốp phủ kín bề mặt, độ dày đồng đều, mặt dưới hộp nuôi cấy tạo nhiều nếp gấp.

Vàng nâu NT 1 Hệ sợi dày, xốp, đều và cao hơn ĐC. Mặt dưới sần sùi, sinh trưởng mạnh chạm đáy hộp nuôi

Vàng nâu NT2 Nấm mọc mỏng, bề mặt chưa phủ đầy hộp, sinh khối chìm một phần xuống môi trường

Sinh khối dày, lớp tơ mọc dày xốp Nâu sẫm NT3

Nâu sẫm NT4 Bề mặt ít hệ sợi, sinh khối mỏng và đều trên mặt môi trường.

Tương tự NT 1 Nâu sẫm NT5

Tương tự NT 1 nhưng sinh khối mỏng hơn Nâu đỏ NT6

Nấm mọc yếu, hệ sợi, mỏng hơn ĐC, tương tự NT2 Nâu đỏ NT7

Bề mặt hệ sợi dày, xốp, sinh khối dày tương tự ĐC Nâu sẫm NT8

Tương tự NT6 Nâu NT9

Tương tự NT3 Nâu đỏ NT10

Nâu đỏ NT11 Nấm mọc yếu, hệ sợi mỏng hơn ĐC, tơ nấm phát triển yếu

Tương tự NT1 Vàng nâu NT12

Tương tự NT2 Đỏ nâu NT13

Vàng nâu NT14 Nấm mọc khá mạnh, hệ sợi phủ đầy về mặt, tơ phát triển mạnh, xốp

Vàng cam NT15

Nấm sinh trưởng khá mạnh, sinh khối ăn sâu xuống đáy hộp, hệ tơ phát triển bung ra khá mạnh

Tương tự NT2 Đỏ nâu NT16

Tương tự NT15 Đỏ cam NT17

Tương tự NT2 Đỏ sậm NT18

Tương tự NT15 Vàng nâu

NT19

115

Phụ lục 13: Khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do ABTS

O. sinensis giàu selen O. sinensis đối chứng

Cao chiết Cao chiết Nồng độ (µg/mL) Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD Giá trị ∆OD

4000 4000

2000 2000

1000 1000

Cao EtOH Cao EtOH

500 500

250 250

4000 4000

2000 2000

1000 1000

Cao PE Cao PE

500 500

250 250

4000 4000 0,091 ± 0,006 0,369 ± 0,006 0,502 ± 0,003 0,564 ± 0,002 0,595 ± 0,006 0,304 ± 0,004 0,471 ± 0,008 0,563 ± 0,006 0,602 ± 0,007 0,633 ± 0,002 0,005 ± 0,002 0,127 ± 0,004 0,385 ± 0,003 0,508 ± 0,007 0,580 ± 0,011 0,602 ± 0,006 0,290 ± 0,002 0,467 ± 0,005 0,559 ± 0,003 0,603 ± 0,008 0,290 ± 0,002 0,105 ± 0,012

2000 2000 0,351 ± 0,004 0,364 ± 0,006

1000 1000 Cao EtOAc Cao EtOAc

500 500

250 250

4000 4000

2000 2000

1000 1000 Cao BuOH Cao BuOH

500 500 0,531 ± 0,007 0,603 ± 0,008 0,657 ± 0,011 0,072 ± 0,004 0,351 ± 0,005 0,518 ± 0,004 0,580 ± 0,007 0,537 ± 0,005 0,612 ± 0,008 0,650 ± 0,006 0,120 ± 0,003 0,381 ± 0,005 0,528 ± 0,004 0,606 ± 0,003

116

O. sinensis giàu selen O. sinensis đối chứng

Cao chiết Cao chiết Nồng độ (µg/mL) Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD Giá trị ∆OD

250 250

4000 4000

2000 2000

1000 1000

Cao H2O Cao H2O 500 500

250 250

4000 4000

2000 2000

1000 1000

Cao CPS Cao CPS

500 500

250 250

4000 4000

2000 2000

1000 1000 0,640 ± 0,006 0,177 ± 0,012 0,373 ± 0,003 0,509 ± 0,007 0,566 ± 0,003 0,586 ± 0,007 0,235 ± 0,003 0,456 ± 0,004 0,563 ± 0,004 0,612 ± 0,004 0,638 ± 0,003 0,270 ± 0,004 0,451 ± 0,013 0,567 ± 0,000 0,645 ± 0,005 0,192 ± 0,008 0,418 ± 0,003 0,513 ± 0,004 0,570 ± 0,003 0,590 ± 0,01 0,254 ± 0,004 0,448 ± 0,011 0,561 ± 0,003 0,616 ± 0,002 0,641 ± 0,004 0,259 ± 0,008 0,454 ± 0,007 0,569 ± 0,002

IPS IPS

500 500 0,625 ± 0,009 0,620 ± 0,005

250 250

4000 4000

2000 2000

1000 1000 EPS EPS

500 500 0,646 ± 0,006 0,288 ± 0,023 0,447 ± 0,017 0,554 ± 0,007 0,589 ± 0,022 0,641 ± 0,003 0,276 ± 0,011 0,434 ± 0,015 0,537 ± 0,010 0,596 ± 0,003

117

O. sinensis giàu selen O. sinensis đối chứng

Cao chiết Cao chiết Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD

250 250 0,623 ± 0,009 0,627 ± 0,003

Phụ lục 14: Khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do DPPH

O. sinensis giàu selen O. sinensis đối chứng

Cao chiết Giá trị ∆OD Cao chiết Giá trị ∆OD Nồng độ (µg/mL) Nồng độ (µg/mL)

2500 0,213 ± 0,008 2500 0,239 ± 0,002

1250 0,439 ± 0,009 1250 0,413 ± 0,013 Cao EtOH Cao EtOH 625 0,516 ± 0,012 625 0,509 ± 0,004

312,5 0,567 ± 0,006 312,5 0,569 ± 0,008

0 0,609 ± 0,008 0 0,609 ± 0,008

5000 0,122 ± 0,002 5000 0,104 ± 0,004

2500 0,339 ± 0,006 2500 0,321 ± 0,005 Cao PE Cao PE 1250 0,481 ± 0,008 1250 0,488 ± 0,003

625 0,561 ± 0,006 625 0,566 ± 0,004

0 0,633 ± 0,002 0 0,634 ± 0,003

2500 0,121 ± 0,003 2500 0,009 ± 0,001

1250 0,349 ± 0,005 1250 0,231 ± 0,008 Cao EtOAc 625 0,457 ± 0,005 625 0,441 ± 0,015 Cao EtOAc 312,5 0,524 ± 0,011 312,5 0,523 ± 0,000

0 0,570 ± 0,011 0 0,591 ± 0,005

5000 0,129 ± 0,005 5000 0,207 ± 0,008

2500 0,370 ± 0,008 2500 0,370 ± 0,008 Cao BuOH 1250 0,502 ± 0,009 1250 0,508 ± 0,003 Cao BuOH 625 0,557 ± 0,004 625 0,563 ± 0,006

0 0,611 ± 0,006 0 0,611 ± 0,006

5000 0,254 ± 0,006 5000 0,302 ± 0,014

2500 0,439 ± 0,009 2500 0,474 ± 0,014

118

O. sinensis giàu selen O. sinensis đối chứng

Cao chiết Giá trị ∆OD Cao chiết Giá trị ∆OD Nồng độ (µg/mL) Nồng độ (µg/mL)

Cao H2O 0,532 ± 0,003 Cao H2O 1250 0,550 ± 0,011 1250

0,580 ± 0,010 625 0,592 ± 0,005 625

0 0,629 ± 0,002 0 0,629 ± 0,002

Phụ lục 15: Khảo sát hoạt tính kháng viêm

O. sinensis giàu selen O. sinensis đối chứng

Cao chiết Giá trị ∆OD Cao chiết Giá trị ∆OD Nồng độ (µg/mL) Nồng độ (µg/mL)

0 0 0 0,00

46,875 12,66 ± 2,06 93,75 13,20 ± 5,53 Cao EtOH Cao EtOH 93,75 22,40 ± 0,76 187,5 23,40 ± 0,81

187,5 54,68 ± 15,37 375 26,86 ± 1,05

375 95,75 ± 1,42 750 40,92 ± 1,21

0,00 0 0 0,00

15,63 15,64 ± 0,81 93,75 20,65 ± 7,60 Cao PE Cao PE 31,25 24,49 ± 1,91 187,5 51,26 ± 4,89

62,50 48,99 ± 2,47 375 92,97 ± 3,32

125,00 95,59 ± 2,49 750 97,90 ± 1,52

0 0 0 0,00

93,75 7,73 ± 1,72 93,75 7,78 ± 5,52 Cao EtOAc 187,5 22,51 ± 1,45 375 26,04 ± 1,98 Cao EtOAc 375 38,26 ± 8,54 750 50,12 ± 2,10

750 80,50 ± 0,87 1500 88,06 ± 1,58

0 0 0 0,00

62,5 -8,62 ± 1,24 93,75 4,97 Cao BuOH 125 0,00 ± 0,53 187,5 7,63 Cao BuOH 250 1,64 ± 1,27 375 11,45

500 5,23 ± 2,98 750 39,22

0 0 0 0,00

93,75 3,82 ± 1,99 93,75 8,37

119

O. sinensis giàu selen O. sinensis đối chứng

Cao chiết Giá trị ∆OD Cao chiết Giá trị ∆OD Nồng độ (µg/mL) Nồng độ (µg/mL)

Cao H2O 187,5 1,95 ± 2,04 Cao H2O 187,5 10,56

14,44 375 4,16 ± 1,23 375

38,56 750 -2,63 ± 1,81 750

0,040 ± 0,010 0 0,00 5000

0,388 ± 0,019 93,75 8,02 ± 3,83 2500 Cao CPS Cao CPS 0,504 ± 0,000 375 18,12 ± 1,17 1250

625 0,563 ± 0,007 1500 58,58 ± 1,79

0 0 0 0,00 Cao IPS

93,75 3,32 ± 0,2 93,75 7,26

187,5 10,09 ±0,08 187,5 12,95

375 13,54 ± 1,59 375 14,65

750 29,0 ± 1,8 750 43,70

1500 59,24 ± 7,23 0 0,00

0 0 0 0,00 EPS

93,75 2,50 ±1,16 93,75 11,47

375 5,24 ± 0,00 750 43,13

750 9,90 ± 1,20 1500 76,88

1500 20,74 ± 2,57

Phụ lục 16: Khả năng ức chế α-glucosidase của các cao chiết C. sinensis

O, sinensis giàu selen O, sinensis đối chứng

Cao chiết Giá trị ∆OD Cao chiết Giá trị ∆OD Nồng độ (µg/mL) Nồng độ (µg/mL)

0 0 0,53 0,968

50 50 0,58 0,958 Cao EtOH Cao EtOH 500 500 0,55 1,003

5000 5000 0,51 1,001

120

O, sinensis giàu selen O, sinensis đối chứng

Cao chiết Giá trị ∆OD Cao chiết Giá trị ∆OD Nồng độ (µg/mL) Nồng độ (µg/mL)

0 0,59 0 0,968

50 0,61 50 0,840 Cao PE Cao PE 500 0,59 500 0,744

5000 0,54 5000 0,737

0 0,59 0 0,888

50 0,58 50 0,889 Cao EtOAc 500 0,56 500 0,873 Cao EtOAc 5000 0,45 5000 0,774

0 0,542 0 0,764

50 0,544 50 0,767 Cao BuOH 500 0,539 500 0,751 Cao BuOH 5000 0,525 5000 0,743

0 0,542 0 0,762

50 0,541 50 0,784

Cao H2O Cao H2O 500 0,530 500 0,797

5000 0,513 5000 0,781

0 0,595 0 0,636

50 0,591 50 0,631 Cao CPS Cao CPS 500 0,566 500 0,605

5000 0,555 5000 0,593

0 0,824 0 0,936 Cao IPS Cao IPS

50 0,780 50 0,906

500 0,725 500 0,940

5000 0,789 5000 0,926

0 0,549 0 0,945 EPS EPS

50 0,534 50 0,952

500 0,543 500 0,903

5000 0,531 5000 0,974

121

Phụ lục 17: Môi trường nuôi khuẩn, môi trường thực hiện kháng khuẩn

Môi trường thực hiện kháng khuẩn: Môi trường Muller Hinton Agar (MHA):

Cao thịt 2g/L; Casein 17,5g/L;Tinh bột 1,5g/L; Agar 17g/L

Phụ lục 18: Kết quả khảo sát khả năng ức chế XO của các cao chiết từ sinh khối nấm

C. sinensis ở nồng độ 4000µg/mL

Khả năng ức chế XO (%) Mẫu C. sinensis giàu Se C. sinensis ĐC

28,94 ± 1,02 47,80 ± 1,09 EtOH

25,27 ± 3,75 PE 57,51 ± 1,93

EtOAc 59,83 ± 0,21 64,18 ± 4,82

27,96 ± 6,51 BuOH 54,70 ± 4,33

26,80 ± 2,40 30,75 ± 4,29 Nước

33,79 ± 2,67 38,07 ± 4,01 CPS

33,07 ± 2,28 20,78 ± 0,82 IPS

39,12 ± 6,42 21,92 ± 3,53 EPS

Phụ lục 19: Kết quả thử độc tính cấp trên chuột của C. sinensis giàu Se

CS-Se liều 2500mg/kg

STT Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Giới Tính

1 21,2 21,5 22,7 24,3 25,3 26,2 27 Cái

2 22,1 23,7 24,7 26,4 27,8 28,7 29,5 Cái

3 21,5 22,1 23 23,6 24,2 24,8 25,6 Cái

4 19,3 19,9 19,2 20,7 21,7 22,5 23,2 Cái

5 20,7 21,3 21,7 23 23,1 24,2 25,1 Cái

6 19,1 19 18,6 19,6 20,3 21,5 22,3 Cái

7 23 24,4 23,9 26 27,2 28,6 29,2 Cái

122

CS-Se liều 2500mg/kg

STT Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Giới Tính

8 19,3 19,3 20,8 22,3 24,2 24,2 26,5 Đực

9 19,4 20 20,7 21,5 23 24,3 25,9 Đực

10 20,6 20 21,3 22,7 23,3 24 26 Đực

11 21,5 20,6 21,4 24 25,8 26 26,2 Đực

12 22 22,5 23,2 25,1 26,2 27,8 28,7 Đực

13 22 22,8 22,8 24,6 25,6 26,8 28,1 Đực

14 21,6 21,3 21,2 23 24 25,9 27,6 Đực

Phụ lục 20: Phần trăm gây độc tế bào (%) trên fibroblast

Mẫu Phần trăm gây độc tế bào (%) trên fibroblast

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

EtOH -10,38 -6,21 -10,38 -8,99 ± 2,41

C. sinensis giàu PE -0,55 1,86 -4,92 -1,20 ± 3,44 Se

EtOAc 9,84 9,94 5,46 8,41 ± 2,55

EtOH -2,66 6,48 6,60 3,48 ± 5,31

PE -1,60 6,02 6,13 3,52 ± 4,43 C. sinensis ĐC EtOAc 11,19 8,16 3,53 7,63 ± 3,86

BuOH 1,60 6,94 6,60 5,05 ± 2,99

123

Phụ lục 21: Phần trăm gây độc tế bào MCF-7 tại các nồng độ khác nhau

Phần trăm gây độc tế bào MCF-7 (%) Nồng độ Mẫu Mẫu (µg/mL) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

100 56,71 57,23 57,97 57,30 ± 0,64

EtOH 57,65 59,51 53,72 56,96 ± 2,96 50

56,89 54,73 56,47 56,03 ± 1,15 25

25,00 21,45 26,62 24,36 ± 2,65 10

-1,39 2,68 -3,44 -0,72 ± 3,12 5

100 56,95 55,02 55,41 55,79 ± 1,02

PE 10 45,98 48,41 48,38 47,59 ± 1,40

C. sinensis 36,79 33,14 35,67 35,20 ± 1,87 5 giàu Se

-4,80 -0,93 -4,13 -3,29 ± 2,07 1

0,5 -5,18 -2,22 -7,30 -4,90 ± 2,55

100 62,07 61,64 61,08 61,60 ± 0,50

EtOAc 10 59,80 61,03 60,33 60,39 ± 0,62

59,54 61,38 60,88 60,60 ± 0,95 5

22,88 24,39 26,45 24,57 ± 1,79 1

0,5 -2,28 0,82 -2,89 -1,45 ± 1,99

EtOH 55,65 60,04 52,76 56,15 ± 3,66 50

43,99 51,12 48,01 47,70 ± 3,58 25

11,39 17,14 26,87 18,46 ± 7,82 10 C. sinensis

ĐC 11,75 10,85 11,83 11,48 ± 0,55 5

7,25 10,55 6,69 8,16 ± 2,08 1

PE 50 55,64 57,41 56,09 56,38 ± 0,92

124

Phần trăm gây độc tế bào MCF-7 (%) Nồng độ Mẫu Mẫu (µg/mL) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

46,76 50,69 43,09 46,85 ± 3,80 25

39,14 44,91 34,43 39,49 ± 5,25 10

14,51 14,93 5,15 11,53 ± 5,53 5

5,85 0,23 3,40 3,16 ± 2,81 1

EtOAc 100 63,09 70,31 70,41 67,94 ± 4,20

61,18 64,60 69,43 65,07 ± 4,14 50

54,93 60,70 59,08 58,24 ± 2,97 25

25,16 31,22 25,52 27,30 ± 3,40 10

1,81 -3,77 -1,95 -1,30 ± 2,85 5

BuOH 100 52,84 52,79 50,94 52,19 ± 1,08

29,85 31,60 20,73 27,39 ± 5,84 50

6,26 -0,69 -5,39 0,06 ± 5,86 25

-0,73 9,26 0,82 3,12 ± 5,38 10

4,18 11,57 -2,11 4,55 ± 6,85 5

125

Phụ lục 22: Phần trăm gây độc tế bào Jurkat tại các nồng độ khác nhau

Phần trăm gây độc tế bào (%) trên Jurkat STT Ký hiệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

-1,98 -1,00 7,00 1,34 ± 4,93 ĐC

18,40 19,90 6,89 15,06 ± 7,12 EPS

-1,35 -1,65 -5,88 -2,96 ± 2,53 IPS

EtOH 37,47 38,23 32,32 36,01 ± 3,21 C. sinensis giàu Se PE 40,08 42,86 30,67 37,87 ± 6,39

EtOAc 35,19 41,54 34,62 37,11 ± 3,84

BuOH 3,54 5,95 14,05 7,85 ± 5,50

-3,29 -4,71 -10,65 -6,22 ± 3,91 Nước

-1,43 2,56 -2,94 -0,60 ± 2,84 CPS

23,39 25,90 27,77 25,69 ± 2,20 EPS

-4,13 8,97 -7,60 -0,92 ± 8,74 IPS

EtOH 23,70 32,54 27,64 27,96 ± 4,42

C. sinensis ĐC PE 21,16 39,71 32,87 31,25 ± 9,38

EtOAc 36,93 40,14 31,69 36,25 ± 4,27

BuOH -10,79 5,55 3,65 -0,53 ± 8,94

0,41 -3,28 -2,18 -1,68 ± 1,89 Nước

-21,80 -7,09 -7,31 -12,06 ± 8,43 CPS

126

Phụ lục 23: Mật độ tế bào ung thư sau khi xử lý với mẫu cao từ C. sinensis ĐC trong

48 giờ (200x)

A: CPT 0,05mgSe/L; B: Cao EtOH 100mgSe/L; C: Cao PE100mgSe/L; D: Cao

EtOAc100mgSe/L; E: Cao BuOH100mgSe/L.

Phụ lục 24: Sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis trên môi trường PGA bổ sung

selenourea từ 0 đến 40 mgSe/L ở thời điểm 15 ngày

127

SeCysa

Phụ lục 25: Sắc kí đồ của selen nguyên dạng

128

Phụ lục 26: Sắc kí đồ phân tích selen nguyên dạng của các mẫu sinh khối nấm C.

C. sinensis theo PP1

Sắc kí đồ của SeMet, SeCys2, Se6+, Se4+, SeMetCys

C. sinensis theo PP1

Sắc kí đồ của SeCysa

sinensis

C. sinensis theo PP2

Sắc kí đồ của SeCys2, SeMet, Se6+, Se4+, SeMetCys

C. sinensis theo PP2

Sắc kí đồ của SeCysa

129

130

Phụ lục 27: Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng, hoạt chất và các chỉ tiêu ATTP

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Lê Quốc Phong

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN

Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU

SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP Hồ Chí Minh – Năm 2021

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Lê Quốc Phong

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN

Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU

SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PGS.TSKH. Ngô Kế Sương

Lê Quốc Phong

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

Nhóm tuổi

Cân nặng (kg)

RNI* (μg/ngày)

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các biến

Nghiệm thức

Y1

Y2

Y3

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

-. Gốc

- tấn công gây chết tế bào. Đồng thời, quá trình khử tạo ra Se0, đây chính là

IC50 (µg/mL)

Mẫu

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có thể bạn quan tâm

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển nguồn nhân lực du lịch trong các cơ sở lưu trú tại Hà Nội

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển nguồn nhân lực du lịch trong các cơ sở lưu trú tại Hà Nội

Luận án Tiến sĩ: Giáo dục đạo đức sinh thái cho sinh viên các trường đại học tại Thành phố Hồ Chí Minh hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Giáo dục đạo đức sinh thái cho sinh viên các trường đại học tại Thành phố Hồ Chí Minh hiện nay

Luận án Tiến sĩ: Công tác hoằng pháp và hoạt động của đạo tràng Phật giáo tỉnh Lào Cai hiện nay

Luận án Tiến sĩ: Hành vi nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe tâm thần của học sinh trung học phổ thông tại Hà Nội hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Hành vi nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe tâm thần của học sinh trung học phổ thông tại Hà Nội hiện nay

Luận án Tiến sĩ: Đảng bộ tỉnh Đồng Nai lãnh đạo công tác bảo tồn và phát huy giá trị các di tích lịch sử - văn hóa từ năm 1996 đến năm 2015

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Đảng bộ tỉnh Đồng Nai lãnh đạo công tác bảo tồn và phát huy giá trị các di tích lịch sử - văn hóa từ năm 1996 đến năm 2015

Luận án Tiến sĩ: Thực hiện Pháp lệnh thực hiện dân chủ ở xã, phường, thị trấn vùng dân tộc thiểu số tỉnh Quảng Nam hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Thực hiện Pháp lệnh thực hiện dân chủ ở xã, phường, thị trấn vùng dân tộc thiểu số tỉnh Quảng Nam hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Công tác hoằng pháp và hoạt động của đạo tràng Phật giáo tỉnh Lào Cai hiện nay

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu chất lượng dịch vụ viễn thông di động tại Tổng công ty viễn thông Viettel

Luận án Tiến sĩ: Nâng cao chất lượng cơ sở vật chất các trường đại học tư thục trên địa bàn thành Hà Nội

Luận án Tiến sĩ: Năng lực cạnh tranh của doanh nghiệp nhỏ và vừa trên địa bàn tỉnh Phú Thọ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự thành công trong khởi sự kinh doanh của phụ nữ khu vực miền Bắc

Luận án Tiến sĩ: Kiểm soát nội bộ tại Tập đoàn xăng dầu Việt Nam

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Kiểm soát nội bộ tại Tập đoàn xăng dầu Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu giải pháp phát triển trung tâm logistics quốc tế cho khu vực kinh tế trọng điểm phía Bắc

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng đến mức độ công bố thông tin trên báo cáo thường niên của các ngân hàng thương mại Việt Nam

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt