Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Bùi Thị Thanh

NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN

TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Bùi Thị Thanh

NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN

TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens

Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. Nguyễn Lan Hương

2. TS.Phạm Tuấn Anh

Hà Nội – 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết

quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công

trình nào khác.

Hà nội, ngày tháng năm 2023

Giáo viên hướng dẫn khoa học Nghiên cứu sinh

1

Bùi Thị Thanh

LỜI CẢM ƠN

Sau 5 năm học tập và nghiên cứu thực hiện luận án tại Viện Công nghệ sinh

học và Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách Khoa Hà Nội, dưới sự hướng dẫn, định

hướng của cô và thầy hướng dẫn trực tiếp trong suốt quá trình học tập, cùng sự giúp

đỡ của tập thể các thầy, cô giáo, các anh, chị, em phụ trách các Bộ môn, Phòng,

Ban, các bạn đồng nghiệp và các em sinh viên trong và ngoài trường đã góp phần

giúp em hoàn thành luận án này.

Em xin chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc tới cô và thầy hướng dẫn trực

tiếp đó là PGS. TS. Nguyễn Lan Hương, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện

Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách khoa Hà Nội. TS. Phạm

Tuấn Anh, Trưởng bộ môn Vi sinh-Hóa sinh-Sinh học phân tử, Viện Công nghệ

sinh học và Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách khoa Hà Nội. Cô và thầy đã hướng

dẫn tận tình, thường xuyên theo dõi, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong

suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án.

Em xin chân thành cảm ơn đến tập thể thầy, cô giáo, cán bộ thuộc Bộ môn

Công nghệ sinh học, Bộ môn Vi sinh-Hóa sinh-Sinh học phân tử, Trung tâm Nghiên

cứu và Phát triển Công nghệ sinh học cùng Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học

và Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách khoa Hà Nội đã đóng góp ý kiến, tạo điều

kiện, giúp đỡ em trong suốt quá trình triển khai thí nghiệm thực nghiệm hoàn thành

nội dung luận án tại Đại học Bách khoa Hà Nội.

Em xin chân thành cảm ơn đến Ban giám hiệu, tập thể các thầy, cô Phòng

Sau đại học/Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời

gian học tập, nghiên cứu và bảo vệ luận án.

Em xin chân thành cảm ơn đến tập thể Ban lãnh đạo, chỉ huy Học viện Hậu

cần và Viện Nghiên cứu KHHC quân sự cùng các đồng nghiệp, tập thể các Phòng,

Ban thuộc Học viện Hậu cần đã tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ và động viên em

trong quá trình công tác, học tập và nghiên cứu tại Đại học Bách khoa Hà Nội.

Em xin chân thành cảm ơn đến lãnh đạo, chỉ huy Đoàn 871, cùng tập thể

Phòng Quản lý học viên trong nước, lãnh đạo, chỉ huy Quản lý Hệ 1/Đoàn 871/

Tổng cục Chính trị đã quan tâm, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập

2

và nghiên cứu tại Đại học Bách khoa Hà Nội.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè đã quan

tâm, chia sẻ khó khăn và động viên để em hoàn thành luận án.

Trân trọng!

Nghiên cứu sinh

3

Bùi Thị Thanh

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................... 1

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................... 2

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... 8

DANH MỤC BẢNG .............................................................................................................. 10

DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ ............................................................................................... 11

MỞ ĐẦU ................................................................................................................................. 13

1. Tính cấp thiết của luận án ................................................................................................... 13

2. Mục tiêu của luận án .......................................................................................................... 14

3. Nội dung của luận án .......................................................................................................... 14

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ....................................................................... 14

5. Những đóng góp mới của luận án .................................................................................... 15

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 16

1.1. Giới thiệu về enzyme thủy phân fibrin .......................................................................... 16

1.1.1. Cơ chế tiêu sợi huyết của enzyme thủy phân fibrin .................................................. 16

1.1.2. Ứng dụng của enzyme thủy phân fibrin ..................................................................... 18

1.1.3. Nguồn thu nhận enzyme thủy phân fibrin .................................................................. 19

1.2. Giới thiệu về Bacillus sp. ................................................................................................ 22

1.2.1. Đặc điểm của Bacillus sp. ............................................................................................ 22

1.2.1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................................................................... 23

1.2.1.2. Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens ...................................................................... 24

1.2.2. Nghiên cứu thu nhận các enzyme thủy phân fibrin được sinh tổng hợp từ

Bacillus sp. .............................................................................................................................. 25

1.3. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bằng đột biến .............. 27

1.3.1. Phương pháp gây đột biến bằng UV ........................................................................... 29

1.3.1.1. Cơ chế gây đột biến UV ............................................................................................ 29

1.3.1.2. Nghiên cứu đột biến UV nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân

fibrin của các chủng vi khuẩn ................................................................................................ 29

1.3.2. Phương pháp gây đột biến bằng hóa chất ................................................................... 31

1.3.2.1. Cơ chế gây đột biến hóa chất EMS và EtBr ........................................................... 31

1.3.2.2. Nghiên cứu đột biến hóa chất EMS và EtBr nâng cao khả năng sinh tổng hợp

4

enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn ................................................................ 32

1.4. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bằng tối ưu môi trường

lên men ..................................................................................................................................... 33

1.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến khả năng

sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin ................................................................................. 34

1.4.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bằng tối ưu

môi trường lên men ................................................................................................................. 35

1.5. Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin ................................................... 38

1.5.1. Lên men theo mẻ........................................................................................................... 38

1.5.2. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất ............................................................................. 39

1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng trong lên men .......................................................................... 40

1.6. Sản phẩm enzyme thủy phân fibrin thương mại ........................................................... 42

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................. 44

2.1. Vật liệu .............................................................................................................................. 44

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................... 44

2.1.2. Hóa chất ......................................................................................................................... 44

2.1.3. Thành phần môi trường ................................................................................................ 45

2.1.4. Thiết bị ........................................................................................................................... 46

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................. 47

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................................... 47

2.2.2. Phương pháp phân tích ................................................................................................. 48

2.2.2.1. Xác định hoạt độ enzyme.......................................................................................... 48

2.2.2.2. Nhuộm Gram ............................................................................................................. 49

2.2.2.3. Nhuộm bào tử ............................................................................................................ 49

2.2.2.4. Xác định đường khử bằng phương pháp DNS ....................................................... 49

2.2.2.5. Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Bradford ...................... 49

2.2.2.6. Xác định hàm lượng sinh khối khô .......................................................................... 50

2.2.2.7. Đo độ nhớt dịch lên men ........................................................................................... 50

2.2.2.8. Định tính enzyme amylase ....................................................................................... 50

2.2.2.9. Định tính enzyme cellulase ....................................................................................... 50

2.2.2.10. Đặc điểm sinh hóa của chủng gốc và chủng đột biến .......................................... 50

2.2.2.11. Tách DNA tổng số và giải trình tự bộ gen của vi khuẩn ................................ 51

2.2.2.12. Xử lý số liệu ............................................................................................................. 52

5

2.2.3. Phương pháp thí nghiệm .............................................................................................. 53

2.2.3.1. Phân lập và sàng lọc chủng ....................................................................................... 53

2.2.3.2. Hoạt hóa chủng .......................................................................................................... 53

2.2.3.3. Thu nhận enzyme thủy phân fibrin ngoại bào ........................................................ 53

2.2.3.4. Đột biến chủng vi khuẩn ........................................................................................... 53

2.2.3.5. Kiểm tra độ ổn định của các chủng đột biến ........................................................... 56

2.2.3.6. Khảo sát khả năng tạo bào tử của chủng đột biến .................................................. 57

2.2.3.7. Tối ưu hóa điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân

fibrin của chủng Bacillus sp. .................................................................................................. 57

2.2.3.8. Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật lên men .................................................................... 60

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 63

3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy

phân fibrin cao ......................................................................................................................... 63

3.1.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease .............................. 63

3.1.2. Khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng .................................. 65

3.2. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng lựa chọn bằng

phương pháp gây đột biến ...................................................................................................... 67

3.2.1. Đột biến bằng tia UV .................................................................................................... 67

3.2.2. Đột biến chủng HY6 bằng hóa chất EtBr ................................................................... 70

3.2.3. Đột biến bằng UV kết hợp hóa chất ............................................................................ 71

3.2.3.1. Đột biến chủng U5_90.5 bằng EtBr ........................................................................ 71

3.2.3.2. Đột biến chủng U5_90.5 bằng EMS........................................................................ 72

3.2.3.3. Đột biến chủng E1 (đã đột biến UV và EtBr) bằng EMS ..................................... 73

3.2.3.4. Đột biến chủng U5_90.5 bằng EtBr kết hợp với EMS .......................................... 75

3.2.4. Độ ổn định của các chủng đột biến ............................................................................. 76

3.2.5. Bước đầu tìm hiểu về hệ gen liên quan đến enzyme thủy phân fibrin của chủng

HY6 ban đầu và chủng đột biến ES4 .................................................................................... 78

3.3. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng ES4 bằng kỹ

thuật lên men ........................................................................................................................... 82

3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp để sinh tổng hợp enzyme thủy

phân fibrin của chủng ES4 ..................................................................................................... 82

3.3.1.1. Nguồn carbon ............................................................................................................. 83

3.3.1.2. Nguồn nitrogen .......................................................................................................... 84

6

3.3.1.3. Các ion kim loại ......................................................................................................... 86

3.3.2. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho khả năng sinh enzyme

của chủng ................................................................................................................................. 88

3.3.2.1. Nhiệt độ lên men ........................................................................................................ 88

3.3.2.2. pH môi trường ban đầu ............................................................................................. 90

3.3.3. Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin . 91

3.3.4. Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin ............ 97

3.3.4.1. Lên men theo mẻ ....................................................................................................... 97

3.3.3.2. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn ........................................................ 98

3.3.3.3. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai đoạn. ..................................................... 100

Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 104

KẾT LUẬN ........................................................................................................................... 104

KIẾN NGHỊ ........................................................................................................................... 105

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ........................... 106

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 107

7

PHỤ LỤC............................................................................................................................... 131

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng việt

BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết thanh bò

BN Bắc Ninh

CFU Colony-forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc

CMC Carboxymethyl cellulose Carboxymethyl xenluloza

CTAB Cetyltrimethylammonium Cetyltrimethylammonium

bromide bromide

cs Cộng sự

DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic

DNS 3,5-Dinitrosalicylic acid Axit 3,5-Dinitrosalicylic

DO Dissolved Oxygen Oxi hòa tan

EDTA Etylenediaminetetraacetic acid Axit etylenediaminetetraacetic

EMS Ethyl methanesulfonate Ethyl methanesulfonate

EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide

FE Fibrinolytic enzyme Enzyme thủy phân fibrin

FU Fibrin unit Đơn vị hoạt độ enzyme thủy

phân fibrin

GĐ Giai đoạn

HD Hải Dương

HN Hà Nội

HP Hải Phòng

HY Hưng Yên

LB Luria-Bertani Luria-Bertani

LM Lên men

mPas Milipascal Đơn vị đo độ nhớt động lực

NA Nghệ An

NTG N-methyl-N-nitro-N- N-methyl-N-nitro-N-

nitrosoguanid nitrosoguanid

OD Optical density Mật độ quang học

PGA Polyglutamic Acid Axit Polyglutamic

8

PT Phú Thọ

RAST Rapid Annotations using Chú thích nhanh bằng Công

Subsystems Technology nghệ hệ thống phụ/ Hệ thống

chú thích chức năng

Revolutions per minute Vòng/phút RPM

Response surface Phương pháp đáp ứng bề mặt RSM

methodolody

Sinh khối SK

Trichloroacetic acid Axit trichloroacetic TCA

Tissue plasminogen activator Tiền tố kích thích plasminogen t-PA

Tris-HCl Tris (hydroxymethyl) Tris (hydroxymethyl)

aminomethane hydrochloride aminomethane hydrochloride

Ultra Violet Tia cực tím UV

Thể tích khí/thể tích chất vvm

lỏng/phút

9

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy

phân fibrin được phân lập từ nguồn thực phẩm…………………………..… 21

Bảng 1.2. Một số sản phẩm enzyme thủy phân fibrin thương mại……..…... 42

Bảng 2.1. Tổng hợp địa điểm và số lượng các mẫu tương thu thập…...….... 44

Bảng 2.2. Danh mục hóa chất………………………………………..….......... 45

Bảng 2.3. Danh mục các trang thiết bị chính………….……………………... 46

Bảng 2.4. Bảng thiết kế thí nghiệm thống kê tối ưu cho sinh khối và enzyme... 59

Bảng 3. 1. Tổng hợp các mẫu và chủng vi khuẩn phân lập…………………. 63

Bảng 3.2. Kết quả đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn.. 65

Bảng 3.3. Đặc điểm tổ hợp bộ gen của chủng HY6 và ES4……………...…. 78

Bảng 3.4. Các gen thay đổi giữa chủng HY6 và chủng ES4 đột biến ……… 80

Bảng 3.5. Đặc điểm của chủng đột biến ES4 thay đổi so với chủng HY6

gốc ban đầu…………………………………………………………………. 82

Bảng 3.6. Kết quả phân tích ANOVA mô hình bậc hai………..……………. 92

Bảng 3.7. Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm……. 93

Bảng 3.8. Thành phần môi trường tối ưu cho sự tạo sinh khối và hoạt độ enzyme. 96

10

Bảng 3.9: Tổng hợp kết quả lên men theo mẻ bổ sung cơ chất…………….. 101

DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1. Cơ chế thủy phân fibrin của enzyme…………………………...... 17

Hình 1.2. Nguồn phân lập vi khuẩn sinh enzyme thủy phân fibrin……….. 20

Hình 1.3. Hình ảnh tế bào Bacillus amyloliquefaciens SEM……………..... 24

Hình 1.4. Quá trình ethyl hóa do EMS tạo ra ở vị trí O-6 của guanine và vị

trí O-4 của thymine có thể dẫn đến sự bắt cặp sai trực tiếp với thymine và

guanine, tương ứng…………………………………………………..……... 31

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu………………………………………………… 47

Hình 2.2. Sơ đồ đột biến chủng bằng tia UV……………………………….. 54

Hình 2.2. Sơ đồ đột biến chủng bằng hóa chất……………………………... 56

Hình 3.1. Tỉ lệ các chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính protease (%)…... 64

Hình 3.2. Kết quả đo đường kính vòng thủy phân sữa gầy của 48 chủng

phân lập……………………………………………………………………... 64

Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và tế bào nhuộm gram của chủng HY6 soi

kính hiển vi trên vật kính dầu 100x………………………………….. …..... 67

Hình 3.4. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng sau đột biến

bằng tia UV. ………………………………………………………………… 69

Hình 3.5. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng đột biến bằng EtBr... 70

Hình 3.6. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến

bằng EtBr từ chủng U5_90.5……………………………..………………… 72

Hình 3.7. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến

bằng EMS từ chủng U5_90.5………………….…………...……………….. 73

Hình 3.8. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến

bằng EMS từ chủng E1……………………………………………...……… 74

Hình 3.9. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến

bằng EtBr kết hợp EMS …............................................................................. 75

Hình 3.10. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng qua 10 lần cấy chuyển. 77

Hình 3.11. Kết quả chạy RAST chủng HY6…………………………….. 79

11

Hình 3.12. Kết quả chạy RAST chủng ES4……………………………... 79

Hình 3.13. Ảnh hưởng của nguồn carbon…………………………………... 83

Hình 3.14. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen………………...………………. 85

Hình 3.15. Ảnh hưởng của các ion kim loại…………...…………………… 87

Hình 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy……………………………..... 89

Hình 3.17. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu………………………... 90

Hình 3.18. Hệ số ảnh hưởng của phương trình hồi quy bậc hai đối với mật

độ tế bào và hoạt độ enzyme thủy phân fibrin……………..……………...... 94

Hình 3.19. Bề mặt đáp ứng cho hàm mật độ tế bào và hàm hoạt độ enzyme. 95

Hình 3.20. Động học quá trình lên men theo mẻ ………………….……….. 97

Hình 3.21. Động học của quá trình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn 99

12

Hình 3.22. Động học của quá trình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai đoạn 101

MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA LUẬN ÁN

Các bệnh tim mạch (CVD) là một trong những nguyên nhân dẫn đến tử

vong ở người và theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã xác định có 17,9 triệu ca tử

vong mỗi năm do CVD, ước tính chiếm 31% số ca tử vong trên toàn cầu. Các bệnh

rối loạn tim mạch như nhồi máu cơ tim cấp tính, tắc mạch và đột quỵ chủ yếu là do

sự tích tụ quá nhiều fibrin trong mạch máu tạo thành huyết khối. Việc sử dụng

thuốc chống đông máu, thuốc chống kết dính tiểu cầu, phẫu thuật và enzyme thủy

phân fibrin để làm tan cục máu đông đã cải thiện được tình trạng huyết khối. Các

enzyme thủy phân fibrin được thu nhận từ các chủng vi sinh vật trở thành nguồn sản

xuất các enzyme thủy phân fibrin dễ tiếp cận hơn, rẻ hơn và các enzyme này có thể

làm tan được huyết khối có trong máu. Ngày nay, enzyme thủy phân fibrin được

quan tâm và nghiên cứu ứng dụng trong hỗ trợ điều trị bệnh liên quan đến huyết

khối, tắc nghẽn mạch máu và đột quỵ. Ngoài ra, enzyme thủy phân fibrin còn được

chứng minh là có tác dụng bảo vệ chống lại bệnh tăng huyết áp, bệnh Alzheimer và

xơ vữa động mạch. Do đó, enzyme thủy phân fibrin được coi là một enzyme làm tan

huyết khối hiệu quả, an toàn và kinh tế.

Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin

được phân lập chủ yếu từ các nguồn thực phẩm lên men, trong đó có nguồn thực

phẩm lên men từ đậu tương được quan tâm nghiên cứu để thu nhận enzyme là chủ

yếu, các chủng vi khuẩn phân lập được thuộc chi Bacillus như B. subtilis, B.

amyloliquefaciens thường chiếm đa số và được cho là an toàn. Tuy nhiên các

chủng phân lập thường cho hoạt lực enzyme thấp, việc nghiên cứu để tăng khả năng

sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn cho năng suất và

hiệu quả cao đến nay vẫn đang là một trong những vấn đề được quan tâm hướng tới

ứng dụng trong quá trình lên men công nghiệp sản xuất sản phẩm thương mại.

Trước nhu cầu về sử dụng enzyme thủy phân fibrin ngày càng tăng trong

các lĩnh vực y dược và thực phẩm bổ sung, việc mở rộng nghiên cứu tăng cường cải

thiện hoạt độ của enzyme cũng như nâng cao sản lượng thông qua việc cải tiến

chủng, tối ưu môi trường và lựa chọn kỹ thuật lên men phù hợp để tăng hiệu quả và

13

năng suất góp phần giảm chi phí sản xuất là rất cần thiết. Ngoài việc lựa chọn

phương pháp lên men phù hợp và tối ưu hóa thành phần môi trường lên men cho

từng chủng cụ thể thì việc nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy

phân fibrin của các chủng vi khuẩn được coi là một trong những cách đem lại hiệu

quả cao, nhất là ứng dụng trong sản xuất quy mô công nghiệp. Vì vậy, tác giả đã

tiến hành “Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân

fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens” được phân lập từ nguồn tương lên

men truyền thống của Việt Nam.

2. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN

Tuyển chọn và nâng cao được khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân

fibrin của vi khuẩn Bacillus sp. phân lập từ nguồn tương lên men truyền thống.

3. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN

1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy

phân fibrin cao. Định danh tên chủng bằng phương pháp giải trình tự gen.

2. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng

bằng phương pháp đột biến dùng tia UV kết hợp hóa chất EtBr và EMS.

3. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng

bằng kỹ thuật lên men theo mẻ bổ sung cơ chất.

4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN

1. Về ý nghĩa khoa học

Đã phân lập và tuyển chọn được chủng Bacillus amyloliquefaciens HY6

từ tường Bần, Hưng Yên và cải biến thành chủng đột biến ES4 có khả năng sinh

enzyme thủy phân fibrin.

Chứng minh được việc nâng cao khả năng sinh tổng enzyme thủy phân

fibrin của chủng bằng cách tạo đột biến sử dụng kết hợp tia UV với hóa chất EtBr

và EMS.

Đã nâng cao được khả năng sinh enzyme thủy phân fibrin bằng cách thiết

lập được kỹ thuật lên men theo mẻ bổ sung cơ chất hai giai đoạn đối với chủng đột

biến ES4.

2. Về ý nghĩa thực tiễn

Bổ sung vào bộ sưu tập giống các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng

14

hợp enzyme thủy phân fibrin cao.

Kết quả là cơ sở khoa học để nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất

enzyme thủy phân fibrin nhằm tạo sản phẩm nhằm ứng dụng hỗ trợ phòng ngừa

và điều trị bệnh liên quan đến huyết khối ở Việt Nam.

5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Là nghiên cứu đầu tiên có tính hệ thống về phân lập, tuyển chọn, tạo

chủng vi khuẩn đột biến, xác định điều kiện lên men nhằm thu enzyme thủy phân

fibrin từ chủng B. amyloliquefaciens HY6 có nguồn gốc từ tương Bần, Hưng Yên.

2. Đã tạo được chủng đột biến B. amyloliquefaciens ES4 sinh tổng hợp

enzyme thủy phân fibrin cao hơn so với chủng đã phân lập bằng kỹ thuật sử dụng

kết hợp đột biến tia UV với hóa chất EMS và EtBr.

3. Đã nâng cao được khả năng sinh enzyme thủy phân bằng cách thiết lập

15

kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất hai giai đoạn trên thiết bị lên men 2 lít.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN

Enzyme thủy phân fibrin hay còn gọi là enzyme tiêu sợi huyết, được phân

lập đầu tiên năm 1987 từ thực phẩm lên men truyền thống “natto” của Nhật Bản bởi

Sumi [1]. Hầu hết các enzyme thủy phân fibrin thuộc họ protease subtilisin [2] và

được sinh tổng hợp bởi chủng vi khuẩn Bacillus sp., các chủng vi khuẩn Bacillus sp.

được phân lập chủ yếu từ các nguồn thực phẩm lên men, trong đó có nguồn đậu

tương lên men truyền thống. Enzyme thủy phân fibrin đã được nghiên cứu thu nhận

ở các nước như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Thái Lan,

trong đó cũng có Việt nam. Một loạt các enzyme thủy phân fibrin đã được báo cáo

thu nhận được từ chi Bacillus khác nhau về đặc tính của chúng như trọng lượng

phân tử từ 20 - 60 KDa [3-23], tính đặc hiệu của cơ chất, có khả năng trở thành tác

nhân làm tan huyết khối tác động trực tiếp, hiệu quả về mặt chi phí và có thể sử dụng

bằng đường uống [24, 25]. Gần đây, các enzyme thủy phân fibrin do vi sinh vật tổng

hợp đã thu hút được nhiều sự chú ý hơn so với các chất tiêu sợi huyết thông thường

trong điều trị huyết khối. Các loài Bacillus sp. có tiềm năng rất lớn để tiết ra nhiều

loại protease và hầu hết chúng đều có khả năng thủy phân fibrin. Vì vậy, việc phân

lập tìm kiếm các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin

có đặc tính mới vẫn được quan tâm đến nay.

1.1.1. Cơ chế tiêu sợi huyết của enzyme thủy phân fibrin

Enzyme thủy phân fibrin vốn sẵn có trong cơ thể bao gồm t-PA (tissue

plasminogen activators), urokinase, đây là những chất hoạt hóa plasminogen, có tác

dụng chuyển plasminogen không hoạt động thành plasmin hoạt động và thủy phân

fibrin. Các enzyme thủy phân fibrin, Streptokinase và Staphylokinase từ các nguồn vi

khuẩn cũng thuộc loại chất kích hoạt plasminogen này.

Enzyme thủy phân fibrin có thể hỗ trợ làm tan các sợi huyết trong cơ thể [26],

giúp máu lưu thông tốt bằng cách phá vỡ các protein fibrin trong máu, thúc đẩy và tăng

cường lưu lượng máu khỏe mạnh theo cơ chế như Hình 1.1. Fibrin thường được hình

thành từ fibrinogen do tác dụng của thrombin (EC 3.4.21.5), bị cắt bởi plasmin (EC

3.4.21.7), plasmin được kích hoạt từ plasminogen bởi chất hoạt hóa plasminogen mô.

16

Trong điều kiện cân bằng, các cục máu đông có chứa các sợi fibrin được thủy phân

bởi plasmin để tránh huyết khối trong mạch máu. Tuy nhiên, trong một số trường hợp

các sợi fibrin không bị thủy phân, lắng đọng trong mạch máu dẫn đến hiện tượng làm

tăng huyết khối và một số bệnh khác liên quan đến tim mạch như huyết áp cao, nhồi

máu cơ tim cấp, bệnh mạch máu ngoại biên [25]. Các cục máu đông bất thường cũng

là nguyên nhân gây ra các cơn đau tim và đột quỵ, và một số tình trạng như viêm

tĩnh mạch, tắc mạch phổi hoặc huyết khối tĩnh mạch sâu [27, 28]. Việc nhanh chóng

làm tan cục máu đông và tái lập lưu lượng máu là rất quan trọng để điều trị bệnh

huyết khối hiệu quả. Enzyme thủy phân fibrin được cho là nguồn hứa hẹn nhất để

điều trị lâm sàng chứng huyết khối. Các enzyme thủy phân fibrin có khả năng cắt bỏ

chất ức chế hoạt hóa plasminogen, kích hoạt pro-urokinase và chất kích hoạt

plasminogen mô (t-PA), hỗ trợ hoạt động tiêu sợi huyết của plasmin, góp phần duy

trì lưu lượng máu thích hợp, ngăn ngừa cục máu đông [29].

Hình 1.1. Cơ chế thủy phân fibrin của enzyme [29]

Các chất tan huyết khối như t-PA và Urokinase được sử dụng phổ biến

nhưng giá thành cao và có tác dụng phụ không mong muốn [30]. Do đó, việc nỗ lực

17

tìm kiếm các tác nhân tan huyết khối an toàn hơn và ít tốn kém hơn từ các nguồn

khác nhau để có thể thay thế, trong đó có các enzyme thủy phân fibrin được sinh

tổng hợp từ vi sinh vật. Các enzyme thủy phân fibrin được thu nhận từ nguồn vi

sinh vật được cho là an toàn hơn cho người sử dụng, các enzyme thủy phân fibrin

đã và đang được quan tâm nghiên cứu thu nhận ứng dụng trong lâm sàng, dược

phẩm, thực phẩm hiện nay [31, 32].

1.1.2. Ứng dụng của enzyme thủy phân fibrin

Một số báo cáo chỉ ra, các enzyme thủy phân fibrin không chỉ làm suy giảm

fibrin trực tiếp mà còn làm tăng sự giải phóng chất hoạt hóa plasminogen mô từ các

tế bào để làm suy giảm fibrin [33, 34]. Các enzyme thủy phân fibrin có tác dụng

kích hoạt các chất hòa tan cục máu đông bao gồm plasmin và pro-urokinase có

trong cơ thể, làm bất hoạt chất ức chế hoạt hóa plasminogen và ức chế kết tập tiểu

cầu bằng cách ngăn chặn sự hình thành thromboxane [35]. Do đó, các enzyme thủy

phân fibrin hiện được coi là một enzyme hiệu quả, an toàn và là trọng tâm của

nghiên cứu thuốc tan huyết khối [36].

Các enzyme thủy phân fibrin được cho là an toàn, thuận tiện, hiệu quả và

được khẳng định có tác dụng phòng ngừa, có hoạt động ly giải huyết khối lớn gấp 4

lần so với plasmin, chất có sẵn trong cơ thể chống lại cục máu đông [35, 37]. Vì

vậy, các enzyme thủy phân fibrin ngày càng được quan tâm và nghiên cứu ứng

dụng trong điều trị và phòng ngừa bệnh như:

- Các enzyme thủy phân fibrin có khả năng hòa tan cục máu đông và ngăn

ngừa sự kết tụ của các tế bào hồng cầu. Do vậy, có khả năng hỗ trợ hệ thống làm

sạch tuần hoàn của cơ thể.

- Các enzyme thủy phân fibrin giúp tăng cường sản xuất plasmin của cơ thể.

Do vậy có thể hỗ trợ ngăn ngừa các bênh xơ cứng động mạnh và động mạch thu hẹp.

- Các enzyme thủy phân fibrin còn được coi là tác nhân tiêu sợi huyết lý

tưởng không chỉ làm tan cục máu đông mà còn ngăn chặn chúng và điều chỉnh quá

trình đông máu theo cách tái lập cân bằng nội mô.

- Các enzyme này có độ an toàn trong sinh học nên được ứng dụng như các

hạt tổng hợp mới được chỉ định để ức chế huyết khối liên quan đến cấy ghép [38],

18

điều trị thủy tinh thể dược lý ở những bệnh nhân bị rối loạn tăng sinh tế bào.

Hiện nay, ứng dụng của các enzyme thủy phân fibrin vẫn được biết đến nhiều

ở dạng thực phẩm chức năng dùng để hỗ trợ tan huyết khối lâm sàng, hoặc sử dụng

trong phòng ngừa. Chế phẩm của enzyme thủy phân fibrin chủ yếu dưới dạng thực

phẩm bổ sung và phổ biến là chế phẩm nattokinase được bán trên thị trường ở một số

nước như Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Hàn Quốc và một số các nước khác.

1.1.3. Nguồn thu nhận enzyme thủy phân fibrin

Các chất tan huyết khối như t-PA và Urokinase do có tác dụng phụ không

mong muốn, giá thành cao [30]. Do đó, việc nỗ lực tìm kiếm các tác nhân tan huyết

khối an toàn hơn và ít tốn kém hơn từ các nguồn khác nhau để có thể thay thế trong

đó có các enzyme thủy phân fibrin được thu nhận từ nguồn vi sinh vật đang được

quan tâm [31].

Các vi sinh vật thể hiện một vai trò quan trọng trong việc sản xuất hàng loạt

các enzyme thủy phân fibrin có tính đặc hiệu cao, chi phí thấp với tính khả thi của

việc biến đổi gen thông qua các phương pháp công nghệ sinh học và đột biến.

Trong những thập kỷ qua, nhiều loại enzyme thủy phân fibrin như vậy đã được thử

nghiệm, đặc biệt là từ các chi Bacillus [39]. Ngoài ra, các enzyme thủy phân fibrin

với các đặc tính sinh hóa đa dạng được thu nhận từ các loài vi khuẩn như

Streptococcus hemolyticus (Streptokinase, dịch tiết của vết thương nhiễm trùng) [3];

Bacillus subtilis (Nattokinase, đậu nành lên men) [24]; Bacillus sp. DJ-4 (Subtilisin

DJ4, Doen-jang, Korea) [11]. Trong đó, Streptokinase được sử dụng lâm sàng như

một chất làm tan huyết khối tiêm tĩnh mạch để ngăn ngừa bệnh tim mạch và được

đề cập trong danh sách mô hình các loại thuốc thiết yếu của Tổ chức Y tế Thế giới.

Nó hoạt động như một chất kích hoạt plasminogen tạo thành phức hợp tỷ lệ 1:1 với

plasmin, dẫn đến thủy phân cục máu đông [40].

Trước nhu cầu thu nhận nguồn enzyme thủy phân fibrin từ các chủng vi

sinh vật, trên thế giới cũng đã có rất nhiều nghiên cứu phân lập các chủng vi

khuẩn thuộc Bacillus sp. từ các nguồn khác nhau, đặc biệt là nguồn thực phẩm lên

men, trong đó có các thực phẩm lên men từ đậu nành đã được chứng minh là

nguồn tiềm năng để phân lập các chủng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin

như Kim và cs [41], đã phân lập chủng B. amyloliquefaciens CH51 từ

19

Cheonggukjang (thức ăn lên men từ đậu nành của Hàn Quốc) có hoạt tính

nattokinase. Obeid và cs [42], đã thực hiện phân lập các chủng B. subtilis có khả

năng sản xuất nattokinase, mục đích sàng lọc các chủng Bacillus sp. phân lập được

có hoạt tính nattokinase tự nhiên cao. Năm 2019, Hu và cs [43] đã nghiên cứu đặc

tính mới và tinh sạch enzyme có khả năng thủy phân fibrin mạnh từ B. subtilis

DC27 được sàng lọc từ Douchi, một loại thực phẩm đậu nành lên men truyền

thống của Trung Quốc. Các chủng phân lập từ nguồn thực phẩm len men cơ bản

sinh tổng hợp ra enzyme có tính đặc hiệu cao và có hoạt tính thủy phân fibrin

mạnh, các chủng vi khuẩn phổ biến phân lập được là Bacillus sp.

Các loại enzyme thủy phân fibrin thu nhận được từ nhiều nguồn vi khuẩn

khác nhau trong tự nhiên như: trong thực phẩm [44], [45, 46], trong đất [47], trong

nước [48-50]. Trong đó, đa phẩn chủ yếu các chủng vi khuẩn được phân lập từ

nguồn thực phẩm lên men (Hình 1.2).

Hình 1.2. Nguồn phân lập vi khuẩn sinh enzyme thủy phân fibrin [51]

Các chủng vi khuẩn được phân lập từ các nguồn thực phẩm, đặc biệt là

nguồn thực phẩm lên men đã được chứng minh là nguồn tiềm năng để phân lập các

chủng sinh tổng hợp enzyme tiêu sợi huyết [52], [36] và phần lớn được phân lập từ

thực phẩm lên men truyền thống [53], chúng được cho là nguồn rất giàu vi khuẩn

sản xuất enzyme thủy phân fibrin như Tempeh và Gembus ở Indonesia [54, 55];

Natto và Meju của Nhật Bản [45, 56]; Douchi [57] và Doufuru [58] ở Trung Quốc;

Chungkook-Jang [59], Kimchi [60] và Jeot-gal ở Hàn Quốc [61]; Thua nao [46] ở

Thái Lan. Ở Ấn Độ có BeKang, Hawijar, Kinema, Tungrymbai, Tungtoh, Aakhone,

Peruyaan, Bemerthu, Maseura, Idli, Dosa batters, Skipjack Shikara [62, 63]. Ở Việt

20

Nam có mắm tôm [64], nước tương, tương, chao [65], nem chua [66], chế phẩm

natto thương mại và một số loại thực phẩm lên men khác [67, 68]. Một số chủng vi

khuẩn được phân lập từ các nguồn thực phẩm có khả năng sinh tổng hợp enzyme

thủy phân fibrin được tổng hợp ở Bảng 1.1.

Bảng 1.1. Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin

được phân lập từ nguồn thực phẩm [29]

Nguồn phân lập Chủng vi khuẩn Gene mã hóa Tài liệu tham khảo

AprE34 [59] B. amyloliquefaciens RSB34 Doenjang, Hàn Quốc

Bacillus sp. DJ-4 Subtilin DJ-4 [69]

B. subtilis HK176 AprE176 [70]

B. subtilis HK176 M179 [70]

AprECB1 [71] B. amyloliquefaciens CB1 Cheonggukjang, Hàn Quốc AprE51 [72] B. amyloliquefancies CH51

B. subtilis CH-3 AprE2 [73]

CK [61]

Chungkook-Jang, Hàn Quốc Bacillus sp. strain CK 11-4

AprE5-41 [74] Meju, Hàn Quốc B. amyloliquefaciens MJ5-41

Kimchi, Hàn Quốc B. subtilis ZA400 BsfA [75]

Tempeh, Indonesia B. subtilis TP-6 TPase [76]

- [77] B. amyloliquefaciens Jxnuwx-1

B. subtilis DC27 DFE27 [78]

Douchi, Trung Quốc B. subtilis LD-8547 DFE [36]

[79] B. amyloliquefaciens DC-4 Subtilisin DFE

B. subtilis DC33 [80] Douchi, Trung Quốc Subtilisin FS33

- [81] Chickpeas, Trung Quốc B. amyloliquefaciens LSSE-62

CFR15 [82] Bột Dosa, Ấn Độ B. amyloliquefaciens MCC2606

21

Natto, Nhật Bản B. subtilis RJAS19 Nattokinase [83]

B. subtilis natto B-12 [84] B-12 nattokinase

B. amyloliquefaciens - [65] Sản phẩm bột đậu nành lên men, Việt Nam

KSK-II [85] Kishk, Ai Cập Lactobacillus plantarum KSK-II

Mắm tôm lên men Châu Á Bacillus sp. nov. SK006 - [86]

Từ Bảng 1.1 cho thấy, các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme thủy

phân fibrin phân lập từ các nguồn thực phẩm lên men chiếm đa số là Bacillus sp.

Trong đó, có vi khuẩn B. amyloliquefaciens được xem là nguồn tiềm năng để sản

xuất enzyme thủy phân fibrin ứng dụng trong cuộc sống [39].

Các enzyme thủy phân fibrin có nhiều ưu điểm trong việc hỗ trợ điều trị

một số bệnh liên quan đến huyết khối, là một trong những bệnh phổ biến hiện nay.

Tuy nhiên, ở Việt Nam các enzyme thủy phân fibrin chưa thực sự được quan tâm,

thu nhận từ các chủng vi khuẩn bản địa có trong các nguồn thực phẩm lên men

truyền thống để hướng tới ứng dụng. Vì vậy, để góp phần đa dạng hóa các chủng vi

khuẩn bản địa có khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân fibrin, tác giả đề

xuất hướng nghiên cứu phân lập các chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens từ sản

phẩm đậu tương lên men thủ công được thu thập ở một số tỉnh miền Bắc và miền

Trung Việt Nam.

1.2. GIỚI THIỆU VỀ Bacillus sp.

1.2.1. Đặc điểm của Bacillus sp.

Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus sp. được phân loại thuộc: Giới:

Bacteria – Ngành: Firrmicutes – Lớp: Bacilli – Bộ: Bacillales – Họ: Bacillaceae –

Chi: Bacillus [87].

Chi Bacillus là một chi lớn và là trực khuẩn Gram dương, kích thước (2 - 3

× 0,7 - 0,8 µm), có khả năng sinh nội bào tử ở trung tâm, bào tử có kích thước (1,5

- 1,8 × 0,8 µm)., Bacillus hình thành bào tử khi môi trường biến đổi đột ngột, cũng

như có thể tồn tại trong thời gian dài dưới những điều kiện bất lợi, khan hiếm chất

dinh dưỡng. Hầu hết các loài thuộc Bacillus đều có khả năng sinh nội bào tử hiếu

khí, chúng được phân lập dễ dàng từ đất, nước hoặc không khí. Khi xử lý mẫu bằng

22

nhiệt độ (50 - 80oC, trong 10 - 30 phút), các tế bào sinh dưỡng thường bị nhiệt độ

phá hủy trong khi nhiều bào tử còn sống sót. Bacillus cũng có thể phản ứng với sự

thiếu dinh dưỡng bằng cách di chuyển cơ thể từ các điều kiện nghèo dinh dưỡng

đến nơi tốt hơn nhờ vào các lông roi hoặc tạo bào tử để tồn tại.

Bacillus sp. là những vi sinh vật hóa dị dưỡng có khả năng sử dụng một số

hợp chất hữu cơ đơn giản như đường, amino acid, acid hữu cơ, dưới điều kiện sinh

trưởng tối ưu Bacillus sp. có thời gian thế hệ khoảng 25 phút. Điều này đem lại lợi

thế của loại vi khuẩn này trong ứng dụng sản xuất công nghiệp [14]

Bacillus sp. gồm có nhiều loài phổ biến hiện nay gồm có B. subtilis, B.

amyloliquefaciens, B. licheniformic, B. cereus,… trong đó có chủng B. subtilis và B.

amyloliquefaciens được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều [88].

1.2.1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được nhà khoa học Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên

năm 1872. Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều

trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên

thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng.

Đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn,

bắt màu tím Gram (+), kích thước (3-5) x 0,6 m, các tế bào thường xếp thành cặp

hoặc chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn

bào ít khi kết chuỗi sợi. Khuẩn lạc khô, màu xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn

hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít,

bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí

tùy nghi, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, nồng độ muối rộng, tồn tại được trong điều

kiện bất lợi một thời gian dài. Trong điều kiện bất lợi chúng có thể tạo thành bào tử,

bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu dục, kích

thước 0,6m - 0,9m. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần

tâm nhưng không chính tâm.

Bacillus subtilis là loài vi khuẩn chiếm ưu thế trong quá trình lên men vi

sinh vật. Nhất là trong quá trình lên men sản xuất các enzyme [89], với sự phát triển

nhanh chóng của chúng và dễ dàng điều khiển chúng để tạo ra các enzyme mới có

tính chất thay đổi. Vi khuẩn Bacillus subtilis có những đặc tính tiêu biểu là không

23

gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và

các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, axit amin,

subtilisin, nattokinase [90].

1.2.1.2. Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

B.amyloliquefaciens được phát hiện đầu tiên vào năm 1943 bởi nhà khoa

học Nhật Bản tên Juichiro Fukumoto lần đầu tiên phân lập được vi khuẩn B.

amyloliquefaciens từ đất [91], sau đó được tìm thấy khắp nơi bao gồm đất, thực vật,

thức ăn, phân động vật và môi trường nước. Bacillus amyloliquefaciens là một loài

thuộc chi Bacillus, có liên quan về mặt di truyền và kiểu hình với B. subtilis,

Bacillus vallismortis, Bacillus mojavensis, Bacillus atrophaeus, Bacillus

methylotrophicus, Bacillus siamensis, Bacillus velezensis, Bacillus licheniformis và

Bacillus pumilus [49, 92].

B. amyloliquefaciens phân bố khắp nơi, là vi khuẩn gram dương, tế bào là

trực khuẩn hình que (Hình 1.3), là vi khuẩn hiếu khí, không gây bệnh và hình thành

nội bào tử. Các tế bào thường tạo thành chuỗi và có khả năng di động, với tiên mao

mọc quanh thân, các bào tử hình bầu dục (0,6 - 0,8 x 1,0 - 1,4 pm) nằm ở trung tâm

hoặc cạnh trung tâm tế bào, bào tử không phình to. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển

từ 30 đến 40°C, vi khuẩn không tăng trưởng ở dưới 15°C hoặc trên 50°C. Sự tăng

trưởng xảy ra khi có 5% NaCl và hầu hết các chủng chịu được 10% NaCl. Loài vi

khuẩn này đóng vai trò quan trọng như một nguồn sản xuất α-amylase và protease

cho các ứng dụng công nghiệp. Phạm vi pH cho sự tăng trưởng được tìm thấy từ

pH 4,5 đến 9,5 hoặc 10,0 [91].

24

Hình 1.3. Hình ảnh tế bào Bacillus amyloliquefaciens SEM [206]

Vi khuẩn B. amyloliquefaciens thuộc nhóm Bacillus sp. là những vi sinh

vật hóa dị dưỡng có khả năng sử dụng một số hợp chất hữu cơ đơn giản như

đường, amino acid, acid hữu cơ, dưới điều kiện sinh trưởng tối ưu Bacillus sp. có

thời gian thế hệ khoảng 25 phút. Điều này đem lại lợi thế của loại vi khuẩn này

trong ứng dụng sản xuất công nghiệp [93].

B. amyloliquefaciens cũng là một loại vi khuẩn tiềm năng trong quá trình

tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm peptide và exopolysacarit. Vi

khuẩn này còn có khả năng thủy phân các hợp chất phức tạp bao gồm protein

không hòa tan, carbohydrate, chất xơ, hemicellulose và lignans. Vi khuẩn B.

amyloliquefaciens cũng là một loại vi khuẩn đa chức năng, có tiềm năng ứng dụng

trong công nghiệp thực phẩm và chế biến thực phẩm chức năng [94]. Trong sản

xuất an toàn và độc hại, Bacillus amyloliquefaciens được coi là vi khuẩn sản xuất

an toàn và không độc hại. Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

(FDA) coi nó là an toàn cho các mục đích thực phẩm và dược phẩm [95].

Trong số các loài trực khuẩn, Bacillus amyloliquefaciens cũng nhận được

nhiều sự quan tâm nghiên cứu và có ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, dược

phẩm, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp môi trường [96].

1.2.2. Nghiên cứu thu nhận các enzyme thủy phân fibrin được sinh

tổng hợp từ Bacillus sp.

Bacillus sp. là vi khuẩn chiếm ưu thế trong quá trình lên men vi sinh vật,

nhất là trong quá trình lên men sản xuất các enzyme [93], với sự phát triển nhanh và

dễ điều khiển, Bacillus sp. có khả năng tiết ra số lượng lớn enzyme ngoại bào nên

chúng đã được đưa vào nhóm sản xuất enzyme công nghiệp quan trọng nhất ứng

dụng trong thực tiễn [93].

Trong nghiên cứu thu nhận các enzyme thủy phân fibrin được sinh tổng hợp

từ Bacillus sp. và được phân lập từ các nguồn cơ chất đậu nành thì 2 chủng vi khuẩn

B. subtilis và B. amyloliquefaciens chiếm ưu thế trong các nghiên cứu đã được công

bố như Kim và cs [61] đã thu nhận enzyme thủy phân fibrin từ chủng Bacillus sp

CK11-4 được phân lập từ Chungkook-jang, Wang và cs đã thu nhận enzyme thủy

phân fibrin từ chủng Bacillus subtilis DC33 [80] được phân lập từ Douchi Trung

25

Quốc, Chen và cs [58] đã thu nhận enzyme thủy phân fibrin từ chủng Bacillus

subtilis FR-33 được phân lập từ Doufuru Trung Quốc, Hu và cs [78] đã thu nhận

enzyme thủy phân fibrin từ chủng Bacillus subtilis DC27 được phân lập từ Douchi

(thực phẩm lên men truyền thống từ đầu nành của Trung Quốc), Sharma và cs [97]

đã nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân fibrin từ Bacillus subtilis được phân lập

từ đậu nành lên men, Yao và cs [60] đã nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân

fibrin có hoạt tính mạnh từ 2 chủng Bacillus được phân lập từ Kimchi, Peng và cs

đã phân lập B. amyloliquefaciens từ sản phẩm Douchi (thực phẩm lên men của

Trung Quốc) có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin sau đó tinh sạch

và thu nhận [98]. Kim và cs đã nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân fibrin từ

chủng B. amyloliquefaciens CH51 (phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống

Cheonggukjang của Hàn Quốc) [41]. Jo và cs đã nghiên cứu thu nhận enzyme thủy

phân fibrin từ chủng B. amyloliquefaciens MJ5-41 (phân lập từ thực phẩm lên men

truyền thống Meju của Hàn Quốc) [56]. Wei và cs cũng đã nghiên cứu thu nhận

enzyme thủy phân fibrin từ B. amyloliquefaciens LSSE-62 (phân lập từ sản phẩm

đậu lên men của Trung Quốc). Huy và cs đã nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân

fibrin từ chủng B. amyloliquefaciens được phân lập từ thực phẩm lên men của Việt

Nam [65]. Yao và cs đã nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân fibrin từ B.

amyloliquefaciens RSB34 được phân lập từ Doenjang của Hàn Quốc [59]. Yogesh

và cs đã nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân fibrin từ chủng B.

amyloliquefaciens MCC2606, phân lập từ Dosa (thực phẩm lên men của Ấn Độ)

[9]. Yang và cs đã nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân fibrin từ B.

amyloliquefaciens Jxnuwx-1 được phân lập từ thực phẩm lên men Douchi của

Trung Quốc [99].

Mặc dù enzyme thủy phân fibrin đầu tiên được phát hiện từ những năm 1987

bởi nhà khoa học Nhật Bản [1], đó là nattokinase được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn B.

subtilis trên nguồn cơ chất đậu nành lên men truyền thống của Nhật Bản thì đến nay

các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực tìm kiếm đa dạng chủng sản xuất enzyme cho hoạt

độ cao từ các nguồn phân lập khác nhau, nhất là ở các nước khu vực Châu Á [39],

[100], [57]. Điều này cho thấy, vấn đề thu thập và tạo nguồn chủng vi khuẩn có khả

năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin vẫn đang được quan tâm và mở rộng. Ở

26

Việt Nam, vẫn đề tìm kiếm thu nhận và cải thiện các chủng vi khuẩn có khả năng

sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bằng các phương pháp đơn giản như đột biến

UV hoặc hóa chất vẫn chưa được quan tâm khai thác sử dụng để thu nhận nguồn

enzyme tiềm năng này.

1.3. NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY

PHÂN FIBRIN BẰNG ĐỘT BIẾN

Đột biến là sự thay đổi di truyền đột ngột trong kiểu hình của một cá nhân.

Trong thuật ngữ phân tử, đột biến được định nghĩa là sự thay đổi vĩnh viễn và tương

đối hiếm về số lượng hoặc trình tự các nucleotide. Các tác nhân gây đột biến thường

đề cập đến là tác nhân vật lý hoặc hóa học.

Vi khuẩn đóng vai trò là nguồn sản xuất enzyme thủy phân fibrin thích hợp

vì sự phát triển nhanh chóng của chúng, có thể nuôi cấy trong không gian hạn chế và

dễ dàng điều khiển chúng để tạo enzyme. Tuy nhiên, các chủng dại thường tạo ra

lượng enzyme ứng dụng trong sản xuất không được hiệu quả. Để nâng cao khả năng

thu nhận enzyme của chủng, mang lại hiệu quả kinh tế, có thể cải thiện khả năng sinh

tổng hợp enzyme của chủng bằng cách sử dụng tác nhân đột biến theo các phương

pháp sinh học, lý học, hóa học hoặc áp dụng các kỹ thuật hoặc quy trình đặc biệt để

phát hiện các đột biến hữu ích tạo chủng có khả năng siêu tổng hợp enzyme.

Sự phát triển của công nghệ gen trong thời gian gần đây đã mở ra rất nhiều

triển vọng trong sản xuất protein tái tổ hợp nói chung và enzyme thủy phân fibrin

tái tổ hợp nói riêng. Hiện nay, enzyme thủy phân tái tổ hợp được quan tâm tập trung

vào việc nâng cao năng suất thu nhận enzyme. Để đạt được các mục tiêu này, gen

aprN mã hóa nattokinase đã được biểu hiện trong nhiều loại vật chủ khác nhau bao

gồm E. coli, B. subtilis, B. licheniformis và Lactococcus lactis [101]. Wu và cs

[102] đã tối ưu hóa promoter khi biểu hiện trên B. subtilis cho hoạt độ enzyme

nattokinase tăng 1,26 lần. Wei và cs [103] đã loại bỏ các gen mã hóa protease, tối

ưu peptid dẫn đường biểu hiện trên B. licheniformis BL10 cho hoạt độ enzyme

nattokinase tăng 39%. Cai và cs [101] đã Tối ưu hóa peptid dẫn đường, tăng sự biểu

hiện của peptidase I Sip V biểu hiện trên B. licheniformis cho hoạt độ enzyme

nattokinase tăng 4,2 lần. Yongjun và cs [104] đã xáo trộn DNA biểu hiện trên B.

subtilis natto cho hoạt độ enzyme nattokinase tăng 2,3 lần, Nguyễn Thị Anh Thư và

27

cs [105] đã nghiên cứu biểu hiện gen NAT05 mã hóa nattokinase trong B. subtilis

BD170, kết quả biều hiện mạnh gấp 9,5 lần so với đối chứng, ở nồng độ IPTG 2

mM, nat05 sinh hàm lượng nattokinase tăng 10 lần so với đối chứng. Các nghiên

cứu về nattokinase tái tổ hợp đã nhận được kết quả khả quan và có triển vọng ứng

dụng trong sản xuất công nghiệp.

Tuy nhiên, đến nay cũng có nhiều nghiên cứu sử dụng các tác nhân đột biến

vật lý và hóa học cho hiệu quả đáng kể trong cải thiện hoạt tính enzyme của chủng

ban đầu, các nghiên cứu đã chứng minh tầm quan trọng và hiệu quả đem lại khi áp

dụng để cải thiện năng suất của các chủng vi khuẩn trong sản xuất các enzyme công

nghiệp quan trọng khác nhau như protease và lipase [106]. Đối với các enzyme thủy

phân fibrin cũng đã có nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được thực hiện để

cải thiện thu nhận enzyme của chủng, trong đó có phương pháp nâng cao khả năng

sinh tổng hợp enzyme của chủng bằng đột biến sử dụng các tác nhân vật lý và hóa

học. Tác nhân đột biến vật lý được dùng phổ biến là tia UV [107], [108], [109],

[110], tác nhân đột biến hóa học là EMS, EtBr, NTG [111]. Các chủng dại có khả

năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin thấp, chưa đáp ứng được cho sản xuất

thương mại. Vì vậy, các nghiên cứu sử dụng tác nhân đột biến để nâng cao khả năng

sinh tổng hợp enzyme của các chủng vi sinh vật như tác nhân gây đột biến vật lý

(UV) và hóa học (EMS, EtBr,…) đã được sử dụng để cải thiện năng suất của các

chủng vi khuẩn trong sản xuất các enzyme như Raju và cs [112] ở Ấn Độ đã nghiên

cứu cải thiện chủng Bacillus cereus GD 55 bằng tia UV, ethyl methane sulfonate

(EMS) và ethidium bromide (EtBr) để tăng cường sản xuất protease thủy phân

fibrin, các thể đột biến cho hoạt độ enzyme tăng 2-4 lần [113]. Chandrasekaran và

cs [114] đã nghiên cứu cải thiện chủng P. aeruginosa CMSS bằng đột biến UV, kết

quả hoạt tính nattokinase của chủng đột biến tăng gấp hai lần so với chủng hoang

dại. Soliman và cs [106] ở Ai Cập đã nghiên cứu nâng cao sản xuất protease của một

số chủng Bacillus spp. phân lập bằng phương pháp đột biến, chủng được đột biến

bằng cách chiếu tia UV và ethidium bromide cho năng suất gấp hai đến ba lần so với

chủng ban đầu. Thakur và cs [115] đã đột biến chủng Bacillus sp. APR-4 để tăng sản

xuất protease bằng đột biến kết hợp chiếu tia UV và hóa chất, kết quả hoạt tính

enzyme tăng gấp 1,24 lần so với chủng ban đầu. Gopinath và cs [116] đã sử dụng tia

28

UV và hóa chất để đột biến chủng cho tăng khả năng thu nhận enzyme 1,24 lần. Wu

và cs [117] đã đột biến chủng Bacillus subtilis bằng tia UV, hoạtđộ enzyme tăng

30,48% so với chủng ban đầu. Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy, khả năng

cải thiện hoạt độ enzyme bằng đột biến UV và các tác nhân hóa học cũng đã đem lại

hiệu quả đáng kể, phương pháp đơn giải, dễ thực hiện. Vì vậy, để nâng cao khả năng

tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng bằng đột biến, trong phạm vi luận án sử

dụng tác nhân đột biến vật lý là tia UV và tác nhân đột biến hóa học là EMS và EtBr.

1.3.1. Phương pháp gây đột biến bằng UV

1.3.1.1. Cơ chế gây đột biến UV

Tia UV là bức xạ không ion hóa, được tạo ra từ đèn hoặc ống hơi thủy

ngân, tia UV cũng có mặt trong bức xạ mặt trời. Tia UV có thể xuyên qua một hoặc

hai lớp tế bào. Do khả năng thâm nhập thấp, tia UV thường được sử dụng để bức xạ

các vi sinh vật như vi khuẩn và vi rút [109, 118, 119].

Tia UV có hai tác dụng hóa học chính đối với pyrimidine: tác dụng đầu tiên

là việc bổ sung một phân tử nước làm suy yếu liên kết -H ở purine và cho phép

phân tách cục bộ các chuỗi DNA. Tác dụng thứ hai hình thành liên kết giữa các gốc

pyrimidine liền kề (thường được gọi là chất làm giảm thymine) trong cùng một sợi

polynucleotide và được gọi là pyrimidine dimer [120].

Khi chiếu tia UV có thể dẫn đến sự hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa

các pyrimidine dimer, các liên kết này làm biến dạng cấu trúc DNA, ức chế quá

trình sao chép và phiên mã DNA, gây đột biến [121].

1.3.1.2. Nghiên cứu đột biến UV nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme

thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn

Nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi

khuẩn bằng đột biến UV được cho là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện. Đến nay

đã có nhiều nghiên cứu được công bố và đem lại hiệu quả đáng kể trong việc cải

thiện nâng cao hoạt tính enzyme của các chủng dại như Sher và cs đã nghiên cứu

nâng cao khả năng thu nhận enzyme protease từ chủng Bacillus subtilis bằng đột

biến UV, với thời gian chiếu trong thời gian từ 5 - 25 phút, kết quả sau 10 phút

chiếu UV chủng đột biến thu được cho hoạt độ enzyme đạt 455,25 ± 1,76 U/ml,

tăng gần 2 lần so với chủng gốc (235,23 ± 1,86 U/ml) [107]. Raju và cs đã sử dụng

29

tia UV để nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ chủng

Bacillus cereus GD 55, mật độ tế bào của dịch huyền phù đạt khoảng 1x107 tế

bào/ml, đèn UV (15W, 2537 Ao) chiếu ở khoảng cách 30 cm, thời gian chiếu từ 30 -

90 phút, ở thời gian chiếu 70 phút chủng đột biến cho hoạt tính enzyme đạt cao nhất

14,60 ± 1,15 U/ml/min, tăng gần 2 lần so với chủng gốc [113]. Mohanasrinivasan

và cs đã nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của

chủng Staphylococcus aureus VITSDVM7 bằng đột biến UV, ở bước sóng 254 nm,

thời gian chiếu từ 5 - 30 phút và ở thời gian chiếu 20 phút, chủng đột biến cho

đường kính thủy phân cơ chất casein tăng 1,36 lần so với chủng gốc [122]. Thakur

và cs đã nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng

Bacillus sp. APR-4 bằng đèn UV, mật độ tế bào của dịch huyền phù là 1x107 tế

bào/ml, thời gian chiếu từ 0 - 150 phút cho hoạt tính enzyme cao nhất đạt 2599 ±

2,6U/ml sau thời gian chiếu 150 phút (chủng ban đầu 2578 ± 0,1 U/ml), tăng 1,01

lần [115]. Mohsin và cs đã sử dụng đèn UV (365nm) để đột biến nâng cao hoạt độ

enzyme protease của chủng Bacillus subtilis trong thời gian từ 30 -120 phút, với

khoảng thời gian 30 phút, kết quả sau thời gian chiếu 90 phút hoạt độ enzyme cao

nhất đạt 90 U/ml tăng 1,14 lần so với chủng gốc (79 U/ml) [108]. Demirkan và cs

đã nghiên cứu nâng cao hoạt độ enzyme protease thu nhận từ chủng Bacillus subtilis

E6-5 bằng đột biến UV (sử dụng đèn diệt khuẩn (30W, 254nm), ở các khoảng cách

5, 10 và 15 cm trong khoảng thời gian từ 1- 120 phút với dịch huyền phù tế bào xấp

xỉ 109-11 tế bào/ml, kết quả ở khoảng cách chiếu 15 cm trong 5 phút, hoạt độ

enzyme của chủng tăng 1,5 lần so với chủng ban đầu [123]. Baig và cs đã nghiên

cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng Bacillus

bằng đột biến UV bằng đèn UV (280nm), ở khoảng cách 20 cm, trong khoảng thời

gian chiếu từ 15 - 120 phút, với khoảng cách 15 phút, kết quả vòng thủy phân

casein của chủng (1,4 cm) tăng 2 lần so với chủng gốc (0,7cm) [110]. Gopinath và

cs đã nghiên cứu đột biến chủng Serratia marcescens bằng UV để tăng hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin, dịch hyền phù có OD = 1,0, chiếu tia UV (15W), ở

khoảng cách 5 cm, trong các khoảng thời gian từ 10 - 60 giây/10 giây và từ 5, 10,

20 và 30 phút, kết quả trong 40 giây chiếu chủng đột biến cho hoạt độ enzyme đạt

3234,9 EU/ml, tăng 1,17 lần so với chủng gốc (2770 EU/ml) [116],... Kết quả

30

nghiên cứu trên cho thấy, nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme của các chủng

vi khuẩn bằng phương pháp đột biến UV cũng đem lại hiệu quả đáng kể, hoạt độ

enzyme được cải thiện tăng từ 1,01 đến 2 lần so với chủng ban đầu.

1.3.2. Phương pháp gây đột biến bằng hóa chất

1.3.2.1. Cơ chế gây đột biến hóa chất EMS và EtBr

Nhiều tác nhân gây đột biến hóa học tạo thành các chất cộng với nucleotide

và do đó bắt cặp sai với các bazơ bổ sung trong khuôn mẫu, dẫn đến sự thay đổi của

các bazơ trong quá trình sao chép [124].

Đối với tác nhân EMS: EMS là một chất gây đột biến alkyl hóa đơn chức

năng, do sự hiện diện của nhóm ethyl (của EMS) có thể được chuyển đến các vị trí

nucleophilic khác nhau dẫn đến phá vỡ chuỗi đơn DNA hoặc làm hỏng các bazơ

dẫn đến thay đổi di truyền như đột biến chuyển tiếp, chèn hoặc xóa cặp bazơ [125].

EMS gây ra cả quá trình chuyển đổi từ GC sang AT và AT sang GC; tuy nhiên đột

biến GC thành AT xảy ra phổ biến hơn [126], [127]. Đột biến sử dụng EMS thường

dẫn đến số lượng đột biến điểm cao và ít sắp xếp lại nhiễm sắc thể (chèn và xóa)

[128]. Cơ chế gây đột biến EMS được thể hiện Hình 1.4.

Hình 1.4. Quá trình ethyl hóa do EMS tạo ra ở vị trí O-6 của guanine và vị trí O-4 của

31

thymine có thể dẫn đến sự bắt cặp sai trực tiếp với thymine và guanine, tương ứng [121]

Đối với tác nhân EtBr (Ethidium bromide): EtBr là thuộc nhóm tác nhân

đột biến gây ra sự hình thành dịch chuyển khung hình. EtBr là phân tử phẳng, có thể

tự trượt vào (xen kẽ) giữa các bazơ nitơ xếp chồng lên nhau ở lõi của chuỗi xoắn

kép DNA. Ở vị trí xen kẽ này, tác nhân có thể gây ra hiện tượng chèn hoặc xóa một

cặp nucleotide. Do sự chèn này, DNA trở nên căng hơn và kết quả là đột biến cấu

trúc xảy ra, làm ảnh hưởng đến sự sao chép DNA [121], [129].

1.3.2.2. Nghiên cứu đột biến hóa chất EMS và EtBr nâng cao khả năng sinh

tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn

Để nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các

chủng vi khuẩn ngoài tác nhân đột biến UV, cũng có nhiều nghiên cứu sử dụng tác

nhân đột biến hóa học (EMS và EtBr), phương pháp này cũng đơn giản, dễ thực

hiện và được chứng minh là chủng đột biến có độ ổn định cao hơn so với đột biến

UV, nhiều nghiên cứu được công bố và đem lại hiệu quả đáng kể trong việc cải

thiện nâng cao hoạt tính enzyme của các chủng dại như Raju và cs sử dụng hóa chất

EtBr và EMS để nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ

chủng Bacillus Cereus GD 55, ở dịch huyền phù tế bào 1x107 bào tử/ml, chủng

được đột biến lần lượt bằng hóa chất EtBr, EMS; EtBr và EMS kết hợp trong thời

gian từ 30 - 270 phút, kết quả cho thấy chủng đột biến EtBr sau đó đột biến bằng

EMS cho độ ổn định sau nhiều chu kỳ nuôi cấy, kết quả đột biến bằng hóa chất EtBr

cho hoạt độ cao nhất 14,72 ± 1,54 U/ml/min, EMS đạt 14,78 ± 0,67 U/ml/min, EMS

kết hợp EtBr đạt 14,92 ± 0,83 U/ml/min, tăng 2 lần so với chủng ban đầu (7,46

U/ml/min) [113]. Thakur và cs đã nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp

enzyme protease của chủng Bacillus sp. APR-4 bằng các hóa chất EMS, EMM,

EtBr và FU ở nồng độ từ 50 – 250 μg/ml trong các khoảng thời gian từ 0 - 150 phút,

kết quả sau 90 phút đối với EMS (ở nồng độ 200 μg/ml, cho hoạt độ enzyme cao

nhất đạt 2678 ± 1,5 U/ml), EtBr (ở nồng độ 100 μg/ml, cho hoạt độ enzyme cao

nhất đạt 1968 ± 3,5 U/ml), EMM (ở nồng độ 150 μg/ml, cho hoạt độ enzyme cao

nhất đạt 2432 ± 3,6 U/ml), FU (ở nồng độ 150 μg/ml, cho hoạt độ enzyme cao nhất

đạt 1481 ± 2,0 U/ml), khi kết hợp đột biến UV và hóa chất EMS ở nồng độ 200

μg/ml chủng đột biến cho hoạt độ enzyme cao nhất đạt 3209 ± 4,0 U/ml, tăng 1,24

32

lần (chủng ban đầu 2578 ± 0,1 U/ml) [115]. Latif và cs đã nghiên cứu nâng cao hoạt

độ enzyme protease của chủng Bacillus subtilis bằng đột biến EMS ở nồng độ 25,

50, 75 và 100 μg/ml trong khoảng thời gian 30, 60, 90 và 120 phút, kết quả hoạt độ

enzyme thu được cao nhất đạt 124,657 U/ml, tăng 1,57 lần so với chủng gốc

(79,611U/ml) [130]. Srivatsava và cs đã nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng

hợp enzyme nattokinase từ chủng Pseudomonas aeruginosa CMSS đã qua đột biến

UV tiếp tục cho đột biến với các hóa chất EMS, NTG, EtBr, NaN3 ở nồng độ 5mM,

kết quả chủng sau đột biến UV cho đột biến tiếp với EMS cho hoạt độ enzyme cao

hơn so với hóa chất còn lại [131]. Kübra Özdemir và cs đã nghiên cứu nâng cao

hoạt độ enzyme protease của chủng Bacillus subtilis E6-5 bằng đột biến hóa chất

EMS ở nồng độ từ 4 - 400 mg/ml trong khoảng thời gian từ 10 - 60 phút, dịch

huyền phù tế bào ở 108 CFU/ml, kết quả vòng thủy phân của enzyme (15 mm) tăng

1,9 lần so với chủng gốc (8 mm) [123]. Gopinath và cs đã nghiên cứu đột biến

chủng Serratia marcescens bằng EMS ở nồng độ từ 5 - 250 μg/ml trong khoảng

thời gian từ 5, 10, 30, 60, 90 và 120 phút, dịch huyền phù có OD = 1,0 để tăng hoạt

độ enzyme Serrapeptase, kết quả hoạt độ enzyme đạt 2797 EU/ml, tăng 1,01 lần so

với chủng gốc (2770 EU/ml), khi kết hợp đột biến UV và hóa chất EMS, hiệu quả

đột biến cao hơn hoạt độ enzyme đạt 3437,6 EU/ml, tăng 1,24 lần [116].

Từ kết quả trên cho thấy, các chủng đột biến bắng tác nhân hóa học EMS,

EtBr cho hoạt độ enzyme chủng tăng so với chủng gốc, khi kết hợp đột biến UV và

hóa chất chủng cho hoạt độ cao hơn và ổn định hơn. Phương pháp đột biến sử dụng

tác nhân UV và hóa chất đem lại hiệu quả đáng kể, cải thiện được hoạt tính enzyme.

Tuy nhiên, ở Việt Nam phương pháp đột biến sử dụng tia UV và hóa chất để cải

thiện hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn vẫn chưa thực sự được quan tâm,

chưa có công bố nào về nghiên cứu cải thiện hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của

các chủng phân lập được bằng phương pháp đột biến vật lý và hóa học.

1.4. NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY

PHÂN FIBRIN BẰNG TỐI ƯU MÔI TRƯỜNG LÊN MEN

Lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin được các tác giả và nhóm tác

giả tập trung giải quyết vấn đề nâng cao hoạt độ enzyme trên thành phần dinh

33

dưỡng môi trường thích hợp cho từng chủng vi khuẩn, thông qua khảo sát để lựa

chọn ra nguồn dinh dưỡng phù hợp cũng như hàm lượng của mỗi thành phần môi

trường, nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme của các chủng vi khuẩn.

1.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi

cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin

Các vi khuẩn có đặc điểm sinh trưởng khác nhau, nên nhu cầu sử dụng các

thành phần dinh dưỡng và điều kiện môi trường thích hợp để phát triển và sinh tổng

hợp enzyme thủy phân fibrin là khác nhau. Các thành phần dinh dưỡng trong môi

trường lên men có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin

của chủng như:

- Nguồn carbon: carbon là thành phần quan trọng và có ý nghĩa hàng đầu

trong sự sống của vi sinh vật, có nhiều nguồn carbon khác nhau như tinh bột,

glucose, mật rỉ đường, sucrose, glycerol, maltose,... để lựa chọn được nguồn carbon

thích hợp cho các chủng vi khuẩn tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân

fibrin, các nghiên cứu đã khảo sát, qua đó lựa chọn sử dụng nguồn carbon thích hợp

cho chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme như Liu và cs đã chỉ ra rằng nguồn

maltose cho hoạt độ enzyme nattokinase cao hơn nguồn glucose, sucrose, xylose và

glycerol [132]. Wang và cs [133]; Kwon và cs [134]; Tuấn và cs [135] đã nghiên

cứu cho thấy các chủng vi khuẩn Bacillus sp. khi sử dụng nguồn carbon là glucose

cho thu nhận enzyme thủy phân fibrin cao nhất. Trái ngược với kết quả nghiên cứu

trên Unrean và cs [136]; Cui và cs [137] cho thấy chủng vi khuẩn Bacillus sp. khi

sử dụng glycerol là nguồn carbon lại cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin tốt hơn.

Theo Xiao và cs [138] chủng B. amyloliquefaciens lại sử dụng maltose là nguồn

carbon trong lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin cho hoạt độ enzyme tốt

hơn. Đối với Vijayaraghavan và cs [139], [140] thì chủng Bacillus sp. sử dụng

sucrose làm nguồn carbon cho thu nhận enzyme thủy phân fibrin cho hoạt độ cao

hơn. Theo Smitha và cs [141] thì cho thấy chủng Bacillus sp được tối ưu khi sử

dụng fructose là nguồn carbon trong lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin cho

hoạt độ enzyme tốt hơn. Điều này cho thấy các nguồn carbon khác nhau có tác dụng

khác nhau lên các chủng vi khuẩn cho sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin.

- Nguồn nitơ: Trong hầu hết các vi sinh vật, nitrogen được chuyển hóa để tạo

34

ra axit amin, axit nucleic, protein và thành phần thành tế bào. Vì vây, nitrogen là

nguồn dinh dưỡng vô cùng quan trọng và cần thiết đối với quá trình sinh tổng hợp

enzyme thủy phân fibrin của các vi sinh vật. Có một số nghiên cứu cho thấy nguồn

nitrogen được lựa chọn là peptone sẽ tốt cho khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy

phân fibrin của chủng [135], [142]; [143], có nghiên cứu lại cho thấy nguồn nitrogen

là cao nấm men tốt cho khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng

[139], có nghiên cứu lại cho thấy dùng nguồn nitrogen là vỏ tôm tốt cho khả năng

sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng [131]. Điều này chứng tỏ các

chủng vi khuẩn có nhu cầu sử dụng nguồn nitrogen khác nhau sẽ cho khả năng sinh

tổng hợp enzyme khác nhau.

- Ion kim loại: Các enzyme khác nhau có ảnh hưởng bởi các ion kim loại

khác nhau, các ion kim loại hóa trị hai như Ca2+, Cu2+, Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+,…

được nghiên cứu bổ sung trong môi trường lên men nhằm tăng khả năng sinh tổng

hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng [144], và cho thấy việc bổ sung các ion Ca2+

và Mg2+ trên môi trường lên men có hiệu quả. Một số nghiên cứu đã công bố trước

đây cho thấy các ion kim loại Ca2+ và Mg2+ ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp

enzyme của chủng vi khuẩn [135], [145].

- pH và nhiệt độ: Đặc tính quan trọng của hầu hết các vi sinh vật là sự phụ

thuộc vào pH để phát triển tế bào và sinh tổng hợp enzyme. pH môi trường có ảnh

hưởng đến nhiều quá trình tổng hợp enzyme và vận chuyển các thành phần khác

qua màng tế bào, các chủng có độ pH tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme là khác

nhau [142].

Nhiệt độ cũng là một thông số quan trọng khác phải được kiểm soát của

vi sinh vật. Kiểm soát nhiệt độ trong lên men thu nhận enzyme được cho là quan

trọng để cho chủng vi khuẩn phát triển và tổng hợp enzyme. Ở dải nhiệt độ 30oC

- 40oC được cho là khoảng nhiệt độ thích hợp để sinh tổng hợp enzyme thủy

phân fibrin bởi Bacillus sp. [131], [146], [147].

1.4.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân

fibrin bằng tối ưu môi trường lên men

Việc tối ưu hóa môi trường lên men kết hợp với các kỹ thuật lên men đóng

một vai trò quan trọng trong việc tối đa hóa năng suất sản xuất các enzyme thủy

35

phân fibrin. Trong lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin, việc tối ưu các điều

kiện và thành phần môi trường lên men để tăng khả năng sinh tổng enzyme thủy

phân fibrin của các chủng vi khuẩn cũng đã được quan tâm nghiên cứu bởi nhiều tác

giả như Liu và cs [132], Chen và cs [148], Deepak và cs [145], Wang và cs [133],

Jau và cs [149], Prafulla và cs [150], Ponnuswamy và cs [151], Kapila và cs

[152],... Kết quả tối ưu cho thấy hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi

khuẩn tăng từ 1,5 đến 6,3 lần so với môi trường ban đầu chưa tối ưu. Cơ bản các kết

quả nghiên cứu tối ưu các thành phần môi trường lên men chủ yếu quan tâm đến

hàm đáp ứng là hoạt độ enzyme, còn đối với thành phần môi trường tối ưu cho hàm

đáp ứng là mật độ tế bào (OD) của các chủng vi khuẩn vẫn chưa được quan tâm cho

một số trường hợp cần tăng sinh khối tế bào để tăng sản phẩm enzyme ngoại bào.

Trong lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin từ nguồn vi sinh vật,

thành phần môi trường lên men có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh tổng hợp

enzyme. Phương pháp tối ưu truyền thống thực hiện tối ưu từng nhân tố (one-factor-

at-a-time) đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, mô hình này lại không xác định được

những tác động giữa các yếu tố trong môi trường, điều này có ý nghĩa khi lên men ở

quy mô lớn. Để khắc phục mặt hạn chế trong tối ưu đơn yếu tố năm 1946, Plackett

and Burman [153] đã thiết kế các thí nghiệm thống kê cung cấp một cách tiếp cận

hiệu quả hơn để tối ưu hóa nhiều hơn một yếu tố ở hai hay nhiều mức độ khác nhau.

Trong đó, phương pháp đáp ứng bề mặt là một mô hình thực nghiệm được sử dụng

để đánh giá mối quan hệ giữa một tập hợp của các yếu tố thử nghiệm, các thí

nghiệm được thiết kế và tối ưu trên các phần mềm đã được ứng dụng trong lên men

thu nhận enzyme bởi Bocchini và cs [154], Senthilkumar và cs [155]. Trong lên

men sản xuất enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn cũng đã được sử dụng bởi Liu và

cs [132], cho thấy việc sản xuất nattokinase từ chủng Bacillus natto NLSSE phụ

thuộc chủ yếu vào peptone đậu nành, cao nấm men, clorua canxi, môi trường sau tối

ưu cho hoạt tính nattokinase cao 1300 ± 30 U/ml, cao hơn 2 lần so với môi trường

ban đầu. Chen và cs [148], đã tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy Bacillus

subtilis WB700 gồm dịch thủy phân đậu nành, kali photphat và canxi clorua thu

nhận nattokinase tái tổ hợp tăng 1,5 lần so với môi trường trước tối ưu. Tuấn và cs

[135], đã tối ưu hóa thành phần môi trường lên men B. subtillis DB104 gồm pepton

36

đậu nành, MgSO4 và NaCl thu nhận nattokinase tái tổ hợp tăng 1,8 lần (152 FU/ml)

so với môi trường trước tối ưu (83 FU/ml). Deepak và cs [145], sau khi tối ưu hóa

thành phần môi trường lên men của chủng B. subtilis gồm glucose, peptone, CaCl2,

and MgSO4 cho nattokinase tăng gấp 2 lần so với mức ban đầu. Wang và cs [133],

đã tối ưu hóa thành phần môi trường lên men của chủng Bacillus natto gồm

glucose, KH2PO2 and MgSO4 cho hoạt độ enzyme nattokinase đạt cao nhất 12,34

FU/ml, cao hơn gấp 6 lần môi trường ban đầu. Jau và cs [149], đã tối ưu hóa thành

phần môi trường lên men Bacillus natto gồm MgSO4, K2HPO4 và cao nấm men cho

hoạt độ nattokinase đạt 13 ± 1 FU/ml, cao hơn 6 lần so với môi trường ban đầu.

Prafulla và cs [150], đã tối ưu hóa thành phần môi trường lên men Bacillus natto

NRRL 3666 gồm pH, cao nấm men, K2HPO4, and MgSO4 cho hoạt độ nattokinase

tăng 6,3 lần so với môi trường ban đầu. Agrebi và cs [156], đã tối ưu hóa thành

phần môi trường lên men B. subtilis A26 gồm cám lúa mì, casein peptone, CaCl2,

NaCl, MgSO4, và KH2PO4 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin tăng gấp 4,2 lần so

với môi trường ban đầu. Trần Quốc Tuấn và cs [157] đã nghiên cứu tối ưu thành

phần môi trường lên men chủng B. subtilis thu nhận nattokinase tái tổ hợp bằng

phương pháp đáp ứng bề mặt, kết quả hoạt độ nattokinase tối đa đạt được là 152

FU/ml, tăng 1,8 lần (83 FU/ml) môi trường ban đầu. Nguyễn Anh Tuấn và cs [135],

đã tối ưu hóa 6 thành phần môi trường lên men B. subtilis natto gồm glucose,

peptone đậu nành, K2HPO4, MgSO4, NaCl, CaCl2 cho hoạt độ enzyme nattokinase

cao nhất đạt 69,3 ± 0,2 FU/ml, tăng 2,9 lần môi trường ban đầu (23,583 ± 1,539

FU/ml). Huy và cs [158] đã nghiên cứu tối ưu môi trường bằng phương pháp đáp

ứng bề mặt RSM-CCD, kết quả hoạt độ nattokinase 136,6 FU/g. Kapila và cs [159]

đã tối ưu thành phần môi trường cho hoạt tính enzyme thủy phân fibrin tăng 1,5 lần

so với môi trường ban đầu.

Từ các kết quả trên cho thấy, đối với các chủng vi khuẩn khác nhau với các

thành phần môi trường lên men ban đầu khác nhau sẽ cho kết quả tối ưu hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin là khác nhau, nó có thể tăng từ 1,5 đến 6,3 lần so với hoạt

độ enzyme ban đầu trên thành phần môi trường chưa tối ưu. Bên cạnh đó, các kết

quả nghiên cứu tối ưu các thành phần môi trường lên men chủ yếu quan tâm đến

37

hàm đáp ứng là hoạt độ enzyme, còn đối với thành phần môi trường tối ưu cho hàm

đáp ứng là mật độ tế bào (OD) của các chủng vi khuẩn vẫn chưa được quan tâm cho

một số trường hợp cần tăng sinh khối tế bào để tăng sản phẩm enzyme ngoại bào.

Vì vậy, để nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của

chủng, bên cạnh sự khảo sát các điều kiện nuôi cấy, nguồn dinh dưỡng thích hợp

cần lựa chọn sử dụng phương pháp để tối ưu các thành phần môi trường nâng cao

khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng.

1.5. KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN

1.5.1. Lên men theo mẻ

Lên men theo mẻ là phương pháp lên men mà trong suốt thời gian lên men

ta không thêm vào chất dinh dưỡng và cũng không loại bỏ các sản phẩm cuối cùng

của quá trình trao đổi chất, ngoại trừ oxi (trong trường hợp vi sinh vật hiếu khí),

chất chống tạo bọt và axit hoặc bazơ để kiểm soát độ pH. Thành phần của môi

trường nuôi cấy, nồng độ sinh khối và nồng độ chất chuyển hóa nói chung thay đổi

liên tục do kết quả của quá trình trao đổi chất của tế bào.

Trong lên men thu nhận enzyme phủy phân fibrin, các thành phần môi

trường lên men là các chất dinh dưỡng như: glucose, K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaCl,

CaCl2, peptone, hoặc bột đậu tương, cao nấm men. Trước đó, Saxena và cs đã lên

men thu nhận nattokinase từ chủng Bacillus sp. trong 24h ở 37oC, với thành phần

môi trường (wt/v): glucose 10,0%, bột đậu tương 10,0%, K2HPO4 5,0%,

MgSO4.7H2O 0,5%, NaCl 0,5% và CaCl2 0,5% cho hoạt độ enzyme đạt 330 U/ml.

Zhou và cs lên men thu nhận nattokinase với thành phần môi trường (wt/v): bột đậu

tương 6%, dextrose 2%, CaCl2 0,06%, MgSO4 0,07% trong 48h ở 38oC cho hoạt độ

enyzme đạt 306,46 IU/ml. Đỗ Thị Hoàng Tuyến và cs [68] đã lên men thu nhận

nattokinase sử dụng thành phần môi trường lên men (g/l): cao thịt 5 g/l, peptone đậu

nành 10 g/l, NaCl 5 g/l cho hoạt độ nattokinase đạt 8,6 FU/ml.

Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy, trong lên men theo mẻ hiệu quả thu nhận

enzyme chưa cao. Để khắc phục và nâng cao hiệu quả trong quá trình lên men theo mẻ

và tiết kiệm được chi phí, nhiều nghiên cứu lựa chọn lên men theo mẻ bổ sung cơ chất

38

để tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng.

1.5.2. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất

Trên cơ sở các thành phần môi trường lên men đã được tối ưu, việc lên men

bổ sung cơ chất có kiểm soát là một trong những phương pháp cần thiết để tăng

năng suất và sản phẩm đích. Đã có nhiều nghiên cứu về lên men theo mẻ có bổ sung

cơ chất với các phương pháp bổ sung cơ chất khác nhau như bổ sung theo theo tín

hiệu pH (pH-stat) hoặc tín hiệu pO2 (DO-stat), hoặc bổ sung cơ chất được xác định

trước (theo cấp số nhân), hoặc bổ sung cơ chất theo nhu cầu,...

Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất là hình thức trung gian giữa lên men theo

mẻ và lên men liên tục, trong đó nguyên liệu được nạp vào thiết bi lên men liên tục

hoặc gián đoạn, sản phẩm chỉ được lấy ra khi quá trình kết thúc (dịch lên men cũng

có thể được chiết ra trong quá trình vận hành). Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất

vừa nâng cao được hiệu quả thu nhận enzyme, lại giúp giảm được chi phí trong quá

trình sản xuất.

Vì vậy, để tăng khả năng thu nhận enzyme thủy phân fibrin của chủng vi khuẩn,

việc lên men sử dụng kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất được cho là đem

lại hiệu quả cao hơn và nó cũng đã được thực hiện trước đó như: Cho và cs [160] đã

nghiên cứu sản xuất nattokinase từ chủng B. subtilis bằng lên men theo mẻ bổ sung

cơ chất là hỗn hợp glucose và peptone theo pH-stat để tăng hoạt độ enzyme

nattokinase, kết quả cho hoạt độ enzyme tăng 2,1 lần so với lên men theo mẻ. Kwon

và cs [134] cũng đã nghiên cứu sản xuất nattokinase từ chủng B. subtilis bằng lên

men theo mẻ bổ sung cơ chất glucose/peptone theo pH-stat trên thiết bị lên men 5L

và kết quả hoạt độ enzyme cao nhất đạt 14.500 unit/ml, tăng 4,3 lần so với lên men

theo mẻ. Unrean và cs [136] đã sử dụng kỹ thuật lên men theo mẻ bổ sung cơ chất

là glycerol theo tín hiệu pO2 đối với chủng B. subtilis để nâng cao khả năng tổng

hợp enzyme nattokinase. Nguyễn Lan Hương và cs [161] đã nghiên cứu nâng cao

khả năng sinh tổng hợp nattokinase của chủng B. subtilis bằng phương pháp lên men

lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất, kết quả hoạt độ tăng từ 4 - 7 lần so với lên men

theo mẻ. Berenjian và cs [32] lên men theo mẻ bổ sung cơ chất glycerol (3%) trong

pha tế bào phát triển của chủng B. subtilis natto để tăng hoạt độ enzyme, kết quả hoạt

độ enzyme nattokinase tăng 1,12 lần (từ 587,14 U/m lên 654,84 U/ml). Năm 2020,

39

Poontawee và cs [162] sử dụng kỹ thuật lên men lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất

glycerol theo 2 giai đoạn để tăng sinh khối tế bào (tăng 1,27 lần) và sản phẩm lipit

(tăng 1,24 lần) so với lên men theo mẻ.

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, lên men theo mẻ bổ sung cơ chất

đã đem lại hiệu quả đáng kể trong trong lên men thu nhận enzyme của các chủng và

nó được sử dụng phần lớn trong lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin từ

nguồn vi khuẩn.

1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng trong lên men

Trong lên men, sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phụ

thuộc vào rất nhiều yếu tố như: chủng giống, thành phần môi trường dinh dưỡng

(nguồn carbon, nguồn nitrogen, các ion kim loại), điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt

độ, cấp khí), thời gian nuôi cấy.

- Đối với chủng giống: chủng giống sử dụng trong lên men phải có nguồn

gốc rõ ràng và được phân loại đến cấp chủng. Chủng giống cần phải đảm bảo giữ

được hoạt tính và không bị chết. Việc nhân giống để chuẩn bị cho lên men cũng rất

quan trọng, khi nhân giống, cần căn cứ vào thể tích thiết bị lên men, thể tích nhân

giống thường bằng 10% so với thể tích tổng (có thể từ 5 đến 20%). Nếu tỉ lệ cấp

quá nhỏ, vi sinh vật sẽ ít so với lượng dinh dưỡng quá lớn dẫn đến kéo dài thời

gian thích nghi của chủng, chủng không kịp tiêu thụ hết dinh dưỡng đã đến pha

suy vong, làm hiệu suất giảm. Khi tỉ lệ cấp quá cao, lượng dinh dưỡng trong môi

trường không đủ, chủng chưa kịp tạo sản phẩm môi trường đã hết dinh dưỡng. Vì

vậy, cần phải chú ý đến lượng nhân giống chuẩn bị cho lên men trong thiết bị sao

cho phù hợp và hiệu quả.

- Quá trình khuấy trộn: Việc khuấy trộn làm tăng tiếp xúc vi sinh vật với

dinh dưỡng và không khí, giảm tập trung cục bộ sản phẩm chính và sản phẩm

phụ trong quá trình lên men, làm ức chế việc sinh tổng hợp enzyme của các

chủng vi sinh vật. Tuy nhiên, nếu tốc độ khuấy trộn trong lên men quá cao, các tế

bào va đập mạnh có thể gây vỡ hoặc tổn thương, nếu khuấy trộn quá nhẹ, thì việc

cấp oxi và trộn đều dinh dưỡng lại kém. Vì vậy, cần phải chú ý và theo dõi các

thông số trong quá trình lên men để điều chỉnh tốc độ khuấy tăng hoặc giảm sao cho

40

phù hợp với từng chủng.

- Quá trình cấp khí: cấp khí rất quan trọng đối với các vi sinh vật, các chủng

hiếu khí thì cần nhiều oxi, các chủng kỵ khí cơ bản không cần oxi. Ngoài ra, quá

trình cấp khí nó cũng còn phụ thuộc vào lượng sinh khối được tạo thành trong quá

trình lên men, nếu lượng oxi hòa tan thấp trong môi trường lên men sẽ cản trở sự

phát triển của chủng vi sinh vật và quá trình tổng hợp enzyme, nếu lượng oxi hòa

tan quá mức sẽ dẫn đến ngộ độc oxi của vi khuẩn, điều này cũng không tốt cho quá

trình lên men của chủng. Do đó, cần điều chỉnh mức oxi thích hợp để quá trình lên

men thu nhận enzyme đạt hiệu quả tốt nhất.

- Chất phá bọt: bọt sinh ra trong quá trình lên men do khuấy trộn và sục khí,

khi bọt tạo ra lượng quá lớn có thể trào ra các đường ống và dễ dẫn đến bị nhiễm tạp,

bọt sinh ra nhiều cũng cản trở việc tiếp xúc của các tế bào vi sinh vật với môi trường

dinh dưỡng. Do đó cần tiến hành phá bọt trong quá trình lên men bằng cách sử dụng

những chất phá bọt (antifoam) đạt chuẩn quốc tế về an toàn cho sức khỏe. Một số

loại chất phá bọt thường được sử dụng là loại chất phá bọt hệ nhũ tương hoặc chất

phá bọt gốc silicone. Tuy nhiên, các chất phá bọt phải đảm bảo có khả năng nhanh

chóng phân tán bọt, không gây độc dược với vi sinh vật, có tác dụng kéo dài và chỉ cần

sử dụng với một lượng nhỏ là có tác dụng.

- pH môi trường: Mỗi vi sinh vật chỉ phát triển trong một điều kiện pH

nhất định, pH ảnh hưởng đến tỉ lệ các ion H+ và OH- trong môi trường, các ion

này ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt lực của các enzyme. Vì vậy, cần ổn định pH

trong quá trình lên men, để duy trì ổn định pH thường dùng các chất hệ đệm như

đệm phosphat, đệm amoni hoặc các chất kiềm nhẹ như CaCO3 để điều chỉnh pH

môi trường.

- Nhiệt độ lên men: Cũng giống như pH, các vi sinh vật cũng chỉ hoạt động

và sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ nhất định và nhiệt độ nó cũng ảnh hưởng đến

hoạt độ và độ bền của enzyme. Đặc biệt trong quá trình lên men, các quá trình như

khuấy trộn, sục khí hay sự hô hấp của vi sinh vật đều là quá trình tỏa nhiệt, làm thay

đổi nhiệt độ môi trường nuôi cấy. Do đó, cần được kiểm soát và điều chỉnh nhiệt độ

thích hợp.

Trong quá trình lên men cần thường xuyên lấy mẫu để kiểm tra các yếu tố ảnh

41

hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng phát triển của chủng như xác định pH môi

trường, hàm lượng dinh dưỡng, độ vô trùng, hàm lượng sản phẩm, trạng thái của vi

sinh vật. Từ đó, tiến hành các biện pháp giải quyết kịp thời và xác định được thời gian

thu sản phẩm thích hợp.

1.6. SẢN PHẨM ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN THƯƠNG MẠI

Các chế phẩm enzyme thủy phân fibrin được ứng dụng phổ biến ở dạng

thực phẩm chức năng đóng viên, dùng để uống phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh

liên quan đến huyết khối hoặc ứng dụng trong y dược điều trị bênh. Trong đó,

enzyme được ứng dụng ở dạng thực phẩm chức năng (chủ yếu sản phẩm enzyme

nattokinase) rất đa dạng. Các sản phẩm thương mại được sử dụng rộng rãi ở Nhật

Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Liên minh Châu Âu, Canada, Hoa Kỳ, Việt Nam như

một chất ngăn ngừa đông máu và cải thiện lưu thông máu. Dự đoán nhu cầu sản

phẩm enzyme thủy phân fibrin ngày càng tăng với hướng nghiên cứu ứng dụng sản

xuất thực phẩm chức năng hoặc trong y dược để hỗ trợ, phòng ngừa và điều trị các

bệnh liên quan đến huyết khối, tim mạch, giúp cải thiện sức khỏe tim mạch, hỗ trợ

phòng chống đột quỵ, giúp ngăn chặn hình thành và làm tan cục máu đông, giúp tăng

tuần hoàn máu, phòng ngừa tắc nghẽn mạch máu, hỗ trợ cải thiện di chứng và chống

tái phát cho bệnh nhân tai biến.

Hiện nay, trên thị trường Việt Nam đang lưu hành một số thực phẩm chức

năng có chứa enzyme thủy phân fibrin (chủ yếu là thành phần nattokinase) dưới dạng

viên nang và đa số nhập khẩu từ Nhật Bản, Mỹ và một số nước khác (Canada, Đức).

Các sản phẩm được tổng hợp ở Bảng 1.2.

Bảng 1.2. Một số sản phẩm enzyme thủy phân fibrin thương mại

TT Tên sản phẩm Nguồn gốc Hoạt độ enzyme Giá sản phẩm

1 Fine Japan Natto 1.568.000VND/ Nhật Bản 2.000 FU/ viên 300 viên Kinase

2 Mamori Nhật Bản 2.400 FU/ viên 680.000 VND Nattokinase

3 Orihiro Nhật Bản 2.000 FU/ viên 610.000 VND Nattokinase

42

4 Noguchi Nhật Bản 4.000 FU/ viên 1.000.000 VND Nattokinase

Premium

6 Kobayashi

Nattokinase Nhật Bản 2.000 FU/viên 495.000 VNĐ

EPA/DHA

7 Doctor's Best Mỹ 2.000 FU/ viên 81.000 VND

8 Olympian labs Mỹ 2.000 FU/ viên 650.000 VND

9 Horbaach 726.000 VND/15 Nattokinase Mỹ 4.000 FU/ viên 0 viên Supplement

418.000 VND/30 10 Vitaginus Canada 800 FU/ viên viên

11 Nattokinase Bio Bio Vaccine/ 600 FU/ viên 75.000/ 30 viên Vaccine Việt Nam

12 Nattokinase F ANZ Pharma/ 250.000 VND/ 5.000 FU/ viên Việt Nam 50 viên

13 Natto EZ- Viện Hàn Lâm/ 2.000 FU/g 390.000 VND/

Nattokinase Việt Nam (50mg) 60 viên

Từ Bảng 1.2. cho thấy, các sản phẩm lưu hành trên thị trường có giá thành

dao động khác nhau, các sản phẩm phụ thuộc vào nguồn gốc và hoạt độ enzyme có

trong sản phẩm cao hay thấp (từ 600 FU - 5.000 FU). Các chế phẩm của Việt Nam

giá thành còn cao, các nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân fibrin trong nước chưa

đáp ứng được nhu cầu thị trường. Do đó, các công ty dược phẩm trong nước phần lớn

phải nhập nguyên liệu enzyme thương mại từ các nước khác (chủ yếu là Nhật Bản).

Vì vậy, để đáp ứng được nhu cầu ứng dụng các chế phẩm enzyme thủy phân fibrin

trong cuộc sống cần phải nghiên cứu hơn nữa để tăng hiệu quả, chủ động được nguồn

43

nguyên liệu sản xuất và giảm giá thành sản phẩm cho người sử dụng.

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn Bacillus sp. phân lập từ sản phẩm tương được thu thập ở

8 tỉnh/thành phố như: Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên, Yên Bái, Phú Thọ, Bắc

Ninh, Nghệ An và Hà Nội.

Các mẫu tương được thu thập từ các hộ gia đình lên men thủ công, nhỏ lẻ

khác nhau, các mẫu được lấy ngẫu nhiên với lượng mẫu từ 300 - 500 ml, đựng trong

chai nhựa và được giữ ở nhiệt độ phòng.

Bảng 2.1. Tổng hợp địa điểm và số lượng các mẫu tương thu thập được

Số Số Địa điểm lấy mẫu (Xã, Địa điểm lấy mẫu (Xã, TT lượng TT lượng Huyện, Tỉnh/Thành phố Huyện, Tỉnh/Thành phố mẫu mẫu

1 Văn Giang/Hưng Yên 11 TP Vinh/Nghệ An 02 02

2 Khoái Châu/Hưng Yên 12 Diễn Châu/Nghệ An 01 01

3 Thị trấn Bần/HY 13 Thanh Trì/Hà Nội 01 02

4 Như Quỳnh/Hưng Yên 14 Đông Anh/Hà Nội 02 01

5 Bình Giang/Hải Dương 15 Sơn Tây/Hà nội 01 01

6 Kim Thành/Hải Dương 16 Hoài Đức/Hà Nội 02 02

7 Thủy Nguyên/Hải Phòng 17 Việt Trì/Phú Thọ 01 01

8 Lê Chân/Hải phòng 18 Thanh Ba/Phú Thọ 02 01

9 Nghĩa Lộ/Yên Bái 19 Từ Sơn/Bắc Ninh 01 02

10 Thành phố Yên Bái 20 Quế võ/Bắc Ninh 01 01

2.1.2. Hóa chất

Trong quá trình phân lập, lên men và phân tích kết quả cần sử dụng một số

44

hóa chất ở Bảng 2.2.

Bảng 2.2. Danh mục hóa chất

TT

Tên hóa chất

TT Tên hóa chất

Hãng

1 Peptone

20 CaCl2 Xilong/TQ

2 Cao nấm men

21 Methanol Merck/Đức

3 NaCl

22 Axit acetic Merck/Đức

4 MgSO4.7H2O

23 β-mercaptoethanol Sigma/Mỹ

5 Sữa gầy

24 Glucose Xilong/TQ

6 Agar

25 Tris-HCl Sigma/Mỹ

7 TCA

26 Acrylamid 40% Sigma/Mỹ

Hãng Himedia/ Ấn Độ Himedia/ Ấn Độ Xilong/Trung Quốc (TQ) Xilong/TQ Himedia/ Ấn Độ Bomei/TQ Duksan/ Hàn Quốc

Sodium Ammonium

8

dodecyl 27 Sigma/Mỹ Sigma/Mỹ persulfate sulfate

Coomassie brilliant

9 Temed

28 Sigma/Mỹ Sigma/Mỹ blue G-250

Fibrin bovine

10

29 Marker protein Biological/Mỹ blood BioBasic/ Canada

Bromophenol

11

30 EtBr blue Sigma Aldrich/ Đức Sigma Aldrich/ Đức

12 EMS

31 HCl Merck/Đức Xilong/TQ

13 NaOH

32 Saccharose Xilong/TQ Xilong/TQ

14 Glycerol

33 Tryptone Xilong/TQ Sigma

15 K2HPO4

34 Maltose Xilong/TQ

16 Cao thịt

35 MnCl2.4H2O Xilong/TQ

17 KH2PO4

36 ZnSO4.7H2O Xilong/TQ Himedia/ Ấn Độ Xilong/TQ Xilong/TQ

18 CuSO4.5H2O

37 FeSO4.7H2O

19 DNS

38 Bradford Xilong/TQ N/A/ Trung Quốc Xilong/TQ Bio Basic/ Canada

2.1.3. Thành phần môi trường

- Môi trường phân lập (LB): gồm peptone (10g/l), cao nấm men (5g/l),

NaCl (5g/l), pH=7,0 - 7,2 thanh trùng ở 121oC trong 20 phút, môi trường LB agar là

45

môi trường LB bổ sung thêm 1,5% (w/v) agar [146].

- Môi trường GY: glucose (10g/l), cao nấm men (50g/l), K2HPO4 (1g/l),

MgSO4 (0,5g/l), pH= 7,0 – 7,5 [150].

- Môi trường GYP có sửa đổi theo Thakur và cs (2017) [163]: glucose (10

g/l), cao nấm men (5 g/l), peptone (5 g/l), NaCl (5 g/l), MgSO4 (0,25 g/l), CaCl2

(0,5 g/l).

- Môi trường tạo bào tử Difco (DSM) [164]: Cao thịt (3 g/l), peptone (5 g/l),

10 % (w/v) KCl (10 ml), 1,2 % (w/v) MgSO4.7H2O (10 ml), NaOH 1M (~1,5 ml),

1M Ca(NO3)2 (1 ml), 0,01M MnCl2 (1 ml), 1mM FeSO4 (1 ml), pH 7,6.

- Môi trường định tính enzyme protease [106]: môi trường LB thạch có

chứa 1% sữa gầy, môi trường được khử trùng ở 110°C trong 20 phút và để nguội

trước khi sử dụng.

- Môi trường định tính enzyme amylase và cellulase: môi trường LB thạch

có chứa 1% tinh bột (đối với định tính enzyme amylase) và chứa 0,1% CMC

(carboxymethyl cellulase) cho định tính enzyme cellulase. Môi trường được khử

trùng ở 121°C trong 20 phút và để nguội trước khi sử dụng.

2.1.4. Thiết bị

Để phân lập và phân tích các kết quả thí nghiệm cần sử dụng các trang thiết

bị cần thiết ở Bảng 2.3 và một số dụng cụ khác.

Bảng 2.3. Danh mục các trang thiết bị chính

TT Thiết bị Hãng sản xuất, nước

Cân phân tích AUW220 Shimadzu, Nhật Bản 1

Cân kỹ thuật Farorius, Nhật Bản 2

Nồi khử trùng Tomy, Nhật Bản 3

Tủ cấy vô trùng JSR, Nhật Bản 4

Mettertoledo, Thụy Sỹ 5 Máy đo pH

Bể ổn nhiệt SB-20, Nhật Bản 6

Bio Shaker BR-43FL, Nhật Bản 7 Máy lắc ổn nhiệt

Tomy CAX-371, Nhật Bản 8 Máy ly tâm lạnh

Hệ thống điện di BioRat, Mỹ 9

Advance Tech, Anh 10 Bộ điện di DNA

46

BioRat, Mỹ 11 Máy soi chụp ảnh gel

BioRat, Mỹ 12 Máy PCR

Thiết bị lên men Sartorious, Đức 13

Tủ lạnh sâu -200C Sanyo, Nhật Bản 14

Thiết bị đo mật độ quang UV-vis DR2800, Nhật Bản 15

MD200, Nhật Bản 16 Máy khuấy từ

Tủ ấm JSR, Nhật Bản 17

VELP, Đức 18 Máy vortex

Tủ lạnh 4oC Panasonic, Nhật Bản 19

Tủ nuôi 37oC EYELA (LTI-601SD), Nhật Bản 20

Thiết bị đo UV-vis UV-1800 Shimadzu, Nhật Bản 21

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu Mẫu tương

Phân lập Bacillus sp.

Đột biến UV (5 lần)

EMS EtBr EtBr + EMS EtBr EMS

Dòng tế bào đột biến có hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao

Kiểm tra độ ổn định hoạt độ enzyme của chủng

Tối ưu môi trường và điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme

Lựa chọn kỹ thuật lên men thu nhận hoạt độ enzyme cao

47

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu

2.2.2. Phương pháp phân tích

2.2.2.1. Xác định hoạt độ enzyme

- Phương pháp định tính enzyme protease: phương pháp định tính enzyme

protease được xác định theo phương pháp của [165], có sửa đổi. Dịch lên men sau

khi đã được ly tâm tách sinh khối, hút 10 µl dịch nhỏ vào giếng đã được đục trên

đĩa thạch LB (1% sữa gầy), ủ tĩnh 37oC trong 4 - 6 h, đo đường kính vòng thủy phân

của mẫu.

- Phương pháp xác định hoạt độ enzyme thủy phân fibrin: Hoạt độ của

enzyme thủy phân fibrin được xác định theo phương pháp được mô tả bởi Lin và cs

[166] với một số sửa đổi như sau. Hỗn hợp phản ứng chứa 0,15 ml dung dịch fibrin

(4 g/l, pH 7,4), 0,42 ml dung dịch đệm Tris-HCl 0,1 M (chứa 0,01M CaCl2, pH 7,4)

và 30 μl enzyme thô ở độ pha loãng thích hợp được ủ ở 37oC trong 30 phút. Các

phản ứng enzyme được dừng lại bằng cách thêm 0,3 ml axit trichloroacetic 1,5M ủ

trong 20 phút. Mẫu kiểm chứng được chuẩn bị bằng cách bổ sung 0,3ml axit

trichloroacetic 1,5M vào hỗn hợp phản ứng trước khi thêm 30 µl dịch enzyme thô

vào với điều kiện phản ứng tương tự như mẫu thí nghiệm, hỗn hợp phản ứng sau đó

ly tâm 10.000 vòng/10 phút ở 4oC, thu dịch nổi phía trên và đo độ hấp thụ ở bước

sóng 275nm.

Một đơn vị hoạt độ của enzyme thủy phân fibrin được định nghĩa là lượng

enzyme làm tăng độ hấp thụ ở bước sóng 275 nm tương đương với 1 µg tyrosine mỗi

phút ở 37oC.

Hoạt độ enzyme được tính theo công thức sau:

Hoạt độ enzyme (FU/ml) = [(ODS-ODC)/(a * t * Ve)] * Vt * D

Trong đó: ODs: giá trị OD của mẫu thí nghiệm

ODc: giá trị OD của mẫu kiểm chứng

Vt: tổng thể tích dung dịch phản ứng (ml)

D: độ pha loãng mẫu

t: thời gian phản ứng (phút)

Ve: thể tích enzyme phản ứng (ml)

a: độ tăng độ hấp phụ ở bước sóng 275 nm ứng với nồng độ

48

tyrosine là 1 µg/ml (Phụ lục 1).

2.2.2.2. Nhuộm Gram

Nhuộm Gram vi khuẩn theo phương pháp của Smith và cs [167]. Dàn đều

vi khuẩn lên lam kính đã được làm sạch, cố định mẫu bằng cách hơ trên ngọn lửa

đèn cồn để nguội, sau đó nhuộm tím Gentian (60 giây, sau đó rửa nước), nhuộm

Lugol (60 giây, rửa nước), tẩy màu bằng cồn 96o (15 giây, rửa nước), nhuộm

Fuchsin (60 giây, rửa nước). Để khô tự nhiên và soi dưới kính hiển vi Nikon Eclipse

E100, ở vật kính dầu 100x/1,25. Vi khuẩn Gram dương sẽ có màu tím, vi khuẩn

Gram âm sẽ có màu đỏ hoặc hồng.

2.2.2.3. Nhuộm bào tử

Phương pháp nhuộm nội bào tử dựa trên phương pháp của Schaeffer-Fulton

[168] và một số sửa đổi. Thuốc nhuộm malachite green sẽ được sử dụng đầu tiên,

dưới tác dụng hơi nóng, thuốc nhuộm sẽ được giữ lại trong bào tử. Malachite

green có khả năng tan trong nước và có ái lực thấp với các vật liệu trong tế bào, do

đo các tế bào sinh dưỡng đang ở dạng hoạt động sẽ bị khử màu trong nước. Tiếp

theo sử dụng Safranin, sẽ nhuộm bất cứ tế bào nào đã được khử màu. Nội bào tử có

màu xanh và tế bào sinh dưỡng có màu đỏ nâu đến hồng. Bào tử có thể nằm ở giữa

hoặc cuối tế bào, có dạng hình cầu hoặc hình elip.

2.2.2.4. Xác định đường khử bằng phương pháp DNS

Xác định đường khử theo phương pháp DNS của Miller [169]. Phương

pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử 3,5 -

dinitrosalicylic axit (DNS) và đo ở bước sóng 540 nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn

của glucose với thuốc thử DNS sẽ tính toán được hàm lượng đường khử của mẫu thí

nghiệm (Phụ lục 2).

2.2.2.5. Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Bradford

Tổng protein hòa tan được xác định bằng phương pháp Bradford [170].

Hàm lượng protein hòa tan được xác định bằng thuốc thử Bradford (Bio-Rad, Mỹ),

sử dụng albumin huyết thành bò (BSA) làm đường chuẩn (Phụ lục 3).

Dựa vào đường chuẩn đã dựng và giá trị OD đo được của các mẫu để suy ra

49

nồng độ protein cần tìm.

2.2.2.6. Xác định hàm lượng sinh khối khô

Xác định sinh khối tế bào khô của vi khuẩn bằng phương pháp sấy đến khối

lượng không đổi theo Stojanović và cs [171].

2.2.2.7. Đo độ nhớt dịch lên men

Độ nhớt của dịch lên men được xác định theo phương pháp của Tamang

và cs [172] có sửa đổi. Các chủng được lên men trên môi trường GYP trong bình

tam giác 250 ml, thể tích 50 ml ở điều kiện nhiệt độ 37oC, lắc 150 vòng/phút, nuôi

trong 24 h. Dịch lên men thu được ly tâm loại sinh khối ở 10000 vòng/10 phút, ở

nhiệt độ 4oC. Độ nhớt của dịch lên men được xác định bằng thiết bị đo độ nhớt

Brookfield DV2T Viscometer (Brookfield, Middleboro, MA, USA) với trục khuấy

LV ở nhiệt độ phòng, tốc độ quay 100 vòng/phút, khuấy đo trong 1 phút. Kết quả

độ nhớt là giá trị trung bình được xác định ở 30 giây cuối của quá trình đo.

2.2.2.8. Định tính enzyme amylase

Định tính enzyme amylase được xác định theo phương pháp của Sharif và

cs (2023) [173] có sửa đổi. Môi trường LB bổ sung tinh bột (1 %) và agar (1,5 %)

đươc đổ trên đĩa Petri (20 ml) và đục lỗ. Đĩa xác định hoạt tính enzyme amylase sau

khi ủ ở nhiệt độ 37oC, trong khoảng thời gian từ 5 - 24 h, sau đó nhuộm màu bằng

Lugol 1,5% và kiểm tra đường kính vòng thủy phân trên đĩa.

2.2.2.9. Định tính enzyme cellulase

(2020) [174] có sửa đổi. Môi trường LB bổ sung CMC (0,1 %) và agar (1,5 %) đươc

Định tính enzyme cellulase được xác định theo phương pháp của Li và cs

đổ trên đĩa Petri (20 ml) và đục lỗ. Đĩa xác định hoạt tính enzyme cellulase sau khi

ủ ở nhiệt độ 37oC, trong khoảng thời gian từ 5 - 24 h, sau đó nhuộm màu bằng

Lugol 1,5% và kiểm tra đường kính vòng thủy phân trên đĩa.

2.2.2.10. Đặc điểm sinh hóa của chủng gốc và chủng đột biến

Để so sánh và phát hiện chủng đột biến ES4 có phản ứng sinh hóa nào khác

so với chủng gốc HY6 ban đầu, 2 chủng được kiểm tra trên bộ kit API [175] sử

dụng đối với Bacillus sp., các phản ứng sinh hóa ở thí nghiệm này được thực hiện

trên bộ kit API 50CH [176] và API 20E [177] của hãng Biomerieux (Pháp).

Cách tiến hành: chuẩn bị các thanh API, lấy 1 hộp nhựa ủ (khay và nắp cung

50

cấp kèm trong hộp API) và nhỏ nước cất vô trùng vào đầy các lỗ trên khay, đặt thanh

API vào trong hộp ủ. Mở ống API (Supspension medium 5 ml)/API 50 CH và ống 5

ml dung dịch muối 0,85%/ API 20 E, dùng que cấy lấy 2 - 3 khuẩn lạc thuần đã nuôi

cấy 24 h, hòa tan vào trong các ống để tạo dịch huyền phù, dùng pipet vô khuẩn hút

dịch vi khuẩn vừa pha nhỏ vào các giếng, nhỏ vừa đủ đến miệng giếng trừ các giếng

CIT, VP và GEL phải nhỏ đầy có vồng, tạo môi trường yếm khí cho các

giếng ADH, LDC, ODC, H2S và URE bằng cách phủ kín miệng giếng bằng paraffin,

đậy nắp khay của hộp ủ, để vào tủ ấm 30oC ủ trong vòng 18 h. Sau giai đoạn ủ lấy ra

và đọc kết quả âm tính hay dương tính của các giếng.

Đọc kết quả phản ứng sinh hóa trên kit API 50CH, các ống dương tính khi

chỉ thị màu đỏ phenol chuyển sang màu vàng (riêng ống 25 chuyển từ màu đỏ sang

màu đen), đối với kit API 20E, nếu có từ 3 giếng dương tính trở lên ta tiến hành nhỏ

hoá chất vào các ô:

TDA: thêm một giọt thuốc thử TDA, nếu hiện màu nâu hơi đỏ chỉ ra rằng

IND: thêm một giọt thuốc thử JAMES, nếu có màu hồng lan ra toàn bộ giếng

phản ứng dương tính và được ghi lại trên bảng kết quả.

hình chén thì là phản ứng dương tính và ghi lại kết quả trên bảng kết quả.

VP: thêm mỗi loại thuốc thử VP1 và VP2 một giọt, đợi ít nhất 10 phút. Nếu

hiện màu đỏ hoặc màu hồng cho phản ứng dương tính (ghi lại kết quả trên bảng kết

quả), nếu hiện ra màu phớt hồng sau 10 phút, phản ứng được xem là âm tính.

Nếu có ít hơn 3 giếng dương tính (chưa nhỏ hoá chất), ủ lại 24 h ± 2 h, sau

đó nhỏ hoá chất cần thiết và đọc lại kết quả (Phụ lục 9)

Dựa vào kết quả các phản ứng sinh hóa thu nhận được để so sánh đặc điểm

sinh hóa giữa 2 chủng.

2.2.2.11. Tách DNA tổng số và giải trình tự bộ gen của vi khuẩn

Tách và tinh sạch DNA tổng số của vi khuẩn: Kỹ thuật chuẩn bị và chiết tách

tế bào dựa trên phương pháp William S. và cs [178] có sửa đổi. Huyền phù vi khuẩn

được chuyển vào ống ly tâm thích hợp (1,5 ml) và ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút

trong 5 phút. Phần nổi phía trên được loại bỏ, các tế bào sau đó được tạo huyền phù

lại trong dung dịch đệm 740 µl TE (10 mM Tris; 1mM EDTA, pH 8,0). Hút 20 µl

lysozyme (100 mg/ml) vào và trộn đều sau đó ủ trong 30 phút ở 37°C. Tiếp theo, bổ

51

sung 40 µl SDS 10% và 4 µl proteinase K (20 mg/ml), hỗn hợp sau đó được trộn đều

trước khi ủ trong 1 h ở 56°C. Hút 100 µl NaCl 5M và 100 µl CTAB/NaCl thêm vào

và ủ ở 65°C trong 10 phút. Bổ sung 0,5 ml chloroform: alcohol isoamyl (24:1) trộn

đều vào hỗn hợp trước khi ly tâm ở tốc độ tối đa trong 10 phút ở 4°C. Pha nước sau

đó được chuyển sang ống siêu nhỏ sạch. Việc chiết với chloroform : isoamyl alcohol

được lặp lại một lần. Sau đó thêm 0,6 thể tích isopropanol (-20°C), hỗn hợp thu được

được ủ ở -20°C trong 2 h hoặc qua đêm, sau đó ly tâm ở tốc độ tối đa trong 15 phút ở

4°C. Pellet được rửa bằng ethanol 70 % lạnh. Hỗn hợp được ly tâm ở tốc độ tối đa

trong 5 phút. Dịch nổi trên bề mặt loại bỏ và các viên DNA được để khô ở nhiệt độ

phòng trước khi được bổ sung 100 µl nước không có DNase. Sau đó, DNA được xử

lý bằng RNase A (5 μl dung dịch gốc 25 μg/ml cho 100 μl dung dịch chứa DNA) ở

37°C trong 15 phút. Sau đó, bổ sung 1/10 thể tích natri axetat 3 M (pH 5,2) và 2,5 thể

tích etanol tuyệt đối, ủ ở - 20°C qua đêm và ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút

ở 4°C. Dịch nổi trên bề mặt đã được loại bỏ cẩn thận, viên DNA được rửa sạch bằng

etanol 70% lạnh và ly tâm lại ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C. Tỷ lệ

OD ở 260/280 nm là > 1,8 (đo máy quang phổ NanoDropND - 1000). Chạy gel

agarose 1% 1 µl DNA để kiểm tra chất lượng.

Giải trình tự bộ gen vi khuẩn: Mẫu DNA của chủng vi khuẩn tách đủ

lượng (1µg) và chất lượng (xác định bằng tỉ lệ hấp thụ quang ở bước sóng 260 và

280 đạt lớn hơn 1,8) được gửi tới 1st BASE (Singapore) để xây dựng thư viện

DNA và xác định trình tự toàn bộ bộ gen của vi khuẩn trên hệ thống xác định

trình tự Illumina thế hệ mới Hiseq - 4000. Trình tự thô được kiểm tra chất lượng

và loại bỏ adapter. Các trình tự đọc có đoạn lặp được xác định hợp nhất. Các trình

tự được tập hợp để tạo thành hệ gen của vi khuẩn nghiên cứu. Chú thích chức

năng của các gen trong hệ gen được thực hiện trên hệ thống chú thích chức năng

RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology) sử dụng các tiêu chuẩn

mặc định trên hệ thống.

2.2.2.12. Xử lý số liệu

Các thí nghiệm được thực hiện có lặp lại để lấy sai số. Các số liệu công bố

là giá trị trung bình với độ sai số được xử lý trên phần mềm Excel với sai số cho

52

phép ≤ 5 % và sử dụng phần mềm Design Expert.

2.2.3. Phương pháp thí nghiệm

2.2.3.1. Phân lập và sàng lọc chủng

a. Phương pháp phân lập chủng Bacillus sp.: các mẫu tương được thu thập

về lắc đều, cân 10g vào bình tam giác 250 ml sau đó bổ sung thêm 90ml nước muối

loãng 0,9% đã thanh trùng, đậy nắp, lắc đều để trong bể ổn nhiệt 80oC trong 20

phút. Mẫu sau đó được pha loãng đếm 10-5-10-6, hút 100 µl mẫu trải trên đĩa môi

trường LB agar, nuôi ở 37oC trong 24 h [106, 165, 179].

b. Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme protease: Các khuẩn lạc

nghi ngờ là Bacillus sp. mọc trên môi trường phân lập LB được sàng lọc sơ bộ bằng

phương pháp cấy ria trên môi trường LB agar có bổ sung 1% sữa gầy [92], nuôi ở

37oC trong 24 h. Các khuẩn lạc có hoạt tính protease sẽ được nuôi trên môi

trường GY, thu dịch nhỏ 50 µl/l lỗ trên đĩa thạch LB + 1% sữa gầy để đo đường

kính vòng thủy phân sữa gầy của các chủng (các đĩa có Ø 8,5cm, đổ 20 ml môi

trường LB agar + 1% sữa gầy và đục lỗ), các đĩa được để ở tủ 37oC trong 6 h lấy

ra đo đường kính của vòng phủy phân. Các khuẩn lạc có đường kính vòng thủy

phân sữa gầy lớn sẽ được chọn lựa, làm thuần và cấy sang ống thạch nghiêng bảo

quản ở 4oC.

2.2.3.2. Hoạt hóa chủng

Chủng trước khi sử dụng được hoạt hóa bằng cách ria trên đĩa thạch LB,

nuôi ở 37oC trong 24 h. Khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch được cấy chuyển sang môi

trường nhân giống trong bình tam giác 250 ml có chứa 50 ml môi trường LB ở 37oC

trong 12 - 14 h trước khi sử dụng.

2.2.3.3. Thu nhận enzyme thủy phân fibrin ngoại bào

Chủng sau khi được hoạt hóa và nhân giống sau 12 - 14 h sẽ được cấp vào

bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường GY hoặc GYP (cấp theo OD 600nm =

0,2). Chủng nuôi ở nhiệt độ 37oC, lắc 150 vòng/phút trong 24 h, sau đó thu dịch

enzyme ngoại bào bằng cách ly tâm tách bỏ sinh khối tế bào ở 10.000 vòng/phút, ở

nhiệt độ 4oC trong 10 phút.

2.2.3.4. Đột biến chủng vi khuẩn

a. Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào cho đột biến: Chủng đã chọn được nuôi

53

cấy trong 50 ml môi trường LB trong bình tam giác 250 ml ở 37oC trong 12 h. Sau

đó, hút 10 ml dịch nuôi cấy được ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/10 phút ở 4oC.

Phần dịch nổi phía trên được loại bỏ và phần cặn tế bào được rửa ba lần bằng nước

cất vô trùng. Cuối cùng, sinh khối tế bào được tạo huyền phù lại trong nước cất vô

trùng đến mật độ tế bào khoảng 1x107 CFU/ml [113], [163] và được sử dụng trong

thí nghiệm đột biến.

b. Đột biến bằng tia UV: chủng vi khuẩn phân lập có hoạt độ enzyme thủy

phân fibrin cao sẽ được đột biến bằng tia UV theo phương pháp được mô tả bởi

Thakur và cs [115] và Raju và cs [113] với một số sửa đổi. Chủng vi khuẩn được gây

đột biến bằng đèn UV (15W, 254nm) (đèn OSRAM PURITEC HNS, Nga), dịch

huyền phù tế bào (2 ml) được chuyển vào đĩa Petri vô trùng và sau đó được chiếu tia

UV trong tủ cấy, các đĩa có chứa dịch huyền phù tế bào được giữ ở khoảng cách giữa

đèn UV và đĩa Petri cố định ở mức 20 cm (Hình 2.2).

Hình 2.2. Sơ đồ đột biến chủng bằng tia UV

Thời gian khảo sát chiếu tia UV là 30, 60, 90, 120, 150 và 180 phút. Sau

các khoảng thời gian tương ứng, các dịch huyền phù tiếp xúc với tia cực tím được

54

voltex đều, pha loãng đến 1x106-7, hút 100 µl trải trên các đĩa môi trường thạch LB

(1% sữa gầy), nuôi trong 24 h ở 37°C, qua đó khảo sát tỉ lệ tế bào sống hoặc chết và

sàng lọc sơ bộ dòng tế bào có hoạt tính protease cao. Quá trình thực hiện đột biến,

xử lứ mẫu sau đột biến được thực hiện theo Heerd và cs [180] và Mohsin và cs [181].

- Sàng lọc sơ bộ các dòng tế bào có hoạt tính protease cao: Các dòng tế bào

sinh enzyme protease cao được sàng lọc sơ bộ ban đầu qua đường kính của các

vòng thủy phân sữa gầy trên cùng một đĩa, sau thời gian nuôi 24 h ở cùng điều kiện

nhiệt độ 37oC.

- Chọn các dòng tế bào có khả năng sinh enzyme thủy phân fibrin cao: Các

dòng tế bào sau khi sàng lọc có đường kính vòng thủy phân sữa gầy trên các đĩa lớn

được lên men trên môi trường GY để xác định hoạt độ enzyme thủy phân fibrin,

dòng tế bào nào cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất sau mỗi lần đột biến

sẽ được lựa chọn để tiếp tục đột biến UV lần sau.

Các lần đột biến bằng tia UV sau được thực hiện như lần 1, quá trình đột biến

và sàng lọc dòng tế bào đột biến được dừng lại sau 3 lần đột biến liên tiếp hoạt độ

enzyme thủy phân thu nhận được của dòng tế bào sau đột biến không tăng (hoặc tăng

không có ý nghĩa về mặt thống kê) so với 2 lần đột biến trước đó.

c. Đột biến chủng bằng hóa chất: Hóa chất sử dụng đột biến chủng gồm có

2 loại EtBr và EMS.

Dịch huyền phù tế bào (6 ml) được chuyển vào các ống fancol 15 ml vô

trùng, sau đó hóa chất được thêm vào ở nồng độ là 50, 100, 150, 200 và 250 μg/ml

và được giữ trong các khoảng thời gian là 30, 60, 90, 120 và 150 phút [115].

Quá trình đột biến được thực hiện ở nhiệt độ phòng, sau các khoảng thời

gian đột biến ở các nồng độ hóa chất khác nhau, mẫu sẽ được rút ra 1 ml và ly tâm

với tốc độ 10.000 vòng/10 phút ở 4oC. Sinh khối tế bào được rửa ba lần bằng dung

dịch muối 0,9 % để loại bỏ chất gây đột biến khỏi mẫu trước khi được hòa tan lại

trong nước cất vô trùng, voltex đều và hút 100 µl trải trên các đĩa thạch LB (1 %

sữa gầy), nuôi 37oC trong 24 h (Hình 2.3). Các chủng đột biến được chọn lọc và

55

nuôi trên môi trường GYP để xác định hoạt độ enzyme thủy phân fibrin.

Hình 2.3. Sơ đồ đột biến chủng bằng hóa chất

Để thu nhận được chủng đột biến cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao,

khảo sát chủng đã qua đột biến tia UV cho đột biến tiếp với hóa chất, hoặc 2 hóa

chất theo lần lượt hoặc đồng thời. Qua đó, dựa vào kết quả đo hoạt độ enzyme thủy

phân fibrin của các chủng sau mỗi lần thực hiện để lựa chọn ra chủng cho khả năng

sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin tốt nhất và chọn làm chủng cho các nghiên

cứu tiếp theo.

2.2.3.5. Kiểm tra độ ổn định của các chủng đột biến

Thông thường, các chủng đột biến sau thời gian nuôi cấy hoạt độ enzyme

của chủng cũng bị giảm. Để xác định độ ổn định của các chủng đột biến, các chủng

đột biến sẽ được cấy chuyển trên môi trường đĩa thạch từ 3 lần trở lên, số lần cấy

chuyển càng nhiều cho kết quả đánh giá độ ổn định của các chủng sau đột biến càng

chính xác. Tuy nhiên, đối với các chủng thông thường nếu thực hiện cấy chuyển

nhiều bản thân chủng cũng bị tự thoái hóa, làm giảm hoạt độ enzyme của chủng. Vì

vậy, để xác định độ ổn định của các chủng đột biến chúng tôi thực hiện xác định độ

ổn định của chủng qua 10 lần cấy chuyển trên môi trường LB agar, sau mỗi lần cấy

chuyển trên đĩa, tách 1 khuẩn lạc để nuôi cấy thu nhận và xác định hoạt độ enzyme

56

thủy phân fibrin của chủng.

2.2.3.6. Khảo sát khả năng tạo bào tử của chủng đột biến

Chủng đột biến và chủng gốc sẽ được nuôi trên môi trường tạo bào tử DSM

trong thời gian 3-7 ngày để khảo sát khả năng tạo bào tử của 2 chủng. Dịch nuôi sau

đó sẽ được nhuộm bào tử để phát hiện sự hình thành bào tử của các chủng theo A

Oktar và cs [182]. Song song đó, dịch nuôi được gia nhiệt ở 80oC trong 20 phút,

dịch nuôi không gia nhiệt và dịch nuôi được gia nhiệt pha loãng 106 và 107, ở chủng

đột biến có 1 mẫu không pha loãng, sau đó hút 100 μl dịch nuôi ở các nồng độ pha

loãng trải trên đĩa thạch LB + 1% sữa gầy, nuôi 37oC trong 24 h, sau thời gian nuôi

24h lấy ra đếm khuẩn lạc trên các đĩa trải dịch nuôi không qua xử lý nhiệt và dịch

nuôi đã qua xử lý nhiệt. Đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa của dịch nuôi không qua xử lý

nhiệt và dịch nuôi đã qua xử lý nhiệt ta tính toán được % khả năng tạo bào tử của

chủng trong thời gian nuôi [183, 184].

2.2.3.7. Tối ưu hóa điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

thủy phân fibrin của chủng Bacillus sp.

a. Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho khả năng sinh

enzyme thủy phân fibrin

Chủng đột biến đã được lựa chọn, lên men trên 50 ml môi trường trong bình

tam giác 250 ml ở điều kiện lắc 150 vòng/phút, pH môi trường ban đầu 7,0, nhiệt độ

lên men 37oC trong 24 h, với OD (600nm) ban đầu là 0,2. Thành phân môi trường

lên men GYP được thay đổi trong từng nghiên cứu.

- Nguồn carbon: Để lựa chọn được nguồn dinh dưỡng carbon phù hợp cho

chủng sinh enzyme thủy phân fibrin, chủng được nuôi trên môi trường GYP có

nguồn dinh dưỡng carbon thay đổi gồm: glucose, sucrose, maltose và glycerol,

với cùng một hàm lượng sử dụng là 10 g/l. Sau 24 h lên men xác định hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin trong dịch, qua đó lựa chọn nguồn carbon cho hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin cao nhất để đưa vào nghiên cứu tiếp theo.

- Nguồn nitrogen: Sử dụng nguồn carbon đã lựa chọn ở trên và thay đổi nguồn

dinh dưỡng N trong thành phần môi trường lên men với cùng một hàm lượng 10 g/l

gồm: cao nấm men, peptone, cao thịt, bột đậu tương và tryptone. Dịch sau lên men 24 h

được đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin, qua đó lựa chọn nguồn N thích hợp cho

57

chủng sinh enzyme thủy phân fibrin cao sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

- Nguồn ion kim loại: Bên cạnh sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng C và

N, các chủng vi khuẩn sinh enzyme có sự ảnh hưởng của các ion kim loại có trong

thành phần môi trường nuôi cấy [185], [144], [186], [187]. Vì vậy, để lựa chọn ion

kim loại thích hợp cho chủng sinh enzyme, chủng được nuôi trên môi trường chứa

các ion kim loại thay đổi gồm: Ca2+, Mg2+, Mn2+, K+, Zn2+, Cu2+và Fe2+ (các ion

kim loại ở dạng muối có nồng độ 5 mM tương ứng CaCl2, MgSO2.7H2O,

MnCl2.4H2O, KH2PO4, ZnSO4, CuSO4.5H2O và FeSO4.7H2O). Trên cơ sở thành

phần môi trường GYP có nguồn C và N đã được lựa chọn ở trên, dịch sau lên men

24 h được đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin. Qua đó, các ion lim loại phù hợp

cho chủng sinh enzyme thủy phân fibrin sẽ được lựa chọn.

b. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện lên men thích hợp

Chủng đột biến đã được lựa chọn, lên men trên môi trường GYP trong bình

tam giác 250 ml với thể tích môi trường lên men là 50 ml, nuôi lắc 150 vòng/phút,

trong 24 h, với OD (600nm) ban đầu là 0,2 ở các điều kiện thay đổi như nhiệt độ, pH

như sau:

- Nhiệt độ lên men: Để xác định được nhiệt độ lên men thích hợp cho chủng

đột biến đã được lựa chọn sinh enzyme thủy phân fibrin, chủng đột biến được nuôi

cấy trong môi trường có các giá trị 30oC, 35oC, 37oC, 40oC và 45oC, với pH môi

trường ban đầu là 7,0. Sau thời gian nuôi trong 24 h, dịch enzyme thu nhận được đo

hoạt độ enzyme thủy phân fibrin, qua đó xác định được nhiệt độ lên men thích hợp

sinh enzyme của chủng đột biến đã lựa chọn.

- pH môi trường ban đầu: Trên cơ sở xác định được nhiệt độ thích hợp cho

chủng đột biến đã lựa chọn để sinh enzyme ở trên, chủng đột biến đã lựa chọn tiếp

tục được khảo sát sự ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến khả năng sinh

enzyme của chủng ở các giá trị 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 và 8,0. Chủng đột biến đã lựa

chọn được nuôi lắc 150 vòng/phút, trong 24 h, dịch sau lên men được đo hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin, qua đó lựa chọn giá trị pH môi trường ban đầu thích hợp

cho chủng đột biến đã lựa chọn để sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin.

c. Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men

Một thiết kế tối ưu bằng phần mềm Design expert 12 đã được sử dụng để

58

nghiên cứu tác động đồng thời của sáu yếu tố môi trường lên men (glucose, cao

nấm men (YE), peptone, CaCl2.2H2O, MgSO2.7H2O và NaCl) đối với sự phát triển

và sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng đột biến đã lựa chọn. Tổng

cộng có 34 thí nghiệm với 3 lần lặp lại tại các điểm trung tâm được thực hiện theo

thiết kế thứ tự ngẫu nhiên (random order design) được thể hiện ở Bảng 2.4. Hàm

mục tiêu là hàm hoạt độ enzyme và hàm mật độ tế bào (OD 600nm) của chủng đột

biến đã lựa chọn, sự ảnh hưởng của các yếu tố cũng như sự tương tác giữa các yếu

tố đến hàm mục tiêu được xây dựng bởi hàm hồi qui bậc 2 và được biểu diễn bằng

phương trình bậc hai (1):

Y=α0+α1A+α2B+α3C+α4D+α5E+α6F+α12AB+α13AC+α14AD+α15AE+α16AF

+α23BC+α24BD+α25BE+α26BF+α34CD+α35CE+α36CF+α45DE+α46DF+α56EF+α11A2+

α22B2+α33C2+α44D2+α55E2+α66F2 (1) [188]

Trong đó: Y là hàm đáp ứng dự đoán; A, B, C, D, E và F là các biến độc lập;

α0 là hằng số;

α1, α2, α3, α4, α5 và α6 là các hệ số tuyến tính;

α12, α13, α14, α15, α16, α23, α24, α25, α26, α34, α35, α36, α45, α46 và α56 là các hệ

số tương tác;

α11, α22, α33, α44, α55 và α66 là hệ số bậc hai.

Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Design-Expert.

Yếu tố 1

Yếu tố 2

Yếu tố 3

Yếu tố 4

Yếu tố 5

Yếu tố 6

TT

F:NaCl

A:Glucose B:Cao nấm men C:Peptone D:CaCl2.2H2O E:MgSO4.7H2O

g/l

g/l

g/l

g/l

g/l

g/l

25,00

1

3,15

3,36

0,35

0,22

5,00

5,00

2

2,88

4,64

0,26

0,30

8,23

5,00

3

2,88

4,64

0,26

0,30

8,23

24,20

4

5,00

7,16

0,60

0,12

10,00

11,20

5

0,00

1,00

0,10

0,26

5,00

25,00

6

5,00

1,00

0,10

0,30

7,38

5,00

7

5,00

5,16

0,10

0,14

5,00

25,00

8

5,00

9,00

0,18

0,10

10,00

59

Bảng 2.4. Bảng thiết kế thí nghiệm thống kê tối ưu cho sinh khối và enzyme

9

19,40

5,00

4,92

0,60

0,10

6,03

16,00

10

0,00

5,88

0,42

0,10

9,75

25,00

11

1,40

9,00

0,60

0,19

7,85

15,70

12

2,40

8,00

0,10

0.24

10,00

10,40

13

2,73

1,00

0,34

0,10

6,50

23,90

14

3,60

1,00

0,48

0,27

8,53

5,00

15

0,00

9,00

0,19

0,16

7,63

25,00

16

0,00

9,00

0,10

0,30

5,00

5,00

17

0,38

1,40

0,60

0,19

8,65

5,00

18

5,00

1,00

0,60

0,30

5,00

5,00

19

0,98

7,40

0,57

0,16

5,00

12,40

20

5,00

1,72

0,35

0,19

9,95

5,00

21

0,00

1,00

0,10

0,10

10,00

13,00

22

5,00

9,00

0,38

0,27

6,15

17,40

23

1,18

3,96

0,60

0,30

6,53

25,00

24

0,48

3,40

0,10

0,15

7,50

25,00

25

2,90

1.00

0.60

0.10

10.00

25,00

26

0,00

1,00

0,60

0,10

5,00

25,00

27

5,00

6,60

0,58

0,30

10,00

25,00

28

5,00

1,00

0,10

0,10

8,05

19,60

29

2,15

9,00

0,10

0,10

5,00

25,00

30

0,00

1,00

0,33

0,30

10,00

10,40

31

2,73

1,00

0,34

0,10

6,50

25,00

32

3,15

3,36

0,35

0,22

5,00

5,00

33

0,00

9,00

0,60

0,30

10,00

5,00

34

4,60

9,00

0,60

0,10

10,00

2.2.3.8. Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật lên men

Quá trình lên men được thực hiện trên thiết bị lên men 2 lít (Sartorius A Plus)

với thể tích dịch lên men 1 lít. Nhiệt độ, pH môi trường lên men được kiểm soát tự

60

động và được cài đặt theo điều kiện xác định ở mục 2.2.3.7.b, pH kiểm soát bằng

cách bơm tự động HCl 2N hoặc NaOH 2N, sự tạo bọt được kiểm soát bằng cách bơm

tự động chất chống tạo bọt gốc silicon (antifoam). Chủng đột biến đã lựa chọn được

nuôi trên môi trường LB trong 14 h, sau đó cấp vào dịch lên men ở OD ban đầu

(600nm) là 0,2. Mức độ oxi hòa tan (DO) được kiểm soát tự động ở mức ≥ 20 % bằng

cách thay đổi tốc độ khuấy (200 - 1.200 vòng/phút). Việc bổ sung cơ chất được xác

định dựa vào động học của quá trình lên men theo mẻ trước đó và được tính theo

phương trình 2 [189]. Dịch lên men được lấy định kỳ 1 h/1 lần để xác định mật độ tế

bào (đo OD) và hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng.

Tốc độ bổ sung cơ chất được tính theo công thức (2).

F=[μ*Xₒ*Vₒ*exp(μ*t)]/Yx/s*(Sf-S0) (l/h) (2)

Trong đó:

μ là tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật/h;

X0 là giá trị OD (600nm) tại thời điểm bắt đầu bổ sung;

V0 là thể tích dịch lên men khi bắt đầu bổ sung cơ chất (lít);

t là khoảng thời gian bổ sung cơ chất (h);

Sf là nồng độ cơ chất bổ sung (g/l);

S0 là nồng độ cơ chất trong dịch lên men tại thời điểm bắt đầu bổ sung cơ

chất (g/l);

YX/S: hiệu suất sử dụng cơ chất của tế bào (g/g).

Trên cơ sở các thành phần môi trường lên men đã được tối ưu, việc lên men

bổ sung cơ chất có kiểm soát là một trong những phương pháp để đạt được mật độ

tế bào cao, điều này cũng cần thiết để tăng năng suất và sản phẩm đích. Trong

nghiên cứu này, quá trình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất theo cấp số nhân được

sử dụng để cải thiện quá trình sản xuất enzyme thủy phân fibrin. Việc bổ sung cơ

chất được thực hiện theo 2 phương pháp: bổ sung cơ chất 1 giai đoạn và bổ sung

cơ chất 2 giai đoạn. Qua đó lựa chọn phương pháp bổ sung cơ chất để tăng hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin của chủng thu nhận được trong lên men.

a. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn

Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn, cơ chất sẽ được bổ sung

trong quá trình lên men là thành phần dung dịch hỗn hợp có chứa glucose, YE và

61

peptone với tỉ lệ tuân theo điều kiện tối ưu cho hàm đáp ứng là enzyme (môi

trường tối ưu cho chủng sinh tổng hợp enzyme), với tốc độ bổ sung cơ chất tính

theo phương trình 2 dựa vào các thông số động học lên men thẻo mẻ như tốc độ

tăng trưởng của chủng/h và hiệu suất sử dụng cơ chất của tế bào, sau các khoảng

thời gian nhất định 0,25 h, cơ chất được cài đặt bổ sung tự động. Chủng đột biến

đã được lựa chọn lên men trên môi trường có thành phần môi trường tối ưu cho

enzyme (mục 2.2.3.7.c), ở điều kiện nhiệt độ lên men và pH môi trường được xác

định theo mục 2.2.3.7.b, tốc độ khuấy được cài đặt tự động theo tín hiệu pO2 ≥ 20

%. Quá trình bổ sung cơ chất được thực hiện trước khi chủng chuyển sang pha cân

bằng nhằm duy trì tốc độ sinh trưởng của chủng (được xác định trong lên men

theo mẻ). Quá trình lên men dừng khi hoạt độ enzyme của chủng đột biến đã lựa

chọn thu nhận được không tăng.

b. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai đoạn

Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai đoạn, cơ chất bổ sung có thành

phần tỉ lệ thay đổi, tỉ lệ thành phần cơ chất bổ sung ở 2 giai đoạn khác nhau, giai

đoạn đầu cơ chất bổ sung là thành phần tối ưu cho mật độ tế bào nhằm tăng sinh

khối tế bào, giai đoạn 2 là giai đoạn bổ sung cơ chất là thành phần môi trường tối

ưu cho enzyme. Các thông số lên men bổ sung cơ chất 2 giai đoạn như điều kiện

lên men, thời gian bổ sung cơ chất và tốc độ cấp cơ chất bổ sung được duy trì như

lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn Trên cơ sở đó, so sánh và lựa chọn

phương pháp bổ sung cơ chất cho thu nhận enzyme thủy phân fibrin của chủng là

tốt nhất. Dung dịch cơ chất bổ sung chứa glucose, YE và peptone với tỷ lệ theo

các điều kiện tối ưu cho sinh khối ở giai đoạn đầu, giai đoạn sau có tỉ lệ tối ưu cho

sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin, tốc độ bổ sung cơ chất được tính theo

62

phương trình 2 (tương tự lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn).

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ

NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN CAO

3.1.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease

Với tổng số lượng 28 mẫu tương được thu thập từ 8 tỉnh, thành phố,

phân lập theo phương pháp mục 2.2.3.1.a thu nhận được 68 khuẩn lạc với đặc

điểm hình thái tương đối khác nhau. Các khuẩn lạc này sau đó được ria và làm

thuần trên môi trường LB agar bổ sung 1% sữa gầy để sàng lọc sơ bộ các chủng

có khả năng sinh enzyme protease (mục 2.2.3.1.b). Các khuẩn lạc này được gọi

là các chủng phân lập. Kết quả sàng lọc được tổng hợp ở Bảng 3.1.

Bảng 3. 1. Tổng hợp các mẫu và chủng vi khuẩn phân lập

Số lượng

Số lượng chủng

Số chủng có hoạt

TT

Tỉnh, Thành phố

mẫu

phân lập

tính protease

Hưng Yên (HY)

6

18

16

1

Hải Dương (HD)

3

7

5

2

Hải Phòng (HP)

3

6

4

3

Yên Bái (YB)

2

4

2

4

Nghệ An (NA)

3

7

5

5

Hà Nội (HN)

6

15

11

6

Phú Thọ (PT)

2

5

2

7

Bắc Ninh (BN)

3

6

3

8

68

48

Tổng

28

Từ Bảng 3.1 cho thấy, trong 68 chủng được phân lập từ 28 mẫu thu

thập, có 48 chủng vi khuẩn có hoạt tính protease. Trong đó, số lượng mẫu thu

thập và khuẩn lạc phân lập được nhiều nhất là 2 tỉnh (thành phố) đó là Hưng Yên và

Hà Nội, số lượng mẫu thu thập được ở tỉnh Hưng Yên là 6 mẫu, phân lập được 18

chủng vi khuẩn, có 16/18 chủng vi khuẩn có hoạt tính protease, chiếm 33,33 % tổng

số chủng vi khuẩn phân lập được có hoạt tính protease. Số lượng mẫu thu thập được

ở Hà Nội là 6 mẫu, phân lập được 15 chủng vi khuẩn, có 11/15 chủng vi khuẩn có

hoạt tính protease, chiếm 22,92 % tổng số chủng vi khuẩn phân lập được có hoạt

63

tính protease. Ở các tỉnh còn lại số lượng mẫu thu thập được không nhiều, chỉ từ 2-3

mẫu, số chủng vi khuẩn phân lập được có hoạt tính protease chỉ chiếm từ 4,17 % -

10,42 % tổng số chủng vi khuẩn phân lập được có hoạt tính protease (Hình 3.1).

Hình 3.1. Tỉ lệ các chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính protease (%)

Kết quả đo đường kính vòng thủy phân sữa gầy của 48 chủng được thể

14

)

12

m m

10

8

( y ủ h n â h p g n ò v

6

4

h n í k g n ờ ư Đ

2

0

1 T P

2 T P

4 P H

1 P H

2 P H

3 P H

2 B Y

1 B Y

1 N B

2 N B

3 N B

1 Y H

2 Y H

3 Y H

4 Y H

5 Y H

6 Y H

7 Y H

8 Y H

9 Y H

1 D H

2 D H

3 D H

4 D H

5 D H

1 A N

2 A N

3 A N

4 A N

5 A N

1 N H

2 N H

3 N H

4 N H

5 N H

6 N H

7 N H

8 N H

9 N H

0 1 Y H

1 1 Y H

2 1 Y H

3 1 Y H

4 1 Y H

5 1 Y H

6 1 Y H

0 1 N H

1 1 N H

Hưng Yên

Nghệ An

Hà Nội

Hải Dương Hải Phòng Yên Bái

Phú Thọ

Bắc Ninh

Nguồn và chủng phân lập

hiện ở Hình 3.2.

Hình 3.2. Kết quả đo đường kính vòng thủy phân sữa gầy của 48 chủng phân lập

Từ kết quả Hình 3.2 cho thấy, các chủng vi khuẩn phân lập được có

64

đường kính vòng thủy phân sữa gầy từ 0,2 đến 12 mm, có 25 chủng vi khuẩn cho

đường kính vòng thủy phân sữa gầy < 4 mm gồm chủng HY2, HY3, HY8, HY9,

HY10, HY11, HY16, HD1, HD2, HD4, HD5, HP1, HP2, HP3, YB1, YB2, NA4,

HN1, HN2, HN3, HN6, HN7, HN10, PT2 và BN2; có 17 chủng có đường kính

vòng thủy phân sữa gầy ≥ 4mm và < 9 mm gồm HY1, HY4, HY5, HY7, HY12,

HY13, HY14, HY15, HD3, HP4, NA1, NA2, HN4, HN5, HN9, HN11 và PT1; có 6

chủng cho đường kính vòng thủy phân sữa gầy > 9 mm là HY6; NA3; NA5; HN8;

BN1 và BN3. Trong đó, chủng HY6 cho đường kính vòng thủy phân sữa gầy lớn

nhất là 12 ± 0 mm.

Kết quả sau khi sàng lọc thu nhận được 23 chủng vi khuẩn phân lập có

đường kính vòng thủy phân sữa gầy ≥ 4mm, đặc điểm hình thái khuẩn lạc của

23 chủng được tổng hợp ở Phụ lục 4. Các chủng có hình thái khuẩn lạc khác

nhau, đa dạng về màu sắc, hình dạng. Tuy nhiên, để xác định chủng nào có hoạt

tính enzyme thủy phân fibrin cao, 23 chủng sinh enzyme protease cao (đường

kính vòng thủy phân sữa gầy ≥ 4mm) được sàng lọc ở trên lên men thu dịch để

đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin.

3.1.2. Khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của các chủng

23 chủng vi khuẩn sinh enzyme protease cao được lên men trên môi trường

GY thu nhận enzyme thủy phân fibrin theo phương pháp ở mục 2.2.3.3. Kết quả đo

hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của 23 chủng được thể hiện ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng vi khuẩn

TT

Chủng

TT

Chủng

Hoạt độ enzyme (FU/ml)

Hoạt độ enzyme (FU/ml)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

HY1 HY4 HY5 HY6 HY7 HY12 HY13 HY14 HY15 HD3 HP4 NA1

11,8 ± 1,4 11,4 ± 2,2 22,8 ± 0,4 49,2 ± 1,2 15,4 ± 1,8 23 ± 0,6 16,8 ± 0,8 19,2 ± 0,8 16 ± 0,4 16,8 ± 3,2 27,2 ± 4,8 20,2 ± 4,6

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

NA2 NA3 NA5 HN4 HN5 HN8 HN9 HN11 PT1 BN1 BN3

22,8 ± 2,4 39,2 ± 5,6 36,4 ± 2,8 24 ± 4,8 11,6 ± 2,0 35,2 ± 3,2 11,6 ± 0,4 24,8 ± 8,0 15,6 ± 0,4 33,6 ± 5,2 34,2 ± 3,0

65

Kết quả xác định hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cho thấy, 23 chủng có

hoạt tính protease đều có sinh tổng hợp enzyme phân hủy fibrin và hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin của các chủng thu được nằm trong khoảng 11,4 ± 2,2

FU/ml đến 49,2 ± 1,2 FU/ml, trong đó có 06 chủng sinh tổng hợp enzyme thủy

phân fibrin có hoạt độ cao hơn 30 FU/ml đó là chủng HY6, HN8, NA3, NA5,

BN1 và BN3. Tuy nhiên, trong 06 chủng có hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao

thì chủng HY6 được phân lập từ nguồn tương Bần ở Hưng Yên cho hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin là cao nhất đạt 49,2 ± 1,2 FU/ml. Trước đó, Jo và cộng

sự [56] phân lập chủng Bacillus amyloliquefaciens MJ5-41 sinh enzyme thủy phân

fibrin từ Meju của Hàn Quốc, cho hoạt tính 37,7 unit/mg protein. Lê thị Bích

Phượng và cộng sự [190] đã phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh

tổng hợp nattokinase từ natto thương phẩm, chủng phân lập lên men trên môi

trường hạt đậu nành, cho hoạt độ nattokinase đạt 470 FU/g; Chen và cộng sự [58]

đã lập chủng Bacillus subtilis FR-33 từ sản phẩm Doufuru của Trung Quốc sinh

enzyme thủy phân fibrin có hoạt độ 1833 IU/ml. Đinh Bùi Quỳnh Anh và cộng sự

[64] đã nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp. từ sản phẩm mắm tôm để

thu nhận enzyme thủy phân fibrin có hoạt tính đạt từ 2,43 FU/ml - 2,95 FU/ml. Huy

và cộng sự [65] đã nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp. từ sản phẩm

đậu tương lên men thương mại để thu nhận enzyme thủy phân fibrin, các chủng

phân lập được lên men rắn cho hoạt độ enzyme thu nhận được từ 29,7 FU/g - 77,9

FU/g. Đỗ Thị Hoàng Tuyến và cộng sự [68] đã phân lập vi khuẩn cho hoạt tính

nattokinase cao từ sản phẩm natto thị trường, kết quả khảo sát lên men cho hoạt

tính nattokinase cao nhất đạt 8,6 FU/ml. Yao và cộng sự [59] phân lập chủng B.

amyloliquefaciens RSB34 từ Doenjang cho hoạt tính enzyme thủy phân fibrin đạt

83,23 mU/µl. Yao và cs [60] đã nghiên cứu phân lập 2 Bacillus (K3 và K208) từ

Jeotgal và Kimchi cho hoạt tính enzyme thủy phân fibrin mạnh. Long và cs [57] đã

phân lập chủng Bacillus spp. từ Douchi cho hoạt tính enzyme thủy phân fibrin cao

đạt 5,500 IU/g. Rajaselvam và cs [191] đã phân lập chủng B. amyloliquefaciens

KJ10 từ bột đậu nành lên men cho thu nhận enzyme thủy phân fibrin trên môi

trường 1% sucrose đạt 3712 ± 52 U/ml. Các kết quả công bố cho thấy, các chủng vi

66

khuẩn phân lập có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủ yếu từ các

sản phẩm lên men truyền thống ở các nước được quan tâm thu nhận nhiều làm

nguồn sản xuất enzyme thủy phân fibrin.

Từ kết quả trên, chủng HY6 được chọn để tiếp tục nghiên cứu, chủng

HY6 được nhuộm Gram cho thấy tế bào của chủng HY6 bắt màu tím, là vi

khuẩn Gram dương, tế bào vi khuẩn hình que, có 2 đầu tròn, tồn tại đơn lẻ hoặc

thành đám hình chuỗi ngắn. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng

HY6 được thể hiện ở Hình 3.3.

Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và tế bào nhuộm Gram của chủng HY6 soi kính hiển

vi trên vật kính dầu 100x

Chủng HY6 có hoạt tính enzyme thủy phân fibrin cao nhất được chọn

để tiếp tục nghiên cứu cải thiện hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng.

3.2. NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY

PHÂN FIBRIN CỦA CHỦNG LỰA CHỌN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

GÂY ĐỘT BIẾN

3.2.1. Đột biến bằng tia UV

Chủng HY6 được đột biến bằng chiếu tia UV theo phương pháp ở mục

2.2.3.4.b. Quá trình đột biến UV lần 1 thu nhận được 94 dòng tế bào (phụ lục

5), các dòng tế bào thu nhận được sẽ được sàng lọc sơ bộ ban đầu qua các vòng

thủy phân sữa gầy trên đĩa LB + 1 % sữa gầy, chọn ra một số dòng tế bào có

vòng thủy phân lớn, sau đó các dòng tế bào nuôi trên môi trường GY thu nhận

dịch enzyme ngoại bào, dịch enzyme ngoại bào được nhỏ trên đĩa thạch LB + 1

67

% sữa gầy đã đục lỗ, sau đó ủ 37oC trong 4 - 6 h, qua đó lựa chọn các dòng tế

bào cho đường kính thủy phân lớn và cuối cùng thu được 06 dòng tế bào

U1_30.1, U1_60.1, U1_90.1, U1_120.1, U1_150.1 và U1_180.1 có hoạt tính

protease cao, các dòng tế bào này tiếp tục được lên men trên môi trường GY đo

hoạt độ enzyme thủy phân fibrin, cuối cùng thu được dòng tế bào U1_60.1 ở

thời gian chiếu 60 phút cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 48 ±

2,4 FU/ml. Kết quả này so với chủng gốc HY6 (49,2 ± 1,2 FU/ml) hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin của dòng tế bào U1_60.1 nhận được là không tăng, tuy

nhiên khi nhỏ hoạt tính enzyme protease thì đường kính vòng thủy phân

enzyme protease của dòng tế bào U1_60.1 lớn hơn so với chủng HY6 (~1mm),

cùng với đó, trên cơ sở nghiên cứu của Heerd và cs đã thực hiện đột biến liên

tiêp để tăng sản phẩm thu nhận của chủng đột biến. Vì vậy, dòng tế bào

U1_60.1 được lựa chọn để đột biến tiếp UV lần 2 (phương pháp đột biến và

sàng lọc như lần 1), kết quả đột biến UV lần 2 thu nhận được 85 dòng tế bào

(phụ lục 5), quá trình sàng lọc cuối cùng thu được 06 dòng tế bào U2_30.2,

U2_60.2, U2_90.2, U2_120.2, U2_150.2 và U2_180.2 có hoạt tính protease

cao, các dòng tế bào được lên men đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin, ở thời

gian đột biến UV trong 90 phút nhận được dòng tế bào U2_90.2 cho hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 50,4 ± 1,6 FU/ml. Kết quả đột biến hoạt

độ enzyme thủy phân fibrin của dòng tế bào U2_90.2 so với dòng tế bào

U1_60.1 (48 ± 2,4 FU/ml) đột biến lần 1 và HY6 (49,2 ± 1,2 FU/ml) tăng

khoảng 1,02 - 1,05 lần. Dòng tế bào U2_90.2 được sử dụng để tiếp tục đột biến

chiếu tia UV lần 3 (phương pháp tương tự lần 1 và 2), sau đột biến lần 3 thu

nhận được 91 dòng tế bào (phụ lục 5), các dòng tế bào sau khi sàng lọc cuối

cùng thu được 06 dòng tế bào U3_30.3, U3_60.3, U3_90.3, U3_120.3,

U3_150.3 và U3_180.3 có hoạt tính protease cao, các dòng tế bào này cũng

được lên men đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin, kết quả ở thời gian chiếu tia

UV 60 phút thu nhận được dòng tế bào U3_60.3 cho hoạt độ enzyme thủy phân

fibrin cao nhất đạt 104 ± 3,2 FU/ml, tăng 2,06 lần so với chủng U2_90.2 đột

biến lần 2 và tăng 2,11 lần so với chủng HY6 (49,2 ± 1,2 FU/ml). Để tiếp tục

đánh giá hiệu quả của tia UV trong cải thiện hoạt độ enzyme thủy phân fibrin

68

của dòng tế bào, dòng tế bào U3_60.3 tiếp tục cho đột biến UV lần 4 (phương

pháp như các lần đột biến trên) thu nhận được 87 dòng tế bào (phụ lục 5), quá

trình sàng lọc thu được 06 dòng tế bào U4_30.4, U4_60.4, U4_90.4, U4_120.4,

U4_150.4 và U4_180.4 có hoạt tính protease cao, các dòng tế bào tiếp tục được

lên men đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin, kết quả ở thời gian chiếu 90 phút

thu nhận được dòng tế bào U4_30.4 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất

đạt 90,4 ± 8,8 FU/ml, dòng tế bào này so với dòng tế bào U3_60.3 cho hoạt tính

enzyme thủy phân fibrin không tăng, nhưng vẫn tăng 1,84 lần so với chủng gốc

HY6. Dòng tế bào U4_30.4 tiếp tục cho đột biến chiếu UV lần 5, kết quả thu nhận

được 83 dòng tế bào (Phụ lục 5) và qua quá trình sàng lọc cuối cùng thu được dòng

tế bào U5_90.5 ở thời gian chiếu 90 phút cho hoạt độ enzyme cao nhất đạt 114 ± 8

FU/ml, so với dòng tế bào U3_60.3 (104 ± 3,2 FU/ml) tăng 1,09 lần và U4_30.4

(90,4 ± 8,8 FU/ml) tăng 1,26 lần, và tăng 2,31 lần so với chủng HY6. Kết quả đột

biến UV lần 5 hoạt độ enzyme thủy phân fibrin tăng 2,31 lần chủng HY6 so với kết

quả đột biến UV lần 3 là 2,11 lần, có tăng nhưng không nhiều (0,2 lần). Vì vậy, quá

trình đột biến chủng bằng tia UV được dừng lại sau 5 lần đột biến. Kết quả sau 5 lần

đột biến tia UV được tổng hợp ở Hình 3.4.

n

120

i r b

100

80

) l

/

60

m U F (

40

i f n â h p y ủ h t e m y z n e

20

0

1

2

1

1

2

2

3

3

3

4

4

4

5

5

5

1

2

1

1

2

2

3

3

3

4

4

4

5

5

5

ộ đ t ạ o H

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

0 9

0 9

0 3

0 6

0 3

0 6

0 3

0 6

0 9

0 3

0 6

0 9

0 3

0 6

0 9

6 Y H

0 8 1

0 8 1

0 2 1

0 5 1

0 2 1

0 5 1

0 2 1

0 5 1

0 8 1

0 2 1

0 5 1

0 8 1

0 2 1

0 5 1

0 8 1

30 ph

60 ph

90 ph

120 ph

150 ph

180 ph

30 ph

60 ph

90 ph

120 ph

150 ph

180 ph

30 ph

60 ph

90 ph

120 ph

150 ph

180 ph

30 ph

60 ph

90 ph

120 ph

150 ph

180 ph

30 ph

60 ph

90 ph

120 ph

150 ph

180 ph

U1

U2

U3

U4

U5

Số lần và thời gian chiếu tia UV

Hình 3.4. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng đột biến bằng tia UV

Từ kết quả đột biến Hình 3.4 cho thấy, sau 5 lần đột biến liên tiếp

chủng HY6 bằng tia UV, thu nhận được dòng tế bào U5_90.5 cho hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 114 ± 8 FU/ml, tăng 2,31 lần so với

69

chủng HY6 ban đầu. Kết quả này cao hơn so với một số kết quả nghiên cứu

trước đó đã được công bố như Sher và cs [107] đã báo cáo rằng dòng tế bào đột

biến của chủng B. subtilis G-4 đã tăng sản lượng protease của nó lên khoảng 2

lần so với chủng ban đầu sau khi được xử lý tia UV trong 10 phút. Tương tự,

Demirkan và cs [109] đã thu được dòng tế bào đột biến của chủng B. subtilis

E6-5 bằng chiếu tia UV ở khoảng cách 15 cm và thời gian chiếu là 5 phút cho

hoạt tính protease tăng gấp 1,5 lần so với chủng ban đầu. Gopinath và cs [116]

đã nghiên cứu đột biên chủng Serratia marcescens bằng tia UV ở khoảng cách

5cm, dòng tế bào đột biến thu nhận được cho hoạt tính enzyme tăng 1,17 lần so

với chủng ban đầu sau 40 giây chiếu xạ. Tuy nhiên, dòng tế bào đột biến bằng

tia UV cải thiện hoạt tính enzyme vẫn chưa đủ đáp ứng khả năng sản xuất

protease hoặc enzyme thủy phân fibrin để có thể áp dụng trong sản xuất

enzyme quy mô lớn.

3.2.2. Đột biến chủng HY6 bằng hóa chất EtBr

Chủng HY6 được đột biến bằng hóa chất EtBr theo phương pháp ở mục

2.2.3.4.b. Quá trình đột biến thu nhận được 214 dòng tế bào (Phụ lục 6), các

dòng tế bào được sàng lọc sơ bộ như phương pháp sàng lọc các dòng tế bào ở

đột biến UV, cuối cùng thu nhận được 29 dòng tế bào cho hoạt tính protease

cao, 29 dòng tế bào này được lên men trên môi trường GYP xác định hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin. Kết quả đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các

dòng tế bào được thể hiện ở các Hình 3.5.

n

i r b

) l

/

m U F (

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

8 H

1 H

6 H

2 H

7 H

3 H

9 H

4 H

5 H

3 1 H

5 1 H

0 2 H

5 2 H

6 1 H

1 2 H

6 2 H

0 1 H

7 1 H

2 2 H

7 2 H

1 1 H

2 1 H

8 1 H

3 2 H

8 2 H

4 1 H

9 1 H

4 2 H

9 2 H

6 Y H

i f n â h p y ủ h t e m y z n e ộ đ t ạ o H

30 ph

60 ph

90 ph

120 ph

150 ph

30 ph

60 ph 90 ph

120 ph

150 ph

30 ph

60 ph 90 ph

120 ph

150 ph

30 ph

60 ph 90 ph

120 ph

150 ph

30 ph

60 ph 90 ph

120 ph

150 ph

50μg/ml

100μg/ml

150μg/ml

200μg/ml

250μg/ml

Thời gian và nồng độ hóa chất EtBr đột biến

70

Hình 3.5. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng đột biến bằng EtBr

Từ Hình 3.5 cho thấy, chủng HY6 sau đột biến bằng EtBr sàng lọc và thu

nhận được 29 dòng tế bào đột biến cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin từ 64 ± 16

FU/ml đến 180 ± 8 FU/ml. Có 27/29 dòng tế bào cho hoạt độ enzyme thủy phân cao

hơn chủng HY6 ban đầu, cho hiệu quả đột biến đạt tỉ lệ 93,1 %. Dòng tế bào cho hoạt

độ enzyme cao nhất đạt 180 ± 8 FU/ml là dòng tế bào H12 đột biến ở nồng độ 200

μg/ml và thời gian xử lý với hóa chất là 60 phút, tăng 2,23 lần so với chủng HY6 ban

± 1,2 FU/ml. So với dòng tế bào U5_90.5 qua 5 lần đột biến bằng tia UV (hoạt độ

đầu. Trên môi trường GYP, chủng HY6 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin là 80,4

enzyme thủy phân fibrin trên môi trường lên men GYP đạt 177,8 ± 9,8 FU/ml) thì

hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của dòng tế bào H12 là tăng xấp xỉ nhau.

3.2.3. Đột biến bằng UV kết hợp hóa chất

Để lựa chọn được dòng tế bào cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao

từ chủng HY6, chủng U5_90.5 qua đột biến UV 5 lần liên tiếp, tiếp tục cho đột

biến bằng hóa chất EtBr và EMS theo phương thức đột biến riêng lẻ hoặc kết

hợp nhằm thu nhận được dòng tế bào cho hoạt độ enzyme cao.

3.2.3.1. Đột biến chủng U5_90.5 bằng EtBr

Chủng U5_90.5 thu nhận được từ chủng HY6 sau đột biến 5 lần bằng

UV sẽ tiếp tục cho đột biến với hóa chất EtBr ở các nồng độ và thời gian xử lý

khác nhau (mục 2.2.3.4.b), thu được 201 chủng (Phụ lục 6), sau khi sàng lọc

trên môi trường LB agar + 1 % sữa gầy (sàng lọc sơ bộ như phương pháp sàng

lọc các dòng tế bào ở đột biến UV) thu nhận được 35 chủng có vòng đường

kính thủy phân lớn được chọn lọc để lên men xác định hoạt độ enzyme thủy

phân fibrin. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của 35 chủng sàng lọc được thể

hiện trên Hình 3.6.

Từ kết quả Hình 3.6 cho thấy, sau khi sàng lọc hoạt độ enzyme thủy

phân fibrin của 35 chủng sau đột biến hóa chất EtBr thu nhận được 05 chủng

E1, E2, E3, E4 và E5 cho hoạt độ enzyme thủy phân lớn hơn chủng đột biến

U5_90.5 (177,8 ± 9,8 FU/ml), chủng cũng cho hoạt độ enzyme cao hơn 300

FU/ml. Trong đó, có 02 chủng cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất đó

là E1 (452 ± 4 FU/ml) và E5 (440 ± 8 FU/ml). Các chủng đột biến còn lại cho

71

hoạt độ enzyme thủy phân thấp hơn so với chủng U5_90.5, điều này cho thấy tỉ

lệ đột biến có lợi cho hiệu quả không cao (làm tăng hoạt độ enzyme), đạt tỉ lệ

500

14,28%.

) l

/

450

400

m U F ( n

i r b

350

300

250

200

150

100

50

i f n â h p y ủ h t e m y z n e ộ đ t ạ o H

0

.

1 E

2 E

3 E

4 E

5 E

6 E

7 E

8 E

9 E

2 2 E

0 2 E

1 1 E

2 1 E

1 2 E

6 2 E

1 3 E

3 1 E

4 1 E

7 2 E

2 3 E

5 1 E

6 1 E

3 2 E

8 2 E

3 3 E

7 1 E

8 1 E

4 2 E

9 2 E

4 3 E

0 1 E

9 1 E

5 2 E

0 3 E

5 3 E

5 0 9 _ 5 U

30 ph 60 ph 90 ph

120 ph

150 ph

30 ph 60 ph 90 ph

120 ph

150 ph

30 ph 60 ph 90 ph

120 ph

150 ph

30 ph 60 ph 90 ph

120 ph

150 ph

30 ph 60 ph 90 ph

120 ph

150 ph

50μg/ml

100μg/ml

150μg/ml

200μg/ml

250μg/ml

Thời gian và tác nhân đột biến U5_90.5 bằng EtBr

Hình 3.6. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng đột biến bằng EtBr từ

chủng U5_90.5

Khi chủng U5_90.5 đã qua đột biến UV 5 lần, cho đột biến tiếp với hóa

chất EtBr thu nhận được chủng đột biến E1 có hoạt độ enzyme thủy phân fibrin

lên đến 452 ± 4 FU/ml, tăng 5,5 lần so với chủng gốc HY6 và tăng 2,5 lần so

với chủng đột biến bằng UV (U5_90.5) và hóa chất trực tiếp (H12).

3.2.3.2. Đột biến chủng U5_90.5 bằng EMS

Chủng U5_90.5 cho đột biến với hóa chất EMS tương tự như đột biến

với hóa chất EtBr theo phương pháp mục 2.2.3.4.b. Sau đột biến, thu nhận được

196 chủng (Phụ lục 6), các chủng được sàng lọc trên môi trường LB agar + 1 %

sữa gầy (sàng lọc sơ bộ như phương pháp sàng lọc các dòng tế bào ở đột biến

UV) thu nhận được 38 chủng có vòng đường kính thủy phân lớn được chọn lọc

để lên men xác định hoạt độ enzyme thủy phân fibrin. Hoạt độ enzyme thủy

72

phân fibrin của 38 chủng sàng lọc được thể hiện trên Hình 3.7.

500

) l

450

/

400

m U F ( n

i r b

350

300

250

200

150

i f n â h p y ủ h t e m y z n e

100

50

ộ đ t ạ o H

0

.

1 S

2 S

3 S

4 S

5 S

6 S

7 S

8 S

9 S

4 3 S

7 3 S

1 1 S

2 1 S

1 2 S

6 2 S

1 3 S

2 3 S

3 1 S

4 1 S

2 2 S

7 2 S

3 3 S

5 1 S

6 1 S

3 2 S

8 2 S

5 3 S

6 3 S

7 1 S

8 1 S

4 2 S

9 2 S

0 1 S

9 1 S

0 2 S

5 2 S

0 3 S

8 3 S

5 0 9 _ 5 U

30 ph 60 ph 90 ph

120 ph

150 ph 30 ph 60 ph 90 ph

120 ph

150 ph 30 ph 60 ph 90 ph

120 ph

150 ph 30 ph 60 ph 90 ph

120 ph

150 ph

30 ph 60 ph 90 ph

120 ph

150 ph

50μg/ml

100μg/ml

150μg/ml

200μg/ml

250μg/ml

Thời gian và tác nhân đột biến U5_90.5 bằng EMS

Hình 3.7. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến bằng EMS

từ chủng U5_90.5

Từ Hình 3.7 cho thấy, sau khi sàng lọc, lên men đo hoạt độ enzyme

thủy phân fibrin của 38 chủng sau đột biến hóa chất EMS thu nhận được 25/38

chủng cho hoạt độ enzyme thủy phân cao hơn chủng U5_90.5, chiếm tỉ lệ 65,78

% đột biến có lợi, còn lại các chủng cho hoạt độ enzyme thấp hơn so với chủng

U5_90.5. Trong số 25 chủng cho hoạt độ enzyme tăng, có 04 chủng S7, S9, S33

và S37 cho hoạt độ enzyme thủy phân lớn hơn 300 FU/ml. Chủng S33 cho hoạt

độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 456 ± 8 FU/ml. Kết quả này so với đột

biến bằng EtBr cho thấy, hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của 2 chủng S33 và

E1 là tương đương nhau, chủng S33 thu nhận được sau đột biến cho hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin tăng so với chủng HY6 ban đầu là 5,6 lần.

3.2.3.3. Đột biến chủng E1 (đã đột biến UV và EtBr) bằng EMS

Để cải thiện hoạt tính enzyme chủng hơn nữa, chủng E1 đã qua đột biến

UV 5 lần và hóa chất EtBr cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất (ở

73

mục 3.2.3.1) tiếp tục cho đột biến hóa chất EMS cùng ở các nồng độ và thời

gian xử lý theo phương pháp mục 2.2.3.4.b. Sau đột biến thu nhận được 205

chủng (Phụ lục 6), các chủng này được sàng lọc trên môi trường LB agar + 1 %

sữa gầy thu nhận được 27 chủng có vòng đường kính thủy phân lớn được chọn

lọc để lên men xác định hoạt độ enzyme thủy phân fibrin. Hoạt độ enzyme thủy

450

phân fibrin của 27 chủng sàng lọc được thể hiện trên Hình 3.8.

) l

/

400

m U F ( n

350

i r b

300

250

200

150

100

50

i f n â h p y ủ h t e m y z n e ộ đ t ạ o H

0

.

.

.

.

.

.

.

.

.

1 E

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

1 1 E

6 1 E

2 1 E

7 1 E

3 1 E

8 1 E

4 1 E

9 1 E

5 1 E

4 2 1 E

3 1 1 E

8 1 1 E

3 2 1 E

4 1 1 E

9 1 1 E

5 1 1 E

0 2 1 E

5 2 1 E

0 1 1 E

6 1 1 E

1 2 1 E

6 2 1 E

1 1 1 E

2 1 1 E

7 1 1 E

2 2 1 E

7 2 1 E

60 ph

60 ph

30 ph

60 ph

90 ph

120 ph

150 ph

30 ph

60 ph

90 ph

120 ph

150 ph

30 ph

60 ph

90 ph

120 ph

150 ph

30 ph

90ph 120 ph

150 ph

30 ph

90 ph

120 ph

150 ph

50μg/ml

100μg/ml

150μg/ml

200μg/ml

250μg/ml

Thời gian và tác nhân đột biến E1 bảng EMS

Hình 3.8. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến bằng EMS

từ chủng E1

Kết quả từ Hình 3.8 cho thấy, sau khi sàng lọc sơ bộ thu nhận được 27

chủng có hoạt tính protease cao, lên men đo hoạt độ enzyme thủy phân fibrin

của 27 chủng thu nhận được đều thấp hơn rất nhiều với chủng E1, có duy nhất

1 chủng E1.10 cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 320 ± 16

FU/ml nhưng vẫn thấp hơn so với E1. Kết quả này cho thấy, việc đột biến

chủng E1 (đã qua đột biến UV và đột biến hóa chất EtBr) tiếp tục với hóa chất

EMS qua sàng lọc và thu nhận được các chủng đột biến có hoạt độ enzyme thủy

phân fibrin không cao, các chủng đột biến thu nhận được không đem lại hiệu

74

quả trong cải thiện hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng.

3.2.3.4. Đột biến chủng U5_90.5 bằng EtBr kết hợp với EMS

Chủng U5_90.5 tiếp tục cho đột biến kết hợp cùng lúc 2 hóa chất EtBr và

EMS, với cùng nồng độ hóa chất (tỉ lệ 1:1), ở các khoảng thời gian xử lý theo

mục 2.2.3.4.b. Quá trình sau đột biến thu nhận được 104 chủng (Phụ lục 6), các

chủng này được sàng lọc trên môi trường LB agar + 1 % sữa gầy thu được 33

chủng cho vòng phân hủy sữa gầy lớn, 33 chủng có vòng phân hủy sữa gầy lớn

được lên men xác định hoạt độ enzyme thủy phân fibrin, kết quả hoạt độ enzyme

400

350

thủy phân fibrin của 33 chủng được tổng hợp trên Hình 3.9.

) l

/

300

m U F ( n

250

i r b

200

150

100

50

i f n â h p y ủ h t e m y z n e

0

5

.

1 S E

2 S E

3 S E

4 S E

5 S E

6 S E

7 S E

8 S E

9 S E

2 1 S E

4 1 S E

6 1 S E

2 2 S E

8 2 S E

1 1 S E

9 1 S E

4 2 S E

9 2 S E

3 1 S E

0 2 S E

5 2 S E

0 3 S E

5 1 S E

1 2 S E

6 2 S E

1 3 S E

7 1 S E

7 2 S E

2 3 S E

0 1 S E

8 1 S E

3 2 S E

3 3 S E

0 9 _ 5 U

ộ đ t ạ o H

30 ph

60 ph

30 ph

60 ph

30 ph

60 ph

30 ph

30 ph

90 ph

120 ph

150 ph

90 ph

120 ph

150 ph

60 ph

90 ph

120 ph

150 ph

60 ph

90 ph

120 ph

150 ph

90ph 120 ph

150 ph

50μg/ml

100μg/ml

150μg/ml

200μg/ml

250μg/ml

Thời gian và tác nhân đột biến U5_90.5 bàng EtBr+EMS

Hình 3.9. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng được đột biến bằng EtBr

kết hợp EMS

Từ Hình 3.9 cho thấy, hoạt độ enzyme của 33 chủng thu nhận được đạt

từ 20 ± 4 FU/ml đến 416 ± 8 FU/ml. Có 17/33 chủng cho hoạt độ enzyme thủy

phân cao hơn chủng U5_90.5, cho tỉ lệ đột biến có lợi đạt 51,51 %, còn lại các

chủng cho hoạt độ enzyme thấp hơn chủng U5_90.5. Trong 17 chủng cho hoạt

độ enzyme cao thì có 06 chủng ES3, ES4, ES17, ES18, ES25 và ES31 cho hoạt

độ enzyme thủy phân lớn hơn 300 FU/ml. Trong đó, chủng ES4 cho hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 416 ± 8 FU/ml, cho hoạt độ enzyme thủy

75

phân fibrin tăng 5 lần so với chủng HY6 ban đầu. Kết quả chủng ES4 cho hoạt

độ enzyme thủy phân fibrin tăng xấp xỉ với các chủng E1, E5, S33 đột biến thu

được trước đó.

Từ kết quả trên cũng cho thấy, các chủng thu nhận được sau khi đột

biến kết hợp UV và hóa chất cơ bản cho tỉ lệ đột biến có lợi cao hơn khi đột

biến riêng lẻ. Quá trình đột biến bằng UV kết hợp hóa chất thu nhận được 04

chủng cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất đó là E1 (452 ± 4 FU/ml),

E5 (440 ± 8 FU/ml), S33 (456 ± 8 FU/ml) và ES4 (416 ± 8 FU/ml), các chủng

này cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin tăng từ 5 - 5,6 lần so với hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin của chủng HY6 ban đầu trên môi trường lên men

GYP. Hiệu quả cải thiện hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng khi kết

hợp đột biến UV với hóa chất cao hơn so với các chủng đột biến bằng UV hoặc

đột biến bằng hóa chất (hoạt độ enzyme thủy phân fibrin tăng 2,1 - 2,2 lần).

Trước đó, Wang và cs [192] đã đột biến kết hợp UV và NTG nhận được

đột biến của chủng B. subtilis S1-4 có hoạt tính phân giải casein ngoại bào cao

gấp 2,5 lần so với chủng dại. Soliman và cs [106] đã nghiên cứu tăng cường

sản xuất protease của một số Bacillus spp. bằng phương pháp gây đột biến vật

lý và hóa học cho năng suất tăng gấp 2 - 3 lần so với các dòng bố mẹ. Sự đột

biến kết hợp của chủng dại với UV và hóa chất đã tạo ra chủng đột biến tốt hơn

cho hoạt tính enzyme thủy phân fibrin cao hơn so với sử dụng một trong hai

phương pháp đột biến UV hoặc hóa chất [116].

3.2.4. Độ ổn định của các chủng đột biến

Kết quả thu được 4 chủng đột biến cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin

cao E1, E5, S33 và ES4. Các chủng đột biến và chủng HY6 được kiểm tra về

tính ổn định sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin qua 10 lần cấy chuyển, sau

10 lần cấy chuyển lựa chọn ra chủng đột biến có độ ổn định cao nhất để tiếp tục

nghiên cứu. Kết quả kiểm tra độ ổn định hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của

các chủng đột biến được thể hiện ở Hình 3.10 cho thấy, hoạt độ enzyme thủy

phân fibrin của chủng HY6 được phân lập từ đậu tương lên men truyền thống

đã được cải thiện đáng kể nhờ đột biến UV kết hợp với EtBr và/hoặc EMS. Đối

với chủng đột biến UV (U5_90.5), cho hoạt tính enzyme thủy phân fibrin

76

không ổn định và giảm 29% sau 10 lần cấy chuyển, các chủng đột biến kết hợp

UV với EtBr (E1 và E5) hoặc EMS (S33) hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của

chủng cũng bị giảm từ 12% đến 8% sau 10 lần cấy chuyển (Hình 3.10). Chủng

đột biến ES4 qua 10 lần cấy chuyển, cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của

chủng đạt 404 ± 4 FU/ml, chủng có độ ổn định nhất trong 5 chủng đột biến,

hoạt độ enzyme thủy phân fibrin giảm ít nhất 2,88 %. Điều này cho thấy, khả

năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng có ổn định cao và có tiềm

năng sử dụng làm chủng sản xuất trong quá trình lên men.

) l

500

/

450

400

350

300

250

200

150

m U F ( n i r b i f n â h p y ủ h t e m y z n e

100

50

ộ đ t ạ o H

0

h t 4

h t 6

h t 8

h t 4

h t 6

h t 8

d n 2

d n 2

h t 4

h t 6

h t 8

h t 4

h t 6

h t 8

h t 4

h t 6

h t 8

h t 4

h t 6

h t 8

d n 2

d n 2

d n 2

d n 2

h t 0 1

h t 0 1

h t 0 1

h t 0 1

h t 0 1

h t 0 1

HY6

U5_90.5

E1

E5

S33

ES4

Tên chủng và số lần cấy chuyển của chủng

Hình 3.10. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của các chủng qua 10 lần cấy chuyển

Kết quả hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng đột biến ES4 tăng

khoảng 5 lần so với chủng HY6 trên môi trường GYP. Trước đó Wang và cs [193]

đã có nghiên cứu báo cáo về tính ổn định của chủng đột biến B. subtilis LD-8547

sau 4 thế hệ. Bhavani và cs [111] đã phát hiện và cải thiện tính ổn định của

Streptomyces venezuela khi sử dụng UV và EMS. Hussain và cs [194] đã đột biến

chủng bằng NTG và hai chủng đột biến đã được khảo sát và cho độ ổn định.

Kết quả, chủng HY6 sau khi được nâng cao hoạt tính enzyme thủy phân

fibrin bằng đột biến UV sau đó đột biến kết hợp EtBr và EMS cho thu nhận

chủng đột biến ES4 có hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 404 ± 4

77

FU/ml sau 10 lần cấy chuyển, tăng 5 lần so với chủng HY6 gốc.

3.2.5. Bước đầu tìm hiểu về hệ gen liên quan đến enzyme thủy phân

fibrin của chủng HY6 ban đầu và chủng đột biến ES4

So sánh, phân tích genome của chủng HY6 và ES4 được thực hiện trên

hệ thống RAST (trang https://rast.nmpdr.org/rast.cgi). Kết quả thu nhận được một

số đặc điểm cơ bản về hệ gen của 2 chủng được thể hiện ở Bảng 3.3.

Chủng HY6

Chủng ES4

24

28

Số lượng contig

3912654

3914062

Kích thước hệ gen (bp)

Số lượng contig (với PEGs)

24

28

Tỷ lệ GC (%)

45,78

45,78

Số lượng các trình tự mã hóa protein

4351

4101

Số lượng hệ thống phân loại

329

329

Số lượng gen mã hóa RNAs

54

54

rRNAs

2

2

tRNAs

52

52

TmRNAs

1

1

Bảng 3.3. Đặc điểm tổ hợp bộ gen của chủng HY6 và ES4

Từ Bảng 3.3 cho thấy, chủng HY6 và ES4 có chênh nhau về kích thước

bộ gen, chủng HY6 có kích thước bộ gen 3912654 bp, với tổng cộng 4351 trình

tự mã hóa các protein. Chủng ES4 có kích thước bộ gen 3914062 bp với tổng

cộng 4101 trình tự mã hóa các protein. Kích thước bộ gen của chủng ES4 tăng

so với chủng HY6 là 1408 bp. Tỷ lệ phần trăm GC của 2 chủng không thay đổi

chiếm 45,78%. Dự đoán chức năng của gen trên nền tảng RAST cho thấy mỗi

chủng có 54 gen mã hóa rRNA.

Phân tích trình tự hệ gen (whole genome sequencing): Gen được chú giải

trên hệ thống máy chủ RAST, số gen được dự đoán chức năng trong hệ thống

(subsystem) của mỗi chủng đạt 28% (Hình 3.11 và Hình 3.12), với các gen trong

subsystem nhỏ đều giống nhau.

Chủng HY6 và ES4 được giải toàn bộ trình tự gen, kết quả 2 chủng được

xác định là Bacillus amyloliquefaciens đã có trong ngân hàng gen của GenBank.

78

Chủng HY6 và ES4 được xây dựng cây phân loài trên TYPE (STRAIN) GENOME

SERVER (https://tygs.dsmz.de/user_requests/new) cho thấy, chủng HY6 và ES4

gần giống nhất với chủng Bacillus amyloliquefaciens DSM7 (Phụ lục 8).

Hình 3.11. Kết quả chạy RAST chủng HY6

Hình 3.12. Kết quả chạy RAST chủng ES4

Các trình tự gen được cho là khác nhau sẽ được BLAST trên trang

http://ncbi.nlm.nih.gov. qua đó thu nhận được số liệu các gen thay đổi và được tổng

79

hợp ở Bảng 3.4.

Bảng 3.4. Các gen thay đổi giữa chủng HY6 gốc và chủng ES4 đột biến

TT HY6 ES4 Sự thay đổi protein

S->A 1 >CALMKEOM_00581 Sporulation kinase A >LCCANNEE_00351 Sporulation kinase A

Không thay đổi 2 >LCCANNEE_03339 Sporulation protein YunB >CALMKEOM_01099 Sporulation protein YunB

>LCCANNEE_04149 Sporulation protein YunB I->V,S->N,Q- >K,S->N

>LCCANNEE_02502 Không thay đổi 3 >CALMKEOM_02669 Protein SprT-like protein Protein SprT-like protein

4 >CALMKEOM_02828 G->S Ferredoxin--NADP reductase 1 >LCCANNEE_02661 Ferredoxin--NADP reductase 1

5 >CALMKEOM_02905 Không thay đổi Glutaminase 1 >LCCANNEE_02738 Glutaminase 1

6 >CALMKEOM_03627 Không thay đổi Protein UmuC

>LCCANNEE_03733 Không thay đổi 7 >CALMKEOM_03629 DNA polymerase IV DNA polymerase IV

>LCCANNEE_02788 8 >CALMKEOM_04093

tRNA-Tyr(gta) tRNA-Tyr(gta) Đột biến 3 nucleotid: A  G, T  G, C T

Từ Bảng 3.4 cho thấy, ở mục số 8 là gen mã hóa tRNA(tyr) (là RNA vận

chuyển đặc hiệu cho tyrosine), trên gen có xuất hiện đột biến 3 điểm A -> T, T -> G,

C -> T, 3 điểm đột biến này là rất nhỏ so với kích thước của hệ gen, do đó, khi tính

toán tỉ lệ GC theo % thì tỉ lệ này gần như không thay đổi. Kết quả này cũng được thể

hiện ở Bảng 3.3 (khi phân tích so sánh genome của 2 chủng HY6 và ES4 trên hệ

thống RAST), tỉ lệ % GC giữa 2 chủng là không thay đổi (45,78 %). Ở mục số 1 và 2

là 2 gen có liên quan đến bào tử, gen spoA thay đổi có khả năng liên quan đến sự hình

thành bào tử của chủng, ở mục số 4 là gen mã hóa cho enzyme trong chuỗi vận

chuyển điện tử.

Trên cơ sở phân tích sự thay đổi các gen giữa 2 chủng HY6 và ES4, 2

80

chủng này được thực hiện khảo sát sơ bộ trên môi trường LB + 1% sữa gầy ở 37oC

cho thấy, đặc điểm khuẩn lạc của chủng ES4 khác so với chủng HY6, khuẩn lạc có

đường kỉnh nhỏ hơn so với chủng gốc ở cùng một thời gian nuôi 16 h, khuẩn lạc

của chủng đột biến ES4 trong và lồi hơn so với chủng gốc. Hai chủng sau đó được

nuôi trên môi trường DSM tạo bào tử kéo dài 7 ngày ở điều kiện lắc 150

vòng/phút, nuôi ở nhiệt độ 37oC, sau 3 ngày nuôi 2 chủng được lấy mẫu, trải đĩa

đếm khuẩn lạc ở thời điểm 24 h, nhuộm bào tử để quan sát dưới kính hiển vi. Kết

quả, chủng ES4 không có tạo bào tử so với chủng gốc HY6 (chủng HY6 cho kết

quả tạo bào tử đạt 98%, trong khi đó chủng ES4 là 0% (không tạo bào tử), chủng

ES4 được nuôi kéo dài đến 7 ngày. Kết quả nhuộm bào tử không thấy có, không

có khuẩn lạc xuất hiện sau nuôi trải mật độ trên đĩa Petri (Phụ lục 7). Kết quả này

tương đồng với kết quả nghiên cứu của Zhang và cs [195] khi đó cũng đột biến

chủng Bacillus amyloliquefaciens bằng UV, chủng đột biến thu nhận được cho hoạt

tính protease ngoại bào cao, không sinh bào tử.

Khảo sát lên men 2 chủng HY6 và ES4 trên 50 ml muôi trường GYP

trong bình tam giác 250 ml/24 h, thu dịch lên men, ly tâm loại bỏ sinh khối tế

bào, đo độ nhớt của dịch lên men 2 chủng cho thấy độ nhớt dịch lên men của

chủng đột biến ES4 (3 mPas) giảm so với dịch lên men của chủng gốc HY6 (4

mPas). Điều này có thể chủng đột biến ES4 bị tác động làm giảm khả năng sinh

PGA (poly-γ-glutamic acid), PGA là một trong những chất làm tăng độ nhớt của

dịch lên men [196]. Trước đó, Geng và cs [197] đã có nghiên cứu chỉ ra vi khuẩn B.

amyloliquefaciens có khả năng sinh PGA. Trong lên men, dịch sau lên men có độ

nhớt cao sẽ ảnh hưởng nhiều đến khả năng thu hồi các sản phẩm, nó gây khó khăn

hơn trong quá trình lắng, lọc và ly tâm dịch thu hồi trong quá trình loại bỏ sinh khối

và tách sản phẩm đích. Sinh khối tạo thành của chủng đột biến ES4 so với chủng

gốc HY6 không tăng, tuy nhiên khi đo hàm lượng protein hòa tan trong dịch lên

men của chủng đột biến ES4 tăng 1,2 lần so với chủng gốc HY6, điều này cho

thấy, chủng đột biến ES4 có khả năng tăng sinh protein ngoại bào so với chủng

HY6, góp phần tăng hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng, hoạt độ

enzyme/hàm lượng protein hòa tan của chủng đột biến ES4 tăng khoảng 4 lần

so với chủng HY6. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng đột biến ES4

81

tăng khoảng 5 lần so với chủng gốc HY6 (Bảng 3.5). Hai chủng được khảo sát

khả năng sinh enzyme amylase và cellulase trên môi trường thạch LB + 0,1%

CMC và LB + 1% tinh bột ở 37oC trong 6 h, sau đó nhuộm Lugol 1,5 %, kết

quả cho thấy 2 chủng đều có hoạt tính enzyme amylase và enzyme cellulase

(Phụ lục 5), trước đó Gould và cs [198] cũng đã chứng minh chủng B.

amyloliquefaciens có khả năng sinh enzyme amylase và cellulase ngoại bào.

Bảng 3.5. Đặc điểm của chủng đột biến ES4 thay đổi so với chủng HY6 gốc ban đầu

TT Đặc điểm HY6 ES4

Hình thái khuẩn lạc Khuẩn lạc to, tròn hơn, Khuẩn lạc màu trắng 1

màu trắng, không lồi. trong và nhỏ hơn, lồi.

Khả năng tạo bào tử Có Không 2

Sinh khối (SK) khô 3,7 g/l 3,1 g/l 3

Hàm lượng protein hòa 280,64 ± 28,72 μg/ml 338,12 ± 29,26 μg/ml 4

tan

Hoạt độ enzyme thủy 144 ± 3 FU/ml 707, 14 ± 21,43 FU/ml 5

phân fibrin

Hoạt độ enzyme/SK 6

Hoạt độ enzyme/hàm 38,92 FU/mg 0,513 FU/µg 228,11 FU/mg 2,091 FU/µg 7

lượng protein hòa tan

Độ nhớt của dịch lên 8 4 mPas 3 mPas men

Kết quả các phản ứng sinh hoá của 2 chủng HY6 và ES4 trên bộ kit

Api-20E và 50CH được tổng hợp ở Phụ lục 9 cho thấy 2 chủng có các phản ứng

sinh hóa cơ bản là giống nhau, chỉ khác nhau 01 phản ứng sinh hóa số 24

(Arbutin). Đối với chủng đột biến ES4 có khả năng sinh arbutin còn HY6 thì

không (Arbutin là một dạng hydroquinone trong phân tử có chứa glucose, giúp ức

chế enzyme sản sinh ra melanin trong tế bào).

3.3. NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN

FIBRIN CỦA CHỦNG ES4 BẰNG KỸ THUẬT LÊN MEN

3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp để sinh tổng

82

hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng ES4

3.3.1.1. Nguồn carbon

Để lựa chọn được nguồn carbon thích hợp cho chủng ES4 sinh tổng hợp

enzyme thủy phân fibrin cao. Dựa trên thành phần môi trường GYP ban đầu,

nguồn dinh dưỡng carbon trong môi trường sẽ được khảo sát thay đổi bằng một

số nguồn carbon khác nhau như glucose, sucrose, maltose và glycerol. Kết quả

khảo sát sau 24 h lên men trên bình tam giác hoạt độ enzyme thủy phân fibrin

FU/ml

OD (600nm)

của chủng đột biến ES4 được thể hiện ở Hình 3.13.

) l

400

10

/

8

300

)

6

m n 0 0 6 (

200

D O

4

ị r t á i G

100

2

m U F ( n i r b i f n â h p y ủ h t e m y z n e ộ đ t ạ o H

0

0

Glucose

Sucrose

Glycerol

Maltose

Nguồn carbon

Hình 3.13. Ảnh hưởng của nguồn carbon

Từ Hình 3.13 cho thấy, trong 4 nguồn carbon khảo sát thì nguồn carbon

là glucose có trong thành phần môi trường GYP ban đầu vẫn cho hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin của chủng đột biến ES4 là cao nhất, cao hơn nguồn

sucrose và maltose, nguồn carbon là glycrol cho hoạt độ enzyme thủy phân

thấp nhất trong số 4 nguồn carbon khảo sát, hoạt độ enzyme thủy phân của

chủng ES4 khi nuôi trên nguồn carbon là glycerol giảm 56% so với hoạt độ

enzyme của chủng thu nhận được khi nuôi trên nguồn carbon là glucose. Đối

với nguồn carbon là sucrose và maltose cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin

của chủng thu nhận được giảm so với nguồn carbon là glucose tương ứng 8%

và 25%. Đối với mật độ tế bào của chủng cho thấy trên môi trường có thành

83

phần nguồn carbon là maltose chủng cho giá trị OD là cao nhất (OD = 8,77)

trong 4 nguồn carbon được khảo sát. Từ Hình 3.13 cũng cho thấy hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin của chủng tăng khi mật độ tế bào tăng. Tuy nhiên, so

với 4 nguồn carbon thì nguồn glucose mặc dù cho hiệu quả tạo sinh khối không

bằng maltose nhưng lại cho hiệu quả sinh tổng hợp enzyme cao hơn. Trước đó,

chủng Bacillus natto được Wang và cs [133] khảo sát lựa chọn sử dụng nguồn

carbon là glucose để tối ưu nhằm tăng sản phẩm nattokinase của chủng. Chủng

Bacillis subtilis được Kwon và cs [134] khảo sát sử dụng nguồn carbon là

glucose kết hợp với peptone theo tỉ lệ bổ sung trong quá trình lên men nhằm

tăng sản phẩm nattokinase của chủng. Chủng B. subtils natto được Tuấn và cs

[135] khảo sát sử dụng nguồn carbon là glucose để tối ưu nhằm tăng khả năng

sinh tổng hợp enzyme nattokinase của chủng. Tuy nhiên, đối với chủng

Bacillus subtilis K-C3 được Unrean và cs [136] sử dụng nguồn carbon là

glycerol để bổ sung trong quá trình lên men nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp

nattokinase của chủng. Đối với chủng B. amyloliquefaciens CGMCC được Xiao

và cs [138] sử dụng maltose là nguồn carbon để tối ưu cho thu nhận hoạt độ

enzyme thủy phân fibrin cao hơn. Đối với chủng Paenibacillus sp. IND8 được

Vijayaraghavan và cs [140] sử dụng saccarose làm nguồn carbon để tối ưu cho

thu nhận enzyme thủy phân fibrin cao. Điều này cho thấy các chủng vi khuẩn

có đặc tính sử dụng nguồn carbon khác nhau trong sinh tổng hợp enzyme và

cần được khảo sát nguồn carbon thích hợp cho các chủng. Trong nghiên cứu

này, nguồn dinh dưỡng carbon là glucose được chọn là nguồn carbon cho

chủng ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin.

3.3.1.2. Nguồn nitrogen

Trên cơ sở nguồn dinh dưỡng carbon là glucose đã được lựa chọn,

chủng ES4 tiếp tục được khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng

sinh tổng hợp enzyme của chủng. Để lựa chọn được nguồn nitrogen thích hợp

cho chủng ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao, trên thành phần môi

trường GYP có nguồn carbon là glucose, nguồn dinh dưỡng nitrogen trong môi

trường sẽ được khảo sát thay đổi bằng một số nguồn nitrogen khác nhau như

84

peptone, cao nấm men, cao thịt, tryptone và bột đậu. Kết quả khảo sát sau 24 h

lên men trên bình tam giác, hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng đột

400

8.00

biến ES4 được thể hiện ở Hình 3.14.

) l

FU avg

OD avg

/

350

7.00

300

6.00

)

250

5.00

m n 0 0 6 (

200

4.00

D O

150

3.00

ị r t á i G

100

2.00

50

1.00

m U F ( n i r b i f n â h p y ủ h t e m y z n e ộ đ t ạ o H

0

0.00

Peptone

Tryptone

GYP

Cao thịt

Cao nấm men

Bột đậu tương

Nguồn nitrogen

Hình 3.14. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen

Kết quả Hình 3.14 cho thấy, trong 5 nguồn nitrogen khảo sát thì nguồn

nitrogen là peptone cho khả năng thu nhận enzyme thủy phân fibrin đối với chủng

ES4 là cao nhất, nó cao hơn các nguồn dinh dưỡng nitrogen khác lần lượt là bột đậu

tương 11,59%, cao nấm men 14,45%, cao thịt 30,43% và tryptone 43,48%. Tuy

nhiên, đối với nguồn nitrogen là peptone được khảo sát riêng lẻ khi so với nguồn

nitrogen có sự kết hợp peptone với cao nấm men (có trong môi trường GYP) thì khả

năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng ES4 là cao hơn. Điều này

chứng tỏ việc sử dụng cả 2 nguồn nitrogen là cao nấm men và peptone trong môi

trường GYP là hợp lý và có hiệu quả. Mật độ tế bào của chủng đạt giá trị OD cao

nhất là 6,96 trên môi trường có thành phần nguồn nitrogen là cao nấm men, nó cao

hơn từ 1,01 đến 3,42 lần so với các nguồn nitrogen còn lại. Từ Hình 3.14 cũng cho

thấy hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng tăng khi mật độ tế bào tăng. Tuy

nhiên, để chủng ES4 cho thu nhận enzyme thủy phân fibrin có hoạt độ cao, chọn

nguồn dinh dưỡng nitrogen là peptone và cao nấm men kết hợp sử dụng trong môi

85

trường lên men để thu nhận enzyme.

Trước đó, chủng Bacillus subtilis được Deepak và cs [199] sử dụng nguồn

nitrogen là peptone để tối ưu cho khả năng thu nhận nattokinase của chủng. Tuấn và

cs [135] cũng đã sử dụng nguồn nitrogen là peptone đậu nành để tối ưu cho chủng

Bacillus subtilis tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase. Đối với chủng

Bacillus sp. IND7 đã được Vijayaraghavan và cs [151, 200] đã khảo sát và lựa chọn

cao thịt bò là nguồn nitrogen thích hợp để tối ưu nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp

enzyme thủy phân fibrin của chủng. Smitha và cs [201] đã khảo sát và lựa chọn sử

dụng fibrin hoặc casein là nguồn nitrogen thích hợp đối với chủng Bacillus sp. để

lên men nhằm tăng hoạt độ enzyme thủy phân fibrin thu nhận được của chủng.

Rajaselvam và cs [191] đã khảo sát và lựa chọn cao nấm men là nguồn nitrogen

thích hợp đối với chủng B. amyloliquefaciens được phân lập từ bộ đậu tương để lên

men thu nhận enzyme thủy phân fibrin của chủng. Từ kết quả trên cho thấy, chủng

ES4 thích hợp với nguồn niơ là cao nấm men và peptone. Do đó, để tăng khả năng

sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng ES4 cao, chủng ES4 lựa chọn sử

dụng peptone và cao nấm men làm nguồn nitrogen trong môi trường lên men.

3.3.1.3. Các ion kim loại

Trên cơ sở nguồn dinh dưỡng carbon là glucose, nguồn nitrogen là

peptone và cao nấm men đã được lựa chọn, chủng ES4 tiếp tục được khảo sát

ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng.

Để lựa chọn được các ion kim loại thích hợp cho chủng sinh tổng hợp enzyme

cao, trên thành phần môi trường GYP các ion kim loại sẽ được khảo sát thay

đổi bằng một số nguồn ion gồm Ca2+, Mg2+, K+, Mn2+, Fe2+, Zn2+ và Cu2+. Kết

quả khảo sát sau 24 h lên men trên bình tam giác, hoạt độ enzyme thủy phân

fibrin của chủng đột biến ES4 được thể hiện ở Hình 3.15 cho thấy, các ion kim

loại cũng có ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng ES4,

các ion kim loại là Ca2+, Mg2+ và K+ cho hoạt độ enzyme cao hơn so với thành

phần môi trường đối chứng (ĐC) không có các ion kim loại, đối với 4 ion kim

loai Mn2+, Fe2+, Zn2+ và Cu2+ khi bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy cho

hoạt độ enzyme thấp hơn so với môi trường ĐC, hoạt độ enzyme thủy phân

fibrin của chủng bị giảm mạnh từ 4,17% (Mn2+) đến 73,61% (Fe2+), 96,81%

86

(Zn2+) và 97,78% (Cu2+), điều này chứng tỏ các ion kim loại này có ảnh hưởng

không tốt cho quá trình sinh tổng hợp thu nhận enzyme thủy phân fibrin của

chủng. Đối với 2 ion kim loại Ca2+ và Mg2+ khi được bổ sung vào trong môi

trường lên men cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng tăng lần lượt là

23,61% và 16,67% so với môi trường ĐC. Tuy nhiên, ở môi trường GYP có sự

kết hợp thành phần 2 ion kim loại Ca2+ và Mg2+ cho hoạt độ enzyme của chủng

ES4 tăng 34,72% cao hơn so với môi trường ĐC và tăng 8,98% so với môi

trường có ion kim loại là Ca2+, 15,47% so với môi trường có ion kim loại là

Mg2+. Điều này cho thấy, sự kết hợp 2 ion kim loại Ca2+ và Mg2+ trong môi

trường GYP ban đầu là hợp lý cho chủng ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân

fibrin và 2 ion kim loại này cũng được lựa chọn sử dụng trong môi trường lên

400

6

FU/ml

OD (600nm)

men của chủng.

) l

350

/

5

300

)

4

250

m n 0 0 6 (

200

3

D O

150

2

ị r t á i G

100

1

50

m U F ( n i r b i f n â h p y ủ h t e m y z n e ộ đ t ạ o H

0

0

GYP

ĐC

Mg²⁺

Ca²⁺ Mn²⁺

K⁺

Zn²⁺

Cu²⁺

Fe²⁺ Ion kim loại

ĐC: mẫu đối chứng không có ion kim loại

Hình 3. 15. Ảnh hưởng của các ion kim loại

Từ Hình 3.15 cũng cho thấy hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng

tăng khi mật độ tế bào tăng, chủng cho mật độ tế bào cao nhất khi môi trường

có chứa ion kim loại là Mg2+. Tuy nhiên, để thu nhận được enzyme thủy phân

fibrin cao trong môi trường lên men chủng đột biến ES4 thì sự kết hợp của 2

ion kim loại là Ca2+ và Mg2+ đem lại hiệu quả tốt nhất. Trước đó Wu và cs cũng

87

đã sử dụng ion Mg2+ trong môi trường lên men thu nhận enzyme thủy phân

fibrin từ chủng Bacillus subtilis WR350. Đối với chủng B. amyloliquefaciens

CGMCC cũng được Xiao và cs bổ sung 2 ion kim loại Ca 2+ và Mg2+ vào trong

môi trường lên men để tăng khả năng thu nhận enzyme thủy phân fibrin của

chủng. Đối với chủng B. amyloliquefaciens strain KJ10 cũng được Rajaselvam

và cs [191] lên men trên môi trường có bổ sung ion Mg2+ để tăng khả năng thu

nhận enzyme thủy phân fibrin của chủng.

Từ các kết quả nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho

sinh tổng hợp enzyme thủy phân của chủng ES4 cho thấy, đối với cả 3 thành

phần là nguồn C, N và các ion kim loại đều cho hoạt độ enzyme tăng khi mật

độ tế bào của chủng tăng, các thành phần môi trường cho mật độ tế bào cao,

đồng thời cũng cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao. Kết quả cho thấy hoạt

độ enzyme tăng tỉ lệ với mật độ tế bào, điều này là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu

nhằm tăng khả năng thu nhận enzyme thủy phân fibrin của chủng bằng cách

tăng mật độ tế bào của chủng trong lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất.

3.3.2. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho khả năng

sinh enzyme của chủng

3.3.2.1. Nhiệt độ lên men

Nhiệt độ có vai trò quan trọng đối với sự phát triển của chủng vi khuẩn,

nó cũng ành hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng trong quá

trình lên men. Vì vậy, đối với chủng đột biến ES4 để lựa chọn được nhiệt độ

thích hợp trong lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin, chủng đột biến ES4

được khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình lên men thu nhận

enzyme. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình lên men thu

nhận enzyme của chủng được thể hiện trên Hình 3.16.

Từ Hình 3.16 cho thấy, chủng được lên men ở nhiệt độ 37 oC cho hoạt

độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 405 ± 5 FU/ml, ở nhiệt độ môi trường

lên men 45oC chủng cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin thấp nhất 285 ± 5

FU/ml. Điều này chứng tỏ, nhiệt độ lên men có ảnh hưởng đến khả năng sinh

tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng. Từ kết quả trên cho thấy, ở nhiệt

độ 37oC được cho là nhiệt độ thích hợp cho chủng ES4 lên men thu nhận

88

enzyme thủy phân fibrin.

FU/ml

OD (600nm)

450

9

) l

/

400

8

350

7

)

300

6

250

5

m n 0 0 6 (

D O

200

4

150

3

ị r t á i G

100

2

50

1

m U F ( n i r b i f n â h p y ủ h t e m y z n e ộ đ t ạ o H

0

0

30

35

40

45

37 Nhiệt độ (°C)

Hình 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men

Trước đó cũng có các nghiên cứu khảo sát điều kiện nhiệt độ thích hợp

cho các chủng lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin như Ibrahim và cs

[202] đã tối ưu nhiệt độ ở 37,14oC đối với chủng Bacillus sp. cho hoạt độ NK

là cao nhất, Tuấn và cs đã tối ưu điều kiện nhiệt độ cho chủng Bacillus subtilis

ở 37oC cho hoạt độ NK là cao nhất [203], Hamadan và cs [204] đã tối ưu nhiệt

độ môi trường đối với chủng Bacillus subtilis cho hoạt độ NK cao nhất ở 37oC,

Smitha và cs [201] đã tối ưu điều kiện môi trường đối với chủng Bacillus sp.

cho thấy ở nhiệt độ 50oC chủng cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin là cao

nhất, Wu và cs [205] đã tối ưu điều kiện nhiệt độ đối với chủng Bacillus

subtilis cho thấy ở nhiệt độ 30oC chủng cho hoạt độ NK là cao nhất, Yang và cs

[99] đã tối ưu điều kiện nhiệt độ cho chủng Bacillus amyloliquefaciens phân

lập từ Douchi (Trung Quốc) để thu nhận enzyme thủy phân fibrin cho thấy ở

nhiệt độ 41oC chủng cho hoạt độ enzyme là cao nhất, Rajaselvam và cs [191]

đã tối ưu điều kiện nhiệt độ của chủng Bacillus amyloliquefaciens phân lập từ

bột đậu tương cho thấy ở nhiệt độ 34oC chủng cho hoạt độ enzyme thủy phân

fibrin là cao nhất. Từ các kết quả công bố trên cho thấy, các chủng vi khuẩn có

89

nhiệt độ thích hợp khác nhau trong lên men thu nhận enzyme thủy phân.

3.3.2.2. pH môi trường ban đầu

Trong nuôi cấy các chủng vi khuẩn để thu nhận enzyme, pH môi trường

nuôi cấy ban đầu có ảnh hưởng đến sự phát triển sinh enzyme của chủng. Đối

với chủng ES4 kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy được

500

5.6

FU/ml

OD (600nm)

thể hiện ở Hình 3.17.

) l

/

5.4

400

5.2

)

300

5

m n 0 0 6 (

D O

4.8

200

ị r t á i G

4.6

100

4.4

m U F ( n i r b i f n â h p y ủ h t e m y z n e ộ đ t ạ o H

0

4.2

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

Giá trị pH

Hình 3.17. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu

Từ Hình 3.17 cho thấy, ở giá trị pH 6,5 cho hoạt độ enzyme thủy phân

fibrin của chủng đạt giá trị cao nhất là 434 ± 14 FU/ml sau đó đến pH 7,0 cho

hoạt độ enzyme đạt 392 ± 14 FU/ml, tại giá trị pH 5,5 hoạt độ enzyme thủy

phân fibrin của chủng là thấp nhất 231 ± 21 FU/ml. Điều này cho thấy, đối với

chủng đột biến ES4 ở giá trị pH môi trường ban đầu là 6,5 cho hoạt độ enzyme

thủy phân fibrin cao nhất được lựa chọn là giá trị pH thích hợp trong lên men

thu nhận enzyme thủy phân fibrin của chủng. Trước đó, Smitha và cs đã tối ưu

pH môi trường đối với chủng Bacillus sp. để thu nhận enzyme thủy phân fibrin

cho thấy ở pH môi trường là 10, chủng cho hoạt độ enzyme là cao nhất [201].

Wu và cs [205] đã tối ưu pH môi trường của chủng Bacillus subtilis cho thấy, ở

pH = 7,0 chủng cho hoạt độ NK là cao nhất. Hu và cs [100] đã tối ưu pH môi

90

trường cho chủng Bacillus subtilis phân lập đc từ Douchi cho thấy, ở pH = 7,0

chủng cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin là cao nhất. Yang và cs [99] đã tối

ưu pH môi trường đối với chủng Bacillus amyloliquefaciens phân lập được từ

Douchi cho thấy, ở pH = 7,6 chủng cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin là cao

nhất. Rajaselvam và cs [191] đã tối ưu pH môi trường đối với chủng Bacillus

amyloliquefaciens phân lập được từ bột đậu tương cho thấy, ở pH = 8,0 chủng

cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin là cao nhất.

3.3.3. Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp

enzyme thủy phân fibrin

Trên cơ sở khảo sát nguồn dinh dưỡng C, N, các ion kim loại và điều

kiện nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường ban đầu thích hợp cho chủng đột biến

ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin. Để tăng khả năng sinh tổng hợp

enzyme của chủng đột biến ES4 hơn nữa, thành phần môi trường lên men được

tối ưu bằng phần mềm Design Expert 12, ở điều kiện pH 6,5 và nhiệt độ 37oC

(phương pháp, mục 2.2.3.7.c). Bên cạnh sự cần thiết tối ưu môi trường cho

chủng sinh tổng hợp enzyme, thì sự lựa chọn tăng lượng sinh khối tế bào của

chủng trong môi trường lên men cũng được quan tâm để tăng sản phẩm

enzyme. Do đó, chủng đột biến ES4 sẽ được tối ưu thành phần môi trường cho

2 hàm mục tiêu là hàm hoạt độ enzyme và hàm sinh khối tế bào. Mục đích để

tăng sản phẩm ở các giai đoạn ứng với các pha phát triển khác nhau của chủng.

Kết quả phân tích ANOVA theo mô hình bậc hai cho cả hàm mật độ tế

bào và hàm hoạt độ enzyme (Bảng 3.6) cho thấy mô hình hồi quy của cả 2 hàm

đều có ý nghĩa (giá trị p < 0,05). Trong số các biến độc lập được phân tích, các

yếu tố như glucose, cao nấm men và peptone có ảnh hưởng đáng kể đến mật độ

tế bào và hoạt độ enzyme của chủng. Phân tích yếu tố MgSO 4 không có ý nghĩa

đối với cả sinh khối và hoạt độ của enzyme thủy phân fibrin của chủng (giá trị

p > 0,05), tuy nhiên MgSO4 lại có sự ảnh hưởng tương tác với các thành phần

môi trường khác. Trong khi đó, yếu tố NaCl không ảnh hưởng đến sinh khối

nhưng lại có ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme. Sự tương tác bậc

hai giữa 6 yếu tố thành phần môi trường, có 5/15 yếu tố tương tác giữa glucose

91

- YE, YE - CaCl2, YE - NaCl, peptone - CaCl2, YE - MgSO4 ảnh hưởng đến

mật độ tế bào. Trong khi đó, đối với hoạt tính của enzyme thủy phân fibrin có

10/15 yếu tố tương tác là có ý nghĩa.

Bảng 3.6. Kết quả phân tích ANOVA mô hình bậc hai

Mật độ tế bào (OD 600 nm)

Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin (FU/ml)

Trung

Tổng

Trung bình

Nguồn

df

bình

Giá trị

Tổng bình

Giá trị

bình

Giá trị p

bình

Giá trị p

bình

F

phương

F

phương

phương

phương

27

Mô hình

143,18

5,30

219,52

< 0,0001 9,851E+05 36484,72

299,59

< 0,0001

A-Glucose

1

1,71

1,71

70,89

0,0002 1,732E+05 1,732E+05 1422,39 < 0,0001

B-Yeast extract

1

91,33

91,33 3780,81

< 0,0001 1,926E+05 1,926E+05 1581,29 < 0,0001

C-Peptone

1

1,37

1,37

56,68

0,0003 1,009E+05 1,009E+05

828,68 < 0,0001

1

D-CaCl2.2H2O

0,4523

0,4523

18,72

0,0049

16552,43

16552,43

135,92 < 0,0001

0,0575

0,0575

2,38

279,82

279,82

2,30

0,1804

0,1738

1

E-MgSO4.7H2O

F-NaCl

0,0135

0,0135

0,5576

0,4834

1

2298,63

2298,63

18,87

0,0049

AB

25,11

25,11

0,2062

0,6657

1

2,38

2,38

98,33

< 0,0001

AC

0,1580

0,0628

0,0628

2,60

1

4950,29

4950,29

40,65

0,0007

AD

0,1290

0,0748

0,0748

3,10

1

1291,78

1291,78

10,61

0,0173

AE

0,0939

0,0955

0,0955

3,95

158,58

158,58

1,30

0,2973

1

AF

0,0167

0,0167

0,6933

0,4369

1

10021,10

10021,10

82,29

0,0001

BC

0,0659

0,0659

2,73

0,1497

1

31062,11

31062,11

255,06 < 0,0001

BD

54,09

54,09

0,4441

0,5299

1

0,0005

1,14

1,14

47,13

BE

0,0594

0,1301

0,1301

5,39

1

3148,49

3148,49

25,85

0,0023

BF

1

0,0451

6105,37

6105,37

50,13

0,0004

0,1537

0,1537

6,36

CD

1

2,11

2,11

87,19

< 0,0001

6438,57

6438,57

52,87

0,0003

CE

1

0,0293

2226,91

2226,91

18,29

0,0052

0,1957

0,1957

8,10

CF

0,2978

0,0314

0,0314

1,30

1

2790,80

2790,80

22,92

0,0030

DE

0,0073

0,0073

0,3041

0,6013

1

11834,46

11834,46

97,18 < 0,0001

DF

0,1644

93,08

93,08

0,7643

0,4156

0,0606

0,0606

2,51

1

EF

0,1797

142,40

142,40

1,17

0,3211

0,0557

0,0557

2,31

1

A²

1

0,3302

0,3302

13,67

0,0101

54585,61

54585,61

448,22 < 0,0001

B²

1

0,6359

0,6359

26,33

0,0022

25173,16

25173,16

206,71 < 0,0001

C²

1

0,8209

0,8209

33,98

0,0011

81269,79

81269,79

667,34 < 0,0001

D²

0,0494

0,0494

2,04

0,2027

1

16622,05

16622,05

136,49 < 0,0001

E²

1

0,2560

0,2560

10,60

0,0173

2425,63

2425,63

19,92

0,0043

F²

0,0450

0,0450

1,86

0,2211

2,68

0,1529

326,02

326,02

1

Phần còn lại

0,1449

0,0242

730,69

121,78

6

Sự không phù hợp

0,0833

0,0278

1,35

0,4049

1,85

0,3132

474,19

158,06

3

Lỗi thuần túy

0,0616

0,0205

256,50

85,50

3

92

Tổng cộng

33

143,32

9,858E+05

Phân tích sự phù hợp của mô hình ở Bảng 3.7 cho thấy, các hàm đáp

ứng đều chỉ ra rằng mô hình đã thể hiện đầy đủ mối quan hệ thực giữa các biến

đang được xem xét (nó được thể hiện ở hệ số hồi quy R2), mức độ chính xác

với các phương pháp xử lý được thực hiện cho độ tin cậy cao trong thử nghiệm

(C.V % càng thấp thì độ tin cậy càng cao).

Bảng 3.7. Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm

Kết quả phân tích cho hàm Kết quả phân tích cho hàm mật

Độ lệch chuẩn

11,04 Độ lệch chuẩn

0,1554

Giá trị trung bình

389,75 Giá trị trung bình

5,78

Hệ số biến thiên %

2,83 Hệ số biến thiên %

2,69

R²

0,9993 R²

0,9990

R² hiệu chỉnh

0,9959 R² hiệu chỉnh

0,9944

R² dự đoán

0,7984 R² dự đoán

0,8066

Độ chính xác

66,7363 Độ chính xác

48,8059

hoạt độ enzyme độ tế bào

Phân tích sự ảnh hưởng của các biến trong môi trường cho thấy: hệ số

ảnh hưởng của các thành phần môi trường trong mô hình bậc hai được thể hiện

ở 2 hàm đáp ứng mật độ tế bào và hàm hoạt độ enzyme được thể hiện ở Hình

3.18, trong các biến độc lập ảnh hưởng đến hàm mật độ tế bào thì tác dụng của

cao nấm men là cao nhất, cao gấp 8 lần so với glucose và peptone, 15 lần so

với CaCl2, trong khi MgSO4 và NaCl có ảnh hưởng ngược lại. Tỷ lệ của các

thành phần này lần lượt là 1/0,12/0,12/0,07 tương ứng với thành phần cao nấm

men/glucose/peptone/CaCl2. Trong khi đó đối với hàm hoạt độ enzyme thủy

phân fibrin, các biến tác động theo thứ tự cao nấm men > glucose > peptone >

MgSO4 > NaCl với tỷ lệ lần lượt là 1/0,84/0,7/0,11/ 0,11/ 0,04. Kết quả này chỉ

ra rằng, ảnh hưởng của các biến độc lập đến mật độ tế bào và hoạt độ của

enzyme là có sự khác nhau. Bên cạnh sự ảnh hưởng tương tác giữa các thành

phần môi trường lên hàm mục tiêu là mật độ tế bào và hoạt độ enzyme của

93

chủng thì có 3 thành phần môi trường ảnh hưởng lớn hơn cả đó là glucose, cao

nấm men và peptone. Kết quả này là cơ sở để thực hiện lên men theo mẻ có bổ

sung cơ chất nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng.

A

F2

B

250

E2

C

D2

D

150

C2

E

50

B2

F

-50

A2

AB

-150

EF

AC

DF

AD

DE

AE

CF

AF

CE

BC

CD

BD

BF

BE

OD (600 nm) Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin (FU/ml)

Hình 3.18. Hệ số ảnh hưởng của phương trình hồi quy bậc hai đối với mật

độ tế bào và hoạt độ enzyme thủy phân fibrin.

Sự tương tác ảnh hưởng giữa các thành phần môi trường được thể hiện ở

Hình 3.18 cho thấy, hoạt độ enzyme của chủng ES4 đột biến bị ảnh hưởng nhiều bởi

cao nấm men, glucose và peptone. Trong đó, hệ số ảnh hưởng của thành phần cao

nấm men có ảnh hưởng lớn hơn cả đến cả hàm mật độ tế bào và hàm hoạt độ enzyme

của chủng. Điều này cho thấy nguồn nitrogen là yếu tố quan trọng trong quá trình

sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng. Trước đó Chen và cs [148], đã

công bố yếu tố quan trọng nhất để sản xuất enzyme thủy phân fibrin từ chủng tái tổ

hợp WB700N/pUKVI-NAT2 là dịch thủy phân đậu tương. Deepak và cs [145] cũng

đã chứng minh tầm quan trọng của peptone trong hoạt động của enzyme thủy phân

fibrin ở chủng dại B. subtilis 1A752.

Sự tương tác và ảnh hưởng giữa các thành phần môi trường glucose và cao

nấm men, glucose và peptone, cao nấm men và peptone đến mật độ tế bào (OD) và

hoạt độ enzyme của chủng ES4 đột biến được thể hiện rõ qua đồ thị bề mặt ba chiều

(3D) tương tác được xây dựng với trục Z là hoạt độ enzyme hoặc mật độ tế bào

(OD) và hai biến độc lập bất kỳ, trong khi duy trì biến còn lại ở mức tối ưu của

94

chúng (Hình 3.19).

95

Hình 3.19. Bề mặt đáp ứng cho hàm mật độ tế bào và hàm hoạt độ enzyme

Kết quả các thành phần môi trường lên men tối ưu cho mật độ tế bào và

hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng đột biến ES4 trích xuất từ phần

mềm Design Expert 12 được thể hiện ở Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Thành phần môi trường tối ưu cho sự tạo thành sinh khối và hoạt độ enzyme

Thành phần môi trường

Glucose (g/l)

YE (g/l)

Peptone (g/l)

NaCl (g/l)

CaCl₂.2H₂O (g/l)

MgSO₄.7H₂O (g/l)

24,49

4,88

1,63

0,60

0,20

7,33

Tối ưu cho mật độ tế bào

16,66

2,75

7,44

0,10

0,24

9,65

Tối ưu cho enzyme (FU/ml)

Từ kết quả tối ưu thành phần môi trường ở Bảng 3.8, hoạt độ enzyme và

sinh khối tế bào cao nhất được dự đoán lần lượt là 704 FU/ml và OD 600nm đạt

9,414. Thí nghiệm kiểm chứng (3 lần) trong bình tam giác, sử dụng môi trường tối

ưu lên men chủng đột biến ES4 trong 24 h, chủng cho hoạt độ enzyme thủy phân

fibrin đạt 686 ± 43 FU/ml (tương đương 97,44% độ mong muốn so với dự đoán) và

mật độ tế bào đạt 8,505 (tương đương 90,34% độ mong muốn so với dự đoán). Hoạt

độ enzyme thủy phân fibrin của chủng đột biến ES4 tăng 1,7 lần khi sử dụng môi

trường tối ưu so với môi trường ban đầu (404 ± 4 FU/ml).

Kết quả tối ưu cho thấy, có sự tương đồng với các nghiên cứu đã được công

bố trước đó như Chen và cs [148] đã đạt được mức tăng gấp 1,24 lần trong việc sản

xuất enzyme thủy phân fibrin bằng cách tối ưu hóa thành phần môi trường. Deepak

và cs [145] đã báo cáo rằng chủng B. subtilis 1A752 tăng khả năng sản xuất enzyme

thủy phân fibrin gấp 2 lần sau khi tối ưu hóa môi trường nuôi cấy bằng cách sử dụng

thiết kế hỗn hợp trung tâm. Tùy thuộc vào chủng, việc tối ưu hóa thành phần môi

trường có thể tăng sản phẩm enzyme thủy phân fibrin lên gấp 1,24-6 lần [143], [133].

Kết quả sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng để thực hiện tối ưu hóa thành

phần môi trường GYP đối với chủng đột biến ES4 cho hoạt độ enzyme thủy phân

fibrin cao nhất đạt 686 ± 43 FU/ml, với thành phần môi trường tối ưu gồm glucose

(16,66 g/l), cao nấm men (2,75 g/l), peptone (7,44 g/l), CaCl2.2H2O (0,1 g/l),

96

MgSO4.7H2O (0,24 g/l) và NaCl (9,65 g/l). Thành phần môi trường tối ưu cho sinh

khối tế bào gồm có glucose (24,49 g/l), cao nấm men (4,88 g/l), peptone (1,63 g/l),

CaCl22H2O (0,6 g/l), MgSO4.7H2O (0,2 g/l) và NaCl (7,33g/l).

3.3.4. Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật lên men thu nhận enzyme thủy

phân fibrin

3.3.4.1. Lên men theo mẻ

Quá trình lên men theo mẻ được thực hiện trên thiết bị lên men 2 lít,

với mục tiêu là xác định các thông số động học cần thiết cho quá trình lên men

theo mẻ có bổ sung cơ chất như: tốc độ tăng trưởng (µ) và sự chuyển đổi

glucose thành sinh khối tế bào (Yx/s) được xác định thông qua hồi quy tuyến

tính của dữ liệu thực nghiệm. Chủng đột biến ES4 được lên men trên môi

trường tối ưu cho chủng sinh tổng hợp enzyme gồm có glucose (16,66 g/l), cao

nấm men (2,75 g/l), peptone (7,44 g/l), CaCl2.2H2O (0,1 g/l), MgSO4.7H2O

(0,24 g/l) và NaCl (9,65 g/l). Quá trình lên men theo mẻ được thực hiện trong

24 h để khảo sát thời gian phát triển của tế bào và quá trình sinh tổng hợp

enzyme thủy phân fibrin của chủng. Kết quả động học của của trình lên men

theo mẻ được thể hiện trên Hình 3.20.

97

Hình 3.20. Động học quá trình lên men theo mẻ

Từ Hình 3.20 cho thấy, tốc độ khuấy trộn được tăng nhanh trong khoảng

thời gian lên men từ 1,75 h đến 3 h, tốc độ khuấy đạt cực đại 700 vòng/phút ở thời

điểm 3 h. Điều này cho thấy, trong khoảng thời gian lên men này chủng đang ở

trong giai đoạn phát triển cần cung cấp nhiều oxi. Kết qủa phân tích OD cũng chỉ

ra rằng chủng vi khuẩn cũng phát triển nhanh và đạt giá trị OD cực đại 13,04 chỉ

sau 6 h lên men, hoạt độ của enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 870 ± 10 FU/ml

ở 14 h, tăng khoảng 1,27 lần so với kết quả lên men trong bình tam giác (686 ± 43

FU/ml ở 24 h) và mật độ tế bào cũng tăng 1,5 lần so với mật độ tế bào lên men

trong bình tam giác (OD đạt 8,505 ở 10 h). Kết quả lên men theo mẻ trên thiết bị 2

lít cho giá trị OD của chủng tăng lên so với lên men trong bình tam giác và cho

hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng cũng tăng lên, điều này cho thấy sự

sinh tổng hợp enzyme của chủng có liên quan đến sự tăng trưởng của tế bào trong

quá trình lên men. Trên cơ sở phân tích tối ưu các thành phần môi trường lên men

cho sinh khối và hoạt độ enzyme thủy phân fibrin, chủng ES4 được thực hiện lên

men theo theo mẻ bổ sung cơ chất để nâng cao hoạt độ enzyme của chủng theo 2

phương pháp bổ sung cơ chất đó là: lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn

(mục đích tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng) và lên men theo mẻ bổ

sung cơ chất theo 2 giai đoạn (mục đích tăng cả sinh khối tế bào và hoạt độ

enzyme của chủng).

3.3.3.2. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn

Trong lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn, thành phần môi

trường lên men và cơ chất bổ sung là thành phần môi trường tối ưu cho chủng

đột biến ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin, tốc độ bổ sung cơ chất

được tính toán theo phương trình 2 (mục 2.2.3.8), dựa vào lượng sinh khối tế

bào tạo thành và lượng tiêu thụ cơ chất (đường khử) tương ứng với lượng sinh

khối tế bào của chủng, cũng như động học của quá trình lên men theo mẻ (Hình

3.20), tốc độ tăng trưởng của chủng đột biến ES4 xác định được là 0,57 h-1 và

hiệu suất sử dụng cơ chất của tế bào Yx/s = 2,53 g/g. Từ kết quả động học lên

men theo mẻ (Hình 3.20) của chủng đột biến ES4 cho thấy, chủng phát triển

mạnh trong thời gian từ 2 - 5 h lên men, sau 5 h chủng phát triển chậm dần và

98

chuyển sang pha cân bằng. Do đó, để duy trì tốc độ sinh trưởng của chủng

nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme, cơ chất bổ sung được cấp theo hàm

số mũ. Trên cơ sở động học của quá trình lên men theo mẻ, cơ chất bổ sung

gồm glucose, cao nấm men và peptone có tỉ lệ theo thành phần môi trường tối

ưu cho hàm hoạt độ enzyme thủy phân fibrin, được bổ sung ở thời điểm lên

men 5 h, tốc độ bổ sung cơ chất được tính toán bổ sung theo Phụ lục 10, cơ

chất bổ sung được cấp tự động sau các khoảng thời gian 0,25 h, quá trình bổ

sung cơ chất trong thời gian 8 h, thời gian lên men kéo dài 24 h. Kết quả động

học của cúa trình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn được thể hiện

trên Hình 3.21.

Hình 3.21. Động học của quá trình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất1 giai đoạn

Từ Hình 3.21 cho thấy, quá trình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1

giai đoạn tốc độ khuấy trộn dao động trong khoảng từ 400 vòng/phút đến 1100

vòng/phút, quá trình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất cũng cho thấy khi chủng

phát triển mạnh sinh nhiều bọt khí trong môi trường, dẫn đến tín hiệu pO2 bị

ảnh hưởng và không được ổn định so với lên men theo mẻ, giai đoạn phát triển

của chủng được kéo dài theo thời gian bổ sung cơ chất, mật độ tế bào của

99

chủng không tăng sau khi dừng bổ sung cơ chất 1 h (ở thời điểm 14 h), chủng

cho mật độ tế bào cao nhất đạt 108,1. Tuy nhiên, hoạt độ enzyme của chủng

cao nhất đạt ở thời điểm 13 h, sau đó hoạt độ enzyme không tăng, do đó. Vì

vây, động học của quá trình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất được thể hiện đến

14 h lên men. Trong lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn theo cấp số

nhân, mật độ tế bào của chủng tăng cao nhất ở 14 h cho OD đạt 108,1 (Hình

3.21), hoạt độ enzyme thủy phân fibrin cao nhất đạt 4057,14 ± 57,14 FU/ml tại

thời điểm 13 h. Kết quả này cho thấy, hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của

chủng trong lên men theo mẻ bổ sung cơ chất tăng lên đáng kể so với lên men

theo mẻ, cụ thể hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng tăng 4,66 lần so với

lên men mẻ (870 ± 10 FU/ml), mật độ tế bào tại thời điểm 13 h đạt 101,2 cũng

tăng 7,75 lần so với lên men theo mẻ (OD đạt 13,04).

3.3.3.3. Lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai đoạn.

Việc bổ sung cơ chất trong quá trình lên men theo 2 giai đoạn dựa trên

các điều kiện tối ưu cho mật độ tế bào và tối ưu cho hoạt độ enzyme thủy phân

fibrin của chủng đột biến ES4 nhằm tăng cả mật độ tế bào và hoạt độ enzyme

của chủng, tốc độ cấp bổ sung cơ chất và thời gian cấp tương tự như lên men

theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn. Trong lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2

giai đoạn thì giai đoạn đầu, mục tiêu của việc bổ sung cơ chất là để tăng sinh

khối tế bào có thành phần môi trường bổ sung là thành phần môi trường tối ưu

cho sinh khối, ở giai đoạn 2 bổ sung cơ chất để tăng khả năng sinh tổng hợp

enzyme thủy phân fibrin của chủng có thành phần môi trường bổ sung là thành

phần môi trường tối ưu cho enzyme. Kết quả động học của cúa trình lên men

theo mẻ bổ sung cơ chất theo 2 giai đoạn được thể hiện trên Hình 3.22.

Quá trình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai đoạn cơ chất bổ sung

cũng được cấp trong 8 h (Hình 3.22). Tuy nhiên, ở giai đoạn đầu của quá trình bổ

sung cơ chất (từ 5 h đến 9 h) thì thành phần cơ chất bổ sung là thành phần tối ưu

cho mật độ tế bào của chủng, sau đó cơ chất bổ sung sẽ được thay đổi sử dụng

thành phần tối ưu cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng, thời gian bổ sung

cơ chất giai đoạn 2 từ 9 h đến 13 h. Kết quả, mật độ tế bào cao nhất trong quá trình

lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai đoạn là 153,5 ở 14 h, hoạt độ enzyme thủy

100

phân fibrin của chủng cao nhất đạt 5.300 ± 100 FU/ml ở 13 giờ. So với kết quả lên

men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn thì lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai

đoạn cho mật độ tế bào và hoạt độ enzyme của chủng đều cao hơn, tại thời điểm 13

h ở cả 2 phương pháp bổ sung cơ chất đều cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của

chủng là cao nhất. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng đột biến ES4 tăng

6,09 lần so với lên men theo mẻ và tăng 13,12 lần so với lên men trong bình tam

giác ở thành phần môi trường ban đầu (404 ± 4 FU/ml).

Hình 3.22. Động học của quá trình lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai đoạn

Kết quả lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất theo 1 và 2 giai đoạn được

Bảng 3.9. Tổng hợp kết quả lên men theo mẻ bổ sung cơ chất

so sánh thể hiện trong Bảng 3.9.

Lên men GĐ đầu

Lên men GĐ hai

Cả quá trình

(5-9h)

(9-13h)

LM bổ

LM bổ

LM bổ

LM bổ

LM bổ

LM bổ

sung cơ

sung cơ

sung cơ

sung cơ

sung cơ

sung cơ

chất 1 GĐ

chất 2 GĐ

chất 1 GĐ

chất 2 GĐ

chất 1 GĐ

chất 2 GĐ

 (1/h)

0,19

0,48

0,54

0,13

Sinh khối khô (g/l)

4,7

17,8

23,1

20,9

26,2

3,2

FE ( FU/ml)

1002,86

2942,86

4142,86

4057,14

5300

831,43

FE/Sinh khối khô (FU/mg)

213,37

165,33

179,34

194,12

202,29

259,82

Ghi chú: Enzyme thủy phân fibrin (FE)

101

Từ Bảng 3.9 cho thấy, trong lên men theo mẻ bổ sung cơ chất theo 2

giai đoạn tốc độ phát triển tế bào của chủng đột biến ES4 cao hơn so với lên

men bổ sung cơ chất 1 giai đoạn, dẫn đến lượng sinh khối tạo thành trong lên

men theo mẻ bổ sung cơ chất theo 2 giai đoạn cũng cao hơn so với lượng sinh

khối tạo thành trong lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn, tăng từ

khoảng 1,3 đến 1,5 lần. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin thu nhận được cũng

tăng. Từ Hình 3.9 cho thấy, tỉ lệ FE/sinh khối tạo thành trong thời gian lên men

bổ sung cơ chất từ 5 - 9 giờ ở lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn cho

tỉ lệ FE/sinh khối cao hơn so với cùng thời điểm bổ sung cơ chất trong lên men

bổ sung cơ chất 2 giai đoạn, điều này cho thấy phù hợp với mục đích ban đầu

khi thực hiện lên men theo mẻ bổ sung cơ chất 2 giai đoạn (giai đoạn đầu từ 5 -

9h bổ sung cơ chất để tăng sinh khối). Khi sang giai đoạn 2 (cơ chất bổ sung từ

từ 9 - 13h) lại cho thấy tỉ lệ FE/sinh khối của lên men theo 2 giai đoạn cao hơn

so với trong lên men bổ sung cơ chất 1 giai đoạn. Kết quả sau lên men bổ sung

cơ chất theo 2 giai đoạn cho thấy sinh khối tạo thành của chủng được tăng lên

so với lên men bổ sung 1 giai đoạn, tăng 1,4 lần và hoạt độ enzyme của chủng

thu nhận được cũng tăng từ 4057,14 ± 57,14 FU/ml lên 5300 ± 100 FU/ml, tăng

1,3 lần. Mặc dù tỉ lệ FE/sinh khối tạo thành của lên men theo mẻ bổ sung cơ

chất theo 2 giai đoạn là không tăng so với 1 giai đoạn, nhưng xét về tổng thể

quá trình khi bổ sung cơ chất theo 2 giai đoạn cũng đã đẩy tăng được hoạt độ

enzyme thủy phân của chủng đột biến ES4 so với lên men theo mẻ bổ sung cơ

chất 1 giai đoạn.

Kết quả, chủng đột biến ES4 sử dụng kỹ thuật lên men bổ sung cơ chất

theo 2 giai đoạn trong thiết bị lên men 2L cho khả năng thu nhận enzyme thủy

phân là cao nhất đạt 5300 ± 100 FU/ml, tăng 6,09 lần so với lên men theo mẻ

và tăng 65,92 lần chủng gốc HY6 nuôi trong bình tam giác 250ml.

Việc bổ sung hỗn hợp cơ chất thay đổi theo tỉ lệ trong quá trình lên men

theo mẻ có bổ sung cơ chất nhằm đem lại hiệu quả trong thu nhận enzyme

trước đó cũng đã được Cho và cs [160] nghiên cứu sản xuất nattokinase bằng

lên men theo mẻ bổ sung cơ chất là hỗn hợp glucose và peptone theo pH-stat để

102

tăng mật độ tế bào của chủng Bacillus subtilis trong quá trình lên men trên thiết

bị 5L, kết quả mật độ tế bào (OD ở 600nm) tăng 2,5 lần và hoạt độ enzyme

nattokinase tăng 2,1 lần so với lên men theo mẻ. Kwon và cs [134] cũng nghiên

cứu sản xuất nattokinase bằng cách lên men chủng Bacillus subtilis theo mẻ có

bổ sung cơ chất glucose/peptone theo pH-stat trên thiết bị lên men 5L và kết

quả hoạt độ enzyme tăng 4,3 lần so với lên men theo mẻ. Berenjian và cs [32]

đã nghiên cứu chiến lược bổ sung cơ chất glycerol (3%) trong pha tế bào phát

triển của chủng Bacillus subtilis natto để tăng mật độ tế bào và hoạt độ enzyme

nattokinase của chủng trong quá trình lên men, kết quả mật độ tế bào (OD 600)

của chủng tăng 1,5 lần và hoạt độ enzyme nattokinase tăng 1,12 lần so với lên

men theo mẻ. Poontawee và cs [162] lên men chủng Rhodosporidiobolus

fluvialis để sản xuất lipid với cơ chất là glycerol, nồng độ glycerol được bổ

sung ở tỉ lệ pha loãng khác nhau theo từng giai đoạn nhằm tăng sinh khối tế

bào và sản phẩm lipit. Kết quả sản phẩm lipit tăng 1,24 lần và sinh khối tế bào

103

tăng 1,27 lần so với lên men theo mẻ.

Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Sau thời gian thực hiện các nội dung nghiên cứu luận án thu được một

số kết quả sau:

1. Đã phân lập và tuyển chọn được chủng HY6 từ nguồn tương Bần,

Hưng Yên trên môi trường GYP cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin đạt 80,4

± 1,2 FU/ml. Chủng HY6 được giải trình tự toàn bộ hệ gen, được định danh và

đặt tên là Bacillus amyloiquefaciens HY6.

2. Đã nâng cao được khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của

chủng HY6 sau 5 lần đột biến tia UV kết hợp đột biến hóa chất EtBr và EMS thu

nhận đươc chủng ES4 đột biến cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin trên môi

trường GYP đạt 416 ± 8 FU/ml. Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng đột

biến ES4 qua 10 lần cấy chuyển cho độ ổn định cao đạt 404 ± 4 FU/ml (giảm

2,88%), tăng khoảng 5 lần so với chủng gốc HY6.

3. Đã nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của

chủng đột biến ES4, xác lập được điều kiện lên men tối ưu cho chủng đột biến

ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin ở điều kiện nhiệt độ 37oC và pH

môi trường ban đầu thích hợp là 6,5. Thành phần môi trường tối ưu cho chủng

đột biến ES4 sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin gồm glucose (16,66 g/l),

cao nấm men (2,75 g/l), peptone (7,44 g/l), CaCl2.2H2O (0,1 g/l), MgSO4.7H2O

(0,24 g/l) và NaCl (9,65 g/l). Hoạt độ enzyme thủy phân fibrin của chủng trên

môi trường tối ưu đạt 686 ± 43 FU/ml, tăng 1,7 lần so bình tam giá 250 ml.

Lựa chọn được kỹ thuật lên men cho chủng đột biến ES4 bằng kỹ thuật

lên men theo mẻ bổ sung cơ chất theo 2 giai đoạn trên thiết bị lên men 2L, ở

điều kiện nhiệt độ lên men 37oC, pH môi trường 6,5 và pO2 duy trì ở mức tối

thiểu 20%, chủng cho hoạt độ enzyme thủy phân fibrin đạt 5.300 ± 100 FU/ml,

tăng 6,09 lần so với lên men theo mẻ, tăng 65,92 lần so với chủng HY6 ở bình

104

tam giác.

KIẾN NGHỊ

1. Nghiên cứu sâu hơn về vấn đề cải tạo chủng bằng kỹ thuật gen, nhằm

tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin của chủng đột biến ES4

hơn nữa.

2. Nghiên cứu thêm về tinh sạch enzyme thủy phân fibrin thu nhận được và

các đặc tính enzyme. Hướng tới hoàn thiện quy trình thu nhận chế phẩm enzyme ở

105

dạng tinh sạch.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

1. Bui Thi Thanh, Dam Thuy Hang, Pham Tuan Anh and Nguyen Lan

Huong (2022). Enhanced Production of Fibrinolytic Enzyme by Bacillus sp.

Isolated from Vietnamese Traditional Fermented Soybean (Tuong ban) using

Ultraviolet Irradiation and Chemical Mutation. International Journal of

Current Microbiology and Applied Sciences, 11(05): 67-80.

2. Bui Thi Thanh, Le Tuan, Nguyen Lan Huong and Pham Tuan Anh

(2023). Improvement of Fibrinolytic Enzyme Production from Bacillus sp. ES4

by Response Surface Methodology and Exponential Fed-Batch Fermentation.

International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, vol

106

12(03): 151-162.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Hamada H Sumi, Tsushima H, Mihara H, Muraki H. (1987). "A novel fibrinolytic

enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto; a typical and popular

soybean food in the Japanese diet ". Experientia, Vol 43 (10): p. 1110-1111.

2. Yang X Y Peng, Zhang Y. (2005). "Microbial fibrinolytic enzymes: an overview

of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo". Appl

Microbiol Biotechnol, Vol 69 (2): p. 126-132.

3. Yusuf Chisti, Anirban Banerjee, U.C. Banerjee. (2004). "Streptokinase—a clinically

useful thrombolytic agent". Biotechnology Advances, Vol 22: p. 287 – 307.

4. Lijnen R. H, D. Collen, S. Vanderschueren. (1995). "Staphylokinase: fibrinolytic

properties and current experience in patients with occlusive arterial

thrombosis". Verh K Acad Geneeskd Belg, Vol 57 (3): p. 183-196.

5. Shreya Gopinath, Selvarajan Ethiraj. (2017). "Production, purification,

characterization, immobilization, and application of Serrapeptase: a

review". Frontiers in Biology, Vol 12 (5): p. 333-348.

6. Feng C, Wu S, Zhong J, Huan L. (2007). "Roles of s3 site residues of nattokinase

on its activity and substrate specificity". The Journal of Biochemistry, Vol

142 (3): p. 357-364.

7. Vaithilingam M, Chandrasekaran S. D, Shanker R, Kumar S, Thiyur S, Babu V,

Selvakumar J. N, Prakash S. (2015). "Exploring the in vitro thrombolytic

activity of nattokinase from a new strain Pseudomonas aeruginosa CMSS".

Jundishapur Journal of Microbiology, Vol 8 (10): p. 1-8.

8. Gu-Taek Kim, Hyun-Kuk Kim, Dae-Kyung Kim, Won-A Choi, Sung-Hoon Park,

Yong-Kee Jeong, In-Soo Kong. (1997). "Purification and characterization of a

novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KA38 originated from fermented

fish". Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol 84 (4): p. 307-312.

9. Savita Kumari Rajender & Prakash Motiram Halami Yogesh Devaraj. (2018).

"Purification, characterization of fibrinolytic protease from Bacillus

amyloliquefaciens MCC2606 and analysis of fibrin degradation product by

107

MS/MS". Preparative Biochemistry and Biotechnology, Vol 48 (2): p. 172-180.

10. Hmidet N, Agrebi R, Hajji M, Ktari N, Haddar A, Fakhfakh-Zouari N, Nasri M.

(2010). "Fibrinolytic serine protease isolation from Bacillus

amyloliquefaciens An6 grown on Mirabilis jalapa tuber powders". Appl

Biochem Biotechnol, Vol 162 (1): p. 75-88.

11. Kyu-Tae Chang, Nack-Shick Choi, Pil Jae Maeng, Seung-Ho Kim. (2004).

"Cloning, expression, and fibrin (ogen)olytic properties of a subtilisin DJ-4 gene

from Bacillus sp. DJ-4". FEMS Microbiology Letters, Vol 236 (2): p. 325-331.

12. Jun Peng, Yan Ju, Ho Ko, Lei Zhu, Yi Peng Qi. (2004). "Identification of two

novel fibrinolytic enzymes from Bacillus subtilis QK02". Comp Biochem

Physiol C Toxicol Pharmacol, Vol 137 (1): p. 65-74.

13. Ren-Huai Zhang, Lu Xiao, Yong Peng, Yi-Zheng Zhang. (2004). "Highly

efficient gene expression of a fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) in Bacillus

subtilis mediated by the promoter of alpha-amylase gene from Bacillus

amyloliquefaciens". Biotechnol Lett, Vol 26 (17): p. 1365-1369.

14. Raman Pachaiappan, Palaniyandi Velusamy, Meera Christopher, Baskaralingam

Vaseeharan, Periasamy Anbu, Jae-Seong So. (2015). "Isolation and identification

of a novel fibrinolytic Bacillus tequilensis CWD-67 from dumping soils enriched

with poultry wastes". J Gen Appl Microbio, Vol 61 (6): p. 241-247.

15. Si-Kyung Lee, A. Bae, D.H.. Kwon, T.J. Lee, S.B. Lee, H. Park, J.H. Heo, S.

Johnson, M. (2001). "Purification and characterization of a fibrinolytic

enzyme from Bacillus sp. KDO-13 isolated from soybean paste". J.

Microbiol. Biotechnol, Vol 11: p. 845–852.

16. Arumugaperumal Arun, Ponnuswamy Vijayaraghavan, Samuel Gnana, Prakash

Vincent, Mariadhas Valan Arasu and Naif Abdullah Al-Dhabi. (2016). "Cow dung

is a novel feedstock for fibrinolytic enzyme production from newly Isolated Bacillus

sp. IND7 and its application in In Vitro clot lysis". Front. Microbiol, Vol 7: p. 1-14.

17. Sudhir K Rai, Ashis K Mukherjee, Rupamoni Thakur, Pronobesh

Chattopadhyay, Santosh K Kar. (2012). "Bafibrinase: A non-toxic, non-

hemorrhagic, direct-acting fibrinolytic serine protease from Bacillus sp.

strain AS-S20-I exhibits in vivo anticoagulant activity and thrombolytic

108

potency". Biochimie, Vol 96 (4): p. 1300-1308.

18. Park Jeong, J.U. Baek, H. Park, S.H. Kong, I.S. Kim, D.W. Joo, W.H. (2001).

"Purification and biochemical characterization of a fibrinolytic enzyme from

Bacillus subtilis BK-17". World J. Microbiol. Biotechnol, Vol 17: p. 89-92.

19. Lee Paik, S.K. Heo, S. Kim, S.Y. Lee, H.H. Kwon, T.J. (2004). "Purification

and characterization of the fibrinolytic enzyme produced by Bacillus subtilis

KCK-7 from Chungkookjang". Journal of Microbiology and Biotechnology,

Vol 14 (4): p. 829-835.

20. Jing Yang, Jun Yuan, Zhenhong Zhuang, Yanling Yang, Ling Lin & Shihua Wang.

(2012). "Thrombolytic effects of Douchi Fibrinolytic enzyme from Bacillus

subtilis LD-8547 in vitro and in vivo". BMC Biotechnol, Vol 12: p. 1-9.

21. Shruti Chatterjee, Priyanka Verma, Merlyn S Keziah, Subathra C Devi. (2018).

"Fibrinolytic Protease from Marine Streptomyces rubiginosus VITPSS1".

Cardiovasc Hematol Agents Med Chem, Vol 16 (1): p. 44-55.

22. Ethiraj S, Narasimhan MK, Krishnamurthi T, Rajesh M. (2018). "Purification,

biochemical, and thermal properties of fibrinolytic enzyme secreted by

Bacillus cereus SRM-001". Prep Biochem Biotechnol, Vol 48 (1): p. 34-42.

23. Muhammad Sulchan, Diana Nur Afifah, Dahrul Syah, Yanti, Maggy

Thenawidjaja Suhartono, Jeong Hwan Kim. (2014). "Purification and

pharacterization of a fibrinolytic enzyme from Bacillus pumilus 2.g isolated

from Gembus, an Indonesian fermented food". Preventive Nutrition and Food

Science, Vol 19 (3): p. 213-219.

24. Jian Yao, Yunqi Weng, Sawyer Sparks, Kevin Yueju Wang. (2017). "Nattokinase:

An Oral Antithrombotic Agent for the Prevention of Cardiovascular Disease".

International Journal of Molecular Sciences, Vol 18 (3): p. 1-13.

25. Shourong Wu, Farwa Altaf, and Vivi Kasim. (2021). "Role of Fibrinolytic Enzymes

in Anti-Thrombosis Therapy". Molecular Biosciences, Vol 8: p. 1-17.

26. Zhang Zu. X, Zhang Yang, Y. Che, H. Zhang, G. Li, Jie. (2010). "Thrombolytic

activities of nattokinase extracted from Bacillus subtilis fermented soybean curd

109

residues". International Journal of Biological Sciences, Vol 2: p. 120-125.

28. Bergmeier Mackman, W. Stouffer, G.A. Weitz, J.I. (2020). "Therapeutic

strategies for thrombosis: New targets and approaches: New targets and

approaches". Nat. Rev. Drug Discov, Vol 19: p. 333–352.

29. Sri Charan, Bindu Bavisetty, Ali Muhammed, Moula Ali, Maria Gullo, Sittiwat

Lertsiri, John Morris, Salvatore Massa6. (2022). "Production of fibrinolytic

enzymes during food production". Current Developments in Biotechnology

and Bioengineering, Vol Chapter 7: p. 157-187.

30. Kumar Dubey. R, Jeetash Agrawala, D. Char, T. Pusp, P. (2010). "Isolation,

production, purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes

(Nattokinase, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources". African

Journal of Biotechnology, Vol 10 (8): p. 1408-1420.

31. Fatemeh Negahdaripour Dabbagh, Manica Berenjian, Aydin Behfar, Abdolazim

Mohammadi, Fatemeh Zamani, Mozhdeh Irajie, Cambyz Ghasemi, Younes.

(2014). "Nattokinase: production and application". Applied Microbiology

and Biotechnology, Vol 98 (22): p. 9199-9206.

32. Berenjian. A, R. Mahanama, J. Kavanagh, F. Dehghani, Y. Ghasemi. (2014).

"Nattokinase Production: Medium components and feeding strategy studies".

Chemical Industry & Chemical Engineering Quarterly, Vol 20 (4): p. 541−547.

33. Hongjie McGowan Chen, Eileen M. Ren, Nina Lal, Sara Nassif, Najah Shad-

Kaneez, Fatima Qu, Xianqin Lin, Yiguang. (2018). "Nattokinase: A

Promising Alternative in Prevention and Treatment of Cardiovascular

Diseases". Biomarker insights, Vol 13: p. 1-8.

34. Shourong Wu and Vivi Kasim Farwa Altaf. (2021). "Role of Fibrinolytic

Enzymes in Anti-Thrombosis Therapy". Protein Biochemistry for Basic and

Applied Sciences, Vol 8: p. 1-17.

35. Ja-Young Kim Jang, Tae-Su Cai, Jingmei Kim, Jihyun Youngeun, Kim Shin, Kyungha

Kim, Kwang Park, Sung Lee, Sung-Pyo Choi, Ehn-Kyoung Rhee, Man Kim, Y. I.

(2013). "Nattokinase improves blood flow by inhibiting platelet aggregation and

110

thrombus formation". Laboratory animal research, Vol 29: p. 221-5.

36. Jun Yang Yuan, Jing Zhuang, Zhenhong Yang, Yanling Lin, Ling Wang, Shihua.

(2012). "Thrombolytic effects of Douchi Fibrinolytic enzyme from Bacillus

subtilis LD-8547 in vitro and in vivo". BMC biotechnology, Vol 12 (36): p. 1-9.

37. Laurentia Tjandrawinata Stephani, Raymond Afifah, Diana Lim, Yanti Ismaya,

Wangsa Suhartono, Maggy. (2017). "Food Origin Fibrinolytic Enzyme With

Multiple Actions". Journal of Biosciences, Vol 24 (3): p. 124-130.

38. Na Song Guo, Xin-Rui Kou, Ping Zang, Yu-Ping Jiao, Jiao Efferth, Thomas Liu,

Zhi-Ming Fu, Yu-Jie. (2018). "Optimization of fermentation parameters with

magnetically immobilized Bacillus natto on Ginkgo seeds and evaluation of

bioactivity and safety". Food Science and Technology, Vol 97: p. 172-179.

39. Alexander Osmolovskiy, Chhavi Sharma, and Rajni Singh. (2021). "Microbial

Fibrinolytic Enzymes as Anti-Thrombotics: Production, Characterisation and

Prodigious Biopharmaceutical Applications". Pharmaceutics, Vol 13 (1880): p. 1-32.

40. Vaishnavi Babu and C. Subathra Devi. (2015). "Exploring the in vitro

thrombolytic potential of streptokinase-producing β-hemolytic Streptococci

isolated from bovine milk". The Journal of General and Applied

Microbiology, Vol 61: p. 139–146.

41. Gyoung Lee Kim, Ae Lee, Kang wook Park, Jae-Yong Park, Ae-Yong Chun, Jiyeon

Cha, Jaeho Song, Young-Sun Kim, Jeong. (2009). "Characterization of a 27 kDa

fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens CH51 isolated from

Cheonggukjang". Journal of microbiology and biotechnology, Vol 19: p. 997-1004.

42. Alawad Obeid, Aisha Mudawi Ibrahim, Hanan Moawia. (2015). "Isolation and

characterization of Bacillus subtillus with potential production of nattokinase".

International Journal of Advanced Research, Vol 3 (3): p. 94-101.

43. DanYu, Yuanliang Hu, Zhaoting Wang, Jianjun Hou, Rohit Tyagi, Yunxiang Liang

& Yongmei Hu. (2019). "Purifcation and characterization of a novel, highly

potent fbrinolytic enzyme from Bacillus subtilis DC27 screened from Douchi, a

traditional Chinese fermented soybean food". Scientific Reports, Vol 9: p. 1-10.

44. Choi Kim, K. H. Kim, Young Park, H. H. Choi, J. Y. Lee, Y. S. Oh, H. I. Kwon, I.

111

B. Lee, S. E. (1996). "Purification and Characterization of a Fibrinolytic

Enzyme Produced from Bacillussp. strain CK 11-4 Screened from Chungkook-

Jang". Applied and environmental microbiology, Vol 62 (7): p. 2482–2488.

45. Nomura Fujita. M, K. Hong, K. Ito, Y. Asada, A. Nishimuro, S. (1993). "Purification

and Characterization of a Strong Fibrinolytic Enzyme (Nattokinase) in the Vegetable

Cheese Natto, a Popular Soybean Fermented Food in Japan". Biochemical and

Biophysical Research Communications, Vol 197 (3): p. 1340-1347.

46. Panuwan Oncharoen Chantawannakul, Anchalee Klanbut, Khanungkan

Chukeatirote, Ekachai Lumyong, Saisamorn. (2002). "Characterization of

proteases of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented

soybean in Northern Thailand". Science Asia, Vol 28: p. 241-245.

47. S. M. Lingappa Gopinath, Kattimani. (2016). "Isolation and Screening of

Fibrinolytic Enzymes producing Bacterium Strain from Soil Waste". International

Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, Vol 5: p. 969-977.

48. Saeid Tamadoni, Jahromi Noora Barzkar, and Fabio Vianello. (2022). "Marine

Microbial Fibrinolytic Enzymes: An Overview of Source, Production,

Biochemical Properties and Thrombolytic Activity". Mar Drugs, Vol 20 (1): p. 46.

49. Radin Shafierul Radin, Yahaya Mohamad, Syazwan Ngalimat, Mohamad Malik

Al-adil Baharudin, Syafiqah Mohd Yaminudin, Murni Karim, Siti Aqlima

Ahmad, and Suriana Sabri. (2021). "A Review on the Biotechnological

Applications of the Operational Group Bacillus amyloliquefaciens".

Microorganisms, Vol 9 (614): p. 1-18.

50. Saeid Tamadoni, Jahromi Noora Barzkar, and Fabio Vianello. (2022). "Marine

Microbial Fibrinolytic Enzymes: An Overview of Source, Production, Biochemical

Properties and Thrombolytic Activity". Marine Drugs, Vol 20 (46): p. 1-13.

51. Lizhen Hou, Danfeng Li, Miao Hu, Yaxin Gao, Zhiliang Tian, Bei Fan, Shuying

Li, and Fengzhong Wang. (2022). "Recent Advances in Nattokinase-

Enriched Fermented Soybean Foods: A Review". Foods, Vol 11: p. 1867.

52. Erumalla Nagaraju. (2014). "An overview on microbial fibrinolytic protease".

International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, Vol 5: p. 643-656.

53. D. Halami, Yogesh, P. M. (2017). "Fibrinolytic enzymes of Bacillus spp.: An

112

overview". International Food Research Journal, Vol 24: p. 35-47.

54. Diana Sulchan Afifah, Muhammad Syah, Dahrul Suhartono, Maggy. (2014).

"Isolation and identification of fibrinolytic protease-producing

microorganisms from Red Oncom and Gembus, Indonesian fermented

soybean cakes". Malaysian Journal of Microbiology, Vol 10: p. 273-279.

55. A Sutrisno I R, A Sasmita, E Zubaidah and A K Wardani. (2018). "Purification

and characterization of a fibrinolytic enzyme from tempeh bongkrek as an

alternative of thrombolytic agents". Conference Series: Earth and

Environmental Science, Vol 131: p. 1-7.

56. Hyeon-Deok Lee Jo, Hwang-A Jeong, Seon-Ju Kim, Jeong-Hwan. (2011).

"Purification and characterization of a major fibrinolytic enzyme from

Bacillus amyloliquefaciens MJ5-41 isolated from Meju". Journal of

microbiology and biotechnology, Vol 21 (11): p. 1166-1173.

57. Xin Zhang, Jia Long, Zexin Gao, Yun Yang, Xueyi Tian, Mingyuan Lu, Laping

He, Cuiqin Li, and Xufeng Zeng. (2021). "Isolation of Bacillus spp. with

High Fibrinolytic Activity and Performance Evaluation in Fermented

Douchi". Journal of Food Protection, Vol 84 (4): p. 717–727.

58. Jinzhu Huo, Bin Chen, Zhengbo He, Qiyi He, Youjin Hao and Zhilin Chen. (2013).

"Isolation and identification of an effective fibrinolytic strain Bacillus subtilis FR-

33 from the Chinese doufuru and primary analysis of its fibrinolytic enzyme".

African Journal of Microbiology Research, Vol 7 (19): p. 2001-2009.

59. Liu X, Yao Z, Shim JM, Lee KW, Kim HJ, Kim JH. (2017). "Properties of a

fibrinolytic enzyme secreted by Bacillus amyloliquefaciens RSB34, isolated

from Doenjang". J Microbiol Biotechnol, Vol 27 (1): p. 9-18.

60. Yu Meng, Zhuang Yao, Huong Giang Le, Se Jin Lee, Hye Sung Jeon, Ji Yeon

Yoo, Diana Nur Afifah and Jeong Hwan Kim. (2020). "Isolation of 2

Bacillus Strains with Strong Fibrinolytic Activities from Kimchi". Microbiol.

Biotechnol, Vol 48 (4): p. 439–446.

61. W. Choi Kim, K. Kim, Y. Park, H. Choi, J. Lee, Y. Oh, H. Kwon, I. Lee, S.

(1996). "Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced

from Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang". Applied

113

and environmental microbiology, Vol 62 (7): p. 2482-2488.

62. Halami. P. M, Yogesh. D. (2017). "Fibrinolytic enzymes of Bacillus spp.: an

overview". International Food Research Journal, Vol 24 (1): p. 35-47.

63. Lizhen Hou, Danfeng Li, Miao Hu, Yaxin Gao, Zhiliang Tian, Bei Fan, Shuying

Li, and Fengzhong Wang. (2022). "Recent Advances in Nattokinase-Enriched

Fermented Soybean Foods: A Review". Foods, Vol 11 (187): p. 1-19.

64. Dinh Bui Quynh Mi Anh, Nguyen Thi Tieu Huy, Do Ngoc Anh Van Hung,

Pham. (2015). "Isolation and Optimization of Growth Condition of Bacillus

sp. from Fermented Shrimp Paste for High Fibrinolytic Enzyme Production".

Arabian Journal for Science and Engineering, Vol 40 (1): p. 23-28.

65. D. N. A. Hao Huy, P. A. Hung, P. V. (2016). "Screening and identification of

Bacillus sp. isolated from traditional Vietnamese soybean-fermented

products for high fibrinolytic enzyme production". International Food

Research Journal, Vol 23 (1): p. 326-331.

66. Hoàng Thu Hà, Nguyễn Quỳnh Uyển, Nguyễn Hồng Nhung, Phan Thị Hà, Nguyễn

Huỳnh Minh Quyên. (2015 ). "Bước đầu nghiên cứu nattokinase của chủng vi

khuẩn Bacillus sp. phân lập từ nem chua". Tạp chí Sinh học, Vol 37: p. 129-133.

67. Nguyễn Hữu Phúc, Bùi Thị Nhung. (2014). "Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis

từ natto Nhật Bản làm giống sản xuất natto". Journal of Thu Dau Mot

University, Vol 1 (14): p. 38-41.

68. Lê Thị Bích Phượng, Đỗ Thị Hoàng Tuyến, Lê Trần Nhật Anh, Nguyễn Thị Mỹ

Trang. (2017). "Phân lập vi khuẩn cho hoạt tính nattokinase cao và khảo sát

ảnh hưởng một số yếu tố đối với quá trình lên men thu nhận nattokinase".

Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một, Vol 4 (35): p. 55-62.

69. Choi N, Kim S. (2000). "Purification and characterization of subtilisin DJ-4

secreted by Bacillus sp strain DJ-4 screened from Doen-Jang". Bioscience,

Biotechnology, and Biochemistry, Vol 64: p. 1722-1725.

70. Heo K, Jeong SJ, Park JY, Lee KW, Park JY, Joo SH, Kim JH. (2015).

"Characterization of AprE176, a fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis

HK176". J Microbiol Biotechnol, Vol 25 (1): p. 89-97.

71. Cho KM, Heo K, Lee CK, Kim GM, Shin JH, Kim JS, Kim JH. (2013).

114

"Characterization of a fibrinolytic enzyme secreted by Bacillus

amyloliquefaciens CB1 and its gene cloning". J Microbiol Biotechnol, Vol

23 (7): p. 974-983.

72. Kyoung-Hwa Choi, Jieun Kim, Jeong Hwan Kim, Young-Sun Song and Jaeho Cha.

(2013). "Enhancement of the thermostability of a fibrinolytic enzyme from

Bacillus amyloliquefaciens CH51". Journal of Life Science, Vol 23 (1): p. 15-23.

73. Cho KM, Jeong SJ, Lee CK, Kim GM, Shin JH, Kim JS, Kim JH. (2014).

"Overexpression of aprE2, a fibrinolytic enzyme gene from Bacillus subtilis

CH3-5, in Escherichia coli and the properties of AprE2". J Microbiol

Biotechnol, Vol 24 (7): p. 969-978.

74. Lee HA, Jo HD, Jeong SJ, Kim JH. (2011). "Purification and characterization

of a major fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens MJ5-41

isolated from Meju". J Microbiol Biotechnol, Vol 21 (11): p. 1166-1173.

75. Ku HJ, Ahn MJ, Lee SH, Lee JH. (2015). "Characterization of a novel fibrinolytic

enzyme, BsfA, from Bacillus subtilis ZA400 in Kimchi reveals its pertinence to

thrombosis treatment". J Microbiol Biotechnol, Vol 25 (12): p. 2090-2099.

76. Lee DW, Kim SB, Cheigh CI, Choe EA, Lee SJ, Hong YH, Choi HJ, Pyun YR.

(2006). "Purification and characterization of a fibrinolytic subtilisin-like

protease of Bacillus subtilis TP-6 from an Indonesian fermented soybean,

Tempeh". J Ind Microbiol Biotechnol, Vol 33 (6): p. 436-444.

77. Yang L, Yang H, Li X, Li H, Tu Z, Wang X. (2020). "Genome sequencing,

purification, and biochemical characterization of a strongly fibrinolytic

enzyme from Bacillus amyloliquefaciens Jxnuwx-1 isolated from Chinese

traditional douchi". J Gen Appl Microbiol, Vol 66 (3): p. 153-162.

78. Dan Yu, Yuanliang Hu, Zhaoting Wang, Jianjun Hou, Rohit Tyagi, Yunxiang

Liang & Yongmei Hu. (2019). "Purifcation and characterization of a novel,

highly potent fbrinolytic enzyme from Bacillus subtilis DC27 screened from

Douchi, a traditional Chinese fermented soybean food". Scientific Reports,

Vol 9 (9235): p. 1-10.

79. Huang Q, Peng Y, Zhang RH, Zhang YZ. (2003). "Purification and

115

characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus

amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean

food". Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, Vol 134 (1): p. 45-52.

80. Ji BP, Wang CT, Li B, Nout R, Li PL, Ji H, Chen LF. (2006). "Purification and

characterization of a fibrinolytic enzyme of Bacillus subtilis DC33, isolated from

Chinese traditional Douchi". J Ind Microbiol Biotechnol, Vol 33 (9): p. 750-758.

81. Luo M, Wei X, Xu L, Zhang Y, Lin X, Kong P, Liu H. (2011). "Production of

fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens by fermentation of

chickpeas, with the evaluation of the anticoagulant and antioxidant

properties of chickpeas". J Agric Food Chem, Vol 59 (8): p. 3957-3963.

82. Rajender SK, Devaraj Y, Halami PM. (2018). "Purification and

characterization of fibrinolytic protease from Bacillus amyloliquefaciens

MCC2606 and analysis of fibrin degradation product by MS/MS". Prep

Biochem Biotechnol, Vol 48 (2): p. 172-180.

83. Rakshitha R, Kumar DJ, Vidhya MA, Jennifer PS, Prasad S, Kumar MR,

Kalaichelvan PT. (2014). "Production, optimization and characterization of

fibrinolytic enzyme by Bacillus subtilis RJAS19". Pakistan Journal of

Biological Sciences, Vol 17 (4): p. 529-534.

84. Du M, Wang C, Zheng D, Kong F, Zu G, Feng Y. (2009). "Purification and

characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B-12". J Agric

Food Chem, Vol 57 (20): p. 9722-9729.

85. Kotb E. (2015). "The biotechnological potential of subtilisin-like fibrinolytic

enzyme from a newly isolated Lactobacillus plantarum KSK-II in blood

destaining and antimicrobials". Biotechnol Prog, Vol 31 (2): p. 316-324.

86. Bo Jiang, Ying Hua, Yoshinori Mine, and Wanmeng Mu. (2008). "Purification

and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. nov.

SK006 isolated from an Asian traditional fermented shrimp paste". Journal

of Agricultural and Food Chemistry, Vol 56: p. 1451–1457.

87. D. & Berkeley Claus, R. C. W. (1986). "Genus Bacillus Cohn 1872, 174AL". In

Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol 2: p. 1105-1140.

88. Keitarou Kimura and Satoshi Yokoyama. (2019). "Trends in the application of

116

Bacillus in fermented foods". Current Opinion in Biotechnology, Vol 56: p. 36-42.

89. Rekha Negi, Padma Singh, Vani Sharma, Alka Rani, Pallavi and Richa Prasad.

(2018). "Production of fibrinolytic enzyme (nattokinase) from Bacillus sp.".

Indo American Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 05 (1): p. 379-383

90. Chuan Liu, Yuan Su, Huan Fang and Dawei Zhang. (2020). "Bacillus subtilis: a

universal cell factory for industry, agriculture, biomaterials and medicine".

Microbial Cell Factories, Vol 19 (173): p. 1-12.

91. l. M. Goodfellow, F. G. Priest, L. A. Shute, and R. C. W. Berkeley. (1987).

"Bacillus amyloliquefaciens sp. nov. norn. rev. ". International Journal of

Systematic Bacteriolo, Vol 37 (1): p. 69-71.

92. Lian Yang, Hui Wang, Yanhai Ping, Yingguo Bai, Huiying Luo, Huoqing

Huang, Bin Yao. (2016). "Engineering of a Bacillus amyloliquefaciens strain

with high neutral protease producing capacity and optimization of its

fermentation conditions". PLoS ONE, Vol 11 (1): p. 1-14.

93. Marcus Singh Schallmey, Ajay Ward, Owen. (2004). "Developments in the use

of Bacillus species for industrial production". Canadian journal of

microbiology, Vol 50: p. 1-17.

94. Zhen Wan Kalekristos, Woldemariam Yohannes, Qinglin Yu, Hongyan Li, Xuetuan

Wei, Yingli Liu, Jing Wang, and Baoguo Sun. (2020). "Prebiotic, probiotic,

antimicrobial, and functional food applications of Bacillus amyloliquefaciens".

Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol 68 (50): p. 14709-14727.

95. U.S. FDA. (1999). "Carbohydrase and protease enzyme preparations derived from

Bacillus subtilis or Bacillus amyloliquefaciens; affirmation of GRAS status as

direct food ingredients". Federal Register, Vol 64 (78): p. 19887−19895.

96. Archana Sharma and T. Satyanarayana. (2013). "Comparative genomics of

Bacillus species and its relevance in industrial microbiology". Genomics

Insights, Vol 6: p. 25–36.

97. Sudhir Kumar, Shekhar Dilutpal Sharma, Alok Kumar and Jai Godheja. (2020).

"Isolation, characterization, production and purification of fibrinolytic

enzyme nattokinase from Bacillus subtilis". International Journal of

117

Pharmaceutical Sciences and Research, Vol 11 (4): p. 1768-1776.

98. Qing Huang, Yong Peng, Ren-huai Zhang, Yi-zheng Zhang. (2003).

"Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by

Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional

Chinese soybean food". Comp Biochem Physiol. Biochem, Vol 134: p. 45-52

99. Lin Yang, Huilin Yang, Xiang Li, Hao Li, Zongcai Tu, and Xiaolan Wang. (2020).

"Genome sequencing, purification, and biochemical characterization of a

strongly fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens Jxnuwx-1 isolated

from Chinese traditional douchi". J. Gen. Appl. Microbiol, Vol 66: p. 153–162.

100. Yuanliang Yu Hu, Dan Wang, Zhaoting Hou, Jianjun Tyagi, Rohit Liang,

Yunxiang Hu, Yongmei. (2019). "Purification and characterization of a

novel, highly potent fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis DC27

screened from Douchi, a traditional Chinese fermented soybean food".

Scientific reports, Vol 9 (1): p. 9235-9235.

101. Xuetuan Wei, Dongbo Cai, Yimin Qiu, Yangyang Chen, Jingbang Chen,

Zhiyou Wen, Shouwen Chen (2016). "High-level Expression of nattokinase

in Bacillus licheniformis by manipulating signal peptide and signal

peptidase". Journal Applied Microbiology, Vol 121 (2): p. 704-712.

102. Chi Feng, Shu-Ming Wu, Jin Zhong and Lian-Dong Huan. (2011). "Enhanced

production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis by promoter

optimization". World J Microbiol Biotechnol, Vol 27: p. 99–106.

103. Yinhua Zhou, Xuetuan Wei, Jingbang Chen, Dongbo Cai, Dan Wang, Gaofu

Qi, Shouwen Chen. (2015). "Efficient expression of nattokinase in Bacillus

licheniformis: host strain construction and signal peptide optimization". J

Ind Microbiol Biotechnol, Vol 42 (2): p. 287-295.

104. Bao Wei, Cai Yongjun, Jiang Shujun, Weng Meizhi, Jia Yan, Yin Yan, Zheng

Zhongliang, Zou Goulin. (2011). "Directed evolution improves the

fibrinolytic activity of nattokinase from Bacillus natto". FEMS Microbiology

Letters, Vol 325 (2): p. 155–161.

105. Hồ Thị Trang, Nguyễn Thị Anh Thư. (2021). "Biểu hiện gen nat05 mã hóa

nattokinase trong Bacillus subtilis BD170". Tạp chí Khoa học Đại học Huế:

118

Khoa học Tự nhiên, Vol 130 (1A): p. 69–75.

106. O.I.M. El-Hamshary and Reem S.M., Batayyib Effat, A.M. Soliman. (2016).

"Enhancement of Protease Production of Some Bacillus spp. Isolated from

Various Regions in Jeddah City". International Journal of Current

Microbiology and Applied Sciences, Vol 5 (5): p. 619-635.

107. MG Nadeem Sher, M Syed, Q Irfan, M Baig, S. (2012). "Protease production

from UV mutated Bacillus subtilis". Bangladesh Journal of Scientific and

Industrial Research, Vol 47 (1): p. 69-76.

108. Muhammad Mohsin I., and Fareeha (2017). "Development of Bacillus subtilis

Mutants for Overproduction of Protease". Journal of Microbial &

Biochemical Technology, Vol 09 (4): p. 174-180.

109. Elif Sevgi Demirkan, Tuba Gokoz, Meltem Guler, Baran Enes Zeren, Behice

Ozalpar, Busra Abdou, Maoulida. (2018). "Strain improvement by UV

mutagenesis for protease overproduction from Bacillus subtilis E6-5 and

nutritional optimization". Journal of Biological & Environmental Sciences,

Vol 12 (35): p. 69-77.

110. Mohamed Abu-Zeid, Abdulghafoor Baig, Najla Bent, Saud Al-Saud and Salah E.M.

Abo-Aba. (2019). "EMS Mutation Improve the Fibrinolytic Enzyme Activity in

Bacillus subtilis Strain". World Applied Sciences Journal, Vol 37 (2): p. 135-139.

111. Balakrishnan Naveena and Nagarajan Partha Balasubramanian Bhavani. (2012).

"Strain Improvement of Streptomyces venezuelae for Enhanced Fibrinolytic

Enzyme Production ". Advanced Materials Research, Vol 584: p. 440-444.

112. E. Raju Venkata, Naga Goli, Divakar. (2013). "Bacillus Cereus GD 55 Strain

Improvement by Physical and Chemical Mutagenesis for Enhanced

Production of Fibrinolytic Protease ". International Journal of Pharma

Sciences and Research, Vol 4(5): p.81-93.

113. E. Venkata Naga Raju and Naga Goli Divakar. (2013). "Bacillus Cereus GD

55 Strain Improvement by Physical and Chemical Mutagenesis for Enhanced

Production of Fibrinolytic Protease ". International Journal of Pharma

Sciences and Research, Vol 4 (5): p. 81-93.

114. Subathra Devi, Vaithilingam Chandrasekaran, Mohanasrinivasan Shanker,

119

Ravi Kumar, Sanjeev Thiyur, Swathi Babu, Vaishnavi Selvakumar, Jemimah

Naine Prakash, Suyash. (2015). "Exploring the in vitro thrombolytic activity

of nattokinase from a new strain Pseudomonas aeruginosa CMSS".

Jundishapur journal of microbiology, Vol 8 (10): p. 1-8.

115. Neha Bhalla Thakur, Tek Kumar, Dinesh. (2017). "Systemic mutagenesis of

Bacillus sp. APR-4 for enhanced production of thermostable and alkaline

protease". Biological Forum, Vol 9: p. 54-60.

116. R. Venkataprasad, Shreya Gopinath, K.N. Rajnish, Saptashwa Datta, and E.

Selvarajan. (2020). "Enhancement of Serrapeptase Hyper Producing Mutant

by Combined Chemical and UV Mutagenesis and its Potential for

Fibrinolytic Activity". J Pure Appl Microbiol, Vol 14 (2): p. 1295-1303.

117. Pang Guang-wu and Liang Zhi-qun. (2022). "Mutagenic Breeding and

Optimization of Fermentation Conditions of Fibrinolytic Enzyme from

Marine Bacillus subtilis". China Biotechnology, Vol 42 (12): p. 27-36.

118. Xing Khai, Chor Hooi, Ling Ho. (2015). "Improvement of Xylanase Production by

Bacillus subtilis in Submerged Fermentation after UV and Chemicals Mutagenesis".

Journal of Advances in Biology & Biotechnology, Vol 3 (2): p. 42-57.

119. Bushra Sadia, Muhammad Naeem, Faisal Saeed Awan and Muhammad Anjum Zia.

(2018). "Enhanced Production of Streptokinase by UV- and Ethidium Bromide-

Treated Streptococus equisimilis Mutant". Pakistan J. Zool, Vol 50 (2): p. 401-797.

120. Hironobu Ikehata and Tetsuya Ono. (2011). "The Mechanisms of UV

Mutagenesis". Journal of Radiation Research, Vol 52: p. 115–125.

121. Mohammad B., Habibi Najafi and Parnian Pezeshki. (2013). "Bacterial

Mutantion; types, mechanisms and mutant detection methods: A Review".

European Scientific Journal, Vol 4: p. 628-638.

122. V Devi Mohanasrinivasan, C Subathra Biswas, Ritusree Paul, Falguni Mitra,

Mohor Selvarajan, E Suganthi, V. (2013). "Enhanced production of

nattokinase from UV mutated Bacillus sp". Bangladesh Journal of

Pharmacology, Vol 8 (2): p. 110-115.

123. Elif and ÖZdemİR Demirkan, Kübra. (2020). "Ethyl Methanesulfonate (EMS)

120

Mutation for Hyper Protease Production by Bacillus subtilis E6-5 and

Optimization of Culture Conditions". Hacettepe Journal of Biology and

Chemistry, Vol 48 (4): p. 355-365.

124. Christine A Codomo, Elizabeth A Greene, Nicholas E Taylor, Jorja G

Henikoff, Bradley J Till, Steven H Reynolds, Linda C Enns, Chris Burtner,

Jessica E Johnson, Anthony R Odden, Luca Comai, Steven Henikoff. (2003).

"Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-

genetic screen in Arabidopsis". Genetics, Vol 164 (2): p. 731-740.

125. G A Sega. (1984). "A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate".

Mutation Research, Vol 134 (2-3): p. 113-142.

126. A. Kodym, & Afza, R. (2003). "Physical and Chemical Mutagenesis". Plant

Functional Genomics, Vol: p. 189-204.

127. D. R. Krieg. (1963). "Ethyl methanesulfonate-induced reversion of

bacteriophage T4rII mutants". Genetics, Vol 48 (4): p. 561-580.

128. S. Henikoff, Till, B. J., & Comai, L. (2004). "Traditional mutagenesis meets

functional genomics". Plant Physiology, Vol 153 (2): p. 630-636.

129. T Lalitha Govardhan and KPJ Hemalatha K Suribabu. (2014). "Strain

Improvement of Brevibacillus borostelensis R1 for Optimization of α-

Amylase Production by Mutagens". Journal of Microbial & Biochemical

Technology, Vol 6 (3): p. 23-127.

130. Mohsin Iqbal, Asia Latif, Muhammad Asgher. (2018). "Ethyl methane sulfonate

chemical mutagenesis of Bacillus subtilis for enhanced production of protease".

Organic & Medicinal Chemistry International Journal, Vol 5 (3): p. 1-8.

131. Mohanasrinivasan.V, Shruti Srivatsava, Jemimah Naine.S, Vaishnavi.B,

Subathra Devi.C. (2018). "Strain improvement, production and stability of

Nattokinase from UV mutant strain of Pseudomonas aeruginosa CMSS".

International Journal of ChemTech Research, Vol 11 (7): p. 314-322.

132. Jianmin Xing Liu. J, Tianshi Chang, Zhiya Ma, Huizhou Liu. (2005).

"Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by

Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods". Process

121

Biochemistry, Vol 40: p. 2757–2762.

133. J. K Wang, Hua-Hsien Chiu, Ching-Shieh Hsieh. (2009). "Optimization of the

medium components by statistical experimental methods to enhance

Nattokinase activity". Fooyin Journal of Health Sciences, Vol 1 (1): p. 21−27.

134. Eun-Yeong Kwon, Kim, Kyung Mi, Kim, Mi Kyoung, Lee, In Young Kim, Beom

Soo. (2011). "Production of nattokinase by high cell density fed-batch culture of

Bacillus subtilis". Bioprocess and biosystems engineering, Vol 34 (7): p. 789-793.

135. N. A Tuan, D. T. H. Thuan, T. T. M. Tam, and N. T. Huong. (2015).

"Determination the optimum fermentation in obtaining nattokinase by

Bacillus subtilis natto". International Journal of Innovation and Applied

Studies, Vol 13 (3): p. 663-668.

136. Nhung H.A. Nguyen, Pornkamol Unrean, Wonnop Visessanguan, and Panit

Kitsubun. (2012). "Improvement of nattokinase production by Bacillus

subtilis using an optimal feed strategy in fed-batch fermentation". KKU

Research Journal, Vol 17 (5): p. 769-777.

137. Wenjing Suo Cui, Feiya Cheng, Jintao Han, Laichuang Hao, Wenliang Guo,

Junling Zhou, Zhemin. (2018). "Stepwise modifications of genetic parts

reinforce the secretory production of nattokinase in Bacillus subtilis".

Microbial Biotechnology, Vol 11 (5): p. 930–942.

138. Ping Xiao, Yao, Si-Ping, Liu, Jin-Fu, Miao, Ying, Wang, Yan-Ping. (2015).

"Enhanced Production of Fibrinolytic Enzyme from Bacillus

amyloliquefaciens CGMCC 7380 Using Broad Bean as Substrate". Advance

Journal of Food Science and Technology, Vol 9: p. 832-839.

139. Ponnuswamy Vijayaraghavan and Samuel Gnana Prakash Vincent. (2014).

"Medium optimization for the production of fibrinolytic enzyme by

paenibacillus sp. IND8 using response surface methodology". The Scientific

World Journal, Vol 2014: p. 1-9.

140. P. Rajendran Ponnuswamy Vijayaraghavan, Samuel Gnana Prakash Vincent,

Arumugaperumal Arun, Naif Abdullah Al-Dhabi, Mariadhas Valan Arasu,

Oh Young Kwon, and Young Ock Kim. (2017). "Novel Sequential Screening

122

and Enhanced Production of Fibrinolytic Enzyme by Bacillus sp. IND12

Using Response Surface Methodology in Solid-State Fermentation". BioMed

Research International, Vol 27: p. 1-13.

141. K.V. Smitha and B.V. Pradeep. (2018). "Optimization of Physical and Cultural

Conditions of Fibrinolytic Enzyme from Bacillus altitudinis S-CSR 0020".

Journal of Pure and Applied Microbiology, Vol 12 (1): p. 343-354.

142. K. Kalishwaralal V. Deepak, S. Ramkumarpandian, S. Venkatesh Babu, S.R.

Senthilkumar, G. Sangiliyandi. (2008). "Optimization of media composition

for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface

methodology". Bioresource Technology, Vol 99: p. 8170–8174.

143. Chang Yee Yee Chandramohan M, Phoon Hue Kei Beatrice, Paulraj Ponnaiah,

Narendrakumar G and Antony V Samrot. (2019). "Production,

characterization and optimization of fibrinolytic protease from Bacillus

pseudomycoides strain MA02 isolated from poultry slaughter house soils".

Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, Vol 22: p. 1-18.

144. Thiago Pajeú Sales Nascimento, Amanda Emmanuelle Porto, Camila Souza Brandão,

Romero Marcos Pedrosa Takaki, Galba Maria Campos Teixeira, J. A. Porto,

Tatiana Souza Porto, Ana Lúcia Figueiredo. (2015). "Production and

characterization of new fibrinolytic protease from Mucor subtillissimus UCP 1262

in solid-state fermentation". Advances in Enzyme Research, Vol 3 (3): p. 81-91.

145. V Deepak, K. Kalishwaralal, S. Ramkumarpandian, B.S. Venkatesh, S.R.

Senthilkumar, G. Sangiliyandi. (2008). "Optimization of media composition

for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface

methodology". Bioresource Technology, Vol 99 (17): p. 8170-8174.

146. Zhilin Cao, Shouyong Ju, Christina Wong, Yangyang Liu, Mohamed F. Foda,

Zhenyu Zhang, and Jinshan Li. (2019). "Isolation and Optimal Fermentation

Condition of the Bacillus subtilis Subsp. natto Strain WTC016 for

Nattokinase Production". Fermentation, Vol 5 (92): p. 1-12.

147. Chao Huang, Xiaojie Ren, Xin Shan, Heng Ban, Baoyue Liu, Yu Du, Yuanda

Song and Xinhe Zhao. (2021). "Nattokinase Activity Guided Natto

Fermentation Process Optimization". American Journal of Biochemistry and

123

Biotechnology, Vol 17 (4): p. 423.432.

148. P.T Chen, C.J. Chiang, Y.P. Chao. (2007). "Medium optimization for the

production of recombinant nattokinase by Bacillus subtilis using response

surface methodology". Biotechnology Progress,Vol 23 (6): p. 1327-1332.

149. K.W Jau, H.C. Hua, S.H. Ching. (2009). "Optimization of the medium

components by statistical experimental methods to enhance nattokinase

activity". Fooyin Journal of Health Sciences, Vol 1 (1): p. 21-27.

150. Prafulla M., Gokhale Mahajan, Sagar V. Lele, Smita S. (2010). "Production of

nattokinase using Bacillus natto NRRL 3666: Media optimization, scale up, and

kinetic modeling". Food Science and Biotechnology, Vol 19 (6): p. 1593-1603.

151. Ponnuswamy Vincent Vijayaraghavan, Samuel. (2014). "Statistical

Optimization of Fibrinolytic Enzyme Production Using Agroresidues by

Bacillus cereus IND1 and Its Thrombolytic Activity In Vitro". BioMed

research international, Vol 2014: p. 1-11.

152. T Kapila, B. K. Bajaj, S. Kumar & N. Dilbaghi. (2018). "Process optimization for

production and purification of novel fibrinolytic enzyme from Stenotrophomonas

sp. KG-16-3". Biocatalysis and Biotransformation, Vol 37 (2): p. 124-138.

153. Plackett. R.L and J. P. Burman. (1946). "The Design of Optimum

Multifactorial Experiments". Biometrika, Vol 33 (4): p. 305-325.

154. Alves-Prado Bocchini. D. A, L.C Baida, I.C Roberto, E Gomes, R Da Silva.

(2002). "Optimization of xylanase production by Bacillus circulans D1 in

submerged fermentation using response surface methodology". Process

Biochemistry, Vol 38 (5): p. 727-731.

155. B. Ashokkumar, Senthilkumar. S. R, K. Chandra Raj, P. Gunasekaran. (2005).

"Optimization of medium composition for alkali-stable xylanase production by

Aspergillus fischeri Fxn 1 in solid-state fermentation using central composite

rotary design". Bioresource Technology, Vol 96 (12): p. 1380-1386.

156. R. Agrebi, A. Haddar, M. Hajji, F. Frikha, L. Manni, K. Jellouli, and M. Nasri.

(2009). "Fibrinolytic enzymes from a newly isolated marine bacterium

Bacillus subtilis A26: characterization and statistical media optimization".

124

Can. J. Microbiol, Vol 55: p. 1049– 1061.

157. Nguyễn Thị Thu Kiều, Trần Quốc Tuấn, Lê Thị Thúy Ái, Đinh Minh Hiệp,

Trần Cát Đông. (2014). "Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men chủng

Bacillus subtillis thu nhận nattokinase tái tổ hợp bằng phương pháp đáp ứng

bề mặt". Tạp chí Sinh học, Vol 36 (1se): p. 130-137.

158. Nguyen Nhut Huy and Nguyen Thuy Huong. (2016). "Optimization of the

possibility synthetic nattokinase in soybean substrates to orientation

products development". International Journal of Pharmaceutical Science

Invention, Vol 5 (3): p. 35-41.

159. Bijender Kumar, Bajaj Kapila Taneja, Sandeep Kumar, Neeraj Dilbaghi. (2017).

"Production, purification and characterization of fibrinolytic enzyme from

Serratia sp. KG-2-1 using optimized media". 3 Biotech, Vol 7 (184): p. 1-15.

160. Y.H Cho, J. Y. Song, K. M. Kim, M. K. Kim, I. Y. Lee, S. B. Kim, H. S. Kim, N. S.

Han, B. H. Lee and B. S. Kim. (2010). "Production of nattokinase by batch and

fed-batch culture of Bacillus subtilis". New Biotechnology, Vol 27 (4): p. 341-346.

161. Pham Tuan Anh, Nguyen Lan Huong, La Thi Quynh Nhu, Duong Van Ha, To

Kim Anh. (2013). "Nâng cao khả năng sinh tổng hợp nattokinase của chủng

Bacillus subtilis D bằng ương pháp lên men fed-batch". Tạp chí khoa học &

Công nghệ các trường đại học kỹ thuật, Vol 92: p. 147-151.

162. Rujiralai Poontawee and Savitree Limtong. (2020). "Feeding Strategies of

Two-Stage Fed-Batch Cultivation Processes for Microbial Lipid Production

from Sugarcane Top Hydrolysate and Crude Glycerol by the Oleaginous Red

Yeast Rhodosporidiobolus fluvialis". Microorganisms, Vol 8 (2): p. 1-19.

163. Tek Chand Bhalla and Dinesh Kumar Neha Thakur. (2017). "Systemic

mutagenesis of Bacillus sp. APR-4 for enhanced production of thermostable

and alkaline protease". Biological Forum, Vol 9 (2): p. 54-60.

164. W. Nicholson & P. Setlow. (1990). "Molecular Biological Methods for

Bacillus". C. Harwood & S. Cutting, New York, Vol: p. 391-450.

165. Sashi Prava Devi and Dhruva Kumar Jha. (2020). "Isolation of a lipolytic and

proteolytic Bacillus licheniformis from refinery oily sludge and optimization

of culture conditions for production of the enzymes". Microbiol Biotechnol.

125

Lett, Vol 48 (4): p. 515–524.

166. H. T. V. Lin, G. J. Wu, M. C. Hsieh, S. H. Chang, and G. J. Tsai. (2015).

"Purification and characterization of nattokinase from cultural filtrate of red

alga Porphyra Dentata fermented by Bacillus subtilis N1". Journal of Marine

Science and Technology, Vol 23 (2): p. 240-248.

167. Ann C. Smith and Marise A. Hussey. (2016). "Gram Stain Protocols".

American Society for Microbiology, Vol: p. 1-9.

168. Alice B. Schaeffer and Mac Donald Fulton. (1990). "A Simplified Method of

Staining Endospores". Science Asia, Vol 77: p. 194.

169. Gail Lorenz Liller. (1959). "Use of DinitrosaIicyIic Acid Reagent for Determination

of Reducing Sugar". Analytical Chemistry, Vol 31 (3): p. 426-428.

170. Marion M. Bradford. (1976). "A Rapid and Sensitive Method for the

Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of

Protein-Dye Binding". Analytical Biochemistry, Vol 72: p. 248-254.

171. Ivana Karabegović Sandra, Stamenković Stojanović, Vladimir Beškoski, Nada

Nikolić, Miodrag Lazić. (2020). "Bacillus subtilis NCIM2063 batch cultivation:

The influence of the substrate concentration and oxygen transferrate on the

biomass yield". Advanced technologies, Vol 9 (1): p. 44-49.

172. J. P. Tamang and S. Nikkuni. (1996). "Selection of starter cultures for the

production of kinema, a fermented soybean food of the Himalaya". World

Journal of Microbiology and Biotechnology, Vol 12 (6): p. 629-635.

173. Asad Hussain, Shah Sobia Sharif, Anila Fariq, Sammyia Jannat, Sajida

Rasheed, Azra Yasmin. (2023). "Optimization of amylase production using

response surface methodology from newly isolated thermophilic bacteria".

Heliyon, Vol 9 (1): p. 1-12.

174. Yingjie Xie, Feng Li, Xiang Gao, Mingxu Shan, Changchao Sun Yan Dong

Niu, Anshan Shan. (2020). "Screening of cellulose degradation bacteria

from Min pigs and optimization of its cellulase production". Electronic

Journal of Biotechnology, Vol 48: p. 29-35.

175. BioMérieux. "API®Reference Guide". Vol: p. 1-7.

176. BioMérieux. "API® 50 CHB/E Medium Bacillus and related genera /

126

Enterobacteriaceae and Vibrionaceae". Vol: p. 1-11.

177. BioMérieux. "api® 20 E Identification system for Enterobacteriaceae and

other non-fastidious Gram-negative rods". Vol: p. 1-5.

178. A. Copeland William S. and Helene Feil. (2012). "Bacterial genomic DNA

isolation using CTAB". Vol 3.

179. Muhammad Sulchan Diana Nur Afifah, Dahrul Syah, Yanti, Maggy T. Suhartono.

(2014). "Isolation and identification of fibrinolytic protease-producing

microorganisms from Red Oncom and Gembus, Indonesian fermented soybean

cakes". Malaysian Journal of Microbiology, Vol 10 (4): p. 273-279.

180. Canan Tari & Marcelo Fernández-Lahore Doreen Heerd. (2014). "Microbial

strain improvement for enhanced polygalacturonase production by

Aspergillus sojae". Appl Microbiol Biotechnol, Vol 98: p. 7471–7481.

181. Mohsin A I, Muhammad B, Fareeha. (2017). "Development of Bacillus subtilis

mutants for overproduction of protease". Journal of Microbial &

Biochemical Technology, Vol 9 (4): p. 174-180.

182. Y Supriatin, A Oktari, M Kamal and H Syafrullah. (2017). "The bacterial

endospore stain on schaeffer fulton using variation of methylene blue

solution ". Journal of Physics: Conference Series, Vol 812: p. 1-6.

183. Lizhen Hou, Zhiliang Tian, Miao Hu, Yaxin Gao, Danfeng Li, Bei Fan,

Fengzhong Wang and Shuying Li. (2022). "Optimization of sporulation

conditions for Bacillus subtilis BSNK-5". Processes, Vol 10: p. 1-10.

184. Jinshan Jin, Liang Li, Haijing Hu, Ian F. Deveau, Steven L. Foley, Huizhong

Chen. (2022). "Optimization of sporulation and purification methods for

sporicidal efficacy assessment on Bacillus spores". Journal of Industrial

Microbiology and Biotechnology, Vol 49 (4): p. 1-10.

185. Ming Sheng, Dong Li Cui, Xiao Hong Chen, Mei Jiang, Xin Lv, Guijun Yan,

Mei Jiang, Xin Lv, Guijun Yan. (2008). "A novel fibrinolytic enzyme from

Cordyceps militaris, a Chinese traditional medicinal mushroom". World J

Microbiol Biotechnol, Vol 24: p. 483–489.

186. Guiguang Chen, Rui Wu, Shihan Pan, Jingjing Zeng, and Zhiqun Liang.

127

(2019). "Cost-effective fibrinolytic enzyme production by Bacillus subtilis

WR350 using medium supplemented with corn steep powder and sucrose".

Sci Rep, Vol 9 (6824): p. 1-10.

187. Asha S. Salunke and Arun S. Kharat. (2019). "Data on isolation and

purification of fibrinolytic enzyme from Pseudomonas baetica SUHU25".

Data in Brief, Vol 26: p. 1-11.

188. Shafiul Haque, Vineeta Singh, Ram Niwas, Akansha Srivastava, Mukesh

Pasupuleti, C. K. M. Tripathi. (2017). "Strategies for fermentation medium

optimization: An in-depth review". Frontiers in Microbiology, Vol 7: p. 1-16.

189. Sang Yup Lee and Sunwon Park Jeongseok Lee. (1997). "Fed-batch culture of

Escherichia coli W by exponential feeding of sucrose as a carbon source".

Biotechnology Techniques, Vol 11 (1): p. 59–62.

190. Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị

Hồng Vân, Lê Thị Hương. (2012). "Phân lập và tuyển chọn một số chủng

Bacillus sinh tổng hợp nattokinase". Tạp chí Sinh học, Vol 34: p. 99-104.

191. Natarajan Benit Jayarajapazham Rajaselvam, Saqer S. Alotaibi, M.A. Rathi,

Srisesharam Srigopalram, Gurupatham Devadhasan Biji, Ponnuswamy

Vijayaraghavan. (2021). "In vitro fibrinolytic activity of an enzyme purified

from Bacillus amyloliquefaciens strain KJ10 isolated from soybean paste".

Saudi Journal of Biological Sciences, Vol 28 (8): p. 4117-4123.

192. Zhao HY, Wang XC, Liu G, Cheng XJ, Feng H. (2016). "Improving

production of extracellular proteases by random mutagenesis and

biochemical characterization of a serine protease in Bacillus subtilis S1-4".

Genetics and Molecular Research, Vol 15 (2): p. 1-11.

193. Shi H. Zhang Wang, Cheng Yang, Yan L. Diao, Miao Bai, Ming F. (2008).

"Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and characterization of

the fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis LD-8547". World Journal

of Microbiology and Biotechnology, Vol 24 (4): p. 475-482.

194. Manzoor Chaudhary Hussain, AK Bashir, Hamid. (2019). "Enhance

production of alkaline protease by chemical mutagenesis of Bacillus

128

species". Biocell, Vol 43 (5-1): p. 312-322.

195. Baoyue Zhu, Jinfang Zhang, Xinyue Li, Xiaojian Xu, Dengke Li, Fang Zeng,

Cuixia Zhou, Yihan Liu, Yu Li and Fuping Lu. (2022). "Multiple Modular

Engineering of Bacillus Amyloliquefaciens Cell Factories for Enhanced

Production of Alkaline Proteases From B. Clausii". Frontiers in

Bioengineering and Biotechnology Advances, Vol 10: p. 1-16.

196. Jian-Tao Chen, Ling-Ling Wang, Long-Fei Wang, Sha Wu, Guang-zhao Zhang,

Han-Qing Yu, Xiao-dong Ye & Qing-Shan Shi. (2017). "Conformations and

molecular interactions of poly-γ-glutamic acid as a soluble microbial product in

aqueous solutions". Scientific Reports, Vol 7: p. 1-11.

197. Mingfeng Cao, Weitao Geng, Cunjiang Song, Hui Xie, Li Liu, Chao Yang, Jun

Feng, Wei Zhang, Yinghong Jin, Yang Du, and Shufang Wang. (2011).

"Complete Genome Sequence of Bacillus amyloliquefaciens LL3, Which

Exhibits Glutamic Acid-Independent Production of Poly-γ-Glutamic Acid".

Journal of Bacteriology, Vol 193 (13): p. 3393–3394.

198. B. K. May, A. R. Gould, and W. H. Elliott. (1975). "Release of Extracellular Enzymes

from Bacillus amyloliquefaciens". Journal of Bacteriology, Vol 122 (1): p. 34-40.

199. K. Kalishwaralal, V. Deepak, S. Ramkumarpandian, S. Venkatesh Babu, S.R.

Senthilkumar, G. Sangiliyandi (2008). "Optimization of media composition

for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface

methodology". Bioresource Technology, Vol 99: p. 8170–8174.

200. S.G. Prakash Vincent P. Vijayaraghavan. (2015). "A low cost fermentation

medium for potential fibrinolytic enzyme production by a newly isolated marine

bacterium, Shewanella sp. IND20". Biotechnology Reports, Vol 7: p. 135-142.

201. B.V. Pradeep, K.V. Smitha. (2018). "Optimization of Physical and Cultural

Conditions of Fibrinolytic Enzyme from Bacillus altitudinis S-CSR 0020".

Journal of Pure and Applied Microbiology, Vol 12 (1): p. 343-354.

202. Kowther Isameldein Bashir, Hanan Moawia Ibrahim, Elrashied Elimam

Elkhidir, Mawa Ibrahim Alnour and Omayma Elyas. (2015). "Statistical

Optimization of Culture Conditions for Nattokinase Production by Batch

Fermentation". International Journal of Current Microbiology and Applied

129

Sciences, Vol 5 (11): p. 143-153.

203. Nguyen Anh, Huong Tuan, Nguyen Thuy. (2014). "Optimization of the

Fermentation Medium to Receive The Highest Biomass Yield By Bacillus

Subtilis Natto And The Initial Test Of Nattokinase Yield". IOSR Journal of

Engineering, Vol 04: p. 35-40.

204. Hanan Hamadan Moawia, Wegdan Alawad, Aisha Elkhidir, Elrashied. (2016).

"Enhancing media compositions for nattokinase production: An approach of

response surface methodology". International Journal of Advanced Research,

Vol 4 (11): p. 1536-1546.

205. Guiguang Chen, Rui Wu, Shihan Pan, Jingjing Zeng & Zhiqun Liang. (2019).

"Cost-effective fibrinolytic enzyme production by Bacillus subtilis WR350

using medium supplemented with corn steep powder and sucrose". Scientific

Reports, Vol 9 (1): p. 6824-6834.

130

206. https://www.sciencephoto.com/media/96159/view/bacillus-amyloliquefaciens-sem.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Dựng đường chuẩn tyrosine

Cân 0,001 g tyrosin pha trong 50 ml HCl 0,2 N, được dung dịch gốc. Từ đó

pha loãng ra các nồng độ từ 2 – 20 µg/ml. Tiến hành so màu ở bước sóng 275nm và

0.7

0.6

y = 0.01x + 0.0039 R² = 0.9997

0.5

xây dựng đường chuẩn.

)

0.4

m n 5 7 2 (

0.3

D O

0.2

0.1

0

0

10

20

30

40

50

60

70

Nồng độ tyrosine (µg/ml)

Phụ lục 2. Dựng đường chuẩn glucose

Dung dịch chuẩn glucose: 100µg/ml (100ml). Pha loãng dung dịch glucose

chuẩn theo dải nồng độ từ 0-100μg/ml. Tiến hành so màu ở bước song 540nm và

0.12

xây dựng đường chuẩn.

) l

0.1

y = 0.022x + 0.0026 y = 0.022x + 0.0026 R² = 0.9977 R² = 0.9977

m / g m

0.08

0.06

l

0.04

( e s o c u G ộ đ g n ồ N

0.02

0

0

1

4

5

3 2 OD (540nm)

131

Phụ lục 3. Dựng đường chuẩn Protein

Pha loãng nồng độ BSA chuẩn:

Thể tích ống 1 ống 2 ống 3 ống 4 ống 5 ống 6

Nồng độ dd gốc (µg/ml) 0 10 20 30 40 50

V H₂O 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,8

∑V (ml) 6 6 6 6 6 6

Vdd chuẩn (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

V Bradford (ml) 5 5 5 5 5 5

+ Lắc đều trong 5 phút.

+ Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm.

0.8

0.7

y = 0.0141x + 0.0148 R² = 0.9982

0.6

+ Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µm/ml) với mật độ quang.

)

0.5

0.4

m n 5 9 5 (

0.3

D O

0.2

0.1

0

0

10

50

60

20 40 30 Nồng độ BSA (µg/ml)

132

Phụ lục 4

1. Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc của 23 chủng phân lập có hoạt tính

protease cao

Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc

HY5 Khuẩn lạc màu trắng sữa, tròn, nhăn lồi ở giữa.

HY6 Khuẩn lạc màu trắng, tròn đều.

HY1 Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, nhăn và lồi.

HY4 Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, nhăn, bờ viền.

HY12

Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, bề mặt nhăn.

HY7 Khuẩn lạc màu trắng xám, tròn, bề mặt nhăn.

HY14 Khuẩn lạc màu trắng xám, tròn đều, có vân.

HY13 Khuẩn lạc màu trắng sữa, tròn, nhăn ở giữa.

HD3

HY15 Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn đều, có vân.

Khuẩn lạc màu trắng sữa, tròn đều, nhăn ở giữa.

NA1 Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn đều, nhăn lồi giữa.

HP4 Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, nhăn lồi, lõm giữa.

NA5

NA3

Khuẩn lạc màu trắng sữa, tròn, bề mặt mịn.

Khuẩn lạc màu trắng xám, không tròn, nhăn lồi.

HN4 Khuẩn lạc màu trắng đục, không tròn, nhăn viền ngoài.

NA2 Khuẩn lạc màu trắng, tròn, xung viền quanh.

HN8 Khuẩn lạc màu xám, không tròn, nhăn lồi ở giữa.

HN9 Khuẩn lạc màu trắng, tròn, vân tròn.

HN11 Khuẩn lạc màu trắng xám, không tròn.

HN5 Khuẩn lạc màu trắng xám, không tròn, nhăn.

133

PT1 Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn đều, viền răng cưa.

BN3 Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn đều, nhăn lồi.

BN1 Khuẩn lạc màu trắng xám, tròn, vân tròn ở giữa.

2. Vòng thủy phân sữa gầy của một số chủng phân lập sàng lọc có

hoạt tính protease trên đĩa thạch LB + 1 % sữa gầy (ủ 37 oC/6 h)

Phụ lục 5

1. Khảo sát tỉ lệ % tế bào sống và tế bào chết sau chiếu tia UV ở các

120

Tỉ lệ % sống

Tỉ lệ % chết

100

80

khoảng thời gian khác nhau (từ 30 - 180 phút).

%

60

ệ l ỉ

T

40

20

0

0

30

60

90

120

150

180

Thời gian chiếu tia UV (phút)

134

2. Một số hình ảnh sàng lọc chủng đột biến bằng tia UV trải trên đĩa

135

thạch LB + 1% sữa gầy và sàng lọc hoạt tính enzyme protease.

3. Bảng tổng hợp số liệu khuẩn lạc thu nhận được sau đột biến UV

TT Đột biên UV Tổng số khuẩn lạc

1 Lần 1 94

2 Lần 2 85

3 Lần 3 91

4 Lần 4 87

5 Lần 5 83

Tổng số 440

Phụ lục 6

1. Một số hình ảnh sàng lọc chủng đột biến bằng hóa chất trải trên đĩa

136

thạch LB + 1% sữa gầy và sàng lọc hoạt tính enzyme protease.

137

138

2. Bảng tổng hợp số liệu khuẩn lạc thu nhận được sau đột biến hóa chất

Chủng sử dụng Tổng số khuẩn lạc TT Hóa chất đột biến để đột biến

EtBr 214 1 HY6

EtBr 201 2 U5_90.5

EMS 196 3 U5_90.5

EMS E1 205 4

139

EtBr +EMMS 104 5 U5_90.5

Phụ lục 7

ES4

HY6

So sánh đặc điểm của 2 chủng HY6 và ES4

Hình ảnh khuẩn lạc của chủng HY6 và ES4

ES4/24 h

HY6/24 h

HY6/72h

ES4/72 h

140

(trên môi trường LB + 1% sữa gầy, 37oC/16 h)

ES4/7 ngày

Hình ảnh nhuộm bào tử của chủng HY6 và ES4

(nuôi trên môi trường DSM)

Hoạt tính enzyme thủy phân tinh bột và xenlulolaza của 2 chủng HY6 và

141

chủng đột biến ES4 (ủ 37oC/6 giờ)

Phụ lục 8

Xây dựng cây phân loài trên TYPE (STRAIN) GENOME SERVER

142

cho 2 chủng HY6 và ES4

Phụ lục 9

Kết quả phản ứng sinh hóa trên thanh API 50CH, API 20E sau 18 h và kết

1. Kết quả phản ứng hóa sinh trên thanh API 50CH

2. Kết quả phản ứng sinh hóa trên thanh API 20E sau ủ 18 h, chưa nhỏ TDA, IND

và VP.

3. Kết quả phản ứng sinh hóa trên thanh API 20E sau ủ 18 h và nhỏ TDA, IND và

VP sau 10 phút.

143

quả phân tích trên phần mềm APIWEDTM của 2 chủng HY6 và ES4

Phục lục 10

1. Bảng tốc độ bổ sung cơ chất theo hàm số mũ trong lên men theo

mẻ bổ sung cơ chất 1 giai đoạn và 2 giai đoạn

Thể tích (ml)

144

TT Thời gian (h) Tốc độ bổ sung cơ chất (ml/h) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 5h 5h15 5h30 5h45 6h 5h15 5h30 5h45 7h 7h15 7h30 7h45 8h 8h15 8h30 8h45 9h 9h15 9h30 9h45 10h 10h15 10h30 10h45 11h 11h15 11h30 11h45 12h 12h15 12h30 12h45 13h 4.83 5.50 6.25 7.10 8.07 9.18 10.44 11.86 13.49 15.33 17.43 19.82 22.53 25.61 29.11 33.10 37.63 42.77 48.63 55.28 62.85 71.45 81.22 92.34 104.97 119.34 135.67 154.23 175.34 199.33 226.60 257.61 292.86 1.21 1.37 1.56 1.78 2.02 2.29 2.61 2.97 3.37 3.83 4.36 4.95 5.63 6.40 7.28 8.27 9.41 10.69 12.16 13.82 15.71 17.86 20.31 23.08 26.24 29.83 33.92 38.56 43.83 49.83 56.65 64.40 73.22

145

2. Hình ảnh thiết bị lên men 2 lít