Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Đánh giá sự thay đổi tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Hồ Nguyễn Quỳnh Chi

ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI TĂNG SINH VÀ CẤU TRÚC

KHUNG XƯƠNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ CUỐNG RỐN

NGƯỜI TRONG ĐIỀU KIỆN VI TRỌNG LỰC MÔ PHỎNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Hồ Nguyễn Quỳnh Chi ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI TĂNG SINH VÀ CẤU TRÚC

KHUNG XƯƠNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ CUỐNG RỐN

NGƯỜI TRONG ĐIỀU KIỆN VI TRỌNG LỰC MÔ PHỎNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS. TS. Hoàng Nghĩa Sơn

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2021

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung

thực và chƣa hề đƣợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp đỡ cho việc

thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã

đƣợc chỉ rõ nguồn gốc rõ ràng và đƣợc phép công bố.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 04 năm 2021

Học viên thực hiện

Hồ Nguyễn Quỳnh Chi

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến Thầy -

PGS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn, ngƣời đã luôn tận tâm chỉ dẫn, tạo mọi điều kiện cho

tôi học tập, nghiên cứu và hoàn chỉnh đề tài này.

Xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện

thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này.

Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều

kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này.

Xin chân thành cảm ơn đề tài: “Nghiên cứu đánh giá sự thay đổi trong cấu

trúc bộ khung tế bào cơ thể sống trong điều kiện mô phỏng trạng thái vi trọng lực

(simulated microgravity)”, thuộc Chƣơng trình Khoa học công nghệ vũ trụ, mã số:

CNVT/16-20 đã hỗ trợ cho nghiên cứu.

Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lê Thành Long, ngƣời đã hƣớng dẫn

tận tình và giúp tôi có cơ hội đƣợc thực hiện đề tài.

Tôi xin cảm ơn Thầy, Cô, các anh chị đồng nghiệp, các bạn sinh viên đã và

đang nghiên cứu tại Viện Sinh học Nhiệt đới đã luôn động viên giúp đỡ tôi trong

quá trình công tác và nghiên cứu.

Con xin cảm ơn ba, mẹ, em đã luôn ở bên con, động viên con trong mọi lúc

khó khăn.

Tp. HCM, ngày 19 tháng 04 năm 2021

Hồ Nguyễn Quỳnh Chi

iii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii

MỤC LỤC ................................................................................................................. iii

DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ................................................................... vi

DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... ix

TÓM TẮT ................................................................................................................. xii

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 5

1.1. Vai trò của các nghiên cứu sinh học trong không gian ........................................ 5

1.2. Giới thiệu về vi trọng lực và vi trọng lực mô phỏng............................................ 6

1.2.1. Vi trọng lực ..................................................................................................... 6

1.2.2. Vi trọng lực mô phỏng .................................................................................... 8

1.3. Các hệ thống mô phỏng vi trọng lực .................................................................... 9

1.3.1. Clinostat ........................................................................................................ 10

1.3.2. Buồng quay ................................................................................................... 13

1.3.3. Máy định vị ngẫu nhiên ................................................................................ 14

1.4. Tế bào gốc trung mô cuống rốn ......................................................................... 15

1.4.1. Khái niệm ...................................................................................................... 15

1.4.2. Lợi ích của tế bào gốc trung mô cuống rốn .................................................. 16

1.5. Sự tăng sinh tế bào ............................................................................................. 17

1.5.1. Định nghĩa..................................................................................................... 17

1.5.2. Các yếu tố điều hòa chu kỳ tế bào ................................................................ 18

1.5.3. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của vi trọng lực lên sự tăng sinh tế bào ...... 19

1.6. Quá trình apoptosis ............................................................................................ 20

1.6.1. Khái niệm ...................................................................................................... 20

1.6.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến apoptosis ............................................................ 22

1.6.3. Phương pháp đánh giá apoptosis ................................................................. 23

1.7. Nhân và tế bào chất ............................................................................................ 26

iv

1.7.1. Định nghĩa và vai trò của nhân và tế bào chất ............................................. 26

1.7.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thái nhân và tế bào chất ............................ 26

1.8. Bộ khung xƣơng tế bào ...................................................................................... 27

1.8.1. Khái niệm ...................................................................................................... 27

1.8.2. Cấu trúc khung xương tế bào ........................................................................ 27

1.8.3. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của vi trọng lực lên khung xương tế bào ..... 29

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 31

2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 31

2.1.1. Thiết bị và dụng cụ cần thiết ......................................................................... 31

2.1.2. Môi trường và hóa chất sử dụng ................................................................... 32

2.1.3. Tế bào gốc trung mô ..................................................................................... 33

2.1.4. Hệ thống vi trọng lực mô phỏng (clinostat 3D) ............................................ 33

2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................... 35

2.2.1. Nuôi cấy tế bào ............................................................................................. 36

2.2.1.1. Phương pháp giải đông ........................................................................... 36

2.2.1.2. Phương pháp cấy chuyền ......................................................................... 36

2.2.1.3. Phương pháp đông lạnh .......................................................................... 36

2.2.2. Đánh giá các chỉ thị marker của tế bào gốc trung mô ................................. 37

2.2.3. Thử nghiệm vi trọng lực ................................................................................ 38

2.2.4. Đánh giá sự tăng sinh tế bào ........................................................................ 39

2.2.4.1. Đánh giá mật độ tế bào ........................................................................... 39

2.2.4.2. Đánh giá chu kỳ tế bào ............................................................................ 39

2.2.5. Đánh giá quá trình apoptosis ....................................................................... 44

2.2.5.1. Thu hoạch tế bào...................................................................................... 44

2.2.5.2. Đánh giá tỉ lệ apoptosis ........................................................................... 44

2.2.5.3. Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis..... 45

2.2.6. Đánh giá sự thay đổi hình thái nhân và tế bào chất ..................................... 46

2.2.6.1. Thu hoạch và cố định tế bào .................................................................... 46

2.2.6.2. Đánh giá sự thay đổi hình thái nhân ....................................................... 46

2.2.6.3. Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào chất ............................................. 46

2.2.7. Đánh giá sự thay đổi cấu trúc khung xương tế bào ...................................... 47

2.2.7.1. Thu hoạch tế bào...................................................................................... 47

v

2.2.7.2. Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi ......... 47

2.2.7.3. Đánh giá biểu hiện mức dịch mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi ........... 48

2.2.7.4. Đánh giá sự tái cấu trúc bộ khung vi ống, vi sợi trong tế bào ................ 49

2.2.8. Phương pháp thống kê .................................................................................. 50

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 51

3.1. Đánh giá các chỉ thị marker của tế bào gốc trung mô ........................................ 51

3.2. Đánh giá sự tăng sinh tế bào .............................................................................. 52

3.2.1. Sự thay đổi mật độ tế bào ............................................................................. 52

3.2.2. Sự thay đổi chu kỳ tế bào .............................................................................. 53

3.2.2.1. Tỉ lệ các pha trong chu kỳ tế bào ............................................................. 53

3.2.2.2. Biểu hiện mức độ phiên mã các gene điều hòa chu kì tế bào .................. 54

3.2.2.3. Biểu hiện mức độ dịch mã các gene điều hòa chu kì tế bào .................... 55

3.3. Đánh giá quá trình apoptosis .............................................................................. 58

3.3.1. Tỉ apoptosis ................................................................................................... 58

3.3.2. Biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis ......................... 58

3.4. Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào ................................................................. 59

3.4.1. Sự thay đổi hình thái nhân ............................................................................ 59

3.4.2. Sự thay đổi hình thái tế bào chất .................................................................. 63

3.5. Đánh giá cấu trúc khung xƣơng tế bào .............................................................. 66

3.5.1. Biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi .............................. 66

3.5.2. Biểu hiện mức dịch mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi ................................ 67

3.5.3. Đánh giá sự tái cấu trúc bộ khung vi ống, vi sợi trong tế bào ..................... 67

3.6. Tóm tắt ảnh hƣởng của vi trọng lực mô phỏng lên tế bào hucMSC và phƣơng

thức ức chế tăng sinh tế bào trong môi trƣờng vi trọng lực mô phỏng ..................... 73

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 77

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ......................................................... 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 79

PHỤ LỤC

vi

DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

7-AAD 7-amino-actinomycin 7-amino-actinomycin

ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphate

Bax Bcl-2-associated X protein Protein X liên kết Bcl-2

Bcl-2 B-cell lymphoma 2 Protein lymphoma tế bào B-2

bmMSC Bone marrow mesenchymal Tế bào gốc trung mô tủy xƣơng

stem cell

CDKs Cyclin-dependent kinases Kinase phụ thuộc cyclin

DMEM Dulbecco's modified Eagle Môi trƣờng Dulbecco's modified

medium Eagle

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

FBS Fetal bovine serum Huyết thanh thai bò

GVHD Graft versus host disease Bệnh ghép chống chủ

hucMSC Human umbilical cord Tế bào gốc trung mô cuống rốn

mesenchymal stem cell ngƣời

ISCT International Society for Hiệp hội liệu pháp tế bào quốc

Cellular Therapy tế

LSCM Laser scanning confocal Kính hiển vi quét laser đồng tiêu

microscopy

mRNA Messenger ribonucleic acid Axit ribonucleic thông tin

MSC Mesenchymal stem cell Tế bào gốc trung mô

NASA National Aeronautics and Cơ quan Hàng không và Vũ trụ

Space Administration Hoa Kỳ

OD Optical density Mật độ quang

PBS Phosphate-buffered saline Phosphate-buffered saline

Pen/Strep Penicillin-Streptomycin Penicillin-Streptomycin

PI Propidium iodide Propidium iodide

PS Phospholipid Màng phospholipid

phosphatidylserine phosphatidylserine

PVDF Polyvinylidene fluoride Polyvinylidene fluoride

vii

qRT-PCR

Quantitative reverse Phản ứng định lƣợng chuỗi

transcription polymerase chain polymerase phiên mã ngƣợc

reaction

Ribonucleic acid Axit ribonucleic RNA

Random positioning machine Máy định vị ngẫu nhiên RPM

Rotating wall vessel Buồng quay RWV

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate– Điện di gel sodium dodecyl

polyacrylamide gel sulfate–polyacrylamide

electrophoresis

Simulated microgravity Vi trọng lực mô phỏng SMG

Transmission electron Kính hiển vi truyền qua TEM

microscopy

TUNEL Terminal dUTP Nick End- Kĩ thuật gắn nhãn cuối dUTP

Labeling Nick

ucMSC Umbilical cord mesenchymal Tế bào gốc trung mô cuống rốn

stem cell

viii

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1. Một số thiết bị chính sử dụng trong đề tài ................................................ 31

Bảng 2.2. Một số dụng cụ chính sử dụng trong đề tài .............................................. 31

Bảng 2.3. Môi trƣờng, hóa chất sử dụng trong đề tài ............................................... 32

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene điều hòa

chu kì tế bào .............................................................................................................. 42

Bảng 2.5. Trình tự mồi các gene điều hòa chu kì tế bào .......................................... 42

Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene liên quan

đến apoptosis ............................................................................................................. 45

Bảng 2.7. Trình tự mồi các gene liên quan đến apoptosis ........................................ 45

Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene mã hóa

khung xƣơng tế bào ................................................................................................... 47

Bảng 2.9. Trình tự mồi các gene mã hóa khung xƣơng tế bào ................................. 47

ix

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Nguyên lý cơ bản của hệ thống clinostat 2D ............................................ 11

Hình 1.2. Mô hình clinostat 2D ................................................................................. 12

Hình 1.3. Mô hình clinostat 3D ................................................................................. 12

Hình 1.4. Mô hình buồng quay (rotating wall vessel-RWV) .................................... 13

Hình 1.5. Mô hình máy định vị ngẫu nhiên (RPM) .................................................. 14

Hình 1.6. Cấu trúc cuống rốn ở ngƣời ...................................................................... 16

Hình 1.7. Chu kỳ tế bào ............................................................................................ 18

Hình 1.8. Hình ảnh tế bào chuột biểu hiện apoptosis dƣới kính hiển vi quang học . 21

Hình 1.9. Hình ảnh tế bào tuyến ức dƣới kính hiển vi điện tử ................................. 22

Hình 1.10. Thành phần cấu trúc khung xƣơng tế bào .............................................. 28

Hình 2.1. Cấu trúc hệ thống máy clinostat 3D tạo môi trƣờng vi trọng lực mô phỏng33

Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu ........................................................... 35

Hình 2.3. Bình nuôi tế bào hucMSC trong thử nghiệm vi trọng lực ........................ 38

Hình 2.4. Đĩa 96 giếng chứa tế bào hucMSC trong thử nghiệm vi trọng lực ........... 38

Hình 2.5. Đĩa nuôi hucMSC đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp WST-1 .................. 39

Hình 2.6. Phƣơng pháp chuyển màng PVDF ........................................................... 43

Hình 3.1. Đánh giá biểu hiện marker ở hucMSC ...................................................... 51

Hình 3.2. Mật độ quang của hucMSC qua đánh giá bằng phƣơng pháp WST-1 ..... 52

Hình 3.3. Chu kì tế bào hucMSC qua phân tích flow cytometry ............................. 54

Hình 3.4. Biểu hiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào bằng phƣơng

pháp Realtime qRT-PCR ........................................................................................... 54

x

Hình 3.5. Biểu hiện mức dịch mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào bằng phƣơng

pháp Western Blot ..................................................................................................... 55

Hình 3.6. Tỉ lệ tế bào sống và apoptosis ở hucMSC qua phân tích flow cytometry sử

dụng phƣơng pháp nhuộm FITC Annexin V ............................................................ 58

Hình 3.7. Biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis ở hucMSC

bằng phƣơng pháp Realtime qRT-PCR .................................................................... 59

Hình 3.8. Cƣờng độ nhân của hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle

App ............................................................................................................................ 60

Hình 3.9. Diện tích nhân của hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App60

Hình 3.10. Hình dạng nhân của hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle

App ............................................................................................................................ 61

Hình 3.11. Sự phân bố nhân trong mối tƣơng quan giữa hình dạng nhân và cƣờng

độ nhân ở hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App .......................... 62

Hình 3.12. Sự phân bố nhân trong mối tƣơng quan giữa diện tích nhân và cƣờng độ

nhân ở hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App ............................... 63

Hình 3.13. Hình thái tế bào chất của hucMSC .......................................................... 64

Hình 3.14. Giá trị FSC biểu thị kích thƣớc tế bào ở hucMSC .................................. 65

Hình 3.15. Biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi bằng phƣơng

pháp Realtime qRT-PCR ........................................................................................... 66

Hình 3.16. Biểu hiện mức dịch mã các protein cấu trúc vi sợi, vi ống bằng phƣơng

pháp Western Blot ..................................................................................................... 67

Hình 3.17. Ảnh nhuộm huỳnh quang vi ống của hucMSC trong điều kiện bình

thƣờng và điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG) .................................................. 69

Hình 3.18. Ảnh nhuộm huỳnh quang vi sợi của hucMSC trong điều kiện bình

thƣờng và điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG) .................................................. 70

Hình 3.19. Kết quả đánh giá mật độ vi ống của hucMSC......................................... 71

xi

Hình 3.20. Kết quả đánh giá mật độ vi sợi actin của hucMSC ................................. 72

Hình 3.21. Sơ đồ tóm tắt ảnh hƣởng của vi trọng lực mô phỏng lên sự tăng sinh tế

bào hucMSC .............................................................................................................. 76

xii

TÓM TẮT

Sinh học trọng lực là ngành khoa học mới và thu hút đƣợc nhiều quan tâm.

Các nghiên cứu ứng dụng hệ thống vi trọng lực mô phỏng tại mặt đất có ƣu điểm

giúp tiết kiệm chi phí và giảm thiểu rủi ro về con ngƣời. Trong nghiên cứu này,

chúng tôi sử dụng hệ thống clinostat 3D tạo môi trƣờng vi trọng lực mô phỏng (SMG) với gia tốc 1,3 × 10-3 G cảm ứng lên dòng tế bào gốc trung mô cuống rốn

ngƣời (hucMSC). Tế bào hucMSC sau khi nuôi cấy tăng sinh và phân tích các

marker đặc trƣng cho tính gốc đƣợc chia làm hai nhóm thí nghiệm: nhóm cảm ứng vi trọng lực mô phỏng (SMG) đƣợc nuôi ở điều kiện 1,3 × 10-3 G và nhóm đối

chứng đƣợc nuôi ở điều kiện trọng lực bình thƣờng (1G). Các chỉ tiêu về tăng sinh,

apoptosis, hình thái tế bào và cấu trúc khung xƣơng ở hucMSC đƣợc đánh giá. Kết

quả đánh giá mật độ tế bào bằng phƣơng pháp WST-1 cho thấy hucMSC giảm tăng

sinh trong điều kiện SMG (p ≤ 0,001). Hơn nữa, phân tích flow cytometry cho thấy

các tế bào hucMSC ở nhóm SMG có xu hƣớng đi vào pha nghỉ G0/G1 nhiều hơn và

giảm tỉ lệ đi vào pha phân chia G2/M (p ≤ 0,01). Thêm vào đó, biểu hiện của các

protein liên quan đến chu kỳ tế bào nhƣ Cyclin A, CDK2, CDK4 và CDK6 đều

giảm trong môi trƣờng SMG qua đánh giá bằng phƣơng pháp Realtime qRT-PCR

và Western Blot. Trong nghiên cứu này, apoptosis đƣợc chứng minh là không làm

ảnh hƣởng đến quá trình tăng sinh của hucMSC khi không tìm thấy sự khác biệt

mang ý nghĩa thống kê ở tỉ lệ apoptosis giữa hai nhóm thí nghiệm. Thay vào đó, sự

giảm biểu hiện cả ở mức phiên mã và dịch mã của các protein cấu trúc khung xƣơng

tế bào nhƣ β-actin và α-tubulin và các protein liên quan đến chu kỳ tế bào ở trên là

nguyên nhân của sự giảm tăng sinh ở hucMSC trong môi trƣờng SMG. Bên cạnh

làm thay đổi các protein điều hòa chu kỳ tế bào, điều kiện SMG đã làm giảm biểu

hiện β-actin cấu trúc vi sợi và α-tubulin cấu trúc vi ống, từ đó ngăn chặn sự hình

thành rãnh phân tách và thoi vô sắc cần thiết cho quá trình phân bào.

1 MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Trọng lực là một hằng số ảnh hưởng đến cả hiện tượng vật lý và sinh học

trong quá trình phát triển sự sống trên Trái Đất. Trọng lực đóng vai trò quan trọng

trong sự tiến hóa hình thái của sinh vật. Để chống lại trọng lực, cơ thể sống cần phát

triển các hệ thống hỗ trợ như xây dựng cấu trúc phù hợp, củng cố màng tế bào và

điều chỉnh dòng chảy của chất lỏng trong cơ thể. Trong không gian, các phi hành

gia đã trải qua những thay đổi sinh lý sâu sắc khi cơ thể họ phải điều chỉnh theo môi

trường vi trọng lực. Tất cả các quá trình sinh lý trong cơ thể bị chi phối bởi hoạt

động của nhiều loại tế bào chuyên biệt trong các mô khác nhau. Do đó, môi trường

vi trọng lực được coi là phát huy tác dụng bất lợi đối với các phi hành gia thông qua

những thay đổi trong cấu trúc và chức năng của tế bào. Chính vì những lý do trên,

nghiên cứu về những ảnh hưởng của môi trường không gian đến cơ thể sinh vật là

rất quan trọng, giúp giảm thiểu những rủi ro cho con người trong quá trình khám

phá vũ trụ.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các loại tế bào ở những sinh vật khác nhau

hoạt động khác nhau trong không gian so với trên Trái Đất. Do có sự đa dạng lớn về

các loại tế bào trong tự nhiên, ảnh hưởng của vi trọng lực (microgravity) lên các tế

bào đó vô cùng đa dạng và thường phức tạp. Một số nghiên cứu về vai trò của vi

trọng lực đối với sự tăng sinh và biệt hóa tế bào đã chứng minh rằng các tế bào phát

triển trong môi trường vi trọng lực phát triển khác với trong điều kiện bình thường

dẫn đến những thay đổi trong quá trình phân chia tế bào. Khung xương tế bào

(cytoskeleton) cũng là một trong những đối tượng chịu ảnh hưởng lớn dưới tác động

của vi trọng lực. Bộ khung xương tế bào hình thành cấu trúc chính của tế bào và bao

gồm các tương tác giữa các vi ống (microtubule), vi sợi (microfilament), vi sợi

trung gian (intermediate filament) và các protein liên quan. Do đó, khung xương tế

bào có liên quan rất lớn đến hình dạng tế bào. Sự bất thường trong hoạt động của

các vi ống và vi sợi trong khung xương tế bào có thể có ảnh hưởng bất lợi lên bản

thân mỗi tế bào, thậm chí gây những hậu quả rất lớn khi tế bào ở giai đoạn phôi.

Các cơ chế của những thay đổi về tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào dưới

tác động của vi trọng lực vẫn chưa được chứng minh rõ ràng.

2

Tác động của trọng lực lên nghiên cứu sinh học hiện có thể được thực hiện

thông qua các chuyến bay vũ trụ hoặc mô phỏng trên mặt đất. Một số mô hình hệ

thống vi trọng lực mô phỏng đã được thiết lập trên mặt đất như các hệ thống

clinostat 2D, 3D, RPM (random position machine - máy định vị ngẫu nhiên), buồng

quay và tháp rơi để nghiên cứu tác động của vi trọng lực trên mặt đất. Một trong

những đối tượng nghiên cứu thường được sử dụng để đánh giá tác động của vi trọng

lực mô phỏng là tế bào gốc trung mô, thường thấy là tế bào gốc trung mô từ tủy

xương. Những thay đổi của tế bào gốc trung mô tủy xương trong môi trường vi

trọng lực mô phỏng tạo ra bởi hệ thống clinostat 2D đã được báo cáo. Hệ thống

quay 2D này đã được đưa vào ứng dụng từ lần giới thiệu đầu tiên năm 1879. Mặc

dù mô hình này tạo ra vi trọng lực mô phỏng, nó cũng đi kèm với các hiệu ứng

ngoài ý muốn. Vì lý do này, hệ thống clinostat 3D đã được phát triển để tạo ra môi

trường vi trọng lực mô phỏng chính xác hơn.

Tế bào gốc trung mô cuống rốn người (human mesenchymal stem cell -

hucMSC) là dòng tế bào tiềm năng và việc thu nhận chúng không vấp phải nhiều

vấn đề đạo đức như các dòng tế bào gốc trung mô từ nguồn khác. Tế bào gốc trung

mô cuống rốn có khả năng tự làm mới trong khi vẫn duy trì tính đa tiềm năng.

Ngoài ra, chúng còn thể hiện nhiều đặc tính miễn dịch lý thú, do đó được coi là một

trong những đối tượng nghiên cứu hấp dẫn cho các ứng dụng điều trị khác nhau.

Hiện nay, vẫn chưa có nhiều báo cáo về tác động của vi trọng lực lên tế bào gốc

trung mô cuống rốn ở người, do đó nghiên cứu sử dụng dòng tế bào này làm đối

tượng để đánh giá các ảnh hưởng của vi trọng lực.

2. Mục tiêu của đề tài

Từ những lý do trên, nghiên cứu sử dụng hệ thống clinostat 3D để tạo ra môi

trường vi trọng lực mô phỏng nhằm đánh giá tác động của điều kiện vi trọng lực lên

sự tăng sinh và cấu trúc khung xương của tế bào gốc trung mô cuống rốn người

(human mesenchymal stem cells - hucMSC). Mục tiêu của nghiên cứu là tìm ra

phương thức tác động của điều kiện vi trọng lực mô phỏng lên sự phát triển của

hucMSC, thông qua việc xác định các thay đổi về hình thái tế bào, sự tăng sinh và

cấu trúc khung xương tế bào của hucMSC trong điều kiện in vitro.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3

Dòng tế bào gốc trung mô cuống rốn người (hucMSC) được sử dụng làm đối

tượng nghiên cứu của đề tài. Dòng tế bào này được cung cấp bởi Viện Sinh học

nhiệt đới và được đánh giá các thay đổi về tăng sinh, hình thái tế bào, apoptosis và

cấu trúc khung xương tế bào trong môi trường vi trọng lực mô phỏng tạo ra từ máy

clinostat 3D.

4. Nội dung nghiên cứu

Các nội dung chính của nghiên cứu bao gồm:

‒ Đánh giá ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên sự tăng sinh tế bào

hucMSC.

‒ Đánh giá ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên quá trình apoptosis ở tế

bào hucMSC.

‒ Đánh giá ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên sự thay đổi hình thái

nhân và tế bào chất ở tế bào hucMSC.

‒ Đánh giá ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên bộ khung xương tế bào ở

tế bào hucMSC.

5. Những đóng góp mới của luận án

Đề tài được thực hiện theo hướng nghiên cứu mới về khoa học vũ trụ, ứng

dụng hệ thống clinostat 3D để tạo ra môi trường vi trọng lực mô phỏng nhằm đánh

giá tác động của vi trọng lực lên dòng tế bào hucMSC. Những đóng góp mới của

luận án bao gồm:

‒ Nghiên cứu cho thấy điều kiện vi trọng lực mô phỏng làm giảm tăng sinh và

làm thay đổi hình thái nhân, tế bào chất đồng thời tái cấu trúc bộ khung

xương tế bào ở hucMSC. Sự chết theo chương trình của hucMSC không bị

ảnh hưởng trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng.

‒ Nghiên cứu cũng đã mô tả hai phương thức ức chế tăng sinh của điều kiện vi

trọng lực mô phỏng lên tế bào hucMSC: phương thức thứ nhất thông qua sự

giảm biểu hiện các protein điều hòa chu kỳ tế bào Cyclin A, CDK2, CDK4,

CDK6, từ đó cảm ứng tế bào đi vào pha G0/G1 và ngăn chặn tế bào đi vào

pha phân chia G2/M; phương thức thứ hai thông qua sự giảm biểu hiện các

4

protein cấu trúc vi sợi và vi ống, làm ức chế sự hình thành thoi vô sắc và

rãnh phân tách từ đó làm giảm sự phân chia tế bào.

5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Vai trò của các nghiên cứu sinh học trong không gian

Nghiên cứu Sinh học không gian là một phần quan trọng các chương trình vũ

trụ của các trung tâm vũ trụ trên thế giới như NASA (Cục Hàng không và không

gian quốc gia Mỹ), ESA (Cơ quan hàng không châu Âu), JAXA (Cơ quan thám

hiểm không gian Nhật Bản). Sinh học không gian đã là một phần của chương trình

Khoa học sự sống của NASA từ những năm 1960. NASA ngày càng tập trung vào

việc ứng dụng các kỹ thuật tiên tiến hiện đại của công nghệ sinh học, sinh học phân

tử, sinh học tế bào để nghiên cứu, khám phá và đánh giá tác động của các chuyến

bay trong không gian lên quá trình sinh học. Với các hệ thống công cụ nghiên cứu

mạnh của thế kỉ 21, các nhà khoa học sẽ nghiên cứu sâu hơn các cơ chế thích nghi

của vi khuẩn, thực vật và động vật đối với môi trường không trọng lực. Điều này sẽ

giúp chúng ta hiểu được những cách cơ bản mà các hệ thống sinh vật sử dụng trọng

lực để điều hòa quá trình tăng trưởng, quá trình biến dưỡng, sinh sản và phát triển,

cũng như hiểu được cách mà chúng sửa chữa các sai hỏng, bảo vệ chúng khỏi bệnh

tật, truyền nhiễm.

Trong các ngành khoa học được lựa chọn để nghiên cứu, Hội đồng nghiên

cứu quốc gia của Mỹ đã đưa ra khuyến nghị nghiên cứu khoa học trong ấn phẩm

“Chiến lược Y-Sinh học không gian trong thế kỉ mới” (năm 1998). Ở đây, Hội đồng

kêu gọi NASA tập trung nghiên cứu sinh học không gian ở tất cả các cấp độ tổ chức

sinh học, từ sinh học phân tử tế bào đến các mô, cơ quan cho đến toàn bộ hệ thống

cơ thể dựa trên tất cả các phương pháp nghiên cứu hiện đại. Mục tiêu chính của

chương trình nghiên cứu sinh học không gian của NASA bao gồm:

- Sử dụng có hiệu quả các đặc tính môi trường vi trọng lực và không gian để

nâng cao hiểu biết của chúng ta về sự thích ứng và chức năng của các quá trình sinh

học cơ bản trong chuyến bay

- Phát triển một nền tảng tri thức khoa học và công nghệ, sẽ góp phần đảm

bảo sự an toàn của con người trong quá trình thăm dò không gian

- Áp dụng kiến thức và công nghệ không gian để nâng cao khả năng cạnh

tranh, giáo dục và chất lượng cuộc sống trên trái đất của người dân.

- Các thí nghiệm Sinh học không gian của NASA giúp khám phá cách thức

các chuyến bay tác động lên các vi sinh vật, thực vật và động vật trong suốt chu

6 trình sống của chúng. Các yếu tố trên không gian đã cho thấy chúng có ảnh hưởng

đến các hệ thống sinh học bao gồm các trường trọng lượng cực tiểu, phóng xạ và từ

trường, cũng như các tương tác và stress giữa các loài trong môi trường không gian.

Chương trình Sinh học không gian đã được tập trung triển khai ở nhiều nước

phát triển mạnh lĩnh vực hàng không không gian. Chương trình này tập trung vào

các hướng chính như sau:

- Vi sinh vật: nghiên cứu tác động của các chuyến bay không gian lên sự

sống, tiến trình sinh học cũng như động lực phát triên của quần thể vi sinh vật

- Sinh học phân tử tế bào: nghiên cứu tác động của các chuyến bay không

gian lên sự sống mức phân tử và tế bào

- Sinh học thực vật: Hiểu được cơ chế đáp ứng và tăng trưởng của thực vật

trong các chuyến bay

- Sinh học động vật: Xác định các cơ chế cơ bản mà động vật sử dụng để

thích ứng với các chuyến bay, đặc biệt là khi trọng lực thay đổi

- Sinh học phát triển, sinh sản và tiến hóa: Xác định các tác động của không

gian lên sự phát triển, sinh sản và tiến hóa.

Từ những ý nghĩa và mục tiêu trên, việc nghiên sinh học không gian đóng

vai trò rất quan trọng trong lĩnh vực hàng không vũ trụ. Ở Việt Nam, các nghiên

cứu về tác động của điều kiện không gian (môi trường không trọng lực và vi trọng

lực) lên các hệ thống sinh vật sống còn hạn chế bởi nhiều nguyên nhân, trong đó

kinh phí thực hiện các thí nghiệm vẫn là nguyên nhân lớn nhất. Đây không chỉ là

khó khăn mà chúng ta găp phải, đây cũng là vấn đề khó khăn ở cả các nước có

ngành hàng không không gian phát triển như Mỹ, Nhật, châu Âu…Do đó, việc xây

dựng, thiết kế các mô hình mô phỏng trạng thái vi trọng lực trong không gian sẽ

không chỉ giải quyết vấn đề kinh phí thực hiện thí nghiệm, mà còn tiết kiệm, rút

ngắn thời gian nghiên cứu, đánh giá tác động của môi trường vi trọng lực trong

không gian lên các hệ thống sinh học.

1.2. Giới thiệu về vi trọng lực và vi trọng lực mô phỏng

1.2.1. Vi trọng lực

Trong vũ trụ, các phi hành gia không thể đi lại bình thường như ở Trái Đất

mà di chuyển lơ lửng trong không gian. Điều này là do vi trọng lực (microgravity).

7 Theo định nghĩa của Cơ quan hàng không và vũ trụ Hoa Kỳ NASA, vi trọng lực là

điều kiện mà trong đó vật thể trở nên gần như mất trọng lực [1]. Từ “vi” trong vi

trọng lực có nghĩa là rất nhỏ. Vi trọng lực xảy ra khi lực kéo của trọng lực trở nên

yếu đi. Trong môi trường vi trọng lực, rất dễ dàng để di chuyển các vật nặng. Phi

hành gia có thể dịch chuyển vật có khối lượng đến hàng chục kilogram với chỉ bằng

một ngón tay.

Lực hấp dẫn làm cho mọi vật thể kéo mọi vật thể khác về phía nó. Một số ý

kiến cho rằng không có trọng lực trong không gian. Trên thực tế, một lượng nhỏ

trọng lực có thể được tìm thấy ở mọi nơi trong không gian. Lực hấp dẫn là thứ giữ

mặt trăng trên quỹ đạo quanh Trái Đất. Lực hấp dẫn khiến Trái Đất quay quanh mặt

trời. Nó giữ cho mặt trời ở đúng vị trí trong thiên hà Milky Way. Tuy nhiên, lực hấp

dẫn trở nên yếu hơn theo khoảng cách. Một tàu vũ trụ có thể đi đủ xa so với Trái

Đất để người bên trong chịu tác động bởi rất ít trọng lực. Nhưng đây không phải là

lý do tại sao mọi thứ lơ lửng trên tàu vũ trụ trong không gian. Trạm vũ trụ quốc tế

quay quanh Trái Đất ở độ cao từ 300 đến 400 km. Ở độ cao đó, lực hấp dẫn của Trái

Đất bằng khoảng 90% lực hấp dẫn của nó trên bề mặt hành tinh. Nói cách khác, nếu

một người nặng 50 kg trên bề mặt Trái Đất đi đến trạm vũ trụ, thì người đó sẽ nặng

45 kg khi đến trạm [1, 2].

Tuy 90% trọng lực Trái Đất tác động đến trạm vũ trụ, trên thực tế các phi

hành gia và vật thể đều lơ lửng trong không gian ở đây, nguyên nhân là bởi sự rơi tự

do. Trong chân không, trọng lực làm cho tất cả các vật thể rơi với tốc độ như nhau.

Khối lượng của vật không quan trọng. Nếu một người đánh rơi một chiếc búa và

một chiếc lông vũ, không khí sẽ làm chiếc lông vũ rơi chậm hơn. Nhưng nếu không

có không khí, chúng sẽ rơi với cùng một gia tốc. Một số công viên giải trí có trò

chơi rơi tự do, trong đó một cabin được thả dọc theo một tháp cao. Nếu lúc đầu

người ta buông một vật thì người và vật sẽ rơi với gia tốc như nhau. Do đó, vật thể

sẽ lơ lửng trước mặt người đó. Đó là những gì xảy ra trong trạm không gian vũ trụ.

Trạm vũ trụ, phi hành đoàn của nó và bất kỳ vật thể nào trên trạm đều đang rơi về

phía xung quanh Trái Đất. Vì tất cả chúng đều rơi cùng nhau, phi hành đoàn và các

vật thể dường như lơ lửng khi so sánh với trạm vũ trụ. Và môi trường vi trọng lực

trên trạm vũ trụ cũng được tạo ra từ đó.

8

Lực hấp dẫn của Trái Đất kéo các vật thể hướng xuống mặt đất và trạm

không gian vũ trụ cũng không phải là ngoại lệ. Thực tế, nó vẫn liên tục rơi xuống bề

mặt Trái Đất. Tuy nhiên, trạm vũ trụ di chuyển với tốc độ rất nhanh (khoảng 28000

km/giờ), phù hợp với đường cong của bề mặt Trái Đất [1]. Nếu một người ném quả

bóng theo phương ngang so với mặt đất, trọng lực sẽ làm quỹ đạo của quả bóng

cong xuống và chạm đất khá nhanh. Trạm vũ trụ quay quanh Trái Đất có quỹ đạo di

chuyển với tốc độ thích hợp nên đường cong rơi của nó khớp với đường cong của

Trái Đất. Do đó, tàu vũ trụ tiếp tục rơi về phía mặt đất nhưng không bao giờ va vào

nó. Kết quả là chúng rơi xung quanh Trái Đất. Mặt trăng vẫn quay quanh quỹ đạo

Trái Đất cũng vì lý do này. Do đó, điều kiện vi trọng lực vẫn luôn duy trì trên trạm

vũ trụ do cả trạm và các vật thể, cũng như phi hành gia ở đây đều đang rơi về hướng

Trái Đất.

Vi trọng lực ảnh hưởng đến cơ thể con người theo nhiều cách [3]. Cơ và

xương có thể trở nên yếu hơn nếu không có trọng lực [4]. Các phi hành gia sống

trên trạm vũ trụ trải qua hàng tháng trời trong môi trường vi trọng lực. Các phi hành

gia du hành đến sao Hỏa cũng sẽ dành nhiều tháng trong môi trường vi trọng lực.

Các nghiên cứu về tác động của vi trọng lực là cần thiết để giữ cho các phi hành gia

an toàn và khỏe mạnh. Ngoài ra, nhiều hiện tượng sẽ diễn ra khác đi trong môi

trường vi trọng lực. Không có lực hấp dẫn, ngọn lửa sẽ trở nên tròn hơn, tinh thể

phát triển tốt hơn [5]. Không có trọng lực, hình dạng của chúng hoàn hảo hơn. Điều

kiện vi trọng lực sẽ giúp thực hiện các nghiên cứu khó có thể làm được ở Trái Đất.

1.2.2. Vi trọng lực mô phỏng

Trong lĩnh vực sinh học trọng lực, các nghiên cứu về vi trọng lực trong

không gian đã tìm ra nhiều tác động của điều kiện trọng lực lên các quá trình sinh

học, các cơ chế nhạy cảm với trọng lực, hay sự định hướng dựa vào trọng lực của

các sinh vật. Tuy nhiên, việc nghiên cứu trong không gian đã và đang gặp phải một

số khó khăn nhất định, bao gồm chi phí đắt đỏ cho các phương tiện nghiên cứu và

những ảnh hưởng tiêu cực từ môi trường vi trọng lực lên cơ thể phi hành gia. Để

khắc phục những khó khăn trên, các nhà khoa học đã cố gắng tạo ra các mô hình hệ

thống sinh học mô phỏng điều kiện tương tự trạng thái vi trọng lực trên mặt đất

9 nhằm nghiên cứu sâu hơn các tác động của điều kiện vi trọng lực hay siêu trọng lực

trên các sinh vật sống hay đối tượng sống trên Trái Đất.

Hiện nay có nhiều thiết bị được sử dụng có thể mô phỏng các trạng thái trọng

lực khác nhau. Đầu tiên là clinostat cổ điển (là một thiết bị sử dụng quá trình xoay

vòng để chống lại tác động của trọng lực), thiết bị này được phát triển đầu tiên vào

cuối thế kỉ 19 bởi nhà khoa học Julius von Sachs [6]. Từ đó tới nay, nhiều thiết bị

khác đã được tạo ra nhằm mô phỏng trạng thái không trọng lực, chúng có thể phân

ngẫu nhiên sự định hướng của trọng lực Trái Đất của đối tượng nghiên cứu, mà đối

tượng này không cảm nhận được sự gia tăng trọng lực (trong các hệ thống clinostat)

hay sự bù đắp trọng lực (trong hệ thống nâng từ) [7]. Ngoài ra, một hệ thống khác

mô phỏng trạng thái không trọng lực là “tháp rơi” (drop-tower), hệ thống này cung

cấp các điều kiện rơi tự do thật trên mặt đất, nhưng quá trình này chỉ diễn ra trong

vài giây, nó phụ thuộc vào khối lượng và kích cỡ của đối tượng nghiên cứu [8]. Tuy

nhiên các hệ thống mô phỏng trên không thể cung cấp điều kiện không trọng lực

thật bởi chúng luôn bị tác động bởi yếu tố khác liên quan đến kĩ thuật như sự tăng

gia tốc ly tâm, sự rung lắc, hay sự phân tán các lực.

Một hệ thống mô phỏng không thể làm giảm vector trọng lực Trái Đất, nhưng

nó có thể thay đổi ảnh hưởng của vector trọng lực lên một hệ thống sinh học [9]. Do

đó, một máy mô phỏng không thể tạo ra vi trọng lực thật sự, thay vào đó nó có khả

năng cung cấp “điều kiện không trọng lực chức năng” (functional weightlessness). Để

tránh sự nhầm lẫm và cung cấp một nền tảng cơ bản về vi trọng lực, thuật ngữ “vi

trọng lực mô phỏng” (simulated microgravity - SMG) được áp dụng đối với các thí

nghiệm sử dụng hệ thống mô phỏng, bao gồm các thông số tạo ra sự mô phỏng (kích

thước và hình dạng buồng chứa mẫu, chế độ hoạt động, tốc độ quay hay đường kính

ống) [10]. Ngoài ra, thuật ngữ “vi trọng lực” còn được sử dụng trong các điều kiện vi

trọng lực thực sự trên trạm ISS (International Space Station) hay các chuyến bay

parabol. Hơn nữa, thuật ngữ “vi trọng lực” còn được sử dụng để chỉ các mức độ G khác nhau, từ khoảng 10-2 G cho tới 10-6 G [11].

1.3. Các hệ thống mô phỏng vi trọng lực

Tiếp xúc với môi trường vi trọng lực đã được chứng minh là ảnh hưởng xấu

đến sinh vật. Tác dụng phụ đáng kể của việc không trọng lượng trong thời gian dài

10 bao gồm các triệu chứng teo cơ và suy xương [12], thay đổi sản xuất hồng cầu [13]

và thay đổi hệ thống miễn dịch [14]. Không trọng lượng gây ra giảm khối lượng cơ

thể, kéo dài telomere, mất ổn định bộ gene, thay đổi quá trình trao đổi chất [15].

Các nghiên cứu về đánh giá tác động của vi trọng lực đối với sinh vật và tế bào đã

được thực hiện trong một thời gian dài. Tuy nhiên, việc thực hiện các thí nghiệm

này gặp rất nhiều khó khăn do cơ hội bay rất khan hiếm và chi phí phát triển trang

thiết bị rất cao [16]. Do đó, các hệ thống mô phỏng vi trọng lực đã được phát triển

và áp dụng để ước tính những thay đổi về cấu trúc, chức năng, sự tăng sinh của các

tế bào động vật. Chúng được sử dụng để đánh giá mức độ nhạy cảm với trọng lực

của hệ thống sinh học. Ba hệ thống mô phỏng trạng thái vi trọng lực chính được các

phòng thí nghiệm sử dụng là:

- Clinostat với 1 trục hoặc 2 trục (clinostat 2D, clinostat 3D)

- Buồng quay (rotating wall vessel-RWV)

- Máy định vị ngẫu nhiên (random positioning machine-RPM)

1.3.1. Clinostat

Hệ thống clinostat là một trong những mô hình đầu tiên được phát minh vào

cuối thế kỷ 19 [6]. Đây là các thiết bị quay và chủ yếu được sử dụng để ước tính

ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên thực vật. Mô hình này đã được cải tiến

thành clinostat xoay nhanh, được áp dụng cho nghiên cứu nuôi cấy tế bào [17]. Cho

đến nay, clinostat 3D và máy định vị ngẫu nhiên (RPM) là hệ thống phổ biến nhất

được sử dụng cho nghiên cứu tế bào động vật [18, 19, 20].

Tất cả các dạng clinostat đều có một dạng phổ biến là mẫu chứa trong hệ

thống nằm quay vuông góc với trường trọng lực để cản trở sự việc nhận biết vector

gia tốc trọng trường của một hệ thống sinh học (Hình 1.1). Clinostat với một trục

quay được gọi là clinostat 2D (Hình 1.2). Trong khi đó ở clinostat 3D, có một trục

thứ hai được lắp đặt vuông góc với trục đầu tiên, vận hành với một tốc độ và sự

định hướng ổn định (Hình 1.3). Nếu tốc độ và hướng quay được thay đổi ngẫu

nhiên trong quá trình vận hành, thì hệ thống mô phỏng đó được gọi là máy định vị

ngẫu nhiên. Những clinostat đầu tiên có tốc độ quay chậm từ 1-10 vòng/phút. Sự

quay chậm này có khả năng ngăn cản những đáp ứng tăng trưởng được kích hoạt

bởi trọng lực [21].

11

Khái niệm về clinostat quay nhanh (fast rotating clinostat) được sử dụng với

mục đích nghiên cứu tế bào [9], hay các sinh vật nhỏ và thực vật, được Wolfgang

Briegleb giới thiệu vào những năm 1950. Sự quay nhanh và ổn định của hệ thống sẽ

ngăn cản quá trình lắng của mẫu nghiên cứu. Việc quan sát sự chuyển động của các

phần tử nằm ở vùng lân cận trong ống trục hay buồng quay cho thấy các phần tử

này chịu một lực làm chúng di chuyển theo một con đường xoay vòng. Đường kính

các vòng này càng giảm thì tốc độ quay càng tăng, cuối cùng chúng sẽ tiến tới một

giai đoạn mà ở đó các chuyển động được cảm ứng bởi trọng lực có thể được loại bỏ.

Do đó, một tế bào có thể quay quanh trục của nó và được bao quanh bởi một lớp

chất lỏng [18]. Từ nguyên lý cơ bản này, nhiều hệ thống clinostat được phát triển

với nhiều hệ thống hỗ trợ như hệ thống kính hiển vi quan sát (Clinostat

Microscope), hệ thống hỗ trợ đo động lực trực tuyến (Photomultiplier Clinostat), hệ

thống cố định trong quá trình quay (Pipette Clinostat), hệ thống nghiên cứu điều

kiện ngập chìm (Submersed clinostat), hệ thống nuôi tế bào bám dính… [7]

Hình 1.1. Nguyên lý cơ bản của hệ thống clinostat 2D [6]. A: Các phần tử lắng dưới

trọng lực g của Trái Đất. B: Trong điều kiện vi trọng lực thực, các phần tử mất quá

trình lắng. C: Ở một tốc độ quay xác định, không có sự chuyển động nào của các

phần tử liên quan đến vector trọng lực, các phần tử này chỉ chuyển động quanh bản

thân chúng, do đó các phần tử này đang nằm trong trạng thái vi trọng lực mô phỏng.

12

Hình 1.2. Mô hình clinostat 2D (Viện nghiên cứu Y học không gian, Cologne,

Đức).

Hình 1.3. Mô hình clinostat 3D (Trung tâm hàng không vũ trụ NASA, Mỹ).

Các hệ thống clinostat thường được sử dụng với nhiều đối tượng, bao gồm tế

bào động vật, thực vật hoặc vi khuẩn. Hệ thống clinostat 2D quay nhanh có thể

được sử dụng cho việc nghiên cứu vi trọng lực mô phỏng trên trùng đế giày

(Paramecium) và trùng roi (Euglena) với kích thước từ 50µm đến 200µm [7]. Năm

2019, Touchstone và cộng sự đã sử dụng hệ thống clinostat 2D để nghiên cứu ảnh

hưởng của vi trọng lực lên tế bào gốc trung mô [22]. Wang và cộng sự năm 2016

cũng sử dụng hệ thống clinostat 2D trên rễ cây Arabidopsis thaliana [23]. Một

13 nghiên cứu trên tế bào động vật có vú là nghiên cứu của Yan và cộng sự năm 2015

trên tế bào gốc trung mô tủy xương chuột [24]. Các nghiên cứu ứng dụng hệ thống

clinostat 3D ngày càng được sử dụng nhiều hơn, điển hình là nghiên cứu của Kim

và cộng sự năm 2017 trên dòng tế bào lympho, các nghiên cứu của Furukawa và

cộng sự, Otsuka và cộng sự, Imura và cộng sự năm 2018 trên các dòng tế bào

myoblast chuột và tế bào gốc trung mô tủy xương [25, 26, 27, 28].

1.3.2. Buồng quay

Buồng quay (Rotating wall vessel, viết tắt RWV) hay hệ thống bioreactor

quay (được phát triển bởi NASA) được thiết kế để nuôi cấy tế bào [29] và các sinh

vật thủy sinh như trứng hay phôi cá [30, 31]. Các đối tượng được giữ trong dịch

nuôi cấy, trong khi chúng chuyển động rơi liên tục trong hệ thống. Hệ thống nuôi

cấy ngập chìm phổ biến hiện nay được thiết kế bởi Trung tâm nghiên cứu không

gian của Đức [32], hệ thống này được sử dụng để nghiên cứu quá trình phát triển

của cá trong trạng thái vi trọng lực mô phỏng. Hình 1.4 mô tả cấu trúc cơ bản của

một buồng quay theo nghiên cứu của Becker và Souza năm 2013 [33].

Hình 1.4. Mô hình buồng quay (rotating wall vessel-RWV). a: cấu tạo của buồng

quay, b: cấu trúc quay 3D trong buồng quay, c: buồng quay thương mại (Synthecon,

Incorporated, Mỹ).

Buồng quay tế bào phù hợp với các nghiên cứu trên các sinh vật thủy sinh

hoặc tế bào nuôi cấy huyền phù. Các nghiên cứu trên động vật thủy sinh áp dụng hệ

thống này bao gồm nghiên cứu của Moorman và cộng sự năm 1999 [31], Li và cộng

sự năm 2011 trên phôi cá ngựa vằn [30], nghiên cứu của Brungs và cộng sự năm

2011 trên phôi cá kiếm [32]. Buồng quay cũng được sử dụng cho vi khuẩn, điển

hình như nghiên cứu của Gilbert và cộng sự năm 2020 trên trực khuẩn Serratia

marcescens. Ứng dụng của buồng quay trong nuôi cấy tế bào động vật ít hơn, tuy

14 nhiên vẫn có một số nghiên cứu được thực hiện như nghiên cứu của Granet và cộng

sự năm 1998 trên tế bào xương, nghiên cứu của Radtke và cộng sự năm 2012 trên tế

bào biểu mô [34, 35].

1.3.3. Máy định vị ngẫu nhiên

Có giả thiết cho rằng chất lượng của việc mô phỏng vi trọng lực đối với các

mẫu lớn hơn có thể được tăng cường bằng việc quay mẫu quanh hai trục. Hệ thống

này được phát triển đầu tiên ở Nhật Bản và Hà Lan [19]. Hệ thống này có hai trục

quay độc lập nhau. Trong trường hợp cả hai trục đều quay với một tốc độ và hướng

ổn định, chúng được gọi là clinostat 3D. Nếu cả hai trục được vận hành với tốc độ

và hướng ngẫu nhiên thì chúng được gọi là máy định vị ngẫu nhiên, hay máy định

vị vị trí ngẫu nhiên (random positioning machine - RPM) (Hình 1.5) [18, 20].

Hình 1.5. Mô hình máy định vị ngẫu nhiên (RPM) (Trung tâm Không gian Hà Lan)

Hệ thống máy RPM chủ yếu được sử dụng trên các đối tượng tế bào động vật

có vú. Năm 2013, Aleshcheva và cộng sự đã sử dụng hệ thống này để nghiên cứu

các tác động của vi trọng lực lên nguyên bào xương [36]. Trong năm 2014, các

nhóm nghiên cứu của Sokolovskaya và Benavides Damm đã tạo môi trường vi

trọng lực mô phỏng bằng hệ thống RMP để nghiên cứu trên dòng tế bào nội mô

người và nguyên bào cơ vân chuột [37, 38]. Cazzaniga và cộng sự năm 2016 cũng

sử dụng hệ thống này để thí nghiệm lên tế bào gốc xương [39]. Tuy nhiên, hệ thống

15 RMP vẫn chưa được ứng dụng nhiều do cơ chế vận hành, cũng như cách đặt mẫu

trong hệ thống để cho các lực phân tán đồng đều vẫn cần được nghiên cứu và phát

triển thêm.

1.4. Tế bào gốc trung mô cuống rốn

1.4.1. Khái niệm

Cuống rốn (umbilical cord) chứa hai động mạch rốn và một tĩnh mạch rốn,

cả hai được bao phủ bởi một loại một mô liên kết niêm mạc đặc thù, được gọi là

thạch Wharton. Thạch Wharton này lại được bao phủ bởi một lớp biểu mô màng ối

(Hình 1.6). Tế bào gốc trung mô cuống rốn (umbilical cord mesenchymal stem cell

- ucMSC) được nhóm nghiên cứu của McElreavey phân lập lần đầu tiên từ thạch

Wharton năm 1991 [40]. Các tế bào này thể hiện kiểu hình, độ bám dính và tính đa

tiềm năng tương tự như các tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cell, viết tắt

MSC) từ các nguồn khác.

Tế bào gốc trung mô cuống rốn mang đặc điểm của tế bào gốc trung mô điển

hình. Chúng có hình thái giống như nguyên bào sợi với kích thước tế bào nhỏ,

thuôn dài và mảnh [40]. Tế bào chứa một nhân lớn, tròn với hạt nhân nổi bật, được

bao quanh bởi các hạt nhiễm sắc phân tán mịn, tạo cho hạt nhân một hình ảnh rõ

ràng khi quan sát dưới kính hiển vi. Phần còn lại của tế bào chiếm một thể tích nhỏ

bao gồm bộ máy Golgi, lưới nội chất, ti thể và polyribosome. Các tế bào phân tán

rộng rãi trong quần thể và ma trận ngoại bào được tạo ra bởi một vài sợi liên võng

(reticular fibril), không có sự xuất hiện của các sợi collagen khác [41, 42]

Cuống rốn được coi là chất thải y tế và việc thu nhận ucMSC là phương pháp

không xâm lấn. Hơn nữa, việc nghiên cứu trên ucMSC không bị vướng mắc bởi các

vấn đề đạo đức. ucMSC, tương tự như MSC từ các nguồn khác, có khả năng tự làm

mới trong khi vẫn duy trì tính đa tiềm năng, tức là chúng có khả năng biệt hóa thành

tế bào mỡ, tế bào xương, tế bào sụn, tế bào thần kinh và tế bào gan, mặc dù đối với

một số loại tế bào đã biệt hóa, ucMSC vẫn chưa hình thành được cơ quan hoàn

chỉnh [41, 42, 43]. Hơn nữa, ucMSC cũng đã thu hút được sự quan tâm lớn vì các

đặc tính điều hòa miễn dịch của chúng. Ngày nay, ucMSC được đề xuất như một

công cụ linh hoạt cho y học tái tạo và liệu pháp miễn dịch.

16

Hình 1.6. Cấu trúc cuống rốn ở người [44]

1.4.2. Lợi ích của tế bào gốc trung mô cuống rốn

Quần thể tế bào gốc có thể được phân lập từ các mô phôi thai, thai và mô

trưởng thành. Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell) là một ứng viên hàng đầu cho

ngành kỹ thuật mô vì khả năng tự tái tạo và tính đa tiềm năng cao (khả năng biệt

hóa thành tất cả các lớp mầm) cả trong in vitro và in vivo. Tuy nhiên, ngoài những

hạn chế về đạo đức, các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc phôi bị giới hạn nghiêm

trọng bởi những khó khăn về mặt kỹ thuật khi sự thiếu hụt tế bào chưa trưởng thành

có thể dẫn đến hình thành u quái (teratoma) [45].

Trái lại, các tế bào gốc trưởng thành, chẳng hạn như tế bào da, tủy xương và

mô mỡ, có thể ứng dụng lâm sàng rộng hơn. Tế bào gốc trung mô tủy xương (bone

marrow mesenchymal stem cell - bmMSC) đã được sử dụng trong cấy ghép tự thân

và cấy ghép đồng loại. Nhiều thành công trong việc ứng dụng bmMSC tự thân đã

được báo cáo gần đây trong nhiều lĩnh vực như nhồi máu cơ tim [46], bệnh ghép

chống chủ (GVHD) [47, 48], bệnh Crohn [49] và kỹ thuật mô xương [50]. Tuy

nhiên, việc sử dụng kỹ thuật cấy ghép tự thân đôi khi bị giới hạn bởi số lượng tế bào

và những thay đổi liên quan đến tuổi như khả năng tăng trưởng và biệt hóa [51, 52].

So với các tế bào gốc trung mô tủy xương (bmMSC) và tế bào gốc phôi, tế

bào gốc trung mô cuống rốn (ucMSC) cho thấy cấu hình biểu hiện gen tương tự như

17 của tế bào gốc phôi và khả năng tự làm mới nhanh hơn tế bào gốc trung mô tủy

xương [43]. Các tế bào ucMSC dễ dàng được thu nhận qua nuôi cấy tăng sinh in

vitro hoặc nuôi cấy ex vivo. Hơn nữa, ưu điểm đáng giá nhất của ucMSC là quy

trình thu thập không xâm lấn và được chấp nhận về mặt đạo đức.

Tương tự như bmMSC, ucMSC có thể được xem xét để ứng dụng trong cấy

ghép tự thân và cấy ghép đồng loại. ucMSC tự thân có thể được sử dụng làm liệu

pháp gene cho các bệnh di truyền và là liệu pháp tái tạo hoặc kháng viêm trong chấn

thương sơ sinh, chẳng hạn như bại não hoặc tổn thương não do thiếu oxy. Mặt khác,

các nguồn ucMSC thu thập được do hiến tặng có thể được nuôi cấy tăng sinh và trữ

đông trong ngân hàng tế bào cho bệnh nhân có nhu cầu [44]. Điều cần lưu ý là các

bác sĩ cần xác nhận sức khỏe của em bé là người hiến vì không thể xác định trước

liệu bé có phát triển bình thường mà không gặp vấn đề về sức khỏe hay không; do

đó, các xét nghiệm về gene và nhiễm sắc thể cần phải được thực hiện. Ngược lại,

trong trường hợp người hiến tủy xương, bác sĩ có thể trực tiếp nhìn thấy và kiểm tra

người hiến, từ đó ra quyết định thu nhận tủy xương. Nhiều ngân hàng máu cuống

rốn theo dõi sức khỏe của bé sau khi sinh. Do đó, mỗi ứng dụng lâm sàng trên

ucMSC cần phải được nghiên cứu kỹ những lợi thế và bất lợi của dòng tế bào này

[44].

1.5. Sự tăng sinh tế bào

1.5.1. Định nghĩa

Sinh trưởng và phát triển là một quá trình tất yếu và liên tục của mọi sinh vật

trên Trái Đất. Quá trình này diễn ra nhờ vào sự lớn lên và phân chia không ngừng

của các tế bào trong cơ thể sống, còn gọi là sự phát triển và tăng sinh tế bào. Trong

giai đoạn phát triển, tế bào gia tăng thể tích tế bào chất, các bào quan cũng như vật

liệu di truyền. Trong khi đó, sự tăng sinh tế bào liên quan đến việc tế bào mẹ phân

chia thành hai tế bào con [53]. Sự sinh trưởng của tế bào được chia thành các giai

đoạn gọi là chu kỳ tế bào [54].

Chu kỳ tế bào, hay chu kỳ phân chia tế bào, là chuỗi các sự kiện diễn ra trong

một tế bào khiến nó phân chia thành hai tế bào con (Hình 1.7). Những sự kiện này

bao gồm sự tự sao chép DNA và một số bào quan, sau đó là phân vùng tế bào chất

và các thành phần khác thành hai tế bào con trong một quá trình gọi là phân chia tế

18 bào [54]. Chu kỳ tế bào nhân chuẩn bao gồm bốn giai đoạn riêng biệt: pha G1, pha

S (tổng hợp), pha G2 và pha M (bao gồm nguyên phân và phân bào). Pha M bao

gồm hai quá trình liên kết chặt chẽ: nguyên phân, trong đó nhân của tế bào phân

chia và cytokinesis, trong đó tế bào chất của tế bào phân chia tạo thành hai tế bào

con. Quá trình phân chia tế bào này chỉ chiếm khoảng 5% vòng đời của mỗi tế bào,

95% còn lại là giai đoạn trung gian (interphase), bao gồm các pha G1, pha S và pha

G2. Ngoài ra, một số tế bào đặc thù sẽ đi vào trạng thái không hoạt động được gọi

là pha G0, ở đó các tế bào sẽ ngừng phân chia tạm thời hoặc vĩnh viễn [54].

Hình 1.7. Chu kỳ tế bào

Ở vi khuẩn, sự tăng trưởng của tế bào và sự sao chép DNA diễn ra liên tục

trong hầu hết chu kỳ tế bào và các nhiễm sắc thể đã nhân đôi được phân phối cho

các tế bào con liên kết với màng plasma. Tuy nhiên, ở sinh vật nhân chuẩn, chu kỳ

tế bào phức tạp hơn và bao gồm bốn giai đoạn riêng biệt. Mặc dù sự phát triển của

tế bào thường là một quá trình liên tục, DNA được tổng hợp chỉ trong một giai đoạn

của chu kỳ tế bào và sau đó các nhiễm sắc thể được sao chép sẽ được phân phối cho

nhân mới hình thành bằng một chuỗi các sự kiện phức tạp trước khi phân chia tế

bào. Quá trình chuyển giao giữa các giai đoạn của chu kỳ tế bào được kiểm soát bởi

một bộ máy điều hòa được bảo tồn, nó không chỉ điều phối các sự kiện khác nhau

của chu kỳ tế bào mà còn liên kết chu kỳ tế bào với các tín hiệu ngoại bào kiểm soát

sự tăng sinh tế bào [54].

1.5.2. Các yếu tố điều hòa chu kỳ tế bào

19

Mỗi giai đoạn của chu trình tế bào được quy định chặt chẽ, với các điểm

kiểm tra được đặt ở gần cuối pha G1, ở giai đoạn chuyển tiếp G2/M và gần cuối giai

đoạn metaphase của quá trình nguyên phân (pha M). Các điểm kiểm tra này là các

cơ chế giám sát có chức năng đảm bảo rằng các tế bào con được tạo ra là các bản

sao của tế bào mẹ với số lượng nhiễm sắc thể chính xác và không bị đột biến. Trong

điểm kiểm tra G1, các điều kiện cần thiết cho sự tiến triển trong chu kỳ tế bào được

đánh giá. Một tế bào thường vượt qua điểm kiểm tra G1 nếu nó có kích thước phù

hợp, sở hữu năng lượng đầy đủ và không có DNA bị hỏng. Chức năng chính của

điểm kiểm tra G2 là đảm bảo rằng sự sao chép của tất cả các nhiễm sắc thể đã hoàn

tất và không có các đột biến hoặc tổn thương DNA chưa được sửa chữa. Ngoài ra,

kích thước tế bào và khả năng dự trữ protein thích hợp cũng được đánh giá trong

điểm kiểm tra này. Điểm kiểm tra thoi vô sắc/M đảm bảo rằng tất cả các nhiễm sắc

thể chị em được gắn chính xác vào các thoi vô sắc và mỗi tế bào có số lượng nhiễm

sắc thể chính xác [55].

Các chất điều chỉnh chính của chu trình tế bào ở sinh vật nhân chuẩn là các

phức hợp enzyme dị loại, bao gồm các cyclin và kinase phụ thuộc cyclin (Cdks)

[56]. Sự biểu hiện của cyclins tăng hoặc giảm trong các giai đoạn riêng biệt của chu

kỳ tế bào và chúng được chia thành các nhóm dựa trên giai đoạn chu kỳ tế bào mà

chúng điều chỉnh [56]. Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, nồng độ của Cdks

vẫn tương đối ổn định. Mỗi tiểu đơn vị Cdk có thể liên kết với các cyclin khác nhau

và cyclin liên quan sẽ xác định cơ chất protein nào được phosphoryl hóa bởi phức

hợp Cdk-cyclin [57]. Hơn nữa, Cdks không có hoạt động kinase trừ khi ràng buộc

cyclin. Ngoài sự ràng buộc của cyclins, việc kích hoạt phức hợp cũng đòi hỏi sự

phosphoryl hóa các dư lượng chính trong vòng kích hoạt của tiểu đơn vị Cdk [58].

1.5.3. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của vi trọng lực lên sự tăng sinh tế bào

Tế bào sinh vật cần phân chia để phát triển. Sự phân chia tế bào là cần thiết

cho sự tăng sinh tế bào. Vi trọng lực mô phỏng có thể ảnh hưởng đến sự tăng sinh tế

bào theo những cách khác nhau, tùy thuộc vào các hệ thống mô phỏng được sử

dụng và dòng tế bào. Sự tăng sinh đã được quan sát thấy trong các tế bào gốc trung

mô tủy xương người trong môi trường vi trọng lực tạo ra bằng hệ thống clinostat 3D

trong nghiên cứu của Yuge và cộng sự [59]. Nghiên cứu gần đây của Ratushnyy và

20 cộng sự báo cáo rằng không có sự khác biệt về sự tăng sinh của các tế bào trung mô

có nguồn gốc từ mô mỡ giữa nhóm đối chứng (1G) và nhóm vi trọng lực gây ra bởi

máy định vị ngẫu nhiên (RPM) [60]. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu khác đã

chứng minh rằng vi trọng lực gây ra sự ức chế tăng sinh của nhiều dòng tế bào.

Nghiên cứu của Touchstone và cộng sự năm 2019 đã cho thấy rằng các tế bào gốc

trung mô chuột có sự giảm tăng sinh trong điều kiện vi trọng lực tạo ra bằng hệ

thống clinostat 1D [22]. Các tế bào gốc tạo máu ở người cũng cho thấy giảm sự tăng

sinh trong điều kiện vi trọng lực tạo ra từ buồng xoay tế bào trong nghiên cứu của

Plett và cộng sự [61].. Môi trường vi trọng lực mô phỏng tạo ra từ trục quay trọng

lực cũng ức chế sự tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương [24]. Bên

cạnh đó, môi trường vi trọng lực tạo ra từ hệ thống clinostat 2D đã ức chế sự tăng

sinh và di chuyển của tế bào gốc trung mô chuột [62]. Sự ức chế tăng sinh đã được

ghi lại trong tế bào ung thư hắc tố melanoma nuôi trong môi trường vi trọng lực mô

phỏng tạo ra bởi máy định vị ngẫu nhiên (RPM) [63]. Các nghiên cứu này tiết lộ

rằng môi trường vi trọng lực mô phỏng có thể tạo ra một loạt các thay đổi về phát

triển, tăng sinh hoặc di chuyển các tế bào ở động vật có vú.

Những thay đổi của tế bào gốc trung mô trong hệ thống clinostat 3D vẫn

chưa được chứng minh rõ ràng. Sự thay đổi mật độ, diễn tiến của chu kỳ tế bào và

các yếu tố điều hòa chu kỳ vẫn chưa được làm rõ. Do đó, nghiên cứu hiện tại đánh

giá ảnh hưởng của môi trường vi trọng lực mô phỏng đối với sự tăng sinh tế bào gốc

trung mô cuống rốn người (hucMSC), đặc biệt là trong quá trình phát triển chu kỳ tế

bào và biểu hiện của các protein điều hòa chu kỳ tế bào.

1.6. Quá trình apoptosis

1.6.1. Khái niệm

Quá trình apoptosis, còn gọi là sự chết theo chương trình, là một dạng chết tế

bào được lập trình [64]. Quá trình này khác với hoại tử, trong đó các tế bào chết do

chấn thương. Apoptosis là một quá trình có trật tự, trong đó các thành phần của tế

bào được tách nhỏ ra trước khi được xử lý bởi các tế bào miễn dịch. Apoptosis xảy

ra bình thường trong quá trình phát triển và lão hóa và như một cơ chế cân bằng nội

môi để duy trì quần thể tế bào trong các mô [64]. Apoptosis cũng xảy ra như một cơ

chế bảo vệ như trong các phản ứng miễn dịch hoặc khi các tế bào bị tổn thương do

21 bệnh hoặc các tác nhân độc hại [65]. Mặc dù có rất nhiều kích thích và điều kiện, cả

về sinh lý và bệnh lý, có thể kích hoạt quá trình tự hủy, không phải tất cả các tế bào

sẽ nhất thiết phải chết khi đáp ứng với cùng một kích thích. Chiếu xạ hoặc thuốc

được sử dụng cho hóa trị ung thư dẫn đến tổn thương DNA ở một số tế bào, có thể

dẫn đến tử vong do apoptosis thông qua con đường phụ thuộc p53. Một số hormone,

chẳng hạn như corticosteroid, có thể dẫn đến quá trình apoptosis ở một số tế bào (ví

dụ, tuyến ức) mặc dù các tế bào khác không bị ảnh hưởng hoặc thậm chí bị kích

thích [65].

Kính hiển vi quang học và điện tử đã xác định những thay đổi hình thái khác

nhau xảy ra trong quá trình apoptosis [66]. Trong quá trình đầu tiên của apoptosis,

có thể nhìn thấy sự co rút của tế bào và pyknosis bằng kính hiển vi quang học [67].

Với sự co rút của tế bào, các tế bào có kích thước nhỏ hơn, tế bào chất dày đặc và

các bào quan được đóng gói chặt chẽ hơn. Pyknosis là kết quả của sự ngưng tụ

chromatin và đây là biểu hiện đặc trưng nhất của apoptosis. Khi quan sát bằng

phương pháp nhuộm với hematoxylin và eosin, apoptosis biểu hiện trong quần thể

tế bào ở các tế bào đơn hoặc cụm tế bào nhỏ. Tế bào apoptotic xuất hiện dưới dạng

khối tròn hoặc hình bầu dục với tế bào chất bạch cầu ái toan sẫm màu và các mảnh

nhiễm sắc thể hạt nhân màu tím dày đặc (Hình 1.8). Kính hiển vi điện tử có thể xác

định tốt hơn các thay đổi bên trong tế bào apoptosis. Trong giai đoạn đầu của quá

trình ngưng tụ chromatin, các mảnh vỡ của nhân cô đặc lại và tập trung xung quanh

màng nhân mặc dù cũng có thể có một số nhân mà các mảnh vỡ này phân bố đồng

đều (Hình 1.9).

Hình 1.8. Hình ảnh tế bào chuột biểu hiện apoptosis dưới kính hiển vi quang học

[68]. Tế bào apoptosis được đánh dấu bằng mũi tên đen.

22

Hình 1.9. Hình ảnh tế bào tuyến ức dưới kính hiển vi điện tử [69]. A: tế bào tuyến

ức bình thường. B: tế bào tuyến ức biểu hiện apoptosis. Tế bào apoptosis được đánh

dấu bằng mũi tên đen.

1.6.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến apoptosis

Apoptosis xảy ra thường xuyên trong quá trình phát triển và lão hóa và là cơ

chế cân bằng nội môi để duy trì quần thể tế bào trong các mô. Quá trình này cũng

xảy ra như một cơ chế bảo vệ trong các phản ứng miễn dịch hoặc khi các tế bào bị

tổn thương do bệnh hoặc các tác nhân độc hại [65]. Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) là

protein điều hòa quá trình apoptosis của tế bào [69]. Protein này nằm ở màng ngoài

ti thể, nơi nó đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự sống của tế bào và ức

chế hoạt động của các protein tiền apoptosis. Các protein tiền apoptosis trong họ

Bcl-2, bao gồm Bax và Bak, thường hoạt động trên màng ti thể để thúc đẩy sự thẩm

thấu và giải phóng cytochrom C và ROS, đó là những tín hiệu quan trọng trong con

đường apoptosis. Các protein tiền apoptosis này lần lượt được kích hoạt bởi các

protein BH3 và bị ức chế bởi Bcl-2 và Bcl-Xl [70]. Bax là một thành viên của họ

Bcl-2. Các thành viên họ Bcl-2 hình thành các đồng nguyên hoặc dị nguyên và hoạt

động như protein điều hòa chống lại hoặc mở đầu quá trình apoptosis. Bax gắn kết

với Bcl-2 và hoạt động như một chất kích hoạt apoptosis. Protein này được báo cáo

là tương tác và tăng độ mở của kênh anion phụ thuộc điện thế ti thể, dẫn đến mất

tiềm năng màng và giải phóng cytochrom c. Sự biểu hiện của gen này được điều

chỉnh bởi chất ức chế khối u p53 và đã được chứng minh là có liên quan đến quá

trình apoptosis qua trung gian p53 [69]. Trong các tế bào động vật có vú khỏe

mạnh, phần lớn Bax được tìm thấy trong cytosol, nhưng khi bắt đầu truyền tín hiệu

23 apoptosis, protein Bax thay đổi cấu trúc và trở thành protein bám màng ti thể trong

quá trình apoptosis [71, 72].

1.6.3. Phương pháp đánh giá apoptosis

Quá trình apoptosis được nhận biết thông qua các đặc điểm hình thái nhất

định, bao gồm mất sự gắn kết và bất đối xứng của màng sinh chất, sự cô đặc của tế

bào chất và nhân và phân mảnh DNA. Nhiều phương pháp đã được sử dụng để phát

hiện và đếm các tế bào đi vào con đường apoptosis. Tuy nhiên, quá trình này có thể

bị nhầm lẫn với hoại tử (necrosis) do có một số biểu hiện tương đồng, do đó cần

thiết phải sử dụng các xét nghiệm đặc thù để xác nhận rằng tế bào chết thông qua

quá trình apoptosis. Các phương pháp đánh giá apoptosis thường được phân thành

các nhóm chính:

- Thay đổi hình thái tế bào

- Phân mảnh DNA

- Xét nghiệm ti thể

- Phát hiện và định lượng các protein liên quan đến apoptosis: caspase, chất

nền bị phân cắt, chất điều hòa và chất ức chế

- Sự thay đổi phospholipid phosphatidylserine (PS)

Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào là phương pháp trực quan nhất để xem

xét quá trình apoptosis diễn ra trong quần thể tế bào đó. Tế bào có thể được nhuộm

với hematoxylin hoặc eosin và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Tuy nhiên

phương pháp này chỉ nhận biết được các tế bào apoptosis trong giai đoạn trễ. Để cải

thiện phương pháp này, hệ thống kính hiển vi truyền qua (transmission electron

microscopy, viết tắt TEM) đã được ứng dụng. Nhờ vào hệ thống này, các điểm đặc

trưng của tế bào apoptosis đã được xác định [73]. Những đặc điểm này là: (1) hạt

nhân dày đặc electron (giai đoạn đầu); (2) sự phân mảnh hạt nhân; (3) màng tế bào

còn nguyên vẹn kể cả ở cuối giai đoạn phân hủy tế bào; (4) các bào quan trong tế

bào chất vô tổ chức; (5) không bào lớn rõ ràng; và (6) bong ra ở bề mặt tế bào.

Những nhược điểm chính của TEM là chi phí, thời gian và khả năng chỉ khảo

nghiệm một vùng nhỏ tại một thời điểm. Những bất lợi khác bao gồm khó khăn

trong việc phát hiện các tế bào apoptosis do tính chất thoáng qua của chúng và

không có khả năng phát hiện các tế bào apoptosis ở giai đoạn sớm nhất.

24

Sự phân mảnh DNA có thể được nhận biết bằng phương pháp thang DNA

[74] hoặc phương pháp TUNEL (Terminal dUTP Nick End-Labeling) [75]. Trong

phương pháp thang DNA, tế bào được ly giải và điện di trên gel agarose. Mẫu chứa

nhiều tế bào apoptosis sẽ biểu hiện thành một thang DNA do sự phân mảnh DNA

của chúng. Phương pháp này hữu ích khi đánh giá số lượng lớn tế bào, tuy nhiên

không phù hợp với mẫu có số lượng tế bào apoptosis thấp và không thể phân biệt

với quá trình hoại tử. Phương pháp TUNEL được sử dụng để kiểm tra các sản phẩm

phân cắt endonuclease bằng cách đánh dấu đầu cuối bằng enzym cho các đứt gãy

sợi DNA [75]. Các tế bào apoptosis được phát hiện bằng kính hiển vi ánh sáng, kính

hiển vi huỳnh quang hoặc phương pháp flow cytometry. Xét nghiệm này rất nhạy

và cũng là một kỹ thuật nhanh có thể hoàn thành trong vòng 3 giờ. Nhược điểm là

chi phí và thông số không xác định về số lượng đứt gãy sợi DNA cần thiết để phát

hiện bằng phương pháp này. Phương pháp này cũng có thể xảy ra hiện tượng dương

tính giả từ các tế bào bị hoại tử và các tế bào trong quá trình sửa chữa DNA và

phiên mã gen. Vì những lý do này, nó nên được kết hợp với một xét nghiệm khác.

Các xét nghiệm ty thể và giải phóng cytochrome c cho phép phát hiện những

thay đổi trong giai đoạn đầu của apoptosis theo con đường nội tại (intrinsict

pathway). Kính hiển vi quét laser đồng tiêu (Laser scanning confocal microscopy,

viết tắt LSCM) tạo ra các lát quang học mỏng xuyên qua các tế bào sống có thể

được sử dụng để theo dõi một số sự kiện của ty thể trong các tế bào đơn nguyên vẹn

theo thời gian [76, 77]. Quá trình chuyển đổi tính thấm của ty thể, sự khử cực của màng trong ty thể, dòng ion Ca2+, tình trạng oxy hóa khử của ty thể và các loại oxy

phản ứng đều có thể được theo dõi bằng phương pháp này. Bất lợi chính là các

thông số ty thể mà phương pháp này theo dõi cũng có thể xảy ra trong quá trình

hoại tử.

Ngoài ra, để so sánh mức độ apoptosis giữa hai mẫu tế bào, người ta còn có

thể sử dụng cách đo biểu hiện các protein tham gia vào quá trình apoptosis như

Caspase, Bax, Bcl-2, Bid… [78]. Phương pháp Realtime qRT-PCR thường được sử

dụng để đánh giá mức độ biểu hiện các gene này trong tế bào.

Mất màng sinh chất là một trong những đặc điểm xảy ra sớm nhất trong quá

trình apoptosis ở tế bào. Trong tế bào apoptosis, phospholipid phosphatidylserine

25 (PS) dịch chuyển vị trí từ trong ra ngoài màng sinh chất, tiếp xúc với môi trường tế bào bên ngoài [79]. Annexin V là một protein liên kết phospholipid phụ thuộc Ca2+

có ái lực cao với PS, do đó có thể liên kết với các tế bào có biểu hiện PS ra ngoài tế

bào [80]. Annexin V có thể được liên kết với các phân tử phát huỳnh quang bao

gồm FITC. Phức hợp này vẫn giữ được ái lực cao đối với PS và do đó được sử dụng

như một đầu dò nhạy cảm để phân tích các tế bào đang trải qua quá trình apoptosis

bằng phương pháp flow cytometry [81]. Vì sự di chuyển ra ngoài của PS xảy ra

trong giai đoạn sớm trong quá trình apoptosis, phương pháp nhuộm FITC Annexin

V có thể xác định quá trình apoptosis ở giai đoạn sớm hơn so với các xét nghiệm

dựa trên những thay đổi về nhân như phân mảnh DNA [80].

Phương pháp nhuộm FITC Annexin V cho biết sự mất tính toàn vẹn của

màng đi kèm với sự chết tế bào ở giai đoạn cuối do apoptosis hoặc hoại tử. Do đó,

nhuộm FITC Annexin V thường được sử dụng kết hợp với một loại thuốc nhuộm

khác đánh giá sự sống tế bào như propidium iodide (PI) hoặc 7-Amino-

Actinomycin (7-AAD) để xác định các tế bào apoptosis sớm [82]. PI chỉ có thể

thấm qua màng của tế bào đã chết hoặc tế bào đang ở giai đoạn cuối của apotosis

(tính thấm của màng những tế bào này đã tăng lên). Chính vì vậy tế bào chết hoặc đi

vào giai đoạn cuối trong chu trình apotosis sẽ có nhân được nhuộm bởi PI. Ví dụ,

các tế bào được coi là sống khi cùng âm tính với FITC Annexin V và PI; các tế bào

đang trong giai đoạn apoptosis sớm sẽ dương tính với FITC Annexin V và âm tính

với PI; các tế bào đang trong giai đoạn apoptosis muộn hoặc đã chết đều dương tính

với FITC Annexin V và PI. Xét nghiệm này không phân biệt giữa các tế bào đã chết

khi bước vào giai đoạn cuối của apoptosis với những tế bào đã chết do hoại tử vì

trong cả hai trường hợp, các tế bào chết sẽ được nhuộm cả FITC Annexin V và PI.

Tuy nhiên, khi quá trình apoptosis được đo theo thời gian, các tế bào có thể được

theo dõi thường xuyên từ âm tính với cả FITC Annexin V và PI (tế bào sống, hoặc

chưa biểu hiện apoptosis), đến dương tính với FITC Annexin V và âm tính với PI

(apoptosis sớm, màng tế bào vẫn bảo toàn) và cuối cùng là dương tính với FITC

Annexin V và PI (apoptosis giai đoạn cuối và chết). Sự di chuyển của các tế bào

qua ba giai đoạn này cho thấy quá trình apoptosis. Ngược lại, các tế bào chỉ trải qua

một giai đoạn dương tính với FITC Annexin V và PI không được coi là tế bào

apoptosis [83, 84].

26

1.7. Nhân và tế bào chất

1.7.1. Định nghĩa và vai trò của nhân và tế bào chất

Nhân tế bào một cấu trúc chuyên biệt xuất hiện trong hầu hết các tế bào (trừ

vi khuẩn và tảo lam) và được ngăn cách với phần còn lại của tế bào bởi màng nhân.

Màng này kết nối với lưới nội chất của tế bào và có các lỗ rỗng, có thể cho phép các

phân tử lớn xâm nhập [54]. Nhân kiểm soát và điều chỉnh các hoạt động của tế bào

(ví dụ tăng trưởng và trao đổi chất) và mang các gene, cấu trúc chứa thông tin di

truyền. Nhân duy trì tính toàn vẹn của các gene và kiểm soát các hoạt động của tế

bào bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của gene. Do đó, chúng là trung tâm điều

khiển của tế bào [54].

Tế bào chất là chất bán lỏng của tế bào nằm bên ngoài màng nhân và bên

trong màng tế bào. Ở sinh vật nhân thực, tế bào chất là nơi chứa các bào quan, bao

gồm ty thể, là nơi sản xuất năng lượng thông qua tổng hợp ATP (adenosine

triphosphate); lưới nội chất, nơi tổng hợp lipid và protein; bộ máy Golgi, vị trí nơi

các protein được biến đổi, đóng gói và sắp xếp để chuẩn bị vận chuyển đến các

điểm đến tế bào của chúng; lysosome và peroxisome, những túi chứa các enzym

tiêu hóa thực hiện quá trình tiêu hóa nội bào của các đại phân tử như lipid và

protein; khung xương tế bào, một mạng lưới các sợi protein tạo hình dạng và hỗ trợ

cho tế bào; và cytosol, khối chất lỏng bao quanh các bào quan. Tế bào chất là nơi

diễn ra hầu hết các hoạt động của tế bào, chẳng hạn như các con đường trao đổi chất

bao gồm đường phân và các quá trình như phân chia tế bào [54].

1.7.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thái nhân và tế bào chất

Hình thái nhân chịu ảnh hưởng bởi khá nhiều yếu tố, bao gồm màng ngoại

biên nhân, màng lưới nội chất, nhiễm sắc thể và sự tổng hợp lipid [85]. Đã có nhiều

nghiên cứu cho thấy sự thiếu hụt lamin, thành phần chính của màng ngoại biên nhân

đã làm thay đổi hình dạng nhân trên nhiều tế bào [86]. Màng nhân có thể được xem

như một thành phần của lưới nội chất, do đó nó cũng góp phần duy trì hình dạng

của nhân. Những sự thay đổi trên màng lưới nội chất như quá trình vận chuyển lipid

và protein giữa lưới nội chất ngoại vi và màng nhân được ghi nhận là đã làm thay

đổi kích thích và hình dạng nhân ở tế bào [85]. Số lượng nhiễm sắc thể cũng là một

yếu tố ảnh hưởng đến kích thước của nhân [87]. Ngoài ra, phospholipid là một

27 thành phần chính của màng nhân, sự tổng hợp lipid có thể đóng vai trò quan trọng

trong việc xác định hình dạng và kích thước nhân. Bằng chứng trực tiếp về vai trò

của tổng hợp lipid trong việc xác định hình dạng nhân đã được cung cấp trong các

nghiên cứu về nấm men bị thay đổi chuyển hóa lipid của Siniossoglou và cs. năm

2009 và Santos-Rosa và cs. năm 2005 [88, 89].

Mặc dù có vẻ như không có cấu trúc chuyên biệt, nhưng tế bào chất thực sự

được tổ chức theo một cấu trúc nhất định. Một tập hợp mạng lưới protein được gọi

là khung xương tế bào cung cấp cấu trúc cho tế bào chất và tế bào. Khung xương tế

bào bao gồm các sợi và ống giống như sợi chỉ đan chéo nhau qua tế bào chất [54].

Như tên gọi của nó, khung xương tế bào giống như bộ xương của tế bào. Nó giúp tế

bào duy trì hình dạng và cố định các bào quan trong tế bào chất. Do đó, các ảnh

hưởng lên khung xương tế bào sẽ tác động trực tiếp đến hình dạng cũng như kích

thước của tế bào chất [54].

1.8. Bộ khung xương tế bào

1.8.1. Khái niệm

Khung xương tế bào là một mạng lưới phức tạp, năng động của các sợi

protein liên kết có trong tế bào chất của tất cả các tế bào, bao gồm cả vi khuẩn và vi

khuẩn cổ [90]. Khung xương tế bào kéo dài từ nhân tế bào đến màng tế bào. Ở sinh

vật nhân chuẩn, khung xương tế bào bao gồm ba thành phần chính là vi sợi actin, vi

sợi trung gian và vi ống. Tất cả các thành phần này đều có khả năng tăng trưởng

nhanh hoặc tháo gỡ tùy thuộc vào yêu cầu của tế bào [91].

Khung xương tế bào nắm giữ ba chức năng lớn: là không gian tổ chức tế bào,

kết nối tế bào về vật chất và sinh hóa với môi trường bên ngoàivà tạo ra các lực

phối hợp cho phép tế bào di chuyển và thay đổi hình dạng. Để đạt được các chức

năng này, bộ khung tế bào kết hợp hoạt động của vô số các protein tế bào chất

(cytoplasmic proteins) và các cơ quan. Khác với ý nghĩa của từ “bộ xương”, bộ

khung xương tế bào không phải là một cấu trúc cố định trong đó chức năng của nó

có thể được hiểu một cách riêng biệt. Thay vào đó, nó là một cấu trúc năng động và

thích nghi, trong đó các chuỗi polymer thành phần và các protein điều hòa luôn hiện

diện với một lưu lượng ổn định [54].

1.8.2. Cấu trúc khung xương tế bào

28

Có ba loại polyme chính cấu thành nên cấu trúc khung xương tế bào: vi sợi,

vi ống và một nhóm các polyme được gọi chung là các sợi trung gian. Cùng nhau,

các polyme này kiểm soát hình dạng và cơ học của các tế bào nhân chuẩn (Hình

1.10). Cả ba đều được tổ chức thành các mạng lưới chống lại sự biến dạng nhưng có

thể tổ chức lại để đáp ứng với các ứng lực bên ngoài và chúng có vai trò quan trọng

trong việc sắp xếp và duy trì tính toàn vẹn của các khoang nội bào [92].

Hình 1.10. Thành phần cấu trúc khung xương tế bào [93].

Vi ống có kích thước lớn nhất trong ba loại sợi tế bào, với đường kính

khoảng 25nm, được tạo thành từ các protein tubulin (α-tubulin và β-tubulin) sắp xếp

xen kẽ nhau để tạo thành một ống rỗng. Trong quá trình phân bào, một phần của

chu trình tế bào, trong đó các tế bào phân tách các nhiễm sắc thể thành hai bộ giống

hệt nhau, các vi ống trong bộ khung xương tế bào sắp xếp lại chính nó thành một bộ

máy phân tách DNA có độ chính xác cao được gọi là thoi vô sắc. Khả năng của thoi

vô sắc để tìm và căn chỉnh các nhiễm sắc thể phụ thuộc phần nào vào các động lực

lắp ráp của các vi ống [94]. Ở các sinh vật đơn bào, vi ống là thành phần chính của

tiên mao (flagella) và tiêm mao (cilia) giúp cho các sinh vật này di chuyển [54].

Vi sợi (vi sợi actin) có đường kính nhỏ nhất trong 3 thành phần khung xương

tế bào (7 nm), được tạo nên bởi sự trùng hợp các monomer của protein actin tạo

thành chuỗi xoắn kép [54]. Vi sợi mềm dẻo hơn hơn so với vi ống. Tuy nhiên, sự

hiện diện của nồng độ cao liên kết chéo bám vào vi sợi thúc đẩy việc lắp ráp các cấu

trúc cứng, tổ chức cao, bao gồm các mạng đẳng hướng (isotropic networks), các

mạng gói (bundled networks) và các mạng nhánh (branched networks). Vi sợi kết

29 hợp với protein vận động myosin hỗ trợ các chuyển động của tế bào, từ đó đóng vai

trò chính trong quá trình phân tách tế bào chất (cytokinesis). Các bó vi sợi hỗ trợ

chân giả của tế bào trong quá trình chemotaxis (chuyển động trực tiếp theo gradient

hoá học) và giao lưu thông tin tế bào. Ngược lại, các mạng lưới vi sợ đa nhánh hỗ

trợ mép dẫn hướng (leading edge) của hầu hết các tế bào di chuyển và tạo ra các lực

liên quan đến những thay đổi trong hình dạng tế bào, ví dụ như những thay đổi xảy

ra trong quá trình thực bào [54].

Sợi trung gian có đường kính từ 8-12 nm, được tạo nên bởi nhiều loại protein

như keratin, vimentin, desmin và lamin. Chúng chống lại lực căng có hiệu quả hơn

nhiều so với lực nén. Không giống vi ống và vi sợi actin, các vi sợi trung gian

không phân cực và không thể hỗ trợ chuyển động theo hướng của động cơ phân tử.

Cấu trúc của vi sợi trung gian khá ổn định. Chúng giúp tế bào chống lại các lực kéo

giãn, đóng vai trò duy trì hình dạng của tế bào và neo giữ nhân và các bào quan

khác [54].

1.8.3. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của vi trọng lực lên khung xương tế bào

Các sinh vật sống luôn chịu ảnh hưởng của trọng lực [95]. Những thay đổi

của trọng lực có thể gây ra các rối loạn trong quá trình chuyển hóa các cơ quan và

thay đổi cấu trúc của xương và da [96]. Tiếp xúc với môi trường vi trọng lực sẽ làm

phát sinh những tác động tiêu cực đến cơ thể con người, bao gồm loãng xương, thay

đổi cấu trúc tim mạch và các cơ quan thần kinh [97]. Trọng lực có thể ảnh hưởng

đến cả hình thái và cấu trúc khung xương tế bào [98]. Tác động của vi trọng lực lên

chức năng và cấu trúc của tế bào động vật có vú đã được nghiên cứu bằng cách sử

dụng các hệ thống mô phỏng khác nhau như buồng quay tế bào [35], clinostat 2D

[23], clinostat 3D [24, 25, 26] hoặc máy định vị ngẫu nhiên (RPM) [99, 100]. Điều

kiện vi trọng lực gây ra sự sắp xếp lại tế bào của các tế bào nội mô bằng cách sửa

đổi biểu hiện gelsolin và α-tubulin [101]. Tế bào myoblast chuột C2C12 được nuôi

trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng cho thấy sự giảm tăng sinh và giảm biểu hiện

của thụ thể tiềm năng canonical loại 1 (TRPC1) và các yếu tố tăng trưởng giống

như insulin 1 (IGF-1) [28, 38]. Sự tăng cường quá trình tạo xương đã được xác định

trong các tế bào tủy xương chuột trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng bằng

phương pháp xác định các dấu hiệu tự thực bào [102]. Những thay đổi của hệ thống

miễn dịch cũng được mô tả trong điều kiện vi trọng lực. Vi trọng lực có thể sửa đổi

30 sự tải nạp tín hiệu tế bào lympho T, dẫn đến làm suy yếu hệ thống miễn dịch [103].

Vi trọng lực mô phỏng (SMG) đã được chứng minh là có liên quan đến suy giảm

miễn dịch bằng cách thay đổi biểu hiện của arginase và trong cytokine gây viêm ở

đại thực bào [104].

Khung xương tế bào là mạng lưới các vi sợi và vi ống kéo dài khắp tế bào.

Khung xương tế bào hỗ trợ tế bào, tạo cho nó hình dạng, tổ chức và sắp xếp các bào

quan và có vai trò trong vận chuyển phân tử, phân chia tế bào và tín hiệu tế bào.

Nhiều nghiên cứu cho thấy trong điều kiện vi trọng lực, khung xương tế bào được tổ

chức lại sau một thời gian từ 20 đến 72 giờ, nhưng không phải lúc nào cũng có cùng

cấu hình giống như trước đây [105-109]. Trong tế bào ung thư vú, mạng lưới khung

keratin quanh nhân (perinuclear cytokeratin network) và cấu trúc nhiễm sắc thể trở

nên lỏng lẻo hơn dưới điều kiện vi trọng lực [107]. Năm 1999, một thí nghiệm trên

tế bào thận người trong môi trường vi trọng lực được thực hiện để theo dõi biểu

hiện gene. Người ta phát hiện ra rằng hơn 1.632 gene đã thay đổi biểu hiện bao gồm

những thay đổi lớn trong các yếu tố phiên mã [110]. Một trong những tế bào động

vật có vú phổ biến nhất đã được sử dụng cho các nghiên cứu về vi trọng lực là tế

bào gốc trung mô. Việc sắp xếp lại F-actin và tăng độ cứng của tế bào thực hiện trên

các tế bào gốc trung mô tủy xương ở chuột đã được chứng minh rằng gây ức chế di

chuyển tế bào [62]. Trong nghiên cứu này, các tế bào gốc trung mô cuống rốn ở

người (hucMSC) đã được sử dụng để đánh giá tác động của môi trường vi trọng lực

mô phỏng đối với bộ khung xương tế bào.

31 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

Đề tài được thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh

từ 11/2017 đến 11/2020.

2.1.1. Thiết bị và dụng cụ cần thiết

Các thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong đề tài được liệt kê ở Bảng 2.1 và

Bảng 2.2.

Bảng 2.1. Một số thiết bị chính sử dụng trong đề tài

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất

Tủ ấm 37oC nuôi tế bào

1 Kính hiển vi quang học 2 Máy ly tâm 3 4 Máy Vortex VX100 5 Máy PCR Meiji Hettich Sanyo Labnet Agilent Nhật Đức Nhật Đức Mỹ

6 Thermo Scientific Mỹ

Máy Realtime PCR Piko Thermo Tủ lạnh

Flow cytometer

Sanyo 7 GE Healthcare 8 Nanovue 9 Máy chụp hình tế bào Cytell™ GE Healthcare 10 Hệ thống điện di Western blot GE Healthcare BD Bioscience 11 12 Tủ -80oC Panasonic 13 Tủ -30oC Panasonic Memmert 14 Bể ổn nhiệt Nhật Mỹ Mỹ Mỹ Mỹ Nhật Nhật Đức

15 Promega Mỹ

BD Biosciences Mỹ 16 Máy quang phổ GloMax® Explorer Multimode Microplate Reader Máy BD Accuri C6 flow cytometer

Bảng 2.2. Một số dụng cụ chính sử dụng trong đề tài

STT Tên dụng cụ Hãng sản xuất Nước sản xuất

Beaker (50 ml, 100 ml) Erlen (100 ml, 250 ml)

1 2 3 Ống ly tâm 15 ml

Schott Schott Corning Nychiro Đức Đức Hoa Kỳ Nhật 4

Micropipette (100-1000 μl, 10-100 μl, 5-50 μl) 5 Eppendorf (1500 và 2000 μl) 6 Đầu tip 20 μl, 100 μl, 1000 μl Eppendorf Eppendorf Đức Đức

7 Bình nuôi T25 8 Đĩa 96 giếng 9 Ống đông lạnh

32 Thermo Scientific Mỹ Thermo Scientific Mỹ Mỹ Corning

2.1.2. Môi trường và hóa chất sử dụng

Môi trường và hóa chất được sử dụng trong đề tài được liệt kê ở Bảng 2.3.

Bảng 2.1. Môi trường, hóa chất sử dụng trong đề tài

STT Tên dụng hóa chất Hãng sản xuất Nước sản xuất

Gibco BRL Mỹ 1

Đức 2

Mỹ 3

Kháng sinh (penicillin/ streptomycin) DMEM/Ham’s F-12 with L- Glutamine Phalloidin CruzFluor™ 488 Conjugate Fetal bovine serum (FBS) Đức 4

Trypsin EDTA Đức 5

Đức 6 Phosphate buffered saline (PBS)

7 Hoechst 33342

Capricorn Scientific Santa Cruz Biotechnology Capricorn Scientific Capricorn Scientific Capricorn Scientific Sigma-Aldric Nacalai Tesque Đức Nhật Bản 8

Promega Mỹ 9 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System

10 Cồn

Merk BD Biosciences Đức Mỹ 11 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I

13 12 PCRBIO 1-Step RT-PCR Kit Môi trường đông lạnh HyCryo- STEM

14 Human MSC analysis kit 15 WST-1

PCR Biosystems Mỹ Mỹ GE Healthcare Life Sciences BD Biosciences Roche PCRBiosystem Mỹ Thụy Sĩ Anh 16 2x qPCR SyGreen 1-Step Go Hi-ROX kit

17 Optiblot LDS Sample Buffer Abcam 18 Precast Gel SDS-PAGE 4-12 % Abcam Abcam 19 Optiblot SDS Run Buffer Abcam 20 Màng PVDF Bio-Rad Mỹ Mỹ Mỹ Mỹ Mỹ 21 Giấy lọc Extra Thick Blot Paper

22 Blocking Buffer 23 Kháng thể Western Blot 24 ECL Western Blotting Abcam Abcam Abcam Mỹ Mỹ Mỹ

33

Substrate Kit

Nhật Bản

25 AUTOMATIC X-RAY kit 26 CL-XPosure Film 27 Triton 28 SiR-Tubulin Kit Fujifilm Thermo Scientific Mỹ Mỹ Sigma-Aldrich Mỹ Cytoskeleton

2.1.3. Tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô cuống rốn người (hucMSC) được cung cấp bởi Viện

Sinh học Nhiệt đới. Đây là dòng tế bào đông lạnh đã được phân lập từ mô cuống

rốn và được sử dụng trong nghiên cứu từ lần cấy chuyền thứ hai.

2.1.4. Hệ thống vi trọng lực mô phỏng (clinostat 3D)

Hệ thống máy clinostat 3D tạo môi trường vi trọng lực mô phỏng được thiết

kế và chế tạo trong đề tài: “Nghiên cứu đánh giá sự thay đổi trong cấu trúc bộ

khung tế bào cơ thể sống trong điều kiện mô phỏng trạng thái vi trọng lực

(simulated microgravity)”, thuộc Chương trình Khoa học công nghệ vũ trụ, mã số:

VT-CB.15/18-20 (Hình 2.1).

Hình 2.1. Cấu trúc hệ thống máy clinostat 3D tạo môi trường vi trọng lực mô phỏng

Hệ thống bao gồm khung trong và khung ngoài được nối với 2 motor có thể

điều chỉnh tốc độ riêng biệt. Khung giá đỡ được dùng để cố định 2 khung này và là

nơi đặt bộ điều khiển tốc độ của motor. Mẫu thí nghiệm được đặt vào khung giữ đĩa

34 gắn với khung trong. Trong nghiên cứu này, hệ thống clinostat 3D tạo ra một môi

trường tương tự như môi trường bên ngoài không gian với gia tốc trọng trường 1,3 × 10-3 G bằng cách quay hai khung trong vào ngoài với vận tốc 1 vòng/phút. Điều

này dẫn đến sự phân tán đồng đều của vectơ trọng lực trong một thể tích hình cầu

với vận tốc góc không đổi. Các điều kiện này đã tạo ra một môi trường vi trọng lực với gia tốc 1,3 × 10-3 G và nó được định nghĩa là môi trường vi trọng lực mô phỏng.

Điều kiện vận hành

- Máy clinostat 3D có thể được đặt trong tủ nuôi tế bào động vật có dung tích

từ 160 l trở lên.

- Cần kiểm tra kích thước 3 hướng của tủ nuôi và kích thước của máy clinostat

3D.

- Trong điều kiện tủ nuôi, 2 dây nguồn của hệ thống clinostat 3D sẽ được luồn

qua lỗ bên trên của tủ nuôi đi ra ngoài bộ cấp nguồn điện.

- Cần kiểm tra các ngăn, khay chứa dụng cụ nuôi tế bào như bình nuôi, đĩa

nuôi, đĩa 96 giếng. Kiểm tra khả năng chứa, nâng đỡ của khay nuôi (>15 kg).

- Máy clinostat 3D phải được đặt nằm ngang, chống rung lắc dịch chuyển

- Máy clinostat 3D là máy vận hành quay, 2 khung có thể quay độc lập, nhưng

đã được cố định với các motor.

- Máy clinostat 3D có được sử dụng cho các nghiên cứu vừa mô phỏng 2D

(2D simulation) và mô phỏng 3D (3D simulation). Các đối tượng nghiên cứu

là tế bào, phôi của các loài động vật khác nhau, điều kiện nhiệt độ nuôi cấy,

nồng độ CO2 khác nhau.

Vận hành máy clinostat 3D

- Bật nguồn cấp điện cho máy.

- Bật nút nguồn của 2 hệ thống điều khiển tốc độ motor.

- Kiểm tra sự vận hành của các khung trong và khung ngoài bằng cách thay

đổi tốc độ ở bộ điều khiển.

- Cố định mẫu trên giá đỡ khung trong.

- Đối với các mẫu tế bào, chỉnh tốc độ quay 2 khung là 1 vòng/phút.

- Kiểm tra bọt khí trong các dụng cụ nuôi tế bào.

- Bật nút bộ điều khiển tốc độ để vận hành.

- Sau khi vận hành xong, tắt nút bộ điều khiển tốc độ.

35 - Lấy mẫu ra khỏi máy clinostat 3D.

- Tắt nguồn và vệ sinh máy.

2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu được tóm tắt trong Hình 2.2.

Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu

Tế bào gốc trung mô cuống rốn (hucMSC) được giải đông và cấy chuyền để

tăng sinh khối. Trước khi bắt đầu quá trình thử nghiệm vi trọng lực, hucMSC được

đánh giá các marker (dấu ấn sinh học) biểu thị tính gốc của tế bào gốc trung mô

bằng phương pháp Flow cytometry. Trong thí nghiệm vi trọng lực, hucMSC được

chia làm 2 nhóm: nhóm đối chứng được nuôi trong môi trường trọng lực bình

thường (1 G) và nhóm SMG được nuôi trong môi trường vi trọng lực mô phỏng (~1,3 × 10-3 G). Sự thay đổi ở hucMSC trong môi trường vi trọng lực mô phỏng

được đánh giá bằng cách so sánh các tiêu chí giữa hai nhóm thí nghiệm. Các tiêu

36 chí này bao gồm: sự tăng sinh tế bào, quá trình apoptosis, hình thái tế bào, cấu trúc

khung xương tế bào.

2.2.1. Nuôi cấy tế bào

Trong nội dung này, tế bào gốc trung mô cuống rốn người (hucMSC) được

giải đông và cấy chuyền để tăng sinh khối nhằm cung cấp đủ lượng tế bào cần thiết

cho các thí nghiệm tiếp theo. Tế bào được giải đông thuộc lần cấy chuyền thứ 1, các

tế bào được sử dụng trong nghiên cứu thuộc lần cấy chuyền từ thứ 2 đến thứ 5. Tế

bào sau khi cấy chuyền được lấy ra một phần để đông lạnh và lưu trữ.

2.2.1.1. Phương pháp giải đông

Ống đông lạnh chứa tế bào được lấy ra khỏi bình chứa nitơ lỏng và nhanh

chóng đưa vào bể ổn nhiệt 37°C trong 2 phút. 1 ml môi trường nuôi cấy được cho

vào ống và trộn đều. Hỗn dịch tế bào được ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 5 phút ở

nhiệt độ phòng. Tủa tế bào được thu nhận sau khi loại bỏ huyền phù. Tủa tế bào

được tái huyền phù hóa và chuyển sang bình nuôi T25 chứa 4 ml môi trường nuôi

cấy. Các bình nuôi tế bào được cho vào tủ nuôi ở nhiệt độ 37°C, 5% CO2. Môi

trường sử dụng để nuôi cấy tế bào là DMEM/Ham’s F-12 with L-Glutamine

(DMEM-12-A, Capricorn Scientific, Đức) bổ sung 15% FBS (FBS-HI-22B,

Capricorn Scientific, Đức) và 1% Pen/Strep (15140-122, Gibco, Mỹ).

2.2.1.2. Phương pháp cấy chuyền

Tế bào phát triển đến khoảng 90% diện tích nuôi cấy được cấy chuyền với tỉ

lệ 1:2. Sau khi lấy ra khỏi tủ nuôi, bình nuôi tế bào được loại bỏ môi trường và rửa

3 lần với PBS (PBS-10XA, Capricorn Scientific, Đức). Mỗi bình nuôi tế bào được

xử lý với 1 ml dung dịch Trypsin 0,25% (TRY-2B, Capricorn Scientific, Đức) trong

5 phút ở 37ºC để tách khỏi bề mặt nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy với thể tích tương

ứng được bổ sung vào để bất hoạt Trypsin. Tế bào được thu hoạch và ly tâm với tốc

độ 1500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng để thu tủa tế bào. Tủa tế bào ở

mỗi bình nuôi được tái huyền phù hóa và được chia ra 2 bình nuôi T25 chứa 4 ml

môi trường nuôi cấy. Môi trường sử dụng để nuôi tế bào là DMEM/Ham’s F-12

with L-Glutamine (DMEM-12-A, Capricorn Scientific, Đức) bổ sung 15% FBS

(FBS-HI-22B, Capricorn Scientific, Đức) và 1% Pen/Strep (15140-122, Gibco,

Mỹ). Các bình nuôi tế bào được cho vào tủ nuôi ở nhiệt độ 37°C, 5% CO2.

37

2.2.1.3. Phương pháp đông lạnh

Tủa tế bào sau khi thu hoạch được huyền phù hóa với 500 μl DMEM/Ham’s

F-12 with L-Glutamine (DMEM-12-A, Capricorn Scientific, Đức) và 500 μl môi

trường đông lạnh HyCryo-STEM (SR30002.02, GE Healthcare Life Sciences, Mỹ).

Huyền phù tế bào được chuyển vào ống đông lạnh (430663, Corning, Mỹ) và trữ ở -

20°C trong 1 giờ, sau đó trữ ở -80°C qua đêm và cuối cùng chuyển vào nitơ lỏng để

lưu trữ.

2.2.2. Đánh giá các chỉ thị marker của tế bào gốc trung mô

Sau thời gian lưu trữ đông lạnh, các tế bào gốc có thể mất đi khả năng phân

chia và biệt hóa, do đó, việc đánh giá tính gốc giúp bảo đảm dòng tế bào được

nghiên cứu vẫn giữ nguyên các tính chất của tế bào gốc ban đầu. Các tiêu chuẩn xác

định tế bào gốc trung mô được đanh giá theo đề xuất của Hiệp hội liệu pháp tế bào

quốc tế (International Society for Cellular Therapy – ISCT). Tế bào gốc trung mô

cuống rốn (hucMSC) sau giải đông và cấy chuyền được thu hoạch và đánh giá tính

gốc bằng phương pháp Flow cytometry sử dụng kit Human MSC analysis kit

(562245, BD Biosciences, Mỹ). Bộ kit đánh giá bao gồm:

- PE Mouse Anti-Human CD44

- FITC Mouse Anti-human CD90

- APC Mouse Anti-Human CD73

- PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD105

- PE hMSC Negative Isotype Control Cocktail (mIgG1, κ PE; mIgG2a, κ

PE)

- hMSC Positive Isotype Control Cocktail (mIgG1, κ FITC; mIgG1, κ

APC; mIgG1, κ PerCP-Cy5.5)

- PE hMSC Negative Cocktail (CD34 PE, CD11b PE, CD19 PE, CD45 PE,

HLA-DR PE)

- hMSC Positive Cocktail (CD90 FITC, CD73 APC, CD105 PerCP-Cy5)

hucMSC được tách bằng Trypsin 0,25% (TRY-2B, Capricorn Scientific,

Đức) và thu hoạch như ở phương pháp cấy chuyền. Các tế bào này được huyền phù hóa trong PBS 1X và chia đều vào các ống eppendorf với mật độ 105 tế bào/ống.

Mỗi ống tế bào được ủ lần lượt với 1 µl kháng thể đã liệt kê ở trên trong 30 phút ở

38 nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Mẫu tế bào được phân tích bằng hệ thống máy BD

Accuri C6 flow cytometer (BD Biosciences, Mỹ).

2.2.3. Thử nghiệm vi trọng lực

Đối với bình nuôi T25: Tế bào hucMSC được nuôi trong bình nuôi T-25 (160430, Thermo Scientific, Mỹ) với mật độ 105 tế bào/bình nuôi ở 37ºC, 5% CO2.

Môi trường sử dụng để nuôi tế bào là DMEM/Ham’s F-12 with L-Glutamine

(DMEM-12-A, Capricorn Scientific, Đức) bổ sung 15% FBS (FBS-HI-22B,

Capricorn Scientific, Đức) và 0,5% Pen/Strep (15140-122, Gibco, Mỹ). Sau khi các

tế bào đã bám vào bề mặt bình nuôi, bình nuôi chứa tế bào được đổ đầy môi trường

nuôi cấy (Hình 2.3).

Hình 2.3. Bình nuôi tế bào hucMSC trong thử nghiệm vi trọng lực

Đối với đĩa 96 giếng: Tế bào hucMSC được cấy vào đĩa 96 giếng (161093, Thermo Scientific, Mỹ) với mật độ 2 × 103 tế bào/giếng và nuôi ở 37°C, 5% CO2

đến khi các tế bào đều đã bám lên bề mặt đĩa nuôi. Môi trường sử dụng nuôi tế bào

tương tự như đối với bình nuôi T25. Mỗi giếng tế bào sau đó được đổ đầy môi

trường và phủ parafilm trước khi đậy nắp (Hình 2.4).

Hình 2.4. Đĩa 96 giếng chứa tế bào hucMSC trong thử nghiệm vi trọng lực

39

Tế bào sau đó được chia làm 2 nhóm: nhóm SMG (môi trường vi trọng lực)

và nhóm đối chứng (môi trường bình thường). Đối với nhóm SMG, đĩa/bình nuôi tế

bào được đặt cố định vào khung giữ mẫu của máy clinostat 3D (được đặt trong tủ nuôi) và quay ở chế độ 1,3 × 10-3 G. Tế bào ở nhóm đối chứng được nuôi ở điều

kiện trọng lực bình thường (1 G). Thử nghiệm vi trọng lực được tiến hành trong

vòng 72 giờ. Các mẫu tế bào đều được nuôi trong tủ nuôi ở 37°C có bổ sung 5%

CO2. Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất ba lần.

2.2.4. Đánh giá sự tăng sinh tế bào

2.2.4.1. Đánh giá mật độ tế bào

Phương pháp WST-1 được dùng để đánh giá mức độ tăng sinh của tế bào gốc

trung mô cuống rốn (hucMSC) khi nuôi cấy trong môi trường vi trọng lực. Phương

pháp dựa trên phản ứng đổi màu của muối tetrazolium trong dung dịch WST-1 với

các enzyme dehydrogenase trong ti thể. Khi tế bào tăng sinh mạnh, mức độ hô hấp

càng nhiều dẫn đến lượng enzyme tiết ra môi trường càng lớn, môi trường nuôi

chứa WST-1 sẽ chuyển màu càng đậm.

Sau thử nghiệm vi trọng lực, các giếng nuôi tế bào được rút bỏ môi trường và

rửa với 200 µl PBS 1X mỗi giếng (PBS-10XA, Capricorn Scientific, Đức). 100 µl

môi trường nuôi cấy và 10 µl dung dịch WST-1 (11644807001, Roche, Thụy Sĩ)

được cho vào mỗi giếng nuôi của mỗi nhóm và ủ trong 3,5 giờ ở 37ºC, 5% CO2

(Hình 2.5). Giá trị OD mỗi giếng được đo bởi máy quang phổ GloMax® Explorer

Multimode Microplate Reader (Promega, Mỹ) ở bước sóng 450 nm.

Hình 2.5. Đĩa nuôi hucMSC được sử dụng trong phương pháp WST-1

2.2.4.2. Đánh giá chu kỳ tế bào

Thu hoạch tế bào:

40

Sau thử nghiệm vi trọng lực, các bình nuôi T25 chứa hucMSC được hút bỏ

môi trường và rửa 3 lần với 5 ml PBS 1X (PBS-10XA, Capricorn Scientific, Đức)

cho mỗi lần. Mỗi bình nuôi tế bào được ủ với 1 ml dung dịch Trypsin 0,25% (TRY-

2B, Capricorn Scientific, Đức) trong 5 phút ở 37ºC. Sau đó, 1 ml môi trường được

cho thêm vào bình nuôi tế bào để bất hoạt Trypsin. Tế bào được thu hoạch và ly tâm

với tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ thường để thu tủa tế bào.

Đánh giá tỉ lệ tế bào đi vào các pha trong chu kỳ tế bào:

Hệ thống máy BD Accuri C6 flow cytometer (BD Biosciences, Mỹ) được sử

dụng để phân tích những thay đổi trong chu kỳ của hucMSC khi nuôi trong môi

trường mô phỏng vi trọng lực. hucMSC sau khi thu hoạch được xử lý với FITC

Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, Mỹ) để kết hợp đánh giá tỉ

lệ apoptosis và chu kì tế bào. Eppendorf chứa tế bào được ủ với dung dịch chứa 100

ml Binding Buffer 1X, 5 μl PI và 5 μl FITC trong 25 phút ở nhiệt độ phòng, tránh

ánh sáng. Sau đó, mẫu tế bào được bổ sung thêm 400 μl Binding Buffer 1X và được

phân tích bởi hệ thống máy BD Accuri C6 flow cytometer.

Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào:

RNA tổng của hucMSC được tách bằng kit ReliaPrepTM RNA Cell

Miniprep System (Z6011, Promega, Mỹ). Ống eppendorf chứa tế bào sau khi thu

hoạch được giữ lạnh ở 4ºC và được bổ sung 250 µl dung dịch BL + TG Buffer, hút

lên xuống đều để ly giải tế bào. Sau đó, 85 µl Isopropanol 100% được cho vào ống

tế bào, trộn đều trong 5 giây. Dịch tế bào sau khi ly giải được cho vào cột

Minicolumn có chứa màng lọc và ly tâm với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 30 giây

ở 20ºC. Dịch thải ra qua ống thu được loại bỏ. RNA bám trên màng lọc của cột

Minicolumn được rửa với 500 µl dung dịch RNA Wash Solution bằng cách ly tâm

với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 30 giây. Cột Minicolumn chứa mẫu RNA được ủ

với 30 µl DNase I incubation mix trong 15 phút ở 20ºC, sau đó được rửa với 200 µl

Column Wash Solution và ly tâm với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 15 giây. Cột

chứa mẫu được bổ sung 500 µl RNA Wash Solution và ly tâm với tốc độ 11.000

vòng/phút trong 30 giây, dịch thải qua ống được loại bỏ. Cột Minicolumn được

chuyển sang ống thu mới, được bổ sung 300 µl RNA Wash Solution vào cột và ly

tâm với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 2 phút. Cột Minicolumn tiếp tục được

41 chuyển sang ống eppendorf sạch và được bổ sung 50 µl nước cất Nuclease-Free

Water, ly tâm với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 1 phút để thu RNA. Các mẫu RNA

thu được được trữ trong Nitơ lỏng trước khi tiến hành chạy Realtime qRT-PCR.

Biểu hiện mức độ phiên mã của các gene liên quan đến chu kì tế bào được

đánh giá bằng phương pháp Realtime qRT-PCR. Các gene được đánh giá bao gồm

CDK2, CDK6, Cyclin A. Gene GAPDH được sử dụng để làm đối chứng. Phản ứng

Realtime qRT-PCR được chạy bằng máy Real-Time PCR System (Thermo

Scientific, Mỹ), sử dụng kit 2x qPCR SyGreen 1-Step Go Hi-ROX kit (PB25.32.03,

PCRBiosystem, Anh). Mỗi phản ứng có tổng thể tích là 20 μl bao gồm 1 μl RNA

mẫu, 2 μl mồi xuôi và ngược, 10 μl 2X Mix Hi-ROX, 1 μl RTAsevà 6 μl dH2O.

Chu trình nhiệt của phản ứng như trong Bảng 2.4. Các cặp mồi đặc trưng cho các

gene khảo sát được thể hiện trong Bảng 2.5. Giá trị Ct của mẫu được tính bằng phương pháp 2−ΔΔCt [111].

Phương pháp 2-∆∆Ct (Livak) (Real-time PCR Applications Guide – Biorads)

được áp dụng để đánh giá mức độ biểu hiện tương đối sự biểu hiện gene [111].

Phương pháp này giả định rằng cả gene đích và gene tham chiếu được khuếch đại

với hiệu quả gần 100% và trong phạm vi 5% của mỗi gene. Để xác định sự khác

biệt tương đối trong mức độ biểu hiện của gene đích ở các mẫu khác nhau, phương pháp 2-∆∆Ct được thực hiện theo các bước sau:

- Chuẩn hóa giá trị CT của gene mục tiêu với gene tham khảo cho cả mẫu thí

nghiệm và mẫu hiệu chỉnh:

- CT(tham chiếu, mẫu)

∆CT(mẫu) = CT(mục tiêu, mẫu)

- CT(tham chiếu, chuẩn)

∆CT(chuẩn) = CT(mục tiêu, chuẩn)

- Chuẩn hóa giá trị ∆CT của mẫu thí nghiệm với ∆CT của mẫu chuẩn

∆∆CT = ∆CT(mẫu) - ∆CT(chuẩn)

- Cuối cùng, tỉ lệ biểu hiện được tính theo công thức:

Tỉ lệ biểu hiện = 2-∆∆Ct

Kết quả thu được là sự tăng (hay giảm) theo tỷ lệ của gene đích trong mẫu thí

nghiệm tương quan với mẫu chuẩn và được chuẩn hóa theo sự biểu hiện của gene

tham chiếu. Chuẩn hóa sự biểu hiện của gene đích theo gene tham chiếu bù đắp cho

những khác biệt về lượng tế bào mẫu. Trong nghiên cứu này, gene GAPDH được sử

42 dụng làm gene tham chiếu để đánh giá mức độ biểu hiện của các gene CDK2,

CDK6, Cyclin A.

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene điều hòa

chu kì tế bào

Phản ứng Nhiệt độ Thời gian

Chuyển hóa RNA thành DNA 45ºC 15 phút

Tách mạch 95ºC 2 phút

95ºC 10 giây 40 chu kì 62°C 15 giây

71 chu kì 60°C 30 giây

Trữ mẫu 4°C 30 phút

Bảng 2.5. Trình tự mồi các gene điều hòa chu kì tế bào

Tài liệu tham Gene Trình tự mồi khảo

F: 5’-CCAGGAGTTACTTCTATGCCTGA-3’ CDK2 [112] R: 5’-TTCATCCAGGGGAGGTACAAC-3’

F: 5’-TCTTCATTCACACCGAGTAGTGC-3’ CDK6 [112] R: 5’-TGAGGTTAGAGCCATCTGGAAA-3’

F: 5’-GCCATTAGTTTACCTGGACCCAGA-3’ Cyclin A [113] R: 5’-CACTGACATGGAAGACAGGAACCT-3’

F: 5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’ GAPDH [114] R: 5’-AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’

Đánh giá biểu hiện mức dịch mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào:

Trong nội dung nghiên cứu này, mức độ biểu hiện của các protein liên quan

đến chu kì tế bào bao gồm Cyclin A1+A2, CDK4, CDK6 được đánh giá bằng

43 phương pháp Western Blot. Protein GAPDH được sử dụng làm đối chứng. Các

bước thực hiện bao gồm: ly giải protein, điện di SDS-PAGE, chuyển màng PVDF,

khóa màng, ủ kháng thể sơ cấp, ủ kháng thể thứ cấp, hiện phim.

hucMSC sau khi thu hoạch được ly giải bằng Optiblot LDS Sample Buffer

(ab119196, Abcam, Mỹ) ở bể ổn nhiệt 70°C trong 10 phút. Protein thu được từ các

mẫu được chuyển với lượng bằng nhau vào các giếng của gel Precast Gel SDS-

PAGE 4-12% (ab139596, Abcam, Mỹ) và được điện di trong Optiblot SDS Run

Buffer (ab119197, Abcam, Mỹ) trong 2 giờ ở 50 V. Bể điện di được giữ lạnh bằng

đá gel để tránh sự thoái hóa protein. Protein đã được phân tách trong Precast Gel

SDS-PAGE được chuyển lên màng PVDF (ab133411, Abcam, Mỹ), được kẹp bởi

một lớp giấy lọc Extra Thick Blot Paper (1703966, Bio-Rad, Mỹ) và một lớp bọt

biển ở mỗi bên và đặt cố định vào cassette (Hình 2.6). Cassette này được đặt vào bể

điện di chứa buffer TBST sao cho mặt gel nằm ở phía cực âm (cathode) và màng

PVDF nằm phía cực dương (anode)và được điện di trong 2 giờ ở 50 V.

Hình 2.6. Phương pháp chuyển màng PVDF

44

Màng PVDF sau đó được khóa màng qua đêm ở 4ºC trong Blocking Buffer

(ab126587, Abcam, Mỹ). Màng PVDF này tiếp tục được ủ với kháng thể sơ cấp

trong Blocking Buffer qua đêm ở 4ºC. Các kháng thể được sử dụng bao gồm: Anti-

Cyclin A1 + Cyclin A2 antibody (ab185619, Abcam, Mỹ), Anti-CDK4 antibody

(ab137675, Abcam, Mỹ)và Anti-CDK6 antibody (ab124821, Abcam, Mỹ) được pha

loãng với tỉ lệ 1:5000; kháng thể Anti-GAPDH antibody (ab181602, Abcam, Mỹ)

cho protein GAPDH được pha loãng với tỉ lệ 1:5000. Sau khi ủ qua kháng thể sơ

cấp, màng PVDF được rửa 3 lần, mỗi lần 10 phút với dung dịch TBST. Màng này

sau đó được ủ với kháng thể thứ cấp Goat Anti-Rabbit IgG (HRP) (ab6721, Abcam,

Mỹ) trong Blocking Buffer ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.

Các vạch protein được hiển thị bằng ECL Western Blotting Substrate Kit

(ab65623, Abcam, Mỹ). Màng PVDF được cố định trên cassette. Dung dịch A và B

được trộn đều với tỉ lệ 1:1 và nhỏ trực tiếp lên màng PVDF với thể tích 0,125 ml/cm2 diện tích màng. Màng được ủ trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch hiển

thị ECL được hút bỏ trước khi tiến hành quá trình hiện phim.

Kết quả Western Blot trong nghiên cứu này được hiển thị bằng phương pháp

hiện phim sử dụng kit AUTOMATIC X-RAY (873498, Fujifilm, Nhật Bản). Quá

trình hiện phim được thao tác trong phòng tối. Tấm phim CL-XPosure Film (34090,

Thermo Scientific, Mỹ) được đặt lên màng PVDF và ủ trong 1 phút. Sau đó, phim

được nhúng vào dung dịch Develope trong 15 giây và chuyển qua dung dịch Fixing

trong 15 giây. Cuối cùng, phim được rửa bằng nước cất trong 30 giây. Các vạch

protein phát huỳnh quang trên màng PVDF được hiển thị âm bản trên phim. Phần

mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) được dùng để đo cường

độ của các vạch protein trong kết quả hiện phim [115].

2.2.5. Đánh giá quá trình apoptosis

2.2.5.1. Thu hoạch tế bào

Quá trình thu hoạch tế bào được thực hiện như ở Mục 2.2.4.2. Đánh giá chu

kỳ tế bào, phần Thu hoạch tế bào.

2.2.5.2. Đánh giá tỉ lệ apoptosis

45

Tế bào hucMSC sau khi thu hoạch được xử lý với FITC Annexin V

Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, Mỹ) để đánh giá tỉ lệ apoptosis.

Eppendorf chứa tế bào được ủ với dung dịch chứa 100 ml Binding Buffer 1X, 5 μl

PI và 5 μl FITC trong 25 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau đó, mẫu tế bào

được bổ sung thêm 400 μl Binding Buffer 1X và được phân tích bởi hệ thống máy

BD Accuri C6 flow cytomete (BD Biosciences, Mỹ). Những tế bào đang trong quá

trình apoptosis sẽ được thể hiện bằng tỉ lệ các tế bào dương tính với Annexin- V-

FITC và các tế bào dương tính với PI.

2.2.5.3. Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis

Biểu hiện mức độ phiên mã của các gene liên quan đến apoptosis được đánh

giá bằng phương pháp Realtime qRT-PCR. Các gene được đánh giá bao gồm Bax

và Bcl-2. Gene GAPDH được sử dụng để làm đối chứng. Quá trình thực hiện thí

nghiệm tương tự như ở Mục 2.2.4.2. Đánh giá chu kỳ tế bào, phần Đánh giá biểu

hiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào. Chu trình nhiệt của phản ứng

như trong Bảng 2.6. Các cặp mồi đặc trưng cho các gene khảo sát được thể hiện trong Bảng 2.7. Giá trị Ct của mẫu được tính bằng phương pháp 2−ΔΔCt [111].

Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene liên quan

đến apoptosis

Phản ứng Nhiệt độ Thời gian

Chuyển hóa RNA thành DNA 45ºC 15 phút

Tách mạch 95ºC 2 phút

95ºC 10 giây 40 chu kì 52,2°C 15 giây

71 chu kì 60°C 15 giây

Trữ mẫu 4°C 30 phút

Bảng 2.7. Trình tự mồi các gene liên quan đến sự apoptosis

Gene Trình tự mồi Tài liệu

46

tham khảo

F: 5’-CCAGGAGTTACTTCTATGCCTGA-3’ Bax [112] R: 5’-TTCATCCAGGGGAGGTACAAC-3’

F: 5’-TCTTCATTCACACCGAGTAGTGC-3’ Bcl-2 [112] R: 5’-TGAGGTTAGAGCCATCTGGAAA-3’

F: 5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’ GAPDH [114] R: 5’-AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’

2.2.6. Đánh giá sự thay đổi hình thái nhân và tế bào chất

2.2.6.1. Thu hoạch và cố định tế bào

Sau thử nghiệm vi trọng lực, các đĩa 96 giếng chứa tế bào hucMSC được rút

bỏ môi trường và rửa 3 lần với PBS. Mỗi giếng tế bào được rửa 3 lần với 100 µl

PBS (PBS-10XA, Capricorn Scientific, Đức). 50 µl 4% Paraformaldehyde

Phosphate Buffer Solution (09154-85, Nacalai Tesque, Nhật Bản) được cho vào

mỗi giếng tế bào và ủ trong 15 phút. Mỗi giếng tế bào được rửa 3 lần với PBS (100

µl/lần). Sau đó, 50 µl Triton 0,1% (X100, Sigma-Aldrich, Mỹ) được bổ sung vào

mỗi giếng và ủ trong 1 giờ.

2.2.6.2. Đánh giá sự thay đổi hình thái nhân

Nhân tế bào được nhuộm bằng Hoechst 33342 (14533, Sigma-Aldrich, Mỹ)

với thể tích 30 µl/giếng trong 15 phút. Quá trình nhuộm huỳnh quang được thực

hiện ở nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng. Tế bào sau đó được rửa lại 3 lần với PBS

và quan sát dưới hệ thống kính hiển vi huỳnh quang Cytell (GE Healthcare, Mỹ).

Ứng dụng Cell Cycle App được sử dụng để đánh giá hình thái nhân, bao gồm diện

tích, cường độ và giá trị hình dạng nhân (nuclear shape value) [116].

2.2.6.3. Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào chất

Phần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) được dùng

để đánh giá diện tích tế bào. Ảnh chụp tế bào từ hệ thống Cytell được chuyển đổi

sang dạng 8-bit và thiết lập các thông số theo một ngưỡng chung để loại bỏ độ sáng

nền trước khi tính toán [116].

47

Những thay đổi về mặt hình thái của hucMSC trong điều kiện vi trọng lực

mô phỏng cũng được đánh giá bằng phương pháp flow cytometry thông qua kết quả

đo chỉ số FSC (Forward Scatter). Khi dòng tế bào đi qua nguồn laser trong máy

flow cytometer, chúng sẽ tán xạ lại ánh sáng. Sự tán xạ này được đo bằng hai cảm

biến quang học. Một cảm biến đo sự phân tán dọc theo đường đi của tia laser và cho

ra chỉ số FSC. Chỉ số này được tính toán bằng cách chuyển đổi cường độ ánh sáng

phát ra thành tín hiệu điện. Phép đo FSC cho phép phân biệt các tế bào theo kích

thước do cường độ FSC tỷ lệ với đường kính của tế bào. Trong nghiên cứu này, các

tế bào hucMSC được nhuộm với PI và đo chỉ số FSC bằng hệ thống BD Accuri C6

flow cytomete (BD Biosciences, Mỹ). Giá trị FSC từ nhóm đối chứng và nhóm

SMG được so sánh với nhau để đánh giá sự khác biệt về kích thước tế bào ở hai

nhóm thí nghiệm.

2.2.7. Đánh giá sự thay đổi cấu trúc khung xương tế bào

2.2.7.1. Thu hoạch tế bào

Quá trình thu hoạch tế bào được thực hiện như ở Mục 2.2.4.2. Đánh giá chu

kỳ tế bào, phần Thu hoạch tế bào.

2.2.7.2. Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi

Biểu hiện mức độ phiên mã của các gene mã hóa cho bộ khung xương tế bào

được đánh giá bằng phương pháp Realtime qRT-PCR. Các gene được đánh giá bao

gồm α-tubulin 3 và β-actin. Gene GAPDH được sử dụng để làm đối chứng. Quá

trình thực hiện thí nghiệm tương tự như ở Mục 2.2.4.2. Đánh giá chu kỳ tế bào,

phần Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào. Chu trình

nhiệt của phản ứng như trong Bảng 2.8. Các cặp mồi đặc trưng cho các gene khảo

sát được thể hiện trong Bảng 2.9. Giá trị Ct của mẫu được tính bằng phương pháp 2−ΔΔCt [111].

Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene mã hóa

khung xương tế bào

Phản ứng Nhiệt độ Thời gian

Chuyển hóa RNA thành DNA 45ºC 15 phút

48

Tách mạch 95ºC 2 phút

95ºC 10 giây 40 chu kì 60°C 15 giây

71 chu kì 60°C 15 giây

Trữ mẫu 4°C 30 phút

Bảng 2.9. Trình tự mồi các gene mã hóa khung xương tế bào

Gene Trình tự mồi Tài liệu tham khảo

F: 5’-CATTGAAAAGTTGTGGTCTGATCA-3’ α-tubulin 3 [117] R: 5’-GCTTGGGTCTGTAACAAAGCAT-3’

F: 5’-GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3’ [118] β-actin R: 5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3’

F: 5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’ [114] GAPDH R: 5’-AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’

2.2.7.3. Đánh giá biểu hiện mức dịch mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi

Trong nội dung nghiên cứu này, mức độ biểu hiện của các protein cấu trúc

khung xương tế bào là α-tubulin và β-actin được đánh giá bằng phương pháp

Western Blot. Protein GAPDH được sử dụng làm đối chứng. Các bước thực hiện thí

nghiệm tương tự như ở Mục 2.2.4.2. Đánh giá chu kỳ tế bào, phần Đánh giá biểu

hiện mức dịch mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào. Các kháng thể được sử dụng bao

gồm:

- Kháng thể sơ cấp: Anti-beta Actin antibody (ab8226, Abcam, Mỹ) và Anti-

alpha Tubulin antibody (ab52866, Abcam, Mỹ) được pha loãng với tỉ lệ

1:1000; Anti-GAPDH antibody (ab181602, Abcam, Mỹ) được pha loãng với

tỉ lệ 1:5000.

- Kháng thể thứ cấp: Goat Anti-Rabbit IgG (HRP) (ab6721, Abcam, Mỹ) và

Goat Anti-Mouse IgG (HRP) (ab6789, Abcam, Mỹ)

49 2.2.7.4. Đánh giá sự tái cấu trúc bộ khung vi ống, vi sợi trong tế bào

Nhuộm huỳnh quang vi ống: SiR-Tubulin Kit (CY-SC002, Cytoskeleton,

Inc., Mỹ) được sử dụng để nhuộm vi ống. Dung dịch này là phức hợp của chất

nhuộm huỳnh quang fluorophore silicon rhodamine (SiR) và chất liên kết với vi ống

Docetaxel. Sir-tubulin cho phép thực hiện trên tế bào sống với độ đặc hiệu và độ

tương phản với nền cao. Chuẩn bị 1mM dung dịch nhuộm Sir-Tubulin bằng cách

hòa tan toàn bộ Sir-Tubulin dạng bột trong ống kit với 50µL DMSO. Dung dịch này

sau đó được bảo quản ở -20°C trước khi sử dụng. Tế bào gốc trung mô được nuôi trong đĩa 96 giếng với mật độ 103 tế bào/giếng. Quá trình nhuộm vi ống được tiến

hành cùng lúc với thử nghiệm vi trọng lực. Dung dịch SiR-tubulin và verapamil

được pha trong môi trường nuôi cấy với tỉ lệ 1:1:1000. Mỗi giếng tế bào được bổ

sung 395 µl môi trường nuôi cấy chứa thuốc nhuộm sao cho nồng độ cuối cùng

trong mỗi giếng là 50 nM. Các giếng nuôi tế bào sau đó được phủ bằng màng

parafilm trước khi đậy nắp. Quá trình thử nghiệm vi trọng lực được tiến hành trong

72 giờ. Sau 72 giờ, các đĩa nuôi được rút bỏ môi trường, rửa với PBS và được quan

sát dưới hệ thống hiển vi huỳnh quang Cytell (GE Healthcare, Mỹ).

Nhuộm huỳnh quang vi sợi và nhân: Tế bào hucMSC được nuôi trong đĩa 96 giếng với mật độ 103 tế bào/giếng. Sau thử nghiệm vi trọng lực, đĩa tế bào được rút

bỏ môi trường nuôi cấy. Mỗi giếng tế bào được rửa 3 lần với 100 µl PBS (PBS-

10XA, Capricorn Scientific, Đức). 50 µl 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer

Solution (09154-85, Nacalai Tesque, Nhật Bản) được cho vào mỗi giếng tế bào và ủ

trong 15 phút. Mỗi giếng tế bào được rửa 3 lần với PBS (100 µl/lần). Sau đó, 50 µl

Triton 0.1% (X100, Sigma-Aldrich, Mỹ) được bổ sung vào mỗi giếng và ủ trong 1

giờ. Vi sợi actin được nhuộm với Phalloidin CruzFluor™ 488 Conjugate (sc-

363791, Santa Cruz Biotechnology, Mỹ) với thể tích 30 µl/giếng trong 1 giờ. Tế

bào sau đó được rửa 3 lần với PBS và tiếp tục nhuộm nhân. Nhân tế bào được

nhuộm bằng Hoechst 33342 (14533, Sigma-Aldrich, Mỹ) với thể tích 30 µl/giếng

trong 15 phút. Quá trình nhuộm huỳnh quang được thực hiện ở nhiệt độ phòng và

tránh ánh sáng. Tế bào sau đó được rửa lại 3 lần với PBS và quan sát dưới hệ thống

kính hiển vi huỳnh quang Cytell (GE Healthcare, Mỹ).

Đánh giá mật độ vi sợi, vi ống: Mật độ các bó vi sợi, vi ống trong tế bào

được đánh giá bằng cách đo cường độ phát huỳnh quang của protein trong các bó

50 sợi này. Ảnh chụp huỳnh quang của hucMSC sau khi nhuộm được phân tích bằng

phần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ). Hình ảnh được

chuyển đổi sang dạng 8 bit và sử dụng một ngưỡng chung cho tất cả các hình để

loại bỏ sự chênh lệch phông nền trước khi diện tích tế bào và cường độ phát huỳnh

quang của vi ống và vi sợi actin được đo [116].

2.2.8. Phương pháp thống kê

Phần mềm Sigma Plot (SYSTAT Software, Mỹ) được dùng để phân tích số

liệu trong nghiên cứu. Phương pháp One-way ANOVA được sử dụng để đánh giá

sự khác biệt giữa các nhóm thí nghiệm, trong đó p ≤ 0,05, p ≤ 0,01, p ≤ 0,001 được

xem là các khác biệt có ý nghĩa thống kê.

51 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đánh giá các chỉ thị marker của tế bào gốc trung mô

Biểu hiện của các marker âm tính và dương tính cho tế bào gốc trung mô

được thể hiện ở Hình 3.1. Kết quả phân tích flow cytometry cho thấy tế bào

hucMSC được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện dương tính với các marker đặc

trưng cho tế bào gốc trung mô là CD90, CD73 và CD105. (Hình 3.1B2-B4) và biểu

hiện âm tính với các marker không đặc trưng cho dòng tế bào này trong PE hMSC

Negative Cocktail, bao gồm CD34, CD11B, CD19, CD45và HLA-DR (Hình 3.1

B1). Việc âm tính với các marker CD34, CD45, CD19 chứng tỏ quần thể tế bào

hucMSC không nhiễm các tế bào tiền thân tạo máu, tế bào nội mô hay tế bào bạch

cầu [119].

Hình 3.1. Đánh giá biểu hiện marker ở hucMSC. A1: Nhuộm với PE hMSC

Negative Isotype Control Cocktail (mIgG1, κ PE; mIgG2a, κ PE). A2-A4: hMSC

Positive Isotype Control Cocktail (mIgG1, κ FITC; mIgG1, κ APC; mIgG1, κ

PerCP-Cy5.5). B1: hucMSC biểu hiện âm tính với PE hMSC Negative Cocktail

(CD34 PE, CD11b PE, CD19 PE, CD45 PE, HLA-DR PE). B2-B4: hucMSC biểu

hiện dương tính với các marker đặc trưng cho hMSC (CD90, CD73, CD105).

Hơn nữa, sự âm tính với marker CD19 cho thấy tế bào B và tế bào tua

(dendritic cells) không tồn tại trong quần thể tế bào hucMSC trên. Ngoài ra, sự âm

tính với marker HAL-DR và CD11B chứng tỏ không tồn tại tế bào bạch cầu hay đại

52 thực bào trong quần thể tế bào hucMSC [120, 121]. Các kết quả phân tích trên

chứng tỏ quần thể tế bào hucMSC sử dụng trong nghiên cứu vẫn giữ được các đặc

tính của tế bào gốc trung mô.

3.2. Đánh giá sự tăng sinh tế bào

3.2.1. Sự thay đổi mật độ tế bào

Mật độ quang của hucMSC trong hai nhóm thí nghiệm được tính toán và thể

hiện ở Hình 3.2. Theo đó, mật độ quang trung bình ở nhóm thử nghiệm vi trọng lực

(SMG) là 0,97 ± 0,05, thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng là 1,09 ± 0,13 (p ≤

0,001). Điều này cho thấy mức độ tăng sinh của hucMSC giảm khi nuôi cấy trong

môi trường vi trọng lực mô phỏng.

Hình 3.2. Mật độ quang của hucMSC qua đánh giá bằng phương pháp WST-1. A:

Biểu đồ mật độ quang. B: hucMSC trong điều kiện bình thường. C: hucMSC trong

điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG). ***: p ≤ 0,001. Thước đo: 111,82 μm

Những ảnh hưởng của lực hấp dẫn đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu

trước đây, bao gồm mô tả sự thay đổi về mặt hình thái hoặc xác định các đặc tính

của tế bào [25, 28, 122, 123]. Một số dòng tế bào như tế bào mỡ, bạch cầu đơn

nhân, nguyên bào xương người, tế bào gốc phôi chuột, tế bào gốc trung mô chuột đã

được sử dụng làm mô hình cho các nghiên cứu vi trọng lực mô phỏng trong các

nghiên cứu của Yuge và cộng sự năm 2003, Huang và cộng sự năm 2009,

Kawahara và cộng sự năm 2009, Meloni và cộng sự năm 2011 [124-127].

53

Sự sinh trưởng của tế bào được thể hiện qua quá trình tăng sinh, ở đó tế bào

gia tăng về số lượng. Đây là quá trình tất yếu và diễn ra thường xuyên trong cơ thể

sinh vật. Vi trọng lực mô phỏng đã được chứng minh là làm giảm sự tăng sinh của

một số loại tế bào. Vào năm 2004, nhóm nghiên cứu của Plett đã quan sát thấy tế

bào tiền thân tạo máu ở người giảm phân chia khi chịu ảnh hưởng của môi trường vi

trọng lực tạo ra từ buồng xoay tế bào (RWV) trong thời gian dài [61]. Đến năm

2014, Benavides Damm và cộng sự đã sử dụng máy định vị vị trí ngẫu nhiên (RPM)

tạo môi trường vi trọng lực mô phỏng để thử nghiệm lên nguyên bào cơ vân chuột

và nhận thấy dòng tế bào bi ức chế tăng sinh khi nuôi cấy trong môi trường vi trọng

lực mô phỏng [38]. Nghiên cứu của Yan và cộng sự năm 2015 sử dụng clinostat 2D

đã chứng mình tế bào gốc trung mô tủy xương ở chuột giảm tăng sinh trong môi

trường vi trọng lực mô phỏng [24]. Các nghiên cứu gần đây của Tan năm 2018 trên

tế bào hắc tố melanoma và Touchstone năm 2019 trên tế bào gốc trung mô chuột, sử

dụng các hệ thống RMP và clinostat 2-D đều cho thấy sự giảm tăng sinh của các

dòng tế bào này trong môi trường vi trọng lực mô phỏng [22, 63].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng mật độ tế bào gốc trung mô cuống

rốn ở người (hucMSC) trong nhóm thử nghiệm vi trọng lực mô phỏng (SMG) thấp

hơn nhóm đối chứng sau 3 ngày nuôi cấy. Điều này đã chứng minh rằng các điều

kiện vi trọng lực mô phỏng đã làm giảm sự tăng trưởng của tế bào hucMSC. Kết

quả này tương đồng với các kết quả nghiên cứu đã đề cập ở trên. Tuy nhiên, cơ chế

của sự giảm tăng sinh này chưa được mô tả rõ ràng, nhất là trên dòng tế bào gốc

trung mô cuống rốn. Các đánh giá về chu kỳ tế bào, sự chết theo chương trình và sự

thay đổi bộ cấu trúc khung xương tế bào ở hucMSC được trình bày ở phần kết quả

tiếp theo sẽ góp phần làm rõ hơn cơ chế này.

3.2.2. Sự thay đổi chu kỳ tế bào

3.2.2.1. Tỉ lệ các pha trong chu kỳ tế bào

Kết quả phân tích chu kỳ tế bào ở Hình 3.3 cho thấy một sự thay đổi rõ nét

giữa tỉ lệ đi vào các pha của hucMSC trong điều kiện trọng lực bình thường và vi

trọng lực mô phỏng. Qua đó, tỷ lệ tế bào hucMSC bước vào pha nghỉ G0/G1 ở

nhóm nuôi cấy dưới điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG) là 85,65 ± 0,65% cao

hơn rõ rệt so với nhóm đối chứng là 72,27 ± 1,28%. Đồng thời, tỉ lệ hucMSC đi vào

54 pha phân chia G2/M ở nhóm SMG cũng giảm so với ở nhóm đối chứng (5,65 ±

0,05% ở nhóm SMG và 22,10 ± 1,27% ở nhóm đối chứng). Những khác biệt này

đều có ý nghĩa thống kê khi phân tích bằng One-way ANOVA với p ≤ 0,01. Dữ liệu

này cho thấy rằng vi trọng lực mô phỏng có thể làm giảm quá trình phân chia và có

xu hướng tạo ra giai đoạn bắt giữ chu kỳ tế bào.

Hình 3.3. Chu kì tế bào hucMSC qua phân tích flow cytometry

3.2.2.2. Biểu hiện mức độ phiên mã các gene điều hòa chu kì tế bào

Biểu hiện mRNA của các gene CDK2, CDK6, Cyclin A của tế bào gốc trung

mô cuống rốn (hucMSC) được mô tả trong Hình 3.4.

Hình 3.4. Biểu hiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào bằng phương

pháp Realtime qRT-PCR. ***: p ≤ 0,001; *: p ≤ 0,05

55

Khi nuôi cấy trong môi trường vi trọng lực mô phỏng, biểu hiện của các gene

này đều có sự giảm xuống mang ý nghĩa thống kê. CDK2 ở nhóm vi trọng lực

(SMG) có biểu hiện giảm mạnh còn 0,59 ± 0,07 so với nhóm đối chứng là 1,01 ±

0,13 (p ≤ 0,001). CDK6 giảm biểu hiện nhẹ hơn khi mức độ biểu hiện ở nhóm SMG

là 0,68 ± 0,05 so với đối chứng là 1,00 ± 0,14 (p ≤ 0,01). Cyclin A có mức độ hiểu

hiện giảm nhẹ nhất trong ba gene với mức độ biểu hiện ở nhóm SMG là 0,83 ± 0,09

và ở nhóm đối chứng là 1,00 ± 0,09 (p ≤ 0,05).

3.2.2.3. Biểu hiện mức độ dịch mã các gene điều hòa chu kì tế bào

Biểu hiện các protein Cyclin A1+A2, CDK4 và CDK6 ở hucMSC đều có xu

hướng giảm khi nuôi cấy trong môi trường vi trọng lực mô phỏng (Hình 3.5).

Cyclin A1+A2 có mức độ biểu hiện giảm rõ nét nhất khi tỉ lệ biểu hiện ở nhóm vi

trọng lực (SMG) là 0,34 ± 0,04, bằng một phần ba tỉ lệ biểu hiện ở nhóm đối chứng

là 1,00 ± 0,07 (p ≤ 0,001). Mức độ biểu hiện CDK4 và CDK6 ở nhóm SMG lần lượt

là 0,79 ± 0,01 và 0,82 ± 0,01, giảm nhẹ so với nhóm đối chứng (1,00 ± 0,06 ở

CDK4 và 1,00 ± 0,10 ở CDK6).

Hình 3.5. Biểu hiện mức dịch mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào bằng phương

pháp Western Blot. ***: p ≤ 0,001; **: p ≤ 0,01; *: p ≤ 0,05

56

Sự sinh trưởng của tế bào gắn liền với chu kỳ tế bào. Một chu kỳ của tế bào

bao gồm bốn giai đoạn cơ bản: pha G0/G1 (pha nghỉ), pha S (tổng hợp DNA), pha

G2 (giai đoạn tổng hợp protein và chuẩn bị cho nguyên phân) và pha M (nguyên

phân). Kết quả phân tích chu kỳ tế bào cho thấy tỷ lệ các tế bào hucMSC đi vào pha

G0/G1 ở nhóm SMG cao hơn nhóm đối chứng, điều này cho thấy điều kiện vi trọng

lực mô phỏng đã thúc đẩy hucMSC bước vào giai đoạn bắt giữ (arrest phase) trong

chu kỳ tế bào. Ngoài ra, tỷ lệ hucMSC ở pha G2/M của nhóm SMG nhỏ hơn so với

nhóm đối chứng cũng cho thấy điều kiện vi trọng lực mô phỏng gây ra sự giảm quá

trình phân chia tế bào của hucMSC.

Cyclins và CDKs (cyclin-dependent kinases) là hai nhóm phân tử đóng vai

trò chính trong việc điều hòa chu kỳ tế bào [128]. Cyclin là những protein mang

chức năng điều hòa, trong khi đó CDK là những ezyme xúc tác. Trong các giai đoạn

của chu kỳ tế bào, Cyclins kích hoạt CDKs tạo ra phản ứng phosphoryl hóa nhằm

kích hoạt hoặc bất hoạt các protein mục tiêu để điều phối diễn tiến của chu kỳ tế

bào [129].

Cyclin A là một protein nắm vai trò khá quan trọng nhờ khả năng tác động

đến nhiều giai đoạn trong chu kỳ tế bào [130]. Cyclin A có thể gắn kết và kích hoạt

cả hai loại CDK riêng biệt là CDK1 và CDK2 [131]. Liên kết giữa Cyclin A và

CDK1 cần thiết cho quá trình chuyển giao từ pha G2 sang pha M trong khi đó liên

kết giữa Cyclin A và CDK2 kích hoạt tế bào đi vào pha S [132-135]. Cyclin A ở

người bao gồm hai loại là Cyclin A1, thường biểu hiện ở các tế bào gốc phôi và

Cyclin A2, biểu hiện trong các tế bào soma [130, 132, 133]. Kết quả đánh giá biểu

hiện mRNA và biểu hiện protein bằng Western Blot của Cyclin A đều cho thấy

protein này giảm biểu hiện trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng. Điều này phù

hợp với kết quả flow cytometry trong đó tỉ lệ hucMSC đi vào pha G2/M ở nhóm

SMG thấp hơn hẳn so với nhóm đối chứng.

CDK2 là enzyme đóng vai trò thiết yếu trong quá trình tổng hợp DNA của

chu kỳ tế bào [136, 137]. Ngoài liên kết với Cyclin A, CDK2 còn có thể gắn với

Cyclin E và kích hoạt quá trình chuyển giao từ pha G1 sang pha S [138]. Trong

nghiên cứu này, biểu hiện mRNA thông qua kết quả Realtime qRT-PCR của CDK2

ở nhóm SMG thấp hơn nhóm đối chứng. Đồng thời, kết quả flow cytometry đánh

57 giá chu kỳ tế bào lại cho thấy tỉ lệ tế bào hucMSC ở nhóm SMG trong pha G0/G1

tăng trong khi pha S gần như không đổi. Điều này cho thấy sự giảm biểu hiện của

CDK2 làm giảm tỉ lệ hucMSC bắt đầu quá trình chuyển giao từ pha G1 sang pha S

hơn là giảm tỉ lệ hucMSC đang đi vào pha S.

CDK6 là một thành viên thuộc họ CDKs, đóng vai trò quan trọng trong quá

trình tiến triển pha G1 và chuyển giao pha S/G1 [139, 140]. Trong chu kỳ tế bào,

CDK4 và CDK6 kết hợp với Cyclin D để tạo ra các phức hợp thúc đẩy quá trình

chuyển từ pha G1 sang pha S [141]. Sự chuyển đổi này đóng một vai trò quan trọng

trong việc kiểm soát sự tăng sinh tế bào [142]. Ức chế CDK4/6 gây ra sự suy giảm

tăng sinh tế bào [143-145]. Kết quả Western Blot cho thấy biểu hiện protein của

CDK4 và CDK6 ở hucMSC giảm trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng. Đồng thời,

biểu hiện mRNA của CDK6 của nhóm thử nghiệm vi trọng lực (SMG) cũng thấp

hơn so với nhóm đối chứng. So sánh với kết quả flow cytometry, có thể suy ra rằng

sự giảm biểu hiện của hai protein này ở nhóm vi trọng lực mô phỏng đã dẫn đến sự

gia tăng tỉ lệ tế bào hucMSC đi vào pha G0/G1.

Ảnh hưởng của điều kiện vi trọng lực lên chu kỳ tế bào hiện vẫn chưa được

nghiên cứu nhiều, đặc biệt là các nghiên cứu thực hiện trên máy clinostat 3D. Một

nghiên cứu thực hiện trên hệ thống RPM của Sokolovskaya và cộng sự năm 2014

trên dòng tế bào nội mô người cho thấy điều kiện vi trọng lực mô phỏng làm tăng tỉ

lệ tế bào đi vào pha G0/G1 và giảm lượng tế bào đi vào pha S [37]. Nghiên cứu

thực hiện trong buồng quay tế bào (RWV) của Maier trên tế bào bạch cầu đơn nhân

U937 ở người cho thấy tế bào U937 không gia tăng mức độ apoptosis mà phát triển

chậm hơn so với điều kiện bình thường [146].

Nghiên cứu hiện tại trên dòng tế bào hucMSC cũng cho ra kết quả tương tự

khi tỉ lệ tế bào đi vào pha G0/G1 tăng và tỉ lệ tế bào ở pha G2/M giảm ở nhóm SMG

so với ở điều kiện bình thường, dẫn đến mức độ tăng sinh của hucMSC giảm trong

môi trường vi trọng lực mô phỏng. Tuy nhiên, thời gian thử nghiệm và đặc trưng

của dòng tế bào cũng là nhân tố tác động đến sự sinh trưởng và chu kỳ tế bào. Do

đó, cần có các nghiên cứu thực hiện trên nhiều dòng tế bào khác nhau với các mức

thời gian, cũng như điều kiện vi trọng lực khác nhau để làm rõ hơn cơ chế tác động

của vi trọng lực lên tế bào của sinh vật.

58

3.3. Đánh giá quá trình apoptosis

3.3.1. Tỉ lệ apoptosis

Phân tích flow cytometry chỉ ra rằng không có sự khác biệt mang ý nghĩa

thống kê về tỷ lệ sống của các tế bào gốc trung mô cuống rốn (hucMSC) từ nhóm

đối chứng (93,20 ± 0,35%) và nhóm vi trọng lực (SMG) (92,85 ± 1,15%) (Hình

3.6). Tổng tỷ lệ apoptosis (apoptosis sớm và apoptosis muộn) của các MSC từ nhóm

SMG cũng tương tự như đối chứng.

Hình 3.6. Tỉ lệ tế bào sống và apoptosis ở hucMSC qua phân tích flow cytometry sử

dụng phương pháp nhuộm FITC Annexin V

3.3.2. Biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis

Phương pháp Realtime qRT-PCR được sử dụng để ước tính biểu hiện phiên

mã của hai gene Bcl-2 và Bax của hucMSC. Kết quả từ Hình 3.7 chỉ ra rằng không

có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về biểu hiện mRNA của Bcl-2 và Bax ở

hucMSC giữa nhóm đối chứng và nhóm vi trọng lực (SMG).

Đã có nhiều nghiên cứu cho rằng sự chết tế bào không làm giảm mức độ tăng

sinh của tế bào trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng [22, 60, 38]. Nghiên cứu của

Plett và cộng sự năm 2004 cho thấy điều kiện vi trọng lực mô phỏng đã gây ra sự

kéo dài pha S dẫn đến làm chậm quá trình tăng sinh của tế bào tủy xương CD34+

[61]. Điều kiện vi trọng lực mô phỏng còn được cho rằng đã làm ức chế quá trình

tăng sinh của tế bào gốc trung mô tủy xương (bmMSCs) bằng cách chặn đứng giai

đoạn G2/M trong nghiên cứu của Yan và cộng sự năm 2015 [24]. Nghiên cứu gần

59 đây của Tan và cộng sự năm 2018 đã chứng minh môi trường vi trọng lực mô

phỏng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bằng cách đảo ngược quá trình bộ

máy trao đổi chất dị hóa của một số chức năng cố định (housekeeping functions)

[63].

Hình 3.7. Biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis ở hucMSC

bằng phương pháp Realtime qRT-PCR

Trong nghiên cứu hiện tại, tỉ lệ sống và tỉ lệ apoptosis của tế bào hucMSC ở

điều kiện vi trọng lực mô phỏng không có sự khác biệt so với điều kiện bình

thường, cho thấy sự chết của tế bào không dẫn đến sự giảm tăng sinh của các tế bào

hucMSC. Cùng với kết quả đánh giá chu kỳ tế bào ở phần trước, có thể thấy sự ức

chế tăng sinh của tế bào hucMSC trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng được gây

ra bởi sự giảm biểu hiện các protein điều hòa chu kỳ tế bào. Những protein này đã

kích hoạt hucMSC gây ra sự bắt giữ các tế bào trong pha G0/G1 và làm chậm quá

trình phân chia tế bào.

3.4. Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào

3.4.1. Sự thay đổi hình thái nhân

Hình thái nhân của hucMSC đã có một số thay đổi khi tế bào được nuôi trong

môi trường vi trọng lực mô phỏng. Trong nghiên cứu, giá trị cường độ nhân ở

hucMSC được xác định bằng cách đo cường độ phát huỳnh quang trong nhân ở các

tế bào này. Ở biểu đồ Hình 3.8, cường độ nhân của hucMSC có biểu hiện giảm

trong môi trường vi trọng lực mô phỏng, ở nhóm SMG là 5629317 ± 39469 so với

60 nhóm đối chứng là 5957254 ± 65063 (p ≤ 0,001). Trong khi đó, diện tích nhân của

hucMSC không có sự thay đổi đáng kể khi không tìm thấy sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê nào giữa hai nhóm SMG (314,04 ± 2,55 µm2) và đối chứng (318,07 ± 1,73 µm2) (Hình 3.9). Giá trị hình dạng nhân biểu thị mức đối xứng của nhân tế

bào, nhân càng đối xứng thì giá trị càng tiệm cận đến 1,0. Hình 3.10 cho thấy giá trị

hình dạng nhân của hucMSC không có sự thay đổi giữa nhóm SMG (0,89 ± 0,002)

và nhóm đối chứng (0,88 ± 0,003).

Hình 3.8. Cường độ nhân của hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle

App. ***: p ≤ 0,001

Hình 3.9. Diện tích nhân của hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App

61

Hình 3.10. Hình dạng nhân của hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle

App

Sự phân bố các tế bào hucMSC theo hình dạng và cường độ nhân giữa hai

nhóm thí nghiệm cũng khá tương đồng (Hình 3.11 và 3.12). Nhóm đối chứng có sự phân bố cường độ nhân vượt qua ngưỡng 1,5 × 107 trong khi đó hầu hết giá trị cường độ nhân nhóm SMG đều nằm dưới ngưỡng 1,5 × 107.

Việc tái cấu trúc hạt nhân đòi hỏi sự tổng hợp DNA và các thành phần tế bào

liên quan. Trong pha S của chu kỳ tế bào, sự sao chép DNA dẫn đến sự tăng cường

độ hạt nhân và ngưng tụ chromatin [147]. Quá trình chuyển từ pha S sang pha

G2/M chuẩn bị cho giai đoạn nguyên phân cũng làm tăng cường độ nhân trong tế

bào [148, 149]. Kết quả đánh giá hình thái nhân trong nghiên cứu cho thấy tuy

không có sự thay đổi mang ý nghĩa thống kê về diện tích và hình dạng, cường độ

nhân của hucMSC giảm khi được nuôi trong môi trường vi trọng lực mô phỏng. Kết

hợp với các đánh giá về chu kỳ tế bào ở kết quả trước, thay đổi này được cho là kết

quả của sự giảm biểu hiện các gene liên quan đến chu kỳ tế bào, dẫn đến làm giảm

tỷ lệ tế bào đi vào quá trình phân chia ở hucMSC trong môi trường vi trọng lực mô

phỏng.

62

Hình 3.11. Sự phân bố nhân trong mối tương quan giữa hình dạng nhân và cường

độ nhân ở hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App. Màu xanh dương

biểu thị tế bào đang ở pha G0/G1, màu đỏ biểu thị tế bào đang ở pha S, màu xanh lá

biểu thị tế bào đang ở pha G2/M.

63

Hình 3.12. Sự phân bố nhân trong mối tương quan giữa diện tích nhân và cường độ

nhân ở hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App. Màu xanh dương

biểu thị tế bào đang ở pha G0/G1, màu đỏ biểu thị tế bào đang ở pha S, màu xanh lá

biểu thị tế bào đang ở pha G2/M

3.4.2. Sự thay đổi hình thái tế bào chất

64

Hình 3.13A và 3.13B cho thấy hình thái hucMSC ở hai nhóm vi trọng lực

(SMG) và đối chứng đều có dạng thuôn dài đặc trưng của tế bào gốc trung mô. Tuy

nhiên màng tế bào chất của các tế bào hucMSC ở nhóm SMG có xu hướng trải rộng

ra hơn nhiều so với nhóm đối chứng. Nhận định này được bổ sung bằng kết quả đo

diện tích tế bào ở Hình 3.13C, trong đó diện tích trung bình của các tế bào hucMSC ở nhóm SMG là 14083,34 ± 1069,38 µm2, cao hơn so với nhóm đối chứng (11368,67 ± 535,27 µm2) (p ≤ 0,05). Các tế bào hucMSC cũng cho thấy sự sinh

trưởng bình thường ở cả hai nhóm khi không phát hiện dấu hiệu của các thể

apoptosis nào trong quần thể.

Hình 3.13. Hình thái tế bào chất của hucMSC. A, B: Hình thái tế bào chất của

hucMSC trong điều kiện bình thường (A) và trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

(B). C: Biểu đồ đánh giá diện tích tế bào ở hucMSC. *: p ≤ 0,05. Thước đo: 223,64

µm.

Những thay đổi về mặt hình thái của hucMSC trong điều kiện vi trọng lực

mô phỏng cũng được đánh giá bằng phương pháp flow cytometry thông qua kết quả

đo chỉ số FSC (Forward Scatter). Chỉ số này cho phép đo lượng tia laser đi qua tế

bào, từ đó có thể tính toán được kích thước tương đối của tế bào so với đối chứng.

65 Kết quả ở Hình 3.14 cho thấy giá trị FSC của hucMSC ở nhóm SMG tăng lên với

giá trị trung bình là 10803988,58 ± 20960,12, cao hơn so với nhóm đối chứng

(9829898,02 ± 206370,30) (p ≤ 0,01). Điều này cho thấy điều kiện vi trọng lực mô

phỏng đã làm tăng kích thước tế bào ở tế bào hucMSC.

Hình 3.14. Giá trị FSC biểu thị kích thước tế bào ở hucMSC. A, B: Biểu đồ

thể hiện giá trị FSC của hucMSC ở nhóm đối chứng (A) và nhóm vi trọng lực mô

phỏng (B). C: Biểu đồ so sánh giá trị FSC trung bình ở hucMSC giữa nhóm đối

chứng và nhóm vi trọng lực mô phỏng (SMG). **: p ≤ 0,01

Kết quả phân tích hình thái tế bào chất cho thấy điều kiện vi trọng lực mô

phỏng gây ra những thay đổi về mặt hình thái của hucMSC sau 3 ngày nuôi cấy. Cụ

thể là các tế bào trong môi trường vi trọng lực mô phỏng có xu hướng mở rộng diện

tích hơn so với ở điều kiện bình thường. Các nghiên cứu trước đây đã khám phá

được điều kiện vi trọng lực mô phỏng có thể tạo ra sự thay đổi hình thái của tế bào

động vật có vú bằng nhiều cơ chế khác nhau. Năm 2018, Dinarelli và cộng sự đã

chứng minh rằng môi trường vi trọng lực mô phỏng gây ra những thay đổi về hình

dạng tế bào và độ nhám màng trên hồng cầu ở người [150]. Nghiên cứu trên nguyên

bào xương nguyên phát ở người của Gioia và cộng sự cũng trong năm này cho thấy

các tế bào xương thay đổi hình thái từ dạng phẳng sang dạng hình thoi khi được

nuôi trong môi trường vi trọng lực mô phỏng [151]. Môi trường vi trọng lực mô

66 phỏng cũng gây ra sự thay đổi khung xương actin trong các tế bào A431 ở người

trong nghiên cứu của Moes năm 2011 [152]. Một nghiên cứu khác của Kapitonova

năm 2013 báo cáo rằng môi trường vi trọng lực mô phỏng tạo ra những thay đổi

mạnh mẽ về kích thước và hình dạng của các tế bào và sự chuyên môn hóa bề mặt

của chúng [153]. Sự tăng diện tích của hucMSC trong nghiên cứu này có thể được

giải thích bằng việc tác động của môi trường vi trọng lực mô phỏng lên bộ khung

xương tế bào, cụ thể là vi sợi actin và vi ống. Những thay đổi này được đánh giá và

chứng minh ở kết quả đánh giá cấu trúc khung xương tế bào.

3.5. Đánh giá cấu trúc khung xương tế bào

3.5.1. Biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi

Nghiên cứu đánh giá biểu hiện mức phiên mã của các gene α-tubulin 3 mã

hóa vi ống và β-actin mã hóa vi sợi ở hucMSC. Kết quả Realtime qRT-PCR cho

thấy hai gene này giảm mức độ biểu hiện mRNA khi tế bào được nuôi cấy trong

môi trường vi trọng lực mô phỏng (SMG) (Hình 3.15). Mức độ biểu hiện của β-

actin ở nhóm SMG là 0,60 ± 0,03, thấp hơn hẳn so với nhóm đối chứng là 1,00 ±

0,06 (p ≤ 0,001). Sự thay đổi biểu hiện của α-tubulin 3 càng rõ rệt hơn khi mức độ

biểu hiện ở nhóm SMG là 0,23 ± 0,03 giảm gần năm lần so với nhóm đối chứng là

1,00 ± 0,08 (p ≤ 0,001).

Hình 3.15. Biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi bằng phương

pháp Realtime qRT-PCR. ***: p ≤ 0,001

67

3.5.2. Biểu hiện mức dịch mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi

Kết quả Western Blot đánh giá biểu hiện protein của β-actin ở vi sợi và α-

tubulin ở vi ống được thể hiện ở Hình 3.16. Theo đó, protein β-actin giảm biểu hiện

mạnh trong môi trường vi trọng lực mô phỏng (SMG). Mức độ biểu hiện của β-

actin trong nhóm SMG 0,06 ± 0,01, giảm 16 lần so với nhóm đối chứng (1,00 ±

0,02). Biểu hiện protein của α-tubulin cũng giảm khi mức độ biểu hiện ở nhóm

SMG là 0,42 ± 0,01 và ở nhóm đối chứng là 1,00 ± 0,02. Các khác biệt này đều có ý

nghĩa thống kê qua phân tích bằng One-way ANOVA (p ≤ 0,001).

Hình 3.16. Biểu hiện mức dịch mã các protein cấu trúc vi sợi, vi ống bằng phương

pháp Western Blot. ***: p ≤ 0,001

3.5.3. Đánh giá sự tái cấu trúc bộ khung vi ống, vi sợi trong tế bào

Vi ống là các protein có hình dạng ống và là một thành phần của bộ xương tế

bào. Chúng tham gia vào việc duy trì hình dạng của tế bào; nếu không có chúng, tế

68 bào sẽ bị chén ép bởi các tế bào lân cận của nó. Chúng cũng chịu trách nhiệm tổ

chức bên trong tế bào và các chuyển động khác nhau trong tế bào, đặc biệt là sự

chuyển động của các bào quan và thành phần nhỏ khác di chuyển từ vị trí này sang

vị trí khác trong tế bào chất. Chức năng này làm cho các vi ống quan trọng đối với

quá trình phân chia tế bào. Các vi ống hình thành bộ máy thoi vô sắc, giúp phân

chia nhiễm sắc thể trực tiếp trong quá trình phân bào. Kết quả ở Hình 3.17 cho thấy

hucMSC ở nhóm đối chứng có mật độ vi ống (tubulin) dày hơn và tập trung nhiều

xung quanh nhân. Trong khi đó các bó vi ống ở nhóm vi trọng lực (SMG) có mật độ

thấp hơn và trải đều khắp tế bào. Qua quan sát, hucMSC ở nhóm đối chứng có hình

dạng giống như nguyên bào sợi với các bó vi ống phân bố song song dọc theo chiều

dài tế bào. Cách sắp xếp này không được tìm thấy ở nhóm SMG, thay vào đó là sự

phân bố đan xen các bó vi ống trong tế bào chất.

Vi sợi, một thành phần khác của bộ khung xương tế bào, là các protein dạng

sợi được trải rộng khắp tế bào. Chúng có một vai trò nhỏ trong việc hỗ trợ hình

dạng của tế bào và tổ chức bên trong của nó. Vi sợi đóng vai trò quan trọng trong

các chuyển động của tế bào. Các vi sợi chịu trách nhiệm cho bất kỳ chuyển động

nào mà tế bào tạo ra, chẳng hạn như hình dạng thay đổi, tế bào co lại hay tế bào di

chuyển trên bề mặt. Ngoài ra trong quá trình phân chia tế bào, hệ thống vi sợi tham

giá cấu trúc nên vòng thắt phân chia tế bào, cũng như tham gia vận chuyển bào

quan bằng các protein vận động dọc theo các bó vi sợi. Hình 3.18 mô tả sự phân bố

song song dọc theo chiều dài tế bào của các bó vi sợi trong nhóm hucMSC đối

chứng. Quan sát cho thấy ở nhóm SMG vi sợi biểu hiện mật độ thấp hơn và phân bố

đều trong tế bào. Các bó sợi actin ở nhóm SMG cũng mảnh hơn so với nhóm đối

chứng. Cả hai kết quả nhuộm actin và tubulin đều cho thấy sự giới hạn về chiều dài

tế bào của hucMSC ở nhóm SMG. Các tế bào trong nhóm này có xu hướng mở rộng

theo hình tròn thay vì kéo dài.

69

Hình 3.17. Ảnh nhuộm huỳnh quang vi ống của hucMSC trong điều kiện bình

thường và điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG). Vi ống được nhuộm với Sir-

Tubulin (đỏ). Thước đo: 223,64 µm

70

Hình 3.18. Ảnh nhuộm huỳnh quang vi sợi của hucMSC trong điều kiện bình

thường và điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG). Vi sợi được nhuộm với

Phalloidin (xanh lá). Nhân được nhuộm với H33342 (xanh dương). Thước đo:

223,64 µm.

71

Cường độ phát huỳnh quang của vi ống ở hai nhóm đối chứng và SMG được

thể hiện ở Hình 3.19. Qua tính toán, cường độ vi ống của hucMSC trong nhóm đối

chứng là 3980694.27 ± 842699,73, cao hơn so với nhóm SMG (2860286.60 ±

338612.60) (p ≤ 0,001). Điều này chứng tỏ mật độ vi ống phân bố dày hơn ở nhóm

tế bào được nuôi ở điều kiện bình thường so với môi trường mô phỏng vi trọng lực.

Hình 3.19. Kết quả đánh giá mật độ vi ống của hucMSC. A: Ảnh nhuộm

huỳnh quang vi ống ở nhóm đối chứng. B: Ảnh nhuộm huỳnh quang vi ống ở nhóm

SMG. C: Cường độ phát huỳnh quang vi ống của hucMSC ở nhóm đối chứng và

nhóm SMG. ***: p ≤ 0,001. Thước đo: 223,64 µm.

Kết quả đánh giá cường độ phát huỳnh quang của vi sợi ở Hình 3.20 cho

thấy cường độ actin của hucMSC ở nhóm SMG là 3364019,71 ± 688901,20, thấp

hơn so với nhóm đối chứng (4276497,43 ± 1190673,58) (p ≤ 0,05). Do đó có thể kết

luận môi trường mô phỏng vi trọng lực (SMG) làm giảm khả năng biểu hiện của vi

ống trong hucMSC.

72

Hình 3.20. Kết quả đánh giá mật độ vi sợi actin của hucMSC. A: Ảnh nhuộm

huỳnh quang vi sợi actin ở nhóm đối chứng. B: Ảnh nhuộm huỳnh quang vi sợi

actin ở nhóm SMG. C: Cường độ phát huỳnh quang vi sợi actin của hucMSC ở

nhóm đối chứng và nhóm SMG. *: p ≤ 0,05. Thước đo: 223,64 µm.

Khung xương tế bào đóng vai trò quan trọng trong việc xây dựng hình dạng

và cấu trúc tế bào, hỗ trợ các chuyển động và góp phần vào sự tương tác của tế bào

[154]. Vi sợi và vi ống là hai thành phần cấu trúc chính của khung xương tế bào, rất

cần thiết cho sự phân chia tế bào [155]. Trong nguyên phân, vi ống kéo dài từ trung

tử đến rìa tế bào, hình thành các thoi vô sắc phân tách nhiễm sắc thể trong tế bào

con [156]. Bên cạnh đó, vi sợi góp phần vào việc xây dựng rãnh phân tách trong

quá trình nguyên phân [157].

Trong nghiên cứu này, các tế bào hucMSC đã có sự tổ chức lại vi sợi và vi

ống khi nuôi trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng. Kết quả đánh giá hình thái

khung xương tế bào cho thấy trong môi trường vi trọng lực, các bó vi ống và vi sợi

dàn trải với mật độ đều nhau và phân bố đan xen trong tế bào trong khi ở môi

trường bình thường, các bó vi ống tập trung song song với mật độ cao xung quanh

nhân. Việc tái sắp xếp vi sợi cũng được quan sát thấy trong tế bào hucMSC khi nuôi

73 trong môi trường vi trọng lực mô phỏng. Mật độ của vi ống và vi sợi trong tế bào

hucMSC ở môi trường vi trọng lực mô phỏng đều thấp hơn ở nhóm đối chứng.

Actin và Tubulin là các thành phần tương ứng của vi sợi và vi ống. Những

thay đổi trong quá trình tổng hợp của chúng có thể làm thay đổi cấu trúc của vi sợi

và vi ống. Trong nghiên cứu hiện tại, các tế bào hucMSC giảm biểu hiện β-Actin và

α-Tubulin 3 trong môi trường vi trọng lực mô phỏng, dẫn đến giảm sự hình thành

thoi vô sắc và rãnh phân tách hỗ trợ sự phân chia tế bào. Sự tái tổ chức vi sợi và vi

ống của tế bào gốc trung mô và tế bào sụn đã được nhắc đến trong nhiều nghiên cứu

trước đây của Aleshcheva và cộng sự năm 2013, Chen và cộng sự, Cazzaniga và

cộng sự năm 2016, sử dụng các hệ thống clinostat 2D và máy định vị vị trí ngẫu

nhiên (RPM) để tạo môi trường vi trọng lực mô phỏng [36, 39, 158]. Tuy nhiên,

mối quan hệ giữa sự tái tổ chức các vi sợi, vi ống và mức độ biểu hiện của Actin,

Tubulin vẫn chưa được mô tả. Nghiên cứu hiện tại đã chứng minh rằng việc tái sắp

xếp các vi ống và vi sợi có liên quan đến việc giảm biểu hiện Tubulin và Actin, cho

thấy rằng sự giảm biểu hiện của hai gene này ở hucMSC trong môi trường vi trọng

lực mô phỏng có thể dẫn đến việc tái cấu trúc khung xương tế bào.

3.6. Tóm tắt ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên tế bào hucMSC và

phương thức ức chế tăng sinh tế bào trong môi trường vi trọng lực mô phỏng

Nguyên phân, hay phân chia tế bào, là quá trình sinh học cơ bản dẫn đến sự

gia tăng số lượng tế bào sinh dưỡng theo thời gian. Sự tăng trưởng phần lớn là kết

quả của việc tăng số lượng tế bào nhưng cũng có thể bị ảnh hưởng bởi sự gia tăng

kích thước của các tế bào riêng lẻ, những thay đổi của chất nền ngoại bào, xuất

huyết và sự xâm nhập của các tế bào miễn dịch, chẳng hạn như bạch cầu. Thuật ngữ

tăng sinh đặc biệt áp dụng cho sự gia tăng số lượng tế bào, được đo bằng số lượng

tế bào dưới dạng hàm số thời gian. Tế bào phân chia theo tiến trình thông qua một

trình tự các bước được gọi chung là chu kỳ tế bào. Các tên khác của chu kỳ tế bào là

chu kỳ tăng sinh, chu kỳ thế hệ hay chu kỳ nguyên phân. Các báo cáo khoa học lần

đầu tiên chia chu kỳ tế bào thành bốn pha bao gồm G1, S, G2 và M [159, 160]. Các

thuật ngữ cho các giai đoạn này vẫn được sử dụng cho đến ngày nay, mặc dù

phương pháp đánh giá hiện nay thường là sinh hóa hoặc lý sinh, không phải là sinh

học như trước đây.

74

Hai sự kiện chính trong nguyên phân là tổng hợp DNA, phần lớn xảy ra ở

pha S và sự phân chia của tế bào mẹ thành hai tế bào con trong pha M. Pha M được

đặc trưng về mặt vi hình thái bởi việc xuất hiện vách phân chia tế bào. Khoảng thời

gian giữa quá trình phân chia tế bào và tổng hợp DNA được gọi là pha G1. Khoảng

thời gian giữa tổng hợp DNA và phân chia tế bào được gọi là pha G2. Mặc dù thuật

ngữ nguyên phân thường được dùng để chỉ pha M, nhưng từ nguyên phân được hiểu

đúng là dùng để chỉ tất cả các tế bào tham gia vào bất kỳ phần nào của toàn bộ quá

trình tự sao chép. Toàn bộ quá trình này bao gồm các sự kiện (G1, S, G2) xảy ra

trước pha M, cũng như chính pha M.

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá tác động của vi trọng lực mô

phỏng (SMG) đối với sự tăng sinh, biểu hiện của các protein điều hòa chính liên

quan đến chu kỳ tế bào và protein cấu trúc khung xương trong tế bào gốc trung mô

cuống rốn người (hucMSC). Các phương pháp sinh hóa và sinh học phân tử được sử

dụng để đánh giá chu kì tế bào và sự tăng sinh tế bào. Đầu tiên, thử nghiệm WST-1

cho thấy sự gia tăng số lượng tế bào hucMSC được cảm ứng SMG thấp hơn so với

nhóm đối chứng. Phương pháp phân tích flow cytometry chứng minh rằng tỉ lệ tế

bào hucMSC được cảm ứng SMG đi vào pha G0/G1 cao hơn so với nhóm đối

chứng, trong khi tỉ lệ tế bào hucMSC được cảm ứng SMG đi vào pha S và G2/M

thấp hơn hơn so với nhóm đối chứng. Sự thay đổi tỉ lệ phân bố trong các pha

G0/G1, pha S và G2/M của tế bào hucMSC được củng cố bởi các phân tích cấu trúc

nhân tế bào và kết quả phân tích Western blot. Cường độ nhân tế bào hucMSC

trong nhóm SMG thấp hơn so với nhóm đối chứng, điều này chứng tỏ quá trình

tổng hợp, sao chép DNA tế bào cảm ứng SMG diễn ra thấp hơn so với nhóm đối

chứng. Phân tích Western blot cho thấy sự giảm biểu hiện cyclin A1 và cyclin A2

trong hucMSC do SMG gây ra. Biểu hiện CDK4 và CDK6 cũng giảm ở các tế bào

hucMSC được cảm ứng SMG.

Trong nguyên phân, vi ống kéo dài từ trung thể đến đĩa tế bào, tạo thành trục

phân ly nhiễm sắc thể từ tế bào mẹ sang hai tế bào con [156]. Ngoài ra, vi sợi góp

phần xây dựng rãnh phân tách trong quá trình nguyên phân của tế bào [157]. Như

vậy, sự hình thành thoi vô sắc và rãnh phân tách hai tế bào đóng vai trò rất quan

trọng trong quá trình phân chia tế bào. Những biến đổi tổng hợp hai cấu trúc trên sẽ

ảnh hưởng trực tiếp đến phân chia tế bào. Vi ống và vi sợi là hai thành phần chính

75 trong sự hình hai cấu trúc trên. Kết quả phân tích Western blot và Realtime qRT-

PCR cho thấy tế bào hucMSC ở nhóm SMG giảm biểu hiện β-actin và α-tubulin 3

so với tế bào hucMSC của nhóm đối chứng. Điều này chứng tỏ tế bào hucMSC

không chỉ tái cấu trúc khung xương tế bào, mà sự hình thành các cấu trúc thoi vô

sắc và rãnh phân tách trong quá trình phân chia tế bào cũng bị thay đổi do sự giảm

tổng hợp 2 thành phần protein chính α-tubulin 3 và β-actin trong cấu trúc vi ống và

vi sợi. Kết quả đánh giá diện tích tế bào cũng góp phần củng cố thêm cho kết luận

về sự thay đổi cấu trúc khung xương tế bào. Sự giảm biểu hiện các protein chính

kiểm soát chu kì tế bào cùng việc giảm biểu hiện của protein cấu trúc khung xương

là nguyên nhân dẫn đến sự giảm phân chia tế bào, đây là nguyên nhân dẫn đến việc

giảm tăng sinh của tế bào hucMSC khi được cảm ứng điều kiện vi trọng lực mô

phỏng.

Ngoài ra, tổ chức của vi sợi và vi ống có mối liên hệ mật thiết với CDK4 và

CDK6 [161, 162]. Sự tương tác của CKD6 với một số protein liên quan đến khung

xương tế bào điều chỉnh tổ chức này, đặc biệt là sự trùng hợp của Actin [163]. Các

tế bào suy giảm CDK6 đã làm suy yếu sự hình thành F-actin được trùng hợp để tạo

thành vi sợi [163]. Kết hợp với kết quả đánh giá các protein điều hòa chu kỳ tế bào

ở phần trước, có thể kết luận các tế bào hucMSC trong điều kiện vi trọng lực mô

phỏng xuất hiện sự giảm biểu hiện của CDK4 và CDK6 có liên quan đến việc giảm

β-actin, dẫn đến sự giảm tổng hợp vi sợi trong tế bào chất của hucMSC và từ đó

giảm sự phân chia tế bào.

Từ các kết quả trên, nghiên cứu hiện tại cho thấy vi trọng lực mô phỏng làm

giảm biểu hiện các protein điều hòa chu kỳ tế bào như cyclin A1 và A2, CDK4,

CDK6. Sự giảm biểu hiện các protein điều hòa chu kì tế bào này thúc đẩy tế bào

hucMSC đi vào pha nghỉ. Ngoài ra, vi trọng lực mô phỏng cũng làm giảm sự biểu

hiện của các protein chính cấu trúc nên khung xương tế bào như β-actin và α-

tubulin 3. Việc giảm biểu hiện các protein cấu trúc dẫn đến thay đổi quá trình tổng

hợp hệ thống vi sợi và vi ống, từ đó cảm ứng sự tái tổ chức bộ khung xương tế bào

của các tế bào hucMSC. Vi ống và vi sợi còn là thành phần chính của thoi vô sắc và

rãnh phân tách trong quá trình phân chia tế bào. Sự suy giảm biểu hiện vi sợi và vi

ống cũng là nguyên nhân gây ức chế tăng sinh tế bào. Ngoài ra, các protein điều hòa

chu kỳ tế bào cũng được chứng minh là có ảnh hưởng đến sự tổng hợp vi sợi và vi

76 ống. Do đó, nghiên cứu đề xuất hai phương thức ức chế tăng sinh tế bào hucMSC

dưới tác động của môi trường vi trọng lực mô phỏng là thông qua sự giảm biểu hiện

các protein điều hòa chu kỳ tế bào và giảm biểu hiện các protein cấu trúc vi sợi, vi

ống. Hai quá trình này không tiến hành riêng lẻ mà cùng xảy ra và tác động lẫn

nhau. Các kết quả trên được mô hình hóa trong Hình 3.21.

Hình 3.21. Sơ đồ tóm tắt ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên sự tăng sinh tế

bào hucMSC.

77 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Nghiên cứu đã sử dụng hệ thống clinostat 3D tạo môi trường vi trọng lực mô

phỏng để đánh giá các chỉ tiêu về tăng sinh, hình thái tế bào và cấu trúc khung

xương của tế bào gốc trung mô cuống rốn người (human umbilical cord

mesenchymal stem cell - hucMSC). Kết quả thí nghiệm cho thấy điều kiện vi trọng

lực mô phỏng làm giảm tăng sinh và làm thay đổi hình thái nhân, tế bào chất đồng

thời tái cấu trúc bộ khung xương tế bào ở hucMSC. Sự chết theo chương trình của

hucMSC không bị ảnh hưởng trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng. Nghiên cứu

cũng đề xuất hai phương thức ức chế tăng sinh của điều kiện vi trọng lực mô phỏng

lên tế bào hucMSC: phương thức thứ nhất thông qua sự giảm biểu hiện các protein

điều hòa chu kỳ tế bào Cyclin A, CDK2, CDK4, CDK6, từ đó bắt giữ tế bào ở pha

G0/G1 và ngăn chặn tế bào đi vào pha phân chia G2/M; phương thức thứ hai thông

qua sự giảm biểu hiện các protein cấu trúc vi sợi và vi ống, làm ức chế sự hình

thành thoi vô sắc và rãnh phân tách từ đó làm giảm sự phân chia tế bào. Hai quá

trình này cùng xảy ra và tác động lẫn nhau.

Kiến nghị

Qua nhiều báo cáo, thời gian thử nghiệm và đặc trưng của dòng tế bào cũng

là nhân tố tác động đến sự sinh trưởng và chu kỳ tế bào. Do đó, nghiên cứu sắp tới

sẽ thực hiện trên nhiều dòng tế bào khác nhau với các mức thời gian, cũng như điều

kiện vi trọng lực khác nhau để làm rõ hơn cơ chế tác động của vi trọng lực lên tế

bào của sinh vật. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu sẽ tiến hành đánh giá ảnh hưởng của

điều kiện vi trong lực mô phỏng lên khả năng bám dính cũng như tương tác giữa

các tế bào gốc trung mô. Nghiên cứu sẽ tiến hành trong thời gian dài hơn và sẽ đánh

giá thêm sự ảnh hưởng của các yếu tố khác giống môi trường không gian như bức

xạ lên tế bào gốc trung mô.

78 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

Ho Nguyen Quynh Chi, Hoang Nghia Son, Doan Chinh Chung, Le Dinh Huan,

Tran Hong Diem, Le Thanh Long, Simulated microgravity reduces proliferation

and reorganizes the cytoskeleton of human umbilical cord mesenchymal stem cells,

Physiol. Res., 2020, Sep 9, PMID: 32901501. (SCI, Q2)

Ho Nguyen Quynh Chi and Hoang Nghia Son, Morphological changes of human

mesenchymal stem cells under 3d clinostat culture, Asian Jr. of Microbiol. Biotech.

Env. Sc., 2020, 22 (3), 63-67.

Ho Nguyen Quynh Chi, Hoang Nghia Quang Huy, Doan Chinh Chung, Hoang

Nghia Son, Le Thanh Long, Inhibited growth of mesenchymal stem cells under

simulated microgravity, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2020, 18 (2), 1-10.

79

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] J.B. Rogers, L. Vogt, J. Wargo, Microgravity: A Teacher's Guide with

Activities in Science, Mathematics, and Technology. Grades 5-12, National

Aeronautics and Space Administration, 1997, Washington, DC.

[2] D. Chandler, Weightlessness and Microgravity, Phys. Teach., 1991, 29 (5),

312-313.

[3] M. Bizzarri, M. Monici, J.J.W.A. van Loon, How Microgravity Affects the

Biology of Living Systems, BioMed Res. Int., 2015, 863075, 1-4.

[4] P.D. Häder, R. Hemmersbach, M. Lebert, Gravity and the behavior of

unicellular organisms, Cambridge University Press, 2005, Cambridge, 12-

27.

[5] S. Koszelak, C. Leja, A. McPherson, Crystallization of biological

macromolecules from flash frozen samples on the Russian Space Station Mir,

Biotechnol. Bioeng., 1996, 52 (4), 449-458.

[6] J. von Sachs, Über Ausschliessung der geotropischen und heliotropischen

Krümmungen wärend des Wachsthums, Würzburger Arbeiten, 1879, 2, 209-

225.

[7] R. Herranz , R. Anken, J. Boonstra, M. Braun, P.C.M. Christianen, M. de

Geest, et al., Ground-based facilities for simulation of microgravity:

organism-specific recommendations for their use, and recommended

terminology, Astrobiology, 2013, 13 (1), 1-17.

[8] P. Von kampen, T. Könemann, H.J. Rath, The drop tower bremen – an

overview, in COSPAR, Proceedings of the 38th COSPAR Scientific

Assembly, 2010, 3587, Bremen, Germany.

[9] W. Briegleb, Some qualitative and quantitative aspects of the fast-rotating

clinostat as a research tool, ASGSB Bulletin, 1992, 5, 23-30.

[10] S.L. Wuest, S. Richard, S. Kopp, D. Grimm, M. Egli, Simulated

microgravity: critical review on the use of random positioning machines for

mammalian cell culture, Biomed. Res. Int., 2015, 971474.

80 [11] M. Böhmer, E. Schleiff E, Microgravity research in plants: A range of

platforms and options allow research on plants in zero or low gravity that

can yield important insights into plant physiology, EMBO Rep., 2019, 20

(7): e48541.

[12] G.C. Demontis, M.M. Germani, E.G. Caiani, I. Barravecchia, C. Passino, D.

Angeloni, Human Pathophysiological Adaptations to the Space Environment.

Front Physiol., 2017, 8, 547.

[13] M.M. Udden, T.B. Driscoll, M.H. Pickett, C.S. Leach-Huntoon, C.P. Alfrey,

Decreased production of red blood cells in human subjects exposed to

microgravity, J. Lab. Clin. Med., 1995, 125 (4), 442‐449.

[14] B.E. Crucian, A. Choukèr, R.J. Simpson, S. Mehta, G. Marshall, S.M. Smith,

et al., Immune System Dysregulation During Spaceflight: Potential

Countermeasures for Deep Space Exploration Missions, Front Immunol.,

2018, 9, 1437.

[15] F.E Garrett-Bakelman., M. Darshi, S.J. Green, R.C. Gur, L. Lin, B.R.

Macias, et al., The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a

year-long human spaceflight, Science, 2019, 364 (6436), eaau8650.

[16] C. Ulbrich, M. Wehland, J. Pietsch, G. Aleshcheva, P. Wise, J. van Loon, et

al., The impact of simulated and real microgravity on bone cells and

mesenchymal stem cells, Biomed Res. Int., 2014, 928507.

[17] W. Briegleb, Ein Modell zur Schwerelosigkeits-Simulation an

Mikroorganismen, Naturwissenschaften, 1967, 54, 167.

[18] T. Hoson, S. Kamisaka, Y. Masuda, M. Yamashita, B. Buchen, Evaluation of

the three-dimensional clinostat as a simulator of weightlessness, Planta,

1997, 203, 187-197.

[19] J. van Loon, Some history and use of the Random Positioning Machine,

RPM, in gravity related research, Adv. Space Res., 2007, 39, 1161-1165.

[20] A. Borst, J. van Loon, Technology and Developments for the Random

Positioning Machine, RPM, Microgravity Sci. Technol., 2009, 21, 287-292.

81 [21] W. Hensel, A. Sievers, Effects of prolonged omnilateral gravistimulation on

the ultrastructure of statocytes and on the graviresponse of roots, Planta,

1980, 150, 338-346.

[22] H. Touchstone, R. Bryd, S. Loisate, M. Thompson, S. Kim, K. Puranam, et

al., Recovery of stem cell proliferation by low intensity vibration under

simulated microgravity requires LINC complex, NPJ Microgravity, 2019, 5,

11.

[23] H. Wang, X. Li, L. Krause, M. Görög, O. Schüler, J. Hauslage, et al., 2D

Clinostat for Simulated Microgravity Experiments with Arabidopsis

Seedlings, Microgravity Sci. Technol., 2016, 28, 59-66.

[24] M. Yan, Y. Wang, M. Yang, Y. Liu, B. Qu, Z. Ye, et al., The effects and

mechanisms of clinorotation on proliferation and differentiation in bone

marrow mesenchymal stem cells, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2015,

460 (2), 327-332.

[25] Y.J. Kim, A.J. Jeong, M. Kim, C. Lee, S.K. Ye, S. Kim, Time-averaged

simulated microgravity (taSMG) inhibits proliferation of lymphoma cells, L-

540 and HDLM-2, using a 3D clinostat, BioMed. Eng. OnLine, 2017, 16 (1),

48.

[26] T. Furukawa, K. Tanimoto, T. Fukazawa, T. Imura, Y. Kawahara, L. Yuge,

Simulated microgravity attenuates myogenic differentiation via epigenetic

regulations, NPJ Microgravity, 2018, 4, 11.

[27] T. Otsuka, T. Imura, K. Nakagawa, L. Shrestha, S. Takahashi, Y. Kawahara,

et al., Simulated microgravity culture enhances the neuroprotective effects of

human cranial bone-derived mesenchymal stem cells in traumatic brain

injury, Stem Cells Dev., 2018, 27 (18), 1287-1297.

[28] T. Imura, K. Nakagawa, Y. Kawahara, L. Yuge, Stem cell culture in

microgravity and its application in cell-based therapy. Stem Cells Dev.,

2018, 27 (18), 1298-1302.

[29] R. Schwarz, T. Goodwin, D. Wolf, Cell culture for three-dimensional

modeling in rotating-wall vessels: an application of simulated microgravity.

J. Tissue Cult. Methods, 1992, 14, 51-57.

82 [30] X. Li, R. Anken, G. Wang, R. Hilbig, Y. Liu, Effects to wall vessel rotation

on the growth of larval zebrafish inner ear otoliths, Microgravity Sci.

Technol., 2011, 23, 3-10.

[31] S. Moorman, C. Burress, R. Cordova, J. Slater, Stimulus dependence of the

development of the zebrafish (Danio rerio) vestibular system, J. Neurobiol.,

1999, 38, 247-258.

[32] S. Brungs, J. Hauslage, R. Hemmersbach, R. Hilbig, R. Anken, Effects of

stimulated weightlessness on fish otolith growth: Clinostat versus rotating-

wall vessel. Adv. Space Res., 2011, 48, 792-798.

[33] J.L. Becker, G.R. Souza, Using space-based investigations to inform cancer

research on Earth. Nature Reviews Cancer, 2013, 13, 315-327.

[34] C. Granet, N. Laroche, L. Vico, C. Alexandre, M.H. Lafage-Proust, Rotating-

wall vessels, promising bioreactors for osteoblastic cell culture: comparison

with other 3D conditions, Med. Biol. Eng. Comput., 1998, 36, 513-519.

[35] A.L. Radtke, M.M. Herbst-Kralovetz, Culturing and applications of rotating

wall vessel bioreactor derived 3D epithelial cell models, J. Vis. Exp., 2012,

62, 3868.

[36] G. Aleshcheva, J. Sahana, X. Ma, J. Hauslage, R. Hemmersbach, M. Egli, et

al., Changes in morphology, gene expression and protein content in

chondrocytes cultured on a random positioning machine, PLoS One, 2013, 8,

e79057.

[37] A. Sokolovskaya, T. Ignashkova, A. Bochenkova, A. Moscovtsev, V.

Baranov, A. Kubatiev, Effects of simulated microgravity on cell cycle in

human endothelial cells, Acta Astronaut., 2014, 99, 16-23.

[38] T. Benavides Damm, I. Walther, S.L. Wüest, J. Sekler, M. Egli, Cell

cultivation under different gravitational loads using a novel random

positioning incubator, Biotechnol. Bioeng., 2014, 111, 1180-1190.

[39] A. Cazzaniga, J. Maier, S. Castiglioni, Impact of simulated microgravity on

human bone stem cells: New hints for space medicine, Biochem. Biophys.

Res. Commun., 2016, 473, 181-186.

83 [40] K.D. McElreavey, A.I. Irvine, K.T. Ennis, W.H. McLean, Isolation, culture

and characterisation of fibroblast-like cells derived from the Wharton’s jelly

portion of human umbilical cord, Biochem. Soc. Trans., 1991, 19, 29S.

[41] D.L. Troyer, M.L. Weiss, Wharton’s jelly-derived cells are a primitive

stromal cell population, Stem Cells, 2008, 26, 591-599.

[42] J.Y. Hsieh, Y.S. Fu, S.J. Chang, Y.H. Tsuang, H.W. Wang, Functional

module analysis reveals differential osteogenic and stemness potentials in

human mesenchymal stem cells from bone marrow and Wharton’s jelly of

umbilical cord, Stem Cells Dev., 2010, 19, 1895-1910.

[43] C.Y. Fong, L.L. Chak, A. Biswas, J.H. Tan, K. Gauthaman, W.K. Chan, A.

Bongso, Human Wharton’s jelly stem cells have unique transcriptome

profiles compared to human embryonic stem cells and other mesenchymal

stem cells, Stem Cell Rev., 2011, 7, 1-16.

[44] T. Nagamura-Inoue, H. He, Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells:

Their advantages and potential clinical utility, World J. Stem Cells, 2014, 6

(2), 195-202.

[45] V. Volarevic V, B.S. Markovic BS, Gazdic M, et al. Ethical and Safety

Issues of Stem Cell-Based Therapy. Int J Med Sci. 2018;15(1):36-45.

Published 2018 Jan 1. doi:10.7150/ijms.21666

[46] J.J. Minguell, R. Lorino, G.P. Lasala, Myocardial implantation of a

combination stem cell product by using a transendocardial MYOSTAR

injection catheter: A technical assessment. Acute Card. Care, 2011, 13, 40-

42.

[47] K. Muroi, K. Miyamura, K. Ohashi, M. Murata, T. Eto, N. Kobayashi, et al.,

Unrelated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells for

steroid-refractory acute graft-versus-host disease: a phase I/II study, Int. J.

Hematol., 2013, 98, 206-213.

[48] J.Y. Weng, X. Du, S.X. Geng, Y.W. Peng, Z. Wang, Z.S. Lu, et al.,

Mesenchymal stem cell as salvage treatment for refractory chronic GVHD.

Bone Marrow Transplant., 2010, 45, 1732-1740.

84 [49] M. Duijvestein, A.C. Vos, H. Roelofs, M.E. Wildenberg, B.B. Wendrich,

H.W. Verspaget, et al., Autologous bone marrow-derived mesenchymal

stromal cell treatment for refractory luminal Crohn’s disease: results of a

phase I study, Gut, 2010, 59, 1662-1669.

[50] H. Kagami, H. Agata, A. Tojo, Bone marrow stromal cells (bone marrow-

derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering:

basic science to clinical translation, Int. J. Biochem. Cell Biol., 2011, 43,

286-289.

[51] D. Baksh, R. Yao, R.S. Tuan, Comparison of proliferative and multilineage

differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from

umbilical cord and bone marrow, Stem Cells, 2007, 25, 1384-1392.

[52] S.M. Mueller, J. Glowacki, Age-related decline in the osteogenic potential of

human bone marrow cells cultured in three-dimensional collagen sponges, J.

Cell Biochem., 2001, 82, 583-590.

[53] E.A. Martin, R. Hine, A dictionary of biology (6th ed.), Oxford University

Press, 2008, Oxford, New York.

[54] G.M. Cooper, The Cell: A Molecular Approach (2nd ed.), Sunderland (MA):

Sinauer Associates, 2000.

[55] Rubenstein, Irwin, S.M. Wick, Cell, World Book Online Reference Center,

2008.

[56] A.W. Murray, Recycling the cell cycle: cyclins revisited, Cell, 2004, 116,

221-234.

[57] H. Lodish, A. Berk, S.L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore, J. Darnell,

Overview of the cell cycle and its control. In Molecular Cell Biology (4th

ed.), WH Freeman & Co., 2000, New York.

[58] H. Hochegger, S. Takeda, T. Hunt, Cyclin-dependent kinases and cell-cycle

transitions: does one fit all?, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2008, 9 (11), 910-

916.

[59] L. Yuge, T. Kajiume, H. Tahara, Y. Kawahara, C. Umeda, R. Yoshimoto, et

al,. Microgravity potentiates stem cell proliferation while sustaining the

capability of differentiation, Stem Cells Dev., 2006, 15 (6), 921-929.

85 [60] A. Ratushnyy, D. Yakubets, E. Andreeva, L. Buravkova, Simulated

microgravity modulates the mesenchymal stromal cell response to

inflammatory stimulation, Sci. Rep., 2019, 9, 9279.

[61] P.A. Plett, R. Abonour, S.M. Frankovitz, C.M. Orschell, Impact of modeled

microgravity on migration, differentiation, and cell cycle control of primitive

human hematopoietic progenitor cells, Exp. Hematol., 2004, 32, 773-781.

[62] X. Mao, Z. Chen, Q. Luo, B. Zhang, G. Song, Simulated microgravity

inhibits the migration of mesenchymal stem cells by remodeling actin

cytoskeleton and increasing cell stiffness, Cytotechnology, 2016, 68 (6),

2235-2243.

[63] X. Tan, A. Xu, T. Zhao, Q. Zhao, J. Zhang, C. Fan, et al., Simulated

microgravity inhibits cell focal adhesions leading to reduced melanoma cell

proliferation and metastasis via FAK/RhoA-regulated mTORC1 and AMPK

pathways, Sci. Rep., 2018, 8, 3769.

[64] B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis J, et al, Molecular Biology of the Cell, 4th

edition, Programmed Cell Death (Apoptosis), Garland Science, 2002, New

York.

[65] C.J. Norbury, I.D. Hickson, Cellular responses to DNA damage, Annu. Rev.

Pharmacol. Toxicol., 2001, 41, 367-401.

[66] G. Hacker, The morphology of apoptosis, Cell Tissue Res., 2000, 301, 5-17.

[67] J.F. Kerr, A.H. Wyllie, A.R. Currie, Apoptosis: a basic biological

phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics, Br. J. Cancer,

1972, 26, 239-57.

[68] R. Howden, P.R. Hanlon, J.G. Petranka, S. Kleeberger, J. Bucher, J.

Dunnick, et al., Ephedrine plus caffeine causes age-dependent

cardiovascular responses in Fischer 344 rats, Am. J. Physiol. Heart Circ.

Physiol., 2005, 288, 2219-2224.

[69] S. Elmore, Apoptosis: a review of programmed cell death, Toxicol. Pathol.,

2007, 35 (4), 495-516.

[70] J.M. Hardwick, L. Soane, Multiple functions of BCL-2 family proteins, Cold

Spring Harb. Perspect. Biol., 2013, 5 (2), a008722.

86 [71] Y.T. Hsu, K.G. Wolter, R.J. Youle, Cytosol-to-membrane redistribution of

Bax and Bcl-X(L) during apoptosis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94

(8), 3668-3672.

[72] K.G. Wolter, Y.T. Hsu, C.L. Smith, A. Nechushtan, X.G. Xi, R.J. Youle,

Movement of Bax from the cytosol to mitochondria during apoptosis, J. Cell

Biol., 1997, 139 (5), 1281-1292.

[73] M.K. White, C. Cinti, A morphologic approach to detect apoptosis based on

electron microscopy, Methods Mol. Biol., 2004, 285, 105-111.

[74] A.H.Wyllie, Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with

endogenous endonuclease activation, Nature, 1980, 10, 284 (5756), 555-556.

[75] M. Kressel, P. Groscurth, Distinction of apoptotic and necrotic cell death by

in situ labelling of fragmented DNA, Cell Tissue Res., 1994, 278 (3), 549-

556.

[76] E. Bedner, X. Li, W. Gorczyca, M.R. Melamed, Z. Darzynkiewicz, Analysis

of apoptosis by laser scanning cytometry, Cytometry, 1999, 35 (3), 181-95.

[77] Z. Darzynkiewicz, E. Bedner, X. Li, W. Gorczyca, M.R. Melamed, Laser-

scanning cytometry: A new instrumentation with many applications, Exp.

Cell Res., 1999, 249 (1), 1-12.

[78] J. Gu, H. Kawai, D. Wiederschain, Z.M. Yuan, Mechanism of functional

inactivation of a Li-Fraumeni syndrome p53 that has a mutation outside of

the DNA-binding domain, Cancer Res., 2001, 61, 1741-1746.

[79] H.A. Andree, C.P. Reutelingsperger, R. Hauptmann, H.C. Hemker, W.T.

Hermens, G.M. Willems, Binding of vascular anticoagulant alpha (VAC

alpha) to planar phospholipid bilayers, J Biol Chem., 1990, 265 (9), 4923-

4928.

[80] G. Koopman, C.P. Reutelingsperger, G.A. Kuijten, R.M. Keehnen, S.T. Pals,

M.H. van Oers, Annexin V for flow cytometric detection of

phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis, Blood, 1994,

84 (5), 1415-1420.

87 [81] M.C. O'Brien, W.E. Bolton, Comparison of cell viability probes compatible

with fixation and permeabilization for combined surface and intracellular

staining in flow cytometry, Cytometry, 1995, 19 (3), 243-255.

[82] P. Raynal, H.B. Pollard, Annexins: the problem of assessing the biological

role for a gene family of multifunctional calcium- and phospholipid-binding

proteins, Biochim. Biophys. Acta., 1994, 1197 (1), 63-93.

[83] M. van Engeland, F.C. Ramaekers, B. Schutte, C.P. Reutelingsperger, A

novel assay to measure loss of plasma membrane asymmetry during

apoptosis of adherent cells in culture, Cytometry, 1996, 24 (2), 131-139.

[84] I. Vermes, C. Haanen, H. Steffens-Nakken, C. Reutelingsperger, A novel

assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine

expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V, J.

Immunol. Methods, 1995, 184(1), 39-51.

[85] A.D. Walters, A. Bommakanti, O. Cohen-Fix, Shaping the nucleus: factors

and forces. J. Cell Biochem., 2012, 113 (9), 2813-2821.

[86] H.J. Worman, Nuclear lamins and laminopathies, J. Pathol., 2012, 226 (2),

316-325.

[87] A. Bolzer, G. Kreth, I. Solovei, D. Koehler, K. Saracoglu, C. Fauth, et al.,

Three-dimensional maps of all chromosomes in human male fibroblast nuclei

and prometaphase rosettes, PLoS Biol., 2005, 3, e157.

[88] S. Siniossoglou, Lipins, lipids and nuclear envelope structure, Traffic, 2009

10 (9), 1181-1187.

[89] H. Santos-Rosa, J. Leung, N. Grimsey, S. Peak-Chew, S. Siniossoglou, The

yeast lipin Smp2 couples phospholipid biosynthesis to nuclear membrane

growth, EMBO J., 2005, 24 (11), 1931-1941.

[90] J. Hardin, G. Bertoni, L.J. Kleinsmith, Becker's World of the Cell (8th ed.),

Pearson, 2015, New York, 422-446.

[91] M. McKinley, V. Dean O'Loughlin, E. Pennefather-O'Brien, R. Harris,

Human Anatomy (4th ed.), McGraw Hill Education, 2015, New York, 29.

[92] G.J. Doherty, H.T. McMahon, Mediation, modulation, and consequences of

membrane-cytoskeleton interactions, Annu. Rev. Biophys., 2008, 37, 65-95.

88 [93] G.B. Johnson, The Living World, The McGraw-Hill Higher Education, 2006,

Boston, MA.

[94] M.A. Jordan, L. Wilson, Microtubules as a target for anticancer drugs,

Nature Rev. Cancer, 2004, 4, 253-265.

[95] E.R. Morey-Holton, The impact of gravity on life, In: L.J. Rothschild, A.M.

Lister, Evolution on Planet Earth: The Impact of the Physical Environment,

Academic Press, 2003, Cambridge, Massachusetts, USA, 143-146.

[96] D.M. Ruden, A. Bolnick, A. Awonuga, M. Abdulhasan, G. Perez, E.E.

Puscheck, D.A. Rappolee, Effects of Gravity, Microgravity or Microgravity

Simulation on Early Mammalian Development, Stem Cells Dev., 2018, 27

(18), 1230-1236.

[97] P. Carvil, R. Baptista, T. Russomano, The human body in a microgravity

environment: Long term adaptations and countermeasures, Aviat. Focus,

2013, 4 (1), 10-22.

[98] S.J. Crawford-Young, Effects of microgravity on cell cytoskeleton and

embryogenesis, Int. J. Dev. Biol., 2006, 50 (2-3), 183-191.

[99] S. Brungs, J. Hauslage, R. Hemmersbach, Validation of Random Positioning

Versus Clinorotation Using a Macrophage Model System, Microgravity Sci.

Technol., 2019, 31, 223-230.

[100] V. Mann, D. Grimm, T.J. Corydon, M. Kruger, M. Wehland, S. Riwaldt, et

al., Changes in human foetal osteoblasts exposed to the random positioning

machine and bone construct tissue engineering, Int. J. Mol. Sci., 2019, 20,

1357.

[101] C. Griffoni, S. Di Molfetta, L. Fantozzi, C. Zanetti, P. Pippia, V. Tomasi, et

al., Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low

gravity exposure. J. Cell. Biochem., 2011, 112 (1), 265-272.

[102] Y. Sambandam, M.T. Townsend, J.J. Pierce, C.M. Lipman, A. Haque, T.A.

Bateman, et al., Microgravity control of autophagy modulates

osteoclastogenesis, Bone, 2014, 61, 125-131.

[103] G. Rea, F. Cristofaro, G. Pani, B. Pascucci, S.a. Ghuge, P.A. Corsetto, et al.,

Microgravity-driven remodeling of the proteome reveals insights into

89

molecular mechanisms and signal networks involved in response to the space

flight environment, J. Proteomics, 2016, 137, 3–18.

[104] C. Wang, H. Chen, H .Luo, L. Zhu, Y. Zhao, H. Tian, et al., Microgravity

activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of

arginase and inflammatory cytokines in macrophages, Inflamm. Res., 2015,

64, 303-311.

[105] A. Sundaresan, D. Risin, N.R. Pellis, Loss of signal transduction and

inhibition of lymphocyte locomotion in a ground-based model of

microgravity, In Vitro Cell. Dev. Biol. – Animal, 2002, 38 (2), 118-122.

[106] B.M. Uva, M.A. Masini, M. Sturla, P. Prato, M. Passalacqua, M. Giuliani, et

al., Clinoration-induced weightlessness influences the cytoskeleton of glial

cells in culture, Brain Res., 2002, 934, 132-139.

[107] J. Vassy, S. Portet, M. Beil, G. Millot, F. Fauvel-Lafève, G. Gasset, et al.,

Weightlessness Acts on Human Breast Cancer Cell Line MCF-7, Adv. Space

Res., 2003, 32 (8), 1595-1603.

[108] A.J. Sytkowski, K.L. Davis, Erythroid Cell Growth and Differentiation in

Vitro in the Simulated Microgravity Environment of the NASA Rotation Wall

Vessel Bioreactor, In Vitro Cell Dev. Biol. – Animal, 2001, 37, 79-83.

[109] S. Gaboyard, M.P. Blachard, B.T. Travo, M. Viso, A. Sans, J. Lehouelleur,

Weightlessness affects cytoskeleton of rat utricular hair cells during

maturation in vitro, Neuroreport, 2002, 13 (16), 2139-2142.

[110] T.G. Hammond, E. Benes, K.C. O’Reilly, D.A. Wolf, R.M. Linnehan, A.

Taher, et al., Mechanical culture conditions effect gene expression: gravity-

induced changes on the space shuttle, Physiol. Genomics, 2000, 3 (3), 163-

173.

[111] K.J. Livak, T.D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using

Real-Time Quantitative PCR and the 2-∆∆Ct Method, Methods, 2001, 25,

402-408.

[112] Y. Ren, L. Qiu, F. Lü, X. Ru, S. Li, Y. Xiang, et al., TALENs-directed

knockout of the full-length transcription factor Nrf1α that represses

90

malignant behaviour of human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells, Sci.

Rep., 2016, 6, 23775.

[113] M.A. Tessari , M. Gostissa, S. Altamura, R. Sgarra, A. Rustighi, C.

Salvagno, et al., Transcriptional activation of the cyclin A gene by the

architectural transcription factor HMGA2, Mol. Cell Biol., 2003, 23 (24),

9104-9116.

[114] V.A. Gorgogietas, I. Tsialtas, N. Sotiriou, V.C. Laschou, A.G. Karra, D.D.

Leonidas, et al., Potential interference of aluminum chlorohydrate with

estrogen receptor signaling in breast cancer cells, J.. Mol. Biochem., 2018,

7, 1-13.

[115] C.A. Schneider, W.S. Rasband, K.W. Eliceiri, NIH Image to ImageJ: 25

years of image analysis, Nature methods, 2012, 9 (7), 671-675.

[116] Hoang Nghia Son, Ho Nguyen Quynh Chi, Doan Chinh Chung, Le Thanh

Long, Morphological changes during replicative senescence in bovine

ovarian granulosa cells, Cell Cycle, 2019, 18 (13), 1490-1497.

[117] M. Fischer, M. Skowron, F. Berthold, Reliable transcript quantification by

real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction in primary

neuroblastoma using normalization to averaged expression levels of the

control genes HPRT1 and SDHA, J. Mol. Diagn., 2005, 7, 89-96.

[118] J. Zhao, W. Fu, H. Liao, L. Dai, Z. Jiang, Y. Pan, et al., The regulatory and

predictive functions of miR-17 and miR-92 families on cisplatin resistance of

non-small cell lung cancer, BMC Cancer, 2015, 15, 731.

[119] T.L. Ramos, L.I. Sánchez-Abarca, S. Muntión, S. Preciado, N. Puig, G.

López-Ruano, et al., MSC surface markers (CD44, CD73, and CD90) can

identify human MSC-derived extracellular vesicles by conventional flow

cytometry, Cell Commun. Signal., 2016, 14, 2.

[120] M.S. Winkler, A. Rissiek, M. Priefler, E. Schwedhelm, L. Robbe, A. Bauer,

et al., Human leucocyte antigen (HLA-DR) gene expression is reduced in

sepsis and correlates with impaired TNFα response: A diagnostic tool for

immunosuppression?, PLoS One, 2017, 12 (8), e0182427.

91 [121] Y.R.A. Yu, E.G. O’Koren, D.F. Hotten, M.J. Kan, D. Kopin, E.R. Nelson, et

al., A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune

Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues, PLoS One,

2016, 11 (3), e0150606.

[122] T. Hoson, K. Soga, R. Mori, M. Saiki, K. Wakabayashi, S. Kamisaka, et al.,

Morphogenesis of rice and Arabidopsis seedlings in space, J. Plant Res.,

1999, 112, 477e86.

[123] R. Herranz, F.J. Medina, Cell proliferation and plant development under

novel altered gravity environments, Plant Biol., 2014, 16, 23e30.

[124] L. Yuge, I. Hide, T. Kumagai, Y. Kumei, S. Takeda, M. Kanno, et al., Cell

differentiation and p38 (MAPK) cascade are inhibited in human osteoblasts

cultured in a three-dimensional clinostat, In Vitro Cell Dev. Biol. Anim.,

2003, 39, 89e97.

[125] Y. Huang, Z.Q. Dai, S.K. Ling, H.Y. Zhang, Y.M. Wan, Y.H. Li, Gravity, a

regulation factor in the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem

cells, J. Biomed. Sci., 2009, 16, 87.

[126] Y. Kawahara, T. Manabe, M. Matsumoto, T. Kajiume, M. Matsumoto, L.

Yuge, LIFfree embryonic stem cell culture in simulated microgravity, PLoS

One, 2009, 4, e6343.

[127] M.A. Meloni, G. Galleri, G. Pani, A. Saba, P. Pippia, M. Cogoli-Greuter,

Space flight affects motility and cytoskeletal structures in human monocyte

cell line J-111, Cytoskeleton, 2011, 68, 125e37.

[128] C.J. Sherr, J.M. Roberts, Living with or without cyclins and cyclin-dependent

kinases, Genes Dev., 2004, 18, 2699-2711.

[129] J.B. Reece, L.A. Urry, M.L. Cain, S.A. Wasserman, P.V. Minorsky, R.B.

Jackson, The cell cycle, In Campbell biology (10th ed.), Pearson, 2011, San

Francisco, CA, 244.

[130] C.H. Yam, T.K. Fung, R.Y. Poon, Cyclin A in cell cycle control and cancer,

Cell. Mol. Life Sci., 2002, 59 (8), 1317-1326.

92 [131] N. Bendris, B. Lemmers, J.M. Blanchard, N. Arsic, Cyclin A2 mutagenesis

analysis: a new insight into CDK activation and cellular localization

requirements, PLoS ONE, 2011, 6 (7), e22879.

[132] P. Ji, S. Agrawal, S. Diederichs, N. Bäumer, A. Becker, T. Cauvet, et al.,

Cyclin A1, the alternative A-type cyclin, contributes to G1/S cell cycle

progression in somatic cells, Oncogene, 2005, 24, 2739-2744.

[133] I. Kalaszczynska, Y. Geng, T. Lino, S. Mizuno, Y. Choi, I. Kondratiuk, et al.,

Cyclin A is redundant in fibroblasts but essential in hematopoietic and

embryonic stem cells, Cell, 2009, 138, 352-365.

[134] N. Arsic, N. Bendris, M. Peter, C. Begon-Pescia, C. Rebouissou, G. Gadéa,

et al., A novel function for Cyclin A2: control of cell invasion via RhoA

signaling, J. Cell Biol., 2012, 196 (1), 147-162.

[135] A. Loukil, C.T. Cheung, N. Bendris, B. Lemmers, M. Peter, J.M. Blanchard,

Cyclin A2: At the crossroads of cell cycle and cell invasion, World J. Biol.

Chem., 2015, 6 (4), 346-350.

[136] S. van den Heuvel, E. Harlow, Distinct roles for cyclin-dependent kinases in

cell cycle control, Science, 1993, 262, 2050-2054.

[137] E. Aleem, H. Kiyokawa, P. Kaldis, Cdc2-cyclin E complexes regulate the

G1/S phase transition, Nat. Cell Biol., 2005, 7, 831-836.

[138] A. Echalier, J.A. Endicott, M.E. Noble, Recent developments in cyclin-

dependent kinase biochemical and structural studies, BBA-Proteins

Proteom., 2010, 1804 (3), 511-519.

[139] M. Meyerson, G.H. Enders, C.L. Wu, L.K. Su, C. Gorka, C. Nelson, et al., A

family of human cdc2-related protein kinases, EMBO J., 1992, 11 (8), 2909-

2917.

[140] K. Kollmann, G. Heller, C. Schneckenleithner, W. Warsch, R. Scheicher,

R.G. Ott, et al., A kinase-independent function of CDK6 links the cell cycle to

tumor angiogenesis, Cancer Cell, 2013, 24 (2), 167-181.

[141] A.S. Tigan, F. Bellutti, K. Kollmann, G. Tebb, V. Sexl, CDK6 - a review of

the past and a glimpse into the future: from cell-cycle control to

transcriptional regulation, Oncogene, 2016, 35, 3083-3091.

93 [142] C. Bertoli, J.M. Skotheim, R.A. De Bruin, Control of cell cycle transcription

during G1 and S phases, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2013, 14, 518–528.

[143] A.C. Garrido-Castro, S. Goel, CDK4/6 Inhibition in Breast Cancer:

Mechanisms of Response and Treatment Failure, Curr. Breast Cancer Rep.,

2017, 9, 26–33.

[144] K. Kollmann, C. Briand, F. Bellutti, N. Schicher, S. Blunder, M. Zojer, et al.,

The interplay of CDK4 and CDK6 in melanoma, Oncotarget, 2019, 10,

1346–1359.

[145] M. Bonelli, S. La Monica, C. Fumarola, R. Alfieri, Multiple effects of

CDK4/6 inhibition in cancer: From cell cycle arrest to immunomodulation,

Biochem. Pharmacol., 2019, 170, 113676.

[146] J.A. Maier, Impact of simulated microgravity on cell cycle control and

cytokine release by U937 cells, Int. J. Immunopathol Pharmacol., 2006, 19

(2), 279‐286.

[147] C.W. Habela, H. Sontheimer, Cytoplasmic volume condensation is an

integral part of mitosis, Cell Cycle, 2007, 6, 1613–1620.

[148] M. Webster, K.L. Witkin, O. Cohen-Fix, Sizing up the nucleus: nuclear

shape, size and nuclear-envelope assembly, J. Cell Sci., 2009, 122 (10),

1477-1486.

[149] K. Maeshima, H. Iino, S. Hihara, N. Imamoto, Nuclear size, nuclear pore

number and cell cycle, Nucleus, 2011, 2 (2), 113–118.

[150] S. Dinarelli, G. Longo, G. Dietler, A. Francioso, L. Mosca, G. Pannitteri, et

al., Erythrocyte’s aging in microgravity highlights how environmental stimuli

shape metabolism and morphology, Sci. Rep., 2018, 8 (1), 5277.

[151] M. Gioia, A. Michaletti, M. Scimeca, M. Marini, U. Tarantino, L. Zolla, et

al., Simulated microgravity induces a cellular regression of the mature

phenotype in human primary osteoblasts, Cell Death Discov., 2018, 4, 59.

[152] M.J.A. Moes, J.C. Gielen, R. Bleichrodt, J.J.W.A. van Loon, P.C.M.

Christianen, J. Boonstra, Simulation of Microgravity by Magnetic Levitation

and Random Positioning: Effect on Human A431 Cell Morphology,

Microgravity Sci. Technol., 2011, 23, 249-261.

94 [153] M.Y. Kapitonova, N. Salim, S. Othman, T.M. Muhd Kamauzaman, A.M.

Ali, H.M. Nawawi, et al., Alteration of cell cytoskeleton and functions of cell

recovery of normal human osteoblast cells caused by factors associated with

real space flight, Malays J. Pathol., 2013, 35 (2), 153-163.

[154] D.A. Fletcher, R.D. Mullins, Cell mechanics and the cytoskeleton, Nature,

2010, 463, 485-492.

[155] Y. Nakaseko, M. Yanagida, Cytoskeleton in the cell cycle, Nature, 2001, 412,

291–292.

[156] O. Cohen-Fix, Sister chromatid separation: Falling apart at the seams, Curr.

Biol., 2000, 10 (22), R816-R819.

[157] F. Spira, S. Cuylen-Haering, S. Mehta, M. Samwer, A. Reversat, A. Verma,

et al., Cytokinesis in vertebrate cells initiates by contraction of an equatorial

actomyosin network composed of randomly oriented filaments, Elife, 2017, 6,

e30867.

[158] Z. Chen, Q. Luo, C. Lin, D. Kuang, G. Song, Simulated microgravity inhibits

osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells via depolymerizing F-

actin to impede TAZ nuclear translocation, Sci. Rep., 2016, 6, 30322.

[159] A. Howard, S.R. Pelc, Nuclear incorporation of 32p as demonstrated by

autoradiographs, Exp. Cell Res., 1951, 2, 178.

[160] L.G. Lajtha, R. Oliver, F. Ellis, Incorporation of 32p and adenine 14C into

DNA by human bone marrow cells in vitro, Br. J. Cancer, 1954, 8, 367.

[161] Z. Zhong, W.S. Yeow, C. Zou, R. Wassell, C. Wang, R.G. Pestell, et al.,

Cyclin D1/cyclin-dependent kinase 4 interacts with filamin A and affects the

migration and invasion potential of breast cancer cells, Cancer Res., 2010,

70, 2105-2114.

[162] N. Bendris, B. Lemmers, J.M. Blanchard, Cell cycle, cytoskeleton dynamics

and beyond: the many functions of cyclins and CDK inhibitors, Cell Cycle,

2015, 14 (12), 1786-1798.

[163] I.Z. Uras, R.M. Scheicher, K. Kollmann, M. Glösmann, M. Prchal-Murphy,

A.S. Tigan, et al., Cdk6 contributes to cytoskeletal stability in erythroid cells,

Haematologica, 2017, 102 (6), 995-1005

PHỤ LỤC

1. Mật độ tế bào hucMSC

Bảng giá trị mật độ tế bào

Nhóm thí nghiệm

Failed

(P < 0.050)

Failed

(P < 0.050)

23 23

0 0

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Đối chứng 3867.124 3807.434 3198.667 3468.155 3522.525 2868.663 3361.918 3748.666 3989.325 3690.805 5037.722 5794.755 5116.699 2982.419 3193.696 3414.624 3124.896 2918.171 3183.775 3029.174 3690.805 4660.751 4959.964 SMG 3310.027 3095.866 2811.235 3258.936 3115.189 3029.174 2670.567 2954.713 2936.385 3258.936 3633.837 3168.952 2922.714 3091.054 3048.081 3120.039 3183.775 2895.562 2474.576 2754.957 3203.647 3095.866 3310.027

Mean 3766.554 3058.440

Std Dev 808.257 244.400

SEM 168.533 50.961

MS 5766389.912 356505.129

DF 1 44 45

SS 5766389.912 15686225.661 21452615.574

F 16.175

P <0.001

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Col 1 Col 2 Source of Variation Between Groups Residual Total

Critical Level 0.050

Diff of Means 708.114

Unadjusted P <0.001

t 4.022

Significant? Yes

The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.979 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Col 1 vs. Col 2 2. Chu kì tế bào Bảng tỉ lệ tế bào trong các pha của chu kì tế bào

Cell cycle progression (%)

Control

No. G0/G1 1 2 3 74.3 69.9 72.6

SMG

No. G0/G1 1 2 85.0 86.3 S 3.6 3.5 3.5 S 8.6 7.1 G2/M 19.9 24.3 22.1 G2/M 5.6 5.7

Passed (P = 0.939)

Passed (P = 0.090)

0 0

3 2

2.1. Pha G0/G1

SEM 1.281 0.650

Std Dev 2.219 0.919

P 0.004

MS 214.936 3.564

SS 214.936 10.692 225.628

F 60.309

DF 1 3 4

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Mean 72.267 Col 1 Col 2 85.650 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = 0.004). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.997 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Col 2 vs. Col 1

Critical Level 0.050

Diff of Means 13.383

Unadjusted P 0.004

t 7.766

Significant? Yes

2.2. Pha S + G2/M

Passed (P = 0.999)

Failed

(P < 0.050)

0 0

3 2

SEM 1.241 0.700

Std Dev 2.150 0.990

P 0.006

MS 176.661 3.409

SS 176.661 10.227 186.888

F 51.824

DF 1 3 4

Critical Level 0.050

Diff of Means 12.133

Unadjusted P 0.006

t 7.199

Significant? Yes

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Mean 25.633 Col 1 Col 2 13.500 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = 0.006). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.993 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Col 1 vs. Col 2

3. Hình thái nhân

Bảng giá trị diện tích nhân tế bào hucMSC

No. Well 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 D D D D D D D D D D D D E E Nuclear area (µm2) SMG Control 309 291 316 328 313 318 316 315 313 315 305 328 316 315 314 318 316 321 333 320 314 314 303 313 309 316 284 328

Failed

(P < 0.050)

Passed (P = 0.229)

0 0

24 24

318.167 314.042

15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 E E E E E E E E E E 313 317 329 321 315 327 329 306 315 324 308 319 314 320 331 288 325 304 331 336

SEM 1.739 2.549

Std Dev 8.519 12.488

F 1.787

P 0.188

SS 204.187 5256.292 5460.479

MS 204.187 114.267

DF 1 46 47

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Mean Col 1 Col 2 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0.188). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.131 The power of the performed test (0.131) is below the desired power of 0.800. Less than desired power indicates you are less likely to detect a difference when one actually exists. Negative results should be interpreted cautiously. 4. Hình dạng nhân

Bảng giá trị hình dạng nhân tế bào hucMSC

No. Well 1 2 3 4 5 6 7 8 9 D D D D D D D D D Nuclear shape value SMG Control 0.88 0.86 0.90 0.87 0.89 0.89 0.89 0.89 0.90 0.88 0.90 0.91 0.89 0.88 0.86 0.90 0.90 0.90

Failed

(P < 0.050)

Passed (P = 0.128)

0 0

24 24

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 D D D E E E E E E E E E E E E 0.88 0.89 0.87 0.84 0.89 0.89 0.90 0.87 0.90 0.88 0.90 0.90 0.89 0.88 0.87 0.89 0.88 0.89 0.90 0.87 0.89 0.88 0.90 0.89 0.90 0.89 0.89 0.91 0.89 0.89

SEM 0.00325 0.00221

Std Dev 0.0159 0.0108

F 2.219

MS 0.000412 0.000186

SS 0.000412 0.00855 0.00896

P 0.143

DF 1 46 47

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Mean 0.884 Col 1 Col 2 0.890 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0.143). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.178 The power of the performed test (0.178) is below the desired power of 0.800. Less than desired power indicates you are less likely to detect a difference when one actually exists. Negative results should be interpreted cautiously.

Hình PL1. Hình thái nhân tế bào hucMSC nhóm SMG

Hình PL2. Hình thái nhân tế bào hucMSC nhóm đối chứng

5. Cường độ nhân

Bảng giá trị cường độ nhân

Control

SMG

Control

SMG

Control

SMG

Control

SMG

4787688

4779878

4178670

4680125

3877870

5982957

7759812

5401545

5029879

4675836

4318818

5147564

5816418

6189094

7048077

6054470

4142261

5634409

3719092

4235311

5181465

5919090

5927987

5144822

4801783

6000534

4297952

5486546

746781

6416685

5483275

6298467

4649185

5437299

4520854

6035705

5997138

6212412

6535881

5165065

4831563

4984421

4628165

5825810

6097254

6035797

4249187

4771485

4523880

5372341

4924872

6323945

2521711

5491179

3405625

5956476

5015693

5813861

4345530

4971953

6352375

5870915

7335772

5708086

4295855

4952514

4257335

4541749

6790639

6419981

6530049

5578850

4862617

4756374

4413614

4736299

6553474

5399690

4859951

5708414

4522371

4757287

4525367

7053789

7507634

5697794

732126

4991000

3779666

5019227

4224428

4695287

8592450

6812855

5873646

5216093

4921243

4780473

4146411

5024025

9795890

5016856

8248247

6078758

3581303

4858832

4298965

6192156

13412162

5913032

6270448

5706486

4427222

4666467

3734410

5508052

1621498

5593872

5476517

5562373

3759605

5354314

4232041

6223179

3947374

6363195

6402544

5069862

4202233

4843887

4335013

4427048

6196360

5811877

6089473

6288476

4442256

4938074

4171518

5979487

8052981

6701308

7062755

5482078

4170146

4547560

4166702

5223629

9101175

5233227

5244149

5689912

4634063

4418183

4318638

5312233

7572376

6173961

7973828

5473320

4091199

4555582

4262865

5561894

4102090

5068644

764326

6127165

4957336

4999124

4258668

5987724

8180821

5534831

7621745

5632074

4322459

5468434

4281843

5007428

5270392

5506044

6904886

5609279

4688153

4823956

4431627

5062068

6788474

5832472

7700343

5817602

5354260

5744090

4085911

5554764

7018190

5497071

5642301

5297148

5110666

799947

4317703

6318036

5667127

5746829

6115281

5170867

3997958

3836806

3044260

4523607

6292827

5818923

7513947

5489545

4067397

4943124

4030756

6648129

5743704

5143079

7997738

4575575

4462689

4840805

3960967

6134055

2661480

5606086

6120738

5186511

4025051

3157027

3935499

4670812

5441249

4904157

6338478

5138873

4297368

4933653

4246122

5328586

7139261

1686891

2605679

4671077

4302858

4606659

4377355

4992663

3357053

5722170

5844414

2770464

3643012

4709743

4434159

6345271

6583733

5464693

7314523

5126200

4554126

5196313

4267104

4998509

9276359

4579960

7808278

5608247

3905600

5709078

4173663

5172266

9236507

5094004

7116553

5774577

3226417

4752500

4221053

5897607

6640400

5655222

8059776

5553283

4276969

4595838

3920919

6162608

7518465

5933636

7092462

5859171

4601472

4794131

4438592

5935772

8767902

5591866

8001801

4470931

4395746

4711533

4457458

4980484

7998215

5526235

8505934

5352202

4277678

4919609

4248100

5314699

7690137

5362363

5616542

4890593

4832600

4516933

4320643

5175644

6089107

5538546

7990380

5358719

4805469

6044700

4255558

5750277

7660824

5780287

6688842

4994410

4247336

5688780

4034187

6104556

5166716

5894843

5193184

5319855

5065830

5024907

4251992

5668502

8001531

5714725

5445989

6198054

4519319

4744259

3794692

6003966

15174018

5672795

6786807

6030895

4021711

4966128

4587565

6409732

6081901

5262945

5496302

5890107

4435288

4937833

3692014

5830211

8224218

6124772

5322845

5243226

4680230

5085137

3917699

6031597

6114499

5564188

6866932

5377540

4658163

4522032

4209002

7435556

1330495

4720453

7929666

5174441

4612339

4220477

4254523

5600528

5305200

4907918

8626171

5052647

6991453

5301980

5084499

4233915

5170765

5036622

5617515

4467459

6273407

5279537

4439026

4804024

4775200

6021177

5504533

4698806

7087319

5291260

4336247

5093226

4865752

5210751

4803160

4938065

5821919

4629056

4608487

5281708

5358634

5145155

5256304

4937520

6502860

4531452

4961563

4398325

4752804

4816234

5183634

5219554

6067158

4726466

4846545

4680427

4538365

5157090

5069154

4525812

6607301

4883319

4906247

4332615

5660006

4715771

5408608

1319459

7049594

4097994

5048507

4601616

5132726

5000070

5429190

4220329

5908667

4574449

4912948

4585225

5303765

4890143

5075691

4441677

7528910

4723567

5420760

4763381

4729672

5337092

5402469

4599133

6909949

4745162

5386146

4811504

5168013

5064327

5029560

4999341

6227119

4670792

5870009

4176897

5647054

4773694

5450553

4396503

6182829

4662690

5633073

4923755

5320893

4548650

4736440

4541368

7169021

4817588

5429876

4824412

4818490

4721450

4918385

4350478

8002455

5210972

4745344

5144658

4988958

4599142

5572918

5301734

7280572

4744284

2706551

4504889

6020029

5347638

4921173

4891811

7274014

5029433

4468120

4688247

3495261

5218402

4477708

4672748

5755167

4229146

3647541

4758345

4685466

5384354

1247590

5120935

7659817

4681814

3887886

5383051

4445256

5158963

4846335

4212907

8133362

4965976

2410586

4134470

4788610

4974118

4120248

4356878

7423253

5156089

4062432

4515633

2988105

4887139

4996464

5667721

5681815

4718904

4580301

5824106

3968046

4792455

3721458

4866375

6346790

5343796

4607176

5079067

4854857

5047113

3970169

4463380

7538447

5009996

4635554

5242255

4658868

4644114

5234713

5145987

7761314

4346509

4753667

5252326

4223868

5240945

4920763

5162242

8208033

4848259

4243312

5194553

3730474

4472783

4712995

4764772

8094551

4844053

4664550

4716784

4331580

4778531

5636882

5330127

7329029

5144343

5303261

4899281

4560799

4757530

4601586

4319225

7281246

2794669

5224569

4810600

4890498

4536778

5002154

4491133

7094277

4880158

4069069

3506652

5016355

4966653

5930621

4680750

7228249

4577024

4184943

5562375

4663781

1376649

5035217

4610975

7680828

4211078

5080109

4972479

5141308

4413649

4639435

2721082

7205211

3701720

4550467

4347817

5125846

4287967

4162132

5032362

6811627

5392256

4888851

4509021

5234823

5087572

4823761

4470047

8268585

4032410

4297010

4793207

4719317

1981384

5353773

4562644

4000473

4612749

4112739

2884214

4653163

4122112

4984205

1967680

6550482

5555296

5132876

4416126

3677790

4520766

4776200

5019371

7249470

4918433

4074438

5175031

4442750

4983371

4458395

5103723

7601784

4561002

4439998

5919193

4814804

4661310

4595168

4356095

7316526

5224013

4382673

5414190

4674053

5012727

3591380

4459248

5403758

4791650

4247054

4763616

4853991

5531464

4088665

4864066

5294105

4830292

4245091

5063133

4544285

5205662

3574841

4562430

4672603

5230576

4848222

4847072

3554986

5573339

4615252

5838752

4933583

4798748

4708977

4911939

4600697

5429708

4713363

4797784

5064716

4826512

4247548

5313653

5059589

4599944

4631711

4470205

5196552

4627104

4718447

5065903

5000574

5283141

4959230

5080424

4995481

4690280

4690617

5489929

5324198

5245901

5167909

5440967

5155709

4648793

5275973

4909327

5876333

4961266

5087453

4977998

4499088

5114131

5396799

4922710

5220481

5109368

4931971

4844923

4711361

4642539

4995967

4833922

4911103

6090788

4339093

4569327

4579514

4781496

6554202

5004742

837981

5769694

8317675

8203376

5639019

4359121

5733831

4588670

977017

6321257

6263899

7082226

4876384

4719226

7089551

5133434

6539019

4713843

7660240

8209893

4642704

4621169

6800346

4748731

8583456

5999571

7663346

5959439

5280856

4413050

6119740

4997953

12008869

5604103

7700893

9315741

4983839

4845179

7810841

4976379

6251468

6410885

6001659

6310327

4950982

4319897

6777524

5145713

8609175

5695991

7087844

8474054

4789320

5187228

6495892

3951966

7339995

6022199

12950723

7311074

4958659

4713345

6302594

5983238

8372614

4562974

12729381

7798094

5036434

4664548

6709988

6419857

1131902

6897828

11534779

6840221

4928598

4250918

7248040

5011803

7295120

6728423

11579017

6463888

5083427

5165008

7090997

4884675

9158803

8364327

8137563

7130471

5028796

4920792

7600098

5492302

4293947

7628789

12726422

8178366

5788806

5307310

8295396

4966975

3046724

7940772

4758409

7160302

5172228

4597781

8054237

5636575

10036848

7388198

8550945

5070410

5567903

5392821

7313722

5981265

12318979

8252075

8957454

5052217

4671271

5564432

6926615

5228615

8720308

6418848

7818721

7661131

4532800

4644177

7164868

5310737

8178981

7740932

9573817

6246882

4301353

5191976

6355910

6000717

10490649

7395046

7879308

6274469

5572078

5087597

7838185

5365731

11313544

7041135

9488732

7710238

3968738

4779256

5465321

5742886

9282757

6247695

8860872

7141404

4528407

5169751

7125810

5579588

9159579

6867479

6254187

7218822

4687530

5620458

6482128

5030209

11599010

7792454

6913564

6961624

4426709

5314436

5469994

5327868

11174137

8601559

8899810

6627734

4757241

4396182

6871757

5685673

12971629

8326637

10304292

6924104

5024521

5435766

6826638

4973884

9998622

8167929

10660436

8305495

5430433

4879407

6982941

5125348

8042687

7899149

8756786

7556717

5349097

4894117

6684658

5398267

13873774

8126045

9068968

6978321

4843595

4635449

7426229

5777324

7435190

8874670

7479679

7899469

5269077

4612233

7094453

5766910

7696884

7303630

9790585

6778956

4325406

4902230

6362538

5425866

7562603

8216745

6530825

7441877

5116210

5421271

7854468

5541052

9224776

7103104

6559199

6544693

4909219

2531909

6766766

6466485

8995431

6321994

6484982

6032149

6089717

4999052

6541116

2927137

9097591

7695620

6596744

6033200

5253017

4868774

7419767

6549957

3803109

6887880

6345885

7324984

5417923

4347744

7796655

5473445

10595772

6183112

7096681

3244917

5696058

3435656

6121391

4846059

8016422

5554439

6453685

6514903

4899342

5064214

7122687

5022967

8243932

6454656

6789586

6453123

4854731

5315853

6931874

5083740

8855584

5997959

6086347

8410665

4900598

4083734

6766918

5755798

1242424

6283070

7965571

9897104

5305433

5449187

5979452

4485061

4826429

5425434

6566077

10450212

6314869

4807418

6063594

6618651

955220

5840489

6758859

6044711

6032096

5379446

6525810

5227211

5885595

6661618

8125153

5371885

5275700

4807321

6285842

6418128

5810768

9126529

7474913

7368192

5978232

4559316

6770084

5204738

5776159

7554860

7693382

7441636

6304854

5175140

876631

5860386

5211434

7827635

6414474

8563159

6367312

5003832

928083

5371172

6722675

6845332

7314782

6859281

6771441

5072341

605590

4630339

8810168

7089717

7992853

6940623

6835564

4732689

2747835

4312034

5415602

8090006

7777756

6581283

6891962

5416270

841281

5944716

6491087

7146877

7425264

6050069

7832824

7077565

7708052

4645349

7696463

5770555

5864419

6287036

7137134

7159012

7405486

4468242

7531595

5730839

6361316

5596891

7563397

6926947

6690626

6493986

6633417

6075862

5900206

5260631

5530597

8147924

6365224

6529726

6264366

7546717

5821260

6079748

7871321

7391634

6737475

5984709

6551993

7121374

5748807

8247480

5826752

8959066

6933564

5851578

7397831

6125725

5490621

6492090

6614534

8251793

6440622

5855905

6997079

6965655

6642526

6047089

6811059

7630036

6701587

4831989

6414680

7865181

7686252

4975414

5398971

5444847

6839248

6146733

7396424

5123071

3219687

6710106

6595622

6065300

6799617

4539602

7001227

6340645

7048355

6228682

6135521

5487144

5581658

4569801

6606359

5489058

6258084

7285927

7114141

6461844

6755539

4837493

4572214

5308152

8599467

4767430

6029930

6691380

7952417

6595637

7469472

4936889

7526729

4933093

6441848

6777105

5958143

6568914

7652819

5318506

5942137

4969960

7472823

5009797

7127474

7207527

5581830

6283782

6963850

5492513

6177207

6527734

6157186

6200948

6414524

6738154

5015130

6395700

6276301

6469601

6957961

7197222

6318382

5967235

5947313

6869902

6094149

6255327

6306465

5849753

7747040

6195311

6624469

6062350

6808106

6102203

5640089

6217826

6856959

6844088

5421743

6255681

6668025

5506533

5873348

6500484

7048161

5919340

5021439

5668475

6284580

6136773

6508278

6594315

7403173

4976598

5096617

6801857

7210943

6967550

6831050

6456358

7669861

5210354

6225142

6594382

8410019

5959774

7713775

7756737

7375199

7392578

5417271

6695981

7546138

6395091

6481908

6884165

7399557

6143276

5714790

7047907

6021553

6949511

7159796

6627027

7946078

5767095

4971387

6533210

7379599

6467803

6103707

6449320

7179592

6649283

5552579

5429092

5945992

7132446

7222345

6607512

6816359

5652518

6321195

7083973

6262300

6955859

5203362

6451271

6384060

7957419

6268025

6529686

5458884

6518319

5342959

6727555

5663836

7033577

7675802

5363968

5953284

6343213

6326490

6923593

6020568

5807043

5655652

6554859

5842324

7837496

7834709

6348972

6482410

6383549

8531015

7678322

6314029

6481646

6554873

6682436

5811162

6039444

5206798

8005165

7255340

6585488

7258143

6186469

7206501

5547856

5317390

6818111

5506184

5712843

6348593

6541010

5551297

6230777

6016217

6207647

5882475

7118076

7231839

6670507

6862795

6798243

6392838

5850739

5486410

6001574

5826146

6189349

6941073

7410796

7521839

7905880

6348768

7802835

6095063

7075779

8085008

6012867

5711390

6199552

8731800

6153874

6595224

6985231

6752270

4973311

7673837

6393452

6020929

7227776

6021717

5688491

5915848

6756909

5534487

6132274

4883701

7069068

5966760

6914014

6468646

5579932

5480366

6006141

6091829

6587548

5630874

9547529

9646995

5123335

5802284

6848277

6875994

6513252

7462722

5128499

7054546

3346889

5740268

7088354

5225289

6901573

6833559

5444195

5800997

8786094

6620175

6751053

7136967

5146562

6672198

6034676

6422786

5580352

6677507

7057128

5788785

6877724

5283806

5566500

7649458

6222112

5696645

6142184

7435238

5341384

5949941

7448676

5498092

6654078

5704408

6253189

6197986

6193703

6379853

5907578

7873373

6438456

7264225

5406501

5493957

6425111

4534175

6922823

6157414

7072950

5154501

6849218

4915341

5244145

4718675

6209678

5628649

6402137

6849458

6735891

6620100

6905896

5521855

7302404

5061275

5931597

6680340

Failed

(P < 0.050)

Failed

(P < 0.050)

0 0

784 815

SEM 65063.439 39469.534

Std Dev 1821776.295 1126784.347

Mean 5967253.571 5629317.186

MS

SS

F

4.563E+013 20.065 2.274E+012

4.563E+013 3.632E+015 3.678E+015

P <0.001

DF 1 1597 1598

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Col 1 Col 2 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.997 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Col 1 vs. Col 2

Critical Level 0.050

Diff of Means 337936.385

Unadjusted P <0.001

t 4.479

Significant? Yes

6. Phân tích Western Blot

Intensity of Bands (analyzed by ImageJ)

α-TUBULIN

β-ACTIN Cyclin A1 2

CDK4

CDK6

Group No. GAPDH 1

53931.84

18333.28

2524.37

9211.26

34798.97 34714.48

SMG

2

48919.31

16868.09

2738.56

8820.67

35229.87 39004.63

3

48330.19

16965.21

2695.73

7093.41

35173.04 35330.48

1

66134.37

52887.93

55785.03

30211.23

54143.19 52916.63

Control

2

60271.77

49987.32

50311.37

31264.08

55326.97 58401.06

3

60062.42

49599.56

52284.79

30238.08

54748.73 52884.21

Passed (P = 0.144)

Passed (P = 0.734)

0 0

3 3

6.1. α-TUBULIN

SEM 0.00930 0.0176

Std Dev 0.0161 0.0304

MS

2.816 0.000593

F 4748.441

SS 2.816 0.00237 2.818

P <0.001

DF 1 4 5

Critical Level 0.050

Diff of Means 1.370

Unadjusted P <0.001

t 68.909

Significant? Yes

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Mean 1.000 Col 1 Col 2 2.370 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Col 2 vs. Col 1

Passed (P = 0.365)

Passed (P = 0.231)

6.2. β-ACTIN

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Mean 1.000 Col 1 16.180 Col 2

3 3

0 0

Std Dev 0.0991 1.632

SEM 0.0572 0.942

MS 345.635 1.337

DF 1 4 5

P <0.001

F 258.508

SS 345.635 5.348 350.983

Critical Level 0.050

Diff of Means 15.180

Unadjusted P <0.001

t 16.078

Significant? Yes

Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Col 2 vs. Col 1

Passed (P = 0.834)

Passed (P = 0.330)

0 0

3 3

SEM 0.0833 0.226

Std Dev 0.144 0.391

MS 5.698 0.0869

F 65.577

P 0.001

SS 5.698 0.348 6.046

DF 1 4 5

Critical Level 0.050

Diff of Means 1.949

Unadjusted P 0.001

t 8.098

Significant? Yes

6.3. Cyclin A1 A2 One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Mean 1.045 Col 1 2.994 Col 2 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = 0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Col 2 vs. Col 1

Passed (P = 0.392)

Passed (P = 0.426)

6.4. CDK4

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test:

3 3

0 0

SEM 0.0377 0.00663

Std Dev 0.0654 0.0115

P 0.002

MS 0.106 0.00220

DF 1 4 5

F 47.943

SS 0.106 0.00881 0.114

Critical Level 0.050

Diff of Means 0.265

Unadjusted P 0.002

t 6.924

Significant? Yes

Group Name N Missing Mean 1.000 Col 1 1.265 Col 2 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = 0.002). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.999 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Col 2 vs. Col 1 6.5. CDK6

Passed (P = 0.676)

Failed

(P < 0.050)

3 3

0 0

SEM 0.0615 0.0115

Std Dev 0.106 0.0199

P 0.024

MS 0.0732 0.00586

DF 1 4 5

SS 0.0732 0.0235 0.0967

F 12.487

Critical Level 0.050

Diff of Means 0.221

Unadjusted P 0.024

t 3.534

Significant? Yes

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Mean 1.000 Col 1 1.221 Col 2 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = 0.024). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.723 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Col 2 vs. Col 1 7. Cường độ vi ống

Tubulin intensity of hucMSC (analyzed by ImageJ)

Figure Figure intensity

Background intensity

Tubulin intensity

Cell number/Figure

Tubulin intensity/cell

Control group

A

16,090,340.00

11,213,919.84 4,876,420.16

38

128,326.85

A1

15,378,048.00

10,427,780.84 4,950,267.16

37

133,791.00

A2

15,863,352.00

11,077,640.00 4,785,712.00

38

125,939.79

A3

15,200,579.00

10,841,744.93 4,358,834.07

28

155,672.65

A4

16,515,191.00

11,697,418.26 4,817,772.74

30

160,592.42

SMG group

B

13,048,743.00

10,541,320.42 2,507,422.58

32

78,356.96

B1

12,411,693.00

9,832,826.97 2,578,866.03

29

88,926.41

B2

11,971,641.00

9,629,396.10 2,342,244.90

23

101,836.73

B3

12,730,668.00

10,021,064.77 2,709,603.23

29

93,434.59

B4

12,403,496.00

9,681,353.41 2,722,142.59

29

93,866.99

Passed (P = 0.503)

Passed (P = 0.217)

0 0

5 5

SEM 7205.714 3842.679

Std Dev 16112.465 8592.491

Mean 140864.542 91284.336

MS 6145492067.506 166721218.830

SS 6145492067.506 1333769750.643 7479261818.149

P <0.001

F 36.861

DF 1 8 9

Critical Level 0.050

Diff of Means 49580.206

Unadjusted P <0.001

t 6.071

Significant? Yes

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Col 1 Col 2 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Col 1 vs. Col 2

Hình PL3. Nhuộm tunulin tế bào hucMSC

Actin intensity of hucMSC (analyzed by

ImageJ)

8. Cường độ vi sợi

Figure

Figure intensity

Background intensity

Actin intensity

Cell number/Figure

Actin intensity/cell

Control group

A

19,093,256.00 13,157,622.36

5,935,633.64

37

160,422.53

A1

17,661,326.00 13,192,187.07

4,469,138.93

21

212,816.14

A2

17,632,581.00 13,354,417.47

4,278,163.53

22

194,461.98

A3

18,226,418.00 13,929,458.07

4,296,959.93

22

195,316.36

A4

18,196,846.00 13,541,467.73

4,655,378.27

27

172,421.42

SMG group

B

21,541,076.00 18,116,715.30

3,424,360.70

20

171,218.03

B1

20,660,913.00 17,311,600.11

3,349,312.89

23

145,622.30

B2

20,287,832.00 18,226,570.22

2,061,261.78

15

137,417.45

B3

20,434,042.00 17,900,260.85

2,533,781.15

21

120,656.25

B4

20,730,950.00 17,760,663.10

2,970,286.90

19

156,330.89

Passed (P = 0.492)

Passed (P = 0.866)

0 0

5 5

SEM 9247.093 8539.540

Std Dev 20677.128 19094.992

Mean 187087.686 146248.984

P 0.012

MS 4169498952.612 396081172.735

SS 4169498952.612 3168649381.881 7338148334.493

F 10.527

DF 1 8 9

One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name N Missing Col 1 Col 2 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = 0.012). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.780 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Col 1 vs. Col 2

Critical Level 0.050

Diff of Means 40838.702

Unadjusted P 0.012

t 3.245

Significant? Yes

Hình PL4. Nhuộm actin tế bào hucMSC

9. TBS 10X (Tris-buffered saline)

Công thức cho 1 lít dung dịch 10X:

‒ 24 g Tris base (khối lượng riêng: 121.1 g)

‒ 88 g NaCl (khối lượng riêng: 58.4 g)

‒ Hòa tan vào 900 ml nước cất

‒ Điều chỉnh pH đến 7,6 bằng HCl

‒ Bổ sung nước cất đến 1 l

Đối với dung dịch 1X, pha loãng 1 phần thể tích dung dịch 10X với 9 phần thể

tích nước cất và điều chỉnh pH đến 7,6. Nồng độ các chất trong dung dịch TBS 1X

là 20 mM Tris và150 mM NaCl.

10. TBST (Tris-buffered saline, 0.1% Tween 20)

Công thức cho 1 lít dung dịch:

‒ 100 ml TBS 10x

‒ 900 mLl nước cất

‒ 1 ml Tween 20

11. Nguyên lý hoạt động của máy clinostat 3D sử dụng trong nghiên cứu

Để đánh giá tác động của lực lên mẫu thí nghiệm đặt ở khung trong máy

clinostat 3D, các vector gia tốc khung tổng quát và vector gia tốc khung trong được

tính toán dựa trên các hệ trục tọa độ được mô phỏng trong Hình PL5.

Hình PL5. Hệ tọa độ các khung trong máy 3D clinostat. Các mẫu được lắp đặt ở

khung trong được quay theo 2 trục.

Vector gia tốc khung trong được tính toán theo công thức sau:

⃗ ( ) ⃗ ( )

( ) + ⃗ ( ) *

( ) ( ) ( )

. [ ] . ⃗ ( )

( ) ( ) ( ) ( )

Giá trị αo và βo được chỉnh bằng không (αo = βo = 0). Vận tốc gốc được hiệu chỉnh

( )

( )

như nhau cho hai khung = = ω. Sau khi thay thế và đơn giản chúng ta có.

( )

( )

⃗ ( ) = ( ) ( )

( )

Để tính trọng lực trung bình, các giá trị trọng lực trung bình theo 3 hướng X, Y và Z

được tính toán, sau đó giá trị trung tổng trọng lực trung bình được tính toán bằng

cách cộng vector.

) ⃗ = ω2. (

= | ⃗ | = ω2.√

Trong đó:

thời gian (s) t:

khung trong I:

khung ngoài O:

khung tổng quát G:

góc quay của khung ngoài so với khung tổng quát tại thời điển t (rad) :

góc quay của khung trong so với khung ngoài tại thời điểm t (rad) :

vận tốc góc của khung ngoài (rad/s) :

vận tốc góc của khung trong (rad/s) :

ω: vận tốc góc khi khi tốc độ quay hai khung bằng nhau (rad/s)

⃗ ( ): vector gia tốc ở khung tổng quát tại thời điểm t (m/s2)

⃗ ( ): vector gia tốc ở khung trong tại thời điểm t (m/s2) :gia tốc trung bình ở khung trong (m/s2)

, , : hệ tọa độ X, Y, Z, của vector điểm ⃗ bất kì ở khung

trong (m)