Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một trong những cây trồng

quan trọng hàng đầu ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Việc

tiêu thụ đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương đang gia tăng trên toàn thế giới

do những tác dụng có lợi tới sức khỏe của con người, như phòng chống ung thư,

ngăn ngừa bệnh tiểu đường và béo phì, hạ cholesterol và bảo vệ rối loạn thận.

Hạt đậu tương là nguồn cung cấp dồi dào protein (32%-52%), lipid (12%-25%),

vitamin (B1, B2, C, D, E...), nhiều amino acid thiết yếu (lysine, tryptophan,

methionine, cysteine và leucine), chất xơ, năng lượng và các chất chuyển hóa

thứ cấp. Vì vậy, hạt đậu tương được sử dụng làm thực phẩm cho con người,

thức ăn cho gia súc, là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp chế biến, mặt hàng

xuất khẩu có giá trị kinh tế cao. Không chỉ có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao,

cây đậu tương còn giữ vai trò quan trọng trong việc cải thiện độ phì và sử dụng

bền vững tài nguyên đất canh tác. Gần đây, một trong những ứng dụng được

quan tâm nhiều nhất của cây đậu tương là sản xuất dầu diesel sinh học.

Đậu tương được xem là cây trồng nhạy cảm với hạn. Hạn là yếu tố phi

sinh học gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất và có thể làm giảm năng suất cây

đậu tương khoảng 40%. Hạn ảnh hưởng đến tất cả các thời kì sinh trưởng và

phát triển của cây đậu tương, trong đó thời kì ra hoa và thời kì sau ra hoa đã

được chứng minh là những thời kì bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất. Hiện nay, do

những biến đổi về khí hậu, đặc biệt là hạn kéo dài, lượng mưa không đều ở các

thời điểm trong năm và giữa các vùng miền gây khó khăn cho sản xuất nông

nghiệp ở nhiều quốc gia, tại Việt Nam cũng không tránh khỏi những tác động

tiêu cực đó. Hơn nữa, Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc,

khả năng giữ nước kém nên việc canh tác các cây trồng nói chung và cây đậu tương

nói riêng gặp rất nhiều khó khăn. Do đó, việc chọn tạo giống đậu tương có khả

năng chịu hạn tốt là vấn đề cấp thiết, mang tính thời sự ở Việt Nam cũng như

trên thế giới.

Tính chịu hạn của cây đậu tương do nhiều gen quy định, sản phẩm của các

gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện khả năng chịu hạn hoặc có chức

năng điều hoà nhóm gen chịu hạn. Một số gen của đậu tương đã được mô tả là

có phản ứng với tác động của hạn ở mức phiên mã. Trình tự cis và nhân tố trans

giữ vai trò quan trọng trong sự biểu hiện gen đáp ứng tác động của hạn. Các

protein DREB - Những nhân tố có tác động trans liên kết với các trình tự cis để

kích hoạt sự biểu hiện của các gen mục tiêu khi có tín hiệu stress ở thực vật.

Việc cải thiện đặc tính di truyền của cây đậu tương để thích nghi với hạn

được các nhà khoa học tiếp cận theo nhiều hướng: Lai hữu tính, gây đột biến

thực nghiệm, chọn lọc quần thể, công nghệ tế bào, công nghệ gen. Trong đó,

công nghệ gen được xem là biện pháp đem lại hiệu quả cao. Gần đây, đã có

những tiến bộ trong việc cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương thông qua các

kỹ thuật tác động vào nhân tố phiên mã hoặc yếu tố tín hiệu ở cây trồng chuyển

gen. Tuy nhiên ở nước ta, một số nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc chuyển các

gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn vào cây đậu tương, ít thấy

công bố kết quả hoàn chỉnh về chuyển gen mã hóa protein là nhân tố kích hoạt

quá trình phiên mã, trong đó có gen GmDREB2. Do đó, việc nghiên cứu đặc tính

phân tử, xác định chức năng gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới tính chịu

hạn, cũng như việc chuyển các gen này từ các giống đậu tương có khả năng chịu

hạn tốt sang giống có khả năng chịu hạn kém đang trở thành hướng nghiên cứu

triển vọng, nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học ở trong và

ngoài nước.

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án:

"Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu

hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)".

2. Mục tiêu nghiên cứu

2.1. Phân tích được đặc điểm của gen GmDREB2 phân lập từ các giống đậu

tương Việt Nam có khả năng chịu hạn khác nhau.

2.2. Biểu hiện được protein tái tổ hợp và chức năng sinh học của gen chuyển

GmDREB2 trên cây thuốc lá chuyển gen.

2.3. Tạo cây đậu tương chuyển gen và biểu hiện được protein tái tổ hợp

GmDREB2 trên cây đậu tương chuyển gen.

3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Nghiên cứu thông tin, tách dòng và xác định trình tự gen GmDREB2 phân lập

từ cây đậu tương. Phân tích tính đa dạng trong trình tự nucleotide và protein của

gen GmDREB2 ở cây đậu tương.

3.2. Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc mang gen

GmDREB2.

3.3. Nghiên cứu chuyển gen và phân tích biểu hiện gen GmDREB2 trên cây

thuốc lá: (i) Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmDREB2. (ii)

Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp GmDREB2 trong cây thuốc lá. (iii)

Đánh giá khả năng chịu hạn của các cây thuốc lá chuyển gen.

3.4. Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2 vào cây đậu tương và

phân tích cây đậu tương chuyển gen.

4. Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống, từ việc

phân lập, tách dòng phân tử gen GmDREB2 đến thiết kế vector chuyển gen, tạo

cây chuyển gen và phân tích sự biểu hiện gen chuyển GmDREB2, cụ thể là:

(1) Gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tương có kích thước 480 nucleotide,

mã hóa cho 159 amino acid. Các trình tự gen GmDREB2 đã được đăng ký trên

Ngân hàng Gen mang các mã số: LK936507, LK936508, LK936509, HG965097,

HG965098, HG965099.

(2) Protein tái tổ hợp GmDREB2 biểu hiện mạnh trên cây thuốc lá chuyển gen.

Khi bị hạn, ở các dòng thuốc lá chuyển gen có hàm lượng prolin tăng từ

211,17% - 332,44% sau 5 ngày bị stress hạn và tăng từ 262,79% - 466,04% sau

9 ngày bị stress hạn.

(3) Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang gen GmDREB2 và biểu hiện

thành công protein tái tổ hợp GmDREB2 trên giống đậu tương DT84.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án

5.1. Về mặt khoa học

Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen

GmDREB2 phân lập từ 6 giống đậu tương Việt Nam (DT2008, CB, CBD, ĐT26,

ĐT51, ĐVN5). Những cơ sở khoa học của việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen

nhằm cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định thông qua

việc tăng cường protein tái tổ hợp GmDREB2 và biểu hiện chức năng sinh học

của gen chuyển GmDREB2 trên cây thuốc lá và cây đậu tương. Những kết quả

bước đầu về tạo cây chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật

chuyển gen trong mục đích nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương ở

Việt Nam.

Các bài báo công bố trên các tạp chí Khoa học - Công nghệ quốc tế và ở

trong nước, cùng với 6 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen là những tư liệu

tham khảo có giá trị trong việc nghiên cứu, giảng dạy sinh học và công nghệ

sinh học.

5.2. Về mặt thực tiễn

Các trình tự gen GmDREB2 phân lập được, cấu trúc vector chuyển gen

thực vật mang gen GmDREB2, các cây thuốc lá chuyển gen tạo được có khả năng

chịu hạn tốt hơn so với cây đối chứng, các cây đậu tương chuyển gen đã góp phần

giải quyết những vấn đề cụ thể về việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải

thiện khả năng chịu hạn ở cây đậu tương nói riêng và các cây trồng khác nói

chung, mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ mới trong thực tiễn chọn giống

cây trồng chịu hạn ở Việt Nam.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT

1.1.1. Cơ chế chịu hạn của thực vật

Stress phi sinh học là nguyên nhân chính dẫn đến mất mùa trên toàn

thế giới, gây thiệt hại đến năng suất bình quân hơn 50% ở các loại cây trồng

chính [18]. Trong số các stress phi sinh học, hạn là yếu tố chính làm giảm năng

suất cây trồng. Stress hạn phá vỡ sự cân bằng nội môi và phân bố ion trong tế

bào [197]. Cây trồng phản ứng với các stress hạn thông qua các con đường

truyền tin và phản ứng tế bào như sản xuất protein stress, tăng cường các chất

chống oxi hóa, tích lũy các chất tan [36]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, hạn

gây ra những tác động tiêu cực tới tất cả các cấp độ và các giai đoạn phát triển

của thực vật. Để chống chịu với các stress hạn, thực vật phải thực hiện thông qua

chuỗi các quá trình, với sự tham gia của rất nhiều yếu tố. Khi có hạn, các phản

ứng sinh hóa khác nhau được kích hoạt trong cây trồng để tích lũy nhiều loại

chất dễ hòa tan, như đường, amino acid, glycine betaine và polyamine để giúp

các cây trồng đối phó với hạn [71], tăng lượng chất chống oxy hóa khác nhau,

chẳng hạn như glutathione S-transferase (GST), superoxide dismutase (SOD),

guaiacol peroxidase (POD) và catalase (CAT) chống lại điều kiện oxy hóa để

phục hồi sau một thời gian nhất định bị hạn [12].

Gần đây, những tiến bộ trong việc hiểu biết về biểu hiện gen, cơ chế

phiên mã và việc truyền tín hiệu phản ứng với stress hạn của cây trồng đã được

công bố [198]. Mặt khác, phân tích sinh học phân tử và di truyền học đã tạo điều

kiện thuận lợi cho những khám phá về chức năng gen [155], [170] và được ứng

dụng trong kỹ thuật di truyền với việc sử dụng một số gen chức năng hoặc một

số gen điều hòa để kích hoạt các cơ chế liên quan đến tính chịu hạn, chịu mặn

của cây trồng [176]. Vì vậy, cơ sở phân tử đặc tính chịu hạn của thực vật nói

chung và cây đậu tương nói riêng cũng dần được sáng tỏ. Các gen phản ứng với

stress hạn có thể chia thành 2 nhóm chính: Nhóm gen chức năng mà sản phẩm

của chúng tham gia trực tiếp vào các phản ứng stress hạn như gen điều hòa áp

suất thẩm thấu [167], gen mã hóa các protein chống oxi hóa [100], gen mã hóa

protein LEA (Late embryogenesis abundant) [181], gen mã hóa protein vận

chuyển LTP (Lipid trasfer protein) [111], aquaporin [48]; nhóm gen điều khiển

cho ra các sản phẩm bao gồm các nhân tố phiên mã và các protein kinase truyền

tin. Các nhân tố phiên mã liên quan đến khả năng chịu hạn đang được quan tâm

nghiên cứu bao gồm DREB [24], WRKY [193], [195], bZIP (Basic leucine

zipper) [54], MYB (Myeloblastosis oncogene) [90], [103], NCED (Nine-cis-

epoxycarotenoid dioxygenase) [137] và AP2/ERF [193]. Các protein kinase truyền tin bao gồm: Protein kinase phụ thuộc Ca2+ [80], MAPK (Mitogen activated

protein kinase) [112], RPK (Receptor-like protein kinase) [29], PIK (Phophatidyl

inositol kinase) [185] và protein kinase serine/threonine [102] (Hình 1.1).

Hình 1.1. Cơ chế chịu hạn của thực vật

Sự biểu hiện của các gen cảm ứng với hạn liên quan chặt chẽ với quá

trình phiên mã. Vì vậy, sự biểu hiện của các gen này chịu ảnh hưởng rất nhiều

của môi trường trong và ngoài cơ thể, với nhiều mức độ điều hòa.

Các nhân tố phiên mã (Transcription factors - TFs) đóng vai trò điều

khiển quan trọng của những thay đổi trong biểu hiện gen và phản ứng với các

stress môi trường. Có thể thấy rõ ở cây trồng, các gen mã hóa nhân tố phiên mã

chiếm một phần lớn trong hệ gen. Ví dụ, ở cây Arabidopsis có đến 1500 TF

trong hệ gen [140]. Cả hai loại: Nhân tố kích hoạt và ức chế quá trình phiên mã

đã được sử dụng để nâng cao khả năng chịu hạn cho cây trồng, hầu hết các gen

này đã được xác định và phân tích ở cây Arabidopsis [19]. Hiện nay, các protein

DREB (một trong bốn phân họ lớn của họ AP2/ERF) là nhóm TF được nghiên

cứu thành công nhất trong điều kiện phi sinh học, bởi vì nó kích hoạt sự biểu

hiện của nhiều gen mục tiêu chịu trách nhiệm kiểm soát các yếu tố liên quan

[71]. Wang và cs (2009) đã xác định được trong cây Arabidopsis có 474 gen

mục tiêu mà các nhân tố phiên mã DREB tác động [183]. Trong số những gen này,

có 160 gen có đáp ứng với stress phi sinh học và 27 gen cảm ứng với tình trạng

thiếu nước [106].

1.1.2. Họ nhân tố phiên mã AP2

Các nhân tố phiên mã có thể được phân chia thành nhiều loại khác nhau

dựa trên cấu trúc vùng liên kết của chúng với sợi DNA. Các nhân tố phiên mã như

nhân tố có tác động trans và trình tự cis giữ vai trò trung tâm hoạt hóa promoter

trong biểu hiện của các gen mục tiêu. Kết quả những phân tích về hoạt hóa

promoter phản ứng với điều kiện bất lợi, trình tự cis và nhân tố có tác động trans

liên quan đến phản ứng của các gen với điều kiện bất lợi đã được xác định [178].

Họ AP2/ERF là một nhóm lớn các nhân tố phiên mã ở thực vật, bao gồm

bốn phân họ lớn: AP2 (APETALA 2), RAV (RelatedtoABI3/VP1), ERF

(Ethylene-responsive element binding factor) và DREB (Dehydration responsive

element binding ) [148].

1.1.2.1. Cây phát sinh của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF

Họ AP2/ERF là một nhóm lớn các nhân tố phiên mã có chứa miền

AP2/ERF. Ở cây Arabidopsis chứa 145 locus gen mã hóa các nhân tố phiên mã

của họ AP2/ERF [148] và ở lúa có 167 locus [152]. Miền AP2/ERF lần đầu tiên

được tìm thấy ở Arabidopsis homeotic APETALA 2 [74]. Tương tự, miền này

cũng tìm thấy ở cây thuốc lá (Nicotiana tabacum), đó là yếu tố phản ứng với

ethylene (EREBPs) [124]. Miền AP2/ERF có khoảng 60 amino acid có liên quan

chặt chẽ với nhau [184]. Protein thuộc họ AP2/ERF là những nhân tố phiên mã

có ở thực vật và người ta cũng tìm thấy ở cả những thực vật bậc thấp như tảo

xanh (Chlamydomonas reinhardtii) [157], tương đồng với các miền AP2/ERF ở

vi khuẩn. Do đó, có giả thuyết cho rằng các miền AP2/ERF được chuyển từ một

loài vi khuẩn Cyanobacterium cộng sinh hoặc từ một loại vi khuẩn hay virus bởi

hiện tượng biến nạp gen [98]. Ở đầu N và ở đầu C của miền AP2/ERF có chứa

một đoạn xoắn β tương tự như kiểu xoắn α có chức năng nhận biết điểm bám

trên promoter [158].

Phân tích mối quan hệ và thiết lập cây phát sinh họ AP2/ERF từ bốn

phân họ: Arabidopsis, Selaginella moellendorffii, Physcomitrella patens và

Chlamydomonas reinhardtii, mà đại diện tương ứng là thực vật hạt kín, thông đất,

rêu và tảo xanh (Hình 1.2). Mỗi nhánh trong cây phát sinh đại diện cho một nhóm

và các thành viên của họ AP2/ERF có thể được chia thành ba nhóm dựa trên cấu

trúc tổng thể [141].

Phân họ AP2/ERF trong nhóm Arabidopsis gồm 14 thành viên chứa hai

miền AP2/ERF, phân họ RAV gồm 6 thành viên có chứa một miền AP2/ERF và

thêm một miền B3, trong khi các phân họ khác gồm 125 thành viên chỉ có một

miền AP2/ERF [152]. Phân họ AP2/ERF ở thực vật có hạt có thể được chia

thành các phân nhóm AP2 và nhóm ANT [13].

Sakuma và cs (2002) đã phân tích mối quan hệ của 125 thành viên chứa

duy nhất miền AP2/ERF dựa trên cơ sở miền AP2/ERF của nhóm Arabidopsis.

Thông qua phân tích này, 125 thành viên có một miền AP2/ERF được chia thành

ba nhóm: Nhóm A gồm 56 thành viên thuộc phân họ DREB, nhóm B gồm 65

thành viên thuộc phân họ ERF và nhóm còn lại gồm 4 thành viên thuộc những

phân họ khác. Phân họ DREB được chia thành 6 phân nhóm, từ A-1 đến A-6,

phân họ ERF cũng được chia thành 6 phân nhóm, từ B-1 đến B-6. Các

DREB1/CBF thuộc phân nhóm A-1 và các DREB2 thuộc phân nhóm A-2 [148].

Nakano và cs (2006) phân tích mối quan hệ của các thành viên chứa duy nhất

miền AP2/ERF trong Arabidopsis và lúa, kết quả thu được tương tự như phân

loại của Sakuma và cs (2002). Tuy nhiên, ông cho biết thêm phân nhóm A-1 và

A-4 cùng nguồn gốc và phân nhóm A-2 và A-3 cùng nguồn gốc [115].

Hình 1.2. Cây phát sinh của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF ở thực vật có

diệp lục [109].

Họ nhân tố phiên mã AP2/ERF chỉ có ở thực vật và điều này đặt ra câu

hỏi: Chúng đã tiến hóa như thế nào trong lịch sử phát triển của thực vật? Trong

sơ đồ cây phát sinh loài ở hình 1.2, P. patens và chi nhánh S. moellendorffii được

tìm thấy trong tất cả bốn phân họ lớn và trong một nhánh của AT4G13040

orthologues. Hơn nữa, P. Patens và S. moellendorffii được tìm thấy trong tất cả

các phân nhóm, trừ A-1 và B-2. Điều đó chứng tỏ, rêu và thực vật có mạch

chung nguồn gốc. Phân nhóm A-1 (DREB1s) có quan hệ gần gũi với phân nhóm

A-4 và cùng chung nguồn gốc với phân nhóm A-5. Trong thực tế, người ta

không tìm thấy phân nhóm A-1 ở cây hạt trần. Trong cây phát sinh loài ở hình 1.2,

C. reinhardtii tìm thấy ở bốn nhánh, hai nhánh trong phân họ ERF và hai nhánh

trong phân họ AP2. Điều đó chứng tỏ, trước khi xuất hiện thực vật ở cạn, nhân tố

phiên mã AP2/ERF đã chứa một miền AP2/ERF hoặc chứa hai miền AP2/ERF.

Ngược lại, người ta chưa tìm thấy phân họ RAV ở C. reinhardtii [109].

1.1.2.2. Nhân tố phiên mã DREB

Từ những năm 80 của thế kỷ XX, các nhà khoa học trên thế giới đã quan tâm

nghiên cứu về DREBs, tiến hành giải trình tự gen DREBs trên các loài họ cúc

(Asteraceae), hướng dương (Helianthus annuus), lúa mì (Triticum aestivum L.)

… và so sánh trình tự gen này của các loài cây trồng và hoang dại cho thấy có sự

sai khác giữa chúng [5]. Từ đó, họ đã đề xuất phương án cải thiện khả năng

chống chịu thông qua việc cải tiến ở mức phân tử của cơ chế này với điều kiện

bất lợi trong môi trường sống, đó là chuyển gen mục tiêu từ loài chống chịu tốt

vào loài chống chịu kém. Những gen này bao gồm cả các gen chức năng, như

gen mã hóa những chất chuyển hóa khác nhau quan trọng đối với khả năng chịu

hạn, hoặc gen mã hóa các nhân tố phiên mã. Đối với cây đậu tương, hướng

nghiên cứu này bước đầu đã đạt được những thành công nhất định [6].

Nhiều thành viên phân họ DREB nhạy cảm với điều kiện bất lợi đã được

phân lập, mô tả và các nghiên cứu đã khẳng định chúng là những thành tố quan

trọng, liên quan đến sự phản ứng với nhân tố phi sinh học ở thực vật bằng cách

quy định biểu hiện gen thông qua các trình tự DRE/CRT [188]. Khi phân tích

các gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB, các nhà khoa học đã xác định được 36

gen DREB/CBF trong cây nho (Vitis Vinifera) [200], 57 gen trong cây

Arabidopsis, 52 gen trong cây lúa (Oryza sativa L.) [115], 77 gen trong cây

Populos trichocarpa thuộc họ liễu [199], 36 gen trong cây đậu tương [192].

Một số thành viên của phân họ gen DREB được xác định có trong hệ gen

của cây đậu tương như: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1,

GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7 [141]. Mỗi gen

trong phân họ DREB có trình tự, độ dài khác nhau nhưng đều được biểu hiện

mạnh khi đậu tương gặp các điều kiện về hạn. Nhóm DREB1 điều khiển tính

chịu hạn, mặn và lạnh, trong khi nhóm DREB2 có vai trò chủ yếu trong điều

khiển tính chịu hạn, chịu nóng. Chen và cs (2004) đã phân lập gen DREB1 từ

mRNA của cây đậu tương có kích thước 705 bp [27]. Charlson và cs (2009) đã

phân lập được gen DREB1 từ DNA của cây đậu tương cũng có kích thước 705

bp [23]. Chen và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB5 từ mRNA ở cây đậu

tương với kích thước là 927 bp [25]. Chen và cs (2009) đã phân lập gen

GmDREB3 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước là 597 bp [26]. Liu và cs

(2007) đã phân lập gen GmDREB6 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước là

693 bp [96]... Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu về các gen DREB ở cây trồng nói

chung và cây đậu tương nói riêng vẫn còn rất mới mẻ, chỉ có một vài công trình

công bố về các gen DREB trong những năm gần đây, đó là các nghiên cứu về

đặc điểm cấu trúc và chức năng của gen DREB1 và DREB5 ở cây đậu tương

của Chu Hoàng Mậu và cs (2011) [5].

1.1.2.3. Phân nhóm DREB2

Phân nhóm DREB2 gồm có 8 thành viên ở trong cây Arabidopsis [148]

và 5 thành viên trong cây lúa [107]. Phân tích sự phát sinh của các protein

DREB2 từ cây Arabidopsis và cây lúa, cũng như các protein liên quan cho thấy,

phân nhóm DREB2 liên quan chặt chẽ với phân nhóm A-3, trong đó có ABI4

(ABA-Insensitive 4). Phân nhóm DREB2 trong cây Arabidopsis và lúa có thể

đều được chia thành ba phân nhóm phụ [107]. Ngoài ra, phân nhóm DREB2

cũng đã được phân lập từ một số loài thực vật hạt kín khác như hướng dương

[41], lúa [42], [107], lúa mì [43], [153], lúa mạch (Hordeum vulgare) [187], ngô

(Zea mays L) [134]. Hầu hết các gen DREB2 đã được công bố đều cảm ứng với

sự mất nước hoặc nhiệt độ cao, nhưng các gen DREB2 từ thực vật thân cỏ còn

cảm ứng với lạnh [43], [107], [153]. Điều đáng chú ý là tất cả các DREB2 được

phân lập có cảm ứng stress thuộc phân nhóm phụ 1, trong đó bao gồm DREB2A,

DREB2B, DREB2C, DREB2E và DREB2H của cây Arabidopsis, cũng như

OsDREB2A và OsDREB2B của cây lúa. Điều đó chứng tỏ, phân nhóm phụ 1 mà

đại diện là các DREB2 có cảm ứng với các stress. Phân nhóm phụ 2 bao gồm

DREB2D, DREB2G ở cây Arabidopsis và OsDREB2C ở cây lúa, trong khi phân

nhóm phụ 3 gồm DREB2F ở cây Arabidopsis và OsDREB2E ở cây lúa. Các gen

DREB2 ở hai phân nhóm phụ này không có hoặc cảm ứng không đáng kể trước

các stress và cũng chưa được phân lập từ các thực vật khác, mặc dù tất cả các

loài thực vật hạt kín đều có các gen thuộc 2 phân nhóm phụ này, song vai trò

của chúng còn ít được biết đến [107], [148] .

Chen và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tương và dựa trên

sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 được xếp vào phân nhóm A-5

trong phân họ DREB. Gen GmDREB2 được biểu hiện mạnh trong môi trường có

hạn, mặn, nhiệt độ thấp và ABA [24]. Trong cây thuốc lá chuyển gen

GmDREB2, sự biểu hiện của gen này đã làm tăng sự tích lũy hàm lượng prolin

[88]. Trong Ngân hàng Gen, trình tự gen GmDREB2 phân lập từ DNA của cây

đậu tương đã được công bố lần đầu tiên bởi Wang và cs (2006) có kích thước

480 bp, mã hóa 159 amino acid, miền AP2 có 59 amino acid (từ vị trí amino

acid 34 đến 92) [180]. Gen GmDREB2 ở cây đậu tương có chức năng kích hoạt

sự phiên mã của nhóm gen chịu hạn. Sản phẩm biểu hiện của gen GmDREB2

được tìm thấy khi cây đậu tương gặp hạn, lạnh và mặn. Như vậy, gen

GmDREB2 đã được chứng minh là tích cực tham gia vào việc chống chịu với

hạn ở cây đậu tương [24], [88], [109].

1.1.3. Cơ chế tác động của một số nhân tố phiên mã đối với các phản ứng

stress phi sinh học ở thực vật

Cho đến nay, nhiều nhân tố phiên mã họ AP2/ERF từ các loài thực vật

khác nhau đã được chứng minh có liên quan đến phản ứng của stress phi sinh

học. Cụ thể, các DREB1/CBF và phân nhóm DREB2 đóng vai trò quan trọng

trong việc chống chịu stress bằng cách điều hòa biểu hiện của gen thông qua

trình tự DRE/CRT trong các promoter ở những gen nhạy cảm với stress.

1.1.3.1. Hoạt động của nhân tố phiên mã AP2/ERF và các trình tự cis

DRE/CRT

Các nhân tố phiên mã như DREB1 và DREB2 liên kết với các trình tự cis

CBF đã được xác định ở cây Arabidopsis [94], [164]. Những protein thuộc họ

AP2/ERF là nhân tố phiên mã đã kích hoạt các gen phiên mã thông qua liên kết

với các trình tự DRE/CRT để hoạt hóa promoter của chúng [148], [164]. Các gen

DREB1A/CBF3, DREB1B/CBF1 và DREB1C/CBF2 có trong hệ gen của cây

Arabidopsis được cảm ứng bởi điều kiện lạnh nhưng không do mất nước hoặc

mặn [52], [94], [154]. Sự biểu hiện mạnh của các DREB1/CBF sẽ kích hoạt sự

biểu hiện của các gen phản ứng với các strees và cải thiện khả năng chịu lạnh,

chịu hạn và chịu mặn của cây Arabidopsis [94]. Ngược lại, DREB2A và

DREB2B cảm ứng với tình trạng mất nước, mặn và nhiệt độ cao, không cảm ứng

với lạnh [94], [116], [147]. Sự biểu hiện mạnh của DREB2A đã kích hoạt sự

biểu hiện của các gen cảm ứng với nhiệt độ cao hoặc sự mất nước, do đó đã cải

thiện khả năng chống chịu hạn, chịu mặn, chịu nhiệt độ cao của cây Arabidopsis

[147], [146]. Những phát hiện này đã chỉ ra rằng, các DREB1 và DREB2 tham

gia vào quá trình thích nghi với stress trong cây Arabidopsis bằng cách kích hoạt

phiên mã thông qua liên kết với các trình tự DRE/CRT trong các promoter

điều khiển các gen mục tiêu phản ứng với các stress.

Cho đến nay, nhiều DREB cảm ứng stress đã được phân lập từ nhiều loại

cây trồng, bao gồm các loài thực vật hai lá mầm, như cây cải dầu (Brassica

napus) và cà chua (Solanum lycopersicum) [73], các cây một lá mầm như ngô

[134], [135], lúa [42], lúa mạch [187] và thậm chí từ cây rêu [93]. Sự tồn tại của

những DREB cảm ứng với stress ở các loài thực vật khác nhau đã chỉ ra tầm

quan trọng của trình tự cis DRE/CRT và DREBs trong phản ứng stress của thực

vật trên cạn.

1.1.3.2. Hoạt động của các phân họ DREB và ERF

Phân tích chi tiết các điểm liên kết của DREB1A và DREB2A đã cho thấy,

các protein này có ái lực cao nhất đối với trình tự A/GCCGAC của DRE [148].

Hơn nữa, DREB1A có ái lực mạnh với A/GCCGACNT và DREB2A có ái lực

mạnh với ACCGAC [104], [146]. Những liên kết chặt chẽ này đã được xác nhận

bằng kết quả phân tích các promoter hoạt hóa biểu hiện các gen DREB trong cây

chuyển gen [104], [146]. Ngược lại, năm phân họ protein ERF có ái lực lớn nhất

với hộp (GCC) của trình tự AGCCGCC trong ERE [46]. Tuy nhiên, trong một số

trường hợp, TINY thuộc phân nhóm A-4 của phân họ DREB có thể liên kết với

cả DRE và hộp (GCC) [163]. Một phân nhóm protein A DREB2 (A-2) từ lúa

mạch (HvDRF1) cũng cho thấy ái lực mạnh với TT/AACCGCCTT [31]. Protein

ABI4 từ cây ngô và cây Arabidopsis thuộc về phân nhóm A-3, có liên kết với

yếu tố ghép nối CE1 (Coupling Element 1) là các trình tự CACCG và CCAC

[83], [120].

1.1.3.3. Hoạt động của phân nhóm DREB2

Vai trò của nhân tố phiên mã DREB2 trong điều kiện thiếu nước và nhiệt độ cao

Trong cây Arabidopsis, gen DREB2A và gen DREB2B được cảm ứng bởi

tình trạng mất nước, mặn và nhiệt độ cao [116], [147] (Hình 1.3), trong khi

DREB2C được kích hoạt chậm hơn bởi nhiệt độ cao so với DREB2A hoặc

DREB2B [91]. Các gen DREB2C, DREB2D và DREB2F cảm ứng với mặn và

DREB2E phản ứng với ABA, mặc dù biểu hiện của chúng là rất yếu [148]. Vì vậy,

DREB2A và DREB2B dường như là các DREB2 liên quan chính đến tình trạng

biểu hiện gen cảm ứng mất nước thông qua trình tự DRE/CRT và độc lập với

ABA [116], [148]. Ngược lại với các gen DREB1/CBF, sự biểu hiện mạnh của

DREB2A gây ra những thay đổi không đáng kể trong sinh trưởng của thực vật,

trong biểu hiện gen hoặc khả năng chịu đựng stress [94]. Sakuma và cs (2006)

cho rằng, DREB2A có một vùng điều hòa âm tính (NRD) tiếp giáp điểm liên kết

với DNA và tạo thành một phức hợp hoạt động chủ yếu là DREB2A CA. Cây

chuyển gen có DREB2A CA thường biểu hiện còi cọc, tăng khả năng chịu hạn và

chịu mặn nhưng không có khả năng chịu lạnh [146]. Nhiều gen cảm ứng với

tình trạng mất nước, chẳng hạn như gen mã hóa protein LEA được biểu hiện

trong các cây chuyển gen. Ngoài ra, nhiều gen cảm ứng với nhiệt độ cao cũng

được điều chỉnh và thực tế cây chuyển gen thể hiện tính kháng với các sốc nhiệt

[147]. Những thể đột biến gen DREB2A có biểu hiện làm giảm một phần của sự

mất nước hoặc sốc nhiệt, điều đó cho thấy, DREB2A đóng vai trò quan trọng

trong biểu hiện các gen cảm ứng với mất nước và sốc nhiệt [147] (Hình 1.3).

Hoạt động điều hòa sau phiên mã của DREB2

Điều hòa sau phiên mã của DREB2A có liên quan đến sự ổn định của

protein (Hình 1.3). Vùng NRD trong DREB2A là một trình tự giàu amino acid

serine/threonine ưa nước và tạo thành một chuỗi PEST, đây là một loại protein

không ổn định được tìm thấy ở sinh vật nhân chuẩn [142], [145]. Trong điều

kiện không có stress, protein huỳnh quang xanh GFP (Green fluorescence

protein) ở nhân liên kết với DREB2A CA được tích lũy ổn định hơn so với GFP

liên kết với DREB2A [146].

Theo Qin và cs (2008), các protein DRIP1 và DRIP2 đã được phân lập,

tương tự như enzyme RING E3 ligase, nó tương tác với DREB2A trong nhân

cũng tương tự như chất môi giới ubiquitin của DREB2A. Biểu hiện mạnh của

DRIP1 đã làm chậm lại biểu hiện phản ứng mất nước của các gen chức năng.

Ngược lại, phản ứng mất nước của các gen chức năng được tăng cường đáng kể

ở cả hai thể đột biến drip1 và drip2. Ngoài ra, có sự tích lũy ổn định GFP liên

kết với DREB2A trong nhân của hai thể đột biến drip1 và drip2 ở cây không

chuyển gen trong điều kiện bình thường hoặc có chất ức chế proteasome. Vì vậy,

có giả thuyết cho rằng DRIP1 và DRIP2 điều hòa âm tính biểu hiện gen cảm ứng

mất nước bằng cách tạo điều kiện cho ubiquitin hoạt động và làm mất chức năng

của DREB2A [136] (Hình 1.3).

Phosphoryl hóa được xem như là một cơ chế điều hòa sau phiên mã đối với

PgDREB2A, đó là một protein thuộc phân nhóm DREB2 được phân lập từ thực

vật thân cỏ như cây Pennisetum glaucum (thuộc phân họ kê) [11]. Toàn bộ dịch

chiết của tế bào cây P. glaucum có thể phosphoryl hóa một protein tái tổ hợp

PgDREB2A ở trong Escherichia coli. Sự phosphoryl hóa thường xảy ra tại

threonine dư, làm giảm ái lực liên kết của các protein PgDREB2A với trình tự

DRE/CRT. Mặc dù vị trí phosphoryl hóa chưa được xác định, song việc phát

hiện này cho thấy sự phosphoryl hóa như là một cơ chế điều hòa sau phiên mã

của các DREB2. Trong thực vật thân cỏ, DREB2 điều hòa qua nhiều bước. Các

DREB2 cảm ứng với các stress trong thực vật thân cỏ được chia thành hai

nhánh: OsDREB2A và OsDREB2B [107]. Cơ chế điều hòa này đã được tìm thấy

ở các gen trong nhánh thứ hai của lúa mạch (HvDRF1) [187], lúa mì (WDREB2)

[43], ngô (ZmDREB2A) [134] và lúa (OsDREB2B) [107]. Những gen này có hai

loại: Sao chép nhưng không hoạt động do có một codon kết thúc trước vùng liên

kết với DNA và sao chép hoạt động mà có thể mã hóa một protein có chiều dài

đầy đủ. Nói chung, loại sao chép không hoạt động được thể hiện dưới điều kiện

không có stress. Sao chép hoạt động để cảm ứng với các tín hiệu stress cao hơn

so với sao chép không hoạt động. Hiện tượng điều hòa qua nhiều bước đối với

các gen DREB2 trong các loài thực vật thân cỏ có thể cho phép cảm ứng với

stress nhanh chóng bằng cách bỏ qua các bước kích hoạt của các chất hoạt hóa

DREB2 hoặc cung cấp trước một lượng của mRNA DREB2s.

DREB2 với cảm ứng với sốc nhiệt

Trong cây Arabidopsis, DREB2A là một nhân tố phiên mã trong cảm ứng

với sốc nhiệt. Khi gặp điều kiện nhiệt cao, gen DREB2A nhanh chóng biểu hiện

và kích hoạt nhiều gen cảm ứng sốc nhiệt, chẳng hạn như các nhân tố phiên mã

và môi giới phân tử. Biểu hiện trực tiếp của các thể đột biến gen DREB2A làm

giảm biểu hiện của các gen này và rất nhạy cảm với sự thay đổi đột ngột về nhiệt

độ [147]. Một trong những gen đích quan trọng của DREB2A là HsfA3, một

thành viên của nhóm HSF, gồm có 21 thành viên trong cây Arabidopsis [122].

Biểu hiện mạnh của HsfA3 là sẽ kích hoạt cho nhiều gen cảm ứng sốc nhiệt,

trong khi sự gián đoạn hoạt động của gen HsfA3 làm giảm phản ứng của các gen

cảm ứng sốc nhiệt và giảm khả năng chống sốc nhiệt [150], [189]. Các báo cáo

gần đây cho thấy, sự tác động của gen DREB2A chỉ ức chế một nhóm các gen

HsfA1 [85] (Hình 1.3).

Hiện nay, có ý kiến cho rằng, nhiệt độ cao kích hoạt mạnh các protein

HsfA1, còn gen HsfA2 gây nên sự phiên mã của DREB2A và là một nhân tố

phiên mã quan trọng [151]. DREB2A sau đó kích hoạt gen HsfA3 và các protein

HsfA3 biểu hiện để tiếp tục tác động các gen chức năng (Hình 1.3). Hoạt động

sao chép của gen OsDREB2B ở cây lúa sẽ hiển thị một mô hình biểu hiện tương

tự như của gen DREB2A dưới điều kiện nhiệt độ cao [107] và một số gen HSF

trong cây lúa có DRE/CRT, và có thể gặp ở hầu khắp thực vật hạt kín.

Chức năng của DREB2 trong điều kiện sốc nhiệt và hạn

Hạn và nhiệt độ cao gắn liền với những điều kiện stress của môi trường tự

nhiên và thường xảy ra đồng thời [110]. Sự tác động đồng thời của hạn và nhiệt

độ cao ảnh hưởng đến sinh trưởng của các cây trồng nhiều hơn những stress đơn

lẻ [110], [143], [144]. Về mặt sinh trưởng, phân tích sự phiên mã và trao đổi chất

ở cây thuốc lá, cây Arabidopsis đã chỉ ra rằng, phản ứng của cây đối với sự kết

hợp của nhân tố hạn và nhiệt độ cao một phần có sự chồng chéo lên nhau, nhưng

rõ ràng những chồng chéo này nhằm chống lại stress đơn lẻ [143], [144]. Gen

DREB2A không chỉ được cảm ứng bởi hạn hay nhiệt độ cao đơn lẻ mà còn bởi

sự kết hợp của hạn và nhiệt độ cao [144], do đó các gen DREB2 đóng vai trò

trong việc điều hòa biểu hiện gen dưới sự tác động đồng thời của hạn và nhiệt độ

cao lên thực vật.

1.1.3.4. Mối quan hệ về chức năng giữa DREB1/CBF, DREB2 và các nhân tố

phiên mã khác

Sự khác biệt về đặc tính liên kết của DREB1A/CBF3 và DREB2A với

DRE/CRT có thể là chìa khóa để điều hòa các gen trong cây Arabidopsis đối với

các stress cụ thể. Trong cây Arabidopsis, sự biểu hiện mạnh của các gen

DREB1/CBF đã cải thiện khả năng chịu hạn và lạnh [42], [77], [135]. Ngược lại,

sự biểu hiện mạnh của các gen DREB2 tăng cường đáng kể khả năng chịu hạn

nhưng không cải thiện khả năng chịu lạnh [134], [146]. Maruyama và cs (2009)

chứng minh rằng, các gen chức năng được kích hoạt bởi DREB1A/CBF3 và

DREB2A CA chịu tác động một phần sự kết hợp của các stress. Tuy nhiên, các

gen chức năng cụ thể lại tương ứng với từng loại protein DREB. Gen mã hóa

enzyme để chuyển hóa carbohydrate chịu tác động của DREB1A, trong khi gen

mã hóa những chất môi giới phân tử chịu tác động của DREB2A CA [105].

Về mặt chuyển hóa cho thấy, mô hình tích lũy chất chuyển hóa là giống

nhau giữa các cây biểu hiện mạnh gen DREB1A ở cây chịu lạnh, cũng như giữa

cây biểu hiện mạnh gen DREB2A CA ở cây chịu hạn [105]. Điều này cho thấy,

những sự khác biệt trong tích lũy chất chuyển hóa đã gây ra sự khác biệt trong

khả năng chịu stress của thực vật. Maruyama và cs (2004), Sakuma và cs (2006)

đã chứng minh rằng, DREB1A có ái lực mạnh với A/GCCGACNT và DREB2A

có ái lực mạnh ACCGAC cả ở điều kiện in vitro và ở cây trồng. Bởi vì, tác động

lạnh đối với thực vật gây ra tình trạng mất nước của tế bào, tác động tới hệ thống

bảo vệ chung giữa phản ứng stress lạnh và mất nước. Chẳng hạn như protein

LEA, được quy định thông qua một trình tự DRE/CRT chung (ACCGACNT) và

được cảm ứng bởi các tín hiệu stress lạnh và mất nước. Ngược lại, các gen hoạt

động trong điều kiện stress cụ thể được quy định bởi trình tự DRE/CRT riêng.

Như vậy, sự khác biệt nhỏ về các trình tự DRE/CRT cùng với sự điều hòa của

một số gen phân họ DREB có thể cải thiện sức sống của cây chống lại điều kiện

bất lợi của ngoại cảnh [104], [146].

Hình 1.3. Điều hòa phiên mã và sau phiên mã của DREB2A trong cây

Arabidopsis [109]

Về sự tương tác của DREB1/CBF và DREB2 với các nhân tố phiên mã

khác, DRE/CRT tương tác với các trình tự cis và DREB tương tác với các nhân

tố phiên mã khác (Hình 1.3). Trong promoter RD29A, DRE/CRT có một mối

quan hệ chặt chẽ với ABRE và có chức năng như một yếu tố liên kết của ABRE

[117]. Dưới sự điều khiển của promoter RD29A, đoạn có chứa cả DRE/CRT và

ABRE tăng cường biểu hiện đồng thời của DREB1A/CBF3 hoặc DREB2A với

AREB1/ABF2 hoặc AREB2/ABF4 [117]. Các protein DREB1A, DREB2A và

DREB2C tương tác với các protein AREB1/ABF2 và AREB2/ABF4 ở nấm men

và trong ống nghiệm [89]. Tương tự, DRE/CRT và các các yếu tố sốc nhiệt - HSEs

(Heat shock elements) phối hợp hoạt động trong promoter để điều khiển biểu

hiện của một loại protein sốc nhiệt có kích thước nhỏ ở phôi cây hướng dương

[41]. Protein HaDREB2 và HaHSFA9 liên kết với promoter và gián tiếp điều

khiển sự phiên mã của các gen đích. Trong ống nghiệm, HaDREB2 và

HaHSFA9 tương tác với nhau, tại các miền AP2/ERF của HaDREB2 và ở đầu C

của HaHSFA9 có chứa các miền kích hoạt tương ứng, được xác định là vùng

tương tác cho mỗi protein.

1.2. NHÂN TỐ PHIÊN MÃ VÀ TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỊU HẠN

CỦA THỰC VẬT

1.2.1. Nâng cao khả năng chống chịu các stress bằng kỹ thuật biểu hiện

mạnh nhân tố phiên mã DREB ở thực vật

Biểu hiện mạnh những gen điều hoà phiên mã của các gen chức năng có

khả năng đáp ứng hạn là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn trong sự phát triển các

giống cây trồng chống chịu hạn và ưu việt hơn kỹ thuật chuyển gen chức năng

đơn lẻ. Vì vậy, việc tăng cường khả năng điều tiết của một nhân tố phiên mã

quan trọng kích thích sự biểu hiện của nhiều gen mục tiêu kiểm soát các đặc tính

tương quan là rất quan trọng. Nhiều gen giữ vai trò quan trọng đã được xác định

có liên quan đến mạng lưới điều hòa trong điều kiện stress phi sinh học [155].

Có thể nói rằng, nhóm gen TF liên quan đến stress phi sinh học, đặc biệt là hạn

và lạnh được nhận thấy rõ nhất là các gen DREB [56], [134], [147]. Nhiều gen

cảm ứng rối loạn thẩm thấu chứa một yếu tố đáp ứng hạn (DRE) bảo thủ trong

promoter của chúng [156], [166]. Một số cDNA mã hóa các protein gắn DRE,

DREB1A và DREB2A đã được phân lập từ cây Arabidopsis, thể hiện sự ràng

buộc và kích hoạt phiên mã của gen chứa trình tự DRE [94]. Trong thực tế,

nhiều nghiên cứu về biểu hiện mạnh của nhân tố phiên mã DREB cảm ứng với

stress đã được tìm thấy để kích hoạt sự biểu hiện của các gen mục tiêu có trình tự

DRE trong các promoter của chúng và kết quả cho thấy cây chuyển gen có khả

năng chống chịu stress tốt hơn cây không chuyển gen (Bảng 1.1). Một ứng dụng

rộng rãi hiện nay là các DREB1A được định hướng bằng một promoter

CaMV35S hoặc promoter cảm ứng với khô hạn RD29A đều biểu hiện mạnh. Với

cách tiếp cận này, các DREB1A đã kích hoạt biểu hiện của nhiều gen chống chịu

stress trong điều kiện phát triển bình thường và kết quả là các thế hệ cây chuyển

gen đã được tăng cường khả năng chịu hạn, lạnh và mặn [77]. Gen DREB1A có

thể biểu hiện tốt ở nhiều cây trồng khác nhau; sự biểu hiện mạnh các AtDREB1A

trong cây thuốc lá, cây lúa mì, cây lúa, cây lạc đã chứng minh khả năng chịu hạn

tốt hơn và tăng cường sự biểu hiện của gen LEA ít nhất là trong điều kiện nhà

kính [16], [78], [131].

Gần đây, dòng lạc chuyển gen DREB1A phân lập từ cây Arabidopsis

dưới tác động của promoter cảm ứng với stress hạn đã biểu hiện tốt, tích lũy

đáng kể một số enzyme quan trọng so với cây không chuyển gen trong điều kiện

gây hạn nhân tạo, những enzyme này không có mối liên hệ nào với hiệu quả

thoát hơi nước [17]. Cây lúa chuyển gen DREB1A phân lập từ cây Arabidopsis

đã biểu hiện tốt khả năng chịu hạn, chịu mặn, chịu được lạnh và sự tích lũy

nồng độ các chất hòa tan cao, như các prolin tự do và các chất đường hòa tan

khác nhau. Kết quả biểu hiện các gen DREB từ cây Arabidopsis ở những loài

cây trồng khác cũng được chứng minh như lúa mì, lúa mạch, đậu tương, cà chua,

thuốc lá, dâu tây, lúa, cải dầu, khoai tây và các loại cây thân cỏ khác [35],

[92], [113].

Bảng 1.1. Các gen mã hóa nhân tố phiên mã được sử dụng trong kỹ thuật chuyển

gen nhằm tăng cường khả năng chịu hạn của thực vật

Gen

Tác động gen

Loài

Kiểu hình

Tài liệu tham khảo

DREB2/DREB3 Nhân tố phiên mã

Chịu hạn và băng giá

[113]

Lúa mì và lúa mạch

ABF3

Nhân tố phiên mã

Arabidopsis Chịu hạn

[9]

OsWRKY45

Nhân tố phiên mã

Arabidopsis Chịu hạn

[138]

ABP9

Nhân tố phiên mã bZIP Arabidopsis

[194]

Cải thiện quang năng trong điều kiện hạn hán

OCPI1

Nhân tố phiên mã

Lúa

Chịu hạn

[70]

TaSrg6

Nhân tố phiên mã

Arabidopsis Chịu hạn

[168]

HvCBF4

Nhân tố phiên mã

Lúa

Chịu hạn, mặn, băng giá

[125]

DREB2A

Nhân tố phiên mã

Arabidopsis Chịu hạn và nhiệt độ cao

[134]

CAP2

Nhân tố phiên mã

Thuốc lá Chịu hạn và mặn

[159]

Lúa

[72]

DREB1 hoặc OsDREB1

Nhân tố phiên mã trong điều kiện phi stress

Chịu hạn, mặn và lạnh với tốc độ tăng trưởng giảm

DREB2A

Nhân tố phiên mã

Arabidopsis Chịu hạn

[146]

HsfA2

Nhân tố phiên mã

Arabidopsis

[121]

Chống chịu với các stress môi trường

ABF3

Nhân tố phiên mã

Lúa

Chịu hạn

[126]

DREB1A

Lúa

Chịu hạn và mặn

[126]

Arabidopsis protein 1 gắn DRE

ZmDREB1A Nhân tố phiên mã

Arabidopsis Chịu hạn

[135]

DREB1C/CBF2 Nhân tố phiên mã

Arabidopsis Chịu hạn

[123]

NAC

Arabidopsis Chịu hạn và chịu mặn

[170]

Nhân tố phiên mã NAM/ATAF/CUC

DREB1A

Nhân tố phiên mã

Thuốc lá Chịu hạn và lạnh

[78]

DREB1A

Nhân tố phiên mã

Lúa mì

[131]

Làm chậm quá trình héo úa trong điều kiện stress hạn

OsDREB1A

Nhân tố phiên mã

Arabidopsis Chịu hạn, mặn, băng giá

[42]

CBF4

Nhân tố phiên mã

Arabidopsis Chịu hạn và băng giá

[57]

ABF3/ABF4

Arabidopsis Chịu hạn

[76]

Nhân tố phiên mã finger proteins

DREB

Nhân tố phiên mã

Arabidopsis Chịu hạn, lạnh

[77]

Một số nghiên cứu đã cho thấy, sự biểu hiện của các gen cấu trúc CBF ở

cây trồng chuyển gen đã thể hiện rõ khả năng chịu stress cao. Biểu hiện mạnh

CBF3/DREB1A và ABF3 của cây Arabidopsis trong cây lúa chuyển gen cho thấy

khả năng chịu hạn và chịu mặn, nhưng khả năng chịu lạnh kém. Điều này có thể

cho thấy, bằng cách kích hoạt sự biểu hiện gen mục tiêu 12 (CBF3/DREB1A) và

gen mục tiêu 7 (ABF3) trong điều kiện bình thường và gen bổ sung 13 và 27 đã

được kích hoạt trong điều kiện hạn mà không làm chậm sự phát triển hoặc các

hiệu ứng kiểu hình có thể quan sát thấy [126].

Những gen có thể biểu hiện trong điều kiện stress sẽ giúp cây trồng

thích nghi với điều kiện stress phi sinh học [177]. Các gen mục tiêu của

DREB1A/CBF3 bao gồm: Các gen mã hóa TFs, phospholipase C, các protein

vận chuyển đường, sự trao đổi chất liên quan đến protein carbohydrate, protein

LEA, protein KIN (protein cảm ứng lạnh), protein tổng hợp các chất hòa tan và

các chất ức chế proteinase [44]. Biểu hiện mạnh của DREB1A/CBF3 trong cây

Arabidopsis chuyển gen cho thấy những thay đổi trong biểu hiện của một số gen

cảm ứng stress và những thay đổi này dẫn đến làm tăng khả năng chịu lạnh, mặn

và hạn [104], [126]. Có thể do cây Arabidopsis có khả năng thích nghi với lạnh

đã được hình thành trong quá trình tiến hóa khác với cây lúa không trải qua sự

thích nghi lạnh [73]. Hơn nữa, gen CBF4 từ cây lúa mạch dường như có hiệu

quả hơn DREB1A/CBF3 từ cây Arabidopsis trong việc nâng cao tính chống chịu

stress ở cây lúa biến đổi gen [125]. Những dữ liệu này cho thấy, sự khác biệt về

chức năng giữa các thành viên trong phân họ DREB/CBF và làm nổi bật sự khác

biệt trong khả năng chống chịu các stress giữa các loài cây trồng biến đổi gen

khác nhau. Những khác biệt chức năng có thể là do tính phức tạp, tính chất của

các gen mục tiêu có mặt trong hệ gen và khả năng của các nhân tố phiên mã để

kích hoạt hay ức chế mỗi gen mục tiêu. Các gen CBF rõ ràng đã sản sinh ra yếu

tố kháng stress phi sinh học bằng cách điều tiết các con đường tự nhiên đáp ứng

các stress, tạo ra sự thích nghi về mặt sinh lý, cho phép các tế bào thực vật đối

phó với rối loạn về thẩm thấu [44], [104].

1.2.2. Hiệu quả đa hiệu trong cây chuyển gen

Một tác dụng không mong muốn của các biểu hiện mạnh ở một nhân tố

phiên mã là đôi khi ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng và phát triển của cây

như gây độc hoặc làm chậm quá trình phát triển và có thể có một số hiệu ứng đa

hiệu khác [72], [94]. Biểu hiện mạnh của các nhân tố phiên mã DREB1A/CBF

dẫn đến tình trạng chậm phát triển của cây trồng biến đổi gen. Điều này có thể là

do sự nhạy cảm của các loại tế bào nhất định đối với sự biểu hiện quá mạnh của

một gen nào đó. Tuy nhiên, sự biểu hiện cấu trúc DREB1A/CBF3 ở cây

Arabidopsis và OsDREB1F trong cây lúa không dẫn đến việc ức chế sự sinh

trưởng cũng như thay đổi kiểu hình [126], [182]. Tương tự, không quan sát được

ảnh hưởng đa hiệu nào biểu hiện ra bên ngoài của nhân tố phiên mã ABF3 bZIP

đối với cây lúa [126]. Sự biểu hiện mạnh của AtDREB2A sau khi xóa miền điều

hòa âm tính (xóa một vùng giữa vị trí 136 và 165) sẽ điều chỉnh các gen cảm ứng

với hạn và cải thiện được khả năng chịu hạn của cây Arabidopsis [148].

Tuy nhiên, trong trường hợp các tác động đa hiệu được quan sát, vấn đề

này có thể khắc phục bằng cách lựa chọn một promoter phù hợp, chẳng hạn một

promoter cảm ứng với stress RD29A [77], [78]. Vì vậy, trong kỹ thuật chuyển

gen, việc hạn chế những tác động có hại của các nhân tố phiên mã đối với cây

trồng là đặc biệt quan trọng. Cũng tương tự như vậy, các con đường trao đổi chất

có thể bị ảnh hưởng bởi các hoạt động của nhân tố phiên mã hoặc gián tiếp hoặc

là một loạt các phản ứng trong chuyển hóa. Cây trồng chuyển gen DREBs/CBFs

biểu hiện tốt khả năng tích lũy đường hòa tan và prolin tự do như là một phần

của phản ứng khử nước mà các nhân tố phiên mã gây ra [53], [72]. Gần đây,

Abdeen và cs (2010) bằng kết quả phân tích microarray ở cây Arabidopsis

chuyển gen đã chứng minh rằng, sự biểu hiện mạnh của nhân tố phiên mã ABF3

dẫn đến các tác động của ABF3 được kiểm soát chặt chẽ mà không biểu hiện bất

kỳ tác dụng không mong muốn nào [9]. Vì vậy, trong kỹ thuật chuyển gen, việc

lựa chọn các nhân tố phiên mã trực tiếp kiểm soát hầu hết các con đường trao đổi

chất và hạn chế tối thiểu tác dụng phụ không mong muốn là rất quan trọng.

1.2.3. Nghiên cứu điều khiển hoạt động của nhân tố phiên mã trong cải tiến

giống cây trồng

Tiềm năng của các nhân tố phiên mã như là một công cụ để phân tích và

tìm kiếm công nghệ điều khiển các gen trong nhóm gen liên quan đến đặc tính

chống chịu của thực vật nhằm nghiên cứu chức năng gen và cải thiện khả năng

chống chịu của cây trồng. Một trong những mục tiêu đạt được từ các nỗ lực này

là việc điều tiết hoạt động của nhân tố phiên mã đã đem lại nhiều hứa hẹn cho

việc điều hòa con đường trao đổi chất của cây trồng.

Một số hiện tượng biểu hiện mạnh của các gen DREB2 trong cây chuyển

gen lại không cải thiện được khả năng chịu stress là do sự xuất hiện các protein

có chứa các miền ngăn chặn sự kích hoạt các gen mục tiêu [94]. Sau khi sửa đổi

những gen này bằng kỹ thuật tạo đột biến điểm, chức năng ức chế đã không biểu

hiện, các cây trồng có được khả năng chịu hạn [45], [147]. Các cây chuyển gen

chứa protein DREB2A tổng hợp từ gen đột biến sinh trưởng bình thường và

không chỉ chịu được stress hạn và mặn mà còn có thể chịu được nhiệt độ cao.

Điều này cho thấy, vai trò của DREB2A trong mối liên hệ giữa phản ứng với

stress hạn và phản ứng với nhiệt độ cao. Trường hợp này cho thấy, DREB2A

kiểm soát sự biểu hiện của các nhân tố phiên mã HsfA3 đáp ứng với nhiệt độ cao

[150]. Ở cây ngô, biểu hiện mạnh của gen ZmDREB2A dưới tác động của

promoter cảm ứng stress đã làm tăng khả năng chịu hạn ở cây chuyển gen [134].

Ngoài đột biến mất vùng ức chế, đột biến điểm cũng đóng một vai trò

quan trọng trong việc khôi phục các hình thức hoạt động của các chất hoạt hoá

phiên mã. Đột biến điểm từ serine đến acid asparatic tại điểm phosphoryl hóa

trong TRAB1 (nhân tố phiên mã bZIP ở cây lúa) đã góp phần đáng kể vào việc

kích hoạt phiên mã mà không cần sự có mặt của ABA trong cây [75]. Tương tự

như vậy, cây chuyển gen biểu hiện AREB1 với nhiều đột biến cũng đã tạo được

nhiều gen phản ứng với ABA, đáp ứng chức năng khi không có mặt ABA.

Những dữ liệu này cho thấy, các nhân tố phiên mã kích hoạt bởi đột biến điểm

có tiềm năng để đóng góp vào việc tăng cường khả năng chịu hạn ở thực vật

chuyển gen [47].

Các yếu tố ức chế phiên mã ít điều hòa biểu hiện gen trong điều kiện

stress cũng là công cụ có giá trị trong kỹ thuật làm tăng khả năng chịu hạn ở thực

vật. Biểu hiện mạnh của một yếu tố ức chế bao gồm cả các nhân tố phiên mã

chiếm ưu thế trong việc ức chế sự biểu hiện của các gen mục tiêu thể hiện trong

kiểu hình mẫn cảm [45], [65], [82]. Cơ chế chính xác vẫn chưa rõ ràng nhưng

yếu tố ức chế này có thể được sử dụng để xác định vai trò của nhân tố phiên mã

thông qua việc tạo ra các đột biến mất chức năng chiếm ưu thế. Tương tự như

vậy, CaZPF1 hoạt động như một chất ức chế phiên mã trong nấm men, cho thấy

khả năng chịu đựng stress hạn khi được biểu hiện trong cây Arabidopsis chuyển

gen [81]. Như vậy, các nhân tố phiên mã được sửa đổi có thể là một nguồn tài

nguyên có giá trị trong kỹ thuật chuyển gen, tạo những đặc điểm mới cho cây

chuyển gen. Kỹ thuật này và các công nghệ có liên quan trở thành công cụ di

truyền quan trọng, cho phép các nhà nghiên cứu có được thông tin nhanh chóng.

Điều này cũng mở ra cánh cửa cho việc kích hoạt phiên mã dựa vào sự ức chế

hay kích hoạt các con đường trao đổi chất trong cây trồng.

Gần đây, Morran và cs (2010) đã tạo ra cây lúa mì và cây lúa mạch

chuyển gen biểu hiện tốt TaDREB2 và TaDREB3 dưới tác động của promoter

35S và promoter cảm ứng hạn RAB17 (ở cây ngô) một cách riêng biệt [113].

Những biểu hiện gia tăng các nhân tố phiên mã dẫn đến sự biểu hiện cao của 10

gen DREB/CBF khác và một số lượng lớn các gen LEA/COR/DHN đáp ứng các

stress. Cây biến đổi gen với sự biểu hiện mạnh cảm ứng stress cho thấy, rất ít

hoặc không có tác dụng không mong muốn. Trong khi đó, cây chuyển gen có

biểu hiện cấu trúc lại cho thấy những điều không mong muốn như còi cọc, chậm

ra hoa và hoa nhỏ. Do đó, biểu hiện của TaDREB2 và TaDREB3 trong cây lúa

mì và cây lúa mạch dưới tác động của promoter cảm ứng hạn có thể giúp gia

tăng khả năng sống sót khi gặp tình trạng thiếu nước.

Phân tích hệ thống ở các phân họ nhân tố phiên mã của cây Arabidopsis

có thể xác định được các gen ứng viên tiềm năng để cải thiện khả năng chịu

stress môi trường ở cây trồng [141]. Yếu tố hạt nhân Y (NF - Y) của nhân tố

phiên mã thường có mối quan hệ với các yếu tố điều hòa khác để điều chỉnh biểu

hiện gen bằng việc kiểm soát chặt chẽ [118]. Sau khi phát hiện ATNF - YB1,

một gen NF - YB từ cây ngô (ZmNF - YB2) đã được xác định và được sử dụng để

tạo cây ngô biến đổi gen. Các biểu hiện của gen ZmNF - YB2 giúp cây ngô có

khả năng chịu hạn trong các thử nghiệm trên đồng ruộng [118]. Nghiên cứu này

còn cho thấy, việc bảo tồn chức năng của các con đường kháng hạn cơ bản ở

thực vật một lá mầm và hai lá mầm. Tương tự nó cũng cho thấy, những phát hiện

ở cây Arabidopsis có thể được trực tiếp áp dụng trong việc cải tiến cây trồng.

1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG CẢI THIỆN KHẢ NĂNG

CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.3.1. Cây đậu tương và tác động của hạn đối với cây đậu tương

Đậu tương hay còn gọi là đậu nành, tên khoa học Glycine max (L.) Merrill

(2n= 40) thuộc họ Đậu (Lenguminoceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae).

Các giống đậu tương trồng ở Việt Nam thuộc giống phụ G.Soja, chi Glycine.

Hiện nay, đậu tương trồng ở Việt Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống địa

phương và các giống nhập nội [5].

Đậu tương thuộc loại cây hai lá mầm, thân thảo, là cây trồng cạn thu hạt,

bao gồm các bộ phận: Rễ, thân, cành, lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu tương thuộc

loại rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ bên, xung quanh có nhiều nốt sần dài khoảng

1cm, đường kính 5-6mm và chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng

cố định đạm từ nito của không khí. Thân cây tròn, mang từ 8 - 14 đốt, trên thân

có nhiều lông nhỏ, có 1 - 2 cành hoặc không có cành, các cành và lá mọc ra từ

các đốt trên thân. Cây đậu tương có 3 loại lá chính: Lá mầm, cặp lá đơn, lá kép

có 3 lá chét, đôi khi 4 - 5 lá chét. Đậu tương là loại cây tự thụ phấn, hoa được

phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân, hoa lưỡng tính và có màu tím hay

trắng. Cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tùy thuộc vào giống và

thời vụ gieo trồng bởi nó chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ. Hoa

đậu tương nhỏ, mọc thành từng chùm, mỗi chùm thường có 3 - 5 hoa. Quả đậu

tương là loại quả ráp, ngoài vỏ quả thường có lông bao phủ, màu sắc vỏ quả khi

chín có màu vàng hay xám đen. Hạt đậu tương có hình dạng tròn bầu dục, tròn

dài, tròn dẹt; vỏ hạt thường nhẵn và đa dạng về màu sắc khi chín như vàng nhạt,

vàng đậm, xanh, nâu, đen... [5]. Cây đậu tương là cây trồng ngắn ngày, có thể

trồng trên nhiều loại đất, nhiều vụ trong năm cho nên có thể xen canh, gối vụ

nhằm tăng hiệu quả sử dụng đất nông nghiệp. Trong suốt thời gian sinh trưởng,

nhu cầu nước của cây đậu tương không đồng đều qua các giai đoạn, độ ẩm của

đất trung bình là 50% - 60%, giai đoạn ra hoa, hình thành quả khoảng 70% - 80%.

Vì vậy, đậu tương được xếp vào nhóm cây trồng có nhu cầu cao về nước [1].

Đậu tương tuy là cây trồng cạn nhưng cần nhiều nước cho quá trình sinh

trưởng và phát triển để có thể cho năng suất cao. Trong các loài cây họ đậu, đậu

tương được xem là cây trồng chịu hạn nhạy cảm nhất [33]. Nhu cầu về nước tăng

theo thời gian sinh trưởng của cây cùng với sự tăng trưởng mạnh của thân, lá.

Quá trình sinh trưởng của cây phụ thuộc vào cường độ quang hợp, hiệu suất

quang hợp, tổng diện tích lá và thế năng quang hợp (thời gian lá xanh). Tổng sản

phẩm quang hợp của cây sẽ giảm nếu bị thiếu nước do tỷ lệ CO2 hấp thụ trên

một đơn vị diện tích lá giảm, diện tích quang hợp giảm từ sự phát triển kém và

chóng tàn của lá [101]. Thiếu nước trầm trọng sẽ ảnh hưởng tới sự hình thành

diệp lục dị hình, giảm sự vận chuyển điện tử trong quang phosphoryl hoá, ảnh

hưởng hoạt tính các enzyme khác tham gia vào quá trình đồng hoá carbon. Từ đó

dẫn tới giảm hiệu quả quang hợp và sự tích luỹ chất khô của cây [69], [101].

Nước rất cần cho sự phát triển bình thường của cây đậu tương cả giai đoạn sinh

trưởng sinh dưỡng và giai đoạn sinh trưởng sinh thực. Trong giai đoạn sinh

trưởng sinh dưỡng, tỷ lệ sử dụng nước ở pha nảy mầm và cây con thấp do tán

còn nhỏ. Nhu cầu nước tăng dần khi cây đạt 3 - 5 lá kép, tăng nhanh khi bắt đầu

bước vào giai đoạn sinh trưởng sinh thực.

Trong giai đoạn sinh trưởng sinh thực, cây rất nhạy cảm với tình trạng

thiếu nước. Phần lớn biến động về năng suất là do biến động về lượng nước cho

cây trong thời kỳ ra hoa, đậu quả. Ở thời kì ra hoa, đậu quả của đậu tương nếu

thiếu nước, hoa và quả non sẽ bị rụng nhiều. Giai đoạn quả phát triển và hạt vào

mẩy cần nhiều nước nhất, thiếu nước ở giai đoạn này sẽ dẫn đến giảm kích thước

hạt, năng suất giảm đáng kể. Nếu thiếu nước xảy ra trước giai đoạn hạt phát

triển, sau đó đủ nước thì quang hợp có thể phục hồi, sinh trưởng có thể trở lại

bình thường và hạt có thể phát triển tới kích thước bình thường [2]. Theo

Manavalan và cs (2009), năng suất của đậu tương giảm từ 32 - 44% nếu gây hạn ở

giai đoạn kết hạt [101]. Do vậy, thời kì ra hoa và thời kì sau ra hoa đã được chứng

minh là những thời kì bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất nếu thiếu nước [171].

Khả năng cố định đạm ở các loài cây họ đậu thường rất nhạy cảm đối với

tình trạng nước ở trong đất. Mất quá nhiều nước, cây đậu tương không chỉ giảm

khả năng cố định CO2, giảm sự phát triển lá mà khả năng cố định đạm cũng bị

ảnh hưởng nghiêm trọng, làm giảm sinh tổng hợp protein [5]. Quá trình cố định

đạm giảm một phần do lượng sản phẩm quang hợp chuyển về rễ giảm, một phần

do ảnh hưởng trực tiếp của thế nước ở trong nốt sần. Theo Huang và cs (1975),

hoạt động cố định đạm giảm khi thế nước giảm và ngừng lại khi trọng lượng nốt

sần giảm dưới 80% so với khi đủ nước [69]. Nhiều nhân tố hạn chế khả năng cố

định đạm trong điều kiện hạn đã được xác định ở cây đậu tương, bao gồm khả

năng sử dụng O2 giảm, nguồn carbon tới các nốt sần giảm, hoạt tính của enzyme

tổng hợp sucrose giảm, hàm lượng ure và amino acid tự do tăng. Đặc biệt, mối

quan hệ về thế năng nước của lá và nốt sần đã được xác định ở cây đậu tương

trong điều kiện hạn. Hoạt tính của nitrogenase giảm 70% trong 4 ngày đầu tiên khi

cây gặp hạn, trong khi đó quá trình quang hợp giảm khoảng 5% [5]. Ngoài ra, sự

thiếu hụt về nước cũng ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của nốt sần thông qua

sự tăng cường tính kháng đối với khả năng khuếch tán O2. Tình trạng thiếu nước

ở trong đất cũng dẫn tới sự tích lũy ure ở lá của cây đậu tương và hậu quả này

chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt sần [5].

1.3.2. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương

1.3.2.1. Chuyển gen ở đậu tương thông qua Agrobacterium tumefaciens

Chuyển gen ở đậu tương đã được báo cáo lần đầu vào năm 1988 [32], [64].

Thậm chí sau hơn hai thập kỷ qua, việc chuyển gen ở đậu tương có thể vẫn chưa

được coi là ổn định, bởi vì nó phụ thuộc vào khả năng kết hợp của các phương

pháp chuyển gen và tái sinh cây chuyển gen có hiệu quả. Hai phương pháp được

sử dụng với mức độ thành công tương đối lớn để tạo cây trồng biến đổi gen là sử

dụng súng bắn gen và hệ thống chuyển gen thông qua Agrobacterium

tumefaciens. Cả hai hệ thống này đều quan trọng đối với nghiên cứu cơ bản và

ứng dụng trong nông nghiệp. Ngoài ra, kỹ thuật chuyển gen qua Agrobacterium

rhizogenes cũng được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu chức

năng gen ở thực vật.

A. tumefaciens là một loại vi khuẩn Gram âm, lây nhiễm tự nhiên các loại

cây trồng [39]. Những phytopathogens gây ra một loạt các khối u. Khi

Agrobacterium gây nhiễm tế bào thực vật, một hoặc nhiều phân đoạn của DNA

(DNA hoặc chuyển T-DNA) từ Ti (Tumor inducing) hoặc Ri (Root inducing)

của plasmid đã được chuyển vào tế bào cây chủ [49]. Quá trình chuyển gen theo

phương pháp này đã được nghiên cứu và ứng dụng [50], [51], [132].

Trong gần 30 năm qua, giải pháp sử dụng chủng A. tumefaciens trong

chuyển gen gián tiếp ở cây trồng đã cung cấp một phương pháp tạo cây trồng

biến đổi gen. Những lợi thế của A. tumefaciens trong chuyển gen bao gồm các

khả năng chuyển được các đoạn DNA tương đối lớn, gen chuyển được tích hợp

vào hệ gen thực vật, sắp xếp lại gen hiếm gặp, giảm biểu hiện gen chuyển bất

thường [49], [87]. Hơn nữa, hệ thống này bao gồm chi phí thấp và các thao tác

đơn giản [20]. Tuy nhiên, các loại cây trồng biểu hiện khác nhau về sự nhạy cảm

với A. tumefaciens và khả năng tiếp nhận gen chuyển. Những sự khác biệt xảy ra

giữa các giống cây trồng hoặc giữa các loại mô trong thực vật [51], [59]. Hệ

thống chuyển gen qua A. tumefaciens thường có hiệu suất thấp hơn so với kỹ

thuật sử dụng súng bắn gen [186].

Trước đây, A. tumefaciens được coi là không gây bệnh cho đậu tương

[39]. Tuy nhiên, các nghiên cứu sau này cho thấy đậu tương dễ bị ảnh hưởng bởi

loài vi khuẩn này [108]. Việc bổ sung các acetosyringone khi lây nhiễm vi

khuẩn, lựa chọn chủng A. tumefaciens thích hợp nhất và sự phát triển của

plasmid đã góp phần vào việc tăng hiệu quả chuyển gen ở đậu tương [160].

Kết quả tái sinh cây đậu tương chuyển gen sử dụng qua trung gian chủng

A. tumefaciens bằng lây nhiễm ở nách lá mầm lần đầu tiên được báo cáo bởi

Hinchee và cs (1988) [64]. Sau đó, những tiến bộ trong kỹ thuật chuyển gen đã

tạo được các thế hệ cây chuyển gen khi sử dụng các mô khác nhau, cả ở nách lá

mầm [95], thân mầm [179], hạt [130], mô sẹo [68] và lá mầm non [84], [85].

Mặc dù phôi soma thứ cấp ở đậu tương vẫn là mục tiêu chính cho việc chuyển

gen bằng súng bắn gen, nhưng sự chuyển gen thông qua A. tumefaciens đã được

chứng minh qua sự lây nhiễm ở mô tổn thương. Thay vào hệ thống chuyển gen

qua trung gian A. tumefaciens thông thường, các phương pháp thay thế đã được

đề xuất cho những mô mục tiêu này [174]. Mặc dù đã có những tiến bộ, nhưng

chỉ có một vài dòng cây chuyển gen khả thi được tạo ra từ những thí nghiệm trên.

Điều này cho thấy, các phương pháp thích hợp và hiệu quả hơn cần phải được

phát triển trong thời gian tới để nâng cao hiệu quả chuyển gen qua A. tumefaciens

ở cây đậu tương.

Việc chuyển gen qua trung gian A. rhizogenes dẫn đến sự hình thành và

phát triển các rễ tơ. Kỹ thuật này nhanh chóng được đánh giá cao và ứng dụng

trong trường hợp không có chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh [34]. A. rhizogenes

là vật trung gian thực hiện chuyển T-DNA từ các plasmid Ri và từ vector nhị thể

chứa các gen thích hợp vào hệ gen thực vật [21], [31]. Rễ tơ có thể được nhân

bản vô tính trong môi trường nuôi cấy. Các dòng rễ tơ chuyển gen được biểu

hiện với số lượng lớn có thể đạt được và phân tích [79]. Lợi thế chính là một

khoảng thời gian tương đối ngắn (khoảng 6 - 8 tuần) có thể sàng lọc được gen

chuyển phát triển trong các mô chuyển gen [30]. Chuyển gen qua trung gian

A. rhizogenes đã trở thành một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu chức năng gen

và sinh học rễ vì sự nhanh chóng và đơn giản của nó [22], [79]. Ở đậu tương,

phương pháp này đã được sử dụng để nghiên cứu chất hoạt hóa [62], sự phát

triển của giun tròn [30], tương tác cộng sinh [61], tương tác gây bệnh [96] và gen

lặn thông qua can thiệp RNA [161]. Không giống như các loài thực vật khác,

cho đến nay chưa có báo cáo cập nhật về sự tái sinh cây đậu tương thành công từ

rễ tơ. Tuy nhiên, Olhoft và cs (2007) cho rằng, sự phục hồi của cây đậu tương

biến đổi gen hoàn chỉnh và ổn định từ lây nhiễm A. rhizogenes đã không còn

tác hại [127].

1.3.2.2. Hệ thống chọn lọc sử dụng trong kỹ thuật chuyển gen ở đậu tương

Liên quan đến các hệ thống chuyển gen được sử dụng, quá trình tạo cây

đậu tương chuyển gen thường đòi hỏi phải có một hệ thống chọn lọc hiệu quả để

xác định và lựa chọn các dòng mô biến đổi gen. Việc sử dụng chất kháng sinh

hoặc thuốc diệt cỏ đã cho phép chọn được vật liệu biến đổi gen.

Chất kháng sinh hygromycin đã được sử dụng thành công như là một trung

gian lựa chọn và trở thành tiêu chuẩn cho việc chọn lọc các dòng mô chuyển gen

ở đậu tương, đặc biệt là các mô phôi [63], [66], [67] và các tế bào ở nách lá mầm

[130]. Olhoft và cs (2003) đã chứng minh rằng, hygromycin có khả năng làm

giảm số lượng, nhưng không thay đổi về thời gian nuôi cấy [129].

Một số nghiên cứu đã báo cáo việc sử dụng thuốc diệt cỏ để chọn lọc các

dòng mô chuyển gen ở cây đậu tương. Hiệu quả chuyển gen ở cây đậu tương đã

được tối ưu hóa nhờ sử dụng các mức tối ưu của glufosinate trong việc chọn

lọc chồi chuyển gen phục hồi từ các nách lá mầm [190], [191]. Rao và cs

(2009) đã phát triển thành công một hệ thống chọn lọc phôi soma sử dụng gen

E.coli dapA kháng glufosinate, glyphosate, S-2 aminoethyl-L-cysteine và

imidazolinones [139].

1.3.3. Tiềm năng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong tạo giống đậu tương

chịu hạn

Sử dụng kỹ thuật chuyển gen mã hóa các thành phần trong con đường

chuyển hóa liên quan đến các stress của môi trường đã cho thấy tiềm năng để

tăng cường khả năng chịu hạn ở đậu tương. Cây đậu tương biểu hiện mạnh gen

chuyển mã hóa P5CS (enzym pyrroline-5-carboxylate synthase) có khả năng

chịu hạn và chịu nhiệt cao do sự tăng lên của prolin tự do [37], [38], [86]. Ngoài

ra, khả năng chịu stress có thể đạt được bằng cách điều khiển sự biểu hiện các

nhân tố phiên mã. Do đó, sẽ điều chỉnh biểu hiện của một số lượng lớn các gen

có liên quan [10]. Các nhân tố phiên mã khác nhau liên quan đến các stress đã

được xác định. Trong đó, DREB thuộc về họ các yếu tố đáp ứng ethylene của

nhân tố phiên mã và đóng một vai trò rất quan trọng trong việc cung cấp khả

năng chịu nhiều stress. Giống đậu tương BR16 mẫn cảm với hạn đã được chuyển

gen AtDREB1A dưới sự kiểm soát của promoter cảm ứng hạn RD29A từ cây

Arabidopsis. Các cây chuyển gen có nhiều chất diệp lục, hiệu suất quang hợp và

thoát hơi nước cao hơn. Một số gen liên quan đến các phản ứng với stress hạn đã

biểu hiện rõ ở cây trồng khi sống trong tình trạng thiếu nước trầm trọng. Kết quả

cho thấy, sự biểu hiện mạnh của gen AtDREB1A đã làm tăng khả năng chịu hạn

của cây đậu tương [133].

Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương thông qua A. tumefaciens được

Tran T.C.H. (2007) tiến hành thử nghiệm bằng 4 phương pháp lây nhiễm khác

nhau, trong đó tạo vết thương tại mặt trong của nách lá mầm với dung dịch có chứa vi khuẩn và được nuôi cấy ở nhiệt độ 210C có hiệu quả hơn cả, với hiệu

suất chuyển gen đạt cao [172]. Tran T.C.H. (2008), đã chuyển gen thành công ở

giống đậu tương PC19 thông qua A. tumefaciens bằng phương pháp nốt lá mầm

và kết quả cho thấy, hiệu quả chuyển gen xác định bằng phân tích Southern blot

của các cây T0 kháng glufosinate trong 4 thí nghiệm biến động từ 1 - 3%. Phân

tích các cây T1 bằng xét nghiệm GUS cho thấy gen chuyển nạp được truyền sang

thế hệ sau theo kiểu di truyền Mendel [173].

Nguyễn Thị Thúy Hường (2009) đã tối ưu quy trình tái sinh và chuyển

gen thông qua nách lá mầm đậu tương và nhận xét rằng, giống đậu tương DT84

là đối tượng phù hợp để tiến hành các thí nghiệm chuyển gen và đã chuyển thành

công cấu trúc gen RD29A/P5CSm vào giống đậu tương DT84, tạo được cây đậu

tương mang gen đột biến loại bỏ ức chế phản hồi, làm tăng cường khả năng tổng

hợp prolin khi cây đậu tương bị hạn [4]. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển

gen của Lò Thanh Sơn (2015) trong định hướng cải thiện kích thước bộ rễ nhằm

nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương đã nhận xét rằng, gen chuyển

GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ được xác định tồn tại trong hệ gen của các

dòng cây thuốc lá, hiệu suất chuyển gen đạt 5%. Xác định được gen chuyển di

truyền ổn định và biểu hiện protein expansin tái tổ hợp qua thế hệ T0 và T1.

Trong điều kiện hạn và không gây hạn, các dòng thuốc lá chuyển gen T1 có khả

năng kéo dài rễ chính cao hơn so với đối chứng từ 34,56% - 41,23%. Đặc biệt,

Lò Thanh Sơn đã thành công chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào giống đậu

tương DT84 nhờ A. tumefaciens và tạo được cây đậu tương chuyển gen T0 cho

sản phẩm PCR. Protein expansin tái tổ hợp được biểu hiện ở một dòng cây đậu

tương chuyển gen và hiệu suất chuyển gen đạt 0,27% [7].

Như vậy, cho đến nay những nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen

trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương ở nước ta mới chỉ được

thực hiện theo hướng chính là chuyển các gen chức năng liên quan trực tiếp đến

tính chịu hạn vào cây đậu tương [3], [7], [173] mà chưa thấy công bố kết quả

chuyển gen mã hóa protein là nhân tố kích hoạt quá trình phiên mã ở đậu tương.

Ngoài các nghiên cứu chuyển gen theo hướng tăng cường khả năng chịu

hạn, trong 5 năm gần đây ở Việt Nam còn có nghiên cứu của Nguyễn Thu Hiền

(2011) đã thành công tái sinh đa chồi từ nách lá mầm hạt chín của hai giống đậu

tương ĐT12, DT84 và thử nghiệm chuyển được gen gus, hiệu suất chuyển gen

kiểm tra ở giai đoạn hạt khoảng 7,6% ở giống ĐT12 và 4,0% với giống DT84.

Kết quả đã tạo được 8 dòng cây đậu tương ở thế hệ T1 mang cấu trúc vector biểu

hiện đặc trưng trong hạt SLHEP-HA1, cho sản phẩm PCR, sang thế hệ T2 dòng

đậu tương H11 mang đoạn gen HA1 nhận được đã biểu hiện thành công protein

tái tổ hợp HA1 trong hạt của dòng đậu tương này [3]. Nghiên cứu tạo cây

chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm của Lò Thị Mai Thu (2014) với kết quả

đã chuyển thành công cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu tương

ĐT12 và DT2008, thu được một số dòng đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 với

hiệu suất chuyển gen đạt từ 1,35% - 2,24% [8].

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Vật liệu thực vật

Sử dụng 6 giống đậu tương trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam làm vật

liệu phân lập gen. Các giống đậu tương: Vàng Cao Bằng (CB), Cao Bằng đen

(CBD), ĐT51, ĐT26 do Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ, Viện Khoa

học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp; giống đậu tương ĐVN5 được cung cấp

bởi Viện Nghiên cứu Ngô và giống DT2008 do Viện Di truyền Nông nghiệp

cung cấp. Giống đậu tương DT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp được

sử dụng làm vật liệu nhận gen chuyển (Bảng 2.1).

Giống đậu tương chịu hạn DT2008 do Viện Di truyền nông nghiệp chọn

tạo, là giống lai giữa giống DT2001 và giống HC100 (gốc Mexico) kết hợp với

phương pháp đột biến thực nghiệm và chọn lọc theo tiêu chuẩn thích ứng với

chống chịu. DT2008 có hoa tím, lông nâu, khi chín vỏ quả vàng, hạt vàng, rốn hạt

màu đen, chất lượng tốt, hàm lượng protein 40%. Giống đậu tương chịu hạn

DT2008 thuộc dạng hình cao cây, phân cành khỏe, số quả chắc trên cây từ 35 - 200

quả, tỷ lệ hạt/quả từ 2,0 - 2,2, năng suất 20 - 40 tạ/ha, có khả năng chống chịu

tổng hợp với nhiều yếu tố bất lợi của sản xuất: Hạn, úng, nhiệt độ, đất nghèo

dinh dưỡng, cho năng suất cao từ 1,5 - 2 lần so với các giống trồng phổ biến

trước đó như DT84 trong các điều kiện sản xuất khó khăn của vụ xuân, vụ đông,

các vùng khô hạn, lạnh. Giống đậu tương DT2008 có thể canh tác trong vụ xuân,

vụ hè thu, vụ đông và vụ đông xuân.

Giống đậu tương Vàng Cao Bằng (CB) là giống địa phương có nguồn gốc

từ tỉnh Cao Bằng. Giống CB có hạt màu vàng nhạt, rốn nâu nhạt, có dạng ovan,

hạt dài 5,2 - 7,0mm, rộng từ 4,2 - 6,2mm. Trọng lượng 1000 hạt từ 140 - 145 gam.

Hàm lượng protein 32,2 - 35,0% khối lượng khô, lipid 14,7 - 15,3% khối lượng

khô. Giống CB có khả năng chịu hạn tốt.

Bảng 2.1. Thống kê một số giống đậu tương sử dụng làm vật liệu nghiên cứu

TT

Nguồn gốc

Tên giống

Đặc điểm của hạt

1 DT2008

Hạt màu vàng, rốn hạt đen.

Giống lai giữa giống DT2001 và giống HC100 (gốc Mexico) kết hợp với phương pháp đột biến thực nghiệm và chọn lọc theo hướng thích ứng với chống chịu.

Khả năng chống chịu Có khả năng chống chịu tổng hợp với nhiều yếu tố bất lợi như hạn, úng, nhiệt độ...

2 CB

Giống địa phương có nguồn gốc từ tỉnh Cao Bằng.

Có khả năng chịu hạn tốt.

Hạt màu vàng nhạt, rốn hạt nâu nhạt, có dạng ô van.

3 CBD

Giống địa phương có nguồn gốc từ tỉnh Cao Bằng.

Có khả năng chịu hạn tốt.

Hạt màu đen, dạng hình trứng, rốn hạt màu đen.

4 ĐT26

Hạt màu vàng, rốn nâu đậm.

Có khả năng kháng bệnh gỉ sắt, đốm nâu, ruồi đục thân và chống đổ khá.

5 ĐT51

Nhiễm nhẹ bệnh vi rút, đốm nâu.

Hạt màu vàng, rốn hạt nâu đậm.

Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo từ tổ hợp lai ĐT2000 x ĐT12. Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo từ tổ hợp lai giữa LS17 x DT2001.

6 ĐVN5

Hạt màu vàng sáng, rốn hạt nâu nhạt.

7 DT84

Hạt màu vàng, rốn hạt nâu nhạt.

Viện Nghiên cứu Ngô chọn tạo năm 1998 bằng lai hữu tính giữa Cúc Tuyền x Chaing Mai và chọn lọc phả hệ. Viện di truyền nông nghiệp tạo ra từ tổ hợp lai DT80 x ĐH4 bằng phương pháp lai hữu tính kết hợp gây đột biến thực nghiệm.

Nhiễm bệnh sương mai, gỉ sắt, lở cổ rễ nhẹ, khả năng chịu hạn tốt. Nhiễm bệnh ở mức độ nhẹ đến trung bình với một số bệnh hại chính.

Giống đậu tương Cao Bằng đen (CBD) là giống địa phương có nguồn gốc

từ tỉnh Cao Bằng. Giống CBD có hạt màu đen, dạng hình trứng, rốn hạt màu đen,

hạt dài 5,1 - 7,5mm, rộng 4,3 - 5,0mm. Trọng lượng 1000 hạt từ 145 - 155 gam.

Hàm lượng protein 33,7 - 34,0% và lipid 12,4 - 15,2% khối lượng khô. Giống

CBD có khả năng chịu hạn tốt.

Giống đậu tương ĐT26 được chọn tạo bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát

triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm - Viện Khoa học

Nông nghiệp Việt Nam từ tổ hợp lai ĐT2000 x ĐT12 từ năm 2002 và được công

nhận giống sản xuất thử năm 2008. Giống đậu tương ĐT26 có hoa màu trắng,

hạt màu vàng và rốn nâu đậm, quả chín có màu nâu. Giống đậu tương mới ĐT26

có thời gian sinh trưởng trung bình từ 90 - 95 ngày, chiều cao cây từ 50 - 60cm,

phân cành khá (2,0 - 2,5 cành/cây). Tỷ lệ quả 3 hạt cao trung bình 18 - 22%.

Năng suất đạt trung bình ở độ ẩm 12% là 22 - 28 tạ/ha thuộc vào mùa vụ và điều

kiện thâm canh bình thường. Trong điều kiện thâm canh cao, ở diện tích hẹp,

năng suất có thể đạt tới 30 - 32 tạ/ha. Hạt màu vàng đẹp, hàm lượng protein

khoảng 42,21%) và lipit khoảng 19,72%. Giống ĐT26 có khả năng kháng bệnh

gỉ sắt, đốm nâu và khả năng chịu ruồi đục thân, chống đổ khá. Giống ĐT26

thích hợp nhất trong vụ đông và vụ xuân, có thể nhân hạt ở vụ hè.

Giống đậu tương ĐVN5 do Viện Nghiên cứu Ngô chọn tạo năm 1998 bằng

lai hữu tính giữa Cúc Tuyền x Chaing Mai và chọn lọc phả hệ, được công nhận

giống năm 2007. Giống đậu tương ĐVN5 có thời gian sinh trưởng 82 - 84 ngày

ở vụ Đông, chiều cao cây 41 - 47cm; phân cành khoẻ, sai quả (25 - 35 quả/cây);

hoa màu tím, khi chín vỏ quả vàng rơm, vỏ hạt vàng sáng, rốn hạt nâu nhạt.

Khối lượng 1000 hạt đạt 165 - 175 gam; năng suất 20 - 23 tạ/ha; nhiễm bệnh

sương mai, gỉ sắt, lở cổ rễ nhẹ; khả năng chịu hạn tốt.

Giống đậu tương ĐT51 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ

thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm chọn lọc từ tổ hợp lai giữa

LS17 x DT2001. Giống được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận,

cho sản xuất thử ở các tỉnh phía Bắc năm 2012. Giống đậu tương ĐT51 có hoa

màu tím, hạt vàng và rốn nâu đậm, quả chín có màu vàng. Chiều cao cây 45 - 55cm,

phân cành khá (hơn 2 cành/cây), số quả chắc cao, tỷ lệ quả 3 hạt đạt 25 - 30%.

Khối lượng 1000 hạt khoảng từ 175 - 200 gam. Thời gian sinh trưởng trung bình

90 - 95 ngày, năng suất 20 - 29 tạ/ha, tuỳ thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm

canh. Giống thích hợp trong vụ hè, xuân và vụ đông. Giống ĐT51 nhiễm nhẹ

bệnh virus, đốm nâu.

Giống đậu tương DT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp tạo ra từ tổ hợp

lai DT80 x ĐH4 bằng phương pháp lai hữu tính kết hợp gây đột biến thực nghiệm (tác nhân gamma Co60 kral trên dòng lai F3-D333). Giống DT84 đang

được trồng phổ biến ở nhiều nơi vì có khả năng cho năng suất cao và chống đổ

tốt, nhiễm bệnh ở mức độ nhẹ đến trung bình với một số bệnh hại chính. Màu

sắc hạt vàng, hạt tròn, to đẹp. Thời gian sinh trưởng vụ xuân 115 - 120 ngày, vụ

thu 90 - 95 ngày, vụ đông 110 - 115 ngày, cao thân chính 50 - 60cm, cứng cây, bộ

lá gọn có màu xanh đậm, có hoa màu tím, vỏ quả khi chín màu vàng, hạt to và

màu vàng, rốn hạt màu nâu nhạt. Năng suất trung bình đạt 15 - 25 tạ/ha, thâm

canh cao có thể đạt 30 tạ/ha.

Cây thuốc lá Nicotinana tabacum K326 do Phòng Công nghệ Tế bào

thực vật - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam cung cấp.

2.1.2. Các chủng vi khuẩn và các loại vector

Vector tách dòng pBT, vector pRTRA7/3 chứa promoter 35S và đuôi

cmyc, vector chuyển gen pBI121 do Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện

Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 do Phòng Công nghệ

Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam cung cấp.

2.1.3. Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu

Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR và colony-PCR có ký

hiệu và trình tự nucleotide được thể hiện ở bảng 2.2.

Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của các cặp mồi PCR

Ký hiệu

Trình tự nucleotide (5’ - 3’)

Sản phẩm dự kiến

GmDREB2-NcoI

CATGCCATGGATGGAAGAAGCGGGTTTAG

500 bp

GmDREB2-NotI

TTGCGGCCGCATCTTCAGGTTTGGGATAC

GmDREB2-BamHI

CGGATCCGATGGAAGAAGCGGGTTTAGG

526 bp

GmDREB2-Cmyc-SacI CGAGCTCGTCAATTCAGATCCTCTTCTG

pUC18-F

GTAAAACGACGGCCAGT

666 bp

pUC18-R

CAGTATCGACAAAGGAC

2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

Các loại kít thao tác phân tử thuộc hãng Bio-Neer, Fermentas: Kít Trizol

Reagents để tách chiết RNA tổng số; kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis

để tổng hợp cDNA; kít GeneJET PCR Purification để tinh sạch sản phẩm PCR;

kít Plasmid Extraction để tách chiết plasmid từ vi khuẩn. Các loại enzyme:

BamHI, NotI, NcoI, SacI, T4 ligase; thang DNA chuẩn 1kb, thang protein chuẩn

1kDa... sử dụng của hãng Fermentas.

Các hoá chất: Bacto pepton, yeast extract, agarose, sucrose, glucose,

trypton, X-gal, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, lycerol, CaCl2;

các loại kháng sinh kanamycin, rifamycine, cefotaxime, carbenicillin... của các

hãng Fermentas, Invitrogen, Sigma, Amersham và một số hãng khác.

Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300

(Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy

Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, máy xung điện Plulser, máy xác định

hàm lượng nucleic acid NanoDrop và một số thiết bị hiện đại khác.

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án

Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 6/2012 đến tháng 12/2015; các

thí nghiệm phân lập gen, thiết kế vector, chuyển gen và phân tích cây chuyển gen

được tiến hành tại Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Công nghệ Tế bào

thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ

Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Luận án được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục

Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các phương pháp nghiên cứu chia thành 5 nhóm chính: (1) nhóm phương

pháp tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen GmDREB2, (2) nhóm

phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật, (3) nhóm phương pháp tạo cây

chuyển gen, (4) nhóm phương pháp phân tích cây chuyển gen và (5) phân tích,

xử lý số liệu. Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ mô tả ở hình 2.1.

2.3.1. Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen GmDREB2

2.3.1.1. Thiết kế cặp mồi PCR nhân gen

Dựa trên các thông tin về trình tự nucleotide của gen GmDREB2 mang

mã số DQ054363 trên Ngân hàng Gen [180] để thiết kế cặp mồi nhân gen

GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI với các thuộc tính đã được mặc định của

chương trình DNAStar. Trình tự nucleotide của cặp mồi được trình bày ở bảng 2.2.

2.3.1.2. Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số từ các mẫu được tách bằng dung dịch đệm với CTAB,

EDTA và β-Mercapto Ethanol tiến hành theo phương pháp của Murray và cs

(1980) [114].

2.3.1.3. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA

Sử dụng bộ kít Trizol Reagents (của hãng Invitrogen) để tách chiết RNA

tổng số từ các mẫu nghiên cứu theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Sử dụng bộ kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis của hãng Fermantas

để tổng hợp cDNA từ RNA tổng số đã tách chiết theo quy trình chỉ dẫn của nhà

sản xuất.

GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CB, CBD, ĐT51, ĐT26, ĐVN5, DT2008

RT-PCR

KHUẾCH ĐẠI TỪ mRNA, TÁCH DÒNG & GIẢI TRÌNH TỰ GEN GmDREB2

Phân tích gen GmDREB2 bằng BASLT trên NCBI

ĐOẠN MÃ HÓA CỦA GEN GmDRE B2 TỪ GIỐNG DT2008

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂ N GEN THỰC VẬT CHỨ A CẤU TRÚC MANG GEN Gm DRE B2

Chuyể n gen GmDREB2 qua A. tumefaciens

GIỐNG ĐẬU TƯƠNG DT84

GIỐNG THUỐC LÁ K326

Xác định sự có mặt của GmDRB2 bằng PCR

Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp GmDREB2

Phân tích gen chuyển GmDRB2 bằng Southern blot

Đánh giá chức năng sinh học của gen chuyển GmDREB2

Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp GmDREB2

Dòng cây chuyển gen chứa gen chuyển GmDREB2

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

2.3.1.4. Kỹ thuật PCR khuếch đại gen GmDREB2

Gen GmDREB2 được khuếch đại từ DNA hoặc cDNA bằng kỹ thuật

PCR với cặp mồi đặc hiệu GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI đã thiết kế. Thành

phần phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR với Master Mix

STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)

PCR Master Mix 2X 12,5 1

GmDREB2-NcoI 10 pmol/μl 1,0 2

GmDREB2-NotI 10 pmol/μl 1,0 3

DNA hoặc cDNA khuôn 25 ng/μl 2,0 4

Nước khử ion - 8,5 5

Tổng thể tích 25

Chu trình nhiệt và thời gian của phản ứng PCR khuếch đại gen GmDREB2: Biến tính khởi động ở 94oC trong 5 phút; (biến tính ở 94oC trong 30 giây; gắn mồi ở 58oC trong 30 giây; tổng hợp kéo dài ở 72oC trong 30 giây) × 30 chu kỳ; ổn định mẫu và kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút; bảo quản ở 4oC.

2.3.1.5. Tách dòng gen GmDREB2

Kỹ thuật tách dòng gen được thực hiện theo Sambrook và Russell (2001)

[149] với các bước cơ bản sau đây:

(1) Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kít GeneJET PCR Purification của hãng

Fermentas theo quy trình chỉ dẫn của nhà sản xuất.

(2) Sản phẩm tinh sạch PCR được gắn vào vector pBT để tạo plasmid tái tổ hợp

mang đoạn DNA quan tâm với thành phần và điều kiện phản ứng mô tả ở bảng 2.4.

(3) Biến nạp vector tách dòng tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

Duy trì hỗn hợp gồm 5µl vector tái tổ hợp và 50µl dịch tế bào khả biến trong nước đá 20 phút, sau đó chuyển ngay vào bể ổn nhiệt ở 42oC trong thời gian

1 phút 30 giây, sau đó đưa ngay vào nước đá trong thời gian 10 phút. Sau khi sốc nhiệt bổ sung 150 - 300µl LB lỏng để nuôi phục hồi ở 37oC, lắc 200rpm

trong vòng 1 giờ. Cấy trải 150 - 250µl dịch khuẩn lên môi trường LB đặc có bổ sung carbenicillin 50mg/l, X-gal 30mg/l và IPTG 100µM rồi nuôi ở 37oC trong

vòng 16 giờ.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB2 vào vector tách dòng

STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)

1 T4 DNA Ligase Buffer 10X 2,0

2 T4 DNA Ligase 5u/μl 1,0

3 GmDREB2 100ng/μl 12,0

4 pBT 100ng/μl 3,0

5 Nước khử ion - 2,0

Tổng 20

Điều kiện phản ứng: 22oC trong 3 giờ

(4) Sàng lọc các dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony-PCR:

Dùng tăm tre khử trùng chấm những khuẩn lạc có khả năng mang plasmid tái tổ

hợp gen GmDREB2, hoà ngay vào 10µl nước khử ion - dung dịch này dùng làm

DNA khuôn cho phản ứng colony-PCR. Cặp mồi sử dụng cho phản ứng là

pUC18F/pUC18R.

Bảng 2.5. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường Thành phần

LB lỏng Bacto pepton 10g/l + NaCl 10g/l + Yeast Extract 5g/l, pH = 7

LB đặc LB lỏng + agar 16g/l

(5) Tách chiết plasmid bằng kít Plasmid Extraction theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

(6) PCR kiểm tra plasmid bằng cặp mồi đặc hiệu.

2.3.1.6. Xác định trình tự nucleotide

Các plasmid tái tổ hợp mang gen GmDREB2 được xác định trình tự trên

máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer.

2.3.2. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen GmDREB2

Vector chuyển gen GmDREB2 được thiết kế theo hai bước cơ bản: Thiết kế

cấu trúc độc lập mang gen chuyển GmDREB2 và gắn cấu trúc gen GmDREB2

vào vector chuyển gen thực vật pBI121.

(1) Thiết kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển:

(i) Cắt pBT-GmDREB2 và pRTRA7/3 bằng cặp enzyme NcoI + NotI;

(ii) Lai ghép vào vector pRTRA7/3 tạo vector pRTRA7/3 chứa cấu trúc

mang gen GmDREB2;

(iii) Nhân bản cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc bằng PCR từ pRTRA7/3-

GmDREB2 với cặp mồi GmDREB2-BamHI/Cmyc-SacI;

(iv) Gắn cấy trúc BamHI-GmDREB2-cmyc-SacI vào pBT;

(v) Tiến hành phản ứng cắt pBT-GmDREB2-cmyc với cặp enzyme

BamHI và SacI.

(2) Tạo vector chuyển gen thực vật pBI121-GmDREB2

(i) Loại bỏ đoạn gen GUS bằng cặp enzyme giới hạn BamHI và SacI;

(ii) Lai ghép cấu trúc GmDREB2-cmyc vào vector pBI121 tạo vector

chuyển gen chứa cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc.

2.3.2.1. Phát triển cấu trúc độc lập mang gen chuyển GmDREB2

Xử lý song song vector tái tổ hợp pBT-GmDREB2 và vector pRTRA7/3

bằng cặp enzyme hạn chế NcoI/NotI tạo các đầu dính tương ứng với thành phần

và điều kiện phản ứng mô tả ở bảng 2.6. Dựa vào kích thước các phân đoạn DNA,

lựa chọn và tinh sạch các băng điện di theo chỉ dẫn của kít GeneJET PCR

Purification để thu nhận các thành phần cần cho phát triển vector gồm: Gen đích

GmDREB2 và vector mở vòng pRTRA7/3.

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI, NcoI

STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)

1 Orange Buffer 10X 2,0

2 NotI 5u/μl 1,5

3 NcoI 5u/μl 2,0

4 Plasmid 200ng/μl 8,0

5 Nước khử ion - 6,5

Tổng 20

Điều kiện phản ứng: 37oC, 6 giờ

Trộn gen GmDREB2 với vector mở vòng pRTRA7/3 sau khi tinh sạch,

bổ sung T4 DNA ligase xúc tác cho quá trình gắn nối nhằm tạo được vector

trung gian tái tổ hợp pRTRA7/3 mang cấu trúc gen chuyển bao gồm:

CaMV35S-GmDREB2-cmyc.

Vector tái tổ hợp pRTRA7/3 mang gen chuyển GmDREB2 được nhân

dòng trong E.coli DH5α bằng biến nạp nhờ sốc nhiệt và chọn dòng tái tổ hợp

bằng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI.

2.3.2.2. Tách dòng cấu trúc BamHI-GmDREB2-cmyc-SacI

Sau khi gắn thành công cấu trúc GmDREB2 vào vector pRTRA7/3, tiến hành

PCR nhân gen với cặp mồi GmDREB2-BamHI/cmyc-SacI để thu được cấu trúc

GmDREB2-cmyc có điểm cắt của BamHI và SacI. Sau đó, gắn cấu trúc này vào

vector tách dòng pBT.

2.3.2.3. Gắn cấu trúc mang gen chuyển GmDREB2 vào vector chuyển gen

pBI121

Xử lý đồng thời pRTRA-GmDREB2 và pBI121 với enzyme hạn chế

HindIII (Bảng 2.7). Dựa vào kích thước các phân đoạn DNA, lựa chọn và tinh sạch

các băng điện di theo chỉ dẫn của kít GeneJET PCR Purification để thu nhận các

thành phần cần cho phát triển vector gồm: Cấu trúc mang gen GmDREB2

khoảng 1,4 kb; vector mở vòng pBI121 khoảng 2,6 kb.

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII

STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)

Tango Buffer 1 10X 2,0

BamHI 2 5u/μl 1,0

SacI 3 5u/μl 1,5

Plasmid 4 200ng/μl 10,0

5 Nước khử ion - 5,5

Tổng 20

Điều kiện phản ứng: 37oC trong 4 giờ

Trộn cấu trúc gen GmDREB2 tinh sạch với vector pBI121 đã mở vòng,

bổ sung T4 DNA ligase xúc tác cho quá trình gắn nối nhằm tạo được vector

chuyển gen thực vật pBI121 mang cấu trúc gen GmDREB2.

Vector tái tổ hợp pBI121 mang cấu trúc gen GmDREB2 được nhân dòng

trong E.coli DH5α bằng biến nạp nhờ sốc nhiệt và chọn dòng tái tổ hợp bằng

colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI.

2.3.2.4. Quy trình thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc

biểu hiện gen GmDREB2

Từ các bước tiến hành trên có thể tóm tắt quy trình thí nghiệm thiết kế

mRNA

vector chuyển gen pBI121/35S-GmDREB2-cmyc trên hình 2.2

Giống đậu tương DT2008

GmDreb2

Ligation

GmDREB2

pBT-GmDREB2 3200 bp

GmDREB2

NcoI + NotI

GmDREB2

pBT-GmDREB2 3200 bp

NcoI + NotI

2 B E R D m G

GmDREB2

Ligation

pRTRA 7/3 3300 bp

pRTRA-GmDREB2 3800 bp

GmDREB2

BamHI

NotI

SacI

PCR

GmDREB2

c-myc

pRTRA-GmDREB2 3800 bp

Primer F: BamHI- DREB2 Primer R: SacI-cmyc

Ligation

pBI121-GmDREB2

BamHI + SacI

pBI121-GUS

Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen pBI121-GmDREB2.

(A): Phân lập gen GmDREB2 từ mRNA và tách dòng gen GmDREB2 trong

vector tách dòng pBT; (B): Cắt vector tái tổ hợp pBT, thu gen GmDREB2 và mở

vòng vector pRTRA7/3; (C): Gắn gen GmDREB2 vào vector pRTRA tạo vector

tái tổ hợp pRTRA-GmDREB2; (D): Phân lập đoạn GmDREB2-cmyc từ vector tái

tổ hợp pRTRA-GmDREB2; (E): Loại bỏ đoạn gen GUS bằng cặp enzyme giới

hạn BamHI và SacI từ vector pBI121-GUS và lai ghép cấu trúc GmDREB2-cmyc

vào vector pBI121 tạo vector chuyển gen chứa cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc.

2.3.3. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens

2.3.3.1. Tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens CV58 mang vector chuyển gen

Biến nạp bằng xung điện

Hỗn hợp tế bào khả biến A. tumefaciens CV58 và vector pBI121-GmDREB2 đặt

trong cuvette được xung điện với thông số 400Ω, 2,5kV, 25μF rồi đưa ngay vào

nước đá, sau 5 phút bổ sung 200μl LB lỏng và đảo nhẹ. Chuyển hỗn dịch đã xung điện sang ống eppendorf 2ml, nuôi phục hồi ở 28oC, lắc 200rpm trong 2

giờ. Cấy trải trên đĩa petri môi trường LB lỏng có kháng sinh kanamycin 50mg/l và rifamycin 50mg/l, ủ ở 28oC trong 48 giờ.

Chọn dòng vi khuẩn mang vector chuyển gen pBI121-GmDREB2

Tiến hành chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pBI121-GmDREB2 bằng

kỹ thuật colony-PCR với cặp mồi GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI. Dòng vi

khuẩn cho sản phẩm colony-PCR được nuôi trong LB lỏng, giữ chủng và dùng

cho lây nhiễm trong chuyển gen.

2.3.3.2. Tạo dòng cây thuốc lá chuyển gen mang gen GmDREB2

Phương pháp chuyển cấu trúc chứa gen GmDREB2 vào cây thuốc lá được thực

hiện theo mô tả của Topping (1998) [168] với các bước cơ bản:

Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp: Khử trùng hạt bằng cồn 70% khoảng 20 giây.

Sau đó ngâm hạt trong dung dịch nước tẩy (Javel 30% + Tween 0,05%) khoảng

20 phút. Loại bỏ dung dịch nước tẩy và rửa hạt khoảng 5 lần bằng nước cất khử

trùng. Hạt thuốc lá sau khi khử trùng cho nảy mầm trên môi trường MS (Bảng 2.8).

Sau 3 - 5 tuần cây con phát triển 3 - 4 lá thật thì sử dụng để biến nạp gen chuyển. Các mảnh lá được cắt với kích thước khoảng 1cm2 và cảm ứng trên môi trường

tái sinh GM trong 48 giờ.

Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: Vi khuẩn A.tumefaciens mang gen chuyển được

nuôi chọn lọc trong 15ml môi trường LB lỏng bổ sung kháng kanamycin 50mg/l và rifamycin 50mg/l ở 28oC, lắc 200rpm trong 48 giờ. Chuyển 10ml dịch

huyền phù tế bào trên vào 50ml LB lỏng không kháng sinh để nuôi phục hồi ở 28oC, lắc 200rpm đến khi OD600nm = 0,6 - 0,8 là đạt số lượng tế bào tối ưu để biến nạp. Ly tâm toàn bộ dịch tế bào ở 4oC, 5000rpm trong 15 phút. Hoà tan tế bào

lắng vào 40ml dung dịch ½MS + AS 50μl đặt trong nước đá lạnh.

Bảng 2.8. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá

Hỗn hợp

Thành phần cho 1 lít dung dịch

Stock I

KNO3 1,9g + KH2PO4 0,17g + NH4NO3 1,65g + MgSO4 0,37g

Stock II CaCl2 0,44g

H3BO3 6,2mg + MnSO4.4H2O 22,3mg + CoCl2.6H2O 0,025mg +

Stock III

CuSO4.7H2O 0,025mg + ZnSO4.7H2O 8,6mg + Na2MoO4.2H2O 0,25mg +

KI 0,83mg

Stock IV FeSO4 27,8mg + Na2EDTA 37,3mg

Myo-Inositol 100mg + Thiamine HCl 0,1mg + Pyridoxine HCl 0,5mg +

Stock V

Nicotic acid 0,5mg + Glycine 2mg

20ml stock I + 10ml/stock (II, III, IV, V) + glucose 35g + agarose 8g

½MS

10ml stock I + 5ml/stock (II, III, IV, V)

MS + BAP 1mg + sucrose 30g + agar 9g

MS + IBA 0,1mg + sucrose 30g + agar 9g

* Ghi chú: Các môi trường đều được chuẩn pH = 5,8 và khử trùng. Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/ngày.

Biến nạp: Ngâm các mảnh lá đã cảm ứng vào dịch huyền phù vi khuẩn 10 phút,

thấm khô và chuyển lên môi trường GM không chứa kháng sinh để đồng nuôi

cấy trong tối 2 ngày.

Tái sinh đa chồi: Thực hiện rửa khuẩn ngoại vi bằng cách ngâm các mảnh lá

biến nạp trong ½MS + cefotaxim 400mg/l trong 10 phút, thấm khô và chuyển

lên môi trường GM bổ sung kanamycin 50mg/l và cefotaxim 400mg/l.

Chọn lọc và kéo dài chồi: Sau 3 - 4 tuần, các cụm chồi hình thành được cắt tách

nhỏ và chuyển sang môi trường MS có bổ sung kanamycin 50mg/l và cefotaxim

400mg/l.

Ra rễ: Sau 4 - 5 tuần, các chồi phát triển cao khoảng 2 - 3cm thì được cắt và

chuyển sang môi trường ra rễ RM có bổ sung kanamycin 50mg/l và cefotaxim

400mg/l.

Ra bầu và nhà lưới: Sau 3 - 4 tuần, cây con ra rễ và phát triển hoàn chỉnh với 3 - 4

lá thật cho ra bầu trấu : cát (tỷ lệ 1 : 1). Cây phát triển với 4 - 5 lá thật thì chuyển

ra trồng trong nhà lưới.

2.3.3.3. Phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen

Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm được tiến hành dựa trên nghiên

cứu của Olhoft và cs (2006) [128] và tham khảo hệ thống tái sinh phục vụ chuyển

gen vào đậu tương của Nguyễn Thu Hiền (2014) [3], Nguyễn Thị Thuý Hường

(2011) [4].

Tạo nguyên liệu biến nạp gen: Hạt đậu tương khử trùng bằng khí clo tạo ra từ

hỗn hợp javen 100ml + HCl 3ml đậm đặc rồi cho nảy mầm trên môi trường MS

(Bảng 2.9). Sau 4 ngày, lá mầm được tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng sử dụng

làm nguyên liệu biến nạp gen và nuôi cấy in vitro.

Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: Nuôi chọn lọc vi khuẩn trong 15ml môi trường

LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc là kanamycin 50mg/l và rifamycin 50mg/l ở 28oC, 150rpm trong 48 giờ. Chuyển 10ml dịch huyền phù tế bào trên vào 50ml LB lỏng không kháng sinh để nuôi phục hồi ở 28oC, 150rpm đến khi

OD600nm = 0,6 - 0,8 là đạt số lượng tế bào tối ưu để biến nạp. Ly tâm dịch tế bào ở 4oC, 5000rpm trong 15 phút. Hoà tan tế bào lắng tạo huyền phù vi khuẩn vào

40ml dung dịch môi trường CCM đặt trong nước đá lạnh.

Lây nhiễm và đồng nuôi cấy: Các mảnh lá mầm đậu tương được gây tổn

thương bằng mũi dao nhọn từ 7 lần trở lên vào phần nách lá mầm trong dịch

huyền phù vi khuẩn trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được

chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc không kháng sinh. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25oC trong thời gian 5 ngày.

Bảng 2.9. Môi trường tái sinh cây đối với giống đậu tương DT84

Môi

Thành phần

trường

GM Muối B5 3,052g/l + sucrose 20g/l + agar 6g/l + vitamin B5 1mg/l

Muối B5 0,316g/l + MES 3,9g/l + sucrose 30g/l + agar 5g/l + vitamin B5

CCM

1mg/l + AS 0,2mM + L-cysteine 400mg/l + Sodium thiosulfate 158mg/l

+ DTT 154mg/l + GA3 0,25mg/l + BAP 1,5mg/l; pH = 5,4

Muối B5 3,052g/l + MES 0,59g/l + sucrose 30g/l + vitamin B5 1mg/l +

SIM

BAP 1,5mg/l

MS 4,3g/l + MES 0,59g/l + sucrose 30g/l + agar 6g/l + vitamin B5 1mg/l +

L-asparagine 50mg/l + L-pyron glutamic acid 100mg/l + IAA 0,1mg/l +

SEM

GA3 0,5mg/l

MS 1,58g/l + MES 0,59g/l + sucrose 20g/l + agar 6g/l + IBA 0,1mg/l +

vitamin B5 1mg/l

Cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM: Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu

biến nạp được rửa trong môi trường cảm ứng tạo chồi (SIM) có bổ sung

cefotaxim 400mg/l với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử

trùng. Đặt mẫu lên môi trường tạo chồi SIM có bổ sung cefotaxim 400mg/l và

kanamycin 50mg/l (lần 1). Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi

trường SIM đặc có bổ sung cefotaxim 400mg/l và kanamycin 75mg/l (lần 2).

Kéo dài chồi: Sau 2 - 3 tuần, các cụm chồi sống sót trên môi trường chọn lọc

được loại bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường phát triển kéo dài chồi (SEM) có

bổ sung cefotaxim 400mg/l và kanamycin 50mg/l.

Tạo rễ: Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 4cm sẽ được chuyển sang

môi trường tạo rễ (RM) có bổ sung cefotaxim 400mg/l và kanamycin 50mg/l để

tạo cây hoàn chỉnh.

Cây ra giá thể: Những cây hoàn chỉnh, khoẻ mạnh được đưa ra bầu trấu hun : cát

(tỷ lệ 1 : 1). Sau khoảng 1 - 2 tuần, các cây sống sót được trồng ra nhà lưới. Tính

toán thời gian biến nạp và tái sinh để thời điểm ra cây trùng với thời vụ gieo

trồng đậu tương.

2.3.4. Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen

2.3.4.1. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR

Tách chiết DNA tổng số từ lá cây chuyển gen và thực hiện phản ứng PCR

với cặp mồi đặc hiệu GmDREB2-BamHI/Cmyc-SacI để xác định sự có mặt của

gen GmDREB2. Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 1,0%.

2.3.4.2. Phân tích cây chuyển gen bằng lai DNA (Southern blot)

Tổng hợp DNA mẫu dò GmDREB2 được tiến hành theo hướng dẫn của bộ

kit "Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit" [202]. Khuôn DNA là gen GmDREB2

trong vector tái tổ hợp pBT-GmDREB2. Phản ứng tạo mẫu dò là PCR một chu

kỳ, thành phần gồm: Enzyme là đoạn Klenow Fragment, exo-; dNTP (1,0mM

dGTp, 1,0mMdATP, 0,65mM dCTP, 0,35mM Biotin-110dUTP); mồi random

primer. Sản phẩm tạo ra các phân đoạn DNA có kích thước khác nhau tương

đồng với cả hai mạch DNA, mỗi phân đoạn đều có Biotin-11-dUTP ở các vị trí

ngẫu nhiên. Klenow Fragment là đại phân tử protein được tạo ra khi cắt DNA

polymerase I từ E.coli bằng protease subtilisin Klenow Fragment. Klenow

Fragment, exo- là dạng đột biến của Klenow Fragment, mất khả năng 3’  5’

exonuclease, nhưng lại có khả năng tổng hợp 5  3’ và tổng hợp ngay cả khi

DNA ở dạng sợi kép.

Phản ứng tổng hợp DNA dò gồm hai bước: (1) Hỗn hợp chứa dung dịch

đệm và DNA khuôn được biến tính ở 95oC, sau đó hạ nhiệt độ đột ngột xuống 0oC, mồi random primer gắn ngẫu nhiên lên mạch DNA khuôn; (2) Bổ sung thêm Klenow Fragment, exo- và dNTP, ủ ở 37oC, phản ứng kéo dài trình tự

nucleotide được thực hiện. Từ 1g DNA ban đầu có thể tạo thành từ vài g đến

vài chục g DNA dò.

Phản ứng lai Southern blot bao gồm các bước: (1) Tách chiết DNA tổng

số từ cây đậu tương chuyển gen, thu 30 - 50g DNA tinh sạch và xử lý bằng

enzyme giới hạn SacI; (2) Điện di sản phẩm cắt bởi enzyme giới hạn trên gel

agarose 1% và chuyển sang màng lai; (3) Bổ sung DNA dò GmDREB2 đã được đánh dấu trong đệm chứa 50% formamid, ở nhiệt độ 42oC; (4) Rửa màng lai ở nhiệt độ 65oC trong đệm 0,1X SSC; (5) Hiện kết quả lai trên màng. Quy trình

hiện màng được thực hiện theo kit Biotin Chromogenic Detection Kit (Thermo

Scientific).

2.3.4.3. Phân tích cây chuyển gen bằng Western blot

Kiểm tra hoạt động của gen chuyển qua sự có mặt của protein DREB2

bằng Western blot với các bước cơ bản sau: (1) Tách chiết protein tổng số

(nghiền 0,5g lá trong nitơ lỏng và hoà tan trong 1ml PBS + Tween 0,05%, ly tâm

13000rpm, 15 phút); (2) Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide - SDS

10%; (3) Chuyển protein trên gel điện di lên màng lai nitrocellulose bằng máy

Pierce G2 Fast Blotter (25V, 1,3mA trong 20 phút); (4) Màng chứa kháng

nguyên cmyc được phủ bằng 5% sữa tách béo pha trong dung dịch PBS + Tween

0,05% trong 16 giờ; (5) Lai kháng thể 1 (ngâm màng trong 15 ml dung dịch PBS

5% sữa tách béo có chứa kháng thể cmyc với độ pha loãng 700 lần, lắc trong 3

giờ ở nhiệt độ phòng); (6) Lai kháng thể 2 (ngâm màng trong 15ml dung dịch

PBS + 5% sữa tách béo có chứa kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (Horse

Radish Peroxidase) trong 2 giờ); (7) Hiện màu trong dung dịch có chứa cơ chất

TMB (3,3’,5,5’-tetramethyl benzidine) hoặc DAB (3,3'-diaminobenzidine

tetrahydrochloride), hiển thị kết quả dưới ánh sáng thường.

2.3.4.4. Xác định hàm lượng prolin trong cây chuyển gen

Hàm lượng prolin trong cây chuyển gen được xác định bằng phương pháp

Bates và cs (1973) [15].

Gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen và các cây đối chứng

không chuyển gen. Nghiền 0,5g lá khô đã xử lý hạn ở ngưỡng sau hạn 5 ngày và

9 ngày trong cối chày xứ, thêm 10ml dung dịch axit sunfosalisilic 3%, li tâm

8000 vòng/phút trong 30 phút, thu dịch. Đo hấp thụ quang phổ ở bước sóng

520nm. Hàm lượng prolin của mỗi dòng cây thuốc lá được tính bằng đơn vị μmol/g

khối lượng khô.

2.3.5. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu

Hiệu suất chuyển gen ở cây đậu tương ở mỗi giai đoạn phân tích được xác

định bằng công thức:

Số dòng cây mang gen chuyển/ hoặc số dòng cây biểu hiện protein tái tổ hợp

Hiệu suất chuyển gen (%) =

Tổng số mẫu biến nạp

Kết quả nghiên cứu về phân tích trình tự gen được xử lý bằng phần mềm

Blast trong NCBI, BioEdit và DNA Star.

Các số liệu phân tích hàm lượng prolin xử lý bằng phần mềm Microsoft

Excel để xác định các đại lượng thống kê như: Giá trị trung bình, phương sai,

độ lệch chuẩn, sai số trung bình mẫu với mức ý nghĩa α = 0,001 [6].

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG

3.1.1. Tách dòng và xác định trình tự của gen GmDREB2 từ một số giống

đậu tương

Thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân bản gen GmDREB2

Dựa trên trình tự gen DREB2 của đậu tương đã công bố tại Ngân hàng Gen

mang mã số DQ054363, cặp mồi đặc hiệu GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI có

trình tự nucleotide được thiết kế cho phản ứng PCR để nhân bản gen GmDREB2

từ 6 giống đậu tương nghiên cứu (Bảng 2.1). Cặp mồi được thiết kế bao gồm cả

trình tự chứa điểm cắt của enzyme giới hạn để phục vụ cho việc thiết kế vector

sau này. Ở vị trí trước bộ ba mở đầu có bổ sung 9 nucleotide trên mồi xuôi

GmDREB2-NcoI chứa điểm cắt của enzyme NcoI và 11 nucleotide trên mồi

ngược GmDREB2-NcoI chứa điểm cắt của enzyme NotI ngay sau bộ ba kết thúc.

Trình tự gen GmDREB2 đã được công bố bởi Wang và cs (2006) có kích thước

480 bp, mã hóa 159 amino acid, miền AP2 có 59 amino acid, từ vị trí amino acid

34 đến 92 [180].

Như vậy, đoạn gen GmDREB2 được khuếch đại từ cDNA bằng cặp mồi

GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI thì kết quả sẽ cho sản phẩm PCR với kích

thước là 500 bp.

Kết quả nhân bản gen GmDREB2

Hạt của 6 giống đậu tương (DT2008, CB, CBD, ĐT26, ĐVN5, ĐT51)

được ngâm ủ, nảy mầm, khi được 6 ngày tuổi tiến hành thu mẫu mô vùng sinh

trưởng của lá để phục vụ thí nghiệm tách chiết RNA. Tách chiết RNA tổng số và

tổng hợp cDNA, gen GmDREB2 được nhân bản bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi

GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI và sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di

trên gel agarose 0,8% (Hình 3.1A).

1 2 3 4 M 5 6

M 1 2 3 4 5 6

2,0 kb 

1,0 kb 

 0,66 kb

0,5 kb 

0,5 kb



Hình 3.1. A: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại cDNA của gen

GmDREB2 từ 6 giống đậu tương; B: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm

colony-PCR với cặp mồi pUC18-F/pUC18-R từ 6 dòng khuẩn lạc.

(M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1-DT2008; 2-CB; 3-CBD; 4-ĐT26; 5-ĐVN5;

6-ĐT51).

Kết quả chọn dòng khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp dựa trên kiểu hình và

bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-F/pUC18-R cho thấy xuất hiện

băng DNA có kích thước khoảng 0,66 kb từ 6 dòng khuẩn lạc (Hình 3.1B),

plasmid tái tổ hợp đã được tách và đem giải trình tự nucleotide. Kết quả xác định

trình tự nucleotide được thể hiện ở hình 3.2. Kết quả ở hình 3.2 cho thấy, đoạn

mã hóa gen GmDREB2 có 480 nucleotide, mã hóa cho 159 amino acid. Bằng

chương trình phân tích BLAST trong NCBI cho kết quả về độ tương đồng từ

94,6% - 99,6% so với trình tự gen GmDREB2 mang mã số DQ054363 trên Ngân

hàng Gen. Như vậy, kết quả phân tích trên đã khẳng định đoạn gen phân lập từ

mRNA của 6 giống đậu tương là gen GmDREB2. Trình tự gen của 6 giống đậu

tương (DT2008, ĐT51, ĐT26, CB, ĐVN5, CBD) đã được đăng ký trên Ngân

hàng Gen với mã số theo thứ tự như sau: LK936507, LK936508, LK936509,

HG965097, HG965098, HG965099.

Hình 3.2. Trình tự đoạn mã hóa của gen GmDREB2 phân lập từ các giống đậu

tương: DT2008, CB, CBD, ĐT26, ĐVN5, ĐT51 so với trình tự gen GmDREB2

mang mã số DQ054363 trên Ngân hàng Gen.

Tuy nhiên, giữa các trình tự nucleotide gen GmDREB2 của các giống đậu

tương trên khác nhau ở một số vị trí nucleotide (Bảng 3.1). Kết quả ở bảng 3.1

cho thấy, giữa các trình tự nucleotide có 36 vị trí nulceotide sai khác. So với

DQ054363, trình tự gen GmDREB2 của giống DT2008 sai khác ở 17 vị trí

nucleotide, giống CB sai khác ở 9 vị trí nucleotide, giống CBD sai khác ở 9 vị trí

nucleotide, giống ĐT26 sai khác ở 3 vị trí nucleotide, giống ĐVN5 sai khác ở 15

vị trí nucleotide và giống ĐT51 sai khác ở 12 vị trí nucleotide.

Bảng 3.1. Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen GmDREB2 giữa các giống đậu tương

TT Vị trí nucleotide DQ054363 DT2008 CB CBD ĐT26 ĐVN5 ĐT51 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

8 9 12 33 36 40 41 45 57 63 69 78 96 159 163 165 178 202 219 234 261 268 318 340 348 355 405 406 415 416 419 437 441 458 459 473

T A G C T A C T A G A G G C A G T G C C T G G A G G G A A T G A G A G A

A A G C T A C T A G A G G T C T C A T C C C G A G G G A A T G A G A G A

A A T C T A C T A G A G G C A G T G C A T C G A G A G A A T G A G A G G

A A G T T A G T A G G G C C A G T G C C T C G C G G G A A T G A G G A A

A A G C T A C T A G A G G C A G T G C C T C G A G G G A A T G A G A G A

T A G C T A C T A G A G G C A G T G C C T G G A G G G A A T G A G A G A

A C G C G T C G G T A A G T C T C G T C C C C A C G C T G C A C C A G A

Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB2 của 6

giống đậu tương nghiên cứu với nhau và với trình tự amino acid của protein

DREB2 mang mã số DQ054363 trên Ngân hàng Gen được thể hiện ở hình 3.3.

Hình 3.3. Trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2 phân lập từ 6 giống

đậu tương (DT2008, CB, CBD, ĐT26, ĐVN5, ĐT51) và gen DREB2 mang mã số

DQ054363 trên Ngân hàng Gen.

Hình 3.3 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB2 của các

giống đậu tương có sự tương đồng từ 91,2% - 99,4%. Tuy nhiên, giữa các trình

tự amino acid có 17 vị trí amino acid sai khác. So với DQ054363, giống DT2008

có số vị trí amino acid sai khác là nhiều nhất (10 vị trí amino acid), giống CB và

CBD sai khác ở 3 vị trí amino acid, giống ĐT26 sai khác ở 1 vị trí amino acid,

giống ĐVN5 sai khác ở 5 vị trí amino acid và giống ĐT51 sai khác ở 4 vị trí

amino acid (Bảng 3.2).

Bảng 3.2. Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn từ gen

GmDREB2 giữa các giống đậu tương

TT Vị trí DQ054363 DT2008 CB

CBD ĐT26 ĐVN5 ĐT51

106

114

119

136

139

140

146

147

153

158

Thuộc tính chủ yếu của DREB là miền bảo thủ AP2 liên kết với các

nhân tố phản ứng với các stress. Phân tích trình tự amino acid ở miền AP2 của

DREB2 ở 6 giống đậu tương Việt Nam và giống mang mã số DQ054363 đã

cho thấy, miền AP2 gồm 59 amino acid, từ vị trí amino acid thứ 34 đến 92

(Hình 3.4, Bảng 3.3).

Hình 3.4. Trình tự amino acid suy diễn của miền AP2 trong protein DREB2

Bảng 3.3. Các vị trí amino acid sai khác ở miền AP2 của protein DREB2 giữa

các giống đậu tương nghiên cứu

TT

DQ054363 DT2008 CB CBD ĐT26 ĐT51 ĐVN5

Vị trí amino acid

Kết quả so sánh cho thấy, miền AP2 của protein DREB2 gồm 59 amino

acid, từ vị trí thứ 34 đến 92 với độ tương đồng rất cao. Trong 6 giống đậu tương

nghiên cứu, protein DREB2 của 3 giống có miền AP2 với độ tương đồng đạt

100% (DT2008, ĐT26 và ĐVN5), các giống còn lại đều đạt 98,3%. Các giống

đậu tương nghiên cứu chỉ sai khác với giống có mã số DQ054363 từ 1 đến 2 vị

trí amino acid. Kết quả ở hình 3.3 còn cho thấy, các điểm liên kết của nhân tố

phiên mã DREB2 với DNA (DNA binding site) ở 11 amino acid, đó là các vị trí:

35, 36, 38, 40, 42, 44, 48, 50, 57, 59, 62. Tuy nhiên, chưa tìm thấy sự khác biệt

nào trong trình tự amino acid của miền AP2 giữa các giống đậu tương nghiên

cứu và giống có trình tự gen GmDREB2 mang mã số DQ054363 trên Ngân hàng

Gen. Từ kết quả so sánh trên có thể khẳng định: Miền AP2 của protein DREB2

có tính bảo thủ cao và những thay đổi về thành phần amino acid tại miền này có

thể làm thay đổi lớn đặc tính của protein.

Mối quan hệ giữa 6 giống đậu tương dựa trên trình tự nucleotide, trình tự

amino acid suy diễn của gen GmDREB2 và trình tự gen GmDREB2 mang mã số

DQ054363 được thể hiện ở hình 3.5.

%

A B

Hình 3.5. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên

trình tự nucleotide (A) và trình tự amino acid suy diễn (B) của gen GmDREB2

Dựa trên phân tích trình tự nucleotide gen GmDREB2 của các giống

đậu tương ở hình 3.5A cho thấy, giống DT2008 phân bố riêng ở một nhánh

chính và các giống còn lại phân bố trong nhánh chính thứ hai. Khoảng cách di

truyền giữa hai nhánh là 2,5%. Dựa trên trình tự amino acid suy diễn từ gen

GmDREB2, 7 giống đậu tương được phân bố trong hai nhánh và giống DT2008

ở một nhánh chính. Khoảng cách di truyền giữa giống DT2008 và các giống còn

lại là 4,0% (Hình 3.5B).

3.1.2. Sự đa dạng của gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tương

Tiến hành phân tích so sánh trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy

diễn của gen GmDREB2 phân lập từ một số giống đậu tương Việt Nam với các

trình tự công bố trên Ngân hàng Gen (Bảng 3.4) để xác định hệ số tương đồng và

hệ số phân ly (Bảng 3.5), thiết lập sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa

các giống đậu tương (Hình 3.6).

Bảng 3.4. Các trình tự gen GmDREB2 phân lập từ các giống đậu tương Việt Nam

và các trình tự gen mang mã số trên Ngân hàng Gen được sử dụng phân tích

STT Mã số trên Ngân hàng Gen Năm công bố Quốc gia

Tác giả

1 LK936507

2014

Việt Nam Dao,T.X và cs

2 LK936508

2014

Việt Nam Dao,T.X và cs

3 LK936509

2014

Việt Nam Dao,T.X và cs

4 HG965097

2014

Việt Nam Dao,T.X và cs

5 HG965098

2014

Việt Nam Dao,T.X và cs

2014

Việt Nam Dao,T.X và cs

6 HG965099

7 HG965100

2014

Việt Nam Hoang TX và cs

8 HG965101

2014

Việt Nam Hoang TX và cs

9 DQ054363

2006

Trung Quốc Wang N và cs

10 FJ965341

2009

Mỹ

Charlson và Purcell

JF946766

2011

Indonesia Arumingtyas và cs

JF946767

2011

Indonesia Arumingtyas và cs

JF946768

2011

Indonesia Arumingtyas và cs

JF946769

2011

Indonesia Arumingtyas và cs

JF946770

2011

Indonesia Arumingtyas và cs

JF946771

2011

Indonesia Arumingtyas và cs

Bảng 3.4 cho thấy, trong 16 trình tự gen GmDREB2 sử dụng phân tích có 8

trình tự gen phân lập từ các giống đậu tương Việt Nam, 1 trình tự ở Trung Quốc,

1 trình tự ở Mỹ và 6 trình tự ở Indonesia. Kết quả phân tích hệ số tương đồng và

hệ số phân ly dựa trên trình tự nucleotide của gen GmDREB2 ở bảng 3.5 cho

thấy, hệ số tương đồng dao động từ 94% - 99,8%, còn hệ số phân ly dao động từ

0,2% - 6,3%.

Bảng 3.5. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của các giống đậu tương dựa trên trình tự nucleotide của gen GmDREB2

Mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu tương dựa trên trình tự nucleotide

của gen GmDREB2 được thể hiện ở sơ đồ hình 3.6. Trên sơ đồ hình 3.6 cho thấy,

16 giống đậu tương phân bố ở hai nhánh chính: Nhánh thứ nhất có 4 giống, trong

đó có DT2008, nhánh chính thứ hai là 12 giống còn lại. Khoảng cách di truyền

giữa hai nhánh là 3,1%.

Hình 3.6. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của 16 giống đậu tương dựa trên

trình tự nucleotide của gen GmDREB2.

Tiếp tục phân tích tính đa dạng di truyền dựa trên trình tự amino acid suy

diễn của gen GmDREB2, kết quả được thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.7.

Bảng 3.6. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của các giống đậu tương dựa trên

trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2

Bảng 3.6 cho thấy, hệ số tương đồng giữa các giống đậu tương từ

91,2% - 100%; hệ số phân ly từ 0% - 9,3%. Mối quan hệ di truyền giữa các

giống đậu tương dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2 được

thể hiện ở sơ đồ hình 3.7.

Trên hình 3.7, 16 giống đậu tương phân bố trong 3 nhóm thuộc hai

nhánh chính. Nhánh chính thứ nhất chỉ có giống BS, 15 giống còn lại thuộc

nhánh chính thứ hai với khoảng cách di truyền là 2,8%.

Kết quả phân tích dựa trên trình tự nucleotide và dựa trên trình tự amino

acid suy diễn của gen GmDREB2 ở cả hai sơ đồ hình 3.6 và hình 3.7 cho thấy, có

đặc điểm chung là giống đậu tương chịu hạn DT2008 có quan hệ gần với các

giống đậu tương ở Indonesia.

%

Hình 3.7. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của 16 giống đậu tương dựa trên

trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2.

3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT MANG GEN GmDREB2

3.2.1. Đặc điểm của vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen GmDREB2

3.2.1.1. Thiết kế cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc

Đoạn gen GmDREB2 (cDNA) phân lập từ mRNA của giống đậu tương

DT2008 chịu hạn tốt đã được tạo dòng trong vector pBT. Cắt vector pBT-GmDREB2

và vector trung gian pRTRA7/3 bằng cùng cặp enzyme giới hạn NcoI và NotI

thu được kết quả trên hình 3.8.

Hình 3.8. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt vector pBT-GmDREB2 và vector

pRTRA7/3 bằng cặp enzyme NcoI và NotI.

M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1: pBT-GmDREB2 đã cắt; giếng 2: pBT-

GmDREB2 chưa cắt; giếng 3: pRTRA7/3 đã cắt; giếng 4: pRTRA7/3 chưa cắt.

Trên hình 3.8, tại giếng 2 có thể thấy vector pBT-GmDREB2 có kích thước

khoảng trên 3 kb, sản phẩm sau khi cắt bởi cặp enzyme NcoI và NotI thu được 2

phân đoạn ở vị trí khoảng 500 bp và 2,7 kb tương ứng với kích thước lý thuyết

của gen GmDREB2 và vector pBT. Vector trung gian pRTRA7/3 sau khi được

cắt bằng cặp enzyme giới hạn có 2 phân đoạn khoảng 3,3 kb và 900 bp. Trong đó,

phân đoạn 3,3 kb chính là vector pRTRA đã được cắt mở vòng và phân đoạn

900 bp là đoạn gen đã được cắt văng ra. Các phân đoạn gen GmDREB2 và

pRTRA7/3 mở vòng được thôi gel và tinh sạch, sau đó chúng được ghép nối

bằng enzyme T4 ligase và được biến nạp vào E.coli DH5α để tạo dòng trong

vi khuẩn E.coli DH5α. Vì trên vector pRTRA7/3 đã có sẵn promoter 35S và

đuôi cmyc nên sau khi tạo dòng ta sẽ thu được cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc.

Kết quả tạo dòng cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc được kiểm tra bằng phương

pháp PCR từ plasmid tái tổ hợp pRTRA-GmDREB2 với cặp mồi đặc hiệu

GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI (Hình 3.9).

M (+) (-) 1 2 3

2,0 kb 

1,0 kb 

0,5 kb 

Hình 3.9. Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn E.coli DH5α chứa vector

pRTRA7/3 với cặp mồi đặc hiệu GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI.

M: Thang DNA chuẩn 1kb, (+): Đối chứng dương pBT-GmDREB2; (-): Đối

chứng âm; giếng 1-3: Các dòng khuẩn lạc.

Trên hình 3.9 có thể nhận thấy, cả ở 3 giếng (1, 2, 3) và giếng đối chứng

dương (+) (pBT-GmDREB2) xuất hiện phân đoạn ở vị trí khoảng 500 bp, đây

chính là phân đoạn gen GmDREB2, trong khi đó ở giếng đối chứng âm (-) không

xuất hiện. Ở 3 giếng (1, 2, 3) cũng xuất hiện các phân đoạn ở vị trí bằng với

phân đoạn ở giếng đối chứng dương khoảng 500 bp. Kết quả PCR chứng tỏ cả

3 dòng khuẩn lạc đều đã mang cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc. Các dòng

khuẩn lạc cho sản phẩm PCR được tiếp tục tách chiết plasmid chứa cấu trúc

35S-GmDREB2-cmyc để chuyển vào vector chuyển gen pBI121.

3.2.1.2. Chuyển cấu trúc chứa gen GmDREB2 vào vector chuyển gen pBI121

Sau khi tạo được cấu trúc mang gen GmDREB2 chứa đầy đủ các thành

phần cần thiết cho biểu hiện và kiểm tra hoạt động của gen, việc tiếp theo là gắn

cấu trúc này vào vector chuyển gen phù hợp để có thể biến nạp được vào hệ gen

thực vật.

Vector pBI121 được lựa chọn chuyển gen vì mang những đặc điểm phù

hợp, như: Có điểm cắt của enzyme phù hợp, giữa bờ trái (Left boder - LB) và bờ

phải (Righ boder - RB) có gen kháng kanamycin hoạt động trong tế bào thực vật

nhờ promoter và terminator, có điểm khởi động tái bản oriV trong vi khuẩn, có

gen chọn lọc kháng kanamycin hoạt động trong vi khuẩn, có operon TrfA mang

các gen vir đảm trách quá trình chuyển gen từ vi khuẩn vào hệ gen thực vật và

một số thành phần khác.

Việc gắn cấu trúc mang gen GmDREB2 vào vector chuyển gen pBI121

được thực hiện bởi các phản ứng: Thu nhận cấu trúc gen GmDREB2 bằng

enzyme giới hạn, cắt mở vòng vector pBI121 và gắn cấu trúc mang gen

GmDREB2 tạo vector chuyển gen.

Thu nhận cấu trúc chứa gen GmDREB2

PCR thu nhận cấu trúc GmDREB2-cmyc có chứa điểm cắt của 2 enzyme

BamHI và SacI và gắn vào vector pBT. Khi sử dụng BamHI và SacI xử lý vector

tái tổ hợp pBT-GmDREB2-cmyc sẽ thu nhận được cấu trúc chứa gen GmDREB2

dài 526 bp và phần còn lại của vector pBT dài 2,7 kb. Điện di sản phẩm cắt hạn

chế trên gel agarose 1% (Hình 3.10A) nhận được 2 băng có kích thước khoảng

2,7 kb và 0,52 kb tương ứng với kích thước tính toán.

Băng DNA trên cùng có kích thước gần 2,7 kb tương ứng với kích thước

của vector pBT. Băng DNA có kích thước khoảng 0,52 kb có cấu trúc mô tả ở

hình 3.10B được tinh sạch để thu nhận cấu trúc chứa gen GmDREB2-cmyc cho

bước phát triển vector tiếp theo.

A

BamHI

NotI

SacI

GmDREB2

C-myc

B

Hình 3.10. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt thu cấu trúc GmDREB2-cmyc

từ pBT (A). M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1: Vector tái tổ hợp pBT-GmDREB2

không cắt; 2: Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp pBT-GmDREB2; (B): Sơ đồ cấu

trúc GmDREB2-cmyc.

Gắn cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc vào vector chuyển gen pBI121

Cấu trúc mang gen chuyển 35S-GmDREB2-cmyc được gắn vào vector

pBI121 để biểu hiện trong thực vật. Cắt đồng thời vector trung gian

pRTRA/35S-GmDREB2-cmyc và cắt mở vòng vector pBI121 bằng enzyme

HindIII. Cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc được tinh sạch, sử dụng enzyme T4

ligase để gắn cấu trúc vào và vector pBI121 đã mở vòng tạo vector tái tổ hợp và

biến nạp tạo dòng trong E.coli DH5α. Chọn dòng vi khuẩn tái tổ hợp chứa vector

chuyển gen pBI121 mang cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc và tách chiết plasmid

tái tổ hợp.

3.2.2. Tạo vi khuẩn A. tumefacien tái tổ hợp

Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào A. tumefaciens CV58 bằng xung điện.

Chọn dòng và kiểm tra ngẫu nhiên 5 dòng khuẩn A. tumefaciens bằng colony-PCR

với cặp mồi đặc hiệu GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI thu được 4 dòng khuẩn

1 2 3 4 5 M

 2,0 kb

 1,0 kb

 0,5 kb

(1, 2, 3, 4) xuất hiện băng DNA ở vị trí khoảng 0,5 kb (Hình 3.11).

Hình 3.11. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ các dòng khuẩn

A. tumefaciens CV58 được biến nạp plasmid pBI121/35S-GmDREB2-cmyc

M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2, 3, 4, 5: Các dòng khuẩn A. tumefaciens CV58

Kết quả chọn dòng A. tumefaciens và kiểm tra sản phẩm colony-PCR

bằng điện di đã chứng tỏ, cấu trúc 35S-GmDREB2-cmyc đã được thiết kế thành

công trong vector chuyển gen pBI121 và tạo được dòng khuẩn A. tumefaciens tái

tổ hợp chứa vector pBI121/35S-GmDREB2-cmyc. Các dòng khuẩn A. tumefaciens

chứa vector pBI121/35S-GmDREB2-cmyc được sử dụng trong các thí nghiệm

chuyển gen tiếp theo.

3.3. CHUYỂN GEN VÀ PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN GmDREB2

TRÊN CÂY THUỐC LÁ

3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2 vào cây thuốc lá

thông qua A. tumefaciens

Tiến hành chuyển cấu trúc pBI121/35S-GmDREB2-cmyc vào cây thuốc lá

N. tabacum giống K326 thông qua chủng vi khuẩn A. tumefaciens CV58. Mô đích sử dụng là các mảnh lá, khoảng 1cm2 đã được gây tổn thương và nuôi cấy

trên môi trường cảm ứng MS trước khi biến nạp 48 giờ. Tiến hành biến nạp

bằng cách ngâm các mảnh lá mang cấu trúc gen chuyển đã chuẩn bị trong dịch

huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens, thời gian 20 phút. Kết quả chuyển gen

GmDREB2 vào cây thuốc lá giống K326 được thể hiện ở hình 3.12.

Hình 3.12. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen

A: Mảnh lá sau khi rửa khuẩn được cấy trên môi trường chọn lọc;

B: Tái sinh đa chồi;

C: Kéo dài chồi;

D, E: Tạo rễ;

G: Ra cây trong bầu ở điều kiện nhà lưới.

Trên hình 3.12, các mảnh lá sau 2 ngày đồng nuôi cấy trong tối (Hình 3.12A),

được rửa khuẩn bằng kháng sinh cefotaxim 400mg/l và được đặt lên môi trường

tạo đa chồi MS có bổ sung cefotaxim 400mg/l, kanamycin 50mg/l và BAP 1mg.

Sau 2 tuần, từ các mảnh lá xuất hiện các cụm chồi nhỏ (Hình 3.12B). Những

chồi xanh có thể mang cấu trúc gen chuyển, kháng được kháng sinh chọn lọc

nên phát triển xanh tốt. Những chồi vàng úa, héo có thể không mang cấu trúc

gen chuyển nên bị kháng sinh chọn lọc đào thải. Các chồi xanh tốt được tách

từ cụm chồi và cấy lên môi trường MS bổ sung chứa kháng sinh chọn lọc để

kéo dài chồi (Hình 3.12C). Sau 1 - 2 tuần, các chồi này được cấy chuyển sang

môi trường ra rễ RM (Hình 3.12D, E). Các cây ra rễ, khoẻ mạnh sau 1 - 2 tuần

được đưa ra bầu trấu cát và ra nhà lưới (Hình 3.12G). Kết quả chuyển gen

GmDREB2 vào cây thuốc lá K326 được trình bày ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Kết quả biến nạp cấu trúc pBI121/35S-GmDREB2-cmyc vào cây

thuốc lá

Thí nghiệm và đối chứng

Số mẫu thí nghiệm

Số mẫu sống tạo cụm chồi

Số cây sống sót ra rễ

Số cây ra bầu đất

Số cây trong nhà lưới

Thí nghiệm

60 (30x2)

157

128

ĐC0*

ĐC1*

Ghi chú: ĐC0*: Mẫu thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có

bổ sung kháng sinh; ĐC1*: Mẫu thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường

tái sinh không bổ sung kháng sinh.

Bảng 3.7 cho thấy, sau 2 lần biến nạp, với 60 mảnh lá cây thuốc lá giống

K326 có 57 mảnh sống sót và tạo được cụm chồi. Các cụm chồi hình thành được

đưa sang môi trường chọn lọc và kéo dài chồi. Số các cây sống sót được đưa vào

môi trường ra rễ là 157. Số cây ra rễ sống sót in vitro được đưa ra bầu đất là 128

và lựa chọn 35 cây sinh trưởng tốt đem trồng tại nhà lưới. Trong khi đó ở lô

ĐC0*, 30 mảnh lá không có mẫu nào sống sót trong môi trường chọn lọc bằng

kháng sinh. Ở lô không chuyển gen (ĐC1*) cũng lựa chọn 10 cây xanh tốt,

khoẻ mạnh trồng ra nhà lưới làm đối chứng.

Các cây thuốc lá chuyển gen sau khi trồng trong nhà lưới được khoảng

4 tuần thì tiến hành thu mẫu lá để phân tích, kiểm tra sự có mặt và hoạt động

của gen chuyển GmDREB2. Tiến hành kiểm tra 35 cây thuốc lá thu được sau

khi biến nạp gen GmDREB2 trồng ở trong nhà lưới, kết quả xác định sự có

mặt của gen chuyển GmDREB2 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

GmDREB2-NcoI/GmDREB2-NotI được thể hiện ở hình 3.13.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 WT (-) (+)

2,0 kb 



1,0 kb  0,5 kb 

M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

2,0 kb 

1,0 kb  0,5 kb 



Hình 3.13. Kết quả PCR kiểm tra 35 cây thuốc lá được chuyển gen trồng trong

nhà lưới. M: Thang DNA chuẩn 1kb; WT (wild type): Cây thuốc lá không

chuyển gen; (+): Đối chứng dương; 1 - 35: Các cây thuốc lá được chuyển gen.

Hình 3.13 cho thấy, trong số 35 cây thuốc lá trồng ở trong nhà lưới có

29 cây thu được sản phẩm PCR, kết quả này bước đầu cho thấy gen chuyển

GmDREB2 đã được chuyển vào cây thuốc lá. Các cây thuốc lá thu được sản

phẩm PCR ký hiệu là TG và theo thứ tự như sau: TG1, TG2, TG3, TG4,

TG5,… TG35.

3.3.2. Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp GmDREB2 trên cây

thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0

Xác định sự có mặt của protein tái tổ hợp GmDREB2 do gen chuyển

tổng hợp được thực hiện dựa trên kích thước protein và các thí nghiệm chiết rút

protein, điện di biến tính trên SDS-PAGE và phản ứng lai western blot. Kỹ thuật

Western blot được sử dụng rộng rãi trong phân tích để phát hiện protein ngoại lai

dựa trên nguyên lý của phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên (là sản phẩm

protein cần tìm) và kháng thể đặc hiệu đối với kháng nguyên đó. Trong cấu trúc

mang gen chuyển GmDREB2 được thiết kế có trình tự nucleotide xác định chuỗi

peptide cmyc nằm ở phía đầu 3’ của gen GmDREB2. Nhờ đó sản phẩm polypeptide

(nếu có) của cấu trúc gen chuyển có trình tự peptid cmyc ở phía đầu C là tín hiệu

kháng nguyên cho phản ứng lai western blot. Sử dụng công cụ ExPASy đã xác

định được trọng lượng phân tử protein GmDREB2 và chuỗi peptide cmyc

khoảng gần 20kDa.

Trong số 29 cây thu được sản phẩm PCR, chọn 7 cây (TG2, TG3, TG5,

TG6, TG8, TG9, TG12) để phân tích sự biểu hiện protein tái tổ hợp

GmDREB2. Protein của 7 cây thuốc lá chuyển gen (TG2, TG3, TG5, TG6,

TG8, TG9, TG12) được chiết rút và điện di trên gel polyacrylamide, sau đó được

thấm truyền lên màng lai nitrocellulose để xử lý qua các bước blocking, lai

kháng thể 1, lai kháng thể 2 và hiện màu của cơ chất TMB với enzyme gắn trên

màng. Kết quả lai western blot trên mẫu của các cây thuốc lá chuyển gen để

kiểm tra protein tái tổ hợp trong cây chuyển gen được thể hiện trên hình 3.14.

M WT TG2 TG3 TG5 TG6 TG8 TG9 TG12

35 kDa

25 kDa 20 kDa

Hình 3.14. Kết quả lai Western blot từ một số cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0

M: Thang protein chuẩn 1kDa; WT: Protein cây thuốc lá đối chứng (không

chuyển gen); TG2, TG3, TG5, TG6, TG8, TG9, TG12: Protein của các cây

thuốc lá chuyển gen.

Kết quả lai Western blot từ một số cây thuốc lá chuyển gen trên hình 3.14

cho thấy, trên màng lai nitrocellulose xuất hiện băng màu ở vị trí kích thước

khoảng gần 20 kDa trên giếng điện di của các cây thuốc lá chuyển gen TG2,

TG3, TG6, TG8, TG12. Kết quả phân tích Western blot đã chứng minh gen

GmDREB2 phân lập từ cây đậu tương đã hoạt động và protein tái tổ hợp

GmDREB2 đã được biểu hiện thành công trên cây thuốc lá N. tabacum K326.

Phân tích cây thuốc lá chuyển gen cho thấy, gen GmDREB2 đã được gắn

vào hệ gen cây thuốc lá và hoạt động cho sản phẩm cuối cùng là protein. Đây là

nguồn nguyên liệu cho việc phân tích khả năng biểu hiện chức năng sinh học của

gen chuyển GmDREB2 trên cây thuốc lá.

3.3.3. Hàm lượng prolin trong các cây thuốc lá chuyển gen

Gây hạn nhân tạo các cây thuốc lá chuyển gen TG2, TG3, TG6, TG8,

TG12 và cây không được chuyển gen bằng cách không tưới nước và phân tích

hàm lượng amino acid prolin trong lá của các cây chuyển gen và đối chứng

không chuyển gen sau 5 ngày và 9 ngày gây hạn, kết quả được trình bày ở

bảng 3.8. Kết quả cho thấy, so với điều kiện bình thường không xử lý bởi hạn

nhân tạo ở cây WT và các cây thuốc lá chuyển gen hàm lượng prolin đều tăng từ

hơn 1,5 đến hơn 3 lần. Sau 5 ngày bị stress hạn, hàm lượng prolin ở cây đối

chứng (WT) tăng so với điều kiện không xử lý bởi hạn là 161,25%, còn các cây

chuyển gen tăng từ 211,17% (TG3) đến 332,44% (TG2). Sau 9 ngày bị stress

hạn, hàm lượng prolin ở cây WT tăng so với điều kiện không xử lý bởi hạn là

212,27%, còn các cây chuyển gen tăng từ 262,79% (TG8) đến 466,04% (TG2)

(Bảng 3.8).

Bảng 3.8. Hàm lượng prolin của các cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng sau 5

Sự thay đổi hàm lượng prolin sau 5 ngày stress hạn

Sự thay đổi hàm lượng prolin sau 9 ngày stress hạn

Cây thuốc lá chuyển gen và WT

Hàm lượng (μmol/g khối lượng khô)

Hàm lượng prolin trong điều kiện bình thường (μmol/g khối lượng khô)

X  S X

Tỷ lệ tăng so với điều kiện không xử lý hạn (%)

161,25

212,27

0,1076  0,0024 0,1735  0,0039

0,2284  0,0045

332,44

466,04

TG2 0,2232  0,0022 0,7420  0,0052

1,0402  0,0466

211,17

300,18

TG3 0,2193  0,0014 0,4630  0,0055

0,6583  0,0030

250,98

286,20

TG6 0,2644  0,0027 0,6636  0,0038

0,7567  0,0035

213,60

262,79

TG8 0,2427  0,0020 0,5184  0,0044

0,6378  0,0029

246,89

339,95

TG12 0,2508  0,0035 0,6192  0,0040

0,8526  0,0058

ngày, 9 ngày stress hạn ( = 0,001)

Trong điều kiện stress hạn sau 5 ngày và 9 ngày, các cây thuốc lá chuyển

gen đều có hàm lượng và tỷ lệ prolin tăng cao hơn so với dòng thuốc lá WT

(Hình 3.15).

Như vậy có thể nhận xét rằng, khi cây bị hạn quá trình tổng hợp proline

tăng lên làm cho hàm lượng proline tích lũy cao hơn so với điều kiện không xử

lý bởi hạn và cây thuốc lá chuyển gen có tỷ lệ tăng hàm lượng proline cao hơn

1,2

cây không chuyển gen.

) g

/ l

o m μ (

n

0,8

i l

o r p

0,6

0,4

g n ợ ư

l

0,2

m à H

Không xử lý hạn

Sau 5 ngày bị hạn

Sau 9 ngày bị hạn

TG2

TG3

TG6

TG8

TG12

Hình 3.15. Biểu đồ so sánh hàm lượng prolin của các cây thuốc lá chuyển gen và

đối chứng không chuyển gen trong điều kiện không xử lý hạn và sau 5, 9 ngày

stress hạn. WT: Cây không chuyển gen; TG2, TG3, TG6, TG8, TG12: Các cây

thuốc lá chuyển gen; thanh đứng trên mỗi cột biểu đồ là sai số chuẩn.

3.4. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN GmDREB2 VÀ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG

CHUYỂN GEN TỪ GIỐNG DT84

Trên cơ sở kết quả phân tích sự biểu hiện protein tái tổ hợp GmDREB2

trên cây thuốc lá chuyển gen và đánh giá biểu hiện chức năng sinh học của gen

chuyển GmDREB2 thông qua phân tích hàm lượng amino acid prolin trong điều

kiện gây hạn nhân tạo so sánh với điều kiện bình thường, gen chuyển GmDREB2

từ giống đậu tương chịu hạn tốt DT2008 được chuyển vào giống đậu tương

DT84. Lựa chọn giống đậu tương DT84 chịu hạn kém [4], [7] làm đối tượng

phân tích sự biểu hiện mạnh protein tái tổ hợp - Nhân tố phiên mã DREB2 trong

mục đích tăng cường khả năng chịu hạn của cây đậu tương.

3.4.1. Tái sinh in vitro và chuyển cấu trúc chứa gen chuyển GmDREB2 vào

giống đậu tương DT84 qua A. tumefaciens

Lá mầm thu từ hạt nảy mầm được sử dụng làm mẫu biến nạp. Tiến hành

chuyển cấu trúc chứa gen GmDREB2 nhờ A. tumefaciens qua nách lá mầm, sau các

giai đoạn nuôi cấy và chọn lọc, kết quả được mô tả ở hình 3.16. Trên hình 3.16,

hạt của giống đậu tương DT84 được chọn những hạt chắc mẩy, đem khử trùng khô

bằng khí Clo (Hình 3.16A) trong 16 giờ, sau đó cho nảy mầm trong tối trên môi

trường GM (Hình 3.16B), sau 3 ngày tuổi cắt bỏ rễ mầm, chồi mầm, bỏ vỏ, tách đôi

lá mầm để làm vật liệu nhận gen (Hình 3.16C). Gây tổn thương nách lá mầm

(Hình 3.16D) và các mảnh lá mầm tổn thương được ngâm trong dịch huyền phù

vi khuẩn 40 phút để lây nhiễm (Hình 3.16E). Các mẫu sau đó được đưa sang môi

trường đồng nuôi cấy 5 ngày trong tối. Sau đó mẫu được rửa khuẩn trong SIM lỏng

bổ sung kháng sinh cefotaxime 500mg/l (Hình 3.16F) và đặt lên môi trường cảm

ứng tạo chồi SIM từ 3 tuần (Hình 3.16G). Khi các mẫu phát sinh cụm chồi gồm các

chồi nhỏ, tiến hành cắt bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường chọn lọc kéo dài chồi

SEM (Hình 3.16H,K). Các chồi nhỏ sống sót kéo dài trên môi trường SEM có

kháng sinh chọn lọc kanamycin (Hình 3.16L). Chọn những chồi có sức sinh trưởng

tốt và chuyển sang môi trường ra rễ RM (Hình 3.16M) và sau đó là đem trồng trên

giá thể (Hình 3.16N). Cây tái sinh được đưa ra trồng trong nhà lưới (Hình 3.16N).

Nách lá mầm D

C

A

B

G

H

E

F

K

L

M

N

Hình 3.16. Kết quả tạo cây đậu tương chuyển gen từ giống DT84 bằng kỹ thuật

lây nhiễm A. tumefaciens tái tổ hợp qua nách lá mầm hạt chín. (A): Hạt đậu

tương DT84 sau khi khử trùng bằng khí Clo; (B): Nảy mầm hạt trên GM tạo

nguyên liệu biến nạp; (C): Mảnh lá mầm làm nguyên liệu biến nạp; (D): Nách lá

mầm hạt chín; (E): Gây tổn thương nách lá mầm trong dịch khuẩn và lây nhiễm

30 phút; F: Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối trong 5 ngày; (G), (H), (K):

Cảm ứng tạo đa chồi trên SIM lần 1 trong 2 tuần (bổ sung BAP 2mg/l +

kanamycin 50mg/l); (L): Cắt bỏ lá mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi

SEM trong 2 tuần (bổ sung GA3 0,5mg/l + IAA 0,1mg/l + kanamycin 50mg/l);

(M): Ra rễ trên môi trường RM (bổ sung IBA 0,1mg/l) trong 20 ngày; (N): Ra cây

trên giá thể có tỷ lệ 1 trấu hun : 1 cát vàng.

Kết quả chuyển cấu trúc chứa gen GmDREB2 vào giống đậu tương DT84

với 530 mẫu được trình bày ở bảng 3.9. Kết quả cho thấy, ở lô thí nghiệm, với

530 mẫu trong 3 lần biến nạp có 257 mẫu tạo chồi, qua hai lần chọn lọc kháng sinh

ở giai đoạn chồi và sinh trưởng của chồi, đã thu được 94 chồi kéo dài sống sót và

sinh trưởng tốt chuyển sang môi trường ra rễ. Ở giai đoạn này có 58 chồi ra rễ và

chọn được 32 cây in vitro có hình thái thân, lá, rễ bình thường đem trồng trên giá

thể. Kết quả thu được 17 cây sống sót và sinh trưởng bình thường ở điều kiện

nhà lưới (Bảng 3.9). Như vậy, trong 530 mẫu biến nạp, qua các giai đoạn tái sinh

và sinh trưởng chồi, chọn lọc bằng kháng sinh tạo được 17 cây được chuyển gen

GmDREB2 trong điều kiện nhà lưới, chiếm 3,21%.

Bảng 3.9. Kết quả chuyển cấu trúc chứa gen GmDREB2 vào giống đậu tương

DT84

Số mẫu

Số mẫu biến nạp

Số chồi kéo dài

Số chồi ra rễ

tạo chồi

Thí nghiệm biến nạp và đối chứng

Số cây trồng trên giá thể

Số cây sống trên giá thể

ĐC0*

ĐC1*

180

160

Thí nghiệm

190

Tổng

530

257

94

58

32

17

Ghi chú: ĐC0*: Lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái

sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1*: Lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy

trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh.

Song song với các thí nghiệm lây nhiễm vi khuẩn tái tổ hợp chứa cấu trúc

ĐC1*, mỗi lô 30 mẫu lá mầm được nuôi cấy trong môi trường tạo chồi, kéo dài

mang gen chuyển GmDREB2 ở lô thí nghiệm, hai lô đối chứng là ĐC0* và

chồi và ra rễ. Ở lô đối chứng ĐC0*, lá mầm đậu tương không chuyển gen được

cấy trên môi trường tái sinh chồi có bổ sung kháng sinh chọn lọc, kết quả các

mẫu lá mầm đều bị kháng sinh đào thải. Đối với lô đối chứng ĐC1*, lá mầm đậu

tương không chuyển gen cấy trên môi trường tái sinh chồi không bổ sung kháng

sinh chọn lọc, trong 30 mẫu nuôi cây, kết quả thu được 18 mẫu tạo chồi, 12 chồi

được kéo dài, 9 chồi ra rễ, 5 cây được chuyển trồng trên giá thể và cả 5 cây đều

sống sót trong điều kiện nhà lưới. Các cây tái sinh in vitro không chuyển gen

được sử dụng làm dòng cây đối chứng (WT).

3.4.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển GmDREB2 trong hệ gen của các

cây đậu tương được chuyển gen ở thế hệ T0

Kết quả kiểm tra các cây đậu tương được chuyển gen bằng PCR

Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển GmDREB2 trong hệ gen của 17 cây

đậu tương được chuyển gen ở thế hệ T0, kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu để

nhân đoạn gen chuyển GmDREB2 từ DNA hệ gen đã được sử dụng.

Các cây đậu tương ở thế hệ T0 tái sinh sau lây nhiễm được trồng, chăm sóc

trong nhà lưới, khi được 6 tuần thì tiến hành thu mẫu lá để kiểm tra sự có mặt và

hoạt động của gen chuyển GmDREB2. Kết quả tách DNA tổng số từ các mẫu lá

của 17 cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 được kiểm tra bằng phương pháp

điện di trên gel agarose 0,8% thể hiện ở hình 3.17. Từ kết quả cho thấy, hàm

lượng và chất lượng DNA tổng số tách chiết được đảm bảo cho việc tiến hành

phản ứng PCR nhân bản đoạn gen GmDREB2. Thực hiện phản ứng PCR với cặp

mồi GmDREB2-BamHI/Cmyc-SacI để khuếch đại gen GmDREB2 từ DNA hệ

gen của 17 cây đậu tương ở thế hệ T0 được chuyển gen và đối chứng, kết quả

điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel 1,0% được thể hiện ở hình 3.18.

M 1 2 3 4 5 6 7

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19



Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ các cây

đậu tương được chuyển gen ở thế hệ T0 của giống DT84.

Các làn điện di 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ,15, 16, 17: DNA tổng

số của 17 cây đậu tương được chuyển gen ở thế hệ T0.

M (+) (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

 0,5 kb

2,0 kb  0,75 kb  0,5 kb 

Hình 3.18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định sự có mặt của

gen chuyển GmDREB2 trong hệ gen của các cây đậu tương được chuyển gen;

M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1 - 17: Sản phẩm PCR nhân gen GmDREB2 từ các cây

đậu tương được chuyển gen; (+): Sản phẩm PCR nhân gen GmDREB2 từ vector

chuyển gen; (-): Sản phẩm PCR từ DNA hệ gen cây đậu tương không chuyển gen.

Trên bản gel điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen GmDREB2

ở hình 3.18 cho thấy, ở làn chạy điện di của cây số 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12,

13, 14,15, 17 xuất hiện băng DNA với kích thước khoảng 0,52 kb, đúng như

kích thước của băng DNA của đối chứng (+) và chính là kích thước của gen

chuyển GmDREB2. Như vậy, trong 17 cây đậu tương được chuyển gen có 14 cây

thu được sản phẩm PCR. Các cây thu được sản phẩm PCR được ký hiệu là

TG-01, TG-03, TG-04, TG-05, TG-06, TG-07, TG-08, TG-010, TG-011, TG-012,

TG-013, TG-014, TG-015, TG-017. Kết quả này có thể rút ra nhận xét rằng,

hệ gen của 14 cây đậu tương được chuyển gen ở thế hệ T0 đã tồn tại gen ngoại lai

GmDREB2. Hiệu suất chuyển gen GmDREB2 ở giai đoạn phân tích này được

xác định đạt 14/530 = 2,64% (Bảng 3.10).

Bảng 3.10. Hiệu suất chuyển gen GmDREB2 vào giống đậu tương DT84 của

thế hệ T0 ở các giai đoạn phân tích

Số

Hiệu suất chuyển gen dựa trên kết quả phân tích PCR

Hiệu suất chuyển gen dựa trên kết quả phân tích Southern blot

Hiệu suất chuyển gen dựa trên số cây sống sót và sinh trưởng bình thường trong nhà lưới

mẫu biến nạp

Số cây sống trên giá thể

Số cây có kết quả lai Southern blot

Số cây thu được sản phẩm PCR

530

3,21

2,64

1,13

Tuy nhiên, để có kết luận chính xác rằng gen chuyển GmDREB2 được

dung hợp vào hệ gen của cây đậu tương hay không cần phải tiến hành các thí

nghiệm tiếp theo và lai Southern blot được lựa chọn để phân tích các cây đậu

tương thu được sản phẩm PCR.

Kết quả kiểm tra các cây đậu tương được chuyển gen bằng lai Southern blot

Trong 14 cây thu được sản phẩm PCR có 8 cây sinh trưởng kém, còi cọc

và 6 cây có hình thái thân, lá và phát triển bình thường. Kết quả phân tích

Southern blot đối với 6 cây chuyển gen phát triển bình thường được thể hiện ở

hình 3.19. Trên hình 3.19, cả 6 cây (TG-01, TG-03, TG-04, TG-06, TG-07, TG-08)

đem phân tích lai Southern blot đều thu được kết quả lai. Hiệu suất chuyển gen ở

giai đoạn phân tích này là 6/530 = 1,13% (Bảng 3.10). Như vậy, có thể kết luận

rằng, gen GmDREB2 đã được gắn vào hệ gen của giống đậu tương DT84.

Hình 3.19. Kết quả lai Southern blot xác định gen chuyển GmDREB2 trong hệ

gen cây đậu tương được chuyển gen ở thế hệ T0.

M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1, 3, 4, 6, 7, 8: Các cây đậu tương thu được sản

phẩm PCR có hình thái thân, lá và sinh trưởng bình thường (TG-01, TG-03,

TG-04, TG-06, TG-07, TG-08).

Bảng 3.10 cho thấy, hiệu suất chuyển gen xác định dựa trên số cây sống

sót và sinh trưởng bình thường trong nhà lưới là 3,21%, hiệu suất chuyển gen

dựa trên số cây thu được sản phẩm PCR là 2,64% và hiệu suất chuyển gen dựa

trên kết quả lai Southern blot là 1,13%.

3.4.3. Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp GmDREB2 trên cây

đậu tương chuyển gen

Sử dụng các cây có kết quả lai Southern blot để phân tích sự biểu hiện

protein tái tổ hợp GmDREB2. Protein GmDREB2 ngoại lai xác định bởi gen

chuyển GmDREB2 có đặc điểm phân biệt với protein DREB2 nội tại là có chứa

đuôi cmyc ở phía đầu C của chuỗi polypeptide. Phản ứng lai Western lot cho

phép phát hiện những protein trên màng lai nitrocellulose có mang đuôi cmyc khi

gắn kháng thể phù hợp để cho phản ứng hiện màu với cơ chất. Trên cơ sở đó,

protein tổng số từ lá các cây đậu tương chuyển gen thu được sản phẩm

Southern blot (TG-01, TG-03, TG-04, TG-06, TG-07, TG-08) và tiến hành điện di

biến tính trên SDS-PAGE, chuyển lên màng lai nitrocellulose, blocking, lai với

kháng thể cmyc (kháng thể 1), lai với kháng thể 2. Kết quả hiện màu với cơ chất

DAB được thể hiện ở hình 3.20.

Hình 3.20. Kết quả lai Western blot trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0.

M: Thang chuẩn protein 1 kDa; WT: Mẫu protein từ cây đậu tương đối chứng

không chuyển gen; 1, 3, 4, 6, 7, 8: Mẫu protein từ các cây chuyển gen (TG-01,

TG-03, TG-04, TG-06, TG-07, TG-08).

Hình 3.20 cho thấy, trên màng lai nitrocellulose ở làn điện di protein của

các cây đậu tương TG-01, TG-03, TG-04, TG-07, TG-08 xuất hiện một băng

màu ở vị trí kích thước khoảng 20 kDa, tương ứng với kích thước của protein tái

tổ hợp GmDREB2. Điều đó chứng tỏ rằng, gen chuyển GmDREB2 ở 5 cây

đậu tương chuyển gen (TG-01, TG-03, TG-04, TG-07, TG-08) đã biểu hiện

dịch mã tổng hợp protein tái tổ hợp GmDREB2 và hiệu suất chuyển gen đạt

5/530 = 0,943%. Như vậy có thể thấy, vector chuyển gen pBI121/35S-

GmDREB2 đã thiết kế không chỉ phù hợp với cây thuốc lá mô hình mà còn có

khả năng chuyển được gen GmDREB2 vào cây đậu tương. Các cây đậu tương

chuyển gen thu được sản phẩm PCR, phản ứng Southern blot, biểu hiện protein

tái tổ hợp GmDREB2 chính là kết quả làm cơ sở cho thành công của quy trình

chuyển gen GmDREB2 vào cây đậu tương. Cả 5 cây chuyển gen (TG-01, TG-03

TG-04, TG-07, TG-08) tiếp tục được chăm sóc, ưu tiên phát triển để thu hạt T1

nhằm có những phân tích, đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen

chuyển ở các thế hệ tiếp theo.

Chương 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Biến đổi khí hậu, hiện tượng El Nino gây khô hạn ở các quốc gia thuộc đông

bán cầu và các nước thường xuyên chịu ảnh hưởng khô hạn do El Nino là Australia,

Philippines, Indonesia, Thái Lan, Việt Nam... Trong đó, Việt Nam là một trong

những quốc gia bị tác động mạnh mẽ của biến đổi khí hậu, hạn hán kéo dài, sự

khác nhau về lượng mưa giữa các thời điểm trong năm và giữa các vùng miền

cùng với diện tích đồi núi chiếm tỷ lệ lớn, đất dốc, khả năng giữ nước kém đã

gây khó khăn cho sản xuất nông nghiệp. Hiện tượng El Nino gây khô hạn kéo

dài ở nhiều vùng miền trong cả nước và nghiêm trọng nhất đối với các tỉnh miền

Trung, Tây Nguyên. Hạn là yếu tố phi sinh học gây tác hại rất lớn đến sinh

trưởng và phát triển của cây trồng, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm.

Đậu tương là loại cây trồng chịu hạn kém và hạn hán tác động làm giảm năng

suất và chất lượng hạt đậu tương. Chọn giống đậu tương chịu hạn sẽ đáp ứng với

tình hình biến đổi khí hậu hiện nay.

Chọn giống đậu tương chịu hạn có thể sử dụng phương pháp chọn lọc

quần thể, lai hữu tính và đột biến thực nghiệm kết hợp chọn lọc và bồi dưỡng

qua nhiều thế hệ. Tuy nhiên, đặc tính chịu hạn của cây đậu tương là tính trạng đa

gen, liên quan đến sản phẩm của nhiều gen. Do vậy, gây đột biến và lai hữu tính

rất khó khăn trong việc tạo ra tổ hợp gen có khả năng nâng cao tính chịu hạn.

Mặt khác, các phương pháp truyền thống tốn nhiều thời gian, công sức, chi phí

tốn kém và hiệu quả không cao. Ứng dụng công nghệ gen trong chọn giống

đậu tương sẽ là giải pháp khắc phục những khó khăn nêu trên. Chính vì vậy,

chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phân lập gen GmDREB2 từ giống đậu tương

chịu hạn rất tốt là DT2008, tạo gen nguyên liệu cho thiết kế vector chuyển gen

thực vật; phân tích biểu hiện gen GmDREB2 trên cây thuốc lá mô hình nhằm

xác định chức năng cụ thể của gen GmDREB2 và tạo cây đậu tương chuyển gen

GmDREB2.

4.1. Về kết quả phân lập gen GmDREB2

Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương có thể phân chia

thành hai nhóm, nhóm gen mà sản phẩm của chúng liên quan trực tiếp đến tính

chịu hạn và nhóm gen mà sản phẩm có chức năng điều hòa biểu hiện gen. Các

gen tham gia điều hòa theo hướng kích thích tăng cường phiên mã của nhóm gen

chịu hạn đang được đặc biệt quan tâm hiện nay. Một số gen ở đậu tương đã được

mô tả là có phản ứng với tác động của hạn ở mức phiên mã. Protein DREB là

một phân họ của nhân tố phiên mã AP2/ERF có chức năng điều khiển sự biểu

hiện của một số gen cảm ứng stress hạn. Các protein DREB - Những nhân tố có

tác động trans có thể liên kết với các trình tự cis để kích hoạt biểu hiện các gen

mục tiêu khi có tín hiệu stress ở thực vật.

Hiện nay, các nhà khoa học cũng chưa xác định được gen nào đóng vai trò

chủ đạo chi phối khả năng chịu hạn của cây đậu tương. Chính vì lẽ đó, việc cải

thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương gặp rất nhiều khó khăn. Nếu chọn tạo

giống đậu tương chịu hạn theo các phương pháp truyền thống như lai hữu tính,

gây đột biến thực nghiệm, chọn lọc quần thể sẽ mất nhiều thời gian, công sức và

hiệu quả chọn giống thấp. Công nghệ gen sẽ là giải pháp khắc phục được những

khó khăn nêu trên. Tuy nhiên, việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để chuyển các

gen thuộc hai nhóm trên nhằm cải thiện khả năng chịu hạn có thể gặp một số khó

khăn trong biểu hiện gen chuyển ở cây được chuyển gen, từ đó dẫn đến hiệu quả

chuyển gen không đạt được mục tiêu. Trong sự biểu hiện gen đáp ứng tác động

của hạn thì trình tự cis và nhân tố trans giữ vai trò quan trọng, nếu sản phẩm của

gen ngoại lai là các protein điều hoà như các protein DREB đòi hỏi phải có sự

cân bằng tương quan về số lượng trình tự cis trên DNA với các protein điều hoà,

các sản phẩm của gen ngoại lai có thể ức chế phản hồi chính gen sinh ra nó.

Ngoài ra, việc kiểm soát được sự kích hoạt gen đích cũng gặp nhiều khó khăn.

Nếu sản phẩm gen ngoại lai là các protein chức năng thường là enzyme xúc tác

cho một khâu của chuỗi phản ứng với các stress hạn cũng đòi hỏi sự cân bằng cả

về cơ chất và enzyme. Đây chính là những vấn đề cần làm sáng tỏ.

Ở cây đậu tương, một số thành viên của phân họ gen DREB được xác định

có trong hệ gen, đó là các gen GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1,

GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6 và GmDREB7 [141]. Mỗi gen

trong họ DREB có trình tự, độ dài khác nhau nhưng đều được biểu hiện nhiều

khi đậu tương gặp các điều kiện về hạn. Tuy nhiên, chức năng cụ thể của nhiều

gen DREB còn chưa được làm rõ. Gen GmDREB2 ở cây đậu tương có chức năng

kích hoạt sự phiên mã của nhóm gen chịu hạn và sản phẩm biểu hiện của gen

GmDREB2 được tìm thấy khi cây đậu tương gặp hạn [24], nhưng cụ thể gen

GmDREB2 kích hoạt phiên mã của gen nào, theo cơ chế như thế nào là vấn đề

chúng tôi quan tâm. Trong nghiên cứu của chúng tôi, gen GmDREB2 đã được

nhân bản, tách dòng thành công từ mRNA của 6 giống đậu tương địa phương

Việt Nam (ĐT26, ĐT51, ĐVN5, CB, CBD, DT2008). Trình tự nucleotide của

gen GmDREB2 (cDNA) có kích thước là 480 nucleotide, xác định chuỗi

polypeptid dài 159 amino acid. Miền AP2 của protein DREB2 gồm 59 amino

acid và có 11 vị trí amino acid liên kết với DNA. Các trình tự gen GmDREB2

phân lập từ các giống đậu tương Việt Nam đã được công bố trên Ngân hàng Gen

mang mã số LK936507, LK936508, LK936509, HG965097, HG965098,

HG965099 đã làm phong phú thêm dữ liệu về họ gen DREB của cây đậu tương.

Đậu tương có 2n = 40, số cặp nhiễm sắc thể là n = 20 và gen GmDREB2 chỉ có

một locus LOC732579 trên nhiễm sắc thể số 6 (Hình 4.1). Trong khi đó ở cây

Arabidopsis, gen DREB2A nằm trên NST số 5 và gen DREB2B trên nhiễm sắc

thể số 3, cả hai gen đều được cảm ứng bởi tình trạng mất nước, mặn và nhiệt độ

cao [116].

Kết quả so sánh về trình tự nucleotide của gen GmDREB2 phân lập từ 6

giống đậu tương nghiên cứu cho thấy: Hệ số tương đồng dao động từ 95% - 99,9%;

nhưng giữa các trình tự nucleotide của gen GmDREB2 đã có tất cả 36 vị trí

nulceotide sai khác. Đối với trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2, tỷ

lệ tương đồng từ 91,2% - 99,4% và xuất hiện 17 vị trí amino acid sai khác.

DREB2 tuy không trực tiếp tham gia vào quá trình chịu hạn, nhưng nó là nhân tố

kích hoạt sự phiên mã đồng thời lên các gen liên quan đến tính chịu hạn [24].

A

B

Hình 4.1. Locus GmDREB2 trên nhiễm sắc thể số 6 (A) và một đoạn trong

bản đồ gen trên nhiễm sắc thể số 6 của cây đậu tương (B) [201].

Mặc dù kết quả phân tích đã chỉ ra sự sai khác ở nhiều vị trí trong trình tự

nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2, tuy nhiên chúng tôi

chưa tìm thấy tính quy luật thay đổi và sự thay đổi đó liên quan thế nào tới hoạt

động phiên mã của các gen mục tiêu quy định tính chịu hạn của cây đậu tương,

đây chính là vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu. Công bố của Mai Q.V. và cs

(2010) [99], Ha C.V. và cs (2013) [58], Sulieman và cs (2015) [162] đã khẳng

định giống đậu tương DT2008 là giống chịu hạn tốt. Giống đậu tương DT2008

xuất hiện nhiều vị trí nucleotid sai khác và có độ tương đồng thấp nhất so với

trình tự nucleotide gen GmDREB2 của giống mang mã số DQ054363 trên Ngân

hàng Gen (trình tự gen GmDREB2 sử dụng để thiết kế mồi) và 5 giống còn lại.

Trong kết quả phân tích ở hình 3.5 và hình 3.6, giống DT2008 (giống chịu hạn

tốt) lại phân bố riêng ở một nhánh, điều này gợi ý xem xét mối quan hệ giữa

những sai khác về trình tự nucleotide của gen GmDREB2 và đặc biệt giữa trình tự

amino acid của protein DREB2 ở giống DT2008 với hoạt động phiên mã của các

gen chức năng quy định đặc tính chịu hạn của cây đậu tương. Chính vì vậy, trình

tự gen GmDREB2 của giống DT2008 được lựa chọn để thiết kế vector phục vụ

chuyển gen thực vật nhằm nghiên cứu chức năng gen GmDREB2 và tạo cây

đậu tương chuyển gen chịu hạn ở Việt Nam.

4.2. Về kết quả phân tích biểu hiện chức năng của gen GmDREB2

Gen DREB2 đã được phân lập ở nhiều loại thực vật và được đánh giá là có

vai trò trong điều kiện thiếu nước và sốc nhiệt [116], [147]. Biểu hiện mạnh gen

DREB2A trong cây Arabidopsis chuyển gen đã dẫn đến tăng khả năng chịu hạn

đáng kể, nhưng khả năng chịu lạnh chỉ tăng nhẹ [147]. Guo và Wang (2011) đã

phân tích biểu hiện gen LeDREB2 phân lập từ cây cà chua cho thấy, LeDREB2 là

một bản gen duy nhất trong hệ gen của cà chua, nó đã được biểu hiện mạnh mẽ ở

lá non và rễ, nhưng biểu hiện yếu ở lá trưởng thành và chồi. Sự phiên mã của

gen LeDREB2 được cảm ứng bởi stress hạn, lạnh và stress oxy hóa [55]. Gen

PeDREB2 phân lập từ cây Populus euphratica cho thấy gen PeDREB2 cảm ứng

bởi lạnh, hạn hán và độ mặn cao, nhưng không cảm ứng ABA. Phân tích biểu

hiện gen PeDREB2 trên cây thuốc lá chuyển gen dưới sự điều khiển bởi

promoter 35S cho thấy, khả năng chịu mặn của cây thuốc lá chuyển gen được cải

thiện và không gây chậm phát triển cho cây chuyển gen. Kết quả chỉ ra rằng,

PeDREB2 là nhân tố phiên mã tham gia vào phản ứng của stress muối và có thể

có chức năng trong việc cải thiện khả năng chịu mặn trong cây chuyển gen [28].

Nghiên cứu của Qin và cs (2007) về chức năng của gen ZmDREB2A từ cây ngô

trên cây Arabidopsis cho thấy, sự biểu hiện của gen ZmDREB2A có chức năng

kép, đáp ứng cả stress hạn và stress nhiệt [134]. Nghiên cứu của Chen và cs

(2007) cho thấy gen GmDREB2 có chức năng kích hoạt biểu hiện của các gen

chống chịu trong cây Arabidopsis chuyển gen ở mức phiên mã, dẫn đến tăng

cường khả năng chịu stress hạn và độ mặn cao và không gây chậm phát triển của

cây [24]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, để đánh giá sự biểu hiện chức năng

của gen chuyển GmDREB2, 35 cây thuốc lá chuyển gen được chọn để phân tích.

Kết quả có 29 cây thu được sản phẩm PCR và tiếp tục chọn 6 cây để phân tích

biểu hiện gen GmDREB2 bằng kỹ thuật Western blot đã thu được protein tái tổ

hợp có trọng lượng phân tử khoảng 20 kDa ở 5 cây thuốc lá được chuyển gen

(TG-01, TG-03, TG-04, TG-07, TG-08). Kết quả phân tích cho thấy, protein

DREB2 ở cây thuốc lá Nicotiana tabacum có 215 amino acid, còn DREB2 ở đậu

tương có 159 amino acid; miền AP2 của DREB2 đều có 59 amino acid và có 11

vị trí amino acid liên kết với DNA của promoter. Biểu hiện protein tái tổ hợp

GmDREB2 từ đậu tương sẽ làm tăng protein DREB2 trong cây thuốc lá chuyển

gen và hiện tượng này có làm thay đổi mức độ chịu hạn của cây thuốc lá chuyển

gen hay không, chúng tôi đã tiến hành so sánh hàm lượng prolin giữa cây chuyển

gen và cây WT. Ở thực vật bậc cao, prolin được tổng hợp từ hai con đường hoặc

từ glutamate hoặc từ ornithine. Sự tổng hợp prolin từ tiền chất glutamate là chu

trình quan trọng nhất với sự tham gia của hai loại enzyme pyrroline-5-

carboxylate synthetase (P5CS) và pyrroline-5-carboxylate reductase (P5CR)

[40]. Kết quả của chúng tôi cho thấy, các dòng cây thuốc lá chuyển gen có hàm

lượng prolin tích lũy cao hơn so với cây WT từ 211,17% - 332,44% sau 5 ngày

stress hạn, và 262,79% - 466,04% sau 9 ngày stress hạn. Sự thay đổi hàm lượng

prolin trong các dòng cây thuốc lá chuyển gen khi bị stress hạn so với cây WT là

do ở cây được chuyển gen, gen chuyển GmDREB2 biểu hiện làm hàm lượng

protein DREB2 trong cây chuyển gen hơn cây WT, làm tăng cường phiên mã

của gen P5CS, P5CR và hàm lượng prolin trong cây chuyển gen tăng, kết quả là

mức độ chịu hạn của cây chuyển gen cao hơn cây WT. Đối với gen chức năng

chống chịu, theo nguyên lý điều hòa biểu hiện gen, hiện tượng tăng hàm lượng

protein có thể gây ức chế phản hồi vì các protein đã ngăn chặn sự kích hoạt

phiên mã của các gen mục tiêu và không cải thiện được khả năng chịu stress từ

ngoại cảnh. Tuy nhiên, để khắc phục hạn chế này, Fujita và cs (2005) [45],

Sakuma và cs (2006ab) [146], [147], Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) [4] đã

nghiên cứu tạo đột biến điểm với mục đích loại bỏ ức chế phản hồi và khả năng

chịu hạn của cây trồng vẫn được tăng cường. Đối với gen mã hóa nhân tố phiên

mã của nhiều gen chức năng liên quan đến tính chịu hạn, sự biểu hiện mạnh của

gen chuyển GmDREB2 có gây ức chế phản hồi hay không cần có những nghiên

cứu tiếp theo.

4.3. Về kết quả chuyển gen và phân tích cây đậu tương chuyển gen

Theo chúng tôi, hướng tiếp cận chủ yếu hiện nay trong việc cải thiện tính

chịu hạn của cây đậu tương thông qua việc chuyển các gen chức năng liên quan

trực tiếp đến tính chịu hạn hoặc chuyển gen mã hóa protein là nhân tố kích hoạt

quá trình phiên mã từ các giống đậu tương chịu hạn tốt sang giống chịu hạn kém.

Hiện nay, việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn

của cây đậu tương đã được nhiều tác giả quan tâm và thu được một số kết quả

ban đầu. Nguyễn Thị Thuý Hường (2011) đã chuyển thành công cấu trúc

RD29A/P5CSm vào giống đậu tương DT84, tạo được cây đậu tương mang gen

đột biến loại bỏ ức chế phản hồi làm tăng cường khả năng tổng hợp prolin khi

cây đậu tương bị stress hạn [4]. Lò Thanh Sơn (2015) đã tạo được cây đậu tương

chuyển gen mang gen chuyển GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ [7]. Kết quả

phân tích biểu hiện mạnh gen GmEXPB2 trên cây đậu tương chuyển gen của

Zhou và cs (2014) đã cung cấp thông tin protein EXPB2 có chức năng thúc đẩy

bộ rễ phát triển, cải thiện hiệu quả sử dụng phospho [196]. Tuy nhiên, các công

trình trên mới chỉ đề cập kết quả chuyển từng gen chức năng riêng rẽ, nên hiệu

quả tác động tới chuỗi phản ứng tạo ra các sản phẩm liên quan đến tính chịu hạn

là không nhiều. Một hướng tiếp cận khác là nghiên cứu cải tiến để tạo promoter

mạnh trong vector chuyển gen thực vật và coi đây như là công cụ cải thiện khả

năng chịu hạn của cây đậu tương [175]. Hiện tượng đa gen tác động đến tính

chịu hạn đã gợi ý nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã với kỳ vọng

làm tăng tốc độ biểu hiện của nhóm gen chịu hạn và khả năng chịu hạn của cây

đậu tương chuyển gen được tăng cường. Đó là nghiên cứu biểu hiện gen

GmNFYA3 của Ni và cs (2013) [119], chuyển gen GmNAC của Hao và cs (2011)

[60], của Thao và cs (2013) [165]. Đồng ý với cách tiếp cận nâng cao khả năng

chịu hạn của cây đậu tương bằng chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã, chúng

tôi chọn gen GmDREB2 - gen mã hóa nhân tố kích hoạt quá trình phiên mã của

nhóm gen chịu hạn với mong muốn mang lại tác động đa hiệu, làm tăng khả

năng chịu hạn của cây đậu tương.

Trong kết quả chuyển gen của chúng tôi, qua các giai đoạn tái sinh và sinh

trưởng chồi và chọn lọc bằng kháng sinh, bước đầu đã tạo được 17 cây được

chuyển gen GmDREB2 trong điều kiện nhà lưới từ 530 mẫu biến nạp của giống

đậu tương DT84. Đồng thời, kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển

GmDREB2 trên các cây chuyển gen và thu được 14 cây cho sản phẩm PCR,

hiệu suất chuyển gen GmDREB2 ở giai đoạn phân tích này được xác định đạt

14/530 = 2,64%. Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng công cụ PCR để phân tích gen

chuyển thì rất có thể xảy ra hiện tượng thu được sản phẩm giả hoặc ô nhiễm gen.

Chính vì vậy, Southern blot là kỹ thuật cho phép xác định được sự tồn tại của

gen chuyển trong hệ gen cây được chuyển gen. Trong kết quả nghiên cứu của

chúng tôi, có 6/14 cây thu được sản phẩm PCR với hình thái thân, lá và phát

100

triển bình thường được lựa chọn để phân tích Southern blot và cả 6 cây đều

cho kết quả lai (Hình 3.19) ở các vị trí khác nhau trong hệ gen cây đậu tương

chuyển gen. Hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn phân tích này là 1,13%. Như vậy có

thể kết luận rằng, gen GmDREB2 đã được gắn vào hệ gen của giống đậu tương

DT84. Cùng chuyển gen vào giống đậu tương DT84 qua nách lá mầm nhờ

A.tumefaciens, dựa trên kết quả phân tích PCR, kết quả của Nguyễn Thị Thúy

Hường (2011) xác định hiệu suất chuyển gen GmP5CSm đạt 0,23% [4], kết quả

của Lò Thanh Sơn (2015) chuyển gen GmEXP1 đạt hiệu suất 0,53% [7]. Trong kết

quả của chúng tôi, hiệu suất chuyển gen dựa trên số cây thu được sản phẩm PCR

là 2,64%, hiệu suất chuyển gen dựa trên kết quả lai Southern blot là 1,13% và

dựa trên kết quả lai Western blot là 0,943%. Như vậy, có thể cho rằng hiệu suất

chuyển gen phụ thuộc vào đặc điểm của gen chuyển.

Từ báo cáo đầu tiên về chuyển gen ở đậu tương năm 1988 đến nay cho

thấy, hệ thống chuyển gen qua nách lá mầm đậu tương nhờ A.tumefaciens đã

mang lại nhiều kết quả ứng dụng trong nông nghiệp. Ưu điểm của A.tumefaciens

có khả năng chuyển được các đoạn DNA tương đối lớn, gen chuyển được tích

hợp vào hệ gen thực vật và chi phí thấp, có thể thực hiện thành công ở các phòng

thí nghiệm Việt Nam. Trong nghiên cứu của chúng tôi, kết quả biểu hiện mạnh

gen GmDREB2 và đánh giá chức năng sinh học của gen chuyển thông qua so sánh

hàm lượng prolin trên cây thuốc lá chuyển gen; chuyển thành công và tạo được

các dòng cây đậu tương thu được sản phẩm PCR và phản ứng Southern blot,

biểu hiện thành công protein tái tổ hợp GmDREB2 trên cây đậu tương chuyển

gen đã mở ra triển vọng tạo giống đậu tương chịu hạn trong bằng kỹ thuật

chuyển gen ở Việt Nam. Đây là những kết quả bước đầu khẳng định hướng

tiếp cận đúng trong chọn tạo cây trồng chịu hạn bằng về kỹ thuật chuyển gen,

nhất là trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu và hiện tượng El Nino đang

gây khô hạn ở nhiều khu vực trên thế giới, trong đó nước ta chịu ảnh hưởng

rất nghiêm trọng.

101

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1.1. Gen GmDREB2 của 6 giống đậu tương Việt Nam đã được nhân bản, tách dòng

thành công và xác định trình tự nucleotide. Gen GmDREB2 có kích thước 480

nucleotide, mã hóa 159 amino acid. Dựa trên trình tự nucleotide và trình tự amino

acid suy diễn của gen GmDREB2, 16 giống đậu tương đều phân bố trên hai nhánh

với khoảng cách di truyền lần lượt là 3,1% và 2,8%. Giống đậu tương DT2008

phân bố cùng nhóm và có quan hệ gần với các giống đậu tương của Indonesia.

1.2. Vector chuyển gen thực vật pBI121-GmDREB2 đã được thiết kế và chuyển

thành công vào cây thuốc lá nhờ A. tumefaciens; 35 cây thuốc lá được chuyển gen ở

thế hệ T0 trồng trong nhà lưới có 29 cây thu được sản phẩm PCR.

1.3. Protein tái tổ hợp GmDREB2 được biểu hiện thành công ở 5 cây thuốc lá

chuyển gen thế hệ T0. Trong điều kiện gây hạn nhân tạo, các cây thuốc lá chuyển

gen có hàm lượng prolin tăng từ 211,17% - 332,44% (sau 5 ngày stress hạn) và

tăng từ 262,79% - 466,04% (sau 9 ngày stress hạn).

1.4. Cấu trúc mang gen GmDREB2 đã được chuyển thành công vào giống đậu

tương DT84 nhờ A.tumefaciens và tạo được 14 cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ

T0 thu được sản phẩm PCR, trong đó có 6 cây cho kết quả lai Southern blot.

Protein tái tổ hợp GmDREB2 được biểu hiện ở 5 cây đậu tương chuyển gen

thế hệ T0 với kích thước phân tử khoảng 20 kDa, hiệu suất chuyển gen đạt

0,943%.

2. Đề nghị

Tiếp tục phân tích sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển GmDREB2

ở 5 cây đậu tương chuyển gen qua các thế hệ T1, T2, T3 ... nhằm chọn tạo được

các dòng cây có sự sinh trưởng, phát triển bình thường và có khả năng chịu

hạn cao.

102

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

Các bài báo đã xuất bản

1. Dao Xuan Tan, Ho Manh Tuong, Vu Thi Thu Thuy, Le Van Son, and Chu

Hoang Mau (2015), Cloning and Overexpression of GmDREB2 Gene from a

Vietnamese Drought-resistant Soybean Variety, Braz. Arch. Biol. Technol.,

58(5), pp. 651-657 (SCI-E).

2. Đào Xuân Tân, Hồ Mạnh Tường, Vũ Thị Thu Thủy, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng

Mậu (2015), Phân tích trình tự nucleotide của gen GmDREB2 phân lập từ một số

giống đậu tương Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Thái Nguyên,

138(08), tr. 67-72.

3. Đào Xuân Tân, Vũ Thị Thu Thủy, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2015), Họ

nhân tố phiên mã AP2/ERF và ứng dụng nghiên cứu cải thiện khả năng chịu hạn

của cây trồng, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Thái Nguyên, 142(12),

tr. 3-16.

4. Đào Xuân Tân, Hoàng Thị Thu Hoàn, Hồ Mạnh Tường, Vũ Thị Thu Thủy,

Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2016), Sự đa dạng của gen GmDREB2 phân lập

từ một số giống đậu tương Việt Nam, Kỷ yếu Hội nghị Khoa học toàn quốc về

nghiên cứu và giảng dạy sinh học Việt Nam lần thứ II, Đà Nẵng 5/2016, Nxb

Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 680-688.

Các trình tự gen đăng ký trên Ngân hàng Gen

1. Dao T.X., Hoang H.T.T., Ho TM., Hoang H.P., Vu T.T.T., Le S.V., and Chu

M.H. (2014), Glycine max mRNA for DREB2 factor (DREB2 gene), cultivar

DT2008, GenBank LK936507.

2. Dao T.X., Pham M.T., Ho T.M., Hoang H.P., Vu T.T.T., Le S.V., and Chu M.H.

(2014), Glycine max mRNA for DREB2 factor (DREB2 gene), cultivar DT51,

GenBank LK936508.1.

103

3. Dao T.X., Pham M.T., Ho T.M., Hoang H.P., Vu T.T.T., Le S.V., and Chu M.H.

(2014), Glycine max mRNA for DREB2 factor (DREB2 gene), cultivar DT26,

GenBank LK936509.1.

4. Dao T X., Dinh H.T., Ho T.M., Vu T.T.T., Nguyen T.N.T., Nguyen V.T.T., Le

V.S., and Chu H.M. (2014), Glycine max mRNA for transcription factor DREB2

protein (DREB2 gene), cultivar CaoBang (CB), GenBank HG965097.1.

5. Dao T.X., Dinh H.T., Ho T.M., Vu T.T.T., Nguyen T.N.T., Nguyen V.T.T., Le

V.S., and Chu H.M. (2014), Glycine max mRNA for transcription factor DREB2

protein (DREB2 gene), cultivar VietNam5 (DVN5), GenBank HG965098.1.

6. Dao T.X., Dinh H.T., Ho T.M., Vu T.T.T., Nguyen T.N.T., Nguyen V.T.T., Le

V.S., and Chu H.M. (2014), Glycine max mRNA for transcription factor DREB2

protein (DREB2 gene), cultivar CaoBangDen (CBD), GenBank HG965099.1.

104

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Mạnh Chinh, Nguyễn Đăng Nghĩa (2007), Trồng - chăm sóc &

phòng trừ sâu bệnh đậu nành - đậu xanh, Nxb Nông nghiệp.

2. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây đậu tương, Nxb Đại học Nông nghiệp.

3. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2011),

Nghiên cứu khả năng tái sinh và biến nạp gen qua nách lá mầm của hai giống

đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) ĐT12 và DT84 bằng Agrobacterium,

Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3B), tr. 1305-1310.

4. Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS

liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam,

Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên.

5. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thuý Hường, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu

Hoàng Hà (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương, Nxb Đại học

Quốc gia Hà Nội.

6. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong

chọn giống cây trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên.

7. Lò Thanh Sơn (2015), Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan

đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill), Luận án

tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên.

8. Lò Thị Mai Thu (2014), Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và

phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương

chuyển gen kháng bệnh, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên.

Tiếng Anh

9. Abdeen A., Schnell J., Miki B. (2010), Transcriptome analysis reveals

absence of unintended effects

in drought-tolerant

transgenic plants

overexpressing the transcription factor ABF3. BMC Genomics, 28;11:69.

doi: 10.1186/1471-2164-11-69.

105

10. Agarwal P.K., Agarwal P., Reddy M.K., and Sopory S.K. (2006), Role of

DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants,

Plant Cell Rep, 25, pp. 1263-1274.

11. Agarwal P., Agarwal P., Nair S., Sopory S., Reddy M. (2007), Stress-

inducible DREB2A transcription factor from Pennisetum glaucum is a

phosphoprotein and its phosphorylation negatively regulates its DNA-

binding activity, Mol Genet Genomics, 277, pp. 189-198.

12. Ahmad P., Jaleel C.A., Salem M.A., Nabi G., Sharma S. (2010), Roles of

enzymatic and nonenzymatic antioxidants in plants during abiotic stress,

Crit Rev Biotechnol, 30, pp. 161-175.

13. Allen M.D., Yamasaki K., Ohme-Takagi M., Tateno M., Suzuki M. (1998),

A novel mode of DNA recognition by a β-sheet revealed by the solution

structure of the GCC-box binding domain in complex with DNA, EMBO J.,

17, pp. 5484-5496.

14. Andeani J.K., Mohsenzadeh S., and Mohabatkar H. (2009), Isolation and

Characterization of Partial DREB Gene from Four Iranian Triticum aestivum

Cultivars, World Journal of Agricultural Sciences, vol. 5(5), pp. 561-566.

15. Bates LS., Waldren R.P., Teare I.D. (1973), Rapid determination of free

proline for water-stress studies, Plant Soil, 39(1), pp. 205-207.

16. Bhatnagar-Mathur P., Devi M.J., Reddy D.S., Vadez V., Yamaguchi-

Shinozaki K., Sharma K.K. (2006), Overexpression of Arabidopsis thaliana

DREB1A in transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) for improving

tolerance to drought stress (poster presentation). In: Arthur M. Sackler,

editor. Colloquia on ‘‘From Functional Genomics of Model Organisms to

Crop Plants for Global Health’’, Washington, DC: National Academy of

Sciences, April 3-5.

17. Bhatnagar-Mathur P., Devi M.J., Vadez V., Sharma K.K. (2009), Differential

106

antioxidative responses in transgenic peanut bear no relationship to their

superior transpiration efficiecy under drought stress, Plant Physiol, 166, pp.

1207-1217.

18. Boyer J.S. (1982), Plant productivity and environment, Science, 218, pp.

443-448.

19. Bray E.A., (2004), Genes commonly regulated by water-deficit stress in

Arabidopsis thaliana, J. Exp. Bot., 55, pp. 2331-2341.

20. Brasileiro A.C.M. and Lacorte C. (2000), Agrobacterium: Um sistema

natural de transferencia de genes para plantas, Biotecnol Cienc Desenvolv,

15, pp. 12-15.

21. Broothaerts W., Mitchell H.J., Weir B., Kaines S., Smith L.M.A., Yang W.,

Mayer J.E., Roa-Rodriguez C. and Jefferson R.A. (2005), Gene transfer to

plants by diverse species of bacteria, Nature, 433, pp. 629-633.

22. Cao D., Hou W., Song S., Sun H., Wu C., Gao Y. and Han T. (2009),

Assessment of conditions affecting Agrobacterium rhizogenes-mediated

transformation of soybean, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 96, pp. 45-52.

23. Charlson D.V., Hu X., Okimoto B., Purcell L.C. (2009), Glycine max

cultivar Jackson drought responsive element binding protein 1 (DREB1),

NCBI, Accession FJ965342, http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

24. Chen M., Wang Q.Y., Cheng X.G., Xu Z.S., Li L.C., Ye X.G., Xia L.Q., Ma

Y.Z. (2007), GmDREB2 a soybean DRE-binding transcription factor,

conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants, Biochem.

Biophys. Res. Commun., 353, pp. 299-305.

25. Chen M., Ma Y., Xu Z., Li L., Wang Q. (2007), Glycine max dehydration-

responsive element binding protein 5 (DREB5) mRNA, complete cds.,

NCBI, Accession EF583447, http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

26. Chen M., Xu Z., Xia L., Li L., Cheng X., Dong J., Wang Q., Ma Y.

107

(2009b), Cold-induced modulation and functional analyses of the DRE-

binding transcription factor gene GmDREB3, in soybean (Glycine max L.), J.

Exp. Bot., 60(1), pp. 121-135.

27. Chen Y., Chen P. and de los Reyes B.G. (2004), Analysis of the expression

of DREB1 gene orthologs in cultivated and wild species of soybean, NCBI,

Accession AY802779, http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

28. Chena J., Xia X., Yina W. (2009), Expression profiling and functional

characterization of a DREB2-type gene from Populus euphratica, Biochem.

Biophys. Res. Commun., 378(3), pp. 483-487.

29. Chinchilla D., Shan L., He P., de Vries S., Kemmerling B. (2009), One for

all: thereceptor-associated kinase BAK1, Trends in Plant Science, 14, pp.

535-541.

30. Cho H.J., Farrand S.K. and Noel G.R. (2000), High-efficiency induction of

soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode, Planta,

210, pp. 195-204.

31. Christey M.C. (2001), Use of Ri mediated transformation for production of

transgenic plants, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 37, pp. 687-700.

32. Christou P., McCabe D.E. and Swain W.F. (1988), Stable transformation of

soybean callus by DNA-coated gold particles, Plant Physiol, 87, pp. 671-674.

33. Clement M., Lambert A., Herouart D., Boncompagni E.

(2008),

Identification of new up-regulated genes under drought stress in soybean

nodules, Gene, 426, pp. 15-22.

34. Collier R., Fuchs B., Walter N., Kevin L.W. and Taylor C.G. (2005), Ex vitro

composite plants: An inexpensive, rapid method for root biology. The Plant J.,

43, pp. 449-457.

35. Cong L., Zheng H.C., Zhang Y.X., Chai T.Y. (2008), Arabidopsis DREB1A

confers high salinity tolerance and regulates the expression of GA dioxygenases

in Tobacco, Plant Sci., 174, pp. 56-164.

108

36. Cushman J.C, Bohnert H.J. (2000), Genomic approaches to plantstress

tolerance, Curr. Opin. Plant Biol., 3, pp. 117-124.

37. De Ronde J.A., Cress W.A., Kruger G.H.J., Strasser R.J. and Van Staden J.

(2004a), Photosynthetic response of transgenic soybean plants, containing an

Arabidopsis P5CR gene during heat and drought stress, Plant Physiol, 161, pp.

1211-1224.

38. De Ronde J.A., Laurie R.N., Caetano T., Greyling M.M. and Kerepesi I. (2004b),

Comparative study between transgenic and non-transgenic soybean lines proved

transgenic lines to be more drought tolerant, Euphytica, 158, pp. 123-132.

39. DeCleene M. and DeLey J. (1976), The host range of crown gall, Bot. Gaz.,

42, pp. 389-466.

40. Delauney A.J., and Verma D.P.S. (1993), Proline biosynthesis and

osmoregulation in plants, The plant J., 4 (2), pp. 215-223.

41. Díaz-Martín J., Almoguera C., Prieto P.D, Espinosa J.M., Jordano J. (2005),

Functional interaction between two transcription factors involved in the

developmental regulation of a small heat stress protein gene promoter, Plant

Physiol, 139, pp. 1483-1494.

42. Dubouzet J.G., Sakuma Y., Ito Y., Kasuga M., Dubouzet E.G., Miura S.,

Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2003), OsDREB genes in rice,

Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought, high

salt and cold-responsive gene expression, The Plant J., 33, pp. 751-763.

43. Egawa C., Kobayashi F., Ishibashi M., Nakamura T., Nakamura C., Takumi

S. (2006), Differential regulation of transcript accumulation and alternative

splicing of a DREB2 homolog under abiotic stress conditions in common

wheat, Genes Genet. Syst., 81, pp. 77-91.

44. Fowlers F., Thomashow M.F. (2002), Arabidopsis transcriptome profiling

indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold

109

acclimation in addition to CBF cold response pathway, Plant Cell, 14, pp.

1675-1690.

45. Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Parvez M., Seki M., Hiratsu K.,

Ohme-Takagi M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2005), AREB1 Is

a transcriptional activator of novel ABRE dependent ABA signaling that

enhances drought stress tolerance in Arabidopsis, Plant Cell, 17, pp. 3470-3488.

46. Fujimoto S.Y., Ohta M., Usui A., Shinshi H., Ohme M., Takagi. (2000),

Arabidopsis

ethylene-responsive

element binding

factors

act

transcriptional activators or repressors of GCC box-mediated gene

expression, Plant Cell, 12, pp. 393-404.

47. Furihata T., Maruyama K., Fujita Y., Umezawa T., Yoshida R., Shinozaki K.,

Yamaguchi-Shinozaki K.

(2006), Abscisic

acid-dependent multisite

phosphorylation regulates the activity of a transcription activator AREB1, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA., 103, pp. 1988-1993.

48. Gao Z., He X., Zhao B., Zhou C., Liang Y., et al. (2010), Overexpressing a

putative aquaporin gene from wheat, TaNIP, enhances salt tolerance in

transgenic Arabidopsis, Plant and Cell Physiology, 51, pp. 767-775.

49. Gelvin S.B. (2003) Agrobacterium and plant transformation: The biology

behind the “gene-jockeying” tool, Microbiol Mol. Biol. Rev., 67, pp. 16-37.

50. Gelvin S.B. (2010a), Finding a way to the nucleus, Curr. Opin. Microbiol,

13, pp. 53-58.

51. Gelvin S.B. (2010b), Plant proteins involved in Agrobacterium-mediated

genetic transformation, Annu. Rev. Phytopathol, 48, pp. 45-68.

52. Gilmour S.J., Zarka D.G., Stockinger E.J., Salazar M.P., Houghton J.M.,

Thomashow M.F. (1998), Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF

family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR

gene expression, The Plant J., 16, pp. 433-442.

110

53. Gilmour S.J., Sebolt A.M., Salazar M.P., Everard J.D., Thomashow M.F.

(2000), Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator

mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation,

Plant Physiol, 124, pp. 1854-1865.

54. Gong P., Zhang J., Li H., Yang C., Zhang C., et al. (2010), Transcriptional

profiles of droughtresponsive genes in modulating transcription signal

transduction, andbiochemical pathways in tomato, J. Exp. Bot., 61, pp.

3563-3575.

55. Guo J., Wang M.H. (2011), Expression profiling of the DREB2 type gene

from tomato (Solanum lycopersicum L.) under various abiotic stresses,

Horticulture, Environment, Biotechnology, 52, pp. 105-111.

56. Gutha L.R., Reddy A.R. (2008), Rice DREB1B promoter shows distinct stress-

specific responses, and the overexpression of cDNA in tobacco confers

improved abiotic and biotic stress tolerance, Plant Mol. Biol., 68, pp. 533-555.

57. Haake V., Cook D., Riechmann J.L., Pineda O., Thomashow M.F., Zhang J.Z.

(2002), Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in

Arabidopsis, Plant Physiol, 130, pp. 639-648.

58. Ha C.V., Le D.T., Nishiyama R., Watanabe Y., Tran U.T., Dong N.V., et al.

(2013), Characterization of the newly developed soybean cultivar DT2008 in

relation to the model variety W82 reveals a new genetic resource for

comparative and functional genomics for improved drought tolerance,

Biomed Res. Int., doi: 10.1155/2013/759657.

59. Hadiarto T., Tran L.S. (2011), Progress studies of drought-responsive genes

in rice, Plant Cell Rep., 30, pp. 297-310.

60. Hao Y.J., Wei W., Song Q.X., Chen H.W., Zhang Y.Q., Wang F., Zou H. F.,

Lei G., Tian A.G., Zhang W.K., Ma B., Zhang J.S., Chen S.Y. (2011),

Soybean NAC transcription factors promote abiotic stress tolerance and

111

lateral root formation in transgenic plants, The Plant J., 68(2), pp. 302-313.

61. Hayashi S., Gresshoff P.M. and Kinkema M. (2008), Molecular analysis of

lipoxygenases associated with nodule development in soybean, Mol.

Plant-Microbe Interact., 21, pp. 843-853.

62. Hernandez-Garcia C.M., Bouchard R.A, Rushton P.J., Jones M.L., Chen X.,

Timko M.P., and Finer J.J. (2010), High level transgenic expression of

soybean (Glycine max) GmERF and Gmubi gene promoters isolated by a novel

promoter analysis pipeline, BMC Plant Biol., doi: 10.1186/1471-2229-10-237.

63. Hernandez-Garcia C.M., Martinelli A.P., Bouchard R.A. and Finer J.J.

(2009), A soybean (Glycine max) polyubiquitin promoter gives strong

constitutive expression in transgenic soybean, Plant Cell Rep., 28, pp. 837-849.

64. Hinchee M.A., Connor-Ward D.V., Newell C.A., McDonell R.E., Sato S.J.,

Gasser C.S., Fishhoff D.A., Re D.B., Fraley R.T. and Horsch R.B. (1988),

Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA

transfer, Bio/Technol, 6, pp. 915-922.

65. Hiratsu K., Matsui K., Koyama T., Ohme-Takagi M. (2003), Dominant

repression of target genes by chimeric repressors that include the EAR motif,

a repression domain, in Arabidopsis, The Plant J., 34, pp. 733-739.

66. Homrich M.S., Passaglia L.M.P., Pereira J.F., Bertagnolli P.F., Pasquali G.,

Zaidi M.A., Altosaar I and Bodanese-Zanettini M.H. (2008a), Resistance to

Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepi-doptera, Noctuidae) in transgenic

soybean (Glycine max (L) Merrill Fabales, Fabaceae) cultivar IAS5

expressing a modi-fied Cry1Ac endotoxin, Genet Mol. Biol., 31, pp. 522-531.

67. Homrich M.S, Passaglia L.M.P, Pereira J.F., Bertagnolli P.F., Salvadori J.R.,

Nicolau M., Kaltchuk-Santos E. and Bodanese-Zanettini M.H. (2008b),

Agronomic performance, chromosomal stability and resistance to velvetbean

caterpillar of transgenic soybean expressing cry1Ac gene, Pesq Agropec

Bras., 43, pp. 801-807.

112

68. Hong H.P., Zhang H., Olhoft P., Hill S., Wiley H., Toren E., Hillebrand H.,

Jones T. and Cheng M. (2007), Organogenic callus as the target for plant

regeneration and transformation via Agrobacterium in soybean (Glycine max

(L) Merrill), In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 43, pp. 558-568.

69. Huang C.Y., Boyer J.S., Vanderhoef L.N. (1975), "Acetylene reduction

(nitrogen fixation) and metabolic activities of soybean having various leaf

and nodule water potentials", Plant Physiol, 56(2), pp. 222 - 227.

70. Huang Y, Xiao B, Xiong L. (2007), Characterization of a stress responsive

proteinase inhibitor gene with positive effect in improving drought resistance

in rice, Planta, 226, pp. 73-85.

71. Hussain S.S., Ali M., Ahmad M., Siddique K.H., (2011). Polyamines: natural

and engineered abiotic and biotic stress tolerance in plants, Biotechnol Adv., 29,

pp. 300-311.

72. Ito Y., Katsura K., Maruyama K., Taji T., Kobayashi M., Seki S., Shinozaki

K., Yamaguchi-Shinozaki K.

(2006), Functional analysis of

rice

DREB1/CBF type transcription factors involved in cold responsive gene

expression in transgenic rice, Plant Cell Physiol, 47, pp. 141-153.

73. Jaglo K.R., Kleff S., Amundsen K.L., Zhang X., Haake V,, Zhang J.Z.,

Deits T., Thomashow M.F. (2001), Components of the Arabidopsis C-

repeat/dehydration-responsive element binding

factor cold-responsive

pathway are conserved in Brassica napus and other plant species, Plant

Physiol., 127, pp. 910-917.

74. Jofuku K.D., Boer B., Montagu M.V., Okamuro J.K. (1994), Control of

Arabidopsis flower and seed development by the homeotic gene APETALA2,

Plant Cell, 6, pp 1211-1225.

75. Kagaya Y., Hobo T., Murata M., Ban A., Hattori T. (2002), Abscisic acid

induced transcription is mediated by phosphorylation of an abscisic acid

response element binding factor, TRAB1, Plant Cell, 14, pp. 3177-3189.

113

76. Kang J., Choi H., Im M., Kim S.Y. (2002), Arabidopsis basic leucine zipper

proteins that mediate stress-responsive abscisic acid signaling, Plant Cell,

14, pp. 343-357.

77. Kasuga M., Liu Q., Miura S., Yamaguchi S., Shinozaki K. (1999), Improving

plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-

inducible transcription factor, Nat Biotechnol, 17, pp. 287-291.

78. Kasuga M., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K. (2004), A combination of the

Arabidopsis DREB1A gene and stress inducible rd29A promoter improved

drought and low temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer,

Plant Cell Physiol, 45, pp. 346-350.

79. Kereszt A., Li D., Indrasumunar A., Nguyen C.D., Nontachaiyapoom S.,

Kinkema M. and Gresshoff P.M. (2007) Agrobacterium rhizogenes-mediated

transformation of soybean to study root biology, Nat Protoc, 2, pp. 948-952.

80. Kim J.H. (2002). Ca2+-dependent Inhibition of Na+/H+exchanger 3 (NHE3)

requires an NHE3-E3KARP-alpha-actinin-4 complex for oligomerization

andendocytosis, Journal of Biological Chemistry, 277, pp. 23714-23724.

81. Kim S.H., Hong J.K., Lee S.C., Sohn K.H., Jung H.W., Hwang B.K. (2004),

CAZFP1, Cys2/His2-type zinc-finger transcription factor gene functions as a

pathogen-induced early-defense gene in Capsicum annuum, Plant Mol. Biol.,

55, pp. 883-904.

82. Kubo M., Udagawa M., Nishikubo N., Horiguchi G., Yamaguchi M., Ito J.,

Mimura T., Fukuda H., Demura T. (2005), Transcription switches for

protoxylem and metaxylem vessel formation, Genes Dev, 19, pp. 1855-1860.

83. Koussevitzky S., Nott A., Mockler T.C., Hong F., Sachetto-Martins G.,

Surpin M., Lim J., Mittler R., Chory J. (2007), Signals from chloroplasts

converge to regulate nuclear gene expression, Science, 316, pp. 715-719.

84. Ko T.S., Lee S., Farrand S.K. and Korban S.S. (2004), A partially disarmed vir

114

helper plasmid, pKYRT1, in conjunction with 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

promotes emergence of regenerable transgenic somatic embryos from immature

cotyledons of soybean, Planta, 218, pp. 536-541.

85. Ko T.S., Lee S., Krasnyanski S. and Korban S.S. (2003), Two critical factors

are required for efficient transformation of multiple soybean cultivars:

Agrobacterium strain and orientation of immature cotyledonary explant,

Theor Appl Genet, 107, pp. 439-447.

86. Kocsy G., Laurie R., Szalai G., Szilagyi V., Simon-Sarkadi L., Galiba G. and

De Ronde J.A. (2005), Genetic manipulation of proline levels affects

antioxidants in soybean subjected to simultaneous drought and heat stresses,

Physiol Plant, 124, pp. 227-235.

87. Kohli A., Twyman R.M., Abranches R., Weget E., Stoger E. and Christou P.

(2003), Transgene integration, organization and interaction in plants, Plant

Mol. Biol., 52, pp. 247-258.

88. Kobayashi F., Ishibashi M., Takumi S. (2008), Transcriptional activation of

Cor/Lea genes and increase in abiotic stress tolerance through expression of

a wheat DREB2 homolog in transgenic tobacco, Transgenic Res. (2008),

17(5), pp. 755-767.

89. Lee S., Kang J., Park H., Kim M.D., Bae M.S., Choi H., Kim S.Y. (2010),

DREB2C interacts with ABF2, a bZIP protein regulating abscisic acid-

responsive gene expression, and its overexpression affects abscisic acid

sensitivity, Plant Physiol, 153, pp. 716-727.

90. Liao Y., Zou H.F., Wang H.W., Zhang W.K., Ma B., et al. (2008), Soybean

GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in

transgenic Arabidopsis plants, Cell Research, 18, pp. 1047-1060.

91. Lim C.J., Hwang J.E., Chen H., Hong J.K., Yang K.A., Choi M.S., Lee K.O.,

Chung W.S., Lee S.Y., Lim C.O. (2007), Over-expression of the Arabidopsis

115

DRE/CRT-binding transcription factor DREB2C enhances thermotolerance,

Biochem. Biophys. Res. Commun., 362, pp. 431-436.

92. Lin R.C., Park H.J., Wang H.Y. (2008), Role of Arabidopsis RAP2.4 in

regulating light and ethylene-mediated developmental processes and drought

stress tolerance, Mol. Plant, 1, pp. 42-57.

93. Liu N., Zhong N.Q., Wang G.L., Li L.J., Liu X.L., He Y.K., Xia G.X. (2007),

Cloning and functional characterization of PpDBF1 gene encoding a

DRE-binding transcription factor from Physcomitrella patens, Planta, 226,

pp. 827-838.

94. Liu Q., Kasuga M., Sakuma Y., Abe H., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K.,

Shinozaki K. (1998), Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an

EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction

pathways in drought- and low-temper-ature-responsive gene expression,

respectively, in Arabidopsis, Plant Cell, 10, pp. 1391-1406.

95. Liu S.J., Wei Z.M. and Huang J.Q. (2008), The effect of cocultivation and

selection parameters on Agrobacterium-mediated transformation of Chinese

soybean varieties, Plant Cell Rep., 27, pp. 489-498.

96. Liu Y.W., Chen M., Xu Z.S., Zh G.Y., Li L.C., Ma Y.Z. (2007), Glycine

max dehydration-responsive element binding protein 6 mRNA, complete

cds., NCBI, Accession EF551166, http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

97. Lozovaya V.V., Lygin A.V., Zernova O.V., Li S., Hartman G.L., and

Widholm J.M. (2004), Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon

treatment with Fusarium solani, Plant Physiol Biochem, 42, pp. 671-679.

98. Magnani E., Sjölander K., Hake S. (2004), From endonucleases to

transcription factors: evolution of the AP2 DNA binding domain in plants,

Plant Cell, 16, pp. 2265-2277.

99. Mai V.Q., Pham C.T.B., Nguyen M.V., Le H.A.T. (2010), Results of

116

research, creation, drought-tolerant soybean variety, DT2008, Journal of

Vietnamese Agricultural Science and Technology, 6, pp. 46-50.

100. Manaa A., Ben A.H, Valot B., Bouchet J.P., Aschi-Smiti S., et al. (2011),

Salt and genotype impact on plant physiology and root proteome variations

in tomato, J. Exp Bot., 62, pp. 2797-2813.

101. Manavalan L.P., Guttikonda S.K., Tran L.S., Nguyen H.T. (2009),

"Physiological and molecular approaches to improve drought resistance in

soybean", Plant Cell Physio., 50(7), pp. 1260-1276.

102. Mao X., Zhang H., Tian S., Chang X., Jing R. (2009), TaSnRK2.4, an SNF1-

typeserine/threonine protein kinase of wheat (Triticum aestivum L.), confers

enhancedmultistress tolerance in Arabidopsis, J. Exp. Bot., 61, pp. 683-696

103. Mao X., Jia D., Li A., Zhang H., Tian S., et al (2011), Transgenic

expression of TaMYB2A confers enhanced tolerance to multiple abiotic

stresses in Arabidopsis, Functional & Integrative Genomics, 11(3), pp. 445-65.

104. Maruyama K., Sakuma Y., Kasuga M., Ito Y., Seki M., Goda H., Shimada Y,

Yoshida S., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2004), Iden-tification of

cold

inducible downstream genes of

the Arabidopsis DREB1A/CBF3

transcriptional factor using two microarray systems, The Plant J., 38, pp.

982-993.

105. Maruyama K., Takeda M., Kidokoro S., Yamada K., Sakuma Y., Urano K.,

Fujita M., Yoshiwara K., Matsukura S., Morishita Y., Sasaki R., Suzuki H.,

Saito K., Shibata D., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2009),

Metabolic pathways involved in cold acclimation identified by integrated

analysis of metabolites and transcripts regulated by DREB1A and DREB2A,

Plant Physiol, 150, pp. 1972-1980.

106. Marcolino-Gomes J., Rodrigues F.A., Oliveira M.C.N., Farias J.R.B.,

Neumaier N., et al. (2013), Expression Patterns of GmAP2/EREB-Like

Transcription Factors Involved in Soybean Responses to Water Deficit, PLoS

ONE, 8(5): e62294. doi: 10.1371/journal.pone.0062294.

117

107. Matsukura S., Mizoi J., Yoshida T., Todaka D., Ito Y., Maruyama K.,

Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2010), Comprehensive analysis of

rice DREB2-type genes that encode transcription factors involved in the

expression of abiotic stress-responsive genes, Mol. Genet Genomics, 283,

pp. 185-196.

108. Mauro A.O.O., Pfeiffer T.W. and Collins G.B. (1995), Inheritance of soybean

susceptibility

to Agrobacterium

tumefaciens and

its

relationship

transformation, Crop Sci., 35, pp. 1152-1156.

109. Mizoi J., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2012), AP2/ERF family

transcription factors in plant abiotic stress responses, Biochim Biophys

Acta, 1819, pp. 86-96.

110. Mittler R. (2006), Abiotic stress, the field environment and stress

combination, Trends Plant Sci., 11, pp. 15-19.

111. Morino M., Natsui S., Ono T., Swartz T.H., Krulwich T.A., et al (2010),

Single site mutations in the heterooligomeric MRP antiporter from alkaliphilic Bacillus pseudofirmus OF4 that affect Na+/H+ antiport activity,

sodium exclusion, individual MRP protein levels, or MRP complex

formation, Journal of Biological Chemistry, 285, pp. 30942-30950.

112. Moris P.C. (2010). Integrating lipid signalling, mitogen-activated protein

kinase cascades and salt tolerance, New Phytologist, 188, pp. 640-643.

113. Morran S., Eini O., Pyvovarenko T., Parent B., Singh R., Ismagul A., Eilby

S., Shirley N., Langridge P., Lopato S. (2010), Improvement of stress

tolerance of wheat and barley by modulation of expression of DREB/CBF

factors, Plant Biotechnol J., doi: 10.1111/ j.1467-7652.2010.00547.x.

114. Murray M.G., Thompson W.F. (1980), "Rapid isolation of high molecular

weight plant DNA", Nucleic Acids Res., 8(19), pp. 4321-4325.

115. Nakano T., Suzuki K., Fujimura T., Shinshi H. (2006), Genome-wide

118

analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice, Plant Physiol.,

140, pp. 411-432.

116. Nakashima K., Shinwari Z.K., Sakuma Y., Seki M., Miura S., Shinozaki

K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2000), Organization and expression of two

Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involved in

dehydration and high-salinity-responsive gene expression, Plant Mol. Biol.,

42, pp. 657-665.

117. Narusaka Y., Nakashima K., Shinwari Z.K., Sakuma Y., Furihata T., Abe

H., Narusaka M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2003), Interaction

between two cis-acting elements, ABRE and DRE, in ABA-dependent

expression of Arabidopsis rd29A gene in response to dehydration and high-

salinity stresses, The Plant J., 34, pp. 137-148.

118. Nelson D.E., Repetti P.P., Adams T.R., Creelman R.A., Wu J., Warner

D.C., Anstrom D.C., Bensen R.J., Castiglioni P.P., Donnarummo M.G.,

Hinchey B.S., Kumimoto R.W., Maszle D.R., Canales R.D., Krolikow-ski

K.A., Dotson S.B., Gutterson N., Ratcliffe O.J., Heard J.E. (2007), Plant

nuclear factor Y (NF-Y) B subunits confer drought tolerance and lead to

improved corn yields on water-limited acres, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,

104, pp. 16450-16455.

119. Ni Z., Hu Z., Jiang Q., Zhang H. (2013), GmNFYA3, a target gene of

miR169, is a positive regulator of plant tolerance to drought stress, Plant

Mol. Biol., 82(1-2), pp. 113 - 129.

120. Niu X., Helentjaris T., Bate N.J. (2002), Maize ABI4 binds coupling element

1 in abscisic acid and sugar response genes, Plant Cell, 14, pp. 2565-2575.

121. Nishizawa A., Yabuta Y., Yoshida E., Maruta T., Yoshimura K.,

Shigeoka S. (2006), Arabidopsis heat shock transcription factor A2 as a key

regulator in response to several types of environmental stress, The Plant J.,

48, pp. 535-547.

119

122. Nover L., Bharti K., Döring P., Mishra S.K., Ganguli A., Scharf K.D.

(2001), Arabidopsis and the heat stress transcription factor world: how

many heat stress transcription factors do we need?, Cell Stress Chaperones,

6, pp. 177-189.

123. Novillo F., Alonso J.M., Ecker J.R., Salinas J. (2004), CBF2/DREB1C is a

negative regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A expression and

plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA., 101, pp. 3985-3990.

124. Ohme-Takagi M., Shinshi H. (1995), Ethylene-inducible DNA binding

proteins that interact with an ethylene-responsive element, Plant Cell, 7,

pp. 173-182.

125. Oh S.J., Kwon C.W., Choi D.W., Song S.I.K., Kim J.K. (2007), Expression

of barley HvCBF4 enhances tolerance to abiotic stress in transgenic rice,

J. Plant Biotechnol, 5, pp. 646-656.

126. Oh S.J., Song S.I., Kim Y.S., Jang H.J., Kim M., Kim Y.K. (2005),

Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in transgenic rice increased tolerance

to abiotic stress without stunting growth, Plant Physiol, 138, pp. 341-351.

127. Olhoft P.M., Bernal L.M., Grist L.B. and Ozias-Akins P. (2007), A novel

Agrobacterium rhizogenes-mediated

transformation method of soybean

[Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings, In Vitro

Cell Dev. Biol. Plant, 43, pp. 536-549.

128. Olhoft P.M., Donovan C.M., Somers D.A. (2006), Soybean (Glycine max)

transformation using mature cotyledonary node explants, Methods Mol.

Biol., 343, pp. 385-396.

129. Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M. and Somers D.A. (2003), Efficient

soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-

node method, Planta, 216, pp. 723-735.

120

130. Paz M.M., Martinez J.C., Kalvig A.B., Fonger T.M. and Wang K. (2006),

Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived

from mature

seed

for efficient Agrobacterium-mediated

soybean

transformation, Plant Cell Rep., 25, pp. 206-213.

131. Pellegrineschi A., Reynolds M., Pacheco M., Brito R.M., Almeraya R.,

Yamaguchi-Shinozaki K., Hoisington D. (2004), Stress induced expression

in wheat of the Arabidopsis thaliana DREB1A gene delays water stress

symptoms under greenhouse conditions, Genom, 47, pp. 493-500.

132. Pitzschke A. and Hirt H. (2010), New insights into an old story:

Agrobacterium-induced tumour formation in plants by plant transformation,

EMBO J., 29. pp. 1021-1032.

133. Polizel A.M., Medri M.E., Nakashima K., Yamanaka N., Farias J.R.B.,

Oliveira M.C.N., Marin S.R.R., Abdelnoor R.V., Marcelino-Guimaraes FC,

Fuganti R, et al. (2011), Molecular, anatomical and physiological properties

of a genetically modified soybean line transformed with rd29A: AtDREB1A

for the improvement of drought tolerance, Genet Mol. Res., 10, pp. 3641-3656.

134. Qin F., Kakimoto M., Sakuma Y., Maruyama K., Osakabe Y., Tran L.S.P.,

Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2007), Regulation and functional

analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays

L., The Plant J., 50, pp. 54-69.

135. Qin F., Sakuma Y., Li J., Liu Q., Li Y.Q., Shinozaki K., Yamaguchi-

Shinozaki K. (2004), Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF

transcription factor involved in cold-responsive gene expression in Zea mays L.,

Plant Cell Physiol, 45, pp. 1042-1052.

136. Qin F., Sakuma Y., Tran L.S.P., Maruyama K., Kidokoro S., Fujita Y.,

Fujita M., Umezawa T., Sawano Y., Miyazono. K., Tanokura M., Shinozaki

K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2008), Arabidopsis DREB2A-interacting

proteins function as RING E3 ligases and negatively regulate plant drought

121

stress-responsive gene expression, Plant Cell, 20, pp. 1693-1707.

137. Qin X., Zeevaart J.A.D., (1999), The 9-cisepoxycarotenoid cleavage reaction

is thekey regulatory step of abscisic acid biosynthesis in water-stressed bean,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96, pp. 15354-15361.

138. Qiu Y.P., Yu D.Q. (2009), Over-expression of the stress-induced OsWRKY45

enhances disease resistance and drought tolerance in Arabidopsis, Environ. Exp.

Bot., 65, pp. 35-47.

139. Rao S.S., Mamadou L., McConnell M., Polisetty R., Kwanyuen P. and

Hildebrand D. (2009). Non-antibiotic selection systems for soybean somatic

embryos: The lysine analog aminoethyl-cysteine as a selection agent, BMC

Biotechnology, Nov 18;9:94. doi: 10.1186/1472-6750-9-94.

140. Ratcliffe O.J., Riechmann J.L. (2002), Arabidopsis transcription factors

and the regulation of flowering time: a genomic perspective, Curr. Issues

Mol. Biol., 4, pp. 77-91.

141. Riechmann J.L., Heard J., Martin G., Reuber L., Jiang C.Z., Keddie J.,

Adam L., Pineda O., Ratcliffe O.J., Samaha R.R., Crelman R., Pilgrim M.,

Broun P., Zhang J.Z., Ghandehari D., Sherman B.K, Yu G.L. (2000),

Arabidopsis transcription factors: Genome-wide comparative analysis among

eukaryotes, Science, 290, pp. 2105-2110.

142. Rechsteiner M., Rogers S.W. (1996), PEST sequences and regulation by

proteolysis, Trends Biochem Sci., 21, pp. 267-271.

143. Rizhsky L., Liang H., Mittler R. (2002), The combined effect of drought

stress and heat shock on gene expression in tobacco, Plant Physiol, 130,

pp. 1143-1151.

144. Rizhsky L., Liang H., Shuman J., Shulaev V., Davletova S., Mittler R.

(2004), When defense pathways collide. The response of Arabidopsis to a

combination of drought and heat stress, Plant Physiol, 134, pp. 1683-1696.

122

145. Rogers S., Wells R., Rechsteiner M. (1986), Amino acid sequences

common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis, Science, 234,

pp. 364-368.

146. Sakuma Y., Maruyama K., Osakabe Y., Qin F., Seki M., Shinozaki K.,

Yamaguchi-Shinozaki K. (2006a), Functional analysis of an Arabidopsis

transcription factor, DREB2A, involved in drought-responsive gene expression,

Plant Cell, 18, pp. 1292-1309.

147. Sakuma Y., Maryyama K., Qin F., Osakabe Y., Shinozaki K., Yamaguchi-

Shinozaki K. (2006b), Dual function of an Arabidopsis transcription factor

DREB2A

in water-stress-responsive

and heat-stress-responsive gene

expression, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 103, pp. 18822-18827.

148. Sakuma Y., Liu Q., Dubouzet J.G., Abe H., Shinozaki K., Yamaguchi-

Shinozaki K. (2002), DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of

Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration-and

cold-inducible gene expression, Biochem. Biophys. Res. Commun., 290,

pp. 998-1009.

149. Sambrook J., Russell D.W. (2001), Molecular cloning a Laboratory

Manual, Vol 3.

150. Schramm F., Larkindale J., Kiehlmann E., Ganguli A., Englich G., Vierling E.,

Von Koskull-Doring P. (2008), A cascade of transcription factor DREB2A and

heat stress transcription factor HsfA3 regulates the heat stress response of

Arabidopsis, The Plant J., 53, pp. 264-274.

151. Schramm F., Ganguli A., Kiehlmann E., Englich G., Walch D., Von

Koskull-Doring P. (2006), The heat stress transcription factor HsfA2 serves

as a regulatory amplifier of a subset of genes in the heat stress response in

Arabidopsis, Plant Mol. Biol., 60, pp. 759-772.

152. Sharoni A.M., Nuruzzaman M., Satoh K., Shimizu T., Kondoh H., Sasaya T.,

123

Choi I.-R., Omura T., Kikuchi S. (2011), Gene structures, classification, and

expression models of the AP2/EREBP transcription factor family in rice, Plant

Cell Physiol., 52(2), pp. 344-360.

153. Shen Y.G., Zhang W.K., He S.J., Liu Q., Chen S.Y. (2003), An

EREBP/AP2-type protein

in Triticum aestivum was a DRE-binding

transcription factor inducedby cold, dehydration and ABA stress, Theor.

Appl. Genet.,106, pp. 923-930.

154. Shinwari Z.K., Nakashima K., Miura S., Kasuga M., Seki M., Yamaguchi -

Shinozaki K., Shinozaki K. (1998), An Arabidopsis gene family encoding

DRE/CRT binding proteins involved in low-temperature-responsive gene

expression, Biochem. Biophys. Res. Commun, 250, pp. 161-170.

155. Seki M., Umezawa T., Urano K., Shinozaki K. (2007), Regulatory metabolic

networks in drought stress responses, Curr. Opin. Plant Biol., 10, pp. 296-302.

156. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2000), Molecular responses to

dehydration and low temperature: differences and cross-talk between two

stress signaling pathways, Curr. Opin. Plant Biol., 3, pp. 217-223.

157. Shigyo M., Hasebe M., Ito M. (2006), Molecular evolution of the AP2

subfamily, Gene, 366, pp. 256-265.

158. Shigyo M., Ito M. (2004), Analysis of gymnosperm two-AP2-domain-

containing genes, Dev. Genes Evol. 214, pp. 105-114.

159. Shukla R.K., Raha S., Tripathi V., Chattopadhyay D.

(2006), Expression

of CAP2, an APETALA2-family transcription factor from chickpea,

enhances growth and tolerance to dehydration and salt stress in transgenic

tobacco, Plant Physiol, 142, pp. 113-123.

160. Somers D.A., Samac D.A., and Olhoft P.M. (2003), Recent advances in

legume transformation, Plant Physiol, 131, pp. 892-899.

161. Subramanian S., Graham M.Y., Yu O., and Graham T.L. (2005), RNA

124

interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues

distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora

sojae, Plant Physiol, 137, pp. 1-9.

162. Sulieman S., Ha C.V., Nasr Esfahani M., Watanabe Y., Nishiyama R.,

Pham B.C.T., et al. (2015), DT2008: A Promising New Genetic Resource

for Improved Drought Tolerance in soybean When Solely Dependent on

Symbiotic N2 Fixation, Biomed Res. Int., doi:10.1155/2015/687213.

163. Sun S., Yu J.P., Chen F., Zhao T.J., Fang X.H., Li Y.Q., Sui S.F. (2008),

TINY, a dehydration-responsive element

(DRE)-binding protein-like

transcription factor connecting the DRE- and ethylene-responsive element-

mediated signaling pathways in Arabidopsis, J. Biol. Chem, 283, pp. 6261-6271.

164. Stockinger E.J., Gilmour S.J., Thomashow M.F. (1997), Arabidopsis

thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator

that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that

stimulates transcription in response to low temperature and water deficit,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94, pp. 1035-1040.

165. Thao N.P., Thu N.B., Hoang X.L., Van Ha C., Tran L.S. (2013),

"Differential expression analysis of a subset of drought-responsive GmNAC

genes in two soybean cultivars differing in drought tolerance", Int. J. Mol.

Sci., 14(12), pp. 23828 - 23841

166. Thomashow M.F. (1999), Plant cold acclimation: freezing tolerance genes

and regulatory mechanisms, Ann. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol., 50,

pp. 571-599.

167. Tomy S., Chang Y.M., Chen Y.H., Cao J.C., Wang T.P., et al (2009),

Salinity effects on the expression of osmoregulatory genes in the euryhaline

black porgy Acanthopagrus

schlegeli, General and Comparative

Endocrinology, 161, pp. 123-132.

125

168. Tong S., Ni Z., Peng H., Dong G., Sun Q. (2007), Ectopic overexpression

of wheat TaSrg6 gene confers water stress tolerance in Arabidopsis, Plant

Science, 172, pp. 1079-1086.

169. Topping J.F. (1998), Tobacco transformation, Methods Mol. Biol., 81, pp.

365-372.

170. Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S..D., Fujita Y., Maruyama

K., Fujita M., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2004),

Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress inducible NAC

transcription factors that bind to a drought responsive cis-element in the early

responsive to dehydration stress 1 promoter, Plant Cell, 16, pp. 2481-2498.

171. Tran L.S., Mochida K. (2010a), Functional genomics of soybean for

improvement of productivity in adverse conditions, Funct Integr Genomics,

10, pp. 447-462.

172. Tran T.C.H. (2007), Study on

the response capacity of genetic

transformation of soybean varieties grown in Vietnam, Science & Technology

Journal of Agriculture and Rural Development, 18, pp. 9-14.

173. Tran T.C.H., Tran V.H. and La C.T. (2008), Transformation efficiencies of

the soybean variety PC19 [Glycine max (L.) Merrill] using Agrobacterium

tumefaciens and the cotyledonary node method, Omonrice, 16, pp. 1-8.

174. Trick H.N., Dinkins R.D., Santarem E.R., Di R., Samoylov V., Meurer

C.A., Walker D.R., Parrott Trick H.N., and Finer J.J. (1997b), SAAT:

Aonication-assisted Agrobacterium-mediated trans-formation, Transgenic

Res, 6, pp. 329-336.

175. Tripathi

P., Rabara

R.C., Reese

R.N., Miller M.A., Rohila

J.S., Subramanian

S., Shen Q.J., Morandi D., Bücking H., Shulaev

V., Rushton P.J. (2016), A toolbox of genes, proteins, metabolites and

promoters for improving drought tolerance in soybean includes the

126

metabolite

coumestrol

and

stomatal

development

genes, BMC

Genomics. 17(1),102. doi: 10.1186/s12864-016-2420-0.

176. Trujillo L., Menendez C., Ochogavia M.E., Hernandez I., Borras O.,

Rodriguez R., Coll Y., Arrieta J.G., Banguela A., Ramirez R., Hernandez L.

(2009), Engineering drought and salt tolerance in plants using SodERF3, a

novel sugarcane ethylene responsive factor, Biotech-nologia Aplicada, 26,

pp. 168-171.

177. Valliyodan B., Nguyen H. (2006), Understanding regulatory networks and

engineering for enhanced drought tolerance in plants, Curr. Opin. Plant

Biol., 9, pp. 1-7.

178. Vágújfalvi A., Galiba G., Cattivelli L., Dubcovsky J. (2003), The cold-

regulated transcriptional activator Cbf3 is linked to the frost-tolerance locus

Fr-A2 on wheat chromosome 5A, Mol. Genet. Genomics, 269, pp. 60-67.

179. Wang G. and Xu Y. (2008), Hypocotyl-based Agrobacterium-medi-ated

transformation of soybean (Glycine max) and application for RNA

interference, Plant Cell Rep., 27, pp. 1177-1184.

180. Wang N., Liu M., Cheng X. and Ma Y. (2006), Glycine max DREB protein

(DREB2)

gene,

complete

cds.

GenBank:

DQ054363.1.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

181. Wang Y., Jiang J., Zhao X., Liu G.., Yang C., et al. (2006), A novel LEA

gene from Tamarix androssowii confers drought tolerance in transgenic

tobacco, Plant Science, 171, pp. 655-662.

182. Wang Q.Y., Guan Y.C., Wu Y.R., Chen H.L., Chen F., Chu C.C. (2008),

Overex-pression of a rice OsDREB1F gene increases salt, drought and low

temperature tolerance in both Arabidopsis and rice, Plant Mol. Biol., 67,

pp. 589-602.

183. Wang S., Yang S., Yin Y., Guo X., Wang S., et al. (2009), An in

silico strategy identified the target gene candidates regulated by dehydration

127

responsive element binding proteins (DREBs) in Arabidopsis genome, Plant

Mol. Biol., 69, pp. 167-178. doi: 10.1007/s11103-008-9414-5.

184. Weigel D. (1995), The APETALA2 domain is related to a novel type of

DNA binding domain, Plant Cell , 7, pp. 388-389.

185. Whitman M., Downes C.P., Keeler M., Keller T., Cantley L. (1988), Type

Iphosphatidylinositol kinase makes a novel

inositol phospholipid,

phosphatidylinositol-3-phosphate, Nature, 332, pp. 644-646.

186. Wiebke-Strohm B., Pasquali G., Margis-Pinheiro M., Bencke M., Bücker-

Neto M., Becker-Ritt A.B., Martinelli A.H.S., Polacco J.C., Stolf R.,

Marcelino F.C., et al.

(2012), Ubiquitous urease affects soybean

susceptibility to fungi, Plant Mol. Biol., 79, pp. 75-87.

187. Xue G.P., Loveridge C.W. (2004), HvDRF1 is involved in abscisic acid-

mediated gene regulation in barley and produces two forms of AP2

transcriptional activators, interacting preferably with a CT-rich element, The

Plant J., 37, pp. 326-339.

188. Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (2006), Transcriptional regulatory

networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses,

Annu. Rev. Plant Biol, 57, pp. 781-803.

189. Yoshida T., Sakuma Y., Todaka D., Maruyama K., Qin F., Mizoi J.,

Kidokoro S., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2008),

Functional analysis of an Arabidopsis heat-shock transcription factor HsfA3

in the transcriptional cascade downstream of the DREB2A stress-regulatory

system, Biochem. Biophys. Res. Commun, 368, pp. 515-521.

190. Yorinori J.T., Paiva W.M., Frederick R.D., Costamilan L.M., Bertagnolli

P.F., Hartman G.E., Godoy C.V., Nunes J.J.R. (2005), Epidemics of soybean

rust (Phakopsora pachyrhizi) in Brazil and Paraguay from 2001 to 2003,

Plant Dis, 89, pp. 675-677.

128

191. Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z. and Polacco J.C. (2004), Refined

glufosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of soybean

[Glycine max (L.) Merrill], Plant Cell Rep, 22, pp. 478-482.

192. Zhang G., Chen M., Chen X., Xu Z., Guan S., et al. (2008), Phylogeny,

gene structures, and expression patterns of the ERF gene family in soybean

(Glycine max L.), J. Exp. Bot., 59, pp. 4095-4107.

193. Zhang G., Chen M., Li L., Xu Z., Chen X., et al. (2009), Overexpression

of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for

increasedtolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco, J.

Exp. Bot., 60, pp. 3781-3796.

194. Zhang X., Wollenweber B., Jiang D., Liu F., Zhao J. (2008), Water

deficits

and

heat

shock

effects

photosynthesis

transgenic Arabidopsis thaliana constitutively expressing ABP9, a bZIP

transcription factor, J. Exp. Bot., 59, pp. 839-848.

195. Zhou Q.Y., Tian A.G., Zou H.F., Xie Z.M., Lei G., et al. (2008), Soybean

WRKY type transcription factor genes, GmWRKY13, GmWRKY21, and

GmWRKY54, confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic

Arabidopsis plants, Plant Biotechnology Journal, 6, pp. 486-503.

196. Zhou J., Xie J., Liao H., Wang X. (2014), Overexpression of β-expansin

gene GmEXPB2 improves phosphorus efficiency in soybean, Physiol. Plant.,

150(2), pp. 194-204.

197. Zhu J.K. (2001), Plant salt tolerance, Trends Plant Sci., 6, pp. 66-71.

198. Zhu Q., Zhang J., Gao X., Tong J., Xiao L., Li W., Zhang H. (2010), The

Arabidopsis AP2/ERF transcription factor RAP2.6 participates in ABA, salt

and osmotic stress responses, Gene, 457, pp. 1-12.

199. Zhuang J., Cai B., Peng R.H., Zhu B., Jin X.F., et al. (2008), Genome-wide

analysis of the AP2/ERF gene family in Populus trichocarpa, Biochem.

Biophys. Res. Commun., 371, pp. 468-474.

129

200. Zhuang J., Peng R.H., Cheng Z.M., Zhang J., Cai B., et al. (2009),

Genome-wide analysis of the putative AP2/ERF family genes in Vitis

vinifera, Scientia Horticulturae, 123, pp. 73-81.

201. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?cmd=retrieve&list_uids=732579.

202. http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K0651.