Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Thu thập, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi trồng hai loại nấm ăn và nấm dược liệu hoang dại từ vùng Thất Sơn, An Giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HỒ THỊ THU BA

THU THẬP TU ỂN CHỌN VÀ NGHI N C U QU TR NH NU I TRỒNG H I OẠI NẤ N VÀ NẤ Ƣ C IỆU HO NG ẠI TỪ V NG THẤT SƠN N GI NG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã ngành: 94 20 2001

Cần Thơ 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HỒ THỊ THU BA

THU THẬP TU ỂN CHỌN VÀ NGHI N C U QU TR NH NU I TRỒNG H I OẠI NẤ N VÀ NẤ Ƣ C IỆU HO NG ẠI TỪ V NG THẤT SƠN N GI NG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã ngành: 94 20 201

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

PGS TS TRẦN NH N NG

TS I THỊ INH IỆU

Cần Thơ 2019

LỜI CẢM TẠ

Đầ V N ứu và Phát Triển Công Ngh Sinh Họ K oa Sa Đại Họ a G H T Đạ ọ ầ T ạo ễ o ọ

Xin chân thành c ầy PGS.TS. Trầ N Dũ n tình chỉ dẫn trong suốt th i gian thực hi n lu n án.

X ầy PGS.TS. Phạm Thành Hổ. GS.TSKH. Trịnh Tam Ki ẫ n tình truy ạt ki n thức cần thi t và kinh nghi o o

Xin trân trọng c ầy cô PGS.TS. Nguyễ M PGS.TS. Nguyễ Vă T TS ù T ị Minh Di PGS TS T T ọng Ngôn, PGS.TS. Nguyễn Hữu Hi ấp cho tôi những ki n thức quý báo trong suốt khóa học.

N ũ ửi l i bi n quý thầ Đại Học An G a ạo u ki ể o ì

Xin c e N ễn Thị T a G a e T T ần Thu n, em T N ọ Đ e s ỡ ộng viên tôi trong suốt quá trình học t p.

Xin chân thành c a N ễ Vă ì Ha (V Đ Dựng), anh Ẩ … ất nhi u bà con Núi Cấ N D ỗ trợ ỡ mang thầy trò chúng tôi trong suốt th i gian tìm ki m những loài nấm m i. Đặc bi ũ a n lý Núi Cấ ễn phí hoàn toàn vé vào cổng cho thầy trò chúng tôi suốt bố ă a

Xin trân trọng c ất c

Cần Thơ, ngày 14 tháng 12 năm 2017

i

TÓM TẮT

Lu “Thu th p, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi tr ng hai loại nấ ă ấ ợc li u hoang dại từ vùng Thấ S A G a ” ợc thực hi n v i mục tiêu xây dựng quy trình tố ng một loại nấ ă và một loại nấ ợc li u m i. Lu ợc hoàn thành v i bốn nội dung. Nội dung thứ nhất là thu th ợc 28 mẫu nấm hoang dại từ tự o ó có 5 mẫu nấ ă 7 ẫu nấ ợc li u, 5 mẫu nấ ộc và 11 mẫ a ịnh. Dựa theo k t qu u tra và kh o sát từ ịa ng th i dựa eo ặ ể ì ì ự gen Internal Transcribed S a e o ấ ợ ị nấm t ợng hoàng (Phellinus sp.), linh chi tầng (Ganoderma applanatum), nấm vân chi (Trametes sp.), nấm dai (Lentinus squarrosolus). Nội dung thứ a ị ộc tính cấp c ă ẫu nấ u ộc tính cấp trên chuộ ợc bố o ợng hoàng, linh chi tầng, nấm dai và nấm vân chi. Nội dung ti eo ịnh thành phầ ỡ ợc tính của bốn loài nấ ợc chọn trên. K t qu cho thấy hai loài nấm là nấm t ợng toàng Phellinus sp. và nấm dai Lentinus squarrosolus có giá trị ỡ ợ ao o ó a o nấ ợc chọ ể ti p tục các nghiên cứ X ị ộ ng diễn nấm t ợng hoàng trên chuột, k t qu chuộ o o ì ng trong th i gian thử nghi m. Ti p tục thử tác dụng của nấm t ợng hoàng trên dòng t o K562 ại trự H T116 apoptosis ợc kích hoạt, t o a ă ể a ă n ộ. Nội dung cuối cùng là nghiên cứu quy trình nuôi tr ng nấ ă nấm dai Lentinus squarrosolus và nấ ợc li u là nấm t ợng hoàng Phellinus sp. Quy trình nuôi tr ng nấm dai Lentinus squarrosolus: M ng nhân giống cấp một tốt nhất v i 6 ngày g m PDA bổ s c dừa, môi ng nhân giống cấp hai g m lúa bổ s 5% ợc chọn v i th i gian 12 ng nuôi tr ợc chọ 90% ù a ao s ổ sung 5% cám và 5% bột bắp v 70 ă ắng bịch và ra thể qu sau 28 Đối v i quy trình nuôi tr ng nấm t ợng hoàng Phellinus sp. môi ng nhân giống cấp một tốt nhất v 6 PDA ng nhân giống cấp hai g m lúa bổ s 5% ợc chọn v i th i gian 12 ngày và môi ng nuôi tr ợc chọ 90% ù a ao s ổ sung 5% cám và 5% bột bắp v 50 ă ắng bịch và nấm ra thể qu sau 70 ngày.

Từ khóa: Nấ oa ạ ù T ấ S ấ ợ o ấ

ầ ấ a ấ

ii

ABSTRACT

The dissertation, entitled “Collecting, selecting and the studying the cultivation of a wild edible mushroom and a wild medicinal mushroom in the T a So e o A G a o e“ was o e establish the optimal procedure for cultivation of a wild edible mushroom and a wild medicinal mushroom . There were four main research contents. The first content was that twenty-eight wild mushroom samples were collected, whereas there were five edible mushrooms, seven medicinal mushrooms, five poisonous mushrooms and eleven unidentified mushrooms. Based on the results of surveys, questionares, and morphological and Internal Transcribed Spacer sequences characteristics, five mushrooms were identified as Linh Chi Tang mushroom (Ganoderma applanatum), Van Chi mushroom (Trametes sp.), Thuong Hoang mushroom (Phellinus sp.), Dai mushroom (Lentinus squarrosolus) and Moc Ba Hue mushroom. The second research content was evaluating acute toxicity of the selected mushrooms, and the results showed that all 5 wild mushroom species were not toxic to tested mice. Subsequently, all 5 wild mushrooms were isolated using PDA medium, and only four mushrooms consisting of Linh Chi Tang mushroom, Van Chi mushroom, Thuong Hoang mushroom, Dai mushroom were successfully isolated. The third research content related to determination of nutrient contents and pharmaceutical activity of the selected mushrooms. As a result, Phellinus sp. and Lentinus squarrosolus were selected for further experiments. The sub-chronic toxicity was also evaluated on mice, and the tested mice had no effects. The activity of Thuong Hoang mushroom was examined using K562 blood cancer cells and HCT116 colorectal cancer cells. The cancer cells reduced when the concentrations of sample were increased. The final content focused on the cultivation of Phellinus sp. and Lentinus squarrosolus. For the Lentinus squarrosolus mushroom, the best medium for the first propagation was PDA added coconut milk with 6 days growth in vitro; the best medium for the second propagation was intact rice + 5% rice bran with 12 days developing in the culture bottle; and the optimal medium for fruit body development with high yield was 90% rubber sawdust + 5% rice bran + 5% corn flour with 70 days full development and 28 days for harvesting of fruit bodies. For the Phellinus sp. mushroom, the best medium for the first propagation was PDA with 6 days growth in vitro; the best medium for the second propagation was intact rice + 5% rice bran with 12 days in the culture bottle; and the optimal medium for fruit body development with high yield was 90% rubber sawdust + 5% rice bran + 5% corn flour with 50 days for full development and 70 days for harvesting of fruit bodies

Key words: wild mushroom in the That Son region, Phellinus sp., Trametes sp., Ganoderma applanatum and Lentinus squarrosolus.

iii

CAM KẾT KẾT QUẢ

T a oa ì ứu của b n thân và thầy ng dẫn. Các số li u, k t qu trình bày trong lu ự a ợc ai công bố trong bất kỳ lu o

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học Tác giả luận án

PGS. TS. Trần Nhân ũng Hồ Thị Thu Ba

iv

MỤC LỤC

ỤC ỤC v

NH S CH ẢNG viii

NH S CH H NH x

DANH MỤC C C TỪ VIẾT TẮT xii

CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1 1 1 Đ t vấn ề

1 1 2 c ti u v n i dung nghi n c u

1 2 1 Mụ …………………… ……… ………………………… … 1

1 2 2 Nộ ứ ………………………………………… …… 2

1 3 Đ i tƣ ng v ph m vi nghi n c u 2

1 3 1 Đố ợ ứ ………………………………… ………… 2

1 3 2 P ạ ứ ……………………………………………… 2

1.4 Những óng góp mới ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án... 2

CHƢƠNG 2 TỔNG QU N TÀI IỆU 3

3 2 1 h i qu t về nấm trồng

2 1 1 Nấ s ọ ấ ……………… …………… ………… 3

2 1 2 G ị ỡ ợ ủa ấ … …………… …… 5

2.1.3 Nấ ă sự phát triể ữ ……………… … 10

2 2 Sự ph t triển nghề trồng nấm 11

2.2.1 Lịch sử phát triển ngh tr ng nấ ă ấ ợc li …………… 11

2.2.2 Sự phát triển ngh tr ng nấm trên th gi ………………………… 12

2.2.3 Sự phát triển ngh tr ng nấm Vi Na ………………………… 15

16 2 3 C ng nghệ trồng nấm

2 3 1 S ì ng nấ … … ……………………… 16

2 3 2 Meo ố ấ ………………………………………… ………… 17

2 3 3 ấ ấ …… ……………… 17

2 3 4 G eo eo ủ a ……………………………… ……………… 18

2 3 5 ă só ( ố ……………… ……… 19

2 4 Định danh nấm ăn v nấm dƣ c liệu 20

loài nấm dƣ c của m t thƣ s

2 5 C c phƣơng ph p x c ịnh ho t tính gây c tế b o v cơ chế tác liệu ng kh ng ung . 22 v

2.6 Các nghiên c u có li n quan 23

2.6.1 Các nghiên cứu v khu h nấm Vi Na ……………………… 23

2.6.2 Các nghiên cứu v nấ ă ấ ợc li u Vi Na ………… 25

CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PH P NGHI N C U 27

3 1 Phƣơng tiện nghi n c u 27

3 1 1 T a ịa ể ………………………………………… … 27

3 1 2 N …………………………………… ………… …… 27

3 1 3 Hóa ấ …………………………………………………………… 27

3 1 4 T ị ụ ụ ……………………………… ……… ………… 27

3 2 Phƣơng ph p nghi n c u 28

28 3 2 1 S ột số o ấ n vùng rừng núi Thấ S AG u tra kh o s ịa ì a o ấm sử dụ ợ ịnh danh các loài nấm này ………………………………………

3 2 2 X ị ộc tính cấp, phân l p và gi i trình tự gen các loài nấ ă và nấ ợc li u hoang dại không chứa ộ …………… 29

33 3 2 3 X ịnh thành phầ ỡ ợ ộ ng diễn và thử ộng của nấm trên dòng t o ại trự ……………………………………………… … …

3.2.4 Nghiên cứ ì o ỉnh hai chủng nấ ợc tuyển chọ ………………………… …… …… 43

CHƢƠNG 4 ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

danh ịnh nấm loài các 48 4 1 Sƣu tập m t s lo i nấm lớn ở vùng rừng núi Thất Sơn n Giang iều tra khảo s t ngƣời dân ịa phƣơng tìm ra c c lo i nấm sử d ng ƣ c này

4.1.1 Thu th p mẫu nấm l n ……………………… …………………… 48

4 1 2 Đ u tra kh o sát các mẫu nấ ợc chọ ………… ……………… 53

4 1 3 Định danh các loài nấ ợc chọ eo ì ………………… 54

4 2 X c ịnh c tính cấp, phân lập và giải trình tự gen các loài nấm ăn v nấm dƣ c liệu hoang d i không ch a c tính 58

4 2 1 X ị ộc tính cấp các mẫu nấ ợc chọn từ ịa …………………………………………………………………… 58

4.2.2 Phân l p các loài nấ ợc chọn lọc ……………………… 63

65 4.2.3 Gi i trình tự ITS ịnh loài dựa o ặ ểm hình thái và trình tự ITS ……………………………………………………………………

vi

68 4 3 X c ịnh thành phần dinh dƣỡng dƣ c tính c tính b n trƣờng diễn và thử t c ng của nấm trên dòng tế b o ung thƣ m u v ung thƣ i trực tr ng

4 3 1 X ịnh thành phầ ỡ ợ ng diễ … 68

4 3 2 X ịnh thành phầ ợc tính trong hai mẫu nấm linh chi tầng và ợ o …………………………………………………………… 69

4 3 3 X ị ộ ng diễn nấm t ợng hoàng …………………………………………………………………………….. 71

4 3 4 X ịnh kh ă ụng v i t o ủa nấm t ợng hoàng Phellinus s ………………………………………… …………… 81

4.4 Nghiên c u quy trình c ng nghệ nu i trồng ho n chỉnh hai chủng nấm ã ƣ c tuyển chọn 85

4.4.1 Nghiên cứu quy trình nuôi tr ng nấm dai Lentinus squarosolus…… 85

4.4.2 Nghiên cứu quy trình nuôi tr ng nấm t ợng hoàng Phellinus sp. .. 93

CHƢƠNG 5 ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 105

5.1 Kết luận 105

5.2 Kiến nghị 105

TÀI LIỆU THAM KHẢO 107

PHỤ LỤC 120

vii

DANH SÁCH BẢNG

B ng trang

2.1 Lịch sử nuôi tr ng một số loài nấ …………………………… … 11

2.2 Tổng s ợng nấm tr ng trên th gi i từ ă 1960 2002 … 12

2.3 S ợng nấm tr ng phổ bi n trên th gi ă 1981 1997 … 13

2.4 S ợng nấm (tấ ợ o ă 2003 2004 ……… … 14

3.1 B ng kh o sát thông tin nấm l n từ ịa …… … 29 3.2 Khố ợng nấ và nấ sấy 60o a ……… … 30

3.3 Khố ợng cao nấm sau khi chi …………………………… … 30

3.4 Thành phần một ph n ứng PCR thể 25 µ ………………… … 32

3 5 Q ì ị ợ GOT o ………………………… … 37

3 6 Q ì ị ợng GPT o ………………………… … 38

3 7 Q ì ị ợ P o e o ……………………… … 38

3 8 Q ì ị ợ ea o ………………………… 39

3 9 Q ì ị ợ ea o …………………………… 40

3 10 Q ì ị ợng tryglyceride trong …………………… 41

4.1 B ng phân loại các loài nấm hoang dại thu th ợ ………… 48

4.2 Kh o sát thông tin nấm l n từ ịa ………… … 54

58 4.3 K t qu ộc tính cấ o ao c và cao c n nấm linh chi tầ …

59 4.4 K t qu ộc tính cấp o ao c và cao c n nấ ợng o …

4.5 K t qu ộc tính cấ o ao c và cao c n nấ … 59

4.6 K t qu ộc tính cấ o ao c và cao c n nấ a ………… 60

4.7 K t qu ộc tính cấ o ao c và cao c n nấm mộc bá … 61

4.8 B ng tổng hợp li u tố a o ột uống các loại nấ …………… 61

4.9 K t qu ột sau 1 ngày uống các loại cao nấm .. 62

4.10 Tố ộ s ng của các loài nấ PDA ……… 63

4.11 Thành phầ ỡ ợc tính của các loài nấ ………… 68

4 12 H ợng triterpen toàn phần trong nấm linh chi tầ ợng o ………………………………………………………………… 69

70 4 13 H ợng polysacharide trong nấm linh chi tầ ợng hoàng

4 14 H ợ ng tự do trong nấm linh chi tầ ợng hoàng. 70

viii

4 15 H ợ ng khử trong nấm linh chi tầ ợng hoàng .. 71

4.16 Trọ ợng chuộ c và sau khi thử cao nấm mộ …… 71

4.17 Số ợng h ng cầu ……………………………………………… 72

4 18 H ợ e o o ………………………………………… 72

4 19 H ợ e a o …………………………………………… 73

4.20 Số ợng tiểu cầ ………………………………………………… 73

4.21 Thể tích trung bình h ng cầ …………………………………… 74

4.22 Huy t sắc tố trung bình h ng cầ ………………………………… 74

4.23 N ộ huy t sắc tố trung bình h ng cầ ……………………… 75

4.24 Tỷ l phân bố h ng cầ ………………………………………… 75

4.25 Số ợng bạch cầ ……………………………………………… 76

4.26 Số ợng bạch cầu hạ ………………………………… 76

4.27 Số ợng bạch cầ o ……………………………………… 76

4.28 Số ợng bạch cầ ……………………………………… 77

4 29 H ợng GOT trong huy ……………………………… 77

4 30 H ợng GPT trong huy ……………………………… 78

4 31 H ợng protein toàn phần trong huy ………… …… 78

4 32 H ợng triglyceride trong huy ……………………… 78

4 33 H ợng creatinin trong huy ……………… ………… 79

4 34 H ợng urea trong huy …………… ………………… 79

4.35 K t qu gi i phẩu vi thể gan chuột sau 1 tháng thử nghi ……… 80

4.36 K t qu gi i phẩu vi thể th n chuột sau 1 tháng thử nghi … … 80

4.37 Tố ộ a ấ a ng nhân giống cấp mộ …… 85

4 38 T ấ a a 50% 100% ng hạ ……………… 89

4 39 T ấm nấm dai lan 50% và 100% trên ng nuôi tr … 91

4.40 Tố ộ a nấm t ợng hoàng ng nhân giống cấp mộ …………………………………………………………………… 94

4 41 T nấm t ợng hoàng a 50% 100% ng hạ …… 97

4 42 T ấm nấm t ợng hoàng lan 50% và 100% trên môi ng nuôi tr ……………………………………………………………… 100

ix

DANH SÁCH HÌNH

Hình trang

2.1 Nấ ………………………………… ………………… … 4

2.2 Nấ ………………………………………………………… 4

2.3Nấ ụa bạ ………………………………………………… … 4

2 4 S tổng quát quy trình nuôi tr ng các loài nấ ă ……… … 16

2.5 Vùng trình tự ITS o DNA R oso e ………………………… 21

3.1 Chu trình nhi t của ph n ứng PCR v i cặp m ITS 1 ITS 4 … 33

t ợng hoàng chi t dịch nấm cao ĩa 42 3.2 S bố trí các nghi m thứ ịnh kh ă của 96 gi …………………………………………………………………..

4.1 Bào tử và nấm linh chi tầ ……………………………………… 54

4.2 Nấ ……………………………………………………… 55

4.3 Nấ T ợng Hoàng và bào tử …………………………………… 56

4.4 Nấm dai và bào tử ………………………………………………… 57

4.5 Nấm mộ …………………………………………………… 57

4.6 H sợi nấm nghiên cứ ng PDA ngày thứ 7 ………… 64

4.7 Đ ứng dòng t o K562 ối v i cao chi t của Phellinus s … 81

4.8 Đ ứng dòng t o H T 116 ối v i cao chi t của Phellinus sp.. 83

4.9 Biể mứ ộ ức ch ă ng của cao chi t nấm t ợng hoàng lên t bào HTC116 …………………………………………… 84

4.10 Biể tố ộ a ấ a ng nhân giống cấp một 86

4.11 Nấ a a sa 3 ng nhân giống cấp một .... 86

4.12 Nấ a a sa 5 ng nhân giống cấp mộ … 87

4.13 Nấ a a sa 7 ng nhân giống cấp mộ … 88

4.14 Biể tố ộ a ấ a ng hạ ……………… 88

4.15 T ấ a sa 14 ng hạ …………………… 90

4.16 Biể tố ộ a ấ a ng nuôi tr ……… 92

4.17 T ấ a sa 50 ng nuôi tr …… ……… 92

4.18 Quy trình nuôi tr ng nấm dai Lentinus squarrosolus …………… 93

4.19 Biể tố ộ a nấm t ợng hoàng ng nhân giống cấp mộ ………………………………………………………… 94

95 4.20 T nấm t ợng hoàng ng thạ sa 3 ………

x

4.21 T nấm t ợng hoàng ng thạ sa 5 ……… 95

4.22 T nấm t ợng hoàng ng thạ sa 7 ……… 95

4.23 Biể tố ộ a nấm t ợng hoàng ng hạ … 97

4.24 T nấm t ợng hoàng sa 6 ng hạ ………… 98

4.25 T nấm t ợng hoàng sa 11 ng hạt ……… 98

4.26 Biể tố ộ a nấm t ợng hoàng ng nuôi tr ……………………………………………………………… 100

4.27 T nấm t ợng hoàng sa 6 ng nuôi tr … 101

4.28 T nấm t ợng hoàng sa 9 ng nuôi tr … 102

4.29 Quy trình nuôi tr ng nấm t ợng hoàng ……………………… 104

xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ALT Alanin Transaminase

AST Aspartat Transaminase

BH Nấm mộc bá huê

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

B5 Mù a ao s ổ sung 5% bắp

B5C5 Mù a ao s ổ sung 5% bắp và 5% cám

CCPL Cao chi t nấ ợng hoàng

CT Nấm linh chi tầng

GOT Glutamat Oxalate Transaminase

GPT Glutamat Pyruvat Transaminase

ND Nấm dai

NT Nấm t ợng hoàng

DNA Deoxyribonucleic Acid

DNS Dinitro Salicylic

ETS External Transcribed Spacer

ITS Internal Transcribed Spacer

KDD Mùn a ổ s ỡng

MCH Huy t sắc tố trung bình h ng cầu

MCHC N ộ huy t sắc tố trung bình h ng cầu

MCV Thể tích trung bình h ng cầu

MS Mã số

NCBI The Nationnal Center for Biotechnology Information

xii

NT Nghi m thức

PCR Polymerase chain reaction

PDA Potato – Dextrose - Agar

PDD Potato – Glucose – Agar - c dừa

PDK Potato – Glucose – Agar - khoáng

ppm parts per million

RDW Tỉ l phân bố h ng cầu

RNA Ribonucleic Acid

rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid

SL Số ợng

T5C5 Mù a ao s ổ sung 5% tấm và 5% cám

TN Thí nghi m

VC Vân chi

w/v Trọ ợng/ thể tích

w/w Trọ ợng/ trọ ợng

xiii

CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đ t vấn ề

T o o s ó ợ sử ụ ấ ầ ũ o ể ấ Nấ ộ o s ó ấ ụ số ị ỡ T o ố oạ ă ấ ứ a a ự ộ (T ầ Vă M o 2004

Tr ng nấm có lịch sử i. Trên th gi i, từ nhữ ă 1960 n nay ngh tr ng nấ ă ấ ợc li ển mạnh và nhanh một cách toàn di n v nhi u mặt. Ở Vi t Nam, ngh tr ng nấ ũ ợc phát triển liên tục từ nhữ ă 1980 i nhi u loài nấm m ợc du nh p. Công ngh s n xuất giống nuôi tr ng và ch bi n nấm hi a ợc du nh p từ Nh t B n, Đ Loa c Châu Âu. Trong quá trình nghiên cứu và triển khai s n xuấ ó sự a ổ ể phù hợp v u ki n tự nhiên, xã hội của Vi t Nam (Nguyễn Hữ Đống và ctv, 2000).

Vi t Nam là mộ c nông nghi ng th i có nhi u ki n cho vi c phát triển ngh tr ng nấ ặc bi t là các tỉnh phía Nam. V i y u tố nguyên li ao ộng d i dào và th i ti t, khí h u gầ ổ ị a ă ấm có thể ợc cung cấp suốt bốn mùa (Trung tâm Unesco phổ bi n ki n thứ ă hóa giáo dục cộ ng, 2004).

Vi Na ấ c nhi u rừng núi v i ngu n tài nguyên sinh họ a dạ Đặc bi o ùa a ó ất nhi u loại nấ ă phát triển. Tuy nhiên, vi c khai thác và thuần hóa các giống nấm hoang dại ngoài thiên nhiên của vùng rừ a a ợc chú trọng. Đ ng Bằng Sông Cử Lo ợc ó ù ừng núi Thấ S u mát mẻ a ă i rất nhi u loại nấ ă ấ ợc li u có giá trị a ợc nghiên cứu nuôi tr Đứ c vi a ổi khí h u toàn cầu vi c b o t n ngu n tài nguyên quý giá này là vi c cần ph i làm ngay. Vì v y, vi c tìm ki m, thu th p, nghiên cứ ặ ểm sinh học và quy trình nuôi tr ng của một số loài nấm hoang dại có giá trị ỡ ợc li u là cần thi ể ti n t i vi c thuần hóa và s n xuất các giống nấm m i nhằm tiêu thụ o c và xuất khẩu, ó ó o của ịa X ất phát từ những lý do trên, lu n án “Thu th p, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi tr ng hai loại nấ ă nấ ợc li u hoang dại từ vùng Thấ S A G a ” ợc thực hi n.

1.2 M c tiêu và n i dung nghiên c u

1.2.1 M c tiêu

Thu th p, tuyển chọ ị ộc tính cấ ịnh thành phần dinh ỡng, thành phầ ợ ộ ng diễn, thử nghi m trên dòng t o a o ng một loại nấ ă ột loại nấ ợc li u thu oa ạ ù T ấ S A G a

1

1.2.2 N i dung nghiên c u

Nghiên cứ ợc thực hi n v i 4 nội dung chính:

(1) Nộ 1: S ầm một số loại nấm l n vùng Thấ S A G a u tra mẫu nấm có thể sử dụng từ ịa ịnh danh mẫu nấm ợc chọn dựa trên hình thái bên ngoài.

(2) Nộ 2: X ị ộc tính cấp, phân l p giữ giống nấm trên môi PDA ịnh danh phân tử các loại nấm không chứa ộc tính.

(3) Nộ 3: X ịnh thành phầ ỡ ợc tính các loại nấm hoang dại có giá trị X ịnh một số thành phầ ợc tính quan trọng trong hai loại nấ ợc li ộ ng diễn và thử tác dụng nấm trên t o ại trự ối v i nấ ợc li u hoang dại m i.

(4) Nội dung 4: Nghiên cứu quy trình công ngh o ỉnh hai loại nấ ợc chọn.

1.3 Đ i tƣ ng và ph m vi nghiên c u

1.3.1 Đ i tƣ ng nghiên c u

Các loại nấ ă ấ ợc li u hoang dạ ợc từ vùng rừng núi

Thấ S A G a

1.3.2 Ph m vi nghiên c u

Các loại nấ ă ấ ợc li u hoang dạ ợ i dân sử dụng a ợc nghiên cứu nuôi tr ng thu từ vùng rừng núi Thấ S A Giang.

1.4 Những óng góp mới ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Lu n án mang tính m i là nghiên cứu v hai loại nấm hoang dại hi n di n ịa ấm dai Lentinus Squarrosolus và nấm t ợng hoàng Phellinus s T o ó ấm dai là loại nấ ă o o ợc nhân giống nuôi tr ng thành công từ loại nấm hoang dạ o ng n vi c từ c xây dự u nấ ă ần chủng Vi t Nam. Lu ũ ng thành công nấm t ợng hoàng là loại nấ ợc li u có giá trị ao ộ ng diễn trên chuột thử nghi Đ u a ĩa oa ọc to l a ĩa ao o ộ ì là loại nấm hoang dại lầ ầ ợc thu th p, phân l p và nghiên cứ Đặc bi t nấm t ợng hoàng có kh ă ti n phân hủy t bào trên dòng t bào ung th ại trự Đ u này hứa hẹn mộ ĩa o n trong vi ỗ ợ u trị b ó ại trực tràng nói riêng.

2

CHƢƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát về nấm

2.1.1 Nấm và sinh học nấm lớn

2 1 1 1 Định nghĩa về nấm lớn

Theo Phạm Thành Hổ (2004 o ă 1969 W a e thống phân loại 5 gi i: Kh i sinh, Nguyên sinh, Nấm, Thực v Động v t. Vào ă 1977 Woese ựa vào trình tự nucleotide của 16S rRNA a sinh gi i thành 3 lãnh gi i a “s ” Bacteria, Archaea và Eukarya. Thực v ộng v t và nấm x p chung vào Eukarya. N y, nấm là một gi i riêng trong lãnh gi i Eukarya.

Gi i nấm g m những sinh v t nhân thực o oặ a o ấu trúc dạng sợi, phần l n thành t bào chứa kitin, không có lục lạp, không có lông và roi. Nấm có hình thức sinh s n hữu tính và vô tính nh bào tử. Nấm là sinh v t dị ỡ s ỡng bằng hấp thụ các chất qua b mặt t bào, khác v i thực v t là tự ỡ ộng v t là nội tiêu hoá qua ống tiêu hoá. Nấm l n theo ĩa ẹp, mà mọ i dễ nh n thấ o a ợc nuôi tr ng, ti ng Anh là mushroom. Trên th gi i, mushroom có thể ợc hiểu khác nhau ù ấ c và dân tộc. Hi n nay, có thể tạm chấp nh n mộ ị ĩa : “ ấm l eo ĩa ẹp là nấm l n v i qu thể phân bi t rõ, có thể mọc trên mặ ấ a i mặ ấ ủ o ể thấ ợc bằng mắ ng và thu hái bằng tay” ( a and Miles, 2004).

Theo Trịnh Tam Ki t (2011) khu h nấm của Vi Na a ợc nghiên cứ ầ ủ so v i thực v ộng v t, tạm th i ngu n tài nguyên nấm l n Vi t Nam chia thành 4 nhóm là nấ ă ợc, nấ ợc li u, nấ ộc và nhóm nấ a ợc nghiên cứu v kh ă ứng dụ a x ợc thuộc nhóm nào.

2 1 1 2 Đ c iểm sinh học

Hình thái: Nấm l n có cấu tạo ă n g m hai phần: h sợ ấm và qu thể. Phần nhi u qu thể các nấm l n rấ a ạng: hình dù v ũ ấm và cuống nấm (hình 2.1), có bao ngoài (hình 2.2), giống vỏ sò ấm sò, hình cúp uố ă ạng cầu, dùi cui nhỏ (hình 2.3), dạng giống lỗ a ấm tai mèo. Trên thực t , khó mà kể h t các hình dạng của các nấm l n. Màu sắc của nấm l ũ ất khác nhau: trắ ỏ e … ấu trúc mà i ì ng gọi nấm, thực chất là qu thể hay tai nấm của loài nấm. Phầ s ỡng của loài nấ ợc gọi là h sợ ấm, bao g m một h các sợi mãnh nhỏ sợi chỉ mọ a a ất, compost, khúc gỗ a ất

3

tr ng nấm. Sau một th a ă i nhữ u ki n thu n lợi, h sợ ấ ng thành có thể s n sinh ra qu thể là tai nấm (Nguyễn Thị Chính và ctv, 2005).

Sinh lý, sinh hóa: Nhóm nấm l ặc bi ò ỏi các ngu n dinh ỡng d o u ki ng (nhi ộ, ẩ ộ, thông khí, pH, ánh sáng,..) phức tạ ể hình thành qu thể, so v i vi c tạo các bào tử vô tính vi nấm. Ngu ỡng chủ y u cho nấm l n là các chấ lignocellulose của thực v Đ ặc bi t là các nấm l n, giống các loài nấm khác nói chung, có thể ti t ra các enzyme mạ ( e ase ase phân rã các v t li u lignocellulose thành các chấ ỡng dễ hấp thu. Ngu a o o e o ấ ó ĩa a ọ giá qua tỷ l C/N.

Hình 2.2: Nấ (có bao ngoài) Hình 2.1: Nấ (hình dù) Hình 2.3: Nấ ụa bạc (dùi cui nhỏ)

( :P ạm Thành Hổ,2004)

Phân nhóm nấm theo giá trị sử dụng: ă ứ theo giá trị sử dụng, có

thể chia nấm l n thành 4 loại:

(1) Nấ ă : nấ Lentinus edodes, nấ Vovariella volvacea.

(2) Nấ ợc ấm linh chi Ganoderma lucidum.

(3) Nấ ộc ấm Amanita phalloides.

(4) Nhóm nấm hỗn hợp hay “ nấ ” số ợng l n các nấm còn lại

a ị õ ợc giá trị sử dụng.

Kiểu phân loại này chỉ có giá trị ối. Nhi u loại nấm l n tuy không

ă ợ ó ị ă ực và y học (Chang and Miles, 2004).

2 1 1 3 Định danh các lo i nấm lớn

Để ịnh danh nấm l n, cần dựa vào các khóa phân loại. Tuy nhiên không ph i loài nấ oa o ũ ó o óa oại. Mẫu nấ ừa thu

4

hái là tốt nhấ o ịnh danh và dựa vào khóa phân loạ ịnh theo các ặc tính chủ y u sau:

(1) Kích c, màu sắ ộ chắc của ũ ống nấm.

(2) Cách gắn các phi n vào cuống.

(3) Màu bào tử có số ợng l n.

(4) Các thử nghi m hóa học.

Số ợng các loài nấm l ợ o ă 2000 14.000, chi m kho ng 10% tổng số các loài nấm l n dự ki ó T ất. Trong số ó o 2000 o ợc dùng làm thứ ă o ng 200 loài ợ ù ợc li u vùng Viễ Đ R Trung Quố c tính có kho ng 1500–2000 loài nấ ă ợc li u v 981 o ợ ịnh danh (Shu-Ting Chang, 2008). Cần bi t rằng, 1% các nấm l n ghi nh n trên th gi i là nguy hiểm n ă m chí một số ộc ch Đ ă 2002 92 chủng loại nấm l ợc thuần hóa, mà 60 trong số ợc nuôi tr ể bán ra thị ng (Mau et al., 2001).

2.1.2 Giá trị dinh dƣỡng v y dƣ c của nấm ăn

2.1.2.1 Giá trị dinh dƣỡng

Nấ ă ộ ó ă ỉ ì o ò ì ó ị ỡ ao Độ ẩm cố ịnh của nấ ao ộng trong kho ng 70–95%, còn nấm khô thì mức 10–13% H ợng protein của nấm tr ng mức từ 1 75 n 5,9% trọ ợ ó ể lấy giá trị ì ợ o e ủa ấ o 3 5–4 0 ọ ợ H ợ o e ủa ủ 1 4% ọ ợ ắ 1 4% ọ ợ V o e ấ ấp 2 lần củ ắ So s ợ o e ị eo 9–16% ị ò 12–20%, thị 18–20% 18–20% và sữa 2 9–3 3% ọ ợ X trọ ợng khô, nấ ă th ng chứa 19–35% protein, so v i 7,3% gạo, 12,7% lúa mì, 38,1% trong u nành và 9,4% N y, tỷ l protein thô nấ ă ấ ịt ộng v ao ần l n thực phẩm khác, kể c sữa H ữa, protein của nấ ă ứa ủ 9 loại acid amin không thay th (Chang and Miles, 2004).

Nấ ă ứa nhi u vitamin không kém thực v a 1 (thiamin), B2 (riboflavin), vitamin C, vitamin PP (niacin), vitamin D, ti n vitamin A (carotene),... v ợng khá cao. Trong 140 loài nấ ă ợc phân tích Nh t B n có t i 118 loài có chứa bình quân 0,126 mg vitamin B2/100 g nấm, 47 loài có chứa bình quân 1,229 mg vitamin B2/100 g nấm. Vitamin B12 vốn không có trong thứ ă ực v ại có chứa khá nhi u trong nấm Agaricus bisporus, A.campestris, Morchella s … (N A 2005 Nấ ă ũ ứa khá nhi u các nguyên tố khoáng (K, Na, Ca, Fe, Al, Mg, Mn, Cu,

5

Z S P S … ợ ng vào kho ng 7% trọ ợng khô. N y, nấm có nhi u vitamin và khoáng chất không kém rau qu (Chang and Miles, 2004).

Trong nhữ ă ầ ộ ng nghiên cứu m i là tìm cách xử lý ất tr ể ă trị. Ví dụ, nấm giàu selenium có thể tr ng bằng cách bổ sung sodium selenite vào compost. Ngoài giá trị ỡng cao, các loại nấ ă ò ó sắc, mùi vị ộ o ặc tính k t cấu hấp dẫ i ă ( a and Miles, 2004).

2.1.2.2 Giá trị y dƣ c

Từ lâu, các tính chấ ợc của nấ sự chú ý của các nhà nghiên cứu. Trong số 14.000–15.000 nấm l n trên th gi i, kho ng 400 có các tính chấ ợc bi ợ ự ki n kho ng 1800 loài có ti ă các tính chấ ợc. Nhi u công trình nghiên cứ o tính chấ ợc này của nấm, ví dụ u qu ối v i áp huy t cao và th u bi n miễn dịch và các hoạt tính chống khối u của các phức hợp protein-polysaccharide polysaccharide–protein complex (PSPC) từ nuôi h sợ ấm (Liu, 2007) và các hoạt tính chống khối u của các lectin từ nấ ă (Chang and Miles, 2004). Nhi u loại nấm tr ng thể hi n các tác dụ ợc :

Nấm mỡ (Agaricus bisporus) có chứa hợp chất ức ch enzyme aromatas ă ng khối ă ừa ợ (N ễ L Dũ 2002).

Nấm kim châm (Flammulina velutipes) có chứa Flammulin, có tác dụng hi u qu từ 80-100% (sa o a 180 ểu bì. Các nhà tr ng nấm kim châm tỉnh Nagano có tỉ l ất thấp so v i cộ ng (Nguyễn Thị H ng Nụ và ctv, 2005).

Nấ (Lentinula edodes) từ ợc coi có tác dụ ă ực, có chất Lentinan làm gi m cholesterol máu và phòng chố (T ịnh Tam Ki t, 2011). Polysaccharide khác trong nấ ũ ống lại sa o a 180 ểu bì, chất aritadenin làm gi m cholesterol máu (Nguyễ L Dũ 2002

Nấ (Volvariella volvacea) có chứa chất có phân tử ợng kho ng 10kDa có tác dụng hạ huy ộ se o o (N ễ L Dũ 2002).

Nấm mèo (Auricularia spp.) có tác dụng hi u qu từ 80-90% trên ung ểu bì và sarcoma 180. Polysaccharide trong nấ èo a o c làm gi ng huy t của chuột tiể ng do di truy n (Nguyễ L Dũ 2002).

6

Nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) có tác dụng chủ y u kích thích h miễn dịch, phòng chố ạ ổ ă Hợp chất Erinacin trong nấm hầu thủ s ng neuron, có kh ă u trị não suy, b A z e e ă , phục h i chấ ần kinh o ột quị (Nguyễ L Dũ 2002

2.1.2.3 Bổ sung dinh dƣỡng dƣ c vào khẩu phần ăn

Trong nhữ ă ầ ứ s thành phần hóa họ ặ ỡng và chứ ă ủa nấ n nhi u hợp chất hoạt tính sinh học có giá trị y ợc. Chúng có thể dùng làm các phụ gia bổ sung cho thực phẩm chứa s ă ti m lực miễn dịch, gi m cholesterol, và b o v gan. Các chất m ợc gọi là ỡ ợc nấm, tức là thứ ă ó ụng phòng và trị b nh (Chang, 1999) và nấ ă thực phẩm chứ ă ấ ỡ ợ ợc chi t tách từ h sợ ấm hoặc từ qu thể và là một cấu phần quan trọng của công nghi p công ngh sinh học nấ a rộng (Chang and Miles, 2004). C qu thể và h sợ ấ u s n sinh ra các chấ ợc hoặ ỡ ợ ă ng miễn dịch tổng quát, mà chủ y u là o sa a e e e e o e u bi n miễn dịch. Mặc dù hầ tất c các loài nấm và thực phẩm có polysaccharide trong vách t o một số chứa các polysaccharide cho hi u qu ặc bi t trong làm ch m sự ti n triển khối u và nhi u b nh khác, gi m b t tác dụng phụ của phóng xạ và hóa trị li u. Nhi u nghiên cứu Á ặc bi t Trung Quốc và Nh t B n, ghi nh n sự kéo dài cuộc sống của các b nh nhân bị ịu các trị li u nói trên kèm uống hay tiêm chi t suất nấm (Mizuno, 1995; Liu, 1999 theo Chang and Miles, 2004). Ngoài ra, nh ă ng h miễn dị ấ s ấ ấ ò m bị nhiễm các b nh khác.

2.1.2.4 Các h p chất quan trọng có trong nấm dƣ c liệu

Triterpenes là một nhóm các hợp chất hóa học bao g a e e e vị v i công thức phân tử C30H48 ũ ó ể coi triterpens bao g m sáu ị so e e Động v t, thực v t và nấ u tạo triterpenes, ví dụ quan trọng nhấ s a e e ì ó s tạo thành hầu h t các steroid.

Triterpenes t n tại v i kho ng 200 dạng khung carbon khác nhau trong

thiên nhiên hoặc từ các ph n ứng (Xu et al., 2004).

Triterpenes chứ ă óa ợc gọ e e o a t ngữ ợc sử dụng thay th cho nhau. Triterpenoid có tính chất hóa học o ợc học (ví dụ o es e o i một số motief pentacyclic, ặc bi t lupane, oleanane và ursane cho thấy hứa hẹn là chất chố (Laszczyk, 2009, Jie Liu, 1995).

7

Squalene là một hydrocarbon và một triterpene, và là một phần tự nhiên thi t y u của sự tổng hợp tất c s e o s ộng, thực v t, bao g m cho es e o o o s e o a D o ể o i.

S a e e ợc sử dụng trong mỹ phẩm, và gầ ột chất bổ trợ miễn dịch (vắ S a e e ợ nghị là một phần quan trọng trong ch ộ ă ù Địa Trung H i vì nó có thể là một chấ ă ừa ung (S 2000; Owe et al., 2004).

Ganoderic acid T là triterpen phổ bi n nhất trong nấ ũ oạt chất thể hi n hoạt tính chố ạnh mẽ c in vitro và in vivo (Chen et al., 2010; Tang et al., 2006; Xu et al., 2010). Trong nghiên cứu của Chen et al. (2010), ganoderic acid T thể hi n kh ă ố bằng cách ức ch sự biểu hi n của Matrix Metalloproteinase (MMP)-9. Yue et al. (2008 ừng minh rằ Ga o e a D ó ộng trực ti p t i 14- 3-3 δ o e a o os s t bào HeLa.

liên k t glycosidic và khi bị thủy phân tạo

Po sa a e ợ e o e s ọ ầu tiên hình là polymer ất (Tolstoguzov, 2004). Polysaccharide carbohydrate phân tử g m một chuỗi dài các monosaccharide liên k t v i nhau bằng mối thành các monosaccharides hoặc oligosaccharides. Ví dụ o sa a es ữ tinh bột và glycogen, và polysaccharides cấ e ose

Po sa a es ng khá ng nhất, có chứa nhữ a ổi nhỏ của ị lặp lại. Tùy thuộc vào cấ ại phân tử có thể có những tính chất khác bi t v i nhau dù có cùng số ị lặp lại. Polysaccharide có thể vô ịnh hình hoặc th òa a o c (Varki et al., 2009).

Khi tất c các monosacaride trong một polysaccharide là cùng loại, các o sa a e ợc gọi là một homopolysaccharide hoặ o o a khi có nhi ột loạ o osa a e ì ợc gọi là heteropolysaccharides hoặc heteroglycans.

Sacaride tự ợc cấu tạo từ a o a e n gọi là monosaccharide v i công thức chung (CH2O)n mà n là ba hoặc nhi Các monosacaride là glucose, fructose và glyceraldehyde (Mathews, 1999). Polysaccharide có một công thức chung của Cx(H2O)y v ng là một số ợng l n từ 200 2500 ị lặ ặp lại trong khung của o e ng là monosaccharide sáu carbon, công thức tổ ũ ó thể ợc biểu diễ ( 6H10O5)n v 40 ≤ ≤ 3000

8

Polysaccharide chứa ị monosaccharide. Polysaccharide là phần quan trọng của nhóm các polyme sinh học. Tinh bột (một polymer của ose ợc sử dụ ộ o sa a e ữ trong thực v ợc tìm thấy trong các hình thức của c hai amylose và các nhánh amylopectin.

Beta – glucan là polysaccharides g ng liên phân tử ợc tạo nên từ D – glucose gắn v i nhau qua liên k β – glycoside (Chen and Seviour, 2007). Chúng hi n di n n ộ cao trong thành t bào của nấm, nấm men, y n mạch, lúa mạ ũ ẩn (McIntosh et al., 2005).

Cấu trúc của beta – glucans rấ a ạng v i beta – glucans nấm là beta - 1,3 vị trí carbon 1 và 6 trong khi y n mạch và lúa mạch, beta – glucans liên k t vị trí carbon 1, 4 (Chen and Seviour, 2007 ; Sadiq Butt et al., 2008).

Một loạt các thử nghi m lâm sàng của o i trong nhữ ă 1990 ộng của PGG – a ối v i nhiễm khuẩn của các b nh nhân phẫu thu t. Trong những nghiên cứu này, PGG – glucan làm gi m bi n chứ ể. Dùng men – glucan dạng uố ợc chứng minh làm gi m n ộ của IL – 4 và IL – 5 o e ó a n các biểu hi n lâm sàng của chứ ũ ị ứng (Cengiz et al., 2005).

Β – Glucan tạo thu n lợ o ộng ruột và có thể ợc sử dụng trong c i tạo của vấ ng ruộ ặc bi t là chứng táo bón (Dongowski, 2002; Battilana et al., 2001).

N o a β – D – Glucan, khi phức hợp v i một protein thì có tác dụng

chống ung th õ t (Kishida et al.,1989).

Polysaccharide trong nấ ợc chứng minh là có hoạt tính chống khối u (anti – tumor) mạnh mẽ. Chúng có thể i các t bào gi t tự nhiên ( NK – natural killer cells) hay t bào bạch huy ộc hại t bào (Cytotoxic T – lymphocytes). Sự o o ă ng hoạ ộng, giúp chúng dễ dàng tấn công trực ti p các t bào mang phân tử lạ hoặc phân tử ì o ể (Chang, 2004).

Bên cạ ó o sa a e o linh chi còn có tác dụng trong li u pháp chống quá trình tạo mạch máu khối u bằng cách kích thích y u tố gây hoại tử khối u TNF (tumor necrosis factor) sinh ra các hoạt chất thuộc nhóm cytokine làm t bào khối u ch t theo l p trình (Kao et al., 2013).

Nghiên cứu của Cao et al. (2006) cho thấy một polysaccharide peptide có kh ă ức ch sự a ă bào nội mô dây rố i. Nghiên cứu của Stanley et al. (2005 ũ ứng minh polysaccharide có tác dụng trong

9

vi ă ừa sự hình thành mao mạch, mộ c quan trọng trong sự hình thành mạ N ứ ũ ỉ ra rằng, polysaccharide của nấm có tác dụ o ă ừa u trị n li t tuy tác ộng của o sa a e o ì thể s n sinh MAPK và tín hi u của o e ase ộng t i quá trình phosphoryl óa ase u hòa tín hi u ngoại bào ½ và Atk kinase (Stanley et al., 2005).

Sự k t hợp của hai nhóm chất triterpen và polysaccharide trong nấm có tác dụng ức ch sự hoạ ộng của enzyme oxi hóa và các nhóm tự o o thể, ức ch quá trình lão hóa. Bên cạ ó sự k t hợp này còn ức ch hoạt ộng của y u tố ă ng nội mô mạ (VEGF ũ ức ch hình thành mạch máu m i. Một khi các mạch máu m ợc hình thành, chúng a ỡ n giúp khối u phát triể Đ ng th i, các t bào khối u gi i phóng tín hi u hóa học trực ti o ò Đ u này khi n ngày càng nhi u mạch máu m i và t bào khối u m ợc tạo ra (Kao et al., 2013).

2.1.3 Nấm ăn v sự phát triển nông nghiệp bền vững

2.1.3.1 Sử d ng có hiệu quả sinh kh i lignocellulose

Hi n nay, dân số th gi 6 ỉ, mà sẽ ti p tụ a ă o kỷ 21 này. Hai thách thức l ặt ra cho nhân loạ eo a ố ợc: Gia ă n thực phẩm v i số ợng l ấ ợng tố G m thiểu ô nhiễ ng và các h u qu của hi u ứng nhà kính (Chang and Miles, 2004).

Tuy nhiên, th gi i có khố ợng khổng l ngu n v t li u lignocellulose là b n vữ ự ă ợng mặt tr i. V t li u lignocellulose dạng sinh khố c tính có khố ợ n 1,09 x 1011 tấ ă ặ ất. S ợ ạ ũ ốc trên th gi o ă 1999 ạt 3570 x 106 tấn ă ợng mặt tr i cố ịnh trong sinh khối lignocellulose là 3020 x 1018 Jo e ( ị ă ợ o i cần chuyể ổi thành s n phẩm hữu ích. (Chang and Miles, 2004).

Đ ó u chi ợ a ợc phát triể ể sử dụng ngu n lignocellulose khổng l tạo a ă a n pháp nông lâm nghi p và công nghi p thực phẩ N n pháp có giá trị là tr ng nấ ì ấ ó u loại enzyme phân rã lignocellulose tạo ra nấm có giá trị kinh t cao, lại gi m ô nhiễ H nữa, gầ s n xuất nấm ợc và các chất có hoạt tính sinh học làm giá bán nấ ă ao ể.

Sự phân rã sinh học của nấm nh các enzyme không những làm các ph li ợc phân rã nhanh gi m ô nhiễ ò ó ộng b i

10

hoàn sinh học ất sau tr ng nấm làm giàu chất hữ o ất, th m chí phân bón hữ sạch cho cây tr ng.

2.1.3.2 Trồng nấm với phát triển nông nghiệp bền vững

Nông nghi p b n vững là một h thố o ó o i t n tại và sử dụng những ngu ă ợ ộc hại, ti t ki s ă ợng, sử dụng ngu n tài nguyên phong phú của thiên nhiên mà không phá hoại những ngu ó Gó ần tích cực vào b i hoàn sinh học những h s ị suy thoái. Vi c t n dụng những ph phụ li u của nông nghi ể s n xuất ra thực phẩm sẽ góp phầ ể vào phát triển nông nghi p b n vững. Ngu n ph th i của nông nghi p rất l n, n u bi t t n dụng làm nguyên li u tr ng nấm, sau khi thu hoạch nấm, ủ ể làm phân vi sinh sẽ ợc nhi u lợi ích. Thứ nhất, có s n phẩm giá trị ao ể thu hoạch. Thứ hai, không gây ô nhiễ ng. Thứ ba, bã sau tr ng nấm lại có thể thành ngu n phân hữ ất tố ối v ất (Nguyễ L Dũ 2002 T ng nấm góp phần phát triển nông nghi p b n vững một cách tích cực.

2.2 Sự phát triển nghề trồng nấm

2.2.1 Lịch sử phát triển nghề trồng nấm ăn v nấm dƣ c liệu

Kh ầu từ th kỉ thứ VI a t tr ng một số loại nấ ể ă mặ ù ĩ ò s T eo u của Chang and Miles (2004), nấm èo ợc tr ầu tiên Trung Quốc, nấ ợc tr ng vào kho ă 800-900, nấ ợc tr o ă 1000 sa N yên (Nguyễ L Dũ 2002 Nă ầu nuôi tr ng nhi u loại nấm thực phẩm và ợc li ợ o 2 1 sa

B ng 2.1: Lịch sử nuôi tr ng một số loại nấm

Loài nấm Chứ ă N ng

Nă ng lần ầu

Thực phẩm

Nă 50 c công nguyên

Agrocybe cylinaracea ( thụ nam) Nam Châu Âu (South Europe)

Từ ă 600 Trung Quốc

Auricularia auricula (nấm mèo) Thực phẩm, ợc li u

Thực phẩm Từ ă 800 Trung Quốc

Flammulina velutipes (kim châm)

edodes Từ ă 1000 Trung Quốc

Lentinula (nấ Thực phẩm, ợc li u

Poria cocos D ợc li u Từ ă 1232 Trung quốc

(nấm phục linh)

11

bisporus Từ ă 1600 Pháp

Agaricus (nấm mỡ) Thực phẩm, ợc li u

Ganoderma spp. D ợc li u Từ ă 1621 Trung Quốc

(linh chi)

Thực phẩm Từ ă 1700 Trung Quốc

Volvariella volvacea (nấ

Từ ă 1900 Đức

Pleurotus ostreatus ( o Thực phẩm, ợc li u

Từ ă 1960 Trung Quốc

Hericium erinaceus (hầu thủ) Thực phẩm, ợc li u

Agaricus brasiliensis Từ ă 1970 Nh t

Thực phẩm, ợc li u (nấ

( : S -Ting Chang, 2008)

Nhìn chung, công vi ă ò ứu cách tr ng nấ ực sự phát triển mạnh và rộng khắp trong những th p kỉ qua, nhấ o 20 ă tr lạ H n nay, trên th gi i có kho ng 60 loài nấ a ợc nuôi tr ng v i mụ ại, v 20 o ợc nuôi tr ng quy mô công nghi p.

2.2.2 Sự phát triển nghề trồng nấm trên thế giới

2.2.2.1 Sản lƣ ng nấm trồng trên thế giới

Thị ng nấm trên th gi o ă 2001 ạt doanh số trên 40 tỉ USD. Thị ng nấm g m 3 loại chủ y u: nấ ă phẩm nấ ợc và nấm hoang dại (Chang and Miles, 2004). S n xuất nấm tr ng trên th gi i gia ă ột cách ổ ịnh nh sự ó ó áng kể từ T Q ốc, Ấ Độ, Ba lan, Hungary, và Vi t Nam. B ng 2.2 minh họa sự a ă y vọt s ợng nấm tr ng từ ă 1960 n 2002 (Chang and Miles, 2004).

B ng 2.2: Tổng s ợng nấm tr ng trên th gi i từ ă 1960 n 2002

Nă S ợng (tấ Nă S ợng (tấ

1960 1983 1.453.000 170.000

1965 1970 1975 1978 1981 1986 1990 1994 1997 2002 2.182.000 3.763.000 4.909.000 6.158.000 12.250.000 301.000 484.000 922.000 1.060.000 1.257.000

12

( : a and Miles, 2004)

Doanh số thị ng nấ ợ ấ ổ sung vào thứ ă ủa chúng trên toàn th gi i kho ng 1,2 tỉ USD ă 1991 3 6 ỉ USD ă 1994 ( a 1996 eo a a M es 2004 Nă 1999 c tính 6,0 tỉ USD. Doanh số thị ng chỉ riêng các s n phẩ ỡ ợc gốc nấm linh chi ă 1995 c tính 1628,4 tri u USD (Chang and Buswell, 1999 theo Chang and Miles, 2004). Nấ ổi ti ũ ó oa ự. Chín ầ ă s n phẩm kể trên s n xuất c châu Á và Âu, chỉ i 0,1% Bắc Mỹ (Chang and Miles, 2004).

Tóm lại, s ợng nấm trên toàn th gi ă ục từ ă 1960 n a ặc bi ă ọ : ă 1981 1 257 200 ấ ă 1997 ă 6.158.400 tấn, gấ 4 5 ầ o 16 ă ; ấ o 5 ă 1997 – 2002 từ 6.158 tri u tấn lên 12.250 tri u tấ / ă ( a and Miles, 2004).

2.2.2.2 Sự thay ổi cơ cấu sản lƣ ng các loài nấm trồng

Trong quá trình phát triển, tr ng nấm không nhữ a ă số ợng, ò a ạng hóa chủ o a ổ ấu s ợ o ợc tr ng. B ng 2.3 ( ă 1981-1997) và b ng 2.4 (2003-2004) ph n nh sự gia ă s ợng nấm trên toàn th gi i v i chi ti t cho từng loài (Akanuma et al., 2006). B ng 2.3 cho thấy trong nhữ ă 1990 v c, nấm mỡ Agaricus bisporus chi , có s ợng l n nhất trong các loài nấm tr Nó ợc tr ng quy mô công nghi p c tiên ti Mỹ (thứ nhất), Pháp (thứ hai), Hà Lan, Anh,.... S ợng nấm mỡ ă ục qua các ă ỉ l ối so v i các nấm khác gi m dầ Nă 1981 ó chi m 71,6% tổng s ợng; con số này gi m dầ ă 1997 ò 31 8%

B ng 2.3: S ợng nấm tr ng phổ bi n trên th gi ă 1981-1997

Nă 1981 Nă 1986 Nă 1990 Nă 1994 Nă 1997

S ợ % o ă

x 1000 tấ (%) x 1000 tấ (%) x 1000 tấn (%) x 1000 tấ (%) x 1000 tấ (%)

900,0 (71,6%) 1.227,0 (56,2%) 1.420,0 (37,8%) 1.846,0 (37,6%) 1.955,9 (31,8%)

Nấm mỡ Agaricus bisporus

180,0 314,0 393,0 826,2 1.564,4

(14,3%) (14,4%) (10,4%) (16,8%) (25,4%) Nấ Lentinula edodes

35,0 169,0 900,0 797,4 875,6

Nấ o Pleurotus spp. (2,8%) (7,7%) (23,9%) (16,3%) (14,2%)

13

10,0 119,0 400,0 420,1 485,3

(0,8%) (5,5%) (10,6%) (8,5%) (7,9%) Nấm mèo Auricularia spp.

Nấ 54,0 178,0 207,0 298,8 180,8

(4,3%) (8,2%) (5,5%) (6,1%) (3,0%)

Vovariella. volvacea

60,0 100,0 143,0 229,8 284,7 Nấm kim châm Flammulina (4,8%) (4,6%) (3,8%) (4,7%) (4,6%) Velutipes

N ĩ 40,0 105,0 156,2 130,5 --- Tremella spp. (1,8%) (2,8%) (3,2%) (2,1%)

22,6 54,8 74,2

-- -- (0,6%) (1,1%) (1,2%) Nấm ngọc trâm Hypisizygus spp.

Các nấm khác 1.2 (0,1%) 10,0 (0,5) 139,4 (3,7%) 238,8 (4.8%) 518,4 (8,4%)

Tổng s ợng 1.357,2 (100,0) 2.182,0 (100,0) 3.763,0 (100,0) 4,909,3 (100,0) 6.158,4 (100,0)

73.6 % 72.5% 30.5% 25.4%

% a ă eo ă

( : a 1999

B ng 2.4: S ợng nấm (tấ ợ o ă 2003 ă 2004

Các loài nấm 2003 2004

Trung Quốc Nh t B n Hoa Kỳ

Nấ o Pleurotus spp. 2.468.000 5.210 1.803

Nấ Lentinula edodes 2.228.000 >200.000 3.428

Nấm mỡ Agaricus bisporus 1.330.400 110.185 383.636

Nấm mèo Aurilaria spp. 1.654.800 84.356 2,3

Nấ Volvariella volvacea 25.068 197.400 2,2

45.805 557.700 22,7

Nấm Kim châm Flammulina velutipes

Nấm Tuy ĩ Tremella spp. 183.300 29.882 0,9

14

N.Hầuthủ Hericium erinaceum 30.500 1.821 42,5

N. Ngọc trâm Hypsizygus spp. 242.500

Nấm Pholiota nameko 171.500 33,0

Nấm Kê tọa Grifola frondosa 24.900 2,7

Nấm Mực Coprinus comatus 177.800 130,0

NấmPleurotus nebrodensis 52.200

N. Bào Pleurotus eryngii 114.100

Nấm Agrocybe chaxinggu 92.900

Nấ i Dictyophora spp. 32.200

42.000

Nấ T Agaricus brasiliensis

N. Linh chi Ganoderma spp. 49.100

N. Phục linh Wolfiporia cocos 145.900

Các nấm khác 571.700 ~300

Tổng s ợng 10.386.900

( : A a a et al., 2006)

2.2.3 Sự phát triển nghề trồng nấm ở Việt Nam

T eo ng chung trên th gi i, tr ng nấm Vi Na ũ triển nhanh và mạnh, c v quy mô nuôi tr ng, nhi u chủng loài m i, lẫn nhi u nghiên cứu v nấ ă ấ ợc li u. Do v ợc coi là một trong 4 c phát triển nhanh ngh tr ng nấm (Chang and Miles, 2004).

Tr ng nấm a o 20 ă ầ ( o ă 1990 ă 2010) từ s n xuấ a ì ì ột ngh sinh sống của nhi u gia ì Ở mi n Bắ c ta, nh sự hỗ trợ của Trung tâm Công ngh sinh học thực v t thuộc Vi n Di truy n nông nghi p, tr ng nấ ợc triển khai khắp các tỉnh, mà một số o n. Ở mi n Nam, một số vùng tr ng nấm t ì Đức Trọ (L Đ Lo K (Đ ng Nai), Bình Chánh (TPHCM), Long An, Huy La V (Đ ng Tháp) và Thốt Nốt (H u Giang).

L ợng nấ ợc s n xuất nhi a ố ợc chính xác số ợ T thị ng chỉ có nấ ấ èo sa ó ó nấ o n nay trên 10 loài nấ ợc bán siêu thị và các chợ. S n ợng nấm Vi Na ă 2012 c tính: Nấ ~20 000 ấ ấm

15

o ~1 800 ấ ấm mỡ ~300 Tấ ấm mèo (mộ ĩ ~5 500 tấn khô, nấ ~50 ấn khô, nấm linh chi ~25 tấn khô (Lê Xuân Thám và ctv 2013). Sự a ă ặc bi ối v i nấm bào ấ o: Nấ o ó o ợc nuôi tr ng, dễ tr ng a ì công nghi ă s ất cao rất thích hợp cho phát triển nông nghi p b n vững. Nấ ực phẩm chứ ă ó ị ỡ ợc cao và một phầ ợc chi t thành các ch phẩ ợc. Nhi u loài nấm m ợc nuôi tr ng và s ợ a ă ất nhanh. Nói chung nấm tr ng ngày càng có vai trò l o i số o i.

2.3 Công nghệ trồng nấm

2 3 1 Sơ ồ khái quát quy trình trồng nấm

Hì 2 4: S tổng quát qui trình nuôi tr ng các loại nấ ă

( : A a a et al.,2006)

N ng nấm nh ứng dụng các ti n bộ khoa học mà nó có những c ti n nh y vọt. Công ngh tr ng nấm sử dụng nhi u kỹ thu t và ki n thức v vi sinh v t: khử trùng, nuôi cấy giống thuầ e ất, tạo u ki n cho vi sinh v t có lợi phát triển và hạn ch các vi sinh v t có hại,... Các nghiên

16

cứu khoa học góp phần thuần hóa các chủng nấm m a o ng, kh o sát các ặ ểm sinh họ ịnh giá trị ỡ ợc,... làm th nào khống ch u ki n khác nhau, mà chủ y u là các y u tố môi ộ ộ ẩ s ể nấm tr a ợc nhi u qu thể (Phạm Thành Hổ, 2004)

2.3.2 Meo gi ng nấm

Trong s n xuất nấm, meo giống giữ vai trò quan trọ ầu. Dù ch bi n nguyên li u tố ă só ĩ ống nấm xấ ì ă s ất không cao hoặc t ó ấm mọ T c khi tr ng cần chọn chủng nấm thích hợp v u ki ịa c tiên là nhi ộ cho ra qu thể n nguyên li ủ ừ ẩ

Nấm ra các tai nấm chỉ o ó ợc phát triển từ h sợ ấm. Đố ạ ẩm có nấm mọ o ó ó sẵn h sợ ấm hoặc bào tử n y mầm tạo ra h sợ ỗ nào không có h sợ oặc bào tử thì không có nấm mọc lên. Meo giống nấm ợc s n xuấ ể cung cấ o i tr ng thực chất là h sợ ấm thuần chủ ợc nuôi bằ ng tự nhiên hay nhân tạo ử ù ể cấ o ất tr ng nấm làm giống kh ầu.

Để tạo ra meo giống nấm g c chủ y u: giống gốc từ ống nghi m hoặc hộp Petri  meo giống cấp I (meo hạt lúa hoặc gạo)  meo giống cấp II (meo hạt lúa, meo cọ eo ó ù a  meo giống cấp III (meo s n xuất gieo trực ti o ất tr ng nấm) (Phạm Thành Hổ, 2009).

2.3.3 Chế biến nguyên liệu th nh cơ chất trồng nấm

ă ứ vào sự phân rã nhi u ít nguyên li a ầ ù ất cho

tr ng nấm có thể g m hai loại chủ y u:

Nguyên li a oặc ít bị ạ, bã mía, mụ ừa, mạ a õ ắp, lá chuối khô, lục bình khô, thân cây u, thân cây gỗ... Phần l n các loài nấm tr ấ ấ èo o ấ … sử dụng ngu n nguyên li u này v i quy trình ch bi n.

Nguyên li ối bị phân hủy mạ ựa, phân bò, phân gà, mà khi ủ ti p v ạ a … sẽ tạo ất gọi là compost ất mùn. Compost dùng chủ y u tr ng các loại nấm mỡ Agaricus.

Tuỳ từng loại nấm tr ng mà chọn loại nguyên li u. Nguyên li u thô không ph i khúc gỗ ợc xử ể ất qua c c: Thấ c a ộ ẩm thích hợp, bổ sung thêm chấ ỡ ắ DAP… Hoặ o o ố ủ oặ o o t chứa a ịch và khử ù Sa ó ó oặ o o a … T ỳ từng loại nấ pháp nuôi tr ợ

17

Ch bi n compost cho nuôi tr ng nấm mỡ Agaricus. Quá trình ch bi n compost có th i gian kéo dài, kèm mùi hôi thối của nguyên li u và g m nhi u pha. Trong pha I của quá trình thực hi n ngoài tr i, nguyên li a ầu chất ố ợ o trộ c theo chu kỳ. Trong pha I này, các vi sinh v t thực hi n sự a ầ ối v i nguyên li P a ng thực hi n xong trong 9–12 ngày, khi nguyên li ( ạ) tr nên m m dẻo m và có kh ă ữ T ng ammonia bốc mùi mạnh. Pha II lên men trong nhà (indoor fermentation) là khử trùng Pasteur (pasteurization), khi mà các sinh v t không mong muốn bị loại bỏ. Quá trình khử trùng Pasteur này thực hi o ò ợc thổ ó o ể giữ nhi ộ không khí 60oC trong ít nhất 4 gi . Nhi ộ sẽ hạ xuố n 50oC trong 8-72 gi phụ thuộc vào compost. Carbon dioxide CO2 duy trì 1,5-2% và mức ammonia gi m xuố 10 o sự ổ ộ ì (50o 60o ì a T p theo pha II tạo o os ấ ợc làm lạnh xuống 30oC thích hợp cho meo Agaricus bitorquis hoặc 25oC thích hợp cho meo Agaricus bisporus (Chang, 1999).

2.3.4 Gieo meo và ủ lan tơ

Sau khi khử ù o ể nguội, ti n hành gieo meo. Có nhi ể

gieo meo tuỳ eo ng và loại nấm:

(1) Gieo meo cụm: T ng các cụm meo cách nhau 10-15 cm theo chi u dọc rìa mỗi l ất.

(2) Gieo meo b mặt: R i meo nấm thành 1 l p mỏ u trên b mặt compost.

(3) Gieo meo trộ u: Meo ợc trộ u v i compost r i cho vô khay, túi plastic.

(4) Gieo meo từng l p: R i meo theo từng l ất cách nhau giữa l p meo i kho ng 5-10 Đối v i các bị ù a ì ấy meo hạt phía trên mi ng bịch, n u dùng meo cọng thì cắm sâu cọng meo thẳng từ mi ng bịch xuố (P ạm Thành Hổ, 1992 - 1994).

Ủ tơ nấm: Nấm l n g m 2 phần chủ y u: qu thể hay tai nấ a sinh s n và h sợ ấm là bộ ph s ỡng. So v i thực v ì ứng v i qu và thân cây. T ứng v u này, tr ng nấ ó 2 a oạn: Nuôi h sợ ấm phát triển tố ủ l n m i ra nhi u trái tố ợc và tạo u ki n cho nấm mọc ra qu thể s Do y, ủ ấm tốt cho lan nhanh, choáng h t khố ất, có ý ĩa ất quan trọng cho s n ợng nấm. Tuy nhiên, quá trình ủ a ò ỏi nghiêm nhặt các y u tố ì thể. Khi cấy meo vào luống nấm, những sợ ọc lan ra. Trong lúc mọc lan ra các nhánh ngang gặp nhau nối lại thành mạ i. Nh tạo mạng nối mà h sợ ấm thành một khối thống nhất. Các chất bên trong khối h sợi có thể thông v i nhau, di chuyển từ chỗ

18

này t i chỗ khác. Hi ợng tạo mạng nối và sự di chuyển các chất bên trong sợ ấ ó ĩa ặc bi t ối v i tr ng nấm. Khi tr ng nấ a ũ ấy là nấm ra trên b mặ ă s ất thì phụ thuộc vào c khố ất bên trong. S ĩ y là vì các sợ ấm nằ s o ạ hút chất dinh ỡng chuyể a o ể tạo ra các tai nấm. Gầ ình thành một nguyên tắc là s ợng nấm phụ thuộc vào khối nguyên li e ng, ít phụ thuộc b mặt chỗ nấm mọc ra (Phạm Thành Hổ, 2004)

2 3 5 Chăm sóc v thu h i

K ấ a ầy khố ấ i nhữ u ki ng nhấ ịnh, khác nhi u v a oạn ủ a ụ nấm sẽ xuất hi n và l n dần thành qu thể. Ngh thu t tr ng nấm thể hi n nhi u nhất khâu có tính chất quy ịnh thành bại của toàn bộ quá trình tr ng nấm. Ở a oạn này, con i bằng vi ă só ó ộng trực ti ể tạo các y u tố ng thu n lợi nhất cho sự hình thành qu thể nấm c v số ợng lẫn chấ ợng. Ti i và thu hái qu thể (Võ Thị P K a P ạm Thành Hổ, 1998).

G a oạn này cầ ột số u ki sau:

Nhi ộ: Nhi ộ có ng l ối v i sự hình thành qu thể nấm tr ng, là y u tố gi i hạn nhấ ị ối v i nấm tr Đa số loài nấm tr ng có gố ù i, có loạ ấ ỉ tr ợc vùng nhi i. Cần phân bi t nhi ộ nuôi h nấm và nhi ộ ra qu thể a số có nhi ộ ra qu thể thấ V ụ: Nấ Vovariella volvacea 35 - 40oC ra qu thể 35 - 40oC; nấ o Pleurotus eringii 20 - 30oC và ra nấm 15 - 20oC. Nhi u loài nấ o ố i ra qu thể nhi ộ 25 – 35oC, chủng nấm hầu thủ chịu nhi ũ ì thể nhi ộ này.

Ẩ ộ: Sợ ấm thi c dễ bị khô ch t. Mỗi loài cầ ộ ẩm nhất

ị ể sợ ă ng và ra qu thể. Trong tr ng nấm cần phân bi t:

(1) Độ ẩ ất nguyên li u ộ ẩ o ấ sa ợc thấm ất quá khô hoặc quá ẩ u bất lợi cho h sợ ấ Độ ẩm thích hợp kho ng 65-80%.

(2) Độ ẩ ối của không khí trong kho ng 70-95% ối v a số nấm tr ng. Cần ph i giữ ộ ẩm không khí tố : ủ ẩ c ít bố a Độ ẩ ợc duy trì nh c, mà tốt nhấ s ít ng h sợ ấm (Võ Thị P K a P ạm Thành Hổ, 1998).

Ánh sáng: Mỗi loài nấm tr ng có ph n ứng khác nhau v i ánh sáng. Nấm mỡ Agaricus bisporus hoàn toàn không cần ánh sáng trong suốt quá trình tr ng từ ủ a n ra qu thể. Ánh sáng cần mộ a oạn ngắn cho nấm ể tạo nụ s o ũ ủ cho nấ a thể. Tuy

19

nhiên, nhi u nấ ấ ụa bạc, nấ u cần ánh sáng ể ra qu thể.

Thông khí: T o ì ă ng, sợ ấm hô hấp tạo ra nhi u thán khí (CO2), ph n ứng của các loại nấ a ối v i n ộ CO2 khác nhau. Hầu h t các loài nấm tr u cần thông khí mạ o a oạn ra qu thể. Nấ ng ngoài tr i, vi c thông thoáng cho nấm không thành vấ . Nấ o ần thông khí mạ ể ra qu thể.

Độ chua pH: Trong quá trình phát triển của nấ a ổi theo tính chua. Một số chất bổ sung vừa có tính chấ u hoà ẩm vừa làm b t ộ a ột thạch cao CaSO4 ịn CaCO3…Độ a a ầu có n các vi sinh v t có trong nguyên li u và có thể ng c ỡ n các vi sinh v t gây nhiễm hoặc cạ a T o ì ố ộ ấ ấ ổ s a O3, CaSO4 oặ aO ể ă ộ H

Vi c thu hái nấm phụ thuộc vào chủng loài và thị hi i tiêu dùng. Ví dụ, nấ a oạn hình trứ c khi nứt bao; nấ hái lúc màng trắ ũ ấm vừa tách khỏi mép qu thể; nấm linh chi thu ũ ấm cứng toàn bộ mặ ó e ó u bụi bào tử Đa ần nấm tiêu thụ dạ ( ể c nấm mèo), số khác vừa ừa dạ ấm mèo, nấ ột số ấm linh chi chủ y u dạng khô. Nấm mỡ và nhi u loài nấ ợ hộp (Phạm Thành Hổ, 2004).

2 4 Định danh nấm ăn v nấm dƣ c liệu

Sự lựa chọn trình tự DNA dùng cho vi c nh n di n các loài nấ ò ỏi sự khác bi t của các trình tự sao cho ta có thể phân bi ợc dòng phân l p cấp ộ loài hay giống của Ge e óa ù oso a RNA m b o ợc yêu cầu này. Gene là một phần thi t y u của sự sống t bào và các vùng gen có sự khác bi t v trình tự giữa các loài. Mặt khác, các gene t n tại v i một số ợng l o e o e ă ộ nhạy của các kiểm tra chẩ o

Tổ a DNA ITS:

S ợ DNA: DNA ó e óa RNA ủa oso e ó a ò a ọ o ứ a s o DNA ợ a ứ ì DNA ộ e ó sao ặ không mã hóa cho protein nào (Guarro et al., 1999).

sao ủa e ằ ộ o s a ì óa H ữa oso e ầ ạ o ọ s ó ù ố óa P ầ ử DNA ố o ợ e s ể ì a sự so s s a e ựa ữ o o eo e ó o

20

ao ợ sử ụ o ấ s ằ ạ ù ù o so s N o a oạ ẫ ò ũ ợ ựa ù o ù o ị a s (Van de Peer et al. 1996 DNA 5 8 S 18 S 25 S RNA ẽ ằ e ẽ ù o (ITS ù o (ETS G ữa ó e sao ặ ạ ù ó ộ DNA 5 S ó ị ố ị ó sao ợ e ò ạ DNA 5 S ỉ ó ó ể ủa ộ số o ấ K ủa ỗ ù ạ ằ o o 7 7 – 24 kbp (Guarro et al., 1999; Leo Antony et al., 2012)

rDNA 18 S ợ a ứ ; DNA 5 8 S ó ấ ỏ ó sự ổ so RNA 5S ầ ể ủa - LSU- rRNA (nuclear large subunit rRNA) ó a ò ổ ị ấ oso e ẩ ì ổ ợ o e n (Szymanski et al., 2003); DNA 25 S ặ ù ó sự ổ so ạ ấ ó ĩa o oạ (Guarro et al., 1999).

Vù ITS ù ó ấ sự ổ ặ ù ù ITS ợ sử ụ o ứ óa ủa s ầ so s ù ỉ sử ụ ứ ộ ị óa o cùng loài (Guarro et al., 1999).

ứ s ọ ử ằ oạ ấ s DNA ợ ể ữ ă ầ ủa 90 (Bruns et al., 1991).

S ợc v ITS (Internal Transcribed Spacer)

Hình 2.5: Vùng trình tự ITS trong DNA ribosome

( : D e and Irwin, 2001)

Trong hầu h t các sinh v t Eukaryote, gene ribosomal RNA (rDNA) g m một họ a e e o ó sao ợc sắp x p lặp lại liên ti p nhau. Mỗi oạn lặp lại g m mộ ị ao m một tiể ị nhỏ 5,8S và một cấu trúc tiể ị l n (chia làm hai phần) là ITS1, ITS2 (Drenth và Irwin, 2001). Cặp m ITS4 ITS5 ũ ặp m i phổ bi ợc White

21

et al., (1990) thi t k ể khu ạ oạn gene nằm trong vùng ITS. Vùng ITS có thể ợc ứng dụ ể o ột bi ểm trong quá trình hình o o ng sự giống nhau bên trong trình tự DNA, dùng các phần m m chuyên dụng tạo ra cây ti n hóa loài không chỉ các loài giống nhau mà còn phân bi t sự khác nhau giữa các loài.

Gi i trình tự e e óa o RNA ITS o ịnh danh nấ : Để phân loạ ợc các loài nấm hoang dạ N ễ N và ctv (2013 ị a o ấ ổ ạ ì D ằ t hợp giữa phân loại truy n thống và dẫn li u rRNA 25S v ộ ng là 99% so v Ge a Độ ng trình tự rRNA 25S của chủng Macrocybe gigantea so v i dẫn li ó Macrocybe gigantea o Ge a ≈ 99% ự k t qu của Amirati (2007); Hong-Min (2008). Tổng hợp các dẫn li u cho phép xây dựng quan h chủng loại phát sinh trong các nhóm gần ũ Từ mô t gi i phẩu hình thái theo Pegler (1998) và Lê Xuân Thám (2001) k t hợp v ịnh rRNA 25S có thể khẳ ịnh rằng mẫu nấ ợc L T ì D o nấm Macrocybe gigantea.

T ầ N Dũ và ctv (2012 ù ạ oạ ITS ằ P R a oạ ITS1 ITS4 ể ì ự 16 o ấ ă ụ ộ ự Đ ằ s ử Lo K ủa ợ ủa 16 o ấ o ấ ứ a ữa o ấ o s ứ ắ ó bootstrap ao o ấ o ấ ó ố ấ ầ

2 5 C c phƣơng ph p x c ịnh ho t tính gây c tế b o v cơ chế tác

ng kh ng ung thƣ của m t s loài nấm dƣ c liệu

Đ “Nghiên cứu tác dụ ă ng miễn dịch, chống oxy hóa và kh ă o ực nghi m của nấ ” o N ễn Thị Thu H (2012 ực hi n trên chuột thí nghi m mang lạ ĩa o n hứa hẹn cho vi c thử nghi m một số loài nấm hoang dại kh o u trị T eo ng trên th gi i ngày nay là quay v sử dụng các s n phẩm có ngu n gốc tự o u trị ốc có ngu n gốc tự nhiên an o ì ợc tạo nên từ những quá trình sinh lý-sinh hóa tự nhiên giống các quá trình sinh lý của ể o i. Nhi u loạ n nay không có thuốc tổng hợ ặc trị.

Hi n nay mục tiêu của trị li ù ất thiên nhiên tác ộng theo nhi khác nhau lên dòng t o ối cùng dẫn n hoạt hóa quá trình apoptosis mà không gây ph n ứng viêm n t o ì ng xung quanh. C m ứng apoptosis trong những dòng t bào hoặc nhữ ằng cao chi t từ thực v t là một chi ợc hi u qu trong hóa trị li u do thành phần cao chi t thực v t là hỗn hợp của nhi u hoạt

22

chất thiên nhiên có tác dụng bổ trợ cộng lực v a ă ụ u trị và gi m tác dụng không mong muốn của hoạt chất chính (Simon, 2004).

Song song v i vi c tìm ki m, sàng lọc những hợp chất m pháp nghiên cứu của hoạt tính của các hợp chấ ũ ển s o ộng. Các hợp chất m ợc sàng lọc bằ ộc t bào trên các dòng t o ấy. Một số pháp phổ bi n hi a : P MTT [3 (4 5- e azo -2- -2 5- e e azo o e ; XTT [2 3- s (2- e o -4- o-5-s o e -5-[( e a o a o -2H- [2-(4-Iodophen -3-(4- e azo o e ; WST-1 o e -5-(2 4- s o e -2H- e azo SR (sulforhodamine B);... (Simon, 2004).

P MTT XTT WST-1 ộc t bào dựa vào hoạ ộng của enzyme dehydrogenase của ty thể trong các sống còn lại sau khi xử lý v i các hợp chất kh o sát. Enzyme này bi ổi ất không màu thành s n phẩ ó phát hi n dựa trên sự so màu (Simon, 2004).

P SR oạ ộc t bào dựa vào tổ ợng protein t o ợc nhuộm v i SRB sau khi xử lý v i các hợp chất kh o sát. Tổng số ợng protein t o ợc nhuộm ph n ánh số ợng t bào sống và ợ ằ o ộ quang (Simon, 2004).

2.6 Các nghiên c u có liên quan

2.6.1 Các nghiên c u về khu hệ nấm ở Việt Nam

Qua các công trình nghiên cứu nấm Vi Na a oạn 1890 – 1928, tổng cộng có kho 200 o o ó 28 o ố Trung bộ và 37 loài Bình Trị Thiên. Trong công trình nghiên cứu v nấm v i tác phẩ “ ỏ mi n nam Vi Na ” Phạm Hoàng Hộ ă 1960 vắn tắt 48 chi, 31 loài nấm. Ở mi n bắc Vi t Nam, vi c nghiên cứu nấ ợc bắ ầ o ă 1954 tạ Đại học Tổng hợp Hà Nội v i các công trình tiêu biểu của Nguyễn Vă D ễ ă 1965 28 loài nấ ă ợc và 10 loài nấ ộc; T Vă Nă ă 1965 “N ứu nấm sống trên gỗ ng Hữu Lũ ”; T ịnh Tam Ki t v “ ầ u tra bộ Aphyllophorales vùng Hà Nộ ” o ă 1965 “S ộ u tra nghiên cứu các loài nấ ă và nấ ộc chính một số vùng mi n Bắc Vi Na ” o ă 1966 (T ị Ta o và T ị Ta K 2011

T ă 1978 ó 618 o ấm thuộ 150 ợc ghi nh n mi n Bắc Vi t Nam. Trong số ó ổi b L Dũ o ă 1977 t 22 o o “N ứu họ Polyporaceae mi n Bắc Vi Na ” (L Dũ 2003 ; L Vă L ễu (1977) phát hi n v 118 o o “Một số nấ ă ợc và nấ ộc rừ ” T eo T ị Ta o và T ị Ta K (2011

23

o

ă 1978 T ịnh Tam Ki t công bố “N ững dẫn li u v h nấm sống trên gỗ vùng Ngh A ” 90 loài nấm sống trên gỗ; và v ì “Nấm Vi t Nam (t 1 ” 116 loài nấ ng gặp Vi t Nam. Trầ Vă M o “Gó ần nghiên cứu thành phầ o ặ ểm sinh học của một số nấm phá gỗ vùng Thanh – Ngh - Tĩ ” ố 239 o (T ị Ta o và T ị Ta K 2011 Đ ă 1991 P a H Dục công bố “K t qu ầ u tra bộ Agaricales Clements trên một số ịa ểm thuộ ng bằng Bắc Bộ Vi Na ” a ụ 56 o (T ị Ta o và T ị Ta K 2011 ù ă 1991, Ngô Anh công bố ì “N ứu nấm Thành Phố Hu ” 104 o “Dẫn li c ầu v họ Coriolaceae Sing Thừa Thiên Hu ” a ục 60 loài và Phan Huy Dục công bố “Nấm phá hoại gỗ ng gặp trong rừng nhi i mi n Bắc Vi Na ” c gi a ục 39 loài nấm phá hoại gỗ Đ n ă 1994 này công bố “Một số loài nấm hoang dạ ợc dùng làm thực phẩm Vi Na ” ị ợ 16 o (T ị Ta o và T ị Ta K 2011 ù ă P ạ Q a T cứu một số ặc ểm sinh học của nấm lim Ganoderma lucidum ù Đ ắc Vi Na (T ị Ta o và T ị Ta K 2011 Nă 1995 T ịnh Tam Ki t và Lê cứu v họ nấm Linh “N ững nghiên X T o chi Ganodermataceae Donk Vi Na ” a c gi a ục 43 loài nấ L o ó ó 10 o i ghi nh n cho lãnh thổ Vi t Nam và biên soạ sa “Nấm Linh chi Ganodermataceae Donk – ngu ợc li u quý Vi Na ” (T ị Ta o và T ị Ta K 2011 Nă 1996 T ịnh Tam Ki t và Ngô Anh báo cáo v họ nấm Linh chi Ganodermataceae Donk mi n Trung Vi t Nam tại hội nghị quốc t v nấm tại Nh t B n v i 30 loài L o ó ó 20 o i ghi nh n lầ ầu tiên cho khu h nấm mi n Trung Vi Na (T ị Ta o và T ị Ta K 2011 ù ă ó Ngô Anh nghiên cứu thành phần loài nấm sống trên gỗ Thừa Thiên Hu công bố 172 loài nấ o ó ó 6 o i ghi nh n lầ ầu cho khu h nấm Vi Na (T ị Ta o và T ị Ta K 2011 Nă 1998 N Anh và Lê Thứ o o “Dẫn li ầu v họ Hymenochaetaceae Donk Thừa Thiên Hu ” 39 o o ó 10 o i ghi nh n cho khu h nấm Vi Na (T ị Ta o và T ị Ta K 2011 ù ă N A o cáo tổng k tài nghiên cứu cấ s “N ứu khu h nấm (Macrofungi) Thừa Thiên Hu ” i 272 loài nấ o ó 46 o i ghi nh n cho khu h nấm Vi Na (T ị Ta o và T ị Ta K 2011 Nă 1998 T ịnh Tam Ki t công bố ặ ểm khu h nấm Vi t Nam “ a a e s a e G o z o a V e a s” a ục khu h nấm Vi t Na “P e a e s o a o o V e a ” i 837 loài nấm Vi Na ợc công bố và ghi nh (T ị Ta o và T ị Ta K 2011). Hội nghị Sinh học toàn quốc Hà Nộ o ă 1999 N A o o “N ứu họ nấm linh chi (Ganodermataceae) Thừa Thiên Hu ” m 35

24

loài thuộc 2 chi Ganoderma và Amauroderma o ó 10 o i ghi nh n cho khu h nấm Vi Na ” (T ị Ta o và T ị Ta K 2011

T eo T ị Ta o và T ị Ta K (2011 Hội nghị Sinh học Quốc Gia, những vấ n trong nghiên cứu sinh họ o ă 2000 Trịnh Tam Ki N A G a e Do e ố “N ững dẫn li u bổ sung v thành phần loài và hoá các hợp chất tự nhiên của khu h nấm Vi t Na ” o ó ố 65 loài m i của khu h nấm Vi t Nam và báo cáo v các hợp chất tự ợc nghiên cứu 25 loài nấm Vi t Nam, o ó 10 ấu trúc m i v các hợp chất tự nhiên nấm Vi Na ợc x ị L Dũ (2001 ố “T ần loài của chi Hexagonia Fr. ù T N ” 5 o o ó Hexagonia rigida Berk. là loài m i cho khu h nấm Vi t Nam. Hội th o quốc t sinh học ă 2001 ại Hà Nộ ó o o : N A i công ì “Sự a ạng v công dụng của khu h nấm Thừa Thiên Hu ” m 326 loài trong 6 nhóm nấm có ích và có hại; Phan Huy Dụ o o “Nấm (Macromyces) n Quố G a Ta Đ o Vĩ P ” ố 41 loài, 17 họ trong 2 l p Ascomycetes và Basidiomycetes; Trịnh Tam Ki t và Henrich Dorfelt báo o “ a o i ghi nh n cho khu h nấm Vi Na ĩa ủa h thống sinh thái của ” ố 9 loài m i cho lãnh thổ Vi t Nam. Tổng k o ă 2001 ó 1250 o ộc khu h nấm Vi Na ợc công bố.

2.6.2 Các nghiên c u về nấm ăn v nấm dƣ c liệu ở Việt Nam

Nấ Lentinula edodes là một thực phẩm chứ ă Nă 1994 nấ ợc nghiên cứu hoàn chỉnh qui trình s n xuất trên mạ a ao s Nă 1998 ấ ợc lai giữa chủng Cao Bằng và chủng nh p từ Nh t, tạo ợc chủng lai chịu nhi t (25-30oC) phù hợ u ki n khí h u Vi t Nam (Phạm Thành Hổ, 2002).

Linh chi là một loài nấ ợ ợc nuôi tr ng từ nhữ ă 1990 nhi u tác gi ứu một số thành phần và hoạt chất sinh học và ti m ă u trị một số b nh (Nguyễn Thị 2005 N o a ò ă ò ộng bột sinh khối và bào tử (Trịnh Tam Ki 2011 a ạng di truy n (Nguyễn Thị H ng Nụ et al., 2005).

Nấm hầu thủ ( ầu khỉ) Hericium erinaceus ũ ực phẩm chứ ă có giá trị cao. Cổ Đức Trọng thuộc Trung tâm Nghiên cứu Linh chi và nấm ợc li u (Bộ Y t ) tr ng thử nghi m thành công dòng nấm hầu thủ chịu nhi t do ông chọn ra tạ ì D TP H M ực hi n dự “S n xuất ẩm dòng nấm hầu thủ chịu nhi t (Hericium erinaceus) tại Thành Phố H M ” Dự ợc nghi 11 ă 2007 i k t qu chủ y u: s n xuấ ợc 16.000 kg nấ 1 600 ấm khô ất khẩu 200 kg nấm khô (Cổ Đức Trọng, 2007).

25

Nấ ụa bạc Volvariella bombycina, mà trên th gi a ó báo v kỹ thu t tr ng, từ nhữ ă 1990 ợc phân l p Vi Na ợc nghiên cứ ặ ểm sinh học và tr ng thành công quy mô 400 bịch phôi u cho ra qu thể (Phạm Thành Hổ, 2002) (Tran Thị Kim Dung, Pham Thanh Ho, 2009).

Các loài nấ ă ợc li ấ o N t Pleurotus eringii (nấ ù ấm ngọc trâm Hypsizygus spp, … ũ ợc nghiên cứu.

26

CHƢƠNG 3

PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PH P NGHI N C U

3 1 Phƣơng tiện nghiên c u

3.1.1 Thời gian v ịa iểm

Th i gian: Từ ă 2014 ă 2017

Địa ểm: Mẫu nấ ợc thu th p vùng rừng núi An Giang, nuôi tr ng tạ A G a ị ộc tính, giá trị ỡ ợc chấ ịnh danh phân tử tạ Đại học Cầ T

3.1.2 Nguyên vật liệu

Các mẫu nấm l n thu từ vùng rừng núi An Giang.

Mạ a ao s a ạ ì P c.

Phụ gia phối trộn: trấu, lúa, gạo lứ c dừa, bột bắ u xanh.

3.1.3 Hóa chất

Acetic acid (Tây Ban Nha), Ethanol (Vi t Nam), Glacial acetic acid (Trung Quốc), HCl (Trung Quốc), H2SO4 ặc (Trung Quốc), NaOH (Trung Quốc), Phenol (Trung Quốc), D-Glucose (Trung Quốc), Saccharose (Trung Quốc), Pepton (Trung Quốc), Methanol (Trung Quốc), Vanillin (Trung Quốc), Olenolic acid (Trung Quốc), Perchloric acid (Trung Quốc), Dextrose (Trung Quốc), MgSO4.7H2O (Trung Quốc), Yeast extract (Trung Quốc), K2HSO4 (Trung Quốc) và một số hóa chất cho các thí nghi m sinh học phân tử.Hóa chấ ng phân l p giống nấm: D-Glucose, dịch chi t nấm men, Pepton, Agar, saccharose, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, CaCO3, ure, DAP (Diamoni Phosphate).

Hóa chấ ù ể trích DNA: Dung dịch Lysis Buffer ly trích (100 mM Tris, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% w/v CTAB), dung dịch TE 0,1 X, ethanol 70% và 96%.

Hóa chất dùng kiểm tra sự hi n di n của DNA: Agarose, dung dịch TE 1X, Ethidium Bromide, Loading buffer.

Hóa chấ P R: Ta o e ase Đoạn m i, BiH2O, MgCl2, dNTPs, Buffer.

3.1.4 Thiết bị và d ng c

ể (Me e Đứ (A a N (Sa o s Đứ ò só (LG H Q ố o H (E tech, Malaysia), a ổ (T e o Ge es s UV10 USA (He e Đứ ắ (New sw s e USA o e (Ve Ý ử ù (P I e a o a Ý ủ ạ (H s j N ủ ạ (Sa o N ủ sấ ( e Đứ M ị P R ủ sấy, tủ cấy,

27

tủ lạ ĩa e ì a ụng cụ và thi t bị ng dùng trong phòng thí nghi m.

3 2 Phƣơng ph p nghi n c u

3 2 1 Sƣu tầm m t s loài nấm lớn ở vùng rừng núi Thất Sơn n Giang iều tra khảo s t ịa phƣơng tìm ra c c lo i nấm sử d ng ƣ c, ịnh danh các loài nấm này

3.2.1.1 Thu thập mẫu nấm lớn

Mục đích: s ầm trên 20 loài nấm l n vùng rừng núi Thấ S A

Giang, l p bộ s p giống.

Cách tiến hành:

Chọn mẫu

Kh o sát thự ịa 7 dãy núi: Núi Cấ N D N P ng, Núi Dài Nă G N K N T N N c tại khu vực rừng núi Thấ S A G a ể thu mẫu. Chọ ao ò oa s ữ ể a a thác du lị ể kh o sát, thu các loài nấm hoang dại vào th 6 ( ầu mùa a 8 ( ữa ùa a 10 ( ố ùa a ỉ thu những mẫu nấm mọc ngoài thiên nhiên không thu những mẫu nấ o i dân tr ng.

Phƣơng ph p thu mẫu

Mỗi dòng nấm thu kho ng 5 mẫ ối v i mẫu nấm xuất hi n nhi u, thu

tất c ối v i mẫu nấm hi o o ũ ựa ịnh hình thái ngoài.

Đị a s ộ dựa vào hình thái bên ngoài, v i ì n cho

u tra nấm ngoài thiên nhiên theo chuẩn quốc t (Trịnh Tam Ki t, 2011)

Phƣơng ph p phân tích c c dữ liệu hiển vi

Quan sát t o i kính hiển vi quang học ị 40X ộm t

bào nấm v i dung dịch Lactophenol cotton blue. Ghi nh n các chỉ tiêu sau:

Đ m bào tử: Hình dạ c, màu sắc, cấ ( m

dày hay mỏng, bắt màu hay không bắt màu, nội chất bắt màu hay không)

Bào tử: Hình dạ c, màu sắc, cấ ( m dày hay mỏng, mấy l p, giữa hai l p có tầng cột chống hay không, có giọt nội chất hay không, nội chấ ó a …

Xử lý và bảo quản mẫu:

V i mẫ : sa a s , chụp nh, phân loại nấm xác

ịnh tên và phân nhóm nấm thu th ợc.

B o qu n mẫu khô: sấy mẫu nhi ộ 45oC , b o qu n mẫ o ũ

nhựa cùng v i chất hút ẩm.

B o qu n mẫ : ẫu trong dung dịch formol 15%.

28

Chỉ tiêu theo dõi:

Ghi nh n giá thể n các loài nấm l n bằng hình nh Ghi nh n theo nhóm các loài nấm thu th ợc g m bốn nhóm: Nấm

ă ấ ợc li u, nấ ộ a õ oại.

3 2 1 2 Điều tra khảo sát các loài nấm ngƣời dân ã từng sử d ng

M c ích S ển các loại nấm m ợ ịa sử

dụ a ợc nuôi tr ng Vi t Nam.

Cách tiến hành

Tham kh o ịa một số loại nấm hoang dại có thể ă ợ a ợc nuôi tr ng Vi t Nam. Tổng số có 11 hộ ịa ợc phỏng vấ ể thu th p thông tin theo phi u kh o sát (Phụ lục B)

B ng 3.1: B ng kh o sát thông tin nấm l n từ ịa

…

…

Cách ứ sử ụ T ịa ( ộ ổ T ọ ấ eo ịa G ể ấ ấ Số ầ ấ ấ ( ao ợ / ă G ị ỡ / ợ eo

…

…

… … A

… … B

3 2 1 3 Định danh theo hình thái các mẫu nấm ƣ c chọn

Dựa theo ì o u tra nấm ngoài thiên nhiên theo

chuẩn quốc t (Trịnh Tam Ki t, 2011, 2012, 2013).

3 2 2 X c ịnh c tính cấp, phân lập và giải trình tự ITS các loài

nấm ăn v nấm dƣ c liệu hoang d i không ch a c tính.

3 2 2 1 X c ịnh c tính cấp các mẫu nấm ăn ƣ c ho c có giá trị

dƣ c liệu ƣ c chọn từ ngƣời dân ịa phƣơng

X ị ộc tính cấp theo Vi D ợc li u, Bộ Y t : P nghiên cứu tác dụ ợc lý của thuốc từ ợc th o, 2006 và tài li u của Đỗ T Đ P ị ộc tính cấp của thuốc, 1996.

c thực hi n: Cân trọ ợng mẫ ẫu sấy 60o a ng

3.2

29

Mẫ ủa mỗi loại nấ ợc chia thành hai phần bằng nhau và chi t

xuất v a c v i c n 96% theo tỉ l 1:10 B ng 3.2: Khố ợng nấ ấ sấy 60o a

Tên

Khố ợng mẫ ( Khố ợng mẫu khô (Sau khi sấy 60oqua (

Nấm linh chi tầng 750 320

Nấ ợng hoàng 500 340

Nấm vân chi 750 310

Nấm dai 750 260

Nấm mộc bá huê 750 270

P t xuất: Cao chi c: Chi ó : Đ ủy 60o trong 1 gi v c

cất. Cô cách thủy 60oC

Cao chi t c n: Chi t lạnh: Ngâm 72 gi v i c n 96%. Cô cách thủy 60o

K t qu chi t xuấ ợc tóm tắt trong b ng 3.3

B ng 3.3: Khố ợng cao nấm sau khi chi t xuất

Tên Khố ợ ao ợc (g)

Khố ợng nấm a ầu (g) Cao chi c Cao chi t c n

27,2g 11,7g Nấm linh chi tầng 160g

28,9g 12,4g 170g

Nấ ợng hoàng

27,3g 11,5g Nấm vân chi 155g

27,5g 11,4g Nấm dai 130g

28,2g 11,9g Nấm mộc bá huê 135g

Động v t nghiên cứu: Chuột nhắt trắ ực 5-6 tuần tuổi, trọ ợng 22±2 ợc ổ ịnh ít nhất 1 tuầ c khi ti n hành thí nghi m. Thể tích cho chuột uống 20ml/kg thể trọng chuột và không quá 0,5ml/chuột

Chia chuột thành các lô thí nghi m, mỗi lô 5 co ựa vào các lô bất ứng hay toàn ứng (ch t hay sống) ghi nh n sau 72 gi sau khi cho chuột sử dụng cùng một li u kh o sát. Ti p tục theo dõi chuột trong 14 ngày, ghi nh n những tri u chứng bấ ng (n u có). Thí nghi m lặp lại 2 lần.

30

Có 3 t ng hợp có thể x y ra:

Chuột nhắ a ự, những chuột cùng một lô sẽ nh n cùng một li u chất kh o sát. Sự ựa vào ph n ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay ch t) nh n thấy mỗi chuột trong nhóm sau 72 gi . Chuột ợc ti p tục theo dõi sau 14 ngày uố ể ghi nh n những tri u chứng bất ng (n ó ó 3 ng hợp có thể x y ra:

Trường hợp 1: Sau khi cho chuột uống mẫu thử, số chuột trong lô thử nghi m vẫn b o o ịnh li u cao nhất có thể a làm ch t chuột. Li ợc ký hi u là Dmax và li ối an toàn DS dùng trong các thực nghi ợc lý có thể bằng 1/5 Dmax hoặc l 1/5 Dmax.

Trường hợp 2: Sau khi cho chuột uống mẫu thử, tỉ l tử vong là 100% thì u ch t tuy ối – LD100. Tính toán và gây lô thử nghi ể ti p tục ị ợc li u không làm ch t con v t nào – LD0. Từ ó s a u LD50 ợc tính theo công thức Karber - Behrens.

Trường hợp 3: Sau khi cho uống mẫu thử, phân xuất tử vong thấ 100% ị ợc li u gây ch t tuy ố Đối v ng hợp này, không thể suy ra li u LD50 ó ể ị ợc li u tố a ch t chuột, gọi là li i li u ch t – LD0. Li ối an toàn DS dùng cho thực nghi ợc lý có giá trị bằng 1/5 hoặc 1/10 LD0.

Chọn các mẫu không chứa ộc tính ti n hành các thí nghi m ti p theo

3.2.2.2 Phân lập các gi ng nấm không ch a c tính ƣ c chọn ở

trên

Theo Nguyễ L Dũ (2003 ng phân l p giống thuần và

kh o sát h sợ ng thạch PDA (Potato Dextrose Agar).

Cắt lấy 1 cm2 thịt nấ o ũ oặc thân nấm, chuyển vào giữa ống nghi m có chứa PDA ử trùng, ủ nhi ộ 25- 30oC và kiểm tra mỗ K ấm mọc lan ra từ mô nấ ấy, ti n hành kiể a ộ thuần của t ấ ằ a ẫ oạ ấ oặ s o ố ộ a ủa các mẫu nấm, ghi nh n k t qu

3 2 2 3 Định danh các mẫu nấm ƣ c chọn bằng phƣơng ph p sinh

học phân tử

Mẫ ịnh là 4 loài nấ ợc chọn nội dung trên, mỗi loài nấm chọn 3 dòng. Ở thí nghi m này có tất c 12 dòng nấ ợc chọn ti n hành gi i trình tự. Thực hi n ph n ứng PCR và gi i trình tự oạn gen ITS theo ủa White et al., 1990.

PCR và giải trình tự o n gen ITS:

31

Thu sinh khối: thu sinh khối nấm sau 2 ngày nuôi cấy lắ ng

PDA lỏng, nghi n mịn sinh khối v ỏng và cho vào eppendorf 2mL.

Ly trích DNA

Cho 600µL dung dịch ly gi i t bào vào mỗi eppendorf, vortex mẫu, ủ

65oC trong 1 gi , cách 20 phút lắc 1 lần trong quá trình ủ.

Lấy mẫu ra khỏi bể ổn nhi t, thêm ti p 450µL hỗn hợp g m Phenol, Chloroform, Isoamyl Alcohol (25:24:1) vào eppendorf, lắc nhẹ o u ể 5 phút nhi ộ phòng.

Ly tâm v i tố ộ 13000 vòng/phút trong 5 phút nhi ộ 4oC, hút 300

– 400µL dịch nổi chuyển sang tube m i.

Thêm 180 – 240µL isopropanol lạnh vào dịch mẫ ( m b o thể tích isopropanol gấp 0,6 lần thể tích dịch nổi) và ủ -20o o 20 sa ó tâm v i tố ộ 13000 vòng/phút trong 7 phút nhi ộ 4oC.

Hút bỏ dịch nổ ể thu tủa e e o

Rửa tủa 2 n 3 lần bằng Ethanol 70%.

P ẫ sa ó o qu n trong 50µL dung dịch TAE 0,5X và trữ

lạnh -20oC.

Kiểm tra DNA tổng số ( n di hoặ o ằng máy quang phổ)

B ng 3.4: Thành phần một ph n ứng PCR thể tích 25µL

N ộ ph n ứng Thành phần Thể (μL

10X buffer 1X 2,5

dNTP 200μM 0,5

Taq polymerase 0,05units/μL 0,25

M i ITS1 0,2μM 0,5

M i ITS4 0,2μM 0,5

Mẫu DNA 200pg/μL 1

N c cất 19,75

25 Tổng thể tích ph n ứng

Khu ạ oạn ITS bằng PCR v i cặp m i:

ITS1 (5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’

ITS4 (5’ – TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’

( : W e et al., 1990)

32

Thiết lập chu trình nhiệt:

94oC 94oC

72oC 72oC 30’’ 5’ 56oC 2’ 10’

4oC 35’’

∞ 35 chu kỳ

Hình 3.1: Chu trình nhi t của ph n ứng PCR v i cặp m i ITS1 – ITS4 Chu kỳ nhi ợc thi t l sa : 94o o 5 ể kh ộng quá trình PCR, ti n là 35 chu kỳ v ì : 94oC trong 30 giây, 56oC trong 35 giây, 72oC trong 2 phút c kéo dài cuố ù ợc thực hi n v i 72oC trong 10 phút. Đ n di s n phẩm PCR trên gel agarose 1,2%, th i gian 30 sa ó n hành chụp hình gel.

Gi i trình tự DNA: mẫ ợc g i gi i trình tự tại công ty Macrogen, Hàn

Quốc.

X ịnh trình tự eo ì LAST ( as Lo a

Aligement Search Tool).

X ịnh loài: k t hợ ặc tính hình thái và k t qu ng trình tự

oạn ITS v i các trình tự trên ngân hàng gen NCBI.

Qua hai nội dung nghiên cứu trên chọn lựa 4 loại nấm có giá trị ti n hành

các thí nghi m ti p theo.

3 2 3 X c ịnh thành phần dinh dƣỡng dƣ c tính c tính bán trƣờng diễn và thử t c ng kh ng ung thƣ của loài nấm dƣ c liệu trên dòng t b o ung thƣ m u v ung thƣ i trực tràng

Mụ : ển chọn một loại nấ ă ó ị ỡng cao và một

loại nấ ợc li ó ợc tính cao.

3 2 3 1 X c ịnh thành phần dinh dƣỡng b n loài nấm ƣ c tuyển

chọn

Mục đích: X ịnh thành phầ ỡng có trong bốn loại nấ ợ s ển nộ 2 Q a ó tuyển chọn một loại nấ ă ột loài nấ ợc li ó ỡng cao.

Cách tiến hành: Đị ợ ầ ị o ẫ ằ sắ ỏ sắ ỏ ao X ịnh hàm ợng chất béo, chấ ạm, các loại vitamin A, vitamin C, thành phần amino a o ợng canxi, sắt, kẽm, kali.

33

3 2 3 2 X c ịnh h m lƣ ng dƣ c tính

Mục đích: X ịnh thành phầ ó ợc trong hai loại nấ ợc li ợ s ển nộ 2 Q a ó ển chọn lại một loại nấ ợc li ó ợc tính cao.

Cách tiến hành: Đị ợ ầ ị o ẫ ị ợ e e o ợ ng khử ng tự o ị ợng polysaccharide.

a) Định lƣ ng triterpenoid theo phƣơng pháp cân

P ị ợ e e o eo ( e and Y 1993 ợ ( ợ a ỏ ằ ỹ ấ 45% ( ỉ 1:20 T ị ợ o ắ ( ọ ợ sấ ọ ợ ắ e a o 45% ( e e o sa ó òa a ắ ể oạ

oạ eo ộ ự ă ầ ầ ợ môi diethyl ether, n- a o T e e o ủ ng trong oạ - a o V ợ e e o o ầ ũ ố ợ ao - a o ắ

Mỗ oạ ứ ừ ợ ể a oạ ấ ứa o oạ ó ằ eo õ ấ sắ ỏ sa ố ử H2SO4 10% /E OH sấ 110oC/ 10 phút.

P oạ - a o ợ ể oạ ợ

50o ể ắ e e o o ầ ạ ộ

b) X c ịnh h m lƣ ng polysaccharid ƣờng khử ƣờng tự do

Bộ ợc li ợc chi t h c trong 6 gi (tỉ l ợc li u: c là 1:20). Lấy dịch chi sa ó ủa bằng c n 96% (tỉ l c: c n là 1:5). Thu nh n k t tủa. Sấy khô tủa, thu nh n polysaccharid thô. P ị ợ ng tự do bằng phenol-sulfuric acid theo Lâm Thị Kim Châu và ctv (2004)

Cách ti n hành:

Đ ng chuẩ ose: 0 1 ose òa a o 100 c cất, ợc dung dịch glucose chuẩ 0 1% D ng chuẩ ợc pha v i các n ộ 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 g/mL bằng cách hút lầ ợt 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 mL dung dịch glucose chuẩn 0,1% và lầ ợ ịnh mức thành 100 mL bằ c cất.

Mẫu thử o sa a ợc pha v i n ộ 100 g/mL, 150 g/mL và

200 g/mL

34

V i mỗi một n ộ ng và n ộ mẫ a 0 5 mL dung dịch mẫu cho vào ống nghi m r i thêm vào 0,5 mL dung dịch phenol 5% Sa ó o o ống nghi m 2,5 mL H2SO4 ặ 96% Để 10 phút r i lắc và giữ nhi ộ phòng 10-20 ể xuất hi n màu. Màu b n vững trong vài gi X ị ộ màu trong quang phổ k c sóng 490 nm. Ống trắng v 0 5 L c cất thay th cho dung dị ố o polysaccharide.

Cách tính k t qu : ạ o ng chuẩ ose ể suy ra ợng

ng trong mẫu theo công thức:

H ợ ng tự do (%) = [N ộ ng tự do chứa trong mẫu

(g/mL)/ n ộ mẫu (g/mL)] x 100

X ị ợ ng khử bằng acid 3,5-dinitro salicylic theo

Miller (1959)

Đ ng chuẩn glucose: Pha dung dịch glucose mẫu 500 (g/mL): cân 50 mg D-glucose pha v c cấ ịnh mức t i 100 mL. Từ dung dịch glucose mẫu, pha các dung dịch glucose chuẩn có n ộ từ 100 n 500 g/mL.

Mẫu thử o sa a ợc pha v i n ộ 1000 g/mL, 1500 g/mL

và 2000 g/mL.

Cho 0,5 mL dung dịch D-glucose chuẩn hay mẫu thử vào ống nghi m. Thêm 0,5 mL thuốc thử DNS Đ ủy trong 3 phút, làm lạ n nhi t ộ phòng thí nghi m, thêm vào mỗi ống nghi 5 L c cấ o ộ quang c sóng 540 nm. Ống trắng dùng 0,5 c thay cho dung dịch ng.

Cách tính k t qu : N ộ ng khử trong mẫ ợ ịnh nh

ng chuẩ ose H ợ ng khử ợc tính theo công thức:

H ợ ng khử (%) = [N ộ ng khử chứa trong mẫu

(μ / L / ộ mẫ (μ / L ] x 100

So s ợng triterpenoide, polysaccharide ử ự o ể ọ a oạ ấ ó ợ ao ộ ễ

3 2 3 3 Đ nh gi c tính b n trƣờng diễn của nấm.

Mụ : ị ợc dòng nấm hoang dại m ợc tuyển chọn

ó ộ ng diễ ể nghiên cứu quy trình nuôi tr ng.

Cách ti n hành:

X ịnh các chỉ n v ỡ ợc lý theo Vi D ợc li u – Bộ Y T : “P ứu tác dụ ợc lý của thuốc từ D ợc th o” (Nhà xuất b n Khoa học và Kỹ thu t, 2006). Tuyển chọn một loại nấm

35

ă ó ị ỡng cao và một loài nấ ợc li ó ợc tính cao. Kh o s ộ ng diễn của hai loài nấ ợc tuyển chọn theo h ng dẫn thử lâm sàng-ti n lâm sàng - QĐ 141-2015 ủa ộ Y T

Động v t nghiên cứu: Chuột nhắt trắ ực và cái chủng Swiss albino ng thành (4-5 tuần tuổ ợc cung cấp b i Vi n Vắc xin và Sinh phẩm Y t N a T a ợ ể ổ ịnh ít nhất một tuầ c khi thử nghi m. Chuột nuôi trong các l ng nhựa (22 x 34 x 25 cm), mỗi l ng 8 con chuộ ợc ầ ủ bằng thực phẩ ợc cung cấp b i Vi n Vắc xin và Sinh phẩm Y t Nha Trang. Thể tích cho chuột uống là 0,1 mL/10 g thể trọng chuột. Th i gian cho chuột uống thuốc các thử nghi m kho ng 8 – 9 gi sáng.

Chọn chuột có trọ ợng 25 ± 2 g, chia ngẫ ối chứng cho chuột uố c cất, lô thử cho chuột uống cao chi t từ nấm li u 0,4 g/kg trọ ợng chuột. Chuộ ợc cho uống liên tục trong vòng 1 tháng. Lấy máu ĩ ạch ột xét nghi m (lấy máu vào buổ s c khi cho chuộ ă

Thời điểm xét nghiệm: c thử nghi m và sau 1 tháng.

Các chỉ tiêu đánh giá: trọ ợ ể, thông số huy t học (h ng cầu, hemoglobin, bạch cầu, công thức bạch cầu, tiểu cầu, các chỉ số a n h ng cầ M V M H M H RDW), thông số thuộc chứ ă a (GOT, GPT), protein toàn phần, triglyceride, thông số thuộc chứ ă n (creatinin, urea), kh o sát vi thể gan và th n.

Các bộ ị ợng protein toàn phần, triglyceride, urea, creatinin,

GOT GPT ợc cung cấp b H a Đức.

a) Kỹ thuật buồng ếm s lƣ ng hồng cầu, s lƣ ng b ch cầu,

hematocrit

P ị số ợ ầ số ợng bạch cầu, hematocrit

theo Phelan and Lawler (1997)

Chuẩn bị: Ống EDTA (ống chố Tiến hành thí nghiệm: Đo ằng máy sinh hóa: CELL - DYN 1700 của

Mỹ

b) Kỹ thuật ịnh lƣ ng GOT trong huyết tƣơng

Kỹ thu ị ợng GOT trong huy eo K e

(Bộ Y T , 2009)

GOT

Hoạ ộ GOT ịnh dựa trên ph n ứng sau:

MDH 36

α-Ketoglutarat + L-Aspatat L- Glutamat + Oxaloacetat Oxaloacetat + NADH + H+ L-Malat + NAD+

GPT

LDH

L-glutamate + Pyruvate 2-Oxoglutarate + L-alanine

L-lactate + NAD+ Pyruvate + NADH + H+

MDH a a e e o e ase o ộ gi m NADH c sóng 340 nm,

từ ó ợc hoạ ộ enzyme.

Chuẩn bị hóa chất

Huy t thanh (Heparin hoặc EDTA chố

SU : α-ketoglutarat, NADH, Natriumazid

BUF: TRIS buffer (PH 7,9), L-Asparaginsaure, LDH.

Tiến hành

Pha SUB và BUF theo tỉ l 1:4 ợc thuốc thử A.

Lầ ợt hút chính xác cho vào ống nghi m theo b ng 3.5

Trộn và ủ 1 Đọc k t qu o ò 3 o o s óa

bán tự ộng. B 3 5: T ầ ị ợ GOT o ộ 37oC

T ể (µL)

Mẫ ử 50

T ố ử A 500

c) Kỹ thuật ịnh lƣ ng GPT trong huyết tƣơng

Kỹ thu ị ợng GPT trong huy eo K e

(Bộ Y T , 2009)

Hoạt độ GPT xác định dựa trên phản ứng sau:

LDA a a e e o e ase o ộ gi m NADH c sóng 340 nm,

từ ó oạt ộ enzyme.

Chuẩn bị hóa chất

Huy t thanh hoặc huy (He a oặc EDTA chố

SUB: 2-oxoglutarate, NADH

BUF: TRIS buffer (pH 7,5), L-alanin, LDH (Lactate dehydrogenase)

TRIS: 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol

Tiến hành

Pha SUB và BUF theo tỉ l 1 : 4 ợc thuốc thử A.

37

Lầ ợt hút chính xác cho vào ống nghi m theo b ng 3.6

Trộ ủ 1 Đọc k t qu o ò 3 o o s óa

bán tự ộng. B 3 6: T ầ ị ợ GPT o t ộ 37oC

T ể (µL

Mẫu thử 50

Thuốc thử A 500

d) Kỹ thuật ịnh lƣ ng protein toàn phần trong huyết tƣơng

Kỹ thu ị ợng protein toàn phần trong huy eo

pháp Biuret (Gornall et al., 1949).

Io ng ph n ứng v i protein trong dung dịch ki m hình thành phức hợ ó a Độ m màu các phức hợp tỉ l thu n v i n ộ protein huy a ợ ịnh m ộ quang c sóng 546 nm.

Cu2+ + Protein K phức hợp màu xanh tím

Chuẩn bị hóa chất

Huy t thanh hoặc huy (He a oặc EDTA chố

Thuốc thử g m: sodium hydroxide, potassium sodium tartrate, copper

sulfate, potassium iodide, Irritant R 36/38

Tiến hành

Lầ ợt hút chính xác cho vào ống nghi m theo B ng 3.7

Trộ ể y 10 sa ó e o o s óa ự

ộng.

B 3 7: T ầ ị ợng protein toàn phần

Mẫ ắng Mẫ ẩn Mẫ ấ

Thuốc thử 1 mL 500 µL 1 mL

Dung dịch chuẩn 20 µL - -

Mẫu thử - 10 µL -

e) Kỹ thuật ịnh lƣ ng creatinin trong huyết tƣơng

38

Kỹ thu ị ợng creatinin trong huy eo La

(McEvoy-Bowe, 1966).

ea o ng ki m ph n ứng v i acid picric tạo thành hợp

chất màu cam. Creatinin + acid picric K hợp chất màu cam

Chuẩn bị hóa chất

Huy t thanh hoặc huy (He a ố

R1 (pha loãng NaOH theo tỉ l 1NaOH:4H2O)

R2 (Picric acid)

Tiến hành

Pha hỗn hợp g m R1, R2 theo tỉ l 1R1:1R2 ợc thuốc thử A.

Lầ ợt hút chính xác cho vào ống nghi m theo b ng 3.8

Trộ sa 10 e o o s óa ự ộng.

B 3 8: T ầ ị ợ ea ộ 37oC

T ể (µL

Mẫu thử 50

Thuốc thử A 500

f) Kỹ thuật ịnh lƣ ng urea toan trong huyết tƣơng

Kỹ thu ị ợng urea toan trong huy eo

Berthelot (Fawcett and Scott, 1960)

urease

(NH2)2CO + H2O 2NH3 + CO2

Amonium + Salicylate + Hypochlorite sodium  Indophenol có màu xanh

(2,2 – Dicarboxylindophenol )

Chuẩn bị hóa chất: Huy t thanh hoặc huy (He a ố

RGT1: Phosphat buffer (pH 7), sodium salicylate, sodium nitroprussiate,

EDTA

RGT2: Phosphate buffer (pH <13), sodium hypochlorid.

ENZ: urease

Tiến hành

39

Pha hỗn hợp g m RGT1 và ENZ theo tỉ l 100 mL RGT1:1mL ENZ

ợc thuốc thử A. Lầ ợt hút chính xác cho vào ống nghi m theo b ng 3.9

B 3 9: T ầ ị ợng urea

Mẫ ắ Mẫ ấ

Mẫ / ấ ẩ - 10µL

T ố ử A 1000 µL 1000 µL

T ộ ủ 5 20 – 25oC

RGT2 1000 µL 1000 µL

T ộ ủ 10 20 – 25o o o s óa ự ộ

g) Kỹ thuật ịnh lƣ ng triglyceride toàn phần trong huyết tƣơng

lipases

theo phƣơng ph p GPO-PAP

Triglycerides Glycerol + fatty acids

GPO Dihydroxyacetone phosphate + H2O2

Glycerol + ATP GK Glycerol-3-phosphate + ADP

Glycerol-3-phosphate + O2 H2O2+ 4-aminoantipyrine POD Quinoneimine + HCl + H2O +4-chlorophenol

Chuẩn bị hóa chất:

Huy t thanh hoặc huy (He a EDTA a a e ố

Thuốc thử: PIPES buffer (piperazine-N N′-bi(acid 2-etansulfonic)), 4- lipase, triphosphate),

chlorophenol, 4-aminofenazona, ATP (Adenosine peroxidase, glycerol kinase, glycerol-3-phosphate oxidase, magnesium ions.

Tiến hành

Lầ ợt hút chính xác cho vào ống nghi m theo b ng 3.10

Trộ ể yên 10 phút r o o s óa ự ộng.

Các số li ợc biểu thị bằng trị số trung bình M ± SEM (Standard Error of Mean – sai số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý thống kê bằng phần m m SigmaStat-3.5 dựa vào phép kiểm Student t-test v ộ tin c y > 95% (P < 0,05).

40

B 3 10: T ầ ị ợng triglyceride

Mẫ ắng Mẫ ẩn Mẫ ấ

Thuốc thử 1 mL 1 mL 1 mL

N c cất 10 µL - -

Dung dịch chuẩn - 10 µL -

Mẫu thử - - 10 µL

3.2.3.4 Phƣơng ph p nh gi khả năng c chế sự tăng trƣởng tế

b o ung thƣ của dịch cao chiết nấm.

a) Nguyên vật liệu:

Dòng t bào ung K562 (AT Mỹ ò o

ại trực tràng HTC116 (AT Mỹ

Cao chi t nấ ( ạng bột), c n 96o

Hóa chất nuôi cấy t bào:

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (S a Mỹ

RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) (S a Mỹ

Trypsin EDTA (S a Mỹ

MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)

(S a Mỹ

Dụng cụ nuôi t o: Đĩa 96 ng (Corning), bình droux 25 cm2

(Corning), ống falcon 50 mL, 15 mL (Corning),...

b) Phƣơng ph p thực hiện

Thí nghi ợc ti ĩa 96 ng v i các n ộ khác nhau của dịch cao chi t nấ ợ a o 7 ầ eo 2 ộ lặp lại 8 lần, n ng ộ a ầu của dịch cao chi t là 5000 µg/mL (trên t o K562 và là 1000 µg/mL (trên t o ại trự HT 116 Đối chứng (Đ o ợc xử lí v i dịch cao chi t nấm. Ngoài ra, có nhóm t o ợc xử lí v ng n ( ng nuôi cấy t bào có bổ sung c n 96 ộ theo tỉ l a ao t). M ộ t o a ầ a o ất c các gi ng của ĩa 96 1 x 104 t bào/gi /100 μL ng sử dụng trong thử nghi m là RPMI 1640 (t o DMEM ( o ại trực tràng). Sau 72 gi xử ng ức ch sự ă ng t bào ủa dịch cao chi t nấm dựa vào số ợng t bào sống (giá trị OD595) a MTT Bố trí thử nghi ợ ì ì 3 2 Đặc tính ức ch sự ă ng t o ủa dịch cao chi ợ

41

giá qua kh ă m sự sống của t o ợ ịnh dựa trên hình thái t bào và kh ă bào sống sót khi so v i t bào các gi ối chứng (Farha et al., 2013)

Thử nghi ă sống của t o ợc gọi là MTT, ầ ợc mô t b i Tim Mosmann vào 1983. T bào sống có kh ă chuyển hóa dạng khử của muối tetrazolium (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide, hay MTT) (có màu vàng) - ợc dùng làm chất chỉ thị màu.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

: ối chứng - cột 1 và cộ 2 ( ng nuôi cấy t bào)

: ng n n - cột 3 và cột 4 (c 96 ợc pha loãng bằ ng nuôi t bào, tỉ l a o ố ỉ l pha cao chi t nấ ể ạt n ộ cao nhất trong thử nghi m

: Cao chi t có n ộ cao nhất - cột 5 (dịch cao chi t n ộ 5000 µg/ml (trên t bào K562 và n ộ 1000 µg/mL trên t bào HTC 116)

: Cao chi ó ộ pha loãng 1/2 - cột 6 (dịch cao chi t n ộ 2500 µg/mL (trên t o K562 ộ 500 µg/mL trên t bào HTC 116)

: Cao chi ó ộ pha loãng 1/4 – cột 7 : Cao chi ó ộ pha loãng 1/8 - cột 8

: Cao chi ó ộ pha loãng 1/16 - cột 9

: Cao chi ó ộ pha loãng 1/32 - cột 10

: Cao chi ó ộ pha loãng 1/64 - cột 11

: Cao chi t có ộ pha loãng 1/128 - cột 12

Pha loãng bậc 2 (từ trái qua phải, c t 5  c t 12)

Hì 3 2 S bố trí các nghi m thứ ịnh kh ă

ủa dịch cao chi t nấ ĩa 96 ng.

42

Những t bào sống chứa các enzyme dehydrogenase cần trong hoạ ộng hô hấp t bào, chúng có thể khử MTT thành formazan - một loại tinh thể a ó m. Tinh thể formazan có thể ợc hòa tan bằng sử dụng một dung môi thích hợ ộ hấp thu của t o ợc do c sóng 500-600 nanometer. Màu dung dị m cho thấy số ợng t bào sống càng nhi u

Chỉ ti u nh gi

N ộ dịch cao chi t làm t o t.

3.2.4 N i dung 4 Nghiên c u quy trình công nghệ nu i trồng ho n

chỉnh 2 chủng nấm ã ƣ c tuyển chọn.

Mẫu nấ ợc nhân giống cấp I, cấp II, nuôi tr ng theo Nguyễn Lân

Dũ (2003

Mục tiêu: Hoàn thi n quy trình nuôi tr ng loài nấ ă ó ị dinh

ỡng và nấ ợc li ó ộ ng diễn.

Cách tiến hành: thí nghi m v i các loạ ất khác nhau ể ì a ất thích hợ o ì s ng, phát triển h sợ ì ể qu nhanh nhất và hi u qu nhất của hai dòng nấ ợc tuyển chọn .

3.2.4.1 Quy trình công nghệ nuôi trồng nấm ăn

a) Thí nghiệm 1 X c ịnh m i trƣờng cấy chuyền nấm ăn t t nhất.

Mụ : ọ ợ ng cấy chuy n thuần hóa giống nấ ă ốt

nhất.

Thí nghi ợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên v i 4 nghi m thức và 5 lần lặp lại.

Chuẩn bị môi trường.

i trƣờng Raper: Cao nấm men 2 g, Pepton 2 g, KH2PO4 0,46 g, K2HPO4 1 g, MgSO4.7H2O 0 5 a a 20 ose 20 c cấ ủ 1000 mL (Nguyễ L Dũ 2003 o ất c các thành phần của ng vào n i, nấu sôi, khuấ u cho tan ti p theo cho agar vào khuấ a ổ vào ống nghi m hấp thanh trùng 121oC trong 15 phút.

i trƣờng PDA: Khoai tây 200 g, D- ose 20 a a 20 c cất

ủ 1000 mL (Nguyễ L Dũ 2003 ự ng Raper

i trƣờng PDA bổ sung nƣớc dừa: Chuẩn bị ng PDA

ù c dừa a c cất.

i trƣờng PDA bổ sung mu i khoáng: Khoai tây 200 g, D-glucose 20 g, agar 20 g, KH2PO4 3 g, MgSO4.7H2O 1 5 V a 1 0 01 c cất ủ 1000 mL) chuẩn bị ự ng Raper.

43

Tiến hành cấy mẫu

Cấy chuy n mẫu nấ ă p nộ 2 o

chuẩn bị. Mỗi loạ ng cấy 5 ống nghi m.

Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự a ủa giống nấ ng và kh o s ộ a ì ng bằ o ộ sâu của sự a ( eo ừng ngày thứ 3, thứ 5, thứ 7 ừ ấ G nh n và so sánh th a a ủa giống nấm. Chọ o ấm lan nhanh và dày nhất, ti p tục cho thí nghi m ti p theo.

b) Thí nghiệm 2: Kh o s ng nhân giống nấ ă

Mụ : ọ ợ ng nhân giống nấ ă ù ợp nhất

Thí nghi ợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên v i 4 nghi m thức và 5 lần

lặp lại.

Chuẩn bị môi trường

i trƣờng g o l t: (gạo lứt, cám gạo 5% c cất): gạo lứt vo sạch, nấ s n khi vừa n ổ ra tr i l p cho nguộ o ộ ạo 5% o o ì ủ ị ử trùng 121oC trong 15 phút.

i trƣờng h t lúa – cám g o 5% (hạt lúa, vôi 1%, cám gạo 5% c cất): cho a o o c, loại các hạt lép và trấu, ngâm v c vôi 1% trong 12 gi Sa ó ấ n khi nứt 1/3 và nhìn thấy hạt gạo bên trong, v t ra ể ráo trộn v 5% o u cho vào chai thủ ị K ử trùng 121oC trong 15 phút.

Môi trƣờng h t ậu xanh (Hạ u xanh, cám gạo 5% c cất): chuẩn

bị ự ng gạo lứt.

i trƣờng h t bắp (Hạt bắp, cám gạo 5% c cất): chuẩn bị

tự ng gạo lứt.

Tiến hành cấy: Cấy chuy n mẫu nấ ă ợc chọn thí nghi m trên o ẩn bị. Mỗi loạ ng cấy 5 chai thủ ị

Chỉ tiêu theo dõi: số a 50% 100% ủa nấ ă

ng nhân giống. Chọ o ấm lan nhanh và dày nhất.

c)Thí nghiệm 3: Chọn môi trƣờng nuôi trồng t t nhất

Mụ : ì a ất thích hợ ể nuôi tr ng nấ ă

Thí nghi ợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên v i 4 nghi m thức và 5 lần

lặp lại.

Chuẩn bị môi trường

44

i trƣờng mùn cƣa kh ng bổ sung dƣỡng chất: Mù a ao s ổ sung thêm 1% c cho nguyên li ó ộ ẩm 65 - 75%, ủ ống trong mộ o ù a o o ặt vừa ph i, trọng ợng trung bình mỗi túi kho ng 1,1 kg. Hấp khử trùng 121oC trong 2 gi .

i trƣờng mùn cƣa bổ sung b t bắp 5%: L tự ng

ù a ổ s ất, thêm 5% bột bắp

i trƣờng mùn cƣa bổ sung b t bắp 5% và cám g o 5%: Làm ự ù a ổ s ất, thêm 5% bột bắp và 5% cám gạo.

i trƣờng mùn cƣa bổ sung tấm g o 5% và cám g o 5%: Làm ự ù a ổ s ất, thêm 5% tấm gạo và 5% cám gạo.

Tiến hành cấy: Cấy chuy n mẫu nấ ă ợc chọn thí nghi m trên

o ẩn bị. Mỗi loạ ng cấy 5 bịch phôi.

Chỉ tiêu theo dõi: số a 50% và 100% của nấ ă ất

nuôi tr ng. Chọ o ấm lan nhanh và dày nhất.

3.2.4.2 Quy trình nuôi trồng nấm dƣ c liệu

a) Thí nghiệm 1: Chọn lựa ng cấy chuy n giống tốt nhất. Mục đích: Chọ ng thích hợp nhấ ể cấy chuy n giống nấm

ợc li u.

Thí nghi ợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên v i 4 nghi m thức và 5 lần

lặp lại.

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

i trƣờng Raper m i trƣờng P v m i trƣờng PDA bổ sung

nƣớc dừa: ự ng nuôi tr ng nấ ă

Môi trƣờng tự nhiên: Agar 20 g, khoai tây 100 g, D-glucose 20 g, giá ỗ 100 g, cám gạo 10 10 c cấ ủ 1000mL (Nguyễn Lân Dũ 2003

Cám gạo + cám ngô: mịn nhỏ ó ù ặ ốc,

không chua, ph òa o c ấm 40oC  lọ ĩ ấy dịch lọc.

Khoai tây: gọt vỏ  rửa sạch  cắt lát  o o s o ng 15 K oa ì o ỗ o ù oa o ng 10-15 phút, khi nhìn thấy cọng giá chín và chuyển thành màu trong suốt  lọc  lấ c. Trộn 2 loại dịch trên v a o ủ 1 lít dịch  lọc 1-2 lần  lấy dị o a c còn lạ ự ng Raper.

Các bước tiến hành: Cấy chuy n mẫu nấ ợc li p nội 2 o ẩn bị. Mỗi loạ ng cấy 5 ống nghi m.

45

Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự a ng nhân giống. Kh o s ộ a ì ng bằ o ộ s a ( qua các ngày thứ 3, thứ 5, thứ 7 ừ ấ G n và so sánh th a ấm lan. Chọ o ấm lan nhanh và dày nhất.

b) Thí nghiệm 2: Kh o s ng nhân giống nấ ợc li u tốt

nhất.

Mục đích: Chọ ng thích hợp nhất cho nhân giống dạng hạt

nấ ợc li u

Thí nghi ợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên v i 4 nghi m thức và 5 lần

lặp lại

Chuẩn bị môi trường

i trƣờng g o l t (gạo lứt, cám gạo 1% c cất) gạo lứt vo sạch, nấ s n khi vừa n ổ ra tr i l p cho nguộ o ộ 1% cho vào chai thủy tinh khử trùng 1210C trong 15 phút.

i trƣờng h t lúa – cám g o 5% (hạt lúa, vôi 1%, cám gạo 5% c cấ o a o o c loại các hạt lép và trấu, ngâm v c vôi 1% trong 12 gi Sa ó ấ o n khi nứt 1/3 và nhìn thấy hạt gạo bên trong, v a ể ráo trộn v 5% o u cho vào chai thủy tinh. Khử trùng 1210C trong 15 phút.

i trƣờng h t ậu xanh ( a c cấ ự ng gạo

lứt

i trƣờng h t bắp (hạt bắ c cấ ự ng gạo lứt

Tiến hành cấy mẫu: Cấy chuy n mẫu nấ ợc li ợc chọn thí nghi o ẩn bị. Mỗi loạ ng cấy 5 chai thủy tinh.

Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự a ng nhân giống. Kh o s ộ a ì ng bằng ghi nh n số ă ợc 50% và 100%. Ghi nh n và so sánh th a ấm lan. Chọ o ấm lan nhanh và dày nhất.

c) Thí nghiệm 3: Chọn lựa m i trƣờng nuôi trồng nấm dƣ c liệu t t

nhất.

Mục đích: Chọ ng nuôi tr ng nấ ợc li u tốt nhất.

Thí nghi ợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên v i 4 nghi m thức và 5 lần

lặp lại

Chuẩn bị môi trường

ùn cƣa bổ sung 5% cám g o ự ng nuôi tr ng

nấ ă

46

i trƣờng mùn cƣa bổ sung b t bắp 5% và 5% cám g o

tự ng nuôi tr ng nấ ă a thành phần thích hợp

i trƣờng mùn cƣa bổ sung b t bắp 5% và 10% cám g o

tự ng nuôi tr ng nấ ă a thành phần thích hợp

Tiến hành cấy Cấy chuy n mẫu nấ ợc li ợc chọn thí nghi m

o ẩn bị. Mỗi loạ ng cấy 5 bịch phôi.

Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự a ng nhân giống. Kh o s ộ a ì ng bằng ghi nh n số ă ợc 50% và 100%. Ghi nh n và so sánh th a ấm lan. Chọn o ấm lan nhanh và dày nhất.

Phƣơng ph p phân tích s liệu

Số li ợc xử lý bằ ì M oso E e 2010 ần m m thống kê Minitab 17.0. Số li o ợ ợc xử lý bằng phần m m SAS 9.1.3 và k t qu ì ợc thể hi n trong các b ng bằ DUNCAN v ộ tin c 95% ì M oso E e 2010 ợc dùng ể xử lý các biểu b ng và biể P ầ ộ ễ số li ợc biểu thị bằng trị số trung bình M ± SEM (Standard Error of Mean – sai số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý thống kê bằng phần m m SigmaStat-3.5 dựa vào phép kiểm Student t-test v ộ tin c y > 95% (P < 0,05).

47

CHƢƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thu thập m t s lo i nấm lớn từ vùng rừng núi Thất Sơn n Giang iều tra khảo s t ngƣời dân ịa phƣơng tìm ra c c lo i nấm sử d ng ƣ c ịnh danh các lo i nấm này

4.1.1 Thu thập mẫu nấm lớn

4 1: oạ oạ ấ oa ạ ợ

Hì Loạ ấ M số T ọ T oa ọ G ể N ẫ

01 Nấm trứng Amanita caesarea Trên mặt ất 24/07/ 2014

09 Nấm tuy t Tremella fuciformis Thân cây mục 24/07/ 2014

14 Nấ ă Nấm dai Lentinus squarosolus Thân gỗ xoài 14/08/ 2014

18 Tremella cinnabarina Thân cây mục 14/08/ 2014 Nấm ngân ĩ ỏ da cam

19 Nấm tràm Tylopilus felleus Trên mặt ất 14/08/ 2014

48

02 Trên gỗ Pycnoporus sanguineus 24/07/ 2014 Nấm lie da cam mỏng

05 Trên gỗ 24/07/ 2014 Nấm linh chi da trâu Amauroder ma subresinosu m

10 Trametes sp. Trên gỗ Nấm vân chi 24/07/ 2014

15 Thân cây Nấm vàng rỉ Phellenus givus 14/08/ 2014 Nấ ợ

20 Trên gỗ Ganoderma apllanatum 14/08/ 2014 Nấm linh chi tầng

22 Thân cây Phellenus sp. 14/08/ 2014 Nấm ợng hoàng

25 Trên gỗ Amauroder ma niger 14/08/ 2014 Nấm linh e

49

03 Mặ ất 24/07/ 2014 chi Scleraderma taceae

04 chi Amanita Mặ ất 24/07/ 2014

06 chi Amanita Mặ ất 24/07/ 2014 Nấ ộ

17 Mặ ất 14/08/ 2014 Chi Leucocoprin us

23 Mặ ất Russula emetica 14/08/ 2014

50

07 Gymnopilus penetrans Thân cây mục 24/07/ 2014

08 Mặ ất Lycogala epidendrum 24/07/ 2014

tre 11 Mycena niveipes Thân 14/08/ 2014

Nấ a thuộc nhóm nào

12 Xylaria polymorpha Thân cây mục 14/08/ 2014

13 Mặ ất chi Thelephora 14/08/ 2014

51

16 Cyathus striatus Thân cây mục 14/08/ 2014

21 Daldinia concentrica Thân cây mục 14/08/ 2014

24 Polyporus ciliatus Thân cây mục 14/08/ 2014

26 Cookeina sinensis Thân cây mục 14/08/ 2014

27 D i mặt ất 14/08/ 2014 Nấm mộc bá huê

28 chi Coprinopsis Thân cây mục 14/08/ 2014

52

Ở thí nghi ợc tất c 28 mẫu nấm hoang dại tại vùng B y N A G a o ó khu vự N P N D Nă G ng, Núi

K N T N N c sự xuất hi n các loài nấm rãi rác và không a ạ Núi Dài và Núi Cấm. Các loài nấm các Núi kể ũ ất hi n nhi u Núi Cấm và Núi Dài nên chọn các mẫu nấ ợc Núi Dài và Núi Cấm dựa theo c m quan của sự xuất hi n các loại nấm nhi u nhất của các loài nấm khu vực này. Các mẫu nấ ợc phân loạ ị a s bộ k t qu g o a thuộc nhóm nào nhi u nhất 11 loài, nấm có ợc 7 loài, nấ ă 5 o ấ ộc 5 loài.

Nă o ấ ă ao m nấm trứng Amanita caesarea (mã số 01), nấm tuy t Tremella fuciformis (mã số 09), nấm dai Lentinus squarosolus (mã số 14); nấ ĩ ỏ da cam Tremella cinnabarina (mã số 18); nấm tràm Tylopilus felleus (mã số 19);

B y loài nấ ó ợc g m nấm lie da cam mỏng Pycnoporus sanguineus (mã số 02), nấm linh chi da trâu Amauroderma subresinosum (mã số 05), nấm vân chi Trametes sp. (mã số 10), nấm vàng rỉ Phellenus givus (mã số 15), linh chi tầng Ganoderma apllanatum (mã số 20), Phellenus sp. (mã số 22 e Amauroderma niger (mã số 25).

Nă o ấ ộc là nấm thuộc chi Scleradermataceae (mã số 03), hai loài thuộc chi Amanita (mã số 04 và mã số 06), Chi Leucocoprinus (mã số 17), Chi Russula emetica (mã số 23).

M ộ o a bi t thuộc nhóm nào g m Gymnopilus penetrans (mã số 07), Lycogala epidendrum (mã số 08), Mycena niveipes (mã số 11), Xylaria polymorpha (mã số 12) chi Thelephora (mã số 13), Cyathus striatus (mã số 16), Daldinia concentrica (mã số 21), Polyporus ciliatus (mã số 24), Cookeina sinensis (mã số 26), Nấm mộ a ị a ợc (mã số 27) và chi Coprinopsis (mã số 28).

4 1 2 Điều tra khảo sát các mẫu nấm ƣ c chọn

Trong 28 mẫu nấm hoang dạ ợc sau khi kh o sát thông tin từ ịa ó ă ẫu nấm có thể sử dụ ể ă oặc sử dụng ợc li u là nấm linh chi tầng, nấm vân chi, nấ ợng hoàng, nấm dai và nấm mộc bá huê. B ng kh o sát thông tin 5 loài nấ ịa ng sử dụ ợc tóm tắt trong B ng 4.2

53

B ng 4.2: Kh o sát thông tin nấm l n từ ịa

Tên gọi nấm eo ịa giá thể xuất hi n nấm Số lần nấm xuất hi n (bao nhiêu ợ / ă Giá trị theo kinh nghi m i dân Cách thức ng sử dụng

a ă ợc li u

Linh chi tầng (mã số 20)

thân cây, gốc cây còn P thái lát nấu c uống

Nấm vân chi ùa a ợc li u

thân cây mục (mã số 10)

P nấ c uống thay trà

a ă ợc li u

Nấm t ợng hoàng thân cây còn sống Nấ c uống

(mã số 22)

Nấm dai tháng 3-11 thực phẩm

thân cây Xoài mục Xào, nấu canh (mã số 14)

Mộc bá huê ùa a ợc li u

i mặt ất Nấ c uống (mã số 27)

4 1 3 Định danh các lo i nấm ƣ c chọn theo hình thái

4.1.3.1 Nấm linh chi tầng

T ịa : linh chi tầng. Sống trên thân cây, h e ỏi trong mô

ò n núi Cấm. Bào tử hình trứ ụ ầu.

Hình 4.1: Bào tử (10X) và Nấm linh chi tầng (mã số 20)

Là loại nấm có nhi u tầng. qu thể của nấm có hình quạt hay hình tròn, ng kính từ 6-100 cm, dày từ 3-8 cm, không có vỏ bóng trên mặ ũ ấm,

54

không cuống, màu từ nâu dấ e sẫ ă ng tâm có thể nổi rõ hoặc không tạo thành những mấu l i g gh trên mặ ũ nấm, hóa gỗ, hóa sừng, sần sùi tạo nên vẻ ũ ỹ, mép nấ e ố ũ nấm và uố ợn chi u dày từ 0,5-1 cm.

H ă o ùa ợp, nấm ti p tục ă ng rộng ra l p thụ tầng m ợc tạo thành nằ i l p thụ tầ ũ ng hoặc không. Bổ dọc từ mặt trên xuố m các l p thụ tầng có thể bi ợc tuổi của nấm.

N ịa o t là nấm hi n di n khá lâu, không bi t rõ chính xác th i gian hình thành của nấm, nấm linh chi tầ ợc sử dụng làm c uố ó ụng mát gan gi ộc, lọc th n bổ phổi, mạnh gân ă ng trí nh .

Dựa vào nhữ ặ ểm v hình thái qu thể của nấm linh chi tầng mọc tại núi Cấm, thấy rằ ó ặ ể ng v i loại nấm cổ linh chi có tên khoa học Ganoderma applanatum ợc Trịnh Tam Ki t mô t trong sách Nấm lớn ở Việt Nam t p 1 (2011) còn gọ a u tầng.

4.1.3.2 Nấm vân chi

Hình 4.2: Nấm vân chi (mã số 10)

T ịa ấm vân chi

Là loại nấm không cuống, phát triển một bên. Khi non qu thể dạng nhi u u l i tròn, mọc thành dạng vành v i mép tán màu trắng kem. Nấm ng thành có dạng qu gi , chất da hóa gỗ. Qu thể hình nan quạt có nhi u ng tâm, ch ng chất xen kẽ a ó ợ ũ ấm mỏng, phẳng hoặ ă ì t, mọc thành cụ c 40-50 cm. Mặt trên tai nấm không có lông, có các vòng màu trắ ụ ng tâm, thịt nấm màu trắng. Mặ i nấm có các ống nhỏ, các ống này rất nhỏ kho ng 4-5 ống/mm. Mi ng ố ò a ò a ợc bào tử. Dựa ặ ểm hình thái bên ngoài của nấm thấy rằ ó ặ ể ng v i nấm

55

vân chi thuộc chi Trametes ợc Trịnh Tam Ki t (2011) mô t trong nấm lớn ở Việt Nam tập 1.

4.1.3.3 Nấm thƣ ng hoàng

T ịa : ấ t ợ o

Số ổ ụ ò số ộ ao o 5 10 ấ ừ s oa ắ ( ộ o 24o 27oC) Q ể ă ố ố ố ỉ sắ số ộ ạ o ỗ Mặ sẫ e ó ỏ ứ e ứ ẻ ố s Mặ ũ a ầ ủ ộ ă ầ sẫ e e ó ấ ỏ ứ ữ ù ỏ M ũ ù ị ấ ỉ sắ o ể s s ạ ố ầ s a ầ ũ o ử ì ò Dựa ặ ể o ấ o o Phellinus linteus, loài Phellinus igniarius và Phellinus lamaensis eo ủa T ị Ta K (2011 ó ể ộ o ộ Phellinus a ể ị ợ o ạ ị o ấ oa ạ số 22 o Phellinus sp.

Hình 4.3: Nấm ợng hoàng và bào tử (mã số 22)

56

4 1 3 4 Nấm dai

Hình 4.4: Nấm dai (mã số 14) và bào tử

T ịa ấ xoài

Mũ ấ ì ễ 2-15 ắ ặ ủ ẩ ạ s T ị ấ ắ P ấ ắ e ố ố ẹ ; ố 3-5 ắ ụ ó ủ ẩ ũ ó ò ao ố T ấ n vào tháng 3-11 Nấ ọ ừ ẻ a ụ ỗ a o ụ Nấ ọ a ă ấ sa a ể ạ o ùa è o ẩ Nấ ợ ù o ă a ấ a K ấ ò o ă ọ K ấ ì ă a ỉ ấ ấ a ă o ử ì e Dựa vào nhữ ặ ểm v hình thái qu thể của nấm xoài mọc tại núi Cấm, thấy rằ ó ặ ể ng v i loại nấm dai - Lentinus squarosolus ợc Trịnh Tam Ki t (2011) mô t trong Nấm lớn ở Việt Nam t p 1.

4 1 3 5 Nấm m c bá huê

Hình 4.5: Nấm mộc bá huê (mã số 27)

T ịa mộc bá huê

Là loài nấm sống trên rễ cây, thân nằ o ất, g 1 a xung quanh là những qu thể nấm màu vàng ngh có hình trái tim, trên những

57

qu thể có những chấ e ạt cát, từ thân nấm mọc ra rễ ũ vàng ngh a ợc bào tử.

N ấm mọ ó ó ững m ắng xuất hi n và sau a ì ấm bắ ầu phát triể Đ o ấm khá m a ó nào mô t v ì o ũ ịnh danh.

Loại nấ ợ i dân sử dụ ể nấ c uố ại trà

cho khách du lị ộ ặc s ợc li u quý của vùng núi Cấm.

4 2 X c ịnh c tính cấp, phân lập giữ gi ng nấm tr n m i trƣờng

P ịnh danh phân tử các lo i nấm không ch a c tính.

4 2 1 X c ịnh c tính cấp các mẫu nấm có giá trị ƣ c chọn từ

ngƣời dân ịa phƣơng

4.2.1.1 Khảo s t c tính cấp nấm linh chi tầng

Sau 72 gi thử nghi m li u tố a ó ể cho chuột uống cao chi c và cao chi t c n nấm linh chi tầng lầ ợt là 23,41 g cao/kg và 28,66 g cao/kg thể trọng chuộ ( ố a ó ể o ộ ố s ất tử vong là 0% c hai loại cao và không thể ị ợc LD50 Do ó ị ợc:

Dmax ( ao ấ ó ể o ộ ố ủa cao chi c là 23,41 g

cao /kg thể trọng chuộ 137 7 ấm khô/kg thể trọng chuột

Dmax của cao chi t c n 28,66 gam cao/kg thể trọng chuộ

391,9 g nấm khô/kg thể trọng chuột

B ng 4.3: K t qu ộc tính cấ ao c và cao c n nấm linh chi tầng

Mẫu

Số lần TN Li u cho uống Số chuột thử Số chuột ch t Phầ ă tử vong

(g cao/kg thể trọng chuột)

1 23,43 5 0 0

Cao chi t c 2 23,38 5 0 0

1 28,67 5 0 0

Cao chi t c n 2 28,65 5 0 0

Cao chi ặc nấm linh chi tầng không có thể hi ộc tính cấp ng uống trên chuột nhắt trắng, toàn bộ chuột vẫ ă ống và sinh hoạt ì ng trong 72 gi quan sát. Chuộ ợc ti p tục theo dõi sau 14 ngày uống và không ghi nh n các tri u chứng bấ ng. K t qu gi i phẫ ại thể a ội tạng gan, tim, phổi, dạ dày, th n không có dấu hi u bất ng.

4.2.1.2 Khảo s t c tính cấp nấm thƣ ng hoàng

58

B ng 4.4: K t qu ộc tính cấ ao c và cao c n nấ ợng hoàng

Mẫu lần cho chuột chuột

Số TN Li u uống Số ch t Phầ ă tử vong Số thử

(g cao/kg thể trọng chuột)

chi t 1 22,78 5 0 0

Cao c 2 22,94 5 0 0

chi t 1 27,86 5 0 0

Cao c n 2 28,08 5 0 0

Sau 72 gi thử nghi m li u tố a ó ể cho chuột uống cao chi c và cao chi t c n nấm t ợng hoàng lầ ợt là 22,86g cao/kg và 27,97g cao/kg thể trọng chuột, tỉ l tử vong là 0% c hai loại cao và không thể ịnh ợc LD50 Do ó ị ợc:

Dmax của cao chi c là 22,86 g cao /kg thể trọng chuộ

134,5 g nấm khô/kg thể trọng chuột

Dmax của cao chi t c n 27,97 g cao /kg thể trọng chuộ

383,4 g nấm khô/kg thể trọng chuột

Cao chi ặc nấm t ợng hoàng không có thể hi ộc tính cấp ng uống trên chuột nhắt trắng, toàn bộ chuột vẫ ă ống và sinh hoạt ì ng trong 72 gi quan sát. Chuộ ợc ti p tục theo dõi sau 14 ngày uống và không ghi nh n các tri u chứng bấ ng. K t qu gi i phẫ ại thể a ội tạng gan, tim, phổi, dạ dày, th n không có dấu hi u bất ng.

4.2.1.3 Khảo s t c tính cấp nấm vân chi

B ng 4.5: K t qu ộc tính cấ ao c và cao c n nấm vân chi

Mẫu lần cho chuột chuột

Số TN Li u uống Số ch t Phầ ă tử vong Số thử

(g cao/kg thể trọng chuột)

1 23,37 5 0 0

Cao chi t c 2 23,46 5 0 0

1 28,78 5 0 0

Cao chi t c n 2 28,81 5 0 0

Thử nghi ự trên nấm vân chi, li u tố a ó ể cho chuột uống cao chi c và cao chi t c n nấm vân chi lầ ợt là 23,42 g cao/kg và

59

28,80 g cao/kg thể trọng chuột, tỉ l tử vong là 0% c hai loại cao và không thể ị ợc LD50 Do ó ị ợc:

Dmax của cao chi c là 23,42 g cao /kg thể trọng chuộ

132,9 g nấm khô/kg thể trọng chuột Dmax của cao chi t c n 28,80 g cao /kg thể trọng chuộ 388 2 nấm khô/kg thể trọng chuột Cao chi ặc nấm vân chi không có thể hi ộc tính cấ ng uống trên chuột nhắt trắng, toàn bộ chuột vẫ ă ống và sinh hoạt bình ng trong 72 gi quan sát. Chuộ ợc ti p tục theo dõi sau 14 ngày uống và không ghi nh n các tri u chứng bấ ng. K t qu gi i phẫ ại thể các a ội tạng gan, tim, phổi, dạ dày, th n không có dấu hi u bấ ng. 4.2.1.4 Khảo s t c tính cấp nấm dai

B ng 4.6: K t qu ộc tính cấ ao c và cao c n nấm dai

Mẫu

Số lần TN Số chuột thử Số chuột ch t Phầ ă tử vong

Li u cho uống (g cao/kg thể trọng chuột)

23,49 1 5 0 0 Cao chi t c 23,52 2 5 0 0

29,73 1 5 0 0 Cao chi t c n 29,71 2 5 0 0

T ự thử nghi m li u tố a ó ể cho chuột uống cao chi c và cao chi t c n nấm dai lầ ợt là 23,51 g cao/kg và 29,72 g cao/kg thể trọng chuột, tỉ l tử vong là 0% c hai loại cao và không thể ị ợc LD50. Do ó ị ợc:

Dmax của cao chi c là 23,51 g cao /kg thể trọng chuộ

111,1 g nấm khô/kg thể trọng chuột

Dmax của cao chi t c n 29,72 g cao /kg thể trọng chuộ

338,9 g nấm khô/kg thể trọng chuột

Cao chi ặc nấm dai không có thể hi ộc tính cấ ng uống trên chuột nhắt trắng, toàn bộ chuột vẫ ă ống và sinh hoạ ì ng trong 72 gi quan sát. Chuộ ợc ti p tục theo dõi sau 14 ngày uống và không ghi nh n các tri u chứng bấ ng. K t qu gi i phẫ ại thể quan nội tạng gan, tim, phổi, dạ dày, th n không có dấu hi u bấ ng.

4.2.1.5 Khảo s t c tính cấp nấm m c bá huê

Mẫu thử nghi m li u tố a ó ể cho chuột uống cao chi c và cao chi t c n nấm mộc bá huê lầ ợt là 23,26 g cao/kg và 29,27 g cao/kg thể trọng chuột, tỉ l tử vong là 0% c hai loại cao và không thể ị ợc LD50 Do ó ị ợc:

60

Dmax của cao chi c là 23,26 g cao /kg thể trọng chuộ

111,3 g nấm khô/kg thể trọng chuột

Dmax của cao chi t c n 29,27 G cao /kg thể trọng chuộ

332,1 g nấm khô/kg thể trọng chuột

B ng 4.7: K t qu ộc tính cấ ao c và cao c n nấm mộc bá huê

cho Mẫu lần chuột chuột Số TN Số thử Số ch t Phầ ă tử vong

Cao chi t c Cao chi t c n Li u uống (g cao/kg thể trọng chuột) 23,24 23,27 29,25 29,28 1 2 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0

5 5 5 5 Cao chi ặc nấm mộc bá huê không có thể hi ộc tính cấp ng uống trên chuột nhắt trắng, toàn bộ chuột vẫ ă ống và sinh hoạt ì ng trong 72 gi quan sát. Chuộ ợc ti p tục theo dõi sau 14 ngày uống và không ghi nh n các tri u chứng bất ng. K t qu gi i phẫ ại thể a ội tạng gan, tim, phổi, dạ dày, th n không có dấu hi u bất ng.

Thử nghi m li u tố a ó ể cho chuột uống cao chi c và cao chi t

c ợc tóm tắt trong B ng 4.8

B ng 4.8: B ng tổng hợp li u tố a cho chuột uống cao các loại nấm

Tên nấm g nấm khô/kg thể trọng chuột Dmax(g)

Cao chi c Cao chi t c n Cao chi c Cao chi t c n

Linh chi tầng 23,41 28,66 137,7 391,9

T ợng hoàng 22,86 27,97 134,5 383,4

Vân chi 23,42 28,80 132,9 388,2

Nâm Dai 23,51 29,72 111,1 338,9

Mộc bá huê 23,26 29,27 111,3 332,1

Sau 72 gi thử nghi m li u tố a ó ể cho chuột uống cao chi c và cao chi t c n nấm linh chi tầng lầ ợt là 23,41g cao/kg và 28,66g cao/kg thể trọng chuột, tỉ l tử vong là 0% c hai loại cao.

Thử nghi ự trên nấ ợng hoàng, li u tố a ó ể cho chuột uống cao chi c và cao chi t c n nấm t ợng hoàng lầ ợt là 22,86g cao/kg và 27,97g cao/kg thể trọng chuột, tỉ l tử vong là 0% c hai loại cao.

61

Thử nghi ự trên nấm vân chi, li u tố a ó ể cho chuột uống cao chi c và cao chi t c n nấm vân chi lầ ợt là 23,42g cao/kg và 28,80g cao/kg thể trọng chuột, tỉ l tử vong là 0% c hai loại cao.

T ự thử nghi m li u tố a ó ể cho chuột uống cao chi c và cao chi t c n nấm dai lầ ợt là 23,51g cao/kg và 29,72g cao/kg thể trọng chuột, tỉ l tử vong là 0% c hai loại cao.

Mẫu thử nghi m li u tố a ó ể cho chuột uống cao chi c và cao chi t c n nấm mộc bá huê lầ ợt là 23,26g cao/kg và 29,27g cao/kg thể trọng chuột, tỉ l tử vong là 0% c hai loại cao.

B ng 4.9: K t qu ủa chuột trong 14 ngày kh o sát sau khi uống cao nấm linh chi tầng, nấ ợng hoàng, nấm vân chi, nấm dai và mộc bá huê li u Dmax.

thố sát và thử Dấu hi u chung

Quan nghi m H quan

Hành vi, v ộng

Chuột v ộng và sinh hoạ ă uố ì ng trong l ng nuôi. Không ghi nh n các trạng thái bị ộng hay mất ph n xạ ă bằng, ngủ, hôn mê H thần kinh h thần kinh v n ộng

Không biểu hi n bấ ng

Ph n ứng não và tủy sống thần kinh

H thực v t T ự ì ng

Mắt- ũ ì ng

H hô hấp Đặc tính và tố ộ

Nhịp th ì ng, không ghi nh n tri u chứng khó th hay co gi t khí qu n

H tim mạch Dấu hi u của tim mạch Không ghi nh n tri u chứng bất

ng nhịp tim

Các tri u chứng

Không ghi nh n tri u chứng tiêu ch y, táo bón. Dạ dày, ruột

Hình dáng bụng

Không ghi nh n tri u chứ a xoắn bụng

Phân chuộ ì ng.

Độ chắc và màu sắc của phân

D t

quan sinh dục H ng hào và trạ ă ph ng

62

Da và lông Màu, tình trạng

Lông trắ ợt. Không ghi nh n tri u chứng ử ỏ trên da hay xù lông

trạng Sự ă ọng T o ỡ s ì ng

Tình chung

Từ ó a ợc k t lu n các cao chi ặc từ mẫu nấm linh chi tầng, vân chi, nấm dai và mộc bá huê không thể hi ộc tính cấ ng uống trên chuột nhắt trắng.

Toàn bộ số chuột thử nghi m vẫ ă ống và sinh hoạ ì ng trong 72 gi quan sát. Ti p tục theo dõi chuột trong 14 ngày sau khi dùng thuốc không ghi nh ợc tri u chứng bấ ng nào.

Sa ịnh các mẫu nấm linh chi tầng, nấ ợng hoàng, vân chi, nấm dai và mộ ộc tính cấp trên chuột, các mẫu nấm này ợc ti n hành phân l ể giữ giống.

4.2.2 Phân lập các loài nấm ƣ c chọn lọc ở trên

Ti n hành phân l p các loại nấ ợ ng thạch ống PDA v ù u ki n nhi ộ, th i gian phân l p. K t qu o u sâu phát triển h sợi cùa các loài nấm PDA ợ ịnh ngày thứ 5 và ngày thứ 7 ừ ấy. K t qu ợc trình bày trong B ng 4.10 sa :

Chi s ấm trung bình/ngày (cm)

Nghi m thức

5 ( 7 (

CT 4,22a 6,26a

NT 2,60 b 4,34 b

VC 1,64 c

3,46 c

ND 1,56 c 2,84 d

BH 0 d 0 e

Mứ ĩa ** **

CV 13,07% 8,49%

B ng 4.10: Tố ộ s ng của các loài nấ ng PDA

CT : Nấm linh chi tầng , VC : Nấm vân chi, ND : Nấm dai

NT : Nấm t ợng hoàng, BH : Nấm mộc bá huê

Ghi chú: các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức xác suất tin cậy 95%.

63

20 10 22 14 27

20 Nấm linh chi tầng 10 Nấm vân chi 22 Nấm ợng hoàng 14 Nấm dai 27 Nấm mộc bá huê

Hình 4.6:. H sợi nấm linh chi tầng, nấm vân chi, nấm ợng hoàng, nấm dai và nấm mộc bá h ng PDA ngày thứ 7

Từ B ng 4.10, Hình 4.6 cho thấy: Sau 5 ngày nuôi cấy, chi u sâu phát triển trung bình của h sợ ủa 5 loại nấm: linh chi tầng, nấm t ợng hoàng, nấm vân chi, nấm dai và nấm mộc bá huê lầ ợt là 4.22 cm, 2.6 cm, 1.64 cm, 1.56 cm và 0 c N y, tố ộ phát triển của nấm linh chi tầng cao nhất và nấm mộc bá huê là thấp nhất. Trong quá trình nuôi cấy, ngày thứ 3 các loại nấm m i bắ ầ a ừ ngày thứ 3 n ngày thứ 5 tố ộ a khá ch m. Do th a ầu sau khi cấy, chuyển từ ng sống tự nhiên sa ng thạch nấm ph i thích nghi v ng sống m i nên tốc ộ a m. Tố ộ phát triển h sợ ấm của nấm linh chi tầng khác bi t rất l n so v i các nấm còn lạ ối v i nấm ợng hoàng khác bi t 1.62 cm, nấm vân chi 2.58 cm, nấm dai là 2.66 cm. Nấm t ợng hoàng trong giai oạn này sự phát triển của h sợ ấ ũ t v i nấm vân chi, nấm dai lầ ợt là 0.96 cm và 1.04 cm còn nấm vân chi thì không có sự khác bi t nhi u so v i nấm dai. Do nấm mộc bá huê ngày thứ 5 trong quá trình phân l a ó sự phát triển của ấm nên so v i các loài nấm còn lại khác bi t khá cao.

H sợ ấm của nấm linh chi tầng sau 5 ngày phân l p phát triển khá s o ng, sợ ắ ục, chi s s so i tất c các loài nấm còn lại, nấm vân chi sợ ọ ũ

64

không bằng linh chi tầng, sợ ắ s ng nhìn khá giố nấm linh chi tầ a Nấm t ợng hoàng có tố ộ a ũ khá cao chỉ sau nấm linh chi tầng, h sợ ấ s ng, sợi ỏng ngắ ấm linh chi tầng và vân chi, nấm dai h sợ ấm rất khác so v i các nấm còn lại là h sợ a a ất mứ ộ t p trung h sợi mỏng, sợ ắng trong còn nấm mộc bá h o ng PDA không ph ng thích hợp nên h sợ ấm không phát triển, nên ti p tục nghiên cứu phân l p loài nấ ng khác.

Sa u sâu trung bình phát triển của h sợ ấm của 5 loại nấm lầ ợt là: 6,26 cm, 4,34 cm, 3,46 cm, 2,84 cm và 0 cm. Tố ộ phát triển của nấm linh chi tầng giữ vị trí cao nhất và thấp nhất là nấm mộc bá huê. Tố ộ phát triển của 5 loại nấm vẫn giữ ợc sự khác bi t v i nhau. Nấm linh chi tầng tạo sự khác bi t rõ r t so v i các loài nấm khác, so v i nấm t ợng hoàng khác bi t 1,92 cm, nấm vân chi là 2,8 cm, nấm dai 2,84 cm. Nấm t ợng hoàng a oạ ũ ạo sự khác bi t so v i nấm vân chi, nấm dai lầ ợt là 0,88 cm và 1,5 cm còn nấm vân chi khác bi t so v i nấm dai là 0,62 T o a oạn này nấm mộc bá huê vẫ a ể nấm nên ti p tục tạo sự khác bi t l ối v i các nấm còn lại.

V cách phát triển h sợ ấm của các loài nấ ũ ố thứ 5 và nấm mộc bá huê vẫ a ển từ o ấ ng PDA không phù hợ ể nuôi cấy nấm mộc bá huê và nấm linh chi tầng là nấm có tố ộ a ao ấ T o ù u ki n v ng nuôi cấy PDA, nhi ộ phòng, th i gian nuôi cấy thì tố ộ phát triển của 5 loại nấm trong nghiên cứu là khác nhau. Sự khác bi t này là do b n chất v chủng giống.

K t qu phân l p ghi nh ợc cho thấ ng PDA thích hợp cho phân l p nấm linh chi tầng, nấm t ợng hoàng, Nấm vân chi và nấm dai phù hợ ể phân l p nấm mộc bá huê, cần có những nghiên cứu ti eo ể chọ a ng phân l p phù hợp v i nấm mộc bá huê. Ở thí nghi m này loại trừ nấm mộc bá huê không phân l ợc còn lại 4 loài nấm là nấm t ợng hoàng, nấm dai, nấm linh chi tầng và nấm vân chi, bốn loài nấ ợc ti n hành gi i trình tự ể ịnh loài theo trình tự ITS.

4.2.3 Giải trình tự ITS x c ịnh loài

4.2.3.1 Nấm vân chi (MS 10)

DNA của h sợ ấm vân chi thuầ o ng thạch rắ ợc

ly trích và ti n hành thực hi n ph n ứng PCR v i cặp m i

ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3’

65

Nhằm khu ại vùng trình tự ITS của nấm vân chi. S n phẩm PCR có c l 650 ase K t qu khu ạ ợc kiểm tra trên gel agarose 1,2%.

S n phẩm PCR của mẫu nấ ợc tinh sạch trên gel và gi i trình tự một

chi u (m i xuôi ITS1) bằ Sa e (Sa e et al.,1977)

K t qu gi i trình tự sa ó ợc so sánh v s dữ li u trên Ngân e N I ể tìm loài có ộ ao a ó ó s ể ịnh danh nấ p và phân l ợc. Mứ ộ ng của trình tự nấm thu th p v i chi Trametes s dữ li u NCBI (Hì ụ ụ 1

Đoạn gen của nấm dài 666 bps có tỷ l ng hình 93% v i một số loài trong chi Trametes s dữ li N I ầ ẫu nấm thu th ợc chính là một loài trong chi Trametes.

Trình tự ITS của nấm vân chi ITS ợc khu ại bằng cặp m i ITS1-

ITS4 (P ụ ụ

4.2.3.2. Nấm dai (MS14)

DNA của h sợ ấm dai o ng thạch rắ ợc ly trích và

ti n hành thực hi n ph n ứng PCR v i cặp m i ITS1- ITS4 (P ụ ụ

K t qu ợc so sánh v s dữ li u trên Ngân hàng gen NCBI. Mứ ộ ng của trình tự nấm thu th p v i loài Lentinus squarrosulus s dữ li N I (Hì ụ ụ 2

Đoạn gen của nấm dài 567 bps có tỷ l ng hình là 96% v i loài Lentinus squarrosulus s dữ li N I (A ess o e : KT956127 1 c ầ ẫu nấm thu th ợc chính là một loài trong chi L. squarrosulus. Từ mô t hình thái theo Trịnh Tam Ki t (2012) k t hợp giám ịnh rRNA 18S có thể khẳ ịnh rằng mẫu nấ ợc An Giang là loài nấm Lentinus squarrosulus.

4.2.3.3 Linh chi tầng (MS20)

Trình tự ITS của nấm linh chi tầng ợc khu ại bằng cặp m ITS1- ITS4 (P ụ ụ

trình

Đoạn gen của nấm linh chi tầng dài 631 bps có tỷ l ì 97% ộ phủ 91% v i tự ITS của Ganoderma applanatum (Acession: KR867655.1) Mứ ộ ng của trình tự nấm thu th p v i loài Ganoderma applanatum s dữ li u NCBI. K t qu ợc so sánh v s dữ li N e N I (Hì P ụ ụ 3

Từ mô t hình thái theo Trịnh Tam Ki t (2011)k t hợ ịnh rRNA 18S có thể khẳ ịnh rằng mẫu nấ ợc An Giang là loài nấm Ganoderma applanatum

66

4.2.3.4 Nấm thƣ ng hoàng (MS22)

DNA của h sợ ấm ợng hoàng o ng thạch rắ ợc ly trích và ti n hành thực hi n ph n ứng PCR v i cặp m i ITS1- ITS4

Đoạn gen của nấm dài 653 bps có tỷ l ì 92% ộ phủ 91% v i loài Phellinus linteus s dữ li u NCBI (Acession number: AF534075.1) ầ ẫu nấm thu th ợc chính là một loài thuộc chi Phellinus. Mứ ộ ng của trình tự nấm thu th p v i loài Phellinus sp. s dữ li N I (Hì P ụ ụ 4

K t hợ a ì phần trên có thể k t lu

một loài thuộc chi Phellinus. Tạm th i gọi tên là Phellinus sp.

Trình tự ITS nấm t ợng hoàng khu ại bằng cặp m ITS1- ITS4

(P ụ ụ

Ở thí nghi ị a ợ n chi hai dòng là nấm vân chi Trametes (MS10) ợng hoàng Phellinus (MS22) ị n loài hai dòng nấm linh chi tầng Ganoderma applanatum (MS20) và nấm dai Lentinus squarrosolus (MS14). Nh n thấy trong bốn loài chỉ có một loài nấ ă ấm dai Lentinus squarrosolus nên chọ o ể ti p tục các nghiên cứu ti p theo. Riêng ba loài nấ ợc li ợ ị a o ó ó ấm thuợng hoàng là loài hoang dại m ợc thu th p và nghiên cứ ố ịa o o i và có giá trị ợc li ao a ợc nghiên cứu Vi t Nam, hi n tại chỉ có giống nh p từ Hàn Quố a ợc nghiên cứu nuôi tr ng (Trịnh Tam Ki t, 2011) nên nấm t ợng hoàng ợc chọ ể bố trí các thí nghi m ti p theo. Còn hai loài linh chi tầng và vân chi c a o u có giá trị ợc li ao n thấy nấm linh chi tầng là loài nấm quý hi m hình thành trong nhi ă ó ấ o ấm này khá cao do hi ợng phá rừng và quan trọ ứ c vi a ổi khí h u toàn cầu, vì th ể n vi c b o t n loài nấm quý hi m này nên nấm linh chi tầ ợc chọn.

Ngoài ra thí nghi m xét nghi ộc tính cấp các mẫu nấm hoang dại nội dung hai có loài nấm mộ ộc tính cấ Đ o ấm rất m ợc phát hi n Núi Cấm thuộc Huy n Tịnh Biên, Tỉnh An Giang, và là loài nấ ợ i dân sử dụng rộng rãi thu th p hoang dại bán cho khách du lịch. Nấm này mọ s o ấ c khi tạo thể qu nấ a ắng và chỉ tạo thể qu vào cuố ùa a ặc bi t nấm có hình dạ mọ s o ò ấ ột dạng củ. Nấm không có trong h thống phân loại nấm l n của Vi Na a ợc trình tự gen v i m i của nấm và c m i khuy t thực v t. Nấ a ợc từ thể qu , kể c ấm thu th ợ c khi hình thành nấm vẫn không thể a o ống nghi m v i nhi u loại ng khác nhau. V i nhi u bí ẩ hy vọ một loài m i cần ph ợc ti p tục nghiên cứu.

67

Qua hai nội dung nghiên cứu bốn loài nấ ợc chọ ể ti p tục ti n hành nghiên cứu là nấm dai Lentinus squarrosolus, nấm linh chi tầng Ganoderma applanatum, nấm t ợng hoàng Phellinus sp. và nấm mộc bá huê.

4 3 X c ịnh thành phần dinh dƣỡng dƣ c tính c tính bán trƣờng diễn và thử t c ng kh ng ung thƣ của loài nấm dƣ c liệu trên dòng t b o ung thƣ m u v ung thƣ i trực tràng

4.3.1. X c ịnh thành phần dinh dƣỡng v dƣ c tính các loài nấm

ƣ c tuyển chọn

B ng 4.11: Thành phầ ỡ ợc tính của bốn loại nấ ợc

Thành phầ ịnh

Tên loại nấm

bá

Nấm dai

chi

T ợng hoàng

Linh tầng

Mộc huê

% ợ ị / ấ

Béo

mg/kg

7,01

H ạ

Không xác ịnh

Không xác ịnh

Protein

0,79

0,75

mg/kg

Không xác ịnh

Không xác ịnh

4-Hydroxyprolin

193

376

186

mg/kg

Không phát hi n

Acid aspartic

624

2510

891

695

mg/kg

Acid glutamic

759

1780

767

693

mg/kg

Alanin

68,8

1460

623

72,8

mg/kg

Cystine

1470

355

338

mg/kg

Không phát hi n

Glycin

419

1810

566

331

mg/kg

Histidin

176

520

259

169

mg/kg

Isoleucin

106

829

421

113

mg/kg

Leucin

439

1480

671

432

mg/kg

Lysin

172

540

349

309

mg/kg

Methionine

237

103

262

mg/kg

Không phát hi n

Phenylalanin

244

658

470

245

mg/kg

Prolin

649

1470

550

495

mg/kg

Serin

245

1550

623

313

mg/kg

Threonin

507

1610

563

537

mg/kg

chọn

68

Tyrosin

117

165

158

193

mg/kg

Valin

298

248

1190

494

mg/kg

Tro tổng

3,31

0,28

5,78

2,20

mg/kg

Canxi

216

602

5370

2060

mg/kg

Sắt

312

13,5

1650

2210

mg/kg

Kali

3880

255

mg/kg

Không xác ịnh

Không xác ịnh

Kẽm

20,8

23,4

25,9

36,4

mg/kg

Vitamin A

1,04

0,91

mg/kg

Không xác ịnh

Không xác ịnh

ổ ợ ầ ấ ỡ ó o ấ ằ sắ ỏ ao ấ o ấ a o ấ ă ấ ợ ọ ọ ừ ữ ầ ấ ộ ấ ị ấ ỡ o ấ ể o ứ sa Nấ t ợ hoàng o ấ oa ạ V Na a ỡ ấ ỉ số ỡ ấ ao ứa ẹ o ấ ó ị ao ầ ợ ầ ứ

4 3 2 X c ịnh th nh phần dƣ c tính có trong hai mẫu nấm linh chi

tầng v thƣ ng ho ng

Để ị ợ o o ấ ó ị ợ ì ấ ầ ị ầ ợ ó o ấ ợ so s ấ ầ oa ạ ù ể

4 3 2 1 ết quả ịnh lƣ ng triterpenoid to n phần

4 12: H ợ e e o o ầ (% o ấ

ầ ấ ợ o

Mẫ ấ

K ố ợ ợ ( T e e o o ầ (g)

K ố ợ sấ trong ethanol (g) H ợ e e o ó o ẫ (%)

L ầ 501 13,0166 5,5150 1,10

346 32,2253 7,2956 2,11

T ợ o

H ợng triterpenoid trong nấm linh chi tầng là 1,1%, thấ so i ợng này trong nấm t ợng hoàng là 2,11%. Khi so sánh k t qu vừa ợc v i nghiên cứu của Mai Thành Chung (2013) trên nấm linh chi ỏ Ganoderma lucidum ợ e e o ợ a pháp chi t cao là 1,39%, nấm cổ òa 0 19 % V ợng

69

triterpenoid chênh l ch giữa các loài nấm linh chi không quá l so i ợng hoàng là một loài nấm hoang dại thì lạ ó ợ ao Nấ T ợng Hoàng có thể là loài nấm cầ ợc nghiên cứ ể khai thác ngu n tritrepenoid

4 3 2 2 ết quả ịnh lƣ ng polysaccharid

4 13: H ợ o sa a (% o ấ ầ

ấ ợ o

Mẫ ấ

K ố ợ ợ (

K ố ợ o sa a sấ ( H ợ o sa a ó o ẫ (%

L ầ 500 2,317 0,46

T ợ o 50 2 4,0

Khi so sánh k t qu vừa ợc v i nghiên cứu của Mai Thành Chung (2013) trên nấm cổ linh chi thu hái tại Nha Trang, Khánh Hòa, hàm ợ o sa a e ợ a t cao là 0,346%. H ợng polysaccharide trong nấm linh chi tầ ợc ngoài tự nhiên ũ ao ần 0,5%, riêng nấm t ợng hoàng ợng này là 4,0%. H ợng polysacharide trong nấm t ợng hoàng mang lại hy vọng rất l n cho vi c nghiên cứu v a ợ ể trị b i.

4 3 2 3 ết quả ịnh lƣ ng ƣờng khử ƣờng tự do

4 14: H ợ ự o (% o ấ ầ ấ

ợ o

Mẫ N ộ ẫ (µ / L N ộ ự o (µ / L H ợ ự o (%) H ợ ự o ì (%)

100 29,186 29,19

29,42 150 42,209 28,14 Nấ chi ầ 200 61,860 30,93

100 40,058 40,06

40,17 150 60,000 40,00

Nấ ợ hoàng 200 80,930 40,47

H ợ ự o ì o ẫ ấ t ợ hoàng (40 17% ao ầ (29 42% ấ ầ Khi so sánh k t qu vừa ợc v i nghiên cứu của Ma T (2013 ợng ng tự do trên nấ ỏ Vi t Nam là 19 53% V a o ấ

70

ứ ó ợ ự o ao ấ ỏ V Na o ấ ợ ạ óa ị

H ợ ử ủa ấ ầ 22 07% o ấ t ợ hoàng 57 14% ợ ấ T ợ Ho ao ấ ầ ấ ầ

4 15: H ợ ử (% o ấ ầ ấ

ợ o

Mẫ ộ N ẫ (µ / L N ộ ử (µ / L H ợ ử (%) H ợ ử ì (%)

1000 200,50 20,05

22,07 359,67 23,98 1500 Nấ ầ 443,83 22,19 2000

56,80 1000 568,000

57,14 56,92 1500 853,83

Nấ ợ hoàng 57,69 2000 1153,83

K so s ộ số ị ợ ợ ầ ỡ ( 4 11 o ẫ ứ ó ể ọ ấ t ợ hoàng ể eo ẫ ấ oa ạ ó ứa ợ ợ ao ể ứ s a a sử ụ ộ o ố

4 3 3 X c ịnh c tính b n trƣờng diễn nấm thƣ ng hoàng

4.3.3.1. Trọng lƣ ng cơ thể chu t

4 16: T ọ ợ ộ ử sa 1

T ọ ợ ể (

Lô (n = 8) L (g/kg) Sau 1 tháng T ử

Đố ứ - 24,13 ± 0,9 36,63 ± 1,28**

0,4 26,75 ± 1,22 37,13 ± 1,3**

Cao ấ T ợ Ho **: P< 0,001 so v c thử nghi m

Trọ ợng chuột của lô chứng cho uố c cất, và lô thử cho uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg th ểm sau 1 tháng có sự ă ạt ý ĩa ống kê so v c thử nghi m. Ở th ểm sau 1 tháng, thể trọng

71

chuột khi cho uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg không khác bi ạt ý ĩa ống kê so v ố ứng.

Chuộ ợc thử nghi m là chuộ ực và cái 6 tuần tuổ a o a oạ ă ng và phát triể ể chuyể sa a oạ ng thành nên thể trọng chuột của lô chứng và lô uống cao nấm t ợng hoàng 0,4 g/kg sau 1 tháng thử nghi ă so c thử nghi m; ng th i, sự ă ể trọng của lô thử nghi m không có sự khác bi ạ ĩa ống kê so v i lô chứng cho thấy cao nấm t ợng hoàng không n sự phát triển của chuột trong th i gian cho uống.

4.3.3.2. Các thông s huyết học

a) Hồng cầu

4 17: Số ợ ầ

Lô Li u Số ợng h ng cầu

(n = 8) (g/kg) (M/uL))

T c thử nghi m Sau 1 tháng

Đố ứng 9,85 ± 0,13 10,48 ± 0,18** -

9,53 ± 0,08 10,19 ± 0,11** 0,4 ao ấ T ợ o

**: P< 0,001 so v c thử nghi m

Số ợng h ng cầu lô chứng và lô thử nghi m uống cao nấm t ợng hoàng 0,4 g/kg th ểm sau 1 tháng thử nghi m có sự ă ạ ĩa thống kê so v c thí nghi ng th i, số ợng h ng cầu lô thử nghi ũ ạ ĩa ống kê so v ố ứng. N v y cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không nh n số ợng h ng cầu trong máu.

b) Hemoglobin

H ợng hemoglobin lô chứng và lô chuột uống cao nấm t ợng toàng 0,4 g/kg th ể sa 1 u không có sự khác bi ạ ĩa thống kê so v c thử nghi ; ng th ợng hemoglobin lô thử nghi ũ ạ ĩa ống kê so v i lô chứng. N y cao nấm t ợng hoàng 0,4 g/kg sau 2 tháng cho uống không n ợng hemoglobin trong máu.

4 18: H ợ e o o

Lô L ( / Hemoglobin

72

(n = 8) (g/dL)

T ử Sau 1 tháng

Đố ứ - 15,88 ± 0,13 16,64 ± 0,18

ấ 0,4 15,79 ± 0,10 15,90 ± 0,24 ao t ợ o

c) Hematocrit

4 19: H ợ e a o

Lô Li u Hematocrit

(n = 8) (g/kg) (%)

T c thử nghi m Sau 1 tháng

Chứng - 53,19 ± 0,60 53,06 ± 1,13

0,4 53,34 ± 0,70 51,96 ± 0,93

Cao nấm t ợng hoàng

H ợng hematocrit lô chứng uố c cất và lô uống cao nấm t ợng hoàng 0,4g/kg th ểm sau 1 tháng không có sự khác bi ạt ý ĩa ống kê so v c thử nghi ; ng th ợng hematocrit lô thử nghi ũ ạ ĩa ống kê so v i lô chứng. N v y cao nấm t ợng hoàng 0,4g/kg sau 1 tháng cho uống không ng ợng hematocrit trong máu.

d) Tiểu cầu

4 20: Số ợ ể ầ

Lô

Li u (g/kg) (n = 8) T ể ầ (103 o/µL

T c thử nghi m Sau 1 tháng

Chứng - 1014,88 ± 74,94 880,14 ± 90,77 *

0,4 1189,88 ± 70,87 979,63 ± 62,21 *

nấm Cao t ợng hoàng *: P < 0 05 so ử

Số ợng tiểu cầu lô chứng và lô uống cao nấm t ợng hoàng th i ểm sau 1 tháng có sự gi ạ ĩa ống kê so v c thử nghi m. Số

73

ợng tiểu cầu lô thử nghi m không khác bi ạ ĩa ống kê so v i lô chứng. N y cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không n số ợng tiểu cầu trong máu.

e) Thể tích trung bình hồng cầu

B ng 4.21: Thể tích trung bình h ng cầu

Thể tích trung bình h ng cầu (MCV)

Lô (n = 8) Li u (g/kg) (fl)

T c thử nghi m Sau 1 tháng

Chứng - 52,95 ± 0,73 51,30 ± 1,07

53,09 ± 0,35 0,4 50,19 ± 0,94*

nấm Cao t ợng hoàng *: P < 0 05 so ử

Thể tích trung bình của h ng cầu lô chứng và lô uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg không có sự khác bi ạ ĩa ống kê th i ể c và sau thử nghi m 1 tháng.

Thể tích trung bình của h ng cầu lô uống cao nấm t ợng hoàng 0,4 g/kg có sự gi ạ ĩa ống kê so v i th ể c thử nghi m 1 ẫn nằm trong gi i hạ ì ng của chỉ số này (48-56 fl). N y, cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không nh ng lên chỉ số thể tích trung bình của h ng cầu.

f) Huyết sắc t trung bình hồng cầu

B ng 4.22: Huy t sắc tố trung bình h ng cầu

Lô Huy t sắc tố trung bình h ng cầu (MCH)

Li u (g/kg) (n = 8) (pg)

T c thử nghi m Sau 1 tháng

Đố ứng - 16,20 ± 0,23 15,87 ± 0,27

0,4 16,48 ± 0,11 15,63 ± 0,22**

nấm Cao t ợng hoàng **: P < 0,001 so v c thử nghi m

Chỉ số huy t sắc tố trung bình h ng cầu lô chứng và lô uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg không có sự khác bi ạ ĩa ống kê th i ể c và sau thử nghi m 1 tháng.

Chỉ số huy t sắc tố trung bình h ng cầu lô uống cao nấm t ợng hoàng 0,4 g/kg có sự gi ạ ĩa ống kê so v i th ể c thử

74

nghi 1 ẫn nằm trong gi i hạ ì ng của chỉ số này (11-19 N y, cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không ng lên chỉ số huy t sắc tố trung bình h ng cầu.

g) Nồng huyết sắc t trung bình hồng cầu

B ng 4.23: N ộ huy t sắc tố trung bình h ng cầu

Lô

Li u (g/kg) N ộ huy t sắc tố trung bình h ng cầu (MCHC) ( g/dL) (n = 8)

T c thử nghi m Sau 1 tháng

Đố ứng - 30,63 ± 0,26 30,97 ± 0,31

0,4 31,06 ± 0,19 31,16 ± 0,27

Cao nấm t ợng hoàng

N ộ huy t sắc tố trung bình h ng cầu lô chứng và lô uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg không có sự khác bi ạ ĩa ống kê th i ể c và sau thử nghi 1 N y, cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không ng lên n ộ huy t sắc tố trung bình h ng cầu.

h) Tỷ lệ phân b hồng cầu

B ng 4.24: Tỷ l phân bố h ng cầu (RDW)

Lô Tỷ l phân bố h ng cầu (RDW) ( %) Li u (g/kg) (n = 8) T c thử nghi m Sau 1 tháng

Đố ứng - 14,48 ± 0,43 13,29 ± 0,23

0,4 14,35 ± 0,21 14,91 ± 0,99

Cao nấm t ợng hoàng

Tỷ l phân bố h ng cầu lô chứng và lô uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg không có sự khác bi ạ ĩa ống kê th ể c và sau thử nghi 1 N y, cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không ng lên tỷ l phân bố h ng cầu.

i) S lƣ ng b ch cầu

Số ợng bạch cầu lô chứng và lô chuột uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg th ể sa 1 u có sự ă ạ ĩa ống kê so v c thử nghi Đ u này có thể lý gi i là do lấ o h miễn dịch của ể ă số ợng bạch cầ ă c lô chứng và lô thử nghi ẫn nằm trong gi i hạ ì ng của chỉ số này. Số

75

ợng bạch cầu lô thử nghi m không khác bi ạ ĩa ống kê so v i lô chứng các th ểm xét nghi m. N y cao nấm t ợng hoàng 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không n số ợng bạch cầu trong máu.

B ng 4.25: Số ợng bạch cầu

Lô ạ ầ

Li u (g/kg) (n = 8) ( o/µL

T c thử nghi m Sau 1 tháng

4,26 ± 0,32 8,42 ± 0,57** Đố ứng -

4,41 ± 0,33 8,95 ± 0,91** 0,4

Cao nấm t ợng hoàng **: P< 0,001 so v c thử nghi m

j) S lƣ ng b ch cầu h t trung tính

B ng 4.26: Số ợng bạch cầu hạt trung tính

Lô Số ợng bạch cầu hạt trung tính ( %) Li u (g/kg) (n = 8) T c thử nghi m Sau 1 tháng

Đố ứng - 21,59 ± 2,54 20,89 ± 2,66

0,4 23,94 ± 1,76 20,06 ± 2,07

Cao nấm t ợng hoàng

Số ợng bạch cầu hạt trung tính lô chứng và lô uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg không có sự khác bi ạ ĩa ống kê th ểm c và sau thử nghi 1 N y, cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không ng lên số ợng bạch cầu hạt trung tính.

k) S lƣ ng b ch cầu lympho

B ng 4.27: Số ợng bạch cầu lympho

Lô Số ợng bạch cầu lympho ( %) Li u (g/kg) (n = 8) T c thử nghi m Sau 1 tháng

- Chứng 68,76 ± 2,97 70,47 ± 2,60

0,4 65,01 ± 2,97 67,21 ± 2,04

Cao nấm t ợng hoàng

76

Số ợng bạch cầu lympho lô chứng và lô uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg không có sự khác bi ạ ĩa ống kê th ể c và sau thử nghi 1 N y, cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không ng lên số ợng bạch cầu lympho.

l) S lƣ ng b ch cầu ơn nhân

B ng 4.28: Số ợng bạch cầ

Lô Số ợng bạch cầ ( %) Li u (g/kg) (n = 8) T c thử nghi m Sau 1 tháng

Đố ứng - 3,68 ± 0,35 3,71 ± 0,33

0,4 3,45 ± 0,28 3,34 ± 0,16

Cao nấm t ợng hoàng

Số ợng bạch cầ lô chứng và lô thử uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg không có sự khác bi ạ ĩa ống kê th ểm c và sau thử nghi 1 N y, cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không ng lên số ợng bạch cầ nhân.

4.3.3.3. Các thông s sinh hóa

a) H m lƣ ng GOT

4 29: H ợ GOT o

GOT Lô (IU/L) L (g/kg) (n = 8) T ử Sau 1 tháng

Đố ứ - 40,0 ± 1,76 36,50 ± 2,95

ấ 0,4 46,88 ± 3,25 35,5 ± 1,28 *

ao t ợ o *: P < 0 05 so ử

H ợng GOT trong huy lô chứng sau thử nghi m 1 tháng không có khác bi ạ ĩa ống kê so v c thử nghi m, còn lô chuột uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg th ểm sau 1 tháng có sự gi m ạ ĩa ống kê so v c thử nghi H ợng GOT lô uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg không có khác bi t so v i lô chứng th i ểm sau thử nghi m 1 tháng và vẫn nằm trong gi i hạn sinh ì ng (69-191 IU/L N y cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không ợng GOT trong huy ột.

77

b) H m lƣ ng GPT

4 30: H ợ GPT o

GPT Lô (IU/L) L (g/kg) (n = 8) T ử Sau 1 tháng

Đố ứ - 49,75 ± 2,0 49,50 ± 2,97

H ợng GPT trong huy lô chứng và lô thử uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg không có sự khác bi ạ ĩa ống kê th i ể c và sau thử nghi 1 N y, cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không ợng GOT trong huy ột.

0,4 ao ấ t ợ o 46,38 ± 1,64 45,0 ± 1,85

c) H m lƣ ng protein to n phần

4 31: H ợ o e o ầ o

Protein Lô (g/dL) L (g/kg) (n = 8) T ử Sau 1 tháng

Đố ứ - 4,23 ± 0,03 5,88 ± 0,19

H ợng o e o ầ o lô chứng và lô thử không có sự khác bi ạ ĩa ống kê th ể c và sau thử nghi 1 N y, cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không ợng o e o ầ o chuột.

0,4 ao ấ t ợ hoàng 4,43 ± 0,09 5,6 ± 0,07

d) Hàm lƣ ng triglyceride

4 32: H ợ e e o

Triglycerid (mg/dL) Lô

L (g/kg) (n = 8) T ử Sau 1 tháng

Đố ứ - 83,5 ± 8,23 115,13 ± 6,37*

ấ 0,4 81,5 ± 8,33 114,63 ± 7,98*

ao t ợ o *: P < 0,05 so ử

78

H ợng triglyceride của lô chứng và lô thử nghi m cho uống cao nấm T ợng Hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng có sự ă ạ ĩa thống kê so v c thử nghi ẫn trong gi i hạ ì ng (71- 164 mg/dL). H ợng triglyceride o lô thử nghi m không khác bi ạ ĩa ống kê so v i lô chứng th ể sa 1 N v y, cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không làm nh ợng triglyceride trong huy ột.

e) Creatinin

H ợng creatinin o lô chứng và lô chuột uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg th ể sa 1 ă ạ ĩa thống kê so v c thử nghi H ợng creatinin o lô thử nghi m không khác bi ạ ĩa ống kê so v i lô chứng th ểm sa 1 N y cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không làm ợng creatinin o .

4 33: H ợ ea o

Creatinin Lô (mg/dL) L (g/kg) (n = 8) T ử

Đố ứ - 0,64 ± 0,03 Sau 1 tháng 1,2 ± 0,06*

0,4 0,71 ± 0,04 1,25 ± 0,04*

ao ấ t ợ hoàng *: P < 0 05 so ử

f) Urea

4 34: H ợ ea o

Urea (mg/dL) Lô L ( / (n = 8) T ử Sau 1 tháng

Đố ứ - 52,16 ± 4,92 60,10 ± 2,86

0,4 ao ấ t ợ o 53,09 ± 3,15 53,0 ± 1,75

H ợng ea o lô chứng và lô uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg không có sự khác bi ạ ĩa ống kê th i ể c và sau thử nghi 1 N y, cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không ợng urea trong chuột.

79

4.3.3.4. Giải phẫu vi thể

Kh o sát vi thể gan ố ứng và lô uống cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg cho thấy có tình trạng viêm gan mạn c 2 Đ u này có thể do nh ng của kỹ thu t tách mẫu và xử lý tiêu b n gan chuột.

Kh o sát vi thể th n ố ứng và lô uống cao nấm t ợng hoàng

li u 0,4 g/kg không cho thấy có sự bấ ng

Cao nấm t ợng hoàng li u 0,4 g/kg sau 1 tháng cho uống không có biểu hi n bấ ng v ộ ng diễn trên chuột nhắt trắng. Các thông số v huy t học, chỉ số sinh hóa thuộc v chứ ă a - th n nằm trong gi i hạ ì ng.

4 35: K ẫ ể a sa 1 ử

Stt Đố ứ ao ấ ợ o 0 4 /

1 V a ạ oạ ộ ứ ộ ẹ

2 V a ạ oạ ộ ứ ộ ẹ

3 Viêm a ạ oạ ộ ứ ộ ẹ

V a ạ oạ ộ ứ ộ ẹ 4

V a ạ oạ ộ ứ ộ ẹ 5

V a ạ oạ ộ ứ ộ ẹ 6

V a ạ oạ ộ ứ ộ ẹ 7

V a ạ oạ ộ ứ ộ ẹ

8

4 36: K ẫ ể sa 1 ử

Stt Đố ứ ao ấ ợ o 0 4 /

1 M o ạ ì

2 M o ạ ì

3 M o ạ ì

M o ạ ì 4

M o ạ ì 5

80

6 M o ạ ì

7 M o ạ ì

8 M o ạ ì

4 3 4 X c ịnh khả năng t c d ng với tế b o ung thƣ của nấm

thƣ ng hoàng Phellinus sp.

T ộng của nấm t ợng hoàng hoang dại (Phellinus sp.) lên t bào ung

ạch cầ ại trực tràng

4.3.4.1 Ảnh hƣởng của cao chiết nấm thƣ ng hoàng Phellinus sp.

(CCPL) lên sự tăng tƣởng của tế b o ung thƣ b ch cầu K562

Sau 72 gi ti p xúc v i dịch cao chi t của nấm t ợng hoàng Phellinus sp., t o ò K562 ó ể hi ứng (v mặt hình thái) (hình 4.7). K t qu cho thấy, hầ tất c n ộ của dịch cao chi t, t o K562 ó ứng mà m ộ t bào gi ng chứa cao chi t khá ng v i gi ối chứng.

Hình 4.7: Đ ứng của dòng t o K562 ối v i cao chi t của Phellinus sp. Quan sát trên kính hiể o ợ ộ ó ại 10X. a) t bào K562, b) ĩa ứa t bào K562 thêm CCPL n ộ 500 µ / L ĩa ứa t bào K562 thêm CCPL n ộ 250 µ / L ĩa ứa t bào K562 thêm CCPL n ộ 125 µ / L e ĩa ứa t bào K562 thêm CCPL n ộ 61,5 µg/mL.

T ộng của cao chi t cho thấy Phellinus sp. có kh ă ức ch ă ng khối u một cách chọn lọc một số dòng t o ó ể những tác ộng của cao chi t Phellinus sp. n sự biểu hi n gen của K562 không gây ức ch t bào hoặc gây apoptosis. K t qu trên phù hợp v i những

81

nghiên cứ ó Shnyreva et al., (2010) ử nghi m cao chi t ethanol của Phellinus sp. lên t o K562 ( n ộ 10 µg/mL) cho thấy sự biểu hi n của các gene Bcl-2 ( ă 4 4 ần) và Casp-9 (2,1 lần) (Alla, 2010). Quá trì a o os s ợ a a a o ng chính là bên trong và bên ngoài t o o ng bên trong diễn ra b i sự cân bằng hai biểu hi n hai gene Bax (kích hoạt apotosis) và Bcl-2 gây ức ch apopotosis (Reed, 1997). N y sự ă biểu hi n Bcl-2 có thể là giúp t bào sống sót khi kích thích bằng cao chi t ethanol của Phellinus sp.

S e a ũ ột thử nghi m khác, sau khi xử lý v i INF-γ ao chi t ethanol của Phellinus sp. ợc thêm vào, sự phiên mã cho TNF-α ă lên 4,5 lần, biểu hi n Bcl-2 gi m so v i t bào không xử lý INF-γ N ững biểu hi e e ó o ấy hoạ oa o os s ẫ a ủ tín hi ể t o o ì t theo chu trình (Alla,2010). Tính hi ó ó ể là INF-γ ì o hi m trên t o ợc kích thích INF-γ sa ủ th a ó ể thấ ợc những t bào ch t chủ y u a o os s Đó ó ể gi i thích tại sao t bào K562 không bị ức ch ă ng khi xử lý v i CCPL. Câu hỏ ợ ặt ra là li u trong thử nghi m in vivo những nhân tố kích hoạ a o os s ó ợc cung cấ ầ ủ.

4.3.4.2 Ảnh hƣởng của CCPL lên sự tăng trƣởng của tế b o ung thƣ

i trực tràng HCT 116

Sau 72 gi ti p xúc v i dịch cao chi t của nấm t ợng hoàng Phellinus sp., t o ại trự HT 116 ó ững biểu hi n bị ức ch sự sống (hình 4.8). K t qu cho thấy hi u qu ức ch rõ r t ngay n ộ 15 µg/mL. Từ n ộ 250 µg/mL thấ ợc ức ch ă õ t. Mứ ộ bao phủ của t bào trên b mặ ĩa ứng v i n ộ cao chi t Phellinus sp. 16 µg/mL; 31 µg/mL; 62,5 µg/mL; 125 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL và 1000 µg/mL là 50%, 40%, 45%, 40%, 20%, 15% và 10%.

Sự ức ch ă s bào HCT 116 của CCPL thấy rõ khi sử dụng dịch chi t n ộ thấp (15 µg/mL). V i các n ộ cho vào 16 µg/mL; 31 µg/mL, 62,5 µg/mL; 125 µg/mL thì không thấy rõ sự ức ch có hay không sự phụ thuộc vào n ộ ại thấy sự bi n thiên rõ ràng khi sử dụng n ộ ao T o m này khi sử dụng n ộ thấ ( 125 µg/mL) thì sự chênh l ch n ộ giữa hai phép thử quá ít nên vẫ a o thấy rõ sự khác bi t. Ở n ộ ao ó ể cho thấy sự ức ch ă ng này có thể ạt t i mức bão hòa.

Một số hợp chấ ợc tách chi t từ Phellinus sp. ợc thử nghi m trên dòng t o ại trực tràng là hispidin (Ji Hong, 2014) và hispolon (J H 2015 o ấy hi u qu trong vi c ức ch ă ng của t bào HCT 116. Khi t o H T 116 ợc xử lý v i hispidin cho thấy gi m sự biểu hi n của Bcl-2 ă ểu hi n Bax và p53. Protein p53 là một nhân tố ức ch

82

khố ợc biểu hi n khi DNA bị ại do tia UV hay nhữ a ổi bộ e e 53 ũ ột nhân tố ể ẩy biểu hi n các gen khác, giúp sữa chữa DNA hoặc kích hoạt apoptosis.

Hình 4.8: Đ ứng của HCT 116 v i cao chi t Phellinus s i kính hiển vi o ợ ộ ó ại 10X. a ối chứng b) HCT 116 thêm CCPL n ộ 16 µg/mL. c) HCT 116 thêm CCPL n ộ 31 µg/mL d)HCT 116 thêm CCPL n ộ 62,5 µg/mL e) HCT 116 thêm CCPL n ộ 125 µg/mL. f) HCT 116 thêm CCPL n ộ 250 µg/mL. g) HCT 116 thêm CCPL n ộ 500 µg/mL. h) HCT 116 thêm CCPL n ộ 1000 µg/mL.

N s ợc chứng minh trong vi c gây ức ch ă s HCT 116 bằ o ng bên trong t bào. Sự ă ểu hi n của các gene death receptor 3 (DR3), cleaved caspase-8, cleaved caspase-1, và cleaved Parp cho thấ ộng gây apoptosis ngoài t bào khi kích thích bằng s N y hispidin từ Phellinus sp. có thể n quá trình

83

apoptosis của t bào HCT 116 qua c a o ng (Ji Hong, 2014). Sự ă biểu hi n của các gen Bax, DR3, caspase-8, caspase-1 và cleaved Parp, và sự gi m của Bcl-2 dịch chuyển theo vi ă ộ của hispidin (Ji Ho 2014 Đ u này cho thấy n ộ của cao chi t Phellinus sp. càng cao thì kh ă ức ch ă ng t o H T 116 ă ù ợp v i k t qu của a a ử nghi m ức ch s ng HCT các n ộ khác nhau.

Y u tố hoại tử khố (TNF a n apoptosis (TRAIL) là một cytokine có vai trò quan trọng trong vi c ức ch nhi u loại khối u, là li u pháp a ợ o u trị T u t o lại có thể kháng TRAIL. Vi c cùng bổ sung hispolon từ Phellinus.sp và TRAIL o o ng nuôi t bào, cho thấy hi u qu ức ch gây ch rõ r t t o H T 116 (J H 2015 N y hispolon hỗ trợ cho TRAIL ộng vào t bào ằng vi a ổi một số biểu hi n gen trên t bào.

Hình 4.15: Biể mứ ộ ức ch ă ng của CCPL lên t bào HCT 116 60.0

50.0

quote from

Tỉ lệ tế bào s ng (%)

40.0 bào ( ng hợp K562).

30.0

Từ những thí nghi m trên cho thấy k t qu nghiên cứu hoàn toàn phù hợp v i những thí nghi ó Tù ừng loại t bào khác nhau mà biểu hi e e a ổi khác nhau. Sự a ổi biểu hi n gene cao chi o P e s s ộng có thể gây apoptosis ( ng hợp HCT 116) hoặc hỗ trợ gây apoptosis các t

20.0

10.0

0.0

0

200

400

600

800

1000

1200

your cfvv[Grab Adx ea e ’s a e o w a great the document or use this space to emphasize a key point. To place text box this anywhere on the page, just drag it.]

Nồng cao chiết (ug/ml)

Hình 4.9: Biể mứ ộ ức ch ă ng của CCPL lên t bào HCT

116

Từ những thí nghi m trên cho thấy k t qu nghiên cứu hoàn toàn phù hợp v i những thí nghi ó Tù ừng loại t bào khác nhau mà biểu hi e e a ổi khác nhau. Sự a ổi biểu hi n gene cao chi t do

84

P e s s ộng có thể gây apoptosis ( ng hợp HCT 116) hoặc hỗ trợ gây apoptosis các t bào ( ng hợp K562).

N y Phellinus sp. có thể là một vị thuốc hứa hẹ ể hỗ trợ u trị t o o ấy kh ă ức ch khối u và hỗ trợ quá trình ch t theo chu trình. Thí nghi ầu trong vi c nghiên cứ u ch loại thuốc chố i từ nấ ợng hoàng. Những thí nghi m sâu ử nghi ộng v t mô hình, lâm sàng cầ ợc thực hi n.

4.4 Nghiên c u quy trình công nghệ nu i trồng ho n chỉnh 2 chủng

nấm ã ƣ c tuyển chọn.

Thí nghi ộ a a ng cấy chuy n giống, nhân giố ng nuôi tr ng c hai loài nấ ợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên.. Số li ợc ghi nh n bằ o ộ a ( sa 3 ngày, 5 7 ng ống thạ ối v ng cấy chuy n. Ghi nh n 50% và 100% số a m thức nhân giố ng nuôi tr ng c hai loài nấm dai Lentinus squarrosolus và nấ T ợng Hoàng Phellinus sp. Ti p theo, số li o ợ ợc xử lý bằng phần m m SAS 9.1.3 và k t qu ì ợc thể hi n trong các b ng bằng DUN AN ộ tin c y 95%

4.4.1 Nghiên c u quy trình nuôi trồng nấm dai Lentinus squarrosolus

4 4 1 1 X c ịnh m i trƣờng cấy chuyền nấm dai t t nhất

K t qu quan sát tố ộ a ng thạch sau 3 ngày, 5 ngày,

7 ợc tổng hợp trong b ng sau:

B ng 4.37: Tố ộ a ấ a ng nhân giống cấp một

Nghi m thức

Độ a sa 3 ngày (cm) Độ a sa 5 ngày (cm) Độ a sa 7 ngày (cm)

PDD 2,9 a 5,62 a 6,7 a

Raper 2,46 ab 5,1 a 7 a

PDK 2,2 b 5,02 a 6 ab

PDA 2,1 b 4,1 a 4,9 b

Ghi chú: các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức xác suất tin cậy 95%.

Dựa o ì ộ a sa 3 5 7 ừng loạ ng

Raper, PDA, PDD và PDK trên b ng 4.37 vẽ ợc biể sau:

85

8

7

6.7

7

)

6

5.62

6

5.12

5.02

4.9

5

m c ( ơ t n a l

4.1

4

h n

ì

N ứ 3

2.9

N ứ 5

3

2.46

2.2

2.1

b g n u r T

N ứ 7

2

1

0

Raper

PDA

PDA ổ s ừa

PDA ổ s khoáng

C c lo i m i trƣờng

Hình 4.10: Biể tố ộ a ấm dai trên ng nhân giống cấp một

PDD PDK

PD RP PD PD

RP

PDA

Hình 4.11: Nấ a a sa 3 ng nhân giống cấp một.

Sau ấ a ợc cấ o ng thạch v i các nghi m thức Ra e ng PDA bổ s c dừa (PDD ng

86

PDA bổ s o (PDK ng PDA. Sau mộ ấm bắ ầu phục h a ng.

Dựa vào biểu Hình 4.16 nh n thấy:

Sau 3 ngày tố ộ a ì ao ộng từ 2,1 n 2,9 cm. Tố ộ a ì a ất là ng PDD là 2,9 cm còn ch m nhất ng PDA là 2,1 cm. Ở ng Raper và PDK ó ộ lan t ì ầ ợ 2 46 2 2 Đ u này cho thấy PDD ng thích hợ ể nấ Da a ì o c dừa có các khoáng chấ ợng phù hợp cho nấm phát triển mặ ù ng Raper có khoáng chấ ợng khoáng chất cao không phù hợp bằng PDD T PDK ũ ó ững khoáng chất cần thi t ó ữ ợng phù hợ PDD ấm phát triển ch ò PDA ng thuần tự nhiên nên ỡng khôn ao ấm không phát triể ng trên.

Hình 4.12: Nấ a a sa 5 ng nhân giống cấp một.

Sau 5 ngày tố ộ a ì ao ộng từ 4,1 n 5,62 cm. Tố ộ a ì a ất ng PDD là 5 62 a m nhất ng PDK là 4,1 cm. Tố ộ a bình của nấ Ra e ng PDA lầ ợt là 5,12 cm 5 02 T o a oạ ì ấm bắ ầu lan y ng PDK có thể o ợ ỡng của ng PDA k t hợp v i các khoáng chất bị bi o o ng không còn phù hợ ối v i sự phát triển của ấ a ầu nữa dẫ n mứ ộ a trung bình của ng này thấ ng khác trong thí nghi m.

87

Hình 4.13: Nấ a a sa 7 ng nhân giống cấp một.

Sau 7 ngày tố ộ a ì ao ộng từ 4,9 n 7 cm. Tố ộ a ì a ất ng Raper là 7 cm và ch m nhất ng PDK là 4,9 cm. Tố ộ a ì ầ ợt của PDD 6 7 PDA 6 T o a oạn này thì tố ộ a ủa ng PDD bị tụt gi o ủ chất din ỡ ì ể ấm có thể cấy chuy n vào ngày thứ 5.

Qua quá trình thí nghi m cho thấy giữa a ng Raper và môi ng PDD không có sự khác bi t v mặt thống kê. Nên khi ti n hành cấy chuy n nấ Da ì ng PDD là phù hợp nhất vì ng này có ầ ủ chấ ỡng cần thi t cho sự phát triển của nấ Da ng th i ũ ễ dàng ti n hành chuẩn bị ng và chi phí thấ ng Raper. Vì v y thí nghi ng PDA bổ s c dừa (PDD) ợc chọ ể cấy chuy n giống nấm Dai

4.4.1.2. Khảo s t m i trƣờng nhân gi ng nấm dai.

Sa ấ ợc cấ ng hạ ng gạo lứt, môi ng hạt lúa – cám gạo 5% ng hạt bắ ng hạ u xanh. Sau mộ ấm bắ ầu phục h i và lan s o ng.

Khi ti n hành thí nghi ng hạ a ị nhiễ c khi ể ợ 50% N o u xanh là một loại hạt có kh ă c cao dẫ n ẩ ộ trong hạ ao ng th i hạ ũ ó ợ ỡ ao oại hạt khác. V u ki n ẩ ộ ợ ỡng cao phù hợp v i sự phát triển của các loài vi

88

sinh v ấ a u xanh hoàn toàn không thích hợ ể nhân giống nấm dai.

K t qu quan sát th i a a ợ 50% 100% ng hạt

ợc tổng hợ sa :

B 4 38 T ấ a a 50% 100% ng hạt

N ứ

Số ấm a ợc 50% Số ấ a ợc 100%

M ng gạo lứt 9 a 17 a

12,8 b 23 ab

Môi ng hạt lúa- cám gạo 5%

Ghi chú: các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức xác suất tin cậy 95%.

M ng hạt bắp 13,2 b 24,4 b

Dựa vào trung bình số a ợc 50% và 100% của của môi ng gạo lứ ng hạt lúa – cám gạo 5% ng hạt bắp trên B ng 4.38 vẽ ợc biể hình 4.14.

Qua biể Hình 4.14 nh n thấy:

Trung bình số a ợc 50% trên từng loại môi tr ao ộng từ 9 13 2 T o ó ì số a ắn nhất ng gạo lứt là 9 ngày còn dài nhấ 13 2 ng hạt bắp. Còn trung bình số a ợc 50% của ng hạt lúa- cám gạo 5% là 12,8 Đ u này cho thấy trong bốn loạ ì ng gạo lứt phù hợp cho sợ ấm phát triể ì o ạo lứt có chứa ợng dinh ỡng, khoáng chất và một số ợng cần thi t ngoài ra khi nấu gạo lứt thì làm cho các liên k a o ạo lứt bị ứt ra thành những phân tử ấm dễ dàng sử dụ T o ng hạt bắ ấm lan ch m một phần là do kho ng cách giữa các hạt l ấ ă a ợ ò ng hạt lúa tuy là có hạt gạo o ngo ợc bao phủ b i một l p vỏ trấu chứa cenlullose khi ấm khó hấp thụ ạo lứt. Trung bình số a ợc 100% trên từng loại môi ao ộng từ 17 24 4 T o ó ì số a ắn nhấ 17 ng gạo lứt và dài nhất là 24,4 ngày trên môi ng hạt bắp. Trung bình số a ng hạt lúa – cám gạo 5% là 23 ngày.

89

30

24.4

25

23

20

17

15

13.2

12.8

Số a 50%

9

10

ơ t n a l y g n S

Số a 100%

5

0

Gạo ứ

Hạ ắ

Hạ a – ạo 5% C c lo i m i trƣờng

Hình 4.14: Biể tố ộ a ấ a ng hạt

Hình 4.15: T ấ a sa 14 ng hạt.

Qua quá trình ti n hành thí nghi m giữa số a ủa môi ng gạo lứ ng hạt lúa – cám gạo 5% không có sự khác bi t v mặt thố ng hạt lúa – cám gạo 5% là phù hợ o ấm dai phát triển nhất trong bốn loại môi tr Đ ng th ng lúa – cám gạo 5% phù hợ o ng này dễ dàng thực hi ầ thấp. V y nên thí nghi m này chọ ng hạt lúa – cám gạo 5% làm ng nhân giống nấm dai.

4.4.1.3 Chọn m i trƣờng nuôi trồng nấm dai t t nhất

90

Sa ấ ợc cấ o ng bị ng mùn a ổ sung chấ ỡ (KDD ù a ổ sung bột bắ 5% ( 5 ù a ổ sung bột bắp 5% và cám gạo 5% ( 5 5 ù a ổ sung tấm và bột bắ (T5 5 Sa 20 nấm bắ ầu phục h a o ng.

K t qu quan sát th a a ợ 50% 100% ng

ù a ợc tổng hợ sa :

B 4 39: T ấ a a 50% 100% ng nuôi tr ng.

Nghi m thức ấm

Số a ợc 50% Số ấm a ợc 100%

B5C5 46.0 a 68.8 a

B5 47.6 a 72.2 a b

KDD 52.8 a b 76.0 a b

Ghi chú: các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau biểu thị

sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức xác suất tin cậy 95%.

T5C5 62.6 b 81.4 b

Dựa vào trung bình số a ợc 50% và 100% của của môi ù a ổ sung chấ ỡ ù a ổ sung bột bắ 5% ù a ổ sung bột bắp 5% và cám gạo 5%, ù a ổ sung tấm 5% và bột bắp 5% trên B ng 4.39 vẽ ợc biể hình 4.16.

Qua biể hình 4.16 nh n thấy:

Trung bình số a ợ 50% ao ộng trên từng loạ ng là 46-62 ngày. Trung bình số a ắn nhất ù a ổ sung bột bắp 5% và cám gạo 5% là 46 ngày và trung bình số a nhất ù a ổ sung tấm gạo 5% ( ấ ộ o ù a ấ ạo 5% là 62 ngày. Còn trung bình số ngày trên từng loạ ù a ổ sung chấ ỡ ng ù a ổ sung bột bắp 5% lầ ợ 52 8 62 Đ u này cho thấy ù a ổ sung bột bắp 5% và cám gạo 5% là phù hợp nhất trong bốn loạ ng trên vì trong bột bắp có chấ ấ ạ ũ ột số khoáng chất và cám gạo chứa một số vitamin những này phối trộn v i nhau thích hợ o ấm dai phát triển. T ù a ổ sung tấm gạo 5% và cám gạo 5% ấ a m nhất là do khi phối trộn tấm v i mùn a ững hạt tấ ợc nghi n nhuyễn nên quá trình phân gi ũ o ấm dai khó sử dụ M ù a ổ sung bột bắ 5% a o ợc cung cấp dinh ỡ ù ợp bằ ù a ợc bổ sung bột

91

90

81.4

76

80

72.2

68.8

70

62

60

52.8

47.6

46

50

số a ợ 50%

40

bắp lẫn cám gạo ò ù a ổ sung chấ ỡng do không cung cấ ủ ỡ o ấ o ấm hấp thụ chất dinh ỡng ch a so ng ù a ổ sung bột bắp 5% và cám gạo 5% ù a ổ sung bột bắp 5%. Trung bình số a ợc 100% trên từng loạ ao ộ 68 8 n 81,4 ngày.

ơ t n a l y g n s h n

ì

30

số a ợ 100%

20

b g n u r T

10

0

KDD

B5

T5C5

B5C5 c c lo i m i trƣờng

Hình 4.16: Biể tố ộ a ấ a ng nuôi tr ng.

KDD: mùn a ổ sung chấ ỡng

5: ù a ổ sung bột bắp 5%

5 5: ù a ổ sung bột bắp 5% và cám gạo 5%

T5 5: ù a ổ sung tấm 5% và bột bắp 5%

Hình 4.17: T ấ Da sa 50 ng nuôi tr ng

Trung bình số a ắn nhất ù a ổ sung bột bắp 5% và cám gạo 5% 68 8 a m nhất ng mùn a ổ sung tấm gạo 5% và cám gạo 5% là 81,4 ngày. Còn trung bình số ngày a ù a bổ sung bột bắ ù a

92

bổ sung chấ ỡng lầ ợt là 72,2 và 76 ngày. Qua quá trình ti n hành thí nghi m cho thấ ù a ổ sung bột bắp 5% và cám gạo 5% có số a a ất kho ng 70 ngày. Có thể ứng dụng ng o u ki n s n xuất thực tiễn giúp rút ngắn th a a ể nhanh ra qu thể. Sau quá trình nghiên cứu từ thí nghi m 1, thí nghi m 2 và thí nghi m 3 tổng hợp qui trình nuôi tr ng và thuần hóa giống nấm dai Lentinus squarrosolus hoang dạ sa :

MT PDA bổ sung nƣớc dừa

pH = 7

5 -7 ngày nhiệt

30o-34oC

12 ngày

Nhiệt

30o-34oC

MT mùn cƣa bổ sung b t bắp 5% cám và 5% g o pH = 10

Nhiệt

Sau 98 ngày nấm ra quả thể

29o-32oC

MT h t lúa – cám g o 5%, pH = 7

\

Hình 4.18: Qui trình nuôi tr ng nấm dai Lentinus squarrosolus.

4.4.2 Nghiên c u quy trình nuôi trồng nấm thƣ ng hoàng Phellinus

sp.

4.4.2.1 Khảo s t m i trƣờng nhân gi ng cấp m t

Sa nấm t ợng hoàng ợc cấ o ng thạch v i các nghi m thứ Ra e ng PDA bổ s c dừa (PDD),

93

ng PDA bổ sung khoáng(PDK), môi ng PDA. Sau mộ nấm bắ ầu phục h a ng.

B ng 4.40: Tố ộ a nấm t ợng hoàng ng nhân giống cấp một.

lần Sau 5 ngày Sau 7 ngày Sau 3 ngày Nghi m thức Số lặp lại

NT1 5 3,32 a 5,04 a 6,86 a

NT4 5 3,22 a 4,96 a 6,72 a

NT2 5 2,94 ab 4,8 a 6,52 a

NT3 5 2,46 b 3,5 b 5,24 b

NT1: M ng Raper.

NT2: M ng PDA.

NT3: M ng PDA bổ s c dừa

NT4: M ng tự ( ố ộ oa ỗ

Ghi chú: các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau biểu

thị sự khá biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức xác suất tin cậy 95%.

Sau 3 ngày

Sau 5 ngày

ạo ắ

ơ t n a l y g n S

Sau 7 ngày

8 7 6 5 4 3 2 1 0

NT1

NT4

NT2

NT3

C c lo i m i trƣờng

Hình 4.19: Biể tố ộ a ấm t ợng ho ng nhân giống cấp một

94

Hình 4.20: T ấ ợng hoàng trên môi ng thạch sau 3 ngày Hình 4.21: T ấ ợng hoàng lan t ng thạch sau 5 ngày

Hình 4.22: T ấ ợng hoàng trên môi ng thạch sau 7 ngày 95

Sau khi cấy giống trên các loạ ng thạch ta nh n thấy, tố ộ lan ì a 3 Ra e 3 32 ng tự 3 22 PDA 2 94 ng PDA bổ s c dừa 2 46 T ự, tố ộ a ẫn ổ ịnh trung bình qua 5 ngày trên ng Ra e 5 04 ng tự 4 96 ng PDA 4 8 ng PDA bổ s c dừa là 3,5 cm. Và sau 7 ngày, tố ộ a ì Ra e 6 86 ng tự nhiên 6 72 ng PDA là 6,52 cm, môi tr ng PDA bổ s c dừa là 5,24 cm.

V y, tố ộ a ì a ứ 3, thứ 5, thứ 7 trên 4 môi ng nhân giống cấp 1 gi m dần theo thứ tự sa : ng Rapper, ng tự ng PDA và kém nhấ ng PDA bổ sung n c dừa.

Đối v i nấm th ợng ho ì ột loại nấm m i nên có những quá trình sinh học khác lạ, nên vi c bổ sung một số chấ ỡ ặc bi t c dừa có thể là không thích hợ T ng Raper do thành phầ ng chứa nhi u khoáng chấ ầ ủ ỡ o ấm phát triể o ó ấm lan rấ a ất mạnh. Bên cạ ó ng tự ũ ứa rất nhi u khoáng chất bao g m những chất dinh ỡng chủ y : ạo ỗ, khoai tây, cám bắ ộ a trên ng này xấp xỉ v Ra e T PDA ấm vẫn phát triển tốt, mặc dù sợ ển mạnh bằng hai loại môi T ng PDA có bổ s c dừa mặc dù ỡ ao ng PDA n ộ a a ấp nhất do thành phầ c dừa o ng không thích hợ ể ấm phát triển tố

Qua số li ợc phân tích bằ DUN AN ộ tin c y 95% ta nh n thấ ng thích hợ ể nhân giống nấm t ợng hoàng v i số ợng l ng cấ 1 ng PDA vì nghi m thức này nằm trên phân l p A và AB, không có sự khác bi t v mặt thống kê so v i 2 nghi m thứ ó ộ a ao ấ Ra e ng PDA, ối v i nghi m thức là môi ng PDA có bổ s c dừa nằm phân l p B có sự khác bi t v mặt thống kê so v i 3 lọa ng còn lại. Bên cạnh ó ầ ng PDA chủ y oa ể thực hi n là thấp nhấ ấm vẫn phát triể ng nhất so v i 2 loại m ng tốt nhất là Ra e ng tự M ng Raper thành phần chủ y u là các loại hóa chấ ể thực hi n tố ò ối v ng tự nhiên c thực hi ối phức tạp và nhi oạn. Vì v y, ta chọn ng PDA ể nhân giống cấp 1 nấm t ợng hoàng.

4.4.2.2. Khảo s t m i trƣờng nhân gi ng cấp 2

96

Thí nghi ộ a a ng nhân giống cấp 2, ợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên v i 4 nghi m thức và mỗi nghi m thức g m 5 lần lặp lại. Số li ợc ghi nh n bằ o ộ a ( ấ a ợ 50% 100% ng hạt chứa trong bình c biển. Ti p theo, số li o ợ ợc xử lý bằng phần m m SAS 9.1.3 và k t qu ì ợc thể hi n trong b ng bằ DUN AN v ộ tin c 95% sa :

B 4 41: T nấ T ợng Hoàng a 50 % 100 % ng

hạt.

lần a a Nghi m thức Số lặp lại Độ 50% Độ 100 %

NT4 5 9,6 a 15,8 a

NT3 5 7,8 b 12,8 b

NT2 5 6,4 c 12,2 c

NT1 5 6,2 c 11,2 c

NT1: M ng hạt gạo lứ NT2: M ng hạt lúa – 5% cám gạo.

Ghi chú: các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau biểu

thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức xác suất tin cậy 95%.

18

16

14

12

10

Độ a 50 %

8

Độ a 100 %

NT3: M ng hạ a NT4: M ng hạt bắp.

ơ t n a l y n f a g n S

6

4

2

0

NT4

NT2

NT1

NT3 c c lo i m i trƣờng

Hình 4.23: Biể tố ộ a ủa nấ ợng hoàng trên môi ng hạt.

97

Hì 4 24: T ấ ợ o sa 6 ng hạt.

Hì 4 25: T ủa nấ ợng hoàng sau 11 ngày cấy giống trên môi ng hạt

Ở thí nghi m ngày k t qu số ấ a 50% ng hạt gi m dần theo thứ tự sa : ng có số ấ ă a o giá thể nhấ ng gạo lứ ng hạt lúa sau kho 6 nấ a i 50% của bình gạo lứ V ng hạ u xanh là kho ng 8 ngày. Cuố ù ấ ă o giá thể ch m nhất là môi ng hạt bắp, sau kho 10 ấm m ă ợc 50% vào giá thể.

98

T ự số ấ a 100% ng hạt gi m dần theo thứ tự sa : ng có số ấ ă a o ể nhất là môi tr ng gạo lứt sau kho 11 ấ a i 100 % của bình gạo lứt. Hai loạ ấm lan nhanh ti eo sa ng hạt gạo lứ ng hạt lúa kho 12 ng hạ u xanh kho ng 13 ngày. Cuố ù ấm ă o ể ch m nhất là ng hạt bắp, sau kho 16 ấm m ă ợc 100% vào giá thể.

N y, tố ộ a ng gạo lứt là nhanh nhất, ti p theo là

ng hạt lúa và hạ u xanh, cuố ù ng hạt bắp.

Độ lan ng hạt có sự khác nhau là do hạt gạo lứt m m, l p cám bên ngoài hạt gạo rất nhi ỡ ộ ẩm của ng vừa ph i nhấ ấm phát triển nhanh và rất tố T ấ ng hạt a ũ ển rất tốt, gầ ng hạt gạo lứ nấ ộ a a o ng hạ a ỡng là môi ng tố o u loại nấ ă ấ ợc li u phát triển. Trên môi ng hạ u xanh và hạt bắ ấ a ấ o ộ ẩm quá cao, sau quá trình thanh trùng c hai loại hạ ể lại mộ ợ c rất nhi u trong ng dẫ ộ ẩ ấm thi o ể hô hấp và dễ bị tạp nhiễ

Qua số li ợc phân tích bằ DUN AN ộ tin c y 95% ta nh n thấy, ng thích hợp nhấ ể nhân giống cấp 2 nấm T ợng Hoàng v i số ợng l ng hạt lúa bổ sung 5% cám gạo vì nghi m thức của ng này nằm phân l p C không có sự sai khác v mặt thống kê so v ng tốt nhấ ng hạt gạo lứt. Bên cạnh ó m thứ ng hạ u xanh nằm phân l p B và nghi m thứ ng hạt bắp nằm phân l p A, c hai nghi m thứ u có sự khác bi t v mặt thống kê so v i nghi m thứ ng hạt gạo lứt và hạt lúa bổ sung 5% cám gạo T o ó ứ ộ a ng hạt lúa rất nhanh, giá thành thấp nhất trong 4 loạ ng thực hi n, thao tác thực hi n dễ dàng và dễ cấy chuy a ng nhân giống cấp 3 vì hạ a ó ộ cứng dễ a ị ù a M ng hạt gạo lứt tốt nhất tuy nhiên hạt gạo có hi ợng bị co gộp lạ ấ ă s o chất, làm gi m khố ợng meo tạo ối cao. Môi ng hạ u xanh và hạt bắp chi phí rất cao và rất dễ nhiễm trong quá trình cấ o ó ống cấp 2 trên 2 loạ N y, ng hạt lúa bổ s 5% ợc lựa chọ ể nhân giống cấp 2 nấm t ợng hoàng.

4.4.2.3. Khảo s t m i trƣờng nhân gi ng cấp 3

99

14

12

10

8

Độ a 50 %

6

Độ a 100 %

4

2

ơ t n a l y g n S

0

NT1

NT3

NT2 C c lo i m i trƣờng

Hình 4.26: Biể ộ a của nấ ợng hoàng trên môi ng nuôi tr ng

Thí nghi ộ a a ng nhân giống cấp 3, ợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên v i 3 nghi m thức và mỗi nghi m thức g m 5 lần lặp lại. Số li ợc ghi nh n bằ o ộ lan ( ấ a ợ 50% 100% ù a ứa trong túi PE, mỗi túi có khố ợng 1,1 kg. Ti p theo, số li o ợ ợc xử lý bằng phần m m SAS 9.1.3 và k t qu ì ợc thể hi n trong b ng bằng DUN AN i ộ tin c 95% sa :

B 4 42: T nấm t ợng hoàng a 50% 100% ng

nuôi tr ng.

a a Nghi m thức Số lần lặp lại Độ 50% Độ 100 %

NT1 5 9,8 a 11,8 a

NT2 5 6,8 b 9,4 b

NT3 5 6,4 c 9,2 b

NT1: Mùn a ổ sung 5% cám gạo.

NT2: Mù a ổ sung bột bắp 5% và 5% cám gạo.

Ghi chú: các giá trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau biểu

thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức xác suất tin cậy 95%.

NT3: Mù a ổ sung bột bắp 5% và 10% cám gạo.

100

NT1

NT2

NT3

Hì 4 27: T ấ ợ o sa 6 ng nuôi tr ng.

NT1: Mù a ổ sung 5% cám gạo, NT2: Mù a ổ sung bột bắp 5% và 5% cám gạo, NT3: Mù a ổ sung bột bắp 5% và 10% cám gạo.

101

NT3

Hì 4 28: T ấ ợ o sa 9 ng nuôi tr ng

NT1: Mù a ổ sung 5% cám gạo, NT2: Mù a ổ sung bột bắp 5% và 5% cám gạo, NT3: Mù a ổ sung bột bắp 5% và 10% cám gạo.

102

Ở thí nghi m này, trung bình số ấm a 50% ng ù a ổ sung 5% cám bắp và 10% cám gạo là kho ng 6 ngày, trên môi ù a ổ sung 5% cám bắp và 5% cám gạo là kho ng 7 ngày và trên ù a ổ sung 5% cám gạo là kho ng 10 ngày.Tố ộ a vẫn ổ ịnh, trung bình số ấ a 100% ù a bổ sung 5% cám bắp, và 10% cám gạo là kho 9 ng mùn a ổ sung 5% cám bắp và 5% cám gạo vẫn kho ng 9 ngày và trên môi ù a ổ sung 5% cám gạo là kho ng 12 ngày.

Do ó, tố ộ a a ấ ù a ổ sung 5% cám bắp và 10% cám gạo, ti eo ù a ổ sung 5% cám bắp và 5% cám gạo và cuố ù ù a ổ sung 5% cám gạo có tố ộ a m nhấ o 3 ng nêu trên.

Trên c 3 loạ ng này tố ộ a ch quá l n, do ù a ất thích hợp cho nấm t ợng hoàng phát triể ộ a a a ch m tùy thuộ o ợng cám bắp và cám gạo ợc bổ sung thêm. Trên ù a ổ sung 5% cám bắp và 10% cám gạo ỡng cao nhấ ấm lan rất nhanh và m ộ ặc nhấ ng mùn a ổ sung 5% cám bắp và 5% cám gạo ấm lan rất nhanh tuy nhiên kém ù a ổ sung 5% cám bắp và 10% cám gạo o ợng cám gạo thấ 5% T ù a ổ sung 5% cám gạo ộ a ộ a mức trung bình.

Qua số li ợc phân tích bằ DUN AN ộ tin c y 95% ta nh n thấ ng thích hợp nhấ ể nhân giống cấp 3 nấm T ợng Hoàng ù a ổ sung 5% cám bắp và 5% cám gạo, theo k t qu chạy thống kê ta thấy rằng nghi m thức của ng này nằm trên phân l p B có cùng phân l p v i nghi m thứ ó ộ a a nhấ ù a bổ sung 5% cám bắp và 10% cám gạo, nên c 2 nghi m thức này không có sự sai khác v mặt thống kê. Nghi m thức 1 môi ù a ổ sung 5% cám gạo nằm trên phân l p A nên có sự khác bi t v mặt thống kê so v i 2 nghi m thức còn lại. Ở nghi m thức 2 môi ng ù a ổ sung 5% cám bắp và 5% cám gạo ợc thực hi m thức 3 là 5% cám gạo, tuy nhiên tố ộ a ẫn khá nhanh và m ộ m b o ấ ợc phát triển tốt và gi ợc chi phí thực hi n s n phẩm. Vì v y, ta lựa chọn m ù a ổ sung 5% cám bắp và 5% cám gạo ng cấ 3 ể nhân giống nấm t ợng hoàng.

4.4.2.4. Hoàn thiện quy trình nuôi trồng nấm thƣ ng hoàng

Từ k t qu nghiên cứu trên, quy trình nhân giống nấm t ợng hoàng ợc hoàn thi ể nhân giống ại trà v i số ợng l ối v i loại nấm quý hi m này nhằ ứng nhu cầu phòng và chữa b nh trong xã hội hi n nay.

103

Do ó c xây dựng một quy trình nhân giống loại nấ ợc li u này sử dụng ngu n nguyên li u có giá thành thấp là vô cùng cần thi t và mang tính tất y ối v i xã hội ngày nay.

Gi ng g c

Sau 60- 70 ngày

Nhiệt 27o-29oC

Môi trƣờng PDA pH=7

Sau 50- 52 ngày

Sau 6-7 ngày Nhiệt 32o-34oC

Nhiệt 27o-29oC

Môi trƣờng h t lúa+ 5% cám pH=7

ùn cƣa cao su+5%cám bắp+5 %cám g o, pH=10

Sau 12 ngày

Sau 3-4 ngày

Nhiệt 32o-34oC

Hình 4.29: Quy trình nhân giống nấ ợng hoàng (Phellinus sp.)

104

CHƢƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1 Kết luận

Lu n án thu th ợc 28 mẫu nấm hoang dại từ tự o ó ó 5 mẫu nấ ă m nấm trứng, nấm tràm, nấm dai, nấm tuy ĩ ấm ngân ĩ ỏ da cam; 7 mẫu nấ ợc li u g m hai loài nấ ợng hoàng, 3 loài nấm linh chi, một vân chi và một nấ e ỏ; ă o ấ ộc và 11 loài a t x o Đ u tra kh o s ịa ựa chọn và ịnh danh 5 mẫu nấm theo hình thái những loài nấ ng sử dụ ại hóa là nấm dai (MS14), nấm linh chi tầng (MS20), nấm ợng hoàng (MS22), nấm vân chi (MS10) và nấm mộc bá huê (MS27). C 5 mẫu nấ ộc tính cấp khi thử nghi m trên chuộ ợc ti n hành phân l p, k t qu chỉ phân l ợc bố o ợng hoàng, linh chi tầng, nấm dai và nấm vân chi. Ti p theo gi i trình tự gen bốn loài nấm này xác ịnh tên khoa học theo trình tự DNA k t qu là nấm t ợng hoàng Phellinus sp., linh chi tầng Ganoderma applanatum, nấm vân chi Trametes sp., nấm dai Lentinus squarrosolus. Ở nội dung này chọ ợc bốn loài nấ ể ti n hành nghiên cứu ti p theo là nấm nấm t ợng hoàng Phellinus sp., nấm dai Lentinus squarrosolus, linh chi tầng Ganoderma applanatum và nấm mộc bá huê là loài nấm rất m i có triển vọng. K t qu ịnh thành phần dinh ỡng của bốn loài nấm trên chọ ợc hai loài nấm là nấm t ợng hoàng Phellinus sp. và nấm dai Lentinus squarrosolus, k t qu ị ợc tính trên hai loài nấ ợc li ợng hoàng và linh chi tầng chọ ợc nấm t ợng hoàng ể ti p tục nghiên cứu. Ti p tụ ị ộ ng diễn nấm t ợng hoàng trên chuột, k t qu chuộ o o ì ng trong th i gian thử nghi m, ti p tục thử tác dụng của nấm t ợng hoàng trên dòng t o K562 ại trự H T116 apoptosis ợc kích hoạt, t o a ă ể khi g a ă n ộ ối v i dòng t bào HCT116. Nghiên cứu quy trình nuôi tr ng loài nấ ă ấm dai Lentinus squarrosolus kho ng 120 ngày và nấ ợc li u là nấm t ợng hoàng Phellinus sp. kho ng 150 ngày kể từ ngày cấy chuy n.

5.2 Kiến nghị

Đối v i nấm mộc bá huê là loài nấm m i rất lạ có triển vọng cao cầ ợc nghiên cứ s ịnh tên khoa học, cần thử nghi m tìm một số ng nuôi tr ng thích hợ ịnh các hoạt chất hay thành phần dinh ỡng hi n di n trong nấm này. Riêng nấm linh chi tầng là loài nấm cổ linh a ũ ột loài nấ ợc li u quý cầ ợc nghiên cứ s ựng quy trình nuôi tr ịnh thêm một số thành phầ ợc tính quan trọ ể bổ sung thêm bộ s a ạng loài nấm linh chi Vi t Nam. Riêng nấm dai Lentinus squarrosolus là loài nấ ă o oa ạ

105

ợc nuôi tr ng thành công nên có chi ợc nhân giố ại trà, phổ bi n cho i dân nuôi tr ng sử dụ ể bổ s a ạng loài nấ ă ịa thuần chủng của Vi Na Đối v i nấm t ợng hoàng Phellinus sp. là loài nấ ợc li u hoang dại hi ại hi n di n tạ ịa ấ nhân giống và nuôi tr ng rất dễ thực hi n vì phù hợp v i khí h u và thổ ỡng của vùng, nên cần ti n hành nuôi tr ng v i số ợng l Đ loài nấm có triển vọ u trị ao ần thử nghi m trên một số dòng t o Đặc bi t nấm t ợng hoàng Phellinus sp. là một vị thuốc hứa hẹn hỗ trợ u trị ại trực tràng vì chúng có kh ă ức ch khối u và hỗ trợ quá trình ch eo ì ần nghiên cứ u ch loại thuốc chố ại trực tràng từ nấ ợng hoàng. Những thí nghi m s ử nghi ộng v t mô hình và thử nghi m lâm sàng thuốc từ nấm t ợng hoàng cần ph ợc thực hi n. Vấ cuối cùng là ngu n tài nguyên nấm khu vực Thấ S A G a ù o i nhi u loài nấm m i lạ, quý hi m cần ph i ợc b o t ứ c vi ị hóa nông thôn mi a ổi khí h u toàn cầu.

106

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Acharya K., Chatterjee S, Biswas G, Chatterjee A and Saha GK, 2012. Hepatoprotective effect of a wild edible mushroom on carbon tetrahydrochloride-induced hepatotoxicity in mice. Inter.J.Pharm.Sci. V.4 (Suppl.3).

Akanuma AM, Yamagishi A, Motoi M, Ohno N, 2006. Cloning and characterization of polyphenoloxidase DNA from Agaricus brasiliensis S. Wasser et al. (Agaricomycetideae). Int J Med Mushrooms.;8:67–76

Alla V.Shnyreva, 2010. Extracts of Medicinal Mushrooms Agaricus bisporus and Phellinus linteus Induce Proapoptotic Effects in the Human Leukemia Cell Line K562.

Amino M, Noguchi R, Yata J, Matsumura J, Hirayama R, Abe O, Enomoto K, Asato Y, September 1983. Studies on the effect of lentinan on human immune system. II. In vivo effect on NK activity, MLR induced killer activity and PHA induced blastic response of lymphocytes in cancer patients. Gan to Kagaku Ryoho. 10(9): 2000-2006.

Amirati J. F, 2007. Cleistocybe, a new genus of Agaricales. Mycoscience

48.

Asai, K. 1980. Miracle Cure Organic Germanium. Japan: Japan

Publications, pp. 16-76.

Atlas, R.M. 2010. Handbook of Microbiological Media (4th edition).

Boca Raton: Taylor & Francis, pp. 911-978.

Banerjee A, G Biswas, M. Rai, G.K. Saha and K Acharya, 2007. Antioxidant and nitric oxide synthase properties activation of Macrocybe gigantea (Massee) Pegler & Lodge. Global J.Biotech.Biochem.

Bộ Y T 2009 D ợ ển Vi t Nam tái b n lần 4. Nhà xuất bản Y học,

Hà Nội.

Boh, B. 2013. Ganoderma lucidum: a potential for biotechnological production of anti-cancer and immunomodulatory drugs. Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery, 8(3):255-287.

Brossi, A. 1988. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology. London:

Academic Press, pp. 3.

Bruns TD, White TJ and Taylor JW, 1991. Fungal molecular

systematics. Annu Rev Ecol Syst 22:525-564.

Burke, R.W., B.I. Diamondstone, R.A. Velapoldi and O. Menis. 1974. Mechanisms of the Liebermann-Burchard and Zak Color Reactions for Cholesterol. Clinical Chemistry, 20(7):794-801.

Cao QZ. and Lin ZB., 2006. Ganoderma lucidum polysaccharides peptide inhibits the growth of vascular endothelial cell and the induction of VEGF in human lung cancer cell. Life Sciences 78(13):1457-1463.

107

Cengiz K, Papatya B., Ozge Y. and Hasan Y., 2005. Effects of glucan treatment on the Th1/Th2 balance in patients with allergic rhinitis: a double- blind placebo-controlled study. European cytokine network. Volume 16 No 2: 128 – 134.

Chandrashekar, R., M. Jayaraj, A. Prabhakar and S.N. Rao. 2013. Literature reviewed and self conducted comparitive phytochemical analysis of powder of Ganoderma lucidum with methanolic extract. Unique Journal of Ayurvedic and Herbal Medicines, 01(02):55-57.

Chang, S-T, 1999, Global impact of edible and medicinal mushrooms on human welfare in the 21st century, International journal of Medicinal Mushroom.

Chang & Miles, 2004. Mushrooms: Cultivation, Nutritional Value,

Medicinal Effect, and Environmental Impact, Second Edition, CRC Press

Chang S.T. and J.A. Buswell. 2008. Safety, quality control and regulational aspects relating to mushroom nutriceuticals. In Proceedings of the 6th International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products, 188-195. GAMU Gmbh, Krefeld, Germany.

Chang, Y.W. and T.J. Lu. 2004. Molecular Characterization of Polysaccharides in Hot-Water Extracts of Ganoderma lucidum Fruiting Bodies. Journal of Food and Drug Analysis, 12(1):59-67.

Chen, J.H., J.P. Zhou, L.N. Zhang, Y. Nakumura and T. Norisuye. 1998. Chemical structure of the water-insoluble polysaccharide isolated from the fruiting body of Ganoderma lucidum. Polymer Journal, 30:838–842.

Chen RY, Yu DQ, 1993. Studies on the triterpenoid constituents of the

spores from Ganoderma lucidum Karst. J. Chin. Pharm. Sci., 2: 91-96.

Chen, S., J. Xu, C. Liu, Y. Zhu, D.R. Nelson, S. Zhou, ... and C. Sun. 2012. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nature Communications, 3(913):1-9.

Chen NH., Liu JW. and Zhong JJ., 2010. Ganoderic acid T inhibits tumor invasion in vitro and in vivo through inhibition of MMP expression. Pharmacol Rep 62(1):150-163.

Chen J and Seviour R, 2007. Medicinal importance of fungal beta - (1–

>3), (1–> 6) - glucans. Mycological Research (111): 635 – 652.

Cheong, J., W. Jung and W. Park. 1999. Characterization of an alkali- extracted peptidoglycan from Korean Ganoderma lucidum. Archives of Pharmacal Research, 22:515-519.

Chin, S.K. and C.L. Law. 2012. Optimization of Convective Hot Air Drying of Ganoderma lucidum Slices Using Response Surface Methodology. International Journal of Scientific and Research Publications, 2(5):1-11.

Chin, S.K., C.L. Law, P.G. Cheng. 2011. Effect of drying on crude ganoderic acids and water soluble polysaccharides content in Ganoderma

108

lucidum. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(1):38-43.

CLSI. 2012. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically. In CLSI document M07-A9 (9th edition). Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. pp. 1-53.

Ho M 2005 s s ọ ử G o ụ H Nộ Cổ Đức Trọng, 2007. Báo cáo nghi m thu Dự án: S n xuấ ẩm dòng nấm Hầu thủ chịu nhi t Hericium erinaceus (Bulleard:Ffries) Pearsoon. Đ tài Hội Sinh học. Thành phố H Chí Minh.

Djide, M.N., Sartini, L. Rahman, N. Hasyim. 2014. Antibacterial Activity of Various Extracts from the Fruiting Bodies of Ganoderma Lucidum Growing at Samanea Saman (Jacq.) Merr) Trunk. International Journal of Scientific & Technology Research, 3(1):15-16.

Dongowski G., Huth M., Gebhard E. and Flamme W., 2002. Dietary fiber-rich barley products beneficially affect the intestinal tract of rats. The Journal of Nutrition. Volume 132: 3704 – 3714.

Drenth A., Irwin J.A.G., 2001.Routine DNA based diagnostic test for Phytophthora. A report for Rural Industries Research and Development Corporation. RIRDC Pubblication. No 01/36; RIRDC Project No UQ-68A.

Dubois, M., K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers and F. Smith. 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28(3):350-356.

Đỗ T Đ Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, NXB Y

học, Hà Nội, 7-24, 50-51, 1996.

Đ ng H ng D t, 2003. Kỹ thu t nuôi tr ng nấm mỡ, nấ ấm sò,

nấ ộ ĩ N ất b n Hà Nội.

El-Sakka, M.A. 2010. Phytochemistry (3) Alkaloids (3rd edition). Al Azhar University-Department of Pharmacognosy-Faculty of Pharmacy, pp. 7- 22.

Evans, W.C. 2009. Part 5: Pharmacopoeial and related drugs of biological origin. In Trease and Evans' Pharmacognosy (16th edtion), eds. P. Graham, Edinburgh: W.B. Saunders, pp. 169-482.

Fakoya, S., K.T. Adegbehingbe and A.A. Ogundiimu. 2013. Biopharmaceutical Assessment of Active Components of Deadaleopsis confragosa and Ganoderma lucidum. Open Journal of Medical Microbiology, 3:135-138.

Farha A.K, Geetha B.S, Mangalam S. Nair, Dhanya S.R, Latha P.G and Remani P., Apoptosis Mediated Cytotoxicity Induced By Isodeoxyelephantopin On Nasopharyngeal Carcinoma Cells. Asian J Pharm Clin Res, 2013. 6(2), 51-56).

Fawcett, J. K., & Scott, J. 1960. A rapid and precise method for the

determination of urea. Journal of clinical pathology, 13(2), 156-159.

109

Firenzuoli F, Gori L, Lombardo G, March, 2008. The medicinal mushroom Agaricus blazei Murrill: review of literature and pharmaco- toxicological problems. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine. 5(1): 3-15.

from

Fujimiya Y, Suzuki Y, Katakura R, Ebina T, 1999. Tumor-specific cytocidal and immunopotentiating effects of relatively low molecular weight the basidiomycete, Agaricus blazei Murill products derived Division of Immunology, Miyagi Cancer Center Research Institute, Natori, Japan. 113-8.

Gao, Y., S. Zhou, G. Chen, X. Dai and J. Ye. 2002. A phase I/II study of a Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst. extract (ganopoly) in patients with advanced cancer. International Journal of Medicinal Mushrooms, 4(3):207- 214.

Gao, Y., S. Zhou, W. Jiang, M. Huang and X. Dai. 2003. Effects of ganopoly (a Ganoderma lucidum polysaccharide extract) on the immune functions in advanced-stage cancer patients. Immunological Investigations, 32(3):201-215.

Gornall, A. G., Bardawill, C. J., & David, M. M. 1949. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. Journal of biological chemistry, 177(2), 751-766.

Guarro, J., Gené, J. and Stchigel, A.M, 1999. Developments in fungal

taxonomy. Clin. Microbiol. Rev., 12:454–500.

Hall, M.B. 2003. Challenges with nonfiber carbohydrate methods.

Journal of Animal Science, 81:3226-3232.

Harborne, J.B. 1998. The Terpenoids. In Phytochemical Methods A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis (3rd edition). London: Chapman & Hall, pp. 129.

Hattori 8t.Hattori M, 1997. Inhibitory effects of components from Ganoderma lucidum on the growth of human immunodeficiency virus (HIV) and the protease activity. Proc. 97 Inter. Sym. on Ganoderma Res., 27th Nov. 1997, Tokyo, Japan.

Hawksworth, D.L. 2001. The magnitude of fungal diversity: the 1.5

million species estimate revisited. Mycological Research, 105:1422-1432.

Hetland G, Sandven P, March, 2002. b-1,3-glucan reduces growth of in macrophage cultures. FEMS Immunol Med

Mycobacterium bovis Microbiol (Amsterdam: Elsevier). 33(1): 41-45.

Hibbett, D.S., M. Binder, J.F. Bischoff, M. Blackwell, P.F. Cannon, O.E. Eriksson, ... and N. Zhang. 2007. A higher level phylogenetic classification of the Fungi. Mycological Research, 111(5): 509–547.

Hong-Min T, 2008. DNA identification of Tricholoma giganteum

isolates [J]. Acta Microbiologica Sinica.

110

Hostettmann, K. and A. Marston. 2005. Saponins. New York: Cambridge

University Press, pp. 1-3.

Huang, S.Q., J.W. Li, Z. Wang, H.X. Pan, J. X. Chen and Z.X. Ning. from 2010. Optimization of Alkaline Extraction of Polysaccharides Ganoderma lucidum and Their Effect on Immune Function in Mice. Molecules, 15:3694-3708.

Huie, C.W. and X. Di. 2004. Chromatographic and electrophoretic methods for Lingzhi pharmacologically active components. Journal of Chromatography B, 812:241-257.

Ito H, Shimura K, Itoh H, Kawade M, 1997. Antitumor effects of a new polysaccharide-protein complex (ATOM) prepared from Agaricus blazei (Iwade strain 101) "Himematsutake" and its mechanisms in tumor-bearing mice. Department of Pharmacology, Mie University School of Medicine, Japan. 17(1A):277-84.

Itoh H, Ito H, Amano H, Noda H, 1994. Inhibitory action of a (1-->6)- beta-D-glucan-protein complex (F III-2-b) isolated from Agaricus blazei Murill ("himematsutake") on Meth A fibrosarcoma-bearing mice and its antitumor mechanism. Laboratory of Marine Biochemistry, Faculty of Bioresources, Mie University, Japan. 66(2):265-71.

Kao, C.H.J., A.C. Jesuthasan, K.S. Bishop, M.P. Glucina and L.R. Ferguson. 2013. Anti-cancer activities of Ganoderma lucidum: active ingredients and pathways. Functional Foods in Health and Disease, 3(2):48- 65.

Kawaghishi H, Kanao T, Inagaki RT, Mizuno T, Shimura K, Ito H, Hagiwara T, and Nakamura T, 1989. Formolysis of a potent antitumor (1--6)- b-D-Glucan-protein complex from Agaricus blazei fruiting bodies and antitumor activirty of the resulting products. Carbohydrate Polymer. 12 : 393 - 403.

Kerrigan RW., 2005. Agaricus subrufescens, a cultivated edible and

medicinal mushroom, and its synonyms. Mycologia. 97(1): 12-24.

Kim Ji-Hun, 2015. Hispolon from Phellinus linteus induces apoptosis and sensitizes human cancer cells to the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand through upregulation of death receptors.

Kinjo K. and T. Miyagi, 2006. Nutritional Requirements for Mycelial growth and Artificial cultivation of Tricholoma giganteum. Journal of the Japan Wood Research Society.

Kishida E, Sone Y and Misaki A, 1989. Purification of an antitumor – active, branched (1,3) – beta – D – glucan from Volvariella volvacea, and elucidation of its fine structure. Carbohydrate research (193): 227 – 239.

Laszczyk M., 2009. Pentacyclic Triterpenes of the Lupane, Oleanane and Ursane Group as Tools in Cancer Therapy. Planta Medica. Vol 75: 1549 – 1560.

111

Lâm Thị K Vă Đứ N Đại Nghi p, 2004 Thực tập lớn

Sinh hóa NX Đại học Quốc gia TP. H Chí Minh, 75-79.

Lê Xuân Thám, 2001. Ghi nh ầu tiên v nấm Shimeji thuộc chi Lyophyllum (họ nấm Thông Tricholomataceae) Vi t Nam. Tạp chí Di truy n học và Ứng dụng, số 12, Hà Nội.

Lê Xuân Thám, 2013. Ti ă ức công ngh nấ Hộ o

ể ấ ữ Đ ng Tháp 2013.

Leo Antony M., D. Mubarak Ali, E. Baldev, D. Pandiaraj, R. Praveen Kumar and N.Thajuddin, 2012. Analysis of Indoor Fungal Contaminants Using Internal Transcribed Spacer Sequence Variability. Asian Journal of Biological Sciences, 5: 304-313.

L Dũ 2001 K ấ T N N ấ K oa

ọ Kỹ H Nộ

L Vă L ễ 1977 Mộ số ấ ă ấ ộ ừ N ấ

N H Nộ

Li G, Kim DH, Kim TD, Park BJ, Park HD, Park JI, Na MK, Kim HC, Hong ND, Lim K, Hwang BD, Yoon WH. 2004. Protein-bound polysaccharide from Phellinus linteus induces G2/M phase arrest and apoptosis in SW480 human colon cancer cells. Cancer Lett. 2004; 216: 175- 181.

Li T, 2008. Spectrometric determination of trace elements in Tricholoma

giganteum Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi.

Lim Ji-Hong, 2014. Anticancer Activity of Hispidin via Reactive

Oxygen Species-mediated Apoptosis in Colon Cancer Cells.

Liu H. G, 2007. Determination of selenium in Tricholoma giganteum by flow injection-hydride generation-Atomic Absorption spectrometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi.

Lide, D.R. (ed). 2005. Analytical Chemistry. In CRC Handbook of

Chemistry and Physics. Boca Raton, Florida: CRC Press, pp. 8-2.

Liu, G.Q., Y. Zhao, X.L. Wang and C.Y. Zhu. 2011. Response surface methodology for optimization of polysaccharides extraction by mild alkaline hydrolysis from fruiting body of medicinal mushroom, Ganoderma lucidum. Journal of Medicinal Plants Research, 5(10):2064-2070.

Loren, K. 1987. The Report on Germanium. Life Extension Educational

Service, pp. 42.

Mai Thành Chung, 2013. Kh o s ị ợng hoạt tính trong nấm linh chi vàng Ganderma colossum, nấ ỏ Ganoderma lucidum và hoạt tính chống oxy hóa, Lu ă T ạ sĩ Đại học Khoa học Tự Nhiên. TpHCM

Malinee T. and R. Aree, 2005. Mating system and genetic variations of Tricholoma crassum (Berk.) Sacc. in some area of Thailand by isozyme electrophoresis and PCR-RFLP Method. IntJMedMushr.

112

Mathews C., Holde K. and Ahern K., 1999. Biochemistry. 3rd edition.

Prentice hall. US. 1200 pp.

Mau, J.L, H.C. Lin and C.C. Chen. 2001. Non-volatile components of

several medicinal mushrooms. Food Research International, 34:521–526.

McEvoy-Bowe, E. 1966. Determination of creatinine in urine by separation on DEAE-Sephadex and ultraviolet spectrophotometry. Analytical biochemistry, 16(1), 153-159.

McIntosh M, Stone BA and Stanisich VA, 2005. Curdlan and other

bacterial (1–>3)-beta-D-glucans. Appl Microbiol Biotechnol (68): 163 – 173.

Meynell, G. G. and E. Meynell. 1970. Bacterial growth. In Theory and Practice in Experimental Bacteriology (2nd edition). Cambridge, Britain: Cambridge University Press, pp. 1-34.

Miller G.L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination

of reducing sugar. Anal. Chem.; 31:426, 1959.

Mizuno M, Minato K, Ito H, Kawade M, Terai H, Tsuchida H, 1999. Anti-tumor polysaccharide from the mycelium of liquid-cultured Agaricus blazei mill. Graduate School of Science and Technology, Kobe University, Japan, Biochem Mol Biol Int. 47(4):707-14.

Mizuno T, 1995. Antitumor-active Heteroglycans from Niohshimeji

Mushroom, Tricholoma giganteum.

Mizuno, T. 1995. Reishi, Ganoderma lucidum and Ganoderma tsugae: bioactive substances and medicinal effects. Food Reviews International, 11(1):151–166.

Mizuno T, 1989. Development and utilization of bioactive substances from medicinal and edible mushroom fungi (1). Himematsutake Agaricus blazei Murrill. The Chemical Times, No. 1 : 12 - 21.

Morikawa K, Takeda R, Yamazaki M, Mizuno D, 1985. Induction of tumoricidal activity of polymorphonuclear leukocytes by a linear beta-1,3-D- glucan and other immunomodulators in murine cells. Cancer Res (Baltimore: Waverly). 45(4): 1496-1501.

(Pers.) Pat. of Shivamogga District-Karnataka,

Nagaraj, K., N. Mallikarjun, R. Naika, T.M. Venugopal. 2013. Phytochemical Analysis and In Vitro Antimicrobial Potential of Ganoderma applanatum India. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 23(2):36-41.

Ngô Anh, 2003. Nghiên cứu thành phần loài nấm l n Thừa Thiên Hu . Lu n án Ti n sỹ Sinh họ T Đại học Khoa học Tự Đại học Quốc gia Hà Nội

Ngô Anh, 2005. Sự a ạng của khu h nấm l n Thừa Thiên Hu . Báo

cáo Những vấ n trong khoa học sự sống. p7

Nielsen, S.S. 2010. Chapter 6: Phenol-Sulfuric Acid Method for Total Carbohydrates. In Food Analysis Laboratory Manual, Food Science Texts

113

Series 2010. United State of America: Springer Science + Business Media, pp. 47-53.

Nguyễn Huỳnh Minh Quyên, Khuất Hữu Trung, Nguyễn Hữu Toàn, Nguyễn Thị P Đo T ần Nguy t Lan, Nguyễn Hữ Đống, Bùi Mạnh Đo T ị Bích Th o, 2005. Sử dụng marker phân tử RAPD a ạng di truy n của một số chủng nấm linh chi, Báo cáo Những vấ n trong khoa học sự sống, p990

Nguyễn Huỳnh Minh Quyên, Khuất Hữu Trung, Nguyễn Hữu Toàn, Nguyễn Thị P Đo T ần Thị Nguy t Lan, Nguyễn Hữ Đống, Lê Xuân Thám, Ngô Anh, 2005. Nghiên cứu sự a ạng v hình thái qu thể và so sánh thành phầ óa s n giữa một số chủng Linh chi, Báo cáo Những vấn n trong khoa học sự sống, p994

Nguyễn Hữ Đố Đ X L N ễ T S Za Fe e o 2002. Nấ ă s khoa học và công ngh nuôi tr ng. Hà Nội. NXB Nông Nghi p.

Nguyễn Hữ Đống, 2003. Nuôi tr ng và sử dụng nấ ă ấ ợc li u.

Ngh An. NXB Ngh An.

Nguyễ L Dũ 2002 nuôi tr ng nấ ă T p II, Nhà

xuất b n Nông Nghi p.

Nguyễ L Dũ 2003 nuôi tr ng nấm. Hà Nội. NXB Nông

Nghi p.

Nguyễ L Dũ 2001 Tự học ngh tr ng nấm. Hà Nội. NXB Nông

Nghi p.

N ễ L Dũ ù T ị V H N ễ Đì Q P ạ Vă T P ạ T Hổ L Vă H T L T ị Hòa 2012 V s ọ N ấ K oa ọ ỹ H Nộ

N ễ L A T ầ Q ố Q T ầ H T a 2013 G ì ự ộ e s ẫ o ằ ì ự e Hộ o s ọ ù Đ ằ s ử Lo 2013

Nguyễ N L X T N ễn Thị P 2013 ầ ấ ù ổ Macrocybe Gigantea ì D V Na Hộ o ể ấ ữ

Nguyễn Thị Vũ T I -Dong Yoo, Jong-Pyung Kim, Đặng Xuy N D H ng Dinh. 2005. Nghiên cứu một số thành phần và hoạt chất sinh học của nấm linh chi Garnoderma lucidum nuôi tr ng Vi t Nam, Báo cáo Những vấ n trong khoa học sự sống. p429

Nguyễn Thị H ng Nụ, Trịnh Xuân H u, Nguyễn Thị Chính, 2005. T ă ò ộng của bột sinh khối và bào tử nấm Linh Chi lên cấu trúc mô học tinh hoàn chuột nhắt trắng dòng Swiss bị chi u xạ, Báo cáo những vấ n trong khoa học sự sống, p697

N ễ T ị T H 2012 N ứ ụ ă ễ ị ố o óa ă o ự ủa ấ

114

ỏ (Ganoderma lucidum) (Ganoderma colossum),Đ N KH ấ S KH N TP H M

Nguyễ T ợng Dong. 2006. Nghiên cứu thuốc từ th o ợc. Nhà xuất

b n Khoa học và Kỷ thu t. Hà Nội.

Ogbe, A.O., S.E. Atawodi, P.A. Abdu, A. Sannusi and A.E. Itodo. 2009. Changes in weight gain, faecal oocyst count and packed cell volume of Eimeria tenella-infected broilers treated with a wild mushroom (Ganoderma lucidum) aqueous extract. Journal of the South African Veterinary Association, 80(2):97–102.

Ofodile, L.N. 2011. Effect of the Mycelial Culture of Ganoderma lucidum on Human Pathogenic Bacteria. International Journal of Biology, 3(2):111-114.

Ooi, V.E.C. and F. Liu. 2000. Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide–protein complexes. Current Medical Chemistry, (7):715–729.

Owen R W., Haubner R., Würtele G., Hull W E., Spiegelhalder B. and Bartsch H., 2004. Olives and olive oil in cancer prevention. European Journal of Cancer Prevention. Vol 13(4): 319 – 326.

Pegler D. N, 1998. The pantropical genus Macrocybe gen. nov.

Mycologia.

Petcharat V, 1996. Cultivation of wild mushroom: VIII. Hed Tin Raed [Tricholoma crassum (Berk.) Sacc.]. Onklanakarin. Journal of Science and Technology.

P ạ Ho Hộ 1960 ỏ Na V Na N ấ ộ

Q ố a G o ụ S Gò

P ạ T Hổ 2008 D ọ N ấ G o ụ T

ố H M

Phạm Thành Hổ, 1992-1994. Hoàn chỉnh qui trình s n xuất nấ (Lentinus edodes). Đ tài nghiên cứu cấp bộ ng Khoa học Tự N Đại học quốc gia Thành phố H Chí Minh, p1

Phạm Thành Hổ, Một số ặc tính sinh học và h thống chọn dòng nấm ụa bạc Volvariella bombicina phân l p tại Vi t Nam, tạp chí Di truy n và Ứng dụng tháng 2/2002, p7-14

Phạm Thành Hổ, Nghiên cứu nuôi tr ng bố ò o ử của nấm ụa bạc Volvariella bombicina ầu ứng dụng vào chọn giống, tạp chí Di truy n và Ứng dụng tháng 2/2002, p1-5

Phạm Thành Hổ, Công nghệ trồng nấm ăn 2004 Đại học Khoa học Tự

nhiên Thành phố H Chí Minh, p13-18, 20, 21, 30

Phạm Thành Hổ, 2009. Kỹ thu t làm meo giống nấm và công ngh nuôi tr ng một số loài nấ ă ấ ợc li u. Vi n Khoa học Nông Nghi p mi n Nam, Trung tâm nghiên cứu chuyển giao ti n bộ kỹ thu t.

115

Phan Huy Dụ Đ X L N A 2005 ổ sung một số loài nấm hoang dại dùng làm thực phẩm Vi t Nam, Báo cáo Những vấ b n trong khoa học sự sống.

Phan Huy Dục, Norbert Arnold, 2005. Dẫn li ầu v a ạng thành phần loài nấm l n (macromycestes) Hà Giang, Báo cáo Những vấ n trong khoa học sự sống, p58

Phelan, M. C., Lawler, G. 1997. Cell counting. Current Protocols in

Cytometry, A-3A

Quereshi, S., A.K. Pandey, S.S. Sandhu. 2010. Evaluation of antibacterial activity of different Ganoderma lucidum extracts. People’s Journal of Scientific Research, 3(1):9-13.

Reed JC, 1997. Bcl-2 family proteins: regulators of apoptosis and

chemoresistance in haematologic malignancies. Semin Hematol 34: 9-19.

Riley, T., Sontag, E., Chen, P., & Levine, A. (2008). Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nature reviews Molecular cell biology, 9(5), 402-412.

Roy, U. 2006. Reishi Mushroom Ganoderma lucidum Standards of Analysis, Quality Control, and Therapeutics. American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium, pp. 1-23.

Sadiq Butt M., Tahir – Nadeem M. and Khan MK., 2008. Oat: unique

among the cereals. European Journal of Nutrition (47): 68 –79.

Sanger, F., S. Nicklen and A.R. Coulson, 1977. DNA sequencing with

chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(12): 5463-5467.

Sarker, S.D. and L. Nahar. 2007. Chemistry for Pharmacy Students: General, Organic and Natural Product Chemistry. Chichester, England: John Wiley & Sons, pp. 288-302.

Segelman, A.B. and N.R. Farnsworth. 1969. Biological and phytochemical screening of plants. IV. A new rapid procedure for the simultaneous determination of saponins and tannins. Lloydia, 32:59-65.

Shamaki, B.U., U.K. Sandabe, I.A. Fanna, O.O. Adamu, Y.A. Geidam, I.I. Umar and M.S. Adamu. 2012. Proximate Composition, Phytochemical and Elemental Analysis of Some Organic Solvent Extract of The Wild Mushroom- Ganoderma lucidum. Journal of Natural Sciences Research, 2(4):24-35.

Shibata Y, Kurita S, Okugi H, Yamanaka H. 2004. Dramatic remission of hormone refractory prostate cancer achieved with extract of the mushroom, Phellinus linteus. Urol Int; 73: 188-190.

the human leukemia effects cell in

Shnyreva, A. V., Song, W., & Van Griensven, L. J. L. D. (2010). Extracts of medicinal mushrooms Agaricus bisporus and Phellinus linteus induce proapoptotic line K562. International Journal of Medicinal Mushrooms, 12(2).

116

Shu-Ting Chang, 2008. Overview of mushroom cultivation and

utilization as functional foods

Simon P. Langdon. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. In: Methods in Molecular Medicine, vol.88. Humana Press Inc., Totowa, N.J., (2004); 111-119

Skalicka-Woź a K J Sz ows R Łoś M S w s K. So e a s K Głow a a A Ma 2012 E a a o o o sa a es content in fruit bodies and their antimicrobial activity of four Ganoderma lucidum (W Curt.: Fr.) P. Karst. strains cultivated on different wood type substrates. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 81(1):17-21.

Smith J., 2000. Squalene: potential chemopreventive agent. Expert

Opinion on Investigational Drugs. Vol 9: 1841 – 1848.

Sood, G., S. Sharma, S. Kapoor and P.K. Khanna. 2013. Optimization of extraction and characterization of polysaccharides from medicinal mushroom Ganoderma lucidum using response surface methodology. Journal of Medicinal Plants Research, 7(31):2323-2329.

Stanley G., Harvey K., Slivova V., Jiang J. and Sliva D, 2005. Ganoderma lucidum suppresses angiogenesis through the inhibition of secretion of VEGF and TGF-beta1 from prostate cancer cells. Biochemical and biophysical research communications 330(1):46-52.

Swanholm, C.E., H.S. John and P.J. Scheuer. 1959. A Survey for

Alkaloids in Hawaiian Plants. I, Pacific Science, 8:295-305.

Szymanski M, Barciszewska MZ, Erdmann VA, Barciszewski J. 2003. 5

S rRNA: structure and interactions. Biochem J 371: 641–651

Tang, Y.J., J.J. Zhong. 2002. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid. Enzyme and Microbial Technology, 31:(2002):20-28.

Tang W., Liu JW., Zhao WM., Wei DZ. and Zhong JJ, 2006. Ganoderic acid T from Ganoderma lucidum mycelia induces mitochondria mediated apoptosis in lung cancer cells. Life Science 80(3):205-211.

Toai, T.D., V.N. Ban, L.C. Tu, N.T. Hanh. 2005. Study on polysaccharide (1,3)-β-D-glucan from Ganoderma lucidum. Journal of Chemistry, 43(2):258-262.

Tolstoguzov V, 2004. Why are polysaccharides necessary?. Food

Hydrocolloids. Volume 18: 873 – 877.

T ầ N Dũ L ễ N Ý 2012 Đa ạ ộ số oạ ấ

ă ựa ì ự ITS Tạ oa ọ Đạ ọ ầ T

Tran thi Kim Dung, Pham thanh Ho, 2009. Experimental cultivation of the silver-silk straw mushroom Volvarielle bombicyna (Per.ex.Fr) Sing. isolated in vietnam. The 6th meeting of the Asian Consortium for the

117

Conservation and Suistanable Use of Microbial Resource (ACM). November 2009, Hanoi.

Trầ Vă M o 2004 Sử dụng vi sinh v t có ích- t p 1: Nuôi tr ng ch bi n nấ ă ấm làm thuốc chữ b nh. Thành phố H Chí Minh. NXB Nông Nghi p.

Trigos, A. and J.S. Medellín. 2011. Biologically active metabolites of the genus Ganoderma: Three decades of myco-chemistry research. Revista Mexicana de Micología, 34:63-83.

T ị Ta o T ị Ta K 2011 Đa ạ ấ V Na ị ủa o o oa ọ Hộ ị o ố ầ ứ ấ ố o V Na

Trịnh Tam Ki t, 2011. Nấm l n Vi t Nam t p 1. NXB KHTN &CN. Hà

Nội.

Trịnh Tam Ki t, 2012. Nấm l n Vi t Nam t p 2. NXB KHTN &CN. Hà

Nội.

Trịnh Tam Ki t, 2013. Nấm l n Vi t Nam t p 3. NXB KHTN &CN. Hà

Nội.

Trịnh Tam Ki T ịnh Tam B o, 2005. Nghiên cứu thành phần loài nấ a ủa Vi t Nam, Báo cáo Những vấ n trong khoa học sự sống, p206

Trịnh Tam Ki t, Ngô Anh, 2001. Nghiên cứu chi nấm trắng khổng l Macrocybe Pegler & Lodge m ợc tìm thấy cho khu h nấm l n của Vi t Nam. Tạp chí Di truy n học và Ứng dụng, Chuyên san Công ngh Sinh học: 56 – 60.

Trung tâm Unesco phổ bi ă óa o ục cộ ng, 2004. Sổ tay

nuôi tr ng nấ ă ấm chữa b nh. Hà Nộ NX Vă óa ộc.

Van de Peer Y, S Chapelle, and R De Wachter, 1996. A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA. Nucleic Acids Res. 24(17): 3381–3391.

Varki A., Cummings R., Esko J., Freeze H., Stanley P., Bertozzi R., Hart G. and Etzler M., 2009. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. California. 784 pp.

Võ Thị P K a P ạm Thành Hổ,1998. Lai nấ (Lentinus edodes) Cao Bằng v i chủng nấ p từ Nh t, Tạp chí Di truy n học và ứng dụng, p1

Vi D ợc li u – Bộ Y T , Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ Dược thảo, NXB Khoa học và Kỹ thu t, 220-222, 355-368, 377- 387, 2006.

Wagner, H., S. Bladt and V. Rickl. 1996. Plant drug analysis: a thin

layer chromatography atlas (2nd edition). Berlin: Springer, pp. 360.

118

Wasser, S.P. 2010. Reishi. In Encyclopedia of Dietary Supplements (2nd edition), eds. P.M. Coates, J.M. Betz, M.R. Blackman, G.M. Cragg, M. Levine, J. Moss, J.D. White. New York-London: Informa Healthcare, pp. 680- 690.

Wasser, S.P., A.L. Weis. 1999. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: current perspectives (review). International Journal of Medicinal Mushrooms, 1(1):31–62.

Wachtel-Galor S., J. Yuen, J.A. Buswell and I.F.F. Benzie. 2011. Chapter 9 Ganoderma lucidum (Lingzhi or Reishi)  A Medicinal Mushroom. In Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects, eds. I.F.F. Benzie and S. Wachtel-Galor. Boca Ratonm (Florida): CRC Press, pp.175-199.

White, T. J., T. Bruns, S. Lee, and J. W. Taylor, 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. Pp. 315- 322 In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, M. A., D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White. Academic Press, Inc., New York.

Wiley, 2008. Mushrooms as Functional Foods. Xu J., R.Q. Yue, J. Liu, H.M. Ho, T. Yi, H.B. Chen, Q.B. Han. 2014. Structural diversity requires individual optimization of ethanol concentration in polysaccharide precipitation. International Journal of Biological Macromolecules, 67:205-209.

Xu K., Liang X., Gao F., Zhong J. and Liu J, 2010. Antimetastatic effect of ganoderic acid T in vitro through inhibition of cancer cell invasion. Process Biochemistry 45(8):1261-1267.

Xu R., Gia C. Fazio and Seiichi P.T. Matsuda, 2004. On the origins of

triterpenoid skeletal diversity. Phytochemistry. Vol 65: 261 – 291.

Yoshikazu M. and M. Takashi, 1997. Cultivation of nioshimeji

(Tricholoma giganteum). Food Reviews International.

Ying Liu, Yasushi Fukuwatari, Ko Okumura, Kazuyoshi Takeda, Ken- ichi Ishibashi, Mai Furukawa, Naohito Ohno, Kazu Mori, Ming Gao, Masuro Motoi, 2008. Immunomodulating Activity of Agaricus brasiliensis KA21 in Mice and in Human Volunteers. Oxford journals, Med. 5:205-219

Yue QX., Cao ZW., Guan SH., Liu XH., Tao L., Wu WY., Li YX., Yang PY., Liu X. and Guo DA, 2008. Proteomics characterization of the cytotoxicity mechanism of ganoderic acid D and computer-automated estimation of the possible drug target network. Mol Cell Proteomics 7(5):949- 961.

PHỤ LỤC A: CÁC HÌNH ẢNH PHÂN LOẠI

119

Hì A1: ấ oạ

Striation : hệ sọc, hệ vạch ; wart : nốt sần, mụn ; areolae : quầng, khoanh ; scale : vảy ; CAP : ũ; zonations:phân vùng, phân tầng ; gill : phiến tia ; pores : lỗ ; tubes : ống teeth : răng ; RING : vòng; Reticulum : lưới, tổ ong ; Stipe : cuống, chân ; scales : vảy ; VOLVA : bao gốc ; basal bulb : củ hành gốc.

120

Hì A2: ấ ì 1

1. White stipe and cap with gills beneath : có cuống nấ ũ i các phi n i.

2. White stipe and cap with pores beneath : có cuống nấ ũ i các lỗ i.

3. White stipe and cap with teeth beneath : có cuống nấ ũ ă nhọn i.

4. White stipe and hood-shaded cap : có cuống nấ ũ ấm trùm.

5. Bracket-s a e w o es s o ee e ea o s oo o woo : ũ nấm hình b (rầm) chìa v i các lỗ, phi a ă ọn i hay nhẵn trên gỗ.

121

6. Cup-s a e w o w o s e : ũ ì i cuống nấm hoặc không.

7. Globose, pear- or star-shaped : hình cầu, hình trái lê hay ngôi sao

8. Club-shaped or branched : hình cái cup hay phân nhánh

9. Cruslike, smooth or with pores or teeth on wood : giống cuộng, nhẵn hay v i các lỗ hoặ ă ọn, trên gỗ

10. Gelatinous, mainly on wood : dạng nhầy, chủ y u trên gỗ.

Hì A3: ấ ì 2

122

PHỤ LỤC B: KHẢO S T ĐIỀU TR NGƢỜI N ĐỊ PHƢƠNG

Các b ng thông tin ý ki i dân v các mẫu nấm hoang dại thu th p ợc tại rừng núi Thấ S A G a

B ng B1: Thu th p thông tin mẫu nấm từ Bà Nguyễn Thị Đ p (54 tuổi, Xã An H o, Huy n Tịnh Biên, An Giang)

Mã số Giá thể xuất hi n nấm Cách thức ng sử dụng

Số lần nấm xuất hi n (bao nhiêu ợ / ă

Giá trị dinh ỡ / ợ c li u theo kinh nghi m i dân

01 trên mặ ất Mùa a Nấ ă Xào, nấu canh

02 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

03 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

04 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

05 Trên thân cây Mùa a Không bi t Không sử dụng

06 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

07 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

08 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

09 Mùa a Thực phẩm Nấu chè, làm Trên thân cây mục gỏi

10 Mùa a D ợc li u Trên thân cây mục P ấu c uống thay trà

B ng B2: Thu th p thông tin mẫu nấm từ Ông Phạ Vă (70 tuổi, Xã An H o, Huy n Tịnh Biên, An Giang)

123

Mã số Giá thể xuất hi n nấm Cách thức ng sử dụng

Số lần nấm xuất hi n (bao nhiêu ợ / ă

Giá trị dinh ỡ / ợ c li u theo kinh nghi m i dân

01 trên mặ ất Mùa a Nấ ă Xào, nấu canh

02 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

03 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

04 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

05 Trên thân cây Mùa a Không bi t Không sử dụng

06 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

07 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

08 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

09 Mùa a Thực phẩm Nấu chè, làm Trên thân cây mục gỏi

10 Mùa a D ợc li u Trên thân cây mục P ấu c uống thay trà

124

B ng B3: Thu th p thông tin mẫu nấm từ Ông Trầ Vă K (47 ổi, Xã An H o, Huy n Tịnh Biên, An Giang)

Mã số Giá thể xuất hi n nấm thức Cách ng sử dụng

Số lần nấm xuất hi n (bao nhiêu ợ / ă

Giá trị dinh ỡ / ợ c li u theo kinh nghi m i dân

01 trên mặ ất Mùa a Nấ ă Xào, nấu canh

02 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

03 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

04 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

05 Trên thân cây Mùa a Không bi t Không sử dụng

06 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

07 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

08 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

09 Mùa a Thực phẩm Nấu chè, làm Trên thân cây mục gỏi

10 Mùa a D ợc li u Trên thân cây mục P ấu c uống thay trà

125

B ng B4: Thu th p thông tin mẫu nấm từ Bà Đặng Kim Nén (45 tuổi, Xã An H o, Huy n Tịnh Biên, An Giang)

Mã số Giá thể xuất hi n nấm Cách thức ng sử dụng

Số lần nấm xuất hi n (bao nhiêu ợ / ă

Giá trị dinh ỡ / ợ c li u theo kinh nghi m i dân

01 trên mặ ất Mùa a Nấ ă Xào, nấu canh

02 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

03 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

04 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

05 Trên thân cây Mùa a Không bi t Không sử dụng

06 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

07 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

08 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

09 Mùa a Thực phẩm Nấu chè, làm Trên thân cây mục gỏi

10 Mùa a D ợc li u Trên thân cây mục

P ấu c uống thay trà

126

B ng B5: Thu th p thông tin mẫu nấm từ Bà Nguyễn Thị Nhã (50 tuổi, Xã An H o, Huy n Tịnh Biên, An Giang)

Mã số Giá thể xuất hi n nấm Cách thức ng sử dụng

Số lần nấm xuất hi n (bao nhiêu ợ / ă

Giá trị dinh ỡ / ợ c li u theo kinh nghi m i dân

01 trên mặ ất Mùa a Nấ ă Xào, nấu canh

02 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

03 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

04 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

05 Trên thân cây Mùa a Không bi t Không sử dụng

06 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

07 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

08 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

09 Mùa a Thực phẩm Nấu chè, làm Trên thân cây mục gỏi

10 Mùa a D ợc li u

Trên thân cây mục P ấu c uống thay trà

127

B ng B6: Thu th p thông tin mẫu nấm từ Ô L Vă (52 ổi, Xã L P T T A G a )

Mã số thể Giá xuất hi n nấm Cách thức ng sử dụng Số lần nấm xuất hi n (bao nhiêu ợ / ă

Giá trị dinh ỡ / ợ c li u theo kinh nghi m i dân

11 T e Mùa a Không bi t Không sử

dụng

12 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

13 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

14 Thực phẩm Xào, nấu Trên thân cây Xoài mục Tháng 3- 11 canh

15 T Mùa a Không bi t Không sử dụng

16 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

17 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

18 Mùa a Không bi t Không sử

Trên thân cây mục dụng

19 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Xào, nấu canh

20 Mùa a D ợc li u T và khô

P lát thái nấ c uống

21 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

128

22 Mùa a sử Thân cây còn sống quý ất a dụng Bi t hi m

23 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

24 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

25 Trên gỗ mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

26 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

27 D i mặ ất Mùa a D ợc li u

P nấ c uống

28 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

B ng B7: Thu th p thông tin mẫu nấm từ Ông Phạm Hữu Ngãi (60 tuổi X L P T T A G a )

Mã số thể Gía xuất hi n nấm Cách thức ng sử dụng Số lần nấm xuất hi n (bao nhiêu ợ / ă

Giá trị dinh ỡ / ợ c li u theo kinh nghi m i dân

11 T e Mùa a Không bi t Không sử dụng

12 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

129

13 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

14 Thực phẩm Xào, nấu Trên thân cây Xoài mục Tháng 3- 11 canh

15 T Mùa a Không bi t Không sử dụng

16 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

17 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử

dụng

18 Mùa a Không bi t Không sử Trên thân cây mục dụng

19 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Ă o

20 Mùa a D ợc li u T và khô P uống

21 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

22 Mùa a Thân cây còn sống quý ất Bi t hi m sử a dụng vì không gặp

23 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

24 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

25 Trên gỗ mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

26 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

130

27 D i mặ ất Mùa a D ợc li u Bán cho du khách

28 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

B ng B8: Thu th p thông tin mẫu nấm từ Bà Nguyễn Thị Hòa (55 tuổi, X L P T T A G a )

Mã số thể Gía xuất hi n nấm Cách thức ng sử dụng Số lần nấm xuất hi n (bao nhiêu ợ / ă

Giá trị dinh ỡ / ợ c li u theo kinh nghi m i dân

11 T e Mùa a Không bi t Không sử dụng

12 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

13 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

14 Thực phẩm Xào, nấu Trên thân cây Xoài mục Tháng 3- 11 canh

15 T Mùa a Không bi t Không sử

dụng

16 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

17 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

18 Mùa a Không bi t Không sử Trên thân cây mục dụng

131

19 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

20 Mùa a D ợc li u T và khô P uống

21 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

22 Mùa a sử Thân cây còn sống quý ất a dụng Bi t hi m

23 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

24 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

25 Trên gỗ mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

26 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

27 D i mặ ất Mùa a D ợc li u

P nấ c uống

28 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử

dụng

B ng B9: Thu th p thông tin mẫu nấm từ Bà Trần L Bình (63 tuổi, Xã L P T T A G a )

Mã số thể Gía xuất hi n nấm Cách thức ng sử dụng Số lần nấm xuất hi n (bao nhiêu ợ / ă

Giá trị dinh ỡ / ợ c li u theo kinh nghi m i dân

132

11 T e Mùa a Không bi t Không sử dụng

12 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

13 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

14 Thực phẩm Xào, nấu Trên thân cây Xoài mục Tháng 3- 11 canh

15 T Mùa a Không bi t Không sử

dụng

16 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

17 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

18 Mùa a Không bi t Không sử Trên thân cây mục dụng

19 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử

dụng

20 Mùa a D ợc li u T và khô nấ c uống

21 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

22 Mùa a sử Thân cây còn sống quý ất a dụng Bi t hi m

23 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử

dụng

24 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

25 Trên gỗ mục Mùa a Không bi t Không sử

133

dụng

26 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

27 D i mặ ất Mùa a D ợc li u

P nấ c uống

28 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

B ng B10: Thu th p thông tin mẫu nấm từ Ông Chau Khul (63 tuổi, Xã L P T T A G a )

Mã số thể Gía xuất hi n nấm Cách thức ng sử dụng Số lần nấm xuất hi n (bao nhiêu ợ / ă

Giá trị dinh ỡ / ợ c li u theo kinh nghi m i dân

11 T e Mùa a Không bi t Không sử dụng

12 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

13 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

14 Thực phẩm Xào, nấu

Trên thân cây Xoài mục Tháng 3- 11 canh

15 T Mùa a Không bi t Không sử dụng

16 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

134

17 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

18 Mùa a Không bi t Không sử Trên thân cây mục dụng

19 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Xào, nấu canh

20 Mùa a D ợc li u T và khô

P thái lát nấ c uống

21 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

22 Mùa a sử Thân cây còn sống quý ất a dụng Bi t hi m

23 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

24 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

25 Trên gỗ mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

26 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

27 D i mặ ất Mùa a D ợc li u

P nấ c uống

28 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

135

B ng B11. Thu th p thông tin mẫu nấm từ Ông Chau Kol (47 tuổi, Xã L P T T A G a )

Mã số thể Gía xuất hi n nấm Cách thức ng sử dụng Số lần nấm xuất hi n (bao nhiêu ợ / ă

Giá trị dinh ỡ / ợ c li u theo kinh nghi m i dân

11 T e Mùa a Không bi t Không sử dụng

12 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

13 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

14 Thực phẩm Xào, nấu Trên thân cây Xoài mục Tháng 3- 11 canh

15 T Mùa a Không bi t Không sử dụng

16 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

17 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

18 Mùa a Không bi t Không sử Trên thân cây mục dụng

19 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Xào, nấu canh

20 Mùa a D ợc li u T và khô

P thái lát nấ c uống

136

21 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

22 sử Thân cây còn sống Mùa a Không bi t a dụng

23 Trên mặ ất Mùa a Không bi t Không sử dụng

24 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

25 Trên gỗ mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

26 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

27 D i mặ ất Mùa a D ợc li u

P nấ c uống

28 Thân cây mục Mùa a Không bi t Không sử dụng

137

PHỤ ỤC C Trình tự ITS c c lo i nấm ƣ c chọn

Trình tự ITS của nấm vân chi ợc khu ại bằng cặp m i ITS1- ITS4:

“ARTTTK ATGGGGTTGTAG TGG T A GAGG ATGTG A G TGCTCATCCACTCTACACCTGKGCACTTACTGTAGGTTTGGCGTGG GCTTTCGGGGCCTTCACGGGCTTTGAGAGCATTCTGCCTGCCTATGT ATCACTATAAACACTAYGAAGTAACAGAATGTAATCGCGTCTAACG CATCTTAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGA TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATT CAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGKTATTC CGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGGTATTCTCAACCCMCACA TCCTTGYGATGCTTGTGAGGCTTGGACTTGGAGGCTTGCTGGCCCA TCGCGGTCGGCTCCTCTTGAATGCATTARCTTGGTTCCTTGCGGATC GGCTCTCASTKGGGWTAATGGYYTACYTTGKGACCGGGAASGGTT GGGGGAGTTTCTAMCCGTCCTCTTAGGRSCAATTTATTTGACTTCTA ACCTCMATTCAGGWAGGACAACCCCTCGACCTTAWSCTTATWATT AAKGGAAGAAGGGGRGGT”

138

Hình C1: Mứ ộ ng của trình tự nấm thu th p v i chi Trametes sp. s dữ li u NCBI

Trình tự ITS của nấm dai ợc khu ại bằng cặp m i ITS1- ITS4:

“AGA GA TAGAA TGG TATGAAAA G TT A GGTGG GG GTAGACATTTATCACACCTTGAGCCGATCCGCACAGGAACCAAGCT AATGCATTTAAGAGGAGCCGACTTGACATTGAAGCAAGCCGACAA GAACCTCCTAGTCCAAGCCTAAAGCAAGTCCCGTTAAGAACCCGGT TAGGTTGAGAATTTCATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAAT ACCAAGGAGCGCAAGGTGGGTTCAAAGATTGGATGATTCACTGAA

139

TTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTAATCGA TGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATATAGATGCGT TACATCCCAATACACATTCTGATACTTTATAAGTGTTTGTAGTGAAA CGTAGGCCCAGTAACAACTAGGCAAGAAAAAAGCCCGTGAAGGCC CCTTTCTCGCTTTTCAAACTCCTGAAACCCACAGTAAGTGCACAGG TGTAGAGTGGATGAGTAGGGCGTGCACATGCCTCGGAAAGGCCAG TAA AA GTTT AAAA ”

140

Hình C2: Mứ ộ ng của trình tự nấm thu th p v i loài Lentinus squarrosulus s dữ li u NCBI

Trình tự ITS của nấm linh chi tầng ợc khu ại bằng cặp m i ITS1- ITS4:

“ GRAAAGGGGGTTTTTTGTTGATGGGTGKA TGG TTT AGSAGG GCCGCCCTGCTCTCCATCTACACCTGKGCACTTACTGTGGGTTTACG GGTCGTGAAACGGGCTCGYTYKTCGGGCTTGTYGAGCGCACTTGTT GCCTGCGTTTATCACAAACTCTRTAAAGTATCATAATGTGTATTGCG ATGTAACGCATCTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCT CGCATCGATGAAGAACGCACGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTG CAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCT TGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAA TCTACAAACTTCTTATGGGGCTTGTAGGCTTGGACTTGGAGGCTTGT CGGTCCYTTTACAAGGTCGGCTCCYCTTAAATGCATTAGCTTGGTTC CTTGCGGATCGGCTTGTCGGTGTGATAATGTCTACGCCGCGACCGT GAAGCGTGTTTGGGCGAGCTTCTAATCGTCTCGTTACAGAGACAAC CTTTATGACCTCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCCGCTGAAC TTAAG ATAT ATAAG GGAGRAGAAAAT”

K t qu ợc so sánh v s dữ li u trên Ngân hàng gen NCBI.

141

Hình C3: Mứ ộ ng của trình tự nấm thu th p v i loài Ganoderma applanatum s dữ li u NCBI

Trình tự ITS nấ T ợng Hoàng khu ại bằng cặp m i ITS1- ITS4:

“TTGAAG GAGGT TGTTG TGGTG GGAAA G G ATGTG A GG CTTTCGCGCTCAAATCCACTCAACCCCTGTGCACCTTTATCCTGTCG AAGCGAGTAGTGGGGGACCTTTATCCTGTCGAAGCGAGTAGTTTGG GACCTTTGAGGACGTGTGTAGCAGTAGCCGGCCAAGTAGAAAGGG GAAGCCAAACAGCTCTCCATTCGAAAGGCGGGAACTAATTTCTCGT CTAGCTCGGGCGAAAGCTTTGGCTTGTATTTATTCAACCACATTTGT TGTCTTGTGAATGCAAACGCTCCTCGTGGGCGAAAATAAATACAAC TGGATCAATTGGGAATCCGGGGGTCGATGAAGAACGCAGCGAAAT GCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGGGACATCGAATCTT TGAACGTCTCAAATCACTTGTCTTTTTTAAATCGAAAGGCTCGTGGT TTGGACTTGGAGGTTTATGCCGGCTCCGGTCGGCTCCTACCAAATA AAATTTTTGGGGCCCAATGCCGGGGGAAATTTTCCCCGGGGGGGAA ACCTGAGCGCTTGCCTGAGGGGTCCGCTTCTAATCGTCTGCTTGGTC GGACAAGGCCGTTCGTGCCTTCTTGACTATCTTGACCTCAAATCAG GTAGGA T”

142

Hình C4: Mứ ộ ng của trình tự nấm thu th p v i loài Phellinus sp. s dữ li u NCBI

143

PHỤ LỤC D: BẢNG X C ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP

B ng D1. K t qu ộc tính cấ ao c nấm linh chi tầng

Chuột ch t ă Mẫu Phầ tử vong Chuột thí nghi m Li u cho uống (g cao/kg thể trọng chuột)

1 23,41 0 0 Thí nghi m lần thứ nhất 2 23,47 0 0

3 23,45 0 0

4 23,42 0 0

5 23,40 0 0

23,43 Trung bình

1 23,42 0 0

Thí nghi m lần thứ hai 2 23,37 0 0

3 23,37 0 0

4 23,38 0 0

5 23,36 0 0

23,38 Trung bình

B ng D2. K t qu ộc tính cấp cao c n nấm linh chi tầng

Mẫu Chuột ch t ă Phầ tử vong Chuột thí nghi m Li u cho uống (g cao/kg thể trọng chuột)

1 28,72 0 0 Thí nghi m lần thứ nhất 2 28,45 0 0

3 28,65 0 0

4 28,69 0 0

5 28,84 0 0

28,67

Trung bình

1 28,67 0 0 Thí nghi m lần thứ hai 2 28,62 0 0

3 28,65 0 0

4 28,68 0 0

144

5 28,63 0 0

28,65 Trung bình

B ng D3: K t qu ộc tính cấ ao c nấ ợng hoàng

Mẫu Chuột ch t ă Phầ tử vong Chuột thí nghi m Li u cho uống (g cao/kg thể trọng chuột)

1 22,41 0 0 Thí nghi m lần thứ nhất 2 23,37 0 0

3 23,24 0 0

4 22,42 0 0

5 22,46 0 0

22,78 Trung bình

1 23,42 0 0 Thí nghi m lần thứ hai 2 22,37 0 0

3 22,74 0 0

4 22,81 0 0

5 23,36 0 0

22,94 Trung bình

B ng D4: K t qu ộc tính cấp cao c n nấ ợng hoàng

Mẫu Chuột ch t ă Phầ tử vong

Chuột thí nghi m Li u cho uống (g cao/kg thể trọng chuột)

1 28,72 0 0 Thí nghi m lần thứ nhất 2 27,43 0 0

3 27,65 0 0

4 27,63 0 0

5 27,87 0 0

27,86 Trung bình

Thí nghi m 1 28,67 0 0

145

lần thứ hai 2 28,62 0 0

3 27,54 0 0

4 27,68 0 0

5 27,74 0 0

28,05 Trung bình

B ng D5: K t qu ộc tính cấ ao c nấm vân chi

Mẫu Chuột ch t ă Phầ tử vong Chuột thí nghi m Li u cho uống (g cao/kg thể trọng chuột)

1 23,42 0 0 Thí nghi m lần thứ nhất 2 23,35 0 0

3 23,36 0 0

4 23,34 0 0

5 23,38 0 0

23,37 Trung bình

1 23,52 0 0 Thí nghi m lần thứ hai 2 23,48 0 0

3 23,42 0 0

4 23,39 0 0

5 23,49 0 0

23,46 Trung bình

B ng D6: K t qu ộc tính cấp cao c n nấm vân chi

Mẫu Chuột ch t ă Phầ tử vong

Chuột thí nghi m Li u cho uống (g cao/kg thể trọng chuột)

1 28,72 0 0 Thí nghi m lần thứ nhất 2 28,79 0 0

3 28,83 0 0

4 28,76 0 0

146

0 0 5 28,80

28,78 Trung bình

0 0 1 28,84 Thí nghi m lần thứ hai 0 0 2 28,75

0 0 3 28,82

0 0 4 28,79

0 0 5 28,85

28,81 Trung bình

B ng D7: K t qu ộc tính cấ ao c nấm dai

Mẫu Chuột ch t ă Phầ tử vong Chuột thí nghi m Li u cho uống (g cao/kg thể trọng chuột)

0 0 1 23,46 Thí nghi m lần thứ nhất 0 0 2 23,52

0 0 3 23,47

0 0 4 23,46

0 0 5 23,54

23,49 Trung bình

0 0 1 23,46 Thí nghi m lần thứ hai 0 0 2 23,49

0 0 3 23,54

0 0 4 23,57

0 0 5 23,54

23,52 Trung bình

B ng D8: K t qu ộc tính cấp cao c n nấm dai

Mẫu Chuột ch t ă Phầ tử vong Chuột thí nghi m Li u cho uống (g cao/kg thể trọng chuột)

Thí nghi m 1 29,75 0 0

147

lần thứ nhất 2 29,68 0 0

3 29,73 0 0

4 29,69 0 0

5 29,80 0 0

29,73 Trung bình

1 29,71 0 0 Thí nghi m lần thứ hai 2 29,68 0 0

3 29,70 0 0

4 29,69 0 0

5 29,77 0 0

29,71 Trung bình

B ng D9: K t qu ộc tính cấ ao c nấm mộc bá huê

Mẫu Chuột ch t ă Phầ tử vong Chuột thí nghi m Li u cho uống (g cao/kg thể trọng chuột)

1 23,20 0 0 Thí nghi m lần thứ nhất 2 23,29 0 0

3 23,24 0 0

4 23,26 0 0

5 23,21 0 0

23,24 Trung bình

1 23,24 0 0 Thí nghi m lần thứ hai 2 23,32 0 0

3 23,27 0 0

4 23,28 0 0

5 23,24 0 0

23,27 Trung bình

148

B ng D10: K t qu ộc tính cấp cao c n nấm mộc bá huê

Chuột ch t ă Mẫu Phầ tử vong Chuột thí nghi m Li u cho uống (g cao/kg thể trọng chuột)

1 29,23 0 0 Thí nghi m lần thứ nhất 2 29,28 0 0

3 29,27 0 0

4 29,28 0 0

5 29,19 0 0

29,25

Trung bình

1 28,27 0 0 Thí nghi m lần thứ hai 2 28,25 0 0

3 28,32 0 0

4 28,25 0 0

5 28,31 0 0

28,28 Trung bình

149

PHỤ LỤC E: CÁC BẢNG THÍ NGHIỆM PHÂN LẬP GIỐNG B ng E1: Tố ộ s ng của h sợi nấm Linh Chi Tầng, nấm T ợng hoàng, nấm Vân Chi, nấm Dai và nấm Mộc Bá Huê ngày thứ 5 và thứ 7 ng PDA

Chi s a ấm (cm)

STT CT NT VC ND BH

5 7 5 5 7 5 7 7 5 7

1 4.3 6.2 2.8 1.6 3.2 1.5 4 2.6 0 0

2 4.2 6.2 2.6 1.2 3 1.4 4.4 3 0 0

3 4.1 6.1 2.1 1.8 3.4 1.2 4.2 2.3 0 0

4 4.2 6.3 3.1 2 4 1.7 4.8 3.2 0 0

5 4.4 6.5 2.4 1.6 3.7 2 4.3 0 0

3.1 2.84 2.6 TB 4.22 6.26 4.34 1.64 3.46 1.56 0 0

B ng E2: Phân tích ANOVA và phép thử Duncan v tố ộ s ng của h sợi nấm Linh Chi Tầng, nấ T ợng hoàng, nấm Vân Chi, nấm Dai và nấm Mộc Bá Huê ngày thứ 5 của ng PDA

Nguồn Độ tự do Gía trị F Gía trị P Tổng bình phương Trung bình bình phương

48.0576 4 12.0144 175.14** 0.0000 Nghi m thức

1.3720 20 0.0686 Sai số

49.4296 24 Tổng

Ghi chú: ** = khác bi t mứ ĩa 1% P D a ộ tin c y 99.0%

Loại nấm Số ống nghiệm Trung bình Các nhóm đồng nhất

5 0 X BH

5 1.56 X ND

5 1.64 X VC

5 2.60 X NT

5 4.22 X CT

Tương phản Sig. Khác biệt +/- Limits

150

CT-NT * 1.62 0.4713

CT-VC * 2.58 0.4713

CT-ND * 2.66 0.4713

CT-BH * 4.22 0.4713

NT-VC * 0.96 0.4713

NT-ND * 1.04 0.4713

NT-BH * 2.6 0.4713

VC-ND 0.08 0.4713

VC-BH * 1.64 0.4713

ND-BH * 1.56 0.4713

Ghi chú: *các nghi m thức khác bi ó ĩa ống kê

B ng E3: Phân tích ANOVA và phép thử Duncan v tố ộ s ng của h sợi nấm Linh Chi Tầng, nấ T ợng hoàng, nấm Vân Chi, nấm Dai và nấm Mộc Bá Huê thứ 7 ng thạch PDA

Nguồn Độ tự do Gía trị F Tổng bình phương Gía trị P Trung bình bình phương

104.6920 4 26.1730 317.63** 0.0000 Nghi m thức

1.6480 20 0.0824 Sai số

106.3400 24 Tổng

Ghi chú: ** = khác bi t mức ý ĩa 1% P D a ộ tin c y 99.0%

Loại nấm Số ống nghiệm Trung bình nhóm Các đồng nhất

X 5 0 BH

X 5 2.84 ND

X 5 3.46 VC

X 5 4.34 NT

X 5 6.26 CT

Tương phản Sig. Khác biệt +/- Limits

151

CT-NT * 1.92 0.1565

CT-VC * 2.8 0.1565

CT-ND * 2.84 0.1565

CT-BH * 6.26 0.1565

NT-VC * 0.88 0.1565

NT-ND * 1.5 0.1565

NT-BH * 4.34 0.1565

VC-ND * 0.62 0.1565

VC-BH * 3.46 0.1565

* 2.84 0.1565 ND-BH

Ghi chú: *các nghi m thức khác bi ó ĩa ống kê

152

PHỤ LỤC F: CÁC BẢNG X C ĐỊNH ĐỘC TÍNH N TRƢỜNG DIỄN NẤ THƢ NG HOÀNG

F.1. Thể trọng chu t nghiên c u

F1: THỂ TRỌNG ( ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 2 v/kg ứ 2 vg/kg

25 26 40 40 1

23 23 33 35 2

22 23 36 34 3

24 23 38 33 4

TB 23.50 23.75 36.75 35.50

SEM 0.65 0.75 1.49 1.55

F2: THỂ TRỌNG ( ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 2 v/kg ứ 2 vg/kg

26 28 43 41 1

23 30 36 40 2

21 30 32 33 3

29 31 35 41 4

TB 24.75 29.75 36.50 38.75

SEM 1.75 0.63 2.33 1.93

F.2 Huyết học chu t nghiên c u

F3: Số ợ ầ (R (M/UL ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 9.64 9.10 9.86 10.44

2 9.97 9.35 10.35 10.31

3 10.01 9.46 10.23 10.25

4 10.20 9.73 10.41 9.62

153

TB 9.96 9.41 10.21 10.16

SEM 0.12 0.13 0.12 0.18

F4: Số ợ ầ (R (M/UL ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg ứ

1 10.26 9.74 11.31 10.54

2 9.96 9.65 10.89 10.18

3 9.65 9.41 10.28 10.36

4 9.13 8.78 10.84 9.8

TB 9.75 9.40 10.83 10.22

SEM 0.24 0.22 0.30 0.16

F5: H sắ ố H ( / L ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 16.50 15.90 16.60 16.60

2 15.70 15.40 16.00 16.20

3 16.20 15.80 16.80 16.50

4 15.30 16.20 16.00 14.80

TB 15.93 15.83 16.35 16.03

SEM 0.27 0.17 0.21 0.42

F6: H sắ ố H ( / L ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 15.50 15.80 16.90 14.90

2 16.00 16.10 17.20 16.10

3 15.90 15.40 17.00 16.30

4 15.90 15.70 17.00 15.80

TB 15.83 15.75 17.03 15.78

154

SEM 0.11 0.14 0.09 0.31

F7: T ể ố ầ (H (% ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 54.30 48.30 53.10 54.70

2 58.10 48.30 51.10 50.20

3 50.50 51.40 55.60 54.00

4 54.90 51.40 50.60 48.10

TB 54.45 49.85 52.60 51.75

SEM 1.56 0.89 1.14 1.57

F8: T ể ố ầ (H (% ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 51.80 55.30 55.90 56.90

2 53.40 52.00 53.20 51.30

3 52.60 50.80 56.10 53.90

4 54.10 56.60 55.10 49.70

TB 52.98 53.68 55.07 52.95

SEM 0.50 1.36 0.94 1.58

F9: T ể ì ầ (M V ( L ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 56.30 53.10 53.90 52.40

2 53.00 51.60 49.30 48.70

3 50.50 54.40 54.40 52.70

4 53.80 52.90 48.60 50.10

TB 53.40 53.00 51.55 50.98

SEM 1.20 0.57 1.51 0.96

155

F10: T ể ì ầ (M V ( L ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 50.40 51.80 49.40 44.50

2 53.70 53.90 48.90 50.40

3 54.50 53.90 54.60 52.00

4 51.40 53.10 51.00 50.70

TB 52.50 53.18 50.97 49.40

SEM 0.96 0.50 1.82 1.67

F11: H sắ ố ì ầ (M H ( ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 17.10 16.40 16.80 15.90

2 16.10 16.50 15.40 15.70

3 16.10 16.70 16.40 16.10

4 16.90 16.60 15.30 15.40

TB 16.55 16.55 15.98 15.78

SEM 0.26 0.06 0.37 0.15

F12: H sắ ố ì ầ (M H ( ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 15.10 15.80 14.90 14.20

2 16.10 16.70 15.80 15.80

3 16.50 16.40 16.50 15.70

4 15.70 16.70 15.70 16.20

TB 15.85 16.40 15.73 15.48

SEM 0.30 0.21 0.46 0.44

156

F13: N ộ sắ ố ì ầ (M H ( / L ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 30.30 30.90 31.20 30.40

2 30.40 32.00 31.30 32.30

3 32.00 30.70 30.10 30.60

4 31.50 31.50 31.50 30.80

TB 31.05 31.28 31.03 31.03

SEM 0.42 0.30 0.31 0.43

F14: N ộ sắ ố ì ầ (MCHC) ( / L ộ

NGÀY 1 NGÀY 30

STT ứ 2 v/kg ứ 2 v/kg

1 30.00 30.60 30.20 31.80

2 30.00 30.90 32.30 31.40

3 30.30 30.40 30.20 30.20

4 30.50 31.50 30.90 31.80

TB 30.20 30.85 30.90 31.30

SEM 0.12 0.24 0.70 0.38

F15: Tỷ ố ầ (RDW (% ộ cái

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 15.00 14.90 13.90 13.40

2 14.20 15.00 13.50 16.80

3 13.60 14.50 12.80 12.90

4 13.10 13.40 14.20 16.60

TB 13.98 14.45 13.60 14.93

SEM 0.41 0.37 0.30 1.03

157

F16: Tỷ ố ầ (RDW (% ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 17.00 14.30 13.20 20.40

2 13.70 13.70 12.50 12.00

3 14.90 14.90 12.90 13.40

4 14.30 14.10 12.90 13.80

TB 14.98 14.25 12.87 14.90

SEM 0.72 0.25 0.20 1.87

F17: Số ợ ạ ầ (W (K/µL ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 4.60 4.36 7.88 5.91

2 5.19 4.43 7.95 9.37

3 4.68 3.56 7.39 6.62

4 3.91 5.07 8.76 14.30

TB 4.60 4.36 8.00 9.05

SEM 0.26 0.31 0.28 1.90

F18: Số ợ ạ ầ (W (K/µL ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

3.72 4.51 6.35 9.07 1

4.57 6.28 10.79 7.72 2

2.41 3.41 9.84 8.40 3

4.98 3.66 8.98 10.17 4

3.92 4.47 8.99 8.84 TB

0.57 0.65 1.35 0.52 SEM

158

F19: SL ạ ầ (LYM (%/L ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 78.60 79.90 77.10 77.80

2 68.20 59.90 74.60 68.50

3 82.10 65.50 79.50 68.00

4 72.50 63.70 63.10 57.50

TB 75.35 67.25 73.58 67.95

SEM 3.10 4.38 3.63 4.15

F20: SL ạ ầ (LYM (%/L ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 62.30 73.90 66.60 67.20

2 57.80 61.30 70.40 66.90

3 65.40 52.80 62.00 62.70

4 63.20 63.10 66.30 69.10

TB 62.18 62.78 66.33 66.48

SEM 1.60 4.34 2.43 1.35

F21: Số ợ ạ ầ Ne o (Ne (%/N ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

15.00 14.40 1 14.80 16.00

18.20 22.80 2 18.20 16.30

12.50 28.70 3 14.90 21.80

16.60 28.90 4 30.20 33.80

15.58 23.70 TB 19.53 21.98

3.41 SEM 1.22 3.64 4.16

159

F22: Số ợ ạ ầ Ne o (Ne (%/N ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 29.10 20.90 18.30 19.40

2 30.80 26.30 18.10 17.80

3 21.30 21.80 31.70 18.60

4 29.20 27.70 22.70 16.80

TB 27.60 24.18 22.70 18.15

SEM 2.14 1.67 4.50 0.56

F23: Số ợ ạ ầ eos o (*MID (%/E ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 2.70 2.10 3.30 2.80

2 10.30 4.40 2.40 11.10

3 0.90 2.20 2.30 7.00

4 6.50 2.60 1.90 4.40

TB 5.10 2.83 2.48 6.33

SEM 2.09 0.54 0.30 1.81

F24: Số ợ ạ ầ eos o (*MID (%/E ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

4.70 2.40 1 10.80 10.10

5.10 8.00 2 11.80 7.30

9.60 7.10 3 14.80 3.70

3.80 4.00 4 7.30 11.00

5.80 5.38 TB 11.93 7.27

1.31 SEM 1.30 1.02 2.05

160

F25: Số ợ ạ ầ o o (*MID (%/M ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

3.00 3.20 4.30 3.20 1

2.50 2.70 4.40 3.90 2

3.70 3.20 2.70 2.90 3

3.90 3.90 4.50 3.90 4

3.28 3.25 3.98 3.48 TB

0.32 0.25 0.43 0.25 SEM

F26: Số ợ ạ ầ o o (*MID (%/M ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

3.60 2.50 4.10 3.10 1

5.90 4.10 3.70 3.00 2

3.30 3.10 2.30 3.40 3

3.50 4.9 3.40 2,8 4

4.08 3.65 3.37 3.17 TB

0.61 0.53 0.55 0.12 SEM

F27: Số ợ ạ ầ aso (*MID (%/ ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

0.70 0.40 0.50 0.20 1

0.80 0.20 0.40 0.20 2

0.80 0.40 0.60 0.30 3

0.50 0.90 0.30 0.40 4

0.70 0.48 0.45 0.28 TB

0.07 0.15 0.06 0.05 SEM

161

F28: Số ợ ạ ầ aso (*MID (%/ ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 0.30 0.30 0.20 0.20

2 0.40 0.30 0.50 0.50

3 0.40 0.20 0.30 0.50

4 0.30 0.30 0.30 0.30

TB 0.35 0.28 0.33 0.38

SEM 0.03 0.02 0.09 0.08

F29: Số ợ ể ầ (PLT (K/µL ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 1038.00 1197.00 861.00 1339.00

2 956.00 1015.00 1166.00 861.00

3 1271.00 1222.00 917.00 857.00

4 1023.00 1283.00 1098.00 1076.00

TB 1072.00 1179.25 1010.50 1033.25

SEM 68.69 57.65 72.42 114.03

F30: Số ợ ể ầ (PLT (K/µL ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 30

STT ứ 2 v/kg ứ 2 v/kg

1 1357.00 1445.00 956.00 951.00

2 716.00 887.00 706.00 786.00

3 851.00 1035.00 457.00 910.00

4 907.00 1435.00 707.00 1057.00

TB 957.75 1200.50 706.33 926.00

SEM 138.99 141.55 144.05 56.01

162

F.3 Sinh hóa chu t nghiên c u

F31: GOT (U/L ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

30 47 23 37 1

42 42 51 33 2

44 42 40 42 3

44 42 35 35 4

TB 40.00 43.25 37.25 36.75

SEM 3.37 1.25 5.81 1.93

F32: GOT (U/L ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

44 37 30 30 1

37 47 33 33 2

37 51 40 37 3

42 67 40 37 4

TB 40.00 50.50 35.75 34.25

SEM 1.78 6.24 2.53 1.70

F33: GPT (U/L ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

57 49 41 41 1

45 49 61 53 2

49 39 45 45 3

53 53 41 45 4

TB 51.00 47.50 47.00 46.00

SEM 2.58 2.99 4.76 2.52

163

F34: GPT (U/L ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ 0,4 g/kg ứ 0,4 g/kg

1 53 41 57 41

2 39 49 41 41

3 49 45 53 41

4 53 46 57 53

TB 48.50 45.25 52.00 44.00

SEM 3.30 1.65 3.79 3.00

F35: ea ( / ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ ứ 0,4 g/kg 0,4 g/kg

1 0.5 0.6 1.5 1.2

2 0.7 0.6 1 1.3

3 0.7 0.6 1.2 1.4

4 0.7 0.5 1.2 1.3

1.23 1.30 TB 0.58 0.65

0.10 0.04 SEM 0.03 0.05

F36: ea ( / ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ ứ 0,4 g/kg 0,4 g/kg

1 0.8 0.7 1.3 1.3

2 0.9 0.7 1.1 1.2

3 0.8 0.7 1.1 1.2

4 0.6 0.7 1.3 1

1.20 1.18 TB 0.70 0.78

0.06 0.06 SEM 0.00 0.06

164

F37: U ea ( / ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ ứ 0,4 g/kg 0,4 g/kg

56.5 45.6 1 68.4 57.3

41.1 45.6 2 56.8 51.7

40.2 50.3 3 66.2 54.6

46.9 46.3 4 59.9 52.4

TB 46.18 46.95 62.83 54.0

SEM 3.75 1.13 2.70 1.26

F38: U ea ( / ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

0,4 g/kg STT ứ ứ 0,4 g/kg

75.5 60.8 1 70.4 60.8

67.7 54.3 2 60.4 53

36.2 71.1 3 50.6 44.1

53.2 50.7 4 48.1 50.1

TB 58.15 59.23 57.38 52.00

SEM 8.65 4.48 5.09 3.47

F39: TRIGLY ERIDE ( / ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ ứ 0,4 g/kg 0,4 g/kg

83 1 77 94 107

64 2 65 148 127

67 3 62 102 83

67 4 72 131 107

TB 69.00 70.25 118.75 106.00

SEM 3.39 4.31 12.58 9.00

165

F40: TRIGLY ERIDE ( / ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ ứ 0,4 g/kg 0,4 g/kg

82 1 135 103 151

73 2 78 117 137

137 3 84 122 93

79 4 95 104 112

TB 98.00 92.75 111.50 123.25

SEM 12.83 14.87 4.73 12.91

F41: o e ( / ộ

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ ứ 0,4 g/kg 0,4 g/kg

4 4.4 5.9 5.4 1

4.4 4.2 5.5 5.5 2

4.2 4.1 5.4 5.7 3

4.3 4.2 5.2 5.6 4

TB 4.23 4.23 5.50 5.55

SEM 0.06 0.09 0.15 0.06

F42: P o e ( / ộ ự

NGÀY 1 NGÀY 28

STT ứ ứ 0,4 g/kg 0,4 g/kg

6 5.8 1 4.6 4.2

6.4 5.3 2 4.6 4.3

6.8 5.6 3 4.7 4.2

5.8 5.9 4 4.6 4.2

TB 4.23 4.63 6.25 5.65

166

SEM 0.02 0.03 0.22 0.13

Hình F1.: Gi i phẩu chuột nghiên cứu

Hình F2: Tiêu b n gan chuột và th n chuột

167

PHỤ LỤC G: CÁC BẢNG THÍ NGHIỆM NUÔI TRỒNG NẤM G.1. Quy trình nuôi trồng nấm dai Lentinus squarroolus G.1.1 Thí nghiệm 1 x c ịnh m i trƣờng cấy chuyền nấm dai t t

nhất. B G1: Độ a sa 3 ủa nấm trên từng loạ ng

Raper PDA PDA bổ sung c dừa PDA bổ sung muối khoáng

MT Ống Nghi m

1 2.2 1.8 3.4 2.5

2 2.6 2.2 2.7 2

3 1.8 2.3 2.5 2

4 2.7 2.2 3.5 2.5

5 3 2 2.4 2

TB 2.46 2.1 2.9 2.2

B G2: Độ a sa 5 ủa nấm trên từng loạ ng

Raper PDA PDA bổ sung c dừa PDA bổ sung muối khoáng

MT Ống Nghi m

1 6.3 4 7 3.5

2 4 3.5 7.3 4.5

3 5 7.1 5.3 4

4 5.8 5.5 4.5 4.5

5 4.5 5 4 4

5.12 4.1 TB 5.02 5.62

B ng G3: Độ a sa 7 ủa nấm trên từng loạ ng

Raper PDA c PDA dừa PDA bổ sung khoáng

MT Ống Nghi m

1 9 5.5 8.5 4.5

2 7 4.5 8 5

3 6 8 6 4.5

4 6.5 6 5.5 6

168

5 6.5 6 5.5 4.5

TB 7 6 6.7 4.9

B ng G4: B ng phân tích ANOVA của ộ lan sa 3 ừng loạ ng raper, PDA, PDA bổ s c dừa và PDA bổ sung khoáng.

Ngu n bi ộng Độ tự bình do Tổng bình Trung ì F tính Giá trị P

3 Nghi m thức 1.9135 0.6378 4.27 0.0125

16 Sai số TN 2.3920 0.1495

19 Tổng 4.3055

B ng G5: B ng phân tích ANOVA của ộ a sa 3 ừng loạ ng raper, PDA, PDA bổ s c dừa và PDA bổ sung khoáng.

Ngu n bi ộng Độ tự bình do Tổng bình Trung ì F tính Giá trị P

3 Nghi m thức 6.0215 2.0072 1.54 0.2422

16 Sai số TN 20.824 1.3015

19 Tổng 26.8455

B ng G6: B ng phân tích ANOVA của ộ a sa 3 ừng loạ ng raper, PDA, PDA bổ s c dừa và PDA bổ sung khoáng.

Ngu n bi ộng Độ tự bình do Tổng bình Trung ì F tính Giá trị P

3 Nghi m thức 13.05 4.35 3.16 0.0534

16 Sai số TN 22 1.375

19 Tổng 35.05

G.1.2 Thí nghiệm 2 B ng G7: Số a 50% ủa nấ Da ng nhân giống.

Gạo lứt Hạt bắp Hạ u xanh Hạt lúa – cám gạo 5% MT BNB

1 8 14 13 Bị nhiễm

2 9 14 12 Bị nhiễm

3 10 16 14 Bị nhiễm

4 10 9 14 Bị nhiễm

169

5 11 13 Bị nhiễm 8

TB 12.8 13.2 9

B ng G8: Số a 100% ủa nấm Dai trên từng loạ ng

Gạo lứt Hạt bắp Hạ u xanh Hạt lúa – cám gạo 5% MT BNB

1 Bị nhiễm 27 27 14

2 Bị nhiễm 18 25 14

3 Bị nhiễm 25 25 17

4 Bị nhiễm 20 25 20

5 Bị nhiễm 25 20 20

TB 23 24.4 17

B ng G9: B ng phân tích ANOVA so sánh th a a ợc 50% trên các loạ ng hạt.

Ngu n bi ộng Độ tự bình Tổng bình Trung ì F tính Giá trị P do

8.57 0.0049 Nghi m thức 53.73 26.87 2

Sai số TN 37.60 3.13 12

Tổng 91.33 14

B ng G10: B ng phân tích ANOVA so sánh th a a ợc 100% trên các loại môi ng hạt.

Ngu n bi ộng Độ tự bình Tổng bình Trung ì F tính Giá trị P do

7.65 0.0072 Nghi m thức 154.53 77.27 2

Sai số TN 121.20 10.10 12

Tổng 275.73 14

G.1.3 Thí nghiệm 3 B ng G11: Số a ợc 50% của nấm trên từng loạ ng

a bổ chất Mù a ổ sung bột bắp 5% Mù a ổ sung tấm và bột bắp 5% MT Túi nilon Mù không sung ỡng Mù a ổ sung bột bắp 5% và cám gạo 5%

170

1 32 45 63 41

2 41 35 63 53

3 60 45 60 60

4 60 50 64 60

5 45 55 63 50

TB 52.8 47.6 46 62.6

B ng G12: Số a ợc 100% của nấm trên từng loại môi ng

a bổ chất Mù a ổ sung bột bắp 5% Mù a ổ sung tấm và bột bắp 5% MT Túi nilon Mù không sung ỡng Mù a ổ sung bột bắp 5% và cám gạo 5%

1 60 63 83 63

2 64 60 84 80

3 79 63 75 80

4 78 75 80 87

5 80 83 85 70

76 TB 72.2 68.8 81.4

B ng G13: B ng phân tích ANOVA so sánh th a a ợc 50% trên các loạ ù a

Ngu n bi ộng Độ tự bình Tổng bình Trung ì F tính Giá trị P do

4.15 0.0237 Nghi m thức 840.55 280.18 3

Sai số TN 1081.20 67.57 16

Tổng 1921.75 19

B ng G14: B ng phân tích ANOVA so sánh th a a ợc 100% trên các loạ ù a

Ngu n bi ộng Độ tự bình Tổng bình Trung ì F tính Giá trị P do

2.01 0.1538 Nghi m thức 438 146.0 3

Sai số TN 1164.80 72.80 16

Tổng 1602.80 19

171

G.2 Nuôi trồng nấm thƣ ng hoàng G.2.1 Thí nghiệm 1

B ng G15: Độ a sa 3 eo õ ủa từng loạ ng nhân giống cấp 1 nấ T ợng Hoàng (cm).

Ống Nghi m Môi ng Raper Môi ng PDA Môi ng tự nhiên Môi ng PDA c dừa

1.8 3.1 3.2 2.7 1

2.1 2.9 3.3 2.8 2

2.6 3.3 3.3 3.7 3

3.5 3 3.8 2.8 4

2.3 3.8 3 2.7 5

TB 3.32 2.94 2.46 3.22

bình bình Độ tự do F tính

Trung ì 0.74 0.2 Tổng 2.25 3.28 5.5 3.62 3 16 19

B ng G16: B ng phân tích ANOVA so sánh th a ấm lan trên ng Raper, PDA, PDA bổ s c dừa ng tự nhiên sau 3 ngày. Ngu n bi n ộng Nghi m thức Sai số TN Tổng CV = 15. 2 %

B ng G17: Độ a sa 5 eo õ ủa từng loạ ng môi ng nhân giống cấp 1 nấ T ợng Hoàng (cm).

Ống Nghi m Môi ng Raper Môi ngP DA Môi ng tự nhiên Môi ng PDA c dừa

4.4 4.4 4.2 5 1

4.4 5.4 2.9 5.7 2

5.6 4.3 3.3 4.7 3

5 5.5 3.9 4.8 4

172

5 5.8 4.4 3.2 4.6

TB 5.04 4.8 3.5 4.96

bình bình Độ tự do F tính

Trung ì 2.62 0.31 Tổng 7.85 5.04 12.9 8.3 3 16 19

B ng G18: B ng phân tích ANOVA so sánh th a ấm lan trên ng Raper, PDA, PDA bổ s c dừa ng tự nhiên sau 5 ngày. Ngu n bi n ộng Nghi m thức Sai số TN Tổng CV= 12.3 %

B G19: Độ a sa 7 eo õ ủa từng loạ ng môi ng nhân giống cấp 1 nấ T ợng Hoàng (cm).

Ống Nghi m Môi ng Raper Môi ngP DA Môi ng tự nhiên Môi ng PDA c dừa

5.5 6.9 1 7.5 6

5.4 6.5 2 6.5 6

5.2 7.2 3 6.4 7.2

5.5 6.5 4 7.4 6.1

4.6 6.5 5 6.5 7.3

TB 6.86 6.52 5.24 6.72

B ng G20: B ng phân tích ANOVA so sánh th a ấm lan trên ng Raper, PDA, PDA bổ s c dừa ng tự nhiên sau 7 ngày.

bình bình Độ tự do F tính Ngu n bi n ộng Tổng Trung ì

3 16 19 8.28 3.94 12.23 2.76 0.25 11.22

Nghi m thức Sai số TN Tổng CV = 7.8 %

G.2.2 Thí nghiệm 2 B ng G21: Số a 50 % ủa nấ T ợng Hoàng trên từng loại ng nhân giống cấp 2 nấ T ợng Hoàng (ngày).

173

Gạo lứt Hạt bắp Hạ u xanh Hạt lúa – cám gạo 5% Bình c biển

1 7 7 8 9

2 6 6 7 10

3 7 6 8 10

4 5 7 9 8

5 6 6 7 11

9.6 TB 6.2 6.4 7.8

B ng G22: B ng phân tích ANOVA so sánh th a ấm lan 50 % ng hạt gạo lứt, hạt lúa, hạt bắp và hạt u xanh.

bình bình Độ tự do F tính Ngu n bi n ộng Tổng Trung ì

3 16 19 16.44 12.33 0.75 37 12 49

Nghi m thức Sai số TN Tổng CV = 11.5 % B ng G23: Số a 100 % ủa nấ T ợng Hoàng trên từng loại

ng nhân giống cấp 2 nấ T ợng Hoàng (ngày).

Gạo lứt Hạt lúa – cám gạo 5% Hạt bắp Hạ u xanh Bình c biển

1 12 13 12 15

2 11 13 12 16

3 10 12 14 16

4 12 12 13 15

5 11 11 13 17

TB 11.2 12.2 12.8 15.8

B ng G24: B ng phân tích ANOVA so sánh th a ấm lan 100 %

Độ tự do bình bình F tính ng hạt gạo lứt, hạt lúa, hạt bắp và hạ u xanh. Ngu n bi n ộng Trung ì Tổng

Nghi m thức 3 58 19.6 28

174

16 19 11.2 70 0.7

Sai số TN Tổng CV= 6.4 % G.2.3 Thí nghiệm 3 B ng G25: Số a 50 % ủa nấ T ợng Hoàng trên từng loại ng nhân giống cấp 3 nấ T ợng Hoàng (ngày).

Bình c biển Mù a ổ sung 5% cám gạo Mù a ổ sung bột bắp 5% và 5% cám gạo Mù a ổ sung bột bắp 5% và 10% cám gạo

1 9 7 7

2 10 6 6

3 10 7 6

4 11 7 7

5 9 7 6

9.8 TB 6.8 6.4

B ng G26: B ng phân tích ANOVA so sánh th a ấm lan 50 % ù a ổ sung 5 % cám gạo ù a ổ sung 5 % bột bắp 5 % cám gạo ù a ổ sung 5 % bột bắp 10% cám gạo.

bình bình Độ tự do F tính Ngu n bi n ộng Tổng Trung ì

2 12 14 34.53 4.8 39.33 17.27 0.4 43.17

Nghi m thức Sai số TN Tổng CV= 8.2 % B ng G27: Số a 100 % ủa nấ T ợng Hoàng trên từng loại ng nhân giống cấp 3 nấ T ợng Hoàng (ngày).

Bình c biển Mù a ổ sung 5% cám gạo Mù a ổ sung bột bắp 5% và 5% cám gạo Mù a ổ sung bột bắp 5% và 10% cám gạo

1 11 10 10

175

2 11 9 9

3 13 9 9

4 12 10 9

5 12 9 9

9.4 9.2 TB 11.8

B ng G28: B ng phân tích ANOVA so sánh th a ấm lan 50 % ù a ổ sung 5 % cám gạo ù a ổ sung 5 % bột bắp 5 % cám gạo ù a ổ sung 5 % bột bắp 10% cám gạo.

bình bình Độ tự do F tính Ngu n bi n ộng Tổng Trung ì

20.93 4.8 25.73 10.47 0.4 26.17 2 12 14

Nghi m thức Sai số TN Tổng CV = 6.2 %

176