Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM __

LÊ NGỌC TRIỆU

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG

DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ

TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

ĐÀ LẠT, 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM __

LÊ NGỌC TRIỆU

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 62.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. NGUYỄN VĂN KẾT

GS.TSKH. TRẦN DUY QUÝ

ĐÀ LẠT, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Đà Lạt, ngày 21 tháng 12 năm 2017

Tác giả luận án

Lê Ngọc Triệu

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành luận án, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn Kết, GS.TSKH. Trần Duy Quý, những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ tận tình để tôi có thể tôi hoàn thành luận án.

Xin đƣợc trân trọng cám ơn quý thầy cô thuộc Ban đào tạo sau đại học -Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam, Viện Di truyền Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Đà Lạt đã truyền đạt các kiến thức, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, sinh hoạt chuyên môn và thực hiện luận án.

Để có đƣợc các kết quả nghiên cứu trong luận án này, tôi xin chân thành cám ơn Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia và đặc biệt là TS. Trần Văn Tiến đã tạo điều kiện cho tôi tham gia, thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền chi sâm (Panax L.) ở Việt Nam”. Xin đƣợc tri ân đến Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên cũng nhƣ các anh em, bạn bè đồng nghiệp gần xa,…..đã chia sẻ, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Sau cùng, từ tận đáy lòng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến cha mẹ tôi, ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng tôi nên ngƣời và vợ tôi đã luôn động viên và chia sẻ để tôi phấn đấu hoàn thành luận án này.

Lê Ngọc Triệu

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan ...................................................................................................................... i

Lời cám ơn ......................................................................................................................... ii

Danh mục chữ viết tắt ....................................................................................................... vi

Danh mục bảng ................................................................................................................ vii

Danh mục hình.................................................................................................................. ix

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................................. 1

2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................................ 2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ....................................................................................... 2

4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ................................................................. 3

5. Những đóng góp mới của luận án ................................................................................. 4

Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 5

1.1. Vai trò của các loại sâm trong đời sống ..................................................................... 5

1.2. Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu về phân loại, khảo sát quan hệ phát sinh

chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật ................. 7

1.2.1. Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật ............................................................................... 7

1.2.1.1. Các phƣơng pháp dựa trên đặc điểm hình thái ..................................................... 7

1.2.1.2. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử ........................................................... 8

1.2.2. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và

quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật ................................................................. 10

1.2.2.1. Các phƣơng pháp xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại .......................... 11

1.2.2.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng các trình tự DNA bảo thủ cao trong phân

tích quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật .......................................................... 11

1.2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền quần thể ............................................ 14

1.3. Vị trí hệ thống học và phân loại chi Panax, họ Araliaceae ...................................... 16

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới .................................................................................. 16

1.3.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam ................................................................................ 22 1.4. Quan hê ̣ phát sinh chi Panax L. dƣ̣a trên hê ̣ thống ho ̣c mƣ́ c đô ̣ phân tƣ̉ ................. 23 1.4.1. Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong

chi Panax không dựa vào giải trình tự DNA .......................................................... 25

1.4.1.1. Các nghiên cứu trên thế giới ............................................................................... 25

iii

1.4.1.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam ............................................................................. 26

1.4.2. Các nghiên cứu dựa trên giải trình tự các vùng DNA bảo thủ .............................. 27

1.4.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới ............................................................................... 27

1.4.2.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam ............................................................................. 32

1.4.3. Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong

chi Panax sử dụng DNA fingerprint từ các vùng DNA bảo thủ ............................ 33

1.5. Các nghiên cứu đánh giá đa da ̣ng di truyền quần thể ở chi Panax .......................... 34

1.6. Nghiên cứu về thành phần hoạt chất ở chi Panax .................................................... 39

1.7. Nhận xét chung ......................................................................................................... 41

Chƣơng 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 33

2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................... 44

2.1.1. Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại của

sâm Lang Bian và các taxon Panax khác ............................................................... 44

2.1.2. Vật liệu cho nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian .................... 46

2.1.3. Vật liệu cho nghiên cứu sơ bộ thành phần saponin của sâm Lang Bian ............... 46

2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 47

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................................... 47

2.3.1.Điều tra, thu thập mẫu ............................................................................................ 47

2.3.1.1. Thu thập, xử lý mẫu để nghiên cứu hình thái thực vật học, lƣu trữ và

nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại ................................................................ 50

2.3.1.2. Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể ......................... 50

2.3.1.3. Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu sơ bộ về thành phần saponin .......................... 51

2.3.2. Nghiên cứu về hình thái nhằm bổ sung dữ liệu cho xác định vị trí phân loại

sâm Lang Bian ........................................................................................................ 51

2.3.3. Tách chiết DNA và kiểm tra chất lƣợng, hàm lƣợng DNA trong các mẫu ........... 52

2.3.4. Phân loại, phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự bảo

thủ .......................................................................................................................... 52

2.3.4.1. Phân lập và khuếch đại các vùng DNA bảo thủ ................................................. 52

2.3.4.2. Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự DNA bảo thủ

cao ........................................................................................................................... 55

2.3.5. Phân tích đa dạng và biến động di truyền trong quần thể dựa trên DNA

fingerprint nảy sinh bằng kỹ thuật ISSR ................................................................. 55 2.3.5.1. Sử dụng kỹ thuâ ̣t ISSR để hình thành các DN A fingerprint .............................. 56 2.3.5.2. Phân tích đa dạng và biến động di truyền dựa trên các DNA fingerprint thu

nhận đƣợc ................................................................................................................ 57

2.3.6. Sơ bộ phân tích, so sánh thành phần saponin ....................................................... 59 iv

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................. 61

3.1. Vị trí phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và một số

loài khác cùng chi dựa trên đặc điểm hình thái và trình tự DNA bảo thủ .............. 61

3.1.1. Vị trí phân loại thực vật của sâm Lang Bian dựa trên đặc điểm hình thái ............ 61

3.1.2. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa

trên các trình tự bảo thủ .......................................................................................... 66

3.1.2.1. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi

dựa trên vùng gene matK ........................................................................................ 66

3.1.2.2. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi

dựa trên vùng trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 .................................................. 75

3.1.2.3. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi

khác dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA .......................................................... 84

3.1.2.4. Khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại dựa vào việc phối hợp các vùng

trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK .................... 90

3.1.3. Vị trí phân loại của sâm Lang Bian dựa trên quan hệ phát sinh chủng loại với

các taxon Panax khác ở mức độ phân tử và đặc điểm hình thái ........................... 102

3.2. Đánh giá đa dạng di truyền ở quần thể sâm Lang Bian.......................................... 104

3.2.1. Kết quả thu thập, chuẩn bị mẫu và chọn lọc mồi phục vụ cho đánh giá đa

dạng di truyền quần thể ......................................................................................... 104

3.2.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể LD ................................................ 110

3.2.3. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể DR ................................................ 116

3.2.4. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền tổng thể taxon nghiên cứu .......................... 122

3.3. Kết quả nghiên cứu về phân tích, so sánh sơ bộ thành phần saponin ở sâm

Lang Bian và một số taxon cùng chi khác ............................................................ 129

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 132

1. Kết luận ...................................................................................................................... 132

2. Kiến nghị ................................................................................................................... 132

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .. 134

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 135

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: PHỔ ĐỒ TRÌNH TỰ CÁC VÙNG DNA BẢO TỒN CỦA CÁC

TAXON ĐƢỢC THU THẬP TRONG NGHIÊN CỨU

PHỤ LỤC 2: SO SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG BẢO TỒN GIỮA CÁC TAXON

KHẢO SÁT

PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ ĐIỆN DI DNA KHUẾCH ĐẠI BẰNG CÁC MỒI ISSR

AFLP: DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Amplified Fragment Length Polymorphism

CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence

DDBJ: DR: DNA Data Bank of Janan Đam Rông

G-Rb1: Ginsenoside Rb1

G-Rd: Ginsenoside Rd

G-Re: Ginsenoside Re

G-Rg1: Ginsenoside Rg1

expected heterozygosity He:

ISSR: Inter Simple Sequence Repeats

ITS: Internal transcribed spacer

IUCN: International Union for Conservation of Nature

LD: Lạc Dƣơng

M-R2: Majonoside R2

NCBI: N-R1: National Centre for Biotechnology Information Notoginsenosid R1

PPB: PS: percentage of polymorphic bands Panax stipuleanatus (lá chét nguyên)

PSDL: Panax stipuleanatus (lá chét xẻ)

PV: Panax vietnamensis

PVF: Panax vietnamensis var. fuscidiscus

PVL: Panax vietnamensis var. langbianensis

RAPD: Random Amplified Polymorphic

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

rRNA: ribosomal RNA

SCAR: Sequence Characterized Amplified Region

SNP: Single Nucleotide Polymorphism

SSR: Simple sequence Repeat - Microsatellites

VNTR: Variable Number of Tandem Repeats - Minisatellites

DANH MỤC BẢNG

TT Tên bảng Trang

1.1. Đặc điểm hình thái tƣơng đồng và khác biệt giữa chi Aralia và chi Panax ......... 18

1.2. Phân loại các taxon Panax ở châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên cứu

hệ thống học thực vật giai đoạn 1970-1975 ......................................................... 19

1.3. Phân loại các taxon Panax ở châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên cứu

hệ thống học thực vật giai đoạn 1996-2014 ......................................................... 20

1.4. Số lƣợng nhiễm sắc thể theo Yang (1981) ........................................................... 21

2.1. Các mẫu sử dụng để tách chiết DNA cho phân tích quan hệ phát sinh chủng

loại ........................................................................................................................ 44

2.2. Mã truy cập các trình tự 18S rRNA; vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 và một phần gene matK của các mẫu thu thập tại Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại ..................................................... 45

2.3. Các trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8SrRNA-ITS2 và gen matK đƣợc lấy từ

Genbank sử dụng trong nghiên cứu phân tích quan hệ phát sinh chủng loại ....... 45

3.1. So sánh đặc điểm hình thái giữa sâm Lang Bian, P. vietnamensis và P.

vietnamensis var. fuscidiscus ................................................................................ 62

3.2. Thành phần và số lƣợng nucleotide các trình tự một phần gene matK ở các

taxon đƣợc khảo sát .............................................................................................. 68

3.3. Những vị trí khác biệt ở trình tự một phần gene matK của đối tƣợng nghiên

cứu so với các taxon khác cùng chi ...................................................................... 69

3.4. Khoảng cách di truyền giữa các taxon đƣợc khảo sát dựa trên trình tự một

phần vùng gene matK ........................................................................................... 70

3.5. Sự khác biệt giữa trình tự gene matK giữa Panax sp., P. vietnamensis và P.

vietnamensis var. fuscidiscus ................................................................................ 72

3.6. So sánh trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các mẫu thuộc taxon Panax

vietnamensis từ các nguồn khác nhau ................................................................... 77

3.7. Thành phần, số lƣợng nucleotide các trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 khảo

sát .......................................................................................................................... 78

3.8. Những vị trí khác biệt ở trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 của đối tƣợng

nghiên cứu so với các taxon cùng chi ................................................................... 79

3.9. Khoảng cách di truyền giữa các taxon khảo sát dự trên trình tự vùng ITS1–

5,8SrRNA–ITS2 ................................................................................................... 81

3.10. Sai khác giữa sâm Lang Bian với Panax vietnamensis và P. vietnamensis

vii

var. fuscidiscus dựa trên trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 ............................ 84

3.11. Phành phần và số lƣợng nucleotide các trình tự vùng 18S rRNA ở các taxon

đƣợc khảo sát ........................................................................................................ 86

3.12. Các vị trí khác biệt giữa các taxon Panax khảo sát dựa trên trình tự vùng

gene 18S rRNA ..................................................................................................... 87

3.13. Khoảng cách di truyền giữa các taxon khảo sát dựa trên trình tự 18S rRNA ...... 88

3.14. Đặc điểm thành phần và số lƣợng nucleotide của các trình tự phối hợp ở các

taxon khảo sát ....................................................................................................... 94

3.15. Khoảng cách di truyền giữa các taxon Panax đƣợc khảo sát dựa trên sự phối hợp ba trình tự DNA bảo thủ 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK .................................................................................................... 95

3.16. Ký hiệu, độ tuổi và phân nhóm tuổi các cá thể thuộc quần thể LD ................... 105

3.17. Ký hiệu, độ tuổi và phân nhóm tuổi các cá thể thuộc quần thể DR ................... 106

3.18. Đặc điểm các mồi ISSR đƣợc chọn lọc và sử dụng để làm nảy sinh DNA

fingerprint làm cơ sở đánh giá đa dạng di truyền ............................................... 107

3.19. Tỷ lệ band đa hình ở mức độ tổng thể mẫu nghiên cứu, quần thể và các

nhóm tuổi trong quần thể .................................................................................... 109

3.20. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi lớn ở quần thể

LD ....................................................................................................................... 111

3.21. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi nhỏ ở quần thể

LD ....................................................................................................................... 112

3.22. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ hai nhóm tuổi lớn và nhỏ ở

quần thể LD ........................................................................................................ 113

3.23. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi lớn ở quần thể

DR ....................................................................................................................... 117

3.24. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi nhỏ ở quần thể

DR ....................................................................................................................... 118

3.25. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ hai nhóm tuổi lớn và nhỏ ở

quần thể DR ........................................................................................................ 119

3.26a. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ nhóm tuổi lớn thuộc quần

thể LD và tất cả mẫu thuộc quần thể DR ............................................................ 123

3.26b. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ nhóm tuổi nhỏ thuộc quần

thể LD và tất cả mẫu thuộc quần thể DR ............................................................ 124

viii

3.27. Thành phần saponin theo chất chuẩn của các mẫu khảo sát............................... 130

DANH MỤC HÌNH

TT Tên hình Trang

1.1. Cây quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon Panax theo Wen và cộng sự (1996) ................................................................................................................. 28

1.2. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên phối hợp trình tự gene trnK và gene 18S rRNA theo Komatsu và cộng sự (2003) ................................................. 32

2.1. Bản đồ địa hình điều tra thu thập mẫu đối với sâm Lang Bian ............................... 48

2.2. Bản đồ không ảnh tổng thể khu vực phân bố sâm Lang Bian ................................. 49

3.1. So sánh hình thái giữa sâm Lang Bian, Panax vietnamensis và Panax vietnamensis var. fuscidiscus .................................................................................. 63

3.2. Hình vẽ mô tả đặc điểm thực vật học của sâm Lang Bian ..................................... 64

3.3. Ảnh chụp đặc điểm thực vật học của sâm Lang Bian ............................................. 65

3.4. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự một phần gene matK ............................ 66

3.5. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ........................... 71

3.6. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining .................................. 71

3.7. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood sử dụng 5 chuẩn ngoại ............................................................................................................. 73

3.8. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining sử dụng 5 chuẩn ngoại ........................................................................................................................ 73

3.9. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood sử dụng 8 chuẩn ngoại ............................................................................................................. 74

3.10 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining sử dụng 8 chuẩn ngoại ........................................................................................................................ 75

3.11 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 ................... 76

3.12. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ............. 82

3.13 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining ............................ 82

3.14. Cây quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon Panax theo Yang và cộng sự (2001) ................................................................................................................. 83

3.15 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự 18S rRNA ............................................. 85

3.16 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng gene 18S rRNA giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ........................... 89

3.17. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng gene 18S rRNA giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining .................................. 89

3.18. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ........................... 96

3.19. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining .................................. 97

3.20. A. Mẫu tiêu bản Panax bipinnatifidus; B. Mẫu Lectotype của P. bipinnatifidus; C. Mẫu P. stipuleanatus ở Lai Châu, Việt Nam ; D. Mẫu P. bipinnatifidus ở Lai Châu, Việt Nam. ..................................................................... 99

3.21. Cây quan hệ phát sinh chủng loại chính thức dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rDNA, vùng ITS1-5,8S rDNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ................... 100

3.22. Cây quan hệ phát sinh chủng loại chính thức dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rDNA, vùng ITS1-5,8S rDNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining .......................... 101

3.23. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum parsimony ................................... 101

3.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR 844A ở quần thể LD .................... 107

3.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR UBC873 ở quần thể LD ............... 108

3.26. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR 814 ở quần thể DR ....................... 108

3.27. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR HB12 ở quần thể DR ................... 108

3.28. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể thuộc quần thể LD ............ 115

3.29. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể thuộc quần thể DR ............ 121

3.30. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể trong tổng thể nghiên cứu ......................................................................................................................... 126

3.31. Sơ đồ dạng cây vềquan hệ di truyền các cá thể thuộc hai nhóm lá chét nguyên và lá chét xẻ loài P. stipuleanatus theo Trieu và cộng sự (2016) ......................... 127

3.32. Sắc đồ sắc ký lớp mỏng saponin của các taxon đƣợc khảo sát và các chất chuẩn ..................................................................................................................... 129

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Chi sâm (Panax L.) thuộc ho ̣ Araliaceae là một chi thực vật làm thuốc quan trọng và kinh điển trong Đông dƣợc cũng nhƣ trong y học hiện đại. Panax ginseng là một

trong số các loài thuộc chi sâm đã góp phần đƣa Hàn Quốc trở nên nổi tiếng khắp thế giới về dƣợc liệu . Hiê ̣n nay trên thế giớ i đã phát hiê ̣n đƣơ ̣c nhiều loài sâm nhƣ : Panax ginseng C.A.Mey., P. japonicus (T.Nees) Mey., P. quinquefolius L., P. notoginseng

(Burkill) F.H.Chen, P. zingiberensis C.Y.Wu & Feng, P. vietnamensis Ha et Grushv., P. pseudoginseng Wall., P. stipuleanatus Tsai & Feng, P. trifolius L.…, phân bố ở Đông Á , vùng Himalaya, Indochina và Bắc Mỹ . Do có giá trị làm thuốc cao nên nhiều loài sâm đã bị khai thác quá mức dẫn đến cạn kiệt trong tự nhiên. Các quốc gia trên thế

giới có phân bố tự nhiên của các loài thuộc chi này nhƣ Hàn Quốc, Mỹ, Canada, Trung

Quốc… đều đã đƣa ra các chƣơng trình bảo tồn, phát triển và hạn chế khai thác tự

nhiên để bảo vệ nguồn tài nguyên quý hiếm này.

Ở Việt Nam, các nghiên cứu trên nhiều phƣơng diện về các loài thuộc chi Panax đã đƣợc tiến hành tƣ̀ khá lâu , đă ̣c biê ̣t là loài P. vietnamensis vốn là đă ̣c hƣ̃u củ a Viê ̣t thuốc trọng điểm quốc gia và đã đƣợc đầu tƣ nhiều Nam và đến nay đã trở thành cây tiền của, công sức để bảo tồn, phát triển. Kết quả từ các nghiên cứu gần nhất về thành

phần loài và phân loại chi Panax đã chỉ ra rằng hiện nay ở Việt Nam có 3 loài: P.

vietnamensis Ha và Grushv., P. bipinnatifidus Seem., P. stipuleanatus Tsai & Feng và một thứ là P. vietnamensis var. fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai là các taxon

có phân bố tự nhiên và đang trong tình trạng nguy cấp theo tiêu chuẩn IUCN.

Loài đầu tiên đƣợc Phạm Hoàng Hộ ghi nhận năm 1970 ở miền Nam Việt Nam là Panax schingseng Nees var. japonicum Mak.. Theo tác giả, loài này mọc dƣới tán rừng râ ̣m lá rô ̣ng, thƣờng xanh, ẩm ở vùng núi Lang Bian, tỉnh Lâm Đồng. Trong các công trình xuất bản sau đó về thành phần loài thực vật Việt Nam, tác giả này vẫn luôn ghi nhận về sự tồn tại của taxon này nhƣng dƣới tên khoa học khác là P. japonica (Nees)

Mayer. Tuy vậy, trong những tài liệu gần nhất về thành phần loài chi Panax ở Việt Nam, taxon do Phạm Hoàng Hộ ghi nhận có phân bố ở vùng Lạc Dƣơng, Lâm Đồng không đƣợc nhắc đến, thay vào đó, một số tài liệu ghi nhận có sự phân bố tự nhiên của

P. vietnamensis tại đây.

Trong quá trình điều tra khảo sát khu hê ̣ thƣ̣c vâ ̣t ta ̣i

vùng núi Lang Bian, huyện Lạc Dƣơng, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 10 năm 2010, nơi mà Phạm Hoàng Hộ đã ghi nhận có sự phân bố của một taxon Panax từ năm 1970, chúng tôi đã phát hiê ̣n mô ̣t

quần thể sâm nhỏ thuô ̣c chi Panax mọc tự nhiên. Qua nghiên cứu về hình thái thân rễ, lá, hoa, quả ban đầu cho thấy các cá thể thuô ̣c quần thể có sự khác biệt về cấu trúc cơ quan dinh dƣỡng và sinh sản so với các taxon thuộc chi Panax khác.

Do mới đƣợc tái phát hiện và rất thiếu các dữ liệu khoa học liên quan đến taxon

này, trƣớc mắt cần phải có các nghiên cứu chuyên sâu về phân tử và sơ bộ về thành

phần saponin để xác định rõ vị trí phân loại trong hệ thống phát sinh chi Panax và

bƣớc đầu tìm hiểu khả năng làm thuốc của taxon này. Bên cạnh đó, do khu phân bố của quần thể sâm mới tái phát hiện rất hẹp, số lƣợng cá thể ít nên cần thông tin về tính

đa dạng và biến động di truyền làm cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển.

Để có thêm cơ sở khoa ho ̣c cho viê ̣c phân loa ̣i , khẳng đi ̣nh nguồn tài nguyên quý

, đề tài “Nghiên cứu

hiếm vừa phát hi ện nói trên củ a Viê ̣t Nam đối vớ i thế giớ i cũng nhƣ bảo tồn và phát triển chú ng phu ̣c vu ̣ cho công tác nghiên cứu và sử dụng về sau phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng” đƣợc tiến hành.

2. Mục tiêu của đề tài

Đề tài đƣợc tiến hành hƣớng tới mục tiêu làm sáng tỏ các vấn đề:

- Quần thể sâm mới đƣợc phát hiện có các đặc điểm khác biệt về di truyền so với

các taxon khác hay không?, quan hệ phát sinh chủng loại của nó đối với các taxon

cùng chi khác thế nào?;

- Tính đa dạng và biến động di truyền trong quần thể của đối tƣợng này ra sao?;

- Taxon mới phát hiện này có chứa các saponin chính nhƣ một số taxon thuộc chi

Panax hay không? và dựa trên các dƣợc chất này, có sự khác biệt giữa taxon khảo sát

so với các taxon cùng chi khác không?.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả đề tài minh chứng cho sự tồn tại thực tế của một taxon thuộc chi Panax,

họ Araliaceae tại vùng núi Lang Bian, Lâm Đồng vốn đã gây nhiều tranh luận do một thời gian dài không tìm thấy mẫu vật, chỉ ra sự mở rộng phân bố của chi Panax trên thế giới về phía Nam.

Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học để công bố, bổ sung vào Danh lục thực vật, Sách đỏ Việt Nam một taxon mới, đặc hữu và góp phần làm rõ về thành phần loài của chi Panax ở Việt Nam. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu DNA bảo thủ cho các giống/loài,

đăng ký ở ngân hàng gene thế giới là việc làm cần thiết để khẳng định chủ quyền quốc

gia về tài nguyên thực vật, đặc biệt là đối với nguồn tài nguyên đặc hữu, quý hiếm mới

phát hiện lại nói trên.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả đánh giá đa dạng và biến động di truyền trong quần thể thực vật cho

phép nhận thức rõ hơn về tình trạng các quần thể cũng nhƣ tổng thể taxon Panax phân

bố tự nhiên tại Lâm Đồng, tạo cơ sở cho việc đề xuất phƣơng án bảo tồn và phát triển

trong tƣơng lai. Bên cạnh đó, các dữ liệu sơ bộ về thành phần saponin là cơ sở ban đầu cho việc xem xét giá trị làm thuốc taxon này.

4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

4.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Trong nghiên cứu vị trí phân loại của taxon Panax phân bố tự nhiên tại Lâm

Đồng, đối tƣợng nghiên cứu là bản thân taxon thực vật này (Panax sp., đƣợc gọi là

sâm Lang Bian), các taxon Panax khác phân bố tại Việt Nam và trên thế giới.

Trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể, đối tƣợng nghiên cứu là tập hợp

các cá thể thuộc hai quần thể sâm Lang Bian phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng.

Trong nghiên cứu về phân tích sơ bộ thành phần saponin ở sâm Lang Bian, đối tƣợng nghiên cứu là thân rễ và rễ củ của các taxon thuộc chi Panax có phân bố tại Việt

Nam.

4.2. Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi chuyên môn:

Với hai nội dung chính của đề tài là nghiên cứu vị trí phân loại và đa dạng di

truyền quần thể, sơ bộ phân tích hoạt chất đối với sâm Lang Bian, phạm vi nghiên cứu

chuyên môn của luận án là: (1) Xác định vị trí phân loại dựa phƣơng pháp phân loại

thực vật kinh điển dựa trên hình thái giải phẫu; (2) Xác định vị trí phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu trình tự DNA bảo thủ trong nhân và lạp thể; (3) Đánh giá đa dạng di truyền quần thể dựa trên DNA fingerprint nảy sinh thông qua kỹ

thuật ISSR và (4) Sơ bộ phân tích hoạt chất của sâm Lang Bian dựa trên phƣơng pháp phân tích hóa học kinh điển.

Địa điểm nghiên cứu:

Nghiên cứu điều tra, phân loại và thu thập mẫu thực địa đƣợc tiến hành ở các vùng có phân bố các taxon thuộc chi Panax tại Việt Nam, tập trung vào khu vực phát hiện quần thể sâm Lang Bian phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng và các khu vực lân cận.

Nghiên cứu về phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sinh học phân tử

cũng nhƣ đa dạng di truyền quần thể đƣợc thực hiện tại các phòng thí nghiệm sinh học

phân tử của Trung tâm Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong công nghiệp, trƣờng Đại học Đà Lạt.

Nghiên cứu về hình thái giải phẫu, phân loại thực vật truyền thống và sơ bộ về

thành phần saponin đƣợc thực hiện chủ yếu tại Bảo tàng thực vật Trƣờng Đại học Đà

Lạt (DLU), Bảo tàng thực vật (VTN) và Phòng thí nghiệm hóa hợp chất thiên nhiên - Viện Nghiên cứu khoa học Tây nguyên. Việc so sánh mẫu vật cũng đƣợc tiến hành tại

một số bảo tàng, phòng lƣu trữ tiêu bản thực vật trong và ngoài nƣớc.

Thời gian nghiên cứu:

Nghiên cứu đƣợc tiến hành từ năm 2012 đến năm 2016.

5. Những đóng góp mới của luận án

Chứng minh sự tồn tại thực tế của một taxon thuộc chi Panax, họ Araliaceae tại

vùng núi Lang Bian, Lâm Đồng, chỉ ra sự mở rộng phân bố của chi Panax trên thế giới

về phía Nam.

Tạo cơ sở khoa học để công bố, bổ sung vào Danh lục thực vật, danh lục cây thuốc và Sách đỏ Việt Nam một taxon mới đặc hữu. Góp phần làm rõ về thành phần

loài của chi Panax ở Việt Nam.

Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA cho một chủng loại sâm mới, đăng ký ở ngân hàng

gene thế giới để khẳng định chủ quyền Quốc gia về nguồn tài nguyên này.

Xây dựng cơ sở khoa học cho việc hình thành chiến lƣợc bảo tồn nguồn tài

nguyên thực vật đặc hữu, quý hiếm thông qua kết quả đánh giá về điều tra phân bố,

nghiên cứu đa dạng và biến động di truyền trong quần thể.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vai trò của các loại sâm trong đời sống

Sâm (Ginseng) đƣợc hiểu là bất kỳ loài nào trong số các loài cây thảo lƣu niên

có củ nạc sinh trƣởng chậm thuộc chi Panax, họ Araliaceae. Các loài sâm đƣợc đặc

trƣng bởi khả năng làm thuốc nhờ có chứa các loại ginsenoside. Ginsenoside hay còn gọi là panaxoside có bản chất là steroid glycoside và triterpene saponin vốn có nhiều

hoạt tính sinh học và giá trị làm thuốc cao.

Lịch sử sử dụng sâm bắt đầu từ 4.500 năm trƣớc và tài liệu ghi nhận về sâm

sớm nhất đƣợc biết đã có từ 2.000 năm trƣớc. Về giá trị kinh tế, các loại sâm là những

nguồn cây thuốc có giá trị kinh tế rất cao đối với nhân loại, đƣợc mua bán tại trên 35

quốc gia với kim ngạch đạt đến 2,1 tỷ USD vào năm 2013 và khoảng một nửa trong số

đó là từ Hàn Quốc. Trong nhiều năm lịch sử, Triều Tiên – Hàn Quốc là các quốc gia

cung cấp lớn nhất và Trung quốc là quốc gia tiêu thụ sâm lớn nhất thế giới (Baeg và

So, 2013).

Giá trị của các loại sâm rất khác nhau tùy vào loài, xuất xứ, độ tuổi, có nguồn

gốc trồng hay từ tự nhiên. Theo ghi nhận thực tế của chúng tôi trong quá trình điều tra,

trong khi giá bán của P. vietnamensis 15-30 triệu đồng/kg tại Kon Tum thì giá bán của

P. vietnamensis var. fuscidiscus là 4-6 triệu đồng/kg; của P. stipuleanatus là 3-5 triệu

đồng/kg và của P. bipinnatifidus là 2-4 triệu đồng/kg tại Lai Châu. Trong khi giá bán

tại Hàn Quốc của P. ginseng (Nhân sâm đỏ) trồng là 250 USD/kg thì giá 1 củ sâm tự nhiên cùng loại là 2.000 – 20.000USD/kg tùy vào tuổi.

Chính vì có giá trị kinh tế cao mà nhiều loài thuộc chi Panax đã đƣợc trồng

dƣới nhiều hình thức: mô hình vƣờn rừng (Li và cộng sự, 2011; Artyukova và cộng sự, 2004), trồng thuần thâm canh cũng nhƣ đƣợc sản xuất in vitro công nghiệp (Nguyen

Trung Thanh và cộng sự, 2014; Grażyna và cộng sự, 2013). Những hoạt động này đã

hình thành nên nghề trồng sâm hay các nhà máy sản xuất lớn, tạo việc làm cho nhiều ngƣời (Proctor và cộng sự, 2011).

Do có giá trị làm thuốc và giá trị kinh tế lớn mà những quốc gia trên thế giới có sự phân bố tự nhiên của các loài thuộc chi Panax nhƣ Hàn Quốc, Mỹ, Canada, Trung Quốc… đều đã đƣa ra các chƣơng trình bảo tồn, phát triển và khai thác đôi khi đến mức nghiêm ngặt để bảo vệ nguồn tài nguyên quý hiếm này (Bai và cộng sự, 1997;

Jennifer và Hamrick, 2004; Eidus và Leopold, 2013). Ở nƣớc ta đã có nhiều chƣơng 5

trình, dự án nghiên cứu triển khai để bảo tồn, phát triển tập trung vào đối tƣợng đƣợc

xem là đặc hữu của Việt Nam là P. vietnamensis. Hiện nay, Trung tâm Sâm và Dƣợc

liệu thành phố Hồ Chí Minh đƣợc xem là một trong những đơn vị đƣợc đầu tƣ để nghiên cứu và phát triển Sâm Ngọc Linh. Gần đây nhất là việc xây dựng Trung tâm

quốc gia nghiên cứu phát triển Sâm Ngọc Linh, là hạng mục đầu tiên của Dự án đầu tƣ

“Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ nhân giống, canh tác, mở rộng sản xuất,

xây dựng và phát triển thƣơng hiệu quốc gia cho Sâm Ngọc Linh”, đƣợc thực hiện trên cơ sở thỏa thuận hợp tác giữa Bộ Khoa học và Công nghệ với Ủy ban nhân dân tỉnh

Kon Tum và giao cho Cục Phát triển thị trƣờng và Doanh nghiệp - Bộ Khoa học và

công nghệ chủ trì thực hiện (http://www.most.gov.vn).

Do có giá trị cao mà nhiều loài Nhân sâm bị làm giả, có thể bằng các loài khác

cùng chi Panax hay thậm chí những loài có quan hệ phát sinh chủng loại rất xa. Ví dụ,

Mirabilis jalapa L. và Phytolacca acinosa Roxb. là hai loài thƣờng đƣợc dùng làm giả

cho P. ginseng, P. notoginseng, P. japonicus, P. trifolius và P. mayor (Ngan và cộng

sự, 1999); Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) bị làm giả bởi Sâm Lai Châu (Panax

vietnamensis var. fuscidiscus), Tam thất hoang (P. stipuleanatus), Sâm Vũ diệp (P. stipuleanatus lá xẻ, từng đƣợc xem là P. bipinnatifidus) để bán tại các vùng Kon Tum,

Quảng Nam, Lâm Đồng.

Các taxon thuộc chi Panax đã biết đều là các đối tƣợng có giá trị dƣợc dụng cao

và đƣợc xem là thần dƣợc cuộc sống bởi khả năng chống các bệnh kinh niên, chống

oxy hóa của chúng (Lee và cộng sự, 2016), do vậy đã có hàng loạt các công trình

nghiên cứu trên thế giới và cũng nhƣ ở Việt Nam đƣợc tiến hành nhằm thúc đẩy sản

xuất, khai thác, sử dụng hiệu quả. Nhiều nhất là các nghiên cứu về thành phần hóa

dƣợc và dƣợc lý, tiếp đến là nghiên cứu về nhân giống, canh tác, chế biến, hệ thống

học thực vật, đa dạng di truyền, bảo tồn đa dạng nguồn gene… và kết quả là có một số lƣợng lớn các công trình đƣợc công bố trên các tạp chí, sách chuyên khảo và các thông

tin trên các phƣơng tiện đại chúng liên quan đến sâm. Nói cách khác, các loại sâm là

đối tƣợng thực vật có một sự cuốn hút lớn đối với những ngƣời làm công tác nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực trên toàn thế giới. Những công trình nghiên cứu về sâm vẫn đang đƣợc triển khai cho dù những phát hiện đột phá về mặt thành phần loài gần đây không nhiều.

1.2. Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu về phân loại, khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật

1.2.1. Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật

Cơ sở nền tảng của việc phân loại, xây dựng quan hệ phát sinh chủng loại các

taxon và đánh giá đa dạng di truyền ở sinh vật chính là nghiên cứu sự giống hay khác nhau giữa chúng, sự khác nhau đó có thể nhận biết bằng hình thái hay thông qua các

phƣơng pháp sinh học phân tử. Tùy vào các mục đích và hoàn cảnh nghiên cứu cụ thể

mà sự tƣơng đồng hay khác nhau của sinh vật đƣợc xem xét ở những mức độ khác

nhau về số lƣợng cá thể khảo sát, đặc điểm hình thái ghi nhận hay phƣơng pháp làm

nảy sinh DNA fingerprint bao gồm cả các DNA barcode (Duminil và Michele, 2009).

1.2.1.1. Các phƣơng pháp dựa trên đặc điểm hình thái

Các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật đƣợc sử dụng từ rất sớm. Nguyên

tắc cơ bản của phƣơng pháp này là hai đơn vị phân loại (taxon) càng có nhiều đặc điểm

chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa hai taxon càng gần nhau. Bất cứ sự khác nhau

nào giữa hai cá thể đều đƣợc nghiên cứu, nhƣng không phải bất cứ đặc điểm nào cũng có

thể dùng làm đặc điểm phân loại. Những đặc điểm phân loại ổn định, biến đổi chậm,

liên quan đến những cấu trúc ít biến đổi của cơ thể sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng

để phân biệt và xác định các taxon bậc cao, những biến đổi nhanh hoặc liên quan

đến cơ chế cách ly sinh sản đƣợc dùng để xác định các taxon bậc thấp. Các nhà

nghiên cứu thƣờng kết hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá trị tin cậy của kết quả

so sánh (Pellegrino và cộng sự, 2005).

Mặc dù phƣơng pháp sử dụng các chỉ tiêu hình thái có ƣu điểm là tiện lợi,

nhanh chóng, kinh tế, có thể so sánh các đặc điểm giữa các loài hoá thạch với các

loài đang sống để tìm kiếm mối quan hệ họ hàng giữa chúng, nhƣng việc lựa chọn

và cân nhắc giá trị sử dụng của các đặc điểm phân loại là một trong những khâu khó nhất, không chỉ đòi hỏi kiến thức mà còn đòi hỏi kinh nghiệm và sự khéo léo

của các nhà phân loại học. Bên cạnh đó, phƣơng pháp này nhiều khi không chính xác vì có hiện tƣợng đồng quy tính trạng và không phân biệt đƣợc các loài đồng hình (Krishnan và cộng sự, 2011). Mặt khác, bởi hình thái chính là kết quả của biểu hiện gene trong một điều kiện ngoại cảnh nhất định nên việc hoàn toàn dựa vào hình thái đôi khi dẫn đến các kết quả không xác thực, nhất là đối với các taxon thực vật có mức độ thƣờng biến cao. Hơn nữa, các đặc điểm hình thái có nhiều điểm hạn chế nhƣ: các biến đổi hình thái không phát hiện đƣợc ở một số loài; các nghiên cứu sử dụng đặc

điểm hình thái nói chung thƣờng giới hạn trong một hay một vài locus trong toàn bộ

bộ gene; nhiều đặc điểm hình thái chỉ có thể quan sát đƣợc vào cuối chu kỳ sống;

nhiều đặc tính hình thái không riêng biệt mà mang tính liên tục và chồng lấp giữa các sinh vật đƣợc khảo sát gây trở ngại cho việc phân tích chính xác sự đa dạng di truyền

của quần thể (Duminil và Michele, 2009).

1.2.1.2. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử

Chỉ thị (Marker) phân tử đã có những đóng góp lớn vào lĩnh vực nghiên cứu sự đa dạng quần thể thông qua các kỹ thuật làm nảy sinh các DNA fingerprint và phát

hiện những biến động di truyền giữa các cá thể, quần thể và loài. Trƣớc đây, khi sinh

học phân tử và kỹ thuật di truyền chƣa phát triển, thì chỉ thị hình thái thƣờng đƣợc sử

dụng để nghiên cứu sự đa dạng này.

Trong những thập kỷ qua, việc sử dụng các marker phân tử để phản ánh các đa

hình ở mức độ DNA đã đóng vai trò ngày càng quan trọng trong công nghệ sinh học

thực vật và đặc biệt là lĩnh vực nghiên cứu di truyền. Có thể chia marker phân tử thành

hai loại chính: marker sinh hóa và marker phân tử dựa trên cơ sở DNA. Những marker

phân tử dựa trên cơ sở DNA có thể phân biệt thành 2 kiểu, thứ nhất là các marker không dựa trên cơ sở PCR (RFLP) và thứ hai là kiểu marker dựa trên cơ sở PCR

(RAPD, AFLP, SSR, ISSR SNP …).. Việc phát triển các kiểu marker mới và đặc

trƣng ngày càng đóng vai trò quan trọng trong tìm hiểu về biến động bộ gene cũng nhƣ

tính đa dạng di truyền ở các thực vật cùng hay khác loài (Kumar và cộng sự, 2009).

Các kiểu khác nhau của marker phân tử đƣợc sử dụng để đánh giá đa hình DNA

đƣợc phân thành hai loại: marker dựa trên cơ sở lai phân tử và marker dựa trên cơ sở

phản ứng chuỗi polymer hóa (PCR). Những marker phân tử thƣờng đƣợc sử dụng bao

gồm: RFLP, RAPD, AFLP, VNTR, SSR, ISSR, CAPS, SCAR, SNP, Kỹ thuật giải

trình tự DNA (Weising và cộng sự, 2005).

Giới thiệu về kỹ thuật ISSR

ISSR là các đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 100-3000 bp nằm giữa các

microsatellite cận kề và ngƣợc hƣớng nhau. Kỹ thuật này do Zietkiewicz và cộng sự báo cáo năm 1994. Các mồi dựa trên trình tự microsatellte đƣợc sử dụng để khuếch đại các trình tự DNA nằm giữa các SSR. ISSR đƣợc khuếch đại bằng PCR sử dụng trình tự lõi microsatellite với vai trò là các mồi cùng với một số nucleotide chọn lọc với vai trò là các neo giữ vào các vùng không lặp cận kề (16-18bp). Khi sử dụng kỹ thuật ISSR, khoảng 10-60 các đoạn DNA từ nhiều locus đƣợc hình thành đồng thời, tách

nhau ra thông qua điện di trên gel và đƣợc ghi nhận nhƣ là sự hiện diện hay vắng mặt

của các đoạn có kích thƣớc đặc trƣng.

Ƣu điểm chính là không cần có dữ liệu trình tự dùng cho việc xây dựng mồi. Bởi tiến trình phân tích bao gồm việc sử dụng PCR, chỉ một lƣợng ít khuôn mẫu DNA

đƣợc yêu cầu (khoảng 5-50ng cho một phản ứng). Hơn thế, ISSR phân bố ngẫu nhiên

trên toàn bộ bộ gene. Phần lớn ISSR là các marker trội, cho dù thỉnh thoảng chúng thể

hiện tính chất nhƣ marker đồng trội. Nhƣợc điểm: bởi ISSR là kỹ thuật đa locus, các hạn chế của nó có thể là sự di chuyển đồng thời của các đoạn DNA không đồng nhất

có cùng kích thƣớc.

Ứng dụng: do DNA fingerprint đa locus nhận đƣợc, phân tích ISSR có thể đƣợc

ứng dụng để nghiên cứu trong xác định về di truyền, quan hệ bố mẹ, nhân dòng và

nhận dạng dòng, nghiên cứu về hệ thống phân loại học ở mức độ các loài gần nhau.

Thêm vào đó, ISSR đƣợc xem nhƣ hữu dụng trong việc nghiên cứu lập bản đồ gene

(Godwin và cộng sự, 1997), trong nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể (Li và

cộng sự, 2011; Reunova và cộng sự, 2010).

Kỹ thuật giải trình tự DNA (DNA sequencing)

Quá trình xác định thứ tự các base nucleotide dọc theo mạch DNA đƣợc gọi là

việc xác định trình tự (sequencing). Giải trình tự đƣợc ứng dụng rộng rãi trong dự

đoán chức năng gene, nhân dòng phân tử hay các mối liên hệ tiến hoá, đa dạng sinh

học và công nghệ sinh học nói chung. Trong lĩnh vực phân loại dựa trên phân tử,

nghiên cứu phát sinh các taxon… thì chỉ cần phân tích xác định và so sánh trình tự một

vài gene chỉ thị (marker) hoặc DNA barcode giữa các loài cần khảo sát mà không cần

thiết phải xác định trình tự toàn bộ bộ gene.

Phƣơng pháp đang đƣợc sử dụng phổ biến nhất hiện nay trong việc giải trình tự

hiện nay đó là giải trình tự bằng máy tự động. Cơ sở của những phƣơng pháp này vẫn sử dụng các dideoxynucleotide, việc đánh dấu phóng xạ đƣợc thay bằng đánh dấu

huỳnh quang trên các ddNTP, và kết quả đƣợc ghi nhận thông qua một hệ thống máy

tính. Trình tự sau khi đƣợc xác định bằng hệ thống máy tự động chƣa thể sử dụng ngay cho việc phân tích. Việc đọc base tự động do các máy thực hiện (automated base- calling) có một tỷ lệ sai sót nhất định tuỳ theo phƣơng pháp và loại máy sử dụng. Khi một base bị đọc sai có thể dẫn đến nhiều sai lầm nghiêm trọng trong việc phân tích sau này. Do vậy, những biện pháp hiệu chỉnh lại trình tự cần đƣợc chính con ngƣời trực tiếp thực hiện nhằm khắc phục tối đa việc xác định sai trình tự (Schadt và cộng sự,

2010).

1.2.2. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử trong nghiên cứu hệ

thống học và quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật

Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên nền tảng những đặc điểm giống và khác nhau trong phạm vi nhóm sinh vật nào đó, từ đó xây dựng lại các cây quan hệ

phát sinh chủng loại để thể hiện quá trình tiến hóa (Felsenstein, 1985). Trong hệ thống

học kinh điển, cây quan hệ phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng dựa trên các dữ liệu về

hình thái. Từ khi có sự phát triển mạnh mẽ của thông tin di truyền, việc xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu phân tử đã trở thành công việc thực hành

thông dụng và đƣợc biết đến dƣới tên gọi là phân tích quan hệ phát sinh chủng loại sử

dụng dữ liệu phân tử - molecular phylogeny (Lio và Goldman, 1998). Các dữ liệu

đƣợc biểu hiện dƣới dạng trình tự DNA, trình tự protein và các DNA fingerprint.

Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại sử dụng dữ liệu phân tử để xây dựng lại

quá trình tiến hóa bao gồm bốn bƣớc. Khi sử dụng các trình tự DNA làm dữ liệu mang

tính thông tin thì bƣớc đầu tiên là chọn và căn trình tự. Việc này đƣợc tiến hành nhằm

xác định các vị trí tƣơng đồng và thăm dò các sai khác về trình tự DNA. Bƣớc thứ hai

là xây dựng mô hình toán để mô tả lịch sử tiến hóa của các trình tự. Mô hình tính toán cho phép đánh giá khoảng cách di truyền giữa hai trình tự tƣơng đồng. Khoảng cách di

truyền đƣợc đo bằng số lƣợng đƣợc các thay thế tại một vị trí xảy ra trong quá trình

tiến hóa. Các khoảng cách di truyền đƣợc biểu diễn bởi chiều dài nhánh trong cây quan

hệ phát sinh chủng loại. Bƣớc thứ ba là áp dụng một phƣơng pháp phân tích phù hợp

để tìm hình thể của cây và chiều dài các nhánh vốn mô tả mối quan hệ phát sinh chủng

loại. Bƣớc cuối cùng là giải thích, biện luận. Ngày nay, các mô hình toán đƣợc thực

hiện trong rất nhiều các phần mềm máy tính nhƣ MOLPHY (Adachi và Hasegawa,

1995), PHYLIP (Felsenstein, 1995), PASSML (Lio và Goldman, 1998), PAUP*

(Swofford, 2003) and MEGA (Tamura và cộng sự, 2011).

Việc bao gồm thêm một hay một vài taxon ngoài nhóm (outgroup – chuẩn

ngoại) là một tiêu chí quan trọng trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại. Các

taxon ngoài nhóm đƣợc cho là không thuộc cùng nhóm với các taxon đang khảo sát và có thể là bất kỳ taxon nào có quan hệ gần với nhóm taxon đang nghiên cứu nhƣng không là tổ tiên của chúng. Chuẩn ngoại đƣợc dùng với mục đích so sánh trong việc xác định tính khác biệt về đặc điểm và xác định chiều hƣớng thay đổi trong việc thay đổi trang thái đặc điểm (Swofford và cộng sự, 1996).

Bên cạnh đó, việc kiểm tra độ tin cậy của cây quan hệ phát sinh chủng loại

đƣợc suy luận ra là cần thiết. Phƣơng pháp kiểm tra thông dụng nhất là phân tích

bootstrap. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng vào nghiên cứu phân tích phát sinh

(Felsenstein, 1985). Độ tin cậy càng cao khi giá trị bootstrap càng cao.

1.2.2.1. Các phƣơng pháp xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại

Cây quan hệ phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng nhằm mô hình hóa lịch sử tiến

hóa của một nhóm các trình tự hay các sinh vật. Việc tái hiện mối quan hệ phát sinh

chủng loại có thể đƣợc thực hiện bằng các phƣơng pháp dựa trên khoảng cách di

truyền hoặc dựa trên đặc điểm nhƣ trình bày sau đây:

+ Các phƣơng pháp dựa trên khoảng cách

Hai thuật toán thông dụng dựa trên so sánh khoảng cách theo cặp là phƣơng

pháp lập nhóm không có trọng số dùng trung bình số học (UPGMA - Unweighted Pair

Group Method using arithmetic Averages) (Sneath và Sokai, 1973) và Gom cụm lân

cận (Neighbor joining) (Saitou và Nei, 1987). Bƣớc đầu tiên trong các phép phân tích

này là tính toán xây dựng ma trận khoảng cách theo cặp giữa các taxon đƣợc khảo sát

thông qua các đặc điểm khác nhau về trình tự của chúng. Để hiệu chỉnh, thông thƣờng

ngƣời ta sử dụng hiệu chỉnh khoảng cách bằng một mô hình tiến hóa nào đó, chẳng

hạn nhƣ mô hình Jukes-Cantor, mô hình Felsentein, mô hình hai thông số của Kimura, mô hình Tamura, mô hình Tamura và Nei.

+ Các phƣơng pháp dựa trên đặc tính

Trong khi các phƣơng pháp dựa trên khoảng cách đƣa thông tin trình tự thành

một con số đơn (biểu diễn khoảng cách) thì các phƣơng pháp dựa trên đặc tính lại cố

gắng suy luận mối quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên toàn bộ các đặc tính riêng lẽ

nhƣ các nucleotide hay amino acid. Thuộc nhóm phƣơng pháp này là các phƣơng pháp

Giản tiện tối đa (Parsimony) không dựa trên mô hình tiến hóa và hai phƣơng pháp

Maximum likelihood và Bayesian, là những phƣơng pháp suy luận dựa vào xác xuất.

1.2.2.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng các trình tự DNA bảo thủ cao

trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật

Hệ thống hóa là quá trình thăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng của thế giới

sinh vật. Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân loại mang tính thứ tự trƣớc khi phát triển học thuyết tiến hóa. Sự xuất hiện và phát triển của các kỹ thuật phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi polymer hóa – PCR đã hình thành nên một lƣợng lớn các dữ liệu sẵn sàng cho việc giải trình tự DNA và các kỹ thuật làm nảy sinh DNA fingerprint. Tính phổ biến của các dữ liệu phân tử trên Genbank hiện nay đã cho phép mở rộng phân tích ra các taxon khác ngoài các taxon thu đƣợc mẫu.

Nhiều dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt là các trình tự DNA đã đƣợc

ứng dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại và quá trình tiến hóa ở

thực vật. Các thực vật bậc cao mang trong nó ba bộ gene: bộ gene trong nhân, bộ gene ty thể và bộ gene lạp thể. Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở các bộ gene này xảy ra không

đồng đều (Kimura, 1980). Bộ gene ty thể có mức độ thay thế nucleotide thấp nhất, trung bình khoảng (0,2 - 1,1) × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm. Bộ gene lạp thể có mức độ thay thế nhanh hơn chút ít, khoảng (1,1 – 2,9) × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm. Trái lại, bộ gene trong nhân có tỷ lệ thay thế nucleotide nhanh hơn gấp 150 lần so với bộ gene ty thể (đến 31,5 × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm (Gaut,1988). Tỷ lệ thay thế nucleotide ở thực vật khác về căn bản so với sự tiến

hóa nhanh chóng của các phân tử ty thể ở động vật. Trong lịch sử tƣơng đối ngắn của

hệ thống học phân tử, lúc đầu các nhà nghiên cứu tập trung nhiều vào bộ gene lục lạp,

về sau đã chuyển hƣớng sang các trình tự gene trong nhân (Soltis và Soltis, 1998).

+ Bộ gene lục lạp: Bộ gene lục lạp của đa số các thực vật trên cạn thông

thƣờng đƣợc đặc trƣng bởi phân tử dạng vòng. Bộ gene này bé nhất trong số ba bộ

gene, khoảng 135-160kb với hai phân đoạn lặp đảo [inverted repeat (IR) segments] chia phần phân tử còn lại thành một vùng LSC (large single-copy region) và một vùng

SSC (small single-copy region) (Judd và cộng sự, 1999). Thành phần, kích thƣớc, cấu

trúc và trình tự của bộ gene lục lạp đã đƣợc xác định là có mức độ bảo thủ cao trong

các nghiên cứu về tiến hóa. Tính bảo thủ cao này chỉ ra rằng bất kỳ thay đổi nào về cấu

trúc, cách sắp xếp hay thành phần đều liên quan mạnh mẽ đến quan hệ phát sinh chủng

loại. Các phần khác nhau của bộ gene tiến hóa theo các tỷ lệ khác nhau và tƣơng đối

chậm ở mức độ trình tự nucleotide (Downie và Palmer, 1992). Tính bảo thủ cao của

DNA lục lạp thực sự là ƣu thế khi sử dụng nó để xây dựng mối quan hệ phát sinh

chủng loại và quá trình tiến hóa ở các mức độ từ loài đến chi và đến họ thực vật (Soltis

và Soltis, 1998).

Có thể thấy những vùng trình tự ở lục lạp thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên

cứu quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật gồm: gene rbcL, gene atpB (Soltis và Soltis, 1998), 16S rRNA, gene matK (Sharma và cộng sự, 2012) và vùng trình tự không mã hóa thƣờng trnL-F (Muller và cộng sự, 2006).

Gene matK có tên đầy đủ là Maturase K, là gene mã hóa cho protein Maturase vốn đóng vai trò enzyme trong việc loại bỏ các intron trong quá trình chuyển từ tiền RNA thông tin (pre-mRNA) thành RNA trƣởng thành. Gen này nằm trên vùng LSC (large single copy region), có độ dài xấp xỉ 1500bp, đồng phiên mã với gene trnK

(Chieba và cộng sự, 1996). Gene matK gồm 1 đoạn ORF chứa 509 codon nằm trong

intron của gene trnK và dƣờng nhƣ chƣa rõ chức năng. Các nghiên cứu sử dụng trình

tự gene matK để xây dựng cây phát sinh cho thấy gene matK có tính đa dạng hơn những gene khác có trong lục lạp, do đó trở thành gene marker quan trọng để giúp

phân loại thực vật (Sharma và cộng sự, 2012). Bởi gene matK có thể dễ dàng đƣợc

khuếch đại cùng với vùng intron không mang mã ở hai đầu của nó, mở rộng trình tự

lên đến 2400-2700bp nên việc sử dụng vùng này đƣợc ứng dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại giữa các loài và trong một loài (Soltis và cộng sự,

1996). Mặc khác, một phần gene matK cũng thƣờng đƣợc sử dụng để xây dựng quan

hệ phát sinh chủng loại (Zuo và cộng sự, 2011).

+ Các trình tự bảo thủ ở bộ gene trong nhân: Bộ gene trong nhân có kích thƣớc lớn nhất trong số ba bộ gene ở thực vật (1,1 × 106 đến 110 × 106 kbp) và bao gồm rất nhiều gene. Phần lớn các nỗ lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại

bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự DNA ribosome trong nhân. Cấu trúc căn bản

của DNA ribosome là một đơn vị lặp đơn, mỗi đơn vị nhƣ thế có thể lặp lại đến hàng

ngàn lần trong bộ gene. Bộ gene trong nhân chứa một vùng sao mã có cấu trúc bao gồm khoảng trống bên ngoài vùng sao mã (ETS), tiếp theo là gene 18S mã hóa cho

tiểu đơn vị nhỏ và gene 26S mã hóa cho tiểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau bởi một

gene nhỏ hơn là 5,8S. Các khoảng trống trong vùng phiên mã (ITS1 và ITS2) tách rời

những gene vừa đề cập. Chiều dài của ba vùng mang mã là giống nhau ở các thực vật:

gene 18S là khoảng 1800bp, 26S là khoảng 3300bp và gene 5,8S là khoảng 160bp. Họ

gene rRNA chứa các vùng bảo thủ cao nhƣ 18S, 26S có thể sử dụng để suy luận các

quan hệ phát sinh chủng loại ở các mức độ phân loại cao. Các đoạn tiến hóa nhanh nhƣ

các vùng ITS có thể là thích hợp nhất trong so sánh các loài và những chi gần nhau.

Các trình tự 18S rRNA thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi hơn các trình tự 26S. Cho

dù cả hai vùng cùng đƣợc có dải ứng dụng rộng nhƣ nhau. Kích thƣớc trên 3000bp của

26S rRNA đã cản trở việc sử dụng nó, đặc biệt là trong việc giải trình tự toàn bộ gene.

Trái lại, kích thƣớc của 18S rRNA khoảng 1800bp giúp cho nó đƣợc ƣu tiên lựa chọn hơn để khuếch đại bằng PCR và giải trình tự. Thực tế cho thấy cây quan hệ phát sinh chủng loại sử dụng trình tự 18S rRNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh chủng loại sử dụng trình tự rbcL ở nhiều mức độ phân loại thực vật hạt kín (Soltis và Soltis, 1997).

Gene 5,8S rRNA dễ dàng đƣợc khuếch đại và giải trình tự khi sử dụng các mồi định vị trên các gene 18S và 26S rRNA nhƣng ít khi đƣợc sử dụng để suy luận quan hệ

phát sinh chủng loại bởi tính bảo thủ cao và kích thƣớc bé (164-165bp). Tỷ lệ các vị trí

mang thông tin tiềm năng cho phân tích quan hệ phát sinh chủng loại tƣơng đƣơng với

gene 18S rRNA.

Vùng ITS: ITS1 phân cách gene 18S rRNA với gene 5,8S rRNA còn ITS2 phân

cách gene 5,8S rRNA với gene 26S rRNA. Vùng ITS hiện hữu một cách rộng rãi dƣới

700bp ở các thực vật có hoa (Baldwin và cộng sự, 1995). Có rất nhiều mồi tổng thể

đƣợc thiết kế cho việc khuếch đại và giải trình tự vùng ITS đã đƣợc mô tả (Taberlet và cộng sự, 1991). Các trình tự ITS biến động một cách hiệu quả cho phép giải quyết

những câu hỏi về quan hệ phát sinh chủng loại ở những taxon có quan hệ họ hàng gần.

Các trình tự ITS đƣợc sử dụng rất thành công trong việc xây dựng lại lịch sử tiến hóa

(Bellarosa và cộng sự, 2005).

+ Bộ gene ty thể: Các nghiên cứu phân tử về DNA ty thể chính là tâm điểm

chính của nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại ở mức độ phân tử trên động vật. Sự

thay đổi nhanh chóng của cấu trúc, kích thƣớc và hình thể bộ gene ty thể gây ra tình

trạng khó mà phân tích đƣợc bộ gene này ở thực vật. Điều này khiến cho bộ gene ty

thể ở thực vật khác hẳn với bộ gene ty thể ở các sinh vật khác.

Ngoài việc sử dụng các vùng DNA riêng rẽ khác nhau trong các bộ gene ở thực

vật, Soltis và cộng sự (1999) cũng nhƣ Qiu và cộng sự (1999) đã chỉ ra rằng việc phân

tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên việc phối hợp các trình tự có trong các bộ

gene khác nhau là xác thực hơn xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa vào

một gene riêng rẽ bởi gene hay bộ gene trong những trƣờng hợp đặc biệt có thể không

thể hiện đúng quy luật. Việc phối hợp dữ liệu giữa các trình tự rDNA trong nhân và

DNA lạp thể có thể đƣợc thực hiện ở các loài thụ phấn chéo và ở cả con lai khác loài

vì rDNA trong nhân di truyền từ cả bố và mẹ còn DNA lục lạp thì theo dòng mẹ.

1.2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền quần thể

Đa dạng di truyền quan trọng đối với sự sống còn của các loài hoang dại và là

nguồn biến động di truyền của các chủng cây trồng. Sự đa dạng di truyền giúp cho một

loài sinh vật cụ thể có khả năng đáp ứng lại những điều kiện khác nhau của môi trƣờng sống, từ đó có khả năng tồn tại khi có sự biến đổi của môi trƣờng cũng nhƣ có thể mở rộng khu phân bố ra các khu vực (Beardmore, 1983). Đánh giá sự đa dạng di truyền của một quần thể là một trong những việc làm cần thiết để có thể phác thảo ra những chiến lƣợc bảo tồn in situ và ex situ. Các kiến thức về sự đa dạng di truyền quần thể còn giúp các nhà quản lý, hoạch định chiến lƣợc có hƣớng khai thác và bảo vệ nguồn

tài nguyên di truyền một cách phù hợp. Tính đa dạng di truyền cao là điều mong mỏi

của các nhà chọn giống bởi vì đó chính là nguồn nguyên liệu phong phú cho công

công tác lai tạo ra giống mới hay cải tiến đặc tính (Weising và cộng sự, 2005).

Nghiên cứu về di truyền quần thể chính là tìm hiểu, mô tả mức độ đa dạng trong cấu trúc di truyền, các biến động di truyền trong quần thể và giữa các quần thể

với nhau, đánh giá mối quan hệ giữa các cá thể hay nhóm cá thể trong quần thể, giữa

các quần thể trong tổng thể nghiên cứu cũng nhƣ biến động di truyền qua các thế hệ. Cấu trúc di truyền quần thể chịu ảnh hƣởng của các yếu tố: sƣ̣ cho ̣n lo ̣c tƣ̣ nhiên , sƣ̣ trôi da ̣t gene ngẫu nhiên , đô ̣t biến, hê ̣ thống giao phấn không ngẫu nhiên , sƣ̣ di cƣ di truyền (giƣ̃a các quần t hể). Năm yếu tố ảnh hƣở ng lớ n nhất này chính là động lực của tiến hóa (Matthew, 2009).

Công cu ̣ căn bản mang tính tiền đề cho viê ̣c đánh giá các yếu tố ảnh hƣở ng nói

trên là định luật Hardy -Weinberg. Khi sử dụng dữ liệu DNA fingerprint để nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể, các tiêu chí hƣớng đến là:

- Mức độ đa dạng di truyền, đƣợc thể hiện qua các thông số nhƣ:

+ Tỷ lệ band/locus đa hình (PPB): một gene đƣợc xem là đa hình khi bất kỳ tần

số allele nào của nó bé hơn 1. Chỉ tiêu này có đƣợc khi quan sát trực tiếp và thể hiện sự đa dạng di truyền trong quần thể, tỷ lệ này càng cao thì quần thể càng đa dạng.

). Có một vài phép đo mức độ di

+ Mức độ dị hợp - Heterozygosity, He (hay còn gọi là tính đa da ̣ng gene ). Tính dị hợp là mối quan tâm lớn nhất khi đ ánh giá về đa dạng di truyền . Nó thƣờng là thông số đầu tiên hiê ̣n diê ̣n trong mô ̣t tâ ̣p hơ ̣p dƣ̃ liê ̣u cho ta biết về cấu trú c và các biến cố lịch sử của chủng quần . Tính dị hợp cao nghĩa là có nhiều biến động di truyền và ngƣơ ̣c la ̣i . Thông thƣờ ng , mƣ́ c đô ̣ di ̣ hơ ̣p quan sát đƣơ ̣c so sánh vớ i mức dị hợp kỳ vọng theo quy luật cân bằng Hardy-Weinberg. Nếu mƣ́ c đô ̣ di hơ ̣p thấp hơn trông đơ ̣i thì có sự nội phối hay tự thụ , nếu cao hơn thì cho là có hiê ̣u ứng phá vỡ sự cô lập (tƣ́ c có sự hỗn hợp của hai quần thể bị cô lập trƣớc đây hơ ̣p và giá tri ̣ mƣ́ c đô ̣ di ̣ hơ ̣p trong các phép đo này trong dải tƣ̀ 0 đến gần 1 (trong hê ̣ thống vớ i mô ̣t lƣơ ̣ng lớ n các allele cân bằng tần số ). Mức độ dị hợp có thể đƣợc tính trên một locus hay xuyên suốt các locus khảo sát (de Vicente, 2003).

- Sự biệt hóa di truyền giữa các tập hợp con trong tập hợp đƣợc nghiên cứu: có thể ở các mức độ: nhóm cá thể mang đặc tính chung nào đó, tiểu quần thể trong quần thể hay quần thể trong tổng thể nghiên cứu. Sự biệt hóa di truyền có thể đƣợc xem xét ở một locus nào đó hay xuyên suốt các locus để chỉ ra sự biệt hóa về tần số allele ở quy mô tƣơng ứng cũng nhƣ mức độ đóng góp đa dạng di truyền do sự khác nhau của

các tập hợp con vào tập hợp lớn hơn. Mức độ biệt hóa giữa các tập hợp đƣợc hệ thống

hóa nhƣ sau: 0 - 0,05: mức nhỏ; 0,05 - 0,15: mức vừa phải; 0,15 - 0,25: mức lớn; trên

0,25: mức rất lớn. (de Vicente, 2003)

- Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cá thể dựa trên sự xuất hiện hay vắng mặt của band: có nhiều chỉ số khác nhau về cách tính toán phụ thuộc vào quan niệm của

các tác giả để đo mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các cá thể nhƣng các chỉ số đƣợc

sử dụng nhiều là chỉ số Jaccard; chỉ số Dice; chỉ số của Sokal & Michener và chỉ số

Nei &Li (de Vicente, 2003).

- Khoảng cách di truyền giữa các mẫu thƣờng đƣợc tính toán nhƣ phần bổ sung

cho các chỉ số tƣơng đồng đề cập trên (Weising, 2005).

- Khoảng cách di truyền giữa các tập hợp mẫu : Để tính toán khoảng cách này ,

. Có

cần một phép đo đạc vốn ràng buột với khoảng cách tiến hóa chung của các mẫu một số cách thức đo đạc nhƣng công thức tính khoảng cách di truyền của Nei là thƣờng đƣợc sử dụng nhất, bản chất của cách tính này là khoảng cách giữa hai tập hợp

đƣợc suy luận dựa trên độ đồng nhất giữa chúng (Mohammadi và Prasanna, 2003).

- Chỉ số về dòng gene di cƣ hay số lƣợng cá thể di cƣ trung bình: các dữ liệu về

biệt hóa quần thể cho phép đánh giá tỷ lệ di cƣ giữa các quần thể với điều kiện xem nhƣ các quần thể này đặt trong sự cân bằng (ví dụ, không có sự chọn lọc, tỷ lệ đột biến

và thời gian thế hệ là nhƣ nhau). Trong thực tế, các quần thể thƣờng không hội đủ tất

cả các giả thiết nhƣ trên nên giá trị về dòng gene di cƣ đƣợc tính toán gián tiếp, vì thế chỉ mang tính chất đánh giá thô (Weising và cộng sự, 2005).

1.3. Vị trí hệ thống ho ̣c và phân loại chi Panax, họ Araliaceae

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Chi sâm (Panax L.) là một chi có số lƣợng loài rất ít trong số khoảng 70 chi củ a họ Araliaceae trên thế giớ i đƣợc Carl von Linnaeus mô tả năm 1753 với chỉ hai loài là P. quinquefolius L. và P. trifolius L.. Theo Linnaeus điểm khác biệt so với các chi khác trong họ Araliaceae là bầu 2 ô, hoa mẫu 5, xếp van hay xếp lợp. Trong giai đoạn này, khi số lƣợng loài đƣợc phát hiện còn ít, nên tác giả chỉ giới hạn ở các đặc điểm của hoa: hoa vừa xếp lợp vừa xếp van. Đây là đặc điểm chính của chi để phân biệt với các chi khác của họ Araliaceae. Tuy nhiên, với cách sắp xếp này thì đặc điểm của chi Panax bao gồm một số chi khác thuộc họ Araliaceae, đặc biệt là chi Nothopanax (Linnaeus, 1754).

Theo quan điểm trên, De Candolle (1830) đã chuyển một số loài thuộc chi Nothopanax vào chi Panax. Kể từ đây vị trí phân loại và mối quan hệ phát sinh chủng loại của chi Panax không có sự đồng nhất về quan điểm giữa các tác giả khác nhau.

Decaisne và Planchon (1854) cho rằng đặc điểm chính của chi Panax là đài xếp van, nên chuyển 2 loài P. quinquefolius và P. trifolius sang chi Aralia, đồng thời đồng nhất hoá các chi Polyscias Forest, Cheirodendron Nutt, Pseudopanax Koch và Maralia Pet. vào chi Panax. Nhƣ vậy, với cách sắp xếp nhƣ trên, các tác giả đã cho rằng đặc điểm hình thái của chi Panax bên cạnh đài xếp van còn có đặc điểm thân gỗ và thân thảo. Đồng ý với quan điểm trên, các tác giả Bentham và Hooker (1867), Clarke (1879) tiếp tục sát nhập chi Nothopanax vào chi Panax, đồng thời chuyển chi Panax vào tông (tribe) Panaceae. Ở thời điểm này, số lƣợng loài thuộc chi Panax lên đến 25, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi, Newzeland và Australia.

Seemann (1868) xem xét lại vị trí phân loại chi Panax và cho rằng đặc điểm giới hạn hình thái của chi Panax không rõ ràng kể từ khi đƣợc Linnaeus mô tả lần đầu tiên. Theo tác giả, đặc điểm chính để phân biệt chi Panax so với các chi khác trong họ Aralaiaceae là đài 5, xếp lợp, bầu 2 ô. Với đặc điểm này thì 2 loài P. quinquefolius và P. trifolius thuộc về chi Panax và có mối quan hệ gần với chi Aralia. Đối chiếu với đặc điểm của các chi khác thuộc họ Araliaceae, tác giả ghi nhận có một đặc điểm đặc biệt dẫn ra sự khác biệt giữa chi Panax so với chi khác là thân dạng củ. Qua đó, tác giả chuyển các loài có thân dạng củ trƣớc đây ở các chi khác vào chi Panax, đồng thời chuyển một số loài không có thân dạng củ ra khỏi chi Panax. Nhƣ vậy, chi Panax có 3 đặc điểm quan trọng làm cơ sở để phân biệt với các chi khác trong họ Araliaceae là: thân dạng củ, đài 5, xếp lợp, bầu 2 ô. Với quan điểm trên, tác giả đã chuyển 61 loài ra khỏi chi Panax, và chi này chỉ còn lại các loài: P. trifolium L., P. quinquefolius L., P. ginseng Mey., P. pseudoginseng Wall., P. japonicus Mey. và P. bipinnatifidus Seem.. Với loài P. fructicosus có đặc điểm là đài xếp van, Seemann xếp vào chi Nothopanax và đồng thời lấy loài này là type danh pháp cho chi Nothopanax. Có lẽ đây là quan điểm đƣợc nhiều nhà nghiên cứu về chi Panax cho là phù hợp hơn cả.

Một lần nữa để khẳng định lại quan điểm của Seeman (1868), Harm (1897) đã nghiên cứu tất cả các đặc điểm của các loài sâm phân bố trên thế giới nhƣ: cơ quan sinh sản, cơ quan sinh dƣỡng và cho rằng chi Panax có nguồn gốc từ chi Aralia, điểm khác biệt ở đây là thân dạng củ. Britton và Brown (1913) tiếp tục xem xét vị trí phân loại chi Panax và đồng tình với quan điểm của Seeman (1868) và Harm (1897), chỉ ra loài P. quinquefolius có đặc điểm đại diện cho chi: thân dạng củ, hoa mẫu 5 xếp lợp, bầu 2 ô, và loài đƣợc mô tả lần đầu tiên, nên lấy loài này làm type danh pháp cho chi.

Hoo (1961) khi nghiên cứu về hệ thống, mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân bố của taxon trong họ Araliaceae, và cho rằng Panax có nguồn gốc phát sinh từ Acanthopanax. Vì Acanthopanax có đặc điểm hoa mẫu 5, lá có lông cứng mọc trên gân lá, thân thảo hay thân dạng cây bụi nhỏ. Tác giả cho rằng điểm thân thảo là đặc điểm tƣơng đồng quan trọng nhất, Aralia hầu nhƣ không có đặc điểm này. Quan điểm này của Hoo hầu nhƣ không nhận đƣợc sự đồng tình của các nhà nghiên cứu về sâm.

Năm 1970, Hara một lần nữa xem xét đặc điểm của chi Panax dựa trên mẫu vật của các loài thuộc chi Panax ở châu Á thu đƣợc ngoài tự nhiên cũng nhƣ dựa trên mẫu lƣu giữ ở các Bảo tàng thực vật. Qua đó, tác giả thống nhất với các quan điểm nghiên cứu trƣớc đó về đặc điểm của chi Panax: thân dạng củ, hoa mẫu 5 xếp van hay xếp lợp, bầu 2 ô và có mối quan hệ gần với chi Aralia. Tuy nhiên, theo tác giả các loài trong chi Panax có đặc điểm hình thái biến đổi rất lớn so với các bậc phân loại khác trong họ Araliaceae. Do đó, việc định loại các loài trong chi Panax là việc rất khó khăn nếu chỉ dựa vào một đặc điểm hình thái nào đó. Theo tác giả để phân biệt các loài thuộc chi Panax, trƣớc tiên xếp loài vào 1 trong 3 chuẩn hình thái của thân rễ (Rhizome type): thân rễ có dạng thân củ (carot type); thân rễ có đốt kéo dài; và thân rễ có đốt ngắn nhƣ đốt trúc. Tiếp theo đó là các đặc điểm hình thái lá, đài, tràng, số lƣợng chỉ nhụy, quả... Cách phân loại dựa vào hình thái thân rễ trƣớc rồi mới đến các đặc điểm cơ quan sinh dƣỡng và sinh dƣỡng đƣợc các nhà khoa học Trung Quốc áp dụng trong khóa phân loại chi Panax ở Trung Quốc (Xiang và Lowry, 2007).

Wen (1993), Wen và Zimmer (1996), Plunkett và cộng sự (1996) dựa vào đặc điểm hình thái, hình thái giải phẫu, hạt phấn và sinh học phân tử cho rằng chi Panax có mối quan hệ gần gũi với chi Aralia.

Đặc điểm

Khác

Giống

Cấu trúc của lá

Noãn

Cách sắp

Nội nhũ

Hạt phấn

(leaf architecture)

(carpel)

xếp hoa

(endosperm)

(pollen)

Kép 2 hay 3, dạng (Bi-, chim lông

5-8

Aralia

Các khoảng

tripinnately)

Xếp lợp

Đồng nhất

trống phức tạp, thể

2-3

Panax

ống ngắn

Hình vịt chân (palmately compound)

Bảng 1.1. Đặc điểm hình thái tƣơng đồng và khác biệt giữa chi Aralia và chi Panax

Có lẽ cho đến thời điểm hiện nay, các hệ thống quan điểm dựa vào hình thái giải phẫu và sinh học phân tử đều thống nhất và cho rằng chi Panax có mối quan hệ gần với chi Aralia, điểm khác khác biệt chủ yếu dễ dàng nhận thấy so với chi Aralia là thân dạng củ, lá kép hình chân vịt, noãn 2-3.

Sau năm 1970, vị trị phân loại và hệ thống phát sinh của chi Panax hầu nhƣ

không thay đổi. Tuy nhiên do đặc điểm hình thái có biến đổi rất lớn, ngay trong một

loài ở các vùng phân bố khác nhau thì có đặc điểm hình thái cũng khác nhau (Hara, 1970), đồng thời ngày càng có nhiều phát hiện mới. Do vậy, từ đó đến nay, việc ghi

nhận số lƣợng taxon trong chi Panax có sự thay đổi theo thời gian và tùy vào quan

điểm của các nhà nghiên cứu.

Ở nửa đầu của thập niên 1970, quan niệm về thành phần loài sâm châu Á của

các nhà nghiên cứu cũng rất khác nhau và có sự bổ sung nhanh chóng những taxon

mới, thể hiện qua bảng 1.2.

Bảng 1.2. Phân loại các taxon Panax ở châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên

cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1970-1975

Hara (1970)

Hoo và Tseng (1973)

Hoo và Tseng (1975)

Zhou và cộng sự (1975)

Panax ginseng

P. pseudoginseng

var. pseudoginseng

var. pseudoginseng P. japonicus

subsp. pseudoginseng

subsp. himalaicus

var. elegantior

var. japonicus

var. angustifolius

var. bipinnatifidus

subsp. japonicus

var. japonicus

var. major

var. angustatus

var. wangianus

var. notoginseng

P. notoginseng

P. zingiberensis

P. stipuleanatus

Gần đây, quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon thuộc chi Panax đã đƣợc bổ sung các dữ liệu dựa trên việc so sánh trình tự các DNA bảo thủ, tuy vậy vẫn chƣa có sự thống nhất giữa các nhóm tác giả (bảng 1.3).

Bảng 1.3. Phân loại các taxon Panax ở châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1996-2014

Wen, 1996

Shu, Komatsu, 2003

Panax ginseng P. japonicus P. bipinnatifidus (Sichuan, China)

Panax ginseng P. japonicus (Japan) P. japonicus (China) P. japonicus var. bipinnatifidus

i ạ o l

n â h p

Zuo, Wen, 2011&2014 Panax ginseng P. japonicus P. bipinnatifidus P. elegantior P. assamicus P. shangianus P. variabilis P. omeiensis

ề v

õ r

P. major

m à l c ợ ƣ đ

P. wangianus

P. japonicus var. major P. pseudoginseng subsp. himalaicus P. japonicus var. angustifolius

n ầ c i à o l

m ó h N

P. omeiensis P. bipinnatifidus (Hubei, China) P. major (Syn.: P. japonicus var. major; P. pseudoginseng subsp. himalaicus) P. wangianus (Syn.: P. japonicus var. angustifolius) P. sinensis P. zingiberensis P. pseudoginseng P. notoginseng P. stipuleanatus

P. sinensis P. zingiberensis P. vietnamensis P. pseudoginseng P. notoginseng P. stipuleanatus

P. zingiberensis P. vietnamensis P. vietnamensis var. fuscidiscus P. pseudoginseng P. notoginseng P. stipuleanatus

Từ thành phần taxon của chi Panax qua các thời kỳ có thể nhận thấy việc ghi

nhận các taxon của các tác giả khác nhau do các nguyên nhân: tính đa dạng về hình

thái trong chi Panax; quan điểm về hệ thống phát sinh dựa vào đặc điểm hình thái rất đa dạng; việc sử dụng các trình tự DNA bảo thủ khác nhau để hỗ trợ cho nghiên cứu phân loại; các phát hiện mới về taxon.

Bên cạnh cách phân loại dựa trên các hình thái thông thƣờng còn có một số phƣơng thức phân loại khác dựa trên thành phần hoạt chất và số lƣợng nhiễm sắc thể, điển hình là các nghiên cứu:

Tsai và Feng (1975) khảo sát thành phần hoạt chất trong các loài Sâm ở Trung

Quốc. Thông qua đó, các tác giả đã chỉ ra có 2 nhóm triterpenoid saponin chính tồn tại trong các loài Sâm khác nhau: Triterpenoid dammarane gồm có các loài: P. ginseng,

P. notogingseng và Triterpenoid oleanane gồm các loài: P. pseudoginseng, P.

zingiberensis, P. japonicus, P. japonicus var. angustifolius, P. japonicus var. major, P.

japonicus var. bipinatifidus, P. stipuleanatus. Ngoài ra, kết hợp với các đặc điểm hình thái của thân rễ, các tác giả chia các loài Sâm ở Trung Quốc thành 2 nhóm chính:

Nhóm 1 gồm các loài có thân rễ ngắn, giống thân củ cà rốt, hạt lớn, đồng thời hoạt

chất chính là tetracyclic triterpenoid có trong thân rễ; Nhóm 2 gồm các loài có thân rễ

dài hay dạng đốt trúc, hạt nhỏ, đồng thời có hoạt chất pentacyclic triterpenoid.

Trong Từ điển Bách khoa dƣợc học (Nguyễn Duy Cƣơng và Nguyễn Hữu Quỳnh, 1999) có ghi nhận rằng theo tác giả Tanaka thì chi Panax có đến 8 loài và 11 taxon dƣới loài đƣợc phân thành 3 nhóm dựa vào thành phần hoạt chất.

Yang (1981) sử dụng số lƣợng nhiễm nhiễm sắc thể xây dựng mối quan hệ phát

sinh chủng loại các loài Panax., tác giả đã chỉ ra số lƣợng nhiễm sắc thể của 7 loài

Sâm (Bảng 2.4). Hai loài P. gingseng và P. quinquefolius không là tổ tiên của chi

Panax vì 2n = 48 (44), mà tổ tiên của chi Panax phải là P. japonicus với bộ nhiễm sắc

thể 2n = 24).

Bảng 1.4. Số lƣợng nhiễm sắc thể theo Yang (1981)

Nguồn

Loài Panax ginseng P. japonicus P. notoginseng P. pseudoginseng P. quinquefolius P. sinensis P. wangianus Số lƣợng nhiễm sắc thể 2n = 44 2n = 44 2n = 44 2n = 48 n = 24 2n = 48 2n = 24 2n = 24 n = 12 2n = 48 2n = 24 2n = 48 Sugiura (1936) Graham (1966) Yang (1981) Harn and Whang (1963) Matsuura and Suto (1935) Kurosawa in Hara (1966) Yang (1981) Kurosawa in Hara (1970) Guha (1970) Yang (1981) Yang (1981) Kurosawa in Hara (1970)

Các loài thuộc chi Panax có phân bố ở Bắc bán cầu , tƣ̀ trung tâm Hymalaya , qua Trung Quốc , vùng Viễn Đông nƣớc Nga , khu vƣ̣c Triều Tiên - Nhâ ̣t Bản, đến Bắc Mỹ, mô ̣t nhánh khác là tƣ̀ Hymalaya đi về phía Đông Nam đến Viê ̣t Nam . Các khu vƣ̣c phân bố nhìn chung có điều kiện khí hâ ̣u ôn đớ i và Á nhiê ̣t đớ i . Trƣớ c khi đối tƣơ ̣ng nghiên cứu củ a luâ ̣n án này đƣợc công bố thì Sâm Viê ̣t Nam P. vietnamensis đƣơ ̣c xem là loài sâm có phân bố về phía Nam nhất của thế giớ i. Trong chi Panax có 2 loài phân bố ở Đông Bắc Mỹ: Panax quinquefolius L. and P. trifolius L. (Seemann, 1868; Proctor và Bailey, 2011); các loài còn lại phân bố Đông Trung Á (Hara 1970; Wen và 21

Zimmer, 1996). Trung tâm đa dạng nhất của chi Panax tập trung ở Đông, Nam, Trung

Trung Quốc và một phần Đông Nam Châu Á (Hara 1970; Wen và Zimmer, 1996; Zuo

và cộng sự, 2014).

1.3.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam

Ở Việt Nam , không nhiều tác giả nghiên cứu phân loại chi Panax, các công

trình nghiên cứu chủ yếu là ghi nhận có phân bố ở Việt Nam và mô tả loài mới cho

khoa học (Phạm Hoàng Hộ, 1970 & 2000; Ha & Grushvitzky, 1985; Nguyễn Tập, 2005; Nguyễn Thị Phƣơng Trang và cộng sự, 2011; Phan Kế Long và cộng sự, 2013).

Loài đầu tiên đƣợc ghi nhận ở miền Nam Việt Nam là Panax schingseng Nees

var. japonicum Mak. do Phạm Hoàng Hộ ghi nhận năm 1970. Theo tác giả , loài này

mọc dƣới tán rừng rậm lá rộng, ẩm ở vùng núi Lang Bian, tỉnh Lâm Đồng.

Năm 1985, hai tác giả Hà Thị Dụng và Grushvitzky đã cô ng bố một loài mới cho khoa học là P. vietnamensis Ha et Grushv. dƣ̣a trên mẫu vâ ̣t thu thâ ̣p tƣ̀ vù ng nú i Ngọc Linh, tỉnh Kon Tum . Theo các tác giả, loài này khác so với P. japonicus (Nees)

Meyer ở đặc điểm đầu lá dài, mép lá có răng cƣa đều, chỉ nhụy 1, ít khi 2, quả dẹp.

Vào năm 1991, Phạm Hoàng Hộ đã xuất bản bộ sách “Cây cỏ Viê ̣t Nam” lần

đầu tiên ở Việt Nam (Phạm Hoàng Hộ, 1991). Trong đó đã ghi nhận có 3 loài sâm

phân bố ở Việt Nam , P. , đó là P. bipinnatifidus Seem ở Hoàng Liên Sơn

pseudogingseng Wall. ở Sa Pa và loài P. schingseng Nees var. japonicum Mak. (vốn đƣơ ̣c ghi nhâ ̣n trong “Cây cỏ miền Nam Viê ̣t Nam” xuất bản năm 1970 của cùng tác giả) đƣơ ̣c thay thế bằng P. japonica (Nees) Mayer với phân bố là khu vực núi Lang Bian và Kom Tum. Tuy nhiên không đề câ ̣p đến P. vietnamensis đã đƣợc 2 tác giả Hà Thị Dụng và Grushvitzky công bố vào năm 1985. Đến năm 1999, Phạm Hoàng Hộ đã mở rô ̣ng việc ghi nhận về chi Panax ở Việt Nam , theo đó P. vietnamensis phân bố ở Gia Lai và Kon Tum đƣợc bổ sung vào phiên bản này , nâng số lƣơ ̣ng loài thuô ̣c chi Panax ghi nhâ ̣n ta ̣i Viê ̣t Nam lên 4 loài (Phạm Hoàng Hộ, 1999, 2000).

Theo điều tra nghiên cứu củ a Viê ̣n Dƣơ ̣c liê ̣u , Trung tâm Sâm và dƣơ ̣c liê ̣u thành

phố Hồ Chí Mi nh và Viê ̣n Sinh thái tài nguyên thƣ̣c vâ ̣t cho thấy ở Viê ̣t Nam có phân bố tƣ̣ nhiên củ a các loài P. vietnamensis Ha et Grushv., P. pseudoginseng Wall và P . bipinnatifidus Seem. Điều này đƣợc thể hiện rõ hơn trong công bố của tác giả Nguyễn Tập (2005) thì ở Việt Nam có 5 loài thuộc chi Panax, 3 loài sâm mọc tự nhiên là P. vietnamensis Ha et Grushv. ở vùng núi Ngọc Linh và hai loài P. stipuleanatus H. T.

Tsai et K.M. Feng và P. bipinnatifidus Seem. ở sƣờn Đông Bắc dãy núi Hoàng Liên

Sơn và vài nhánh phụ kề của nó thuộc 6 xã của Huyện Bát Xát và Sapa của tỉnh Lào

Cai. Thông tin về các loài Panax mọc tự nhiên tại vùng núi phía Bắc Việt Nam nói

trên đƣợc chính tác giả Nguyễn Tập và cộng sự khẳng định một lần nữa vào năm 2006 (Nguyễn Tập, 2006).

Kết quả nghiên cứu về thành phần loài tự nhiên của tác giả Nguyễn Tâ ̣p nêu trên tƣơng đồng với ghi nhận trong hai phiên bản Sách đỏ Viê ̣t Nam năm 1996 và 2007: ở Viê ̣t Nam có ba loài Panax phân bố tƣ̣ nhiên là P. bipinnatifidus, P. stipuleanatus và P. vietnamensis. Trong phiên bản xuất bản năm 2007, các tác giả ghi nhận loài P.

vietnamensis có phân bố trong nƣớc ở Quảng Nam, Kon Tum, Gia Lai và Lâm Đồng

và trên thế giới có ở Trung Quốc.

Nguyễn Thị Phƣơng Trang và cộng sự (2011) khi nghiên cứu ở vùng Phong

Thổ, Lai Châu nhận thấy ở đây có phân bố một taxon thuộc chi Panax, rất gần với sâm

Việt Nam dựa trên hình thái cũng nhƣ so sánh trình tự ITS-rNDA và có thể là loài mới.

Tuy vậy, nghiên cứu tiếp theo nhóm tác giả Phan Kế Long và cộng sự (2013) đã chỉ ra

rằng taxon phân bố tại Lai Châu, giáp ranh với tỉnh Vân Nam của Trung quốc chính là

một thứ của loài Panax vietnamensis đã đƣợc công bố từ năm 2003 là P. vietnamensis var. fuscidiscus Komatsu, Shu & Cai.

Nhƣ vậy theo các tài liệu gần đây thì cho đến hiện nay, ở Việt Nam có 3 loài và

1 thứ có phân bố ở Việt Nam: P. vietnamensis, P. bipinnatifidus, P. stipuleanatus, P.

vietnamensis var. fuscidiscus đƣợc ghi nhận chính thức. Loài P. bipinnatifidus đƣợc

Viện Dƣợc liệu ghi nhận và nhà thực vật học ngƣời Trung Quốc là Ngô Chỉnh Dật xác

định tên khoa học vào năm 1964 (Nguyễn Văn Tập, 2007), tuy nhiên so với mẫu

chuẩn (type species), đặc biệt là hình thái thân rễ và rễ củ thì cần phải xem xét lại việc

định danh cho taxon này thông qua hình thái và sinh học phân tử.

1.4. Quan hê ̣ phá t sinh chi Panax L. dƣ̣a trên hê ̣ thố ng ho ̣c mƣ́ c đô ̣

phân tƣ̉

Một cách tự nhiên , phần lớ n các nhà thƣ̣c vâ ̣t khi khảo sát thực địa hay làm việc

với các tiêu bản thực vật đều dựa vào các đặc điểm hình thái giải phẫu của thân, rễ, lá, hoa… để phân loại, định danh cho các loài thực vật . Tuy nhiên, viê ̣c xác đi ̣nh loài dƣ̣a trên đặc điểm hình thái thƣờng phải là nhƣng chuyên gia về phân loại , và hơn thế nữa, các đặc điểm hình thái luôn biến đổi theo các giai đoa ̣n si nh trƣở ng khác nhau củ a sinh vâ ̣t, điều này dẫn đến việc phân loại trở nên khó khăn và phức tạp (Steele và Pires,

2011). Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc phân lập các vùng gene

bảo thủ cao phục vụ cho việc phân loại và nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng

loại giữa các taxon đã trở nên dễ dàng hơn rất nhiều trong những thập kỷ gần đây . Dựa vào các dƣ̃ liê ̣u phân tƣ̉ có thể cung cấp thêm các bằng chƣ́ ng cho viê ̣c đƣa ra các quyết đi ̣nh mang tính hê ̣ thống , mà hầu nhƣ không p hụ thuộc vào hình dạng hay tình trạng sinh lý của cây đƣợc lấy mẫu phân tích (Steele và Pires, 2011).

Việc sử dụng cơ sở dữ liệu phân tử trong nghiên cứu phân loại và hệ thống học, quan hệ tiến hóa của sinh giới nói chung, thực vật nói riêng đã trở nên rất phổ biến và

hình thành nên một chuyên ngành mới đƣợc gọi là phylogenetics, đƣợc định nghĩa là

khoa học về hệ thống học thực vật sử dụng công cụ di truyền phân tử.

Bản chất của việ c sử dụng các công cu ̣ phân tử trong phân loại là các bâ ̣c phâ n : tƣơng tác loại (taxon) khác nhau sẽ có bộ gene khác nhau dẫn đến sự khác nhau về bằng enzyme cắt ma ̣ch , sản phẩm khuếch đại bằng PCR hay sản phẩm trao đổi chất và cao nhất là trình tƣ̣ nucleotide củ a DNA . Nhìn chung, có nhiều kỹ thuật sinh học phân tƣ̉ tƣ̀ đơn giản đến phƣ́ c ta ̣p đã đƣợc ƣ́ ng du ̣ng để phân biê ̣t các taxon thƣ̣c vâ ̣t và có rất nhiều nhƣ̃ng công trình đƣợc công bố trong lĩnh vƣ̣c này.

Ở sinh vật tiền nhân, ranh giới của các chi đƣợc đề xuất là khi tỷ lệ % các protein

bảo tồn [percentage of conserved proteins (POCP)] thấp hơn 50% (Qin và cộng sự,

2014). Cũng ở sinh vật tiền nhân nhƣng dựa trên trình tự 16S rRNA, Kim và cộng sự

(2014) đã xác định mức khác biệt trung bình giữa các loài là 0,0145, trùng với các đề

xuất của các tác giả trƣớc đó là trong khoảng 0,01-0,018. Ở các sinh khuẩn nhƣ

Streptomices albovinaceus, S. globisporus và S. griseinus, khoảng cách di truyền giữa

các loài dựa trên vùng 16S rRNA là bằng không và dựa trên gene gyrB là từ 0,0016

đến 0,0032 (Kim và cộng sự, 2012).

Ở nấm, để giải quyết các vấn đề chƣa rõ về hệ thống học, Jeewon và Hyde (2016) đề xuất rằng sử dụng cả các đặc điểm hình thái và phân tử để định loại, các

vùng DNA bảo thủ đƣợc đề xuất là ITS và tối thiểu một vùng gene mã hóa cho

protein. Để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên phân tử đối với một taxon mới cần phải so sánh với 4-5 taxon có sẵn. Để chỉ ra loài mới thì loài đó cần có khác biệt trên 1,5% các nucleotide thuộc vùng ITS với giá trị bootstrap tối thiểu là 60%.

Ở thực vật bậc cao, Hala và Ashraf (2016) đã chỉ ra khoảng cách di truyền giữa các chủng nông nghiệp của loài Cải dầu dựa trên vùng ITS dao động từ 0,002 đến

0,106. Kim và cộng sự (2016) nhận thấy ơ các loài thuộc chi Mẫu đơn Paeonia,

khoảng cách di truyền giữa các loài trong khoảng 0,0235 – 0,0273 dựa trên trình tự

ITS, 0,0049 – 0,0122 dựa trên trình tự matK và 0,003 – 0,004 dựa trên trìn h tự rbcL.

Ở mức độ giữa các mẫu thuộc cùng loài, khoảng cách di truyền trong khoảng 0,0018 – 0,0095 dựa trên trình tự ITS, 0 – 0,0005 dựa trên trình tự matK và 0– 0,0007 dựa trên

trìn h tự rbcL. Ở chi Dendrobium thuộc họ Lan (Orchidaceae), khoảng cách di truyền

giữa các section từ 0,013 đến 0,112 dựa trên tổ hợp gene matK và vùng ITS. Khoảng

cách giữa các loài dựa trên gene matK là 0,003-0,023 và vùng ITS là 0,014-0,187 (Kornsorn và cộng sự, 2015).

Có thể nhận thấy có hai khuynh hƣớng nghiên cứu chính và một khuynh hƣớng

trung gian về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong chi Panax dựa

trên dữ liệu phân tử:

1.4.1. Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các

taxon trong chi Panax không dựa vào giải trình tự DNA

Trƣớc khi việc xác định trình tự trở nên phổ biến, việc nghiên cứu về phân loại

và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon không định hƣớng vào vùng mang tính bảo

thủ mà dựa vào các kỹ thuật hình thành DNA fingerprint là rất phổ biến ở nhiều taxon động, thực vật, trong đó có các taxon thuộc chi Panax. Hiện nay, cách làm này vẫn

đƣợc duy trì và phát triển để tiến hành xác định các loại dƣợc liệu từ chi Panax.

1.4.1.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Tại nhiều nƣớc trên thế giới, đặc biệt là Hàn Quốc, việc sử dụng các chỉ thị phân

tử không phải trình tự DNA trong phân loại chi Panax đã đƣợc triển khai nhiều và đạt

đƣợc nhiều kết quả mang tính ứng dụng cao.

Shim và cộng sự

(P. t. Nhƣ̃ng kết quả này cho phép phân biê ̣t Nhân sâm Hàn quốc

(2003) tiến hành phân biê ̣t P.ginseng (Hàn Quốc ) vớ i các taxon Panax khác gồm Nhân sâm SheoAn (Trung Quốc ), P. notoginseng (Trung Quốc), P. japonicus (Nhâ ̣t Bản) và hai loại sâm thu ộc loài P. quinquefolius tƣ̀ Mỹ và Canada đƣơ ̣c thu thâ ̣p tƣ̀ 6 vùng khác nhau. Công viê ̣c phân biê ̣t bao gồm cả viê ̣c thăm dò các hoạt chất bằng kỹ thuật sắc ký bản mỏng và sử dụng kỹ thuật RAPD với các mồi 80 mồi ngẫu nhiên 10-mer. Kết quả cho thấy khó phân biê ̣t đƣợc P. ginseng với các taxon khác trong chi Panax. Các mồi OP-5A cho mô ̣t band đă ̣c trƣng cho tất cả các mẫu; Mồi OP-13B có thể xem là marker RAPD duy nhất để phân biê ̣t các taxon sâm đƣơ ̣c khảo sá ginseng) với các taxon khác ở mức độ phân tử.

Năm 2007, Kim và cộng sự đã phát triển các chỉ thị Microsatellite mới để nhận

dạng P. ginseng. Nhóm nghiên cứu đã xây dựng mô ̣t thƣ viê ̣n đƣợc làm giàu

(46,6%), tiếp đó là các t

microsatellite củ a P. ginseng và 251 trình tự microsatellite mới đƣợc xác định . Các rình tự lặp 2 trình tự lặp 3 đƣợc xác định là nhiều nhất nucleotide (23,1%). Kiểu lă ̣p (AG)n là phổ biến nhất (23,1%), tiếp theo là (AAC)n (22,3%). Thông qua viê ̣c xác đi ̣nh kiểu gene củ a 91 microsatellite bằng cách sƣ̉ du ̣ng tâ ̣p hơ ̣p các mồi đă ̣c hiê ̣u cho chỉ thi ̣, nhóm tác giả đã xác định 11 chỉ thị đa hình trong loài cũng nhƣ 14 chỉ thị đa hình phân biệt P. ginseng và P. quinquefolius. Cấu trú c allele chính xác củ a các marker đa hình đƣợc xác đi ̣nh và các allele cũng đƣợc đă ̣t tên. Dan và cộng sự (2010) dựa vào có 2.492 trình tự đầu cuối nhiễm sắc thể nhân tạo

(BAC end sequence) từ 2.167 dòng BAC trong một thƣ viện chứa 106.368 BAC đại

diên cho DNA bộ gene của P. ginseng để chọn lọc 35 microsatellite có kiểu đơn vị lặp

từ 11 đến 30 nucleotide. Thử nghiệm 35 cặp mồi đƣợc thiết kế cho 35 microsatellite

đã chọn ở các chủng P. ginseng cho thấy 12 trong số chúng là đa hình, 19 là đơn hình

và 3 không có sản phẩm khuếch đại. Chỉ số dị hợp trông đợi trong khoảng 0,7500 đến

0,9678 và chỉ số dị hợp quan sát trong khoảng 0,5645 đến 0,7109. Thử nghiệm thêm

các chủng thuộc P. quinquefolius từ Mỹ và Canada cho thấy các mồi có khả năng

khuếch đại ở P. ginseng cũng thể hiện kết quả ở P. quinquefolius. Từ đó, nhóm tác giả đề xuất và có thể sử dụng các chỉ thị ISSR có đƣợc trong việc phân biệt các chủng P.

ginseng và P. quinquefolius, cũng nhƣ trong việc lập bản đồ gene.

Lee và cộng sự (2011) đã phát triển mô ̣t chỉ thi ̣ SCAR dẫn xuất tƣ̀ ISSR để nhâ ̣n dạng các chủng giống sâm P. ginseng để xác định sự phân biệt các chủng nông nghiệp có đặc tính tốt p hục vụ cho chọn giống . Các tác giả đã khảo sát 80 mồi ISSR trên 6 chủng thuộc P. ginseng và 2 chủng sâm nƣớ c ngoài thuô ̣c hai loài P. quinquefolius và P. notoginseng. 34 trong số 85 mồi ISSR hình thành các lo cus đa hình vớ i tần suất trung bình 6,9 locus/mồi. Các mẫu kiểm tra đƣợc nhận thấy có khác biệt rõ ràng bằng cách sử dụng các mồi này . Các mồi UBC -821, UBC-868 và UBC -878 làm nảy sinh

các band đa hình giữa các chủng P. ginseng và cho phép phân biệt c húng với các mẫu P. quinquefolius và P. notoginseng. Hê ̣ chỉ thi ̣ SCAR đƣợc đƣa vào để làm tăng khả năng tái lă ̣p củ a các đa hình , mô ̣t chỉ thi ̣ SCAR là PgI 821C650 đƣợc chuyển đổi thành công tƣ̀ đa hình khuếch đa ̣i ngẫu nhiên sử dụng mồi UBC-821. Kết quả đã thể hiê ̣n đa hình giữa các mẫu sâm . Thêm vào đó , đa hình đă ̣c hiê ̣u cho chủ ng Nhân sâm Sunwon đƣợc hình thành bằng cách xƣ̉ lý sản phẩm PCR bằng mồi PgI 821C650 vớ i enzyme giớ i ha ̣n Taq I. Kết quả này là công cu ̣ chỉ thi ̣ DNA hƣ̃u ích để xác đi ̣nh Nhân sâm Hàn Quốc, đă ̣c biê ̣t là chủ ng Sunwon , quản lý hạt giống và các chƣơng trình chọn giống đƣợc hỗ trơ ̣ bằng chỉ thi ̣ phân tƣ̉ .

1.4.1.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam

Việc sử dụng các chỉ thị phân tử nhƣ RADP, SSR, ISSR trong phân loại và

phân tích quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon thực vật ở Việt Nam đã đƣợc triển khai khá nhiều, tuy nhiên trên đối tƣợng các taxon Panax thì chỉ ghi nhận đƣợc

nghiên cứu “Sử dụng chỉ thị phân tử DNA kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong

nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam” do Viện Dƣợc liệu chủ trì và tiến

sĩ Nguyễn Văn Tập làm chủ nhiệm. Trong công trình này, với quan điểm có ba loài sâm mọc tự nhiên tại Việt Nam là P. vietnamensis, P. bipinnatifidus và P.

stipuleanatus, Nguyễn Văn Tập và cộng sự (2007) cho rằng có ba dạng hình thái lá ở

hai taxon đƣợc cho là hai loài là lá chét xẻ thùy, lá chét xẻ thùy sâu và lá chét xẻ thủy

nông. Kết quả phân tích dữ liệu có đƣợc từ việc sử dụng 13 mồi RAPD trên 5 mẫu lá

chét xẻ thùy sâu, 4 mẫu lá chét xẻ thùy nông và 8 mẫu lá chét nguyên cùng với 14 mẫu

từ loài P. vietnamensis cho thấy chúng lập thành ba nhóm: nhóm thứ nhất gồm các

mẫu P. vietnamensis, nhóm thứ hai gồm các mẫu có lá chét xẻ thùy thuộc loài P.

bipinnatifidus và nhóm thứ ba gồm các mẫu có lá chét nguyên thuộc loài P.

stipuleanatus trong cây quan hệ phát sinh chủng loại. Dựa trên hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu và sự lập nhóm của chúng, các mẫu lá xẻ trung gian là thuộc loài

P. bipinnatifidus. Khoảng cách di truyền giữa P. vietnamensis và hai loài P.

bipinnatifidus và P. stipuleanatus lần lƣợt là từ 0,75 đến 0,81 và từ 0,71 đến 0,78, giữa

P. bipinnatifidus và P. stipuleanatus là 0,51 đến 0,61.

Qua các công trình nghiên cứu vừa trình bày trên, có thể nhận thấy nhiều chỉ thị

phân tử khác nhau đã và vẫn đang đƣợc sử dụng trong nghiên cứu phân loại và phân

tích quan hệ phát sinh chủng loại ở các taxon thuộc chi Panax. Tuy nhiên mục tiêu chủ

yếu ở đa số các nghiên cứu là góp phần làm nhanh chóng và thuận tiện hóa việc xác

thực mẫu, phân biệt các taxon hơn là phân tích quan hệ phát sinh chủng loại.

1.4.2. Các nghiên cứu dựa trên giải trình tự các vùng DNA bảo thủ

Viê ̣c nghiên cứu phân loại cũng nhƣ mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài thuộc chi Panax có thể đƣợc tiến hành dựa trên các dữ liệu phân tử và biện luận thông qua các đặc điểm hình thái . Việc sƣ̉ du ̣ng các chỉ thị phân tử khác nhau để nhâ ̣n dạng taxon cũng nhƣ làm rõ mối quan hệ giữa các taxon khác nhau trong chi Panax đã đƣợc áp dụng vào các hoạt động thực tiễn nhƣ chọn giống, xác định nguồn gốc dƣợc liệu, đăng ký, công bố taxon mới và nghiên cứu về tiến hóa của chi này.

1.4.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Tổng hợp các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon

thuộc chi Panax dựa vào các trình tự DNA bảo thủ có thể nhận thấy có một số nhóm nghiên cứu chính trong việc chọn lọc các vùng bảo thủ cao để phân tích, đánh giá.

Ở nhóm nghiên cứu thứ nhất, các nhà nghiên cứu sử dụng các trình tự vùng gene

bảo thủ đơn lẻ để phân tích.

Fushimi và cô ̣ng sƣ̣ (1996) sử dụng trình tƣ̣ gene 18S rRNA để phân biê ̣t 3 loài Panax là P. ginseng, P. japonicus and P. quinquefolius, cho thấy chúng khác nhau ở

các vị trí 497, 499, 501 và 712 trên vùng trình tự 18S rRNA cùng có chiều dài 1809bp.

Wen và Zimmer (1996) khi nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại và địa

thực vật chi Panax đã khảo sát 12 loài Panax với 6 chuẩn ngoại thuộc chi Aralia, kết

quả chỉ ra rằng tổng chiều dài các vùng ITS1, 5,8S rRNA và ITS2 biến động từ 606

đến 608bp trong đó ITS1 là 220–221 bp, 5,8S là 163bp và ITS2 là 222–224 bp. Từ đó

các tác giả chỉ ra chi Panax có quan hệ gần với chi Aralia.

Hình 1.1. Cây quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon Panax theo Wen và cộng sự (1996)

Kết quả về quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2

theo cả hai phƣơng pháp Neighbor joining và Maximum likelihood cho thấy: P. trifolius tách biệt khỏi nhóm các taxon Panax còn lại thành nhánh riêng tƣơng tự nhƣ

chuẩn ngoại Aralia racemosa; P. stipuleanatus và P. pseudoginseng lập nhóm với nhau tạo nhánh lớn riêng tách khỏi nhánh các taxon còn lại gồm 2 nhánh: nhánh thứ nhất chỉ có P. notoginseng và nhánh thứ hai gồm 3 phân nhánh: (1) là nhóm gồm P. sinensis, P. major và P. bipinnatifidus 2; (2) là nhóm gồm P. omeiensis, P.

zingiberensis, P. bipinnatiﬁdus 1 và P. wangianus; (3) là nhóm gồm: P. ginseng, P.

quinquefolius và P. japonicus.

Điều đáng lƣu ý trong cây quan hệ phát sinh chủng loại trên là hai taxon P. bipinnatifidus 1 và P. bipinnatifidus 2 dù mang cùng tên nhƣng lại lập nhóm với các

taxon rất khác nhau và theo tác giả là lập nhóm với taxon có cùng khu phân bố (P.

bipinnatifidus 1 với P. omeiensis ở Sichuan và P. bipinnatifidus 2 với P. major ở

Hubei, Trung Quốc vốn cách nhau khoảng 1000km). Kết quả này đã từng làm các tác giả phải suy xét đến sự tạp nhiễm chéo DNA trong phòng thí nghiệm và phải giải trình

tự lại để tái khẳng định. Sau khi nghiên cứu thêm về hình thái, các tác giả nhận thấy có

ít nhất ba loài P. major, P. omeiensis và P. stipuleanatus có dạng lá chét xẻ thùy vốn là

đặc điềm mà Seemann đã mô tả cho loài P. stipuleanatus vào năm 1868.

Ngan và cộng sự (1999) đã khuếch đa ̣i và xác đi ̣nh trình tƣ̣ trong vù ng ribosome ITS1-5,8S-ITS2 của 6 loài Panax gồm Panax: P. ginseng Mey., P. quinquefolius L.,

P. notoginseng (Burkill) Chen, P. japonicus Mey., P. trifolius L. and P.major Ting.

Kết quả giải trình tự cho thấy 6 taxon nghiên cứu có sự sai khác nhau về trình tự vùng

ITS1-5,8S rRNA -ITS2. Các tác giả cũng sử dụng kỹ thuật RFLP để phân cắt trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA -ITS2 nhằm xây dựng phƣơng pháp nhận dạng các taxon khảo

sát cùng với hai loài thƣờng dùng làm giả là Mirabilis jalapa L. and Phytolacca

acinosa Roxb.. Kết quả là phƣơng pháp này thực sự hữu dụng trong phân biệt hai loài

P. ginseng và P. quinquefolius với nhau và với các nguyên liệu giả.

Yang và cộng sự (2001) đã so sánh trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA -ITS2 ở 3 thứ

thuộc loài P. ginseng là thứ Jakyung gồm 2 chủng nông nghiệp Yunpoong và

Chunpoong; thứ Chunggyung và thứ Hwangsook. Kết quả cho thấy thứ Hwangsook

đặc trƣng bởi quả màu vàng khác biệt các chủng còn lại ở vị trí nucleotide 14 (G thay

vì A). Trong nghiên cứu này, tác giả cũng sử dụng dữ liệu Genbank kết hợp với các trình tự tự nghiên cứu để phân tích quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon.

Kim và cộng sự (2007) đã so sánh trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA -ITS2 ở 09

chủng nông nghiệp P. ginseng khác nhau cùng với hai loài P. japonicus và P. quinquefolius. Kết quả so sánh này cho phép phân biệt ba loài khảo sát bởi 3 vị trí đa hình nucleotide đơn đồng thời cho phép phân biệt hai chủng Nhân sâm chính của Hàn Quốc là Gopoong và Kumpoong khỏi các chủng khác bởi một vị trí đa hình đơn trên các vùng trình tự ITS1-5,8S rRNA -ITS2 đều dài 619 nucleotide ở tất cả các mẫu. Từ kết quả này cũng cho thấy vùng ITS1-5,8S rRNA -ITS2 không chỉ thích hợp trong

phân biệt các loài mà còn có thể phân biệt các chủng nông nghiệp ở chi Panax.

Wang và cộng sự (2010) dựa trên một đa hình nucleotide đơn ở trình tự tiểu đơn

vị cytochrome oxidase trên bộ gene ty thể để phân biệt chủng “Chunpoong” thuộc loài

Panax ginseng với các chủng khác.

Nhƣ vậy, việc sử dụng các trình tự DNA bảo thủ đơn trong phân loại, xác định

taxon và phân tích quan hệ phát sinh chủng loại chủ yếu dựa trên vùng gene ITS1-5,8S

rRNA-ITS2 và với trình tự này, có thể phân biệt đƣợc các taxon trong chi Panax với

nhau.

Ở nhóm nghiên cứu thứ hai, các nhà nghiên cứu sử dụng các trình tự vùng gene

lạp thể phối hợp với vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 để phân tích. Điển hình cho việc sử

dụng ITS1-5,8S-ITS2 đơn lẻ trong nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại chi Panax

là hai nhà nghiên cứu Wen và Zimmer (1996) đã mở rộng nghiên cứu bằng việc phối

hợp nhiều trình tự DNA bảo thủ để nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại chi Panax. Cũng theo phƣơng thức này, Zuo và cộng sự (2011) đã khảo sát 11 locus DNA barcode, kết quả đã hình thành nên mô ̣t hê ̣ thống xác đi ̣nh các loài sâm chính xác và hiê ̣u quả cho cả hai mu ̣c đích thƣơng ma ̣i và bảo tồn . Các tác giả sử dụng 95 mẫu sâm đa ̣i diê ̣n cho tất cả các taxon thuộc chi Panax đƣợc ghi nhâ ̣n. Viê ̣c giải trình tƣ̣ barcode atpF-atpH không thành công do cấu trú c poly -N. Tuy nhiên các vù ng rbcL, rpoB, và rpoC1 đƣơ ̣c nhâ ̣n thấy là ít biến đô ̣ng nhất, chỉ có từ 1 đến 8 vị trí biến động . Các tác giả sử dụng matK, psbK-I, psbM-trnD, rps16 và nad1 để phân biê ̣t đƣơ ̣c tƣ̀ 4 đến 6 1 đến 5 trong số 19 tập hợp trong trong số 8 loài riêng biệt nhƣng chỉ phân biệt từ

nhóm thuộc loài P.bipinnatifidus. Các chỉ thị phân tử psbA-trnH và ITS là những vùng biến đô ̣ng nhất và có khả năng ƣ́ ng du ̣ng tốt trong xác đi ̣nh ở cả mƣ́ c đô ̣ loài và nhóm loài. Ngoài ra, các tác giả cũng đã chƣ́ ng minh viê ̣c kết hơ ̣p psbA-trnH và ITS là hiệu quả cho viê ̣c xác đi ̣nh tất cả các loài và các tập hợp loài trong chi Panax. Trong nghiên cứu này, tác giả chỉ ra rằng với phƣơng pháp khuếch đại của mình, 100% các mẫu có

thể đƣợc khuếch đại và giải trình tự thành công.

Ở nhóm nghiên cứu thứ ba, các nhà nghiên cứu sử dụng các trình tự vùng gene

lạp thể phối hợp với vùng gene 18S ribosome RNA để phân tích. Có thể nhận thấy nhóm nghiên cứu gồm các tác giả Nhật Bản nhƣ Fushimi, Komatsu và Shu (1996) cũng đã có sự chuyển hƣớng từ sử dụng các trình tự DNA bảo thủ đơn (18S rRNA) sang việc phối hợp thêm các trình tự DNA bảo thủ khác để nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại chi Panax.

Komatsu và cộng sự (2001) sử du ̣ng trình tƣ̣ các gene 18S rRNA trong nhân và gene lu ̣c la ̣p matk để khảo s át quan hệ giữa P. vietnamensis với 5 taxon khác gồm P.

6 taxon. Trình tự này của P.

ginseng, P. japonicus, P. pseudoginseng subsp. himalicus, P. japonicus var. major và P. quinquiefolius với chuẩn ngoại là loài Hedera hexix. Kết quả cho thấy trình tƣ̣ gene 18S rRNA củ a P.vietnamensis là 1809 bp giống hê ̣t vớ i P. quinquefolius, và biểu hiện có sƣ̣ thay thế base so vớ i cả P. japonicus var. major và P. pseudoginseng subsp. himalaicus. Gene matk có chiều dài bằng nhau ở cả vienamensis khác biệt so với P. japonicus var. major, P. pseudoginseng subsp. himalaicus, P. ginseng, P. japonicus và P. quinquefolius lần lƣơ ̣t ở 4, 5, 9, 9 và 10 vị trí nucleotide. Thông qua phƣơng pháp Maximum parsimony , cây phát sinh đƣợc xây dƣ̣ng la ̣i dƣ̣a trên phân tích tổ hơ ̣p cả hai gene 18S rRNA – matK, kết quả cho thấy P. P. vietnamensis thuô ̣c cù ng nhóm vớ i các loài Panax khác và có quan hệ gần với japonicus var. major và P. pseudoginseng subsp. himalaicus.

P. vienamensis là P. Shu và cộng sự (2003a) đã mô tả mô ̣t thƣ́ mớ i củ a

vienamensis var. fuscidiscus dựa trên trình tƣ̣ nucleotide củ a các gene 18s rRNA và matK. Các trình tự này đƣơ ̣c xem xét để phân biê ̣t P. vietnamensis var. fuscidiscus với sáu loài khác thuộc chi sâm. Quan hê ̣ phát sinh giƣ̃a P. vietnamensis var. fuscidiscus và các loài khác đã đƣợc làm rõ và P. vietnamensis var. fuscidiscus có mối quan hê ̣ gần nhất vớ i P. vietnamensis.

Shu và cộng sự (2003b) khảo sát quan hệ phát sinh của 13 loài thuộc chi Panax dƣ̣a trên trình tƣ̣ gene lu ̣c la ̣p trnK và gene trong nhân 18S rRNA. Chiều dài củ a gene trnK biến đô ̣ng tƣ̀ 2537 đến 2573 bp tù y vào từng loài , trong khi trình tƣ̣ gene matK là cố đi ̣nh ở 1512 bp ở tất cả các loài . Trình tƣ̣ gene 18S rRNA có chiều dài 1808 – 1809 bp, chỉ có 9 kiểu trình tự gene 18S rRNA quan sát đƣơ ̣c ở 13 loài khác nhau. Phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại, các tập hợp dữ liệu về các gene trnK and matK đã đƣa ra đƣơ ̣c mối quan hê ̣ phát sinh loài trong chi Panax vớ i ba nhánh lớn đƣơ ̣c chỉ ra tƣơng ứng với 3 nhóm lớn các taxon. Trong cây quan hệ phát sinh chủng loại giữa các

taxon so sánh, điểm cần lƣu ý là hai taxon có cùng tên P. japonicus nhƣng có nguồn

gốc khác nhau (từ Nhật Bản và từ Trung Quốc) lại thuộc hai nhánh lớn khác nhau.

Taxon dƣới loài P. pseudoginseng subsp. himalaicus thu thập từ các vùng khác nhau lại thuộc cùng nhánh lớn với với P. japonicus có nguồn gốc từ Trung Quốc, trong khi chính loài P. pseudoginseng lại cùng với loài P. stipuleanatus lập thành một nhánh. Các tác giả lý giải rằng taxon P. pseudoginseng subsp. himalaicus đƣợc Hara (1970) xem là dƣới loài của loài P. pseudoginseng còn tác giả Wu và cộng sự xếp thành một thứ của P. japonicus là chƣa rõ về mặt danh pháp, cần giải quyết vấn đề này cùng với việc đặt lại tên cho P. japonicus có nguồn gốc từ Trung Quốc.

Hình 1.2. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên phối hợp trình tự gene trnK và gene 18S rRNA theo Komatsu và cộng sự (2003)

Quan và cộng sự (2003) đã dƣ̣a trên cơ sở trình tƣ̣ các gene matK gene và 18S rRNA kết hợp vớ i thành phần hóa ho ̣c để chƣ́ ng minh mô ̣t cách rõ ràng loài Sâ m mo ̣c dại ở Myama chính là P. zingiberensis.

1.4.2.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam

Ở Việt Nam có rất ít các nghiên cứu về phân loại hay quan hệ phát sinh chủng

loại các taxon thuộc chi Panax L.. Những nghiên cứu ghi nhận đƣợc gồm:

Năm 2011, các tác giả Nguyễn Thị Phƣơng Trang, Lê Thanh Sơn, Nguyễn Giang

Sơn và Phan Kế Long dựa trên trình tự ITS-rRNA (ITS1-5,8S và một phần ITS2) để

phân tích so sánh các mẫu thuộc taxon thu tại Lai Châu (gọi là Sâm Lai Châu) và tại Quảng Nam (đƣợc xác định là P. vietnamensis) với nhiều trình tự tƣơng ứng của các

taxon cùng chi khác nhƣ P. sinensis, P. japonicus var. bipinntifidus, P. pseudogingseng var. bipinntifidus… từ Genbank., các tác giả đi đến kết luận là taxon thu tại Lai Châu có quan hệ rất gần gũi với P. vietnamensis.

Vũ Huyền Trang và cộng sự (2013) đã tiến hành nhận dạng loài Panax vietnamensis thông qua đặc điểm trình tự một số DNA barcode, từ đó chỉ ra một công cụ hữu ích trong việc xác định loại dƣợc liệu này.

Thực hiện đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phân loại, phân bố và thành phần hóa

học của cây Sâm mọc tự nhiên ở Lai Châu” vào năm 2012 – 2013, nhóm nghiên cứu

của Phan Kế Long và cộng sự đã tiến hành thu thập mẫu, giải trình tự P. vietnamenesis tại Kon Tum và một taxon thuộc chi Panax tại Lai châu, và công bố trình tự vùng gen

matK và ITS-rRNA của taxon này lên Genbank và xác định đây là taxon P.

vietnamensis var. fuscidiscus Komatsu, Zhu & Cai (http://www.vast.ac.vn) (Phan Kế

Long và cộng sự, 2014). BLAST các trình tự từ mẫu thu tại Lai Châu trên website của NCBI (Genbank) cho thấy chúng có mức tƣơng đồng 100% so với trình tự do Shu và

công sự (2003a) công bố cho thứ P. vietnamensis var. fuscidiscus.

Cấu trúc hệ gene ở thực vật nói chung, đặc biệt là các loài thuộc chi Panax nói

riêng cũng đã đƣợc các nhà khoa học trong nƣớc thuộc Viện Nghiên cứu hệ gene –

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam quan tâm nghiên cứu. Từ những

nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các loài thuộc chi Panax ở Việt Nam cho dù là những

loại cây thuốc rất quan trọng nhƣng những hiểu biết về đặc điểm di truyền vẫn còn hạn

chế, chủ yếu xoay quanh các chỉ thị phân tử sử dụng trong việc nghiên cứu về phân

loại và quan hệ phát sinh chủng loại. Theo đó cần phải giải mã cả bộ gene các loài này để hiểu biết thêm về đặc điểm di truyền, lịch sử tiến hóa và vai trò của các gene trong

các con đƣờng trao đổi chất vốn tạo nên giá trị dƣợc dụng của chúng. Việc giải trình tự

bộ gene và transcriptome ở thực vật nói chung và các loài thuộc chi Panax nói riêng

bằng các kỹ thuật tiên tiến trong thập kỷ vừa qua đã đƣợc tổng hợp lại trong nghiên

cứu của Lê Thị Thu Hiền và cộng sự (2016).

1.4.3. Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các

taxon trong chi Panax sử dụng DNA fingerprint từ các vùng DNA bảo thủ

Bên cạnh hai khuynh hƣớng nghiên cứu chính về phân loại và quan hệ phát sinh

chủng loại các taxon trong chi Panax nói trên thì còn có một khuynh hƣớng trung gian: sử dụng DNA fingerprint đƣợc nhận ra thông qua các phƣơng pháp không giải trình tự

vốn nảy sinh từ việc phân cắt, PCR các vùng DNA bảo thủ cao.

Fushimi và cô ̣ng sƣ̣ (1997) đã khảo sát trình tƣ̣ gene 18S rRNA của ba loài sâm P. ginseng, P. japonicus và P. quinquefolius bằng hai kỹ thuật PCR -RFLP và Khuếch đa ̣i đă ̣c hiê ̣u allele đô ̣t biến (MASA). Sản phẩm PCR củ a mỗi loài đƣợc cắt giớ i ha ̣n bằng BanII và DdeI, dƣ̃ liê ̣u hình thành band sau điê ̣n di ở mỗi loài là khác nhau , kết quả này đƣợc sử dụng để xây dựng quy trình phân biệt dƣợc liệu từ ba loài Panax trên.

Shu và cộng sự (2004) xây dựng hệ thống mồi đặc hiệu phân biệt các loài Panax

nhằm nhận dạng dƣợc liệu thông qua phản ứng PCR đa thành phần và nhận biết thông

qua kích thƣớc band đặc hiệu khuếch đại đƣợc từ vùng gene 18S rRNA và gene trnK.

Wang và cộng sự (2010) sau khi biệt chủng “Chunpoong” thuộc loài P. ginseng

với các chủng khác dựa trên đa hình nucleotide đơn ở trình tự tiểu đơn vị cytochrome

oxidase trên bộ gene ty thể đã phát triển phƣơng pháp xác thực nhanh các chủng này

dựa trên phƣơng pháp ARMS-PCR để thăm dò đột biến đơn nói trên.

Thuan và cộng sự (2010) đã sử dụng kỹ thuật PCR -Restriction Fragment Length Polymorphic (PCR-RFLP) vớ i các mồi khuếch đa ̣i các vù ng rDNA 18S và ITS cũng nhƣ kỹ thuật Random Amplified Microsatellite (RAMS) để xác định 4 loài P. ginseng, P. quinquefolius, P. notoginseng và P. vietnamensis. Kết quả cho thấy , tất cả các mẫu đƣợc xác đi ̣nh là thuô ̣c chi Panax nhƣng không thể sử dụng để phân biê ̣t các loài dƣ̣a trên trình tƣ̣ gene 18S rRNA. Phân tích RFLP trên vù ng ITS cho thấy hai mẫu thuô ̣c P. notoginseng không giống nhau do khác nhau về nguồn gốc, điều kiện trồng; các tác giả cho rằng 2 loài P. ginseng và P. quinquefolius có quan hệ phát sinh gần . Phân tích RFLP vù ng 18S rRNA cũng cho thấy các mẫu th uô ̣c P. ginseng mua ở Hàn Quốc là giố ng nhau hơn nhƣ̃ng mẫu cù ng loài này mua ở Viê ̣t Nam . Kết quả phân tích RFLP dƣ̣a trên vù ng 18S rRNA có mƣ́ c đô ̣ tƣơng đồng cao hơn dƣ̣a trên vù ng ITS.

1.5. Các nghiên cứu đánh giá đa da ̣ng di truyền quần thể ở chi Panax

Biến dị di truyền đƣợc xem là động lực cho sự tồn tại lâu dài của quần thể hay loài (Anatonovis, 1984). Viê ̣c hiểu biết tính đa da ̣ng và biến dị di truyền trong và giƣ̃a các quần thể của các loài quý hiếm và có nguy cơ b ị đe dọa là vấn đề cần thiết , đây là cơ sở để định hƣớng chiến lƣợc cho các hoa ̣t đô ̣ng bảo tồn theo cả hai hƣớ ng ta ̣i chỗ và ngoại vi (Hogbin và Peakall, 1999). Ngoài ra các dƣ̃ liê ̣u di truyền cũng hỗ trơ ̣ cho viê ̣c thu thâ ̣p mẫu phục vụ c ho việc bảo tồn ngoa ̣i vi , cụ thể là các bộ sƣu tập lõi của nguồn tài nguyên di truyền thƣ̣c vâ ̣t (Woff và Sinclair, 1997).

Có một số công trình nghiên cứu trên phổ rộng các đối tƣợng thực vật thƣờng đƣợc sử dụng làm cơ sở để so sánh, nhận xét khi đánh giá về đa dạng di truyền quần thể. Điển hình trong số đó là nghiên cứu về ảnh hƣởng của các đặc điểm sống mang tính tích lũy qua các thế hệ lên đa dạng di truyền của các loài thực vật dựa trên dữ liệu allozyme của Hamrick và Godt (1996). Các tác giả Nybom và Bartish (2000) cũng tiến hành một nghiên cứu tƣơng tự nhƣng dựa trên marker RAPD. Kết quả từ các nghiên cứu này chủ yếu là các thông số về đa dạng di truyền gồm chỉ số đa dạng gene hay

mức độ dị hợp tự (He), tỷ lệ band đa hình (PPB) ở mức độ loài và mức độ biệt hóa gene giữa các quần thể (GST) ở các loài thực vật khác nhau về tích hợp các cặp trong số đặc điểm: hình thức sinh sản (vô tính, hữu tính hay cả hai); cơ chế phát tán (nhờ gió, qua đƣờng tiêu hóa, rơi tự do hay dính vào các sinh vật); dạng sống (hàng năm,

lƣu niên ngắn hay lâu năm); dải phân bố địa lý (đặc hữu, hẹp, vùng hay rộng khắp) và

vị trí hệ thống học (hạt trần, một hay hai lá mầm) đƣợc thống kê lại. Dải biến động của

các thông số trên đƣợc chỉ ra là khá lớn khi so sánh. Theo đó, với các đặc điểm ghi nhận ở đối tƣợng nghiên cứu và các taxon cùng chi thì các thông số đa dạng và biến động di truyền ƣớc tính trong các khoảng sau: PPB từ 42 đến 46%, He từ 0,10 đến 0,14, GST từ 0,14 đến 0,24 nếu dựa trên dữ liệu allozyme và He từ 0,19 đến 0,24, GST từ 0,17 đến 0,23 nếu dựa trên dữ liệu RAPD.

Gần đây, nhiều nghiên cứu đã sử dụng chỉ thi ̣ phân tƣ̉ để đánh giá về đi ̣a thƣ̣c

, thậm chí là giữa các taxon khác nhau

vâ ̣t, chỉ ra đƣợc tầm quan trọng của ngoại cảnh ảnh hƣởng đến bảo tồn sinh ho ̣c , đồng thời cũng chỉ ra đƣợc giới hạn phân bố của đa da ̣ng di truyền , đa dạng và biến động di truyền trong và giƣ̃a các quần thể cùng loài thuô ̣c chi Panax đã nghiên cứu.

Bai và cộng sự (1997) sử dụng chỉ thi ̣ RAPD để phân tích đa da ̣ng di truyền loài P. quinquefolius ở Ontario (Canada) và chỉ ra rằng hệ số tƣơng đồng giữa DNA từ các cá thể sâm đƣợc phân tích là thấp, trong dải tƣ̀ 0,149 đến 0,605 với giá trị trung bình là 0,412, cho thấy mƣ́ c đô ̣ đa da ̣ng di truy ền cao tồn tại trong các quần thể sâm . Mức tƣơng đồng trung bình ở các cá thể 1 tuổi là 0,397; ở các cá thể 2 tuổi là 0,411 và ở các

cá thể 3 tuổi là 0,526.

Schluter và Zamir (2002) sử dụng 15 mồi RAPD để nghiên cứu đa dạng di

truyền 3 quần thể sâm P. quinquefolius tự nhiên ở vùng Quebec, kết quả cho thấy

khoảng cách di truyền trung bình giữa các mẫu trong mỗi quần thể lần lƣợt là 0,21; 0,29; 0,33 và trong tổng thể 58 cá thể khảo sát là 0,27. Sự biệt hóa di truyền giữa các quần thể là GST = 0,280.

Artyukova và cộng sự (2004) sử dụng chỉ thị RAPD và Allozyme để kiểm tra

tính đa dạng di truyền hai loài P. ginseng và P. quinquefolius, kết quả chỉ ra rằng khi P. ginseng trồng là PPB = sử dụng kỹ thuật RAPD thì mƣ́ c đô ̣ đa da ̣ng di truyền ở 21,14%; He = 0,0783; ở quần thể P. ginseng tự nhiên là PPB = 14,52%; He = 0,0600 và ở các cây P. quiquefolius trồng từ hạt là PPB = 41,28%; He = 0.1637, chỉ số biệt hóa di truyền giữa quần thể cây trồng và quần thể tự nhiên là GST = 0,4321. Sử dụng allozyme thì mức độ đa dạng di truyền ở P. ginseng trồng là He = 0,0200; ở quần thể

P. ginseng tự nhiên là He = 0,0250 và ở các cây P. quiquefolius trồng từ hạt là He = 0,06655. Điều đó thể hiện rằng tính đa dạng di truyền dựa trên dữ liệu khảo sát các

locus ngẫu nhiên (RAPD) trên toàn bộ gene cao hơn tính đa dạng di truyền tính toán bằng dữ liệu dựa trên các locus chức năng (allozyme).

(GST = 0,491) so vớ i các quần thể đƣợc bảo vê ̣

Jennifer và Hamrick (2004) khảo sát đa dạng di truyền của 21 quần thể hoang dại thuộc hai nhóm: bị thu hái và đƣợc bảo vê ̣ thuộc loài P. quinquefolius L. trong khu vực từ Georgia đến Tây Virginia, Mỹ bằng chỉ thị allozyme , kết quả đã chỉ ra rằng tính dị hợp trông đợi hay chỉ số đa dạng gene ở 8 quần thể đƣợc bảo vê ̣ là cao hơn đáng kể (He = 0,076) so vớ i 13 quần thể đƣơ ̣c cho phép thu hái (He = 0,070), mức độ đa dạng của tổng thể nghiên cứu đạt HeT = 0,159. Chỉ số biệt hóa di truyền là cao hơn ở các quần thể không đƣợc bảo vê ̣ (GST = 0,167), và đạt GST = 0,493 ở mức tổng thể loài, mức độ di cƣ đƣợc tính theo phƣơng pháp Wright là Nm = 0,26. Các cây chƣa trƣởng thành có tính đa dạng di truyền thấp hơn (He = 0,067) so vớ i các cá thể đã có khả năng sinh sản (He = 0,076). Các tác giả đề xuất rằng viê ̣c bảo tồn mô ̣t tỷ lê ̣ các cây già trong mỗi quần thể là quan tro ̣ng để bảo vê ̣ tính vừa đủ về sinh sản cũng nhƣ tiềm năng tiến hóa của loài..

Deborah và cộng sự (2005) đã nghiên cứu đa da ̣ng di truyền ở P. notoginseng bằng kỹ thuật AFLP và giải trình tƣ̣ vù ng trống bên trong khu vƣ̣c phiên mã 2 (ITS2). Kết quả phân tích AFLP đƣợc nhâ ̣n thấy là đa hình hơn so vớ i trình tƣ̣ ITS 2. Mức độ tƣơng đồng giữa các mẫu cây 5 tuổi là 0,75-0,92; giữa các mẫu cây 2 tuổi là 0,78-0,96

và giữa các mẫu cây 1 tuổi là 0,75-0,91. Các tác giả cũng khảo sát thành phần saponin

và cho rằng tính đa dạng di truyền có ảnh hƣởng đến hàm lƣợng 6 loại saponin.

Zhou và cộng sự (2005) sử dụng chỉ thị AFLP để khảo sát đa dạng di truyền 24

mẫu P. notoginseng từ hai khu vực trồng và 51 mẫu từ 8 quần thể P. stipuleanatus, kết

quả cho thấy với P. notoginseng tỷ lệ band đa hình ở hai vùng trồng là 41,0% và 66,9%, tổng thể khảo sát là 76,9%, còn ở P. stipuleanatus tỷ lệ band đa hình ở các

quần thể nằm trong dải 50,2% đến 84,9%, tổng thể khảo sát là 96,5%.

Wang và cộng sự (2008) sử dụng chỉ thị AFLP để nghiên cứu đa dạng sinh học 92 mẫu 3 tuổi lấy ngẫu nhiên từ 4 quần thể Panax notoginseng đƣợc trồng Zhulijie, Shangliuhe, Bazai và Jinbuhuan thuộc Vân Nam, Trung Quốc, kết quả cho thấy tỷ lệ band đa hình lần lƣợt cho từng quần thể là 74,05%; 45,36%; 38,83%; 51,89% và mức độ dị hợp tƣơng ứng là 0,166; 0,093; 0,094 và 0,125. Xét ở tổng thể nghiên cứu, mức độ dị hợp trông đợi đạt 0,155 và tỷ lệ band đa hình đạt 87,5%. Khoảng cách di truyền

giữa các quần thể dao động từ 0,007 đến 0,021.

Zhuravlev và cộng sự (2008) sƣ̉ du ̣ng các chỉ thi ̣ AFLP và SSR để khảo sát đa dạng di truyền các cá thể thuộc 3 quần thể P. ginseng tự nhiên ở vù ng Primorye thuô ̣c Nga là Khasan, Núi xanh và Sikhotealin. Kết quả cho thấy, tính đa dạng di truyền tổng thể ở mƣ́ c đô ̣ loài là thấp (He= 0,1601; 0,2371; 0,2483 khi sử dụng marker AFLP và He= 0,1546, 0,2787; 0,1386 khi sử dụng chỉ thi ̣ SSR lần lƣợt với ba quần thể ) so với ở mức độ tổng thể loài (HeT = 0,255 khi sử dụng chỉ thi ̣ AFLP và HeT = 0,259 khi sử dụng SSR). Sự biệt hóa di truyền giữa các quần thể GST = 0,1484 (AFLP) và GST = 0,2608 (SSR). Ở ba quần thể, các cá thể thuộc các thế hệ chƣa trƣởng th ành và cây con

chiếm ƣu thế , đồng nghĩa cới các quần thể đƣợc nghiên cứu có thể tồn tại đƣợc một cách tự nhiên và việc phát triển các quần thể Nhân sâm tƣ̣ nhiên là hoàn toàn có thể .

Cũng chính tác giả Zhuravlev và cộng sự (2010) sử dụng chỉ thị AFLP để đánh

giá đa dạng di truyền 10 quần thể P. ginseng tự nhiên vùng Primorsky Krai rộng khoảng 175.000 km2 và các quần thể cách nhau tối thiểu 60-70km. Kết quả cho thấy tỷ lệ band đa hình PPB biến động từ 38,65% đến 69,17%, trung bình đạt 55,68% ở các

quần thể, và đạt đến 99,65% ở tổng thể nghiên cứu, số lƣợng cá thể di cƣ trung bình

đạt Nm = 0,45 với tổng số cá thể khảo sát là 167. Khoảng cách di truyền giữa các quần thể dao động từ 0,09 đến 0,24 ở các quần thể gần nhau và ở hai quần thể xa nhau

khoảng cách di truyền là 0,3.

Emily và James (2009) trong nghiên cứu về ảnh hƣởng của đa dạng di truyền,

áp lực thu hái và kích thƣớc quần thể sâm Panax quinquefolius L. đã sử dụng 6 mồi

RAPD phân tích 342 cá thể từ 18 quần thể, kết quả chỉ ra rằng mức độ đa dạng gene của các quần thể He nằm trong dải từ 0,1058 đến 0,3261, tỷ lệ band đa hình tổng thể đạt 71,93%. Chỉ số biệt hóa gene giữa các quần thể là 0,5474.

Reunova và cộng sự (2010) đã sử dụng đến 3 loại chỉ thị phân tử là RAPD,

ISSR và AFLP để khảo sát đa dạng và biến động di truyền 35 cá thể thuộc 3 quần thể P. ginseng tự nhiên tƣơng ứng với ba khu vực rừng Taiga Spassky, Chuguevsky và

Ussuriisky thuộc vùng Primorsky, Nga. Với 13 mồi RAPD đƣợc sử dụng thì tỷ lệ band

đa hình tổng thể là 4,0%, mức độ dị hợp trông đợi theo thứ tự lần lƣợt nêu trên là 0,0193; 0,0107 và 0,0089; mức độ dị hợp trông đợi tổng thể nghiên cứu là 0,0173 và chỉ số biệt hóa gene giữa các quần thể là 0,2485. Với 06 mồi ISSR đƣợc sử dụng, tỷ lệ band đa hình tổng thể là 9,3%, mức độ dị hợp trông đợi theo thứ tự lần lƣợt nêu trên là 0,0354; 0,0000 và 0,0063; mức độ dị hợp trông đợi tổng thể nghiên cứu là 0,0207 và chỉ số biệt hóa gene giữa các quần thể là 0,2851. Tƣơng tự, với 9 cặp mồi AFLP đƣợc sử dụng thì tỷ lệ band đa hình tổng thể là 21,1%, mức độ dị hợp trông đợi theo thứ tự

lần lƣợt nêu trên là 0,0164; 0,0823 và 0,0615; mức độ dị hợp trông đợi tổng thể nghiên

cứu là 0,0816 và chỉ số biệt hóa gene giữa các quần thể là 0,3762.

Li và cộng sự (2011) sử dụng chỉ thi ̣ ISSR (6 mồi) để khảo sát tính đa dạng di truyền củ a các quần thể trồng P. ginseng vớ i 228 mẫu thuô ̣c ba da ̣ng : Nhân sâm vƣờ n nhà, Nhân sâm vƣờ n rƣ̀ ng và Nhân sâm hoang dã trồng la ̣i ở vù ng Đông Bắc Tr ung Quố c và nhâ ̣n thấy rằng đa da ̣ng di truyền là cao ở mƣ́ c đô ̣ loài (HeT = 0,2886, PPB = 98,96%) nhƣng thấp hơn ở các dạng trồng khác: ở Nhân sâm vƣờ n nhà là He = 0,2294, PPB = 85,42%; ở Nhân sâm vƣờ n rƣ̀ ng là He = 0,1702, PPB = 57,29%; ở Nhân sâm hoang dã trồng la ̣i là He = 0,2021, PPB = 76,04%. Ở 7 quần thể Nhân sâm vƣờn nhà, mức độ đa dạng di truyền nằm trong dải từ He = 0,1153; PPB = 40,62% đến He = 0,1815; PPB = 53,12%, chỉ số biệt hóa gene giữa các quần thể đạt 0,3187 và chỉ số về

dòng gene di cƣ Nm = 1,069. Ở 5 quần thể Nhân sâm vƣờn rừng, mức độ đa dạng di truyền nằm trong dải từ He = 0,1065; PPB = 36,46% đến He = 0,1520; PPB = 40,62%, chỉ số biệt hóa gene giữa các quần thể đạt 0,2328 và chỉ số về dòng gene di cƣ Nm =

1,6480. Ở 4 quần thể sâm hoang dã trồng lại, mức độ đa dạng di truyền nằm trong dải từ He = 0,1266; PPB = 38,54% đến He = 0,1798; PPB = 56,25%, chỉ số biệt hóa gene giữa các quần thể đạt 0,2540 và chỉ số về dòng gene di cƣ Nm = 1,4686.

Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể trên các

đối tƣợng Panax rất ít, chúng tôi chỉ ghi nhận đƣợc hai công trình nghiên cứu là đề tài

cấp Bộ - Bộ Y tế “Sử dụng chỉ thị phân tử AND kết hợp với các dấu hiệu hình thái

trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam” do Viện Dƣợc liệu chủ trì

và tiến sĩ Nguyễn Văn Tập làm chủ nhiệm và “Đa dạng di truyền các quần thể sâm tự

nhiên Panax ginseng C.A. Meyer ở Nga, Panax vietnamensis Ha et Grushv. và các

loài Nhân sâm khác ở Việt Nam: đề xuất công tác thực hiện bảo tồn” do Viện Sinh thái

và tài nguyên sinh vật thực hiện, tiến sĩ Đặng Tất Thế làm chủ nhiệm.

Trong công trình của Nguyễn Tập và cộng sự (2007) về 3 loài mọc tự nhiên tại

Việt Nam là P. vietnamensis, P. bipinnatifidus, và P. stipuleanatus, nghiên cứu sử

dụng 13 mồi RAPD tập trung vào việc phân loại. Tuy nhiên kết quả về đa dạng di truyền cũng đƣợc chỉ ra thông qua tỷ lệ band đa hình ở các mẫu thu thập đƣợc. Tỷ lệ band đa hình tập hợp mẫu thuộc P. vietnamensis là 33,3%, thuộc P. bipinnatifidus là 26,0% và thuộc P. stipuleanatus là 27,4%. Mức độ tƣơng đồng giữa các mẫu ở P. vietnamensis là 65 - 100%, ở P. bipinnatifidus và ở P. stipuleanatus đều là 67-100%, giữa các cặp mẫu thuộc hai loài P. bipinnatifidus và ở P. stipuleanatus là 39 – 49%.

Nhóm tác giả Reunova và cộng sự (2011) nghiên cứu đa dạng di truyền của 45

cá thể sâm Việt Nam P. vietnamensis Ha et Grushv phân bố trên các sƣờn núi Ngọc

Linh, tỉnh Kon Tum bằng 4 cặp mồi SSR đã chỉ ra mức độ dị hợp tử trông đợi hay mức độ đa dạng gene của quần thể là He =0,412 nhỏ hơn mức độ dị hợp tử quan sát là Ho = 0,466, cho thấy xu hƣớng nội phối của quần thể này.

1.6. Nghiên cứu về thành phần hoạt chất ở chi Panax Ở các loài sâm thuộc chi Panax, đến nay các nhà khoa học đã xác định rất

nhiều hoạt chất dƣợc thuộc các nhóm ginsenoside, polysaccharide, polyacetylene,

peptide và amino acid. Tuy nhiên, thành phần dƣợc dụng chủ yếu đƣợc quan tâm là các triterpen saponin (ginsenoside), trong đó nhóm saponin dam marane và oleane là quan trọng nhất. Chính thành phần và hàm lƣợng của nhóm hoạt chất này quyết định

giá trị dƣợc dụng của các taxon cũng nhƣ chất lƣợng dƣợc liệu (Yang và cộng sự,

2014).

Có nhiều nghiên cứu cho thấy sự biến động thành phần ginsenodide theo vào

tuổi, điều kiện canh tác, vùng trồng ở nhiều taxon Panax khác nhau trên thế giới

(Kenneth và cộng sự, 2004; Deborah và cộng sự, 2005), biến động ginsenodide và các

hoạt chất khác theo điều kiện nuôi cấy in vitro (Yu, 2000; Zhou và cộng sự, 2007)

cũng nhƣ sự đa dạng và khác biệt hóa học của các loài (Kim, 2012; Komatsu và cộng

sự, 2005; Quan và cộng sự, 2001 & 2003).

Quá trình nghiên cứu, sự đa dạng các hoạt chất có bản chất Saponin đƣợc phát

hiện ở chi Panax đƣợc hệ thống hóa trong một công trình nghiên cứu mang tính khái

quát hóa của các nhà khoa học Hàn Quốc. Theo đó, đến cuối năm 2012, có tối thiểu

289 loại saponin khác nhau đƣợc ghi nhận, phân loại thành 6 nhóm là protopanaxadiol,

protopanaxatriol, octillol, oleanolic acid, nhóm biến động vị trí chuỗi C17 và một nhóm đa thành phần có cấu trúc sapogenin khác nhau (Yang và cộng sự, 2014).

Có một số nghiên cứu sử dụng thành phần hoạt chất, chủ yếu là các saponin để

phân biệt các taxon thuộc chi Panax.

Tsai và Feng (1975) khảo sát thành phần hoạt chất trong các loài Sâm ở Trung Quốc. Thông qua đó, các tác giả đã chỉ ra có 2 nhóm triterpenoid saponin chính tồn tại trong các loài Sâm khác nhau: Triterpenoid dammarane và Triterpenoid oleanane.

Theo Osamu Tanaka thì chi Panax có đến 8 loài và 11 taxon dƣới loài đƣợc phân thành các nhóm dựa vào thành phần hoạt chất (Nguyễn Duy Cƣơng và Nguyễn

Hữu Quỳnh 1999).

Ở Việt Nam , trong quá trình nghiên cứu về tính năng dƣơ ̣c ho ̣

ặc hữu của Việt Nam là

c củ a các loài thuô ̣c chi Panax phục vụ cho y học gồm các loài trên thế giớ i nhƣ Panax ginseng, P. P. quinquefolius, P. japonicus và các loài có phân bố tự nhiên tại Việt Nam nhƣ stipuleanatus, P. bipinnatifidus mà đă ̣c biê ̣t là loài đ P. vietnamensis.

Tổng hợp các kết quả nghiên cứu về thành phần hoạt chất của P. vietnamensis

của nhóm tác giả Nguyễn Minh Đức và cộng sự (2008) cho thấy:

- Từ rễ và thân rễ sâm Ngọc Linh tự nhiên, đã chiết xuất và xác định cấu trúc hơn 50 hợp chất saponin. Saponin có cấu trúc đã biết gồm chủ yếu saponin nhóm

damaran, trong đó, majonosid R2 là saponin quan trọng nhất, hàm lƣợng chiếm khoảng 50% saponin toàn phần. Sâm Ngọc Linh chứa rất ít saponin thuộc nhóm

olean. Ngoài ra, đã xác định 24 saponin có cấu trúc mới, đƣợc đặt tên là các vina-

ginsenosid- R1 đến R24.

- Từ lá sâm Ngọc Linh, đã chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học

của 19 saponin dammaran. Trong số này, có 11 saponin là những chất đã biết

và đã 8 saponin damaran mới, đặt tên là các vina ginsenosid- L1 đến L8.

Khảo sát so sánh sâm Ngọc Linh từ nguồn tự nhiên và trồng trọt, các tác giả

Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Viết Tựu, Võ Văn Chín đi đến kết luận rằng chúng chứa

những thành phần tƣơng tự nhau, thành phần saponin qua phân tích bằng sắc ký nhƣ

nhau nhƣng có sự khác nhau nhỏ về tỷ lệ tƣơng đối giữa các saponin và thành phần

các minor saponin (Nguyễn Minh Đức và cộng sự, 1998 & 1999).

Nghiên cứu về thành phần hóa học của hai loài sâm Vũ diệp (Panax

bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (P. stipuleanatus Tsai et Feng), Trần Công

Luậnvà cộng sự đi đến kết luận giữa hai loài này có sự tƣơng đồng về các thành phần

dinh dƣỡng nhƣ acid béo, acid amin tự do và khoáng chất nhƣng acide béo không no ở Tam thất hoang cao hơn sâm Vũ diệp 4,5 lần. Ở hai loài này có polyacetylen đƣợc xem là nhóm hoạt chất chống ung thƣ. Thành phần hoạt chất chính của chúng là các

saponosid, chủ yếu thuộc nhóm oleanolic. (Trần Công Luận và cộng sự, 1999).

Lê Thi Hồng Vân và cộng sự (2013) nghiên cứu về thành phần saponin ở loài P. vietnamensis, chỉ ra rằng majonosid – R2 (M-R2) là saponin chính thuộc nhóm ocotillol chỉ riêng có ở loài P. vietnamensis chiếm đến gần 50% saponin toàn phần với

nhiều tác dụng dƣợc lý quan trọng. M-R2 đã đƣợc nghiên cứu phân lập và thiết lập chất chuẩn có độ tinh khiết cao (98,86%) từ thân rễ sâm Ngọc Linh để làm cơ sở cho việc kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu này và các chế phẩm liên quan.

Giá trị làm thuốc và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Panax cũng đƣợc

ghi nhận trong công trình nghiên cứu về thành phần hoạt chất của họ Araliaceae tại

Việt Nam (Lã Đình Mỡi và cộng sự, 2013).

Tại Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu về thành phần hoạt chất của sản

phẩm nuôi cấy in vitro loài P. vietnamensis đã đƣợc tiến hành nhằm đánh giá phƣơng

pháp sản xuất, nhân giống theo hƣớng này nhƣ nghiên cứu của Hoàng Xuân Chiến và

cộng sự (2011).

Một công trình đáng lƣu ý là việc xây dựng cơ sở dữ liệu để phân biệt các loại

sâm. Mẫu các loại sâm đƣợc chiết Soxhlet bằng dung môi Methanol, định tính bằng

sắc ký lớp mỏng và định lƣợng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Các saponin chính đƣợc khảo sát là G-Rb1; G-Rg1; G-Rd; G-Re; N-R1 và M-R2 (Nguyễn Hải Anh và cộng sự, 2011).

Nhut và cộng sự (2012) đã phân tích so sánh giữa mẫu nuôi cấy in vitro và mẫu tự nhiên thuộc loài sâm Ngọc Linh dựa trên các hoạt chất là MR2, G-Rb1 và G-Rg1, kết quả là không có khác biệt về sự xuất hiện các hoạt chất này giữa các mẫu.

1.7. Nhận xét chung

Về ý nghĩa và cơ sở khoa học liên quan đến nội dung luận án

Qua tổng quan tài liệu nghiên cứu về sâm trên trên thế giới, có thể nhận thấy

các taxon Panax, họ Araliaceae đều là những loài thực vật làm thuốc có giá trị kinh tế

cao và thƣờng đặt trong tình trạng quý hiếm, cần đƣợc bảo tồn theo tiêu chuẩn IUCN.

Trên mọi lĩnh vực liên quan đến luận án, đã có nhiều công trình nghiên cứu mang tính

chuyên sâu nhằm tạo cơ sở khoa học cho công tác phân biệt, nhận dạng, khẳng định

nguồn tài nguyên, phát triển, khai thác và sử dụng hiệu quả nhóm dƣợc liệu này.

Cơ sở khoa học cho việc phân loại, xây dựng quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon thực vật và đánh giá đa dạng di truyền quần thể dựa trên các phƣơng pháp

truyền thống kết hợp với sử dụng công cụ sinh học phân tử đã đƣợc xây dựng, tích lũy thành hệ thống, đáp ứng cho việc ứng dụng rộng rãi ngày nay. Đây cũng là cơ sở khoa học nền tảng để định hƣớng và tiến hành các nghiên cứu thuộc luận án.

Về vị trí hệ thống học , phân loại, phân bố củ a chi Panax , họ Araliaceae và

quan hê ̣ phá t sinh trong chi Panax dựa trên hê ̣ thố ng học mứ c độ phân tử

Các kết quả nghiên cứu về phân loại và hệ thống học chi Panax theo phƣơng pháp truyền thống cho thấy có sự hoàn thiện dần tập hợp các đặc điểm hình thái đặc

trƣng của chi từ khi đƣợc Linneaus mô tả năm 1753 cho đến năm 1970. Theo đó, việc

sử dụng hình thái thân rễ và rễ củ trƣớc sau đó đến đặc điểm hình thái lá, đài, tràng, số

lƣợng chỉ nhụy, quả... để phân biệt các taxon là phù hợp đối với chi Panax.

Thành phần loài của chi Panax theo các tác giả khác nhau là rất khác nhau bởi

đặc điểm hình thái của các taxon trong chi này rất đa dạng, dẫn đến quan điểm về hệ

thống phát sinh dựa vào đặc điểm hình thái giữa các tác giả không đồng nhất. Theo

thời gian, ngày càng có nhiều phát hiện các taxon mới đƣợc phát hiện. Việc sử dụng các trình tự DNA bảo thủ để hỗ trợ cho phân loại trong các nghiên cứu là khác nhau.

Để xây nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon, các nhà nghiên cứu đi trƣớc đã sử dụng sử dụng trình tƣ̣ các vùng bảo thủ một cách riêng rẽ hay phối hợp với nhau để xây dựng các cây quan hệ phát sinh chủng loại và biện luận

cho kết quả bằng chính các đặc điểm hình thái và phân bố của các taxon. Các vùng

trình tự 18S rRNA; ITS1-5,8S rRNA -ITS2 và một phần gene matK tỏ ra thích hợp

trong nghiên cứu này bởi cơ sở khoa học trong việc ứng dụng các trình tự này đã đƣợc

chứng minh. Bên cạnh đó, kết quả từ các nghiên cứu tƣơng tự trên các đối tƣợng cùng

chi đã có trƣớc và các dữ liệu liên quan từ Genbank là một nguồn tham khảo và so sánh tốt.

Trong nƣớc, các nghiên cứu về thành phần loài thuộc chi Panax đã đƣợc tiến

hành từ rất lâu, tuy nhiên vẫn có nhiều điểm còn cần nghiên cứu thêm để làm sáng tỏ.

Mặc dù đƣợc Phạm Hoàng Hộ ghi nhận từ năm 1970 dƣới tên khoa học là P.

schingseng var. japonicum và hiệu chỉnh thành P. japonica trong các công bố sau đó

của chính tác giả (1991, 1999, 2003) nhƣng taxon Panax phân bố tự nhiên tại Lâm

Đồng không đƣợc nhắc đến hoặc đƣợc cho là P. vietnamensis mà thiếu cơ sở giám

định mẫu trong các nghiên cứu về sau (Nguyễn Tập, 2005; Nguyễn Tiến Bân,

1996&2007; Phan Kế Long và cộng sự, 2013).

Về các nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở chi Panax:

Đúc kết các công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể ở chi Panax, , RAPD, SSR, có thể nhận thấy rằng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ allozyme ISSR và AFLP, đã đƣợc sử dụng để làm xuất hiện các chỉ thi ̣ đa hình đủ để đánh giá đa dạng di truyền ở cả hai mức độ : trong và giƣ̃a các quần thể ở các loài thuô ̣c chi Panax. Các thông số di truyền thu nhâ ̣n nhƣ trên giúp việc quản lý các hệ sinh thái có các loài sâm sinh sống cũng nhƣ giúp cho việc bảo tồn các loài này một cách thuận lợi hơn.

Việc khảo sát đa dạng di truyền quần thể trong các nghiên cứu đƣợc trình bày

trên xoay quanh các tiêu chí: mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các cá thể trong tập hợp mẫu, tỷ lệ band đa hình (PPB), mức độ dị hợp hay chỉ số đa dạng gene (He), chỉ số biệt hóa gene và khoảng cách di truyền giữa các tập hợp mẫu (GST và D). Điều này góp phần vào định hƣớng nghiên cứu của chúng tôi trong việc khảo sát về đa dạng di

truyền quần thể Panax mới đƣợc tái phát hiện tại Lâm Đồng.

Về thành phần hoạt chất ở chi Panax

Những nghiên cứu về mặt hóa học ở chi Panax đã tiến hành trong và ngoài nƣớc

đã chỉ ra các thành phần hoạt chất của nhóm dƣợc liệu quý này cũng nhƣ thành phần

chính trong các taxon riêng rẽ. Có thể xem đây là một trong các cơ sở để tham khảo,

định hƣớng và ứng dụng phƣơng pháp cho nghiên cứu so sánh thành phần saponin

giữa đối tƣợng nghiên cứu và các taxon khác thuộc chi Panax.

Chƣơng 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh chủng

loại của sâm Lang Bian và các taxon Panax khác

- Khoảng 30 cá thể sâm Lang Bian đƣợc nghiên cứu về hình thái tại thực địa. 5

mẫu sâm Lang Bian, các mẫu đại diện cho các taxon Panax khác tại Việt Nam và mẫu

loài Đinh Lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harm.) để nghiên cứu giải phẫu hình thái và

làm tiêu bản khô: các mẫu vật cần thu bao gồm: thân rễ, thân củ, lá, hoa, quả (toàn

cây) để làm tiêu bản khô và lƣu giữ tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây nguyên.

- 03 mẫu DNA từ các cá thể thuộc taxon sâm Lang Bian cùng với các mẫu thuộc

5 loài đã đƣợc định tên có phân bố tại Việt Nam bao gồm: P. vietnamensis (sâm Việt

Nam - 1 mẫu DNA), P. vietnamensis var. fuscidiscus (sâm Lai Châu - 1 mẫu DNA), P.

bipinnatifidus (sâm Vũ diệp - 1 mẫu DNA) và P. stipuleanatus (Tam thất hoang - 1

mẫu DNA) và chuẩn ngoại (outgroup - 1 mẫu DNA) là loài Polyscias fruticosa (L.)

Harm. đƣợc sử dụng để khuếch đại các trình tự DNA bảo thủ phục vụ cho việc nhận

dạng, so sánh, đánh giá quan hệ phát sinh chủng loại. Các mẫu này đƣợc tách chiết từ

lá tƣơi của các mẫu tiêu bản tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên (VTN) nói

trên. Các mẫu đƣợc sử dụng để tách chiết DNA phục vụ cho phân tích quan hệ phát

sinh chủng loại trong nghiên cứu này đƣợc thống kê lại trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các mẫu sử dụng để tách chiết DNA cho phân tích quan hệ phát sinh

TT Taxon 1

Panax sp. – sâm Lang Bian

P. vietnamensis var. fuscidiscus

P. stipuleanatus

P. bipinnatifidus

P. vietnamensis

Polyscias fruticosa

Nguồn mẫu/ngƣời thu Nông Văn Duy, Trần Văn Tiến, Lê Ngọc Triệu - VTN 520b, c, e Nông Văn Duy, Trần Văn Tiến, Lê Ngọc Triệu - VTN 990b Nông Văn Duy, Trần Văn Tiến, Lê Ngọc Triệu - VTN 991c Nông Văn Duy, Trần Văn Tiến, Lê Ngọc Triệu - VTN 992b Nông Văn Duy, Trần Văn Tiến, Lê Ngọc Triệu - VTN 994c Nông Văn Duy, Lê Ngọc Triệu - VTN 993a

Xuất xứ Lâm Đồng, Việt Nam Lai Châu, Việt Nam Lai Châu, Việt Nam Lào Cai, Việt Nam Kontum, Việt Nam Lâm Đồng, Việt Nam

chủng loại

Sau khi khuếch đại, phân lập, giải trình tự gene 18S rRNA; vùng ITS1 – 5,8S

rRNA – ITS2 và một phần gene matK của các mẫu thu thập, các trình tự thu nhận

đƣợc đƣợc công bố trên ngân hàng Gene (NCBI) với mã truy cập nhƣ trong bảng 2.2.

Bảng 2.2. Mã truy cập các trình tự 18S rRNA; vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 và một phần gene matK của các mẫu thu thập tại Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại

TT Taxon 18S rRNA Một phần gene matK

ITS1– 5,8SrRNA – ITS2 1 Panax sp. – sâm Lang Bian KX768316 KX768322 KX768328 2 P. vietnamensis var. fuscidiscus KX768320 KX768326 KX768332 KX768317 KX768323 KX768329 3 P. stipuleanatus KX768318 KX768324 KX768330 4 P. bipinnatifidus KX768319 KX768325 KX768331 5 P. vietnamensis KX768321 KX768327 KX768333 6 Polyscias fruticosa

- Các trình tự các trình tự DNA bảo thủ gồm: gene 18S rRNA, một phần gene

matK và vùng gene ITS1-5,8S-ITS2 của một số taxon Panax đƣợc công bố trên ngân

hàng gene (Genbank – http:// www. ncbi. nlm.nih.gov) đƣợc sử dụng làm chuẩn nội

(cùng taxon với các taxon đƣợc thu mẫu tại Việt Nam) và để so sánh kết quả và phân

tích quan hệ phát sinh chủng loại (P. quinquefolius, P. japonicus, P. pseudoginseng)

(bảng 2.3).

Xuất xứ

Bảng 2.3. Các trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8SrRNA-ITS2 và gen matK đƣợc lấy từ Genbank sử dụng trong nghiên cứu phân tích quan hệ phát sinh chủng loại Ký hiệu Genbank

Trình tự

AB044906

Quảng Nam, Việt Nam

Trà linh, Quảng Nam KJ418206.1

Nguồn mẫu/ngƣời thu/ Voucher Kadota et Komatsu, TM455 Phan Ke Long, Le Thanh Son Wen6243 (US) J1 (PE)

Virginia, Mỹ Tottori, Nhật

HQ113077 HQ113071.1

D1 (PE)

Yunnan, Trung Quốc HQ113079.1

matK

K. Komatsu, Y276 Yunnan, Trung Quốc AB088004.1

Phan Kế Long

Lai Châu, Việt Nam KJ418212.1

Taxon/ sử dụng trong nghiên cứu Panax vietnamensis P. vietnamensis P. quinquefolius P. japonicus P. stipuleanatus P. vietnamensis var. fuscidiscus P. vietnamensis var. fuscidiscus P. bipinnatifidus P. pseudoginseng Hedera helix

D8(PE) Wen4900 (US) 27HH02

Yunnan, Trung Quốc HQ113050.1 HQ113076.1 Gotehola, Nepal AJ319074.1

AB088017.1

S. Zhu, 20001

Toyama, Nhật

John Gerrath, AP282 Ontario, Canada

HQ593177.1 HQ427394.1 DQ133795.1 KJ510942.1 KF412429.1

AB033635.1

P. vietnamensis

D85172.1

Eleutherococcus senticosusgi Aralia racemosa Dendropanax dentiger Schefflera elegantissima Andersson 2381 (GB) Macropanax undulatusgi Tetrapanax papyrifer Quảng Nam, Việt Kadota et Komatsu, TM455 Nam TMPU, Fushimi, 15 Canada

Kading, Sichuan

AB044901.1

D84100.1

P. quinquefolius P. japonicus var. bipinnatifidus P. japonicus

18S

P. stipuleanatus

Yunnan, Trung Quốc AB088025.1

Yunnan, Trung Quốc AB080243.1

P. vietnamensis var. fuscidiscus

P. pseudoginseng

Arunachal, Ấn Độ

AB088026.1

P. vietnamensis P. bipinnatifidus

TMPW No. 12022 Toyama, Nhật K. Komatsu et al., Y277-1 K. Komatsu et al., Y276-1 K. Komatsu và A. Takano, I-42 Wen 5638-2 (F) Wen 1166 (CS)

KJ418195.1

P. vietnamensis

Long P.K., Son T.L.

Yunnan, Trung quốc AY271924 Sichuan, Trung Quốc U41678.1 Trà linh, Trà My, Quảng Nam Lai Châu, Việt Nam Lai Châu, Việt Nam Virginia, Mỹ Tottori, Nhật

JF772119.1 JF772118.1 HQ112440.1 HQ112432.1

P. vietnamensis P. vietnamensis P. quinquefolius P. japonicus

Nguyen,G.S.et al. Nguyen,G.S et al. Wen6243 (US) J1 (PE)

ITS1 – 5,8S – ITS2

P.stipuleanatus

Wen 1204 (CS)

Yunnan, Trung Quốc U41695

Yunnan, Trung Quốc HQ112441

Lai Châu, Việt Nam KJ418192.1

P. stipuleanatus P. vietnamensis var. fuscidiscus P. pseudoginseng

D1 (PE) Phan,K.L. et al. Wen4900 (US)

Gotehola, Nepal

HQ112438.1

2.1.2. Vật liệu cho nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian

Vật liệu nghiên cứu là mẫu lá từ tập hợp các cá thể đƣợc phát hiện thuộc hai

quần thể taxon Panax phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng, trừ các cá thể đƣợc giữ nguyên

vẹn để làm tiêu bản (64 mẫu từ quần thể Lạc Dƣơng và 51 mẫu thuộc quần thể Đam

Rông theo bản đồ ở hình 2.1 và 2.2.

2.1.3. Vật liệu cho nghiên cứu sơ bộ thành phần saponin của sâm Lang Bian

Trong nghiên cứu về phân tích sơ bộ thành phần saponin của sâm Lang Bian

phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng, vật liệu nghiên cứu là thân rễ và rễ củ của 5 taxon

thuộc chi Panax có phân bố tại Việt Nam đã nêu ở phần 2.1.1 với lƣợng 30 gam

khô/taxon.

2.2. Nội dung nghiên cứu

Các nội dung chính của nghiên cứu là:

- Nghiên cứu vị trí phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian

và một số loài khác cùng chi dựa trên các trình tự DNA bảo thủ và đặc điểm hình thái.

- Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền ở quần thể sâm Lang Bian.

- Nghiên cứu phân tích so sánh sơ bộ thành phần saponin ở sâm Lang Bian và

một số taxon cùng chi khác.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1.Điều tra, thu thập mẫu

Viê ̣c điều tra, thu mẫu tiến hành theo phƣơng pháp nghiên cƣ́ u thƣ̣c vâ ̣t củ a Klein

và Klein (1970), và Nguyễn Nghĩa Thìn (2007). Khảo sát la ̣i khu vƣ̣c đã phát hiê ̣n quần thể ban đầu và những khu vực lân cận nhằm xác định thêm các khu phân bố khác

của taxon nghiên cứu.

Dựa vào điều kiện nơi phân bố đã phát hiện quần thể ban đầu, xác định các khu

vực có cùng đai độ cao và kiểu rừng trong vòng bán kính 50 km. Với các khu vực xác

định đƣợc, tiến hành lập các tuyến điều tra trên bản đồ (trên bản đồ phóng lớn thành

bản đồ địa hình tỷ lệ 1:5.000) đi qua các đai độ cao cách nhau 30 m và bao phủ toàn bộ

khu vực điều tra đã xác định.

Tiến hành khảo sát theo theo tuyến đã thiết kế với độ rộng quan sát của tuyến là 20 m nhằm đánh dấu để thu thâ ̣p mẫu vâ ̣t , ghi nhâ ̣n thêm các đă ̣c tính sinh trƣở ng, phát triển và đặc điểm cũng nhƣ mùa ra hoa, quả của đối tƣợng nghiên cứu.

Tại những khu vực phát hiện có sự phân bố của taxon nghiên cứu, tiến hành ghi

nhận các đặc điểm về điều kiện sinh cảnh thông qua mô tả, hình ảnh và dữ liệu tọa độ

từ thiết bị định vị GPS Map 60 CSX. Đánh dấu vị trí khu vực phát hiện có sự phân bố

của taxon nghiên cứu trên bản đồ tuyến.

+ 12001’30’’ N

+ 110 56’ 22’’ N

+

1080 12’ 42’’ E

1080 18’ 12’’ E

1080 23’ 42’’ E

1080 29’ 12’’ E

Hình 2.1. Bản đồ địa hình điều tra thu thập mẫu đối với sâm Lang Bian

Ghi chú: : ranh giới khu khu vực điều tra : ranh giới khu phát hiện quần thể

Quần thể tại Lạc Dƣơng phân bố trong khu vực có tọa độ từ 108025‟38‟‟ đến 108028‟06‟‟ E và 12001‟50‟‟ đến 12005‟01‟‟N; quần thể tại Đam Rông phân bố trong khu vực có tọa độ từ từ 108011‟35‟‟ đến 108016‟25‟‟ E và 11059‟35‟‟ đến 12001‟35‟‟N. Đây cũng chính là hai khu vực thu thập mẫu.

Hình 2.2. Bản đồ không ảnh tổng thể khu vực phân bố sâm Lang Bian

2.3.1.1. Thu thập, xử lý mẫu để nghiên cứu hình thái thực vật học, lƣu trữ

và nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại

Thu mẫu ngoài thực địa

Thu thập mẫu sâm Lang Bian để nghiên cứu giải phẫu hình thái và làm tiêu bản

khô. Các mẫu vật cần thu bao gồm: thân rễ, thân củ, lá, hoa, quả (toàn cây) của 5 cá

thể. Mẫu thu đảm bảo không bị sâu bệnh, hƣ hỏng và có tính đại diện cao cho taxon,

đƣợc thu vào thời điểm cây đang ra hoa và đậu quả. 3 trong số 5 mẫu này đƣợc lấy bớt

1 lá kép để tách chiết DNA phục vụ cho nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại. Các

vật liệu còn lại đƣợc ép vào kẹp mắt cáo và ghi đầy đủ thông tin để đƣa về phòng thí

nghiệm để nghiên cứu các đặc điểm vi phẫu và làm tiêu bản khô, lƣu giữ tại Viện

Nghiên cứu Khoa học Tây nguyên. Cách làm này cũng áp dụng với các mẫu taxon

khác thuộc chi Panax có phân bố ở Việt Nam và chuẩn ngoại sử dụng trong nghiên

cứu.

Xử lý mẫu trong phòng thí nghiệm

Xử lý mẫu vật: mẫu vật đƣợc sắp xếp bằng phẳng, có lá sấp, lá ngửa; lá quá dài

đƣợc gấp lại. Mẫu đƣợc ép trong các tờ báo kích thƣớc 40 x 60 cm. Mỗi kẹp mắt cáo giữ khoảng 1 - 2 mẫu. Mẫu đƣợc sấy trong tủ sấy Memmert tại nhiệt độ 60oC từ 3 – 5

ngày; thông gió tối đa. Mẫu khô đƣợc đƣa lên giấy làm tiêu bản kích thƣớc 38 - 45 cm

để làm tiêu bản thực vật. Tiêu bản khô đƣợc giữ thông thoáng và bảo quản ở nhiệt độ

phòng (Klein và Klein, 1970; Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007).

2.3.1.2. Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể

Mẫu vâ ̣t để tách chiết DNA phục vụ cho nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể là mẫu lá (khoảng 5 lá chét) đối vớ i tất cả các cá thể đƣơ ̣c ghi nhâ ̣n , ngoại trừ các cá thể đƣợc thu mẫu toàn cây cần giữ nguyên vẹn để làm tiêu bản lƣu giữ tại Viện

Nghiên cứu Khoa học Tây nguyên.

Thờ i điểm thu thâ ̣p lá để tách chiết DNA phục vụ cho nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể là lúc cây sắp rụng lá ngủ đông để gìn giữ quần thể đang có , các mẫu

lá thu thập đƣợc đƣợc giữ tƣơi và bảo quản trong thời gian ngắn trƣớc khi tách chiết ,

đƣợc giữ mát chứ không đông lạnh (gói trong giấy hay đặt trong túi nhựa khóa kéo và

giữ phía trên nƣớc đá) không quá 48 giờ sau khi thu thâ ̣p hoặc giữ trong silica gel nếu

thời gian chuyến điều tra thu thập mẫu trên 3 ngày sau đó tiến hành xử lý tách chiết

DNA (Weising và cộng sự, 2005).

Việc xác định tuổi mẫu đƣợc dựa trên số vết sẹo thân khí sinh để lại trên thân rễ.

Nhằm giảm thiểu tối đa các thƣơng tổn cho cây, việc đào bới để xác định độ tuổi chỉ

tiến hành khi đếm đến 20 vết sẹo, điều này đồng nghĩa với việc không ghi nhận chi tiết

độ tuổi của các cá thể trên 20 năm tuổi. Căn cứ vào độ tuổi của các mẫu thu thập để

sắp xếp mẫu theo nhóm tuổi.

2.3.1.3. Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu sơ bộ về thành phần saponin

Với mỗi taxon thuộc chi Panax phân bố tự nhiên tại Việt Nam, thân rễ và rễ củ

của 1-3 cá thể trƣởng thành (trên 7 tuổi) đƣợc thu thập trong quá trình điều tra và sử

dụng làm nguyên liệu cho khảo sát về thành phần các hoạt chất Saponin.

2.3.2. Nghiên cứu về hình thái nhằm bổ sung dữ liệu cho xác định vị trí phân

loại sâm Lang Bian

Nghiên cứu thực địa

Các mẫu sâm Lang Bian, các taxon thuộc chi Panax khác có phân bố tại Việt

Nam đƣợc đo đạc, chụp ảnh để ghi nhận đặc điểm hình thái các cơ quan dinh dƣỡng và

sinh sản (Klein và Klein, 1970; Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007).

Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Quan sát mẫu vật: Mẫu đƣợc sau khi đƣa về phòng thí nghiệm đƣợc quan sát

bằng mắt thƣờng và kính lúp, đo đạc chính xác kích thƣớc các bộ phận. Riêng mẫu

hoa, quả và từng thành phần cấu trúc của chúng đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi soi

nổi Ermecon (Đức) gắn kèm máy ảnh kỹ thuật số Canon EOS 600D. Mô tả chi tiết và

chụp ảnh các bộ phận để tƣ liệu hóa (Klein và Klein, 1970).

So sánh đặc điểm hình thái giải phẫu:

Các đặc điểm hình thái ghi nhận đƣợc cho sâm Lang Bian cũng nhƣ các taxon

Panax khác có phân bố tại Việt Nam đƣợc so sánh một cách chi tiết với nhau và với

các bản mô tả gốc cũng nhƣ với các tiêu bản lƣu giữ ở các bảo tàng thực vật ở Việt

Nam và thế giới nhƣ: Phòng lƣu trữ mẫu vật của Viện Dƣợc liệu, Bảo tàng Viện Sinh

thái Tài nguyên sinh vật (HN), Bảo tàng thực vật Viện Nghiên cứu khoa học Tây

nguyên (VTN), Bảo tàng thực vật Trƣờng Đại học Đà Lạt (DLU), Bảo tàng thực vật

Kew của Hoàng gia Anh (K), Bảo tàng lịch sử tự nhiên Paris của Pháp (P), Bảo tàng

thực vật Côn Minh (KUN) thông qua ghi nhận trực tiếp và hình ảnh online. Từ đó chỉ

ra các đặc điểm hình thái làm cơ sở cho việc xác định vị trí phân loại thực vật của sâm

Lang Bian và các điểm tƣơng đồng hay khác biệt giữa taxon này và các taxon cùng chi

có quan hệ gần.

2.3.3. Tách chiết DNA và kiểm tra chất lƣợng, hàm lƣợng DNA

Tách chiết DNA: Mẫu lá của từng cá thể thu thập đƣợc tiến hành tách chiết DNA

theo quy trình CTAB I theo Weising và cộng sự (2005) có cải tiến bằng viê ̣c bổ sung SDS 10% vào thành phần đệm chiết.

Kiểm tra chất lƣợng và nồng độ DNA: Kiểm tra chất lƣợng và nồng độ DNA

theo phƣơng pháp của Weising và cộng sự (2005): để xác định nồng độ DNA ở các

mẫu tách chiết dựa trên tƣơng quan với mật độ quang ở bƣớc sóng 260nm, độ tinh

sạch đƣợc xác định dựa trên tỷ lệ mật độ quang đo đƣợc ở hai bƣớc sóng 260nm và

280nm.

Các mẫu DNA sau khi đƣợc kiểm tra chất lƣợng đƣợc giữ ở điều kiện -200C. Chỉ

các mẫu đạt độ tinh sạch dựa trên tỷ lệ OD260/OD280 trong khoảng từ 1,75 – 1,95 mới đƣợc sử dụng cho đánh giá đa dạng di truyền cũng nhƣ phân tích quan hệ phát sinh

chủng loại.

2.3.4. Phân loại, phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình

tự bảo thủ

2.3.4.1. Phân lập và khuếch đại các vùng DNA bảo thủ + Một phần gene matK

- Gene matK đƣợc khuếch đa ̣i một phần (818/1512 nucleotide từ vị trí 444 đến

1261) bằng phản ứng PCR vớ i mồi đă ̣c hiê ̣u và điều kiện phản ƣ́ ng đƣợc cải biến từ phƣơng pháp đã sử dụng trong nghiên cứu có trƣớc của Zuo và cộng sự (2011), cụ thể:

Cặp mồi được sử dụng:

Mồi xuôi: matK F có trình tƣ̣: 5'- CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C-3' Mồi ngƣợc: matK R có trình tƣ̣: 5'- GTT CTA GCA CAA GAA AGT CG -3' Thành phần phản ứng:

Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với dung tích 50 µl chứa 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 1,3 U Taq DNA

polymerase (ThermoScientific), 0,20 µM mồi, khoảng 60-80 ng DNA tổng số làm

khuôn mẫu và BSA 1% theo thể tích.

Chu trình nhiê ̣t được sử dụng: Quá trình khuếch đại DNA đƣợc tiến hành trên máy luân nhiệt Peqstar 96X

Universal Gradient (Đức) với chƣơng trình nhiệt nhƣ sau:

5 phút ở 940C (Bƣớc biến tính ban đầu) 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 45 giây ở 940C (biến tính), 45 giây ở 510C (gắn mồi),

1 phút 30 giây ở 720C (kéo dài mạch)

15 phút ở 720C (bƣớc kéo dài mạch cuối cùng)

Với các khuếch đại này, một phần gen matK sẽ đƣợc khuếch đại (kích thƣớc

trình tự là 818bp)

+ Vùng trình tự ITS1 – 5,8S – ITS2

- Vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 đƣợc khuếch đa ̣i bằng phản ứng PCR vớ i mồi

đă ̣c hiê ̣u và điều kiện phản ƣ́ ng cải biến từ phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong nghiên cứu của Ngan và cộng sự (1999), cụ thể:

Cặp mồi được sử dụng:

Mồi xuôi: 18d có trình tƣ̣: 5'- CAC ACC GCC CGT CGC TCC TAC CGA-3' Mồi ngƣợc: 28cc có trình tƣ̣: 5'- ACT CGC CGT TAC TAG GGG AA-3' Thành phần phản ứng:

Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với dung tích 50 µl chứa 1 × đệm theo Taq

(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0,001% gelatin), 0,25 mM mỗi loại dNTP, 1,5

U Taq DNA polymerase (ThermoScientific), 0,20 µM mồi, BSA 1% theo thể tích và

khoảng 60-80 ng DNA tổng số làm khuôn mẫu.

Chu trình nhiê ̣t được sử dụng: Quá trình khuếch đại DNA đƣợc tiến hành trên máy luân nhiệt Peqstar 96X

Universal Gradient (Đức) với chƣơng trình nhiệt nhƣ sau:

7 phút ở 940C (Bƣớc biến tính ban đầu) 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm: 1 phút ở 940C (biến tính), 1 phút ở 600C (gắn mồi),

2 phút ở 720C (kéo dài mạch)

10 phút ở 720C (bƣớc kéo dài mạch cuối cùng)

+ Gene 18S rRNA

Gene 18S rRNA đƣợc khuếch đa ̣i bằng phản ứng PCR vớ i mồi đă ̣c hiê ̣u và điều kiện phản ƣ́ ng đƣợc cải biến từ phƣơng pháp tiến hành trong các nghiên cứu có trƣớc trên các đối tƣợng cùng chi (Komatsu và cộng sự, 2001; Fushimi và cộng sự, 1996), cụ

thể nhƣ sau:

Cặp mồi được sử dụng:

Mồi xuôi: 18S5'F có trình tƣ̣: 5'-CAA CCT GGT TGA TCC TGC CAG T-3' Mồi ngƣợc: 18S3'R có trình tƣ̣: 5'-CTG ATC CTT CTG CAG GTT CAC CTA-3' Thành phần phản ứng:

Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với dung tích 50 µl chứa 10 mM Tris-HCl (pH 9), 50 mM KCl, 1,8 mM MgCl2, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 1,5 U Taq DNA polymerase (ThermoScientific), 0,25 µM mồi và khoảng 60-80 ng DNA tổng số làm

khuôn mẫu và BSA 1% theo thể tích.

Chu trình nhiê ̣t được sử dụng: Quá trình khuếch đại DNA đƣợc tiến hành trên máy luân nhiệt Peqstar 96X

Universal Gradient (Đức) với chƣơng trình nhiệt nhƣ sau: 01 chu kỳ gồm 3 phút ở 940C, 8 phút ở 650C 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 45 giây ở 940C, 8 phút ở 650C 30 phút ở 720C (bƣớc kéo dài mạch cuối cùng)

Sản phẩm khuếch đại PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1,2% với các marker

trọng lƣợng 100bp và 1kb (ThermoScientific) để kiểm tra. Những mẫu khuếch đại tạo

band DNA đặc hiệu rõ, nét đƣợc phân lập và làm sạch khỏi gel agarose bằng Kit tinh

sạch AccuPrep® Gel của hãng Bioneer, Hàn Quốc.

Các sản phẩm PCR từ việc khuếch đại các trình tự DNA bảo thủ bằng các mồi đặc hiệu nói trên đƣợc gửi đi giải trình tự tại hai hãng Bioneer và Macrogen (Hàn Quốc) bằng máy giải trình tự tự động ABI 3730. Đối với trình tự một phần gene matK

và 18S rDNA (giải trình tự từ hai phía mạch DNA sản phẩm PCR sử dụng ngay trình tự mồi khuếch đại để làm mồi giải trình tự). Kết quả giải trình tự đƣợc rà sát, hiệu chỉnh thủ công một lần nữa trƣớc khi đƣợc phân tích , so sánh vớ i các trình tƣ̣ tƣơng ứng đã đƣơ ̣c công bố cho các taxon thuộc chi Panax để nhận dạng sự khác biệt di truyền cũng nhƣ phân tích quan hệ phát sinh chủng loại. Các phần mềm BioEdit 5.0.6 và Chromas 2.0 đƣợc sử dụng để hiệu chỉnh trình tự, cụ thể là: quan sát, đối sánh trên

phổ đồ để xác định loại nucleotide mơ hồ (ambiguous nucleotide) theo nguyên lý chọn

cao điểm (peak) trội bằng phần mềm BioEdit 5.0.6; đếm số lƣợng nucleotide của trình

tự, nghịch đảo các trình tự khuếch đại bằng mồi ngƣợc và xuất tệp định dạng FASTA

bằng các công cụ của phần mềm Chromas 2.0.

2.3.4.2. Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự DNA

bảo thủ cao

Các trình tự có đƣợc thông qua việc giải trình tự cùng với các trình tự tƣơng ứng

từ Genbank đƣợc sử dụng để phân tích đặc điểm trình tự và quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon đƣợc khảo sát bằng cách sử dụng phần mềm MEGA 5.1 (Tamura

và cộng sự, 2011). Các thuật toán/công cụ trong phần mềm MEGA 5.1 sử dụng trong

nghiên cứu này gồm: sắp xếp (căn) trình tự đa chuỗi; cắt các trình tự đã giải để tƣơng

đồng với các trình tự tƣơng ứng từ Genbank; xác định thành phần, số lƣợng các

nucleotide cho từng trình tự khảo sát; so sánh các trình tự khảo sát, nhận biết các điểm

khác biệt sử dụng công cụ đánh dấu màu khác nhau cho các nucleotide ký hiệu đồng

nhất trình tự; tính khoảng cách di truyền giữa các trình tự khảo sát; và xác định mối

quan hệ phát sinh chủng loại thông qua các cây quan hệ phát sinh chủng loại, sử dụng

giá trị bootstrap 1500.

Các vùng DNA thuộc bộ gene trong nhân và bộ gene lạp thể đƣợc sử dụng riêng

rẽ và sau đó phối hợp để phân tích quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon khảo

sát.

Tính bất tƣơng đồng có thể có giữa các tập hợp trình tự khảo sát khi phối hợp

trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại đƣợc kiểm tra bằng công cụ Incongruence

Length Difference (ILD) của phần mềm PAUP* (Phylogenetic Analysis Using

Parsimony*) version 4.0a147, sử dụng thuật toán Heuristic search, 100 lần lặp để tính

toán giá tri P (Swofford, 2003; John và cộng sự, 1996). Bởi trình tự gene 18S rRNA và

vùng ITS1-18S rRNA-ITS2 nối tiếp nhau ở bộ gene trong nhân, trong nghiên cứu này có hai hƣớng kiểm tra tính bất tƣơng đồng có thể có khi phối hợp các trình tự:

- Hƣớng thứ nhất: xem vùng18S rRNA-ITS1-5,8S rRNA-ITS2 là một trình tự

liên tục để phối hợp với trình tự một phần gene matK trong nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại.

- Hƣớng thứ hai: xem gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK là những trình tự riêng rẽ để phối hợp với nhau trong nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại.

Các vùng trình tự lấy từ Genbank đại diện cho mỗi taxon Panax đáp ứng một

trong các tiêu chí: có nguồn gốc mẫu thực địa với cùng ngƣời thu thập, đƣợc cùng

nhóm tác giả sử dụng trong nghiên cứu, có sự thống nhất giữa các tác giả nghiên cứu

trƣớc về tên khoa học và vị trí phân loại.

2.3.5. Phân tích đa dạng di truyền quần thể dựa trên DNA fingerprint nảy

sinh bằng kỹ thuật ISSR

Tỗng dố mẫu đƣợc khảo sát là 115 mẫu, trong đó 64 mẫu từ quần thể Lạc

Dƣơng và 51 mẫu thuộc quần thể Đam Rông.

2.3.5.1. Sử dụng kỹ thuâ ̣t ISSR để hình thành các DNA fingerprint

Khuếch đại DNA:

Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với dung tích 20 µl chứa 2 mM MgCl2, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 1U Taq DNA polymerase (ThermoScientific), 0,2 µM mồi và khoảng

30 ng khuôn mẫu DNA. Quá trình khuếch đại DNA đƣợc tiến hành trên máy luân

nhiệt Peqstar 96X Universal Gradient (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Germany)

với chƣơng trình nhiệt sau:

Bƣớc biến tính đầu tiên ở 94 0C trong 5 phút; 10 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C trong 45 giây, nhiệt độ gắn mồi thích hợp +5 (Ta +5) 0C (Ta trong khoảng tùy mồi 50-570C, xem thêm ở Bảng 3.18.) trong 45 giây, giảm dần 0,5 0C/chu kỳ, kéo dài mạch ở 720C trong 1 phút 30 giây;

36 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C trong 45 giây, nhiệt độ bắt mồi

thích hợp (Ta) trong 45 giây, kéo dài mạch ở 720C trong 1 phút 30 giây;

Bƣớc kéo dài mạch cuối cùng ở 720C trong 15 phút.

Chọn lọc mồi:

Khảo sát tập hợp 45 mồi đã đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu về đa dạng di

truyền quần thể các loài cùng chi với đối tƣợng nghiên cứu bao gồm:

- Nhóm mồi ISSR do đại học Zagazig (Ai cập) đề xuất (Ahmed, 2005)

- Nhóm mồi ISSR đƣợc cung cấp bởi NAPS Unit (UBC primers set #9), trong đó có các mồi đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu của Reunova và cộng sự (2010) cũng

nhƣ của Li và cộng sự (2011)

5 mẫu DNA chọn ngẫu nhiên từ các mẫu thu thập đƣợc thử nghiệm khuếch đại với mỗi mồi sử dụng bằng tiến trình khuếch đại nêu trên để sàng lọc các mồi với tiêu chí là ghi nhận đƣợc sản phẩm khuếch đại bằng PCR và có ít nhất 1 band đa hình.

Ghi nhận các DNA fingerprint bằng các chỉ thị ISSR:

Các mẫu DNA có độ tinh sạch cao đại diện cho toàn bộ các mẫu thu thập đƣợc

ký hiệu và sử dụng làm khuôn mẫu để thực hiện PCR. Việc khuếch đại đƣợc thực hiện theo mẻ riêng cho từng mồi.

Sản phẩm khuếch đại đƣợc phân tách trên gel agarose 2%, sử dụng đệm TBE

với điện thế 60 Volt trong 3 giờ, gel sau điện di đƣợc nhuộm với ethidium bromide

(0,5 µg/ml), và đƣợc chụp ảnh dƣới các ánh sáng cực tím có bƣớc sóng 254/312 nm bằng hệ thống Micro Doc Gel Documentation (Cleaver Scientific, Mỹ).

2.3.5.2. Phân tích đa dạng và biến động di truyền dựa trên các DNA

fingerprint thu nhận đƣợc

Bởi chỉ thị ISSR mang tính trội, mỗi dãy band DNA trên gel sau điện di đƣợc

xem là đại diện cho một locus gồm hai allele (Williams và cộng sự, 1990). Các band

ISSR đƣợc ghi nhận về sự hiện diện (với ký hiệu là 1) hay vắng mặt (với ký hiệu là 0)

để lập ma trận dữ liệu nhị phân theo từng mồi sử dụng. Tổng hợp các ma trận nhị phân

theo mồi để xây dựng ma trận nhị phân tổng thể.

Phần mềm Microsoft Office Excel 2007 đƣợc sử dụng để tính toán các thông số về đa dạng và biến động di truyền. Các thông số này bao gồm: tỷ lệ phần trăm band đa

hình (percentage of polymorphic bands - PPB), mức độ dị hợp trông đợi trung bình/chỉ số đa dạng gene (the average expected heterozygosity - He), chỉ số biệt hóa di truyền giữa các tập hợp mẫu (gene differentiation among sample sets –GST), khoảng cách di truyền giữa các tập hợp mẫu (the genetic distance among sample sets - D) và chỉ số về

dòng gene hay số lƣợng cá thể di cƣ trung bình (Nm). Cụ thể nhƣ sau:

+ Tỷ lệ phần trăm band đa hình: công thức tính: PPB = npj/ntotal × 100

với PPB là tỷ lệ phần trăm band đa hình, npj là số lƣợng band đa hình và ntotal là tổng số band ghi nhận đƣợc (de Vicente và cộng sự, 2003).

Chỉ số này đƣợc tính toán ở các mức độ: mức độ tổng thể nghiên cứu (PPB đƣợc ký hiệu lại là PPBT) nếu phát hiện từ hai quần thể trở lên, mức độ quần thể (PPB đƣợc ký hiệu lại là PPBAB với AB là tên viết tắt của quần thể) và và mức độ các nhóm tuổi trong quần thể (PPB đƣợc ký hiệu lại là PPBABO với nhóm tuổi lớn và PPBABY với nhóm tuổi nhỏ).

+ Mức độ dị hợp trông đợi trung bình:

Lhj/L; hj = 1 – Σpi

Công thức tính: He = Σj

với hj là mức độ dị hợp tử của locus thứ j, pi là tần số của allele thứ i ở locus thứ j, He là mức độ dị hợp trông đợi trung bình cho tất cả các locus khảo sát và L là tổng số

locus. (de Vicente và cộng sự, 2003).

Phƣơng pháp tính toán này đƣợc áp dụng ở các mức độ sau: mức độ tổng thể taxon nghiên cứu (He đƣợc ký hiệu lại là HeT) nếu phát hiện nhiều quần thể, mức độ quần thể (He đƣợc ký hiệu lại là HeAB với AB là tên viết tắt của quần thể) và mức độ các nhóm tuổi trong quần thể (He đƣợc ký hiệu lại là HeAB O với nhóm tuổi lớn và HeAB Y với nhóm tuổi nhỏ).

+ Chỉ số biệt hóa di truyền giữa các tập hợp mẫu:

n (Ni × Hei)

Công thức tính: GST = (HeT – HeS)/ HeT; HeS = 1/N × Σi

với HeT là mức độ dị hợp trông đợi trung bình của tập hợp tất cả các mẫu khảo sát, HeS là mức độ di hợp giữa các tập hợp con của tập hợp lớn và GST là chỉ số biệt hóa di truyền giữa các tập hợp mẫu. N là tổng số mẫu khảo sát, n là số lƣợng tập hợp con, Ni là số lƣợng mẫu trong tập hợp con thứ i và Hei là mức độ di hợp trong đợi trung bình n Ni). (Mohammadi và Prasanna, 2003; de Vicente và của tập hợp con thứ i, (N = Σi cộng sự, 2003).

Việc tính toán chỉ số biệt hóa di truyền giữa các tập hợp mẫu đƣợc áp dụng ở

các mức độ khảo sát sau: mức độ giữa các quần thể trong tổng thể taxon nghiên cứu (GST đƣợc ký hiệu lại là GSTTaxon) nếu phát hiện nhiều quần thể và mức độ giữa các nhóm tuổi trong quần thể (GST đƣợc ký hiệu lại là GSTAB với AB là tên viết tắt của quần thể).

+ Khoảng cách di truyền giữa các tập hợp mẫu:

Khoảng cách di truyền từng cặp giữa các tập hợp mẫu đƣợc tính toán theo phƣơng

pháp tính khoảng cách di truyền của Nei (Nei‟s genetic distance) dựa trên khái niệm về

tính tƣơng đồng di truyền:

Với hai tập hợp mẫu X và Y thì:

DXY = -ln(IXY)

IXY= JXY/ √ (JX × JY)

với: JX và JY là độ đồng hợp tử trung bình lần lƣợt của tập hợp X và tập hợp Y.

JX = 1- HeX và JY = 1- HeY với HeX và HeY lần lƣợt là mức độ di hợp trông đợi

trung bình của tập hợp X và tập hợp Y.

JXY là giá trị đồng hợp trung bình giữa hai tập hợp mẫu X và Y. JXY đƣợc tính dựa vào tƣơng quan của nó với jXY là giá trị đồng hợp giữa hai tập hợp mẫu theo locus theo công thức: JXY = jXY / L

L là số locus khảo sát

jXY là tổng của tích các tần số allele giống nhau giữa hai tập hợp mẫu và đƣợc đƣợc tính theo công thức: jXY = ΣXYnk (pXnK × pYnK)

trong đó pXnK và pYnK lần lƣợt là tần số allele thứ K ở locus thứ n ở tập hợp mẫu X và tập hợp mẫu Y. (de Vicente và cộng sự, 2003).

Việc tính toán khoảng cách di truyền giữa các tập hợp mẫu đƣợc áp dụng ở các mức độ khảo sát sau: mức độ giữa các quần thể trong tổng thể taxon nghiên cứu (DXY đƣợc ký hiệu lại là DAB-A‟B‟ với với AB và A‟B‟ là tên viết tắt của cặp quần thể đƣợc ) nếu phát hiện nhiều quần thể và mức độ giữa các nhóm tuổi trong quần thể (DXY đƣợc ký hiệu lại là DAB O-Y với AB là tên viết tắt của quần thể).

+ Dòng gene di cƣ: Dòng gene di cƣ đƣợc tính toán theo phƣơng pháp không trực tiếp của Wright (1951), sử dụng chỉ số biệt hóa di truyền GST thay cho FST. Chỉ số về dòng di cƣ đƣợc tính theo công thức: Nm = (1-GST)/4GST

với N là số lƣợng tất cả cá thể trong tập hợp khảo sát, m là tỷ lệ di cƣ trung bình trong một thế hệ và GST là chỉ số biệt hóa di truyền GST giữa các tập hợp con trong tập hợp khảo sát (Jennifer và Hamrick, 2004).

Phần mềm chuyên dụng NTSYSpc 2.1 (Numerical Taxonomy and Multivariate

Analysis System software) (Rohlf, 2004) đƣợc sử dụng để tính toán hệ số tƣơng đồng

di truyền giữa các cặp mẫu khảo sát và xây dựng sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền

giữa các mẫu, sử dụng phƣơng pháp lập nhóm UPGMA. Các chỉ tiêu phân tích này

đƣợc tiến hành ở các cấp độ: tổng thể taxon nghiên cứu (nếu phát hiện từ hai quần thể

trở lên), quần thể và các nhóm tuổi trong quần thể.

2.3.6. Sơ bộ phân tích, so sánh thành phần saponin

Nhằm mục tiêu xác định sơ bộ taxon sâm Lang Bian có các thành phần saponin nhƣ ở một số taxon thuộc chi Panax hay không và so sánh thành phần hoạt chất chính với các taxon cùng chi khác, thí nghiệm đƣợc thiết kế nhƣ sau:

Chọn đối tượng để so sánh: đối tƣợng để so sánh về sơ bộ thành phần hóa học với taxon sâm Lang Bian phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng (ký hiệu là: PVL) là 2 taxon có quan hệ gần với nó gồm Panax vietnamensis (ký hiệu là: PV) và P. vietnamensis var. fuscidiscus (ký hiệu là: PVF) và hai biến thể dạng lá của loài P. stipuleanatus [lá

chét nguyên (ký hiệu là: PS) và lá chét xẻ (ký hiệu là: PSDL)], các taxon này đều có

phân bố tại Việt Nam.

Chọn nguyên liệu: nguyên liệu đƣợc chọn là thân rễ và rễ củ cây trƣởng thành trên 7 năm tuổi thu thập đƣợc thông qua quá trình điều tra, thu mẫu thuộc các taxon

Panax phân bố tự nhiên đã đƣợc phát hiện tại Việt Nam.

Chọn các hoạt chất phân tích: các hoạt chất phân tích là khoảng 3 – 6 chất sau: G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, M-R2. Nguồn chất chuẩn đƣợc điều chế từ nguồn dƣợc liệu tự nhiên với độ tinh khiết sắc ký trên 97%.

Phương pháp chiết xuất saponin: Các mẫu sâm đƣợc chiết kiệt hoạt chất bằng

thiết bị Soxhlet với dung môi chiết là methanol. Dịch chiết đƣợc cho bốc hơi dung môi

để thu cắn MeOH.

Phân tích định tính bằng sắc ký lớp mỏng:

Điều kiện sắc ký:

Bản mỏng tráng sẵn silicagel F254.

Dung dịch sắc ký: các chất chuẩn và các saponin toàn phần pha trong MeOH.

Hệ dung môi: n-butanol-Acetic acid-H2O theo tỷ lệ 7:2:1 Thuốc thử hiện màu: H2SO4 20%/EtOH 50%, sấy ở 105oC cho đến khi hiện

màu.

Chạy sắc ký cùng lúc 5 mẫu đại diện cho 5 taxon so sánh và 6 chất chuẩn, chụp

ảnh và so sánh vệt sắc ký giữa các mẫu và so với các chất chuẩn về thời gian lƣu (Rf).

Phƣơng pháp chiết xuất saponin và tiến hành phân tích định tính bằng sắc ký lớp

mỏng trên đƣợc cải biến từ phƣơng pháp tƣơng ứng của Hoàng Hải Anh và cộng sự

(2011).

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Vị trí phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian

và một số loài khác cùng chi dựa trên đặc điểm hình thái và trình tự DNA

bảo thủ

3.1.1. Vị trí phân loại thực vật của sâm Lang Bian dựa trên đặc điểm hình

thái

Đặc điểm hình thái của taxon sâm Lang Bian

Lang Bian đƣợc mô tả lại nhƣ sau:

Thông qua giải phẫu, quan sát, đo đạc và ghi ảnh, đặc điểm hình thái của sâm

Cây có dạng thân thảo, lâu năm, cao 50-90 cm. Thân rễ dạng đốt, thƣờng bò

ngang, đƣờng kính 1-2,5cm, các đốt xếp gần nhau với khoảng cách giữa các đốt từ 2-

5cm, mặt bên ngoài có màu nâu vàng. Rễ củ gắn vào phần dƣới của thân rễ, dạng

phồng lớn, có hình chóp hay gần nhƣ dạng hình nón, kích thƣớc 3-5 × 2-4cm. Thân

khí sinh thẳng, mảnh, nhẵn với phần lõi xốp, mang các lá kép chân vịt với 3, 4 hoặc

hiếm khi 5 lá kép mọc vòng ở đỉnh thân khí sinh, cuống lá kép dài 8-13cm, nhẵn,

không có lá kèm hay những phần phụ giống lá kèm.

Lá kép thƣờng gồm 5 lá chét (hiếm khi đến 7), gồm ba lá chét lớn liền nhau có

hình oval hay elip, kích thƣớc 10–12 × 4–5 cm; hai lá chét còn lại nhỏ hơn cũng có dạng oval-elip với kích thƣớc 4–5 × 2–3 cm; lá chét mang 5-8 gân thứ cấp, phiến dạng

màng, có lông ở các gân cả hai mặt lá; gốc lá dạng nêm hay hẹp dần, mép lá chét

thƣờng có răng cƣa, hiếm khi mang răng cƣa đôi; đầu lá chét có dạng mũi nhọn ngắn,

dài 8mm, cuống lá chét dài 8-11mm.

Cụm hoa dạng tán, khoảng 40-80 hoa, cuống cụm hoa dài 10-18cm, có tuyến. Các hoa có đƣờng kính 1,5-2cm, cuống hoa dài 4-6mm, đế hoa có dạng chén, đĩa bầu ban đầu dạng hơi lồi, màu xanh, sau đó chuyển sang dạng lồi hẳn lên và có màu vàng

nhạt; đài hoa 5, dạng tam giác, dài 0,45–0,55 mm, nhẵn; cánh hoa 5, dạng hình trứng ngƣợc, kích thƣớc 1,4 × 0,75 mm, nhẵn. Bao phấn 5, kích thƣớc 0,7–0,8 × 0,3–0,4 mm, chỉ nhị dài tƣơng đƣơng hay ngắn hơn cánh hoa; vòi nhụy 2 (hiếm khi 1), kích thƣớc 0,6–0,8 mm; bầu nhụy 2 ô, dài khoảng 1mm. Quả có dạng trứng, hơi dẹt, đƣờng

kính khoảng 4-5 mm, mang 1 (hiếm khi 2) hạt. Hạt chắc, dạng trứng với kích thƣớc 3,5–4,5 × 3–4 mm (hình 3.2, 3.3).

Vị trí phân loại của taxon sâm Lang Bian:

Đối chiếu với khóa phân loại của Hara (1970) cũng nhƣ Xiang và Lowry

(2007), có thể nhận thấy:

Với các đặc điểm: cụm hoa dạng tán; hoa nhỏ, mẫu 5 với 5 nhị xen kẽ với cánh

hoa, sâm Lang Bian thuộc họ Araliaceae.

Với các đặc điểm: cây thảo sống lâu năm; thân dạng củ; lá kép chân vịt mọc

vòng ở đỉnh thân khí sinh; hoa xếp lợp; bầu nhụy 2 ô, sâm Lang Bian thuộc chi Panax.

Hơn thế nữa, với thân rễ có dạng đốt, nên sâm Lang Bian rất gần với P.

vietnamensis var. vietnamenis và P. vietnamensis var. fuscidiscus theo quan điểm của

Hara (1970) cũng nhƣ Xiang và Lowry (2007).

Các đặc điểm khác biệt thể hiện giữa 3 taxon này thể hiện ở bảng 3.1 và hình

3.1 B1, B2, B3, B4, C1, C2, C3, C4.

Bảng 3.1. So sánh đặc điểm hình thái giữa sâm Lang Bian, P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus

Đặc điểm

Sâm Lang Bian

P. vietnamensis var. fuscidiscus

Kích thƣớc Gốc

P. vietnamensis var. vietnamensis 8-14 × 3-5 cm Không cân hoặc dạng nêm

5–18 × 2–5,5 cm Không cân hoặc dạng nêm

5–12 × 2–5 cm Dạng nêm hay hẹp dần, lan dọc xuống đến gần gốc cuống

Lá chét

Chiều dài mũi Chiều dài cuống

Chiều dài cuống hoa Số lƣợng hoa trên tán Kích thƣớc cánh hoa Hình dạng đĩa bầu Số lƣợng vòi nhụy

0,8 cm 0,8–1,1 cm 0,4-0,6 cm 40–80 0,75 × 1,4 mm Lồi rõ 2 (–1)

1,5–2,0 cm 0,3 – 2 cm 1,5–2,0 cm 50–120 1 × 2 mm Lõm 1 (–2–3)

2,0–2,5 cm 0,3–2 cm 1–2 cm. 70–100 1 × 2,5 mm Phẳng 1 (–2)

Điểm khác biệt giữa sâm Lang Bian, P. vietnamensis và P. vietnamensis var.

fuscidiscus đƣợc thể hiện qua hình 3.1.

Những khác biệt về hình thái giữa sâm Lang Bian, P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus cho thấy chúng là ba taxon riêng rẽ có quan hệ gần nhau và cũng nhƣ P. vietnamensis var. fuscidiscus, sâm Lang Bian có thể là một variete của

P. vietnamensis. Để chứng minh sâm điều này, cần phân tích thêm các dữ liệu về trình

tự các vùng bảo thủ cao nhƣ 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2, gene matK….

Hình 3.1. So sánh hình thái giữa sâm Lang Bian, Panax vietnamensis và Panax vietnamensis var. fuscidiscus Panax vietnamensis (từ vùng núi Ngọc Linh) - A1: các lá chét – A2: mép lá chét dạng răng cƣa đôi– A3: Cuống lá. – A4: Đĩa bầu; Panax vietnamensis var. fuscidiscus (Từ biên giới giữa Huyện Sìn Hồ, Tỉnh Lai Châu, Việt Nam với Tỉnh Vân Nam, Trung Quốc – B1: Các lá chét. – B2: mép lá chét có răng cƣa. – B3: Cuống lá. – B4: Đĩa bầu; Sâm Lang Bian – C1: các lá chét. – C2: mép lá chét có răng cƣa. – C3: Cuống lá. – C4: Đĩa bầu.

Hình 3.2. Hình vẽ mô tả đặc điểm thực vật học của sâm Lang Bian A: rễ; B: thân; C: lá kép với 3 lá chét lớn (C1) và hai lá chét nhỏ (C2); D: cuống hoa;

E-F: hoa; G: cánh hoa; H: Đĩa bầu và vòi nhụy; I: nhị; J: quả – M: Quả. Hình vẽ của

Trần Văn Tiến dựa trên holotype.

Hình 3.3. Ảnh chụp đặc điểm thực vật học của sâm Lang Bian

A: Sinh cảnh. - B-C: Thân, lá chét mang tán hoa– D: thân rễ. – E: Tán hoa. - F, H-I:

Hoa. – G: Cuống hoa. - J: cánh hoa. - K: Đĩa bầu và vòi nhụy – L: Nhị. – M: Quả.

Ảnh của Nông Văn Duy.

3.1.2. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng

chi dựa trên các trình tự bảo thủ

3.1.2.1. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon

cùng chi dựa trên vùng gene matK

Sản phẩm khuếch đại PCR trình tự một phần vùng gene matK, phân lập, tinh

sạch và giải trình tự, thu đƣợc trình tự của các taxon nghiên cứu thể hiện trong bảng

(bảng 2.3). Các trình tự này có độ dài 894 – 1003 nucleotide trong khi độ dài trông đợi là 818 nucleotide để có thể so sánh với các trình tự tƣơng ứng từ Genbank.

M 1 2 3 4 M 5 6 7 8 M M’

Ghi chú: M: thang 100bp; M‟: thang 1.000bp; 1: Panax vietnamensis; 2: P. vietnamensis var. fuscidiscus; 3: P. stipuleanatus; 4: P. bipinnatifidus; 5, 6 & 7: P. sp.; 8: Polyscias fruticosa.

Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự một phần gene matK

Các trình tự vùng gene matK đƣợc thu thập từ Genbank để sử dụng làm chuẩn

nội gồm: các trình tự AB044906 và KJ418206 thuộc taxon P. vietnamensis; các trình tự AB088004.1 và KJ418212.1 cho taxon P. vietnamensis var. fuscidiscus; trình tự

HQ113050.1 thuộc taxon P. bipinnatifidus; trình tự HQ113079.1 thuộc taxon P. stipuleanatus.

Trình tự HQ113077 thuộc taxon P. quinquefolius, HQ113071.1 thuộc taxon P. japonicus và HQ113076.1 với taxon P. pseudoginseng từ Genbank là các trình tự một phần gene matK (818 nucleotide) đƣợc khuếch đại cùng phƣơng pháp với nghiên cứu trong báo cáo này, đƣợc nhóm tác giả Wen và Zimmer (1996) cũng nhƣ Zuo và

cộng sự (2011) công bố trong các nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại và xác

lập các DNA barcode trong chi Panax, trong nghiên cứu này đƣợc sử dụng để so sánh,

lập nhóm, xây dựng quan hệ phát sinh chủng loại của đối tƣợng nghiên cứu và các taxon cùng chi.

Sau khi căn trình tự, nhận thấy các trình tự một phần vùng gene matK ở 03 mẫu

của sâm Lang Bian là giống hệt nhau hoàn toàn, do vậy chỉ chọn một trình tự trong số

đó để nghiên cứu. Xác lập vùng 818 nucleotide tƣơng ứng với tất cả các taxon, thu đƣợc các trình tự với đặc trƣng về thành phần nucleotide thể hiện trong bảng 3.2.

Qua bảng 3.2 cho thấy rằng thành phần Nucleotide có sự biến động nhỏ giữa

các taxon khảo sát, sâm Lang Bian đặc trƣng bởi thành phần T thấp nhất.

Tiến hành rà soát, so sánh, có thể nhận thấy rằng dựa vào trình tự một phần

vùng gene matK thì sâm Lang Bian khác với các taxon cùng chi đƣợc so sánh tại các

vị trí thể hiện trong bảng 3.3.

Khi xét trên trình tự vùng gene matK, không tìm thấy trình tự nào công bố cho

loài P. bipinnatifidus trực tiếp trên Genbank, nhƣng số hiệu truy cập trình tự vùng

gene matK ghi trong công bố của Zuo và cộng sự (2011) đối với loài này lại mã hóa cho taxon P. japonicus var. bipinnatifidus. Theo Nguyễn Tập (2007), thực tế hai tên

khoa học P. bipinnatifidus và P. japonicus var. bipinnatifidus cùng đƣợc sử dụng để

chỉ cùng 1 taxon.

Những sai khác thể hiện trong bảng 3.3 dẫn đến khoảng cách di truyền giữa các

trình tự so sánh trong bảng 3.4.

Dựa trên kết quả từ bảng 3.3 và bảng 3.4 có thể nhận thấy trình tự một phần

gene matK đƣợc khuếch đại trong nghiên cứu này đối với hai taxon P. vietnamensis

cũng nhƣ P. vietnamensis var. fuscidiscus trong nghiên cứu này tƣơng đồng hoàn toàn

(khoảng cách di truyền bằng 0) với các trình tự của các taxon tƣơng ứng theo kết quả nghiên cứu của Komatsu và cộng sự (2003) cũng nhƣ Phan Kế Long và cộng sự

(2013). Do đó, các trình tự từ các mẫu tự thu thập đƣợc sử dụng để đại diện cho hai

taxon này trong quá trình nghiên cứu tiếp theo.

Với các trình tự có đƣợc sau khi loại bỏ các chuẩn nội tƣơng đồng hoàn toàn, tiến hành phân tích về mối quan hệ phát sinh chủng loại, thu đƣợc các cây quan hệ phát sinh chủng loại ở hình 3.5 và 3.6.

Bảng 3.2. Thành phần và số lƣợng nucleotide các trình tự một phần gene matK ở các taxon đƣợc khảo sát

Taxon đƣợc khảo sát T (%) C (%) Thành phần Nucleotide A (%) G (%)

Panax sp. (KX768328) P. vietnamensis var. fuscidiscus (KX768332) P. stipuleanatus (KX768329) P. bipinnatifidus (KX768330) P. vietnamensis (KX768331) P. vietnamensis (*-AB044906) P. vietnamensis (**-KJ418206.1) P. quinquefolius (*-HQ113077.1) P. japonicus (*-HQ113071.1) P. stipuleanatus (*-HQ113079.1) P. vietnamensis var. fuscidiscus (*-AB088004.1) P.vietnamensis var. fuscidiscus (**-KJ418212.1) P. pseudoginseng (*-HQ113076.1) P. bipinnatifidus (*-HQ113050.1) Polyscias fruticosa (KX768333) 19,6 19,6 19,2 19,2 19,6 19,6 19,6 19,4 19,4 19,2 19,6 19,6 18,9 19,6 19,7 29,5 29,5 30,0 30,0 29,3 29,3 29,3 29,6 29,6 30,0 29,5 29,5 30,1 29,5 29,6 Tổng số nucleotide 818 818 818 818 818 818 818 818 818 818 818 818 818 818 818 16,1 16,0 15,3 15,3 16,1 16,1 16,1 15,9 15,9 15,3 16,0 16,0 16,0 16,0 15,8 34,8 35,0 35,6 35,6 35,0 35,0 35,0 35,1 35,1 35,6 35,0 35,0 35,0 35,0 35,0

Taxon khảo sát

Vị trí 76 126 128 133 159 163 170 258 332 347 409 425 430 539 600 611 641 721 734 762 785 793 T G A G C G G G G C A T C C

T G C C C G C

. A

. A C

T C A A A

. A

. A C

T C A A A

. A

. A C

T C A A A

. A

G G G A

T A

C A A A

. A

Bảng 3.3. Những vị trí khác biệt ở trình tự một phần gene matK của đối tƣợng nghiên cứu so với các taxon khác cùng chi

Bảng 3.4. Khoảng cách di truyền giữa các taxon đƣợc khảo sát dựa trên trình tự một phần vùng gene matK

TAXON (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12)

(1)

(2) 0,0025

(3) 0,0203 0,0177 (4) 0,0203 0,0177 0,0000 (5) 0,0012 0,0012 0,0190 0,0190

(6) 0,0012 0,0012 0,0190 0,0190 0,0000

(7) 0,0012 0,0012 0,0190 0,0190 0,0000 0,0000

(8) 0,0049 0,0025 0,0177 0,0177 0,0037 0,0037 0,0037

(9) 0,0049 0,0025 0,0177 0,0177 0,0037 0,0037 0,0037 0,0000

(10) 0,0203 0,0177 0,0000 0,0000 0,0190 0,0190 0,0190 0,0177 0,0177

(11) 0,0025 0,0000 0,0177 0,0177 0,0012 0,0012 0,0012 0,0025 0,0025 0,0177

(12) 0,0025 0,0000 0,0177 0,0177 0,0012 0,0012 0,0012 0,0025 0,0025 0,0177 0,0000

(13) 0,0177 0,0151 0,0151 0,0151 0,0164 0,0164 0,0164 0,0151 0,0151 0,0151 0,0151 0,0151

(14) 0,0025 0,0000 0,0177 0,0177 0,0012 0,0012 0,0012 0,0025 0,0025 0,0177 0,0000 0,0000 Panax sp. (KX768328) P. vietnamensis var. fuscidiscus (KX768332) P. stipuleanatus (KX768329) P. bipinnatifidus (KX768330) P. vietnamensis (KX768331) P. vietnamensis (*-AB044906) P. vietnamensis (*-KJ418206.1) P. quinquefolius (*-HQ113077.1) P. japonicus (*-HQ113071.1) P. stipuleanatus (*-HQ113079.1) P. vietnamensis var. fuscidiscus (*-AB088004.1) P. vietnamensis var. fuscidiscus (*-KJ418212.1) P. pseudoginseng (*-HQ113076.1) P. bipinnatifidus (*-HQ113050.1)

Hình 3.5. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood Ghi chú: Giá trị tại các nút trong các cây quan hệ phát sinh chủng loại là giá trị bootstrap, thể hiện giá trị % số lần các taxon trong nút lập nhóm với nhau. Thƣớc bên dƣới thể hiện khoảng cách di truyền.

Hình 3.6. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining

Có thể nhận thấy các nhóm chính trong các cây quan hệ phát sinh chủng loại là:

- Nhóm 1: gồm Sâm Lang Bian (Panax sp.), P. vietnamensis; P. vietnamensis var. fuscidiscus và chuẩn nội P. bipinnatifidus (P. japonicus var. bipinnatifidus - HQ113050.1.). Chính vì sự lập nhóm của Panax sp. Với hai taxon P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus dựa trên trình tự một phần vùng gene matK, vị trí địa lý giữa nơi phấn bố đối tƣợng nghiên cứu là gần nơi phân bố của P. vietnamensis nhất, mặt khác giữa đối tƣợng nghiên cứu với P. bipinnatifidus có những hình thái khác biệt rõ ràng nên kết quả nghiên cứu có đƣợc có thể xem là một trong những cơ sở để cho thấy đề xuất sâm Lang Bian thành một thứ (variety) của P. vietnamensis là hợp lý. Kết quả rà soát lại các trình tự cho thấy thấy taxon đang nghiên cứu khác với P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus tại các vị trí thể hiện trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Sự khác biệt giữa trình tự gene matK giữa Panax sp., P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus

TAXON

Vị trí 221 388 469 535 558 566 593 594 602 T C A C C G

C A

G A

C A

G A

C T

Panax sp. ( KX768328) P. vietnamensis ( KX768331) P. vietnamensis var. fuscidiscus (KX768332)

- Nhóm 2: gồm P. japonicus và P. quinquefolius (Genbank)

- Nhóm 3: gồm P. pseudoginseng (Genbank), P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus

thu thập tại Việt Nam và P. stipuleanatus (số truy cập HQ113079.1 từ Genbank).

Điều có vẻ nhƣ bất hợp lý trong cây quan hệ phát sinh chủng loại nói trên là

việc chuẩn ngoại (outgroup) đƣợc chọn lại không tách thành nhóm riêng biệt mà xen vào giữa nhóm 3 và các nhóm còn lại. Điều này khiến hình thành nên giả thiết là trong

chi Panax, riêng nhóm gồm các taxon P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus thu thập tại

Việt Nam, P. stipuleanatus và P. pseudoginseng (từ Genbank) có cấu trúc gene matK tƣơng đối tách biệt so với các taxon còn lại. Để chứng minh điều này, các trình tự matK tƣơng ứng từ các loài khác chi trong họ Araliaceae gồm: Hedera helix;

Eleutherococcus senticosusgi; Aralia racemosa; Dendropanax dentiger từ Genbank đƣợc sử dụng để phân tích cùng với các taxon thuộc chi Panax và Polyscias fruticosa.

Kết quả phân tích lập nhóm theo phƣơng pháp Maximum likelihood và

Neiborgh joining đƣợc thể hiện trong các hình 3.7 và 3.8.

Hình 3.7. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood sử dụng 5 chuẩn ngoại

Hình 3.8. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining sử dụng 5 chuẩn ngoại

Kết quả trên chỉ ra rằng cho dù có thay đổi taxon chuẩn ngoại, các taxon P.

stipuleanatus, P. bipinnatifidus đƣợc thu thập tại Việt Nam cùng với P. stipuleanatus

và P. pseudoginseng vẫn lập thành nhóm riêng tách với các taxon còn lại. Các taxon sử dụng làm chuẩn ngoại cũng không thể hiện việc tách biệt riêng khỏi các taxon thuộc

chi Panax dựa trên trình tự một phần của vùng gene matK.

Tuy vậy, khi nâng số lƣợng các chuẩn ngoại cùng họ Araliaceae nhƣng không

thuộc chi Panax để xem xét mối tƣơng quan trong hệ thống lớn hơn thì các taxon khảo sát thuộc chi Panax lập nhóm với nhau và tách riêng khỏi các chuẩn ngoại. Nghĩa là

taxon là Polyscias fruticosa đƣợc chọn vẫn thể hiện đƣợc vai trò là chuẩn ngoại khi

xem xét các taxon khảo sát trong tổng thể lớn hơn, và khi đó các cây quan hệ phát sinh

chủng loại đƣợc xây dựng lại không nằm ngoài hệ thống học thực vật truyền thống đối

với họ Araliaceae. Điều này đƣợc chứng minh khi đƣa thêm các trình tự đƣợc lấy từ

Genbank gồm: Schefflera elegantissima, Macropanax undulatusgi, Tetrapanax

papyrifer vào phân tích lập nhóm cùng với tập hợp các taxon thuộc chi Panax đƣợc

khảo sát và 5 chuẩn ngoại đã sử dụng trong phần trên. Các cây quan hệ phát sinh

chủng loại dựa trên 8 chuẩn ngoại đƣợc thể hiện trong hình 3.9 và 3.10.

Hình 3.9. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood sử dụng 8 chuẩn ngoại

Hình 3.10. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining sử dụng 8 chuẩn ngoại.

Nhƣ vậy, trình tự một phần vùng gene matK có thể dùng để nhận dạng sự khác

biệt giữa các nhóm taxon đang nghiên cứu với các taxon đƣợc so sánh, tuy nhiên

không thể hiện sự sai biệt giữa hai taxon: P. vietnamensis var. fuscidiscus và P.

japonicus var. bipinnatifidus. Mặt khác, nó chỉ ra rằng taxon P. bipinnatifidus mà đƣợc

thu thập tại Việt Nam có sai khác lớn so với P. japonicus var. bipinnatifidus. Taxon

Polycias fruticosa thể hiện vai trò chuẩn ngoại khi đƣợc xem xét trong tổng thể lớn

hơn bao gồm nhiều taxon khác cùng họ nhƣng khác chi Panax.

3.1.2.2. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon

cùng chi dựa trên vùng trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2

Sau khi khuếch đại PCR trình tự toàn bộ vùng ITS1 – 5,8S rRNA - ITS2, phân lập, tinh sạch sản phẩm và giải trình tự, đặc điểm trình tự của các taxon nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng 2.3. Các trình tự này có độ dài 901 – 998 nucleotide trong khi độ dài trông đợi là 608 nucleotide để có thể so sánh với các trình tự tƣơng ứng từ Genbank.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 M’

Ghi chú: M: thang 100bp; M‟: thang 1.000bp; 1: Panax vietnamensis; 2: P. vietnamensis var. fuscidiscus; 3: P. stipuleanatus; 4: P. bipinnatifidus; 5, 6 & 7: P. sp.; 8: Polyscias fruticosa.

Các trình tự vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 đƣợc lấy từ Genbank để làm chuẩn nội gồm: trình tự AY271924 (Lee và Wen, 2004), KJ418195.1 (Phan Kế Long và cộng sự, 2013), JF772119.1 và JF772118.1 (Nguyễn Thị Phƣơng Trang và cộng sự, 2011) thuộc taxon P. vietnamensis; trình tự KJ418192.1 thuộc taxon P. vietnamensis var. fuscidiscus (Phan Kế Long và cộng sự, 2013); trình tự U41678.1 (Wen và Zimmer, 1996) thuộc taxon P. bipinnatifidus và U41695, HQ112441 (Zuo và cộng sự, 2011) đối với P. stipuleanatus.

Hình 3.11. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2

Các trình tự HQ112440.1 thuộc taxon P. quinquefolius, HQ112432.1 thuộc taxon P. japonicus và HQ112438.1 thuộc taxon P. pseudoginseng: trình tự toàn bộ vùng ITS1-5.8S rRNA –ITS2 do Wen và Zimmer (1996) cũng nhƣ Zuo và cộng sự (2011) công bố trong các nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại và xác lập các DNA barcode trong chi Panax, đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này để so sánh, lập nhóm, xây dựng quan hệ phát sinh chủng loại giữa đối tƣợng nghiên cứu và các taxon trong chi Panax.

Kết quả căn trình tự cho thấy các trình tự một phần vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 ở 03 mẫu của đối tƣợng nghiên cứu là giống hệt nhau hoàn toàn, do vậy chỉ chọn một trình tự trong số đó để nghiên cứu.

Kết quả khảo sát các trình tự có đƣợc cho thấy các trình tự ITS1-5,8S rRNA-

ITS2 của Nguyễn Thị Phƣơng Trang và cộng sự (2011) cũng nhƣ Phan Kế Long và cộng sự (2013) công bố với P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus không đủ mà chỉ có một phần ITS2, thiếu từ 19 đến 59 nucleotide ở đầu 3‟. Khi loại bỏ 59

nucleotide đầu 3‟ ở các trình tự đƣợc sử dụng để so sánh thì tự trình tự ITS1-5,8S

rRNA-ITS2 của taxon P. vietnamensis var. fuscidiscus đƣợc thu thập và giải trình tự

trong nghiên cứu này tƣơng đồng hoàn toàn với trình tự tƣơng ứng của các tác giả nêu trên.

Ngay các trình tự KJ418192.1, JF772119.1 và JF772118.1 do Phan Kế Long và

cộng sự đăng ký trên Genbank cho taxon P. vietnamensis cũng sai biệt nhau 0,1% -

0,4% và khác với trình tự đăng ký Genbank của Lee và Wen (2004) từ 0,9 đến 1,1%.

Trình tự P. vietnamensis trong nghiên cứu này khác với trình tự của nhóm Phan

Kế Long đăng ký từ 0,4 đến 0,6%, khác với trình tự của Lee và Wen (2004) 1,3%.

Chi tiết các điểm khác biệt này thể hiện trong bảng 3.6.

Bảng 3.6. So sánh trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các mẫu thuộc taxon Panax vietnamensis từ các nguồn khác nhau

Vị trí Trình tự 104 176 218 384 402 404 408 416 438 532

P.vietnamensis (KX768325) G G A A A T C A G C

P.vietnamensis (*-AY271924.1) A A . G C G G . . .

P.vietnamensis (*-KJ418195.1) . . G . . . . . . .

P.vietnamensis (*-JF772119.1) . . G . . . C . . .

P.vietnamensis(*-JF772118.1) . G G . . . . . . .

Kết quả từ bảng trên cho thấy trình tự AY271924.1 cho P. vietnamensis do Lee

và Wen (2004) công bố có rất nhiều khác biệt với trình tự còn lại theo công bố của

Phan Kế Long và cộng sự (2013) và trình tự có đƣợc từ nguồn mẫu thu thập đƣợc

trong nghiên cứu này (KX768325). Khi truy nguồn gốc mẫu thì trình tự AY271924.1 có nguồn gốc từ mẫu vật thu tại Vân Nam, Trung Quốc. Theo ghi nhận của tác giả Shu và cộng sự (2003) thì taxon phân bố tự nhiên nơi đây lại là Panax vietnamensis var.

fuscidiscus, do đó chúng tôi không đủ cơ sở để so sánh. Điểm khác biệt rõ nhất giữa các trình tự KX768325 và tổng thể các trình tự theo Phan Kế Long và cộng sự (2013) là vị trí 384 đối với taxon P. vietnamensis (A so với G), còn lại đa số đều trùng khớp giữa các mẫu. Khi truy nguyên nguồn gốc mẫu, cả mẫu thu thập trong nghiên cứu này và mẫu do nhóm Phan Kế Long thu thập đều từ vùng nguyên sản của P. vietnamensis, tuy vậy mẫu mẫu thu thập trong nghiên cứu này là từ Kon Tum còn mẫu do nhóm Phan Kế Long thu là từ Quảng Nam, đây có thể xem là hai vùng sinh thái khác nhau 77

đối với taxon P. vietnamensis và có sự lệch mùa sinh trƣởng giữa hai khu vực (Lê

Ngọc Triệu, 2000). Từ những phân tích trên, trình tự ITS1 - 5,8S rRNA – ITS2 cho

taxon P. vietnamensis đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại là trình tự KX768325.

Sau khi căn trình tự, xác lập vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 tƣơng ứng với tất cả

các trình tự đại diện cho các taxon đƣợc chọn để khảo sát, thu đƣợc các trình tự với

đặc trƣng về thành phần nucleotide nhƣ trong bảng 3.7.

Bảng 3.7. Thành phần, số lƣợng nucleotide các trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2

Thành phần Nucleotide

TAXON

T (%) C (%) A (%) G (%)

Tổng số nucleotide

Panax sp. (KX768322)

18,1

31,4

21,4

29,1

608

P. vietnamensis var. fuscidiscus (KX768326)

31,1

22,0

28,8

608

18,1

P. stipuleanatus (KX768323)

31,8

21,6

28,5

607

18,1

P. bipinnatifidus (KX768324)

31,8

21,6

28,5

607

18,1

P. vietnamensis (KX768325)

31,3

21,7

28,8

608

18,3

P. vietnamensis (*-AY271924.1)

31,4

21,7

28,9

608

17,9

P. stipuleanatus (*-U41695)

31,8

21,6

28,5

607

18,1

P. bipinnatifidus (*-U41678.1)

31,4

21,7

28,6

595

18,3

P. quinquefolius (*-HQ112440.1)

31,1

21,6

29,0

607

18,3

P. japonicus (*-HQ112432.1)

30,4

22,1

28,7

606

18,8

P. stipuleanatus (***-HQ112441)

31,5

21,6

28,5

606

18,3

P. pseudoginseng (*-HQ112438.1)

31,4

22,6

27,8

605

18,2

Polyscias fruticosa (KX768327)

31,8

21,3

29,3

611

17,7

khảo sát

Tiến hành rà soát, so sánh, có thể nhận thấy rằng dựa vào trình tự vùng ITS1- 5,8S rRNA –ITS2 thì sâm Lang Bian khác với các taxon đƣợc so sánh cùng chi tại các vị trí nhƣ trong bảng 3.8.

Bảng 3.8. Những vị trí khác biệt ở trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 của sâm Lang Bian so với các taxon cùng chi

14 29 42

Taxon Vị trí 43

. . . C . C . . . C . . .

54 60 82 (1) T C A T G G T (2) . . . . . (3) C . A . . (4) C . A . . (5) . . . . . (6) C . A . . (7) . . . . C . (8) . . . . . . (9) . . T . . . (10) C . C C A C .

109

104

103

112

116

115

101

128

175

139

176

162

179

151

Taxon

. .

. . . . . A . . A . . . . . A . - A . A . . A A . . . . . . . .

Vị trí 83 182 117 G A C G T G G C T C C C T C G C C (1) . . . . . (2) . . . T T C A (3) . . . T T C A (4) . . . . . (5) . . . T T C A (6) . . . . . . . T (7) . . . . . . . . (8) . T - . . . A . (9) . A . . T T C . (10) A . . . . . . T A . . T A . . . . . . T A . . A . . A . A . . A C . . . . . . . . . . . . - . - T - . C T A

364

203

404

407

406

274

414

217

384

281

400

340 350

189 201

Vị trí Taxon

. .

. . .

178 416 C G C G A G G C C C G C T A T C C . . . . . . . . . . . T - C C G . . . . T - C C G . . . . . . . . . . . T - C C G . . C - . . . T . T T . C . . . . T . . C . . A . . - C C G . .

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A T . A . . . . . A . . . - . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . - . . . . . . . . - . . .

498

496

493

489

476

470

462

444

429

465

481

466 467

418 425

Vị trí Taxon

. . . C . C . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

417 509 A C C G A G C G C T C G T C T G A . . . . . . . . . . T . C . T . . . T . C . T . . . . . . . . . . . T . C . T . . A . . . - G - . . . . . . G . . . . . . G . . . . A A T C A . . . . T

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) . T . . . T . . T . T . . . T . . C . . . . T . . . T . . . . . - . . . . . . . . - . . .

587

548

598

596

592

589

554

562

564

590

532 546

Taxon

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) Vị trí 526 582 583 600 A C C G C G A G T G C G C G T C . . . A . C . . . . . T A C . . . . . T A C . . . . . C . . . . . T A C . C . . G - . . . C T . . . . . . C T . . . . . . C T . T . . T . . A . A G . A G . . T . A G . . . . . . . . . . . T . A A . . . . . A . . . . - . . . . . A . . . . . . . . . . - C . . . . . . . . . . . . . . -

Kết quả từ bảng 3.7 và 3.8 cho thấy trình tự và thành phần nucleotide vùng

ITS1–5,8SrRNA–ITS2 biến động mạnh trong tập hợp các taxon khảo sát. Số lƣợng

nucleotide dao động từ 595 đến 608 nucleotide trong chi Panax, ở chuẩn ngoại Polyscias fruticosa số lƣợng này lên đến 611 nucleotide. Điều này cho thấy vùng

ITS1–5,8SrRNA–ITS2 thể hiện tiềm năng lớn trong việc phân biệt các taxon và nhóm taxon trong chi Panax. Sâm Lang Bian có số lƣợng nucleotide thuộc vùng ITS1 ITS1– 5,8SrRNA–ITS2 giống với P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus. Đây có thể xem là một trong các cơ sở cho thấy ba taxon này có quan hệ gần với nhau. Những

sai khác trên dẫn đến khoảng cách di truyền giữa các trình tự so sánh trong bảng 3.9.

Bảng 3.9. Khoảng cách di truyền giữa các taxon khảo sát dự trên trình tự vùng ITS1–5,8SrRNA–ITS2

Taxon (2) (1) (8) (5) (7) (3) (4) (9) (6)

Panax sp. (KX768322) P. vietnamensis var. fuscidiscus (KX768326) P. stipuleanatus (KX768323) P. bipinnatifidus (KX768324) P. vietnamensis (KX768325) P. stipuleanatus (*-U41695) P. bipinnatifidus (*-U41678.1) P. quinquefolius (*-HQ112440.1) P. japonicus (*-HQ112432.1) P. pseudoginseng_(*-HQ112438.1) (1) (2) 0,0067 (3) 0,0217 0,0255 (4) 0,0217 0,0255 0,0000 (5) 0,0041 0,0041 0,0245 0,0245 (6) 0,0217 0,0255 0,0000 0,0000 0,0245 (7) 0,0101 0,0155 0,0256 0,0256 0,0127 0,0256 (8) 0,0066 0,0118 0,0216 0,0216 0,0092 0,0216 0,0067 (9) 0,0118 0,0154 0,0264 0,0264 0,0127 0,0264 0,0118 0,0066 (10) 0,0293 0,0314 0,0181 0,0181 0,0323 0,0181 0,0334 0,0274 0,0323

Xét trên khoảng cách di truyền dựa trên vùng ITS1–5,8SrRNA–ITS2 thì sâm Lang Bian có khác biệt từ 0,41 – 2,93% so

với các taxon khác cùng chi đƣợc so sánh, có khoảng cách di truyền gần nhất với P. vietnamensis và tiếp đến là P. quinquefolius

rồi theo P. vietnamensis var. fuscidiscus.

Các trình tự vùng ITS1–5,8SrRNA–ITS2 của các taxon P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus thu thập trong nghiên cứu này và P. stipuleanatus (U41695 đƣợc sử dụng trong nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại các taxon thuộc chi Panax do Wen

và Zimmer (1996) công bố trên Genbank) là tƣơng đồng nhau hoàn toàn trong khi chúng khác với trình tự của P. bipinnatifidus (U41678.1 cũng do các tác giả này công bố) ở mức 2,56%. Vấn đề tƣơng tự cũng đã thể hiện khi sử dụng các dữ liệu phân tử một

phần gene matK của nghiên cứu này: trình tự matK của P. bipinnatifidus thu thập trong nghiên cứu này không trùng khớp với trình tự P. japonicus var. bipinnatifidus từ Genbank mà tƣơng đồng hoàn toàn với các trình tự P. stipuleanatus khảo sát.

Với các trình tự có đƣợc, tiến hành phân tích về mối quan hệ phát sinh chủng

loại, kết quả là các cây quan hệ phát sinh chủng loại thể hiện trong các hình 3.12 và

3.13.

Hình 3.12. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA- ITS2 giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood

Hình 3.13. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA- ITS2 giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining

So với nghiên cứu của Wen và cộng sự (1996) (hình 2.1) thì sự lập nhóm trong

các cây quan hệ phát sinh chủng loại xây dựng đƣợc có những nét tƣơng đồng:

+ Các taxon P. japonicus, P. quinquefolius và P. bipinnatifidus lập nhóm với

nhau (nhóm A)

+ P. pseudoginseng và P. stipuleanatus là hai nhánh chính của một nhóm

(nhóm B) tách khỏi nhóm A.

+ Cấu trúc cây quan hệ phát sinh chủng loại có sự tƣơng đồng khi xét riêng ở

các taxon khảo sát trong nghiên cứu này.

So với nghiên cứu của Yang và cộng sự (2001) dựa trên trình tự ITS và 5,8S

rRNA, sự lập nhóm của các taxon khảo sát trong nghiên cứu này cũng có những điểm

tƣơng đồng nhất định: P. pseudoginseng và P. stipuleanatus vẫn hình thành chung một nhóm và tách khỏi nhóm còn lại gồm P. japonicus, P. quinquefolius và P.

bipinnatifidus (hình 3.13).

Hình 3.14. Cây quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon Panax theo Yang và

cộng sự (2001)

Có thể nhận thấy các nhóm chính trong các cây quan hệ phát sinh chủng loại

dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 trong nghiên cứu này (các hình 3.12 và 3.13) là:

- Nhóm 1: gồm sâm Lang Bian, P. vietnamensis và P. vietnamensis var.

fuscidiscus;

Chính vì sự lập nhóm chặt chẽ của sâm Lang Bian với hai taxon P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus dựa trên trình tự vùng ITS1-5,8S rDNA-ITS2, nên cần tiến hành rà soát lại vùng này. Kết quả rà soát cho thấy sâm Lang Bian khác với P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus tại các vị trí thể hiện trong bảng 3.10.

Bảng 3.10. Sai khác giữa sâm Lang Bian với Panax vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus dựa trên trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2

TAXON

Panax sp. P. vietnamensis P. vietnamensis var. fuscidiscus Vị trí 217 384 465 532 554 562 589 590 598 T A G C G A C A G C G C G C A A A C A T G C C T A C T

- Nhóm 2: gồm các taxon P. bipinnatifidus (số hiệu U41678.1 từ Genbank đã

đƣợc sắp xếp lại thành P. japonicus var. bipinnatifidus), P. quinquefolius và P.

japonicus;

- Nhóm 3: gồm P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus đƣợc thu thập trong nghiên

cứu này cùng với P. pseudoginseng và P. stipuleanatus (số hiệu U41695 từ Genbank).

Điểm khác biệt trong việc lập nhóm các taxon dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-

ITS2 so với dựa trên trình tự một phần gene matK là taxon P. bipinnatifidus

(U41678.1 từ Genbank) không lập nhóm với các taxon thuộc P. vietnamensis và sâm

Lang Bian nữa, thay vào đó, nó lập nhóm với P. quinquefolius và P. japonicus. Loài

Polyscias fruticosa đã thể hiện rõ vai trò chuẩn ngoại của mình khi tách biệt hẳn khỏi

các taxon thuộc chi Panax.

Nhƣ vậy, trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 có thể dùng để nhận dạng sai

khác giữa sâm Lang Bian với các taxon đƣợc so sánh, tuy nhiên không thể hiện sự sai biệt giữa hai taxon P. stipuleanatus và P. bipinnatifidus thu thập đƣợc trong nghiên

cứu này. Mặt khác, kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng taxon P. bipinnatifidus đã đƣợc ghi

nhận trên Genbank từ trƣớc và taxon P. bipinnatifidus đƣợc thu thập trong nghiên cứu

này có sự sai khác.

Trong các cây quan hệ phát sinh chủng loại thu nhận đƣợc, sâm Lang Bian đều lập nhóm gần nhất với P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus, trong khi

các taxon còn lại lập thành các nhóm khác có quan hệ phát sinh chủng loại xa hơn. Nhƣ vậy, dựa vào trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 có thể nhận thấy việc đề xuất sâm Lang Bian thành một thứ của P. vietnamensis là hợp lý.

3.1.2.3. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon

cùng chi khác dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA

Sau khi khuếch đại PCR trình tự vùng gene 18S rRNA, phân lập, tinh sạch sản

phẩm và giải trình tự, trình tự của các taxon nghiên cứu có phân bố tại Việt Nam đƣợc 84

thể hiện trong bảng 2.2. Các trình tự này có độ dài 1873 – 1912 nucleotide trong khi

độ dài trông đợi là 1808 - 1809 nucleotide để có thể so sánh với các trình tự tƣơng

ứng.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 M

Ghi chú: M: thang 1.000bp; 1: Panax vietnamensis; 2: P. vietnamensis var. fuscidiscus; 3: P. stipuleanatus; 4: P. bipinnatifidus; 5, 6 & 7: P. sp.; 8: Polyscias fruticosa.

Hình 3.15. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự 18S rRNA

Các trình tự vùng gene 18S rRNA đƣợc thu thập từ Genbank để làm chuẩn nội

bao gồm: AB033635.1 thuộc taxon P. vietnamensis; AB080243.1 thuộc P.

vietnamensis var. fuscidiscus; AB044901.1 thuộc P. japonicus var. bipinnatifidus và

AB088025.1 thuộc taxon P. stipuleanatus.

Các trình tự D85172.1 thuộc taxon P. quinquefolius, D84100.1 thuộc taxon P.

japonicus và AB088026.1 thuộc taxon P. pseudoginseng là trình tự toàn bộ vùng gene

18S rNDA đƣợc các tác giả Komatsu và cộng sự (2013) cũng nhƣ Shu và cộng sự

(2013) công bố trong các nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong

chi Panax đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này để so sánh, lập nhóm, xây dựng quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon trong chi Panax.

Sau khi căn trình tự, xác lập vùng tƣơng ứng với tất cả các taxon, nhận thấy các trình tự vùng gene 18S rRNA ở 03 mẫu thuộc sâm Lang Bian giống hệt nhau hoàn toàn nên chỉ một trong số chúng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu tiếp theo. Các trình tự tƣơng ứng với các taxon khảo sát có đặc trƣng về thành phần nucleotide nhƣ trong bảng 3.11.

Bảng 3.11. Phành phần và số lƣợng nucleotide các trình tự vùng 18S rRNA ở các taxon đƣợc khảo sát

Thành phần Nucleotide

TAXON T (%) C (%) A (%) G (%) Tổng số nucleotide

Panax sp. – (KX768316) 25,6 22,1 25,0 27,3 1809

25,6 22,1 25,0 27,3 1809 P. vietnamensis var. fuscidiscus (KX768320)

P. stipuleanatus (KX768317) 25,6 22,1 25,1 27,3 1808

P. bipinnatifidus (KX768318) 25,6 22,1 25,1 27,3 1808

P. vietnamensis (KX768319) 25,6 22,1 25,0 27,3 1809

P. vietnamensis (*-AB033635.1) 25,6 22,1 25,0 27,3 1809

P. quinquefolius (*-D85172.1) 25,6 22,1 25,0 27,3 1809

P. japonicus (*-D84100.1) 25,7 22,0 25,0 27,3 1809

P. stipuleanatus (*-AB088025.1) 25,6 22,1 25,1 27,3 1808

25,6 22,1 25,0 27,3 1809 P. vietnamensis var. fuscidiscus (*-AB080243.1)

P. pseudoginseng (*-AB088026.1) 25,7 22,0 25,1 27,3 1808

25,7 22,1 25,0 27,3 1809 P. japonicus var. bipinnatifidus (*-AB044901.1)

Kết quả từ bảng 3.11 cho thấy trình tự vùng gene 18S rRNA khá tƣơng đồng nhau trong số các taxon khảo sát, tuy vậy xét về số lƣợng nucleotide vẫn có sự dao động: 1808 (P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus, P. pseudoginseng) và 1809 ở các taxon còn lại. Đáng lƣu ý là trình tự 18S rRNA ở taxon P. bipinnatifidus tại Việt Nam thu thập trong nghiên cứu này (KX768318) đƣợc trông đợi là có số nucleotide giống với P. japonicus var. bipinnatifidus (*-AB044901.1) nhƣng cũng chỉ có 1808 nucleotide.

Các trình tự chuẩn nội của P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus là tƣơng đồng hoàn toàn so với các trình tự tƣơng ứng từ nguồn mẫu tự thu thập.

Tiến hành rà soát, so sánh, có thể nhận thấy rằng dựa vào trình tự vùng gene 18S rRNA thì sâm Lang Bian khác với các taxon đƣợc so sánh cùng chi tại các vị trí thể hiện trong bảng 3.12.

Bảng 3.12. Các vị trí khác biệt giữa các taxon Panax khảo sát dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA

Taxon khảo sát Vị trí 233 499 712 714 729

Panax sp. (KX768316) T C C C G

P. vietnamensis var. fuscidiscus (KX768320) . . . . .

P. stipuleanatus (KX768317) P. bipinnatifidus (KX768318) P. vietnamensis (KX768319) P. quinquefolius (*-D85172.1) C C . . - - . . . . . . . . . . . . . .

P. japonicus (*-D84100.1) P. stipuleanatus (*-AB088025.1) P. pseudoginseng (*-AB088026.1) T C C . - - T . A . . T . . T

P. japonicus var. bipinnatifidus (*-AB044901.1) T . . . .

Các vị trí có sự sai khác nucleotide giữa các taxon trong trƣờng hợp này là rất

ít, chứng tỏ tính bảo thủ cao ở mức độ của vùng gene 18S rRNA ở chi Panax. Trong

các nghiên cứu có trƣớc thì các sai khác nucleotide giữa các taxon xảy ra ở các vị trí

497, 499, 501 và 712 với các taxon P. ginseng, P. japonicus and P. quinquefiolius

(Fushimi và cộng sự, 1996); ở các vị trí 191, 233, 497, 499, 502, 683, 712, 714, 725,

729, 1718 với 13 taxon khảo sát, trong đó có P. japonicus, P. quinquefolius, P.

vietnamensis, P. vietnamensis var. fuscidiscus, P. pseudoginseng và P. stipuleanatus

(Shu và cộng sự, 2003). Kích thƣớc của vùng gene 18S rRNA trong các nghiên cứu

nói trên cũng là 1808 – 1809 bp. Nhƣ vậy, kết quả từ nghiên cứu này về các vị trí sai

khác nucleotide giữa các taxon cũng nhƣ kích thƣớc gene 18S rRNA là tƣơng đồng với

nghiên cứu của các tác giả đã nghiên cứu trƣớc đây.

Chính tính bảo thủ cao của vùng gene 18S rRNA dẫn đến khoảng cách di truyền giữa các taxon đƣợc khảo sát là thấp, kết quả cụ thể đƣợc thể hiện trong bảng

3.13.

Bảng 3.13. Khoảng cách di truyền giữa các taxon khảo sát dựa trên trình tự 18S rRNA

TAXON (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11)

(1)

(2) 0,0000

(3) 0,0006 0,0006 (4) 0,0006 0,0006 0,0000 (5) 0,0000 0,0000 0,0006 0,0006 (6) 0,0000 0,0000 0,0006 0,0006 0,0000 (7) 0,0000 0,0000 0,0006 0,0006 0,0000 0,0000 (8) 0,0011 0,0011 0,0011 0,0011 0,0011 0,0011 0,0011 (9) 0,0006 0,0006 0,0000 0,0000 0,0006 0,0006 0,0006 0,0011

(10) 0,0000 0,0000 0,0006 0,0006 0,0000 0,0000 0,0000 0,0011 0,0006

(11) 0,0022 0,0022 0,0017 0,0017 0,0022 0,0022 0,0022 0,0022 0,0017 0,0022

(12) 0,0006 0,0006 0,0006 0,0006 0,0006 0,0006 0,0006 0,0006 0,0006 0,0006 0,0022 Panax sp. (KX768316) P. vietnamensis var. fuscidiscus (KX768320) P. stipuleanatus (KX768317) P. bipinnatifidus (KX768318) P. vietnamensis (KX768319) P. vietnamensis (*-AB033635.1) P. quinquefolius (*-D85172.1) P. japonicus (*-D84100.1) P. stipuleanatus (*-AB088025.1) P. vietnamensis var. fuscidiscus (*-AB080243.1) P. pseudoginseng (*-AB088026.1) P. japonicus var. bipinnatifidus (*-AB044901.1)

Khoảng cách di truyền giữa sâm Lang Bian, P. vietnamensis, P. quinquefolius và P. vietnamensis var. fuscidiscus từ cả nguồn

tự thu thập hay lấy từ Genbank đều bằng không, nghĩa là chúng là tƣơng đồng nhau hoàn toàn.

Các taxon P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus đƣợc thu thập trong nghiên cứu này và P. stipuleanatus (lấy từ Genbank với mã

truy cập AB088025.1) cũng có trình tự vùng gene 18S rRNA tƣơng đồng nhau hoàn toàn, nhƣng khác với P. japonicus var. bipinnatifidus (lấy từ Genbank với mã truy cập AB044901.1). Điều này lại một lần nữa cho thấy mẫu đƣợc cho là P. bipinnatifidus

thu thập trong nghiên cứu này có sự tƣơng đồng với taxon P. stipuleanatus.

Sử dụng các trình tự có đƣợc để tiến hành phân tích về mối quan hệ phát sinh chủng loại, thu đƣợc các cây quan hệ phát sinh chủng loại thể hiện trong các hình 3.16 và 3.17.

Hình 3.16. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng gene 18S rRNA giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood

Hình 3.17. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng gene 18S rRNA giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining

Có thể nhận thấy các nhóm chính trong các cây là:

- Nhóm 1: sâm Lang Bian, P. vietnamensis, P. vietnamensis var. fuscidiscus và P. quinquefolius. Cơ sở cho sự lập nhóm của đối tƣợng nghiên cứu với nhóm hai taxon

P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus dựa trên trình tự vùng gene 18S

rRNA chính là sự tƣơng đồng hoàn toàn về trình tự.

- Nhóm 2: chỉ có P. japonicus var. bipinnatifidus

- Nhóm 3: chỉ có P. japonicus

- Nhóm 4: gồm P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus thu thập trong nghiên cứu

này và P. pseudoginseng và P. stipuleanatus (lấy từ Genbank với số hiệu lần lƣợt là

AB088026.1 và AB088025.1).

Sự lập nhóm các taxon dựa trên vùng gene 18S rRNA nhƣ trên có sai khác so

với sự lập nhóm các taxon dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2. Sai khác này thể hiện

qua việc P. quinquefolius thay vì lập nhóm với P. japonicus var. bipinnatifidus và P.

japonicus dựa trên trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 thì lại lập nhóm với Panax

sp., P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus. Khi sử dụng trình tự vùng

gene 18S rRNA để phân tích phát sinh thì hai taxon P. japonicus var. bipinnatifidus và

P. japonicus tách thành hai nhóm khác nhau.

Sử dụng trình tự vùng gene 18S rRNA, loài Polyscias fruticosa đã thể hiện rõ

vai trò chuẩn ngoại của mình khi tách biệt hẳn khỏi các taxon thuộc chi Panax. Có thể

nhận thấy giá trị bootstrap trong các cây quan hệ phát sinh chủng loại sử dụng dữ liệu

vùng 18S rRNA không cao.

Nếu chỉ dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA thì không thể phân biệt đƣợc các

taxon khác nhau trong chi, nhƣng bởi chính bản chất bảo thủ cao của trình tự này, nó lại đóng một vai trò quan trọng trong việc thể hiện sự lập nhóm với nhau của các

taxon.

Trong các cây quan hệ phát sinh chủng loại thu nhận đƣợc dựa trên trình tự gene 18S rRNA, sâm Lang Bian đều lập nhóm gần nhất với P. vietnamensis và P.

vietnamensis var. fuscidiscus.

3.1.2.4. Khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại dựa vào việc phối hợp các

vùng trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK

Từ các kết quả có đƣợc khi khảo sát riêng từng vùng trình tự bảo thủ riêng rẽ,

có thể đƣa ra một số nhận xét sau:

- Việc lập nhóm taxon thuộc chi Panax trong các cây quan hệ phát sinh chủng loại có những nét tƣơng đồng nhất định: đều chia thành 3 - 4 nhóm, trong đó có 2

nhóm luôn giữ cố định khi sử dụng riêng lẽ từng trình tự DNA bảo thủ để phân tích

quan hệ phát sinh chủng loại:

+ Nhóm 1: gồm sâm Lang Bian, P. vietnamensis và P. vietnamensis var.

fuscidiscus.

+ Nhóm 2: gồm P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus thu thập trong nghiên cứu

này và P. pseudoginseng, P. stipuleanatus (đƣợc công bố trên Genbank).

Tuy vậy, có những khác biệt nhất định trong việc lập nhóm của ba taxon P.

bipinnatifidus, P. japonicus và P. quinquefolius:

Dựa trên trình tự matK thì P. bipinnatifidus (Genbank) đƣợc xếp vào nhóm 1,

P. quinquefolius và P. japonicus lập với nhau thành nhóm thứ 3.

Dựa trên trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 thì cả ba taxon P. japonicus, P.

japonicus var. bipinnatifidus và P. quinquefolius lập với nhau thành nhóm thứ 3.

Dựa vào trình tự gene 18S rRNA thì P. quinquefolius đƣợc xếp vào nhóm 1 còn

P. japonicus var. bipinnatifidus và P. japonicus lập thành hai nhóm khác với các taxon

còn lại.

- Taxon Polyscias fruticosa không thể hiện vai trò chuẩn ngoại (outgroup) nếu

sử dụng đơn, đây không phải là taxon duy nhất cùng thuộc họ Araliaceae nhƣng không

thuộc chi Panax không thể hiện vai trò chuẩn ngoại trong trƣờng hợp sử dụng trình tự

vùng gene matK. Điều này thể hiện cấu trúc gene matK ở nhóm gồm P. stipuleanatus,

P. bipinnatifidus thu thập trong nghiên cứu này và P. pseudoginseng có sự khác biệt so

với nhóm còn lại và cần thêm các nghiên cứu khác về vấn đề này.

- Sử dụng vùng trình tự bảo thủ riêng rẽ nào trong số các vùng trình tự 18S

rRNA, ITS1-5,8SrRNA-ITS2 hay một phần gene matK để nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại đều cho kết quả rằng trình tự taxon P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus

từ nguồn mẫu tự thu thập và trình tự P. stipuleanatus trong các công bố có trƣớc là tƣơng đồng hoàn toàn và khác với các trình tự P. bipinnatifidus (tên đồng nghĩa là P. japonicus var. bipinnatifidus) từ Genbank.

- Mức độ biến động trong các trình tự DNA bảo thủ khảo sát cao nhất ở vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2, tiếp đến là một phần gene matK và bảo thủ cao nhất ở trình tự gene 18S rRNA.

- Trong nghiên cứu này, việc sử dụng bất kỳ trình tự vùng bảo thủ riêng rẽ nào

đều có những nhƣợc điểm:

+ Với trình tự một phần gene matK: chuẩn ngoại chỉ thể hiện vai trò của nó khi xét trong một tổng thể lớn hơn, các taxon Panax đƣợc khảo sát hình thành nên các

nhóm lớn nhƣng không thể phân biệt hai taxon P. vietnamensis var. fuscidiscus và P.

japonicus var. bipinnatifidus vì sự tƣơng đồng trình tự.

+ Với trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2: Tuy là cách thức mang lại hiệu quả cao

nhất nhƣng vẫn thiếu các cơ sở để so sánh, vẫn chƣa phân tách đƣợc nhóm taxon P.

stipuleanatus, P. bipinnatifidus từ nguồn mẫu tự giải trình tự và trình tự P. stipuleanatus trong các công bố có trƣớc.

+ Với trình tự gene 18S rRNA: tuy vẫn có vai trò nhất định trong việc xác lập

các nhóm taxon, sự khác nhau giữa các trình tự không thể phân tách sâu các taxon

khảo sát vì tính bảo thủ cao của vùng dẫn đến tƣơng đồng trình tự cao giữa các taxon.

+ Sự lập nhóm của các taxon Panax dựa trên các các vùng riêng rẽ vẫn có sự

không đồng nhất về các taxon P. japonicus, P. japonicus var. bipinnatifidus và P.

quinquefolius.

+ Nếu sử dụng riêng rẽ từng vùng thì không phản ánh ở mức đầy đủ nhất mối

quan hệ phát sinh chủng loại trong khi có đƣợc dữ liệu từ cả ba vùng trình tự DNA bảo

thủ.

Những phân tích trên là lý do cho việc tìm biện pháp nhằm khắc phục các

nhƣợc điểm gặp phải và nâng cao độ tin cậy cho việc xác định quan hệ phát sinh chủng

loại các taxon thuộc chi Panax. Một trong những phƣơng thức để có thể khắc phục, cải

thiện hiệu quả xác định quan hệ phát sinh chủng loại của đối tƣợng nghiên cứu với các

taxon Panax khác đã biết là phối hợp các trình tự để phân tích quan hệ phát sinh chủng

loại. Soltis (1999) và Qiu (1999) đã chỉ ra rằng việc phân tích quan hệ phát sinh chủng

loại dựa trên việc phối hợp các trình tự có trong các bộ gene khác nhau là có ý nghĩa

hơn việc xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa vào một gene riêng rẽ. Bởi các gene hay bộ gene trong những trƣờng hợp đặc biệt có thể không thể hiện đúng quy

luật. Việc phối hợp dữ liệu giữa các trình tự DNA mã hóa cho ribosome trong nhân và

DNA lạp thể là thƣờng đƣợc thực hiện hơn cả ở thực vật.

Trên thực tế, đa số các nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại trong chi

Panax đã đƣợc tiến hành là dựa trên việc phối hợp các trình tự DNA mã hóa cho ribosome trong nhân và DNA lạp thể nhƣ Shu và cộng sự (2003) dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA và matK/trnK; Zuo và Wen (2011) dựa trên trình tự vùng ITS1- 5,8S rRNA-ITS2 và matK, có phối hợp thêm với các DNA barcode lạp thể khác. Chỉ một số ít các nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại trong chi Panax sử dụng một loại trình tự DNA bảo thủ riêng rẽ nhƣ trƣờng hợp của Fushimi và cộng sự (1996) hay Ngan và cộng sự (1999).

Trong nghiên cứu này, ba trình tự: vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S

rRNA-ITS2 và một phần gene matK đƣợc phối hợp để nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại.

Cơ sở để khẳng định ba trình tự này có thể phối hợp với nhau nhằm phân tích

quan hệ phát sinh chủng loại là kết quả kiểm tra tính bất tƣơng đồng có thể có giữa các tập hợp trình tự khảo sát khi phối hợp trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại

đƣợc kiểm tra bằng công cụ Incongruence Length Difference (ILD) của phần mềm

PAUP*. Kết quả kiểm tra nhƣ sau:

- Hƣớng thứ nhất: xem vùng18S rRNA-ITS1-5,8S rRNA-ITS2 là một trình tự

liên tục để phối hợp với trình tự một phần gene matK trong nghiên cứu quan hệ phát

sinh chủng loại, giá trị P = 0,13.

- Hƣớng thứ hai: xem gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một

phần gene matK là những trình tự riêng rẽ để phối hợp với nhau trong nghiên cứu quan

hệ phát sinh chủng loại, giá trị P = 0,24.

Kết quả nghiên cứu theo cả hai hƣớng đều cho giá trị P lớn hơn 5%, điều đó

cho thấy dựa trên cả hai quan điểm khi phối hợp các trình tự đƣợc khảo sát, tính bất

tƣơng đồng khi phối hợp trình tự đều không khả dĩ hay nói cách khác là việc phối hợp

những trình tự này trong nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại là hợp lý (Jonh và

cộng sự, 1996).

Phối hợp các vùng trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần

gene matK ở các taxon đƣợc chọn để khảo sát, thu đƣợc các trình tự để khảo sát quan

hệ phát sinh chủng loại có đặc điểm đƣợc nêu trong bảng 3.14.

Riêng trình tự KX768325 với taxon chuẩn nội Panax vietnamensis chính là trình

tự tự giải từ nguồn mẫu có đƣợc do không tìm thấy trình tự ITS1-5,8S-ITS2 đầy đủ và

chuẩn về nguồn mẫu cho taxon này từ Genbank.

Số nucleotide trong các trình tự phối hợp các vùng 18S rRNA, ITS1-5,8S

rRNA-ITS2 và một phần gene matK dao động từ 3.222 đến 3.235. Sâm Lang Bian

cùng với P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus có chung số nucleotide

lớn nhất là 3.235 nucleotide, đây là một trong các cơ sở cho thấy chúng gần nhau về

mặt di truyền so với các taxon Panax khác đƣợc khảo sát.

Khoảng cách di truyền của các taxon khảo sát dựa trên việc phối hợp các trình

tự đƣợc thể hiện trong bảng 3.15.

Bảng 3.14. Đặc điểm thành phần và số lƣợng nucleotide của các trình tự phối hợp ở các taxon khảo sát

TAXON T (%) C (%) A (%) G (%) Tổng số nucleotide

Panax sp. (KX768316-KX768322-KX768328) 26,5 23,2 25,5 24,8 3235

P. vietnamensis var. fuscidiscus (KX768320-KX768326- KX768332) 26,6 23,1 25,6 24,7 3235

P. stipuleanatus (KX768317- KX768323- KX768329) 26,7 23,2 25,6 24,5 3233

P. bipinnatifidus (KX768318- KX768324- KX768330) 26,7 23,2 25,6 24,5 3233

P. vietnamensis (KX768319- KX768325- KX768331) 26,6 23,2 25,5 24,8 3235

Polyscias fruticosa (KX768321- KX768327- KX768333) 26,4 23,3 25,6 24,7 3237

P. vietnamensis (*-AB033635.1- KX768325-AB044906) 26,6 23,2 25,5 24,8 3235

P. quinquefolius (*-D85172.1-HQ112440.1-HQ113077.1) 26,6 23,1 25,5 24,7 3234

P. japonicus (*-D84100.1-HQ112432.1-HQ113071.1) 26,8 22,9 25,6 24,6 3232

P. stipuleanatus (*-AB088025.1-U41695-HQ113079.1) 26,7 23,2 25,6 24,5 3233

P. pseudoginseng (*-AB088026.1-HQ112438.1-HQ113076.1) 26,6 23,0 25,9 24,5 3231

P. japonicus var. bipinnatifidus (*-AB044901.1-U41678.1-HQ113050.1) 26,7 23,2 25,5 24,6 3222

Bảng 3.15. Khoảng cách di truyền giữa các taxon Panax đƣợc khảo sát dựa trên sự phối hợp ba trình tự DNA bảo thủ 18S

TAXON

rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK

(1)

(2)

0,0028

(3)

0,0132 0,0135

(4)

0,0132 0,0135 0,0000

(5)

0,0016 0,0019 0,0135 0,0135

(6)

0,0212 0,0221 0,0224 0,0224 0,0215

(7)

0,0016 0,0019 0,0135 0,0135 0,0000 0,0215

(8)

0,0037 0,0047 0,0126 0,0126 0,0041 0,0211 0,0041

(9) 0,0059 0,0069 0,0141 0,0141 0,0062 0,0218 0,0062 0,0028

(10) 0,0132 0,0135 0,0000 0,0000 0,0135 0,0224 0,0135 0,0126 0,0141

(11) 0,0161 0,0157 0,0113 0,0113 0,0164 0,0244 0,0164 0,0148 0,0161 0,0113

(12) 0,0047 0,0056 0,0138 0,0138 0,0050 0,0208 0,0050 0,0034 0,0050 0,0138 0,0167

Panax sp. (KX768316-KX768322-KX768328) P. vietnamensis var. fuscidiscus (KX768320-KX768326- KX768332) P. stipuleanatus (KX768317- KX768323- KX768329) P. bipinnatifidus (KX768318- KX768324- KX768330) P. vietnamensis (KX768319- KX768325- KX768331) Polyscias fruticosa (KX768321- KX768327- KX768333) P. vietnamensis (*-AB033635.1- KX768325-AB044906) P. quinquefolius (*-D85172.1-HQ112440.1-HQ113077.1) P. japonicus (*-D84100.1-HQ112432.1-HQ113071.1) P. stipuleanatus (*-AB088025.1-U41695-HQ113079.1) P. pseudoginseng (*-AB088026.1-HQ112438.1- HQ113076.1) P. japonicus var. bipinnatifidus (*-AB044901.1-U41678.1-HQ113050.1)

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11)

Từ khoảng cách di truyền trong bảng trên, có thể nhận thấy rằng:

- Trình tự P. vietnamensis (*-AB033635.1-KX768325-AB044906) và P. stipuleanatus (*-AB088025.1-U41695-HQ113079.1) làm chuẩn nội là tƣơng đồng với các taxon tƣơng ứng.

- Các taxon khảo sát đều có thể phân biệt nhau ngoại trừ trƣờng hợp duy nhất là P. bipinnatifidus đƣợc thu thập trong nghiên cứu này không thể phân biệt với P. stipuleanatus.

- Khoảng cách di truyền giữa các taxon khảo sát khi phối hợp ba trình tự là thấp hơn nhiều so với việc sử dụng các trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và trình tự một phần gene matK nhƣng cao hơn khi sử dụng trình tự vùng gene 18S rDNA.

- Sâm Lang Bian có khoảng cách di truyền so với P. vietnamensis là 0,16% và so với P.vietnamensis var. fuscidiscus là 0,28%, trong khi khoảng cách di truyền giữa P. vietnamensis so với P.vietnamensis var. fuscidiscus là 0,19% cho thấy dù sâm Lang Bian khá gần với P. vietnamensis nhƣng khác biệt với P.vietnamensis var. fuscidiscus. Đây là một trong các cơ sở để xếp sâm Lang Bian thành một thứ của P. vietnamensis.

Tiến hành phân tích về mối quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự có đƣợc sau khi loại bỏ bớt các chuẩn nội tƣơng đồng, kết quả thu đƣợc là các cây quan hệ phát sinh chủng loại nhƣ trong các hình 3.18 và 3.19.

Hình 3.18. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood

Hình 3.19. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S

rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc

chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining

Có thể nhận thấy các nhóm chính trong các cây là:

- Nhóm 1: gồm sâm Lang Bian, P. vietnamensis và P. vietnamensis var.

fuscidiscus. Giá trị bootstrap tại nút phân nhánh đối tƣợng nghiên cứu với các taxon

còn lại trong nhóm đều đạt ở mức cao: 99.

- Nhóm 2: P. japonicus var. bipinnatifidus, P. quinquefolius và P. japonicus

(Genbank).

- Nhóm 3: gồm P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus đƣợc thu thập trong nghiên

cứu này và P. pseudoginseng, P. stipuleanatus (Genbank).

Loài Polyscias fruticosa vẫn thể hiện rõ vai trò chuẩn ngoại của mình khi tách

biệt hẳn khỏi các nhóm lớn gồm tất cả các taxon thuộc chi Panax.

Trong tất cả các cây quan hệ phát sinh chủng loại thu nhận đƣợc, sâm Lang Bian đều lập nhóm gần nhất với P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus, trong khi các taxon còn lại lập thành các nhóm khác có quan hệ phát sinh chủng loại xa hơn. Nhƣ vậy dựa vào trình tự phối hợp của ba vùng bảo thủ trong nhân và ngoài nhân (lạp thể) cho thấy việc xác định taxon đang nghiên cứu thành một thứ của P.

vietnamensis là hợp lý.

Điểm chƣa hợp lý trong kết quả chính là sự giống hệt về trình tự giữa taxon P.

bipinnatifidus đƣợc thu thập, giải trình tự trong nghiên cứu này với taxon P.

stipuleanatus nhƣng lại khác xa với taxon P. japonicus var. bipinnatifidus (có tên đồng nghĩa là P. bipinnatifidus) mà lẽ ra thì nó phải có quan hệ gần. Vấn đề này đƣợc

tìm hiểu và lý giải nhƣ sau:

+ Loài P. bipinnatifidus ở Việt Nam đƣợc xác định chủ yếu dựa trên hình thái lá

xẻ thùy, vốn có sự khác biệt rõ ràng so với taxon P. stipuleanatus với cùng khu phân bố tại Lào Cai và Lai Châu, Việt Nam. Tuy vậy, cũng có những thắc mắc về dạng lá

trung gian (nửa xẻ, nửa không xẻ) và nghi ngờ về mặt vị trí phân loại đƣợc đặt ra.

Nhƣng bởi sự lập nhóm riêng rẽ của taxon đƣợc cho là P. bipinnatifidus và P.

stipuleanatus khi phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên kỹ thuật RAPD-PCR

với 13 mồi ngẫu nhiên nên việc ghi nhận loài P. bipinnatifidus lại càng đƣợc khẳng

định (Nguyễn Văn Tập, 2007).

+ Trong nhiều nghiên cứu trƣớc đây, một số taxon trong chi Panax bao gồm P.

stipuleanatus và P. bipinnatifidus đƣợc ghi nhận là có cả đặc điểm lá chét xẻ và lá chét

nguyên (Wen và Zimmer, 1996; Guo và cộng sự, 2010), việc sử dụng các dữ liệu phân tử nhƣ các vùng ITS hay DNA fingerprint không dựa trên giải trình tự nhƣ kỹ thuật

AFLP cũng không thể phân biệt hai dạng lá chét này (Zhou và cộng sự, 2005). Chính

sự đa dạng về hình thái lá trong một loài mà khuynh hƣớng phân loại dựa trên hình

thái thân rễ và rễ củ trƣớc, tiếp đến mới là các đặc điểm khác đƣợc Hara (1970) đề

nghị và đƣợc các nhà thực vật học Trung Quốc sử dụng hiện nay (Xiang và Lowry,

2007), cách phân loại này chƣa đƣợc sử dụng với taxon đƣợc cho là P. bipinnatifidus ở

Việt Nam.

+ Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) đƣợc Seeman mô tả lần đầu tiên vào năm

1868. Theo tác giả, điểm khác biệt giữa P. bipinnatifidus so với các loài khác trong chi Panax là lá xẻ thùy. Tuy nhiên, Clark (1879), Burkill (1902) chuyển loài này sang chi

Aralia, vì loài này một số đặc điểm tƣơng đồng với chi Aralia nhƣ: hoa xếp lợp. Sau

gần một thế kỷ nghiên cứu và xem xét, các tác giả Hara (1970), Zhou và cộng sự (1975) chuyển loài này thuộc chi Panax, vì ngoài đặc điểm là hoa xếp lợp, còn có thân dạng củ. Đây là một trong những đặc điểm quan trọng nhận biết chi Panax (Seeman 1868). Tuy nhiên vị trí phân loại của loài này luôn thay đổi. Hara (1970), chuyển loài này thành một thứ của P. pesudoginseng (P. pesudoginseng var. bipinnatifidus). Zhou et al. (1975), chuyển loài này thành thứ của P. japonicus var. bipinnatifidus. Vì theo

Zhou (1975), Xiang và Lowry (2007) thì đặc điểm thân củ của loài này giống nhƣ thân

củ của loài P. japonicus, điểm khác biệt duy nhất là lá xẻ thùy (Hình 3.20 A, B).

Hình 3.20. A. Mẫu tiêu bản Panax bipinnatifidus; B. Mẫu Lectotype của P. bipinnatifidus; C. Mẫu P. stipuleanatus ở Lai Châu, Việt Nam ; D. Mẫu P. bipinnatifidus ở Lai Châu, Việt Nam.

+ Tam thất hoang (P. stipulenatus) đƣợc Tsai và Feng (1975) mô tả lần đầu tiên dựa vào mẫu thu đƣợc ở khu vực biên giới giữa Việt Nam và Trung Quốc. Theo các tác giả, điểm khác biệt so với P. japonicus var. japonicus, P. japonicus var.

bipinnatifidus là có lá kèm ở cuống lá chét, thân củ giống đốt trúc nhƣng giữa các đốt kéo dài.

+ Đặc điểm hình thái của mẫu đƣợc cho là P. bipinnatifidus thu đƣợc ở Lai

Châu, Việt Nam cũng nhƣ các mẫu tiêu bản của loài này lƣu giữ ở Viện Dƣợc Liệu có

nhiều đặc điểm giống với P. stipuleanatus nhƣ: có lá kèm ở cuống lá chét, thân củ giống đốt trúc nhƣng giữa các đốt kéo dài, vòi nhụy 2-3, hạt có kích thƣớc 5-6 mm.

Tuy nhiên điểm khác biệt ở đây là lá xẻ thùy nhƣng không giống xẻ thùy ở thứ P.

japonicus var. bipinnatifidus, mà xẻ thùy cạn. Nghiên cứu về các mẫu type khi công

bố loài P. bipinnatifidus cũng nhƣ các tiêu bản tại một số bảo tàng trên thế giới cho thấy chính loài này cũng có hai dạng lá xẻ và lá nguyên nhƣng đặc điểm quan trọng

trong nhận dạng loài là hình thái thân rễ: kéo dài và phồng lên từng đoạn.

Do đó, qua kết quả nghiên cứu dựa trên đặc điểm hình thái và sinh học phân tử,

taxon từng đƣợc cho là loài P. bipinatifidus ở Việt Nam mà Nguyễn Tập và cộng sự

nghiên cứu và công bố trƣớc đây (Nguyễn Tập và cộng sự, 2005) thực chất thuộc về

loài P. stipuleanatus. Trong khuôn khổ nghiên cứu này việc xác định vị trí phân loại

của taxon này chƣa đƣợc tiến hành sâu để định danh khoa học mà chỉ xem loài P.

stipuleanatus có hai dạng lá: lá chét xẻ thùy và lá chét không xẻ thùy.

Khi đó, các cây quan hệ phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng lại dựa trên các trình tự các taxon có đƣợc và không sử dụng chuẩn nội cho chúng đƣợc thể hiện trong

các hình 3.21, 3.22 và 3.23.

100

Hình 3.21. Cây quan hệ phát sinh chủng loại chính thức dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood

Hình 3.22. Cây quan hệ phát sinh chủng loại chính thức dựa trên sự phối

hợp vùng gene 18S rDNA, vùng ITS1-5,8S rDNA-ITS2 và một phần gene matK

giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining

Hình 3.23. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum parsimony

101

Ghi chú: trong các hình cây quan hệ phát sinh chủng loại, số hiệu sau tên taxon là số hiệu truy cập của trình tự tƣơng ứng trên ngân hàng gene (NCBI, DDBJ).

Dƣới góc độ phân tử, có thể nhận thấy:

So với kết quả nghiên cứu của nhóm Komatsu và cộng sự (2003) (hình 1.2) thì các cây quan hệ phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở dữ liệu kết hợp ba vùng bảo thủ 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK dù có xây dựng theo phƣơng pháp lập nhóm nào cũng đều có nét tƣơng đồng sau:

+ P. japonicus, P. quinquefolius lập nhóm với nhau (nhóm A)

+ P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus lập nhóm với nhau (nhóm B)

+ P. pseudoginseng và P. stipuleanatus lập nhóm với nhau (nhóm C)

+ Hai nhóm A, B lập thành một nhóm lớn hơn, nhóm C tách biệt khỏi nhóm lớn

này.

Các taxon đƣợc lấy trình tự từ ngân hàng gene để so sánh trong nghiên cứu này

lập nhóm với nhau tạo nên cấu trúc cây quan hệ phát sinh chủng loại cũng có nét

tƣơng đồng với nghiên cứu của Zuo và cộng sự (2011) dựa trên tập hợp trình tự các vùng ITS, nadI, matK, psbA-trnH, psbK-psbI, psbM-trnD và rbs16: P. pseudoginseng

và P. stipuleanatus lập thành một nhóm tách khỏi nhóm gồm P. bipinnatifidus, P.

japonicus và P. quinquefolius.

Sau khi xác định lại vị trí phân loại taxon đƣợc cho là P. bipinnatifidus ở phía Bắc Việt Nam chính là một biến thể lá xẻ thùy của loài P. sipuleanatus, cây quan hệ phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng lại dựa trên sự phối hợp cả ba vùng trình tự có hình thể rất giống với cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên trình tự ITS1-5,8S- ITS2. Theo đó, việc sử dụng trình tự này cũng có thể phân biệt đƣợc tất cả các taxon Panax đƣợc khảo sát.

3.1.3. Vị trí phân loại của sâm Lang Bian dựa trên quan hệ phát sinh

chủng loại với các taxon Panax khác ở mức độ phân tử và đặc điểm hình thái

Những đặc điểm về hình thái nêu trên cho thấy có sự phù hợp giữa phân loại

dựa trên hình thái và dựa vào dữ liệu sinh học phân tử:

102

- Về mặt hình thái, sâm Lang Bian có những đặc điểm hình thái: thân rễ có dạng đốt, rễ củ phồng lốn có dạng chop hay gần nhƣ dạng nón, các đặc điểm về bao phấn, chỉ nhị, hình dạng quả. Điều này cho thấy sâm Lang Bian mang đặc điểm gần với các mô tả cho hai taxon Panax vietnamensis Ha et Grushv. (Ha và Grushvitzky, 1985) và Panax vietnamensis var. fuscidiscus Komatsu, Shu & Cai khi công bố (Shu và cộng

sự, 2003a). Tuy nhiên, giữa ba taxon này cũng có những khác biệt nhất định về: hình thái đĩa bầu, độ dài cuống hoa, dạng răng cƣa ở mép lá chét, cấu trúc gốc lá chét.

- Kết quả phân tích về quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi khác cho thấy sâm Lang Bian có quan hệ rất gần với hai taxon đƣợc công bố là Panax vietnamensis Ha et Grushv. và Panax vietnamensis var. fuscidiscus Komatsu, Shu & Cai, luôn lập nhóm với hai taxon này xét trên bất kỳ vùng bảo thủ nào trong số trình tự một phần gene matK, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 hay vùng gene 18S rRNA cho dù việc lập nhóm của các taxon khác đƣợc nghiên cứu có thể thay đổi tùy vào trình tự DNA bảo thủ đƣợc sử dụng để khảo sát. Tuy vậy, giữa chúng có những khác biệt di truyền nhất định. Dựa trên trình tự phối hợp cả ba vùng gene 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK, sâm Lang Bian có khoảng cách di truyền so với P. vietnamensis là 0,16% và so với P.vietnamensis var. fuscidiscus là 0,28%, trong khi khoảng cách di truyền giữa P. vietnamensis so với P.vietnamensis var. fuscidiscus là 0,19%.

Theo đó, vai trò của các vùng DNA bảo thủ trong nhân và lục lạp trong việc phân loại và xác định quan hệ phát sinh chủng loại của sâm Lang Bian đã đƣợc thể hiện rõ: chỉ ra các taxon có quan hệ gần và đồng thời cũng chỉ ra khoảng cách di truyền giữa taxon này với các taxon khác cùng chi nhằm khẳng định đây là một taxon riêng biệt. Vai trò này thể hiện rõ nhất đối với vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 trong số ba vùng trình tự bảo thủ khảo sát khi mà sử dụng trình tự đơn của vùng bảo thủ này cũng có thể xây dựng đƣợc cây quan hệ phát sinh chủng loại có hình thể tƣơng tự với cây tƣơng ứng sử dụng sự kết hợp cả ba vùng.

Nhƣ vậy, dựa trên kết quả nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng

loại ở mức độ phân tử đƣợc kết hợp thêm các dữ liệu về hình thái, cho phép khẳng

định sâm Lang Bian là một thứ mới của loài Panax vietnamensis Ha et Grushv. var.

vietnamensis với tên khoa học là P. vietnamensis var. langbianensis N.V. Duy, V.T

Tran & L.N. Trieu với tên Việt đề xuất là Sâm Lang Bian (Duy và cộng sự, 2016).

Đối với sâm Lang Bian, holotype với số hiệu tiêu bản là VTN520 tại Viện Khoa học Tây Nguyên đƣợc thu thập tại vùng núi Lang Bian thuộc xã Lát, huyện Lạc

103

Dƣơng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam ở độ cao 1879m so với mặt nƣớc biển, tọa độ 12002‟06.54‟‟N, 108026‟02.78‟‟E do Nông Văn Duy và Trần Văn Tiến thu thập. Isotype của taxon này hiện lƣu giữ tại Trƣờng Đại học Đà Lạt. (Duy và cộng sự, 2016).

3.2. Đánh giá đa dạng di truyền ở quần thể sâm Lang Bian

3.2.1. Kết quả thu thập, chuẩn bị mẫu và chọn lọc mồi phục vụ cho đánh

giá đa dạng di truyền quần thể

Mẫu thu từ hai quần thể đƣợc phát hiện thông qua quá trình điều tra cách nhau

25-30 km theo đƣờng chim bay nằm tại hai huyện Đam Rông và Lạc Dƣơng, tỉnh Lâm

Đồng. Tên các quần thể đƣợc lấy theo ký tự viết tắt của địa danh nơi phân bố: quần thể

ở Lạc Dƣơng ký hiệu là LD, quần thể ở Đam Rông ký hiệu là DR.

Với các tiêu chí thu thập mẫu để đánh giá nhƣng giảm thiểu tối đa các thƣơng

tổn cho các cá thể trong các quần thể, việc xác định độ tuổi dựa vào số vết sẹo thân khí

sinh để lại trên thân rễ ở các cá thể độ lớn chỉ đào bới để đếm đến 20. Theo đó, các

mẫu có đƣợc để đánh giá đa dạng di truyền quần thể cho hai quần thể nghiên cứu đƣợc

thống kê trong bảng 3.16 và 3.17.

Đối với quần thể LD: đã tiến hành 6 đợt nghiên cứu tại khu phân bố của quần

thể tại Lạc Dƣơng, cụ thể là vào tháng 12/2012: điều tra và thu mẫu; 4/2013: điều tra,

tháng 7/2013: điều tra, tháng 12/2013: điều tra và thu mẫu, 4/2014: điều tra và tháng

06/2014: điều tra và thu mẫu. Qua các đợt thu mẫu, tổng số mẫu thu đƣợc ở quần thể

LD là 64 (bảng 3.16).

Đối với quần thể DR: đã tiến hành 2 đợt điều tra kết hợp với thu mẫu tại khu

phân bố của quần thể tại Đam Rông vào giữa và cuối tháng 11/2014. Tổng số mẫu thu

đƣợc ở quần thể DR là 51 (bảng 3.17).

Số thứ thự của các mẫu cũng chính là ký hiệu mẫu sử dụng trong các ảnh điện

di và ma trận về sự xuất hiện hay thiếu vắng của các band.

Tách chiết DNA từ lá theo quy trình CTAB cải tiến thu đƣợc mẫu DNA cho

từng cá thể với nồng độ DNA ở các mẫu tách chiết đạt trong khoảng 146 – 265 ng/µl,

độ tinh sạch dựa trên tỷ lệ OD260/OD260 trong khoảng từ 1,64 – 2,12.

Sau khi thử nghiệm, 20 trong số 45 mồi ISSR cho kết quả đáp ứng hai tiêu chí

tạo đƣợc band và các band mang tính đa hình trên 5 mẫu lấy ngẫu nhiên thuộc taxon

nghiên cứu. 20 mồi này đƣợc tiến hành khuếch đại các mẫu DNA tách chiết từ các

104

mẫu thu thập. Các mồi này có trình tự và đặc tính khuếch đại các mẫu thể hiện trong bảng 3.18.

TT Ký hiệu mẫu Tuổi

Phân nhóm

L1o

L33y

Nhóm tuổi nhỏ

11 Nhóm tuổi lớn

L2o

L34o

Nhóm tuổi lớn

14 Nhóm tuổi lớn

L3o

L35o

Nhóm tuổi lớn

L4y

L36o

Nhóm tuổi lớn

Nhóm tuổi nhỏ

L5o

L37o

Nhóm tuổi lớn

L6y

L38o

Nhóm tuổi lớn

Nhóm tuổi nhỏ

L7y

L39o

Nhóm tuổi lớn

Nhóm tuổi nhỏ

L8o

L40o

Nhóm tuổi lớn

12 Nhóm tuổi lớn

L9y

L41o

Nhóm tuổi lớn

Nhóm tuổi nhỏ

L10o

L42o

>20 Nhóm tuổi lớn

14 Nhóm tuổi lớn

L11o

L43o

>20 Nhóm tuổi lớn

L12y

L44o

Nhóm tuổi lớn

Nhóm tuổi nhỏ

L13y

L46y

Nhóm tuổi nhỏ

L14y

L47y

Nhóm tuổi nhỏ

L15y

L48y

Nhóm tuổi nhỏ

L16y

L49y

Nhóm tuổi nhỏ

L17y

L50y

Nhóm tuổi nhỏ

L18y

L51y

Nhóm tuổi nhỏ

L19y

L52y

Nhóm tuổi nhỏ

L20y

L53y

Nhóm tuổi nhỏ

L21y

L45o

Nhóm tuổi lớn

Nhóm tuổi nhỏ

L22o

L54y

Nhóm tuổi nhỏ

17 Nhóm tuổi lớn

L23o

L55o

Nhóm tuổi lớn

10 Nhóm tuổi lớn

L24o

L56o

Nhóm tuổi lớn

11 Nhóm tuổi lớn

L25o

L57o

>20 Nhóm tuổi lớn

14 Nhóm tuổi lớn

L26y

L58o

Nhóm tuổi lớn

Nhóm tuổi nhỏ

L27y

L59o

Nhóm tuổi lớn

Nhóm tuổi nhỏ

L28y

L60o

>20 Nhóm tuổi lớn

Nhóm tuổi nhỏ

L29o

L61o

Nhóm tuổi lớn

16 Nhóm tuổi lớn

L30y

L62y

Nhóm tuổi nhỏ

L31o

L63y

Nhóm tuổi nhỏ

>20 Nhóm tuổi lớn

L32y

L64y

Nhóm tuổi nhỏ

Bảng 3.16. Ký hiệu, độ tuổi và phân nhóm tuổi các cá thể thuộc quần thể LD TT Ký hiệu mẫu Tuổi

105

TT Ký hiệu mẫu Tuổi

Ghi chú

TT Ký hiệu mẫu Tuổi

Ghi chú

>20 Nhóm tuổi lớn

D27y

Nhóm tuổi nhỏ

D1o

Nhóm tuổi lớn

D28y

Nhóm tuổi nhỏ

D2o

12 Nhóm tuổi lớn

D29y

Nhóm tuổi nhỏ

D3o

16 Nhóm tuổi lớn

D30y

Nhóm tuổi nhỏ

D4o

10 Nhóm tuổi lớn

D31y

Nhóm tuổi nhỏ

D5o

11 Nhóm tuổi lớn

D32y

Nhóm tuổi nhỏ

D6o

14 Nhóm tuổi lớn

D33y

Nhóm tuổi nhỏ

D7o

>20 Nhóm tuổi lớn

D34y

Nhóm tuổi nhỏ

D8o

18 Nhóm tuổi lớn

D35y

Nhóm tuổi nhỏ

D9o

19 Nhóm tuổi lớn

D36y

Nhóm tuổi nhỏ

D10o

Nhóm tuổi lớn

D37y

Nhóm tuổi nhỏ

D11o

15 Nhóm tuổi lớn

D38y

Nhóm tuổi nhỏ

D12o

14 Nhóm tuổi lớn

D39y

Nhóm tuổi nhỏ

D13o

>20 Nhóm tuổi lớn

D40y

Nhóm tuổi nhỏ

D14o

13 Nhóm tuổi lớn

D41y

Nhóm tuổi nhỏ

D15o

17 Nhóm tuổi lớn

D42y

Nhóm tuổi nhỏ

D16o

10 Nhóm tuổi lớn

D43y

Nhóm tuổi nhỏ

D17o

Nhóm tuổi lớn

D44y

Nhóm tuổi nhỏ

D18o

11 Nhóm tuổi lớn

D45y

Nhóm tuổi nhỏ

D19o

16 Nhóm tuổi lớn

D46y

Nhóm tuổi nhỏ

D20o

16 Nhóm tuổi lớn

D47y

Nhóm tuổi nhỏ

D21o

12 Nhóm tuổi lớn

D48y

Nhóm tuổi nhỏ

D22o

10 Nhóm tuổi lớn

D49y

Nhóm tuổi nhỏ

D23o

17 Nhóm tuổi lớn

D50y

Nhóm tuổi nhỏ

D24o

>20 Nhóm tuổi lớn

D51y

Nhóm tuổi nhỏ

D25o

Nhóm tuổi lớn

D26o

106

Bảng 3.17. Ký hiệu, độ tuổi và phân nhóm tuổi các cá thể thuộc quần thể DR

Bảng 3.18. Đặc điểm các mồi ISSR đƣợc chọn lọc và sử dụng để làm nảy sinh DNA fingerprint làm cơ sở đánh giá đa dạng di truyền

TT Tên mồi Trình tự

1 ISSR 808 2 ISSR 814 3 ISSR 844A 4 ISSR 17898A 5 ISSR 17898B 6 ISSR 17899A 7 ISSR 17899B 8 ISSR HB8 9 ISSR HB9 10 ISSR HB10 11 ISSR HB11 12 ISSR HB12 13 ISSR HB15 14 ISSR UBC 807 15 ISSR UBC 826 16 ISSR UBC 842-C 17 ISSR UBC 842-T 18 ISSR UBC 856-C 19 ISSR UBC 856-T 20 ISSR UBC 873

Tổng thể 5' –(AG)8 C-3' 5' –(CT)8 TG-3' 5' –(CT)8 AC-3' 5'-(CA)6 AC-3' 5'-(CA)6 GT-3' 5'-(CA)6 AG-3' 5'-(CA)6 GG-3' 5'-(GA)6 GG-3' 5'-(GT)6 GG-3' 5'-(GA)6 CC-3' 5'-(GT)6 CC-3' 5'-(CAC)3 GC-3' 5'-(GTG)3 GC-3' 5'-(AG)8 T-3' 5'-(AC)8 C-3' 5'-(GA)8 CG -3' 5'-(GA)8 TG -3' 5'-(AC)8 CA-3' 5'-(AC)8 TA-3' 5'-(GACA)4 -3' Ta (0C) 52 51,5 52 54,5 54,5 54 54 52 52 52 52 52 52 54 54 51,5 51,5 52 52 52 Số band ghi nhận cho tổng thể mẫu 14 15 19 19 27 19 32 18 19 28 17 23 12 23 23 26 26 25 19 24 428

107

Hình 3.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR 844A ở quần thể LD

Hình 3.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR UBC873 ở quần thể LD

Hình 3.26. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR 814 ở quần thể DR

108

Hình 3.27. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR HB12 ở quần thể DR

Kết quả từ bảng 3.18 cho thấy số lƣợng band hình thành khá chênh lệch giữa

các mồi đƣợc chọn để khảo sát đa dạng di truyền (từ 14 band đến 32 band), tổng thể

các band hình thành đƣợc ghi nhận là 428 band tƣơng đƣơng với 428 locus đƣợc sử dụng cho đánh giá đa dạng và biến động di truyền hai quần thể nghiên cứu.

Kết quả khảo sát về tỷ lệ band đa hình ở mức độ tổng thể mẫu nghiên cứu, quần

thể và các nhóm tuổi trong quần thể đƣợc thể hiện ở bảng 3.19.

Bảng 3.19. Tỷ lệ band đa hình ở mức độ tổng thể mẫu nghiên cứu, quần thể và

Tỷ lệ band đa hình (PPB) (%)

Mồi

Tổng thể mẫu

92,9 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 94,4 100,0 89,3 94,1 100,0 100,0 87,0 95,7 96,2 100,0 100,0 94,7 100,0 97,2

Quần thể LD Nhóm tuổi lớn 92,9 86,7 88,5 84,2 77,8 89,5 84,4 66,7 84,2 71,4 70,6 39,1 41,7 52,2 87,0 92,3 69,2 84,0 89,5 87,5 77,1

Nhóm tuổi nhỏ 57,1 66,7 78,9 68,4 74,1 84,2 87,5 61,1 100,0 67,9 58,8 47,8 41,7 65,2 69,6 61,5 73,1 84,0 89,5 87,5 72,4

Quần thể 92,9 86,7 89,5 84,2 77,8 94,7 87,5 72,2 100,0 75,0 70,6 47,8 41,7 69,6 87,0 92,3 76,9 92,0 94,7 87,5 81,5

Quần thể DR Nhóm tuổi lớn 85,7 66,7 94,7 63,2 81,5 84,2 93,8 66,7 84,2 78,6 76,5 100,0 91,7 56,5 56,5 65,4 61,5 92,0 52,6 54,2 75,2

Nhóm tuổi nhỏ 78,6 73,3 84,2 47,4 92,6 89,5 90,6 55,6 73,7 82,1 76,5 91,3 75,0 52,2 43,5 57,7 65,4 92,0 63,2 58,3 72,7

Quần thể 85,7 80,0 94,7 63,2 96,3 94,7 96,9 72,2 84,2 82,1 76,5 100,0 91,7 60,9 56,5 65,4 61,5 92,0 63,2 62,5 79,4

808 814 844A 17898A 17898B 17899A I17899B HB8 HB9 HB10 HB11 HB12 HB15 UBC 807 UBC 826 UBC 842C UBC 842T UBC 856C UBC 856T UBC 873 Tổng thể

các nhóm tuổi trong quần thể

Kết quả trên cho thấy dù ở cấp độ khảo sát nào thì cũng không có mồi nào trong

số các mồi đƣợc chọn tạo toàn bộ các band mang tính đơn hình. Xét về mức độ đa

hình thành band đa hình của các mồi, tỷ lệ đa hình thấp nhất ở mức độ tổng thể là

89,3% (HB 10), cao nhất là 100% (814, 844A, 17898AB, 17899AB, HB12, HB15,

109

UBC 842T, UBC 856 C và UBC 873), trung bình đạt 97,2%. Ở mức độ quần thể, tính

đa hình thấp nhất là 41,7% (HB15 ở quần thể LD), cao nhất là 100% (HB9 ở quần thể

LD và HB12 ở quần thể DR), trung bình đạt 79,4 ở quần thể DR và 81,5 ở quần thể

LD. Ở mức độ nhóm tuổi trong quần thể, tính đa hình thấp nhất là 39,1% (HB12 ở

nhóm tuổi lớn, quần thể LD), cao nhất là 100% (HB12 ở nhóm tuổi lớn, quần thể DR),

trung bình đạt 72, 7% đến 77,1% ở các nhóm tuổi trong hai quần thể nghiên cứu.

Kết quả từ bảng 3.19 cho thấy tỷ lệ band đa hình của các mồi là khác nhau đối

với các quy mô khảo sát theo chiều hƣớng giảm dần từ tổng thể nghiên cứu đến quần

thể và đến các nhóm trong quần thể. Điều này thể hiện quy luật chung: trong tự nhiên

nếu tổng thể mẫu càng lớn thì mức độ đa dạng càng cao, nếu xem xét trong cùng một

hệ quy chiếu thì tính đa dạng di truyền của nhiều quần thể bao giờ cũng lớn hơn một

quần thể đơn lẻ. Bên cạnh đó tỷ lệ band đa hình ở các tập hợp mẫu cùng quy mô cũng

có sự sai khác, sự sai khác đó thể hiện sự khác nhau về cơ cấu di truyền và cũng chính

là hệ quả của quá trình biệt hóa di truyền.

= 0,228 và tỷ lệ band đa

3.2.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể LD

Mức độ đa dạng gene hay tính dị hợp trông đợi HeLD

hình PPBLD = 81,5 % đƣợc ghi nhận cho quần thể LD. Mức độ dị hợp trông đợi cũng

nhƣ tỷ lệ band đa hình của quần thể LD ở mức cao so với các quần thể P. ginseng

mọc tự nhiên ở vùng Primorye (Zhuravlev và cộng sự, 2008 & 2010) và các quần thể

P. notoginseng đƣợc trồng ở Zhulijie, Shangliuhe, Bazai và Jinbuhuan thuộc Vân

Nam, Trung Quốc (Wang và cộng sự, 2008). Tuy nhiên chỉ số dị hợp trung bình này

cũng chỉ đạt mức trung bình khi so với các quần thể P. quinquefolius tự nhiên trong

nghiên cứu của Emily và James (2009).

Tƣơng đồng di truyền trong tổng thể các mẫu khảo sát thuộc quần thể LD cao

nhất là giữa mẫu L47y và mẫu L51y với mức tƣơng đồng 89,49%; thấp nhất là giữa

mẫu L19o và mẫu L56o với mức tƣơng đồng 65,65%; trung bình các mẫu tƣơng đồng

nhau ở mức 77,80%. Mức tƣơng đồng giữa các mẫu trong quần thể LD là cao hơn

không nhiều so với giữa các mẫu trong ba quần thể P. quinquefolius tự nhiên ở vùng

Quebec, Canada (Schluter và Zamir, 2002). Mức tƣơng đồng giữa các cặp mẫu đƣợc

110

thể hiện chi tiết trong các bảng 3.20, 3.21 và 3.22.

111

Bảng 3.20. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi lớn ở quần thể LD

Bảng 3.21. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi nhỏ ở quần thể LD

112

113

Bảng 3.22. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ hai nhóm tuổi lớn và nhỏ ở quần thể LD

Tính đa dạng di truyền ở hai nhóm tuổi thể hiện qua chỉ số đa dạng gene và tỷ lệ band đa hình là HeLD O = 0,233; PPBLD O = 77,1% và HeLD Y = 0,214; PPBLD Y = 72,4% lần lƣợt với nhóm tuổi lớn và nhóm tuổi nhỏ. Kết quả về mức độ đa dạng gene này cho thấy tính đa dạng di truyền của nhóm tuổi lớn có cao hơn so với nhóm tuổi

nhỏ, nghĩa là có sự suy giảm di truyền nhất định giữa các cá thể lớn và nhỏ tuổi.

Nguyên nhân của sự suy giảm đa dạng di truyền trong trƣờng hợp này có thể có là môi

trƣờng sống của quần thể có sự thay đổi do các hoạt động của con ngƣời. Ở gần khu phân bố của quần thể có ngƣời dân phá rừng làm rẫy, chặt cây làm than, săn bắt các

động vật gậm nhấm và sử dụng thuốc trừ sâu làm ảnh hƣởng đến các nhân tố thụ phấn

và phát tán hạt cũng nhƣ làm thay đổi sinh cảnh môi trƣờng sống của đối tƣợng nghiên

cứu.

Trƣờng hợp mức độ đa dạng di truyền dựa trên chỉ số đa dạng gene ở nhóm cá

thể lớn tuổi cao hơn ở nhóm quần thể nhỏ tuổi ghi nhận ở quần thể LD cũng tƣơng tự

nhƣ trƣờng hợp từng đƣợc ghi nhận trong kết quả nghiên cứu của Jennifer cộng sự (2004) trên 21 quần thể hoang da ̣i bi ̣ thu hái và quần thể đƣơ ̣c bảo vê ̣ thuộc loài Panax quinquefolius trong khu vực từ Georgia đến Tây Virginia, Mỹ.

Mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các cá thể trong nhóm tuổi lớn trong dải từ

68,46% (cặp L34o-L56o) đến 86,92% (cặp L2o-L3o), trung bình là 76,6%. Ở nhóm cá

thể nhỏ tuổi, mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các cá thể trong dải từ 69,16% (cặp

L30y-L54y) đến 89,49% (cặp L47y-L51y), trung bình là 79,1%. Điều đó đã cho thấy

rằng nhóm các cá thể nhỏ tuổi có mức độ tƣơng đồng di truyền với nhau cao hơn

nhƣng không nhiều so với nhóm các cá thể lớn tuổi. Tuy vậy, những chỉ số này cũng

phần nào cho thấy các bằng chứng cho việc suy giảm đa dạng di truyền đã đƣợc trình

này trên.

Khả năng thích ứng với các thay đổi điều kiện sống phụ thuộc chính những đặc điểm tiềm ẩn trong tổng thể cơ cấu di truyền của quần thể, vốn đƣợc bộc lộ và lan

truyền một cách ƣu thế cho các thế hệ sau khi mà chúng giúp cho sinh vật tồn tại và

114

phát triển trong điều kiện môi trƣờng thay đổi (Hogbin và Peakall, 1999; Anatonovis, 1984). Đối với quần thể LD, mức độ đa dạng di truyền suy giảm ở nhóm tuổi nhỏ trong khi khoảng cách di truyền giữa hai nhóm tuổi không đáng kể tƣơng ứng với mức độ biệt hóa di truyền giữa chúng. Điều này đồng nghĩa với việc phần lớn các đặc điểm di truyền dẫn đến khả năng thích ứng với biến đổi môi trƣờng có ở nhóm tuổi nhỏ nếu có đƣợc thì cũng đã đƣợc bao hàm trong cơ cấu di truyền của nhóm tuổi lớn. Với các đặc điểm này, quần thể LD đang đối mặt với nguy cơ suy giảm vì cho dù mức độ đa

dạng di truyền tƣơng đối cao nhƣng sự biệt hóa quần thể để thích ứng với các thay đổi

điều kiện sống không đƣợc thể hiện rõ. Trong trƣờng hợp mức độ đa dạng di truyền

suy giảm ở nhóm tuổi nhỏ ở P. quinquefolius, Jennifer và cộng sự (2004) đã đề xuất viê ̣c bảo tồn mô ̣t tỷ lê ̣ các cây già trong mỗi quần thể là quan tro ̣ ng để bảo vê ̣ tính vƣ̀ a đủ về sinh sản cũng nhƣ tiềm năng tiến hóa củ a loài.

Dựa trên mức tƣơng đồng di truyền của từng cặp mẫu, sơ đồ dạng cây về quan

hệ di truyền giữa các mẫu trong quần thể LD đƣợc xây dựng và thể hiện trong hình 3.28.

Hình 3.28. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể thuộc quần thể LD

115

Ghi chú: Coefficient là hệ số tƣơng đồng (Similarity).

Trong sơ đồ dạng cây này, các cá thể thuộc hai nhóm cấp tuổi trên 8 (lớn) và

dƣới 6 (nhỏ) không lập nhóm riêng mà xếp xen kẽ nhau, điều đó thể hiện đặc điểm

sinh sản hữu tính kéo dài suốt từ khi trƣởng thành đến hết chu trình sống của cây. Tuy nhiên sự xen kẽ là không đều mà có những nhóm vài cá thể cùng nhóm tuổi xếp gần

nhau cho thấy có sự biệt hóa nhỏ giữa hai nhóm tuổi.

Chỉ số biệt hóa di truyền giữa hai nhóm tuổi thuộc quần thể LD ở mức GSTLD = 0,0205. Theo hệ thống học về đánh giá biệt hóa di truyền (de Vicente, 2003) thì sự biệt hóa di truyền giữa hai nhóm cá thể tuổi lớn và nhỏ trong quần thể này chỉ đạt ở mức

= 0,228.

thấp.

Sự biệt hóa di truyền ở mức thấp dẫn đến khoảng cách di truyền giữa hai nhóm tuổi trong quần thể là DLD O-Y = 0,0061, khoảng cách này là rất bé so với tính dị hợp trông đợi của toàn quần thể LD đạt đến HeLD

3.2.3. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể DR

Quần thể DR có mức độ đa dạng di truyền tƣơng đối cao thể hiện qua chỉ số đa = 0,213 và tỷ lệ band đa hình PPBDR = dạng gene hay tính dị hợp trông đợi HeDR = 0,228 và PPBLD = 79,4%, các chỉ số đa dạng này đều thấp hơn quần thể LD (HeLD 81,5%). Tuy thấp hơn quần thể LD nhƣng so với nghiên cứu của Li và cộng sự (2011) cũng dựa trên chỉ thị ISSR ở đối tƣợng P. ginseng hoang dã đƣợc trồng lại và P.

ginseng rừng của P. ginseng thì mức độ đa dạng di truyền của quần thể DR ở mức cao.

Cũng sử dụng các mồi ISSR, Reunova và cộng sự (2010) ghi nhận đƣợc chỉ số đa dạng

gene ở các quần thể P. ginseng tự nhiên lần lƣợt là 0,0354; 0,0000 và 0,0063 tƣơng

ứng với ba khu vực rừng Taiga Spassky, Chuguevsky và Ussuriisky thuộc vùng

Primorsky, Nga. Qua đó cho thấy mức độ đa dạng của quần thể DR cũng ở mức cao.

Tƣơng đồng di truyền trong tổng thể các mẫu khảo sát thuộc quần thể DR cao

nhất là giữa mẫu D34y và mẫu D35y với mức tƣơng đồng 87,62%; thấp nhất là giữa mẫu D2o và mẫu D47y với mức tƣơng đồng 60,51%; trung bình các mẫu tƣơng đồng

nhau ở mức 77,65%. Mức tƣơng đồng giữa các cặp mẫu ở quần thể DR là thấp hơn

nhƣng không chênh lệch nhiều so với quần thể LD. So với các quần thể loài P. quinquefolius ở Ontario (Canada) đƣợc Bai và cộng sự (1997) ghi nhận trong nghiên cứu của mình thì mức tƣơng đồng giữa các cá thể trong quần thể ở cả hai quần thể trong nghiên cứu này ở mức cao.

Tƣơng đồng di truyền trong tổng thể các mẫu khảo sát thuộc quần thể DR đƣợc

116

thể hiện chi tiết trong các bảng 3.23, 3.24 và 3.25.

117

Bảng 3.23. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi lớn ở quần thể DR

118

Bảng 3.24. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi nhỏ ở quần thể DR

119

Bảng 3.25. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ hai nhóm tuổi lớn và nhỏ ở quần thể DR

Tính đa dạng di truyền ở hai nhóm tuổi thể hiện qua chỉ số đa dạng gene và tỷ

lệ band đa hình là HeDR O = 0,204; PPBDR O = 75,2 % và HeDR Y = 0,209; PPBDR Y =

72,7% lần lƣợt với nhóm tuổi lớn và nhóm tuổi nhỏ. Các chỉ số này cũng thấp hơn so

với các nhóm tuổi ở quần thể LD (HeLD O = 0,233; PPBDL O = 77,1% và HeLD Y = 0,214;

PPBDL Y = 72,4%), đây cũng là điều dễ lý giải bởi tính đa dạng của cả quần thể LD

cũng cao hơn quần thể DR.

Mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các cá thể trong nhóm tuổi lớn trong dải từ

63,08% (cặp D2o-D47y) đến 86, 21% (cặp D11o-D12o), trung bình là 78,49%. Chỉ số

tƣơng ứng giữa các cá thể trong nhóm tuổi nhỏ trong dải từ 67,52 % (cặp D31y –

D47y) đến 87,62% (cặp D34y-D35y), trung bình là 77,74%. Qua đó cho thấy rằng xét

ở góc độ phân tử, mức độ tƣơng đồng giữa các cá thể là không khác nhau giữa hai

nhóm tuổi. Điều này cho thấy sự ổn định về mức độ đa dạng di truyền qua các thế hệ.

Khác với quần thể LD, mức độ đa dạng gene của hai nhóm tuổi ở quần thể DR

là không khác nhau quá nhiều và nhóm tuổi <6 thậm chí còn có mức độ đa dạng di

truyền nhỉnh hơn nhóm tuổi >8. Mức độ chênh lệch về mức dị hợp trông đợi giữa hai

nhóm tuổi không đủ lớn để đi đến kết luận quần thể DR đang trên đà phát triển, tuy

nhiên nó thể hiện tính ổn định, không bị suy giảm đa dạng di truyền ở nhóm tuổi nhỏ

nhƣ ở quần thể LD. Trên thực tế, quần thể DR phân bố tại một khu vực khá hẻo lánh,

nằm sâu trong khu vực rừng nguyên sinh, điều kiện sinh cảnh ít bị tác động và chia

cắt. Có lẽ chính bởi ít chịu tác động của con ngƣời đến sinh cảnh là lý do cho tính ổn

định về mức độ đa dạng di truyền qua các thế hệ ở quần thể DR. Bởi cho dù cách quần

thể LD khoảng 25-30km đƣờng chim bay nhƣng vùng phân bố của quần thể DR có sự

tƣơng đồng về độ cao, không khác nhau nhiều về vĩ độ và cùng chịu sự tác động của

một kiểu khí hậu.

Dựa trên mức tƣơng đồng di truyền của từng cặp mẫu, sơ đồ dạng cây về quan

hệ di truyền giữa các mẫu trong quần thể DR đƣợc xây dựng lại và thể hiện trong hình

120

3.29.

Hình 3.29. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể thuộc quần thể DR

121

Cũng nhƣ quần thể LD, trong sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể thuộc quần thể DR các cá thể thuộc hai nhóm cấp tuổi trên 8 (lớn) và dƣới 6 (nhỏ) không lập nhóm riêng mà tạo các nhóm nhỏ xếp xen kẽ nhau, số lƣợng các cá thể cùng nhóm tuổi trong các nhóm nhỏ ở quần thể DR là nhiều hơn quần thể LD hay nói cách

khác là các cá thể cùng nhóm tuổi lập nhóm với nhau rõ hơn. Điều đó thể hiện mức độ mức độ biệt hóa giữa hai nhóm tuổi ở quần thể DR là cao hơn so với quần thể LD.

Thực vậy, chỉ số biệt hóa di truyền giữa hai nhóm tuổi thuộc quần thể DR ở mức GSTDR = 0,0304, cao hơn gần 50% so với quần thể LD. Tuy nhiên, với chỉ số này thì theo đánh giá hệ thống về biệt hóa di truyền của de Vicente (2003), mức độ biệt hóa này giữa hai nhóm tuổi lớn và nhỏ trong quần thể DR cũng này chỉ đạt ở mức thấp.

Trong trƣờng hợp không chịu ảnh hƣởng bởi các hoạt động của con ngƣời thì sự biệt hóa di truyền giữa các thế hệ trong quần thể DR có thể do số lƣợng cá thể trong quần thể không cao, số lƣợng các cá thể trƣởng thành lại càng ít hơn.

Kết quả tính toán cho thấy khoảng cách di truyền giữa hai nhóm tuổi lớn và nhỏ trong quần thể DR chỉ đạt mức DDR O-Y = 0,01393, cao hơn nhiều so với chỉ số tƣơng ứng ở quần thể DL (DLD O-Y = 0,0061).

3.2.4. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền tổng thể taxon nghiên cứu

Tổng thể nghiên cứu của taxon Panax vietnamensis var. langbianensis trong

nghiên cứu này bao gồm tất cả các cá thể của cả hai quần thể đƣợc phát hiện.

Mức độ đa dạng di truyền của tổng thể các mẫu nghiên cứu từ cả hai quần thể dựa trên chỉ số dị hợp tử trông đợi đạt đến mức HeT = 0,284 và tỷ lệ band đa hình đạt đến mức PPBT = 97,2%. Mức độ đa dạng này là ở mức cao so với kết quả thu nhận từ dữ liệu RAPD (Nybom và Bartish, 2000) và allozyme (Hamrick và Godt, 1996) khi xem xét ở số lƣợng lớn các thực vật có đặc điểm tƣơng tự. Nếu khảo sát riêng ở chi Panax, mức độ đa dạng di truyền ở tổng thể nghiên cứu thì Panax vietnamensis var. langbianensis có mức đa dạng di truyền cao so với loài P. notoginseng đƣợc trồng ở Vân Nam, Trung Quốc (HeT = 0,155; PPB = 87,5%) (Wang và cộng sự , 2008); loài P. ginseng tự nhiên thuộc vùng Primorsky, Nga (HeT = 0,0173) (Reunova và cộng sự, 2010), loài P. quinquefolius trong khu vực từ Georgia đến Tây Virginia , Mỹ (HeT = 0,159) (Jennifer và cộng sự, 2004), thấp hơn loài P. vietnamensis ở Việt Nam (He =0,412) và tƣơng đƣơng với loài P. ginseng ở Đông Bắc Trung Quốc (HeT = 0,2886; PPB = 98,96%) (Li và cộng sự, 2011).

122

Kết quả nghiên cứu về tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu trong tổng thể nghiên cứu với taxon Panax vietnamensis var. langbianensis đƣợc thể hiện trong các bảng từ 3.20 đến 3.25 đối với hai quần thể khảo sát và kết quả về so sánh các cặp mẫu từ hai quần thể nêu trong các bảng 3.26a và 3.26b dƣới đây.

123

Bảng 3.26a. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ nhóm tuổi lớn thuộc quần thể LD và tất cả mẫu thuộc quần thể DR

124

Bảng 3.26b: Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ nhóm tuổi nhỏ thuộc quần thể LD và tất cả mẫu thuộc quần thể DR

Tƣơng đồng di truyền trong tổng thể các mẫu khảo sát cao nhất là giữa mẫu

L47y và mẫu L51y với mức tƣơng đồng 89,49%; thấp nhất là giữa mẫu L19y và mẫu

D37y với mức tƣơng đồng 52,80%; trung bình các mẫu tƣơng đồng nhau ở mức 69,37%. So các cặp mẫu từ hai quần thể cho thấy mức độ tƣơng đồng giữa chúng

trung bình là 60,94%, cao nhất là 67,62% (cặp L48y-D8o) và thấp nhất là 52,80%

(cặp L19y-D37y. Kết quả này đã thể hiện sự biệt hóa di truyền rõ ràng giữa hai quần

thể khảo sát: mức độ tƣơng đồng giữa các cặp mẫu có nguồn gốc khác quần thể là thấp hơn hẵn mức độ tƣơng đồng giữa các cặp mẫu cùng quần thể.

Xét cả tổng thể mẫu nghiên cứu, không có cặp mẫu nào tƣơng đồng nhau ở

mức 100% mà cao nhất chỉ đến mức 89,49%. Bởi việc thu mẫu hoàn toàn mang tính

ngẫu nhiên để đánh giá đa dạng di truyền, cùng với kết quả về mức độ tƣơng đồng

cao nhất giữa các cặp mẫu chỉ đạt mức 89,49% đã cho thấy khả năng thụ phấn chéo

cao của đối tƣợng nghiên cứu.

Việc sử dụng 20 mồi ISSR trong nghiên cứu cho phép phân tách các cá thể

thuộc hai quần thể thành hai nhóm lớn khác nhau nhƣ trong sơ đồ dạng cây về quan

hệ di truyền giữa các cá thể dƣới đây (hình 3.30).

Có thể nhận thấy sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể trong

tổng thể taxon nghiên cứu chia thành hai nhánh rõ ràng, nhánh 1 tƣơng ứng với quần

thể LD và nhánh 2 tƣơng ứng với quần thể DR. Hình dáng nhánh 1 giống hệt với sơ

đồ dạng cây về quan hệ di truyền của quần thể LD (*) và hình dáng nhánh 2 giống

hệt với sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền của quần thể DR (**). Xét về cấu trúc thì

sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các mẫu trong tổng thể nghiên cứu có thể

xem là sự kết nối của hai sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền của hai quần thể thuộc

tổng thể.

Trong kết quả nghiên cứu của mình, Zhou và cộng sự (2005) sử dụng 4 cặp mồi AFLP nhƣng không phân biệt đƣợc hai nhóm hình thái lá chét nguyên và lá chét

xẻ thùy ở loài P. stipuleanatus phân bố ở Vân Nam, Trung Quốc. Khi nghiên cứu về

125

đa dạng di truyền hai nhóm cá thể thuộc loài P. stipuleanatus mà ban đầu đƣợc cho là hai taxon: P. bipinnatifidus và P. stipuleanatus ở vùng Lào Cai và Lai Châu bằng chỉ thị ISSR (17 mồi), kết quả cũng nhận thấy có hiện tƣợng nhóm lá chét lập nhóm hoàn toàn nhƣng là một nhánh phát sinh từ nhóm lá nguyên trong tổng thể nghiên cứu (hình 3.31) (Trieu và cộng sự, 2016).

*

Nhánh 1

D L ể h t n ầ u q c ộ u h t ể h t

á c c á C

**

R D ể h t n ầ u q c ộ u h t ể h t

Nhánh 2

á c c á C

126

Hình 3.30. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể trong tổng thể nghiên cứu

Hình 3.31. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền các cá thể thuộc hai nhóm lá chét nguyên và lá chét xẻ loài P. stipuleanatus theo Trieu và cộng sự (2016). Ghi chú: B: nhóm lá chét xẻ, S: nhóm lá chét nguyên. Chỉ số biệt hóa di truyền giữa hai nhóm là GST = 0,102.

Theo đó, sự khác biệt di truyền giữa hai quần thể đối tƣợng nghiên cứu trong

nghiên cứu này là cao hơn so với khác biệt di truyền giữa các nhóm cá thể mang hình

thái khác nhau ở loài cùng chi là P. stipuleanatus phân bố tại Tây Bắc, Việt Nam.

Chỉ số biệt hóa di truyền giữa hai quần thể nghiên cứu ở mức GSTTaxon = 0,221. Theo quan điểm hệ thống học về lƣợng hóa tính biệt hóa di truyền thì chỉ số này đạt ở mức cao, sự biệt hóa di truyền giữa chúng là lớn (de Vicente, 2003). Sự biệt hóa di

127

truyền giữa hai quần thể LD và DR là ở mức cao so với sự biệt hóa giữa các quần thể các thực vật tự nhiên có đặc điểm tƣơng tự (Nybom và Bartish, 2000; Hamrick và Godt, 1996). Nếu khảo sát riêng ở chi Panax, sự biệt hóa di truyền giữa hai quần thể nghiên cứu thấp hơn sự biệt hóa di truyền giữa các quần thể bị thu hái (GST = 0,491) nhƣng cao hơn nhiều so với các quần thể đƣợc bảo vệ (GST = 0,167) của loài P. quinquefolius trong khu vực từ Georgia đến Tây Virginia, Mỹ (Jennifer và cộng sự, 2004). Cùng sử dụng cùng kỹ thuật ISSR nhƣng sự biệt hóa trong hai quần thể tổng

thể nghiên cứu này thấp hơn sự biệt hóa giữa ba quần thể P. ginseng tự nhiên vùng Primorsky, Nga (GST = 0,2851) (Reunova và cộng sự, 2010), các dạng P. ginseng trồng tại Trung Quốc (GST = 0,3187; 0,2328 và 0,2540) (Li và cộng sự , 2011). Sự biệt hóa ghi nhận cho Panax vietnamensis var. langbianensis tại Lâm Đồng thấp hơn nhiều so với các quần thể bị thu hái thuộc loài P. quinquefolius (GST = 0,5474) ( Emily và James, 2009). Kết quả từ các nghiên cứu trƣớc vừa trình bày cho thấy áp lực thu hái đã làm tăng đáng kể chỉ số biệt hóa GST của các quần thể Panax. Việc chỉ số biệt hóa giữa hai quần thể Panax vietnamensis var. langbianensis ở mức cao so

với tổng thể các loài thực vật tự nhiên nhƣng thấp hơn ở đa số các quần thể Sâm

đƣợc nghiên cứu trong các công trình có trƣớc đƣợc là phù hợp với thực tế vì đối

tƣợng nghiên cứu ít đƣợc biết đến và chƣa chịu áp lực thu hái.

Sự biệt hóa di truyền giữa hai quần thể LD và DR lớn hơn rất nhiều so với sự biệt hóa giữa các nhóm tuổi trong mỗi quần thể (GSTLD = 0,0205 với quần thể LD và GSTDR = 0,0304 với quần thể DR). Điều này đã chỉ ra rằng nếu giả thuyết hai quần thể hiện nay đƣợc tách ra từ một quần thể lớn có phân bố bao trùm khắp cả toàn bộ khu

vực nghiên cứu thì quá trình phân tách đã xảy ra từ lâu hoặc sự chia cắt địa lý giữa hai quần thể là rất lớn.

Khoảng cách di truyền giữa hai quần thể LD và DR đƣợc tính toán dựa trên tần số allele của 428 locus khảo sát là DLD-DR = 0,191 một lần nữa chứng minh cho sự biệt hóa di truyền lớn giữa hai quần thể. So với kết quả nghiên cứu của Wang và

cộng sự (2008), thì khoảng cách di truyền giữa hai quần thể đối tƣợng nghiên cứu là

cao hơn giữa các quần thể P. notoginseng đƣợc trồng ở Vân Nam, Trung Quốc (D =

0,007 đến 0,021) và tƣơng đƣơng với mức trung bình giữa các nhóm quần thể P.

ginseng tự nhiên gần nhau (khoảng cách địa lý giữa các quần thể tối thiểu 60-70km)

thuộc vùng Primorsky Krai (Zhuravlev và cộng sự, 2008).

Sự biệt hóa di truyền trong trƣờng hợp các quần thể của taxon nghiên cứu cao

so với các loài tự nhiên có cùng đặc điểm sống cho dù chúng chƣa chịu áp lực thu hái

có thể có các nguyên nhân sau:

- Việc khai thác rừng nguyên sinh trƣớc đây và sau đó thay thế bằng rừng trồng, chủ yếu là Thông ba lá (Pinus kesiya) đã làm thay đổi môi trƣờng sống của Panax vietnamensis var. langbianensis tại Lâm Đồng.

128

- Các loại động vật gậm nhấm, chim và côn trùng vốn đóng vai trò phát tán hạt và hạt phấn trong khu vực nghiên cứu không có nhiều bởi sự săn bắt của ngƣời dân

với nhiều mục đích nhƣ bảo vệ mùa màng, làm thực phẩm, giải trí cũng nhƣ việc sử

dụng các thuốc trừ sâu trong canh tác nông nghiệp đã trở nên quá phổ biến hiện nay.

- Việc phá rừng, mở rộng các khu dân cƣ và hoạt động canh tác nông nghiệp

dẫn đến sự ngăn cách giữa hai quần thể (bản đồ ở hình 2.2).

Sự chia cắt điều kiện sống nhƣ trên đã hạn chế sự trao đổi nguồn gene giữa hai

quần thể. Kết quả nghiên cứu về dòng di cƣ đã thể hiện rõ điều này khi chỉ số di cƣ

trung bình là Nm= 0,8793, xét trong tổng thể quan sát với số cá thể khảo sát là N = 115 thì tỷ lệ di cƣ chỉ đạt 0,0076, tức là chỉ xấp xỉ 8‰ cá thể di cƣ từ quần thể này

sang quần thể khác trong một thế hệ. Chỉ số di cƣ giữa các quần thể P. ginseng vùng

Primorsky Krai là Nm = 0,45 (Zhuravlev và cộng sự, 2008); giữa các quần thể P.

quinquefolius trong khu vực từ Georgia đến Tây Virginia , Mỹ là Nm = 0,26 (Jennifer

và cộng sự, 2004); giữa các quần thể sâm vƣờn là Nm = 1,065; sâm vƣờn rừng là Nm

= 1,648 và sâm hoang dã trồng lại là Nm = 1,469 ở loài P. ginseng ở vùng Đông Bắc

Trung Quốc (Li và cộng sự, 2011). Qua đó có thể nhận thấy cho thấy chỉ số dòng

gene di cƣ trung bình trong tổng thể taxon cao hơn các quần thể hoang dại nhƣng

thấp hơn ở các quần thể trồng thuộc chi Panax ở một số nơi trên thế giới.

3.3. Kết quả nghiên cứu về phân tích, so sánh sơ bộ thành phần saponin ở

sâm Lang Bian và một số taxon cùng chi khác

Kết quả phân tích sơ bộ thành phần saponin theo phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng

của 5 mẫu đại diện cho các taxon đƣợc thể hiện qua sắc đồ sắc ký lớp mỏng saponin

của các taxon đƣợc khảo sát và các chất chuẩn (hình 3.32).

PS PSDL PVF PV PVL G-Rb1 G-Rg1 G-Rd G-Re N-R1 M-R2

Hình 3.32. Sắc đồ sắc ký lớp mỏng saponin của các taxon đƣợc khảo sát và các chất chuẩn 129

Từ sắc đồ nói trên, thành phần saponin đặc trƣng của các taxon đƣợc thể hiện

qua bảng sau:

Bảng 3.27. Thành phần saponin theo chất chuẩn của các mẫu khảo sát

G-Rb1 G-Rg1 G-Rd G-Re N-R1 M-R2 Rf 0,32 0,67 0,48 0,55 0,53 0,60 PS     ×  PSDL     ×  PVL × × × × × × PV × × × × × × PVF × × × × × ×

Ghi chú: ×: có xuất hiện vết, : không xuất hiện vết

Qua hình 3.27 và bảng 3.27, có thể nhận thấy các mẫu khảo sát cho các vết sắc ký đặc trƣng, phù hợp về màu sác và kích thƣớc vết, có giá trị Rf bằng với có giá trị Rf của chất chuẩn tƣơng ứng thể hiện trên bảng mỏng.

Giá trị Rf của các chất chuẩn G-Rb1, M-R2 và G-Rg1 tăng dần theo thứ tự, điều này tƣơng đồng với nghiên cứu của Dƣơng Tấn Nhựt và cộng sự (2011) khi sử dụng hệ dung môi n-butanol:Acetic acid:H2O (7:1:2) nhƣng khác với kết quả nghiên cứu của các tác giả này trong cùng công bố khi sử dụng hệ dung môi CHCl3:MeOH:H2O (65:35:10), thứ tự tăng dần khi đó là G-Rb1, G-Rg1 và M-R2. Cũng sử dụng hệ dung môi CHCl3:MeOH:H2O (65:35:10), Hoàng Hải Anh và cộng sự (2011) sử dụng 06 chất chuẩn để phân biệt các dƣợc liệu, thứ tự tăng dần của giá trị Rf cho các chất chuẩn nhƣ sau: G-Rb1, G-Re, N-R1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2. Nghĩa là cũng tƣơng tự nhƣ kết quả nghiên cứu của đề tài này ngoại trừ việc thay đổi vị trí giá trị Rf của G- Rg1 và M-R2. Điều này cho thấy việc lựa chọn phƣơng pháp để so sánh hoạt chất giữa taxon Panax phân bố tại Lâm Đồng và các taxon cùng chi khác là hợp lý, các sai

khác về kết quả chi tiết phụ thuộc vào dung môi và điều kiện sắc ký.

Nhận xét chung về phân tích sơ bộ thành phần saponin:

Dựa trên các dƣợc chất saponin đƣợc so sánh, ở taxon Panax vietnamensis var. langbianensis phân bố tại Lâm Đồng (PVL) có các hoạt chất sau: G-Rb1, G-Re, N-R1, G-Rd, G-Rg1 và M-R2.

PVL giống hoàn toàn với PV và PVF, khác với PS và PSDL bởi sự thiếu vắng

G-Rb1, G-Re, G-Rd, G-Rg1 và M-R2ở các taxon này.

Kết quả này có nét tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên phân tử và phân loại hình thái: PVL, PV và PVF là các mẫu từ

130

các taxon có quan hệ gần, đƣợc đặc trƣng bởi hoạt chất M-R2.

Ngoài ra, thông qua sắc đồ sắc ký lớp mỏng, nếu không dựa trên các chất

chuẩn đã xác định từ trƣớc thì với phƣơng pháp chiết đƣợc tiến hành trong nghiên

cứu này, có thể nhận thất sự sai khác nhất định về thành phần sản phẩm chiết thông qua hình thể các vết sắc ký giữa các taxon so sánh. Đặc điểm tạo vết trên sắc đồ sắc

ký bản mỏng của taxon Panax phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng có sự khác biệt so với

các taxon khác. Tuy nhiên, giữa hai taxon PS và PSDL, hình thể các vết sắc ký gần

131

nhƣ tƣơng đồng hoàn toàn, điều này một lần nữa lại bổ sung dữ liệu về mặt hóa học để nhìn nhận chúng thuộc cùng một loài.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

1. Kết hợp các kết quả nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên

các dữ liệu về hình thái so sánh với các trình tự DNA bảo thủ cho phép khẳng định

sâm Lang Bian là một thứ mới của loài Panax vietnamensis Ha et Grushv. var. vietnamensis và đƣợc đặt tên khoa học là Panax vietnamensis Ha & Grushvitzky var.

langbianensis N.V. Duy, V.T Tran & L.N. Trieu, tên tiếng Việt đề xuất là sâm Lang

Bian.

2. Tổng thể taxon sâm Lang Bian gồm hai quần thể LD và DR đƣợc phát hiện

trong quá trình điều tra, có thể phân tách nhau trong sơ đồ dạng cây về quan hệ di

truyền giữa các cá thể. Chỉ số đa dạng gene và tỷ lệ band đa hình của tổng thể taxon ở mức cao: HeT = 0,284 và PPBT = 97,2 %, mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các cá thể trong khoảng 52,80% đến 89,49%, trung bình là 69,37%. Sự biệt hóa gene giữa hai quần thể LD và DR thuộc tổng thể đạt đến mức GSTTaxon = 0,221 và khoảng cách di truyền giữa chúng lên đến DLD-DR = 0,191. Chỉ số di cƣ trung bình trong tổng thể taxon nghiên cứu là Nm= 0,8793.

= 0,228, PPBLD O = 77,1%, mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các cá thể trung bình là 77,80%. Nhóm tuổi lớn có mức độ đa dạng di

Quần thể LD có HeLD

truyền cao hơn nhóm tuổi nhỏ. Chỉ số biệt hóa di truyền giữa hai nhóm tuổi và

khoảng cách di truyền giữa chúng thấp.

= 0,213, PPBDR = 79,4%, mức độ tƣơng đồng di truyền giữa các cá thể trung bình là 77,65%. Nhóm tuổi lớn có mức độ đa dạng di truyền

Quần thể DR có HeDR

tƣơng đƣơng nhóm tuổi nhỏ. Chỉ số biệt hóa giữa hai nhóm tuổi và khoảng cách di

truyền giữa chúng cao hơn so với quần thể LD.

3. Dựa trên các hoạt chất đƣợc khảo sát, ở taxon Panax vietnamensis var. langbianensis phân bố tại Lâm Đồng có các hoạt chất sau: G-Rb1, G-Re, N-R1, G- Rd, G-Rg1 và M-R2. Taxon P. vietnamensis var. langbianensis giống với P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus, khác với hai biến thể lá chét nguyên và lá chét xẻ thuộc taxon Panax stipuleanatus bởi sự thiếu vắng G-Rb1, G-Re, G-Rd, G-Rg1 và M-R2 ở hai taxon này.

2. Kiến nghị

Cần bổ sung một taxon thực vật mà cũng là một loại dƣợc liệu mới là Panax

132

vietnamensis var. langbianensis vào danh lục thực vật, danh lục cây thuốc và Sách đỏ

Việt Nam, hiệu chỉnh tên đối với biến thể lá chét xẻ của loài P. stipuleanatus trong

các tài liệu này trên cơ sở kết quả nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh

chủng loại từ luận án. Cần nghiên cứu thêm để làm rõ về vị trí phân loại của biến thể lá chét xẻ của loài P. stipuleanatus tại Việt Nam.

Cần hoạch định chiến lƣợc khoanh vùng bảo vệ, bảo tồn, phát triển Sâm Lang

Bian trên cơ sở kết quả nghiên cứu về đa dạng và biến động di truyền quần thể của

luận án.

Cần nghiên cứu về các biện pháp nhân giống, gây trồng và nghiên cứu chuyên

sâu về thành phần hoạt chất và tác dụng dƣợc lý đối với sâm Lang Bian để phát triển,

133

khai thác và sử dụng nguồn tài nguyên hiệu quả theo hƣớng bền vững.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

Duy N.V., Trieu L.N., Chinh N.D., Tien T.V. (2016), “A new variety of

1. Panax (Araliaceae) from Lam Vien Plateau, Vietnam and its molecular evidence”,

Phytotaxa 277(1): 047-058.

2. Trieu L.N., Mien N.T., Tien T.V., Ket N.V. & Duy N.V. (2016), “Genetic diversity of Panax stipuleanatus Tsai in North Vietnam detected by Inter simple

sequence repeat (ISSR) markers”, Biotechnology & Biotechnological Equipment,

30(3): 506-:511.

Trieu L.N., Duy N.V., Quy T.D., Ket N.V., Tien T.V. (2016), “Genetic

3. diversity of Panax vietnamensis var. langbianensis populations in Lam Vien plateau -

Vietnam detected by Inter simple sequence repeat (ISSR) markers”, Academia

134

Journal of Biotechnology. (Đã chấp nhận đăng, đang chờ in).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A. Tài liệu Tiếng Việt

1. Hoàng Hải Anh, Nguyễn Minh Cang, Nguyễn Minh Đức (2011), “Xây dựng cơ sở dữ liệu để phân biệt các loại sâm bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, Tập 15 – Phụ bản số 1: 574-578.

2. Nguyễn Tiến Bân (1996), Sách đỏ Việt Nam, Tập II – Phần Thực vật. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.

3. Nguyễn Tiến Bân (2007), Sách đỏ Việt Nam – Phần Thực vật, Nhà xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ.

4. Hoàng Xuân Chiến, Ngô Thanh Tài, Nguyễn Bá Trực, Trần Xuân Tình, Lâm Bích Thảo, Trần Công Luận và Dƣơng Tấn Nhựt (2011) “Nghiên cứu một số yếu tố tạo củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro và xác định hàm lƣợng Saponin trong cây tạo từ củ trồng thử nghiệm ở núi Ngọc Linh”, Tạp chí công nghệ sinh học 9(3): 317-331.

5. Nguyễn Duy Cƣơng, Nguyễn Hữu Quỳnh (1999), Từ điển Bách khoa dược học. Nhà xuất bản Từ điển Bách Khoa: 554-558.

6. Nguyễn Minh Đức (2008), “Bảo tồn và phát triển cây sâm Việt Nam thông qua đẩy mạnh trồng trọt và nghiên cứu giá trị gia tăng”, Hội thảo Khai thác, phát triển và xây dựng thương hiệu nhân sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv., Araliaceae). Bộ Y tế - Ủy ban nhân dân tỉnh Kon Tum.

7. Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Viết Tựu, Võ Văn Chín (1998), “Khảo sát so sánh sâm Việt Nam từ nguồn thiên nhiên và trồng trọt – Thông báo số 1”, Tạp chí dược liệu 3(1).

8. Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Viết Tựu, Võ Văn Chín (1999), “Cấu trúc hóa học của các saponin trong cây sâm trồng – Thông báo số 2”, Tạp chí dược liệu 4(1).

9. Lê Thị Thu Hiền, Hugo De Boer, Vincent Manzanilla, Hà Văn Huân, Nông Văn Hải (2016), “Giải mã hệ gene ở thực vật và các loài thuộc chi Panax L.”, Tạp chí Công nghệ sinh học 14(1): 1-13.

10. Phạm Hoàng Hộ (1970), “Cây cỏ miền Nam Việt Nam”, Trung tâm học liệu Sài Gòn.

11. Phạm Hoàng Hộ (1991), “Cây Cỏ Việt Nam”, Montreal 2: 640-641.

12. Phạm Hoàng Hộ (2000), “Cây Cỏ Việt Nam”, Nhà xuất bản Trẻ 2: 515-516.

13. Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc, Nguyễn Giang Sơn, Nguyễn Thị Phƣơng Trang, Lê Thị Mai Trinh, Lê Thanh Sơn (2014), “Nghiên cứu đặc điểm di truyền của các mẫu sâm thu ở Lai Châu trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen matK và ITS-rRNA”. Tạp chí Công nghệ sinh học 12(2):327-337.

135

14. Trần Công Luận, Lƣu Thảo Nguyên và Nguyễn Tập (1999), “Nghiên cứu về thành phần hóa học của hai loài sâm Vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang Panax stipuleanatus Tsai et Feng)”, Tạp chí dược liệu 14.

15. Lã Đình Mỡi, Châu Văn Minh, Trần Văn Sung, Phạm Quốc Long, Phan Văn Kiệm, Trần Huy Thái, Trần Minh Hợi, Ninh Khắc Bản, Lê Mai Hƣơng (2013), “Họ Nhân sâm (Araliaceae Juss.) – Nguồn hoạt chất sinh học đa dạng và đầy triển vọng ở Việt Nam”, Hội nghị khoa học toàn quốc về Sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5: 1152-1158

16. Nguyễn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu 10(3): 71-76.

17. Nguyễn Tập (2006), “Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái cây sâm Vũ diệp và Tam Thất Hoang ở Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu 11(5): 177-181.

18. Nguyễn Văn Tập (2007), “Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam”, Báo cáo tổng kết đề tài cấp Bộ. Viện Dƣợc liệu, Bộ Y tế.

19. Nguyễn Nghĩa Thìn (2007), Các phương pháp nghiên cứu thực vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.

20. Nguyễn Thị Phƣơng Trang, Lê Thanh Sơn, Nguyễn Giang Sơn, Phan Kế Long (2011), “Phát hiện về một loài sâm mới Panax sp. (Araliaceae) ở Việt Nam”, Tạp chí Dược học 426: 59-63.

21. Vũ Huyền Trang, Hoàng Đăng Hiếu , Chu Hoàng Hà (2013), “Nghiên cƣ́ u xây dƣ̣ng mã vạch DNA cho việc phân loa ̣i nhâ ̣n da ̣ng cây sâm Ngo ̣c Linh ”, Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc: 1100-1104.

22. Lê Thị Hồng Vân, Lê Thị Sƣơng Mai, Nguyễn Ngọc Khôi, Nguyễn Đức Tuấn, Dƣơng Hồng Tố Quyên, Hà Diệu Lý và Nguyễn Minh Đức (2013), “Phân lập và thiết lập chất chuẩn majonosid – R2 từ sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Tạp chí Dược học 448(53): 14-20. B. Tài liệu Tiếng Anh

1. Adachi J. and Hasegawa M. (1995), MOLPHY version 2.3: program for molecular phylogenetics base on maximum likelihood, Institute of Statistical Mathematics, Tokyo.

2. Admed M. A. (2005), PCR techniques, Department of genetics. Zagazig University, Zagazig, Egypt.

3. Anatonovis J. (1984), “Genetic variation within population”, In Dirzor R., Sarukan Journal (eds) perspectives on plant population biology. Sinauer, Sunderland: 229- 241.

136

4. Artyukova E.V., Kozyrenko M.M., Koren O.G., Reunova G.D., and Zhuravlev Y.N., (2004), “RAPD and Allozyme Analysis T. I. of Genetic Diversity in Panax ginseng C.A. Meyer and P. quinquefolius L.”, Russian Journal of Genetics 40(2): 239-247. 5. Baeg I.H. and So S.H. (2013), “The word ginseng market and the ginseng (Korea)”, Journal of Ginseng Research 37(1): 1-7.

6. Bai D., Brandle J. and Reeleder R. (1997), “Genetic diversity in North American ginseng (Panax quinquefolius L.) grown in Ontario detected by RAPD analysis”, Genome 40(1): 111-115.

7. Beardmore J.A. (1983), “Extinction, survival and genetic variation”. In: Schoenwald- Cox C.M., Chamber S.M., Macbryde B., Thomas L. (eds), Genetics and Conservation, pp. 125-151

8. Bellarosa R., Simeone M. C., Papini A. and Schirone B. (2005), “Utility of ITS sequence data for phylogenetic reconstruction of Italian Quescus spp.”, Molecular Phylogenetics and Evolution 34(2): 355-370.

9. Bentham G. and Hooker J.D. (1867), Araliaceae, Vol.1, Genera plantarum. London: L. Reeve &Amp;Co.,pp. 931–947.

10. Britton N.L. and Brown. A. (1913), An illustrated ﬂora of the northern United States, Canada and the British possessions, second edition Vol. 1.. New York: Charles Scribner‟s Sons.

11. Burkill, I.H. (1902), “Ginseng in China”, Kew Bulletin 4: 4–11. 12. Chieba T., Harada T., Goto S., Ishikawa R. and Niizeki M. (1996), “Transcription of tRNA genes from large-scale plastid DNA deletion clearly reveals the action of nuclear encode RNA polymerase in the plastid”, Journal of Plant Physiology 148: 652-656.

13. Clarke C.B. (1879), Araliaceae. Flora of British India, Vol. 2. London: L. Reeve &Amp; Co., pp. 134–179.

14. Dan N.V., Ramchiary N., Choi S.R., Uhm T.S., Yang T.J., Ahn I.O. and Lim Y.P. (2010), “Development and characterization of new microsatellite markers in Panax ginseng (C.A. Meyer) from BAC end sequences”, Conservation Genetics 11: 1223- 1225.

15. De Candolle A.P. (1830), Araliaceae. Prodromus systematis naturalis regni vegetabilis Vol. 4, ed. A. P. de Candolle. Paris: Treuttel & Wurtz., pp. 251–266. 16. de Vicente M.C., Lopez C., Fulton T. (2003), Genetic Diversity Analysis with Molecular Marker Data: Learning Module. International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI) and Cornell University.

17. Deborah Y., Hong Q., Lau A.J., Yeo C.L., Liu X.K., Yang C.R., Koh H. L. and Hong Y. (2005), “Genetic Diversity and Variation of Saponin Contents in Panax notoginseng Roots from a Single Farm”, Journal of Agricultural and Food Chemistry 53: 8460−8467.

18. Decaisne J. and Planchon J.E. (1854), “Esquisse d‟une monographie des Araliacees”, Revue Horticole 4:104–109.

19. Duminil J. and Michele D.M. (2009), Plant species delimitation: A comparison of morphological and molecular markers. Plant Biosystems, pp. 1–15.

137

20. Eidus R. and Leopold S. (2013), “Highlights of the International American Ginseng Expo”, Journal of Medicinal Plant Conservation.

21. Emily H.M. and James B.M. (2009), “Relationship between age, size, and reproduction in populations of American ginseng, Panax quinquefolius (Araliaceae), across a range of harvest pressures”, Ecoscience 16(1): 84-94.

22. Felsenstein J. (1985), “Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap”, Evolution 39(4): 783-791.

23. Felsenstein J. (1995), PHYLIP (Phylogenetic inference package) version 3.57c. Department of Genetics, University of Washington: Washington.

24. Fushimi H., Komatsu K., Isobe M. and Namba T. (1996), “18S ribosomal RNA gene sequences of three Panax species and the corresponding ginseng drugs”, Biological and Pharmceutical Bulletin 19(11): 1530-1532.

25. Fushimi H., Komatsu K., Isobe M. and Namba T. (1997), “ Application of PCR- RFLP and MASA analyses on 18S ribosomal RNA gene sequence for the identification of three Ginseng drugs”, Biological and Pharmaceutical Bulletin 20(7): 765-769.

26. Gaut B.S. (1988), “Molecular clocks and nucleotide substitution rate in higher plants”, Evolutionary Biology 30: 93-120.

27. Godwin I.D., Aitken E.A.B. and Smith L.W. (1997), “Application of inter simple sequence repeat (ISSR) markers to plant genetics”, Electrophoresis 18: 1524–1528.

28. Grażyna S., Ewa K., and Piotr S. (2013), “Field Cultivation and in vitro Cultures, Root-Forming Callus Cultures and Adventitious Root Cultures, of Panax für quinquefolium as a Source of Ginsenosides” Verlag der Zeitschrift Naturforschung 68(c): 482 – 488

29. Guo H.B., Cui X.M., An N. and Cai G.P (2010), “Sanchi ginseng (Panax notoginseng (Burkill) F. H. Chen) in China: distribution, cultivation and variations”, Genetic Resources Crop Evolution 57: 453–460.

30. Ha D.T. and Grushvitzky, I.V. (1985), “A new species of the genus Panax (Araliaceae) from Vietnam”, Botanicheskii Zhurnal 70: 519-522.

31. Hala M.A. and Ashraf E. (2016), “Molecular phylogenetic implications in Brassica napus based on internal transcribed spacer sequences”, Journal of Genetics 95(2):447-451

32. Hamrick J.L. and Godt M.J.W. (1996), “Allozyme diversity in cultivated crops”, Crop Science 37(1): 26-30

33. Hara H. (1970), “On the Asiatic species of the genus Panax”, Journal Japan Botany 45(7): 197–212.

34. Harms H. (1897), “Zur Kenntnis der Gattungen Aralia und Panax”, Botanische Jahrbücher fur Systematik 23: 1-23.

35. Hogbin P.M. and Peakall R. (1999), “Evalution of the contribution of the genetic research to the management of the endangered plant Zieria prostrate”, Conservation Biology 13: 514-522.

138

36. Hoo G. (1961), “The systematics, relationship and distribution of the Araliaceae of China”, Bulletin of Amoi University (Natural Sciences) 8(1): 1–11.

37. Hoo, G. & Tseng, C.J. (1973), “On the Chinese species of Panax Linn.”, Acta Phytotaxonomica Sinica 11: 431–438

38. Jeewon R. and Hyde K.D. (2016), “Establishing species boundaries and new taxa among fungi: recommendations to resolve taxonomic ambiguities”, Mycosphere 7 (11): 1669–1677

39. Jennifer M.C. and Hamrick J.L. (2004), “Genetic diversity in harvested and protected populations of wild American ginseng, Panax quinquefolius L. (Araliaceae)”, American Journal of Botany 91(4): 540–548.

40. John P.H., Bull J.J. and Clifford W.C. (1996), “Combiningdata in phylogeneticanalysis”, Trends in Ecology And Evolution 11(4): 152-158.

41. Judd W. S., Campbell C. S., Kellogg E. A. and Steven P.F. (1999), Plant Systematics.

A phylogenetic Approach. Sinauer Associates, Inc. USA.

42. Kenneth W.M., Joseph P.L., Wansang L. and Robert L. B. (2004), “Effects of Population and Age on Ginsenoside Content of American Ginseng (Panax quinquefolium L.)”, Acta horticulturae 629: 161-166.

43. Kim D.H. (2012), “Chemical Diversity of Panax ginseng, Panax quinquifolium, and Panax notoginseng”, Journal of Ginseng Reseach 36(1): 1-15.

44. Kim J., Jo B.H., Lee K.L., Yoon E.S., Ryu G.H. and Chung K.W. (2007), “Identification of New Microsatellite Markers in Panax ginseng”, Molecules and Cells 24(1): 60- 68.

45. Kim K.O., Shin K.S., Kim M.N., Shin K.S., Labeda D.P., Han J.H. and Kim S.B. (2012), “Reassessment of the status of Streptomyces setonii and reclassification of Streptomyces fimicarius as a later synonym of Streptomyces setonii and Streptomyces albovinaceus as a later synonym of Streptomyces globisporus based on combined 16S rRNA/gyrB gene sequence analysis”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 62, 2978–2985.

46. Kim M., Oh H.S., Park S.C. and Chun J. (2014), “Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64: 346–351

47. Kim O.T., Bang K.H., In D.S., Lee J.W., Kim Y.C., Shin Y.S., Huyn D.Y., Lee S.S., Cha S.W. and Seong N.S. (2007), “Molecular authentication of ginseng cultivar by comparision of internal transcribed spacer and 5.8S rDNA sequences”, Plant Biotechnology Report 1: 163-167.

48. Kim W.J., Ji Y., Choi G., Kang Y.M., Yang S. and Moon B.C. (2016), “Molecular identifiation and phylogenetic analysis of important medicinal plant species in genus Paeonia based on rDNA-ITS, matK, and rbcL DNA barcode sequences”, Genetics and Molecular Research 15 (3): gmr.15038472.

139

49. Kimura M. (1980), “A simple method for estimating evolutionary rate of base substitution through comparative studies of nucleotide sequences”, Journal of Molecular Evolution 16(2): 111-120.

50. Klein R.M., Klein D. T. (1970), Research methods in Plant science. Garden City, Newyork. Natural History Press.

51. Komatsu K., Zhu S., Fushimi H., Qui T.K, Cail S.Q. and Kadota S (2001), “Phylogenetic Analysis Based on 18S rRNA Gene and Five related Species”, Planta Medica 67(5): 461- 465.

52. Komatsu K., Chihiro T. and Shu Z. (2005), “Ginseng drugs – Molecular and chemical characteristics and possibility as antidementia drugs”, Nutraceutical Research 3(1): 47-64.

53. Kornsorn S., Sunisa S., Tanarat K. J., Pradit P. and Surin P. (2015), “Phylogenetic Relationship of Dendrobium Species in Thailand Inferred from Chloroplast matK Gene and Nuclear rDNA ITS Region”, The Horticulture Journal 84 (3): 243–252. 54. Krishnan M.G. and Amerjothy S. (2011), “Morphological diversity and some newly recorded plant galls in Tamil Nadu, India”, Indian Journal of Science and Technology 4(9): 1067-1073.

55. Kumar P., Gupta V.K., Misra A.K., Modi D. R. and Pandey B. K. (2009), “Potential of Molecular Markers in Plant Biotechnology”, Plant Omics Journal 2(4): 141-162.

56. Lee J.W., Kim Y.C., Jo I.H., Seo A.Y., Lee J.H., Kim O.T., Hyun D.Y., Cha S.W., Bang K.H. and Cho J.H. (2011), “Development of an ISSR-Derived SCAR Marker in Korean Ginseng Cultivars (Panax ginseng C. A. Meyer)”, Journal of Ginseng Research 35(1): 52-59.

57. Lee Y.M., Yoon H., Park H.M., Song B.C. and Yeum K.J. (2016), “Implications of red Panax ginseng in oxidative stress associated chronic diseases”, Journal of Ginseng Research 41: 113-119.

58. Li S., Li J., Yang X.L., Cheng Z. and Zhang W.J. (2011), “Genetic diversity and differentiation of cultivated ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer) populations in North-east China revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers”, Genetics Resources Crop Evolution 58: 815–824.

59. Linnaeus C. (1754), Genera plantarum, 5th edition. Stockholm. 60. Lio P. and Goldman N. (1998), “Models of Molecular evolution and phylogeny”, Genome Research 8: 1233 – 1244.

61. Matthew B.H. (2009). Population Genetics. John Wiley & Sons, Ltd. 62. Mohammadi S.A. and Prasanna B.M. (2003), “Analysis of genetic diversity in crop plants – salient statistical tools and considerations”, Crop Science 43: 1235–1248. 63. Muller K.F., Borsch T. and Hili K.W. (2006), “Phylogenetic utility of rapidly evolving DNA at high taxonomical levels: Contrasting matK, trnT-F, and rbcL in basal angiosperms”, Molecular Phylogenetics and Evolution 41(1): 99-117.

64. Ngan F., Shaw P., But P. and Wang J. (1999), “Molecular authentication of Panax species”, Phytochemistry 50(5): 787-791.

140

65. Nguyen T.T., Hosakatte N.M. and Paek K.Y. (2014), “Optimization of ginseng cell culture in airlift bioreactors and developing the large-scale production system” Industrial Crops and Products 60: 343–348

66. Nhut D.T., Huy N.P., Chien H.X., Luan T.C., Vinh B.T. and Thao L.B. (2012), “In vitro culture of petiole longitudinal thin cell layer explants of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) and preliminary analysis of saponin content”, International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology 3(3): 178- 190.

67. Nybom H. and Bartish I. (2000), “Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants”, Perspectives in Plant Ecology Evolution and Systematics 3(2): 93–114.

68. Pellegrino G., Musacchio A., Noce M. E., Palermo A. M. and Widmer A. (2005), “Reproductive Versus Floral Isolation Among Morphologically Similar Serapias L. Species (Orchidaceae)”, Journal of Heredity 96(1): 15-23.

69. Phan Ke Long, Le Thanh Son, Phan Ke Loc, Vu Dinh Duy, Pham Van The (2013), “Lai Chau ginseng Panax vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai I. morphology, ecology, distribution and conservation status”, In Proceeding of the 2nd VAST-KAST Workshop on Biodiversity and Bio-active compounds, pp. 65-73. 70. Plunkett G.M., Soltis D.E. and Soltis P.S. (1996), “ Higher level relationships of Apiales (Apiaceae and Araliaceae) based on phylogenetic analysis of rbcLsequences”, American Journal of Botany 83(4): 499–515.

71. Proctor J.T.A. and Bailey W.G. (2011), “Ginseng: industry, botany, and culture”, Horticulture Review 9: 187–236.

72. Qin Q.L., Xie B.B., Zhang X.Y., Chen X.L., Zhou B.C., Zhou J., Oren A., Zhang Y. Z. (2014), “A Proposed Genus Boundary for the Prokaryotes Based on Genomic Insights”, Journal of Bacteriology 196(12): 2210-2215

73. Qiu Y. L., Lee J., Bernasconi-Quadroni F., Soltis P.S., Zanis M., Zimmer E. A., Chen Z., Savolainen V. and Chase M. W. (1999), “The earliest angiosperms: evidence from mitochondrial, plastid and nuclear genomes”, Nature 402: 404 – 407.

74. Quan L.T., Than M.M., Tezuka Y., Banskota A.H., Kouda K., Watanabe H., Zhu S., Komatsu K., Thet M.M., Swe T., Maruyama Y., Kadota S. (2003), “Wild Ginseng grows in Myanmar”, Chemical and Pharmaceutial Bulletin 51(6): 679-682.

75. Quan L.T., Adnyana I.K., Tezuka Y., Nagaoka T., Qui K.T., and Kadota S. (2001), “Triterpene Saponins from Vietnamese Ginseng (Panax vietnamensis) and their hepatocytoprotective Activity”, Journal of Natural Products 64(4): 456- 461.

76. Reunova G.D., Kats I.L., Muzarok T.I., and Zhuravlev Y.N. (2010), “Polymorphism of RAPD, ISSR and AFLP Markers of the Panax ginseng C. A. Meyer (Araliaceae) Genome”, Russian Journal of Genetics 46(8): 938–947.

77. Reunova G.D., Katsa I.L., Muzaroka T.I., Nguyen C.T.P., Dang T.T., Brennerc E. V., and Academician Zhuravleva Y.N. (2011), “Diversity of Microsatellite Loci in the Panax vietnamensis Ha et Grushv. (Araliaceae) population”, Doklady Biological Sciences 441(1): 408–411.

141

78. Rohlf F.J. (2004), NTSYSpc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 2.1 - User Guide. Applied Biostatistics Inc.

79. Schadt E.E.; Turner S. and Kasarskis A. (2010), “A window into third-generation sequencing”, Human Molecular Genetics, 19 (R2): R227–40.

80. Schluter C. and Zamir K. (2002), “Genetic diversity among natural and cultivated field populations and seed lots of American ginseng (Panax quinquefolius L.) in Canada”, International Journal of Plant Sciences 163(3): 427–439.

81. Seemann B. (1868). Revision of the natural order of Hederaceae. London: L. Reeve & Co.

82. Sharma S.K., Dkhar J., Kumaria S., Tandon P. and Rao S.R. (2012), “Assessment of phylogenetic inter-relationships in the genus Cymbidium (Orchidaceae) based on internal transcribed spacer region of rDNA”, Gene 495(1): 10-15.

83. Shim Y.H., Choi J.H., Park C.D., Lim C.J., Cho J.H. and Kim H.J. (2003), “Molecular Differentiation of Panax Species by RAPD Analysis”, Archives of Pharmacal Research 26(8): 601-605.

84. Shu Z., Fushimi H., Cai S. and Chen H. (2003a), “A new variety of the Genus Panax from Southern Yunnan, China and its sequences of 18S ribosomal RNA Gene and matK gene”, Journal Japanese of Botany 78(2): 86-94.

85. Shu Z., Fushimi H., Cai S. and Komatsu K. (2003b), “Phylogenetic relationship in the genus Panax: inferred from chloroplast trnK Gene and Nuclear 18S rDNA Gene Sequences”, Planta Medica 69(7): 647-653.

86. Shu Z., Fushimi H., Cai S. and Komatsu K. (2004), “Species Identification of Ginseng Drugs by Multiplex Amplication Refractory Mutation System (MARMS)”, Planta Medica 70(2): 189-192.

87. Soltis D. E., Kuzoff R. K., Conti E., Gornall R. and Ferguson K. (1996), “matK and rbcL gene sequence data indicate that Saxifraga (Saxifragaceae) is polyphyletic”, American Journal of Botany 83:371-381.

88. Soltis D.E. and Soltis P.S. (1997), “Phylogenetic relationships among Saxifragaceae sensu lato: a comparison of topologies based on 18S rDNA and rbcL sequences”, American Journal of Botany 84(4): 504-522.

89. Soltis D. E. and Soltis P. S. (1998), Choosing an approach anf an appropriate gene for phylogenetic analysis. Molecular systematic of plants II. DNA sequencing. Kluwer Academy Publications: Boston, pp. 1- 42.

90. Soltis P.S., Soltis D.E. and Chase M.W. (1999), “Angiosperm phylogeny inferred

from multiple gene as tool for comparative biology”, Nature 402: 402-404. 91. Sneath P. and Sokal R. (1973), Numerical Taxonomy. Freeman: San Francisco. 92. Steele P.R. and Pires J.C. (2011), “Biodiversity assessment: State of the art techniques in phylogenomics and species indentification”, American Journal of Botany 98(3): 415-415.

142

93. Swofford D.L., Olsen G.J., Waddell P.J. and Hillis D.M. (1996), “Phylogenetic Inference”. In Hiillis D.M., Moritz D., and Mable B.K., editors, Molecular Systematics. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, pp. 407-514.

94. Swofford D.L. (2003), PAUP*: Phylogenetic analysis using parsimony (* and other methods), version 4. Sinauer, Sunderland, Massachusetts, USA.

95. Taberlet P., Gielly L., Pautou G. and Bouvet J. (1991), “Universal primer for amplification of three non-codding regions of chloroplast DNA”, Plant Molecular Biology 17: 1105-1109.

96. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M. and Kumar S. (2011), “MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods”, Molecular Biology and Evolution 28(10): 2731-2739.

97. Thuan N.T., Thao V.T., Thanh N.V., Dong T.C. (2010), “Authentication of ginseng species by biomolecular methods”, Y Hoc TP. Ho Chi Minh – Supplement 14(1): 129-133.

98. Tsai H.T. and Feng K.M. (1975), “Triterpenoid from Panax L. and their relationship with taxonomy and geographical distribution”, Acta Phytotaxonomica Sinica 13(2): 29-48.

99. Wang D., Deborah H., Koh H.L., Zhang Y.J., Yang C.R. and Yan H. (2008), “Biodiversity in cultivated Panax notoginseng populations”, Acta Pharmacologica Sinica 29(9): 1137–1140.

100. Wang H., Sun H., Kwon W.S., Jin H. and Yang D.C. (2010), “A PCR-based SNP marker for speciﬁc authentication of Korean ginseng (panax ginseng) cultivar „„Chunpoong‟‟”, Molecular Biology Report 37(2): 1053–1057.

101. Weising K., Nybom H., Wolff K., Kahl G. (2005). DNA Fingerprinting in Plants Principles, Methods, and applications (second Edition). Cpc Press Taylor & Fancies group.

102. Wen J. (1993), “Generic delimitation of Aralia L. (Araliaceae)”, Brittonia 45(1) 47– 55.

103. Wen J. and Zimmer E.A. (1996), “Phylogeny and Biogeography of Panax L. (the Ginseng Genus, Araliaceae): Inferences from ITS Sequences of Nuclear Ribosomal DNA”, Molecular Phylogenetics and Evolution 6(2): 167-177.

104. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. (1990), “DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers”, Nucleic Acids Research 18:6531–6535

105. Woff P.G. & Sinclair R.B. (1997), “Highly differentiated populations of the narrow endemic plant Maquire Primrose (Primula maguirei)”, Conservation Biology 11(2): 375-391.

106. Xiang Q.B. and Lowry P.P. (2007), “Araliaceae”. – In: Wu C.Y., Rawen P.H. & Hong D.Y. (eds), Flora of China, Vol. 13. Science Press, Beijing, Missouri Botanical Garden Press., pp. 435-491

143

107. Yang D.C., Yang K.J. and Yoon E.S. (2001), “Comparison of ITS (Internal Transcribed Spacer) and 5.8S rDNA Sequences among Varieties and Cultivars in Panax ginseng”, Journal of Photoscience 8(2): 55−60.

108. Yang D.Q. (1981), “The cyto-taxonomic studies on some species of Panax L.”, Acta Phytotaxonomica Sinica 19:298–303. (In Chinese with English summary.).

109. Yang W., Hu Y., Wu W., Ye M. and Guo D. (2014), “Saponins in the genus Panax L. (Araliaceae): A systematic review of their chemical diversity”, Phytochemistry 106: 7-24.

110. Yang Z., Kumar S. and Nei M. (1995), “A new method of inference of ancestral nucleotide and amino acid sequences”, Genetics 141(4): 1641 – 1650.

111. Yu K.W., Gao W.Y., Son S.H. and Paek K.Y. (2000), “Improvement of ginsenoside production by jasmonic acid and some other elicitors in hairy root culture of ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer)”, In Vitro Cellar and Development Biology – Plant 36(5): 424-428.

112. Zhou J., Huang W.G., Wu M.Z., Yang C.R., Feng K.M., Wu Z.Y. (1975), “Triterpenoids from Panax Linn. and their relationship with taxonomy and geographical distribution”, Acta Phytotaxonomica. Sinica 13(2): 29–45, plates 6–7

113. Zhou L., Cao X., Zhang R., Peng Y., Zhao S. and Wu J. (2007), “Stimulation of saponin production in Panax ginseng hairy roots by two oligosaccharides from Paris polyphylla var. yunnanensis”, Biotechnology Letters 29(4): 631–634.

114. Zhou S.L., Xiong G.M., Li Z.Y. and Wen J. (2005), “Loss of Genetic Diversity of Domesticated Panax notoginseng F H Chen as Evidenced by ITS Sequence and AFLP Polymorphism: A Comparative Study with P. stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng”, Acta Botanica Sinica 47 (1): 107−115.

115. Zhuravlev Y.N., Koren O.G., Reunova G.D., Muzarok T.I., Gorpenchenko T.Y., Kats I.L. and Khrolenko Y.A. (2008), “Panax ginseng natural populations: their past, current state and perspectives”, Acta Pharmacologica Sinica 29(9): 1127–1136. 116. Zhuravlev Y.N., Reunova G.D., Kats I.L., Muzarok T.I. and Bondar A.A. (2010), “Genetic variability and population structure of endangered Panax ginseng in the Russian Primorye”, Chinese Medicine 5(21): 1-9.

117. Zietkiewicz E., Rafalski A. and Labuda D. (1994), “Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification”, Genomics 20(2): 176–183

118. Zuo Y.J., Chen Z.J., Kondo K.K., Funamoto T., Wen J. & Shou S.L. (2011), “DNA

Barcoding of Panax Species”, Planta Medica 77(2): 182-187.

119. Zuo Y.J., Wen J., Ma J. and Zhou S. (2014), “Evolutionary radiation of the Panax

bipinnatifidus species complex (Araliaceae) in the Sino‐Himalayan region of eastern Asia as inferred from AFLP analysis”, Journal of Systematics and Evolution 53(3):

144

210–220.

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: PHỔ ĐỒ TRÌNH TỰ CÁC VÙNG DNA BẢO TỒN CỦA CÁC TAXON ĐƢỢCTHU THẬP TRONG NGHIÊN CỨU

PHỔ ĐỒ GIẢI TRÌNH TỰ MỘT PHẦN GENE matK

Panax sp. Đối tƣợng nghiên cứu (mẫu 1) Panax sp. Đối tƣợng nghiên cứu (mẫu 2)

Panax vietnamensis var. fuscidiscus Panax stipuleanatus (undivided leaflet)

Panax stipuleanatus (bipinnatified leaflet) Panax vietnamensis

Polycias fruticosa

PHỔ ĐỒ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG ITS1-5,8s rDNA-ITS2

Panax sp. Đối tƣợng nghiên cứu (mẫu 1 - trình tự xuôi và ngƣợc)

Panax sp. Đối tƣợng nghiên cứu (mẫu 2 - trình tự xuôi và ngƣợc)