VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LÊ THỊ THỦY
NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN
TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9
BẰNG PHƯƠNG PHÁPBIỂU HIỆN TẠM THỜI
TRONG CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana benthamiana)
THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens”.
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Mã số: 9 42 01 12
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội, 2019
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS.
Chu Hoàng Hà đã hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi luôn nhận
đƣợc sự giúp đỡ của tập thể cán bộ hƣớng dẫn, các thầy cô giáo, các nhà khoa học,
các anh chị em đồng nghiệp và quý cơ quan, phòng ban. Tôi xin chân thành cảm ơn
Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng của Viện Công
nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án.
Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng
Công nghệ tế bào thực vật, phòng Công nghệ ADN ứng dụng Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Luận án đƣợc thực hiện tại, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thử
nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ
Việt Nam. Với sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong khuôn khổ đề tài
cấp Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Nghiên cứu sinh
Lê Thị Thủy
Lê Thị Thủy
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi các số liệu và kết quả trình bày
trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên tạp chí khoa học chuyên
ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chƣa ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong
luận án.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả
Lê Thị Thủy
iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN......................................................................................
i
LỜI CAM ĐOAN................................................................................
Ii
MỤC LỤC...........................................................................................
Iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.....................................................
Vi
DANH MỤC BẢNG........................................................................
Viii
DANH MỤC HÌNH.........................................................................
Xi
MỞ ĐẦU...............................................................................................
1
1
Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................
1
2
Mục tiêu nghiên cứu............................................................................
3
3
Nội dung nghiên cứu............................................................................
3
4
Những đóng góp mới của luận án........................................................
3
5
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án..........................................
4
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................
5
1.1
5
1.1.1
Nguồn gốc virus cúm A/H7N9............................................................
5
1.1.2
Đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9..................................................
6
1.1.3
Đa hợp tạo nên phân type A/H7N9.......................................................
9
1.1.4
Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của virus cúm A/H7N9......................
10
1.1.5
Tình hình dịch cúm A/H7N9...............................................................
13
1.2
Vacxin phòng chống bệnh cúm A......................................................
16
1.2.1
Một số loại vacxin phòng bệnh cúm A hiện nay...................................
16
1.2.2
Vacxin tái tổ hợp từ thực vật.................................................................
19
1.2.3
Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam......................................
20
1.2.4
Một số nghiên cứu về vắc xin cúm ở Việt Nam
21
1.3
Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vật thông qua
Agrobacterium....................................................................................
24
1.3.1
Hệ thống biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vât.....................
24
1.3.2
Quá trình biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium...........................
26
iv
1.3.3
Các chiến lƣợc tăng cƣờng biểu hiện protein tái tổ hơp ở thực vật………..
28
1.3.4
Tinh sạch protein tái tổ hợp ở thực vật………………………………..
34
1.4
Nano kim cƣơng (NDs) và những ứng dụng tiềm năng trong công
nghệ sinh học.................................................................................
37
1.4.1
Giới thiệu chung về vật liệu nano kim cƣơng.......................................
37
1.4.2
Ứng dụng của Nanodiamons trong khoa học sự sống và công nghệ
sinh học..................................................................................................
37
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................
41
2.1
Vật liệu..................................................................................................
41
2.1.1
Chủng vi khuẩn......................................................................................
41
2.1.2
Các vector và vật liệu thực vật, động vật...............................................
41
2.1.3
Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu..................................................
42
2.1.4
Hóa chất………………………………………………………………
42
2.1.5
Thiết bị………………………………………………………………...
43
2.2
Phƣơng pháp nghiên cứu.....................................................................
43
2.2.1
Các phƣơng pháp thiết kế gen, thiết kế vector chuyển gen và tạo
chủng A. tumefaciens cho biểu hiện tạm thời......................................
43
2.2.2
Thiết kế cấu trúc vector mang gen HA phục vụ chuyển gen.............
45
2.2.3
Các phƣơng pháp trong biểu hiện tạm thời và đánh giá mức độ biểu
hiện của protein tái tổ hợp trong lá thuốc lá...........................................
47
2.2.4
Tách chiết và tinh sạch protein tái tổ hợp …………………………….
50
2.2.5
51
2.2.6
Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm………………………………
55
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NHIÊN CỨU........................................................
56
3.1
Tổng hợp nhân tạo và thiết kế vector hỗ trợ biểu hiện gen mã hóa
kháng nguyên HA…………………………………………………….
56
3.1.1
Tổng hợ nhân tạo gen mã hóa kháng nguyên HA……………………..
56
3.1.2
Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA
mono_ELP..............................................................................................
59
3.1.3
Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA
trimeric_ELP .........................................................................................
62