BÒ GIAO DUO VÀ DÀO TAO
•
•
• DAI HOC QUÓC GU HA NÓI
TRUÒNG DAI HOC KHOA HOC TUNHIÈN
****
CAO XUAN THINH
DÙNG TRYPSIN THÈM AXIT AMIN TÀCH
TÉ BÀO PHÒI GÀ VÀ DANH GIÀ SUPHÀT TRIÉN
CÙA TÈ BÀO DÒ
LUAN AN THAC S? KHOA HOC HOA HOC
Qiuyèn ngành: Hoà HOu co
Masd:
01-04-02
Nguòrf hiróng dàn khoa hoc: GS.TS.KH Ngò Thi Thuàn
GS.TS.KH Nguyén Vàn Man
HA NÓI-2000
MUC LUC
Trang
MÒ DÀU
CHUONGLTÓNG QUAN
Ll.Tébào
4
7.7.7. Saluge lich sùtébào hgc
4
7.7.2. Màng bào tuoitg
5
1.1.3. Siéu càu trùc cùa càc vùng lién két giua càc té bào
10
7.7.-^. Suphàn chia té bào
19
1.2. Trypsin
19
7.2.7. Càc tién chat cùa enzym
19
7.2.2. Hogt hoà trypsinogen
20
1.2.J?. Dàc diém cùa trypsinogen - co che thuy phàn protein,
dnh huòiìg cùa nhiet dò va pll dai vói trypsin
23
1.2.4. Nhoni hydroxyl cùa serin
28
7.2.5. Axit amin
30
CHUONG 2. VÀT LIÈU VÀ PHUONG PHÀP
THUC NGHIÈM
2.1. Vatlieu
32
2.7.7. Trang thiét bi va dung cu can thiét
32
2.7.2. Càc mói truàng càn thiét dùng de tàch va nuói cày té bào 33
2.2. Phifimg phap thirc nghiem
37
2.2.7. Chuàn hi tritng gà co phói
37
2,2.2. Chuàn hi nuói cày té bào CEF
(Chick Embryos Fibroblast)
39
CHUONG 3. KÉT QUA VÀ THÀO LUÀN
40
3.1. So té bào song / mi dirgc tàch tir phói gà
40
3.2. So té bào chét / mi dugc tàch tir phói gà
42
3.3. So té bào song / gam dirgc tàch tir phòl gà
43
3.4. So té bào chét / gam dirgc tàch tir phói gà
44
3.5.Ty le té bào song / tong so té bào (%) tàch tir phói gà
45
3.6. Quan sàt sir phàt trién cùa té bào qua 2 ngày nuói cày
46
3.7. Su nhàn lén cùa virut trén té bào phói gà
48
3.8. Su phàn huy va tài tao té bào
51
3.9. Tàc dung cùa trypsin va trypsin axit amin
52
KÉT LUÀN
57
TÀI LIÈU THAMKHÀO
58
MODÀU
Tir dàu thàp nién 1950 viéc nghién culi va phàt trién càc vaexin da eó
dugc buóc tién bó nbày vgt nhó phuang phàp nuói cà'y té bào in vitro thành
cóng .
Thoat tién Goodpasture dà nuói cà'y tình dugc màng phói gà. Sau dò
Maitland dà cài tién nuói té bào thàn gà trong chai thuy tinli, dùng mói
truàng eó huyét thanh gà va mot sÓ muói khoàng de cà''y virut vaexin.
Khóng lAu ve sau, Gey da eó mot dóng góp dàng ké : óng de xuA't phuang
phàp quay tròn lién tue càc óng nghiém nuói té' bào dà cày virut vaexin va
bÀng ky thuAt này Gey dà thu hoach dugc lugng virut lón han gA'p bòi.
Cilng trong nhiTng nàm 50, Enders, Wella va Robbins thue hién nhiéu thf
nghiém cày virut trén té bào nguòi nuói in vitro, chù yéu là càc nguyén bào
xa (fibroblast) tu tÓ chirc da va ea cùa tré chét khi mói sinh. Bang phuang
phàp này càc tàc già dà dat dugc nhung két qua rat khà quan là dugc
polyovirut typ II Langsing vói khói lugng khà lón trong té bào nuói.
Thành cóng trong viéc su diing té' bào nuói in vitro de cày virut gay bénh
cho nguói dà ma ra mot ky nguyén mói nghién cuu va phàt trién mot loat càc
vaexin mai phòng càc bénh bai liét, dai, quai bj, thuy dàu, sai, v.v...
Gòng nghé nuói té bào a mot quy mó lón ngày càng dugc cài tién va hoàn
thién sé tao diéu kién thuAn Igi hon nùa cho viéc san xuà't càc vaexin va
nghién ciru sinh y hoc.
Bang phuang phap trypsin hoà nguòi ta dà tàch dugc càc té bào riéng ré
tìrmó [3]. Trypsin là mot trong nhung enzym phAn giài protein dac hiéu nhA't
san eó va cung dugc su dung róng rai nhàt [9]. Trypsin vói net dàc tnrng cùa
chuói peptit lién quan dé'n nhóm eaeboxyl cùa càc axit amin ea ban [22]. 0
diéu kién thieh hgp trypsin boat dóng rat huu hiéu trong viéc tàch mó, nhung
trypsin sé phà huy té' bào né'u kéo dai thòi gian trypsin hoà [26]. Tiì yéu cÀu
thue té càn lugng té bào song nhiéu han, nén chùng tói tién hành nghién cuu
de tài:
''Dùng trypsin thém axit amin tàch té bào phói gà va dành già su phàt
trién cùa té bào dò " .
Mue tiéu cùa de tài bao góm nhung vA'n de ehinh sau:
1 )Nghién cùru ành huong cùa trypsin va trypsin co axit
amin dén sir tàch té bào phói gà.
2) Dành già sir phàt trién cùa hai nhóm té' bào tàch
dugc theo càc phuang phàp trén.
Chuong 1
TÓNG QUAN
1.1. Té bào.
7.7.7, Saluge lich sùtébào hgc.
Té bào dugc Robert Hook phàt hién lÀn dàu tién vào nàm 1665 nhò kmh
hién vi tir tao vói dò phóng dai 30X. Ong dà xuàt ban euón "Kinh hién vi"
mó ta nhiéu dói tugng ma óng dà quan sàt dugc. Ong mó tà càu tiiie cùa tiéu
bau thue vAt à dcing càc xoang róng eó thành bao quanh va dat tén là cella
[4].
Antoni Van Leuvenhock (1674) vói kmh hién vi eó dò phóng dai 270X dà
mó tà càc té bào dóng vAt va dà xàc djnli té bào khóng phài là xoang róng ma
eó cA'u trùc phùe tap.
Tu quan diém té bào là "xoang róng" dà chuyén sang quan niém té bào là
khói té bào chat eó chùa nhàn (R. Brawn, 1831) va dugc giói han bòi màng
té bào [4]. Nhiéu qua trình sinh ly quan trong cùa té bào dugc nghién cuu
làm ca sa cho sir phàt trién cùa di truyén hoc , sinh ly hoc va phói sinh hoc a
cuòi théky XIX va dàu théky XX [21].
Ca thè ehi song trong tiiròng hgp néu càc hgp phÀn cùa nò dugc càu tao
tir le bào. Mó cùa tA't cà càc ea thè déu bao góm nhung té bào gAn vói nhau
bÀng nhiìng lue bàm thóng thuòng. TA't cà càc mó va càc ca quan ehi là càc
khói té bào bién dang khàc nhau [11], té bào sinh ra bang eàch chia dói va co
cAu phàt biéu nói tié'ng : "Ngoài té bào khóng eó su song" [4].
Hoc thuyét té bào dirge Engels dành già là mot trong mhiìng su kién lón
nliAt cùa thè ky 19. Hoc thuyét cho rÀng:
+ Mèi ca thè song déu eó càu tao té bào va san phàm boat dóng song cùa
té bào.
+ Càc té bào mói duae hình thành ti^ su phAn chia té bào cu
+ Thành phàn hoà hoc va su chuyén hoà cùa chùng rat gió'ng nhau. Boat
tinh ca thè toàn ven bao góm boat tinh va su tàc dóng tuang hó cùa càc dan
vi té bào dóc lAp càu tao nén nò [5].
Té bào là dan vj só'ng ea ban dugc tao thành bòi càc thành phàn quan
trong lién quan màt thiét vói nhau góm 3 thành phàn ea ban: màng, té bào
chA't, nhàn [4].
7.7.2. Màng bào tuoyig
Trong de tài nghién cuu này bang phuang phàp trypsin hoà chùng tói da
tàch dugc iihùng té bào riéng ré tir mó (phói gà), de bié't dugc nhung tàc dung
tfch cuc cung nhu khóng tieh ciré trong viéc thuy phAn protein màng té bào
cùa trypsin. Chùng tói quan tAm rat nhiéu dé'n cA'u tiijc cùa màng, dac biét
dé'n càc phàn biét hoà cùa màng nói giua càc té bào vói nhau. Màng bào
tuong là màng ngàn, giói han su ngA'm thu dóng dàn dé'n két qua là màng dò
chi cho phép càc chA't di qua theo gradien nóng dò, nguòi ta thày ràng niróc
va nhung chA't eó kliói lugng phAn tir nhò di qua màng ngàn do mot eàch tu
do. Su vAn chuyén mot so chat nhu duòng, axit amin... co su tham già cùa càc
enzym. Càc enzynì làm tàng toc dò thAm thà'u cùa càc chat dò qua màng. He
thóng enzym này tham già vào thành phàn càu tao cùa ehinh màng va boat
dóng nhu "chat chuyén chò" khóng phii thuóc vào nàng lugng [5]
Màng té bào là mot màng rat mòng , khóng thè nhìn thA'y dugc duói kùih
hién vi quang hoc ma dugc nhìn thA'y duói knih hién vi dién tu . Màng bào
tuong boc quanh té bào cùng dugc xàc nhàn nhò càc hién tugng sau:
- Càc ch^t chùa trong té' bào bi chày ra, dàc biét là khi thié'u Ca^^ khi té'
bào bi tén thircfng.
- Càc loai phàn tu ngà'm vào tè' bào khòng cùng tó'c dò nhir nhau.
- Nhùng ion cùng nhu phàn tir mang dién tfch thàm nhàp vào té' bào chàm
han nhùng phan tir khòng mang dién tich.
- Nhùng phàn tir bé thàm nhap vào té' bào nhanh hon nhùng phàn tu lón.
a. Càu tao cùa bào tuong.
Overton (1902) nhàn thà'y nhùng chc'ft hoà tan trong lipit rà't de xàm nhàp
vào té' bào, dòng thòi òng ta nhftn thà'y ràng nhùng dung mòi cùa lipit va
nhùng men iipaza phà huy màt té' bào. Tu dò òng két luàn màng bào tuong
co chat lipit . Già thuyét duoc khàng dinh sau khi nguòi ta nhàn thày nhùng
hoc7t dóng men ò màt ngoài màng bào tuong. Tu dò két luàn màng bào tuong
dugc tao thành bòi lipit va protit. Bang phuong phàp hoà hoc té' bào, nguói ta
còli chùng minh su co màt mot lóp chat co tinh chat cùa polysaccarit o trén
màt té' bào. Phàn tfch hoà hoc, nhàn thày màng bào tuong tàch rói co lipit,
protit vói so lugng tuong duong, dóng thòi co thém polisaccarit [28].
Màng bào tuong là mot màng dàm, day eàch màng té' bào bòi mot vùng
sàng nhò hon dò là mot tnjóng hgp càc desmosom dà dugc biét hoà cao dò
[6]. Màng té' bào co thè két dfnh vói là trong. Màng bào tuong co thè cà'u trùc
kiéu màng, song song vói màt té' bào. Càc màng này lién két vói nhau trong
mot khuón co ban chat hoà hoc gàn giò'ng keratohyaline [18]. Càc sgi nhò
nói té bào (tonofilaments) là nhùng thành phàn quan trong nhà't cùa vùng lién
két. Tonofilaments co duòng kfnii 10 nm, xuyén qua càc màng bào tuong, va
chia ra tiiành càc tién sgi bàm vào càc tiéu thè protein nói màng. Càc
tonofilaments là mot thành phàn cùa bó xuong té bào, là chat sùng cùa té' bào
nguòi ta dành già rat cao già tri cùa gangliosit eó trén màng té bào. Nhfmg
chat này tuong tu nhu photpholipit nò là mot ehuói ki nuóc, nhung phàn eó
ciré thi dai va két thue boi axit neuramin, cài ma co mot nhóm eaeboxyl tir
do.
Cuc cuòi cùa phAn tu chùra N-axetyllactosamil, glaetosamil va diròng
glucose [17]. Dién tieh bé màt Am tinh nguòi ta cho ràng eó lién quan dé'n
nóng dò cùa doan cuòi axit neuramin. Sau khi hoà tan nhe vói neuraminidase
dac biét thi axit neuramin tan ra tir té bào song va tinh (-) cùa bé mat giàm.
Càc thành phÀn quan trong cùa gangliosit dóng vai trò trong vàn chuyén ion
va trong màng chùra neuron. Ben canh viéc tao nén càc nhóm eaeboxyl
ionogen trén bé mat té bào axit neuramin là thành phàn quan trong cùa mot
sé khàng nguyén bé màt (vimt va khàng nguyén toxin). Nhung diéu dò chi
ra ràng càc gangliosit là thành phàn cA'u trùc quan trong cùa màng té bào.
e. Su biét hoà màng bào tuong va su két dinh.
Càc té bào canh nhau cùa co thè dugc ngan eàch nhau boi nhung khoàng
gian bào, giàn doan tùng quàng tuy theo càc kiéu phùe hgp lién két. Càc té
bào dugc ràp lai vói nhau qua càc móng.
Càc khoàng gian bào: Càc té bào khòng dfnh vói nhau trén suót chiéu dai
cùa chùng. Trong biéu mó hình lang kmh don giàn thày eó nhung kè ho giua
càc té bào, dò là càc khoàng gian bào. 0 dinh eó mot càu trùc ggi là khung té
bào, co tàc diing ngàn khóng cho dich lién bào thoàt ra va khóng cho chat
liéu bé mat biéu mó nhAp vào khoàng gian bào. Khoàng gian bào eó kieh
lluróc tuong dói bang dinh. Càc té bào lién két dugc vói nhau là do mot chA't
"kco" co chira càc protein (fibroneetin, elastin, collagen). Su eó màt cùa
Mg'^ va Ca'' là cÀn thiét cho sir lién két giùa càc té bào [ 14].
1.1.3. Siéu càu trùc cùa càc vùng lién két giira càc té bào.
Càc té' bào dugc phàn eàch vói nhau bang mot khoàng gian bào hep hoàc
ròng. Càc té' bào khóng dfnh vói nhau trén suót chiéu dai cùa chùng ma thà'y
co nhùng kè ho giùa càc tè' bào, dò là càc khoàng gian bào. Khoàng gian bào
co kfch thuóc tucmg dÓi hàng djnh [11].
Trong gian bào co djch khe vàn chuyè'n càc chà^t nuói duòng, càc chà't tié't
va càc chat thài [15]. Tai mot sÓ vùng càc màng tè' bào dinh lai vói nhau. Càc
vùng lién két này góm càc kiè'u lién két khàc nhau: (hình 2, 3, 4, 5a, 5b, 5c,
5d,5e )
- Càc lién két kiéu chat.
- Càc lién két kiéu khe.
- Càc lién két kiéu càu nói.
- Càc lién két kiéu desmosom.
a. Càc lién két kiéu chat.
Dò là càc vùng chuyén biét cùa màng, tai dò càc là ngoài lién ké't vói
nhau dén nói khòng con khoàng gian bào nùa, va nhu vày khòng con su van
chuyén chat giùa càc té' bào. Lién két kiéu chat thuòng thà'y ó nhiéu mó, nói
lién càc té' bào nói mó .Kiéu lién két chat này khòng con chó cho dich luu
chuyén giùa càc té' bào. Vi vày viéc trao dói ó day là giùa hai té' bào, chù
khòng phài là qua càc gian bào. Mòi màng té'bào thuóc lién két kiéu chat déu
co chùa pròtéin dugc ggi là càc connexin [4] (càc chat nói )(hình 2).
10
Hình 2- Lién két kiéu chat
b. Càc lién két kiéu khe.
Dò là càc vùng chuyén biét tai màng cùa hai té bào làn càn, nói hai màng
\:Ì\ vói nhau. Néu càt theo hình thuóc thg, lién ké't khe góm eó bay lóp :
- Càc là (hai là dàm va mot là sàng ) cùa mot trong hai té bào.
- Khoàng gian bào eó chiéu day 2-3 nm.
Ba là cua màng té bào lan can,
11
Nhu vay lién két kiéu khe góm co btfn là th^m thàu dugc
Nhung hai là ngoài sàt nhau qua nén khóng phin biét dugc. Do dò làm
tucmg lién két kiéu chat, vi vày khó xàc dinh dugc. Phài chùng minh su co
màt cùa gian bào bang Nitratlanthan. Vi chat này co thè nhàp vào càc gian
bào ké cà càc gian bào nhò. Nén dùng chat Nitratlanthan làm chat dành dàu
[10]. Qua hién vi dién tu, chat này due va de phàt hién. Néu ngàm mot tÓ
chùc trong dung dich Nitratlanthan thi de phàt hién dugc tà^t cà càc khoàng
gian bào. Càc phàn tu hgp thành connexon (mot hexame) càc connexon cùa
hai màng té bào làn càn dugc lién két vói nhau. Connexon co duòng kinh là 6
nm va co mot kénh trung tàm 2 nm, dugc bé trf theo mang luói hình lijc giàc
(hìnli 3).
Kénh giùa cùa connexon
Hình 3-Lién két kiéu khe
12
e. Lién két kiéu cdu nói.
Day va càc vùng chuyén biét cùa màng té bào, dugc nói vói nhau bang
càu nói xuyén qua gian bào. Khoàng gian bào eó kieh thuóc 16 ^ 20 nm giua
càc màng té bào là càc càu nói, hình dàm (hình 4).
Hình 4 - Lién két kiéu càu nói
d. Càc lién két kiéu desmosom.
Giùa càc té bào biéu mó chùng ta hay thA'y desmosom. Cài này dugc nhìn
thày nhuòm màu tói trén kmh hién vi quang hoc, cài ma nguòi ta cho là cài
13
càu giùa càc té bào, nhùng sgi mòng euón vào desmosom txi dAy nguòi ta tin
ràng thóng qua càc càu eó thè dua tu té bào này sang té bào kia. Cuòi cùng
kinh hién vi dién tu da làm sàng tò càu bòi khóng eó vàn de ve su lién nhau
giùa càc té bào (hình 5a).
M
<-•« ».* *
' :\
\
wi
~^ fi
-'> J
••'.Vtf'.-V
^z,
lu-
» >•
•»
Hình 5(a)- Lién ké't kiéu desmosom
14
Cài goi là phàn ''Khoà" thóng thuòng gap ò giGa càc té bào biéu mó hình
tru tnic tiép duói bé màt tu do (hình 5c).
rp=^
rr=^
vy^
Hình 5(c)- Lién két kiéu desmosom
Duói kinh hién vi dién tiJ nò tuong tu nhu Desmosom, màng day lén a
ben canh nò co mot chft màu tèi co thè gap nhung thóng thuòng khóng co sgi
ta.
Giùa càc bé màt té bào tiép xùc vói nhau co nhiéu hình thùc cài ràng
Urge co thè quan sàt. Mot trong vf dii mmh hoa là (hình 5d).
ifi
Desmosom là phàn day lén tal chó cùa càc màng té bào dÓi dién vói nliau,
tu nhung cài ma sgi nhò mòng tién thành hình tia di vào ben trong bào tucfng.
Giua càc Desmosom tliuòng xuàt hién nhung doan noi ma càu tao long léo va
ò day khoàng lién bào thuc chat da hình thànli. Tai day chat long tu do co thè
v9n chuyén (hình 5b).
Hình 5(b)- Lién két kiéu desmosom
Desmosom co thè tliày trong mot sÓ té bào bièu mO.
15
Hình 5(d)- Lién két kiéu desmosom
Nhung Desmosom va phàn "Khoà" ben canh bé màt chay theo làn song
dà làm cho mÓi lién két chat che hcfn.
Day là càc he phùc tap nhàt, biét hoà ò mùc cao nhàt, de lién két càc té
bào vói nliau, dugc phàn bÓ thành càc diém déu dàn doc theo duòng bién
giùa hai té bào làn càn. Hình trai xoan duòng k(nh lón là 400^500 nm duòng
kùili nhò 190 nm. Truc lón thuòng song song vói tnjc té bào. Cit theo hình
thiróc thg sé thày màng cùa càc té bào làn càn khòng hgp nhàt vói nhau, va
kliòng co tiép xùc truc tiép.
H»C- U- •
'
IJ ••
V.-- V» i
N
u!(,^
17
- Khoàng gian bào là 24 nm, co khi lón tói 50 nm (tniòng hgp desmosom
da dugc biét hoà cao dò) [26].
- Càc thành phàn ngoai té bào: "ào" khoàng gian bào cùa desmosom co
chùa càc chat hoà hoc giÓng nJiU cùa "ào". 0 day "ào" trò nén dàm hon eó
vai trò nhu xi màng gàn càc desmosom vói nhau [31] (hình 5e).
Demosom
Demosom
PHUC HO? CÀC DlEM NOI GIUA HAI TE BÀO RUÒT
Hình 5(e)- Lién két kiéu desmosom
18
1.1.4. Su phàn chia té bào.
Co hai loai té bào: té bào soma (dinh duong) va té bào sinh dite. Té bào
don cùng nhu té bào trong càc mó cùa ea thè da bào thuòng phAn chia theo
kiéu nguyén phAn vói mot lÀn nhAn dói cùa phAn tu DNA va 4 kì phAn chia:
kì dàu, kì giùa, kì sau va kì cuòi, lui nam 1858 Virchov dà dua ra dinh de nói
tié'ng: *'té bào sinh ra tu té bào eó tiiróe" [5]. Tu té bào con mói dugc sinh ra
bang con duòng trao dói chA't tang truòng kJió'i lugng té bào chat va nhàn dàp
ùng càc boat dòng song. Té bào tàng truòng dén mot mue dò nào dò thi phAn
chia ra thành càc té bào mói [16].
1.2. Trypsin.
Trypsiiì là mot proteaza serin tuyén tuy vói net dac trung cùa chuói peptit
lien quan dén nhóm eaeboxyl cùa càc axit amin ca bàn là arginin va lysin.
Trypsin tinh khiét mot minh thiròng kém hiéu qua trong viéc tàch té bào mó,
vi no ehi ra tmh chon loc ft dÓi vói càc protein gian bào. Trypsin khi co su
két hgp vói chymotrypsin va elastase thi eó hiéu qua trong viéc tàch mó
nhiéu hon. Hoat tmh cùa trypsin bi IJTC che' bòi Ca^^ va Mg^^. Vi vày, trypsin
nén dugc chuAn bi vói sir vAng mat cùa càc muói này.
7.2.7. Càc tién chat cùa enzym
PhÀn lón càc enzym dirgc tóng hgp thành càc phàn tu enzym eó boat tinh,
nlìtrng co nhiìng enzym dugc tóng hgp qua 1 dang trung gian khóng eó boat
tùih xùc tac goi là zymoenzym hay proenzym. Dò là nhung tién chA't de tao
(hành enzym, chù khóng phài là enzym thue su. Nhung chà't này phài trai qua
I qua trình bién dói, sAp xép hai cA'u trùc phAn tu mói trò thành enzym hoat
tinh. Qua trình dò bao góm su thùy phAn lién két peptit, loai bò 1 vài doan
peptit co tàc dung kìm hàm hocit dóng hoàc bao vAy che lA'p trung tAm hoat
19
dóng cùa enzym. Do dò ma phàn tt!r khÓi cùa enzym eó boat tinh thuòng nhò
hon phàn tu khÓi cùa ehinh tién chat tao ra no. Qua trình này ggi là su boat
hoà zymogen va nguòi ta cho ràng ehinh qua trình này da làm bóc lo hoàc da
tao ra tàm boat dòng cùa enzym. Qua trình hoat hoà eó thè là qua trình tu xùc
tàc hoàc do 1 enzym khàc xùc tàc [1].
Hoat dòng cùa trypsin là hién tugng tóng hgp ra càc zymogen eó mot y
nghTa sinh hoc quan trong, eó thè nói ràng, càc proteaza trong óng tiéu hoà
dugc tóng hgp qua giai doan tmng gian nhu vày ehinh là mot ca che tu bào
ve cùa ca thè vi néu khòng nhu vày thi ehinh càc tuyén da tóng hgp nén càc
loai enzym này sé bi tiéu hùy bòi ehnih nhung enzym do chùng tóng hgp nén
[6].
Ò loài ngiròi va nhiéu locii dóng vàt eó vù, càc enzym thuy phàn protit
(proteaza) trong óng tiéu hoà déu dugc tóng hgp ra duói dang tién chat cùa
enzym. Vi du trypsinogen cùa tuyén tuy là tién chat cùa trypsin. Càc chat này
déu ehi duge boat hoà thành dang enzym boat dóng sau khi da tié't vào long
óng tiéu hoà. Trypsinogen duge hoat hoà thành trypsin duói tàc diing cùa
chuìh trypsin hoàc enterokinaza.
7.2.2. llogt hoà trypsinogen.
Su phAn lAp tinh khiét trypsinogen va trypsin cùng nliu su nghién cuu
dóng hoc cùa qua trinh hocit hoà trypsinogen thành trypsin dà dugc thirc hién
long lai trong truòng phài cùa Northrop. Trypsinogen tinh thè eó thè boat hoà
bang ehmh trypsin va nhu vày vói nhùng diéu kién thieh hgp, qua trình tu xùc
tàc dà dugc thue hién. Trypsinogen cùng duge boat hoà bang enterokinaza,
mot enzym thùy phàn protit eó trong dich tié't cùa ruót va 1 sÓ enzym tuang
tu tu nguón góc khàc nhau, vi dii nhu "kinaza^' cùa penicillinum sp. TA't cà
càc triròng hgp déu san xuA't ra cùng 1 loai trypsin.
20
Trong qua trình tu xùc tàc, co thè xày ra 2 phàn ùmg canh tranh nhau: mot
phàn ung (a) tao thành trypsin eó boat tinh va 1 phàn ùmg (b) tao thành 1
protein khóng eó hoat tinh enzym, su phàn phÓi pepsinogen cho 2 phàn ùng
này phu thuóc vào pH va sii eó mat cùa 1 sÓ ion. Ion Ca^^ làm tàng cuòng
phàn ung (a) va ngàn chàn phàn ung (b). Ké't qua là khi co màt 0,02 mol
CaClj va dugc khòi dàu vói sir eó mat cùa 1 lugng nliò (vét) enterokinaza thi
phàn ung sé xày ra nhu 1 qua trình tu xùc tàc thuàn nhà't. Ion Ca""^ va pH thàp
sé làm tàng hiéu suA't enzym eó hoat tinh, nhung ò pH thàp thi toc dò boat
hoà kém [2].
Hai phàn ung Ccinh tranh nhau trong qua trình hoat hoà trypsinogen eó thè
biéu thi nhu sau:
Trypsinogen
*- Trypsni + Hcxapcpiil
(a)
Hoac "kina/a"
Trypsin ^ .
Trypsinogen irypsin ^ Protein khóng co hoat tinh enzym (b)
Kinaza cùa nàm mÓc eó su khàc biét rò lét vói càc "kinaza'' khàc ò ebÓ là
nò hoat dòng trong dung dich axit (pH thieh hgp nhà't vào khoàng 3,5) ma a
pH do trypsin khóng hoat dóng duge, do dò trong truòng hgp này su hoat hoà
khòng phài là hién tugng tu xùc tàc.
Trypsinogen cùa bò eó phAn tu khói vào khoàng 24.000 va trypsin cùa bò
eó phAn tu khói nhò han mot ehùt, nguòi ta cùng phàt hién thày 2 loai phAn
tu này eó su khàc biét nhau ve hA'p thu quang phó (tia tu ngoai). Mói loai
phAn tu ké trén déu chi do mot ehuói polypeptit càu tao nén va eó thè phàt
hién dugc nhóm a-amino tAn cùng, nhung khòng phàt hién dugc nhóm C tàn
l^ang eàch su dung eaeboxylpeptitaza. Diéu dò eó thè là do cA'u trùc vòng a
dàu này, nhung do su càn tra khóng gian nào do nén eaeboxylpeptitaza
21
khóng tàc dóng dugc. Nguòi ta da chung minh ràng, mot doan 6 axit amin dà
tàch ra khòi trypsin trong qua trình boat hoà va nguòi ta cùng phàn làp duge
1 hexapeptit góm 6 axit amin (Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys). Su loai bò
hexapeptit dà làm cho phàn tir thay dói hình dang khòng gian va eó le vi thè
da tao diéu kién cho su hình thành tàm boat dòng cùa enzym [1]. Trypsin
dugc boat boa bòi enteropeptitaza. Trypsin là mot chat khòi dàu thóng dung
cùa càc zymogen tiiy tang. Nò duge tóng hgp khi trypsinogen zymogen
khóng boat dóng va phài duge boat hoà bòi ehinh nò. Enzym hoat hoà trypsin
dugc ggi là enteropeptitaza, enzym thùy phàn protein nàm trong tà tràng. Nò
xùc tàc cho qua trình tàch doan chuói polypeptit ò trypsinogen giua góc
Lysin 6 va Isoleucin 7.
-f- Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys - ILcu-Val-Gly^
Peptit
Trypsin
Su do niò tà su bién dói trypsinogen cùa bò thành trypsin
Trén sa dò này, nguòi ta thà'y lién ké't peptit giua Lysin va Isoleucin dà bj
bé gay trong qua trình boat hoà.
Ngoài ra, nguòi ta cùng nghién cuu su boat boa cùa nhiéu trypsinogen tu
tuy cùa dòng vAt khàc. Trong khi boat hoà trypsinogen tiiy Ign, nguòi ta thà'y
oetapeptit (-Phe-Thr-Pro-Asp 4-Lys-) da duge giài phóng ra. Khóng gió'ng
nhu triròng hgp cùa bò, nguòi ta dà xàc dinh duge axit amin C tàn cùa
trypsinogen trong tiiy ign va xàc dinh dirge chuói thu tu ò dAu này là Ala-Asp
(NH^ hoac là Ileu-Ala-Glu (NH^). Trong qua trình bién dói trypsinogen
thành trypsin, dAu C tàn cùng cùa chuói khóng bi bién dói [1].
22
1.2.3. Dàc diém cùa trypsin - Ca che thùy phàn protein, dnh huong cùa
nhiet do va pH dai vói trypsin
a. Dac diém, càu truc cùa trypsin.
- Dàc diém.
Qua trình thùy phàn protein trong ruót dóng vàt eó vù duge dién ra trong
truc tràng a pH gàn = 6 bòi càc thành phàn chùa enzym eó trong qua trình
tié't ra dich tiiy. Qio dé'n khi eó su biéu hién cùa nhiéu locii protein hocit dòng
trong dich tuy, tbì nguòi ta vàn tin ràng qua trình này ehi chua duy nhA't I loai
proteaza, co tén là trypsin. Hón hgp cùa càc enzym thùy phAn protein trong
dich tiiy eó thè duge bÓ nbiém mot eàch thieh hgp han bòi tiiy tang, trypsin
dirge An dinh cho mot trong càc proteaza, va chymotrypsin dugc An dinh cho
mot proteaza khàc. Su hién dién cùa mot proteaza khàc trong tiiy tang dugc
chi ra do viéc tìm thày mot loai enzym (enzym dàn hói) ma xuàt hién tuang
dói dac trung trong qua trình làm giàm su dàn hói, mae dù càc protein khàc
cùng bi thùy phAn bòi enzym này. Han nùa, chùng eó là rat ro ràng cho su
tón tai cùa tnót "protaminaza" tuy tang [16].
- Càu trùc.
Càu trùc cùa chymotrypsin, trypsin va elastaza là tuang tu nhau, ea che
xùc tàc cùa chùng cho qua trình thuy phAn càc ehuÓi peptit là gàn nhu giò'ng
hét nhau. Ba loai proteaza serin này chi khàc nhau a 1 vài màt xich trén bé
mat va net dac tiirng ve góc cùa chùng. Chymotrypsin xùc tàc cho qua trình
thùy phAn càc chuói peptit ve phfa C tàn cùa càc chuói ben hydrophobic lón.
Trypsin xùc tàc cho qua trình thùy phàn cùa càc chuói peptit ve phia C tàn
cùa càc chuói ben ca bàn cùa arginili va lysin. Elastaza thuòng xùc tàc cho
23
qua trình thùy phàn cùa càc chuói peptit trong dò 1 glycin hoàc 1 phàn cùa
ehymofryp Mnogen
alanin bó sung cho phàn axyl [13] (hình 6).
Hình 6- Sa dò càu trùc phàn tir cùa Chymotrypsinogen A va Trypsinogen.
b, Ca che thuy phàn protein
Trypsin eó dang tinh thè do Kunitz va Narthrop phàt hién, eó khÓi lugng
phàn tu klioàng 24000 va c6 diém ding dién ò pH =10,5, nò tàn cóng dugc
vào càc protein. Vi dii Casem boat dòng tÓi uu ò pH = 8, màc dù mot sÓ qua
trình tliuy phàn protein co thè dién ra Ò pH thàp = 6 [7]. GiÓng nhu pepsin,
trypsin dugc tìm thày là mot endopeptidaza ma co tàc dung tói càc lién két
CO-NH trong càc co chat tÓng hgp cùa càc càu trùc don giàn. Tu càc nghièn
cuu này cùa Bergmann va cOng su, nguòi ta di dén két luàn ràng net dàc
tnrng cùa trypsin là truc tiép tliùy phàn càc lién két peptit de tao thành dufti
L-arginin hoàc L-lysùi làm cho hàm lugng nhóm cacbonyl tàng lén. Do vSy,
24
càc ca chat tóng hgp eó thè phù hgp cho trypsin tinh thè là benzoyl-L-
arginamit hoàc benzoyl-L-lysinamit, càc chat này bj kbir amin va làn lugt tao
thành benzoyl-L-arginin va benzoyl-L-lysin. Su thay thè càc duói axit amin
bang càc chà't khàc nhau tao ra hgp chat chiù dugc tàc dung cùa trypsin [29].
Trypsin tinh thè cùng thùy phàn càc protamin va càc peptitlysin tÓng hgp
dugc tao bòi càc phàn ung tiìing hgp. Trypsin tinh thè eó thè co tàc dung tói
càc lién ké't este cùng nhu tói càc lién ké't amit, vói diéu kién là eó càc yéu
càu dàc biét khàc cùa enzym ma dà de càp a trén. Nhu vày, trypsin thùy phàn
benzoyl-L-arginin methyl este, nhung khóng thùy phàn benzoyl-L-leuein
metyl este, trong khi dò chymotrypsin eó khà nàng thùy phàn tà't cà càc lién
két este [19J.
H2N
C Il HN NH I {Cìhh NH2 I ' (CTl2)4
Q,H,,CO-NH(^HCX)-Ì-NH2-a a Cr,HsCX)-NHCHC04-NH2-a a
Benzoyl-L-arginamit Benzoyl-L-Lysinamit
H2N
C I HN NH I (CH2)3
QHsCO-NHCHCO-foCH, Benzoyl-L-arginin metyl este
Dàc trirng ciìa trypsin dò'i vói cac lién ké't co duói arginin hay lysin là
khòng chi ap dung dói vói cac co chat tóng hcfp ma con cà vói càc protein, do
vay, viéc tao ra enzym nhy là chft't phàn ihig vó cijng già tri trong viéc nghién
7
cuu càc chuói aminoaxid trong càc mach polypeptit phuc tap [23].
e. Anh huòiig cùa nhiet dò va pll ddi vói trypsin.
- Anh buòne cùa nhiét dò.
25
Trypsin thu dugc ixi mot tién chà't khòng boat dóng, eó tén là trypsinogen,
co trong càc té bào acinar cùa tiiy tang. Tién chà't này eó duge ò dang tinlì thè
do Kuintz va Northrop, là nhung nguòi dà chi ra ràng su hình thành trypsin
xày ra rat nhanh khi trypsinogen dugc hoà tan trong dung dich trung tinh.Su
bién dói tix trypsinogen sang thành trypsin là xày ra nhanh nhà't ò pH = 7 ^ 8,
va sif boat hoà duge xùc tàc bòi trypsin, do vày phàn ùmg này là phàn ùmg tu
xùc tàc [7].
Cùng gióng nhu hàu hét càc phàn ùmg hoà hgc, càc phàn ùmg co enzym
xùc tàc phii thuóc rat manh vào nhét dò. Arbenius da trình bay 1 eàch eó he
thóng ve tàc dung cùa nhiét dò dói vói toc dò phàn ùmg. Ong cho ràng khóng
phài mgi phàn tu trong I he thóng co thè tham già phàn ùmg, ma ehi 1 phàn
tu nào eó dù nàng lugng hoat hoà mói eó khà nàng phàn ùmg. Trong càc phàn
ùng enzym, nhiét dò eó tàc diing làm tàng toc dò cùa phàn ihig lén tÓc dò cuc
dai, va cùng gió'ng nhu càc phàn ung hoà hoc nói chung, cbijlig nào enzym
chua bi bién tinh tbì mói khi tàng nhiét dò lén 10''C, toc dò phàn ùmg sé tàng
lén khoàng 2 làn. Khi tàng nhiét dò lén dén khoàng 60 ^ 70^C tbì phàn lón
càc enzym màt bàn boat tinh va nhiét dò dò duge goi là nhiét dò tói han [2].
Mòi enzym déu eó mot nliiét dò thieh hgp nhà't cho sir boat dóng xùc tàc, ò
nhiét dò dò phàn ihig enzym dat tói toc dò cao nhà't [24]. Nói chung nhiét dò
thieh hgp cùa enzym gàn vói nhiét dò cùa ea thè. Tuy nhién cùng càn chù y
ràng, nhiét dò thieh hgp cùa 1 enzym khòng eÓ dinh ma phii thuóc vào nhiéu
yéu to', thòi gian tàc dung càng dai thi nhiét dò thieh hgp cùa enzym càng
thàp. Ngoài ra, nóng dò enzym, nÓng dò ca chat, dang tón tai cùa enzym
cùng eó thè làm thay dói tàc dung cùa nhiét dò dói vói enzym [17]. Nói
chung enzym ò dung dich loang, khóng eó ea chat, thuòng kém ben nhà't. Ò
trcang thài khó va co ca chà't tbì khà ben vói nhiét [25]. Vói nhiét dò thàp thi
boat dò cùa enzym giàm di. Tai nhiét dò O^'C, boat dò cùa nhiéu enzym con
26
lai khóng dàng ké. Khi tàng nhiét dò lén tbì boat tinh cùa enzym lai tàng theo
vi enzym khóng bi bién tinh ò nhiét dò lanh. Nguòi ta su diing dàc tinh này
de bào quàn enzym. Enzym thuòng dugc bào quan a OX hoàc nhiéu khi ò -
20''C hoàc -30X hoac thàp han nua [2]. Trong truòng hgp dùng trypsin de
tàch té bào ti^ mó hoàc té bào mot lóp, nhiét dò thieh hgp nhàt là 37''C.
- Ành huong cùa pH dÓi vói trypsin
Enzym rà't nhay càm vói pH cùa mói tiiròng, do dò pH eó tàc dung rat lón
tói toc dò cùa enzym. MÓi enzym eó mot tri sÓ pH thieh hgp cho sir boat
dóng cùa nò. Ò pH dò, toc dò cùa phàn img enzym tòt nhàt, vói nhung tri sÓ
lón han va nhò han tri so thieh hgp, toc dò phàn ùmg enzym giàm dàn. Co rat
nhiéu enzym eó pH thieh hgp a vùng trung tnih nhung cùng eó nhùng enzym
hocnt dòng ò vùng rat axit nhu pepsin ( pH = 1,5 ) va eó nhùng enzym khàc
boat dóng ò vùng rat kiém nhu phosphataza kiém (pH = 9 -:- 10) [1].
Trong thue hành, phài luón luón bào dàm pH thieh hgp nhà't cho su boat
dóng cùa enzym càn nghién cuu. MuÓn vày phài su diing càc dung dich dém
de giù vijng pH càn thiét cho enzym. Dói vói mot enzym nhà't dinh, pH thieh
hgp cùa nò khóng phài lue nào cùng eó' dinh, ma co thè thay dói theo tinh
chat va nóng dò cùa ca chat, nhiét dò cùa phàn ung va bàn chat cùa càc loai
dung dich dém. Mantaza eó pH thieh hgp là 6,6 khi ea chat là Mantoza, pH
thieh hgp là 6,2 khi ca chat là Metyl glueoxit; néu nhiét dò là 4TC thi pH
thich hgp là 4,3, khi nhiét dò là 37,5"C tbì pH thieh hgp là 7,2 [8], pH thieh
hgp de tàch té bào phói gà là 7,4.
Anh hiròng cuà pH dói vói càc phàn ùmg enzym eó thè do nhiéu tàc diing
rat khàc nhau. pH eó thè ành huong dén toc dò cùa phàn ung enzym do tàc
dung vào trang thài ion hoà cùa phàn tu enzym (nhà't là càc nhóm boat dóng
27
cùa enzym), vào trang thài ion hoà cùa co chat, vào dò ben vùmg cùa phàn tir
enzym va ành huong dén sir ké't hgp giiia phàn protein va phàn phii khóng
phài protein (nhóm phii hay nhóm eoenzym) cùa enzym. Enzym là nhung
protein vói nhung nhóm hoat dòng dàc biét, eó thè tón tai duói nhiéu trang
thài ion khàc nhau va thuòng chi mot trang thài eó boat tinh xùc tàc; pH eó
tàc dimg quyét dinh dÓi vói trang thài ion hoà cùa phàn tir enzym nói chung
va càc nhóm boat dòng cùa enzym nói riéng, do dò ma ành huong dén boat
tinh cùa enzym. Trong rat nhiéu tniòng hgp, co chat là nbiJng chat ion hoà va
phàn ùmg phii thuóc vào mot trang thài ion nhà't dinh cùa co chat. Càc phàn tu
enzym cùng nhu nhiéu protein nói chung ehi ben vùmg trong mot vùng pH
nhà't dinh, phàn lón là ò vùng trung tinh. Tuy nhién cùng co nhung enzym
ben vung ò vùng pH rat axit, vi du nhu |:>epsin, enzym này sé màt boat tinh
nhanh chóng trong dung djch trung tinh hay pH kiém.
1.2.4. Nhóm hydroxyl cùa serin.
Nguòi ta dà phàt hién duge vai trò quan trgng cùa góc serin trong tàm
hoat dóng cùa mot sé esteraza, proteinaza va photphoglucomutase. Vai trò
cùa serin dà duge xàc dinh khi dùng càc chat photpho huu co nhu
diisopropylfluoio-photphat hay tetraetylpyrophotphat làm chà't ùe che càc
enzym axetyleholinesterase va nhiéu hydrolase khàc. Nguòi ta thà'y góc
photphat cùa càc chat uè che này da két hgp vói nhóm hydroxyl cùa góc serin
hoat dòng cùa cholinesterase, chymotrypsin va mot sÓ enzym khàc cùng
loai, tao nén nhung dàn xuàt 0- pbotphoryl ben vung. Càc lién két này ehi bi
phàn giài trong nhùìig diéu kién nhà't dinh bòi nhung chat ài nhàn, vi du nhu
càc dàn chat cùa hydioxylamin. Sau khi lién ké't vói chat ùfc che bi phàn giài
thi hocit tmh cùa enzym dugc phiie hói. Sau khi thùy phàn tùng phàn nhùng
enzym két hgj) vói chat ùe che eó chùa P"^^ hoàc chymotrypsin két hgp vói N-
28
nitrophenylaxetat C*"*, nguòi ta da tìm thà'y 0-axyl-serin dành dàu trong
nhung doan peptit co chuói axit amin gàn gióng nhau.
Ser —Gly- Asp Gly Gly Ala
Vói nhùng ké't qua cùa nhiéu loai thue nghiém khàc nhau, nguòi ta di dén
két luàn ràng, ehinh nhóm serin cùa esterase va proteinase da tbiJc hién ebùc
nàng cùa chà't nhàn tmng gian dói vói nhóm axyl trong càc phàn ùng thùy
phàn càc co chat thién nhién hoac càc phàn ùng ké't hgp vói càc chat ùe che'.
Nhóm hydroxyl (OH ) cùa serin tu do, giò'ng nhu nhiJng nhóm ancol bàc nhà't
khàc, rà't tra ve màt hoà hgc, nhimg khi eó nhùng diéu kién gay ra su phàn
cuc cùa nhóm dò thi khà nàng phàn ùng cùa nò tàng lén rat nhiéu. Trong
phàn tu eó nhàn thom dà làm cho màt dò dién tu ò nguyén tu oxy cùa nhóm
OH bi giàm di ró lét, do dò nguyén tu bydro cùa nò de bi phàn ly va thay thè'
bang nhùng nhóm tieh dién duong [1].
ir + H^
Trong phàn tu serin, ta khòng thà'y eó nhùng lién két dói va nhùng chat
thè nhàn dién tu két hgp vói nhóm hydroxyl (-OH) (nhu truòng hgp cùa
phenol) de gay ra su phàn cuc nhóm dò do su chuyén chó nói phàn tu cùa càc
dién tu. Nhu vày, io ràng là su tàng boat tinh cùa nhóm hydroxyl cùa serin
trong trung tàm boat dóng cùa enzym nguyén thùy bàn là do ành huong cùa
nhtTmg nhóiiì ebùc nàng khàc gàn ké vói nhóm này, va cùng vói nhóm này
tham già vào tuong tàc tinh dién (hiéu ùng càm ùng ngoài, su tao thành lién
két bydro...). Diéu này dugc ehirng minh thém khi nguòi ta nhàn xét thà'y
ràng, nhóm hydroxyl cùa nhùng góc serin khàc cùa phàn tu enzym hoac cùa
nhiìng góc serin trong trung tàm boat dòng cùa nhùng phàn tu enzym dà mà't
29
hoat tinh do nhijmg nhàn tÓ làm bié'n tinh, déu rat tro ve màt hoà hoc. Trong
càc peptit tóng hgp phòng theo cà'u tao mot doan cùa chuói peptit co chùa
serin boat dóng trong phàn tu enzym esterase (vi dii trong tetrapeptit-Gly-
Asp-Ser-Gly-) thi nhóm hydroxyl cùa Ser cùng rat tro [12].
Mot sé tàc già dua ra già thuyét ràng, trong tmng tàm boat dòng cùa
esterase, nhóm hydroxyl (Ser) duge boat hoà nhò tàc diing qua lai vói nhóm
carboxyl tu do cùa axit aspartie hoàc axit glutamie nàm canh serin trong
chuói peptit, do su tao thành lién két bydro hoàc lién ké't este. Tuy nhién,
trong mot sÓ enzym khàc eó chùa serin, nhu subtilisin va
photphoglucomutase nguòi ta khóng thà'y eó axit amin dicaeboxylie ò canh
serin.
1.2.5.Axit amin.
Trong tìiòi truòng nuói cà'y té bào, càc axit amin phài dugc thém vào mói
triròng nuói cà'y té bào, chùng duge su dung cho viéc tóng hgp protein va axit
nucleic (ADN va RNA) [26]. Chùng cùng tham già vào qua trình vàn chuyén
ion. Bòi vi càc axit amin là luong tinh, phàn ùng nhu là axit va bazo. Càc axit
amin tu do eó thè dóng vai trò nhu là càc chat dém [25]. Khi thié'u càc
enzym, té bào trong nuói cà'y khóng thè san xuàt tà't cà càc axit amin ma té
bào dói bòi. Trong in vitro, IO axit amin dugc coi là càn thiét, té bào khòng
thè tu tóng ligi") duge: là arginin, bistidin, isoleucin, leuein, lysin, methionin,
phenylalanin, thrionin, tryptophan, valin. Nhiéu té bào dac biét là càc té bào
giù chire nàng vàn chuyén eó dói bòi cao ve glutamin. Trong mói tiiròng nuói
cà'y lo lirng va càc cóng nghé nuói cà'y dac biét khàc eó thè dói bòi thém càc
axit amin khàc chàng han serin cho viéc phàt trién té bào don le [30]. Vi vày
càc axit amin khàc ngoài 10 axit amin khòng thè thay thè thuòng duge thém
vào hàu hét càc mói triròng nuòi cày té bào [27]. Vi càc té bào chi su dung
càc dóng phàn L cùa càc axit amin, càc dóng phàn D co thè bi han che, nhìn
30
chung trong mói truòng nuói cày té bào chi chùa càc L axit amin. Nhùng axit
amin ma té bào khòng tir tóng hgp dugc là nhu càu tÓi càn thiét cho su phàt
trién cùa té' bào. Vi nò là nguón du trù tao ADN va protein trong té bào,
khóng chi trong qua trình nuói cà'y ma ngay cà trong dung dich trypsin dùng
tàch nhimg té bào riéng ré tu càc mó. Viéc dua thém nhùng axit amin này
cùng rà't càn thiét.
31
Chirong 2
VAT LIÈU VÀ PHl/ONG PHÀP THlTC NGHIÈM
2.1. Vat lìeu.
2.1.1. Trang thiét bi va dung cu can thiét.
- May do pH. - Trùng gà da thu thai 9 ngày tuoi.
- Tu à'p ti-ùng 39'^C.
- May kiém tra trùng.
- Dung dich cÓn.
- Quàn ào vó trùng, khan lau, khàu trang.
- Già de trùng.
- Bình xjt tu dòng.
- Kéo thàng, kéo cong, panh kep, panh thàng.
- Bình càu thuy tinh chia vach 250 mi.
-Chai thuy tinh 1500 mi.
- Pipet 1 mi, 2 mi, 5 mi, 10 mi.
- Ung dong co Vcich 50 mi, 500 mi, 1000 mi.
32
- Phéu thuy tinh.
- Luói Igc nylon mets.
- Chai nhua 25 cm^ .
- Dia petri 9 cm .
- Tu lanh.
- Tu à'm 3 3X va 3rC.
- Tu dà.
- May ly tàm lanh, óng ly tàm.
- May khuà'y tu, nam chàm.
- Kùih hién vi soi ngirgc.
- Hot vó trùng (Laminar Flow air Cabinets).
- Càn dién, mày diéu nhiét.
- Buóng dém té bào
2.7.2. Càc mai truòng càn thiét dùng de tàch va nuói cày té bào,
a. Mói truòiig CMF^l (Calcium. Magnesium Free llanks Balancel
Salt Solution).
33
Tén hoà chat Gòng thùc hoà hoc Sògli S'il
NaCl Natrium chlorit 8 1
Potassium chlorit 0,4 KCl 2
Di-natri hydiogen 0,06 Na2HP04.2H20 3
phosphat 2-hydrat
4 Potassium dihydiogeno KH^PO, 0,06
phosphat
QH,A,
D(+) glucose anhydre 5 1
6 C,9HpO 0,4% Kaiiamycin sulfate 7 C,«H3,N,0„S0, 0,1 Fungizone Q,H,3N0, 8 0,001 Nuóc càt bai làn dù trong 1 lit b. Trypsin pha trong mói truòng CMF-Hanks. Tén hoà chat Cóng thùc hoà hoc STT Sò-g/1 Trypsin 2,5 1 Q H 3 , 0 „ S 0, Kanamycin sulfate 0,2 2 Q H , 3 N 0, Fungizone 0,002 3 Mói truòng CMF-Hanks dù trong 1 Ift e. Trypsin pha trong mòi truòng CMF-Hanks thém axit amin. Tén hoà chìft Tén hoà STT STT chat L-Aiginin.HCl Q H „ C 1 N , 0, 0,0528 1 Histidin HCI.H2O QHgNjOjHCl.Hp 0,0163 2 L-Lisin HCl QHi.ClNjO 0,0290 3 L-Leusin 0,026 4 QH,3N02 0,026 L-Isoleusin 5 C,H„N02 L-Methionin 0,0075 6 C,H,,N02 L-Plienylalanin C9H,9N03 0,0160 7 0,0240 L-Thieonin 8 QH,,N02 0,0230 L-Valin QH,,N02 9 2,5 Trypsin 10 0,2 Q H 3 , 0 „ S 0, Kanamycin sulfate 11 0,002 Fungizone 12 QH,3N02 Dung dich CMF-Hanks vùa dù trong 1 lit d. Mói truòng LIl [Lactabunim hydrolysate - llanks Balanced salt solution). 35 Tén hoà chà't Sóg/1 Gòng thùc hoà hoc STT Natrium chlorit 8 NaGl 1 Potassium chlorit 0,4 KGl 2 Na2HP04.2H20 0,06 Di-natri hydrogen 3 phosphat 2-hydrat 4 Canxi chlorit 0,14 GaGl2 Magiesium sulfate MgS04.7H20 5 0,1 heptahydrate MgGlj.òHjO Magiesium chlorit 6 0,1 heptahydrate Q H , 2 0, D(-f-) Glucose 7 1 0,01 Phenol dò 8 G,«H3,N,0,,SO, Kanamycin sulfate 0,1 9 0,001 Fungizone QH,3N02 10 Nuóc càt hai lÀn dù 1 lit. e. Mòi tiicàìig nuói cày LI! 3% huyét thanh bé Huyé't thanh Bè 30 mi. Mòi triròng LH vira dù mot Iit 36 5 Lactabumin hydrolysate 11 2.2 . Phircmg phàp thirc nghiém. 2.2.1. Chudn bi triaig gà co phói. Trùng gà da thii tinh duge à'p ò tu àm 3 9^ vói dò àm 60% trong 9 ngày. Trong thòi gian này càc trùng gà dugc dào it nhàt 2 làn trong 1 ngày. Vào ngày tbù 9, truóc khi dùng trùng phài kiém tra su phàt trién cùa phói dirói dèn soi tmng, quan sàt thà'y càc mach màu rò, phói phàt trién bình thuòng, khoè mói dem su dung. Trùng nào khòng dat càc tiéu chuàn trén sé loai bò. Phàn vò chùa tùi khf cùa càc trùng bình thuòng duge dành dàu bang bùt ehi. 2.2.2. Chuàn bi nuói cày té bào CEF (chick Embryos Fibroblast). Nhùng trùng dà lua chon dugc lùa saeb bang nuóc càt, dùng gae vó trùng tàm dung dich con lau lai va dàt vào già. Càc tn'rng trén già duge xit con mot làn nùa. Dùng kéo cong nhe nhàng càt lua bò phàn vò cùng chùa khóng khf cùa trùng, lóp màng tràng ben trong dugc bóc lo, locai bò lóp màng do bang kcp vó trùng. Su diing kep khàc, kep eó nhàe phói ra khòi tróng, thao tàc càn nhe nhàng va ehùih xàc trành làm dùt eó cùa phòi. Phói là'y ra dat trong dia petri 9 cm chùa 20 mi CMF-H. Mói dia chùa 4 phòi, dàu chàn va nói tang duge càt bò, càn lugng phói truóc khi rùa. Qio phàn vùa càn vào bình thuy tinh dung tieh 200 mi eó chùa 50 mi CMF-H de rùa phòi. Càc phòi này dugc rùa 3 làn bang CMF-H de loai bò màu, rùa lai làn nùa bang trypsin 0,25% trong CMF- H hoàc trypsin 0,25% thém axit amin. Cho 4 phói dà rua saeb vào bom tiém 5 mi, dùng pittòng day té bào phòi ra khòi bom tiém vào bình càu chia vach chi'ra 40 mi trypsin hoàc trypsin eó axit amin da duge de à'm ò nhiét do 37X\ Làc nhe phói rói de yèn 5 phùt, sau dò khuà'y bang mày khuà'y tu trong 7 phùt, de làng nhùng mành phói chua tan trong 1 phùt. Gan phàn hón dich té 37 bào da tàch ò trén vào bình thuy tinh co 200ml eó chùa 50 mi mói truòng LH vói 5% huyét thanh bé, làc nhe cho déu hón dich trong té bào, hón dich này giù trong tu lanh ò 4 ^. Viéc trypsin hoà càc mành vò té bào duge nhàe lai 2 làn nùa vói dung dich trypsin hoàc trypsin axit amin. Lgc qua phéu Ige (eó 3 lóp màng lgc), li tàm hón dich té' bào thu duge vói tÓc dò 1000 vòng/phùt trong 7 phùt ò nhiét dò 5''C. Nhe nhàng loai bò lóp nuóc nói ben trén, tròn déu lóp té bào làng ò duói vói 20 mi mói tniòng LH 3% huyé't thanh bé. Hón dich té bào trén pha vùa dù trong 100 mi bang LH 3% huyét thanh bé. Là'y 1 mi hón djch té bào trén pha loang 8 làn, nhuòm té bào bang thuóc nhuòm xanh trypan 0,4%. Dém sÓ té bào song va chét trén buóng dém té bào. Té bào song sé khòng bàt màu vói thuÓc nhuòm, té bào chét bàt màu xanh thàm cùa thuóc nhuòm. Tnih lugng té bào càn thiét dua vào mòi chai cày. Pha loang sÓ hón dich té bào ban dàu bang mói truòng LH 3% huyét thanh bé, vói nóng dò 4.10^ té bào/lml. Dua vào mói chai té bào 15 mi hón dich té bào. Nhùng chai này duge giù trong tu à'm 36,5"C tói 3TC. Sau 2 ngày quan sàt su phàt trién cùa té bào mot lóp bang kmh hién vi. Dùng té bào 1 lóp này de nghién eùu càc buóc tiép theo. Néu chua tao thành té bào 1 lóp càn kiém tra cac yéu tó lién quan. Dua trén phuong phàp xù li so lieu ve ké hoach hoà thuc nghiém chùng tói dành già nhùng két qua dò theo phàn tieh phuong sai: - Phàn tfch tàc dòng cùa càc nhàn tó qua tham sÓ phuong sai, goi là phàn tfch phuong sai. Tu nhùng ké't qua thuc nghiém duge tfnh toàn su diing chuàn Tim F,,„ fisher de so sành phifong sai. Fanh = l i- so vói F,,„g (P, f„ f^) Trong dò: S^ : dàc trung cho su khàc nhau cùa ké't qua thuc nghiém. Do su khàc nhau giùa càc mùc cùa A gay ra. S]: dac tiimg cho sai sÓ thuc nghiém nói chung, vi làm thue nghiém bao giò cùng màc sai sÓ. f,: bàc tu do cùa sÓ mùc thuc nghiém dà làm f, = k - 1. (2: bàc tu do cùa sÓ nghién eùu da tién hành trong qui hocach thuc nghiém, f^ = k(n - 1). Vi F luón lón hon 1 nén: - Néu F,^„„ < Fb.^„g tbì F,f„„ khóng dàng tin cày, tue là S; ^ S] khóng dàng tin cày. Cho nén chùng duge eoi là giÓng nhau. Chùng khóng khàc nhau nén nhàn to' A khi thay dói da tò ra khòng eó tàc dòng dén ké't qua thue nghiém. - Néu F,j„,, > Ft,.,g tbì F(f„,, dàng tin cày, tue là S^ ;^ S^. Suy ra nhàn tó A dà co tàc dòng lén két qua thuc nghiém. 39 Chuong 3 KÉT QUA VÀ THÀO LUÀN Nbiém vu cùa luàn àn là tìm diéu kién de tàch té bào tu phòi gà va quan sàt qua trình phàt trién cùa té bào sau hai ngày nuói cày. O day chùng tói dà dùng trypsin (T) va trypsin eó axit amin (Ta) de tàch té bào. Qua thue nghiém chùng tói dà thu duge ké't qua sau: 3.L So' té bào sóng/ml dugc tàch tir phói gà. Trong bang 1 va biéu dò I chùng tói trình bay càc két qua ve sÓ té bào sóng/ml bang phuong phàp trypsin hoà qua 10 thf nghiém. BànR 1 : So té bào sÓng/ml. 10'' SÒ té'bào song/1 mLlO"* ^"^•-v^ung dich T So thi n g h i é m ^\ T. 3,75 4,82 1 1,46 4,05 2 2,56 4,49 3 1,58 2,45 4 2,8 4,89 5 2,64 3,14 6 3,42 4,78 7 1,96 1,4 8 1,76 2,95 9 1,82 3,51 2,319 3,704 10 r 40 Qua càc két qua dà thu dugc chùng tói nhàn thày axit amin eó ành huong rò rét dén qua trình trypsin. SÓ lugng té bào sÓng thu duge bang phuong phàp trypsin hoà dÓi vói trypsin co axit amin nhiéu hon trypsin khòng eó axit amin. Vói nhùng già tri : k = 2; n = 10. F^^^g tra dugc = 4,414 fi = l;f2=18 F,„,. =10,509 Nhu vày F,j„,, > F^^^^g , nén trypsin eó axit amin dà tàc dóng lén két qua thuc nghiém 41 n MMmmMtinniiimn ir; -^t CNI — r^>
nr|iu/t?Liosot^iqojL 3.2. So té bào chét/ml dugc tach tir phòi gà. Chùng tói cùng quan sàt sÓ té bào chét khi dùng dung dich trypsin va trypsin thém axit amin de trypsin hoà. Két qua thu dugc qua 10 thf nghiém duge trình bay ò bang 2 va biéu dò 2. Bang 2: SÓ té bào chét/1 mi. 10''' ^"~~-^Dung dich Sòté'bàochéVl ml.lO"^ SÒ thf nghiénì^^^ T 0,07 0,51 1 2 0,14 0,1 0,16 0,2 3 0,06 4 0,09 0,36 0,25 5 0,16 0,12 6 0,18 7 0,1 0,06 0,08 8 0,06 0,1 9 0,12 0,07 0,181 0,118 10
Z SÓ lugng té bào chét sau khi tàch bang dung dich trypsin va trypsin co axit amin khóng eó su khàc biét lón. Bang phuong phàp xù li so liéu ké hoach hoà thuc nghiém, chùng tói eó già tri cùa F(f^,, < F^^.^^ (F, = l/xF^ = 4,414). Do vày, yé'u tó trypsin thém axit amin khóng co tàc dóng lén két qua thuc nghiem. mmm^m. i NC : . . . : • :. l 3.3. So té' bào sóng/g dugc tàch tir phói gà. De dành già ehfnh xàc hon sÓ té bào song trén lugng phói sau khi bò dàu, chàn va phù tang, chùng tói phài xàc dinh trgng lugng cùa phói nhàn duge, rói dém so té bào song /l gam phói. Két qua dugc trình bay ò bang 3 va biéu dÓ3 Bang 3: So té bào sóng/1 gam.lO""' ^^---.^^^ Dung dich SÒté'bhosÒng/1 gam. 10'' SÒ thf nghiérn"\^ T 56,17 90 1 2 30,99 80,9 50,19 95,53 3 72,47 10,9 4 72,47 120,1 5 110 126,61 6 91,94 118,32 7 53,8 80,5 8 73,3 116 9 43,3 100,3 10 65,463 103,916 Ò dAy già tri F, > F^, (F, = 16,9; F^ = 4,414) nhu vày yéu tò trypsin thèm axit amin co tac dòng lén két qua thuc nghiém. r 1 3.4. So' té bào chét/gani dugc tàch tir phói gà. Bang phuong phàp trypsin hoà té bào phói gà trong dung dich trypsin va trypsin axit amin chùng tói eó dugc sÓ té bào chét qua 10 ké't qua thf nghiém ò bang 4 va biéu dò 4. Bang 4: SÓ té bào ehét/1 gam. 10^ ^""^•^.^^ Dung dich SÒ té'bào ché't/l gam. 10'' T SÒ thf nghiém^-^..^^ 7,29 1,25 1 2,12 2 2,85 3,14 2,34 3 2,75 4 4,11 9,3 6,04 5 6,66 4,86 6 4,84 2,54 7 2,3 3,35 8 4,2 2,49 9 2,85 2,05 10 4,545 3,188 Tlieo già tri két qua thu diroc F, < F^ (F, = 1,6) nhir vày yéu tò trypsin thém axit amin khòng tac dòng lén ké't qua thuc nghiém. ^ r^ O ^- -t r-, ^1 - 3.5. Ti le té bào sóng/tóng so té bào (%) tàch tir phól gà. SÓ té bào song dugc tàch bang trypsin va trypsin axit amin duge tfnh/tóng SÓ té bào qua 10 ké't qua thuc nghiém dugc néu ra trong bang 5 va biéu dò 5. Bang 5. SÓ té bào sóng/tóng sÓ té bào {%) ^""^--^.^^^Dung dich SÒ té' bào sòng/t6ng sÒ té' bào (%) T SÒ thf nghièm^-^^^^^ T, 88,51 98,63 1 93,6 2 96,6 94,71 95,65 3 96,34 96,43 4 92,5 95,21 5 94,29 96,3 6 95 97,9 7 95 96 8 95 97,9 9 93,9 98 10 93,885 96,862 Qua nhùng thue nghiém trén chùng tói dành già ti le té bào sóng/tòng so té bào tàch duge bang trypsin thém axit amin vàn lón hon dÓi vói té bào tàch bang trypsin. F^ > F^, (F^ = 15,7; F^ = 4,414) nhu vày yéu tÓ trypsin thém axit amin eó tàc dóng lén két qua thuc nghiém. D B OD
C ci-fL: o
X2 O O ^ O ^ C 7 ^ 0 ^ C ^ o o o o o o oo (%)ouq 31 ()s guoi/^Lios ouq 91 àj Xl 3.6. Quan sàt su phàt trién cùa té bào qua hai ngày nuòi cày. Chùng tói tién hành nuói cày té bào da tàch dugc bang phuong phàp trypsin hoà trong càc chai nhiia eó dién tieh mat day 25 cm^ Mói chai duge dua vào 15 mi hón dich té bào vói sÓ lugng 4,5. l a' té bào/lml. SÓ lugng chai té bào thu dugc sau khi tàch bang trypsin va trypsin axit amin nhu sau: a. Trypsin: Nhàn xét SÓ chai
nuói cày HésÓ
pha
loang Z hón dich
té bào cuòi
cùng(ml) Hón dich té
bào ban dàu
(mi) 100 5,12 512 34 té bào phàt trién
bình thuòng nhirng
chua kfn Sau 48 giò su phàn chia cùa té bào bào thai gà bình thuòng nhung phàt trién kém, chua kfn mot tój!, té bào hình sgi moc lài làc khàp thành chai con mot vài khoàng tróng. Co thè té' bào bi chét nliiéu trong thòi gian nuói cày do qua trìnli trypsin hoà tén thuòng hoàc con nhiéu mó chua duge tàch thành nliùng té bào riéng le (hìnhV). 46 Hình7- Su phàt trién cùa té bào duge tàch bang trypsin. b. Trypsin axit amin. Hón dich té Hésò SÒ chai Z hòn dich pha Nhàn xét nuòi bào ban dàu té'bào cuòi cà'y loang (mi) cùng(ml) té' bào phàt trién 8,96 896 59 100 bình thuòng va kfn Nhu vày, càc té bào bào thai gà duge tàch bang trypsin axit amin phàt trién tòt hon té bào hình sgi moc khàp thành chai (hình 8) va sÓ chai nuòi cày gàn gap dói (59/ 34). Quìng tói da kiém tra càu tnic cùng nliu chat lugng cùa té bào thi thày chùng vàn bình thuòng. Chùng tòi nghì ràng eó thè té bào duge tàch bang trypsin thém axit amin ft bi ton thuòng, sau khi tàch khòi mó càc té bào dugc hàp thu thém mot lugng axit amin càn thiét cho su phàt trién sau này cùa té bào. Vi vày trong qua trình nuói cày sÓ té bào chét sé ft hon. HìnbS- Su phàt trién cùa té bào tàch bang trypsin axit amin. 3.7. Su nhàn lén cùa virut trén té bào phòi gà Buóc dàu chùng tói thue hién nghién cuu nhiém virut vaexin soi trén lóp té bào phòi gà dà phàt trién sau hai ngày nuòi cày. Quan sàt thày su nhàn lén cùa vimt bang kfnli hién vi dién tu trén hai lóp té bào duge tàch bang trypsin va trypsin co axit amin. Vi rùt nhàn lén trong bào tuong té bào hoàn chinh càc virut mói. Hình thài virut là hình càu eó duòng kfnh khàc nhau tu SOnm dén 250nm, vimt eó dang sgi dai 300nm, ben trong chùa chat Nueleocapsit cùa viiut. Qua trình nhàn lén cùa virut gay lén huy boai té bào phói gà (hình 9,10,11). 48 Hình 9 - Té b ào bào thai gà bình thuòng (ành phóng dai 60.000) 49 Hình 10 - T6 bào bào thai gà nhiém vinjl vaexin sèi san 8 Tigày gay nhiém, virai sòi nhàn lèn ò bào tiroiig té bào Vt (ành phrtng dai 60.000) Sur dung ky thuàt mién dich gàn vàng cho thà'y khàng thè khàng virut sòi phàii l'mg trirc tié'p vói virut sai t. Càc hat vàng gàn chung quanh virut sai (ành phóng deli 60.000) THÀO LUÀN 3.8. Su phàn huy va tài tao té bào Nhùng hình ành biét hoà da ké trén cùa bé màt té bào va càc tàng phù ngoai bào eó mói quan he chat che vói khà nàng tài tao dàc biét vi no tcao nén càc mó. Nhùng boat dóng di truyén co lién quan dé'n càc tàng va cóng thùc té bào va dóng vai trò thùc day quan trgng trong su phàt trién bào thai [17]. Willson, 1908 dà viét néu nhu càc bgt bién sÓng bi co làp thi khà nàng vàn dóng bi tan ra thành nhùng té bào, nhung cài này sau mot thòi gian lai telo thành bgt bién mói. Nhùng bgt bién tu nhùng té bào bgt bién nhiéu màu sàc khàc nhau co thè tc^o nhùng bgt bién mói. Sau này nhùng mó bào thai dugc tàch bang trypsin cùng thành nhùng té bào riéng rè. Sau do chùng lai tu nhau Lai va xuàt bién nhiìng tó ebùc nhu tó cht're ban dàu. Trypsin tàc dòng nhung mói lién két nhàt dinh, nguòi ta già thiét ràng khà nàng tàp hgp cùa té bào phii thuge su eó mat cùa càc lién két i>eptit tìm thà'y trong càc chat bao bgc màng. Tu* day này ra y nghì là té bào san xuàt dich tié't Colbidalis nhu là yéu tÓdinh buóng. Hién nay trong san xuà't mot sÓ locii vaexin, hoàc cóng nghé gen phài su diing dén nhiéu té bào khàc nhau, nhung té bào dugc tàch ti^ nhung mó nhu: thàn, da, phòi hoàc bào thai... Trén thue té bang phuong phàp trypsin hoà da tàch duge càc té bào riéng rè tu càc mó này va nuói cày chùng de phàt trién thành té bào mot lóp. Trypsin là mot enzym thuy phàn protein cùa màng té bào, càt càc lién két pepit va càc lién két khàc nói càc té bào vói nhau. Trong qua trình trypsin hoà mot sÓ té bào cùng co nhung yéu tó gay ành huong dén boat dóng trypsin nhu càc ion kim loai. Vi vày dói vói nhùng loai té bào này khi dùng trypsin de tàch nguòi ta thuòng dua thém mot lugng nhò EDTA (Etylen Dimetyl Tetra axetic Axit) nhàm tao phù'c vói càc ion kim loai giùp 51 cho boat dóng trypsin de dàng hon trong viéc càt càc lién ké't. Nguge lai trypsin cung gay tén thuòng màng té bào, ành huong dé'n su phàt trién sau này. Nén nguòi ta da bé sung thém mot sÓ axit amin càn thiét ma té bào khóng tu tóng hgp duge vào mot sÓ mói truòng nuói cà'y té bào, hoàc vào dung dich trypsin trong qua trinh trypsin hoà giùp cho viéc tàch té bào dat hiéu qua cao hon. 3.9. Tàc dung cùa trypsin va trypsin axit amin trong tàch té bào tir mó. Trypsin là mot enzym eó tàc diing thuy phàn lién ké't peptit, lién két amin, lién két este do arginin hay lysin tao nén; a-benzoyl-L-argininamit hoac a-benzoyl-L-Lysinamit là nhung mó hình co chat thfeh hgp cùa enzym này. Trong tniòng hgp này nhung nhóm cation cùa co chat dugc két hgp vói nhóm aspatyl (vói nhóm COO' cùa axit aspatie) cùa phàn tu enzym mot eàch rat chfnh xàc. Nhung chat co càu tao phàn tu dai hon phàn tu co chat mot nhóm CH2 nhu a-benzoyl-L-homoargininamit hoàc ngàn hon phàn tu co chat mot nhóm CHj nhu a-benzoyl-L-omithiamit déu khóng chiù tàc dung cùa trypsin, eó le nlióm cation cùa co chat khóng ò vi trf tuong ùng vói nhóm anion cùa enzym. Enzym vira dàc hiéu vói co chat vira dàc hiéu vói phàn ùng hoà hgc nén tfnh dàc hiéu cùa enzym rat cao. Tuy nhién, eó nhung enzym co tinh dàc hiéu tuyét dói, nhung cùng eó nhung enzym ehi eó tfnh dàc hiéu tuong dói. Bàn chat cùa trypsin là mot enzym xùc tàc, do càu trùc If boa dac biét cùa phàn tu enzym va dac biét là tmng tàm hoat dòng ma eó tfnh dàc hiéu rat cao so vói nhung chat xùc tàc thóng thuòng khàc. Trypsin là enzym dugc tóng hgp qua mot giai doan trung gian là càc tién chat cùa enzym (proenzym). Càc tién chat này phài trai qua mot qua trình bién dói sàp xép lai cà'u trùc phàn tu mói bién thành enzym boat dong duge. Trypsin là enzym thuy phàn protein, duge su dung trong viéc tàch mó cùa té bào tao ra càc té bào riéng le. Trypsin thuy phàn càt lién két peptit cùa protein nói càc màng tè' bào mò. Phàn lón té bào bié'u mó, trong càc mao mach va nhiéu noi ò khoàng gian bào ta co thè gap glucoprotein va polysaccarit ò dang axit hyaluron hoàc gàn day nguói ta goi là glucocalyx de chi sir co màt cùa càc màng polysaccarit va glucoprotein bao boc té' bào. Càc bé màt té' bào tiét ra chà't kè trén, tuy ràng khóng phài là càn thiét hoàn toàn dé'n su toàn ven cùa té' bào, nhir sau này chung ta dà thà'y nò dóng vai trò rat quan trong trong viéc càc té' bào hofp lai thành mó. Trong tó chirc lién ké't hyaluron dòng vai trò chi dao thàm thà'u. Su duy tri càc vi mói tmòng cùa té bào nhùng tàng bao boc ngoai bào này co thè ành huong dé'n nóng dò càc chat khàc nhau trén bé màt té' bào. Khóng chi vi hoat dóng nhu barie thàm thà'u ma con ành huòng dé'n nóng dò cation cùa mói tiiròng té' bào. Tir quan diém này nò tucmg tir nhu viéc trao doi ion trong hoà hoc. Càc glucocalyx bao boc màng té' bào nhay càm, kfch thich cùa té' bào co, vi du nhu khà nàng giù \a\ ion Na^, nguoc lai axit hyaluron co thè thay dói rat manh thàm chi làm dói hàn trén dién tich bé màt té' bào va dò pH. Day chfnh là nguyén nhàn cùa sir thay dói hoat tfnh cùa càc enzym trén màng té bào noi ma co thè tàch chùng ra khòi càc vi mó trong tè' bào. a. Tàch té bào bang trypsin. Trong qua trình tàch tè' bào tu mò bang trypsin theo phuong phàp thóng tlìiróng, SÓ luong té bào duoc tàch chua cao con nhiéu mó chua duoc tàch. Do cà'u trùc cùa màng va càc lién ké't giùa càc té' bào rat phùc tap nén khà nàng hoat dòng cùa tàm hoat dòng cùng bi ành huong. Khi hoat dòng de thuy phàn protein tàm hoat dong phài làm càng hoàc xoàn càc lién két de be gay càc lién két này. Viéc tàch té' bào khòi mó bang phuang phàp co hoc cQng gay ành huong khòng it tói màng té' bào, nhà't là dói vói nhùng té' bào vira duoc tàch khòi mò. Bình thuòng enzym dugc bao boc kfn trong màng lypoprotein cùa lysosom bi phà vò hoàc bi tón thuòng, càc he enzym cùa nò bi giài phóng ra se làm tiéu huy cà té bào. Mot diéu dàng chù nguyén ven, enzym thuòng chua boat dóng dé'n mùc tói da va nhùng diéu kién trong co thè cùng chua phài là nhùng diéu kién thfeh hgp nhà't cho su boat dòng cùa enzym. Trong càu tme cùa mó, càc té bào thuòng ò nhCnig giai doan phàt trién khàc nhau: kì dàu, kì giùa va kì cuòi. Nhùng té bào ò ki dàu con non tre, hoac ki giùa dang phàn chia, trong qua trinh trypsin hoà gay ành huòng hoàc tén thuòng tói càc té bào này va day cùng là diéu kién de enzym cùa nò dugc giài phóng. Két qua té bào chét nhiéu sau hai ngày nuói cày, su phàt trién cùa té bào kém va thua hon. b. Tàch té bào bang trypsin axit annn. Mijc dfeh de tàch duge nhiéu té bào sÓng tu mó, chùng tói tién hành nghién cuu dua thém 9 axit amin co bàn vào dung dich trypsin de tàch té bào nhu dà trinh bay ò trén. Qua thuc nghiém chùng tói thày lugng té bào tàch dugc nhiéu hon tu mò trong cùng diéu kién nhu tàch bang trypsin. Chùng tói nghì ràng, eó thè thành phàn axit amin eó mot so khà nàng tfch cuc sau: Nhóm imidazol cùa bistidin eó khà nàng tàc dung vói nhóm bidroxyl cùa serin (eó thè bang eàch tao lién két hidio) va dà làm tàng khà nàng phàn img cùa nhóm này lén nhiéu làn. Trong trypsin ngoài nhóm serin boat dóng, histidin cùng eó vai trò quan trgng trong tàm boat dóng, dàn xuàt cùa histidin boat dóng gàn vói nhùng co chà't. Nhóm idimazol cùa histidin là mot trong nhùng chat xùc tàc axit-bazo khà manh. Nhò eó su xùc tàc axit-bazo ma pH cùa mói truòng ò mùc ón djnh, trung tinh hon trong qua trinh trypsin boa so vói trypsin khóng eó axit amin, nóng dò H^ va OH" rat thàp. Lysin va arginin thuge nhóm axit amin kiém co tàc diing trung hoà phàn nào nhóm eaeboxyl tu do cùa axit neuramin làm giàm tfnh (-) cùa bé màt té bào. Su eó màt cùa axit amin làm tàng toc dò chuyén dóng cùa phàn tu 54 trypsin di vào va di ra khòi lién ké't giùa càc té bào mó khi thuy phàn lién két peptit cùa protein màng té' bào, giài phóng té bào kliòi càu trùc mó nhanh
hon. Càc axit amin cùng giùp cho su dinh huóng cùa tàm hoat dóng Hong trypsin chfnh xàc han khi ké't hgp vói co chat. Viéc tàch té' bào khòi mò bÀng phuang phàp co hoc cùng gay ành huòng khóng ft tói màng té bào, nhàt là dói vói nhùng té' bào vùa dugc tàch khòi mó. Bình thuòng enzym dugc bao bgc kfn trong màng lypoprotein cùa lysosom bi phà vò hoàc bi tón thuòng, càc he enzym cùa nò bi giài phóng ra se làm tiéu huy cà té' bào. Mot diéu dàng chù y nùa là trong té bào song nguyén ven, enzym thuòng chua hoat dóng dé'n mùc tói da va nhùng diéu kién trong co thè cùng chua phài là nhùng diéu kién thfeh hgp nhà't cho su hoat dóng cùa enzym. Trong cà'u hùc cùa mó, càc té' bào thuòng ò nhùng giai doan phàt trién khàc nhau: kì dàu, kì giùa va kì cuòi. Nhùng té' bào o kì dàu con non tré, hoàc kì giùa dang phàn chia, trong qua trình trypsin hoà gay ành huong hoàc tón thU(yng lai càc té bào này va day cùng là diéu kién de enzym cùa nò dugc giài phóng. Nguyén nhàn ké't qua té bào chét nliiéu sau hai ngày nuói cà'y, su phàt trién cùa té' bào kém va thua hon. e. Ti le té bào song va chét khi tàch bang trypsin axit amin sau 48 già nuói cày. Vói tfnh chat cùa axit amin nhu dà mièu tà ó trén, chùng tói nhàn thà'y té' bào song tàch dugc nliiéu hon, màc dù lugng té' bào chét chua ft hon nhiéu so vói phuang phàp tàch bang trypsin. So lugng té bào song va phàt trién tòt sau hai ngày nuói cà'y co khàc biét so vói té bào dugc tàch bang trypsin. Co thè axit amin tu do co xu huóng làm giàm bót càc phàn ùng gay tón thuang màng té bào, càc axit amin de dàng dugc hàp thu qua màng té' bào, dac biét quan trgng là dói vói nhùng té' bào con non tré. Lugng axit amin này làm thèm nguón du trù tao ADN (axit desoxyribónuclèic) va protein trong té bào giùp cho tè' bào song va phàt trién tòt sau 48 giò nuòi cà'y. 56 KÉT LUÀN 1. Da dùng trypsin thém axit amin de tàch té bào phòi gà. Ké't qua sÓ té bào tàch khòi mó thu dugc nhiéu han so vói phuang phàp tàch bang trypsin. 2. Tè' bào dugc tàch bang trypsin axit amin sau 48 gió nuòi cà'y phàt trién tòt hon 3. Dà tién hành thu nghiém nhiém virut vaexin sai trén lói"» té bào phói gà. Ké't qua virut dà nhàn lén va huy hoai té bào. Ciào due, (1992). già Ha Nói, (1997). hoc, Nxb Y hgc Ha Nói, (1990) niediiini, Anal. Biochem., (1980). 8. Harnes D.W., Sirbasky D.A., and Sato G. H., Celi Culture Methods For Molecular and Celi Biology, Alanr. Liss, (1984). 58 9. IJerger S.L., Lymphocytes as resting cells, Methods in Enzymology. Voi. LVIL, Celi Culture, New York, Academic Press, (1979). 10. Birnie G.D., Simon.s P..I., The incorporation of Ti- thymidine and II- uridine into chick and mouse embyryo celi ceiltured on stainless steel, Exp. Celi Res., 46, p. 355-366, (1967). 11. Brandew C, Tooze J., Introduction to protein structure. New York : Scientific American Books, (1984). 12. Cantor C. R., and Schimmel P.R., Biophysical Chemistry, W. H. Fieeman and Company, (1980). 13. Claak (ì., Stainini> Frocedures Vsed hy the fìiological Stain Coniniission, 3id ed, Baltimore, Williams and Wilkins Co, (1973). 14. Dressier D.H., and Potter H.,. Discovering Enzynies, Scientific American and Company, (1991). 15. Fersht, A., Enzynte Structure and Mechanisnis., 2d ed., Fieeman and Company.(1985). 16. Jacobson (i.R., and Stark G.R., Asportate Transcarhaniylases, in P.D. Boyer, Tlie Enzym, 3d ed.,Voi. 9, pt B, Academic, New York, (1973). 59 17. Hoelzi- walIach,D.F., and Eylar, E.H Biochem. Biophys. Acta. 52- 59. (1961). 18. Lesk, A.M.,. Frotein Architectruc, A Practical Appoach. IRL. Press.
(1991). 19. Loomis, VV. F., Similaraties in enkaryotic genomes. Comp. Biochem. Physiol. 95B(l):21-27, (1990). 20. Mile,s,A,A., and Pire, N.W The nature of the bacterial surface. Charles C Thomas, Springfield, (1950) 21. Neurath IL, Evolution of proteolytic enzynies, Science 224, p. 350- 357, (1984). 22. Novikoff A.IL, and Holtzman K., Celi and Organelles, HoIl, New York, (1970). 23. Pertz M. F., Protein Structure and Function, VV. H. Fieeman and Co., (1991). 24. Richards F.M., The protein folding problem. Sci. Amer. 264 (1) : 54 - 63, (1991). 25. Ross Man M.G., and Argos P., Frotein folding. Ann. Rev,. (1981). 26. Rose (ì. I)., et al,. Hydrophohicity of amino acid, residues in glohular protein, (1985). 27. Segai H.L. Enzyniatic Interconversion of Active and Inactive Fonìr of Enzynies, Science, 180, p. 25-32 (1973).. 60 28. Sharon N., Carbonhydrates, Sci. Am., 243 (5), 90-116, (1980). 29. Siekevitz P., The Turnover of Frotein aiul the Visage of Information. J. Theoret. Biol., 37, p. 321-33 (1972). 30. Thare A.A., Sernetz M., Fluorescence Techniques in Celi Bi(ìlogy, New York, Spriger-Verlag, (1973). 31. Walsh C.,. Enzymatic Reaction Mechanisnis, W. H. Fieeman and Company, (1979). 6134
38
3C
r--
ri)'riVtVivrri'ii'^"'"i'>vri^VH"rrtvi"i'i"ri"t"i'i"i"<'''ivi"i'riVi^i'i'?>M'»'i"ri
OX)
e
C/5
o
. . r:
'^>
3C
i n n * i » » * H J i in
on
-J-
'<0
3
r^*
r I
^
Ta
42
D ^
rsi
-
.
^C
r--
B
<0'
o
^^ £MMjimmrtttt«imn>>>tj«»ttytiMM
tt»tt.>ttttm*mn
o
iiimuitl'fffffiifiimmtiiimniiiimini
o
ri
r^.
2 [
^^
it>w>i m u n ii
: • • • • - , :•
.-
ì
r \
. : vÈ
:
• ?
•
•
d
d
d d
o
yOriui/loipot^^qoi
Ta
Z
43
D
^
r-
c
!S
o
r*^.
r 1
-*
-i-
ri
ce
Ql -o/oLios oviq 01 ()<^
^;
Ta
Z
44
n
B
r—
e
s:
O
C/O
s
O
cr-
z
45
^
o
DC
t^
0 /j
c
vr.
«ri
's
r^-
li-; 1
H
-^ I
• •
in
'
47
ma
, ^ * -^
È;'«#*<^'S
It»
50
52
53
55
57
TÀI LIÈU THAMKHÀO
TIÉNG VIÈT:
1. Nguyén Htifu Chàn , 57;//) hoc hién dai, Nxb Khoa hgc va ky thuàt,
(1999).
2. Pham rhì Tran Chàu, Tran Thi Àng, Hoà sinh hoc dai citmg, Nxb
3. Pham Phan Djch, Mó hoc. Nxb Y hgc, (1998).
4. Nguyén Nhu Hién, Trinh Xuàn Hàu, Té'hào hoc, Nxb Deli hgc Quòc
Dàng Vàn NRÙ
Ngó (ìia I hach, Trinh Vàn Hào , Sinh
TIENG ANH:
6. Atkins P.W., The Second Law, Scientific American Books New York,
(1984).
7. IJarncs I)., Sato G., Methods for gromvth of cultared celi in serum- free
