Luận án tiến sĩ: Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN ĐƯỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ

CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 62 64 01 02

CẦN THƠ, 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN ĐƢỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ

CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 62 64 01 02

HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC HIỀN

Cần Thơ, 2018

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành các nội dung trong luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng học hỏi của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ quý thầy cô, bạn bè. Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

PGS. TS Nguyễn Đức Hiền đã động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi

cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Quí thầy cô Bộ môn Thú y, khoa Nông nghiêp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.

Ban lãnh đạo Vemedim Corporation, Trung tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu và nâng cao trình độ trong thời gian qua.

Cty TNHH chăn nuôi một thành viên Vemedim đã tạo điều kiện thuận lợi

cho tôi được thực hiện các thí nghiệm.

Xin chân thành cảm ơn tất cả bạn bè, các bạn đồng nghiệp, các anh, chị, em phòng Sản phẩm sinh học, Trung Tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim đã hỗ trợ, chia sẻ và cung cấp thông tin giúp tôi hoàn thành luận án.

Cảm ơn gia đình và những người thân đã động viên, chia sẻ và luôn sát

cánh bên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài.

ii

TÓM LƢỢC

Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện với mục đích phân lập chủng vi khuẩn B. subtilis có tiềm năng probiotic thích hợp cho gia cầm từ đất và phân của trại gà. Nghiên cứu này nhằm tìm biện pháp mới thay thế kháng sinh trong phòng và trị bệnh, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp, giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn kháng kháng sinh trong tự nhiên.

Đề tài đã phân lập được 296 chủng vi khuẩn từ 70 mẫu đất và 70 mẫu phân gà thu thập tại các trại gà thuộc 7 tỉnh, thành vùng ĐBSCL. Các chủng vi khuẩn này được chọn lọc qua kiểm định sinh lý, sinh hóa với các chỉ tiêu như: âm tính với lecithinase, dương tính với catalase, amylase, cellulase, VP (Voges- Proskauer), và chịu nhiệt cao (phát triển được ở 50oC); và được định danh bằng bộ kít API CH50B (Biomerieux-France) kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA (sử dụng phần mềm BLAST so sánh trình tự gen trên cơ sở dữ liệu NCBI). Kết quả phân tích cho thấy đã chọn ra được 21 chủng vi khuẩn đạt chỉ tiêu về mặt sinh lý, sinh hóa theo yêu cầu và về mặt định danh có mức độ tương đồng của gene 16S rRNA cao (≥ 99%) với B. subtilis. Nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic, 21 chủng B. subtilis tuyển chọn đã được khảo sát các đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn probiotic như: tính nhạy cảm kháng sinh (erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin), tính chịu nhiệt (phát triển ở nhiệt độ từ 50-60oC), khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, lipase), khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh (E. coli, S. enterica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), khả năng chịu pH acid dạ dày (pH 2,0), khả năng chịu muối mật 0,3%, khả năng bám dính (tự bám dính, bám dính với vi khuẩn gây bệnh, bám dính tế bào biểu mô ruột) và khả năng sống được trong đường tiêu hóa gà. Kết quả cho thấy trong 21 chủng vi khuẩn khảo sát, B. subtilis VL28 thể hiện tốt nhất các đặc tính probiotic, do vậy chủng này được chọn để sử dụng trong thử nghiệm thức ăn bổ sung probiotic cho gà. Vi khuẩn B. subtilis VL28 mật độ 107 CFU/g với liều lượng 5 g/kg thức ăn được bổ sung vào thức ăn cho gà ở độ tuổi 1-56 ngày cho thấy hiệu quả tăng trọng của gà đạt 11,7%, đồng thời lượng thức ăn sử dụng giảm 16,8% so với đối chứng nuôi bằng thức ăn không bổ sung vi khuẩn. Bên cạnh đó, gà 18 ngày tuổi lây nhiễm với S. enterica (liều 7,5x104 CFU/mL/gà) và E. coli (liều 5,0x106 CFU/mL/gà), được nuôi với thức ăn có bổ sung B. subtilis VL28 với liều như trên có khả năng tăng trọng và tỉ lệ sống tương đương với điều trị bằng kháng sinh enrofloxacin và

iii

oxytetracyclin. Các kết quả này cho thấy chủng B. subtilis VL28 phân lập và tuyển chọn được trong đề tài này có tiềm năng probiotic rất lớn, chủng này có thể sử dụng để thay cho kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh đường tiêu hóa ở gia cầm.

Trình tự gen 16S rRNA của B. subtilis VL28 đã được đăng ký trên ngân

hàng gen của NCBI với mã số truy cập là KY346980.

Từ khóa: B. subtilis, gà, phân lập, định danh, probiotic

iv

ABSTRACT

The dissertation “Isolation of Bacillus subtilis and its application on the prevention of intestinal diseases in chicken” was carried out to isolate the B. subtilis strains with probiotic potential from soil and fecal samples at intensive chicken farms. This study aimed to find out alternatives for antibiotics in the prevention and treatment of intestinal diseases as well as to increase productivity and effectiveness in poultry industry and also to reduce the risks of spreading antibiotic resistant bacteria in nature.

From 70 soil samples and 70 fecal samples of chicken farms from 7 provinces in the Mekong Delta, 296 similarly B. subtilis bacteria were isolated. These isolates were analyzed further for B. subtilis characteristics by physio- biological tests with the following criteria such as: negative in lecithinase, positive in catalase, amylase, cellulase, VP (Voges-Proskauer), and temperature tolerance (being able to grow at 50oC); and identified by the API CH50B kit (Biomerieux-France) in combination with the bio-molecular technique namely partial sequencing of 16S rRNA (using BLAST alignment with the known sequences on the NCBI genbank). The results showed that there were 21 isolates which satisfied the required physio-biochemical criteria, and the strain identification revealed that the similarity of gene 16S rRNA was high (≥ 99%) with B. subtilis. In order to select the B. subtilis strain with probiotic capabilities, 21 selected B. subtilis isolates were investigated further on the susceptibility to antibiotics (erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin), temperature tolerance (being able to grow at 50-60oC), extracellular enzyme production (amylase, protease, lipase), bacterial pathogen inhibition properties (E. coli, S. enterica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), tolerance to acidity of the gastric juice (pH 2,0) and 0.3% bile salts, adherence ability (autoaggregation, coaggregation, adherence to epithelial cells) and survival rate in gastro- intestinal environment. The results showed that among 21 isolates observed, the strain B. subtilis VL28 exposed the best probiotic capabilities. Consequently, this strain was chosen to use as a supplement for chicken feed. The B. subtilis VL28 (the density of 107 CFU/g and the dosage at 5 g/kg of feed) was supplemented in feed for the 1-56 day old chicken. The results showed that chicken growth increased by 11,7% and feed usage decreased by 16,8%, compared with the control groups without supplementing B. subtilis VL28. Furthermore, the 18 day old chicken, infected by S. enterica (with the dosage of 7,5x104CFU/mL/chicken) and by E. coli (with the dosage of 5,0x106 CFU/mL/chicken), then fed with

v

B. subtilis VL28 (supplemented in feed with the above described dosage), had growth ability and mortality rate equivalent to control groups treated with enrofloxacin and oxytetracyclin. These results showed that the selected B. subtilis VL28 strain in our study has great probiotic potential and could be used to replace antibiotics for prevention and treatment of intestinal diseases in poultry.

The 16S rRNA partial sequence of the new B. subtilis VL28 was registered

in the Genbank of NCBI with the access code KY346980.

Key words: B. subtilis, chicken, isolation, identification, probiotic

vi

MỤC LỤC

Lời cam kết kết quả......................................................................................... i

Lời cảm ơn ..................................................................................................... ii

Tóm lược ....................................................................................................... iii

Abstract .......................................................................................................... v

Danh sách bảng .............................................................................................. x

Danh sách hình ............................................................................................. xii

Danh mục từ viết tắt ..................................................................................... xv

CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ......................................................................... 1

1.1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1

1.2. Mục tiêu .................................................................................................. 1

1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................... 2

1.4. Những đóng góp mới của luận án ........................................................... 2

1.5. Ý nghĩa thực tiễn của luận án ................................................................ 2

CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....... ……………………………..3

2.1. Tổng quan về probiotic ........................................................................ 3

2.1.1. Lịch sử probiotic .................................................................................. 3

2.1.2. Các định nghĩa về probiotic ................................................................. 3

2.1.3. Xu hướng sử dụng probiotic ................................................................ 4

2.1.4. Vai trò và cơ chế tác động của probiotic ............................................. 5

2.1.5. Cơ chế tác động của probiotic ở gia cầm ............................................ 8

2.1.6. Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic................................ 12

2.1.7. Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm probiotic ........................... 13

2.1.8. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic ................... 14

2.2. Tổng quan về Bacillus subtilis ............................................................ 15

2.2.1. Đặc điểm chung của giống Bacillus .................................................. 15

2.2.2. Đặc điểm loài Bacillus subtilis .......................................................... 16

vii

2.2.3. Dinh dưỡng và tăng trưởng ............................................................... 22

2.2.4. Các chất do B. subtilis sinh ra ............................................................ 23

2.2.5. Tính đối kháng của B. subtilis ........................................................... 25

2.2.6. Một số phương pháp nghiên cứu tính đối kháng của B. subtilis và

vi sinh vật gây bệnh ................................................................................... 26

2.3. Hệ tiêu hóa và vi sinh vật đƣờng ruột ............................................... 27

2.3.1. Hệ tiêu hóa gia cầm và sự khác biệt so với động vật hữu nhũ .......... 27

2.3.2. Vi sinh vật đường ruột và tác động của chúng đến vật nuôi ............. 30

2.4. Một số vi khuẩn gây bệnh đƣờng tiêu hóa thƣờng gặp trên gà ...... 31

2.4.1. Salmonella ......................................................................................... 31

2.4.2. E. coli ................................................................................................. 36

2.4.3.Clostridium perfringens ...................................................................... 39

2.5. Một số nghiên cứu về probiotic trên thế giới và tại Việt Nam ....... 42

2.5.1. Trên thế giới ...................................................................................... 42

2.5.2. Tại Việt Nam .................................................................................... 43

2.6. Một số nghiên cứu ứng dụng B. subtilis ............................................ 44

2.6.1. B. subtilis ứng dụng cho người và vật nuôi ....................................... 44

2.6.2. B. subtilis sử dụng cho gia cầm ........................................................ 45

CHƢƠNG 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 47

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 47

3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ..................................................................... 47

3.2.1. Vật liệu ............................................................................................... 47

3.2.2. Dụng cụ .............................................................................................. 47

3.2.3. Thiết bị .............................................................................................. 47

3.2.4. Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn ......................... 48

3.3. Nội dung nghiên cứu và phƣơng pháp nghiên cứu .......................... 49

3.3.1. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 49

3.3.2. Phân lập các chủng Bacillus subtilis .................................................. 50

viii

3.3.3. Tuyển chọn các chủng B. subtilis có đặc tính probiotic .................... 56

3.3.4. Đánh giá tính an toàn và tác dụng của chế phẩm trên gà .................. 61

3.4. Xử lý số liệu ......................................................................................... 65

CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 66

4.1. Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus subtilis ............................ 66

4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus spp............................................. 66

4.1.2. Kết quả định danh Bacillus spp ......................................................... 67

4.2. Kết quả khảo sát các đặc tính probiotic ........................................... 77

4.2.1. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao..................................... 77

4.2.2. Khả năng nhạy/ kháng kháng sinh .................................................... 78

4.2.3. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào .......................... 81

4.2.4. Khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh .................. 85

4.2.5. Khả năng chịu acid dạ dày và muối mật ............................................ 98

4.2.6. Khả năng bám dính ......................................................................... 104

4.2.7. Khả năng sống của vi khuẩn trong đường ruột gà ........................... 109

4.3. Kết quả thí nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm trên gà ..... 111

4.3.1. Kết quả thí nghiệm 1….. .................................................................. 111

4.3.2. Kết quả thí nghiệm 2 ....................................................................... 114

4.3.3. Kết quả thí nghiệm 3 ........................................................................ 123

4.4. Đăng ký trình tự B. subtilis trên Genbank…………………….....131

CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................. 133

5.1. Kết luận .............................................................................................. 133

5.2. Đề nghị ............................................................................................... 134

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .............................. 135

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 136

PHỤ LỤC ................................................................................................. 154

ix

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1. Bậc phân loại của Bacillus subtilis ...................................................... 15

Bảng 2.2. Một số đặc điểm của Bacillus subtilis ................................................. 22

Bảng 2.3. Một số loại enzyme do B. subtilis sinh tổng hợp ................................ 23

Bảng 3.1. Phân bố mẫu ........................................................................................ 50

Bảng 3.2. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR ..................................... 54

Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ..................................................................... 62

Bảng 3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ..................................................................... 64

Bảng 3.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 ..................................................................... 65

Bảng 4.1. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào quan sát dưới kính hiển vi của 296 chủng vi khuẩn ............................................................................................. 66

Bảng 4.2. Kết quả sàng lọc vi khuẩn bằng các test sinh hóa ............................... 68

Bảng 4.3. Kết quả định danh 29 chủng vi khuẩn bằng kit API CH50B .............. 70

Bảng 4.4. Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA .... 74

Bảng 4.5. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng B. subtilis ......... 77

Bảng 4.6. Kết quả kháng sinh đồ của 21 chủng B. subtilis chọn lọc ................... 79

Bảng 4.7. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 21 chủng B. subtilis ............... 81

Bảng 4.8. Kết quả hoạt lực enzyme amylase, protease, lipase của 10 chủng

B. subtilis khảo sát ............................................................................................... 83

Bảng 4.9. Khoảng cách kháng khuẩn của các chủng B. subtilis bằng phương pháp kẻ vạch vuông góc .............................................................................................. 86

Bảng 4.10. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với E. coli ............................................................................................ 88

Bảng 4.11. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với S. enterica ...................................................................................... 91

Bảng 4.12. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và

VL28 đối với Staphylococcus spp ....................................................................... 93

Bảng 4.13. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Streptococcus spp. ........................................................................ 96

x

Bảng 4.14. Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 4 và pH 5 ............................. 99

Bảng 4.15. Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 3 ......................................... 101

Bảng 4.16. Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 2 ......................................... 103

Bảng 4.17. Kết quả khảo sát khả năng tự bám dính .......................................... 105

Bảng 4.18. Kết quả khảo sát khả năng bám dính với E. coli và S. enterica ...... 107

Bảng 4.19. Khả năng sống của B. subtilis VL28 trong đường ruột gà .............. 109

Bảng 4.20. Tăng trọng, thức ăn tiêu thụ và FCR qua 8 tuần thí nghiệm ......... 112

Bảng 4.21. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi trong thí nghiệm 2 ............................................................................................................ 115

Bảng 4.22. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 15- 28 ngày tuổi…117

Bảng 4.23. Tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 29-56 ngày tuổi trong thí nghiệm 2.......................................................................................................................... 120

Bảng 4.24. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-56 ngày tuổi trong thí nghiệm 2 .............................................................................................. 122

Bảng 4.25. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi…...123

Bảng 4.26. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 15- 28 ngày tuổi…124

Bảng 4.27. Kết quả test sinh hóa E. coli trên bệnh phẩm gan………………...127

Bảng 4.28. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 29-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 3 .................................................................................................... 129

Bảng 4.29. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 3 .................................................................................................... 130

xi

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1. Biểu đồ về sự tăng trưởng trong sử dụng probiotic ............................... 4

Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp về vai trò và cơ chế của probiotic đối với sức khỏe ..... 8

Hình 2.3. Sơ đồ mô tả tác động qua lại giữa các vk probiotic và niêm mạc ruột . 9

Hình 2.4. Sự tương tác giữa các sản phẩm loại trừ cạnh tranh, probiotic hoặc chất kích thích miễn dịch, và khả năng miễn dịch đường ruột ở gia cầm ........... 11

Hình 2.5. Mô hình cấu tạo tế bào vi khuẩn Bacillus spp ..................................... 16

Hình 2.6. Mô hình các vị trí nhiễm sắc thể trên bộ gen B. subtilis...................... 17

Hình 2.7. Sơ đồ quá trình hình thành bào tử B. subtilis....................................... 19

Hình 2.8. Sự biệt hóa tế bào ở B. subtilis ............................................................ 21

Hình 2.9. Sơ đồ hệ tiêu hóa gà ............................................................................. 28

Hình 3.1. Sơ đồ sàng lọc, định danh vi khuẩn B. subtilis .................................... 55

Hình 3.2. Sơ đồ kiểm tra khả năng chịu acid dạ dày và muối mật của vi khuẩn

B. subtilis………………………………………………………………………...59

Hình 3.3. Chuồng gà thí nghiệm………………………………………………...62

Hình 4.1. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus spp. trên môi trường TSA và hình thái dưới kính hiển vi ................................................................................................. 67

Hình 4.2. Kết quả test sinh hóa ............................................................................ 69

Hình 4.3. Định danh bằng kit API CH50B .......................................................... 71

Hình 4.4. Sản phẩm PCR của các chủng B. subtilis trong nghiên cứu ................ 73

Hình 4.5. Sơ đồ chọn lọc và định danh vi khuẩn B. subtilis ................................ 76

Hình 4.6. Khả năng chịu nhiệt của các chủng B. subtilis phân lập...................... 78

Hình 4.7. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của 21 chủng vi khuẩn B. subtilis…….80

Hình 4.8. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng B. subtilis AG27 và VL28 ....... 81

Hình 4.9. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis AG27 ........... 82

Hình 4.10. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng B. subtilis .... 87

Hình 4.11. Hiệu quả kháng khuẩn của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với

E. coli ................................................................................................................... 90

xii

Hình 4.12. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với S. enterica ............................................................................................................ 92

Hình 4.13. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Staphylococcus spp .............................................................................................. 94

Hình 4.14. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Streptococcus spp ................................................................................................ 97

Hình 4.15. Hoạt tính đối kháng của VL28 với E. coli, S. enterica, Staphylococcus spp và Streptococcus spp. .......................................................... 98

Hình 4.16. Khả năng chịu pH 4 và 5 của các chủng B. subtilis ......................... 100

Hình 4.17. Khả năng chịu pH 3 của các chủng B. subtilis ................................ 102

Hình 4.18. Khả năng chịu pH 2 của các chủng B. subtilis ................................ 104

Hình 4.19. Khả năng tự bám dính của các chủng B. subtilis ............................. 105

Hình 4.20. Khả năng bám dính với vi khuẩn gây bệnh của AG27 và VL28 ..... 108

Hình 4.21. Khả năng bám dính của 2 chủng VL28 và AG27 trong biểu mô ruột ............................................................................................................................ 108

Hình 4.22. Khả năng tồn tại của B. subtilis VL28 ở ruột non, manh tràng, và ruột già .......................................................................................................... 110

Hình 4.23. Tóm tắt quá trình phân lập và chọn lọc vi khuẩn probiotic……….111

Hình 4.24. Biểu đồ tăng trọng và FCR của gà qua các tuần ở thí nghiệm 1 ..... 113

Hình 4.25. FCR và tăng trọng ở giai đoạn 1-14 ngày tuổi của thí nghiệm 2 .... 116

Hình 4.26. Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 15-28 ngày tuổi ............................. 118

Hình 4.27. Bệnh tích gà trong thí nghiệm gây nhiễm S. enterica ..................... 119

Hình 4.28. Khuẩn lạc S. enterica trên môi trường SS và kết quả test sinh hóa . 119

Hình 4.29. Kết quả giải trình tự vi khuẩn S. enterica phân lập từ lách gà bệnh 120

Hình 4.30. Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 29-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 2 ..... 121

Hình 4.31. Tăng trọng và FCR giai đoạn 15-28 ngày tuổi ở thí nghiệm 3 ........ 125

Hình 4.32. Bệnh tích gà trong thí nghiệm gây nhiễm E. coli ............................ 126

Hình 4.33. Khuẩn lạc E. coli trên môi trường Mac Conkey và EMB ............... 126

Hình 4.34. Test sinh hóa vi khuẩn E. coli .......................................................... 127

xiii

Hình 4.35. Kết quả giải trình tự vi khuẩn E. coli phân lập từ gan gà bệnh ....... 128

Hình 4.36. Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 29-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 3 ..... 129

Hình 4.37. Kết quả đăng ký trình tự gen B. subtilis VL28 trên ngân hàng gen NCBI…………………………………………………………………………..131

xiv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Viết tắt

Viết đầy đủ (tiếng Anh)

Tiếng Việt

Tế bào trình diện kháng nguyên (tế bào đuôi gai hay đại thực bào)

Đơn vị hoạt lực amylase của vi khuẩn Loại trừ cạnh tranh Đơn vị hình thành khuẩn lạc

Môi trường bào tử hóa Hệ số chuyển hóa thức ăn Thuốc nhuộm tiêu bản mô Môi trường làm kháng sinh đồ

Thạch dinh dưỡng Muối đệm phosphate Phản ứng chuỗi trùng hợp Thành phần kích thích tiết

Trichloroacetic acid

Hóa chất dùng cho phản ứng kết

APC Antigen presenting cells ATCC American Type Culture Collection Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ Bacterial Amylase Units BAU CE Competitive exclusion Colony-forming unit CFU Clinical and Laboratory Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và CLSI Standards Institute Xét nghiệm Difco sporulation Medium DSM FCR Feed conversion ratio HE Hematoxylin- eosin Mueller Hinton agar MHA Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MIC Nutrient agar NA Phosphate buffered saline PBS Polymerase Chain Reaction PCR SC Secretory component immunoglobulin TCA tủa protein TSB

Môi trường dinh dưỡng

Tryptone Soya Broth

xv

CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 . Tính cấp thiết của đề tài

Sự phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi gà công nghiệp trong những thập niên gần đây đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế - xã hội to lớn, nhưng cũng làm nảy sinh nhiều vấn đề cần được quan tâm xem xét. Một trong những vấn đề cần quan tâm giải quyết là việc sử dụng rộng rãi các chất kháng sinh để phòng bệnh và kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi. Việc này đã làm gia tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc trong tự nhiên, có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh viêm nhiễm trên người. Do vậy, nhiều nước tiên tiến đã quyết định hạn chế việc sử dụng các chất kháng sinh trong chăn nuôi. Để thay thế kháng sinh trong chăn nuôi, các nhà khoa học đã đưa ra nhiều giải pháp khác nhau trong đó có biện pháp sử dụng probiotic - những vi sinh vật sống hữu ích cho hoạt động tiêu hóa và có tác dụng tăng cường sức khỏe nói chung cho người và động vật. Bacillus subtilis là một vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, hầu như không có độc tính trên người cũng như nhiều loài động vật và có sức đề kháng cao với nhiều tác nhân vật lý và hóa học. Do vậy, từ lâu vi khuẩn này được chọn nghiên cứu để làm probiotic cho người và vật nuôi theo mô hình công nghiệp. Tuy nhiên, B. subtilis rất đa dạng về các đặc tính sinh học nên không phải tất cả các chủng đều có thể sử dụng làm probiotic và mỗi chủng probiotic chỉ phù hợp và có hiệu quả khi sử dụng cho một đối tượng nhất định.

Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện nhằm nghiên cứu tìm giải pháp mới thay thế sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp và giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong tự nhiên.

1.2. Mục tiêu

- Phân lập được ít nhất 01 chủng Bacillus subtilis tại một số tỉnh ĐBSCL có các đặc tính probiotic như: khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase); chịu được tác động của dịch tiêu hóa (dịch vị, muối mật), khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột (S. enterica, E. coli).

- Xác định được liều dùng hiệu quả của chủng probiotic phân lập được trong

phòng bệnh đường ruột ở gà do E. coli và S. enterica gây ra.

1

1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.

- Phạm vi nghiên cứu: Các chủng Bacillus subtilis được phân lập từ đất và phân gà ở 7 tỉnh thành thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm: Cần Thơ, Hậu Giang, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang.

1.4. Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên chọn lọc được chủng B. subtilis bản địa có hiệu quả trong phòng bệnh đường tiêu hóa trên gà tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt là bệnh do S. enterica và E. coli gây ra.

- Đã phân lập và giám định chính xác 21 chủng B. subtilis bản địa từ phân và đất chuồng gà ở khu vực ĐBSCL và tuyển chọn được chủng B. subtilis VL28 có thể sử dụng làm probiotic trên gà.

- Đã chứng minh bằng thực nghiệm việc bổ sung chủng B. subtilis VL28 107 CFU/g với liều 5 g/kg thức ăn có khả năng thay thế kháng sinh ngăn ngừa quá trình nhiễm trùng đường ruột ở đàn gà được gây nhiễm thực nghiệm với S. enterica và E. coli, đồng thời làm tăng mức tăng trưởng cũng như giảm hệ số chuyển hóa thức ăn so với gà đối chứng.

- Đã được ngân hàng gen NCBI công nhận trình tự gen 16S rRNA của

B. subtilis VL28 với mã số truy cập KY346980.

(có thể truy cập trên trang web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ky346980)

- Là công trình nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn vi khuẩn probiotic một

cách hệ thống theo tiêu chuẩn Quốc tế.

1.5. Ý nghĩa thực tiễn của luận án

Chọn lọc được chủng B. subtilis bản địa có tiềm năng dùng làm probiotic phù hợp với điều kiện chăn nuôi tại Đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả nghiên cứu của đề tài dùng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic, phòng chống bệnh đường ruột gia cầm, làm tăng năng suất chăn nuôi đem lại lợi nhuận cao cho người chăn nuôi. Tạo cơ sở khoa học để đề xuất hạn chế sử dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trưởng và phòng bệnh trong chăn nuôi. Góp phần tạo được nguồn thịt gia cầm sạch, không tồn dư kháng sinh, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

2

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về probiotic

2.1.1. Lịch sử probiotic

Nghiên cứu về probiotic bắt đầu được chú ý vào năm 1900 khi Tisser quan sát và thấy phân của những đứa trẻ tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh (Schillinger et al., 1996). Sau đó năm 1907, Metchnikoff đã chứng minh việc sử dụng Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dắc (Caucasians) ở Bulgaria là họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men (Metchnikoff E., 1907). Có thể nói Tisser và Metchikoff là những người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic.

Năm 1930, Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các trẻ em khỏe mạnh (Cartwright, 2003). Cùng năm đó các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Harvard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất được. Khái niệm chung về probiotic xuất hiện ở Châu Âu vào những năm đầu của thập niên 80, ở Châu Á, nhiều năm sau các sản phẩm từ sữa lên men mới được du nhập vào và bắt đầu có khái niệm về probiotic (Cartwright, 2003).

Cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, đặc biệt là công nghệ sinh học, các nghiên cứu về probiotic ngày càng được mở rộng. Ngày nay probiotic đã được sử dụng rộng rãi trong dược phẩm, thực phẩm và chăn nuôi.

2.1.2. Các định nghĩa về probiotic

Năm 1965, Lilley và Stillwell lần đầu tiên sử dụng thuật ngữ probiotic để mô tả những chất tiết ra từ vi sinh vật có khả năng kích thích sự phát triển của vi sinh vật khác (Grover and Luthra, 2011).

Trải qua lịch sử định nghĩa probiotic ngày càng cụ thể hơn, như:

“Probiotic là các chủng vi khuẩn sống mà chúng tác động có lợi cho sự cân

bằng vi sinh vật đường ruột của động vật” (Marteau et al., 2002).

3

“Probiotic là các chủng vi sinh vật sống bổ sung tạo ảnh hưởng có lợi lên vật chủ bằng cách thay đổi các nhân tố liên quan đến vật chủ hay quần thể vi sinh vật bao quanh, tăng cường việc sử dụng thức ăn hoặc giá trị dinh dưỡng, tăng cường khả năng phản ứng của vật chủ với bệnh, tăng cường chất lượng môi trường xung quanh vật chủ” (Verschuere et al., 2000).

“Probiotic là lượng vi sinh vật sống xác định với số lượng thích hợp được chuẩn bị trong các sản phẩm, có tác dụng biến đổi tích cực hệ vi sinh vật ruột và có tác dụng tốt đến sức khỏe vật chủ." (Schrezenmeir and de Vrese, 2001).

"Probiotic, đó là những vi sinh vật sống được kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ". (FAO/WHO, 2002). Đây là định nghĩa được chấp nhận nhiều hơn cả, nó được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học.

2.1.3. Xu hƣớng sử dụng probiotic

Theo khảo sát của hiệp hội lương thực và thực phẩm (International Food Information Council - IFIC), số người biết đến và sử dụng probiotic ngày càng tăng qua các năm. Mức tăng trưởng về thị trường probiotic từ năm 2009 đến 2014 là 12,6%. Năm 2004, số người biết đến probiotic ít hơn 10%, nhưng năm 2011 thì hơn 81% người tiêu dùng biết và sử dụng probiotic (Hình 2.1). Theo dự báo của IFIC, sản lượng probiotic toàn cầu dự báo đạt 31,1 tỉ USD vào năm 2015, nhưng thực tế đạt 41 tỉ USD (Monica Feldman, 2016), cho thấy thị trường probiotic rất tiềm năng, luôn phát triển ngoài mong đợi.

Tỉ lệ người biết và sử dụng probiotic

D S U

ỉ

T

Dự báo mức tăng trưởng probiotic

Hình 2.1. Biểu đồ về sự tăng trưởng trong sử dụng probiotic (IFIC, 2011)

4

2.1.4. Vai trò và cơ chế tác động của probiotic

Probiotic khi được đưa vào cơ thể sẽ có nhiều tác động tích cực không chỉ với hệ tiêu hóa mà còn trên nhiều hệ cơ quan khác (Patterson and Burkholder, 2003). Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả Kabir (2009); Otutumi et al. (2012) đã tổng kết các ảnh hưởng có lợi của probiotic đối với động vật thể hiện ở các khía cạnh sau:

2.1.4.1. Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây

bệnh.

- Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn: bao gồm bacteriocin, acid hữu

cơ, và hydrogen peroxide.

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein, được ribosome tổng hợp nên các peptide hoặc protein. Chất này có ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương nhằm ức chế các vi khuẩn cạnh tranh khác. Cơ chế tác động của bacteriocin rất đa dạng, nó có thể làm biến đổi các enzyme, ức chế sự sản sinh bào tử, xâm nhập vào tế bào làm mất lực đẩy proton, làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất và thay đổi pH nội bào dẫn đến tế bào bị phá vỡ.

Acid hữu cơ được sản xuất bởi vi khuẩn lactic như acid acetic, lactic, propionic, … làm pH môi trường hạ thấp, ảnh hưởng đến pH nội bào của vi khuẩn gây bệnh, do đó có tác dụng ức chế sự phát triển của chúng.

Tính chất kháng khuẩn của hydrogen peroxide chủ yếu thông qua việc tạo ra các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc superoxide và các gốc hydroxyl tự do.

- Cạnh tranh vị trí gắn kết

Khả năng gắn kết trên biểu mô ruột là một yếu tố quan trọng cho vi sinh vật cư trú trong ruột. Các vi khuẩn probiotic có mặt trong hệ tiêu hóa có khả năng ngăn chặn khả năng bám dính của vi khuẩn gây bệnh, do đó làm giảm lượng chất độc của chúng tiết ra trên biểu mô ruột. Một số trường hợp, vi khuẩn probiotic có thể chiếm cả vị trí gắn kết của vi khuẩn gây bệnh ngay cả khi những vi khuẩn này đã bám chặt trên tế bào biểu mô (Czerucka and Rampal, 2002).

- Cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng

Probiotic còn có khả năng cạnh tranh các chất dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh. Bất kỳ vi sinh vật nào cũng cần có nguồn dinh dưỡng để phát triển. Chẳng hạn sự phát triển của probiotic sử dụng đường đơn (glucose, fructose) sẽ

5

làm giảm sự phát triển của Clostridium difficile (cũng sử dụng đường đơn) (Peter, 2006). Các sinh vật probiotic còn tạo ra những cản trở không gian ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh (Otutumi et al., 2012).

2.1.4.2. Tác động trên mô biểu bì ruột

Một số chủng probiotic có khả năng tiết ra một số chất giúp đẩy mạnh sự liên kết giữa những tế bào biểu mô, hoặc có khả năng làm giảm độ thẩm thấu vào màng nhầy, hạn chế sự xâm nhập của vi sinh vật. Một số chủng có khả năng sinh tổng hợp chất nhầy, đây cũng là một trong những cơ chế chống lại các tác nhân gây bệnh do chất nhầy sẽ cô lập, bất hoạt vi sinh vật gây bệnh.

2.1.4.3. Tăng cƣờng khả năng miễn dịch

Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật, giữa hệ vi sinh vật ruột và hệ thống miễn dịch có mối tương quan đặc thù. Probiotic tác động đồng thời lên cả hệ miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu của cơ thể. Với hệ miễn dịch không đặc hiệu, probiotic giúp giảm thiểu sự di chuyển của các vi khuẩn và chất lạ (kháng nguyên) từ ruột xâm nhập vào mạch máu (Dugas et al., 1999). Nhờ đó giúp giảm nhiễm khuẩn và dị ứng đối với các kháng nguyên trong thực phẩm. Đối với hệ miễn dịch đặc hiệu, tác động của probiotic tương đối phức tạp hơn. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành, và một số cơ chế tác động của probiotic lên hệ miễn dịch đã được phát hiện (Lee and Salminen, 2009). Tuy nhiên cơ chế tác động của probiotic đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chưa được hiểu biết đầy đủ.

2.1.4.4. Tác động đến vi khuẩn đƣờng ruột

Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột. Probiotic có thể làm giảm pH trong hệ tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của vi khuẩn gây bệnh và thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật chủ. Đồng thời tăng sự dung nạp đường lactose, giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi, giảm vi khuẩn gây hại (Soccol et al., 2010).

2.1.4.5. Tổng hợp vitamin

Các vi khuẩn probiotic có khả năng sinh các loại vitamin nhóm B (folic acid, niacin, riboflavin, B12, B6, acid pantothenic) và vitamin K (Chaucheyras-

6

Durand and Durand, 2010). Theo các nghiên cứu, Lactobacillus brevis có khả năng tổng hợp vitamin D và vitamin K; Bacillus longum tổng hợp vitamin B; Bacillus bifidum và Lactobacillus acidophillus tổng hợp được các vitamin B như niacin, folic acid, biotin, B6 và vitamin K.

2.1.4.6. Một số tác động khác

- Tác động chống ung thư: Probiotic giúp gắn kết và phân hủy các chất gây ung thư, sản xuất ra những hợp chất kháng ung thư, điều hòa những enzyme tiền chất gây ung thư (Holm, 2003).

- Tác động chống dị ứng: Một phương pháp phòng chống dị ứng thức ăn là điều chỉnh hệ vi sinh vật đặc biệt là hệ vi sinh vật đường ruột, vì đây là nguồn vi sinh vật chính kích thích hệ thống miễn dịch. Qua các nghiên cứu, người ta thấy rằng ở những người ít bị dị ứng số lượng vi khuẩn Lactobacilli nhiều hơn và Clostridia ít hơn so với ở những người thường bị dị ứng (Soccol et al., 2010).

- Làm tăng khả năng dung nạp của cơ thể với lactose, giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose (Soccol et al., 2010).

- Làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh. Vi khuẩn đường ruột chuyển cholesterol sang dạng khó hấp thu hơn (coprostanol) do đó làm cản trở việc hấp thu cholesterol vào hệ thống ruột.

7

Kiểm soát rối loạn tiêu hóa

Ngăn chặn mầm bệnh bên ngoài (tiêu chảy do kháng sinh)

Kiểm soát các bệnh viêm nhiễm đƣờng ruột

Chống lại sự tấn công của vi khuẩn gây bệnh

Cân bằng vi sinh trong ruột

Giảm triệu chứng dị ứng thức ăn

Cân bằng đáp ứng miễn dịch

Ngăn chặn mầm bệnh bên ngoài (tiêu chảy)

Probiotic

Cung cấp SCFA và vitamin đến tế bào biểu mô ruột

Điều hòa miễn dịch

Tăng cƣờng hệ miễn dịch tự nhiên

Giảm rủi ro ung thƣ ruột

Khử và tiết muối mật

Giảm cholesterol

Hiệu quả chuyển hóa

Thủy phân Lactose

Làm giảm phản ứng sinh độc tố/ đột biến trong ruột

Cải thiện khả năng dung nạp lactose

SCFA: short chain fatty acids: acid béo mạch ngắn: có tác dụng hạ pH trong đường tiêu

hóa, ức chế vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn lên men thối.

Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp về vai trò và cơ chế của probiotic đối với sức khỏe

2.1.5. Cơ chế tác động của probiotic ở gia cầm

Cơ chế tác động của probiotic lên hệ thống miễn dịch ở niêm mạc gia cầm chưa được biết đến một cách rõ ràng. Tuy nhiên, tác dụng điều hòa miễn dịch của

8

probiotic là điều không thể phủ nhận (Erickson and Hubbard, 2000; Everlon, 2012).

Theo Erickson and Hubbard (2000) và Loddi et al. (2003), các giống vi khuẩn probiotic như Lactobacillus và Bifidobacterium có liên quan trực tiếp đến khả năng gia tăng miễn dịch ở gia cầm, chủ yếu là trong các bệnh đường tiêu hóa. Tuy nhiên, các giống vi khuẩn khác cũng có ảnh hưởng tích cực lên sự điều hòa miễn dịch (Hong et al., 2005).

Hình 2.3. Sơ đồ mô tả tác động qua lại giữa các vi khuẩn probiotic và niêm mạc ruột (Everlon, 2012).

Vi khuẩn probiotic ức chế vi khuẩn gây bệnh đường ruột, và tăng cường chức năng làm rào cản. Theo Hình 2.3, hoạt động kháng khuẩn của probiotic bao gồm:

(1) Sản xuất các kháng khuẩn sinh học (bacteriocins và defencins). (2) Ức chế cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh. (3) Ức chế sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh hoặc chuyển vị. (4) Giảm pH trong lòng ruột. (5) Tăng cường sản xuất chất nhầy.

Cơ chế điều hòa miễn dịch xảy ra theo hai cách: (a) Từ vi sinh vật, các vi

khuẩn probiotic cư trú nơi thành ruột và số lượng các vi khuẩn được nhân lên. (b) Từ kháng nguyên, tạo bởi các sinh vật chết được hấp thụ, từ đó kích thích hệ thống miễn dịch (Havenaar and Spanhaak, 1994). Theo Loddi (2003), các kháng

9

nguyên (lipopolysaccharides và peptidoglycans) được tạo ra liên tục trong lòng ruột. Quá trình này tăng lên khi xảy ra viêm nhiễm, các thành phần này mang tính thiết yếu trong sự phát triển và duy trì các phản ứng miễn dịch (Loddi, 2003).

Probiotic tạo ra những thay đổi ở biểu mô ruột bằng cách: làm giảm pH của ruột, tiết ra các peptide kháng khuẩn ức chế vi khuẩn xâm nhập và ngăn chặn sự bám dính vào tế bào biểu mô. Điều này có nghĩa là chúng cải thiện chức năng rào cản ở ruột, gia tăng tổng hợp cytokine (TNF-α, IFN-γ, IL-10 và IL-12) (Arvola et al., 1999), kích thích IgA tiết ra trong niêm mạc ruột, giải phóng mucin (Gupta and Garg, 2009). Mucin là lớp glycoprotein khi tiếp xúc với nước sẽ tạo thành một màng bôi trơn và bảo vệ các tế bào biểu mô ruột chống lại tác nhân gây bệnh, chúng thành lập một rào cản vật lý giữa các tế bào biểu mô và các thành phần trong lòng ruột, giúp giữ vi khuẩn an toàn trong ruột (Mattar et al., 2002). Trong ruột, probiotic tương tác với các tế bào hấp thu ở nhung mao, tế bào hình ly, tế bào M (Microfold cells) từ các lympho bào. Những tương tác này dẫn đến tăng số lượng IgA, thêm vào đó là việc tiết IgM và IgA, đặc biệt quan trọng đối với khả năng miễn dịch của niêm mạc ruột, góp phần tạo rào cản chống lại mầm bệnh (Szajewska et al., 2001). Khả năng lấn át mầm bệnh trong cơ chế điều hòa đáp ứng miễn dịch đã được quan sát thông qua sự gia tăng của nhu động ruột (Gupta and Garg, 2009), gia tăng quần thể tế bào lympho trong biểu mô ruột (Dalloul et al., 2003), loại bỏ các tác nhân gây bệnh (Patterson and Burkholder, 2003), ổn định hệ vi sinh vật đường ruột và gia tăng chiều cao vi nhung ruột (Salzman et al., 2003). Thêm vào đó, các nhóm vi khuẩn phát triển một mạng lưới để khóa các vị trí liên kết của các tác nhân gây bệnh đường ruột.

Vi khuẩn probiotic có khả năng sản xuất ra một loại chất có khả năng “loại trừ” các vi sinh vật cạnh tranh khác, cơ chế này được biết đến như là cơ chế loại trừ cạnh tranh, chúng cạnh tranh vị trí bám dính vào màng tế bào hình ly, các tế bào nội tiết và các tế bào hấp thu ở nhung mao trong niêm mạc ruột, cơ chế này tạo nên hệ thống hàng rào vật lý toàn vẹn, giúp ngăn ngừa tác nhân gây bệnh đường ruột. Cơ chế đã được mô tả bởi Revolledo et al. (2006) (Hình 2.4). Cũng theo cơ chế này, tác dụng đối kháng thông qua một số chất được tiết ra nhằm ức chế sự tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như bacteriocin, acid hữu cơ và hydrogen peroxide (Patterson and Burkholder, 2003; Mazmanian et al., 2008). Những lợi ích khác từ việc sử dụng các vi khuẩn probiotic đó là: tăng hoạt động enzyme thúc đẩy quá trình hấp thu và dinh dưỡng; ức chế các enzyme gây bệnh ung thư (Gill, 2003).

10

Hình 2.4. Sự tương tác giữa các sản phẩm loại trừ cạnh tranh, probiotic hoặc chất kích thích miễn dịch, và khả năng miễn dịch đường ruột ở gia cầm (Revolledo et al., 2006).

SIgA = IgA phân tiết (secretory IgA) ; CE = loại trừ cạnh tranh (competitive exclusion) ; IEC = tế bào biểu mô ruột (intestinal epithelial cells); IEL = lympho bào trong biểu mô ruột (intestinal intraepithelial lymphocyte) ; LPL = lympho bào đệm niêm mạc (hoạt hóa lympho bào T) (lamina propria lymphocytes); tế bào đuôi gai hay đại thực bào = tế bào trình diện kháng nguyên (APC- antigen-presenting cells); LB = lympho bào B; LT = lympho bào T; Tế bào M = tế bào cần cho việc vận chuyển các kháng nguyên từ lumen ruột đi vào các mô bạch huyết ruột; SC = thành phần kích thích tiết IgA (secretory component); endocytosis = nhập bào (xâm nhập tế bào bằng cách hình thành túi trên màng tế bào, sau đó túi này lộn ngược vào trong tế bào phóng thích chất xâm nhập vào bên trong tế bào); transcytosis = chất trung gian trên màng tế bào.

Theo Revolledo et al. (2006), cơ chế được đề xuất như sau (Hình 2.4):

Hấp thu kháng nguyên:

- Lympho bào trong biểu mô ruột (IEL) nhận diện kháng nguyên một cách

trực tiếp, tín hiệu được gửi đến lympho bào T (LT).

- Khi kháng nguyên được mang đi trong các tế bào M bằng chất trung gian trên màng tế bào (transcytosis), có 2 cơ chế có thể hoạt hóa các đáp ứng miễn dịch: a) Kháng nguyên được mang đi trực tiếp bằng đại thực bào hoặc tế bào đuôi

11

gai. b) Kháng nguyên kích hoạt các tế bào B, quá trình này hoạt hóa lympho T trong đệm niêm mạc.

- Các tế bào trong biểu mô (IEC) sử dụng quá trình nhập bào (endocytosis) để hấp thu kháng nguyên. IEC có thể hoạt động như một tế bào đại diện kháng nguyên (APC) và xử lý kháng nguyên, kháng nguyên đại diện cho lympho T trong đệm niêm mạc.

Sự sản xuất SIgA: Lympho bào T (LT - LPL) được kích hoạt sản xuất cytokin (chất trung gian điều hòa các tế bào trong cơ thể), kích thích lympho B hoạt động, và cuối cùng là các tương bào, sản xuất IgA. Các IgA được gắn thành phần kích thích tiết tế bào trong biểu mô (IEC) và tự biến đổi chúng thành IEC; cuối cùng SIgA được hình thành và phát huy hiệu quả bảo vệ bề mặt.

2.1.6. Các chủng vi khuẩn thƣờng dùng làm probiotic

Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu thuộc Lactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra Enterococcus và Streptococcus cũng được sử dụng nhưng ít hơn. Những vi khuẩn này thường cư trú trong ruột. Một số chủng tiêu biểu bao gồm Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. rhamnosus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii, S. cerevisiae cũng được xem là probiotic (Vuyst et al., 2004). Tuy nhiên, các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn lactic bị diệt khi gặp nhiệt độ cao và tác động của muối mật (Fernandes et al., 1988). Bên cạnh đó, các vi khuẩn này không chịu được các điều kiện khắc nghiệt của quá trình sản xuất như sấy khô, tạo hạt, … làm cho tuổi thọ của sản phẩm ngắn. Để bảo đảm hiệu quả của sản phẩm, một số nhà sản xuất tiên tiến đã sử dụng công nghệ vi bao (Cell Biotech) trong quá trình sản xuất, đưa đến giá thành sản phẩm cao. Trong khi đó, các vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus có thể chịu đựng được nhiệt độ đến 100oC trong vài phút (Teo et al., 2003), tồn tại trong muối mật 0,5% (Teo et al., 2006), bền vững trong điều kiện bảo quản thông thường và trong quá trình sản xuất sấy khô, tạo hạt, … nên rất phù hợp để tạo sản phẩm probiotic bổ sung vào thức ăn vật nuôi.

Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy B. subtilis có khả năng cạnh tranh mạnh với các vi khuẩn gây bệnh (La Ragione and Woodward, 2003), thân thiện với nhóm vi khuẩn lên men lactic, là nhóm được xem là có lợi cho sức khỏe động vật (Knarreborg et al., 2008). Ngoài ra do B. subtilis có khả năng hình thành bào tử, tồn tại lâu dài trong điều kiện tự nhiên mà không mất hoạt tính nên sản phẩm

12

probiotic sẽ rất thuận lợi khi lưu hành và bảo quản (La Ragione et al., 2008). Chính vì lẽ đó B. subtilis đã được ưu tiên sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi ở nhiều quốc gia.

2.1.7. Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm probiotic

2.1.7.1. Về mặt sản xuất

- Có thể nhân lên nhanh chóng với số lượng lớn trong điều kiện lên men đơn

giản và giá thành thấp.

- Có thể tồn tại và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc vi hiếu khí.

- Có thể sống sót qua quá trình ly tâm, lọc, đông lạnh hoặc sấy lạnh mà không mất số lượng đáng kể.

- Có khả năng hoạt hóa nhanh sau khi được sử dụng.

- Có thể sống sót dưới những điều kiện biến đổi khác nhau trong chế biến thực phẩm bao gồm các quá trình nhiệt độ cao trên 45oC cũng như chịu đựng được nồng độ cồn và muối cao.

- Có thể tồn tại được trong quá trình lưu trữ trong khoảng thời gian dài mà

không bị giảm mật số.

2.1.7.2. Về mặt sử dụng cho vật nuôi

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật, tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh trong đường tiêu hóa vật chủ. Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp lý hóa thông qua các thí nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng có tiềm năng như là nguồn probiotic (FAO/WHO, 2002).

Theo FAO (2002) các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu

chuẩn chủ yếu sau:

- Có tính định danh chính xác thuộc loài nào.

- Không mang các gen kháng kháng sinh.

- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ.

- Có khả năng cạnh tranh thức ăn với các vi sinh vật có hại.

- Không sinh chất độc và không gây bệnh cho vật chủ.

- Có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian dài.

13

- Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà cơ thể vật

chủ có thể sử dụng.

- Chịu được pH thấp ở dạ dày và nồng độ muối mật cao ở ruột non.

- Khả năng chịu được các dịch tiêu hóa.

- Khả năng cư trú trong ruột.

2.1.8. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic

Đánh giá độ an toàn phải tính đến bản chất của vi khuẩn được sử dụng, phương pháp điều trị, mức độ phơi nhiễm, trạng thái sức khoẻ của động vật sử dụng và các chức năng sinh lý mà probiotic được hướng tới.

Đối với nghiên cứu phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn

nuôi cần bắt đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia

súc, gia cầm (Arturo et al., 2006). Điều này cho thấy yêu cầu an toàn đối với chủng vi sinh vật được tuyển chọn làm probiotic dù dùng trong chăn nuôi cũng

cần xem xét các yếu tố tác động đến vật nuôi, con người và môi trường.

- Đối với động vật cần có thời gian thử nghiệm từ 1-3 tháng, kiểm tra các

chỉ tiêu tăng trọng, phản ứng cơ thể, theo dõi các bệnh tiêu hóa, bệnh nhiễm

khuẩn và các phản ứng phụ (Arturo et al., 2006).

- Với môi trường cần đảm bảo là vi sinh vật không có hại đối với con người

và động vật, không mang gen lạ. Nói chung các chủng vi sinh vật probiotic có

nguồn gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi, đất) là các chủng được

khuyến cáo sử dụng.

- Tổ chức FAO (2002) hướng dẫn với việc tuyển chọn các chủng probiotic,

ngoài các đặc tính probiotic và đảm bảo an toàn thì các chủng này phải được cụ thể hóa các thông tin về nguồn gốc chủng, tên phân loại đến chi và loài. Đối với vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu Âu đã lập một Ủy ban khoa học về dinh dưỡng động vật (Scientific committee for animal nutrition, SCAN) đưa ra những qui định đánh giá an toàn đối với sản phẩm và những khuyến cáo cho vấn

đề này qua các điều luật và kỹ thuật online (SCAN, 2000).

Tổ chức FAO (2002) khuyến cáo các chủng probiotic không những cần

được phân loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo tàng vi sinh vật đạt tiêu chuẩn quốc tế. Quy trình sản xuất phải theo tiêu chuẩn GMP

(Good Manufacturing Practices).

14

2.2. Tổng quan về Bacillus subtilis

2.2.1. Đặc điểm chung của giống Bacillus

Theo Online Textbook of Bacteriology (Todar, 2015), Wikipedia và

Microbewiki Bacillus được phân loại như sau:

Bảng 2.1: Bậc phân loại của Bacillus subtilis

Tiếng Việt Latin Tiếng Anh Bậc phân loại

Giới Ngành Lớp Bộ Họ Chi/giống Loài Regnum Divisio Classis Ordo Familia Genus Species Kingdom Division Class Order Family Genus Species Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae Bacillus Bacillus subtilis

Hiện nay đã xác định được 226 loài Bacillus có mặt rộng rãi trong tự nhiên (Euzéby, 1997) đặc biệt trong đất, không khí, nước, trên cơ thể thực vật và động vật, bụi cỏ khô và rơm rạ. Hầu hết là các vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí, tạo nội bào tử, các tế bào tồn tại riêng lẻ hay dính nhau thành chuỗi ngắn. Nội bào tử được mô tả đầu tiên bởi Cohen (1872) khi nghiên cứu về B. subtilis và sau đó là Robert Koch trong các nghiên cứu về các loài vi khuẩn gây bệnh như B. anthracis vào năm 1876. Sự tạo thành nội bào tử sau đó được chấp nhận như là một đặc tính căn bản để phân loại và xác định các thành viên của chi. Tuy nhiên, cũng có một số loài Bacillus không tạo bào tử như B. thermoamylovorans, B. halodenitrificans, một số khác bắt màu Gram âm hay Gram dương yếu như B. thermosphaericus, B. horti, B. oleronius, B. azotoformans (Yumoto et al., 1998). Thêm vào đó, khi phân loại dựa vào giải trình tự rRNA/DNA, dạng vi khuẩn không tạo bào tử, kỵ khí bắt buộc cũng thuộc nhóm Bacillus như B. infernus (Boone et al., 1995).

Tế bào sinh dưỡng Bacillus thẳng, có đầu tròn hay vuông, kích thước từ

0,5-1,2 x 2,5-10 µm, ở dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn hoặc dài. Đối với Bacillus có nội bào tử thì bào tử hình trụ, tròn, thỉnh thoảng có hình bầu dục. Tùy theo loài, bào tử có thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc ở cuối, và túi bào tử phồng hoặc không - trong bình kỵ khí hoặc môi phồng. Trong một số điều kiện đặc biệt (có HCO3 trường CO2), B. subtilis, B. licheniformis B. megaterium và B. anthracis, tạo ra một vỏ polypeptide (poly-γ-D-glutamic acid) nhìn thấy được khi nhuộm tế bào với polychrome methylene blue. Trừ B. anthracis và B. mycoides, hầu hết các loài

15

Bacillus đều di động, mặc dù có sự khác biệt rất lớn về khả năng di động trong mỗi loài. Đa số các loài có catalase dương tính.

Hình 2.5. Mô hình cấu tạo tế bào vi khuẩn Bacillus spp.

2.2.2. Đặc điểm loài B. subtilis

Vi khuẩn lần đầu tiên được Ehrenberg phát hiện năm 1835 và được đặt với tên Vibrio subtilis. Sau đó, năm 1872 được Cohen đổi tên thành B. subtilis và được sử dụng cho đến ngày nay. B. subtilis là một trong những vi khuẩn đầu tiên được nghiên cứu, và được sử dụng như mô hình nghiên cứu quá trình phát triển và biệt hóa của tế bào (Entrez Genome Project, NCBI).

B. subtilis là vi khuẩn Gram dương, hình que được tìm thấy tự nhiên trong

đất, cát, thực vật, hệ tiêu hóa người và động vật (Raghavendra et al., 2006). B. subtilis có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 5-15oC đến 40-50oC, nhiệt độ tối ưu để phát triển là 25-35oC (Entrez Genome Project, NCBI). Khi gặp điều kiện môi trường không thuận lợi, khắc nghiệt, thiếu thức ăn, B. subtilis có khả năng hình thành bào tử. Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng hấp thu DNA bên ngoài, cho phép các vi khuẩn thích nghi bằng cách tái tổ hợp. Tuy nhiên, điều này cần nhiều thời gian. Nhờ sự hình thành bào tử, B. subtilis cũng có thể gia tăng sự chống chịu nhanh trước môi trường khắc nghiệt như acid, kiềm, oxy hóa, nhiệt hoặc ethanol bằng cách kích hoạt yếu tố B (sigma factor B) (Bandow, 2002).

2.2.2.1. Tính an toàn của B. subtilis

B. subtilis được xem là sinh vật không gây bệnh và được Cục Quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ (FDA) công nhận là sinh vật an toàn (Generally Regarded As Safe - GRAS, No. 562) (Peter, 2009). B. subtilis có độc tính rất thấp

16

đối với người vì enzyme ngoại bào và các tác nhân gây độc do vi sinh vật này sản xuất ra không đủ liều lượng và hoạt độ gây nguy hại cho người, ngoại trừ các trường hợp đột biến trong tế bào vi khuẩn hay hệ miễn dịch của người quá suy yếu. Các nghiên cứu cho thấy B. subtilis sử dụng ở người với liều uống lên đến 1×1011 CFU/ngày/người vẫn an toàn và không hề có tác dụng phụ (Hong et al., 2008).

2.2.2.2. Cấu trúc gen

Trình tự bộ gen của vi khuẩn B. subtilis đã được Kunst giải mã thành công

và được công bố vào tháng 11 năm 1997 (Kunst et al., 1997).

Bộ gen B. subtilis chỉ có một phân tử DNA nằm trong một nhiễm sắc thể vòng tròn. Kích thước tổng thể của DNA là 4.214.814 cặp bp (4215 kbp) (Hình 2.6). Có 4.100 gen là gen mã hóa protein. 192 gen trong số này được xem là không thể thiếu và 79 gen được xem là cần thiết cho các quá trình sống của B. subtilis (Kunst et al., 1997). Phần lớn các gen trong vi khuẩn này là gen đơn bản. Khoảng 220 yếu tố điều hòa phiên mã đã được xác định trong hệ gen. Cho đến nay, chỉ khoảng 58% số gen đã được biết chức năng. 42% số gen còn lại vẫn đang được nghiên cứu.

Hình 2.6. Mô hình các vị trí nhiễm sắc thể trên bộ gen B. subtilis được khảo sát ở một số quốc gia (Kyoto University Bioinformatics Center, 2006) (http://bacillus.genome.ad.jp/bsorf.html)

17

Hầu hết các gen cần thiết là các gen tham gia vào các hoạt động sống của tế bào, 50% trong số các gen thiết yếu có trách nhiệm xử lý thông tin, 20% trong số chúng có trách nhiệm tổng hợp thành tế bào, phân chia tế bào, cấu thành tế bào và khoảng 10% trong số chúng chịu trách nhiệm về việc tổng hợp năng lượng tế bào. Ngoài ra, còn khoảng 4% gen cần thiết khác chức năng chưa được biết rõ (Kobayashi, 2003). B. subtilis có khả năng tiết ra một số lượng lớn kháng sinh ra ngoài vỏ tế bào (Ara, 2007). Được biết có 5 gen mã hóa peptidase giữ vai trò quan trọng trong việc tiết kháng sinh và nhiều gen của tế bào chịu trách nhiệm trong việc tổng hợp kháng sinh (Kunst et al., 1997).

2.2.2.3. Nhiễm sắc thể

B. subtilis nhân đôi nhiễm sắc thể bắt đầu từ một sợi đơn DNA, bản gốc (oriC). Tiến trình sao chép theo hai hướng: theo chiều kim đồng hồ và ngược chiều kim đồng hồ. Sự sao chép nhiễm sắc thể hoàn tất khi sợi DNA mẫu đến điểm cuối, tại vị trí đối diện với đoạn gốc trên bản đồ nhiễm sắc thể và nó chứa một đoạn ngắn DNA. Protein cụ thể điều hòa tất cả các bước trong sao chép DNA. Mặc dù các thành phần cơ bản thúc đẩy bắt đầu, kéo dài, và chấm dứt sự sao chép được bảo tồn tốt, một số khác biệt quan trọng có thể được tìm thấy (như một số loại vi khuẩn thiếu protein thiết yếu). Những khác biệt này nhấn mạnh sự đa dạng trong các cơ chế và chiến lược mà các loài vi khuẩn khác nhau đã áp dụng để thực hiện việc sao chép bộ gen của chúng (Graumann, 2012).

2.2.2.4. Cấu trúc tế bào và chuyển hóa

B. subtilis là vi khuẩn hình que, Gram dương (Perez, 2000). Thành tế bào được cấu tạo từ các đơn phân murein (còn gọi là peptidoglycan hay glycopeptide). Mỗi đơn phân murein bao gồm: N- acetyl glucozamin (G), N- acetyl muramic (M), alanin, D- glutamic, Di - aninoacid. Mối liên kết giữa các chất trong đơn phân: G và M liên kết với nhau bởi liên kết 1-4 β glucoside. Các acid amin liên kết với nhau và liên kết với M bởi liên kết peptid. Các đơn phân liên kết với nhau để tạo lớp thành vững chắc. Thành tế bào có nhiều lớp murein nên dày, hình thành lớp bảo vệ giữa môi trường và tế bào vi khuẩn, ngoài ra nó còn giữ vai trò duy trì hình dạng của tế bào và giữ áp lực của sức trương nội bào (Schaechter, 2006).

B. subtilis là vi sinh vật mẫu để nghiên cứu sự hình thành nội bào tử của vi khuẩn. Trong điều kiện môi trường không thuận lợi, vi khuẩn B. subtilis hình thành nội bào tử. Tuy nhiên quá trình này cần bắt đầu trước khi chất dinh dưỡng

18

cạn kiệt toàn bộ; nếu không, sự hình thành bào tử không được hoàn tất (Perez, 2000). Sự hình thành bào tử xảy ra trong nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất. Đầu tiên, nhiễm sắc thể tế bào vi khuẩn thực hiện sao chép và chuyển về một phía của tế bào. Sau đó, tế bào hình thành một vách ngăn và bắt đầu phân chia thành hai phần. Phần nhỏ hơn của tế bào được gọi là các tiền bào tử (forespore) và phần lớn hơn được gọi là tế bào mẹ (mother cell) (Perez, 2000). Tế bào mẹ nuôi dưỡng tiền bào tử. Khi hình thành vách ngăn, 30% số nhiễm sắc thể nằm bên trong tế bào mẹ. 70% nhiễm sắc thể còn lại chuyển vào tiền bào tử thông qua một loại protein vận chuyển được gọi là SpoIIIE (Schaechter, 2006). Sau đó, tế bào mẹ nuốt tiền bào tử vào trong theo kiểu thực bào, lúc này tiền bào tử có hai lớp màng peptidoglycan dày, gọi là vỏ bao, một là lớp áo protein của bào tử và một lớp màng bảo vệ bên ngoài. Tại thời điểm này, tiền bào tử bắt đầu có những thay đổi bên trong, và cuối cùng nó tách rời ra khỏi tế bào mẹ (Perez, 2000). Một nội bào tử trưởng thành không có hoạt động trao đổi chất, nó là trơ. Phần lõi của nội bào tử rất khô và có khả năng đề kháng với ẩm độ (Schaechter, 2006).

Hình 2.7. Sơ đồ quá trình hình thành bào tử B. subtilis

B. subtilis sử dụng lông của nó để kết lại thành từng đám. Hiện tượng này thường thấy trên đĩa thạch hơn là trong môi trường dịch lỏng. Vi khuẩn B. subtilis có thể ở dạng đơn hoặc kết thành chuỗi. Các tế bào ở cạnh nhau có khuynh hướng

19

kết lại thành mảng, nhờ vào chất nhày mỏng gọi là surfactin, là một lipopeptide có khả năng làm giảm sức căng bề mặt (Schaechter, 2006).

Trước đây, B. subtilis được xem là hiếu khí bắt buộc, nghĩa là chúng cần được cung cấp oxy để phát triển. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy chúng có thể phát triển trong điều kiện yếm khí. Nó có thể tạo ra ATP thông qua quá trình lên men đường, peptides và một số cơ chất khác trong điều kiện yếm khí. Sản phẩm của quá trình lên men tạo ra butanediol và nitơ thu được từ quá trình khử nitrate (Marino, 2001).

Trong điều kiện yếm khí B. subtilis có thể sử dụng nitrite hoặc nitrate cho việc hô hấp. Tế bào B. subtilis có chứa hai men khử nitrate (nitrate reductases). Một sử dụng cho việc đồng hóa nitơ trong nitrate và một được sử dụng cho việc hô hấp nitrate. Tuy nhiên, chỉ có men khử nitrite (nitrite reductase) là thực hiện nhiệm vụ hô hấp. Men khử nitrate sẽ khử nitrate thành nitrite để sử dụng hô hấp, sau đó dưới tác dụng của nitrite reductase sẽ khử nitrite thành ammonia (NH3) (Marino, 2001).

B. subtilis chứa men catalase KatA và MrgA, một loại enzyme giữ nhiệm vụ xúc tác thủy phân hydrogen peroxide thành nước và oxy, và superoxide dismutase, một loại enzyme xúc tác sự phân hủy của superoxide thành oxy và hydro peroxide (Bandow, 2002).

2.2.2.5. Các dạng tế bào trong quá trình biệt hóa

B. subtilis có khả năng biệt hóa rất lớn biểu hiện ở nhiều dạng tế bào khác nhau. Nghiên cứu chuyên sâu đã cho kết quả chi tiết đặc tính phân tử về sinh lý của một số loại tế bào khác nhau trong các môi trường phân tán.

Ví dụ, vào giai đoạn bắt đầu pha tĩnh, B. subtilis có thể biệt hóa thành các tế bào khả biến (competent cells) - có khả năng thu nhận DNA từ môi trường (Dubnau, 1991; Dubnau and Provvedi, 2000), hay nó có thể biệt hóa thành các bào tử miên trạng (dormant spore) có khả năng chống lại các điều kiện khắc nghiệt bên ngoài (Rudner and Losick, 2001; Piggot and Hilbert, 2004). Ngoài ra, một tập hợp con của các tế bào có thể sản xuất một “tác nhân hủy diệt” ngoại bào (killing factor) và độc tố có chức năng tiêu diệt (hoặc thực bào) các tế bào chưa bắt đầu hình thành bào tử, do đó cho phép các tế bào có thể thực bào lẫn nhau để trì hoãn tham gia vào lộ trình hình thành bào tử (Gonzalez - Pastor, 2003).

20

Một loại tế bào thứ tư được quan sát trong quá trình thành lập màng sinh học (biofilm), khi một phần của quần thể tế bào sản xuất ra chất nền ngoại bào (extracellular matrix) giúp kết dính các tế bào với nhau (Vlamakis, 2008).

Sự biệt hóa cũng đã được quan sát trong các tế bào đang ở pha tăng trưởng. Chỉ một phần nhỏ của các tế bào thể hiện sigD, nhân tố sig cần thiết cho quá trình sản xuất tiên mao, kết quả là không có sự đồng nhất về tính di động (Kearns et al., 2005). Một số loại tế bào này có thể được phân biệt với những tế bào chị em của chúng do quá trình biểu hiện gen bị biến đổi dẫn đến thay đổi hình thái quan sát được dưới kính hiển vi. Một số khác chỉ có thể phân biệt bằng cách đo lường sự biểu hiện gen chuyên biệt cho từng loại tế bào bằng cách sử dụng các phân tử chỉ thị (Hình 2.8).

Hình 2.8. Sự biệt hóa tế bào ở B. subtilis được quan sát trong các tế bào chứa tổ hợp chỉ thị phiên mã cho mỗi loại tế bào. Hình ảnh được phủ 1 lớp nền (màu xám) là do ánh sáng truyền qua với chất chỉ thị huỳnh quang. Màu xanh là các tế bào di động (Motile cells) (Phag-CFP), màu đỏ là các tế bào sản xuất chất nền (Matrix – producing cells) (PyqxM-yfp), màu xanh lá cây là các tế bào thành lập bào tử (sporulating cells) (PsspB-yfp) và các tế bào khả biến (competent cells) có màu vàng (PcomG-yfp). Mỗi loại tế bào thể hiện một kiểu hình đặc trưng để phân biệt nó với các loại còn lại (Lopez et al., 2009).

21

2.2.3. Dinh dƣỡng và tăng trƣởng

2.2.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy

Phần lớn chi Bacillus phát triển tốt trên các môi trường dinh dưỡng thương mại gồm các thành phần cơ bản như: pepton, cao thịt, glucose, lactose, chất khoáng, … mặc dù trong một số trường hợp đặc biệt, các môi trường này cần được điều chỉnh pH hoặc nồng độ muối (pH từ 2-11, và nồng độ muối từ dưới 2- 25%). Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện phát triển tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus khoảng 25 phút.

Trong môi trường nuôi cấy lỏng chúng tạo váng trên bề mặt. Trên môi trường thạch tạo khuẩn lạc to, tròn hay hình dạng bất thường, có màu xám ngả vàng nhạt, bề mặt khuẩn lạc sần sùi, hơi nhăn hoặc tạo màng mịn lan trên bề mặt thạch (Gibson et al., 2000).

Hình dạng khuẩn lạc thay đổi tùy theo thời gian nuôi cấy, và các đĩa nuôi cấy

riêng lẻ có thể tạo ra các dạng khuẩn lạc khác nhau.

Bảng 2.2: Một số đặc điểm của vi khuẩn B. subtilis

Phản ứng sinh hóa

Kết quả Phản ứng sinh hóa Kết quả

Gram Hình thành chuỗi tế bào Di động Chiều dài tế bào >3µm Vị trí và hình dạng bào tử Tế bào mang bào tử trương phồng Phát triển ở 50ºC Phát triển ở nồng độ NaCl 10% Phát triển yếm khí Lên men carbohydrate 1. Glucose 2. Cellobiose 3. Galactose 4. Mannose

5. Melibiose 6. Raffinose 7. Salicin 8. Xylose ONPG Sử dụng citrate Urease Indole VP Khử nitrate Thủy phân casein Thủy phân hippurate Thủy phân tinh bột Oxidase

d + + d + + - - + + + d + -

+ d + - VX - + d - + + d +

(Manual for the identification of medical bacteria, 2004)

: có hoặc không (khác nhau giữa các thứ trong cùng một loài) : bào tử ở trung tâm : bào tử hình oval D V X ONPG : ortho-nitrophenyl glucuronide

22

2.2.3.2. Môi trƣờng tạo bào tử

Hầu hết các loài Bacillus cần một môi trường đặc biệt để có thể tạo bào tử. Sự tạo bào tử được cảm ứng sau pha tăng trưởng hàm mũ do nồng độ dinh dưỡng bị cạn kiệt, đặc biệt là việc thiếu nguồn carbon, nitrogen, hoặc phospho. Có thể sử dụng môi trường nhân tạo như Difico Sporulation Medium (DSM), 2xSG Chemically Defined Sporulation Medium (CDSM) để tạo bào tử (Monteiro et al., 2014).

2.2.4. Các chất do B. subtilis sinh ra 2.2.4.1. Các enzyme Enzyme nội bào

Trong tế bào B. subtilis nói riêng và vi sinh vật nói chung đều có những enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa. Enzyme nội bào là những enzyme được vi sinh vật tổng hợp trong tế bào, nằm trong tế bào và chỉ tham gia vào quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ hay sinh tổng hợp các vật chất trong tế bào của chúng. Các enzyme nội bào của B. subtilis gồm các enzyme thủy phân, protease nội bào, penicillin amidase, catalase, amylase nội bào.

Enzyme ngoại bào

B. subtilis có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình sống để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường như α-amylase, protease, lipase, β-glucanase, xylanase (Oyeleke et al., 2012).

Bảng 2.3: Một số loại enzyme do B. subtilis sinh tổng hợp, đặc tính và phản ứng thủy phân (Oyeleke et al., 2012).

Enzyme

Phản ứng thủy phân

Nhiệt độ tối ưu (oC)

α-amylase

70-80

pH tối ưu 5,6-6,2

Protease

40

6,2-7,4

β-glucanase

35-55

6,0-7,0

Xylanase

25

5,0

Thủy phân liên kết α-1,4-glucoside trong tinh bột và những polysaccharide khác tạo ra các dextrin và oligosaccharide. Thủy phân liên kết peptide, protein và các polypeptide, tạo ra các peptide có phân tử lượng thấp hơn và các amino acid. Thủy phân liên kết β-1,6-glucoside của β-glucan tạo ra những chất có phân tử lượng thấp. Thủy phân liên kết xylan- một thành phần của hemicellulose.

23

2.2.4.2. Các kháng sinh do B. subtilis tổng hợp

B. subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau: subtilin, rhizocticins, subtilosin A, TasA, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, bacillanene, difficidin (Stein, 2005), … với những đặc tính kháng khuẩn và kháng nấm hữu ích. Các chất kháng sinh do vi khuẩn tiết ra thường được gọi với tên chung Bacteriocin. Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được ribosome tổng hợp ở cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương.

Bacteriocin được chia thành 4 nhóm: Nhóm I là nhóm lantibiotic, là các peptide có khối lượng phân tử < 5 KDa. Nhóm II gồm các bacteriocin không phải là lantibiotic, có khối lượng < 10 KDa, nhóm này lại chia ra thành 3 nhóm nhỏ khác. Nhóm III là bacteriocin có khối lượng phân tử > 30 KDa, nhóm IV là các bacteriocin phức tạp, ngoài thành phần chính là protein chúng còn chứa lipid và carbohydrate.

Subtilin

Subtilin là bacteriocin thuộc nhóm I lantibiotic, những kháng sinh thuộc nhóm lantibiotic có tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn gram dương như Propionibacterium acnes, Staphylococci, Streptococci và Clostridia (Klein et al., 1994). Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với màng nguyên sinh chất bằng tương tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự khử hydro các nhóm sulfhydyl (nhóm chứa Hydro và sulfur trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hưởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng lượng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton (Stein, 2005).

Subtilosin là bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria

monocytogenes và Bacillus cereus (Kawulka et al., 2004).

Sublancin không tác động với vi khuẩn gram âm nhưng có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn gram dương kể cả tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử. Sublancin là bacteriocin rất bền, bảo quản ở nhiệt độ thường trong thời gian 2 năm không mất hoạt tính (Stein, 2005).

TasA có phổ kháng khuẩn rộng được tổng hợp và tiết vào môi trường 30 phút sau khi quá trình tạo bào tử được bắt đầu, đồng thời TasA cũng được chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử, sau đó định vị trong lớp petidoglycan vách của lõi bào tử, TasA giúp cho B. subtilis chiếm ưu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm (Stöver and Driks, 1999).

24

Surfactin là một kháng sinh có tính đối kháng mạnh với Mycoplasma và Pseudomonas syringae, virus và kháng lại các tế bào ung thư nhưng ít tác động đối với nấm (Bais et al., 2004). Tác động của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên lớp màng lipid kép đồng thời ức chế hoạt tính của 1 số enzyme (Stein, 2005).

Bacilysocin là một kháng sinh có bản chất phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh với nấm được phát hiện lần đầu tiên trên B. subtilis vào năm 2002 (Tamehiro et al., 2002).

Mycosubtilin là một lipopeptide có tính kháng khuẩn thuộc họ iturin. Mycosubtilin có tính đối kháng mạnh với nấm nhưng có tác động hạn chế với vi khuẩn (Sieber and Marahiel, 2003).

2.2.5. Tính đối kháng của B. subtilis

Với vi sinh vật gây bệnh

Hình thức đối kháng chủ yếu của B. subtilis đối với vi sinh vật gây bệnh là cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng sinh (Yonggang et al., 2013). Tác dụng chủ yếu của kháng sinh đối với vi khuẩn có thể biểu hiện ở 3 hướng chủ yếu sau:

- Làm ngừng tổng hợp màng tế bào hay làm tan màng tế bào vi khuẩn và do đó phá hủy tính chất thẩm thấu của tế bào, các ion Mg++, Na+, Ca++ thoát ra ngoài làm tế bào chết.

- Ảnh hưởng quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Chất kháng sinh có thể phong bế quá trình tổng hợp protein bằng cách ngăn cản ribosome tổng hợp chuỗi polypeptide hay đưa đến tổng hợp protein bất thường.

- Phá hủy sự trao đổi của DNA và RNA của vi khuẩn cạnh tranh bằng cách ức chế men RNA polymerase hay gắn vào các base làm đứt đoạn chuỗi xoắn kép DNA. Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của B. subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Yueju et al., 2014).

Với các vi khuẩn khác

Trong môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, B. subtilis đã tạo ra chất kháng sinh giết chết những tế bào vi khuẩn lân cận nhằm tiêu thụ chất dinh dưỡng giải

25

phóng từ các tế bào này, để duy trì sự sống trước khi tạo bào tử (Gonzalez et al., 2003).

2.2.6. Một số phƣơng pháp nghiên cứu tính đối kháng của B. subtilis và

vi sinh vật gây bệnh

Các phương pháp của Nguyễn Lân Dũng (1984), dựa trên sự khuếch tán của

chất kháng sinh trong môi trường thạch được sử dụng phổ biến, có thể tóm tắt

như sau:

Phương pháp cấy theo đường thẳng góc: Trên môi trường dinh dưỡng

thạch đĩa, cấy 1 đường vi sinh vật đối kháng dọc theo đường kính của đĩa. Đặt

vào tủ ấm ủ ở nhiệt độ thích hợp khoảng 1 ngày đối với vi khuẩn, 4-5 ngày đối với nấm mốc. Sau khi các vi sinh vật đối kháng đã mọc và sinh chất kháng sinh,

dùng que cấy, cấy vi sinh vật kiểm định thành những đường thẳng góc và sát với

đường vi sinh vật đối kháng. Sau 24 giờ ủ trong tủ ấm, quan sát vùng ức chế vi

khuẩn. Hoạt tính kháng sinh được đánh giá sơ bộ bằng cách đo khoảng cách từ

vết cấy vi sinh vật đối kháng đến nơi vi sinh vật kiểm định ban đầu mọc.

Phương pháp thỏi thạch

Sử dụng trong xác định hoạt tính kháng sinh trong trường hợp vi sinh vật

kiểm định và vi sinh vật sinh chất kháng sinh không mọc được trên cùng một môi

trường.

Nuôi vi sinh vật đối kháng trên đĩa thạch dinh dưỡng cho mọc tốt. Sau đó,

dùng ống thép không gỉ (đường kính 10-20 mm) ấn nhẹ lên bề mặt thạch để lấy ra

những thỏi thạch hình trụ. Dùng kẹp vô trùng gắp những thỏi thạch này đặt lên

môi trường đã cấy sẵn vi sinh vật kiểm định. Sau 18-20 giờ nuôi cấy trong tủ ấm và quan sát vòng vô khuẩn xung quanh thỏi thạch. Có thể dùng phương pháp này để xem thời gian nào vi sinh vật sinh chất kháng sinh nhiều nhất.

Phương pháp phủ lớp thạch vi sinh vật kiểm định lên khuẩn lạc vi sinh

vật đối kháng.

Phương pháp này dùng để lựa chọn trong số các chủng nghiên cứu những chủng có hoạt tính cao nhất. Trên môi trường dinh dưỡng thạch đĩa petri, cấy vi

sinh vật đối kháng sao cho các khuẩn lạc mọc cách nhau một khoảng khá xa. Sau khi các khuẩn lạc đã mọc và sinh chất kháng sinh người ta đổ lên trên các khuẩn

26

lạc 1 lớp mỏng môi trường đã trộn vi sinh vật kiểm định. Nồng độ vi khuẩn trong

môi trường thạch thường là 100 triệu CFU/mL, lắc đều, cẩn thận đổ lên trên

khuẩn lạc thành 1 lớp mỏng rồi đặt đĩa vào tủ ấm. Quan sát vòng vô khuẩn.

Phương pháp đục lỗ thạch Dùng ống thép không gỉ (đường kính 10-20 mm) ấn nhẹ lên bề mặt thạch

để lấy ra những thỏi thạch hình trụ bỏ đi để tạo được những lỗ hình trụ trên môi

trường thạch đĩa. Phết vi khuẩn kiểm định lên bề mặt thạch bằng cách dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào môi trường tăng sinh lỏng. Sau đó, dùng pipette hút

dịch chiết ly tâm từ vi sinh vật đối kháng bơm vào các lỗ trên (lượng dịch này khoảng 50 μL/lỗ). Ủ các đĩa này trong tủ ấm và quan sát vòng vô khuẩn sau 1

thời gian thích hợp đối với từng loài vi sinh vật.

Phương pháp này được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu các hợp chất

kháng sinh của B. subtilis vì loại trừ được trường hợp vòng vô khuẩn tạo ra do

cạnh tranh dinh dưỡng giữa 2 loại vi sinh vật.

2.3. Hệ tiêu hóa và vi sinh đƣờng ruột

2.3.1. Hệ tiêu hóa gia cầm và sự khác biệt so với động vật hữu nhũ

Gia cầm có tốc độ trao đổi chất và năng lượng cao hơn so với động vật có vú. Cường độ tiêu hóa mạnh ở gia cầm được xác định bằng tốc độ di chuyển của thức ăn qua ống tiêu hóa. Ở gà còn non, tốc độ này là 30-39 cm trong 1 giờ; ở gà lớn hơn là 32-40 cm và ở gà trưởng thành là 40-42 cm (Sklan, 2001). Chiều dài của ống tiêu hóa gia cầm không lớn, thời gian mà khối thức ăn được giữ lại trong đó không vượt quá 2-4 giờ, ngắn hơn rất nhiều so với động vật khác. Trong quá trình phát triển của phôi, ban đầu hệ tiêu hóa chỉ là một ống thẳng, về sau nó hình thành xoang miệng, thực quản, diều, dạ dày tuyến, dạ dày cơ, ruột (ruột non, ruột già) tận cùng là hậu môn.

27

Hình 2.9. Sơ đồ hệ tiêu hóa gà (http://www.geauga4h.org/poultry/chicken_digestion.htm)

Tiêu hóa ở miệng

Gia cầm lấy thức ăn bằng mỏ. Hình dáng và độ lớn của mỏ ở các loài gia cầm rất khác nhau. Lưỡi gia cầm nằm ở đáy khoang miệng, có hình dạng và kích thước tương ứng với mỏ. Bề mặt phía trên của lưỡi có những gai rất nhỏ hóa sừng hướng về cổ họng, có tác dụng giữ khối thức ăn trong miệng và đẩy chúng về phía thực quản. Khi thức ăn đi trong khoang miệng, nó được thấm ướt nước bọt để dễ nuốt. Các tuyến nước bọt của gia cầm phát triển kém. Viên thức ăn thu nhận được ở cuống lưỡi được đẩy vào lỗ thực quản và sau đó, do những co bóp nhu động của thành thực quản, nó được đẩy vào diều. Ở gia cầm đói, thức ăn được đẩy thẳng vào dạ dày, không qua diều. Trong thành thực quản có các tuyến nhầy hình ống, tiết ra chất nhầy, cũng có tác dụng làm ướt và trơn thức ăn khi nuốt.

Tiêu hóa ở diều

Ở gà, diều là một chỗ phình rộng hơn, hình túi. Mặt ngoài của diều được tiếp xúc trực tiếp với cơ da, nó có thể giãn nở rộng khi thức ăn rơi vào. Các lỗ dẫn vào và dẫn ra của diều rất gần nhau và có các cơ thắt. Giữa các cơ thắt lại có ống diều - là một phần của diều. Khi gia cầm đói, thức ăn theo ống này đi thẳng vào dạ dày, không qua túi diều. Thức ăn ở diều được làm mềm ra, quấy trộn và được tiêu hóa từng phần bởi các men của thức ăn và các vi khuẩn có trong thức ăn.

Tiêu hóa ở dạ dày

Dạ dày gia cầm gồm dạ dày tuyến và dạ dày cơ. Thức ăn từ diều được chuyển vào dạ dày tuyến. Dịch dạ dày được tiết vào trong khoang của dạ dày

28

tuyến, có acid chlorhydric, enzyme và mucin. Cũng như ở động vật có vú, pepsin được tiết ra ở dạng không hoạt động (pepsinogen) và được hoạt hóa bởi acid chlorhydric. Các tế bào hình ống của biểu mô màng nhầy bài tiết ra một chất nhầy đặc rất giàu mucin, chất này phủ lên bề mặt niêm mạc của dạ dày. Sự tiết dịch dạ dày ở gia cầm là liên tục, sau khi ăn thì tốc độ tiết tăng lên.

Dịch dạ dày tinh khiết là một chất lỏng không màu hoặc hơi trắng đục, có pH acid. Độ pH của dịch dạ dày ở gia cầm trung bình là 3,0; thường là 2,6. Độ pH sẽ giảm xuống sau khi tiếp nhận thức ăn giàu chất kiềm.

Ở gà, số lượng dịch dạ dày và độ acid tăng dần lên cùng với độ tuổi. Gà con vài ngày tuổi, dịch dạ dày có tính acid (pH = 4,2-4,4). Ở gà 31-40 ngày, độ acid đạt mức tối đa (pH = 1,15-1,55) và giữ ở mức độ đó với sự dao động không lớn trong các thời kỳ tiếp theo.

Trong dạ dày cơ, ngoài việc nghiền thức ăn cơ học, còn xảy ra quá trình hoạt động của các men. Dưới tác động của acid chlorhydric, các phân tử protein trở nên căng phồng và dễ bị phân giải.

Tiêu hóa ở ruột

Quá trình tiêu hóa các chất dinh dưỡng đều xảy ra ở ruột non gia cầm. Nguồn các men tiêu hóa quan trọng nhất là từ dịch dạ dày, cùng với mật đi vào manh tràng, chất tiết của các tuyến ruột có ý nghĩa kém hơn.

Dịch ruột gà là một chất lỏng đục, có phản ứng kiềm yếu (pH 7,42) với tỉ trọng 1.0076. Trong thành phần dịch ruột có các men proteolytic, aminolytic và lypolytic và cả men enterokinase. Dịch tụy của gia cầm trưởng thành có chứa các men trypsin, carbocipeptidase, amylase, maltase, invertase và lipase. Các men amylase và maltase phân giải các polysaccharide đến các monosaccharide như glucose, lipase được dịch mật hoạt hóa, phân giải lipid thành glycerin và axit béo.

Các quá trình tiêu hóa và hấp thu ở ruột non xảy ra đặc biệt tích cực. Sự phân giải các chất dinh dưỡng không chỉ có trong khoang ruột (tiêu hóa ở khoang), mà cả ở trên bề mặt các lông mao của các tế bào biểu bì (sự tiêu hóa ở màng). Tiêu hóa ở khoang là sự thủy phân thức ăn, còn tiêu hóa ở màng là các giai đoạn tiếp theo, tạo ra các sản phẩm cuối cùng của sự tiêu hóa để hấp thu (Sklan, 2001). Các cấu trúc phân tử và trên phân tử của thức ăn có kích thước lớn được phân giải dưới tác động của các men trong khoang ruột, tạo ra các sản phẩm trung gian nhỏ hơn, chúng đi vào vùng có nhiều nhung mao của các tế bào biểu mô. Tại đây, diễn ra giai đoạn cuối cùng của sự thủy phân để tạo ra sản phẩm

29

cuối cùng như acid amin, monosaccharide chuẩn bị cho việc hấp thu. Quan hệ qua lại của quá trình tiêu hóa ở khoang, ở màng và vai trò của tiêu hóa màng ruột của gia cầm hiện nay còn chưa được nghiên cứu đầy đủ.

Sự tiêu hóa trong manh tràng của gia cầm nhờ có các men đã đi vào cùng với chymus từ phần ruột non và từ hệ vi khuẩn. Các vi sinh vật bắt đầu thâm nhập vào manh tràng gia cầm non ngay từ lần tiếp nhận thức ăn đầu tiên. Ở đây, các vi khuẩn Streptococcus, trực khuẩn ruột, Lactobacicoli, ... sinh sản rất nhanh. Trong manh tràng cũng xảy ra quá trình tiêu hóa protein, glucid và lipid. Ngoài ra, các vi khuẩn còn tổng hợp các vitamin nhóm B.

Khả năng tiêu hóa chất xơ của gia cầm rất hạn chế. Cũng như ở động vật có vú, các tuyến tiêu hóa của gia cầm không tiết ra một men đặc hiệu nào để tiêu hóa xơ. Một lượng nhỏ chất xơ được phân giải trong manh tràng bằng các men do vi khuẩn tiết ra. Những gia cầm nào có manh tràng phát triển hơn như đà điểu, ngan, ngỗng, ... thì các chất xơ được tiêu hóa nhiều hơn. Ở các loại gia cầm khác nhau thì chỉ có trung bình từ 10-30% chất xơ được phân giải (Gauthier, 2002).

2.3.2. Vi sinh vật đƣờng ruột và tác động của chúng đến vật nuôi

Mối quan hệ giữa vi khuẩn và vật nuôi đã được công nhận là yếu tố quyết định đến sức khỏe của vật nuôi. Vi khuẩn trong hệ đường ruột của động vật đóng vai trò quan trọng đối với khả năng tiêu hóa của vật nuôi. Vì vậy, hệ vi sinh đường ruột sẽ ảnh hưởng đến vật nuôi về mặt dinh dưỡng, sự đáp ứng miễn dịch và khả năng đề kháng bệnh của vật nuôi (Arturo, 2006; Soccol et al., 2010).

Bên cạnh sự hấp thu các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai trò quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể, là hệ thống bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm (Jans, 2005). Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Khu hệ vi sinh vật đường ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân gây bệnh (Jans, 2005).

Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hóa của vật nuôi ở trạng thái vô trùng, nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và sinh sống trong đường tiêu hóa (WHO, 2001). Theo thời gian do tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên. Số lượng tế bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp 10 lần số lượng tế bào cấu

30

tạo nên cơ thể chúng (Chaucheyras et al., 1996). Số lượng loài có thể lên tới từ 400-500 (Tannock, 1999). Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của đường tiêu hóa (dạ dày, tá tràng, ruột non và ruột già) ở động vật dạ dày đơn rất khác nhau (khoảng 101 - 103; 101 - 104; 105 - 108; và 109 - 1012 CFU/mL chất chứa tương ứng) (Jans, 2005).

Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: trạng thái sinh lý của vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật. Các yếu tố này chịu tác động của môi trường, stress và tác động qua lại lẫn nhau. Trong số các nhân tố trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất lợi của một trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật (Conway, 1996). Sự cộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hóa của vật nuôi (chủ yếu là trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật được xác lập chỉ một thời gian rất ngắn sau khi sinh (Jans, 2005).

Jans (2005) đánh giá trạng thái cân bằng của các vi sinh vật ruột dựa vào sự hiện diện của 3 nhóm là: (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài vi khuẩn kỵ khí (Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides, Eubacteria); (2) nhóm vệ tinh gồm chủ yếu là Enterococcus và E. coli, và (3) nhóm còn lại (Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas, …

2.4. Một số vi khuẩn gây bệnh đƣờng tiêu hóa thƣờng gặp trên gà

2.4.1. Salmonella

Chi Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, có thể chia thành 5 loài phụ dựa vào đặc tính sinh hóa: Sal.enterica subsp enterica; Sal.enterica subsp. Tuy nhiên, dựa vào sự giống nhau của hệ gen, người ta cho rằng thật sự chúng chỉ có 2 loài là Sal. enterica và Sal. bongori (Grimont and Bouvet, 2000). Sal. enterica bao gồm hơn 2.400 serotypes. Các serotypes được cho là có liên quan đến phó thương hàn gia cầm là serotype Sal. enterica Enteritidis và serotype S. enterica Typhimurium. Những tên truyền thống để gọi các serotype theo cách viết như Salmonella enteritidis hoặc Salmonella typhimurium vẫn còn sử dụng phổ biến do ngắn gọn, tiện lợi trong sự phân loại và chẩn đoán bệnh.

Gần đây, bệnh phó thương hàn gia cầm được quan tâm vì có thể làm bùng phát dịch bệnh ở con người khi sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật, thịt, trứng bị nhiễm khuẩn. Một số quốc gia công bố tình trạng người bị bệnh do nhiễm khuẩn Salmonella từ thực phẩm rất cao như ở Scotland gần 84% (1980-

31

1989), Italy khoảng 81% (1991-1994). Trong thời gian từ 1985-1995, tình trạng nhiễm khuẩn ở người, đặc biệt là S. enteritidis và S. typhimurium DT104 gia tăng nhanh tại nhiều quốc gia. Theo số liệu của trung tâm kiểm soát dịch bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) hàng năm có khoảng 1,34 triệu người nhiễm bệnh, 16.430 người nhập viện và 582 người chết do nhiễm Salmonella (Mead et al., 1999). Những sản phẩm gia cầm như thịt, trứng được xác định là nguyên nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn Salmonella ở người.

Hình thái

Vi khuẩn gram âm, có dạng hình que thẳng, không sinh bào tử, kích thước khoảng 0,7-1,5 x 2-5 µm. Vi khuẩn có thể nhuộm trực tiếp với methylene blue hoặc carbolfuchsin. Vi khuẩn thường có lông rải rác xung quanh và di động, mặc dù vậy đôi khi cũng gặp những chủng đột biến không di động.

Khuẩn lạc S. enteritidis và S. typhimurium trên thạch thường tròn, nhăn bóng

láng, có đường kính khoảng 2-4 mm.

S. typhimurium là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc, có thể phát triển tốt ở môi trường có hoặc thiếu oxy. Nhiệt độ phát triển thích hợp là 37oC, có thể chịu được trong phạm vi biến động là 5-45oC. pH tối ưu là 7 và chịu được trong biến động ở pH từ 4-9, tuy nhiên, ở điều kiện pH cao một số đặc trưng của vi khuẩn như lông có thể không hiện diện.

Những nhu cầu dinh dưỡng của S. typhimurium thì tương đối đơn giản chỉ cần cung cấp nguồn nitơ và carbon cho nhu cầu nuôi cấy phân lập như môi trường thạch peptone hoặc thạch dinh dưỡng NA (nutrient agar).

Yếu tố độc lực

* Độc tố

Salmonella có 3 độc tố, trong đó nội độc tố có bản chất là lipopolysaccharide (LPS), một thành phần cấu tạo của vách tế bào vi khuẩn Gram âm. Khi vi trùng xâm nhập vào cơ thể, nội độc tố phóng thích đi vào máu động vật gây sốt, gây bệnh tích ở gan và lách và kết hợp với vách tế bào vi khuẩn đề kháng lại sự tấn công và phá hủy của tế bào thực bào của ký chủ. Hai loại độc tố khác có bản chất là protein của Salmonella cũng đã được xác định, làm tăng tiết dịch ruột và hư hại tế bào thượng bì ống ruột.

32

* Sự kết bám, tính xâm nhập và sự tồn tại trong tế bào

Sự kết bám của S. typhimurium đến tế bào biểu mô ruột là bước quan trọng đầu tiên trong tiến trình phát sinh bệnh. Cả lông roi và lông tơ của Salmonella đều có vai trò trong việc kết bám này. Những chủng đột biến của S. enteritidis bị thiếu các phần này sẽ giảm khả năng kết bám của Salmonella dẫn tới khả năng gây bệnh cũng bị giảm. Tuy nhiên, sự thiếu lông roi hay lông tơ không phải là tác nhân chủ yếu làm giảm sự cố định vi khuẩn ở ruột gia cầm, mà lipopolysaccharide cũng có vai trò nhất định. Sau khi bám, Salmonella sẽ xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột và sự xâm nhập càng tăng mạnh khi được cung cấp nhiều thức ăn và oxy.

Salmonella xâm nhập tế bào biểu mô ruột sinh sản và phát triển, ban đầu chúng bị phá hủy bởi các đại thực bào hoặc những chất kháng khuẩn của cơ thể. Sau đó, những biến chủng xuất hiện, chúng có thể phát triển ngay bên trong những thực bào và tiêu hủy chính những đại thực bào này.

Sự phân bố các serotype

Trong khoảng 2.400 serotype Salmonella được xác định, chỉ khoảng 10% được phân lập từ gia cầm. Sự thay đổi của các serotype thường theo vùng địa lý và theo thời gian. Tuy nhiên, cũng có những serotype hiện diện lâu dài ở những vùng có sự nhiễm bệnh cao.

Tại Hoa Kỳ serotypes các chủng nhiễm phổ biến ở gà là Sal. Heidelberg, Sal. Kentucky, Sal. Senftenberg, Sal. Enteritidis, Sal. Thompson và ở gà tây là Sal. Senftenberg, Sal. Heidelberg, Sal. Hadar, Sal. Muenster, Sal. Typhimurium. Trong đó, phổ biến là Sal. Typhimurium và Sal. Enteritidis.

Tại Canada thì Sal. Hadar và Sal. Heidelberg phổ biến ở gà thịt; Sal.

Heidelberg và Sal. Typhimurium phổ biến ở trứng ấp.

Ở Bỉ, Sal. Enteritidis, Sal. Hadar, Sal. Virchow ở thịt gà và Sal. Newport thịt

gà tây.

Ở Malaysia thì Sal. Enteritidis, Sal. Muenchen, Sal. Kentucky, và Sal.

Blockley phổ biến ở gia cầm nuôi.

Ở Thụy điển, Sal. Livingstone và Sal. Typhimurium.

Ở Nhật là Sal. Blockley và Sal. Hadar.

33

Gần đây thì sự truyền lây của Sal. Enteritidis rất được quan tâm vì sự lây

nhiễm cho con người qua trứng.

Ở Việt Nam, chưa có các số liệu chính thức về các serotype đang lưu hành.

Ký chủ tự nhiên và thực nghiệm

Gà con và gà giò dễ mắc bệnh và tỉ lệ chết cao hơn gà lớn, ví dụ chủng

S. arizonae có thể gây chết 50% gà tây ở tháng tuổi đầu tiên. Trong khi đó, gà lớn nhiễm khuẩn có thể không thể hiện triệu chứng và bệnh tích. Khi nhiễm bệnh tỉ lệ chết cao nhất lúc gà 3-7 ngày tuổi. Các nghiên cứu về bệnh phó thương hàn cho thấy gia cầm mới nở có khả năng nhiễm khuẩn rất cao và sẽ giảm dần theo thời gian. Thí nghiệm cho thấy ở liều 109 vi khuẩn Sal. Typhimurium gây chết 50% gà 1 ngày tuổi, 20% gà 3 ngày tuổi, và không gây chết gà 7 ngày tuổi. Trong một nghiên cứu khác số gà chết liên quan đến gây nhiễm Sal. Typhimurium giảm mạnh từ 79% ở gà 1 ngày tuổi còn 3% lúc 2 ngày tuổi.

Gây nhiễm cho gà 1 ngày tuổi, Sal. Enteritidis có thể tồn tại trong ruột và bài

thải qua phân ở 50% đàn gà đến 24 tuần tuổi và vài con có thể đến 64 tuần tuổi.

Gà trưởng thành được cho là không mắc bệnh và chết do phó thương hàn. Tuy nhiên, Humphrey et al. (1991) làm thí nghiệm cho thấy có 6/10 gà 1 năm tuổi bị chết khi cho uống thực khuẩn thể type 4 S. enteritidis. Cho thấy gà lớn cũng có thể bệnh do vài chủng có độc lực cao.

Sự lây truyền của Salmonella trong sức khỏe cộng đồng được quan tâm vì trứng từ những gà mang trùng có thể gây bệnh cho người. Trong tự nhiên, trứng nhiễm S. enteritidis với một số lượng nhỏ nhưng vi khuẩn tăng sinh nhanh chóng nếu được giữ ở nhiệt độ phù hợp với sự tăng trưởng của vi khuẩn. Khi gà mái nhiễm khuẩn, vi khuẩn có thể được tìm thấy trong lòng đỏ và albumin mặc dù chỉ có vài tế bào vi khuẩn trong 1 mL dung dịch trứng.

Bệnh lý học

Hai đặc tính của nhiễm S. typhimurium ở gia cầm trưởng thành là sự hình thành khuẩn lạc ở ruột non và sau đó có thể xâm nhập vào các nội quan. Trong thời gian khoảng 2 tuần đầu sau khi gây nhiễm bằng đường uống ở gà và gà tây có thể phân lập được Salmonella từ ống ruột và phân với tỉ lệ cao. Mặc dù khuẩn lạc vi khuẩn từ ruột và mầm bệnh phóng thích từ phân nhanh chóng giảm tác động nhưng vài chủng S. enteritidis có thể tồn tại trong ống tiêu hóa gà đẻ vài tháng sau khi gây nhiễm qua đường uống.

34

Sau khi gây nhiễm qua đường uống ở gà mái đẻ có thể phân lập được

S. enteritidis từ các mô nội quan bao gồm gan, lách, buồng trứng, vòi trứng, máu, tim, phúc mạc, khí quản, âm đạo. Ở gà trống còn phân lập được Salmonella ở tinh dịch.

Triệu chứng

Bệnh phó thương hàn thường liên quan đến những gia cầm non. Sự nhiễm khuẩn Salmonella ở trứng có thể gây chết phôi hoặc chết gia cầm ngay khi nở ra trước khi xuất hiện triệu chứng. Triệu chứng bệnh hiếm khi quan sát được ở gà dưới 2 tuần tuổi mặc dầu giai đoạn này số chết rất cao, gia cầm chỉ thể hiện tăng trưởng chậm.

Dấu hiệu của bệnh phó thương hàn ở gia cầm non tương tự như bệnh Pullorum, thương hàn và bệnh do các vi khuẩn khác gây nhiễm trùng huyết cấp tính.

Một vài chủng S. enteritidis có thể gây ra các triệu chứng quan sát được như

biếng ăn, tiêu chảy, giảm trứng khi gây bệnh thực nghiệm ở gà đẻ.

Những triệu chứng của bệnh phó thương hàn ở gà con bao gồm, ủ rũ, mắt nhắm, cánh xệ, lông xù, gà biếng ăn, gầy còm, run rẩy, thường tập trung gần nguồn nhiệt. Gà tiêu chảy phổ biến, sự mù và đi cà nhắc đôi khi xuất hiện trong đàn bệnh.

Bệnh tích

* Bệnh tích đại thể

Nhiễm trùng máu có thể làm gia cầm chết nhanh mà không thể hiện bệnh tích. Khi bệnh phát triển lâu dài, bệnh tích phổ biến là ruột bị viêm nặng với những vết hoại tử trên niêm mạc ruột non. Manh tràng có chất phó mát. Lách và gan sưng và sung huyết, có những vệt xuất huyết hoặc nốt hoại tử. Thận đôi khi nở lớn và sung huyết. Nhiều trường hợp viêm quanh gan và viêm màng ngoài tim có tơ huyết. Tiến trình viêm nhẹ với sự thẩm thấu của bạch cầu dị ái sắc phân bố từ cục bộ đến khuếch tán xảy ra trong buồng trứng, vòi tử cung ở những đàn nhiễm tự nhiên với S. enteritidis. Sự không hấp thu làm đông tụ lòng đỏ trứng trong túi noãn hoàng.

Những thương tổn khác thỉnh thoảng xảy ra bao gồm viêm mắt, viêm khớp

có mủ, viêm túi khí, viêm manh tràng tiết dịch, viêm rốn.

35

Bệnh tích vi thể

Sau khi xâm nhập cơ thể gia cầm qua đường tiêu hóa, vi khuẩn Salmonella kết dính vào các tế bào biểu mô và các đỉnh lông nhung gây xáo trộn sự tiết dịch và chất điện phân ở ruột. Tiến trình này có thể gây ra sự chết tế bào và gây ra chứng tiêu chảy.

Ở gà mái đẻ có thể gây ra hiện tượng viêm biểu mô của ruột kết và manh tràng. Lúc này Salmonella có thể bị loại bỏ do tác động của đại thực bào và khả năng vi khuẩn sống sót nhân lên trong nội quan như gan, lách thì phụ thuộc vào độc lực của Salmonella trong các ký chủ khác nhau.

2.4.2. E. coli

Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae, E. coli có thể tăng trưởng trong môi trường hiếu khí và yếm khí, sử dụng nguồn nitrogen và carbon đơn giản. vi khuẩn E. coli có liên hệ gần với vi khuẩn Shigella và Salmonella.

Hình thái

E. coli là vi khuẩn hình que gram âm, không sinh bào tử, kích thước có thể thay đổi từ 2-6 x 6 µm. Hầu hết các chủng di động (khoảng 57%) và có vành lông rung.

Trên môi trường thạch ủ trong 24 giờ ở 37oC, khuẩn lạc thấp, lồi, mịn và không có màu sắc. Khuẩn lạc màu hồng sáng và có viền khi cấy vào môi trường thạch MacConkey. Khuẩn lạc có ánh kim loại xanh lục thẩm khi cấy trên môi trường thạch EMB (eosin–methylen blue agar) và màu vàng trên môi trường thạch tergitol-7. Khuẩn lạc thường có đường kính 1-3 mm có cấu trúc hạt và bờ rìa đồng nhất. Những khuẩn lạc nhám (rough) thì lớn với bờ không đều. Sự gây dung huyết của E. coli gây bệnh trên loài hữu nhũ thì không đặc trưng cho E. coli phân lập ở gia cầm.

Đặc tính sinh hóa

Sinh hơi và acid trong quá trình lên men glucose, maltose, mannitol, xylose, glycerol, rhamnose, sorbitol và arabinose nhưng không diễn ra trong sự lên men dextrin, starch hoặc inositol.

Môi trường MacConkey-Sorbitol hữu ích cho phân biệt E. coli O157:H7 từ

các loài E. coli khác vì nó không lên men sorbitol.

Hầu hết các chủng E. coli đều lên men lactose khác với Salmonella, nhưng

36

có một số chủng E. coli không lên men lactose đôi khi cũng xuất hiện. Một số chủng lên men adonitol, sucrose, salicin, raffinose, dulcitol thì hay biến đổi.

E. coli sản sinh indol, phản ứng dương tính methyl red và hoàn nguyên nitrat thành nitrit. Phản ứng Voges Proskauer và oxidase âm tính. Không sinh hydrogen sulfide trong môi trường Kligler’s iron. E. coli không phát triển trong môi trường có sự hiện diện của potassium cyanide, không thủy phân urea (urease âm tính), hóa lỏng gelatin hoặc phát triển trên môi trường citrate.

Có thể dùng các xét nghiệm sinh hóa phân biệt E. coli từ các loài Escherichia khác và vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. E. coli phân lập từ gia cầm có đặc tính sinh hóa tương tự E. coli phân lập từ các nguồn khác.

Sức đề kháng

E. coli bị bất hoạt một phần ở nhiệt độ 60-70oC, trong 3 đến 2 phút. E. coli sống sót ở nhiệt độ lạnh và đóng băng, ở 4oC vi khuẩn có thể sống đến 22 tuần. Sự bất hoạt của vi khuẩn chậm hơn trong môi trường ẩm ướt và có khí ammoniac.

Sự sinh sôi của hầu hết các chủng E. coli bị ức chế ở pH < 4,5 và pH > 9 nhưng không chết. Acid hữu cơ hiệu quả hơn acid vô cơ trong việc ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn. Tương tự, muối 8,5% có khả năng ngăn ngừa sự tăng trưởng nhưng không bất hoạt vi khuẩn. Các chất sát trùng có chlorine dioxide diệt E. coli rất tốt.

Cấu trúc kháng nguyên

Nhiều serotype của E. coli đã được phân loại theo sơ đồ Ewing. Hiện có khoảng 180 kháng nguyên O, 60 kháng nguyên H, 80 kháng nguyên K và 17 kháng nguyên F đã được xác nhận.

* Kháng nguyên O (thân):

Kháng nguyên thân là nội độc tố giải phóng từ vách tế bào vi khuẩn gram âm. Nó là kết hợp của một polysaccharide với phospholipide và một phần protein chịu nhiệt.

* Kháng nguyên K (vỏ):

Kháng nguyên K là những acid trùng hợp (polymeric) chứa 2% đường, kháng nguyên K liên hệ với độc lực và nằm trên bề mặt của tế bào, gây ngăn cản ngưng kết kháng nguyên O.

Kháng nguyên K rất bền, chỉ bị mất đi ở 100oC trong 1 giờ nhưng vài chủng

37

chịu đến 2,5 giờ ở 121oC. Trên cơ sở chịu nhiệt, kháng nguyên K phân chia thành những loại phụ là L, A và B. Hầu hết kháng nguyên này có thể được xác định bởi phản ứng ngưng kết trên phiến kính với huyết thanh pha loãng phù hợp.

* Kháng nguyên H (lông roi):

Để khảo sát được kháng nguyên H, E. coli phải được cấy dưới điều kiện làm tăng khả năng di động của vi khuẩn. Kháng nguyên H thường không dùng trong việc xác định kháng nguyên của E. coli được phân lập vì không liên quan đến bệnh học. Chúng là protein và bị phá hủy ở nhiệt độ 100oC. Ngưng kết trong ống nghiệm đọc được kết quả sau khi ủ 50oC trong 2 giờ.

* Kháng nguyên F (lông nhung)

Kháng nguyên F là yếu tố bám dính của vi khuẩn E. coli vào tế bào niêm mạc ruột. Số lượng kháng nguyên F thay đổi phụ thuộc vào cả môi trường in vitro và in vivo mà chúng tăng trưởng. Pili/Fimbriae được phân loại bằng sự mẫn cảm hoặc kháng mannose, phụ thuộc vào sự ngưng kết có bị ức chế hoặc không khi có sự hiện diện của mannose.

Yếu tố độc lực

Một số yếu tố độc lực đã phân lập ở gia cầm bệnh E. coli nhưng vai trò

chính của nó thì chưa được biết nhiều như ở loài hữu nhũ.

Khả năng làm chết phôi gà có thể dùng để phân biệt E. coli gây bệnh trên gà (Avian Pathogenic E. coli = APEC) với các chủng E. coli cộng sinh. Mặc dù đa số các nhiễm trùng E. coli ở gia cầm xảy ra ở ngoài đường ruột, nhưng một số chủng APEC có đặc tính liên quan tới type E. coli gây bệnh đường ruột như EPEC (Enteropathogenic E. coli), ETEC (Enterotoxigenic E. coli), EIEC (Enteroinvasive E. coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli). Các chủng APEC độc lực có thể tồn tại lâu dài trong ruột non và có thể liên quan đến sản xuất colicin. Các thử nghiệm cho thấy 48% các serotype E. coli là nguyên nhân gây viêm màng ngoài tim và gây chết ở gà 3 tuần tuổi.

Độc tố

E. coli gây bệnh ở gia cầm thì ít độc hơn E. coli gây bệnh ở loài hữu nhũ. Sự khác nhau có thể do E. coli ở gia cầm sản sinh ít độc tố hơn hoặc do không có các xét nghiệm xác định chủng gây bệnh như E. coli ở loài hữu nhũ. Bên cạnh một số độc tố thông thường, APEC sản sinh một số độc tố có vai trò quan trọng như độc

38

tố gây chết tế bào (Cytolethal toxin), độc tố hoại tử tế bào (Cytonecrotizing toxin) và nhiều haemolysin.

Yếu tố bám

Một yếu tố độc tính khác của E. coli là tính bám dính. Tính bám dính có thể do lông nhung hoặc cũng có khi không do lông nhung. Vai trò của yếu tố lông nhung trong nguyên nhân gây bệnh nhiễm khuẩn E. coli ở gia cầm thì không rõ ràng. Lông nhung có thể biến đổi phụ thuộc vào mô và tổ chức mà E. coli định cư phát triển (F1 ở khí quản và P ở đường hô hấp dưới). Vi khuẩn bị diệt nhanh chóng bởi tế bào thực bào khi lông nhung kiểu F1 phát triển nhiều.

Một yếu tố bám dính quan trọng không lông nhung là intimin được sản sinh bởi “gen eae” hiện diện ở EHEC và EPEC. Intimin giúp vi khuẩn dán chặt vào mặt trong ruột gây những bệnh tích đặc trưng trên bề mặt ống tiêu hóa. Ngoài ra, APEC còn có một số yếu tố bám dính khác.

2.4.3. Clostridium perfringens

C. perfringens là trực khuẩn gram dương, nuôi cấy dễ dàng trên thạch máu yếm khí ở 37oC qua đêm. Khuẩn lạc C. perfringens trên thạch máu được bao quanh ở trong bởi một vùng tan huyết hoàn toàn và ở ngoài là vùng nhạt màu tan huyết không hoàn toàn.

Hầu hết vi khuẩn đều lên men glucose, maltose, lactose, sucrose; không lên men mannitol và lên men thay đổi salicin. Những sản phẩm của quá trình lên men là acid acetic và acid butyric. Thủy phân gelatin, casein sữa và không sản sinh indol. Trên môi trường thạch lòng đỏ trứng sinh lecithinase và không sinh lipase.

Các chủng C. perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gia cầm thuộc type A hoặc C. Độc tố alpha - toxin do C. perfringens type A và C sản sinh, độc tố beta - toxin do C. perfringens type C sản sinh gây hoại tử niêm mạc ruột, bệnh tích đặc trưng của bệnh viêm ruột hoại tử.

Bệnh lý học

C. perfringens có thể tìm thấy trong phân, đất, bụi, thức ăn nhiễm trùng và chất độn chuồng hoặc chất chứa trong ruột. Vi khuẩn yếm khí C. perfringens cũng có thể phân lập được trong đường ruột gà khỏe mạnh nhưng số lượng thấp.

Việc xây dựng khẩu phần ăn ảnh hưởng C. perfringens trong ống tiêu hóa và số lượng C. perfringens gia tăng trong ruột sẽ là nguyên nhân gây bệnh trong tự nhiên. Mức độ cao của bột cá hoặc mức độ cao của lúa gạo trong khẩu phần có

39

thể là nguyên nhân xảy ra bệnh hoặc làm bệnh trầm trọng hơn. Với gà được nuôi khẩu phần nhiều lúa, bệnh tích sẽ giảm khi thêm vào khẩu phần chất xơ và hỗn hợp carbohydrate.

Bệnh tác động từ 1,3-37,3% ở gà thịt và đến 62% ở gà con. Viêm ruột hoại tử có thể tái nhiễm ở những đàn gà nuôi trên nền chuồng đã có bệnh trước đó vì vi khuẩn tồn tại trong môi trường phân, chất độn chuồng, thức ăn nước uống trong thời gian lâu dài. Bệnh dễ xảy ra khi cho gà nhiễm cùng lúc C. perfringens và noãn nang của cầu trùng Eimeria spp..

Triệu chứng và bệnh tích

Gà ủ rũ, giảm ăn, ít đi lại, tiêu chảy và lông xơ xác. Dấu hiệu lâm sàng thể

hiện ngắn, gà thường chết nhanh ở thể cấp tính.

Bệnh tích đại thể quan sát được chủ yếu tại ruột non đoạn không tràng và hồi tràng, ruột thường bở. Gây bệnh thực nghiệm với C. perfringens, sau 3 giờ có thể quan sát bệnh tích đặc trưng là niêm mạc tá tràng và không tràng dầy lên có màu xám. Sau 5 giờ niêm mạc ruột hoại tử và tiến trình phát triển hình thành lớp màng trắng trên niêm mạc.

Trong bệnh tự nhiên, bệnh tích vi thể thay đổi chủ yếu là hoại tử trầm trọng niêm mạc ruột với nhiều chất trộn lẫn của fibrin và chất phân rã của tế bào hoại tử. Những bệnh tích ban đầu phát triển tại các đỉnh của lông nhung và đặc trưng bởi sự bong tróc biểu mô và hoại tử đông đặc. Những vùng hoại tử được bao quanh bởi các bạch cầu dị ái sắc. Bệnh tích tiến triển từ lông nhung đến biểu mô tuyến ruột.

Hoại tử có thể mở rộng vào phần cơ dưới niêm mạc ruột. Một số lượng lớn

vi khuẩn hình que được thấy trong các tế bào phân rã.

Bệnh tích vi thể khi gây bệnh bằng C. perfringens có thể quan sát được

gồm: - Một giờ sau khi gây nhiễm: Có sự phù và giãn nở mạch máu trong tế bào màng nhày, sự bong tróc của tế bào biểu mô trong khoang ruột và đôi khi có bạch cầu dị sắc và tế bào đơn nhân trong màng nhày.

- Lúc 3 giờ, sự phù thể hiện rõ, đó là kết quả của sự tách riêng ra của tế bào biểu bì nền từ màng nhày, phần lớn xuất hiện ở đỉnh lông nhung. Sự thẩm thấu của tế bào đơn nhân của màng nhày thì rõ hơn giai đoạn đầu.

40

- Lúc 5 giờ, có hoại tử đông đặc rõ ràng của tế bào biểu mô nền và màng nhày tại đầu lông nhung, làm cho lông nhung bị ngắn lại. Tác động của vi khuẩn thể hiện nổi bật trên sự hoại tử mô và đỉnh của tế bào màng nhày. Mạch máu rất hay bị nghẽn bởi những cục máu đông.

- Lúc 8-12 giờ, có mảng hoại tử lông nhung, trong vài trường hợp lan tới biểu mô tuyến ruột đặc trưng những vùng vật chất vô định hình qua nhuộm. Chất fibrin và tế bào phân rã hiện diện trong xoang ruột. Sự thay đổi nổi bật nhất của màng tế bào xoang ruột là sự mất khoang và mất sự hoàn chỉnh của lông nhung.

Nói chung, bệnh tích chủ yếu của viêm ruột hoại tử do C. perfringes là hoại tử màng nhày ruột và xa hơn nữa là sự thủy phân màng tế bào biểu bì bởi độc tố vi khuẩn.

Chẩn đoán

Chẩn đoán dựa vào bệnh tích đại thể, vi thể và phân lập vi khuẩn gây bệnh. C. perfringens có thể phân lập dễ dàng từ chất chứa trong ruột, chất nạo ra từ thành ruột hoặc những hạt lympho xuất huyết bằng việc nuôi cấy yếm khí qua đêm ở 37oC trên môi trường thạch máu. Định danh C. perfringens dựa vào đặc tính sinh hóa.

Những bệnh cần phân biệt với viêm ruột hoại tử là viêm loét ruột

(ulcerative enteritis - UE) và nhiễm cầu trùng Eimeria brunetti.

- Viêm loét ruột là do vi khuẩn C. colinum, bệnh tích đại thể điển hình là nhiều vùng hoại tử và loét trong ruột non và manh tràng và các vùng hoại tử ở gan. Trong khi đó, bệnh tích của viêm ruột hoại tử thường được xác định ở không tràng và hồi tràng với ít hoặc không có dấu hiệu liên quan đến manh tràng và gan. Sự khác biệt này cho phép phân biệt viêm ruột hoại tử và viêm loét ruột. Nuôi cấy và định danh vi khuẩn được dùng trong chẩn đoán bệnh.

- Nhiễm cầu trùng E. brunetti có bệnh tích tương tự C. perfringens, tuy nhiên, kiểm tra vi thể phết kính phân gà hoặc đoạn ruột phải xác định có sự hiện diện hay không của cầu trùng. Chú ý, viêm ruột hoại tử và cầu trùng thường xảy ra cùng lúc trong đàn gà và thể hiện triệu chứng bệnh của 1 hoặc 2 cùng lúc khi bị nhiễm.

41

2.5. Một số nghiên cứu về probiotic trên thế giới và tại Việt Nam

2.5.1. Trên thế giới

Việc sử dụng thức ăn có bổ sung probiotic đã được biết đến từ lâu, nhưng việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotic mới thực sự phát

triển từ những năm 80 của thế kỷ 20 (Patterson et al., 2003). Những nghiên cứu

phân loại và đặc điểm của quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật

được tiến hành bởi Vahjen et al. (1998). Apajalahti et al. (1998); Van der Wielen et al. (2000) đã cho thấy nếu như Bacteroides và Bifidobacterium chiếm ưu thế trong ruột non của người thì Ruminococcus và Streptococcus chiếm ưu thế trong

ruột non của gà. Bằng kỹ thuật phân tử, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20-50% số loài vi sinh vật đường ruột ở động vật được phân lập, nuôi cấy

như nguồn probiotic (Patterson et al., 2003). Apajalahti et al. (1998); Netherwood

et al. (1999); Gong et al. (2002); Zhu et al. (2002) đã sử dụng kỹ thuật phân tử để

nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật

đường ruột dưới tác động của probiotic. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố

nào góp phần tạo nên 1 hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của

hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ (Patterson et al.,

2003). Đã có rất nhiều nghiên cứu về vai trò của probiotic đối với đời sống động

vật như tác động của probiotic đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc ruột

(Sharma and Schat, 1991); tác động của probiotic đối với sự thay đổi của niêm

mạc ruột non ở vật nuôi (Dai et al., 2000).

Những ảnh hưởng có lợi của probiotic thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau

nhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotic còn rất hạn

chế. Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotic trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự kiềm hãm vi khuẩn gây bệnh của probiotic được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao

đổi (các acid béo bay hơi, các chất giống kháng sinh, …), cạnh tranh vị trí bám

dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột (Knight et al., 2009).

Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nhờ những tiến bộ kỹ thuật trong lĩnh vực

sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật giải trình tự gen trong nghiên cứu phân loại các chủng vi sinh vật, công nghệ sản xuất các sản phẩm probiotic phục vụ chăn

42

nuôi ngày càng trở nên dễ dàng và phổ biến hơn ở nhiều nước trên thế giới. Tuy

nhiên, các kết quả nghiên cứu về sử dụng các sản phẩm probiotic trong chăn nuôi

rất khác nhau, đôi khi trái ngược nhau. Nhiều nghiên cứu bổ sung chế phẩm probiotic trên heo và gà cho thấy có đáp ứng tích cực như tăng cường khả năng

miễn dịch ở heo con; tăng tỉ lệ tiêu hóa các chất dinh dưỡng; tăng hiệu quả sử

dụng thức ăn, … (Henrich et al., 2006). Rất nhiều công trình nghiên cứu khác

cũng cho thấy những đáp ứng rất tích cực của gia cầm đối với việc bổ sung probiotic trong thức ăn (Stappenbeck et al., 2002). Bên cạnh đó cũng có nhiều

nghiên cứu cho thấy hiệu quả không rõ rệt của việc bổ sung các chế phẩm probiotic trên heo: không quan sát thấy ảnh hưởng tích cực của probiotic

(Lactobacillus) bổ sung trong khẩu phần cho heo cái và đực thiến ở giai đoạn heo

choai và vỗ béo (Gao and Meng, 2004); Galassi et al. (2004) thì không thấy có sự

khác nhau về tỉ lệ tiêu hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng năng lượng ở các nhóm

heo thí nghiệm và đối chứng được ăn thức ăn có và không có bổ sung

probiotic,…

Có rất nhiều ý kiến khác nhau khi giải thích sự khác biệt của các kết quả

nghiên cứu, nhưng ý kiến được nhiều nhà khoa học thống nhất là chế phẩm

probiotic tạo nên các đáp ứng tích cực ở gia súc và gia cầm chỉ khi nó có đầy đủ

các đặc tính probiotic, sự thiếu một hoặc nhiều các đặc tính probiotic là nguyên

nhân chủ yếu của đáp ứng âm tính (Soccol et al., 2010).

2.5.2. Tại Việt nam

Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu sản xuất probiotic phục vụ cho đời

sống con người nói chung và chăn nuôi nói riêng vẫn chưa được ứng dụng nhiều,

nó bắt đầu được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây. Lê Thanh Bình và ctv (1999) đã sản xuất chế phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và nuôi thử nghiệm trên gà thịt cho thấy quần thể vi sinh vật đường ruột thay đổi theo chiều hướng tích cực, các vi khuẩn lactic tăng, E. coli giảm rõ rệt ở nhóm gà được

ăn thức ăn bổ sung PR099 cao hơn so với đối chứng 10,6%. Phạm Ngọc Lan và

ctv (2003) đã phân lập được 2 trong số 789 chủng vi khuẩn lactic trong ruột gà.

Bằng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định

được chủng CH123 và CH156 có những tính chất probiotic gần với L. agillis và L. salivavirus (có khả năng đề kháng được 40% acid mật, sinh trưởng được ở môi

43

trường pH 4,0 và nồng độ NaCl 6% có hoạt tính kháng với Salmonella và E .coli)

có thể sử dụng như nguồn probiotic ứng dụng trong chăn nuôi. Nguyễn Thị Hồng

Hà và ctv (2003) đã sử dụng hai chủng Bifidobacterium bifidum và L. acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic, bước đầu đã nghiên cứu được công nghệ sản xuất

bằng phương pháp sấy phun. Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức 106 CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella. Nguyễn Thùy Châu (2003) thông báo đã lựa chọn được chủng nấm men Candida ultilis CM 125 cho sinh khối cao trên môi trường rỉ mật, bước đầu đã ra qui trình công

nghệ sản xuất sinh khối loại nấm men này. Trần Quốc Việt và ctv, (2008) cũng cho thấy, khi bổ sung chế phẩm probiotic đa chủng dạng bột vào thức ăn đã làm

tăng tỉ lệ tiêu hóa thức ăn và tốc độ sinh trưởng ở gà Lương Phượng nuôi thịt.

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm đánh giá hiệu quả của việc bổ sung các chế

phẩm probiotic dạng bột và dạng lỏng vào thức ăn và nước uống trong nuôi

dưỡng gà thịt.

2.6. Một số nghiên cứu ứng dụng B. subtilis 2.6.1. B. subtilis ứng dụng cho ngƣời và vật nuôi

Do khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzyme ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Candida albicans, E. coli, S. aureus, Salmonella, Shigella, Vibrio spp., … nên Bacillus spp. được sử dụng làm probiotic sử dụng trong phòng bệnh tiêu hóa ở người và vật nuôi.

Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa vi khuẩn

B. subtilis chủng IB 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng ống và viên nang (Regis, 1999).

Khoa Vệ sinh Y học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm B. subtilis dùng điều trị bệnh tiêu chảy ở người, sản phẩm đã được công nhận và sản xuất từ năm 2014.

Trong 1 nghiên cứu của Labellarte et al. (2015) đã cho 40 người khỏe mạnh sử dụng chế phẩm B. subtilis (liều 1,9x109 CFU/viên nang) liên tục trong 20 ngày. Kết quả cho thấy việc bổ sung B. subtilis hàng ngày có hiệu quả việc tăng cường điều hòa hoạt động đường ruột.

44

Ngoài ra, B. subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc, nấm

men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic.

2.6.2. B. subtilis ứng dụng cho gia cầm

Đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng B. subtilis trong phòng và trị bệnh tiêu chảy ở người và gia súc. Tuy nhiên, những nghiên cứu sử dụng B. subtilis đối với gia cầm còn rất nhiều hạn chế. Thực tế cho thấy tại Việt Nam chưa có một công trình khoa học nào nghiên cứu tuyển chọn B. subtilis sử dụng chuyên biệt cho gia cầm, cũng như chưa có một nghiên cứu nào chứng tỏ các chủng B. subtilis đang sử dụng hiện nay cho người và gia súc có tác dụng hữu ích khi sử dụng cho gia cầm.

Nghiên cứu của La Ragione et al. (2001) đã cho gà uống một liều đơn

2,5x 108 bào tử B. subtilis/gà, sau đó 5 ngày công cường độc bằng E. coli 078: K80 105 CFU/con. Kết quả cho thấy bào tử B. subtilis có khả năng kháng lại Escherichia coli O78: K80 trên gà. Tương tự như vậy, Teo et al. (2006) thử nghiệm chủng B. subtilis PB6 phân lập từ ruột gia cầm khỏe mạnh. Thí nghiệm thực hiện trên gà gây nhiễm E. coli, so sánh với lô điều trị bằng kháng sinh. Kết quả cho thấy chủng B. subtilis PB6 không chỉ giúp duy trì nhóm vi khuẩn hữu ích đường ruột mà còn có khả năng thay thế kháng sinh trong điều trị bệnh.

Barbosa et al. (2005) khảo sát đặc tính probiotic của chủng B. subtilis phân lập từ ruột gà cho thấy các chủng này có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh như Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus và Listeria monocytogenes. Năm 2011, Wu et al. đã nhận thấy chủng B. subtilis KD1 đã cải thiện hệ vi sinh đường ruột bằng cách gia tăng mật số vi khuẩn Lactobacilli và giảm hàm lượng vi khuẩn E. coli, và giúp gia tăng tăng trọng ở gà. Cũng cùng năm 2011, Knap et al. chứng minh rằng B. subtilis (DSM17299) có khả năng giảm thiệt hại trên gà nhiễm Salmonella. Thí nghiệm cho thấy lô sử dụng B. subtilis (DSM17299) đã giảm 58% Salmonella thải ra ngoài so với lô đối chứng.

Thirabunyanon and Thongwittaya (2012) khi khảo sát đặc tính đối kháng của các chủng B. subtilis phân lập từ hệ tiêu hóa của gà đã nhận thấy chủng NC11 có khả năng đối kháng cao đối với S. enteridis. Năm 2013, Tactacan et al. đã ghi nhận vi khuẩn B. subtilis QST 713 có khả năng kiểm soát và điều trị bệnh nhiễm trùng đường ruột do vi khuẩn Clostridium perfringens gây ra trên gà, mà không cần dùng kháng sinh trong suốt thời kỳ nuôi.

45

Năm 2017, Gao et al. khi bổ sung B. subtilis với liều 200 mg/kg thức ăn cho gà đã ghi nhận giúp cải thiện tăng trọng, đồng thời giảm vi khuẩn gây bệnh E. coli và Salmonella.

Một trong những tiêu chí để có thể ứng dụng B. subtilis như là probiotic sử dụng cho gia cầm là bào tử của B. subtilis khi vào đường tiêu hóa có thể phát triển thành tế bào sinh dưỡng bám được vào niêm mạc tế bào và phát triển ở đó.

Năm 1997, Nakano and Zuber đã phát hiện vi khuẩn B. subtilis có thể phát triển và thành lập bào tử trong điều kiện kỵ khí. Sau đó, nghiên cứu sinh học phân tử đã khẳng định lại bào tử B. subtilis có thể nảy mầm, tăng sinh và thành lập bào tử trở lại trong ruột non và hồi tràng của chuột (Casula and Cutting, 2002). Đây là một phát hiện quan trọng cho thấy vi khuẩn B. subtilis hiếu khí có thể tồn tại và phát triển trong hệ tiêu hóa kỵ khí. Một số nghiên cứu đã cho thấy bào tử B. subtilis có khả năng sống và phát triển thành tế bào sinh dưỡng trong đường tiêu hóa của chó, thỏ, chuột (Hoa et al., 2001; Tam et al., 2006) và đường tiêu hóa của heo (Leser et al., 2007). Tất cả các nghiên cứu trên đều thực hiện ở động vật hữu nhũ, do đó để khẳng định rằng bào tử B. subtilis cũng có thể phát triển thành tế bào sinh dưỡng trong hệ tiêu hóa gia cầm thì cần thực hiện các thí nghiệm trên loài gia cầm do có sự khác biệt về giải phẫu học cũng như các chức năng sinh lý. Để làm sáng tỏ điều này, năm 2008, Stephen et al. đã tiến hành nghiên cứu trên gà. Trong thí nghiệm của mình Stephen và các cộng sự đã thí nghiệm trên giống gà Leghorn 1 ngày tuổi và cho uống 0,1 mL bào tử B. subtilis 1x109CFU/ml, 20 giờ sau đó đã quan sát được tế bào sinh dưỡng với số lượng vượt trội trong đường tiêu hóa gia cầm (Stephen et al., 2008). Điều này cho thấy bào tử B. subtilis có khả năng phát triển trong đường tiêu hóa gia cầm.

46

CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian tiến hành thí nghiệm từ tháng 3/ 2014 đến 4/ 2017.

- Địa điểm thu mẫu: Thành phố Cần Thơ, các tỉnh Hậu Giang, An Giang,

Vĩnh Long, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang.

- Phân tích mẫu: phòng thí nghiệm Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển

Vemedim.

- Giải trình tự gen 16S rRNA Bacillus subtilis tại: Công ty Nam Khoa (Việt

Nam) và Công ty Macrogen (Hàn Quốc).

- Bố trí thí nghiệm: Công ty TNHH Một thành viên chăn nuôi Vemedim, xã

Thới Thạnh, huyện Thới Lai, Ô Môn, Cần Thơ.

3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu

3.2.1. Vật liệu

- Chủng đối chứng 1 (ĐC1): B. subtilis (ATCC ® 19659™) do Công ty thiết

bị khoa học Lan Oanh cung cấp.

- Chủng đối chứng 2 (ĐC2): B. subtilis sử dụng phổ biến trên thị trường

(B. subtilis của Cty Vemedim, chứa B. subtilis 108 CFU/g).

- Chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella enterica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. do phòng vi sinh Chi Cục Thú Y Cần Thơ cung cấp (các vi khuẩn này được phân lập từ đề tài PRRS do Chi Cục Thú Y Cần Thơ thực hiện, được phòng thí nghiệm bộ môn Thú Y khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ phân lập và gởi định danh tại Bệnh viện Nhiệt Đới TP. Hồ Chí Minh).

- Gà giống: gà ta Greenfeed GF168, là giống gà do Công ty Greenfeed cung

cấp được nuôi phổ biến hiện nay.

3.2.2. Dụng cụ

Ống nghiệm 10 mL, 20 mL, ống falcon 50 mL, đĩa petri, que tran, que cấy, bình tam giác, ống đong, bộ micropipet Eppendoft 2 µL - 10.000 µL (Đức), đầu col vàng, xanh, trắng, lamme, lamen, que cấy, đèn cồn, thước đo, và một số dụng cụ khác, …

47

3.2.3. Thiết bị

Nồi khử trùng nhiệt ướt Yuin (Đài Loan), tủ cấy an toàn sinh học Esco (Singapore), tủ ấm vi sinh Binder (Đức), tủ sấy Binder (Đức), tủ âm 86oC Panasonic (Nhật), cân điện tử Sartorius (Đức), máy ly tâm lạnh Eppendorf (Đức), quang phổ kế Ultrospec 10 (Anh), máy vortex Stuart (Anh), máy lắc mẫu Stuart (Anh), kính hiển vi quang học Olympus (Nhật), kính hiển vi phản pha nền đen Zeiss (Đức), pH kế Jenway (Anh), máy PCR Biorad-T100 Thermal cycler (Mỹ), bộ điện di 1 chiều 90V Biorad SGE-014-02 (Mỹ), hệ thống chụp hình gel Bio- Rad XR (Mỹ), hệ thống lên men 10 L Sartorius (Đức).

3.2.4. Hóa chất và môi trƣờng phân lập nuôi cấy vi khuẩn

Hóa chất phân lập, nuôi cấy và khảo sát các đặc tính vi khuẩn

Hóa chất dùng để định lượng và định tính B. subtilis: Môi trường TSA (Trypticase Soy Agar), và môi trường MYP (Mannitol Yolk Polymycin) dùng để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn B. subtilis. Hóa chất dùng nhuộm Gram và test sinh hóa vi khuẩn, bộ KIT APICH50B của Biomereux (Pháp).

Hóa chất dùng để định lượng và định tính Salmonella spp. và E. coli: môi trường EMB (Eosin Methylene Blue Agar), môi trường Mac Conkey, môi trường SS (Salmonella - Shigella Agar), môi trường BGLS (Brilliant - Green Phenol - Red Lactose Sucrose Agar), môi trường TSI (Triple Sugar - Iron Agar), môi trường Simmon citrate, môi trường Peptone 1%, môi trường MR - VP (Methyl Red - Vos Proskauer Agar), môi trường Lysine Decarboxylase.

Hóa chất dùng để tinh sạch DNA của vi khuẩn

TE (pH 8,0), SDS 10%, phenol, ethanol 99,5%, nước cất hai lần vô trùng, dung dịch TE (gồm 1% triton X - 100, 1M Tris HCl (pH 8,5), 0,5M EDTA (pH 8,0), nước cất vô trùng.

Hóa chất dùng để thực hiện PCR và điện di sản phẩm PCR

Taq buffer, Taq DNA polymerase, DNA vi khuẩn đã phân lập, nước cất hai

lần vô trùng, dNTPs .

Cặp mồi tổng để nhận diện vi khuẩn (Saminathan and Narayanan, 2015) Mồi xuôi: 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'27F) Mồi ngược: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') (Cung cấp bởi Sigma-Aldrich, chi nhánh tại Nhật)

48

Agarose 1,5%, TAE buffer, Loading buffer, thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo scientific - Fermentas và Bio Basic Inc - Canada), Ethidium bromide (EtBr).

Kháng sinh làm kháng sinh đồ: erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracycline, doxycycline, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin (đĩa kháng sinh chuẩn của Oxoid - Thermo Scientific).

3.3. Nội dung và Phƣơng pháp nghiên cứu

3.3.1. Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu gồm 3 phần chính như sau

Nội dung 1: Phân lập các chủng B. subtilis

- Phân lập B. subtilis bằng phương pháp truyền thống: dựa vào đặc điểm khuẩn lạc và quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi, nhuộm Gram và thử phản ứng sinh hóa.

- Định danh chính xác đến loài bằng kit API 50 CHB.

- Giám định chính xác giống và loài các chủng Bacillus tuyển chọn bằng

phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA.

Nội dung 2: Tuyển chọn các chủng B. subtilis có đặc tính probiotic

Gồm 7 chỉ tiêu như sau:

- Tính chịu nhiệt.

- Khả năng nhạy kháng sinh (9 loại kháng sinh đang được dùng phổ biến trên gia cầm: erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin).

- Khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase): chọn những

chủng có khả năng sinh cả 3 loại enzyme.

- Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh (E. coli, S. enterica,

Staphylococcus spp., Streptococuss spp.).

- Khả năng chịu đựng tác động của dịch tiêu hóa (acid và muối mật).

- Khả năng bám dính (khả năng tự bám dính, bám dính với vi khuẩn bệnh,

và bám dính vào niêm mạc ruột).

- Khả năng sống của vi khuẩn trong ruột gà.

49

Nội dung 3: Thử nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm probiotic

chứa B. subtilis trên gà

Thí nghiệm 1: Xác định liều sử dụng B. subtilis hiệu quả Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic ở gà khi gây nhiễm

bằng Salmonella enterica.

Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic ở gà khi gây nhiễm

bằng chủng E. coli gây bệnh trên gà.

3.3.2. Phân lập các chủng B. subtilis

3.3.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu và số lƣợng mẫu

Phƣơng pháp lấy mẫu

Mẫu đất: Đất được lấy ở tầng mặt, độ sâu từ 4-5 cm. Mẫu gộp được lấy từ 5

vị trí khác nhau của 1 trại gà.

Mẫu phân: Lấy phân tươi trên nền chuồng. Mẫu gộp được lấy từ 5 vị trí

khác nhau trong chuồng gà (4 mẫu ở 4 góc và 1 mẫu ở trung tâm).

Lượng đất và phân lấy mỗi lần từ 30-50 g. Mẫu được đựng trong túi nilon (polypropylen) đã được khử trùng. Sau khi lấy mẫu, tiến hành ghi nhãn địa điểm và thời gian lấy, sau đó tất cả các mẫu được bảo quản bằng thùng trữ lạnh và đưa về phòng thí nghiệm.

Số lƣợng mẫu Chọn mẫu theo phương pháp định ngạch (phi ngẫu nhiên), mỗi địa phương 20 mẫu (10 mẫu đất + 10 mẫu phân). Tổng cộng: 140 mẫu/ 7 tỉnh, thành phố (Bảng 3.1). Trong các tỉnh ĐBSCL, chọn đại diện 7 tỉnh, thành phố như sau:

- Kiên Giang, An Giang, Sóc Trăng là các tỉnh có địa hình giáp biển, có

đồng bằng, đồi núi.

- Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp: là các tỉnh chuyên canh lúa

có đàn vật nuôi phát triển.

Bảng 3.1: Phân bố mẫu Địa điểm lấy mẫu TP. Cần Thơ Hậu Giang Vĩnh Long Đồng Tháp Kiên Giang An Giang Sóc Trăng Tổng cộng

Mẫu đất 10 10 10 10 10 10 10 70 Mẫu phân 10 10 10 10 10 10 10 70

50

3.3.2.2. Phân lập và giám định vi khuẩn B. subtilis

Chuẩn bị mẫu

Cân 10 g mẫu + 90 mL nước muối sinh lý vô trùng cho vào bình tam giác, lắc đều. Gia nhiệt ở 80ºC trong 20-25 phút để chọn những vi khuẩn có khả năng là Bacillus spp. (Eman, 2013).

Phân lập vi khuẩn

Sau khi gia nhiệt, mẫu được tiến hành pha loãng và trải đĩa trên môi trường TSA, ủ ở 30ºC trong 24 giờ. Kết thúc thời gian ủ, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ, khác biệt nhau và tiến hành cấy phân lập, kết hợp với quan sát, ghi nhận hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi để thu được chủng vi khuẩn thuần.

Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống thạch nghiêng làm tiêu bản nhuộm Gram quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1.000 lần. Ghi nhận các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, sự di động, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử, vị trí và hình dạng bào tử, hình dạng của tế bào mang bào tử. Do sự đa dạng của các loài thuộc giống Bacillus và theo mục tiêu của đề tài là chọn lọc loài B. subtilis nên chúng tôi chọn các trực khuẩn, Gram dương, có khả năng di động và sinh bào tử.

Tiến hành giám định các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn B. subtilis theo phương pháp của Cowan and Steel (2004) với một số cải tiến. Các phản ứng sinh hóa bao gồm: lecithinase (-), catalase (+), VP (+), amylase (+), khả năng phát triển ở 50oC và cellulase (+) được thực hiện lần lượt theo trình tự để sàng lọc sơ bộ được nhóm vi khuẩn thuộc loài B. subtilis. Các chủng đạt yêu cầu, sau đó sẽ được định danh bằng bộ kit API 50 CHB, chủng nào có kết quả là B. subtilis sẽ được giải trình tự gen 16S RNA để khẳng định lại.

3.3.2.3. Các phản ứng sinh hóa

Phản ứng Lecithinase: Được tiến hành trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin - Mossel). Vi khuẩn B. subtilis có phản ứng lecithianase âm tính (khuẩn lạc có màu vàng) (UK Standards for Microbiology, 2015).

Theo hướng dẫn của UK Standards for Microbiology, (2015) trong việc xác định loài Bacillus, phản ứng Lecithinase (phản ứng Nagler) được đề xuất để loại trừ nhóm Bacillus gây độc, bao gồm B. cereus, B. anthracis, B. thurigiensis, B. mycoides, là 4 loài dương tính với phản ứng Lecithinase.

51

Phản ứng Catalase: Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí. Sử dụng đặc tính này để thử khả năng sinh enzyme catalase của vi khuẩn (Cowan and Steel, 2004). Vi khuẩn B. subtilis có phản ứng catalase dương tính. Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiến kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính và quan sát. Vi khuẩn sinh catalase sẽ sủi bọt khí, vi khuẩn không sinh catalase sẽ không thấy sủi bọt.

Phản ứng VP (Voges-Proskauer)

Tiến hành theo Levine et al. (1934). Cấy chủng vi khuẩn vào môi trường VP, ủ ở 37ºC trong 24 giờ, sau đó nhỏ 1 mL KOH 40% và 3 mL α-napthol 5%, theo dõi sự đổi màu của môi trường. Vi khuẩn B. subtilis có phản ứng VP dương tính (màu đỏ hồng).

Phản ứng Amylase

Thực hiện theo phương pháp của Harley (2004). Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được cấy lên môi trường TSB (Tryptic Soy Broth), để tủ ấm 37oC trong 2-6 giờ. Huyền phù vi khuẩn được pha loãng ở mật độ tương đương 108 vi khuẩn/mL và cấy thành một đường thẳng lên môi trường TSA (Trypticase Soy Agar), ủ ở 37oC trong 24 giờ. Đọc kết quả bằng thuốc thử lugol. Nếu trong môi trường không còn tinh bột thì lugol sẽ không làm chuyển màu môi trường. Vi khuẩn B. subtilis sẽ có phản ứng amylase dương tính.

Khả năng phát triển ở 50ºC

Khả năng phát triển ở 50oC của vi khuẩn được khảo sát theo phương pháp của Barbosa et al. (2000) có cải tiến. Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào ống nghiệm chứa 5 mL TSB và ủ ở 50oC trong 24 giờ. Kết thúc thời gian ủ, dịch vi khuẩn được cấy lên đĩa thạch TSA để kiểm tra khả năng sống sót trên môi trường này.

Phản ứng cellulase

Thực hiện theo phương pháp của Cowan and Steel (2004) có cải tiến như sau: vi khuẩn được cấy vạch lên môi trường CMC agar (Carboxymethyl cellulose agar) (thành phần (g/L): KH2PO4 1,0, MgSO4.7H2O 0,5, NaCl 0,5, FeSO4.7H2O 0,01, MnSO4.H2O 0,01, NH4NO3 0,3, CMC 10,0, Agar 12,0. (pH 7,0 với NaOH 1M), ủ ở 30-37°C trong 48 giờ để kiểm tra khả năng sinh enzyme cellulase của vi khuẩn. Sau thời gian ủ, dung dịch Congo red 0,1% được đổ ngập đĩa, để yên

52

trong 15 phút và rửa lại bằng NaCl 1M trong 10 phút. Nếu vi khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase thì sẽ xuất hiện một vùng trong ở xung quanh đường cấy vi khuẩn. Vi khuẩn B. subtilis có phản ứng cellulase dương tính.

3.3.2.4. Định danh bằng bộ kit API 50 CHB

API 50 CHB là một bộ kit định danh chuẩn, bao gồm 50 phản ứng sinh hóa dùng để kiểm tra khả năng chuyển hóa carbohydrate của vi sinh vật. Bộ kit được sử dụng cùng với môi trường chuyên biệt để định danh đến loài thuộc giống vi khuẩn Bacillus.

Nguyên tắc thực hiện: Tạo dung dịch huyền phù vi khuẩn bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn hòa chung với môi trường chỉ thị. Sau đó, lần lượt bơm dung dịch huyền phù này vào 50 giếng trong bộ Kit, tiến hành ủ ở 30oC trong 24-48 giờ. Trong quá trình ủ, carbonhydrate sẽ được lên men thành acid, làm giảm pH, là tác nhân gây ra sự thay đổi màu chỉ thị. Đọc kết quả ở thời điểm 24 và 48 giờ. Kết quả được xác định là dương tính khi vi khuẩn chuyển màu môi trường từ đỏ sang vàng trong giếng, âm tính khi giếng vẫn giữ nguyên màu đỏ ban đầu, riêng giếng số 25, kết quả được ghi nhận là dương tính khi môi trường chuyển sang màu đen (Giếng số 25 là test Esculin ferric citrate). Nếu vi khuẩn có khả năng tiết enzyme thủy giải esculin tạo esculetin, thì esculetin sẽ phản ứng với sắt (II) citrate trong môi trường, tạo phức hợp phenol sắt, môi trường đổi màu từ nâu sang đen là dương tính. Sau đó, kết quả ghi nhận 50 test sẽ được nhập vào phần mềm API web có kết nối Internet, sau khi xử lý sẽ cho kết quả định danh loài Bacillus kèm theo tỉ lệ phần trăm tương đồng.

3.3.2.5. Định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp giải trình tự gen

Qui trình ly trích DNA từ khuẩn lạc

Qui trình ly trích DNA thực hiện theo hướng dẫn của Professor Hayashidani Hideki (Tokyo University of Agriculture and Technology) như sau: Chọn 10 khuẩn lạc rời đã được cấy thuần trên môi trường thạch TSA cho vào ống nghiệm có bi thủy tinh, vortex khoảng 3 phút, sau đó cho 1 mL TE buffer, lắc đều, sau đó rút 0,5 mL cho vào eppendorf ly tâm 15.000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy khoảng 400 µL phần dịch bên trên cho vào Eppendorf, thêm 400 µL phenol trộn đều ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút. Thu phần dịch lỏng bên trên thêm ethanol trộn đều, giữ ở -20oC trong 30 phút, ly tâm 15.000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần lắng bên dưới. Sau đó hòa tan DNA thu được trong 500 µL 1X TE và trữ ở -20oC.

53

Đo OD:

OD (Optical Density) được đo ở bước sóng 260nm bằng máy Beckman Coulter 640 (Hoa Kỳ). Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ 50 ng/μL cho một dung dịch DNA sợi đôi. Do đó, nồng độ NA ở bước sóng 260nm được tính theo công thức:

[DNA] ng/μL = OD260nm x 50 x Độ pha loãng mẫu

Mẫu DNA được xem là tinh sạch khi có tỉ lệ OD 260nm/OD280nm nằm trong

khoảng 1,8 đến 2,0

Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA

Sau khi ly trích DNA của các chủng vi khuẩn, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi phổ biến mã hóa cho đoạn gen 16S rRNA (Saminathan and Narayanan, 2015) có trình tự như sau:

27F: (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 1492R: (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'27F)

Thành phần cho phản ứng PCR theo Bảng 3.2

Hóa chất Nước cất Buffer MgCl2 dNTP F primer R primer Taq DNA polymerase DNA vi khuẩn

Bảng 3.2: Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 Tổng cộng

Nồng độ ban đầu Thể tích (μL) 14,375 5 5 x 2 2 mM 0,5 0,5 100 nmol/μL 0,5 100 nmol/μL 0,125 0,5 U/μL 2 25

Chu trình nhiệt của phản ứng: 1 chu kỳ: 94oC trong 4 phút; 30 chu kỳ: 94oC trong 1 phút, 52oC trong 1 phút, 72oC trong 1 phút và 1 chu kỳ ở 72oC trong 5 phút.

Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% có bổ sung 0,02% Ethidium Bromide ở hiệu điện thế 95V trong 1 giờ. Sau đó chụp hình qua hệ

54

thống máy chụp ảnh gel điện di Bio-Rad XR. Chọn sản phẩm trên phổ điện di cho băng rõ và tương đồng có kích thước 1.500 bp ở thang chuẩn plus 100.

Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn

Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và được gởi đến phòng thí nghiệm của Cty Nam Khoa (Việt Nam) và Cty Macrogen (Hàn Quốc) giải mã trình tự nucleotide.

- Mỗi mẫu được giải trình tự với 2 phản ứng sử dụng mồi 27F và 1492R. Trình tự thu được từ các phản ứng này được lắp ráp lại thành công dựa trên vùng gối đầu của các trình tự giải được bằng chương trình SeqMan trong bộ phần mềm Lasergene phiên bản 7,0 và đối chiếu kết quả lắp ráp với dữ liệu giải trình tự ABI (Applied Biosystem) để hiệu chỉnh các nucleotide không khớp.

- Trình tự 16S rRNA sau khi lắp ráp được loại bỏ khoảng 100 nucleotide ở hai đầu do tín hiệu giải trình tự ở vùng này không chính xác (trình tự cuối cùng thu được khoảng trên 1.200 nucleotid). Trình tự cuối cùng được đưa lên NCBI BLAST để so sánh với dữ liệu ADN của GenBank. Các loài có giá trị E thấp nhất và vùng Querry Coverage cao nhất là tương đối gần nhất với các chủng giải trình tự.

Qui trình phân lập và giám định vi khuẩn B. subtilis được trình bày tóm tắt

theo sơ đồ sau:

Chủng vi khuẩn thuần ↓ Test Lecithinase: (-) ↓ Test Catalase: (+) ↓ Test VP: (+) ↓ Test Amylase: (+) ↓ Khả năng phát triển ở 50ºC ↓ Test Cellulase: (+) ↓ API CH50B ↓ Giải trình tự gen 16S rRNA

Hình 3.1. Sơ đồ sàng lọc, định danh vi khuẩn B. subtilis

55

3.3.3. Chọn lọc các chủng B. subtilis có đặc tính probiotic

3.3.3.1. Tính chịu nhiệt

Thực hiện tương tự như khả năng phát triển ở 50oC theo phương pháp của Barbosa et al. (2005) có cải tiến. Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra trên đĩa thạch TSA và ủ ở 55oC và 60oC trong 24 giờ. Kết thúc thời gian ủ, kiểm tra khả năng sống của vi khuẩn.

3.3.3.2. Khả năng nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn

Tính nhạy cảm kháng sinh của các vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đĩa khuếch tán kháng sinh theo hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm (Clinical and Laboratoty Standards Institude - CLSI, 2015) (Wayne, 2015). Dịch vi khuẩn sau khi nuôi cấy 18 giờ có mật số tương đương 108 CFU/mL (so màu Mc Farland 0,5%). Sau đó, bơm 100 µL dung dịch vi khuẩn phân tán đều lên bề mặt môi trường Muller Hinton agar (MHA, Merck). Đĩa kháng sinh (Oxoid, England) được đặt lên mặt thạch và ủ ở 37oC trong 24 giờ. Đường kính vòng kháng khuẩn được đo bằng mm, chủng vi khuẩn trên đĩa MHA tương ứng sẽ được xác định là kháng (≤ 14 mm), nhạy (≥ 20 mm) hoặc trung gian (15-19 mm) với kháng sinh thử nghiệm theo tiêu chuẩn của CLSI (2015). Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

3.3.3.3. Khả năng sinh các enzyme tiêu hóa (amylase, protease và lipase)

Amylase: thực hiện theo phương pháp đã trình bày ở mục 3.3.2.3

Protease

Một số vi sinh vật có thể tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại bào xúc tác sự thủy phân gelatine thành peptide và acid amin. Theo Harley (2004) để nhận biết khả năng làm tan gelatine của vi sinh vật trichlroacetic acid (TCA) 25% được sử dụng để gây tủa protein gelatine có trong môi trường nuôi cấy. Nếu có sự phân giải gelatine (vi khuẩn tiết ra gelatinase), xung quanh khuẩn lạc sẽ xuất hiện một vòng trong (phản ứng dương tính), nếu không có sự phân giải gelatine, môi trường xung quanh khuẩn lạc sẽ đục (phản ứng âm tính). Phản ứng được tiến hành như sau: chuẩn bị môi trường thạch dinh dưỡng bổ sung 1% gelatin, và hoạt hóa chủng vi sinh vật cần thử nghiệm 37ºC/ 24 giờ, sau đó nhỏ TCA 25% và xem kết quả.

56

Lipase

Một số vi khuẩn có khả năng sinh ra lipase phân giải dầu thực vật và các hợp chất béo khác. Trong thử nghiệm lipase, môi trường nuôi cấy có CaCl2 và Tween 80. Nếu vi khuẩn có khả năng tiết lipase, thì lipase sẽ thủy phân Tween 80 tạo các acid béo tự do, dưới sự có mặt của ion Ca2+, tủa calcium oleate được tạo thành, tạo nên một vùng mờ đục phía dưới và xung quanh khuẩn lạc. Tiến hành phản ứng như sau: chuẩn bị môi trường thạch dinh dưỡng bổ sung CaCl2 và Tween 80 với tỉ lệ thích hợp, hoạt hóa chủng vi sinh vật thử nghiệm ở 37ºC/ 24 giờ, sau đó dùng tăm bông vô trùng chấm dịch vi khuẩn lên đĩa môi trường, ủ 37ºC/ 24 giờ, và quan sát kết quả.

Định lƣợng hoạt tính amylase, protease và lipase do vi khuẩn sinh ra

(Phụ lục A.1)

3.3.3.4. Khả năng đối kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh

Thử nghiệm khả năng đối kháng theo phương pháp vạch thẳng vuông góc: Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng B. subtilis trên môi trường Starch agar (SA) bao gồm: tinh bột 10 g/L, peptone 5 g/L, NaCl 0,5 g/L, agar 15 g/L (Moore et al., 2013). Các bước tiến hành theo phương pháp của Sertaç et al. (2014) có cải tiến như sau: cấy vi khuẩn B. subtilis dọc theo một đường thẳng trên đĩa thạch SA, ủ ở 37oC trong 24 giờ, tiến hành cấy vi khuẩn gây bệnh (S. enterica, E. coli, Staphylococcus, Streptococcus) theo các vạch ngang vuông góc với vạch vi khuẩn đã mọc, tiếp tục ủ ở 37oC trong 24 giờ. Khả năng kháng khuẩn được xác định bằng cách đo khoảng cách vùng kháng khuẩn theo đơn vị mm dựa theo Hutt et al. (2006). Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Thử nghiệm khả năng đối kháng theo phương pháp đối kháng trực tiếp: Thực hiện theo phương pháp của Moore et al. (2013) có điều chỉnh như sau: Vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn B. subtilis được hoạt hóa trong môi trường TSB và ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ. Huyền phù vi khuẩn B. subtilis được điều chỉnh sao cho mật số đạt 105 CFU/mL, 106 CFU/mL và 107 CFU/mL tương ứng với nồng độ vi khuẩn gây bệnh để tiến hành thử khả năng đối kháng. Tiến hành bơm 100 µL huyền phù vi khuẩn gây bệnh lên các đĩa thạch và dùng que tran trải đều; sau đó, bơm 10 µL dịch vi khuẩn B. subtilis tương ứng với các nồng độ khảo sát lên bề mặt thạch đã được trải vi khuẩn gây bệnh, và đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Khả năng đối kháng được đo bằng đường kính vòng ức chế vi khuẩn gây bệnh

57

theo đơn vị mm. Đánh giá khả năng đối kháng theo Sumathi and Reetha (2012). Mỗi thử nghiệm được lặp lại 3 lần.

3.3.3.5. Khả năng chịu acid dạ dày và muối mật

Thực hiện theo phương pháp của Corcoran et al. (2005) và Dunne (2001) có cải tiến. Vi khuẩn B. subtilis được cấy ria trên môi trường DSM, ủ từ 24 - 48 giờ ở 30ºC. Sau đó, tạo huyền phù sinh khối vi khuẩn trong dung dịch đệm PBS pH 7,2, pha loãng để đạt mật số vi khuẩn trong dịch huyền phù là 107 CFU/mL. Sau đó chủng 1 mL dịch huyền phù vào 9 mL dung dịch dạ dày mô phỏng gồm Glucose (3,5 g/L), NaCl (2,05 g/L), KH2PO4 (0,6 g/L), CaCl2 (0,11 g/L), và KCl (0,37 g/L) được chuẩn độ về các pH 2, 3, 4, 5 bằng dung dịch HCl 1M và lọc bằng màng lọc 0,2 μm. Sau đó Pepsin (13,3 mg/L) và dịch mật (0,05 g/L) được cho vào dịch gốc trước khi tiến hành thí nghiệm. Trộn đều và ủ dịch hỗn hợp ở 37ºC trong máy lắc 90 phút, đồng thời tiến hành kiểm tra mật số vi khuẩn ở các thời điểm 0; 10; 30; 60, 90 phút. Tính tỉ lệ phần trăm sống sót của vi khuẩn B. subtilis.

Qui trình được thực hiện theo sơ đồ ở Hình 3.2.

58

Vi khuẩn B. subtilis chọn lọc

Cấy ria trên môi trường thạch DSM

Tạo huyền phù sinh khối trong dung dịch đệm PBS, pH 7,2

Chủng 1mL dịch huyền phù (107 CFU/mL) vào 9 mL dung dịch dạ dày mô phỏng, pH 2, 3, 4, 5

Bổ sung Pepsin, muối mật

Trộn đều, ủ 37ºC trong máy lắc 90 phút

Kiểm mật số dịch ủ ở 0; 10; 30; 60; 90 phút

Tính tỉ lệ vi khuẩn sống sót

Hình 3.2. Sơ đồ kiểm tra khả năng chịu acid dạ dày và muối mật của vi khuẩn B. subtilis

3.3.3.6. Khả năng bám dính

- Khả năng bám dính cùng một chủng (tự bám dính): xác định theo phương pháp của Del Re et al. (2003) có cải tiến theo mô tả của Kos et al. (2003). Hoạt hóa chủng vi khuẩn cần kiểm tra trên môi trường TSA, ủ ở 37oC trong 24 giờ, sau đó cấy vi khuẩn vào 100 mL TSB, nuôi ở 37oC trong 18 giờ. Sinh khối tế bào thu được sau khi nuôi cấy được rửa 2 lần và tái huyền phù trong đệm Phosphate buffered saline (PBS) sao cho nồng độ vi khuẩn đạt khoảng 108 CFU/mL (so độ đục Mc Farlan 0,5%). Sau đó 4 mL dịch huyền phù tế bào được trộn đều trong 10 giây. Khả năng bám dính của các tế bào trong cùng một chủng được xác định trong 5 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau mỗi giờ, lấy 0,1 mL dịch nổi phía trên cho vào

59

1 ống nghiệm khác chứa 3,9 mL PBS và xác định mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 600 nm (OD600). Kết quả được tính theo công thức sau:

Khả năng tự bám dính (%) = (Ao - At)/Ao × 100

Trong đó: Ao: OD600 của dung dịch tế bào ở thời điểm t = 0 giờ

At: OD600 dung dịch tế bào ở các thời điểm t = 1, 2, 3, 4 và 5 giờ

- Khả năng bám dính giữa các chủng vi sinh vật khác nhau: xác định theo mô tả của Kos et al. (2003) có cải tiến theo mô tả của Anwar et al. (2014). Phương pháp chuẩn bị mẫu tương tự như phương pháp thử nghiệm khả năng tự bám dính, tuy nhiên sử dụng vi khuẩn phân lập được lần lượt với hai chủng vi khuẩn thử nghiệm là E. coli và S. enterica. Khả năng bám dính giữa các chủng vi sinh vật khác nhau được tính toán theo công thức:

Khả năng bám dính giữa các chủng khác nhau (%)

= [(Ax + Ay)/2 - A(x+y)]/[(Ax+Ay)/2]×100

Trong đó: Ax là OD600 của chủng vi khuẩn x ở ống đối chứng

Ay là OD600 của chủng vi khuẩn y ở ống đối chứng

A(x+y) là OD600 của hỗn hợp 2 chủng vi khuẩn x và y

- Khả năng bám dính với biểu mô ruột

Tiến hành theo phương pháp của Piatek et al. (2012) có cải tiến như sau: Chủng vi khuẩn B. subtilis được tăng sinh bậc 2 trong 20 mL dung dịch NB, ủ ở 37oC trong 24 giờ, và được điều chỉnh với mật số 108 CFU/mL. Mẫu biểu mô ruột gà được cắt thành những đoạn ngắn khoảng 1cm, và nhúng vào dung dịch đệm PBS trong 30 phút ở 4oC. Sau đó, mẫu được ngâm trong dung dịch vi khuẩn cần kiểm tra, tiếp tục ủ ở 37oC, trong 30 phút. Dung dịch vi khuẩn được loại bỏ, mẫu được cố định trong formalin, và tiến hành làm tiêu bản mô. Quá trình thực hiện tiêu bản mô được tiến hành như sau: Mẫu được thu và cố định trong dung dịch formalin trung tính (10%). Mẫu cố định sau 24 giờ và chuyển sang cồn 70o. Mẫu cố định được cắt tỉa với độ dày từ 5 mm, sau đó được xử lý bằng máy xử lý tự động qua các giai đoạn loại nước, làm trong mẫu và tẩm paraffin. Sau đó, đúc khối mẫu bằng paraffin và sáp ong nóng chảy (1:1), sử dụng máy cắt mẫu với độ dày 5 µm và nhuộm mẫu bằng dung dịch haematoxylin và eosin (H&E). Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi quang học lần lượt ở vật kính 10X, 40X, 100X có

60

nhỏ giọt dầu soi kính và chụp lại hình tiêu bản đặc trưng. Đọc kết quả dựa theo tài liệu của Ferguson (2006) (trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011).

3.3.3.7. Khả năng sống của vi khuẩn trong đƣờng ruột gà

Được thực hiện theo phương pháp của Cartman et al. (2008) có cải tiến như sau: gà con 1 ngày tuổi sạch bệnh được cho uống bào tử B. subtilis với liều 0,1 mL canh khuẩn chứa 1x109 CFU/mL. Sau đó, vào các mốc thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ, chọn 3 gà ngẫu nhiên, mổ và thu mẫu ở hồi tràng, manh tràng và ruột già. Tiến hành rửa mẫu, xử lý nhiệt ở 80oC, trong 20 phút để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng và các vi khuẩn khác. Sau đó, tiến hành trải mẫu kiểm tra mật số vi khuẩn B. subtilis ở các mốc thời gian như trên. Giá trị trung bình được tính theo số lượng bào tử/ g ruột non, manh tràng và ruột già.

3.3.4. Đánh giá tính an toàn và tác dụng của chế phẩm trên gà

Để đánh giá tính an toàn và tác dụng của chế phẩm trên gà, chúng tôi thực

hiện 3 thí nghiệm như sau:

Thí nghiệm 1: Đánh giá tính an toàn và hiệu quả tăng trọng của gà khi bổ

sung probiotic (B. subtilis) với các tỉ lệ khác nhau.

Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic (B. subtilis) ở gà khi

gây nhiễm với S. enterica so với kháng sinh.

Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic (B. subtilis) ở gà khi

gây nhiễm với E. coli so với kháng sinh.

3.3.4.1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu trong 3 thí nghiệm là B. subtilis được phân lập và

tuyển chọn trong đề tài.

Gà thí nghiệm: là gà 1 ngày tuổi, thuộc giống gà ta Greenfeed GF168 nuôi

tại công ty.

Thức ăn và các qui trình tiêm chủng vaccine thực hiện theo qui trình của

công ty chăn nuôi (Phụ lục B).

3.3.4.2. Chuồng trại thí nghiệm

Gà được nuôi trên chuồng lồng, đáy lồng và vách được làm bằng khung kẽm kích thước 0,6 x 1 x 2 m. Diện tích mỗi ô chuồng là 2m2 ngăn làm 2 ngăn, mỗi

61

ngăn là 15 con. Máng ăn và máng uống được bố trí riêng cho mỗi ngăn chuồng

(Hình 3.3).

Hình 3.3. Chuồng gà thí nghiệm

3.3.4.3. Thí nghiệm 1:

Mục đích: đánh giá tính an toàn và xác định liều hiệu quả của sản phẩm đối

với gà.

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm

thức, trong đó có 3 nghiệm thức tương ứng với 3 liều bổ sung B. subtilis và 1

nghiệm thức đối chứng không bổ sung B. subtilis.

Mỗi nghiệm thức gồm 30 gà và lặp lại 3 lần. Sơ đồ bố trí thí nghiệm được

trình bày qua Bảng 3.3.

Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1

Chỉ tiêu theo dõi

Tuổi gà thí nghiệm, ngày B. subtilis bổ sung, CFU/g (*) Lượng bổ sung, g/kg thức ăn Số ngày chuẩn bị thí nghiệm Số ngày thí nghiệm

Nghiệm thức NT2 1 106 5 7 60

NT3 1 5x105 5 7 60

ĐC 1 - - 7 60

NT1 1 107 5 7 60

Ghi chú: (*): Liều tham khảo từ thí nghiệm của Knap et al. (2011) và Teo et al.

(2006)

62

Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm

Lượng thức ăn đưa vào: được xác định bằng cách cân tổng lượng thức ăn

cho ăn và thức ăn thừa hàng ngày của từng lô trong suốt thời gian thí nghiệm.

Số gà chết: ghi nhận số gà chết hàng ngày và tổng kết mỗi 2 tuần.

Tăng trọng: gà được cân khối lượng khi bắt đầu thí nghiệm, sau đó mỗi 2

tuần cân một lần đến khi kết thúc thí nghiệm, tính khối lượng chung cho cả lô.

Tăng khối lượng toàn kỳ (g) = Khối lượng cuối kỳ (g) - Khối lượng đầu kỳ (g).

Tăng khối lượng toàn kỳ Tăng khối lượng bình quân (g/ngày) = Số ngày thí nghiệm Tổng lượng thức ăn đưa vào (g) Hệ số chuyển hóa thức ăn = Tổng tăng trọng của gà (g) 3.3.4.4. Thí nghiệm 2

Mục đích: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic so với kháng sinh ở gà

gây nhiễm với S. enterica.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên theo phương pháp của Knap et al. (2011) có cải tiến như sau: 2 nghiệm thức đối chứng (ĐC âm, ĐC dương) cho ăn khẩu phần ăn bình thường của trại trong suốt quá trình nuôi. Các nghiệm thức thí nghiệm (bổ sung probiotic hoặc kháng sinh) được bố trí như sau:

NT1: Bổ sung B. subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời gian

thí nghiệm.

NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ

ngày gây nhiễm.

NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ

ngày gây nhiễm.

Gây nhiễm S. enterica cho các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, và ĐC (+) vào

ngày thứ 18, mỗi nghiệm thức gồm 30 gà và lặp lại 3 lần.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày qua Bảng 3.4

63

Bảng 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2

Chỉ tiêu theo dõi

ĐC (+) ĐC (-)

1 - -

NT2 1 18 7,5x104 - 50 - 60

1 18 7,5x104 - - - 60 Nghiệm thức NT3 1 18 7,5x104 - - 15 60

NT1 Tuổi gà thí nghiệm, ngày 1 Tuổi gây nhiễm, ngày 18 7,5x104 S. enterica gây nhiễm(1), CFU/mL B. subtilis bổ sung(2), g/kg thức ăn 5 - Oxtetracycline, mg/kg thức ăn (3) - - Enrofloxacine, mg/kg thức ăn (4) - - 60 60 Số ngày thí nghiệm (1) S. enterica phân lập từ gà bệnh, gây nhiễm qua đường uống 0,5ml/con (Knap et al., 2011). (2) Liều B. subtilis hữu dụng được chọn ở thí nghiệm 1 (107CFU/g) (3), (4) Liều oxtetracycline và enrofloxacine thí nghiệm tham khảo từ Pattison, 2008 Chỉ tiêu khảo sát:

- Mổ khảo sát gà (5 gà/nghiệm thức) ở 21 và 42 ngày tuổi, ghi nhận bệnh tích, thu mẫu bệnh phẩm ở gan và lách, trữ lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm kiểm tra vi khuẩn gây bệnh.

- Ghi nhận các biểu hiện bệnh lý của gà, tỉ lệ chết ở các nghiệm thức.

- Các chỉ tiêu lượng thức ăn đưa vào, tăng trọng, tăng khối lượng toàn kỳ, hệ

số chuyển hóa thức ăn ghi nhận giống thí nghiệm 1.

3.3.4.5. Thí nghiệm 3:

Mục đích: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic so với kháng sinh ở gà

gây nhiễm với E. coli.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên theo phương pháp của Teo and Tan (2006) có cải tiến như sau: 2 nghiệm thức đối chứng (ĐC âm, ĐC dương) cho ăn khẩu phần ăn bình thường của trại trong suốt quá trình nuôi. Các nghiệm thức thí nghiệm (bổ sung probiotic hoặc kháng sinh) được bố trí như sau:

NT1: Bổ sung B. subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời gian

thí nghiệm.

NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ

ngày gây nhiễm.

NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ

ngày gây nhiễm.

Gây nhiễm E. coli cho các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, và ĐC (+) vào

ngày thứ 18, mỗi nghiệm thức gồm 30 gà và lặp lại 3 lần.

64

Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày qua Bảng 3.5

Bảng 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3

Chỉ tiêu theo dõi

ĐC (+) ĐC (-)

Nghiệm thức NT3 1 18 5x106 - - 15 60

NT2 1 18 5x106 - 50 - 60

1 18 5x106 - - - 60

NT1 1 18 5x106 5 - - 60

1 - - - - - 60

Tuổi gà thí nghiệm, ngày Tuổi gây nhiễm, ngày E. coli gây nhiễm(1), CFU/mL B. subtilis bổ sung(2), g/kg thức ăn Oxtetracycline, mg/kg thức ăn (3) Enrofloxacine, mg/kg thức ăn (4) Số ngày thí nghiệm (1) E. coli phân lập từ gà bệnh, gây nhiễm qua đường uống 0,5ml/con (Teo and Tan,2006). (2) Liều B. subtilis hữu dụng được chọn ở thí nghiệm 1 (107CFU/g) (3), (4) Liều oxtetracycline và enrofloxacine thí nghiệm tham khảo từ Pattison (2008). Chỉ tiêu khảo sát:

- Mổ khảo sát gà (5 gà/nghiệm thức) ở 21 và 42 ngày tuổi, ghi nhận bệnh tích, thu mẫu bệnh phẩm ở gan và lách, trữ lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm kiểm tra vi khuẩn gây bệnh.

- Ghi nhận các biểu hiện bệnh lý của gà, tỉ lệ chết ở các nghiệm thức.

- Các chỉ tiêu lượng thức ăn đưa vào, tăng trọng, tăng khối lượng toàn kỳ, hệ

số chuyển hóa thức ăn ghi nhận giống thí nghiệm 1.

3.4. Xử lý số liệu

Số liệu thô thí nghiệm được xử lý sơ bộ trên bảng tính Microsoft Excel 2010,

sau đó phân tích phương sai (ANOVA) theo mô hình tuyến tính tổng quát

(General Linear Model) trên phần mềm Minitab 16.1.

65

CHƢƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Phân lập và định danh vi khuẩn B. subtilis

4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus spp.

Từ 70 mẫu đất và 70 mẫu phân tại các trại gà ở 6 tỉnh và thành phố Cần Thơ, mẫu đƣợc xử lí nhiệt, pha loãng, cấy tran và ủ ở 30ºC trong 24 giờ, kết thúc thời gian ủ, dựa vào hình dạng khuẩn lạc, tiến hành chọn riêng từng dòng vi khuẩn và cấy chuyển nhiều lần cho đến khi thuần. Kết quả thu đƣợc tổng cộng 296 chủng vi khuẩn có hình que, gram dƣơng và có khả năng sinh bào tử khi quan sát sau 48 giờ. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào các chủng Bacillus spp. đƣợc trình bày ở Bảng 4.1.

Bảng 4.1: Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào quan sát dƣới kính hiển vi của 296 phân lập vi khuẩn

Chỉ tiêu quan sát Thể loại

Đặc điểm khuẩn lạc Màu sắc

Hình dạng

Đƣờng kính khuẩn lạc

Hình thái tế bào Hình dạng

Vị trí và hình dạng bào tử

Trắng đục Trắng kem Vàng nhạt Vàng Cam Bất định, lồi, nhô cao, khô Bất định, lồi, nhô cao, ƣớt Bất định, phẳng, khô Bất định, phẳng, ƣớt Tròn, lồi, nhô cao, khô Tròn, lồi, nhô cao, ƣớt Tròn, phẳng, khô Tròn phẳng, ƣớt 1-3 mm 3-5 mm Que, hai đầu bầu Que, hai đầu vuông Ở một đầu Trung tâm

Hình dạng tế bào mang bào tử Không biến đổi

Số lƣợng 230 44 4 11 7 41 39 5 32 75 82 3 19 284 12 78 218 91 205 237 59 Tỉ lệ (%) 77,70 14,86 1,35 3,72 2,36 13,85 13,18 1,69 10,81 25,34 27,70 1,01 6,42 95,95 4,05 26,35 73,65 30,74 69,26 80,07 19,93 Phình

66

Theo UK Standards for Microbiology (2015), Bacillus có hơn 268 loài nên việc xác định theo phƣơng pháp truyền thống rất phức tạp và mất nhiều thời gian, bên cạnh đó, quá trình này đòi hỏi phải có sự kết hợp các kiểm định sinh hóa và kỹ thuật sinh học phân tử để định danh chính xác các loài Bacillus spp. Khuẩn lạc B. subtilis có màu trắng đục, khô, bìa bất định, kích thƣớc tế bào lớn hơn 3 µm (David et al., 2016). Bảng 4.1 cho thấy có đến 77,7% khuẩn lạc màu trắng đục, 13,85% khuẩn lạc có bìa bất định, bề mặt khô. Bên cạnh đó, kết quả ghi nhận hình thái tế bào vi khuẩn quan sát dƣới kính hiển vi có nhiều điểm tƣơng đồng với B. subtilis (trực khuẩn Gram dƣơng, bào tử ở trung tâm và không làm biến đổi hình dạng tế bào), điều này cho thấy trong 296 chủng vi khuẩn có nhiều chủng có tiềm năng là B. subtilis. Các khuẩn lạc của 296 chủng đƣợc tách ròng bằng phƣơng pháp cấy ria và trữ trong dung dịch NB (nutrient broth) có chứa 16% glycerol, bảo quản trong tủ âm sâu 86oC.

Hình 4.1. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus spp. trên môi trƣờng TSA và hình thái dƣới kính hiển vi (100X)

4.1.2. Kết quả định danh Bacillus spp.

4.1.2.1. Định danh bằng các phản ứng sinh hóa

Từ 296 chủng, tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa theo trình tự: âm tính với lecithinase, dƣơng tính với catalase, VP, amylase, cellulase và có khả năng phát triển ở 50oC (Cowan and Steel, 2003). Các chủng vi khuẩn không đạt yêu cầu sẽ đƣợc loại bỏ dần, cuối cùng, các chủng vi khuẩn tƣơng đồng với 6 đặc điểm sinh hóa của B. subtilis sẽ đƣợc định danh bằng bộ kit API CH50B. Kết quả kiểm tra sinh hóa đƣợc trình bày ở Bảng 4.2.

67

Bảng 4.2: Kết quả sàng lọc vi khuẩn bằng các test sinh hóa

Chỉ tiêu

Số lƣợng

Kết quả

Lecithinase Catalase VP Amylase Phát triển ở 50ºC Cellulase

296 230 230 169 91 49

Dƣơng tính 66 230 169 91 49 29

Âm tính 230 0 61 78 42 20

Theo qui trình chọn lọc, phản ứng sinh hóa đầu tiên đƣợc thực hiện là lecithinase, đây là enzyme có khả năng phá vỡ hệ thống mô tế bào, gây ngộ độc (Sharaf, 2014). Do đó, test lecithinase là chỉ tiêu quan trọng giúp loại bỏ các loài Bacillus có độc tính. Theo UK Standards for Microbiology Investigations (2015), các loài Bacillus đều âm tính với lecithinase, ngoại trừ nhóm Bacillus cereus. Kết quả kiểm tra cho thấy 66/296 chủng dƣơng tính với lecithinase, 66 chủng này sẽ loại bỏ, không kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa tiếp theo.

Tiếp tục thực hiện phản ứng sinh hóa thứ 2 (catalase) với 230 chủng còn lại, tất cả đều cho kết quả dƣơng tính nghĩa là các chủng này có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí. Cowan and Steel (2003) đã ghi nhận phần lớn các loài Bacillus đều có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí, nên phản ứng này giúp nhận diện vi khuẩn Bacillus.

Phản ứng VP giúp xác định sản phẩm cuối trong tiến trình lên men đƣờng của vi khuẩn có phải là acid hay không (Talaiekhozani et al., 2015), vì B. subtilis dƣơng tính với phản ứng này nên thực hiện phản ứng VP sẽ giúp loại bớt các chủng không phải B. subtilis, kết quả có 169/230 chủng dƣơng tính, 61 chủng âm tính sẽ loại bỏ.

Phản ứng sinh hóa thứ 4 là amylase, 1 chỉ tiêu sinh hóa giúp nhận biết khả năng thủy phân tinh bột. Vi khuẩn B. subtilis từ lâu đã trở thành nguồn sản xuất chính enzyme amylase, và nhiều enzyme công nghiệp khác (Sushma et al., 2012). Do đó các B. subtilis sẽ dƣơng tính với amylase, những chủng âm tính sẽ loại bỏ. Kết quả có 78 chủng âm tính, và 91 chủng dƣơng tính.

Theo Nicholson et al. (2000), trong cùng một loài, bào tử vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt độ cao hơn so với tế bào sinh dƣỡng, nhờ khả năng này giúp vi

68

khuẩn chống chịu tốt với những điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt của môi trƣờng. Bào tử B. subtilis đã đƣợc ghi nhận có khả năng phát triển ở 50oC (Cowan and Steel, 2003). Kết quả khảo sát cho thấy có 49/91 chủng có khả năng phát triển ở 50oC.

+ -

Test lecithinase

Test catalase (+) : bọt khí sủi mạnh

1

3

4

5

6

7

2

Ống 1: ống chứng (-) Ống 2,3,4,5,6,7 : ống chứa vi khuẩn Bacillus, phản ứng (+) môi trƣờng có màu hồng

VP (+)

+

-

Test cellulase (+) Test amylase

Hình 4.2. Kết quả test sinh hóa

69

Cuối cùng, phản ứng cellulase đƣợc tiến hành nhằm xác định khả năng thủy phân cellulose của vi khuẩn. Theo Immanuel et al. (2006), vi khuẩn Bacillus là nguồn sản xuất cellulase công nghiệp, nên một số loài Bacillus trong đó có B. subtilis có khả năng này. Kết quả của chúng tôi phù hợp với nhận định của Immanuel et al., trong 49 chủng khảo sát, có 29 chủng dƣơng tính với cellulase, 29 chủng vi khuẩn này sẽ đƣợc tiếp tục định danh bằng bộ kit API CH50B để xác định loài.

4.1.2.2. Định danh bằng bộ kit API CH50B

Sau khi tiến hành kiểm tra các đặc tính sinh hóa, có 29 chủng đã thỏa đặc

tính của B. subtilis, tuy nhiên để khẳng định các chủng này có thuộc loài B. subtilis hay không thì phải thực hiện các phản ứng chuyên biệt hơn. Bộ KIT API CH50 đƣợc sử dụng để định danh tiếp theo, kết quả định danh đƣợc trình bày ở Bảng 4.3.

Bảng 4.3: Kết quả định danh 29 chủng vi khuẩn bằng kit API CH50B

Ký hiệu chủng ID (%) Số lƣợng

ST08, DT29 ST06 VL28 AG07, AG49 AG27, VL05, VL16 AG19, DT26 KG12 AG17, VL41 ST10, KG22, KG36 CT11 KG09, DT11 AG60, KG29, DT30 DT19 AG14, DT40 ST41 HG20 CT20 Loài B. subtilis/ B. amyloliquefaciens B. subtilis/ B. amyloliquefaciens B. subtilis/ B. amyloliquefaciens B. subtilis/ B. amyloliquefaciens B. subtilis/ B. amyloliquefaciens B. subtilis/ B. amyloliquefaciens B. subtilis/ B. amyloliquefaciens B. subtilis/ B. amyloliquefaciens B. subtilis/ B. amyloliquefaciens B. subtilis/ B. amyloliquefaciens B. subtilis/ B. amyloliquefaciens B. subtilis/ B. amyloliquefaciens B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis B. licheniformis 99,9 99,8 99,7 99,5 99,3 98,7 98,4 98,0 97,3 96,2 95,7 90,7 99,5 98,5 97,0 93,6 90,6 2 1 1 2 3 2 1 2 3 1 2 3 1 2 1 1 1

Mặc dù có rất nhiều tài liệu mô tả đặc tính sinh hóa và đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bacillus (trực khuẩn Gram dƣơng, sinh trƣởng hiếu khí, có khả năng thành lập bào tử khi gặp điều kiện bất lợi, …) nhƣ Smith et al. (1946); và Cowan

70

and Steel (2003), tuy nhiên, việc định danh nhóm vi sinh vật này vẫn đƣợc xem là phức tạp (King and Phillips, 1978). Do đó, cần có sự kết hợp giữa các phƣơng pháp sinh hóa truyền thống và bộ kit API CH50B để định danh. Trong 29 chủng định danh bằng kit API, có 23 chủng đƣợc xác định là B. subtilis/ B. amyloliquefaciens với phần trăm chính xác từ 90,7% đến 99,9%. Trong đó có 9 chủng xác định là B. subtilis với độ chính xác trên 99% là AG27, VL05, VL16, AG07, AG49, VL28, ST06, ST08, DT29; 6 chủng còn lại thuộc loài B. licheniformis.

50 phản ứng sinh hóa trong kit API

Đọc kết quả bằng phần mềm API Hình 4.3. Định danh bằng kit API CH50B.

71

Từ các kết quả trên, các phản ứng sinh hóa đã giúp loại bỏ các chủng không thuộc loài B. subtilis và kit API CH50B đã giúp loại bỏ thêm 6 chủng thuộc loài B. licheniformis (DT19, AG14, DT40, ST41, HG20, CT20). Còn lại 23 chủng sẽ tiến hành giải trình tự gen để xác định chính xác đến loài B. subtilis.

4.1.2.3. Định danh bằng PCR và giải trình tự gen 16S rRNA

Thông thƣờng, Bacillus đƣợc xác định bằng các xét nghiệm sinh hóa (Vaerewijck et al., 2001). Tuy nhiên, các qui trình kỹ thuật này khá phức tạp và tốn kém, hơn nữa, một số loài vi khuẩn thƣờng không đƣợc ghi nhận đầy đủ các đặc điểm sinh hóa khiến cho việc nhận diện chính xác trở nên khó khăn hơn (Khamis et al., 2003). Cho đến nay, với sự phát triển của kỹ thuật PCR và giải trình tự gen 16S rRNA đã giúp đơn giản hóa việc định danh và phát hiện các loài vi khuẩn một cách đặc hiệu (Wang et al., 2003; Wu et al., 2006). Phƣơng pháp giải trình tự gen 16S ngày nay đƣợc sử dụng nhƣ một phƣơng pháp hiện đại để phân loại và xác định các loài vi khuẩn, bao gồm cả giống Bacillus.

Kết quả điện di sản phẩm PCR

Để nhận diện chính xác các chủng vi khuẩn đã đƣợc phân lập và loại trừ bằng các phản ứng sinh hóa, 23 chủng vi khuẩn xác định là B. subtilis và B. amyloliquefaciens đƣợc ly trích DNA theo phƣơng pháp của Bai et al. (2012) và sử dụng cặp mồi 27F và 1492R (Saminathan and Narayanan, 2015) để khuếch đại vùng 16S rRNA của vi khuẩn.

Các giá trị đo OD cho thấy mẫu DNA ly trích đƣợc có chất lƣợng tốt (tỷ lệ hấp thụ ánh sáng giữa hai bƣớc sóng 260nm / 280nm trong khoảng 1,8 đến 2,0) và nồng độ DNA đƣợc ghi nhận trong Phụ lục C.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 23 chủng vi khuẩn cho thấy đã khuếch đại thành công đoạn gen với kích thƣớc 1500bp (Hình 4.4)

72

Hình 4.4. Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn B. subtilis trong nghiên cứu (M: thang chuẩn 100bp; ST10, DT11, …: sản phẩm PCR của 23 chủng VK khảo sát; C: đối chứng âm)

Giải trình tự gen 16S rRNA

Giải trình tự nucleotide gen 16S rRNA là kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng dụng ngày càng phổ biến để xác định các loài vi sinh vật mới với kết quả rất đáng tin cậy (Patel, 2001). Để xác định danh pháp đến mức loài của các chủng vi khuẩn phân lập, các chủng vi khuẩn sau khi thực hiện phản ứng PCR sẽ tiến hành giải trình tự nucleotide ở đoạn gen 16S rRNA. Trình tự nucleotide của 23 chủng vi khuẩn đƣợc chọn sau khi giải mã tiến hành so sánh với các loài vi khuẩn đƣợc lƣu trữ từ ngân hàng dữ liệu gen của NCBI. Kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 4.4.

73

Bảng 4.4: Kết quả định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự gen 16S rRNA.

Số TT

Mức độ tƣơng đồng - ID (%) Tỉ lệ nucleotide tƣơng đồng Ký hiệu chủng Loài vi khuẩn từ ngân hàng dữ liệu gen của NCBI

B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 CT11 AG07 AG17 AG19 AG27 AG49 AG60 ST06 ST08 ST10 VL05 VL16 VL28 VL41 KG09 KG12 KG22 KG29 KG36 DT11 DT26 DT29 DT30 Mã số lƣu trữ trong ngân hàng dữ liệu gen NR113265.1 NR113265.1 CP007173.1 NR112116.1 AB201120.1 CP007173.1 CP002468.1 KP307830.1 NR112116.1 NR112116.1 CP002468.1 KP307830.1 CP011051.1 CP011051.1 NR112116.1 AB201120.1 CP010053.1 AB201120.1 AB201120.1 B. amyloliquefaciens CP011686.1 B. amyloliquefaciens CP011686.1 AB201120.1 AB201120.1 B. subtilis B. subtilis 100 100 100 100 99 100 100 100 100 100 100 100 100 100 99 100 99 100 100 100 100 100 100 500/500 500/500 510/510 518/518 533/535 518/518 511/511 517/517 520/520 517/517 518/518 517/517 511/511 526/526 522/525 534/534 526/527 535/535 530/530 516/516 527/527 525/525 530/530

Sau khi giải trình tự và xử lý bằng phần mềm BLAST so sánh kết quả trên NCBI, kết quả Bảng 4.4 cho thấy có 21 trong 23 chủng đƣợc xác định là B. subtilis với mức độ tƣơng đồng cao (99%-100%), 2 chủng còn lại là B. amyloliquefaciens.

Theo Janda and Abbott (2007) đề nghị độ dài trình tự gen 16S khi giải mã để định danh loài cần ít nhất từ 500 đến 525 bp và lý tƣởng nhất khi độ dài đạt 1300 đến 1500 bp và theo Bosshard et al. (2003) khi so sánh trình tự đoạn gen với mức độ tƣơng đồng đạt ≥99% thì xác định chính xác đến mức độ loài, khi mức độ

74

tƣơng đồng nằm trong khoảng ≥ 95% và < 99% thì xác định đƣợc ở mức độ chi, nhƣ vậy với kết quả giải trình tự gen của 23 chủng với trình tự độ dài gen trên 525 bp và tỉ lệ tƣơng đồng đạt từ 99% trở lên đủ tin cậy cho việc định danh loài vi khuẩn.

Với kết quả tra cứu trên NCBI, dựa vào mức độ tƣơng đồng trình tự đoạn gen 16S rRNA ở các chủng đƣợc giải trình tự so sánh trên hệ thống ngân hàng gen cho thấy, 21 chủng vi khuẩn khi giải trình tự và so sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI đều trùng khớp với các chủng vi khuẩn đƣợc xác định là B. subtilis với mức độ tƣơng đồng ≥ 99% (Phụ lục C.4. Kết quả giải trình tự 23 chủng).

Tóm lại, từ 296 chủng vi khuẩn, sau khi tiến hành các bƣớc chọn lọc kiểm tra các phản ứng sinh hóa, và định danh bằng bộ kit API, cuối cùng ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA, có 21 chủng vi khuẩn đƣợc xác định là B. subtilis. 21 chủng B. subtilis này sẽ thực hiện các bƣớc tuyển chọn probiotic để chọn ra chủng tối ƣu có khả năng phòng bệnh đƣờng tiêu hóa trên gà.

Tóm tắt quá trình phân lập và định danh vi khuẩn B. subtilis đƣợc thể hiện

qua Hình 4.5

75

Hình 4.5. Sơ đồ chọn lọc và định danh vi khuẩn B. subtilis

76

4.2. Kết quả khảo sát các đặc tính probiotic

4.2.2. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao

Theo Sottnik (2002) gia cầm có thân nhiệt khoảng 41,5oC, cao hơn các loài động vật hữu nhũ, do đó, ứng viên probiotic sử dụng trong chăn nuôi gia cầm phải có khả năng phát triển cao hơn nhiệt độ bình thƣờng (30-37oC). Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao thể hiện qua Bảng 4.5

Bảng 4.5. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng B. subtilis

Chủng VK Số lƣợng chủng

1 1 3 Nhiệt độ khảo sát 55oC - + + 60oC - - + 50oC + + +

12 + + -

6 + - -

ĐC 1 ĐC 2 KG36, AG19, VL05 AG07, AG27, AG49, AG60, VL16, VL28, VL41, ST08, DT30, KG09, KG12, KG22 CT 11, AG17, ST06, ST10, DT29, KG29 Tổng cộng 21 21 15 3

Ghi chú : + có khả năng sống đƣợc trong môi trƣờng ở nhiệt độ khảo sát -

không có khả năng sống đƣợc trong môi trƣờng ở nhiệt độ khảo sát

ĐC1: chủng đối chứng B. subtilis (ATCC ® 19659™) ĐC2: chủng đối chứng (sản phẩm trên thị trƣờng)

Kết quả trình bày ở Bảng 4.5 cho thấy tất cả 21 chủng vi khuẩn đều có thể phát triển ở mốc nhiệt độ 50oC. Tuy nhiên, ở 55oC, 6 chủng vi khuẩn không thể phát triển, 15 chủng sống đƣợc, và cuối cùng, ở mốc nhiệt độ 60oC, chỉ có 3 chủng (AG19, VL05, KG36) có thể chịu đƣợc. Hai chủng đối chứng ĐC1 và ĐC2 cũng không chịu đƣợc đến 60oC. Điều này cho thấy, dù cùng thuộc loài B. subtilis, và cùng có khả năng tạo bào tử nhƣng khả năng chịu nhiệt của tế bào sinh dƣỡng ở các chủng hoàn toàn có thể khác nhau. Kết quả này phù hợp với kết quả của Praveen Kumar et al. (2014) khi khảo sát khả năng chịu nhiệt của 120 giống Bacillus thì có 82 chủng có khả năng chịu đƣợc ở nhiệt độ 50oC. Khả năng chịu nhiệt của B. subtilis cũng đƣợc ghi nhận qua một nghiên cứu khác của Andriani et al. (2017) khi khảo sát tính chịu nhiệt của 2 loài vi khuẩn B. subtilis

77

và B. licheniformis đã ghi nhận cả 2 đều chịu đƣợc ở các nhiệt độ 40oC, 50oC và 60oC.

Theo Bergey (1919), vi khuẩn có khả năng phát triển từ 50oC trở lên đƣợc gọi là vi khuẩn chịu nhiệt. Hình 4.6 cho thấy 100% các chủng B. subtilis có thể phát triển đƣợc ở 50oC, (71,43% sống ở 55oC, và 14,29% sống đƣợc ở 60oC). Vậy 21 chủng B. subtilis phân lập đều có khả năng chịu nhiệt, hoàn toàn có thể đáp ứng khi đƣợc dung nạp vào cơ thể gia cầm. Nhƣ vậy ở chỉ tiêu chịu nhiệt thì 21 chủng B. subtilis khảo sát đều có thể chọn làm probiotic.

Tỉ lệ %

100

100

71.4

80

60

40

14.28

20

0

55ᵒC

60ᵒC

50ᵒC Nhiệt độ khảo sát (oC)

Hình 4.6. Khả năng chịu nhiệt của các chủng B. subtilis phân lập

4.2.2. Khả năng nhạy/ kháng kháng sinh

Khả năng nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn probiotic đƣợc xem là một trong những tiêu chí quan trọng trong tiêu chuẩn chọn lọc vi khuẩn probiotic (Hummel et al., 2007), vì theo Gueimonde et al. (2013), nếu vi khuẩn probiotic còn nhạy với kháng sinh thì sẽ an toàn về mặt sinh học, vì không chứa plasmid hoặc các gen kháng kháng sinh của các kháng sinh đƣợc sử dụng.

Theo Hombach et al. (2013), các chủng vi khuẩn sẽ nhạy cảm với các loại kháng sinh ở mức độ khác nhau và chúng thể hiện sự khác nhau đó bằng đƣờng kính vòng vô trùng xung quanh đĩa tẩm kháng sinh khi có sự tiếp xúc giữa vi khuẩn và kháng sinh. Kết quả khảo sát khả năng nhạy/ kháng kháng sinh của 21 chủng B. subtilis đƣợc trình bày ở Bảng 4.6.

Kết quả cho thấy 21 chủng B. subtilis, gồm cả 2 chủng đối chứng còn nhạy với hầu hết 9 loại kháng sinh với tỉ lệ khá cao (hơn 50%), cao nhất là 5 chủng AG19, AG27, AG60, VL05, VL28 nhạy 7/9 loại kháng sinh, chiếm tỉ lệ 78%, và chỉ kháng 1-2 loại kháng sinh. Nhóm thứ 2 gồm 5 chủng AG49, CT11, VL16, ST06, và KG22 nhạy 6 loại kháng sinh, trung gian 1-2 loại và kháng 1-2 loại

78

kháng sinh. Nhóm thứ 3 gồm 7 chủng (AG07, AG17, ST08, VL41, DT29, KG09, KG12) nhạy với 5 loại kháng sinh, trung gian 2-3 loại và kháng 1-2 loại kháng sinh. Nhóm còn lại gồm 4 chủng ST10, DT30, KG29, KG36 nhạy với 5 loại kháng sinh, nhƣng kháng từ 3-4 loại kháng sinh. Chủng vi khuẩn ST10 có tỉ lệ kháng kháng sinh cao nhất trong 21 chủng B. subtilis khảo sát (kháng 4/9 loại kháng sinh) tuy nhiên tỉ lệ nhạy kháng sinh vẫn trên 50% trong tổng số kháng sinh khảo sát (56%). Theo Wright (2005) và Panel (2008) vi khuẩn probiotic không nên mang gen kháng kháng sinh, vì chúng có thể hoạt động nhƣ vector truyền gen kháng kháng sinh cho vật chủ là các động vật nuôi, đây lại là nguồn thực phẩm chủ yếu cho ngƣời. Bằng cách này, vi khuẩn kháng kháng sinh ở động vật nuôi gián tiếp làm gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh ở ngƣời, khiến gặp khó khăn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn (Ashraf and Shad, 2011). Do đó, chọn lọc các vi khuẩn probiotic an toàn cho ngƣời và động vật phải là các chủng vi khuẩn càng nhạy với nhiều kháng sinh càng tốt.

Bảng 4.6: Kết quả kháng sinh đồ của 21 chủng B. subtilis chọn lọc

Nhạy Trung gian Kháng Chủng vi khuẩn % % %

Số lƣợng kháng sinh 6 4 33 50

Số lƣợng kháng sinh 2 3 - Số lƣợng kháng sinh 1 2 2 11 22 22 67 44 78

7 17 11 1 78 1

33 11 1 67 2

17 22 2 6 67 1

33 22 2 56 2

5 50 11 1 56 3

5 17 44 33 4 3 ĐC 1 ĐC 2 AG19 AG27, AG60, VL05, VL28 ST06 CT11, AG49, VL16, KG22 AG07, AG17, ST08, DT29, VL41, KG09, KG12 ST10, DT30 KG29, KG36 56 56 - 1

Ghi chú : Vòng kháng khuẩn ≥ 20 mm : Nhạy Vòng kháng khuẩn từ 15-19 mm : Trung gian Vòng kháng khuẩn ≤ 14 mm : Kháng ĐC1: chủng đối chứng B. subtilis (ATCC ® 19659™)

ĐC2: chủng đối chứng (sản phẩm trên thị trƣờng)

79

Tỉ lệ nhạy cảm (%) 120%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

80%

% nhạy

57%

57%

60%

% kháng

33%

40%

24%

14%

20%

% trung gian

5%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

0%

ERY

GEN

DOX

NOR

OTC

SXT

COL

ENR

NEO

Kháng sinh khảo sát

Hình 4.7. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của 21 chủng vi khuẩn B. subtilis

Hình 4.7 cho thấy 21 chủng B. subtilis đều nhạy với hầu hết các loại kháng sinh với tỉ lệ khá cao từ 100% các chủng nhạy với erythromycin, enrofloxacin, doxycyclin, norfloxacin, sulfadimidin - trimethoprim, đến gentamycin (24% nhạy, 57% trung gian, 19% kháng), neomycin (14% nhạy, 57% trung gian, 29% kháng), oxytetracylin (33% nhạy, 33% trung gian, 33% kháng), thấp nhất là colistin chỉ có 5% nhạy. Một điều đáng ghi nhận là có đến 95% chủng B. subtilis trong khảo sát này kháng với kháng sinh colistin, điều này có thể là do colistin là kháng sinh đƣợc sử dụng rất phổ biến trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Huỳnh Nam (2006) cho thấy Bacillus spp. đã kháng với colistin, và một nghiên cứu của Sampa et al. (2012) khi khảo sát khả năng nhạy cảm kháng sinh đối với các chủng vi khuẩn phân lập từ nội tạng gà, kết quả ghi nhận tất cả các chủng đều kháng với colistin. Một số nghiên cứu trƣớc đây của El-Naggar (2004), Thirabunyanon and Thongwittaya (2012), Vũ Thanh Thảo và ctv (2014) đã báo cáo các chủng B. subtilis còn nhạy với hầu hết với các kháng sinh, gồm enrofloxacin, erythromycin, gentamycin, norfloxacin, oxytetracylin và gentamycin.

80

Hình 4.8. Kết quả kháng sinh đồ của chủng B. subtilis AG27 và VL28

Qua khảo sát 21 chủng B. subtilis phân lập đƣợc chúng tôi nhận thấy trên 50% các chủng còn nhạy với nhiều kháng sinh và cả 21 chủng đều nhạy với nhiều kháng sinh hơn so với 2 chủng đối chứng. Kết quả này cho thấy về chỉ tiêu nhạy với kháng sinh thì cả 21 chủng B. subtilis khảo sát đều có khả năng chọn làm probiotic.

4.2.3. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

4.2.3.1. Khả năng sinh enzyme amylase, protease và lipase

Kết quả khảo sát khả năng sinh 3 loại enzyme đƣợc trình bày ở Bảng 4.7.

Bảng 4.7: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 21 chủng B. subtilis

Amylase + + Protease + + Lipase - -

+ + +

+ + - Vi khuẩn ĐC1 ĐC2 AG27, AG60, VL05, VL28, VL41, DT29, KG09, KG12, KG22, KG36 CT11, AG07, AG17, AG19, AG49, VL16, ST06, ST08, ST10, DT30, KG29

Ghi chú (+) : Có khả năng sinh enzyme, (-): không có khả năng sinh enzyme

ĐC1: chủng đối chứng B. subtilis (ATCC ® 19659™)

ĐC2 : chủng đối chứng (sản phẩm trên thị trƣờng)

Theo Parsons (2004) các enzyme ngoại bào nhƣ amylase, protease, và lipase đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa thức ăn, giúp thức ăn đƣợc hấp thu dễ dàng. Stein (2005) ghi nhận B. subtilis là nguồn sản xuất enzyme quan trọng nhất từ vi khuẩn vì hệ enzyme của B. subtilis rất đa dạng gồm amylase (Konsoula and Kyriakides, 2005), protease và lipase (Ruiz et al., 2003). Ngoài ra, B. subtilis có khả năng thích nghi cao với những điều kiện biến đổi của môi

81

trƣờng (Nicolas et al., 2012); hơn nữa, B. subtilis đƣợc đánh giá là an toàn bởi tổ chức Lƣơng nông thế giới (Baysal, 2017). Do đó, để trở thành một probiotic thì chủng B. subtilis phải có khả năng sinh đƣợc nhiều loại enzyme. Theo Morikawa (2006) amylase, protease và lipase do B. subtilis sản xuất chiếm 60% trong tổng sản lƣợng enzyme công nghiệp. Đặc biệt, B. subtilis đứng đầu trong số các vi khuẩn đƣợc sử dụng trong sản xuất amylase vì amylase do B. subtilis sinh ra có đặc tính bền nhiệt (Bano et al., 2011).

Kết quả trình bày ở Bảng 4.7 cho thấy 21 chủng B. subtilis đều có khả năng sinh amylase, hoàn toàn phù hợp với đặc điểm sinh hóa mô tả của loài. Bên cạnh đó, B. subtilis cũng là vi khuẩn chủ lực để sản xuất enzyme protease (Yandri et al., 2008) vì theo ghi nhận của Vangalapati et al. (2012) khi so sánh với sản lƣợng protease thu đƣợc từ loài Bacillus khác nhƣ B. licheniformis thì sản lƣợng enzyme từ B. subtilis thu nhận đƣợc cao hơn. Kết quả định tính khả năng sinh protease của 21 chủng B. subtilis cho thấy 100% các chủng dƣơng tính với protease, tức là tất cả các chủng B. subtilis đều có khả năng sinh đƣợc protease. Tuy nhiên, chỉ một số ít chủng vi khuẩn có hoạt tính lipase dù các chủng này cùng thuộc một loài B. subtilis, nhƣng không phải tất cả đều có thể sinh đƣợc lipase. Kết quả kiểm tra cho thấy chỉ có các chủng AG27, AG60, VL05, VL28, VL41, DT29, KG09, KG12, KG22, KG36 dƣơng tính với test lipase. Kết quả này phù hợp với kết quả của những nghiên cứu trƣớc đây của Okorie và Olasupo (2013). Cụ thể, khi khảo sát trên 7 chủng B. subtilis, chỉ có duy nhất chủng Bs2 phân lập từ sản phẩm lên men “Ugba” thể hiện đầy đủ hoạt tính thủy phân tinh bột, gelatine và chất béo trong sữa, các chủng còn lại chỉ thể hiện khả năng phân hủy protein và tinh bột. Theo nghiên cứu của Ngô Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà (2009) trên 236 chủng Bacillus phân lập từ mẫu đất và nƣớc thải, tất cả các chủng đều có thể sinh amylase, và protease nhƣng chỉ có 2 chủng T20 và M27 có thể sinh đƣợc enzyme lipase.

Amylase (+) Protease (+)

Lipase (+)

Hình 4.9. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis AG27

82

Trong thức ăn của gia cầm có đầy đủ các thành phần đạm, đƣờng và chất béo do đó cần có đủ 3 loại enzyme amylase, protease và lipase để tiêu hóa đƣợc tốt hơn. Hơn nữa, tiêu hóa tốt chất béo có trong thức ăn là 1 trong những yếu tố để giảm tỉ lệ bệnh tiêu chảy (Chen et al., 2014). Do đó probiotic sử dụng cho gia cầm trong phòng bệnh đƣờng tiêu hóa cần chứa cả 3 loại enzyme amylase, protease và lipase. Trong 21 chủng B. subtilis khảo sát chỉ có 10 chủng có khả năng sinh cả 3 loại enzyme, 10 chủng này sẽ tiến hành định lƣợng kiểm tra hoạt lực enzyme.

4.2.3.2. Định lƣợng enzyme amylase, protease, và lipase

Các chủng B. subtilis có khả năng sinh đƣợc cả 3 loại enzyme amylase, protease và lipase đƣợc tiến hành định lƣợng enzyme. Kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 4.8.

Bảng 4.8. Kết quả hoạt lực enzyme amylase, protease, lipase của 10 chủng B. subtilis khảo sát

STT Chủng vi khuẩn

ĐC1: chủng đối chứng B. subtilis (ATCC ® 19659™)

ĐC2: chủng đối chứng (sản phẩm trên thị trƣờng)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ĐC1 ĐC2 VL41 KG22 VL28 DT29 KG09 AG27 AG60 KG36 KG12 VL05 Hoạt lực enzyme (U/mL) Protease 1,07 1,08 3,43 0,43 4,71 1,78 0,93 3,63 5,80 0,91 0,99 2,65 Amylase 0,38 0,36 0,92 0,82 0,78 0,40 0,36 0,34 0,34 0,30 0,30 0,26 Lipase - - 0,06 0,20 0,08 0,02 0,02 0,08 0,06 0,02 0,10 0,08

Kết quả định lƣợng hoạt lực amylase trình bày ở Bảng 4.8 cho thấy hoạt lực amylase của các chủng sinh ra là khác nhau, dao động từ 0,3-0,92 U/mL, có thể chia thành 3 nhóm, nhóm có hoạt lực amylase cao nhất là VL41, KG22, và VL28 với hoạt lực amylase từ 0,78-0,92 U/ mL, kế đến là nhóm trung bình, gồm AG27, AG60, DT29, và KG09 (0,34-0,40 U/ mL). Hoạt lực amylase của 2 chủng

83

đối chứng cũng thuộc nhóm trung bình (0,36-0,38 U/mL). Cuối cùng là nhóm VL05, KG12, và KG36 có hoạt lực từ 0,26-0,30 U/mL. Hoạt lực amylase của 10 chủng B. subtilis trong khảo sát này cao hơn so với hoạt lực amylase trong nghiên cứu của Khan and Priya (2011), trong nghiên cứu này amylase chỉ đạt 0,115 U/mL. Tuy nhiên, nghiên cứu của Vũ Thanh Thảo và ctv (2014) về hoạt lực amylase của chủng Bs02 ghi nhận chủng này có hoạt lực cao hơn, đạt 1,74 U/mL.

Kết quả kiểm tra hoạt lực protease ghi nhận 2 chủng AG60 và VL28 có hoạt lực cao nhất, AG60 là 5,8 U/mL, VL28 là 4,71 U/mL. Trong khi đó, AG27, VL05, và VL41 chỉ đạt hoạt lực trung bình từ 2,65-3,42 U/ mL; còn lại là nhóm có hoạt lực enzyme thấp gồm 5 chủng DT29, KG09, KG12, KG22, KG36 và 2 chủng đối chứng ĐC1 và ĐC2. Kết quả nghiên cứu của Võ Hồng Thi và ctv, (2012) đã ghi nhận hàm lƣợng protease của B. subtilis sinh ra là 1-1,15 U/mL, hoạt lực này tƣơng đƣơng với 5 chủng vi khuẩn DT29, KG09, KG12, KG22, KG36, là nhóm có hoạt lực thấp. Vũ Thanh Thảo và ctv (2014) sau khi kiểm tra hoạt tính protease của B. subtilis Bs02, kết quả đạt 2,97 U/mL, tƣơng đƣơng với nhóm hoạt lực trung bình gồm AG27, VL05, và VL41. Khi so sánh với các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, protease của 10 chủng B. subtilis có hoạt lực khá cao, đặc biệt là 2 chủng AG60 và VL28.

Hoạt lực lipase do 10 chủng B. subtilis tổng hợp đƣợc dao động từ 0,02- 0,20 U/mL, nhìn chung, kết quả này tƣơng đối thấp, hoạt lực lipase cao nhất ghi nhận ở chủng KG22 là 0,2 U/mL nhƣng vẫn thấp hơn so với hoạt lực của B. subtilis Bs02 (1,01 U/ mL) trong nghiên cứu của Vũ Thanh Thảo và ctv (2014). Theo Baysal (2017), vi khuẩn B. subtilis vẫn là nguồn chủ lực trong sản xuất lipase. Tuy nhiên, trở ngại lớn nhất khi sử dụng các loài B. subtilis hoang dại (phân lập trong tự nhiên) để sản xuất lipase đó là năng suất thấp, kết quả trên cũng đã góp phần chứng minh cho nhận định này. Vì lý do đó, công nghệ DNA tái tổ hợp đã đƣợc ứng dụng bằng cách chuyển gen sinh tổng hợp lipase với hoạt lực cao vào tế bào chủ là B. subtilis, từ đó giúp gia tăng năng suất lipase (Kanimozhi et al., 2013). Trong công nghệ sản xuất enzyme, hiếm khi các chủng B. subtilis hoang dại đƣợc ứng dụng trực tiếp vào sản xuất. Trên thực tế, để thu đƣợc sản lƣợng enzyme cao, không chỉ đối với lipase, mà cả amylase, protease và nhiều loại enzyme khác thì quy trình sản xuất phải đƣợc nghiên cứu rất cẩn thận. Quá trình nghiên cứu đó bao gồm nâng cao hoạt lực enzyme cho vi khuẩn và tối ƣu hóa các điều kiện lên men. Một số kết quả nghiên cứu đã chứng minh cho điều này nhƣ Muzzamal and Latif (2016) khi sử dụng 2 loài B. subtilis và

84

B. amyloliquefaciens đột biến để sản xuất galacturonase, kết quả hoạt lực đã tăng gấp 3 lần khi so sánh với các loài hoang dại. Sirohi and Prakas (2016) cũng cho thấy hoạt lực amylase đạt đƣợc là 121,22 U/mL khi các thông số lên men B. subtilis đƣợc tối ƣu hóa. Kết quả nghiên cứu của Badhe et al. (2016) về cải tiến môi trƣờng lên men B. subtilis thu nhận protease đã ghi nhận protease có hoạt lực đạt 20,74 U/mL; Mazhar et al. (2016) cho thấy hoạt lực lipase đã đạt 34,93 U/mL khi sử dụng phế phẩm đậu nành làm cơ chất lên men bề mặt. Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy khi các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men thu nhận enzyme đƣợc tối ƣu hóa, thì hoạt lực enzyme hoàn toàn có thể đƣợc nâng lên rất nhiều lần.

Tóm lại, 10 chủng B. subtilis khảo sát có hoạt lực amylase, protease và lipase khá tốt, có khả năng chọn làm probiotic. Các chủng này sẽ tiếp tục khảo sát các chỉ tiêu probiotic tiếp theo.

4.2.4. Khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh

Đây là chỉ tiêu quan trọng để tuyển chọn chủng probiotic có khả năng phòng bệnh đƣờng tiêu hóa gia cầm. Theo Kabir et al. (2009), trong chăn nuôi gia cầm, các vi khuẩn probiotic bao gồm Bacillus đóng vai trò quan trọng trong việc giúp cân bằng hệ vi sinh đƣờng ruột, ức chế vi khuẩn gây bệnh (Dhama et al., 2011), và điều hòa miễn dịch (Nayebpor et al., 2007), từ đó, tăng cƣờng, giúp hệ tiêu hóa khỏe mạnh và chống nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa (Isolauri et al., 2002). Trƣớc sự gia tăng tình trạng kháng thuốc trên vi khuẩn gây bệnh, probiotic ngày càng đƣợc quan tâm sử dụng nhƣ liệu pháp thay thế kháng sinh và các chất kích thích tăng trƣởng trong chăn nuôi (Faria Filho et al., 2006). Chính vì thế, để đáp ứng yêu cầu phòng và trị bệnh cho gia cầm thì các vi khuẩn probiotic cần phải đƣợc kiểm tra, và chọn lọc khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh.

Mƣời chủng B. subtilis (có khả năng sinh cả 3 loại enzyme) đƣợc khảo sát khả năng đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh E. coli, S. enterica, Staphylococcus spp. và Streptococcus spp. theo hai phƣơng pháp kẻ vạch vuông góc và phƣơng pháp đối kháng trực tiếp.

4.2.4.1. Khả năng đối kháng của B. subtilis với 4 loài vi khuẩn gây

bệnh theo phƣơng pháp kẻ vạch vuông góc

Kết quả kháng khuẩn của các chủng B. subtilis theo phƣơng pháp kẻ vạch

vuông góc đƣợc trình bày ở Bảng 4.9.

85

Kết quả ở Bảng 4.9 cho thấy 10 chủng B. subtilis thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở những mức độ khác nhau. Bốn chủng AG27, AG60, VL05 và VL28 có hoạt tính cao nhất, với khả năng ức chế sự phát triển của cả 4 loài vi khuẩn gây bệnh. Trong đó, chủng VL28 thể hiện hiệu quả kháng khuẩn mạnh nhất, với khoảng cách kháng khuẩn đối với E. coli đạt trung bình 10 mm, S. enterica đạt 13 mm, Staphylococcus đạt 10 mm, và khoảng cách trung bình đạt 12 mm đối với Streptococcus. Tiếp theo là chủng AG27 có khoảng cách kháng khuẩn từ 8-12 mm, VL05 thấp hơn với khoảng cách từ 6-10 mm, và cuối cùng là AG60 (4-7 mm). Trong khi đó, nhóm đối kháng đƣợc với 3 vi khuẩn gây bệnh là VL41, KG12, KG22 cùng với 2 chủng ĐC1và ĐC2, khoảng cách kháng khuẩn không cao chỉ từ 4-10 mm.

Bảng 4.9: Khoảng cách kháng khuẩn của các chủng B. subtilis bằng phƣơng pháp kẻ vạch vuông góc

Vi khuẩn Khoảng cách kháng khuẩn (mm)

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) ĐC1: chủng đối chứng B. subtilis (ATCC ® 19659™)

ĐC2: chủng đối chứng (sản phẩm trên thị trƣờng)

E. coli 5,47c 6,10c 8,00b 6,00c 6,00c 10,00a 6,00c - 4,00d 6,00c - - 0,184 0,00 S. enterica 6,27c - 12,00a 6,00c 10,00b 13,00a 10,00b 9,00b 6,00c 10,00b 9,00b - 0,275 0,00 Staphylococcus 7,00bc 7,00bc 10,00a 7,00bc 8,00b 10,00a 10,00a 10,00a 6,00c - 6,00c 8,00b 0,281 0,00 Streptococcus - 6,23c 10,00b 4,00d 6,00c 12,00a - 4,00d - - - - 0,167 0,00 ĐC1 ĐC2 AG27 AG60 VL05 VL28 VL41 KG12 KG22 KG09 KG36 DT29 SEM P

Tiếp theo là nhóm chỉ có hoạt tính kháng khuẩn đối với 2 loài vi khuẩn bệnh là KG36, khoảng cách kháng khuẩn thấp, với S. enterica là 9 mm và Staphylococuss là 6 mm. Cuối cùng là DT29 khoảng cách kháng khuẩn chỉ quan sát đƣợc đối với vi khuẩn Staphylococcus (8 mm). Theo Marahier et al. (1993) và

86

Todorova and Kozhuharova (2010), vi khuẩn B. subtilis có khả năng sinh ra nhiều hợp chất kháng khuẩn phổ rộng nhƣ subtilin, bacilysin, macobacillin để tiêu diệt vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dƣơng. Tuy nhiên, khả năng kháng khuẩn có khác nhau giữa các chủng dù cùng thuộc 1 loài B. subtilis. Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Xie et al. (2009) cũng ghi nhận khả năng kháng khuẩn của B. subtilis LFB112 đối với cả vi khuẩn gram dƣơng (Staphylococcus aureus) và vi khuẩn gram âm (E. coli, S. pullorum). Tuy nhiên, kết quả khảo sát tính đối kháng của Barbosa et al. (2005) thì lại cho thấy B. subtilis NC11 hoàn toàn không có tính đối kháng với cả E. coli, S. enterica và Staphylococcus aureus.

Hình 4.10 cho thấy 9/10 chủng B. subtilis có khả năng ức chế sự phát triển của S. enterica và Staphylococcus spp., 8 chủng B. subtilis ức chế đƣợc E. coli, chỉ có 5 chủng B. subtilis có hoạt tính đối kháng với vi khuẩn Streptococcus spp. Điều này cho thấy có khá ít chủng B. subtilis có khả năng đối kháng với Streptococcus. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Vũ Thanh Thảo và ctv (2014) khi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của B. subtilis Bs02 đã ghi nhận vi khuẩn này có khả năng ức chế với phần lớn các loài vi khuẩn gây bệnh khảo sát ngoại trừ Streptococcus faecalis.

Tỉ lệ (%)

100

90

90

80

80

60

50

40

20

0

E.coli

S.enterica

Staphylococcus spp.

Streptococcus spp.

Vi khuẩn gây bệnh khảo sát

Hình 4.10. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng B. subtilis

Từ kết quả đối kháng theo phƣơng pháp kẻ vạch vuông góc, 4 chủng vi khuẩn B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 thể hiện đƣợc hoạt tính đối kháng

87

với cả 4 vi khuẩn bệnh, là các chủng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh sẽ đƣợc tiếp tục khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phƣơng pháp đối kháng trực tiếp, để kiểm tra và so sánh hoạt tính đối kháng ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau.

4.2.4.2. Khả năng đối kháng của B. subtilis với 4 loài vi khuẩn gây bệnh

theo phƣơng pháp đối kháng trực tiếp

a. Đối với E. coli

Kết quả đối kháng trực tiếp của 4 chủng B. subtilis (AG27, AG60, VL05 và VL28) đối với E. coli ở các nồng độ 105 CFU/mL, 106 CFU/mL, 107 CFU/mL đƣợc trình bày quả Bảng 4.10.

Bảng 4.10: Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với E. coli

Vi khuẩn phân lập

Chủng Nồng độ (CFU/ mL)

105

AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P

106

AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P

107

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)

Nồng độ E.coli (105 CFU/mL) 14,43bc 14,20c 15,53a 15,27ab 0,204 0,005 16,57a 15,23b 16,57a 17,43a 0,251 0,002 18,57ab 17,40b 19,07ab 20,20a 0,449 0,014 Đƣờng kính đối kháng (mm) Nồng độ E. coli (106 CFU/mL) 14,00a 11,00c 13,00b 14,00a 0,166 0,00 16,00b 12,00d 14,00c 17,00a 0,180 0,00 16,00b 14,00c 16,00b 19,00a 0,194 0,00 Nồng độ E. coli (107 CFU/mL) 12,07b 10,33c 10,27c 13,50a 0,214 0,00 12,30b 12,57b 11,23c 16,83a 0,178 0,00 14,23bc 13,57c 15,17b 17,17a 0,301 0,00 AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P

Mặc dù vi khuẩn E. coli hiện diện nhƣ vi sinh vật cƣ trú trong đƣờng ruột của hệ tiêu hóa, nhƣng một số chủng E. coli độc có thể gây những bệnh nguy hiểm cho gia cầm nhƣ nhiễm trùng tiêu hóa hay viêm hô hấp (Gross, 1994). Để điều trị các bệnh do E. coli gây ra, kháng sinh đƣợc dùng rất rộng rãi. Tuy nhiên,

88

khi khảo sát 55 chủng E. coli phân lập từ vịt, Adzitey et al. (2013) nhận thấy vi khuẩn đã kháng với nhiều loại kháng sinh, trong đó 60% kháng với vancomycin, 92,7% kháng với tetracyline, tỉ lệ kháng với ampicillin là 72,7%, streptomycin và sulfamethoxazole-trimethoprim là 67,3%. Hệ quả của việc lạm dụng kháng sinh đã làm tăng nhanh tình trạng kháng thuốc, do đó, probiotic ngày càng đƣợc quan tâm sử dụng nhƣ liệu pháp thay thế kháng sinh trong chăn nuôi gia cầm.

Kết quả đối kháng với E. coli trình bày ở Bảng 4.10 cho thấy cả 4 chủng AG27, AG60, VL05, và VL28 đều thể hiện hoạt tính đối kháng với E. coli ở tất cả các nồng độ 105 CFU/mL, 106 CFU/mL và 107 CFU/mL. Đáng ghi nhận là dù nồng độ thấp hơn vi khuẩn E. coli, thì B. subtilis vẫn có thể ngăn chặn đƣợc sự phát triển của vi khuẩn này. Ở nồng độ 105 CFU/mL các chủng B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 có kháng khuẩn đối với E. coli 107 CFU/mL lần lƣợt là 12,07 mm, 10,33 mm, 10,27 mm và 13,50 mm. Khi nồng độ các vi khuẩn B. subtilis càng cao thì khả năng kháng khuẩn càng tăng. Ở nồng độ 107 CFU/mL các chủng B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 có kháng khuẩn đối với E. coli 105CFU/ mL lần lƣợt là 18,57 mm, 17,40 mm, 19,07 mm và 20,20 mm. Theo CLSI (2016), đƣờng kính vòng kháng khuẩn của gentamycin, tetracycline ≥ 15 mm đƣợc xem là nhạy với vi khuẩn nhóm Enterobacter (E. coli, Salmonella, Shigella, ...). Nhƣ vậy, ở nồng độ 107 CFU/mL các chủng B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 có vòng kháng khuẩn ≥ 15 mm nên đƣợc xem là nhạy đối với nhóm Enterobacter. Điều này cho thấy cả 4 chủng B. subtilis đều có tiềm năng trong việc phòng và kiểm soát bệnh do E. coli cho gia cầm.

Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05, VL28 với E. coli đƣợc thể

hiện qua hình 4.11

Hình 4.11 cho thấy trong 4 chủng B. subtilis khảo sát thì VL28 luôn thể hiện hiệu quả đối kháng cao nhất. Điều này dễ dàng quan sát đƣợc khi ở cùng nồng độ 105, 106, hay 107 CFU/mL thì đƣờng kính đối kháng của VL28 thƣờng cao hơn AG27, AG60 và VL05. Đáng chú ý là đƣờng kính đối kháng của VL28 khi ở nồng độ thấp nhất (105 CFU/mL) với E. coli ở nồng độ cao nhất (107 CFU/mL) là 13,50 mm, đƣờng kính này cao hơn khi so sánh với AG27, AG60, VL05 ở 106 CFU/mL với E. coli ở 107 CFU/mL. Xu hƣớng này cũng lặp lại tƣơng tự với E. coli ở 107 CFU/mL, VL28 ở 106 CFU/mL, và 3 chủng còn lại ở 107CFU/ mL. Một điều đáng lƣu ý nữa đó là đƣờng kính kháng khuẩn của VL28 ở 106 CFU/mL với E. coli ở 107 CFU/mL là 16,83 mm, khác biệt không ý nghĩa thống kê khi so với đƣờng kính vùng kháng khuẩn của VL28 ở 107 CFU/mL với E. coli ở

89

107CFU/mL là 17,17 mm. Tất cả điều này cho thấy VL28 có khả năng ức chế sự phát triển của E. coli khá mạnh.

AG27

Đƣờng kính đối kháng (mm)

AG60

20

VL05

VL28

15

10

5

Các nghiệm thức khảo sát (E. coli / B. subtilis)

Hình 4.11. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05, VL28 với E. coli

Trƣớc đây, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy B. subtilis có khả năng ức chế sự phát triển của E. coli nhƣ Ouoba et al. (2007), hay Fernandes et al. (2007) đã nhận thấy B. subtilis R14 có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn E. coli đa kháng thuốc; kết quả nghiên cứu của Hồ Lê Quỳnh Châu và ctv (2010) đã ghi nhận B. subtilis LII4 có khả năng đối kháng đƣợc với vi khuẩn E. coli ở mật số 106CFU/ mL. Bên cạnh đó, khi so sánh hoạt tính kháng khuẩn của 4 chủng B. subtilis AG27, AG60, VL05, và VL28 với một số kết quả nghiên cứu khác thì nhận thấy 4 chủng vi khuẩn này có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn. Nghiên cứu của Aslim et al. (2002) khi khảo sát hiệu quả kháng khuẩn trên E. coli nhận thấy chủng B. subtilis K8 có đƣờng kính kháng khuẩn là 5,6 mm. Nghiên cứu của Nguyen Thi Thanh Thuy và ctv (2016) đã ghi nhận 2 chủng B. subtilis TO43.13 và TO53.2 có đƣờng kính kháng khuẩn với E. coli chỉ đạt từ 4-6 mm. Kết quả khảo sát kháng khuẩn của Thirabunyanon and Thongwittaya (2012) cho thấy B. subtilis NC11 có đƣờng kính kháng khuẩn với E. coli đạt 13 mm.

90

b. Đối với S. enterica

Kết quả đối kháng trực tiếp của 4 chủng B. subtilis (AG27, AG60, VL05 và VL28) đối với S. enterica ở các nồng độ 105 CFU/mL, 106 CFU/mL, 107 CFU/mL đƣợc trình bày qua Bảng 4.11.

Theo Arsenault et al. (2013), Salmonella là tác nhân quan trọng gây nhiều bệnh nhiễm khuẩn trên nhiều loài động vật, và S. enterica là nguyên nhân chính gây ra bệnh viêm ruột trên gia cầm, ngoài ra nó còn là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm. Thông thƣờng, khi gà bị nhiễm vi khuẩn Salmonella khởi đầu chƣa có biểu hiện rõ rệt, nhƣng dễ dàng lây lan cho đàn, và vi khuẩn có thể cƣ trú trong phân nhiều tháng (Clavijo et al., 2006). Cũng nhƣ E. coli, Salmonella đã đƣợc báo cáo là một trong những vi khuẩn có nhiều dòng kháng thuốc nhất (Wybo et al., 2004), bao gồm kháng oxytetracyline (Sharma et al., 1996), penicillin (Rahman et al., 2004) và tetracycline (Parveen et al., 2007).

Bảng 4.11: Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với S. enterica

Vi khuẩn phân lập

Chủng

Nồng độ (CFU/mL)

105

AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P

106

AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P

107

AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P

Nồng độ S. enterica (105CFU/mL) 20,23a 19,33a 19,17a 20,17a 0,331 0,109 22,83a 20,50a 21,17a 22,2a 0,676 0,143 25,33a 21,57b 23,17ab 25,83a 0,702 0,009

Đƣờng kính đối kháng (mm) Nồng độ S. enterica (106CFU/mL) 20,00a 16,00b 15,00b 19,00a 0,255 0,00 21,00a 17,00b 18,00b 20,00a 0,303 0,00 25,00a 21,00b 20,00b 24,00a 0,338 0,00

Nồng độ S. enterica (107CFU/mL) 15,50a 12,30b 11,03b 16,83a 0,302 0,00 16,50b 13,90c 12,93c 18,50a 0,352 0,000 17,67b 15,50c 14,33c 20,17a 0,323 0,00

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)

91

Bảng 4.11 cho thấy cả 4 chủng B. subtilis đều thể hiện hiệu quả đối kháng trên S. enterica, trong đó AG27 và VL28 thể hiện hiệu quả đối kháng vƣợt trội hơn ở tất cả các nồng độ khảo sát.

AG27

Đƣờng kính vòng đối kháng (mm)

AG60

VL05

25

VL28

20

15

10

5

Các nghiệm thức khảo sát (Salmonella / B. subtilis)

Hình 4.12. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05, VL28 với S. enterica

Hình 4.12 cho thấy khi S. enterica ở nồng độ 105-6 CFU/mL thì đƣờng kính đối kháng của AG27 và VL28 khác biệt không ý nghĩa; tuy nhiên, khi mật số vi khuẩn bệnh đạt 107 CFU/mL thì VL28 lại thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, đƣờng kính đối kháng đạt 18,5 mm ở 106 CFU/mL, và 20,17 mm ở 107 CFU/mL, cao hơn mức nhạy của kháng sinh gentamycin và tetracycline (15 mm, CLSI 2016). Mặc dù đƣờng kính đối kháng thấp hơn AG27 và VL28, nhƣng 2 chủng AG60 và VL05 vẫn thể hiện đƣợc hoạt tính kháng khuẩn cao, ngay cả khi S. enterica ở nồng độ cao nhất thì không chỉ AG27, VL28 mà AG60, và VL05 vẫn có khả năng kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn bệnh, điều này có thể quan sát qua đƣờng kính đối kháng, đƣợc ghi nhận đạt từ 11,03-12,30 mm (105 CFU/mL); đến 12,93-13,90 mm (106 CFU/mL); và khi cả 2 nhóm vi khuẩn ở cùng nồng độ cao nhất thì đƣờng kính vùng đối kháng đạt 14,33-15,50 mm (107 CFU/mL). Một lần nữa, kết quả kiểm tra tính đối kháng với S. enterica cho thấy 4 chủng AG27, AG60, VL05, VL28 có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh ngay khi ở nồng độ thấp hơn. Khi so sánh hiệu quả kháng khuẩn của

92

AG27 và VL28 với một số nghiên cứu trƣớc đây thì nhận thấy 2 chủng này có hoạt tính tƣơng đƣơng với 3 chủng B. subtilis BSB, 16K và 105 trong kết quả của Moore et al. (2013) khi kiểm tra trên nhiều dòng Salmonella, trong đó có S. enterica thì nhận thấy hiệu quả đối kháng của chủng BSB là 20,30 mm, chủng 16K là 22 mm, và chủng 105 là 23,60 mm. Trong khi đó, hoạt tính của AG27 và VL28 lại cao hơn hoạt tính kháng khuẩn của B. subtilis NC11(12 mm) trên S. enterica (Thirabunyanon and Thongwittaya, 2012); Mặt khác, nghiên cứu của Vũ Thanh Thảo và ctv (2014) khi kiểm tra hoạt tính của B. subtilis Bs02 thì không ghi nhận đƣợc hiệu quả đối kháng trên Salmonella.

c. Đối với Staphylococcus

Kết quả đối kháng trực tiếp của 4 chủng B. subtilis (AG27, AG60, VL05 và VL28) đối với Staphylococcus ở các nồng độ 105 CFU/mL, 106 CFU/mL, 107CFU/mL đƣợc trình bày qua Bảng 4.12.

Bảng 4.12: Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Staphylococcus spp.

Vi khuẩn phân lập

Chủng Nồng độ (CFU/ mL)

105

106

107

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)

Nồng độ Staphylococcus (105 CFU/mL) 20,23bc 18,90c 21,57b 27,57a 0,379 0,00 20,50b 21,70b 22,20b 30,43a 0,490 0,00 22,77b 24,00b 24,67b 34,10a 0,431 0,00 Đƣờng kính đối kháng (mm) Nồng độ Staphylococcus (106 CFU/mL) 15,00c 18,00b 15,00c 26,00a 0,176 0,00 18,00b 18,00b 17,00b 27,00a 0,334 0,00 19,00c 21,00b 19,00c 30,00a 0,144 0,00 Nồng độ Staphylococcus (107 CFU/mL) 13,17c 16,33b 14,33bc 22,47a 0,489 0,00 15,73c 17,13b 17,43b 23,67c 0,237 0,00 16,33d 21,07b 18,67c 26,20a 0,312 0,00 AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P

93

Theo McNamee and Smyth (2000), Staphylococcus spp. là vi khuẩn phổ biến gây bệnh tụ cầu khuẩn và viêm khớp trên gà. Hầu hết các dòng Staphylococcus aureus đã kháng với penicillin, và một số dòng kháng với methicillin, điều này gây nhiều khó khăn trong công tác điều trị (Rayner and Munckhof, 2005). Tƣơng tự E. coli và S. enterica, 4 chủng AG27, AG60, VL05, và VL28 đều có hiệu quả kháng khuẩn đối với Staphylococcus ở tất cả các nồng độ khảo sát, đặc biệt hoạt tính kháng khuẩn của 4 chủng B. subtilis đối với Staphylococcus lớn hơn nhiều so với E. coli và S. enterica, cụ thể đƣờng kính đối kháng cao nhất ghi nhận trên Staphylococcus là 34,10 mm, so với E. coli là 20,20 mm, và S. enterica là 25,83 mm.

Đƣờng kính đối kháng (mm)

AG27

35.00

AG60

30.00

VL05

25.00

VL28

20.00

15.00

10.00

5.00

Các nghiệm thức khảo sát (Staphylococcus / B. subtilis)

Hình 4.13. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05, VL28 với Staphylococcus spp.

Hình 4.13 cho thấy chủng có hiệu quả đối kháng vƣợt trội nhất là VL28 thể hiện qua (1) đƣờng kính đối kháng cao hơn AG27, AG60, VL05 ở tất cả nghiệm thức, và (2) ở nồng độ thấp nhất (105CFU/ mL) nhƣng đƣờng kính đối kháng của VL28 luôn cao hơn 3 chủng còn lại ở nồng độ cao hơn, khi quan sát Staphylococcus ở 105CFU/mL thì đƣờng kính của VL28 với nồng độ 105CFU/mL là 27,57 mm, cao hơn AG27, AG60, VL05 ở nồng độ 106-7CFU/mL

94

(20,50-22,20 mm, và 22,77-24,67 mm). Kết quả này một lần nữa cho thấy VL28 có hiệu quả kháng khuẩn vƣợt trội không chỉ với E. coli mà còn Staphylococcus.

Kết quả của một số nghiên cứu trƣớc đây đã báo cáo khả năng đối kháng của B. subtilis trên Staphylococcus nhƣ (1) Tabbene et al. (2011) đã ghi nhận dòng vi khuẩn B. subtilis B38 có khả năng đối kháng với chủng S. aureus kháng methicillin. (2) Khochamit et al. (2015) khi khảo sát đặc tính kháng khuẩn của chủng B. subtilis subsp. subtilis 168 đã nhận thấy bacteriocin của vi khuẩn này tiết ra có khả năng ức chế sự phát triển của S. aureus, và (3) B. subtilis TR50 đã đƣợc xác định có khả năng ức chế sự phát triển của S. aureus (Baruzzi et al., 2011). Khi so sánh đƣờng kính vùng đối kháng của 4 chủng B. subtilis với một số kết quả nghiên cứu gần đây thì thấy rằng AG27, AG60, VL05, VL28 có hiệu quả kháng khuẩn vƣợt trội B. subtilis TO43.13 và TO53.2, đƣờng kính kháng khuẩn chỉ đạt 4-6 mm (Nguyen Thi Thanh Thuy et al., 2016), và B. subtilis Bs02 với đƣờng kính ghi nhận trên S. aureus đạt 13,8-14 mm (Vu Thanh Thao và ctv, 2014). Tuy nhiên, hiệu quả kháng khuẩn của 4 chủng AG27, AG60, VL05, VL28 thì lại cao tƣơng đƣơng với chủng B. subtilis M1-1 (28,3 mm), 11-89 (29,3 mm), và 105 (34,1 mm) trong kết quả khảo sát của Moore et al. (2013).

d. Đối với Streptococcus

Theo Pattison (2008) có hơn 50 loài thuộc giống Streptococcus, thƣờng gây một số bệnh cho gia cầm nhƣ nhiễm trùng huyết, viêm hô hấp mãn tính, viêm màng trong tim (Sekizaki et al., 2008). Để điều trị các bệnh do Streptococcus gây ra, kháng sinh thƣờng đƣợc sử dụng (Cardona et al., 1993). Tuy nhiên, Camara et al. (2013) đã ghi nhận 40 dòng Streptococcus pyogenes đã kháng hoàn toàn với tetracycline, và Streptococcus pneumonia đã đƣợc báo cáo là kháng các kháng sinh nhóm penicillin và erythromycin (Antibiotic Resistance Threats in the United State, 2013).

Kết quả đối kháng trực tiếp của 4 chủng B. subtilis (AG27, AG60, VL05 và VL28) đối với Streptococcus ở các nồng độ 105 CFU/mL, 106 CFU/mL, 107CFU/mL đƣợc trình bày qua Bảng 4.13.

95

Bảng 4.13: Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Streptococcus spp.

Vi khuẩn phân lập

Chủng

Nồng độ (CFU/mL)

105

106

107

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)

Nồng độ Streptococcus (105 CFU/mL) 20,13a 19,27a 17,17b 18,70a 0,333 0,001 20,90a 20,83a 19,53b 18,93b 0,281 0,002 22,57b 26,23a 21,60b 22,23b 0,284 0,00 Đƣờng kính đối kháng (mm) Nồng độ Streptococcus (106 CFU/mL) 15,00b 18,00a 16,00b 18,00a 0,235 0,00 19,00a 18,00a 18,00a 18,00a 0,299 0,108 21,00a 22,00a 20,00a 20,00a 0,224 0,014 Nồng độ Streptococcus (107 CFU/mL) 14,10c 17,93a 15,13c 17,40a 0,137 0,00 17,47a 18,23a 16,57b 17,70a 0,173 0,001 18,93bc 21,20a 18,37c 19,67b 0,202 0,00 AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P AG27 AG60 VL05 VL28 SEM P

Bảng 4.13 cho thấy khả năng đối kháng của 4 chủng B. subtilis đối với Streptococcus cũng tƣơng tự nhƣ 3 vi khuẩn gây bệnh đã khảo sát (E. coli, S. enterica, Staphylococcus), nghĩa là luôn thể hiện đƣợc hiệu quả đối kháng ở tất cả các nồng độ vi khuẩn. Trong đó, AG60 là ứng viên có hiệu quả đối kháng cao nhất. Có thể nhận thấy đƣờng kính đối kháng của AG60 luôn cao hơn có ý nghĩa thống kê khi so sánh với đƣờng kính của AG27, VL05, VL28. Khi đối kháng với Streptococcus ở nồng độ 105CFU/ mL, đƣờng kính của AG60 đạt từ 19,27- 26,23mm; khi Streptococcus ở nồng độ cao hơn (106 CFU/mL), đƣờng kính đạt từ 18-21mm; và đƣờng kính đối kháng đƣợc ghi nhận từ 17,93-22,00 mm khi Streptococcus ở nồng độ cao nhất (107 CFU/mL).

96

Đƣờng kính đối kháng (mm)

30.00

25.00

20.00

15.00

AG27

10.00

AG60

5.00

VL05

VL28

0.00

Các nghiệm thức thí nghiệm (Streptococcus / B. subtilis)

Hình 4.14. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05, VL28 với Streptococcus spp.

Hình 4.14 cho thấy khi nồng độ AG60 tăng giúp gia tăng hiệu quả ức chế Streptococcus. Kết quả trên cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Ramachandran et al. (2014) khi khảo sát đặc tính đối kháng của B. subtilis RLID 12.1 đã nhận thấy RLID 12.1 có hoạt tính đối kháng đối với Streptococcus pyogenes, cũng nhƣ Teo and Tan (2006) đã ghi nhận B. subtilis PB3 và B. subtilis PB6 có khả năng sinh ra bacteriocin phổ rộng ức chế sự phát triển của Streptococcus.

Qua kết quả khảo sát hiệu quả đối kháng của 4 chủng B. subtilis AG27, AG60, VL05, VL28 nhận thấy cả 4 chủng đều có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn bệnh khi so sánh với các nghiên cứu trƣớc đây. Tuy nhiên, mỗi chủng B. subtilis có hiệu quả ức chế khác nhau trên các vi khuẩn bệnh khác nhau, nếu nhƣ VL28 có khả năng đối kháng mạnh nhất với E. coli và Staphylococcus spp., thì AG27 lại thể hiện hoạt tính cao nổi bật trên S. enterica, và đối với Streptococcus spp. thì hiệu quả kháng khuẩn của AG60 lại ƣu thế hơn. Do đó, cả 4 chủng AG27, AG60, VL05, VL28 đều mang đặc tính kháng khuẩn cao, và mỗi chủng lại có ƣu thế trên mỗi tác nhân gây bệnh, đều là những ứng viên tiềm năng đƣợc sử dụng trong phòng và điều trị bệnh trên gà.

97

b a C

d e

Hình 4.15. Hoạt tính đối kháng của VL28 với E. coli, S. enterica, Staphylococcus spp. và Streptoccus spp. (a): đối kháng theo vạch thẳng vuông góc. (b): đối kháng trực tiếp với E. coli (c): đối kháng trực tiếp với S. enterica; (d) đối kháng trực tiếp với Streptococcus; (e) đối kháng trực tiếp với Staphylococcus

4.2.5. Khả năng chịu acid dạ dày và muối mật

Ở gà, pH dạ dày (dạ dày tuyến và mề) dao động trong khoảng từ 2,5-3,5 (Gauthier, 2002). Muối mật đƣợc tiết vào ruột non làm giảm khả năng sống của vi khuẩn bằng cách phá hủy màng tế bào của chúng (Boke et al., 2010). Vì vậy, môi trƣờng dạ dày rất bất lợi cho vi khuẩn có thể tồn tại. Theo Ganguly et al. (2011) các chủng probiotic nên đƣợc kiểm tra khả năng chịu acid dạ dày và muối mật trong điều kiện in vitro. Bởi vì muốn thực hiện chức năng này một cách tốt nhất, các probiotic cần phải sống đƣợc khi di chuyển trong hệ tiêu hóa. Thực tế là sau khi đi vào đƣờng tiêu hóa, các probiotic phải vƣợt qua hai rào cản chính, đó là môi trƣờng acid trong dạ dày, và dịch mật đổ vào tá tràng (Lankaputhra and Shah, 1995). Chính vì thế Tuomola et al. (2001) đã nhấn mạnh: để đảm bảo khả năng sống đƣợc trong đƣờng tiêu hóa, các chủng probiotic tiềm năng phải đƣợc sàng lọc khả năng chịu pH acid và muối mật, đó là một trong nhiều tiêu chuẩn bắt buộc vi khuẩn probiotic phải đạt đƣợc (Fuller, 2012).

Khả năng thành lập bào tử đã giúp B. subtilis có khả năng chống chịu đƣợc những điều kiện khắc nghiệt trong đó bao gồm điều kiện acid trong dạ dày và muối mật. Tuy nhiên, khả năng chịu đựng của mỗi chủng B. subtilis là khác nhau.

98

Với mật số ban đầu của vi khuẩn B. subtilis đƣợc điều chỉnh về 4,5x106CFU/ mL (tƣơng đƣơng 6,65 log CFU / mL), kết quả khảo sát khả năng chịu pH trong dịch dạ dày mô phỏng và muối mật với nồng độ 0,3% đƣợc trình bày sau đây.

4.2.5.1. Kết quả khảo sát acid-muối mật ở pH 4 và pH 5

Kết quả khảo sát khả năng chịu pH 4 và pH 5 trong dịch dạ dày mô phỏng

và muối mật nồng độ 0,3% đƣợc trình bày qua Bảng 4.14.

Bảng 4.14: Kết quả khảo sát acid-muối mật ở pH 4 và pH 5

0 phút

%

%

%

%

%

Chủng vi khuẩn

97

95

95

95

92

pH=4 ĐC1

96

95

95

94

93

ĐC2

97

95

95

94

94

AG27

99

98

97

95

94

AG60

97

96

95

94

88

VL05

99

98

98

97

95

VL28

log CFU/mL 6,43a 6,36a 6,43a 6,58a 6,42a 6,58a 0,09 0,44

Lƣợng vi khuẩn và % sống tại các thời điểm 10 phút log CFU/mL 6,34a 6,35a 6,34a 6,52a 6,38a 6,53a 0,08 0,28

30 phút log CFU/mL 6,33a 6,29a 6,32a 6,44a 6,35a 6,50a 0,07 0,36

60 phút log CFU/mL 6,31a 6,26a 6,26a 6,34a 6,24a 6,43a 0,07 0,45

90 phút log CFU/mL 6,13a 6,07a 6,22a 6,22a 5,84a 6,32a 0,11 0,09

SEM P

pH =5

97

96

96

97

96

ĐC1

97

96

96

97

95

ĐC2

100

97

95

97

93

AG27

100

98

97

99

96

AG60

97

95

95

96

94

VL05

100

98

97

98

96

VL28

6,45a 6,46a 6,89a 6,70a 6,46a 6,91a 0,19 0,33

6,39a 6,40a 6,33a 6,44a 6,30a 6,45a 0,06 0,55

6,37a 6,35a 6,21a 6,37a 6,28a 6,38a 0,07 0,45

6,43a 6,46a 6,47a 6,62a 6,38a 6,52a 0,05 0,09

6,41a 6,41a 6,44a 6,50a 6,33a 6,51a 0,05 0,30

SEM P

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) ĐC1: chủng đối chứng B. subtilis (ATCC ® 19659™) ĐC2: chủng đối chứng (sản phẩm trên thị trƣờng)

99

Theo Vakevainen et al. (2000) vi sinh vật bắt đầu hoạt động ở điều kiện pH ≥4. Kết quả trình bày ở Bảng 4.14 cho thấy ở pH 4 và 5, tất cả 4 chủng B. subtilis cùng với 2 chủng đối chứng đều có thể tồn tại, duy trì mật số gần nhƣ không đổi trong suốt thời gian khảo sát. Khi so sánh khả năng sống giữa các chủng ở cùng một điều kiện pH, hay ở cả 2 mức pH 4 và 5 thì nhận thấy không có sự khác biệt thống kê. Gần nhƣ tất cả các chủng đều ổn định mật số khá tốt ở thời điểm 90 phút (≥90%).

AG27

AG27

AG60

AG60

VL05

VL05

VL28

VL28

Tỉ lệ sống (%) ở pH 5 100 98 96 94 92 90 88 86 84 82

Tỉ lệ sống (%) ở pH 4 100 98 96 94 92 90 88 86 84 82

0

10

30

60

90

10

60

0 90 30 Thời gian khảo sát (phút)

Thời gian khảo sát (phút)

Hình 4.16 Khả năng chịu pH 4 và 5 của các chủng B. subtilis

Hình 4.16 cho thấy tỉ lệ sống của các chủng vi khuẩn ở pH 4 và 5 khá tƣơng đồng nhau, VL05 phát triển ở pH 5 khá tốt sau 90 phút tỉ lệ sống đạt 94%, tuy nhiên, ở pH 4 tỉ lệ sống đã giảm, chỉ đạt 88% sau 90 phút. Có rất nhiều nghiên cứu đã góp phần khẳng định vi khuẩn B. subtilis có khả năng phát triển tốt ở pH 4 và 5 nhƣ Liu et al. (2009) ghi nhận B. subtilis E20 chịu đƣợc pH 5, và Bholay et al. (2017) nhận thấy B. subtilis NCIM 2548 chịu đƣợc pH 3, pH 4 và pH 5 với nồng độ muối mật 0,3%. Trong một kết quả nghiên cứu khác của Hồ Thị Trƣờng Thi và ctv (2011) cũng đã cho thấy chủng B. subtilis B20.1 có khả năng chịu đựng tốt ở pH 4 và 5, nhƣng lại giảm tỉ lệ sống ở pH 2 và 3.

4.2.5.2. Kết quả khảo sát acid-muối mật ở pH 3

Kết quả khảo sát khả năng chịu pH 3 trong dịch dạ dày mô phỏng và muối

mật nồng độ 0,3% đƣợc trình bày ở Bảng 4.15.

Kết quả trình bày ở Bảng 4.15 cho thấy ở pH 3, khả năng chịu acid của 4 chủng vi khuẩn đã có sự khác biệt so với pH 4 và pH 5. Nếu nhƣ VL05 và AG60 vẫn có thể sống ở pH 4 với tỷ lệ cao (96%-88%), thì ở pH 3, 2 chủng vi khuẩn này vẫn chịu đƣợc nhƣng mật số vi khuẩn giảm khá nhanh, AG60 với tỉ lệ sống từ 83% (0 phút) còn 35% sau 90 phút, VL05 tỉ lệ sống 82% ở thời điểm 0 phút,

100

sau 90 phút, giảm còn 35%. Trong khi đó, AG27 và VL28 là nhóm có thể chịu pH 3 tốt, với tỉ lệ sống cao trong thời gian khảo sát (AG27: 86-81%; VL28: 97- 94%) và cao hơn ĐC2 (80-65%), cũng nhƣ hoàn toàn vƣợt trội ĐC1 (73% ở 0 phút, và giảm còn 0 ở 10 phút).

Bảng 4.15: Kết quả khảo sát acid-muối mật ở pH 3

0 phút 90 phút

% % % % % Chủng vi khuẩn log CFU/mL Lƣợng vi khuẩn và % sống tại các thời điểm 60 phút 30 phút log log CFU/mL CFU/mL 10 phút log CFU/mL log CFU/mL

73 ĐC1 4,86d 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e

80 ĐC2 5,35c 67 67 66 65

86 AG27 85 84 84 81

83 AG60 51 45 36 35

82 VL05 50 41 38 35

97 VL28 97 97 96 94

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) ĐC1: chủng đối chứng B. subtilis (ATCC ® 19659™)

ĐC2: chủng đối chứng (sản phẩm trên thị trƣờng)

SEM P 5,73b 5,52bc 5,43c 6,48a 0,05 0,00 4,48c 5,66b 3,40d 3,35d 6,47a 0,04 0,00 4,44c 5,60b 3,01d 2,71d 6,42a 0,1 0,00 4,34c 5,57b 2,40d 2,53d 6,41a 0,04 0,00 4,33c 5,40b 2,31d 2,35d 6,28a 0,08 0,00

Hình 4.17 thể hiện rõ AG27 và VL28 là 2 chủng có tỉ lệ sống cao nhất trong nhóm, trong đó AG27 với tỉ lệ sống thấp hơn nhƣng khả năng sống vẫn duy trì khá cao, và thấp nhất là VL05 và AG60. Kết quả của VL28 hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của AlGburi et al. (2016), theo đó, khi khảo sát đặc tính này của B. subtilis KATMIRA1933 cho thấy mật số vi khuẩn giữ không đổi ở pH 2 và 3. Trong khi đó, kết quả của AG27 lại khá tƣơng đồng với kết quả của B. subtilis natto (59,68% ở pH 2, và 81,15% ở pH 3) do Huynh Thi Hong Nhi và Nguyen Thuy Huong (2016) khảo sát.

101

Tỉ lệ sống (%) ở pH 3

AG27

AG60

VL05

VL28

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

0

10

30

60

90

Thời gian khảo sát (phút)

Hình 4.17. Khả năng chịu pH 3 của các chủng B. subtilis

4.2.5.3. Kết quả khảo sát acid-muối mật ở pH 2

Có thể nói pH acid của dạ dày là hàng rào đầu tiên giúp cơ thể ngăn chặn và tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh di chuyển sâu vào hệ tiêu hóa, tuy nhiên điều này lại gây bất lợi cho vi khuẩn probiotic, vì nếu muốn thực hiện đƣợc chức năng thì chúng phải có khả năng thích nghi đƣợc với điều kiện khắc nghiệt này.

Kết quả khảo sát khả năng chịu pH 2 trong dịch dạ dày mô phỏng và muối

mật nồng độ 0,3% đƣợc trình bày ở Bảng 4.16.

Kết quả trình bày ở Bảng 4.16 cho thấy AG60, VL05 và ĐC1 là nhóm vi khuẩn hoàn toàn không thể chịu đƣợc pH 2, ngay từ thời điểm 0 phút, mật số của AG60, VL05 và ĐC1 đã giảm về 0. Trong khi đó, AG27 và VL28 có khả năng chịu đựng khá cao, và cao hơn so với ĐC2. Nếu nhƣ VL28 vẫn duy trì tỉ lệ sống cao gần nhƣ không giảm trong suốt 90 phút khảo sát (ở 0 phút là 99% và sau 90 phút là 97%), thì tỉ lệ sống của AG27 ở thời điểm 0 phút là 82%, và giảm còn 78% ở thời điểm 90 phút (Bảng 4.16).

102

Bảng 4.16: Kết quả khảo sát acid-muối mật ở pH 2

% % % % % Chủng vi khuẩn

0 phút log CFU/mL 0,00d Lƣợng vi khuẩn và % sống tại các thời điểm 30 phút log CFU/mL 0,00d 10 phút log CFU/mL 0,00d - - - ĐC1 - -

72 64 55 70 69 ĐC2

82 78 78 81 80 AG27

AG60 - - - - -

VL05 - - - - -

99 97 97 99 98 VL28

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) ĐC1: chủng đối chứng B. subtilis (ATCC ® 19659™)

ĐC2: chủng đối chứng (sản phẩm trên thị trƣờng)

4,76c 5,43b 0,00d 0,00d 6,62a 0,027 0,00 60 phút log CFU/mL 0,00d 4,24c 5,21b 0,00d 0,00d 6,48a 0,062 0,00 90 phút log CFU/mL 0,00d 3,67c 5,19b 0,00d 0,00d 6,46a 0,037 0,00 4,69c 5,39b 0,00d 0,00d 6,58a 0,017 0,00 4,58c 5,31b 0,00d 0,00d 6,54a 0,035 0,00 SEM P

Hình 4.18 cho thấy VL28 là chủng vi khuẩn có khả năng chịu pH acid vƣợt trội nhất trong 4 chủng B. subtilis, kế đến là AG27 với khả năng chịu đựng cũng khá tốt. Hai chủng vi khuẩn này thực sự là các ứng viên tiềm năng, vì có thể thích nghi đƣợc với pH dạ dày của gà. pH 2 là tiêu chuẩn quan trọng để chọn lọc khả năng chịu acid của vi khuẩn probiotic, đó là lý do nhiều nhà nghiên cứu đã tiến hành kiểm tra ở pH 2 và có kết quả khá phù hợp với nghiên cứu của chúng tôi. Mingmongkolchai and Panbangred (2017) đã ghi nhận B. subtilis NCIM40 có khả năng chịu pH 2, với nồng độ muối mật 0,3%, ở thời điểm 30 phút với tỉ lệ sống sót là 96,96%, ở thời điểm 60 phút giảm còn 96,07% và 90 phút là 94%. Lee et al. (2017) đã khảo sát khả năng chịu acid dạ dày và muối mật của 3 chủng Bacillus MKSK-E1, MKSK-J1 and MKSK-M1, kết quả cho thấy MKSK-M1 có khả năng chịu đựng cao nhất với 96% ở pH 2, và muối mật 3% trong 3 giờ, kế đến là MKSK-E1 (92,50%) và MKSK-J1 (90,31%). Kunchala et al. (2016) đã báo cáo chủng B. subtilis PHFB-22 và B. subtilis S8CF-32 có thể chịu đƣợc pH 2, và nồng độ muối mật 0,3%.

103

Tỉ lệ sống (%) ở pH 2

AG27

AG60

VL05

VL28

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

0

10

30

60

90

Thời gian khảo sát (phút)

Hình 4.18. Khả năng chịu pH 2 của các chủng B. subtilis

Nhìn chung, khả năng chịu acid dạ dày và muối mật của 4 chủng AG27, AG60, VL05, và VL28 là khá tốt. Tuy nhiên, ứng viên probiotic sử dụng cho gà thì phải thích nghi đƣợc với pH dạ dày của gà từ 2,5-3,5; do đó chỉ có 2 chủng AG27 và VL28 (có khả năng sống sót cao ở điều kiện pH 2) mới có thể đáp ứng đƣợc yêu cầu này. Hai chủng này sẽ tiếp tục đƣợc kiểm tra các chỉ tiêu probiotic tiếp theo.

4.2.6. Khả năng bám dính Theo Gobin (2011), tính bám dính là quá trình các tế bào vi khuẩn liên kết lại với nhau. Có 2 dạng bám dính khác nhau, đó là tự bám dính và đồng bám dính. Tính bám dính giữa các vi khuẩn cùng một loài (tự bám dính) hoặc giữa các loài vi khuẩn khác nhau (đồng bám dính) đóng vai trò quan trọng trong sự tƣơng tác giữa các vi sinh vật. Các vi khuẩn có khả năng bám dính có thể thành lập biofilm hoặc kết dính với bề mặt niêm mạc của tế bào chủ và thực hiện chức năng của chúng. Các vi sinh vật với khả năng kết dính có nhiều thuận lợi hơn các vi sinh vật không có khả năng này, vì chúng sẽ dễ dàng bị trôi khỏi bề mặt niêm mạc vật chủ. Ngoài ra, để thực hiện đƣợc chức năng probiotic, các vi khuẩn cần phải có khả năng bám dính với một số lƣợng lớn, tức là phải có tỉ lệ kết dính cao (Grześkowiak et al., 2012). Do đó, khả năng bám dính là một trong những đặc tính cần phải đƣợc tiến hành kiểm tra trong quá trình chọn lọc vi khuẩn probiotic.

4.2.6.1. Khả năng tự bám dính

Tự bám dính là khả năng của vi khuẩn trong cùng một loài có thể liên kết lại với nhau, hình thành một quần thể lớn, giúp tăng cƣờng sức sống, sự phát triển

104

theo kiểu quan hệ hỗ trợ cùng loài, cũng nhƣ hạn chế vi khuẩn bị đào thải ra ngoài, và có nhiều lợi thế cạnh tranh hơn các vi khuẩn khác (Kos et al., 2003). Kết quả khảo sát khả năng tự bám dính của 2 chủng B. subtilis AG27 và VL28 đƣợc trình bày ở Bảng 4.17.

Bảng 4.17: Kết quả khảo sát khả năng tự bám dính

Vi khuẩn bám dính tại các thời điểm (%)

Chủng vi khuẩn 3 giờ 4 giờ

ĐC1 66,4 72,2

a,b các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) ĐC1: chủng đối chứng B. subtilis (ATCC ® 19659™) ĐC2: chủng đối chứng (sản phẩm trên thị trƣờng)

ĐC2 AG27 VL28 SEM P 1 giờ 43,9a 30,2ab 24,3b 36,8ab 3,51 0,021 2 giờ 62,5a 57,8ab 62,1a 40,9b 4.02 0,016 65,0 63,3 61,9 2,11 0,508 66,1 69,8 74,5 2,13 0,106 5 giờ 73,8ab 76,7ab 70,2b 82,0a 2,13 0,024

Có thể dễ dàng quan sát thấy tỉ lệ bám dính giữa các tế bào B. subtilis có xu hƣớng tăng dần đều theo thời gian. Sau 5 giờ ủ ở nhiệt độ phòng, mức độ bám dính của các chủng gần nhƣ tăng gấp đôi so với thời điểm 1 giờ. Trong đó, AG27, VL28 và 2 chủng đối chứng có tỉ lệ bám dính khá cao từ 70,2% đến 82%, VL28 có tỉ lệ bám dính cao nhất (82%), AG27 có tỉ lệ bám dính thấp hơn (70,2%), và thấp hơn so với ĐC1 (73,8%) và ĐC2 (76,7%) ở thời điểm 5 giờ.

Tỉ lệ bám dính (%) 90

80

70

60

ĐC1

50

ĐC2

40

AG27

30

VL28

20

10

0

1

2

3

4

5

Thời điểm khảo sát sau khi ủ (giờ)

Hình 4.19. Khả năng tự bám dính của các chủng B. subtilis

105

Hình 4.19 cho thấy VL28 có mức độ tự bám dính cao hơn AG27 sau khi kết thúc thời gian ủ. Khi so sánh với các nghiên cứu trƣớc đây nhận thấy AG27 và VL28 có khả năng tự bám dính cao hơn so với nghiên cứu của Thirabunyanon and Thongwittaya (2012), theo đó hai tác giả này đã ghi nhận tỉ lệ phần trăm tự bám dính của B. subtilis P33 là 35,7% và B. subtilis P72 là 42,2%. Manhar et al. (2016) khi khảo sát khả năng tự bám dính của B. subtilis AMS6 thấy tỉ lệ bám dính đạt 64,7% sau 24 giờ ủ. David et al. (2016) đã báo cáo khả năng tự bám dính của B. subtilis P11 là 27%, và B. subtilis W4 là 37%, đây là 2 chủng có tỉ lệ bám dính cao nhất trong tổng số 11 chủng B. subtilis khảo sát. Tuy nhiên, tỉ lệ tự bám dính của AG27 và VL28 lại thấp hơn một số chủng B. subtilis trong các kết quả khảo sát gần đây nhƣ chủng B. subtilis Mat43, và GAtB1 có tỉ lệ bám dính đạt 99,4% (Mazón-Suástegui, 2016). Ba chủng B. subtilis MKSK-E1 (89,6%), MKSK-J1 (89,6%), và MKSK-M1 (90,4%) đều có tỉ lệ bám dính cao sau khi ủ 3 giờ trong nghiên cứu của Lee et al. (2017). B. subtilis ATCC 6633 có phần trăm bám dính đạt 100% sau thời gian ủ 100 phút (El-Naggar, 2004).

4.2.6.2. Khả năng bám dính với vi khuẩn gây bệnh

Theo Collado et al. (2007) và Soleimani et al. (2010) khả năng đồng kết dính thể hiện mối quan hệ tƣơng tác, gắn kết giữa vi khuẩn probiotic và vi khuẩn gây bệnh, vì khi liên kết đƣợc với vi khuẩn bệnh sẽ giúp vi khuẩn probiotic phóng thích ra các hợp chất kháng khuẩn tiêu diệt chúng dễ dàng hơn (Botes et al., 2008). Do đó, khả năng bám dính với vi khuẩn gây bệnh giúp thành lập rào cản ngăn chặn và tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh (Kos et al., 2003).

Kết quả trình bày ở Bảng 4.18 cho thấy cả 4 chủng AG27, VL28, ĐC1 và ĐC2 đều có khả năng gắn kết với vi khuẩn E. coli và S. enterica. Tuy nhiên, tỉ lệ phần trăm bám dính của VL28 cao hơn so với AG27 và 2 chủng đối chứng. Sau 5 giờ, tỉ lệ bám dính với E. coli của VL28 đã tăng gần 3 lần so với thời điểm 0 giờ, đạt 60,98%, trong khi đó, phần trăm bám dính của AG27 chỉ đạt 19,33%, thấp hơn gần 3 lần so với VL28 ở cùng thời điểm, và thấp hơn cả 2 chủng ĐC1 (26,3%) và ĐC2 (41,35%). Tƣơng tự nhƣ E. coli, VL28 tiếp tục đƣợc ghi nhận có tỉ lệ bám dính với vi khuẩn S. enterica cao, đạt 65,64% sau 5 giờ ủ, kết quả này cao gấp 2 lần so với AG27 (36,4%), và cao hơn 2 chủng ĐC. Sau khi kết thúc thời gian ủ, tỉ lệ bám dính của AG27 tăng không đáng kể, từ 16,15% ở thời điểm 0 giờ, chỉ đạt 36,40% sau 5 giờ, và thấp hơn so với đối chứng.

106

Bảng 4.18. Kết quả khảo sát khả năng bám dính với E. coli và S. enterica

Tỉ lệ bám dính với vi khuẩn gây bệnh (%)

Thời gian

0 giờ

5 giờ

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) ĐC1: chủng đối chứng B. subtilis (ATCC ® 19659™) ĐC2: chủng đối chứng (sản phẩm trên thị trƣờng)

chủng VK ĐC 1 ĐC 2 AG 27 VL28 SEM P ĐC 1 ĐC 2 AG 27 VL28 SEM P E. coli 8,60b 10,14b 4,76c 24,82a 0,627 0,00 26,30c 41,35b 19,33c 60,98a 2,56 0,000 S. enterica 25,75a 12,62c 16,15bc 20,79ab 1,37 0,00 59,51b 46,14c 36,40d 65,64a 1,22 0,001

Hình 4.20 cho thấy VL28 có đặc tính bám dính khá tốt với cả E. coli và

S. enterica, ở thời điểm 0 giờ, VL28 đã có khả năng gắn kết với vi khuẩn bệnh, và tăng dần tỉ lệ bám dính đến thời điểm 5 giờ. Ngƣợc lại, khả năng kết dính của AG27 thấp hơn, sau thời gian ủ, tỉ lệ kết dính của AG27 tăng không đáng kể so với mức ban đầu, đặc biệt là với vi khuẩn E. coli. Khi so sánh với kết quả nghiên cứu trƣớc đây nhận thấy khả năng bám dính của VL28 cũng tƣơng đƣơng với B. subtilis KATMIRA1933 ghi nhận tỉ lệ bám dính với E. coli là 50,3% (AlGburi et al., 2016); Chủng B. subtilis trong nghiên cứu của El-Naggar (2004) có khả năng bám dính với E. coli đạt 60%, tỉ lệ bám dính với Salmonella là 67% sau 6 giờ ủ. B. subtilis ASM6 có khả năng liên kết với S. enterica typhimurium với kết quả đạt 50,6% (Manhar et al., 2016). Tuy nhiên, khả năng kết dính của B. subtilis VL28 cao hơn B. subtilis P5 (32%), và B. subtilis P14 (35,14%) khi đƣợc khảo sát khả năng kết dính với vi khuẩn E. coli (David et al., 2016), nhƣng 2 chủng này có tỉ lệ kết dính cao hơn chủng AG27. Một kết quả khảo sát khác của Hồ Lê Quỳnh Châu và ctv (2010) đã báo cáo B. subtilis LII4 hoàn toàn không có khả năng kết dính với vi khuẩn E. coli.

107

Tỉ lệ bám dính (%)

70

60

50

40

0 giờ

30

5 giờ

20

10

0

AG27-E.coli

VL28-E.coli

AG27-S.enterica VL28-S.enterica

Chủng B. subtilis khảo sát/ vi khuẩn gây bệnh

Hình 4.20. Khả năng bám dính với vi khuẩn gây bệnh của AG27 và VL28

4.2.6.3. Khả năng bám dính với biểu mô ruột

Khả năng bám dính của 2 chủng AG27, và VL28 đƣợc quan sát qua tiêu bản vi thể biểu mô ruột gà thí nghiệm, nhuộm HE. Quan sát tiêu bản dƣới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 và 1000 lần đƣợc trình bày ở Hình 4.21

Hình 4.21. Khả năng bám dính của 2 chủng VL28 (bên trái) và AG27(bên phải) trong biểu mô ruột (400X và 1000X)

Kết quả cho thấy cả 2 chủng B. subtilis đều có khả năng bám dính với màng tế bào biểu mô ruột. Một số nghiên cứu trƣớc đây cũng góp phần khẳng định B. subtilis có khả năng bám dính trên tế bào biểu mô trong hệ tiêu hóa vật trong nghiên cứu của Thirabunyanon and chủ, nhƣ B. subtilis NC11

108

Thongwittaya (2012), B. subtilis AMS6 (Manhar et al., 2016), Nguyễn Thị Huyền và ctv (2014) cũng đều cho thấy B. subtilis có khả năng bám dính trên biểu mô ruột gà.

Tính kết dính của vi khuẩn probiotic góp phần quan trọng giúp tăng cƣờng sức khỏe của vật chủ (Oiwehand et al., 1999). Vì khả năng kết dính đƣợc xem là yếu tố quyết định cho việc sinh sống, cạnh tranh dinh dƣỡng, thành lập quần thể vi khuẩn probiotic trong đƣờng ruột của vật chủ, từ đó thể hiện hiệu quả kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh, điều hòa hệ miễn dịch, và hỗ trợ quá trình phục hồi cho mô ruột tổn thƣơng (Rinkinen et al., 2000, Ouwehand and Salminen, 2003). Do đó, Vine et al. (2004) đã khẳng định khả năng bám dính đƣợc xem nhƣ là tiêu chí quan trọng khi lựa chọn probiotic. Sau khi kiểm tra 3 đặc tính kết dính của 2 chủng VL28 và AG27 nhận thấy cả 2 đều có khả năng tự bám dính cao, có khả năng bám dính với tế bào biểu mô ruột gà, tuy nhiên khả năng kết dính của AG27 đối với vi khuẩn gây bệnh là rất thấp, vì thế dù AG27 đã đƣợc ghi nhận mang nhiều đặc điểm probiotic có lợi, nhƣng khả năng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh khi đƣợc dung nạp vào hệ tiêu hóa có thể kém hơn. Do đó chúng tôi chỉ chọn chủng VL28 để khảo sát khả năng sống trong đƣờng ruột gà.

4.2.7. Khả năng sống của vi khuẩn trong đƣờng ruột gà

Kết quả khảo sát khả năng sống của vi khuẩn trong đƣờng ruột gà đƣợc thể hiện thông qua mật số bào tử B. subtilis VL28 và phần trăm bào tử hiện diện đƣợc ghi nhận qua các mốc thời gian theo Bảng 4.19.

Bảng 4.19. Khả năng sống của B. subtilis VL28 trong đƣờng ruột gà

24 giờ 48 giờ Mẫu Lƣợng vi khuẩn và % hiện diện tại các thời điểm 72 giờ % % % % % 96 giờ log CFU/g 120 giờ log CFU/g log CFU/g log CFU/g log CFU/g

Ruột non

49 48 3,96 3,61 44 40 3,28 3,1 36 34 2,85 2,8 32 31 2,59 2,5 29 28 4,40 Manh Tràng 4,32

Ghi chú: Liều B. subtilis VL28 cho uống ban đầu 109 CFU/mL, mỗi gà 1mL.

3,94 44 3,32 37 3,07 34 2,69 30 2,26 25 Ruột già

Kết quả trình bày ở Bảng 4.19 cho thấy bào tử vi khuẩn B. subtilis VL28 có thể tồn tại trong đƣờng tiêu hóa của gà, với mật số giảm dần theo thời gian. Với liều cho uống ban đầu là 109CFU/mL, sau 24 giờ, đến ruột non, số lƣợng bào tử đƣợc ghi nhận hiện diện 49% (so với mật số ban đầu), giảm còn 44% ở thời điểm 48 giờ, và chỉ còn 29% bào tử hiện diện sau 120 giờ (2,59 log CFU/g, tƣơng

109

đƣơng mật số 3,8x102CFU/g). Kết quả cũng tƣơng tự ở manh tràng và ruột già. Điều này có thể là do bào tử đã nảy mầm trong hệ tiêu hóa hoặc thải ra ngoài theo phân. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Cartman et al. (2008), theo đó ghi nhận bào tử hiện diện trong đƣờng tiêu hóa còn 5x102 - 5x103 CFU/g sau thời gian 168 giờ. Một nghiên cứu khác của Latorre et al. (2014), sau khi khảo sát 120 giờ (5 ngày) đã nhận thấy mật số bào tử trong manh tràng chỉ còn 102CFU/g. Những kết quả trên đã góp phần khẳng định bào tử B. subtilis tồn tại luân chuyển trong ống tiêu hóa ở gà, và sẽ đƣợc thải ra ngoài theo phân. Theo Valerio et al. (2006), probiotic chỉ là sinh vật tạm trú, chỉ có mặt trong đƣờng ruột một thời gian ngắn, chúng không đƣợc xem là vi sinh vật đƣờng ruột của vật chủ. Chính vì thế, probiotic đƣợc khuyến cáo bổ sung thƣờng xuyên với mật số thích hợp để có thể ổn định hoạt tính.

Hình 4.22 cho thấy mật số bào tử B. subtilis giảm dần theo thời gian khi

luân chuyển qua ruột non, manh tràng và ruột già trƣớc khi đƣợc thải ra ngoài.

Tỉ lệ B. subtilis hiện diện so với mật số bổ sung ban đầu (%)

60

50

Ruột non

40

Manh tràng

Ruột già

30

20

10

0

48 giờ

96 giờ

72 giờ

120 giờ

24 giờ Thời điểm khảo sát sau bổ sung B. subtilis VL28

Hình 4.22. Khả năng tồn tại của B. subtilis VL28 ở ruột non, manh tràng và ruột già

Tóm lại, qua quá trình phân lập, tuyển chọn đã xác định chính xác bằng giải trình tự gen 21 chủng B. subtilis. Sau đó thực hiện khảo sát 7 đặc tính probiotic của 21 chủng B. subtilis này, chúng tôi đã chọn đƣợc chủng B. subtilis VL28 là chủng còn nhạy với nhiều kháng sinh, có khả năng chịu nhiệt, có hoạt tính cao với cả 3 loại enzyme amylase, protease và lipase. Hơn nữa, chủng này có

110

khả năng đối kháng cao với E. coli và S. enterica, chịu đƣợc acid dạ dày và muối mật, có tính bám dính cao và sống đƣợc trong đƣờng tiêu hóa gia cầm. B. subtilis VL28 thể hiện đầy đủ các đặc tính của chủng vi khuẩn làm probiotic, chúng tôi tiến hành thử nghiệm thực tế trên gà để có thể xác định đƣợc liều sử dụng hiệu quả cũng nhƣ khả năng phòng bệnh đƣờng tiêu hóa của chủng B. subtilis VL28.

Các quá trình phân lập và chọn lọc đƣợc thể hiện qua hình 4.23.

B. subtilis VL28 - B. subtilis AG27

B. subtilis VL28

Hình 4.23. Tóm tắt quá trình phân lập và chọn lọc vi khuẩn probiotic

4.3. Kết quả thí nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm trên gà

4.3.1. Kết quả thí nghiệm 1: Xác định liều sử dụng B. subtilis hiệu quả

Một số nghiên cứu cho thấy B. subtilis có khả năng cải thiện hiệu quả tăng trƣởng trên gà (Zhang et al., 2014). B. subtilis có thể sản sinh ra các enzyme amylase, protease và lipase với hoạt tính cao giúp phân giải các hợp chất

111

carbohydrate (protein và lipid) có nguồn gốc từ thực vật trong thức ăn, điều này giúp gia tăng hiệu suất tiêu hóa các dƣỡng chất và cung cấp thêm nhiều dinh dƣỡng cho động vật (Gao et al., 2017).

Thí nghiệm 1 với 4 nghiệm thức lần lƣợt là NT1 bổ sung B. subtilis VL28 vào thức ăn với liều 107CFU/g (5g/kg thức ăn), NT2 với liều 106CFU/g (5g/kg thức ăn), NT3 với liều 5x105CFU/g (5g/kg thức ăn), ĐC là nghiệm thức đối chứng sử dụng thức ăn của trại. Kết quả theo dõi tăng trọng, lƣợng thức ăn tiêu thụ và hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) của gà qua 8 tuần thí nghiệm đƣợc trình bày qua Bảng 4.20.

Bảng 4.20: Tăng trọng, thức ăn tiêu thụ và FCR gà qua 8 tuần thí nghiệm

P SEM Chỉ tiêu theo dõi

Nghiệm thức ĐC NT3 NT2 69,50 69,57 69,55 392,35 369,2 381,77 322,80b 312,20c 299,70d 695,00 669,60 671,20 2,32a 2,14b 2,08b 938,0 962,0 970,5 590,8b 556,3c 582,6b 1944a 1745b 1776b 3,29a 3,14a 3,05a 892,5b 868,5c 900,9b 2851a 2548bc 2587b 3,19a 2,94b 2,87b NT1 69,43 423,63 354,20a 653,70 1,85c 1061,7 638,1a 1721b 2,69b 992,2a 2370c 2,39c 0,09 1,09 1,14 9,39 0,03 5,24 4,844 34,80 0,02 5,245 45,83 0,054 0,000 0,000 0,000 0,079 0,000 0,000 0,000 0,007 0,001 0,000 0,001 0,001

Giai đoạn 1- 28 ngày KL đầu kỳ, g/con KL lúc 28 ngày, g/con Tăng trọng, g/con Thức ăn sử dụng, g/con FCR Giai đoạn 29-56 ngày KL lúc 56 ngày, g/con Tăng trọng, g/con Thức ăn sử dụng, g/con FCR Giai đoạn 1-56 ngày Tăng trọng, g/con Thức ăn sử dụng, g/con FCR a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 hàng thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) KL : khối lượng

4.3.1.1. Giai đoạn 1-28 ngày

Từ kết quả trình bày ở Bảng 4.20 cho thấy ở giai đoạn đầu (1-28 ngày tuổi), việc bổ sung B. subtilis VL28 vào khẩu phần thức ăn là có ý nghĩa đối với sự phát triển của gà, điều này thể hiện qua chỉ số tăng trọng ở cả 3 nghiệm thức đều cao hơn so với đối chứng, đầu tiên là NT1 (liều 107CFU/g) với tăng trọng đạt 354,20g, kế đến là NT2 (liều 106CFU/g) với tăng trọng ghi nhận là 322,8g, và cuối cùng là NT3 (liều 105CFU/g), tăng trọng đạt 312,2g. Nhƣ vậy về chỉ tiêu tăng trọng, NT1 cho kết quả cao nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các

112

nghiệm thức còn lại, mặc dù, lƣợng thức ăn sử dụng ở cả 3 nghiệm thức thì không khác biệt nhau, và tƣơng đƣơng so với ĐC. Về hệ số chuyển hóa thức ăn, nghiệm thức NT1 có hệ số chuyển hóa thức ăn thấp nhất, thấp hơn NT2, NT3 và nghiệm thức ĐC. Hệ số chuyển hóa thức ăn của các nghiệm thức theo thứ tự trên lần lƣợt là 1,85; 2,08; 2,14; 2,32. Kết quả trên cho thấy, trong giai đoạn từ 0-28 ngày tuổi, NT1 với liều sử dụng 107CFU/g cho kết quả về tăng trọng cao nhất và có FCR thấp nhất. Các nghiệm thức NT2, NT3 có kết quả FCR thấp hơn so với đối chứng, và tăng trọng NT2, NT3 cũng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng. Do đó, bổ sung B. subtilis VL28 với liều thích hợp có ý nghĩa thúc đẩy sự phát triển trên gà ở giai đoạn nhỏ (1-28 ngày tuổi).

4.3.1.2. Giai đoạn 29-56 ngày

Kết quả Bảng 4.20 cho thấy NT1 tăng trọng đạt 638,1g cao hơn so với các nghiệm thức còn lại, lƣợng thức ăn sử dụng (1,72g) và FCR (2,69) thấp hơn 2 nghiệm thức NT2, NT3 và 2 nghiệm thức ĐC1 và ĐC2. Ở giai đoạn này, các nghiệm thức NT2 và NT3 có FCR tƣơng đƣơng so với đối chứng. Điều này cho thấy khi bổ sung probiotic với liều không đủ thì hiệu quả đạt đƣợc không cao, đúng nhƣ định nghĩa về probiotic “Probiotic, đó là những vi sinh vật sống đƣợc kiểm soát chặt chẽ, với lƣợng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ” (FAO/WHO, 2002). Nhƣ vậy ở giai đoạn lớn (29-56 ngày) bổ sung probiotic với liều 5g B. subtilis 107CFU/g / kg thức ăn cho kết quả tốt.

4.3.1.3. Giai đoạn 1-56 ngày

Tăng trọng (g/con)

1200

1061.7

1000

938.0

NT1

800

NT2

706.8 651.6

600

NT3

400

ĐC

423.6 369.2

186.8

200

163.2

69.43

0

69.5 1

2

6

8

4 Thời gian khảo sát (tuần)

Hình 4.24. Biểu đồ tăng trọng và FCR của gà qua các tuần ở thí nghiệm 1

113

Hình 4.24 cho thấy liều bổ sung B. subtilis VL28 (107CFU/g) ở NT1 có ý nghĩa thúc đẩy sự tăng trƣởng ở gà không chỉ vào giai đoạn gà nhỏ (1-28 ngày), mà còn thích hợp với giai đoạn lớn hơn (29-56 ngày), do đó, tăng trọng toàn kỳ của NT1 đạt giá trị cao nhất (992,2g), tăng 11,17% và lƣợng thức ăn sử dụng (2370g) giảm 16,87%, ngoài ra, chỉ số FCR cũng đƣợc ghi nhận thấp nhất (2,39), giảm 25% khi so sánh với ĐC. Trong khi đó, mặc dù không có nhiều ảnh hƣởng lên giai đoạn 29-56 ngày tuổi, nhƣng khi đánh giá hiệu quả toàn kỳ thì NT2 và NT3 vẫn có hiệu quả tích cực, mặc dù tăng trọng không cao hơn ĐC nhƣng lƣợng thức ăn sử dụng và chỉ số FCR lại đƣợc ghi nhận thấp hơn. Điều này cho thấy việc bổ sung B. subtilis VL28 vào khẩu phần ăn của gà mang một ý nghĩa nhất định, góp phần làm giảm lƣợng thức ăn tiêu thụ, và chỉ số FCR thấp hơn. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Tiến Toàn và Đỗ Văn Ninh (2013) đã ghi nhận bổ sung probiotic B. subtilis với liều 0,6% trong khẩu phần thức ăn đã giúp tăng tốc độ sinh trƣởng 4% và hệ số chuyển hóa thức ăn trên 1 kg tăng trọng giảm 9,8%, so với lô ĐC, vì tác dụng tích cực của probiotic là giúp vật nuôi ăn ngon, tăng sức đề kháng và kích thích chuyển hóa thức ăn tốt hơn. Nhiều nghiên cứu trƣớc đây cũng đã ghi nhận rằng bổ sung B. subtilis với mật số 106-109 CFU/kg có thể gây hiệu quả tích cực trên hệ vi sinh đƣờng ruột, từ đó giúp cải thiện hiệu quả tăng trƣởng trên gà (Teo and Tan, 2006; Zhang et al., 2014). Trong một thí nghiệm của Lee et al. (2010) đã ghi nhận bổ sung với mật số 1,5x105CFU/g không thể hiện hiệu quả tăng trọng trên gà (1-22 ngày tuổi). Theo Chesson (1994), sở dĩ có nhiều ghi nhận khác nhau về liều sử dụng và hiệu quả của B. subtilis trên vật nuôi do chịu ảnh hƣởng của nhiều nhân tố nhƣ: tuổi vật nuôi, liều sử dụng, đặc tính chủng probiotic sử dụng, khẩu phần ăn, dạng thức ăn, và sự tƣơng tác giữa các phụ gia trong thức ăn. Qua thí nghiệm này cho thấy liều bổ sung 0,5% B. subtilis VL28 mật số 107CFU/g vào khẩu phần ăn là thích hợp cho sự phát triển của gà từ giai đoạn 1 đến 56 ngày tuổi. Từ kết quả trên, thí nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic khi gây nhiễm với S. enterica và E. coli sẽ sử dụng liều bổ sung 0,5% B. subtilis VL28 mật số 107CFU/g vào khẩu phần ăn.

4.3.2. Kết quả thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic ở

gà khi gây nhiễm với S. enterica so với kháng sinh

Theo Okuneye et al. (2016) bệnh do vi khuẩn Salmonella ở gia cầm đã gây ra những tổn thất kinh tế nghiêm trọng. Xác định nguồn lây nhiễm Salmonella, và biện pháp để ngăn chặn quá trình lây nhiễm là quá trình khó khăn (Foley et al., 2011). Foley and Lynne (2008) đã ghi nhận S. enterica thƣờng tấn công gà vào

114

giai đoạn còn nhỏ, dẫn đến tỉ lệ chết rất cao nếu không đƣợc điều trị kịp thời. Trong chăn nuôi gia cầm nếu bổ sung probiotic với liều hợp lý sẽ mang lại nhiều lợi ích nhƣ tăng cƣờng sức đề kháng (Khaksefidi and Ghoorchi, 2006), và đối kháng cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh giúp giảm thiệt hại do bệnh tật (Chambers and Gong, 2011; Tellez et al, 2012). Ở thí nghiệm 2, thí nghiệm gây nhiễm S. enterica vào ngày tuổi thứ 18, chúng tôi bổ sung B. subtilis VL28 (NT1) vào khẩu phần ăn của gà để so sánh với các nghiệm thức sử dụng kháng sinh (NT2: bổ sung oxytetracycline 50mg/kg thức ăn và NT3: bổ sung enrofloxacin 15mg/kg thức ăn). Kết quả thí nghiệm qua các giai đoạn đƣợc trình bày sau đây.

4.3.2.1. Giai đoạn 1-14 ngày tuổi

Đây là giai đoạn gà chƣa gây bệnh, kết quả ghi nhận ở Bảng 4.21 cho thấy về tỉ lệ chết không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức ở mức thống kê. Tuy nhiên ở chỉ tiêu tăng trọng, nghiệm thức NT1 có mức tăng trọng cao hơn đạt 129,7g, khác biệt ở mức ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Bên cạnh đó, lƣợng thức ăn sử dụng của NT1 và ĐC (-) (248,9g; 248,8g) thấp hơn NT2, NT3 và ĐC (+). Đặc biệt khi quan sát chỉ số FCR cho thấy FCR của NT1 thấp nhất (1,92) thấp hơn các nghiệm thức còn lại ở mức ý nghĩa thống kê.

Bảng 4.21: Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi trong thí nghiệm 2

Nghiệm thức

SEM

P

Chỉ tiêu

NT1

NT2

NT3 ĐC (+) ĐC (-)

Trọng lƣợng đầu kỳ, g/con 68,71

69,40

68,42

68,32

67,69

0,41

0,118

Tăng trọng, g/con

0,59

0,000

Thức ăn sử dụng, g/con

1,78

0,004

FCR

129,7a 125,1bc 248,9bc 255,7ab 2,02a 1,92b

127,5ab 258,7a 2,03a

124,7c 125,4bc 247,2c 248,9bc 1,99a 1,98a

0,01

0,000

Tỉ lệ chết , %

2,2

3,3

4,4

2,2

2,2

0,98

0,452

a,b,c các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 hàng thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) NT1: Bổ sung B. subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời gian thí nghiệm. NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. ĐC (+): Gây nhiễm Salmonella không điều trị ĐC (-): không gây nhiễm

Các thông số ghi nhận thể hiện qua Hình 4.25, đã chứng minh B. subtilis VL28 ở nghiệm thức NT1 có hiệu quả cho gà ở giai đoạn 0-14 ngày tuổi, giúp gà khỏe mạnh, tăng trọng và lƣợng thức ăn tiêu thụ giảm. Các nghiệm thức NT2,

115

NT3 và ĐC có các kết quả về tăng trọng và FCR không khác biệt. Một số nghiên cứu trƣớc đây cũng đã ghi nhận hiệu quả của B. subtilis khi đƣợc bổ sung vào khẩu phần thức ăn nhƣ: Zaghari et al. (2015) đã ghi nhận sau 7 tuần nuôi, gà ở nghiệm thức bổ sung B. subtilis có trọng lƣợng (2739,95 g) đạt cao hơn đối chứng (2669,15 g), và chỉ số FCR (1,86) đƣợc cải thiện hơn so với đối chứng (1,9). Cho (2014) khi so sánh các nghiệm thức có bổ sung B. subtilis với hàm lƣợng từ 107 - 109CFU/g so với đối chứng đã ghi nhận các nghiệm thức sử dụng B. subtilis đã cải thiện đƣợc FCR (1,613) và khối lƣợng thức ăn tiêu thụ (1242 g) đáng kể so với đối chứng; trong đó nghiệm thức B. subtilis với liều cao nhất (109CFU/g) đƣợc đánh giá cho hiệu quả cao nhất.

Hình 4.25. FCR và tăng trọng ở giai đoạn 1-14 ngày tuổi của thí nghiệm 2

4.3.2.2. Giai đoạn 15-28 ngày

Sau khi gây nhiễm S. enterica ở ngày thứ 18, lô ĐC (+) gà bắt đầu có biểu hiện bệnh và chết vào ngày thứ 3 sau gây nhiễm và chết nhiều nhất vào giai đoạn 5-7 ngày sau gây nhiễm, đến ngày thứ 10 lô ĐC (+) chỉ còn lại 5-7 con/30con. Kết quả về tăng trọng, thức ăn sử dụng, FCR và tỉ lệ chết giai đoạn 15-28 ngày đƣợc ghi nhận qua Bảng 4.22.

Kết quả ở Bảng 4.22 cho thấy nghiệm thức ĐC (+) (nghiệm thức gây bệnh

nhƣng không điều trị) đƣợc ghi nhận có tỉ lệ chết rất cao đến 72,7%, chứng tỏ S. enterica là chủng vi khuẩn độc có khả năng gây chết với tỉ lệ cao ở gà.

116

Bảng 4.22: Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 15-28 ngày tuổi

Nghiệm thức SEM P Chỉ tiêu NT1 NT2 NT3 ĐC (+) ĐC(-)

Tăng trọng, g/con 252,8a 234,4ab 239,2ab 122,2c 226,0b 4,66 0,00

Thức ăn sử dụng, g/con 548,2ab 572,2a 588,6a 450,7c 508,0b 8,88 0,00

FCR 2,17c 2,44b 2,46b 3,69a 2,25bc 0,06 0,00

a,b các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 hàng thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) NT1: Bổ sung B. subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời gian thí nghiệm. NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. ĐC (+): Gây nhiễm Salmonella không điều trị ĐC (-): không gây nhiễm

Tỉ lệ chết , % 1,1b 5,7b 7,0b 72,7a 1,1b 1,959 0,00

Các nghiệm thức NT1, NT2, NT3 và ĐC (-) có tỉ lệ chết lần lƣợt là 1,1%; 5,7%, 7,0% và 1,1%, tỉ lệ chết ở các nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Nhƣ vậy trong thí nghiệm này cho thấy gà ở NT1 sử dụng B. subtilis VL28 có sức đề kháng tốt và B. subtilis VL28 có khả năng đối kháng mạnh với Salmonella. Chính vì vậy mà ở liều gây nhiễm (7,5x104CFU/g) vi khuẩn Salmonella đã bị ức chế không có khả năng phát triển gây bệnh, thể hiện qua tỉ lệ chết ở nghiệm thức này rất thấp (1,1%) thấp hơn so với nghiệm thức sử dụng kháng sinh NT2, NT3. Khi gây nhiễm S. enterica, NT1 không những không bệnh mà còn có tỉ lệ tăng trọng cao. NT1 có tăng trọng cao hơn so với NT2 và NT3 là 2 nghiệm thức sử dụng kháng sinh điều trị. Điều này cho thấy kháng sinh điều trị có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh và cũng tiêu diệt cả các vi khuẩn có lợi trong đƣờng ruột nên đã làm giảm khả năng tăng trọng ở 2 nghiệm thức này. Ngoài ra NT1 còn có tăng trọng cao hơn cả nghiệm thức ĐC (-) là nghiệm thức không nhiễm bệnh. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Knap et al., (2011) đã ghi nhận ở nghiệm thức gây bệnh sử dụng B. subtilis DSM17299 điều trị có tăng trọng cao hơn ĐC (-) là lô không gây bệnh, đồng thời chỉ số FCR cũng đƣợc cải thiện hơn. Có thể nói S. enterica là vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm, khi gà nhiễm bệnh mà không đƣợc điều trị thì gà sẽ chết với số lƣợng rất lớn, ngoài ra, còn gây tiêu tốn thức ăn nhƣng tăng trọng vẫn không cao.

117

Tăng trọng (g) 260 252.8

250

239.9

239.2

240

234.4

226

230

220

210

NT1

NT2

NT3

ĐC (+)

ĐC(-)

Các nghiệm thức thí nghiệm

Hình 4.26. Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 15-28 ngày tuổi trên gà

Các ghi nhận trên cho thấy B. subtilis VL28 và kháng sinh oxytetracyline, enrofloxacine đều có hiệu quả điều trị bệnh do vi khuẩn S. enterica, tỉ lệ chết của 3 nghiệm thức NT1, NT2 và NT3 thấp hơn rất nhiều so với ĐC (+), tỉ lệ chết ở NT1 thấp hơn 66 lần, NT2 thấp hơn 13 lần, và NT3 thấp hơn 10 lần. Thức ăn tiêu thụ và FCR của 3 NT là tƣơng đƣơng, chứng minh VL28 có khả năng kiểm soát bệnh với hiệu quả tƣơng đƣơng so với kháng sinh, tuy nhiên tỉ lệ chết thấp hơn và tăng trọng cao hơn so với lô sử dụng kháng sinh. Hình 4.26 cho thấy rõ NT1 có FCR thấp nhất và tăng trọng cao nhất.

4.3.2.3. Kết quả khảo sát bệnh tích và phân lập vi khuẩn trên gà bệnh

Ở lô ĐC (+) gà bắt đầu chết với số lƣợng nhiều, tiến hành mổ khám, bệnh tích đƣợc ghi nhận trên gà gồm: gan lách sƣng, xung huyết, mật sƣng to, ruột và tiền mề xuất huyết, các dấu hiệu bệnh tích này phù hợp với bệnh tích gây ra do vi khuẩn Salmonella (Hình 4.27).

Mẫu gan và lách đƣợc thu nhận, phân lập, và xác định vi khuẩn gây bệnh. Kết quả cấy trải trên đĩa petri: chỉ có 1 dạng vi khuẩn đƣợc phát hiện trong mẫu bệnh phẩm, khuẩn lạc không màu đặc trƣng có tâm đen trên môi trƣờng SS; và khuẩn lạc có màu hồng, trong, tròn, lồi trên môi trƣờng BGA, là dạng khuẩn lạc của Salmonella trên các môi trƣờng đặc trƣng.

118

Gan lách sƣng, xung huyết Mật sƣng to

Ruột xuất huyết Tiền mề xuất huyết

Hình 4.27. Bệnh tích gà trong thí nghiệm gây nhiễm S. enterica

Kết quả xác định bằng các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bệnh phân lập ở

gan, lách phù hợp với đặc tính sinh hóa của Salmonella thể hiện qua Hình 4.28.

a)

b)

Hình 4.28 (a) Khuẩn lạc S.enterica trên môi trƣờng SS. (b) Kết quả test sinh hóa (từ trái sang: ống 1: Glucose (+), Lactose (-), H2S (+); ống 2: Citrate (+); ống 3: Lysine (+), Ống 4: Indole(-), ống 5: VP(-); MR(+))

119

Kết quả giải trình tự gen đã xác nhận trình tự gen của vi khuẩn phân lập có tỉ lệ đồng hình 100% với S. enterica, chứng tỏ vi khuẩn gây chết gà trong thí nghiệm trùng khớp với vi khuẩn gây nhiễm thực nghiệm.

Hình 4.29. Kết quả giải trình tự vi khuẩn S. enterica phân lập từ lách gà bệnh

4.3.2.4. Giai đoạn 29 - 56 ngày

Kết quả khảo sát các chỉ tiêu trong giai đoạn 29-56 ngày tuổi đƣợc trình

bày qua Bảng 4.23.

Bảng 4.23: Tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 29-56 ngày trong thí nghiệm 2

Nghiệm thức Chỉ tiêu SEM P

5,04 27,98 Tăng trọng , g Thức ăn sử dụng, g 0,00 0,00

0,06

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 hàng thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) NT1: Bổ sung B. subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời gian thí nghiệm. NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. ĐC (+): Gây nhiễm Salmonella không điều trị ĐC (-): không gây nhiễm

2,00 FCR Tỉ lệ chết , % NT1 542,3a 1877a 3,46c 1,11b NT2 493,5c 496,8bc 1999a 1956a 4,02b 3,96b 7,4b 4,8b NT3 ĐC (+) ĐC (-) 518,2b 307,5d 1738b 1480c 3,35c 4,81a 2,30b 20,37a 0,00 0,00

120

Ở giai đoạn 29-56 ngày, tỉ lệ chết của các nghiệm thức NT1, NT2, NT3 và ĐC đều giảm so với giai đoạn bắt đầu gây bệnh. Tỉ lệ chết ở các NT1, NT2, NT3 và ĐC khác biệt không ý nghĩa thống kê, nhƣng các nghiệm thức này lại khác biệt rất có ý nghĩa so với ĐC (+). Điều này cho thấy các nghiệm thức sử dụng probiotic và kháng sinh đã khống chế đƣợc bệnh, tỉ lệ chết đã giảm hẳn, và tăng trọng cao hơn so với ĐC (+). Ngƣợc lại, ảnh hƣởng bệnh do vi khuẩn Salmonella mà không đƣợc điều trị đã tiếp tục gây thiệt hại trên gà ở ĐC (+), gà có tăng trọng thấp hơn gần 2 lần so với NT1, cùng với trị số FCR cao. Điều đáng ghi nhận ở giai đoạn này là NT1 vẫn đạt tăng trọng cao nhất (542,3g), đồng thời có chỉ số FCR (3,46) khác biệt không ý nghĩa so với ĐC (-) (3,35). Khi so với 2 nghiệm thức sử dụng kháng sinh thì NT1 vƣợt trội hơn. Ở lô ĐC (-), là lô không gây bệnh, có FCR thấp hơn NT1 (khác biệt không ý nghĩa) nhƣng tăng trọng lại thấp hơn (khác biệt có ý nghĩa thống kê). Giai đoạn này đã chứng minh B. subtilis VL28 giúp gà phát triển tốt, tăng sức đề kháng, khi bị nhiễm bệnh, gà vẫn tiếp tục duy trì với tỉ lệ sống, và tăng trọng cao tƣơng đƣơng với lô ĐC (-) không bị nhiễm bệnh. Hình 4.30 thể hiện sự khác biệt về các thông số ghi nhận giữa các nghiệm thức, và cho thấy NT1 có hiệu quả cao hơn các nghiệm thức còn lại.

Tăng trọng (g)

FCR

5

4.44

600

545.6

3.71

3.54

513.1 502.7

3.47

4

3.28

480.8

500

3

400

2

283.3

300

1

0

200

NT1

NT2

NT3

ĐC (+)

ĐC(-)

NT1

NT2

NT3 ĐC (+) ĐC(-)

Các nghiệm thức thí nghiệm

Các nghiệm thức thí nghiệm

Hình 4.30. Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 29-56 ngày tuổi trên gà thí nghiệm 2

4.3.2.5. Giai đoạn 1 – 56 ngày

Kết quả khảo sát các chỉ tiêu trong toàn thí nghiệm đƣợc trình bày qua

Bảng 4.24.

121

Bảng 4.24: Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-56 ngày tuổi trong thí nghiệm 2

Nghiệm thức SEM P Chỉ tiêu

1,792 Tỉ lệ chết , % 0,00

2,92 Tăng trọng, g 0,00

11,41 Thức ăn sử dụng, g 0,00

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 hàng thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) NT1: Bổ sung B. subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời gian thí nghiệm. NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. ĐC (+): Gây nhiễm Salmonella không điều trị ĐC (-): không gây nhiễm

0,01 FCR NT1 4,44d 924,8a 2674b 2,89c NT2 13,33bc 852,9c 2757a 3,23b NT3 17,78b 863,5bc 2792a 3,23b ĐC (+) 78,89a 554,4d 2101d 3,80a ĐC(-) 5,56cd 869,7b 2495c 2,87c 0,00

Khi đánh giá toàn kỳ (1-56 ngày), nhận thấy NT1 có khả năng điều trị bệnh nhiễm khuẩn do S. enterica, với hiệu quả đƣợc chứng minh qua các thông số nhƣ: tỉ lệ chết, tăng trọng cao qua các giai đoạn, lƣợng thức ăn tiêu thụ, và chỉ số FCR gần nhƣ luôn đƣợc ghi nhận thấp hơn các nghiệm thức còn lại. Điều trị bằng B. subtilis VL28 có hiệu quả hơn điều trị bằng kháng sinh, khi tỉ lệ chết, FCR và tiêu tốn thức ăn thấp hơn, nhƣng tăng trọng cao hơn 2 nghiệm thức sử dụng kháng sinh. Đặc biệt, dù là lô bị nhiễm bệnh, nhƣng gà ở NT1 lại có tăng trọng cao hơn ĐC (-), là lô không gây bệnh trên gà.

Dễ dàng nhận thấy ở nghiệm thức ĐC (+), khi gà bị bệnh mà không đƣợc điều trị sẽ gây hậu quả nghiêm trọng nhƣ (1) Tỉ lệ chết rất cao, đến 78,89%, nghĩa là chỉ còn 21% gà sống sót đến cuối kỳ, (2) Tăng trọng thấp, chỉ đạt 544,4g sau 8 tuần nuôi. Ngƣợc lại, khi gà đƣợc bổ sung B. subtilis VL28 với liều 0,5g/kg thức ăn ở NT1 từ giai đoạn đầu thì khi nhiễm bệnh S. enterica vẫn duy trì tỉ lệ sống cao (95,56%), tăng trọng cao, đạt 924,8g sau 8 tuần nuôi. Những kết quả ghi nhận ở thí nghiệm này đã giúp khẳng định việc bổ sung B. subtilis VL28 vào khẩu phần ăn thực sự có ý nghĩa, không chỉ giúp hỗ trợ phát triển dinh dƣỡng trên gà ngay cả khi gà bị bệnh, mà hoàn toàn có thể thay thế kháng sinh trong kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn do S. enterica. Mặt khác, sử dụng probiotic mang lại nhiều lợi ích nhƣ an toàn cho vật nuôi, tránh đƣợc tình trạng tồn dƣ kháng sinh, và không gặp phải hiện tƣợng kháng thuốc nhƣ hiện nay.

122

Kết quả trên cũng phù hợp với nhiều báo cáo trƣớc đây đã khẳng định vi khuẩn B. subtilis có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Salmonella trên gà nhiễm bệnh, nhƣ (1) Jeong và Kim (2014); Baltzley et al. (2014) đã khảo sát và ghi nhận bào tử B. subtilis có khả năng làm giảm hàm lƣợng S. enterica trong manh tràng và hồi tràng. (2) Knap et al. (2011) đã chứng minh bào tử B. subtilis có thể đối kháng lại với vi khuẩn Salmonella, thể hiện qua mật số vi khuẩn bệnh trong đƣờng tiêu hóa và trên sàn nuôi đều giảm. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này lại không ghi nhận đƣợc sự khác biệt về chỉ số FCR cũng nhƣ tăng trọng giữa lô ĐC dƣơng (lô gây nhiễm, không điều trị), và lô có bổ sung B. subtilis.

4.3.3. Kết quả thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic ở

gà khi gây nhiễm với E. coli so với kháng sinh

Theo Ewers et al. (2003), bệnh do E. coli gây ra là một trong những nguyên nhân chính gây sụt giảm kinh tế trong chăn nuôi gia cầm. Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy bổ sung B. subtilis vào thức ăn giúp giảm thiểu khả năng mắc bệnh do E. coli ở gia cầm (Jeong and Kim, 2014). B. subtilis VL 28 qua các thí nghiệm invitro cho thấy có khả năng đối kháng với E. coli. Trong thí nghiệm này, chúng tôi bổ sung B. subtilis VL28 vào thức ăn cho gà và thực hiện gây nhiễm E. coli ở gà 18 ngày tuổi để so sánh với các nghiệm thức điều trị bằng kháng sinh enrofloxacin và oxytetracyclin. Kết quả khảo sát qua các giai đoạn đƣợc trình bày dƣới đây.

4.3.3.1. Giai đoạn 1-14 ngày

Kết quả khảo sát các chỉ tiêu trong giai đoạn 1-14 ngày tuổi đƣợc trình bày

qua Bảng 4.25.

Bảng 4.25: Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi

Nghiệm thức Chỉ tiêu SEM P NT1 NT2 NT3 ĐC (+) ĐC(-)

0,96 Tỉ lệ chết , % 3,33 2,22 0,74

Tăng trọng, g 0,00

0,527 2,00 Thức ăn sử dụng, g 0,04

a,b các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 hàng thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) NT1: Bổ sung B. subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời gian thí nghiệm. NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. ĐC (+): Gây nhiễm E.coli mà không điều trị ĐC (-): không gây nhiễm

0,018 FCR 2,22 130,3a 246,6 1,89b 3,33 2,22 126,2b 124,8bc 123,5c 124,2bc 246,6 255,2 1,97a 2,02a 251,7 2,02a 247,1 2,00a 0,00

123

Ở giai đoạn đầu thí nghiệm, tỉ lệ chết và lƣợng thức ăn sử dụng giữa các nghiệm thức không khác biệt nhau. Tuy nhiên, tăng trọng và FCR của nghiệm thức NT1 có cải thiện. Có thể nhận thấy NT1 có tăng trọng cao nhất (130,3 g) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại, NT2 (126,2 g) và NT3 (124,8 g), ĐC (+) 123,5 g và ĐC (-) 124,2 g. Bên cạnh đó, hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) của NT1 đƣợc ghi nhận thấp nhất (1,89), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Kết quả ở giai đoạn này cho thấy sử dụng probiotic B. subtilis VL28 cho gà giúp tăng trọng và cải thiện chỉ số FCR. Kết quả này khá phù hợp với nghiên cứu của Gao et al., (2017), trong nghiên cứu này B. subtilis giúp cải thiện tăng trọng và FCR đáng kể nhƣng không quan sát thấy cải thiện lƣợng thức ăn sử dụng. Những báo cáo tƣơng tự cũng đƣợc ghi nhận bởi các nghiên cứu của Huang (2012); Gao et al., (2017).

4.3.3.2. Giai đoạn 15-28 ngày

Sau khi gây nhiễm E. coli ở ngày thứ 18, lô ĐC (+) gà bắt đầu có biểu hiện bệnh và chết vào ngày thứ 5 sau gây nhiễm và chết nhiều nhất vào giai đoạn 5-10 ngày sau gây nhiễm, đến ngày thứ 10 lô ĐC (+) chỉ còn lại 15 con/30con. Kết quả về tăng trọng, thức ăn sử dụng, FCR và tỉ lệ chết giai đoạn 15-28 đƣợc ghi nhận qua Bảng 4.26.

Bảng 4.26: Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR gà giai đoạn 15-28 ngày tuổi

Nghiệm thức Chỉ tiêu SEM P

1,95 Tỉ lệ chết , % 0,00

a,b các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 hàng thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01) NT1: Bổ sung B. subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời gian thí nghiệm. NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu từ ngày gây nhiễm. ĐC (+): Gây nhiễm E.coli mà không điều trị ĐC (-): không gây nhiễm

Tăng trọng , g Thức ăn sử dụng, g FCR NT1 4,56b 246,9a 551,9a 2,24b NT2 5,75b 242,2a 544,4a 2,25b NT3 ĐC (+) ĐC (-) 1,11b 35,25a 8,05b 119,1b 240,6a 238,2a 4,28 477,5b 521,8ab 11,35 552,5a 2,19b 4,01a 2,30b 0,037 0,00 0,004 0,00

Sau khi gây nhiễm E. coli, tỉ lệ chết ở các nghiệm thức có sự khác biệt, ở lô ĐC (+) là lô gây bệnh nhƣng không điều trị, tỉ lệ chết đến 35,25%, kết quả này cho thấy vi khuẩn E. coli đã đƣợc dung nạp với mật số đủ để gây bệnh. Tỉ lệ chết ở NT1 là 4,56%, NT2 là 5,75%, NT3 là 8,05%, điều này cho thấy B. subtilis VL28 và các kháng sinh enrofloxacin và oxytetracycline đều có khả năng làm

124

giảm tỉ lệ chết ở gà nhiễm E.coli hay nói cách khác là có khả năng điều trị bệnh. Lô sử dụng B. subtilis VL28 có tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR tƣơng đƣơng với các lô sử dụng kháng sinh và tƣơng đƣơng với ĐC (-) không bệnh.

Từ kết quả trên cho thấy (1) E. coli là tác nhân gây bệnh nguy hiểm, với tỉ lệ chết gần đến 40% nếu không đƣợc điều trị sẽ kéo theo nhiều hệ quả nhƣ tăng trọng giảm, tiêu tốn thức ăn cao. (2) Cả kháng sinh và B. subtilis VL28 đều có hiệu quả trong kiểm soát bệnh do E. coli, khi so sánh các chỉ tiêu tăng trọng và FCR các nghiệm thức này khác biệt không ý nghĩa thống kê so với ĐC (-). Qua hình 4.31 có thể thấy cả 3 NT điều trị bằng kháng sinh và VL28 cũng nhƣ ĐC (-) thể hiện tăng trọng và FCR nhƣ nhau, ngƣợc lại ĐC (+) có chỉ số tăng trọng thấp nhất trong khi FCR lại đƣợc ghi nhận cao nhất.

5

300

4.01

246.9 242.2 240.6

238.2

250

4

200

3

2.3

2.25

2.24

2.19

119.1

150

2

100

1

50

0

0

NT1

NT2

NT3 ĐC (+) ĐC(-)

NT1

NT2

NT3

ĐC (+)

ĐC(-)

Tăng trọng (g) FCR

Hình 4.31. Tăng trọng và FCR giai đoạn 15-28 ngày tuổi của gà thí nghiệm 3

4.3.3.3. Kết quả khảo sát bệnh tích và phân lập vi khuẩn trên gà bệnh

Ở lô ĐC (+) gà bắt đầu chết với số lƣợng nhiều, tiến hành mổ khám, bệnh tích đƣợc ghi nhận trên gà gồm: Viêm màng bao tim tích nƣớc, màng bụng có dịch viêm, gan có những đốm trắng hoại tử, ruột tích nƣớc sƣng phồng, cắt bên trong ruột có bọt khí (Hình 4.32). Các dấu hiệu bệnh tích này phù hợp với bệnh tích gây ra do vi khuẩn E. coli.

125

Viêm màng bao tim, tích nƣớc

Gan sung huyết, hoại tử

Ruột tích nƣớc sƣng phồng

Có bọt khí trong ruột

Hình 4.32. Bệnh tích gà trong thí nghiệm gây nhiễm E. coli

Mẫu gan và lách đƣợc thu nhận, phân lập, và xác định vi khuẩn gây bệnh. Kết quả cấy trải trên đĩa petri: chỉ có 1 dạng vi khuẩn đƣợc phát hiện trong mẫu bệnh phẩm, khuẩn lạc màu tím ánh kim trên môi trƣờng EMB, khuẩn lạc màu đỏ, tròn, lồi trên Mac Conkey, là dạng khuẩn lạc của E. coli trên các môi trƣờng đặc trƣng (Hình 4.33).

Hình 4.33. Khuẩn lạc E. coli trên trƣờng Mac Conkey (khuẩn lạc màu hồng) và EMB (khuẩn lạc màu tím ánh kim)

126

Kết quả xác định bằng các phản ứng sinh hóa phù hợp với đặc tính sinh hóa

của E. coli

Bảng 4.27: Kết quả test sinh hóa E. coli trên bệnh phẩm gan

Test Glucose Lactose Lysine Citrate Indole Kết quả + + - - + Test VP MR Di động H2S Kết quả - + + -

Hình 4.34. Test sinh hóa vi khuẩn E. coli Từ trái sang: ống 1: glucose (+), ống 2: lysine (-), ống 3: citrate (-), ống 4: Indol (+), ống 5:Methyl red (+)

Kết quả giải trình tự gen cho kết quả là vi khuẩn E. coli, với tỉ lệ đồng hình

100% phù hợp với vi khuẩn E. coli đã gây nhiễm (Hình 4.35)

127

Hình 4.35. Kết quả giải trình tự vi khuẩn E. coli phân lập từ gan gà bệnh

4.3.3.4. Giai đoạn 29-56 ngày

Khi chuyển sang giai đoạn lớn hơn, tỉ lệ chết đã giảm ở tất cả các lô gây nhiễm, cho thấy gà đã phục hồi sau khi bị nhiễm bệnh. Kết quả khảo sát các chỉ tiêu đƣợc thể hiện trong Bảng 4.28.

Bảng 4.28 cho thấy ở lô ĐC (+) vẫn còn chịu ảnh hƣởng bệnh do E. coli nên mặc dù tỉ lệ chết đã giảm nhƣng tăng trọng không đáng kể so với giai đoạn trƣớc, cùng với chỉ số FCR cao hơn các NT còn lại. Ngƣợc lại, NT2 và NT3 vẫn tiếp tục duy trì hiệu quả nhƣ giai đoạn gây bệnh cho gà, nghĩa là gà có tăng trọng, và FCR tƣơng đƣơng nhƣ lô ĐC (-). Điều đáng lƣu ý ở giai đoạn này là NT1 đã thể hiện hiệu quả cao hơn các NT2, NT3 và ĐC. Với tăng trọng đạt 545,6 g, và chỉ số FCR là 3,28, NT1 đã cải thiện đƣợc 2 chỉ tiêu này so với NT2 và NT3.

128

Bảng 4.28: Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 29-56 ngày tuổi trong thí nghiệm 3

Chỉ tiêu SEM P

Tỉ lệ chết , % Tăng trọng , g 0,356 0,00

2,01 4,826 22,73 Thức ăn sử dụng, g 0,00

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 hàng thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)

NT1: Bổ sung B. subtilis VL28 107CFU/g (5g/kg thức ăn) NT2: Bổ sung oxytetracyclin 50mg/kg thức ăn NT3: Bổ sung enrofloxacin 15mg/kg thức ăn ĐC (+): Gây nhiễm E.coli mà không điều trị ĐC (-): không gây nhiễm

0,035 FCR NT1 1,15 545,6a 1791a 3,28d Nghiệm thức NT3 NT2 6,04 6,18 513,1b 502,7bc 1864a 1816a 3,71b 3,54c ĐC (+) ĐC(-) 4,48 480,8c 1666b 3,47c 6,57 283,3d 1258c 4,44a 0,00

Có thể thấy, khi sử dụng liên tục probiotic B. subtilis VL28 sẽ mang lại nhiều lợi ích cho sự phát triển của gà. Gà không chỉ phát triển khỏe mạnh mà hệ miễn dịch còn đƣợc tăng cƣờng, có khả năng đối kháng lại với vi khuẩn gây bệnh.

Hình 4.36 cho thấy VL28 có tăng trọng và FCR cải thiện hơn so với các lô

còn lại.

Tăng trọng (g)

FCR

5

545.6

4.44

513.1 502.7

3.71

480.8

3.54

4

3.47

3.28

3

2

283.3

1

0

600 550 500 450 400 350 300 250 200

NT1

NT2

NT3

ĐC (+)

ĐC(-)

NT1

NT2

NT3

ĐC (+) ĐC(-)

Các nghiệm thức thí nghiệm

Các nghiệm thức thí nghiệm

Hình 4.36. Tăng trọng và FCR giai đoạn 29-56 ngày tuổi của gà thí nghiệm 3

4.3.3.5. Giai đoạn 1-56 ngày Kết quả đánh giá cả giai đoạn thí nghiệm (8 tuần) đƣợc thể hiện trong

Bảng 4.29.

129

Bảng 4.29: Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-56 ngày tuổi trong thí nghiệm 3

Nghiệm thức Chỉ tiêu SEM P NT2

1,57 Tỉ lệ chết , % 0,00

3,71 Tăng trọng , g 0,00

21,53 Thức ăn sử dụng, g 0,001

a,b,c,d các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 hàng thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)

0,03 FCR NT1 7,78cd 922,7a 2589a 2,80c NT3 14,44bc 16,66b 868,0b 881,5b 2633a 2583a 3,03b 2,93bc ĐC (+) ĐC(-) 5,56d 42,22a 843,2c 525,9d 2435b 2657c 2,89bc 3,69a 0,00

Kết quả đánh giá toàn kỳ cho thấy điều trị bệnh bằng B. subtilis VL28 mang lại hiệu quả cao nhất, vì VL28 đã hỗ trợ cho gà phát triển tốt ngay cả trong trƣờng hợp bị nhiễm bệnh, thể hiện qua tăng trọng toàn kỳ đạt 922,7 g, chỉ số FCR đƣợc cải thiện (2,8). Không chỉ vậy, gà đƣợc tăng cƣờng sức đề kháng, ức chế và tiêu diệt đƣợc vi khuẩn gây bệnh, nên mặc dù trong lô này vẫn xuất hiện gà chết nhƣng tỉ lệ chết rất thấp (7,78%). Khi so sánh với ĐC(-) có thể thấy tỉ lệ chết là tƣơng đƣơng nhau, nhƣng NT1 đã cải thiện đƣợc tăng trọng và chỉ số FCR. Khi so sánh với ĐC(+), tỉ lệ chết của NT1 thấp hơn gần 7 lần, hay nói cách khác bổ sung VL28 trong thức ăn giúp tỉ lệ gà sống đạt đến 92,22 %, còn lô không sử dụng chỉ còn 57,78 % gà sống sót đến cuối kỳ. Bên cạnh đó tăng trọng lại cao hơn, và chỉ số FCR lại thấp hơn. Khi đánh giá các lô điều trị bằng kháng sinh nhận thấy kháng sinh có hiệu quả điều trị, giúp giảm tỉ lệ chết, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn probiotic vì tỉ lệ chết ghi nhận cao hơn (14,44-16,66 %). Ngoài ra, ở 2 lô điều trị bằng kháng sinh, gà cũng không đạt tăng trọng, và FCR nhƣ NT1. Trong chăn nuôi gà, bệnh do vi khuẩn E. coli khá phổ biến, chính vì vậy, làm thế nào để giúp gà phòng và trị bệnh là điều cần thiết. Có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sử dụng kháng sinh nhƣ chất kích thích tăng trƣởng cho vật nuôi sẽ kéo theo nhiều hệ quả nhƣ tình trạng loạn khuẩn, và tiêu chảy do kháng sinh có thể tiêu diệt các vi sinh vật có lợi trong đƣờng ruột, nghiêm trọng hơn là tình trạng kháng thuốc (Thirabunyanon and Thongwittaya, 2012). Chính vì vậy, ngày nay, probiotic đƣợc xem là giải pháp hiệu quả thay thế kháng sinh (Reuter, 2001), trong nghiên cứu này đã chứng minh đƣợc điều đó, khi bổ sung VL28 trong suốt giai đoạn nuôi đã hỗ trợ cho gà duy trì đƣợc tình trạng khỏe mạnh, gia tăng tăng trọng, cải thiện FCR trong cả điều kiện bình thƣờng lẫn trong điều kiện bị nhiễm bệnh.

Trƣớc đây cũng có nhiều thí nghiệm đã ghi nhận B. subtilis có khả năng đối

kháng với vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gà nhƣ La Ragione et al. (2001), và

130

Wu et al. (2011). Đặc biệt, kết quả trên khá phù hợp với nghiên cứu của Teo and Tan (2006) khi khảo sát trên vi khuẩn B. subtilis PB6. Kết quả đã ghi nhận ở nghiệm thức bổ sung PB6 liên tục trong 42 ngày, chỉ số tăng trọng và FCR đƣợc cải thiện cao hơn nghiệm thức sử dụng kháng sinh, và đối chứng trong cả 2 điều kiện bình thƣờng và điều kiện gây bệnh. Tóm lại, nghiên cứu này đã góp phần khẳng định hiệu quả của probiotic B. subtilis VL28 trong việc phòng và kiểm soát bệnh do E. coli trên gà.

4.4. Đăng ký trình tự B. subtilis VL28 trên Genbank

Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng B. subtilis VL28 đã đạt đƣợc những tiêu chí của vi khuẩn probiotic. Hơn nữa khi thử nghiệm trên gà cho kết quả tốt ở thí nghiệm gây nhiễm E. coli và S. enterica, tỉ lệ chết giảm hẳn so với lô đối chứng và tƣơng đƣơng với lô sử dụng kháng sinh.

Từ kết quả trên chúng tôi tiến hành đăng ký trình tự gen của B. subtilis VL28 trên ngân hàng gen NCBI và đã đƣợc ngân hàng gen công nhận trình tự gen 16S rRNA của B. subtilis VL 28 với mã số truy cập: KY346980 (Hình 4.37)

(có thể truy cập trên trang web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ky346980)

Hình 4.37. Kết quả đăng ký trình tự gen B. subtilis VL28 trên Genbank NCBI

131

Trình tự đoạn gen B. subtilis VL 28 với 1280 nucleotic nhƣ sau:

1 acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga tgcttgtttg

61 aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg gacccgcggc

121 gcattagcta gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga

181 gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag

241 ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt

301 tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag ggcggtacct

361 tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta

421 ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc

481 tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactggggg aacttgagtg

541 cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca

601 ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag

661 cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg

721 ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc

781 gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcacc agcggtggag catgtggttt

841 aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat

901 aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg

961 tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg ccagcattca

1021gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa

1081 tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa caaagggcag

1141 cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc gcagtctgca

1201 actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac

1261 gttcccgggc cttgtacaca

132

CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1.

Kết luận

5.1.1. Phân lập đƣợc 21 chủng B. subtilis từ đất và phân gà

- Từ 70 mẫu đất và 70 mẫu phân thu thập từ trại gà ở 7 tỉnh và thành phố Cần Thơ, thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long, đã phân lập đƣợc 296 chủng có hình que, Gram dƣơng, có khả năng thành lập bào tử.

- Kết quả thử đặc tính sinh hóa để chọn lọc vi khuẩn B. subtilis đã cho thấy có 230 chủng âm tính với lecithinase và dƣơng tính catalase, 169 chủng dƣơng tính với phản ứng VP, 91chủng dƣơng tính amylase, và 49 chủng có khả năng phát triển ở 50oC, và cuối cùng có 29 chủng dƣơng tính với phản ứng cellulase. Định danh bằng bộ Kit API CH50B đã loại đƣợc 6 chủng B. licheniformis, 23 chủng còn lại đƣợc xác định là B. subtilis/B. amyloliquefaciens. Ứng dụng kĩ thuật giải trình tự gen 16S rRNA đã khẳng định có 21 chủng thuộc loài B. subtilis với mức độ tƣơng đồng ≥ 99%.

5.1.2. Tuyển chọn đƣợc chủng B. subtilis VL28 có các đặc tính probiotic

phù hợp để sử dụng cho gà

- Tính chịu nhiệt: 21 chủng đều có khả năng phát triển ở 50oC, 15 chủng

chịu đƣợc 55oC, và chỉ có 3 chủng chịu đƣợc 60oC.

- Nhạy với kháng sinh: 21 chủng B. subtilis đều nhạy với hầu hết với 9 loại kháng sinh khảo sát, có 5 chủng có tỉ lệ nhạy cao nhất với 7/9 loại kháng sinh (AG19, AG27, AG60, VL05, VL28).

- Khả năng sinh 3 loại enzyme tiêu hóa: 10 chủng B. subtilis có khả năng

sinh cả 3 loại enzyme ngoại bào amylase, protease và lipase.

- Khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh: 4 chủng B. subtilis (AG27,

AG60, VL05, VL28) có khả năng ức chế sự phát triển cả 4 vi khuẩn gây bệnh E. coli, S. enterica, Staphylococcus spp., và Streptococcus spp.

- Khả năng chịu đƣợc ở acid dạ dày pH 2 và muối mật: 2 chủng AG27 và VL28 có thể duy trì tỉ lệ sống cao từ 78% (AG27) đến 97% (VL28) sau 90 phút khảo sát ở pH 2, nồng độ muối mật 0,3%.

- Khả năng tự bám dính và bám dính với vi khuẩn gây bệnh: AG27 và VL28 đều có khả năng đồng kết dính cao (≥70%); Tuy nhiên tỉ lệ phần trăm kết dính của chủng VL28 với E. coli và S. enterica lần lƣợt là 61% và 65,6%, cao hơn chủng AG27 (16,1%; 36,4%).

133

- Chủng B. subtilis VL28 có đầy đủ các tiêu chuẩn của vi khuẩn probitoic

nêu trên.

5.1.3. Đã chứng minh bằng thực nghiệm việc bổ sung chủng B. subtilis VL28 107 CFU/g với liều 5g/kg thức ăn có khả năng thay thế kháng sinh ngăn ngừa quá trình nhiễm trùng đƣờng ruột ở đàn gà.

Khi bổ sung chế phẩm B. subtilis VL28 vào khẩu phần ăn của gà liên tục 56 ngày tuổi, với liều 0,5% x 107 CFU/g/kg thức ăn đã cải thiện tăng trọng (992,2 g) và chỉ số FCR (2,39) so với ĐC. Hiệu quả điều trị của VL28 tƣơng đƣơng với kháng sinh trên các lô gà gây nhiễm S. enterica và E. coli. Tuy nhiên, lô sử dụng VL28 đã cải thiện đƣợc tăng trọng và FCR so với lô điều trị bằng kháng sinh, và lô đối chứng.

5.2.

Đề nghị

Mở rộng nghiên cứu ứng dụng chủng B. subtilis VL28 trong phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa nhƣ Salmonellosis, Colibacillosis, Necrotic Enteritis, … trên thực địa ở qui mô công nghiệp.

Tối ƣu hóa qui trình lên men thu sinh khối B. subtilis VL28 nhằm sản xuất

vi khuẩn probiotic với mật độ cao, giá thành rẻ.

Xây dựng chiến lƣợc bảo quản giống và sản xuất chế phẩm góp phần tăng năng suất vật nuôi và tạo đƣợc nguồn thịt gia cầm sạch, không tồn dƣ kháng sinh, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

134

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2015. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis ứng dụng làm probiotic từ đất và phân gà tại TP. Cần Thơ. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 6, trang 55-62

2. Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2015. Khảo sát đặc tính probiotic của một số chủng Bacillus phân lập tại một số trại gà thành phố Cần Thơ. Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc Chăn nuôi – Thú y 2015. ISBN 978-604-60-2019-6. Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 485-491

3. Le Thi Hai Yen and Nguyen Duc Hien, 2016. Isolation and identification of Bacillus subtilis isolated from soil and feces on chicken farms in the Mekong delta, Vietnam. Proceedings of The 19th Federation of Asian Veterinary Associations Congress, Ho Chi Minh city, September 6-9th, 2016. Vietnam National University-Ho Chi Minh city Press, page 143-147

4. Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2016. Khảo sát đặc tính probiotic các chủng vi khuẩn phân lập tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. ISSN 1859-2333. Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ số 2, trang 26-32

5. Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2017. Khảo sát khả năng chịu acid dạ dày - muối mật và khả năng bám dính của hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis AG27 và VL28. Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc Chăn nuôi – Thú y 2017. ISBN 978-604-60-2492-7. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 341-346

6. Le Thi Hai Yen and Nguyen Duc Hien, 2017. Isolation and characterization of probiotic Bacillus subtilis VL28 on chicken farms in Vietnam. Proceedings of 33rd World Veterinary Congress, Incheon – Korea, August 27-31, 2016.

7. Le,T.H.Y. and Nguyen,D.H., 2017. Bacillus subtilis strain VL28 16S

ribosomal RNA gene, partial sequence. GenBank: KY346980.1

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KY346980

135

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG ANH 1. Adzitey F, Ali GRR, Huda N and Ting SL, 2013. Antibiotic resistance and plasmid profile of Escherichia coli isolated from ducks in Penang, Malaysia. International Food Research Journal, 20:1473-1478.

2. AlGburi, A., A. Volski, C. Cugini, E. M. Walsh, V. A. Chistyakov, M. S. Mazanko, A. B. Bren, L. M. Dicks and M. L. Chikindas, 2016. Safety Properties and Probiotic Potential of Bacillus subtilis KATMIRA1933 and Bacillus amyloliquefaciens B- 1895. Advances in Microbiology, 6 (06): 432.

3. Andriani, Y., R. Safitri, E. Rochima And S. D. Fakhrudin, 2017. Characterization of Bacillus subtilis and B. licheniformis potentials as probiotic bacteria in Vanamei shrimp feed (Litopenaeus vannamei Boone, 1931). Nusantara Bioscience, 9 (2): 188-193.

4. Anwar A. Abdulla, Thikra A. Abed1, A. M. Saeed, 2014. Adhesion, Autoaggregation and Hydrophobicity of Six Lactobacillus Strains. British Microbiology. 4: 381-391.

5. Apajalahti, J. H., L. K. Särkilahti, B. R. Mäki, J. P. Heikkinen, P. H. Nurminen and W. E. Holben, 1998. Effective recovery of bacterial DNA and percent-guanine-plus- cytosine-based analysis of community structure in the gastrointestinal tract of broiler chickens. Applied and environmental microbiology, 64 (10): 4084-4088 6. Ara, K., et al., 2007. Bacillus minimum genome factory: effective utilization of microbial genome information. Biotechnol. Appl. Biochem. 46(Pt 3):169-78.

7. Arsenault, R. J., S. Napper and M. H. Kogut, 2013. Salmonella enterica Typhimurium infection causes metabolic changes in chicken muscle involving AMPK, fatty acid and insulin/mTOR signaling. Veterinary research, 44 (1): 35. 8. Arturo, A., Maria Rosa, M.L., and Maria Aranzazu, M., 2006. Probiotics for animal nutrition in the European Union. Regulation and safety assessment. Regul Toxicol Pharm 45: 91-95.

9. Arvola, T., K. Laiho, S. Torkkeli, H. Mykkänen, S. Salminen, L. Maunula and E. Isolauri, 1999. Prophylactic LactobacillusGGReduces Antibiotic-Associated Diarrhea in Children With Respiratory Infections: A Randomized Study. Pediatrics, 104 (5): e64-e64.

10. Ashraf, R. and N. P. Shah, 2011. Antibiotic resistance of probiotic organisms and safety of probiotic dairy products. International food research Journal, 18 (3). 11. Aslim, B., Z. Yuksekdag and Y. Beyatli, 2002. Determination of PHB growth quantities of certain Bacillus species isolated from soil. Turkish Electronic Journal of Biotechnology: 24-30.

12. Badhe, P., M. Joshi and R. Adivarekar, 2016. Optimized production of extracellular proteases by Bacillus subtilis from degraded abattoir waste. Journal of BioScience & Biotechnology, 5 (1).

136

13. Bai, S., M. R. Kumar, D. M. Kumar, P. Balashanmugam, M. B. Kumaran and P. Kalaichelvan, 2012. Cellulase production by Bacillus subtilis isolated from cow dung. Arch Appl Sci Res, 4 (1): 269-279.

14. Bais, H. P., R. Fall and J. M. Vivanco, 2004. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production. Plant physiology, 134 (1): 307-319. 15. Baltzley, T., F. Lago, T. Neumann, T. Rehberger and S. Gebert, 2013. Microorganisms and methods for treating poultry: Google Patents.

16. Bandow, J.E., H. Bratz, M. Hecker, 2002. Bacillus subtilis Tolerance of Moderate Concentrations of Rifampin Involves the B-Dependent General and Multiple Stress Response. Journal of Bacteriology. 184(2): 459-467

17. Bano, S., S. A. U. Qader, A. Aman, M. N. Syed and A. Azhar, 2011. Purification and characterization of novel α-amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS. Aaps Pharmscitech, 12 (1): 255-261. 18. Barbosa, T. M. and S. B. Levy, 2000. The impact of antibiotic use on resistance development and persistence. Drug resistance updates, 3 (5): 303-311.

19. Barbosa, T. M., C. R. Serra, R. M. La Ragione, M. J. Woodward and A. O. Henriques, 2005. Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract. Applied and environmental microbiology, 71 (2): 968-978.

20. Barnes HJ. Vaillancourt J. Gross WB, 2003. Colibacillosis. In: Saif YM, editor. Diseases of Poultry. Ames, IA: Iowa State University Press. pp. 631–652 21. Baruzzi, F., L. Quintieri, M. Morea and L. Caputo, 2011. Antimicrobial compounds produced by Bacillus spp. and applications in food. Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances, 2: 1102- 1111. 22. Baysal, O and Yıldız, A, 2017. Bacillus Subtilis: An Industrially Important Microbe for Enzymes Production. EC Microbiology 5.4: 148-156.

23. Bergey, D. H., 1919. Thermophilic bacteria. Journal of bacteriology, 4 (4): 301. 24. Bholay A.D, PagareVasudha S, BhavsarAshwini A, Deshmukh Jaee R, 2017. Bacteriocin: Promising Natural Antimicrobials from Probiotic Bacillus subtilis. Journal of Biotechnology and Biochemistry. Volume 3, Issue 2, PP 28-33.

25. Boke, H., B. Aslim and G. Alp, 2010. The role of resistance to bile salts and acid tolerance of exopolysaccharides (EPSS) produced by yogurt starter bacteria. Archives of Biological Sciences, 62 (2): 323-328.

26. Boone DR, Liu Y, Zhao Z-J, Balkwill DL, Drake GR, Stevens TO, Aldrich HC, 1995. Bacillus infernus sp.nov., an Fe (III) and Mn (IV)- reducing anaerobe from the deep terrestrial subsurface. Int J Syst Bacterial 45: 441-448.

27. Boris, S., J. Suarez and C. Barbes, 1997. Characterization of the aggregation promoting factor from Lactobacillus gasseri, avaginal isolate. Journal of applied microbiology, 83 (4): 413-420.

28. Bosshard, P., S. Abels, R. Zbinden, E. Böttger and M. Altwegg, 2003. Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic gram-positive rods in the clinical laboratory (an 18-month evaluation). Journal of clinical microbiology, 41 (9): 4134- 4140.

137

29. Botes, M., B. Loos, C. A. van Reenen and L. M. Dicks, 2008. Adhesion of the probiotic strains Enterococcus mundtii ST4SA and Lactobacillus plantarum 423 to Caco-2 cells under conditions simulating the intestinal tract, and in the presence of antibiotics and anti-inflammatory medicaments. Archives of microbiology, 190 (5): 573-584.

30. Camara, M., A. Dieng and C. S. B. Boye, 2013. Antibiotic susceptibility of Streptococcus pyogenes isolated from respiratory tract infections in Dakar, Senegal. Microbiology insights, 6: 71.

31. Cardona, C., A. Bickford, B. Charlton and G. Cooper, 1993. Enterococcus durans infection in young chickens associated with bacteremia and encephalomalacia. Avian diseases: 234-239.

32. Cartman, S. T., R. M. La Ragione and M. J. Woodward, 2008. Bacillus subtilis spores germinate in the chicken gastrointestinal tract. Applied and environmental microbiology, 74 (16): 5254-5258.

33. Cartwright, P., 2003. Probiotics for Crohn's & Colitis: Prentice Publishing. 34. Chambers, J. R. and J. Gong, 2011. The intestinal microbiota and its modulation for Salmonella control in chickens. Food Research International, 44 (10): 3149-3159. 35. Chaucheyras-Durand, F. and H. Durand, 2010. Probiotics in animal nutrition and health. Beneficial microbes, 1 (1): 3-9.

36. Chen, S.Y , Liu, Z.X. , He, Y.D. , Chu, C. and Wang, M.Q., 2014 Effect of Coated Lipase Supplementation on Growth, Digestion and Intestinal Morphology in Weaning Piglets. Journal of Animal and Veterinary Advances 13(18): 1093-1097. 37. Chesson, A., 1994. Probiotics and other intestinal mediators. Principles of pig science: 197-214.

38. Cho Jin Ho, Mostarina Begum , In-Ho Kim, 2014. Effects of Bacillus subtilis on growth performance, relative organ weight, meat quality, Salmonella population, and blood profiles in broilers.Joint annual meeting Korea. 1312.

39. Clavijo, R. I., C. Loui, G. L. Andersen, L. W. Riley and S. Lu, 2006. Identification of genes associated with survival of Salmonella enterica serovar Enteritidis in chicken egg albumen. Applied and environmental microbiology, 72 (2): 1055-1064. 40. Collado, M. C., I. Surono, J. Meriluoto and S. Salminen, 2007. Indigenous Dadih Lactic Acid Bacteria: Cell‐Surface Properties and Interactions with Pathogens. Journal of food science, 72 (3). 41. Conway. P. L., 1996. Development of the intestinal microbiota. Gastrointestinal microbes and host interactions, Gastrointestinal Microbiology ( 2) 3-39

42. Corcoran B, Stanton C, Fitzgerald G, Ross R, 2005. Survival of probiotic lactobacilli in acidic environments is enhanced in the presence of metabolizable sugars. Applied and environmental microbiology 71 (6): 3060-3067. 43. Cowan, S. T. and K. J. Steel, 2004. Cowan and Steel's manual for the identification of medical bacteria: Cambridge university press. 44. Czerucka, D. and P. Rampal, 2002. Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheal pathogens. Microbes and infection, 4 (7): 733-739.

45. Dai, D., N. N. Nanthkumar, D. S. Newburg and W. A. Walker, 2000. Role of oligosaccharides and glycoconjugates in intestinal host defense. Journal of pediatric gastroenterology and nutrition, 30: S23-S33

46. Dalloul, R., H. Lillehoj, T. Shellem and J. Doerr, 2003. Enhanced mucosal immunity against Eimeria acervulina in broilers fed a Lactobacillus-based probiotic. Poultry science, 82 (1): 62-66.

138

47. David, O., J. Olagunju, A. Adebayo, T. Oluwaniyi and M. Olajide, 2016. Probiotic Properties and Antibiotic Resistance Pattern of Bacillus spp. Isolated from Two Types of Fermented Locust Bean (iru).

48. Del Re B, Suskovic J, Vukovic, Simpraga M, Frece J and Matosic, 2003. Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. Journal of Applied Microbiology, 94: 981-987.

49. Del Re, B., A. Busetto, G. Vignola, B. Sgorbati and D. Palenzona, 1998. Autoaggregation and adhesion ability in a Bifidobacterium suis strain. Letters in applied microbiology, 27 (5): 307-310.

50. Dhama, K., V. Verma, P. Sawant, R. Tiwari, R. Vaid and R. Chauhan, 2011. Applications of probiotics in poultry: Enhancing immunity and beneficial effects on production performances and health: A review. J. Immunol. Immunopathol, 13 (1): 1-19. 51. Dubnau, D. and R. Provvedi, 2000. Internalizing DNA. Research in microbiology, 151 (6): 475-480. 52. Dubnau, D., 1991. Genetic competence in Bacillus subtilis. Microbiological reviews, 55 (3): 395-424. 53. Dugas. N. And Postaire. E., 1999. Immunity and prebiotics. Immunology Today, 20: 387-390.

54. Dunne C, O'Mahony L, Murphy L, Thornton G, Morrissey D, O'Halloran S, Feeney M, Flynn S, Fitzgerald G, Daly C, 2001. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings. The American journal of clinical nutrition 73 (2): 386s-392s. 55. E Metchnikoff, E., 1907. The Prolongation of Life: Optimistic Studies. Heinemann, London, 1907

56. El-Naggar, M. Y., 2004. Comparative study of probiotic cultures to control the growth of Escherichia coli O157: H7 and Salmonella typhimurium. Biotechnology, 3 (2): 173-180.

57. Eman F. Sharaf , Wael S.El-Sayed, Roaa M. Abosaif, 2014. Lecithinase-producing bacteria in commercial and home-made foods: Evaluation of toxic properties and identification of potent producers. Journal of Taibah University for Science, 8: 207- 215

58. Entrez Genome Project, NCBI 59. Erickson, K. L. and N. E. Hubbard, 2000. Probiotic immunomodulation in health and disease. The Journal of nutrition, 130 (2): 403S-409S.

60. Euzéby, J. P., 1997. List of Bacterial Names with Standing in Nomenclature: a the Internet. International Journal of Systematic and folder available on Evolutionary Microbiology, 47 (2): 590-592. 61. Everlon Cid Rigobelo, 2012. Probiotic in animals. Chapters 9, Variations on the efficacy of probiotics in poultry. Publisher: InTech. under CC BY 3.0 license.

62. Ewers, C., T. Janßen and L. Wieler, 2003. Avian pathogenic Escherichia coli (APEC). Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift, 116 (9-10): 381- 395. 63. FAO/WHO, J., 2002. Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food London. Ontario, Canada.

139

64. Faria Filho, D., K. Torres, D. Faria, D. Campos and P. Rosa, 2006. Probiotics for broiler chickens in Brazil: systematic review and meta-analysis. Revista Brasileira de Ciência Avícola, 8 (2): 89-98.

65. Fernandes, C. F. and K. M. Shahani, 1988. Effect of Nutrient Media and Bile Salts on Growth and Antimicrobial Activity of Lactobacillus acidophilus1. Journal of Dairy Science, 71 (12): 3222-3229

66. Fernandes, P. A. V., I. R. d. Arruda, A. F. A. B. d. Santos, A. A. d. Araújo, A. M. S. Maior and E. A. Ximenes, 2007. Antimicrobial activity of surfactants produced by Bacillus subtilis R14 against multidrug-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology, 38 (4): 704-709.

67. Foley, S. and A. Lynne, 2008. Food animal-associated challenges: Pathogenicity and antimicrobial resistance. Journal of animal science, 86 (14_suppl): E173-E187. 68. Foley, S. L., R. Nayak, I. B. Hanning, T. J. Johnson, J. Han and S. C. Ricke, 2011. Population dynamics of Salmonella enterica serotypes in commercial egg and poultry production. Applied and environmental microbiology, 77 (13): 4273-4279. 69. Fuller, R., 2012. Probiotics: the scientific basis: Springer Science & Business Media.

70. Galassi, G., G. Crovetto, L. Rapetti and A. Tamburini, 2004. Energy and nitrogen balance in heavy pigs fed different fibre sources. Livestock Production Science, 85 (2): 253-262.

71. Ganguly, N., S. Bhattacharya, B. Sesikeran, G. Nair, B. Ramakrishna, H. Sachdev, V. Batish, A. Kanagasabapathy, V. Muthuswamy and S. Kathuria, 2011. ICMR- DBT guidelines for evaluation of probiotics in food. The Indian journal of medical research, 134 (1): 22.

72. Gao, W. and Q. Meng, 2004. Lectin activity and chemical characteristics of Escherichia coli, Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. from gastrointestinal mucosa of growing pigs. Asian australasian journal of animal sciences, 17 (6): 863- 868.

73. Gao, Z., H. Wu, L. Shi, X. Zhang, R. Sheng, F. Yin and R. Gooneratne, 2017. Study of Bacillus subtilis on growth performance, nutrition metabolism and intestinal microflora of 1 to 42 days broiler chickens. Animal Nutrition 3: 109-113 74. Gauthier, R., 2002. Intestinal health, the key to productivity: The case of organic acids. IASA XXVII convencion ANECA-WPDC.

75. Gibson, G. R. and R. Fuller, 2000. Aspects of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use. The Journal of nutrition, 130 (2): 391S-395S. 76. Gill, H. S., 2003. Probiotics to enhance anti-infective defences in

the gastrointestinal tract. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 17 (5): 755-773.

77. Gobin, I. 2011. The protective role of lactic acid bacteria to systemic Salmonella enterica serotype Typhimurium infection in mice, Prehrambeno-biotehnološki fakultet, Sveučilište u Zagrebu.

140

78. Gong, J., R. J. Forster, H. Yu, J. R. Chambers, P. M. Sabour, R. Wheatcroft and S. Chen, 2002. Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the mucosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen. FEMS microbiology letters, 208 (1): 1-7. 79. González-Pastor, J. E., E. C. Hobbs and R. Losick, 2003. Cannibalism by sporulating bacteria. Science, 301 (5632): 510-513. 80. Graumann, P., 2012. Bacillus: cellular and molecular biology: Horizon Scientific Press.

81. Gross, W., 1994. Diseases due to Escherichia coli in poultry. Poultry diseases p.143. 82. Grover, H. S. and S. Luthra, 2011. Probiotics–The nano soldiers of oral health. J Indian Acad Clin Med, 13 (1): s48-54.

83. Grzeskowiak, L., M. C. Collado, C. Mangani, K. Maleta, K. Laitinen, P. Ashorn, E. Isolauri and S. Salminen, 2012. Distinct gut microbiota in southeastern African and northern European infants. Journal of pediatric gastroenterology and nutrition, 54 (6): 812-816. 84. Gueimonde, M., B. Sánchez, G. Clara and A. Margolles, 2013. Antibiotic resistance in probiotic bacteria. Frontiers in microbiology, 4. 85. Gupta, V. and R. Garg, 2009. Probiotics. Indian journal of medical microbiology, 27 (3): 202 86. Harley, J. P., 2004. Laboratory exercises in microbiology: McGraw-Hill Science, Engineering & Mathematics. 87. Harwood, C. R. and S. M. Cutting, 1990. Molecular biological methods for Bacillus: Wiley.

88. Haucheyras, F., G. Fonty, P. Gouet, G. Bertin and J.-M. Salmon, 1996. Effects of a strain of Saccharomyces cerevisiae (Levucell® SC), a microbial additive for ruminants, on lactate metabolism in vitro. Canadian journal of microbiology, 42 (9): 927-933. 89. Havenaar, R. and S. Spanhaak, 1994. Probiotics from an immunological point of view. Current opinion in biotechnology, 5 (3): 320-325

90. Henrich, J., R. McElreath, A. Barr, J. Ensminger, C. Barrett, A. Bolyanatz, J. C. Cardenas, M. Gurven, E. Gwako and N. Henrich, 2006. Costly punishment across human societies. Science, 312 (5781): 1767-1770.

91. Hoa, T. T., L. H. Duc, R. Isticato, L. Baccigalupi, E. Ricca, P. H. Van, and S. M. Cutting. 2001. Fate and dissemination of Bacillus subtilis spores in a murine model. Appl. Environ. Microbiol. 67:3819-3823.

92. Holm F., 2003. Gut health and diet: The benefits of probiotic and prebiotics on human health. Evaluation of Probiotics in Food London, Ontario, Canada. The World of Ingredients. 2: 52–55

93. Hombach, M., R. Zbinden and E. C. Böttger, 2013. Standardisation of disk diffusion results for antibiotic susceptibility testing using the sirscan automated zone reader. BMC microbiology, 13 (1): 225. 94. Hong, H. A., L. H. Duc and S. M. Cutting, 2005. The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS microbiology reviews, 29 (4): 813-835

95. Hong, H.A., Huang, J-M., Khaneja, R., Hiep, L.V., Urdaci,M.C. & Cutting, S.M., 2008. The Safety of Bacillus subtilis and Bacillus indicus as food probiotics. Journal of Applied Microbiology 105: 510-520. 96. Huang J.H. . 2012. Effect of Bacillus subtilis on growth performance of broilers chicken. Heilongjiang Anim Sci Vet Med, 2, pp. 78-79.

97. Hummel, A. S., C. Hertel, W. H. Holzapfel and C. M. Franz, 2007. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria. Applied and environmental microbiology, 73 (3): 730-739.

141

98. Hutt P, Shchepetova J, Loivukene K, Kullisaar T, Mikelsaar M, 2006. Antagonistic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and activity of probiotic uropathogens. Journal of Applied Microbiology 100: 1324–1332.

99. Immanuel, G., R. Dhanusha, P. Prema and A. Palavesam, 2006. Effect of different growth parameters on endoglucanase enzyme activity by bacteria isolated from coir retting effluents of estuarine environment. International Journal of Environmental Science & Technology, 3 (1): 25-34. 100. Isolauri, E., P. Kirjavainen and S. Salminen, 2002. Probiotics: a role in the

treatment of intestinal infection and inflammation. Gut, 50 (suppl 3): iii54-iii59. 101. Janda, J. M. and S. L. Abbott, 2007. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of clinical microbiology, 45 (9): 2761-2764. 102. Jans. D., 2005. Probiotics in Animal Nutrition. Booklet. www. Fefana.org. pp. 4-18.

103. Jeong J. S, Kim I. H. , 2014. Effect of Bacillus subtilis C-3102 spores as a probiotic feed supplement on growth performance, noxious gas emission, and intestinal microflora in broilers. Poultry Science, 93 (12): 3097–3103.

104. Kabir, S. L., M. M. Rahman, M. Rahman, M. Rahman and S. Ahmed, 2004. The dynamics of probiotics on growth performance and immune response in broilers. Int. J. Poult. Sci, 3 (5): 361-364. 105. Kabir, S., 2009. The role of probiotics in the poultry industry. International Journal of Molecular Sciences, 10 (8): 3531-3546. 106. Kanimozhi, K., E. Devairrakam and D. Kumar, 2013. Decolorization of leather effluent by lipase producing Bacillus sp. Acad Indus Res, 1: 813-815.

107. Kawulka, K. E., T. Sprules, C. M. Diaper, R. M. Whittal, R. T. McKay, P. Mercier, P. Zuber and J. C. Vederas, 2004. Structure of subtilosin A, a cyclic antimicrobial peptide from Bacillus subtilis with unusual sulfur to α-carbon cross- links: formation and reduction of α-thio-α-amino acid derivatives. Biochemistry, 43 (12): 3385-3395.

108. Kearns, D. B., F. Chu, S. S. Branda, R. Kolter and R. Losick, 2005. A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis. Molecular microbiology, 55 (3): 739-749.

109. Khaksefidi, A. and T. Ghoorchi, 2006. Effect of probiotic on performance and immunocompetence in broiler chicks. The Journal of Poultry Science, 43 (3): 296- 300.

110. Khamis, A., P. Colson, D. Raoult and B. La Scola, 2003. Usefulness of rpoB gene sequencing for identification of Afipia and Bosea species, including a strategy for choosing discriminative partial sequences. Applied and environmental microbiology, 69 (11): 6740-6749.

111. Khan, J. A. and R. Priya, 2011. A study on partial purification and characterization of extracellular amylases from Bacillus subtilis. Adv. Appl. Sci. Res, 2 (3): 509-519.

112. Khochamit, N., S. Siripornadulsil, P. Sukon and W. Siripornadulsil, 2015. Antibacterial activity and genotypic–phenotypic characteristics of bacteriocin- producing Bacillus subtilis KKU213: Potential as a probiotic strain. Microbiological research, 170: 36-50.

142

113. King, A. and I. Phillips, 1978. The identification of pseudomonads and related bacteria in a clinical laboratory. Journal of medical microbiology, 11 (2): 165-176.

114. Klein, C. and K. Entian, 1994. Genes involved in self-protection against the lantibiotic subtilin produced by Bacillus subtilis ATCC 6633. Applied and environmental microbiology, 60 (8): 2793-2801.

115. Knap, I., A. Kehlet, M. Bennedsen, G. Mathis, C. Hofacre, B. Lumpkins, M. Jensen, M. Raun and A. Lay, 2011. Bacillus subtilis (DSM17299) significantly reduces Salmonella in broilers. Poultry science, 90 (8): 1690-1694.

the

116. Knarreborg, A., E. Brockmann, K. Hoybye, I. Knap, B. Lund, N. Milora and T. ileal microbial Leser, 2008. Bacillus subtilis (DSM17299) modulates communities and improves growth performance in broilers. Int. J. Prebiotic Probiotic, 3: 83-88.

117. Knight, M., W. M. Callaghan, C. Berg, S. Alexander, M.-H. Bouvier-Colle, J. B. Ford, K. Joseph, G. Lewis, R. M. Liston and C. L. Roberts, 2009. Trends in postpartum hemorrhage in high resource countries: a review and recommendations from the International Postpartum Hemorrhage Collaborative Group. BMC pregnancy and childbirth, 9 (1): 55. 118. Kobayashi, K., et al., 2003. Essential Bacillus subtilis genes. Proc Natl Acad Sci U S A.; 100(8): 4678-4683.

119. Kolář, M., R. Pantůček, J. Bardoň, I. Vagnerova, H. Typovska, I. Valka and J. Doškař, 2002. Occurrence of antibiotic-resistant bacterial strains isolated in poultry. Vet Med Czech, 47: 52-59.

120. Konsoula, Z. and M. Liakopoulou-Kyriakides, 2005. Alpha-amylase production in aqueous two-phase systems by Bacillus subtilis. The Febs Journal, 272: 497. 121. Kos B, Šušković J, Vuković S, Šimpraga M, Frece J, Matošić S, 2003. Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. Journal of applied microbiology 94 (6): 981-987

122. Kramer, L., 2010. The Bacillus subtilis story. Retrieved, 9 (19): 2011. 123. Kunchala, R., R. Banerjee, S. D. Mazumdar, P. Durgalla, V. Srinivas and S. Gopalakrishnan, 2016. Characterization of potential probiotic bacteria isolated from sorghum and pearl millet of the semi-arid tropics. African Journal of Biotechnology, 15 (16): 613-621. 124. Kunst, F., et al., 1997. The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature. 390. pp 249-256.

125. La Ragione, R. M. and M. J. Woodward, 2003. Competitive exclusion by Bacillus subtilis spores of Salmonella enterica serotype Enteritidis and Clostridium perfringens in young chickens. Veterinary microbiology, 94 (3): 245-256.

126. La Ragione, R. M., G. Casula, S. M. Cutting and M. J. Woodward, 2001. Bacillus subtilis spores competitively exclude Escherichia coli O78: K80 in poultry. Veterinary microbiology, 79 (2): 133-142.

127. Labellarte, G. M. 2015. Tolerance and efficacy of a probiotic supplement delivered in capsule form. University of Wisconsin-La Crosse, 29 Suppl 924:33 128. Latorre, J., X. Hernandez-Velasco, G. Kallapura, A. Menconi, N. Pumford, M. Morgan, S. Layton, L. Bielke, B. Hargis and G. Téllez, 2014. Evaluation of germination, distribution, and persistence of Bacillus subtilis spores through the gastrointestinal tract of chickens. Poultry science, 93 (7): 1793-1800.

143

129. Lee, K., S. Lee, H. Lillehoj, G. Li, S. Jang, U. Babu, M. Park, D. Kim, E. Lillehoj and A. Neumann, 2010. Effects of direct-fed microbials on growth

performance, gut morphometry, and immune characteristics in broiler chickens. Poultry science, 89 (2): 203-216.

130. Lee, S., J. Lee, Y.-I. Jin, J.-C. Jeong, Y. H. Chang, Y. Lee, Y. Jeong and M. Kim, 2017. Probiotic characteristics of Bacillus strains isolated from Korean traditional soy sauce. LWT-Food Science and Technology, 79: 518-524. 131. Lee, Y. K. and S. Salminen, 2009. Handbook of probiotics and prebiotics: John Wiley & Sons.

132. Leser, T. D., A. Knarreborg, and J. Worm, 2007. Germination and outgrowth of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis spores in the gastrointestinal tract of pigs. J. Appl. Microbial. 104:1025-1033.

133. Levine, M., S. Epstein and R. Vaughn, 1934. Differential reactions in the colon group of bacteria. American Journal of Public Health and the Nations Health, 24 (5): 505-510.

134. Liu, C. H., C. S. Chiu, P. L. Ho and S. W. Wang, 2009. Improvement in the growth performance of white shrimp, Litopenaeus vannamei, by a protease‐ producing probiotic, Bacillus subtilis E20, from natto. Journal of applied microbiology, 107 (3): 1031-1041.

135. Loddi, M. M., E. Gonzales, T. S. Takita, A. A. Mendes and R. d. O. Roça, 2000. Effect of the use of probiotic and antibiotic on the performance, yield and carcass quality of broilers. Revista Brasileira de Zootecnia, 29 (4): 1124-1131 136. Lopez, D., H. Vlamakis and R. Kolter, 2009. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS microbiology reviews, 33 (1): 152-163.

137. Manhar, A. K., Y. Bashir, D. Saikia, D. Nath, K. Gupta, B. K. Konwar, R. Kumar, N. D. Namsa and M. Mandal, 2016. Cellulolytic potential of probiotic Bacillus Subtilis AMS6 isolated from traditional fermented soybean (Churpi): An to application as an animal feed additive. in-vitro study with regards Microbiological research, 186: 62-70. 138. Marahier, M., M. Nakano and P. Zuber, 1993. Regulation of peptide antibiotic production in Bacillus. Molecular microbiology, 7 (5): 631-636. 139. Marino. M., 2001. Modulation of Anaerobic Energy Metabolism of Bacillus subtilis by arf M (ywiD). J Bacteriol.; 183(23): 6815-6821.

140. Marteau, P., E. Cuillerier, S. Meance, M. Gerhardt, A. Myara, M. Bouvier, C. Bouley, F. Tondu, G. Bommelaer and J. Grimaud, 2002. Bifidobacterium animalis strain DN‐173 010 shortens the colonic transit time in healthy women: a double‐ blind, randomized, controlled study. Alimentary pharmacology & therapeutics, 16 (3): 587-593.

141. Mattar, A., D. H. Teitelbaum, R. Drongowski, F. Yongyi, C. Harmon and A. Coran, 2002. Probiotics up-regulate MUC-2 mucin gene expression in a Caco-2 cell-culture model. Pediatric surgery international, 18 (7): 586-590

142. Mazhar, H., N. Abbas, Z. Hussain, A. Sohail and S. S. Ali, 2016. Extracellular lipase production from Bacillus subtilis using agro-industrial waste and fruit peels. Punjab Univ. J. Zool, 31 (2): 261-267. 143. Mazmanian, S. K., J. L. Round and D. L. Kasper, 2008. A microbial symbiosis factor prevents intestinal inflammatory disease. Nature, 453 (7195): 620

144

144. Mazón-Suástegui, J. M., 2016. Isolation and characterization of potential probiotic bacteria from pustulose ark (Anadara tuberculosa) suitable for shrimp

farming. Submission article platform-Latin American Journal of Aquatic Research, 43 (1).

145. McNamee, P. T. and J. A. Smyth, 2000. Bacterial chondronecrosis with osteomyelitis ('femoral head necrosis') of broiler chickens: a review. Avian Pathology, 29 (5): 477-495.

146. Mead PS, Slutsker L, Dietz V, McCaig LF, Bresee JS, Shapiro C, Griffin PM, Tauxe RV, 1999. Food-related illness and death in the United States. Emerging Infectious Diseases. 5:607-25.

147. Mingmongkolchai, S. and W. Panbangred, 2017. In vitro evaluation of candidate Bacillus spp. for animal feed. The Journal of General and Applied Microbiology, 63 (2): 147-156.

148. Monica Feldman, 2016. The new market profile of the probiotics consumption. Global Health& Nutrition network. (https://www.naturalproductsinsider.com) 149. Monteiro, S., J. Clemente, M. Carrondo and A. Cunha, 2014. Enhanced spore production of Bacillus subtilis grown in a chemically defined medium. Advances in Microbiology, 4 (08): 444.

150. Moore T., Globa L., Barbaree J., Vodyanoy V., Sorokulova I., 2013. Antagonistic Activity of Bacillus Bacteria against Food-Borne Pathogens. Prob Health 1: 110.

151. Morikawa, M., 2006. Beneficial biofilm formation by industrial bacteria Bacillus subtilis and related species. Journal of bioscience and bioengineering, 101 (1): 1-8. 152. Muzzamal, H. and Z. Latif, 2016. Improvement of Bacillus strains by mutation for overproduction of exopolygalacturonases.

153. Nakano, M. M., Y. P. Dailly, P. Zuber and D. P. Clark, 1997. Characterization of anaerobic fermentative growth of Bacillus subtilis: identification of fermentation end products and genes required for growth. Journal of bacteriology, 179 (21): 6749-6755

154. Nayebpor, M., P. Farhomand and A. Hashemi, 2007. Effects of different levels of direct fed microbial (Primalac) on growth performance and humoral immune response in broiler chickens. J. Anim. Vet. Adv, 6 (11): 1308-1313.

155. Netherwood, T., H. Gilbert, D. Parker and A. O’Donnell, 1999. Probiotics shown to change bacterial community structure in the avian gastrointestinal tract. Applied and environmental microbiology, 65 (11): 5134-5138.

156. Nicholson, W. L., B. Setlow and P. Setlow, 2002. UV photochemistry of DNA in vitro and in Bacillus subtilis spores at earth-ambient and low atmospheric pressure: implications for spore survival on other planets or moons in the solar system. Astrobiology, 2 (4): 417-425.

157. Nicolas, P., U. Mäder, E. Dervyn, T. Rochat, A. Leduc, N. Pigeonneau, E. Bidnenko, E. Marchadier, M. Hoebeke and S. Aymerich, 2012. Condition- dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis. Science, 335 (6072): 1103-1106.

158. Okorie, P. and N. Olasupo, 2013. Growth and extracellular enzyme production indigenous Nigerian fermented isolated from Ugba-an by microorganisms condiment. African Journal of Biotechnology, 12 (26).

145

159. Okuneye, O., L. Ogunfolabo, O. Fasanmi, O. Adekunle and N. Oloso, 2016. Performance and physiological responses of Salmonella enteritidis challenged

broilers fed diets containing antibiotic, probiotic and aromabiotic. Journal of Dairy Veterinary and Animal Research, 3 (3): 00081.

160. Otutumi, L. K., E. R. de Moraes Garcia, M. B. Góis, M. M. Loddi and E. Rigobelo, 2012. Variations on the efficacy of probiotics in poultry: INTECH Open Access Publisher.

161. Ouoba, L. I. I., B. Diawara, L. Jespersen and M. Jakobsen, 2007. Antimicrobial activity of Bacillus subtilis and Bacillus pumilus during the fermentation of African locust bean (Parkia biglobosa) for Soumbala production. Journal of applied microbiology, 102 (4): 963-970.

162. Ouwehand, A. C. and S. Salminen, 2003. In vitro adhesion assays for probiotics and their in vivo relevance: a review. Microbial ecology in health and disease, 15 (4): 175-184.

163. Ouwehand, A., P. Kirjavainen, M.-M. Grönlund, E. Isolauri and S. Salminen, 1999. Adhesion of probiotic micro-organisms to intestinal mucus. International Dairy Journal, 9 (9): 623-630.

164. Oyeleke, S., O. Oyewole, E. Egwim, B. Dauda and E. Ibeh, 2012. Cellulase and pectinase production potentials of Aspergillus niger isolated from corn cob. Bayero Journal of Pure and Applied Sciences, 5 (1): 78-83. 165. Panel, E. B., 2008. The maintenance of the list of QPS microorganisms intentionally added to food or feed. The EFSA Journal (2008), 923: 1-48.

166. Parsons, C., 2004. Gastrointestinal development and nutrient digestion in chicks. Paper read at Proceedings of the 25thWestern Nutrition Conference, Saskatoon, Canada. University of Saskatchewan, Saskatoon, Canada.

167. Parveen, S., M. Taabodi, J. G. Schwarz, T. P. Oscar, J. Harter-Dennis and D. G. White, 2007. Prevalence and antimicrobial resistance of Salmonella recovered from processed poultry. Journal of food protection, 70 (11): 2466-2472. 168. Patel, J. B., 2001. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Molecular diagnosis, 6 (4): 313-321. 169. Patterson, J. and K. Burkholder, 2003. Application of prebiotics and probiotics in poultry production. Poultry science, 82 (4): 627-631.

170. Pattison, M., 2008. Poultry diseases: Elsevier Health Sciences. 171. Perez, A.R., A. Abanes-De Mello, K. Pogliano, 2000. SpoIIB Localizes to Active Sites of Septal Biogenesis and Spatially Regulates Septal Thinning during Engulfment in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182(4): 1096-1108. 172. Peter Cartwright, 2009. Bacillus subtilis-Identification & Safety. Probiotic News. Published by Protexin, Issue 2.

173. Peter, K., 2006. Handbook of herbs and spices: Woodhead publishing. 174. Piatek, J., M. Gibas-Dorna, A. Olejnik, H. Krauss, K. Wierzbicki, W. Zukiewicz- Sobczak and M. Glowacki, 2012. The viability and intestinal epithelial cell adhesion of probiotic strain combination-in vitro study. Annals of Agricultural and Environmental Medicine, 19 (1). 175. Piggot, P. J. and D. W. Hilbert, 2004. Sporulation of Bacillus subtilis. Current opinion in microbiology, 7 (6): 579-586.

146

176. Praveen Kumar, G., S. Mir Hassan Ahmed, S. Desai, E. Leo Daniel Amalraj and A. Rasul, 2014. In Vitro Screening for Abiotic Stress Tolerance in Potent Biocontrol and Plant Growth Promoting Strains of Pseudomonas and Bacillus spp. International journal of bacteriology, 2014.

177. Rahman, M., M. Samad, M. Rahman and S. Kabir, 2004. In vitro antibiotic sensitivity and therapeutic efficacy of experimental salmonellosis, colibacillosis and pasteurellosis in broiler chickens. Bangladesh Journal of Veterinary Medicine, 2 (2): 99-102.

178. Ramachandran, R., A. G. Chalasani, R. Lal and U. Roy, 2014. A broad-spectrum antimicrobial activity of Bacillus subtilis RLID 12.1. The Scientific World Journal, 2014.

179. Rayner, C. and W. Munckhof, 2005. Antibiotics currently used in the treatment of infections caused by Staphylococcus aureus. Internal medicine journal, 35 (s2). 180. Regis, E., 1999. The History of America's Secret Germ Warfare Project: The Biology of Doom. 1st. New York: Henry Holt and Company

181. Reuter, G., 2001. Probiotics--possibilities and limitations of their application in food, animal feed, and in pharmaceutical preparations for men and animals. Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift, 114 (11-12): 410-419.

182. Revolledo, L., A. Ferreira and G. Mead, 2006. Prospects in Salmonella control: competitive exclusion, probiotics, and enhancement of avian intestinal immunity. Journal of applied poultry research, 15 (2): 341-351

183. Rinkinen, M., J. Mättö, S. Salminen, E. Westermarck and A. Ouwehand, 2000. In vitro adhesion of lactic acid bacteria to canine small intestinal mucus. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 84 (1‐2): 43-47. 184. Rudner, D. Z. and R. Losick, 2001. Morphological coupling in development: lessons from prokaryotes. Developmental cell, 1 (6): 733-742.

185. Ruiz, C., F. Javier Pastor and P. Diaz, 2003. Isolation and characterization of Bacillus sp. BP‐6 LipA, a ubiquitous lipase among mesophilic Bacillus species. Letters in applied microbiology, 37 (4): 354-359.

186. Salzman, N. H., D. Ghosh, K. M. Huttner, Y. Paterson and C. L. Bevins, 2003. Protection against enteric salmonellosis in transgenic mice expressing a human intestinal defensin. Nature, 422 (6931): 522

187. Saminathan, D. and J. S. Narayanan, 2015. Isolation and classical identification of potent extracellular alkaline protease producing alkalophilic Bacillus sp from coastal regions of Tamil Nadu. African Journal of Microbiology Research, 9 (12): 847-854.

188. Sampa R.R, Bahanur R., Jayedul H., Nazmul H.N, 2012, Isolation and identification of bacterial flora from internal organs of broilers and their antibiogram studies. Microbes and Health 1(2): 72-75

importance. veterinary Available and 189. SCAN, 2000. Opinion of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the criteria for assessing the safety of micro-organisms resistant to antibiotics of human clinical at: http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scan/outcome_en.html 190. Schaechter, M., J.L. Ingraham, F.C. Neidhardt, 2006. Microbe. (ASM Press, Washington, DC)

147

191. Schillinger, U., R. Geisen and W. Holzapfel, 1996. Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods. Trends in food science & technology, 7 (5): 158-164.

192. Schrezenmeir, J. and M. de Vrese, 2001. Probiotics, prebiotics, and synbiotics— approaching a definition. The American journal of clinical nutrition, 73 (2): 361s- 364s.

193. Sekizaki, T., H. Nishiya, S. Nakajima, M. Nishizono, M. Kawano, M. Okura, D. Takamatsu, H. Nishino, T. Ishiji and R. Osawa, 2008. Endocarditis in chickens caused by subclinical infection of Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus. Avian diseases, 52 (1): 183-186.

194. Sertaç Argun Kıvanç, Murat Takım, Merih Kıvanç, Gülay Güllülü, 2014. Bacillus spp. isolated from the conjunctiva and their potential antimicrobial activity against other eye pathogens. African Health Sciences 14(2):364-371

195. Sharma, J. and K. Schat, 1991. Natural immune functions. Avian Cellular Immunology: 51-70 196. Sharma, M., R. Katoch, M. Batta and A, 1996. Deadly outbreak in chicks owing to Salmonella typhimurium. Indian Journal of Poultry Science, 31 (1): 60-62.

197. Sieber, S. A. and M. A. Marahiel, 2003. Learning from nature's drug factories: nonribosomal synthesis of macrocyclic peptides. Journal of bacteriology, 185 (24): 7036-7043

198. Sirohi Rekha and Prakash Veeru, 2016. Optimization of Process Parameters for Amylolytic Bacillus Subtilis LC060260 Isolated from Almora Region of Central Himalayas. Research Journal ofEngineering Sciences. Vol. 5(3): 1-5. 199. Sklan, D., 2001. Development of the digestive tract of poultry. World's Poultry Science Journal, 57 (4): 415-428. 200. Smith, N. R., R. E. Gordon and F. E. Clark, 1946. Aerobic mesophilic sporeforming bacteria: US Department of Agriculture.

201. Soccol, C. R., L. P. d. S. Vandenberghe, M. R. Spier, A. B. P. Medeiros, C. T. Yamaguishi, J. D. D. Lindner, A. Pandey and V. Thomaz-Soccol, 2010. The potential of probiotics: a review. Food Technology and Biotechnology, 48 (4): 413- 434.

202. Soleimani, N. A., R. K. Kermanshahi, B. Yakhchali and T. N. Sattari, 2010. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli against Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis. African Journal of Microbiology Research, 4 (20): 2169-2173. 203. Šottník, J., 2002. Climatical factors and their effect on production in animal housing. Paper read at 2002 ASAE Annual Meeting.

204. Spivey, M. A., S. L. Dunn-Horrocks and T. Duong, 2014. Epithelial cell adhesion and gastrointestinal colonization of Lactobacillus in poultry. Poultry science, 93 (11): 2910-2919

205. Stappenbeck, T. S., L. V. Hooper and J. I. Gordon, 2002. Developmental regulation of intestinal angiogenesis by indigenous microbes via Paneth cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 99 (24): 15451-15455. 206. Stein, T., 2005. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions. Molecular microbiology, 56 (4): 845-857.

148

207. Stephen T, Roberto M. La Ragione and Martin J. Woodward, 2008. Bacillus subtilis Spores Germinate in the Chicken Gastrointestinal Tract. Applied and Environmental Microbiology. 74(16): 5254–5258

208. Stöver, A. G. and A. Driks, 1999. Secretion, localization, and antibacterial activity of TasA, a Bacillus subtilis spore-associated protein. Journal of bacteriology, 181 (5): 1664-1672.

209. Sumathi V. and Reetha D., 2012. Screening of Lactic Acid Bacteria for Their Antimicrobial Activity against Pathogenic Bacteria. International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives; 3(4):802-808.

210. Sushma, K., S. Abha and P. Chander, 2012. Isolation and characterization of Bacillus subtilis KC3 for amylolytic activity. International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics, 2 (5): 336.

211. Szajewska, H., M. Kotowska, J. Z. Mrukowicz, M. Arma and W. Mikolajczyk, 2001. Efficacy of Lactobacillus GG in prevention of nosocomial diarrhea in infants. The Journal of pediatrics, 138 (3): 361-365.

212. Tabbene, O., I. Karkouch, I. B. Slimene, N. Elfeddy, P. Cosette, M.-L. Mangoni, T. Jouenne and F. Limam, 2011. Triggering of the antibacterial activity of Bacillus subtilis B38 strain against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Applied biochemistry and biotechnology, 164 (1): 34-44.

213. Tactacan, G., J. Schmidt, M. Miille and D. Jimenez, 2013. A Bacillus subtilis (QST 713) spore-based probiotic for necrotic enteritis control in broiler chickens. Journal of applied poultry research, 22 (4): 825-831. 214. Talaiekhozani, A., S. Alaee and M. Ponraj, 2015. Guidelines for quick application of biochemical tests to identify unknown bacteria.

215. Tam, N. K., N. Q. Uyen, H. A. Hong, H. Duc le, T. T. Hoa, C. R. Serra, A. O. Henriques, and S. M. Cutting, 2006. The intestinal life cycle of Bacillus subtilis and close relatives. J. Bacterial. 188:2692-2700

216. Tamehiro, N., Y. Okamoto-Hosoya, S. Okamoto, M. Ubukata, M. Hamada, H. Naganawa and K. Ochi, 2002. Bacilysocin, a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis 168. Antimicrobial agents and chemotherapy, 46 (2): 315-320. 217. Tannock. G.W, 2002. Analysis of the intestinal microflora: a renaissance. Antonie van Leeuwenhoek, 76(4) 265-278.

218. Team, E. E., 2013. CDC publishes report on antibiotic resistance threats in the United States for the first time. Euro surveillance: bulletin Europeen sur les maladies transmissibles= European communicable disease bulletin, 18 (38).

219. Tellez, G., C. Pixley, R. Wolfenden, S. Layton and B. Hargis, 2012. Probiotics/direct fed microbials for Salmonella control in poultry. Food Research International, 45 (2): 628-633.

220. Teo, A. Y. and H.-M. Tan, 2003. The effect of heat, pH and bile salts on a new strain of Bacillus subtilis isolated from the gastrointestinal tract of healthy chicken. Abstr. 12th World Food Sci. Technol. Congr., Chicago, IL. IFST, UK

221. Teo, A.-L. and H.-M. Tan, 2006. Effect of Bacillus subtilis PB6 (CloSTAT) on broilers infected with a pathogenic strain of Escherichia coli. The Journal of Applied Poultry Research, 15 (2): 229-235.

149

222. Thirabunyanon, M. and N. Thongwittaya, 2012. Protection activity of a novel probiotic strain of Bacillus subtilis against Salmonella Enteritidis infection. Research in veterinary science, 93 (1): 74-81. 223. Todar, K., 2015. Textbook of bacteriology.

224. Todorova, S. and L. Kozhuharova, 2010. Characteristics and antimicrobial isolated from soil. World Journal of activity of Bacillus subtilis strains Microbiology and Biotechnology, 26 (7): 1207-1216.

225. Tuomola, E., R. Crittenden, M. Playne, E. Isolauri and S. Salminen, 2001. Quality assurance criteria for probiotic bacteria. The American journal of clinical nutrition, 73 (2): 393s-398s. 226. UK Standards for Microbiology Investigations, 2015. Identification of Bacillus species. Bacteriology – Identification, ID 9, Issue no: 3, Page: 1 of 27.

227. Vaerewijck, M., P. De Vos, L. Lebbe, P. Scheldeman, B. Hoste and M. Heyndrickx, 2001. Occurrence of Bacillus sporothermodurans and other aerobic spore‐forming species in feed concentrate for dairy cattle. Journal of applied microbiology, 91 (6): 1074-1084.

228. Vahjen, W., K. Gläser, K. Schäfer and O. Simon, 1998. Influence of xylanase- supplemented feed on the development of selected bacterial groups in the intestinal tract of broiler chicks. The Journal of Agricultural Science, 130 (4): 489-500.

229. Vakevainen, S., J. Tillonen, M. Salaspuro, H. Jousimies‐Somer, H. Nuutinen and M. Färkkilä, 2000. Hypochlorhydria induced by a proton pump inhibitor leads to intragastric microbial production of acetaldehyde from ethanol. Alimentary pharmacology & therapeutics, 14 (11): 1511-1518.

230. Valerio, F., P. De Bellis, S. L. Lonigro, L. Morelli, A. Visconti and P. Lavermicocca, 2006. In vitro and in vivo survival and transit tolerance of potentially probiotic strains carried by artichokes in the gastrointestinal tract. Applied and environmental microbiology, 72 (4): 3042-3045.

231. Van Der Wielen, P. W., S. Biesterveld, S. Notermans, H. Hofstra, B. A. Urlings and F. van Knapen, 2000. Role of volatile fatty acids in development of the cecal in broiler chickens during growth. Applied and environmental microflora microbiology, 66 (6): 2536-2540.

232. Vangalapati, M., S. S. Nandam, S. D. Prakash and S. Avanigadda, 2012. Production of Protease through SSF by Bacillus subtilis NCIM 2724. Journal of Chemical, Biological and Physical Sciences (JCBPS), 2 (4): 1929.

233. Verschuere, L., G. Rombaut, P. Sorgeloos and W. Verstraete, 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiology and molecular biology reviews, 64 (4): 655-671.

234. Vine, N., W. Leukes, H. Kaiser, S. Daya, J. Baxter and T. Hecht, 2004. Competition for attachment of aquaculture candidate probiotic and pathogenic bacteria on fish intestinal mucus. Journal of fish diseases, 27 (6): 319-326.

235. Vlamakis, H., C. Aguilar, R. Losick and R. Kolter, 2008. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes & development, 22 (7): 945-953.

236. Vuyst, L. D., L. Makras, L. Avonts, H. Holo, Q. Yi, A. Servin, D. Fayol- Messaoudi, C. Berger, G. Zoumpopoulou and E. Tsakalidou, 2004. Antimicrobial potential of probiotic or potentially probiotic lactic acid bacteria, the first results of the international European research project PROPATH of the PROEUHEALTH cluster. Microbial ecology in health and disease, 16 (2-3): 125-130

150

237. Wang, X., S. Heazlewood, D. Krause and T. Florin, 2003. Molecular characterization of the microbial species that colonize human ileal and colonic

mucosa by using 16S rDNA sequence analysis. Journal of applied microbiology, 95 (3): 508-520. 238. Wayne, P., 2015. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 20 239. Wright, A. v., 2005. Regulating the safety of probiotics-the European approach. Current pharmaceutical design, 11 (1): 17-23. 240. Wu, B., T. Zhang, L. Guo and J. Lin, 2011. Effects of Bacillus subtilis KD1 on broiler intestinal flora. Poultry science, 90 (11): 2493-2499.

241. Wu, X.-Y., M. J. Walker, M. Hornitzky and J. Chin, 2006. Development of a group-specific PCR combined with ARDRA for the identification of Bacillus species of environmental significance. Journal of Microbiological Methods, 64 (1): 107-119.

242. Wybo, I., C. Wildemauwe, C. Godard, S. Bertrand and J.-M. Collard, 2004. Antimicrobial drug resistance in nontyphoid human Salmonella in Belgium: trends for the period 2000-2002. Acta Clinica Belgica, 59 (3): 152-160.

243. Xie, J., R. Zhang, C. Shang and Y. Guo, 2009. Isolation and characterization of a bacteriocin produced by an isolated Bacillus subtilis LFB112 that exhibits antimicrobial activity against domestic animal pathogens. African Journal of Biotechnology, 8 (20).

244. Yandri, T. S., H. Dian and H. Sutopo, 2008. The chemical modification of protease enzyme isolated from local bacteria isolate, Bacillus subtilis ITBCCB148 with cyanuric chloride polyethylenglycol. Eur J Sci Res, 23 (1): 177-186.

245. Yonggang Li, Li Zhang, Chunling Wang, Xiaobing Geng and Wenbin Li, 2013. Antagonistic mechanism and control effect of Bacillus subtilis Y2 against Fusarium oxysporum causing soybean root rot. African Journal of Microbiology Research Vol. 7(8): 652-656.

246. Yueju Zhao, Jonathan Nimal Selvaraj, Fuguo Xing, Lu

Zhou, Yan Wang, Huimin Song, Xinxin Tan, Lichao Sun, Lancine Sangare, Yawa Minnie Elodie Folly, and Yang Liu, 2014. Antagonistic Action of Bacillus subtilis Strain SG6 on Fusarium graminearum. Journal List v.9(3); 2014.PMC3961383

247. Yumoto, I., K. Yamazaki, T. Sawabe, K. Nakano, K. Kawasaki, Y. Ezura and H. Shinano, 1998. Bacillus horti sp. nov., a new Gram-negative alkaliphilic bacillus. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 48 (2): 565- 571.

248. Yurong, Y., S. Ruiping, Z. ShiMin and J. Yibao, 2005. Effect of probiotics on intestinal mucosal immunity and ultrastructure of cecal tonsils of chickens. Archives of animal nutrition, 59 (4): 237-246

249. Zaghari, M., N. Zahroojian, M. Riahi and S. Parhizkar, 2015. Effect of Bacillus subtilis spore (GalliPro®) nutrients equivalency value on broiler chicken performance. Italian Journal of Animal Science, 14 (1): 3555.

151

250. ZHANG, S.-c., Z.-h. GAO, H. HE, Z. CAO, G.-x. CHEN, P.-h. ZHOU and Z.-p. HUANG, 2014. Preliminary Observation of the Effect of Endophytic Marine Bacterium from Mangrove on Growth Performance and Immunologic Function of Yellow-feather Broilers. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2: 028

251. Zhu, X. Y., T. Zhong, Y. Pandya and R. D. Joerger, 2002. 16S rRNA-based analysis of microbiota from the cecum of broiler chickens. Applied and environmental microbiology, 68 (1): 124-137.

TIẾNG VIỆT

1. Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011. Giáo trình Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản. Nhà xuất bản Nông nghiệp, 148 trang.

2. Hồ Lê Quỳnh Châu, Hồ Trung Thông, Nguyễn Thị Khánh Quỳnh, 2010. Đánh giá khả năng bám dính và kháng khuẩn ở mức độ in vitro của một số chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng làm probiotics. Tạp chí khoa học, Đại học Huế, số 57.

3. Hồ Thị Trường Thy, Nguyễn Nữ Trang Thùy, Võ Minh Sơn, 2013. Khào sát một số đặc tính chủng Bacillus subtilis B20.1 làm cơ sở cho việc sản xuất probiotic phòng bệnh gan thận mủ do Edwardseilla ictaluti trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi thâm canh. Tạp chí khoa học công nghệ - Thủy sản. Số 4 : PP 225-233.

4. Hoàng Thủy Nguyên, Đặng Đức Trạch, 1980. Ứng dụng công nghệ tiên tiến sản xuất văcxin phòng bệnh cho người. Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương. Giải thưởng Trần Đại Nghĩa 2016.

5. Huynh Thi Hong Nhi; Nguyen Thuy Huong, 2016. Examining Some Probiotics Activities of Bacillus Subtilis Natto. Journal Of Modern Engineering Research. Volume 6, Issue 5PP 33-37.

6. Lê Thanh Bình, Phạm Thị Ngọc Lan, Yoshimi Benno, 1999. Tác dụng tăng trưởng đối với gia cầm của chế phẩm vi sinh vật PRO 99. Tuyển tập báo cáo tại hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 1999, pp. 139-144

7. Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, 2009. Nghiên cứu hoạt tính enzyme ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải. Tạp chí khoa học ĐHQGHN, Khoa tự nhiên và công nghệ 25: 101- 106.

8. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phan Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, 1978. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật Hà Nội. Tập 3

9. Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu, 2003. Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic. Tuyển tập báo cáo tại hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2003, pp. 251-255.

10. Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Thị Thu Hường, Trịnh Thị Thùy Linh, Nhữ Thị Hà, Trịnh Thị Hảo, Nguyễn Thành Linh, Đặng Xuân Nghiêm, 2014. Khảo sát thành phần vi sinh và các đặc tính probiotic của các sản phẩm men tiêu hóa trên thị trường. Tạp chí Khoa học và Phát triển. Tập 12, số 1: 65-72

152

11. Nguyen Thi Thanh Thuy, Vu Thi Huyen Trang, Vu Quynh Huong, Trinh Thi Thu Thuy, Nguyen Thi Lam Doan, Tran Thi Na, Nguyen Hoang Anh, 2016. Phân lập, định danh và sơ bộ xác định đặc tính của các chủng Bacillus subtilis có phổ kháng khuẩn rộng từ tương ớt Mường Khương. Tạp chí KH Nông nghiệp VN, tập 14, số 7: 1009-1015.

12. Nguyễn Thuỳ Châu, Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, 2003. Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic. Tuyển tập báo cáo tại Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp. 251-255

13. Nguyễn Tiến Toàn, Đỗ Văn Ninh. 2013. Nghiên cứu ảnh hưởng của lysine, probiotics đến tốc độ sinh trưởng và chất lượng thịt gà ta. Tạp chí khoa học công nghệ - Thủy sản. Số 4: 144-149.

14. Phạm Thị Ngọc Lan, Lê Thanh Bình, 2003. Đặc điểm phân loại chủng Lactobacillus probiotic CH123 và CH 126 phân lập từ đường ruột của gà. Tuyển tập báo cáo tại Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp. 101-105.

15. Trần Quốc Việt, 2008. Ảnh hưởng của việc bổ sung probiotic vào khẩu phần đến khả năng tiêu hóa, tốc độ sinh trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và tỉ lệ mắc bệnh tiêu chảy lợn con và lợn thịt. Tạp chí Khoa học Công nghệ chăn nuôi, số 11 16. Võ Hồng Thi, Nguyễn Hoàng Mỹ, Nguyễn Phạm Huyền, 2012. Hoạt tính protease của một số chủng Bacillus phân lập từ nước thải chế biến thịt và thủy hải sản. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 28: 116-124

153

17. Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Minh Thái,Nguyễn Thị Linh Giang, Trần Hữu Tâm, Trần Cát Đông, 2014. Nghiên cứu đặc tính probiotic của Bacillus subtilis Bs02. Y học thực hành (907) – số 3: 21-25. 18. Vũ Văn Ngữ, 1978. Loạn khuẩn đường ruột và tác dụng của Colisubtin. Nhà xuất bản y học Hà Nội. 19. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1984. Phân lập và lựa chọn một số chủng Bacillus có khả năng sinh tổng hợp proteineza ngoài bào. Tạp chí sinh học, 1984.

PHỤ LỤC A

HÓA CHẤT VÀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU

A.1. Xác định hoạt tính amylase, protease và lipase do vi khuẩn sinh ra

Xác định hoạt tính các enzyme theo dược điển Mỹ (USP, 2015). Phương pháp thực hiện như sau: enzyme chuẩn Pancreatin (USP - working standard) chứa amylase 25,31 USP unit, protease 25,35 USP unit và lipase 2,01 UPS unit/mg. Trong đó, hoạt tính enzyme được định nghĩa như sau:

 1 USP Unit amylase: chứa lượng enzyme thủy phân tinh bột với tốc độ

0,16 µEq liên kết glycosidic trong một phút ở điều kiện thử nghiệm.

 1 USP Unit lipase: chứa lượng enzyme có thể giải phóng 1,0 µEq acid

trong 1 phút ở pH 9, ở 37oC.

 1 USP Unit protease: chứa lượng enzyme thủy phân casein trong 1 phút ở điều kiện thử nghiệm tạo ra lượng peptid không tủa trong TCA có độ hấp thu ở 280 nm tương tự tyrosin 15 nmol.

Xác định amylase theo USP:

Tiến hành chuẩn bị (1) dung dịch đệm phosphate pH 6,8: cân 13,6 g KH2PO4 hòa tan trong 500 mL nước (A). Cân 14,2 g K2HPO4 hòa tan trong 500 mL nước (B). Trộn 51 mL A với 49 mL B. Nếu cần thêm vài giọt dung dịch thích hợp để được pH 6,8; (2) Dung dịch cơ chất: cân 2 g tinh bột cho vào 10 mL nước, thêm 160 mL nước đun sôi. Rửa becher với 10 mL nước và cho vào dung dịch tinh bột, đun cho tinh bột tan hoàn toàn, để nguội và thêm nước đủ 200 mL, và (3) Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 20 mg Pancreatin. Thêm 30 mL đệm phosphat pH 6,8, chuyển sang bình định mức 50 mL và thêm đệm phosphat vừa đủ 100 mL. Phản ứng được tiến hành bằng cách chuẩn độ iodine bằng sodium thiosufate sau khi thực hiện phản ứng của 1 mL enzyme chuẩn với tinh bột sau 10 phút.

Xác định lipase theo USP

Tiến hành chuẩn bị (1) Dung dịch acacia: ly tâm dung dịch acacia (1 mL/10 mL) cho đến khi trong và sử dụng dung dịch trong, (2) Dung dịch cơ chất: phối hợp 165 mL Acacia, 20 mL dầu olive và 15 g đá, xay trong máy xay, đồng hóa trong 15 phút ở tốc độ cao để thu được hệ nhũ tương, (3) Dung dịch đệm: Hòa tan 60 mg Tris và 234 mg NaCl để có 100 mL dung dịch, (4) Dung dịch muối mật: chuẩn bị dung dịch chứa 80 mg muối mật trong mỗi mL, (5) và enzyme chuẩn:

154

cân chính xác 200 mg Pancreatin trong 3 mL nước lạnh thêm nước vào sao cho dung dịch cuối cùng có hoạt tính 8 -16 USP unit/ mL. Phản ứng được thực hiện như sau: trộn 10 mL cơ chất dầu olive với 8 mL đệm, 2 mL dung dịch muối mật và 8 mL mước vào trong becher 50 mL, để ổn nhiệt ở 37oC. Thêm NaOH 0,1N chỉnh pH lên 9,2 bằng máy đo pH. Thêm 1 mL dung dịch enzyme và NaOH vào mẫu trong 5 phút duy trì pH 9. Tính lượng NaOH thêm vào sau mỗi phút để xác định hoạt tính của enzyme.

Xác định protease theo USP:

Tiến hành chuẩn bị: (1) Cơ chất casein: cân 1,25 g casein cho vào bình nón 100 mL chứa 5 mL nước, thêm 10 mL NaOH 0.1 N, lắc trong 1 phút, thêm 50 mL nước lắc trong 1giờ để hòa tan cesein (pH khoảng 8). Chuyển sang bình định mức 100 mL vào pha loãng với nước trộn đều. Cơ chất sử dụng trong ngày, (2) Dung dịch đệm: hòa tan 6,8 g KH2PO4 và 1,8 g NaOH trong 950 mL nước trong bình định mức 1 L, chỉnh pH 7,5 với NaOH 0,2 N và pha loãng với nước để đạt thể tích. Giữ dung dịch trong tủ lạnh, và (3) Dung dịch chuẩn: cân chính xác 100 mg cho vào 100 mL dung dịch đệm, trộn và lắc trong 25 phút để có dung dịch 2,5 USP unit/ mL. Phản ứng được tiến hành với enzyme 1,5 mL, cơ chất 2 mL, thời gian phản ứng 60 phút ở 40oC. A2. Qui trình phân lập Salmonella

1 gram mẫu ↓37oC/ 24 giờ. 9 ml môi trường Buffered peptone water ↓37oC/ 24 giờ. Rút 1ml cho vào 9ml môi trường Rappaport ↓37oC/ 24 giờ. Cấy chuyển lên môi trường phân lập (BGA-SS) ↓37oC/ 24 giờ. Cấy thuần trên môi trường BGA ↓37oC/ 24 giờ. Cấy trên môi trường TSA ↓37oC/ 24 giờ. Kiểm tra sinh hóa trên các môi trường (Peptone, MR-VP, Citrate, KIA, Lysine) ↓37oC/ 24 giờ. Cấy giữ giống Salmonella trên môi trường TSA

155

Bước 1: Tăng sinh và tăng sinh chọn lọc

- Cấy mẫu ban đầu vào môi trường Peptone, ủ mẫu ở 37oC/ 24 giờ - Sau 24 giờ, nếu canh khuẩn đục thì dùng pipet hút 1 mL cho vào môi trường tăng sinh chọn lọc Selenite hoặc Rappaport trong suốt, không đổi màu thì sơ bộ kết luận không có vi khuẩn trong bệnh phẩm.

- Nếu sau 24 giờ canh khuẩn đục do vi khuẩn trong bệnh phẩm phát triển,

tiếp tục thực hiện các bước kế tiếp.

Bước 2: Nuôi cấy phân lập

- Dùng que cấy, cho vào ống môi trường Selenic hoặc Rappaport lấy 1 vòng

cấy, cấy ria lên đĩa thạch SS và BGA, ủ 37oC/ 24 giờ.

- Nếu không có khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella mọc trên 2 loại môi

trường thì kết luận canh khuẩn không có Salmonella.

- Nếu có khuẩn lạc không màu đặc trưng có tâm đen trên môi trường SS, khuẩn lạc màu hồng, trong, tròn, lồi trên BGA thì nghi ngờ là có Salmonella.

Bước 3: Nuôi cấy thuần

- Lấy những khuẩn lạc điển hình trên hai môi trường SS và BGA cấy lại trên

môi trường thạch dinh dưỡng NA, ủ 37oC/ 24 giờ.

- Lấy những khuẩn lạc môi trường NA nhuộm Gram và thực hiện phản ứng

sinh hóa

Bước 4: Phương pháp nhuộm Gram

- Dùng lame sạch, que cấy tiệt trùng, cho một ít nước muối sinh lý hoặc

nước cất lên lame.

- Cho một ít vi khuẩn lên dàn mỏng  để khô tự nhiên. - Hơ lame qua đèn cồn để cố định vi khuẩn  để nguội. - Nhuộm Crystal violet trong 1 phút - Rửa lại bằng nước nhuộm Lugol 2 phút. - Rửa lại bằng cồn để cố định vi khuẩn để nguội. - Nhuộm Safranine 1 phút. - Rửa lại bằng nước  để khô. - Quan sát trên kính 100X có giọt dầu. - Kết quả: Gram dương màu tím, Gram âm màu hồng.

Bước 5: Các thử nghiệm sinh hóa định danh

156

A2.1. Môi trƣờng TSI: được hấp khử trùng và cho vào ống nghiệm vô trùng để tạo ống thạch nghiêng sao cho đỉnh thạch ống nghiệm cách nắp ống nghiệm khoảng 2,5cm và phần sâu có chiều cao 25cm. Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối vi khuẩn không quá 24 giờ từ đĩa NA cấy vào phần sâu của ống thạch nghiêng nhưng tránh chạm đáy ống, sau đó ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng. Ủ ống nghiệm vừa cấy ở 37oC/ 24 giờ.

Đọc kết quả: - Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, không lên men lactose, sau 24 giờ nuôi cấy, phần thạch nghiêng ở trên kiềm có màu đỏ, còn phần thạch đứng trở nên acid có màu vàng (lactose(-), glucose(+)).

- Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, lactose, sau 24 giờ nuôi cấy thì phần thạch nghiêng và phần thạch đứng trở nên acid có màu vàng (lactose(+), glucose(+)).

- Nếu vi khuẩn có sinh H2S thì xuất hiện tủa màu đen trong ống nghiệm sau

24 giờ nuôi cấy là H2S(+). Nếu không xuất hiện màu đen là (H2S(-)). A2.2. Môi trƣờng Simmon Citrate: lấy sinh khối vi khuẩn không quá 24 giờ trên đĩa NA ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng của ống nghiệm chứa môi trường Simmon Citrate đã tiệt trùng, ủ ống nghiệm vừa cấy ở 37oC/ 24 giờ.

Đọc kết quả: Citrate (+): Nếu môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh dương. Citrate (-): Môi trường vẫn giữ nguyên màu xanh lá cây ban đầu.

A2.3.Môi trƣờng Peptone: Lấy sinh khối vi khuẩn không quá 24 giờ trên đĩa NA cấy vào ống nghiệm chứa môi trường Peptone 1% đã tiệt trùng, ủ ống nghiệm vừa cấy ở 37oC/ 24 giờ.

Đọc kết quả:

Nhỏ 2-3 giọt thử Kovac’s vào ống nghiệm có chứa vi khuẩn đã ủ ở 37oC/ 24 giờ. +Indole(+): Nếu có vòng màu đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường. +Indole (-): Nếu có vòng màu vàng xuất hiện trên bề mặt môi trường. A2.4.Môi trƣờng MR-VP: Lấy sinh khối không quá 24 giờ trên đĩa NA cấy vào 2 ống nghiệm chứa môi trường MR-VP đã tiệt trùng, ủ các ống nghiệm vừa cấy ở 37oC/ 24 giờ.

Đọc kết quả: +VP(+): Nếu xuất hiện vòng đỏ trên bề mặt môi trường. +VP(-): Nếu bề mặt môi trường không đổi màu.

157

A2.5.Thử nghiệm Methyl Red: Nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Methyl red +MR(+): Khi môi trường có màu đỏ.+MR(-): Khi môi trường có màu vàng.

A2.6.Môi trƣờng Lysine Decacoxylase: Lấy sinh khối vi khuẩn không quá 24 giờ trên đĩa NA cấy vào ống nghiệm chứa môi trường Lysine Decacoxylase đã tiệt trùng, ủ ống nghiệm vừa cấy ở 37oC/ 24 giờ.

Đọc kết quả: +Lysine (+): Nếu môi trường trở nên đục và có màu tím. +Lysine(-): Nếu môi trường trong và có màu vàng.

Kết quả định danh vi khuẩn Salmonella bằng phản ứng sinh hóa Glucose Lactose Lysine Citrate

Indole VP

MR

H2S

Di động +

+/-

-

+/-

-

+

+

+

- A3. Qui trình phân lập, xác định E.coli

1 gram mẫu ↓ 9 mL môi trường Buffered peptone water

↓ 37oC/ 24 giờ.

Rút 1mL cho vào 9 mL môi trường Lactose Broth

↓ 37oC/ 24 giờ.

Cấy chuyển lên môi trường phân lập MC-EMB

↓ 37oC/ 24 giờ.

Cấy thuần trên EMB

↓ 37oC/ 24 giờ.

Cấy trên môi trường TSA

↓ 37oC/ 24 giờ.

Kiểm tra sinh hóa trên các môi trường (Peptone-MR-VP-Citrate)

↓ 37oC/ 24 giờ.

Cấy giữ giống E.coli trên môi trường TSA

Bước 1: Tăng sinh và tăng sinh chọn lọc

- Cấy mẫu ban đầu vào môi trường Peptone, ủ mẫu ở 37oC/ 24 giờ. - Sau 24 giờ, nếu canh khuẩn đục thì dùng pipet hút 1mL cho vào môi

trường tăng sinh chọn lọc Lactose Broth, ủ mẫu 37oC/ 24 giờ.

158

- Sau 24 giờ, nếu môi trường Lactose Broth trong suốt, không có váng thì sơ

bộ kết luận không có vi khuẩn trong bệnh phẩm.

- Nếu sau 24 giờ canh khuẩn đục do vi khuẩn trong bệnh phẩm phát triển,

tiếp tục thực hiện các bước kế tiếp.

Bước 2: Nuôi cấy phân lập

- Dùng que cấy, cho vào môi trường Lactose Broth lấy 1 vòng cấy, cấy ria

lên đĩa thạch MC và EMB, ủ 37oC/ 24 giờ.

- Nếu không có khuẩn lạc đặc trưng của E.coli mọc trên 2 loại môi trường

thì kết luận canh khuẩn không có E.coli.

- Nếu có khuẩn lạc màu tím ánh kim trên môi trường EMB, khuẩn lạc màu

đỏ, tròn, lồi trên MC thì nghi ngờ là có E.coli.

Bước 3: Nuôi cấy thuần

- Lấy những khuẩn lạc điển hình trên hai môi trường MC và EMB cấy lại

trên môi trường thạch dinh dưỡng NA, ủ 37oC/ 24 giờ.

- Lấy những khuẩn lạc môi trường NA nhuộm Gram và thực hiện phản ứng sinh hóa. Kết quả phản ứng sinh hóa tương tự như phản ứng sinh hóa của Salmonella.

Kết quả định danh vi khuẩn E.coli bằng phản ứng sinh hóa Glucose Lactose Lysine Citrate

Indole VP

MR

H2S

+

-

-

+

-

+

Di động +

-

+

159

PHỤ LỤC B QUI TRÌNH PHÒNG BỆNH VÀ THỨC ĂN SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM

1. Qui trình phòng bệnh

Loại bệnh phòng Tên thuốc Ghi chú

Sát trùng chuồng trại Vimekon 100g/20lít nước sạch Phun xịt toàn bộ chuồng trại sau khi làm vệ sinh sạch và để khô

Ngày tuổi 7 ngày trước khi gà vào trại 1, 2, 3 Phòng CRD, E.coli, viêm rốn Goody ST

Tăng sức đề kháng Vime C Electrolyte

3 Gumboro lần 1 Gumbo L Lọ 500 liều dạng đông khô

5, 6, 7 Tăng sức đề kháng

7

Dịch tả + Viêm phế quản truyền nhiễm lần 1 Cầu trùng lần 1 Vime C Electrolyte Ma5-Clone 30 (Lọ 1000 liều dạng đông khô) Vicox Toltra 2,5% 8, 9

10 Đậu

Vaccine Đậu gà Lọ 100 liều dạng đông khô

Amox 50% 11, 12, 13 Phòng bệnh hô hấp và tiêu hóa

14

18 Cúm gia cầm (gà) lần 1 Gumboro 2 Vaccin H5N1 I.B.D L Lọ 1000 liều dạng đông khô

Dịch tả + Viêm phế quản truyền nhiễm Ma5-Clone 30 (Lọ 1000 liều dạng 21 Pha 1g/lít nước sạch, cho uống trong 3 giờ vào buổi sáng Pha 1g/lít nước, cho uống trong 2 giờ vào buổi chiều Pha 1 lọ vaccine với chai nước pha 1000 liều (30ml) hoặc Sinh lý mặn, nhỏ mũi. Pha nước uống trong 3 giờ buổi sáng Pha 1 lọ vaccine với chai nước pha 1000 liều, nhỏ mắt, cho uống. Pha 3ml/lít nước sạch. Cho uống trong 6 giờ buổi sáng. Sau đó thay nước sạch. Pha 1 lọ với 2ml nước sinh lý mặn 0,9%. Dùng kim chủng đâm vào màng cánh gà Pha 1g/5 lít nước sạch, cho uống trong 2 giờ vào buổi sáng Tiêm dưới da cổ phía trên Pha 1 lọ vaccine với chai nước pha 1000 liều (30ml) hoặc Sinh lý mặn, nhỏ mũi. Nhỏ mắt hoặc Tiêm dưới da cổ

160

30-32 lần 2 Phòng bệnh Tăng sức đề kháng đông khô) CRD plus Vime C Electrolyte

33 CRD 5g/lít nước uống buổi sáng Pha 1g/l nước, cho uống buổi chiều Nhỏ mũi

34-35 Cầu trùng lần 2 Cevac MG-F Lọ 1000 liều dạng đông khô Vicox Toltra 2,5%

36 Tẩy giun sán Pha 3ml/lít nước sạch. Cho uống trong 6 giờ vào buổi sáng. Sau đó thay nước sạch. Pha 1ml/ lít nước uống.

38-40 Giải độc gan thận

42

49 Cúm gia cầm (gà) lần 2 Dịch tả Pha 1ml/lít nước sạch. Cho uống buổi sáng Tiêm dưới da cổ phía trên Tiêm bắp 0,5ml/con Albendazol Sorpherol hoặc Goliver Vaccin H5N1 Newcavac Nhũ dầu 1000 liều

2. Thành phần thức ăn

Nguyên liệu

Bắp Cám gạo Bột cá 55 Bột đậu nành 46 Lysin Methionin Bột xương Bột sò to Muối ăn Embavit 2 Vime Senic EH Lactozyme Diclacox Chất chống mốc Tổng số

Gà 0-3 tuần (kg) 564,98 50,00 20,00 285,30 0,98 2,30 29,40 37,50 1,70 4,40 0,45 2,00 1,00 1000 kg

Gà 4-7 tuần (kg) 597,30 50,00 40,00 245,30 27,50 30,00 0,79 4,40 0,32 2,00 0,20 0,20 1,00 1000 kg

161

PHỤ LỤC C

SỐ LIỆU KẾT QUẢ KHẢO SÁT

1. Đặc điểm khuẩn lạc của 296 chủng vi khuẩn

STT Ký hiệu Độ nổi Màu sắc Bề mặt Hình dạng Bìa (bờ rìa)

Đƣờng kính (mm) 5-Mar 1-1,5 1,5-2 0,5-1 1,5-2 0,5-1 0,5-1 0,5-1 0,75-1 1,5-2 1-1,5 1,5-2 1-1,5 1-1,5 1-1,5 1,5-2 1-1,5 0,75-1 1,5-2 1-1,5 1,5-2 1,5-2 1-1,5 3-Feb 4-Feb 1-1,5 2-2,5 3-Feb 2-3,5 4-Mar 1-1,5 kéo dài bất định tròn bất định tròn bất định bất định bất định tròn tròn bất định bất định bất định bất định tròn bất định bất định tròn tròn bất định bất định bất định tròn tròn kéo dài tròn kéo dài kéo dài bất định tròn tròn bất định bất định nguyên bất định nguyên bất định bất định bất định bất định bất định bất định nguyên nguyên bất định nguyên bất định bất định bất định bất định bất định bất định nguyên bất định nguyên bất định nguyên bất định bất định bất định bất định nguyên phẳng lồi lồi nổi lồi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi nổi nổi lồi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng phẳng phẳng u lồi phẳng phẳng trắng đục trắng kem trắng kem trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng kem trắng kem trắng kem trắng kem trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục trắng đục trắng kem trắng kem trắng kem vàng kem trắng đục cam trắng đục vàng trắng đục trắng đục trắng đục 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 CT01 CT02 CT03 CT04 CT05 CT06 CT07 CT08 CT09 CT10 CT11 CT12 CT13 CT14 CT15 CT16 CT17 CT18 CT19 CT20 CT21 CT22 CT23 CT24 CT25 CT26 CT27 CT28 CT29 CT30 CT31 ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt khô ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt khô ướt ướt ướt khô khô ướt ướt ướt khô ướt ướt

162

32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 CT32 CT33 CT34 CT35 CT36 CT37 CT38 CT39 CT40 CT41 CT42 AG01 AG02 AG03 AG04 AG05 AG06 AG07 AG08 AG09 AG10 AG11 AG12 AG13 AG14 AG15 AG16 AG17 AG18 AG19 AG20 AG21 AG22 AG23 AG24 AG25 AG26 1,5-2,5 1-1,5 3-Jan 5-Mar 2-2,5 1-1,5 3-Feb 2-Jan 3-Feb 0,5-2 0,5-1,5 1-1,5 1,5-2 1-1,5 0,5-1,5 1-1,5 2-Jan 0,5-1 0,5-1,75 2-Jan 1-1,5 1,5-2 0,75-1,5 1-1,75 1-1,5 1,5-2 1-1,5 0,75-1 2-2,75 0,5-1,5 0,5-2 1-1,75 1-1,5 1-1,5 1,5-2 1-1,5 0,5-1,75 tròn tròn kéo dài kéo dài kéo dài tròn kéo dài kéo dài tròn tròn tròn tròn kéo dài tròn tròn kéo dài tròn bất định tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn bất định tròn tròn kéo dài tròn kéo dài tròn tròn kéo dài tròn phẳng nổi phẳng phẳng phẳng nổi phẳng nổi phẳng nổi phẳng nổi phẳng nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi nổi nổi bất định bất định nguyên bất định bất định nguyên bất định nguyên bất định bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên trắng đục trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục vàng kem trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục ướt ướt ướt ướt ướt khô ướt ướt ướt ướt ướt ướt khô ướt khô khô khô khô ướt khô ướt ướt ướt ướt ướt ướt khô khô khô khô ướt ướt ướt khô ướt khô khô

163

69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 AG27 AG28 AG29 AG30 AG31 AG32 AG33 AG34 AG35 AG36 AG37 AG38 AG39 AG40 AG41 AG42 AG43 AG44 AG45 AG46 AG47 AG48 AG49 AG50 AG51 AG52 AG53 AG54 AG55 AG56 AG57 AG58 AG59 AG60 AG61 AG62 AG63 1-1,5 1-1,5 0,75-2 1-1,5 1,5-2,5 1-1,75 2-Jan 0,5-1,5 1,25-1,5 1-1,5 0,75-1,5 1-1,5 1-1,5 2-Jan 0,5-1,5 0,75-2 1-1,5 2-Jan 1,5-2,5 0,5-1,5 1-2,5 1-1,5 1-2,75 0,5-1,5 1-1,5 0,5-1,5 1-2,75 1-2,5 2-Jan 0,75-2 1-1,5 2-Jan 1,5-2,75 0,5-1,5 2-Jan 0,5-1,75 1-2,5 bất định tròn tròn kéo dài tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn kéo dài kéo dài tròn tròn kéo dài tròn tròn tròn tròn tròn bất định tròn tròn kéo dài nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi nổi nổi bất định nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên bất định bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng kem trắng đục trắng kem trắng kem trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục khô khô khô ướt ướt khô khô ướt khô khô ướt khô khô ướt khô ướt khô khô ướt khô ướt khô khô khô ướt khô khô khô khô ướt khô khô ướt khô khô ướt ướt

164

106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 VL01 VL02 VL03 VL04 VL05 VL06 VL07 VL08 VL09 VL10 VL11 VL12 VL13 VL14 VL15 VL16 VL17 VL18 VL19 VL20 VL21 VL22 VL23 VL24 VL25 VL26 VL27 VL28 VL29 VL30 VL31 VL32 VL33 VL34 VL35 VL36 VL37 1-1,5 1,5-2 1-1,5 0,5-1,5 1-1,5 2-Jan 0,5-1 0,5-1,75 2-Jan 1-1,5 1,5-2 0,75-1,5 1-1,75 1-1,5 1,5-2 1-1,5 0,75-1 2-2,75 0,5-1,5 0,5-2 1-1,75 1-1,5 1-1,5 1,5-2 1-1,5 0,5-1,75 0,5-1 1,5-2,5 0,75-2 1-1,5 1,5-2,5 1-1,75 2-Jan 0,5-1,5 1,25-1,5 1-1,5 0,75-1,5 tròn kéo dài tròn tròn kéo dài tròn bất định tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn bất định tròn tròn kéo dài tròn kéo dài tròn tròn kéo dài tròn bất định bất định tròn kéo dài tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn nổi phẳng nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên bất định bất định nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên bất định nguyên trắng đục trắng đục trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục vàng trắng đục cam trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục vàng trắng đục trắng đục trắng đục cam trắng đục trắng đục trắng kem ướt khô ướt khô khô khô khô ướt khô ướt ướt ướt ướt ướt ướt khô khô khô khô ướt ướt ướt khô ướt khô khô khô khô khô ướt ướt khô ướt ướt khô khô ướt

165

143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 178 179 180 VL38 VL39 VL40 VL41 ST01 ST02 ST03 ST04 ST05 ST06 ST07 ST08 ST09 ST10 ST11 ST12 ST13 ST14 ST15 ST16 ST17 ST18 ST19 ST20 ST21 ST22 ST23 ST24 ST25 ST26 ST27 ST28 ST29 ST30 ST31 ST32 ST33 1-1,5 1-1,5 2-Jan 0,5-1,5 1-1,5 1,5-2 1-1,5 0,5-1,5 1-1,5 2-Jan 0,5-1 0,5-1,75 1-2,5 1-1,5 1,5-2 0,75-1,5 1-1,75 1-1,5 1,5-2 1-1,5 0,75-1 2-2,75 0,5-1,5 0,5-1,5 1-1,75 1-1,5 1-1,5 1,5-2 1-1,5 0,5-1,75 0,5-1 1-1,5 0,75-2 1-2,5 1,5-2,5 1-1,75 2-Jan tròn tròn tròn tròn tròn kéo dài tròn tròn kéo dài tròn bất định tròn tròn tròn tròn kéo dài tròn tròn tròn tròn bất định tròn tròn kéo dài tròn kéo dài tròn tròn kéo dài tròn bất định tròn tròn kéo dài tròn tròn tròn nổi nổi nổi phẳng nổi phẳng nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên bất định nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên trắng đục trắng kem trắng kem trắng đục vàng trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục khô khô ướt khô ướt khô ướt khô khô khô khô ướt khô ướt ướt ướt ướt ướt ướt khô khô khô khô ướt ướt ướt khô ướt khô khô khô khô khô ướt ướt khô khô

166

181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 ST34 ST35 ST36 ST37 ST38 ST39 ST40 KG01 KG02 KG03 KG04 KG05 KG06 KG07 KG08 KG09 KG10 KG11 KG12 KG13 KG14 KG15 KG16 KG17 KG18 KG19 KG20 KG21 KG22 KG23 KG24 KG25 KG26 KG27 KG28 KG29 KG30 0,5-1,5 1,25-1,5 1-1,5 0,75-1,5 1-1,5 1-1,5 1-2,5 0,5-1,5 1-1,5 1,5-2 0,5-1 0,5-1,75 2-Jan 1-1,5 1,5-2 1,5-2 1-1,75 1-1,5 1,5-2 1-1,5 0,75-1 2-2,75 0,5-1,5 0,5-2 1-1,75 1-1,5 1-1,5 1,5-2 1,5-2 0,75-1 2-2,75 0,5-1,5 0,5-2 1-1,75 1-1,5 1,5-2 1,5-2 tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn kéo dài tròn bất định tròn tròn tròn tròn bất định tròn tròn bất định tròn bất định tròn tròn kéo dài tròn kéo dài tròn tròn bất định bất định tròn tròn kéo dài tròn kéo dài bất định tròn nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi lồi phẳng lồi lồi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi lồi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi nguyên nguyên bất định nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên nguyên bất định nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên bất định bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên vàng trắng đục trắng đục trắng kem trắng đục trắng kem trắng kem trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục cam trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục vàng trắng đục trắng đục trắng đục ướt khô khô ướt khô khô ướt khô khô khô khô ướt khô ướt ướt khô ướt ướt khô khô khô khô khô ướt ướt ướt khô ướt khô khô khô khô ướt ướt ướt khô ướt

167

218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 KG31 KG32 KG33 KG34 KG35 KG36 DT01 DT02 DT03 DT04 DT05 DT06 DT07 DT08 DT09 DT10 DT11 DT12 DT13 DT14 DT15 DT16 DT17 DT18 DT19 DT20 DT21 DT22 DT23 DT24 DT25 DT26 DT27 DT28 DT29 DT30 DT31 1-1,5 0,5-1,75 0,5-1 0,75-1,5 1-1,75 1,5-2 1,5-2 1-1,5 0,75-1 2-2,75 0,5-1,5 0,5-2 1-1,75 1-1,5 1-1,5 1,5-2 1,5-2 1-1,5 2-2,5 3-Feb 2-3,5 3-3,5 1-1,5 1,5-2,5 1-1,5 3-Jan 5-Mar 2-2,5 1-1,5 3-Feb 4-Feb 1,5-2 2-2,5 3-Feb 1,5-2 1,5-2 1-1,5 kéo dài tròn bất định tròn tròn bất định tròn tròn bất định tròn tròn kéo dài tròn kéo dài tròn tròn bất định tròn kéo dài kéo dài bất định tròn tròn tròn tròn kéo dài kéo dài kéo dài tròn kéo dài kéo dài bất định kéo dài kéo dài bất định bất định tròn nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi lồi lồi phẳng phẳng phẳng u lồi phẳng phẳng phẳng nổi phẳng phẳng phẳng nổi phẳng nổi lồi phẳng phẳng lồi lồi phẳng nguyên nguyên bất định nguyên nguyên bất định nguyên nguyên bất định nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên bất định nguyên bất định bất định nguyên bất định nguyên bất định bất định nguyên bất định bất định nguyên bất định bất định bất định bất định bất định bất định bất định nguyên trắng đục trắng đục trắng đục vàng trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục cam trắng đục vàng trắng đục vàng trắng đục trắng kem trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục vàng trắng đục trắng đục trắng đục khô khô khô ướt ướt khô ướt khô khô khô khô ướt ướt ướt khô ướt khô ướt ướt ướt khô ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt khô ướt khô khô ướt ướt khô khô ướt

168

255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 DT32 DT33 DT34 DT35 DT36 DT37 DT38 DT39 DT40 HG01 HG02 HG03 HG04 HG05 HG06 HG07 HG08 HG09 HG10 HG11 HG12 HG13 HG14 HG15 HG16 HG17 HG18 HG19 HG20 HG21 HG22 HG23 HG24 HG25 HG26 HG27 HG28 1,5-2,5 1-1,5 3-Jan 4-Mar 2-2,5 2-Jan 3-Feb 1,5-2,5 3-3,5 0,75-1 1-1,5 1,5-2 0,5-1 1,5-2 0,5-1 0,5-1 0,5-1 0,75-1 1,5-2 1-1,5 1,5-2 1-1,5 1-1,5 0,5-1 0,5-1 1-1,5 0,75-1 1,5-2 1-1,5 1,5-2 1,5-2 1-1,5 3-Feb 4-Feb 1-1,5 2-2,5 3-Feb tròn tròn kéo dài kéo dài kéo dài tròn bất định kéo dài kéo dài tròn bất định tròn bất định tròn bất định bất định bất định tròn tròn bất định bất định bất định bất định bất định bất định bất định tròn tròn bất định bất định bất định tròn tròn kéo dài tròn kéo dài kéo dài phẳng nổi phẳng phẳng phẳng nổi phẳng nổi phẳng nổi lồi lồi nổi lồi nổi nổi nổi nổi nổi nổi nổi phẳng lồi nổi nổi nổi lồi nổi phẳng nổi nổi nổi nổi nổi phẳng phẳng phẳng bất định bất định nguyên bất định nguyên nguyên bất định nguyên bất định bất định bất định nguyên bất định nguyên bất định bất định bất định bất định bất định bất định nguyên nguyên bất định bất định bất định bất định bất định bất định nguyên bất định nguyên bất định nguyên bất định nguyên bất định bất định trắng đục trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục trắng kem trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục trắng kem trắng kem trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục trắng kem trắng kem trắng kem trắng đục trắng đục trắng kem trắng đục trắng đục trắng kem trắng kem trắng kem trắng kem vàng kem trắng đục cam trắng đục vàng ướt ướt ướt ướt ướt khô ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt khô ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt ướt khô khô ướt ướt ướt

169

292 293 294 295 296 HG29 HG30 HG31 HG32 HG33 2-3,5 1,5-2 0,5-1 1-1,5 3-Feb bất định tròn bất định bất định tròn u lồi lồi nổi phẳng nổi bất định nguyên bất định nguyên nguyên trắng đục trắng kem trắng đục trắng kem vàng kem khô ướt ướt ướt khô

2. Hình thái tế bào quan sát dƣới kính hiển vi của 296 chủng vi khuẩn

STT Ký hiệu Bào tử Hình dạng vi khuẩn Cách sắp xếp tế bào vi khuẩn Kích thƣớc(dà ix rộng µm ) Hình dạng tế bàomang bào tử Vị trí & hình dạng bào tử hình dạng bào tử

1 CT01 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1- 1,5x 3- 3,5 không biến đổi

2 CT02 1,0 x 2-3 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông

3 CT03 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

4 CT04 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

5 CT05 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

6 CT06 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

7 CT07 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

8 CT08 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

9 CT09 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

10 CT10 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

11 CT11 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm

12 CT12 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

13 CT13 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2

170

14 CT14 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

15 CT15 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu bầu 0,5-1x 2- 2,5 không biến đổi

16 CT16 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 1-1,5x 2- 3 không biến đổi

17 CT17 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

18 CT18 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu bầu 0,5-1x 2- 2,5 không biến đổi

19 CT19 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2 không biến đổi

20 CT20 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2 không biến đổi

21 CT21 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

22 CT22 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2 không biến đổi

23 CT23 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

24 CT24 có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 3,5-4 đơn, đôi, chuỗi không biến đổi

25 CT25 1,0 x 2-3 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông

26 CT26 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5 không biến đổi

27 CT27 0,5 x 3-4 vơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông không biến đổi

28 CT28 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5

29 CT29 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 3,5-4 không biến đổi

30 CT30 đơn, đôi có que, hai đầu bầu 0,5-1 x 2- 2,5 trung tâm/ một đầu không biến đổi

31 CT31 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu bầu 0,5 x 3- 3,5

32 CT32 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5

171

33 CT33 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông 0,5 x 2,5- 3

34 CT34 1 x 2,5-3 có trung tâm đơn, đôi, chuỗi que, hai đầu bầu không biến đổi

35 CT35 1 x 3-3,5 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông không biến đổi

36 CT36 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5

37 CT37 1 x 2-2,5 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông không biến đổi

đơn, đôi có trung tâm 38 CT38 không biến đổi que, hai đầu bầu 0,5 x 1,5- 2

đơn, đôi có trung tâm 39 CT39 không biến đổi que, hai đầu vuông 0 ,5x1,5- 2,5

đơn, đôi có trung tâm 40 CT40 không biến đổi que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5

đơn, đôi có một đầu 41 CT41 không biến đổi que, hai đầu vuông 0,5 x 2,5- 3

đơn, đôi có trung tâm 42 CT42 không biến đổi que, hai đầu vuông 0,5 x 3- 3,5

đơn, đôi có trung tâm 43 AG01 không biến đổi que, hai đầu bầu 1-1,25 x 3-3,5

đơn, đôi có trung tâm phình 44 AG02 que, hai đầu vuông 1,0 x 2- 2,5

phình đơn, đôi có 45 AG03 trung tâm/ một đầu que, hai đầu vuông 0,5 x 1- 1,5

đơn, đôi có trung tâm 46 AG04 không biến đổi que, hai đầu bầu 0,5 x 3- 3,5

đơn, đôi có trung tâm phình 47 AG05 que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5

đơn, đôi có trung tâm 48 AG06 không biến đổi que, hai đầu bầu 1-1,5 x 3,5-4

đơn, đôi có trung tâm 49 AG07 không biến đổi que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5

đơn, đôi có một đầu phình 50 AG08 que, hai đầu bầu 0,5 x 3- 3,5

đơn, đôi có một đầu phình 51 AG09 que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5

172

52 AG10 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2,5-3

53 AG11 1 x 2,5-3 có trung tâm đơn, đôi, chuỗi que, hai đầu bầu không biến đổi

54 AG12 1 x 3-3,5 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông không biến đổi

55 AG13 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5

56 AG14 1 x 2-2,5 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông không biến đổi

57 AG15 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 0,5 x 1,5- 2 không biến đổi

58 AG16 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0 ,5x1,5- 2,5 không biến đổi

59 AG17 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5 không biến đổi

60 AG18 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2,5- 3 không biến đổi

61 AG19 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 3- 3,5 không biến đổi

62 AG20 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2,5-3,5 không biến đổi

đơn, đôi có một đầu phình 63 AG21 que, hai đầu vuông 0,5 x 3- 3,5

64 AG22 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 3- 3,5 không biến đổi

65 AG23 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 1,5- 2,5 không biến đổi

66 AG24 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 0,5 x 2- 2,5 không biến đổi

67 AG25 đơn, đôi có phình que, hai đầu vuông 0,5 x 3- 3,5 trung tâm/ một đầu

68 AG26 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 3,0 không biến đổi

69 AG27 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 3- 3,5 không biến đổi

70 AG28 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1,0 x 3- 3,5 không biến đổi

173

71 AG29 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5 không biến đổi

72 AG30 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1 x 3- 3,5 không biến đổi

73 AG31 đơn, đôi có phình que, hai đầu vuông 1,0 x 1- 1,5 trung tâm/ một đầu

74 AG32 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 3,0 không biến đổi

75 AG33 có trung tâm que, hai đầu bầu 1,0 x 3- 3,5 đơn, đôi, chuỗi không biến đổi

76 AG34 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 3- 3,5 không biến đổi

77 AG35 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5 không biến đổi

78 AG36 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1 x 1,5-2,5 không biến đổi

79 AG37 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông 0,5 x 3- 3,5

80 AG38 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 1,0 x 2- 2,5 không biến đổi

81 AG39 có trung tâm que, hai đầu bầu 0,5 x 1- 1,5 đơn, đôi, chuỗi không biến đổi

82 AG40 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 3,0

83 AG41 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi que, hai đầu vuông 0,5-1 x 3- 3,5

84 AG42 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 1,0 x 3- 3,5 không biến đổi

85 AG43 có trung tâm que, hai đầu bầu 0,5 x 3- 3,5 đơn, đôi, chuỗi không biến đổi

86 AG44 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 1,0 x 2- 3,0 không biến đổi

87 AG45 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5 không biến đổi

88 AG46 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 1- 1,5 không biến đổi

89 AG47 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi que, hai đầu vuông 0,5-1 x 3- 3,5

174

90 AG48 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 1,0 x 2- 2,5 không biến đổi

91 AG49 có trung tâm que, hai đầu bầu 0,5 x 3- 3,5 đơn, đôi, chuỗi không biến đổi

92 AG50 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 1,0 x 1- 1,5 không biến đổi

93 AG51 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 3,5

94 AG52 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 3,0 không biến đổi

95 AG53 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 1,0 x 2- 3,5 không biến đổi

96 AG54 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông 0,5 x 3- 3,5

97 AG55 có trung tâm que, hai đầu bầu 0,5 x 3- 3,5 đơn, đôi, chuỗi không biến đổi

98 AG56 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 3,5 không biến đổi

99 AG57 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 2,5 không biến đổi

100 AG58 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông 0,5 x 1- 2,5

101 AG59 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 3,5 không biến đổi

102 AG60 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5x1,5- 2,0 không biến đổi

103 AG61 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 0,5 x 1- 1,5 không biến đổi

104 AG62 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1 x 1- 2,5 không biến đổi

105 AG63 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5 không biến đổi

106 VL01 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

107 VL02 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

108 VL03 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

175

109 VL04 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

110 VL05 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

111 VL06 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

112 VL07 0,5x 2,5 đơn, đôi một đầu có

113 VL08 0,5x 1,5 đơn, đôi một đầu có

114 VL09 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

115 VL10 đơn, đôi có trung tâm phình 0,5x 1,5- 2 que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông

116 VL11 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

117 VL12 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

118 VL13 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

119 VL14 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

120 VL15 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

121 VL16 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

122 VL17 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

123 VL18 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

124 VL19 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm

125 VL20 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

126 VL21 đơn, đôi có trung tâm phình 0,5x 1,5- 2 que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông

127 VL22 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

176

128 VL23 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

129 VL24 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

130 VL25 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

131 VL26 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

132 VL27 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

133 VL28 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

134 VL29 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

135 VL30 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm

136 VL31 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

137 VL32 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2

138 VL33 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

139 VL34 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

140 VL35 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

141 VL36 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

142 VL37 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

143 VL38 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

144 VL39 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

145 VL40 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

146 VL41 0,5x 1,5 đơn, đôi trung tâm có que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông không biến đổi không biến đổi không biến đổi

147 ST01 que, hai 0,5x 2-3 đơn, đôi trung tâm không có

177

đầu bầu biến đổi

148 ST02 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2

149 ST03 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

150 ST04 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

151 ST05 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

152 ST06 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

153 ST07 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

154 ST08 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

155 ST09 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

156 ST10 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

157 ST11 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm

158 ST12 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

159 ST13 đơn, đôi có trung tâm phình 0,5x 1,5- 2 que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông

160 ST14 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

161 ST15 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

162 ST16 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

163 ST17 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

164 ST18 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

165 ST19 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

166 ST20 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2 không biến đổi

178

167 ST21 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

168 ST22 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm

169 ST23 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi

170 ST24 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2

171 ST25 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

172 ST26 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

173 ST27 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

174 ST28 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

175 ST29 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

176 ST30 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

178 ST31 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

179 ST32 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

180 ST33 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm

181 ST34 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

182 ST35 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2

183 ST36 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

184 ST37 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

185 ST38 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

186 ST39 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

179

187 ST40 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

188 KG01 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

189 KG02 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

190 KG03 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

191 KG04 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm

192 KG05 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

193 KG06 đơn, đôi có trung tâm phình 0,5x 1,5- 2 que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông

194 KG07 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

195 KG08 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

196 KG09 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

197 KG10 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

198 KG11 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

199 KG12 0,5x 2-4 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông không biến đổi

200 KG13 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

201 KG14 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

202 KG15 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm

203 KG16 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

204 KG17 đơn, đôi có trung tâm phình 0,5x 1,5- 2 que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông

205 KG18 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

180

206 KG19 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

207 KG20 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

208 KG21 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

209 KG22 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

210 KG23 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

211 KG24 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

212 KG25 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

213 KG26 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm

214 KG27 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

215 KG28 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2

216 KG29 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

217 KG30 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

218 KG31 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

219 KG32 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

220 KG33 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

221 KG34 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

222 KG35 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

223 KG36 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

224 DT01 0,5x 1,5 đơn, đôi trung tâm có que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông không biến đổi không biến đổi không biến đổi

225 DT02 que, hai 0,5x 2-3 đơn, đôi trung tâm không có

181

đầu bầu biến đổi

226 DT03 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2

227 DT04 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

228 DT05 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

229 DT06 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

230 DT07 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

231 DT08 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

232 DT09 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

233 DT10 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

234 DT11 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

235 DT12 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm

236 DT13 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

237 DT14 đơn, đôi có trung tâm phình 0,5x 1,5- 2 que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông

238 DT15 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

239 DT16 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

240 DT17 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

241 DT18 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

242 DT19 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

243 DT20 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

244 DT21 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2 không biến đổi

182

245 DT22 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

246 DT23 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm

247 DT24 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi

248 DT25 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2

249 DT26 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

250 DT27 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

251 DT28 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

252 DT29 1x 2-2,5 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông không biến đổi

253 DT30 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

254 DT31 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

255 DT32 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

256 DT33 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

257 DT34 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm

258 DT35 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

259 DT36 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2

260 DT37 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

261 DT38 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

262 DT39 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

263 DT40 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

183

264 HG01 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1- 1,5x 3- 3,5 không biến đổi

265 HG02 1,0 x 2-3 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông

266 HG03 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

267 HG04 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-0,8 x 1-2 không biến đổi

268 HG05 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1 x 2- 2,5 không biến đổi

269 HG06 0,5 x 1-2 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu vuông

270 HG07 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 2- 2,5 không biến đổi

271 HG08 0,5x 2-4 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông không biến đổi

272 HG09 đơn, đôi có trung tâm 0,5x 1,5- 2

273 HG10 0,5x 2,5 đơn, đôi trung tâm có

274 HG11 0,5x 2,5 đơn, đôi trung tâm có

275 HG12 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

đơn, đôi có trung tâm phình 276 HG13 que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2

đơn, đôi có trung tâm 277 HG14 que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

đơn, đôi có một đầu 278 HG15 0,5-1x 2- 2,5

279 HG16 0,5x 2,5 đơn, đôi có trung tâm

280 HG17 đơn, đôi có một đầu 0,5-1 x 2- 2,5

281 HG18 0,5x 2-3 đơn, đôi có trung tâm

282 HG19 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông que, hai đầu bầu que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2 không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi không biến đổi

184

283 HG20 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5x 1,5- 2 không biến đổi

284 HG21 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

285 HG22 0,5x 1,5 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông không biến đổi

286 HG23 đơn, đôi có một đầu que, hai đầu vuông 0,5-1x 2- 3 không biến đổi

287 HG24 có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 3,5-4 đơn, đôi, chuỗi không biến đổi

288 HG25 1,0 x 2-3 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông

289 HG26 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5 không biến đổi

290 HG27 0,5 x 3-4 vơn, đôi có trung tâm que, hai đầu vuông không biến đổi

291 HG28 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông 0,5 x 2- 2,5

292 HG29 đơn, đôi có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 3,5-4 không biến đổi

293 HG30 đơn, đôi có que, hai đầu bầu 0,5-1 x 2- 2,5 trung tâm/ một đầu không biến đổi

294 HG31 đơn, đôi có một đầu phình que, hai đầu bầu 0,5 x 3- 3,5

295 HG32 có trung tâm que, hai đầu bầu 1-1,5 x 3,5-4 đơn, đôi, chuỗi không biến đổi

296 HG33 1,0 x 2-3 đơn, đôi có trung tâm phình que, hai đầu vuông

185

3 .Kết quả đo OD 23 mẫu DNA ly trích đƣợc

Mẫu DNA

260nm

260nm/280nm

CT11 AG07 AG17 AG19 AG27 AG49 AG60 ST06 ST08 ST10 VL05 VL16 VL28 VL41 KG09 KG12 KG22 KG29 KG36 DT11 DT26 DT29 DT30

0,9096 1,3370 1,3078 0,9356 0,9970 0,6833 1,2056 0,9823 1,0651 0,7347 0,8167 1,2651 0,7347 0,9167 1,1671 0,9431 0,8198 1,2914 0,9234 1,4256 0,8926 0,9891 1,2345

Nồng độ DNA (μg/mL) 254,80 368,50 287,56 221,13 225,78 255,78 305,12 300,18 225,58 309,22 301,22 215,44 233,65 212,89 203,47 200,10 301,12 325,25 356,45 245,54 265,01 230,21 201,11

1,8007 1,8477 1,8036 1,8324 1,9849 1,9057 1,8786 1,8234 1,9021 1,8161 1,8203 1,9650 1,9231 1,8210 1,8213 1,8346 1,9123 1,9291 1,8132 1,8510 1,8001 1,8306 1,9304

186

4. Kết quả giải trình tự 23 chủng vi khuẩn

1.DT11

2.DT26

187

3.DT29

4.KG09

188

5.KG12

6.KG29

189

7.DT30

8.KG36

190

9.ST06

10.ST08

191

11.ST10

12.VL05

192

13.VL16

14.VL41

193

15.AG07

16.CT11

194

17.AG19

18.KG22

195

19.AG49

20.AG60

196

21.AG17

22.AG27

197

23.VL28

198

5. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng B. subtilis chọn lọc

STT Chủng ENR5 GEN DOX30 NOR10 OT30 SXT COL E15 NEO

ĐC1 35±1 18±1 37±1 30±0,5 32±1 30±0,5 25±1 18±0,5 0 1

ĐC2 31±0 17±0.5 26±0.5 27±1 15±0 25±0.5 24±0.5 16±0 0 2

CT11 30±1 20±0.5 30±0 29±1 30±0 26±0.5 25±1 11±0.5 0 3

4 AG07 28±0 18±0.5 24±0.5 24±1 11±1 20±0 20±1 18±0.5 0

5 AG17 29±0 17±0.5 24±0.5 24±0 7±1 27±0.5 24±0.5 16±0.5 0

6 AG19 28±0.5 20±0 23±0.5 24±1 10±1 26±0 20±1 22±0.5 0

7 AG27 30±0 20±0.5 26±1 27±0 16±0.5 25±0.5 24±1 20±0 0

8 AG49 30±0.5 18±0 28±1 27±0.5 28±0.5 30±1 24±0.5 12±1 0

9 AG60 27±0 22±1 25±1 26±1 20±0.5 21±0.5 24±0.5 16±1 0

10 VL05 30±0.5 20±0.5 27±1 23±0.5 18±0.5 24±0 23±1 20±0 0

11 VL16 20±0 16±1 26±1 25±0.5 28±1 32±0.5 24±1 12±0.5 0

12 VL28 30±1 20±0.5 27±1 29±1 20±0.5 23±0 17±0.5 30±0.5 17±0.5

13 VL41 30±0.5 17±0.5 21±0 30±1 17±1 28±1 25±1 18±0.5 0

ST06 29±0.5 19±0 27±1 26±0.5 25±1 28±0.5 22±1 18±0.5 0 14

ST08 30±1 16±0.5 25±1 27±0.5 16±0.5 24±1 24±0.5 13±0.5 0 15

ST10 31±0.5 12±0.5 24±0 26±1 13±1 24±0.5 21±1 13±0.5 0 16

17 DT29 25±0.5 15±0.5 25±1 24±0 16±0.5 22±0.5 22±0.5 15±0 0

18 DT30 24±0.5 13±0.5 25±0.5 24±1 16±0.5 23±0.5 23±1 15±0.5 0

19 KG09 23±0.5 15±1 28±0.5 25±0.5 16±1 25±0.5 26±1 16±0.5 0

20 KG12 26±1 16±0.5 27±0.5 24±0.5 17±0.5 24±0.5 25±0.5 18±0.5 0

21 KG22 29±0.5 19±0 29±1 26±0.5 30±0.5 30±1 25±0.5 13±0.5 0

22 KG29 23±0.5 12±1 24±0.5 26±1 13±0.5 26±0.5 21±0.5 15±0 0

23 KG36 22±1 13±0.5 27±0.5 24±0 12±0.5 28±0.5 23±0.5 16±0.5 0

199

PHỤ LỤC D.

THỐNG KÊ

Đối kháng bằng phƣơng pháp kẻ vạch vuông góc

1.

General Linear Model: Ecoli, salmonella, staphylo, strepto versus NT Factor Type Levels Values NT fixed 12 AG27, AG60, ĐC 1, ĐC 2, DT29, KG09, KG12, KG22, KG36, VL05, VL28, VL41 Analysis of Variance for Ecoli, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P NT 11 344.803 344.803 31.346 310.01 0.000 Error 24 2.427 2.427 0.101 Total 35 347.230 Analysis of Variance for salmonella, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P NT 11 576.412 576.412 52.401 231.75 0.000 Error 24 5.427 5.427 0.226 Total 35 581.839 S = 0.475511 R-Sq = 99.07% R-Sq(adj) = 98.64% Analysis of Variance for staphylo, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P NT 11 260.750 260.750 23.705 100.16 0.000 Error 24 5.680 5.680 0.237 Total 35 266.430 S = 0.486484 R-Sq = 97.87% R-Sq(adj) = 96.89% Analysis of Variance for strepto, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P NT 11 606.650 606.650 55.150 659.60 0.000 Error 24 2.007 2.007 0.084 Total 35 608.656 S = 0.289156 R-Sq = 99.67% R-Sq(adj) = 99.52% Least Squares Means

------Ecoli----- ---salmonella--- ----staphylo---- -----strepto---- NT Mean SE Mean Mean SE Mean Mean SE Mean Mean SE Mean AG27 8.0000 0.1836 12.0000 0.2745 10.0000 0.2809 10.0000 0.1669 AG60 6.0000 0.1836 6.0000 0.2745 7.0000 0.2809 4.0000 0.1669 ĐC 1 5.4667 0.1836 6.2667 0.2745 7.0000 0.2809 -0.0000 0.1669 ĐC 2 6.1000 0.1836 0.0000 0.2745 7.0000 0.2809 6.2333 0.1669 DT29 0.0000 0.1836 0.0000 0.2745 8.0000 0.2809 0.0000 0.1669 KG09 6.0000 0.1836 10.0000 0.2745 0.0000 0.2809 0.0000 0.1669 KG12 0.0000 0.1836 9.0000 0.2745 10.0000 0.2809 4.0000 0.1669 KG22 4.0000 0.1836 6.0000 0.2745 6.0000 0.2809 0.0000 0.1669 KG36 0.0000 0.1836 9.0000 0.2745 6.0000 0.2809 0.0000 0.1669 VL05 6.0000 0.1836 10.0000 0.2745 8.0000 0.2809 6.0000 0.1669 VL28 10.0000 0.1836 13.0000 0.2745 10.0000 0.2809 12.0000 0.1669 VL41 6.0000 0.1836 10.0000 0.2745 10.0000 0.2809 0.0000 0.1669

200

Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for Ecoli NT N Mean Grouping VL28 3 10.0000 A AG27 3 8.0000 B ĐC 2 3 6.1000 C KG09 3 6.0000 C AG60 3 6.0000 C VL41 3 6.0000 C VL05 3 6.0000 C ĐC 1 3 5.4667 C KG22 3 4.0000 D KG12 3 0.0000 E KG36 3 0.0000 E DT29 3 0.0000 E Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for salmonella NT N Mean Grouping VL28 3 13.0000 A AG27 3 12.0000 A KG09 3 10.0000 B VL05 3 10.0000 B VL41 3 10.0000 B KG36 3 9.0000 B KG12 3 9.0000 B ĐC 1 3 6.2667 C KG22 3 6.0000 C AG60 3 6.0000 C ĐC 2 3 0.0000 D DT29 3 0.0000 D Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for staphylo NT N Mean Grouping AG27 3 10.0000 A VL41 3 10.0000 A VL28 3 10.0000 A KG12 3 10.0000 A DT29 3 8.0000 B VL05 3 8.0000 B ĐC 2 3 7.0000 B C ĐC 1 3 7.0000 B C AG60 3 7.0000 B C KG22 3 6.0000 C KG36 3 6.0000 C KG09 3 0.0000 D Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for strepto NT N Mean Grouping VL28 3 12.0000 A AG27 3 10.0000 B ĐC 2 3 6.2333 C VL05 3 6.0000 C AG60 3 4.0000 D

201

KG12 3 4.0000 D KG22 3 0.0000 E KG09 3 0.0000 E KG36 3 0.0000 E DT29 3 0.0000 E ĐC 1 3 0.0000 E VL41 3 0.0000 E Means that do not share a letter are significantly different.

Khả năng bám dính

2.

General Linear Model: 0 giờ, 5 giờ versus AG27- E.coli và VL28 – E.coli Factor Type Levels Values cặp VK đối kháng fixed 4 AG 27- E.coli, ĐC 2-E.coli, ĐC1-E.coli, VL 28 - E.coli Analysis of Variance for 0 giờ, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P cặp VK đối kháng 3 0.069475 0.069475 0.023158 196.10 0.000 Error 8 0.000945 0.000945 0.000118 Total 11 0.070420 Analysis of Variance for 5 giờ, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P cặp VK đối kháng 3 0.30620 0.30620 0.10207 52.05 0.000 Error 8 0.01569 0.01569 0.00196 Total 11 0.32188 Least Squares Means ------0 giờ------ ------5 giờ------ cặp VK đối k Mean SE Mean Mean SE Mean AG 27- E.coli 0.04765 0.006274 0.19332 0.025566 ĐC 2-E.coli 0.10147 0.006274 0.41348 0.025566 ĐC1-E.coli 0.08605 0.006274 0.26307 0.025566 VL 28 - E.coli 0.24818 0.006274 0.60984 0.025566 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for 0 giờ cặp VK đối kháng N Mean Grouping VL 28 - E.coli 3 0.24818 A ĐC 2-E.coli 3 0.10147 B ĐC1-E.coli 3 0.08605 B AG 27- E.coli 3 0.04765 C Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for 5 giờ cặp VK đối kháng N Mean Grouping VL 28 - E.coli 3 0.60984 A ĐC 2-E.coli 3 0.41348 B ĐC1-E.coli 3 0.26307 C AG 27- E.coli 3 0.19332 C Means that do not share a letter are significantly different.

202

General Linear Model: 0 giờ, 5 giờ versus AG27- Salmonellai và VL28 – Salmonella Factor Type Levels Values cặp VK đối kháng fixed 4 AG 27- Salmonella, ĐC 2-Salmonella, ĐC1-Salmonella, VL 28 - Salmonella Analysis of Variance for 0 giờ, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P cặp VK đối kháng 3 0.0292266 0.0292266 0.0097422 17.22 0.001 Error 8 0.0045259 0.0045259 0.0005657 Total 11 0.0337525 Analysis of Variance for 5 giờ, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P cặp VK đối kháng 3 0.156050 0.156050 0.052017 116.75 0.000 Error 8 0.003564 0.003564 0.000446 Total 11 0.159614 -----0 giờ----- -----5 giờ----- cặp VK đối k Mean SE Mean Mean SE Mean AG 27- Salmonella 0.1615 0.01373 0.3640 0.01219 ĐC 2-Salmonella 0.1262 0.01373 0.4614 0.01219 ĐC1-Salmonella 0.2575 0.01373 0.5951 0.01219 VL 28 - Salmonella 0.2079 0.01373 0.6564 0.01219 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for 0 giờ cặp VK đối kháng N Mean Grouping ĐC1-Salmonella 3 0.2575 A VL 28 - Salmonella 3 0.2079 A B AG 27- Salmonella 3 0.1615 B C ĐC 2-Salmonella 3 0.1262 C Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for 5 giờ cặp VK đối kháng N Mean Grouping VL 28 - Salmonella 3 0.6564 A ĐC1-Salmonella 3 0.5951 B ĐC 2-Salmonella 3 0.4614 C AG 27- Salmonella 3 0.3640 D Means that do not share a letter are significantly different.

Khả năng sống của vi khuẩn trong môi trƣờng acid và muối mật

3. General Linear Model: 0 phút, 10 phút, ... versus NT pH2

Factor Type Levels Values NT fixed 6 AG27-pH2, AG60-pH2, ĐC1pH2, ĐC2-pH2, VL05-pH2, VL28- pH2 Analysis of Variance for 0 phút, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P NT 5 146.576 146.576 29.315 13061.18 0.000 Error 12 0.027 0.027 0.002 Total 17 146.602 Analysis of Variance for 10 phút, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P NT 5 144.346 144.346 28.869 33310.65 0.000 Error 12 0.010 0.010 0.001 Total 17 144.357

203

Analysis of Variance for 30 phút, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P NT 5 140.772 140.772 28.154 7725.27 0.000 Error 12 0.044 0.044 0.004 Total 17 140.815 S = 0.0603692 R-Sq = 99.97% R-Sq(adj) = 99.96% Analysis of Variance for 60 phút, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P NT 5 134.326 134.326 26.865 2317.08 0.000 Error 12 0.139 0.139 0.012 Total 17 134.465 Analysis of Variance for 90 phút, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P NT 5 129.006 129.006 25.801 6159.43 0.000 Error 12 0.050 0.050 0.004 Total 17 129.056 Least Squares Means ------0 phút----- -----10 phút----- -----30 phút----- -60 phút NT Mean SE Mean Mean SE Mean Mean SE Mean Mean AG27-pH2 5.43000 0.02735 5.39333 0.01700 5.30667 0.03485 5.20667 AG60-pH2 0.00000 0.02735 0.00000 0.01700 0.00000 0.03485 0.00000 ĐC1pH2 0.00000 0.02735 0.00000 0.01700 0.00000 0.03485 0.00000 ĐC2-pH2 4.76333 0.02735 4.68667 0.01700 4.57667 0.03485 4.24000 VL05-pH2 0.00000 0.02735 0.00000 0.01700 0.00000 0.03485 0.00000 VL28-pH2 6.61667 0.02735 6.58333 0.01700 6.54000 0.03485 6.47667 -----90 phút----- NT SE Mean Mean SE Mean AG27-pH2 0.06217 5.18667 0.03737 AG60-pH2 0.06217 0.00000 0.03737 ĐC1pH2 0.06217 0.00000 0.03737 ĐC2-pH2 0.06217 3.67000 0.03737 VL05-pH2 0.06217 0.00000 0.03737 VL28-pH2 0.06217 6.46000 0.03737 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for 0 phút NT N Mean Grouping VL28-pH2 3 6.61667 A AG27-pH2 3 5.43000 B ĐC2-pH2 3 4.76333 C ĐC1pH2 3 0.00000 D VL05-pH2 3 0.00000 D AG60-pH2 3 -0.00000 D Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for 10 phút NT N Mean Grouping VL28-pH2 3 6.58333 A AG27-pH2 3 5.39333 B ĐC2-pH2 3 4.68667 C VL05-pH2 3 0.00000 D ĐC1pH2 3 0.00000 D AG60-pH2 3 0.00000 D Means that do not share a letter are significantly different.

204

Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for 30 phút NT N Mean Grouping VL28-pH2 3 6.54000 A AG27-pH2 3 5.30667 B ĐC2-pH2 3 4.57667 C ĐC1pH2 3 0.00000 D VL05-pH2 3 0.00000 D AG60-pH2 3 0.00000 D Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for 60 phút NT N Mean Grouping VL28-pH2 3 6.47667 A AG27-pH2 3 5.20667 B ĐC2-pH2 3 4.24000 C ĐC1pH2 3 0.00000 D VL05-pH2 3 0.00000 D AG60-pH2 3 0.00000 D Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence for 90 phút NT N Mean Grouping VL28-pH2 3 6.46000 A AG27-pH2 3 5.18667 B ĐC2-pH2 3 3.67000 C ĐC1pH2 3 0.00000 D VL05-pH2 3 0.00000 D AG60-pH2 3 0.00000 D Means that do not share a letter are significantly different.

4.

Thí nghiệm 1:

General Linear Model: Trong luong dau ky versus NT Factor Type Levels Values NT fixed 4 NT1, NT2, NT3, NTĐC Analysis of Variance for Trong luong dau ky, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P NT 3 0.03483 0.03483 0.01161 0.42 0.746 Error 8 0.22269 0.22269 0.02784 Total 11 0.25752 Least Squares Means for Trong luong dau ky NT Mean SE Mean NT1 69.43 0.09633 NT2 69.55 0.09633 NT3 69.57 0.09633 NTĐC 69.50 0.09633 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence NT N Mean Grouping NT3 3 69.57 A NT2 3 69.55 A NTĐC 3 69.50 A NT1 3 69.43 A Means that do not share a letter are significantly different.

205

General Linear Model: Thức ăn 1-28 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 4 ĐC, NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Thức ăn 0-28 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 3 2614.0 2614.0 871.3 3.29 0.079 Error 8 2118.3 2118.3 264.8 Total 11 4732.3 Least Squares Means for Thức ăn 1-28 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC 695.0 9.395 NT1 653.7 9.395 NT2 671.2 9.395 NT3 669.6 9.395 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC 3 695.0 A NT2 3 671.2 A NT3 3 669.6 A NT1 3 653.7 A Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: Tăng trọng 1-28 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 4 ĐC, NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Tăng trọng 0-28 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 3 4885.2 4885.2 1628.4 416.65 0.000 Error 8 31.3 31.3 3.9 Total 11 4916.4 Least Squares Means for Tăng trọng 1-28 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC 299.7 1.141 NT1 354.2 1.141 NT2 322.8 1.141 NT3 312.2 1.141 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT1 3 354.2 A NT2 3 322.8 B NT3 3 312.2 C ĐC 3 299.7 D Means that do not share a letter are significantly different.

General Linear Model: FCR 1-28 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 4 ĐC, NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for FCR 0-28 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P

206

Nghiệm thức 3 0.34485 0.34485 0.11495 46.13 0.000 Error 8 0.01993 0.01993 0.00249 Total 11 0.36478 Least Squares Means for FCR 1-28 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC 2.319 0.02882 NT1 1.846 0.02882 NT2 2.080 0.02882 NT3 2.145 0.02882 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC 3 2.319 A NT3 3 2.145 B NT2 3 2.080 B NT1 3 1.846 C Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: Thức ăn ăn vào 29-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 4 ĐC, NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Thức ăn ăn vào 29-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 3 92070 92070 30690 8.45 0.007 Error 8 29070 29070 3634 Total 11 121140 Least Squares Means for Thức ăn ăn vào 29-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC 1944 34.80 NT1 1721 34.80 NT2 1776 34.80 NT3 1745 34.80 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC 3 1944 A NT2 3 1776 B NT3 3 1745 B NT1 3 1721 B Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: Tăng trọng 29-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 4 ĐC, NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Tăng trọng 29-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 3 10464.9 10464.9 3488.3 49.56 0.000 Error 8 563.1 563.1 70.4 Total 11 11028.0

207

Least Squares Means for Tăng trọng 29-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC 590.8 4.844 NT1 638.1 4.844 NT2 582.6 4.844 NT3 556.3 4.844 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT1 3 638.1 A ĐC 3 590.8 B NT2 3 582.6 B NT3 3 556.3 C Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: Thức ăn ăn vào 1-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 4 ĐC, NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Thức ăn ăn vào 0-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 3 354416 354416 118139 18.75 0.001 Error 8 50402 50402 6300 Total 11 404819 Least Squares Means for Thức ăn ăn vào 0-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC 2851 45.83 NT1 2370 45.83 NT2 2587 45.83 NT3 2548 45.83 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC 3 2851 A NT2 3 2587 B NT3 3 2548 B C NT1 3 2370 C Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: Tăng trọng 1-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 4 ĐC, NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Tăng trọng 29-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 3 26475.9 26475.9 8825.3 106.95 0.000 Error 8 660.1 660.1 82.5 Total 11 27136.0 Least Squares Means for Tăng trọng 29-56 ngày

208

Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic ở gà khi gây

Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC 892.5 5.245 NT1 992.2 5.245 NT2 900.9 5.245 NT3 868.5 5.245 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT1 3 992.2 A NT2 3 900.9 B ĐC 3 892.5 B NT3 3 868.5 C Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: FCR 1-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 4 ĐC, NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for FCR 0-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 3 1.01600 1.01600 0.33867 38.82 0.000 Error 8 0.06979 0.06979 0.00872 Total 11 1.08579 Least Squares Means for FCR 1-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC 3.194 0.05392 NT1 2.389 0.05392 NT2 2.871 0.05392 NT3 2.935 0.05392 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC 3 3.194 A NT3 3 2.935 B NT2 3 2.871 B NT1 3 2.389 C Means that do not share a letter are significantly different. 5. nhiễm với S. enterica so với kháng sinh General Linear Model: Trọng lượng đầu kỳ versus Nghiệm thức

Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Trọng lượng đầu kỳ, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 4.6760 4.6760 1.1690 2.41 0.118 Error 10 4.8428 4.8428 0.4843 Total 14 9.5188 Least Squares Means for Trọng lượng đầu kỳ

209

Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 67.69 0.4018 ĐC (+) 68.32 0.4018 NT1 68.71 0.4018 NT2 69.40 0.4018 NT3 68.42 0.4018 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT2 3 69.40 A NT1 3 68.71 A NT3 3 68.42 A ĐC (+) 3 68.32 A ĐC (-) 3 67.69 A Means that do not share a letter are significantly different.

General Linear Model: Tăng trọng 1-14 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Tăng trọng 0-14 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 53.829 53.829 13.457 15.09 0.000 Error 10 8.918 8.918 0.892 Total 14 62.746 Least Squares Means for Tăng trọng 1-14 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 125.4 0.5452 ĐC (+) 124.7 0.5452 NT1 129.7 0.5452 NT2 125.1 0.5452 NT3 127.5 0.5452 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT1 3 129.7 A NT3 3 127.5 A B ĐC (-) 3 125.4 B C NT2 3 125.1 B C ĐC (+) 3 124.7 C Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: Thức ăn 1-14 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Thức ăn 0-14 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 305.500 305.500 76.375 7.99 0.004 Error 10 95.618 95.618 9.562 Total 14 401.117 Least Squares Means for Thức ăn 1-14 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 248.9 1.785 ĐC (+) 247.2 1.785 NT1 248.9 1.785 NT2 255.7 1.785 NT3 258.7 1.785 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence

210

Nghiệm thức N Mean Grouping NT3 3 258.7 A NT2 3 255.7 A B NT1 3 248.9 B C ĐC (-) 3 248.9 B C ĐC (+) 3 247.2 C Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: FCR 1-14 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for FCR 0-14 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 0.0240589 0.0240589 0.0060147 15.74 0.000 Error 10 0.0038209 0.0038209 0.0003821 Total 14 0.0278798 Least Squares Means for FCR 1-14 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 1.985 0.01129 ĐC (+) 1.982 0.01129 NT1 1.919 0.01129 NT2 2.027 0.01129 NT3 2.029 0.01129 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT3 3 2.029 A NT2 3 2.027 A ĐC (-) 3 1.985 A ĐC (+) 3 1.982 A NT1 3 1.919 B Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: % số chết 1-14 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for % số chết 7-21 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 11.616 11.616 2.904 1.00 0.452 Error 10 29.040 29.040 2.904 Total 14 40.656 Least Squares Means for % số chết 7-21 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 2.200 0.9839 ĐC (+) 2.200 0.9839 NT1 2.200 0.9839 NT2 3.300 0.9839 NT3 4.400 0.9839 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT3 3 4.400 A NT2 3 3.300 A ĐC (+) 3 2.200 A ĐC (-) 3 2.200 A NT1 3 2.200 A Means that do not share a letter are significantly different.

211

General Linear Model: Tăng trọng 15-28 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Tăng trọng 15-28 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 33378.7 33378.7 8344.7 127.94 0.000 Error 10 652.2 652.2 65.2 Total 14 34030.9 Least Squares Means for Tăng trọng 15-28 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 226.0 4.663 ĐC (+) 122.2 4.663 NT1 252.8 4.663 NT2 234.4 4.663 NT3 239.2 4.663 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT1 3 252.8 A NT3 3 239.2 A B NT2 3 234.4 A B ĐC (-) 3 226.0 B ĐC (+) 3 122.2 C Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: Thuc an 15-28 ngay versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Thuc an 15-28 ngay, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 36757.2 36757.2 9189.3 38.86 0.000 Error 10 2365.0 2365.0 236.5 Total 14 39122.2 Least Squares Means for Thuc an 15-28 ngay Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 508.0 8.879 ĐC (+) 450.7 8.879 NT1 548.2 8.879 NT2 572.2 8.879 NT3 588.6 8.879 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT3 3 588.6 A NT2 3 572.2 A NT1 3 548.2 A B ĐC (-) 3 508.0 B ĐC (+) 3 450.7 C Means that do not share a letter are significantly different.

212

General Linear Model: FCR 15-28 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for FCR 15-28 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 4.6289 4.6289 1.1572 112.43 0.000 Error 10 0.1029 0.1029 0.0103 Total 14 4.7319 Least Squares Means for FCR 15-28 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 2.248 0.05858 ĐC (+) 3.691 0.05858 NT1 2.169 0.05858 NT2 2.444 0.05858 NT3 2.463 0.05858 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC (+) 3 3.691 A NT3 3 2.463 B NT2 3 2.444 B ĐC (-) 3 2.248 B C NT1 3 2.169 C Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: Tỉ lệ chết 29-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Tỉ lệ chết 29-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 721.04 721.04 180.26 14.96 0.000 Error 10 120.51 120.51 12.05 Total 14 841.55 Least Squares Means for Tỉ lệ chết 29-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 2.299 2.004 ĐC (+) 20.370 2.004 NT1 1.110 2.004 NT2 4.806 2.004 NT3 7.418 2.004 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC (+) 3 20.370 A NT3 3 7.418 B NT2 3 4.806 B ĐC (-) 3 2.299 B NT1 3 1.110 B Means that do not share a letter are significantly different.

213

General Linear Model: tăng trọng 29-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for tăng trọng 29-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 105627 105627 26407 346.76 0.000 Error 10 762 762 76 Total 14 106388 Least Squares Means for tăng trọng 29-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 518.2 5.038 ĐC (+) 307.5 5.038 NT1 542.3 5.038 NT2 493.5 5.038 NT3 496.8 5.038 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT1 3 542.3 A ĐC (-) 3 518.2 B NT3 3 496.8 B C NT2 3 493.5 C ĐC (+) 3 307.5 D Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: thức ăn 29-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for thức ăn 29-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 527211 527211 131803 56.13 0.000 Error 10 23481 23481 2348 Total 14 550692 Least Squares Means for thức ăn 29-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 1738 27.98 ĐC (+) 1480 27.98 NT1 1877 27.98 NT2 1956 27.98 NT3 1999 27.98 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT3 3 1999 A NT2 3 1956 A NT1 3 1877 A ĐC (-) 3 1738 B ĐC (+) 3 1480 C Means that do not share a letter are significantly different.

214

General Linear Model: FCR 29-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for FCR 29-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 4.0071 4.0071 1.0018 103.24 0.000 Error 10 0.0970 0.0970 0.0097 Total 14 4.1041 Least Squares Means for FCR 29-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 3.354 0.05687 ĐC (+) 4.811 0.05687 NT1 3.462 0.05687 NT2 3.965 0.05687 NT3 4.023 0.05687 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC (+) 3 4.811 A NT3 3 4.023 B NT2 3 3.965 B NT1 3 3.462 C ĐC (-) 3 3.354 C Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: tang trong 1-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for tang trong 0-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 260185 260185 65046 2552.44 0.000 Error 10 255 255 25 Total 14 260440 Least Squares Means for tang trong 0-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 869.7 2.915 ĐC (+) 554.4 2.915 NT1 924.8 2.915 NT2 852.9 2.915 NT3 863.5 2.915 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT1 3 924.8 A ĐC (-) 3 869.7 B NT3 3 863.5 B C NT2 3 852.9 C ĐC (+) 3 554.4 D Means that do not share a letter are significantly different.

215

General Linear Model: Thuc an 1-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Thuc an 0-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 960410 960410 240102 614.41 0.000 Error 10 3908 3908 391 Total 14 964317 Least Squares Means for Thuc an 0-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 2495 11.41 ĐC (+) 2101 11.41 NT1 2674 11.41 NT2 2757 11.41 NT3 2792 11.41 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT3 3 2792 A NT2 3 2757 A NT1 3 2674 B ĐC (-) 3 2495 C ĐC (+) 3 2101 D Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: FCR 1-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for FCR 0-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 1.66602 1.66602 0.41651 643.16 0.000 Error 10 0.00648 0.00648 0.00065 Total 14 1.67250 Least Squares Means for FCR 0-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 2.869 0.01469 ĐC (+) 3.790 0.01469 NT1 2.892 0.01469 NT2 3.232 0.01469 NT3 3.234 0.01469 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC (+) 3 3.790 A NT3 3 3.234 B NT2 3 3.232 B NT1 3 2.892 C ĐC (-) 3 2.869 C Means that do not share a letter are significantly different.

216

Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic ở gà khi gây

6. nhiễm với E.coli so với kháng sinh General Linear Model: tỉ lệ chết 1-14 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for tỉ lệ chết 0-14 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 4.436 4.436 1.109 0.50 0.737 Error 10 22.178 22.178 2.218 Total 14 26.613 Least Squares Means for tỉ lệ chết 0-14 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 2.220 0.8598 ĐC (+) 2.220 0.8598 NT1 2.220 0.8598 NT2 3.330 0.8598 NT3 3.330 0.8598 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT3 3 3.330 A NT2 3 3.330 A ĐC (+) 3 2.220 A ĐC (-) 3 2.220 A NT1 3 2.220 A Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: Thức ăn 1-14 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Thuc an 0-14 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 178.70 178.70 44.67 3.71 0.042 Error 10 120.32 120.32 12.03 Total 14 299.02 Least Squares Means for Thuc an 0-14 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 246.6 2.003 ĐC (+) 247.1 2.003 NT1 246.6 2.003 NT2 255.2 2.003 NT3 251.7 2.003 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT2 3 255.2 A NT3 3 251.7 A ĐC (+) 3 247.1 A NT1 3 246.6 A ĐC (-) 3 246.6 A Means that do not share a letter are significantly different.

217

General Linear Model: Tang trong 1-14 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Tang trong 0-14 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 87.950 87.950 21.987 26.42 0.000 Error 10 8.323 8.323 0.832 Total 14 96.272 Least Squares Means for Tang trong 0-14 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 124.2 0.5267 ĐC (+) 123.5 0.5267 NT1 130.3 0.5267 NT2 126.2 0.5267 NT3 124.8 0.5267 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT1 3 130.3 A NT2 3 126.2 B NT3 3 124.8 B C ĐC (-) 3 124.2 B C ĐC (+) 3 123.5 C Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: FCR 1-14 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for FCR 0-14 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 0.033609 0.033609 0.008402 8.26 0.003 Error 10 0.010176 0.010176 0.001018 Total 14 0.043785 Least Squares Means for FCR 0-14 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 1.986 0.01842 ĐC (+) 2.001 0.01842 NT1 1.893 0.01842 NT2 2.022 0.01842 NT3 2.017 0.01842 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT2 3 2.022 A NT3 3 2.017 A ĐC (+) 3 2.001 A ĐC (-) 3 1.986 A NT1 3 1.893 B Means that do not share a letter are significantly different.

218

General Linear Model: FCR 15-28 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for FCR 15-28 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 7.5204 7.5204 1.8801 458.07 0.000 Error 10 0.0410 0.0410 0.0041 Total 14 7.5614 Least Squares Means for FCR 15-28 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 2.191 0.03699 ĐC (+) 4.011 0.03699 NT1 2.235 0.03699 NT2 2.249 0.03699 NT3 2.297 0.03699 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC (+) 3 4.011 A NT3 3 2.297 B NT2 3 2.249 B NT1 3 2.235 B ĐC (-) 3 2.191 B Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: tăng trọng 15-28 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for tăng trọng 15-28 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 36368.8 36368.8 9092.2 165.61 0.000 Error 10 549.0 549.0 54.9 Total 14 36917.8 Least Squares Means for tăng trọng 15-28 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 238.2 4.278 ĐC (+) 119.1 4.278 NT1 246.9 4.278 NT2 242.2 4.278 NT3 240.6 4.278 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT1 3 246.9 A NT2 3 242.2 A NT3 3 240.6 A ĐC (-) 3 238.2 A ĐC (+) 3 119.1 B Means that do not share a letter are significantly different.

219

General Linear Model: Thức ăn 15-28 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Thức ăn 15-28 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 12034.7 12034.7 3008.7 7.78 0.004 Error 10 3866.5 3866.5 386.6 Total 14 15901.2 Least Squares Means for Thức ăn 15-28 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 521.8 11.35 ĐC (+) 477.5 11.35 NT1 551.9 11.35 NT2 544.4 11.35 NT3 552.5 11.35 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT3 3 552.5 A NT1 3 551.9 A NT2 3 544.4 A ĐC (-) 3 521.8 A B ĐC (+) 3 477.5 B Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: tỉ lệ chết 15-28 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for tỉ lệ chết 15-28 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 2290.77 2290.77 572.69 50.12 0.000 Error 10 114.26 114.26 11.43 Total 14 2405.03 Least Squares Means for tỉ lệ chết 15-28 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 1.111 1.952 ĐC (+) 35.249 1.952 NT1 4.559 1.952 NT2 5.747 1.952 NT3 8.046 1.952 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC (+) 3 35.249 A NT3 3 8.046 B NT2 3 5.747 B NT1 3 4.559 B ĐC (-) 3 1.111 B Means that do not share a letter are significantly different.

220

General Linear Model: tỉ lệ chết 29-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for tỉ lệ chết 29-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 59.96 59.96 14.99 1.24 0.356 Error 10 121.30 121.30 12.13 Total 14 181.26 Least Squares Means for tỉ lệ chết 29-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 4.483 2.011 ĐC (+) 6.576 2.011 NT1 1.149 2.011 NT2 6.041 2.011 NT3 6.180 2.011 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC (+) 3 6.576 A NT3 3 6.180 A NT2 3 6.041 A ĐC (-) 3 4.483 A NT1 3 1.149 A Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: tăng trọng 29-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for tăng trọng 29-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 130433 130433 32608 466.64 0.000 Error 10 699 699 70 Total 14 131132 Least Squares Means for tăng trọng 29-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 480.8 4.826 ĐC (+) 283.3 4.826 NT1 545.6 4.826 NT2 513.1 4.826 NT3 502.7 4.826 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT1 3 545.6 A NT2 3 513.1 B NT3 3 502.7 B C ĐC (-) 3 480.8 C ĐC (+) 3 283.3 D Means that do not share a letter are significantly different.

221

General Linear Model: Thức ăn 29-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Thức ăn 29-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 729505 729505 182376 117.65 0.000 Error 10 15502 15502 1550 Total 14 745006 Least Squares Means for Thức ăn 29-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 1666 22.73 ĐC (+) 1258 22.73 NT1 1791 22.73 NT2 1816 22.73 NT3 1864 22.73 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT3 3 1864 A NT2 3 1816 A NT1 3 1791 A ĐC (-) 3 1666 B ĐC (+) 3 1258 C Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: FCR 29-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for FCR 29-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 2.40420 2.40420 0.60105 165.82 0.000 Error 10 0.03625 0.03625 0.00362 Total 14 2.44045 Least Squares Means for FCR 29-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 3.465 0.03476 ĐC (+) 4.440 0.03476 NT1 3.283 0.03476 NT2 3.539 0.03476 NT3 3.708 0.03476 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC (+) 3 4.440 A NT3 3 3.708 B NT2 3 3.539 C ĐC (-) 3 3.465 C NT1 3 3.283 D Means that do not share a letter are significantly different.

222

General Linear Model: FCR 1-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for FCR 0-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 1.52635 1.52635 0.38159 121.59 0.000 Error 10 0.03138 0.03138 0.00314 Total 14 1.55773 Least Squares Means for FCR 1-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 2.887 0.03234 ĐC (+) 3.690 0.03234 NT1 2.806 0.03234 NT2 2.930 0.03234 NT3 3.033 0.03234 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC (+) 3 3.690 A NT3 3 3.033 B NT2 3 2.930 B C ĐC (-) 3 2.887 B C NT1 3 2.806 C Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: Thuc an 1-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for Thuc an 0-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 928683 928683 232171 166.98 0.000 Error 10 13904 13904 1390 Total 14 942587 Least Squares Means for Thuc an 1-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 2435 21.53 ĐC (+) 1961 21.53 NT1 2589 21.53 NT2 2583 21.53 NT3 2633 21.53 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT3 3 2633 A NT1 3 2589 A NT2 3 2583 A ĐC (-) 3 2435 B ĐC (+) 3 1961 C Means that do not share a letter are significantly different.

223

General Linear Model: tang trong 1-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for tang trong 0-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 308927 308927 77232 1870.33 0.000 Error 10 413 413 41 Total 14 309340 Least Squares Means for tang trong 1-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 843.2 3.710 ĐC (+) 525.9 3.710 NT1 922.7 3.710 NT2 881.5 3.710 NT3 868.0 3.710 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping NT1 3 922.7 A NT2 3 881.5 B NT3 3 868.0 B ĐC (-) 3 843.2 C ĐC (+) 3 525.9 D Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: tỉ lệ chết 1-56 ngày versus Nghiệm thức Factor Type Levels Values Nghiệm thức fixed 5 ĐC (-), ĐC (+), NT1, NT2, NT3 Analysis of Variance for tỉ lệ chết 0-56 ngày, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Nghiệm thức 4 2574.81 2574.81 643.70 86.90 0.000 Error 10 74.07 74.07 7.41 Total 14 2648.89 Least Squares Means for tỉ lệ chết 1-56 ngày Nghiệm thức Mean SE Mean ĐC (-) 5.556 1.571 ĐC (+) 42.222 1.571 NT1 7.778 1.571 NT2 14.444 1.571 NT3 16.667 1.571 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Nghiệm thức N Mean Grouping ĐC (+) 3 42.222 A NT3 3 16.667 B NT2 3 14.444 B C NT1 3 7.778 C D ĐC (-) 3 5.556 D Means that do not share a letter are significantly different.

224