Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chế biến thực phẩm chức năng từ bã đậu nành (Okara) và cám gạo bằng công nghệ vi sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH

Trần Thị Thảo Nguyên

NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN THỰC PHẨM CHỨC

NĂNG TỪ BÃ ĐẬU NÀNH (OKARA) VÀ CÁM

GẠO BẰNG CÔNG NGHỆ VI SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh-2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH

Trần Thị Thảo Nguyên

NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN THỰC PHẨM CHỨC

NĂNG TỪ BÃ ĐẬU NÀNH (OKARA) VÀ CÁM

GẠO BẰNG CÔNG NGHỆ VI SINH

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. LÊ CHIẾN PHƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh-2014

LỜI CẢM ƠN

Có được thành quả như ngày hôm nay, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu

sắc đến:

• Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Chiến Phương đã tận tình hướng dẫn,

truyền đạt kiến thức chuyên môn cũng như những kinh nghiệm quý báu trong

suốt quá trình thực hiện luận văn.

• Ban giám hiệu trường ĐHSP TP.HCM, quý thầy cô bộ môn vi sinh vật

đã giảng dạy, hướng dẫn để tôi có được nền kiến thức như ngày hôm nay.

• Các anh chị em phòng thí nghiệm Biến đổi sinh học - Viện Sinh học

nhiệt đới TP.HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá

trình thực hiện luận văn.

• Các bạn học viên cao học niên khóa 2012-2014 ngành Vi sinh vật đã

giúp đỡ, động viên, đóng góp ý kiến cho tôi trong thời gian thực hiện luận

văn.

• Cuối cùng tôi xin cám ơn ba mẹ và những người thân yêu đã động

viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, tháng 09, năm 2014

Trần Thị Thảo Nguyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và

không trùng lặp với các đề tài khác.

Tác giả luận văn

Trần Thị Thảo Nguyên

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục các sơ đồ

Danh mục các đồ thị

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 4

1.1. Thực phẩm chức năng .......................................................................... 4

1.2. Nguyên liệu sử dụng trong đề tài.......................................................... 4

1.2.1. Bã đậu nành (Okara) ......................................................................... 4

1.2.2. Cám gạo ............................................................................................ 6

1.2.3. Chất xơ và vai trò của chất xơ trong bã đậu nành và cám gạo ......... 7

1.2.4. Những nghiên cứu và ứng dụng của bã đậu nành và cám gạo ......... 9

1.3. Các chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài ........................................... 11

1.3.1. Nấm Linh chi .................................................................................. 11

1.3.2. Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus natto ................................. 16

1.4. Sấy chân không ..................................................................................... 21

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................. 23

2.1. Vật liệu .................................................................................................. 23

2.1.1. Hóa chất .......................................................................................... 23

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ......................................................................... 25

2.1.3. Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng .......................................... 26

2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 26

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật ............................................... 26

2.2.2. Quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm ............................................ 38

2.2.3. Phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm ......................................... 41

2.2.4. Phương pháp định tính một số HCSH của nấm sợi Linh chi ......... 51

2.2.5. Phương pháp định lượng Ba tổng số và bào tử Ba trong sản phẩm

........................................................................................................ .52

2.2.6. Phương pháp kiểm tra vệ sinh an toàn toàn thực phẩm .................. 53

2.2.7. Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm .................................... 54

2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 56

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................... 57

3.1. Kết quả nghiên cứu vi sinh vật.............................................................. 57

3.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa của nấm sợi Linh chi ........................ 57

3.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của Ba, Bn ........................... 58

3.1.3. Kết quả xác định hoạt tính hệ enzyme của vi sinh vật sử dụng trong

đề tài theo thời gian ......................................................................... 62

3.2. Kết quả chế biến sản phẩm ................................................................... 66

3.2.1. Kết quả thủy phân xơ của hỗn hợp bã đậu nành và cám bằng các

enzyme của tơ nấm Linh chi ........................................................... 66

3.2.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein, tinh bột trên cơ chất

bã đậu nành và cám gạo bằng các enzyme của Ba ......................... 67

3.2.3. Kết quả phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm ........................... 71

3.2.4. Kết quả định tính một số HCSH của nấm sợi Linh chi trong sản

phẩm ................................................................................................ 72

3.2.5. Kết quả định lượng Ba tổng số và bào tử Ba trong sản phẩm ........ 74

3.2.6. Hoạt tính enzyme có trong 1g sản phẩm ........................................ 75

3.2.7. Kết quả kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm .................................. 75

3.2.8. Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm ............................................ 75

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 79

PHỤ LỤC ......................................................................................................... 1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ba Bacillus amyloliquefaciens

Bn Bacillus natto Carboxymethyl cellulose CMC

Enzyme carboxymethyl cellulase CMCase

Môi trường cá peptone CP

Số đơn vị khuẩn lạc trong 1ml hoặc 1g mẫu CFU/ml (g)

Acid 2-hydroxy-3,5 dinitrobenzoic DNS

Hoạt chất sinh học HCSH

Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất MPN

Nguyên liệu Đạm ammoniac NNH3

Nformol

Nitơ formol Nitơ tổng số NtsOD

Mật độ quang học SP

Sản phẩm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần bã đậu nành (100g)……………………………………6

Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của cám gạo……………………………...7

Bảng 1.3. Điều kiện cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi…………..13

Bảng 1.4. Thành phần hoạt chất cơ bản và hoạt tính dược lý trong nấm Linh

chi………………………………………………………………..14

Bảng 2.1. Đường glucose chuẩn……………………………………………..33

Bảng 2.2. Đường chuẩn tyrosine…………………………………………….36

Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm định lượng enzyme amylase…………………...38

Bảng 2.4. Chỉ tiêu và giới hạn vi sinh trong ngũ cốc và sản phẩm chế biến từ

ngũ cốc…………………………………………………………..54

Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái vi khuẩn Ba và Bn……………………………59

Bảng 3.2. Kết quả mật độ tế bào theo thời gian……………………………..60

Bảng 3.3. Sự biến thiên hoạt tính CMCase của nấm sợi Linh chi theo thời

gian………………………………………………………………62

Bảng 3.4. Sự biến thiên hoạt tính protease của Ba, Bn theo thời gian………63

Bảng 3.5. Sự biến thiên hoạt tính amylase của Ba, Bn theo thời gian………65

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân xơ…………………………67

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein……………………68

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột……………………69

Bảng 3.9. Kết quả phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm…………………71

Bảng 3.10. Kết quả định lượng Ba tổng số và bào tử Ba trong sản phẩm…..74

Bảng 3.11. Hoạt tính enzyme có trong 1g sản phẩm………………………...75

Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra vệ sinh an toàn toàn thực phẩm……………….75

Bảng 3.13. Kết quả khảo sát…………………………………………………76

Bảng 3.14. Các tham số đặc trưng…………………………………………...76

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Bã đậu nành dạng bột………………………………………. ……..5

Hình 1.2. Cám gạo…………………………………………………………….6

Hình 1.3. Lớp cám trong hạt lúa…………………………….………………...6

Hình 1.4. Cellulose……………………………………………………………8

Hình 1.5. Hemicellulose………………………………………………………9

Hình 1.6. Pectin……………………………………………………………….9

Hình 1.7. Sự thủy phân các polysaccharide…………………………………11

Hình 1.8. Nấm Linh chi……………………………………………………...11

Hình 1.9. Chu trình sống của Linh chi………………………………………12

Hình 1.10. Hình thái Ba ……………………………………………………..17

Hình 1.11. Hình thái Bn ……………………………………………………..17

Hình 1.12.Cấu trúc và bề mặt Bacillus………….…………………………...18

Hình 3.1. Hệ sợi nấm Linh chi trên môi trường thạch………………………57

Hình 3.2. Hình thái sợi nấm Linh chi trên tiêu bản phòng ẩm (100x)………57

Hình 3.3. Khả năng thủy phân cellulose…………………………………….57

Hình 3.4. Khuẩn lạc Ba (trái),Bn (phải)…………………………………….58

Hình 3.5. Tế bào Ba (trái),Bn (phải)………………………………...............58

Hình 3.6. Khả năng thủy phân casein của Ba (trái), của Bn (phải)………….61

Hình 3.7. Khả năng thủy phân fibrin của Ba (trái), của Bn (phải)…………..62

Hình 3.8. Khả năng thủy phân tinh bột của Ba (trái), của Bn (phải)………...62

Hình 3.9. Bịch cơ chất sau 9 ngày nuôi tơ nấm Linh chi……………………66

Hình 3.10. Mặt cắt đôi khối cơ chất sau 9 ngày nuôi tơ nấm Linh chi ……..66

Hình 3.11. Định tính saponin………………………………………………..73

Hình 3.12. Định tính steroid…………………………………………………73

Hình 3.13. Định tính alkaloid………………………………………………..73

Hình 3.14. Định tính triterpenoid……………………………………………74

Hình 3.15. Sản phẩm dạng bột………………………………………………75

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1.Quy trình thu nhận bã đậu nành từ công nghệ sản xuất sữa………5

Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm……………………………………………36

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1. Đường cong sinh trưởng của Ba, Bn trên môi trường sữa đậu nành

......................................................................................................................... 60

Đồ thị 3.2. Sự biến thiên hoạt tính CMCase của nấm sợi Linh chi theo thời

gian .................................................................................................................. 63

Đồ thị 3.3. Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease của Ba, Bn theo thời gian

......................................................................................................................... 64

Đồ thị 3.4. Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase của Ba, Bn theo thời gian

......................................................................................................................... 65

Đồ thị 3.5. Hàm lượng Nformol theo thời gian và tỉ lệ giống Ba sử dụng ......... 68

Đồ thị 3.6. Hàm lượng tinh bột theo thời gian và tỉ lệ giống Ba sử dụng....... 70

Đồ thị 3.7. Kết quả phân phối tần suất ............................................................ 76

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Bã đậunành (okara)và cám gạo là hai nguồn phụ phế phẩm dồi dào của

ngành công nghiệp chế biến sữa đậu nành và xay xát gạo ở nước ta. Trong hai

loại phụphế phẩm này còn chứa rất nhiều thành phần dinh dưỡng,theo Vander

và cộng sự[32], hàm lượng protein trong bã đậu nành chiếm 25,4-25,8%, xơ

thô chiếm 52,8-58,1% cùng một lượng lớn lipid và carbonhydrate. Cám gạo

chiếm 65% chất dinh dưỡng của gạo trong đó 28% là carbohydrate,13,3% là

protein, chất xơ chiếm 21%, lipid 21% và nhiều loại vitamin nhóm B, E [36].

Do hàm lượng xơ cao và thành phần protein, tinh bột trong bã đậu nành

và cám gạo là những thành phần không tan, khó tiêu hóa đặc biệt trong cám

gạo chứa một lượng lớn lipid rất dễ bị oxi hóa gây khó khăn trong việc chế

biến và bảo quản vì vậy, hiện nay chúng vẫn chưa được tận dụng hiệu quả mà

chủ yếu được dùng làm thức ăn cho ngành chăn nuôi.

Với khả năng hoạt động mạnh của enzyme cellulase từ hệ sợi nấm Linh

chi (Ganoderma lucidum) có thể thủy phân cellulose trong bã đậu nành và

cám gạo, cùng enzyme amylase và protease từ Bacillus amyloliquefaciens

(Ba)có thể thủy phân tinh bột và protein có trong nguyên liệu, biến các chất

không tan, khó tiêu hóa thành những chất dễ hấp thu, đồng thời chứa các

enzyme hỗ trợ tiêu hóa (cellulase, amylase, protease), dược chất từhệ sợi nấm

Linh chi và cả sinh khối của Linh chi và vi khuẩn Ba, có thể biến những

nguồn nguyên liệu rẻ tiền thành sản phẩm có thể dùng làm thực phẩm chức

năng góp phần bảo vệ sức khỏe con người, Do đó, việc thực hiện đề tài

“Nghiên cứu chế biến thực phẩm chức năng từ bã đậu nành (okara) và

cám gạo bằng công nghệ vi sinh” là điều hết sức cần thiết và có ý nghĩa thực

tiễn.

2. Mục tiêu

Tạo thực phẩm dạng bột dùng ngay có thể được sử dụng làm thực phẩm

chức năng chứa các enzyme hỗ trợ tiêu hóa: amylase, protease, cùng sinh khối

của Ba; đặc biệt là cellulase cùng các hoạt chất sinh học (HCSH) có dược tính

từ sinh khối tơ nấm Linh chi từ bã đậu nành và cám gạo bằng công nghệ vi

sinh.

3. Nhiệm vụ

- Nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi và sinh khối các vi khuẩn Ba, Bacillus

natto (Bn) trong các môi trường dịch thể và khảo sát hoạt tính các enzyme

cellulase của nấm sợi Linh Chi, amylase và protease của Ba, Bn.

- Khảo sát khả năng thủy phân cellulose của bã đậu nành và cám gạo

thông qua việc nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi trên hai nguyên liệu nói trên.

- Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột và protein của bã đậu nành và

cám bằng việc nuôi vi khuẩn Ba, Bn trên hai nguyên liệu đó.

- Tạo sản phẩm dạng bột.

- Định tính các HCSH của sinh khối tơ nấm Linh chi trong sản phẩm .

- Định lượng các chất trong sản phẩm: cellulose, protein (NTS, NNH3,

NNH2), đường tổng, đường khử.

- Định lượng vi sinh vật.

- Xác định hoạt tính enzyme cellulase, amylase, protease.

- Đánh giá an toàn vệ sinh thực phẩm.

- Đánh giá cảm quan sản phẩm.

4. Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nấm Linh chi, Ba, Bndo phòng thí nghiệm Công nghệ biến

đổi Sinh học – Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM cung cấp.

Bã đậu nành mua tại công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk.

Cám gạo mua loại cám mịn lấy ngay sau khi xay, tại nhà máy xay lúa

Bảy Đạm, Long An.

5. Ý nghĩa của đề tài

Tận dụng được các phụ phế phẩm công nghiệp để chế biến được các loại

sản phẩm có giá trị gia tăng cao, có thể làm thực phẩm chức năng góp phần

bảo vệ sức khỏe con người.

6. Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài

Dự kiến thời gian: từ11/2013 đến tháng 08/2014.

Địa điểm thực hiện đề tài: phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh

học – Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM.

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Thực phẩm chức năng

Một số khái niệm về thực phẩm chức năng[35]:

Cho đến nay chưa có một tổ chức quốc tế nào đưa ra định nghĩa đầy đủ

về thực phẩm chức năng, mặc dù đã có nhiều Hội nghị quốc tế và khu vực về

thực phẩm chức năng. Gần đây các định nghĩa về thực phẩm chức năng được

đưa ra nhiều hơn và có xu hướng gần thống nhất với nhau.

- Hiệp Hội thông tin thực phẩm quốc tế (International Food Information

Council), định nghĩa: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm mang đến những

lợi ích cho sức khỏe vượt xa hơn dinh dưỡng cơ bản”.

- Hiệp Hội nghiên cứu thực phẩm Leatherhead (châu Âu): “Thực phẩm

chức năng là thực phẩm được chế biến từ thức ăn thiên nhiên, được sử dụng

như một phần của chế độ ăn hàng ngày và có khả năng cho một tác dụng sinh

lý nào đó khi được sử dụng”.

- Bộ Y tế Việt Nam: Thông thư số 08/TT-BYT ngày 23/8/2004 về việc

“Hướng dẫn việc quản lý các sản phẩm thực phẩm chức năng” đã đưa ra định

nghĩa: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các

bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng

thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh”.

Khái quát lại có thể đưa ra một định nghĩa như sau: “Thực phẩm chức

năng (TPCN) là thực phẩm (hoặc sản phẩm) dùng để hỗ trợ (phục hồi, duy trì

hoặc tăng cường) chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có tác dụng dinh

dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt

nguy cơ bệnh tật”.

1.2. Nguyên liệu sử dụng trong đề tài

1.2.1. Bã đậu nành (Okara)

1.2.1.1. Giới thiệu về bã đậu nành

Bã đậu nành hay còn được gọi là

okara hoặc soy-pulp (okara đã trở thành

thuật ngữ quốc tếđể gọi bã đậu nành) là

phần bãvà các chất dinh dưỡng khác

không tan trong nước còn lại sau khi đã

tách khỏi dịch các chất tan hoặc huyền

phù trong nước, của công nghiệp sản

xuất sữa đậu nành hay đậu hũ [9].

Hình 1.1. Bã đậu nành dạng bột

Bã đậu nành có màu trắng hay trắng ngà, thường nằm trên mặt lưới lọc

sữa đậu nành, sau sấy khô có màu vàng, chứa một lượng lớn protein (chiếm

khoảng 50% protein tinh chất), carbohydrate, lipid, có cả calci, sắt, riboflavin

[9].

Hạt đậu nành

Ngâm nước nóng đối lưu (5 phút, 85-900C)

Bóc vỏ

Thải bỏ nước

Nghiền

Trích ly

Bã

Dịch sữa

Sấy 15 phút, 150-1700C

Sấy rung

Bã đậu nành

Quy trình thu nhận bã đậu nành từ công nghệ sản xuất sữa đậu nành.

Sơ đồ 1.1. Quy trình thu nhận bã đậu nành từ công nghệ sản xuất sữa

1.2.1.2. Thành phầnbã đậu nành

Ở Việt nam, theo các thông tin của công ty sữa Vinamilk cung cấp cho

Viện Sinh học Nhiệt đới, nơi có công nghệ sản xuất sữa đậu nành tận thu bã

đậu nành hiện đại của nước ngoài thì bã đậu nành có thành phần như sau[19]:

Bã đậu nành dạng bột có hàm ẩm: 6,7%; đạm: 36,43%; xơ: 1,99% và

chất béo: 10,59%.

Tại công ty Tribeco theo quy trình sản xuất sữa đậu nành lọc sữa 1 lần

chỉ thu được khoảng 50% protein của hạt đậu nành. Từ 1kg đậu nành thu

được 1,5kg bã đậu nành ướt (sau ly tâm), chứa khoảng 20% chất khô. Bã ướt

là dạng phế liệu cuối cùng của công nghệ sản xuất sữa đậu nành và mới chỉ

được sử dụng cho chăn nuôi[11].

Theo một số nghiên cứu ngoài nước thành phần bã đậu nành như sau

[32],[33]:

Bảng 1.1. Thành phầnbã đậu nành(100g)

8,37 9,3-10,9

52,8-58,1

2,82

%Protein %Lipid 19,91 25,4-28,4 %Carbohydrate %Xơ thô %Tinh bột 9,53 3,8-5,3

1.2.2. Cám gạo

1.2.2.1. Giới thiệu về cám gạo

Hình 1.2. Cám gạoHình 1.3. Lớp cám trong hạt lúa[36]

Trong qui trình xay xát và chế biến gạo, sau khi thu được sản phẩm

chính là gạo thì còn một sản phẩm phụ chiếm khoảng 65% chất dinh dưỡng

của gạo, có giá trị sử dụng khá cao nhưng giá thành lại rất thấp đó chính là

cám gạo.

Cám gạo là hỗn hợp các lớp vỏ ngoài của hạt gạo và lớp aleurone thường

có dạng bột, mềm và mịn.

Hàng năm trên thế giới có khoảng 40–45 triệu tấn cám gạo được sản

suất, trong đó 90% là nằm ở châu Á[36], [37].

1.2.2.2. Thành phần dinh dưỡng của cám gạo

Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của cám gạo[38].

Thành phần Calori Tổng số lipid Chất béo bão hòa Chất xơ tiêu hóa được Carbohydrate Đường Protein Vitamin E Vitamin B6 Calci Khối lượng/100g 316KJ 21g 4g 21g 28g 0,9g 13,3g 4,9mg 4,1mg 57mg

1.2.3. Chất xơ và vai trò của chất xơ trong bã đậu nành và cám gạo

Chất xơ gồm các phần còn lại của tế bào thực vật, các polysaccharide,

lignin và các chất liên quan chịu được sự thủy phân của các enzyme trong hệ

tiêu hóa người. Tùy theo độ phân tán trong nước mà chất xơ được chia thành

hai loại là tan và không tan. Tất cả các thức ăn có nguồn gốc từ thực vật đều

có cả hai loại chất xơ này.

Trong bã đậu nành hàm lượng xơ không tan chiếm đa số, các xơ tan thì

chiếm với hàm lượng thấp. Chất xơ trong cám gạo có thể từ lớp aleurone,

những lớp vỏ bên ngoài của cám gạo và cũng có thể từ các chất bẩn trên vỏ

gạo (cellulose, lignin và silica)[41].

Xơ không tan:chủ yếu là cellulose, ngoài ra còn có hemicellulose,

lignin, cutin…Chất xơ không hòa tan có đặc tính thẩm thấu nước trong

ruột,trương lên tạo điều kiện cho chất bã thải dễ thoát ra ngoài.

• Cellulose: là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật, được

cấu tạo bởi các β-D glucose-pyranose, các thành phần này liên kết với nhau

bởi liên kết glucose. Cellulose không tan trong nước (cả nước nóng và nước

lạnh), tan trong acid và kiềm. Khi đun sôi với acid sulfuric đậm đặc, cellulose

sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo

nên disaccharide cellobiose.Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng

Hình 1.4. Cellulose[45]

của người vì không tiêu hóa được ở ống tiêu hóa.

• Hemicellulose: là nhóm polysaccharide không tan được trong nước,

chỉ tan được trong dung dịch kiềm. Hemicellulose cũng là thành phần của

thành tế bào thực vật và tồn tại chủ yếu ở các phần như vỏ hạt, bẹ ngô, cám,

rơm rạ, trấu. Khi thủy phân hemicellulose sẽ thu được các monosaccharide

thuộc nhóm hexose (như manose, galactose) và nhóm pentose (như arabinose,

xilose).

Hình 1.5. Hemicellulose[46]

Xơ tan: gồm pectin, β-glucan, galactose, mannan, gum… Chất xơ hòa

tan khi đi qua ruột sẽ tạo ra thể đông làm chậm quá trình hấp thu một số chất

dinh dưỡng vào máu, và cũng làm tăng độ xốp, mềm của bã thải tiêu hóa.

• Pectin: là polysaccharide có nhiều ở quả, củ hoặc thân cây. Trong

thực vật, pectin tồn tại dưới hai dạng: dạng protopectin không tan (tồn tại chủ

yếu ở thành tế bào) và dạng hòa tan của pectin (tồn tại ở dịch tế bào). Dưới

tác dụng của acid, enzyme protopectinase hoặc khi đun sôi, protopectin

chuyển sang dạng pectin hòa tan.

Hình 1.6. Pectin[47]

Vài năm trở lại đây, nhiều nghiên cứu đã đưa ra bằng chứng về những

tác dụng đáng kể của chất xơ trong việc phòng và chữa bệnh. Tác dụng phòng

và điều trị của chất xơ chủ yếu tập trung vào các chứng bệnh mạn tính như:

phòng ngừa táo bón, phòng ngừa bệnh ung thư, giảm mỡ máu, phòng ngừa và

điều trị tiểu đường, chống béo phì, điều trị sỏi mật[27].

1.2.4. Những nghiên cứu và ứng dụng của bã đậu nành và cám gạo

Theo các dữ liệu trên thì trong thành phần bã đậu nành còn lại một lượng

lớn protein và xơ không tan, đây là thành phần khó hấp thu trong hệ tiêu hóa.

Trong cám có lượng dinh dưỡng rất caolại cân đối với nhiều lọai vitamin và

chất béo tốt, có nhiều xơ dễ tiêu, được xem là rất tốt cho cả con người tuy

nhiên các nhóm béo chưa no của cám rất dễ bị oxi hóa tạo mùi hôi khó chịu

chỉ trong vài giờ sau khi chế biến, thêm vào đó do công nghệ xay xát gạo

chưa cao lại ít được đầu tư theo hướng thu cám sạchnên cám thường lẫn rất

nhiều loại tạp chất.Do vậy, bã đậu nành và cám thường chủ yếu được dùng

làm thức ăn cho các loại gia súc và thủy sản.

Trong những năm gần đây chỉ có một số ít công trình nghiên cứu sử

dụng bã đậu nành như:

Vũ Văn Độ và các cộng tác viên nghiên cưu dùng nấm sợi của các loại

nấm lớn (Linh chi – Ganoderma lucidum, Bào ngư – Pleurotus florida) xử lý

okara để chế biến bánh biscuit, trà túi lọc…[7].

Lê Chiến Phương và các cộng tác viên (2004) xử lý okara bằng nấm mốc

Mucor và vi khuẩn Lactic[16].

Ngô Đại Nghiệp dùng Asp.oryzae chế biến okara thành tương xay.

Lại Mai Hương và các cộng tác viên dùng enzyme kết hợp với phương

pháp cơ học xử lý cellulose trong okara để sản xuất chế phẩm giàu chất xơ bổ

xung vào một số thực phẩm [9].

Và vẫn chưa có sản phẩm nào trong các sản phẩm nêu trên được triển

khai ở quy mô sản xuất thử.

Riêng cám gạo,hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu,

thử nghiệm và sản xuất tạo các sản phẩm thực phẩm chức năng như BioBran

MGN-3 hay Lentinplus, nhờ các loại enzyme từ nấm Đông cô (Shiitake

mushroom) thủy phân các polysaccharide thành hemicellulose arabinoxylan

có hoạt tính miễn dịch, phòng chống ung thư hiệu quả[24],[25],[39].

Hình1.7. Sự thủy phânpolysaccharide từ cám gạo bởi các enzyme của nấm Đông cô[39]

1.3. Các chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài

1.3.1. Nấm Linh chi

1.3.1.1. Hệ thống phân loại

Ngành: Mycota

Ngành phụ: Basidiomycota

Lớp: Hymenomycetes

Bộ: Aphyllophorales

Họ: Ganodermataceae

Giống: Ganoderma

Loài: Ganoderma lucidum

Hình 1.8. Nấm Linh chi [48]

1.3.1.2. Đặc tính sinh học

Nấm Linh chi đã nổi tiếng từ ngàn xưa ở các nước Á Đông, phiên âm

theo tiếng Trung Quốc gọi là Lingzhi, theo tiếng Nhật là reishi, ở Việt Nam

thì hay gọi là nấm Lim. Nấm Linh chi còn có nhiều tên gọi khác như: Bất lão

thảo, Vạn niên nhung, Mộc Linh chi… nhưng tên Linh chi có lẽ mang tính

tiêu biểu và được sử dụng phổ biến hơn cả (tên Linh chi chính thức được sử

dụng trong sách “Thần nông bản thảo” cách đây hơn 2000 năm).

Linh chi thường mọc ký sinh trên các cây gỗ trong nhiều năm. Cây gỗ bộ

Đậu (Fabales) là những cây chủ ưa thích của chúng, ta thường gặp Linh chi

trên các cây Lim, phượng vĩ, so đũa và một số loài cây khác đã chết, mục

hoặc cả trên cây sống như xoài, mít, mãng cầu, phi lao, dừa…

 Vòng đời sinh sản của nấm Linh chi

Phần sinh sản là một lớp ống dày từ 0,2-1,7cm gồm các ống nhỏ, thẳng,

miệng tròn, đảm mang 4 đảm bào tử hình trứng. Thực chất đó là do màng phủ

lỗ nảy mầm phồng căng hay lõm thụt vào mà thành. Bào tử đảm có cấu trúc

vỏ kép, lõm ở đầu, màu vàng mật ong sáng, kích thước 5-6 x 8,5-12µm.

Hình 1.9. Chu trình sống của Linh chi[17]

Các bào tử đảm đơn bội khi gặp điều kiện thuận lợi, nảy mầm tạo ra hệ

sợi sơ cấp (primary hyphae). Hệ sợi sơ cấp đơn nhân đơn bội nhanh chóng

phát triển, phối hợp với nhau tạo ra hệ sợi thứ cấp hay còn gọi là hệ sợi song

hạch, phân nhánh rất mạnh tràn ngập khắp giá thể. Lúc này, thường có hiện

tượng hình thành bào tử vô tính màng dày dễ rụng và khi gặp điều kiện thuận

lợi sẽ cho ra hệ sợi song hạch tái sinh. Tiếp sau đó là giai đoạn phân hóa hệ

sợi: các hệ sợi nguyên thủy hình thành các sợi cứng màng dài, ít phân nhánh

bện kết lại thành cấu trúc bó được cố kết bởi các sợi bện phân nhánh rất

mạnh. Từ đó hình thành các mầm nấm màu trắng mịn vươn dài thành các trụ

tròn mập. Phần đỉnh trụ bắt đầu xòe tán, lớp vỏ láng đỏ cam xuất hiện. Tán

lớn dần hình thành bào tầng và phát tán bào tử đảm liên tục cho đến khi nấm

già sẫm màu, khô tóp và lụi dần trong vòng 3-4 tháng[17].

 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi

Bảng 1.3. Điều kiện cần thiết cho sự phát triển của nấm Linh chi[4].

Yếu tố Nhiệt độ Ẩm độ pH Ánh sáng C/N Nuôi tơ 20-35oC 55-60% 4,5-6 Không cần 25/1 Ra quả thể 20-35oC 90-95% 4,5-6 Cần ánh sáng tán xạ từ mọi phía 30/1 hoặc 40/1

1.3.1.3. Dược tính của nấm Linh chi

Số lượng các chủng loài nấm Linh chi được sử dụng trong công nghệ

dược liệu, dược phẩm ngày càng tăng. Vào thập niên 70-80, bắt đầu một trào

lưu khảo cứu hóa dược học các nấm Linh chi.Một số loài Linh chi đã được

phân chất trong đó có G.lucidum… với các nhóm hoạt chất steroid,

triterpenoid, và polysaccharide.

Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế

UV, IR… đặc biệt là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và phổ kế plasma (ICP), đã

được xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi.

Có thể khái quát trong bảng sau:

Bảng 1.4. Thành phần hoạt chất cơ bản và hoạt tính dược lý trong nấm Linh chi[17]. Nhóm Nucleotide Hoạt chất Cyclooctasulfur Adenosine dẫn xuất

Lingzhi-8 Proteine

*** Ganodosterone Lanosporeric acid A Lanosterol II, III, IV, V Ganoderans A, B, C Beta-D-Glucan Alcaloid Steroide Steroide Steroide Steroide Polysaccharide Polysaccharide

BN-3B: 1, 2, 3, 4 D-6 Polysaccharide Polysaccharide

Polysaccharide Triterpenoid Triterpenoid Hoạt tính dược lý Ức chế giải phóng histamine Ức chế kết dính tiểu cầu, thư giản cơ,giảm đau Chống dị ứng phổ rộng, điều hòa miễn dịch Trợ tim Giải độc gan Giảm cholesterol Ức chế sinh tổng hợp Giảm cholesterol Hạ đường huyết Chống ung thư,tăng tính miễn dịch Tăng tổng hợp protein, tăng chuyển hóa acid nucleic Trợ tim Trợ tim Hạ huyết áp, ức chế ACE

*** Ganoderic acids R, S Ganoderic acids B, D, F, H, K, Y Ganoderic acids Triterpenoid

Ganodermadiol Ganodermic acids Mf Triterpenoid Triterpenoid

Triterpenoid

Ganodermic acids T, O Lucidone A Lucidenol Ganosporelacton A Ganosporelacton Oleic acid dẫn xuất Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Acid béo Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Hạ huyết áp, ức chế ACE Ức chế sinh tổng hợp cholesterrol Ức chế sinh tổng hợp cholesterrol Bảo vệ gan Bảo vệ gan Chống khối u Chống khối u Ức chế giải phóng histamine

Điều đáng lưu ý là các nhóm hoạt chất này gặp khá phổ biến trong cấu

trúc nấm, trong thể mang bào tử, trong bào tử đảm và trong hệ sợi (Mycelia),

trong nấm tự nhiên hoang dại và nuôi trồng chủ động[17].

1.3.1.4. Công dụng của nấm Linh chi

Từ xưa đến nay, ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước

châu Á khác đã sử dụng nấm Linh chi để giúp tăng cường sức khỏe và kéo dài

tuổi thọ của con người.

Trong Dược điển Trung Quốc xuất bản vào năm 2000 đã công bố nấm

Linh chi có tác dụng giảm căng thẳng, giảm ho và hen suyễn, được sử dụng

để điều trị chóng mặt, mất ngủ, hồi hộp và khó thở.

Ngày nay, nấm Linh chi còn được biết đến với tác dụng phòng và chống

ung thư, kháng khuẩn, chống nấm, kháng virus (đặc biệt tốt trong điều trị mụn

giộp và HIV), chống viêm, tăng cường khả năng miễn dịch và giúp kéo dài

tuổi thọ.

Trước những lợi ích mà nấm Linh chi mang lại, hiện nay nấm Linh chi

đã được sử dụng trong việc phát triển những phương thuốc điều trị bệnh hoặc

các loại thực phẩm chức năng. Đã có rất nhiều nghiên cứu được tiến hành trên

động vật, trong các mô hình nuôi cấy tế bào trong các ống nghiệm và đã

chứng minh được những tác động tích cực của nấm linh chi đối với sức khoẻ

con người[40].

1.3.1.5. Enzyme cellulasecủa nấm Linh chi

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật, và chúng được thực vật

tổng hợp với số lượng nhiều nhất. Trong tự nhiên cellulose chỉ bị phân giải

bởi vi sinh vật có khả năng tiết enzyme cellulase. Hệ thống cellulase được

phân loại dựa trên phương thức thủy phân và đặc điểm cấu trúc của chúng:

- Exo-1,4-β-glucanase (EC.3.2.1.91.): enzyme cắt đầu không khử của

chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzyme này không có khả năng phân

giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng,

giúp cho enzyme endo 1,4-β glucanase phân giải chúng. Enzyme này còn có

các tên gọi khác như: exocellulase,cellobiohydrolase, exoglucanase,

cellobiosidase.

- Endo 1,4-β-D glucanase (EC 3.2.1.4): enzyme này tham gia phân giải

liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose, trong lichenin và β-D-glucan. Sản

phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose. Enzyme

này còn có các tên gọi khác như: endoglucanase, C-cellulase, 1,4-β-D-glucan-

- β-D glucoside glucohydrolase (EC3.2.1.21): thủy phân cellodextrin hòa

tan và cellobiose thành glucose. Chúng còn được gọi là cellobiase và β-

glucosidase[12],[30].

1.3.2. Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus natto

1.3.2.1. Hệ thống phân loại

Giới: Bacteria

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales

Họ: Bacillaceae

Giống: Bacillus

Loài: Bacillusamyloliquefaciens

Bacillus natto[49]

1.3.2.2. Phân bốvà điều kiện sống

Bacilluscó mặt khắp mọi nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm

cỏ nên còn gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”. Chúng còn phân bố trên bề mặt các

loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt đó.Trong các sản phẩm

thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm lên men chua),

natto,… chúng cũng có mặt và có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh

học.

Hầu hết các loài thuộc chi Bacillussống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện.

Chúng có mức độ thích nghi cao. Phần lớn Bacillus là vi khuẩn ưa nhiệt với nhiệt độ tối thích từ 30–450C, một số chịu nhiệt lên tới 650C hoặc ưa lạnh từ5-

250C nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 34-370C. Bacillus sinh

trưởng trong khoảng pH rộng từ 2–11. Chúng sinh trưởng tốt ở pH = 7.

1.3.2.3. Hình thái

Bacilluslà trực khuẩn nhỏ, thẳng, có kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10μm,

thường xếp thành cặp đôi hay chuỗi ngắn, hai đầu tế bào tròn hoặc hơi vuông.

Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,6–0,9μm, không phân bố theo một

nguyên tắc chặt chẽ nào - lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chínhtâm[26].

Hình 1.10.Hình tháiBa [50]Hình 1.11. Hình tháiBn[51]

Bacillus là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí, khi còn non di động bằng

tiên mao; về già, tiên mao rụng nên mất khả năng di động. Khuẩn lạc khô

hoặc nhớt, vô màu hay có màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hay tạo thành lớp

màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám

chặt vào mặt thạch

1.3.2.4. Cấu trúc

Như hầu hết các vi khuẩn Gram dương khác, cấu trúc bề mặt của

Bacillus khá phức tạp và có các đặc tính kết dính và chống chịu điều kiện

khắc nghiệt cao. Bề mặt tế bào được cấu tạo bởi các lớp giáp mạc, lớp bề mặt

có tính chất protein (S-layer), một vài lớp lót peptidoglycan và các protein

trên mặt ngoài của màng tế bào

Hình 1.12.Cấu trúc và bề mặt Bacillus[44]

C=Capsule; S=S-layer; P=Peptidoglycan.

S-layers

Hiện diện trong một số thành viên của giống Bacillus. Chức năng chưa

được xác định một cách rõ ràng, nhưng dường như có liên quan đến tính kết

dính của vi khuẩn.

Giáp mạc (capsules)

Thành phần hóa học của lớp vỏ nhầy ở các vi khuẩn khác nhau cũng

khác nhau, thường là được tạo nên từ các polysaccharide, nitrogen,

phosphorite và có thể có cả polypeptide, nhưng thành phần chủ yếu vẫn là

nước (98%), có nhiệm vụ như một hàng rào thẩm thấu để bảo vệ tế bào chống

lại quá trình khô.

Vách tế bào

Vách tế bào rất mỏng (100-200Å) và trong suốt không màu. Vách tế bào

có tính chất đàn hồi và có độ bền rất lớn, có thể chịu được áp suất cao. Thành

phần hóa học chủ yếu là glucid, một số chất béo, protide và các acid amin.

Thành phần hóa học thay đổi tùy loại vi khuẩn và môi trường sống.

Tiên mao (flagella)

Hầu hết các vi khuẩn tạo bào tử hiếu khí đều di động nhờ vào các tiên

mao, là các sợi lông rất mảnh mọc trên những phần xác định của tế bào vi

khuẩn. Nó có cấu trúc là protid. Chiều dài tiên mao thường bằng chiều dài tế

bào, nhưng cũng có thể dài hơn tùy từng loại vi khuẩn. Số lượng và vị trí tiên

mao ở các tế bào vi khuẩn khác nhau ở mỗi loài. Tiên mao có thể mọc ở một

đầu, mọc ở hai đầu, mọc xung quanh…[44].

1.3.2.5.Sự hình thành bào tử

Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng tạo bào

tử trong những điều kiện nhất định[6].

Sự hình thành bào tử: vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển sẽ sinh ra

bên trong tế bào một thể nghỉ có dạng hình cầu hay hình bầu dục được gọi là

bào tử hay nội bào tử. Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hoá

chất, kháng áp suất thẩm thấu. Trong thời kỳ nghỉ, bào tử vi khuẩn ở trạng

thái sống ẩn (cryptopiosis). Bào tử có thể giữ sức sống từ vài năm đến vài

chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống 200-300 năm của

bào tử Bacillus.

Các tế bào sinh bào tử khi gặp điều kiện cạn kiệt thức ăn hoặc có tích lũy

các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành

bào tử. Về mặt hình thái, có thể chia quá trình hình thành bào tử ra thành các

giai đoạn:

- Hình thành những búi chất nhiễm sắc.

- Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là

tiền

bào tử.

- Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ.

- Lớp vỏ sơ khai hình thành giữa hai lớp màng của bào tử sau khi đã

tích lũynhiều PG và tổng hợp DPA, tích lũy calci. Tính chiết quang tăng cao.

- Kết thúc việc hình thành áo bào tử.

- Kết thúc việc hình thành vỏ bào tử, bắt đầu có tính kháng nhiệt.

- Bào nang vỡ ra, bào tử thoát ra ngoài.

1.3.2.6. Hệ enzyme

Hệ enzyme protease [29]

Bacillus tổng hợp protease trung tính và kiềm.

Các enzyme protease xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid

trong các peptid hoặc protein giúp phân giải protein và các cơ chất cao phân

tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử bé, để vi sinh

vật dễ dàng hấp thụ.

Một số nghiên cứu cho thấy Ba phát triển tốt trong khoảng pH 5-12, tại pH 9 và nhiệt độ là 400C lượng enzyme protease được tổng hợp cực đại [34].

Hệ enzyme amylase [12].

Bacilluscó khả năng tạo một lượng lớn ngoại bào.

∝ −amylase

Một số nghiên cứu cho thấy lượng enzyme amylase được tạo ra nhiều nhất trong khoảng pH từ 6,0-9,5 và nhiệt độ từ 32-450C, đạt cực đại tại pH 9,0 và 420C [23].

Amylase của Bacillus không có các liên kết sulfihidril và có khả năng

phân giải tinh bột nhanh gấp 2-2,5 lần so với của nấm mốc.

này thủy phân tinh bột tạo ra các dextrin có mạch dài ∝ −amylase

khoảng 6-8 gốc glucose. Các dextrin này lại tiếp tục bị phân giải theo sơ đồ :

∝ − amylase G8  G2 + G6

G7  G1 + G5

G6 G1 + G5

Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân cơ chất bởi amylase là glucose và

maltose.

1.3.2.7. Ứng dụng của Bacillus

Hệ enzyme của Bacillusđược dùng để tạo kháng sinh: eumycin, bacillin,

bacillomin chống được nhiều loại vi trùng gây bệnh.Protease là một trong

những nhóm enzyme công nghiệp quan trọng nhất, chiếm gần 60% tổng

lượng enzyme được bán ra, được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp tẩy rửa

khô, sản xuất các loại thuốc tiêu hóa, thuốc điều trị các vết thương do bỏng

hay do tác nhân virus[18].

Trong thực phẩm, Bacillus đã được sử dụng từ rất lâu trong lịch sử. Các

chủng Bacillus được sử dụng trong lên men đậu cocoa từ nhiều thế kỉ và sự

lên men đậu tương được thực hiện bởi các chủng Bn tạo ra natto (đậu nành lên

men) đã được sử dụng nhiều ở Nhật trong hàng nghìn năm nay, đặc biệt hơn

nữa chủng Bnđã đượcđưa vào sản xuất tạo các sản phẩm thực phẩm chức

năng với khả năng điều trị tắc nghẽn mạch máu, hỗ trợ tim mạch, điều trị

huyết áphiệu quả,…[28].

Với Ba, theo nghiên cứu của Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM, thì

chủngBa là lợi khuẩn, không có tác dụng gây hại cho sức khỏe con người

chúng có khả năng tiết ra enzyme amylase và protease thuỷ phân tinh bột,

protein không tan, có chức năng tương tự như Bn.

Trong những năm gần đây đã có một số các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn

Ba trong việc chế biến thực phẩm, thực phẩm lên men,… tạo sản phẩm có giá

trị dinh dưỡng cao. Tuy nhiên, chưa có sản phẩm nào được triển khai sản xuất

ở quy mô công nghiệp.

1.4. Sấy chân không

Nguyên lý

Phương pháp sấy chân không phụ thuộc vào áp suất điểm sôi của nước.

Ở một áp suất nhất định nước sẽ có một điểm sôi nhất định, nếu làm giảm (hạ

thấp) áp suất trong một thiết bị chân không xuống đến áp suất mà ở đây nước

trong vật bắt đầu sôi và bốc hơi sẽ tạo nên một dòng chênh lệch áp suất đáng

kể dọc theo bề mặt vật, hình thành nên một dòng ẩm chuyển động theo hướng

từ trong ra bề mặt vật[42].

Hệ thống sấy chân không

Hệ thống sấy chân không gồm buồng sấy, thiết bị ngưng tụ và bơm chân

không.

Vật sấy được cho vào trong buồn kín, sau đó buồng này được hút chân

không. Lượng ẩm trong vật được tách ra khỏi vật và được hút ra ngoài[43].

Ưu điểm

Sấy chân không được dùng để sấy các vật liệu, dược liệu quý hiếm như

các loại vật liệu có chứa nhiều hàm lượng tinh dầu, hương hoa, dược phẩm,

các nông sản thực phẩm có yêu cầu nhiệt độ thấp.

Giữ được các tính chất đặc trưng ban đầu: tính chất sinh học, màu sắc,

hương vị, hình dạng của sản phẩm[42].

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

Hóa chất, thiết bị và dụng cụ do Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM cung

cấp.

2.1.1. Hóa chất

- Định tính cellulase:thuốc thử Lugol(0,5g iod + 5g KI, thêm nước cất

cho đủ 200ml),1% carboxymethyl cellulose (CMC).

- Nhuộm Gram: dung dịch Lugol, dung dịch Crystal violet, dung dịch

NaCl 0,9%, cồn 960, safranin.

- Nhuộm bào tử: Fuchsin, HCl 0,5%, H2SO4 1%, xanh methylen, nước

cất.

- Định tính protease: thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, NaCl 0,8%,

• Phương pháp thu sợi fibrin:

CaCl22,5%, fibrin.

Dùng 5ml huyết heo: bổ sung 0,5% kalioxalat (K2C2O4.H2O), thêm

150ml NaCl 0,8%, 5ml dung dịch CaCl2 (2,5g/100ml nước cất). Để 10-15

phút. Lọc qua giấy lọc. Rửa mẫu trên giấy bằng NaCl 0,8% đến khi sợi fibrin không còn máu. Đem sấy ở nhiệt độ 400C. Sau đó đem đi nghiền mịn.

- Định tính amylase:dung dịch Lugol.

- Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase):

CMC 1% (w/v): cân 1g CMC, hòa tan trong 80ml dung dịch đệm Na-

acetate 50mM, pH 5, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm

đến vạch, lắc đều.

Dung dịch enzyme: pha loãng dung dịch enzyme với dung dịch đệm Na-

acetate 50mM, pH 5 đến độ pha loãng thích hợp.

Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS).

Dung dịch lactose.

Dung dịch DNS-lactose: trộn 75ml dung dịch DNS với 25ml dung dịch

lactose.

- Xác định hoạt tính enzyme protease:

HCl 0,1M, H3PO41/30M, trichloroacetic 5%, NaCl 2M,Na2CO3

0,4M,Tyrosin tinh khiết, NaOH 0,1N, Ca(CH3COOH)2 0,2M, casein 1%,

• Cách pha dung dịch đệm phosphat pH 6,2: trộn 81,5ml dung dịch

thuốc thử Folin, dung dịch đệm phosphat pH 6,2.

mononatri orthophosphate 0,2M với 18,5ml dung dịch dinatri

hydrophosphate:

+ Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M: 27,8 g NaH2PO4 hòa tan,

dẫnnước đến 1000ml

+ Dung dịch dinatri hydrophosphate: 53,05 Na2HPO4.7H2O hoặc 71,1g

Na2HPO4.12H2O hòa tan dẫn nước đến 1000ml.

- Xác định hoạt tính enzyme amylase: đệm phosphate pH 6,2, Lugol,HCl

1N, NaCl 3%, tinh bột 1% (1g tinh bột tan, cho vào bình định mức 100ml,

thêm 50ml nước cất, lắc đều trong bể cách thủy 10–15 phút, đến khi tinh bột

tan hoàn toàn, thêm 10ml dung dịch đệm phosphate 6,2. Thêm nước cất cho

đủ 100ml).

- Xác định hàm lượng Nitơ tổng số (Nts): H2SO4đậm đặc, NaOH 40%,

H2SO4 0,01N, H3BO3 2%, chất xúc tác: K2SO4/CuSO4 (9:1), Thuốc thử

• Thuốc thử tarshiro: Trộn xanh methylen 0,1% trong cồn tuyệt đối với

tarshiro.

methyl đỏ 0,2% trong cồn tuyệt đối theo tỉ lệ 1:2.

- Xác định hàm lượng Nitơ formol (Nformol ):

+ Dung dịch formol pha loãng ½ (tỷ lệ1:1) đã trung hòa bằng NaOH

0,1N: lấy 50ml dung dịch formol pha loãng ½, thêm vào vài giọt

phenolphtalein 1%, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch có màu

hồng nhạt

+ Dung dịch NaOH 0,1N

+ Chất chỉ thị màu phenolphtalein 1% trong cồn.

- Xác định hàm lượng đạm ammoniac (NNH3): MgO khan, H2SO4 0,1N,

NaOH 0,1N, phenolphtalein 1%.

- Xác định đường tổng: Cồn 960, cồn 800, pheno l5%, H2SO4 đậm đặc, đường saccharose 0,1%: 500mg saccharose sấy khô ở 600C, hòa tan trong

50ml nước cất.

- Xác định đường khử:

+ Dung dịch kali ferixianua (K3Fe(CN) 6): hòa tan 1,65 K3Fe(CN)6 và

10g NaNO3 trong 1 lít nước cất. Bảo quản dung dịch trong lọ thủy tinh màu

nâu. Dung dịch sắt sulphate (Fe2(SO4)3): hòa tan 1g Fe2(SO4)3trong 10ml

H2SO4 đậm đặc. Đổ từ từ dung dịch vào nước cất có sẵn trong bình định mức,

pha loãng thành 1000ml

+ Gelatin 10%

+ Trộn lẫn dung dịch Fe2(SO4)3 và gelatin 10% theo tỉ lệ 20:1. Hỗn hợp

dung dịch chỉ sử dụng trong ngày.

- Xác định tinh bột: HCl 5%, NaOH 5%, Pb(CH3COO)2 10%, Na2HPO4

bão hòa, các thuốc thử dùng xác định đường khử.

- Xác định hàm lượng lipid: ether dầu hỏa ether ethylic.

- Xác định chỉ số peroxide:acid acetic, KI bão hòa (pha dùng ngay), lắc

kỹ đậy nút cẩn thận, Na2S2O3 0,01N, dung dịch hồ tinh bột 1%, Cloroform.

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ

- Dụng cụ thí nghiệm bao gồm: bình định mức 500ml, 100ml, 50ml, ống

nghiệm, becher, erlen, ống đong, pipet, đĩa Petri, buret, phễu lọc, giấy lọc, cối

chày sứ,…

- Thiết bị thí nghiệm: tủ cấy, kính hiển vi, máy lắc, tủ hấp, cân điện tử,

bể ổn nhiệt, máy Kjeldahl bán tự động, máy đo quang phổ, tủ lạnh, máy sấy

chân không, tủ sấy, cân phân tích, bình hút ẩm, bếp nung, bình chưng cất,hệ

thống sinh hàn hoàn lưu, máy Soxhlet…

2.1.3. Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng

- Môi trường giữ giống: + Ba, Bn: môi trường thạch cá peptone (CP) (nước mắm 300N 10ml,

peptone 5g, agar 10g, nước cất 500ml).

+ Nấm Linh chi: môi trường thạch nước giá (500ml nước giá, 0,5%

CMC, 1% glucose) .

- Môi trường nhân giống:

+ Ba, Bn: môi trường sữa đậu nành (sữa đậu nành, 3% saccharose).

+ Nấm Linh chi: môi trường dịch nước giá (500ml nước giá + 0,5%

CMC + 1% glucose) .

- Môi trường định tính:

+ Định tính cellulase: môi trường thạch có bổ sung 1% CMC.

+ Định tính protease: môi trường thạch Nutrient Broth có bổ sung 1%

casein và môi trường thạch có bổ sung 1% fibrin.

+ Định tính amylase: môi trường thạch có bổ sung 1% tinh bột.

- Môi trường quan sát hình thái nấm Linh chi:môi trường thạch nước giá

( 500ml nước giá, 0,5% CMC, 1% glucose).

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật

2.2.1.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa của

nấm sợi Linh chi

 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái

Quan sát đại thể trên môi trường thạch.

Cách tiến hành:

Cắt miếng sinh khối tơ nấm Linh chi từ ống giống, đặt lên môi trường

thạch nước giá, ủ trong 2–3 ngày, tiến hành quan sát đại thể hệ sợi nấm Linh

chi.

Quan sát vi thể tơ nấm Linh chi bằng phương pháp làm tiêu bản phòng

ẩm[5].

Cách tiến hành:

- Đặt vào đáy hộp Petri một tờ giấy thấm, đặt tiếp lên đó một miếng

lame. Đậy lại, gói giấy và đem khử trùng.

- Đun chảy môi trường môi trường thạch nước giá đã khử trùng trong

ống nghiệm.

- Mở hé nắp đĩa Petri gần ngọn lửa đèn cồn, đổ thạch trong ống nghiệm

lên miếng lame sao cho thạch chảy dài thành một lớp mỏng một bên của tấm

lame.

- Khi thạch trên lame đã đặc lại, nhỏ nước cất vô trùng thấm đều tờ giấy

thấm mà không tràn lên lame.

- Dùng que cấy móc, khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm sợi rồi chấm lên phần

thạch của miếng lame trong phòng ẩm.

- Hộp được gói giấy và nuôi ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày.

- Mở hộp Petri và lấy lame bên trong ra.

- Dùng giấy thấm chùi mặt đáy của lame.

- Đậy lamelle lên chỗ có tơ nấm Linh chi mọc và đặt dưới kính hiển vi

để quan sát mẫu.

 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa

Định tính cellulase

Nguyên tắc:

Nấm sợi Linh chi tiết enzyme cellulase phân giải CMC thành các phân

tử bé và các dạng đường khử không cho phản ứng màu với Iod.

Cách tiến hành:

Nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi trong môi trường dịch nước giá. Chuẩn

bị môi trường thạch có bổ sung 1% CMC, khoan lỗ thạch. Cấy sinh khối tơ

nấmLinh chi và ủ trong 24 giờ, tiến hành nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol

để xác định vòng phân giải.

Kết quả:

Phản ứng (+): môi trường xung quanh sinh khối tơ nấm Linh chi không

bắt màu với thuốc thử Lugol.

Phản ứng (-): môi trường xung quanh bắt màu với thuốc thử Lugol.

2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh

hóa của vi khuẩn Ba, Bn

 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái

Phương pháp nhuộm Gram [5].

Nguyên tắc :

Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc tím kết tinh (crystal

violet) và iod mà vi khuẩn chia làm 2 nhóm khác nhau:

Nhóm thứ nhất vẫn giữ nguyên màu tím của thuốc nhuộm, không bị rửa

trôi khi xử lý bằng cồn do có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan. Cồn

làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím tinh thểiod bị

giữ lại trong tế bào, ngoài ra các vi khuẩn thuộc nhóm này có ít lipid hơn nên

khi bắt màu, màu cũng ít bị rửa trôi hơn. Vi sinh vật thuộc nhóm này là Gram

dương.

Nhóm thứ hai có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn)

nhưng lượng lipid của lớp màng ngoài cao hơn; khi bị tẩy bằng cồn, lipid bị

hòa tan nhiều hơn và vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung, chúng sẽ bắt

màu thuốc nhuộm mới (đỏ vàng, đỏ tía, hồng). Vi sinh vật nhóm này là Gram

âm.

Cách tiến hành:

- Lau nhẹ sạch tiêu bản bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn.

- Dùng bút lông ghi tên mẫu, vẽ vòng tròn phía dưới mặt lame để đánh

giấuvết khuẩn phía trên lame.

- Nhỏ dung dịch NaCl 0,9% lên giữa vòng tròn.

- Dùng que cấy khử trùng để nguội lấy một ít sinh khối vi khuẩn hòa vào

giọt NaCl 0,9% trên lame.

- Dàn mỏng thành vết bôi, cố định bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn

cồn.

- Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa.

- Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính.

- Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để yên từ 30 giây-1

phút, rửa trôi thuốc nhuộm dư với nước.

- Nhỏ dung dịch Lugol, để 30 giây, rửa lại nhẹ nhàng với nước. - Tẩy màu bằng cồn 960 từ 15-20 giây: giữ phiến kính ở góc nghiêng nhỏ

và cẩn thận nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi cho đến khi không

thấy vết thuốc nhuộm chảy theo. Ngay lập tức rửa vết bôi lại với nước. Thời

gian khử màu trong bước này đóng vai trò quyết định kết quả của quá trình

nhuộm.

- Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin và để yên trong vòng 30 giây. Rửa

với nước.

- Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn,

quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100).

Phương pháp nhuộm bào tử[5].

Cách tiến hành:

Với thuốc nhuộm Fuchsin, HCl 0,5%, H2SO4 1% và xanh methylen

- Làm vết bôi trên phiến kính sạch và để khô tự nhiên.

- Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho

đến bốc hơi trong 2 phút rồi rửa với nước.

- Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fucshin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng

cho đến bốc hơi trong 5 phút.

- Rửa vết bôi bằng nước.

- Nhuộm vết bôi bằng xanh methylen trong 5-15 phút.

- Rửa lại với nước và để khô tự nhiên.

- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100). Bào tử sẽ mang

màu đỏ, tế bào sinh dưỡng mang màu xanh.

 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý

Xây dựng đường cong tăng trưởng trong môi trường sữa đậu nành[22].

Khảo sát đường cong sinh trưởng của vi khuẩn là một công việc quan

trọng, nó cho biết tại thời điểm nào thì chất lượng giống vi khuẩn cho vào lên

men là tốt nhất.

Nguyên tắc:

Sự tăng trưởng vi sinh vật là sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong

quần thể. Tốc độ tăng trưởng là sự tăng trưởng của vi sinh vật trong một đơn

vị thời gian. Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật theo thời gian ta có thể xác

định được đường cong tăng trưởng của chúng.

Dụng cụ và môi trường:

Đĩa Petri, ống nghiệm, nước cất, đầu típ 1ml đã được hấp khử trùng.

Môi trường thạch CP, môi trường sữa đậu nành.

Cách tiến hành:

Vi khuẩn được nuôi tăng sinh (nhân giống cấp 1) trong môi trường sữa

đậu nành từ ống giống gốc, lắc ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.

Hút 1ml giống từ bình nhân giống cấp 1 sang một bình chứa môi trường

sữa đậu nành mới (nhân giống cấp 2), lắc ở nhiệt độ phòng.

Khoảng 4 giờ lấy mẫu, cấy trên môi trường thạch CP.

Đếm khuẩn lạc, xác định mật độ tế bào (CFU/ml) có trong mẫu.

Pha loãng mẫu ở các nồng độ khác nhau sao cho khuẩn lạc mọc riêng lẻ

trên mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán.

Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như

FDA, AOAC là 30–300 khuẩn lạc trên đĩa.

Tính kết quả:

Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha

loãng Di được tính theo công thức:

𝐀𝐢 × 𝐃𝐢

CFU/ml = (2.1)

𝐕

Ai: số khuẩn lạc trung bình trên đĩa

Di: độ pha loãng thứ i

V: dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml).

Vẽ đồ thị đường cong sinh trưởng giữa log CFU/ml – trục tung và thời

gian – trục hoành.

 Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Ba,

Bn[31].

Định tính protease

- Khả năng thủy phân casein

Nguyên tắc:

Vi sinh vật tiết enzyme protease phân giải casein thành polypeptide và

acid amin.

Cách tiến hành:

Tăng sinh vi khuẩn Ba trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục

một lỗ trên môi trường NB thạch đĩa có bổ sung 1% casein. Nhỏ dịch tăng sinh Ba vào, ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Tiến hành tương tự đối với Bn.

Đọc kết quả:

Nhỏ thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần lên bề mặt thạch. Kiểm tra vòng

phân giải casein.

- Khả năng thủy phân Fibrin

Nguyên tắc:

Vi sinh vật tiết protease phân giải fibrin thành polypeptide và các acid

amin.

Cách tiến hành:

Tăng sinh vi khuẩn Bavà Bntrên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ.

Đục một lỗ trên môi trường NB thạch đĩa có bổ sung 1% fibrin. Nhỏ dịch tăng sinh Bavà Bnvào, ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Đọc kết quả:

Nhỏ thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần lên bề mặt thạch. Kiểm tra vòng

phân giải fibrin.

Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi khuẩn xuất hiện màu xanh.

Phản ứng (-): môi trường xung quanh không bắt màu với thuốc thử folin.

Định tính amylase

Nguyên tắc:

Một số vi sinh vật có enzyme α-amylase thuộc nhóm hydrolase phân giải

liên kết glycozide tạo thành dextrin có phân tử bé và maltose. Vì vậy dưới tác

dụng của α-amylase, tinh bột bị phân giải thành dextrin không cho phản ứng

màu xanh tím với iod.

Cách tiến hành:

Tăng sinh vi khuẩn Ba trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục

một lỗ trên môi trường Starch agar, ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Tiến hành tương tự đối với Bn.

Kết quả:

Dùng thuốc thử Lugol nhỏ lên bề mặt môi trường để quan sát đường

kính vòng phân giải tinh bột:

Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi khuẩn không bắt màu với thuốc

thử Lugol.

Phản ứng (-): môi trường xung quanh bắt màu với thuốc thử Lugol.

2.2.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của vi sinh vật

sử dụng trong đề tài theo thời gian

 Phương pháp xác định hoạt tínhCMCase của nấm sợi Linh chi[8].

Định nghĩa đơn vị hoạt tính: Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ

giải phóng đường khử glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút

dưới điều kiện phản ứng.

Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC bởi CMCase ở pH

5 và 40°C. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với DNS, màu sinh

ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở

mức bước sóng 540 nm.

Dựng đường glucose chuẩn:

Hòa tan 100mg glucose monohydrate với 80ml nước cất và chuyển vào

bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Thực hiện một loạt

7 ống nghiệm theo bảng sau đây:

Bảng 2.1. Đường glucose chuẩn

Ống số Nồng độ glucose (mg/ml) - ml dd glucose (1mg/l) - ml dd CMC 1% - ml dd DNS – Lactose - ml nước cất 0 0 0 1 2 1 1 0,1 0,1 1 2 0,9 2 0,2 0,2 1 2 0,8 3 0,3 0,3 1 2 0,7 4 0,4 0,4 1 2 0,6 5 0,5 0,5 1 2 0,5 6 0,6 0,6 1 2 0,4

Lắc đều ống nghiệm, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút . Làm lạnh

đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540

nm.

Xác định hoạt tính của CMCase:

Ống nghiệm 1: phản ứng enzyme

- Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 40°C/5 phút.

Đồng thời ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 40°C/5

phút.

- Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc

đều. Đểphản ứng ở 400C chính xác 10 phút.

- Thêm 2ml dung dịch DNS–lactose, lắc đều đểngừng phản ứng enzyme.

- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng

trong chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm (AT).

Ống nghiệm 2: đối chứng

- Hút 1ml dung dịch đệm Na-acetate 50 mM, pH 5 cho vào ống nghiệm

để ở40°C/5 phút.

- Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc

đều.

- Thêm 2ml dung dịch DNS-lactose, lắc đều đểngừng phản ứng enzyme.

Đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độphòng trong một

chậunước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm (AB).

Kết quả:

- Giá trị hệ số glucose trung bình (F)

F = (0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 +.....+ 0,6/AG0,6)/6(2.2)

- Hoạt tính enzyme:

CMCase UI/g = (AT – AB) x F (1000/198) x (1/10phút) x (1/1,0ml) x (1/C)

(2.3)

AT: Độ hấp thụ của dung dịch có phản ứng enzyme

AB: Độ hấp thụ của dung dịch không có phản ứng enzyme

F: yếu tố glucose (mg/ml)

1000: chuyển mg thành µg

198: phân tửlượng của glucose monohydrat, chuyển µg thành µmol.

10: thời gian phản ứng (phút)

1,0: thểtích dung dịch enzyme (ml)

C: Nồng độdung dịch mẫu (g/ml).

 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease của Ba,Bn[8].

Định nghĩa đơn vị hoạt tính:Một đơn vị hoạt tính enzyme protease được xác

định là lượng enzyme để tạo ra một lượng amino acid tương đương với 100µg

tyrosin trong 1ml dịch lọc trong điều kiện thí nghiệm.

Nguyên tắc:

Dùng protein casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của

enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng

bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.

Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản

phẩm thủy phân dưới tác dụng enzyme.

Cách tiến hành:

Dựng đường chuẩn

Bảng 2.2. Đường chuẩn tyrosine

Ống số Đối chứng 1 2 3 4 5

0 10 20 30 40 50 Nồng độ ( g/ml)

Dung dịch tyrosine 0 10 20 30 40 50

1000 990 980 970 960 950 𝜇 chuẩn ( l) Dung dịch HCl ( l) 𝜇 5 5 5 5 5 5 Na2CO3 0.4M (ml) 𝜇

Thuốc thử Folin (ml) 1 1 1 1 1 1

Pha dung dịch tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 μg

tyrosin/1ml HCl 0,1M. Thêm 5ml Na2CO3 0,4M vào 1ml dung dịch tyrosin

(các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm 1ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều để ổn định dung dịch ở 37±0,50C

trong 20 phút.

Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả

AS10, AS20, AS30, AS40, AS50).

Ống đối chứng: dùng 1ml HCl 0,1M thay cho tyrosin, đo độ hấp thụ của

𝟏𝟏

𝟐𝟏

𝟓𝟏 𝑨𝑺𝟓𝟏−𝑨𝑺𝟏

𝑨𝑺𝟏𝟏−𝑨𝑺𝟏 +

𝑨𝑺𝟐𝟏−𝑨𝑺𝟏 +

𝟑𝟏 𝑨𝑺𝟑𝟏−𝑨𝑺𝟏 +

𝟒𝟏 𝑨𝑺𝟒𝟏−𝑨𝑺𝟏 +

dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này AS0).

𝑭 = 𝟓 (2.4)

Dựng đường chuẩn theo hàm lượng μg tyrosin và độ hấp thụ.

Định lượng enzyme trong mẫu:

Ống nghiệm 1: phản ứng enzyme Cho 1ml dung dịch cơchất casein vào ống nghiệm, ủ ởnhiệt độ37±0,50C

trong 15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme vào, lắc đều, ủhỗn hợp này ởnhiệt độ37±0,50C trong 60 phút. Sau đó cho vào hỗn hợp này 2ml

dung dịch trichloroacetic 5%. Để ổn định nhiệt trong 25 phút, sau đó lọc dung

dịch này qua giấy lọc đểloại tủa. Cho 5ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch

lọc. Cho thêm thuốc thửFolin đã pha loãng 5 lần vào hỗn hợp, đểyên ở37±0,50C trong 20 phút. Khi xuất hiện màu xanh, đem đo độhấp thu ởbước

sóng 660nm.

Ống nghiệm 2: đối chứng

Lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước

tương tự ởmẫu thí nghiệm với cùng điều kiện.

Kết quả:

Hoạt tính enzyme protease:

ĐVHT/g hoặc ml dung dịch enzyme = (A60 – A0) × F × n × 1/100 (2.5)

A60: độ hấp thụ của mẫu

A0: độ hấp thụ của mẫu đối chứng

F: hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosin và độ hấp thu ở bước sóng

660nm trên đường chuẩn

n: hệ số pha loãng mẫu

1/100: hệ số chuyển đổi

 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase của Ba,Bn[13].

Nguyên tắc:

Hoạt tính enzyme amylase được xác định theo phương pháp Smith và

Roe (1966). Hoạt tính amylase biểu thịkhảnăng amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở500C và được thểhiện bằng số đơn vịcủa

enzyme đó trong một gam mẫu. Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra,

lượng tinh bột còn lại chưa bịphân hủy sẽtạo phản ứng với iod và được đo

bằng máy so màu quang học.

Cách tiến hành:

Dùng các ống nghiệm có đánh dấu sẵn và tiến hành cho vào các ống

nghiệm các dung dịch và hóa chất.

Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm định lượng enzyme amylase

Ống đối chứng

Ống thử

1ml nước cất 1ml dịch enzyme các mẫu

1ml đệm phosphate pH 6,2 1ml đệm phosphate pH 6,2

1ml dung dịch tinh bột 1% 1ml dung dịch tinh bột 1%

Đem ủ ở nhiệt độ500C trong 30 phút, sau đó cho mỗi ống 1ml dung dịch

0,5ml dung dịch NaCl 3% 0,5ml dung dịch NaCl 3%

HCl 1N để kiềm hãm sự hoạt động của enzyme. Cho nước cất đến 10ml

mỗi ống.

Cho tiếp một giọt dung dịch Lugol vào mỗi ống. Đem đo mật độ quang ở

bước sóng 595 nm.

Đơn vị hoạt tính của enzyme amylase được tính theo công thức:

UI =

(2.6)

(𝐚−𝐛) ×𝐂 × 𝐋 𝐚 ×𝐭 × 𝐦

a: mật độquang học của ống chuẩn

b: mật độquang học của ống thử

C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (0,01g)

L: hệ số pha loãng

m: trọng lượng (g) hoặc thểtích (ml) mẫu.

2.2.2. Quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm

Quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm từ bã đậu nành và cám gạo

Cám Bã đậu nành

Rây Xay

Hấp 1210C/60phút

Hỗn hợp bã đậu nành + cám+ H2O

Cấy giống Linh chi Ủ tạo tơ nấm

Bịch tơ nấm Linh chi

Xay

Chỉnh pH về 6,5-7

Cấy giống Ba

Đảo, trộn

Hỗn hợp sinh khối Linh chi, Ba và cơ chất đã được thủy phân

Sấy chân không

Sản phẩm TPCN

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Bước 1: xử lý nguyên liệu

- Bã đậu nành xay nhuyễn

- Cám rây kỹ loại bỏ trấu còn lẫn trong nguyên liệu

- Phối trộn hỗn hợp bã đậu nành + cám + H2O

+ Phối trộn hỗn hợp bã đậu nành và cám theo tỉ lệ 1:1

+ Xác định độ ẩm ban đầu của hỗn hợp bã đậu nành và cám. Tăng độ

ẩm của hỗn hợp nguyên liệu đến 50% bằng cách phối trộn với nước sạch.

Mục đích của công đoạn này là làm bột nguyên liệu trở nên mềm, ẩm, tạo

điều kiện cho tơ nấm Linh chi mọc tốt, thuỷ phân triệt để cellulose.

 Phương pháp xác định lượng nước cho vào 1kg nguyên liệu ở

các độ ẩm cần thiết:

a =

(2.7)

𝒎𝒃−𝒎 𝒎− 𝒎𝒂

a: lượng nước cần cho vào với độ ẩm cần (lít)

ma: 1 (100% độ ẩm)

mb: độ ẩm nguyên liệu

m: độ ẩm cần.

Nguyên liệu ban đầu (bã đậu nành và cám gạo) có độ ẩm trung bình

6,75%. Để có độ ẩm môi trường là 50% thì lượng nước cần cho vào 1kg

nguyên liệu là:

(0,0675- 0,5)/(0,5 - 1) = 0,865 (lít)

- Hấp thanh trùng

Sau quá trình phối trộn thì bán thành phẩm sẽ được cho vào từng bao nhỏ mỗi bao 100g sau đó làm nút bông và tiến hành hấp thanh trùng ở 1210C

trong 60 phút .

Bước 2: Xử lý xơ của hỗn hợp bã đậu nành và cám bằng nấm Linh chi

Sử dụng 10% giống Linh chi từ môi trường dịch nước giá nuôi lắc sau 4

ngày, cấy vào từng bịch cơ chất (100g) đã được xử lý. Sau đó ủ ở nhiệt độ

phòng với điều kiện không chiếu sáng đến khi tơ nấm lan rộng ra khắp bề mặt

và trong lòng cơ chất.

Mục đích: sử dụng Linh chi để phân giải cellulose của bã đậu nành và

cám gạo, làm cho thực phẩm dễ sử dụng hơn, giá trị dinh dưỡng tăng và chứa

sinh khối nấm sợi Linh chi mang dược tính, đặc biệt trong thực phẩm chứa

enzyme cellulase của tơ nấm Linh chi, có thể góp phần tiêu hóa chất xơ trong

đường tiêu hóa.

Bước 3: Xử lý protein, tinh bột bằng Ba

Xay:sau khi nấm Linh chi đã lan tơ khắp bề mặt và trong lòng cơ chất

khoảng 9 ngày, ta tiến hành xay nhuyễn sinh khối nấm Linh chi này.

Chỉnh pH:bán thành phẩm sau khi xay có pH acid khoảng 4,5- 5,0, cần

chỉnh pH về 6,5 -7,0 bằng dung dịch KOH bão hòa, tạo điều kiện tốt nhất để

vi khuẩn Bahoạt động.

Khảo sát tỉ lệ giống cấy: 1%, 3%, 5%.

Khảo sát thời gian thủy phân: 0 giờ, 4 giờ, 8 giờ, 12 giờ,…, 28 giờ, 32

giờ.

Bước 4: sấy chân không tạo sản phẩm

Nguyên liệu sau khi được xử lý xơ, protein và tinh bột được sấy chân không để làm khô nguyên liệu ở nhiệt độ450C, áp suất là -1 atm, thời gian sấy

là 20 giờ. Sau đó nghiền nhỏ tạo sản phẩm dạng bột.

2.2.3. Phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm

2.2.3.1. Phương pháp xác định độ ẩm

Nguyên tắc[8]:

Làm bay hơi đến cạn kiệt nước trong thực phẩm. Cân thực phẩm trước

và sau khi sấy khô, từ đó tính ra % nước từ trong thực phẩm đã bay hơi.

Cách tiến hành:

- Cân đĩa đã được sấy khô, cân 10g mẫu đã chuẩn bị sẵn, nghiền nhỏ cho

vào đĩa Petri.

- Cho tất cảvào tủsấy 100–1050C, sấy khô đến trọng lượng không đổi,

thường khoảng 6 giờ.

- Sấy xong, làm nguội ởbình hút ẩm (25–30 phút), đem cân ởcân phân

tích.

Tính kết quả:

Độ ẩm %X được xác định theo công thức:

X=

(𝐆𝟏 − 𝐆𝟐)× 𝟏𝟏𝟏 𝐆𝟏 − 𝐆𝟐

(2.8)

Trong đó:

G1: trọng lượng đĩa Petri và trọng lượng mẫu thửtrước khi sấy(g)

G2: trọng lượng đĩa Petri và trọng lượng mẫu thửsau khi sấy (g)

2.2.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng cellulose

Nguyên tắc[8]:

Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính bền đối với tác dụng của

acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu, còn

các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin… ít

bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm nên bị oxy hóa, phân giải và tan

vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch acid nitric và acid acetic.

Cách tiến hành:

Cân chính xác mẫu đã nghiền nhỏ (sấy khô đến trọng lượng không đổi ở

100–1050C), cho vào bình nón dung tích 250ml. Nếu :

- Hàm lượng cellulose trong mẫu khoảng 40–50%, thì cân 1–1,5g

- Hàm lượng cellulose trong mẫu khoảng 10–20%, thì cân 1,5–2g

- Hàm lượng cellulose trong mẫu nhỏ hơn 10%, thì cân 2,5–5g

Thêm vào bình 16,5ml dung dịch hỗn hợp gồm 15ml acid nitric đậm đặc

và 1,5ml acid acetic đậm đặc. Lắp ống sinh hàn hồi lưu vào bình và đun sôi

hỗn hợp 30 phút. Để nguội pha loãng hỗn hợp bằng nước cất nóng. Lọc qua

giấy lọc đã biết trước trọng lượng.

Rửa kết tủa cellulose nhiều lần bằng nước cất nóng (mỗi lần 10–15ml). Sau đó tiếp tục rửa bằng 15ml rượu etylic 960 từ1–2 lần. Cuối cùng rửa kết tủa

bằng 5ml ether ethylic. Sấy miếng giấy lọc có chứa cellulose ởnhiệt độ100– 1050C đến trọng lượng không đổi (khoảng 2-3 giờ).

Tính kết quả:

Hàm lượng cellulose được tính theo công thức sau :

X (%) =

𝒂 ×𝟏𝟏𝟏

𝒘

(2.14)

X: hàm lượng cellulose ( % )

a: trọng lượng cellulose (g)

w: trọng lượng mẫu thí nghiệm (g)

100: hệ sốchuyển thành %

2.2.3.3. Xác định hàm lượng Nts bằng phương pháp Kjeldahl

Nguyên tắc[10]:

- Chất đạm được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc thành amomnsulphate

(NH4)2SO4. Muối này đem tác dụng với kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng

H2SO4 đậm đặc Chất đạm (NH4)2SO4

Xúc tác, nhiệt độ (NH4)2SO4 + NaOH 2 NH3

NH3

+ 2 H2O + Na2SO4

- Sau đó, lượng NH3 được hơi nước lôi cuốn sang một bình tam giác có ↑

chứa một lượng thừa H3BO3. Mà ở đó H3BO3 tự phân ly.

H3BO3 HBO2 + H2O

- Khi cất đạm, NH3 bay sang sẽ phản ứng với HBO2 - + H2O NH4OH + HBO2 NH4

BO2

+ + BO2 - là một base mạnh, vì vậy dung dịch của bình hứng sẽ chuyển từ - được tạo thành tương đương - bằng

màu tím đỏ sang màu xanh lá mạ. Lượng BO2

với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2

cách chuẩn độ ngược với H2SO4 0,01N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung

dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ.

- + H+ HBO2

BO2

Cách tiến hành:

Vô cơ hóa mẫu:

Sự vô cơ hóa chất đạm là sự vô cơ hóa tất cả các chất đạm dù ở bất cứ

dạng nào (hữu cơ, protein, vô cơ) thành hợp chất vô cơ là ammonsulphate

(NH4)2SO4) đậm đặc và chất xúc tác.

Cân 100mg mẫu đã nghiền nhỏ, 1g chất xúc tác cho vào ống phá mẫu +

10 ml H2SO4 đậm đặc, nối bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu. Khi thời gian phá

mẫu kết thúc để ống phá mẫu nguội. Chuyển sang bình định mức 100ml, dẫn

nước cất vô đạm đến vạch định mức.

Cất đạm:

Rửa máy nhiều lần bằng nước cất vô đạm.

Cho 10ml dung dịch đạm đã vô cơ hóa và pha loãng vào bình chưng cất,

bổ sung 20ml NaOH 40%. Dịch chưng cất chuyển sang bình tam giác có chứa

sẵn 20ml dung dịch acid boric 2%, dung dịch của bình hứng sẽ chuyễn từ màu

tím đỏ sang màu xanh lá mạ và ngừng chưng cất khi dịch chưng cất ra không

còn NH3 (thử bằng giấy quỳ). Chuẩn độ bằng H2SO4 0,01N, ngừng chuẩn độ

khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ.

Tính kết quả:

Thông qua lượng H2SO4 0,01N ta biết được lượng acid boric kết hợp với

NH3và do vậy biết được NH3 giải phóng từ mẫu.

(2.9)

Nts (%) =

𝑽𝒕 × 𝟏,𝟏𝟒 × 𝑽 × 𝟏𝟏𝟏 𝑽𝒎ẫ𝒖 × 𝒎

- (ml)

Vt : lượng H2SO4 0,01N để chuẩn độ BO2

V: thể tích dung dịch mẫu pha loãng (100ml)

Vmẫu: số ml dung dịch mẫu cất đạm (10ml)

m: trọng lượng mẫu đem vô cơ hóa (mg) 0,14: số mg N tương đương 1ml H2SO4 0,01N.

2.2.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng Nformol

Nguyên tắc[8]:

Phương pháp này cho phép xác định đạm có trong acid amin, peptid.

Phân tử amin hay peptid có một đầu – COOH và đầu kia là – NH2. Formol sẽ

tác dụng lên đầu – NH2 để tạo thành hợp chất methylen. Vì thế sản phẩm là

hợp chất có chứa nhóm methylen, đầu – COOH có tính acid nên ta có thể định

phân bằng NaOH, từ đó gián tiếp cho phép ta xác định được lượng – NH2

(tiêu biểu cho chất đạm amin trong nguyên liệu).

Cách tiến hành:

- Cân 3g mẫu tươi đã nghiền nhuyễn cho vào cốc thủy tinh, dẫn nước

đến 30ml, khuấy đảo trong 10 phút, lọc qua giấy lọc.

- Hút 10ml dịch lọc vào bình tam giác, thêm vào 10ml dung dịch formol

pha loãng ½ đã trung hòa bằng NaOH 0,1N + vài giọt phenolphtalein 1%, lắc

đều đểphản ứng xảy ra hoàn toàn. Sau đó, định phân bằng NaOH 0,1N đến

khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt, lấy màu chuẩn là màu của formol

sau khi trung hòa.

Tính kết quả:

V (2.10)

Nformol(%) = 0,0014

𝟏𝟏𝟏 𝒎

𝟑𝟏 𝟏𝟏 ×

× × 0,0014: số g nitơ tương ứng với 1ml NaOH 0,1N

V: thể tích NaOH 0,1N dùng cho việc chuẩn độ (ml)

m: khối lượng mẫu (g)

2.2.3.5. Phương pháp xác định hàm lượng NNH3

Nguyên tắc[8]:

Trong nguyên liệu chứa đạm thường có một loại đạm dưới dạng vô cơ

(muối ammon hay các amin dễ bay hơi). Đây là dạng đạm tạo thành do sự

phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình phân hủy cacboxyl của

acid amin) có bản chất là base, vì thế về khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm

này không cần cho cơ thể. Nếu có sự hiện diện của nó ở hàm lượng cao thì

nguyên liệu được đánh giá là kém chất lượng.

Do loại đạm này có tính kiềm yếu nên dưới tác dụng yếu của MgO thì

những loại đạm trên sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, chúng sẽ bị lôi kéo theo hơi

nước đến một bình chứa, có sẵn một lượng thừa acid. Sau đó đem định phân

lượng acid dư, cho phép chúng ta xác định được loại đạm ammoniac này.

2 (NH4)+ + Mg(OH)2 2 NH3 + 2 H2O + Mg2

2 NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 →

Cách tiến hành: →

Cân 1g nguyên liệu hay sản phẩm hòa tan vào 10ml nước cất cho vào

ống phá mẫu. Cho vào 5g MgO. Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất. Dịch

chưng cất đưa vào một bình tam giác chứa 10ml H2SO40,1N + 3 giọt

phenolphtalein 1%. Chưng cất tới khi không còn NH3 (thửbằng giấy quỳ).

Định phân lượng H2SO4 0,1N bằng NaOH 0,1N, ta sẽbiết được lượng

acid phản ứng với NH3. Làm một mẫu đối chứng với 10ml nước cất.

Tính kết quả:

Gọi V0 là thể tích NaOH 0,1N thử không.

Vt là thể tích NaOH 0,1N thử thật.

ΔV = V0 - Vt là lượng NaOH 0,1N tương đương với lượng NH3 phóng

thích đã được hấp thụ trong H2SO4 0,1N.

Sốg NNH3trong 100g mẫu:

ΔV x 0,0014 x 100 = ΔV x 0,14 (g/100g) (2.11)

Trong đó: 0,0014 là sốg NNH3tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N.

2.2.3.6. Phương pháp xác định đường tổng

Nguyên tắc[8]:

Sự định phân hàm lượng đường tổng số hòa tan dựa trên phản ứng màu

đặc trưng bởi đường và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của H2SO4.

Sự chuẩn xác của kết quả phụ thuộc:

Độ sạch của dụng cụ

Độ tinh khiết của thuốc thử nhất là H2SO4

Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian phản ứng

Cách tiến hành:

- Cách trích đường: lấy 1g nguyên liệu đã nghiền nhỏ cho vào cốc thủy tinh 50ml và thêm 10ml cồn 960. Đun sôi trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần.

Khuấy đều bằng đũa thủy tinh. Sau đó để nguội, lọc qua giấy lọc.

- Sau đó cho 10ml cồn 800vào cốc đựng bã, khuấy đều đun sôi 2 lần trên

bếp cách thủy. Để nguội lọc tiếp tục, chiết rút như vậy khoảng 2 lần, xong để bã lên giấy lọc và rửa 2–3 lần bằng cồn 800 (rửa từng ít một).

- Cồn qua lọc được cho bay hơi ởnhiệt độphòng hoặc trên lò cách thủy

đun nhẹ. Sau khi cồn bay hơi hết, mẫu có thể đểlâu trong bình hút ẩm.

- Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50ml với nước cất (bình định

mức). Nếu có cặn thì đểlắng xuống. Khi đem làm hiện màu, dung dịch này có

thể pha loãng thành 5–10 lần tùy nồng độnhiều hay ít.

- Thực hiện phản ứng màu: hút 1ml đường cho vào ống nghiệm rồi thêm

vào 1ml dung dịch phenol 5%. Sau đó, cho chính xác 5ml dung dịch H2SO4

đậm đặc vào ống nghiệm. Để10 phút rồi lắc đều, giữtrên nồi cách thủy 10–20 phút ở25–300C đểxuất hiện màu. Màu bền vững trong vài giờ. Xác định

cường độmàu trong quang phổkế ở490 nm.

Xây dựng đường chuẩn:

Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi cho vào theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7ml

dung dịch đường saccharose mẫu 0,1% cho nước cất tới vạch định mức. Từ

mỗi bình lấy ra 1ml cho vào ống rồi nhuộm màu bằng phenol 5% và H2SO4

đậm đặc như ở trên. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương đương 10, 20, 30,

40, 50, 60, 70 μg saccharose. So màu ở bước sóng 490 nm, sau đó vẽ đồ thị

mẫu. Làm thêm một ống thử với 1ml nước cất.

Tính kết quả:

Trị số mật độ quang của những ống đối chứng sau khi trừ đi trị sốcủa

ống thử sẽ xác định được một đường cong mẫu.Với dung dịch cần xác định

nồng độ, ta cũng trừ đi ống thử rồi chiếu lên đường cong mẫu để suy ra nồng

độ đường trong ống, từ đó tính % lượng đường trong mẫu.

2.2.3.7. Phương pháp xác định đường khử

Nguyên tắc[1]:

Trong môi trường kiềm, đường khử kali ferixianua thành kali

peroxianua. Với sự có mặt của gelatin, kali ferixianua kết hợp với sắt sulphate

tạo thành một chất có màu xanh bền.

Cường độ màu được xác định trên máy so màu. Phương pháp này cho

phép xác định lượng đường rất thấp trong dung dịch (0,01–0,1mg/ml).

Cách tiến hành:

Lấy 1g nguyên liệu hòa tan trong 20ml nước cất, lọc lấy dịch lọc (dịch

đường), rửa bã lọc sau đó hiệu chỉnh đến mức 50ml. Cho vào ống nghiệm (V

= 20ml) 2ml dịch chiết đường và 2ml dung dịch kali ferixianua, khuấy đều,

đun trên nồi cách thủy sôi 15 phút. Sau đó đểnguội, thêm vào ống nghiệm 4ml

dung dịch Fe2(SO4)3 khuấy đều và dẫn đến mức 20ml. Đo cường độ màu trên

máy so màu ở bước sóng 710 nm.

Tính kết quả:

Dựa vào OD đo được đối chiếu với đồ thị chuẩn, tính được khối lượng

đường.

Số g đường khử trong 100g mẫu:

X (%) = (2.12)

𝒂 × 𝑽 ×𝑳 ×𝟏𝟏𝟏 đường nhận được từ đồ thị chuẩn

𝒗 ×𝒎

a: số

V: thể tích dịch chiết đường trong bình định mức 𝜇𝜇

L: hệ số pha loãng mẫu

v: thể tích dịch chiết đường lấy để đo OD

m: trọng lượng mẫu thí nghiệm ( ).

𝜇𝜇

2.2.3.8.Phương pháp xác định tinh bột

Nguyên tắc[8]:

Phương pháp định lượng tinh bột đơn giản và phổ biến nhất là dùng acid

thủy phân hoàn toàn tinh bột thành glucose. Sau đó, dùng một trong các

phương pháp xác định lượng đường glucose tạo thành rồi nhân với hệ số 0,9

ta được hàm lượng tinh bột.

Cách tiến hành:

Cân chính xác 1g nguyên liệu đã nghiền nhỏ và sấy khô trước đó, cho

vào bình cầu dung tích 100ml, thêm vào đó 50ml nước cất, lắc đều để yên 30-

45 phút.Lọc qua giấy lọc, rửa cặn 2-3 lần. Chọc thủng giấy lọc và chuyển tinh

bột vào bình cầu bởi 25ml HCl 5%.

Lắp ống sinh hàn hoàn lưu trong 3-5 giờ đến khi tinh bột thủy phân hoàn

toàn (có thể dùng dung dịch iod để thử). Sau khi tinh bột đã thủy phân hoàn

toàn, làm lạnh dung dịch. Trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 5% đến

pH 5,6- 6,0 (thử bằng giấy quỳ).

Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100ml. Kết tủa protein bằng dung

dịch Pb(CH3COO)2 10%. Loại Pb(CH3COO)2 bằng dung dịch Na2HPO4.

Thêm nước cất tới vạch, lắc đều, lọc.

Định lượng glucose trong dung dịch bằng phương pháp so màu.

Tính kết quả:

Số g tinh bột trong 100g mẫu:

X (%) = (2.13)

a: số g đường khử trong 100g mẫu

𝒂 × 𝟏, 𝟗

0,9: hệ số quy chuyển đường khử thành tinh bột

2.2.3.9. Phương pháp xác định hàm lượng lipid

Nguyên tắc[2]:

Nguyên liệu được làm khô, sau đó trích ly lipid ra khỏi nguyên liệu bằng

ether dầu hỏa hoặc ether ethylic trên máy Soxhlet và xác định khối lượng chất

béo.

Cách tiến hành:

Giấy lọc được sấy ở1050C đến trọng lượng không đổi, cân khối lượng

giấy lọc.

Nguyên liệu và sản phẩm được nghiền nhỏ, sấy ở1050C đến trọng lượng

không đổi. Cân chính xác 2-5g nguyên liệu khô tuyệt đối cho vào giấy lọc và

gói lại cho kín không đểmẫu rơi ra ngoài. Để giấy lọc có chứa mẫu vào trụ

chiết của máy Soxhlet. Chiết bằng ether dầu hỏa hoặc ether ethylic. Sau khi

chiết hết lipid (khoảng 8 giờ), lấy túi mẫu ra, cho bay hết dung môi, sấy khô

đến trọng lượng không đổi.

Tính kết quả:

Hàm lượng lipid thô được tính theo công thức:

X =

(2.14)

(𝐚−𝐛) × 𝟏𝟏𝟏 𝐜

X: hàm lượng lipid %

a: trọng lượng giấy lọc và mẫu trước khi chiết (g)

b: trọng lượng giấy lọc và mẫu sau khi chiết (g)

c: trọng lượng mẫu lấy để phân tích lipid (g)

2.2.3.10. Phương pháp xác định chỉsốperoxide

Nguyên tắc[2]:

Chỉ số peroxid là số g iod giải phóng ra bởi peroxide có trong 100g

mẫu,phản ánh mức độ ôi của chất béo đem phân tích. Chỉ số peroxid càng cao

thì độ tươi của chất béo càng thấp.

Cách tiến hành:

Lấy 1g mẫu khô tuyệt đối cho vào bình tam giác, bình đối chứng 1ml

nước cất. Mỗi bình cho 10ml dung dịch hỗn hợp acid acetic: cloroform (2:1),

1ml dung dịch KI bão hòa (mới pha), cho erlen vào chỗ tối 10 phút. Cho thêm

vào erlen 0,5ml chỉ thị hồ tinh bột 1% chuẩn độ iod tạo thành bằng dung dịch

Na2S2O3 (đến khi mất màu nâu).

Tính kết quả:

(𝒂−𝒃)×𝒇 × 𝟏,𝟏𝟏𝟐𝟎𝟗 ×𝟏𝟏𝟏 a: số ml dung dịch Na2S2O3 dùng chuẩn mẫu thật 𝒄

Chỉ số peroxide: P = (2.15)

b: sốml dung dịch Na2S2O3 dùng chuẩn mẫu thử không

c: trọng lượng mẫu (g)

f: hệ số hiệu chỉnh của dung dịch Na2S2O3 0,01N

0,01269: sốg iod tương ứng với 1 ml dung dịch Na2S2O3 0,01N

100: hệ số quy chuẩn 100g chất béo

2.2.4. Phương pháp định tính một số HCSH của nấm sợi Linh chi

- Định tính saponin[20]: Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo

bọt nên đây là một trong những phương pháp chính xác để xác định có sự

hiện diện của saponin.

Chiết 10g bột dược liệu với cồn 70% bằng cách đun hồi lưu trong 30

phút rồi lọc. Cô bốc hơi dịch lọc cho đến cắn khô.

Hòa tan một lượng cắn tương ứng 1g bột nguyên liệu vào 5ml nước

nóng. Lọc vào một ống nghiệm và để nguội, thêm nước cho đủ 10ml, dùng

ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc của ống

nghiệm trong 1 phút (khoảng 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt

và đánh giá kết quả:

Bọt bền trong 15 phút: +

Bọt bền trong 30 phút: ++

Bọt bền trong 60 phút: +++

- Định tính alkaloid[20]: ngâm bột nguyên liệu trong dung dịch H2SO4

loãng 1%, sau đó cho lên nồi đun cách thủy 15 phút. Lọc nước chiết. Từ đây

có thể định tính được alkaloid.

Chuẩn bị các loại thuốc thử sau:

Thuốc thử Mayer: 1,35g HgCl2 hòa tan trong 100ml dung dịch KI 5%.

Các alkaloid sẽ tủa vô định hình màu trắng vàng.

Thuốc thử Wagner: hòa tan 5g I2 trong 100ml dung dịch KI 10%.

Các alkaloid cho tủa màu nâu sáng đến nâu đen (phần lớn ở dạng tủa

bông hoặc bột, đôi khi tạo thành giọt dầu có màu nâu đen).

- Định tính steroid[20]: Phản ứng Salkowki.

Hòa tan 1-2mg bột nguyên liệu trong CHCl3 và nhỏ vào 1ml H2SO4 đậm

đặc. Phản ứng dương tính là cho màu đỏ sẫm, xanh, xanh tím.

- Định tính triterpenoid[20]

Phản ứng Liebermann - Burchard.

Chiết 10–20gam bột nguyên liệu bằng diethylether lắc trong bình nón,

trong 10–20 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại

lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi

còn khoảng 50ml dịch chiết ether.

Lấy 5ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn

với 0,5ml anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5ml chloroform. Chuyển

dung dịch vào1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1–2ml

H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống

nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp

phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. Kết luận có

triterpenoid.

2.2.5. Phương pháp định lượngBa tổng số và bào tử Batrong sản phẩm

Nguyên tắc[14]:

Cấy một thể tích xác định mẫu huyền phù vi sinh vật cấy lên môi trường

thạch có thành phần cơ chất đặc trưng và thích hợp cho loài vi sinh vật cần

định lượng phát triển. Sau một khoảng thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch

sẽ xuất hiện các khuẩn lạc. Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, thể tích mẫu đã

cấy và hệ số pha loãng, ta có thể suy ra số khuẩn lạc có trong 1g mẫu khảo sát

ban đầu.

Cách tiến hành:

Đếm bào tử Ba Pha loãng 1g sản phẩm trong 9ml nước cất vô trùng (10-1). Đun nóng dung dịch ở nhiệt độ 800C trong 15 phút.Dùng pipet hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng (10-2),tiếp tục pha loãng dung dịch ở các nồng độ thích hợp 10-3, 10-4, 10-5… Tiến hành trộn 0,1ml dịch mẫu ở các độ

pha loãng khác nhau với môi trườngthạch CPchưa đông. Chú ý khi trộn thạch

với dịch pha loãng thì thạch đã đủ nguội để không làm chết vi khuẩn hay làm thương tổn với một số loại mẫn cảm với nhiệt độ.

Đặt các đĩa thạch vừa cấy ở nhiệt độ phòng và ủ trong 24 giờ.

Kết thúc thời gian ủ, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng bào tử

trong 1g mẫu.

Đếm Ba tổng số

Tiến hành tương tự như đếm bào tử nhưng không có giai đoạn thanh

trùng.

Tính kết quả:

Mật độ tế bào được tính theo công thức 2.1.

2.2.6. Phương pháp kiểm tra vệ sinh an toàn toàn thực phẩm

Quy định giới hạn cho phép vi sinh trong ngũ cốc và sản phẩm chế biến

từ ngũ cốc (dùng trực tiếp không qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng) với các

chỉ tiêu[21]:

Bảng 2.4. Chỉ tiêu và giới hạn vi sinh trong ngũ cốc và sản phẩm chế

biến từ ngũ cốc

Loại vi sinh vật

Coliforms E.coli S.aureus Cl.perfringens B.cereus TSBTNM-M Giới hạnvi sinh vật (trong 1g hay 1ml thực phẩm) 10 MPN 3 MPN 10 CFU 10 CFU 10 CFU 102CFU

Mẫu sản phẩm được gửi đến phòng Kiểm nghiệm Hóa – Lý – Vi sinh

của Viện Pasteur để phân tích.

2.2.7. Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm

 Mô tả màu sắc, mùi vị, trạng thái sản phẩm

 Phép thử thị hiếu

Mục đích: tìm hiểu mức độ hài lòng, ưa thích của người sử dụng đối với

sản phẩm

Nguyên tắc: người thử đánh giá mức độ ưa thích của họ đối với sản

phẩm trên một thang điểm 9 đã được định nghĩa trước thông qua các thuật

ngữ mô tả cấp độ hài lòng, ưa thích [3]:

1. Cực kỳ không thích

2. Rất không thích

3. Không thích

4. Tương đối không thích

5. Không thích cũng không ghét

6. Tương đối thích

7. Thích

8. Rất thích

9. Cực kỳ thích

Cách tiến hành:

- Chuẩn bị mẫu thử

- Chọn đối tượng thử: 100 người tại Viện Sinh học nhiệt đới và người

dânở đường số 4, phường Tam Phú, Thủ Đức, TP. HCM.

- Thử và cho điểm sản phẩm theo thang điểm 9 với mức đánh giá như

trên

- Lập bảng phân phối thí nghiệm.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Điểm Số người

- Tính các tham số

𝒊=𝟗

+ Trung bình cộng

𝑿� = � 𝑿𝒊𝒇𝒊 𝒊=𝟏 (2.16) 𝟏 𝒇

Với Xi là điểm số; fi là số người cho điểm Xi

+ Sai số trung bình cộng

𝑺

�𝒇 Với S là độ lệch chuẩn: S =

𝟐

SE = (2.17)

𝒊=𝟗

𝟐

√𝝈

𝟐 � 𝒇𝒊(𝑿𝒊 − 𝑿)�� 𝒊=𝟏

(𝒑𝒑ươ𝒏𝒏 𝒔𝒂𝒊) = 𝝈 + Hệ số biến thiên 𝟏 𝒇

Cv% =

100%(2.18)

𝑺 𝑿 �

Cv% = 0%-10%: dao động nhỏ, đáng tin cậy

Cv% = 10%-30%: dao động trung bình, tin cậy

Cv% = 30%- 100%: dao động lớn, ít tin cậy

- Vẽ đồ thị

2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm trong luận văn được lặp lại ít nhất 3 lần. Kết quả trình

bày trong luận văn là số liệu trung bình ± sai số, được tính bằng phần mềm

Microsoft Execl 2010 và SPSS.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả nghiên cứu vi sinh vật

3.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa của nấm sợi Linh chi

3.1.1.1. Đặc điểm hình thái

Hình 3.1. Hệ sợi nấm Linh chi trên môi trường thạch(100x) Hình 3.2. Hình thái sợi nấm Linh chi trên tiêu bản phòng ẩm (100x) Nhận xét:

Tơ nấm Linh chi có hình sợi mảnh, dài, phân nhánh, đanxen vào nhau

tạo thành hệ sợi chằng chịt.

3.1.1.2.Đặc điểm sinh hóa

Định tính cellulose

Hình 3.3. Khả năng thủy phân cellulose

Nhận xét:

Kết quả cho thấy Linh chi có khả năng phân giải CMC nên tạo thành

vòng tan, nơi cơ chất CMC bị enzyme cellulase của nấm Linh chi phân giải

hết.

3.1.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa củaBa,

3.1.2.1.Đặc điểm hình thái

Tế bào sinh dưỡng

Bào tử

Hình 3.4. Khuẩn lạc của Ba(trái),củaBn (phải)

Hình 3.5. Tế bàoBa (trái),Bn (phải) (100x)

Bảng 3.1. Đặc điểm hình tháiBa và Bn

Đặc điểm Ba Bn

Khuẩn lạc to, tròn, màu trắng Khuẩn lạc to, tròn, màu trắng

sữa, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn sữa, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn Hình dạng khuẩn lạc hoặc trơn, nhớt, có núm nhỏ ở hoặc trơn, nhớt, có núm nhỏ ở

giữa hơi nhô lên hoặc lõm vào giữahơi nhô lên hoặc lõm vào

trong so với bề mặt khuẩn lạc, bên trong, mọc bám vào bề mặt

mọc bám vào bề mặt thạch. thạch.

Hình que, đứng riêng lẻ hay Hình que, đứng riêng lẻ hay kết

kết chuỗi. Tế bào có mang bào chuỗi. Tế bào có mang bào tử Hình dạng tế bào tử hình trứng, nằm ở giữa hay hình trứng, nằm ở giữa hay lệch

lệch về một bên. về một bên.

1-1,5 0,5 1-1,5 0,5 Kích thước tế bào

× 𝜇𝜇 × 𝜇𝜇

Nhuộm Gram Gram dương Gram dương

Nhận xét:

Về mặthình thái Ba và Bn khá giống nhau, do đó không thể phân biệt hai

chủng vi khuẩn này dựa vào tiêu chí hình thái.

3.1.2.2. Đặc điểm sinh lý

 Đường cong sinh trưởng của Ba, Bn trên môi trường sữa đậu nành

Bảng 3.2. Kết quả mật độ tế bào theo thời gian

Ba Bn

log (CFU/ml) log (CFU/ml)

7,114 7,322

7,58

Thời gian (giờ) 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 CFU/ml 1,3 x 107 2,1 x 107 3,8 x 107 9,4 x 107 1,28 x 108 5,7 x 108 1,35 x 109 3,6 x 109 2,3 x 109 8,1 x 108 6,2 x 108 7,973 8,107 8,756 9,13 9,556 9,362 8,908 8,792 CFU/ml 1,64 x 107 2,48 x 107 3,3 x 107 1,69 x 108 3,4 x 107 7,9 x 108 2,5 x 109 3,2 x 109 6,9 x 109 4,8 x 109 1,14 x 109 7,215 7,394 7,519 8,227 8,531 8,897 9,398 9,505 9,839 9,681 9,057

m U F C g o l

20 25 Thời gian (giờ)

Ba Series1 Bn Series2

Đồ thị 3.1. Đường cong sinh trưởng của Ba, Bn trên môi trường sữa

đậu nành

Nhận xét:

- Pha lag của cả Ba và Bn kéo dài từ 0-8 giờ

- Mật độ tế bào của Ba đạt cực đại tại 28 giờ, của Bn tại 32 giờ

- Mật độ tế bào giảm sau 28 giờ đối với Ba và sau 32 giờ với Bn.

Kết luận:

Quá trình tăng sinh vi khuẩn trong môi trường sữa đậu nành được kết

thúc sau 24 giờ nuôi cấy đối với Ba và 28 giờ đối với Bn.

3.1.2.3.Một số đặc điểm sinh hóa

 Định tính protease

Khả năng thủy phân casein

Hình 3.6. Khả năng thủy phân casein của Ba (trái), của Bn (phải)

Khả năng thủy phân fibrin

Hình 3.7. Khả năng thủy phân fibrin của Ba (trái), của Bn (phải)

 Định tính amylase

Hình 3.8. Khả năng thủy phân tinh bột của Ba (trái), của Bn (phải)

Nhận xét:

Kết quả cho thấy Ba cũngcó khả năng thủy phân protein, tinh bột tương

tự như Bn.Đây là đặc điểm quan trọng để ứng dụng trong công nghệ thực

phẩm. Thêm vào đó, Ba cũngcó khả năng thủy phân fibrin làm tăng thêm giá

trị của thực phẩm vì sẽ có tác dụng tốt làm tan sợi huyết (fibrin)nguyên nhân

gây huyết khối.

3.1.3. Kết quả xác định hoạt tính hệ enzyme của vi sinh vật sử dụng

trong đề tài theo thời gian

3.1.3.1. Kết quả khảo sát hoạt tính chung CMCase của nấm sợi Linh

chi

Bảng 3.3. Sự biến thiên hoạt tính CMCase của nấm sợi Linh chi theo thời gian

Thời gian (ngày)

0 0,048 2 1,665 4 6,516 6 8,501 10 9,19 8 9,686

Hoạt tính CMCase (UI/ml)

) l

m

/ I U

( h n

í t t ạ o H

8 Thời gian (ngày)

Đồ thị 3.2. Sự biến thiên hoạt tính CMCase của nấm sợi Linh chi theo thời gian

Nhận xét:

Hoạt tính CMCase của nấm sợi Linh chi thay đổi theo thời gian: trong 2

ngày đầu hoạt tính này chưa thay đổi đáng kể. Từ ngày thứ 2 trở đi hoạt tính

liên tục tăng nhanh, tăng khả năng phân giải chất xơ củacơ chất. Hoạt tính đạt

cực đại ở ngày thứ 8, sau đó giảm.

Kết luận:

Có thể ngừng nuôi lắc sinh khối tơ nấm Linh chi trên môi trường dịch

nước giá tại thời điểm 4 ngày.

3.1.3.2. Kết quả xác định hoạt tính chung enzyme protease của Ba,

Bn theo thời gian

Bảng 3.4. Sự biến thiên hoạt tính protease của Ba, Bn theo thời gian

Thời gian (giờ)

0 4 8 12 16 Ba Hoạt tính UI/ml 4,786 5,306 6,405 8,299 12,499 Bn Hoạt tính UI/ml 4,200 6,164 6,887 7.128 14,152

Bảng 3.4. Sự biến thiên hoạt tính protease của Ba, Bn theo thời gian(tt)

Thời gian (giờ) 20 24 28 32 36 40 Ba Hoạt tính UI/ml 16,976 24,670 25,240 24,275 19,524 16,528 Bn Hoạt tính UI/ml 17,285 22,967 26,445 27,822 26,686 19,524

) l

m

/ I U

Series Ba 1 Bn Series 2

( h n í t t ạ o H

20 24 Thời gian (giờ)

Đồ thị 3.3. Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease của Ba, Bn theo thời gian

Nhận xét:

Hoạt tính enzyme protease của cả hai chủng tăng nhẹ trong khoảng thời

gian từ 0-8 giờ đầu, từ 12-32 giờ hoạt tính tăng nhanh và đạt cực đại ở 28 giờ

đối với Ba, 32 giờ đối với Bnsau đó giảm dần.

Nhìn chung hoạt tính enzyme protease của Bncao hơn so với Banhưng

không nhiều, thời gian đạt cực đại lâu hơn khoảng 4 giờ.

3.1.3.3. Kết quả xác định hoạt tính chung enzyme amylase của Ba,

Bn theo thời gian

Bảng 3.5. Sự biến thiên hoạt tính amylase của Ba, Bn theo thời gian

Thời gian (giờ)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Bn Hoạt tính (UI/ml) 0,00168 0,00233 0,00294 0,00583 0,0116 0,01822 0,0285 0,03141 0,03252 0,03045 0,02411

0,035

0,03

0,025

Ba Hoạt tính (UI/ml) 0,0015 0,00134 0,00266 0,00615 0,01149 0,01793 0,02805 0,03123 0,0304 0,0282 0,02368

0,02

0,015

Hoạt tính (UI/ml)

0,01

0,005

Ba Series1 Bn Series2

Thời gian (giờ)

Đồ thị 3.4. Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase của Ba, Bn theo thời gian

Nhận xét:

Hoạt tính enzyme amylase của cả hai chủng tăng rõ trong khoảng 12-32

giờ, sau đó giảm dần. Với Ba, hoạt tính đạt cực đại ở 28 giờ còn Bn ở 32 giờ.

Nhìn chung, hoạt tính enzyme amylase của cả hai chủng là gần như

nhau, đối với Bn hoạt tínhenzyme có sự biến động nhẹ và thời gian đạt cực

đại lâu hơn so với Ba.

Kết luận chung:

Qua kết quả khảo sát hoạt tính hệ enzyme của hai chủng Ba, Bnchúng tôi

nhận thấy gần như cả hai hoạt tính amylase và protease của Bncó phần trội

hơn nhưng không đáng kể, kết hợp với đặc điểm sinh lý, sinh hóa thì chủng

Bahoàn toàn mang những đặc điểm giống với Bn (có nguồn gốc từ sản phẩm

Nattospes của Nhật),có thể ứng dụng tốt trong công nghệ thực phẩm, đặc biệt

là thực phẩm chức năng, nhằm khẳng định chủng Ba của Việt Nam cũng có

vai trò chức năng không kém so với chủng Bn của Nhật. Vì vậy chúng tôi

chọn Badùng để thủy phân protein và tinh bột trong cơ chất bã đậu nành và

cám gạo, tạo thực phẩm dạng bột có thể dùng làm thực phẩm chức năng.

3.2. Kết quả chế biến sản phẩm

3.2.1. Kết quả thủy phân xơ của hỗn hợp bã đậu nành và cám bằng các

enzyme của tơ nấm Linh chi

Với tỉ lệ giống cấy là 10% sau 9 ngày tơ nấm lan rộng, phủ khắp bề mặt và

trong lòng khối cơ chất.

Hình 3.9. Bịch cơ chất sau 9 ngày nuôi tơ nấm Linh chi Hình 3.10. Mặt cắt đôi khối cơ chất sau 9 ngày nuôi tơ nấm Linh chi

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân xơ

Hiệu suất thủy phân

NL Sau khi xay nhuyễn Xay nhuyễn

Sau 9 ngày nuôi tơ nấm Linh chi

Hàm lượng xơ (%)

16,12% 5,97% 4,896% 62,97% 69,63%

Nhận xét:

Nhờ enzyme cellulase của tơ nấm Linh chi mà hàm lượng cellulose của

khối cơ chất sau khi cấy Linh chi giảm đáng kể và sau khi xay nhuyễn thì

lượng cellulose cũng giảm khá nhiều, do trong quá trình xay chất xơ trong

nguyên liệu được tiếp xúc tốt hơn với enzyme cellulose.

Vì vậy việc sử dụng sinh khối tơ nấm Linh chi để thủy phân cellulose có

trong bã đậu nành và cám gạo là rất hợp lý và hữu hiệu.

3.2.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein, tinh bột trên cơ

chất bã đậu nành và cám gạo bằng các enzyme của Ba

 Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein

Thời gian (giờ)

Tỉ lệ giống %

1 5

0 4 8 12

0,295 0,317 0,369 0,413 0,458 Chưa nhuyễn 0,578 20

3 % Nformol 0,318 0,344 0,422 0,514 0,698 Nhuyễn 0,8167 Nhuyễn, màu vàng tươi 0,393 0,405 0,45 0,579 0,715 Nhuyễn 0,905 Nhuyễn, màu vàng tươi Khá nhuyễn màu vàng tươi

Bả 3 7 Kết ả khả át khả ă thủ hâ t i (tt) Tỉ lệ giống %

1% 5% Thời gian (giờ)

1,212 24

0,861 Nhuyễn, đắng, béo, thơm nồng, màu vàng tươi 3% % Nformol 1,089 Nhuyễn, đắng, béo, thơm nồng, màu vàng tươi Nhuyễn, đắng, béo, thơm nồng, màu vàng tươi

1,038 1,379 28

Sẫm màu, hơi bị sình Nhuyễn, đắng, béo, nồng, màu vàng tươi 1,502 1,324 1,518 Nhuyễn, nhớt, dẻo, vị đắng, béo, nồng 1,593 32 Sẫm màu, sình, nồng Sẫm màu, nồng,

1,8

1% 3% 5%

1,6

1,4

nhớt,dẻo Sẫm màu,nồng, nhớt, nhão

)

1,2

%

(

0,8

l o m r o f

N

0,6

0,4

0,2

12 Thời gian ( giờ)

Đồ thị 3.5.Hàm lượng Nformoltheo thời gian và tỉ lệ giống Ba sử dụng

Nhận xét:

Trong khoảng từ0-12 giờ hàm lượng Nformolđược tạo ra chưa cao và ít có

sự khác biệt giữa 3 tỉ lệ giống khảo sát là 1%, 3%, 5%.

Từ 16-32 giờ hàm lượng Nformol tăng mạnh và có sự khác biệt rõ giữa các

tỉ lệ giống khảo sát:

- Với tỉ lệ Ba 1%, quá trình thủy phân chậm hơn, hàm lượng Nformolđược

tạo ra ít hơn và tới 28 giờ cơ chất bắt đầu bị sình và sẫm màu.

- Với tỉ lệ Ba 3%, ở thời điểm 16 giờ khối cơ chất nhuyễn hơn, hàm

lượng Nformol tăng đáng kể, khối cơ chất có màu vàng tươi, vị béo và có mùi

thơm nồng. Song tới 28 giờ cơ chất có mùi hơi nồng, ở 32 giờ cơ chất trở nên

dẻo,nhiều nhớt và sẫm màu. Nên ngừng thủy phân ở 24 giờ.

- Với tỉ lệ Ba 5%, tới 28 giờ cơ chất trở nên dẻo và có nhiều nhớt. Nên

ngừng thủy phân ở 24 giờ.

 Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột

Tỉ lệ giống %

0 4 8 12 16

11,786 11,742 11,728 11,599 11,503 Chưa nhuyễn 10,905

1 5 Thời gian (giờ)

Khá nhuyễn màu vàng tươi

Nhuyễn, màu vàng tươi

11,762 11,685 11,407 10,412 9,148 Nhuyễn 8,19 Nhuyễn, màu vàng tươi

10,215 Nhuyễn, đắng, béo, thơm nồng, màu vàng tươi

3 % tinh bột 11,776 11,733 11,537 10,981 10,172 Nhuyễn 9,176

7,778 Nhuyễn, đắng, béo, thơm nồng, màu vàng tươi

7,408 Nhuyễn, đắng, béo, thơm nồng, màu vàng tươi

9,603

6,974

6,634 Nhuyễn, nhớt, dẻo, sẫm màu

Sẫm màu, hơi bị sình Nhuyễn, đắng, béo, hơi nồng, màu vàng tươi

8,339

5,983

5,797

Sẫm màu, sình, nồng Sẫm màu, nồng,

nhớt, dẻo

Sẫm màu,nồng, nhớt, nhão

Tinh bột (%)

20 16 12 Thời gian (giờ)

Đồ thị 3.6. Hàm lượng tinh bột theo thời gian và tỉ lệ giống Ba sử dụng

Nhận xét:

Với tỉ lệ giống 1%, hàm lượng tinh bộtđược thủy phân chưa cao qua các

mốc thời gian khảo sát.

Với tỉ lệ giống khảo sát là 3%, 5%, hàm lượng tinh bộtđược thủy phân

chậm trong khoảng từ0-12 giờ. Từ 16 giờ trở đi hàm lượng tinh bột được thủy

phân mạnh .

Kết hợp giữa cảm quan và hàm lượng tinh bột được thủy phân thì nên

ngừng thủy phân ở 24 giờ đối với cả 2 tỉ lệ giống là 3% và 5%.

Hiệu suất thủy phân tinh bột ở 24 giờ với tỉ lệ giống cấy 3% là 33,95%,

5% là 37,02%.

Kết luận chung:

Dựa vào yếu tố cảm quan, hàm lượng Nformol được tạo ra và hiệu suất

thủy phân tinh bột trên cơ chất là bã đậu nành và cám gạo thì ở cả 2 tỉ lệ giống

cấy 3%, 5% đều có thể được sử dụng. Tuy nhiên ở tỉ lệ giống cấy là 5% thì

khối cơ chất nhanh bị đổi màu, bên cạnh đó hàm lượng Nformol được tạo ra và

hiệu suất thủy phân tinh bột không cao hơn nhiều so với tỉ lệ giống cấy là 3%.

Nên tỉ lệ giống Bađược chọn là 3% và thời gian thủy phân là 24 giờ.

3.2.3. Kết quả phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm

Bảng 3.9.Kết quả phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm

Chỉ tiêu NL% SP% Nhận xét

Do NL trước khi chế biến phải có công đoạn bổ

sung ẩm để đạt 50%, mặc dù SP đã trải qua công Độ ẩm 6,75 8,26

đoạn sấy chân không nhưng độ ẩm của SP vẫn cao

hơn NL tuy nhiên vẫn không có ảnh hưởng gì đến

chất lượng cũng như cảm quan của SP.

Hàm lượng xơ trong SPgiảm đáng kể so với hàm Xơ 16,12 4,896 lượng xơ trong NL.

Hàm lượng Nts giảm vì vi sinh vật sử dụng nguồn

nitơ cho hoạt động sống của chúng. Chỉ tiêu Nts

còn cho thấy hàm lượng protein trong SP tương 2,275 1,692 Nts

đương 10,575%(1,629 x 6,25) là khá cao ở một số

sản phẩm thực phẩm dạng bột có nguồn gốc từ phụ

liệu bã đậu nành và cám gạo.

Hàm lượng Nformoltăng do hoạt động thủy phân

protein củaBa. Hàm lượng protein thủy phân xấp 0,247 1,089 Nformol

xỉ mức0,5 (Nformol/Nts=1,089/2,275 = 0,479)

Hàm lượng tinh bột giảm dohoạt động thủy phân Tinh bột 11,81 7,778 tinh bột của Ba.

Hàm lượng đường tổng giảm là do nấm sợi Linh 3,25 2,96 chi và Ba sử dụng lượng đường này cho các hoạt Đường tổng

động sống của chúng.

Bảng 3.9.Kết quả phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm (tt)

Chỉ tiêu NL% SP% Nhận xét

Hàm lượng đường khử tăng là do hoạt động của tơ

nấm Linh chi tiết ra enzyme cellulase để thuỷ phân 0,62 1,14

Đường khử một phần cellulose thành glucose và Ba tiết

enzyme amylase thủy phân một phần tinh bột

thành glucose.

Hàm lượng NNH3 tăng do các vi sinh vật chuyển

hóa protein thành các acid amin và giải phóng một

tỉ phần NH3. Tuy nhiên lệ NNH3/Nformol= 0,039 0,086 NNH3

0,086/1,089 = 0,0789 là rất thấp, vẫn còn rất xa

dưới mức cho phép (< 0,5) nên không ảnh hưởng

xấu đến chất lượng sản phẩm.

Trong quá trình xử lý với các loại vi sinh vật hàm

lượng lipid trong SP cao hơn trong NL, có thể là Lipid 10,27 10,68

do Ba tích luỹ trong quá trình tăng sinh khối.

Chỉ số peroxide giảm mạnh (46,6%) có thể là do

tơ nấm Linh chi và Ba tạo các enzyme peroxidase

khử các peroxide có sẵn trong NL và trong SP. Do Peroxide 0,73 0,39

đó có thể kết luận nấm sợi Linh chi và Ba có khả

năng chống oxy hóa rất tốt.

3.2.4. Kết quả định tính một số HCSH của nấm sợi Linh chi trong sản

phẩm

 Kết quả định tính saponin

(1): nước cất 1 3 2 (2): dịch chiết mẫu

(3): dịch chiết mẫu sau khi

lắc xuất hiện bọt bền trong

60 phút cósaponin.

→

Hình 3.11. Định tính saponin

 Kết quả định tính steroid

1 2 3

(1): nước cất (2): dịch chiết mẫu với

CHCl3

(3): dịch chiết mẫu + CHCl3

+ H2SO4 đậm đặc xuất hiện

màu đỏ sẫm cósteroid.

→

Hình 3.12. Định tính steroid

 Kết quả định tính alkaloid

(1): nước cất 1 2 3 4

(2): dịch chiết mẫu

(3): định tính với thuốc thử

Mayer xuất hiện tủa vô

định hình màu trắng vàng

(4): định tính với thuốc thử

Wagner xuất hiện tủa nâu

đen

cóalkaloid.

Hình 3.13. Định tính alkaloid →

 Kết quả định tính triterpenoid

(1): nước cất 1 2

(2): dịch chiết mẫu + anhydrid

acetic + chloroform +

H2SO4 đậm đặc xuất hiện màu

xanh lục có triterpenoid.

→

Hình 3.14. Định tính triterpenoid

Kết luận:

Sau khi định tính các HCSH có trong sản phẩm ta thấy sản phẩm có

nguyên liệu từ bã đậu nành và cám gạo được thủy phân bằng tơ nấm Linh chi

cũng có các thành phần dược chất tương tự như trong quả thể. Nghĩa là, so

với quả thể Linh chi thì sản phẩm này cũng có tác dụng chữa bệnh tương tự.

Tuy nhiên, chúng có thể chứa hàm lượng khác nhau, điều này cần xác định cụ

thể bằng các phương pháp định lượng để cho kết quả chính xác hơn.

3.2.5. Kết quả định lượng Ba tổng số và bào tử Ba trong sản phẩm

Bảng 3.10. Kết quả định lượng Ba tổng số và bào tử Ba trong sản

phẩm

Ba tổng số Bào tử Ba CFU/g 5,1x109 3,8x108

Nhận xét:

Sản phẩm sau khi sấy vẫn còn một lượng lớn sinh khối Ba và đặc biệt là

lượng bào tử Ba có trong sản phẩm, lượng bào tử này có khả năng tồn tại

trong môi trường acid của dạ dày, điều đó giúp Ba có thể sống sót trong ống

tiêu hóa. Ngoài ra theo Lê Chiến Phương, một lượng đáng kể tế bào sinh

dưỡng khi vô dạ dày trở thành bào tử, chúng có khả năng tồn tại trong thời

gian ở dạ dày và trở thành dạng hoạt động sau đó [15].

3.2.6.Hoạt tính enzyme có trong 1g sản phẩm

Bảng 3.11. Hoạt tính enzyme có trong 1g sản phẩm

Enzyme Cellulase Protease Amylase Hoạt tính ( UI/g) 6,53 8,16 0,018

Nhận xét:

Sản phẩm qua quá trình sấy vẫn còn hoạt lực của các enzyme và đặc biệt

enzyme cellulase vẫn còn hoạt tính.

3.2.7. Kết quả kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm

Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra vệ sinh an toàn toàn thực phẩm

Chỉ tiêu PP thử nghiệm

E.coli Coliforms Clostridium perfringens Tổng số nấm men Tổng số nấm mốc B.cereus Staphylococcus aureus Kết quả <0,3 <10 <10 <10 <10 <10 <10 Đơn vị MPN/g MPN/g CFU/g CFU/g CFU/g CFU/g CFU/g ISO 7251:2005 ISO 4831:2006 ISO 7937: 2004 ISO 21527: 2008 ISO 21527: 2008 NF V08-023:1998 ISO 6888-1:1999

Nhận xét:

Các chỉ tiêu vi sinh đều nằm trong giới hạn cho phép.

3.2.8. Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm

 Đặc điểm cảm quan sản phẩm

Hình thái: dạng bột mịn

Màu sắc: vàng

Mùi: thơm nồng

Vị: đắng của Linh chi

Hình 3.15. Sản phẩm dạng bột

 Kết quả khảo sát

Bảng 3.13. Kết quả khảo sát

Điểm Số người 1 0 2 0 3 11 4 10 5 19 6 38 7 12 8 10 9 0

Bảng 3.14. Các tham số đặc trưng

f Cv% SE

𝑋� ± Các tham số Giá trị 100 24,87 5,6 0,13928

0,4

0,35

0,3

0,25

0,2

±  Đồ thị kết quả phân phối tần suất

0 0 1 / i f

0,15

0,1

0,05

Đồ thị 3.7.Kết quả phân phối tần suất

Nhận xét:

Qua thực nghiệm đánh giá cảm quan, ta thấy mức độ ưa thích cũng như

sự hài lòng của người thử đối với sản phẩm nằm trong khoảng 5,6 0,13928,

tương đương điểm 6 trong bản điểm là tương đối thích. Vì đây là sản phẩm ±

mới còn lạ với người tiêu dùng hơn nữa sản phẩmcó nguồn nguyên liệu là các

phụ phế phẩm (bã đậu nành và cám gạo) cộng thêm vị đắng của Linh

chi,ngoài ra, sản phẩm mới chỉ là phần thô, chưa bổ sung các gia vị cần thiết

như hương, vị, màu,... nên độ ưa thích chưa cao.

Kết quả thực nghiệm là tin cậy vì có hệ số biến thiên Cv%<30%.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

 Xây dựng được quy trình chế biến sản phẩm

 Tạo được sản phẩm thực phẩm có triển vọng trong việc hỗ trợ tiêu hóa,

điều trị bệnh ung thư, các bệnh về tim mạch và nâng cao hệ miễn dịch cho cơ

thể, có thể được dùng làm thực phẩm chức năngnhờ sử dụng hỗn hợp hai

chủng vi sinh vật là nấm sợi Linh chivà Ba thủy phân cơ chất bã đậu nành và

cám gạo, tạo sản phẩm có chứa các thành phần quan trọng:

Bảng một số chỉ tiêu quan trọng trong sản phẩm

Hoạt tính enzyme

Sinh khối vi sinh vật HCSH có dược tính từ Linh chi

Cellulase = 6,53 ( UI/g) Protease = 8,16 ( UI/g) Amylase = 0,018 ( UI/g) Ba tổng số = 5,1x109 CFU/g Bào tử Ba = 3,8x108 CFU/g Saponin Steroid Alkaloid Triterpenoid

 Đồng thời so sánh được một số đặc điểm sinh học quan trọng của

chủng Ba sử dụng trong đề tài tương đương với chủng Bn (dùng để sản xuất

chế phẩm Nattospes của Nhật) và Linh chi (Ganoderma lucidum) có thể được

so sánh với nấm Đông cô (Shitake mushroom) trong việc thủy phân các

polysaccharide từ cám gạo.

Kiến nghị

Do thời gian và điều kiện có hạn nên chúng tôi vẫn chưa khảo sát trọn

vẹn và đầy đủ hơn các thông số liên quan đến quá trình chế biến sản phẩm. Vì

vậy chúng tôi có một số kiến nghị sau:

 So sánh thêm hoạt tính protease , amylase của BnvớiBa trên cơ chất bã

đậu nành và cám gạo.

 Đánh giá cảm quan sản phẩm chi tiết hơn ở các đặc điểm: trạng thái,

màu, mùi, vị…

 Nghiên cứu lâm sàng để chứng tỏ những lợi ích cho sức khỏe khi sử

dụng sản phẩm và khẳng định sản phẩm này là thực phẩm chức năng.

 Ứng dụng vào sản xuất ở quy mô sản xuất thử.

Với các kiến nghị trên, chúng tôi hi vọng phương pháp chế biến thực

phẩm chức năng từ bã đậu nành và cám gạo bằng phương pháp sinh học: thủy

phân cellulose bằng nấm sợi Linh chi và thủy phân protein không tan và tinh

bột bằng Bangày càng hoàn thiện hơn. Đồng thời tận dụng được các phụ phế

phẩm công nghiệp để tạo nên sản phẩm có lợi cho sức khỏe của người sử

dụng và nâng cao giá trị kinh tế của các nguồn phụ phế phẩm này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Phạm Thị Trân Châu, Thực hành sinh hóa, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội,

tr.54-56.

2. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hường, Phùng Gia Tường (1997), Thực

tập lớn sinh hóa, Nxb Giáo dục, Hà Nội.

3.Nguyễn Hoàng Dũng (2005), Giáo trình thực hành đánh giá cảm quan, Đại

học Bách Khoa TP.HCM, tr.9-10, 36-37.

4. Nguyễn Lân Dũng (2008), Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 2, Nxb Nông

nghiệp, Hà Nội.

5. Nguyễn Lân Dũng, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình

Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương

pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.

6.Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1976), Vi sinh vật

học, tập 2,Nxb Đại học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội.

7. Vũ Văn Độ, Lê Chiến Phương, Lê Duy Thắng (2004), Nghiên cứ tận dụng

bã đậu nành bằng phương pháp lên men xốp bởi nấm sợi:Linh chi

(Gnoderma lucidum) và bào ngư (pleurotus florida) dùng trong chế

biến thực phẩm, Viện Sinh học Nhiệt đới, TPHCM. Đề tài do Sở KH &

CN TP.HCM đã nghiệm thu.

8.Phạm Thị Ánh Hồng, Kỹ thuật sinh hóa, Trường Đai học Quốc gia,

TP.HCM, tr.32, 113-114,164-166,174.

9. Lại Mai Hương và các CTV (2008), Nghiên cứu công nghệ chế biến bã đậu

nành tạo chế phẩm dinh dưỡng giàu chất xơ, Báo cáo nghiệm thu,

Trường Đại học Bách Khoa, TP.HCM.

10. Nguyễn Đình Huyên và cộng sự, Giáo trình thực tập lớn sinh hóa, trường

Đại học Tổng hợp, TP.HCM, tr.43- 46.

11.Nguyễn Trí Lộc, GĐ nhà máy II của Cty Tribeco, phát biểu tại Sở KH &

CN TP.HCM tháng 10.2007.

12. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, Đại học Quốc gia

TP.HCM, trường ĐH Bách Khoa, Nxb Đại học Quốc gia, TP.HCM.

13. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Nxb Kỹ thuật, Hà Nội.

14. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2006), Thí nghiệm vi sinh vật học thực

phẩm, Nxb ĐHQG, TP.HCM.

15.Lê Chiến Phương, Trần Văn Năm và các CTV (2013), nghiên cứu tạo loại

thức uống chức năng mới từ các loại nguyên liệu thực vật để phổ biến

trong cộng đồng.Đề tài do Sở KH & CN TP.HCM cấp kinh phí, đã

nghiệm thu.

16.Lê Chiến Phương, Lê Thị Bích Phượng, Đỗ Thị Tuyến, Vũ Đăng Khánh

(2004), Nghiên cứu chế biến các loại thực phẩm ăn liền, thực phẩm lên

men có giá trị dinh dưỡng cao, tiện sử dụng từ đậu nành và các phế

liệu của đậu nành, Viện Sinh học Nhiệt đới, TP.HCM. Đề tài do Sở KH

& CN TP.HCM đã nghiệm thu.

17. Lê Xuân Thám (1996), Nấm Linh chi,nguồn dược liệu quý ở Việt

Nam,khảo cứu kết hợp các kỹ thuật phóng xạ hạt nhân, Nxb Mũi Cà

Mau, TP.HCM,tr. 51-57.

18.Đồng Thị Thanh Thu (2000), Sinh hóa ứng dụng, Nxb Đại học Quốc gia,

TP.HCM, tr. 218.

19.Phòng kỹ thuật Cty Sữa Việt Nam 10.8.2001.

20. Bộ môn Dược liệu, khoa dược (2009), giáo trình Thực tập dược liệu,

Trường Đại học Y dược TP.HCM, tr.26-61.

21. Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm”

của Bộ Y tế số 46/2007/ QĐ-BYT,tr.63.

Tiếng Anh

22. Elina Tuomola, Ross Grittenden, Martin Playne, Erika Isolauri, and Seppo

Salmine (2001), “Quality assurance criteria for probiotic bacteria”, The

American Journal of Clinial Nutrition.

23.Gangadharan D, Sivaramakrishnan S, Namboothiri KM, Pandey A (2006),

Solid culturing of Bacillus amyloliquefaciens for -amylase production,

Food Technol Biotechnol, 44(2), pp. 269–274.

24. Ghoneum M. (1998), Anti-HIV activity in vitro of MGN-3, and activated

arabinoxylan from rice bran, Biochem Biophys Res Commun 234,

pp.25-29.

25. Ghoneum M. (1998), “Enhancement of human natural killer cell activity

by modified arabinoxylane from rice bran (MGN-3)”, Int. J.

Immunotherrapy XIV (2),pp. 89-99.

26. John G.Holt, Noel R.Knieg, Peter H.A.Sneath, James T. Staley, Stanky

T.Williams, Bergey’s Manual of Determinative bacteriology, Ninth

edition.

27.Jonathan W.DeVries, Ph.D, Total dietary fiber, Medallion Laboratories.

28. Ralph E. Holsworth, Jr., D.O. , Nattokinase and Cardiovascular Health.

29. E.M.EL-Safey, U.M.Abdul-Raouf (2004) Production, purification and

characterization of protease enzyme from Bacillus , International

conferences for development and the enviroment in the Arab world,

Assiut University,14.

30. Sasidhara R. and T. Thirunalasundari.(2014), “Lignolytic and

lignocellulosic enzymes of Ganoderma lucidum in liquid medium”,

European Journal of Experimental Biology, 4(2), pp.375-379.

31.Stephen A.Norrell, Karen E.Mesley (1997), Microbiology Laboratory

Manual,principles and applications, Prentice Hall Inc.,New Jersey.

32.Vander Riet, W.B.; Wight, A.W; Cilliers, J.J.L; Datel, J.M.Food (1989),

Chemical investigation of tofu and its by product okara, Food Chem,

(34), pp.193-202.

33. IOSR Journal of Environmental Science, “Toxicology and Food

Technology (IOSR-JESTFT)” ISSN: 2319-2402, ISBN: 2319-2399.

Volume 1, Issue 2 (Sep-Oct. 2012), pp.32-35.

34. International Journal of ChemTech Research CODEN (USA), “Production

and Characterisation of an Alkaline Protease from Bacillus

amyloliquefaciens isolated from the Soil” IJCRGG ISSN : 0974-4290.

Vol.6, No.7 (Sept-Oct 2014), pp 3860-3863.

Internet

35. http://vads.org.vn/vi-vn/tintuc/33/30/Default.aspx

36. http://nnptntvinhphuc.gov.vn/index.php?action=details&&idmuc=spl2

37. http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%A1m_g%E1%BA%A1o

38. www.Nutritiondata.com

39. http://www.biobran.org/overview/

40.http://www.linhchivn.com/tim-hieu-them/de-tai-nghien-cuu-nam-linh-chi-

6-2014-truong-dh-khoa-hoc-cn-thuc-pham-hcm.html

41.http://www.heo.com.vn/?x/=newsdetail&n=3287&/c/=55&/g/=2&/6/4/201

1/cam-gao-%E2%80%93-thanh-phan-huu-dung-cho-heo-o-moi-lua-

tuoi--rice-bran--useful-component-to-all-category-of-pig.html

42. http://bomhutchankhong.net/ung-dung-bom-hut-chan-khong-trong-cong-

nghe-say-kho/

43.https://lacotech.com/ProductFiles/SMT-04-

1011%20revA1%20(App%2005-07%20Vacuum%20Drying).pdf

44. http://www.textbookofbacteriology.net/Bacillus_2.html

45. https://myorganicchemistry.wikispaces.com/Cellulose

46.http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-

explorer/learning-center/carbohydrate-analysis/carbohydrate-analysis-

ii.html

47. http://www.scientificpsychic.com/fitness/carbohydrates2.html

48. http://www.ganoderma-extract.com/

49. http://textbookofbacteriology.net/Bacillus.html

50. http://www.abitep.de/en/research.html

51. http://www.vedan.com/english/products/pro01_012.html

PHỤ LỤC

Bình tăng sinh Ba (trái) sau 24 giờ, Bn (phải) sau 28 giờ trong môi trường sữa đậu nành

Bình nấm sợi Linh chi nuôi lắc sau 4 ngày trong môi trường dịch nước giá

ONEWAY OD BY Nongdo /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS. ODDescriptives mg/m

Mean

Std.

Std. Error

95% Confidence Interval

Minimum

Maximum

Deviation

for Mean

Lower

Upper

Bound

.12367

.025929

.014970

.05925

.18808

.094

.142

.26200

.048384

.027934

.14181

.38219

.226

.317

.51367

.033081

.019099

.43149

.59584

.482

.548

.69767

.077002

.044457

.50638

.88895

.621

.775

.85267

.035473

.020480

.76455

.94079

.821

.891

.96767

.003055

.001764

.96008

.97526

.965

.971

1.23333

.085149

.049161

1.02181

1.44485

1.163

1.328

1.40600

.057297

.033081

1.26367

1.54833

1.344

1.457

Total

.75708

.431134

.088005

.57503

.93914

.094

1.457

Bảng: Kết quả đo OD <540nm> dựng đường glucose chuẩn

Phương trình đường chuẩn glucose

1,6

1,4

Đường glucose chuẩn

1,2

0,8

y = 1,8269x - 0,0649 R² = 0,9943

D O

0,6

0,4

0,2

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Nồng độ glucose (mg/ml)

Bảng: Kết quả đo OD <540nm> xác định hoạt tính enzyme cellulase

OD1 OD2 Thời gian (ngày)

ONEWAY HoattinhCMCase BY Thoigian /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY

0.314 0.315 0.372 0.515 0.587 0.614 0.609 ĐC 0 2 4 6 8 10 0.323 0.325 0.369 0.529 0.581 0.628 0.602

/MISSING ANALYSIS. Descriptives HoattinhCMcase

Ngày N

Mean

Std.

Std. Error

95% Confidence

Minimum Maximum

Deviation

Interval for Mean

Lower

Upper

Bound

.04800

.022627

.016000

-.15530

.25130

.032

.064

1.66500

.271529

.192000

-.77459

4.10459

1.473

1.857

6.51600

.113137

.080000

5.49950

7.53250

6.436

6.596

8.50100

.339411

.240000

5.45151 11.55049

8.261

8.741

9.68600

.113137

.080000

8.66950 10.70250

9.606

9.766

9.19000

.362039

.256000

5.93721 12.44279

8.934

9.446

Total 12

5.93433 3.923117

1.132506

3.44170

8.42696

.032

9.766

ONEWAY OD BY Nongdo /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS ODDescriptives

Mean

Std. Deviation Std. Error

95% Confidence Interval

Minimum Maximum

Bảng kết quả đo OD <490n> dựng đường chuẩn để định lượng đường tổng số

for Mean

g/ml

Lower Bound

Upper

Bound

.08200

.023065

.013317

.02470

.13930

.064

.108

.18900

.015875

.009165

.14957

.22843

.177

.207

.29067

.014503

.008373

.25464

.32669

.276

.305

.36133

.022368

.012914

.30577

.41690

.346

.387

.47333

.023587

.013618

.41474

.53193

.451

.498

.55200

.017692

.010214

.50805

.59595

.536

.571

.63700

.038432

.022189

.54153

.73247

.594

.668

.76933

.040673

.023483

.66829

.87037

.731

.812

.82033

.012097

.006984

.79028

.85038

.811

.834

Total

.46389

.245856

.047315

.36663

.56115

.064

.834

𝜇

Phương trình đường chuẩn định lượng đường tổng

0,9

0,8

Đồ thị chuẩn dùng định lượng đường tổng

0,7

0,6

0,5

y = 0,0093x - 0,0008 R² = 0,9969

D O

0,4

0,3

0,2

0,1

100

50 70 Nồng độ đường (µg/ml)

ODDescriptives

g/ml

Mean

Std.

Std. Error

95% Confidence Interval for

Minimum Maximum

Deviation

Mean

𝜇

Lower Bound Upper Bound

.23633

.013013

.007513

.20401

.26866

.223

.249

.59467

.019218

.011096

.54693

.64241

.574

.612

.90467

.037873

.021866

.81059

.99875

.874

.947

1.16267

.045391

.026206

1.04991

1.27542

1.134

1.215

1.26667

.023459

.013544

1.20839

1.32494

1.248

1.293

1.49600

.006083

.003512

1.48089

1.51111

1.492

1.503

1.72533

.071501

.041281

1.54772

1.90295

1.645

1.782

1.98233

.051160

.029537

1.85525

2.10942

1.929

2.031

.93654

1.40563

.223

2.031

Total

1.17108

.555446

.113380

Bảng kết quả đo OD <710nm> dựng đường chuẩn để định lượng đường khử ONEWAY OD BY Nongdo /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS.

Phương trình đường chuẩn định lượng đường khử

2,5

Đồ thị chuẩn dùng định lượng đường khử

1,5

y = 0.0235x + 0.1131 R² = 0.9853

D O

0,5

30 Nồng độ đường (µg/ml)

Bảng Kết quả đo OD <660nm> dựng đường chuẩn Tyrosine

ONEWAY OD BY Nongdo /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS. ODDescriptives µg/ml

Mean

Std.

Std. Error

95% Confidence Interval

Minimum

Maximum

Deviation

for Mean

Lower

Upper Bound

Bound

.12967

.014364

.008293

.09398

.16535

.119

.146

.19000

.029462

.017010

.11681

.26319

.158

.216

.28900

.024637

.014224

.22780

.35020

.263

.312

.37167

.030238

.017458

.29655

.44678

.346

.405

.49667

.037287

.021528

.40404

.58929

.457

.531

.55967

.063516

.036671

.40188

.71745

.497

.624

.62900

.004359

.002517

.61817

.63983

.624

.632

.70133

.010116

.005840

.67620

.72646

.695

.713

Total

.42088

.201190

.041068

.33592

.50583

.119

.713

Phương trình đường chuẩn

0,8

0,7

Đường chuẩn Tyrosin

0,6

0,5

0,4

y = 0,0085x + 0,039 R² = 0,9933

D O

0,3

0,2

0,1

Nồng độ Tyrosin (µg/ml)

Bảng Kết quả đo OD <660nm> xác định hoạt tính enzyme protease của Ba,

Bn theo thời gian, với độ pha loãng 100 lần.

OD3 0.189 0.217 0.219 0.248 0.239 0.301 0.347 0.396 0.432 0.445 0.436 0.368 OD1 0.177 0.299 0.221 0.241 0.263 0.311 0.341 0.409 0.427 0.411 0.362 0.337 Ba OD2 0.165 0.218 0.234 0.241 0.258 0.294 0.338 0.403 0.421 0.418 0.335 0.309 OD3 0.189 0.223 0.229 0.235 0.251 0.289 0.345 0.413 0.416 0.407 0.401 0.365 OD1 0.177 0.221 0.236 0.247 0.254 0.326 0.344 0.394 0.429 0.449 0.431 0.356 Bn OD2 0.165 0.215 0.231 0.236 0.245 0.315 0.342 0.408 0.438 0.445 0.439 0.374 Thời gian(giờ) DC 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Bảng kết quả xác định hoạt tính enzyme protease của Ba

ONEWAY Hoattinh BY Thoigian /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS. Descriptives

Hoattinh

Giờ

Mean

Std.

Std. Error

95% Confidence Interval for

Minimum

Maximum

Deviation

Mean

Lower Bound Upper Bound

4.78633 1.104806

.637860

2.04184

7.53082

3.512

5.475

5.30633 1.599464

.923451

1.33305

9.27962

4.132

7.128

6.40500 1.559836

.900571

2.53015

10.27985

4.752

7.851

8.29867 1.679334

.969564

4.12697

12.47036

6.405

9.607

3 12.49933 1.896330 1.094847

7.78859

17.21008

10.330

13.842

3 16.97567

.878513

.507210

14.79332

19.15801

16.115

17.871

3 24.67000

.750121

.433082

22.80660

26.53340

23.966

25.459

3 25.23967 1.581444

.913047

21.31114

29.16819

23.449

26.445

3 24.27533 1.810213 1.045127

19.77851

28.77215

22.519

26.135

3 19.52400 2.198785 1.269469

14.06191

24.98609

17.561

21.900

3 16.52800 1.653000

.954360

12.42172

20.63428

14.875

18.181

Total 33 14.95530 7.821848 1.361609

12.18180

17.72881

3.512

26.445

Test of Homogeneity of Variances

Hoattinh

Levene Statistic

df1

df2

Sig.

.619

.781

ANOVA

Hoattinh

Sum of Squares

Mean Square

Sig.

Between Groups

1903.187

76.664

.000

Within Groups

54.615

190.319 2.483

Total

1957.802

22 32

ONEWAY Hoattinh BY Thoigian /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS.

Bảng kết quả xác định hoạt tính enzyme protease của Bn

Descriptives

Hoattinh

Giờ

Mean

Std.

Std. Error

95% Confidence Interval

Minimum

Maximum

Deviation

for Mean

Lower

Upper

Bound

4.20067

1.174971

.678370

1.28188

7.11946

2.892

5.165

6.16367

.622845

.359600

4.61643

7.71090

5.578

6.818

6.88667

.687535

.396948

5.17874

8.59460

6.095

7.334

7.12767

1.706772

.985405

2.88781

11.36752

5.165

8.264

14.15233

2.236959

1.291509

8.59542

19.70925

11.570

15.495

17.28533

.981950

.566929

14.84603

19.72463

16.321

18.284

22.96700

1.919750

1.108368

18.19808

27.73592

21.383

25.102

26.44467

1.589692

.917809

22.49565

30.39368

25.102

28.200

27.82233

1.262281

.728779

24.68665

30.95801

26.445

28.924

26.68567

1.447389

.835650

23.09015

30.28118

25.515

28.304

19.52400

1.789208

1.033000

15.07936

23.96864

18.491

21.590

Total

16.29636

8.884668

1.546622

13.14600

19.44673

2.892

28.924

Test of Homogeneity of Variances

Hoattinh

Levene Statistic

df1

df2

Sig.

1.430

.232

ANOVA

Hoattinh

Sum of Squares

Mean Square

Sig.

Between Groups

2477.545

112.501

.000

Within Groups

48.449

247.755 2.202

Total

2525.995

22 32

Bảng Kết quả đo OD <660nm> xác định hoạt tính enzyme amylase của Ba,

Bn theo thời gian, với độ pha loãng 100 lần.

Thời gian(giờ) DC 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 OD1 1.869 1.787 1.868 1.767 1.524 1.248 0.853 0.304 0.118 0.158 0.256 0.449 Ba OD2 1.881 1.763 1.699 1.679 1.517 1.226 0.874 0.295 0.109 0.164 0.294 0.592 OD1 1.869 1.796 1.775 1.744 1.613 1.268 0.817 0.241 0.105 0.032 0.127 0.437 Bn OD2 1.881 1.815 1.694 1.649 1.504 1.216 0.901 0.316 0.118 0.064 0.154 0.546 OD3 1.858 1.742 1.746 1.718 1.511 1.172 0.825 0.257 0.101 0.041 0.204 0.569 OD3 1.858 1.805 1.758 1.714 1.532 1.203 0.861 0.288 0.123 0.167 0.312 0.581

ONEWAY Hoattinh BY Thoigian /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS.

Bảng kết quả xác định hoạt tính enzyme amylase của Ba.

Descriptives

Hoattinh

Giờ

Mean

Std.

Std. Error

95% Confidence Interval

Minimum Maximum

Deviation

for Mean

Lower

Upper

Bound

.0015000

.00057105

.00032970

.0000814

.0029186

.00095

.00209

.0013400

.00116228

.00067104

-.0015473

.0042273

.00002

.00221

.0026600

.00088272

.00050964

.0004672

.0048528

.00182

.00358

.0061500

.00030000

.00017321

.0054048

.0068952

.00585

.00645

.0114867

.00034210

.00019751

.0106368

.0123365

.01110

.01175

.0179267

.00015535

.00008969

.0175408

.0183126

.01780

.01810

.0280533

.00013614

.00007860

.0277151

.0283915

.02790

.02816

.0312333

.00015275

.00008819

.0308539

.0316128

.03110

.03140

.0304000

.00010000

.00005774

.0301516

.0306484

.03030

.03050

.0282000

.00055678

.00032146

.0268169

.0295831

.02770

.02880

.0236767

.00143270

.00082717

.0201176

.0272357

.02280

.02533

Total

.0166024

.01192203

.00207536

.0123751

.0208298

.00002

.03140

Test of Homogeneity of Variances

Hoattinh

Levene Statistic

df1

df2

Sig.

4.565

.001

ANOVA

Hoattinh

Sum of Squares

Mean Square

Sig.

Between Groups

.005

978.449

.000

Within Groups

.000

.000 .000

Total

.005

22 32

ONEWAY Hoattinh BY Thoigian /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS.

Bảng kết quả xác định hoạt tính enzyme amylase của Bn

Descriptives

Hoattinh

Giờ

Mean

Std. Deviation

Std. Error

95% Confidence Interval

Minimum Maximum

for Mean

Lower

Upper

Bound

.0016767

.00046372

.00026773

.0005247

.0028286

.00117

.00208

.0023333

.00086176

.00049754

.0001926

.0044741

.00168

.00331

.0029400

.00102093

.00058943

.0004039

.0054761

.00223

.00411

.0058267

.00111132

.00064162

.0030660

.0085873

.00457

.00668

.0116033

.00080959

.00046742

.0095922

.0136145

.01072

.01231

.0182200

.00074505

.00043016

.0163692

.0200708

.01737

.01876

.0284967

.00068296

.00039431

.0268001

.0301932

.02773

.02904

.0314067

.00014742

.00008511

.0310404

.0317729

.03124

.03152

.0325200

.00028844

.00016653

.0318035

.0332365

.03220

.03276

.0304467

.00071248

.00041135

.0286768

.0322166

.02967

.03107

.0241100

.00126645

.00073119

.0209640

.0272560

.02313

.02554

Total

.0172345

.01232057

.00214474

.0128659

.0216032

.00117

.03276

Test of Homogeneity of Variances

Hoattinh

Levene Statistic

df1

df2

Sig.

1.974

.088

ANOVA

Hoattinh

Sum of Squares

Mean Square

Sig.

Between Groups

.005

747.367

.000

Within Groups

.000

.000 .000

Total

.005

22 32

Bảng kết quả % Nformol được thủy phân theo thời gian với tỉ lệ giống Ba 1%,3%, 5% Giờ

Tỉ lệ giống (%) 0 Độ ẩm NL (%) 6.75 VNaOH(ml) V2 1.63 0 V1 1.67 V3 1.71

1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 56.83 56.86 56.95 56.83 56.86 56.95 56.83 56.86 56.95 56.83 56.86 56.95 56.83 56.86 56.95 56.83 56.86 56.95 0.91 0.95 1.13 0.97 1.06 1.16 1.18 1.24 1.28 1.28 1.49 1.85 1.36 2.19 2.28 1.69 2.53 2.95 0.96 0.12 1.37 1.04 1.14 1.31 1.25 1.27 1.4 1.34 1.61 1.71 1.42 2.05 2.19 1.77 2.52 2.78 0.86 0.87 1.23 0.92 0.98 1.27 0.98 1.39 1.47 1.2 1.65 1.78 1.46 2.21 2.13 1.8 2.5 2.62

ONEWAY Dam BY Thoigianvatilegiong /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS.

56.83 56.86 56.95 56.83 56.86 56.95 56.83 56.86 56.95 2.75 3.45 3.6 3.13 4.32 4.69 3.9 4.63 4.8 1 3 5 1 3 5 1 3 5 2.57 3.27 3.73 3.19 4.15 4.57 4.14 4.67 4.86 2.65 3.35 3.85 3.25 4.28 4.75 4.21 4.58 5.04

Descriptives

Dam

Mean

Std.

Std. Error

95% Confidence Interval for

Minimum Maximum

Deviation

Mean

Lower Bound Upper Bound

.24700

.003464

.002000

.23839

.245

.251

.25561

.29533

.016503

.009528

.25434

.279

.312

.33633

.31833

.042454

.024511

.21287

.282

.365

.42379

.39333

.045611

.026333

.28003

.367

.446

.50664

.31667

.019553

.011289

.26809

.298

.337

.36524

4.1

.34400

.026000

.015011

.27941

.318

.370

.40859

4.3

.40533

.025384

.014655

.34228

.377

.426

.46839

4.5

.36867

.045236

.026117

.25629

.318

.405

.48104

8.1

.42167

.025891

.014948

.35735

.402

.451

.48598

8.3

.44967

.031342

.018095

.37181

.416

.478

.52753

8.5

.41300

.023065

.013317

.35570

.389

.435

.47030

12.1

.51367

.026502

.015301

.44783

.484

.535

.57950

12.3

.57900

.023000

.013279

.52186

.556

.602

.63614

12.5

.45833

.016166

.009333

.41818

.441

.473

.49849

16.1

.69767

.028449

.016425

.62700

.665

.717

.76834

16.3

.71533

.024173

.013956

.65528

.693

.741

.77538

16.5

.57833

.032716

.018889

.49706

.548

.613

.65960

20.1

.81667

.005132

.002963

.80392

.811

.821

.82941

20.3

.90500

.053507

.030892

.77208

.852

.959

1.03792

20.5

.86133

.029569

.017072

.78788

.833

.892

.93479

24.1

1.16279

1.08933

.029569

.017072

1.01588

1.061

1.120

24.3

1.31263

1.21200

.040509

.023388

1.11137

1.171

1.252

24.5

28.1

1.03800

.014731

.008505

1.00141

1.07459

1.025

1.054

28.3

1.37933

.028746

.016597

1.30792

1.45074

1.347

1.402

28.5

1.51767

.031644

.018270

1.43906

1.59627

1.483

1.545

32.1

1.32433

.052548

.030339

1.19380

1.45487

1.265

1.365

32.3

1.50167

.015044

.008686

1.46429

1.53904

1.486

1.516

32.5

1.59333

.040673

.023483

1.49229

1.69437

1.561

1.639

Total

.74121

.423622

.046221

.64928

.83315

.245

1.639

Test of Homogeneity of Variances

Dam

Levene Statistic

df1

df2

Sig.

1.255

.233

ANOVA

Dam

Sum of Squares

Mean Square

Sig.

Between Groups

14.841

569.532

.000

Within Groups

.054

.550 .001

Total

14.895

56 83

Bảng kết quả OD <710nm> với độ pha loãng 100 lần và % tinh bột được

thủy phân theo thời gian với tỉ lệ giống Ba1%,3%, 5%

Giờ OD

Tỉ lệ giống (%) 0 OD1 1.346 OD2 1.348 0

1.341 1.341 1.338 1.342 1.336 1.335 1.335 1.315 1.307 1.327 1.263 1.195 1.316 1.172 1.066 1.255 1.069 0.966 1.184 0.923 0.857 1.117 0.848 0.803 0.989 0.743 0.715 1.347 1.345 1.345 1.337 1.341 1.332 1.341 1.321 1.302 1.322 1.257 1.206 1.313 1.179 1.071 1.249 1.074 0.971 1.176 0.928 0.854 1.115 0.835 0.809 0.979 0.733 0.722 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5 1 3 5

ONEWAY Tinhbot BY Thoigianvatilegiong /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS.

Descriptives

Tinhbot

Mean

Std.

Std. Error 95% Confidence Interval

Minimum Maximum

Deviation

for Mean

Lower

Upper

Bound

11.81400

.014142

.010000

11.68694 11.94106

11.804

11.824

11.78550

.041719

.029500

11.41067 12.16033

11.756

11.815

11.77550

.027577

.019500

11.52773 12.02327

11.756

11.795

11.76150

.047376

.033500

11.33584 12.18716

11.728

11.795

11.74200

.033941

.024000

11.43705 12.04695

11.718

11.766

4.1

11.73250

.033234

.023500

11.43390 12.03110

11.709

11.756

4.3

11.68450

.020506

.014500

11.50026 11.86874

11.670

11.699

4.5

11.72750

.040305

.028500

11.36537 12.08963

11.699

11.756

8.1

11.53650

.040305

.028500

11.17437 11.89863

11.508

11.565

8.3

11.40700

.033941

.024000

11.10205 11.71195

11.383

11.431

8.5

11.59850

.033234

.023500

11.29990 11.89710

11.575

11.622

12.1

10.98100

.041012

.029000

10.61252 11.34948

10.952

11.010

12.3

10.41150

.074246

.052500

9.74442 11.07858

10.359

10.464

12.5

11.50300

.019799

.014000

11.32511 11.68089

11.489

11.517

16.1

10.17200

.046669

.033000

9.75270 10.59130

10.139

10.205

16.3

9.14750

.033234

.023500

8.84890

9.44610

9.124

9.171

16.5

10.90450

.040305

.028500

10.54237 11.26663

10.876

10.933

20.1

9.17600

.033941

.024000

8.87105

9.48095

9.152

9.200

20.3

8.19000

.033941

.024000

7.88505

8.49495

8.166

8.214

20.5

10.21500

.053740

.038000

9.73216 10.69784

10.177

10.253

24.1

7.77800

.033941

.024000

7.47305

8.08295

7.754

7.802

24.3

7.10800

.019799

.014000

6.93011

7.28589

7.094

7.122

24.5

9.60250

.013435

.009500

9.48179

9.72321

9.593

9.612

28.1

6.97400

.087681

.062000

6.18622

7.76178

6.912

7.036

28.3

6.63400

.041012

.029000

6.26552

7.00248

6.605

6.663

28.5

8.33850

.067175

.047500

7.73496

8.94204

8.291

8.386

32.1

5.98300

.067882

.048000

5.37310

6.59290

5.935

6.031

32.3

5.79650

.047376

.033500

5.37084

6.22216

5.763

5.830

32.5

Total

9.91000

2.006948

.268190

9.37254 10.44746

5.763

11.824

Phiếu đánh giá cảm quan sản phẩm

PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN SẢN PHẨM

Họ và tên: Giới tính: Tuổi: Ngày thử:

Bạn nhận được một mẫu sản phẩm thực phẩm chức năng dạng bột từ bã đậu

nành và cám gạo được thủy phân bằng nấm sợi Linh chi và vi khuẩn

B.amyloliquefacien.

Bạn vui lòng nếm và cho biết cảm nhận của mình về sản phẩm theo các mức độ

của thang điểm sau:

6. Tương đối thích

1. Cực kỳ không thích

7. Thích

2. Rất không thích

8. Rất thích

3. Không thích

9. Cực kỳ thích

4. Tương đối không thích

5. Không thích cũng không ghét

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chế biến thực phẩm chức năng từ bã đậu nành (Okara) và cám gạo bằng công nghệ vi sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH

Trần Thị Thảo Nguyên

NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN THỰC PHẨM CHỨC

NĂNG TỪ BÃ ĐẬU NÀNH (OKARA) VÀ CÁM

GẠO BẰNG CÔNG NGHỆ VI SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh-2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH

Trần Thị Thảo Nguyên

NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN THỰC PHẨM CHỨC

NĂNG TỪ BÃ ĐẬU NÀNH (OKARA) VÀ CÁM

GẠO BẰNG CÔNG NGHỆ VI SINH

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. LÊ CHIẾN PHƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh-2014

Hình 1.1. Bã đậu nành dạng bột

Hình 1.2. Cám gạoHình 1.3. Lớp cám trong hạt lúa[36]

Hình1.7. Sự thủy phânpolysaccharide từ cám gạo bởi các enzyme của nấm Đông cô[39]

UI =

a =

X=

X (%) =

Nts (%) =

Nformol(%) = 0,0014

𝒂 × 𝟏, 𝟗

X =

Cv% =

100%(2.18)

Hình 3.5. Tế bàoBa (trái),Bn (phải) (100x)

) l

m

/ I U

( h n

í t t ạ o H

8 Thời gian (ngày)

) l

m

/ I U

( h n í t t ạ o H

20 24 Thời gian (giờ)

)

%

(

l o m r o f

N

12 Thời gian ( giờ)

7,778 Nhuyễn, đắng, béo, thơm nồng, màu vàng tươi

7,408 Nhuyễn, đắng, béo, thơm nồng, màu vàng tươi

20 16 12 Thời gian (giờ)

0 0 1 / i f

D O

/MISSING ANALYSIS. Descriptives HoattinhCMcase

D O

50 70 Nồng độ đường (µg/ml)

D O

30 Nồng độ đường (µg/ml)

ONEWAY OD BY Nongdo /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS. ODDescriptives µg/ml

D O

ONEWAY Hoattinh BY Thoigian /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS. Descriptives

Test of Homogeneity of Variances

ANOVA

Descriptives

Test of Homogeneity of Variances

ANOVA

Descriptives

Test of Homogeneity of Variances

ANOVA

Descriptives

Test of Homogeneity of Variances

ANOVA

Descriptives

Test of Homogeneity of Variances

ANOVA

Descriptives

PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN SẢN PHẨM

Hãy khoanh tròn câu trả lời vào thang điểm trên. Cám ơn các bạn đã hợp tác!