Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu sự biến đổi thành phần gen nhân ITS-2, 28S rRNA và gen ty thể COX1 của loài sán lá gan lớn Fasciola ssp dạng thuần và dạng lai gây bệnh trên động vật tại Việt Nam

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:80

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm giải trình tự và phân tích gen nhân ITS-2, gen 28S của sán lá gan lớn dạng thuần và xác định dạng laigây bệnh trên động vậttại Việt Nam; giải mã gen COX1 của hệ gen ty thể F. hepatica và F. gigantica dạng thuần và dạng lai, phân tích đặc điểm di truyền; xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự của gen ITS-2, 28S rRNA và COX1 trong phân loại. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu sự biến đổi thành phần gen nhân ITS-2, 28S rRNA và gen ty thể COX1 của loài sán lá gan lớn Fasciola ssp dạng thuần và dạng lai gây bệnh trên động vật tại Việt Nam

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------------------- NguyÔn thÞ hoa ¸nh NGHI£N CøU BIÕN §æi thµnh phÇn gen nh©n its-2, 28s rrna vµ gen ty thÓ cox1 cña loµi s¸n l¸ gan lín fasciola ssp d¹ng thuÇn vµ d¹ng lai g©y bÖnh trªn ®éng vËt t¹i viÖt nam LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2016
i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------------------- NGUYỄN THỊ HOA ÁNH NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI THÀNH PHẦN GEN NHÂN ITS-2, 28S rRNA VÀ GEN TY THỂ COX1 CỦA LOÀI SÁN LÁ GAN LỚN FASCIOLA SSP DẠNG THUẦN VÀ DẠNG LAI GÂY BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT TẠI VIỆT NAM TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ BÍCH NGA THÁI NGUYÊN - 2016
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi trực tiếp thực hiện và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chính xác. Ngày…… tháng ….. năm 201… Học viên Nguyễn Thị Hoa Ánh
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến: - TS. Nguyễn Thị Bích Nga là người đã trực tiếp hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận văn. - Cảm ơn các cán bộ của Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học nơi tôi thực tập đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn của mình. Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến: - Ban Giám đốc Đại học Thái Nguyên, Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học, Phòng Đào tạo và Quan hệ Quốc tế, Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên - Sự tài trợ kinh phí của Quỹ phát triển Khoa học và công nghệ quốc gia (Nafosted) cho đề tài mã số 106-YS.02-2013.06 do TS Nguyễn Thị Bích Nga làm chủ nhiệm. - Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân đã luôn khuyến khích,động viên cũng như chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành nghiên cứu của mình. Học viên Nguyễn Thị Hoa Ánh
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC ............................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................... v DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................. vii MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 1.1. Giới thiệu về loài sán lá gan lớn..................................................................... 3 1.1.1.Vị trí phân loại sán lá gan lớn trong hệ thống phân loại động vật ............... 3 1.1.2.Đặc điểm hình thái học của sán lá gan lớn Fasciola sp................................ 3 1.1.3.Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của sán lá. ................................................ 5 1.1.4.Trứng sán lá gan lớn..................................................................................... 8 1.1.5.Sán trưởng thành .......................................................................................... 9 1.2.Đặc điểm của bệnh do sán lá gan lớn............................................................ 10 1.2.1.Cơ chế sinh bệnh ........................................................................................ 10 1.2.2. Đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá Fasciola ở trâu, bò ở Việt Nam .................. 12 1.3. Tầm quan trọng của nghiên cứu giám định loài bằng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự ............................................................................................. 17 1.3.1. Giới thiệu sơ bộ hệ gen nhân ribosomal DNA (rDNA) ............................ 18 1.3.2. Hệ gen DNA ty thể .................................................................................... 19 CHƯƠNG 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 22 2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 22 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................................ 22 2.3. Dụng cụ và thiết bị và hóa chất .................................................................... 22 2.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị ............................................................................... 22 2.3.2. Hóa chất..................................................................................................... 22 2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 23
iv 2.4.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu Fasciola sp ................................ 24 2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số....................................................... 24 2.4.3. Thiết kế mồi, thực hiện PCR gen ITS2, 28S và gen cox1 ........................ 25 2.4.4. Phương pháp giải trình tự.......................................................................... 27 2.4.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu .................................................... 28 CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ............................... 30 3.1. Thu nhận gen ITS-2 trong chẩn đoán phân biệt ........................................... 30 3.1.1. Thu thập mẫu sán lá gan lớn và phân loại hình thái ................................. 30 3.1.2. Sử dụng gen ITS-2 trong chẩn đoán phân biệt.......................................... 30 3.2. Kết quả thu nhận gen 28s và xây dựng cây phả hệ ...................................... 35 3.3. Kết quả thu nhận chuỗi gen ty thể COX1 .................................................... 39 3.3.1. Kết quả giải trình tự gen cox1 của Fasciola sp Việt Nam và so sánh với các loài thuộc lớp sán lá Trematoda .................................................................... 41 3.3.2. Xây dựng mối quan hệ phả hệ giữa các loài thuộc lớp sán lá................... 47 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 54
v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleotide AST Abnormal Spermatogenic Type NST Normal Spermatogenic Type Cox1 cytochrome oxidase subunit 1 ITS-2 Second internal transcribed spacer Rdna Ribosome DNA SLGL Sán lá gan lớn PCR Polymerase chain reaction ddNTP dideoxyrinonucleotide triphosphate dNTP deoxyrinonucleotide triphosphate bp Cặp bazơ (base pair) TAE Tris base-Acetic-EDTA PAGE Điện di gel polyacylamid EtBr Ethidium Bromide EDTA Ethylene Diamine Tetraacemic Acid OD Mật độ quang học Kb Kilobase Kda Kilodalton µl Microlitre µm Micrometer mm Millimeter
vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Danh sách các mồ i dùng trong phản ứng PCR thu nhận gen ITS-2, 28S và COX1. ............................................................................................................. 25 Bảng 3.1. So sánh các nucleotide ở các vị trí biến đổi của vùng giao gen ITS-2 của các mẫu sán lá gan lớn ở các vùng địa lý và vật chủ khác nhau .................. 33 Bảng 3.2. Các mẫu cung cấp chuỗi gen 28S trong nghiên cứu .......................... 36 Bảng 3.3. Các mẫu sán lá Trematoda trong Ngân hàng gen cung cấp chuỗi cox1 sử dụng so sánh đối chiếu trong nghiên cứu ....................................................... 40 Bảng 3.4. Tỷ lệ tương đồng trình tự amino acid gen cox1 của các loài sán lá thuộc lớp Trematoda ..................................................................................................... 46
vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình ảnh mô tả hình thái của sán lá gan lớn Fasciola sp ..................... 4 Hình 1.2. Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của SLGL Fasciola sp ký sinh vật chủ ở động vật và người ............................................................................................... 5 Hình 1.3. Hình ảnh của trứng sán lá gan lớn Fasciola sp phóng đại 400 lần dưới kính hiển vi điện tử................................................................................................ 8 Hình 1.4. Hình thể sán lá gan lớn Fasciola sp trưởng thành ................................ 9 Hình 1.5. Mô hình cấu trúc ribosome DNA của gen nhân và vùng gen cần nghiên cứu 18 Hình 1.6. Mô hình cấu trúc DNA của hệ gen ty thể. .......................................... 20 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu giải mã hệ gen ty thể Fasciola sp. .......... 23 Hình 3.1. Hình ảnh sán lá gan lớn FspNB-VN và FspCB-VN trong nghiên cứu ...........30 Hình 3.2. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của vùng gen ITS-2. ........................ 31 Hình 3.3. So sánh trình tự chuỗi nucleotide ITS-2của 16 mẫu Fasciola sp.. ...... 32 Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR gen 28S với cặp mồi U28SF – U28SR.......... 35 Hình 3.5. Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa mẫu Fasciola sp xác trên lập dựa trên thành phần nucleotide gen 28S ribosome bằng chương trình MEGA6.06 . ............. 38 Hình 3.6. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của gen cox1 với cặp mồiFSP12F – FGHR2. ............................................................................................................... 40 Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn của FspNB-VN và FspCB-VN so sánh với các chuỗi gen cox1 thuộc lớp sán lá Trematoda...........................................44 Hình 3.8. Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ về loài giữa các mẫu sán lá dựa trên thành phần amino acid của gen cox1 bằng chương trình MEGA6.. ................... 48
1 MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Bệnh sán lá gan lớn (fascioliasis) do hai loài Fasciola hepatica và Fasciola gigantica thuộc họ Fasciolidaekí sinh trên động vật nhai lại (trâu, bò, dê, cừu…) và đang dần thích ứng gây bệnh trên người. Trước đây, các đặc tính hình thái học (morphology), sinh thái học (ecology) và huyết thanh học (serology) thường sử dụng trong chẩn đoán cũng đã đáp ứng được phần lớn yêu cầu về phân loại sinh vật trong đó có ngành ký sinh trùng [5],[18]. Tuy nhiên nếu phân loại sán lá gan chỉ dựa vào hình thái thì rất khó phân định. Đặc biệt đã có hiện tượng lai và dạng trung gian (hybrid form) trong quần thể sán lá gan đã được phát hiện, đó là hệ gen có sự trộn lẫn của F. hepatica và F. gigantica (Fh/Fg), trong đó hệ gen nhân tế bào mang gen từ dòng bố (F. hepatica) và hệ gen ty thể (F. gigantica) mang tính di truyền theo dòng mẹ [7]. Bệnh sán lá gan lớn hiện nay được coi là bệnh ký sinh trùng mới nổi bị lãng quên (neglected emerging infectious disease) và đang được tổ chức y tế thế giới (WHO) quan tâm. Sán lá gan lớn gây bệnh ở người, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng, do chúng gây ra các tổn thương bệnh lý ở hệ thống gan mật, gây can xi hóa đường mật, ký sinh lạc chỗ hoặc di chuyển lạc lên não… gây tổn thương nặng ở nhu mô gan làm suy gan dẫn đến tử vong [4], [7], [17]. Một số trường hợpdo bệnh sán lá gan lớn ở người gây phản ứng viêm, xơ hóa gan, dẫn đến chẩn đoán bị nhầm là bệnh ung thư gan [2], [5]. Đối với động vật ăn cỏ (trâu, bò, dê, cừu…) khi nhiễm sán lá gan lớn làm giảm trọng lượng của con vật, ốm yếu, thiếu máu bệnh lý, con vật không sinh sản, gây thiệt hại lớn về kinh tế [11]. Vì vậy việc phát hiện sớm và xác định chính xác loài Fasciola gây bệnh là rất cần thiết, có ý nghĩa thực tiễn trong chẩn đoán và điều trị. Chẩn đoán, giám định và phân biệt loài Fasciola được thực hiện bằng các phương pháp sinh học phân tử dựa trên các chỉ thị gen nhân và ty thể.
2 Xuất phát từ yêu cầu đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự biến đổi thành phần gen nhân ITS-2, 28S rRNA và gen ty thể COX1 của loài sán lá gan lớn Fasciola sp dạng thuần và dạng lai gây bệnh trên động vật tại Việt Nam”. Mục tiêu của đề tài - Giải trình tự và phân tích gen nhân ITS-2, gen 28S của sán lá gan lớn dạng thuần và xác định dạng laigây bệnh trên động vậttại Việt Nam. - Giải mã gen COX1 của hệ gen ty thể F. hepatica và F. gigantica dạng thuần và dạng lai, phân tích đặc điểm di truyền. - Xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự của gen ITS-2, 28S rRNA và COX1 trong phân loại. Nội dung nghiên cứu - Thu nhận và sàng lọc các mẫu của Fasciola sp, giám định bằng hình thái học nhận dạng dòng lai dựa vào vùng gen của hệ gen nhân ITS-2 để phân biệt Fasciolagigantica và Fasciola dạng lai (hybrid), so sánh phân tích dữ liệu trình tự của gen ITS-2 và gen 28S, xây dựng cây phả hệ. - Thu nhận gen ty thể COX1 của gen ty thể, phân tích trình tự nucleotide/amino acid, xem xét mối quan hệ tiến hóa di truyền phả hệ. - Phân tích biến đổi di truyền và dịch tễ học phân tử: xác định khác biệt của trình tự hệ gen nhân vùng ITS-2, 28S và COX1 của F. hepatica và F. gigantica (thuần và lai). Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Góp phần cung cấp trình tự các chuỗi gen ITS-2, 28S và cox1 của sán lá gan lớn Fasciola sp ở Việt Nam. - Ngoài ra các kết quả chính xác của sinh học phân tử cho phép ứng dụng những hướng mới và rất có thể sẽ làm thay đổi một phần hệ thống phân loại về ký sinh trùng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử và phân loại loài. - Sử dụng các số liệu của hệ gen ty thể để ứng dụng phát triển các phương pháp chẩn đoán phân tử trong phòng và điều trị bệnh sán lá gan lớn ở người và động vật tại Việt Nam.
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về loài sán lá gan lớn 1.1.1. Vị trí phân loại sán lá gan lớn trong hệ thống phân loại động vật Theo Skarjabin cs. (1997) [67], sán lá gan lớn kí sinh và gây bệnh cho trâu bò được xếp trong hệ thống phân loại động vật như sau: Ngành: Plathelminthes (Schneider, 1873) Phân ngành: Platodes (Leuckart, 1854) Lớp: Trematoda (Rudolphi, 1808) Phân lớp: Prosostomadidea (Skrjabin và Guschanskaja, 1926) Bộ: Fasciolida (Skrjabin et Schulz, 1937) Phân bộ : Fasciolata (Skrjabn et Schulz, 1937) Họ : Fasciotidae (Railliet, 1985) Phân họ : Fasciolinae (Stiles et Hasall, 1898) Giống : Fasciola (Linnaeus, 1758) Loài : Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758) Loài : Fasciola gigantica (Cobbold, 1888). 1.1.2. Đặc điểm hình thái học của sán lá gan lớn Fasciola sp Cũng như nhiều loài sán lá khác, sán lá gan lớn thuộc dạng sinh sản lưỡng tính có thể thụ tinh chéo hoặc tự thụ tinh. Sán lá có giác miệng và giác bụng, giác bụng không nối với cơ quan tiêu hóa. Sán lá không có hệ hô hấp, tuần hoàn và cơ quan thị giác, ở giai đoạn mao ấu có dấu vết sắc tố mắt. Hệ sinh dục rất phát triển với cả hệ sinh dục đực và cái trong cùng một cơ thể, tử cung sán lá chứa đầy trứng (Hình 1.1). Có thể phân biệt 2 loài sán lá gan thuộc giống Fasciola như sau: - Loài F.gigantica (Cobbold, 1885): Có chiều dài gấp 3 lần chiều rộng, vai không có hoặc không nhìn rõ rệt, nhánh ruột chia tỏa ra nhiều nhánh ngang. F.gigantica (có nghĩa là sán khổng lồ), có kích thước chiều dài 25 – 75mm, chiều rộng 3 – 12mm, u lồi hình nón của đầu là phần tiếp theo của thân, vì vậy nó không
4 có vai như loài khác của giống Fasciola, hai rìa bên thân sán lá song song với nhau, đầu cuối của thân tù. Giác bụng tròn lồi ra. Ruột, tuyến noãn hoàng, buồng trứng và tinh trùng đều phân nhánh. Trứng hình bầu dục, màu vàng nâu, phôi bào to đều và xếp kín vỏ. Kích thước trứng 0,125 – 0,170 × 0,06 – 0,10mm (Hình 1.1A). Hình 1.1. Hình ảnh mô tả hình thái của sán lá gan lớn Fasciola sp A. Fasciola gigantica ; B : Fasciola hepatica [71] - Loài F. hepatica (Linnaeus, 1758): loài này thân rộng, đầu lồi và nhô ra phía trước làm cho sán có vai, nhánh ruột chia ít nhánh ngang hơn. F. hepatica (nghĩa là sán ở gan) dài 18 – 51mm, rộng 4 - 13mm, phần trước thân nhô ra tạo cho sán có vai bè ra hai bên. Hai rìa thân sán không song song với nhau mà phình ra ở chỗ vai rồi thót lại ở đoạn cuối thân. Những ống dẫn tuyến noãn hoàng chạy ngang, chia vùng giữa của sán lá thành phần trước và phần sau của thân. Phần sau thân có tinh hoàn và bộ phận sinh dục đực. Tinh hoàn phân nhiều nhánh xếp chỗ sau thân. Tử cung ở phần giữa thân trước tạo nên một mạng lưới rối như tơ vò. Buồng trứng phân nhánh nằm ở sau tử cung. Trứng của sán lá F. hepatica có màu sắc, hình thái tương tự như trứng của loài F.gigantica, kích thước 0,13 – 0, 145 × 0,07 – 0,09mm (Hình 1.1B).
5 1.1.3. Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của sán lá. Chu kỳ sinh học của sán lá Fasciola đã được Leukart (1882) nghiên cứu ở Đức và Thomas (1882) nghiên cứu ở Anh. Chu kỳ sinh trưởng và phát triển (vòng đời) của SLGL Fasciola sp được trình bày ở Hình 1.2. Người hoặc động vật ăn phải ấu trùng Sán lá gan lớn ký sinh ở người hoặc động vật Hình 1.2. Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của SLGL Fasciola sp ký sinh vật chủ ở động vật và người [71] Quá trình Fasciola sp trưởng thành sinh sống trong ống dẫn mật của trâu, bò, dê. Sau khi thụ tinh mỗi sán lá đẻ hàng chục vạn trứng. Những trứng này cùng dịch mật vào ruột, sau đó theo phân ra ngoài. Nếu gặp được điều kiện thuận lợi như nước mưa cuốn trôi xuống các vũng nước, ao, hồ, ruộng nước ở nhiệt độ 15 – 300C, pH = 5 - 7,7, có điều kiện ánh sáng thích hợp thì sau 10 – 25 ngày trứng nở thành miracidium bơi tự do trong nước. Nếu thiếu ánh sáng miracidium không có khả năng thoát vỏ nhưng vẫn có thể tồn tại 8 tháng trong vỏ. Miracidium có hình tam giác, xung quanh thân có lông và có thể di chuyển được trong nước. Khi gặp vật chủ trung gian thích hợp (ốc Lymnaea sp). Miracidium xâm nhập vào tế bào ốc
6 và phát triển thành bào ấu (Sporocyst). Những miracidium không gặp vật chủ trung gian thì sẽ rụng lông, rữa dần và chết. Bào ấu (Sporocyst) hình túi, màu sán lá được bao bọc bởi lớp màng mỏng, các tế bào ngọn lửa hoạt động thành hình hầu, ống ruột và các đám phôi. Trong 1 ốc có thể có 1 - 2 ấu trùng. Khoảng 3 – 7 ngày, bào ấu sinh sản vô tính cho ra nhiều redia (lôi ấu). Một bào ấu sinh ra 5 – 15 lôi ấu. Redia hình suốt chỉ, ít hoạt động, có miệng, hầu, ruột, hình túi đơn giản. Có 2 hệ: Redia thế hệ I và redia thế hệ II cùng phát triển trong ốc – vật chủ trung gian. Ở nhiệt độ 160C hoặc thấp hơn, lôi ấu chỉ sinh sản Redia I và dừng phát triển, ở nhiệt độ thích hợp (20 – 300C), sau 29 – 35 ngày, lôi ấu biến thành vĩ ấu (cercaria). Một redia có thể sinh ra 12 – 20 cercaria. Cercaria (vĩ ấu) là ấu trùng sống ở pha sống tự do của sán lá gan, có cấu tạo thân hình tròn lệch, đuôi dài hơn thân giúp vĩ ấu di chuyển dễ dàng trong nước. Cấu tạo của vĩ ấu gồm giác miệng, giác bụng, hầu, thực quản và ruột phân thành 2 nhánh. Theo Giniecisz – Kaija (1960), trong cơ thể cercaria có những dạng glycogen cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của ấu trùng, đặc biệt là cho sự vận động không ngừng của đuôi. Đuôi là cơ quan vận động của vĩ ấu. Theo một số tác giả đuôi làm nhiệm vụ thay đổi vị trí của ấu trùng tronh môi trường nước. Nhờ sự hoạt động tích cực của đuôi mà vĩ ấu tiếp cận để bám vào các cây thủy sinh, tạo thành kén (Adolescaria). Từ khi miracidium chui vào ốc đến khi phát triển thành cercaria cần khoảng thời gian 50 – 80 ngày. Sau khi phát triển thành thục, cercaria thoát khỏi vỏ ốc, ra môi trường bên ngoài, bơi tự do trong nước, có kích thước 0,28 mm– 0,30 mm chiều dài và 0,23 mm chiều rộng. Sau vài giờ bơi trong nước, cercaria rụng đuôi tiết chất nhầy xung quanh thân nếu gặp không khí khô rất nhanh, lúc này cercaria đã biến thành adolesscaria. Adolescaria hình khối tròn, bên trong chứa phôi hoạt động, phôi có giác miệng, giác bụng, ruột phân nhánh và túi bài tiết, adolescaria thường ở trong nước hoặc bám vào cây cỏ thủy sinh. Nếu trâu, bò, nuốt phải adolescaria vào đến dạ
7 dày và ruột, lớp vỏ ngoài được phân hủy, ấu trùng được giải phóng và di chuyển đến ống mật bằng 3 con đường. - Một số ấu trùng dùng tuyến xuyên qua niêm mạc ruột, vào tĩnh mạch ruột, qua tĩnh mạch vào gan, xuyên qua nhu mô vào ống mật. - Một số ấu trùng khác cũng dùng tuyến xuyên chui qua thành ruột vào xoang bụng đến gan, xuyên qua vỏ gan vào ống mật. - Một số ấu trùng từ tá tràng, ngược dòng dịch mật để lên ống dẫn mật. Sau khi vào ống dẫn mật, ấu trùng kí sinh ở đó và phát triển thành sán lá gan trưởng thành. Theo Skerman (1966), thời gian hoàn thành vòng đời là 9 – 117 ngày. Fasciola trưởng thành có thể kí sinh trong ống dẫn mật của trâu bò 3 – 5 năm, có khi tới 11 năm. Theo Phan Địch Lân [13], tác giả sách Bệnh ngã nước trâu bò, NXB Nông nghiệp Hà Nội cho biết, khoa học thú y nước ta đã nghiên cứu thành công vòng đời của sán lá gan trong điều kiện nhiệt độ thích hợp (28-300C) có ốc vật chủ trung gian là Lymnae swinhoei và Lymnae viridis, vật chủ cuối cùng (trâu, bò, dê, cừu) thì vòng đời sán lá gan ở nước ta được xác định với các mức thời gian sau: - Ở ngoài thiên nhiên:trứng sán lá gan phát triển thành mao ấu (Miracidium) trong khoảng 14 -16 ngày. - Ở trong ốc vật chủ trung gian: mao ấu (Miracidum) phát triển thành lôi ấu (Redia) cần 8 – 21 ngày. Lôi ấu (Redia) phát triển thành vĩ ấu (cercaria) non cần 7 – 14 ngày, thành vĩ ấu trưởng thành 13 – 14 ngày. - Ở ngoài ốc vật chủ trung gian: vĩ ấu phát triển thành kén (Adolescaria) sau 2 giờ. - Ở trâu, bò: Khi trâu, bò, bê nghé nuốt phải adolescaria, sau 79 – 88 ngày trong ống dẫn mật của trâu bò đã có sẵn sán lá gan trưởng thành đẻ trứng theo phân ra ngoài. Điều kiện nhiệt độ và độ ẩm của nước ta rất thuận lợi cho sự nhiễm và gây bệnh sán lá gan (kế cả gây nhiễm và nhiễm tự nhiên). Ở những vùng có mầm bệnh tồn tại, trung bình 3 tháng sán lá gan lại hoàn thành vòng đời trong cơ thể trâu, bò, nghĩa là trâu cứ trong vòng 3 tháng lại sản sinh ra một đời sán lá gan mới, gây
8 tình trạng bội nhiễm sán lá gan, vì vậy cường độ nhiễm tăng lên theo tuổi thọ trâu, bò. 1.1.4. Trứng sán lá gan lớn Hình thái: trứng SLGL có kích thước lớn nhất trong các loài sán lá, trứng có màu vàng, hình elip đối xứng qua trục dọc, vỏ có nắp ở một đầu (Hình 1.3). Kích thước: trứng sán lá gan có kích thước trung bình (140-172,3 × 80- 89,6) µm, dao động (130-150 x 60-90) μm có khi tới 152-198 x 72-94 μm [Tomimura, Nishitani., 1976]. Trứng SLGL có phổ dao động kích thước rộng là do chúng tồn tại dưới 2 thể: nhị bội (diploid form) và tam bội (triloid form). Sức đề kháng của trứng: Trứng sán lá gan được thải theo phân động vật mắc bệnh ra ngoài môi trường ngoại cảnh. Trứng rất nhảy cảm với môi trường khô hạn và tác động trực tiếp của ánh sáng mặt trời. Ở trong phân khô, phôi ngừng phát triển và trứng sẽ chết sau 8 – 9 ngày. Hình 1.3. Hình ảnh của trứng sán lá gan lớn Fasciola sp phóng đại 400 lần dưới kính hiển vi điện tử [71]. Trong điều kiện khô hạn, vỏ trứng bị nhăn nheo, biến đổi hình dạng, miracidium bị chết trong vỏ trứng sau 1 – 1,5 ngày. Ở môi trường ẩm ướt, trứng có khả năng sống rất lâu (trong phân hơi ẩm chúng tồn tại đến 8 tháng). Dưới ánh nắng chiếu trực tiếp, trứng chết nhanh. Phôi bị chết sau 2 ngày ở nhiệt độ thấp (- 50C → -150C). Nhiệt độ 10 - 200C trứng ngừng phát triển. Nhiệt độ 40 – 500C, phôi chết sau vài phút [8].
9 1.1.5. Sán trưởng thành Sán lá gan lớn Fasciola sp trưởng thành có dạng giống hình chiếc lá, thân dẹt và bờ mỏng, kích thước 20-30 x10-12 mm, màu trắng hồng hoặc xám đỏ, giác miệng (oral sucker) nhỏ, kích thước 1 mm, giác bụng (ventral suckers) to hơn, kích thước 1,6 mm. Cơ thể sán được bao phủ bởi một lớp cutile mỏng và có nhiều chóp nhỏ. Chúng thường “bám dính” với nhiều cơ quan khác của vật chủ thông qua các giác hút (một giác hút ở phía trước gọi là giác miệng và một cái còn lại ở giữa gọi là giác bụng). Miệng thường nằm ngay ở giác miệng và nối với manh tràng, chia hai nhánh và mỗi nhánh mở rộng về một phía của cơ thể. Đặc điểm chính của sán lá gan lớn là sự có mặt của các tế bào hình ngọn lửa trong hệ bài tiết của sán (Hình 1.4). Sán lá gan lớn sinh sản lưỡng tính, bộ phận sinh dục có lỗ nằm gần giác bụng. Cũng như nhiều loài sán lá khác, sán lá gan lớn lưỡng tính, có thể thụ tinh chéo hoặc tự thụ tinh, trong cơ thể sán có cả cơ quan sinh dục đực và cái. Hệ thống sinh dục rất phát triển, tử cung sán chứa đầy trứng. Sán có giác bụng và giác miệng, giác miệng đóng kín và không nối với cơ quan tiêu hóa. Sán không có hệ thống tuần hoàn, hô hấp và cơ quan thị giác, hệ bài tiết ở cuối thân. Hình 1.4. Hình thể sán lá gan lớn Fasciola sp trưởng thành [70] Cơ quan sinh dục đực bao gồm một hay nhiều tinh hoàn kết nối với một ống đơn thuần hoặc một ống dẫn tinh lớn, nhờ vào một ống ngắn hoặc ống dẫn
10 tinh. Ống dẫn tinh sẽ kết thúc bằng một cơ quan sinh dục đực. Cơ quan sinh dục cái bao gồm một buồng trứng duy nhất kết nối với ống dẫn trứng. Ống dẫn trứng nối với vài ống hoặc ống noãn hoàng. Ống dẫn trứng nối tiếp với ootype rồi được bao quanh bởi một khối tuyến ngoại tiết (tuyến Mehlis). Tử cung nằm ở cuối của ootype. Sự tự thụ tinh hiếm khi xảy ra trong các loài sán lá. SLGL có cả những loại sinh tinh bất thường (abnormal spermatogenic type (AST) bao gồm nhiễm sắc thể nhị bội (diploid form), tam bội (triloid form) và đa bội mà không thụ tinh và loại sinh tinh bình thường (normal spermatogenic type (NST) của Fasciola sp được tìm thấy ở một số quốc gia châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Nepal, Philippines, Thái Lan và Việt Nam. AST xảy ra đặc biệt ở Nhật Bản và Hàn Quốc. Tại vùng Đông Nam Á, loài sán có loại AST cùng khu vực phân bố với NST của F. hepatica và NST của F. gigantica. Tương tự, tại châu Phi, chủ yếu gặp chủng F. gigantica. Ngược lại, ở châu Âu, phần Nam và Bắc Mỹ, châu Đại Dương là các địa danh phân bố chủ yếu của loài sán lá gan lớn F. hepatica. 1.2.Đặc điểm của bệnh do sán lá gan lớn 1.2.1. Cơ chế sinh bệnh Theo các nhà ký sinh trùng học, sán lá gan gây bệnh ở vật chủ bằng tác động của độc tố, sự chiếm đoạt dinh dưỡng và tác động mang trùng. Khi trâu bò mới nhiễm bệnh, sán lá non di chuyển trong cơ thể làm tổn thương ở ruột, thành mạch máu, nhu mô gan. Một số ấu trùng có thể di chuyển “lạc chỗ” đến phổi, lách, cơ hoành, tuyến tụy…gây tổn thương hoặc xuất huyết nặng hoặc nhẹ. Sán lá non xuyên qua các nhu mô gan làm các tổ chức gan bị phá hoại tạo ra các đường di hành đầy máu và mảnh tổ chức gan bị phá hủy. Gan bị viêm từ nhẹ đến nặng tùy theo số lượng ấu trùng nhiễm vào cơ thể. Trâu bò có thể thiếu máu do xuất huyết, có thể chết do mất máu. Tác động ảnh hưởng của sán lá còn tiếp tục khi sán lá đã đi vào ống dẫn mật, tiếp tục tăng lên về kích thước và phát triển thành sán lá trưởng thành xuyên qua kích thích niêm mạc ống mật bằng các gai cutin trên cơ thể gây viêm ống mật.
11 Số lượng sán lá nhiều có thể làm tắc ống mật, mật ứ không xuống ruột được sẽ tràn vào máu gây hiện tượng hoàng đản. Trong quá trình ký sinh sán lá thường xuyên tiết độc tố. Độc tố tác động vào thành ống mật và mô gan, gây biến đổi đại thể và vi thể làm tăng quá trình viêm. Đồng thời độc tố của sán lá còn hấp thu vào máu gây hiện tượng trúng độc toàn thân, gây hủy hoại máu, làm biến chất protein trong máu, làm Albumin giảm, Globumin tăng. Độc tố của sán lá còn làm tăng nhiệt độ cơ thể, tăng bạch cầu (đặc biệt là bạch cầu ái toan) và tác động vào thần kinh, làm cho con vật có triệu chứng thần kinh (run rẩy, siêu vẹo…). Độc tố của sán lá gan tác động vào thành mạch máu, làm tăng tính thẩm thấu của thành mạch, gây hiện tượng thủy thũng, làm cho máu đặc lại. Cũng do tác động của độc tố nên giữa các tiểu thùy gan có hiện tượng thẫm nhiễm huyết thanh và tế bào, hình thành nên các mô liên kết mới dọc theo các vách ngăn của tiểu thùy gan và quanh ống mật, vì vậy các ống mật này cũng dày lên. Quá trình viêm kéo dài làm cho các tế bào yêu cầu tăng sinh, thay thế những tế bào nhu mô gan, gây hiện tượng sơ gan và teo gan.Khi trâu bò nhiễm sán lá gan nặng, hiện tượng sơ gan chiếm diện tích lớn của gan, làm cho chức năng gan bị phá hủy. Từ đó dẫn đến hàng loạt các rối loạn khác như: rối loạn cơ năng dạ dày – ruột, thiếu máu, suy nhược, gầy dần, cổ chướng, xoang phúc mạc tích nước. Một tác động quan trọng của Fasciola khi ký sinh ở vật chủ là chiếm đoạt dinh dưỡng. Dinh dưỡng của sán lá gan là máu trâu, bò mà nó ký sinh. Bằng phương pháp phóng xạ, người ta đã thấy mỗi sán lá ký sinh ở ống dẫn mật lấy 0,2ml máu mỗi ngày. Như vậy nếu trâu bò nhiễm ít sán là thì vai trò chiếm đoạt dinh dưỡng không rõ, Nhưng nếu trâu bò có hàng trăm, hàng nghìn sán lá ký sinh thì lượng máu mất đi rất nhiều. Ngoài các tác động gây bệnh trên, trong khi di hành, sán lá non còn mang theo các loại vi trùng từ bên ngoài vào máu, gan và những cơ quan khác, gây những bọc mủ hoặc gây bệnh truyền nhiễm ghép với bệnh sán lá gan.