Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tách chiết và xác định hoạt tính sinh học của Chlorogenic acid từ quả cà phê xanh

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:75

Thêm vào BST

Báo xấu

73
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm cung cấp chế phẩm hoạt chất tự nhiên quý, làm nguyên liệu sản xuất các thực phẩm chức năng dùng trong phòng và hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính như tăng huyết áp, tiểu đường và đặc biệt là hội chứng chuyển hóa, những bệnh lý đang tăng nhanh hiện nay. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tách chiết và xác định hoạt tính sinh học của Chlorogenic acid từ quả cà phê xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP TRỊNH TRÚC GIANG NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC Chlorogenic acid TỪ QUẢ CÀ PHÊ XANH CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN VIỆT PHƯƠNG TS. VŨ KIM DUNG Hà Nội, 2020
i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các thầy cô, bạn bè và các cơ quan. Trước hết cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Việt Phương – Trung tâm Công nghệ sinh học, Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực phẩm và TS. Vũ Kim Dung – Bộ môn Công nghệ Vi sinh- Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và định hướng cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin cảm ơn tới ban lãnh đạo, các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ là chủ tịch hội đồng, phản biện, thư ký và ủy viên hội đồng đã dành thời gian quý báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận văn với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn thiện tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận văn. Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự khích lệ, động viên và giúp đỡ hết sức nhiệt tình của gia đình, bè bạn đã dành cho tôi để tôi hoàn thành bản luận văn nghiên cứu này. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Trịnh Trúc Giang
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân tôi và đuợc thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Việt Phương, Trung tâm Công nghệ sinh học- Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực phẩm và TS. Vũ Kim Dung, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam. Các số liệu, những kết quả nghiên cứu và kết luận trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, chưa từng được công bố trong bất cứ một công trình nào khác trước đây. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng yêu cầu. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Trịnh Trúc Giang
iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iii DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ v DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vi ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ............................ 3 1.1. Tổng quan về Chlorogenic acid ............................................................. 3 1.1.1. Giới thiệu về Chlorogenic acid ....................................................... 3 1.1.2. Công dụng của Chlorogenic acid ................................................... 4 1.2.Tổng quan về cà phê ............................................................................... 8 1.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê ở Việt Nam .......................... 8 1.2.2. Cấu tạo quả cà phê xanh............................................................... 10 1.2.3. Thành phần hóa học của quả cà phê ............................................ 11 1.2.4. Cà phê xanh và lợi ích sử dụng..................................................... 13 1.3. Tổng quan về enzyme pectinase .......................................................... 16 1.3.1. Giới thiệu về Enzyme pectinase .................................................... 16 1.3.2. Ứng dụng của enzyme pectinase ................................................... 17 1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất Chlorogenic acid từ cà phê trên thế giới và ở Việt Nam ............................................................................................. 17 Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ................... 22 2.1. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................. 22 2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 22 2.3. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 22 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 22 2.3.2. Hoá chất và thiết bị ....................................................................... 22 2.4. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 23
iv 2.4.1. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất CGA ................................................................................................. 23 2.4.2. Phương pháp tối ưu hoá quá trình chiết xuất CGA ...................... 30 2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính CGA thu nhận........................... 32 2.4.4. Phương pháp sấy chân không ....................................................... 33 2.4.5. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu ......................................... 33 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 34 3.1. Kết quả xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất CGA 35 3.1.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất : dung môi đến quá trình chiết CGA 35 3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình chiết xuất CGA ... 37 3.1.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết xuất CGA ........................ 39 3.1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất CGA................ 40 3.1.5. Kết quả ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình chiết xuất CGA 42 3.1.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình chiết xuất CGA……………………………………………………………………………..44 3.2. Kết quả mô hình hoá và tối ưu hoá quá trình chiết xuất CGA ............ 45 3.2.1. Kết quả ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố ............... 46 3.2.2. Phân tích phương sai .................................................................... 48 3.2.3. Phương trình hồi quy .................................................................... 49 3.2.4. Tối ưu hóa điều kiện thủy phân cà phê xanh bằng enzyme pectinase. ................................................................................................. 50 3.2.5. Kết quả xác định hàm lượng CGA bằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC ....................................................................................................... 52 3.3. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa ................ 54 3.3.1. Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn ...................................... 54 3.3.2. Kết quả xác định hoạt tính oxy hóa .............................................. 56 3.4. Kết quả quá trình sấy chân không ........................................................ 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61
v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất- dung môi đến quá trình chiết CGA .. 24 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình chiết xuất CGA. .. 24 Bảng 2.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết xuất CGA ......................... 25 Bảng 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất CGA ................. 26 Bảng 2.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình chiết xuất CGA .............. 26 Bảng 2.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình chiết xuất CGA 27 Bảng 2.7. Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn CGA ............................. 28 Bảng 2.8. Thiết kế chế độ chạy hệ thống HPLC ............................................. 29 Bảng 2.9. Bố trí thí nghiệm xây dựng dường chuẩn CGA bằng HPLC ......... 30 Bảng 2.10. Các biến số và khoảng chạy ......................................................... 30 Bảng 2.11. Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố và hàm lượng CGA thu được trong các điều kiện thuỷ phân khác nhau ............................... 31 Bảng 2.12. Lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi trên môi trường lỏng. .............. 32 Bảng 2.13. Thí nghiệm xác định điều kiện sấy chân không ........................... 33 Bảng 3.1. Giá trị nồng độ CGA đo ở bước sóng 324 nm ............................... 34 Bảng 3.2. Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố và hàm lượng CGA thu được trong các điều kiện thuỷ phân khác nhau......................................... 47 Bảng 3.3. Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm Design Expert 10.0.3 (Bảng Anova) ............................................................... 48 Bảng 3.4. Kiểm tra mô hình thí nghiệm tối ưu hoá tách chiết CGA .............. 51 Bảng 3.5. Diện tích peak CGA ở các nồng độ ................................................ 52 Bảng 3.6. Kết quả xác định hàm lượng CGA bằng HPLC ............................. 54 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của CGA tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và vi khuẩn gây hại. ................................................................................................. 55 Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa ...................................... 56 Bảng 3.9. Nhiệt độ và thời gian sấy mẫu để thu nhận chế phẩm CGA .......... 57
vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu trúc của chlorogenic acid .................................................... 3 Hình 1.2. Một số sản phẩm thực phẩm chức năng chứa chlorogenic acid. .............. 8 Hình 1.3. Cấu tạo quả cà phê ......................................................................................10 Hình 1.4. Tác động của pectinase lên phân tử pectin ...............................................16 Hình 3.1. Quả cà phê xanh sau khi xử lý (A), sấy (B), nghiền và rây (C) ..............34 Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn CGA ..........................................................................35 Hình 3.3. Đồ thị mối liên hệ tỷ lệ cơ chất – dung môi và hàm lượng chiết xuất CGA...............................................................................................................................36 Hình 3.4. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu tới quá trình chiết xuất CGA.............................................................................................36 Hình 3.5. Đồ thị mối liên hệ nồng độ enzyme tới hàm lượng chiết xuất CGA .....37 Hình 3.6. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới quá trình chiết xuất CGA.............................................................................................38 Hình 3.7. Đồ thị mối quan hệ độ pH dung môi và hàm lượng chiết xuất CGA ...39 Hình 3.8. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của pH tới quá trình chiết xuất CGA ......................................................................................................................40 Hình 3.9. Đồ thị mối quan hệ của nhiệt độ và hàm lượng chiết xuất CGA...........41 Hình 3.10. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình chiết CGA .....................................................................................................................42 Hình 3.11. Đồ thị mối quan hệ của tốc độ lắc và hàm lượng chiết xuất CGA......43 Hình 3.12. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của tốc độ lắc tới quá trình chiết xuất CGA ....................................................................................................43 Hình 3.13. Đồ thị mối quan hệ của thời gian thuỷ phân và hàm lượng chiết xuất CGA...............................................................................................................................44 Hình 3.14. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân tới quá trình chiết xuất CGA .......................................................................................45 Hình 3.15. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu thuỷ phân cà phê xanh thu CGA ...50
vii Hình 3.16. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng CGA.....................................................51 Hình 3.17. Sắc ký đồ kết quả trước và sau tối ưu hoá ..............................................52 Hình 3.18. Đồ thị đường chuẩn CGA ........................................................................53 Hình 3.19. Sắc ký đồ của chất chuẩn CGA ...............................................................53 Hình 3.20. Sắc ký đồ của mẫu thử CGA ...................................................................53 Hình 3.21. Chế phẩm CGA dạng bột. ........................................................................57 Hình 3.22. Quy trình thu nhận CGA từ quả cà phê xanh. ........................................58
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, khi nhu cầu cuộc sống ngày càng cao, các loại sản phẩm chức năng ra đời với mục đích hỗ trợ, cải thiện, nâng cao sức khỏe của con người luôn là một vấn đề được xã hội đặc biệt quan tâm. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng bột chiết cà phê xanh có rất nhiều tác dụng đối với sức khỏe con người như: hạ huyết áp, ức chế sự tích tụ chất béo, hạn chế tăng trọng lượng cơ thể và điều chỉnh hàm lượng đường trong máu (Farah và cộng sự, 2005). Các tác dụng tích cực này của bột chiết cà phê xanh là do sự có mặt của Chlorogenic acid. Chất này có tác dụng kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng ung thư, chống béo phì, hạ huyết áp và chống co giật (Santana-Gálvez, 2017). Đặc biệt hơn nữa, những nghiên cứu mới cho thấy tác dụng có lợi của Chlorogenic acid đối với Hội chứng chuyển hóa (Metabolic syndrome). Hội chứng này được định nghĩa bao gồm một loạt các yếu tố sinh lý, hóa sinh, lâm sàng và chuyển hóa làm tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và tiểu đường type 2. Các biểu hiện của hội chứng bao gồm: các rối loạn chuyển hóa lipid máu (tăng cholesterol tổng số trong máu, tăng hàm lượng LDL - cholesterol, triglycerid, giảm hàm lượng HDL - cholesterol), huyết áp cao, đường máu cao, dễ viêm, gan nhiễm mỡ và ngưng thở khi ngủ. Hội chứng này được coi như hội chứng mang tính toàn cầu vì chi phí chữa trị cao và số người mắc ngày càng tăng ngay cả trong thanh niên và trẻ em (Santana-Gálvez, 2017). Cà phê xanh là nguồn Chlorogenic acid quan trọng trong thực phẩm của con người với tổng lượng Chlorogenic acid lên đến 41 – 113 mg/g chất khô tùy thuộc giống. Việc thu nhận CGA từ quả cà phê xanh làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng phòng và hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính đặc biệt là hội chứng chuyển hóa giúp đa dạng hóa các sản phẩm từ cà phê và tăng giá trị kinh tế của cây cà phê. Pectinase là các enzyme được dùng không giới hạn trong thực phẩm vì không ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Bằng ưu điểm là dễ nuôi cấy, sinh
2 trưởng và phát triển nhanh, cho nhiều enzyme trong một thời gian ngắn, vi sinh vật là lựa chọn hàng đầu của các nhà sản suất công nghiệp với mong muốn giảm giá thành, tăng năng suất sản xuất lên cao nhất. Sự sản xuất pectinase quy mô công nghiệp được thực hiện chủ yếu từ Aspergillus niger (Yogesh, 2009). Với rất nhiều các kết quả khả quan về tác dụng dược lý cũng như tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm của acid chlorogenic từ quả cà phê xanh, việc tách chiết axit chlorogenic từ nguyên liệu này cung cấp chế phẩm hoạt chất tự nhiên quý, làm nguyên liệu sản xuất các thực phẩm chức năng dùng trong phòng và hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính như tăng huyết áp, tiểu đường và đặc biệt là hội chứng chuyển hóa, những bệnh lý đang tăng nhanh hiện nay. Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tách chiết và xác định hoạt tính sinh học của Chlorogenic acid từ quả cà phê xanh”.
3 Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về Chlorogenic acid 1.1.1. Giới thiệu về Chlorogenic acid - Màu sắc: Màu vàng nhạt đến bột trắng. - Công thức phân tử: C16I18O9 - Công thức cấu tạo: về cấu trúc, chlorogenic acid là este của caffeic acid với nhóm 3-hydroxyl của quinic acid.  Cấu trúc Chlorogenic acid Chlorogenic acid là este được hình thành giữa acid caffeic và 3-hydroxyl của acid L -quinic (Clifford, 1999), đồng phân chlorogenic acid bao gồm các este caffeoyl tại các vị trí hydroxyl khác nhau trên vòng acid quinic: 4 O acid -caffeoylquinic (acid cryptoChlorogenic hoặc 4-CQA) và 5 Oacid- caffeoylquinic (acid neoChlorogenic hoặc 5-CQA). Các cấu trúc có nhiều hơn một nhóm acid caffeic được gọi là acid isochlorogenic và có thể được tìm thấy trong cà phê (Barnes và cộng sự, 1950). Có một số đồng phân, chẳng hạn như acid 3,4-dicaffeoylquinic và acid 3,5-dicaffeoylquinic và cynarine (acid 1,5-dicaffeoylquinic) (Corse và cộng sự,1965). Hình 1.1. Công thức cấu trúc của chlorogenic acid
4  Sự tổng hợp CGA trong tự nhiên Tiền chất sinh tổng hợp của chlorogenic acid là 4-coumaroyl-CoA, chứa một nhóm hydroxyl duy nhất trên vòng aryl. Các hydroxyl của este coumaryl, tức là gắn các nhóm hydroxy thứ hai, được xúc tác bởi enzyme cytochrome P450 (Vogt, 2010). Chlorogenic acid có thể được tìm thấy trong cây tre (Phyllostachys edulis) (Kweon, 2001) hay trong chồi của cây thạch nam (Calluna vulgaris) (Jalal và cộng sự, 1982) cũng như trong nhiều loại cây khác (Clifford, 2003). Trong thực phẩm, chlorogenic acid và các hợp chất liên quan như cryptochlorogenic acid và neochlorogenic acid đã được tìm thấy trong lá của cây dâm bụt (Sabdariffa) (Zhen, 2016). Các chất đồng phân của chlorogenic acid được tìm thấy trong khoai tây. Ngoài ra, chlorogenic acid có trong thịt quả cà tím, đào, mận khô và quả cà phê. 1.1.2. Công dụng của Chlorogenic acid Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng việc tiêu thụ bột chiết cà phê xanh có rất nhiều tác dụng đối với sức khỏe con người như hạ huyết áp, tác dụng ức chế sự tích tụ chất béo, tăng trọng lượng cơ thể và điều chỉnh hàm lượng đường trong máu (Farah, 2005). Các tác dụng này của bột chiết cà phê xanh được giải thích bởi sự có mặt của Chlorogenic acid có trong bột chiết do nó thể hiện các tính chất sinh học quý bao gồm kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng ung thư, chống béo phì, hạ huyết áp và chống co giật (Santana-Gálvez, 2017). - Đối với bệnh béo phì: Một thí nghiệm trên chuột cho thấy rằng Chlorogenic acid làm giảm khối lượng cơ thể, chất béo nội tạng, triglycerid trong gan và tim, giảm cholesterol trong các mô mỡ và trong tim ở các con chuột bị béo phì (Ae- SimCho, 2010). Chlorogenic acid làm hạn chế sự tăng cân và hạn chế sự tích tụ các axit béo tự do trong gan của chuột ăn chế độ giàu chất béo. Đối với con
5 người, có nghiên cứu đã chỉ ra rằng người béo phì với chỉ số BMI 27,5–32 khi dùng chế phẩm Coffee Slender từ cà phê xanh (45 mg CGAs/g), 5 cốc/ngày đã giảm được 5,4 kg trong vòng 12 tuần (Thom, 2007). - Đối với các rối loạn chuyển hóa lipid máu: Chlorogenic acid giảm axit béo tự do triglyceride và cholesterol trong huyết tương và làm tăng đáng kể tỷ số HDL-cholesterol/cholesterol toàn phần ở chuột ở nhóm chuột bị gây béo phì (Ae-SimCho, 2010). Khi cho chuột ăn chế độ giàu cholesterol, Chlorogenic acid (10 mg/kg trong 28 ngày) làm giảm cholesterol toàn phần và LDL-cholesterol, tăng HDL cholesterol và cải thiện các chỉ số liên quan đến nguy cơ bệnh động mạch vành và bệnh tim. - Đối với bệnh tiểu đường: Ở chuột bị tiểu đường, chế độ ăn có Chlorogenic acid (27 mg/kg trong 11 ngày) làm giảm hàm lượng glucose trong máu (Attila Hunyadi và cộng sự, 2012). Sử dụng Chlorogenic acid (10 hoặc 50 mg/kg thể trọng trong hai tuần) làm giảm lượng chất béo và nồng độ đường glucose trong máu sau ăn của chuột bị béo phì đồng thời rút ngắn thời gian lành vết thương của chúng (Deniz Bagdasa, 2015) (Junghyun Kim, 2011). Đối với con người, việc sử dụng bột chiết giàu Chlorogenic acid từ hạt cà phê xanh (300 mg chất chiết chứa 13,9% Chlorogenic acid) cùng với snack giàu glucid làm giảm hàm lượng glucose trong máu sau khi ăn. Hàm lượng glucose trong máu của người tình nguyện giảm 6,9% khi được uống nước chứa 25 g đường saccharose và chế phẩm Coffee Slender từ cà phê xanh so với nhóm đối chứng (Thom, 2007). - Đối với bệnh cao huyết áp: Theo Thom (2007), đối với chuột bị cao huyết áp, tác giả đã chỉ ra rằng chế độ ăn bổ sung 0,5% Chlorogenic acid trong 8 tuần hạn chế đáng kể sự tăng huyết áp. Đối với người khỏe mạnh, Chlorogenic acid tinh khiết (400 mg) làm giảm huyết áp 1,53-2,41 mm Hg. Trong một thí nghiệm khác, 117
6 tình nguyện viên 30-50 tuổi bị cao huyết áp ở mức độ trung bình dùng súp bổ sung bột chiết cà phê xanh với hàm lượng Chlorogenic acid tương ứng 0, 25, 50 và 100 mg trong 28 ngày có huyết áp giảm 3,2-4,7 mm Hg (Kazuya Kozuma và cộng sự, 2005). Một nghiên cứu khác thực hiện đối với 11 đàn ông và 17 phụ nữ bị cao huyết áp ở mức độ trung bình cho thấy huyết áp giảm 6,9-7,7% khi uống nước rau quả có bổ sung 0,48 g bột chiết cà phê xanh/ngày (chứa 140 mg Chlorogenic acid) trong 12 tuần (Takuya Watanabe, 2006). * Vai trò của Chlorogenic acid trong công nghiệp thực phẩm: Tiềm năng ứng dụng Chlorogenic acid trong công nghiệp chế biến thực phẩm rất lớn do hợp chất này thể hiện khả năng kháng khuẩn, kháng oxi hóa, hoạt động hiệp đồng với các chất kháng oxi hóa khác trong thực phẩm và có tính chất prebiotic (Santana-Gálvez, 2017). - Về khả năng kháng khuẩn: Việc sử dụng chất bảo quản hóa học tổng hợp trong các sản phẩm thực phẩm là một mối quan ngại cho người tiêu dùng bởi các tác dụng phụ của chúng. Do đó, việc xác định các chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên có thể được chấp nhận bởi người tiêu dùng đã trở nên có giá trị và là mối quan tâm của rất nhiều nhà sản xuất thực phẩm. Nhiều nghiên cứu đã khẳng định rằng Chlorogenic acid có thể được sử dụng như một chất bảo quản do có khả năng kháng vi sinh vật. Khả năng kháng các vi sinh vật probiotic của Chlorogenic acid cũng được nghiên cứu. Chlorogenic acid không kìm hãm sự phát triển của Biﬁdobacterium lactis, Lactobacillus crispatus (L. crispatus), L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, hay L. rhamnosus khi nồng độ đạt đến 10 mg/m (R. Puupponen‐Pimiä, 2001) .Đây này là một thuận lợi đáng kể cho việc ứng dụng Chlorogenic acid trong bảo quản các sản phẩm thực phẩm như chất kháng khuẩn. - Về khả năng kháng oxi hóa:
7 Chlorogenic acid có khả năng hạn chế sự oxi hóa trong thực phẩm đặc biệt là các thực phẩm giàu chất béo và các nhũ tương dầu/nước hay nước/dầu. Quá trình oxi hóa chất béo trong thực phẩm thường làm giảm giá trị dinh dưỡng, giá trị sinh học và giá trị cảm quan của các sản phẩm thực phẩm do các chất béo đặc biệt là các axit béo không no nhiều nối đôi và các vitamin bị phân giải, các sản phẩm oxi hóa tạo thành (hydroxyperoxide, aldehyde, polymer) gây nên mùi ôi khét và đôi khi độc cho thực phẩm. - Về hoạt động hiệp đồng với các chất kháng oxi hóa khác: Hoạt động hiệp đồng của các chất kháng oxi hóa làm tăng mạnh hiệu quả kháng oxi hóa của các chất kháng oxi hóa tự nhiên. Cơ chế hiệp đồng có thể là khử gốc tự do của chất kháng oxi hóa khác sau khi chất này đã cho điện tử và vô hoạt gốc tự do. Ngoài ra, sự bảo vệ các chất kháng oxi hóa cũng là một cơ chế hoạt động hiệp đồng. Anthocyanin là một chất kháng oxi hóa rất phổ biến trong tự nhiên đặc biệt trong các loại rau, quả có màu đỏ, tím, đen, xanh. Chúng có khả năng kháng oxi hóa mạnh nhưng lại kém bền dưới tác động của nhiệt độ, ánh sáng và pH kiềm. - Về tác dụng prebiotic: Tác dụng prebiotic của Chlorogenic acid thể hiện ở khả năng tăng cường phát triển của các vi sinh vật có lợi trong đường ruột. Mills và cộng sự. (2015) trong thí nghiệm in vitro của mình với hệ thống bắt chước ruột già của người đã chỉ ra rằng Chlorogenic acid tinh khiết hoặc cà phê giàu Chlorogenic acid tăng cường sự phát triển của vi sinh vật có lợi trong đường ruột bao gồm Biﬁdobacterium spp. và nhóm Clostridium coccoides-Eubacterium. Với rất nhiều các kết quả khả quan về tác dụng dược lý cũng như tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm của Chlorogenic acid từ hạt cà phê xanh, việc tách chiết Chlorogenic acid từ nguyên liệu này cung cấp chế phẩm hoạt chất tự nhiên quý, làm nguyên liệu sản xuất các thực phẩm chức năng dùng trong phòng và hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính như tăng huyết
8 áp, tiểu đường và đặc biệt là hội chứng chuyển hóa, những bệnh lý đang tăng nhanh hiện nay. Ngoài ra Chlorogenic acid cũng có thể tạo ra các phản ứng tích cực với cơ thể. Theo nghiên cứu mới đây của Carlos Tello (2020), CGA có các tác dụng sau: - Ức chế 11-βHSD1 là enzyme tạo ra các hormon gây tăng huyết áp. - Kích hoạt thụ thể GABAa bằng cách liên kết với vị trí của benzodiazepine, dẫn đến giảm mức độ lo lắng. - Tăng Glucagon – một loại hormon làm tăng nồng độ insulin trong máu và làm giảm glucose. - Kích hoạt Peroxisome proliferator – Activated receptor alpha dẫn đến tăng sự gia nhiệt và giảm mỡ cơ thể. - Ức chế HMG-CoA là enzyme chịu trách nhiệm sản xuất cholesterol và là mục tiêu chính của thuốc statin. - Ức chế acetylcholinesterase giúp cải thiện nhận thức và trí nhớ. Hình 1.2. Một số sản phẩm thực phẩm chức năng chứa chlorogenic acid. 1.2. Tổng quan về cà phê 1.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê ở Việt Nam Cà phê là một trong những thức uống phổ biến nhất trên toàn thế giới, nó được trồng rộng khắp ở hơn 75 nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, là nguồn lợi xuất khẩu quan trọng cho các quốc gia này.
9 Cây cà phê được người Pháp đưa vào Việt Nam từ khoảng năm 1850. Do điều kiện khí hậu và đất đai thích hợp nên cây được phát triển trên quy mô rộng và cho hạt chất lượng tốt không kém sản phẩm của những nước sản xuất và xuất khẩu cà phê lớn trên thị trường. Tuy nhiên phải đến sau giải phóng ngành cà phê Việt Nam mới đi vào thời kỳ phát triển, sản lượng sản xuất ra chủ yếu để xuất khẩu. Cà phê thuộc họ Rubiaceae với hơn 70 loài khác nhau, nhưng hai loài có giá trị kinh tế quan trọng đó là: Arabica (Coffea arabica) và Robusta (C. canephora). Cây cà phê trồng ở nước ta hiện nay có 3 loài là: cà phê chè (Coffea arabica), cà phê vối (C. canephora) và cà phê mít (C. excelsa). Về chất lượng thì cà phê chè có vị thơm ngon và dịu, hàm lượng cafein khoảng 1,2%. Cà phê vối hương vị kém hơn cà phê chè nhưng đậm đà hơn, hàm lượng cafein tương đối cao, khoảng 2,5%. Cà phê mít ít thơm, vị hơi chua, ít được ưa chuộng nhất. Tính đến năm 2018, diện tính cà phê của cả nước rất lớn, khoảng 720.000 ha. Trong đó, cà phê Robusta chiếm khoảng 670.000 ha (chiếm 93% diện tích), đạt khoảng 1,71 triệu tấn (khoảng hơn 96% sản lượng). Cà phê Arabica, diện tích là 50.000 ha (chỉ gần 7%), sản lượng gần 67.000 tấn (chỉ gần 4%). Theo hiệp hội Cà phê ca cao Việt Nam (Vicofa) ước tính tổng lượng tiêu thụ cà phê của thị trường trong nước chỉ chiếm khoảng 10% sản lượng cà phê sản xuất, 90% còn lại là xuất khẩu. Trong đó chỉ có 10% xuất khẩu ở dạng chế biến sâu. Điều này hoàn toàn không có lợi cho ngành cà phê Việt Nam vì khi tỉ lệ xuất khẩu quá cao nhà sản xuất cà phê dễ bị lệ thuộc vào các nhà nhập khẩu. Do đó, thúc đẩy tiêu dùng nội địa chính là cách căn bản nhất. Ngoài ra, do nhiều yếu tố chủ quan và khách quan, vấn đề thu hoạch cà phê khi quả còn xanh từ vài chục năm nay vẫn chưa được khắc phục, tỉ lệ quả non xanh chiếm đến 50%. Điều này làm cho cà phê nhân Việt Nam xuất
10 khẩu bị mất giá, có nhiều lô hàng bị trả lại. Mặt khác cà phê Việt Nam còn bị từ chối ở một số thị trường trên thế giới. Điều đó cho thấy việc loại cà phê xanh ra khỏi nhân cà phê xuất khẩu là cần thiết. 1.2.2. Cấu tạo quả cà phê xanh Quả cà phê xanh được cấu tạo từ 3 lớp vỏ, thịt quả và nhân hạt (hình 1.3). Trong đó, 2 thành phần chính giàu hoạt chất sinh học là: Hình 1.3. Cấu tạo quả cà phê1  Lớp vỏ trấu (Parchment): Là lớp ngoài cùng của phần quả, tiếp xúc trực tiếp với phần vỏ quả, vỏ trấu được hình thành từ ba đến bảy lớp tế bào xơ cứng (tế bào sợi đóng vai trò chính trong thực vật) nên còn được gọi là vỏ trấu. Các tế bào cấu thành vỏ trấu sẽ cứng dần trong quá trình trưởng thành của quả cà phê, do đó hạn chế kích thước cuối cùng của quả nhân cà phê. Trong cà phê Arabica, trọng lượng trung bình của vỏ trấu với độ ẩm khoảng 11% nằm trong khoảng 3,8% tổng trọng lượng quả cà phê.  Lớp vỏ lụa (Silver skin): Vỏ lụa được hình thành từ nucellus có màu trắng bạc sau khi phơi khô, nên còn được gọi là vỏ bạc. Lớp vỏ này rất mỏng và có thể được bóc ra khỏi nhân trong quá trình đánh bóng quả. Tuy nhiên, một số nhà chế biến cà phê thường để lại vỏ lụa trên quả cà phê như một lớp bảo vệ tự nhiên, lớp vỏ này sau đó sẽ tự hủy trong quá trình rang cà phê. Ở một số vùng và tùy thuộc vào giống cà phê lớp vỏ lụa có thể sẫm màu hơn. 1 Nguồn: https://primecoffea.com/cau-tao-hat-cafe-va-thanh-phan-hoa-hoc-trong-hat-ca-phe.html
11  Nhân cà phê Phần trong cùng và là quan trọng nhất của quả, chịu trách nhiệm tích lũy chất dinh dưỡng cho quá trình nẩy mầm của phôi. Một quả cà phê thông thường có 2 nhân (cá biệt có 1 hoặc 3 nhân). Thành phần hóa học của nhân vô cùng quan trọng vì đây được xem là tiền thân của các hương vị và mùi thơm sau này trong cà phê rang. Các hợp chất hóa học được tìm thấy trong nội nhũ có thể kể đến bao gồm: - Các hợp chất tan trong nước, như: caffeine, trigonelline, nicotinic acid (niacin), ít nhất 18 chlorogen acid, các thành phần cacbohydrat (mono-, di- và oligosacarit) một số protein các khoáng chất và carboxylic acid… - Trong khi đó các thành phần không hòa tan trong nước bao gồm: cellulose, polysacaride, lignin và hemicellulose, một số protein, khoáng chất và lipid. - Trong lớp nhân cà phê sẽ là phôi (embryo) bao gồm một trục phôi (hypocotyl) và hai lá mầm dài từ 3 – 4 mm. Khi quả bắt đầu nảy mầm trục phôi sẽ kéo dài và đẩy quả lên trên mặt đất. Các lá mầm ban đầu ở dưới lòng đất ngay sau đó các lá mầm mới sẽ hình thành. 1.2.3. Thành phần hóa học của quả cà phê Nhóm chất cơ bản sau đây đều có mặt ở tất cả các giống loài cà phê, tuy nhiên tùy theo giống cà phê và phụ thuộc vào điều kiện canh tác mà các thành phần hóa học trong cà phê có thể thay đổi. Theo trang Coffee Chemistry.com, thành phần cà phê bao gồm:  Nhóm chất hữu cơ Nước: cà phê tươi có độ ẩm tuyệt đối, với hàm lượng nước cao thì các loại nấm mốc phát triển mạnh làm hỏng quả đồng thời khi rang sẽ tốn nhiều nhiên liệu và thất thoát hương nhiều hơn. Vì vậy, thông qua các phương pháp chế biến cà phê hàm lượng nước giảm xuống 10 – 12% cà phê sẽ được bảo quản lâu hơn. Hàm lượng nước sau khi rang còn khoảng 2 – 3%.
12  Cacbohydrat (glucid) Chiếm 50% tổng số chất khô, đại bộ phận không tham gia vào thành phần nước uống mà chỉ cho màu và vị caramen. Đường có trong cà phê do quá trình thủy phân dưới tác dụng của acid hữu cơ và các enzyme thủy phân. Hàm lượng saccharose có trong cà phê phụ thuộc vào độ chín của quả, quả càng chín thì hàm lượng càng cao. Saccharose bị caramen hóa trong quá trình rang tạo thành hương vị cho nước cà phê.  Thành phần protein Hàm lượng protein không cao nhưng đóng vai trò quan trọng giúp hình thành hương vị của cà phê trong quá trình rang qua phản ứng Maillard với các loại đường có trong cà phê. Bằng các phương pháp định tính người ta nhận thấy trong thành phần protein có những acid amin chính như: cystein, alanie, phenylalanine, histidine, leucine, lysine, derine.  Các Acid hữu cơ Chlorogenic acid (CGA) – Một trong những loại acid quan trọng nhất trong cà phê, tổng hàm lượng lên tới khoảng 41 – 113 mg/g chất khô tùy thuộc giống. Acetic acid là một trong nhiều axit hữu cơ đóng vai trò quan trọng trong chất lượng cà phê. Nồng độ acetic acid cao hay thấp còn phụ thuộc vào phương pháp chế biến ướt hoặc khô, vì vậy đây là loại axit được sinh ra đáng kể trong quá trình chế biến chứ không nhiều trong chính quả cà phê. Citric acid - đóng một vai trò như một hợp chất trung gian quan trọng trong chu trình trao đổi chất của cây cà phê. Trong cà phê xanh, citric acid chiếm một phần đáng kể trong tổng hàm lượng acid. Khi rang, citric acid đạt mức tối đa khi rang ở nhiệt độ thấp rồi nhanh chóng giảm đi khi tăng dần nhiệt độ rang. Quinic acid: khi rang, quinic acid tăng dần lên theo mức giảm của Chlorogenic acid (CGA). Trong quá trình rang, một phần quinic acid sẽ tiếp