Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:95

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro bước đầu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho loài nhằm đảm bảo độ tin cậy và chính xác trong nhân giống cây Kim tiền thảo. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN THỊ HIÊN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN MÃ VẠCH VÀ NHÂN GIỐNG CÂY KIM TIỀN THẢO (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.)BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH:8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. HÀ BÍCH HỒNG Hà Nội, 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Hà Bích Hồng. Các kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã được công bố trên Tạp chí khoa học - công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ. Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn. Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020 Ngƣời cam đoan Nguyễn Thị Hiên
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp,Trường Đại học Lâm Nghiệp đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Hà Bích Hồng và PGS. TS Nguyễn Văn Việt đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản Luận văn Thạc sĩ này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020 Học viên Nguyễn Thị Hiên
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................ v DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................... vi ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3 1.1. Giới thiệu chung về cây Kim tiền thảo ................................................. 3 1.1.1. Nguồn gốc và hệ thống phân loại........................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật của cây Kim tiền thảo............................................... 4 1.1.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố ............................................................... 5 1.1.4. Giá trị dược liệu ..................................................................................... 5 1.1.5. Các nghi n cứu về h a sinh h c dược h c của cây Kim tiền thảo ........ 6 1.1.6. Một số bài thuốc dân gian về cây Kim tiền thảo .................................... 9 1.2. Tình hình nhân giống một số loài thuộc chi Desmodium .................... 10 1.3. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro thực vật ..................................................... 12 1.3.1. Cơ sở của khoa h c của phương pháp nuôi cấy mô -tế bào thực vật ... 12 1.3.2. Các giai đoạn ch nh của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật . 13 1.4. Tổng quan về ADN mã vạch .............................................................. 14 1.4.1. Giới thiệu về ADN mã vạch (DNA barcoding)..................................... 14 1.4.2. Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật......... 16 1.4.3. nh h nh nghi n cứu ADN mã vạch ở thực vật ................................... 21 1.4.3. Ứng dụng của ADN mã vạch ............................................................... 27 Chƣơng 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 30 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................... 30 2.1.1. Mục ti u tổng quát ............................................................................... 30 2.1.2. Mục ti u cụ thể ..................................................................................... 30 2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 30 2.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 30
iv 2.3.1. Đối tượng nghi n cứu .......................................................................... 30 2.3.2. hiết bị dụng cụ................................................................................... 31 2.3.3. H a chất............................................................................................... 31 2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 32 2.4.1. Xác định một số ADN mã vạch để xác định loài cây Kim tiền thảo ..... 32 2.4.2. Nghi n cứu nhân giống in vitro loài Kim tiền thảo .............................. 35 2.5. Phương pháp thu thập và xử lí số liệu ................................................. 39 2.5.1. Phương pháp thu thập số liệu .............................................................. 39 2.5.2. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................... 40 2.5.3. Địa điểm và thời gian bố tr th nghiệm ............................................... 40 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 41 3.1. Xác định một số trình tự ADN mã vạch cho loài Kim tiền thảo .......... 41 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ........................................................... 41 3.1.2. Kết quả nhân bản tr nh tự ADN mã vạch cho loài Kim tiền thảo......... 42 3.1.3. Kết quả giải tr nh tự và so sánh tr nh tự các đoạn ADN mã vạch ........ 45 3.1.4. o sánh hiệu quả giám định loài Kim tiền thảo của một số tr nh tự ADN mã vạch .......................................................................................................... 54 3.2. Kết quả nhân giống in vitro loài Kim tiền thảo ................................... 55 3.2.1. Kết quả nghi n cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và tái sinh chồi in vitro............................................................. 55 3.2.2. Kết quả nghi n cứu ảnh hưởng của nồng độ chất ĐH đến nhân nhanh chồi Kim tiền thảo ............................................................................... 57 3.2.3. Kết quả nghi n cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi.................................................................................... 60 3.2.4. Kết quả nghi n cứuảnh hưởng của chất ĐH đến khả năng ra rễ cây Kim tiến thảo.................................................................................................. 62 3.2.5. Kết quả ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống, sinh trưởng của cây Kim tiền thảo......................................................................... 64 KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ..................................................... 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 69 PHỤ BIỂU
v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi sử dụng trong đề tài .................................... 31 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR........................................................... 34 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt độ cho phản ứng PCR .......................................... 34 Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm khử trùng vật liệu hạt Kim tiền thảo ................. 36 Bảng 2.5: Bố trí các thí nghiệm nhân nhanh chồi Kim tiền thảo ................... 36 Bảng 2.6: Ảnh hưởng của hàm lượng chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi Kim tiền thảo ........................................................................................ 37 Bảng 2.7: Thiết kế các thí nghiệm ra rễ Kim tiền thảo .................................. 37 Bảng 2.8: Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống và sinh trưởng của cây .............................................................................................. 38 Bảng 3.1: Các trình tự đoạn gen matK tương ứng với tên loài tương đồng với đoạn trình tự matK của mẫu Kim tiền thảo ................................................... 48 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống và tái sinh chồi ...... 56 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi ..... 58 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của hàm lượng chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi 60 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ α-NAAvà than hoạt tính đến khả năng ... 62 ra rễ. ............................................................................................................. 62 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống, sinh trưởng của cây Kim tiền thảo ................................................................................... 64
vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr) ........... 3 Hình 1.2: Hình thái cây Kim tiền thảo ............................................................ 4 Hình 3.1: Kết quả tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá Kim tiền thảo ............. 41 Hình 3.2: Kết quả điện di sản ph m PCR các đoạn trình tự ADN mã vạch ... 42 Hình 3.3: Trình tự nucleotide đoạn gen MatK của các mẫu Kim tiền thảo .... 46 Hình 3.4: Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen matK của mẫu Kim tiền thảo (query với loài Desmodium styracifolium trên NCBI (sbjct) ......... 47 Hình 3.5: Cây quan hệ di truyền giữa mẫu Kim tiền thảo với các trình tự tương đồng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI .............................................. 49 Hình 3.6: Trình tự nucleotide đoạn gen rbcL của các mẫu Kim tiền thảo ..... 50 Hình 3.7: Cây quan hệ di truyền của mẫu Kim tiền thảo với các trình tự tương đồng trên NCBI dựa trên trình tự đoạn gen rbcL .......................................... 51 Hình 3.8: Trình tự nucleotide đoạn gen ITS của các mẫu Kim tiền thảo ....... 52 Hình 3.9: Cây quan hệ di truyền giữa mẫu Kim tiền thảo với các trình tự tương đồng trên ngân hàng gen đối với trình tự ITS...................................... 52 Hình 3.10: Trình tự nucleotide đoạn gen ycf1b của các mẫu Kim tiền thảo .. 53 Hình 3.11: Cây quan hệ di truyền giữa mẫu Kim tiền thảo với các trình tự tương đồng trên ngân hàng gen dựa trên trình tự đoạn gen ycf1b .................. 54 Hình 3.12: Hạt Kim tiền thảo được khử trùng bằng công thức 2 sau 4 tuần nuôi cấy ........................................................................................................ 57 Hình 3.13: Cụm chồi Kim tiền thảo trên môi trường nhân nhanh NN1 (A và MN2 (B) ....................................................................................................... 59 Hình 3.14: Cụm chồi Kim tiền thảo trong môi trường NC1 sau 7 tuần nuôi cấy....... 61 Hình 3.15: Cây Kim tiền thảo được nuối cấy với công thức R5 .................... 64 Hình 3.16: Cây Kim tiền thảo được nuôi cấy ở công thức B3 ....................... 66
vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỉ lệ mẫu sạch và tỉ lệ nảy mầm ở các công thức khử trùng ............................................................. 56 Biểu đồ 3.2: Hệ số nhân chồi và tỉ lệ chồi hữu hiệu ở các môi trường. ......... 59 Biểu đồ 3.3: Hệ số nhân chồi và tỉ lệ chồi hữu hiệu ở các công thức môi trường có bổ sung chất hữu cơ khác nhau ..................................................... 61 Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng của Chất ĐHST đến tỉ lệ chồi ra rễ (A và số rễ trung bình, chiều dài rễ ở các công thức thí nghiệm (B . .............................. 63 Biểu đồ 3.5: Tỉ lệ cây sống và chiều cao TB của cây Kim tiền thảo được nuối cấy trong các công thức thí nghiệm. ............................................................. 65
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay các hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây dược liệu đã được sử dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được sử dụng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực ph m và mĩ ph m… Trong hệ thống các loài thực vật ở Việt Nam, có nhiều loài cây thuộc họ Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, được dùng để bào chế làm thuốc chữa bệnh, trong đó có cây Kim tiền thảo. Đối với cây Kim tiền thảo thì mọi bộ phận của cây như: rễ, thân, lá đều có thể sử dụng được. Các nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy Kim tiền thảo có tác dụng lợi tiểu, lợi mật, kháng sinh, kháng viêm, dãn mạch, hạ huyết áp, tăng bài tiết mật, giảm đau ống mật, tăng lưu lượng máu ở thận, tăng tuần hoàn máu não và các động mạch đùi… Song công dụng chủ yếu là lợi mật, thông tiểu tiện, thường dùng chữa sỏi thận, sỏi mật, sỏi bàng quang, sỏi đường tiết niệu, viêm gan vàng da, viêm thận phù thũng, chữa bệnh trĩ, chữa viêm mật (Đỗ Tất Lợi, 1999). Tuy nhiên, hiện nay hầu hết nguồn dược liệu đều được nhập từ nước ngoài và chưa có nghiên cứu đầy đủ về nhân giống, gieo trồng, chế biến Kim tiền thảo nên năng suất và chất lượng còn hạn chế. Để có nguồn dược liệu Kim tiền thảo chất lượng tốt, bền vững đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe con người đồng thời đảm bảo được hàm lượng và hoạt tính dược liệu trong sản ph m sau thu hoạch, cần phải có biện pháp hữu hiệu trong bảo tồn và phát triển loài dược liệu đa tác dụng này. Vì vậy, nhân giống loài Kim tiền thảo bằng phương pháp nuôi cấy in vitro sẽ giúp tạo ra số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn, có thể đáp ứng nguồn giống cho các vùng sản xuất dược liệu, nhằm nâng cao thu nhập cho người dân và phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen cây thuốc. Mặt khác, để giám định hay định danh chính xác loài Kim tiền thảo phục vụ cho lựa chọn loài đưa vào nhân giống in vitro thì phương pháp ADN mã
2 vạch được cho là có độ tin cậy cao. Phương pháp ADN mã vạch đã trở thành công cụ hữu hiệu cho các nhà khoa học trong việc phân loại, đánh giá đa dạng di truyền và quan hệ di truyền các loài cả động vật và thực vật. Với mục tiêubước đầu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho loài nhằm đảm bảo độ tin cậy và chính xác trong nhân giống Cây Kim tiền thảo tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xác định một số trình tự ADN mã vạch và nhân giống Cây Kim Tiền Thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”
3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Kim tiền thảo 1.1.1. Nguồn gốc và hệ thống phân loại Tên khoa học: Desmodium styracifolium (Osb.) Merr Tên khác: Đồng tiền lông, Mắt trâu, Vảy rồng, Dây sâm lông, Bươm bướm,Cỏ Đồng tiền vàng (Gold Money Herb , Cat’s foot, maiden-hair, ground ivy(Anh); Herbe de St-Jean, couronne de terre, lierre terrestre, rondette (Pháp). Chi: Thóc lép (Desmodium) Họ: Đậu (Fabaceae Bộ: Đậu (Fabales Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta (https://thaoduocquy.net/products/kim-tien-thao) Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium (Osb.) Merr) Desmodium là một chi lớn thuộc họ Đậu với khoảng 350 loài thực vật đa số được sử dụng làm ngũ cốc và thảo dược. Hiện nay chỉ có khoảng 30 loài
4 được nghiên cứu về đặc điểm thực vật, tính chất hóa học và tác dụng sinh học (Nguyễn Minh Ngọc, 2013). 1.1.2. Đặc điểm thực vật của cây Kim tiền thảo Kim tiền thảo là loại cây thân cỏ, mọc bò. Thân hình trụ, màu xanh hơi vàng, phủ đầy lông mịn màu vàng hoe. Lá mọc so le, đơn hay kép lông chim lẻ gồm 1-3 lá chét, lá chét ở giữa to hơn 2 lá bên. Cuống lá dài 2-4 cm, hình trụ phù ở đáy, phủ đầy lông trắng. Hai lá kèm hình mũi mác, dài 6-9 mm, ngang 2-3 mm, nhiều gân dọc, đầy lông trắng mịn. Lá kèm con nhỏ, hình tam giác. Lá chét có phiến tròn hoặc hơi xoăn, đường kính 2-4 cm, ít khi đến 5 cm, mép nguyên, đỉnh tròn hay tù hoặc chia 2 thùy cạn, đáy hình tim; mặt trên nhẵn, màu hơi vàng hoặc lục xám, mặt dưới mốc do phủ đầy lông mịn màu trắng, gân lá kiểu lông chim nổi rõ ở mặt dưới, gân phụ 8-10 đôi, cuống lá dài 1-2 mm, phủ đầy lông trắng mịn. Hai lá chét bên có phần phiến hai bên gân giữa không đều nhau ở gốc,một bên to, một bên hơi nhỏ hơn. (https://thaoduocquy.net/products/kim-tien-thao) Hình1.2: Hình thái cây Kim tiền thảo Cụm hoa: Chùm dài đến 5 cm, thường ở ngọn cành ít khi ở nách những lá phía ngọn, mỗi mấu của chùm là một xim co gồm 2 hoa có chung một lá bắc, giữa 2 gốc cuống hoa có một u lồi nhỏ. Cụm hoa phủ đầy lông trắng mịn.
5 Hoa nhỏ, không đều, lưỡng tính, mẫu 5. Hai cuống hoa của xim hướng ra hai bên sau đó xụ xuống trên quả. Quả loại đậu xụ xuống, mang đài tồn tại ở gốc, dẹp, dài 1,5 - 2 cm, ngang 3-4 mm, nhiều lông trắng mịn, chia thành 2 - 6 đốt. Cây thường được thu hái vào mùa hè thu, có thể dùng tươi hay phơi khô (Đỗ Tất Lợi, 1999); (Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương, 2000); (Võ Văn Chi, 1997). 1.1.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố Kim tiền thảo thích hợp với điều kiện nhiệt độ nóng m hoặc m mát, đất ít chua, có thành phần cơ giới trung bình, m và thoát nước nhưng cũng chịu được đất chua, nghèo xấu và khô hạn. Ưa sáng nhưng cũng chịu được bóng râm, sống lưu niên, tái sinh hạt, chồi gốc, chồi thân, chồi cành đều khỏe (Võ Văn Chi, 1997; Đỗ Tất Lợi, 1999). Phân bố địa lý: Cây Kim tiền thảo là một loại dược liệu mọc nhiều ở Đông Nam Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Việt Nam và Nhật Bản… Tại Việt Nam, cây phân bố rộng rãi ở vùng đồi núi. Thường gặp ở những chỗ sáng, trên đất cát pha, vùng trung du Hà Tây, Lạng Sơn, Ninh Bình và Hải Phòng (Võ Văn Chi, 1997; Đỗ Tất Lợi, 1999). 1.1.4. Giá trị dược liệu Theo Đông y đây là một loại cây có vị ngọt, tính hàn. Trong dân gian cây Kim tiền thảo được dùng thanh nhiệt, lợi thủy, tiêu sạn, giải độc, tiêu viêm. Các nghiên cứu dược lý hiện đại cho thấy Kim tiền thảo có tác dụng lợi tiểu, lợi mật, kháng sinh, kháng viêm, dãn mạch, hạ huyết áp. Nhưng công dụng chủ yếu là lợi mật, thông tiểu tiện, thường dùng chữa sỏi thận, sỏi mật, sỏi bàng quang, sỏi đường tiết niệu, viêm gan vàng da, viêm thận phù thũng… Đối với hệ tim mạch, Kim tiền thảo làm tăng lưu lượng mạch vành,hạ huyết áp, làm tim đập chậm, đồng thời làm giảm mức tiêu thụ oxy của cơ tim. Tác dụng hạ huyết áp do sự kích thích các thụ thể cholinergic vàsự phóng bế các thụ thể adrenergic. Các nhà khoa học đã nghiên cứu và chứng minh được rằng
6 thành phần flavonoid trong Kim tiền thảo có tác dụng rất tốt trong việc làm hạ huyết áp ở những người huyết áp cao. Bên cạnh đó,Kim tiền thảo cũng có tác dụng đối kháng với các triệu chứng do pituitrin gây giảm lưu lượng mạch vành, đồng thời làm giảm mức tiêu thụ ôxy của cơ tim (Đoàn Thị Nhu, 2013). Đặc biệt hoạt chất soyasaponin I chứa trong Kim tiền thảo đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự hình thành sỏi calci axalat ở thận. Cao Kim tiền thảo thí nghiệm trên động vật có tác dụng ức chế sự hình thành sỏi can xi axalat ở thận do thành phần polysacchorid chứa trong cao có tác dụng này và đồng thời làm tăng lượng bài tiết nước tiểu, ngoài ra còn có tác dụng tăng cường sự tiết mật (Đoàn Thị Nhu, 2013). 1.1.5. Các nghiên cứu về hóa sinh học, dược học của cây Kim tiền thảo Zhou C và cộng sự (2012) tiến hành nghiên cứu phương pháp đánh giá chất lượng của Desmodium styracifolium bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với phát hiện mảng photodiode và phương pháp quang phổ khối ion hóa song song. Desmodium styracifolium, với C-flavone glycosides là hợp chất hiệu quả dược lý chính, là một loại thảo dược phổ biến của Trung Quốc và đã được sử dụng để điều trị rối loạn tiểu tiện, sỏi tiết niệu, phù và vàng da. Xuehai Wang và cộng sự (2013 đã công bố liên quan đến lĩnh vực y học cổ truyền Trung Quốc, đặc biệt là viên nang chứa flavonoid tổng số của Desmodium styracifolium, một phương pháp điều chế viên nang và sử dụng viên nang chứa flavonoid tổng số của Desmodium styracifolium trong chế ph m thuốc điều trị sỏi tiết niệu. Điều chế viên nang chứa flavonoid tổng số của Desmodium styracifolium với tỷ lệ hòa tan cao, tác dụng lâm sàng đáng chú ý, tác dụng phụ nhẹ và hiệu quả điều trị tốt cho bệnh sỏi tiết niệu, đặc biệt đối với sỏi vùng chậu thận và sỏi niệu quản(https://patents.google.com/patent/CA2931528A1/en). Nghiên cứu của Zhou J. và cộng sự (2018) cho thấy flavonoid tổng số của D. styracifolium làm suy yếu sự hình thành của sỏi niệu canxi oxalat do hydroxy-L-proline gây ra ở chuột. D. styracifolium được coi là một loại thuốc
7 thảo dược Trung Quốc, đã được báo cáo để điều trị các bệnh sỏi thận. Tuy nhiên, các thành phần hoạt động hóa học tiềm năng và các cơ chế cơ bản liên quan đến hiệu quả của nó trong việc nhắm mục tiêu sỏi tiết niệu vẫn còn tiếp tục được làm sáng tỏ. Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra tác dụng chống tiết niệu của flavonoid tổng số của D. styracifolium (TFDS trên sỏi thận canxi oxalat (CaOx)trên chuột Sprague-Dawley. Kết quả chứng minh rằng TFDS có tác dụng có lợi trong việc ức chế sự hình thành CaOx ở thận chuột có thể thông qua sự kết hợp của các hoạt động chống oxy hóa, chống viêm, kiềm hóa nước tiểu và làm giảm nồng độ các thành phần tạo sỏi trong nước tiểu. Do đó, TFDS có thể có ý nghĩa lâm sàng trong việc ngăn ngừa tổn thương tế bào thận oxy hóa và cuối cùng là hình thành sỏi thận. Dữ liệu cung cấp một lý do cho việc sử dụng TFDS trong điều trị bệnh sỏi thận và xác định tác nhân này là một nguồn tiềm năng của thuốc chống lợi tiểu mới(Zhou J.và cộng sự, 2018). Xie H. và cộng sự (2018 cũng tiến hành nghiên cứu tổng flavone của D. styracifolium làm giảm bớt apoptosisvà autophagy của các tế bào HK-2 gây ra bởi COM bằng cách điều chỉnh KIM-1 thông qua con đường p38/MAPK. Mục đích của nghiên cứu là điều tra cơ chế tổng flavone của D. styracifolium (TFDS trong việc điều chỉnh sự hình thành của nước tiểu. Hàm lượng protein của KIM-1, LC3-II, p-p38 được đo bằng phương pháp Western blot. Ảnh hưởng của nồng độ COM khác nhau, nồng độ TFDS khác nhau, SB203580 (chất ức chế đặc hiệu của p38/MAPK và sự biểu hiện quá mức của KIM-1 đối với khả năng sống của tế bào đã được phát hiện bằng xét nghiệm WST-1. Các tế bào apoptotic và tế bào dương tính FITC được phát hiện bằng phương pháp dòng tế bào học. Khả năng sống của tế bào HK-2 giảm khi tăng nồng độ COM và nồng độ protein của KIM-1, LC3-II và p-p38 tăng theo thời gian. Chặn con đường p38/MAPK hoặc đồng nuôi cấy với TFDS đã ức chế tác động của COM đối với quá trình tự hủy và tự động của
8 các tế bào HK-2. Ngoài ra, việc chặn đường dẫn p38/MAPK đã ức chế biểu hiện của KIM-1. Trong các tế bào gây ra bởi COM, sau khi được xử lý bằng SB203580, sự biểu hiện quá mức của KIM-1 có thể đảo ngược tác dụng bảo vệ của SB203580 đối với tổn thương tế bào do COM gây ra và ức chế SB203580 đối với quá trình tự trị quá mức do COM gây ra, cho thấy p38/MAPK được điều chỉnh điều chỉnh quá trình apoptosis tế bào gây ra COM và autophagy. Cuối cùng, chúng tôi đã chứng minh rằng TFDS ức chế con đường p38/MAPK. Và hiệu quả bảo vệ của tổn thương tế bào do COM gây ra tăng lên khi tăng nồng độ TFDS, và độ bám dính giữa COM và tế bào giảm khi tăng nồng độ TFDS. Với sự gia tăng nồng độ của TFDS, con đường p38/MAPK dần bị ức chế, và các protein liên quan đến KIM-1 và autophagy đã giảm. TFDS đã ức chế apoptosis tế bào HK-2 và autophagy bằng cách điều chỉnh KIM-1 thông qua con đường p38/MAPK (Xie H, Li J và Gao H.,2018). Sun X. và cộng sự (2018 tiến hành nghiên cứu phương pháp vân tay định lượng hiệu quả để đánh giá tính nhất quán chất lượng của Desmodium styracifolium. Phương pháp vân tay định lượng HPLC này có thể được coi là một phương pháp phù hợp để đánh giá chất lượng của các loại thuốc và chế ph m thảo dược truyền thống của Trung Quốc. Để tiến hành phương pháp định lượng HPLC cần có sự kết hợp cùng năm thành phần chính (vicenin-1, schaftoside, isoschaftoside, vicenin-3 và isovitexin của D. styracifolium đã được phát triển để đánh giá tính nhất quán chất lượng của loại thảo dược này. Việc phân tách sắc ký được thực hiện trên cột Agilent 5 TC-C18 (4,6 × 250 mm, 5 m bằng cách rửa giải gradient bằng acetonitril và axit formic 0,1% (v/ v . Nhiệt độ cột là 30°C và bước sóng phát hiện là 272 nm. Dữ liệu sắc ký được phân tích bằng phương pháp vân tay định lượng có hệ thống mới (SQFM . Phương pháp vân tay định lượng được thiết lập đã được áp dụng thành công để xác định đồng thời mức độ của các thành phần chính và 39 đỉnh chung đã được tìm thấy. Các mẫu được thu thập ở tỉnh Quảng Đông có
9 tính nhất quán chất lượng tốt, theo quan điểm truyền thống rằng tỉnh Quảng Đông là khu vực tốt nhất để trồng D. styracifolium. Mối quan hệ hiệu quả chống oxy hóa dấu vân tay của các mẫu khác nhau đã được nghiên cứu bằng cách kiểm tra mối tương quan giữa các đỉnh chung và tác dụng chống oxy hóa. Hai mươi hai đỉnh chung có tương quan dương với tác dụng chống oxy hóa, trong khi các đỉnh khác cho thấy mối tương quan nghịch. SQFM là đáng tin cậy và hiệu quả để phân tích dữ liệu sắc ký (Vasantha M.M. và cộng sự,2005). Hiện nay, hầu hết các công trình đã công bố đều chủ yếu nghiên cứu về hóa sinh học và thành phần dược học của cây Kim tiền thảo. Ở Việt Nam cũng như trên thế giới hiện chưa có công trình nghiên cứu nào về nhân giống cây Kim tiền thảo bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. 1.1.6. Một số bài thuốc dân gian về cây Kim tiền thảo Chữa mụn nhọt, ghẻ lở: Kim tiền thảo + xa tiền thảo tươi, giã nát, cho rượu vào, vắt lấy nước cốt, lấy lông ngỗng chấm thuốc bôi vào vết thương. Chữa sạn mật: Chỉ xác (sao) 10-15g, xuyên luyện tử 10g, hoàng tinh 10g, Kim tiền thảo 30g, sinh địa 6-10g (cho vào sau), sắc uống. Hoặc Kim tiền thảo 30g, xuyên phá thạch 15g, trần bì 30g, uất kim 12g, xuyên quân (cho vào sau) 10g, sắc uống. Chữa sạn đường tiểu: Kim tiền thảo 30-60g, hải kim sa (gói vào túi vải 15g, đông quỳ tử 15g, xuyên phá thạch 15g, hoài ngưu tất 12g, hoạt thạch 15g, sắc uống. Hoặc kim tiền thảo 30g, xa tiền tử (bọc vào túi vải 15g, xuyên sơn giáp (chích 10g, thanh bì 10g, đào nhân 10g, ô dược 19g, xuyên ngưu tất 12g, sắc uống. Chữa sỏi đường tiểu do thận hư thấp nhiệt: hoàng kỳ 30g, hoàng tinh 15g, hoài ngưu tất 15g, Kim tiền thảo 20g, hải kim sa (gói vào túi vải , xuyên phá thạch 15g, vương bất lưu hành 15g, sắc uống. Chữa bệnh trĩ: mỗi ngày dùng toàn cây Kim tiền thảo tươi 100g (nếu khô 50g sắc uống. Đối với trĩ nội và ngoại đều có kết quả như nhau.Chữa viêm
10 đường mật không do vi khu n: Dùng Kim tiền thảo sắc uống sáng 1 lần hoặc nhiều lần trong ngày. Mỗi ngày dùng 30g, có khi 20g hoặc 10g/ ngày, 30 ngày là 1 liệu trình. Thông thường uống trong 2-3 tháng có kết quả với tỉ lệ 76,9%. Chữa sỏi niệu gây chảy máu, sung huyết: Dùng 40g kim tiền thảo, 20g mã đề, 12g ngưu tất, 12g ý dĩ, 8g các loại uất kim, đào nhân, đại phúc kì, kê nội kim. Sắc uống, mỗi ngày 1 thang. Chữa phù, viêm túi mật, viêm gan, viêm thận: 40g Kim tiền thảo, 10g chút chít, 10g dành dành, 20g mộc thông, 20g ngưu tất. Mỗi ngày sắc 1 thang uống. Chữa viêm vàng da: Mỗi ngày dùng 60g kim tiền thảo sắc uống cho đến khi hết vàng da. 1.2. Tình hình nhân giống một số loài thuộc chi Desmodium Năm 2005, Vasantha Kumari tiến hành nghiên cứu tái sinh cây Desmodium oojeinense Roxb. bằng phương pháp tạo mô sẹo. Trong nghiên cứu, mô sẹo được tạo ra bằng cách nuôi cấy lá, cuống lá, chồi nách, trụ dưới lá mầm và lá mầm của D. oojeinense trên môi trường MS, B5 hoặc WP được bổ sung 2,4-D hoặc BAP. Trong số các môi trường được sử dụng, tất cả các nhà nghiên cứu đều cho rằng môi trường MS và WP được bổ sung 2,4-D hoặc BAP được tìm thấy là môi trường lý tưởng cho việc tạo ra mô sẹo. Trong đó, B5 là môi trường kém hiệu quả nhất. Các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy phiến lá mỏng được nuôi trong môi trường MS được bổ sung 2,4-D hoặc BAP ở mức 1,0 mg/l và môi trường WP được bổ sung một trong hai hormone này ở mức 0,25 mg/l thì tạo mô sẹo tốt nhất. Tái sinh cây chỉ đạt được từ mô sẹo khi cho lá, lá mầm và trụ dưới lá mầm phát triển trên môi trường MS được bổ sung với sự kết hợp 4 mg/l BAP và Kinetin (Ki . Chồi tái sinh được tạo thành cây hoàn chỉnh trong môi trường MS bổ sung 3 mg/l IAA. 50% số cây tái sinh sống sót khi trồng ngoài tự nhiên. Đây là báo cáo đầu tiên về việc tạo ra mô sẹo và tái sinh cây con D. oojeinense của các nhà nghiên cứu (Preeti S. và cộng sự, 2013).
11 Srivastava Preeti và cộng sự (2013 tiến hành nhân giống in vitro tần số cao cây Thóc lép (Desmodium gangeticum L.L. (DDCC) – cây thuốc có nguy cơ tuyệt chủng. Các nhà nghiên cứu sử dụng cây giống vô trùng 10 ngày tuổi, cắt bỏ đỉnh sinh trưởng và lấy mắt ngủ nuôi cấy trên môi trường Murashige ADN Skoog (MS , ½ MS và Gamborg (B5 chứa các cytokinin 6-benzyl aminopurine (BA , kinetin (Ki và thiadiazuran (TDZ . BA đã được tìm thấy là hiệu quả nhất cho sự phát sinh chồi chiếm tỉ lệ 98% và số lượng chồi tối đa là 12,4 được tạo ra trên môi trường MS được bổ sung 4,44 µM BA. Tỉ lệ ra rễ cao nhất (98% và số rễ tối đa là 8 rễ/chồi khi chồi được nhúng vào dung dịch axit indol-3-butyric (IBA (492,12 µM trong 30 phút và sau đó nuôi cấy trên môi trường ½ MS. Các cây con đã được trồng thành công trong Soilrite (hỗn hợp gồm 75% rêu than bùn Ailen và 25% đá trân châu có pH trong khoảng từ 5,0 đến 6,5 với tỷ lệ sống 96%. Cây tái sinh phát triển bình thường và không có bất kỳ biến đổi hình thái nào (Preeti S. và cộng sự, 2013). San Thandar và cộng sự (2015 đã nghiên cứu thành công quy trình nhân giống in vitro cây Mũi mác (Desmodium triquetrum D.C.). Trong nghiên cứu này, sự phát triển chồi trực tiếp và sự hình thành mô sẹo đã đạt được từ các chồi nách và mô lá khác nhau của cây giống in vitroD.triquetrum D.C. Môi trường Murashige và Skoog từ (MS được bổ sung với nồng độ khác nhau của cytokinin và kết hợp với chất phụ gia đã được sử dụng để nhân chồi, cảm ứng mô sẹo và hình thành rễ. Sự tiết ra polyphenolic từ vật liệu nuôi cấy được kiểm soát bằng cách bổ sung axit citric vào môi trường. Những cây con đã bén rễ được cấy vào một túi nhựa chứa hỗn hợp đất và được trồng trong điều kiện nhà xanh để thích nghi với môi trường tự nhiên. Nồng độ khác nhau của auxin và cytokinin ảnh hưởng đến quá trình nhân nhanh chồi, cảm ứng mô sẹo và sự hình thành rễ. Kết quả của nghiên cứu cho thấy, môi trường bổ sung 4 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA là tối ưu để nhân chồi, 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA là tốt nhất cho sự tăng sinh mô sẹo. Môi trường ⅟₂MS chứa ở
12 NAA 0,75 hoặc 1 mg/l cho thấy chồi ra rễ tối đa. Quy trình nhân giống in vitro có thể được tiêu chu n hóa rất hữu ích trong việc nâng cao chất lượng cây trồng Desmodium triquetrum DC cho các chương trình trồng thương mại và bảo tồn tế bào mầm (Thandar S và Tun O. M.,2015). 1.3. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro thực vật Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture , hoặc vi nhân giống (micropropagation là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây (Nguyễn Văn Uyển,1993) đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật. 1.3.1. Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện vô trùng (Nguyễn Quang Thạch và Lý Thị Anh , 2000). Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào của nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20: “Mọi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (ADN cần thiết và đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”. Ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Trong nuôi cấy in vitro, quá trình phát sinh hình thái thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai