Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nhân giống cây Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:75

Thêm vào BST

Báo xấu

43
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nhân giống cây Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dựng được kỹ thuật nhân giống cây Tục đoạn bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nhân giống cây Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP PHAN THỊ THU TRANG NHÂN GIỐNG CÂY TỤC ĐOẠN (Dipsacus japonicus Miq) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học1: PGS.TS. BÙI VĂN THẮNG Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 2: TS. KHUẤT THỊ HẢI NINH Hà Nội, 2018 HÀ NỘI, 2018
i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan, đề tài nghiên cứu của tôi về “Nhân giống cây Tục Đoạn (Dipsacus japonicus Miq) bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro” do tôi và nhóm nghiên cứu thực hiện, chƣa từng đƣợc công bố trong bất kì công trình nào khác. Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ công nghiên cứu nào đã công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của Hội đồng khoa học. Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2018 Ngƣời cam đoan Phan Thị Thu Trang
ii LỜI CÁM ƠN Đề tài nghiên cứu của tôi đƣợc thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện đã tạo điều kiện để các công việc chuyên môn của đề tài đƣợc tiến hành thuận lợi. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Bùi Văn Thắng và TS. Khuất Thị Hải Ninh đã tận tình hƣớng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn những góp ý, chỉ dẫn, chia sẻ kinh nghiệm của các cán bộ nghiên cứu Viện Công nghiệp sinh học lâm nghiệp đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời, tôi đã nhận đƣợc sự động viên, quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình của bạn bè và các đồng nghiệp nơi tôi công tác. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những ngƣời thân đã luôn bên tôi, là động lực để tôi vƣợt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Phan Thị Thu Trang
iii MỤC LỤC TRANG LỜI CÁM ƠN................................................................................................................. ii MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................................... v DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ .................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ..........................................................................................viii ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU................................................ 4 1.1. Giới thiệu chung về cây Tục Đoạn (D. japonicus Miq) ......................... 4 1.1.1. Đặc điểm sinh vật học, phân bố và giá trị kinh tế của cây Tục Đoạn (D. japonicus Miq) ..................................................................................... 4 1.1.2. Tình hình bảo tồn, khai thác và phát triển cây Tục Đoạn ............... 9 1.1.3. Các phương pháp nhân giống Tục Đoạn (D. japonicus Miq) ....... 10 1.2. Tình hình nghiên cứu cây Tục Đoạn (D. japonicus Miq)..................... 12 1.2.1. Tình hình nghiên cứu Tục Đoạn trên thế giới ................................ 12 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Tục Đoạn ở Việt Nam ................................. 13 1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro một số loài dƣợc liệu ở Việt Nam ..................................................................................................... 14 Chƣơng 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................. 20 2.1. Nội dung nghiên cứu ........................................................................... 20 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 20 2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm và thu thập số liệu ....................... 21 2.2.2. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 24 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................... 27 3.1. Tạo mẫu sạch Tục Đoạn (D. japonicus Miq) ....................................... 27
iv 3.1.1. Tạo mẫu sạch từ hạt ...................................................................... 27 3.1.2. Tạo mẫu sạch từ chồi cây con ........................................................ 29 3.2 Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng, môi trƣờng dinh dƣỡng và hàm lƣợng đƣờng đến khả năng tạo cụm chồi............................................. 31 3.2.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo cụm chồi ........................................................................................................... 31 3.2.2. Ảnh hưởng của loại môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo cụm chồi ................................................................................................................... 35 3.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tạo cụm chồi ..... 37 3.3. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng đến khả năng ra rễ của chồi... 41 3.4. Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây in vitro giai đoạn vƣờn ƣơm......... 44 3.4.1 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây non ...44 3.4. 2. Ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây in vitro tại vườn ươm ......................................................................... 45 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ ......................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 51
v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ 1 BAP Benzyl aninopurine 2 CTTN Công thức thí nghiệm 3 ĐC Đối chứng 4 CS Cộng sự 5 ĐHST Điều hòa sinh trƣởng 6 IBA Indole butiric acid 7 LSD Khoảng sai dị tối thiểu (Least significant difference) Murashige and Skoog, 1962 (một loại môi trƣờng nuôi 8 MS cấy mô) Murashige and Skoog, 1962 (một loại môi trƣờng nuôi 9 MS* cấy mô) 10 NAA Naphtyl acetic acid 11 STT Số thứ tự 12 Sig Mức ý nghĩa (Significant) 13 TB Trung bình 14 TDZ Thidiazuron 15 WPM Woody plant medium
vi DANH MỤC BẢNG TRANG Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian và loại hóa chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch của cây Tục Đoạn, sau 4 tuần nuôi cấy ...................................................... 27 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng mẫu chồi b ng HgCl2 0,1 đến khả năng tạo mẫu sạch của Tục Đoạn sau 3 tuần nuôi cấy............................................... 29 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tạo cụm chồi Tục Đoạn sau 3 tuần nuôi cấy ............................................................................................. 32 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của loại môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tạo cụm chồi của cây Tục Đoạn in vitro ............................................................................................ 35 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng các loại đƣờng đến khả năng tạo cụm chồi Tục Đoạn in vitro .......................................................................................................... 38 Bảng 3.6. Khả năng ra rễ của chồi in vitro Tục Đoạn trên môi trƣờng.................... 42 MS bổ sung NAA, IBA................................................................................................ 42 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống......................... 45 của cây mô Tục Đoạn ................................................................................................... 45 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của các loại giá thể đến khả năng sống và sinh trƣởng của cây in vitro Tục Đoạn ................................................................................................... 46
vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ ( ) mẫu hạt sạch Tục Đoạn nảy chồi khi khử trùng b ng HgCl2 0,1% và NaClO 5 với thời gian khác nhau.............................................................. 28 Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ mẫu sạch Tục Đoạn nảy chồi khi khử trùng b ng HgCl2 0,1 với thời gian khác nhau...................................................................................... 30 Biều đồ 3.3. Tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi trên môi trƣờng MS bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng ở các nồng độ khác nhau…………………………...............31 Biều đồ 3.4. Số chồi TB/cụm Tục Đoạn trên môi trƣờng MS bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng ở các nồng độ khác nhau .......................................................................... 33 Biều đồ 3.5. Chiều cao TB chồi Tục Đoạn trên môi trƣờng MS bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng ở các nồng độ khác nhau................................................................... 33 Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi trên môi trƣờng MS, MS*, WPM sau 3 tuần nuôi cấy…………………………………………………..…….............34 Biểu đồ 3.7. Số chồi TB/cụm trên môi trƣờng MS, MS*, WPM .............................. 36 sau 3 tuần nuôi cấy........................................................................................................ 36 Biểu đồ 3.8. Chiều cao trung bình chồi trên môi trƣờng MS, MS*, WPM.............. 36 sau 3 tuần nuôi cấy........................................................................................................ 36 Biểu đồ 3.9. Tỷ lệ ( ) mẫu tạo cụm chồi trong môi trƣờng bổ sung ...................... 38 Biểu đồ 3.10. Số chồi TB/cụm trong môi trƣờng bổ sung các loại đƣờng khác nhau (sau 3 tuần nuôi cấy)..................................................................................................... 39 Biểu đồ 3.11. Chiều cao trung bình chồi trong môi trƣờng bổ sung các loại đƣờng khác nhau (sau 3 tuần nuôi cấy)................................................................................... 39 Biểu đồ 3.12. Số lƣợng trung bình rễ/chồi (sau 4 tuần cấy)....................................... 43 Biểu đồ 3.13. Số lƣợng chiều dài trung bình rễ /chồi (sau 4 tuần cấy) ..................... 43 Biểu đồ 3.14. Tỉ lệ cây sống sót trong các giá thể khác nhau .................................... 47 Biểu đồ 3.15. Chiều cao trung bình cây trong các giá thể khác nhau ....................... 47
viii DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Hình 1.1. Cây Tục Đoạn ................................................................................................ 5 Hình 2.1. Mẫu Tục Đoạn làm vật liệu nuôi cấy ......................................................... 22 Hình 3.1 Mẫu hạt sạch Tục Đoạn nảy mầm in vitro sau 3 tuần nuôi cấy ................ 29 Hình 3.2. Mẫu sạch Tục Đoạn nảy chồi sau 3 tuần nuôi cấy. ................................... 31 Hình 3.3. Cụm chồi Tục Đoạn sau 3 tuần cấy chuyển sang môi trƣờng nhân chồi . 34 Hình 3.4. Cụm chồi Tục Đoạn sau 3 tuần nuôi cấy trên các loại môi trƣờng: ............. A: WPM, B: MS* và C: MS........................................................................................ 37 Hình 3.5. Cụm chồi Tục Đoạn sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng các hàm lƣợng đƣờng khác nhau: A: là công thức D4; B: là công thức D1;...................................... 40 Hình 3.6. Cụm chồi Tục Đoạn sau 4 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng các hàm lƣợng đƣờng khác nhau........................................................................................................... 41 Hình 3.7. Cây Tục Đoạn hoàn chỉnh trên môi trƣờng MS + 0,4 mg/l NAA.......... 44 Hình 3.8. Cây mô Tục Đoạn trên giá thể GT2 ........................................................... 48
1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng trên thế giới, với hơn 5.117 loài và dƣới loài, thuộc 1.823 chi, 360 họ của 8 ngành Thực vật bậc cao có mạch, cùng với một số taxon thuộc nhóm Rêu, Tảo và Nấm lớn, có công dụng làm thuốc (Danh lục cây thuốc Việt Nam, 2016). Theo Tổ chức Y tế Thế giới, 80 dân số ở các nƣớc đang phát triển có nhu cầu sử dụng y học cổ truyền hoặc thuốc từ thảo dƣợc để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Trong vài thập niên gần đây, nhiều nƣớc đã và đang đẩy mạnh việc nghiên cứu, bào chế và sản xuất các dƣợc phẩm có nguồn gốc từ dƣợc liệu để hỗ trợ, phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh. Theo thống kê của ngành Y tế, hiện nay nhu cầu sử dụng dƣợc liệu ở Việt Nam vào khoảng 60.000 - 80.000 tấn dƣợc liệu/năm. Lĩnh vực sản xuất và kinh doanh dƣợc liệu cho sản xuất thuốc, thực phẩm chức năng đã và đang mang lại nguồn lợi lớn cho nền kinh tế. Tuy nhiên, một phần lớn khối lƣợng dƣợc liệu hiện nay vẫn phải nhập khẩu, trong khi Việt Nam lại là quốc gia có tiềm năng về nguồn tài nguyên dƣợc liệu phong phú. Năm 2013, theo Quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 của Thủ tƣớng Chính phủ “Phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dƣợc liệu đến năm 2020 và định hƣớng đến năm 2030” và quyết định số 206/QĐ-BYT, ngày 22/1/2015 của Bộ trƣởng bộ Y tế về việc ban hành danh mục cây dƣợc liệu ƣu tiên phát triển giai đoạn 2015 – 2020, nh m bảo tồn và khai thác dƣợc liệu tự nhiên. Việt Nam sẽ quy hoạch 8 vùng dƣợc liệu trọng điểm để lựa chọn sản xuất và khai thác hợp lý. Trong đó, triển khai sản xuất 28 loài dƣợc liệu bản địa phục vụ cho sản xuất thì Tục Đoạn là một trong các loài cây dƣợc liệu đƣợc qui hoạch trồng ở các vùng núi cao và vùng núi trung bình có khí hậu Á nhiệt đới.
2 Hiện nay, nhu cầu trong và ngoài nƣớc về Tục Đoạn rất lớn, việc khai thác những cây mọc hoang trong tự nhiên không đủ nhu cầu. Trong điều kiện tự nhiên cây Tục Đoạn sinh sản b ng hạt hoặc sinh dƣỡng (Đỗ Huy Bích, 2006). Tuy nhiên, tốc độ đẻ nhánh từ cây mẹ trong điều kiện tự nhiên chậm. Mặt khác, theo dân gian do công dụng cây Tục Đoạn ở bộ phận rễ, khi khai thác trong tự nhiên ngƣời dân nhổ cả cây, đào rễ và do cây Tục Đoạn sống ở vùng núi cao, thời gian thu hoạch hạt vào mùa đông tháng 11,12 giá rét, nên thu hoạch hạt để nhân giống trong điều kiện tự nhiên gặp khó khăn (Đỗ Huy Bích, 2006; Xu li, 2002). Vì vậy, sử dụng phƣơng pháp nhân giống tiên tiến để tiến hành nhân nhanh cây Tục Đoạn và gây trồng tại những khu phân bố của chúng là hết sức cần thiết hiện nay. Nhân giống cây Tục Đoạn b ng phƣơng pháp in vitro giúp tạo ra số lƣợng lớn cây giống tốt trong thời gian ngắn, có thể quy hoạch thành các vùng sản xuất dƣợc liệu, nâng cao thu nhập cho ngƣời dân và tránh nguy cơ cạn kiệt ngoài tự nhiên. Để chủ động nguồn cây giống và chọn lọc giống Tục Đoạn cần đƣợc tiến hành để nâng cao năng suất và chất lƣợng giống cho việc gây trồng Tục Đoạn góp phần cung cấp nguồn dƣợc liệu ổn định cho thị trƣờng chúng tôi thực hiện đề tài “Nhân giống cây Tục Đoạn (Dipsacus japonicus Miq) bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Xây dựng đƣợc kỹ thuật nhân giống cây Tục Đoạn b ng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro. Mục tiêu cụ thể: - Xác định đƣợc phƣơng pháp tạo mẫu sạch thích hợp; - Xác định đƣợc công thức môi trƣờng phù hợp để nhân nhanh chồi; - Xác định đƣợc công thức môi trƣờng phù hợp để tạo cây con hoàn chỉnh;
3 - Xác định đƣợc thành phần giá thể và kỹ thuật chăm sóc cây mô giai đoạn vƣờn ƣơm. + Xác định đƣợc ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây mô; + Xác định đƣợc ảnh hƣởng của loại giá thể đến khả năng sống và sinh trƣởng của cây mô tại vƣờn ƣơm. 3. Đối tƣợng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Loài Tục Đoạn (Dipsacus japonicus Miq) - Vật liệu nghiên cứu: Chồi và hạt Tục Đoạn do Trung tâm Nghiên cứu Giống cây trồng Đạo Đức – Hà Giang cung cấp. - Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học lâm nghiệp. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp cơ sở khoa học về kỹ thuật nhân giống in vitro cây Tục Đoạn và các dẫn liệu khoa học về ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây Tục Đoạn. Việc nhân nhanh thành công cây Tục Đoạn b ng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro góp phần vào công tác bảo tồn hữu hiệu loài cây quý này. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Áp dụng quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro cây Tục Đoạn có thể tạo ra số lƣợng lớn cây giống tốt phục vụ sản xuất cho các vùng chuyên canh cây dƣợc liệu đáp ứng mục tiêu bảo tồn và phát triển các loài cây dƣợc liệu quý này.
4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Giới thiệu chung về cây Tục Đoạn (D. japonicus Miq) 1.1.1. Đặc điểm sinh vật học, phân bố và giá trị kinh tế của cây Tục Đoạn (D. japonicus Miq) 1.1.1.1. Đặc điểm sinh học Cây Tục Đoạn còn gọi là Sâm nam, Đầu vù, Rễ Thái, Sơn cân thái, Oa thài, có tên khoa học Dipsacus japonicus Miq, thuộc họ Tục Đoạn (Dipsacaceae). Tục là nối, đọan là đứt vì ngƣời xƣa cho r ng vị thuốc có tác dụng nối đƣợc gân xƣơng đã đứt. Theo đông y, Tục Đoạn có vị đắng cay, tính hơi ôn, có tác dụng bổ can ích thận, nối liền gân cốt, thông huyết mạch, cầm máu, giảm đau. Chủ trị can thận hƣ, lƣng đau, chân yếu, gẫy xƣơng, bong gân, dọa sảy thai, an thai, chỉ huyết và chữa băng lậu đới hạ (Bùi Thị B ng, 2010; Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001). Tục Đoạn là cây thuốc quý ở Việt Nam. Hàng năm, ngƣời dân thƣờng xuyên khai thác loại dƣợc liệu này để cung cấp cho nhu cầu sử dụng trong nƣớc. Việc khai thác liên tục nhiều năm hoặc bị tàn phá do nạn cháy rừng, đốt nƣơng làm rẫy đã làm cho nguồn cây thuốc này mau cạn kiệt. Tục Đoạn đã đƣợc đƣa vào Sách Đỏ Việt Nam để lƣu ý bảo vệ (Đỗ Huy Bích, 2006; Sách đỏ Việt Nam, 2007). Cây Tục Đoạn là một loài thực vật có hoa trong họ Tục đoạn. Loài này đƣợc Miq mô tả đầu tiên năm 1868, cây cao 1,5 – 2 m, thân có 6 cạnh, trên cạnh có một hàng gai thƣa, càng lên trên càng mau dần, gai quặp trở xuống, lá mọc đối, không có cuống, bẹ ôm lấy cành hoặc thân. Lá non có răng cƣa dài, phiến lá nhỏ, thuôn dài, đầu nhọn. Gân lá cách, trên đƣờng gân của mặt dƣới có một hàng gai nhỏ cứng, càng lên đầu lá, càng mềm dần. Lá già có phiến lá xẻ sâu, răng cƣa mau hơn lá non, phiến lá xẻ cách từ 3 - 9 thuỳ, gân lá có gai
5 nhỏ nhƣ lá non. Cũng có lá nguyên, cụm hoa hình trứng hay hình cầu, cành mang hoa dài 10 - 20 cm, 6 cạnh có lông cứng, càng lên trên càng mau dần. Hoa màu trắng có lá bắc dài 1- 2 cm. Quả bế có 4 cạnh, màu xám trắng còn đài sót lại, dài 5 - 6 mm (Danh mục cây thuốc Việt Nam, 2016; Đỗ Tất Lợi, 2004). Hình 1.1. Cây Tục Đoạn (Nguồn: Đỗ Tất Lợi, 2004) 1.1.1.2. Phân bố Chi Dipsacus gồm một số loài, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ấm hoặc cận nhiệt đới thuộc châu Âu, châu Á và Bắc Phi. Ở Việt Nam, chi này có 2 loài D.japonicus Miq và D. asper Wallich ex Candolle, đều gọi chung là Tục Đoạn. Trên thế giới, cả 2 loài này đều thấy phân bố ở vùng Đông Á, bao gồm Trung Quốc, Nhật Bản và một phần ở Bắc Việt Nam (Đỗ Huy Bích, 2006; Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001; Van Dan Nguyen, 1999; Shizhen Li, 1990). Ở Việt Nam, Tục Đoạn chỉ thấy phân bố ở một số vùng núi cao, thuộc các tỉnh Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, Bắc Hà, Mƣờng Khƣơng, Than Uyên), Lai Châu (Sìn Hổ, Phong Thổ; Tủa Chùa) và Hà Giang (Đồng Văn, Mèo Vạc và Quản Bạ), nhiều nhất ở Sapa, Bình Lƣ (Lào Cai), Hà Giang, Tuyên Quang. (Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001; Van Dan Nguyen, 1999). Tục
6 Đoạn bắt đầu đƣợc khai thác vào khoảng từ năm 1935. Mùa thu hoạch vào các tháng 8 – 10. Đào lấy rễ già rửa sạch đất cát cắt bỏ phần trên cổ rễ và rễ con, phơi trong râm hay sấy nhẹ cho khô để làm dƣợc liệu (Đỗ Huy Bích, 2006; Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001). Cây Tục Đoạn phân bố ở độ cao từ 1350 đến 1600 m (Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001; Narayan Das Prajapati, 2003). Nhìn chung, cả 2 loài Tục Đoạn thuộc loại cây ƣa sáng, mọc rải rác, đôi khi tạo thành đám trên các nƣơng rẫy mới bỏ hoang, ở trảng cỏ hay ven rừng núi đá vôi. Hàng năm, vào mùa đông phần trên mặt đất thƣờng tàn lụi. Cây sinh trƣởng tốt trong điều kiện khí hậu ẩm mát của vùng nhiệt đới núi cao; nhiệt độ trung bình năm là 13 - 15°C; lƣợng mƣa dao động từ 1600 đến trên 3000 mm/năm, độ ẩm không khí trung bình 85 (Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001; Narayan Das Prajapati, 2003). Tục Đoạn mọc trên những loại đất tơi xốp, dễ thoát nƣớc và có hàm lƣợng mùn tƣơng đối cao, mọc ở nơi đất chặt, lẫn trong các trảng cỏ, cây thƣờng sinh trƣởng kém, rễ củ nhỏ và nhiều xơ. Cây ra hoa quả hàng năm; quả có túm lông, nên thuận lợi cho việc phát tán nhờ gió. Cây con mọc từ hạt có thể thấy vào cuối mùa xuân hay đầu mùa hè (Đỗ Huy Bích, 2006). Ở Trung Quốc, Tục Đoạn chủ yếu mọc ở vùng Tứ Xuyên, Vân Nam, Tây Tạng. Cây ra hoa vào tháng 8 - 9, có quả tháng 9 - 10 (Hoàng Văn Vinh, 2001). 1.1.1.3. Thành phần hoá học Tục Đoạn chƣa đƣợc nghiên cứu sâu về thành phần hóa học. Kết quả nghiên cứu còn chƣa thống nhất. Có tài liệu nói rễ cây Tục Đoạn chứa alkaloid , tinh dầu, chất màu (Hoàng Văn Vinh, 2001). Sơ bộ nghiên cứu Tục Đoạn Việt Nam cho thấy: Dịch chiết tục đoạn có vị hơi ngọt, sau hơi se lƣỡi, có phản ứng axit với giấy quỳ, cho phản ứng dƣơng tính với thuốc thử chung của alkaloid, phản ứng tanin cũng rõ rệt, có đƣờng và cũng có thể có saponin (Đỗ Tất Lợi, 2004; Xu li, 2002).
7 Thành phần chính có trong Tục Đoạn bao gồm: alkaloid, dầu dễ bay hơi, trierpene saponin, gentianine, B – sitosterol, daucosterol và vitamin E (Lê Thị Thảo, 2013; Miao, 2000; Wei, 1998). Theo Trung dƣợc từ hải III (1997) rễ của loài Tục Đoạn D. japonicus có 2 saponin là japondipsaponin E1 và japondipsanonin E2. E1 gồm có rhamnose 1 -> 3 glucose 1 -> 3 rhamnose 1 -> 2 arabinose 1 -> 5 hederagenin. E2 : rhamnose 1 -> 3 glucose 1 -> 3 rhamnose 1 -> 2 arabinose 1 -> 3 acid oleanolic (Đỗ Tất Lợi, 2004). Dịch chiết cây Tục Đoạn xác định đƣợc một saponin triterpenoid mới chứa năm loại đƣờng đƣợc phân lập từ chiết xuất gốc etanol của D. japonicus và cấu trúc của nó đƣợc thiết lập là 3-O- [β-D-glucopyranosyl (1 → 4)] [α-L- rhamnopyranosyl (1 → 3)] -β-D-glucopyranosyl (1 → 3) -α-L -rhamnopyranosyl (1 → 2) -α-L-arabinopyranosyloleanoic axit (Miao, 2000). Rễ Tục Đoạn chứa 6 chất là sucrose, daucosterol, β - sitosterol, akebia saponin D, 3 - O - (4 - acetyl) - α - L - arabinopyranosyl - hederagenin - 28 - O - β - O - glucopyranosyl - (1 -> 6) - β - D - glucopyranosid và 3-O-α-L - arabinopyranosyl - oleanolic acid - 28 - o - β - D. glucopyranosyl - (1 -> 6) - β - D. glucopyranosid (Đỗ Tất Lợi, 2004). Ngoài ra, rễ còn có 3 - O - β - D. glucopyranosyl (1 -> 3) - α - L. rhamnopyranosyl (1 -> 2) - α - L. arabinopyranosyl hederagenin 28 - O - β - D. glucopyranosyl (1 -> 6) - β - O - glucopyranosyl (1 -> 6) - β - D. glucopyranosyl-ester và 3 - O - α - L. rhamnopyranosyl (1 -> 3) - β - D. glucopyranosyl (1 -> 3) - α - L. rhamnopyranosyl (1 -> 2) - α - L - arabinopyranosyl - hederagenin -28-O-β-D- glucopyranosyl (l->6)-β-D. glucopyranosyl ester (Đỗ Tất Lợi, 2004). Rễ chứa một triterpen glycosid (I), một triterpen glycosid khác là akebia saponin D và 3 iridoid glycosid là swerosid, loganin và cantleyosid .
8 (Trịnh Thị Thủy, 1999). Iri- doid và bis-iridoid glycosides, Tri- terpene glycosides (Trịnh Thị Thủy, 2002). Dịch chiết trong lá, thân cây Tục Đoạn cho thấy: Thành phần hóa học chủ yếu trong các dịch chiết từ cây Tục Đoạn gồm chủ yếu là alkaloid, glycoside, saponin và các hợp chất polyphenol trong đó có chứa nhiều tannin và flavonoid (Lê Thị Thảo, 2013). Tinh dầu chƣng cất nƣớc từ bộ phận quang hợp của cây Tục Đoạn ở giai đoạn ra hoa đƣợc phân tích b ng phép sắc ký khí khối phổ (GC-MS) bao gồm 46 hợp chất, chiếm 96,76 tổng lƣợng dầu, đã đƣợc xác định và hợp chất chính của tinh dầu là linalool (11,78 ), trans-geraniol (8,58%), 1,8- cineole(7,91 ), β-caryophyllene (5,58 ), α-terpineol (5,32 ), β-selinene (5,15%) và spathulenol (5,04%) (Zhi Long Liu, 2013). 1.1.1.4. Công dụng Tục Đoạn thƣờng dƣợc dùng làm thuốc bổ toàn thân, thuốc dịu đau, chữa đau đớn do bị ngã, bị thƣơng, còn có tác dụng lợi sữa, an thai, cầm máu. Liều đùng: Ngày uống 9 – 18 g dƣới dạng thuốc sắc hay ngâm rƣợu (Bùi Thị B ng, 2010; Đỗ Tất Lợi, 2004; Xu li, 2002). Theo dân gian nhiều bài thuốc dùng rễ cây Tục Đoạn có công năng, chủ trị: bổ can, thận, nối gân xƣơng, thông huyết mạch, lợi quan tiết, hết đau, an thai, dùng chữa đau lƣng, động thai, di tinh, gân cốt đứt đau giảm đâu, chống viêm, chữa viêm đa khớp dạng thấp (Bùi Thị B ng, 2010; Đỗ Tất Lợi, 2004; Xu li, 2002). Hiện nay, với sự phát triển của khoa học kĩ thuật có một số công trình nghiên cứu tác dụng của cây Tục Đoạn không chỉ sử dụng bộ phận rễ cây mà có thể sử dụng các bộ phận khác của cây. Với các nghiên cứu bƣớc đầu về dịch chiết của các loài cây trong chi Dipsacus ( Li Dahui, 2012) cho thấy có thể dùng điều trị nhiều bệnh cho con ngƣời nhƣ viêm đa khớp (Hyo Won
9 Jung, 2012), bệnh tiểu đƣờng, béo phì (Dong Chil Koo, 2013), cầm máu (Cong, 2013), chống ôxi hóa, điều hòa miễn dịch hỗ trợ phản ứng phụ trong ghép nội tạng (Kam Ming Ko, 2007) hay có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm chống lại các bệnh viêm, truyền nhiễm (Choi NH, 2017;; Li Dahui, 2012; T. Liebold , 2011; Jing Jing Liu, 2011; Shaw, 2011; YiTao, 2017). Điều đó cho thấy vai trò quan trọng của cây này. Theo Zhi Long Liu và cộng sự, (2012), dịch chiết các bộ phận quang hợp trong thời kì ra hoa của cây Tục Đoạn có tác dụng chống lại 2 loài côn trùng Sitophilus zeamais và Tribolium castaneum. 1.1.2. Tình hình bảo tồn, khai thác và phát triển cây Tục Đoạn Tục Đoạn là cây thuốc quý ở Việt Nam. Cây Tục Đoạn phân bố ở Lào Cai, Sơn La, Hà Giang trên các đỉnh núi cao (Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001). Nguồn tri thức bản địa của ngƣời dân trong việc khai thác, sử dụng cây cỏ làm thuốc trị bệnh và chăm sóc sức khoẻ cộng đồng rất đa dạng và phong phú. Hàng năm, ở các địa phƣơng kể trên, ngƣời ta thƣờng xuyên khai thác loại dƣợc liệu này để cung cấp cho nhu cầu sử dụng trong nƣớc. Việc khai thác liên tục nhiều năm hoặc bị tàn phá do nạn cháy rừng, đốt nƣơng làm rẫy đã làm cho nguồn cây thuốc này mau cạn kiệt. Tục Đoạn đã đƣợc đƣa vào Sách Đỏ Việt Nam để lƣu ý bảo vệ (Sách đỏ Việt Nam, 2007). Tuy nhiên, tình trạng khai thác, buôn bán cây thuốc tự phát diễn ra khá phổ biến, thƣơng lái trong và ngoài nƣớc lợi dụng sự thiếu thông tin của bà con vùng sâu để thu mua với giá rẻ mạt. Hoạt động này không chỉ làm suy giảm nguồn tài nguyên, tính đa dạng sinh học mà còn làm cạn kiệt, thậm chí là sự biến mất của nhiều loại cây thuốc quý hiếm, gây thiệt hại lớn về môi trƣờng sinh thái và lợi ích kinh tế của ngƣời dân. Theo một số nghiên cứu mới nhất của các nhà khoa học, việc khai thác không đảm bảo tái sinh, vấn đề du canh và phát triển cây công nghiệp, việc
10 phát triển các công trình thuỷ điện, suy thoái tầng gỗ trong rừng tự nhiên, v.v. cũng là nguyên nhân gây suy kiệt nguồn tài nguyên dƣợc liệu quý. Bên cạnh đó, việc sản xuất, thu hoạch, công nghệ chế biến và tiêu thụ sản phẩm dƣợc liệu cũng còn nhiều vấn đề hạn chế (Hội nghị trực tuyến toàn quốc của Chính phủ về phát triển dƣợc liệu Việt Nam, 2017). Hiện nay, cây Tục Đoạn mới chỉ đƣợc ngƣời dân chủ yếu khai thác trong điều kiện tự nhiên, chƣa có các vùng quy hoạch trồng cây Tục Đoạn do nguồn cung cấp nhân giống còn ít, sự hiểu biết các kiến thức về chăm sóc trồng cây Tục Đoạn hạn chế. Các nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ vào sản xuất, chế biến dƣợc liệu nói chung và cây Tục Đoạn nói riêng chƣa đƣợc chú trọng; công tác bảo tồn, phát triển nguồn gen gặp nhiều khó khăn. Để chủ động có dƣợc liệu bán ra thị trƣờng, ngƣời dân ở xung quanh thị trấn Sa Pa đã trồng cây Tục Đoạn ngay ở vƣờn nhà hoặc trên nƣơng rẫy. Việc làm này góp phần làm giảm nguy cơ bị tuyệt chủng của loài cây này (Đỗ Huy Bích, 2006). Thực trạng này cho thấy cần phải có cơ chế chính sách mang tính tổng thể, đồng bộ về bảo tồn, phát triển, khai thác và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên dƣợc liệu, phục vụ chăm sóc sức khoẻ cộng đồng và tạo thu nhập bền vững cho ngƣời dân bản địa. 1.1.3. Các phương pháp nhân giống Tục Đoạn (D. japonicus Miq) 1.1.3.1. Phương pháp gieo hạt Tục Đoạn mọc trên những loại đất tơi xốp, dễ thoát nƣớc và có hàm lƣợng mùn tƣơng đối cao, mọc ở nơi đất chặt, lẫn trong các trảng cỏ, cây thƣờng sinh trƣởng kém, rễ củ nhỏ và nhiều xơ. Cây ra hoa quả hàng năm; quả có túm lông, nên thuận lợi cho việc phát tán nhờ gió. Cây con mọc từ hạt có thể thấy vào cuối mùa xuân hay đầu mùa hè.
11 Cây Tục Đoạn nhân giống b ng hạt có ƣu điểm là hạt có tỉ lệ nảy mầm cao, nhân giống nhanh, cây thích nghi tốt, bộ rễ khỏe. Tuy nhiên, thu hoạch hạt khó, số lƣợng ít do: Cây giá trị dƣợc liệu ở rễ nên khi khai thác thƣờng nhổ cả cây, cây lúc đó chƣa ra hoa do đó số lƣợng cây trong tự nhiên giảm, có nguy cơ tuyệt chủng. Hơn nữa, cây sống nơi có độ cao so với mực nƣớc biển lớn, mùa thu hoạch hạt vào mùa đông nhiều vùng bị băng giá, nên gặp khó khăn. Cách trồng: Tục Đoạn ƣa khí hậu cận nhiệt đới, nhiệt độ trung bình trong năm khoảng 20°C, đƣợc trồng ở Lào Cai, Vĩnh Phúc, Hoà Bình, Đà Lạt. Cây ƣa đất nhẹ, cát pha, tầng canh tác dày, cao ráo, thoát nƣớc, giữ ẩm (Đỗ Huy Bích, 2006). Có thể gieo thẳng hoặc gieo trong vƣờn ƣơm, khi cây con có 3 - 4 lá thật, mang đi trồng. Thời vụ gieo hạt vào tháng 8 - 9 và trồng vào tháng 2 - 3. Đất trồng Tục Đoạn cần cày bừa kỹ, vơ sạch cỏ, lên thành luống cao 25 - 30 cm, rộng 70 - 90 cm để trồng hàng đôi hay hàng ba, lệch nanh sấu. Khoảng cách trồng 35 x 30 cm hoặc 30 x 30 cm. Cây cần bón phân đầy đủ, trung bình 20 - 27 tấn phân chuồng, 300 - 500 kg phân lân, 150 - 200 kg kali cho 1 ha. Phân đƣợc trộn đều với đất theo hốc rồi trồng cây con. Trong quá trình cây sinh trƣởng, cần xới xáo, làm cỏ, bón thúc 2 - 3 lẩn b ng đạm urê, mỗi lần 100-120 kg cho 1 ha. Ngoài ra, có thể bón thêm tro, nƣớc phân chuồng, nƣớc giải pha loãng hoặc phân xanh ủ mục. Ở trạng thái hoang dại, Tục Đoạn ít có sâu bệnh. Nhƣng khi trồng, cây thƣờng bị sâu xám, sâu xanh, bệnh thối củ gây hại nên cần có biện pháp phòng trừ sâu bệnh (Đỗ Huy Bích, 2006). Tục Đoạn trồng đƣợc một năm có thể cho thu hoạch. Nếu để 2 - 3 năm, củ cái sẽ bị thối, chỉ còn lại củ nhánh. Củ thu vào tháng 11 -12, rửa sạch, phơi khô (Đỗ Huy Bích, 2006; Đỗ Tất Lợi, 2004).