Luận văn Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa quả vả (ficus auriculata Lour) và bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt bò

Chia sẻ: Xedapbietbay Xedapbietbay | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:78

Thêm vào BST

Báo xấu

49
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là thiết lập quy trình thu nhận chế phẩm ficin ở quy mô phòng thí nghiệm. Khảo sát một số tính chất của chế phẩm ficin. Bước đầu ứng dụng chế phẩm ficin thu được để làm mềm thịt bò.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa quả vả (ficus auriculata Lour) và bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt bò

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THÀNH TRUNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ (FICUS AURICULATA LOUR) VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM HUẾ 2017 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THÀNH TRUNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ (FICUS AURICULATA LOUR) VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã số: 60540101 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. VÕ VĂN QUỐC BẢO HUẾ 2017 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong Luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một tài liệu nào khác. Tác giả luận văn Nguyễn Thành Trung PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ii LỜI CẢM ƠN Để thực hiện và hoàn thành Luận văn cùng với sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể. Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học Thầy giáo TS. Võ Văn Quốc Bảo đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo và tạo điều kiện thuận lợi để cho tôi hoàn thành tốt Luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn đến Quý Thầy, Cô giáo Khoa Cơ khí - Công nghệ, Phòng Đào tạo Sau đại học cũng như Quý Thầy, Cô trong Trường Đại học Nông Lâm, Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã truyền đạt những kiến thức cơ bản về lý luận và thực tiễn trong thời gian qua. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ và ủng hộ khuyến khích trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp Trong quá trình thực hiện Luận văn có gì sai sót rất mong Quý Thầy, Cô và các bạn đóng góp ý kiến để Luận văn được hoàn thiện hơn. Huế, ngày….. tháng….. năm 2017 Học viên cao học Nguyễn Thành Trung PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iii TÓM TẮT Protease được chiết xuất từ nhựa quả vả, chứa chủ yếu enzyme ficin; một loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes). Trong công trình này, chúng tôi đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận chế phẩm ficin từ dịch nhựa quả vả cũng như khảo sát một số tính chất đặc trưng của chế phẩm enzyme ficin, nhằm nâng cao giá trị sử dụng của quả vả tại Thừa Thiên Huế để từ đó nghiên cứu bước đầu về khả năng làm mềm thịt của chế phẩm ficin. Để tách một enzyme có kết quả tốt cần phải tiến hành thí nghiệm để lựa chọn các thông số kỹ thuật thích hợp. Kết quả cho thấy, quả vả đạt độ chín thu hoạch cho hàm lượng protein và hoạt độ protease cao nhất, tương ứng 2,212 (mg/ml) và 1,015 (Hp/ml) khi tỷ lệ giữa dịch nhựa quả vả/ethanol 96% là 1/4 và nhiệt độ chiết 3°C. Thời gian thu nhận enzyme này thích hợp nhất là 60 phút. Chế phẩm protease hoạt động thích hợp ở nhiệt độ 45ºC, pH = 6, bền nhiệt từ 35ºC đến 50ºC trong một giờ. Ngoài ra, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng làm mềm thịt của chế phẩm khi khảo sát được độ dai của thịt bò sau 20 phút là 50,60 N và tỷ lệ mất nước giảm còn 17,33% so với mẫu đối chứng 25,13%. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii TÓM TẮT...................................................................................................................... iii MỤC LỤC ......................................................................................................................iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... vii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ..................................................................................ix MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................1 2. Mục đích của luận văn .................................................................................................1 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận văn ................................................................2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .......................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME ..................................................................................3 1.2. TỔNG QUAN PROTEASE .....................................................................................5 1.2.1. Giới thiệu về protease ............................................................................................5 1.2.2. Phân loại protease ..................................................................................................5 1.2.3. Nguồn thu nhận protease .......................................................................................7 1.2.4. Sản xuất protease từ các nguồn thực vật khác nhau ..............................................9 1.3. TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU ......................................................................13 1.3.1. Giới thiệu chung về quả vả ..................................................................................13 1.3.2. Đặc điểm hình thái...............................................................................................14 1.3.3. Đặc điểm sinh học ...............................................................................................15 1.3.4. Thành phần hóa học của nhựa vả ........................................................................15 1.3.5. Enzyme ficin ........................................................................................................15 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC .................................20 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................................20 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................................21 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
v CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................23 2.1. PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................23 2.1.1. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................23 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................23 2.1.3. Hóa chất ...............................................................................................................24 2.1.4. Một số thiết bị chính ............................................................................................24 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................24 2.2.1. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa quả vả ..........................................24 2.2.3. Bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt bò ....................................................25 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................25 2.3.1. Phương pháp tách chế phẩm ficin từ nhựa vả .....................................................25 2.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng protein ..........................................................27 2.3.3. Phương pháp xác định hoạt độ protease ..............................................................28 2.3.4. Phương pháp vật lý ..............................................................................................28 2.3.5. Phương pháp cơ học ............................................................................................28 2.3.6. Phương pháp xác định độ mềm thịt bò ................................................................28 2.3.7. Phương pháp toán học .........................................................................................29 2.3.8. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................................30 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................................32 3.1. HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT ĐỘ PROTEASE Ở BA GIAI ĐOẠN THU HOẠCH KHÁC NHAU CỦA QUẢ VẢ ......................................................................32 3.2. KHẢO SÁT DUNG MÔI KẾT TỦA .....................................................................33 3.3. KHẢO SÁT TỶ LỆ DỊCH NHỰA/ETHANOL ....................................................34 3.4. KHẢO SÁT THỜI GIAN KẾT TỦA PROTEASE ...............................................35 3.5. KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ KẾT TỦA PROTEASE .................................................35 3.6. KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ ........................................................................................................................38 3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của chế phẩm ficin ...................................38 3.6.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của chế phẩm ficin ...........................................39 3.6.3. Khảo sát độ bền nhiệt của chế phẩm ficin ...........................................................39 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vi 3.7. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ .................................................40 3.7.1. Khảo sát độ dai của thịt .......................................................................................40 3.7.2. Khảo sát tỷ lệ mất nước của thịt ..........................................................................41 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................42 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................42 4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................43 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CBB Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue Cys – EP Cystein – proteinase N Newton ĐC Đối chứng FC Thuốc thử folin – clocalteau TCA Acid trichloroacetic Ser-EP Serin – proteinase OD Mật độ quang kD Khối lượng phân tử kilo Dalton CT1 Công thức 1 CT2 Công thức 2 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
viii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Hàm lượng protein và hoạt độ protease theo từng loại dung môi.................33 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chế phẩm ficin đến độ dai của thịt bò .................................40 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chế phẩm ficin đến tỷ lệ mất nước của thịt bò ....................41 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ix DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Quá trình tổng quát thu nhận Enzyme từ thực vật ........................................12 Hình 1.2. Quả vả ............................................................................................................13 Hình 1.3. Nhựa quả vả ...................................................................................................15 Hình 1.4. Chế phẩm Enzyme Wied N ...........................................................................20 Hình 1.5. Chế phẩm Enzyme-Mix .................................................................................20 Hình 1.6. Chế phẩm ficin ..............................................................................................20 Hình 2.1. Dịch nhựa thu nhận từ ba giai đoạn thu hoạch của quả vả ............................23 Hình 2.2. Thu mua thịt bò tại lò giết mổ gia súc ...........................................................23 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thu nhận dịch nhựa từ quả vả [6], [18] ................................25 Hình 3.1. Hàm lượng protein và hoạt độ protease theo độ chín của quả ......................32 Hình 3.2. Hàm lượng protein và hoạt độ protease biến thiên theo tỷ lệ dịch nhựa/ethanol 96% ..........................................................................................................34 Hình 3.3. Hàm lượng protein và hoạt độ protease biến thiên theo thời gian ................35 Hình 3.4. Hàm lượng protein và hoạt độ protease biến thiên theo nhiệt độ ..................36 Hình 3.5. Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme ficin từ dịch nhựa quả vả .................37 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ chế phẩm ficin ....................................38 Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ chế phẩm ficin ............................................39 Hình 3.8. Khả năng bền nhiệt của chế phẩm ficin ........................................................40 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Protease là enzyme công nghiệp rất quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm cùng sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học – thực phẩm, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều.Trên thế giới nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu, đưa vào ứng dụng các chế phẩm protease trong công nghiệp chế biến thực phẩm và thương mại hóa chế phẩm này. Ở Việt Nam, có rất nhiều nghiên cứu về enzyme, tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng vẫn còn hạn chế và hiện nay chưa có cơ sở nào sản xuất chế phẩm enzyme nói chung và protease nói riêng để sử dụng trong các ngành công nghiệp. Nước ta vẫn hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn enzyme từ nước ngoài nên giá thành rất cao. Vì vậy, việc hiểu biết, nghiên cứu và phát triển sản xuất enzyme trong nước là việc rất cần thiết và là một ngành công nghiệp đầy tiềm năng [2], [3]. So với protease động vật và vi sinh vật, protease thực vật cũng đã được nghiên cứu và ứng dụng phổ biến. Bên cạnh hai loại enzyme bromelain và papain thì ficin cũng là một enzyme có nhiều tiềm năng ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm [6]. Ficin, có nhiều trong các loại quả cây họ sung (vả), được sử dụng nhiều nhất trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (làm formage, làm mềm thịt, bổ sung để chống lại hiện tượng kết tủa protein trong quá trình làm trong bia, ngăn cản sự hóa nâu trong rau củ, xử lí phế phụ phẩm trong chế biến phế thực phẩm…), trong y học như: làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa, tẩy giun. Ngoài ra, có nhiều ứng dụng đang được nghiên cứu như: sản xuất thuốc làm tan máu bầm, trị bệnh ngoài da, mụn nhọt [10], [33]. Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên các loại cây họ sung nói chung và loại cây vả nói riêng phát triển rất thích hợp. Tuy nhiên, sản phẩm từ cây vả chỉ biết đến qua các món thực phẩm được dùng hằng ngày như: vả trộn, vả kho thịt, hay dùng làm rau... mà chưa có nhiều nghiên cứu về protease trên loại cây này. Lá và quả vả đều chứa một lượng lớn protease trong đó chủ yếu là ficin, nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme tự nhiên. Từ những ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi chọn đề tài "Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa quả vả (ficus auriculata Lour) và bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt bò" để thực hiện nhằm tạo cơ sở cho những nghiên cứu sau. 2. Mục đích của luận văn - Thiết lập quy trình thu nhận chế phẩm ficin ở quy mô phòng thí nghiệm. - Khảo sát một số tính chất của chế phẩm ficin. - Bước đầu ứng dụng chế phẩm ficin thu được để làm mềm thịt bò. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận văn - Nâng cao giá trị sử dụng của quả vả, nguồn thực vật phổ biến ở Huế. - Góp phần bổ sung dữ liệu nghiên cứu về nguồn protease từ thực vật. - Sử dụng thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid để xác định hàm lượng protein. Bên cạnh đó xác định hoạt độ protease theo phương pháp Amano. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME Enzyme là chất xúc tác sinh học được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống, đặc biệt đóng vai trò quan trọng đối với các quy trình chế biến thực phẩm. Enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhẹ nhàng, cân đối theo những chiều hướng xác định [2], [14]. Enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Nó có thể được tiết ra ngoài dịch tế bào, tồn tại trong các dịch của cơ thể, dịch môi trường (gọi là enzyme ngoại bào) hoặc giữ lại bên trong tế bào (enzyme nội bào). Hiện nay trong các nguồn nguyên liệu trên, vi sinh vật là nguồn sản xuất enzyme ở quy mô lớn cho công nghiệp. Tuy nhiên, khi ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm, nguồn nguyên liệu này cần phải lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Chính vì thế, trong một số ngành sản xuất thực phẩm, nguồn enzyme chính được khai thác từ động vật và thực vật [10], [16]. Để tách một enzyme có kết quả tốt cần phải tiến hành thí nghiệm để lựa chọn loại nguyên liệu giàu enzyme và dễ dàng tinh chế enzyme. Cho đến nay, đã biết được nhiều loại cấu trúc hóa học của nhiều loại enzyme quan trọng. Đáng chú ý là trong nhóm ngoại của đa số enzyme hai cấu tử có chứa vitamin: piruvatdecacbonxylase chứa B1 (thiamin), aminotransferase chứa B6 (piridoxan),... Ngoài ra, một số hợp chất khác như glutation dạng khử, nucleotid và các dẫn xuất, estephosphat của một số monosacharid cùng tham gia vào thành phần coenzyme của enzyme [3], [17]. Enzyme là chất xúc tác sinh học, nó có đầy đủ các tính chất của một chất xúc tác. Tuy nhiên, enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác thông thường. Bên cạnh đó, tính chất đặc trưng của enzyme vẫn là tính đặc hiệu. Đó là một trong những khác biệt giữa enzyme và các chất xúc tác khác [3]. Người ta phân biệt hai kiểu đặc hiệu chính là đặc hiệu cơ chất và đặc hiệu kiểu phản ứng: - Đặc hiệu kiểu phản ứng: thể hiện ở chỗ, mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một trong các phản ứng chuyển hóa nhất định. Ví dụ: phản ứng oxy hóa khử, phản ứng chuyển vị, phản ứng thủy phân... - Đặc hiệu cơ chất: cơ chất là chất có phản ứng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme. Mức độ đặc hiệu của các enzyme không giống nhau. Có những enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối, nghĩa là enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định và hầu như không có tác dụng với cơ chất nào khác. Nhưng cũng có những enzyme có tác dụng lên một kiểu liên kết hóa PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
4 học trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các thành phần tham gia tạo thành mối liên kết đó, chúng thể hiện tính đặc hiệu tương đối. Có enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất, nó thể hiện đặc hiệu quang học. Ngoài ra, enzyme còn có khả năng phân biệt được hai gốc đối xứng trong phân tử giống nhau hoàn toàn về mặt hóa học [10], [14]. Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp vật lí, cơ học, hóa học. Có ba khó khăn khi tách enzyme khỏi tế bào cần hết sức lưu ý [10]: - Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác. Do đó, việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là điều rất khó. - Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi tác động của các yếu tố bên ngoài. - Enzyme là protein. Protein enzyme luôn luôn đi cùng những loại protein không phải enzyme nhưng lại có tính chất lý hóa rất giống protein enzyme. Do đó, việc tách protein – enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt và không phải không gặp được những khó khăn nhất định. Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lí theo những phương pháp trên. Dịch chiết thu được, người ta gọi là chế phẩm enzyme thô vì trong chế phẩm này, ngoài enzyme ra còn có nước, protein không phải enzyme và các thành phần của tế bào. Như vậy, việc làm sạch enzyme chính là việc loại protein không phải là enzyme (đôi khi loại bỏ cả các protein – enzyme không mong muốn), nước, các thành phần khác của tế bào ra khỏi enzyme. Công việc này hoàn toàn không dễ dàng. Do đó việc làm sạch enzyme đòi hỏi người làm nghiên cứu về enzyme, ngoài sự hiểu biết về enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều thao tác kỹ thuật khác nhau để tránh gây mất hoạt tính hoạt động của enzyme [4]. Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện những phương pháp như: gây biến tính chọn lọc dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối hoặc dung môi hữu cơ, phương pháp hấp thụ chọn lọc khi cho chúng vào cột chất hấp thụ, phương pháp sắc ký dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protien tan trong nước và tác nhân trao đổi ion. Để xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ hoạt động của enzyme, người ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
5 1.2. TỔNG QUAN PROTEASE 1.2.1. Giới thiệu về protease Protease là nhóm enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (CO – NH) trong phân tử protein hoặc trong các cơ cấu tương tự. Quá trình thủy phân liên kết peptid được biểu diễn qua chuỗi phản ứng sau: Protein ―> Pepton ―> Polypeptid ―> Acid amin Đây là quá trình thủy phân tương đối phức tạp, có sự tham gia của nhiều protease khác nhau [12], [14]. Trong các protease, protease của hệ tiêu hóa được phát hiện sớm nhất. Từ lâu người ta đã tách được protease từ dạ dày và từ dịch tụy tạng của động vật. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu về protease thực vật cũng được nghiên cứu. Năm 1874, người ta đã công bố nhận được protease từ hạt của một cây họ đậu, nhiều tác giả thấy rằng, dịch chiết từ cây đại mạch, bông lau, đu đủ có khả năng phân giải protein [17]. Ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu, thăm dò, phát hiện và khảo sát tính chất về enzyme này nhưng cho đến nay vẫn chưa có một cơ sở nào sản xuất chế phẩm enzyme nói chung và protease nói riêng. Hầu hết các chế phẩm enzyme dùng trong nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất đều phải nhập ngoại. Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm ra quy trình thu nhận các chế phẩm enzyme và ứng dụng là vấn đề cần thiết và mang ý nghĩa thực tiễn [15]. 1.2.2. Phân loại protease Theo phân loại quốc tế, protease được chia làm hai phân nhóm (exo – peptidase, endopeptidase) [10], [12]. 1.2.2.1. Exopeptidase Là nhóm enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptid ở đầu mạch, gồm có 3 loại: + Amynopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptid nằm kề nhóm amin tự do trong chuỗi polypeptid H2N – CH – CO – NH – CH – CO – ... – NH – CH – COOH R1 R2 R3 + Cacboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid mà có nhóm cacboxyl (-COOH) nằm gần kề trong chuỗi polypeptid. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
6 H2N–CH –CO –NH –CH –CO –...–NH – CH – CO – NH – CH – COOH R1 R2 R3 R4 + Dipeptid hydrolase: xúc tác thủy phân các liên kết dipeptid. 1.2.2.2. Endopeptidase (proteinase) Là nhóm enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptid bên trong phân tử protein. Endopeptidase được phân loại dựa vào cơ chế xúc tác của chúng. Trong thực vật, endopeptidase được chia làm 4 loại: serin-proteinase, cystienproteinase, aspartic- proteinase và metallo-proteinase. + Serin – proteinase (Ser-EP) là những enzyme trung tính, có nhóm –OH, có một phân tử Ser hoạt động tại vị trí xúc tác, vị trí này có tác dụng tương hỗ với cơ chất protein. Các Ser – EP được tìm thấy có liên quan tới quá trình sinh lý như sự lão hóa, sự chết của tế bào, sự tạo gỗ, sự nảy mầm. + Cystein – proteinase (Cys – EP): là những enzyme có nhóm –SH trong trung tâm hoạt động; là một nhóm proteinases thực vật được nghiên cứu nhiều nhất. Cơ chế xúc tác của enzyme có liên quan đến nhóm cystein tham gia nhiều quá trình sinh học như quá trình lão hóa sự tạo gỗ, sự cố định protein trong quá trình nảy mầm. Cys – EP được biết đến nhiều nhất là protein giống caspase, các peptid giống papain, bromelain, ficin và ngoài ra chứa các protein loại cathepsin. +Aspartic – proteinase gồm các liên kết peptid có các nhóm bên của aminoacid kỵ nước và hoạt động ở pH acid (pH < 7). Mặc dù, các enzyme này đã được tìm thấy ở nhiều loại thực vật, nấm mốc. Tuy nhiên sự quan tâm đến nhóm này là rất ít, chủ yếu gồm các protein cardosin và cathepsin. Cardosin được chiết từ hoa Cynara cardunculus khô và được sử dụng trong sản xuất phomat từ sữa cừu của Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha. Cathepsin được tìm thấy trong các hạt chưa nảy mầm, trong suốt thời gian nảy mầm và trong các mô sống của đại mạch bao gồm cả chồi và rễ. + Metallo – proteinase: chủ yếu được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các loại vi sinh vật bậc cao. Hầu hết loại enzyme này chứa Zn, lượng rất ít chứa Co và Mn. Một metallo – proteinase tồn tại trong lá đậu nành, có nhiều nhất trong các giai đoạn sau của quá trình phát triển của lá. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
7 1.2.3. Nguồn thu nhận protease Protease là một enzyme rất cần thiết cho quá trình sinh lý trong cơ thể sống và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Chính vì vậy, chúng phân bố khá phổ biến ở vi sinh vật, động vật và thực vật. Tuy nhiên, sự phân bố của chúng có tính không đồng đều giữa các loài, các cá thể và ngay cả các mô, các bộ phận trên một cơ thể sinh vật [6], [15], [17]. 1.2.3.1. Protease vi sinh vật Thu nhận enzyme từ vi sinh vật đang được nghiên cứu và triển khai rộng rãi. Các enzyme thu nhận từ nguồn này thường có tính đặc hiệu cao, cho các sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Nguồn protease chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn. Trong số các vi khuẩn, chủng có khả năng tổng hợp protease mạnh là Bacillus subtilis, Bacillus menseneterisus, Bacillus thermoproteoliticus và một số thuộc giống Clostridium [16]. Các chế phẩm proteinase được sản xuất từ vi sinh vật đa dạng, phong phú về chủng loại và tính chất. Đặc biệt, các proteinase của vi khuẩn có nhiều ưu điểm hơn so với proteinase của nấm mốc như tốc độ phản ứng nhanh, độ bền nhiệt lớn. Trên thế giới, chế phẩm proteinase đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp và đã được thương mại hóa. Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn không ngừng tìm kiếm nguồn nguyên liệu mới, nghiên cứu tách chiết và khảo sát tính chất của chế phẩm enzyme thu được. Trong khi đó, các nghiên cứu thăm dò thu nhận chế phẩm proteinsae từ nguồn vi khuẩn ở nước ta vẫn còn quá ít so với trên thế giới. Vấn đề đặt ra là cần phải tuyển chọn được những chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp proteinase ngoại bào cao góp phần tạo tiền đề phát triển công nghiệp sản xuất enzyme từ vi khuẩn ở Việt Nam. 1.2.3.2. Protease động vật Protease thu nhận từ động vật được nghiên cứu và ứng dụng khá lâu. Tuy nhiên khả năng thu nhận không cao do nó chỉ có ở các bộ phận nhất định trong cơ thể động vật và chứa một lượng không nhiều. Enzyme thu nhận từ động vật có tính đặc hiệu ít rộng rãi so với enzyme từ thực vật và vi sinh vật. Do vậy, khả năng thủy phân của enzyme thuộc nhóm này thấp nhất. Hiện nay, người ta đã tách được renin từ dạ dày bê, trypsin từ tụy tạng bò [16]. Trypsin: trypsin có khối lượng phân tử 23,3kD là enzyme tiêu hóa đường ruột chính phù hợp với sự thủy phân protein thực phẩm. Nó là một serine proteinase và thủy phân mối liên kết peptide giữa lysine và arginine. Chymotrypsin: chymotrypsin có khối lượng phân tử 23,8kD được tìm thấy trong dịch tụy. Nó đặc hiệu với mối liên kết peptide có các nhóm carboxyl của các amino acid thơm như phenylalanine, tyrosine hoặc tryptophan. Pepsin: pepsin có khối lượng phân tử 24,5kD là một proteinase acid được tìm PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
8 thấy trong dạ dày của hầu hết động vật có xương sống. Dạng hoạt động của nó được giải phóng từ dạng zymogen như pepsinogen do quá trình tự phân khi có mặt acid HCl. Enzyme này thủy phân mối liên kết peptide giữa hai amino acid ưa béo. Rennin: rennin là proteinase giống pepsin (rennin, chymosin: EC 3.4.23.4) được sinh ra ở dạng tiền enzyme không hoạt động trong dạ dày của tất cả các động vật có vú và được chuyển thành dạng rennin hoạt động do sự hoạt động của pepsin hoặc do quá trình tự xúc tác của chúng. Do đa số nguồn proteinase động vật phải thu nhận từ nội tạng, không mang lại hiệu quả kinh tế cao nên gần đây các nghiên cứu về chúng rất hạn chế so với proteinase thực vật và vi sinh vật. 1.2.3.3. Protease thực vật Việc nghiên cứu protease thực vật được bắt đầu vào thế kỷ XIX gắn liền với công trình của nhà bác học Kiecgov người Nga, ông đã chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa bột thành đường. Và đến năm 1929, lần đầu tiên Summer đã tách được protease từ thực vật ở dạng tinh thể (urease). Trong những năm gần đây, nhiều tác giả trong nước đã nghiên cứu thu nhận được một số protease thực vật ở các mức độ tinh khiết khác nhau tùy theo mục đích sử dụng. Protease thu nhận từ thực vật chiếm một tỉ lệ quan trọng trong công nghệ enzyme. Một số enzyme thu nhận từ thực vật đã được ứng dụng nhiều trong y học, thực phẩm và công nghiệp. Trong đó, phải kể đến papain trong đu đủ, bromelain có trong dứa, ficin trong quả sung và keratinase có trong các cây họ đậu [6], [14]. Papain: papain là một loại protease thực vật truyền thống, sử dụng lâu đời và được tách chiết từ trái đu đủ (Carica papapya). Chế phẩm thô của enzyme có tính đặc hiệu rộng do có chứa nhiều enzyme peptydase và proteinase. Papain đặc biệt bền nhiệt, có thể chịu được 100ºC trong 3 giờ, nhiệt độ tối thích 60 - 70ºC và pH tối thích thường là giữa 5 (với gelatin) và 7 (với casein, hemoglobin, albumin trứng). Tính chất enzyme phụ thuộc vào nguồn thực vật, các điều kiện khí hậu và phương pháp tách, tinh chế [14]. Ở Việt Nam, nhiều tác giả cũng đã nghiên cứu tách chiết, điều chế và khảo sát một số tính chất của papain từ nhựa đu đủ xanh. Chế phẩm proteinase từ nhựa đu đủ là hỗn hợp của papain, chymopapain, peptidase III và peptidase IV và bị ức chế hoàn toàn bởi flavonoid tách từ bọ mẩy (Clorodendron cyrtophyllum Turez) ở nồng độ 200mg/l [14]. Bromelain: bromelain được thu từ thân cây và dịch chiết của quả dứa. Enzyme này có tính chất giống như một cystein protease. Biên độ pH rộng từ 3 – 10 nhưng pH tối thích giữa 5 và 8 tùy cơ chất (5-6 với gelatin và hemiglobin, 7-8 với casein), nhiệt độ tối thích là 50 - 60ºC. Nhiệt độ bất hoạt của enzyme là 70ºC. Bromelain có phổ tác dụng PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
9 rộng như papain nên ngày càng được dùng thay cho papain vì papain rất đắt (làm mềm thịt, chế biến bia, bánh, chế biến dầu cá, nước mắm...). Bromelain còn được sử dụng trong y học và trong công nghiệp. Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm nghiên cứu về chế phẩm enzyme này [10], [18]. Các tác giả Nguyễn Đình Huyên, Trần Minh Tâm, Lê Thị Thanh Mai (1997) đã nghiên cứu hoạt tính của promelain trong quá trình phát triển của quả dứa và cho thấy rằng hoạt tính promelain cao nhất ở thời điểm 25 ngày trước khi quả chín. Harrach và cộng sự (1995) đã tinh sạch, xác định tính chất của các proteinase có trong chồi dứa đã phát hiện rằng chế phẩm này có tám phân đoạn khác nhau. Trong đó có ba phân đoạn chính, hai phân đoạn trong số đó có pH thích hợp 4-4,5 và một phân đoạn hoạt động ở pH trung tính. Ficin: là mủ của một loại sung có màu vàng kem đến màu hồng và pH biến động tương đối rộng (3-9) tùy thuộc vào cơ chất gelatin, hemiglobin hay casein. Ficin thương mại là hỗn hợp của một số enzyme protease và peroxydase cộng thêm chất độn (đường hay bột) [10]. Keratinase: người ta có thể sản xuất protease từ một số nhóm thực vật, các protease này có khả năng thủy phân lông, tóc. Sự phân giải lông, tóc có phần quan trọng để sản xuất acid amin thiết yếu – lysine và để tránh sự tắc nghẽn của hệ thống nước tiểu. Từ việc tìm hiểu về protease có nguồn gốc thực vật ở trên cho thấy các enzyme này có mặt ở nhiều loài thực vật và phân bố ở trong các mô khác nhau. Cho đến nay, ở Việt Nam các tác giả chỉ mới tập trung nghiên cứu tách chiết và khảo sát tính chất của các chế phẩm protease trên đối tượng đu đủ và dứa. Nghiên cứu thăm dò khả năng thu nhận chế phẩm này ở các loài thực vật khác nhau như ở các loại cây họ sung (vả) vẫn còn hạn chế. 1.2.4. Sản xuất protease từ các nguồn thực vật khác nhau 1.2.4.1. Nguyên tắc tách và tinh chế enzyme Enzyme rất dễ bị giảm hoạt độ dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài, do đó khi tinh chế enzyme, để tránh sự biến tính protein gây ảnh hưởng xấu đến hoạt độ của enzyme cần tiến hành nhanh quá trình tinh chế trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian ngắn và môi trường có pH thích hợp [10], [15], [17]. Không có quy trình cụ thể nào để chiết xuất và tinh chế enzyme khác nhau. Do enzyme có mặt trong các tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật nên quá trình tách và tinh chế enzyme sẽ được thực hiện theo các bước tổng quan sau [6]: - Thứ nhất phá vỡ cấu trúc tế bào bằng nhiều phương pháp khác nhau như: PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma