Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu tách, chiết và xác định hàm lượng một số hợp chất diterpenoid từ loài kim giao (Nageia fleuryi (Hick.) De laubenf)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:68

Thêm vào BST

Báo xấu

17
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn này tập trung nghiên cứu phân tích cấu trúc và xác định hàm lượng một số hợp chất diterpenoid được phân lập từ cây Kim giao (Nageia fleuryi), có ý nghĩa quan trọng giúp làm sáng tỏ thành phần hóa học và tìm kiếm những hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ cuộc sống. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu tách, chiết và xác định hàm lượng một số hợp chất diterpenoid từ loài kim giao (Nageia fleuryi (Hick.) De laubenf)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN DUY HẢI NGHIÊN CỨU TÁCH, CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT DITERPENOID TỪ LOÀI KIM GIAO (NAGEIA FLEURYI (HICK.) DE LAUBENF) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN DUY HẢI NGHIÊN CỨU TÁCH, CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT DITERPENOID TỪ LOÀI KIM GIAO (NAGEIA FLEURYI (HICK.) DE LAUBENF) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 01 18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM HẢI YẾN THÁI NGUYÊN - 2017
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến với TS. Phạm Hải Yến. Cô đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Nghiên cứu cấu trúc – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ trang thiết bị cho nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Hóa Phân tích nói riêng và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời gian tôi học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại Học Thái Nguyên. Qua đây, tôi xin cảm ơn gia đình, các bạn học viên và sinh viên của Bộ môn Hóa phân tích đã luôn động viên, tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận văn này. Thái Nguyên, ngày 18 tháng 05 năm 2017 Học viên Nguyễn Duy Hải
MỤC LỤC Mở đầu ........................................................................................................................... 1 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về cây Kim Giao ............................................................................ 3 1.1.1. Vài nét về thực vật .......................................................................................... 3 1.1.2. Phân bố và sinh thái ....................................................................................... 4 1.1.3. Ứng dụng ........................................................................................................ 4 1.1.4. Các nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học ................... 4 2.1. Mẫu thực vật ......................................................................................................... 11 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất ................................................................... 11 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................................................ 11 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế............................................................................. 11 2.2.3. Sắc ký cột (CC) ............................................................................................. 11 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ ................... 11 2.3.1. Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR) ................................................ 12 2.3.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy - MS) ................................................. 12 2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .......................................................... 13 2.4. Phương pháp định lượng và đánh giá chất sạch bằng LC/MS .......................... 15 2.5. Thực nghiệm ................................................................................................... 17 2.5.1. Phân lập các hợp chất........................................................................................ 17 2.5.2. Hằ ng số vâ ̣t lý và các dữ kiện phổ của các hơ ̣p chấ t đã phân lâ ̣p ................... 18 2.5.3. Định lượng các hợp chất.................................................................................... 19 3.1. Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được...................... 21 3.1.1. Hợp chất D1: ................................................................................................ 21 3.1.2. Hợp chất D2: ................................................................................................ 25 3.1.3. Hợp chất D3: ................................................................................................ 29 3.1.4. Hợp chất D4: ................................................................................................ 32 3.1.5. Hợp chất D5: ................................................................................................ 36 3.2. Xác định hàm lượng các hợp chất phân lập được bằng phương pháp LC/MS 40 3.2.1. Xác định hàm lượng chất D1 (kí hiệu PE1) ............................................... 40 3.2.2. Xác định hàm lượng chất D2 (kí hiệu PE2): .............................................. 42 KẾT LUẬN: ........................................................................................................... 45
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CC Column Chromatography Sắc ký cột TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng MeOH Methanol EtOAc Ethyl acetate Proton Magnenic Rosonance 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Spectrocopy Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR Resonance Spectroscopy cacbon 13 Distortionless Enhancement DEPT Phổ DEPT by Polarisation Transfer Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua HMBC Connectivity nhiều liên kết Heteronuclear Single- Phổ tương tác dị hạt nhân qua HSQC Quantum Connectiv ity 1 liên kết Nuclear Overhauser Effect Phổ học hạt nhân Overhauser NOESY Spectroscopy có hiệu lực
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ lá kim giao .............................................. 17 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn diclometan của lá kim giao .......... 18
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây kim giao - Nageia fleuryi ................................................................... 3 Hình 3.1. Cấu trúc hợp chất D1 .............................................................................. 21 Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của D1 ............................................................................... 22 Hình 3.3. Phổ 13C-NMR của D1.............................................................................. 22 Hình 3.4. Phổ HSQC của D1 .................................................................................. 24 Hình 3.5. Phổ HMBC của D1 ................................................................................. 24 Hình 3.6. Phổ NOESY của D1 ................................................................................ 25 Hình 3.7. Cấu trúc của D2 ...................................................................................... 25 Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của D2 ............................................................................... 26 Hình 3.9. Phổ 13C-NMR của D2.............................................................................. 26 Hình 3.10. Phổ HSQC của D2 ................................................................................ 28 Hình 3.11. Phổ HMBC của D2 ............................................................................... 28 Hình 3.12. Cấu trúc hợp chất D3 ............................................................................ 29 Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của D3 ............................................................................. 29 Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của D3............................................................................ 30 Hình 3.15. Phổ HSQC của D3 ................................................................................ 31 Hình 3.16. Phổ HMBC của D3 ............................................................................... 32 Hình 3.17. Cấu trúc hợp chất D4 ............................................................................ 32 Hình 3.18. Phổ 1H-NMR của D4 ............................................................................. 33 Hình 3.19. Phổ 13C-NMR của D4............................................................................ 33 Hình 3.20. Phổ HSQC của D4 ................................................................................ 35 Hình 3.21. Phổ HMBC của D4 ............................................................................... 35 Hình 3.22. Phổ NOESY của D4 .............................................................................. 36 Hình 3.23. Cấu trúc hợp chất D5 ............................................................................ 36 Hình 3.24. Phổ 1H-NMR của D5 ............................................................................. 37 Hình 3.25. Phổ 13C-NMR của D5............................................................................ 37 Hình 3.26. Phổ HSQC của D5 ................................................................................ 39 Hình 3.27. Phổ HMBC của D5 ............................................................................... 40 Hình 3.28. Diện tích pic chất D1 (PE1) trên mẫu tổng .......................................... 42 Hình 3.29. Diện tích pic chất D2 (PE2) trên mẫu tổng .......................................... 44
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1.1. Số liệu phổ hợp chất D1 và chất tham khảo ........................................ 23 Bảng 3.1.2. Số liệu phổ hợp chất D2 và chất tham khảo ........................................ 27 Bảng 3.1.3. Số liệu phổ hợp chất D3 và chất tham khảo ........................................ 30 Bảng 3.1.4. Số liệu phổ hợp chất D4 và chất tham khảo ........................................ 34 Bảng 3.1.5. Số liệu phổ hợp chất D5 và chất tham khảo ........................................ 38 Bảng 3.2.1. Kết quả đo phổ LC/MS của mẫu PE1.................................................. 40 Bảng 3.2.2: Kết quả phân tích phương sai ............................................................. 41 Bảng 3.2.3. Kết quả định lượng của mẫu 1............................................................. 42 Bảng 3.2.4. Kết quả đo phổ LCMS của mẫu PE2 .................................................. 42 Bảng 3.2.5. Kết quả phân tích phương sai .............................................................. 43 Bảng 3.2.6. Kết quả định lượng của mẫu D2 .......................................................... 44
DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của D1 ........................................................................... 1 - PL Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của D1 ...................................................................... 1 - PL Phụ lục 3. Phổ HSQC của D1 .......................................................................... 2 - PL Phụ lục 4. Phổ HMBC của D1 ......................................................................... 2 - PL Phụ lục 5. Phổ NOESY của D1 ........................................................................ 3 - PL Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR của D2 ....................................................................... 3 - PL Phụ lục 7. Phổ 13C-NMR của D2 ...................................................................... 4 - PL Phụ lục 8. Phổ HSQC của D2 .......................................................................... 4 - PL Phụ lục 9. Phổ HMBC của D2 ......................................................................... 5 - PL Phụ lục 10. Phổ 1H-NMR của D3 ..................................................................... 5 - PL Phụ lục 11. Phổ 13C-NMR của D3 .................................................................... 6 - PL Phụ lục 12. Phổ HSQC của D3 ........................................................................ 6 - PL Phụ lục 13. Phổ HMBC của D3 ....................................................................... 7 - PL Phụ lục 14. Phổ 1H-NMR của D4 ..................................................................... 7 - PL Phụ lục 15. Phổ 13C-NMR của D4 .................................................................... 8 - PL Phụ lục 16. Phổ HSQC của D4 ........................................................................ 8 - PL Phụ lục 17. Phổ HMBC của D4 ....................................................................... 9 - PL Phụ lục 18. Phổ NOESY của D4 ...................................................................... 9 - PL Phụ lục 19. Phổ 1H-NMR của D5 ................................................................... 10 - PL Phụ lục 20. Phổ 13C-NMR của D5 .................................................................. 10 - PL Phụ lục 21. Phổ HSQC của D5 ...................................................................... 11 - PL Phụ lục 22. Phổ HMBC của D5 ..................................................................... 11 - PL
Mở đầu Hiện nay, các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên đang ngày càng được ưa chuộng do những đặc tính nổi bật của chúng như: ít độc, ít gây phản ứng phụ, dễ hấp thu. Từ ngàn xưa ông cha ta đã sử dụng nhiều phương thuốc dân gian từ cây cỏ để chữa bệnh, bồi bổ cơ thể, hay tạo mùi thơm... Do đó ngày nay các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thực vật và động vật đang nhận được sự quan tâm rất lớn từ giới khoa học. Trong tương lai, các hợp chất có hoạt tính sinh học sẽ đóng vai trò rất quan trọng, là các yếu tố khởi đầu cho việc tổng hợp nên các loại dược phẩm mới có tác dụng tốt hơn. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới, có khí hậu nóng, độ ẩm cao, lượng mưa lớn, là những điều kiện rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của các loài thực vật. Với hệ thực vật phong phú và đa dạng khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao có mạch, trong đó có tới 4.000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược, điều này là một tiền đề lớn cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta. Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của các loài cây thuốc có giá trị cao của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lí và có hiệu quả có ý nghĩa đặc biệt quan trọng. Kim giao hay còn gọi Kim giao núi đá (danh pháp khoa học Nageia fleuryi hay Podocarpus fleuryi) là một loài thực vật trong họ Podocarpaceae. Lá loài này được dân gian dùng sắc uống chữa ho ra máu, sưng cuống phổi và dùng làm thuốc giải độc… Ở Việt Nam, chưa thấy có công bố nào về thành phần hóa học của loài này. Trên thế giới, năm 1990 và 1991 nhóm tác giả Xu Ya-ming và cộng sự đã công bố cấu trúc của 16 hợp chất được phân lập từ loài Podocarpus fleuryi. Năm 2013, Lan- Chun Zhang và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất diterpenoid mới. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên năm dòng tế bào ung thư HL-60, SMMC-772, A-549, MCF-7 và SW480 cho thấy hợp chất fleuryinol B và 19-hydroxyferruginol có hoạt tính ở mức độ trung bình với giá trị IC50 nằm trong khoảng 14-38 µM. Luận văn này tập trung nghiên cứu phân tích cấu trúc và xác định hàm lượng một số hợp chất diterpenoid được phân lập từ cây Kim giao (Nageia fleuryi), có ý HV: Nguyễn Duy Hải 1
nghĩa quan trọng giúp làm sáng tỏ thành phần hóa học và tìm kiếm những hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ cuộc sống. Nội dung nghiên cứu 1, Nghiên cứu phân lập một số hợp chất diterpenoid từ loài Kim giao 2, Phân tích cấu trúc và xác định hàm lượng các hợp chất diterpenoid phân lập được HV: Nguyễn Duy Hải 2
Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Kim Giao 1.1.1. Vài nét về thực vật Hình 1.1. Cây kim giao - Nageia fleuryi Chi Kim giao (Nageia) là một chi thực vật nhỏ nằm trong họ Thông tre (Podocarpaceae). Một vài phân loại khoa học trước đây xếp chi Kim giao vào chi Thông tre (Podocarpus). Đến năm 1987 thì người ta bắt đầu tách riêng chi Kim giao (Nageia). Ở Việt Nam, chi Kim giao được ghi nhận có 3 loài là: Kim giao đế mọng (Nageia wallichiana hay Podocarpus wallichiana), Kim giao hạt to (Nageia fleuryi hay Podocarpus fleuryi) và Kim giao hạt nhỏ (Nageia nagi hay Podocarpus nagi). Cây kim giao hạt to (Nageia fleuryi) là một loài cây thân gỗ nhỡ cao từ 15- 25m. Thân thường thẳng và tán cây hình tháp. Các cành nhánh của cây thường mọc ngang và rủ xuống. Vỏ thân cây màu nâu xám và thường bong mảng. Lá cây thường có hình bầu dục hoặc mũi mác, đầu lá hình nhọn, đuôi lá hình nêm. Lá dài 15-18cm, rộng 4-5cm Hệ gân lá thuộc dạng đa gân, đặc trưng của thực vật chi Nageia. Bề mặt phiến lá thường trơn bóng như chất liệu da. Lá đính đơn và đối HV: Nguyễn Duy Hải 3
xứng nhau qua cành. Nón đực thường đính thành chùm 3-4, nón cái thường mọc đơn lẻ ở nách lá. Quả hình trụ đường kính từ 1,5 - 2,5 cm. Cây ra nón vào tháng 5; nón chín vào tháng 11-12. 1.1.2. Phân bố và sinh thái Kim giao được tìm thấy ở miền nam Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Lào, Campuchia, Việt Nam (hầu hết các tỉnh miền núi có địa chất đá vôi). Loài ưa phát triển trên đất đá vôi có độ dày tầng đất lớn, thoát nước tốt. Ngoại trừ trường hợp đặc biệt về quần hợp đơn loài ở Vườn quốc gia Cát Bà của Việt Nam thì Kim giao là loài thường phân bố hỗn giao với các loài Sến, Táu và Dẻ ở các khu rừng mưa nhiệt đới và á nhiệt đới thường xanh, có độ cao từ 200 - 1000m. Ở Việt Nam, chi này phân bố khá rộng, từ Cao Bằng, Phú Thọ, Hải Phòng, Ninh Bình đến Quảng Nam, Ninh Thuận, Lâm Đồng. 1.1.3. Ứng dụng Lá Kim giao được dân gian dùng sắc uống chữa ho ra máu, sưng cuống phổi và dùng làm thuốc giải độc… Gỗ của Kim giao có màu trắng sáng rất đẹp và bền thường được dùng đóng đồ nội thất. Người Á Đông có cả những kinh nghiệm truyền thống về việc dùng gỗ Kim giao để thử độc thực phẩm. Tán và lá cây đẹp nên cây cũng được dùng nhiều cho kiến trúc cảnh quan, trồng ven đường, các công trình tôn giáo như đình chùa, nhà thờ, các công trình mang lối kiến trúc cổ Đông Á. 1.1.4. Các nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học Các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Nageia gồm các hợp chất diterpenoid, flavonoid, biflavonoid, phenolic, lignan, và steroid ...Nghiên cứu về thành phần hóa học một số loài thuộc chi Nageia đã bắt đầu vào giữa những năm 60 của thế kỉ 20. Năm 1968, Yuji Hayashi và cộng sự đã công bố phân lập được ba hợp chất norditerpenoid dilactone: nagilactone A (1), B (2), C (3) và một hợp chất bisnorditerpenoid dilactone: nagilactone D (4) từ lá và hạt loài P. nagi [2]. Năm 1977, Yuji Hayashi HV: Nguyễn Duy Hải 4
tiếp tục nghiên cứu hạt và vỏ rễ loài P. nagi và công bố 3 hợp chất diterpeniod dilactone mới: 15-hydroxy-nagilactone D (5), 3β-hydroxy-nagilactone A (6), 1β,2β-dihydroxy-nagilactone D (7) cùng với 6 hợp chất đã biết: 3β,17-diacetyl- nagilactone D (8), 1β,3β,7β-triacetyl-nagilactone A (9), 1β,2β,3β-triacetyl- nagilactone D (10), nagilactone A (1), B (2) và D (4) [3]. Từ hạt loài P. nagi, hai hợp chất 15-methoxycarbonyl-nagilactone D (11) và 1-deoxy-2α-hydroxy- nagilactone A (12) được Yuji Hayashi và cộng sự phân lập [4]. Tiếp tục các nghiên cứu về thành phần hóa học của vỏ rễ loài P. nagi nhóm tác giả trên thông báo cấu trúc ba hợp chất mới diterpenoid dilactone dạng 7,8-epoxy-enolide: 16- hydroxy-podolide (13), 2,3-dihydro-16-hydroxy-podolide (14) và 2β,3β-epoxy- podolide (15) [5]. Cũng từ vỏ rễ loài P. nagi, Bai-Ping Ying và cộng sự đã phân lập được ba hợp chất norditerpene dilactone: 2,3-dehydro-16-hydroxynagilactone F (16), nagilactone I (17) và 16-hydroxynagilactone E (18) [6]. Năm 1990 và 1991 nhóm tác giả Xu Ya-ming, Fang Sheng-ding và He Qi-min đã công bố cấu trúc của 16 hợp chất được phân lập từ loài P. fleuryi: palmitic acid (19), sugiol (20), β- sitosterol (21), nagilactone A (1), nagilactone B (2), isoginkgetin (22), β-sitosteryl stearate (23), 3β,5α-dihydroxy-6-stigmastanone (24), 5α-hydroxy-6-stigmastanone- 3β-palmitate (25), daucosterol (26), syringin (27) và 5 hợp chất robustaflavone (28-32) [7]. Năm 1991, Isao Kubo và cộng sự đã phân lập được hợp chất 2α- hydroxynagilactone F (33) từ vỏ rễ loài P. nagi và kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng nấm cho thấy hợp chất này có hoạt tính đối với chủng nấm S. cerevisiae (MIC 800 µg/ml) [8]. Từ lá loài P. nagi, bảy hợp chất được phân lập: 3-deoxy-2α- hydroxy-nagilactone E (34), 3-epi-nagilactone C (35), 15-methoxy-nagilactone D (15), sugiol (20), nagilactone A (1), nagilactone C (3), vomifoliol (36) [9] và từ vỏ rễ loài này, sáu hợp chất: nagilactone J (37), nagilactone C (3), nagilactone D (4), nagilactone I (17), 16-hydroxynagilactone E (18) và vomifoliol (36) đã được phân lập [10]. HV: Nguyễn Duy Hải 5
Một nghiên cứu khác của Isao Kubo về tác dụng kháng khuẩn, sáu hợp chất diterpenoid: totarol (38), totaradiol (39), 19-hydroxytotarol (40), totaral (41), HV: Nguyễn Duy Hải 6
4β-carboxy-19-nortotarol (42), sugiol (20) đã được phân lập và thử tác dụng kháng khuẩn trên 12 chủng, kết quả cho thấy hợp chất totarol thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với các vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là vi khuẩn Propionibacterium acnes. Đồng thời, totarol, cũng thể hiện hoạt tính mạnh đới 4 chủng vi khuẩn Gram (+) khác là: Streptococcus mutans, Bacillus subtilis, Brevibacterium ammoniagenes và Staphylocorrur aureus (đây là những chủng vi khuẩn kháng penicillin). Hoạt kháng khuẩn của totarol được thể hiện mạnh hơn khi nó kết hợp với một số hợp chất khác. Đáng chú ý, hoạt tính của totarol đối với chủng vi khuẩn Sta. aureus tăng lên gấp tám lần khi kết hợp với axit anacardic. Tác động hiệp đồng của axit anacardic và totarol làm cho nồng độ tối thiểu diệt khuẩn (MBC) của totarol được giảm xuống trong khoảng từ 1,56-0,2 µg/ml [11]. Năm 1993, Isao Kubo tiếp tục nghiên cứu tác dụng kháng nấm của ba hợp chất: 2α-hydroxynagilactone F (43), nagilactone E (44) và nagilactone C (3) trên ba chủng nấm: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae và Pityrosporum ovale. Kết quả cho thấy, nagilactone E thể hiện hoạt tính trung bình trên chủng Pit. ovale và yếu trên 2 chủng còn lại. Tuy nhiên, khi kết hợp với các hợp chất phenylpropanoid như anethole và isosafrole thì tác dụng kháng nấm tăng lên đáng kể [12]. Một nghiên cứu khác của nhóm tác giả trên đã tiếp tục công bố cấu trúc của ba hợp chất khung norditerpene dilactone: 1-deoxynagilactone A (45), 1-deoxy-2,3-dehydronagilactone A (46) và 2,3-dehydronagilactone A (47). Từ hạt loài P. nagi, Li-Jang Xuan và cộng sự đã phân lập được năm hợp chất diterpene dilactone glycoside, nagilactoside C-E (48-50) [13] và nagilactoside F và G (51- 52) [14]. Từ vỏ rễ loài P. nagi lần đầu tiên hai hợp chất cyclopeptide được phân lập, và được đạt tên là nagitide A và B (53-54) [15]. Một axit béo không bão hòa phân lập từ hạt P. nagi, sciadionic axit (SCA; 5, 11, 14-20:3) đã được Szu-Jung Chen thử nghiệm tác dụng kháng viêm kết quả cho thấy SCA làm giảm quá trình sản sinh PGE2 (29%), nitric oxide (NO) (31%), interleukin-6 (IL-6) (34%) và khối u hoại tử một (TNF-α) (14%). Tác dụng ức chế các chất trung gian gây viêm là do SCA làm giảm biểu hiện của cảm ứng của enzym tổng hợp NO (iNOS) và cyclooxygenase-2 (COX-2) và ức chế yếu tố nhân kappa B (NF-B) của quá trình HV: Nguyễn Duy Hải 7
chuyển vị và phosphoryl hóa protein mitogen-activated protein kinase (MAPK) [16]. Năm 2013, từ cành và lá loài P. fleuryi, Lan-Chun Zhang đã phân lập được ba hợp chất abietane diterpenoid mới: fleuryinol A-C (55-57), cùng với 14 hợp chất đã biết: 19-hydroxyferruginol (58), lambertic acid (59), inumakiol D (60), totaradiol (39), 19-hydroxytotarol (40), 3-acetoxy-methyl-5-[(E)-3-acetoxypropen- 1-yl)]-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-methoxy-2,3-dihydrobenzofuran (61), divanillyltetrahydrofuran (62), (+)-pinoresinol (63), ligballinol (64), sitostane- 3β,5α,6β-triol (65), ergosta-7,22-dien-3β,5α,6β-triol (66), stigmast-4-ene-3β,6β- diol (67), stigmast-5-ene-3β,7β-diol (68) và ergosterol peroxide (69). Tám hợp chất (55-62) được đáng giá hoạt tính gây độc tế bào trên năm dòng tế bào: HL-60, SMMC-772, A-549, MCF-7 và SW480 kết quả cho thấy hợp chất fleuryinol B (56) và 19-hydroxyferruginol (58) có hoạt tính trung bình đối với dòng tế bào SMMC-7721 và A-549 với giá trị IC50 lần lượt là 38 và 14 µM [17]. Một nghiên cứu được công bố vào tháng 01 năm 2016 của các nhà khoa học Trung Quốc về loài P. wallichiana cho thấy đã phân lập được bốn hợp chất: sugiol (20), vanillic axit (70), p-hydroxybenzoic axit (71) và 7-ketositosterol (72). Cấu trúc của chúng được xác đinh bằng các phương pháp phổ NMR và đây là nghiên cứu hóa học đầu tiên về loài này [18]. HV: Nguyễn Duy Hải 8
HV: Nguyễn Duy Hải 9
Từ kết quả tổng quan các nghiên cứu trên, có thể nhận thấy các nghiên cứu chủ yếu của các nhà khoa học Nhật Bản và Trung Quốc. Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Nageia khá đa dạng, đồng thời các nghiên cứu về hoạt tính sinh học đã phát hiện được nhiều hợp chất có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa và diệt tế bào ung thư. HV: Nguyễn Duy Hải 10
Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Mẫu thực vật Mẫu cành và lá cây Kim giao (Nageia fleuryi (Hick.) de Laubenf) thu tại Hải Phòng vào tháng 6/2016. Tên khoa học được TS. Bùi Văn Thanh, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H 2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu. 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp. 2.2.3. Sắc ký cột (CC) Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240- 430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, Fujisilica Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.). 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ thường được xác định nhờ vào ứng dụng của các phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà sử dụng các phương pháp phổ cho phù hợp. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác HV: Nguyễn Duy Hải 11