Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Tách, xác định cấu trúc một số hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển Paraconiothyrium sp. VK-13 bằng phương pháp hóa lý hiện đại

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:70

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận văn nhằm phân tích cấu trúc hóa học của một số hợp chất thứ cấp phân tách từ chủng vi nấm biển Paraconiothyrium sp. VK-13 bằng các phương pháp phổ như: phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HRESIMS), phổ cộng hưởng từ nhân 1 chiều (1D NMR) và 2 chiều (2D NMR). Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Tách, xác định cấu trúc một số hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển Paraconiothyrium sp. VK-13 bằng phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐINH XUÂN CHUNG TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ VI NẤM BIỂN Paraconiothyrium sp. VK-13 BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN-2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐINH XUÂN CHUNG TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ VI NẤM BIỂN Paraconiothyrium sp. VK-13 BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 844.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRẦN HỒNG QUANG THÁI NGUYÊN-2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ, chuyên ngành Hóa phân tích, Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa Học – Đại học Thái Nguyên, tôi đã luôn nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Lời đầu tiên với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Trần Hồng Quang ( Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam ) - người đã truyền cho tôi tri thức cũng như tâm huyết nghiên cứu khoa học, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo Khoa Hóa Học, các thầy cô trong Ban Giám hiệu trường Đại học Khoa Học - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và thời gian ,đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Luận văn được sự đồng ý sử dụng một phần nội dung của Nhiệm vụ hợp tác quốc tế cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (mã số Nhiệm vụ: VAST.HTQT.HANQUOC.03/17-18) Trong quá trình thực hiện luận văn do còn hạn chế về mặt thời gian cũng như trình độ chuyên môn của bản thân nên không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận văn Đinh Xuân Chung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... a DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... B DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................. C MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 Chương 1: TỔNG QUAN ................................................................................. 3 1. Sơ lược về phương pháp sắc ký : ............................................................... 3 1.1. Định nghĩa ................................................................................................. 3 1.2. Nguyên tắc của sắc ký .............................................................................. 3 1.3 Các giai đoạn của quá trình sắc ký ……………………………………….3 1.4. Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng ...................................................... 4 2.Sơ lược về phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............. 11 2.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H ........................ 15 2.1.1. Cường độ vạch phổ ............................................................................... 15 2.1.2. Phân loại phổ ......................................................................................... 16 2.2. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C ............................................. 21 2.2.1. Phổ 13C tương tác 1H ........................................................................... 22 2.2.2. Phương pháp phổ 13C xóa tương tác 1H .............................................. 23 3. Tình hình nghiên cứu vi nấm biển trên thế giới ..................................... 24 Chương 2: THỰC NGHIỆM........................................................................... 29 2.1. Thực nghiệm: .......................................................................................... 29 2.1.1. Mẫu nghiên cứu: ................................................................................. 29 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu..................................................................... 29 2.2. Dụng cụ và hóa chất ................................................................................. 31 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết và phân tích sắc ký ................................ 31 2.2.2. Thiết bị phân tích xác định cấu trúc ...................................................... 31 2.2.3. Hóa chất sử dụng phân tích sắc ký và cấu trúc ..................................... 31 2.3. Thực nghiệm phân tích sắc ký các hợp chất ............................................ 32 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2.4. Hằng số vật lí và dữ kiện phổ các hợp chất ......................................... 33 2.4.1. Hợp chất VK-13-1 (modiolide D): ..................................................... 33 2.4.2. Hợp chất VK-13-2 (modiolide E):...................................................... 34 2.4.3. Phân tích dữ kiện phổ 1H NMR ........................................................ 34 Chương 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .......................................................... 36 3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất VK-13-1....................................................... 36 3.2 Phân tích cấu trúc của hợp chất VK-13-2 ............................................ 39 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 43 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 13 C NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1 H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR Spectroscopy CC Sắc ký cột Column Chromatography DAD Bộ phát hiện mảng điot Diode array detector DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer EtOAc Ethylacetate HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HRESITOFMS Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử thời gian bay High Resolution Electronspray Ionization Time-Of- Flight Mass Spectroscopy HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High-performance liquid chromatography MeOH Methanol PDA Potato Dextrose Agar TLC Sắc ký lớp mỏng Thin layer chromatography a
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống HPLC ....................................................................... 4 Hình 1.2: Phổ 1H NMR của 1-xiclopentylbut-1-en-3-on ............................... 14 Hình 1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của etylbenzen. Chiều cao bậc thang đường cong tích phân tỷ lệ với số proton ở mỗi nhóm ......... 15 Hình 1.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của một số hợp chất ............... 17 Hình 1.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của 3-brom-2-tert- butoxithiophen ................................................................................ 18 Hình 1.6. Phổ lý thuyết A2B ........................................................................... 18 Hình 1.7. Phổ 1H-NMR của 1,3,4-tribrombut-1-in ........................................ 19 Hình 1.8. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của stirenoxit ......................... 19 Hình 1.9 Phổ lí thuyết hệ ABX với JAX và JBX a) ngược dấu, b) cùng dấu.. 20 Hình 1.10. Phổ lý thuyết A2B2 ....................................................................... 21 Hình 1.11. Phổ CHTN–13C có tương tác C–H (a) và xóa tương tác C–H (b) ... 23 Hình 1.12 Một số hình ảnh về bốn loài vi nấm mới ....................................... 25 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ Paraconiothyrium sp. VK-13 ............ 32 Hình 2.2. Sắc ký đồ HPLC phân tách hợp chất VK-13-2 ............................... 33 Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất VK-13-1......................................... 36 Hình 3.2. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất VK-13-1 ...... 37 Hình 3.3. Các tương tác NOESY chính của hợp chất VK-13-1 ..................... 37 Hình 3.4. Hiệu số H của VK-13-1a và VK-13-1b ........................................ 38 Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất VK-13-2......................................... 39 Hình 3.6. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất VK-13-2 ...... 40 Hình 3.7. Hiệu số H của VK-13-2a và VK-13-2b ........................................ 41 b
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 . Số liệu phổ NMR của hợp chất VK-13-1 ...................................... 37 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất VK-13-2 ....................................... 40 c
MỞ ĐẦU Đã từ lâu các loài nấm trên cạn được biết đến như nguồn cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Kể từ khi penicillin được phát hiện bởi Alexander Fleming vào năm 1928 tạo ra bước đột phá trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, vi nấm đã trở thành một nguồn phát triển thuốc quan trọng cho y học. Bên cạnh các hoạt chất kháng khuẩn phổ biến có nguồn gốc từ vi nấm như fusidic acid và griseofulvin, một số loại thuốc kháng nấm mới như Eraxis, Cancidas, và Altabax được bán tổng hợp từ các hợp chất phân lập từ vi nấm. Các hoạt chất hạ mỡ máu statin sử dụng trong điều trị bệnh mạch vành từ mevastitin và lovastatin . Tuy nhiên việc phát hiện lặp lại với tần suất cao các hợp chất đã biết đã cản trở việc nghiên cứu phát triển thuốc từ nguồn nấm trên cạn truyền thống. Do đó hiện nay việc nghiên cứu nấm trên thế giới đã chuyển hướng sang khu vực có hệ sinh thái và môi trường còn ít được biết đến, đó là các đại dương. Các đại dương bao phủ ba phần tư diện tích bề mặt trái đất và là nơi trú ngụ của tất cả các loài vi sinh vật thiết yếu. Các ổ sinh thái như trầm tích, rừng ngập mặn, tảo, và các sinh vật biển cung cấp các điều kiện sống riêng biệt cho các vi sinh vật[1]. Hiện nay, việc nghiên cứu tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn, vi nấm, vi tảo-các đối tượng có khả năng nhân sinh khối lượng lớn, phục vụ cho phát triển thuốc đang được các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm. Trong đó, các hợp chất thứ cấp sản sinh từ vi nấm có sự đa dạng cao về cấu trúc và hoạt tính sinh học và tiềm năng khai thác còn rất lớn. Với nguồn thực vật và động vật biển dồi dào và phong phú, cùng với sự đa dạng về hệ sinh thái và môi trường sống, sự đa dạng về sinh học của các chủng vi nấm ở biển Việt Nam được đánh giá rất cao và tiềm năng khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học có giá trị là rất khả quan. Tuy nhiên, cho đến nay hướng nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các chủng vi nấm từ biển hầu như chưa được tiến hành ở Việt Nam. Do đó việc nghiên 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
cứu một cách hệ thống nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu về hóa học và hoạt tính sinh học của các loài vi nấm phân lập từ biển ở Việt Nam, qua đó tìm ra các hoạt chất sinh học phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo là cần thiết. Các nghiên cứu về thành phần hóa học trên thế giới cho thấy chi vi nấm Paraconiothyrium là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất thứ cấp có nhiều hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, ở nước ta việc nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý của các loài vi nấm biển nói chung và vi nấm Paraconiothyrium còn rất mới mẻ và giàu tiềm năng. Vì vậy, em đã lựa chọn đề tài: “Tách, xác định cấu trúc một số hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển Paraconiothyrium sp. VK-13 bằng phương pháp hóa lý hiện đại” Mục tiêu của đề tài : Phân tích cấu trúc hóa học của một số hợp chất thứ cấp phân tách từ chủng vi nấm biển Paraconiothyrium sp. VK-13 bằng các phương pháp phổ như: phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HRESIMS), phổ cộng hưởng từ nhân 1 chiều (1D NMR) và 2 chiều (2D NMR). Các bước thực hiện của đề tài: 1. Nghiên vứu phân tách một số hợp chất bằng các phương pháp phân tích sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC), và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) từ sinh khối của chủng vi nấm Paraconiothyrium sp. VK-13. 2. Nghiên cứu phân tích xác định cấu trúc hóa học một số hợp chất thứ cấp bằng các phương pháp phổ như: phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HRESIMS), phổ cộng hưởng từ nhân 1 chiều (1D NMR) và 2 chiều (2D NMR). 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Sơ lược về phương pháp sắc ký :[22.23] 1.1. Định nghĩa Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh. Một hệ sắc ký bao gồm: chất phân tích, pha tĩnh và pha động. 1.2. Nguyên tắc của sắc ký Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố ác chất giữa hai pha: một pha thường cố định gọi là pha ĩnh(stationaryphase) và một pha chuyển động gọi là pha động (mobile phase). Khi cho mẫu chứa hỗn hợp chất cần phân tích đã được hoà tan trong dung môi thích hợp (pha động) di chuyển qua pha tĩnh do sự phân bố các chất cần phân tích giữa hai pha là khác nhau nên tốc độ di chuyển của chúng khác nhau và sẽ được tách khỏi nhau sau một thời gian nhất định. 1.3. Các giai đoạn của quá trình sắc ký: Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn chính: a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch các sắc tố lên đầu cột canxi cacbonat). Các chất được giữ trên pha tĩnh. b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha động sẽ kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromato- gram). Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký. Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua thì các chất có thể lần lượt bị kéo ra ngoài pha tĩnh (ví dụ: ra khỏi cột). Đó là quá trình rửa giải và dung môi dùng được và dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng được ờ cuối cột gọi là dịch rửa giải (eluate). 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta có thể lấy từng phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất. Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng thu lấy các phân đoạn dịch rửa giải có các chất cần phân tích. c) Phát hiện các chất: Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải có thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detec- tor đặt sau cột. 1.4. Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng [24] 1.4.1. Cơ sở lý thuyết Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột. Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể. 1.4.2. Cấu trúc Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống HPLC Thiết bị bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ có thể được sử dụng nếu cần thiết), detector và một 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị). Pha động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector. 1.4.2.1 Hệ thống bơm Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn chảy với một lưu lượng không đổi. Những biến đổi áp suất sẽ được giảm thiểu, ví dụ cho dung môi chạy qua một thiết bị giảm xung. Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm. Các bơm có thể được lắp với thiết bị loại bỏ bọt khí. Hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp pha động hoặc hằng định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi tỷ lệ thành phần (rửa giải gradient) theo một chương trình xác định. Trong trường hợp rửa giải gradient, hệ thống bơm lấy các dung môi từ một vài bình chứa và các dung môi có thể được trộn lẫn ở áp suất thấp hoặc áp suất cao. 1.4.2.2. Bộ phận tiêm mẫu Dung dịch mẫu thử được đưa vào dòng pha động hoặc vào vị trí gần đầu hoặc đầu cột nhờ một bộ phận tiêm mẫu có khả năng hoạt động ở áp suất cao. Có thể dùng vòng chứa mẫu thử, có thể tích cố định hoặc thiết bị có thể tích thay đổi, có thể vận hành bằng tay hoặc tự động. Khi tiêm mẫu bằng tay có thể gây ra sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ. 1.4.2.3. Pha tĩnh Có nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc ký lỏng, bao gồm: - Silica (silica dioxyd), alumina trioxyd hoặc graphit xốp thường được dùng trong sắc ký pha thuận mà quá trình phân tách dựa trên sự khác nhau về khả năng hấp phụ hoặc (và) phân bố khối lượng; - Nhựa hoặc polymer có chứa các nhóm chức acid hoặc base, sử dụng trong sắc ký trao đổi ion mà trong đó sự chia tách được thực hiện dựa trên sự cạnh tranh giữa các ion cần tách và các ion trong pha động; 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
- Silica xốp hoặc polymer, sử dụng trong sắc ký rây phân tử, ở đó sự chia tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, tương ứng với sự loại trừ không gian; - Rất nhiều chất mang biến đổi hóa học được chế tạo từ polymer, silica gel hoặc graphit xốp được dùng trong sắc ký lỏng pha đảo mà ở đó sự chia tách về nguyên tắc cơ bản dựa trên sự phân bố phân tử các chất giữa pha động và pha tĩnh; - Pha tĩnh loại biến đổi hóa học đặc biệt, ví dụ dẫn xuất của celulose hoặc amylose, protein hoặc peptid, cyclodextrin v.v... dùng để tách các đồng phân đối quang (sắc ký đối quang). Phần lớn sự chia tách dựa trên cơ chế phân bố, sử dụng silica biến đổi hóa học làm pha tĩnh và các dung môi phân cực làm pha động. Bề mặt của chất mang, ví dụ như các nhóm silanol của silica được phản ứng với các thuốc thử silan khác nhau tạo thành các dẫn xuất silyl có liên kết cộng hóa trị, che phủ một số lượng khác nhau các vị trí hoạt động trên bề mặt chất mang. Bản chất của các pha liên kết là tham số quan trọng để xác định các tính chất tách của hệ sắc ký. Các pha liên kết dùng phổ biến là: Octyl = Si–(CH2)7–CH3 Octadecyl = Si–(CH2)17–CH3 Phenyl = Si–(CH2)n–(C6H5) Cyanopropyl = Si–(CH2)3–CN Aminopropyl = Si–(CH2)3–NH2 Diol = Si-(CH2)3-OCH(OH)-CH2-OH Trừ khi có tiêu chuẩn riêng của nhà sản xuất, thông thường các cột sắc ký pha đảo dựa trên silica được coi là ổn định đối với pha động có pH từ 2,0 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
tới 8,0. Cột chứa graphit xốp hoặc các hạt vật liệu polymer như styren - divi- nylbenzen copolymer ổn định ở một khoảng pH rộng hơn. Phân tích sử dụng sắc ký pha thuận với pha tĩnh là silica không bị biến đổi, graphit xốp hoặc silica biến đổi hóa học làm cho phân cực (ví dụ cy- anopropyl hoặc diol) và pha động không phân cực được sử dụng trong một số trường hợp. Đối với sự tách nhằm mục đích phân tích, kích thước hạt của pha tĩnh phổ biến nhất từ 3 µm đến 10 µm. Các hạt có thể hình cầu hoặc không có hình dạng nhất định, có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu. Những tham số này cấu thành biểu hiện sắc ký của từng pha tĩnh cụ thể. Trong trường hợp pha đảo, các yếu tố bổ sung như bản chất của pha tĩnh, mức độ liên kết, ví dụ như độ dài mạch carbon liên kết, hoặc các nhóm hoạt động bề mặt của pha tĩnh có được che phủ hết hay không. Sự kéo đuôi peak, đặc biệt của các chất base, có thể xảy ra khi có mặt các nhóm silanol bề mặt của silica. Cột được làm bằng thép không gỉ trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, có chiều dài và đường kính trong () khác nhau được sử dụng cho phân tích sắc ký. Cột với đường kính trong nhỏ hơn 2 mm thường được coi là vi cột. Nhiệt độ của pha động và cột phải được giữ ổn định trong suốt thời gian phân tích. Phần lớn quá trình tách được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu được hiệu quả cao hơn. Tuy nhiên, nhiệt độ cột cũng không được phép vượt quá 60 °C vì khả năng phân hủy của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thể xảy ra. 1.4.2.4. Pha động Đối với sắc ký pha thuận, thường sử dụng dung môi ít phân cực. Sự có mặt của nước trong pha động phải được hạn chế và kiểm tra chặt chẽ nhằm thu được kết quả tái lặp lại. Đối với sắc ký lỏng pha đảo, sử dụng pha động chứa nước, có hoặc không có dung môi hữu cơ. 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Các thành phần của pha động thường được lọc nhằm loại bỏ các tiểu phân lớn hơn 0,45 m. Pha động chứa nhiều thành phần được chuẩn bị bằng cách đong các thể tích qui định (trừ khi có chỉ định về khối lượng) của các thành phần riêng lẻ rồi sau đó trộn lẫn với nhau. Ngoài ra, dung môi cũng có thể được cấp qua các bơm riêng lẻ, điều khiển bằng các van chia tỷ lệ, để có thể trộn lẫn theo các tỷ lệ mong muốn. Dung môi thường được loại khí trước khi bơm bằng cách sục khí heli, lắc siêu âm hoặc sử dụng hệ thống lọc màng lọc/chân không trực tuyến nhằm tránh sự tạo bọt khí trong cốc đo của detector. Dung môi dùng để chuẩn bị pha động thường không được chứa các chất làm ổn định và phải trong suốt (không hấp thụ quang) ở vùng bước sóng phát hiện, nếu như sử dụng detector tử ngoại. Dung môi và những thành phần khác được dùng phải có chất lượng phù hợp. Khi cần điều chỉnh pH chỉ thực hiện với thành phần nước của pha động mà không điều chỉnh với hỗn hợp. Nếu sử dụng dung dịch đệm, cần phải rửa hệ thống bằng hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ nhằm ngăn chặn sự kết tinh muối sau khi kết thúc quá trình sắc ký. Pha động có thể chứa những thành phần khác, ví dụ một ion trái dấu trong sắc ký tạo cặp ion hoặc một chất chọn lọc đối quang trong trường hợp sắc ký sử dụng pha tĩnh không chọn lọc đối quang. 1.4.2.5. Detector Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn loại detector phù hợp. Tín hiệu detec- tor thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,… Trên cơ sở đó, người ta sản xuất rất nhiều lọai detector khác nhau, trong đó Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm, mỹ phẩm Thái Nguyên đang áp dụng Detector mảng diod (DAD) trong máy HPLC. 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Detector DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất. 1.4.3. Phương pháp tiến hành Làm cân bằng cột với pha động và tốc độ dòng theo qui định, ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ qui định trong chuyên luận riêng, cho đến khi đường nền ổn định. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và dung dịch thử theo yêu cầu. Các dung dịch phải không được có các tiểu phân rắn. 1.4.4. Hiệu năng Thành phần và tốc độ dòng của pha động được qui định trong chuyên luận riêng. Pha động là hỗn hợp dung môi được đuổi khí bằng bơm chân không hoặc bằng một thiết bị đuổi khí khác phù hợp nhưng không ảnh hưởng đến thành phần của hỗn hợp. Trong quá trình định lượng, khi trong chuyên luận riêng không qui định dùng chuẩn nội, nên sử dụng bộ phận tiêm mẫu có thể tích cố định. Trong một số trường hợp ngoại lệ, khi trong chuyên luận chỉ dẫn tính theo chiều cao peak thì không cần quan tâm đến hệ số đối xứng. Cột sắc ký thường được làm bằng thép không gỉ có kích thước (chiều dài × đường kính trong) được qui định trong chuyên luận riêng. Trong chuyên luận riêng, khi pha tĩnh được ký hiệu bằng một chữ cái thì tra cứu ở phần Nguyên vật liệu nêu ở dưới đây. Đường kính danh nghĩa của hạt pha tĩnh được để trong ngoặc đơn ngay sau ký hiệu chữ cái cụ thể. Nếu không có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, quá trình sắc ký được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ không đổi trong môi trường phòng thí nghiệm. Khi sử dụng các pha động có pH cao với cột có bản chất là silica nên sử dụng một tiền cột ở trước cột phân tích. 9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Trừ khi có các chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, hệ thống detector gồm một detector đo quang gắn với một cốc đo có thể tích nhỏ (khoảng 10 L là phù hợp). Phải đặt bước sóng theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng. Khi dùng một máy sắc ký có thiết kế riêng biệt có thể phải thay đổi các điều kiện sắc ký đã ghi trong chuyên luận riêng. Trong trường hợp này, người phân tích cần đảm bảo rằng những thay đổi đó cho kết quả tương đương. 1.4.5. Thể tích tiêm Khi thể tích tiêm không qui định trong chuyên luận riêng, nên chọn một thể tích tiêm phù hợp để áp dụng. Chọn thể tích tiêm phụ thuộc vào đáp ứng của phép phân tích, detector sử dụng, hiệu lực cột và toàn bộ hiệu năng của hệ thống sắc ký. Khi không có chỉ dẫn, thường dùng thể tích tiêm là 20 L, tuy nhiên cần kiểm tra sự thích hợp trong điều kiện cụ thể. 1.4.6. Peak phụ (Peak thứ cấp) Có thể cần chất đối chiếu để xác định peak phụ. Peak phụ là một peak có trên sắc ký đồ nhưng không phải là peak chính hay peak của chuẩn nội hoặc peak của dung môi hay của các thuốc thử tạo dẫn xuất. 1.4.7. Nguyên vật liệu Các dung môi và thuốc thử dùng để pha các dung dịch sử dụng trong phân tích phải có chất lượng thích hợp cho sắc ký lỏng. Khi chuyên luận riêng quy định pha tĩnh được gán với một chữ cái (A hoặc B hoặc C) là muốn nói tới các pha tĩnh như mô tả dưới đây: Pha tĩnh A, hạt silica; Pha tĩnh B, hạt silica được biến đổi hóa học, gắn với nhóm octylsilyl (C8); Pha tĩnh C, hạt silica được biến đổi hóa học, gắn với nhóm octade- cylsilyl (C18). 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2.Sơ lược về phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phổ CHTHN) viết tắt của tiếng Anh là NMR (nuclear Magnetic Resonance) là một phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ, nó có ý nghĩa quan trọng để xác định cấu tạo các hợp chất hữu cơ phức tạp như các hợp chất thiên nhiên, các thuốc chữa bệnh, các chất trong thành phần dầu mỏ. Phương pháp phổ biến được sử dụng là CHTHN- 1H và phổ CHTHN- 13C. Hạt nhân của nguyên tử 1 H và 13C có momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [26] Độ chuyển dịch hoá học Hằng số chắn và từ trường hiệu dụng: Hằng số chắn xuất hiện do hai nguyên nhân: - Hiệu ứng nghịch từ: các điện tử bao quanh nguyên tử sinh ra một từ trường riêng, ngược chiều với từ trường ngoài nên làm giảm tác dụng của nó lên hạt nhân nguyên tử. Lớp vỏ điện tử càng dày đặc thì từ trường riêng ngược chiều với từ trường ngoài càng lớn tức hằng số chắn càng lớn. - Hiệu ứng thuận từ: bao quanh phân tử là lớp vỏ điện tử, các điện tử này chuyển động sinh ra một dòng điện vòng, do đó xuất diện một từ trường riêng có hướng thay đổi ngược hướng hoặc cùng hướng với từ trường ngoài. Tập hợp tất cả các điểm trên các đường sức mà tại đó tiếp tuyến vuông góc với từ trường ngoài sẽ tạo nên một mặt parabol. Phía trong mặt parabol, từ trường tổng hợp nhỏ hơn B0 vì từ trường riêng ngược hướng với từ trường ngoài, còn phía ngoài parabol thì từ trường tổng hợp lớn hơn B0 vì từ trường riêng cùng hướng với từ trường ngoài. Do đó hằng số chắn phía ngoài parabol nhỏ còn phía trong thì có hằng số chắn lớn nghĩa là độ chuyển dịch học cùng các proton nằm phía ngoài parabol sẽ lớn còn phía trong sẽ nhỏ. 11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Độ chuyển dịch hóa học : Đối với các hạt nhân trong phân tử càng phức tạp trong nguyên tử do ảnh hưỏng của các đám mây electron của các nguyên tử bên cạnh. Độ chuyển dịch hóa học của 13C trong các hợp chất hữu cơ biến đổi trong khoảng từ 0-230ppm (so với TMS) tức là lớn gấp 20 lần so với sự biến đổi độ chuyển dịch hóa học của 1H. TMS là chất có hằng số chắn lớn nhất nên dùng nó làm chất chuẩn để đo độ chuyển dịch hoá học.Đối với hạt nhân 1H thì: 0 H TMS TMS H  Ở đây, σ TMS là hằng số chắn của chất chuẩn TMS (tetrametylsilan), σH là hằng số chắn của hạt nhân mẫu đo, ν TMS ν H là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân mẫu đo. Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tuỳ thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13 C trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hoá học của mỗi hạt nhân khác nhau. Tổng quát: δ = σTMS – σX σX: hằng số chắn của chất cần đo. δ không có thứ nguyên mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với phổ CHTHN 1H thì δ có giá trị từ 1 đến 12 ppm còn phổ 13C thì δ có giá trị từ 0 đến 220ppm. Vậy độ chuyển dịch hoá học δ là đại lượng đặc trưng cho những hạt nhân cùng loại của một đồng vị bị che chắn tương đương nhau trong một hợp chất. Nó không phụ thuộc vào thiết bị bên ngoài (cường độ từ trường hay tần số sóng) không có thứ nguyên và được tính bằng ppm Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:  TMS  x  .10 6 ( ppm) o 12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn