Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu khả năng ức chế hình thành β-amyloid gây bệnh Alzheimer bởi một số hoạt chất từ hoa hòe (Sophora japonica L.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Đỗ Thị Hải Anh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HÌNH THÀNH β-AMYLOID

GÂY BỆNH ALZHEIMER BỞI MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ

HOA HÒE (Sophora japonica L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Đỗ Thị Hải Anh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HÌNH THÀNH β-AMYLOID

GÂY BỆNH ALZHEIMER BỞI MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ

HOA HÒE (Sophora japonica L.)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội – 2018

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới người thày đã

luôn tận tâm chỉ bảo, tạo điều kiện cho em được học tập, trau dồi kiến thức trong suốt

thời gian qua – PGS.TS. Nguyễn Quang Huy. Nếu không có sự hướng dẫn, giúp đỡ và

động viên liên tục của thày, em sẽ khó có thể hoàn thành được luận văn thạc sĩ này.

Tiếp đến, em xin chân thành cảm ơn GS Shunsuke Izumi và PGS.TS. Kazumi

Saikusa, phòng thí nghiệm Khoa Toán học và Khoa học sự sống, ĐH Khoa học tự

nhiên, ĐH Hiroshima đã hết sức tạo điều kiện, quan tâm và hướng dẫn em làm thí

nghiệm trong thời gian em học tập và trao đổi tại ĐH Hiroshima. Dưới sự hướng dẫn

của thầy cô, em đã học được rất nhiều điều hay và bổ ích, phục vụ rất nhiều cho quá

trình thực hiện đề tài.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân

tử, các thày cô giáo tại Khoa Sinh học và chuyên viên phòng Đào tạo Sau Đại học

trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện cho em hoàn thành chương trình học

tập của khóa học.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động

viên, cổ vũ tinh thần cho em mỗi khi em gặp khó khăn trong suốt thời gian em học tập

và thực hiện đề tài.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Học viên cao học

Sinh học thực nghiệm K25

Đỗ Thị Hải Anh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3

1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer ........................................................................ 3

1.1.1. Bệnh Alzheimer trên thế giới và Việt Nam ............................................... 3

1.1.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Alzheimer................................................... 5

1.1.3. Chẩn đoán và phòng ngừa bệnh Alzheimer ............................................. 6

1.1.4. Mối liên hệ giữa stress oxi hóa và bệnh Alzheimer.................................. 9

1.1.5. Vai trò của β-amyloid trong bệnh Alzheimer ......................................... 10

1.2. Tổng quan về flavonoids và các nghiên cứu flavonoids từ thực vật ......... 12

1.2.1. Tổng quan về flavonoids .......................................................................... 12

1.2.2. Giá trị sinh học của flavonoids ............................................................... 15

1.3. Tổng quan về Hoa hòe (Sophora japonica L.) ............................................. 19

1.3.1. Giới thiệu chung ...................................................................................... 19

1.3.2. Thành phần hóa học của cây hoa hòe .................................................... 20

1.3.3. Công dụng của hoa hòe ........................................................................... 21

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 23

2.1. Nguyên liệu ..................................................................................................... 23

2.1.1. Mẫu thực vật ............................................................................................ 23

2.1.2. Mẫu peptide .............................................................................................. 23

2.2. Hóa chất .......................................................................................................... 23

2.3. Thiết bị thí nghiệm ........................................................................................ 23

2.3.1. Thiết bị tách chiết và xác định hợp chất ................................................. 23

2.3.2. Thiết bị đánh giá khả năng bắt gốc tự do và giảm sự tích tụ peptide β- amyloid 24

Sinh học thực nghiệm K25

Đỗ Thị Hải Anh

2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 24

2.4.1. Phương pháp tách chiết ........................................................................... 24

2.4.2. Phương pháp sắc ký bản mỏng ............................................................... 25

2.4.3. Phương pháp sắc ký cột ........................................................................... 26

2.4.4. Phương pháp chiết lỏng – lỏng ............................................................... 28

2.4.5. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân .................................................. 29

2.4.6. Phương pháp khối phổ ............................................................................ 31

2.4.7. Phương pháp chuẩn bị mẫu β-amyloid và các dung dịch chất chuẩn, chất tinh sạch ......................................................................................................... 32

2.4.8. Phương pháp bắt gốc tự do DPPH ......................................................... 33

2.4.9. Phương pháp thực nghiệm huỳnh quang Thioflavin T ......................... 35

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 37

3.1. Phân lập và tinh sạch các hợp chất chính có trong dịch chiết................... 37

3.1.1. Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký bản mỏng ....................... 37

3.1.2. Tinh sạch các chất bằng phương pháp sắc ký cột .................................. 38

3.1.3. Tinh sạch chất bằng phương pháp sắc ký lỏng-lỏng ............................. 40

3.2. Xác định các hợp chất có trong phân đoạn chính ...................................... 42

3.2.1. Xác định cấu trúc chất C2 ....................................................................... 42

3.2.2. Xác định cấu trúc chất C6 ....................................................................... 45

3.3. Đánh giá khả năng làm giảm sự tích lũy β-amyloid ................................... 52

3.3.1. Hoạt tính chống oxi hóa .......................................................................... 52

3.3.2. Hoạt tính làm giảm sự tích tụ peptide β-amyloid ................................... 54

KẾT LUẬN .................................................................................................................. 56

KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 56

iii

Sinh học thực nghiệm K25

Đỗ Thị Hải Anh

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 57

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Kết quả phân tách dịch chiết nụ hoa hòe bằng phương pháp sắc ký cột ...... 38

Bảng 3.2. Kết quả sắc ký bản mỏng các phân đoạn thu được sau khi chạy sắc ký cột 39

Bảng 3.3. Tổng kết các chất tinh sạch và cao khô thu được từ dịch chiết nụ hoa hòe . 41

Bảng 3.4. Bảng so sánh giá trị peak của quercetin chuẩn với chất C2 ......................... 43

Bảng 3.5. Thành phần nguyên tố của hợp chất C6 ....................................................... 47

Bảng 3.6. Bảng so sánh giá trị peak của Neohesperidin chuẩn và chất C6 .................. 50

Sinh học thực nghiệm K25

Đỗ Thị Hải Anh

Bảng 3.7. Giá trị quét gốc tự do DPPH của các chất .................................................... 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ minh họa quá trình tạo nên đám rối tơ thần kinh [4] ............................ 7

Hình 1.2. Mảng viêm thần kinh do sự tích tụ β-amyloid ở não bệnh nhân Alzheimer

[2] .................................................................................................................................. 11

Hình 1.3. Cấu trúc vòng flavonoid ................................................................................ 13

Hình 1.4. Cây hoa hòe ................................................................................................... 20

Hình 2.1. Sơ đồ minh họa cột sắc ký ............................................................................ 27

Hình 2.2. Sơ đồ minh họa hoạt động của hệ ESI-MS/MS ............................................ 32

Hình 3.1. Kết quả sắc ký bản mỏng dịch chiết nụ hoa hòe ........................................... 37

Hình 3.2. Các phân đoạn khác nhau sau khi chạy sắc ký cột ....................................... 39

Hình 3.3. Kết quả sắc ký bản mỏng các chất C2 và C6 khi so sánh với quercetin và

rutin chuẩn ..................................................................................................................... 40

Hình 3.4. Chất C6 .......................................................................................................... 41

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của quercetin chuẩn ............................................................... 42

Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của C2 .................................................................................... 43

Hình 3.7. Công thức cấu tạo của chất C2 – quercetin ................................................... 45

Hình 3.8. Phổ khối lượng ESI của chất C6 ................................................................... 46

Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của Neohesperidin chuẩn ....................................................... 48

Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của chất C6 .......................................................................... 48

Hình 3.11. Phổ 13C-NMR của Neohesperidin chuẩn ................................................... 49

Hình 3. 12. Phổ 13C-NMR của chất C6 ....................................................................... 49

Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của C6 – neohesperidin ................................................... 51

Hình 3.14. Đồ thị đường chuẩn khả năng chống oxi hóa của vitamin C ...................... 52

Sinh học thực nghiệm K25

Đỗ Thị Hải Anh

Hình 3.15. Biểu đồ thể hiện sự tích lũy β-amyloid trong các điều kiện khác nhau ...... 54

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Aβ Β-amyloid

DPPH 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

MS Mass Spectrometry – Phổ khối lượng

NMR Nuclear Magnetic Resonance – Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Sinh học thực nghiệm K25

Đỗ Thị Hải Anh

SSTT Sa sút trí tuệ

MỞ ĐẦU

Nhờ sự tiến bộ của khoa học công nghệ và sự phát triển của kinh tế xã hội, cuộc

sống của con người ngày càng được cải thiện. Tuổi thọ trung bình của loài người tăng

lên là một thành tựu đối với y tế công cộng và là kết quả của sự phát triển kinh tế, xã

hội. Tuy nhiên cũng gây thách thức về vấn đề chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cho một số

lượng lớn người cao tuổi trong xã hội. Tuổi già làm tăng nguy cơ phát triển các bệnh

mạn tính và thoái hóa. Một trong những bệnh mạn tính không lây nhiễm và thoái hóa

thường gặp ở người cao tuổi là hội chứng sa sút trí tuệ (SSTT), trong đó bệnh

Alzheimer chiếm tới 50-70%.

Hiện nay tỉ lệ mắc SSTT tăng theo tuổi theo hàm số mũ rên toàn thế giới, theo

báo cáo của Hiệp hội Alzheimer thế giới, có khoảng 50 triệu người mắc bệnh

Alzheimer trong năm 2016, và ước tính sẽ lên đến khoảng 150 triệu người vào năm

2050. Sa sút trí tuệ thật sự là một thảm hoạ đối với người cao tuổi. Bệnh gây suy giảm

trí nhớ và nhiều lĩnh vực nhận thức khác, kèm theo với những rối loạn về hành vi, gây

ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng hoạt động và chất lượng sống của bệnh nhân.

Người mắc bệnh Alzheimer bị mất dần khả năng tự chăm sóc và ngày càng phụ thuộc

vào người khác trong việc thực hiện các hoạt động thể chất và tinh thần cơ bản nhất.

Chi phí cho điều trị bệnh Alzheimer rất tốn kém, chỉ đứng sau các bệnh tim mạch và

ung thư. Vì vậy việc tìm ra các phương pháp phòng ngừa và chữa trị bệnh Alzheimer là

vô cùng cần thiết đối với xã hội hiện nay.

Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật phong phú

với trữ lượng lớn, có nhiều tiềm năng về cây thuốc. Cây hoa hòe (Sophora japonica L.)

là một loại cây được trồng phổ biến ở Việt Nam. Cây vừa cho bóng mát, vừa cung cấp

các giá trị khác đặc biệt về kinh tế và y học. Hoa hòe là một vị thuốc được sử dụng

rộng rãi trong các bài thuốc y học cổ truyền từ xưa đến nay. Mọi bộ phận của cây, đặc

biệt là quả khô, hoa và chồi có giá trị rất lớn trong y học như nụ hoa hòe được dùng

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

làm thuốc cầm máu cho các bệnh đổ máu cam, ho ra máu, ruột chảy máu, tiểu tiện ra

máu ở dạng thuốc sắc. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng thành phần flavonoids ở

trong thực vật có khả năng giúp chống oxi hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, và đặc biệt

là khả năng giảm sự tích lũy peptide β-amyloid – một loại peptide gây bệnh Alzheimer.

Vì các lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ức chế hình

thành β-amyloid gây bệnh Alzheimer bởi một số hoạt chất từ hoa hòe (Sophora

japonica L.)” với mục đích:

 Tách chiết và tinh sạch các chất có hoạt tính sinh học từ nụ cây hoa hòe.

 Đánh giá khả năng ngăn chặn sự tích tụ peptide β-amyloid in vitro từ một

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

số chất tách từ nụ hoa hoè.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer

1.1.1. Bệnh Alzheimer trên thế giới và Việt Nam

Bệnh Alzheimer là một bệnh thoái hóa thần kinh, biểu hiện bằng giảm trí nhớ và

những rối loạn nhận thức khác, kèm theo các thay đổi về hành vi, gây ảnh hưởng

nghiêm trọng đến hoạt động nghề nghiệp và xã hội của bệnh nhân. Bệnh tiến triển nặng

dần và không hồi phục.

Bệnh do bác sĩ Alois Alzheimer phát hiện lần đầu năm 1901, ông là người đầu

tiên mô tả lâm sàng và đặc điểm giải phẫu bệnh lý của bệnh bao gồm các búi tơ thần

kinh (neurofibrillary tangles) và các mảng dạng tinh bột (amyloid plaque). Sau này

bệnh được mang tên ông, gọi là bệnh Alzheimer [18].

Trước kia, bệnh Alzheimer thường được dùng chỉ các trường hợp SSTT với

người ở độ tuổi 45-65 với những tổn thương mô học điển hình nên còn được gọi là

SSTT trước tuổi già (presenile dementia). Còn khái niệm SSTT tuổi già (senile

dementia) được xem là do quá trình lão hoá bình thường của não, chủ yếu do các mạch

máu trong não bị “xơ cứng” trong quá trình lão hóa. Từ những năm 70 – 80 của thế kỷ

XX, người ta thấy biểu hiện lâm sàng cũng như đặc điểm tổn thương giải phẫu bệnh

tương tự ở người trẻ cũng như ở người già nên danh từ bệnh Alzheimer được dùng để

chỉ các trường hợp có đặc điểm lâm sàng, tiến triển và giải phẫu bệnh điển hình, bất kể

ở lứa tuổi nào [23].

Tuổi càng cao, tỷ lệ mắc SSTT càng nhiều. Cứ sau mỗi năm năm, tỷ lệ mắc

bệnh của sa sút trí tuệ toàn bộ lại tăng gần gấp đôi, từ 1,5% ở độ tuổi 60-69 lên 40% ở

độ tuổi 90. Một nhóm chuyên gia đã ước tính tỷ lệ mắc bệnh toàn bộ của sa sút trí tuệ ở

những người từ 60 tuổi trở lên trên toàn thế giới là 3,9%, Châu Phi là 1,6%, Đông Âu

là 3,9%, Trung Quốc 4,0%, Mỹ La tinh 4,6%, Tây Âu 5,4% và Bắc Mỹ 6,4%. Trong

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

các nguyên nhân gây sa sút trí tuệ, bệnh Alzheimer hay gặp nhất chiếm từ 50 đến 70%,

tiếp đến là sa sút trí tuệ do mạch máu từ 14 đến 25%, còn lại là các nguyên nhân khác

[42].

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, hiện số người mắc SSTT trên toàn thế

giới vào khoảng 50 triệu người. Con số này ước tính sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030

(65,7 triệu) và tăng gấp hơn ba lần vào năm 2050 (115,4 triệu người) [60]. Với xu

hướng già hoá dân số, cứ sau mỗi khoảng hai mươi năm số người mắc sa sút trí tuệ sẽ

tăng gấp đôi. Mặc dù tỷ lệ mới mắc sa sút trí tuệ ở khu vực các nước phát triển cao

hơn, nhưng đa số người bị sa sút trí tuệ sống ở các nước đang phát triển. Trung Quốc

và các nước khu vực Tây Thái Bình Dương có số người mắc sa sút trí tuệ cao nhất (6

triệu người), tiếp theo là Cộng đồng Châu Âu (5 triệu), Hoa kỳ (2,9 triệu) và Ấn Độ

(1,5 triệu). Tỷ lệ tăng số lượng bệnh nhân sa sút trí tuệ dao động rất nhiều theo vùng, ở

các nước đang phát triển cao hơn các nước phát triển từ ba đến bốn lần. Hậu quả là tỷ

lệ người bị sa sút trí tuệ ở các nước đang phát triển dự đoán sẽ tăng từ 61% (năm 2000)

lên 65% (năm 2020) và 71% (năm 2040). Tình hình mắc bệnh Alzheimer cũng có bức

tranh tương tự [7].

Ở Việt Nam, theo khảo sát của Bệnh viện Tâm thần tiến hành trên 258 người từ

65 tuổi trở lên được chọn ngẫu nhiên từ cộng đồng tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy

tỷ lệ mắc SSTT là 7,8% [3]. Nghiên cứu của Bệnh viện Lão khoa Trung ương về tỷ lệ

mắc và một số yếu tố liên quan đến SSTT ở người cao tuổi tại huyện Ba Vì, Hà Nội

năm 2005 - 2006 cho thấy tỷ lệ người cao tuổi (từ 60 tuổi trở lên) sống tại cộng đồng

có SSTT là 4,63%. Cứ sau mỗi khoảng cách 5 tuổi, tỷ lệ mắc bệnh lại tăng lên 1,78 lần

[2, 5]. Trong một nghiên cứu về một số đặc điểm dịch tễ học sa sút trí tuệ và suy giảm

nhận thức nhẹ ở người cao tuổi Hà Nội (thực hiện trong giai đoạn 2009- 2010) cho

thấy tỷ lệ người cao tuổi có sa sút trí tuệ tại xã Thanh Xuân huyện Sóc Sơn, Hà Nội là

5,1% trong tổng số 410 người cao tuổi, ở phường Phương Mai quận Đống Đa, Hà Nội

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

là 3,2% trong tổng số 556 người cao tuổi [7].

Tuy chưa có một điều tra mang tính đại diện cho thực trạng sa sút trí tuệ ở người

cao tuổi tại Việt Nam nhưng qua một số nghiên cứu đã được tiến hành thì tỷ lệ mắc sa

sút trí tuệ và bệnh Alzheimer tại Việt Nam cũng tương tự như ở các nước khác trong

khu vực.

1.1.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer biểu hiện bằng giảm trí nhớ và những rối loạn nhận thức khác,

kèm theo các thay đổi về hành vi [4, 5].

 Giảm trí nhớ: là biểu hiện đầu tiên làm cho bệnh nhân và người nhà chú ý. Đây

là triệu chứng đặc trưng nhất của bệnh. Trong giai đoạn đầu chủ yếu giảm trí

nhớ gần (không còn khả năng ghi nhận các thông tin mới), giảm khả năng hiểu

ngữ nghĩa, nhắc đi nhắc lại một chi tiết. Khi bệnh tiến triển nặng hơn, bệnh nhân

quên cả những thông tin đã tiếp thu được từ trước, thậm chí quên tên người

thân.

 Mất ngôn ngữ (aphasia): Giảm ngôn ngữ là triệu chứng nổi bật trong bệnh cảnh

lâm sàng của bệnh Alzheimer. Bệnh nhân diễn đạt ý nghĩ của mình ngày càng

khó khăn, ngôn ngữ nghèo nàn, không lưu loát, khó tìm từ, nói vòng vo, không

hiểu hết lời nói của người đối diện, không thể tiếp xúc cùng lúc với nhiều người.

Trong giai đoạn muộn, bệnh nhân không nói gì, mất giao tiếp hoàn toàn gây khó

khăn lớn cho mối quan hệ giữa bệnh nhân và người chăm sóc.

 Mất sử dụng động tác (apraxia): Gần như tất cả bệnh nhân Alzheimer ở giai

đoạn nặng đều có mất sử dụng động tác (apraxia). Hay gặp nhất là mất sử dụng

động tác ý-vận (ideomotor apraxia), bệnh nhân không có khả năng chuyển một

ý định thành động tác có định hướng không gian chính xác, làm cho bệnh nhân

khó thực hiện các hoạt động sinh hoạt hàng ngày.

 Mất nhận biết (agnosia), mất khả năng tổng hợp suy luận và rối loạn chức năng

thực hiện. Bệnh nhân than phiền là không nhìn rõ đồ vật và vì vậy khó khăn

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

trong việc xác định đồ vật đó. Họ không thể sao chép hoặc miêu tả đồ vật một

cách chính xác, không thể phân biệt các đồ vật tương tự nhau, không thể nhận

biết được tất cả các chi tiết của đồ vật, không thể nhận ra được đồ vật dưới các

góc nhìn bất thường hoặc không thể phân biệt các hình chồng lên nhau… Bệnh

nhân mất khả năng nhận mặt những người quen, mất khả năng nhận diện loài

hoa, loại ô tô…

 Suy giảm khả năng thực hiện hoạt động: biểu hiện bằng không có khả năng

quản lý các nhiệm vụ phức tạp như chi tiêu trong gia đình hoặc chuẩn bị bữa ăn.

 Các triệu chứng về hành vi: là những biểu hiện lâm sàng quan trọng và đôi khi

bệnh nhân đến khám vì những triệu chứng này: không thừa nhận bệnh, thờ ơ, rối

loạn tâm thần (hoang tưởng, ảo giác), rối loạn cảm xúc (trầm cảm, lo âu), kích

động,…

Biểu hiện lâm sàng điển hình của bệnh Alzheimer theo mức độ:

 Nhẹ: Trí nhớ giảm, có thể không rõ với những người thường xuyên tiếp xúc với

bệnh nhân, không thực hiện được các hoạt động phức tạp (ví dụ chuẩn bị bữa

ăn, chi tiêu), vẫn tự chăm sóc được bản thân, tính tình trở nên thụ động, ít hoặc

không có các biểu hiện về hành vi.

 Trung bình: Trí nhớ giảm rõ, không thực hiện được các hoạt động thông thường

(như sử dụng bếp, gọi điện thoại), không tự chăm sóc được bản thân (như tắm

rửa, trang điểm), có rối loạn hành vi (hội chứng hoàng hôn, hoang tưởng hệ

thống - paranoia), kỹ năng giao tiếp xã hội thay đổi, cần người giám sát.

 Nặng: Trí nhớ giảm nhiều, chỉ còn những mảnh vụn, không nhận biết được

người thân, không thực hiện được mọi hoạt động phức tạp, giảm vận động, cần

có người chăm sóc thường xuyên.

1.1.3. Chẩn đoán và phòng ngừa bệnh Alzheimer

 Chẩn đoán

Xác định bệnh Alzheimer chỉ dựa trên giải phẫu bệnh học. Hai tổn thương đặc

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

trưng nhất của bệnh Alzheimer là mảng lão hóa và đám rối tơ thần kinh. Các tổn

thương này thường xuất hiện trong não nhiều năm trước khi bệnh biểu hiện đầy đủ trên

lâm sàng. Ở các tế bào thần kinh bệnh lý xảy ra hiện tượng các vi ống tan rã, tức là các

đơn vị vi quản tách rời nhau, hình thành nên đám rối tơ thần kinh. (hình 1.1).

Hình 1.1. Sơ đồ minh họa quá trình tạo nên đám rối tơ thần kinh [4]

Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh hiện đại cũng được xem là có giá trị

hỗ trợ chẩn đoán các trường hợp có khả năng là bệnh Alzheimer (probable Alzheimer’s

disease). Phương pháp chụp cộng hưởng từ (MRI) sọ não cũng giúp nhận dạng được

tình trạng teo vỏ não thùy trong rãnh mũi và teo hồi hải mã ở bệnh nhân Alzheimer.

Các chụp hình hệ thần kinh như chụp cắt lớp phát điện tử dương (Positron Emission

Tomography/PET) và chụp cắt lớp phát photon đơn (Single Photon Emission

Tomography/SPECT) giúp cho thấy có hình ảnh của giảm chuyển hóa hay giảm tưới

máu tại các vùng thái dương đỉnh phía sau.

 Phòng ngừa: Có rất nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã và đang

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

cố tìm những biện pháp nhằm giảm, hạn chế các yếu tố nguy cơ:

 Liệu pháp hóc môn thay thế: Nhiều nghiên cứu trên thế giới cùng ghi nhận kết

quả ở phụ nữ khi dùng liệu pháp thay thế hóc môn đều giảm được triệu chứng sa

sút trí tuệ. DHEA (dehydroepiandrosterone) là hóc môn dùng chống lão hóa ở

nữ có tác dụng làm giảm nguy cơ bệnh Alzheimer. Ở nam giới thì liệu pháp thay

thế bằng testosteron có hiệu quả tương tự như nữ giới [40].

 Thuốc kháng viêm không có thành phần steroid: Nhiều nghiên cứu cho thấy

dùng các thuốc kháng viêm không có thành phần steroid sẽ chống lại sự tích tụ

beta Amyloid trong não [24].

 Statin: đây là thuốc làm giảm cholesterol máu. Một vài nghiên cứu cho thấy

những người dùng statin giảm được 70% nguy cơ bị sa sút trí tuệ [20].

 Chế độ ăn uống

 Chất béo: Một nghiên cứu ở Hà Lan cho thấy có mối liên hệ giữa sa sút

trí tuệ và chế độ ăn nhiều chất béo toàn phần, chất béo bão hòa và

cholesterol. Tuy nhiên mỡ dạng omega-3 có tác dụng chống lão hóa cho

tế bào não. Người ta khuyến cáo năng lượng từ chất béo chỉ nên ở mức

dưới dưới 30% tổng nhu cầu hàng ngày [46].

 Rau quả sậm màu: Nghiên cứu cho thấy các loại rau quả có mầu sẫm có

tác dụng bảo vệ não chống lại sự lão hóa.

 Đậu nành: Có chứa một thành phần giống estrogen; trên động vật thí

nghiệm cho thấy có tác dụng bảo vệ chống lại bệnh Alzheimer. Đậu nành

đặc biệt tốt cho phụ nữ sau mãn kinh [16].

 Rượu: Nếu dùng lượng vừa phải (một đến hai ly mỗi ngày) thì có tác

dụng tốt bảo vệ não do kích thích phóng thích acetylchotine (chất dẫn

truyền thần kinh bị khiếm khuyết trong bệnh Alzheimer [47].

 Folate và vitamin B12: có tác dụng làm giảm hemocysteine (chất làm

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

tăng nguy cơ Alzheimer và bệnh tim mạch) [45].

 Vitamin chống oxi hóa: chủ yếu là vitamin E và C, chống sự giải phóng

gốc tự do làm tổn thương tế bào.Vắc xin: Dùng vắc xin giúp kích thích

cơ thể tạo ra kháng thể đặc hiệu tiêu hủy các phân tử protein liên quan

đến bệnh Alzheimer [37].

1.1.4. Mối liên hệ giữa stress oxi hóa và bệnh Alzheimer

Chuyển đổi năng lượng là một trong những quá trình rất cơ bản của cuộc sống.

Chuyển đổi năng lượng có từ khi bắt đầu sự sống thông qua các cơ chế đơn giản, ví dụ

như việc dịch chuyển các ion trong màng bán thấm có mặt trong tất cả các sinh vật

sống. Sự chuyển đổi này là những phản ứng oxi hóa khử, trong đó các electron được

truyền trong một chuỗi từ chất cho đầu tiên thông qua các chất trung gian để đến chất

nhận cuối cùng.

O2 + 4 e- + 4H+ → 2H2O

Ở người và các động vật, thường chất nhận cuối cùng là O2. Trong các phản

-, H2O2 và ion OH-

ứng, một phần O2 bị khử để tạo ra O2

Những chất trung gian này ẩn chứa nguy hiểm vì chúng hoạt động mạnh và do

đó khó kiểm soát (ví dụ như OH-), hoặc chúng là tiền chất dễ dàng hình thành các chất

phản ứng không kiểm soát được ví dụ như O2•- + NO  peroxynitrite. Các chất oxi

hóa khử như O2•-, H2O2, HO• được gọi là các tác nhân oxi hóa (ROS). Các tác nhân oxi

hóa được định nghĩa rộng rãi là các chất chứa oxy với khả năng phản ứng hóa học tích

cực. Sự sống trong môi trường hiếu khí và với O2 là chất nhận điện tử cuối cùng dẫn

đến việc sản xuất ROS liên tục trong cơ thể. Do tầm quan trọng của chuyển đổi năng

lượng, hầu hết ROS có nguồn gốc từ chuỗi hô hấp và có khả năng gây nguy hiểm. Vì

vậy một số enzyme và các phân tử nhỏ tồn tại để kiểm soát mức ROS. Nhìn chung,

ROS được giữ ở mức thấp nhưng chưa loại bỏ được hoàn toàn. Sự tích tụ nồng độ ROS

quá cao là nguy hiểm và được xác định là stress oxi hóa.

Xem xét vai trò trung tâm của oxy, các hệ thống sản xuất và loại bỏ ROS khác

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

nhau, cách điều hòa các tác nhân này, sự stress oxi hóa được quan sát thấy trong vô số

các bệnh. Đặc biệt, trong các bệnh thoái hóa thần kinh như Alzheimer và Parkinson,

não bộ cho thấy sự tổn thương do oxi hóa và stress oxi hóa một cách rõ ràng. Bộ não có

thể đặc biệt nhạy cảm với stress oxi hóa do sự tiêu thụ oxy rất cao của não (chiếm 20%

tổng lượng tiêu thụ cơ thể). Quá trình oxi hóa các phân tử sinh học trong bệnh

Alzheimer chủ yếu liên quan đến các phân tử sinh học của màng tế bào thần kinh và

làm gián đoạn tính toàn vẹn của màng tế bào. Nó liên quan đến quá trình oxi hóa chất

béo, protein và axit nuleic. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng stress oxi hóa đóng một vai

trò quan trọng trong sinh bệnh học Alzheimer và có liên quan đến sự hiện diện của

peptide β-amyloid (Aβ) [12].

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu đã cung cấp các bằng chứng về việc

tăng các stress oxi hóa bao gồm:

 Tăng sắt, nhôm và thủy ngân trong não bệnh nhân Alzheimer, các ion

này kích thích tạo gốc tự do.

 Tăng lipid peroxide và giảm axit béo không bão hòa, tăng 4-

hydroxynonenal – một sản phẩm aldehyde của peroxi hóa lipid.

 Tăng sự xuất hiện các protein và tăng quá trình oxi hóa DNA.

 Giảm chuyển hóa năng lượng và giảm cytochrome C oxidase.

Nghiên cứu cho thấy rằng peptide β-amyloid có khả năng kích hoạt tạo thêm các

gốc tự do. Các bằng chứng gián tiếp hỗ trợ cho kết luận này xuất phát từ các nghiên

cứu in vitro cho thấy gốc tự do là trung gian thoái hóa thần kinh và liên quan đến sinh

bệnh học trong bệnh Alzheimer [61].

1.1.5. Vai trò của β-amyloid trong bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer được coi như một dạng thoái hóa amyloid – kết quả của quá

trình biến đổi bất thường của protein tiền thân amyloid (APP), một protein xuyên màng

mà chức năng cho đến nay vẫn chưa được hiểu rõ. Mảng viêm thần kinh (neuritic

plaque) nằm ngoài tế bào, chủ yếu chứa amyloid, một chất liệu chứa protein và các yếu

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

tố tế bào (hình 1.2). Dạng amyloid lắng động trong não bệnh nhân Alzheimer là β-

amyloid (Aβ). Aβ là một peptid chứa các đoạn gồm 39-43 axit amin, được phân giải từ

APP. Quá trình phân giải APP là quá trình phân cắt protein trong màng liên quan đến 3

loại enzyme: α-, β- và γ- secretase. Trước tiên APP bị cắt bởi α- hoặc β- secretase. Sản

phẩm của lần phân cắt đầu tiên được cắt lại 1 lần nữa nhờ γ- secretase. Sảm phẩm thu

được bao gồm 1 phân đoạn protein tan hình thành từ đoạn cắt α- γ- và 1 phân đoạn

không tan tự kết tụ (Aβ40 và Aβ42) từ đoạn cắt β- γ-. Đoạn protein vùng carboxyl còn

lại từ quá trình biến đổi của APP di chuyển vào trong nhân và hoạt hóa sự biểu hiện

các gen [11].

Hình 1.2. Mảng viêm thần kinh do sự tích tụ β-amyloid ở não bệnh nhân Alzheimer [2]

Aβ40 là dạng phổ biến nhất của Aβ trong dịch não tủy và huyết tương ở người.

Aβ42 kết tụ thành các sợi amyloid nhanh hơn so với Aβ40, Aβ42 có mặt ở cả những mảng

lan tỏa mới hình thành cũng như những mảng viêm thần kinh đã hình thành đầy đủ

[51]. Aβ sợ có tính chất gây độc ở mức độ in vitro và in vivo [17]. Sự lắng đọng của

Aβ cho phép tiên lượng trước các triệu chứng lâm sàng của bệnh Alzheimer Tổng hàm

lượng Aβ trong vỏ não tăng lên trong quá trình tiến triển bệnh tương ứng với sự suy

giảm nhận thức, và thường xuất hiện trước khi hình thành các đám rối tơ thần kinh

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

[36]. Điều này gợi ý rằng sự bất bình thường trong quá trình biến đổi từ APP đến Aβ

hoặc sự thoái hóa và phân giải của Aβ có thể là sự biến đổi hóa sinh đầu tiên của bệnh

Alzheimer [35]. Sự suy giảm các peptid Aβ cũng có thể góp phần dẫn tới trường hợp

mắc Alzheimer thể muộn [27].

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng β-amyloid 1-42 cảm ứng quá trình stress

oxi hóa và gây độc thần kinh thông qua các biểu hiện sau:

 Aβ1-42 gây ra oxi hóa protein: Khi thêm Aβ1-42 vào các neuron thần kinh

dẫn đến sự tăng biểu hiện protein carbonyl và giảm sự sống sót của tế

bào so với mẫu đối chứng [57, 62, 63].

 Aβ1-42 gây ra peroxi hóa lipid trong màng não: Thêm Aβ1-42 vào môi

trường nuôi neuron hoặc màng synaptosomal dẫn đến sự hình thành 4-

hydroxy-2-nonennal (HNE) hoặc isoprostanes, cả hai sản phẩm của

peroxi hóa lipid [33, 34].

1.2. Tổng quan về flavonoids và các nghiên cứu flavonoids từ thực vật

1.2.1. Tổng quan về flavonoids

1.2.1.1. Khái niệm và nguồn gốc

Khái niệm: Là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong dược liệu nguồn gốc

thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa… Phần lớn các flavonoid có màu

vàng (bắt nguồn từ flavus có nghĩa là màu vàng), tuy vậy, một số sắc tố xanh, tím đỏ,

không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sườn

cơ bản. Flavonoid là hợp chất phenol có cấu trúc khung cơ bản là 1,3-diphenylpropan,

nghĩa là hai vòng benzene A và B nối nhau qua dây có 3 carbon, nên thường được gọi

là C6-C3-C6 [19].

Nguồn gốc: Cũng giống vitamin C, các flavonoid được phát hiện bởi Albert

Szent-gyorgyi (1893-1986). Ông nhận giải Nobel năm 1937 với những khám phá quan

trọng về đặc tính của vitamin C và flavonoid. Trong quá trình phân lập vitamin C,

Szent-Gyorgyi đã khám phá ra các flavonoid. Ban đầu ông gọi chất này là “vitamin P”,

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

do có khả năng làm giảm tính thấm thành mạch của nó, một trong những triệu chứng

thường gặp của bệnh Scurvy do thiếu vitamin C. Sau này ông đã công bố bệnh Scurvy

xảy ra không chỉ do thiếu vitamin C mà còn do thiếu flavonoid. Tuy nhiên vì flavonoid

không có đầy đủ tính chất của một vitamin nên sau này người ta bỏ tên vitamin P.

Giống như hầu hết các vitamin và khoáng chất, flavonoid là một chất cần thiết cho cơ

thể người [19].

1.2.1.2. Phân loại và tính chất

Phân loại: thường các flavonoid mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và

7 trên nhân A và vị trí 3,4,5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện dưới dạng tự

do hoặc dạng glycoside. Các đường thường gặp nhất là D-glucose, kế đó là D-

galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose và acid uronic. Các flavonoid

được phân thành nhiều nhóm với cấu trúc cơ bản khác nhau, dựa vào việc sinh tổng

hợp. Có nhiều cách phân loại khác nhau, cách phân loại thường dùng là dựa vào vị trí

của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxi hóa của mạch 3C.

Hình 1.3. Cấu trúc vòng flavonoid

 Euflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2. Trong phân nhóm này gồm

các nhóm phụ: flavan, flavan 3-ol (catechin), flavan 4-ol, flavan 3,4-diol,

anthocyanidin, flavanone, flavone, flavonol, 3-hydroxy flavanon, chalcon,

dihidrochalcon, aurone.

 Isoflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3. Trong phân nhóm này gồm

các nhóm phụ: iso flavan, iso flavan-4-ol, isoflavon, isoflavanon,

rotenoid…Thường gặp nhất là isoflavon trong cây họ đậu.

 Neoflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4. Chỉ giới hạn trong một số

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

cây gồm các nhóm phụ 4-aryl-chroman, 4-aryl-coumarin, dalbergion.

Tính tan: aglycon kém tan trong dung môi kém phân cực (hexan, benzen, ether

dầu hỏa), tan trong dung môi phân cực vừa và mạnh (ethyl acetate, dimethyl ether,

methanol, ethanol), tan trong kiềm loãng, kém tan trong dung dịch acid. Glycoside: tan

trong ethanol, methanol. Các glycoside càng có nhiều nhóm đường và mạch đường

càng dài thì tan tốt trong nước nóng. Các flavonoid glycoside có nhóm -OH tại vị trí

C7 còn tan được trong dung dịch NaOH, Na2CO3, NaHCO3 do có tính axit. Các

flavonoid dạng aglycon thường dễ kết tinh, trong khi các glycoside thường khó kết tinh

hơn [19].

Màu sắc: Các flavonoid thường có màu. Flavon có màu vàng nhạt hoặc màu

cam; flavonol có màu vàng đến vàng nhạt; chalcon có màu vàng đến cam đỏ. Các

isoflavon, flavanon, flavanonol, leucoanthocyanidin, catechin kết tinh không màu.

Anthocyanidin thường hiện diện ở dạng glycosid: pelargonidin, cyanidin,

delphinidin…tạo màu xanh dương, đỏ, tím cho hoa và trái.

Các flavonoid dễ tạo muối tan trong nước với các hydroxyd kiềm, nhạy cảm với

pH, nhiệt độ và ánh sáng. Có khả năng tạo phức với các ion kim loại cho sản phẩm có

màu đặc trưng.

Hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra bởi 2 vòng benzen và vòng pyron làm cho

flavonoid có khả năng hấp thụ tia tử ngoại. Thường thu được 2 dải hấp thu cực đại, dải

1 có λmax = 320 - 380 nm, dải 2 có λmax = 240 - 280 nm [19].

1.2.1.3. Phân bố, tổng hợp và vai trò của flavonoids trong thực vật

Flavonoids là các chất chuyển hóa thứ cấp có trọng lượng phân tử thấp được sản

xuất bởi thực vật và thường được miêu tả là không cần thiết cho sự sống còn của thực

vật, không giống như các chất chuyển hóa chính. Các sản phẩm thứ cấp có hoạt tính

sinh học theo nhiều cách, và hơn 10000 biến thể cấu trúc của flavonoids đã được báo

cáo. Sự tổng hợp của chúng phổ biến ở thực vật và phát triển sớm trong quá trình tiến

hóa của thực vật, trợ giúp thực vật bằng cách bảo vệ hoặc tín hiệu. Do tính chất vật lý

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

và sinh hóa của chúng, flavonoids cũng có thể tương tác với nhiều các mục tiêu đa

dạng để tham gia hoạt động trong vi khuẩn, thực vật và động vật. Chúng đóng vai trò

quan trọng trong điều chỉnh mức độ gốc oxi hóa (ROS) trong các mô thực vật, ảnh

hưởng đến sự vận chuyển auxin và cung cấp màu sắc cho các mô khác nhau của thực

vật bao gồm hoa [31].

Con đường sinh tổng hợp flavonoids đã được nghiên cứu khá rõ ràng, so sánh

với các con đường sinh tổng hợp khác của các hợp chất thứ cấp. Flavonoids được tổng

hợp thông qua con đường chuyển hóa phenylpropanoid hoặc acetate-malonate, đã được

nghiên cứu trên mô hình Arabidopsis. Ở thực vật bậc cao, flavonoids được tổng hợp

khi phức hợp enzym được hình thành ở phía ngoài của tế bào nội chất lưới, và sau đó

được cố định ở tonoplast để glycosyl hóa và lưu trữ trong không bào. Trong các mô cụ

thể, flavonoids được tổng hợp và tích lũy ở các ô riêng biệt. Tiểu phần flavonoid đã

được tìm thấy trong nhân, không bào, thành tế bào, màng tế bào và tế bào chất.

Trong khi flavonoid glycosides được lưu trữ trong không bào không thể hiện vai

trò tích cực thì aglycone lại thể hiện chức năng trong tế bào chất, ví dụ điều hòa hoạt

động enzyme, hình thành các phản ứng oxi hóa, vận chuyển auxin. Sự tích lũy flavanol

thường được tìm thấy trong nhân, đặc biệt là trong thực vật hạt trần. Vai trò của chúng

có thể bao gồm sự điều hòa biểu hiện gen thông qua tái tạo chromatin và ảnh hưởng lên

các phức hợp protein và enzyme. Trong các mô rễ, flavonoids có thể tích lũy ở gốc rễ

và trong các tế bào gốc từ nơi chúng có thể được tiết ra hoặc trút vào đất. Flavonoid

cũng được cố định trong các loại tế bào cụ thể của rễ và có thể nghiên cứu bằng hình

ảnh huỳnh quang. Flavonoids được sản xuất ở rễ đóng vai trò trong báo hiệu cho vi

khuẩn và thực vật, cũng như bảo vệ cây khỏi các mầm bệnh từ đất [31].

1.2.2. Giá trị sinh học của flavonoids

1.2.2.1. Hoạt tính chống oxi hóa

Gần đây, các hợp chất flavonoid đã được coi là chất chống oxi hóa mạnh mẽ và

được chứng minh là chất chống oxi hóa mạnh hơn vitamin C, vitamin E và carotenoids.

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

Chất chống oxi hóa là các hợp chất có thể trì hoãn, ức chế hoặc ngăn chặn quá trình oxi

hóa gây ra bởi các gốc tự do và giảm bớt tình trạng stress oxi hóa. Stress oxi hóa là một

trạng thái mất cân bằng do số lượng gốc tự do sản sinh quá nhiều vượt qua khả năng

chống oxi hóa nội sinh, dẫn đến quá trình oxi hóa của một loại đại phân tử sinh học,

như các enzyme, protein, DNA và lipid. Stress oxi hóa là nguyên nhân quan trọng

trong sự phát triển của các bệnh thoái hóa mãn tính bao gồm bệnh mạch vành tim, ung

thư và lão hóa [14].

Khả năng chống oxi hóa của flavonoid có thể được giải thích dựa vào các đặc

điểm cấu trúc phân tử của chúng:

 Trong phân tử flavonoid có chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với

vòng thơm có khả năng nhường hydro giúp chúng có thể tham gia vào

các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do.

 Chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ

liên hợp giúp chúng có thể bắt giữ, làm bền hóa các phần tử oxi hoạt

động và các gốc tự do.

 Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại như

catechol…giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động

Quá trình chống oxi hóa của flavonoid chủ yếu theo 3 cơ chế sau [1]:

 Khử và vô hoạt các gốc tự do nhờ thế oxi hóa khử thấp: các hợp chất

flavonoid nhờ thế oxi hóa khử thấp nên có thể khử các gốc tự do bằng

cách nhường ngyên tử hidro hoặc một electron cho gốc tự do

 Ức chế sự hình thành các gốc tự do bằng cách liên kết với các ion kim

loại vi lượng tham gia vào quá trình sản xuất các gốc tự do

 Ức chế sự hình thành các gốc tự do bằng cách ức chế một số enzyme

tham gia vào quá trình sản xuất các gốc tự do

1.2.2.2. Tác dụng ức chế vi sinh vật, chống viêm nhiễm

Trong các năm gần đây, các bằng chứng dịch tễ học cho thấy rằng hấp thu thức

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

ăn có nguồn gốc từ thực vật giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính. Cộng đồng các

nhà khoa học đã đưa ra nhiều bằng chứng về các tác dụng chống viêm của flavonoids

trong ống nghiệm hoặc trong mô hình tế bào. Cơ chế của phản ứng chống viêm này

liên quan đến sự ức chế tổng hợp và hoạt động của các chất trung gian gây viêm như

eicosanoids, cytokine, các phân tử bám dính và các protein phản ứng C [53].

Dịch chiết flavonoid từ quả mơ cho thấy khả năng ức chế đối với sự phát triển

của Staphylocooccus aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Candida albicans với

đường kính vòng ức chế tương ứng là 23, 21, 26 và 29 mm [8]. Kết quả tương tự đối

với dịch chiết flavonoid của cây diếp cá trên sự phát triển của E.coli, P. aeruginosa,

B.subtilis và S.aureus với giá trị MIC lần lượt là 100, 200, 200 và 50 μg/ml [44].

Quercetin làm giảm đáng kể tình trạng viêm nhiễm và sự peroxyd lipid gây ra bởi

Helicobacter pylori trong niêm mạc dạ dày của chuột bạch [50].

1.2.2.3. Tác dụng đối với enzym

17 loại flavonoids thuộc năm loại cấu trúc cho thấy khả năng ức chế hoạt động

của ACE (enzyme chuyển đổi angiotensin), đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa

huyết áp động mạch. Khả năng ức chế của chúng dao động từ 17 đến 95% ở 500 μM

và từ 0 đến 57% ở 100 μM. Các giá trị IC50 đối với luteolin, quercetin, rutin,

kaempferol, rhoifolin và apigenin K lần lượt là 23, 43, 64, 178, 183 và 196 μM. Nghiên

cứu cho thấy mối liên hệ giữa cấu trúc khung flavonoids và hoạt động của chúng phụ

thuộc vào nhóm catechol trong vòng B, liên kết đôi giữa C2 và C3 tại vòng C và nhóm

cetone trong C4 tại vòng C [66].

Dẫn xuất 6-hydroxy luteolin của luteolin có thể ức chế sự hoạt động của α-

glucosidase đến 92% ở nồng độ 500 μM [6]. Một số flavonoid cũng đã cho thấy hoạt

tính ức chế đối với xanthine oxidase, enzyme xúc tác cho sự oxi hóa xanthine và

hypoxanthine thành axit uric [21].

Kaempferol, quercetin, myricetin và rutin trong flavonol ức chế phản ứng

hyaluronidase đặc biệt, trong khi apigenin, luteolin, baicalin và baicalein trong flavon

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

cho thấy sự ức chế đặc hiệu đối với phản ứng collagenase. Quercetin và luteolin cho

thấy các hoạt động ức chế mạnh nhất trên 15 ‐ lipoxygenase (LOX), và quercetin cho

thấy sự ức chế tương đối mạnh trên phản ứng cyclooxygenase-1 (COX-1). Nghiên cứu

đã chỉ ra các flavonoids này thể hiện hoạt tính chống lại các enzyme viêm rất tốt [28].

1.2.2.4. Tác dụng đối với các bệnh tim mạch, tiểu đường

Tác động bảo vệ của các flavonoid đối với tim mạch có thể do khả năng của

chúng trong việc ngăn ngừa sự oxi hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, phòng ngừa xơ

vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tim, ngăn ngừa bệnh mạch

vành và nhồi máu cơ tim, điều hòa huyết áp. Năm 2012, Arranz S. và cộng sự đã chỉ ra

mối liên hệ giữa việc tiêu thụ polyphenols/flavonoids giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim

[9]. Hấp thu 10 mg flavonol và 500 mg flavonoids một ngày giúp giảm nguy cơ mắc

bệnh tim mạch [58] và bệnh tiểu đường [56] là 5%.

Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng các flavonoid có vai trò như chất kích

thích insulin hay có chức năng tương tự như insulin; ngoài ra chúng còn có sự ảnh

hưởng đến hoạt động của các enzyme trong quá trình chuyển hóa đường [21]. Năm

2015, Ramachandran và cộng sự đã chỉ ra cơ chế của flavonoids trong điều trị tiểu

đường bao gồm tăng tiết insulin, giảm apoptosis và thúc đẩy sự phát triển của tế bào

tụy, giảm sự kháng lại insulin, viêm và stress oxi hóa trong cơ và thúc đẩy các con

đường chuyển hóa khác nhau [43].

1.2.2.5. Tác dụng đối với ung thư

Với nỗ lực nhằm nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hợp chất flavonoid,

gần đây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm tác dụng in vitro và in vivo

của flavonoid lên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Quercetin có tác dụng ức chế sự

phát triển của các tế bào ung thu tuyến tụy, chế độ ăn bổ sung quercetin cũng có tác

dụng làm giảm khả năng phát triển của các khối u [34]. Quercetin có khả năng tương

tác với DNA, bắt giữ tế bào và giảm khối u thông qua hoạt hóa con đường apoptosis

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

[54].

Naringenin và kaempferol-3-O- (2”, 6”-di-O-p-trans-coumaroyl) glucoside thu

nhận từ hoa của cây Melastoma malabathricum L. cũng đã được tìm thấy là có khả

năng ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư vú MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là

0,28 μM và 1,3 μM [35].

Một trong những cơ chế quan trọng nhất mà flavonoids có thể tác động là thông qua

tương tác của chúng với enzym chuyển hóa giai đoạn I (ví dụ cytochrome P450), kích

hoạt một số lượng lớn các chất gây ung thư để kích hoạt lại các chất trung gian tương

tác với nucleophiles tế bào và cuối cùng là gây ung thư. Flavonoids ức chế hoạt động

của một số isozyme P450, chẳng hạn như CYP1A1 và CYP1A2 (đóng vai trò kích hoạt

chất gây ung thư). Một cơ chế hoạt động khác là cảm ứng enzyme chuyển hóa pha II

(ví dụ GST, quinone reductase và UDP-GT), do đó các chất gây ung thư được giải độc

và lại bỏ khỏi cơ thể [32].

1.3. Tổng quan về Hoa hòe (Sophora japonica L.)

1.3.1. Giới thiệu chung

Phân loại khoa học

Giới (regnum): Plantae

(không phân hạng): Angiospermae

(không phân hạng): Eudicots

(không phân hạng): Rosids

Bộ (ordo): Fabales

Họ (familia): Fabaceae

Phân họ (subfamilia): Faboideae

Tông (tribus): Sophoreae

Chi (genus): Styphnolobium

Loài (species): S. japonicum

Danh pháp hai phần

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

Styphnolobium japonicum

Hoa hòe là thực vật thân gỗ, cao 6 – 10 m, sữa lâu năm. Thân thẳng, chỏm lá

tròn, cành cong queo, lá kép long chim lẻ, mọc so le, mỗi lá có 1 – 17 lá chét. Hoa nhỏ,

cụm hoa hình chùy ở đầu cành, tràng hoa hình bướm màu trắng ngà, đài hoa hình

chuông, màu vàng xám. Quả hòe loại đậu, không mở, dày và thắt nhỏ lại ở giữa các

hạt. Nụ hoa hình trứng, có cuống nhỏ, ngắn, một đầu hơi nhọn, dài 3 - 6mm, rộng 1 -

2mm màu vàng xám (Hình 1.4).

Hoa chưa nở dài từ 4 - 10mm, đường kính 2 - 4 mm. Cánh hoa chưa nở màu

vàng, mùi thơm, vị hơi đắng. Hòe trồng cây lấy nụ hoa và quả làm thuốc chữa được

nhiều bệnh, song chủ yếu dược liệu dùng nụ hoa [48].

Cây hòe phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc, trong đó trồng nhiều ở Thái Bình,

tập trung ở các huyện Thái Thụy, Vũ Thư. Cây cũng được trồng ở các tỉnh Tây Nguyên

làm cây bóng mát.

Hình 1.4. Cây hoa hòe

1.3.2. Thành phần hóa học của cây hoa hòe

Chi Sophora giàu alkaloid và flavonoid. Khoảng 153 hợp chất hóa học, bao gồm

flavonoids, isoflavonoids, triterpenes, alkaloid, polysaccharides, amino acid và các hợp

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

chất khác, đã được phân lập từ lá, cành, hoa, chồi, và hoa quả của S. japonica [22].

Trong số các chất chuyển hóa thứ cấp này, flavonoids và isoflavonoids được coi là

thành phần có hoạt tính sinh học chính của các loại thuốc phổ biển hiện nay, thể hiện

hiệu ứng dược lý khác nhau. Các flavonoid chủ yếu được tìm thấy trong hoa và chồi

của S. japonica, trong khi isoflavonoid glycosides có trong quả và hạt.

Cho đến nay, ngoài các hợp chất kể trên, chỉ rất ít các hợp chất hóa học khác

được tìm thấy trong Sophora japonica, khoảng 14 loại axit amin được tìm thấy trong

quả của cây hoa hòe, bao gồm: Lysine, asparagine, arginine, serine, aspartic acid,

glutamic acid, threonine, alanine, proline, tryptophan, valine, phenylalanine, leucine,

and isoleucine [29].

1.3.3. Công dụng của hoa hòe

Theo đông y, hoa hòe có vị đắng, tính bình (còn quả vị đắng tính hàn). Do có

nhiều tác dụng sinh học và dược lý, từ lâu hoa hoè đã được sử dụng làm thuốc. Mọi bộ

phận của cây, đặc biệt là hoa quả khô, hoa và chồi có giá trị rất lớn trong y học. Trong

dân gian, hoa hòe được dùng làm thuốc cầm máu cho các bệnh đổ máu cam, ho ra máu,

ruột chảy máu, tiểu tiện ra máu với liều lượng từ 5-20g mỗi ngày ở dạng thuốc sắc.

Dựa trên bằng chứng về việc sử dụng phổ biến hoa hòe trong dân gian, các nhà

khoa học đã tiến hành các nghiên cứu lâm sàng hiện đại để xác định các hoạt tính sinh

học này. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các flavonoid và isoflavonoid chi phối hoạt tính

sinh học chính của S. japonica, như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống

loãng xương, chống oxi hóa, triệt tiêu, hạ huyết áp, chống nôn, chống ung thư, và tác

dụng cầm máu [22]. Tác dụng của dịch chiết hoặc hợp chất có hoạt tính sinh học được

phân lập từ hoa hòe đã được thí nghiệm trên một số mô hình động vật cũng như nghiên

cứu in vitro.

In vitro, dịch chiết ethanol của hoa hòe thể hiện hoạt tính chống viêm đáng kể

bằng cơ chế ức chế sản xuất NO và TNF-α trong mô hình đại thực bào RAW 264,7 với

giá trị IC50 lần lượt là 0,06 và 0,18 mg/ml [64]. Dịch chiết trong ethyl acetate thể hiện

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

hoạt tính kháng khuẩn E. coli và K. pneumoniae với giá trị ức chế tối thiểu (MIC) lần

lượt là 125 và 120 µg/ml. Đồng thời dịch chiết ethyl acetate còn thể hiện hoạt tính

chống oxi hóa mạnh và khả năng quét gốc tự do mạnh nhất với RC50=3,13 µg/ml [38].

Loãng xương là một căn bệnh do thiếu hormone, đặc biệt là ở phụ nữ mãn kinh.

Nghiên cứu in vivo chỉ ra rằng, dịch chiết nước nóng của hoa hòe với liều dùng 0,556

g/kg/ngày trong 8 tuần đã cải thiện tăng diện tích xương thắt lưng của chột OVX [55].

Wang và cộng sự đã chứng minh rằng sử dụng flavonoids từ hoa hòe theo

đường uống với liều 40, 80 và 120 mg/kg mỗi ngày trong 6 tuần có thể giảm

cholesterol tổng số, triglyceride và lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL-C) và tăng

lipoprotein tỉ trọng cao (HDL-C) trong máu ở những con chuột có hàm lượng mỡ máu

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

cao [59].

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Mẫu thực vật

Nụ hoa hòe khô (Sophora japonica L.) được công ty Tochimoko, Osaka, Nhật

Bản cung cấp.

2.1.2. Mẫu peptide

β-amyloid protein 1-42 được đặt từ công ty Sigma-Aldrich, Mỹ.

2.2. Hóa chất

Các loại hóa chất, dung môi sử dụng cho tách chiết mẫu: n-hexane, ethyl

acetate, ethanol, methanol, axit acetic (WAKO, Nhật Bản).

Thuốc nhuộm peptide Thioflavin T (Sigma-Aldrich Mỹ)

Các chất chuẩn: Quercetin (WAKO, Nhật Bản), Rutin (WAKO, Nhật Bản),

Neohesperidin (WAKO, Nhật Bản), Quercetin chuẩn (Viện kiểm nghiệm thuốc trung

ương, Việt Nam), Rutin (Trung Quốc).

Các muối Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl được cung cấp bởi Merck, Đức.

Các hoá chất còn lại đảm bảo độ tinh khiết cho phân tích.

2.3. Thiết bị thí nghiệm

2.3.1. Thiết bị tách chiết và xác định hợp chất

 Máy cô quay chân không (Eyela, Nhật Bản)

 Máy đo pH (Horiba, Nhật Bản)

 Tủy sấy (Memmert, Đức)

 Máy vortex (Ika, Đức)

 Cân phân tích (Shimadzu, Nhật Bản)

 Cột chạy sắc kýNhật Bản)

 Đèn tử ngoại hai bước sóng 245 nm và 368 nm (Trung Quốc)

 Thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân có độ phân giải siêu cao (JEOL, Nhật Bản)

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

 Thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân bán rắn JNM-ECA50 (JEOL, Nhật Bản)

 Thiết bị đo phổ khối lượng LTQ-Orbitrap XL (ThermoFisher Scientific, Mỹ)

2.3.2. Thiết bị đánh giá khả năng bắt gốc tự do và giảm sự tích tụ peptide β-

amyloid

 Máy đọc tín hiệu huỳnh quang

 Máy đo UV/VIS (Bionate, Anh)

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp tách chiết

Nguyên lý: Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra

khỏi các mô thực vật. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của

các chất hòa tan trong dung môi. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp trong thực vật có độ

phân cực khác nhau, vì vậy dung môi dùng cho các quá trình chiết được lựa chọn với

các đặc điểm là dễ thấm vào dược liệu, hòa tan chọn lọc (hòa tan nhiều hoạt chất, ít tạp

chất), dễ dàng bay hơi khi cần cô đặc dịch chiết và có tính trơ về mặt hóa học. Về

nguyên tắc, để chiết được các chất phân cực (Flavonoids, alkaloids, glycoside…) thì

phải sử dụng các dung môi phân cực. Qua khảo sát một số dung môi có độ phân cực

tăng dần bao gồm n-hexane, ethyl actate, ethanol, methanol, dung môi methanol được

chọn làm dung môi chiết do đáp ứng đầy đủ các yêu cầu nêu trên.

Mục đích: Tách chiết, thu các thành phần chính từ nụ hoa hòe khô bằng phương

pháp ngâm chiết. Với mục đích này, chúng tôi không tiến hành nghiền nhỏ nụ hoa hòe

để tránh việc thu quá nhiều tạp chất trong quá trình chiết.

Quy trình:

 10 g nụ hoa hòe khô được ngâm chiết trong bình tam giác với 100 ml dung môi

methanol, tỉ lệ mẫu/dung môi là 1:10 (đảm bảo khả năng chiết các hợp chất

chính) trong 24 giờ, thỉnh thoảng lắc đều để tăng sự khuếch tán.

 Lọc thu dịch chiết bằng giấy lọc Whatman và phễu lọc, loại bỏ bã, thu được

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

dịch chiết methanol nụ hoa hòe khô.

 Cất quay dung môi methanol có trong dịch chiết với hệ thống cô quay chân

không Eyela – Nhật Bản, nhiệt độ 70oC, tốc độ quay 400 vòng/phút cho đến khi

thu được cao khô. Làm khô cao bằng khí N2 lỏng. Lưu trữ cao khô này trong

bình thủy tinh ở 4oC.

Đánh giá kết quả: Tiến hành cân khối lượng cao khô thu được, so sánh với khối

lượng nụ hoa hòe khô mang đi chiết xuất thu được tỉ lệ cao khô/nguyên liệu.

2.4.2. Phương pháp sắc ký bản mỏng

Nguyên tắc: Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography - TLC) là kỹ thuật

sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc ký bản mỏng bao

gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxit

hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động là hệ dung môi đơn

hoặc đa thành phần được trộn theo tỉ lệ thích hợp. Trong quá trình di chuyển các chất

trong mẫu thử được di chuyển qua lớp mỏng, theo chiều của pha động, tuy nhiên di

chuyển với tốc độ khác nhau. Sau quá trình ta thu được một sắc ký đồ bản mỏng. Cơ

chế của sự chia tách là hấp thụ, phân bố trao đổi ion, sàng lọc phân tử, hay sự phối hợp

của nhiều cơ chế tùy vào tính chất của pha tĩnh và dung môi của pha động.

Mục đích: Dựa vào sự phân tách khác nhau của các chất trên bản TLC, xác định

số lượng các hợp chất có trong dịch chiết. Đồng thời, định hướng xác định nhóm hợp

chất dựa vào màu sắc quan sát được dưới bước sóng 365 nm, cũng như màu sắc các

hợp chất khi sử dụng thuốc thử Vanillin và AlCl3,

Quy trình:

 Sử dụng ống mao quản, chuyển dịch chiết methanol lên bề mặt bản silica gel

kích thước 36 cm. Cố định độ dài đường chạy trên bản silica gel là 4,5 cm.

 Chuẩn bị 5 ml hỗn hợp dung môi khai triển, ổn định trong bình khai triển trước

30 phút để đảm bảo bão hòa dung môi. Hỗn hợp bao gồm ethyl acetate/axit

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

acetic/ethanol với tỉ lệ 4/1/1,

 Đặt bản silica gel vào bình khai triển, đậy nắp, đợi đến khi dung môi chạy hết

độ dài đường chạy thì lấy bản silica gel ra, để khô.

 Quan sát các băng chất trên bản silica gel trong điều kiện thường, dưới bước

sóng dài 365 nm, sau khi phun thuốc thử Vaniline và thuốc thử AlCl3.

Đánh giá kết quả: Xác định hệ số di chuyển - giá trị Rf của từng chất dựa vào tỉ lệ

độ dài đường chạy của chất với độ dài đường chạy của dung môi. Từ giá trị Rf xác định

được, so sánh với giá trị Rf của các chất chuẩn Quercetin và Rutin.

Xác định nhóm chức có thể có trong các hợp chất dựa vào màu sắc khi quan sát

được dưới các điều kiện: ánh sáng thường, bước sóng 365 nm, sau khi phun thuốc thử.

2.4.3. Phương pháp sắc ký cột

Nguyên tắc: Sắc ký cột là phương pháp sắc ký được sử dụng để phân lập một

hợp chất hóa học đơn lẻ từ hỗn hợp dựa trên sự hấp phụ khác nhau. Các hợp chất di

chuyển qua cột với tốc độ khác nhau, cho phép chúng được tách thành các phân đoạn.

Tương tự sắc ký bản mỏng, sắc ký cột bao gồm pha động và và pha tĩnh. Pha tĩnh là

các loại chất hấp phụ khác nhau (thường là silica gel SiO2 hoặc alumina Al2O3) được

nhồi vào cột thủy tinh thẳng đứng, pha động – dạng lỏng, được rót vào từ trên đỉnh cột

và chảy xuống dưới cột nhờ tác dụng của trọng lực hoặc của áp suất bên ngoài, là hệ

các dung môi dùng để rửa giải (hình 2.1). Kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi vì tính

đa dạng của chất hấp phụ (pha thường, pha đảo) và các loại dung môi. Ưu điểm chính

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

của sắt ký cột là chi phí tương đối thấp và dễ thao tác.

Hình 2.1. Sơ đồ minh họa cột sắc ký

Mục đích: Tách hỗn hợp cao chiết methanol thành các phân đoạn khác nhau

trong các hệ dung môi, tiến hành tinh sạch để thu được các hợp chất.

Quy trình:

 Chuẩn bị hệ dung môi để chạy cột, thể tích mỗi hệ là 200 ml, bao gồm:

 Hệ dung môi 1: n- hexane/ethyl acetate với tỉ lệ 5/5

 Hệ dung môi 2: n-hexane/ethyl acetate với tỉ lệ 2/8

 Hệ dung môi 3: ethyl acetate 100%

 Hệ dung môi 4: ethyl acetate/ethanol với tỉ lệ 5/5

 Hệ dung môi 5: ethanol 100%

 Hệ dung môi 6: ethanol/nước với tỉ lệ 8/2

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

 Cân 30g silica gel, hòa cùng hệ dung môi 1, để ổn định trong 30 phút.

 Tiến hành nhồi cột ướt, rót hỗn hợp silica gel và dung môi vào cột. Mở van tháo

dung môi với tốc độ chảy nhỏ để dung môi thoát ra khỏi cột, tránh bị tràn. Kích

thước cột sử dụng: chiều dài 60 cm, đường kính trong 3 cm.

 Vừa nhồi vừa gõ nhẹ cột để bọt khí thoát ra ngoài và silica lắng xuống.

 Tiếp tục đổ hỗn hợp vào cột cho đến khi tất cả lượng silica gel đã hết.

 Rửa thành cột bằng dung môi và mở van tháo dung môi đến khi mức dung môi

cách bề mặt silica 2cm thì dừng lại.

 Thêm 1 lớp cát mỏng để ổn định bề mặt silica gel.

 Thêm 0,6g cao khô và bắt đầu chạy cột với hệ dung môi 1, tốc độ 45 giọt/phút.

 Khi hệ dung môi 1 gần hết (còn cách mặt phẳng cát khoảng 3 cm) thì tiếp tục

thêm hệ dung môi 2, Lặp lại bước này cho đến khi hết các hệ dung môi.

Đánh giá kết quả: Dựa vào màu sắc và thể tích dung môi để thu các phân đoạn

khác nhau, sử dụng sắc ký bản mỏng để xác định số lượng các chất trong phân đoạn,

đồng thời so sánh với giá trị Rf của chất chuẩn Quercetin và Rutin. Từ kết quả này, xác

định các phân đoạn chỉ chứa một hợp chất duy nhất để tiến hành tinh sạch.

2.4.4. Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Nguyên tắc: Chiết lỏng-lỏng, còn được gọi là tách pha, là một quá trình tách bao

gồm việc chuyển chất tan từ một dung môi này sang dung môi khác, hai dung môi

không hòa tan hoặc hòa tan một phần với nhau. Thông thường, một trong các dung môi

là dung môi phân cực và dung môi còn lại là dung môi không phân cực.

Trong các quá trình chiết tách, chiết lỏng-lỏng bao gồm bước pha trộn (tiếp

xúc), bước tách pha trong một dụng cụ chiết như phễu chiết, bình chiết. Trong bước

pha trộn, cần lắc mạnh và đều để tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển giao chất

chiết từ dung môi này sang dung môi khác. Chiết lỏng lỏng là một phương pháp hiệu

quả để tách hoặc loại bỏ các hợp chất không mong muốn ra khỏi hỗn hợp trong các

phân cứu và phân tích hóa học. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi vì sự đơn giản

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

và tiện lợi của nó [10].

Mục đích: Dựa vào khả năng tan khác nhau của các chất trong các dung và sự

phân lớp của các dung môi, thu các phân đoạn chất và chất kết tủa khi tiến hành chiết

lỏng lỏng.

Quy trình:

 10 g nụ hoa hòe khô được ngâm chiết trong 100 ml methanol trong 24 giờ. Thu

được 100 ml dịch chiết methanol.

 Chuyển 100 ml dịch chiết methanol sang phễu chiết quả lê, thêm 100 ml n-

hexane, lắc đều, sau khi dung dịch trong phễu phân lớp, tiến hành tách phần

dịch phía dưới và phía trên của phễu.

 Với phần dịch phía dưới, cô quay với hệ thống cô quay chân không Eyela –

Nhật Bản ở 70oC, tốc độ 450 vòng/phút đến khi thu được 10 ml dịch chiết đặc.

 Thêm 100 ml Ethyl acetate vào bình chứa 10 ml dịch chiết đặc, thấy xuất hiện

kết tủa.

 Dùng giấy lọc thu lấy kết tủa, rửa tủa nhiều lần bằng ethyl acetate, sử dụng hệ

thống khí N2 lỏng để làm khô tủa.

Đánh giá kết quả: Hòa tan 1 lượng nhỏ kết tủa thu được bằng methanol, kiểm

tra bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với chất chuẩn Quercetin và Rutin.

2.4.5. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân

Nguyên tắc: Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance – NMR) là

một phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ, có ý

nghĩa quan trọng để xác định cấu tạo các phân tử phức tạp như các hợp chất thiên

nhiên. Phương pháp NMR nghiên cứu cấu trúc phân tử bằng sự tương tác bức xạ điện

từ tuần số radio với tập hợp hạt nhân được đặt trong từ trường mạnh. Các hạt nhân này

là một phần của nguyên tử và các nguyên tử lại được tập hợp thành phân tử. Do vậy

phổ NMR có thể cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử mà khó có thể nhận

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

biết bằng bất kỳ phương pháp nào khác. Có nhiều hạt nhân có thể nghiên cứu bằng kỹ

thuật NMR, xong hydro và carbon là chung nhất. Phương pháp phổ biến được sử dụng

là phương pháp phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR [25].

Mục đích: Xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất tinh sạch được từ cao

chiết nụ hoa hòe khô.

Quy trình:

 Hòa tan 10 mg hợp chất cần xác định cấu trúc vào 1 ml DMSO trong ống NMR.

Đảm bảo toàn bộ hợp chất tan hết trong DMSO và mực chất lỏng chiếm 1/3 ống

NMR.

 Đo phổ bằng hệ thống máy cộng hưởng từ hạt nhân độ phân giải cao Lamda 500

(JEOL, Nhật Bản) và thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân bán rắn JNM-ECA500

(JEOL, Nhật Bản) tại Khoa Toán học và Khoa học sự sống, ĐH Khoa học tự

nhiên, ĐH Hiroshima, Nhật Bản.

 Thông số thiết bị được cài đặt khi đo phổ 1H-NMR như sau:

Cường độ từ trường: 11,72T

Tần số cộng hưởng: 1H/499MHz

Quang phổ kế: Lambda

Hệ điều hành: WinLambda_V2

Dung môi: dimethyl sulfoxide-d6 99,9%D với 0,03% TMS (Công ty

KANTO, Nhật Bản)

Ống mẫu: 5 mm

Đếm tích lũy: 1H  16 lần

 Thông số thiết bị được cài đặt khi đo phổ 13C-NMR như sau:

Quang phổ kế: ECA

Hệ điều hành: DELTA5,04

Đầu ra gradient từ trường: 0,9T/m

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

Tần số cộng hưởng: 13C/125,7MHz

Dung môi: dimethyl sulfoxide-d6 99,9%D, với 0,03% TMS (Công ty

KANTO, Nhật Bản)

Ống mẫu: 5mm

Số lượng tích lũy: 13C  2000 lần

Đánh giá kết quả: Dựa vào phổ thu được, so sánh với phổ của chất chuẩn, so

sánh với ngân hàng phổ chuẩn có sẵn, xác định cấu trúc phân tử của hợp chất.

2.4.6. Phương pháp khối phổ

Nguyên tắc: Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry – MS) là một kỹ thuật

phân tích hóa học giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa học có trong một mẫu

bằng cách đo tỉ lệ khối lượng trên điện tích và số lượng của các ion pha khí. Đây là kỹ

thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử điện khi chúng di chuyển trong

điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các phân tử tích điện khác nhau và được phân

tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. Dữ liệu khối phổ được tự động ghi lại. Khối

phổ hiện là một trong những công cụ linh hoạt và nhạy nhất áp dụng cho đặc tính cấu

trúc của các chất chuyển hóa thứ cấp được phân lập từ thực vật bao gồm các flavonoids

[41].

ESI (ElectroSpray Ionization) là thuật ngữ chỉ phương pháp ion hóa mẫu bằng

phương pháp phun chum ion trong dung dịch tạo thành đám sương mù với các giọt nhỏ

dễ bay hơi. Cơ chế hoạt động của nguồn ESI khá đơn giản. Dưới áp lực dòng liên tục,

đường kính cột bé và hiệu điện thế cao (2500 V), mẫu sẽ được phun tơi thành các giọt

nhỏ đa điện tích ra khỏi đầu kim phun. Kim phun sẽ tạo thành các giọt nhỏ, như đám

sương mù (đám mây khí ion), dễ bay hơi, các giọt này chứa mẫu và các thành phần

dung môi khác. Quá trình bay hơi được thực hiện bởi nhiệt độ hoặc màng chắn khí nitơ

(curtain gas) làm cho mẫu dễ bay hơi. Kết quả là chỉ còn mẫu tích điện và bay vào bộ

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

phận phân tích khối của máy khối phổ (hình 2.2).

Hình 2.2. Sơ đồ minh họa hoạt động của hệ ESI-MS/MS

Mục đích: Xác định phổ khối lượng và đặc trưng cấu trúc của hợp chất cần quan

tâm, kết hợp với kết quả phổ NMR để xác định được tên, cấu tạo của hợp chất.

Quy trình:

 Cân 5 mg mẫu phân tích, hòa tan trong methanol (dùng cho phân tích HPLC),

thu được dung dịch với nồng độ 10 µg/ml.

 Đo phổ khối lượng với nguồn ion hóa mẫu bằng phương pháp phun chùm ion

(ESI-MS) được thực hiện trên thiết bị LTQ-Orbitrap XL (ThermoFisher

Scientific) tại Khoa Toán học và Khoa học sự sống, ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH

Hiroshima. Phổ khối ESI được đặt trong giá trị m/z 150-2000, điện áp mao dẫn

và điện áp hình nón ESI lần lượt được đặt ở mức 4,5 kV và 50V, với nguồn hoạt

động ở chế độ ion dương. Phổ khối được ngoại chuẩn bằng dung dịch natri

trifluoro acetate (JEOL) và được xử lý bằng phần mềm Xcalibur.

Đánh giá kết quả: Kết hợp kết quả phân tích phổ MS với phổ NMR, xác định

thành phần hóa học, công thức cấu tạo, tên của hợp chất.

2.4.7. Phương pháp chuẩn bị mẫu β-amyloid và các dung dịch chất chuẩn,

chất tinh sạch

Nguyên tắc: Bệnh Alzheimer là nguyên nhân hàng đầu gây mất trí nhớ ở người

già. Bệnh lý được đặc trưng bởi sự hiện diện của mảng β-amyloid và mất nơron thần

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

kinh trong mô não của những người bị ảnh hưởng. Vì vậy các thí nghiệm sinh lý và

độc tính đều sử dụng mô hình mô tả sự hình thành sợi và dạng oligomer của β-amyloid,

thường bao gồm việc chuẩn bị mẫu ở dạng monomer. Thực tế, trong lịch sử nghiên cứu

β-amyloid, NaOH đóng một vai trò nổi bật trong việc hòa tan các mảng β-amyloid. Về

mặt lý thuyết, môi trường pH kiềm chênh lệch nhiều so với pI của β-amyloid, nghĩa là

lực đẩy tích điện sẽ can thiệp vào các tương tác bên trong và giữa các phân tử dẫn đến

việc gấp và lắp ráp monomer và đạt sự cân bằng dưới dạng monomer.

Mục đích: Chuẩn bị dung dịch β-amyloid dưới dạng monomer trong dung môi

thông thường, dễ bảo quản, dễ thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Chuẩn bị các dung

dịch chất chuẩn, chất tinh sạch với nồng độ thích hợp.

Quy trình:

Dung dịch peptide β-amyloid 1-42: được chuẩn bị bằng cách hòa 1 mg bột

peptide với 2,2 ml dung dịch NaOH 0,01 M, thu được dung dịch peptide có nồng độ

0,1 mM trong NaOH. Bảo quản ở điều kiện -20oC khi chưa sử dụng đến. Hòa với đệm

PBS để đạt nồng độ mong muốn khi tiến hành thí nghiệm.

Dung dịch chất chuẩn: Cân lần lượt 3,02 mg và 6,10 mg quercetin và rutin

chuẩn vào hai ống Eppendorf riêng rẽ. Hòa tan chất chuẩn bằng dung môi DMSO, đạt

chất chuẩn nồng độ 1 mM. Tiếp tục pha loãng dung dịch chất chuẩn ra 10 lần và 100

lần bằng nước, thu được các nồng độ 100 µM và 10 µM.

Dung dịch chất tinh sạch: Cân lần lượt 3,02 mg chất C2 và 6,10 mg chất C6 vào

hai ống Eppendorf riêng rẽ. Hòa tan chất chuẩn bằng dung môi DMSO, đạt chất chuẩn

nồng độ 1 mM. Tiếp tục pha loãng dung dịch chất chuẩn ra 10 lần và 100 lần bằng

nước, thu được các nồng độ 100 µM và 10 µM.

2.4.8. Phương pháp bắt gốc tự do DPPH

Nguyên tắc: Đây là một phương pháp nhanh chóng, đơn giản và rẻ tiền để đo

lường khả năng chống oxi hóa của các hợp chất liên quan đến việc sử dụng gốc tự do 2,

2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) – được sử dụng rộng rãi để kiểm tra khả năng của

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

các hợp chất hoạt động như các gốc tự do hoặc chất cho hydro để đánh giá hoạt động

chống oxi hóa. Phương pháp bắt gốc tự do DPPH dựa trên nguyên lý khử DPPH, một

gốc tự do ổn định. Gốc tự do DPPH với một electron đơn lẻ cho phép hấp thụ cực đại ở

517 nm (màu tím). Khi chất chống oxi hóa phản ứng với DPPH, một gốc tự do ổn định

sẽ được ghép nối với sự hiện diện của một chất cho hydro và khử thành DPPH-H và

kết quả là độ hấp thụ giảm. Khi chuyển sang dạng DPPH-H, màu tím chuyển thành

màu vàng (sau khi bị khử) tương ứng với số lượng electron bị bắt. Màu càng vàng càng

thể hiện hoạt tính bắt gốc tự do tốt [39].

Mục đích: Kiểm tra hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của các hợp chất tách chiết từ

nụ hoa hòe khô.

Quy trình:

 Chuẩn bị hóa chất DPPH: Cân 4,3 mg DPPH, hòa tan với 3,3 ml Methanol trong

ống nghiệm đã bọc kín bằng giấy bạc.

 Chuẩn bị các dung dịch xây dựng đường chuẩn Vitamin C: Hòa tan 1mg

Vitamin C trong 1ml Methanol, thu được dung dịch Vitamin C nồng độ 1000

µg/ml. Sau đó pha loãng thành dải nồng độ 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700

µg/ml đựng trong các ống Eppendorf được bọc giấy bạc.

 Chuẩn bị các dung dịch chất chuẩn quercetin, rutin và các chất tách chiết được

từ dịch chiết nụ hoa hòe khô trong dải nồng độ từ 100 µg/ml đến 10000 µg/ml.

 Đo mẫu chuẩn (control): 600 µl Methanol + 30 µl DPPH vào ống eppendorf,

mang đi đo tại bước sóng 517 nm.

 Dựng đường chuẩn vitamin C: 10 µl dung dịch vitamin C + 590 µl methanol +

30 µl DPPH, mang đo tại bước sóng 517 nm.

 Đo mẫu thử nghiệm: 20 µl mẫu thử nghiệm + 580 µl methanol + 30 µl DPPH,

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

mang đo tại bước sóng 517 nm.

Đánh giá kết quả:

Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH được tính toán bằng cách sử dụng công thức sau:

% Hoạt động = [(Acontrol – Amẫu thử nghiệm)/Acontrol] × 100

Trong đó: Acontrol là giá trị đo độ hấp thụ của mẫu chuẩn

Amẫu thử nghiệm là giá trị đo độ hấp thụ của mẫu thử nghiệm

2.4.9. Phương pháp thực nghiệm huỳnh quang Thioflavin T

Nguyên tắc: Thioflavin T (ThT) là một muối benzothiazole thu được bằng cách

methyl hóa ofehehrothiotoluidine với metanol khi có mặt của axit clohydric. ThT được

sử dụng làm thuốc nhuộm để quan sát và định lượng sự hiện diện hoặc sự hình thành

sợi của các protein tổng hợp, hoặc amyloid, cả in vitro và in vivo (ví dụ, mảng beta

amyloid tìm thấy trong não của bệnh nhân bệnh Alzheimer; trong não của bệnh nhân

CGD). Xét nghiệm Thioflavin T (ThT) đo lường những thay đổi về cường độ ThT khi

gắn với các sợi amyloid. Cơ chế tăng cường huỳnh quang khi liên kết với amylid là do

sự cố định quay của liên kết C-C liên kết với vòng benzothiazole và aniline. ThT liên

kết với các chuỗi dọc theo trục dài của bề mặt sợi amyloid. Sự tăng cường phát huỳnh

quang có thể được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang hoặc bằng quang phổ

huỳnh quang [13].

Mục đích: Đánh giá khả năng tạo sợi của peptide β-amyloid trong điều kiện

thường và điều kiện với sự có mặt của các chất chuẩn Quercetin, Rutin và các hợp chất

tinh sạch từ nụ hoa hòe khô

Quy trình:

 Chuẩn bị dung dịch stock ThT bằng cách thêm 8 mg ThT vào 10 ml phosphate

buffer (10 mM phosphate, 150 mM NaCl, pH 7,0). Bảo quản dung dịch stock

tránh ánh sáng, dung dịch này có thể ổn định trong 1 tuần.

 Pha loãng dung dịch stock vào phosphate buffer (1ml dung dịch stock ThT với

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

49 ml dung dịch buffer) để tạo dung dịch làm việc (chỉ sử dụng trong ngày).

 Đo mật độ huỳnh quang của dung dịch làm việc ở bước sóng kích thích 390 nm,

bước sóng phát quang 535 nm

Đánh giá kết quả:

S1−So

Sử dụng công thức đánh giá khả năng ngăn chặn sự tích tụ β-amyloid như sau:

Sự ngăn chặn (%) = 100 – 100× T1−To

Trong đó:

S1: giá trị huỳnh quang của mẫu khi có mặt ThT

So: giá trị huỳnh quang của mẫu khi không có mặt ThT

T1: giá trị huỳnh quang của đối chứng âm khi có mặt ThT

To: giá trị huỳnh quang của đối chứng âm khi không có mặt ThT

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

Các kết quả được xử lý bằng phần mềm Excel, Microsoft.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập và tinh sạch các hợp chất chính có trong dịch chiết

3.1.1. Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký bản mỏng

Chúng tôi tiến hành khảo sát hệ dung môi phù hợp cho việc phân tích bằng sắc

ký bản mỏng, kết quả để định hướng cho việc xác định, tách chiết và phân tích các hợp

chất. Tham khảo các hệ dung môi khác nhau sử dụng cho dịch chiết thực vật, các hệ

dung môi sau đã được khảo sát:

1. N-hexane : ethyl acetate (thay đổi tỉ lệ để đạt độ phân cực tăng dần)

2. Ethyl acetate : n-butanol : nước = 5:3:1

3. Ethyl acetate : n-butanol : axit băng = 5:3:1

4. Chloroform : ethyl acetate : methanol: acetic acid 25 mM = 1:1:1:1

5. Ethyl acetate : ethanol : acetic acid 25 mM = 4:1:1

Các hệ dung môi số 1,2,3 và 4 cho kết quả là những vệt chất kéo dài, không rõ

ràng. Vì vậy chúng tôi quyết định sử dụng hệ dung môi số 5 làm dung môi khai triển

trong sắc ký bản mỏng.

Hình 3.1. Kết quả sắc ký bản mỏng dịch chiết nụ hoa hòe (Bên trái: điều kiện thường, bên phải: dưới bước sóng 365 nm)

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

Khi quan sát bản silica gel dưới điều kiện thường, ta có thể thấy có ít nhất 3

băng chất màu vàng hiện diện trong dịch chiết với các giá trị Rf lần lượt là 0,89, 0,73

và 0,47. Đặt bản silica gel dưới điều kiện ánh sang tia UV, bước sóng dài 365 nm, quan

sát được ít nhất 6 chất với các giá trị Rf lần lượt là 0,89, 0,81, 0,73, 0,47, 0,42 và 0,38.

Các băng chất có màu vàng nâu với độ đậm nhạt khác nhau (hình 3.1).

Khi dùng thuốc thử Vanillin, thu được kết quả các băng chất chuyển sang màu

nâu đậm, chứng tỏ các chất này có chứa các nhóm OH liền kề nhau. Còn khi dùng

thuốc thử AlCl3, các băng chất chuyển sang màu vàng tươi, chứng tỏ các chất này có

bộ khung flavonoids. Vì vậy chúng tôi định hướng thành phần chính thu được từ dịch

chiết nụ hoa hòe là nhóm chất flavonoids.

3.1.2. Tinh sạch các chất bằng phương pháp sắc ký cột

Với mục đích phân tách và tinh sạch các phân đoạn chất khác nhau từ hỗn hợp

dịch chiết nụ hoa hòe khô, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký cột. Các phân đoạn

được phân biệt với nhau dựa vào thể tích dung môi của mỗi hệ dung môi cũng như thứ

tự màu sắc của các chất xuất hiện trên cột, sau khi cô quay, các phân đoạn màu khác

nhau được thu lại (bảng 3.1).

Bảng 3.1. Kết quả phân tách dịch chiết nụ hoa hòe bằng phương pháp sắc ký cột

STT Hệ dung môi

Tên phân đoạn

Màu sắc

1 C1

Xanh vàng

2 C2

Vàng

3 C3

Xanh

4 C4

Cam

5 C5

Vàng cam

6 C6

Vàng nhạt

Như vậy, có 6 phân đoạn khác nhau thu được từ cao chiết nụ hoa hòe khô với

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

các màu sắc được mô tả trong bảng trên (hình 3.2)

Hình 3.2. Các phân đoạn khác nhau sau khi chạy sắc ký cột

Sau khi thu được các phân đoạn chất khác nhau, để xác định số lượng các chất

có trong các phân đoạn này, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng với hệ

dung môi khai triển ethyl acetate/ethanol/acetic acid 25 mM = 4/1/1, thu được kết quả

trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả sắc ký bản mỏng các phân đoạn thu được sau khi chạy sắc ký cột

STT

Tên phân đoạn

Số lượng (chất)

Giá trị Rf

1 C1

1 0,95

2 C2

1 0,89

3 C3

1 0,73

4 C4

1 0,68

5 C5

2 0,60 và 0,50

6 C6

1 0,50

Sau khi cô quay thu hồi dung môi từng phân đoạn chất thu được, vì nồng độ

thấp nên các phân đoạn 1,3,4 và 5 không tạo được thành dạng bột. Chỉ có phân đoạn 2

và 6 (tương ứng với chất C2 và C6) lần lượt tạo thành bột có màu vàng xanh và vàng

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

tươi.

Khi so sánh giá trị Rf của các chất thu được với hai chất chuẩn quercetin và

rutin, chúng tôi thu được chất C2 và chất C6 có giá trị Rf lần lượt bằng với giá trị Rf

của querctin chuẩn và rutin chuẩn (hình 3.3).

Hình 3.3. Kết quả sắc ký bản mỏng các chất C2 và C6 khi so sánh với quercetin và rutin chuẩn

3.1.3. Tinh sạch chất bằng phương pháp sắc ký lỏng-lỏng

Dựa vào sự phân bố của các chất trong các dung môi là khác nhau và khả năng

tạo tủa được quan sát trong quá trình làm thí nghiệm. Chúng tôi sử dụng phương pháp

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

chiết lỏng-lỏng để thu được một chất kết tủa có màu vàng tươi (hình 3.4).

Hình 3.4. Chất C6

Sau khi so sánh với giá trị Rf của quercetin và rutin chuẩn, nhận thấy chất kết

tủa thu được có giá trị Rf bằng với giá trị Rf của Rutin chuẩn. Kết hợp với phương pháp

sắc ký cột cổ điển, chúng tôi thu được bảng tổng kết về lượng các chất thu được từ dịch

chiết nụ hoa hoè (bảng 3.3).

Bảng 3.3. Tổng kết các chất tinh sạch và cao khô thu được từ dịch chiết nụ hoa hòe

Mẫu hoa hòe

Cao khô (mg)

C2 (mg)

C6 (mg)

(mg)

20000

3006

45

287 20000

2195

40

277 20000

2267

35

215 Trung bình

2489

40

260

Trung bình khối lượng cao khô sau khi cô quay thu hồi dung môi chiếm khoảng

12,45% khối lượng mẫu ban đầu. Sau khi phân tách cao khô bằng phương pháp sắc ký

cột cổ điển và sắc ký lỏng-lỏng, thu được hai chất C2 và C6 lần lượt chiếm khoảng

0,2% và 1,3% khối lượng mẫu ban đầu. Hai chất C2 và C6 là hai hợp chất chính thu

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

được từ mẫu hoa hòe khô, để xác định thành phần hóa học và cấu trúc của hai chất này,

chúng tôi sử dụng phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phương pháp đo

phổ khối lượng.

3.2. Xác định các hợp chất có trong phân đoạn chính

3.2.1. Xác định cấu trúc chất C2

Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp hiện đại và thường được sử

dụng để xác định cấu trúc phức tạp của các hợp chất thiên nhiên. Qua đánh giá kết quả

sắc ký bản mỏng bao gồm: giá trị Rf chất C2 bằng giá trị Rf của quercetin chuẩn, thuốc

nhuộm vanillin và thuốc thử AlCl3 chỉ thị sự có mặt của nhóm chức flavonoids, chúng

tôi định hướng chất C2 là một chất có tính chất tương tự quercetin. Vì vậy, chúng tôi

tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR của quercetin chuẩn và chất

C2, kết quả được thể hiện trong hình 3.5 và hình 3.6.

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của quercetin chuẩn

Phổ này cho thấy ba loại tín hiệu proton: proton nhân thơm, tín hiệu proton

hydroxyl của chất phân tích và tín hiệu proton của dung môi. Cấu trúc khung của

flavonol là một flavon được thay thế ở vị 3 trên benzopyrone với một nhóm hydroxyl,

làm cho nó trở thành một 3-hydroxyflavone. Hai proton thơm tại vị trí màu xanh da

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

trời và đỏ, xuất hiện dưới dạng cấu trúc kép lần lượt ở mức 6,8 và 6,6 ppm, sự nhân đôi

phát sinh từ khớp nối xa trên hệ thống nhân thơm. Các proton tại vị trí màu hồng (5,53

ppm) và xanh lá cây (5,30 ppm) xuất hiện dưới dạng một cặp đôi và là các tín hiệu

riêng vì có sự tách tín hiệu ở các khớp nối. Trong khi proton tại vị trí màu đen, cặp đôi

với proton lân cận ở vị trí màu xanh da trời xuất hiện dưới dạng một tín hiệu đôi tại

trung tâm ở 6,01 ppm. Các proton hydroxyl xuất hiện riêng rẽ với tín hiệu ở bến trái

của phổ tại các giá trị 9,92, 8,72, 8,48 và 8,43,

Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của C2

Phổ 1H-NMR của chất C2 cũng cho thấy sự xuất hiện của proton hydroxyl,

proton nhân thơm và proton từ dung môi. Các giá trị phổ của chất C2 và chất chuẩn

quercetin được so sánh trong bảng kết quả 3.4:

Bảng 3.4. Bảng so sánh giá trị peak của quercetin chuẩn với chất C2

1H NMR

STT

Quercetin_St

C2

ppm

1 11,613

12,441

2 9,928

9,911

3 8,729

4 8,482

5 N/A

7,672

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

6 N/A

7,54

7 N/A

7,536

8 N/A

6,933

9 6,800~6,794

6,899

10 6,676

6,881

11 6,673~6,652

6,863

12 N/A

6,452

13 N/A

6,394

14 N/A

6,39

15 6,019~6,018

6,173

16 6,003~6,000

5,971

17 5,536~5,531

5,529

18 5,316~5,309

5,279

19 N/A

3,828

20 N/A

3,484

21 N/A

2,729

22 2,497

2,49

23 N/A

2,141

24 N/A

1,975

25 1,626

1,62

26 N/A

1,452

27 N/A

1,177

28 N/A

0,889

29 N/A

0,817

Chú thích: N/A là không tồn tại

Từ bảng so sánh 3.4 có thể thấy, các tín hiệu proton thu nhận được của chất C2

tương đồng với các tín hiệu đo được của quercetin chuẩn. Các tín hiệu chính thể hiện

sự có mặt của các proton nhân thơm bao gồm tín hiệu 6,800~6,793 ppm đến 5,316-

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

5,309 đều quan sát được trong phổ đồ của chất C2. Ngoài ra, trong phổ đồ của chất C2

còn xuất hiện một số tín hiệu nhiễu. Vì quá trình tinh sạch chất trải qua nhiều bước, sử

dụng nhiều hệ dung môi khác nhau, nên các tín hiệu nhiễu trong phổ đồ có thể được

giải thích là do các dung môi chưa được loại bỏ hoàn toàn khỏi chất tinh sạch.

Kết hợp các dữ liệu thu được bao gồm: giá trị Rf tương đồng với quercetin

chuẩn, giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H tương đồng với chất quercetin.

Chúng tôi dự kiến chất C2 là quercetin với công thức cấu tạo như sau:

Hình 3.7. Công thức cấu tạo của chất C2 – quercetin

Quercetin là một flavonoids phổ biến trong tự nhiên, thuộc nhóm polyphenols,

có nhiều trong các loại rau, củ, quả. Đã có nhiều nghiên cứu về cấu trúc, đặc tính, công

dụng và chức năng của quercetin. Thêm vào đó, Dasha cùng cộng sự đã xác định

quercetin là một thành phần được tìm thấy trong cây Sophora japonica, đồng thời các

nghiên cứu khác cũng chỉ ra sự xuất hiện của quercetin trong các họ thực vật khác nhau

[15, 26]. Điều này củng cố thêm rằng chất C2 là quercetin và kết quả chúng tôi thu

được là tương đồng với những nghiên cứu trước đây.

3.2.2. Xác định cấu trúc chất C6

Dựa trên các kết quả đã thu được bao gồm: giá trị Rf bằng với rutin chuẩn và sự

tồn tại của khung flavonoids thông qua sự chỉ thị của thuốc thử vanillin và AlCl3, chúng

tôi định hướng chất C6 có tính chất tương tự như rutin. Rutin là một flavonoids bao

gồm 2 thành phần gốc quercetin flavonol và đường đôi rutinose. Đây là một hợp chất

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

tự nhiên với cấu trúc tương đối phức tạp. Vì vậy, với mục tiêu xác định thành phần hóa

học và khối lượng của chất C6, chúng tôi kết hợp sử dụng 2 phương pháp đo phổ khối

lượng và đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

3.2.2.1. Xác định phổ khối lượng chất C6

Phổ khối lượng với nguồn ion hóa mẫu bằng phương pháp phun chùm ion (ESI-

MS) được thực hiện trên thiết bị LTQ-Orbitrap XL. Kết quả phổ được thể hiện trong

hình 3.8.

Hình 3.8. Phổ khối lượng ESI của chất C6

Chú thích: Các số ở trên mỗi đỉnh thể hiện giá trị m/z. Giá trị Z chỉ trạng thái tích điện của

các tín hiệu

Trong phổi khối lượng này, giá trị m/z 610 đã được phát hiện. Ngoài ra, các

đỉnh với giá trị m/z lớn hơn 610 cũng được phát hiện. Những đỉnh này được xác định là

chất có giá trị m/z 610 được thêm một chất khác. Ví dụ, giá trị m/z 633 (lớn hơn m/z

610) là kết quả của sự hợp nhất giữa ion natri với hợp chất có giá trị m/z 610 vì khối

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

lượng ion natri là 23, Các đỉnh khác dịch chuyển 74 Da so với các đỉnh có giá trị m/z

thấp hơn, như m/z 684 được dịch chuyển 74 Da từ m/z 610. 74 Da ở đây là KCl hoặc

polysiloxanes. Từ những kết quả này, có thể khẳng định khối lượng của chất C6 là 610.

Sau đó, sử dụng phần mềm Xcalibur để đưa ra kết quả dự kiến thành phần

nguyên tố mẫu chất C6, chúng tôi thu được bảng 3.5.

Bảng 3.5. Thành phần nguyên tố của hợp chất C6

Số

Thành phần

Cân

thứ

khối lượng lý

Delta

bằng

Thành phần

Hợp chất

m/z

tự

thuyết

(mmu)

RDB

1 610,19

-0,62

13,5

C22 H28 O12 N9

Không tồn tại

2 610,19

-1,97

13,0

C24 H30 O13 N6

Không tồn tại

3 610,18

2,06

9,0

C19 H30 O15 N8

Không tồn tại

4 610,19

-3,30

18,0

C25 H26 O9 N10

Không tồn tại

5 610,19

-3,31

12,5

C26 H32 O14 N3

Không tồn tại

610,18

6 610,19

-4,65

17,5

C27 H28 O10 N7

Không tồn tại

Hesperidin,

7 610,19

-4,65

12,0

C28 H34 O15

Neohesperidin

8 610,18

5,24

17,0

C30 H30 O12 N2

Không tồn tại

9 610,18

5,25

22,5

C29 H24 O7 N9

Không tồn tại

-5,99

17,0

C29 H30 O11 N4

Không tồn tại

10 610,19

Như thể hiện trong bảng trên, 10 hợp chất với các thành phần nguyên tố tương

tự chất C6 có thể trở thành ứng cử viên cho chất C6. Dựa vào ngân hàng dữ liệu có sẵn

về các hợp chất, chỉ có hợp chất C28H34O15 được tìm thấy tương ứng với hợp chất hiện

có, với tên hesperidin và neohesperidin. Như vậy, từ kết quả ESI-MS, chúng tôi định

hướng mẫu chất C6 là hesperidin hoặc neohesperidin.

3.2.2.2. Xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân chất C6

Từ kết quả đo phổ khối lượng, định hướng chất C6 là hesperidin hoặc

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

neohesperidin, chúng tôi tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon

của hợp chất neohesperidin chuẩn và chất C6, kết quả phổ được thể hiện trong các hình

3.9, 3.10, 3.11 và 3.12.

Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của Neohesperidin chuẩn

Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của chất C6

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

Hình 3.11. Phổ 13C-NMR của Neohesperidin chuẩn

Hình 3. 12. Phổ 13C-NMR của chất C6

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

Bảng 3.6. Bảng so sánh giá trị peak của Neohesperidin chuẩn và chất C6

1H STT Neohesperidin_St 13C Nehesperidin_St C6 C6

ppm ppm 197,711~197,558 1 12,011 N/A N/A

2 9,091 9,19 177,375 N/A

3 N/A 8,880 173,703 N/A

4 N/A 8,767 171,518 N/A

5 6,841 6,815 165,385~165,280 166,778

6 N/A 6,32 163,458~163,125 161,541

7 6,090~6,060 6,113 157,106 N/A

8 5,294~5,086 5,258 156,925 N/A

9 4,703~4,557 4,362 149,437 148,569

10 N/A 4,004 145,546 147,014

11 N/A 3,975 131,419~131,343 133,632

12 3,744 3,79 127,27 N/A

13 3,649 3,682 121,423 N/A

14 N/A 3,167 118,476~118,361 116,73

15 N/A 3,492 114,737~112,543 115,881

16 3,425 3,475 103,596 103,873

17 3,407 3,409 102,499 100,963

18 3,346 3,344 101,984 100,925

19 N/A 3,325 101,24 N/A

20 3,29 3,259 99,896 97,949~97,835

21 N/A 3,218 94,525 96,805~95,708

22 N/A 3,194 84,262 N/A

23 N/A 3,057 76,974 79,225~78,958

24 N/A 3,006 76,316 77,671~77,732

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

25 2,761~2,708 2,987 74,599 76,717~76,612

26 2,474~2,467 2,473 72,358 68,762

27 N/A 2,27 71,003~70,116 67,522

28 N/A 2,248 68,819 67,131

29 N/A 1,944 60,969 60,33

30 1,142~1,130 1,143 N/A 57,402

31 1,041 1,114 56,219 55,637

32 1,027~1,012 1,129 N/A 53,768

33 N/A 0,932 N/A 45,746

34 N/A 0,806 42,684 42,579

35 N/A 0,712

Chú thích: N/A là không tồn tại

Tiến hành so sánh giá trị các tín hiệu thu được ở phổ 1H-NMR và 13C-NMR

của chất chuẩn neohesperidin và chất C6 (bảng 3.6), chúng tôi nhận thấy các tín hiệu

chính tương đồng nhau với nhau, giá trị phổ của chất C6 xuất hiện một số peak nhiễu,

có thể được giải thích là do các dung môi chưa được tách hết ra khỏi hợp chất.

Kết hợp với giá trị phổ khối lượng đã đo được, chúng tôi kết luận chất C6 là

neohesperidin với cấu trúc hóa học được thể hiện trong hình 3.13:

Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của C6 – neohesperidin

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

3.3. Đánh giá khả năng làm giảm sự tích lũy β-amyloid

3.3.1. Hoạt tính chống oxi hóa

Vitamin C là một chất chống oxi hóa có nhiều trong các loại thực vật. Hoạt tính

chống oxi hóa của nó đã được nghiên cứu đầy đủ và rõ ràng. Vì vậy trong phương pháp

xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH, chúng tôi sử dụng vitamin C làm chất chuẩn để

so sánh với các chất chuẩn quercetin, rutin, các chất tinh sạch được từ dịch chiết nụ hoa

hòe khô. Kết quả xây dựng đường chuẩn vitamin C với nồng độ từ 100 µg/ml đến 700

µg/ml được thể hiện trong hình 3.14 dưới đây.

70,000

)

59,198 60,000 54,525

( a ó h

i x o

46,647 50,000

35,169 40,000

g n ố h c

g n ă n

30,000 22,702 y = 0,0906x - 1,4038 R² = 0,982 19,977 20,000

ả h K

5,647 10,000

,000

0 100 200 600 700 800 300 500

400 Nồng độ vitamin C (µg/ml)

Hình 3.14. Đồ thị đường chuẩn khả năng chống oxi hóa của vitamin C

= 0,982. Từ đường chuẩn, kết

Đường chuẩn vitamin C tuyến tính với giá trị R2

hợp với giá trị độ hấp thụ của các chất quercetin, rutin chuẩn, chất C2 và C6, chúng tôi

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

tính toán và đưa ra bảng so sánh giá trị quét gốc tự do của các chất trong bảng 3.7 sau:

Bảng 3.7. Giá trị quét gốc tự do DPPH của các chất

Quercetin C2 Rutin chuẩn C6 chuẩn

Nồng độ (µM) 200 20 200 20 200 20 200 20

Khả năng bắt 91,3 9,57 69,86 5,28 91,44 14,6 91,11 11,81 gốc tự do (%)

Trong điều kiện thí nghiệm, khả năng bắt gốc tự do của các chất giảm đáng kể

khi nồng độ bị pha loãng 10 lần. So sánh với khả năng bắt gốc tự do của vitamin C, ta

có thể thấy quercetin chuẩn, chất C2, rutin chuẩn, và chất C6 tại nồng độ 20 µM có

hoạt tính tương đương với vitamin C nồng độ từ 100-200 µg/ml. Còn tại nồng độ 200

µM, các chất thử nghiệm có hoạt tính cao hơn hẳn vitamin C tại nồng độ 700 µg/ml.

So sánh khả năng bắt gốc tự do của chất C2 và quercetin chuẩn, nhận thấy

quercetin chuẩn thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh mẽ hơn, tại nồng độ 200 µM là

91,3% so với 69,86%, tại nồng độ 20 µM là 9,57% so với 5,28%. Tương tự, cũng nhận

thấy khả năng chống oxi hóa mạnh hơn của rutin chuẩn so với chất C6,

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, tùy vào điều kiện thí nghiệm, môi

trường đệm, độ pH, nồng độ DPPH, nồng độ chất thử nghiệm mà quercetin và rutin thể

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

hiện hoạt tính chống oxi hóa, quét gốc tự do DPPH khác nhau [52, 65].

3.3.2. Hoạt tính làm giảm sự tích tụ peptide β-amyloid

Sự tập hợp protein để tạo thành sợi amyloid là một đặc tính phổ biến trong các

bệnh rối loạn ở con người như bệnh Alzheimer.

Thioflavin T là một chất đánh dấu thường được sử dụng để theo dõi sự hình

thành sợi amyloid in vitro. Khi gắn với các sợi amyloid, ThT cho tín hiệu huỳnh quang

mạnh hơn. Dựa vào đặc tính này, chúng tôi ghi nhận sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang

của thioflavin T trong các mẫu thí nghiệm khác nhau. Sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang

được tính toán và thể hiện trong hình 3.15.

89,643

y ũ l

80,571 78,214

h c í t

m ă r t

n ầ h P

51,143 46,857

100,000 90,000 80,000 70,000 60,000 50,000 40,000 30,000 20,000 10,000 ,000

Qc C2 C6 Aβ

Rc Các chất thử nghiệm

Hình 3.15. Biểu đồ thể hiện sự tích lũy β-amyloid trong các điều kiện khác nhau

Trong đó: Aβ là β-amyloid peptide trong điều kiện bình thường

Qc: mẫu β-amyloid khi có mặt quercetin chuẩn

Rc: mẫu β-amyloid khi có mặt rutin chuẩn

C2: mẫu β-amyloid khi có mặt của chất C2

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

C6: mẫu β-amyloid khi có mặt của chất C6

Trong điều kiện thường, không có mặt của các chất ức chế, tỉ lệ tạo thành sợi

của β-amyloid là 89,64%. Với sự có mặt của chất ức chế quercetin chuẩn, tỉ lệ tạo

thành sợi chỉ còn 46,86%, tỉ lệ này thấp hơn khi có mặt của chất C2 là 51,14%. Với sự

có mặt của chất chuẩn Rutin, khả năng tạo sợi của β-amyloid giảm khoảng 11% còn

78,21%. Chất C6 có khả năng ức chế kém hơn rutin chuẩn, khả năng tạo sợi của β-

amyloid khi có mặt chất này là 80,87%.

Theo See-Lok Ho và cộng sự, với sự xuất hiện của quercetin và neohesperidin ở

nồng độ 200 µM, β-amyloid giảm đáng kể sự hình thành sợi peptide, Trong môi trường

đệm có mặt neohesperidin hoặc quercetin, các monomer β-amyloid tồn tại trong thời

gian dài hơn trước khi tạo thành oligomer và tạo sợi peptide so với trong môi trường

đệm phosphate đối chứng [49]. Karim và cộng sự cũng đã chứng minh quercetin và

rutin ngăn cản sự tạo thành sợi và sự tích tụ của β-amyloid in vitro thông qua mô hình

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

tế bào APPswe [30].

KẾT LUẬN

 Đã tinh sạch được hai chất C2 và C6 từ dịch chiết nụ hoa hòe khô. Chất C2

được xác định là quercetin, chất C6 được xác định là neohesperidin.

 Các chất quercetin chuẩn, rutin chuẩn, C2 và C6 tại nồng độ 20 µM thể hiện

hoạt tính chống oxi hóa tương đương với vitamin C chuẩn nồng độ từ 100 đến

200 µg/ml.

 Các chất quercetin chuẩn, rutin chuẩn, C2 và C6 tại nồng độ 1 mM thể hiện hoạt

tính chống lại sự tích tụ peptide β-amyloid. Trong môi trường có mặt các chất

này, tỉ lệ tích tụ β-amyloid lần lượt là: 46,86%, 78,21%, 51,14% và 80,57%.

KIẾN NGHỊ

Chúng tôi kiến nghị thực hiện tiếp các nghiên cứu về khả năng ức chế sự tích tụ

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

β-amyloid trên mô hình tế bào và mô hình động vật thí nghiệm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư (2013). "Stress oxi hóa và các chất chống oxi hóa tự nhiên", Tạp chí Khoa học và Phát triển, 7(5), tr.667-677.

2. Nguyễn Ngọc Hòa (2006). Nghiên cứu tỷ lệ mắc và một số yếu tố liên quan đến SSTT ở người cao tuổi huyện Ba Vì, tỉnh Hà Tây 2005-2006, Hà Nội, Đại học Y Hà Nội.

3. Lê Quốc Nam và Trần Duy Tâm(2007). "Khảo sát sơ bộ tỷ lệ sa sút tâm thần trong cộng đồng dân", Nghiên cứu khoa học tại Bệnh viện Tâm thần TP. Hồ Chí Minh.

4. Phạm Thắng (2010), Bệnh Alzheimer và các thể sa sút trí tuệ khác, Hà Nội, Nhà Xuất bản Y học.

5. Phạm Thắng (2007), Chẩn đoán và điều trị bệnh Alzheimer, Hà Nội, Nhà xuất bản Y học.

6. Hoàng Văn Tuấn (2013). "Nghiên cứu tách chiết và xác định một số hoạt tính sinh học của dịch chiết flavonoid từ cây diếp cá (Hoyttuynia cordata Thunberg) thu hái tại Hà Nội", Tạp chí Sinh học, 35(3), tr.183-187.

7. Lê Văn Tuấn (2010). "Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học sa sút trí tuệ và suy giảm nhận thức nhẹ (MCI) ở người cao tuổi Hà Nội, Mã số 01C-08/08-2009-2", Đề tài nghiên cứu cấp thành phố, Hà Nội,

8. Đỗ Thị Hoa Viên (2007). "Nghiên cứu khảo sát hoạt chất flavonoid trong quả mơ Prunus armeniaca (họ Rosaceae)", Tạp chí Khoa học và công nghệ, 45(2), tr.49-53.

Tài liệu tiếng Anh

9. Arranz S. and Chiva-Blanch G. (2012). "Wine, beer, alcohol and polyphenols on cardiovascular disease and cancer", Nutrients, 4(7), pp.759-781.

10. Barrie M.P., Rhiannon B., Alfred T. and Louis A.T. (2016), The Life-Cycle of Pharmaceuticals in the Environment, Woodhead Publishing.

11. Cao X. and Sudhof T.C. (2001). "A transcriptively active complex of APP with Fe65 and histone acetyltransferase Tip60", Science, 293(8), pp.115-120.

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

12. Cheignon C., Thomas M., Faller P., Hureau C. and Collin F. (2018). "Oxidative stress and the amyloid beta peptide in Alzheimer’s disease", Redox Biology, 14(5), pp.450-464.

13. Christine X., Tiffany Y.L., Dennis C. and Zhefeng G. (2017). "Thioflavin T as an amyloid dye: fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation", Royal Society Open Science, 4(1), pp.16069-16072.

14. Dai J. and Mumper R.J. (2010). "Plant Phenolics: Extraction. Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties", Molecules, 15(2), pp.7313-7352.

15. Dasha M. and Sebastian S. (2013). "Antioxidant and Stabilization Activity of a Quercetin Containing Flavonoid Extract Obtained from Bulgarian Sophora japonica L.", Brazilian Archives of Biology and Technology, 56(3), pp.431-438.

16. Ding B.J., Ma W. and He L.L. (2011). "Soybean isoflavone alleviates β-amyloid 1- 42 induced inflammatory response to improve learning and memory ability by down regulation of Toll-like receptor 4 expression and nuclear factor-κB activity in rats", International Journal of Developmental Neuroscience, 29(5), pp.537-542.

17. Geula C., Wu C. and Daroff D. (1998). "Aging renders the brain vulnerable to amyloid β protein neurotoxicity", Nature Medicine, 4(3), pp.827-831.

18. Graeber MB., Ko¨sel S., Grasbon-Frodl E., Mo¨ller HJ. and Mehraein P. (1998). "Histopathology and APOE genotypes of the first Alzheimer disease patient, Auguste D.", Neurogenetics, 1( 1), pp.223–228.

19. Grotewold E. (2006), The Science of Flavonoids, New York: Springer Science Business Media. Inc.

20. Haag M., Hofman A. and Koudstaal P. (2009). "Statins are associated with a reduced risk of Alzheimer disease regardless of lipophilicity. The Rotterdam Study", Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, 80(1), pp.150-159.

21. Harborne J.B. and Williams C.A. (2000.). "Review: Advances in flavonoid research since 1992", Phytochemistry, 55(6), pp.481 -504.

22. He X., Bai Y., Zhao Z., Wang X., Fang J., Huang L., Zeng M., Zhang Y. and Zheng X. (2016). "Local and traditional uses, phytochemistry, and pharmacology of Sophora japonica L.: A review.", Journal of Ethnopharmacology, 187(11), pp.160-182.

23. Hodges J.R. (2006). " Alzheimer’s centennial legacy: origins, landmarks and the current status of knowledge concerning cognitive aspects", Brain, 12(3), pp.2811– 2822.

24. Ian R.A. (2000). "Anti-inflammatory drugs and Alzheimer-type pathology in aging", Neurology, 54(3), pp.112-119.

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

25. Ioannis P., Anastassios T. and Klimentini B. (2002). "Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy: Basic principles and phenomena, and their applications to

chemistry, biology and medicine", Chemistry education: Research and practice in Europe, 3(2), pp.229-252.

26. Ishida J., Takayuki U., Kuniro T. and Takuo K. (1989). "Studies on the Antihemostatic Substances in Herbs Classified as Hemostatics in Traditional Chinese Medicine. I.: On the Antihemostatic Principles in Sophora japonica L.", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 6(37), pp.1616-1618.

27. Iwata N., Tsubuki S. and Takaki Y. (2001). "Metabolic regulation of brain Abeta by neprilysin", Science, 292(9), pp.1550-1552.

28. Je-Hyuk L. and Gun-Hee K. (2010). "Evaluation of Antioxidant and Inhibitory Activities for Different Subclasses Flavonoids on Enzymes for Rheumatoid Arthritis", Journal of Food Science, 75(7), pp.212-217.

29. Jing L.X., Qiu H.J., Yang L.J., Miu M. and Gao Z.M. (2012). "Study on nutrition of the pagoda flower", Journal of Dalian University, 23(5), pp.87-89.

30. Karim J., Paloma B. and Juana B. (2011). "Quercetin and rutin exhibit antiamyloidogenic and fibril-disaggregating effects in vitro and potent antioxidant activity in APPswe cells", Life Sciences, 89(25), pp.939-945.

31. Leslie A. and Ulrike M. (2013). "Flavonoids: Their structure, biosynthesis and role in the Rhizosphere, including Allelopathy", Journal of Chemical Ecology, 39(6), pp.283-297.

32. Maheep K., Neelu S. and Mahabeer P. (2011). "Flavonoids: A versatile source of anticancer drugs", Pharmacognosy Review, 5(9), pp.1-12.

33. Mark R.J., Fuson K.S. and May P.C. (1999). "Characterization of 8- epiprostaglandin F2alpha as a marker of amyloid b-peptide-induced oxidative damage", Journal Of Neurochemistry, 72(8), pp.1146-1153.

34. Mark R.J., Lovell M.A. and Markesbery W.R. (1997). "A role for 4- hydroxynonenal, an aldehydic product of lipid peroxidation in disruption of ion homeostasis and neuronal death induced by amyloid b-peptide", Journal Of Neurochemistry, 68(3), pp.255-264.

35. Masters C.L., Simms G. and Weiman N.A. (1985). "Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome", The National Academy of Sciences of the United States of America National Academy of Sciences, 82(8), pp.4245-4249.

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

36. Naslund A., Haroutunian V. and Mohs R.C. (2000). "Correlation between elevated levels of amyloid beta-peptide in the brain and cognitive decline", The Journal of the American Medical Association, 288(3), pp.1571-1577.

37. Novak P., Reinhold S., Kontsekova E. and Nobert Z. (2017). "Safety and immunogenicity of the tau vaccine AADvac1 in patients with Alzheimer's disease: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 trial", Neurology, 16(2), pp.123- 134.

38. Park S., Shin E.H. and Hahm T.S. (2009). "Biological activities in the extract of flos Sophora japonica L.", Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, 01(38), pp.9-13.

39. Patel R. and Natvar P. (2011). "In vitro antioxidant activity of coumarin compounds by DPPH, Superoxide and nitric oxide free radical scavenging methods", Journal of Advanced Pharmacy Education & Research, 1(5), pp.52-68.

40. Peter P., Michelle C. and Brenda L. (2002). "Hormone Replacement Therapy and Incidence of Alzheimer Disease in Older Women", Journal of the American Medical Association, 288(17), pp.2123-2129.

41. Piotr K., Anna P., Maciej S. and Lukasz M. (2016). "Structural Characterization of Flavonoid Glycoconjugates and Their Derivatives with Mass Spectrometric Techniques", Molecules, 21(3), pp.1494-1505.

42. Qiu C., De-Ronchi D. and Fratiglioni L. (2007). " The epidemiology of dementias: an update", Current Opinion in Psychiatry, 20(4), pp.380-385.

43. Ramachandran V. and Baojun X. (2015). "Antidiabetic properties of dietary flavonoids: a cellular mechanism review", Nutrition and Metabolism, 12(60), pp.12015-12035.

44. Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M. and Rice-Evans C. (1999). "Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay", Free radical biology and medicine, 26(9), pp.1231-1237.

45. Robert C., David S. and Kim A. (1998). "Folate, Vitamin B12, and Serum Total Homocysteine Levels in Confirmed Alzheimer Disease", Journal of the American Medical Association, 55(4), pp.1449-1455.

46. Robert E., Patrick K. and Christian H. (2003). "Amyloidogenic processing of the Alzheimer β-amyloid precursor protein depends on lipid rafts", Journal of Cell Biology, 160(1), pp.113-120.

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

47. Russo A., Palumbo M., Aliano C. and Lempereur L. (2003). "Red wine micronutrients as protective agents in Alzheimer-like induced insult", Life Sciences, 72(21), pp.2369-2379.

48. Santamour F. and Reidel L. (1997). "A new name for Sophora japonica", Journal of Arboriculture, 24(4), pp.166-167.

49. See-Lok H., Chung-Yan P., Chengyan L., Ting Y., D. W/. and Ken K. (2015). "Inhibition of β-Amyloid Aggregation by Albiflorin, Aloeemodin and Neohesperidin and their Neuroprotective Effect on Primary Hippocampal Cells Against β-Amyloid Induced Toxicity", Current Alzheimer Research, 12(5), pp.424-433.

50. Segovia R.G. (2008). "Effect of the flavonoid quercetin on inflammation and lipid peroxidation induced by Helicobacter pylori in gastric mucosa of guinea pig", Journal of Gastroenterol, 43(5), pp.441-447.

51. Selkoe D.J., Growdon J.H. and Rossor M.N. (1998). "Molecular pathology of Alzheimer's disease: The role of amyloid", The Dementias, 2(1), pp.567-573.

52. Senay O., Ozgur K. and Zeliha S. (2016). "Antioxidant Activity of Quercetin: A Mechanistic Review", Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology, 4(12), pp.1134-1138.

53. Serafini M., Peluso I. and Raguzzini A. (2010). "Flavonoids as anti-inflammatory agents", Nutrition Society, 69(3), pp.273-278.

54. Shikha S., Ranganatha R., Mahesh H., Satish K., Mrinal S., Bibha C. and Sathees C. (2016). "Quercetin, a Natural Flavonoid Interacts with DNA, Arrests Cell Cycle and Causes Tumor Regression by Activating Mitochondrial Pathway of Apoptosis", Nature, 6(2), pp.24049-24052.

55. Shim J.G., Yeom S.H., Kim H.J., Choi Y.M. and Lee D.I. (2005). "Bone loss preveting effect of Sophrae fructus on overiectomized rats", Archives of Pharmacal Research, 28(4), pp.106-110.

56. Van R.M., Naidoo N. and Landberg R. (2013). "Dietary flavonoids and the development of type 2 diabetes and cardiovascular diseases: review of recent findings", Current Opinion In Lipidology, 24(1), pp.25-33.

57. Varadarajan S., Yatin S. and Aksenova M. (2000). "Review: Alzheimer’s amyloid b-peptide-associated free radical oxidative stress and neurotoxicity", Journal of Structural Biology, 130(5), pp.184-208.

58. Wang X., Ouyang Y. and Liu J. (2014). "Flavonoid intake and risk of CVD: a systematic review and meta-analysis of prospective cohort studies", British Journal of Nutrition, 111(1), pp.1-11.

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

59. Wang Y.H., Long X.F., He F., Wang J.B. and Yuan J.L. (2009). "Study of total flavonoid from Fructus Sophorae on lipid-lowering in hyperlipidemic rats and its

antioxidant capacity", Journal of the Fourth Military Medical University, 30(8), pp.2677-2681.

60. WHO (2012). Dementia: a public health priority. Geneva, Switzerland, World Health Organization.

61. William R. (1997). "Oxidative Stress Hypothesis in Alzheimer's Disease", Free radical biology and medicine, 23(1), pp.134-147.

62. Yatin S., Varadarajan S., Aksenova M. and Butterfield D.A. (2001). "Vitamin E prevents Alzheimer’s amyloid b-peptide (1–42)-induced protein oxidation and reactivespecies formation", The Journal of Alzheimer's Disease, 2(4), pp.123-131.

63. Yatin S.M., Link C.D. and Butterfield D.A. (1999). "In-vitro and in-vivo oxidative stress associated with Alzheimer’s amyloid b-peptide (1–42)", Neurobiology of Aging, 20(6), pp.325-330.

64. Zhang L., Ravipati A.S., Koyyalamudi S.R. and Jeong S.C. (2011). "Antioxidant and anti-inflammatory activities of selected medicinal plants containing phenolic and flavonoid compounds", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(5), pp.12361- 12367.

65. Zhang M., Swarts S.G., Yin L., Tian Y. and Cao Y. (2011). "Antioxidant properties of quercetin", Advances in Experimental Medicine and Biology, 701(6), pp.283-289.

Đỗ Thị Hải Anh

Sinh học thực nghiệm K25

66. Ligia G., Julian C. and Mar Q. (2012). "Inhibition of Angiotensin-Converting Enzyme Activity by Flavonoids: Structure-Activity Relationship Studies", Plos, 7(11), pp.49493-49499.