Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoic, acid sorbic, muối của chúng và một số chỉ tiêu đường hóa học trong đối tượng thực phẩm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:93

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn xây dựng được quy trình phân tích acid benzoic, acid sorbic và chất tạo ngọt saccharin, aspartam trong thực phẩm tại Labo Xét nghiệm ATVSTP. Từ đó thẩm định được phương pháp xác định acid benzoic, acid sorbic và chất tạo ngọt saccharin, aspartam trong thực phẩm đã xây dựng tại Labo XN ATVSTP. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoic, acid sorbic, muối của chúng và một số chỉ tiêu đường hóa học trong đối tượng thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ HỒNG THÚY NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID BENZOIC, SORBIC, MUỐI CỦA CHÚNG VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU ĐƢỜNG HÓA HỌC TRONG ĐỐI TƢỢNG THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ HỒNG THÚY NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID BENZOICSORBIC, MUỐI CỦA CHÚNG VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU ĐƢỜNG HÓA HỌC TRONG ĐỐI TƢỢNG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Hóa Phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. TẠ THỊ THẢO Hà Nội – Năm 2014
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các anh chị, bạn bè, đồng nghiệp, những ngƣời thân trong gia đình và các cơ quan có liên quan. Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới: PGS.TS. Tạ Thị Thảo cô đã luôn quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài này. Tôi vô cùng biết ơn Tập thể các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên Bộ môn Hóa Phân tích- trường Đa ̣i học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Labo Xét nghiệm An toàn vê ̣ sinh Thực phẩ m, Khoa Y tế Công cộng / Y học Dự phòng, Khoa Xét nghiệm - Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương, cho tôi cơ hội đƣợc đi học chuyên sâu về xét nghiê ̣m Hoá - Độc, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu. Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những ngƣời đã hết lòng ủng hộ, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài. Nguyễn Thị Hồng Thúy i
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan , luận văn này là kế t quả nghiên cứu và làm viê ̣c của tôi , các kết quả, số liê ̣u của luận văn là trung thực , thực tế tại nơi nghiên cứu. Hải Dương, tháng 12 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hồng Thúy Học viên cao học khoá học 2012-2014 ii
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................. i LỜI CAM ĐOAN...................................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU , CÁC CHỮ VIẾT TẮT........................................................ v DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................................... vi DANH MỤC CÁC SƠ ĐÔ,̀ HÌNH VẼ................................................................................. vii ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................................... 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .................................................................................................... 3 1.1. Giới thiệu chung về chất bảo quản và chất tạo ngọt ........................................3 1.1.1. Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam .............3 1.1.2. Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid sorbic, acid benzoic và saccharin, aspartam. ............................................................................................4 1.2. Một số phƣơng pháp xác định acid benzoic, acid sorbic, saccharin, và aspartam ...................................................................................................................7 1.2.1. Phƣơng pháp trắc quang ...........................................................................7 1.2.2 Phƣơng pháp chuẩn độ ..............................................................................9 1.2.3. Phƣơng pháp điện di mao quản (CE) .......................................................9 1.2.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................11 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 14 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ....................................................................................14 2.1.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu .........................................14 2.1.2. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm lấy mẫu phân tích ..............................14 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu ...................................14 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................14 2.2.2. Hóa chất, thuốc thử ................................................................................15 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ...............................................................................16 2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ ...........................................16 2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích .........................17 2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu : ....................................................................22 iii
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 23 3.1. Nghiên cứu, xây dựng phƣơng pháp phân tích ..............................................23 3.1.1. Khảo sát các điều kiện phân tích ............................................................23 3.1.2. Tối ƣu quá trình xử lý mẫu .....................................................................33 3.2. Xác định giá trị sử dụng của phƣơng pháp ....................................................38 3.2.1. Kế t quả nghiên cƣ́u tính phù hợp của hệ thống ......................................38 3.2.2. Tính đặc hiệu, chọn lọc ..........................................................................38 3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của thiết bị đo .....................40 3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp ................58 3.2.5. Khoảng tuyến tính ..................................................................................41 3.2.6. Độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích ....................................................43 3.2.8. Đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp bằng phân tích đối chứng ......58 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI.................................................................... ̣ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 63 PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 66 iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril Assosiation of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hóa phân tích AOAC chính thức) ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm Asp Aspartam BA Acid benzoic BYT Bộ y tế DAD Diode Array Detector (Detector mảng diod) GC Gas chromatography (Sắc ký khí) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) R (%) Độ thu hồi (đơn vi ̣%) Sac Saccharin SA Acid sorbic KPH Không phát hiê ̣n (nhỏ hơn ngƣỡng phát hiện của phƣơng pháp) MeOH Methanol LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lƣợng) S/N Signal to noise ratio (Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu) SOP Standard Operation Procedure (Quy trình thao tác chuẩn) ppm Nồ ng đô ̣ ppm (mg/kg) QC Quality control (Kiểm soát chất lƣợng). RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tƣơng đối) UV-VIS Ultraviolet – Visible (Tử ngoại khả kiến) TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam. INS International numbering system (hệ thống đánh số quốc tế). ADI Acceptable daily intake (lƣợng ăn vào hằng ngày có thể chấp nhận đƣợc) Maximum Level (lƣợng phụ gia tối đa của một chất phụ gia thực phẩm), ML tính bằng mg/kg thực phẩm dạng rắn và mg/l đối với thực phẩm dạng lỏng CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử KLPT Khối lƣợng phân tử v
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam.......................... 3 Bảng 1.2. Ảnh hƣởng của một số chất bảo quản trên vi sinh vật ........................................... 4 Bảng 3.1 : Ảnh hƣởng bản chất cột đến thời gian lƣu và diện tích pic .... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.2: Tính chất của1 số loa ̣i dung môi dùng làm pha đô......................................... ̣ng 26 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng thành phần pha động đến thời gian lƣu và diện tích pic................... 26 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của pH pha động đến thời gian lƣu của chất phân tích .................... 28 Bảng 3.5. Tỷ lệ dung môi của chế độ gradient 2 ................................................................... 30 Bảng 3.6. Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 3.......................................... 31 Bảng 3.7. Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 4.......................................... 31 Bảng 3.8. Diện tích pic theo các chƣơng trình gradient ........................................................ 32 Bảng 3.9. Chƣơng trình gradient pha động và tốc độ dòng tối ƣu........................................ 33 Bảng 3.10. Sự phụ thuộc diện tích pic vào thời gian siêu âm ............................................... 35 Bảng 3.11. Sự phụ thuộc diện tích pic vào thể tích MeOH thêm vào mẫu.......................... 36 Bảng 3.12: Kế t quả tiń h toán ựs phù hợp của hệ thống......................................................... 38 Bảng 3.13. Hệ số tách và độ phân giải của pic các chất phân tích........................................ 40 Bảng 3.14 : Giới hạn phát hiện của thiết bị đối với các chất đang nghiên cứu .................... 40 Bảng 3.15. LOD và LOQ của từng nền mẫu ......................................................................... 58 Bảng 3.16: Phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ............................................................. 42 Bảng 3.17: Phƣơng trình hồi quy và hệ số tƣơng quan của đƣờng chuẩn ........................... 44 Bảng 3.18: Kết quả phân tích lặp lại hàm lƣợng saccharin trong mẫu thực (n=6) .............. 44 Bảng 3.19: Kết quả phân tích lặp lại hàm lƣợng aspartam trong mẫu thực (n=6)............... 46 Bảng 3.20: Kết quả phân tích lặp lại hàm lƣợng acid benzoic trong mẫu thực (n=6)......... 47 Bảng 3.21: Kết quả phân tích lặp lại hàm lƣợng acid sorbic trong mẫu thực (n=6)............ 49 Bảng 3.22: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu xúc xích .................... 51 Bảng 3.23: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu bánh đậu xanh .......... 52 Bảng 3.24: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu thạch bách vị ............ 53 Bảng 3.25: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu dƣa chuột muối ........ 54 Bảng 3.26: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu ô mai .................... 55 Bảng 3.27: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu kẹo........................ 56 Bảng 3.28: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu nƣớc ngọt ............ 57 Bảng 3.29. Kết quả mẫu kiểm nghiệm đối chứng ................................................................. 60 vi
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ Sơ đồ 2.1. Quy trình phân tích theo TCVN 8471:2010 ......................................................... 17 Sơ đồ 2.2: Qui trình phân tích mẫu dự kiến ........................................................................... 34 Hình 3.1: Phổ của Saccharin và Aspartam............................................................................ 23 Hình 3.2: Phổ của acid Benzoic.............................................................................................. 24 Hình 3.3: Phổ của acid Sorbic ................................................................................................ 24 Hình 3.4. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chất bằng cột C8 (150mm× 4,6mm × 5μm) ...... Error! Bookmark not defined. Hình 3.5. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chất bằng cột C18 (150mm×4,6mm× 5μm)...... Error! Bookmark not defined. Hình 3.6. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chấtc bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm) ............ 25 Hình 3.7: Sắc đồ hỗn hợp chất phân tích, thành phần pha động K2HPO4 : ACN = 80 : 20 (v/v) tại bước sóng 210nm, 226nm và 254nm. ....................................................................... 27 Hình 3.8. Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 1................................................. 29 Hình 3.9. Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 2................................................. 30 Hình 3.10. Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 3............................................... 31 Hình 3.11. Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 4............................................... 32 Hình 3.12: Sắc đồ của mẫu trắng (A) và mẫu trắng có thêm chuẩn (B) ............................. 39 Hình 3.13: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với saccharin.......................................................... 40 Hình 3.14: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với aspartam .......................................................... 41 Hình 3.15: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với acid benzoic..................................................... 41 Hình 3.16: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với acid sorbic ....................................................... 41 Hình 3.17: Đường chuẩn của saccharin trong khoảng nồ ng 0,02 độ ÷ 80 ppm................. 42 Hình 3.18: Đường chuẩn của aspartam trong khoảng nồ ng độ0,5 ÷ 90 ppm ................... 42 Hình3.19: Đường chuẩn của A. benzoic trong khoảng nồ ng độ 0,08÷90 ppm ................... 43 Hình 3.20: Đường chuẩn của A.sorbic trong khoảng nồ ng độ 0,01 ÷ 85 ppm ................... 43 Hình 3.21. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp chuẩn 1 ppm của các chất phân tích. ............................ 43 Hình 3.22. Sắc đồ của mẫu nước ngọt ................................................................................... 50 vii
ĐẶT VẤN ĐỀ Chất lƣợng thực phẩm nói chung, chất lƣợng an toàn vệ sinh thực phẩm nói riêng là vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt, ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khỏe con ngƣời và nền kinh tế của xã hội. Gần đây, liên tiếp xảy ra các vụ ngộ độc tại nhiều địa phƣơng trên toàn quốc, cũng nhƣ việc xuất hiện nhiều mặt hàng không rõ nguồn gốc xuất xứ hoặc sử dụng những phụ gia ngoài danh mục cho phép hay sử dụng quá hàm lƣợng cho phép. Tác hại do sử dụng phụ gia sai quy định có thể ảnh hƣởng đối với sức khỏe con ngƣời. Những tác động này thƣờng không xảy ra cấp tính, rầm rộ và nguy kịch mà diễn biến lâu dài do tích lũy trong cơ thể. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ở Việt Nam hàng năm có khoảng hơn 3 triệu trƣờng hợp nhiễm độc, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD (khoảng 4000 tỷ VND). Acid sorbic, acid benzoic và một số muối của chúng là những phụ gia đƣợc phép sử dụng với nồng độ đủ để bảo quản sản phẩm thì chúng không gây độc cho cơ thể con ngƣời. Tuy nhiên, một số nhà sản xuất đã dùng quá hàm lƣợng cho phép ảnh hƣởng tới sức khoẻ, gây ngộ độc cấp và mãn tính. Tổ chức Y tế thế giới, tổ chức Nông Lƣơng thế giới đã thử nghiệm natri benzoat trên chuột sau nhiều ngày trọng lƣợng chuột giảm, hại gan và thận dẫn tới chết, thử nghiệm trên chó thì dẫn tới thần kinh, kết hợp với acid ascobic trong thực phẩm natri benzoat có thể gây ung thƣ do tạo ra benzen. Năm 2012, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Hƣơng trên địa bàn tỉnh Quảng Bình cho thấy: Tổng số mẫu xét nghiệm acid benzoic là 291 có 69 mẫu thực phẩm sử dụng chất bảo quản acid benzoic chiếm là 23,7%, trong các thực phẩm sử dụng chất bảo quản acid benzoic tỷ lệ mẫu thực phẩm sử dụng vƣợt quá giới hạn cho phép là 46,4%. Tổng số mẫu xét nghiệm acid sorbic là 286 có 50 mẫu thực phẩm sử dụng chất bảo quản acid sorbic chiếm là 17,5%, trong các thực phẩm sử dụng chất bảo quản acid sorbic tỷ lệ mẫu thực phẩm sử dụng vƣợt quá giới hạn cho phép là 50% [3]. Nguyễn Thị Hồng Thúy 1 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Đƣờng hóa học (hay là chất ngọt tổng hợp) là chất không có trong tự nhiên, có vị ngọt rất cao so với đƣờng kính saccharose và không hề có một giá trị dinh dƣỡng. Thƣờng dùng trong việc điều trị cho những ngƣời bệnh thừa cân hay đái tháo đƣờng. Các đƣờng hóa học nhƣ: saccharin, manitol, acesulfam K, aspartam, isomalt, sorbitol, sucraloza đƣợc phép sử dụng trong chế biến thực phẩm với giới hạn tối đa và có quy định của Bộ Y tế [12]. Tuy vậy, các chất này có thể gây ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời dùng ở các mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào liều lƣợng đƣa vào cơ thể. Điều nguy hiểm là loại đƣờng này hòa tan trong nƣớc, không màu, không mùi nên khó phát hiện. Chỉ có thể chỉ tên "đích danh" qua phân tích hoá học. Nếu nhà sản xuất chỉ cần cho 7 phần đƣờng mía và 3 phần đƣờng hóa học thì ngay cả các chuyên gia cũng không thể phát hiện ra. Cho đến nay có rất nhiều phƣơng pháp khác nhau để xác định chất bảo quản và chất tạo ngọt. Tuy nhiên, để định lƣợng đƣợc đồng thời chất quản: acid benzoic, acid sorbic và chất tạo ngọt trong thực phẩm, phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có nhiều ƣu điểm vƣợt trội. Phƣơng pháp này có độ nhạy, độ chính xác cao, thao tác đơn giản, có thể đồng thời xác định dƣợc nhiều chất. Xuất phát từ vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoic, acid sorbic, muối của chúng và một số chỉ tiêu đường hóa học trong đối tượng thực phẩm” nhằm giải quyết 2 mục tiêu: 1. Xây dƣ̣ng đƣơ ̣c quy trin ̀ h phân tić h acid benzoic, acid sorbic và chất tạo ngọt saccharin, aspartam trong thực phẩm tại Labo Xét nghiệm ATVSTP. 2. Thẩ m đinh ̣ đƣơ ̣c phƣơng pháp xác đinh ̣ acid benzoic, acid sorbic và chất tạo ngọt saccharin, aspartam trong thực phẩm đã xây dƣ̣ng tại Labo XN ATVSTP. Nguyễn Thị Hồng Thúy 2 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về chất bảo quản và chất tạo ngọt 1.1.1. Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam Tên hóa học, các tính chất, công thức cấu tạo của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam đƣợc cho trong bảng 1.1. [7], [8], [11] Bảng 1.1. Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam Acid benzoic Acid sorbic saccharine Aspartam Tên Acid benzoic, Acid sorbic, 1,2-Benzisothiazol- Aspartyl hóa acid benzen acid 2.4 – 3(2H)-on-1,1- phenylamin học carboxylic, hexadienoic dioxid; metyl ester, acid phenol 3-oxo-2,3- 3-Amino-N-(α arboxylic dihydrobenzo[d]iso carbomethoxy- thiazol-1,1-dioxid phenyletyl)-acid succinamic CTPT C7H6O2 C6H8O2 C7H5NO3S C14H18N2O5 (C6H5COOH) KLPT 122,12 g/mol 112,12 g/mol 183,18 g/mol 294,31 g/mol pKa 4,21 4,76 3,86 4,5-6,0 CTCT Tính - Tinh thể rắn - Tinh thể hình - Tinh thể hoặc bột - Tinh thể màu chất màu trắng, có kim không màu tinh thể trắng, trắng, không mùi vật lý dạng vảy hoặc hoặc bột trơn - không mùi hoặc có vị ngọt mạnh. hình kim chảy màu trắng, có mùi thơm nhẹ. - Ít tan trong - có mùi đặc - có mùi nhẹ đặc - Ít tan trong nƣớc, nƣớc và ethanol trƣng rất nhẹ trƣng ethanol, tan trong - tan ít trong - ít tan trong dung dịch kiềm. nƣớc, tan vô nƣớc, tan nhiều - Giữ đƣợc độ ngọt hạn trong trong ethanol, ở nhiệt độ cao. etanol. methanol. Nguyễn Thị Hồng Thúy 3 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
1.1.2. Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid sorbic, acid benzoic và saccharin, aspartam. Tác dụng của một số chất bảo quản trên vi sinh vật được thể hiện ở bảng 1.2. [1] Bảng 1.2. Ảnh hưởng của một số chất bảo quản trên vi sinh vật Chất chống vi sinh vật Vi khuẩn Nấm men Nấm mốc Nitrit ++ - - Sulfit ++ ++ + Acid formic + ++ ++ Acid propionic + ++ ++ Acid benzoic ++ +++ +++ Acid sorbic + +++ +++ Acid este-p hydrobenzoic ++ +++ +++ Biphenyl - ++ ++ Chú thích: - Không tác dụng + Tác dụng yếu + + Tác dụng trung bình +++ Tác dụng mạnh 1.1.2.1. Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng acid benzoic Acid benzoic và các benzoat là chất sát trùng mạnh đối với nấm men và các nấm mốc, có tác dụng yếu đối với các vi khuẩn. Tác dụng bảo quản chỉ xảy ra ở môi trƣờng acid pH = 2,5 – 3,5. Đảm bảo hiệu quả tác dụng bảo quản, nồng độ natri benzoat có trong sản phẩm phải đạt tới 0,07 – 0,1%. Các nồng độ này của acid benzoic và natri benzoat không có hại đối với cơ thể con ngƣời. [11] Acid benzoic và các benzoat không gây độc khi dùng đúng liều quy định mà chỉ ảnh hƣởng tới mùi và vị của sản phẩm khi cảm quan (natri benzoat cho dƣ vị ở nồng độ 0,04%). Nƣớc quả và rau quả nghiền bảo quản bằng các benzoat thƣờng có màu thâm đen so với sản phẩm sunfit hoá. Trong cơ thể acid benzoic và các benzoat tác dụng với acid ascorbic hình thành benzen, một chất gây ung thƣ. Natri benzoat có thể phá huỷ và khử hoạt tính của ADN trong ti thể tế bào. Ti thể tiêu thụ ôxi để tổng hợp ATP, cung cấp năng lƣợng cho cơ thể, khi ADN bị phá huỷ sẽ gây ra các Nguyễn Thị Hồng Thúy 4 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
triệu chứng về thần kinh bao gồm hội chứng Parkinson và các hội chứng thoái hoá thần kinh khác, làm tăng quá trình lão hóa của cơ thể. [3] Giới hạn cho phép (ML) của acid benzoic trong thịt và các sản phẩm từ thịt, trong nƣớc chấm và các sản phẩm tƣơng tự 1000mg/kg; trong các loại thủy sản, sản phẩm thủy sản ngâm dấm, kể cả nhuyễn thể, giáp xác, da gai 2000mg/kg. [12] 1.1.2.2. Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng acid sorbic Acid sorbic và các sorbate có tác dụng sát trùng mạnh đối với nấm men và nấm mốc, các vi sinh vật này là nguyên nhân chủ yếu gây hƣ hỏng sản phẩm rau quả, tác dụng rất yếu đối với vi khuẩn. Sử dụng Acid sorbic đem lại kết quả tốt trong công nghiệp chế biến rau quả, trong công nghiệp rƣợu nho, trong sản xuất đồ hộp sữa và các sản phẩm sữa, các sản phẩm cá, các sản phẩm thịt loại thịt dồi, xúc xích, các sản phẩm bánh mỳ... [11] Khi sử dụng acid sorbic với hàm lƣợng vƣợt mức cho phép sẽ ảnh hƣởng không tốt đến sức khoẻ ngƣời sử dụng. Các chất này có thể gây dị ứng, gây hiện tƣợng đầy bụng, đầy hơi, khó tiêu. Nếu tích tụ lâu ngày sẽ gây hại cho gan, thận, thậm chí có thể gây ung thƣ. [3] Giới hạn cho phép (ML) của acid sorbic trong các loại pho mát cao nhất là 3000mg/kg; trong các loại bánh nƣớng là 2000mg/kg; trong nƣớc chấm và các sản phẩm tƣơng tự : 2000mg/kg; viên xúp và nƣớc thịt: 1000mg/kg. [12] 1.1.2.3. Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng saccharin Là chất làm ngọt nhân tạo không có năng lƣợng, độ ngọt gấp khoảng 300 lần đƣờng mía, nhƣng có dƣ vị kim loại hơi đắng, đặc biệt là ở nồng độ cao. Khi đi vào cơ thể, saccharin không bị hấp thụ vào các bộ phận trong cơ thể mà đƣợc thải hồi sau đó qua đƣờng tiểu tiện. Dùng để làm ngọt các sản phẩm nhƣ đồ uống, kem, chè, bánh kẹo, bánh quy, các loại thuốc và kem đánh răng [7], [11]. Năm 1977, Canada và FDA Hoa Kỳ cấm sử dụng hóa chất này vì phát hiện gây ung thƣ bàng quang ở chuột. Nhƣng trƣớc áp lực của dân chúng và nhà sản xuất, Quốc hội Hoa Kỳ cho phép dùng với điều kiện phải có hàng chữ “có nguy cơ độc hại cho sức khỏe” (potentially hazardous to health). Năm 2000, FDA Hoa Kỳ Nguyễn Thị Hồng Thúy 5 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
lấy hàng chữ này ra vì có những nghiên cứu chứng minh sự an toàn của saccharin. Tuy nhiên, hiện nay một số nghiên cứu hiện đại lại chỉ ra rằng, saccharin có thể tạo ra dị ứng cho cơ thể nhƣ nhức đầu, tiêu chảy, da bị tróc v.v… Đối với các phụ nữ đang mang thai, saccharin có thể đi thẳng vào bào thai và nằm yên trong đó trong suốt thời kỳ mang thai, do đó thai nhi có thể bị ảnh hƣởng và tạo nên những chứng rối loạn chức năng của cơ bắp. Dùng nhiều lƣợng saccharin có thể sinh ra chứng béo phì. Tuy nhiên tất cả những biến chứng do việc xử dụng saccharin vẫn còn là một tranh cãi và chƣa có kết luận nào có tình cách thuyết phục. [30] Một khả năng gây nguy hiểm khác của saccharin là khả năng gây dị ứng. Phản ứng dị ứng này là do nhóm hợp chất sufonamides gây ra đối với những ngƣời không đáp ứng đƣợc thuốc chứa sulfa. Phản ứng này bao gồm đau đầu, khó thở, phát ban và tiêu chảy. Một số sản phẩm dành cho trẻ em có chứa saccharin đƣợc cho là có thể gây kích ứng và rối loạn cơ bắp. [30] Giới hạn cho phép (ML) của saccharin trong kẹo cao su cao nhất là 2500 mg/kg, trong các loại gia vị là 1500 mg/kg, trong thực phẩm bổ xung là 1200 mg/kg, trong sản phẩm thịt, thịt gia cầm và thịt thú, thủy sản và cá đã qua xử lý nhiệt, rau củ đông lạnh là 500 mg/kg,...[12] 1.1.2.4. Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng aspartam Hiện nay, aspartam là chất ngọt rất đƣợc ƣa chuộng. Nó đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới với sự hiện diện trong hơn 6000 loại thực phẩm khác nhau nhƣ bánh kẹo, yogurt, trong các thức uống ít nhiệt năng nhƣ Coke diete, Pepsi và cả trong dƣợc phẩm. [29] Một gram aspartam tạo ra bốn kcal năng lƣợng khi chuyển hóa nên lƣợng calo là không đáng kể. Đa số ngƣời tiêu dùng có nhận xét là aspartam không để lại dƣ vị khó chịu , tuy nhiên mô ̣t số ngƣời nhạy cảm cho rằng đƣờng này để la ̣i trên lƣỡi mô ̣t hâ ̣u vi ̣không ngon . Điều này có thể khắc phục bằng cách trộn aspartam với các loại đƣờng khác (nhƣ acesulfame - K hay saccharin). [7] Khi vào cơ thể , aspartam không hấp thụ vào máu mà tan ra trong ruột thành ba chất: acid aspartic (40%), phenylalanin (50%) và methanol (10%). Nguyễn Thị Hồng Thúy 6 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
+ Methanol là một chất có độc tính thấp. Vào cơ thể, methanol đƣợc oxy hóa tạo nên formaldehyd, chất này lại tiếp tục bị oxy hóa tạo nên acid formic (hoặc formate, tùy theo pH). Acid formic có độc tính rất cao. Chính acid formic là nguyên nhân gây nên tình trạng toan chuyển hóa (nhiễm acid) và mù lòa, những tổn thƣơng đặc trƣng của nhiễm độc methanol. + Phenylalanine là một chất độc thần kinh. Quá nhiều phenylalanine gây động kinh, chậm phát triển trí óc , mất ngủ… Chin ́ h phenylalanine ta ̣o ra bệnh phenylketonuria (PKU), làm chậm phát triể n trí tuê ̣ nghiêm tro ̣ng và làm tổn hại đến hê ̣ thầ n kinh. + Dƣ thừa acid aspartic có thể gây ra rối loạn nội tiết và các vấn đề về thị lực. acid Aspartic là một chất kích thích thần kinh, ảnh hƣởng đến hệ thống thần kinh trung ƣơng, gây nên các chứng: nhức đầu, buồn nôn, đau bụng, mệt mỏi, rối loạn giấc ngủ, vấn đề về thị lực, trầm cảm, và bệnh suyễn, động kinh… [11] Giới hạn cho phép (ML) của aspartam trong sản phẩm tạo màu trắng cho đồ uống là 6000 mg/kg, trong thực phẩm bổ sung là 5500 mg/kg, trong bánh mỳ và các sản phẩm bánh nƣớng thông thƣờng và hỗn hợp là 4000 mg/kg, trong kẹo, kẹo mềm, kẹo cứng, kẹo ca su, dấm là 3000 mg/kg, viên xúp và nƣớc thịt là 1200 mg/kg,....[12] 1.2. Một số phƣơng pháp xác định acid benzoic, acid sorbic, saccharin, và aspartam Hiện nay trên thế giới có nhiều phƣơng pháp phân tích đã đƣợc triển khai và chuẩn hóa và chuẩn hóa tại phòng thí nghiệm, bao gồm các phƣơng pháp xác định riêng chất bảo quản cũng nhƣ đƣờng hóa học và các phƣơng pháp xác định đồng thời cả chất bảo quản và đƣờng hóa học: phƣơng pháp chuẩn độ, quang phổ hấp thụ phân tử, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và điện di mao quản. 1.2.1. Phương pháp trắc quang * Xác định hàm lƣợng acid benzoic trong các mẫu thực phẩm: Mẫu thử đƣợc đồng hóa, sau đó đƣợc pha loãng và acid hóa phần mẫu thử. Acid benzoic đƣợc chiết bằng dietyl ete , rồi đƣợc chiết tiếp bằng kiềm Nguyễn Thị Hồng Thúy 7 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
tinh chế bằng oxi hóa sử dụng kali dicromat trong môi trƣờng acid. Acid benzoic tinh sạch hòa tan trong dietyl ete đƣợc xác định bằng cách đo quang ở bƣớc sóng 267,5 nm; 272 nm và 276,5 nm. Độ hấp thụ tính theo acid benzoic trong công thức này đối với phƣơng pháp so sánh ở bƣớc sóng 272 nm là: A2 – (A1 + A3)/2 A1 là độ hấp thụ ở 267,5 nm A2 là độ hấp thụ ở 272 nm A3 là độ hấp thụ ở 276,5 nm Chuẩn bị dãy chuẩn acid benzoic với các nồng độ khác nhau, tiến hành đo độ hấp thụ, dựng đƣờng chuẩn. Dựa vào đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng acid benzoic trong mẫu phân tích.[14] * Xác định hàm lƣợng acid sorbic trong các mẫu thực phẩm: Cất acid sorbic từ mẫu bằng hơi nƣớc, oxy hóa bằng acid crom, dùng acid barbituric tạo phức màu hồng, đo cƣờng độ màu của phức bằng máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 532 nm. Để tính kết quả hàm lƣợng acid sorbic cần chuẩn bị dãy chuẩn acid sorbic với các nồng độ khác nhau, tiến hành đo độ hấp thụ, dựng đƣờng chuẩn. Dựa vào đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng acid sorbic trong mẫu phân tích.[15] Phƣơng pháp này tuy có độ chính xác cao nhƣng phức tạp và tốn nhiều dung môi hóa chất. Đặc biệt là không phân tích đƣợc đồng thời 2 acid. * Xác định đƣờng hóa học: - Nếu mẫu là chất rắn: hòa tan lƣợng mẫu thích hợp và định mức 25 ml với nƣớc khử ion. Nếu là mẫu lỏng, pha loãng thể tích mẫu thích hợp thành 25 ml. Lấy 500 µl dung dịch trên pha loãng thành 10 ml với dung dịch đệm Clark and Lubs (dung dịch gồm KCl 0,2 M và HCl 0,2 M) pH = 1,3. Để xác định Saccharin acesulfam-K trong các chất làm ngọt và bột nƣớc trái cây, sử dụng bƣớc sóng phát hiện saccharin là 206 nm, acesulfam - K là 226 nm. Độ thu hồi đối với cả hai chất phân tích trên nền mẫu thực trong khoảng 93,5 105,1%, sai số tƣơng đối < 5%. [26] Nguyễn Thị Hồng Thúy 8 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
- Để xác định đồng thời 3 chất ngọt nhân tạo (Saccharin, Aspartam, Acesulfame-K) và vitamin C trong đồ uống bằng phƣơng pháp PLS - UV: cân chính xác 0,05 g mẫu, hòa tan và chuyển vào bình định mức 100 ml bằng dung dịch H3PO4 0,1N. Chất phân tích đƣợc đo ở bƣớc sóng từ 190 – 300 nm. Nếu mẫu có chứa màu thực phẩm, các chất phân tích đƣợc chiết bằng dung dịch n - butanol và đƣợc đo ở bƣớc sóng từ 190 – 300 nm. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng cho đồ uống thƣơng mại, đồ uống có màu (dạng bột và chất lỏng). [28] Phƣơng pháp này tƣơng đối chính xác nhƣng tốn dung môi, hóa chất độc hại, không xác định đƣợc đồng thời các chất cần phân tích. 1.2.2 Phương pháp chuẩn độ * Xác định acid benzoic và acid sorbic: Cân 50g mẫu chính xác đến 0,001g chuyển toàn bộ vào bình định mức 250ml, dùng NaOH 10% trung hòa đến trung tính thử bằng giấy đo pH. Thêm 10ml kali feroxyanua 15% lắc đều, để lắng sau đó lọc. Hút 50ml dịch lọc chuyển vào phễu chiết chia độ, trung hòa bằng HCl 10%, thử bằng giấy đo pH sau đó thêm 5ml HCl 10%. Thêm 30ml clorofooc vào phễu chiết lắc trong 5 phút để phân lớp, chiết phần dung dịch nƣớc sang phễu chiết khác, cho thêm 15 ml clorofooc và chiết lại hai lần nữa. Gộp toàn bộ cloroform, có thể cho vào bộ cất thu hồi bớt cloroform ở 650 đến còn lại ¼ thể tích. Chuyển phần cặn còn lại trong cốc sứ và làm bốc hơi trên bếp ở 500 để nguội, dùng 50ml etanol hòa tan cặn trong cốc, thêm 2 giọt phenolphthalein rồi chuẩn độ bằng NaOH 0,05 M. Phƣơng pháp này tốn dung môi hóa chất, độc hại, đặc biệt là phƣơng pháp này phân tích đối với mẫu có hàm lƣợng lớn. [8], [14], [21] * Xác định saccharin: Cân khoảng 0,5g (chính xác đến mg) mẫu thử đã đƣợc làm khô, hòa tan trong 75 ml nƣớc nóng. Làm nguội nhanh và thêm dung dịch phenolphtalein (TS), chuẩn độ với dung dịch natri hydroxyd 0,1 M. Mỗi ml natri hydroxyd 0,1N tƣơng đƣơng với 18,32 mg C7H5NO3S. [7] Phƣơng pháp này cần hóa chất độc hại, chỉ phân tích đƣợc nếu hàm lƣợng chất lớn. 1.2.3. Phương pháp điện di mao quản (CE) Nguyễn Thị Hồng Thúy 9 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Đây là phƣơng pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không ion nhƣng có mối quan hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trƣờng. Do độ linh động điện di của các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách khỏi nhau. Ứng dụng phƣơng pháp này, tác giả Ana Beatriz Bergamo, José Alberto Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus đã xác định đồng thời aspartam, cyclamate, saccharin và acesulfam - K trong đồ uống và các chất làm ngọt bằng điện di mao quản với detector độ dẫn. Phƣơng pháp sử dụng hỗn hợp đệm tris (hydroxymetyl) aminometan (TRIS) 100 mmol/L và 1 histidin (HIS) 10 mmol/L với thời gian phân tích là 6 phút, hiệu suất thu hồi các chất trong khoảng từ 94% đến 108%, độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) trong khoảng 1,5 6,5%.[22] Tác giả Richard A. Frazier và các cộng sự đã xác định đồng thời các chất ngọt nhân tạo acesulfam-K, aspartam, saccharin, chất bảo quản acid benzoic, acid sorbic và 7 phẩm màu quinolin yellow, sunset yellow FCF, carmoisin, ponceau 4R, brilliant lue FCF, green S và black PN trong mẫu nƣớc giải khát bằng phƣơng pháp điện di mao quản. Phƣơng pháp sử dụng chế độ sắc ký điện động học mixen, dung dịch đệm cacbonat 20 mM ở pH 9,5 với dun dịch natri dodecyl sulfat 62 mM trong vòng 15 phút. Kết quả cho thấy giới hạn định lƣợng đối với tất cả các chất là 0,01 mg/ml. [25] Tác giả Trần Phúc Nghĩa đã xây dựng phƣơng pháp định lƣợng Acesulfame - K, Saccharin, Aspartam trong đồ uống, nƣớc giải khát với các điều kiện điện di: bƣớc sóng phát hiện các chất là 215,5 nm, sử dụng dung dịch đệm borat 20 mM ở pH = 9,5, điện thế đặt vào hai đầu mao quản là 25kV, nhiệt độ 25oC, với áp suất bơm mẫu 50 mbar trong thời gian 5s, dòng điện 100µA. Xác định đƣợc giới hạn phát hiện LOD với Asp, Sac, Ace-K lần lƣợt là 3,79 ppm; 6,46 ppm; 4,43 ppm. Giá trị LOQ tìm đƣợc là 4,8 ppm; 1,5 ppm và 3,0 ppm. Sai số tƣơng đối từ 0,75 – 1,85%, giá trị biến thiên CV < 3%. Độ lặp lại tƣơng đối tốt với độ lệch chuẩn (SD) từ 0,2 – 1,5%, hiệu suất thu hồi trên mẫu giả là 96,6 - 101,8%. Đồng thời cũng đánh giá phƣơng pháp trực tiếp trên mẫu thực với hiệu suất thu hồi là 95,2 – 107,0%.[6] Nguyễn Thị Hồng Thúy 10 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên
Phƣơng pháp này có độ nhạy cao, xác định đƣợc đồng thời các chất cần phân tích nhƣng thiết bị đắt tiền, quy trình phân tích phức tạp. 1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Tác giả Ion Trandafir , Violeta Nour, Mira Elena Ionică đã phát triể n phƣơng pháp HPLC pha đảo để định l ƣợng đồng thời acesulfame - K, saccharin, aspartam, caffeine và acid benzoic trong nƣớc giải khát cola không đƣờng. Việc tách sắc ký đƣợc thực hiện bởi sử dụng pha đô ̣ng là đệm kali dihydrogen orthophosphate (pH = 4,3) và acetonitrile (88:12, v/v). Cô ̣t DS hypersil C18 (250 mm x 4,6mm) và detector DAD với bƣớc sóng λ = 227 nm cho acesulfame - K , λ = 265 nm cho saccharin và λ = 217 nm cho aspartam, caffeine và acid benzoic. Thời gian các phân tích khoảng 40 phút, các đƣờng chuẩn tuyến tính tốt trên phạm vi nồng độ 0-100 mg/L. Viê ̣c xác nhâ ̣n giá tri ̣sƣ̉ du ̣ng của phƣơng pháp phân tích đã thƣ̣c hiê ̣n về đô ̣ nhạy, khoảng tuyến tính, độ tái lặp, đô ̣ lặp lại, đô ̣ thu hồ i. [27] Mô ̣t phƣơng pháp sắ c ký ion mới đƣơ ̣c Qing - Chuan Chen, Jing Wang đề xuấ t để xác đinh ̣ đồ ng thời các chất làm ngọt nhân tạo (natri saccharin, aspartam, acesulfame - K ), chất bảo quản (acid benzoic, acid sorbic ), caffeine, theobromine và theophylline. Mẫu đƣợc rung siêu âm, pha loãng, loại tạp bằng K4[Fe(CN)6 và ZnSO4 (mẫu sữa lên men) rồi cho qua cột chiết pha rắn C18. Việc tách đƣợc thực hiện trên một cột trao đổi anion của máy HPLC, phân tích đƣơ ̣ c tiế n hành ở 40°C trong vòng 45 phút và giải hấp theo chế đô ̣ isocratic với dung môi là dung dịch NaH2PO4 5mM (pH 8,20) và acetonitrile theo tỉ lê ̣ 4% (v/v), và detector UV. Các giới hạn phát hiện (signal/noise = 3:1) cho tất cả các chất phân tích ở mức dƣới µg/ml. Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng cho các chế phẩm thực phẩm và dƣợc phẩm, và sự thu hồi trung bình cho mẫu thật trong khoảng 85 -104%. [23] Tác giả N. Dossi và các cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp RP – LC để xác định các chất phụ gia trong nƣớc giải khát. Các chất ngọt nhân tạo (acesulfam, aspartam, saccharin), chất bảo quản (acid benzoic, acid sorbic) và phẩm màu (Ponceau 4R, sunset yellow, tatrazin) đƣợc tách trên cột LiChrosorb RP 18. Pha động là dung dịch đệm phosphat 0,1 M (pH = 4,0) với tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thời Nguyễn Thị Hồng Thúy 11 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên