Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân tích biến đổi của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

--------  -------

PHẠM THỊ BÍCH

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------------------

Phạm Thị Bích

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội – 2012

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, người thầy đã rất quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này.

Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các anh chị và các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, trường Đại học Khoa học tự nhiên. Tôi xin chân thành cảm ơn.

Để thực hiện tốt luận văn này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của cán bộ nhân viên thuộc khoa Trữ máu của Viện huyết học và Truyền máu Trung Ương; khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh thuộc Bệnh viện K- Tam Hiệp, Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn.

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và

luôn bên tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, tháng 03 năm 2012

Học Viên

Phạm Thị Bích

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3

1.1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .............................................. 3

1.1.1. Khái quát về ung thư .......................................................................... 3

1.1.2. Ung thư đại trực tràng là gì ................................................................ 4

1.1.3. Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng.............................................. 4

1.1.4. Các hệ thống phân giai đoạn ung thư đại trực tràng ............................ 6

1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ...................... 8

1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì ....................................................................... 8

1.2.2. Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thư đại trực tràng ............... 9

1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN QUAN ĐẾN

1.4.CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC

BỆNH UNG THƯ…………………………………………………………………12

TRÀNG …………………………………………………………………… 16

1.4.1. Chemokine .................................................................................................. 16

1.4.2. Chemokine CXCL12 và thụ thể của nó CXCR4 .......................................... 19

1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH VÀ METHYL HÓA GEN CXCL12 Ở

BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ................................................... 21

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................... 23

2.1. NGUYÊN LIỆU ............................................................................................. 23

2.1.2. Hóa chất ........................................................................................... 23

2.1.3. Thiết bị............................................................................................. 24

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 24

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô ......................................................... 24

2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ máu ....................................................... 25

2.2.3. Khuếch đại gen CXCL12 bằng phương pháp PCR ........................... 27

2.2.4. Phân tích RFLP ................................................................................ 28

2.2.5. Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP ..... 29

2.2.6. Điện di kiểm tra sản phẩm ................................................................ 32

2.2.7. Kỹ thuật nhuộm bạc ......................................................................... 33

2.2.8. Dự đoán vùng promoter và xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị

trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12 ...................................................... 34

2.2.9. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê ................................... 34

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 35

3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PCR - RFLP ............................................................ 35

3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu ............................................... 35

3.1.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen CXCL12 bằng PCR ........................... 36

3.1.3. Kết quả phân tích RFLP ................................................................... 37

3.1.4. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê ................................... 41

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÌNH TRẠNG METHYL HÓA GEN CXCL12....... 47

3.2.1. Kết quả tách chiết ADN từ mẫu mô .................................................. 47

3.2.2. Kết quả xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên

mã của gen CXCL12 .................................................................................. 48

3.2.3. Khuyếch đại đoạn trình tự nằm trong đảo CpG thuộc vùng promoter

của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP ......................................................... 52

3.2.4. Phân tích tích tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12

ở bênh ung thư đại trực tràng ..................................................................... 53

KẾT LUẬN ........................................................................................................... 62

KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 64

PHỤ LỤC 1 .............................................................................................................. i

PHỤ LỤC 2 ............................................................................................................. ii

PHỤ LỤC 3 ............................................................................................................ iv

PHỤ LỤC 4 ............................................................................................................ ix

PHỤ LỤC 5 ............................................................................................................. x

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribo Nucleic

AJCC American Joint Committee on Cancer

APC Adenomatous polyposis coli

APS Ammonium persulfate

CEA Carcinoembryonic antigen (kháng nguyên ung thư)

CIN Chromosomal instability (sự bất ổn định nhiễm sắc thể)

CPG-CIMP CpG island methylator phenotype

CRC Colorectal cancer (ung thư đại trực tràng)

cs Cộng sự

CXCL12 CXC ligand 12 (phối tử dạng CXC 12)

CXCR4 CXC receptor 4 (thụ thể dạng CXC 4)

Denaturing high performance liquid chromatography DHPLC

FAP

Familial adenomatous polyposis (hội chứng polyp u tuyến theo dòng họ)

FOBT Fecal occult blood test (xét nghiệm máu trong phân)

IUAC International Union Against Cancer

HNPCC

Hereditary nonpolyposis colon cancer (ung thư ruột kết không polyp di truyền)

LOI Loss of imprinting (sự mất dấu ấn)

MAPK Mitogen activated protein kinase

MSI Microsatellite instability (sự bất ổn định vi vệ tinh)

MSP Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng

chuỗi trùng hợp đặc hiệu methyl)

NCBI National Center for Biotechnology Information

PI3KCA Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit

PCR- RFLP Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length

Polymorphism

SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình nucleotide đơn)

SSCP Single strand conformation polymorphism

TBE Tris borate EDTA

TE Tris - EDTA

TEMED Tetramethylethylenediamine

TGF β Transforming growth factor β (yếu tố tăng trưởng chuyển

hóa β)

TNF Tumor necrosis factor (Yếu tố gây hoại tử khối u)

TNM Tumor- lymph node- metastases (khối u-hạch-di căn)

UTĐTT Ung thư đại trực tràng

NST Nhiễm sắc thể

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh học

Bảng 2 Các chemokine thuộc họ CXC

Bảng 3 Các thành phần của phản ứng PCR

Bảng 4

Các thành phần của phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme FastDigest MspI

Bảng 5 Thành phần phản ứng PCR (với thể tích 12,5 µl)

Bảng 6 Thành phần bản gel polyacrylamide 10% (bản 7cm)

Bảng 7 Phân bố genotype giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng theo vị trí khối u

Bảng 8 Phân bố genotype theo giới tính của bệnh nhân

Bảng 9

So sánh phân bố genotype giữa nhóm người bệnh trên 70 tuổi và dưới 70 tuổi

Bảng 10 Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu đối chứng và mẫu bệnh theo vị

trí khối u

Bảng 11 Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo giới tính

Bảng 12 Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo độ tuổi

Bảng 13 Tỷ lệ methyl hóa và không methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12

trên mô u và mô lân cận u

Bảng 14 Thống kê tỷ lệ methyl hóa trong vùng promoter của gen CXCL12 theo các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi

Hình 2 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng

Hình 3 Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu

Hình 4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12

Hình 5 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng

302bp, 202bp và 100bp

Hình 6 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 2 băng 202bp

và 100bp

Hình 7 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng

302bp, 202bp và 100bp (genotype dị hợp tử)

Hình 8 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 1 băng 302bp

Hình 9 Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ mô

Hình 10 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer

Hình 11 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm cpgplot

Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12

Hình 13 Tỷ lệ methyl và unmethyl khảo sát trên 2 loại mô u và lân cận u

Hình 14 Hình ảnh điện di sản phẩm MSP của gen CXCL12 của bệnh nhân ung thư

đại trực tràng

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

MỞ ĐẦU

Ung thư trực tràng là bệnh lý hay gặp trong ung thư đường tiêu hóa, đứng

hàng thứ hai sau ung thư dạ dày và chiếm 1,4 % trong tổng số ung thư. Bệnh tiến

triển tương đối chậm, di căn muộn, nếu phát hiện sớm, điều trị kịp thời và triệt để

thì tỷ lệ sống trên 5 năm đạt 60-80% [26]. Tuy nhiên bệnh thường được phát hiện ở

giai đoạn muộn khi đã di căn hay biến chứng, do đó hiệu quả điều trị rất hạn chế.

Hàng năm, trên thế giới có khoảng 650.000 người được chẩn đoán mắc bệnh

ung thư đại trực tràng và có khoảng 150.000 người chết vì căn bệnh này, đây là loại

ung thư nguy hiểm đứng hàng thứ ba gây tử vong trên thế giới và đứng hàng thứ hai

gây ra tử vong tại Mỹ. Tại Việt Nam, bệnh này chiếm khoảng 15% trong số các loại

ung thư và đang gia tăng một cách rõ rệt. Gần đây, do sự thay đổi trong thói quen ăn

uống giàu chất đạm, ít chất xơ, lạm dụng thức ăn nhanh khiến ung thư đại trực tràng

ngày càng phổ biến. Tuổi mắc căn bệnh chết người này ngày càng trẻ hóa, nhiều

trường hợp mới 18 - 20 tuổi, thậm chí có trẻ mới 12 đã mắc ung thư đại trực tràng

[30].

Trên thế giới ung thư đại trực tràng luôn được các nhà sinh y học quan tâm,

có nhiều nghiên cứu genomics, transcriptomics, proteomics đã được tiến hành. Mục

tiêu của những nghiên cứu này nhằm tìm ra những chỉ thị sinh học cho việc chẩn

đoán bệnh sớm hơn để điều trị kịp thời. Tuy nhiên, đến nay, mới chỉ có

carcinoembryonic antigen (CEA) là chỉ thị sinh học thường dùng cho chẩn đoán

bệnh cho các bệnh nhân trong giai đoạn III, IV, nhưng chi phí cho xét nghiệm còn

rất tốn kém[38].Vì vậy, việc tìm ra những chỉ thị mới dễ nhận biết và có thể phát

hiện chính xác giai đoạn ung thư là cần thiết. Genomics và proteomics là những lĩnh

vực nghiên cứu cho phép xác định các chỉ thị đặc trưng cho bệnh, phục vụ cho công

tác chẩn đoán, điều trị và tìm nguyên nhân bệnh.

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích biến đổi của gen

CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng”, nhằm mục tiêu:

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

1. Nghiên cứu đa hình gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng:

- Xác định được tính đa hình của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực

tràng, so sánh với các mẫu đối chứng.

- Đánh giá mức độ liên quan giữa tính đa hình của gen CXCL12 với các đặc

điểm lâm sàng của bệnh ung thư đại trực tràng ở Việt Nam.

2. Phân tích tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 ở bệnh

nhân ung thư đại trực tràng:

- Xác định được sự phân bố của đảo CpG và mật độ nucleotide CpG trong

các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12.

- Xác định được tình trạng methyl hóa của 1 đảo CpG thuộc vùng promoter

của gen CXCL12.

- Đánh giá mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa gen CXCL12 với các đặc

điểm bệnh học lâm sàng của ung thư đại trực tràng ở người Việt Nam.

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc

thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.1.1. Khái quát về ung thư

Ung thư (u ác tính) là một loại bệnh của các tế bào, biểu hiện là sự phát triển

không bình thường của các tế bào, tăng sinh nhanh chóng về số lượng một cách

không kiểm soát được và tế bào không tuân theo các cơ chế kiểm soát và phát triển

của cơ thể [33]. Trong một số trường hợp, chúng di căn (lan tràn tới các cơ quan ở

xa) (bảng 1).

Bảng 1. Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh bệnh học

U lành tính

U ác tính (ung thư)

- Tế bào ít biệt hóa

- Tế bào biệt hóa cao

- Phân bào nhanh, không tuân theo sự kiểm

- Phân bào ít và chậm

soát của chu trình tế bào

- Không xâm lấn xung quanh

- Xâm lấn xung quanh

- Có vỏ bọc

- Không có vỏ bọc

- Không hoại tử

- Thường hoại tử

- Rất ít tái phát và ít ảnh hưởng tới cơ thể

- Ảnh hưởng lớn tới cơ thể

Ung thư không phải là một bệnh. Bệnh này là một nhóm của hơn 100 bệnh

khác nhau.

Ung thư có thể có nguồn gốc từ bất cứ tế bào nào của cơ thể và có rất nhiều

loại khác nhau trong mỗi vùng của cơ thể. Hầu hết các bệnh ung thư được đặt tên

theo loại tế bào hoặc cơ quan nơi chúng phát sinh. Nếu một khối ung thư lan rộng ra

(di căn), thì khối u mới mang tên giống với tên của khối u nguồn gốc đầu tiên [33].

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

1.1.2. Ung thư đại trực tràng là gì

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là căn bệnh phổ biến, đứng hàng đầu trong

ung thư đường tiêu hóa tại các nước Âu Mỹ. Tại Việt Nam và các nước châu Á,

UTĐTT đứng thứ hai trong ung thư đường tiêu hóa sau ung thư dạ dày. Ở nước ta,

mỗi năm có khoảng hơn 7.300 người mới mắc và hơn 4.100 người tử vong do ung

thư đại trực tràng [34]. Ung thư đại trực tràng là ung thư biểu mô phổ biến hiện nay,

bao gồm ung thư đại tràng và ung thư trực tràng. Đại tràng là phần ruột lớn hình

chữ N gồm đoạn lên, đoạn ngang và đoạn xuống. Trực tràng là phần ruột thẳng nối

giữa đại tràng và hậu môn. Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực

tràng (hình 1). Ung thư đại tràng và ung thư trực tràng thường có liên hệ với nhau

và khó có thể xác định ung thư nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau, vì thế

chúng được gọi chung là ung thư đại trực tràng [35].

Hình 1. Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi [35]

1.1.3. Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng

Các loại ung thư khác nhau có tác nhân gây bệnh khác nhau. Trong ung thư

đại trực tràng thì có rất nhiều tác nhân và các nghiên cứu cho thấy các tác nhân sau

đây có thể gây nguy cơ bị bệnh ung thư đại trực tràng:

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

 Polyp đại trực tràng là bệnh khá thường gặp, đây là những khối u lồi vào

trong lòng đại trực tràng, chúng được hình thành do sự tăng sinh quá mức của niêm

mạc đại trực tràng. Triệu chứng của bệnh thường nghèo nàn và không đặc hiệu.

Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời, đặc biệt nếu xác định rõ và loại bỏ những

polyp bằng thủ thuật cắt polyp qua nội soi sẽ làm giảm thiểu đáng kể nguy cơ polyp

trở thành ung thư.

 Tác nhân lối sống: Những người có thói quen hút thuốc, hoặc có chế độ

ăn uống giàu chất mỡ và ít trái cây, rau quả sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thư đại

trực tràng cao hơn vì nó có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực

tràng, gây viêm loét đại tràng và từ đó có thể dẫn tới ung thư đại trực tràng.

 Bệnh Crohn hoặc chứng lở ruột già: Người bị chứng bệnh gây viêm đại

tràng (như chứng lở ruột già hoặc bệnh Crohn) trong nhiều năm sẽ có nguy cơ mắc

bệnh cao.

 Bệnh sử ung thư cá nhân: Người từng bị ung thư đại trực tràng có thể sẽ

lại bị ung thư đại trực tràng lần thứ hai. Đồng thời, phụ nữ có tiền sử ung thư buồng

trứng, dạ con, hoặc ung thư vú, sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thư đại trực tràng cao

hơn.

 Bệnh sử ung thư trong gia đình: Trong khi phần lớn các trường hợp ung

thư đại trực tràng là các khối u rời rạc thì có rất ít các trường hợp xảy ra do đột biến

gen di truyền. Phổ biến nhất là hội chứng polyp u tuyến theo dòng họ (familial

adenomatous polyposis - FAP) và hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền

(hereditary nonpolyposis colon cancer - HNPCC). Dạng ung thư này thường biểu

hiện từ rất sớm (trung bình dưới 45 tuổi) [20].

Khối u FAP chủ yếu nằm ở vùng ngoại biên (bên trái) trong khi HNPCC chủ

yếu nằm ở vùng đầu gần (bên phải) của đại tràng. Khi có thành viên trong gia đình

được chẩn đoán là mắc ung thư đại trực tràng thì nguy cơ các thành viên khác mắc

căn bệnh này cao gấp nhiều lần so với bình thường, phụ thuộc nhiều vào số thành

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

viên mắc bệnh và độ tuổi mắc bệnh. Thực tế, các nghiên cứu cho thấy phải có tới 20

đến 25% các bệnh nhân ung thư đại trực tràng có tiền sử gia đình mắc căn bệnh này.

1.1.4. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng [39]

Phân loại Duke cho ung thư trực tràng

Năm 1932, Cuthbert E. Dukes, một bác sĩ giải phẫu bệnh ở bệnh viện

St.Mark, đã đưa ra một hệ thống phân loại giai đoạn cho ung thư trực tràng.

Phân loại được chia làm 3 giai đoạn:

- Dukes A: khối u giới hạn ở thành trực tràng.

- Dukes B: những khối u đã vượt thành trực tràng đến những cơ quan cạnh

trực tràng.

- Dukes C: những khối u đã di căn đến hạch lympho vùng.

Phân loại TNM (Tumor, Node, Metastasis)

Phân loại này được đưa ra vào năm 1954 bởi AJCC (American Joint

Committee on Cancer) và IUAC (International Union Against Cancer) dựa trên

những dữ kiện lâm sàng và bệnh học. Phân loại TNM thường dùng để dự báo tỉ lệ

sống sót 5 năm của bệnh nhân ung thư trực tràng.

Phân loại TNM cho ung thư đại trực tràng

U nguyên phát (T):

Tx – không xác định được u.

T0 – không có bằng chứng của khối u.

Tis – u tại chỗ (niêm mạc).

T1 – u xâm lấn lớp dưới niêm mạc.

T2 – u xâm lấn thanh mạc.

T3 – u xuyên qua thanh mạc vào lớp dưới thanh mạc hoặc vào các mô xung quanh

đại tràng hay trực tràng.

T4 – U xâm lấn trực tiếp các cơ quan khác hoặc xuyên vào lớp phúc mạc tạng.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Hạch lympho vùng (N):

Nx – không xác định được hạch.

N0 – không có hạch di căn.

N1 – di căn 1-3 hạch xung quanh đại tràng hoặc trực tràng.

N2 – di căn từ 4 hạch trở lên.

N3 – di căn đến bất kì một hạch nào dọc theo mạch máu chính.

Di căn xa (M):

Mx – không xác định được di căn xa.

M0 – không di căn xa.

M1 – di căn xa.

Nói chung, ung thư đại trực tràng được chia làm các giai đoạn (hình 2):

 Giai đoạn 0: Trong giai đoạn 0, các tế bào bất thường được tìm thấy trong

các lớp trong cùng của đại trực tràng. Những tế bào bất thường có thể trở thành ung

thư và lây lan vào các mô bình thường gần đó. Giai đoạn 0 cũng được gọi là ung thư

biểu mô tại chỗ.

Hình 2. Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [28].

 Giai đoạn I: Ung thư đã bắt đầu lây lan, nhưng vẫn còn trong lớp lót bên

trong.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

 Giai đoạn II: Ung thư đã lan đến các cơ quan khác ở gần đại trực tràng hoặc

trực tràng nhưng chưa lây lan đến các hạch bạch huyết.

 Giai đoạn III: Ung thư đã lan đến hạch bạch huyết nhưng chưa lan đến

những phần xa của cơ thể.

 Giai đoạn IV: Ung thư đã lan đến các phần xa của cơ thể thông qua hệ

thống bạch huyết, được gọi là di căn. Các cơ quan mà ung thư đại trực tràng

thường di căn đến là phổi và gan.

Tỉ lệ sống sót sau 5 năm của ung thư đại trực tràng: Giai đoạn I: 72%. Giai

đoạn II: 54% . Giai đoạn III: 39% . Giai đoạn IV: 7%.[39]

1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì

Chỉ thị sinh học (biomarker) là những phân tử chất được sử dụng như một

chỉ báo của một trạng thái sinh học. Đó là một đặc tính khách quan được đặc trưng

bởi các thông số như các chỉ số hóa sinh, miễn dịch… Do đó, nó được dùng để đánh

giá những quá trình sinh học bình thường, quá trình gây bệnh hoặc các phản ứng

dược của quá trình điều trị [18].

Trong ung thư, chỉ thị sinh học đóng một vai trò quan trọng, nó là công cụ

hữu hiệu, chỉ thị sinh học mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao sẽ giúp cho việc

kiểm soát ung thư tốt hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định nhanh chóng

các đáp ứng của khối u đối với liệu pháp điều trị mới. Ví dụ như đột biến dòng phôi

gen APC là một chỉ thị để chẩn đoán nguy cơ mắc polyp và sự phát triển tiếp theo

của ung thư biểu mô trực tràng, biểu hiện của β-catenin trong tế bào chất và nhân là

một chỉ thị để tiên lượng ung thư biểu mô thực quản. Tuy nhiên, rất ít các chỉ thị

phân tử hiện nay được ứng dụng thực tiễn trong lâm sàng vì sự hạn chế về độ nhạy

và tính đặc hiệu, do đó, cần phải phát triển nhiều hơn nữa các chỉ thị đáng tin cậy có

liên quan tới phần lớn các khối u để có thể sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và điều

trị ung thư.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

1.2.2. Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thư đại trực tràng

Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tìm ra các chỉ thị phân

tử trong chẩn đoán ung thư. Trong đó, nhiều nghiên cứu tập trung vào việc xem xét

mức biến đổi của ADN, các đột biến, đa hình của gen, ... Các nghiên cứu đã cho

thấy trong ung thư đại trực tràng, một số biến đổi về gen đóng vai trò quan trọng

trong sự phát sinh ung thư.

Đột biến gen APC (Adenomatous polyposis coli). APC là gen ức chế khối u

có vai trò điều hòa sự tăng sinh và bám dính tế bào. Sự biến đổi của gen này đóng

vai trò quan trọng, đánh dấu sự hình thành và phát triển của ung thư.

Đột biến gen APC là dạng đột biến phổ biến nhất trong ung thư đại trực tràng

được tìm thấy ở 60 - 80% ung thư đại trực tràng. Đột biến chủ yếu xảy ra trong khu

vực exon 15. Các cá thể sinh ra với một alen đột biến của gen này sẽ phát sinh hàng

trăm, thậm chí hàng nghìn polyp u tuyến ở đại tràng trong lứa tuổi 13 đến 20. Hội

chứng này gọi là hội chứng FAP. Protein APC khu trú trong bào tương, ở đây chúng

tương tác với nhiều protein nội bào khác, trong đó có β-catenin - một protein có thể

đi vào nhân tế bào, hoạt hoá việc phiên mã các gen. Chức năng quan trọng của

protein APC là duy trì mức độ thấp của β-catenin trong bào tương nhờ sự hình

thành phức hệ APC/β-catenin, phức này kích thích sự phân hủy của β-catenin. Sự

bất hoạt gen APC gây hậu quả mất protein APC, dẫn đến làm tăng β-catenin của tế

bào, chất này sẽ xâm nhập vào nhân tế bào và điều hòa tăng sinh tế bào. Hậu quả là

các khối u hình thành trong lớp biểu mô ruột và có thể tiến triển thành ung thư. Vì

vậy, APC là yếu tố điều hòa âm tính của việc truyền tín hiệu β-catenin.

Ngoài ra, những đột biến làm mất chức năng của APC cũng dẫn đến sự bất

ổn định nhiễm sắc thể do APC liên kết với các vi ống làm chúng bị sai lệch [21].

TP53 là một gen ức chế khối u cực kì quan trọng với một số chức năng chủ

yếu như khởi động quá trình apoptosis, sửa chữa ADN bị lỗi và điều khiển chu trình

tế bào. Đột biến gen này dẫn đến sự biểu hiện bất thường của protein p53. Do đó,

khi p53 mất chức năng thì các tế bào sẽ tiếp tục phân chia mang theo các sai hỏng

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

ADN, tích lũy qua mỗi chu trình tế bào và đến một lúc nào đó tế bào không kiểm

soát được hoạt động phân bào nữa và chuyển sang trạng thái ung thư.

Một số gen gây ung thư như RAS và BRAF cũng đóng vai trò quan trọng

trong việc phát triển căn bệnh ung thư trong đó có: Đột biến RAS xảy ra ở 37% các

trường hợp mắc ung thư đại trực tràng và 13% đối với BRAF. Các đột biến RAS mà

phần lớn là ở KRAS đã làm hoạt hóa GTPase, vốn có vai trò dẫn tín hiệu trực tiếp

đến RAF. Các đột biến BRAF ảnh hưởng tới enzyme MAPK (mitogen activated

protein kinase) vốn có vai trò điều hòa một số hoạt động của tế bào (như phân bào,

tăng sinh, biệt hóa tế bào, chết theo chu trình) và sau đó điều khiển các lớp tín hiệu

dẫn tới con đường tín hiệu này bị hạn chế từ đó ảnh hưởng tới hoạt động của tế bào.

Các đột biến BRAF có thể phát hiện được ngay cả ở các polyp nhỏ và so với các đột

biến RAS thì chúng phổ biến hơn ở các polyp tăng sản, các u tuyến dạng khía và các

ung thư đại trực tràng phần đầu gần, và đặc biệt là ở các trường hợp ung thư có kiểu

hình methyl hóa đảo CpG - CIMP (CpG island methylator phenotype) [16]. Năm

2003, Shield và cộng sự khi nghiên cứu về gen KRAS (gen gây ung thư) cho thấy

đột biến này có vai trò chuyển ung thư đa u tuyến từ giai đoạn trung gian.

Sự methyl hóa ADN

Như đã biết, những biến đổi di truyền bao gồm các đột biến trong gen gây

ung thư, các gen gây ức chế khối u gây ung thư, tuy nhiên chỉ khoảng 10% bệnh

nhân thuộc kiểu genotype kiểu cổ điển này. Ngoài ra, sự phát sinh ung thư còn có

thể do cơ chế biến đổi ngoại di truyền gây ra.

Di truyền ngoại sinh (Epigenetics) là sự biến đổi trong biểu hiện gen mà sự

biến đổi này không phải do những biến đổi trình tự base trên ADN, bao gồm sự

methyl hóa ADN, biến đổi histone,…Trong đó, di truyền ngoại sinh được nghiên

cứu nhiều nhất là sự methyl hóa ADN.

Methyl hóa là sự gắn nhóm methyl vào vị trí C thứ 5 ở cytosine của vòng

pyrymidine nhờ enzyme methyl transferase. Có 3 dạng methyl hóa ADN khác nhau

được biết đến liên quan tới ung thư, đó là: sự giảm methyl hóa (hypomethylation),

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

tăng cường methyl hóa (hypermethylation) và sự mất đi dấu ấn gen (loss of

imprinting – LOI).

Bình thường có 3-6% cytosine bị methyl hóa trong tế bào bình thường ở

người. Cặp nucleotide CpG là vị trí trong vùng giàu CpG, còn được gọi là đảo CpG.

LOI là hiện tượng có sự mất biểu hiện hay hoạt hóa biểu hiện của các alen

bố mẹ trong các khối u. Sự giảm methyl hóa ADN xảy ra ở giai đoạn tiến triển của

bệnh, liên quan tới sự tăng cường phiên mã của gen (như các gen gây ung thư).

Trong khi đó thì sự tăng cường methyl hóa ADN lại xảy ra tại các vị trí điều hòa

đặc hiệu ở các vùng promoter, dẫn tới sự ngăn cản phiên mã từ đó gây bất hoạt gen

(như ở các gen ức chế khối u). Chính sự tăng cường methyl hóa ADN này đã trở

thành một lĩnh vực được quan tâm lớn trong nghiên cứu ung thư hiện nay [12].

Ngoài ra, sự methyl hóa ADN còn đóng vai trò trung tâm trong sự đánh dấu của

gen, sự phát triển của phôi, sự im lăng NST X và sự điều khiển chu trình tế bào.

Đã có những bằng chứng chứng tỏ rằng sự methyl hóa bất thường là một

hiện tượng phổ biến trong ung thư và đó có thể là sự thay đổi sớm nhất trong sự

phát sinh ung thư .

Năm 2010, Kim và cs thuộc trường đại học y John Hopkins, Hoa Kỳ qua

việc tổng hợp từ hơn 40 bài báo khác nhau đã đưa ra một bản tổng hợp về tình trạng

methyl hóa của 59 gen khác nhau trên mô đại trực tràng, 19 gen được phân tích từ

mẫu huyết tương, huyết thanh hoặc mẫu phân. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ

methyl hóa là: 76,2% ở CXCL12, 32% ở E-Cadherin, 100% như ở Cyclin

A1,…Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy có sự tăng cường methyl hóa cao ở

các gen của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, trong khi đó tỷ lệ này rất thấp và gần

như là 0% ở người bình thường, điều đó cho thấy tình trạng tăng cường methyl hóa

ADN có thể là yếu tố quan trọng góp phần vào sự phát sinh ung thư đại trực tràng

[12]. Sự methyl hóa ADN có thể được phát hiện trong các ADN bắt nguồn từ mẫu

mô, mẫu phân hoặc dịch cơ thể.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Vì vậy, nếu các phương pháp nghiên cứu sự methyl hóa ADN khi được tối

ưu hóa về độ nhạy và độ đặc hiệu của nó sẽ giúp xác định chính xác những khác

biệt trong tình trạng methyl hóa ADN giữa bệnh nhân ung thư và người bình

thường, cho thấy rằng đây có thể là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện sớm

bệnh và là một chỉ thị tầm soát mới cho ung thư đại trực tràng.

1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN

QUAN ĐẾN BỆNH UNG THƯ

PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length

Polymorphism)

Đây là kĩ thuật truyền thống, được sử dụng để lập bản đồ gen, xác định đột

biến điểm. Kĩ thuật này được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu ung thư ở cấp độ

đột biến gen.

Nguyên lí cơ bản của phương pháp này là dựa vào tính chất của enzyme giới

hạn, có thể nhận biết một trình tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnh

nhỏ có chiều dài khác nhau. Các mảnh giới hạn này sau đó được phân tách theo

chiều dài của chúng bằng phương pháp điện di trên gel agarose/polyacrylamide và

được chuyển qua màng bằng phương pháp lai Southern blot. Trên màng có những

đầu dò ADN để xác định những đoạn ADN giới hạn có thể bắt cặp bổ sung với. đầu

dò RFLP xảy ra khi chiều dài của các đoạn giới hạn khác nhau ở những mẫu khác

nhau. Mỗi đoạn giới hạn đó được gọi là một alen và có thể dùng để phân tích di

truyền. Phân tích RFLP thường được hỗ trợ bằng kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn

gen cần phân tích. Chính vì thế, kĩ thuật này thường được gọi là PCR-RFLP. Tùy

theo mục đích và dựa vào đặc điểm của gen cần nghiên cứu, người ta có thể thực

hiện phương pháp PCR-RFLP theo các cách khác nhau, có thể đơn giản hóa hoặc

tiến hành cùng một số phương pháp khác.

SSCP (Single strand conformation polymorphism)

Một phương pháp đơn giản khác được sử dụng trong nghiên cứu đột biến

điểm là phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN. Cấu trúc

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

không gian 3 chiều của phân tử ADN sợi đơn được xác định bởi trình tự và môi

trường chứa chúng. Do đó, trong trường hợp điều kiện môi trường không thay đổi,

cấu trúc của chúng chỉ phụ thuộc vào trình tự nucleotide và bất cứ thay đổi nào

trong đó cũng làm thay đổi cấu hình sợi đơn. Khi điện di trên gel polyacrylamide

không biến tính, các cấu hình khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và phân

tách ra. Những yếu tố khác ảnh hưởng đến cấu hình sợi đơn như nhiệt độ, pH, đệm

chạy có thể được sử dụng để tăng khả năng phân tách. Nhìn chung, nhiệt độ và pH

thấp giúp duy trì cấu hình và dễ dàng phân biệt được các phân tử ADN có trình tự

khác nhau.

DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography)

Đây là phương pháp phân tích ADN dị sợi kép. Thay vì sử dụng gel và phân

tách ADN bằng điện di, ADN được phân tách bằng sắc ký HPLC. Các mạch ADN

được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau

và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Các phân tử

dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường. DHPLC

là một kĩ thuật mạnh, đơn giản và mẫu được đưa vào tự động. Với những tiến bộ

gần đây trong việc phát triển phần mềm dự đoán đường cong biến tính, phương

pháp này có độ nhạy cao và khả năng tái sử dụng tốt.

Real Time PCR

Trong sinh học phân tử, đây là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN

được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Kĩ thuật này cho phép phát

hiện và định lượng tuyệt đối số lượng bản sao của một hay nhiều trình tự cụ thể của

một mẫu ADN. Hai phương pháp để định lượng là nhuộm huỳnh quang không đặc

hiệu với trình tự ADN kép và lai sản phẩm với một đầu dò ADN đặc hiệu có gắn

huỳnh quang. Qua mỗi chu kì của phản ứng, lượng sản phẩm tăng lên dẫn đến sự

gia tăng tỉ lệ phát huỳnh quang. Qua đó có thể dựa vào số đo huỳnh quang để định

lượng chính xác lượng sản phẩm. Đây được coi là hướng tiếp cận mới so với PCR

chuẩn, được sử dụng nhiều trong cả khoa học cơ bản và trong chẩn đoán.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Giải trình tự

Phần lớn các phương pháp nói trên được sử dụng để sàng lọc bước đầu đột

biến điểm/SNPs. Để khẳng định chính xác đột biến hay biển đổi người ta phải giải

trình tự trực tiếp. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện nay

đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được gọi là

phương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phương pháp dideoxy) [3].

Theo phương pháp này, một trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị

trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một oligonucleotide ngắn, có trình tự

bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó. Các mồi oligonucleotide được kéo dài nhờ

tác dụng của enzyme ADN polymerase. Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại

deoxynucleotide A, T, G, C trong đó có một loại là di-deoxynucleotide để ngắt phản

ứng kéo dài chuỗi.

Các đoạn ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gel

polyacrylamide, hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự ADN. Ngày

nay, phương pháp giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí

nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý như trên. Với sự phát

triển của các enzyme ADN polymerase và các hợp chất hóa học, phương pháp này

cho phép sàng lọc SNPs hiệu quả rất cao khi so sánh với các kỹ thuật đã miêu tả

trên. Cho đến nay, nó đã được cải tiến thành giải trình tự tự động và sử dụng chất

huỳnh quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với

độ nhạy rất cao. Ưu điểm lớn nhất của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về

điểm đột biến như: loại đột biến, vị trí, hậu quả. Tuy nhiên nó có hạn chế là đòi hỏi

sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt

tiền.

Kỹ thuật phân tích ADN microarray

Đây là một trong những kỹ thuật được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu

genomics tìm các chỉ thị về gen. Phân tích ADN microarray có thể đo mức độ biểu

hiện ARN của hàng nghìn gen cùng một lúc, sự biểu hiện gen có thể được sử dụng

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

để phân biệt các dạng khối u cũng như có ý nghĩa trong chẩn đoán bệnh. Điều này

đã được chứng minh với ung thư vú và trong ung thư bạch cầu ác tính. Các mảnh

ADN trên các tấm kính mỏng được lai với các mẫu cADN, chúng có thể được

nhuộm huỳnh quang đỏ và xanh. Phụ thuộc vào mối tương tác của mẫu phân tích,

mỗi điểm trên kính có thể phát ra tín hiệu màu đỏ hoặc xanh. Các gen có thể được

tập hợp lại thành nhóm và có thể so sánh giữa các mẫu.

Một số phương pháp trong nghiên cứu sự methyl hóa ADN

Sự methyl hóa ADN trong vùng promoter của các gen khác nhau có thể đóng

vai trò làm chỉ thị sinh học trong việc phát hiện sớm ung thư từ ADN có trong mẫu

phân và mẫu máu của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, giúp cho việc theo dõi và

điều trị bệnh hiệu quả hơn. Các nghiên cứu tình trạng methyl hóa ADN chủ yếu sử

dụng kỹ thuật PCR làm cơ sở do độ nhạy và khả năng ứng dụng cao của kỹ thuật

này. Sau đây là một số phương pháp phổ biến dùng để khảo sát tình trạng methyl

hóa ADN:

MSP (Methyl Specific PCR)

Hiện nay, kỹ thuật MSP được sử dụng phổ biến nhất do tính đơn giản, nhạy

và chi phí hợp lý của nó, chủ yếu để phát hiện sự tăng cường methyl hóa tại một

vùng promoter quan tâm của một số gen có chức năng quan trọng, liên quan tới sự

bất hoạt gen đó trong các bệnh ung thư ở người [9]. Đây là kỹ thuật nhanh chóng

phát hiện được sự methyl hóa của bất kỳ vị trí CpG nào trong một đảo CpG. Đầu

tiên, ADN được biến đổi với sodium bisulfite để chuyển hóa tất cả các cytosine

không bị methyl hóa thành uracil, sau đó, ADN này được khuếch đại lên qua phản

ứng PCR bằng cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho đoạn trình tự bị methyl hóa và không

bị methyl hóa. Kỹ thuật MSP đòi hỏi lượng ADN rất ít, phát hiện nhạy tới 0,1% các

alen bị methyl hóa trên locus đảo CpG quan tâm và cũng có thể thực hiện được với

ADN tách chiết từ các mẫu đúc paraffin. Kỹ thuật MSP hạn chế được các kết quả

dương tính giả từ các nghiên cứu trước đó dựa trên PCR và sự phân cắt của enzyme

giới hạn để phân biệt giữa ADN bị methyl hóa và không bị methyl hóa.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

MethyLight

Đây là kỹ thuật định lượng, phát triển dựa trên kỹ thuật MSP. Kỹ thuật này

cho phép phân biệt được các vị trí methyl hóa và không methyl hóa trên cùng một

mẫu. Để phát hiện ra các vị trí methyl, đầu dò đánh dấu FAM được sử dụng trong

khi đầu dò đánh dấu VIC phát hiện ra các vị trí không methyl. Kỹ thuật này có độ

nhạy và độ đặc hiệu cao, chỉ cần một lượng ADN rất nhỏ là có thể phát hiện ra các

alen bị methyl hóa trong sự có mặt của 10.000 các alen không bị methyl hóa khác,

tuy nhiên chi phí cho phương pháp này là khá cao [6].

Pyrosequencing

Phương pháp này được sử dụng để phân tích ADN đã được xử lý với

bisulfite mà không cần sử dụng kỹ thuật MSP. Sau khi dùng PCR khuếch đại vùng

gen quan tâm thì pyrosequencing được sử dụng để xác định trình tự đã biến đổi với

bisulfite của các vị trí CpG đặc hiệu trong vùng. Tỷ lệ C chuyển thành T tại các vị

trí riêng biệt có thể được định lượng dựa trên tỷ lệ kết hợp của C và T trong suốt

quá trình kéo dài chuỗi. Hạn chế duy nhất của phương pháp này chính là giá thành

cao, tuy nhiên giải trình tự luôn là phương pháp chính xác nhất để xác định trình tự

ADN, nên kỹ thuật này thường được sử dụng trong việc khẳng định kết quả nghiên

cứu cuối cùng từ các phương pháp khác.

1.4. CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC

TRÀNG

1.4.1. Chemokine

Chemokine là những cytokine có bản chất là protein, có kích thước 8-14

kDa, có khả năng di chuyển trực tiếp hoặc hóa hướng động, có khả năng hòa tan.

Nó liên kết và hoạt hóa với một họ các thụ thể chemokine.

Chemokine được sản xuất trong những giai đoạn sớm nhất của nhiễm trùng.

Các phân tử này được phát hiện cách đây không lâu. Chúng phát huy tác dụng hóa

hướng động đến các tế bào có khả năng đáp ứng gần đó. Interleukine-8 là

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

chemokine đầu tiên được nghiên cứu rõ ràng và nó là đại diện tiêu biểu của họ này.

Tất cảc các chemokine đều có trình tự sắp xếp amino acid giống nhau và các thụ thể

của chúng có đến 7 vùng xuyên màng. Các tín hiệu của chemokine sau khi gắn với

thụ thể sẽ được truyền thông qua protein G.

Tổng cộng khoảng 50 chemokine đã được xác định, chia thành 4 họ (CXC,

CX3C, CC, và C) [11]. Để phân biệt các chemokine trong dưới họ thì người ta thêm

L (có nghĩa là ligand- phối tử) và số thứ tự tương ứng theo từng dòng và đặc điểm

của nó (bảng 2).

Thụ thể của chemokin gồm các thụ thể được đặt tên CCR1 đến CCR11 và

CXCR1 đến CXCR7, XCR1 và CX3CR1. Hầu hết các thụ thể đều gắn trên bề mặt

màng thế bào, tuy nhiên cũng có một số thụ thể tự do, hòa tan lưu hành trong máu

[15].

Chemokine và thụ thể của nó đóng vai trò quan trọng trong quá trình viêm,

nhiễm, tổn thương mô, dị ứng, các bệnh về tim mạch và các khối u ác tính. Một

trong những chức năng quan trọng nhất của phức hệ chemokine và thụ thể của nó là

điều hòa quá trình di căn. Thụ thể chemokine có thể giúp cho việc phát tán tế bào

ung thư dễ dàng hơn trong mỗi giai đoạn chính của quá trình di căn, bao gồm việc

gắn các tế bào khối u vào nội mô, giúp chúng thoát khỏi mạch máu, di căn xâm lấn,

tăng sinh mạch máu, tăng sinh nhanh…Thêm vào đó, chemokine lại đóng vai trò

quan trọng trong việc liên hệ giữa các tế bào ung thư và các tế bào bình thường

trong vi môi trường khối u (tumor microenvironment-TME), nơi chứa các tế bào nội

biểu mô và các nguyên bào sợi. Chúng thúc đẩy sự di chuyển, sự hoạt hóa của bạch

cầu trung tính và các đại thực bào liên quan tới khối u trong môi trường TME [17].

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Bảng 2. Các chemokine thuộc họ CXC [33]

CXC chemokines

Tên Gene Tên gọi khác Thụ thể

CXCL1 Scyb1 Gro-a, GRO1, NAP-3, KC CXCR2

CXCL2 Scyb2 Gro-ß, GRO2, MIP-2a CXCR2

CXCL3 Scyb3 Gro-, GRO3, MIP-2ß CXCR2

CXCL4 Scyb4 PF-4 CXCR3B

CXCL5 Scyb5 ENA-78 CXCR2

CXCL6 Scyb6 GCP-2 CXCR1, CXCR2

CXCL7 Scyb7 NAP-2, CTAPIII, ß-Ta, PEP

CXCL8 Scyb8 IL-8, NAP-1, MDNCF, GCP-1 CXCR1, CXCR2

CXCL9 Scyb9 MIG, CRG-10 CXCR3

CXCL10 Scyb10 IP-10, CRG-2 CXCR3

CXCL11 Scyb11 I-TAC, ß-R1, IP-9 CXCR3, CXCR7

CXCL12 Scyb12 SDF-1, PBSF CXCR4, CXCR7

CXCL13 Scyb13 BCA-1, BLC CXCR5

CXCL14 Scyb14 BRAK, bolekine

CXCL15 Scyb15 Lungkine, WECHE

CXCL16 Scyb16 SRPSOX CXCR6

CXCL17 VCC-1 DMC, VCC-1

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

1.4.2. Chemokine CXCL12 và thụ thể của nó CXCR4

CXCL12

CXCL12 là một chemokine dạng CXC, nó còn có tên khác là yếu tố bắt

nguồn từ tế bào đệm (stroma-derived factor-1, SDF-1), được phân tách lần đầu tiên

từ dòng tế bào đệm bắt nguồn từ tủy xương và có biểu hiện trong nhiều loại mô

khác nhau. Chemokine CXCL12 có hai đồng phân chính là α và β, cả hai dạng này

đều mã hóa bởi một gen CXCL12 nằm trên NST số 10 nhưng hình thành theo hai

hướng khác nhau nhờ cơ chế cắt nối luân phiên. Dạng β được phân biệt bởi 4 amino

acid thêm vào đầu C, dạng α phổ biến hơn và được tiết ra bởi các tế bào đệm tủy và

tế bào nội mô trong phần lớn các cơ quan, có khối lượng phân tử là 7,8kDa [17].

CXCL12 được tiết ra trong các mô bị tổn thương, đã tạo nên vi môi trường

giúp cho việc thu hút các tế bào gốc tạo mô tới khu vực bị tổn thương, thực hiện

chức năng của mình và kết quả là mô đó được sửa chữa.

Chemokine CXCL12 liên kết với 2 thụ thể là CXCR4 và CXCR7.

CXCR4

CXCR4 là một thành viên của họ thụ thể chemokine CXC, được mã hóa bởi

gen nằm trên NST số 2. CXCR4 là một protein có 7 vùng xuyên màng cùng gắn kết

với protein G, có 3 cấu trúc loop thuộc đầu N nằm bên ngoài bề mặt tế bào và 3 cấu

trúc loop thuộc đầu C nằm bên trong tế bào chất. Một trong số các loop nội bào của

thụ thể chemokine đồng gắn kết với protein G và làm trung gian để phối tử gắn kết

với thụ thể hình thành phức hệ chuyển tín hiệu [17].

Vai trò của phức hệ CXCL12/CXCR4 trong ung thư

Chemokine và thụ thể của nó đóng vai trò quan trọng trong quá trình viêm

nhiễm, lây nhiễm, tổn thương mô, dị ứng, các bệnh về tim mạch và các khối u ác

tính [16].

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

CXCR4 liên kết với CXCL12 tạo thành phức hệ CXCL12/CXCR4 giúp hoạt

hóa các quá trình di chuyển tế bào theo con đường CXCL12/CXCR4. Nếu CXCR4

bị tổn thương có thể gây chết phôi thai do không có khả năng tạo máu, hình thành

mạch và vận chuyển tế bào thần kinh.

Trong ung thư, phức hệ CXCL12/CXCR4 thường được nghiên cứu để làm

chỉ thị sinh học cho các loại ung thư vì nó đóng vai trò quan trọng trong việc di

chuyển các tế bào ung thư di căn như trong ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung

thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi, não, vòm họng, khối u ác tính, ung thư thực quản,

ung thư bàng quang, ung thư đại trực tràng, ung thư biểu mô tế bào đáy, u xương ác

tính, bệnh bạch cầu và bệnh u xương mãn tính.v.v..

Về sinh lý, phức hệ CXCL12/CXCR4 tham gia vào việc di chuyển của một

tập hợp con của các tế bào phôi thai, tham gia vào phát triển hệ thống thần kinh

trung ương, xương, tủy và tim. Các tín hiệu di chuyển được sử dụng trong phôi

dường như được nhân đôi trong sự tiến triển khối u và di căn. CXCL12 được tiết ra

bởi các nguyên bào sợi đệm từ môi trường nội mô của khối u có thể liên kết với

CXCR4 trên tế bào khối u và kích thích nhu động tế bào hoặc hoá hướng động tạo

ra một gradient CXCL12, trong đó nồng độ CXCL12 tăng dần ở vị trí quanh khối u.

Chính vì tập trung nồng độ cao ở quanh khối u, CXCL12 kích thích các tế bào bạch

cầu di chuyển đến vùng có khối u, làm nồng độ các loại tế bào này tăng lên.

Ngoài ra, phức hệ này còn giúp cho việc phát sinh mạch máu ở các tế bào

khối u. CXCL12 kích thích sự hình thành cấu trúc dạng mao dẫn với các tế bào nội

mô mạch ở người bằng cách thu hút các tế bào tua PDC (plasmacytoid dendritic

cells) vào trong vi môi trường khối u và phát sinh mạch máu cho khối u đó thông

qua việc sản sinh ra IL-8 và TNF-α [14] .

Thông qua CXCL12, các tế bào nội mô mạch di chuyển, phát triển mở rộng

và sống sót để hình thành một mạng lưới chức năng cần thiết cho sự phát triển mạch

máu của khối u trong nhiều dạng ung thư khác nhau.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Như đã biết, phức hệ CXCL12/CXCR4 đóng vai trò quan trọng trong việc

hàn gắn mô bị tổn thương bằng cách thu hút các tế bào gốc tạo mô về tập trung tại

khu vực đó và thực hiện chức năng sửa chữa, trong khi đó đối với các bệnh ung thư

thì phức hệ này lại tham gia vào quá trình di căn và phát sinh mạch máu cho khối u.

Như vậy, có thể thấy rằng sự rối loạn bất thường của trục tín hiệu trên có thể

là một nguyên nhân góp phần vào quá trình phát triển ung thư.

1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH VÀ METHYL HÓA GEN CXCL12 Ở

BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu đa hình gen như:

Nghiên cứu đa hình gen CXCL12-A ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng của

Dimberg và cộng sự (2007) tiến hành trên các mẫu bệnh nhân người Thụy Điển.

Theo kết quả của nghiên cứu này thì không thấy sự khác biệt đáng kể trong phân bố

genotype và tần xuất alen giữa bệnh nhân ung thư đại trực tràng và mẫu đối chứng

[8].

Hidalgo-Pascual và cộng sự (2007) đã nghiên cứu đa hình gen CXCL12-A

trên mẫu bệnh nhân người Tây Ban Nha. Kết quả cho thấy, không có khác biệt đáng

kể trong phân bố genotype và tần xuất alen của bệnh nhân ung thư đại trực tràng so

với đối chứng. Tuy nhiên, nghiên cứu này đã chỉ ra có sự khác biệt đáng kể trong

phân bố genotype giữa nam và nữ[10].

Nghiên cứu về quá trình methyl hóa thì Wendt và cộng sự [22] đã khảo sát

tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP và giải trình tự

cho kết quả là 62% trong số 21 mẫu ung thư biểu mô đại trực tràng có sự methyl

hóa promoter của CXCL12. Như vậy chính sự tăng cường methyl hóa trên là một cơ

chế làm ngừng hoạt động gen CXCL12 ở biểu mô ung thư đại trực tràng.

Tại việt Nam, hướng nghiên cứu chỉ thị sinh học trong ung thư đại trực tràng

và đặc biệt là chỉ thị methyl hóa và nghiên cứu về đa hình gen liên quan đến ung thư

đại trực tràng vẫn là một hướng nghiên cứu mới. Tuy nhiên có những nghiên cứu

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

gần đây như nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Vân và cộng sự (2011): Phân tích

exon 16 và 19 gen MLH1 liên quan đến ung thư đại trực tràng không polyp di

truyền (HLPCC) bằng PCR- RFLP [4]. Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy trong

26 bệnh nhân bệnh nhân người Việt Nam bị ung thư dạ dày, đại tràng, đại trực tràng

thì vị trí đột biến 528 và 718 tương ứng ở 2 exon 16 và 19 đều có kiểu gen là đồng

hợp tử CC. Nghiên cứu của Phạm Thu Huyền và Trịnh Hồng Thái (2011): Phân tích

tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

[2]. Nghiên cứu này chỉ ra rằng tỷ lệ methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 ở

20 bệnh nhân ung thư đại trực tràng là 80% (16/20 bệnh nhân), tỷ lệ không methyl

hóa là 55% (11/20 bệnh nhân). Tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12

của bệnh nhân ung thư đại trực tràng xảy ra chủ yếu tại vị trí tập trung nhiều tế bào

ung thư (76,47% trên mô u), sai khác giữa mô u và lân cận u là có ý nghĩa thống kê

với p< 0,05. Tỷ lệ methyl hóa này không phụ thuộc và các đặc điểm lâm sàng bao

gồm tuổi, giới tính, dạng ung thư, số lượng, vị trí và kích thước hạch với p> 0,05

[2].

Nhìn chung, các nghiên cứu về đa hình và methyl hóa ở gen CXCL12 đều

nhằm mục đích tìm sự biến đổi ở gen CXCL12 và mối liên quan giữa sự biến đổi đó

với bệnh ung thư đại trực tràng.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Gồm mẫu mô và mẫu máu

Mẫu mô là mẫu của người mắc bệnh ung thư đại trực tràng lấy tại vị trí khối

u. Mẫu so sánh là mô đại trực tràng lân cận, cách 5-10cm so với vị trí khối u đó.

Tổng cộng 25 mẫu mô được phân tích.

Mẫu mô sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh,

Bệnh viện K Tam Hiệp, Hà Nội cung cấp. Mẫu mô được cho vào ống eppendorf, vận chuyển về phòng thí nghiệm trong ni tơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu – 80oC.

Máu người bình thường và người mắc bệnh ung thư đại trực tràng đã được

chống đông bằng EDTA. Mẫu máu người bệnh được lấy từ bệnh viện Hữu Nghị

Việt Đức, Hà Nội gồm 42 mẫu (19 nữ và 23 nam) trong đó có:

Mẫu bệnh có độ tuổi từ 19 đến 87 tuổi, tập trung nhiều nhất ở khoảng trên 60

tuổi.

Mẫu đối chứng gồm 44 mẫu, được lấy từ những người cho máu tình nguyện

tại Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương.

2.1.2. Hóa chất

- Cặp mồi CXCL12 dùng cho phân tích đa hình (F, R) (IDT, Mỹ), Agarose

do hãng Invitrogen (Mỹ) cung cấp.

- Enzyme: Proteinase K, Fastdigest® MspI của hãng Fermentas (Đức)

- Cặp mồi CXCL12 (U-f, U-r, M-f, M-r) (IDT, Mỹ) dùng cho phân tích

methyl.

- Sodium bisulfite (Sigma, Mỹ).

- Hydroquinone (Sigma, Mỹ).

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

- Enzyme HotStarTaq ADN Polymerase (QIAGEN, Đức).

- Enzyme CpG Methyltrasferase (M.SssI) (New England Biolabs, Mỹ).

- Kit tách chiết ADN từ mô: QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN, Đức).

- Kit tinh sạch ADN: QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Đức).

và các hoá chất khác như:

- dNTPs của Fermentas, Taq polymerase của hãng Biorad (Mỹ) cung cấp.

- Phenol, Chloroform, Isopropanol của hãng Sigma Aldrich (Mỹ).

- Hóa chất nhuộm bạc: AgNO3, Na2CO3, HCHO…

- Acid boric, Tris-base, ETDA, ethanol, ...

- Tất cả các hóa chất được sử dụng đều có độ sạch phân tích.

2.1.3. Thiết bị

Bao gồm các thiết bị và máy móc của phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh

học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên như:

- Máy li tâm, li tâm lạnh (Eppendorf, Đức).

- Thiết bị điện di ngang: Mini-Subcell GT (Bio-Rad, Mỹ).

- Thiết bị điện di đứng Mini-protein 3 (Bio-Rad, Mỹ).

- Máy nhân gen PCR (Applied Biosystem, Mỹ).

- Máy Speed vac (Thermo Scientific, Mỹ).

- Ngoài ra còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân

phân tích, cân kỹ thuật, tủ lạnh -20oC, máy vortex …

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

- Sử dụng kit tách chiết ADN từ mô QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN,

Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.

- Cắt 25mg mô cho vào trong ống 1,5ml, thêm 180µl đệm ATL.

- Thêm 20µl proteinase K, trộn bằng vortex, và ủ ở 56ºC cho đến khi mô

được thủy phân hoàn toàn. Vortex thường xuyên trong quá trình ủ.

- Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

- Thêm 200µl đệm AL vào mẫu, trộn bằng vortex trong 15 giây, và ủ ở 70ºC

trong 10 phút. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

- Thêm 200µl ethanol (96 – 100%) vào mẫu, trộn bằng vortex trong 15 giây.

Sau khi trộn, ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

- Cho toàn bộ hỗn hợp vào cột QIAamp Spin Column. Đóng nắp, ly tâm ở

6000g (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Đặt cột vào ống 2ml sạch và loại bỏ ống có

chứa dịch.

- Thêm 500µl đệm AW1. Đóng nắp, ly tâm ở 6000g (8000 vòng/phút) trong

1 phút. Đặt cột vào ống 2ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

- Thêm 500µl đệm AW2. Đóng nắp, ly tâm ở tốc độ tối đa 20.000g (14.000

vòng/phút) trong 3 phút. Có thể lặp lại bước này thêm 1 phút nếu chưa hết dịch trên

cột.

- Đặt cột vào ống 1,5ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch. Thêm 200µl đệm

AE hoặc nước sạch. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 6000g (8000

vòng/phút) trong 1 phút. Lặp lại bước trên 1 lần nữa.

- Kết quả thu được 400µl ADN

2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ máu

ADN tổng số được tách chiết từ máu theo phương pháp của PitroChomczy

và Nicoleta Sacchi [29] bằng cách dùng phenol: chloroform: isopropanol (25:24:1)

bao gồm các bước sau:

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

- Lấy 250µl máu cho vào ống Eppendorf 1,5 ml.

Bổ sung 250µl đệm phân giải (Tris-HCl 10mM, Succroz 0,32M, MgCl2

5mM, Triton X100 1%), trộn đều và để trong lạnh 10-15 phút.

- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 6000 vòng/phút trong 7 phút, bỏ dịch nổi, thu

cặn.

- Lặp lại bước 2 và 3 lần thứ 2 để loại bỏ hoàn toàn huyết sắc tố.

- Thêm 250µl đệm PBS 1x (NaCl 3mM, KCl 0,5mM, Na2HPO4 2mM,

KH2PO4 0,35M), trộn đều, để trong lạnh 10-15 phút.

- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 10000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch nổi,

thu cặn.

- Bổ sung 500µl đệm Lysis (SDS 2,1%, NaCl 0,1mM, EDTA 10mM, Tris-

HCl 10mM, nước cất), thêm Proteinase K (20mg/ml) theo tỷ lệ 1:100, trộn đều, ủ 2h ở 65oC trong bình ổn nhiệt.

- Thêm 500µl dung dịch phenol : chloroform : isopropanol (25:24:1), trộn

đều.

- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trong

ở pha trên cùng.

- Thêm 500µl dung dịch chloroform : isopropanol (24:1), trộn đều.

- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi.

- Bổ sung 500µl ethanol 100% và NaCH3COO 3M (pH 5,2) vào dịch thu được (tỉ lệ dịch nổi/ NaCH3COO = 10:1) để tủa ADN. Giữ ở -20oC trong 3 giờ hoặc

qua đêm.

- Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch nổi,

thu tủa.

- Rửa tủa bằng 500µl ethanol 70%, lặp lại bước ly tâm trên.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

- Làm khô tủa bằng máy Speed vac trong 10 phút hoặc để khô tự nhiên.

- Hòa tan tủa trong 30µl đệm TE, bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các thí

nghiệm tiếp theo.

- Kiểm tra ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8-1%.

2.2.3. Khuếch đại gen CXCL12 bằng phương pháp PCR

Phản ứng PCR với tổng thể tích 25 µl bao gồm các thành phần được trộn

theo thứ tự trong bảng 3.

Bảng 3. Các thành phần của phản ứng PCR

Thành phần

Thể tích

Nồng độ cuối cùng

10,1 µl

H2O

Buffer 10X

2,5 µl

1,5 mM

2.5 µl

MgCl2

dNTPs

200 µM

0,5 µl

Primer CXCL12f

0,5 µM

2,5 µl

Primer CXCL12r

0,5 µM

2,5 µl

Taq ADN polymerase

1 unit

0,4 µl

ADN khuôn

50-100 ng

4 µl

Trình tự cặp mồi được tham khảo theo tài liệu công bố của Dimberg va cs,

(2007) [8].

Mồi xuôi: 5'- CAGTCAACCTGGGCAAAGCC -3'

Mồi ngược: 5'- AGCTTTGGTCCTGAGAGTCC -3'

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 2%, nhuộm ethidium

bromide, và được soi trên đèn UV có bước sóng 245nm.

Sau phản ứng PCR, chúng tôi thu được đoạn ADN có độ dài 302 bp. Sản

phẩm PCR được sử dụng để phân tích RFLP.

2.2.4. Phân tích RFLP

Trong phân tích này, enzyme giới hạn được sử dụng để cắt một đoạn ADN

của hai hay nhiều mẫu phân tích thành các đọan có chiều dài khác nhau MspI

(HpaII) không cắt các vị trí m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG và hm5 Chm5CGG,

nhưng lại cắt tại vị trí Cm5CGG. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng enzyme MspI

để cắt sản phẩm PCR. Enzyme MspI là enzyme endonuclease nhận biết ADN tại

trình tự: 3'...GGC/C...5'

Lọai enzyme được sử dụng là FastDigest® MspI của hãng Fermentas có tác

dụng cắt nhanh chỉ trong 5 -10 phút ủ ở 37oC.

Tiến hành ủ enzyme:

Chuẩn bị sản phẩm PCR (đoạn ADN của gen CXCL12 đã được nhân lên qua

phản ứng PCR).

Tiến hành trộn các thành phần theo tỉ lệ dưới đây trong một ống nhỏ 200 µl ở

nhiệt độ phòng (bảng 4).

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Bảng 4. Các thành phần của phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme

FastDigest MspI

Thành phần

Thể tích

17 µl

H2O loại ion, vô trùng

10X FastDigest® buffer

2 µl

Sản phẩm PCR (~0.2 µg)

10 µl

FastDigest® enzyme

1 µl

Trộn đều và ly tâm nhẹ lắng xuống.

Ủ dung dịch đã trộn enzyme trong 10 phút ở 37oC để enzyme hoạt động cắt

ADN.

Sau đó, tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm thu được sau khi ủ enzyme trên

gel polyacylamide 10%.

2.2.5. Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP

2.2.5.1. Xử lý bisulfite ADN bằng kit DNA Methylation-Gold TM kit và xử

lý bisulfite ADN theo phương pháp của Herman và cs (1996) [9]

Mục đích của việc xử lý này là nhằm biến đổi toàn bộ cytosine không bị

methyl hóa trong trình tự ADN của mẫu thành uracil, còn những cytosine nào bị

methyl hóa thì không bị thay đổi.

Quy trình xử lý bisulfite ADN theo phương pháp của Herman và cộng

sự bao gồm các bước:

1-2µg ADN được biến tính trong 0,3M NaOH ở 42oC, 20 phút trong thể tích

phản ứng là 50µl.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Bổ sung hydroquinone và sodium bisulfite vào dung dịch trên sao cho tổng

thể tích cuối cùng là 600µl trong đó nồng độ cuối cùng của hydroquinone là 0,5mM

và sodium bisulfite là 3,1M; pH 5,0). Đảo nhẹ tay.

Thêm 50µl dầu khoáng để tránh bay hơi. Ủ hỗn hợp ở 55oC trong vòng 16

giờ.

Sau khi xử lý thì hỗn hợp trên sẽ được loại muối bằng kit tinh sạch ADN

QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.

ADN tinh sạch sẽ được desulfo hóa trong NaOH 0,3M ở 42oC trong 20 phút, sau đó tủa ADN bằng isopropanol theo tỷ lệ thể tích 1:1 trong 3-4 h ở -20oC và cuối

cùng được hòa tan lại bằng 20µl nước sạch.

Xử lý bisulfite ADN bằng kit ADN Methylation-Gold TM kit

Cùng với việc xử lý bisulfite ADN theo quy trình trên, chúng tôi còn chuẩn

hóa việc xử lý này bằng kit ADN Methylation- Gold TM. Quá trình xử lý được thực

hiện theo quy trình của nhà sản xuất.[26]

2.2.5.2. Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen CXCL12

Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR là kỹ thuật dùng để khuếch đại một đoạn

trình tự ADN nhờ sự thay đổi của chu trình nhiệt. Mỗi chu kỳ phản ứng gồm ba giai

đoạn: giai đoạn biến tính ở nhiệt độ cao, gắn mồi và kéo dài.

Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng là cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho

phản ứng khuếch đại trình tự bị methyl hóa và không bị methyl hóa ADN, được

tham khảo từ bài báo của Wendt và cs, (2006) [22] và đã được kiểm tra lại sử dụng

phần mềm MethBLAST và MethPrimer.

Cặp mồi được thiết kế để nhân đoạn gen thuộc đảo CpG số 4 (theo

MethPrimer) nằm trong vùng promoter của gen CXCL12 với trình tự như sau:

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

CXCL12-Methyl (kích thước sản phẩm là 242 bp)

Mồi xuôi (M- f ) 5’- GGA GTT TGA GAA GGT TAA AGG TC - 3’

Mồi ngược (M - r) 5’- TTA ACG AAA AAT AAA AAT AGA CGA T - 3’

CXCL12-Unmethyl (kích thước sản phẩm là 241 bp)

Mồi xuôi (U-f) 5’ - GAG TTT GAG AAG GTT AAA GGT TGG - 3’

Mồi ngược (U- r) 5’ - TAA CAA AAA ATA AA ATA CAA CAA T - 3’

Mồi PCR được thiết kế sao cho tất cả những cytosine không bị methyl hóa

trong ADN khuôn sau khi xử lý bisulfite sẽ chuyển thành uracil và những cytosine

này sẽ được chuyển thành timine trong thiết kế mồi [25]. Thành phần phản ứng

PCR như sau (bảng 5):

Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR (với thể tích 12,5 µl)

Thành phần Thể tích Nồng độ cuối cùng

3,125 µl H2O

dNTPs 0,25 µl 200 µM

1,25 µl 1X Buffer 10X (có chứa MgCl2 15mM)

Q-solution 2,5 µl 1X

Mồi* 0,625 µl 0,5 µM/ mỗi loại

HotStarTaq ADN Polymerase 0,125 µl 0,625 Unit

ADN khuôn (đã xử lý bisulfite) 4 µl 50-100 ng

(*) Cặp mồi U-f và U-r để nhân đoạn trình tự không bị methyl hóa, cặp mồi

M-f và M-r để nhân đoạn trình tự bị methyl hóa.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Chu trình nhiệt như sau:

2.2.6. Điện di kiểm tra sản phẩm

Do tính chất tích điện âm của các phân tử acid nucleic nên dưới tác dụng của

dòng điện một chiều, các phân tử này sẽ chuyển động từ cực âm sang cực dương.

Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích thước phân tử

acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN khác nhau có khả năng phân biệt với

nhau trên gel điện di. Gel điện di thường sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy

vào kích thước đoạn ADN muốn phân tách người ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng

độ khác nhau. Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi đã sử dụng 2 phương pháp:

Điện di trên gel agarose 2%

Chuẩn bị gel agarose 2%: 2 gam agarose dạng bột (Invitrogen) được hòa tan

trong 100ml đệm TBE 1X pH 8,3 (tris–base 0,09M, acid boric 0,09M, EDTA 4mM)

đun bằng lò vi sóng cho đến khi agarose tan hết.

Đổ agarose vào khuôn điện di, chờ 15–20 phút cho gel đông lại.

Sản phẩm PCR được trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol

blue dạng vết) và tra lên giếng điện di.

Bản gel sau điện di được nhuộm ethidium bromide trong 20 phút sẽ được

quan sát dưới đèn cực tím ở bước sóng 245 nm.

Điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 10%

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Sau khi phân tích kết quả điện di trên gel agarose 2% có thể lựa chọn những

mẫu nghi ngờ, khó xác định để điện di trên gel polyacrylamide 10% cho kết quả

phân tích chính xác hơn. Bản gel được chuẩn bị với thành phần như sau (bảng 6):

Bảng 6. Thành phần bản gel polyacrylamide 10% (bản 7cm)

Thành phần Thể tích

Monoacrylamide 30% 1,65 ml

TBE 3,31 ml

APS 37,5 µl

TEMED 3 µl

Tiến hành điện di ở 175V trong 1 giờ sau đó nhuộm bạc để phân tích kết quả.

2.2.7. Kỹ thuật nhuộm bạc

Bản gel sau điện di trên gel polyacrylamide sẽ được nhuộm bạc theo phương

pháp của Bassam (1991) [5] gồm các bước sau:

- Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 30 phút.

- Rửa bằng nước cất ba lần, mỗi lần cách nhau 5 phút.

- Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat trong 30 – 40 phút, tránh ánh sáng.

- Rửa nước khoảng 30 giây – 1 phút.

- Hiện băng bằng dung dịch (30g/l Na2CO3, 0,056% formaldehyde, 400µg/l

natri thiosulfate) trong 3 – 5 phút.

- Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 3 – 5 phút.

- Bảo quản gel bằng nước cất.

- Quan sát kết quả dưới ánh sáng trắng.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

2.2.8. Dự đoán vùng promoter và xác định phân bố đảo CpG xung

quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12

Tra cơ sở dữ liệu NCBI để xác định trình tự của gen CXCL12, vị trí khởi đầu

phiên mã, dịch mã từ đó chọn ra một đoạn trình tự xung quanh vị trí khởi đầu phiên

mã để tiến hành xác định phân bố của đảo CpG.

Sử dụng phần mềm MethPrimer [13] và cpgplot (EMBOSS) để xác định các

đảo CpG với các tiêu chuẩn: Kích thước mỗi đảo > 100 bp, tỷ lệ GC > 50% và tỷ số

CpG giữa giá trị quan sát trên giá trị mong đợi > 0,6.

Sử dụng hai chương trình dự đoán vùng promoter là FirstEF (Davuluri và cs,

2001) và Proscan (BIMAS) để dự đoán vùng promoter của gen CXCL12 [7].

- Chương trình FirstEF với các tiêu chuẩn:

+ P(exon) > 0,5 (xác suất dự đoán chính xác exon 1)

+ P(promoter) > 0,4 (xác suất dự đoán chính xác promoter)

+ P(donor) > 0,4 (xác suất dự đoán chính xác một trình tự khớp với vị trí giả

thiết)

Dùng phần mềm MethBLAST (Li Lab, UCSF) để so sánh trình tự mồi với

trình tự tương đồng trong cơ sở dữ liệu từ đó xác định kích thước của đoạn trình tự

nhân lên.

Từ các dữ liệu trên, tiến hành xác định vị trí của đoạn trình tự khảo sát trong

vùng promoter của gen CXCL12 và thuộc đảo CpG nào tìm được.

2.2.9. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê

Sử dụng phép kiểm định thống kê χ2 với mức ý nghĩa α = 0,05 để đánh giá

mối liên quan giữa tính đa hình gen CXCL12 và tình trạng methyl hóa promoter của

gen với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PCR - RFLP

3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu

Bằng cách dùng phenol : chloroform : isopropanol theo tỷ lệ 25:24:1 chúng

tôi đã tách chiết được ADN tổng số từ mẫu máu của bệnh nhân ung thư đại trực

tràng và mẫu máu đối chứng của người bình thường. Sản phẩm ADN tách chiết được hòa trong 30µl đệm TE, bảo quản ở -20oC, kiểm tra nhờ điện di trên gel

agarose 0,8% và quan sát dưới đèn cực tím ở bước sóng 245nm (hình 3):

1 2 3 4 5 6 7 8

Hình 3. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu

(Điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide)

Giếng 1, 2, 3, 4: Mẫu thường

Giếng 5, 6, 7, 8: Mẫu bệnh

Kết quả điện di cho thấy các băng ADN thu được sạch, khá sắc nét và ít bị

đứt gẫy. Do đó, ADN tách chiết theo phương pháp này đủ điều kiện để tiến hành

các nghiên cứu tiếp theo.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

3.1.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen CXCL12 bằng PCR

Mẫu ADN sau khi được tách chiết đạt độ tinh sạch, không đứt gãy chúng tôi

tiến hành nhân đoạn gen CXCL12 ở vị trí 3’- UTR bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi

CXCL12.

Kết quả chúng tôi đã nhân được thành công đoạn gen CXCL12 dài 302 bp ở

vị trí 3’ UTR với 42 mẫu bệnh và 44 mẫu đối chứng. Sản phẩm PCR được điện di

trên gel agarose 2%, nhuộm ethidium bromide và soi trên đèn tử ngoại có bước

sóng 245nm, thu được hình ảnh trên hình 4.

Hình 4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12

(Điện di trên gel agarose 2% và nhuộm ethidium bromide)

Giếng M: : thang chuẩn ADN 100bp; Giếng (-): Đối chứng âm.

Giếng 1, 2, 3: Mẫu đối chứng; Giếng 4, 5, 6: Mẫu bệnh.

Từ hình ảnh điện di, ta thấy, sản phẩm PCR thu được có kích thước 302 bp.

Các băng sáng rõ nét, không xuất hiện các băng phụ, chứng tỏ, không xảy ra hiện

tượng bắt cặp không đặc hiệu.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Giếng đối chứng âm không hiện băng chứng tỏ cặp mồi không bị nhiễm

ADN lạ. Tất cả các dấu hiệu trên cho thấy đã thành công trong việc nhân đoạn gen

CXCL12-3’-UTR dài 302 bp.

3.1.3. Kết quả phân tích RFLP

Để phát hiện được tính đa hình trong đoạn gen CXCL12 sau khi khuếch đại

đoạn gen này bằng phương pháp PCR, chúng tôi tiến hành ủ sản phẩm PCR với enzyme MspI. Sau khi ủ 10 phút ở 37oC, sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel

polyacrylamide 10%. Kết quả được thể hiện ở hình 5.

Hình 5. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng 302bp,

202bp và 100bp

(Điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)

Giếng M: thang chuẩn ADN 100bp

Giếng 1, 3, 5: sản phẩm PCR trước khi cắt bằng enzyme MspI.

Giếng 2, 4, 6: sản phẩm sau khi cắt bằng enzyme MspI của các giếng 1, 3, 5.

Trên bản gel ta thấy xuất hiện những băng có kích thước khác nhau, có

những mẫu sản phẩm PCR sau cắt chỉ cho 1 băng 302bp, có những mẫu cho 2 băng

202bp và 100bp lại có những mẫu sản phẩm bị cắt thành 3 băng 302bp, 202bp,

100bp. Điều này chứng tỏ đã có sự đa hình nucleotide trong đoạn gen này. Ta thấy

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

sản phẩm cắt xuất hiện các băng có kích thước 302 bp, 202 bp và 100 bp, chứng tỏ

đoạn gen 302 bp chỉ có một trình tự nhận biết duy nhất của enzyme MspI và vị trí

cắt chính là vị trí xảy ra đa hình nucleotide.

Như vậy, có ba kiểu đa hình khác nhau như thể hiện trên bản gel. Đó là đa

hình kiểu dại, trên gel điện di chỉ xuất hiện hai băng (giếng 4), đột biến hoặc biến

đổi dị hợp tử (xuất hiện 3 băng như ở giếng 6) và đột biến hoặc biến đổi đồng hợp

tử (chỉ có một băng điện di ở giếng 2).

Tiến hành lặp lại các thí nghiệm, chúng tôi thu được hình ảnh của các kiểu đa

hình riêng biệt như sau:

Genotype kiểu dại, trên gel điện di chỉ xuất hiện hai băng (hình 6):

Hình 6. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 2 băng 202bp

và 100 bp (Điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)

Giếng M: thang chuẩn ADN 100bp

Giếng 1, 3, 5: sản phẩm PCR trước cắt bằng enzyme MspI

Giếng 2, 4, 6 sản phẩm PCR cắt bằng enzyme MspI

Trên hình thấy xuất hiện hai loại băng có kích thước 202bp và 100bp, những

mẫu này không bị đột biến hoặc biến đổi tại vị trí enzyme nhận biết. Do đó, enzyme

dễ dàng nhận ra trình tự nhận biết CCGG và cắt ở cả hai alen của gen nên trên ảnh

điện di chỉ nhìn thấy hai băng có kích thước 202bp và 100 bp. Đây là kiểu genotype

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

phổ biến ở người bình thường, còn gọi là kiểu dại, và được kí hiệu là (G/G). Tuy

nhiên, genotype này cũng xuất hiện ở một số người bệnh ung thư đại trực tràng.

Genotype dị hợp tử (hình 7)

Trên bản gel điện di xuất hiện 3 băng có kích thước lần lượt là 302 bp, 202 bp và

100 bp như ở hình 7.

Hình 7. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng 302bp,

202bp và 100bp (genotype dị hợp tử)

(điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)

Giếng M: thang chuẩn ADN 100bp

Giếng 1, 3, 5: sản phẩm PCR trước khi cắt bằng enzyme MspI

Giếng 2, 4, 6 sản phẩm PCR cắt bằng enzyme MspI

Ở kiểu gen này, trình tự nhận biết CCGG đã bị thay đổi trên 1 alen của gen.

Trên alen này, trình tự CCGG đã bị thay thế làm cho emzyme MspI không nhận biết

được ví trí cắt. Do đó, alen này không bị cắt thành hai mảnh có kích thước 202bp và

100bp. Ở alen còn lại, trình tự nhận biết của enzyme không bị thay đổi nên đoạn

gen CXCL12 vẫn bị cắt thành hai đoạn có kích thước 202bp và 100bp. Do đó, khi

điện di trên gel polyacylamide thấy xuất hiện 3 băng ADN có kích thước lần lượt là

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

302bp, 202bp và 100bp. Những mẫu có kiểu gen như trên là dạng đột biến/ biến đổi

dị hợp tử, kí hiệu G/A.

Genotype đồng hợp tử

Genotype còn lại chỉ có 1 băng ADN duy nhất, có kích thước 302 bp, bằng

kích thước của sản phẩm PCR đoạn gen CXCL12-3’- UTR (hình 8).

Hình 8. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 1 băng 302bp

(điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)

Giếng M: thang chuẩn ADN 100bp;

Giếng 1 sản phẩm PCR trước cắt bằng enzyme MspI

Giếng 2 sản phẩm PCR cắt bằng enzyme MspI

Trên hình ảnh điện di, ta thấy chỉ xuất hiện một băng có kích thước 302bp

chứng tỏ sản phẩm PCR không bị cắt bởi enzyme MspI. Mẫu này bị đột biến hoặc

biến đổi trên cả hai alen của cặp nhiễm sắc thể tương đồng tại vị trí cắt của enzyme

MspI. Khi đó, trình tự CCGG trên cả 2 alen đều bị thay thế. Do đó, emzyme MspI

không thể nhận biết được trình tự nhận biết để cắt ADN. Kiểu gen này là kiểu đột

biến/biến đổi đồng hợp tử, kí hiệu A/A.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

3.1.4. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê

Qua kết quả thu được trong quá trình phân tích PCR-RFLP, chúng tôi tiến

hành phân tích kết quả đó bằng phép kiểm định thống kê. Trong quá trình thực hiện

đề tài, chứng tôi đã tiến hành phân tích PCR-RFLP đối với 86 mẫu, trong đó có 42

mẫu bệnh và 44 mẫu thường làm đối chứng.

Phân bố genotype giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng:

Phân bố genotype giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng được xác định theo vị trí

khối u, theo giới tính và độ tuổi của người bệnh. Kết quả được trình bày trong bảng

7, 8 và 9.

Bảng 7. Phân bố genotype giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng theo vị trí khối u

Mẫu bệnh

Vị trí khối u của người bệnh

Mẫu đối chứng

Genotype

Trực tràng Đại tràng

Đại trực tràng

(n = 44)

(n= 42)

(n= 24)

(n= 11)

(n=7)

72,73%

42,85%

37,5%

45,45%

57,14%

G/G

(32)

(18)

(9 )

(5)

(4)

25%

52,39%

58,33%

45,45%

42,86%

G/A

(11)

(22)

(14)

(5)

(3)

2,27%

4,76%

4,17%

9,09%

A/A

(1)

(2)

(1)

(0)

Kết quả ở bảng 7 đã cho thấy:

Phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu bệnh khác nhau có ý nghĩa

thống kê với p<0,05.

So sánh phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu bệnh theo vị trí khối u

cho kết quả như sau:

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

+ Phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu ung thư trực tràng khác

nhau có ý nghĩa thống kê với p<0,05.

+ Phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu ung thư đại tràng khác nhau

không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

+ Phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu ung thư đại trực tràng khác

nhau không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

+ So sánh phân bố genotype của bệnh nhân ung thư đại tràng và ung thư trực

tràng thấy khác nhau không mang ý nghĩa thống kê với p>0,05.

+ So sánh phân bố genotype của bệnh nhân ung thư trực tràng và ung thư đại

trực tràng thấy khác nhau không mang ý nghĩa thống kê với p>0,05.

+So sánh phân bố genotype của bệnh nhân ung thư đại tràng và ung thư đại

trực tràng thấy khác nhau không mang ý nghĩa thống kê với p>0,05.

Bảng 8. Phân bố genotype theo giới tính của bệnh nhân

Mẫu bệnh

Genotype

Nam (n=23)

Nữ (n=19)

Tổng (n = 42)

30,43%

63,16%

42,85%

G/G

(18)

(7)

(12)

69,57%

26,32%

52,38%

G/A

(16)

(5)

(22)

10,52%

4,77%

A/A

(2)

(0)

Tìm hiểu mối liên hệ giữa ung thư đại trực tràng và giới tính, chúng tôi đã

tính tỷ lệ genotype theo giới tính. Kết quả ở bảng 8 đã cho thấy, bằng phép kiểm

định khi bình phương thấy có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê trong phân bố

genotype theo giới tính (nam - nữ) của bệnh nhân ung thư đại trực tràng (p<0,05).

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Như chúng ta đã biết, càng lớn tuổi thì nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng

càng cao. Do đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra mối liên quan giữa độ tuổi và tính đa

hình trong gen CXCL12 ở người bệnh. Trong tổng số 42 mẫu bệnh nhân ung thư đại

trực tràng, chúng tôi chia làm hai nhóm tuổi khác nhau là: nhóm trên 70 tuổi (7mẫu)

và nhóm dưới 70 tuổi (35mẫu) (bảng 9).

Bảng 9. So sánh phân bố genotype giữa nhóm người bệnh trên 70 tuổi và dưới 70 tuổi

Genotype

≥ 70 tuổi (n= 7)

< 70 tuổi (n= 35)

28,57 %

48,57%

G/G

(2)

(17)

57,14 %

48,57%

G/A

(4)

(17)

14,29%

2,86%

A/A

(1)

Kiểm định thống kê cho thấy sai khác trong phân bố genotype của nhóm

người bệnh trên 70 tuổi và dưới 70 tuổi không có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa

α = 0,05 (p<0,05).

So sánh tần xuất alen ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng và đối chứng

Tần xuất alen đã được tính toán theo vị trí khối u, giới tính và độ tuổi của

người bệnh. Kết quả được trình bày ở các bảng 10, 11 và 12.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Bảng 10. Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu đối chứng và mẫu bệnh theo vị trí

khối u

Mẫu bệnh

Alen

Mẫu đối chứng

Trực tràng

Đại trực tràng

(n = 88)

Tổng số (n = 84)

(n = 48)

Đại tràng (n = 22)

(n = 14)

85,22%

69,05%

68,18%

78,57%

66,67% (15)

(32)

(58)

(11)

(75)

14,78 %

30,95%

33,33%

31,82%

21,43%

(26)

(16)

(7)

(3)

(13)

Kết quả ở bảng 10 đã cho thấy, tần xuất alen khác biệt có ý nghĩa thống kê

với mức p<0,05 giữa bệnh nhân ung thư đại trực tràng và đối chứng.

- Tần xuất alen giữa mẫu ung thư đại trực tràng và mẫu đối chứng, sai khác

không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

- Tần xuất alen giữa mẫu ung thư trực tràng và mẫu đại tràng, sai khác

không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

- Tần xuất alen giữa mẫu ung thư trực tràng và mẫu đại trực tràng, sai khác

không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

Tính toán tần xuất alen của gen CXCL12 của người bệnh theo giới tính được

trình bày ở bảng 11.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Bảng 11. Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo giới tính

Mẫu bệnh

Alen

Nam (n = 46)

Nữ (n = 38)

Tổng số (n = 84)

65,21 %

76,32%

70,23%

(30)

(29)

(59)

34,79%

23,68 %

29,77%

(16)

(9)

(25)

Kết quả ở bảng 11 đã cho thấy, tần xuất alen giữa mẫu ung thư đại trực tràng

ở nam và nữ sai khác không mang ý nghĩa thống kê với p>0,05.

Tính toán tần xuất alen của gen CXCL12 của người bệnh theo độ tuổi được

trình bày ở bảng 12.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Bảng 12. Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo độ tuổi

Alen

≥ 70 tuổi (n = 14)

< 70 tuổi (n = 70)

57,14%

72,85%

(51)

(8)

42,86%

27,15%

(19)

(6)

Kết quả ở bảng 12 đã cho thấy, tần xuất alen khác biệt không có ý nghĩa

thống kê với mức p>0,05 giữa nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng trên 70 tuổi

và dưới 70 tuổi.

Như vậy, qua quá trình nghiên cứu và sử lý số liệu chúng tôi nhận thấy ở

bệnh nhân ung thư đại trực tràng và mẫu đối chứng có sai khác mang ý nghĩa thống

kê về kiểu gen và tần suất alen, điều đó chứng tỏ đã có sự thay đổi đáng kể trong

kiểu gen giữa bệnh nhân ung thư đại trực tràng và mẫu đối chứng, và sự thay đổi

này có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của CXCL12 trong ung thư đại trực tràng.

Khi so sánh kết quả của chúng tôi với môt số nghiên cứu khác trên thế giới

như nghiên cứu của Dimberg và cs (2007) tiến hành trên các mẫu bệnh nhân người

Thụy Điển, kết quả nghiên cứu này thấy không có sự khác biệt đáng kể trong phân

bố genotype và tần xuất alen giữa bệnh nhân ung thư đại trực tràng và mẫu đối

chứng [8]. So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với kết quả của nhóm nghiên

cứu của Dimberg, đã có sự khác biệt đáng kể trong ảnh hưởng của đa hình gen

CXCL12 đối với bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở Thụy Điển và ở Việt Nam. Một

câu hỏi được đặt ra là tại sao lại có sự khác biệt đó, liệu sự khác biệt này có phải do

bắt nguồn từ nguồn gốc phân tử của sự phát sinh ung thư và nguyên nhân dẫn đến

sự phát sinh của hai nhóm bệnh nhân này.

Tương tự một nghiên cứu khác của Hidalgo-Pascual và cs (2007) đã nghiên

cứu đa hình gen CXCL12 trên mẫu bệnh nhân người Tây Ban Nha. Kết quả cho

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

thấy, không có khác biệt đáng kể trong phân bố genotype và tần xuất alen của bệnh

nhân ung thư đại trực tràng so với đối chứng [10].

Chúng tôi tiếp tục tiến hành so sánh phân bố genotype giữa mẫu đối chứng

và mẫu bệnh theo vị trí khối u cho kết quả như sau:

Phân bố genotype giữa mẫu đối chứng và mẫu ung thư trực tràng, ung thư

đại tràng, đại trực tràng thấy khác nhau không có ý nghĩa thống kê.

Xét theo giới tính, kết quả cho thấy có sự khác biệt đáng kể trong phân bố

genotype theo giới tính bệnh nhân (nam - nữ). Trong khi đó, lại không thấy sự khác

biệt trong tần xuất alen giữa hai giới nam - nữ. Như vậy đã có sự thay đổi trong kiểu

gen giữa 2 nhóm bệnh nam nữ.

Xét theo độ tuổi chúng tôi chia bệnh nhân thành 2 nhóm lớn hơn hoặc bằng

70 tuổi và nhỏ hơn 70 tuổi. Cơ sở của việc phân tuổi này là khi lớn hơn 70 tuổi thì ít

nhất 50% người bình thường mang u lành tính ở đại tràng hoặc trực tràng và khoảng

10 % trong số đó sẽ phát triển thành khối u ác tính, nhanh chóng phát triển thành

ung thư [1]. Kết quả là phân bố genotype và tần xuất alen ở người bệnh trên 70 tuổi

và dưới 70 tuổi khác biệt không có ý nghĩa thống kê.

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÌNH TRẠNG METHYL HÓA GEN CXCL12

3.2.1. Kết quả tách chiết ADN từ mẫu mô

Sử dụng kit tách chiết ADN QIAamp ADN Mini Kit của hãng QIAGEN

(Đức), chúng tôi đã tách chiết được ADN từ 25 cặp mẫu mô của 25 bệnh nhân ung

thư đại trực tràng (hình 9).

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Hình 9. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ mô

(điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide)

Giếng 1, 2, 3, 4: Mẫu mô lấy cách khối u 5-10 cm.

Giếng 5, 6, 7, 8: Mẫu mô lấy tại trung tâm khối u.

Kết quả điện di cho thấy các băng ADN thu được sạch, đều sắc nét và rất ít

bị đứt gẫy. Do đó, ADN tách chiết theo phương pháp này đủ điều kiện để tiến hành

các nghiên cứu tiếp theo.

3.2.2. Kết quả xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu

phiên mã của gen CXCL12

Gen CXCL12 nằm ở cánh dài NST số 10 có kích thước 21941bp. Vị trí khởi

đầu phiên mã từ nucleotide 5001, khởi đầu dịch mã từ vị trí nucleotide 5093, sản

phẩm mã hóa là chemokine CXCL12 [32]. Đảo CpG của gen thuộc đoạn trình tự

xung quanh vị trí nucleotide 5001.

Để đảm bảo vùng promoter, vị trí khởi đầu phiên mã, dịch mã nằm trong

vùng khảo sát, chúng tôi tiến hành phân tích trên một đoạn trình tự dài 3000 nu (từ

nucleotide 3001 đến 6001). Sử dụng phần mềm MethPrimer (Li Lab, UCSF) và

phần mềm cpgplot (EMBOSS) để dự đoán các đảo CpG thuộc đoạn trình tự trên với

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

các tiêu chuẩn (kích thước mỗi đảo ≥ 100 bp, tỷ lệ GC ≥ 50% và tỷ số CpG giữa giá

trị quan sát trên giá trị mong đợi ≥ 0,6), chúng tôi thu được kết quả như sau (hình 10

và 11):

Hình 10. Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer [37]

Sequence Name: Sequence Length: 3001 CpG island prediction results (Criteria used: Island size > 100, GC Percent > 50.0, Obs/Exp > 0.6) 5 CpG island(s) were found in your sequence Size (Start - End) Island 1 297 bp (137 - 433) Island 2 161 bp (623 - 783) Island 3 225 bp (891 - 1115) Island 4 1346 bp (1174 - 2519) Island 5 341 bp (2526 - 2866)

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Hình 11. Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm cpgplot (EMBOSS)[28]

CPGPLOT islands of unusual CG composition 3001-6001 from 1 to 3001 Observed/Expected ratio > 0.60 Percent C + Percent G > 50.00 Length > 100 Length 297 (137..433) Length 161 (623..7833) Length 225 (891..1115) Length 1346 (1174..2519) Length 341 (2526..2866)

Kết quả khảo sát từ nucleotide 3001 đến 6001, cả 2 phần mềm đều cho: Đoạn

khảo sát chứa 5 đảo CpG có kích thước khác nhau và kích thước các đảo theo thứ tự

so sánh giữa 2 phần mềm là hoàn toàn giống nhau. Đảo 4 có kích thước lớn nhất

(1346bp) từ vị trí 1174 đến 2519 đảo 2 có kích thước nhỏ nhất (161bp).

Với đoạn trình tự khảo sát (từ nucleotide 3001 đến 6001) thì vị trí khởi đầu

phiên mã là nucleotide số 5001 và vị trí khởi đầu dịch mã là nucleotide số 5093

(theo NCBI) cả hai vị trí trên đều thuộc đảo CpG số 4. Vì vậy, có thể vùng promoter

của gen CXCL12 có trình tự nằm chủ yếu ở đảo này.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Tuy nhiên, khi tra cứu cơ sở dữ liệu nucleotide trong NCBI, chúng tôi lại

không tìm thấy trình tự promoter của gen CXCL12. Vì vậy, để xác định đảo CpG

tương ứng với vùng promoter của gen, cần phải dự đoán vùng promoter của gen

CXCL12.[31]

Sử dụng 2 chương trình dự đoán promoter của gen, kết quả thu được như

- Chương trình Proscan (BIMAS) với tiêu chuẩn mặc định sẵn có, vùng

promoter được xác định gồm 250 nucleotide (từ vị trí nucleotide 4696 đến 4946 của

gen CXCL12).[36]

- Chương trình FirstEF với các tiêu chuẩn đã nêu, vùng promoter được xác

định gồm 570 nucleotide (từ vị trí nucleotide 4474 đến 5043 của gen CXCL12).

Xác xuất dự đoán có độ chính xác rất cao: P(promoter) = 1,0000; P(exon) = 1,0000

và P(donor) = 0,9999.

Chương trình FirstEF cho kết quả dự đoán vùng promoter và exon 1 của gen.

Vị trí của exon 1 dự đoán trùng gần như hoàn toàn với vị trí exon tương ứng đã có

trong trình tự của gen CXCL12 (RefSeqGene -NG_016861.1). Vì vậy, kết quả dự

đoán này có độ tin cậy cao.[27]

Kết quả dự đoán vùng promoter của gen CXCL12 bằng chương trình FirstEF

cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Wendt và cs (2006) khi sử dụng phần

mềm dự đoán PromoterInspector. Các tác giả này đã xác định được 1 vùng

promoter dài 659 bp (-491,+168) trong đó có 491 bp nằm phía trước của vị trí khởi

đầu phiên mã (vị trí +1). Điều đó chứng tỏ vùng promoter này nằm hoàn toàn trong

đảo CpG số 4 đã phân tích ở trên [22].

Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng được thiết kế đặc hiệu cho việc

khuếch đại trình tự bị methyl hóa (cặp mồi methyl) và không bị methyl hóa (cặp

mồi unmethyl).

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

3.2.3. Khuyếch đại đoạn trình tự nằm trong đảo CpG thuộc vùng

promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP

ADN tổng số sau khi được tách chiết đã được xử lý với sodium bisulfite.

Tiếp theo, ADN được tinh sạch, sau đó khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi

methyl và unmethyl đặc hiệu. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel polyacrylamide

và nhuộm bạc (hình 12 và 14).

Hình 12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12

(điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)

M: Thang ADN chuẩn 100 bp.

Giếng 1,2, 3, 4 : Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi methyl (242 bp).

Kết quả trên hình 12 và 14 cho thấy, sản phẩm PCR có kích thước tương ứng

với kích thước mong đợi, dài 242bp (với cặp mồi methyl, và 241bp khi dùng cặp

mồi unmethyl.

Như vậy, bằng kỹ thuật MSP, chúng tôi đã nhân thành công trình tự nằm

trong vùng promoter của gen CXCL12.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

3.2.4. Phân tích tích tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen

CXCL12 ở bênh ung thư đại trực tràng

3.2.4.1. So sánh tỷ lệ methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 giữa mô

bệnh và mô lân cận

Chúng tôi đã tiến hành phân tích MSP thành công trên 25 bệnh nhân ung thư

đại trực tràng, trong đó có 20 mẫu khảo sát trên mô bệnh lấy tại vị trí ung thư của người

bệnh và 16 mẫu trên mô lân cận cách 5cm so với vị trí ung thư, có 11/25 bệnh nhân

được khảo sát thành công trên cả mô u và mô lân cận u với tỷ lệ như trên bảng 13, hình

13.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Bảng 13. Tỷ lệ methyl hóa và không methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 trên

mô u và mô lân cận u

Mô lân cận u

Mô u

Tính chung

Mô của bệnh nhân

U

M

U

M

U

M

Mô u và lân cận u

72,7%

27,3%

63,63%

90,91%

81,81%

(n=11)

(8)

(3)

(7)

(10)

(9)

Mô lân cận u

40%

60%

40%

60%

(3)

(2)

(3)

(n=5)

100%

Mô u

(0)

(9)

(0)

(9)

(n=9)

Tổng cộng

62,5%

37,5%

43,75%

80%

48%

84%

(n=25)

(11)

(6)

(7)

(16)

(12)

(21)

Như vậy, qua thống kê bảng 13 ta thấy đối với riêng 11 bệnh nhân khảo sát

thành công trên cả mô u và lân cận u thì tỷ lệ methyl hóa xảy ra tại vùng promoter

của gen CXCL12 trên mô u là cao hơn hẳn (chiếm 63,63%) so với tỷ lệ đó trên mô

lân cận u (chiếm 27,3). Trong khi đó, tỷ lệ unmethyl trên mô lân cận u lại cao

(chiếm 72,7%), hơn so với tỷ lệ đó trên mô u (chiếm 63,63%). Tính chung trên cả

mô u và lân cận u ở 11 bệnh nhân trên thì có 9 bệnh nhân (chiếm 81,81%) là bị

methyl hóa trên một trong hai mô và chỉ có 2 bệnh nhân (chiếm 19,19%) là không

bị methyl hóa trên mô nào.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

% ẹ l ỷ T

Mô U

Mô lân cận u

loại mô

Hình 13. Tỷ lệ methyl và unmethyl khảo sát trên 2 loại mô u và lân cận u

U: unmethyl; M: methyl

Nhìn vào biểu đồ (hình 13) ta thấy rõ hơn sự khác biệt về tỷ lệ methyl và

unmethyl giữa 2 loại mô u và lân cận u. Đối với mô u, tỷ lệ methyl cao gấp gần 2

lần (80%) so với tỷ lệ unmethyl (43,75%). Đối vối mô lân cận u thì tỷ lệ methyl lại

thấp hơn (37,5%) so với tỷ lệ unmethyl (62,5%).

Thống kê riêng trên 20 mẫu mô u (trong đó bao gồm cả 11 mẫu mô u thuộc

11 bệnh nhân đã phân tích ở trên) cho thấy tỷ lệ methyl hóa trên mô u là khá cao

(chiếm 80%) trong khi tỷ lệ unmethyl chỉ chiếm 43,75% (bảng 13). Còn đối với 16

mẫu mô lân cận u khảo sát riêng (bao gồm cả 11 mẫu mô u thuộc 11 bệnh nhân đã

phân tích ở trên) thì tỷ lệ methyl hóa thấp hơn hẳn (chiếm 37,5%) so với tỷ lệ

unmethyl trên mô đó (chiếm 62,5%).

Tổng kết chung trên 25 bệnh nhân đã khảo sát thành công thì có tới 21 bệnh

nhân (chiếm 84%) bị methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12, trong khi chỉ có

4 bệnh nhân (chiếm 16%) không có sự methyl hóa trên cả hai mô. Qua 11 mẫu bệnh

nhân khảo sát thành công trên cả mô u và lân mô cận u ta thấy có những bệnh nhân

xuất hiện cả băng methyl và unmethyl cùng lúc trên mô u hoặc mô lân cận u, những

bệnh nhân như vậy gọi là bệnh nhân bị methyl hóa không hoàn toàn. Còn những

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

bệnh nhân có xuất hiện băng methyl trên cả mô u và mô lân cận u hoặc xuất hiện

băng methyl trên mô u và unmethyl trên mô lân cận u là trường hợp bị methyl hóa

hoàn toàn (hình 14).

Qua so sánh tỷ lệ methyl hóa giữa mẫu u và mẫu lân cận u ta thấy sự sai khác

về tỷ lệ methyl giữa 2 nhóm mẫu này có ý nghĩa thống kê với p<0,05.

Hình 14. Hình ảnh điện di sản phẩm MSP của gen CXCL12 của bệnh nhân ung thư

đại trực tràng (điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)

M: Thang chuẩn ADN 100 bp; giếng 1-4: Bệnh nhân số 1 (methyl hóa không hoàn

toàn trên mô lân cận u); giếng 5-8: Bệnh nhân số 2 (methyl hóa không hoàn toàn trên mô

u); giếng 1,3,5,7: Unmethyl; giếng 2,4,6,8: Methyl.Trong đó Giếng 1, 2 là khảo sát trên mô

u của bệnh nhân 1. Giếng 3, 4 là trên mô lân cận u của bệnh nhân số 1.

Tóm lại, qua thống kê ta thấy tỷ lệ methyl hóa xảy ra chủ yếu trên mô u là

nơi tập trung nhiều tế bào ung thư nhất của bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Điều

đó cho thấy sự methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 có thể là yếu tố liên

quan tới sự phát triển của căn bệnh này. Tỷ lệ methyl hóa cũng xảy ra trên mô lân

cận là nơi cách xa hơn so với vị trí khối u (cách 5cm) cho thấy có thể mô lân cận

này có chứa một số tế bào ung thư xâm lấn xen lẫn với các tế bào bình thường. Tuy

nhiên, tỷ lệ methyl hóa ở khu vực này thấp hơn nhiều so với ở mô u (chỉ chiếm

khoảng 37,5%).

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

3.2.4.2. Phân tích tình trạng methyl hóa theo các đặc điểm lâm sàng của

bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Tiến hành so sánh tỷ lệ methyl hóa ở vùng promoter của gen CXCL12 với

các đặc điểm lâm sàng của 25 bệnh nhân ung thư đại trực tràng đã khảo sát thành

công, chúng tôi thu được kết quả như sau (bảng 14):

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Bảng 14. Thống kê tỷ lệ methyl hóa trong vùng promoter của gen CXCL12

theo các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Đặc điểm

Số lượng Số bệnh nhân bị methyl Tỷ lệ %

≥70

66,7

Tuổi

<70

90,9

Nam

Giới tính

Nữ

Biểu mô tuyến

Dạng ung thư

Xâm lấn thanh mạc

100

Cả hai dạng trên

100

T1N0M0

Phân loại TNM

T2N0-1M0

100

T3N0-1M0

Đại tràng

89,9

Vị trí ung thư

Trực tràng

Đại trực tràng

100

≤ 3

66,67

Số Hạch

100

Cạnh trực tràng

88,3

Vị trí hạch

Cạnh đại tràng

87,5

Khác

≤ 1 cm

78,9

Kích thước hạch

> 1 cm

100

Có

71,4

Ổ sùi loét

Không

100

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Như vậy, tỷ lệ bệnh nhân bị methyl hóa của nhóm trên 70 tuổi (66,7%) thấp

hơn so với nhóm dưới 70 (90,9%), nữ (90%) cao hơn so với nam (80%), Tỷ lệ

methyl hóa của nhóm bệnh nhân đại trực tràng cao nhất (100%) sau đó đến nhóm

đại tràng (89,9%) và trực tràng (80%). Những bệnh nhân có nhiều hơn 3 hạch

(100%) có tỷ lệ methyl hóa cao hơn những bệnh nhân ít hơn 3 hạch (67,67%). Tỷ lệ

methyl hóa của nhóm với kích thước hạch lớn hơn 1cm (100%) cao hơn so với

nhóm có kích thước nhỏ hơn 1cm, nhóm có ổ sùi loét (71,4%) thấp hơn so với dạng

không có ổ sùi loét (100%). Đối với giai đoạn TNM thì tỷ lệ methyl hóa theo thứ tự

sau: T1N0M0(100%), T3N0-1M0 là (100%), T2N0-1M0 là (75%) và sự khác nhau

về tỷ lệ methyl hóa giữa các giai đoạn bệnh là không có ý nghĩa thống kê với

p>0,05.

Từ các dữ liệu trên, có thể thấy đối với các trường hợp thuộc dạng ung thư

xâm lấn thanh mạc và có nhiều hơn 3 hạch thì cho tỷ lệ methyl hóa cao (100%)

Điều đó cho thấy sự methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 xảy ra chủ yếu

vào giai đoạn sau của quá trình phát triển ung thư đại trực tràng, hay giai đoạn ung

thư đã liên quan tới quá trình di căn.

Tuy nhiên, khi phân tích thống kê chúng tôi lại thấy sự khác biệt về tỷ lệ

methyl giữa các nhóm: tuổi, giới tính, dạng ung thư, vị trí ung thư, số hạch, vị trí

hạch, kích thước hạch, ổ sùi loét là không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).

So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với kết quả nghiên cứu của một số

công trình đã công bố như công bố của Wendt và cs, 2006 [22] khi nghiên cứu tình

trạng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 cho thấy 62% trong số 21 mẫu

mô ung thư biểu mô trực tràng bị methyl hóa. Đến năm 2008, khi nghiên cứu tình

trạng này trên 15 mẫu mô ung thư biểu mô vú, nhóm nghiên cứu này đã công bố tỷ

lệ methyl hóa là 40%. Tiến hành nghiên cứu tình trạng methyl hóa vùng promoter

của gen CXCL12 trên bệnh nhân ung thư vú, Zhou và cs, 2008 đã đưa ra kết quả là

52,4% trong số 63 mẫu mô ung thư vú là bị methyl hóa. Các công trình nghiên cứu

trên đều ủng hộ vai trò của sự tăng cường methyl hóa vùng promoter của gen

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

CXCL12 trong việc làm giảm biểu hiện của gen này ở các mẫu mô ung thư và có thể

đây là yếu tố góp phần vào quá trình di căn ung thư [24].

Quá trình di căn ung thư là một quá trình phức tạp đòi hỏi rất nhiều bước

khác nhau bao gồm sự xâm nhập vào mạch máu từ các khối u nguyên phát, sự

chống lại quá trình apoptosis, sự di chuyển tới các cơ quan thứ hai và sự tăng sinh

của các tế bào ung thư tại mô đích. Một số dữ liệu cho thấy phức hệ

CXCL12/CXCR4 đã tham gia vào hầu hết các con đường của quá trình di căn và

CXCR4 được điều hòa bởi rất nhiều các yếu tố hóa sinh hay di truyền ở nhiều mức

độ khác nhau liên quan tới quá trình phiên mã, dịch mã. Trong sự di căn theo đường

máu thì các yếu tố cơ học sẽ quyết định số phận của các tế bào ung thư sau khi rời

khỏi vị trí ung thư nguyên phát và cơ quan đích sẽ chịu sự điều khiển của các tế bào

di cư tới đây đầu tiên. Như đối với trục tín hiệu CXCL12/CXCR4 thì không chỉ

biểu hiện của CXCR4 đóng vai trò chủ chốt điều khiển quá trình di căn khối u mà

còn có cả CXCL12 cũng đóng vai trò thiết yếu đối với quá trình di căn đặc hiệu

theo vị trí. Biểu hiện của CXCR4 vẫn được duy trì trong các khối u nguyên phát,

trái lại, một số nghiên cứu lại cho thấy biểu hiện CXCL12 là khá hạn chế trong

nhiều trường hợp ung thư biểu mô, điều này có thể liên quan tới sự methyl hóa vùng

promoter của CXCL12 từ đó dẫn tới ức chế quá trình phiên mã của gen này. Phục

hồi biểu hiện CXCL12 và thử nghiệm trên chuột SCID thì thấy rằng sự tái biểu hiện

nội sinh của CXCL12 ở các tế bào ung thư biểu mô trực tràng đã làm giảm sự hình

thành khối u di căn trong cơ thể chuột, điều này phù hợp với vai trò của CXCL12

trong việc hàn gắn các tổn thương, khiến cho các tế bào ung thư tập trung thành tụ

điểm và khó xâm lấn hơn. Như vậy, có thể giả thiết là chính sự im lặng của gen

CXCL12 trong các tế bào ung thư đã làm biến đổi trục tín hiệu CXCL12/CXCR4

dẫn tới quá trình di căn xảy ra. Các tế bào di căn thiếu đi biểu hiện của CXCL12

nhưng vẫn duy trì biểu hiện của CXCR4 sẽ tuân theo gradient tín hiệu hướng hóa

CXCL12, xâm nhập vào mạch máu, tồn tại và xâm lấn ra các mô cơ quan khác, nơi

có nguồn CXCL12 ngoại sinh để đáp ứng lại trục tín hiệu này [22].

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Nhiều bằng chứng gần đây đã xác định vai trò của sự tăng cường methyl hóa

ADN có liên quan tới sự im lặng gen CXCL12 ở các tế bào ung thư đại trực tràng

[22]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào việc tìm ra mối liên hệ giữa

tình trạng methyl hóa của gen CXCL12 với các đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân ung

thư đại trực tràng. Tỷ lệ methyl hóa được phát hiện thấy là khá cao, chiếm 84%

trong số 25 mẫu ung thư đại trực tràng. Quan trọng hơn là tình trạng methyl hóa xảy

ra ở phần lớn các bệnh nhân ung thư đại tràng (66,7%) thuộc nhóm tuổi trên 70,

90,9% với nhóm <70 tuổi, (100%) với các trường hợp có nhiều hơn 3 hạch. Do đó,

đây có thể là những dữ liệu bệnh học có ý nghĩa có thể sử dụng cho các nghiên cứu

tiếp theo trong việc tìm ra chỉ thị sinh học đặc hiệu cho căn bệnh này.

Như vậy qua quá trình nghiên cứu đa hình và sự methyl hóa vùng promoter

của gen CXCL12 chúng tôi thấy rằng:

Khi nghiên cứu đa hình gen CXCL12 trên nhóm bệnh nhân và nhóm đối

chứng thấy có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về kiểu gen. Vậy có thể suy luận

rằng đã có sự thay đổi gen CXCL12 ở một mức độ nào đó dẫn đến ung thư đại trực

tràng.

Khi nghiên cứu quá trình methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 giữa 2

loại mô là mô u và lân cận u trên cùng một bệnh nhân ung thư đại trực tràng, đặc

biệt trong những bệnh nhân ung thư đã bị di căn thì sự khác biệt này càng rõ rệt.

Điều này chứng tỏ rằng sự methyl vùng promoter của gen CXCL12 có thể là một

nguyên nhân quan trọng trong quá trình di căn ung thư đại trực tràng.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu được chúng tôi rút ra được những kết luận sau:

1. Sử dụng kĩ thuật PCR-RFLP, đã xác định được tính đa hình của gen CXCL12:

- Về kiểu gen: mẫu đối chứng có 72,73% dạng G/G, 25% dạng G/A, 2,27% dạng

A/A; mẫu bệnh có 42,86% dạng G/G, 52,39% dạng G/A, 4,76% dạng A/A.

- Về tần xuất alen: mẫu đối chứng có 85,22% dạng G, 14,78% dạng A, mẫu bệnh có

69,05% dạng G, 30,95% dạng A.

Sự phân bố kiểu gen và tần xuất alen giữa nhóm đối chứng và nhóm bệnh khác

nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Sự phân bố kiểu gen và tần xuất alen CXCL12

không phụ thuộc vào tuổi, vào vị trí ung thư, vào giới tính giữa nam và nữ, giữa ung

thư trực tràng và đại tràng (p>0,05).

2. Đã xác định được 5 đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen

CXCL12 và vùng promoter dự đoán có vị trí tương ứng nằm trong đảo CpG số 4, đã

nhân lên được đoạn ADN tương ứng với vùng promoter đã dự đoán.

3. Bằng phương pháp MSP đã xác định được tỷ lệ methyl hóa vùng promoter của

gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng là 80% ở mô u, và 37,5% ở mô lân

cận u. Sự sai khác về tỷ lệ methyl hóa ở 2 nhóm mẫu này có ý nghĩa thống kê

(p<0,05). Tình trạng methyl hóa của gen CXCL12 không phụ thuộc vào các đặc

điểm lâm sàng của bệnh như tuổi, giới tính, vị trí ung thư và các giai đoạn bệnh theo

TNM (p> 0,05).

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục phân tích đa hình gen CXCL12 và sự methyl hóa vùng promoter

của gen CXCL12 trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng với số lượng mẫu

lớn hơn.

2. Sử dụng thêm phương pháp định lượng chemokine để thấy rõ được mối

liên hệ giữa hàm lượng chemokine với sự methyl hóa vùng promoter, và

đa hình gen CXCL12.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Nguyễn Như Hiền (2005), Di truyền ung thư, NXB ĐH Quốc gia Hà Nội,

Hà Nội, tr.12.

2. Phạm Thu Huyền, Trịnh Hồng Thái (2011), “Phân tích tình trạng Methyl

hóa Promoter của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng”, Tạp

chí y học Việt Nam tập 384(2), tr. 72-77.

3. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử và tế

bào, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.

4. Nguyễn Thị Hồng Vân, Trần Thị Thùy Anh, Lương Tuấn Nghĩa, Lê Văn

Quảng, Hà Hoài Nam (2011) “ Ứng dụng kỹ thuật PCR- SSCP để phát

hiện các đột biến ở gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư

ruột kết không polyp di truyền”, Tạp chí khoa học ĐH Quốc gia Hà Nội số

27(2), tr 315.

Tài liệu Tiếng Anh

5. Anollés G.C., Gresshoff P.M. (1994), “Staining Nucleic Acids with Silver:

An Alternative to Radioisotopic and Fluorescent Labeling”, Promega

Notes Magazine 40, pp. 13.

6. Cindy A.E., Kathleen D., Kazuyuki K., Leonard B.S., Corey B., Darryl S.,

Peter V.D., Peter W.L. (2000), “MethyLight: a high-throughput assay to

measure ADN methylation”, Nucleic Acids Research, 28(8), pp.32

7. Davuluri R.V., Grosse I., Zhang M.Q. (2001), “Computational identification

of promoters and first exons in the human genome”, Nature Genetics, 29,

pp. 412-417.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

8. Dimberg J., Dienus O., Hugander A., Wågsäter D. (2007), “Polymorphism

and circulating levels of the chemokine CXCL12 in colorectal cancer

patients”, International Journal of Molecular Medicine, 19(1), pp. 11-15.

9. Herman J.G., Graff J.R., Myöhänen B.D., Baylin S.B.(1996), “Methylation-

specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. ”,

Proceedings of the National Academy of Science of the United States of

America, 93, pp. 9821–9826.

10. Hidalgo-Pascual M, Galan J.J.,Chaves-Conde.M., Ramirez-Armengol J.A.,

Moreno. C., Calvo E,Pelaez. P., Crespo. C., Ruiz. A., Royo, and J.L.

(2007), “ Analysis of CXCL12 3'UTR G>A polymorphism in

colorectal cancer”, Oncology Reports, 18(6), pp. 1583-1588.

11. Indrieux. D., Escobar P., L azennec G. (2009), “Emerging roles of

chemokines in prostate cancer”, Endocrine-Related Cancer, 16(3), pp.

663-673 .

12. Kim M.S., Lee J., Sidransky D. (2010), “ADN methylation markers in

colorectal cancer”, Cancer Metastasis Review, 29, pp. 181-206

13. Li L.C., Dahiya R. (2002), “MethPrimer: designing primers for

methylation PCRs”, Bioinformatics, 18(11), pp. 1427-1431

14. Neiva K., Sun Y.X., Taichman R.S. (2005), “The role of osteoblasts in

regulating hematopoietic stem cell activity and tumor metastasis”,

Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 38(10), pp. 1449–

1454

15. Rot A., Andrian U.H. (2004), “Chemokines in innate and adaptive host

defense: Basic chemokinese grammar for immune cells”, Annual Review

of Immunology, 22, pp. 891–928.

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

16. Sanford D., Markowitz M.D., Bertagnolli M.M. (2009), “Molecular Basis

of Colorectal Cancer”, The New England Journal of Medicine, 361(25),

pp. 2449-2460.

17. Sun X., Cheng G., Hao M., Zheng J., Zhou X., Zhang J., Taichman R.S.,

Pienta K.J., Wang J. (2010), “CXCL12/ CXCR4 / CXCR7 chemokine axis

and cancer progression”, Cancer Metastasis Review, pp.269-270

18. Tainsky M.A. (2009), “Tumor Biomarker Discovery: Methods and

Protocols”, Humana Press, New York, pp. 520.

19. Tones P.A., Baylin S.B. (2002) The fundamental role of epigenetic events

in cancer”, Nature Reviews Genetics, 3(6), pp. 415–428

20. Van Dijk D., Oostindiër M., Kloosterman W., Krijnen P., Vasen H.W.

(2007), “Family history is neglected in the work-up of patients with

colorectal cancer: a quality assessment using cancer registry data”,

Familial Cancer, 6(1), pp. 131-134.

21. Weber G.F. (2007), “Molecular Mechanisms of Cancer”, Springer, Ohio,

pp. 453-462.

22. Wendt M.K., Johanesen P.A. , Kang N., Binion D., Shah V., Dwinell M.B.

(2006), “Silencing of epithelial CXCL12 expression by ADN

hypermethylation promotes colonic carcinoma metastasis”, Oncogene, 25,

pp. 4986–4997.

23. Yu J.K., Chen Y.D., Zheng S. (2004), “An integrated approach to the

detection of colorectal cancer utilizing proteomics and bioinfomatics”,

World Journal of Gastroenteraol, 10, pp. 3127-3131.

24. Zhou W., Jiang Z., Liu N., Xu F., Wen P., Liu Y., Zhong W., Song X.,

Chang X., Zhang X., Wei G., Yu J. (2008), “Down-regulation of CXCL12

mRNA expression by promoter hypermethylation and its association with

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

metastatic progression in human breast carcinomas”, Journal of Cancer

Research and Clinical Oncology, 135, pp. 91-102.

25. Zymo research EZ ADN Methylation- Gold TM Kit

Tài liệu World Wide Web

26. http://www.benhhoc.com/content/1442-Ung-thu-truc-trang.html (2/2012)

27. http://rulai.cshl.edu/tools/FirstEF/)

28.http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/colon/Patient/page2#k

eypoint9 (11/2011)

29. http://en.wikipedia.org/wiki/Phenol%E2%80%93chloroform_extraction

(3/2012)

30. http://www.cancer.gov/cancertopics/types/colon-and-rectal (12/2011)

31. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_016861 (3/2012)

32. http://www.ungthuvn.org/ChuDe.aspx (11/2011)

33. http://www.rndsystems.com/chemokine_nomenclature.aspx (12/2011)

34. http://www.sggp.org.vn/suckhoecuaban/(1/2012)

35. http://ungthu.net.vn/ (11/2011)

36. http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan (3/2011)

37. http://www.urogene.org/methprimer/index1.html (3/2011)

38. http://yhth.vn/LibraryDetail/3002/vai-tro-chat-chi-diem-khoi-u-cea-ca-

19- 9-trong-chan-doan-va-dieu-tri-ung-thu-bieu-mo-truc-

trang.htm(3/2012)

39. http://www.ungbuou.vn/chi_tiet/821/ung_thu_dai_truc_trang (3/2012)

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

PHỤ LỤC 1

Bảng kết quả phân tích MSP của gen CXCL12

ST

Mô lân cận (A) Mô u (B)

Họ và tên

T

M U M U

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Nguyễn Trọng S. Nguyễn Quốc L. Bùi Văn P. Lê Thị M. Lê Thị Y. Vũ Xuân C. Dương Thị H. Lê Văn S. Lê Bật X. Nguyễn Văn T. Phạm Trọng T. Dương Thị H. Nguyễn Thị H. Vũ Thị L. Nguyễn Thế T. Nguyễn Văn P. Trần Văn B. Hoàng Thị V. Nguyễn Thị H. Đặng Văn H. Ngũ Thanh H. Hồ Viết Ch. Vũ Quang Nh. Nguyễn Tiến Ư. Lý Đức H.

- - - + - + - - - - + - + + + + + + - + + + + - + -

+ - -

- + +

+ + + - + - + + - - - - - - - + - - - - + + - + - + + - + + + + + + + - + + + +

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

PHỤ LỤC 2

Trình tự RefSeqGene NG_016861.1 của đoạn khảo sát để

tìm đảo CpG trên gen CXCL12 trong cơ sở dữ liệu NCBI

>gi|292658840:3001-6001 Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (CXCL12), RefSeqGene on chromosome 10

GGCCTCAGGGCGCCTGCGGGAGGGGCAGCGGCCAGGCCTGAATCCCTGGTTCGCCCTCGACTCAGCCCAC

GCGGGCCTTTCAGGCTTCTGGGACAGATCCTAGGTCCAGCTGCCCACCTGATTTTGTGGCAAAGAAAAAA

AGAAGAAGAAGAAGCGAGAGGCGATGGCGTTTGCTTTGGCCAGATTTAAGGGCAAGCGAGGCTGCGCGCG

GCTCCCGCAGGGTCGGATCTCCGAGCTCCAGGGCGCCCCTCCACCCGGGTGTAGATTTCCCGCGGACCCC

TTCGCCCTCCCGGGTTTCATCAGCTGCGCAGGAATGGAGCTGGCCAGAGCTCTGGGAGCGGGGAGGGAGG

CGCCGCCACCAGAGGGCGCCGGAGCCCCAGCGCTGCGGCCGGTGAGCGGCCAGGCTCCCCGGCCCAGCCC

AGCAAAGGCCTGGGGACGCCCGACGGCTGCCTTCTTCACTGGACCTCACTGCCTTCAGTTCTTTAAGAGC

AGGGCCAAGTCAGTGGGGTTCCCGGCTCCAAGCCCAGTGCCCAGGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGGTGGG

TGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGAGTGCCGGCCCACAGCCATCTAACGGCCAAAGTGGTTTTGGAA

AAAAAATGCACAGAAGACACCTACTCCCACCAGCGGAGTTCCGGAGCCCTCGCAGCCTCCTGTTGACCGC

TCCCGCCTAATGCAGCCGCTGACCGCCCACTCCCCGACGGCCAGGACTCCCCAGGGACAGGGACGTGTCC

CCAGGGCAGGCCCCTGGATGGACGCGGCGACTGACCCCACTTCGCTGGACGCTGTGCTGGGAAGGACACA

GAGAGGTGGCTGGGGCAGCCTGCGGTCACAAAGCGAGGCCCAAAGGGGCGCTCTCCTCACCCCCACGTCT

CCTGGGTGCCGACCTGCACCCTCCCTTCGCCACCGGACTGGGGCCATCTGGGATGTCTCGGGGGTATCCG

GAGGGCTAAGCACCGCCGAGGGACGGCTCCGTGGGAAGAGTTTTCTGGACCCAGAAGGCAGACGCCAGTA

GTACTGTCCTAGGAGTCGGAGGTCGGGGTGGGGGAGTTCTCAGCTCTTTGGGTCGCACGGAGCTTTTCTT

GGGTAAGGCAGTAAGTACTTAGGTTTAAAGGACTTACTTACAGCTACCATTTATTGAGTACTGTCTGCTT

GTCAGACACGATGCAGAGAATTTCGCGGCGTGGGGCGGGTCTCATTGAATCTCCCGTCCCACTCCGCGGG

GTGGGCCTGTGATTAGCTCATTTCACCATTGAGAGGTCGGAAGTACAAAGGCTACATTCGCTTTTACTGA

GAGCCGCCGGCGCCTTCTGCTTTGTTTGTACAGGCGAGGAAACTGAGGCTCGGCTGGTGGCGCCGTGGGC

TTGGAGTCCGAGCCACGCTGACTGCAAAGACGGGTCTCATTCCCGCAGATCGAGCTCTGCCGGCGGCTGC

GCCGCAAGCCGGGCAGGTGGCGAGCTTGAGCCCCCACGCACAGAAAGCAGGACCCCCTCGGCTGCCTTGG

GCCGCCACCGCCAGCAGGCCCTCCGCCCGGGACTAACTTGTTTGCTTTTCATTGGTTCTCATTCAGTTCC

CGCCATCGAAAGGCCCCGTCCCGCAGCTTTCCACGCGCGCCCCACTTTACGCCTAAGGTCCTCAGTCTCT

CCAGTGGGGCCCTGTCACAGGGACAATAAGCGGCCCTCCAGCCGGCGTCGCTCAGGCTGCGGACCTCACT

GCAGACCGGGCCAGCGGTGCGGGGCCCAGCGGAGCCTGAGAAGGTCAAAGGCCGGAGCGCACTGCGCCTC

GGGAGCACAGAGGGAGCGGAGGAGGGGCGAAGGGGATGGGTGGGGGGTGCCGCCGAGGGAGTCGCGCGTC

AGAGACCCCGGCCACGGCCAGCACTCGGCTCCGGGCCCGCCCCTCACCGCGCGCCCCGCCCCGCCCCGCC

TGGCTCTCCCCTCTAAAGCGCCCGGCGCGCGCCTCCCACCGCCGCACTTTCACTCTCCGTCAGCCGCATT

GCCCGCTCGGCGTCCGGCCCCCGACCCGCGCTCGTCCGCCCGCCCGCCCGCCCGCCCGCGCCATGAACGC

CAAGGTCGTGGTCGTGCTGGTCCTCGTGCTGACCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGTAAGTGCGCTCGGCGG

GGAGGCCCTGGCGAGGCTCTGGGCTTCGGCTCCCGCCCGGCGCAGAGCCGCGGCTCCTCTGCCTGCGCCC

GCAGTTTGCGCCGCCCGACACAGTGGGGGTGGAGGCAGCTCGCTTAGCTGGGCGCTCTGGTGCGGTGTCG

CGTTCAAAGCCCTACTTTTGCGCCGAGGGTTTGTGACCTGCAGAGAGCGACCGCCTGACCTCAAGCTGGC

TGCAGAGCGAGGTCAGCCGGGACAACTGGGCAGGAACGCCCCAAGAGAGCGTTCGGGACTGGCGCGGGAA

GGCGCGAGGGTGGGGAGCCGCGGACCCCAGACCCCTGCCTGCCCACCCTCCACCCACTGCCTTCCCGCTG

CGGGCTCGGTTTCCACAGGCGAATGGGCTCCGAGGTCCTGCTGCGCACAGTGCTGGAGGTCGGGCGGTGC

ATGGCGAGAGCGCGCTTTGCAAAGTTCGCCTCATGCCGCGACTTGAGGCTGTGAGGTCCGATGCAGCCGC

GCAGCCTCCGCTCCCTGCGAAGCCGATCCTCTCCCCACACCCTCGCGGGGCTCTTGGCCAGGCGCGGGCG

GGCTGCGCGGCGCAGCTGTCGGGCTTGTGCCACCCGCCAGGCCGCGCTTCTGCACAGCTCCGCGGTCCGC

AGCGACGCGGACCTGGGCGCGCGTCCAGCCGCTGTCTTCCTGTCTCTTCTCGGGTTCACCTGAGAGAGGC

CCAGGGACCCTCCGAGCCTCACACGCCCCCTCCCCAGCTCCCCAAACACACCTGCAGACAGGCTCTTTTG

TCACCAGCTGGCCAAGCGCTTTGCCCCAGAATGAGAGCTGCAGCAAAGTTCAATCTCCAAG

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

iii

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

PHỤ LỤC 3

Trình tự tham khảo RefSeqGene NG_016861.1 của gen CXCL12

trong cơ sở dữ liệu NCBI

Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (CXCL12), RefSeqGene on chromosome 10

NCBI Reference Sequence: NG_016861.1

FASTA Graphics

LOCUS NG_016861 21941 bp ADN linear PRI 15-MAY-2011

DEFINITION Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (CXCL12), RefSeqGene on chromosome 10.

ACCESSION NG_016861

VERSION NG_016861.1 GI:292658840

KEYWORDS RefSeqGene.

SOURCE Homo sapiens (human)

ORGANISM Homo sapiens

Vertebrata;

Craniata;

Chordata;

Metazoa;

Eukaryota; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;

Catarrhini; Hominidae; Homo.

FEATURES Location/Qualifiers

source 1..21941

/organism="Homo sapiens"

/mol_type="genomic ADN"

/db_xref="taxon:9606"

/chromosome="10"

/map="10q11.1"

gene 5001..19941

/gene="CXCL12"

/gene_synonym="IRH; PBSF; SCYB12; SDF1; SDF1A; SDF1B;

TLSF; TPAR1"

/note="chemokine (C-X-C motif) ligand 12"

/db_xref="GeneID:6387"

/db_xref="HGNC:10672"

/db_xref="MIM:600835"

mRNA

join(5001..5153,9218..9335,11375..11461,16755..19941)

/gene="CXCL12"

/gene_synonym="IRH; PBSF; SCYB12; SDF1; SDF1A; SDF1B;

TLSF; TPAR1"

/product="chemokine (C-X-C motif) ligand 12,transcript

variant 2"

/transcript_id="NM_000609.5"

/db_xref="GI:291045299"

/db_xref="GeneID:6387"

/db_xref="HGNC:10672"

/db_xref="MIM:600835"

exon 5001..5153

/gene="CXCL12"

/gene_synonym="IRH; PBSF; SCYB12; SDF1; SDF1A; SDF1B;

TLSF; TPAR1"

/inference="alignment:Splign:1.39.8"

/number=1

CDS join(5093..5153,9218..9335,11375..11461,16755..16770)

/gene="CXCL12"

/gene_synonym="IRH; PBSF; SCYB12; SDF1; SDF1A; SDF1B;

TLSF; TPAR1"

/note="isoform beta is encoded by transcript variant2;

intercrine reduced in hepatomas; pre-B cell

growth-stimulating factor"

/codon_start=1

/product="stromal cell-derived factor 1 isoform beta"

/protein_id="NP_000600.1"

/db_xref="GI:10834988"

/db_xref="CCDS:CCDS44373.1"

/db_xref="GeneID:6387"

/db_xref="HGNC:10672"

/db_xref="MIM:600835"

>gi|292658840|ref|NG_016861.1| Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (CXCL12), RefSeqGene on chromosome 10

1 ctcccaaagt gctgggatta cagccgtgag ccaccacgcc cagcccataa tacccttttt

61 aataaaccag taaacataag tgcttccctg agttccatga gctgtggtag caaattaatg

121 aaacccaagg atggggtcat agaaacccta atttatggtc atttggtcag aagcactggg

181 aaaacaaccc agggcttgca actggtatct gaagtagggg cagccttgtg ggactggggc

241 ctcaacatgt ggggcctgag cctacctcca ggtagatcat ctcagagttg aattgaatta

................... ................... ................... ................... ................... ...................

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

1981 ttaactcagc agccagaccc ctgcctccca ccttgaactg tgcttaacaa ggcatccctg

2041 aggagccgct gtgccctgca ttacctggta gagcggcaca gagtctgaag acttcaggag

2101 aaggtggggc tctatgggga gtaagagtcc ccaggcagag aaagaaaggt ggagcctttt

2161 gagcataagc ataagcaaag gacacaggga aaggggtggg gaacttcgct gacccgaatt

2221 tgagaggtac ccctgtggcc gagtgagctg gagacatgtc aaaatggcct ggtctgatgg

2281 ccgcctgcct gtgcaggcgg tgcggaggcc cccagagtgt acagggtttt attttatttt

2341 atttacatat ttacatattt atttatttat ttacatattt gtttatttat ttatttttga

2401 gacggagtct cgctttgtca cccaggctgg agtgcagtgg cgccatctcg gctcactgca

2461 agctccgcct cccgggttca cgccattttc ctgcctcagc ctcccgagta gctgggacta

2521 caggcgcccg ccaccacggc cggctaattt ttttgtattt ttagtagaga cggggtttca

2581 ccgtgttagc caggatggtc tcgaactcct gacctcgtga tccgcccgcc tcggccttcc

2641 aaagtgctgg gattacaggc atgagccacc gtgcccggcc agggttttaa atttcaatcg

2701 ccaattgtaa aattgtgagg cttgtaccta aaatatggat ccttggccac cctatttaaa

2761 atcctaactc ccaccccact ttcctctgct ccatcttccc ctagcattta atggccttct

2821 aagtatttta tgcgtaatta cttatgctta gcgccatgtg cttctaaacg tttagtgcct

2881 tttctaaact acttcaaaca tgtagcccag gtctagcaca tagtgggtgc tcagtaagta

2941 tttaacgaac gactagcgga agggatggcc ccatgggtgc cacagtagct tctgttctgg

3001 ggcctcaggg cgcctgcggg aggggcagcg gccaggcctg aatccctggt tcgccctcga

3061 ctcagcccac gcgggccttt caggcttctg ggacagatcc taggtccagc tgcccacctg

3121 attttgtggc aaagaaaaaa agaagaagaa gaagcgagag gcgatggcgt ttgctttggc

3181 cagatttaag ggcaagcgag gctgcgcgcg gctcccgcag ggtcggatct ccgagctcca

3241 gggcgcccct ccacccgggt gtagatttcc cgcggacccc ttcgccctcc cgggtttcat

3301 cagctgcgca ggaatggagc tggccagagc tctgggagcg gggagggagg cgccgccacc

3361 agagggcgcc ggagccccag cgctgcggcc ggtgagcggc caggctcccc ggcccagccc

3421 agcaaaggcc tggggacgcc cgacggctgc cttcttcact ggacctcact gccttcagtt

3481 ctttaagagc agggccaagt cagtggggtt cccggctcca agcccagtgc ccagggtggg

3541 tgggtgggtg ggtgggtggg tggatggatg gatggatgga tggatggagt gccggcccac

3601 agccatctaa cggccaaagt ggttttggaa aaaaaatgca cagaagacac ctactcccac

3661 cagcggagtt ccggagccct cgcagcctcc tgttgaccgc tcccgcctaa tgcagccgct

3721 gaccgcccac tccccgacgg ccaggactcc ccagggacag ggacgtgtcc ccagggcagg

3781 cccctggatg gacgcggcga ctgaccccac ttcgctggac gctgtgctgg gaaggacaca

3841 gagaggtggc tggggcagcc tgcggtcaca aagcgaggcc caaaggggcg ctctcctcac

3901 ccccacgtct cctgggtgcc gacctgcacc ctcccttcgc caccggactg gggccatctg

3961 ggatgtctcg ggggtatccg gagggctaag caccgccgag ggacggctcc gtgggaagag

4021 ttttctggac ccagaaggca gacgccagta gtactgtcct aggagtcgga ggtcggggtg

4081 ggggagttct cagctctttg ggtcgcacgg agcttttctt gggtaaggca gtaagtactt

4141 aggtttaaag gacttactta cagctaccat ttattgagta ctgtctgctt gtcagacacg

4201 atgcagagaa tttcgcggcg tggggcgggt ctcattgaat ctcccgtccc actccgcggg

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

4261 gtgggcctgt gattagctca tttcaccatt gagaggtcgg aagtacaaag gctacattcg

4321 cttttactga gagccgccgg cgccttctgc tttgtttgta caggcgagga aactgaggct

4381 cggctggtgg cgccgtgggc ttggagtccg agccacgctg actgcaaaga cgggtctcat

4441 tcccgcagat cgagctctgc cggcggctgc gccgcaagcc gggcaggtgg cgagcttgag

4501 cccccacgca cagaaagcag gaccccctcg gctgccttgg gccgccaccg ccagcaggcc

4561 ctccgcccgg gactaacttg tttgcttttc attggttctc attcagttcc cgccatcgaa

4621 aggccccgtc ccgcagcttt ccacgcgcgc cccactttac gcctaaggtc ctcagtctct

4681 ccagtggggc cctgtcacag ggacaataag cggccctcca gccggcgtcg ctcaggctgc

4741 ggacctcact gcagaccggg ccagcggtgc ggggcccagc ggagcctgag aaggtcaaag

4801 gccggagcgc actgcgcctc gggagcacag agggagcgga ggaggggcga aggggatggg

4861 tggggggtgc cgccgaggga gtcgcgcgtc agagaccccg gccacggcca gcactcggct

4921 ccgggcccgc ccctcaccgc gcgccccgcc ccgccccgcc tggctctccc ctctaaagcg

4981 cccggcgcgc gcctcccacc gccgcacttt cactctccgt cagccgcatt gcccgctcgg

5041 cgtccggccc ccgacccgcg ctcgtccgcc cgcccgcccg cccgcccgcg ccatgaacgc

5101 caaggtcgtg gtcgtgctgg tcctcgtgct gaccgcgctc tgcctcagcg acggtaagtg

5161 cgctcggcgg ggaggccctg gcgaggctct gggcttcggc tcccgcccgg cgcagagccg

5221 cggctcctct gcctgcgccc gcagtttgcg ccgcccgaca cagtgggggt ggaggcagct

5281 cgcttagctg ggcgctctgg tgcggtgtcg cgttcaaagc cctacttttg cgccgagggt

5341 ttgtgacctg cagagagcga ccgcctgacc tcaagctggc tgcagagcga ggtcagccgg

5401 gacaactggg caggaacgcc ccaagagagc gttcgggact ggcgcgggaa ggcgcgaggg

5461 tggggagccg cggaccccag acccctgcct gcccaccctc cacccactgc cttcccgctg

5521 cgggctcggt ttccacaggc gaatgggctc cgaggtcctg ctgcgcacag tgctggaggt

5581 cgggcggtgc atggcgagag cgcgctttgc aaagttcgcc tcatgccgcg acttgaggct

5641 gtgaggtccg atgcagccgc gcagcctccg ctccctgcga agccgatcct ctccccacac

5701 cctcgcgggg ctcttggcca ggcgcgggcg ggctgcgcgg cgcagctgtc gggcttgtgc

5761 cacccgccag gccgcgcttc tgcacagctc cgcggtccgc agcgacgcgg acctgggcgc

5821 gcgtccagcc gctgtcttcc tgtctcttct cgggttcacc tgagagaggc ccagggaccc

5881 tccgagcctc acacgccccc tccccagctc cccaaacaca cctgcagaca ggctcttttg

5941 tcaccagctg gccaagcgct ttgccccaga atgagagctg cagcaaagtt caatctccaa

6001 ggccctgggc cactgggaac cgtggtgtcc cgtttcactg ggagagggct tttttctttt

................... ................... ................... ................... ................... ...................

21661 cagggcactg ggtttcagct tccttattcc catcacttgt gggaggcaca aacacagctg

21721 agaaagctgg acccccacgg tgatggggtc ccctcagcac ggctgattgc atggagtgga

21781 cactggatgc atattgcagg ccgatctgat tttctgtcac aggagtacaa ggctgtgatt

21841 caacagcatc gggctttgct ccctttctct gtgcctgcag ctgaggactc ggcactctgg

21901 agtgtgggct gccgggagac agaagcagag ggagccccca c //

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

vii

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

PHỤ LỤC 4

Kết quả dự đoán trình tự promoter của gen CXCL12 theo chương

trình FirstEF (http://rulai.cshl.edu/tools/FirstEF/)

FirstEF Results - Sat Mar 24 12:47:03 2012 >gi|292658840:1-6001_1 Predictions on the direct strand No. Promoter P(promoter) Exon P(exon) P(donor) CpG Window Rank 1 00004474..00005043 1.0000 00004974..00005153 1.0000 0.9999 00004898..00005099 1 1 00004571..00005140 1.0000 00005071..00005391 1.0000 0.9937 00004898..00005099 2 >gi|292658840:1-6001_1 Predictions on the complementary strand No. Promoter P(promoter) Exon P(exon) P(donor) CpG Window Rank 1 00005584..00005015 1.0000 00005084..00004938 1.0000 0.9998 00005139..00004938 1 1 00005779..00005210 1.0000 00005279..00005134 1.0000 0.9880 00005139..00004938 2 1 00005325..00004756 1.0000 00004825..00003924 1.0000 0.9737 00005139..00004938 3 1 00005243..00004674 1.0000 00004743..00003724 1.0000 0.9302 00005139..00004938 4 1 00005324..00004755 1.0000 00004824..00003806 1.0000 0.9264 00005139..00004938 5 1 00005638..00005069 1.0000 00005138..00005056 1.0000 0.9122 00005139..00004938 6 1 00005323..00004754 1.0000 00004823..00003901 1.0000 0.9085 00005139..00004938 7

viii

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

PHỤ LỤC 5

Kết quả dự đoán trình tự promoter của gen CXCL12 theo chương

trình Proscan (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)

Proscan: Version 1.7 Processed Sequence: >gi|292658840:1-6001_1

6001 Base Pairs

S00437 - S01964 + S00974 + S01936 + S00437 + S02016 + S01193 + S01936 - S01561 + S00346 - S01936 + S00437 - S00801 + S00802 + S01964 - S00781 - S00978 - S00979 - S01964 + S00216 + S01081 + S01187 + S00346 + 1.216000 2.361000 1.086000 1.108000 1.278000 1.082000 1.427000 1.091000 1.554000 1.672000 1.108000 1.216000 2.755000 3.292000 2.284000 2.772000 3.361000 6.023000 2.361000 6.003000 6.322000 8.117000 1.355000 4715 4769 4771 4775 4800 4858 4858 4860 4862 4867 4896 4903 4926 4927 4930 4931 4932 4933 4939 4943 4944 4944 4946

Promoter region predicted on forward strand in 4696 to 4946 Promoter Score: 59.64 (Promoter Cutoff = 53.000000) Significant Signals: Name TFD # Strand Location Weight UCE.2 GCF T-Ag AP-2 UCE.2 PuF JCV_repeated_sequenc AP-2 SDR_RS AP-2 AP-2 UCE.2 Sp1 Sp1 GCF Sp1 Sp1 Sp1 GCF APRT-mouse_US EARLY-SEQ1 (Sp1) AP-2

Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Promoter region predicted on reverse strand in 5296 to 5046 Promoter Score: 54.66 (Promoter Cutoff = 53.000000) Significant Signals: Name JCV_repeated_sequenc Sp1 GCF Sp1 GCF JCV_repeated_sequenc Sp1 AP-2 Sp1 EARLY-SEQ1 AP-2 AP-2 Sp1 Sp1 KROX24 Sp1 Sp1 EGR-1 AP-2 Sp1 Sp1 T-Ag UCE.2 Strand Location Weight + - - + + - - + + + - - - + - - - + + + + - - 1.658000 3.013000 2.361000 3.061000 2.284000 1.427000 3.191000 1.672000 3.119000 5.795000 1.355000 1.108000 2.755000 2.772000 2.151000 3.013000 3.191000 2.294000 1.672000 3.061000 3.119000 1.086000 1.278000 5267 5256 5254 5251 5248 5208 5207 5203 5202 5201 5184 5172 5171 5166 5091 5087 5086 5083 5082 5082 5081 5051 5049