Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl transferase) vào cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Tạ Thị Diễm Thu

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN

IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO

CÂY SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Tạ Thị Diễm Thu

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN

IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO

CÂY SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Chuyên ngành : Sinh Học Thực Nghiệm

Mã số

: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2011

TS. NGUYỄN HỮU HỔ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả

nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào.

TẠ THỊ DIỄM THU

MỤC LỤC

Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình

38T6938T ..................................... 8 38THình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pVDH39638T 38THình 3.10. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen ipt ở plasmid tách chiết từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 tạo được qua biến nạp38T ........................................... 38T7038T 8 38TMỞ ĐẦU38T ............................................................................................................................... 1 38TChương 1. TỔNG QUAN38T .................................................................................................... 3

38T1.1. GIỚI THIỆU CHI PANAX38T....................................................................................................... 3 38T1.1.1. Đặc điểm38T ............................................................................................................................ 3 38T1.1.2. Phân bố38T ............................................................................................................................... 3 38T1.1.3. Phân loại38T ............................................................................................................................. 4 38T1.1.4. Thành phần hóa học38T ........................................................................................................... 6 38T1.1.5. Tác dụng chính của sâm38T ..................................................................................................... 6 38T1.2. SÂM NGỌC LINH38T ................................................................................................................... 9 38T1.2.1. Nguồn gốc và lịch sử phát hiện38T .......................................................................................... 9 38T1.2.2. Đặc điểm sinh học và phân bố38T ......................................................................................... 10 38T1.2.3. Phân bố38T ............................................................................................................................. 12 38T1.2.4. Thành phần hóa học chính38T ............................................................................................... 12 38T1.2.5. Tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh38T ............................................................................. 18

38T1.3. PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens38T .................................................................................................................................... 21 38T1.3.1. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens38T ............................................................................. 22 38T1.3.2. Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens38T .................................................................... 23 38T1.3.3. Cơ chế biến nạp T–DNA vào tế bào ký chủ38T .................................................................... 25 38T1.3.4. Ứng dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trong chuyển gen thực vật38T .................. 28 38T1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN SAU KHI CHUYỂN VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT38T .................................................................................................................... 29 38T1.4.1. Phương pháp thử in vitro khả năng kháng kháng sinh của mô chuyển gen38T ..................... 29 38T1.4.2. Phương pháp hóa mô tế bào38T ............................................................................................. 30 38T1.4.3. Phương pháp PCR38T ............................................................................................................ 30 38T1.5. GEN IPT38T ................................................................................................................................. 32 38T1.5.1. Một số nghiên cứu chuyển gen ipt38T ................................................................................... 32 38T1.5.2. Cơ chế tác dụng của gen ipt38T ............................................................................................. 33 38T1.6. NUÔI CẤY TẾ BÀO – SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP38T ............................................... 34 38T1.6.1. Hợp chất thứ cấp và nuôi cấy mô, tế bào38T ......................................................................... 34 38T1.6.2. Quy trình nuôi cấy tế bào sản xuất hợp chất thứ cấp38T ........................................................... 35 38T1.6.3. Một số phương pháp tăng hiệu quả sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy mô, tế bào38T .................................................................................................................................................... 36

38TChương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP38T .................................................................. 38

38T2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU38T .................................................................................................... 38 38T2.1.1. Mẫu cấy38T ............................................................................................................................ 38 38T2.1.2. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 440438T ................................................. 38

38T2.1.3. Enzyme cắt giới hạn38T ......................................................................................................... 39 38T2.1.4. Mồi và thang chuẩn38T .......................................................................................................... 39 38T2.1.5. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm38T ......................................................................... 40 38T2.1.6. Môi trường và điều kiện nuôi cấy38T .................................................................................... 43 38T2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU38T........................................................................................... 44 38T2.2.1. Thí nghiệm về nuôi cấy mô38T .............................................................................................. 44 38T2.2.2. Thí nghiệm chuyển gen38T .................................................................................................... 46 38T2.2.3. Kiểm tra sự hiện diện/biểu hiện của các gen chuyển38T ....................................................... 50

38TChương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN38T ........................................................................ 54

38T3.1. THÍ NGHIỆM VỀ NUÔI CẤY MÔ38T ....................................................................................... 54 38T3.1.1. Tạo mô sẹo từ lá sâm ex vitro và cuống lá sâm in vitro38T .................................................. 54 38T3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và TDZ đến khả năng tăng sinh khối mô sẹo lá sâm38T ............................................................................................................................................. 55 38T3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo lá sâm38T ................... 58 38T3.2. THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN38T .............................................................................................. 66 38T3.2.1. Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen38T ............................. 66 38T3.2.2. Chuyển gen vào mô sẹo sâm nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens38T ........................ 68

38THình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pVDH39638T .......................................... 69 38TDãy 1: thang DNA chuẩn λ-HindIII38T ................................................................................ 69 38TDãy 2: plasmid trong E. coli38T .............................................................................................. 69 38THình 3.10. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen ipt ở plasmid tách chiết từ vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 tạo được qua biến nạp38T ................................................................. 70

38T3.2.3. Kiểm tra sự hiện diện/biểu hiện của các gen chuyển38T ....................................................... 73

38TKẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ38T ........................................................................................... 79 38TTÀI LIỆU THAM KHẢO38T ................................................................................................. 80 38TPHỤ LỤC38T ............................................................................................................................ 94

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

BA: 6-Benzylaminopurin

bp: Base pair

cs.: Cộng sự

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

DNA: Deoxyribonucleic acid

EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid

EtBr: Ethidium bromide

gus A: Gen tạo enzyme β-D-glucuronidase

GUS: Enzyme β-D-glucuronidase

hpt: Gen tạo enzyme hygromycin phosphotransferase

HPT: Enzyme hygromycin phosphotransferase

ipt: Gen tạo enzyme isopentenyl transferase

IPT: Enzyme isopentenyl transferase

kD: Kilodalton

MS: Môi trường Murashige and Skoog

RNA: Ribonucleic acid

SH: Môi trường Schenk và Hidebrandt

PCR: Polymerase chain reaction

pVDH396: Plasmid pVDH396

SAG: Senescence-associated gene

SAGR12R-IPT: Promoter SAGR12R-IPT

Taq: Thermus aquaticus

TDZ: Thidiazuron

Ti: Tumor-inducing

X-gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide

Vir: Gen gây độc (Virulence)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Hệ thống phân loại các loài thuộc chi Panax ở châu Á và thế giới ......... 5

Bảng 1.2. Hàm lượng một số saponin chính trong sâm (đã trừ độ ẩm) ................... 13

Bảng 1.3. Hàm lượng saponin của sâm Ngọc Linh so với các loài Panax .............. 13

Bảng 1.4. Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol

..................................................................................................................... 14

Bảng 1.5. Acid Oleanolic ......................................................................................... 14

Bảng 1.6. Ocotillol ................................................................................................... 14

Bảng 1.7. Các axid béo được tìm thấy ..................................................................... 15

Bảng 1.8. Thành phần acid amin chủ yếu ................................................................ 16

Bảng 1.9. Các nguyên tố vi lượng ........................................................................... 17

Bảng 1.10. Vai trò các gen vir. ................................................................................ 25

Bảng 2.1. Kích thước thang λ-HindIII ..................................................................... 40

Bảng 2.2. Kích thước thang 1 kb ............................................................................. 40

Bảng 2.3. Nồng độ 2,4-D và TDZ cho thí nghiệm tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh 45

Bảng 2.4. Nồng độ NAA và BA cho thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 46

Bảng 2.5. Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR ................................................ 52

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ lên khả năng tăng sinh hối của mô

sẹo sâm Ngọc Linh ................................................................................................... 55

Bảng 3.2. Kết quả tái sinh chồi sâm Ngọc Linh sau 12 tuần ................................... 58

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát nồng độ hygromycin .................................................... 67

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây sâm Ngọc Linh ................................................................................ 11

Hình 1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đang bám vào tế bào thực vật ..... 22

Hình 1.3. Khối u ở thực vật do Agrobacterium tumefaciens gây ra ....................... 23

Hình 1.4. Sơ đồ gen của Ti–plasmid trong vi khuẩn A. tumefaciens ...................... 24

Hình 1.5. Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen ...... 26

Hình 1.6. Trình tự biến nạp T-DNA vào tế bào ký chủ. .......................................... 27

34THình 1.8. Sơ đồ tạo cytokinin trong thực vật dưới tác dụng của gen ipt ................. 34

Hình 1.7. Sơ đồ plasmid tái tổ hợp dựa trên nguyên tắc của Ti-plasmid. ............... 29

Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin .......... 38

Hình 2.2. Vị trí của gen hpt, gen ipt, gen gusA trong vùng T-DNA của plasmid pVDH396

.................................................................................................................................. 39

Hình 2.3. Vật liệu dùng nuôi cấy tạo mô sẹo .......................................................... 45

Hình 3.1. Mô sẹo của hai loại vật liệu dùng nghiên cứu sau 2 tháng nuôi cấy ....... 54

Hình 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ lên khả năng tăng sinh mô sẹo

sâm Ngọc Linh sau 8 tuần ........................................................................................ 56

Hình 3.3. Chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi trường C1, C2, C3,

C4, C5 và C6 ............................................................................................................ 60

Hình 3.4. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi trường C1,

C2, C3 ....................................................................................................................... 61

Hình 3.5. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi trường C4,

C5 và C6 ................................................................................................................... 62

Hình 3.6. Sự hình thành và phát triển của phôi soma từ mô sẹo mảnh lá. .............. 63

Hình 3.7. Sự hình thành và phát triển của phôi soma từ mô sẹo cuống lá in vitro . 65

Hình 3.8. Kết quả thử hygromycin sau 8 tuần ......................................................... 68

Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pVDH396 ................................... 69

Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen ipt ở plasmid tách chiết từ vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens LBA4404 tạo được qua biến nạp ................................ 70

Hình 3.11. Chọn lọc mô chuyển gen ....................................................................... 72

Hình 3.12. Thử nghiệm hóa mô GUS mô chuyển gen ............................................ 74

Hình 3.13. Ảnh chụp gel điện di sản phẩm PCR gen hpt (băng DNA 800 bp) ....... 75

Hình 3.14. Ảnh chụp gel điện di sản phẩm PCR gen ipt (băng DNA 650 bp) ........ 76

Hình 3.15. Chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh chuyển gen .......................................... 78

MỞ ĐẦU

Một số loài thực vật họ Sâm (Araliaceae) nói chung, sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) nói riêng – giống đặc hữu của nước ta là các loài cây

dược liệu rất quý đối với nhiều nước trên thế giới đặc biệt đối với các nước châu Á

như Trung Quốc, Triều Tiên, Việt Nam,...; rễ sâm chứa nhiều hợp chất có tác dụng

dược lý quan trọng.

Sâm Ngọc Linh đã được chứng minh ngoài tác dụng bổ dưỡng còn có nhiều

tác dụng khác như kích thích hoạt động não bộ, nội tiết tố sinh dục, tạo hồng cầu,

kháng khuẩn đặc hiệu với chủng Streptococcus, chống oxy hóa, chống lo âu, chống

trầm cảm, bảo vệ gan, giảm cholesterol và lipid máu, hạ đường huyết, điều hòa tim

mạch, điều hòa miễn dịch và phòng chống ung thư.

Ngoài các nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn theo phương pháp truyền

thống, hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nói chung và biến nạp gen

nói riêng trong công tác giống sâm Ngọc Linh đã và đang được các nhà khoa học

trong và ngoài nước đặc biệt quan tâm.

Như chúng ta đã biết, ipt là gen mã hóa isopentenyl transferase - enzyme

quan trọng của con đường sinh tổng hợp cytokinin ở thực vật. Vai trò tích cực của

gen ipt trong cơ thể thực vật chuyển gen thể hiện tập trung ở một số điểm như: 1/

Làm chậm sự lão hóa, tăng sinh trưởng và năng suất, tăng độ bền của lá và hoa đối

với nhiều loại thực vật như Arabidopsis, thuốc lá, Petunia, bông cải, cải xà lách,

cúc; 2/ Ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp các chất thứ cấp - tăng

hàm lượng artemisinin ở cây Thanh hao chuyển gen; 3/ Làm tăng khả năng chịu hạn

khi gen ipt biến nạp được điều khiển bởi promoter đặc trưng PRSARKR (senescence

associated receptor protein kinase); 4/ Có thể ứng dụng tác động của gen này như

yếu tố chọn lọc in vitro – thay thế tác nhân chọn lọc khác. Với ý nghĩa nêu trên,

nghiên cứu biến nạp gen ipt là vấn đề cần được quan tâm.

Đến nay trên thế giới cũng như ở trong nước chưa ghi nhận được công trình

công bố kết quả nghiên cứu về biến nạp gen nói chung và biến nạp gen ipt nói riêng

trên đối tượng sâm Ngọc Linh.

Do vậy, đề tài “Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl

transferase) vào cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” được

đặt ra với mục đích tạo được mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen ipt bằng kỹ thuật

biến nạp gen phục vụ cho mục đích nghiên cứu dài hạn về ảnh hưởng của gen

chuyển ipt đến khả năng tăng sinh tổng hợp các chất thứ cấp.

Mục tiêu của đề tài

Tạo được một số dòng mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen đích ipt qua biến

nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

Giới hạn của đề tài

Đề tài chỉ tập trung nghiên cứu tạo ra dòng mô sẹo chuyển gen, bước đầu

đánh giá sự hiện diện và biểu hiện của các gen chuyển bằng thử nghiệm định tính

(thử GUS) và phương pháp sinh học phân tử (PCR). Chưa nêu nội dung phân tích

hàm lượng hợp chất thứ cấp.

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU CHI PANAX 1.1.1. Đặc điểm

Panax là chi thực vật có nhiều cây làm thuốc quan trọng, trong đó có họ Nhân

sâm. Đến nay đã biết 14 loài được công bố trên thế giới. Vùng phân bố của chi

Panax ở bắc bán cầu, từ trung tâm Hymalaya qua đông bắc Trung Quốc, vùng Viễn

đông nước Nga, Triều Tiên, Nhật Bản đến Bắc Mỹ…[5], [67]

Đặc biệt, ở Việt Nam năm 1973 đã phát hiện một loài Panax mọc hoang trên

diện tích rộng, ở độ cao 1.800 - 2.000m trên dãy Trường Sơn nam, đó là loài sâm

Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), còn gọi là sâm K5, sâm Ngọc Linh.

Ngoài ra, ở Việt Nam còn phát hiện loài sâm Vũ Diệp (Panax bipinatifidus) và sâm

Tam Thất (Panax pseudoginseng) ở các tỉnh miền núi phía Bắc giáp Trung Quốc.

Một số nghiên cứu các cây thuộc họ Nhân sâm có đặc điểm chung sau:

Về thành phần hóa học: hợp chất saponin thường được đánh giá là thành phần

hoạt chất chính của những cây thuộc họ Nhân sâm và được tập trung nghiên cứu để

xác định cấu trúc.

Về tác dụng dược lý: các tác dụng chính của những cây thuộc họ Nhân sâm là tác dụng bổ, tăng lực, chống stress và một số tác dụng khác như giải độc gan; tác dụng trên nội tiết tố; thận; cơ, xương, khớp,… [5], [6], [45] 1.1.2. Phân bố

Cho đến nay các nhà khoa học đã biết trên thế giới có khoảng 14 loài thuộc chi

Panax, phân bố: [70]

* Panax ginseng C.A. Mey. (Nhân sâm) = Panax schinseng Nees: loài hoang

dại, hiện nay rất hiếm, được trồng ở Đông Bắc, châu Á.

* Panax quingquefolium L. (Sâm Mỹ): mọc hoang và được trồng ở vùng Bắc

Mỹ.

* Panax trifoliatus L. (Dwarf ginseng, “Sâm lùn”): có ở Bắc Mỹ.

* Panax notoginseng F.H. Chen ex C.Y. Wu et K.M. Feng: phân bố của loài

hoang dai chưa rõ, đã được trồng ở Vân Nam, Trung Quốc.

* Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Pseudo-ginseng Hara: mọc hoang dại,

rất hiếm, được tìm thấy ở phía đông dãy Himalaya.

* Panax japonicus C.A. Mey. (Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Japonicus

(Meyer) Hara): mọc hoang dại ở Nhật Bản và miền Nam Trung Quốc.

* Panax japonicus C.A. Mey. var. maijor (Burk.) C.Y. Wu et K.M. Feng

(Panax pseudo-ginseng Wall var. maijor (Burk.) Li.): mọc hoang dại ở miền Nam

Trung Quốc.

* Panax japonicus C.A. Mey. var. angustifolius (Burk.) Chen et Chu: mọc

hoang ở miền Nam Trung Quốc.

* Panax japonicus C.A. Mey. var. bipinatifidus (Seem.) C.Y. Wu et K.M.

Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung Quốc.

* Panax zingiberensis C.Y. Wu et K.M. Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung

Quốc.

* Panax stipuleanatus H. Tsai et K.M. Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung

Quốc từ Vân Nam đến Tây Tạng và miền Bắc Việt Nam.

* Panax pseudo-ginseng Wall. subsp. Himalaycus Hara: mọc hoang ở phái

Đông dãy Himalaya.

* Panax sp.: gồm mẫu C (thu hái ở Chame, Nepal) và mẫu G (thu hái ở

Ghorapani, Nepal): mọc hoang ở miền Trung Nepal.

* Panax vietnamensis Ha et Grushv.: mọc hoang và được trồng ở hai tỉnh Kon

Tum và Quảng Ngãi.

1.1.3. Phân loại

Đã có một số nghiên cứu về thực vật của các loài thuộc chi Panax. Và gần đây

nhất là hệ thống phân loại của Jun Wen (2001) thống kê 12 trong số 14 loài và dưới

loài của chi Panax đã được đề cập ở trên. [70]

Bảng 1.1. Hệ thống phân loại các loài thuộc chi Panax ở châu Á và thế giới

C. Hoo (1973) Jun Wen (2001)

P. ginseng C.A. Mey. P. Pseudoginseng Wall. H.L. Li (1942) P. schinseng Nees P.Pseudoginseng Wall. C.Y. Wu et al (1973) P. ginseng C.A. Mey. P.Pseudoginseng Wall. H. Hara (1970) P. ginseng C.A. Mey. P.Pseudoginseng Wall. Subsp. Pseudoginseng P. ginseng C.A. Mey. P. Pseudoginseng Wall. Var. Pseudoginseng

Var. Notoginseng (Burk.) Chen Var. Notoginseng F.H. Chen

P. japonicus C.A. Mey.

P. japonicus C.A. Mey. Subsp. japonicus

P. Wanggianus S.C. Sun

Var. Notoginseng (Burk.) Hoo et Tseng Var. japonicus Var. Wanggianus (Sun) Hoo et Tseng

Var. major (Burk.) P. Bipinnatifidus Seem.

Var. elagantior (Burk.) Wu et Feng Var. Angustatus (Makino) Hara Subsp. Himalaycus Hara Var. Angustifolius

Var. major (Burk.) Li Var. Angustifolius (Burk.) Li (Burk.) Jun Wen

P. Stipuleanatus Tsai et Feng

P. Zingiberensis C.Y. Wu et K.M. Feng

P. Stipuleanatus Tsai et Feng P. Zingiberensis C.Y. Wu et K.M. Feng P. trifolius L. P. Quinquefolius P. Vietnamensis Ha et Grushv.

1.1.4. Thành phần hóa học

28T1.1.4.1. Hợp chất saponin28T [1], [5], [6], [7], [79], [80]

Saponin và polyacetylen là hai nhóm hoạt chất chính có trong chi Panax.

Saponin còn gọi là saponin glycoside hay saponoside do chữ Latinh “sapo” có

nghĩa là xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycoside lớn, gặp rộng

rãi trong thực vật. Mỗi một saponin đều có hai phần: sapogenin (aglycon) và đường.

Phần sapogenin có thể là một chất steroid hay triterpenoid. Phần đường thường là

glucose, galactose, pentose hay metyl pentose.

Saponin được xem là thành phần hoạt chất chính trong các loài sâm. Các nhà

khoa học đã chiết tách và xác định cấu trúc của hơn 100 saponin từ các loài Panax

L. có thành phần chính là các saponin triterpenoid tetracylic nhóm dammaran, gọi

28T1.1.4.2. Hợp chất polyacetylene28T [1], [6], [80], [93], [112]

chung là glycoside.

Polyacetylene được phát hiện trong sâm Triều Tiên và những năm 60 và phát

hiện thấy có tác dụng phòng chống ung thư vào những năm 80 của thế kỷ 20. Cấu

tạo của polyacetylen thường là các hydrocacbon mạch thẳng có 17 hoặc 18 carbon

có gắn với các nhóm chất liên kết. Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một

đầu là nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại là chuỗi

CR7RHR15R.

Việc nghiên cứu những hợp chất polyacetylen trong các cây họ Nhân sâm đã

cho thấy chúng thể hiện một số đặc tính sinh học như: kháng nấm, kháng khuẩn,

kháng viêm, kháng ngưng tập tiểu cầu, độc tế bào và kháng ung thư.

1.1.5. Tác dụng chính của sâm

Sâm Triều Tiên nói riêng và Nhân sâm nói chung có vai trò quan trọng trong

dự phòng và điều trị các bệnh mãn tính như: bệnh tiểu đường, ung thư, sơ vữa động

mạch, huyết khối, lipid máu, cao huyết áp, thiểu năng tuần hoàn não,… do có tác

dụng tăng cường thể lực và gia tăng sức đề kháng của cơ thể. [6], [52]

28T1.1.5.1. Tác dụng tăng lực, phục hồi sức28T [36], [89], [92]

Bột chiết sâm Triều Tiên và các ginsenosid chính như G-Rg1, G-Rb1 làm thay

đổi các thông số sinh hóa trong máu liên quan đến chuyển hóa năng lượng trong quá

trình vận động như làm tăng hàm lượng glucose, giảm hàm lượng glycogen trong

máu (do tăng dự trữ glycogen trong gan), giảm acid béo tự do, giảm hàm lượng

triglyceride, giảm hàm lượng acid lactic và acid pyruvic. Điều này cho thấy bột

chiết sâm Triều Tiên làm thay đổi cơ chế hằng định nội môi về năng lượng trong

quá trình vận động theo chiều hướng làm gia tăng khả năng sinh hóa của cơ xương,

oxy hóa acid béo tự do sản sinh năng lượng vận động thay cho glucose.

1.1.5.2. Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương

Sâm Triều Tiên thể hiện tác dụng lên hệ thần kinh theo hai hướng là kích thích

hoặc ức chế tùy theo thành phần ginsenosid và trạng thái bệnh lý. Takagi và cộng sự

đã chứng minh rằng các saponin thuộc nhóm protopanaxadiol mà tiêu biểu là G-

Rb1 hoặc hỗn hợp saoponin có G-Rb1 và G-Rc thể hiện ức chế hệ thần kinh trung

ương, trong khi các saponin thuộc nhóm protopanaxatriol, tiêu biểu là G-Rg1 và

những hợp chất tan trong lipid thể hiện tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương,

chống mệt mỏi. [36], [70], [80], [89]

Sâm Mỹ còn có tác dụng điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, G-Rb1 và G-Rg1

đóng vai trò chủ yếu trong tác dụng này. [126]

1.1.5.3. Tác dụng cải thiện trí nhớ

Bột chiết hồng sâm Triều Tiên có tác dụng cải thiện rõ khả năng học tập- ghi

nhớ do hoạt chất G-Rg1 quyết định, nhất là những tổn thương trong hoạt năng não

bộ liên quan đến tuổi già. [37], [68]

1.1.5.4. Tác dụng đáp ứng thích nghi và chống stress

Tác dụng dược lý quan trọng của sâm Triều Tiên là duy trì sự hằng định nội

môi, đưa về bình thường những trạng thái sinh lý bất thường của cơ thể do stress

gây ra. G-Rg1 thuộc nhóm protopanaxatriol saponin là hoạt chất có tác dụng quyết

định chống stress của sâm Triều Tiên. Cơ chế tác động chống stress có liên quan

đến trung khu điều hòa nhiệt độ và sự tạo thành chất hóa học trung gian histamin

của vùng dưới đồi. [89], [114]

1.1.5.5. Tác dụng chống oxy hóa và chống lão hóa

Các ginsenosid thuộc nhóm panaxatriol như G-Rb1, G-Rb2 và ginsenosid

thuộc nhóm panaxadiol như G-Rg1 được chứng minh là những chất có tác dụng

chống oxy hóa điển hình của sâm Triều Tiên. Dịch chiết nước hồng sâm Triều Tiên

uống dài ngày có tác dụng kéo dài thời gian sống, giảm hàm lượng cholesterol,

glucose, TBARS (sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào), gia tăng

hoạt năng của các enzyme chống oxy hóa nội sinh như superoxyd dismutase (Cu,

Zn-SOD và Mn-SOD), catalase, glutathione peroxydase trong gan. [52], [81]

1.1.5.6. Tác dụng bảo vệ gan

Sâm Triều Tiên có tác dụng bảo vệ gan theo cơ chế tác dụng chống oxy hóa.

Các chất điển hình có tác dụng bảo vệ gan: 20(S)-ginsenosid-Rh2, 20(R)-

ginsenosid-Rg3 và prosapogenin của 20(R)-ginsenosid-Rh2 và 20(S)-ginsenosid-

Rs. [5], [112]

1.1.5.7. Tác dụng điều hòa miễn dịch

Dịch chiết nước rễ sâm Triều Tiên làm gia tăng sự tạo thành kháng thể sơ cấp

và thứ cấp in vitro, làm tăng hoạt tính của IgM, IgG và tế bào K (natural killer

cells), làm gia tăng sự sản sinh interferon, tế bào lympho.

Bột chiết hồng sâm Triều Tiên (liều uống 50 - 500mg/kg thể trọng) có tác

dụng kích thích không đặc hiệu đáp ứng miễn dịch. [86], [97]

1.1.5.8. Tác dụng chống ung thư

Tác dụng gia tăng hoạt năng của tế bào K là một trong những cơ chế tác dụng

chống ung thư của sâm Triều Tiên. Bột chiết hồng sâm Triều Tiên và phân đoạn

polysaccharid thể hiện tác dụng kháng ung thư, giảm tần suất và ức chế sự tăng sinh

các khối u. [68], [93]

1.1.5.9. Tác dụng trên hệ tim mạch và huyết áp

Dịch chiết hồng sâm Triều Tiên (liều 200- 500mg/kg thể trọng) và các

ginsenosid chính như G-Rg1 và G-Rb1 có tác dụng cải thiện sự tuần hoàn máu gây

bởi nhiệt độ quá lạnh hoặc bởi norepinephrin, làm giảm suy tim thực nghiệm gây

bởi adriamycin. Bột hồng sâm 1,5-6g/ ngày x 2lần trong 3-24 tháng làm gia tăng sự

co bóp cơ tim, giãn mạch ngoại biên, cải thiện những thông số huyết động của tim,

rõ nhất là ở người cao tuổi. Ngoài ra, dịch chiết methanol của hồng sâm Triều Tiên

(liều 200mg/kg thể trọng) có tác dụng gia tăng tuần hoàn máu trong gan, lách, màng

nhày dạ dày, thận. [36], [56], [113]

* Ngoài những tác dụng chính trên, Nhân sâm còn có tác dụng hạ cholesterol

và lipid máu, giảm đau, giải độc, kích thích ăn ngon, làm sáng mắt, kéo dài tuổi thọ,

điều hòa nội tiết tố sinh dục,… [56], [113]

1.2. SÂM NGỌC LINH 27T1.2.1. Nguồn gốc và lịch sử phát hiện27T [5], [17], [131]

Trước khi có sự phát hiện từ phía các nhà khoa học, sâm Ngọc Linh đã được

các đồng bào dân tộc thiểu số Trung Trung Bộ Việt Nam, đặc biệt là dân tộc Xê

Đăng, sử dụng như một loại củ rừng, mà họ gọi là củ ngải rọm con hay cây thuốc

giấu, chữa nhiều loại bệnh theo các phương thuốc cổ truyền. Sâm Ngọc Linh sống

trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam. Theo những thông tin

lưu truyền trong cộng đồng các dân tộc thiểu số của hai tỉnh này về một loại củ quý

hiếm trên núi Ngọc Linh có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người và do nhu cầu

của kháng chiến, ngành dược khu 38TTrung Trung Bộ38T quyết phải tìm ra cây sâm 38Tchi

Panax38T tại miền Trung.

Năm 1973, khu Y tế Trung Trung bộ cử một tổ 4 cán bộ đi điều tra tìm cây

sâm theo hướng chân núi Ngọc Linh thuộc huyện Đắc Tô tỉnh 38TKon Tum38T. Với sự hỗ

trợ của cán bộ địa phương, đến 9 giờ sáng ngày 19 tháng 03 năm 1973, ở độ cao

1800 mét so với mặt biển, đoàn đã phát hiện hai cây sâm đầu tiên và ngay buổi

chiều cùng ngày đã phát hiện được một vùng sâm rộng lớn thuộc phía Tây núi Ngọc

Linh. Sau 15 ngày nghiên cứu toàn diện về hình thái, sinh thái, quần thể, quần lạc,

phân bố, di cư và phát tán, đã xác định núi Ngọc Linh là quê hương của cây sâm

mới, đặc biệt quý hiếm. Thời điểm này cây sâm phát hiện được đặt tên là “sâm đốt

trúc” với tên khoa học với tên khoa học sơ bộ được xác định là Panax articulates

L., họ Nhân sâm (Araliaceae). Từ đó cây sâm này được nghiên cứu nhiều về đặc

điểm hình thái, phân tích thành phần hóa học, tác dụng dược lý,…

Trải qua hơn 30 năm, sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam, một loài sâm đặc

hữu của nước ta đã được thế giới biết đến với tên khoa học là Panax vietnamensis

Ha et Grushv. Tên khoa học này do Hà Thị Dung và Grushvistky I. V.đặt, được

công bố nǎm 1985 tại Viện thực vật Kamarov (Liên Xô cũ).

1.2.2. Đặc điểm sinh học và phân bố 28T1.2.2.1. Đặc điểm hình thái28T [5], [6], [7], [17]

Sâm Ngọc Linh là cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm,

đôi khi trên 1m.

Thân rễ nạc, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30 - 40cm, có thể hơn, mang

nhiều rễ nhánh và củ, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh hàng năm để lại, mặt ngoài

màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối đuôi đôi khi có một củ hình cầu. Thân rễ

còn mang nhiều rễ phụ. Ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển mạnh nhất chứa

chất dự trữ, hoạt chất, hình dạng thay đổi. Rễ củ ở cây sâm hoang dại phát triển có

dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễ con với những vàm

ngang. Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất rõ rệt, có ba

dạng chính: dạng củ cà rốt, con quay và dạng bó củ.

Thân khí sinh, mảnh, thẳng, màu xanh hay hơi tím, mọc thẳng, mang 2- 4 lá

kép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài

10- 14cm, rộng 3- 5cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía

răng nhỏ.

Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10- 20cm có thể

kèm 1- 4 tán phụ hay 1 hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Mỗi tán 60- 100 hoa,

cuống hoa ngắn 1- 1,5cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi

nhụy. Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy.

Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3- 5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá

chét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt.

Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau chuyển màu đen.

Hạt hình thận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi lõm, có vân. Quả mọc tập

trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8- 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6cm. Mỗi quả

chứa một hạt. Một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây khoảng 10 đến 30 quả.

Mùa hoa: tháng 4– tháng 6, mùa quả: tháng 7– tháng 9.

Hình 1.1. Cây sâm Ngọc Linh.

a.: Cây sâm ngoài tự nhiên, b.: Cây sâm trồng trong vườn

(http://www.google.com.vn/imgres?q=sam+Ngoc+Linh)

1.2.2.2. Đặc điểm sinh thái

Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao

từ 1200 – 2100m so với mặt biển, mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ

0 mù, nhiệt độ khoảng 15- 18P

PC, lượng mưa khoảng 3000mm/ năm. Đất rừng ở đây

dưới tán rừng. Môi trường rừng nơi có sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây

được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn

cao và chứa nhiều nước.

Sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè. Mùa hoa quả từ tháng 5-

tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hàng năm. Sau khi quả chín rụng xuống đất,

tồn tại qua mùa đông khoảng 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau,

sâm có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt.

Sâm có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo rõ. Mỗi năm từ

đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá.

Căn cứ vào vết sẹo trên thân rễ để tính tuổi của sâm. [7], [17], [22]

1.2.3. Phân bố

Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Panax, ở Việt Nam có ba

loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng. Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau

cùng vào 1973, đến 1985 được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học. Đến nay

sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng

o Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107P P50’–

o o o 108P P10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc P0’– 15P P7’ kinh tuyến Đông và từ 15P

Nam và Kon Tum.

Linh cao 2598m. Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ

cao khoảng 1500m- 2200m, chủ yếu tập trung ở 1800– 2000m, thuộc địa bàn của

hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam). Về giới hạn cũng

như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi. [17]

1.2.4. Thành phần hóa học chính 1.2.4.1. Hợp chất saponin

Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây sâm

Ngọc Linh cũng như của các loài sâm khác trên thế giới. Các saponin dammaran

được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học. [67]

Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) chứa 49 hợp chất saponin, gồm 25

saponin đã biết và 24 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenosid-R1-

R24.

Phần trên mặt đất có 19 saponin damaran đã được phân lập, gồm 11 saponin

đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8. [5], [16], [17]

28TBảng 1.2. Hàm lượng một số saponin chính trong sâm (đã trừ độ ẩm 28T28T)28T [5]

Hàm lượng saponin chính (%) Nguyên liệu G-Rb1 G-Ry1 R2 Tổng cộng GRd

Đầu mầm 0.943 0.898 1.359 2.859 6.059

Sâm 2 tuổi 0.979 0.426 1.235 1.868 4.236

Sâm 3 tuổi 0.846 0.678 1.419 2.409 5.352

Rễ củ 4 tuổi 0.818 0.396 1.696 3.141 6.051

Rễ củ 5 tuổi 1.721 0.518 2.219 3.816 8.674

Rễ củ 6 tuổi 1.824 0.632 2.285 4.166 9.474

Thân rễ 4 1.518 1.778 2.432 2.946 8.674 tuổi

Thân rễ 5 1.565 0.981 1.652 4.276 8.494 tuổi

28TBảng 1.3. Hàm lượng saponin của sâm Ngọc Linh so với các loài Pana28T28Tx28T [5]

Thân rễ 6 2.716 0.840 3.648 5.342 12.546 tuổi

Loại aglycon Panax Panax Panax Panax

ginseng notoginseng quinquefolius vietnamensis

20(S)–ppd 2.9 2.1 2.7 3.1

20(S)–ppt 0.6 2.4 1.2 2.0

Ocotillol – – 0.04 5.6

Oleanolic acid 0.02 – 0.07 0.09

Hiệu suất toàn 3.5 4.5 4.0 10.8

phần (%)

(Ghi chú: 20(S)-ppd: 20(S)-protopanaxadiol; 20(S)-ppt: 20(S)-protopanaxatriol)

28TBảng 1.4. Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất

protopanaxatrio28T28Tl28T [5]

Hiệu suất (%) Kiểu RR3 RR1

P-Rha

Tên I G-ReP RR2 2 -GlcP -Glc- 0.17 -H- (I)

2 -GlcP

P-Glc

2 -GlcP

P-Glc

20-glc-G-Rf -Glc- 0.01 -H- (I)

-Glc- 1.37 -H- (I) G-RgR1R*

2 -GlcP

P-Xyl

-Glc- -H- 0.008 -H- (I) G-RhR1

-Glc- 0.36 -H- (I) N-RR1R*

6 -GlcP

P-

2 -GlcP

P-Glc

-Glc- 0.01 -H- (I) N-RR6

-H- -Glc- 0.004 (I) G-RR4

-Glc- -H- 0.005 -H- (K) G-RR12

-Glc- -Glc- 0.003 -H- (J) G-RR15

-Glc- -Glc- 0.002 -H- (K) G-RR17

-Glc- -Glc- 0.002 -H- (K) G-RR18

2 -GlcP

P-Glc

28TBảng 1.5. Acid Oleanoli28T28Tc28T [5]

-H- -Glc- 0.006 (L) G-RR19

R2 Hiệu suất (%) Kiểu Tên

P-Glc

2 -GlcP

P-Glc-Ara(p)

RR1 2 -GlcP -Glc- 0.038 (O) G-RR0

28TBảng 1.6. Ocotillo28T28Tl28T [5]

-Glc- 0.05 H-Ma (O)

Hiệu suất (%) R2 Kiểu Tên RR1

-Glc- 0.065 (M) -CHR3 PG-RTR4

2 -GlcP

P-Rha

2 -GlcP

P-Glc

24(s)-PG- 0.005 (M) -CHR3 FR11

2 -GlcP

P-Xyl

0.14 (M) -CHR3 M-RR1R*

2 -GlcP

5.29 (M) -CHR3 M-RR2R*

P-Rha-AcR6 2 -GlcP

0.033 (M) -CHR3 G-RR1

P-Xyl-AcR4

0.014 (M) -CHR3 G-RR2

(M) Glc 0.006 G-RR6 -CHR3

2 -GlcP

P-Xyl

(M) 0.02 G-RR14 -CHR2ROH

(N) -Glc- 0.007 G-RR10 -CHR3

1.2.4.2. Hợp chất polyacetylen

Có 7 hợp chất đã được phân lập, 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với

panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen chính yếu.

Hai hợp chất mới là 10 acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca-

1,8(E),10(E)-trien-4-6-diyn-3,10-diol. [16]

28TBảng 1.7. Các axid béo được tìm thấ28T28Ty28T [5]

1.2.4.3. Thành phần acid béo

STT Số carbon của hợp chất Tên %

1 8 C Vết

2 10 C Vết

3 11 C Vết

4 12 C 0.22

5 13 C 0.31

6 14 C 1.33

7 0.40

8 15 C 1= 15 CP 0.31

9 29.12 Acid palmitic

10 16 C 1= 16 CP Vết

11 1.13

12 17 C 1= 17 CP Vết

13 4.48 Acid stearic

14 18 CP 13.26 Acid oleic

15 18 CP 40.04 Acid linoleic

16 18 C 1= 2= 3= 18 CP 2.61 Acid linolenic

17 20 C 1.51

28TBảng 1.8. Thành phần acid amin chủ yế28T28Tu28T [5]

1.2.4.4. Thành phần acid amin

Acid amin thủy giải STT Acid amin Acid amin (%) (%)

10.20 Tryptophan 1 -

17.90 Lysin 2 5.29

1.02 Histidin 3 2.59

46.66 Arginin 4 12.90

7.60 Acic aspartic 5 10.38

1.20 Threonin 6 5.19

5.12 Serin 7 5.19

2.05 Acid glutamic 8 6.49

3.07 Prolin 9 15.58

4.10 Glycin 10 5.19

- Alanin 11 5.19

1.53 Cystin 12 Vết

0.51 Valin 13 1.29

0.51 Methionin 14 Vết

1.02 Isoleucin 15 2.59

1.02 Leucin 16 5.19

0.51 Tyrosin 17 6.49

0.51 Phenylanin 18 6.49

1.2.4.5. Các nguyên tố vi lượng

Thành phần nguyên tố vi lượng trong sâm Ngọc Linh rất đa dạng.

28TBảng 1.9. Các nguyên tố vi lượn28T28Tg28T [5]

STT Nguyên tố vi lượng Hàm lượng (ppm)

1 K 9349.19

2 Ca 2844.74

3 Mg 1950.19

4 Fe 491.21

5 Sr 169.87

6 Ti 120.65

7 B 140.00

8 Rb 91.62

9 Mn 68.10

10 Zn 26.11

11 Br 17.27

12 Ni 10.61

13 Cu 6.23

14 Cr 4.10

15 Y 1.51

16 I 0.24

17 Co 0.15

18 As 0.10

19 Se 0.05

28T1.2.4.6. Các thành phần khác28T [5]

20 Hg 0.04

Hợp chất Sterol: β-Sitosterol và daucosterin (β- Sitosteryl-3-o- β-D-

glucopyranosid).

Hợp chất glucid:

 Đường tự do: 6,19%

 Đường toàn phần: 26,77%

 Tinh dầu: 0,05- 0,10%

 Sinh tố C: 0,059%

1.2.5. Tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh 1.2.5.1. Tác dụng tăng lực - phục hồi sức

Tác dụng tăng lực, gia tăng sức bền, chống nhược sức là một trong những tiêu

chuẩn để đánh giá tác dụng bổ khí, trị suy nhược cơ thể và chống stress. Bột chiết

sâm Ngọc Linh thể hiện tác dụng tăng lực, chống nhược sức ở liều khoảng 5- 100

mg/kg thể trọng. Qua kết quả nghiên cứu cơ chế tác dụng tăng lực của bột chiết sâm

Ngọc Linh cho thấy sự giảm hàm lượng glucose tỷ lệ thuận với sự tăng lipid toàn

phần trong huyết thanh. Điều này có nghĩa là sâm Ngọc Linh cũng làm gia tăng sử

dụng lipid có năng lượng cao và hạn chế sử dụng glucose như tác dụng tăng lực của

sâm Triều Tiên. [5], [16], [55]

1.2.5.2. Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương

Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương của bột chiết sâm Ngọc Linh tùy theo

liều sử dụng:

+ Liều < 500 mg/kg thể trọng, sâm Ngọc Linh kích thích hệ thần kinh trung

ương, làm gia tăng vận động tự nhiên;

+ Liều > 500 mg/kg thể trọng, sâm Ngọc Linh ức chế hệ thần kinh trung ương,

làm giảm vận động tự nhiên.

Tác dụng của saponin toàn phần sâm Ngọc Linh cũng có tác dụng tương tự bột

chiết của sâm, ở liều 10 mg/kg thể trọng cũng làm rút ngắn tiềm thời hình thành

phản xạ có điều kiện dương tính và rút ngắn giai đoạn phục hồi phản xạ, trong khi

liều 100 mg/kg thể trọng lại không thể hiện tác dụng điển hình. [5], [19], [37]

1.2.5.3. Tác dụng phòng chống ung thư

Hợp chất majonosid-R2 có tác dụng kích hoạt tác động chống ung thư in vitro

và in vivo. [5], [19], [56]

• Thực nghiệm in vitro

Thực nghiệm sàng lọc các chất dự phòng kháng ung thư do hóa chất trên 6

saponin phân lập từ sâm Việt Nam cho thấy majonosid-R2 thể hiện tác dụng ức chế

điển hình nhất trên kháng nguyên Epstein - Barr virus được hình thành bởi chất làm

tăng sự phát triển của ung thư 12- O- tetradecanoylphorbol- 13 acetat (TPA) trên tế

bào Raji.

• Thực nghiệm in vivo

Hoạt chất majonosid-R2 thể hiện tác dụng kháng ung thư trong thực nghiệm

gây ung thư da hai giai đoạn trên chuột nhắt trắng sử dụng 7,12-

dimethylbenz(a)anthracen (BDMA) là chất kích hoạt và 12-0-tetradecanoylphorbol-

13 acetat (TPA) hay fumonisin B1A là những chất làm tăng sự phát triển của ung

thư.

Hoạt chất majonosid-R2 thể hiện tác dụng kháng ung thư trong thực nghiệm

gây ung thư gan hai giai đoạn trên chuột nhắt trắng sử dụng N-nitrosodiethylamin

(DEN) là chất kích hoạt và phenobarbital (PB) là chất làm tăng sự phát triển của

ung thư. Majonosid-R2 (liều 1,26 mg/ chuột/ tuần và sử dụng trong 25 tuần) ức chế

sự tạo thành các u tăng sản ở gan (giảm 55- 60% so với đối chứng). Saponin toàn

phần sâm Ngọc Linh cũng như hoạt chất chính majonosid-R2 ức chế các phản ứng

peroxy hóa lipid màng tế bào gan trên cả hai hệ oxy hóa NADPH và hệ ascorbat, do

đó có thể có tác dụng bảo vệ tế bào gan khỏi những tổn thương oxy hóa do gốc tự

do.

1.2.5.4. Tác dụng trên hệ tim mạch và huyết áp

Sâm Ngọc Linh có tác dụng điều hòa hoạt động tim mạch theo hướng kích

thích dẫn truyền xung động thần kinh tim, nâng cao huyết áp trong các trường hợp

hạ huyết áp do mất máu. [5], [19]

1.2.5.5. Tác dụng chống stress

Cao lá sâm Ngọc Linh ở những liều 600-1200 mg/kg, saponin toàn phần lá

sâm Ngọc Linh 200 mg/kg, đều thể hiện tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn

bởi stress, đưa trở về trạng thái bình thường. Ở những liều trên, lá sâm Ngọc Linh

không ảnh hưởng trên thời gian ngủ. Như vậy, saponin toàn phần trong lá sâm Ngọc

Linh là nhóm hợp chất quyết định tác dụng chống stress.

Notoginsenosid-Fc là một trong những saponosid có hàm lượng cao trong lá

sâm, ở những liều thử nghiệm 5, 10, 15 mg/kg đều không thể hiện phục hồi thời

gian ngủ bị rút ngắn bởi stress. Chứng tỏ notoginsenosid-Fc không phải là hợp chất

quyết định tác dụng chống stress của lá sâm Ngọc Linh. [5], [19]

1.2.5.6. Tác dụng kháng khuẩn, kích thích miễn dịch không đặc hiệu

Tác dụng kháng khuẩn: sâm Ngọc Linh thể hiện tính kháng khuẩn trên các

chủng vi khuẩn gram dương, có tác dụng kháng khuẩn đặc hiệu trên các chủng vi

khuẩn Staphylococcus và Streptococcus gây viêm họng. Tác dụng kháng khuẩn của

sâm Ngọc Linh tương đương với một số kháng sinh thông dụng và không gây ảnh

hưởng trên hệ vi khuẩn lành tính ở ruột như kháng sinh.

Kích thích miễn dịch không đặc hiệu: hoạt chất majonosid-R2 của sâm Ngọc

Linh thể hiện tác dụng gia tăng chỉ số thực bào ở cơ địa động vật bình thường và cơ

địa động vật bị suy giảm miễn dịch gây bởi stress tâm lý. Cơ chế được xác định như

+ Tác dụng kích thích hoạt động của hệ thống lưới nội chất. Hệ thống lưới nội

chất giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì sự hằng định nội môi và sự miễn dịch

không đặc hiệu.

+ Sự tương quan giữa hệ thần kinh trung ương và hệ miễn dịch trong các bệnh

lý suy giảm miễn dịch gây bởi stress là cơ sở cho tác dụng dự phòng sự suy giảm

miễn dịch của sâm Ngọc Linh. Trong đó, hoạt chất majonosid-R2 đóng vai trò tác

động lên hệ thống GABA-A của hệ thần kinh trung ương tham gia vào quá trình

điều hòa những rối loạn gây bởi stress. [5], [19], [97]

1.2.5.7. Tác dụng bảo vệ gan

Sâm Ngọc Linh có thể hiện tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống oxy hóa

trên thực nghiệm gây tổn thương gan bằng CClR4R. Hợp chất saponin trong đó chủ

yếu là majonosid-R2 quyết định tác dụng bảo vệ.

Bột chiết sâm Ngọc Linh có tác dụng bảo vệ tế bào gan trên thực nghiệm gây

tổn thương gan cấp. Ngoài ra, sâm Ngọc Linh còn hỗ trợ sự tái tạo tế bào gan trên

mô hình cắt bỏ một phần gan, duy trì chức năng sinh hóa của gan và kích thích hoạt

động của hệ thống cytocrom-PR450R trong ty thể gan trên thực nghiệm gây tổn thương

gan cấp bằng CClR4R.

Sâm Ngọc Linh làm giảm số lượng các thể hoại tử (apoptotic bodies), ức chế

sự phân mảnh DNA (DNA fragmentation) và giảm đậm độ chromatin (chromatin

condensation) trong nhân tế bào gan. [5], [19]

1.2.5.8. Tác dụng chống oxy hóa

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các cao chiết từ rễ, thân rễ và lá của sâm Ngọc

Linh đều thể hiện hoạt tính chống các gốc tự do, đặc biệt là hoạt tính đánh bắt gốc

superoxyd và hoạt tính Fe chelatinh.

Trong nghiên cứu in vivo, J. Robak và cộng sự (1988) đã xác định khả năng ức

chế peroxy hóa lipid màng tế bào não thông qua việc xác định hàm lượng malonyl

dialdehyd (MDA), một trong những sản phẩm tạo ra bởi quá trình peroxy hóa lipid

màng tế bào. [5], [19]

1.3. PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Công nghệ chuyển gen ở thực vật đang phát triển mạnh. Cùng với sự phát triển

của khoa học công nghệ, có nhiều phương pháp chuyển gen được khám phá và ngày

càng hoàn thiện về quy trình: phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) (Klee và Roger, 1989), chuyển gen

trực tiếp bằng kỹ thuật bắn gen (Klein và cs., 1989), vi tiêm (Neuhaus và cs., 1987),

xử lý laser (Weber và cs., 1988),… Trong điều kiện của nước ta thì phương pháp

UNguyên tắc

chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng tương đối phổ biến.

Phương pháp này đưa DNA vào tế bào thực vật qua trung gian của vi khuẩn A.

tumefaciens. Sau khi xâm nhiễm, chúng gắn một đoạn DNA (T-DNA) vào bộ máy

di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra

khối u. [13], [14]

UƯu và nhược điểm của phương pháp

* Ưu điểm

- Số lượng bản copy ít hơn do đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau (co–

suppression) và câm lặng gene (gene silencing).

- Đoạn gene được chuyển sẽ có tính toàn vẹn hơn (intactivity).

- Mức độ biểu hiện cao.

- Tồn tại bền vững hơn qua các thế hệ do khả năng thụ tinh (Fertility) tốt hơn.

* Nhược điểm: chủng Agrobacterium có biên độ ký chủ khá hẹp, chủ yếu là

cây hai lá mầm và một số loại một lá mầm. Tuy nhiên biên độ ký chủ của

Agrobacterium ngày càng mở rộng nhờ kỹ thuật cải tiến giống. [87]

1.3.1. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Giới : Bacterium

Ngành : Proteobacteria

Lớp : Alpha Proteobacteria

Bộ : Rhizobiales

Họ : 38TRhizobi29T38Taceae29T

Loài : Agrobacterium

Vi khuẩn A. tumefaciens là vi khuẩn gram âm sống trong đất mang độc tính. A.

tumefaciens và một số loài họ hàng có khả năng chuyển một phần nhỏ DNA của nó

vào tế bào thực vật (nhiều loại thực vật hạt kín hai lá mầm và ở một số ít thực vật

một lá mầm) và qua đó kích thích tạo khối u (crown-gal). Những khối u này là

không gian sống của vi khuẩn.

Hình 1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đang bám vào tế bào thực

Hình 1.3. Khối u ở thực vật do Agrobacterium tumefaciens gây ra.

Một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn cũng được tạo ra trong

những khối u này. Những opine phổ biến nhất là nopaline và octopine. Về hóa học

opine là những sản phẩm ngưng tụ của một amino acid với một cetoacid hoặc một

amino acid với đường. Octopin được tạo nên từ amino acid là arginine và pyruvate,

còn nopalin được tạo nên từ arginine và α-cetoglutaraldehyd.

Việc gây ra khối u và tổng hợp opine liên quan với sự có mặt của một loại

plasmid có kích thước lớn là Ti–plasmid trong tế bào vi khuẩn A. tumefaciens.

1.3.2. Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens

Ti–plasmid (tumor inducing – plasmid cảm ứng tạo khối u) được tìm thấy

o Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 30P PC. Qua nghiên

trong tất cả các dòng A. tumefaciens gây độc, có kích thước khoảng 200 – 800 kb.

cứu cho thấy trong Ti–plasmid có hai vùng quan trọng là: vùng T–DNA (transferred

DNA) và vùng gây độc (virulence – vir gen) liên quan đến sự hình thành khối u, sự

tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong Agrobacterium. Ngoài ra, còn có vùng

đóng vai trò phân giải opine (vùng T–DNA có khả năng tổng hợp loại opine nào thì

vùng này có khả năng phân giải opine đó để cung cấp năng lượng cho tế bào vi

khuẩn). [39]

Hình 1.4. Sơ đồ gen của Ti–plasmid trong vi khuẩn A. tumefaciens. [129]

- T–DNA: là một phần của Ti–plasmid (vùng T–DNA này có kích thước

khoảng 12-24 kb), được chuyển vào thực vật (transfer–DNA). Trên đó định vị

những gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen tạo khối u.

Trong Ti–plasmid, T–DNA được giới hạn bởi hai vùng, vai trái và vai phải (LB: left

border và RB: right border). Các vai này gồm một trình tự lặp lại của 25 bp, là trình

tự nhận biết cho việc cắt T–DNA. [18], [32]

Vai trái 5’ -TGNCAGGATATATATNNNNNNGTNANN- 3’

Vai phải 5’ -TGGCAGGATATATATNNNNNNGTAAAN- 3’

Mặc dù vai trái cũng chứa đoạn lặp lại 25bp tương tự vai phải, nhưng những

nghiên cứu cho thấy vùng này không tham gia vào quá trình biến nạp. [37]

- Vùng vir: nằm ngoài vùng T–DNA (độ dài khoảng 25kb), có khoảng 25 gen

được nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là vir A, vir B, vir C, vir D, vir E, vir F, vir

G. Những gen vir này giữ các vai trò như: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế

bào thực vật, cắt bỏ đoạn, chuyển gen và có cả vai trò trong sự xâm nhập của T–

DNA vào tế bào ký chủ. Trong đó, vir A, B, D, G cần thiết cho việc tạo khối u; vir

C, E ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen trên biên độ ký chủ. [18]

49TVai trò

49TGen

49TVir A

49TNhận biết tín hiệu tế bào bị tổn thương và kích hoạt vir G.

49TVir G

49THoạt hoá phiên mã gen vir.

49TVir D1

49TCắt đoạn T–DNA.

49TVir D2

49THướng dẫn T–DNA hướng nhân tế bào thực vật.

49TBảo vệ đầu 5’ của T–DNA.

49TGiúp T–DNA gắn vào nhân tế bào thực vật.

49TVir E2

49TBảo vệ T–DNA.

49THỗ trợ vận chuyển T–DNA.

49TVir B2–11

49TTạo kênh chuyển T–DNA.

49TVir D4

49TTạo kênh chuyển T–DNA.

49TVirF

49THỗ trợ gắn T–DNA vào nhân tế bào.

Bảng 1.10. Vai trò các gen vir

1.3.3. Cơ chế biến nạp T–DNA vào tế bào ký chủ

Để xảy ra quá trình biến nạp tế bào thực vật phải bị thương. Vì lúc này tế bào

thực vật tiết ra các hợp chất làm tín hiệu cảm ứng cho vi khuẩn tấn công và xâm

nhập. Các hợp chất cảm ứng được chia làm hai loại:

- Các monocharide: tạo ra sự hấp dẫn trên một quãng đường dài đối với những

chủng vi khuẩn Agrobacterium độc và không độc đến vị trí vết thương ở rễ.

-7

- Dạng tiền phenol và các chất trung gian của sự sinh tổng hợp lignin có vai trò

PM đối với acetosyringone) các phenolic này hoạt

rất đặc biệt. Ở nồng độ thấp (<10P

động như chất lôi kéo chuyên biệt chỉ đối với chủng Agrobacterium độc. Sản phẩm

của virA và virG làm trung gian cho sự lôi kéo theo các hóa chất này. Tuy nhiên ở

nồng độ cao hơn thì các hợp chất phenolic cùng loại này có vai trò những chất cảm

ứng chuyên biệt sự điều hòa gen vir thông qua dấu hiệu kép (virA và G) của cơ chế

tải nạp tương tự với các hệ thống điều hòa của các loài vi khuẩn khác. [18]

Một tiến bộ trong phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium là

hoạt chất acetosyringone hỗ trợ cho quá trình chuyển gen.

Hình 1.5. Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen

Acetosyringone (tên hóa học: 1-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) ethanol),

công thức phân tử là CR10RHR12R0R4R, có tác dụng kích thích quá trình biến nạp gen của A.

tumefaciens vào tế bào mô vì acetosyringone là hợp chất được sản sinh khi tế bào bị

tổn thương. Đây là tín hiệu quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn vào

tế bào thực vật. Ở nồng độ cao, acetosyringone sẽ được nhận diện bởi protein virA-

receptor trên màng vi khuẩn. Đây là một protein cần thiết để chuyển phân tử tín

hiệu acetosyringone từ vị trí kế bên mô cây bị tổn thương, xuyên qua màng tế bào,

vào tế bào của A. tumefaciens. Sau khi vào tế bào của A. tumefaciens,

acetosyringone hoạt động như một nhân tố có tính chất hoạt hóa virA hỗ trợ với

virG-protein để kích thích sự thể hiện virB, virC, virD, virE. Sự thể hiện các gen

này cần thiết cho việc cắt T-DNA ra khỏi Ti plasmid và đưa nó vào tế bào thực vật.

Nhờ hoạt chất acetosyringone mà hiệu suất chuyển gen cao gấp nhiều lần.

Theo Sheikholeslam SN. (1987) đã ghi nhận với việc bổ sung acetorycinone tăng

hiệu suất chuyển gen là 55 đến 63% thay vì bình thường là 2-3%. [111]

* Quá trình biến nạp T–DNA vào tế bào ký chủ được tóm tắt như sau:

(1) Vi khuẩn nhận ra và tấn công vào tế bào ký chủ.

(2) Các hợp chất cảm ứng của tế bào ký chủ tiết ra cảm ứng với sản phẩm của

hệ thống tín hiệu kép (vir A và G).

(3) Vùng gen vir được hoạt hóa.

(4) Bản sao của T–DNA được tạo ra dưới sự có mặt phức hợp protein của vir

D1, D2.

(5) Bản sao này kết hợp với protein của vir D2, tạo thành phức hợp T–DNA

protein và với một số protein của các vir khác đi vào tế bào chất của tế bào ký chủ

thông qua kênh vir B/D4T4SS.

(6) Phức hợp này lại kết hợp với sản phẩm của vir E, rồi đi vào tế bào chất của

tế bào ký chủ. Protein của vir D2 và sản phẩm của vir E gắn với bản sao T–DNA có

tác dụng bảo vệ sợi T–DNA không bị phân cắt bởi các enzyme exonuclease.

(7) Phức hợp T–DNA protein đi vào nhân tế bào ký chủ.

(8) Khi đã vào trong nhân, T–DNA xác định điểm để xen vào.

(9) T–DNA tách ra khỏi các protein bảo vệ.

(10) T–DNA gắn vào bộ gen của tế bào ký chủ một cách ngẫu nhiên.

Hình 1.6. Trình tự biến nạp T-DNA vào tế bào ký chủ.

(http://www.egohabitat.com)

1.3.4. Ứng dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trong chuyển gen thực vật Trên thực tế, A. tumefaciens chỉ gây hại ở cây hai lá mầm. Gần đây, nhiều tác

giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens, các cây một lá mầm cũng có

thể sản xuất opine và có thể khai thác việc chuyển gen của A. tumefaciens ở cây một

lá mầm.

Mặc dù Ti–plasmid của A. tumefaciens là vectơ tự nhiên nhưng chúng lại có

nhược điểm so với vectơ nhân dòng:

- Sự sản xuất phytohormon của tế bào thực vật chuyển gen (được nuôi cấy

trong môi trường) ngăn cản chúng tái sinh thành cây trưởng thành hoàn chỉnh và

khỏe mạnh. Do đó, gen mã hóa cho enzyme tham gia tổng hợp auxin và cytokinin

cần phải được loại bỏ khỏi Ti–plasmid.

- Gen mã hóa các enzyme tham gia tổng hợp opine không có vai trò đối với kỹ

thuật tạo thực vật chuyển gen. Do đó, các gen này phải loại bỏ khỏi plasmid.

- Ti–plasmid có kích thước lớn (200 – 800 kb) gây khó khăn trong quá trình

thao tác tạo DNA tái tổ hợp. Vì vậy, các đoạn DNA không cần thiết cho quá trình

tạo dòng và biểu hiện gen cần được loại bỏ.

- Ti–plasmid không sao chép trong E. coli nên việc nhân dòng plasmid tái tổ

hợp trong E. coli không thể thực hiện được. Do đó, khi xây dựng vectơ plasmid phải

thêm đoạn ori của plasmid E. coli để có thể sao chép trong tế bào E. coli. [37]

Để khắc phục những nhược điểm, trên các nhà khoa học đã tạo ra vectơ tái tổ

hợp dựa trên nguyên tắc của Ti–plasmid. Vectơ này gồm có các thành phần sau:

- Các gen chọn lọc như: neomycin phosphotransferase, gen tạo khả năng

kháng kanamycin, kháng hygromycin của tế bào thực vật chuyển gen…

- Trình tự ori cần thiết cho sự sao chép và nhân đôi của plasmid trong E. coli.

- Trình tự vai phải của vùng T–DNA: vùng này tuyệt đối cần thiết cho quá

trình chuyển gen xảy ra. Một số vectơ có thể có trình tự cả hai vai. [40]

- Vùng polylinker (multiple cloning site) để thuận tiện cho việc cắt và chèn gen

vào plasmid.

Hình 1.7. Sơ đồ plasmid tái tổ hợp dựa trên nguyên tắc của Ti-plasmid. [117]

Khi nuôi mẫu cấy tế bào hoặc mô thực vật trong môi trường thích hợp có chứa

A. tumefaciens mang vectơ tái tổ hợp cần chuyển. A. tumefaciens sẽ xâm nhập vào

mẫu cấy từ các vết thương ở mép và chuyển plasmid mang gen cần chuyển vào tế

bào thực vật. Sau đó, những tế bào này được tái sinh trên môi trường thích hợp tạo

thành cây hoàn chỉnh mang gen mong muốn.

1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN SAU KHI CHUYỂN VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT

Các gen sau khi được biến nạp vào tế bào thực vật cần được kiểm tra sự biểu

hiện hoặc hiện diện của gen đó trong tế bào.

1.4.1. Phương pháp thử in vitro khả năng kháng kháng sinh của mô chuyển gen

Các cây (mô) nhận từ thí nghiệm chuyển gen được cấy truyền trên môi trường

có chất kháng sinh (hygromycin, kanamycin hoặc ppt) với nồng độ tùy thuộc vào

loại thực vật khác nhau để theo dõi khả năng sinh trưởng, tạo rễ, tạo chồi,… Trong

điều kiện nuôi cấy như trên, cây (mô) chuyển gen sẽ sinh trưởng bình thường trong

khi cây (mô) không chuyển gen sẽ chết.

Có thể kiểm tra bằng cách nuôi cấy một số loại mô hay mảnh lá, đoạn thân trên

môi trường tạo sẹo hoặc tạo chồi trên môi trường có chứa các tác nhân nói trên với

nồng độ thích hợp. Trong trường hợp này, mô đối chứng sẽ chết, mô chuyển gen có

khả năng tạo sẹo, tạo chồi bình thường. [10], [29]

1.4.2. Phương pháp hóa mô tế bào

Phương pháp này dùng để kiểm tra sự hiện diện của gen chỉ thị gusA (uidA)

mã hóa enzyme β-glucoronidase trong mô tế bào cây chuyển gen. Gen gusA do tác

giả Jefferson phân lập từ vi khuẩn E.coli vào năm 1986. Enzyme β-glucoronidase là

một hydrolase xúc tác sự phân giải các β-glucoronide, sản phẩm phân giải có màu

xanh dương đặc trưng dễ nhận biết.

Trong tự nhiên, gen gusA dường như không hiện diện trong thực vật vì vậy

gen gusA là một gen chỉ thị rất tốt trong việc chuyển gen thực vật. Sản phẩm màu

rất bền và phản ứng rất ít chịu ảnh hưởng của pH nên rất thuận lợi cho việc quan

sát. Sản phẩm thử có thể được bảo quản lâu dài trong cồn 70%.

β-glucoronidase thường dùng nhất trong phản ứng thử là X-Gluc (5-bromo-4-

cloro-3-indolyl-β-D-glucoronide). X-Gluc không màu, dưới tác dụng của enzyme β-

glucoronidase sẽ chuyển sang màu xanh rất đặc trưng. Có thể kiểm tra gen gusA qua

việc sử dụng nhiều loại mô khác nhau như mô sẹo, mảnh lá, đoạn thân hoặc ngay

trên tế bào trần. Có thể thu các số liệu định lượng bằng cách so sánh màu trên quang

27T1.4.3. Phương pháp PCR 27T[9], [13]

phổ huỳnh quang. [28], [72]

1.4.3.1. Khái niệm

PCR 27T(Polimerase Chain Reaction)27T là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ

polimerase, do Karl Mullis và cs. (1985) phát minh, là phương pháp tạo dòng in

vitro, cho phép khuếch đại một đoạn DNA mong muốn lên hàng triệu lần trong thời

gian ngắn mà không cần sự hiện diện của tế bào.

1.4.3.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: (Giai đoạn biến tính- Denaturation)

Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao

o điểm chảy của phân tử, thường là 80- 90P PC, trong thời gian là 30 giây - 1 phút. Kết

chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (Temperature melting) -

quả của giai đoạn này là làm cho 2 mạch đơn của DNA tách nhau ra.

Bước 2: (Giai đoạn lai- Hybridization)

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của mồi), cho phép các mồi bắt cặp với

o khoảng từ 40- 60P PC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng, kéo dài 30 giây- 1phút.

mạch DNA khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ trong giai đoạn này dao động trong

o Nhiệt độ được tăng lên đến 72P PC giúp cho DNA polimerase sử dụng vốn là

Bước 3: (Giai đoạn kéo dài- Elongation)

polimerase chịu nhiệt (Taq-DNA polimerase) hoạt động tốt nhất. Taq polimersae có

vai trò kéo dài mạch DNA từ vị trí 2 mồi xuôi và mồi ngược, kết quả tạo mạch bổ

sung hoàn chỉnh với mạch DNA khuôn. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự

DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.

n tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Sau n chu kì, lượng DNA tăng lên 2P P lần.

Mỗi chu kỳ gồm 3 bước nêu trên sẽ được lặp lại nhiều lần, cứ sau mỗi lần làm

1.4.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

DNA mẫu

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Nồng độ DNA

khuôn mẫu cần phải có tỉ lệ cân bằng với nồng độ các thành phần khác trong phản

ứng PCR, đặc biệt là nồng độ các đoạn mồi. Thông thường, người ta dùng nồng độ

DNA khuôn mẫu trong khoảng từ 10-100ng/25µL dung dịch phản ứng, nồng độ

mồi không quá 0,5 µM (12,5 pmol/ 25 µL)

Enzyme tổng hợp

Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polimerase I. Sau

này được thay thế bằng DNA polimerase chịu nhiệt được tách chiết từ một loại vi

khuẩn sống ở suối nước nóng Thermus aquaticus, đó là Taq polimerase, không bị

0 ứng. Nhiệt độ tối hảo cho hoạt động của Taq pol là 72-80P

PC.

phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản

Mồi (Primer)

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có

hiệu quả cao. Trình tự của mồi được chọn xác định kích thước và vị trí sản phẩm

PCR cũng như Tm của vùng khuếch đại.

Nhiệt độ lai (nhiệt độ ủ)

Nhiệt độ ủ thích hợp là nhiệt độ sao cho ở đó có ½ số primer sẽ gắn với DNA

khuôn mẫu. Công thức dưới đây ứng dụng trong trường hợp primer có khoảng 20

o nucleotide: TRaR = 4 (G+C) + 2 (A+T) – 5P PC

Nucleoside triphosphate

Bốn loại nucleotid thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200µM/ mỗi loại

nucleotid. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại kí sinh. Sự mất cân bẳng

trong thành phần các nucleotid lại làm tăng các lỗi sao chép của polimerase.

Nồng độ MgP

2+ 2+

P (MgClR2R) có thể ảnh hưởng đến nhiệt độ biến tính của DNA

Nồng độ MgP

khuôn mẫu, quá trình ủ của mồi, tính đặc hiệu của sản phẩm PCR, hoạt tính của Taq

P là từ 0,5-2,5mM ứng

pol và độ chính xác của kết quả. Nồng độ thích hợp của MgP

26T1.5. GEN IPT26T

với nồng độ dNTP tổng số đã cho.

Gen ipt (isopentenyl transferase) hiện diện trong plasmid của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens 34T(Akiyoshi và cs., 1984) 34Tvới tên là: gen pga22, được

chèn bởi một intron có 252 bp, mã hóa cho một polypeptide chứa 329 amino acid,

trọng lượng phân tử là 37.2 kd. Gen này được tìm thấy nằm ở vị trí thứ 4 trong

plasmid gây khối u của vi khuẩn A. tumefaciens, mã hóa cho enzyme isopentenyl

transferase. [65]

1.5.1. Một số nghiên cứu chuyển gen ipt

Các nghiên cứu chuyển nạp gen ipt của các tác giả Gan và cs. (1996); Wang và

cs. (1997) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) cho thấy hàm lượng cytokinin

tăng lên trong cây chuyển gen và do đó làm chậm sự lão hoá của lá và hoa.

Năm 2001, công trình "Ảnh hưởng của biểu hiện gen ipt promoter SAG12 đối

với sự phát triển và lão suy ở cây cải xà lách (Lactuca sativa L. cv. ‘Evola’) chuyển

gen", tác giả Matthew S. McCabe và cs. thực hiện chuyển gen ipt điều khiển bởi

promoter SAG12 bằng phương pháp gián tiếp qua vi khuẩn A. tumefaciens trên lá

mầm cây cải xà lách. Kết quả cho thấy hàm lượng cytokinin tăng trong cây chuyển

gen và làm chậm đáng kể sự lão suy lá trong quá trình phát triển cây cũng như sau

thu hoạch của cây chuyển gen.

Hợp chất artemisinine và dẫn suất của chúng là hoạt chất của cây thanh hao

hoa vàng (Artemisia annua L.) có tác dụng chữa nhiều loại bệnh và đặc trị đối với

bệnh sốt rét. Năm 2001, Geng S và cs. đã nghiên cứu ảnh hưởng của sự biểu hiện

gen ipt đến đặc tính lý hóa của cây thanh hao chuyển gen. Kết quả cho thấy, cây

chuyển gen ipt có mức cytokinin (iPA và iP) tăng gấp 2-3 lần, đồng thời lượng diệp

lục tố tăng 20-60%, lượng artemisinine tăng 30-70%.

Năm 2003, công trình "Sản xuất thừa các cytokinins trong hoa cây thuốc lá

cảnh (Petunia) được chuyển gen ipt - promoter SAG12, làm chậm lão suy tràng hoa

và giảm sự nhạy cảm đối với Ethylene", Hsiang Chang và cs. đã nghiên cứu chuyển

gen ipt điều khiển bởi promoter SAG12 vào cây hoa Dã Yên (Petunia hybrida cv.

‘V26’) bằng phương pháp dùng vi khuẩn A. tumefaciens. Kết quả cho thấy hoa của

các dòng cây chuyển gen có tuổi thọ dài hơn 6-10 ngày so với đối chứng và hoa cây

chuyển gen kém mẫn cảm hơn đối với ethylen ngoại sinh.

Năm 2006, công trình nghiên cứu "Sự chậm lão suy lá trong cây cỏ linh lăng

(Medicago sativa) chuyển gen ipt được kiểm soát bởi promoter đặc hiệu lão suy

SAG12" do Ornella Calderini và cs. thực hiện, tạo cây cỏ linh lăng tăng giá trị về

chất và lượng khi sử dụng làm nguồn thức ăn gia súc. Phương pháp chuyển gen

gián tiếp qua A. tumefaciens.

Một nghiên cứu gần đây do hai nhóm nghiên cứu của Mỹ và Nhật Bản (Rivero

và cs, 2007) đã tạo ra cây biến đổi gen có khả năng chống chịu được hạn hán bằng

phương pháp chuyển gen ipt vào cây thuốc lá. Các nhà nghiên cứu hy vọng phát

hiện này sẽ giúp giảm những thiệt hại về mùa màng do hạn hán và cho phép sản

xuất lương thực tại các vùng thiếu nước.

1.5.2. Cơ chế tác dụng của gen ipt

Chất điều hòa sinh trưởng cytokinin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý ở

thực vật (Mok Mok, 2001; Riefler và cs., 2006). Sự biểu hiện của gen ipt trong thực

vật chuyển gen đưa đến sự gia tăng hàm lượng cytokinin nội sinh. [34], [60], [94]

Enzyme isopentenyl transferase do gen ipt mã hóa sẽ tham gia thủy giải bước

đầu tiên trên con đường sinh tổng hợp cytokinin, thêm nhóm isopentenyl

34THình 1.8. Sơ đồ tạo cytokinin trong thực vật dưới tác dụng của gen ipt

34T(iPMP:

pyrophosphate đến N6 của 5’-AMP để hình thành isopentenyl AMP. [44]

isopentenyladenosine 5’-monophosphate, AMP: adenosine 5’-

monophosphate, DMAPP: dimethylallylpyrophosphate, ipt: isopentenyl transferase,

iPA: isopentenyladenosine, ZR: zeatin riboside, ZMP: zeatin monophosphate).

1.6. NUÔI CẤY TẾ BÀO – SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP 1.6.1. Hợp chất thứ cấp và nuôi cấy mô, tế bào

Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp được sinh tổng hợp từ sản phẩm trao đổi chất

sơ cấp, phân bố hạn chế ở một số loài trong giới thực vật. Mặc dù không có vai trò

đáng kể trong chuyển hóa cơ bản (con đường chuyển hóa chính của thực vật) do

không phải là chất dinh dưỡng, không trực tiếp cần thiết cho sự phát triển của thực

vật, nhưng sản phẩm chuyển hóa thứ cấp có ý nghĩa sinh thái quan trọng, giúp thực

vật tương tác với môi trường và sống sót trước áp lực chọn lọc của môi trường. [38]

Những nghiên cứu về hợp chất thứ cấp thực vật phát triển từ những năm 1950.

Có khoảng 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật có hoạt tính và rất có giá trị

đối với cuộc sống. Những hợp chất như các alkaloid, terpenoid, saponin… được

biết đến như là các hợp chất thứ cấp. Các hợp chất thứ cấp thường chỉ được tạo ra ở

một số loại tế bào đặc biệt (tế bào rễ tơ, biểu mô, hoa, lá…) và trong những giai

đoạn phát triển nhất định, thường trong điều kiện đáp ứng với stress môi trường.

[31], [38]

Có nhiều khó khăn trong việc thu nhận một lượng lớn các hợp chất tự nhiên từ

thực vật. Đồng thời, nguồn tài nguyên thực vật ngày càng bị thu hẹp, nhiều loài có

nguy cơ tuyệt chủng, dẫn đến khó khăn trong việc sử dụng các sản phẩm từ thực

vật. Do đó, cần thiết phải có một phương thức sản xuất khác để cung cấp các sản

phẩm này. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có tiềm năng to lớn cho ngành công nghiệp

sản xuất các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Năm 1959, báo cáo đầu tiên về nuôi

cấy tế bào thực vật trên quy mô lớn đã được công bố bởi Tulecke và Nickell (Mỹ).

Trong số các sản phẩm thứ cấp có nguồn gốc từ tế bào thực vật, các hoạt chất rất có

giá trị như shikonin, ginsenosid và berberin đã được sản xuất trên quy mô lớn, và

đây thực sự là những thành công rực rỡ trong công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật.

[27], [31], [38]

1.6.2. Quy trình nuôi cấy tế bào sản xuất hợp chất thứ cấp

Quy trình nuôi cấy tế bào để chiết xuất hợp chất thứ cấp thường qua ba bước

cơ bản: [31]

Khi đã có callus, tiến hành cấy chuyển nhiều lần trong môi trường thạch mềm

rồi được cấy chuyển sang môi trường lỏng chuyển động bằng cách lắc hoặc khuấy

(nuôi cấy dịch huyền phù). Đây là giai đoạn rất quan trọng, nghiên cứu khảo sát

được môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho tế bào phát triển tốt nhất và có

hàm lượng hoạt chất cao nhất có tính chất quyết định thành công của quá trình nuôi

cấy tế bào. [31]

Khi tìm được điều kiện thích hợp, các nhà khoa học có thể phát triển quy mô

nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy sinh học- bioreactor có dung tích khác nhau.

Sau khi nghiên cứu thành công quy trình nuôi cấy tế bào trong phòng thí nghiệm,

tiếp tục triển khai các phòng sinh khối tế bào thực vật. Từ đó sử dụng các kỹ thuật

chiết tách để thu nhận các hợp chất cần thiết. [40], [53], [75], [122]

* Thuận lợi của việc sản xuất sản phẩm chuyển hóa thứ cấp bằng nuôi cấy

mô, tế bào thực vật: [96]

- Điều kiện nuôi cấy (hóa hoạc và vật lý) có thể được kiểm soát và tối ưu hóa

cho việc sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp.

- Tế bào có thể được chọn lọc và cải thiện bằng cách nhân dòng, gây đột biến

hoặc biệt hóa bằng phương pháp hóa học hoặc phương pháp sinh học (kỹ thuật

gen).

- Với những hệ thống đã biết có thể dễ dàng nghiên cứu chuyển hóa các chất

27T1.6.3. Một số phương pháp tăng hiệu quả sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi

trong tế bào và cơ chế sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứu cấp.

cấy mô, tế bào27T [31], [122]

Chọn lọc dòng tế bào cho năng suất cao: chọn lọc tế bào dựa vào khả năng

tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse

công bố năm 1985, sau đó phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi. Với dòng

tế bào của cây bát tiên Euphorbia milli sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp 7 lần

lượng anthocyanin so với nuôi cấy tế bào bố mẹ. Yamada và Sato (Nhật) đã chọn

lọc được một dòng tế bào của cây Coptis japonica, chiết tách lượng chất berberin

đạt 1,2 g/l, có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần sau 3 tuần nuôi cấy.

Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy: các thông số hóa học, vật lý như thành

phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí,

sự lắc hoặc khuấy, ánh sáng… đều có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng các hợp chất

thứ cấp. Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây

trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu. Các thông số vật lý và yếu tố

dinh dưỡng trong một mẻ gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất

nuôi cấy.

Cung cấp tiền chất: bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội

bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một

số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và

vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các

tiền chất có giá thành rẻ. Bổ sung phenylalanin khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây

hoa xôn Salvia officinalis đã kích thích tạo ra acid rosmarinic, cung cấp acid ferulic

trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích lũy vanillin, hoặc bổ sung

leucin làm tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi cấy cây tía tô Perilla

frutiscens.

Phương pháp gợi kích thích (elicitation): các chất kích kháng bảo vệ thực

vật – elicitor báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứcấp. Các elicitor có thể là các

peptid, oligosaccharid, lipid, glycopeptid hay các ion kim loại nặng... Sử dụng các

elicitor là phương thức để thu được các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một

cách hiệu quả nhất. Trong số các elicitor được biết đến nhiều nhất là jasmonat, được

dùng để tăng hàm lượng taxol trong tế bào thông đỏ.

Cố định tế bào: phương pháp cố định tế bào giúp các tế bào tiếp xúc với

nhau tạo thành khối tế bào lớn hơn, giúp làm tăng hiệu suất hợp chất. Cố định tế

bào thường dùng alginate trong một hộp xốp đồng nhất, hoặc cố định tự nhiên cho

tế bào phát triển thành cụm.

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Mẫu cấy

Vật liệu dùng thí nghiệm là lá cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) ex vitro (từ vườn ươm của Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây

thuốc Đà Lạt – Lâm Đồng) và cuống lá cây sâm in vitro ở phòng thí nghiệm Công

Nghệ Gen - Viện Sinh học Nhiệt đới.

2.1.2. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404

Chủng A. tumefaciens LBA 4404 chứa hệ thống vector kép gồm plasmid

pVDH396 dùng để chuyển gen vào mô sâm và helper plasmid pAL4404, được cung

cấp bởi phòng Công Nghệ Gen - Viện Sinh học Nhiệt đới.

2.1.2.1. Helper plasmid pAL4404

- Chứa các gen vir và gen kháng streptomycin.

- Gen kháng streptomycin dùng để chọn lọc vi khuẩn. Gen này mã hóa

enzyme streptomycin phosphotransferase.

2.1.2.2. Plasmid pVDH396

Plasmid pVDH396 (do TS. Nguyễn Thị Thanh thiết kế) có kích thước 15.890

bp với các gen được thiết kế trong vùng T-DNA (hình 2.1, hình 2.2).

Hình 2.1. Plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin (gen hpt),

gen gusA, gen ipt và promoter SAG12 trong A. tumefaciens

Hình 2.2. Vị trí của gen hpt, gen ipt, gen gusA trong vùng T-DNA của plasmid

pVDH396

(*: promoter Senescence– associated gene 12 từ Arabidopsis thaliana)

2.1.3. Enzyme cắt giới hạn

Enzyme giới hạn NcoI được sử dụng để cắt plasmid pVDH396 nhằm kiểm

tra sự hiện diện của plasmid này trong vi khuẩn E.coli, trình tự nhận biết và vị trí

cắt:

2.1.4. Mồi và thang chuẩn 2.1.4.1. Mồi

Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen ipt:

• Mồi ipt forward: 5’ TCGGTCCAACTTGCACAGGAA 3’

• Mồi ipt reverse: 5’ TACTCCTGAGCGATCCCAT 3’

Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen hpt:

• Mồi hpt forward: 5’ CGTCGTTCGAGAAGTTTC 3’

• Mồi hpt reverse: 3’ TACTTCTACACAGCCATC 5’

2.1.4.2. Thang DNA chuẩn

Bảng 2.1. Kích thước thang DNA chuẩn λ-HindIII

Thứ tự vạch DNA Kích thước (bp)

1 23.130

2 9.416

3 6.557

4 4.361

5 2.322

6 2.027

7 564

Bảng 2.2. Kích thước thang DNA chuẩn 1 kb

Thứ tự vạch DNA Kích thước (bp)

1 10.000

2 8.000

3 6.000

4 5.000

5 4.000

6 3.000

7 2.500

8 2.000

9 1.500

10 1.000

11 750

12 500

13 250

2.1.5. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 2.1.5.1. Hóa chất

a. Bộ kit tách chiết plasmid từ vi khuẩn

R WizardP P Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega) với thành

phần gồm có:

• Cell Resuspension Solution (50 mM Tris, 10 mM EDTA, 100 µg/ml

RnaseA, pH 7,5)

• Cell Lysis Solution (0,2 % NaOH và 1 % SDS)

• Neutralization Solution (1,32 M potassium acetate)

• Column Wash Solution (80 mM Potassium acetate; 8,3 mM Tris-HCl;

pH 7,5; 40 µg EDTA, 55 % ethanol)

• Dung dịch đệm TE (1X) (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 1 mM EDTA,

P Minipreps DNA Purification Resin

thêm 70 ml ethanol 95 % để pha 120 ml dung dịch)

P Minicolumn và Syringe Barrels

• WizardP

b. Hóa chất dùng để tách chiết DNA nhiễm sắc thể từ thực vật

NaCl 5M

Tris-HCl 1M

EDTA 5M

Isopropanol

Phenol/Chloroform 1:1

c. Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose

Agarose

Ethidium bromide 10 mg/ml

Dung dịch nạp mẫu

Dung dịch đệm TBE (10X stock):

• Tris base: 108 g/l

• Boric acid: 55 g/l

• EDTA 0,5 M: 40 ml/l

• Nước lên thể tích 1 lít. Hấp vô trùng.

Dung dịch đệm TAE (50X stock):

• Tris base: 242 g/l

• Glacial acetic acid: 57,1 ml

• EDTA 0,5 M; pH 8: 100 ml

• Nước lên thể tích 1 lit. Hấp vô trùng.

d. Hoá chất trong phản ứng PCR

dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

Dung dịch đệm PCR 10X:

Primer 1 và primer 2

Mẫu DNA

Nước

Taq polymerase.

e. Dung dịch stock X-Gluc 0,02M

X-Gluc: 70 mg

DMSO: 2ml

Nước: 8ml

Dung dịch thử X-Gluc

Stock X-Gluc: 5 ml

Dung dịch đệm NaPOR4R (pH 7): 10 ml

EDTA 0,25 M (pH 7): 4 ml

Triton 100 10%: 1 ml.

f. Hóa chất dùng trong nuôi cấy và chuyển gen

Hóa chất dùng trong nuôi cấy: chất điều hòa tăng trưởng thực vật NAA (1-

naphthaleneacetic), BA, 2,4-D và TDZ (thidiazuron).

Hóa chất dùng trong chuyển gen:

• Acetosyringone: hòa tan trong cồn, lên thể tích bằng nước cất, lọc vô trùng.

• Cefotaxime tan: hòa trong nước cất, lọc vô trùng; có tính diệt vi khuẩn.

• Hygromycin: là loại kháng sinh phổ biến thuộc aminoglycosidic, không bền

với điều kiện bên ngoài, bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ. Vì thế, quá trình

chọn lọc hygromycin chỉ diễn ra từ 2-3 tuần, nên sau đó cần cấy chuyển thường

xuyên.

2.1.5.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

a. Thiết bị

Tủ cấy vô trùng.

Nồi hấp vô trùng.

Máy lắc.

Tủ ổn nhiệt.

Máy đo pH.

Máy li tâm lạnh.

Máy khuếch đại DNA (PCR).

Bộ điện di.

Máy chụp gel.

Máy rung vortex.

Cân phân tích với độ chính xác 0,0001g,…

b. Dụng cụ

Bình tam giác.

Kính hiển vi.

Đèn cồn.

Ống eppendorf.

Đầu típ.

Đĩa petri.

Pipet các loại.

2.1.6. Môi trường và điều kiện nuôi cấy

Môi trường

* Môi trường khoáng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)

* Môi trường nuôi cấy tăng sinh khối mô sẹo: môi trường MS có bổ sung 2,4-

D và TDZ ở các nồng độ khác nhau.

* Môi trường khảo sát sự tái sinh chồi từ mô sẹo của lá sâm Ngọc Linh: môi

trường MS có bổ sung NAA và BA ở các nồng độ khác nhau.

* Môi trường khảo sát ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc: môi trường MS có

2,4-D, TDZ và bổ sung hygromycin ở các nồng độ khác nhau.

Điều kiện nuôi cấy

○ phòng 25P

○ PC ± 2P

PC, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng ≈ 3000

Các thí nghiệm nuôi cấy được tiến hành trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ

lux.

○ điều kiện tối, ở nhiệt độ 24P

PC.

Trong thí nghiệm chuyển gen: mô sẹo nuôi chung với vi khuẩn 2 ngày trong

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thí nghiệm về nuôi cấy mô 2.2.1.1. Tạo mô sẹo từ lá sâm ex vitro và cuống lá sâm in vitro

Mục đích

Tạo ra một khối lượng mô sẹo ban đầu. Chọn loại mô phù hợp với điều kiện

phòng thí nghiệm dùng khảo sát chi tiết ở các bước tiếp theo.

Cách tiến hành

+ Khử trùng (đối với lá cây ex vitro): Lá chét cây sâm ở vườn ươm (Hình

2.3a) trước hết được rửa sạch bằng nước máy trong 10 phút; sau đó được khử trùng

lần lượt bằng cồn 70% trong 1 phút, nước Javel 20% (v/v, có bổ sung Tween - 20)

trong 10 phút và dung dịch HgClR2R 0,1% (w/v) trong 5 phút.

+ Chuẩn bị mô cấy, môi trường và điều kiện nuôi cấy: Lá cây ex vitro (sau khử

○ trường tạo mô sẹo MS có 1 mg/l 2,4-D (để trong tối ở nhiệt độ 25P

○ PC ± 2P

PC). Tương

trùng) được cắt thành các mảnh kích thước 5 x 5 mm (Hình 2.3b) và cấy vào môi

tự, các đoạn cắt cuống lá cây in vitro (5 mm) (Hình 2.3) cũng được nuôi cấy trên

môi trường như đối với trường hợp mảnh lá. Điều kiện nuôi như trên.

+ Theo dõi, so sánh khả năng cảm ứng tạo mô sẹo và trạng thái mô sẹo giữa

mô được hình thành từ lá và cuống lá trong thời gian 2 tháng.

2.2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và TDZ đến khả năng tăng sinh

khối mô sẹo lá sâm

Mục đích

Tìm môi trường thích hợp cho mô sẹo tăng trưởng tốt nhằm tạo số lượng mô sẹo đủ lớn dùng cho thí nghiệm chuyển gen và áp dụng nghiệm thức 2,4-D-TDZ xác định được trong nhân mô sẹo cuống lá.

Cách tiến hành + Chọn các cụm mô sẹo lá chắc khỏe có trọng lượng ban đầu 100 mg và cấy vào môi trường MS có bổ sung 2,4-D và TDZ với các nồng độ khác nhau để khảo sát khả năng tăng sinh khối.

+ Mỗi nghiệm thức được thử nghiệm trên 5 mẫu, lặp lại 3 lần. + Theo dõi thí nghiệm trong 12 tuần. Kết luận môi trường thích hợp để tăng

sinh khối mô sẹo. Bảng 2.3. Nồng độ 2,4-D và TDZ cho thí nghiệm tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh

STT Môi trường 2,4-D (mg/l) TDZ (mg/l)

1 S1 1 0,1

2 S2 1 0,2

3 S3 1 0,3

4 S4 2 0,1

5 S5 2 0,2

6 S6 2 0,3

2.2.1.2. Khảo sát sự tái sinh chồi từ mô sẹo lá sâm

2.2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo lá

sâm

Mục đích

Auxin và cytokinin (tỷ lệ auxin/cytokinin) có ảnh hưởng quan trọng đến sự

tạo chồi. Do đó, thí nghiệm nhằm xác định nghiệm thức NAA-BA thích hợp [nồng

độ auxin (NAA) kết hợp với nồng cytokinin (BA)] lên sự tạo chồi từ mô sẹo sâm.

Áp dụng nghiệm thức NAA-BA xác định được đối với tái sinh mô sẹo cuống lá.

Cách tiến hành

+ Các cụm mô sẹo (qua nuôi cấy trên môi trường MS có 1 mg/l 2,4-D + 0,2

mg/l TDZ) có kích thước khoảng 5 mm được đặt trên môi trường MS với 30 g/l

đường sacrose, 9 g/l agar và bổ sung NAA và BA với các nồng độ khác nhau.

+ Mỗi nghiệm thức được thử nghiệm trên 5 mẫu, lặp lại 3 lần.

+ Theo dõi, so sánh trạng thái chồi và số lượng chồi trong mỗi nghiệm thức

trong thời gian 12 tuần, cấy chuyển 2 tuần/lần.

+ Kết luận môi trường thích hợp dùng tái sinh chồi.

Bảng 2.4. Nồng độ NAA và BA cho thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh

STT Môi trường NAA (mg/l) BA (mg/l)

1 C1 0,5 1,0

2 C2 1,0 1,0

3 C3 1,5 1,0

4 C4 0,5 2,0

5 C5 1,0 2,0

6 C6 1,5 2,0

2.2.2. Thí nghiệm chuyển gen 2.2.2.1. Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen

Mục đích

Xác định nồng độ kháng sinh hygromycin thích hợp (tối thiểu gây chết) để

chọn lọc tế bào ở thí nghiệm chuyển gen.

Cách tiến hành

+ Nuôi các cụm mô sẹo lá (≈ 5 mm) trên môi trường S2 có bổ sung

hygromycin với các nồng độ 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35 và 40 (mg/l). Mỗi nồng độ

thực hiện với 5 mẫu, thí nghiệm lặp lại 3 lần.

+ Theo dõi trạng thái và số mô sẹo còn sống sau 8 tuần.

+ Kết luận nồng độ hygromycin thích hợp sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen.

2.2.2.2. Chuyển gen vào mô sẹo sâm nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

a. Biến nạp plasmid vào E. coli, nuôi vi khuẩn và tách chiết plasmid

a.1. Biến nạp plasmid vào E. coli

o nhiệt ở 42P PC trong 2 phút (Sambrook và cs., 1989).

+ Biến nạp plasmid vào E. coli được thực hiện bằng phương pháp gây sốc

a.2. Nuôi vi khuẩn và tách chiết plasmid E. coli biến nạp

Các bước thực hiện

- Nuôi lắc vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng LB qua đêm có bổ sung

kháng sinh tương ứng kanamycin 100 mg/ml.

R Sử dụng bộ kit tách chiết plasmid vi khuẩn: WizardP P Plus SV Minipreps DNA

- Tách chiết plasmid vi khuẩn:

Purification System (Promega); thực hiện các bước tách chiết như sau:

+ Ly tâm kết lắng tế bào vi khuẩn từ 3 – 5 ml huyền phù nuôi cấy lắc ở tốc độ

10.000 vòng trong 10 phút. Bỏ phần nổi (supernatant) và thấm khô ống chứa bằng

cách úp ngược ống trên một tờ giấy thấm.

+ Huyền phù hóa hoàn toàn các tế bào kết lắng trong 300 µl dung dịch tái

huyền phù (Cell Resuspension Solution). Chuyển huyền phù tế bào vào ống ly tâm

nhỏ 1,5 ml.

+ Thêm 300 µl dung dịch tự phân tế bào (Cell Lysis Solution) và trộn đều

bằng cách đảo ngược ống 4 lần. Huyền phù tế bào sẽ được làm sạch.

+ Thêm 300 µl dung dịch trung hòa (Neutralization Solution) và trộn đều bằng

cách đảo ngược ống vài lần. Nếu dùng chuỗi EndA+, thêm 600 µl dung dịch trung

hòa, đảo trộn bằng cách lật ngược 4 lần, ủ hỗn hợp tự phân trong bồn ổn nhiệt trong

10 phút.

+ Ly tâm hỗn hợp tự phân ở 10.000 vòng trong 10 phút

a.3. Tinh sạch và bảo quản plasmid

Các bước thực hiện

+ Với mỗi Miniprep chuẩn bị một Wizard Minicolumn. Hút 1 ml dung dịch

DNA Purification Resin cho vào xy-ranh. Cẩn thận hút dịch trong mỗi Miniprep

(supernatant của phần tách chiết) và chuyển vào trong ống của Minicolumn/xy-ranh

đã chứa sẵn chất sền sệt.

+ Gắn piston vào và đẩy nhẹ nhàng dịch chảy vào Minicolumn. Tháo xy-ranh

khỏi cột và tháo piston khỏi xy-ranh, gắn ống của xy-ranh trở lại Minicolumn. Hút 2

ml dung dịch rửa cột (Column Wash Solution) sau khi đã thêm cồn vào ống xy-

ranh, gắn piston vào và đẩy dịch rửa cột chảy qua Minicolumn.

+ Tháo xy-ranh và chuyển Minicolumn vào ống ly tâm nhỏ 1,5 ml. Ly tâm

Minicolumn ở 10.000 vòng trong 2 phút bằng máy ly tâm nhỏ để làm khô.

+ Chuyển Minicolumn vào một ống ly tâm 1,5ml khác. Thêm 50µl dung dịch

đệm TE vào Minicolumn và chờ trong 1 phút. Ly tâm 10.000 vòng trong máy ly

o + Tháo và bỏ Minicolumn. DNA plasmid được giữ ở nhiệt độ - 20P PC.

tâm nhỏ trong 20 giây để thu nhận plasmid DNA.

b. Kiểm tra sự hiện diện của plasmid pVDH396 trong E. coli bằng phản

ứng cắt bởi enzyme giới hạn NcoI

Plasmid sau tách chiết được xử lý với enzyme cắt giới hạn là NcoI. Điện di

sản phẩm sau phản ứng cắt để kiểm tra kích thước của plasmid.

Hỗn hợp phản ứng như sau:

+ DNA plasmid: 20 µl

+ Buffer: 3 µl

+ Enzyme NcoI: 2 µl

+ BSA: 1 µl

 Tổng thể tích: 26 µl

o Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 2 - 3 giờ ở 37P PC. Sản phẩm cắt được đem điện di

cùng với thang chuẩn λ-HindIII.

o PC, cho vào 2 µl ethidium bromide. Sau TAE đun cho nóng chảy; để nguội đến 60P

* Chạy điện di DNA trên bản gel: Cân 1g agarose cho vào 100 ml dung dịch

đó đổ vào khuôn đã có sẵn lược để tạo giếng, chờ dung dịch nguội hoàn toàn. Nhẹ

nhàng rút lược ra, cho gel vào hộp điện di chứa dung dịch đệm TAE và cho dịch

DNA plasmid (đã có dung dịch nhuộm màu xanh) vào, cắm điện cực chạy ở 75 volt

trong 2 giờ. Xem bản gel dưới đèn cực tím.

Sau khi đã kiểm tra được sự hiện diện của plasmid pVDH396, plasmid này sẽ

được biến nạp vào trong A. tumefaciens bằng cách gây sốc nhiệt để tạo chủng vi

khuẩn A. tumefaciens LBA 4404. Vi khuẩn A. tumefacien LBA 4404 được cấy trong

0 kanamycin 50 mg/l, lắc qua đêm với tốc độ 250 rpm ở 28P

PC và được sử dụng cho

10 ml môi trường LB (Chilton và cộng sự., 1974) lỏng có bổ sung kháng sinh

thí nghiệm chuyển gen.

c. Tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid pVDH396

dùng chuyển gen

Việc tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid pVDH396

cũng được thực hiện bằng phương pháp gây sốc nhiệt tương tự như đối với E. coli.

d. Chuẩn bị mẫu chuyển gen

0 ngày ở điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ phòng 25P PC ± 2, thời gian chiếu sáng 10

Các cụm mô sẹo lá (5 mm) được cấy trên môi trường tạo mô sẹo S2 trong hai

giờ/ngày, cường độ chiếu sáng ≈ 3000 lux.

e. Gây nhiễm và nuôi chung mô sẹo với vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens

Mô sẹo sau hai ngày tiền nuôi cấy (preculture) được gây nhiễm bằng cách

chuyển vào đĩa petri có chứa dịch vi khuẩn đã được chuẩn bị, bổ sung

acetosyringone 100 µM để tăng khả năng cảm ứng chuyển gen của vi khuẩn.

Sau 20 phút, các mô sẹo được vớt ra, đặt trên tờ giấy thấm vô trùng khoảng 10

phút để thấm bớt dịch vi khuẩn thừa. Sau đó các mô sẹo này được cấy trở lại môi

0 nhiệt độ 24P

PC.

trường tạo mô sẹo S2 có bổ sung 100 µM acetosyringone; nuôi ủ trong tối 2 ngày ở

f. Rửa vi khuẩn và chọn lọc

Sau hai ngày, mô sẹo được rửa bằng nước cất vô trùng vài lần đến khi thấy

dịch rửa trong. Lần rửa cuối bổ sung cefotaxime 500 mg/l, lắc nhẹ trong 15 phút.

Gắp các mẫu mô sẹo ra tờ giấy thấm vô trùng, để khoảng 10 phút.

Cấy các mẫu mô sẹo vào môi trường S2 có bổ sung 15 mg/l hygromycin và

500 mg/l cefotaxime.

Theo dõi và cấy chuyển 2 tuần/lần sang cùng môi trường nhưng có 25 mg/l

hygromycin ở các lần cấy chuyển sau. Thực hiện ít nhất 4 lần cấy chuyển chọn lọc.

Trong quá trình cấy chuyển, chọn lọc các mô vẫn còn khả năng tăng trưởng;

những mô không được chuyển gen bị nâu, chết được loại bỏ. Cấy riêng rẽ các mô

sống từ một cụm thành một dòng (thao tác tách dòng).

Những dòng mô còn sống sau quá trình chọn lọc dài được xem là những dòng

mô giả định chuyển gen. Các dòng này được kiểm tra sự hiện diện của gen đích ipt

và các gen khác; chúng tiếp tục được cấy chuyển sang môi trường tạo chồi C2 có bổ

sung chất kháng sinh với nồng độ giảm so với trước đây: 10 mg/l hygromycin và

250 mg/l cefotaxime.

2.2.3. Kiểm tra sự hiện diện/biểu hiện của các gen chuyển 2.2.3.1. Kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen chỉ thị gusA bằng kỹ thuật hóa

mô

Mục đích

Kiểm tra nhanh sự có mặt của gen chỉ thị gusA trong bộ gen của mô sâm giả

định chuyển gen bằng dung dịch X-Gluc.

Cách tiến hành

o dịch X-Gluc khoảng 12 giờ ở 37P PC.

Ngâm các mẫu mô sâm giả định chuyển gen (mô sẹo, mô phôi) với dung

Rửa mẫu bằng dung dịch cồn 70% cho đến khi mất màu diệp lục và quan sát

màu xanh chàm dưới kính hiển vi soi nổi (đối với mẫu biểu hiện mạnh thì có thể

nhận thấy ngay màu xanh đặc trưng sau khi ủ mẫu qua đêm mà chưa cần rửa bỏ

diệp lục tố).

• Nếu là mẫu chuyển gen thì mẫu có màu xanh chàm (indigo) đặc trưng, còn

mẫu đối chứng sẽ biểu hiện âm tính (không có màu).

2.2.3.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen hpt và gen ipt bằng phương pháp PCR

a. Tách chiết DNA nhiễm sắc thể của mô sâm giả định chuyển gen

Mục đích

Thu nhận DNA dùng cho phản ứng PCR để xác định sự hiện diện của gen

hpt và gen ipt.

Cách tiến hành

+ Cắt nhỏ 200-500 mg mẫu mô sâm cho vào ống eppendorf.

o + Cho 30 µl dung dịch SDS 20% và ủ ở 65P PC trong 10 phút.

+ Nghiền mẫu trong 400 µl dung dịch tách chiết DNA.

+ Thêm 400 µl phenol/chloroform, trộn đều hỗn hợp và ly tâm 14.000 vòng

trong 5 phút.

+ Thu lấy dịch nổi vào một ống eppendorf mới.

+ Thêm vào 300 µl isopropanol trộn đều và giữ lạnh trong đá 10 phút.

+ Ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi.

+ Rửa tủa thu được với 100 µl ethanol 70%. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong

2 phút và loại bỏ ethanol.

o + Thêm 2 µl RNase, ủ ở 37P PC trong 30 phút để loại RNA trong mẫu.

o + DNA thu được có thể sử dụng ngay hay bảo quản ở -20P PC.

+ Để khô mẫu khoảng 20-30 phút. Hòa tan mẫu trong 40µl TE.

b. Kiểm tra sự hiện diện của gen hpt và gen ipt ở mô giả định chuyển gen

bằng phương pháp PCR

Bảng 2.5. Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR

Thể tích sử dụng Thành phần (tổng thể tích là 25 μl)

Nước không chứa nuclease 15 μl

PCR Buffer Gotag 5X 5 μl

dNTP (1 mM) 0,5 μl

Mồi xuôi (5 μM) 1 μl

Mồi ngược (5 μM) 1 μl

Taq polymerase (5 unit/μl) 0,5 μl

DNA 2 μl

Các mẫu trong phản ứng PCR gồm có một ống đối chứng dương (chứa

plasmid pVDH396 mang gen đã biết), một ống đối chứng âm (mẫu đối chứng

không chuyển gen), các mẫu còn lại là các mẫu cần xác định sự hiện diện của gen

chuyển.

Chuẩn bị ống Master mix: cho tất cả các hoá chất trên (trừ mẫu) vào ồng

eppendorf 1.500 μl trộn đều (có thể ly tâm ngắn 10.000 rpm trong 1 phút).

Đánh số thứ tự các ống eppendorf dùng PCR.

Cho 23 μl dung dịch trong ống Master vào eppendorf nhỏ dùng trong PCR.

Sau đó lần lượt cho mẫu đối chứng dương, đối chứng âm và các mẫu còn lại vào

ống eppendorf.

Đặt các ống eppendorf vào máy PCR, vặn chặt nắp và chạy ở các chương trình

ο - Đối với gen hpt: 94P

ο PC: 5 phút; 35 chu kỳ (94P

ο PC: 1 phút, 62P

ο PC: 1 phút, 72P

PC:

PC: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.

ο 1 phút); 72P

ο PC: 2 phút; 30 chu kỳ (95P

ο PC: 1 phút, 55P

ο PC: 1 phút, 72P

PC: 2

ο - Đối với gen ipt: 95P

PC: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 615 bp.

ο phút); 72P

như sau:

Sau khi chạy PCR xong, nạp mẫu vào các giếng trong gel agarose để chạy

điện di.

Phương pháp điện di

∗ Cân 0,4 g agarose cho vào 50 ml dung dịch TAE 1X.

∗ Đun hỗn hợp trong lò vi ba khoảng 1 phút.

∗ Lắc đều, chờ cho dung dịch gel nguội bớt; cho 1 μl Ethydium Bromide vào

• Đổ gel 0,8% agarose:

∗ Gắn lược vào khay đổ gel, từ từ đổ dung dịch gel vào khay đổ gel, chờ cho

nhằm quan sát DNA phát huỳnh quang dưới tia UV.

gel đông cứng lại.

∗ Sau khi gel agarose đã đông đặc, nhẹ nhàng lấy lược ra khỏi gel rồi từ từ

• Tiến hành điện di:

∗ Đổ dung dịch đệm TAE 1X vào máy chạy điện di sao cho cao hơn miếng gel

nhấc khay đổ gel đặt vào máy chạy điện di.

∗ Đầu tiên nạp ladder λ DNA cắt hạn chế HindIII (23 kb) vào giếng, sau đó lần

khoảng 3 – 5 mm.

∗ Đậy nắp máy chạy điện di. Chạy điện di dùng dòng điện hiệu thế 80 V

lượt nạp các mẫu còn lại vào các giếng trên miếng gel.

khoảng một giờ.

® bằng hệ thống chụp ảnh gel điện di BioradP

P. Nếu là sản phẩm chuyển gen, quá

• Sau khi chạy điện di, lấy gel ra, quan sát và chụp kết quả khuếch đại DNA

trình soi bản gel sẽ cho thấy hiện băng DNA được khuếch đại với kích thước biết

trước. Như đã trình bày ở trên, chiều dài đoạn gen ipt và hpt được nhân lên có

kích thước lần lượt là 615 bp và 800 bp.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. THÍ NGHIỆM VỀ NUÔI CẤY MÔ

Mục đích của các thí nghiệm về nuôi cấy mô nhằm tạo cơ sở mang tính

quyết định cho nghiên cứu về chuyển gen xét ở các khía cạnh tạo, nhân vật liệu

dùng cho chuyển gen và khía cạnh tái sinh cây chuyển gen.

3.1.1. Tạo mô sẹo từ lá sâm ex vitro và cuống lá sâm in vitro

Các mảnh lá (5 x 5 mm) của cây ex vitro (đã qua khử trùng) và đoạn cuống

lá (5 mm) của cây in vitro được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo (môi trường

MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D). Sau 2 tháng nuôi cấy, kết quả cho thấy có sự khác biệt

trong khả năng cảm ứng tạo mô sẹo; mẫu cuống lá cảm ứng tạo mô sẹo tốt hơn và

tăng trưởng nhanh hơn, mô sẹo hình thành trên khắp bề mặt đoạn cuống (hình

3.1b). Mảnh lá cũng có đáp ứng tạo mô sẹo khá tốt trên môi trường (hình 3.1a).

Nếu nuôi mô ngoài sáng, mô sẹo có màu xanh lục nhạt.

Qua thử nghiệm ban đầu trước đó nhận thấy lá/cuống lá sâm có đáp ứng tốt với nuôi

cấy tạo mô sẹo (thông tin cá nhân); hơn nữa trước đây, tác giả Nguyễn Trung Thành

và cs. (2007) đã thành công trong nghiên cứu tạo mô sẹo (từ rễ cây sâm Ngọc Linh

5 năm tuổi) qua sử dụng môi trường MS có 1 mg/l 2,4-D. Do vậy ở thí nghiệm này,

chỉ một nghiệm thức nồng độ 2,4-D (1 mg/l) được bố trí.

Theo chúng tôi, mô sẹo là loại vật liệu có thể được sử dụng trong nghiên cứu

theo nhiều hướng khác nhau như biến nạp gen, sản xuất hợp chất thứ cấp. Từ tế bào

mô sẹo, có thể chuyển sang dạng nuôi cấy tế bào huyền phù như tác giả Nguyễn

Trung Thành và cs. (2006) đã thực hiện đối với sâm Triều Tiên và cũng từ mô sẹo

có thể nghiên cứu tái sinh rễ bất định; sau đó nuôi nhân rễ bất định như công trình

nghiên cứu của tác giả Dương Tấn Nhựt và cs. (2006), Nguyễn Trung Thành và cs. (2007).

Ở lĩnh vực nghiên cứu biến nạp gen, mô sẹo là vật liệu thường được các nhà

nghiên cứu biến nạp gen sử dụng do chồi tái sinh thường không bị trạng thái khảm

(chimeric) nếu quá trình chọn lọc được thực hiện nghiêm ngặt. Gorpenchenko và cs.

(2006) đã thành công trong nghiên cứu hai kiểu tái sinh phôi (somatic

embryogenesis) và tái sinh cơ quan (organogenesis) qua thực hiện biến nạp gen

rolC từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes dùng vật liệu mô sẹo sâm Triều Tiên.

Choi (2006) cũng đã thành công trong nghiên cứu biến nạp gen chỉ thị gusA, gen

kháng kanamycin (nptII) vào vật liệu mô sẹo phôi hợp tử cây sâm Triều Tiên dùng

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

Mô sẹo từ hai loại vật liệu nói trên đã được nhân lên trên cùng môi trường.

Tuy nhiên, ở thời điểm bố trí thí nghiệm tiếp theo do mô sẹo lá có nhiều hơn nên

chỉ loại mô này được sử dụng để nghiên cứu xây dựng môi trường thích hợp nhằm

nhân nhanh sinh khối dùng cho nghiên cứu chuyển gen.

3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và TDZ đến khả năng tăng sinh khối mô sẹo lá sâm

Các cụm mô sẹo từ mẫu lá có khối lượng khoảng 100 mg được sử dụng để

khảo sát khả năng tăng sinh khối qua tác động của auxin 2,4-D và cytokinin TDZ ở

các nồng độ khác nhau.

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ lên khả năng tăng sinh

khối của mô sẹo sâm Ngọc Linh

STT 1 2 3 4 5 6 Môi trường S1 S2 S3 S4 S5 S6 Trọng lượng tươi trung bình (mg)/mẫu a z 493,8 ± 35,55P c 757,2 ± 42,36P a 483,8 ± 32,95P b 631,6 ± 35,73P P b 613,4 ± 22,87P ab 526,0 ± 34,55P

Các chữ cái a, b, c trong một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức

theo trắc nghiệm phân hạng Duncan (Duncan’s Multiple Range Test).

Hình 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ lên khả năng tăng sinh mô

sẹo sâm Ngọc Linh sau 8 tuần

Theo lý thuyết, auxin có tác dụng mạnh lên sự kéo dài của tế bào dẫn đến

hình thành mô sẹo, tạo các tế bào hay nhóm tế bào có khả năng sinh phôi do chúng

ảnh hưởng lên tính hữu cực của tế bào và kích thích các phân chia không cân xứng.

Do đó auxin đã được sử dụng với mục đích tạo và nhân nhanh mô sẹo. Thực tế cho

thấy, trong nuôi cấy sâm Ngọc Linh nói riêng và các loài thuộc chi Panax nói

chung, chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D trong nhóm auxin được xem là chất có tác

dụng tốt lên sự hình thành và tăng sinh của mô sẹo.

Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sự sinh trưởng của

chồi in vitro. Trong nuôi cấy mô, nếu lượng cytokinin không đủ thì sự phân chia

của nhân tế bào sẽ bị chặn lại tại một giai đoạn trong chu trình tế bào. Tuy nhiên,

tác dụng này sẽ không hiệu quả nếu vắng sự hiện diện của auxin. Do đó, sự kết hợp

giữa auxin và cytokinin là cần thiết cho quá trình hình thành, tăng sinh và phát sinh

hình thái của mô sẹo. Trong nhóm cytokinin, TDZ (thidiazuron) là chất có hoạt tính

sinh học mạnh. TDZ do Arndt và cs. (1976) tìm ra đầu tiên; TDZ không chỉ kích

thích sự tăng trưởng của mô sẹo mà còn được chứng minh có hoạt tính cytokinin

cao hơn cả zeatin (Mok và cs., 1982), đặc biệt TDZ có tính kháng lại sự phân hủy

bởi các chất oxi hóa cytokinin (Mok và cs., 1987) nên khá bền trong môi trường

nuôi cấy mô.

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 2,4-D (thuộc nhóm auxin) và TDZ

(thuộc nhóm cytokinin) để khảo sát ảnh hưởng của chúng lên sự tăng sinh của mô

sẹo cũng như sự hình thành phôi soma. Kết quả cho thấy mô sẹo sâm đều tăng sinh

khối trong cả 6 loại môi trường. Trong đó, sự tăng trưởng của mô sẹo trong môi

trường S1 (trọng lượng tươi trung bình 493,8 mg/mẫu) và S3 (trọng lượng tươi

trung bình 483,8 mg/mẫu), S4 (trọng lượng tươi trung bình 631,6 mg/mẫu) và S5

(trọng lượng tươi trung bình 613,4 mg/mẫu) là tương tự nhau, môi trường S2 (trọng

lượng tươi trung bình 757,2 mg/mẫu) có sự khác biệt so với môi trường S6 (trọng

lượng tươi trung bình 526,0 mg/mẫu). Thành phần môi trường S2 có 1 mg/l 2,4-D

và 0,2 mg/l TDZ phù hợp cho sự tăng trưởng của mô sẹo. Kết quả này hoàn toàn

giống với thí nghiệm của Nhut D.T. và cs. (2006).

Trong nuôi cấy mô các loài thuộc chi Panax, 2,4-D là chất điều hòa sinh

trưởng được sử dụng phổ biến vì có tác dụng tốt cho sự tăng sinh khối của mô sẹo.

Ngoài ra, với việc bổ sung TDZ, mô sẹo tăng sinh nhanh, quá trình phát sinh và

hình thành phôi soma diễn ra mạnh hơn (Proctor J.T.A. và cs., 1996). Sự kết hợp

giữa 2,4-D và TDZ có thể dẫn đến phát sinh cơ quan sau 6 ngày nuôi cấy

(Yancheva và cs., 2003). Trong thí nghiệm này, tỷ lệ mô sẹo hình thành phôi soma

khá cao (>70%). Trạng thái mô ở các nghiệm thức môi trường không khác nhau

nhiều. Tuy nhiên, môi trường S2 là môi trường thích hợp nhất cho sự tăng sinh khối

và hình thành phôi soma.

3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo lá sâm Mỗi giai đoạn phát triển của tế bào sinh phôi cần sự kết hợp đặc biệt của các

chất điều hoà sinh trưởng thực vật ở các nồng độ thích hợp. Một môi trường thích

hợp cho giai đoạn này có thể cản trở sự diễn tiến của các giai đoạn tiếp theo. Trong

giai đoạn cảm ứng (giai đoạn tạo các tế bào sinh phôi trong mô sẹo, dịch treo) thì sự

có mặt của auxin là cần thiết nhưng sự có mặt tiếp tục của nó lại trở nên bất lợi cho

sự biệt hoá mô của phôi (giai đoạn tiến hoá phôi soma) và tái sinh chồi.

Bảng 3.2. Kết quả tái sinh chồi sâm Ngọc Linh sau 12 tuần

STT Môi trường Trạng thái chồi

Số lượng chồi TB/mẫu

ab z

1 C1 7,4 ± 1,63P

- Chồi không xanh tốt. - Phát triển không đồng đều.

c 12,7 ± 0,86P

- Chồi xanh tốt. - Phát triển tương đối đồng đều ở các mẫu, lá chồi xanh, to.

3 C3 10,8 ± 1,93P

- Chồi xanh tốt. - Phát triển đồng đều.

a 6,6 ± 0,68P

4 C4

- Chồi tương đối tốt. - Lá chồi yếu.

a 5,2 ± 0,58P

5 C5 - Chồi không xanh, tốt.

- Số chồi ít, phát triển không đều.

a 6,0 ± 1,18P

6 C6

- Chồi không xanh tốt. - Số chồi ít, phát triển chậm.

Các chữ cái a, b, c trong một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức

theo trắc nghiệm phân hạng Duncan (Duncan’s Multiple Range Test).

Tỷ lệ và nồng độ kết hợp giữa cytokinin và auxin có ảnh hưởng quan trọng

trong quá trình tái sinh chồi. Thông thường, trên môi trường có tỷ lệ

auxin/cytokinin thấp, mẫu có xu hướng tạo chồi (Vanden và cộng sự, 1998).

Trong 6 nghiệm thức khảo sát hiệu quả tác dụng của sự kết hợp giữa auxin

(NAA) và cytokinin (BA) trong hình thành chồi, tỷ lệ chồi ở các nghiệm thức có sự

khác biệt. Các mẫu ở môi trường C5 có số chồi thấp nhất (trung bình 5,2 chồi/mẫu).

Cả 3 môi trường C4, C5 và C6 đều có tỷ lệ chồi thấp và trạng thái chồi cũng không

tốt, chồi tăng trưởng chậm. Môi trường C1 có 7,4 chồi/mẫu, nhưng chồi tăng trưởng

chậm và một số mẫu dường như không tạo được chồi. Ở môi trường C1, nồng độ

BA thấp (0,5 mg/l) và các môi trường C4, C5, C6 có nồng độ NAA cao (2 mg/l)

nên không phù hợp cho sự hình thành và tăng trưởng của chồi.

Môi trường C2 và môi trường C3 cho kết quả tốt nhất. Số lượng chồi nhiều

(môi trường C2: 12,7 chồi/mẫu; môi trường C3: 10,8 chồi/ mẫu) (hình 3.3, 3.4) và

sự tăng trưởng của chồi trong 2 nghiệm thức này tốt hơn hẳn so với 4 nghiệm thức

còn lại. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu vì cả hai môi trường C2 và C3

có tỷ lệ auxin/cytokinin thấp hơn so với các môi trường C1, C4, C5 và C6. Trong

đó, môi trường C2 tốt hơn cho sự tạo chồi nên sẽ được dùng để tái sinh sau chuyển gen.

Nghiên cứu sự tạo chồi in vitro, nhiều loại chất điều hòa sinh trưởng được sử

dụng, đặc biệt có hiệu quả cao khi kết hợp hai hay nhiều hợp chất. Khi nghiên cứu ở

loài Vicia faba, Mutasim và Kazumi (1999) đã chứng minh được rằng với sự kết

hợp giữa BA và TDZ, chồi được hình thành và phát triển tốt hơn hẳn so với tác

dụng riêng lẻ của TDZ. Hay ở sâm Mỹ (Panax quingquefolium L.), sự kết hợp giữa

2,4-D và NAA cũng cho kết quả tạo chồi rất tốt (Ananchanok Tirajoh, 1996). Đối

với sâm Ngọc Linh, sự phối hợp giữa NAA (1mg/l) và BA (1mg/l) được xem là

thích hợp cho sự hình thành và phát triển chồi.

Hình 3.3. Chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi trường C1,

C2, C3, C4, C5 và C6

Hình 3.4. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần

a, b. Môi trường C1

c, d. Môi trường C2

e, f. Môi trường C3

Hình 3.5. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần

g, h. Môi trường C4

i, j. Môi trường C5

k, l. Môi trường C6

Nghiên cứu sâu hơn về bản chất của con đường tái sinh cây (plant

regeneration pathway), nhận thấy ở sâm Ngọc Linh sự hình thành mô có khả năng

sinh phôi (embryogenic) nhiều hay ít từ mô sẹo lá và cuống lá trên môi trường có

2,4-D và TDZ với các nồng độ khác nhau theo thời gian nuôi cấy – theo dõi sau

khoảng 3 – 6 tháng. Sự hình thành mô có khả năng sinh phôi/mô phôi đã tạo điều

kiện thích hợp cho sự tái sinh chồi khi mô sẹo được cây chuyển sang môi trường có

NAA và BA. Hình 3.6 dưới đây minh họa cơ bản quá trình tái sinh chồi thông qua

phôi soma từ mô sẹo lá.

Theo nghiên cứu của nhiều tác giả nước ngoài, ở đối tượng sâm Triều Tiên

(họ Araliaceae), tuy cũng có hiện tượng tái sinh theo kiểu phát sinh cơ quan

(organogenesis) (Gorpenchenko và cs., 2006) nhưng hiện tượng tái sinh theo con

đường sinh phôi soma (somatic embrygenesis) được xem là rất đặc trưng (Chang,

Hsing, 1980; Arya và cs., 1991; Ahn và cs., 1996; Choi và cs., 1998; Choi và cs.,

2003). Ở luận văn này, sự tái sinh qua con đường sinh phôi soma trên đối tượng

sâm Ngọc Linh, cây cùng họ Araliaceae, phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả

nêu trên.

Theo chúng tôi, tương tự phôi hợp tử, phôi soma cũng là nguồn vật liệu rất

có giá trị dùng để biến nạp. Choi và cs. (2001, 2003) qua sử dụng trực tiếp lá mầm

phôi hợp tử đã nghiên cứu biến nạp thành công gen gusA, gen nptII, gen bar (tạo

enzyme phosphinothricin acetyltransferase) vào cây sâm Triều Tiên.

Các chồi phát triển trên môi trường MS có 1 mg/l NAA + 1 mg/l BA được

tách ra và tiếp tục nuôi trên môi trường 1/2 MS (20 g/l đường saccharose) có bổ

sung 1 g/l than hoạt tính để phát triển thành cây hoàn chỉnh (số liệu cá nhân).

Môi trường MS có 1 mg/l NAA + 1 mg/l BA thích hợp cho việc tái sinh chồi

từ mô sẹo lá cũng được thử nghiệm đối với tái sinh mô sẹo có nguồn gốc cuống lá.

Kết quả bước đầu cho thấy mô sẹo cuống lá cũng có đáp ứng tái sinh tốt tương tự

mô sẹo lá. Dưới đây là hình minh họa các bước cơ bản của quá trình tạo mô sẹo và

tái sinh chồi thông qua phôi soma từ mô sẹo cuống lá (hình 3.7).

3.2. THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN

3.2.1. Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen

Hygromycin có tính độc đối với tế bào thực vật lẫn tế bào động vật. Gen hpt

mã hóa enzyme hygromycin phosphotransferase có khả năng phosphoryl hóa

hygromycin, làm mất hoạt tính của kháng sinh này. Do đó những tế bào được

chuyển gen hpt sẽ phát triển bình thường trong môi trường có hygromycin với nồng

độ thích hợp.

Nồng độ kháng sinh hygromycin thích hợp sẽ được sử dụng để chọn lọc các

dòng mô sẹo sau thí nghiệm xử lý chuyển gen. Tùy đối tượng mà hygromycin tác

dụng chọn lọc với các nồng độ khác nhau, nếu nồng độ tác nhân này trong môi

trường chọn lọc quá thấp thì kết quả chọn lọc không đáng tin cậy, nhưng nếu nồng

độ quá cao sẽ làm chết cả các tế bào đã được chuyển gen.

Tiến hành nuôi cấy các mẫu mô sẹo trên môi trường S2 bổ sung hygromycin

ở các nồng độ khác nhau (0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35 và 40 mg/l). Sau 2 tuần, các

mẫu thí nghiệm có biểu hiện tăng trưởng chậm và bắt đầu chuyển sang nâu hơn so

với mẫu đối chứng (0 mg/l), đặc biệt là các mẫu thí nghiệm với nồng độ

hygromycin cao (> 20 mg/l). Tiếp tục cấy chuyển và theo dõi sau 8 tuần, kết quả

cho thấy tất cả các mẫu thí nghiệm ở nồng độ hygromycin ≥ 25 mg/l trở nên nâu và

chết; còn đối với các mẫu thí nghiệm ở nồng độ hygromycin thấp hơn 25 mg/l, sau

thời gian đầu tăng trưởng chậm có sự hình thành các cụm tế bào mới bắt đầu tăng

sinh lại.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát nồng độ hygromycin

Môi trường S2 có bổ Số mẫu sống

sung hygromycin (mg/l) Sau 2 tuần Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần

15 15 15 15 0 mg/l hygromycin

15 14 14 14 5 mg/l hygromycin

13 11 9 9 10 mg/l hygromycin

12 10 8 7 15 mg/l hygromycin

11 7 5 4 20 mg/l hygromycin

8 6 3 0 25 mg/l hygromycin

5 3 1 0 30 mg/l hygromycin

5 2 0 0 35 mg/l hygromycin

3 1 0 0 40 mg/l hygromycin

Một số nghiên cứu môi trường chọn lọc sau chuyển gen đối với các loài

thuộc chi Panax thường sử dụng chất kháng sinh kanamycin hoặc hygromycin.

Nồng độ kanamycin được sử dụng ở các loài này là 50 mg/l (Ananchanok Tirajoh et

al., 1996), hygromycin với nồng độ chọn lọc khoảng 20 mg/l hoặc cao hơn. Tuy

nhiên trong thí nghiệm này, nhận thấy ở nồng độ hygromycin ở giới hạn 25 mg/l thì

các mô sẹo đã ngừng tăng trưởng và chết dần.

Như vậy, 25 mg/l được xem là nồng độ thích hợp cho sự chọn lọc mô sẹo

sâm Ngọc Linh.

Hình 3.8. Kết quả thử hygromycin sau 8 tuần

3.2.2. Chuyển gen vào mô sẹo sâm nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.2.2.1. Biến nạp plasmid vào E. coli; kiểm tra sự hiện diện của plasmid trong E.

coli và tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dùng chuyển gen

Mục đích của các thí nghiệm này là tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens dùng để chuyển gen.

Vật liệu ban đầu là plasmid pVDH396 mang gen ipt. Trước hết, plasmid này

được biến nạp vào vi khuẩn E. coli. Sau biến nạp, vi khuẩn E. coli được nuôi nhân,

tách chiết plasmid. Plasmid tách chiết được đem kiểm tra kích thước bằng cách

dùng enzyme NcoI để cắt và chạy điện di trên gel. Kết quả điện di cho thấy kích

thước plasmid khoảng 15,9 kb (hình 3.9) - phù hợp với kích thước plasmid dùng

biến nạp.

Tiếp theo, plasmid (tách từ E. coli) được biến nạp vào vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Sản phẩm Agrobacterium tumefaciens biến

nạp được nuôi cấy nhân dòng, tách chiết plasmid và thực hiện phản ứng PCR đối

với gen ipt. Kết quả cho thấy có sự hiện diện của băng DNA khuếch đại với kích

thước 615 bp (hình 3.10).

Như vậy, dòng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 tạo được đã chứa plasmid

pVDH396 (mang gen đích ipt) và được sử dụng để chuyển gen vào mô sâm.

3.2.2.2. Gây nhiễm và nuôi chung mô với vi khuẩn; chọn lọc tế bào chuyển gen trên

môi trường có hygromycin

Do lần đầu tiên triển khai thí nghiệm chuyển gen dùng hygromycin để chọn

lọc nên việc tìm hiểu, đánh giá tính chịu đựng tự nhiên của mô sẹo đối với kháng

sinh này là rất quan trọng. Kết quả thử nghiệm cho thấy mô sẹo sâm Ngọc Linh khá

mẫn cảm đối với hygromycin. Trên môi trường S2 có 5 mg/l, mô sẹo tăng sinh

tương đối bình thường. Ở nồng độ 10 mg/l, nhận thấy phần lớn mô sẹo còn khả

năng tăng sinh nhưng chậm; ở nồng độ cao hơn, 20 mg/l, tăng trưởng của mô sẹo bị

ức chế mạnh, chết rất nhiều và chết hoàn toàn ở nồng độ từ 25 mg/l trở lên. Theo

Choi (2006), qua sử dụng mô sẹo có khả năng sinh phôi (embryogenic) sâm Triều

Tiên để nghiên cứu biến nạp gen, nồng độ hygromycin thích hợp dùng chọn lọc tế

bào dao động từ 10 – 30 mg/l; tuy nhiên, Shim và cs. (2010) dùng nồng độ

hygromycin rất cao, 100 mg/l, qua sử dụng lá mầm (cotyledon) để nghiên cứu. Theo

chúng tôi, sự khác nhau về nồng độ hygromycin sử dụng giữa hai tác giả nêu trên có

thể do vật liệu dùng chuyển gen là khác nhau và môi trường nuôi cấy khác nhau.

Kết quả thử nghiệm đánh giá tác động của hygromycin trên sâm Ngọc Linh cho

thấy khá tương hợp với kết quả nghiên cứu của Choi (2006) trên sâm Triều Tiên.

Thực tế cho thấy các cụm mô sẹo, sau nuôi chung với vi khuẩn, nếu được

nuôi cấy chọn lọc ngay trên môi trường có 25 mg/l hygromycin thường không có

khả năng sống; do vậy ở các bố trí thí nghiệm sau, nồng độ hygromycin sử dụng

cho giai đoạn đầu là 15 mg/l. Sau đó tăng lên 25 mg/l ở các chu kỳ chọn lọc tiếp theo.

Trong quá trình chọn lọc, mô sẹo sống sót trên môi trường có 15 mg/l

hygromycin được tách ra và cấy chuyển trải nuôi trên môi trường có nồng độ

hygromycin đạt mức chọn lọc hiệu quả - 25 mg/l.

Theo Choi (2006), trong quá trình chọn lọc cần lưu ý sự tăng sinh của mô

chuyển gen (transgenic) có thể bị ức chế bởi sự hóa nâu của mô chết. Thực tế ở

nghiên cứu này cũng cho thấy hiện tượng tương tự; do vậy các mô sống sót nằm

phía trên phần mô chết nâu đã được tách ra cẩn thận dưới kính hiển vi soi nổi và cấy

chuyển sang môi trường mới.

Trên môi trường S2 có 25 mg/l hygromycin, có sự hình thành một số ít cụm mô

trắng đục, có khả năng tăng sinh tiếp tục (hình 3.11c, 3.11d, 3.11e, 3.11f); chúng

được tách và cấy chuyển sang môi trường chọn lọc mới (cũng có 25 mg/l;

hygromycin) để tiếp tục tăng sinh (hình 3.11g, 3.11h).

Qua triển khai nghiên cứu, đến nay chúng tôi đã nhận được 04 dòng mô có

khả năng tăng sinh trên môi trường có 25 mg/l hygromycin; tuy nhiên, kết cấu

(texture) của mô khi chưa chuyển sang giai đoạn tái sinh có sự khác nhau về độ

cứng (compact)/khả năng tạo cấu trúc phôi soma dạng cầu (hình 3.11e, 3.11f). Tần

số chuyển gen đạt khoảng 0,5% (nhận được 04 dòng chuyển gen trên tổng số 800

cụm mô sẹo sử dụng để làm thí nghiệm).

3.2.3. Kiểm tra sự hiện diện/biểu hiện của các gen chuyển 3.2.3.1. Kiểm tra sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA bằng kỹ thuật hóa mô

Khả năng phát hiện DNA ngoại lai đã được xen vào DNA bộ gen thực vật và

từ đó có thể xác định các dòng tế bào đã biến nạp là điều hết sức quan trọng. Trong

thí nghiệm này, một số dòng mô có khả năng tăng trưởng tương đối tốt trên môi

trường có hygromycin đã được kiểm tra sự biểu hiện GUS.

o dịch X-Gluc ở 37P PC trong thời gian 12 giờ, thực hiện quan sát mô dưới kính hiển vi

Sau thời gian ngâm mẫu mô ở các giai đoạn nuôi cấy khác nhau trong dung

soi nổi. Kết quả cho thấy có sự biểu hiện GUS tạm thời (transient expression) của

mô được ghi nhận ở giai đoạn 5 ngày sau khi nuôi chung - đang được nuôi trên môi

trường chọn lọc có 15 mg/l hygromycin (Hình 3.12a). Biểu hiện GUS bền vững

(stable expression) sau 1 tháng chọn lọc cũng đã được ghi nhận (Hình 3.12b). Sau

nhiều tháng chọn lọc, mô các dòng sống sót trên môi trường có 25 mg/l hygromycin

cũng được dùng để thử GUS; kết quả cho thấy có 02/05 dòng có biểu hiện GUS

dương tính ổn định (Hình 3.12c, 3.12d). Việc ghi nhận biểu hiện GUS ở các giai

đoạn hình thành phôi soma (phôi cầu, phôi trái tim, phôi có lá mầm) cũng đã được

thực hiện với kết quả được trình bày ở hình 3.12e, 3.12f, 3.12g.

Kết quả biểu hiện GUS dương tính chứng tỏ mô giả định chuyển gen có

mang gen gusA. Các dòng này tiếp tục được chọn lọc và được sử dụng để kiểm tra

sự hiện diện của gen hpt và gen ipt bằng phương pháp PCR.

3.2.3.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen hpt và gen ipt bằng phương pháp PCR

Các mẫu mô sâm sau quá trình nuôi chung được nuôi cấy nhiều chu kỳ trên

môi trường chọn lọc (môi trường S2 có bổ sung hygromycin từ thấp đến cao, 15 –

25 mg/l và cefotaxime giảm dần, từ 500 mg/l xuống 250 mg/l) trong nhiều tháng (3

tháng trở lên). Trong quá trình chọn lọc, ở thời gian đầu đa số các mẫu chuyển sang

màu nâu và không còn khả năng tăng trưởng. Bên cạnh đó, ở một số ít mẫu xuất

hiện các cụm tế bào màu vàng tươi. Nếu các cụm mô này có khả năng tăng sinh,

tiếp tục trên môi trường có nồng độ tác nhân chọn lọc cao hơn và đây là những

dòng tế bào có thể được xem là giả định chuyển gen. Chúng được tiếp tục cấy

truyền đến khi mô tăng trưởng ổn định và đạt kích thước tương đối thì được cắt lấy

một phần nhỏ (khoảng 100 mg) đem tách chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR để

kiểm tra sự hiện diện của gen hpt và gen ipt.

Như đã trình bày, phản ứng PCR gồm 01 ống đối chứng dương (chứa

plasmid pVDH396), 01 ống đối chứng âm (chứa mẫu đối chứng không chuyển

chuyển gen), còn lại là 2 ống chứa mẫu giả định chuyển gen (chọn hai dòng mô để

kiểm tra).

Kiểm tra bằng phản ứng PCR, điện di sản phẩm và chụp ảnh gel, kết quả

được thể hiện ở hình 3.13 và hình 3.14.

Như vậy có sự tạo các băng DNA kích thước 800 bp và 615 bp qua sự

khuếch đại đoạn gen hpt và gen ipt.

Các dòng sau kiểm tra dương tính sự có mặt của gen ipt và gen hpt tiếp tục

được cấy chuyển sang môi trường tạo chồi C2 có bổ sung hygromycin và

cefotaxime với nồng độ thấp, lần lượt là 10 mg/l và 250 mg/l, nhằm tạo điều kiện

thúc đẩy sự tái sinh. Qua quá trình cấy chuyển liên tục 2 tuần/lần trong thời gian sau

khoảng 6 tuần, ở các cụm mô sẹo này có sự hình thành chồi (Hình 3.15). Số lượng

chồi tuy ít nhưng xét về hình thái, các chồi này to và có lá màu xanh đậm.

Đồng thời với quá trình cấy chuyển tái sinh các cụm mô sẹo chuyển gen, các

mẫu mô sẹo sâm đối chứng (không qua chuyển gen) cũng được tiến hành thử

nghiệm nuôi cấy tái sinh trên môi trường tạo chồi C2 có bổ sung hygromycin (10

mg/l); kết quả cho thấy ở các cụm mô đối chứng không có hiện tượng phát sinh

hình thái chồi. Kết quả này tương tự kết quả thí nghiệm của Franklin và cs. (2009).

Như vậy, kết quả cho thấy có sự khác biệt về khả năng tái sinh (với sản phẩm lá tái

sinh to khỏe, xanh và có sức sống) giữa mô chuyển gen và mô không chuyển gen;

điều này theo chúng tôi là do mô chuyển gen sản sinh enzyme HPT làm bất hoạt

hygromycin, ngoài ra có thể do có hàm lượng cytokinin nội sinh cao hơn bình

thường. Kết quả này tương tự như kết quả ở nhiều nghiên cứu khác của các tác giả

Sakakibara (2006), Haberer và Kieber (2002), Howell và cs. (2003), Kakimoto

(2003), Geng và cs. (2001).

Chuyển gen ở các loài Panax đã được thực hiện vào khoảng thập niên 80;

trong đó, hai loài được chú ý nghiên cứu nhiều nhất là Nhân sâm (Panax ginseng

C.A. Mey.) và sâm Mỹ (Panax quinquefolium L.). Mục đích của việc nghiên cứu

các đối tượng này chủ yếu là nhằm gia tăng mức ginsengnoside hoặc tăng khả năng

kháng bệnh hại của các loài này qua các nghiên cứu của Yoskikawa và Furuya

(1987), Hwang và cs. (1991), Inomata và cs. (1993), Ananchanok Tirajoh (1996).

Điều đáng chú ý là sau chuyển gen, các tác giả đều nhận thấy khả tái sinh của mô bị

giảm. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh có thể là do mẫu cấy, quá trình

gây nhiễm, điều kiện nuôi chung với vi khuẩn hay do môi trường chọn lọc, tái sinh

sau chuyển gen chưa thực sự thích hợp (Garcia và cs., 1986; Perkins và cs., 1987;

Mathew và cs., 1990). Trong nghiên cứu đề tài này, qua sự hình thành các chồi từ

mẫu chuyển gen cho thấy các xử lý trong nuôi cấy, chọn lọc và tái sinh đã tương đối

thích hợp. Chồi có màu xanh đẹp có thể do gen ipt sau khi được biến nạp vào tế bào

đã hoạt động, kích thích việc sản sinh cytokinin. Ở kết quả thí nghiệm trên cây

Thanh hao (Artemisia annua L.) của Geng và cs. (2001) thì mức cytokinin nội sinh

trong tế bào tỷ lệ thuận với hàm lượng diệp lục tố và hợp chất thứ cấp artemisinin.

Đối với kết quả chuyển gen ở sâm Ngọc Linh, hy vọng rằng hàm lượng saponin

cũng có thể được gia tăng qua tác động của gen ipt hiện diện trong tế bào – làm thay

đổi theo chiều hướng tích cực trạng thái sinh lý hóa sinh của cây.

Hình 3.15. Chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh chuyển gen

a, b. Sau 4 tuần; c. Sau 5 tuần; d. Sau 6 tuần; e. Sau 8 tuần

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. KẾT LUẬN

Từ kết quả nhận được, chúng tôi rút ra những kết luận sau:

1. Tạo được mô sẹo từ vật liệu lá và cuống lá sâm Ngọc Linh dùng môi trường

MS bổ sung 1 mg/l 2,4-D.

2. Môi trường thích hợp cho sự tăng sinh khối mô sẹo lá sâm Ngọc Linh là

môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ.

3. Môi trường thích hợp cho sự tái sinh chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh là môi

trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA và 1 mg/l BA.

4. Nồng độ hygromycin 25 mg/l thích hợp cho việc chọn lọc tế bào chuyển

gen sâm Ngọc Linh.

5. Đã nhận được 04 dòng mô sẹo sâm Ngọc Linh chuyển gen đang trong quá

trình tái sinh nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens; các dòng mô này đã được

kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen gusA, gen hpt và gen ipt bằng thử

nghiệm hóa mô GUS và bằng phương pháp PCR. Tần số chuyển gen đạt khoảng

0,5%.

2. KIẾN NGHỊ

Cũng từ kết quả nhận được, chúng tôi có các đề nghị sau:

+ Khảo sát các điều kiện tối ưu nhằm tăng tần số chuyển gen (thời gian nuôi

chung mô với vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, nồng độ acetosyringone,…).

+ Tiếp tục thực hiện các bước thí nghiệm nhằm tạo cây sâm Ngọc Linh

chuyển gen hoàn chỉnh từ mô phôi và đưa ra trồng ở vườn ươm.

+ Kiểm tra, phân tích một số chỉ tiêu sinh lý hóa sinh cơ bản như hàm lượng

cytokinin, hàm lượng diệp lục tố,… đặc biệt là hàm lượng hợp chất thứ cấp trong

mô/cây sâm chuyển gen.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Đái Duy Ban (2008), Bộ sách chuyên khảo ứng dụng và phát triển công nghệ

cao - Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học phòng chống một số

bệnh cho người và vật nuôi, Viện KH&CN VN, NXB KHTN và Công

Nghệ,

2. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam, NXB Khoa

học Tự nhiên và Công nghệ.

3. Nguyễn Văn Bình (2008), Xây dựng hệ thống tái sinh rễ và bước đầu nghiên

cứu chuyển gen vào mô sẹo cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.), Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Đà Lạt, Lâm Đồng.

4. Lê Thanh Bình, Phùng Văn Vui, Dương Thanh An và cs. (2009), Kiến thức cơ

bản về sinh vật biến đổi gen và an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi

gen, Tài liệu tham khảo.

5. Nguyễn Thượng Dong (Chủ biên), TS. Trần Công Luận, TS. Nguyễn Thi Thu

Hương (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB

Khoa Học Và Kỹ Thuật Hà Nội.

6. Hà Thị Dung, Grushvitzky I. V. (1985), “Một loài sâm mới thuộc chi sâm

(Panax L.), họ Nhân sâm (Araliaceae) ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, tập

7(3), 45-48.

7. Nguyễn Ngọc Dung (1995), Nhân giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis)

bằng con đường công nghệ sinh học và kinh nghiệm trồng Nhân sâm

(Panax ginseng), NXB Nông Nghiệp TPHCM.

8. Trần Quốc Dung, Trần Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen

(Động vât, Thực vật), Đại học Huế.

9. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục.

10. Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Phan Tường Lộc, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị

Thanh (2007), “Nghiên cứu tái sinh in vitro và bước đầu phân tích cây cúc

Dendranthema grandiflorum L. mang gen ipt tạo cytokinin”, Hội nghị

Khoa học và Công nghệ, 358-366.

11. Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, NXB Đại học Quốc Gia Tp.

Hồ Chí Minh.

12. Nguyễn Thị Lang (2002), Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ

sinh học, NXB Nông Nghiệp TPHCM

13. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Viết Dũng, Trần Quốc Dung (2008), Công nghệ AND

tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc gia TPHCM.

14. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Viết Dũng, Trần Quốc Dung (2008), Kỹ thuật chuyển

gen thực vật và ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia TPHCM.

15. Phan Tường Lộc (2007), Biến nạp gen tạo cytokinin vào cây hoa cúc

(Chrysanthemum morifolium L) và khảo sát một số chỉ tiêu sinh hóa và sinh

học phân tử cây chuyển gen, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên, TPHCM.

16. Trần Công Luận (2003), “Kết quả nghiên cứu về hóa học sâm Việt Nam”, Hội

thảo bảo tồn và phát triển sâm Ngọc Linh tại tỉnh Quảng Nam, 62-75.

17. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.

18. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh,

Cao Cường (2002), Công nghệ gen, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM. 402

trang.

19. Nguyễn Thới Nhâm, Phan Văn Đệ, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương

(1993), “Sâm Việt Nam- Kết quả nghiên cứu từ năm 1978-1992, Báo cáo

nghiệm thu đề tài khoa học cấp Nhà nước thuộc chương trình 64C”, Chủ

biên: Trung tâm Sâm Việt Nam, Bộ Y tế, 1-97.

20. Nguyễn Cửu Thành Nhân (2010), Nghiên cứu khả năng nhân nhanh sinh khối

rễ cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) trong một số hệ thống nuôi cấy

in vitro, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

TPHCM.

21. Dương Tấn Nhựt (2006), Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong nghiên cứu

tái sinh, nhân giống và chuyển gen thực vật, NXB Nông Nghiệp TPHCM.

22. Lê Thanh Sơn, Nguyễn Tập (2006), Những đặc điểm sinh thái cơ bản của sâm

48T23. Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen: Nguyên lý và ứng dụng, NXB Khoa

Ngọc Linh, Tạp chí dược liệu, tập 11, số 4, 145-147.

học kỹ thuật.

24. Nguyễn Trung Thành, Lê Văn Cần, Paek Kee Youep (2007) Nuôi cấy rễ bất

định của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Tuyển tập

báo cáo khoa học HN toàn quốc về Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong

khoa học sự sống. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 828-831.

25. Bùi Đình Thạch (2007), Xây dựng hệ thống tái sinh và ứng dụng trong nghiên

cứu chuyển gen ipt tạo cytokinin ở cây bắp cải (Brassica oleracea var.

Capitata), Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

TPHCM.

26. Nguyễn Quang Thạch (Chủ biên), Nguyễn Thị Ly Anh, Phạm Kim Ngọc, Trần

Văn Minh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2009), Cơ sở công nghệ sinh học,

Tập III- Công nghệ sinh học tế bào, NXB Giáo Dục Việt Nam.

27. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu và ứng

dụng, NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật Hà Nội.

28. Nguyễn Trung Thành, Paek Kee Yoeup (2008), “Nhân nhanh rễ bất định Nhân

sâm Panax ginseng C.A Meyer: ảnh hưởng của một số nhân tố lý hóa lên sự

tăng trưởng sinh khối và sản phẩm trao đổi chất ginsenosides”, Tạp chí

Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 24: 318-323.

29. Nguyễn Văn Uyển (1995), Những phương pháp của công nghệ sinh học thực

vật, tập 1 và tập 2, NXB Nông Nghiệp.

30. Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, Phần II- Phát triển, NXB

Đại học Quốc Gia TPHCM.

31. Oanh Vũ (2009), “Nuôi cấy tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp”, Không gian

công nghệ (Technology Space).

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

Ahn I. O., B.V. Le, Gendy C. and Van K.T.T. (1996), "Direct somatic 32.

embryogenesis through thin cell layer culture in Panax ginseng", Plant

Cell, Tissue and Organ Culture, 237-243.

33. Akalezi C.O., Uu S., U Q.S., Yu J.T., Zhong J.J. (1999), "Combined effects of

initial sucrose concentration and inoculum size on cell growth and ginseng

saponin production by suspension cultures of Panax ginseng", Pro

Biochem, 34:639-642.

34. Akiyoshi D.E., Klee H., Amasino R.M., Nester E.W., Gordon M.P. (1984) "T-

DNA of Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin

biosynthesis", Proc Natl Acad Sci USA, 81:5994-5998.

35. Arya S., Liu J.R., Eriksson T. (1991) Plant regeneration from protoplasts of

Panax ginseng (C. A. Meyer) through somatic embryogenesis. Plant Cell

Rep 10: 227-291.

36. Attele A.S., Wu J.A., Yuan C.S. (1999), “Ginseng pharmacology: multiple

constituents and multiple action”, Biochem. Pharmacol., 58 (11): 1685-

1893.

37. Baisong L., Harold N., Renping Z. (2002), “Neuroprotective effects of ginseng

total saponin and ginsengnoside Rb1 and Rg1 on spinal cord neurons in

vitro”, Experimental Neurology, 173: 224-234.

38. Baldarin M.F., Kloccke J.A., Wurtele E.S., Bollinger W.H. (1985), Natural

plant chemical, Ber Dtsch Bot Ges., 94: 1-26.

39. Bernard R.G., Jack J.P. (2003), Molecular Biotechnology: Principles and

Applications of Recombinant DNA, ASM Press, USA, 760 pages.

40. Bourgaud F., Gravot A., Milesi S., Gontier (2001), "Production of plant

secondary metabolites: a historical perspective", Plant Science, Vol 161,

13: 839-851.

41. Calderini O., Bovone T., Scotti C., Pupilli F., Piano E. and Arcioni S. (2006),

“Delay of leaf senescence in Medicago sativa transformed with the ipt gene

controlled by the senescence-specific promoter SAG12”, Plant cell report,

Vol 26 (5), 611-615.

42. Chang H., Michelle L.J., Gary M.B. and David G.C. (2003), “Overproduction

of Cytokinins in Petunia Flowers Transformed with PSAG12-IPT Delays

Corolla Senescence and Decreases Sensitivity to Ethylene”, Plant

Physiology, 132: 2174-2183.

through somatic 43. Chang W.C., Hsing Y.I. (1980) Plant regeneration

embryogenesis in root-derived callus of ginseng (Panax ginseng C. A.

Meyer). Theor. Appl. Genet. 57: 133-136.

44. Chen C. (1997), “Cytokinin biosynthesis and interconvertion”, Physiol Plant,

101: 665-673.

45. Choi K.T., Lee C.H., Ahn I.O., Lee J.H., Park J.C. (1994), "Characteristics of

the growth and ginsenosides in the suspension - culture cells of Korean

ginseng (Panax ginseng C. A. Mayer)", Proc Intl Ginseng Conf, 259-268.

46. Choi Y.E. (2006) Ginseng (Panax ginseng). In: Wang K, ed. Agrobacterium

Protocols, 2/e, vol. 2. Humana Press Inc., Totowa, NJ.

47. Choi Y.E., Jeong J.H., In J.K., Yang D.C. (2003), “Production of herbicide-

resistant transgenic Panax ginseng through the introduction of the

phosphinothricin acetyl transferase gene and successful soil transfer”, Plant

Cell Rep, 21: 563-568.

48. Choi Y.E., Yang D.C., Choi K.T. (1998), “Induction of somatic embryos by

macrosalt stress from mature zygotic embryos of Panax ginseng”, Plant

Cell Tiss Org Cult, 52: 177-181.

49. Choi Y.E., Yang D.C., Kusano T., Sano H. (2001), “Rapid and efficient

Agrobacterium-mediated genetic transformation by plasmolyzing

pretreatment of cotyledons in Panax ginseng”, Plant Cell Rep, 20: 616-621.

50. Chopra V.L., Anwan N. (1990), Genetic Engineering and Biotechnology,

Oxford and IBH Publishing CO.PVT.

51. Clive W. (2002), "Hygromycin-resistant transgenic plants", United States

Patent, 6365799.

52. Coleman C.I., Herbert J.H., Reddy P. (2003), “The effects of Panax ginseng

on quality of life”, J.Clin. Pharm. Ther., 28 (1): 5-15.

53. Dornenburg H., Knorr D. (1995), "Strategies for the improvement of

secondary metabolite production in plant cell cultures", Enzyme Microb

Technol, 17: 674-684.

54. Ebinuma H., Sugita K., Matsunaga E. and Yamakado M. (1997), "Selection of

marker-free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene (plant

genetic engineering DNA transformation selectable marker ipt gene

transposon Ac)", Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94: 2117-2121.

55. Engels H.J., Said J.M., Wirth J.C. (1996), "Failure of chronic ginseng

supplementation to affect work performance and energy metabolism in

healthy adult females", Nutr. Res, 16: 1295-1305.

56. Florence C., Lee (1992), Facts about ginseng – The elixir of life, Hollym

Ltd.Co.

57. Furuya T., Yoshikawa T. (1987), "Saponin production by cultures of Panax

ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes", Plant Cell Rep, 6:

449-453.

58. Franklin G., Oliveira M.M., Dias A.C. (2009), “Transgenic Hypericum

perforatum”, Methods Mol Biol, 547: 217-34.

59. Garcia J.E. (1986) “Conceptus transfer In Jones H.W., Jones G.S., Hodgen

G.D. and Rosenwaks, Z. (eds), In Vitro Fertilisation Williams & Williams”,

Baltimore, 215–220.

60. Geng S., Ma M., Ye H.C., Liu B.Y., Li G.F., Chong K. (2001), "Effects of ipt

gene expression on the physiological and chemical characteristics of

Artemisia annua L.", Plant Sci, 160: 691-698.

61. Glick B.R.., Jackj P. (1994), Molecular Biotechnology, ASM Press.

Washington D.C. USA.

62. Gorpenchenko T.Y., Kiselev K.V., Bulgakov V.P., Tchernoded G.K., Bragina

E.A., Khodakovskaya M.V., Koren O.G., Batygina T.B., Zhuravlev Y.N.

(2006), “The Agrobacterium rhizogenes rolC-gene-induced somatic

embryogenesis and shoot organogenesis in Panax ginseng transformed

calluses”, Planta, 223(3): 457-467.

63. Guo B., Abbasi B.H., Zeb A., Xu L.L. and Wei Y. H. (2011), “Thidiazuron:

A multi-dimensional plant growth Regulator (Review)”, African Journal of

48THaberer G., and Kiebers J.J.48T (2001), “Cytokinins: New insights into a classic

Biotechnology, Vol. 10(45), 8984-9000.

64.

phytohormone”, Plant Physiol, 48T128,48T 354–362.

65. Han J.L., Wang H., Ye H.C., Liu Y., Li Z.Q., Zhang Y.S., Li G.F. (2005)

"High efficiency of genetic transformation and regeneration of Artemisia

annua L. via Agrobacterium tumefaciens-mediated Procedure", Plant Sci,

16: 73-80.

66. Han J.Y., Choi Y.E. (2009), "Rapid induction of Agrobacterium tumefaciens-

mediated transgenic roots directly from adventitious roots in Panax

ginseng", Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 96:143-149.

67. Hiai S., Yokoyama H., Oura H. (1979), "Features of ginseng saponin induced

corticosterone release", Endocrinol. Jpn., 26: 737-40.

68. Huang K.C. (1993), "The Pharmacology of Chinese Herbs", CRC Press, Boca

48THwang I. and Sheen J.48T (2001), “Two-component circuitry in 19TArabidopsis 19T

Raton, FL, USA, 21-45.

69.

signal transduction”, Nature, 48T413,48T 383–389.

70. Hyo-Won B. (1978), Korean ginseng, Samhwa Printing Co., Ltd., Seoul,

Korean.

71. Inomata N. (1993), “Crossability and cytology of hybrid progenies in the cross

between Brassica campestris and three wild relatives of B. oleracea, B.

bourgeaui, B. cretica and B. Montana”, 38TEuphytica38T, 69: 7–17.

72. Jefferson R.A., Burgess S.M. and Hirsh D. (1986), “ß-Glucuronidase from E.

coli as a Gene Fusion Marker”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8447-8451.

73. Jeong G.T. and Park D.H. (2005), "Comparative Evaluation of Modified

Bioreactors for Enhancement of Growth and Secondary Metabolite

Biosynthesis Using Panax ginseng Hairy Root", Biotechnology and

Bioprocess Engineering, 10: 528-534.

74. Jeong G.T. and Park D.H. (2006), "Characteristic of Transformed Panax

ginseng C.A. Meyer Hairy Root: Growth and Nutrient Profile",

Biotechnology and Bioprocess Engineering, 11: 43-47.

75. Jeong G.T. and Park D.H. (2005), "Enhancement of Growth and Secondary

Metabolite Biosynthesis: Effect of Elicitors Derived from Plants and

Insects", Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10: 73-77.

76. John M.C. and Amasino R.M. (1988), "Expression of an Agrobacterium Ti

Plasmid Gene Involved in Cytokinin Biosynthesis Is Regulated by

Virulence Loci and Induced by Plant Phenolic Compounds", Journal of

48TKakimoto T.48T (2001), “Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes

bacteriology, 6: 790-795.

77.

as dimethylallyl diphosphate:ATP/ADP isopentenyltransferases”, Plant

Cell Physiol, 48T42:48T 677–685.

78. Khalafalla M.M. and 38THattori38T K. (1999), “A combination of thidiazuron and

benzyladenine promotes multiple shoot production from cotyledonary node

explants of faba bean (Vicia faba L.)”, Plant Regulation, Vol 72, 145-148.

79. Kim Y.S., Han J.Y., Lim S. and Choi Y.E. (2009), “Ginseng metabolic

engineering: Regulation of genes related to ginsenoside biosynthesis”,

Journal of Medicinal Plants Research, Vol. 3(13): 1270-1276.

80. Kitts D.D. and Hu C. (2000), "Efficacy and safety of ginseng", Public Health

Nutrition, 3(4A): 473-485.

81. Lee B.H., Lee S.J., Hui J.H., Lee S., Huh J.D., Moon C.K. (1998), "In vitro

antigenotoxic activity of novel ginseng saponin metabolites formed by

intestinal bacteria", Planta Med, 64: 500-3.

82. Lee H.S., Kim S.W., Lee K.W., Eriksson T. and Liu J.R. (1995),

"Agrobacterium-mediated transformation of ginseng (Panax ginseng) and

mitotic stability of the inserted beta-glucuronidase gene in regenerates from

isolated protoplasts", Plant Cell Rep, 14: 545- 549.

83. Li T.S.C, Mazza G., Cottrell A.C., Gao L. (1996), "Ginsenosides in roots and

leaves of American ginseng", J. Agric. Food Chem, 44: 717-20.

84. Lian M.L., Chakrabarty D. and Paek K.Y. (2002), "Effect of Plant Growth

Regulators and Medium Composition on Cell Growth and Saponin

Production during Cell- Suspension Culture of Mountain Ginseng (Panax

ginseng C. A. Mayer)", Joumal of Plant Biology, 45 (4): 201-206.

85. Lim H.T., et al. (1997), "Regeneration of Panax ginseng C.A. Meyer by

organogenesis and nuclear AND analysis of regenerants", Plant Cell, Tissue

and Organ Culture, 49: 179-187.

86. Liou C.J., Huang W.C., Tseng J. (2005), Long-term oral administration of

ginseng extract modulates humoral immune response and spleen cell

functions, Am. J. Chin, Med, 33(4): 651-661.

87. Lisa V., et al. (2003), "Agrobacterium tumefaciens and the Plant: The David

and Goliath of Modern Genetics”, Plant Physiology, 133: 948-955.

88. Liu B., Wang H., Du Z., Li G., Ye H. (2010), "Metabolic engineering of

artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L.", Plant Cell Rep, Review.

89. Liu C.X., Xiao P.G. (1992), "Recent advances on ginseng research in China",

J. Ethnopharmacol, 36: 27-38.

90. Lu L., Zhu Y., Liu Y., Zhao D. (2010), "Ethanol inducible isopentenyl

transferase as a high efficiency marker for tobacco transformation", African

Journal of Biotechnology, Vol. 9(48): 8139-8145.

91. Ma Q.H., Liu Y.C. (2009), "Expression of isopentenyl transferase gene (ipt) in

leaf and stem delayed leaf senescence without affecting root growth", Plant

Cell Rep, 28: 1759-1765.

92. Ma Y.C., Zhu J., Luo L. (1995), "A comparative evaluation of ginsenosides in

commercial ginseng products and tissue culture samples using HPLC", J.

Herb Spices Med. Plants, 3: 41-50.

93. Matsunaga H., Katano M., Yamamoto H., Fujito H., Mori M., Tanaka K.

(1990), “Cytotoxic activity of polyacetylene compounds in Panax ginseng

C.A. Meyer”, Chem. Pharm. Bull. Tokyo, 38 (12): 3480-3482.

94. Matthew S.M., Lee C.G., Frank S., Wilco J.R.M.J., Geert M.S., Evert D., J.

Hans A.V.R, Power J.B. and Davey M.R. (2001), "Effects of PSAG12-IPT

Gene Expression on Development and Senescence in Transgenic Lettuce",

American Society of Plant Biologists, Vol. 127, 505-516.

95. McKenzie M.J., Mett V., Reynolds P.H.S., Jameson P.E. (1998), "Controlled

cytokinin induction in transgenic tobacco using a copper inducible

promoter", Plant Physiol, 116: 969-977.

96. Misawa M. (1985), “Production of useful plant metabolites”, Adv Bilchem

Eng, 31: 59-88.

97. Mizuno M., Yamada J., Terai H, Kozukue N., Lee Y.S., Tsuchida H. (1994),

"Differences in immunomodulating effects between wild and cultured

Panax ginseng", Biochem. Biophys. Res. Commun, 200: 1672-8.

98. Murashige T., Skoog F. (1962), “A revised medium for rapid growth and

bioassay with tobacco tissue culture”, Physiol. Plant, 15: 473-497.

99. Murthy H.N, Hahn E.J. and Paek K.Y. (2008), "Adventitious Roots and

Secondary Metabolism", Chinese J. Biotechnology, Vol 24, 711.

100. Nhut D.T., Huy B.N, Phong P.T., Hai N.T. and Luan T.C. (2006), "Primary

Study on Multiplication of Advaentitious Roots of Panax vietnamensis - A

Valuable Source for Saponin Isolation", Proceedings of International

Workshop on Biotechnology in Agriculture, 118-121.

101. Pant D.R., Bhattarai T., Beck E. and Fettig S. (2009), "Genetic Transformation

of Nepalese Spring Wheat (Triticum aestivum L.) Cultivars with ipt Gene

under the Regulation of a Senescence Enhanced Promoter from Maize",

Pakistan Journal of Biological Sciences 12, (2): 101-109.

102. Perkins D. and Buckley K.W. (1987), “Transformative change In Donald L.

Kirkpatrick, How to manage change effectively”, San Francisco: Jossey-

Bass Publishers, 45-63.

103. Proctor J.T.A., Slimmon T. and Saxena P.K. (1996), “Modulation of root

growth and organogenesis in thidiazuron-treated ginseng (Panax

quinquefolium L.)”, Plant Growth Regulation, 20: 201-208.

104. Ramachandra R.S. and Ravishankar G.A. (2002), "Plant cell cultures:

Chemical factories of secondary metabolites", Biotechnol. Adv, 20: 101-

153.

105. Robak J., and Gryglewski I. (1988), “Flavonoides are scavengers of

superoxide anions”, Biochemical Pharmacology, 37, 837 – 841.

106. Sa G., Mi M., He-chun Y., Ben-ye L., Guo-feng L., Kang C. (2001), "Effects

of ipt gene expression on the physiological and chemical characteristics of

Artemisia annua L.", Plant Sci., 160(4): 691-698.

(2006), “Cytokinins: Activity, Biosynthesis, and 107. Sakakibara H.

Translocation”, Plant Biology, Vol. 57: 431-449.

108. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1999), Molecular Cloning – A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press.

109. Schenk R.U. and Hildebrandt A.C. (1972), "Medium and techniques for

induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonuous plant cell

cultures", Can. J. Bot, 50: 199-204.

110. Shahla S.N., Donald W.P. (1987), "Acetosyringone promotes high frequency

transformation of Arabidopsis thaliana explants by Agrobacterium

tumefaciens", Plant Molecular Biology, 8: 291-298.

111. Shim J.S., Lee O.R., Kim Y.J., Lee J.H., Kim J.H., Jung D.Y., In J.G., Lee

B.S., Yang D.C. (2010), “Overexpression of PgSQS1 increases ginsenoside

production and negatively affects ginseng growth rate in Panax ginseng”, J.

Ginseng Res, 34(2): 98-103.

112. Song J.Y., Akhalaia M., Platonov A., Kim H.D., Jung I.S., Hang Y.S., Yun

Y.S. (2004), “Effects of polysaccharide ginsan from Panax ginseng on liver

function”, Arch. Pharm. Res, 27 (5): 531-538.

113. Sotaniemi E.A., Haapakoski E., Rautio A. (1995), "Ginseng therapy in non-

insulin dependent diabetic patients", Diabetes Care, 18: 1373-5.

114. Tang W., Eisenbrand G. (1992) "Panax ginseng C. A. Mayer, Chinese Drugs

of Plant Origin", Springer-Verlag, Berlin, 710-737.

115. Thanh N.T., Ket N.V, Yoeup P.K. (2007), "Effecting of medium composition

on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Panax

vietnamensis Ha et Grushv.", Natural Sciences and Technology, 23: 269-

274.

116. Thanh N.T., Murthy H.N., Y K.W., Jeong C.S., Hahn E.J., Paek K.Y. (2006)

“Effect of oxygen supply on cell growth and saponin production in

bioreactor cultures of Panax ginseng”, J. Plant Physiology, 163(12): 1337-

1341.

117. Thanh N.T., Son L.T. and Paek K.Y. (2007), "Induction and proliferation of

callus of Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.): Effects of

plant growth regulators", J. of Science, 167.

118. Tirajoh A., et al (1996), "Tissue culture and Agrobacterium - mediated

transformation of most American ginseng (Panax quinquefolium L.)",

Biological Sciences, 3.

119. Tirajoh A., Kyung T. S. and Punja Z. K. (1998), "Somatic Embryogenesis and

Plantlet Regeneration in American Ginseng (Panax quinquefolium L.)", In

Vitro Cellular and Developmental Biology, 203-211.

120. Vergauwe A., Cammaert R., Vandenberghe D., Genetello C., Inze D,

VanMontagu M., VandenEeckhout E. (1996), "Agrobacterium tumefaciens-

mediated transformation of Artemisia annua and regeneration of transgenic

plants", Plant Cell Rep, 15: 929-933.

121. Vergauwe A., Van Geldre E., Inze D., Van Montagu M., Van den Eeckhout E.

(1998), "Factors influencing Agrobacterium tumefaciens- mediated

transformation of Artemisia annua L.", Plant Cell Rep, 18:105-110.

122. Verpoorte R., Memelink J. (2002), "Engineering secondary metabolite

production in plants", Curr Opin Biotechnol, 13:181-187.

123. Wang J., Letham D. S., Cornish E., Stevenson K. R. (1997), “Studies on

cytokinins action and metabolism using tobacco p lants expressing either

the ipt or the gus gene controlled by a chalcone synthase promoter”, Aus. J.

Plant Physiol, 24: 661-672.

124. Yancheva S.D., Golubowicz S., Fisher E., Lev-Yadun S., Flaishman M.A.

(2003), “Auxin type and timing of application determine the activation of

the developmental program during in vitro organogenesis in apple”, Plant

Science, Vol 165, 11: 299-309.

125. Yoder J.I, Golgsbrough A.P. (1994), "Transformation system for generating

marker- free transgenic plants", Biotechnology, 12: 263-267.

126. Yuan C.S., Wu J.A., Lowell T., Gu M. (1998), "Gut and brain effects of

American ginseng root on brainstem neuronal activities in rats", Am. J.

Chin. Med., 26: 47-55.

127. Zhong J., Wang S.J. (1998), "Effects of nitrogen source on the production of

ginseng saponin and polysaccharide by cell cultures of Panax

quinquefolium", Pro Biochem 33: 671-675.

128. Zhong J.J., Bai Y., Wang S.J. (1996), "Effects of plant growth regulators on

cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of

Panax quinquefolium", J Biotech, 45: 227-234.

TÀI LIỆU INTERNET

129. http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/transgenese/agrobacterium/agro.htm

130. hppt://www.answers.com/topic/agrobacterium-tumefaciens-2

131. http://ykhoaviet.vn/home/73/sam-khong-nen-lam-dung.htm

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Các polyacetylen tìm thấy trong một số loài sâm

Hợp chất Loài

Panax ginseng Panaxynol (falcarinol)

C.A. Meyer Panaxytriol

Panaxydol

Heptadeca-1-en-4,6-diyn-3,9-diol

Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol

Heptadeca-1,4-dien-6,8-diyn-3,10-diol

Panaxycol

9,10-epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3-ol

10-cloro-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3,9,10-triol

9,10-epoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on

9,10-epoxy-1-heptadecen-4,6-diyn-3-on

3-acetoxy-9,10-epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn

3-acetoxy-9,10-epoxy-4,6-heptadecadiyn

3-acetoxy-9,10-epoxy-16-heptadecen-4,6-diyn

Panax Falcarinol

quinquefolium Panaxytriol

Panaxydol

Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol

Heptadeca-1-en-9,10-epoxy-4,6-diyn-3,8-diol

3-oxo-9,10-epoxy-heptadeca-1-en-4,6-diyn

6,7-epoxy-13-tetradecen-1,3-diyn

1,2,9,10-diepoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on

Panax 8-acetoxy-9,10-epoxy-1-heptadecen 4,6-diyn-3-ol

notoginseng 10-metoxyheptadeca-1-en-4,6-diyn 3,9-diol

Panaxytriol

Panax Heptadeca-1,9(Z)-dien-4,6-diyn-3-ol

Vietnamensis (Panaxynol, Falcarinol)

Ha et Grushv. 10-acetoxy-hetadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol

Heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol

Heptadeca-1,8(Z)-dien-4,6-diyn-3,10-diol

Heptadeca-1,8(E),10 (E)-trien-4,6-diyn-3,12-diol

Phụ lục 2. Thành phần môi trường AB (Chilton và cs., 1974)

Khối lượng (g/l) Thành phần

Dung dịch đệm AB 20X

30 KR2RHPOR4

4 NaHR2RPOR4

Dung dịch muối khoáng 20X

20 NHR4RCl

6 MgSOR4

3 KCl

3 CaClR2R.2HR2RO

0,005 FeSOR4R.7HR2RO

Phụ lục 3. Thành phần môi trường LB (Luria Bertoni)

Khối lượng (g/l) Thành phần

Cao nấm men 5

Bactotrypton 10

NaCl 10

Phụ lục 4. Thành phần môi trường MS (Murashige Skoop, 1962)

(pH = 5,8)

Khối lượng (mg/l) Thành phần

Khoáng đa lượng

1650 NHR4RNOR3R

1900 KNOR3R

440 CaClR2R.2HR2RO

370 MgSOR4R.7HR2RO

27,3 FeSOR4R.7HR2RO

37,3 NaR2REDTA

Khoáng vi lượng

6,2 HR3RBOR3R

22,3 MnSOR4R.4HR2RO

8,6 ZnSOR4R.4HR2RO

0,83 KI

0,25 NaR2RMoOR4R.2HR2RO

0,025 CuSOR4R.5HR2RO

0,025 CoClR2R.6HR2RO

Vitamin

Glycine 2

B1 0,1

B6 0,5

Acid nicotinic 0,5

Inositol 100

Phụ lục 5. Hình tăng sinh mô sẹo sau 8 tuần nuôi cấy

(a., b., c., d., e., f.: Nuôi cấy trên môi trường S1, S2, S3, S4, S5, S6)

Phụ lục 6. Hình tái sinh chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 8 tuần nuôi cấy trên

môi trường C1, C2, C3, C4, C5 và C6.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl transferase) vào cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Tạ Thị Diễm Thu

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN

IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO

CÂY SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Tạ Thị Diễm Thu

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN

IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE) VÀO

CÂY SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Chuyên ngành : Sinh Học Thực Nghiệm

Mã số

: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pVDH396 ................................... 69

MỞ ĐẦU

Chương 1. TỔNG QUAN

o nucleotide: TRaR = 4 (G+C) + 2 (A+T) – 5P PC

2+ 2+

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

c 12,7 ± 0,86P

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

TÀI LIỆU INTERNET

PHỤ LỤC

Có thể bạn quan tâm

Tối ưu hóa phản ứng real-time PCR phát hiện đột biến A2143G trên gene 23S rRNA liên quan đến tính kháng clarithromycin của Helicobacter pylori

Nghiên cứu tỷ lệ, thành phần loài nấm nông gây bệnh ở bàn chân bằng kỹ thuật hình thái và sinh học phân tử ở tiểu thương trên địa bàn tỉnh Nghệ An

Định loài phân tử và quan hệ phả hệ của ngoại ký sinh trùng trên bệnh nhân viêm da do Demodex spp. dựa trên 16S rDNA ty thể

Bài giảng Kỹ thuật gen: Chương 1 - Lịch sử hình thành kỹ thuật gen

Câu hỏi ôn tập môn Sinh học phân tử 1

Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ bệnh rối loạn dự trữ glycogen type 6

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 - Sở GD&ĐT Cà Mau

Đề thi cuối học kì 1 môn Sinh thái học năm 2023-2024

Quyết định số 463/QĐ-TTg năm 2025

Bài giảng Sinh thái học và bảo vệ môi trường

Đề thi giữa học kì 2 môn Giáo dục địa phương lớp 7 năm 2024-2025 có đáp án - Trường PTDTBT THCS Lê Hồng Phong, Bắc Trà My

Bài giảng Con người và môi trường: Chương 2 - ThS. Thái Hữu Phú

Bài giảng Tiêu thể peroxisomes - ThS. Nguyễn Khánh Hòa

Bài thuyết trình Ứng dụng khai thác dữ liệu (Data Mining and Application): Multi-label classification of enzyme subtrates

Bài giảng Sinh thái môi trường: Chương 1 - Dương Thị Bích Huệ

Bài giảng Sinh thái môi trường: Chương 2 - Dương Thị Bích Huệ

Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết lên hoạt tính chống oxy hóa, thành phần ginsenoside và dược tính của dịch chiết sâm Ngọc Linh

Phác đồ điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng tủy trẻ em

Bài giảng Đại cương u xương - ThS. Trần Quang Sơn

Khóa luận tốt nghiệp đại học: Xây dựng và sử dụng sơ đồ tư duy trong giảng dạy phần Sinh thái học sách giáo khoa Sinh học 12 cơ bản

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính