Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84

ĐẠI HỌC THÁ I NGUYÊN TRƢỜ NG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ THU NGA ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN ISOFLAVONE SYNTHASE (IFS1) PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐT26 và ĐT84 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁ I NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ THU NGA ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN ISOFLAVONE SYNTHASE (IFS1) PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐT26 và ĐT84 Chuyên ngành : Di truyền ho ̣c Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣờ i hƣớ ng dẫn khoa ho ̣c : GS.TS. Chu Hoàng Mâ ̣u

Thái nguyên, 4- 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự

hƣớng dẫn của GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu, kết quả trong luận văn là

trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi thông

tin trích dẫn trong luận văn này đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những kết quả trong luận văn này .

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 4 năm 2016

Tác giả luận văn

i

Hà Thu Nga

LỜI CẢ M ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tớ i GS .TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình

chỉ bảo, hƣớng dẫn trong suốt thời gian nghiên cứu , thực hiện và hoàn thành bản

luận văn tha ̣c sỹ sinh ho ̣c này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bô ̣ môn Di truyền &Sinh học

hiê ̣n đa ̣i, Khoa Sinh ho ̣c , trƣờ ng Đại học sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo

mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập cũng nhƣ thực hiện

đề tài luâ ̣n văn tha ̣c sĩ.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn và các cán bộ Phòng Công

nghệ DNA ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi có thể hoàn thành đề tài

nghiên cứu này.

Cuối cùng, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng

nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn cùng tôi trong suốt

quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thiện luận văn này.

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 4 năm 2016

Tác giả luận văn

ii

Hà Thu Nga

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i

LỜI CẢ M ƠN ........................................................................................................... ii

MỤC LỤC ............................................................................................................... iii DANH MỤC NHƢ̃ NG TƢ̀ VÀ CHƢ̃ VIẾ T TẮ T .................................................... iv

DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................v

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vi

Trang

MỞ ĐẦU...................................................................................................................1

1. Đặt vấn đề ..............................................................................................................1

2. Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................2

3. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................2 Chƣơng 1. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU ......................................................................3

1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG ............................................................................................3

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại học và đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng ..................3

1.1.2. Thành phần hóa học trong hạt đậu tƣơng ..........................................................4

1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA ISOFLAVONE ..................................................................... 11

1.2.1. Cấu trúc và thành phần cơ bản của isoflavone ................................................ 11

1.2.2. Cơ chế hoạt động và chƣ́ c năng củ a isoflavone ............................................... 13 1.3. CHUYỂ N HÓ A ISOFLAVONE VÀ GEN MÃ HÓ A ISOFLAVONE

SYNTHASE ............................................................................................................ 14

1.3.1. Chu trình chuyển hóa isoflavone trong hạt đậu tƣơng ..................................... 14 1.3.2. Con đƣờng sinh tổng hợp isoflavone .............................................................. 15

1.3.3. Isoflavone synthase và gen mã hó a IFS .......................................................... 16

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 19 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾ T BI ̣ VÀ ĐI ̣A ĐIỂ M NGHIÊN CƢ́ U ............... 19

2.1.1. Vật liệu........................................................................................................... 19

2.1.2. Hóa chất ......................................................................................................... 20

2.1.3. Thiết bị ........................................................................................................... 21

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 21

iii

2.2. PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U ...................................................................... 21

2.2.1. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng isoflavone trong các mẫu đậu tƣơng ĐT26, DT90, DT84 .................................................................................................. 21

2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết mRNA tổng số .......................................................... 22

2.2.3. Phƣơng pháp nhân bản đoạn mã hóa của gen GmIFS1.................................... 23

2.2.4. Tách dòng phân tƣ̉ .......................................................................................... 25

2.2.5. Phƣơng pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide của gen ...................... 28

2.2.6. Phân tích và xƣ̉ lý dƣ̃ liê ̣u ............................................................................... 28 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 29

3.1. HÀM LƢỢNG ISOFLAVONE TRONG HẠT NẢY MẦM CỦA BA GIỐ NG ĐẬU TƢƠNGĐT26, ĐT90, ĐT84 ............................................................. 29

3.2. TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦ A GEN

GmIFS TƢ̀ mRNA CỦ A ĐẬU TƢƠNG .................................................................. 32

3.2.1. Thiết kế cặp mồi PCR và nhân bản gen GmIFS .............................................. 32 3.2.2. Tách dòng phân tử đoạn mã hóa của gen GmIFS trong E.coli ......................... 34

3.2.3. Trình tự gen GmIFS phân lâ ̣p tƣ̀ hai giống đâ ̣u tƣơng ĐT26 và ĐT84 ............. 35 3.3. SƢ̣ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TƢ̣ NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID SUY DIỄN CỦ A GEN GmIFS1 ....................................................................................... 42

3.3.1. Sƣ̣ đa da ̣ng về trình tƣ̣ nucleotide củ a gen GmIFS1 ........................................ 42 3.3.2. Sƣ̣ đa da ̣ng về trình tƣ̣ amino acid suy diễn củ a gen GmIFS1 ......................... 44 KẾ T LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣ .................................................................................... 47

1. Kết luâ ̣n ............................................................................................................... 47

2. Đề nghi ̣ ................................................................................................................ 47 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾ N LUẬN VĂN ............................... 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 49

iv

DANH MỤC NHƢ̃ NG TƢ̀ VÀ CHƢ̃ VIẾ T TẮ T

cs : cộng sự

bp : base pair (cặp bazơ)

kb : kilo base

kDa : kilo Dalton

DEPC : diethyl pyrocarbonate

DNA : deoxyribosenucleic acid

dNTP : deoxynucleoside triphosphate

cDNA : complementary DNA

mRNA : messenger ribonucleic acid

IFS : Isflavone synthase

PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RNA : Ribonucleic acid

TAE : Tris-acetate-EDTA

X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside

iv

E. coli : Escherichia coli

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA ............................................... 23

Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi PCR sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́ u ................................ 23

Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR ................................................................ 24

Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR .............................................................. 24

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nối gen GmIFS1 vào vector pBT ........................... 26

Bảng 3.1. Hàm lƣợng daidzein , genistein và isoflavo ne trong ha ̣t nảy mầm 3

ngày tuổi của 3 giống đâ ̣u tƣơng ĐT26, ĐT90 và ĐT84. ......................... 31

Bảng 3.2. Sự sai khác về trình tự nucleotide của gen GmIFS1 giƣ̃a các giống

đậu tƣơng ĐT26, ĐT84 và NM_001249093 ............................................ 39

Bảng 3.3. Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn từ gen GmIFS1

giƣ̃a ba giống đâ ̣u tƣơng ĐT26, ĐT84, NM_001249093 ......................... 41

Bảng 3.4. Trình tự gen GmIFS1 của giống đậu tƣơng ĐT26, ĐT84 và các trình tự

có mã số trên Ngân hàng gen quốc tế đƣợc sử dụng trong phân tích ............ 43

Bảng 3.5. Hê ̣ số tƣơng đồng và hê ̣ số phân ly củ a các giống đâ ̣u tƣơng dƣ̣a trên

trình tự nucleotide của gen GmIFS1 ........................................................ 44

Bảng 3.6. Hê ̣ số tƣơng đồng và hê ̣ số phân ly củ a các giống đâ ̣u tƣơng dƣ̣a trên

trình tự amino acid suy diễn của gen GmIFS1 ......................................... 45

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của các aglucone ........................................................... 12

Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của các ß-glucoside ....................................................... 12

Hình 1.3. Con đƣờng sinh tổng hơ ̣p isoflavone (Phản ứng xúc tác bởi enzym

IFS màu xanh dƣơng) [14] ...................................................................... 16

Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT...................................................................................... 26

Hình 3.1. Hình ảnh hạt đậu tƣơngnảy mầm 3 ngày tuổi đƣợc sử dụng chiết rút

daidzein và genistein. A. ĐT26, B: ĐT90, C: ĐT84 ................................ 29

Hình 3.2. Sắc ký đồ phân tích daidzein , genistein tƣ̀ ha ̣t nảy mầm 3 ngày tuổi

của các giống đậu tƣơng. A: ĐT26, B: ĐT90, C: ĐT84. ......................... 30

Hình 3.3. Biểu đồ so sánh hàm lƣơ ̣ng daidzein và genistein trong ha ̣t nảy mầm giƣ̃a ba giống đâ ̣u tƣơngĐT 26, ĐT90, ĐT84 (mg/100 g). Thanh

) ......................... 32

đƣ́ ng trên mỗi cột biểu đồ biểu thị sai số chuẩn ( 

Hình 3.4. Kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmIFS tƣ̀ hai

giống đâ ̣u tƣơng ĐT26 và ĐT84. ............................................................. 34

Hình 3.5. A: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony

-PCR vớ i că ̣p mồi SoyIFS-NcoI-F/ SoyIFS-NotI-R từ 4 dòng khuẩn lạc có kiểu hình trắng đƣơ ̣c lƣ̣a cho ̣n ngẫu nhiên . M: thang DNA 1 kb; giếng 1, 2:

ĐT26; giếng 3,4: ĐT84. .......................................................................... 35

Hình 3.6 Trình tự nucleotide của gen GmIFS1 phân lâ ̣p tƣ̀ hai giống đâ ̣u tƣơng ĐT26 và ĐT84 so vớ i trình tƣ̣ gen IFS1 của giống đậu tƣơng mang mã số NM_001249093 trên Ngân hàng Gen. ........................................... 37

Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmIFS

giống đâ ̣u tƣơng ĐT

1 phân lâ ̣p tƣ̀ hai 26, ĐT84 và từ gen IFS 1 mang mã số

NM_001249093 trên Ngân hàng Gen .................................................... 40

Hình 3.8. Vị trí của gen GmIFS1 phân lâ ̣p tƣ̀ hai giống đâ ̣u tƣơng ĐT 26 và

ĐT84 ....................................................................................................... 42

Hình 3.9. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ củ a mô ̣t số giống đậu tƣơng dƣ̣a

trên trình tự nucleotide củ a gen GmIFS1. ................................................ 44

Hình 3.10. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ củ a mô ̣t số giống đậu tƣơng dƣ̣a

trên trình tự amino acid suy diễn củ a gen GmIFS1 .................................. 46

vi

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Đậu tƣơng có tên khoa học là Glycine max (L.) Merill, thuộc chi Glycine,

họ đậu (Fabaceae) đƣơ ̣c trồng phổ biến ở Viê ̣t Nam và trên thế giớ i . Sản phẩm từ

cây đâ ̣u tƣơng rất đa da ̣ng nhƣ dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ,

ép thành dầu đậu tƣơng, nƣớc tƣơng, làm bánh kẹo, sữa đậu tƣơng, okara... đáp

ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của ngƣời cũng nhƣ gia súc [6].

Hạt đậu tƣơng có hàm lƣợng protein cao , từ 20-40%, dễ tan và chứa hầu hết các

loại amino acid cần thiết cho cơ thể con ngƣời . Cây đâ ̣u tƣơng ngày càng đƣơ ̣c

quan tâm nhiều do trong thành phần có chƣ́ a dƣơ ̣c chất isoflavone . Đây là chất

chống oxy hóa ma ̣nh , ngăn chă ̣n các gốc tƣ̣ do , hỗ trơ ̣ miễn di ̣ch và giảm nguy cơ

mắc bê ̣nh tim ma ̣ch ở ngƣờ i [26], [6].

Đậu tƣơng giờ đây không chỉ là cây thực phẩm mà đã và đang đƣợc nghiên

cứu dƣới vai trò là cây dƣợc phẩm. Theo những nghiên cứu cho thấy, ngoài hàm

lƣợng protein và lipid cao trong đậu tƣơng còn chứa nhiều khoáng chất, các

vitamin và đặc biệt là các hoá chất thảo mộc nhƣ: lecithin, saponin, trypsin

inhibitor, lectin, phenolic acid, omega-3 fatty acid,… và hiện nay isoflavone đang

đƣợc quan tâm nhiều nhất , vì isoflavone có cấu trúc tƣơng tự nhƣ hormone kích

thích tố sinh dục phái nữ (female hormone estrogen) và hoạt động giống nhƣ

estrogen. Isoflavone kiểm soát quá trình tƣơng tác giữa cây và vi sinh vật , điều

chỉnh hormone , kích thích tố sản xuất estrogen , do vâ ̣y có thể cải thiện các hội

chứng tiền mãn kinh và chống loãng xƣơng ở phụ nữ mãn kinh . Isoflavone cũng là

chất chống oxy hóa mạnh, có thể làm giảm nguy cơ ung thƣ bằng cách ngăn chặn

các gốc tự do , trong đó genistein là chất chống oxy hóa mạnh nhất trong số các

isoflavone, tiếp theo là daidzein. Isoflavone làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch ở

ngƣời bằng cách làm giảm nồng độ LDL -cholesterol huyết thanh. Isoflavone còn là

1

chất hỗ trợ miễn dịch [25], [31], [33], [39].

Tuy nhiên, hàm lƣợng isoflavone trong đậu tƣơng thấp , trong khoảng từ 50

- 3000 µg/g và tồn tại ở hai dạng chính là glycoside và aglucone. Dạng glycoside

có trọng lƣợng phân tử lớn, chiếm tới trên 90% isoflavone tổng số đƣợc cho là hấp

thụ hạn chế trong hệ tiêu hóa ngƣời , trong khi đó , dạng aglucone đƣợc hấp thụ

nhanh hơn, nhƣng hàm lƣơ ̣ng la ̣i rất thấp , chỉ chiếm từ 1% - 5% isoflavone tổng

số. Isoflavone trong đâ ̣u tƣơng bao gồm daidzein, genistein và glycitein đƣợc tổng

hợp thông qua con đƣờng phenypropanoid , đƣợc thay đổi bởi các enzyme đặc hiệu

và chứa trong không bào . Isoflavone synthase (IFS) và chalcone isomarase (CHI)

là hai enzyme chìa khóa tham gia vào phản ứng tổng hợp genistein và daidzein

[21]. Tác động làm tăng cƣờng hoạt động của hai loại enzyme này bằng công nghệ

gen là giải pháp cải thiê ̣n hàm lƣơ ̣ng isoflavone trong đâ ̣u tƣơng . Xuất phát tƣ̀

Đặc điểm của gen nhƣ̃ng cơ sở đó chú ng tôi đã xây dƣ̣ng và tiến hành đề tài “

isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giố ng đậu tương ĐT26 và ĐT84”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích đƣơ ̣c đă ̣c điểm củ a gen GmIFS1 phân lâ ̣p tƣ̀ mRNA củ a hai giống

đậu tƣơng khác nhau về hàm lƣơ ̣ng isoflavone trong ha ̣t nảy mầm .

3. Nội dung nghiên cứu

3.1. So sánh hàm lƣơ ̣ng genistein và daidzein củ a ba giống đâ ̣u tƣơng trồng phổ biến ở miền Bắc Viê ̣t Nam ĐT 26, ĐT90, ĐT84.

3.2. Nghiên cƣ́ u thông tin , nhân bản và tách dòng , xác định trình tự nucleotide của gen GmIFS1 tƣ̀ mRNA củ a cây đâ ̣u tƣơng . Phân tích đă ̣c điểm trình tƣ̣ nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen GmIFS1.

2

3.3. Phân tích tính đa da ̣ng trong trình tƣ̣ nucleotide và trình tƣ̣ amino acid suy diễn củ a gen GmIFS1.

Chƣơng 1. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU

1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại học và đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng

Đậu tƣơng có tên khoa học là Glycine max (L.) Merill, thuộc chi Glycine,

họ đậu (Fabaceae), bộ Fabales, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta, giới

Plantae. Đậu tƣơng có thể đƣợc phân loại theo đặc điểm thực vật học, theo thời

gian sinh trƣởng và theo thời vụ. Fukuda (1933) và nhiều nhà khoa học đã thống

nhất cây đậu tƣơng có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu (Trung Quốc) xuất phát từ

một loại đậu tƣơng dại, thân mảnh, dạng dây leo, có tên khoa học là Glycile Soja

Sieb và Zucc. Từ Trung Quốc đậu tƣơng đƣợc lan truyền sang các nƣớc Đông

Nam châu Á và dần lan rộng trên khắp thế giới. Ngày nay, cây đậu tƣơng đã trở

nên phổ biến và đƣợc trồng ở rất nhiều nƣớc trên thế giới, trở thành cây thực phẩm

có giá trị kinh tế cao, quan trọng nhất trong các loại cây thuộc họ đậu, nhờ vào

những đặc điểm ƣu việt vƣợt trội so với các loại cây đậu khác, nhƣ hàm lƣợng

isoflavone, protein, lipit, nhiều vitamin, các khoáng chất và nhiều loại hoá chất

thảo mộc có lợi cho sức khoẻ con ngƣời.

Quê hƣơng của đậu tƣơng ở châu Á , nhƣng 45% diện tích trồng đậu tƣơng

và 55% sản lƣợng đậu tƣơng của thế giới nằm ở Mỹ. Đậu tƣơng là một trong số

các cây thƣ̣c phẩm đã có nhiều giống đƣợ c biến đổi di truyền (GMO) nhằm tăng

năng suất. Hiện nay, khoảng 80% lƣợng đậu tƣơng đƣợc trồng phục vụ thƣơng

mại đều là GMO [23].

Hình thái

Cây đậu tƣơng thuộc loại cây thân thảo, thân có hình tròn, trên thân có

nhiều lông nhỏ, đây là loại cây trồng cạn thu hạt. Một số đặc điểm hình thái bên

ngoài của cây đậu tƣơng chúng ta quan sát đƣợc nhƣ sau:

Rễ

Cây có bộ rễ phát triển gồm rễ chính và rễ phụ, trên rễ chính còn mọc ra

nhiều rễ phụ. Bộ rễ của đậu tƣơng có nhiều nốt sần là kết quả cộng sinh với một

3

loại vi sinh vật hình que có tên khoa học là Rhizobium japonicum.

Lá

Cây đậu tƣơng có 3 loại lá là lá mầm, lá nguyên và lá kép. Lá đậu tƣơng

thƣờng mọc so le và có nhiều hình dạng khác nhau nhƣ hình tròn, dài, ô van, trái

xoan, …tùy theo giống. Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dƣỡng chất nuôi cây

mầm, lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì

chuyển sang màu xanh. Khi hết chất dinh dƣỡng lá mầm sẽ khô héo đi. Lá nguyên

mọc phía trên lá mầm khi cây đƣợc 2-3 ngày. Lá kép mọc so le thƣờng có màu

xanh tƣơi khi già biến thành màu vàng nâu. Trên lá có nhiều long tơ. Các lá có

nhiệm vụ cung cấp dinh dƣỡng cho chùm hoa nằm cạnh nó.

Hoa

Đậu tƣơng là cây có hoa lƣỡng tính, tự thụ phấn. Hoa đậu tƣơng nhỏ, không

hƣơng vị, thuộc loại hoa đồng chu lƣỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa

gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy. Màu sắc của hoa thƣờng có màu

tím, tím nhạt hoặc trắng. Cây đậu tƣơng cho nhiều hoa nhƣng tỷ lệ hoa không

thành quả chiếm 20-80%. Cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian ra hoa tuỳ thuộc

vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hƣởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ.

Quả và hạt

Số quả biến động từ 2 đến 20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới 400 quả

trên một cây. Một quả chứa từ 1 đến 5 hạt, nhƣng hầu hết các giống quả thƣờng từ

2 đến 3 hạt.Quả thõng, hình lƣỡi liềm, gân bị ép, trên quả có nhiều lông mềm màu

vàng, thắt lại giữa các hạt. Quả đậu tƣơng gồm 2 nửa của lá noãn, nối với nhau ở

phần bụng và lƣng. Hạt đậu tƣơng có nhiều hình dạng khác nhau: hình tròn, hình

bầu dục, tròn dẹt,….Trong hạt, phôi thƣờng chiếm 2%, 2 lá tử điệp chiếm 90% và

vỏ hạt 8% tổng khối lƣợng hạt [2].

1.1.2. Thành phần hóa học trong hạt đậu tƣơng

Theo thống kê, trên toàn thế giới có khoảng trên 1,2 vạn sản phẩm làm từ đậu

tƣơng. Ở Nhật Bản, hàng năm dùng tới 460 - 500 vạn tấn đậu tƣơng (bình quân mỗi

ngƣời ăn khoảng 37 - 40kg) trong đó có khoảng 80% dùng làm dầu ăn và thức ăn

4

chăn nuôi, 20% dùng làm thực phẩm. Ở Mỹ, ngƣời ta làm ra khoảng 2500 loại thực

phẩm từ đậu tƣơng. Các sản phẩm đƣợc tiêu thụ trên thị trƣờng gồm bột đâ ̣u tƣơng

đóng gói, đậu phụ, sữa đâ ̣u tƣơng, sữa chua đâ ̣u tƣơng v.v… [45]. Có ngƣời đã tiên

liệu thế kỷ 21 là thế kỷ của các loại sản phẩm làm từ đậu tƣơng [46].

Theo GS. Đỗ Tất Lợi, toàn cây đậu tƣơng chứa 12% nƣớc, 16% gluxit, 45-

50% protein, khoảng 25-30% carbohydrates, 6% muối khoáng và các chất khác

không có nitơ [4].

Trong đậu tƣơng có đủ các amino axit thiết yếu nhƣ: isoleucine, leucine,

lysin, metionin, phenylanin, triptophan, valin. Ngoài ra, đậu tƣơng đƣợc coi là một

nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lƣợng đáng kể các amino acid

không thay thế cần thiết cho cơ thể. Trong hạt đậu tƣơng có các thành phần hóa học

sau: Protein, lipid, glucid, có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin

A, B1,B2,PP D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose có các loại men tiêu hóa nhƣ

amylase, lipase và protease , chất chống men trypsine , chất chống đông máu, chất

sinh bƣớu giáp và isoflavone còn gọi là estrogen thực vật làm giảm các bệnh ung

thƣ và những rối loạn ở tuổi mãn kinh. Nhƣ vậy thành phần dinh dƣỡng trong đậu

tƣơng rất đa dạng, phong phú và toàn diện. Hạt cây là thành phần có giá trị sử dụng

nhất vì nó không những chứa đầy đủ các chất dinh dƣỡng cần thiết mà còn tồn tại

các hoá thảo mộc có tác dụng phòng ngừa và trị bệnh đặc biệt là các căn bệnh thời

đại nhƣ: bệnh ung thƣ, các bệnh liên quan đến tim mạch [3], [19].

Protein

Protein là thành phần dinh dƣỡng quan trọng, chúng có mặt trong thành

phần của nhân và chất nguyên sinh của các tế bào. Quá trình sống là sự thoái hóa

và tân tạo thƣờng xuyên của protein.Các thực phẩm làm từ đậu tƣơng đƣợc xem là

một loại "thịt không xƣơng" vì chứa tỷ lệ đạm thực vật dồi dào, có thể thay thế

cho nguồn đạm từ thịt động vật. Thậm chí, lƣợng đạm (protein) trong 100 gr đậu

tƣơng có thể tƣơng đƣơng với lƣợng đạm trong 800 gr thịt bò. Hàm lƣợng protein

trung bình khoảng 35-45% và cao gấp đôi so với các loại đậu khác.

Tại các quốc gia nhƣ Nhật Bản, Trung Quốc, 60% lƣợng đạm tiêu thụ hằng

ngày là do đậu tƣơng cung cấp. Hàm lƣợng chất đạm chứa trong đậu tƣơng cao

5

hơn nhiều so với lƣợng chất đạm chứa trong các loại đậu khác.

Lipit

Thành phần chính của lipit là triglyxerit là những hợp chất hữu cơ phức tạp

gồm rƣợu bậc 3 glyxerol và các axit béo no, chƣa no. Trong hạt đậu tƣơng còn

chứa hàm lƣợng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên đƣợc coi là cây cung

cấp dầu thực vật. Hàm lƣợng lipid trong đậu tƣơng khoảng 15-20%, lipid của đậu

tƣơng chứa một tỷ lệ các acid béo chƣa no cao gồm: acid oleic có giá trị dinh

dƣỡng là 25-36%, acid linoleic có giá trị dinh dƣỡng là 52-65% và linolenic acid

có giá trị dinh dƣỡng là 2-3%. Nhiều tác giả coi các axit béo chƣa no linoleic,

linolenoic và oleic cùng với các sản phẩm đồng phân của chúng là các axit béo

chƣa no cần thiết vì chúng không tổng hợp đƣợc trong cơ thể.Lipid của đậu tƣơng

chứa một tỷ lệ các acid béo no nhƣ: acid panmitic, acid stearic, acid arachidonic.

photphatit và sterol cũng là những thành phần lipit quan trọng [6], [19].

Gluxit

Gluxit trong đâ ̣u tƣơng chiếm khoảng 15 - 25%. Gồm có mono saccarit, đi

saccarit và poli saccarit.

- Mono saccarit: Glucoza, fructoza, galactoza là các phân tử đơn giản nhất

của gluxit, dễ hấp thu đồng hóa nhất.

- Disaccarit: Saccaroza, lactoza là các phân tử đƣờng kép tiêu biểu. Các

disaccarit khi thủy phân cho 2 phân từ đƣờng đơn. Disaccarit và monosaccarit đều

có vị ngọt.

- Poli saccarit có ảnh hƣởng lớn đến trạng thái và độ đồng hóa hấp thu của

thực phẩm.

Gluxit là sản phẩm ban đầu của quá trình quang hợp và đƣợc dùng làm

"nguyên liệu" để xây dựng tất cả các hợp chất có trong hạt đậu. Trong hạt đậu,

gluxit tự nhiên chủ yếu là xenlulo và hemixenlulo. Lƣợng xenlulo chủ yếu tập

trung ở vỏ.

Vitamin

Hạt đậu tƣơng cũng chứa khá nhiều các loại vitamin, cả tan trong dầu và tan

trong nƣớc, đặc biệt là hàm lƣợng của vitamin B2 và B1. Ngoài ra, trong đậu

6

tƣơng còn có các loại vitamin nhƣ: PP, A, E, K, C, D,…thiamine (6,25-6,85g/g),

riboflavine (0,92-1,19g/g), vitamine E (-tocopherol chiếm 10,9-28,4g/g; -

tocopherol chiếm 150-190g/g; -tocopherol chiếm 24,6-72,5).

Khoáng

Khoáng là một nhóm các chất cần thiết không sinh năng lƣợng nhƣng giữ

vai trò trong nhiều chức phận quan trọng đối với cơ thể. Cơ thể ngƣời ta có gần 60

nguyên tố hóa học. Một số chất có hàm lƣợng lớn trong cơ thể đƣợc xếp vào nhóm

các yếu tố đa lƣợng (macroelements), số khác có hàm lƣợng nhỏ đƣợc xếp vào

nhóm các vi yếu tố (microelements). Các yếu tố đa lƣợng là Ca (1,5%), P (L%),

Mg (0,05%), K (0,35%), Na (0,15%) ; Các yếu tố vi lƣợng là I, F, Cu, Co, Mn,

Zn... . Trong hạt đậu tƣơng khô chứa khoảng 5% khoáng, với các nguyên tố

khoáng đa lƣợng nhƣ muối của K, P, Mg, S, Ca, Cl, Na. Hàm lƣợng trung bình

của các nguyên tố khoáng này nằm trong khoảng 0,2-2,1%. Những nguyên tố

khoáng vi lƣợng gồm có: Cu, Zn, Fe, Co, Pb, I, Se, Mn, Cd,… Hàm lƣợng của

những nguyên tố khoáng vi lƣợng này dao động khoảng 0,01-140 ppm [6], [19].

Isoflavone

Isoflavone là một loại flavonoid có trong đâ ̣u tƣơng và đặc biệt có hàm lƣợng cao nhất trong mầm đâ ̣u tƣơng . Isoflavone có 3 loại là: genistein, daidzein

và glycitein (isoflavone aglycone).

Isoflavones trong đâ ̣u tƣơng là một trong những hoá thảo mộc đang đƣợc

các nhà khoa học nghiên cứu nhất vì nó có những tính năng kì diệu chống lại các

tác dụng gây nên chứng ung thƣ liên hệ đến hormone, sử dụng trong điều trị các

triệu chứng mãn kinh phụ nữ nhƣ: bốc hoả, đổ mồ hôi, mất ngủ, lo âu, rối loạn

chức năng tình dục, lão hoá da, bệnh Alzheimer…[28]. Ở Đậu tƣơng, có chứa

nhiều hợp chất isoflavone, nhƣng có lợi nhất là genistein và daidzein. Những hợp

chất tự nhiên còn đƣợc gọi là estrogen thực vật (phytoestrogen) có khối lƣợng

phân tử tƣơng đối lớn, tan tốt trong nƣớc, có tính phân cực cao và đang đƣợc quan

tâm vì lợi ích sức khỏe của nó đem lại [18]

Genistein

Công thức phân tử: C15H10O5 (trọng lƣợng phân tử 270 đvC). Là tinh thể

7

không màu.

Chuyển màu sang vàng sau khi hòa tan trong kiềm, và màu đỏ sậm trong sắt

dung dịch clorua ethanol (III).

Daidzein

Công thức phân tử: C15H10O4 (trọng lƣợng phân tử 254). Là tinh thể không

màu, tan trong methanol, ethanol và acetone. Chuyển màu sang màu vàng sau khi

hòa tan trong kiềm, và phát huỳnh quang bởi tia UV. Phân hủy để tạo thành axit

formic, resorcin, và ρ-hydroxybenzoate với kiềm.

Trong mầm đâ ̣u tƣơn g có chứa nhiều protein và đặc biệt có chứa chất

Isoflavones . Isoflavones có hoạt tính tƣơng tự nhƣ kích thích tố nữ estrogen mà

đã đƣợc nhiều công trình khoa học chứng minh là có tác dụng trong việc điều trị

và ngăn ngừa một số bệnh đặc biệt là sức khỏe của phụ nữ. Isoflavones đâ ̣u tƣơng

là hoạt chất có cơ chế hoạt động và chức năng gần giống nhƣ nội tiết tố estrogen

ngƣời. Vì thế các nhà khoa học còn gọi là estrogen thảo mộc. [47]

Isoflavones đƣợc xem nhƣ là một chất chống oxy hóa. Trong đó genistein,

một Isoflavone có nhiều nhất trong đâ ̣u tƣơng có tác động giúp ức chế một số

bƣớc trong quá trình khởi phát và tạo thành mảng xơ vữa động mạch. Nghiên cứu

của Ruiz-Larrea MB bệnh viện GUY London và cộng sự thực hiện năm 1997

cũng cho thấy genistein là chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh nhất thể hiện ở

khả năng trung hòa các gốc tự do giúp làm chậm quá trình lão hóa da [47].

Chấ t ƣ́ c chế protease

Đậu tƣơng có khả năng ngăn cản không cho bệnh ung thƣ phát triển trên

các loài động vật, do tác dụng của chất ƣ́ c chế protease . Các nhiều nhà khoa học

đã khảo sát và thử nghiệm chất ƣ́ c chế protease . Trong điều kiê ̣n phòng thí nghiệm

, thấy rằng đâ ̣u tƣơng có tác dụng chống lại sự phát triển mầm ung thƣ kết tràng

ung thƣ phổi , ung thƣ miệng… [35, 36]. Chất ƣ́ c chế protease ngăn ngừa sự tác

động của một số gen di truyền gây nên chứng ung thƣ, bảo vệ các tế bào cơ thể

không cho hƣ hại, gây nên bởi sự tác động của môi trƣờng xung quanh nhƣ tia

8

nắng phóng xạ và các chất có thể tấn công ADN [28, 37].

Phytate

Phytate là một hợp chất khoáng phosphorus và inositon. Các nhà khoa học

đã chứng minh phytate không những có tác dụng ngăn ngừa mầm ung thƣ mà còn

có khả năng ngăn ngừa bệnh tim mạch. Hai nhà nghiên cứu Graf và Eator đã cho

biết phytate bảo vệ chúng ta khỏi bệnh ung thƣ kết tràng, kết quả trong phòng thí

nghiệm cho thấy phytate đã liên tiếp ngăn cản không cho bệnh ung thƣ kết tràng

phát triển và không cho phát sinh mầm ung thƣ vú. Mặt khác phytate có tác dụng

ngăn cản sự hấp thụ sắt trong ruột do đó bảo vệ chúng ta khỏi chứng có quá nhiều

chất sắt vì chất sắt thặng dƣ cũng là một trong những yếu tố nguy hại đến chứng

nhồi máu cơ tim [28, 37].

Phytosteron

Phytosteron có liên hệ với cholesteron, tuy nhiên cholesteron chỉ có nơi các

thực phẩm có nguồn gốc từ thịt động vật còn phytosteron chỉ có trong các thực phẩm

rau đậu. Không giống nhƣ cholesteron, phytosteron có tác dụng ngăn ngừa các bệnh

về tim mạch qua việc dành chỗ thẩm thấu qua ruột của cholesteron để vào máu. Do

đó cholesteron không vào máu đƣợc mà phải bài tiết ra ngoài, lƣợng cholesteron

trong máu giảm, mức độ giảm tuỳ từng cá thể. Phytosteron cũng có khả năng làm

giảm sự phát triển các bƣớu ung thƣ kết tràng và chống lại ung thƣ da [28, 37].

Saponin

Năm 2007 các nhà khoa học Hàn Quốc và Nhật Bản dùng bột đâ ̣u tƣơng

đã khử dầu đem chiết xuất trong metanol, butanol 80%. Dịch chiết sau khi làm

khô trong chân không đƣợc đem định tính bằng sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng

hiệu năng cao HPLC và xác định cấu trúc bằng cách ghi phổ. Sau khi xác định

thành phần saponin trong đâ ̣u tƣơng , các khoa học gia tiến hành thí nghiệm

thử hoạt tính của saponin trên chuột đực 5 tuần tuổi bằng cách tiêm qua tĩnh

mạch đuôi . Kết quả cho thấy saponin trong đâ ̣u tƣơng có tác dụng ngăn cản sự

di căn của những tế bào ung thƣ. [16] Nhiều công trình nghiên cứu khác đã

chỉ ra, saponin là một loại hoá thảo có đặc tính giống nhƣ antioxydant.

Saponin có khả năng trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thƣ kết tràng đồng

9

thời làm giảm lƣợng cholesteron trong máu.

Axit phenolic

Axit phenolic có kh ả năng chống oxy hoá antioxidant và phòng ngừa các

nhiễm sắc thể ADN khỏi bị tấn công bởi những tế bào ung thƣ [28, 37].

Lecithin

Khi nghiên cứu thành phần hoạt chất trong đâ ̣u tƣơngcác nhà khoa học đã

nhận thấy , đạm chất đâ ̣u tƣơng có chứa 3% lecithin bằng với lƣợng lecithin có

trong lòng đỏ trứng gà. Lecithin là một hoá chất thực vật quan trọng, đóng một vai

trò quyết định trong việc kích thích sự biến dƣỡng ở khắp các tế bào cơ thể.

lecithin có khả năng làm gia tăng trí nhớ bằng cách nuôi dƣỡng tốt các tế bào não

và hệ thần kinh, làm vững chắc các tuyến và tái tạo các mô tế bào cơ thể . Ngoài ra,

lecithin có tác dụng cải thiện hệ thống tuần hoàn , bổ xƣơng và tăng cƣờng sức đề

kháng. Khi hệ thần kinh thiếu năng lƣợng , chất lecithin ở đâ ̣u tƣơng sẽ phục hồi

năng lƣợng đã mất [28, 37].

Browman - Birk inhibitor (BBI)

BBI là một hoá thảo mới nhất tìm thấy trong đâ ̣u tƣơng , có khả năng ngăn

cản tiến trình phát triển mầm ung thƣ. Trong nhiều năm qua, các nhà khoa học đã

thử nghiệm và thành công trên các mẫu tế bào trong ống thí nghiệm và trong các thú

vật qua hai dạng tinh chế PBBI và cô đặc BBIC . Theo báo cáo kết quả tƣờng trình

tại hội nghị khoa học thế giới về vai trò của đâ ̣u tƣơngtrong việc phòng và trị bệnh

(1996) thì PBBI và BBIC đã kiểm soát đƣợc sự phát triển tiến trình ung thƣ miệng,

vú, ruột già, gan, phổi, thực quản cả các tế bào trong ống thử nghiệm lẫn ở các con

chuột bạch và chuột đồng. Hiện nay BBI đã đƣợc dùng trên con ngƣời ở vài trung

tâm nghiên cứu và kết quả sơ bộ rất khả quan [37].

Axit béo mega - 3

Axit béo omega - 3 là loại chất béo không bão hoà có khả năng làm giảm

lƣợng cholesterol xấu LDL đồng thời làm gia tăng lƣợng cholesterol tốt HDL

trong máu. Nhiều nghiên cứu khoa học đã xác nhận tiêu thụ nhiều axit omega - 3

10

fatty giúp ngăn chặn sự phát triển của các bệnh tim mạch [37].

1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA ISOFLAVONE

1.2.1. Cấu trúc và thành phần cơ bản của isoflavone

Isoflavone gồm 2 vòng benzen: A và B nối với một dị vòng pyron [37].

Isoflavone là một loại flavonoid có trong đậu tƣơng và đặc biệt có hàm lƣợng

cao nhất trong mầm đậu. Isoflavone dạng tự do có 3 loại genistein, daidzein và

glycitein (isoflavone aglucone). Ngoài dạng isoflavone tự do trong hạt đậu tƣơng còn

có isoflavone dạng liên hợp glucoside, glucoside acetyl và dạng malonyl [34].

Năm 2011, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu chuyển hóa genistein trong isoflavone ở cây Brassica với IFS ở đậu tƣơng kết quả cho thấy, genistein,

4',5,7-trihydroxyisoflavone, là một hợp chất isoflavonoid chủ yếu có trong các loại

đậu và chứa hàm lƣợng phytooestrogen , các hoạt chất chống oxy hóa . Enzyme

isoflavone synthase (IFS) giƣ̃ vai trò quan trọng trong con đƣờ ng phenylpropanoid từ flavonoids đến isoflavonoid . Brassica napus là một cây cho dầu không thuộc họ

đậu với các mô thực vật sản xuất phenylpropanoid và flavonoid, nhƣng không có

khả năng tích lũy isoflavone do sự vắng mặt của IFS [21].

Năm 2013, Cheng và cs đã nghiên cứu so sánh sự đa hình nucleotide trong

Isoflavone synthase (IFS1, IFS2) và gen Flavanone 3-hydroxylase (F3H2) từ 33

giống đâ ̣u tƣơng , trong đó có 17 giống đâ ̣u tƣơng trồng (Glycine max) và 16 dạng

hoang dã của họ (Glycine soja). Isoflavone synthase và flavanone 3-hydroxylase

(F3H) là hai enzyme quan trọng xúc tác sinh tổng hợp isoflavonoid và flavonoid,

cả hai đều đóng vai trò khác nhau trong phản ứng của stress [11].

Các nhà khoa học Bồ Đào Nha cũng đã sử dụng các phƣơng pháp sắc kí

HPLC/DAD và phổ UV để xác định thành phần của isoflavone trong 40 mẫu hạt

11

đậu tƣơng. Sau khi nghiên cứu các khoa học đã khẳng định trong hạt đậu tƣơng

các aglucone chiếm một lƣợng nhỏ, hợp chất chính trong hạt đậu tƣơng là các dẫn

xuất malonyl và dẫn xuất axetyl của ß - glucoside [23].

Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của các aglucone

Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của các ß-glucoside

Matsura và cs đã xác định đƣợc trong đậu tƣơng nảy mầm , isoflavone dạng

aglucone tăng lên rất nhiều do hoạt tính của β-glucosidase nội bào của đậu tƣơng

và đƣợc kích hoạt bở i quá trình nảy mầm. Enzyme này cắt liên kết β-glucoside

12

trong phân tử genistin, loại phân tử glucose để chuyển thành genistein [24].

1.2.2. Cơ chế hoạt động và chƣ́ c năng củ a isoflavone

Isoflavone là hoạt chất có nguồn gốc từ thảo mộc, cơ chế hoạt động và chức

năng gần giống nhƣ những hormone nữ trong cơ thể và mang tính lành, không ảnh

hƣởng xấu lên nam giới. Những hợp chất có thành phần tƣơng tự nhƣ isoflavone

vẫn đƣợc tìm thấy trong một số loại thực vật nhƣ: cỏ ba lá, cỏ linh lăng, cây dong...

Cơ chế hoạt động là các estrogen tác dụng thông qua liên kết với các thụ thể

estrogen trong tế bào. Có hai loại thụ thể ER là alphe ER (α ER) và beta ER (ß

ER), α ER có mặt tại màng trong tử cung, trong chất đệm của buồng trứng và ở

tuyến vú. Còn ß ER, tồn tại trong các tế bào nội mô của thành mạch máu , ở não,

thận và trong các tế bào của bàng quang và niệu đạo , trong tế bào của niêm mạc

ruột và phổi, tế bào xƣơng. Chƣ́ c năng sinh lý chủ yếu củ a estrogen là kích thích α

ER và cho những tác dụng nội tiết rất quen thuộc trên màng trong tử cung và ở vú.

Trái lại, genistein, daidzein và các chất chuyển hoá của chúng kích thích chủ yếu

vào ß ER. Những tác dụng của isoflavone trong đậu tƣơng luôn yếu hơn tác dụng

của hormon estrogen thực thụ. Do đó các hormone trong cơ thể ngƣời phụ nữ sau

khi mãn kinh đƣợc cân bằng [31]. Những nghiên cứu lâm sàng cho thấy đậu tƣơng

làm giảm cƣờng độ bốc hỏa, giảm số lần đổ mồ hôi đêm, số lần thức giấc nâng cao

chất lƣợng sống của phụ nữ mãn kinh là nhờ có tác dụng của isoflavone trong đậu

tƣơng. Do vâ ̣y ăn đậu tƣơng giúp cải thiện toàn bộ về chất lƣợng sống của phụ nữ

mãn kinh [22]. Đặc biệt đối với những phụ nữ bị loãng xƣơng trong thời kì mãn

kinh thì isoflavone cũng có hiệu quả bất ngờ. Nghiên cứu bổ sung isoflavone đậu

tƣơng trong khẩu phần ăn làm tăng đáng kể mật độ khoáng xƣơng (BMD) lên 54%

và giảm tiêu xƣơng biểu hiện bởi giảm DPD (deoxypyridinone) trong nƣớc tiểu là

23% so với trị số cơ bản ở phụ nữ [40].

Những ngƣời phụ nữ sau mãn kinh khi sử dụng isoflavone đậu tƣơng thì làn

da cũng đƣợc cải thiện đáng kể. Tiến hành nghiên cứu với những phụ nữ sau mãn

kinh, trƣớc và sau khi điều trị với 100mg/ngày. Kết quả của nghiên cứu này cho

chúng ta thấy rằng bổ sung chiết xuất đậu tƣơng đậm đặc giàu isoflavone trong 6

13

tháng thì làn da của phụ nữ mãn kinh sẽ giảm sự lão hóa. Do tác dụng của isoflavone

giúp duy trì và tăng độ dầy lớp biểu mô , mạch máu, sợi đàn hồi và sợi collagen của

da. Từ đó tăng giá trị sử dụng của đậu tƣơng [7]. Các kết quả nghiên cứu thu đƣợc đã

khuyến cáo là nên sử dụng trực tiếp hạt đậu tƣơng [9]. Ngoài ra các isoflavone còn có

vai trò ngăn chặn bệnh ung thƣ, đặc biệt là các bệnh ung thƣ phụ thuộc vào hormone

nhƣ màng trong tử cung, ở vú, buồng trứng, ung thƣ tuyến tiền liệt [25].

1.3. CHUYỂ N HÓ A ISOFLAVONE VÀ

GEN MÃ HÓ A ISOFLAVONE

SYNTHASE

1.3.1. Chu trình chuyển hó a isoflavone trong ha ̣t đâ ̣u tƣơng

Khi vào cơ thể, các isoflavone tự do đƣợc hấp thu ở ruột non nhanh hơn so

với các isoflavone ở dạng glucoside. Sự chuyển hoá các isoflavone đáng chú ý vì

quá trình này tạo ra các sản phẩm có tác dụng mạnh hơn nhiều so với các chất ban

đầu. Hệ vi sinh đƣờng ruột đƣợc chứng minh là có tầm quan trọng đặc biệt đối với

chuyển hoá và tính khả dụng của các isoflavone, khi chỉ có các động vật có hệ vi

sinh đƣờng ruột mới đƣợc thấy có bài tiết sản phẩm chuyển hoá có tác dụng mạnh

(equol) của isoflavone. Một số nghiên cứu đánh giá mức độ thải trừ equol qua

nƣớc tiểu cho thấy chỉ khoảng 33% cá thể ngƣời phƣơng Tây chuyển hoá daidzein

thành equol. Sự khác nhau về chuyển hoá isoflavone có thể có những ảnh hƣởng

quan trọng tới hoạt tính sinh học của các phytoestrogen này [31], [33]. Chất

chuyển hoá chính của genistein là hydroxy- O - demethylangolensin. Những chất

chuyển hoá chính của daidzein là O - demethylan - golensin, glyxitein và equol.

Equol là thành phần rất quan trọng cho hoạt tính của isoflavone đậu tƣơng trong

điều trị các triệu chứng mãn kinh, vì hoạt tính estrogen của equol mạnh gấp 5 lần

hoạt tính này của chất daidzein và lớn gấp 2 lần hoạt tính của genistein [13].

Có nhiều bằng chứng thực nghiệm ủng hộ giả thuyết ghi nhận rằng thay vì

isoflavone thì sản phẩm cuối cùng của enzyme IFS là 2 hydroxyisoflavanone -

một hợp chất không ổn định ở điều kiện môi trƣờng. Thử nghiệm cho

liquiritigenin và naringenin ủ với IFS có chứa microsome, sản phẩm thu đƣợc là 2-

14

hydroxyisoflavanone. Vì lý do này , “2-hydroxyisoflavanone synthase” chính là “isoflavone synthase” [9]. Tuy nhiên, ở những thực vật không thuộc họ đậu, khi có

enzyme IFS thì sƣ̣ tích lũy sẽ là isoflavone , thay vì 2-hydroxyisoflavanone. Điều này đƣợc lý giải do tự động chuyển đổi 2- hydroxyisoflavanone tạo ra isoflavone

đủ nhanh để ngăn chặn các hợp chất cũ tích lũy trong thực vật hoặc do có enzyme

“dehydratase flavonoid” làm mất nƣớc hoặc cũng không thể loại trừ khả năng IFS

hỗ trợ việc chuyển đổi này với một tốc độ chậm hơn so với phản ứng dịch chuyển

aryl [43]. Enzyme IFS đƣợc chia làm 2 loại là IFS 1 có thể chuyển đổi

liquiritigenin thành daidzein và enzyme IFS thứ hai (IFS2) chuyển đổi đồng thờ i

cả naringenin thành genistein và liquiritigenin thành daidzein [14].

1.3.2. Con đƣờng sinh tổng hợp isoflavone

Isoflavone đƣợc tổng hợp từ một nhánh của con đƣờng trao đổi chất

phenylpropanoid. Tiền thân của con đƣờng là một axit amin L-phenylalanine,

mà bƣớc khởi đầu là loại bỏ đi nhóm amin để tạo ra axit cinnamic qua các

phenylalaninen ammonia lyase (PAL). Trong phản ứng thứ hai và thứ ba,

cinnamate 4-hydroxylase (C4H) và 4 coumarate CoA ligase (4CL) chuyển đổi

thành axit cinnamic p-coumaryol CoA. Các enzyme quan trọng đầu tiên để tổng

hợp flavonoid là chalcone synthase (CHS) và isomerase chalcone (CHI), trong

đó chuyển đổi chalcone thành flavone và chalcone reductase (CHR) là cần thiết

cho sự hình thành daidzein và glyceollins. Sau đó, isoflavone synthase tham gia

xúc tác cho con đƣờng sinh tổng hợp isoflavone. Đây là enzyme đầu tiên

chuyển đổi isoflavone và các sản phẩm isoflavone trong con đƣờng sinh tổng

hợp isoflavone [17], [30]. Isoflavone synthase đóng một vai trò quan trọng

trong sinh tổng hợp isoflavone [14]. IFS1 là một enzyme xúc tác đặc biệt vì nó

có ít nhất hai phản ứng với một protein; phản ứng thủy phân và phản ứng dịch

15

chuyển aryl nội phân tử.

Hình 1.3. Con đƣờng sinh tổng hơ ̣p isoflavone (Phản ứng xúc tác bởi enzym IFS

màu xanh dƣơng) [14]

1.3.3. Isoflavone synthase và gen mã hó a IFS

Enzyme isoflavone synthase (IFS) là mô ̣t trong hai enzym chìa khóa trong

con đƣờng sinh tổng hợp isoflavone ở cây đậu tƣơng [40]. Ở cây đậu tƣơng , gen

IFS đã đƣợc phân lập gồm 2 gen IFS1 và IFS2 cùng mã hóa cho một sản phẩm có

521 amino acid [11]. Enzyme IFS1 có thể chuyển đổi liquiritigenin thành daidzein

và enzyme IFS 2 chuyển đổi đồng thờ i cả naringenin thành genistein và

liquiritigenin thành daidzein và enzyme IFS 2 có ƣu thế hơn enzym IFS1 [43].

Genistein (4 ', 5,7-dihydroxyisoflavone) là một tiền chất phổ biến trong sinh

tổng hợp kháng sinh và phytoalexin phytoanticipins trong các loại đậu, và một

16

thành phần dinh dƣỡng quan trọng tìm thấy trong hạt đậu tƣơng. Genistein là một

phytoestrogen có nhiều tác dụng dƣợc lý trong các tế bào động vật, bao gồm ức

chế tyrosine kinase, một loạt cáclợi ích với tiềm năng về sức khỏe. Chúng bao

gồm chemoprevention vú và ung thƣ tuyến tiền liệt, bệnh tim mạch và các bệnh

hậu mãn kinh. Genistein có thể đƣợc tổng hợp thông qua các con đƣờng

deoxybenzoin hoặc chalcone. Genistein đƣợc tổng hợp trong thực vật từ

naringenin flavanone bởi một phản ứng chuyển vòng xúc tác bởi cytochrome P450

enzyme isoflavone synthase (IFS) [12].

Isoflavone synthase và cinnamate 4-hydroxylase (C4H) đã đƣợc xác định

là cùng với enzyme P450 đƣợc trong ER, tƣơng tác với các enzyme hòa tan của

phenylpropanoid và đƣờng isoflavonoid (C4H, CHS, CHR và CHI).

Gen IFS đƣợc biết đến thuộc phân họ CYP93C của cytochrome P450. Gen

IFS có kích thƣớc 1556 bp mã hóa cho một polypeptide 521 amino acid đƣợc

biểu hiện ở các bộ phận của cây mặc dù mức độ biểu hiện là khác nhau. Trong

Ngân hàng Gen quốc tế (GenBank), gen IFS đã đƣợc Jung và cs công bố năm

2015 với mã số trên trang NCBI là NM_001249093 [18]. Phân lập gen IFS đã

đƣợc thực hiện trên nhiều đối tƣợng thực vật nhƣ cây Psoralea corylifolia, cây

lúa, cỏ ba lá Trifolium pratense, đậu tƣơng, đậu xanh (AF195807), củ cải đƣờng

(AF195816, AF195817)…[18], [25], [28], [37]. Thông tin về gen IFS1 của đậu

tƣơng trên NCBI cho thấy gen nằm trên NST số 7. Số lƣợng nucleotide của gen là

1625 bp, từ vị trí số 1 đến vị trí 1625, mã hóa cho 521 acid amin [48]. Trong

nghiên cứu phân lập gen IFS1 từ cỏ ba lá (Trifolium pratense) của Bong Gyu Kim

và cs đã cho thấy gen IFS1 của cỏ ba lá có chiều dài 1575 bp, mã hóa cho 525

amino acid [10].

Để sản xuất genistein trong gạo , các nhà khoa học Hàn Quốc đã chuyển gen

IFS phân lâ ̣p tƣ̀ đậu tƣơng vào cây lúa . Gen IFS1 và IFS2 đƣơ ̣c phân lâ ̣p từ giống

đậu tƣơng Hàn Quốc Sinpaldalkong II, giống đâ ̣u tƣơng có hàm lƣợng genistein

cao hơn so với các giống đậu tƣơng khác . Vector biểu hiện đƣợc thiết kế chứa gen

IFS1 hoặc IFS2 dƣới sự kiểm soát của promoter điều khiển biểu hiện trong hạt

17

gạo. Qua phân tích bằng Southern blot trên 8 cây lúa chuyển gen kết quả cho thấy

rằng các thế hệ T 0 có 1 đến 3 bản sao của gen IFS 1 hoặc IFS 2. Và kết quả phân

tích hàm lƣợng isoflavone trong các dòng lúa chuyển gen cho thấy mức độ biểu

hiê ̣n cao hơn khoảng 30 lần so với hàm lƣợng genistein của IFS biểu hiện trong

cánh hoa thuốc lá chuyển gen , bằng khoảng 12% của tổng hàm lƣợng genistein ở

18

giống đâ ̣u tƣơngSinpaldalkong II [35].

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾ T BI ̣ VÀ ĐI ̣A ĐIỂ M NGHIÊN CƢ́ U

2.1.1. Vật liệu

Sử dụng 3 giống đậu tƣơng ĐT26, ĐT90, ĐT84, trồng phổ biến ở miền Bắc

Việt Nam làm vật liệu nghiên cƣ́ u . Giống đậu tƣơng ĐT 26 do Trung tâm nghiên

cứu và phát triển đậu đỗ , Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp , hai

giống ĐT90, ĐT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp.

Giống đậu tƣơng ĐT 26 đƣợc chọn tạo bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát

triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông

nghiệp Việt Nam tổ hợp lai ĐT 2000 x ĐT 12 từ năm 2002 và đƣợc công nhận

giống sản xuất thử năm 2008. Giống đậu tƣơng ĐT26 có hoa màu trắng, hạt vàng

rốn nâu đậm, quả chín có màu nâu. Giống đậu tƣơng mới ĐT26 có thời gian sinh

trƣởng trung bình từ 90-95 ngày, chiều cao cây từ 50-60cm, phân cành khá 2,0-

2,5. Tỷ lệ quả 3 hạt cao trung bình 18-22%. Năng suất đạt trung bình ở độ ẩm 12%

là 22-28 tạ/ha thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh. Trong điều kiện thâm

canh cao, ở diện tích hẹp, năng suất có thể đạt tới 30-32 tạ/ha. Hạt màu vàng đẹp,

hàm lƣợng protêin cao (42,21%) và lipit 19,72%. Giống ĐT26 có khả năng kháng

bệnh gỉ sắt, đốm nâu và khả năng chịu ruồi đục thân, chống đổ khá. Giống ĐT26

thích hợp nhất trong vụ đông và vụ xuân và có thể nhân hạt ở vụ hè.

Giống đâ ̣u tƣơng ĐT90 do Viê ̣n Di truyền nông nghiê ̣p cho ̣n ta ̣o bằng

phƣơng pháp lai hữu tính kết hợp với đột biến thực nghiệm sử dụng tia gamma Co60, 18 Krad ở dòng lai F2 (K7002 x Co ̣c chù m) đƣơ ̣c công nhâ ̣n và khu vƣ̣c hóa năm 1994. Giống ĐT 90 có hoa trắng, lá hình tim nhọn , màu xanh sáng , lông nâu,

cây cao 45-50 cm, thân có 10-11 đốt, phân cành vƣ̀ a phải , cây go ̣n phù hơ ̣p vớ i

trồng thuần và trồng xen . Quả chín màu xanh xám , số quả chắc tà 22-35, tỷ lệ quả

sắt, 3 hạt từ 15020%. Giống ĐT 90 có khả năng chống đổ , chống các bê ̣nh gỉ

19

sƣơng mai, đốm nâu vi khuẩn , lở cổ rễ. Chịu nhiệt và lạnh khá . Hạt vàng sáng, rốn

hạt trắng, hạt to, khối lƣơ ̣ng 1000 hạt từ 180-270g. Tỷ lệ protein từ 41,6-47,5%,

lipid khoảng 18,4%.

Giống đậu tƣơng ĐT84 do Viện di truyền nông nghiệp tạo ra từ tổ hợp lai ĐT-

80/ĐH4 bằng phƣơng pháp lai hữu tính kết hợp gây đột biến bằng tác nhân gamma Co60 kral trên dòng lai F3-D333. Giống ĐT84 là giống đậu tƣơng hiện nay đang

đƣợc trồng phổ biến ở nhiều nơi vì có khả năng cho năng suất cao và chống đổ tốt,

nhiễm bệnh ở mức độ nhẹ đến trung bình với 1 số bệnh hại chính. Màu sắc hạt vàng,

hạt tròn, to đẹp. Thời gian sinh trƣởng, vụ Xuân 115-120 ngày, vụ Thu 90-95 ngày,

vụ Đông 110-115 ngày, cao thân chính 50-60 cm, cứng cây, bộ lá gọn có màu xanh

đậm, có hoa màu tím, vỏ quả màu vàng, hạt to, màu vàng, rốn hạt màu nâu nhạt.

Năng suất trung bình đạt 15-25tạ/ha, thâm canh cao đạt 30 tạ/ha.

2.1.2. Hóa chất

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ Anh,

Đức, Mỹ, Thụy Điển, Trung Quốc nhƣ: CTAB, EDTA, Tris, ethanol, natri clorua,

glycine, đệm PCR, Taq DNA polymerase, MgCl2, dNTPs, agarose, nito lỏng,

cloroform, isoamyl và các hóa chất khác đƣợc mua của hãng Invitrogen.

Bộ kit QIAquick Gel Extraction dùng cho phản ứng PCR, bộ kit AccuPrep

PCR Purification (Bioneer) tinh sạch sản phẩm PCR, bộ kit tách dòng TA Cloning

Kit (Invitrogen), bộ kit tách plasmid tái tổ hợp AccuPrep Plasmid Mini Extraction

Kit (Bioneer)..

Vector tách dòng pBT do Viện Công nghệ Sinh học cung cấp .

Các hóa chất dùng trong xác định hàm lƣợng isoflavone trong các giống

đậu tƣơng: các chất chuẩn: Genistein, Daidzein, Acetonitril, Methanol, Natri

format acid formic (HPLC); Tetrahydrofuran (HPLC); HCl (HPLC); nƣớc cất

(HPLC) và các hoá chất khác đƣợc mua của hãng Invitrogen, Fermatas, Merck

Các loại hóa chất khác nhƣ cồn tuyệt đối, sorbitol, chloroform của Việt

20

Nam, Trung Quốc sản xuất.

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu bao gồm : máy lắc ổn nhiệt , máy li

tâm la ̣nh, máy khuấy trộn Vortex, máy đo pH, Máy PCR, máy sắc ký lỏng, thiết bi ̣

giải trình tự nucleotide , máy quang phổ, máy cất nƣớc, bể ổn nhiệt, máy chụp ảnh gel, tủ an toàn sinh học, Cân phân tích 10-4g, pipetman các loại, bộ điện di DNA, tủ lạnh -20oC, tủ lạnh -84oC, tủ ấm

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm phân lâ ̣p gen đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Công

nghê ̣ gen, Khoa Sinh ho ̣c , Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên . Giải

trình tự nucleotide của gen GmIFS1 đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n ta ̣i Phòng thí nghiê ̣m Trọng điểm công nghê ̣ gen , Viê ̣n Công nghê ̣ sinh ho ̣c . Thí nghiệm phân tích hàm lƣợng

isoflavone thƣ̣c hiê ̣n ta ̣i Phòng Công nghệ Thực phẩm - Viện Kiểm nghiệm và vệ

sinh an toàn thực phẩm Quốc gia Hà Nội, Bộ y tế.

2.2. PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U

2.2.1. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng isoflavone trong các mẫu đậu tƣơng ĐT26, DT90, DT84

Hạt đậu tƣơng nảy mầm 3 ngày tuổi đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để chiết rút

daidzein và genistein. Đi ̣nh lƣơ ̣ng daidzein và genistein theo phƣơng pháp HPLC.

Nguyên lý: Dịch chiết chứa daidzein và genistein đƣợc chiết từ mầm đậu tƣơng

sử dụng dung môi thích hợp. Dịch chiết thu đƣợc sau đó đƣợc loại tạp, làm sạch mẫu

qua hệ thống SPE. Dịch thu đƣợc sau đó đƣợc phân tích trên hệ thống HPLC.

Phương phá p phân tích đi ̣nh lƣơ ̣ng daidzein và genistein đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n theo phƣơng pháp AOAC Official 2006.07 và theo Hao Chen và cs (2001) [15].

Cân chính xác khoảng 1-2g mẫu đã đƣợc ủ cho nảy mầm 3 ngày tuổi cho

vào ống ly tâm 50ml có nắp kín, thêm 35 ml dung dịch chiết mẫu, đậy kín nắp, lắc đều. Thủy phân trong 2 giờ tại nhiệt độ 800C, sau đó để nguội và ly tâm 6000

21

vòng/phút trong 5 phút, gạn lấy phần dịch trong phía trên. Thêm 10 ml dịch chiết

vào phần cặn, lắc đều trong 1 phút rồi đem ly tâm, gộp phần dịch trong cho vào

bình định mức 50ml, định mức bằng acetonitril. Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45

µm, phân tích trên HPLC.

HPLC là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là

chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào ái lực của

chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác

nhau, do đó thứ tự khác nhau. Thành phần pha động đƣa chất phân tích ra khỏi cột

đƣợc thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp lý [15].

Điều kiện sắc ký:

Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm)

Nhiệt độ cột: 400C, tốc độ dòng: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 50µl

Detector PDA quét phổ từ 200-400nm, định lƣợng ở bƣớc sóng 260nm

Pha động: gradient giữa methanol và dung dịch đệm format

2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết mRNA tổng số

Ngâm ủ hạt đậu tƣơng cho nảy mầm , sau 3 ngày tuổi sử dụng mầm để

tách RNA tổng số . Sử dụng bộ Kit Trizol Reagents của hãng Invitrogen để tách

. Các dụng cụ sử dụng trong tách chiết RNA tổng số trong điều kiê ̣n vô trùng

RNA đều đƣợc khử DEPC 0,01%. Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo chỉ dẫn của

nhà sản xuất gồm các bƣớc nhƣ sau: (1) Nghiền nhanh mẫu trong nitơ lỏng

bằng chày cối đã khử trùng. (2) Bổ sung 1ml TRIzol reagents, đảo đều, nhẹ

nhàng trong 5 phút. (3) Bổ sung 500µl chloroform:isoamyl (tỉ lệ 24:1) trong

nhiệt độ phòng 5 phút. (4) Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4 oC. (6) Lấy 500µl

dịch nổi sang eppendolf mới loại 1,5ml. (7) Bổ sung 300µl (isopropanol) +

50µl CH3COONa (3M) đảo nhẹ để 15 phút. (8) Ly tâm 12000vòng/phút trong 15 phút ở 4 oC. (9) Loại bỏ dịch nổi, thu tủa. (10) Rửa RNA bằng cồn 70% (đã

pha trong DEPC 0,01%). (11) Ly tâm 6000vòng/phút trong 10 phút. Lăp lại 2

22

lần. (12)Làm khô 15 - 20 phút trong box.

Pha loãng RNA trong 50µl nƣớc khử DEPC 0,01%, ủ trong đá, sau đó ủ ở nhiệt độ 37oC để RNA tan hoàn toàn. Điện di kiểm tra RNA của các mẫu thí

nghiệm trên gel agarose 0,8%-1% trong TAE 1X.

2.2.3. Phƣơng pháp nhân bả n đoạn mã hóa của gen GmIFS1

Tiến hành phản ứng phiên mã ngƣợc tổng hợp cDNA từ mRNA theo bộ kit

ReverdAid First Stand cDNA Synthesis (Thermo Scientific). Thành phần phản

ứng tổng hợp cDNA thể hiện ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA

TT Thành phần Thể tích (µl)

1 1 Mồi OligoT

6 2 RNA khuôn

5 3 H2O (DEPC)

Trộn nhẹ, ủ ở 65oC trong 5 phút, sau đó cho ngay vào đá. Bổ sung thêm các thành phần sau:

4 4 5X Reaction Buffer

1 5 RiboLock Rnase Inhibitor (20 U/µl)

2 6 dNTP 10 mM

1 7 RevertAid H Minus Transcriptase (200 U/µl)

20 Tổng thể tích

Ủ 250C trong 5 phút - 420C trong 60 phút - 700C trong 5 phút. Bƣớc cuối ủ 40C.

SoyIFS- Nhân bản gen GmIFS1 bằng kỹ thuật PCR với că ̣p mồi đặc hiệu

NcoI-F/ SoyIFS-NotI-R có trình tự đƣợc trình bày ở bảng 2.2.

Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi PCR sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́ u

Kích thƣớc Ký hiệu mồi Trình tự mồi (5’-3’) đoa ̣n DNA

SoyIFS-NcoI-F gcgtcgacgATGTTGCTGGAACTTGCACT

1566 bp

23

SoyIFS-NotI-R ccaagcttggtTAAGAAAGGAGTTTAGATGCA

Tiếp tục thực hiện khuếch đại cDNA bằng kỹ thuật PCR và thành phần

phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR (Bảng 2.3 và Bảng 2.4).

Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR

STT Thành phần Nồng độ

1 Nƣớc khử ion 13µl

2 Đệm PCR 10X 2.5µl

2µl 3 MgCl2 (25mM)

4 dNTPs (10mM) 2.5µl

5 Mồi xuôi: SoyIFS-NcoI-F (10pmol/µl) 1µl

1µl 6 Mồi ngƣơ ̣c: SoyIFS-NotI-R (10pmol/µl)

Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ µl) 1µl 7

cDNA ( 10 - 20 ng/µl) 2µl 8

Tổng 25µl

Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong TAE 1X

với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím, mẫu đạt

yêu cầu thì bảo quản.

Mẫu cDNA thu đƣợc từ phản ứng RT - PCR đƣợc tinh sạch phu ̣c vu ̣ cho

tách dòng phân tƣ̉ .

Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (o C) Thời gian Chu kỳ

Biến tính 4 phút 1 1 94

Biến tính 4 giây 2 94

Gắn mồi 30 giây 3 58 30 Kéo dài chuỗi 1 phút 30 giây 4 72

Hoàn tất kéo dài 10 phút 1 5 72

24

Kết thúc phản ứng ∞ 6 15

2.2.4. Tách dòng phân tƣ̉

Tách dòng phân tử đƣợc thực hiện theo Sambrook và cộng sự (2001) [32].

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch theo bộ kit AccuPrep PCR Pu rification (Bioneer)

và gắn vào vector tách dòng pBT để tạo vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp đƣợc

biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt . Chọn

dòng khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp dựa trên kiểu hình khuẩn lạc và bằng

colony-PCR vớ i că ̣p mồi đă ̣c hiê ̣u (Bảng 2.3).

(i) Tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng

Fermentas thực hiện nhƣ sau: (1) Điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1%

với sự có mặt của marker chuẩn và cắt lấy băng DNA quan tâm cho vào ống

eppendorf 2ml. (2) Bổ sung Binding Buffer với gel đã cắt theo tỉ lệ 1:1, ủ ở 55oC

trong 10 phút cho gel tan hoàn toàn tạo dịch trong suốt. (3) Chuyển sản phẩm sang

ống eppendorf màng lọc đáy (cột lọc tím), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30

giây sau đó bỏ dịch đáy. (4) Bổ sung 700 µl Wash buffer, li tâm 13000 vòng/phút

trong 1 phút 30 giây. (5) Chuyển cột lọc tím sang ống eppendorf loại 1.5 ml, mở

nắp trong vòng 5 phút. (6) Bổ sung 40 µl nƣớc khử ion, ủ mẫu ở 550C trong 5

phút, li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. (7) Bỏ cột lọc, thu dịch đáy bảo

quản. (8) Kiểm tra sản phẩm thôi gel bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE

1X với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.

Mẫu đạt yêu cầu bảo quản và sử dụng cho tách dòng gen.

(ii) Tách dòng phân tử

Nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng

Sản phẩm PCR thu nhận đƣợc sau khi tinh sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào

vector pBT.

25

Thành phần của phản ứng gắn gen vào vector nhƣ sau:

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nối gen GmIFS1 vào vector pBT

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 2

2 1

3 H2O Buffer T4 ligase (10X) Enzyme ligation 1

4 Vector pBT 1

5 Gen GmIFS1 5

Tổng 10

Hỗn hợp thu đƣợc từ phản ứng ligation đƣợc ủ ở 220C trong khoảng 2 giờ,

sau đó sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.

Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α

Sau khi thực hiện phản ứng ghép nối gen quan tâm và vector pBT, tiến

hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α.

Các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau: (1) Tế bào khả biến đƣợc lấy từ tủ -85oC

và đƣợc để trong đá trong 20-30 phút. (2) Bổ sung 5 µl vector đã gắn gen vào ống

đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. (3) Hỗi hợp đƣợc đặt trong bình đá 15 phút, rồi ủ ở 420C chính xác 1 phút 30 giây, sau đó chuyển nhanh hỗn hợp vào đá lạnh( sốc

nhiệt) trong 5- 10 phút. (4) Bổ sung 500 µl LB không bổ sung agarose (pepton,

cao nấm men, NaCl) cho vào hỗn hợp. (5) Hỗn hợp đƣợc nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 1 giờ.

26

Cấy trải tế bào biến nạp trên môi trường LB có bổ sung agarose

Đổ môi trƣờng cấy trải (X-gal: 50 µl; IPTG: 50 µl; carbenicillin: 50µl; LB

có bổ sung agarose: 500µl) vào đĩa thủy tinh hoặc nhựa. LB có agarosse (pepton,

cao nấm men, NaCl, agarose).

Mẫu sau khi nuôi phục hồi li tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút,bỏ dịch nổi

giữ lại 150 µl trộn nhẹ. Sử dụng que cấy trải đã khử trùng, trải 150 µl dịch khuẩn lên đĩa có môi trƣờng cấy trải có kháng sinh carbenicillin. Ủ đĩa petri ở 370C trong

16 giờ.

Chuyển khuẩn lạc sang pha nuôi lỏng: Chọn các khuẩn lạc trắng đem nuôi trong

môi trƣờng LB lỏng có bổ sung carbenicillin (tỉ lệ 1000 µl LB không có agarose: 1 µl carbenicillin). Nuôi ở 370C, lắc 200 vòng /phút, trong 16 giờ.

Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR: Lấy dịch nuôi vi khuẩn kiểm tra

sản phẩm chọn dòng bằng colony- PCR với cặp mồi đă ̣c hiê ̣u. Sản phẩm PCR chọn

dòng đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Sau đó

nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh đèn cực tím.

(iii) Tách chiết plasmid tái tổ hợp

Tách chiết plasmid theo bộ kit Plasmid Miniprep Kit của hãng Qiagen có sự

tham gia của 3 loại hóa chất nhƣ sau: Sol I (50 mM glucose, 25mM Tris HCl pH

8, 10mM EDTA pH8); Sol II (0,2M NaOH, SDS 1%); Sol III (60 ml CH3COOK

5M; 11,5ml CH3COOH; 28,5ml H2O).

Quy trình tách plasmid đƣợc thực hiện theo các bƣớc:

(1) Lấy 2ml dịch khuẩn nuôi cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 5

phút, thu cặn.

(2) Hòa cặn trong 100µl Sol I đảo đều cho tan cặn.

(3) Bổ sung 200 µl Sol II, đảo nhẹ trên đá trong 10 phút.

(4) Bổ sung 150µl sol III đảo nhẹ trên đá trong 10 phút.

(5) Sau đó bổ sung 500μl dung dịch chlorofom:isoamyl (24:1), đảo nhẹ và ly tâm

12000 vòng/phút trong 15 phút.

27

(6) Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút sau đó thu dịch nổi. (7) Bổ sung Isopropanol lạnh theo tỉ lệ 1:1.Ủ ở - 200 C, trong 30 phút.

(8) Ly tâm 13000 vòng/phút/ 40 C, trong 10 phút, sau đó thu tủa.

(9) Bổ sung 500µl cồn lạnh 70% lắc nhẹ, ly tâm 13000vòng/phút 10 phút, thu tủa. (10) Làm khô mẫu trong hộp, bổ sung nƣớc 40 µl RNAase, ủ 370 trong 30 phút.

(11) Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE

1X cùng thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.

2.2.5. Phƣơng pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide của gen

Các mẫu plasmid tái tổ hơ ̣p mang gen GmIFS1 đƣợc sử dụng để giải trình tự bằng máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic

Analyzer (Applied Biosystems - Mỹ) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye

Terminator v3.1 Cycle Sequencing.

2.2.6. Phân tích và xƣ̉ lý dƣ̃ liê ̣u

Phân tích, so sánh trình tự gen GmIFS1 đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n bằng phần mềm

BLAST trong NCBI , phân mềm BioEdit và DNAstar .

Các số liệu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê với các gi á trị trung bình

Test ở mức  =

( ), sai số chuẩn ( ) và so sánh các giá trị trung bình bằng t

28

0,001 Theo Chu Hoàng Mâ ̣u (2008) [5].

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. HÀM LƢỢNG ISOFLAVONE TRONG HẠT NẢY MẦM CỦA BA GIỐNG

ĐẬU TƢƠNGĐT26, ĐT90, ĐT84

Hạt của ba giống đậu tƣơngĐT 26, ĐT90, ĐT84 sƣ̉ du ̣ng làm nguyên liê ̣u để 3

phân tích hàm lƣơ ̣ng daidzein và genistein . Hạt đƣợc nảy mầm và khi đƣợc ngày tuổi tiến hành chiết rú t daidzein và genistein (Hình 3.1).

Hình 3.1. Hình ảnh hạt đậu tƣơngnảy mầm 3 ngày tuổi đƣợc sử dụng chiết rút

daidzein và genistein. A. ĐT26, B: ĐT90, C: ĐT84

Đi ̣nh lƣơ ̣ng daidzein và genistein đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n the o phƣơng pháp HPLC .

Đƣờng chuẩn phân tích đƣợc xây dựng với hàm lƣợng daidzein chuẩn ở ba nồng

đô ̣ 4, 20, 40 (ppm), phƣơng trình đƣờ ng chuẩn đƣơ ̣c xây dƣ̣ng đối vớ i daidzein là y = 98815x + 32675, hê ̣ số tƣơng quan R = 1,0. Đối với gen istein, hàm lƣợng

chuẩn ở ba nồng đô ̣ 4, 20, 40 (ppm), phƣơng trình đƣờ ng chuẩn là y = 153816x + 78011, hê ̣ số tƣơng quan R = 0,9999. Kết quả phân tích sắc ký đồ đƣơ ̣c thể hiê ̣n ở hình 3.2.

Tƣ̀ phƣơng trình đƣờ ng chuẩn phân tích đi ̣n h lƣơ ̣ng daidzein và genistein , hàm lƣợng daidzein và kết quả phân tích sắc ký HPLC của các mẫu nghiên cứu

29

và genistein đƣợc tính toán và trình bày ở bảng 3.1.

A

B

C

Hình 3.2. Sắc ký đồ phân tích daidzein , genistein tƣ̀ ha ̣t nảy mầm 3 ngày tuổi của các giống đậu tƣơng. A: ĐT26, B: ĐT90, C: ĐT84.

Kết quả phân tích ở bảng 3.1 cho thấy hàm lƣợng daizdein trong ha ̣t nảy

mầm 3 ngày tuổi từ 27,4 mg/100g đến 59,70 mg/100g, trong đó giống ĐT 26 có

hàm lƣợng dai zdein cao nhất (59,70 mg/100g) và giống ĐT 84 có hàm lƣợng thấp

nhất (27,40mg/100g). Hàm lƣợng genistein dao đô ̣ng từ 1,32 mg/100ml đến 4,57

mg/100g, giống ĐT 26 có hàm lƣợng genistein cao nhất (4,57 mg/100g) và giống

ĐT90 có hàm lƣợng thấ p nhất (1,32mg/100g). Giống đậu tƣơng ĐT 26 có tổng

(64,27 mg/100g) và thấp nhất ở giống hàm lƣợng daidzein và genistein cao nhất

30

ĐT84 (29,43 mg/100g).

Bảng 3.1. Hàm lƣợng daidzein , genistein và isoflavone trong ha ̣t nảy mầm 3 ngày tuổi của 3 giống đâ ̣u tƣơng ĐT26, ĐT90 và ĐT84.

mg/100 g), (  ;  = 0,001)

Isoflavone ĐT26 ĐT90 ĐT84

Daidzein 59,70  1,30 29,30  1,23 27,40  0,49

Genistein 4,57  0,10 1,32  0,10 2,03  0,11

Isoflavone 64,27 30,62 29,43 (daidzein + genistein)

và genistein giữa ba giống đậu tƣơngĐT

Biểu đồ so sánh ở hình 3.3 đã cho thấy sƣ̣ khác nhau về hàm lƣơ ̣ng daizdein 26, ĐT90, ĐT84. So sánh hàm lƣơ ̣ng daizdein trung bình giƣ̃a hai g iống ĐT 26 và ĐT 84 bằng kiểm đi ̣nh t Test ở mức ý

nghĩa  = 0,001 đã xác đi ̣nh đƣơ ̣c giá tri ̣ t TN = 18,62, t = 6,96 và tTN > t. Nhƣ vậy

hàm lƣợng daizdein trong ha ̣t nảy mầm 3 ngày tuổi có sự khác biệt giữa giống đậu

tƣơng ĐT26 và giống đậu tƣơng ĐT 84 ở mức ý nghĩa  = 0,001. Đối với hàm

lƣơ ̣ng genistein, giá trị t TN = 12,90; t = 6,96 và tTN > t. Vâ ̣y hàm lƣợng genistein

trong ha ̣t nảy mầm 3 ngày tuổi cũng có sự khác biệt giữa giống đậu tƣơng ĐT 26

và giống đậu tƣơng ĐT84 ở mức ý nghĩa  = 0,001.

, có chức Flavonoids và isoflavonoid là chất chuyển hóa thứ cấp ở thƣ̣c vâ ̣t

năng sinh học đa dạng và những hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong nhiều

quá trình sinh lý cần thiết. Ngoài ra, flavonoids và isoflavonoid có tác du ̣ng trực

tiếp đến sức khỏe con ngƣời , từ việc giảm nồng độ cholesterol và ngăn ngừa bệnh

[22]. Chính vì vậy khảo sát hàm lƣợng ung thƣ và cải thiện sức khỏe của phụ nữ

isoflavone trong ha ̣t đâ ̣u tƣơng nảy mầm nhằm lƣ̣a cho ̣n giống đâ ̣ u tƣơ ̣ng có hàm

lƣơ ̣ng genistein và daidzein cao đƣơ ̣c chú ng tôi quan tâm . Trong ba giống đâ ̣u

tƣơngđƣơ ̣c cho ̣n để phân tích , ở hạt nảy mầm 3 ngày tuổi của giống ĐT 26 có hàm

lƣơ ̣ng genistein và daidzein cao nhất (64,27 mg/100g) cho nên có thể sƣ̉ du ̣ng làm

31

nguyên liê ̣u chế biến hoă ̣c sƣ̉ du ̣ng trƣ̣c tiếp phu ̣c vu ̣ cải thiê ̣n sƣ́ c khỏe cô ̣ng đồng .

Hình 3.3. Biểu đồ so sánh hàm lƣơ ̣ng daidzein và genistein trong ha ̣t nảy mầm giƣ̃a ba giống đậu tƣơng ĐT26, ĐT90, ĐT84 (mg/100 g). Thanh đƣ́ ng trên mỗi cột

biểu đồ biểu thị sai số chuẩn (  )

Rebeiro và cs (2007) đã khảo sát hoa ̣t đô ̣ng củ a -glucosidase và hàm lƣơ ̣ng

isoflavone trong rễ mầm và lá mầm đâ ̣u tƣơngđã có nhâ ̣n xét rằng, so vớ i thờ i điểm ha ̣t

chƣa nảy mầm, hoạt độ củ a -glucosidase tăng gấp 3,3 lần trong rễ mầm và 2,3 lần

, hạt của ba giống đậu trong lá mầm [29]. Trong kết quả phân tích củ a chú ng tôi

tƣơngcho nảy mầm và sau 3 ngày tuổi đƣợc sử dụng chiết rút và phân tích hàm lƣợng

daidzein và genistein bằng phƣơng pháp sắc ký HPLC cho thấy sƣ̣ khác biê ̣t giƣ̃a ba

giống đâ ̣u tƣơng ĐT26, ĐT90, ĐT84 ở mức ý nghĩ a =0,001. Nhƣ vâ ̣y hàm lƣơ ̣ng

daidzein và genistein còn phu ̣ thuô ̣c vào kiểu gen củ a giống.

3.2. TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA GEN

GmIFS TƢ̀ mRNA CỦ A ĐẬU TƢƠNG

3.2.1. Thiết kế cặp mồi PCR và nhân bản gen GmIFS

Dựa trên trình tự gen IFS của đậu tƣơng đã công bố tại Ngân hàng Gen

mang mã số NM_001249093 [36], cặp mồi đặc hiệu SoyIFS-NcoI-F/ SoyIFS-NotI-

32

R có trình tự nucleotide đƣợc thiết kế cho phản ứng PCR để nhân bản gen GmIFS

từ 3 giống đâ ̣u tƣơng ĐT 26, ĐT90, ĐT84. Cặp mồi đƣợc thiết kế bao gồm cả trình

tự chứa điểm cắt của enzyme giới hạn để phục vụ việc thiết kế và kiểm tra vector chuyển gen sau này . Ở vị trí trƣớc bộ ba mở đầu có bổ sung 9 nucleotide trên mồi

xuôi SoyIFS-NcoI-F chứa điểm cắt của enzyme NcoI và 11 nucleotide trên mồi

ngƣợc SoyIFS-NcoI-R chứa điểm cắt của enzyme NotI ngay sau bộ ba kết thúc .

Đặc điểm của cặp mồi SoyIFS-NcoI-F/ SoyIFS-NotI-R đã thiết kế nhân gen

GmIFS tƣ̀ cây đâ ̣u tƣơngcu ̣ thể là :

SoyIFS-F: 5’ gcgtcgacgATGTTGCTGGAACTTGCACT 3’

SoyIFS-R: 5’ ccaagcttggtTAAGAAAGGAGTTTAGATGCA 3’

Trình tự gen GmIFS đã đƣợc công bố bởi Jung và cô ̣ng sƣ̣ (2015) mang mã

số NM_001249093 trên GenBank vớ i đoa ̣n mã hóa có kích thƣớc 1566 nucleotide,

mã hóa 521 amino acid [36].

Nhƣ vậy, đoa ̣n gen GmIFS đƣơ ̣c nhân bản từ cDNA bằng PCR vớ i cặp mồi

SoyIFS-NcoI-F/ SoyIFS-NotI-R dƣ̣ kiến cho sản phẩm đoa ̣n DNA có kích thƣớc là

9 + 1566 + 11 = 1586 nucleotide.

Hai giống đậu tƣơng ĐT 26 và ĐT 84 khác biệt nhau về hàm lƣợng

daidzein và genistei n đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng làm đối tƣơ ̣ng phân lâ ̣p và so sánh đă ̣c điểm của gen GmIFS. Hạt của hai giống đậu tƣơng ĐT 26 và ĐT 84 đƣợc ngâm ủ , nảy

mầm, khi đƣơ ̣c 5 ngày tuổi tiến hành thu mẫu mô vùng sinh trƣởng của rễ để

phục vụ thí nghiệm tách chiết RNA. RNA tổng số đƣợc tách chiết và tổng hợp

cDNA, gen GmIFS đƣợc nhân bản bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi SoyIFS-

NcoI-F/ SoyIFS-NotI-R và sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel

agarose 1,0% (Hình 3.4). Kết quả nhân bản gen GmIFS ở hình 3.4 cho thấy băng

1,5 kb, đú ng nhƣ tính toán lý

33

DNA đƣơ ̣c nhân bản có kích thƣớ c khoảng hơn thuyết là kích thƣớ c củ a gen GmIFS. Nhƣ vâ ̣y bƣớ c đầu gen GmIFS đã đƣơ ̣c nhân bản thành công từ mRNA của hai giống đậu tƣơngĐT 26 và ĐT84.

Hình 3.4. Kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmIFS tƣ̀ hai giống đâ ̣u tƣơng ĐT26 và ĐT84.

M: thang DNA chuẩn 1kb; Đƣờng chạy số 1, 2, 3: Sản phẩm nhân gen GmIFS tƣ̀ giống đâ ̣u tƣơng ĐT 26; Đƣờng chạy số 4, 5, 6: Sản phẩm nhân gen GmIFS tƣ̀

giống đâ ̣u tƣơng ĐT 84.

3.2.2. Tách dòng phân tử đoạn mã hóa của gen GmIFS trong E.coli

, tinh 1,5 kb đƣơ ̣c tách khỏi bản gel Đoa ̣n DNA có kích thƣớ c khoảng

sạch và gắn vào vector tách dòng pBT và biến nạp vào tế bà o khả biến E.coli

DH5 và chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp dựa vào kiểu hình khuẩn lạc

-PCR vớ i că ̣p mồi SoyIFS-NcoI-F/

và colony -PCR trƣ̣c tiếp tƣ̀ khuẩn la ̣c . Nhƣ̃ng dòng khuẩn la ̣c màu trắng trong đƣơ ̣c lƣ̣a cho ̣n và tiến hành phản ƣ́ ng colony SoyIFS-NotI-R, dƣ̣ kiến đoa ̣n DNA đƣơ ̣c nhân bản có kích thƣớ c khoảng hơn 1,5kb. Lƣ̣a cho ̣n ngẫu nhiên 4 dòng khuẩn lạc có kiểu hình trắng trong để tiến

ứa vector tái tổ hành phản ứng colony -PCR. Kết quả chọn dòng khuẩn lạc ch

hợp bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi SoyIFS-NcoI-F/ SoyIFS-NotI-R

đƣơ ̣c trình bày ở hình 3.5.

Hình 3.5 cho thấy xuất hiện băng DNA có kích thƣớc khoảng 1,5 kb từ 4

dòng khuẩn lạc , đú ng nhƣ kích thƣớ c nhân bản đoa ̣n DNA bằng că ̣p mồi SoyIFS- NcoI-F/ SoyIFS-NotI-R. Sƣ̉ du ̣ng 4 dòng khuẩn lạc dƣơng tính với colony -PCR để

34

tách chiết plasmid tái tổ hợp.

Hình 3.5. A: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony -PCR vớ i că ̣p mồi SoyIFS- NcoI-F/ SoyIFS-NotI-R từ 4 dòng khuẩn lạc có kiểu hình trắng đƣơ ̣c lƣ̣a cho ̣n ngẫu nhiên. M: thang DNA 1 kb; giếng 1, 2: ĐT26; giếng 3,4: ĐT84.

-

Nhƣ vâ ̣y , kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm cắt vector tái tổ hơ ̣p pBT GmIFS bớ i că ̣p enzyme giớ i ha ̣n NcoI và NotI đú ng nhƣ tính toán lý thuyết. Do đó

có thể kết luận rằng , gen GmIFS đã đƣơ ̣c nhân dòng thành công trong vector pBT ở E.coli và plasmid tái tổ hợp pBT-GmIFS đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng giải trình tƣ̣ nucleotide của gen GmIFS.

3.2.3. Trình tự gen GmIFS phân lâ ̣p tƣ̀ hai giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT26 và ĐT84

35

Đoa ̣n mã hóa củ a gen GmIFS đƣơ ̣c xác đi ̣nh trình tự nucleotide tƣ̀ plasmid tái tổ hợp pBT-GmIFS trên thiết bi ̣ giải trình tƣ̣ nucleotide tƣ̣ đô ̣ng , kết quả đƣơ ̣c thể hiê ̣n ở hình 3.6

36

37

Hình 3.6 Trình tự nucleotide của gen GmIFS1 phân lâ ̣p tƣ̀ hai giống đâ ̣u tƣơng IFS1 của giống đậu tƣơng mang mã số ĐT26 và ĐT 84 so vớ i trình tƣ̣ gen NM_001249093 trên Ngân hàng Gen.

GmIFS1 có 1566 3.6 cho thấy đoa ̣n mã hóa củ a gen Kết quả ở hình

nucleotide. Bằng Blast trong NCBI cho thấy tỷ lê ̣ tƣơng đồng vớ i trình tƣ̣ gen

IFS1 của giống đậu tƣơng mang mã số NM _001249093 (trình tự gen sử dụng thiết

kế mồi) trên Ngân hàng Gen là 99%, do vâ ̣y có thể khẳng đi ̣nh trình tƣ̣ nucleotide

phân lâ ̣p đƣơ ̣c tƣ̀ mRNA củ a hai giống đâ ̣u tƣơng ĐT 26 và ĐT84 là đoạn mã hóa

của gen GmIFS1 và gen GmIFS1 phân lâ ̣p tƣ̀ hai giống đâ ̣u tƣơng ĐT 26, ĐT84 có

kích thƣớc 1566 nucleotide, mã hóa 521 amino acid.

Tuy nhiên , giƣ̃a các trình tự nucleotide của gen GmIFS1 của giống đậu

ĐT26, ĐT84 và giống có trình tự gen IFS1 mang mã số NM _001249093 trên Gen

(Bảng 3.2). Kết quả so sánh cho Bank có sƣ̣ khác nhau ở mô ̣t số vi ̣ trí nucleotide

thấy trình tƣ̣ nucleotide của gen GmIFS1 của ba giống đậu tƣơng có 26 điểm sai

khác ở các vị trí 14, 20, 21, 28, 65, 72, 244, 338, 505, 563, 580, 586, 603, 785,

807, 1221, 1334, 1349, 1403, 1534, 1535, 1540, 1544, 1553, 1557, 1559. Nhƣ̃ng

sai sai khác này có liên quan đến hoạt động của enzyme IFS 1 hay không cần phải

có sự nghiên cứu và phân tích sâu hơn.

Tiếp tu ̣c phân tích, so sánh trình tƣ̣ amino acid suy diễn tƣ̀ đoa ̣n mã hóa củ a

gen GmIFS1 của ba giống đậu tƣơng ĐT 26, ĐT84 và NM_001249093 ở hình 3.7

cho thấy protein IFS 1 đều có 521 amino acid , có hệ số tƣơng đồng với

38

NM_001249093 lần lƣơ ̣t là 97,7% và 97,3%.

Bảng 3.2. Sự sai khác về trình tự nucleotide của gen GmIFS1 giƣ̃a các giống đậu

tƣơng ĐT26, ĐT84 và NM_001249093

STT Vị trí nucleotide NM 001249093 ĐT26 DT84

1 14 T A T

2 20 A T T

3 21 A T T

4 28 A A T

5 65 C G C

6 72 A C A

7 244 C C G

8 338 A T T

9 505 G C G

10 563 G C C

11 580 C G G

12 586 C C G

13 603 A C C

14 785 A G A

15 807 G C C

16 1221 C C G

17 1334 G C G

18 1349 G C C

19 1403 A T A

20 1534 T A A

21 1535 C G G

22 1540 G C G

23 1544 A A T

24 1553 A T A

25 1557 G C C

39

26 1559 T A T

Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmIFS 1 phân lâ ̣p tƣ̀ hai giống

đâ ̣u tƣơng ĐT 26, ĐT84 và t ừ gen IFS 1 mang mã số NM _001249093 trên Ngân

hàng Gen

1 có sự Tuy nhiên giƣ̃a các trình tƣ̣ amino acid củ a protein suy diễn IFS

40

khác nhau ở 21 vị trí amino acid (Bảng 3.3).

Bảng 3.3. Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn tƣ̀ gen GmIFS1

giƣ̃a ba giống đâ ̣u tƣơng ĐT 26, ĐT84, NM_001249093

STT Vị trí amio acid Pr-NM001249093 Pr-ĐT26 Pr-DT84

5 1 L H L

7 2 Q L L

10 3 I I F

22 4 P R P

82 5 L L V

113 6 H L L

169 7 A P A

188 8 C S S

194 9 Q E E

196 10 Q Q E

262 11 E G E

269 12 R S S

407 13 C C W

445 14 G A G

450 15 R P P

468 16 Q L Q

512 17 S S R

514 18 G R G

515 19 D D V

518 20 K I K

520 21 L H L

Đậu tƣơng có 2n = 40, n = 20 và họ gen GmIFS ở đậu tƣơng gồm hai gen

41

GmIFS1 và GmIFS2, trong đó gen GmIFS1 có vị trí LOC 106799383 trên nhiễm sắc thể số 7, còn gen GmIFS2 nằm trên nhiễm sắc thể số 13 (Hình 3.8A). Hai trình tƣ̣ gen GmIFS1 tƣ̀ mRNA củ a hai giống đâ ̣u tƣơng ĐT 26 và ĐT 84 mà chúng tôi

thể số 7, có vị trí trong khoảng từ 37260K đến phân lâ ̣p đƣơ ̣c thuô ̣c nhiễm sắc

37270K (Hình 3.8B)

A

B

Hình 3.8. Vị trí của gen GmIFS1 phân lâ ̣p tƣ̀ hai giống đâ ̣u tƣơng ĐT 26

và ĐT84 [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100037450]

3.3. SƢ̣ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TƢ̣ NUCLEOTI DE VÀ AMINO ACID SUY DIỄN CỦ A GEN GmIFS1

3.3.1. Sƣ̣ đa da ̣ng về trình tƣ̣ nucleotide củ a gen GmIFS1

Trình tự gen GmIFS1 của hai giống đậu tƣơngĐT 26 và ĐT84 và 13 trình tự

42

gen IFS củ a đâ ̣u tƣơngđƣơ ̣c công bố trên Ngân hàng Gen (Bảng 3.4) đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng trong phân tích tính đa da ̣ng trong trình tƣ̣ nucleotide và trình tƣ̣ amino acid suy diễn củ a gen IFS ở đâ ̣u tƣơng.

Bảng 3.4. Trình tự gen GmIFS1 của giống đậu tƣơng ĐT 26, ĐT84 và các trình tự

có mã số trên Ngân hàng gen quốc tế đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng trong phân tích

TT Giố ng/ Mã số trên GenBank Năm công bố Tác giả

1 IFS -ĐT26 2015 Chu và cs

2 IFS-ĐT84 2015 Chu và cs

3 NM_001249093 2015 Jung và cs

4 KP843618 2015 Tripathi và cs

5 JN133900 2013 Artigot và cs

6 JQ934956 2013 Artigot và cs

7 EU526830 2010 Xia và cs

8 GU062790 2009 Sohn và cs

9 EU391460 2008 Cheng và cs

10 EU391468 2008 Cheng và cs

11 EU391472 2008 Cheng và cs

12 EU391474 2008 Cheng và cs

13 EU391475 2008 Cheng và cs

14 DQ835285 2007 Chung và Nam

15 AF195798 2000 Jung và cs

Tiến hành phân tích so sánh trình tự nucleotide và trình tƣ̣ amino acid suy

diễn củ a gen GmIFS1 của các giống đậu tƣơng để xác định hệ số tƣơng đồng và hệ

số phân ly (Bảng 3.5), thiết lập sơ đồ hình cây về mối quan hê ̣ di truyền giƣ̃a các giống đâ ̣u tƣơng (Hình 3.9). Kết quả phân tích hê ̣ số tƣơng đồng và hê ̣ số phân ly dƣ̣a trên trình tƣ̣ nucleotide củ a gen GmIFS1 ở bảng 3.5 cho thấy hê ̣ số tƣơng đồng dao đô ̣ng tƣ̀ 98,6% đến 100%, còn hệ số phân ly từ 0,0% đến 1,4%.

Mối quan hê ̣ di truyền giƣ̃a các giống đâ ̣u tƣơng dƣ̣a trên trình tƣ̣ nucleotide

43

của gen GmIFS1 đƣơ ̣c thể hiê ̣n ở sơ đồ hình 3.9. Dƣ̣a trên trình tƣ̣ nucleotide củ a gen GmIFS1, sơ đồ hình cây cho thấy 15 giống đâ ̣u tƣơng chia làm hai nhánh chính, phân bố trong 7 nhóm. Nhánh I chỉ có giống ĐT26, nhánh II gồm giống ĐT84 (nhánh phụ

II-1) và 13 giống còn la ̣i phân bố trong 5 nhóm ở nhánh phụ II -2. Khoảng cách di

truyền giƣ̃a giống ĐT84 và các giống khác là 0,7%.

Bảng 3.5. Hê ̣ số tƣơng đồng và hê ̣ số phân ly củ a các giống đâ ̣u tƣơng dƣ̣a trên

trình tự nucleotide của gen GmIFS1

Hình 3.9. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ củ a mô ̣t số giống đậu tƣơng dƣ̣a tr ên

trình tự nucleotide củ a gen GmIFS1.

3.3.2. Sƣ̣ đa da ̣ng về trình tƣ̣ amino acid suy diễn củ a gen GmIFS1

Tiếp tu ̣c phân tích tính đa da ̣ng di truyền dƣ̣a trên trình tƣ̣ amino acid suy

diễn củ a gen GmIFS1, kết quả phân tích hê ̣ số tƣơng đ ồng và hệ số phân ly của các giống đậu tƣơngdựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GmIFS1 đƣơ ̣c

44

thể hiê ̣n ở bảng 3.6.

Bảng 3.6. Hê ̣ số tƣơng đồng và hê ̣ số phân ly củ a các giống đâ ̣u tƣơng dƣ̣a trên trình tự amino acid suy diễn củ a gen GmIFS1

Bảng 3.6 cho thấy hê ̣ số tƣơng đồng giƣ̃a các giống đâ ̣u tƣơng tƣ̀ 97,3% đến

100% và hệ số phân ly từ 0% đến 2,9%. Mối quan hê ̣ di truyền giƣ̃a các giống đâ ̣u tƣơng dƣ̣a trên trình tƣ̣ amino acid suy diễn củ a gen GmCHI đƣơ ̣c thể hiê ̣n ở sơ đồ hình 3.10. Trên hình 3.10, mƣờ i lăm giống đâ ̣u tƣơngphân bố trong hai nhánh chính. Nhánh chính thứ nhất chỉ có giống ĐT 84 và 14 giống còn la ̣i thuô ̣c nhánh chính thứ hai với khoảng cách di truyền là 1,5%. Trong nhánh chính thƣ́ hai (II) (II-1 và II -2) và nhánh phụ II -1 chỉ có giống ĐT 26, lại chia làm hai nhánh phụ

nhánh phụ II -2 gồm 13 giống còn la ̣i . Nhƣ vâ ̣y sƣ̉ du ̣ng trình tƣ̣ amino acid suy diễn củ a gen GmIFS1 để phân tích mối quan hê ̣ củ a 15 giống đâ ̣u tƣơngcho thấy

các giống đâ ̣u tƣơngphân bố ở 6 nhóm, trong đó nhóm 5 chỉ có giống ĐT 26 và

45

nhóm 6 chỉ có giống ĐT 84.

Hình 3.10. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ củ a mô ̣t số giống đậu tƣơng dƣ̣a

trên trình tự amino acid suy diễn củ a gen GmIFS1

46

Kết quả phân tích dƣ̣a trên trình tƣ̣ amino acid suy diễn củ a gen GmIFS1 ở sơ đồ hình 3.10 thấy giống ĐT 26 và ĐT 84 phân bố ở hai nhánh khác nhau . Điều này có liên quan gì đến sự khác biệt về hàm lƣơ ̣ng isoflavone giƣ̃a hai giống ĐT 26 và ĐT84 là vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu.

KẾ T LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣

1. Kết luâ ̣n

1.1. Hàm lƣợng daidzein, genistein trong ha ̣t nảy mầm 3 ngày tuổi của ba giống

đâ ̣u tƣơng ĐT 26, ĐT90 và ĐT 84 dao đô ̣ng tƣ̀ 29,43% đến 64,27%. Giống đâ ̣u

tƣơng ĐT 26 có hàm lƣợng daidzein , genistein trong ha ̣t nảy mầm 3 ngày tuổi là

cao nhất và thấp nhất ở giống ĐT 84.

1.2. Gen mã hóa isoflavone synthase 1 đã phân lâ ̣p thành công tƣ̀ mARN củ a

giống đâ ̣u tƣơng ĐT 26 và ĐT84. Kích thƣớc của gen GmIFS1 là 1566 nucleotide,

mã hóa 521 amino acid. Hê ̣ số tƣơng đồng về trình tƣ̣ nucleotide củ a gen GmIFS1 ở hai giống đậu tƣơng ĐT 26, ĐT84 là 98,7% và tƣơng đồng với giống đậu tƣơng

mang mã số NM_001249093 trên GenBank là 99,0%.

1.3. Khoảng cách di truyền của giống ĐT 26 và ĐT 84 so vớ i 13 giống đâ ̣u tƣơng có trình tự gen IFS trên GenBank dƣ̣a trên trình tƣ̣ nucleotide củ a GmIFS1 là 0,6% -0,7% và dựa trên trình tự amino acid suy diễn là 1,35% -1,5%.

2. Đề nghi ̣

1. Cần tiếp tục nghiên cứu để tìm mối liên quan giữa sự khác biệt về trình tự

nucleotide và trình tự amino acid với hàm lƣợng daidzein và genistein

ng ĐT 26 có hàm lƣợng 2. Trình tự gen GmIFS1 phân lâ ̣p tƣ̀ giống đâ ̣u tƣơ

daidzein, genistein cao (64,27 mg/100 g) đề nghị sử dụng làm nguyên liệu để thiết

47

kế vector chuyển gen trong mu ̣c đích nâng cao hàm lƣơ ̣ng isoflavone trong đâ ̣u tƣơng bằng kỹ thuâ ̣t chuyển gen .

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾ N LUẬN VĂN

1. Hà Thu Nga , Lê Thi ̣ Hồng Trang , Lê Đình Chắc , Hoàng Phú Hiệp , Chu Hoàng Mậu (2016). Đặc điểm của gen GmIFS phân lâ ̣p tƣ̀ hai giống đâ ̣u tƣơngkhác

48

nhau về hàm lƣơ ̣ng isoflavone . Kỷ yếu Hội nghị Khoa học toàn quốc về nghiên cứu và giảng dạy sinh học ở Viê ̣t Nam. Đà Nẵng 5-2016: 551 -559

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Viê ̣t

1. Vũ Đình Chính (2010), Cây đậu tương và kỹ thuật trồng trọt, Nxb Nông

Nghiệp, Hà Nội.

2. Ngô Thế Dân (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

3. Nguyễn Ý Đức (2000), Dinh dưỡng và sức khỏe, Nxb Y học, TP Hồ Chí Minh.

4. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội.

5. Chu Hoàng Mâ ̣u (2008), Phƣơng pháp phân tích di truyền hiê ̣n đa ̣i trong cho ̣n

giống cây trồng. Nxb Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên.

6. Phạm Văn Thiều, (2002), Cây đậu tương - Kỹ thuật trồng và chế biến sản

phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

Tiếng Anh

7. AccorsiNeto A., Haidar M., Simoes R., Simoes M., Soares J., Baracat E.

(2009), “Effects of isoflavones on the skin of postmenopausal women: a pilot

study”, Clinics (Sao Paulo), 64(6), 505-510.

8. Anderson J.W., Johnstone B.M., Cook Newell M.E. (1995), “Meta-analysis of

effects of soy protein intake on serum lipids in humans”, New England

Journal of Medicine, 333, 276-282.

9. Bolanos R., Del Castillo A., Francia J. (2010), “Soy isoflavones versus placebo

in the treatment of climacteric vasomotor symptoms: systematic review and

meta-analysis”, Menopause, 17(3), 660-666.

10. Bong G.K., Song Y.K., Hee S.S., Chan L., Hor G.H., Su I.K., Joong H.A.

(2003), “Cloning and Expression of the Isoflavone Synthase Gene (IFS-Tp)

fromTrifoliumpratense”, Mol. Cells, 15(3), 301-306.

11. Cheng H, Wang J, Chu S, Yan HL, Yu D, 2013 “Diversifying selection on

flavanone 3-hydroxylase and isoflavone synthase genes in cultivated soybean

and its wild progenitors” PLoS One. ;8(1), 154.

49

12. Dixon RA, Ferreira D (2002), “Genistein”, Phytochemistry. 60(3):205-11.

13. Eduardo F., Luis G., Gilda C., Elba L., Rodrigo M.C. and Ivan P. (2013),

“Soybean - Bio-Active Compounds", Agricultural and Biological Sciences,

25(8), 521-545.

14. Gutierrez-Gonzalez JJ, Guttikonda SK, Tran LS, Aldrich DL, Zhong R, Yu O,

Nguyen HT, Sleper DA. (2010), “Differential expression of isoflavone

biosynthetic genes in soybean during water deficits”, Plant cell physiol, 51(6).

15. Hao Chen, Yuegang Zuo, Yiwei Deng (2001). Separation and determination of

flavonoids and other phenolic compounds in cranberry juice by high-performance

liquid chromatography”, Journal of Chromatography A, 913: 387-395.

16. Ho S.C., Chan A.S., Ho Y.P. (2007), “Effects of soy isoflavone

supplementation on cognitive function in Chinese postmenopausal women: a

double-blind, randomized, controlled trial”, Menopause, 14(3), 489-499.

17. Jin-Ae Kim, Seung-Beom Hong, Woo-suk Jung, Chang-Yeon Yu, Kyung-Ho

Ma, Jae-Goon Gwang, Ill-Min Chung, (2007) “Comparison of isoflavones

composition in seed, embryo, cotyledon and seed coat of cooked-with-rice and

vegetable soybean (Glycine max (L.)) varieties”, Food Chemistry, Volume

102, Isue 3, 738-744

18. Jung W, Yu O, Lau SM, Odell J, Fader G, McGonigle B, (2000),

"Identification and expression of isoflavone synthase, the key enzyme for

biosynthesis of isoflavones in legumes", Nature biotechnology, 18(2):208-212

19. Keshun L. (2004), Soybeans as Functional Foods and Ingredients, University

of Missouri Columbia, Missouri, AOCS Publishing.

20. LinlsakovaP., RiecanskyI., Jagla F. (2010), “The Physiological Actions of

Isoflavone Phytoestrogens”, Physiol. Res,59(1), 651-664.

21. LIX, Qin JC, Wang QY, Wu X, Lang CY, Pan HY, Gruber MY, Gao

MJ(2011), “Metabolic engineering of isoflavonegenistein in Brassica napus

with soybean isoflavone synthase”, Plant Cell Rep.2011 Aug;30(8):1435-

50

1442.

22. Lyle Ralston,2 Senthil Subramanian, Michiyo Matsuno, Oliver Yu (2005), Partial

Reconstruction of Flavonoid and Isoflavonoid Biosynthesis in Yeast Using

Soybean Type I and Type II Chalcone Isomerases. Plant Physiol. 2005 Apr;

137(4): 1375-1388.

23. Maria G.Campos, Miguel P.Matos, Maria T.Camara, Margarida M.Cunha;

(2007) "The variability of isoflavones in soy seeds and the possibility of

obtaining extracts for over the counter tablet preparations that can be

standardized". Industrial Crops and Products, 26: 85-92.

24. Matsura M., Akio O. (2006). β-Glucosidases from Soybeans Hydrolyze

Daidzin and Genistin”, Journal of Food Science, 58(1): 144 - 147.

25. Messina M.J. (2003), “Emerging evidence on the role of soy in reducing

prostate cancer risk”, Nutr Rev, 61(4), 117-131.

26. Oliver Y., Brian M.G.(2005). Metabolic engineering of isoflavone

biosynthesis. Advances in Agronomy 86: 147-190

27. Pendleton J. M., Tan W.W., Anai S. (2008), “Phase II trial of isoflavone in

prostate-specific antigen recurrent prostate cancer after previous local

therapy”, BMC Cancer, 8(1), 13.

28. Redondo - Cuenca. M.J.Villanueva - Suarez, M.D.Rodriguez - Sevilla,

I.Mateos - Aparicio, (2006) “Chemical composition and dietary fibre of

yellow and green commercial soybeans (Glycinemax)”, Food Chemistry. 101:

1216-1222.

29. Ribeiro M.L.L. , J.M.G. Mandarino, M.C. Carrão-Panizzi, M.C.N. de

Oliveira, C.B.H. Campo, A.L. Nepomuceno, E.I. Ida (2007), “Isoflavone

content and β-glucosidase activity in soybean cultivars of different maturity

groups”. Journal of Food Composition and Analysis, 20(1): 19-24.

30. Rimbach G, Boesch-Saadatmandi C, Frank J, Fuchs D, Wenzel U, Daniel H,

Hall WL, Weinberg PD, (2008) “Dietary isoflavones in the prevention of

cardiovascular diseasea molecular perspective”, Food ChemToxicol

51

Apr;46(4):1308-1319.

31. Sacks F.M., Lichtenstein A., Van H.L., Harris W., Kris E.P., Winston M.

(2006), “Soy protein, isoflavones, and cardiovascular health: an American

Heart Association Science Advisory for professionals from the Nutrition

Committee”, American Circulation, 113(7), 1034-1044.

32. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (2001), “Molecular Cloning: A

Laboratory Manual”. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

33. Setchell K.D., Brown N.M., Lydeking O.E. (2002), “The clinical importance

of the metabolite equol-a clue to the effectiveness of soy and its isoflavones”,

Japanese Nutrition, 132(12), 3577-3584.

34. Shuichi K. (2006), “Fundamental concepts in the safety assessment of food

containing soy isoflavones for the purpose of specified health use”, Food

Safety Commission, Novel Foods Expert Committee, Japanese.

35. Sohn SI, Kim YH, Kim SL, Lee JY, Oh YJ, Chung JH and Lee KR. (2015).

Glycine max isoflavone synthase 1 (IFS1), mRNA. GenBank, ACCESSION:

NM_001249093.

36. Sohn SI, Kim YH, Kim SL, LeeJY, Oh Yj, Chung JH, LeeKR (2014),

“Genistein production in rice seed via transformation with soybean IFS

genes”, Plant Sci. 217-218: 27-35. doi: 10.1016/j.plantsci.2013.11.015.

37. V. S. Sreevidya, C. Srinivasa Rao, S. B. Sullia, Jagdish K. Ladha and

Pallavolu M. Reddy, (2006) “Metabolic engineering of rice with soybean

isoflavone synthase for promoting nodulation gene expression in rhizobia”,

Journal of Experimental Botany, Vol. 57, No, 1957-1969.

38. Vantyghem S.A., Wilson S.M., Postenka C.O., Al-Katib W., Tuck A.B.,

Chambers A. F. (2005), “Dietary genistein reduces metastasis in a postsurgical

orthotopic breast cancer model” Cancer Res,65(1), 3396-3403.

39. Wang L.Q. (2002), “Mammalian phytoestrogens: enterodiol and enterolactone”, J

Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sci, 1(2), 289-309.

40. Wei P., Liu M., Chen Y., Chen D.C. (2012), “Systematic review of soy

isoflavone supplements on osteoporosis in women”, Asian Pac J Trop Med,

52

5(3), 243-248.

41. White L.R., Petrovitch H., Ross G.W., et al (2000), “Brain aging and midlife

tofu consumption”, J Am Coll Nutr, 19(2), 242-255.

42. Wiseman H., Casey K., Clarke B.D., Bowey E. (2002), “isoflaoneaglycone and

gluconjugate content of high and low soy UK foods used in nutritional

studies”, J Agric Food Chem, 50 (1), 1404-1410.

43. Woosuk Jung, Oliver Yu, Sze-Mei Cindy Lau, Daniel P. O'Keefe, Joan Odell,

Gary Fader & Brian McGonigle, “Identification and expression of isoflavone

synthase, the key enzyme for biosynthesis of isoflavones in legumes”, Nature

Biotechnology 18, 208 - 212 (2000) doi:10.1038/72671

44. Zhao L., Brinton R.D. (2007), “WHI and WHIMS follow-up and human

studies of soy isoflavones on cognition”, Expert Rev Neurother, 7(11), 1549-

1564.

III. Trang web

45. http://text.123doc.org/document/23325-xay-dung-quy-trinh-chuyen-gen-gus-

vao-giong-dau-tuong-dt26-thong-qua-vi-khuan-agrobacterium-tumefaciens-va-

quy-trinh-tai-sinh-cay.htm

46. http://www.hoasenlk.com/tin-tuc/dau-tuong-166.html

47. http://www.slideshare.net/TranDangLoc/10-isoflavones-tinh-cht-mm-u-nnh-

novasoy

53

48. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001249093.1