Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh đốm muộn bằng chỉ thị phân tử

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:118

Thêm vào BST

Báo xấu

27
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn đã phân tích trên 200 chỉ thị SSR đối với hai giống được sử dụng làm bố mẹ trong quần thể lập bản đồ TB25xTN6; tiến hành đánh giá bệnh đối với các thế hệ BC1F1, BC2F1 của quần thể lập bản đồ, để xác định di truyền tính kháng bệnh đốm muộn là do các QTL quy định.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh đốm muộn bằng chỉ thị phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --------------------------- VŨ HỒNG ANH NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LẠC KHÁNG BỆNH ĐỐM MUỘN BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, tháng 12 năm 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --------------------------- VŨ HỒNG ANH NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LẠC KHÁNG BỆNH ĐỐM MUỘN BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Đồng Thị Kim Cúc Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Phản biện 1: PGS.TS. Phạm Xuân Hội
Lời cảm ơn Trước hết. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ công tác tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại viện. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đồng Thị Kim Cúc, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ, anh chị em trong Trung tâm TNSHNCNC, Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học vừa qua. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học cũng như trong cuộc sống. Luận văn này được thực hiện từ nguồn kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh đốm muộn bằng chỉ thị phân tử” Xin chân thành cảm ơn! Hà nội, tháng 12 năm 2014 Vũ Hồng Anh i
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác, các số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này chưa từng được công bố. Mọi dữ liệu hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên! Tác giả Vũ Hồng Anh ii
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ......................................................................................................... vii CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY LẠC ............................................................. 3 1.1.1 Cây lạc (Arachis hypogaea L.)....................................................... 3 1.2 Bệnh đốm lá muộn ở Lạc ..................................................................... 4 1.2.1 Bệnh đốm lá muộn ở lạc ................................................................ 4 1.2.2 Triệu chứng bệnh đốm lá muộn ..................................................... 5 1.2.3 Di truyền tính kháng bệnh đốm muộn ở lạc................................... 6 1.3 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử ............................................................ 6 1.3.1 Chỉ thị phân tử ................................................................................ 7 1.3.2 Kỹ thuật PCR(Polymerase Chain Reaction) ................................ 11 1.4 Lập bản đồ tính trạng số lượng ( mapping quantitative traits – QTL) 11 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 14 2.1 Vật liệu nghiên và phương pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng ........ 14 2.1.1 Vật liệu ......................................................................................... 14 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 16 2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu dùng cho lấy mẫu, phân lập và lây nhiễm bệnh nhân tạo .............................................................................. 17 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu ...................................................................... 17 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 17 2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm ........... 19 2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN: phương pháp CTAB ................... 19 2.3.4 Kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide ..................................... 24 2.3.5 Xử lý số liệu ................................................................................. 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................... 30 3.1 Thu thập, đánh giá, xây dựng nguồn vật liêu ..................................... 30 3.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm hạt của các giống mẫu ........................... 30 3.1.2 Các chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của lạc .............................. 30 3.1.3 Thu thập nguồn bệnh, đánh giá vật liệu khởi đầu và đánh giá nhân tạo về khả năng kháng bệnh của tập đoàn lạc........................................... 37 3.2 Lập bản đồ QTLs liên kết tính trạng kháng bệnh đốm muộn ............ 43 3.2.1 Xác định chỉ thị cho đa hình giữa các dòng/giống bố mẹ tham gia thí nghiệm ................................................................................................. 43 3.2.2 Phân tích di truyền các cá thể trong quần thể lập bản đồ BC1F1, BC2F1 bằng chỉ thị phân tử SSR đã cho đa hình giữa hai giống bố mẹ. .. 56 iii
3.3 Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh đốm muộn bằng chỉ thị phân tử .......................................................................................................... 64 3.3.1 Xác định giống lạc tiêu biểu có năng suất cao, ổn định nhiễm bệnh đốm lá muộn dùng làm cây nhận QTL/gen kháng ................................... 64 3.3.2 Lai tạo các quần thể trong chọn tạo giống lạc kháng bệnh đốm lá muộn, năng suất cao BC1F1, BC2F1.......................................................... 64 3.3.3 Sử dụng phương pháp chọn giống truyền thống kết hợp với sử dụng chỉ thị phân tử liên kết QTL/gen kháng bệnh đốm lá muộn , chọn lọc cá thể có tiềm năng năng suất, kháng bệnh, dạng hình đẹp triển vọng. ... 64 3.3.4 Kết quả đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh đốm lá muộn ( trong điều kiện nhân tạo) của các cá thể trong qần thể lập bản đồ BC1F1, BC2F1 67 3.3.5 Lập bản đồ, phân tích và xác định các chỉ thị phân tử liên kết với QTL/gen kháng đốm muộn ....................................................................... 75 3.3.6 So sánh tiềm năng năng suất và kháng bệnh của các dòng lạc triển vọng( tại hai vùng Bắc Giang và Nghệ An) ............................................. 83 3.4 Bước đầu đánh giá tuyển chọn giống lạc kháng bệnh đốm lá muộn, năng suất cao ngoài đồng ruộng................................................................... 86 3.4.1 So sánh đánh giá các dòng/ giống lạc kháng bệnh lá đốm muộn ( thế hệ BC2F4) có năng suất cao ................................................................. 86 3.4.2 Khảo nghiệm sinh thái các dòng/ giống lạc kháng bệnh đốm lá muộn, năng suất cao triển vọng ở một số vùng sinh thái. ........................ 89 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 94 1. Kết luận .................................................................................................. 94 2. Kiến nghị................................................................................................ 94 iv
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Nguồn gốc các mẫu giống 14 2.2 Các công thức kết hợp sự thay đổi thành phần phản ứng PCR 21 3.1 Nguồn gốc và đặc điểm hạt các mẫu giống 30 3.2 Sự phân bố của các mẫu giống theo các tính trạng về thân 31 cành 3.3 Sự phân bố các mẫu giống theo các tính trạng hoa và lá 32 3.4 Sự phân bố các mẫu giống theo các tính trạng về quả và hạt 33 3.5 Sự phân bố các mẫu giống theo thời kỳ sinh trưởng 31 3.6 Sự phân bố các mẫu giống theo các chỉ tiêu về năng suất 36 3.7 Sự phát sinh, gây hại của bệnh đốm muộn tại Huyện Diễn 38 Châu – Nghệ An và huyện Tân Yên – Bắc Giang, năm 2012 3.8 Sự phát sinh, gây hại của bệnh đốm muộn ở các giai đoạn 38 sau khi trồng 3.9 Kết quả giám định mẫu bệnh đốm muộn trên lạc (Viện 39 BVTV, tháng 7-2012) 3.10 Kết quả lây bệnh nhân tạo cho lạc bằng nguồn 39 Phaeiosaraopsis personata 3.11 Khả năng kháng bệnh đốm muộn của tập đoàn giống lạc 40 3.12 Danh sách các chỉ thị SSR đã dùng để sàng lọc điều kiện 44 phản ứng PCR 3.13 Danh sách các chỉ thị RAPD đã tham gia sàng lọc 47 3.14 Danh sách 50 chỉ thị dùng trong đánh giá đa dạng di truyền 49 3.15 Khả năng kháng bệnh đốm muộn của các quần thể lai F2 57 3.16 Danh sách các chỉ thị SSR dùng đánh giá đa hình hai giống 60 bố mẹ của quần thể lập bản đồ 3.17 Khả năng kháng bệnh đốm lá muộn của các cá thể BC1F1 của 67 các cặp lai từ TB25/giống kháng 3.18 Danh sách các chỉ thị dùng cho đánh giá đa hình bố mẹ năm 62 2014 3.19 Danh sách chỉ thị đa hình dùng trong phân tích quần thể lập 73 bản đồ 3.20 Khả năng kháng bệnh đốm lá muộn của các cá thể BC1F1 của 75 các cặp lai từ TB25/TN6 3.21 So sánh tiềm năng năng suất của 19 dòng BC2F3 triển vọng 84 (vụ Xuân – Hè 2014) 3.22 Đánh giá khả năng kháng bệnh ĐLM của 19 dòng BC2F3 85 triển vọng (vụ Xuân – Hè 2014) v
3.23 So sánh tiềm năng năng suất các dòng triển vọng (thế hệ 87 BC2F4) (vụ Hè Thu 2014 tại Hoài Đức – Hà Nội) 3.24 Đánh giá khả năng kháng bệnh ĐLM của các dòng Lạc triển 88 vọng thế hệ BC2F4 (vụ Hè Thu 2014 tại Hoài Đức – Hà Nội) 3.25 So sánh đặc điểm nông sinh học của các dòng BC2F5 89 trồng tại Bắc Giang và Hà Nội (vụ thu - đông năm 2014) 3.26 So sánh năng suất của các dòng BC2F5 trồng tại Bắc Giang 91 và Hà Nội (vụ thu - đông năm 2014) 3.27 So sánh khả năng kháng bệnh ĐLM của các dòng BC2F5 92 trồng tại Bắc Giang và Hà Nội (vụ thu - đông năm 2014) vi
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 3.1 Kết quả điện di kiểm tra ADN của các giống trên gel agarose 1%. 42 3.2 Kiểm tra điều kiện phản ứng PCR trên gel agarose 1,5% đối với 49 một số chỉ thị SSR lạc 3.3 Đánh giá đa hình các giống lạc với chỉ thị pPGSeq13E6 trên gel 51 polyacrylamide đối với 64 giống lạc 3.4 Đánh giá đa hình các giống lạc với chỉ thị pPGSeq8H1 trên gel 51 polyacrylamide đối với 64 giống lạc 3.5 Đánh giá đa hình các giống lạc với chỉ thị pPGSeq11H1 trên gel 52 polyacrylamide đối với 64 giống lạc 3.6 Đánh giá đa hình các giống lạc với chỉ thị pPGSeq2F5 trên gel 52 polyacrylamide đối với 64 giống lạc 3.7 Đánh giá đa hình các giống lạc với chỉ thị Lec1 trên gel 52 polyacrylamide đối với 64 giống lạc 3.8 Mức độ phân nhóm chủng loại phát sinh của 64 giống lạc nghiên 53 cứu khi đánh giá với 50 chỉ thị trong chương trình NTSYS 2.1 3.9 Mức độ phân nhóm của 64 giống lạc nghiên cứu khi phân tích số 54 liệu trong chương trình NTSYS 2.1 3.10 Minh họa thí nghiệm đánh giá đa hình di truyền giữa các chỉ thị 56 dùng trong nghiên cứu. 3.11 Đánh giá con lai của quần thể lập bản đồ ở thế hệ F1 57 3.12 Đánh giá ADN các giống lạc sau khi tách chiết và tinh sạch 59 3.13 Sử dụng chỉ thị phân tử PM 179 và pPGPseq2H8 sàng lọc các cá 59 thể của tổ hợp lai BC1F1 TB25/TN6 dùng để phát triển các cá thể của quần thể lập bản đồ. 3.14 Kết quả đánh giá đa hình hai giống lạc TB25 và TN 6 để sàng lọc 64 chỉ thị đa hình dùng cho lập bản đồ, với tổng số 22 chỉ thị cho đa hình 3.15 Đánh giá con lai đã được chọn của quần thể chọn giống 64 3.16 Đánh giá các dòng lạc kháng cao bằng một số chỉ thị đa hình của 65 tổ hợp BC1F1/CNC3 3.17 Sử dụng chỉ thị phân tử PM 179 và pPGPseq2H8 sàng lọc các cá 66 thể của tổ hợp lai BC1F1 TB25/TN6 dùng để phát triển các cá thể của quần thể lập bản đồ. Các cá thể ở Làn 3, 4, 5, 8, 9, 10, 14, 17, 18 mang băng chỉ thị của TN6 (giống kháng bệnh đốm muộn) sẽ được dùng để phát triển quần thể tiếp theo. 3.18 Kết quả sử dụng chỉ thị PM179 để đánh giá các cá thể BC1F2 67 của quần thể lập bản đồ TB25/TN6. vii
3.19 Sử dụng chỉ thị đa hình trong lập bản đồ gen kháng bệnh đốm 76 muộn trên quần thể BC2F1: Chỉ thị Seq13A7 ; Seq7G2 ; Seq3A08 ; Seq3A10 ; GM1501, GM660 3.20 Sử dụng chỉ thị đa hình trong lập bản đồ gen kháng bệnh đốm 77 muộn trên quần thể BC2F1: Chỉ thị GM2009 ; GM2301 ; GN686 ; TC4F12 ; GNB38 ; TC1D12 3.21 Bản đồ nhóm liên kết LG7-G16 đối với 58 cặp mồi sử dụng. 79 LOD = 3. Bên trái là khoảng cách giữa các chỉ thị tính bằng cM. Bên phải là tên của chỉ thị. 3.22 Sử dụng chỉ thị PM179 để chọn cá thể mang gen kháng dòng 81 CL1 3.23 Sử dụng chỉ thị Lec1 để chọn cá thể mang gen kháng dòng CL1 81 3.27 Sử dụng chỉ thị PM179 để chọn cá thể mang gen kháng dòng 82 CL4 TB25; B.TN6 Các dòng B sẽ được chọn trong thế hệ tiếp theo. 3.28 Sử dụng chỉ thị PM179 để chọn cá thể mang gen kháng dòng 82 CL5 TB25; B.TN6 Các dòng B sẽ được chọn trong thế hệ tiếp theo. 3.29 Sử dụng chỉ thị PM179 để chọn cá thể mang gen kháng dòng 82 CL6 TB25; B.TN6 Các dòng B sẽ được chọn trong thế hệ tiếp theo. 3.30 Sử dụng chỉ thị PM179 để chọn cá thể mang gen kháng dòng 82 CL7 TB25; B.TN6 Các dòng B sẽ được chọn trong thế hệ tiếp theo. 3.31 Sử dụng chỉ thị PM179 để chọn cá thể mang gen kháng dòng 83 CL8TB25; B.TN6 Các dòng B sẽ được chọn trong thế hệ tiếp theo. 3.32 Sử dụng chỉ thị PM179 để chọn cá thể mang gen kháng dòng 83 CL11 TB25; B.TN6 Các dòng B sẽ được chọn trong thế hệ tiếp theo 3.33 Sử dụng chỉ thị PM179 để chọn cá thể mang gen kháng dòng 83 CL12 TB25; B.TN3 Các dòng B sẽ được chọn trong thế hệ tiếp theo. 3.34 5 Dòng lạc triển vọng kháng bệnh đốm lá muộn, năng suất cao 91 3.35 So sánh quả và hạt của các dòng lạc triển vọng kháng bệnh đốm 92 lá muộn, năng suất cao(thế hệ BC2F5). viii
MỞ ĐẦU Cây lạc (Arachis hypogaea L.) (2n = 4x = 40) là một trong những cây lấy dầu quan trọng nhất trên thế giới, được trồng khắp từ châu Mỹ, châu Phi, và châu Á với diện tích hàng năm tính trên toàn cầu lên tới gần 22,2 triệu ha, đạt sản lượng 35 triệu tấn, với năng suất bình quân 1,55 tạ/ha [90]. Là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế , giá trị dinh dưỡng cao và có khả năng cải tạo đất tốt . Trong hạt lạc có giá trị dinh dưỡng cao, đặc biệt có chứa nhiều dầu và protein, hàm lượng lipit 40 – 60%, protein 26 – 34%, gluxit 6 – 22%, đồng thời chứa 8 loại axit amin không thay thế và các vitamin hòa tan trong dầu như B1(Thiamin), B2(Riboflavin), PP(Oxit Nicotinic), E, F...Về giá trị cung cấp năng lượng nếu tính theo đơn vị 100gam, thì đối với gạo tẻ là 353 calo, đậu tương 411cal, thịt lợn nạc 286, trứng vịt 189, cá chép 93 nhưng ỏ lạc là tới 590 calo. Ngoài giá trị cung cấp dinh dưỡng cho con người thì lạc còn là nguồn cung cấp thức ăn cho gia súc, tỷ lệ các chất đường, đạm trong thân lá lạc khá cao, đặc biệt trong khô dầu lạc có chứa tới 50% prrotein có thể cung cấp đầt đủ thức ăn cho gia súc. Bên cạnh đó lạc còn là nguyên liệu cho ngành công nghiệp ép dầu. Việt Nam nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa có điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cây nông nghiệp ngắn này. Trong đó cây Lạc chiếm tới 28% tổng diện tích trồng cây công nghiệp hàng năm. Là một trong 10 mặt hàng xuất khẩu tiêu biểu, có giá trị của nước ta (sau dầu thô, dệt may, gạo, hải sản, cà phê, cao su, thủ công mỹ nghệ, đồ da, than đá), trong số các cây trồng hàng năm thì lạc là cây trồng có khối lượng xuất khẩu đứng thứ 2 (sau cây lúa). Tính đến năm 2008 Việt Nam nằm trong nhóm 10 nước đứng đầu về sản lượng lạc trên toàn thế giới. Tuy nhiên cây lạc còn phải đối mặt với nhiều khó khăn trong đó vấn đề trở ngại nhất chính là quản lý sâu bệnh hại. Đốm lá muộn là bệnh do nấm Phaeoisariopsis personata (Berk. & Curt.) gây ra đã ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất cây lạc trên toàn thế giới. Mức độ thiệt hại do bệnh này gây ra tại Việt Nam là 40%. Cách diệt trừ Chính vì vậy, việc quy tụ các đặc tính kháng bệnh vào các giống có tiềm năng năng suất, chất lượng để đáp ứng nhu cầu về giống của sản xuất là hết sức quan trọng. Để làm được điều này, ngoài các phương pháp chọn giống truyền thống cần có sự hỗ trợ của các kỹ thuật công nghệ sinh học. Thực tế công việc chọn tạo giống hiện nay đã chỉ ra rằng, có nhiều tính trạng nông sinh học trên cây lạc rất khó lựa chọn nếu chỉ dùng phương pháp 1
truyền thống. Sử dụng các loại chỉ thị phân tử trong phân tích di truyền giữa các giống lạc trồng đã cho thấy rất ít sự đa dạng về kiểu gen, chứng tỏ cây lạc trồng có một nền di truyền hẹp. Công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) giúp các nhà chọn giống loại trừ được các tính trạng không mong muốn liên kết trong các phép lai và chọn lọc. Do đó, việc nghiên cứu xác định các chỉ thị phân tử có liên quan đến tính kháng bệnh đốm lá muộn góp phần thiết thực trong việc chọn tạo giống kháng bệnh. Ngoài ra, nghiên cứu lập bản đồ QTLs liên kết với yếu tố cấu thành năng suât cũng rất cần thiết và cấp bách. Việc nghiên cứu di truyền tính trạng năng suất giúp các nhà chọn giống có thể quy tụ những đặc tính năng suất vào một cá thể. Để đáp ứng yêu cầu về giống của thực tiễn sản xuất, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh đốm muộn bằng chỉ thị phân tử”. 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY LẠC 1.1.1 Cây lạc (Arachis hypogaea L.) Cây lạc (Arachis hypogaea L) thuộc chi Arachis, phân họ Faboideae, họ Fabaceace có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ. Loại lạc trồng Arachis hypogaea được phân chia thành hai loài phụ là hypogaea và fastigiata. Hai loài phụ này lại được chia thành 6 thứ khác đựa theo đặc tính sinh trưởng, kiểu nở hoa, phân cành, sặ có mặt của lông trên mặt lá và số lượng hạt trong mỗi quả… Là loài cây thân thảo hàng năm tăng có thể cao từ 30–50 cm. Lá mọc đối, kép hình lông chim với bốnlá chét, kích thước lá chét dài 1–7 cm và rộng 1–3 cm. Hoa dạng hoa đậu điển hình màu vàng có điểm gân đỏ, cuống hoa dài 2–4 cm. Sau khi thụ phấn, quả phát triển thành một dạng quả đậu dài 3–7 cm, chứa 1-4 hạt (ánh), và quả (củ) thường dấu xuống đất để phát triển Cây lạc (2n=4x=40) là một trong những cây trồng chính ở hầu hết các vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới có khả năng thích ứng rộng với các điều kiện đất đai, lạc có thể trồng được trên đất pha cát, đất cằn, đất cát, đất chua, đất kiềm. Do đặc điểm bộ rễ có sự cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium Vigna có khả năng cố định đạm vì thế cây lạc là cây trồng có giá trị cải tạo đất. 1.1.2 Giá trị kinh tế Hạt lạc có giá trị dinh dưỡng cao đặc biệt chứa nhiều dầu và protein, hàm lượng lipit 40 – 60%, protein 26 – 34%, gluxit 6 – 22%, đồng thời chứa 8 loại axit amin không thay thế và các vitamin hòa tan trong dầu như B1(Thiamin), B2(Riboflavin), PP(Oxit Nicotinic), E, F vì vậy lạc thường được dùng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp ép dầu sử dụng làm dầu ăn, sử dụng trong y dược, sản xuất mỹ phẩm, xà phòng...Ngoài ra thân lạc có thể được sử dụng làm thức ăn cho gia súc, vỏ lạc dùng làm nhiên liệu, làm tốt đất, làm dây thừng... 1.1.3 Tình hình trồng Lạc ở Việt nam Tổng sản lượng lạc trên thế giới năm 2012-2013 dự báo đạt 39,94 triệu tấn. Tổng diện tích gieo trồng đạt 23,4 triệu ha với năng suất bình quân 1,72 tấn/ha. Ở Việt Nam, năm 2013, sản lượng lạc tăng 5% đạt 492 nghìn tấn so với năm 2012 dù diện tích canh tác giảm 1,4% do năng suất tăng 6,5%. Lạc vừa là cây thực phẩm, làm tốt đất, lại vừa là cây xuất khẩu đem lại thu nhập cao cho nông dân. Trong số 100 nước trồng lạc trên thế 3
giới, Việt Nam đứng thứ 10 về diện tích và thứ 8 về sản lượng. Còn trong số 25 nước trồng lạc ở Châu Á, Việt Nam đứng thứ 5 về diện tích gieo trồng sau Ấn Độ, Trung Quốc, Myanma và Indonesia. Cây lạc được trồng khắp cả nước ta từ các tỉnh miền Đông Nam Bộ đến các vùng núi phía Bắc. Diện tích lạc chiếm 28% tổng diện tích cây công nghiệp hàng năm Tuy năng suất tăng nhưng điều kiện môi trường và áp lực bệnh hại vẫn ảnh hưởng nặng tới năng suất trồng lạc. Bệnh chủ yếu ảnh hưởng tới lạc bao gồm bệnh gỉ sắt và bệnh đốm lá gây nên. Các bệnh này không gây hại riêng rẽ mà xảy ra đồng thời nên thiệt hại càng nghiêm trọng. Bệnh đốm đen và gỉ sắt là hai bệnh hại lá chính có mặt tại hầu hết các vùng trồng lạc ở nước ta. Mùa vụ gối nhau ở miền nam tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh dịch phát triển một cách liên tục. Ở miền Bắc, mức độ phân bố của bệnh đốm đen cũng tương đối rộng, ở đâu trồng lạc là ở đó có bệnh, đặc biệt nghiêm trọng trong vụ Thu so với vụ Xuân. Lạc trồng liên tục 2 vụ trong năm ở miền Bắc bị bệnh lá nặng hơn so với lạc trồng luân canh với lúa nước và cây trồng khác. Thiệt hại do bệnh lá gây ra khác nhau ở các vùng, các mùa trồng và ở trên các giống kháng nhiễm khác nhau. Tại vùng Đông Anh – Hà Nội, vào những năm bệnh hại nặng, năng suất quả lạc giảm 30 - 70 %, đồng thời, chất lượng hạt cũng giảm đáng kể. Tại Bắc Giang, bệnh được ghi nhận có thể làm giảm tới 40% năng suất. Trong trường hợp không áp dụng các biện pháp phòng trừ, tỷ lệ cây bệnh vào giai đoạn tạo quả chín có thể lên tới 100 % với diện tích lá bị bệnh 50 –80%. Tác giả Nguyễn Văn Thắng đã tiến hành đánh giá nguồn vật liệu kháng bệnh đốm lá muộn của cây lạc trong điều kiện miền Bắc Việt Nam đối với 472 mẫu giống bao gồm 25 giống địa phương và 447 dòng nhập nội, chọn ra được 12 mẫu giống kháng bệnh cao đều là các dòng nhập nội. Những giống địa phương như Trạm Xuyên, Đỏ Bắc Giang, Sen Nghệ An, Lỳ, Giấy Nam Định, Mỏ két… đều thuộc nhóm mẫn cảm với bệnh. Chọn giống kháng bệnh là một biện pháp hiệu quả nhất để giảm mức độ thiệt hại do bệnh gây ra mà không ảnh hưởng tới môi trường. 1.2 Bệnh đốm lá muộn ở Lạc 1.2.1 Bệnh đốm lá muộn ở lạc Bệnh đốm lá muộn trên lạc là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất đối với cây lạc trên toàn thế giới. Tác nhân gây bệnh đốm lá muộn là nấm Phaeoisariopsis personata (Berk. & M.A. Curtis van Arx). Bệnh đốm lá muộn có thể tấn công tất cả các bộ phận phía trên mặt đất của cây lạc như lá, cành, thân, hoa. Trong số các bộ phận bị tấn công thì lá là nơi 4
chịu thiệt hại nặng nề nhất. Bệnh gây hại trên cây bằng cách giảm diện tích quang hợp do sự hình thành vết bệnh, và gây rụng lá. Nấm bệnh sản sinh ra độc tố Cercosporin làm giảm hiệu lực hoạt động của lá và là một trong những nhân tố gây nên hiện tượng rụng lá lạc. Tính trên toàn thế giới, mức độ giảm năng suất có thể từ 10-50%, con số này thay đổi ở các vùng và mùa khác nhau [108]. 1.2.2 Triệu chứng bệnh đốm lá muộn Khi bào tử nấm nảy mầm và tấn công vào một trong hai mặt lá, ống mầm của bào tử đi vào bên trong bằng cách xuyên qua mặt bên của tế bào biểu bì hoặc qua những khí khổng mở. Trong giai đoạn đầu của quá trình phát triển bệnh, tế bào biểu bì chết, sau đó nấm tiếp xúc với các tế bào từ bên trong, từ đó bệnh phát triển rất nhanh. Triệu chứng của đốm muộn là những chấm tròn, đen có viền vàng xuất hiện từ mặt dưới lá. Thường những lá chét ở tầng lá dưới bị nhiễm bệnh trước sau đó lan rộng ra xung quanh và leo lên các tầng lá trên. Những đốm này lan rộng khiến lá vàng và bị rụng. Thậm chí ở những cây bị bệnh nặng vết bệnh có ở hầu hết các tầng lá, cuống lá, thân cây và tia củ. Vết bệnh quan sát dưới kính hiển vi có thể thấy lớp bào tử nấm mịn tạo thành vòng tròn đồng tâm. Ở nhiệt độ cao có thể quan sát thấy cả ở mặt trên của lá. Vết bệnh điển hình trên lá có thể thấy trên thân, cành và toàn bộ các bộ phận trên mặt đất của cây. Đốm lá muộn lây lan từ vụ này qua vụ khác chủ yếu qua tàn dư cây bệnh. Trong thời gian cây sinh trưởng và phát triển trên đồng ruộng, bệnh lây lan chủ yếu qua không khí và nước. Nấm Cercosporidium personatum sinh trưởng ở nhiệt độ 25 – 300C và mạnh nhất ở nhiệt độ 27 – 280C, đặc biệt khi có nhiều mưa và sương vào sáng sớm[78] . Quá trình xâm nhiễm của nấm mất khoảng 4 – 12 giờ khi độ ẩm không khí ở mặt lá khoảng 95% hoặc hơn. Đầu tiên nấm sẽ nhiễm vào từng lá già sát mặt đất sau đó lây lan dần sang các lá hình thành sau và cho cây bên cạnh. Bào tử nấm có thể tồn tại trong đất, trong những tàn dư cây bệnh và lây nhiễm cho những vụ trồng sau. Bào tử nấm còn có thể phát tán qua gió, mưa, côn trùng từ cây này sang cây khác, vùng này sang vùng khác. Sau khi tiếp xúc với mặt lá bào tử sẽ mọc những giác mút xuyên thẳng vào tế bào mô lá. Những lá bị nhiễm thường tăng cường độ hô hấp đáng kể. 5
1.2.3 Di truyền tính kháng bệnh đốm muộn ở lạc Chọn tạo giống lạc là một công việc phức tạp đòi hỏi sự nỗ lực bởi vì bản chất tứ bội khác loài của chúng và sự di truyền các đặc tính nông học được quy định bởi các gen chính hoặc đa gen. Holbrook và Isleib đã chỉ ra các giống lạc thuộc chi A. hypogaea có nguồn gốc từ Bolivia có tần suất kháng bệnh cao hơn so với các giống khác. Những giống thuộc dạnh hình Spanish thường nhiễm hoặc nhiễm nặng đối với bệnh đốm đen, ngược lại dạng Virginia lại có mức độ kháng khác nhau. Những dòng lạc kháng bệnh có thể thu được bằng một số cách sau: - Chọn cây cá thể kháng từ các quần thể trong điều kiện áp lực bệnh cao. - Lai giữa giống nhiễm và giống kháng rồi tiến hành đánh giá và chọn lọc dòng kháng. - Lai giữa giống lạc dại kháng cao hoặc là miễn dịch với loài lạc trồng. Sự di truyền tính kháng bệnh lá rất phức tạp. Những thành phần đóng góp cho tính kháng bao gồm quá trình lây nhiễm ban đầu, kích thước vết bệnh, sự hình thành bào tử và quá trình rụng lá [87], [71], . Tính kháng bệnh lá ở lạc thường liên quan tới tính chín muộn . Aquino và ctv [55] đã tìm thấy thời gian lây nhiễm và phần trăm vết bệnh lớn nhất phát sinh bào tử là các thành phần của tính kháng có mối tương quan chặt chẽ với sự phát triển của bệnh đốm đen. Theo Tiwari và ctv [156], có hai gen điều khiển tính kháng bệnh, trong khi đó, Nevill lại giả định rằng có tới 5 locut quy định tính kháng để lý giải cho sự di truyền tính kháng bệnh với toàn bộ các alen lặn. Coffelt và Porter [73] cho rằng di truyền tính kháng bệnh có ảnh hưởng của nhân tố tế bào chất. Như vậy nhìn chung các tác giả đều thống nhất tính kháng bệnh là do tác động gen cộng tính quy định. Các chương trình đang được tiến hành nhằm hội nhập gen kháng vào A. hypogaea. Quá trình chọn giống đã được tiến hành đối với cả bệnh đốm lá sớm và muộn, nhưng quy tụ cả tính kháng bệnh cao vào các giống năng suất cao với những tính trạng hình thái được thị trường chấp nhận vẫn đang là vấn đề đòi hỏi các nhà chọn giống phải tốn nhiều thời gian và công sức. 1.3 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử Sử dụng chỉ thị phân tử được coi là một công cụ có giá trị trong các chương trình chọn tạo giống, các nghiên cứu đa dạng di truyền, tiến hóa và bảo tồn. xác định các chỉ thị ADN liên kết với tính kháng bệnh và vị trí trên 6
bản đồ di truyền là việc cần trước nhất để đóng góp cho chương trình chọn giống liên kết với chỉ thị phân tử(MAS). Việc sử dụng các chỉ thị trên cây lạc sẽ góp phần tích cực trong những nghiên cứu về hệ ghen và hứa hẹn tiềm năng ứng dụng chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử. Việc chọn lọc đồng thời các gen kháng thông qua biểu hiện kiểu hình là rất khó khăn nếu như không nói là không thể thực hiện được. Nhờ sự phát triển của các kỹ thuật chỉ thị phân tử đã giúp khắc phục được khó khăn này. Các thành tựu về lập bản đồ phân tử đã mở ra hướng chọn lọc nhờ sự trợ giúp của các chị thị phân tử liên kết với gen quan tâm. Phương pháp này được áp dụng trong chọn tạo giống cây trồng với các đặc tính nông học quan trọng. 1.3.1 Chỉ thị phân tử Về nguyên tắc, một chỉ thị ADN lý tưởng là chỉ thị thỏa mãn các yêu cầu sau: Bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ dàng. Tuy nhiên gần như không thể tìm thấy một chỉ thị phân tử nào có thể thỏa mãn tất cả các điều kiện. Tùy thuộc vào từng nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị thỏa mãn được một số điều kiện trên. Chỉ thị phân tử được phân ra làm hai loại chính - Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN (RFLP) - Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR ( RADP, AFLP…) 1.3.1.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN : RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism) Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các den liên quan tới bệnh ở người[98]. Các đa hình RFLP sinh ra bởi các đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN hệ gen như đảo đoạn, thêm đoạn, mất đoạn, hoặc mất đi hay thêm vào của một hoặc nhiều nucleotis khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm riêng biệt của mỗi giống, loài hay cá thể. Mỗi loài sinh vật có một bộ ADN genome đặc hiệu. Vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt ADN của hệ gen người ta có thể nhận biết được đoạn ADN có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò. Đó là nguyên lý của kỹ thuật đa hình chiều dài các mảnh phân cắt giới hạn(RFLP). Ở thực vật chỉ thị này lần đầu tiên được áp dụng trong nghiên cứu gen chịu trách nhiệm tổng hợp rARN trong vùng cấu trúc nhân của lúa mì[86]. Từ đó việc lập bản đồ di truyền sử dụng RFLP đã được ứng dụng với nhiều loại cây trồng khác. Chỉ thị RFLP còn được sử dụng trong 7
lập bản đồ QTLs cho tính trạng chất lượng và năng suất lúa, các gen kháng đạo ôn, gen kháng rầy nâu[97]… Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội do vậy có thể phân biệt được các cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử. Đây là đặc điểm ưu việt của chỉ thị RFLP. Hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời gian và công sức, tiêu hao một lượng lớn ADN mà số lượng đa hình thu được ít, thậm chí khó thu được đa hình ở một số loài. 1.3.1.2 Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR(Amplification-based markers hoặc PCR-based markers) Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc tổng hợp ADN nhờ enzym ADN polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu...) với sự có mặt của đoạn ADN khuôn mẫu, ADN mồi, các nucleotid (dNTP) gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP và ion Mg2+ hoạt động như một chất xúc tác. Tùy theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mà có những hệ thống chỉ thị đặc trưng : Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites – Vị trí đánh dấu trình tự) Phương pháp STS lần đầu tiên được nêu ra bởi M. Olson năm 1989 trong nghiên cứu lập bản đồ gen ở người ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời . Loại chỉ thị này được đưa ra nhờ việc xác định trình tự 2 đầu các đoạn mẫu dò RFLP, trên cơ sở đó người ta thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR. Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs- ADN nhân bội ngẫu nhiên) Loại chỉ thị này được sinh ra do sự nhân bội những đoạn ADN hệ gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primers) dài khoảng 10 nucleotid với nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 37C) . Sản phẩm của phản ứng được phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát dưới đèn tím. RAPD sinh ra những chỉ thị trội bởi sự có mặt hay vắng mặt những băng ADN đặc trưng. Vì vậy không phân biệt được thể dị hợp tử. Đó là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP. Lợi thế của loại chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự . Chỉ thị RAPD còn có thể sử dụng trong việc điền vào những chỗ trống trên bản đồ phân tử RFLP [18]. Chỉ thị RAPD còn có một hạn chế nữa là sự nhân bội của nhiều lôcut, độ nhạy của RAPD bị phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng, đặc biệt là ở những cơ thể có hệ gen lớn như lúa mì [83]. Để khắc phục hạn chế này, đôi khi người ta nhân dòng những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của 8
chúng rồi thiết kế những đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu và gọi là chỉ thị SCARs (Sequence - Characterized Amplified Region). Chỉ thị CAPs (Cleaved Amplification Polymorphisms – Đa hình nhân bội được cắt giới hạn) Chỉ thị này dựa trên đa hình độ dài mảnh cắt giới hạn của các sản phẩm PCR . Những sản phẩm PCR từ STS, SCAR, RAPD nhiều khi không thể hiện đa hình độ dài giữa hai mẫu thí nghiệm được cắt thêm bởi các enzym giới hạn. Các enzym sử dụng trong việc tìm loại chỉ thị này thường là enzym cắt 4. Sản phẩm cắt được phân giải trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide tùy thuộc vào kích thước của những mảnh cắt thu được. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms – Đa hình độ dài đoạn cắt nhân bội) Phương pháp linh hoạt này có thể phát hiện được sự có mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào . Vì thế, loại chỉ thị này được sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản đồ gen và xác định chỉ thị phân tử liên kết gen. Nguyên lý của kỹ thuật dựa trên cơ sở nhân bội có chọn lọc những mảnh cắt giới hạn từ ADN hệ gen. Kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kỹ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi. Lượng ADN tổng số tiêu tốn cho kỹ thuật này lại rất ít. Đây là một phương pháp có hiệu quả cao trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen. Tuy nhiên, mặt hạn chế của loại chỉ thị này là chỉ thị di truyền trội, không có khả năng phân biệt giữa thể đồng hợp tử và dị hợp tử, giá thành cho nghiên cứu tương đối cao. Chỉ thị SSAP (Sequence-specific amplification polymorphims – Đa hình nhân bội trình tự đặc hiệu) Loại chỉ thị SSAP này được phát minh ra từ chỉ thị AFLP và ứng dụng PCR mỏ neo đối với các nhân tố chuyển chỗ (gen nhảy). Gen nhảy (transposons) là các trình tự ADN có khả năng di chuyển xung quanh các vị trí khác nhau trong hệ gen của một tế bào, trong quá trình đó, chúng có khả năng gây ra các đột biến và thay đổi thành phần của ADN hệ gen. SSAP là phương pháp AFLP mỏ neo sử dụng một lôcút đặc hiệu, mồi đánh dấu, cùng với mồi đặc hiệu đoạn gắn để chuyển lỗ hổng giữa bất kỳ trình tự ADN của lôcút đặc hiệu nào và một vị trí giới hạn nằm ở một đầu của gen thành một băng trên gel. SSAP là phương pháp đầu tiên sử dụng các đoạn có trình tự lặp lại dài của gen nhảy retrotransposon để chèn vào như là các lô cút [93]. SSAP đã được áp dụng cho đại mạch, đậu, lúa mì và cỏ chân vịt. Trong 9
những nghiên cứu này, chỉ thị SSAP đã cho tỉ lệ đa hình cao hơn hai đến ba lần so với AFLP. Chỉ thị NBS (Nucleotide binding site – Vị trí liên kết nucleotid) Phương pháp AFLP mỏ neo cũng được áp dụng để đánh dấu các gen kháng tại những vùng có vị trí liên kết nucleotide lặp lại giàu leucine (nucleotide binding site-leucine-rich repeat NBS-LRR) [161]. Phương pháp này có ưu điểm là các chỉ thị sẽ tự động liên kết với các gen chức năng có ích. NBS-LRR cho đến nay được tìm thấy nhiều nhất ở các gen kháng trên thực vật, rất nhiều trong số đó đã được nghiên cứu sâu trong thực tế chọn giống [161]. Phương pháp này (còn được gọi là NBS profiling) sử dụng mồi suy biến mà không cần tới các thông tin khác về trình tự bởi vì mức độ bảo thủ cao của các vùng NBS giữa các loài. Giống như SSAP, NBS profiling cũng neo chặt một phản ứng PCR với một trình tự gen đặc hiệu bằng một mồi đặc hiệu và một mồi-đoạn gắn đặc hiệu. NBS profiling đã được áp dụng thành công trong lập bản đồ vùng tương đồng gen kháng và các nghiên cứu đa dạng sinh học. Chỉ thị SNP (Single nucleotide polymorphisms – Đa hình một nucleotid) Gần đây, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy kiểu đa hình một nucleotide SNP (Single nucleotide polymorphisms) khác nhau ở hầu hết trình tự giữa các allen. SNP có thể được sử dụng như là một loại chỉ thị di truyền có thể xác định được ở vùng lân cận của hầu hết các gen. SNP có khả năng sử dụng để phát hiện mối liên kết hình thành giữa các alen trong một gen và kiểu hình. Xác định trình tự của các sản phẩm PCR từ nhiều cá thể là con đường trực tiếp để xác định các đa hình một nucleotide. Mồi PCR được thiết kế để nhân lên những đoạn ADN có kích thước từ 400-700 bp nằm trong các gen quan tâm hoặc trong các vùng trình tự biểu hiện gen được xác định (expressed sequence tag-EST). Người ta thường lựa chọn để nhân bội các vùng gen không mã hóa chẳng hạn như các intron hoặc đầu 3’-không phiên mã (3’-untranslated region - 3’UTRs) để tăng tần xuất đa hình lên. Một nghiên cứu gần đây của Zhu và ctv về trình tự đa hình của 22 giống đậu tương đã xác định được tần xuất của SNP là 1,64 SNP/kb trong vùng gen mã hóa; 4,85 SNP/kb trong vùng gen không mã hóa và 1/3 trong tổng số đầu 3’ của các gen được nghiên cứu có SNP (với độ dài trung bình là 430 bp). SNP cung cấp nguồn chỉ thị đa hình vô hạn để sử dụng trong việc lập bản đồ các tính trạng ở mức độ phân giải cao, trong các nghiên cứu liên quan đến các gen quan tâm hoặc trên toàn hệ gen. Khi đó chúng ta sẽ hiểu rõ hơn 10