Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:98

Thêm vào BST

Báo xấu

1
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học "Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản" trình bày các nội dung chính sau: Đánh giá ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản; Đánh giá ảnh hưởng của số lần cấy chuyển nguyên bào sợi trong nuôi cấy in vitro đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản; Đánh giá ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM PHẠM THỊ KIM YẾN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ PHẠM THỊ KIM YẾN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA NGUYÊN BÀO SỢI ĐẾN HIỆU QUẢ TẠO PHÔI LỢN Ỉ NHÂN BẢN SINH HỌC THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI 2024 Hà Nội – 2024
i
ii
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... vii DANH MỤC BẢNG ..................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................... viiii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3 1.1. Khái quát chung về lợn Ỉ Việt Nam..................................................... 3 1.2. Cấy chuyển nhân tế bào soma (SCNT) ............................................... 4 1.3. Các dạng tế bào soma sử dụng cho quá trình cấy chuyển nhân tế bào soma ........................................................................................................ 6 1.4. Đồng pha chu trình nguyên bào sợi (tế bào cho) về giai đoạn G0/G1 bằng huyết thanh .......................................................................................... 7 1.5. Thời gian nuôi đồng pha....................................................................... 9 1.6. Cơ sở khoa học để xác định được giai đoạn phát triển của nhân tế bào................................................................................................................ 10 1.7. Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển nguyên bào sợi (tế bào cho) trong nuôi in vitro đến hiệu quả tạo phôi lợn nhân bản ................................... 10 1.8. Vai trò của dòng tế bào cho đến hiệu quả tạo phôi lợn nhân bản .. 11 1.9. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ................................................... 12 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 14 2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu..................... 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 14 2.2.1. Phương pháp thu mẫu mô tai lợn ................................................. 14 2.2.2. Phương pháp phân lập nguyên bào sợi từ mẫu mô tai lợn........... 16 2.2.3. Phương pháp cấy chuyển nguyên bào sợi .................................... 16 2.2.4. Đồng pha chu trình nguyên bào sợi .............................................. 17
iv 2.2.5. Kiểm tra, đánh giá nhân nguyên bào sợi bằng hệ thống FACS ... 17 2.2.6. Đông lạnh nguyên bào sợi ............................................................ 18 2.2.7. Giải đông nguyên bào sợi ............................................................. 18 2.2.8. Thu, lựa chọn và nuôi thành thục in vitro tế bào trứng lợn ......... 18 2.2.9. Phương pháp loại nhân tế bào trứng lợn in vitro không có màng sáng (ZP) ................................................................................................. 19 2.2.10. Phương pháp cấy chuyển nhân tế bào soma (tế bào cho) vào tế bào trứng nhận không có màng sáng ...................................................... 20 2.2.11. Phương pháp hoạt hóa tế bào trứng không có màng sáng sau SCNT ....................................................................................................... 21 2.2.12. Phương pháp nuôi phôi lợn ........................................................ 21 2.2.13. Nhuộm phôi bằng Hoechst 33342 ............................................... 21 2.2.14. Xử lý số liệu................................................................................. 22 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 23 3.1. Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản.............................................................. 23 3.1.1. Ảnh hưởng của thời gian đồng pha đến hiệu quả đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ ....................................................................... 23 3.1.2. Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệu quả cấy chuyển nhân tế bào cho vào tế bào chất của tế bào trứng nhận ......................................................................................................... 26 3.1.3. Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản ............................................................ 28 3.2. Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển nguyên bào sợi trong nuôi cấy in vitro đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản .............................................. 32 3.3. Ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản ............................................................................................ 36 3.3.1. Ảnh hưởng của giới tính nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản ............................................................................................... 36
v 3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản ......................................................................................... 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 46 KẾT LUẬN ................................................................................................. 46 ĐỀ NGHỊ..................................................................................................... 46 DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ............................................ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................48 PHỤ LỤC.......................................................................................................58
vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt SCNT Somatic cell nuclear transfer Cấy chuyển nhân tế bào soma PHA Phytohemagglutinin Phytohemagglutinin NCSU-37 North Carolina State Môi trường nuôi cấy của Đại University-37 học Bang Bắc Carolina BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò PZM3 Porcine zygote medium 3 Môi trường nuôi hợp tử lợn 6-DMAP 6-(Dimethylamino)purine 6-(Dimethylamino)purine DPBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Nước muối đệm photphat Saline Dullbecco DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Môi trường DMEM Medium FCS Fetal Calf Serum Huyết thanh thai bê TALP Tyrode albumin lactate Tyrode albumin lactate pyruvate pyruvate IVM In vitro maturation Thành thục trong ống nghiệm POM Porcine oocyte maturation Môi trường nuôi thành thục tế bào trứng lợn EGF Epidermal Growth Factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì dbcAMP Dibutyryl cAMP sodium salt Muối natri dibutyryl cAMP BME BME Amino Acid Solution Dung dịch amino acid BME MEM MEM Non-essential Amino Dung dịch amino acid không Acid Solution thiết yếu MEM
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian đồng pha đến hiệu quả đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ ...................................................................................... 233 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của việc đồng pha đến hiệu quả cấy chuyển nhân tế bào cho vào tế bào chất của tế bào trứng nhận ...................................................... 27 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản ..................................................................... 28 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển nguyên bào sợi trong nuôi cấy in vitro đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản...................................................... 33 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giới tính nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản .......................................................................................................... 36 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu quả cấy chuyển nhân tế bào cho vào tế bào trứng nhận............................................................ 40 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản..................................................................................................42
viii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Lợn Ỉ .................................................................................................. 3 Hình 2.1. Lợn Ỉ đực thuần trước khi thu mẫu mô tai.......................................14 Hình 2.2. Lợn Ỉ cái thuần trước khi thu mẫu mô tai ....................................... 15 Hình 2.3. Thu mẫu mô tai lợn Ỉ ....................................................................... 15 Hình 2.4. Loại nhân tế bào trứng lợn không có màng sáng trong môi trường TALP-Hepes có bổ sung 0,5μg/ml Cytochalasin B bằng micro pipette.........20 Hình 3.1. Kết quả kiểm tra nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ sau đồng pha 24 giờ bằng hệ thống đo dòng chảy tế bào FACS......................................................24 Hình 3.2. Kết quả kiểm tra nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ sau đồng pha 48 giờ bằng hệ thống đo dòng chảy tế bào FACS ...................................................... 25 Hình 3.3. Kết quả kiểm tra nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ sau đồng pha 72 giờ bằng hệ thống đo dòng chảy tế bào FACS ...................................................... 25 Hình 3.4. Kết quả kiểm tra nhân nguyên bào sợi lợn Ỉ sau đồng pha 96 giờ bằng hệ thống đo dòng chảy tế bào FACS ...................................................... 26 Hình 3.5. Phôi lợn Ỉ nhân bản không có màng sáng phân chia ở ngày thứ 2 sau hoạt hóa ........................................................................................................... 29 Hình 3.6. Phôi nang lợn Ỉ nhân bản không có màng sáng được tạo ra từ nguyên bào sợi lợn Ỉ đã được đồng pha về giai đoạn G0/G1 của chu trình tế bào ................................................................................................................... 30 Hình 3.7. Phôi nang lợn Ỉ nhân bản tạo ra từ nguyên bào sợi chưa đồng pha được nhuộm với Hoechst 33342 ..................................................................... 30 Hình 3.8. Phôi nang lợn Ỉ nhân bản tạo ra từ nguyên bào sợi đã đồng pha được nhuộm với Hoechst 33342 .............................................................................. 31 Hình 3.9. Phôi nang lợn Ỉ nhân bản tạo ra từ nguyên bào sợi lợn Ỉ ở lần cấy chuyển thứ 4 được nhuộm với Hoechst 33342 ............................................... 34 Hình 3.10. Phôi nang lợn Ỉ nhân bản tạo ra từ nguyên bào sợi lợn Ỉ ở lần cấy chuyển thứ 5 được nhuộm với Hoechst 33342 ...............................................34 Hình 3.11. Nguyên bào sợi dạng sợi dài (nguyên bào sợi của lợn Ỉ cái 9155, 9157)................................................................................................................ 40
ix Hình 3.12. Nguyên bào sợi dạng hình sao (nguyên bào sợi của lợn Ỉ cái 6004, 9154, 9156)...................................................................................................... 41 Hình 3.13. Ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản .................................................................................................. 43 Hình 3.14. Phôi nang lợn Ỉ nhân bản được nuôi trong hệ thống WOW ......... 41
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việc ứng dụng thành công kỹ thuật cấy chuyển nhân tế bào soma (SCNT) để tạo ra động vật nhân bản đã mở ra nhiều hướng ứng dụng tiềm năng trong nghiên cứu cơ bản, y học và nông nghiệp. SCNT là một phương pháp đang được nghiên cứu và ứng dụng trong việc lai tạo các động vật có chất lượng tốt, bảo tồn các loài động vật đang bị suy giảm về mặt số lượng. Nhân bản động vật bằng SCNT ở động vật có vú là một kỹ thuật để tạo ra một động vật từ một nhân tế bào soma kết hợp với một tế bào trứng đã loại nhân [1] và đã được thực hiện thành công ở một số loài động vật [2]. Tuy nhiên, tỷ lệ thành công vẫn thấp và có một số yếu tố vẫn chưa được hiểu rõ, đặc biệt là ở lợn khi được so sánh với một số loài khác. Việc áp dụng SCNT để nhân bản lợn thành công đã giúp cho các nhà khoa học có nhiều định hướng nghiên cứu mới, đặc biệt là những nghiên cứu có liên quan tới y sinh. Nhiều nghiên cứu ứng dụng SCNT đã được thực hiện ở trên lợn [3]; nhưng tỷ lệ tạo phôi lợn SCNT thấp, tỷ lệ sảy thai cao, con non sinh ra có sức sống kém. Chất lượng phôi lợn nhân bản SCNT có một vai trò quan trọng trong việc tạo được lợn nhân bản. Một số nhà nghiên cứu đã chỉ ra một số yếu tố ảnh hưởng đến việc tạo phôi nhân bản SCNT như: cấy chuyển nhân tế bào soma [4], dòng tế bào cho [5], sự bất thường trong đặc điểm di truyền ở nhiễm sắc thể của tế bào cho [6] trong đó tế bào cho đóng vai trò quan trọng cho sự hình thành phôi lợn nhân bản sau SCNT. Những dòng tế bào cho sử dụng trong SCNT gồm có: tế bào tuyến vú, tế bào cumulus, tế bào ống dẫn trứng, tế bào hạt, tế bào cơ, nguyên bào sợi [7], trong đó nguyên bào sợi thường được ưu tiên lựa chọn để sử dụng cho quá trình tạo phôi SCNT. Kết quả tạo phôi nhân bản chịu tác động của một số yếu tố liên quan đến tế bào cho như: nguồn gốc tế bào cho, số lần cấy chuyển của tế bào cho, giai đoạn phát triển của nhân tế bào cho tại thời điểm được cấy chuyển… Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả tạo phôi SCNT nói chung và phôi lợn SCNT nói riêng các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu các yếu tố liên quan đến tế bào cho. Nghị định 13/2020/NĐ-CP ngày 21/01/2020 của Chính phủ đã xếp lợn Ỉ vào danh sách những loài vật nuôi cần được bảo tồn bởi sự suy giảm về mặt
2 số lượng của chúng hiện nay tại Việt Nam. Nguyên nhân của sự suy giảm số lượng lợn Ỉ là do ảnh hưởng của dịch bệnh như dịch tả lợn Châu Phi, sự gia tăng của các giống lợn thương mại. Việc tạo ra lợn Ỉ nhân bản bằng SCNT không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen lợn Ỉ, đảm bảo sự đa dạng sinh học, mà còn mở ra hướng bảo tồn, phát triển các động vật nuôi có giá trị khác. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản”. 2. Mục đích nghiên cứu Đánh giá được ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản. 3. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Đánh giá ảnh hưởng của việc đồng pha chu trình nguyên bào sợi lợn Ỉ đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản. - Nội dung 2: Đánh giá ảnh hưởng của số lần cấy chuyển nguyên bào sợi trong nuôi cấy in vitro đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản. - Nội dung 3: Đánh giá ảnh hưởng của nguồn gốc nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát chung về lợn Ỉ Việt Nam Lợn Ỉ là một trong 26 giống lợn bản địa của Việt Nam được nuôi hầu như ở khắp các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và Thanh Hoá trước những năm 70 [8]. Lợn Ỉ có hai dòng: lợn Ỉ gộc và lợn Ỉ mỡ. Lợn Ỉ có hình dáng bên ngoài đặc trưng với lớp da đen bóng, mặt nhăn, mắt híp, nọng cổ và má chảy sệ, lưng võng, chân và mõm ngắn, bụng sệ sát đất [9]. Lợn Ỉ cái có dáng đi chữ bát, trung bình đẻ 2 lứa/năm, 8-11 con/lứa đẻ. Khối lượng sơ sinh của lợn Ỉ thấp, chỉ khoảng 0,4kg/con, trọng lượng giai đoạn 1 năm tuổi đạt 36- 45kg/con, giai đoạn 3 năm tuổi đạt 50-75kg/con. Tỷ lệ mỡ ở dòng Ỉ mỡ lên tới 48%, Ỉ gộc lên tới 42% so với thịt xẻ [9]. Tuy nhiên, lợn Móng Cái với sức sinh sản tốt hơn, ngày càng chiếm ưu thế và gia tăng về mặt số lượng, điều này đã khiến cho số lượng lợn Ỉ giảm dần. Từ cuối những năm 70, số lượng lợn Ỉ ngày càng ít dần đến mức độ nguy kịch và có nguy cơ bị tuyệt chủng [8]. Hình 1.1. Lợn Ỉ (Nguồn ảnh: https://trangtraiviet.danviet.vn/gian-nan-phuc-trang-giong-lon-i-co- truyen-88895838.htm) [9]
4 Năm 1989, xã Quảng Giao (Quảng Xương) có 145 lợn nái, con già nhất 15 năm, con trẻ nhất là 2 tháng tuổi, không có gia đình nào nuôi lợn đực giống. Năm 1992, chỉ còn khoảng 465 con nái Ỉ được nuôi tại một số xã tiếp giáp huyện Quảng Xương- Thanh Hóa, tuy nhiên phần lớn đã già có con tới 14 năm tuổi, không có gia đình nào nuôi lợn đực giống vì sợ lỗ vốn, tình trạng đó dẫn đến đàn lợn ngày càng bị hủy diệt vì không có hậu bị thay thế. Nhờ có chương trình bảo tồn quỹ gen vật nuôi quốc gia, lợn Ỉ Thanh Hóa đã mang lại kết quả bảo tồn được 2 con đực giống Ỉ đưa vào sử dụng khai thác phối giống để sản xuất lợn Ỉ thuần. Trong những năm gần đây đàn lợn Ỉ vẫn đang ở trong tình trạng khủng hoảng lợn đực giống và việc sử dụng đực giống với cách làm cho con phối giống với mẹ, anh phối giống với em, do đó xảy ra hiện tượng đồng huyết cao: lợn con đẻ ra hay bị chết, còi cọc, số con đẻ ra/lứa thấp .v.v. Trước tình hình đó, các cán bộ kỹ thuật là những người tham gia công tác bảo tồn quỹ gen lợn Ỉ đã phải sử dụng phương pháp Exsitu chuyển địa điểm nuôi về Viện Chăn nuôi bảo tồn con vật sống và sau này tiến hành bảo tồn tinh đông lạnh [10]. Đồng thời lợn Ỉ đã được Bộ Nông nghiệp và PTNT, Bộ Khoa học và Công nghệ phê duyệt thực hiện chương trình phục tráng và phát triển nguồn gen lợn Ỉ và giao công ty DaBaCo chủ trì thực hiện giai đoạn 2018-2022. Bên cạnh đó Bộ Nông nghiệp và PTNT cũng đã giao cho Phòng TNTĐ Công nghệ tế bào động vật- Viện Chăn nuôi thực hiện nhiệm vụ tạo lợn Ỉ nhân bản bằng kỹ thuật cấy chuyển nhân tế bào soma (giai đoạn 2017-2020 và 2022-2026), với mục đích nghiên cứu ứng dụng công nghệ nhân bản động vật trong việc gìn giữ và phát triển một số loài vật nuôi quý hiếm, có nguy cơ tuyệt chủng tại Việt Nam. 1.2. Cấy chuyển nhân tế bào soma (SCNT) Các phương pháp tạo phôi động vật nhân bản gồm có: cắt phôi, chia tách phôi, cấy chuyển nhân tế bào soma (SCNT). Tuy nhiên, với những ưu điểm của mình nên hiện nay phương pháp tạo phôi SCNT được ứng dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu về nhân bản động vật. Cấy chuyển nhân tế bào soma (SCNT) là kỹ thuật hỗ trợ sinh sản trong đó tế bào soma được chuyển vào tế bào trứng nhận đã loại nhân, từ đó hình thành các cá thể mới giống hệt con cho (cá thể cung cấp tế bào cho) về mặt di truyền.
5 SCNT là một trong những kỹ thuật hỗ trợ sinh sản duy nhất có thể tạo ra được những động vật nhân bản từ những động vật quý hiếm, qua đó tăng nhanh và nhân rộng các kiểu gen ưu việt [11]. Quá trình chuyển nhân tế bào soma được thực hiện bằng kỹ thuật vi tiêm hoặc xung điện tùy thuộc vào từng loại tế bào trứng nhận có hoặc không có màng sáng. Chuyển nhân tế bào cho bằng vi tiêm được áp dụng để tạo phôi nhân bản có màng sáng, còn đối với phôi nhân bản không có màng sáng thì sử dụng dòng xung điện. Kỹ thuật vi tiêm được thực hiện như sau: Các kỹ thuật viên sẽ tạo một lỗ thủng nhỏ trên màng sáng bằng phương pháp cơ học hoặc chiếu tia lazer. Tiếp theo, để đưa được tế bào cho vào bên trong tế bào trứng nhận cần sử dụng một micropipet có chứa một tế bào cho xuyên vào bên trong tế bào trứng nhận, tạo một lực đẩy để nhẹ nhàng đẩy tế bào cho vào bên trong tế bào trứng nhận. Hiện nay, phổ biến nhất là sử dụng một dòng xung điện để cấy chuyển nhân tế bào soma vào tế bào trứng nhận và tạo phôi động vật nhân bản phổ biến nhất [12]. Để thực hiện được, trước khi cấy chuyển, kết dính tế bào trứng nhận với tế bào soma trong môi trường có bổ sung Phytohemagglutinin (PHA) [13]. PHA có tác dụng giúp cho tế bào soma bám dính vào tế bào trứng nhận, từ đó hình thành cặp đôi tế bào trứng nhận – tế bào cho [14]. Trong khi đó đối với phôi lợn nhân bản có màng sáng, trước khi cấy chuyển tế bào cho được đưa vào dưới màng sáng bằng một micropipette thông qua một lỗ thủng trên màng sáng đã được tạo ra trước đó [15]. Tiếp theo quá trình dung hợp sẽ được thực hiện bằng một dòng xung điện. Dưới tác dụng của dòng xung điện, tế bào cho sẽ từ từ di chuyển vào bên trong tế bào chất tế bào trứng nhận mà không làm tổn thương màng tế bào trứng. Theo Lagutina và cs [16], do tế bào cho được chuyển vào dưới màng zona pellucida, và không được bám dính nên chúng di chuyển bên trong không gian dưới màng sáng, vì vậy tỷ lệ dung hợp thành công của tế bào trứng nhận có màng sáng sẽ thấp hơn so với không có màng sáng. Thậm chí ở bò và ngựa, tỷ lệ dung hợp thành công đối với tế bào trứng nhận không màng sáng lên tới 100% [16].
6 1.3. Các dạng tế bào soma sử dụng cho quá trình cấy chuyển nhân tế bào soma Trong quá trình cấy chuyển nhân tế bào soma, các nhà nghiên cứu thường sử dụng một số loại tế bào khác nhau như: tế bào phôi, nguyên bào sợi, tế bào tuyến vú, tế bào cumulus, tế bào ống dẫn trứng, tế bào hạt, tế bào mầm, tế bào gan [7]. Tuy nhiên, do sự thuận tiện của việc phân lập nguyên bào sợi từ bào thai hoặc mô tai của động vật cho, nên nguyên bào sợi thường được các nhà nghiên cứu sử dụng như một nguồn nguyên vật liệu để tạo phôi động vật nhân bản. Hiệu quả tạo phôi và động vật nhân bản của nhiều dạng nguyên bào sợi khác nhau thu từ động vật trưởng thành, động vật mới sinh, bào thai con cái hoặc con đực đã được nghiên cứu và đánh giá. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ phôi nang tạo ra giữa các dạng nguyên bào sợi, ngoại trừ sự khác biệt giữa nguyên bào sợi thu từ cơ của bào thai và nguyên bào sợi thu từ gan của con đực trưởng thành [17]. Wakayama và Yanagimachi [18] cũng không nhận thấy sự khác biệt về hiệu quả tạo phôi chuột nhân bản bằng SCNT từ các nguyên bào sợi ở các chủng, giới tính hay độ tuổi khác nhau. Điều này cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ tạo phôi nhân bản giữa các dạng nguyên bào sợi. Hiện nay, các nguyên bào sợi chủ yếu được thu từ bào thai của động vật cho hoặc mô tai của động vật cho trưởng thành. Theo Miyoshi và cs [19], nguyên bào sợi thu từ bào thai của động vật cho trong quá trình phân lập, nuôi in vitro sẽ ít chịu những tổn thương về mặt di truyền và tăng sinh tốt hơn so với nguyên bào sợi thu từ mô tai động vật cho trưởng thành. Tuy nhiên, Kato và cs [17] không nhận thấy sự khác biệt về tỷ lệ phôi nang bò nhân bản được tạo ra từ nguyên bào sợi của bò cho trưởng thành, bò mới sinh và bào thai bò. Mặc dù vậy, khi Kato và cs [17] đánh giá khả năng có chửa sau cấy chuyển phôi nhân bản thu từ các nguyên bào sợi của bò cho trưởng thành, bò mới sinh và bào thai bò lại nhận thấy tỷ lệ sảy thai ở những bò nhận được cấy chuyển phôi nhân bản có nguồn gốc từ nguyên bào sợi của bò cho trưởng thành là cao hơn so với các nhóm nguyên bào sợi còn lại. Tương tự như vậy, theo Niemann và cs [20] mặc dù không có sự khác nhau về tỷ lệ dung hợp thành công của tế bào cho, khả năng phân chia và phát triển đến giai đoạn phôi nang của tế bào trứng nhận sau cấy chuyển nhân nguyên bào sợi bào thai
7 bò hoặc bò trưởng thành, tuy nhiên hiện tượng sảy thai sau cấy chuyển phôi bò nhân bản lại chỉ xảy ra đối với những bò nhận được cấy chuyển phôi nhân bản có nguồn gốc từ nguyên bào sợi bò trưởng thành. Bất chấp những rủi ro có thể xảy ra khi cấy chuyển phôi nhân bản có nguồn gốc từ nguyên bào sợi của động vật cho trưởng thành, hiện nay nguyên bào sợi của động vật cho trưởng thành vẫn là sự lựa chọn hàng đầu cho quá trình tạo dòng tế bào cho, sử dụng cho quá trình cấy chuyển nhân tế bào soma tạo động vật nhân bản. Nguyên nhân là do việc thu, phân lập nguyên bào sợi từ bào thai của động vật cho sẽ phức tạp hơn so với việc thu nguyên bào sợi từ mô tai của động vật cho trưởng thành. Bên cạnh đó, đối với những động vật nuôi quý hiếm hoặc bị chết đột ngột thì việc thu nguyên bào sợi từ bào thai là việc làm bất khả thi. Chính vì vậy, đối với những động vật nuôi quý hiếm hoặc có giá trị các nhà nghiên cứu vẫn sử dụng nguyên bào sợi có nguồn gốc từ mô tai của động vật cho trưởng thành. Để cải thiện hiệu quả nhân bản từ nguyên bào sợi dạng này, các nhà nghiên cứu đã chuẩn hóa các điều kiện liên quan đến tế bào cho trước khi cấy chuyển nhân như: đồng pha chu trình tế bào cho, điều kiện nuôi phôi nhân bản, nguồn gốc nguyên bào sợi… 1.4. Đồng pha chu trình nguyên bào sợi (tế bào cho) về giai đoạn G0/G1 bằng huyết thanh Việc ứng dụng kỹ thuật SCNT để tạo ra động vật nhân bản với mục đích sử dụng chúng như là nguồn nguyên liệu dùng trong y học với mục đích cấy ghép nội tạng; trong đó lợn là một loài động vật thích hợp nhất sử dụng cho mục đích này đang rất được quan tâm [21]. Nguyên nhân là do một số bộ phận của lợn có sự tương đồng về mặt giải phẫu và vật lý đối với con người. Mặc dù đã có một số nghiên cứu trên thế giới công bố về việc nhân bản lợn thành công bằng kỹ thuật SCNT [22], tuy nhiên hiệu quả tạo lợn con nhân bản vẫn còn thấp, và đó cũng là một trong những trở ngại lớn của việc ứng dụng kỹ thuật SCNT trên động vật [23]. Hiệu quả thấp của kỹ thuật SCNT thể hiện bởi tỷ lệ phát triển phôi thấp và tỷ lệ sảy thai cao trong suốt thời kỳ mang thai, dẫn đến tỷ lệ sống của con non kém. Có nhiều nguyên nhân cũng như lý do để giải thích cho điều này như: sự không đồng bộ giữa tế bào cho và tế bào nhận [24]; những biểu hiện
8 di truyền và nhiễm sắc thể bất thường của tế bào cho [25]; kỹ thuật cấy chuyển nhân [26]. Các ứng dụng của SCNT trong việc tạo phôi và động vật nhân bản đang được cải thiện từng ngày. Nhân tế bào soma được cấy chuyển vào tế bào trứng nhận ở giai đoạn MII trước khi kích hoạt. Các dòng tế bào cho sử dụng trong SCNT bao gồm: các tế bào tuyến vú, tế bào cumulus, tế bào ống dẫn trứng, tế bào hạt, tế bào cơ, nguyên bào sợi [7]. Nguyên bào sợi (Fibroblast) là nguồn nguyên liệu thường được dùng trong quá trình tạo phôi SCNT, tốc độ phát triển của phôi nhân bản được tăng cường khi nhân của tế bào cho ở giai đoạn G0 trong chu trình tế bào [27]. Nguyên nhân có thể là do sự khác biệt về ADN của nhân tế bào cho ở mỗi giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế bào. Các giai đoạn của nhân tế bào cho trong chu kỳ tế bào là một yếu tố rất quan trọng đối với sự thành công của quá trình tạo phôi nhân bản SCNT [28]. Một chu trình của tế bào nhân chuẩn bắt đầu từ giai đoạn G0 (ngừng hoạt động) đến giai đoạn G1 (không có sự tổng hợp ADN), sau đó là đến giai đoạn S (tổng hợp ADN), rồi đến giai đoạn G2 (không có sự tổng hợp ADN) và cuối cùng là giai đoạn M (phân chia tế bào). Theo Campbell và cs [29] tế bào cho có nhân ở giai đoạn G0 là thuận lợi nhất cho việc tái lập trình nhân của nhân tế bào cho; tuy nhiên đến nay theo một số báo cáo đã được công bố thì cho dù nhân tế bào cho ở pha G0 hay pha G1 cũng sẽ không tác động nhiều đến kết quả nhân bản [30]. Tỷ lệ phôi nang phát triển từ nhân tế bào cho ở pha G0 hoặc G1 là như nhau. Để tăng tỷ lệ này, nhân các tế bào cho phải ở pha G0/G1 khi chuyển vào tế bào trứng nhận thành thục loại nhân. Mặc dù Ono và cs [31] cho rằng khi cấy chuyển nhân tế bào cho ở giai đoạn G2/M vẫn tạo được phôi nhân bản, nhưng hiệu quả là không cao khi được so sánh với giai đoạn G0/G1. Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phôi nang được tăng lên khi nhân của tế bào cho ở giai đoạn G0/G1 được chuyển vào tế bào trứng có tế bào chất đã hoạt hóa và loại nhân [32]. Để có thể thu tế bào cho có nhân được đồng pha ở giai đoạn G0/G1 thì các tế bào này sẽ được nuôi dưới một số điều kiện trước khi cấy chuyển nhân. Nuôi ít huyết thanh là một phương pháp thường được sử dụng để đưa nhân tế bào về pha G0/G1 [33]. Thông thường để có thể hoàn thành được đầy đủ chu trình tế bào của mình thì tế bào nuôi cần được cung cấp đầy đủ dinh dưỡng.
9 Nguyên bào sợi của động vật có vú thường đòi hỏi các chất gây phân bào để tăng trưởng thông qua pha G1 của chu trình tế bào. Khi các tế bào đã vượt qua được giai đoạn G1 chúng có thể vào giai đoạn S và hoàn thiện chu trình tế bào mà không cần sự kích thích của các yếu tố phân bào [34]. Việc không có hoặc có ít huyết thanh trong môi trường nuôi sẽ làm giảm quá trình chuyển hóa tế bào và làm cho các tế bào chuyển về giai đoạn G0/G1 [35]. Khi môi trường nuôi ít huyết thanh sẽ làm mất các tín hiệu phân bào, do đó tế bào sẽ nhanh chóng thoát ra khỏi chu trình tế bào trở về trạng thái không phân chia, gọi là pha G0. Đặc trưng của tế bào khi nhân của chúng ở giai đoạn G0 là các hoạt động trao đổi chất rất thấp [36]. Ngoài phương pháp đồng pha chu trình tế bào bằng việc nuôi ít huyết thanh, có thể sử dụng các chất ức chế hóa học để dừng chu trình tế bào ở các giai đoạn khác nhau. Ví dụ như Aphidicolin là một chất ức chế thuận nghịch polymerase ADN động vật có vú và dừng chu trình tế bào ở các quá trình chuyển đổi từ pha G1 đến pha S. Tuy nhiên các chất ức chế hóa học này thường gây ra những ảnh hưởng bất lợi đến tế bào sau khi đồng pha. Theo Mutomba và Wang [37], Aphidicolin dừng chu trình tế bào không thông qua sự ức chế tổng hợp ADN, mà thông qua con đường không xác định. Do đó, nếu tế bào đã bị ngừng chu trình tế bào, sau khi loại bỏ các chất ức chế sẽ không tiếp tục phát triển bình thường ngay sau đó. Theo Michael [38], trong quá trình đồng pha chu trình tế bào động vật có vú, việc dừng tế bào bằng các chất ức chế hóa học có thể dẫn đến hiện tượng mất cân bằng tăng trưởng tế bào, điều này có thể làm giảm số lượng phôi, động vật nhân bản. Chính vì vậy, hiện nay nuôi ít huyết thanh là phương pháp thường được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng để đồng pha nhân tế bào về pha G0/G1 [39]. 1.5. Thời gian nuôi đồng pha Thời gian nuôi đồng pha tế bào cho để nhân của chúng có thể đạt tới giai đoạn G0/G1 là khác nhau giữa các nghiên cứu. Theo Oback và Wells [40], đối với nguyên bào sợi bò cần phải nuôi trong môi trường nuôi ít huyết thanh từ 3-7 ngày thì mới có thể giúp cho nhân nguyên bào sợi chuyển sang giai đoạn G0/G1 và đủ điều kiện sử dụng cho quá trình cấy chuyển nhân. Trong khi đó, Miranda và cs [39]; Sun và cs [41] nhận thấy chỉ cần nuôi