Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng Enzym Cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:88

Thêm vào BST

Báo xấu

102
lượt xem 25
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng Enzym Cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ là nhằm phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh Enzym Cellulase từ rừng ngập mặn Cần Giờ; đề xuất hướng ứng dụng các chủng nấm sợi phân lập được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng Enzym Cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HOÀ CHÍ MINH KHÖU PHÖÔNG YEÁN ANH Chuyeân ngaønh : Vi sinh vaät Maõ soá : 60 42 40 LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC: TS. TRAÀN THANH THUÛY TS. VOÕ THÒ HAÏNH Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2007
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Thanh Thủy, TS. Võ Thị Hạnh- Người đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy Cô trong Bộ môn Vi sinh đặc biệt là cô Tuyến và Ths. Phương phụ trách phòng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cô trong khoa Sinh học, cùng toàn thể quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy trong suốt khóa học. Tôi xin gởi lời cảm ơn tới Sở Giáo dục đào tạo tỉnh An Giang, Trường THPT Vĩnh Trạch – An Giang, những người thân trong gia đình, bạn bè, đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học. Tác giả luận văn
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMP : Adenozin mono photphat CAP : Cataleolite gene Activator Protein CMCase : Carbomexymethyl cellulase CMC : Carboxymethyl cellulose CBH : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase CBHI : Exoglucanase I CBH II : Exoglucanase II DNS : Acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic Enzym : Enzyme EG : Endoglucanase EGI : Endoglucanase I EGII : Endoglucanase II IU : Imeasure Unit (đơn vị hoạt độ) KHV : Kính hiển vi KL : Khuẩn lạc MT : Môi trường PTN : Phòng thí nghiệm PGA : Potato glucose agar RNM : Rừng ngập mặn VSV : Vi sinh vật
MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Sự hiện hữu của rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ là kết quả của hơn 25 năm phục hồi và phát triển bằng các nổ lực to lớn của chính quyền và nhân dân Thành phố Hồ Chí Minh. Vào ngày 21 tháng 1 năm 2000, Ủy ban MAB/ UNESCO đã công nhận RNM Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên tại Việt Nam [55]. RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật quí hiếm và bền vững, có khả năng chịu đựng điều kiện sống rất đặc biệt khắc nghiệt. Là nơi có hệ VSV vô cùng phong phú và đa dạng như nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn…., trong đó nấm sợi chiếm số lượng rất lớn. Nấm sợi đóng vai trò rất quan trọng trong vòng tuần hoàn vật chất và năng lượng của hệ sinh thái RNM, nhờ có khả năng sinh các loại enzym ngoại bào như cellulase, protease, kitinase, amylase, enzym phân giải dầu…..Đặc biệt, enzym cellulase do nấm sợi sống trong RNM sinh ra là rất lớn. Do thảm thực vật dày đặc ở RNM Cần Giờ là nơi sinh sống tốt nhất, nguồn thức ăn dồi dào nhất cho các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym này. Enzym cellulase là hệ enzym bao gồm các loại enzym: C1, Cx, β- glucosidase, có khả năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose. Enzym cellulase được ứng dụng trong nông nghiệp để chế biến thức ăn chăn nuôi, trong công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, trong quá trình li trích các chất từ thực vật, trong việc phân hủy các phế liệu giàu cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% trong số 1 tỷ USD thu được từ lượng enzym công nghiệp được bán ra trên thế giới gồm các enzym cellulase, hemicellulase và pectinase. Đến năm 2005, thị trường enzym công nghiệp trên thế giới tăng từ 1,7- 2,0 tỷ USD.
Hàng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn enzym cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm MT. Việt Nam là nước nhiệt đới có nền nông nghiệp rất phong phú, đa dạng và đang trên đà phát triển. Vì vậy, lượng phế thải nông nghiệp rất dồi dào, cùng với sự công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, ô nhiễm MT đang trở thành nguy cơ thật sự. Thành phần chính trong phế thải rắn trong sinh hoạt công, nông, lâm nghiệp là cellulose. Trong khi đó, RNM Cần Giờ là kho dự trữ các chủng VSV có hoạt tính enzym cao chưa được khai thác. Các công trình khoa học nghiên cứu về khả năng sinh enzym cellulase của các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ cho đến nay vẫn còn bỏ ngõ. Từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên gợi ý cho tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”. 2. Lịch sử vấn đề nghiên cứu  Các công trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase Khả năng sinh enzym cellulase chủ yếu được tổng hợp từ nấm sợi Trichoderma và Aspergillus. Ở Mỹ, năm 1983 PTN của Quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulase đầu tiên. Sau đó, gây biến chủng và chọn lọc được biến chủng QM9414 có khả năng sinh ra cellulase cao (theo Rehm, 1983) [74]. Năm 1998, YU đã nuôi cấy T. reesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột cellulose và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g [68]. Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzym như polygalacturonase, cellulase, xylanase và protease từ A. niger 3T5B8 trên nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán
rắn và ứng dụng enzym trong việc tách chiết dầu thực vật [61]. Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy A. niger trong MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE (chứa 0,2% CMC) phát hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton [67]. Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và một số đặc tính của cellulase (typ CMCase) ở A. niger VS-1 trên MT lên men bán rắn [40]. Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi T. reesei sinh tổng hợp enzym cellulase trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC [40]. Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê [22]. Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của A. niger Rnnl 363. Châu Hoàng Vũ cũng nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ nấm mốc T. reesei bằng phương pháp lên men bán rắn [24], [57]. Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase từ T. reesei và A. niger trên MT lên men bán rắn [40]. Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase và cellulase của một số chủng nấm mốc [27].  Các công trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase từ RNM Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu về phân lập và phân loại nấm sợi trong hệ sinh thái RNM. Nhưng kết quả nghiên cứu còn sơ sài, chưa đáp ứng được nhu cầu hiểu biết về sự đa dạng của nấm sợi cũng như vai trò của chúng trong hệ sinh thái RNM [64]. Trước đây, người ta cho rằng điều kiện MT RNM quá khắc nghiệt, không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi. Tuy nhiên, các
nghiên cứu gần đây cho thấy trong điều kiện sống đặc biệt như vậy, thì con đường trao đổi chất của nấm sợi cũng khác hơn con đường trao đổi chất của các VSV trên đất liền. Vì vậy, sẽ có những sản phẩm trao đổi chất có tính chất đặc biệt hơn, khác lạ hơn trong đó có các enzym, chất kháng sinh mới …[18]. Nhưng đến nay cũng chưa có công trình đi sâu nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chủng nấm sợi từ RNM. Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ có một thông báo của Mai Thị Hằng và cs về nấm sợi RNM. Năm 2002, tác giả này tiếp tục nghiên cứu sự đa dạng, nghiên cứu khả năng diệt côn trùng và khả năng phân giải cacbua hydro của nấm sợi từ RNM ở hai tỉnh Nam Định, Thái Bình. Riêng ở RNM Cần Giờ chỉ có một số ít nghiên cứu về phân lập. Cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào về khả năng sinh enzym cellulase của các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ [19], [20], [21]. 3. Mục đích nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ RNM Cần Giờ. Đề xuất hướng ứng dụng các chủng nấm sợi phân lập được. 4. Đối tượng nghiên cứu - Hệ sinh thái RNM Cần Giờ. - Nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase ở RNM Cần Giờ. - Enzym cellulase sinh ra từ nấm sợi. 5. Phạm vi nghiên cứu Do hạn chế về thời gian nên đề tài chỉ nghiên cứu phân lập các chủng nấm sợi ở 6 xã của huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã An Thới Đông, xã Tam Thôn Hiệp, xã Long Hòa, xã Thạnh An, xã Lý Nhơn. Sau đó, chỉ nghiên cứu một số chủng nấm sợi có khả năng sinh một loại enzym cellulase trong hệ enzym này.
Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh và PTN Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh. 6. Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ. - Tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase cao. - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa và phân loại các chủng nấm sợi được tuyển chọn. - Nghiên cứu các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp enzym cellulase của các chủng được chọn. - Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm sợi sinh enzym cellulase vào việc phân hủy các chất phế thải, góp phần hạn chế ô nhiễm MT. 7. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ. - Phương pháp vi sinh. - Phương pháp hóa sinh. - Phương pháp thực nghiệm. - Phương pháp thống kê toán học. 8. Dự kiến cấu trúc Luận văn gồm phần mở đầu, 3 chương và phần kết luận kiến nghị được trình bày như sau: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và bàn luận Kết luận và kiến nghị.
Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm tự nhiên RNM Cần Giờ RNM chiếm một phần đáng kể trong các kiểu rừng ngập nước, thường tồn tại ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trên thế giới hiện nay còn khoảng 15 triệu ha RNM phân bố ở các vùng bờ biển có bùn, các cửa sông lớn, các vịnh cạn và các đầm mặn giáp với biển. RNM Cần Giờ tiếp giáp với Thành phố Hồ Chí Minh, là “lá phổi xanh” của thành phố. Có tác dụng giảm tốc độ gió, ngăn bão vào đất liền, hạn chế xói lở bảo vệ bờ biển, bờ sông, điều hòa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi và tạo MT phát triển ngành thủy sản. Bên cạnh đó, RNM Cần Giờ còn là nơi cung cấp thức ăn, là nơi cư trú, sinh sản của các loài thủy sinh vật và động vật có xương sống ở cạn. Hiện nay, Cần Giờ còn là địa điểm du lịch hấp dẫn với 3.000 - 5.000 du khách đến tham quan mỗi tuần [83]. RNM Cần Giờ hiện nay có diện tích khoảng 29,380 ha chiếm 41,18 % đất huyện Cần Giờ [87]. Khí hậu nóng ẩm và chịu chi phối của quy luật gió mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ 1.300mm đến 1.400mm hàng năm. Nhiệt độ trung bình là 25,80C, biên độ nhiệt dao động trong ngày từ 5-70C. Chế độ bán nhật triều không đều. Độ mặn dao động 18 ‰ – 30 ‰ [1]. Một nghiên cứu mới đây cho biết RNM Cần Giờ đã có 157 loài thực vật; 63 loài phiêu sinh vật; 130 loài Tảo thuộc 3 ngành: Tảo khuê, Tảo giáp, Tảo lam; 100 loài động vật đáy không xương sống như tôm, cua, sò ốc. Ngoài ra, còn có 120 loài cá, trong đó có các loài có giá trị kinh tế cao như cá Ngát, cá Dứa, cá Chẽm; 31 loài bò sát như cá sấu, trăn, rắn, kỳ đà nước; 19 loài hữu nhũ như khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng và 145 loài chim [83]. Đây là các nguồn thức ăn tốt nhất cho hệ nấm sợi sống trong RNM. Nấm sợi có khả năng
tiết ra hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có trong lá cây, thân cây ở RNM thành glucose để sử dụng. Ngoài ra, nấm sợi còn có thể sinh các loại enzym khác như protease, amylase, kitinase…phân hủy xác, vỏ tôm, cua, ốc, xác chết các loài động vật khác thành các chất dinh dưỡng chúng có thể hấp thu [1]. Hình 1.1. Bản đồ RNM Cần Giờ [83] Vậy, hệ nấm sợi là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố không thể thiếu trong chu trình chuyển hóa vật chất ở RNM Cần Giờ. Chúng sử dụng chất hữu cơ từ thảm thực vật và hệ động vật phong phú làm thức ăn, đồng thời có tác dụng làm giảm ô nhiễm MT ở RNM Cần Giờ. 1.2. Nấm sợi tổng hợp enzym cellulase Rất ít VSV có khả năng sinh tất cả các loại enzym cần thiết để phân giải cellulose ở dạng tinh thể. Chúng phải tiết ra hệ enzym phức tạp, có khả năng phân hủy cellulose theo phương thức khác nhau như thủy phân, oxy hoá [51], [52]. Cellulose bị phân rã dưới tác dụng của vi khuẩn háo khí và kỵ khí. Song khả năng phân hủy cellulose không bằng nấm, do vi khuẩn thường tạo ra enzym cellulase với hàm lượng nhỏ thấp hơn 0,1g/l [51]. Cellulase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn trong dạ cỏ Ruminococcus albus (Berger
1963), vi khuẩn hiếu khí Cellulomonas sp (Elberson, 2000), vi khuẩn kỵ khí Clostridium sp (Parsiegla, 1998) [39], các loài xạ khuẩn Streptomyces, Thermomonospora …[51]. Nấm sợi là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy cellulose. Các enzym cellulase sản sinh từ nấm sợi được tạo ra với nồng độ rất cao, không có các dạng vật lý phức tạp như cellulase bắt nguồn từ vi khuẩn và có tác dụng phân hủy rất mạnh cellulose. Các chi nấm có khả năng sinh cellulase phổ biến là: Aspergillus, Alternaria tenuis, Celluvirio gilvus, Clasdosporium, Penicillium, Fusarium, Myrotheticum, Trichoderma … [39]. 1.2.1. Đặc điểm hình thái của nấm sợi Nấm sợi là VSV có nhân chuẩn. Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo từ kitin-glucan, kitozan. Hệ nấm sợi được cấu tạo bởi các sợi nấm (hypha) không vách ngang hoặc có vách ngang (septum). Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể (hình 1.2). Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm (hình 1.3). KL nấm sợi thường có dạng hình tròn, hoặc gần tròn. Bề mặt KL có thể mượt, nhẳn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những vết khía xuyên tâm, hoặc lồi lõm không đều. Mép KL trơn, răng cưa…. Hình 1.2. Bào tử mọc ra khuẩn ty [78] Hình 1.3. KL nấm [78] Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm.
Các đặc điểm hình thái khác như có bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết, sắc tố hòa tan…, làm KL nấm sợi có tính đặc trưng loài [78]. Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp phụ qua màng, không có cơ quan tiêu hóa, không có khả năng quang hợp. Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật [18]. Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính. Bào tử vô tính. Bao gồm các động bào tử, bào tử trần, bào tử kín. Bào tử trần là dạng bào tử phổ biến nhất. Hình 1.4. Các dạng bào tử trần của nấm sợi [78] Sinh sản hữu tính. Nấm sợi có các hình thức sinh sản hữu tính như: đẳng giao, dị giao, và tiếp hợp. Hình 1.5. Sự tiếp hợp của nấm sợi [78] Ngoài ra, lớp nấm Túi và nấm Đảm sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospores) và bào tử đảm (basidiospores). 1.2.2. Đặc điểm phân loại của nấm sợi Trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài. Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài. Phân loại vi nấm vẫn đang ở thời kỳ phân loại học hình thái (Phenetic classifications) dựa vào đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một số đặc
điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh sản. Trong những năm gần đây, tiến bộ của sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học nấm. Hiện nay, tồn tại các hệ thống phân loại nấm không thống nhất với nhau, chủ yếu là các hệ thống phân loại theo Ainsworth và cộng sự (1973), V.Arx (1981), Ainsworth & Bisby (1995), Alexopoulos & Mins (1996), Robert A. samson (1989), Saccardo P.A (1880-1886), Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984) …[78]. Trong luận văn này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tả trong các khóa phân loại: Saccardo P.A (cải tiến), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Đặng Hồng Miên, Nguyễn Đức Lượng (2003), Nguyễn Lân Dũng (2006) để phân loại [8], [9], [10], [12] [14], [27], [74]. 1.2.3. Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi Nấm sợi được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh tế cao như: nguồn enzym, các chất kháng sinh, các axit hữu cơ, các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydro được ứng dụng trong xử lý ô nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất ….[5], [6], [40], [43].  Hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào Enzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể [29]. Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 3.500 loại enzym, trong đó phần lớn là enzym từ thực vật và VSV. Nấm sợi có tiềm năng lớn nhất sinh các loại enzym ngoại bào mạnh, phân giải và chuyển hoá các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên. Một số enzym đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: cellulase, protease, amylase, pectinase và kitinase [6].  Enzym cellulase. Xúc tác phân giải các hợp chất ligno - cellulose
thành glucose. Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose (30-40%), hemi-cellulose và lignin (15-30%). Các chủng nấm sợi Trichoderma, Penicillium, Aspergillus….có khả năng sinh enzym cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose…[19], [20], [21].  Enzym protease. Protein là các polyme cấu tạo từ các axit amin liên kết nhau bằng liên kết peptid rất dễ bị cắt đứt tạo thành các chuỗi polypeptid ngắn. Nấm sợi có khả năng phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi Aspergillus, Penicillium,… Được sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp bột giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da, công nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải…[5], [6], [29].  Enzym amylase. Xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ yếu của thực vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzym amylase (α-amylase, β-amylase và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4- glucoside và α-1,6-glucoside trong phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose. Nấm sợi có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là những tác nhân không thể thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor….. Được ứng dụng trong sản xuất sirô, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia súc, trong công nghiệp dệt…[29], [30].  Enzym kitinase. Kitin là các biopolyme chứa các gốc N-acetyl- glucozamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β-1,4-glucoside. Trong RNM, lượng kitin trong xác, vỏ tôm, cua, ốc…rất nhiều. Nấm sợi Trichoderma, Glycladium, Chaetomium,… sinh enzym kitanase phân giải kitin, đồng thời tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây bệnh có thành tế bào là kitin, chống các loài côn trùng có vỏ kitin. Như vậy, nấm sợi còn có vai trò làm tác nhân kiểm soát sinh học chống
các VSV gây bệnh và côn trùng có hại trong nông-lâm- ngư nghiệp [18], [19]. Các chủng nấm sợi Acremonium, Aspergillus, Penicillium còn có khả năng sinh enzym phân giải dầu mỏ và khí đốt là hợp chất có cấu tạo phức tạp và khó phân giải, góp phần xử lý ô nhiễm dầu do các tai nạn chìm tàu dầu. Đặc biệt là ở RNM Cần Giờ lượng dầu tràn vào từ biển gây ô nhiễm và độc hại đối với sinh vật sinh sống ở RNM Cần Giờ, các loài nấm sợi có khả năng phân giải dầu sẽ sử dụng dầu như nguồn thức ăn và bảo vệ MT ở đó. Hình 1.6. Hoạt tính enzym của nấm sợi trên MT thạch [78]  Khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi Kháng sinh là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm sợi chiếm tỉ lệ khá lớn. Chất kháng sinh được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, bệnh viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván. Trong phẫu thuật chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương. Những vấn đề về chất kháng sinh được sinh ra từ VSV đang là vấn đề quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc sống ngày nay [10].  Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều. Các axit hữu cơ như axit axetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong
y học. Năm 2004, Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu sản xuất axit xitric bằng nấm sợi A. niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì [17]. Ngoài ra, các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng nấm sợi F. monoforme và F. oxysporum [29]. Tuy nhiên, có rất nhiều loài nấm sợi mọc trên các nguyên vật liệu, đồ dùng, thực phẩm, phá hỏng hoặc làm giảm chất lượng của chúng. Một số nấm sợi tiết độc tố gây ngộ độc hoặc có thể gây ung thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan. Một số gây bệnh cho người và động vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm tay chân…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ bông ở lúa…[29]. 1.3. Enzym cellulase từ nấm sợi Ngày nay, nguồn enzym từ VSV như amylase, cellulase, protease, kitinase…được chú ý nhiều nhất do có những ưu điểm: Có hoạt tính cao; khối lượng enzym thu được nhiều do tốc độ sinh sản của VSV nhanh; nguyên liệu rẻ tiền; có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp …[29]. 1.3.1. Khái quát về enzym  Cấu trúc Enzym là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng sinh học [30]. Enzym có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 Dalton, được cấu tạo từ L-axit amin liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzym. Enzym gồm 2 nhóm: Nhóm enzym một cấu tử gồm những enzym có thành phần hóa học duy nhất là protein và nhóm enzym hai cấu tử gồm những enzym có hai thành phần: phần protein thuần gọi là apoenzym có vai trò xúc tác, phần thứ hai là coenzym gồm những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác. Ngoài ra, có một số kim loại như Fe, Cu, Zn, Mn,
…đóng vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, liên kết giữa apoenzym và coenzym, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử [30].  Cơ chế hoạt động Hoạt động của phân tử enzym được biểu hiện trong trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động của enzym (E) có cấu trúc không gian tương ứng với cơ chất (S) mà chúng tham gia. Phản ứng không có sẳn mà được hình thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất giống như chìa khóa vào ổ khóa tạo thành enzym - cơ chất (E-S). Cơ chế tác động của enzym vào cơ chất qua ba giai đoạn: Giai đoạn 1: Enzym (E) tương tác với cơ chất (S) bằng những liên kết yếu tạo thành phức enzym - cơ chất (E-S). Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzym (E) sẽ bị thay đổi cấu hình không gian và mức độ bền vững các liên kết. Các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm. Phức enzym cơ chất (E-S) sẽ được tách ra. Giai đoạn 3: Enzym sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản phẩm và tách khỏi enzym. Phản ứng tổng quát: E + S  E-S  E + P E- enzym (enzyme) ; S- cơ chất (substracte) ; P- sản phẩm (Products) 1.3.2. Cellulose và enzym cellulase 1.3.2.1. Cellulose Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murashima, 2002), được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.109 tấn/năm. Hàng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp. Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được tích lũy trong đất. Do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác rưởi,
giấy vụn, mùn cưa…[5], [6]. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40-50% trong gỗ [52]. Cellulose là polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharit gọi là cellobiose có cấu trúc từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucoside. Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành những bó nhỏ gọi là các micrôfibrin có cấu trúc không đồng nhất. Có những phần đặc gọi là phần kết tinh và phần xốp hơn gọi là phần vô định hình. Hình 1.7. Cấu trúc đơn vị cellulose [84] Hình 1.8. Liên kết hydro trong cấu trúc phân tử của cellulose [84] Hình 1.9. Cấu tạo của phân tử cellulose trong không gian [84]
1.3.2.2. Enzym cellulase  Cấu trúc Trong thiên nhiên không gặp cellulase ở dạng tinh khiết. Nó thường tồn tại ở dạng kết hợp với các enzym khác như: cellulase, hemicellulase, pentozanase thành hệ enzym gọi là Citolase [39]. Cellulase là một phức hệ enzym bao gồm các enzym C1, Cx và β-glucosidase tham gia những phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose tạo thành glucose [29]. Hình 1.10. Cấu trúc enzym cellulase trong không gian [86]  Enzym C1: Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự nhiên thành cellulose phản ứng (cellulose vô định hình).  Enzym Cx: Còn gọi là enzym β-1,4 glucanase, thủy phân cellulose phản ứng thành cellobiose. Enzym này được chia thành hai loại: - - Endocellulase hay Endoglucanase (EG) (EC.3.2.1.4): Có tác dụng thủy phân liên kết β-1,4-glucozit tại các điểm bất kỳ trên mạch phân tử cellulose. Được chia làm hai loại EGI, EGII. Cả hai loại enzym này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao. Hình 1.11. Cấu trúc tinh thể của endoglucanase [81]
- Exocellulase hay exoglucanase (CBH) (EC.3.2.1.91): Phân giải chuỗi trên thành disaccarit gọi là cellobiose từ đầu không khử. Bao gồm hai loại CBHI và CBHII: * CBHI có trọng lượng phân tử khoảng 65KD, chứa khoảng 496 axit amin. Enzym này tác động lên cellulose vô định hình, ưu tiên liên kết với vùng tinh thể của cellulose, không tác động lên cellulose biến tính như CMC. * CBHII có trọng lượng phân tử là 53KD, chứa khoảng 471 axit amin. CBHII liên kết với cả vùng tinh thể và vùng vô định hình, không tác động lên cellulose biến tính [52]. Hình 1.12 . Cấu trúc CBH [80] Hình 1.13. Vị trí cắt exoglucanase [80]  β-glucosidase hay cellobiase (EC.3.2.1.21): Thủy phân cellobiose thành glucose. Là nhóm enzym khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH rất rộng từ 4,4 đến 8,4. Trọng lượng phân tử 50- 95 KD, có thể hoạt động ở nhiệt độ cao.  Cơ chế hoạt động C1 Cx β-Glucosidase Cellulose Cellulose Cellobiose Glucose phản ứng Hình 1.14. Cơ chế tác động của enzym cellulase [39] Theo Mandels và Reese (1964), đầu tiên, enzym C1 phá vỡ liên kết hydrogen trong phân tử cellulose tạo thành cellulose phản ứng.