Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất từ quả mướp đắng (Momordica charantia L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐAN THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC HỢP CHẤT

TỪ QUẢ MƯỚP ĐẮNG (Momordica charantia L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

Hà Nội – 11/2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐAN THỊ THÚY HẰNG ĐAN THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC HỢP CHẤT ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC HỢP CHẤT

TỪ QUẢ MƯỚP ĐẮNG (Momordica charantia L.) TỪ QUẢ MƯỚP ĐẮNG (Momordica charantia L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. PHAN VĂN KIỆM PGS. TS. PHAN VĂN KIỆM

Hà Nội – 11/2015 Hà Nội – 11/2015

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh

biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với sự hỗ trợ kinh phí của đề

tài cấp Viện Hàn lâm: “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân lập hoạt chất

momordicoside A từ quả Mướp đắng Momordica charantia L. và tác dụng của nó

trong điều trị tiểu đường trên động vật thực nghiệm”.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phan Văn Kiệm, Viện Hóa

sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã tận tình

hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh

vật, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và phấn đấu để

hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra của luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của tập thể các cán bộ Viện

Hóa sinh biển và tập thể cán bộ Phòng Nghiên cứu cấu trúc đã động viên, giúp đỡ

tôi trong quá trình thực hiện luận văn này.

Hà Nội, 11/2015

Đan Thị Thúy Hằng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luận văn này là

trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kì công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành luận văn đã được

cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này.

Hà Nội, 11/2015

Đan Thị Thúy Hằng

MỤC LỤC

MỤC LỤC .............................................................................................................. I

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... III

DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. IV

DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... V

ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1

Chương 1. Tổng quan ........................................................................................ 3

1.1. Một vài nét về thực vật của cây mướp đắng .............................................. 3

1.1.1. Mô tả thực vật ...................................................................................... 3 1.1.2. Phân bố và sinh thái ............................................................................ 3 1.1.3. Công dụng của cây mướp đắng trong y học dân gian .......................... 4 1.2. Thành phần hóa học của loài mướp đắng ................................................ 5

1.3. Tác dụng dược lí của loài mướp đắng .................................................... 11

1.3.1. Hoạt tính trị bệnh tiểu đường ............................................................. 11 1.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm .................................................... 12 1.3.3. Hoạt tính kháng virus ........................................................................ 13 1.3.4. Hoạt tính chống ung thư .................................................................... 13 1.3.5. Hoạt tính chống viêm loét .................................................................. 14 1.3.6. Hoạt tính điều hòa miễn dịch ............................................................. 14 1.3.7. Hoạt tính kháng viêm ......................................................................... 14 1.4. Bệnh tiểu đường và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase .................. 15

1.4.1. Bệnh tiểu đường................................................................................. 15 1.4.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ............................................. 17

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ........................................ 20

2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 20

2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 20

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất .................................................. 20 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất ....................... 21 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase .......... 22

Chương 3. Thực nghiệm .................................................................................. 24

3.1. Phân lập các hợp chất ............................................................................. 24

3.2. Các thông số vật lí của các hợp chất đã phân lập được .......................... 25

I

3.2.1. Hợp chất MC1: Charantoside D ........................................................ 25 3.2.2. Hợp chất MC2: Charantoside E ........................................................ 25 3.2.3. Hợp chất MC3: Charantoside F ........................................................ 25 3.2.4. Hợp chất MC4: Charantoside G ........................................................ 26 3.2.5. Hợp chất MC5: Goyaglycoside-c ....................................................... 26 3.2.6. Hợp chất MC6: Goyaglycoside-d ...................................................... 26 3.2.7. Hợp chất MC7: Momordicoside F1. .................................................. 26 3.2.8. Hợp chất MC8: Momordicoside N ..................................................... 27 3.2.9. Hợp chất MC9: Momordicoside M .................................................... 27

Chương 4. Kết quả và thảo luận ...................................................................... 29

4.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ................................................. 29

4.1.1. Hợp chất MC1: Charantoside D (hợp chất mới) ................................ 29 4.1.2. Hợp chất MC2: Charantoside E (hợp chất mới) ................................ 34 4.1.3. Hợp chất MC3: Charantoside F (hợp chất mới) ................................ 39 4.1.4. Hợp chất MC4: Charantoside G (hợp chất mới) ................................ 44 4.1.5. Hợp chất MC5: Goyaglycoside-c ....................................................... 49 4.1.6. Hợp chất MC6: Goyaglycoside-d ...................................................... 54 4.1.7. Hợp chất MC7: Momordicoside F1 ................................................... 58 4.1.8. Hợp chất MC8: Momordicoside N ..................................................... 62 4.1.9. Hợp chất MC9: Momordicoside M .................................................... 67 4.2. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ...................... 71

KẾT LUẬN .......................................................................................................... 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 75

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

PHỤ LỤC PHỔ

II

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tiếng Anh

1H-NMR

Kí hiệu 13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

CC DEPT Diễn giải Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Sắc kí cột Phổ DEPT

DMSO HMBC

HSQC

Resonance Spectroscopy Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Column chromatography Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Dimethyl sulfoxide Heteronuclear mutiple Bond Connectivity Heteronuclear Single-Quantum Coherence Inhibitory concentration at 50% IC50

NF-B RP-18 SRB TLC TMS WHO Nuclear Factor-kappa B Reserve phase C-18 Sulforhodamine B Thin layer chromatography Tetramethylsilane World Health Organization Dimethyl sulfoxide Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Yếu tố nhân kappa B Chất hấp phụ pha đảo RP-18 Sulforhodamine B Sắc ký lớp mỏng Tetramethylsilane Tổ chức Y tế Thế giới

III

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC1 và hợp chất tham khảo .... 30

Bảng 2. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC2 và hợp chất tham khảo .... 36

Bảng 3. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC3 và hợp chất tham khảo .... 41

Bảng 4. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC4 và hợp chất tham khảo .... 46

Bảng 5. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC5 và hợp chất tham khảo .... 51

Bảng 6. Số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất MC6 và hợp chất tham khảo .............. 55

Bảng 7. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC7 và hợp chất tham khảo .... 59

Bảng 8. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC8 và hợp chất tham khảo .... 63

Bảng 9. Số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất MC9 và hợp chất tham khảo .............. 67

IV

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Hình ảnh loài mướp đắng ........................................................................... 4

Hình 2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ quả mươp đắng (M. charantia L.) ............ 28

Hình 3. Cấu trúc hóa học của MC1, hợp chất tham khảo MC1A và các tương tác

HMBC chính của MC1. ......................................................................................... 29

Hình 4. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC1 .......................................................... 31

Hình 5. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC1 ............................................................... 32

Hình 6. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC1 .............................................................. 32

Hình 7. Phổ HSQC của chất MC1 ......................................................................... 33

Hình 8. Phổ HMBC của chất MC1 ........................................................................ 33

Hình 9. Phổ NOESY của chất MC1 ....................................................................... 34

Hình 10. Cấu trúc hóa học của MC2, hợp chất tham khảo MC2A và các tương tác

HMBC chính của MC2. ......................................................................................... 34

Hình 11. Phổ HR-ESI-MS của chất MC2 ............................................................... 37

Hình 12. Phổ 1H-NMR của chất MC2 .................................................................... 37

Hình 13. Phổ 13C-NMR của chất MC2 ................................................................... 38

Hình 14. Phổ HSQC của hợp chất MC2 ................................................................ 38

Hình 15. Phổ HMBC của chất MC2 ...................................................................... 39

Hình 16. Cấu trúc hóa học của MC3, hợp chất tham khảo MC3A và các tương tác

HMBC chính của MC3. ......................................................................................... 39

Hình 17. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC3 ........................................................ 42

Hình 18. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC3 ............................................................. 42

Hình 19. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC3 ............................................................ 43

Hình 20. Phổ HSQC của hợp chất MC3 ................................................................ 43

Hình 21. Phổ HMBC của hợp chất MC3 ............................................................... 44

Hình 22. Cấu trúc hóa học của MC4, hợp chất tham khảo MC4A và các tương tác

HMBC chính của MC4. ......................................................................................... 44

Hình 23. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC4 ........................................................ 47

V

Hình 24. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC4 ............................................................. 47

Hình 25. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC4 ............................................................ 48

Hình 26. Phổ HSQC của hợp chất MC4 ................................................................ 48

Hình 27. Phổ HMBC của hợp chất MC4 ............................................................... 49

Hình 28. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của MC5. .................... 49

Hình 29. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC5 ............................................................. 52

Hình 30. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC5 ............................................................ 52

Hình 31. Phổ DEPT hợp chất MC5 ....................................................................... 53

Hình 32. Phổ HSQC của hợp chất MC5 ................................................................ 53

Hình 33. Phổ HMBC của hợp chất MC5 ............................................................... 54

Hình 34. Cấu trúc hóa học của MC6 ..................................................................... 54

Hình 35. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC6 ............................................................... 56

Hình 36. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC6 ............................................................ 57

Hình 37. Phổ DEPT của hợp chất MC6 ................................................................... 57

Hình 38. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của MC7 ..................... 58

Hình 39. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC7 ............................................................. 60

Hình 40. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC7 ............................................................ 60

Hình 41. Phổ HSQC của hợp chất MC7 ................................................................ 61

Hình 42. Phổ HMBC của hợp chất MC7 ............................................................... 61

Hình 43. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của MC8 ..................... 62

Hình 44. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC8 ............................................................. 64

Hình 45. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC8 ............................................................ 65

Hình 46. Phổ DEPT của Hợp chất MC8 ................................................................ 65

Hình 47. Phổ HSQC của hợp chất MC8 ................................................................ 66

Hình 48. Phổ HMBC của hợp chất MC8 ............................................................... 66

Hình 49. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC9 ...................................................... 67

Hình 50. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC9 ............................................................. 69

Hình 51. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC9 ............................................................ 69

Hình 52. Phổ DEPT của hợp chất MC9 ................................................................. 70

VI

Hình 53. Các hợp chất phân lập từ quả mướp đắng M. charantia L. ..................... 70

Hình 54. Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase ở các nồng độ khác nhau. ......... 73

VII

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây thuốc và động vật làm thuốc đã được nhiều dân tộc trên thế giới sử

dụng rộng dãi để điều trị các bệnh khác nhau. Theo thống kê sơ bộ, ở một số nước

châu Á và châu Phi, 80 % dân số phụ thuộc vào y học cổ truyền trong việc chăm

sóc sức khỏe cơ bản. Ở nhiều nước phát triển, 70 % đến 80 % dân số đã sử dụng

các cây thuốc hoặc chế phẩm của nó. Các loài thảo mộc đã được sử dụng trong

dân gian, được chứng minh bởi các nghiên cứu dược lý đã tạo ra nhiều loại thuốc

Tây. Trong vài thập kỉ qua, với các bài thuốc dân gian trong đó dược liệu cổ

truyền đóng vai trò là nguồn nguyên liệu cung cấp cho thuốc Tây với hơn 40%

tổng các loại thuốc. Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc phân tích, đánh giá

hoạt tính sinh học từ các hợp chất tinh khiết cũng như dịch chiết toàn phần từ các

cây thuốc dân gian.

Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo

điều kiện thuận lợi cho sự phát triển đa dạng của các loài sinh vật. Vì vậy, nước ta

có nguồn tài nguyên sinh vật rất đa dạng và phong phú, đặc biệt là tài nguyên

rừng. Rừng Việt Nam có thảm thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài trong

đó khoảng 4.000 loài có giá trị, được nhân dân sử dụng làm thảo dược và các mục

đích hữu ích khác. Cùng với sự đa dạng do thiên nhiên mang lại, Việt Nam còn là

một trong những quốc gia có nhiều kinh nghiệm trong việc sử dụng các thực vật

và sinh vật trong các bài thuốc y học cổ truyền. So với Tây dược, các bài thuốc y

học cổ truyền có rất nhiều ưu điểm trong chữa bệnh như ít độc tính, ít có tác dụng

phụ, dễ tìm nguyên liệu. Chính vì vậy nhiều công ty dược phẩm trong và ngoài

nước đã và đang tập trung hướng nghiên cứu và phát triển các sản phẩm thuốc có

nguồn gốc từ thiên nhiên. Với những định hướng này đã thúc đẩy các hướng

nghiên cứu tìm kiếm dược liệu từ thiên nhiên. Qua các nghiên cứu, các nhà khoa

học đã tìm ra nhiều loài thực vật có ứng dụng cao trong y dược như nhân sâm

(Panax ginseng), giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum), bá bệnh (Eurycoma

longifolia), linh chi (Ganoderma lucidum) đông trùng hạ thảo, … Những kết quả

1

nghiên cứu này giúp cho việc tìm kiếm và cung cấp các hoạt chất nhằm tạo ra các

sản phẩm phục vụ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Mướp đắng (Momordica charantia L.) là một trong những cây trồng được

sử dụng phổ biến để làm thực phẩm và được dùng trong y học. Quả loài này được

sử dụng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới để điều trị bệnh tiểu đường. Ngoài ra,

quả mướp đắng được sử dụng để điều trị các vết thương, diệt giun và kí sinh trùng.

Loài này cũng được sử dụng làm thuốc tránh thai, kháng virus sởi và trị viêm gan.

Viên nang chứa các hợp chất có nguồn gốc từ quả mướp đắng đang ngày

càng trở nên phổ biến rộng rãi trên thế giới và được sử dụng như là thực phẩm

chức năng để hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường và làm giảm cholesterol. Tuy nhiên,

chưa có nhiều nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học và hoạt tính hạ đường

huyết của loài mướp đắng. Nghiên cứu khảo sát về thành phần hóa học và tác dụng

hạ đường huyết về loài mướp đắng ở Việt Nam sẽ là cơ sở khoa học trong việc sử

dụng và phát triển các sản phẩm từ loài mướp đắng. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề

tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

của các hợp chất từ quả mướp đắng (Momordica charantia L.)”.

Mục tiêu của đề tài là làm rõ thành phần hóa học của quả mướp đắng và tìm

kiếm được một số hoạt chất có tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase để chữa các

bệnh tiểu đường.

Đề tài bao gồm các nội dung chính sau:

 Thu mẫu, tạo tiêu bản loài mướp đắng.

 Phân lập các hợp chất từ quả loài mướp đắng.

 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ quả mướp

đắng.

 Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất phân lập

được.

2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Một vài nét về thực vật của cây mướp đắng

: Plantae : Magnoliophyta : Magnoliopsida : Cucurbitales : Cucurbitaceae : Momordica : Charantia Giới Nhánh Lớp Bộ Họ Chi Loài

1.1.1. Mô tả thực vật

Cây mướp đắng hay còn được gọi là khổ qua, có tên khoa học là Momordica

charantia L., thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae). Loài này thuộc loại dây leo, đường

kính dây khoảng 5-10 mm, dây bò dài 5-7 m, thân màu xanh nhạt, có góc cạnh, leo

được nhờ có nhiều tua cuốn, ở ngọn có lông tơ. Lá đơn nhám, mọc so le, dài 5-10

cm, rộng 4-8 cm, phiến lá mỏng chia làm 5-7 thùy hình trứng, mép có răng cưa

đều, dưới lá màu xanh nhạt hơn mặt trên lá, gân lá nổi rõ ở mặt dưới, phiến lá có

lông ngắn. Hoa mọc đơn ở kẽ lá, hoa đực và hoa cái cùng gốc, có cuống dài. Hoa

đực có đài và ống rất ngắn, tràng gồm 5 cánh mỏng hình bầu dục, nhụy rời nhau.

Hoa cái có đài và tràng hoa giống hoa đực. Tràng hoa màu vàng nhạt, đường kính

khoảng 2 cm. Quả hình thoi, dài 8-15 cm, gốc và đầu thuôn nhọn. Vỏ ngoài có

nhiều u lồi to nhỏ không đều. Quả khi chưa chín có màu xanh hoặc xanh vàng

nhạt, khi chín có màu vàng hồng quả nứt dần ra từ đầu, tách làm 3 phần để lộ

chùm áo hạt màu đỏ bên trong. Hạt dẹt, dài từ 13-15 mm, rộng 7-8 mm, hình răng

cưa, thắt đột ngột ở hai đầu. Vỏ hạt cứng, quanh hạt có màng màu đỏ như màng

hạt gấc [1].

1.1.2. Phân bố và sinh thái

Cây mướp đắng được trồng đại trà ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như

rừng Amazon, Đông Phi, Châu Á, Ấn Độ, Nam Mỹ và Cari-bê. Loài này được

trồng trên khắp thế giới và được sử dụng để làm rau ăn và thuốc.

3

Hình 1. Hình ảnh loài mướp đắng

Cây mướp đắng có biên độ sinh thái tương đối rộng, nhiệt độ thích hợp cho

cây sinh trưởng từ 20-240C, hoặc cao hơn. Cây sinh trưởng nhanh trong mùa mưa

ẩm, ra hoa và quả sau 7-8 tuần gieo trồng; hoa thụ phấn nhờ côn trùng. Cây tàn lụi

và kết thúc vòng đời sau 4-5 tháng [1].

1.1.3. Công dụng của cây mướp đắng trong y học dân gian

Hầu hết các bộ phận của cây mướp đắng đều có công dụng chữa bệnh. Ngoài

công dụng làm rau ăn, theo y học cổ truyền, loài mướp đắng thường sử dụng để

điều trị một số bệnh sau:

− Quả mướp đắng được dùng để trị một số bệnh như: trị ho, sốt, kiết lị, kích

thích lên da non các vết thương hở. Quả mướp đắng có tính hàn, mát, có tính giải

nhiệt, làm tiêu đờm, nhuận tràng, bổ thận, lợi tiểu, làm bớt đau khớp xương. Quả

chín có tính bổ thận, dưỡng huyết. Ở Trung Quốc, quả mướp đắng còn dùng để trị

đột quỵ. Ở Ấn Độ, quả mướp đắng còn được dùng để trị rắn cắn. Ở Thái Lan, dịch

4

quả dùng để trị bệnh về gan và lá lách, đặc biệt làm hạ đường máu ở bệnh nhân tiểu

đường.

− Rễ mướp đắng dùng để trị kiết lị. Ngoài ra rễ mướp đắng có thể trị bệnh

gan.

− Lá có vị đắng, tính mát, nhuận tràng. Lá non ăn trị bệnh nóng trong; dịch

nước từ lá thường dùng để chữa mụn nhọt, đau nhức, rắn cắn; giúp cơ thể mau

bình phục khi mệt mỏi, khát nước, kiệt sức.

− Hạt có chất béo, vị đắng, hơi ngọt, tính ấm, thanh nhiệt, giải độc, hạ sốt, lợi

tiểu, chữa ho viêm họng, rắn cắn, trẻ động kinh [1].

1.2. Thành phần hóa học của loài mướp đắng

Trong nhiều nghiên cứu đã chứng minh được các hợp chất thuộc khung

cucurbitane-triterpene là thành phần hóa học chính của cây này. Cho đến nay có

khoảng 100 hợp chất thuộc khung cucurbitane đã được xác định từ mướp đắng.

Yumi Mryahara và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất trirterpene glycoside là

các hợp chất: momordicoside A (1), B (2), C (3), D (4), E (5) [36, 42] từ hạt loài

mướp đắng. Nghiên cứu khác cũng từ quả mướp đắng đã được nhóm nghiên cứu

Hikaru Okabe phân lập và xác định cấu trúc của 6 hợp chất cucurbitacin glycoside

vào năm 1982 gồm: momordicoside G (6), F1 (7), F2 (8), I (9), K (10) và L (11)

[43-45].

5 Sug

2

SugO

1

3

4

OR1

CHO

OR2

R2O

SugO

5 10: R1 =Me; R2 = glc 11: R1 =H ; R2 =glc

6: R1 = Me; R2 = all 7: R1 = Me; R2 = glc 8: R1 = H; R2 = all 9: R1 = glc ; R2 =H

CHO

Oglc

15

12 13: R = H 14: R= glc

Sáu hợp chất thuộc khung cucurbitancin glycoside trong đó có 3 chất mới

cũng được phân lập từ lá của loài này vào năm 1984 và 1990 là momordicine I

(12), momordicine II (13), momordicine III (14), 3β,7β,23-trihydroxycucurbita-

5,24-diene-7-O-β-D-glucoside (15), 3β,7β,25-trihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-

19-al (16) và 3β,7β,dihydroxy-25-methoxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al (17).

Ngoài ra, dịch chiết từ lá của loài này cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và diệt

côn trùng [15, 56]. Các hợp chất được phân lập từ thân loài mướp đắng gồm:

(23E)-25-methoxycucurbit-23-ene-3β,7β-diol (18), (23E)-cucurbita-5,23,25-

6

triene-3β,7β-diol (19), (23E)-25-hydroxycucurbita-5,23-diene-3,7-dione (20),

(23E)-cucurbita-5,23,25-triene-3,7-dione (21), (23E)-5β,19-epoxycucurbita-6,23-

diene-3β,25-diol (22), (23E)-5β,19-epoxy-25-methoxycucurbita-6,23-dien-3β-ol

(23) cũng đã thể hiện khả năng điều trị bệnh tiểu đường, hoạt tính gây độc tế bào

ung thư [7].

7

CH2OH

CHO

35

36 37: R1 = OH; R2 = OH; 38: R1 = O; R2 = O;

CHO

41 42:R1 = O; R2 = O; R3 = H 44:R1 = OH; R2= OH; R3 = H 45: R1 = OH; R2= OH; R3 = OMe

39: R1 = O; R2 = H 40: R1 = O; R2 = OEt 43:R1 = OH; R2 = H

Từ phần thân của loài M. Charantia L., Chang và cộng sự thông báo đã phân

lập được 5 hợp chất mới: octanorcucurbitacin A-D (24-27) và kuguacin M (28)

[8]. Từ dịch chiết lá, Chen và cộng sự đã phân lập được 14 hợp chất triterpenoid

mới là: kuguacin F-S (29-42), cùng với 3 hợp chất đã biết: kuguacin E (43),

3β,7β,25–trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al (44) và 3β,7β-dihydroxy-25-

methoxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al (45) [10]. Các hợp chất này thể hiện hoạt

tính ức chế dòng virus HIV-1. Các nghiên cứu khác từ quả loài này thông báo đã

phân lập được 19 hợp chất mới (46-64), bao gồm: goyaglycoside-A-H (46-53),

(23E)-3βhydroxy-7β-methoxycucurbita-5,23,25-trien-19-al (54), (19R,23E)-5β,19-

epoxy-19-methoxycucurbita-6,23,25-trien-3β-ol (55), (23E)-3β-hydroxy-7β,25-

dimethoxycucurbita-5,23-dien-19-al (56), karavilagenin A-C (57-59), và

karaviloside I-V (60 -64) [26, 37, 39]. Harinantenaina và cộng sự đã phát hiện

dịch chiết methanol của quả loài này có tác dụng hạ đường huyết và đã phân lập

được bốn hợp chất mới (65-68), bao gồm: 3β,25-dihydroxy-7β-methoxycucurbita-

5,23(E)-diene (65), 3β-hydroxy-7β,25-dimethoxycucurbita-5,23(E)-diene (66), 3-

O-β-D-allopyranosyl-7β,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al (67), 3β,7β,25-

8

trihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al (68) [21]. Từ quả loài mướp đắng, Li và

cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất mới: momordicoside M-O (69-71) [28].

Năm 2007, Akihisa và cộng sự thông báo đã phân lập từ quả loài M.

charantia L. được 13 hợp chất cucurbitane thuộc khung triterpene glycoside, trong

đó có tám hợp chất mới: charantoside I-VIII (72-79) cùng với năm hợp chất đã

biết (7, 8, 48, 49, và 60). Các hợp chất này có khả năng kháng dòng virus Epstein-

Barr thuộc họ virus herpes [2].

9

Tan và cộng sự đã phân lập được bốn cucurbitane triterpene mới từ loài

mướp đắng, gồm: momordicoside Q-T (80-83), và karaviloside XI (84). Các hợp

chất này cũng được thông báo có khả năng hạ đường huyết và chống béo phì [35].

Ba cucurbitane glycoside, bao gồm: 19(R)-n-butanoxy-5β,19-epoxycucurbita-

6,23-diene-3β,25-diol 3-O-β-glucopyranoside (85), 23-O-β-

allopyranosylecucurbita-5,24-dien-7α,3β,22(R),23(S)-tetraol 3-O-β-allopyranoside

10

(86), 23(R),24(S),25-trihydroxycucurbit-5-ene 3-O-[β-glucopyranosyl(1→6)]-O-β-

glucopyranosyl}-25-O-β-glucopyranoside (87), và một steroidal glycoside 24(R)-

stigmastan-3β,5α,6β-triol-25-ene-3-O-β-glucopyranoside (88) được Jie-Qing Liu

và cộng sự phân lập từ quả loài mướp đắng vào năm 2009 [29]. Harinantenaina và

cộng sự cũng đã thông báo hoạt tính hạ đường huyết yếu của các hợp chất 5β-19-

epoxy-3β,25-dihydroxycucurbita-6,23(E)-diene và 3β,7β,25-trihydroxycucurbita-

5,23(E)-dien-19-al khi so sánh với đối chứng dương glibenclamide, ở liều thử 400

mg/kg [21].

1.3. Tác dụng dược lí của loài mướp đắng

Trong vài thập kỷ qua đã có rất nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học, tác

dụng dược lí cũng như các phép thử lâm sàng của loài mướp đắng. Các nghiên cứu

này cho biết các dịch chiết cũng như các hợp chất từ loài mướp đắng đã thể hiện

một số hoạt tính sinh học như giảm đường glucose trong máu, diệt tế bào ung thư,

kháng virus, kháng khuẩn,... Dưới đây là tổng quan đến các hoạt tính điển hình của

loài mướp đắng :

1.3.1. Hoạt tính trị bệnh tiểu đường

Loài mướp đắng đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên

cứu liên quan đến bệnh tiểu đường [3, 14, 20, 22, 50, 55, 57]. Bài thuốc có chứa

quả mướp đắng đã được Pari nghiên cứu cho thấy có tác dụng giảm rõ rệt nồng độ

đường trong máu, hemoglobin chứa đường và làm tăng insulin huyết tương và

hemoglobin toàn phần ở động vật [47]. Các hợp chất charantin, polypeptide,

oleanolic acid 3-O-monodemoside, và oleanolic acid 3-O-glucuronide từ loài

mướp đắng đã thể hiện hoạt tính hạ đường huyết [32]. Ngoài ra bốn triterpenoid từ

quả mướp đắng đã thể hiện hoạt tính hạ đường huyết, kích hoạt bởi AMP [35].

Đặc biệt, mướp đắng cải thiện khả năng hấp thụ glucose và ngăn khả năng tăng

đường huyết ở chuột [52]. Dịch chiết của mướp đắng có thể làm tăng độ nhạy

insulin và quá trình thủy phân lipit [11, 12].

11

Một số nghiên cứu khác cũng khẳng định rằng tác dụng hạ đường huyết của

quả mướp đắng tương đương với một số loại thuốc như chloropropamide [41] và

glibenclamide [53]. So với các nghiên cứu trên mô hình động vật, chưa có nhiều

nghiên cứu lâm sàng về tác dụng hạ đường huyết của loài mướp đắng. Trong thử

nghiệm lâm sàng, dịch chiết nước của quả mướp đắng đã làm giảm nồng độ

glucose trong máu của người mắc bệnh tiểu đường tuýp 2 bằng phép thử hấp thụ

glucose. John và cộng sự đã chọn ngẫu nhiên 50 đối tượng (26 bệnh nhân lâm sàng

và 24 đối tượng đối chứng) mắc bệnh tiểu đường tuýp 2 để uống viên nang từ quả

khô loài mướp đắng và giả dược. Tiêu chí dựa trên hàm lượng đường trong máu

lúc chưa ăn và hàm lượng đường sau ăn. Kích thước mẫu được tính toán để lấy

được một lượng giảm đều với nồng độ 300 mg/mL trong tỉ lệ FBS/PPS. Tính chất

cơ bản của tất cả các đối tượng đều có thể so sánh được. Chỉ số của FBS và PPS

được đo bằng chỉ số fructosamine tại đường cơ bản trước khi điều trị 2 tuần và

trong 4 tuần sau điều trị. Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy không có thay đổi nhiều

lượng đường trong máu hoặc mức fructosamine trong điều trị hoặc nhóm dùng giả

dược [24].

1.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

Qua các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh dịch chiết từ lá loài mướp đắng

có hoạt tính kháng khuẩn [25]. Hoạt tính kháng khuẩn của các chất phân lập từ

dịch chiết metanol của quả và lá loài mướp đắng đã được quan sát thử nghiệm đối

với các loài vi sinh vật: trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa), vi khuẩn

đại tràng (Escherichia coli), nấm lưỡng bội gây suy giảm miễn dịch (Candida

albicans), tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus), và 4 chủng vi khuẩn:

Klebsiellapneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella typhi và Cryptococcus

neoformans. Các kết quả cũng cho thấy các chất từ quả có hoạt tính kháng khuẩn

cao hơn so với lá [38]. Trong một nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II, dịch chiết từ

lá loài mướp đắng cho thấy sự ức chế tăng trưởng vi khuẩn lao bằng cách sử dụng

phương pháp BACTEC 460 [17]. Từ kết quả này đã củng cố và khuyến khích dân

12

cư sống ở các nước nhiệt đới ăn quả mướp đắng vì nó có tác dụng bảo vệ chống lại

các vi khuẩn gây bệnh lao, một loại bệnh phổ biến ở các khu vực này.

1.3.3. Hoạt tính kháng virus

Cây mướp đắng và một số hợp chất từ loài này đã được phát hiện có khả

năng kháng các loại virus Epstein-Barr, herpes, HIV, coxsackie B3, và bại liệt.

Protein MAP30 được tách ra từ loài này đã thể hiện khả năng chống lại hoạt động

của HIV. Điều đó cho thấy quả mướp đắng có tiềm năng trong việc nghiên cứu

hoạt tính kháng virus HIV. Đồng thời, MAP30 là chất không độc hại đối với các tế

bào thường [27]. Trong nghiên cứu lâm sàng của Bourinbaiar và cộng sự về

protein MAP30 cho thấy sự kết hợp của MAP30 với liều thấp dexamethasone và

indomethacin có hiệu quả trong việc cải thiện khả năng kháng virus HIV [6]. Hoạt

tính chống virus HIV của một số hợp chất được tách từ loài cây này đã được công

bố như α,β-momorcharin [4, 58] các cucurbitacin, kuguacin C và E [9]. Các lectin

như MRK29 từ loài này đã cho thấy khả năng ức chế quá trình sao chép ngược của

virus [23, 54]. Hoạt tính diệt virus herpes của MAP30 cũng đã được công bố.

MAP30 đã kháng virus HIV-1 và 2 với giá trị IC50 lần lượt là 0,1 và 0,3 µM [4].

Những kết quả này cho thấy rằng protein MAP30 rất hữu ích trong ứng dụng để

diệt virus herpes.

1.3.4. Hoạt tính chống ung thư

Nhiều nghiên cứu về khả năng kháng ung thư của các dịch chiết và các hợp

chất phân lập từ loài mướp đắng đã cho thấy tác dụng diệt các dòng tế bào ung thư

rõ rệt như ung thư bạch cầu, ung thư nhau thai, ung thư da, ung thư hạch, ung thư

vú, ung thư tiền liệt tuyến, và ung thư bàng quang [18,51]. Nghiên cứu của

Pongikorn và cộng sự cho biết khi điều trị với quả loài mướp đắng trong thời gian

45 và 90 ngày đối với bệnh nhân ung thư cổ tử cung cho thấy giảm đáng kể P-

glycoprotein, một protein có tác dụng kháng nhiều loại thuốc, trong khi không có

tác dụng như vậy ở những bệnh nhân được điều trị hóa trị [48].

13

1.3.5. Hoạt tính chống viêm loét

Trong nghiên cứu của Matsuda và cộng sự, hợp chất momordinic với tỷ lệ

(10 mg/kg thể trọng) có tác dụng nhanh làm lành vết thương ở niêm mạc dạ dày

[33]. Nghiên cứu của Gurbuz và cộng sự cho thấy quả của loài này sấy khô tẩm

mật ong có khả năng chống loét dạ dày trên chuột [19]. Thêm vào đó, dịch chiết

etanol từ quả cũng cho thấy hoạt tính chống loét đáng kể trên chuột, gây ra bởi

HCl-etanol trong indomethacin. Hơn nữa, dịch chiết metanol của loài này đã thể

hiện mức giảm các chỉ số loét dạ dày như axit toàn phần, hàm lượng pepsin đồng

thời làm tăng lớp màng của dạ dày [49].

1.3.6. Hoạt tính điều hòa miễn dịch

Một số nghiên cứu về mướp đắng đã tập trung vào tác dụng ức chế miễn dịch

cũng như kích thích miễn dịch. Nghiên cứu in vivo của hợp chất momorcharin trên

chuột đã cho thấy kết quả của các mũi tiêm đơn đến sự giảm đáng kể của các phản

ứng quá mẫn loại chậm cũng như sự hình thành kháng thể miễn dịch thể tế bào

hồng cầu. Tương tự, thioglycollate dẫn đến sự di chuyển của các đại thực bào bị

hạn chế trong cơ thể. Hoạt động của các tế bào trong cơ thể bị ảnh hưởng không

nhiều. Ngoài ra, khả năng ức chế miễn dịch của α-và β-momorcharin không giống

như do lymphocytotoxicity trực tiếp hoặc do một sự thay đổi trong các thông số

động học của các đáp ứng miễn dịch. Tuy nhiên, hoạt động kích thích hệ thống

miễn dịch làm tăng sản xuất interferon [13].

1.3.7. Hoạt tính kháng viêm

Dịch chiết etanol của quả mướp đắng cho thấy tác dụng làm giảm đáng kể

nitric oxide (NO), sản xuất prostaglandin E2 (PGE2), nitric oxide synthase cảm

ứng (iNOS) và biểu hiện pro-IL-1β, gây ra bởi LPS (Lipopolysaccharide). Ngoài

ra, sự thay đổi di động khảo nghiệm điện di cho thấy rằng dịch chiết này ức chế

quá trình kích hoạt yếu tố nhân NF-κB. Những kết quả này cho thấy loài mướp

đắng có lợi cho việc giảm LPS-gây ra phản ứng viêm bằng cách điều chỉnh hoạt

động yếu tố nhân NF-κB. Các hoạt động chống viêm của axit ferulic và axit

14

dehydrodimer ferulic từ loài mướp đắng đã được thử nghiệm. Axit dehydrodimer

ferulic đã ức chế đáng kể việc giải phóng các yếu tố viêm TNFα, NO và ức chế sự

phát triển của phytohemagglutinin trên tế bào lá lách [46].

Trong một nghiên cứu khác, tác dụng của dịch chiết từ quả loài mướp đắng

đến hệ miễn dịch đường ruột bằng cách đánh giá các yếu tố viêm TGF-β, IL-7, IL-

10 và IL-12. Kết quả cho thấy dịch này thể hiện hoạt tính ức chế IL-7 và kích thích

TGF-β và IL-10 [31].

1.4. Bệnh tiểu đường và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

1.4.1. Bệnh tiểu đường

Khái niệm

Tiểu đường là một căn bệnh khá phổ biến hiện nay và có tốc độ gia tăng rất

nhanh. Bệnh này nếu không được điều trị tốt sẽ dẫn đến nhiều biến chứng nguy

hiểm làm giảm chất lượng cuộc sống và đe dọa tính mạng người bệnh như các tổn

thương thần kinh, tim mạch, thị giác, nguy cơ nhiễm trùng… Bệnh tiểu đường

(hay còn gọi là bệnh đái tháo đường) là một bệnh nguy hiểm đặc trưng bằng mức

đường (glucose) trong máu cao, nguyên nhân là do thiếu insulin hoặc kháng

insulin với các mức độ khác nhau. Những người mắc bệnh không những có lượng

đường cao trong máu mà cao cả trong nước tiểu.

Theo thống kê trên thế giới hiện nay có khoảng 347 triệu người mắc bệnh

tiểu đường, trong đó hàng năm gần 10 triệu ca bệnh mới và hơn 3 triệu người chết

liên quan đến tiểu đường. Trên 80% các ca tử vong xuất hiện ở các quốc gia thu

nhập thấp và trung bình. Theo ước tính, đến năm 2030 bệnh tiểu đường sẽ là

nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 7. Tại Mỹ, số người bị tiểu đường tăng từ 5,3%

năm 1997 lên 6,5% năm 2003 và tiếp tục tăng rất nhanh. Người có độ tuổi trên 65

bị tiểu đường cao gấp hai lần người trong độ tuổi 45–54. Ở Việt Nam hiện nay có

khoảng 5 triệu người mắc bệnh, chiếm 6% dân số và dự báo tăng lên 7-8 triệu

người vào năm 2025. Số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường ở Việt Nam lại có tốc độ

15

phát triển rất nhanh. Nếu không được phát hiện sớm và có biện pháp can thiệp kịp

thời thì trong thời gian ngắn sẽ phát triển thành bệnh.

Phân loại bệnh

Một cách tổng quát, bệnh tiểu đường được chia làm 2 dạng chính: tuýp 1 và

tuýp 2.

− Bệnh tiểu đường tuýp 1 thường xảy ra ở trẻ em từ dưới 20 tuổi và chiếm

khoảng 15% trong số các ca bệnh. Nguyên nhân là do cơ thể không sản xuất được

insulin. Khi thiếu insulin, glucose trong máu không chuyển hóa được thành

glycogen làm cho lượng glucose trong máu tăng cao.

− Bệnh tiểu đường tuýp 2 thường xảy ra ở người trên 50 tuổi, chiếm khoảng

90% trong tổng số trường hợp bị tiểu đường. Đối với những người bị tiểu đường

tuýp 2, mặc dù cơ thể vẫn sản xuất được insulin nhưng các insulin này trơ và kém

nhạy cảm trong quá trình chuyển hóa đường thành glycogen. Khi đó, cơ thể phản

ứng bằng cách tăng quá trình sản xuất insulin và gây quá tải cho tuyến tụy. Theo

thời gian, lượng insulin được tiết ra dần dần giảm.

Bệnh tiểu đường tuýp 2 còn có nguyên nhân tiềm ẩn trong cấu tạo gen, điều

này làm cho bệnh phát triển nhanh hơn. Nếu những người mang gen tiềm ẩn được

phát hiện sớm và có biện pháp phòng ngừa bằng cách ăn uống hợp lí thì bệnh có

thể không xuất hiện hoặc phát triển chậm, nhưng bệnh vẫn giữ ở dạng tiềm ẩn.

Trong trường hợp ngược lại, bệnh sẽ phát triển rất nhanh.

Phương pháp điều trị

Phương pháp điều trị tiểu đường tuýp 1: với những người mắc bệnh tiểu

đường tuýp 1, họ sẽ phải tiêm insulin thường xuyên trong cả cuộc đời vì cơ thể họ

không có khả năng tạo ra hoocmon này. Insulin có nhiều loại nhưng nằm trong hai

dạng chính tùy theo tác dụng nhanh hay chậm: dạng tác dụng nhanh dùng ngay

trước bữa ăn để tăng lượng insulin trong cơ thể phù hợp với lượng carbohydrat sắp

16

nhập vào, dạng tác dụng chậm dùng vào buổi tối để giữ lượng đường trong máu

không tăng vọt trong nhiều giờ vào hôm sau.

Hiện nay, việc uống insulin dạng viên là không thể vì insulin trong môi

trường dạ dày sẽ bị phân hủy. Do đó, các nhà khoa học đang nghiên cứu bọc

insulin trong một vỏ nang thích hợp để thuốc có thể qua được dạ dày, giải phóng

ra trong ruột non và ngấm vào máu. Thời gian gần đây, ta thấy xuất hiện insulin

dưới dạng bột, nó được đưa vào máu qua đường phổi. Qua nhiều năm nghiên cứu,

người ta phát hiện được dạng thuốc bột này có hiệu quả rất cao.

Phương pháp điều trị tiểu đường tuýp 2: Phụ thuộc vào tình trạng của bệnh

nhân, phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường hoạt

động. Chỉ bệnh nhân tiểu đường tuýp 2 mới dùng thuốc uống kết hợp với những

chất đặc hiệu nhằm làm giảm lượng đường huyết. Bệnh nhân có thể dùng riêng

thuốc viên hoặc kết hợp với phương pháp tiêm insulin.

Thuốc sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2 chủ yếu chia ba nhóm:

+ Nhóm thuốc thúc tụy tạng tiết thêm insulin

+ Nhóm thuốc giúp insulin hoạt động hữu hiệu hơn

+ Nhóm ngăn ruột bớt hấp thu đường khi ăn bằng chất ức chế enzyme α-

glucosidase

Phương pháp ức chế enzyme α-glucosidase trong điều trị tiểu đường tuýp 2

được ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa

chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của

insulin cũng như kích thích sự sản sinh insulin… như các phương pháp khác.

1.4.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

Sơ lược về enzyme α-glucosidase

Enzyme α-glucosidase còn có tên khác như maltase, glucoinvertase,

glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, nitrophenyl α-D-

17

glucosidase, transglucosidase, α-glucopyranosidase, α-glucosidase hydrolase, α-

1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy

phân) xúc tác phản ứng phân cắt các liên kết 1,4-alpha.

Khi thức ăn được hấp thụ vào cơ thể thì các carbohydrat trong thức ăn được

thủy phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzyme trong ruột non.

Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzyme α-amylase dùng để

phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid. Enzyme α-glucosidase ở

màng ruột non lại tiếp tục phân hoá các oligosaccharit thành các phân tử đường

nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu vào máu. Bằng cách ức chế hoạt động của enzyme

α-glucosidase có thể làm giảm sự thủy phân của carbohydrat và làm chậm sự thẩm

thấu glucose vào mạch máu.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới về các hợp chất thiên nhiên có tác dụng ức chế

-glucosidase

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng các dược phẩm thiên nhiên có

tác dụng ức chế men -glucosidase kết hợp với các thuốc khác trong điều trị tiểu

đường sẽ làm tăng hiệu quả chữa trị đồng thời giảm đáng kể những tác dụng phụ

không mong muốn [5]. Cây nấm múa Grifola frondosa từ lâu đã được sử dụng

trong y học cổ truyền Trung Quốc, Nhật Bản để chữa trị các bệnh miễn nhiễm,

đường huyết, tim mạch. Người ta đã phát hiện ra nó chứa thành phần

polysaccharide (MMP) ức chế -glucosidase và có tác dụng hiệu quả trên bệnh

nhân tiểu đường. Bệnh nhân tiểu đường tuýp 2 sau khi uống 500 mg MMP 3

lần/ngày kết hợp với thuốc glibenclamide (2,5 mg/ngày) trong 10 ngày cho thấy

lượng FBG giảm từ 13,8 mmol/l xuống còn 5,2 mmol/l đồng thời nồng độ HbA1c

giảm từ 11,5% xuống 5,2%. Khi rút liều glibenclamide xuống 1,25 mg thì chỉ số

FBG luôn nằm trong khoảng 4,4-5,0 mM trong 2 tháng tiếp theo. Con số này hầu

như không đổi trong suốt 6 tháng tiếp theo. Sau đó bệnh nhân không sử dụng

glibenclamide và tiếp tục uống MMP trong 6 tháng tiếp thì chỉ số FBG và HbA1c

vẫn dừng ở mức 5,0 mmol/l và 5,6%. Một điểm đáng ghi nhận nữa là trong thời

18

gian điều trị bệnh nhân sút 7kg nhưng sức khỏe lại tăng lên rõ rệt. Điều này cho

thấy MMP tách từ nấm múa có tác dụng hỗ trợ, điều trị hiệu quả bệnh tiểu đường.

Gần đây loại nấm này còn được sử dụng để hỗ trợ và điều trị ung thư rất tốt [34].

Cây mướp đắng cũng đã được biết đến là một dược liệu có tác dụng chữa tiểu

đường rất công hiệu. Ngoài tác dụng ức chế -glucosidase và -amylase, mướp

đắng còn có khả năng làm tăng chỉ số nhạy insulin [16]. Nhiều nghiên cứu khác

trên thế giới đã tiến hành sàng lọc ra những thực vật có tác dụng ức chế -

glucosidase. Nhóm nghiên cứu ở trường ĐH Calabria-Italia đã đánh giá tác dụng

chế -glucosidase và -amylase của chín mẫu dược liệu được sử dụng chữa tiểu

đường ở Li Băng. Kết quả cho thấy dịch chiết metanol của hai loài Marrubium

radiatum và Salvia acetabulosa có tác dụng mạnh nhất. Đối với dịch chiết

chloroform thì hai loài Calamintha origanifolia và Erythraea centaurium lại thể

hiện hoạt tính ức chế mạnh hơn trong khi tác dụng của dịch chiết hexane của C.

origanifolia là mạnh nhất [30].

Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam về các hợp chất thiên nhiên có tác dụng ức chế

-glucosidase

Việt Nam có nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng phong phú trong đó rất

nhiều loài động vật, thực vật, nấm cũng như sinh vật biển được sử dụng trong y

học cổ truyền để phòng chống, hỗ trợ và chữa trị tiểu đường. Tác dụng chữa tiểu

đường của cây mướp đắng đã được các nhà khoa học trên thế giới khẳng định qua

nhiều công trình nghiên cứu. Mới đây, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc

đã phân lập được 14 hợp chất khung cucurbitane glycoside từ quả Mướp đắng. Kết

quả thử hoạt tính ức chế -glucosidase từ các hợp chất này cho thấy, có 11 hợp

chất thể hiện hoạt tính ức chế -glucosidase từ yếu đến trung bình [40].

19 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu quả mướp đắng được thu tại Thái Bình vào tháng 6 năm 2011 và được

TS. Bùi Văn Thanh,Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học là M. charantia L., quả mướp

đắng có màu xanh nhạt, gai tù và ít đắng. Mẫu tiêu bản lưu giữ tại Viện Hóa sinh

biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.1. Mẫu M. charantia L. thu hái tại Thái Bình

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất

Sắc ký lớp mỏng (TLC)

20

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai

bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được

phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.

Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G

F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm

và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ

nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất; sau

đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong

dung môi thích hợp.

Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và chất

hấp phụ pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430

mesh). Chất hấp phụ pha đảo RP-18 (150 m, FuJisilisa Chemical Ltd.). Nhựa trao

đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết

hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:

Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): được đo trên hệ Agilent 6530

Accurate-Mass Q-TOF LC/MS, Đại học Yonsei, Hàn Quốc

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Bruker AVANCE 500, Viện Hoá học, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan).

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC và HMBC.

21

Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: CD3OD.

Điểm nóng chảy (mp): Điểm nóng chảy được đo trên máy Thermo scientific

Mel-Temp 3.0 của Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Độ quay cực: Độ quay cực đo trên máy Jasco P-2000 Polarimeter của Viện

Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

Sàng lọc sơ bộ tìm mẫu (chất) có hoạt tính

Bước 1: Mẫu thử được pha trong DMSO rồi pha loãng ở các nồng độ thích

hợp trong đệm phosphate (0,1 M, pH 6,9).

Bước 2: 50 µl mẫu thử được ủ với 100 µl dung dịch 0,5 µg/mL enzyme α-

glucosidase trong đệm phosphate (0,1 M, pH 6,9) ở nhiệt độ 37oC trong 10 phút.

Bước 3: Thêm 50 µL dung dịch 5 mM pNPG trong đệm phosphate vào hỗn

hợp trên.

Bước 4: Hỗn hợp phản ứng được ủ tiếp ở nhiệt độ 37oC trong 5 phút

Bước 5: Đo hỗn hợp trên bằng máy ELISA ở bước sóng 405 nm.

Chất chuẩn dương (positive control) acarbose được dùng để kiểm soát độ

ổn định và đánh giá hoạt tính ức chế tương đương. Các phép thử được lặp lại 3 lần.

(OD

(OD - )OD - -c

)OD - b

+ c

x 100

Kết quả được tính theo công thức sau:

OD -

-c

% Ức chế =

Trong đó:

ODc+: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu thử,

có α-glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 0%);

ODc-: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng âm (không có mẫu thử và

α-glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%);

22

ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử;

ODb: Mật độ quang trung bình mẫu trắng (có mẫu thử, không có α-

glucosidase).

Tìm nồng độ ức chế 50% (IC50) của mẫu (chất) có hoạt tính:

Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng dựa trên 5 nồng độ thử nghiệm.

Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy phi tuyến tính trên phần mềm

Graphpad Prism 5.0.

23 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Phân lập các hợp chất

Quả mướp đắng được phơi khô, nghiền thành bột (5,0 kg), ngâm chiết với

metanol ba lần, sau đó loại dung môi thu được 350 g cặn chiết metanol. Cặn này

được hòa tan vào 3 lít nước cất và chiết lần lượt bằng n-hexan, clorofoc và etyl

axetat. Sau khi loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn n-hexan (100 g),

clorofoc (90 g), etyl axetat (75 g) và nước (85 g).

Cặn clorofoc (90 g) được hòa tan vào dung môi tối thiểu, sau đó tẩm vào

220g silica gel, cô đuổi dung môi cho đến khi thu được bột tơi, khô. Tiến hành sắc

ký cột nhồi silica gel, sau đó rửa giải với hệ dung môi n-hexan/axeton với độ phân

cực tăng dần (từ 50:1 - 1:1, v/v) thu được 5 phân đoạn chính là CC1 (32,0 g), CC2

(13,5 g), CC3 (28,5 g), CC4 (7,8 g) và CC5 (8,2 g). Phân đoạn CC3 tiếp tục sắc ký

trên cột silica gel với hệ dung môi clorofoc/metanol/nước (9:1:0,05, v/v/v) thu được

4 phân đoạn CC3A (4,5 g), CC3B (3,4 g), CC3C (5,0 g) và CC3D (4,7 g). Sau đó,

từ phân đoạn CC3A (4,5 g) tiếp tục sắc ký cột RP-18 với hệ dung môi axeton/nước

(8:3, v/v) thu được hợp chất MC4 (35 mg). Phân đoạn CC3B (3,4 g) được chạy sắc

ký cột sillica gel với clorofoc/axeton (4:1, v/v) thu được hợp chất MC3 (80 mg).

Phân đoạn CC3C (5,0 g) tiếp tục phân tách trên cột RP-18 với hệ dung môi

metanol/nước (4:1, v/v) thu được 2 hợp chất là MC6 (50 mg) và MC1 (37 mg).

Phân đoạn CC3D (4,7 g) được phân tách trên cột RP-18 với hệ dung môi

metanol/nước (1,5:1, v/v) thu được hợp chất MC5 (20 mg). Phân đoạn CC5 (8,2 g)

được phân tách trên cột silica gel với clorofoc/metanol/nước (5:1:0,1 v/v/v) thu

được 3 phân đoạn CC5A (1,5 g), CC5B (2,5 g), CC5C (4,2 g). Sau đó, từ phân đoạn

CC5B (4,2 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi rửa giải

axeton/metanol/nước (2:1:1, v/vv) thu được hợp chất MC2 (12 mg) và hợp chất

MC7 (35 mg).

Cặn etyl axetat được tẩm vào 150 g silica gel, cô đuổi dung môi cho đến khi

thu được bột tơi, khô sau đó tiến hành phân lập bằng sắc ký cột nhồi silica, rửa giải

bằng hệ dung môi clorofoc/metanol với độ phân cực tăng dần (từ 20:1 – 2:1, v/v)

24

thu được 5 phân đoạn chính là CE1 (20,0 g), CE2 (12,5 g), CE3 (8,5 g), CE4 (12,0

g) và CE5 (18,0 g). Phân đoạn CE2 (12,5 g) được tiếp tục phân lập bằng sắc ký cột

silica gel với hệ dung môi rửa giải là clorofoc/metanol/nước (6:1:0,05, v/v/v) thu

được 4 phân đoạn CE2A (5,5 g), CE2B (1,4 g), CE2C (3,7 g) và CE2D (1,6 g). Từ

phân đoạn CE2C (3,7 g) được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột pha đảo hệ dung

môi axeton/nước (1:1,5, v/v) thu được hợp chất MC9 (35 mg). Phân đoạn CE3 (8,5

g) được tiến hành sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải

clorofoc/metanol (6/1, v/v) và cột silica gel pha đảo với hệ dung môi rửa giải là

axeton/nước (1:1, v/v) thu được hợp chất MC8 (15 mg).

3.2. Các thông số vật lí của các hợp chất đã phân lập được

3.2.1. Hợp chất MC1: Charantoside D

Chất bột màu trắng.  25 D : –91 (c 0.1, CH3OH). HR-ESI-MS m/z 647.4179 [M-H]- (tính toán lý thuyết cho công thức C37H59O9: 647.4165). Công thức phân tử C37H60O9, M = 648. 1H- và 13C-NMR xem Bảng 1.

3.2.2. Hợp chất MC2: Charantoside E

Chất bột màu trắng. D : –48 (c 0.1, CH3OH).  25 HR-ESI-MS m/z 647.4158 [M-H]- (tính toán lý thuyết cho công thức C37H59O9: 647.4165) Công thức phân tử C37H60O9, M = 648. 1H- và 13C-NMR xem Bảng 2.

D : –73 (c 0.1, CH3OH).

3.2.3. Hợp chất MC3: Charantoside F

Chất bột màu trắng. Độ quay cực  25 HR-ESI-MS m/z 615.4270 [M-H]- (tính toán lý thuyết cho công thức

C37H59O7: 615.4266).

1H- và 13C-NMR xem Bảng 3.

Công thức phân tử C37H60O7, M = 616.

25

3.2.4. Hợp chất MC4: Charantoside G

Chất bột màu trắng.

 25 D : –75 (c 0.1, CH3OH).

HR-ESI-MS m/z 615.3904 [M-H]- (tính toán lý thuyết cho công thức

C36H55O8, 615.3902).

1H- và 13C-NMR: xem Bảng 4.

Công thức phân tử C36H56O8, M = 616.

3.2.5. Hợp chất MC5: Goyaglycoside-c

Chất bột màu trắng.

 25 D : -110,8 (c 0.1, CH3OH).

1H- và 13C-NMR xem Bảng 5.

Công thức phân tử C38H62O9, M = 662.

3.2.6. Hợp chất MC6: Goyaglycoside-d

Chất bột màu trắng.

 25 D : -144,1 (c 0.1, CH3OH).

1H- NMR: H 3,52 (1H, br s, H-3); 6,06 (1H, dd J = 9,5; 1,5 Hz, H-6), 5,55

Công thức phân tử C38H62O9, M = 662.

(1H, dd J = 9,5; 1,5 Hz, H-7); 0,91 (3H, s, H-18), 4,69 (1H, s, H-19), 0,96 (3H, d J

= 6,5 Hz, H-21), 5,63 (1H, ddd J = 15,5; 8,5; 5,5 Hz, H-23), 5,41 (1H, d J = 15,5

Hz, H-24), 1,27 (3H, s, H-26), 1,27 (3H, s, H-27), 1,22 (3H, s, H-28), 0,93 (3H, s,

H-29), 0,88 (3H, s, H-30), 3,46 (3H, s, 19-MeO), 3,17 (3H, s, 25-MeO), 4,80 (1H,

13C-NMR xem

d J = 7,5 Hz, H-1′)

Bảng 6.

3.2.7. Hợp chất MC7: Momordicoside F1.

Chất bột màu trắng.

D : -111,0 (c 0.1, CH3OH).

Độ quay cực  25

Công thức phân tử C37H60O8, M = 632.

26

1H- và 13C-NMR xem

Bảng 7.

3.2.8. Hợp chất MC8: Momordicoside N

Chất bột màu trắng.

1H- và 13C-NMR xem Bảng 8.

Công thức phân tử C42H68O16, M = 796.

3.2.9. Hợp chất MC9: Momordicoside M

Chất bột màu trắng.

1H- NMR: H 3,42 (1H, br s, H-3), 6,12 (1H, dd J = 10,0; 2,0 Hz, H-6), 5,65

Công thức phân tử C42H68O16, M = 796.

(1H, dd J = 10,0; 4,0 Hz, H-7), 0,92 (3H, s, H-18), 0,99 (3H, d J = 6,5 Hz, H-21),

5,25 (1H, br d J = 10,0 Hz, H-24), 1,78 (3H, s, H-26), 1,81 (3H, s, H-27), 1,14

(3H, s, H-28), 0,96 (3H, s, H-29), 0,86 (3H, s, H-30), 4,25 (1H, d J = 8,0 Hz, H-

13C-NMR xem Bảng 9.

1′), 4,75 (1H, d J = 8,0 Hz, H-1′′).

27

Hình 2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ quả mươp đắng (M. charantia L.)

28 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

4.1.1. Hợp chất MC1: Charantoside D (hợp chất mới)

Hình 3. Cấu trúc hóa học của MC1, hợp chất tham khảo MC1A và các tương tác HMBC chính của MC1.

Hợp chất MC1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử của MC1, C37H60O9, được xác định dựa trên pic ion giả phân tử trên phổ HR-ESI-MS m/z 647,4160 [M-H]- (tính toán lý thuyết cho công thức [C37H59O9]-, 647,4165). Phổ 1H-

NMR của MC1 xuất hiện tín hiệu của sáu nhóm metyl tại H 0,95 (3H, s, H-18), 1,27

(6H, s, H-26/H-27), 1,17 (3H, s, H-28), 0,90 (3H, s, H-29) và 0,93 (3H, s, H-30), một

nhóm metyl bậc 2 tại H 0,96 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-21) đặc trưng cho khung

cucurbitane; ba proton nhóm metoxi tại H 3,17 (3H, s); hai proton olefin tại H 6,12

(1H, dd, J = 9,5; 2,0 Hz) và 5,60 (1H, dd, J = 9,5; 3,5 Hz) đặc trưng cho liên kết đôi

trong vòng B tại C-6/C-7; tín hiệu của hai proton tại H 5,63 (1H, ddd, J = 15,5; 9,0;

6,0 Hz) và 5,41 (1H, d, J = 15,5 Hz) đặc trưng cho liên kết đôi có cấu hình trans tại C- 23/C-24; một proton anome tại H 4,27 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′). Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của MC1 xuất hiện tín hiệu của 37 cacbon trong đó có 30 cacbon đặc trưng

cho khung cucurbitane bao gồm 6 cacbon không liên kết với hydro tại C 39,70 (C-4),

86,31 (C-5), 48,48 (C-9), 46,22 (C-13), 48,65 (C-14), 76,49 (C-25); 10 cacbon metin

tại C 86,98 (C-3), 134,12 (C-6), 132,58 (C-7), 42,61 (C-8), 42,69 (C-10), 51,32 (C-

17), 105,98 (C-19), 37,44 (C-20), 130,01 (C-23), 137,64 (C-24), 7 cacbon metylen tại

C 19,24 (C-1), 27,88(C-2), 23,95 (C-11), 31,80 (C-12), 34,69 (C-15), 29,00 (C-16),

40,47 (C-22); 7 nhóm metyl tại C 15,16 (C-18), 19,24 (C-21), 26,20 (C-26), 26,49 (C-

27), 20,55 (C-28), 25,63 (C-29), 20,20 (C-30); một nhóm metoxi tại 50,53 (25-MeO);

cùng với sáu cacbon của đường glucopyranoside tại C 107,45 (C-1′), 75,37 (C-2′),

77,74 (C-3′), 71,81 (C-4′), 77,57 (C-5′), 62,87 (C-2′).

29

Bảng 1. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC1 và hợp chất tham khảo

δC

a DEPT δH

a (J = Hz)

C

#

19,24 CH2 27,88 CH2 86,98 CH 39,70 C 86,31 C 134,12 CH 132,58 CH 42,61 CH 48,48* C 42,69 CH 23,95 CH2 31,80 CH2 46,22 C 48,65* C 34,69 CH2 29,00 CH2 51,32 CH 15,16 CH3 105,98 CH 37,44 CH 19,24 CH3 40,47 CH2 130,01 CH 137,64 CH 76,49 C 26,20 CH3 26,49 CH3 20,55 CH3 25,63 CH3 20,20 CH3 50,53 CH3

18,6 27,3 83,6 39,1 85,4 133,1 131,5 42,2 48,1 41,6 23,2 30,9 45,3 48,2 33,8 28,1 50,3 14,8 112,3 36,3 18,8 39,6 128,3 137,6 74,7 26,0 26,4 21,1 24,8 19,9 50,0 57,5

STT Aglycon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 25-OMe 19-OMe 3-O-Glc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′

105,2 76,1 77,8 72,0 78,5 63,0

107,45 CH 75,37 CH 77,74 CH 71,81 CH 77,57 CH 62,87 CH2

1,43 (m)/1,58 (m) 1,76 (m)/2,17 (dd, 3,5; 3,5) 3,41 (br s) - - 6,12 (dd, 9,5; 2,0) 5,60 (dd, 9,5; 3,5) 2,48 (d, 3,5) - 2,94 (m) 1,67 (m)/1,77 (m) 1,62 (m)/1,69 (m) - - 1,39 (m)/1,41 (m) 1,44 (m)/2,04 (m) 1,55 (m) 0,95 (s) 5,11 (s) 1,61 (m) 0,96 (d, 6,0) 1,87 (m)/2,24 (m) 5,63 (ddd, 15,5; 9,0; 6,0) 5,41 (d, 15,5) - 1,27 (s) 1,27 (s) 1,17 (s) 0,90 (s) 0,93 (s) 3,17 (s) 4,27 (d, 8,0) 3,27 (m) 3,26 (m) 3,31 (m) 3,36 (m) 3,69 (dd, 12,0; 5,5) 3,87 (dd, 12,0; 2,0)

ađo trong CD3OD, #C của (19R),25-dimethoxy-5β,19-epoxycucurbita-6,23E-diene-3β-ol 3- O-β-D-glucopyranoside (MC1A) đo trong pyridine-d5 [37].

30

Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của MC1 tương tự hợp chất (19R),25-dimethoxy-5β,19- epoxycucurbita-6,23E-diene-3β-ol 3-O-β-D-glucopyranoside (MC1A) [37] ngoại trừ

mất đi tín hiệu của nhóm metoxi tại C-19. Các tương tác trên phổ HMBC giữa H-6 (H

6,12)/H-7 (H 5,60) với C-5 (C 86,31) chứng tỏ có một liên kết đôi nội vòng tại C-

6/C-7; liên kết đôi thứ hai được xác định tại vị trí C-23/C-24 dựa vào tương tác giữa

H-26 (H 1,27) với C-24 (C 137,64)/C-25 (C 76,49)/C-27 (C 26,49) và giữa H-27

(H 1,27) với C-24 (C 137,64)/C-25 (C 76,49)/C-26 (C 26,20). Tương tác giữa H-3

(H 3,41) với C-5 (C 86,31)/C-1′ (C 107,45) và giữa H-1′ (H 4,27) với C-3 (C

86,98) xác định vị trí của β-D-glucopyranoside tại C-3; tương tác giữa nhóm metoxi

(H 3,17) với C-25 (C 76,49) khẳng định vị trí của nhóm metoxi tại C-25. Bên cạnh

đó, tương tác giữa H-19 (C 5,11) với C-5 (C 86,31)/C-8 (C 42,61)/C-9 (C 48,48)/C-

10 (C 42,69)/C-11 (C 23,95) gợi ý nhóm hydroxyl tại C-19 và cầu epoxy tại C-5/C-

19. Cấu hình tại C-19 được xác định là R dựa vào tương tác NOE giữa H-19 (H 5,11)

với Hβ-1 (H 1,58). Từ các bằng chứng phổ trên, cấu trúc hóa học của MC1 được xác

định là (19R)-5β,19-epoxy-25-methoxycucurbita-6,23E-diene-3β,19-diol 3-O-β-D-

glucopyranoside, một hợp chất mới được đặt tên là charantoside D.

Hình 4. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC1

31

Hình 5. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC1

Hình 6. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC1

32

Hình 7. Phổ HSQC của chất MC1

Hình 8. Phổ HMBC của chất MC1

33

Hình 9. Phổ NOESY của chất MC1

4.1.2. Hợp chất MC2: Charantoside E (hợp chất mới)

Hình 10. Cấu trúc hóa học của MC2, hợp chất tham khảo MC2A và các tương tác HMBC chính của MC2.

Hợp chất MC2 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử của

MC2 được xác định là C37H60O9 bằng kết quả phổ khối lượng phân giải cao tại m/z

647,4158 [M-H]- (tính toán lý thuyết cho công thức [C37H59O9]-, 647,4165). Phổ 1H-

NMR của MC2 tượng tự như MC1 với sự xuất hiện tín hiệu của sáu nhóm metyl bậc

ba tại H 0,95 (3H, s, H-18), 1,27 (6H, s, H-26, 27), 1,17 (3H, s, H-28), 0,90 (3H, s, H-

29) và 0,93 (3H, s, H-30), một nhóm metyl bậc 2 tại H 0,96 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-21),

bốn proton olefin tại H 6,12 (1H, dd, J = 9,5; 2,0 Hz), 5,61 (1H, dd, J = 9,5; 3,5 Hz),

34

5,63 (1H, ddd, J = 15,5; 9,0; 6,0 Hz) và 5,44 (1H, d, J = 15,5 Hz), một proton

oximetin tại H 3,41 (1H, br s, H-3) và ba proton nhóm metoxi tại H 3,17 (3H, s) đặc

trưng cho khung cucurbitane; tín hiệu của proton anome tại H 4,67 (1H, d, J = 8,0 Hz,

H-1′), gợi ý sự có mặt của 1 phân tử đường. Phổ 13C-NMR và DEPT của MC2 xuất

hiện tín hiệu của 37 cacbon, bao gồm tám nhóm metyl tại C 15,16 (C-18), 19,23 (C-

21), 26,20 (C-26), 26,48 (C-27), 20,69 (C-28), 25,65 (C-29), 20,19 (C-30), 50,52 (25-

OMe); tám nhóm metilen tại C 19,30 (C-1), 27,86 (C-2), 23,97 (C-11), 31,80 (C-12),

34,70 (C-15), 29,00 (C-16), 40,47 (C-22), 63,30 (C-6′); 15 nhóm metin tại C 86,91

(C-3), 134,20 (C-6), 132,54 (C-7), 42,63 (C-8), 42,70 (C-10); 51,34 (C-17), 106,00 (C-

19), 37,45 (C-20), 130,02 (C-23), 137,64 (C-24), 104,71 (C-1′), 72,70 (C-2′), 72,70

(C-3′), 69,09 (C-4′), 76,50 (C-5′) và sáu cacbon không liên kết trực tiếp với hydro tại

C 39,67 (C-4), 86,30 (C-5), 48,34 (C-9), 46,24 (C-13), 48,62 (C-14), 75,35 (C-25). So

sánh số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của MC2 với hợp chất (19R),25-dimethoxy-5β,19-

epoxycucurbita-6,23E-diene-3β-ol 3-O-β-D-allopyranoside (MC2A) [37], cho thấy các

giá trị tương đương nhau, ngoại trừ mất đi tín hiệu của nhóm metoxi tại C-19; và với

MC1 cho thấy có sự khác nhau của phân tử đường. Độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR

của đường: C 104,71 (C-1′), 72,70 (C-2′), 72,70 (C-3′), 69,09 (C-4′), 76,50 (C-5′),

D-allopyranoside. Tương tác HMBC giữa H-1′ (H 4,67) với C-3 (H 86,91) và giữa H-

63,30 (C-6′) và hằng số tương tác giữa H-1′ và H-2′, J = 8,0 Hz; gợi ý đây là đường β-

3 (H 3,41) với C-1' (C104,71) khẳng định vị trí của allose tại C-3. Tương tác HMBC

giữa metoxi (H3,17) với C-25 (C 75,35) gợi ý sự có mặt của nhóm metoxi tại C-25.

Từ những dữ kiện trên, cấu trúc hóa học của hợp chất MC2 được xác định là (19R)-

5β,19-epoxy-25-methoxycucurbita-6,23E-diene-3β,19-diol 3-O-β-D-allopyranoside,

một hợp chất mới được đặt tên là charantoside E.

35

Bảng 2. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC2 và hợp chất tham khảo

δC

a

δH

a (J = Hz)

C

#

DEPT

18,7 27,3 83,4 39,0 85,4

19,30 CH2 27,86 CH2 86,91 CH 39,67 C 86,30 C

132,9 134,20 CH 131,3 132,54 CH 42,63 CH

42,2 48,1 48,34* C 42,70 CH 41,6 23,97 CH2 23,3 31,80 CH2 30,9 45,3 46,24 C 48,3 48,62* C 33,9 28,1 50,4 14,9

36,3 18,9 39,6

34,70 CH2 29,00 CH2 51,34 CH 15,16 CH3 112,2 106,00 CH 37,45 CH 19,23 CH3 40,47 CH2 128,2 130,02 CH 137,4 137,64 CH

75,35 C 26,20 CH3 26,48 CH3 20,69 CH3 25,65 CH3 20,19 CH3 50,52 CH3

74,7 26,1 26,5 21,2 24,9 20,0 50,0 57,6

STT Aglycon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 25-OMe 19-OMe 3-O-All 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′

73,6 71,6 69,2 76,3 63,2

102,3 104,71 CH 72,70 CH 72,70 CH 69,09 CH 76,50 CH 63,30 CH2

1,43 (m)/1,58 (m) 1,76 (m)/2,17 (dd, 13,5; 3,5) 3,41 (br s) - - 6,12 (dd, 9,5; 2,0) 5,61 (dd, 9,5; 3,5) 2,48 (d, 3,5) - 2,94 (m) 1,67 (m)/1,77 (m) 1,62 (m)/1,69 (m) - - 1,39 (m)/1,41 (m) 1,44 (m)/2,04 (m) 1,55 (m) 0,95 (s) 5,11 (s) 1,62 (m) 0,96 (d, 6,0) 1,89 (m)/2,24 (m) 5,63 (ddd, 15,5; 9,0; 6,0) 5,44 (d, 15,5) - 1,27 (s) 1,27 (s) 1,17 (s) 0,90 (s) 0,93 (s) 3,17 (s) 4,67 (d, 8,0) 3,27 (m) 3,26 (m) 3,31 (m) 3,36 (m) 3,69 (dd, 12,0; 5,5) 3,87 (dd, 12,0; 2,0)

ađo trong CD3OD, #C của (19R),25-dimethoxy-5β,19-epoxycucurbita-6,23E-diene- 3β-ol 3-O-β-D-allopyranoside (MC2A) đo trong pyridine-d5 [37]

36

Hình 11. Phổ HR-ESI-MS của chất MC2

Hình 12. Phổ 1H-NMR của chất MC2

37

Hình 13. Phổ 13C-NMR của chất MC2

Hình 14. Phổ HSQC của hợp chất MC2

38

Hình 15. Phổ HMBC của chất MC2

4.1.3. Hợp chất MC3: Charantoside F (hợp chất mới)

Hình 16. Cấu trúc hóa học của MC3, hợp chất tham khảo MC3A và các tương tác HMBC chính của MC3.

Hợp chất MC3 thu được dưới dạng bột màu trắng, công thức phân tử được

xác định là C37H60O7 dựa trên sự xuất hiện pic phân tử trên phổ HR-ESI-MS tại m/z

615,4270 [M-H]- (tính toán lý thuyết cho công thức C37H59O7, 615,4266). Phổ 1H-

NMR của MC3 cho biết sự xuất hiện tín hiệu của năm proton olefin tại H 5,76 (1H,

d, J = 6,0 Hz, H-6); 5,68 (1H, ddd, J = 15,5; 8,5; 6,5 Hz, H-23), 5,95 (1H, d, J = 15,5

Hz, H-24), 4,95 (1H, s, Ha-26) và 4,91 (1H, s, Hb-26); sáu nhóm metyl bậc ba tại H

39

1,00 (3H, s, H-18), 0,97 (3H, s, H-19), 1,84 (3H, s, H-27), 1,07 (3H, s, H-28), 1,27

(3H, s, H-29) và 0,78 (3H, s, H-30); một nhóm metyl bậc 2 tại H 0,96 (3H, d, J = 6,0

Hz, H-21); một proton oximetin tại H 3,49 (1H, br s, H-3); tín hiệu của nhóm metoxi

tại H 3,37 (3H, s, 7-OMe); một proton anome tại H 4,68 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′).

Phổ 13C-NMR và DEPT của MC3 xuất hiện tín hiệu của 37 nguyên tử cacbon trong

đó có 30 cacbon của khung cucurbitane bao gồm: sáu cacbon không liên kết với

hydro tại C 42,72 (C-4), 150,00 (C-5), 33,87 (C-9), 47,35 (C-13), 48,70 (C-14),

143,00 (C-25); chín nhóm metin tại C 87,87 (C-3), 120,00 (C-6), 79,03 (C-7), 48,91

(C-8), 40,21 (C-10), 51,42 (C-17), 37,94 (C-20), 129,98 (C- 23), 135,54 (C-24), tám

nhóm metylen tại C 23,13 (C-1), 28,65 (C-2), 31,27 (C-11), 30,71 (C-12), 35,12 (C-

29,47 (C-19), 19,30 (C-21), 18,88 (C-27), 28,65 (C-28), 26,04 (C-29), 18,68 (C-30), 56,57

(7-OMe), và sáu cacbon đặc trưng cho đường allopyranoside. So sánh số liệu phổ 1H-

15), 28,65 (C-16), 40,81(C-22), 114.48 (C-26); tám nhóm metyl tại C 15,87 (C-18),

và 13C-NMR của MC3 với (23E)-cucurbita-5,23,25-triene-3β,7β-diol [7] cho thấy

cấu trúc của MC3 có sự xuất hiện thêm đường allopyranoside tại C-3 và nhóm

metoxi tại C-7.

Các tương tác HMBC giữa H-6 (H 5,76) với C-4 (C 42,72)/C-5 (C 150,00);

giữa H-7 (H 3,51) với C-6 (C 120,00)/C-8 (C 48,91); giữa metoxi (H 3,37) với C-7

(C 79,03) chứng tỏ có một liên kết đôi tại C-5/C-6 của vòng B và nhóm metoxi tại C-

7; liên kết đôi thứ hai được xác định tại C-23/C-24 dựa vào tương tác HMBC giữa H-

23 (H 5,68) với C-22 (C 40,81)/C-25 (C 143,00) và giữa H-24 (H 5,95) với C-27 (C

18,88). Tương tác giữa proton H-3 (H 3,49) với C-1′ (C 103,96) và giữa H-1′ (H

4,68) với C-3 (C 87,87) khẳng định đường allose được nối vào C-3 của aglycon

cucurbita-5,23,25-triene. Từ những phân tích nêu trên, cấu trúc hóa học của hợp chất là 7β-methoxycucurbita-5,23E,25-triene-3β-ol 3-O-β-D- MC3 được xác định

allopyranoside, một hợp chất mới được đặt tên là charantoside F.

40

Bảng 3. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC3 và hợp chất tham khảo

δC

a (J = Hz)

C

STT Aglycon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 7-OMe 3-O-All 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′

# 21,0 28,7 76,7 41,5 146,7 122,5 68,2 53,1 33,9 38,6 32,5 30,0 45,9 48,2 34,6 27,8 50,1 15,4 29,6 36,6 18,8 39,7 129,4 134,1 142,2 114,0 18,7 25,4 27,7 17,8

a DEPT δH 23,13 CH2 28,65 CH2 87,87 CH 42,72 C 150,00* C 120,00* CH 79,03 CH 48,91* CH 33,87 C 40,21 CH 31,27 CH2 30,71 CH2 47,35 C 48,70* C 35,12 CH2 28,65 CH2 51,42 CH 15,87 CH3 29,47 CH3 37,94 CH 19,30 CH3 40,81 CH2 129,98 CH 135,54 CH 143,00* C 114,48 CH2 18,88 CH3 28,65 CH3 26,04 CH3 18,68 CH3 56,57 CH3 103,96 CH 72,80 CH 73,12 CH 69,12 CH 75,14 CH 63,35 CH2

1,36 (m)/1,57 (m) 1,41 (m)/2,06 (dd, 13,0; 2,5) 3,49 (br s) - - 5,76 (d, 6,0) 3,51 (d, 6,0) 2,11 (br s) - 2,37 (dd, 13,0; 4,5) 1,35 (m)/1,57 (m) 1,31 (m)/1,36 (m) - - 1,41 (m) 1,37 (m)/1,38 (m) 1,59 (m) 1,00 (s) 0,97 (s) 1,61 (m) 0,96 (d, 6,0) 1,89 (m)/2,35 (m) 5,68 (ddd, 15,5; 8,5; 6,5) 5,95 (d, 15,5) - 4,91 (s)/4,95 (br s) 1,84 (s) 1,07 (s) 1,27 (s) 0,78 (s) 3,37 (s) 4,68 (d, 7,5) 3,32 (dd, 7,5; 3,0) 4,05 (dd, 3,0; 3,0) 3,47 (dd, 9,0; 3,0) 3,65 (m) 3,67 (dd, 12,0; 5,0) 3,84 (dd, 12,0; 2,0)

ađo trong CD3OD, *tín hiệu che lấp bởi dung môi, #δC số liệu của (23E)-cucurbita-

5,23,25-triene-3β,7β-diol (MC3A) trong CDCl3 [7].

41

Hình 17. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC3

Hình 18. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC3

42

Hình 19. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC3

Hình 20. Phổ HSQC của hợp chất MC3

43

Hình 21. Phổ HMBC của hợp chất MC3

4.1.4. Hợp chất MC4: Charantoside G (hợp chất mới)

Hình 22. Cấu trúc hóa học của MC4, hợp chất tham khảo MC4A và các tương tác HMBC chính của MC4.

Công thức phân tử của hợp chất MC4 được xác định là C36H56O8 dựa trên pic

ion phân tử của phổ HR-ESI-MS tại m/z 615,3904 [M−H]− và 651,3681 [M+Cl]+ (tính

1H-NMR của MC4 xuất hiện tín hiệu của năm nhóm metyl bậc ba tại H 0,95 (3H, s,

toán lý thuyết cho công thức [C36H55O8]-, 615,3902 và C36H56O8Cl]-, 651,3669). Phổ

H-18), 1,84 (3H, s, H-27), 1,10 (3H, s, H-28), 1,34 (3H, s, H-29) và 0,84 (3H, s, H-

30); một nhóm metyl bậc 2 tại H 0,96 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), proton andehit tại H

44

9,87 (1H, s), năm proton olefin H 5,89 (1H, d, J = 5,5 Hz); 5,68 (1H, ddd, J = 15,5;

8,5; 6,5 Hz), 6,12 (1H, d, J = 15,5 Hz), 4,88 (1H, s) và 4,91 (1H, s); một proton

oximetin tại H 3,58 (1H, br s). Ngoài ra, còn xuất hiện tín hiệu của một đơn vị đường

tại H 4,67 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′), 3,31 (1H, dd, J = 8,0, 3,0 Hz, H-2′), 4,05 (1H, dd,

J = 3,0; 3,0 Hz, H-3′), 3,48 (1H, dd, J = 9,0; 3,0 Hz, H-4′), 3,65 (1H, m, H-5′), 3,71

(1H, dd, J = 12,0, 4,5 Hz, Ha-6′), 3,84 (1H, dd, J = 12,0, 1,5 Hz, Hb-6′). Phổ 13C-NMR

và DEPT của MC4 xuất hiện tín hiệu của 36 cacbon, bao gồm: sáu nhóm metyl tại C

15,33 (C-18), 19,27 (C-21), 18,88 (C-27), 27,59 (C-28), 26,05 (C-29), 18,65 (C-30);

chín cacbon metylen tại C 23,31 (C-1), 28,71 (C-2), 22,99 (C-11), 30,16 (C-12), 35,67

(C-15), 28,61 (C-16), 40,79 (C-22), 114,54 (C-26), 63,31 (C-6′); 15 cacbon metin tại C

87,29 (C-3), 123,35 (C-6), 66,77 (C-7), 51,32 (C-8), 37,30 (C-10), 51,32 (C-17), 37,87

(C-20), 129,89 (C-23), 135,60 (C-24), 210,08 (C-19), 103,84 (C-1′), 72,76 (C-2′),

73,18 (C-3′), 69,07 (C-4′), 75,15 (C-5′); sáu cacbon không liên kết trực tiếp với hydro

tại C 42,53 (C-4), 147,81 (C-5), 51,36 (C-9), 46,67 (C-13), 48,66 (C-14), 143,43 (C-

25). Để xác định chính xác cấu trúc của MC4, chúng tôi đã tiến hành đo HSQC và

HMBC. Các tương tác HMBC giữa H-19 (H 9,87) với C-8 (C 51,32)/C-9 (C

51,36)/C10 (C 37,30)/C-11 (C 22,99) gợi ý nhóm aldehyd tại C-9; tương tác HMBC

giữa H-6 (H 5,89) với C-4 (C 42,53)/C-5(C 147,81)/C-7 (C 66,77)/C-8 (C 51,32);

giữa H-7 (H 4,02) với C-5 (C 147,81)/C-6 (C 123,35)/C-8 (C 51,32)/C-9 (C 51,36)

chứng tỏ sự có mặt của liên kết đôi tại C-5/C-6 và nhóm hydroxyl tại C-7; liên kết đôi

thứ hai được xác định tại vị trí C-23/C-24 dựa vào tương tác HMBC giữa H-23 (H

5,68) với C-22 (C 40,79)/C-24(C 135,60)/C-25(C 143,43) và giữa H-24 (H 6,12) với

C-22 (C 40,79)/C-23 (C 129,89)/C-25(C 143,43)/C-26 (C 114,54)/C-27 (C 18,88).

Tương tác HMBC giữa H-3 (H 3,58) với C-1′ (C 103,84) và khẳng định đường allose

được nối vào C-3. Từ những phân tích nêu trên, kết hợp với so sánh dữ kiện phổ với

hợp chất tương tự (23E)-3β-hydroxy-7β-ethoxycucurbita-5,23,25-trien-19-al [26]. Cấu

trúc hóa học của hợp chất MC4 được xác định là 3β,7β-hydroxycucurbita-5,23E,25-

triene-19-al 3-O-β-D-allopyranoside, một hợp chất mới được đặt tên là charantoside G.

45

Bảng 4. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC4 và hợp chất tham khảo

a DEPT

δH

a (J = Hz)

δC

#δC 21,6 29,8 75,6 42,0 147,7 121,1 75,7 45,8 50,3 36,7 22,6 29,3 45,9 48,0 35,1 27,8 50,5 15,0 207,2 36,8 18,9 40,1 129,7 134,8 142,5 114,7 19,0 27,3 26,2 18,3

23,31 CH2 28,71 CH2 87,29 CH 42,53 C 147,81 C 123,35 CH 66,77 CH 51,32 CH 51,36 C 37,30 CH 22,99 CH2 30,16 CH2 46,67 C 48,66 C 35,67 CH2 28,61 CH2 51,32 CH 15,33 CH3 210,08 CH 37,87 CH 19,27 CH3 40,79 CH2 129,89 CH 135,60 CH 143,43 C 114,54 CH2 18,88 CH3 27,59 CH3 26,05 CH3 18,65 CH3

C Aglycon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3-O-All 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′

103,84 CH 72,76 CH 73,18 CH 69,07 CH 75,15 CH 63,31 CH2

1,46 (m)/1,59 (m) 1,45 (m)/2,11(dd, 2,5; 13,0) 3,58 (br s) - - 5,89 (d, 5,5) 4,02 (d, 5,5) 1,95 (br s) - 2,62 (dd, 13,0, 5,0) 1,60 (m)/2,41 (m) 1,32 (m)/1,71 (m) - - 1,38 (m)/1,42 (m) 1,45 (m)/1,95 (m) 1,58 (m) 0,95 (s) 9,87 (s) 1,60 (m) 0,96 (d, 6,5) 1,88 (m)/2,30 (m) 5,68 (ddd, 15,5, 8,5, 6,5) 6,12 (d, 15,5) - 4,88 (br s)/4,91 (br s) 1,84 (s) 1,10 (s) 1,34 (s) 0,84 (s) 4,67 (d, 8,0) 3,31 (dd, 8,0, 3,0) 4,05 (dd, 3,0; 3,0) 3,48 (dd, 9,0, 3,0,) 3,65 (m) 3,71 (dd, 12,0, 4,5) 3,84 (dd, 12,0, 1,5)

ađo trong CD3OD,#δC số liệu của (23E)-3β-hydroxy-7β-methoxycucurbita- 5,23,25-trien-19-al (MC4A) đo trong C5D5N [26]

46

Hình 23. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC4

Hình 24. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC4

47

Hình 25. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC4

Hình 26. Phổ HSQC của hợp chất MC4

48

Hình 27. Phổ HMBC của hợp chất MC4

4.1.5. Hợp chất MC5: Goyaglycoside-c

Hình 28. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của MC5.

Hợp chất MC5 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của

MC5 xuất hiện tín hiệu singlet của sáu nhóm metyl bậc ba tại H 0,95 (3H, H-18), 1,27

(6H, H-26/H-27), 1,24 (3H, H-28), 0,93 (3H, H-29) và 0,91 (3H, H-30), một nhóm

metyl bậc 2 dưới dạng tín hiệu doublet tại H 0,97 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), hai nhóm

49

metoxi tại H 3,40 (3H, s, 19-OMe) và 3,16 (3H, s, 25-OMe), bốn proton olefin tại H

6,19 (1H, dd, J = 10,0; 2,0 Hz) và 5,52 (1H, dd, J = 10,0; 3,5 Hz); 5,64 (1H, ddd, J =

15,5; 8,5; 3,0 Hz) và 5,41 (1H, d, J = 15,5 Hz); Ngoài ra, còn xuất hiện các tín hiệu

đặc trưng của một phân tử đường, proton anome tại H 4,33 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′).

Phổ 13C-NMR và DEPT của MC5 xuất hiện tín hiệu của 38 nguyên tử cacbon trong đó

có 30 nguyên tử cacbon đặc trưng cho khung cucurbitane; sáu cacbon của đường

glucose tại C 106,70 (C-1′), 75,79 (C-2′), 77,74 (C-3′), 71,84 (C-4′), 77,74 (C-5′) và

62,92 (C-6′); hai nhóm thế metoxi tại C 57,25 (19-OMe) và 50,53 (25-OMe). Các

tương tác HMBC giữa H-6 (H 6,19) với C-5 (C 85,36)/C-8 (C 50,98)/C-10 (C

39,94); giữa H-7 (H 5,52) với C-5 (C 85,36)/C-8 (C 50,98)/C-9 (C 49,95)/C-14 (C

49,62) chứng tỏ có một liên kết đôi nội vòng tại C-6/C-7. Liên kết đôi thứ hai được

xác định tại C-23/C-24 dựa vào tương tác HMBC giữa H-23 (H 5,64) với C-22 (C

40,47)/C-24 (C 137,66)/C-25 (C 76,50) và giữa H-24 (H 5,41) với C-22 (C

40,47)/C-23 (C 130,01)/C-25 (C 76,50)/C-26 (C 26,20)/C-27 (C 26,48); giữa metoxi

(H 3,40) với C-19 (C 115,95) và giữa H-19 (H 4,43) với metoxi (C 57,25); giữa

metoxi (H 3,16) với C-25 (C 76,50) chứng tỏ vị trí của metoxi tại C-19 và C-25.

Tương tác HMBC giữa H-3 (H 3,47) với glc C-1′ (C 106,70) và giữa glc H-1′ (H

4,33) với C-3 (C 86,63) gợi ý phân tử đường glucose đính tại vị trí C-3 của aglycon.

Từ những phân tích nêu trên cùng với việc so sánh các dữ kiện phổ của MC5 với giá

trị phổ của hợp chất goyaglycoside-c [37] cho thấy sự giống nhau tại các vị trí tương

ứng. Vì vậy hợp chất này được xác định là goyaglycoside-c.

50

Bảng 5. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC5 và hợp chất tham khảo

δC

a DEPT

a (J = Hz)

C

#

18,6 27,3 83,6 39,1 85,4 133,1 131,5 42,2 48,1 41,6 23,2 30,9 45,3 48,2 33,8 28,1 50,3 14,8 112,3 36,3 18,8 39,6 128,3 137,6 74,7 26,0 26,4 21,1 24,8 19,9 57,5 50,0

18,68 CH2 27,89 CH2 86,63 CH 39,69 C 85,36 C 135,49 CH 130,41 CH 50,98 CH 49,95 C 39,94 CH 22,49 CH2 31,69 CH2 46,33 C 49,62 C 34,80 CH2 28,87 CH2 51,40 CH 15,46 CH3 115,95 CH 37,46 CH 19,22 CH3 40,47 CH2 130,01 CH 137,66 CH 76,50 C 26,20 CH3 26,48 CH3 20,89 CH3 25,82 CH3 20,46 CH3 57,25 CH3 50,53 CH3

STT Aglycon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 19-OMe 25-OMe 3-O-Glc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′

105,2 76,1 77,8 72,0 78,5 63,0

106,70 CH 75,79 CH 77,98 CH 71,84 CH 77,74 CH 62,92 CH2

δH 1,27 (m)/2,08 (m) 1,75 (m)/2,06 (m) 3,47 (br s) - - 6,19 (dd 10,0; 2,0) 5,52 (dd 10,0; 3,5) 2,34 (m) - 2,31 (dd 12,5; 5,5) 1,66 (m)/1,76 (m) 1,21 (m)/1,68 (m) - - 1,38 (m) 1,46 (m)/2,04 (m) 1,57(m) 0,95 (s) 4,43 (s) 1,65 (m) 0,97 (d 6,5) 1,87 (m)/2,24 (dd 11,0; 1,5) 5,64 (ddd 15,5; 8,5; 3,0) 5,41 (d 15,5) - 1,27 (s) 1,27 (s) 1,24 (s) 0,93 (s) 0,91 (s) 3,40 (s) 3,16 (s) 4,33 (d 8,0) 3,25* 3,26* 3,31 * 3,36 * 3,87 (dd 12,0; 2,0) 3,69 (dd 12,0; 5,0)

ađo trong CD3OD, *tín hiệu che lấp bởi dung môi, #δC số liệu của goyaglycoside-C trong pyridine-d5 [37].

51

Hình 29. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC5

Hình 30. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC5

52

Hình 31. Phổ DEPT hợp chất MC5

Hình 32. Phổ HSQC của hợp chất MC5

53

Hình 33. Phổ HMBC của hợp chất MC5

4.1.6. Hợp chất MC6: Goyaglycoside-d

Hình 34. Cấu trúc hóa học của MC6

Hợp chất MC6 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của MC6

khá giống với phổ của MC5 và cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của sáu nhóm metyl bậc

ba tại H 0,91 (3H, s), 1,27 (6H, s), 1,22 (3H, s), 0,93 (3H, s) và 0,88 (3H, s), một nhóm

metyl bậc 2 tại H 0,96 (3H, d, J = 6,5 Hz), hai nhóm thế metoxi tại H 3,46 (3H, s, 19-

OMe) và 3,17 (3H, s, 25-OMe), bốn proton của hai liên kết đôi tại H 6,06 (1H, dd, J =

54

Bảng 6. Số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất MC6 và hợp chất tham khảo

δC

a DEPT

C

#

18,7 27,3 83,4 39,0 85,4 132,9 131,3 42,2 48,1 41,6 23,3 30,9 45,3 48,3 33,9 28,1 50,4 14,9 112,2 36,3 18,9 39,6 128,2 137,4 74,7 26,1 26,5 21,2 24,9 20,0 57,6 50,0

19,25 CH2 27,82 CH2 85,45 CH 39,80 C 86,90 C 133,51 CH 132,55 CH 43,17 CH 48,48 C 42,53 CH 24,09 CH2 31,77 CH2 46,21 C 48,48 C 34,72 CH2 28,98 CH2 51,31 CH 15,16 CH3 113,89 CH 37,44 CH 19,25 CH3 40,47 CH2 129,99 CH 137,65 CH 76,47 C 26,21 CH3 26,49 CH3 21,08 CH3 25,55 CH3 20,28 CH3 58,56 OCH3 50,53 OCH3

STT Aglycon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 19-OMe 25-OMe 3-O-All 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′

102,3 73,6 71,6 69,2 76,3 63,2

103,11 CH 73,33 CH 72,15 CH 69,05 CH 75,73 CH 63,26 CH2

ađo trong CD3OD, #C của goyaglycoside-d trong pyridine-d5 [37]

55

9,5; 1,5 Hz) và 5,55 (1H, dd, J = 9,5; 1,5 Hz); 5,63 (1H, ddd, J = 15,5; 8,5; 5,5 Hz) và

5,41 (1H, d, J = 15,5 Hz); proton anome tại H 4,80 (1H, d, J = 7,5 Hz).

Phổ 13C-NMR và DEPT của MC6 xuất hiện tín hiệu của 38 nguyên tử cacbon

trong đó có 30 nguyên tử cacbon đặc trưng cho khung cucurbitane; hai nhóm thế

metoxi tại C 58,56 và 50,53; sáu nguyên tử cacbon của một đơn vị đường tại C

103,11 (C-1′), 73,33 (C-2′), 72,15 (C-3′), 69,05 (C-4′), 75,73 (C-5′) và 63,26 (C-6′) đặc

trưng cho đường allopyranoside. Phân tích số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của MC6 cho

thấy số liệu phổ của hợp chất này giống hoàn toàn với của hợp chất goyaglycoside-d,

một hợp chất đã được phân lập từ quả mướp đắng. Vì vậy, MC6 được xác định là

goyaglycoside-d [37].

Hình 35. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC6

56

Hình 36. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC6

Hình 37. Phổ DEPT của hợp chất MC6

57

OCH3

OMe

6' 4'

4.1.7. Hợp chất MC7: Momordicoside F1

Hình 38. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của MC7

Phổ 1H-NMR của MC7 tương tự như chất MC5 và MC6. Phổ 13C-NMR và

DEPT của MC7 xuất hiện tín hiệu của 37 cacbon trong đó có 30 cacbon đặc trưng cho

khung cucurbitane; một nhóm thế metoxi tại C 50,56 (25-OMe); sáu nguyên tử

cacbon của một đơn vị đường đặc trưng cho đường glucopyranoside. So sánh số liệu

phổ của MC7 với MC6 cho thấy cấu trúc của MC7 khác với cấu trúc của MC6 tại C-

19 với sự mất đi nhóm metoxi. Các tương tác HMBC giữa H-6 (H 6,29) với C-4 (C

39,67)/C-5 (C 87,71)/C-8 (C 53,25)/C-10 (C 40,95); H-7 (H 5,78) với C-5 (C

87,71)/C-9 (C 45,91) chứng tỏ sự có mặt của liên kết đôi tại C-6/C-7. Liên kết đôi thứ

hai được xác định tại vị trí C-23/C-24 dựa trên sự quan sát các tương tác HMBC giữa

H-23 (H 5,77) với C-22 (C 40,48)/C-24 (C 137,73)/C-25 (C 76,38); H-24 (H 5,57)

với C-22 (C 40,48)/C-23 (C 129,89)/C-25 (C 76,38)/C-26 (C 26,26)/C-27 (C 26,54);

vị trí của nhóm metoxi tại C-25 dựa trên tương tác HMBC từ nhóm metoxi (H 3,30)

đến C-25 (C 76,38). Tương tác giữa glc H-1′ (H 4,41) với C-3 (C 86,89) khẳng định

vị trí nối giữa khung với đường gluco tại vị trí C-3. Chi tiết các tương tác HMBC được

trình bày trên bảng 7 và hình 38. Từ những phân tích nêu trên, hợp chất MC7 được

xác định là momordicoside F1 [43].

58

Bảng 7. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC7 và hợp chất tham khảo

a

 δC

δC

STT Aglycon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

85,4 39,0 85,8 134,1 129,9 45,2 45,4 48,8 80,0

19,48 CH2 28,10 CH2 86,89 CH 39,67 C 87,71 C 133,91 CH 131,41 CH 53,25 CH 45,91 C 40,95 CH 24,58 CH2 31,93 CH2 46,40 C 49,34 C 34,30 CH2 29,04 CH2 51,25 CH 15,48 CH3 80,70 CH2

128,3 137,6 74,8 52,2

37,36 CH 19,34 CH3 40,48 CH2 129,89 CH 137,73 CH 76,38 C 26,26 CH3 26,54 CH3 20,37 CH3 26,23 CH3 20,68 CH3 50,56 OCH3

20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 25-OMe 3-O-Glc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′

106,8 75,7 78,3 71,7 78,3 63,0

107,58 CH 75,17 CH 77,65 CH 71,73 CH 77,46 CH 62,83 CH2

DEPT δH (J = Hz) 1,63 (m) 2,06 (m)/2,41 (m) 3,58 (br s) - - 6,29 (dd 10,0; 1,5) 5,78 (dd 10,0; 2,0) 2,59 (br s) - 2,50 (m) 1,94 (m)/1,71(m) 1,94 (m)/1,88 (m) - - 1,54 (m) 2,20 (dd 13,0; 2,5)/1,63 (m) 1,71 (m) 1,12 (s) 3,84 (d, 8,0) 3,72 (d, 8,0) 1,77 (m) 1,12 (d 6,0) 2,04 (m)/2,42 (m) 5,77 (dd 16,0; 8,0) 5,57 (d 16,0) - 1,43 (s) 1,13 (s) 1,31 (s) 1,10 (s) 1,10 (s) 3,30 (s) 4,41 (d 7,5) 3,43 (dd 9,0; 7,5) 3,11 (t 9,0) 3,45 (t 9,0) 3,20 (m) 3,56 (dd 12,0; 5,0) 3,75 (dd 12,0; 2,5)

ađo trong CD3OD, #C

của momordicoside F1 đo trong pyridine-d5 [43]

59

Hình 39. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC7

Hình 40. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC7

60

Hình 41. Phổ HSQC của hợp chất MC7

Hình 42. Phổ HMBC của hợp chất MC7

61

6''

4''

5''

3''

1''

2''

4.1.8. Hợp chất MC8: Momordicoside N

Hình 43. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của MC8

Phổ 1H-NMR của MC8 xuất hiện tín hiệu của sáu nhóm metyl bậc ba tại H

0,92 (3H, H-18), 1,78 (3H, H-26), 1,81 (3H, H- 27), 1,15 (3H, H-28), 0,96 (3H, H-29)

và 0,86 (3H, H-30), một nhóm metyl bậc 2 tại H 0,99 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 3

proton của 2 liên kết đôi tại H 6,12 (1H, dd, J = 10,0; 2,0 Hz) và 5,64 (1H, dd, J =

10,0; 4,0 Hz); H 5,27 (1H, br d, J = 10,0 Hz), hai proton oximetylen tại H 3,53 (1H,

m) và 3,67 (1H, m), hai proton anome tại H 4,64 (1H, d, J =8,0 Hz, H-1′) và 4,74 (1H,

d, J = 8,0 Hz, H-1′′) gợi ý sự có mặt của hai phân tử đường. Phổ 13C-NMR và các phổ

DEPT của MC8 xuất hiện tín hiệu của 42 nguyên tử cacbon trong đó có 30 nguyên tử

cacbon đặc trưng cho khung cucurbitane; 12 nguyên tử cacbon của hai đơn vị đường

tại C 104,91 (C-1′), 72,91 (C-2′), 72,50 (C-3′), 69,05 (C-4′), 75,52 (C-5′), 62,99 (C-1),

102,41 (C-1′′), 72,84 (C-2′′), 72,50 (C-3′′), 68,68 (C-4′′), 75,27 (C-5′′) và 63,28 (C-6′′)

đặc trưng cho 2 đường allopyranoside. Hằng số tương tác của H-1′ và H-2′; H-1″ và H-

2″, J = 8,0 Hz, gợi ý cấu hình của cả 2 đường này β-D-allopyranoside. Các tương tác

HMBC giữa H-6 (H 6,12) và H-7 (H 5,64) với C-5 (C 87,76) chứng tỏ có một liên

kết đôi nội vòng tại C-6/C-7; liên kết đôi thứ hai được xác định tại vị trí C-24/C-25

dựa vào tương tác HMBC giữa H-26 (H 1,78)/H-27 (H 1,81) với C-24 (C 124,46)/C-

25 (C 137,37). Tương tác HMBC giữa H-1′ (H 4,64) với C-3 (C 86,99); H-1′′ (H

4,74) với C-23 (C 81,38) gợi ý vị trí của đường allose tại C-3 và C-23. Từ những phân

tích nêu trên cùng với việc so sánh các dữ kiện phổ của MC8 với các dữ liệu phổ

tương ứng đã công bố [28] cho thấy số liệu phổ của MC8 giống với của hợp chất

62

momordicoside N. Vì vậy, cấu trúc của hợp chất MC8 được xác định là

momordicoside N.

Bảng 8. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất MC8 và hợp chất tham khảo

δC

a (J = Hz)

C

# 18,9 27,5 85,0 39,0 85,9

a DEPT 19,46 CH2 28,07 CH2 86,99 CH 39,68 C 87,76 C

134,2 133,99 CH 130,0 131,40 CH 53,26 CH 52,3 45,99 C 45,3 41,90 CH 40,1 24,57 CH2 23,8 32,05 CH2 31,2 45,7 46,58 C 48,6 48,82* C 33,7 28,0 46,6 14,5 80,1 40,7 14,7 76,6 81,2

34,46 CH2 28,84 CH2 47,55 CH 14,87 CH3 80,69 CH2 41,98 CH 14,57 CH3 77,21 CH 81,38 CH 124,7 124,46 CH 135,3 137,37 C

26,2 18,6 21,1 25,5 20,2

26,23 CH3 18,90 CH3 20,50 CH3 26,51 CH3 20,77 CH3

STT Aglycon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3-O-All 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′

103,7 104,91 CH 72,91 CH 72,50 CH 69,05 CH 75,52 CH 62,99 CH2

73,1 72,4 69,3 76,2 63,0

δH 1,44 (m) 1,80 (m)/2,20 (m) 3,41 (br s) - - 6,12 (dd 10,0; 2,0) 5,64 (dd 10,0; 4,0) 2,40 (br s) - 2,30 (dd 11,5, 6,0) 1,53 (m)/1,79 (m) 1,60 (dd 10,0; 2,0) - - 1,38 (t 13,0) 1,50 (m)/1,96 (m) 1,81 (s) 0,92 (s) 3,53 (d 8,0)/3,67 (m) 1,84 (m) 0,99 (d 6,5) 3,69 (dd 5,0; 2,0) 4,23 (dd 10,0; 9,0) 5,27 (br d 10,0) - 1,78 (s) 1,81 (s) 1,15 (s) 0,96 (s) 0,86 (s) 4,64 (d 8,0) 4,07 (dd 8,0; 3,0) 3,35 (m) 3,50 (m) 3,66 (m) 3,48 (dd 12,0; 5,0) 3,78 (dd 12,0; 2,0)

63 23-O-All 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′

73,0 73,1 69,0 76,0 63,3

103,8 102,41 CH 72,84 CH 72,50 CH 68,68 CH 75,27 CH 63,28 CH2

4,74 (d 8,0) 4,07 (dd 8,0; 3,0) 3,35 (m) 3,50 (m) 3,66 (m) 3,68 (dd 12,0; 2,0) 3,85 (dd 12,0; 5,0)

ađo trong CD3OD, #C của momordicoside N đo trong pyridine-d5 [28]

Hình 44. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC8

64

Hình 45. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC8

Hình 46. Phổ DEPT của Hợp chất MC8

65

Hình 47. Phổ HSQC của hợp chất MC8

Hình 48. Phổ HMBC của hợp chất MC8

66

4.1.9. Hợp chất MC9: Momordicoside M

Hình 49. Cấu trúc hóa học của hợp chất MC9

Bảng 9. Số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất MC9 và hợp chất tham khảo

a DEPT

δC C

#

19,45 CH2 28,09 CH2 86,99 CH 39,70 C 87,75 C 133,92 CH 131,42 CH 53,23 CH 45,96 C 40,97 CH 24,56 CH2 32,03 CH2 46,57 C 48,83* C

STT Aglycon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 18,8 27,5 85,3 39,1 85,9 134,2 130,0 52,2 45,3 40,1 23,8 31,2 45,6 48,5 33,6 28,0 46,6 14,5 80,1 40,7 14,7 76,6 81,2 34,46 CH2 28,83 CH2 47,53 CH 14,89 CH3 80,69 CH2 41,87 CH 14,59 CH3 77,19 CH 81,38 CH

67

124,44 CH 137,35 C

124,7 135,4 26,2 18,6 21,1 25,6 20,2 26,21 CH3 18,92 CH3 20,38 CH3 26,52 CH3 20,77 CH3

106,7 75,7 78,3 71,9 78,4 63,0 107,58 CH 75,24 CH 77,51 CH 71,79 CH 77,69 CH 62,86 CH2

24 25 26 27 28 29 30 3-O-Glc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 23-O-All 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ 103,7 73,0 73,1 69,4 76,0 63,0

102,41 CH 72,80 CH 72,88 CH 68,66 CH 75,49 CH 62,98 CH2 ađo trong CD3OD, #C của momordicoside M đo trong pyridine-d5 [28]

Phân tích số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và DEPT của MC9 cho thấy cấu trúc của

MC9 giống với của MC8 ngoại trừ sự khác biệt của phân tử đường β-D-

glucopyranoside tại C-3. So sánh tín hiệu phổ của MC9 với các số liệu của hợp chất

momordicoside M [28] cho thấy phù hợp tại các vị trí tương ứng. Vì vậy, cấu trúc của

MC9 được xác định là momordicoside M [28].

68

Hình 50. Phổ 1H-NMR của hợp chất MC9

Hình 51. Phổ 13C-NMR của hợp chất MC9

69

OMe

4' HO

Hình 52. Phổ DEPT của hợp chất MC9

MC1

MC2

MC3

OMe

OHC

MC6

MC5

MC4

OMe

MC8

MC9

MC7

Hình 53. Các hợp chất phân lập từ quả mướp đắng M. charantia L.

70

4.2. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

Tất cả các hợp chất phân lập được từ quả loài mướp đắng Momordica charantia

L. đều được đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ngoại trừ hợp chất MC4

không được đánh giá hoạt tính này vì lượng chất ít. Hoạt tính ức chế enzyme α-

glucosidase các hợp chất được phân lập từ loài Momordica charantia L. được đánh giá

tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam. Phép thử được tiến hành theo phương pháp đã được trình bày tại mục

2.2.3 ở các nồng độ thử 100 và 500 μg/mL với chất đối chứng dương acarbose, một

chất ức chế enzyme α-glucosidase, giảm quá trình hấp thụ đường ở thành dạ dày. Kết

quả thử hoạt tính được biểu diễn tại bảng 10 và bảng 11.

Bảng 10. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ở nồng độ 100 μg/mL

Stt % Ức chế enzyme α-glucosidase Hợp chất phân lập từ loài Momordica charantia L.

1 MC1 23,81 ± 0,99

11,34 ± 1,53 2 MC2

4,27 ± 0,87 3 MC3

4 MC5 34,22 ±0,67

1,43 ±0. 89 5 MC6

- 6 MC7

12,29 ± 2,32 7 MC8

8 MC9 22,68 ± 1,86

21,18 ± 0,65 Pos Acarbose

Kết quả thử hoạt tính cho thấy các hợp chất đều thể hiện hoạt ức chế enzyme α-

glucosidase từ yếu đến mạnh (1,43 – 34,22%), ngoại trừ hợp chất MC7 không thể hiện

hoạt tính ở nồng độ thử 100 μg/mL. Đặc biệt, các hợp chất MC1, MC5 và MC9 thể

hiện hoạt tính khá mạnh trong khoảng 22,68 - 34,22% cao hơn chất đối chứng dương

là acarbose (21,18%).

71

Bảng 11. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ở nồng độ 500 μg/mL

Stt % Ức chế enzyme α-glucosidase Hợp chất phân lập từ loài Momordica charantia L.

56,31 ±2,15

33,63 ± 1,77

MC1 1

19,58 ± 1,14

MC2 2

MC3 3

68,17 ± 3,02

10,86 ±2,02

MC5 4

5,44 ±1,06

MC6 5

29,53 ± 0,58

MC7 6

22,68 ± 1,86

MC8 7

MC9 8

52,47 ±2,09

Acarbose pos

Ở nồng độ thử nghiệm 500 μg/mL cả tám hợp chất được phân lập từ M.

charantia L đều thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase từ yếu đến mạnh với

giá trị phần trăm ức chế trong khoảng 5,44 – 68,17%. Đáng chú ý, hợp chất MC1 và

MC5 thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị phần trăm ức chế lần lượt là 56,31% và

68,17% so với chất đối chứng dương là acarbose (52,47 %).

Kết quả thử nghiệm cho thấy các hợp chất đều thể hiện khả năng ức chế enzyme

α-glucosidase. Đặc biệt, ba hợp chất MC1, MC5, và MC9 cho thấy khả năng ức chế

khá mạnh ở các liều lượng thử nghiệm. Các hợp chất này được lựa chọn để xác định

giá trị nồng độ ức chế 50% enzyme α-glucosidase. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát %

ức chế enzyme α-glucosidase ở các liều lượng 5, 15, 50, 150, 500 μg/mL. Từ % ức chế

của các hợp chất ở các nồng độ khác nhau, chúng tôi xác định được giá trị IC50 của các

hợp chất (xem bảng 12 và hình 54). Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng dựa trên

5 nồng độ thử nghiệm. Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy phi tuyến

tính trên phần mềm Graphpad Prism 5.0

72

Bảng 12. Giá trị IC50 của các hợp chất MC1, MC5 và MC9.

TT Tên mẫu Giá trị IC50 (μg/mL) Giá trị IC50 (μM)

429,58 662,50 1 MC1

337,71 509,80 2 MC5

465,79 584,83 3 MC9

433,80 671,93 pos Acarbose

Hình 54. Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase ở các nồng độ khác nhau.

Theo kết quả tính toán, giá trị ức chế 50% enzyme α-glucosidase của các hợp

chất MC1, MC5 và MC9 lần lượt là 662,50, 509,80, 584,83 μM, nhỏ hơn so với giá

trị IC50 của chất đối chứng dương acarbose (671,93 μM). Kết quả cho thấy khả năng

ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất MC1, MC5 và MC9 khá mạnh.

73 KẾT LUẬN

1. Chín hợp chất thuộc khung cucurbitane glycoside đã được phân lập từ quả loài

mướp đắng M. charantia. Trong đó có bốn hợp chất mới là: Charantoside D (MC1),

charantoside E (MC2), charantoside F (MC3), charantoside G (MC4) và năm hợp

chất đã biết: goyaglycoside-c (MC5), goyaglycoside-d (MC6), momordicoside F1

(MC7), momordicoside N (MC8) và momordicoside M (MC9).

2. Đã tiến hành thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase. Kết quả cho thấy các

hợp chất charantoside D (MC1), goyaglycoside-C (MC5) và momordicoside M

(MC9) thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase mạnh với giá trị IC50 lần lượt

là 662,50, 509,80 và 584,83 µM. Các hợp chất này thể hiện hoạt tính mạnh hơn chất

đối chứng dương acarbose (IC50 671,93 μM).

74 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

[1] V.V. Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam. Nhà Xuất bản Y học: Hà Nội, 2012. 185- 186.

Tiếng Anh

[2] T. Akihisa, N. Higo, H. Tokuda, M. Ukiya, H. Akazawa, Y. Tochigi, Y. Kimura, T. Suzuki, H. Nishino, Cucurbitane-type triterpenoids from the fruits of Momordica charantia and their cancer chemopreventive effects. Journal of Natural Products, 70, 1233-1239 (2007).

[3] L. Ali, A.K. Khan, M.I. Mamun, M. Mosihuzzaman, N. Nahar, M. Nur-e-Alam, B. Rokeya, Studies on hypoglycemic effects of fruit pulp, seed, and whole plant of Momordica charantia on normal and diabetic model rats. Planta Medica, 59, 408–412 (1993).

[4] T.K. Au, R.A. Collins, T.L. Lam, T.B. Ng, W.P. Fong, D.C.C. Wan, The plant ribosome inactivating proteins luffin and saporin are potent inhibitors of HIV-1 integrase. FEBS Letters, 471, 169–172 (2000).

[5] H. Bischoff, Pharmacology of α-glucosidase inhibition. European Journal of Clinical Investigation, 24, 3-10 (1994).

[6] A.S. Bourinbaiar S. Lee-Huang, Potentiation of anti-HIV activity of anti- inflammatory drugs, dexamethasone and indomethacin, by MAP30, the antiviral agent from bitter melon. Biochemical and Biophysical Research, 208, 779–785 (1995).

[7] C.I. Chang, C.R. Chen, Y.W. Liao, H.L. Cheng, Y.C. Chen, C.H. Chou, Cucurbitane-type triterpenoids from Momordica charantia. Journal of Natural Products, 69, 1168–1171 (2006).

[8] C.I. Chang, C.R. Chen, Y.W. Liao, W.L. Shih, C. Hsueh-Ling, C.Y. Tzeng, J.W. Li, M.T. Kung, Octanorcucurbitane triterpenoids protect against tert-butyl hydroperoxide-induced hepatotoxicity from the stems of Momordica charantia. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 58, 225–229 (2010).

[9] J. Chen, R. Tian, M. Qiu, L. Lu, Y. Zheng, Z. Zhang, Trinorcucurbitane and charantia. roots of Momordica triterpenoids the from cucurbitane Phytochemistry, 69, 1043–1048 (2008).

[10] J.C. Chen, W.Q. Liu, L. Lu, M.H. Qiu, Y.T. Zheng, L.M. Yang, X.M. Zhang, L. Zhou, Z.R. Li, Kuguacins F-S, cucurbitane triterpenoids from Momordica charantia. Phytochemistry, 70, 133–140 (2009).

75

[11] Q. Chen, L.L. Chan, E.T. Li, J. Nutr, 133, Bitter melon (Momordica charantia) reduces adiposity, lowers serum insulin and normalizes glucose tolerance in rats fed a high fat diet. Journal of Nutrition, 133, 1088–1093 (2003).

[12] Q. Chen E.T. Li, Reduced adiposity in bitter melon (Momordica charanita) fed triglyceride and higher plasma is associated with tissue rats lower catecholamines. British Journal of Nutrition, 93, 747–754 (2005).

[13] J.E. Cunnick, K. Sakamoto, S.K. Chapes, G.W. Fortner, D.J. Takemoto, Induction of tumor cytotoxic immune cells using a protein from the bitter melon (Momordica charantia). Cellular Immunology, 126, 278–289 (1990).

[14] C. Day, T. Cartwright, J. Provost, Hypoglycaemic effect of Momordica charantia extracts. Planta Medica, 426–429 (1990).

[15] M.O. Fatope, Y. Takeda, H. Yamashita, H. Okabe, T. Yamauchi, New cucurbitane triterpenoids from Momordica charantia. Journal of Natural Products, 53, 1491–1497 (1990).

[16] H.H. Fonseka, A. Chandrasekara, R.M. Fonseka, P. Wickramasinghe, P.D.R.S.P. Kumara, W.N.C. Wickramarachchi. Determination of anti-amylase and anti- glucosidase activity of different genotypes of bitter gourd (Momordica charantia L.) and thumba karavila (Momordica dioica L.). 2007. International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium.

[17] A.D. Frame, O.E. Rios, L. Dejesus, D. Ortiz, J. Pagan, S. Mendez, Plants from Puerto Rico with anti-Mycobacterium tuberculosis properties. Puerto Rico Health Sciences Journal, 17, 243–252 (1998).

[18] C. Ganguly, S. De, S. Das, Prevention of carcinogen-induced mouse skin papilloma by whole fruit aqueous extract of Momordica charantia. European Journal of Cancer Prevention, 9, 283–8 (2000).

[19] I. Gurbuz, C. Akyuz, E. Yesilada, B. Sener, Anti-ulcerogenic effect of Momordica Journal of fruits on various ulcer models rats. in charantia L. Ethnopharmacology, 7, 77–82 (2000).

[20] C. Han, Q. Hui, Y. Wang, Hypoglycaemic activity of saponin fraction extracted from Momordica charantia in PEG/salt aqueous two-phase systems. Natural Product Research, 22, 1112–1119 (2008).

[21] L. Harinantenaina, M. Tanaka, S. Takaoka, M. Oda, O. Mogami, M. Uchida, Y. Asakawa, Momordica charantia constituents and antidiabetic screening of the isolated major compounds. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 54, 1017–1021 (2006).

[22] A.P. Jayasooriya, M. Sakono, C. Yukizaki, M. Kawano, K. Yamamoto, N. Fukuda, Effects of Momordica charantia powder on serum glucose levels and various lipid parameters in rats fed with cholesterol free and cholesterol- enriched diets. Journal of Ethnopharmacology, 72, 331–336 (2000).

76

[23] W. Jiratchariyakul, C. Wiwat, M. Vongsakul, A. Somanabandhu, W. Leelamanit, I. Fujii, N. Suwannaroj, Y. Ebizuka, HIV inhibitor from Thai bitter gourd. Planta Medica, 67, 350–353 (2001).

[24] A.J. John, R. Cherian, H.S. Subhash, Evaluation of the efficacy of bitter gourd (Momordica charantia) as an oral hypoglycemic agent – a randomized controlled clinical trial. Indian Journal of Physiology and Pharmacology, 47, 363–365 (2003).

[25] M.R. Khan A.D. Omoloso, Momordica charantia and Allium sativum: broad spectrum antibacterial activity. Korean Journal of Pharmacognosy, 29, 155–158 (1998).

[26] Y. Kimura, T. Akihisa, N. Yuasa, M. Ukiya, T. Suzuki, M. Toriyama, S. Motohashi, H. Tokuda, Cucurbitane-type triterpenoids from the fruit of Momordica charantia. Journal of Natural Products, 68, 807–809 (2005).

[27] S. Lee-Huang, P.L. Huang, P.L. Nara, H.C. Chen, H.F. Kung, P. Huang, H.I. Huang, P.L. Huang, MAP30: a new inhibitor of HIV-1 infection and replication. FEBS Letters, 272, 12–18 (1990).

[28] Q.Y. Li, H.B. Chen, Z.M. Liu, B. Wang, Y.Y. Zhao, Cucurbitane triterpenoids from Momordica charantia. Magnetic Resonance in Chemistry, 45, 451–456 (2007).

[29] J.Q. Liu, J.C. Chen, C.F. Wang, M.H. Qiu, New cucurbitane triterpenoids and steroidal glycoside from Momordica charantia. Molecules, 14, 4804–4813 (2009).

[30] M.R. Loizzo, A.M. Saab, R. Tundis, F. Menichini, M. Bonesi, V. Piccolo, G.A. Statti, B. de Cindio, P.J. Houghton, F. Menichini, In vitro inhibitory activities of plants used in Lebanon traditional medicine against angiotensin converting to diabetes. Journal of enzyme (ACE) and digestive enzymes related Ethnopharmacology, 119, 109-116 (2008).

[31] M. Manabe, R. Takenaka, T. Nakasa, O. Okinaka, Induction of anti-inflammatory responses by dietary Momordica charantia L. (Bitter gourd). Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 67, 2512–2517 (2003).

[32] H. Matsuda, Y. Li, T. Murakami, N. Matsumura, J. Yamahara, M. Yoshikawa, Antidiabetic principles of natural medicines. Part III. Structure-related inhibitory activity and action mode of oleanolic acid glycosides on hypoglycemic activity. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 46, 1399–1403 (1998).

[33] H. Matsuda, Y. Li, M. Yoshikawa, Roles of capsaicin-sensitive sensory nerves, endogenous nitric oxide, sulfhydryls, and prostaglandins in gastroprotection by momordin Ic, an oleanolic acid oligoglycoside, on ethanol-induced gastric mucosal lesions in rats. Life Sciences, 65, PL27–PL32 (1999).

[34] H. Matsuura, C. Asakawa, M. Kurimoto, J. Mizutani, α-Glucosidase inhibitor from the seeds of Balsam pear (Momordica charantia) and the fruit bodies of

77

Grifola frondosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 66, 1576-1578 (2002).

[35] T. Min-Jia, Y. Ji-Ming, T. Nigel, H.-B. Cordula, K. Chang-Qiang, T. Chun-Ping, C. Tong, W. Hans-Christoph, G. Ernst-Rudolf, R. Alex, J.D. E, Y. Yang, Antidiabetic activities of triterpenoids isolated from bitter melon associated with activation of the AMPK pathway Chemistry & Biology, 15, 263–273 (2008).

[36] Y. Miyahara., H. Okabe., T. Yamauchi., Studies on the constituents of Momordica charantia L. II. Isolation and characterization of minor seed glycosides, Momordicosides C, D, and E. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 29, 1561– 1566 (1981).

[37] T. Murakami, A. Emoto, H. Matsuda, M. Yoshikawa, Medicinal foodstuffs. XXI. Structures of new cucurbitane-type triterpene glycosides, goyaglycosides-a, -b, - c, -d, -e, -f, -g, and -h, and new oleanane-type triterpene saponins, goyasaponins I, II, and III, from the fresh fruit of Japanese Momordica charantia L. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 49, 54–63 (2001).

[38] K.D. Mwambete, The in vitro antimicrobial activity of fruit and leaf crude extracts of Momordica charantia: a Tanzania medicinal plant. African health Sci., 9, 34–39 (2009).

[39] S. Nakamura, T. Murakami, J. Nakamura, H. Kobayashi, H. Matsuda, M. Yoshikawa, Structures of new cucurbitane-type triterpenes and glycosides, karavilagenins and karavilosides, from the dried fruit of Momordica charantia L. in Sri Lanka. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 54, 1545–1550 (2006).

inhibition properties of cucurbitane-type

[40] N.X. Nhiem, P.V. Kiem, C.V. Minh, N.K. Ban, N.X. Cuong, N.H. Tung, M. Ha le, T. Ha do, B.H. Tai, T.H. Quang, T.M. Ngoc, Y.I. Kwon, H.D. Jang, Y.H. Kim, α-Glucosidase triterpene glycosides from the fruits of Momordica charantia. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 58, 720-4 (2010).

[41] J.A. Ojewole, S.O. Adewole, G. Olayiwola, Hypoglycaemic and hypotensive effects of Momordica charantia Linn (Cucurbitaceae) whole-plant aqueous extract in rats. Cardiovascular journal of South Africa, 17, 227–232 (2006).

[42] H. Okabe, Y. Miyahara, T. Yamauchi, K. Miyahara, T. Kawasaki, Studies on the constituents of Momordica charantia L. I. Isolation and characterization of momordicosides A and B, glycosides of a pentahydroxy-cucurbitane triterpene. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 28, 2753–2762 (1980).

[43] H. Okabe, Y. Miyahara, T. Yamauchi, Structures of momordicosides F1, F2, G , I, K, and L, novel cucurbitacins in the fruits of Momordica charantia L. Tetrahedron Letters, 23, 77–80 (1982).

[44] H. Okabe, Y. Miyahara, T. Yamauchi, Studies on the constituents of Momordica charantia L. III. Characterization of new cucurbitacin glycosides of the

78

immature fruits. Structures of momordicosides G, F1, F2 and I. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 30, 3977–3986 (1982).

[45] H. Okabe, Y. Miyahara, T. Yamauchi, Studies on the constituents of momordica charantia L. IV. Characterization of the new cucurbitacin glycosides of the immature fruits. (2) Structures of the bitter glycosides, momordicosides K and L. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 30, 4334–4340 (1982).

[46] L. Ou, L.Y. Kong, X.M. Zhang, M. Niwa, Oxidation of ferulic acid by Momordica charantia peroxidase and related anti-inflammation activity changes. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 26, 1511–1516 (2003).

[47] L. Pari, R. Ramakrishnan, S. Venkateswaran, Antihyperglycaemic effect of Diamed, a herbal formulation, in experimental diabetes in rats. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 53, 1139–1143 (2001).

[48] S. Pongnikorn, D. Fongmoon, W. Kasinrerk, P.N. Limtrakul, Effect of bitter melon (Momordica charantia Linn) on level and function of natural killer cells in cervical cancer patients with radiotherapy. Journal of The Medical Association of Thailand, 86, 61–8 (2003).

[49] A. Samsul, A. Mohammed, A.S.M. Basheeruddin, P.V. Satya, Antiulcer activity in rats. Journal of of methanolic extract of Momordica charantia L. Ethnopharmacology, 123, 464–469 (2009).

in diabetic rats: depression of

[50] B.A. Shibib, L.A. Khan, R. Rahman, Hypoglycaemic activity of Coccinia indica and Momordica charantia the hepatic gluconeogenic enzymes glucose-6-phosphatase and fructose-1,6-bisphosphatase and elevation of both liver and red-cell shunt enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase. Biochemical Journal, 15, 267–270 (1993).

[51] Y. Sun, P.L. Huang, J.J. Li, Y.Q. Huang, L. Zhang, S. Lee-Huang, Anti-HIV agent MAP30 modulates the expression profile of viral and cellular genes for proliferation and apoptosis in AIDS-related lymphoma cells infected with Kaposi's sarcoma-associated virus. Biochemical and Biophysical Research Communications, 287, 983–94 (2001).

[52] T. Uebanso, H. Arai, Y. Taketani, M. Fukaya, H. Yamamoto, A. Mizuno, K. Uryu, K. Hada, E. Takeda, Extract of Momordica charantia supress postprandial hyperglycemia in rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 53, 482–488 (2007).

[53] J. Virdi, S. Sivakami, S. Shahani, A.C. Suthar, M.M. Banavalikar, M.K. Biyani, Antihyperglycemic effects of three extracts from Momordica charantia. Journal of Ethnopharmacology, 88, 107–111 (2003).

[54] H.X. Wang T.B. Ng, Examination of

immunodeficiency transcriptase reverse human virus lectins, polysaccharopeptide, polysaccharide, alkaloid, coumarin and trypsin inhibitors for inhibitory activity and against glycohydrolases. Planta Medica, 67, 669–672 (2001).

79

[55] M. Yadav, A. Lavania, R. Tomar, G.B.K.S. Prasad, S. Jain, H. Yadav, Complementary and comparative study on hypoglycemic and antihyperglycemic activity of various extracts of Eugenia jambolana seed, Momordica charantia fruits, Gymnema sylvestre, and Trigonella foenum graecum seeds in rats. Applied Biochemistry and Biotechnology, 160, 2388–2400 (2010).

[56] M. Yasuda, M. Iwamoto, H. Okabe, T. Yamauchi, Structures of momordicines I, II and III, the bitter principles in the leaves and vines of Momordica charantia L. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 32, 2044–2047 (1984).

[57] X. Yuan, X. Gu, J. Tang, Purification and characterization of a hypoglycemic peptide from Momordica charantia L. Var. abbreviata Ser. Food Chemistry, 111, 415–420 (2008).

[58] Y.T. Zheng, K.L. Ben, S.W. Jin, Alpha-momorcharin inhibits HIV-1 replication in acutely but not chronically infected T-lymphocytes. Zhongguo Yao Li Xue Bao, 20, 239–243 (1999).