Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính Chitinase tại thành phố Buôn Ma Thuột

Chia sẻ: Trang Lê | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:90

Thêm vào BST

Báo xấu

171
lượt xem 50
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu đề tài "Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính Chitinase tại thành phố Buôn Ma Thuột" nhằm: tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn có khả năng tạo chitinase cao, xác định các yếu tố ảnh hưởng đến việc sản sinh và hoạt tính enzyme chitinase từ các chủng xạ khuẩn tuyển chọn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính Chitinase tại thành phố Buôn Ma Thuột

1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của ñề tài Chitinase là enzyme thủy phân chitin, có vai trò quan trọng trong sản xuất các sản phẩm từ chitin như N-acetyl-D-glucosamine, Oligo N-acetyl-D- glucosamine, glucosamine. Oligo N-acetyl-D-glucosamine ñược biết ñến như một loại thuốc quý, một loại thuốc ña hiệu quan trọng trong y học, là nguyên liệu ñiều chế một số dược phẩm quý chữa trị các bệnh: viêm khớp, bệnh viêm phổi, viêm sưng dạ dày, chống nhiễm trùng … Ngoài ra, Oligo N-acetyl-D- glucosamine còn có khả năng chống khối u, kháng nấm và kháng vi khuẩn. Chính vì vậy, nghiên cứu về chitinase là vấn ñề ñã và ñang ñược quan tâm nhiều của các nhà khoa học từ trước ñến nay. Enzyme chitinase có thể ñược tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau như ñộng vật, thực vật và vi sinh vật. Quy trình thu nhận chitinase từ ñộng vật, thực vật khá phức tạp, không thể tiến hành tự ñộng hóa, giá thành chế phẩm cao và cũng không thể ñáp ứng nhu cầu thực tế. Trong khi ñó vi sinh vật có thể nói là nguồn quý giá và vô tận ñể thu nhận enzyme chitinase. Đặc biệt cùng với xu hướng phát triển một nền nông nghiệp sạch, bền vững thì các loại phân bón - thuốc bảo vệ thực vật hữu cơ hoặc có nguồn gốc sinh học ñang ñược ñề cao nghiên cứu và phát triển. Những nhóm vi sinh vật có khả năng tạo chitinase rất ñược quan tâm. Chúng vừa có khả năng phân giải nguồn chitin tự nhiên bổ sung dinh dưỡng cho cây trồng; vừa có tính ñối kháng với các loài nấm gây bệnh cây trồng, gây mục gỗ, nhờ hoạt chất kháng sinh và ñặc biệt là hệ enzyme thủy phân, trong ñó có chitinase. Như vậy, việc nghiên cứu các ñối tượng vi sinh vật có khả năng tạo chitinase có hoạt tính cao là một bước ñi hữu ích trong nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng chitinase trong ñời sống. Trên cơ sở ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase tại thành phố Buôn Ma Thuột”.
2 2. Mục tiêu ñề tài 1. Tuyển chọn ñược các chủng xạ khuẩn có khả năng tạo chitinase cao. 2. Xác ñịnh các yếu tố ảnh hưởng ñến việc sản sinh và hoạt tính enzyme chitinase từ các chủng xạ khuẩn tuyển chọn. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Ý nghĩa khoa học + Khai thác và bảo tồn nguồn gen quí của một nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải chitin, hợp chất phức tạp thành những chất ñơn giản, dễ sử dụng cho các ñối tượng sinh vật hay phục vụ nghiên cứu khoa học. - Ý nghĩa thực tiễn + Góp phần khai thác tiềm năng ứng dụng của các chủng xạ khuẩn trên hệ thống canh tác ở Đắk Lắk.
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Enzyme vi sinh vật Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác. Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, ñảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc ñộ nhịp nhàng cân ñối, theo những hướng xác ñịnh. Như vậy, enzyme ñảm bảo cho sự trao ñổi thường xuyên giữa cơ thể sống và môi trường ngoài, nghĩa là bảo ñảm ñiều kiện tiên quyết cho sự tồn tại của cơ thể sống. Enzyme có trong tất cả các cơ thể ñộng vật, thực vật và vi sinh vật. Sau khi ñược tổng hợp enzyme có thể ñược tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch của cơ thể, dịch môi trường ñược gọi là enzyme ngoại bào (extracellular enzyme) hoặc giữ lại bên trong tế bào gọi là enzyme nội bào (intracellular enzyme). Sự phân bố enzyme không ñồng ñều giữa các loài, các tế bào mô và cơ quan khác nhau. Trong các nguồn nguyên liệu ñể tách enzyme, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất ñể sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp. Dùng vi sinh vật ñể thu nhận enzyme có những lợi ích chính như sau: - Có thể chủ ñộng về nguồn nguyên liệu. - Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, khoảng 16 - 100 giờ. Do ñó có thể thu hoạch hàng trăm lần trong một năm. - Điều khiển sự tổng hợp enzyme ñể tăng lượng enzyme ñược tổng hợp hoặc tổng hợp ñịnh hướng enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác. - Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương ñối ñơn giản rẻ tiền. Tuy nhiên, ñiều ñáng lưu ý là một số vi sinh vật có khả năng sinh ñộc tố, vì vậy cần có biện pháp xử lý thích hợp. Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật chịu sự tác ñộng của nhiều yếu tố khác nhau, trong ñó ñặc ñiểm chủng giống có tính quyết ñịnh. Ngoài ra, ñiều kiện môi trường, trước hết là thành phần môi trường nuôi cấy cũng có vai trò ñáng kể.
4 Để lựa chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme mạnh có thể tiến hành phân lập từ môi trường tự nhiên, gây ñột biến các chủng ñã ñược lựa chọn hoặc cấy chuyển gen ñể nâng cao khả năng thu nhận enzyme hoặc tổng hợp enzyme có ñịnh hướng. Môi trường dinh dưỡng phải ñảm bảo những nhu cầu tối thiểu cho sự sinh trưởng của vi sinh vật và sinh tổng hợp enzyme. Trong môi trường cần có các chất chứa C, N, H, O và các chất vô cơ khác như mangan, canxi, fotfo, lưu huỳnh, sắt, kali và một số chất khác [2], [16]. 1.2. Đại cương về chitinase Chitinase hay poly β-1,4 (2-acetamido-2-deoxy) - D - glucozid glucanohydrolase, thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 β-glucoside trong chitin. Mã số của chitinase EC 3.2.1.14 [23]. Chitinase thuộc lớp 3 tổ 2 nhóm 1 số thứ tự là 14. 1.2.1. Phân loại chitinase 1.2.1.1. Phân loại theo phản ứng cắt Chitinase ñược chia làm 2 phân nhóm chính: - Endochitinase (EC 3.2.1.14) là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các ñoạn oligosaccharide. - Exo chitinase ñược chia làm 2 phân nhóm: + Chitobiosidase = chitobiase (EC 3.2.1.29) xúc tác sự tạo thành liên tục Diacetylchitibiose của sợi chitin. + β-1,4-N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.30) tiếp tục phân cắt các oligomer trên thành N-acetyl-D-glucosamine [24]. 1.2.1.2. Phân loại theo cấu trúc phân tử Chitinase ñược xếp vào hai họ Glycohydrolase: - Họ Glycohydrolase 18
5 Là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi ñược tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và Virus. Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N- acetylglucosaminidase. Các chitinase thuộc họ glycohydrolase 18 ñược tổng hợp từ Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Tricoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens… Chitinase họ glycohdrolase 18 giữ nguyên cấu hình anomer tại vị trí phân cắt nhờ cơ chế nghịch chuyển ñôi. Đến nay cấu trúc không gian ba chiều của một vài enzyme thuộc họ này ñã ñược xác ñịnh như chitinase A của Serratia marcescens, chitinase của Hevea brasiliensis, β-N-acetylglucosaminidase của Flavobacterium menigoseptium và Streptomyces plicatus. Mặc dù ba protein này ít tương ñồng với nhau về trình tự axit amin nhưng chúng ñều có cấu trúc xác ñịnh gồm 8 sợi xoắn α và β cuộn tròn. - Họ Glycohydrolase 19 Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở các xạ khuẩn như Streptomyces griceus, vi khuẩn như Haemophilus influenzae… Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II, IV,… Chitnase thuộc họ 19 có cấu trúc hình cầu với các vòng α thông qua cơ chế nghịch chuyển cấu hình anomer tại vị trí phân cắt. Đây là ñiểm khác biệt chính so với họ Glycohydrolase 18 [24]. 1.2.1.3. Phân loại theo trình tự amino axit Dựa vào trình tự ñầu amin, sự ñịnh vị của enzyme, ñiểm ñẳng ñiện, peptit nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại chitinase thành 5 nhóm: - Nhóm I: gồm những ñồng phân trong phân tử có ñầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một ñoạn giàu glycin hoặc prolin ở ñầu cacboxyl C (peptit nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng ñối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt tính xúc tác. Nhóm 1 còn có
6 thể chia thành 2 nhóm: Ia hoặc Ib tùy thuộc vào enzyme thuộc tính axit hay bazơ. Chitinase có ở thực vật thường ñịnh vị ở vị trí không bào. - Nhóm II: gồm những ñồng phân trong phân tử chỉ có tâm xúc tác thiếu ñầu cystein ở ñầu N và peptit nhận biết ở ñầu C, có trình tự amino axit tương tự như trình tự chitinase nhóm I. Chitinase nhóm II có ở xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm, thực vật và chúng ñược cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. - Nhóm III: có trình tự amino axit hoàn toàn khác với trình tự amino axit ở nhóm I và nhóm II. - Nhóm IV: gồm những ñồng phân chitinase, 41% - 47% trình tự amino axit có ở tâm xúc tác của chúng giống với trình tự chủ yếu có ở cây 2 lá mầm, amino axit ở nhóm I. Phân tử cũng có ñoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn ñáng kể so với chitinase ở nhóm I. - Nhóm V: Dựa trên cơ sở dữ liệu về trình tự người ta nhận thấy vùng gắn với chitin (vùng giàu cystein) có thể ñã giảm ñi nhiều lần trong quá trình tiến hóa gặp ở thực vật bậc cao. 1.2.2. Cấu trúc của chitinase 1.2.2.1. Cấu trúc phân tử Nhiều enzyme phân cắt carbonhydrat ñược phát hiện có cấu trúc chia vùng tương tự nhau. Blaak và cộng sự [21] tiến hành phân tích chitinase của thực vật, nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và ñã xác ñịnh ñược những vùng riêng biệt trong cấu trúc của chitinase. Các chitinase của thực vật như: cây thuốc lá, ñậu, củ cải ñường...chỉ chứa duy nhất một trung tâm xúc tác. Chitinase của nấm men bao gồm 4 vùng: trình tự báo hiệu, trung tâm xúc tác, vùng giàu serin/ threonin và trung tâm gắn chitin ở ñầu C. Vùng giàu serin/ threonin hoạt tính như một chất nhận tham gia trong sự glycosyl hóa nguyên tử oxy. Bên cạnh ñó Wantanabe và cộng sự [20] ghi nhận loài Bacillus circulans có chitinase A1 chứa tâm gắn chitin ở ñầu C, tâm xúc tác ở ñầu N và một vùng chức năng thứ ba là vùng fipronectin kiểu III, nếu loại bỏ vùng này thì không
7 ảnh hưởng ñến sự gắn kết enzyme và cơ chất nhưng khả năng xúc tác của enzyme thì bị giảm ñi. 1.2.2.2. Cấu trúc không gian của chitinase - Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 Tâm của chitinase thuộc họ này tạo thành từ 8 thùy tròn α và β. Thùy số 8 cuộn vào bên trong cấu hình nhộng với vòng xoắn thể hiện như một chiếc nhẫn hướng ra ngoài. Hình 1.1. Mô hình cấu trúc không gian của chitinase ở cây cao su Hevea brasiliensis - Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ này là phức hợp của cấu trúc bậc 2, bao gồm 10 ñoạn helical và 1 phiến β ba sợi. Phân tích protein cho thấy có nhiều nhóm tương tác kỵ nước bảo vệ tâm protein của cấu trúc bậc 3 [24]. 1.2.3. Cơ chế tác dụng của chitinase Chitinase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết 1,4-β-glycozid trong phân tử chitin, phân cắt dọc theo mạch carbon và sản phẩm chủ yếu là chitibiose và chitotriose. Những chất này sau ñó lại tiếp tục bị phân cắt thành những monomer là các N -acetyl -D -glucosamine [29]. Quá trình phân cắt tóm tắt như sau: Chitinase Chitobiase Chitin ----------- chitobiose,chitotriose -------- N-acetyl-D glucosamin
8 Có hai cơ chế cho sự thuỷ phân: cơ chế giữ lại cấu tử β anomer trong sản phẩm và cơ chế nghịch chuyển từ dạng β sang dạng α. Ngoài ra ñể khảo sát sự phân cắt người ta sử dụng N-acetyl chitoolygosaccharide thường ñược thuỷ phân bên trong trên một vài vị trí xác ñịnh hoặc một cách ngẫu nhiên. 1.2.4. Đặc tính cơ bản của hệ chitinase - Khối lượng phân tử Chitinase ñược tìm thấy ở thực vật bậc cao hoặc tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa. Ở các loài thân mềm, ñộng vật có xương, trọng lượng phân tử của chitinase khoảng 40-90 kDa, hoặc cao hơn khoảng 120 kDa. Trọng lượng phân tử của chitinase thu nhận từ xạ khuẩn và vi khuẩn có khoảng biến ñộng từ 30-120 kDa [24]. - Điểm ñẳng ñiện Chitinase ở thực vật bậc cao và tảo có giá trị ñiểm ñẳng ñiện pI thay ñổi từ 3,0-10,0. Ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá pI từ 4.7-9.3 và ở vi sinh vật từ 3,5-8,8 [29]. - Ảnh hưởng của nhiệt ñộ Nhiệt ñộ tối ưu cho hệ chitinase ở hầu hết vi sinh vật là 400C. Ngoại trừ Aspergilus niger có khả năng tổng hợp chitinase hoạt ñộng trên cơ chất glycochitin có nhiệt ñộ tối ưu là 500C [29]. Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà chitinase có thể có những giá trị nhiệt ñộ tối ưu khác nhau. - Ảnh hưởng của pH Giá trị pH tối ưu (pHopt) ở thực vật bậc cao và tảo ñạt giá trị từ 4-9 của các chitinase. Hệ chitinase ở ñộng vật là 4,8 – 7,5; ở vi sinh vật là 3,5 – 8,0.
9 pHopt của chitinase có thể phụ thuộc vào cơ chất ñược sử dụng. Chitinase ñã ñược nghiên cứu có pHopt khoảng 5,0 khi cơ chất là chitin; pHopt của chitinase khi cơ chất này là glycolchitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu. Hoạt tính của chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế bởi pH < 4,5 [24]. - Chất hoạt hóa và chất ức chế + Allosamidin Allosamidin ức chế cạnh tranh với chitinase. Chất này có cấu tạo tương tự dạng trung gian của cơ chất, có vòng oxazoline. Vòng này có thể ở giữa carbonyl oxygen của nhóm N-acetyl và C1 của N-acetylglucosamine trong quá trình thủy phân. | Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của allosamidin và dẫn xuất của allosamidin (demethylallosamidin và dimethylallosamidin) Allosamidin và những dẫn xuất của nó chỉ ức chế chitinase ñược tổng hợp từ tằm, tôm he và một số vi sinh vật như Piromyces communis, Streptomyces sp. và Streptomyces olivaceoviridis. Gần ñây Allosamidin ñược phát hiện có khả năng gắn kết và ức chế các chitinase thực vật (ña số thuộc họ Glycohydrolase 18). Allosamidin ức chế chitinase H ở cây củ cải với ID50 (liều lượng 50% chất ức chế) là 44.7µm. Chitinase ñược tạo ra bởi Streptomyces sp. có khả năng tổng hợp hai loại chitinase, một loại nhạy cảm Allosamidin và loại có tính ñề kháng. Như vậy, Allosamidin và dẫn xuất của nó chỉ ức chế các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18, không ức chế các enzyme thuộc họ Glycohydrolase 19 [13]. + Styloguanidin
10 Styloguanidin là chất ức chế chitinase ñược tách chế từ loài hải miên Stylotella aurantium. Tính ñặc hiệu, tính bền vững trong tự nhiên của những hợp chất này vẫn chưa ñược biết rõ [24]. + Các ion kim loại Các ion kim loại Hg2+, Ag+ là những chất ức chế ñối với chitinase. Các ion Cu2+, có hai dạng chitinase, một bị ức chế và một ñược tăng cường nhờ Cu2+ ñược tìm thấy ở một số loài cá và vi sinh vật. + Các chất khác Dipeptit CI-4[cyclo-(L-Arg-D-Pro)] là một sản phẩm tự nhiên ñược tổng hợp từ vi khuẩn nước mặn Pseudomonas IZ208. CI-4 ức chế việc phân tách tế bào Sacchromyces cerevisiae. Về cơ chế, CI-4 ức chế chitinase họ 18 và có cấu trúc giống chất trung gian phản ứng. Chất ức chế chitinase họ 18 có ảnh hưởng ñến chu trình sống của nhiều loại nấm và ngăn cản sự truyền kí sinh trùng sốt rét (Plasmodium falciparum) từ vật chủ ñến côn trùng. Argifin và argadin là 2-peptid ức chế glycosidehydrolase, có thể ức chế chitinase từ nồng ñộ nM - µM. Các peptide này gắn trực tiếp lên các gốc ở tâm của enzyme và chiếm các vị trí -1, +1, +2. Mặc dù những chất ức chế này là peptit nhưng chúng có nhiều nhánh bên bất thường như acetyl hay vòng thơm. Huyết thanh Allbumin, ngược lại có vai trò làm tăng hoạt ñộng của chitinase nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõ ràng sau 2-3 giờ ñầu của phản ứng. 1.2.5. Nguồn thu nhận chitinase Chitinase hiện diện ở hầu hết các giới sinh vật. Đến nay ñã có nhiều nghiên cứu của các nha khoa học trên thế giới về chitinase ở vi sinh vật, thực vật, ñộng vật. - Vi sinh vật Vi khuẩn sản sinh chitinase nhằm ñáp ứng nhu cầu dinh dưỡng. Chúng thường tổng hợp nhiều loại chitinase ñể có thể phân cắt ñược nhiều loại chitin ña dạng trong sinh giới.
11 Chitinase ñược tìm thấy trong vi khuẩn như Chrombacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Aeromonas…. Các chủng nấm Trichoderma, Gliocladium, Calvatia…và ñặc biệt là các nấm lớn như Lycoperdon, Corinus… có hàm lượng chitinase cao. Chitinase của nấm có nhiều chức năng. Tương tự như ở vi khuẩn, chitinase của nấm cũng ñóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng nhưng khác là hoạt tính của chúng rất linh ñộng trong quá trình sinh trưởng và phát sinh hình thái của nấm. Nguyên nhân, vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm. Chitinase của Trichoderma còn giữ vai trò quan trọng trong hoạt tính kí sinh của nấm nhằm ñối kháng lại các nấm gây hại ở thực vật. - Thực vật Chitinase tham gia vào cơ chế tự vệ của thực vật nhằm chống lại các nấm kí sinh hoặc các loại côn trùng như chitinase tách chiết từ cây cần tây có khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm. Một số thực vật bậc cao có khả năng tạo chitinase như như cao su (Heave Brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp), lúa mạch (Hodeum vulgare), cà rốt (Dacus carota), hạt ñậu nành (Glycine max)…Một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp chitinase. - Động vật Từ một số ñộng vật nguyên sinh hoặc từ các mô, các tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều ñộng vật không xương như ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân ñốt có thể thu nhận ñược chitinase. Đối với ñộng vật có xương sống chitinase ñược tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, từ dịch dạ dày của chim thú ăn sâu bọ. Ngoài ra chitinase còn ñược thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch chiết biểu bì của các loài chân ñốt trong giai ñoạn thay vỏ, lột da. Chitinase ñã giúp côn trùng tiêu hóa lớp vỏ ngoài trong giai ñoạn thay vỏ, lột da [24], [23], [27], [29].
12 1.2.6. Ứng dụng của chitinase 1.2.6.1. Trong nông nghiệp Chitinase ức chế nấm bệnh côn trùng, chân ñốt bao gồm nhiều loại côn trùng gây bệnh hại. Nấm chứa chitin bị ức chế bởi chitinase bao gồm: Fusarium, Gliocladium, Rhizotinia, Trichoderma, Ustilago, Erysiphe, Botrytis, Sclerotium, và Alternaria,… Côn trùng chứa chitin bị kìm hãm bởi chitinase bao gồm Epidoptera, Trichoplusia (sâu cải), Orthoptera bao gồm châu chấu, Hemiptera bao gồm bọ xít ở lúa. Người ta có thể sử dụng chitinase như một tác nhân kiểm soát sinh học an toàn và dễ phân hủy thay cho thuốc trừ sâu hóa học. Chtinase tinh sạch ñược thực hiện bằng cách cho enzyme tiếp xúc với nấm hay côn trùng. Chitinase tinh khiết có thể ñược sử dụng như một dung dịch và có nồng ñộ xác ñịnh (50- 100ppm) và ñược ứng dụng trong thuốc xịt hay một dịch ñặc chitinase tinh khiết cùng hiện diện với chất mang gắn với nó (methylcellulose, gumArabic) ñược sử dụng như là một loại thuốc bột [21]. 1.2.6.2. Trong y dược - Tổng hợp chitoolygosaccharide Hiện nay hoạt tính sinh học của các chitoolygosaccharide ngày càng ñược nghiên cứu sâu. Trong y học người ta sử dụng các oligomer chitohexaose và chitoheptataose làm tác nhân kháng ung thư. Chitinase của Vibrio algjnolyticus phân cắt huyền phù chitin thành chitopentaose và tritotriose. N,N-diacetylchitobioase ñược sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu khởi ñầu cho việc sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học. Chitinase thu nhận từ S. griseus có khả năng thủy phân chitin huyền phù thành chitobiose tiếp tục ñược cải biến hóa học thành một dẫn xuất disacchaside mới 2-acetamido-2-Deoxy-D allopyranosse. Đây là chất trung gian ñể tổng hợp nên những chất ức chế enzyme.
13 Ngược lại có thể sử dụng chitinase của Bacillus ñể tổng hợp chitobiose nhờ sự kết nối N-acetyl- D-glucosamine với dẫn xuất ñường oxalozin. - Chuẩn ñoán các bệnh truyền nhiễm do vi nấm bằng chitinase Các loài nấm chính liên quan ñến các bệnh cơ hội ở các bệnh nhân AIDS là Candidosis, Cryptococcosis (nấm men), Histoplasmosis, coccidioimucosis (nấm lưỡng hình). Những nguồn kháng nguyên của nấm (mannan của Candidosis, glucuronoxylomanan có trong nấm men) có thể hoạt tính như là một nhân tố ngăn chặn tế bào T trong sự phát triển của AIDS. Một lượng nhỏ kháng nguyên của nấm có thể kích thích phản ứng miễn dịch, nhưng sự thừa thãi kháng nguyên có thể gây ra tác ñộng ngược lên tính miễn dịch của tế bào. Do ñó, ñiều cần thiết là việc ñiều trị phải ñược tiến hành một cách nhanh chóng và có hiệu quả trước khi những tình trạng trên có ñiều kiện lan rộng. Nhiều phương pháp chẩn ñoán bệnh nấm ñược dề xuất như ELISA, sự ngưng kết kháng thể, mẫu dò phân tử… ñể phát hiện ñặc hiệu các nấm gây bệnh trong các dịch cơ thể nhưng giá thành quá cao. Những bất lợi chung ở những phương pháp hiện ñược sử dụng là khó áp dụng ñối với mẫu dịch cơ thể bởi vì khó cố ñịnh ñược các mẫu này. Các phương pháp nhuộm như GMS (Grocott methanamine AgNO3 staining) dùng nhuộm cố ñịnh các tiêu bản nấm nhưng không có tính ñặc hiệu cao và sử dụng các thiết bị ñắt tiền. Chitin hiện diện nhiều trong hầu hết vách các tế bào nấm gây bệnh, ít nhất là một giai ñoạn trong quá trình sống của nấm hay ở nấm men thì hiện diện trong vết chồi. Do ñó cần một phương pháp nhuộm chitin ñặc biệt cho nấm tạo cơ sở cho một phương pháp chuẩn ñoán nhanh chóng hiệu quả các loài nấm gây bệnh. Hiện nay các nhà khoa học ñã ñề nghị một phương pháp chuẩn ñoán mới các bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng chitinase ñã ñược phân lập tạo dòng từ Vibrio parahemolyticus (ñặt tên chitinase VP1) nó kết hợp chặt chẽ với chition và có thể sử dụng như một mẫu dò trong việc chuẩn ñoán với ñộ nhạy
14 cao ñể nhận diện một cách ñặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh. - Chế phẩm thuốc mới chitinase và các dược chất kháng nấm Hiện nay các nhà khoa học ñề nghị sử dụng chitinase với các tác nhân kháng nấm có thể chấp nhận khác nhằm bổ trợ cho hoạt tính nội sinh của chitnase. Các tác nhân bao gồm: - Amphotericin b và những phức chất có cấu trúc tượng tự nystatin và pyramicin. - 5-flourocytosin và các dẫn xuất azol như fluconazol, ketoconazol, itraconazol, miconazol…. - Allylamine–thiocarbamate như tolnaftat, terbinafin, Griseofulvin, acid undecylenic, bezoic… Chitinase có thể phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều lượng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân. Ngoài ra việc kết hợp giữa các chitinase và laminarinase ñược ghi nhận là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vào vách tế bào nấm (so với chỉ dùng chitinase). Các nhà khoa học ñã thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của chtinase tái tổ hợp trong cơ thể chuột và thỏ bị nhiễm các lạo nấm khác nhau thuộc nhóm Aspergillus, Candida. 1.3. Đại cương về xạ khuẩn 1.3.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn 1.3.1.1. Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong ñất, trong nước ao hồ, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển ñược. Xạ khuẩn có nhiều nhất trong lớp ñất bề mặt, số lượng xạ khuẩn trong ñất không chỉ phụ thuộc vào loại ñất mà còn phụ thuộc vào mức ñộ canh tác của ñất và khả năng bao phủ của thực vật. Đất giàu dinh dưỡng và lớp ñất bề mặt (40cm) thường có số lượng xạ khuẩn lớn. Số ñơn vị hình thành khuẩn lạc (CPU) của xạ khuẩn trong 1g ñất canh tác thường
15 ñạt tới hàng triệu mầm xạ khuẩn, trong ñất hoang hóa chỉ khoảng 10000 – 100000. Số lượng xạ khuẩn trong ñất cũng thay ñổi theo thời gian trong năm. Xạ khuẩn cũng thường sống trên các cây chết, rơm rạ, thường hoại sinh nhưng có thể kí sinh ở thân cây, ở củ và rễ cây. Một số nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của xạ khuẩn trong trầm tích biển như các loài Actinomyces halophia, Actinomyces mortivalis và Actinomyces iraquensis, Actinomyces như Actinomyces antibioticus (MU106, MU 107) Actinomyces rimosus (MU114) hoặc trong các mẫu nước và bùn ao nuôi trồng thủy sản ñặc biệt là lớp bùn nơi xác các hợp chất hữu cơ lắng ñọng nhiều. Xạ khuẩn ñược nghiên cứu một cách sâu sắc vì chúng có ý nghĩa quan trọng trong tự nhiên, tích cực tham gia vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong ñất, trong nước, chúng có vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất. Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong ñất. Bên cạnh ñó, chúng còn sản sinh nhiều sản phẩm trao ñổi chất quan trọng nên ñược dùng ñể sản xuất nhiều loại enzyme như protease, amilase, celulase, glucoiomerase; chitinase …; các vitamin và các acid hữu cơ. Người ta hi vọng rằng có thể sử dụng một số loại xạ khuẩn ñể chế biến một số loại thực phẩm thay cho nấm mốc, vì nhiều nấm mốc có thể sinh ñộc tố aflatoxin. Một ñặc ñiểm quan trọng của xạ khuẩn là là khả năng sinh chất kháng sinh. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy có tới trên 70% xạ khuẩn phân lập từ thiên nhiên có khả năng này. Trong số khoảng 8000 chất kháng sinh hiện ñã ñược biết ñến trên thế giới thì trên 80% ñược tạo từ xạ khuẩn. Một số xạ khuẩn (thuộc chi Frankia) có thể tạo nốt sần trên rễ một số cây không thuộc bộ ñậu và có khả năng cố ñịnh nitơ không khí thành dạng dễ sử dụng cho cây. Tuy nhiên, bên cạnh những xạ khuẩn có ích thì một số ít xạ khuẩn kỵ khí hoặc vi hiếu khí có thể gây bệnh cho người, cho ñộng vật và cho cây trồng. Chúng sống trên rễ cây hoặc củ và gây bệnh, nhất là vùng ñất kiềm, ñất cát khi thời tiết khô hạn, làm cho củ lở loét, sần sùi ngay từ ngoài ñộng ruộng [4], [5], [11], [17], [32]. 1.3.1.2. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới
16 Trước ñây, vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận giữa các nhà Vi sinh vật học, do nó có những ñặc ñiểm vừa giống Vi khuẩn vừa giống Nấm. Trước thế kỷ 19, xạ khuẩn ñược xếp vào nhóm nấm. Tuy nhiên, ñến nay, khi ñã nghiên cứu sâu hơn người ta ñã tìm ra các bằng chứng về mối liên hệ giữa xạ khuẩn và vi khuẩn như: - Một số xạ khuẩn như các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống với các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium. - Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắc chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào. - Đường kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với ở vi khuẩn. Đồng thời sợi xạ khuẩn thường không chứa vách ngăn. - Xạ khuẩn là ñích tấn công của các thực khuẩn thể giống như vi khuẩn, trong khi ñó, nấm không bị tấn công bởi thực khuẩn thể. - Xạ khuẩn thường nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn, nhưng lại thường kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm như các polyen. - Xạ khuẩn không chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà không có ở vi khuẩn. Đồng thời giống như phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không chứa cellulose. - Tương tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng axit của môi trường, ñặc ñiểm này không có ở nấm. - Các ñặc ñiểm về sợi và nang bào tử kín (sporangium) của chi Actinoplanes cho thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp. Từ những ñặc ñiểm trên, nên xạ khuẩn ñược xếp vào nhóm vi khuẩn thật Eubacteria. Xạ khuẩn thuộc về nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 478 loài ñã ñược công bố thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và ñược xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm [4], [5].
17 1.3.2. Hình thái, kích thước và cấu tạo của xạ khuẩn 1.3.2.1. Đặc ñiểm hình thái của xạ khuẩn Trên môi trường ñặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc khô, có bề mặt khô nhám. Kích thước khuẩn lạc thay ñổi tùy từng loài và ñiều kiện môi trường. Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn ướt như ở vi khuẩn, nấm men, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ vì vậy mới có tên gọi là xạ khuẩn (actinomycetes, tiếng Hi Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”). Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc. Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc của xạ khuẩn không thể lẫn với khuẩn lạc của nấm mốc vì khuẩn ty của xạ khuẩn thường mảnh hơn của nấm mốc (khuẩn ty cơ chất 0,8 µm; khuẩn ty khí sinh 1,14 µm) ñường kính khuẩn ty nấm thường lớn hơn khoảng 10 lần so với ñường kính khuẩn ty của xạ khuẩn. Đa số xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi, các sợi kết với nhau tạo khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám .... Xạ khuẩn có hệ khuẩn ty phát triển tốt, khuẩn ty không có vách ngăn và không tự ñứt ñoạn, bắt màu gram dương, háo khí, hoại sinh, không hình thành nha bào, không có lông và giáp mô, ña hình thái như dạng hình chùy, dạng phân nhánh hay dạng sợi dài gọi là khuẩn ty (hipha) hay phân nhánh chùm, thành bó gọi là khuẩn ty thể (mycelium). Kích thước và khối lượng khuẩn ty thể thường không ổn ñịnh, chúng phụ thuộc vào từng loại ñiều kiện môi trường nuôi cấy. Các khuẩn ty non và các khuẩn ty có mang bào tử thường lớn hơn khuẩn ty già và không mang bào tử. Khuẩn lạc xạ khuẩn có những vòng tròn ñồng tâm cách nhau một khoảng nhất ñịnh, nguyên nhân là do xạ khuẩn sinh ra các chất ức chế sinh trưởng, khi sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu ñi, qua ñược vùng có chất ưc chế chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh trưởng khiến khuẩn ty lại phát triển yếu ñi. Cứ thế tạo thành khuẩn lạc có các dạng vòng tròn ñồng tâm.
18 Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp gồm lớp vỏ ngoài là các sợi bền chặt, lớp trong tương ñối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có hoạt tính sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao ñổi chất như chất kháng sinh, ñộc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ ... ñược tích lũy trong mỗi lớp khác nhau. Khuẩn lạc của xạ khuẩn có mầu sắc khác nhau như ñỏ, da cam, vàng, lam, tím tùy thuộc vào loại xạ khuẩn và ñiều kiện ngoại cảnh. Có loại xạ khuẩn tạo sắc tố tan trong môi trường nuôi cấy, thường gặp các loại mang màu: xanh, tím, ñỏ, da cam, vàng, lục, nâu và ñôi khi màu ñen [5], [11], [17]. 1.3.2.2. Cấu tạo tế bào Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính là thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60-120A0, khi già có thể ñạt tới 150-200A0; lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0; lớp trong dày khoảng 50A0 . Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp copeptide bao gồm các gốc N-axetyl glucozamine liên kết với N- axetyl muramic bởi các liên kết 1,4-glucozit. Khi xử lý bằng lyzozyme, các liên kết 1,4-glucozid bị cắt ñứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipid khác. Màng sinh chất xạ khuẩn dày, khoảng 50nm, có cấu trúc tương tự màng tế bào chất của vi khuẩn. Chức năng chủ yếu của màng sinh chất là ñiều hòa sự hấp thu các chất dinh dưỡng vào tế bào, ngoài ra nó còn tham gia vào quá trình hình thành bào tử. Trong quá trình hình thành bào tử, màng sinh chất ăn sâu vào phía trong khuẩn ty, tạo thành một cái gờ hình vành khăn theo mặt cắt, sau ñó hình
19 vành khăn phát triển sâu vào phía trong trung tâm và dần dần liền lại với nhau gồm hai lớp, dày khoảng 25nm. Tế bào chất của xạ khuẩn cũng không khác gì mấy so với tế bào chất của vi khuẩn. Đặc ñiểm này làm cho người ta tưởng nhầm xạ khuẩn là cùng loại với vi khuẩn. Điểm giống nhau cơ bản giữa xạ khuẩn và vi khuẩn là nhân không có cấu trúc ñiển hình. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thể sau ñó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty (gọi là hạt cromatin). Các thể ẩn nhập nằm trong tế bào chất của xạ khuẩn, gồm có các hạt polyphotphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Soudan III), các hạt polysaccarit (bắt màu với dung dịch Lugol) [5], [17]. 1.3.3. Sinh sản Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử. Bào tử ñược hình thành trên nhánh phân hóa từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử, ñược hình thành theo kiểu kết ñoạn (fragmentation) hoặc cắt khúc (segmentation). - Kiểu kết ñoạn: hạt cromatin phân chia phân bố ñồng ñều dọc theo cuống sinh bào tử. Sau ñó tế bào tập trung bao bọc quanh mỗi hạt cromatin gọi là tiền bào tử. Tiền bào tử hình thành màng tạo thành màng nằm trong cuống sinh bào tử. Bào tử thường có hình cầu hoặc ô van, ñược giải phóng khi màng cuống sinh bào tử bị phân giải hoặc bị tách ra. - Kiểu cắt khúc: hạt cromatin phân chia phân bố ñồng ñều dọc theo cuống sinh bào tử. Sau ñó giữa các hạt hình thành vách ngăn ngang, mỗi phần ñều có tế bào chất. Bào tử hình thành theo cách này thường có hình viên trụ hoặc hình que. Bào tử xạ khuẩn ñược bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với ñộ dày khoảng 300-400 A0 chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác ñộng bất lợi của ñiều kiện ngoại cảnh như nhiệt ñộ, pH…Hình dạng,
20 kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương ñối ổn ñịnh và là ñặc ñiểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn. Ngoài ra, xạ khuẩn còn sinh sản bằng khuẩn ty. Các ñoạn khuẩn ty gãy ra môi trường phát triển thành hệ khuẩn ty [5], [17]. Hình 1.3. Một số dạng bào tử ở xạ khuẩn 1.4. Tình hình nghiên cứu chitinase trong và ngoài nước 1.4.1. Ngoài nước Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về chitinase. Anke và Terwisscha van Scheltinga (1995) nghiên cứu sự thủy phân chitin bằng chitinase thực vật, chứng minh chitinase có vai trò quan trọng trong hệ thống bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm của nấm bệnh và stress [18]. Năm 1998, Wen-Chi Hou và cộng sự nghiên cứu hoạt ñộng của chitinase thu nhận từ khoai lang có pH tối ưu là 5, nhiệt ñộ tối ưu là 250C [31]. Năm 2002, Kyoung Ja Kim và cộng sự nghiên cứu tách chiết và tinh sạch chitinase từ Streptomyces sp M20. Chitinase thu nhận từ dịch môi trường nuôi cấy Streptomyces sp M20, ñược kết tủa bởi (NH4)2SO4 và lọc gel