VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
NGUYỄN THỊ THU THỦY
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT
TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN
(Ehretia asperula Zoll. & Mor)
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
HÀ NỘI – 2017
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
NGUYỄN THỊ THU THỦY
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT
TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN
(Ehretia asperula Zoll. & Mor)
CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã số: 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN TIẾN ĐẠT
HÀ NỘI - 2017
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Tiến Đạt. Các số liệu, kết quả nêu trong luận
văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào
khác. Nếu không đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về
đề tài của mình.
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Thu Thủy
ii
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Tiến
Đạt, Trung tâm nghiên cứu và Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa
Học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình học
tập và thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Y sinh nhiệt đới – Trung tâm Nhiệt đới
Việt – Nga và các bạn đồng nghiệp phòng Thích nghi và Y học quân sự đã tạo
điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện, bảo vệ luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, thầy cô giáo Viện Sinh thái
và Tài nguyên Sinh vật, các cán bộ nghiên cứu của phòng Hoạt tính Sinh học
- Viện Hóa sinh biển, phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp
chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt
tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành bản luận văn này.
Luận văn được tiến hành dưới sự hỗ trợ của đề tài: “Nghiên cứu thành
phần hóa học, đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được
từ cây Xạ đen tại tỉnh Hoà Bình. Thử nghiệm tạo chế phẩm làm thực phẩm
chức năng từ các cao chiết tiềm năng”, do GS. TS. Đặng Đình Kim, Viện
Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam làm
chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TS. Đặng Đình Kim, ThS. Vũ Thị
Nguyệt đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành bản
luận văn này.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu, bạn bè, người thân và đồng
nghiệp – những người đã luôn ở bên tôi, luôn động viên, khích lệ và là chỗ
Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017
dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Học viên
Nguyễn Thị Thu Thủy
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vi
KÝ HIỆU VIẾT TẮT .................................................................................... vii
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Giới thiệu về lá Xạ đen. ............................................................................ 3
1.1.1. Đặc điểm sinh thái và sự phân bố. ..................................................... 3
1.1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các
hợp chất của cây xạ đen ............................................................................... 4
1.1.3. Tác dụng sinh học ............................................................................ 12
1.1.4. Một số bài thuốc y học cổ truyền: .................................................... 13
1.2. Giới thiệu chung về các phương pháp Sắc kí. ........................................ 13
1.2.1. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM). .......................................... 13
1.2.2. Phương pháp sắc ký cột .................................................................... 17
1.3. Sơ bộ các phương phác xác định cấu trúc. ............................................. 19
1.3.1. Phổ khối lượng MS .......................................................................... 20
1.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR .................................................. 21
1.3.3. Phổ 1H-NMR .................................................................................... 22
1.3.4. Phổ 13C-NMR ................................................................................... 22
1.3.5. Phổ DEPT ......................................................................................... 23
1.3.6. Phổ 2D-NMR ................................................................................... 23
1.4. Giới thiệu một số phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ................ 25
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................... 27
2.1. Mẫu thực vật ........................................................................................... 27
iv
2.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất .................................................................. 28
2.2.1. Dụng cụ và thiết bị chiết tách mẫu .................................................. 28
2.2.2. Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc ................................................... 29
2.2.3. Hoá chất ............................................................................................ 29
2.2.4. Dòng tế bào (cell lines) ................................................................... 30
2.3. Chiết phân đoạn. ..................................................................................... 30
2.4. Phân lập một số hợp chất trong cây xạ đen. ........................................... 32
2.4.1. Phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 ................................................. 33
2.4.2. Phân lập hợp chất Ed 17.3 ................................................................ 35
2.4.3. Phân lập hợp chất Ed 11.4 ................................................................ 36
2.5. Hằng số vật lý và các số liệu phổ nghiệm .............................................. 37
2.5.1. Hợp chất Ed 3.2 ................................................................................ 37
2.5.2. Hợp chất Ed 5.5 ................................................................................ 37
2.5.3. Hợp chất Ed 17.3 .............................................................................. 38
2.5.4. Hợp chất Ed 11.4 .............................................................................. 38
2.6. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity) ...................... 39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 42
3.1. Hợp chất 1: Ed 3.2 .................................................................................. 42
3.2. Hợp chất 2: Ed 5.5 .................................................................................. 44
3.3. Hợp chất 3: Ed 17.3 ................................................................................ 47
3.4. Hợp chất 4: Ed 11.4 ................................................................................ 50
3.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào. ........................................ 54
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................. 56
4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................ 56
4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 58
PHỤ LỤC PHỔ ............................................................................................. 62
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Ehretia asperula Zoll. & Mor ........................................................... 3
Hình 1.2: Cấu trúc một số hợp chât theo tài liệu ............................................. 8
Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu ....................................... 9
Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu . .................................... 10
Hình 1.5: Cấu trúc một số hợp chất theo tài liệu ........................................... 11
Hình 1.6: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu ..................................... 12
Hình 2.1. Mẫu Xạ đen thu được tại Hòa Bình ................................................ 27
Hình 2.2. Mẫu tiêu bản Xạ đen đã được giám định ........................................ 28
Hình 2.3. Sơ đồ chiết phân đoạn, phân lập cao xạ đen ................................... 32
Hình 2.4. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 ...................................... 34
Hình 2.5. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 17.3 .................................................... 35
Hình 2.6. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 11.4 .................................................... 36
Hình 3.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 3.2 ................ 42
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 5.5 ................ 44
Hình 3.3. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 5.5 ............... 45
Hình 3.4. Phổ DEPT của hợp chất Ed 5.5 ....................................................... 45
Hình 3.5. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 17.3 .............. 47
Hình 3.6. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 17.3 ............. 48
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 11.4 .............. 50
Hình 3.8. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 11.4 ............. 51
Hình 3.9. Phổ hai chiều HSQC của hợp chất Ed 11.4 .................................... 52
Hình 3.10. Phổ hai chiều HMBC của hợp chất Ed 11.4 ................................. 52
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của các cắn chiết xạ đen trên vi khuẩn Gram
dương Gram âm ................................................................................................. 5
Bảng 3.1. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR của Ed 3.2 với số liệu phổ 1H-
NMR của caffeic acid ..................................................................................... 43
Bảng 3.2. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 5.5 với số
liệu phổ 1H-NMR của Methyl caffedte .......................................................... 46
Bảng 3.3. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 17.3 với số
liệu phổ 1H-NMR của Rosmarinic acid ......................................................... 49
Bảng 3.4. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 11.4 với số
liệu phổ 1H-NMR của Methyl rosmarinate .................................................... 53
Bảng 3.5: Kết quả hoạt tính gây độc tế bào .................................................... 54
vii
KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt
13C-NMR
Ed Ehretia asperula Zoll. & Mor Xạ đen
1H-NMR
Carbon (13) Nucleaedr Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13)
Hydro (1) Nucleaedr Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1)
DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT
HMBC Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Polarization Transfer Heteronucleaedr Multiple Bond Coherence
HSQC Heteronucleaedr Single Quantum Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết
Chemical shift Độ chuyển dịch hóa học δ
ppm Part per million Một phần triệu
Singlet s
Doublet d
Double of doublet
retardation factors Phát triển chậm dd Rf
Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Tế bào Ung thư gan
LU-1 Human lung adenocarcinoma Tế bào Ung thư phổi
MCF-7 Tế bào Ung thư vú Human breaedst adenocarcinoma
HeLa HeLa cervical cancer cells Tế bào Ung thư cổ tử cung HeLa
nước Water W
Dichloromethane D
n-Hexane H
Methanol M
Ethyl acetate E
Acetone A
1
LỜI MỞ ĐẦU
Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã
được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y học hiện đại. Giá trị
của chúng không chỉ có công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà còn có
thể dùng làm nguyên mẫu hoặc cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát
triển nhiều dược phẩm mới. Việt Nam được đánh giá có nguồn tài nguyên
dược liệu phong phú và có nhiều kinh nghiệm sử dụng nguồn dược liệu này
nhờ vào nền y học cổ truyền lâu đời. Theo thống kê ở Việt Nam hiện có hơn
13000 loài thực vật trong đó khoảng 4000 loài được sử dụng làm thuốc. Đây
là một lợi thế để chúng ta khai thác nguồn dược liệu này phục vụ cho cuộc
sống. Các nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học là con
đường ngắn nhất và hiệu quả nhất để tìm kiếm có chọn lọc các hoạt chất từ
nguồn tài nguyên thiên nhiên.
Ung thư được coi là một trong những căn bệnh nan y do khả năng
kháng thuốc, gây di căn mạnh của các tế bào ung thư. Chính vì thế, việc phát
triển những loại dược phẩm mới đặc trị hoặc ngăn ngừa quá trình di căn ung
thư đang là vấn đề cấp thiết của y học hiện đại. Cây xạ đen có tên khoa học là
Ehretia asperula Zoll. & Mor, họ Vòi Voi (Boraginaceae). Xạ đen phân bố
chủ yếu tại các tỉnh Sơn La, Hà Nam, Quảng Ninh, Hòa Bình, chúng mọc tự
nhiên trong rừng. Xạ đen là cây thân gỗ mọc leo thành bụi, nhánh non tròn,
không lông. Dài trung bình 5-7m có khi tới hàng chục mét, thân già vỏ nâu
đốm trắng, chồi và lá non có màu tím đỏ. Tại Việt Nam đã có một số công
trình nghiên cứu về cây Xạ đen như: Lê Thế Trung và cộng sự (1999) đã
nghiên cứu về khả năng chữa ung thư của cây xạ đen Hòa Bình; Nguyễn Huy
Cường (2008) nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học
cây xạ đen.
2
Dựa trên kết quả sàng lọc hoạt tính trên tế bào ung thư cho thấy cao
chiết lá xạ đen có tác dụng diệt tế bào ung thư mạnh. Chính vì vậy việc lựa
chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng diệt tế bào
ung thư của lá Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor)” là một việc cấp thiết
có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn.
Đề tài được thực hiện với các mục tiêu chính sau:
Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ lá xạ đen (Ehretia
asperula Zoll. & Mor) và đánh giá được tác dụng diệt tế bào ung thư của
chúng.
Để đạt được mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung
sau:
Nghiên cứu về thành phần hóa học:
- Phân lập các chất sạch
- Xác định cấu trúc các chất phân lập được.
Nghiên cứu về tác dụng sinh học:
- Khảo sát khả năng gây độc tế bào của các hợp chất đối với bốn dòng
tế bào ung thư: Hep-G2, LU-1, MCF-7, HeLa.
3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về lá Xạ đen.
1.1.1. Đặc điểm sinh thái và sự phân bố.
Hình 1.1. Ehretia asperula Zoll. & Mor
Xạ đen có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Mor thuộc họ
Vòi voi cây thân gỗ, bụi hay cây thảo có hình trụ, lá đơn mọc so le, không
có lá kèm, trên thân và cả lá bao phủ những lông cứng hoặc mềm. Hoa hầu
như luôn đều, đài hợp nhiều hoặc ít, tồn tại trên quả, sau đó lớn lên. Nhị
luôn dính với ống tràng, nhưng có phần chỉ nhị hoặc lớn hoặc nhỏ rời nhau.
Nhụy gồm 2 lá noãn và lúc đầu là bầu trên, 2 ô, với 2 noãn trong mỗi ô.
Nhưng ngay sau đó, ở đa số các cây họ Vòi voi, mỗi ô của bầu lại được
sớm phân chia bằng một vách ngăn giả. Do đó bầu nhụy trở thành có 4 ô
chứa mỗi ô một noãn. Do sự phát triển của các vách trong mỗi ô của bầu
làm cho bầu chở lên có 4 thùy, còn vòi nhụy đâm ra ở chỗ lõm giữa 4 thùy
của bầu đó. Vòi nhụy thường mag ở phía trên một đầu nhụy, và đầu nhụy
hơi lõm, đôi khi cũng có 2 đầu nhụy. Khi quả chín thì các thùy của bầu
4
tách nhau ra thành 4 quả hạch nhỏ riêng biệt có một hạt. Hạt thường kông
có nội nhũ hay rất ít khi có nội nhũ. [1]
Ở Việt Nam Ehretia asperula Zoll. & Mor còn được gọi là Dót, Thân
cây gỗ nhỏ cao đến 1m. Lá có phiến bầu dục thon, 4 – 10 x 2-5cm, đáy tròn,
mép có răng hay nguyên, gân phụ 6 cặp, cuống dài 1,7cm. Chùm sim ở đầu
cành, có vài lá nhỏ ở đáy. Hoa ống ngắn, bộ nhị 5 bầu không lông, quả tròn,
to 4-5mm, có 4 cạnh, có 4 hột. Loài phân bố chủ yếu ở Indonesia và Việt
Nam (Quảng Ninh, Hà Nam, Hà Nội, Hòa Bình). [1]
Về phân bố, họ Vòi voi là một họ khá lớn phân bố rộng rãi ở khắp nơi
trên thế giới, nhưng chủ yếu ở vùng ôn đới phía bắc, đặc biệt là vùng Địa
Trung Hải, Tây và Trung Á và Thái Bình Dương thuộc Bắc Mỹ, ở nước ta loài
mọc khắp cả nước. Ehretia asperula Zoll. & Mor phân bố chủ yếu ở Indonesia
và ở Việt Nam cây phân bố chủ yếu ở các tỉnh Quảng Ninh, Hà Nam, Hà Nội,
Hòa Bình.
Sơ lược về chi Ehretia
Cây bụi hoặc gỗ, lá nguyên hay có răng cưa ở mép, cụm hoa ngù hay
chùy, đài chia làm 5 phần, tràng hoa hình ống hay hình chuông, hiếm khi hình
phễu, hoa mẫu 5 chỉ nhị thò ra, bao phấn hình trứng hay thon dài. Bầu nhụy
hình trứng, chia làm 2 ngăn, mỗi ngăn chứa 2 noãn. Vòi nhụy chẻ 2, có 2 đầu
nhụy, hình tròn hay thon dài. Quả hạch màu vàng, cam, hay đỏ nhạt, hình cầu,
nhẵn, khi chín vỏ quả trong chia làm 2 thùy mỗi thùy có 2 hạt hoặc chia làm 4
thùy mỗi thùy có 1 hạt, hạt cứng.[5]
1.1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các
hợp chất của cây xạ đen
Xạ đen được biết đến bởi mang trong mình nhiều hoạt tính sinh học
quý giá như điều trị mụn nhọt, ung thư, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch
trong xơ gan cổ chướng và đặc biệt trong chữa trị ung thư. Có tác dụng thông
5
kinh lợi niệu, cây dùng trị kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, bệnh
lậu. Điều trị ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, tiêu hạch,
tiêu độc, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm đau, an
thần, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Ở Việt Nam cũng như trên thế giới
đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính
sinh học của cây Xạ đen nhằm khai thác triệt để tiềm năng y học của cây
thuốc này. Dưới đây là một số công trình khoa học, nghiên cứu trong và ngoài
nước đối với cây xạ đen.
Năm 2012 nhóm nghiên cứu Phạm Thị Lương Hằng, Đoàn Thị Duyên,
Nguyễn Thị Yến, Ngô Thị Trang thuộc khoa Sinh học của trường Đại Học
Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội tiến hành thử hoạt tính sinh
học của cây xạ đen bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Họ thử
nghiệm bốn loại dịch chiết của xạ đen là dịch chiết n-Hexane, dịch chiết
EtOAc, dịch chết MeOH và dịch chiết nước trên vi khuẩn Gram dương
(Bacillus subtilis và Sarcina sp), vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC
25922 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853). Kết quả hoạt tính sinh học
được tổng hợp ở (Bảng 1.1) [3].
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của các cắn chiết xạ đen trên vi khuẩn
Gram dương Gram âm
D-d (mm) B. subtilis Sarcina sp. E. coli P. aeruginosa
Dịch chiết
n-Hexane - - - -
EtOAc - - - -
MeOH 2 - - -
Nước 7 - - -
6
Trong luận án tiến sĩ hóa học của Nguyễn Huy Cường năm 2008 với đề
tài Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò hoạt tính sinh học cây Xạ đen[2,
10], đã phân lập được một số hợp chất trong cây xạ đen và khảo sát hoạt tính
sinh học của chúng trên một vài dòng tế bào ung thư. Trong luận án có bốn
chất khung friedelan: 3α-friedelanol (1), 3-friedelanon (2), D:A-friedo-
olednon-3,21-dion (3), canophyllol (4); năm hợp chất có khung lupan là: lup-
20-en-3β-ol (5), lup-12-en-3β-ol (6), lup-20-en-3-ol (lupenon, 7), lup-12-en-3-
on (8), lup-20-en-3β, 11β-diol (9); và hai hợp chất khác là clionasterol (10),
axit glucosyringic (11). Kết quả thử hoạt tính trên hai tế bào ung thư gan (Hep-
G2) và ung thư phổi (Lu-1) cho thấy các hợp chất thử (1, 2, 3 và 9) đều không
thể hiện hoạt tính đối với hai dòng tế bào ung thư này. Một số hợp chất của xạ
đen có cấu trúc như sau:
7
8
Hình 1.2: Cấu trúc một số hợp chât theo tài liệu [2, 10]
Năm 2000 Huang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của celahin
D: 1β,2β,6α,15β-tetracetoxy-8β,9α-dibenzoyloxy-β-dihydroagarofuran (12), 1β-
acetoxy-8β,9α-dibenzoyloxy-4α,6α-dihydroxy-2β(α-methylbutanoyloxy)-β-
dihydroagarofuran (13), 1β-acetoxy-8β,9α-dibenzoyloxy-6α-hydroxy-2β
(a-methylbutanoyloxy)-β-dihydroagarofuran (13), emarginatine-E (15),
13C-NMR, phổ COSY, HMBC, HMQC và thử hoạt tính sinh học của các
lupenone (16), friEdelinol (17) có trong cây xạ đen bằng phổ 1H-NMR,
hợp chất này. Kết quả cho thấy emarginatine-E (15) gây độc tế bào chống
lại tế bào ung thư hầu họng (ED50 = 1,7 µg/ml), và tế bào ung thư ruột kết
(ED50 = 4,1 µg/ml), ngược lại các giá trị ED50 cho các hợp chất 12, 14, 16
tất cả vượt 10 µg/ml. [14]
9
Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [14]
10
Năm 2007 nhóm nghiên cứu gồm Trần Văn Sung, Nguyễn Huy Cường, Trịnh
Thị Thủy, Phạm Thị Ninh, Lê Thị Hồng Nhung thuộc Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam, đã phân lập và xác địch cấu trúc của một
phenolic glycoside và ba hợp chất triterpenes trong cây xạ đen. Cấu trúc của
các hợp chất được xác định bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR và một số phổ hai
chiều, phổ phân giải cao. Các hợp chất phân lập được là glucosyringic acid
(18), lup-20(29)-ene-3β,11β-diol (19), lup-20(29)-ene-3-one (20) và lup-
5,20(29)-diene-3-one (21).[8, 10]
Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [8,10].
Vào năm 1995 một số nhà khoa học của Trung quốc tên là Yao-Haur
Kuo, Chieh-Fu Chen và Li-Ming Yang Kuo[16] đã phân lập được hai hợp
chất từ cây xạ đen, một hợp chất là celahinine A (22) và một hợp chất
alkaloid mới tên của nó là sesquiterpene pyridine alkaloid emarginatine A
(23). Hợp chất mới này có tác dụng gây độc tế bào mạnh đối với tế bào Hepa-
2 (hepatoma), Hela, Colo 205 và các tế bào ung thư biểu mô KB (in-vitro), có
11
ED50 (KB)=4,0 µg/ml. Công thức hóa học của chúng được các tác giả xác
định bằng các phương pháp phổ 1H, 13C-NMR, COSY, NOESY và HMBC.
Hình 1.5: Cấu trúc một số hợp chất theo tài liệu [16]
Vào năm 1997 Kuo YH và Kuo LM đã phân lập được bốn hợp chất
triterpene là celasdin A, celasdin B, celasdin C và maytenfolone A từ xạ đen.
Trong bốn hợp chất hai hợp chất celasdin A và celasdin C là hai hợp chất
mới, celasdin B. Hợp chất maytenfolone A có tác dụng gây độc tế bào,
12
Maytenfolone A được tiếp tục nghiên cứu X-ray và kết quả sinh học đã cho
thấy Maytenfolone A gây độc tế bào chống lại gan (HEPA-2B ED50 = 2,3
µg/ml) và ung thư vòm họng (ED50 = 3,8 µg/ml).[15]
Hình 1.6: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [12]
1.1.3. Tác dụng sinh học
Theo Đông y:
Cây xạ đen có vị đắng chát, tính hàn, có tác dụng hữu hiệu trong điều
trị mụn nhọt, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng và
đặc biệt trong chữa trị ung thư. Có tác dụng thông kinh lợi niệu. Cây dùng trị
kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, bệnh lậu. [22]
Điều trị, ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, tiêu
hạch, tiêu độc, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm
đau, an thần, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. [22]
Về Tây y:
Từ năm 1987 GS. Lê Thế Trung và các bác sĩ của Học viện Quân y đã
đi tiên phong trong nghiên cứu, tìm hiểu về cây xạ đen. Sau nhiều năm nghiên
cứu, hiện Học Viện Quân Y đã chiết xuất được từ loài cây này một loại tinh
13
thể thuộc nhóm Fanavolnoid có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung
thư. [22, 23]
Qua nghiên cứu về thực vật học, hoá dược, dược lý, nghiên cứu thực
nghiệm trên động vật được gây ung thư, các bác sĩ đã phát hiện ở loài cây này
tác dụng hạn chế sự phát triển của khối u ác tính. Hơn nữa, theo GS. Trung,
một số hợp chất lấy từ xạ đen nếu được kết hợp với chất Phylamin có thể kéo
dài tuổi thọ trung bình của động vật bị ung thư. [22, 23]
Nghiên cứu cho thấy trong xạ đen có các hoạt chất Fanavolnoid ;
Quinon (có tác dụng phòng chống Ung thư và làm cho tế bào Ung thư hóa
lỏng dễ tiêu), hợp chất Saponin Triterbenoid (có tác dụng chống nhiễm
khuẩn). [22, 23]
1.1.4. Một số bài thuốc y học cổ truyền:
Bài thuốc hỗ trợ điều trị ung thư từ xạ đen lưu truyền trong dân gian là:
Dùng 50g cây xạ đen khô, 40g cây bạch hoa xà và 20g cây hoàng cầm râu, tất
cả các nguyên liệu trên đem sắc với 1,5 lít nước, sắc đến khi còn khoảng 1 lít
thì chắt ra uống. [24]
Điều trị các bệnh về gan, giúp thanh nhiệt, giải độc: Dùng 50g cây xạ
đen khô, 10g cây bá bệnh và 30g cây cà gai leo đem sắc với nước uống. [24]
Để giúp điều trị mụn, tiêu viêm lấy lá cây xạ đen đem rửa sạch rồi đun
sôi dùng thay trà uống hàng ngày, nó còn giúp cho tăng cường sức khỏe, cải
thiện giấc ngủ hiệu quả. [24]
1.2. Giới thiệu chung về các phương pháp Sắc kí.
1.2.1. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM).
a. Nguyên tắc.
Dựa vào hệ số phân tích khác nhau của chất cần phân tích giữa pha
động và pha tĩnh. Chất cần phân tích được hấp phụ (hoặc phân bố, trao đổi
ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc
14
vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động) trên pha tĩnh
trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu chất
được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác
nhau. Dựa vào hệ số phân bố khác nhau của mỗi chất đối với pha động và pha
tĩnh ta có thể tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp phân tích. Các thành
phần sau khi phân tách riêng biệt ra khỏi hỗn hợp được lưu trữ trên pha
tĩnh.[6]
Sau đó có thể nhận biết các chất cần phân tích bằng ánh sánh thường
(nếu chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở bước sóng 254 nm, 365
nm hay phun thuốc thử hiện màu[6]….tùy thuộc bản chất chất cần phân tích
mà sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn
hợp cần phân tách.
b. Đại lượng đặc trưng.
Hệ số lưu trữ Rf. [6]
Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số
di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và
khoảng dịch chuyển của dung môi:
Rf = (a/b)
Trong đó:
- a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm).
- b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng
đường đi của vết (cm).
- Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
Hệ số lưu giữ tương đối Rr
Rr = dx/dc
15
Trong đó:
- dx là đường đi của chất phân tích (cm).
- dc là đường đi của chất chuẩn (cm).
Giá trị Rr càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất.
Dụng cụ:
- Bình triển khai, thường bằng thuỷ tinh trong suốt có kích thước phù
hợp với kích thước bản mỏng dùng triển khai và có nắp đậy kín.
- Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng
dài 365 nm.
- Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để
sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện.
- Tủ hút chân không.
- Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần
những dung dịch pha loãng chất cần phân tích.
- Máy ảnh thích hợp có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày.
- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.
- Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản.
- Bản mỏng tráng sẵn silica gel.
c. Cách tiến hành.
Chuẩn bị bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình
trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử
dụng.Hệ dung môi thích hợp được cho vào bình triển khai sắc kí cho bão hòa
dung môi.[6]
16
Chấm một lượng chất phân tích vừa phải lên bản mỏng, nếu lượng chất
quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf
gần nhau sẽ bị chồng lấp còn nếu lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện
được do độ nhạy của thuốc thử không đủ. Lượng mẫu thông thường cần đưa
lên bản mỏng là 0,1 - 50 mg ở dạng dung dịch trong ether, c1oroform, nước
hay dung môi thích hợp khác. Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml
đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml
khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều
chế. Ðối với các dung dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp
trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi
lần chấm.
Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2 cm và kẻ
vạch xuất phát cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1cm, vạch tiền tuyến dung môi
là vạch kết thúc đường đi của dung môi. Các vết chấm phải nhỏ, có đường
kính 2 - 6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản
mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ. Với những trường hợp phân tích bán
định lượng phải dùng các mao quản định mức chính xác. Khi không cần định
lượng dùng micropipet hoặc ống mảo quản thường.
Triển khai sắc ký: Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển
khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy kín
bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản
mỏng chạy tới vạch tiền tuyến đã định sẵn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh
dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện
vết chất.
Việc sắc ký lớp mỏng được tiến hành trong điều kiện chuẩn hoá cho kết
quả có độ tin cậy cao hơn. Hiện nay người ta thường tiến hành sắc ký với sự
giúp đỡ của hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao.
17
1.2.2. Phương pháp sắc ký cột
a. Nguyên tắc.
Sắc kí là quá trình tách cấu tử của một hỗn hợp dựa vào việc các cấu tử
này sẽ phân bố khác nhau giữa pha tĩnh và pha động.
Sắc ký côt là phương pháp sắc ký mà pha tĩnh được nhồi trong một cột
hình trụ hở 2 đầu hoặc được tráng trong lòng một mao quản có đường kính
trong rất hẹp còn dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp
phụ.
Tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của mỗi chất riêng biệt
trong hỗn hợp đối với dung môi rửa cột mà mỗi chất được lấy ra trước hoặc
sau.
Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng là Al2O3, silica gel. Dung
môi dùng có thể là 1 hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp. Dung
môi sử dụng rửa cột thường có độ phân cực tăng dần. Cột là những ống làm
bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên hở để tiếp thêm dung môi, có
nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ khác nhau. Việc lựa chọn kích thước cột rất quan
trọng. Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách
càng tốt[6].
b. Cách tiến hành.
Chuẩn bị cột[6]:
- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
- Cho bông gòn vào đáy cột.
- Kẹp cột thẳng đứng trên giá.
- Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột:
18
Nhồi cột ướt: Dùng các chất hấp phụ có khả năng trương phình như
Silicagel, Sephadex.
Nhồi cột khô: Dùng các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như
Al2O3, CaCO3.
Đưa chất phân tích vào cột[6]:
- Khi đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng
đồng đều trên mặt thoáng phẳng.
- Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột:
Cho thẳng hỗn hợp dung dịch lên cột.
Trộn hỗn hợp chất với một lượng chất hấp phụ: Trộn dung dịch cần
phân tích với một lượng nhỏ chất hấp phụ, trộn đều, quay khô dung môi rồi
cho vào cột bằng cách trải thành một lớp đều trên mặt cột.
c. Rửa cột (giải li chất).
Có hai cách rửa cột là rửa áp suất thường và áp suất nén[6]:
- Rửa cột bằng áp suất thường: Dung môi chảy xuống nhờ trọng lực.
- Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen
hoặc không khí) vào đầu cột.
Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể
tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén. Việc lựa chọn các
phương pháp rửa cột khác nhau tùy thuộc vào việc sử dụng kích thước hạt
silicagel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột.
Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào
độ phân cực của dung môi giải ly và của chất cần giải li.
Thông thường người ta sử dụng dung môi có độ phân cực tăng dần để
giải li các chất. Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển
19
từ từ bằng cách pha tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần. Nếu tăng tính phân cực
nhanh và đột ngột thì sẽ làm gãy cột. Nguyên nhân do các chất hấp phụ như
Al2O3 hoặc silicagel khi được trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng sẽ
sinh ra nhiệt làm cho dung môi bốc hơi cục bộ sẽ tạo nên bọt khí làm nứt gãy
cột, hiệu quả tách sẽ không tốt.
Theo dõi quá trình rửa cột
Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có
thể được theo dõi bằng mắt thường. Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thiên
nhiên không màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột
thường bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo để
chọn chất hấp phụ và dung môi, thăm dò bằng SKLM để chọn hệ dung môi
tách tốt nhất. Khi chọn được chất hấp và hệ dung môi thích hợp, việc quyết
định thể.
Tích của mỗi phân đoạn hứng hay thể tích của mỗi loại dung môi giải
ly cột tùy thuộc vào thực nghiệm và kinh nghiệm của người thực hành.
Trong trường hợp sắc ký cột khô hay cột ngược, những chất hay nhóm
chất được tách ra không được rửa giải ra khỏi cột mà được cắt thành các
“khoang” và giải hấp bằng dung môi để thu các chất.
Trang bị cho sắc ký cột rất đơn giản, không tốn kém nên hiện nay
vẫn là phương tiện chủ yếu để tách các chất có trong thành phần hóa học
của dược liệu. Hiện nay, sắc ký cột cổ điển và các kỹ thuật cải tiến của nó
vẫn đóng vai trò chính trong việc chiết tách và phân lập các chất tinh khiết
từ dược liệu.
1.3. Sơ bộ các phương phác xác định cấu trúc.
20
1.3.1. Phổ khối lượng MS
Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa
học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa
vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên
ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể
xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học của hợp
chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, một số phương phấp chủ yếu
được nêu ra dưới đây[11]:
Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự
phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau,
phổ biến là 70Ev.
Phổ ESI (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun
mù điện tử.Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so
với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc
trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá
nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó
phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
Phổ khối lượng phân giải cao (Hight Resolution Mass spectroscopy)
cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao, kết
quả phổ khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích nguyên tố sẽ cho
phép khẳng định chính xác công thức cộng của các hợp chất hữu cơ
Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc
kí kết hợp với khối phổ, phương pháp này đặc biệt hiệu quả khi sử dụng thư
viện phổ để so sánh nhận dạng cấc hợp chất. Có thể dùng GC-MS (sắc kí khí-
khối phổ) cho các hợp chất dễ bay hơi như tinh dầu hay LC-MS (sắc kí lỏng-
khối phổ) cho các hợp chất khác. Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt
21
hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc
trong ngành dược). [11]
1.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cùng với phổ khối và nhiễu xạ đơn tinh thể
tia X hiện là những công cụ mạnh và thường được sử dụng nhất hiện nay
trong xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là tần số cộng hưởng của các hạt nhân
trong phân tử. Tuy nhiên, tần số hấp thu của hạt nhân thay đổi theo từ trường
ngoài B0. Để thuận tiện và loại bỏ ảnh hưởng của B0 trong số liệu phổ, người ta
chia sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với một chất chuẩn
(thường dùng nhất là trimethyl silan, TMS) cho tần số cộng hưởng của chất
chuẩn đó. Vì kết quả thu được (Hz/MHz) là rất nhỏ (phần triệu) nên người ta
dùng ppm để thể hiện giá trị cộng hưởng của các hạt nhân. Giá trị này thường
được gọi là chuyển dịch hoá học. Giá trị chuyển dịch hoá học của các proton
thường nằm trong khoảng 0 - 14 ppm, còn của cacbon-13 là từ 0 - 240 ppm.[11]
Có 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này:
- Cách thứ nhất là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt
dải tần số cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét.
- Cách thứ 2 là ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng
biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân. Kỹ thuật
này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform -
NMR, FT– NMR) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay.
Như đã trình bày ở trên, tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào
từ trường của máy. Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt
nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao.
Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz
hay 500 MHz... là theo tần số dùng để kích thích các proton.
22
Có nhiều kỹ thuật xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân khác nhau
được áp dụng. Mỗi kỹ thuật dùng để xác định những đặc tính cộng hưởng từ
nhất định của hạt nhân. Tuỳ vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc,
người ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau. Người ta có thể xác định
phổ của cùng một loại hạt nhân (1H hay 13C) như trong các phổ một chiều
(1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân
trong các phổ 2 chiều (COSY, HETCOR, Long-range HETCOR, NOESY...).
1.3.3. Phổ 1H-NMR
Trong phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hóa học (δ) của các proton được xác
định trong thang ppm từ 0-14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử
cũng như đặc trưng riêng từng phần. Mỗi proton cộng hưởng ở một trường
khác nhau.Vì vậy chúng được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học khác
nhau.Ví dụ, các proton của liên kết với cacbon thơm hay liên hợp thường
chuyển dịch trong vùng 6 - 8 ppm, các proton trong alkan thường chuyển dịch
trong vùng 0 - 2 ppm. Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi
trường hoá học (như 3 proton của nhóm CH3) thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh.
Đỉnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba... tới 7 đỉnh thành phần (đỉnh 7). Diện tích
của mỗi đỉnh tỉ lệ với số lượng proton của đỉnh. Dựa vào diện tích đỉnh có thể
biết số proton của đỉnh đó. Một thông số quan trọng khác của phổ proton là
hằng số ghép (J) tính bằng Hz, cho biết tương tác của proton với các proton kế
cận. Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch hóa học và tương tác spin
mà ta có thể xác định được cấu trúc của hợp chất.[11]
1.3.4. Phổ 13C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng
hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của
phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230 ppm. Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân cacbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hoá học
23
của cacbon. Cacbon lai hoá sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong
khoảng 0 - 60 ppm. Cacbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch
trong khoảng 45 - 85 ppm. Cacbon lai hoá sp2 chuyển dịch trong khoảng 100 -
150 ppm; nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể chuyển dịch tới 240 ppm. Với
kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của cacbon là những vạch đơn, mỗi vạch
ứng với một cacbon (hơn 1 cacbon nếu chúng có chung môi trường hoá học)
của phân tử.[11]
1.3.5. Phổ DEPT
Kỹ thuật này giúp xác định số lượng proton trên cacbon cho biết số
lượng proton liên kết trên mỗi cacbon. Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại
các loại cacbon khác nhau. Nói cách khác, nó cho biết cacbon đó là C, CH,
CH2 hay CH3, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử. Trong phổ DEPT-
153, cacbon bậc IV không xuất hiện, cacbon bậc II là các đỉnh âm, C bậc III
và bậc I là các đỉnh dương, ở phổ DEPT-90, chỉ còn các C bậc III là các đỉnh
dương trong phổ. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất,
tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ
DEPT 135. Trên phổ DEPT 90 chỉ xuất hiện tín hiệu của nhóm CH.[11]
1.3.6. Phổ 2D-NMR
Đây là các kĩ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của
các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kĩ thuật chủ
yếu thường được sử dụng như sau[11]:
- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các
tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ các tương tác trên phổ này.
- Phổ 1H-1H COSY(1H-1H Chemical Sift Correlation Spectroscopy):
Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với
cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại
với nhau.
24
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là
phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác
trên phổ này mà từng phần của các phân tử cũng như toàn bộ phân tử được
xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu
diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên
kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả
phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kĩ thuật phổ NOE
differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào
một xung bằng đúng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các
proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng
hưởng mạnh hơn cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn.
Ngày nay còn sử dụng nhiều kĩ thuật phổ hai chiều hiện đại khác như:
kĩ thuật xóa tương tác trên các phổ nhất định, ví dụ trên phổ proton, xóa tương
tác của một proton nào đó xác định có thể xác định được vị trí của các proton
bên cạnh.
Ngoài các phương pháp phổ nêu trên, trên thế giới còn có loại phổ X-
RAY (nhiễu xạ Ronghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử
dụng kết hợp với các chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân
tích so sánh kết hợp khác. Đặc biệt, đối với các phân tử nhiều mạch nhánh
dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khó khăn xã định chính xác được
chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có đơn vị đường, thì việc
xác định chính xác các loại đường cũng như cấu hình đường thông thường
phải sử dụng phương pháp thủy phân rồi sử dụng bằng phương pháp so sánh
bằng LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.
25
1.4. Giới thiệu một số phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào
Một vài phép thử so màu đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các
dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử
dụng hai phương pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB.
Phương pháp MTT:
Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử
dụng phổ biến. Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann
trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [18]. Theo tác giả, muối
tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự
sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử
là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng
của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím
formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao. Phương
pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt
động của tế bào.
Phương pháp SRB
Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm
1990[19] để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển
của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép
thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein¸ SRB nhuộm bằng cách
26
phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không
ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm.
Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ
thuộc vào pH của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều
kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các
protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử
dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết
từ tế bào một cách định lượng.
Việc nghiên cứu cấu trúc hóa học của chất phân lập từ lá Xạ đen sẽ góp
phần bổ sung những thông tin khoa học về cây Xạ đen. Đồng thời, mở ra
hướng mới để đánh giá tác dụng sinh học của cây trên cơ sở khoa học, góp
phần hiện đại hóa và khoa học hóa nền Y học cổ truyền.
27
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Mẫu thực vật
- Mẫu được thu tại Xóm Bái Rồng, Thường Tín, Kim Bôi, Hòa Bình
- Thời gian thu mẫu: tháng 6/2016
- Đã thu mẫu và gửi PGS.TS. Nguyễn Xuân Phương, Viện sinh thái và
Tài nguyên sinh vật giám đinh tên loài của cây Xạ đen tại Hòa Bình. Sau khi
giám định tên loài thu được kết quả như sau: Cây Xạ đen tại Hòa Bình có tên
khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Mor. (hình 2.1)
Hình 2.1. Mẫu Xạ đen thu được tại Hòa Bình
28
Hình 2.2. Mẫu tiêu bản Xạ đen đã được giám định
2.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
2.2.1. Dụng cụ và thiết bị chiết tách mẫu
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được
sử dụng bao gồm:
- Bình chiết.
- Bình cầu cất quay
- Máy cất quay chân không.
- Cốc thuỷ tinh
- Ống đong chia vạch.
29
- Máy sấy.
- Bình triển khai sắc ký.
- Cột sắc ký thuỷ tinh các kích cỡ.
- Bàn cắt, dao cắt bản mỏng.
- Bản sắc ký
- Bình nuôi cấy tế bào
- Phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur
- Đầu týp cho micropipet
2.2.2. Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc
Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy
BRUKER Avante 500 với chất chuẩn nội TMS (Tetrametyl Silan) tại Viện
Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Máy LC-MS Agilent 1260 series Single Quadrupole để đo phổ khối
lượng được thực hiện tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KHCNVN.
2.2.3. Hoá chất
Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản nhôm tráng sẵn Silicagel 60
F254 (pha thường) và RP-18 F254 (pha đảo) độ dày 0,2 mm (Merck-Đức).
Sắc ký cột: Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430
mesh). Silicagel pha đảo YMC (30-50 m, Fujisilisa Chemical Ltd).
Dung môi chiết và chạy sắc ký: dung môi được sử dụng là:
n-Hexan
Ethyl acetate
Methanol
30
Axeton
Dichloromethane
Nước
Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Edgle Medium) hoặc
MEME (Minimum Essential Medium with Edgle’s salt) có bổ
sung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penicillin-
Streptomycin sulfate - Fungizone); NAA (Non-Essential Amino
Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum)
Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA
(Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered
Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic.
Các loại chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipticine,
Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO.
Phát hiện vệt chất: đèn tử ngoại bước sóng 254 và 368 nm, thuốc thử
H2SO4 10% hơ nóng từ từ đến khi vết chất hiện màu.
2.2.4. Dòng tế bào (cell lines)
- Dòng tế bào Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan)
- Dòng tế bào LU-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thư phổi)
- Dòng tế bào MCF-7 (Human bredst adenocarcinoma – Ung thư vú)
- Dòng tế bào HeLa (HeLa cervical cancer cells – ung thư cổ tử cung
HeLa)
2.3. Chiết phân đoạn.
Sử dụng phương pháp ngâm dầm, trích kiệt bằng methanol để chiết các
hợp chất ra khỏi lá xạ đen, qua trình cụ thể được thực hiện như sau:
31
Lá xạ đen đem phơi khô sau đó nghiền nhỏ thành bột (5,8kg), tiến
hành ngâm bột xạ đen trong bình thủy tinh với dung dịch methanol trong
vòng 3 ngày, sau đó lọc loại bỏ cặn, dịch chiết đem cất loại dung môi thu
được cao tổng MeOH, quá trình này lập lại thêm 3 lần để lấy tối ưu lượng
chất có trong lá xạ đen. Từ cao tổng MeOH tiến hành chiết phân đoạn với
các hai loại dung môi là n-Hexane và ethyl acetate, quá trình được thực
hiện cụ thể như sau. Hòa tan cao MeOH với hai lít nước chia đều vào 2
bình chiết có thể tích 2 lít sau đó bổ sung thêm vào mỗi bình chiết 1 lít n-
Hexane lắc đều trong 15-20 phút rồi để cho hai dung dịch tách thành 2 lớp,
sau khi tách thành 2 lớp tiến hành chiết lấy phần n-Hexane cất loại dung
môi thu được cao n-Hexane, quá trình này được thực hiện liên tiếp 3 lần.
Sau khi chiết lấy phần n-Hexane thì phần hỗn hợp nước lại tiếp tục được bổ
sung thêm 2 lít EtOAc và cũng lắc đều trong 15-20 phút, quá trình chiết với
EtOAc có khả năng tạo nhũ cao hơn so với n-Hexane cho nên thời gian
tách lớp của chúng cũng lâu hơn. Sau khi tách lớp đem chiết lấy phần dịch
EtOAc, cất loại dung môi thu được cao EtOAc. Cũng như với quá trình làm
với dung dịch n-Hexane thì quá trình này cũng thực hiện chiết liên tiếp 3
lần, tổng lượng cao thu được là 34,47g. Dưới đây là sơ đồ chiết phân đoạn
lá xạ đen:
32
Bột xạ đen khô
Ehretia asperula Zoll. & Mor
Ehretia asperula Zoll. & Mor MeOH
Cặn MeOH (320g)
Hòa tan với 2 lít nước
Chiết với n-Hexane tỉ lệ 1:1
Cất loại dung môi
Cặn n-hexane Dịch chiết nước
Chiết với ethyl acetate tỉ lệ 1:1
Cất loại dung môi
Dịch chiết nước
Cặn ethyl acetate (34.47g)
Hình 2.3. Sơ đồ chiết phân đoạn, phân lập cao xạ đen
2.4. Phân lập một số hợp chất trong cây xạ đen.
Từ cao ethyl acetate được chạy gradien, sắc kí cột trên silicagel pha
thường với hệ giải li D/M thu được 6 phân đoạn ký hiệu từ Ed 1.1 đến Ed 1.6.
Sau khi thu được 6 phân đoạn nhỏ đem tiến hành khảo sát trên sắc ký bản
mỏng và tiến hành phân lập trên sắc ký cột.
33
2.4.1. Phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5
Tiến hành sắc ký cột phân đoạn Ed 1.2 silicagel pha thường hệ dung
môi D/M với tỉ lệ 5/1 thu được 3 phân đoạn nhỏ Ed 2.1; Ed 2.2; Ed 2.3. Sử
dụng cột YMC cho phân đoạn Ed 2.3 với hệ dung môi là M/W tỉ lệ 1/2 thu
được 37,5mg chất sạch Ed 2.3. Từ phân đoạn Ed 2.1(488mg) chạy sắc ký cột
silicagel pha thường hệ dung môi H/D/M tỉ lệ 5/15/1 thu được phân đoạn Ed
2.4 (80mg). Do phân đoạn Ed 2.4 vẫn còn nhiều vết nên lại tiếp tục chạy sắc
ký cột silicagel pha thường hệ dung môi D/A tỉ lệ 5/1 thu được 17mg Ed 5.1,
quan sát trên sắc ký bản mỏng pha đảo thấy Ed 5.1 vẫn còn nhiều vết chất cho
nên lại tiến hành chạy sắc ký cột silicagel pha đảo (YMC) với hệ dung môi
MeOH/H2O tỉ lệ 1/1,5 thu được 7mg chất sạch Ed 5.5.
Quá trình phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 được tiến hành qua sơ đồ
sau.
34
Cao ethyl acetate
Gradien hệ Dichlorometane/Methanol
100% D 1/1 5/1 50/1 10/1
100%M 1 Ed 1.1 Ed 1.3 Ed 1.4 Ed 1.5 Ed 1.6
Ed 1.2 1.67g
Dichlorometane/Methanol D/M 5/1 Silicagel pha thường
Ed 2.1 488mg Ed 2.3 47mg
H/D/M 5/15/1 YMC M/W 1/2 Silicagel pha thường
Ed 2.4 80mg Ed 3.2 37.5mg
Dichlorometane/Acetone D/A 5/1
Silicagel pha thường
Ed 5.1 17mg
Silicagel pha đảo YMC
M/W 5/1 Ed 5.5 7mg
Hình 2.4. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5
35
2.4.2. Phân lập hợp chất Ed 17.3
Tiến hành chạy gradien phân đoạn Ed 1.3, với hệ dung môi
dichlorometane/acetone tỉ lệ 5/1 thu được phân đoạn Ed 7.3, sử dụng sắc ký
cột silicagel pha thường cho phân đoạn Ed 7.3 với hệ dung môi
dichlorometane/methanol tỉ lệ 2/1 thu được phân đoạn nhỏ Ed 16.4. Tiếp tục
tiến hành sắc ký cột silicagel pha thường hệ như trên với một tỉ lệ khác D/M
3/1 thu được phân đoạn nhỏ Ed 17.2. Tiếp tục chạy sắc ký cột YMC với hệ
dung môi Methanol/nước tỉ lệ 1/3 thu được 51mg chất sạch Ed 17.3.
Dưới đây là sơ đồ phân lợp hợp chất Ed 17.3:
Ed 1.3 (16,28g)
Gradien hệ dichlorometane/acetone
D/A 50/1 D/A 5/1 D/A 10/1
Ed 7.3 Ed 7.2 Ed 7.1
dichlorometane /methanol Silicagel pha thường
D/M 2/1
Ed 16.4
dichlorometane /methanol Silicagel pha thường
D/M 3/1
Ed 17.2
YMC M/W 1/3
Ed 17.3 (51mg)
Hình 2.5. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 17.3
36
2.4.3. Phân lập hợp chất Ed 11.4
Từ phân đoạn Ed 8.3 tách được từ phân đoạn Ed 7.2 với hệ dung môi
dichlorometane/methanol với tỉ lệ 7/1,tiếp tục tiến hành chạy sắc kí cột
silicagel pha thường hệ dung môi dichlorometane/methanol với tỉ lệ 10/1 thu
được phân đoạn Ed 8.9 (300mg), tiến hành chạy cột silicagel pha đảo (YMC)
cho phân đoạn Ed 8.9 với hệ dung môi methanol/nước tỉ lệ 1/1 thu được phân
đoạn nhỏ Ed 9.2 (220mg), quan sát trên bản mỏng vẫn thấy vết chất chưa
sạch, cho nên lại tiếp tục sử dụng sắc ký cột sephadex cho phân đoạn Ed 9.2
với hệ dung môi methanol/nước tỉ lệ 1/1 thu đươc hợp chất Ed 11.4 có khối
lượng 100mg.
Ed 7.2
Dưới đây là sơ đồ phân lập hợp chất Ed 14.1:
Dichlorometane/Methanol Silicagel pha thường D/M 7/1
Ed 8.3 (400mg)
Dichlorometane/Methanol Silicagel pha thường
D/M 10/1
Ed 8.9 (300mg)
Methanol/Nước Silicagel pha đảo
M/W 1/1
Ed 9.2 (220mg)
Methanol/Nước Silicagel sephadex
M/W 1/1
Ed 11.4 (100mg)
Hình 2.6. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 11.4
37
2.5. Hằng số vật lý và các số liệu phổ nghiệm
2.5.1. Hợp chất Ed 3.2
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ = 7,53 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-3); 7,05
(1H, d, J = 1,5 Hz, H-5); 6,96 (1H, dd, J = 8,0 1,5 Hz, H-9) ; 6,79 (1H, d, J =
8,0 Hz, H-8); 6,22 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-2);
13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ = 169,0 (C-1); 148,3 (C-7); 145,8 (C-
6); 145,6 (C-3); 126,7 (C-4); 121,7 (C-9); 115,3 (C-8); 114,3 (C-5); 113,9 (C-2)
2.5.2. Hợp chất Ed 5.5
1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ = 7,53 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-3); 7,03
(1H, d, J = 2,0 Hz, H-5); 6,94 (1H, dd, J = 8,0 2,0 Hz, H-9), 6,78 (1H, d, J =
8,0 Hz, H-8); 6,25 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-2); 3,75 (3H, s, OCH3);
13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ = 168,6 (C-1); 148,4 (C-7); 145,8 (C-
6); 145,7 (C-3); 126,6 (C-4); 121,8 (C-9); 115,3 (C-8); 114,0 (C-5); 113,7 (C-
2); 50,8 (OCH3)
38
2.5.3. Hợp chất Ed 17.3
1H-NMR (CD3OD): 𝛿 = 7,52 ( 1H, d, J = 15,5 Hz, H-3); 7,04 (1H, d, J
= 2,0 Hz, H-5); 6,91 (1H, dd, J = 8,0 2,0 Hz, H-9); 6,75 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-
8); 6,70 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5’); 6,69 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-8’); 6,57 (1H,
dd, J = 8,0 2,0 Hz; H-9’); 6,26 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-2); 5,19 (1H, dd, J =
10,0 3,5 Hz, H-2’); 3,06 (1H, dd, J = 14,5 5,5 Hz, H-3’a); 3,00 (1H, dd, J =
14,5 5,5 Hz, H-3’b);
13C-NMR (CD3OD): 𝛿 = 174,3 (C-1’); 169,4 (C-1); 149,5 (C-7); 145,7
(C-3); 145,0 (C-6’); 144,9 (C-7’); 143,2 (C- 6); 130,4 (C-4’); 128,2 (C-4);
122,2 (C-9’); 121,4 (C-9); 117,6 (C-5’); 116,3 (C-8’); 116,1 (C-8); 115,8 (C-
2); 115,3 (C-5); 77,8 (C-2’); 38,9 (C-3).
2.5.4. Hợp chất Ed 11.4
39
1H-NMR (CD3OD): 𝛿 = 7,52 (1H, d, 15,5 Hz, H-3); 7,04 (1H, d, 2,0
Hz, H-5); 6,91 (H, dd, 8,5 2,0 Hz, H-9); 6,75 (1H, d, 8,5 Hz, H-8); 6,71 (1H,
d, 2,0 Hz, H-5’); 6,64 (1H, d, 8,0 Hz, H-8’); 6,61 (1H, dd, 8,0 2,0 Hz, H-9’);
6,27 (1H, d, 15,5 Hz, H-2); 5,11 (1H, dd, 7,5 5,0 Hz, H-2’), 3,72 (3H, s,
OCH3); 3.06 (1H, dd, 14,5 5,5 Hz, H-3’a), 3,00 (1H, dd, 14,5 5,5 Hz, H-3’b).
13C-NMR (CD3OD): 𝛿 = 172,1 (C-1’); 168,2 (C-1); 150,1 (C-7); 148,6
(C-3); 147,3 (C-6); 146,1 (C-6’); 145,7(C-7’); 128,4 (C-4’); 127,5 (C-4);
123,3 (C-9); 122,8 (C-9’), 117,9 (C-5’); 116,9 (C-8’); 116,2 (C-8); 115,3 (C-
5); 114,2 (C-2); 74,9(C-2’); 52,8 (OCH3); 38,0 (C-3).
2.6. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity)
Nuôi tế bào ung thư in vitro theo Skehan và cs[21]. Xác định hoạt tính
gây độc các dòng tế bào ung thư theo phương pháp SRB của Likhitayawuid
và cs. đang được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ
(NCI). Phương pháp này đã được phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện
Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm 1996.
Phản ứng dựa vào khả năng thuốc nhuộm SRB bám vào protein của tế
bào đã được cố định bởi trichloroacetic acid (TCA). SRB là chất nhuộm
aminoxanthene hồng nhạt với 2 nhóm sulfonic tác dụng gắn với các chất chứa
amino acid cơ bản trong điều kiện axit nhẹ, và tách ra trong môi trường pH
kiềm. Lượng chất màu tách ra từ tế bào được nhuộm là tương ứng với lượng
tế bào.
Phép xác định gồm hai bước như sau:
Bước 1: Sàng lọc tìm các mẫu thử có hoạt tính
Chuẩn bị tế bào: Hep-G2, LU-1, Dòng HeLa, MCF7
Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các
môi trường dinh dưỡng MEME, Edgle hoặc DMEM.
40
Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (CO2 5%; độ ẩm 98%;
nhiệt độ 37oC, vô trùng tuyệt đối), tế bào được hoạt hoá trước khi thí nghiệm
tiến hành từ 1824 giờ.
Dùng dung dịch tripsin versel 0,1% để tách tế bào sau khi đã rửa tế bào
bằng đệm PBS. Pha tế bào bằng môi trường sạch, đếm số lượng, tạo huyền
dịch tế bào ở nồng độ thí nghiệm ( khoảng 35104 tế bào/mL tùy theo từng
loại tế bào thử nghiệm).
Chuẩn bị mẫu thử
Mẫu thử: Chất chiết từ thực vật hay sinh vật nói chung
Tạo mẫu gốc (110 mg mL1) trong dung môi DMSO. Dimethyl
sulphoxide (DMSO) độc tính ở nồng độ cao, nên cần hòa loãng với môi
trường ở nồng độ nhỏ hơn 1%.
Tiến hành thí nghiệm
Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ như sau:
Dãy đối chứng âm: DMSO 10%
Dãy đối chứng dương: chất chuẩn có khả năng diệt tế bào (ellipithine)
pha tới nồng độ 0,01mM trong DMSO.
Dãy thí nghiệm: mẫu thử + dịch huyền phù tế bào
Phiến được ủ trong tủ CO2 ở 37oC trong 3 ngày.
Kết thúc thí nghiệm
Tế bào sau khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh.
Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit axetic 1% và rửa lại bằng axit
axetic 1% để loại màu thừa; để khô, hoà lại bằng dung dịch đệm Trisbazơ
10M trên máy lắc ngang.
Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 515-540mm.
41
Tính kết quả
Tính giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu
thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì được đánh giá là có hoạt tính.
Giá trị CS (%) được tính theo công thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn
σ được tính theo công thức:
Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i
: giá trị OD trung bình
n: số giếng thử lặp lại
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± ) sẽ được chọn ra cho
thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50.
Bước 2: Tìm giá trị IC50
Dùng giá trị CS% của 10 nồng độ, dựa vào chương trình Table curve
theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử
để tính giá trị IC50.
Công thức:
Trong đó: y: nồng độ chất thử
X: Giá trị CS (%)
42
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong quá trình thực nghiệm đã phân lập được bốn hợp chất hữu cơ có
trong cây xạ đen, cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng các
phương pháp phân tích phổ hiện đại, cụ thể là các phương pháp phổ 1D và 2D.
Cấu trúc hóa học được xác định như sau:
3.1. Hợp chất 1: Ed 3.2
Hình 3.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 3.2
43
Hợp chất Ed 3.2 được phân lập dưới dạng bột màu trắng. Trên phổ
proton 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 5 proton tại vùng trường thấp bao
gồm: ba proton thơm tại H [7,06 (d, J = 2,0 Hz), 6,95 (dd, J = 2,0; 8,0 Hz),
6,80 (d, J = 8.0 Hz)] gợi ý cho sự có mặt của hệ tương tác spin ABX của vòng
thơm, hai olefin proton tại H [7,55 (d, J = 16,0 Hz), 6,24 (d, J = 16,0 Hz)]
xác định một nối đôi có cấu hình trans trong cấu trúc của Ed 3.2. Trên cơ sở
phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR, so sánh với tài liệu tham khảo[13] xác định
cấu trúc của Ed 3.2 là acid caffeic.
Bảng 3.1. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR của Ed 3.2 với số liệu
phổ 1H-NMR của caffeic acid [13]
Tài liệu tham khảo Ed 3.2
STT H H
C
(mult, J = Hz) (mult, J = Hz)
169,0 - - 1
113,9 6,22 (1H, d, 16,0) 6,24 (1H, d, 16,0) 2
7,53 (1H, d, 16,0) 145,6 7,55 (1H, d, 16,0) 3
126,7 - - 4
7,05 (1H, d, 1,5) 114,3 7,06 (1H, d, 2,0) 5
145,8 - - 6
148,3 - - 7
6,79 (1H, d, 8,0) 115,3 6,80 (1H, d, 8,0) 8
6,96 (1H, dd, 8,0 1,5) 121,7 6,95 (1H, dd, 2,0 8,5) 9
44
3.2. Hợp chất 2: Ed 5.5
Hợp chất Ed 5.5 được phân lập dưới dạng bột màu trắng. Phân tích dữ
liệu phổ một chiều của chất Ed 5.5 thấy gần giống với hợp chất Ed 3.2 với sự
có mặt của hệ tương tác spin ABX của vòng thơm [H 7,05 (d, J = 2,0 Hz),
6,95 (dd, J = 2,0; 8,0 Hz), 6,80 (d, J = 8,0 Hz)] và một nối đôi có cấu hình
trans tại H [7.56 (d, J = 16,0 Hz) và 6,27 (d, J = 16,0 Hz)]. Sự khác nhau duy
nhất của Ed 5.5 so với Ed 3.2 là tín hiệu singlet của một nhóm methoxy tại H
3,78 tương ứng với chuyển dịch hóa học tại 51,97 trên phổ cacbon 13C-NMR.
Từ những phân tích trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo[13], cấu trúc
của Ed 5.5 được xác định là methyl caffedte. Hợp chất này được tìm thấy ở
nhiều loài thực vật khác và có nhiều hoạt tính sinh học hay. Đây là lần đầu
tiên methyl caffedte được phân lập từ chi Ehretia
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 5.5
45
Hình 3.3. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 5.5
Hình 3.4. Phổ DEPT của hợp chất Ed 5.5
46
Bảng 3.2. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 5.5 với số
liệu phổ 1H-NMR của Methyl caffedte [13]
Tài liệu tham khảo Ed 5.5
STT H H
C C
(mult, J = Hz) (mult, J = Hz)
- 169,8 - 168,6 1
6,25 (1H, d, 15,5) 113,7 6,27 (d, 16,0) 115,4 2
7,53 (1H, d, 15,5) 145,7 7,56 (d, 16,0) 146,9 3
126,6 127,7 - - 4
7,03 (1H, d, 2,0) 114,0 7,05 (d, 2,0) 114,8 5
- 146,7 - 145,8 6
- 149,5 - 148,4 7
6,78 (1H, d, 8,0) 115,3 6,79 (d, 8,5) 116,5 8
6,94 (1H, dd, 8,0 2,0) 121,8 6,95 (dd, 2,0 8,0) 122,9 9
3,75 (3H, s) 50,8 3,78 (s) 52,0 OCH3
47
3.3. Hợp chất 3: Ed 17.3
Hình 3.5. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 17.3
48
Hình 3.6. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 17.3
Hợp chất Ed 17.3 được phân lập dưới dạng bột màu vàng sẫm. Trên
phổ 1H NMR của Ed 17.3 xuất hiện tín hiệu của 6 proton thơm, hai olefinic
proton, một oxymethine proton và hai proton của nhóm methylen. Phân tích
độ chuyển dịch hóa học và hằng số tương tác của các proton thơm xác định sự
có mặt của hai hệ tương tác spin ABX tại H [7,05 (d, J = 2,0, H-5), 6,93 (dd,
J = 2,0; 8,0 Hz, H-9), 6,78 (overlap, H-8] và [6,79 (overlap, H-5′), 6,69 (d, J =
8,0 Hz, H-8′), 6,65 (dd, J = 1,5; 8,0 Hz, H-9′)]. Cấu hình trans của nối đôi
trong cấu trúc của Ed 17.3 được khẳng định bởi hằng số tương tác J = 16,0
Hz của hai proton tại H (7, 52 (d, H-3) và 6,28 (d, H-2). Phổ 13C-NMR của
Ed 17.3 xuất hiện tín hiệu hấp thụ của hai nhóm cacbonyl tại C 173,6 (C-1)
và 168,5 (C-1a), tín hiệu của hai vòng thơm tại C từ 114,3 đến 149,5 ppm,
hai cacbon sp2, một nhóm methylen và một nhóm oxymethine. Từ những
phân tích trên kết hợp so sánh với tài liệu[12] đã công bố trước đó, hợp chất
Ed 17.3 được xác định là rosmarinic acid
49
Bảng 3.3. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 17.3 với số
liệu phổ 1H-NMR của Rosmarinic acid [12]
Tài liệu tham khảo Ed 17.3
STT H H C C (mult, J = Hz) (mult, J = Hz)
69,4 - 168,5 - 1
6,26 (d, 15,5) 6,28 (d, 16,0) 115,8 114,3 2
7,52 (d, 15,5) 7,52 (d, 16,0) 145,7 147,7 3
128,2 - 127,6 - 4
7,04 (d, 2,0) 7,05 (d, 2,0) 115,3 115,2 5
143,2 - 146,6 - 6
149,5 - 149,5 - 7
116,1 116,3 6,75 (d, 8,0) 6,78 (overlap) 8
6,91 (dd, 8,0 2,0) 121,4 6,93 (dd, 2,0 8,0) 123,1 9
174,3 - 173,6 - 1′
5,19 (dd, 10,0 3,5 ) 77,8 5,11 (dd, 3,5 10,0) 74,6 2′
3,06 (dd, 14,5 5,5 Hz, H-3’a) 38,9 3,12 (dd, 3,0 14,0 ) 37,8 3′
3,00 (dd, 14,5 5,5 Hz, H-3’b) 2,96 (dd, 10,0; 14,0 )
130,4 - 129,2 - 4′
117,6 117,5 6,70 (d, 2,0) 6,79 (overlap) 5′
145,0 - 145,9 - 6′
144,9 - 145,1 - 7′
116, 116,5 6,69 (d, 8,0) 6,69 (d, 8,0) 8′
6,57 (dd, 8,0 2,0) 122,2 6,65 (dd, 1,5 8,0) 121,8 9′
50
3.4. Hợp chất 4: Ed 11.4
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 11.4
Hợp chất Ed 11.4 được phân lập dưới dạng bột màu vàng sẫm. So sánh
dữ liệu phổ một chiều của chất Ed 11.4 với chất Ed 17.3 nhận thấy có sự
giống nhau gợi ý chất Ed 11.4 là một dẫn xuất của acid rosmarinic. Từ điểm
khác nhau duy nhất giữa hai chất là sự có mặt của một singlet tại H 3,72
tương ứng với C 52,65, và dịch chuyển về phía trường cao của một nhóm
51
cacbonyl tại C 172.2 xác định có một nhóm methoxy trong cấu trúc của Ed
11.4 tạo liên kết este với nhóm acid COOH. Nhận định này đã được chứng
minh trên cơ sở phân tích phổ hai chiều HMBC ghi nhận tương tác giữa
proton methyl H 3,72 với C-1′ (C 172,2). Như vậy cấu trúc của Ed 11.4 đã
được xác định là methyl rosmarinate.
Hình 3.8. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 11.4
52
Hình 3.9. Phổ hai chiều HSQC của hợp chất Ed 11.4
Hình 3.10. Phổ hai chiều HMBC của hợp chất Ed 11.4
53
Bảng 3.4. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 11.4 với số
liệu phổ 1H-NMR của Methyl rosmarinate [12]
Tài liệu tham khảo Ed 11.4
STT H H C C (mult, J = Hz) (mult, J = Hz)
- 168,3 - 68,2 1
7,52 (d, 15,5) 7,58 (d, 16,0) 114,2 114,2 2
6,27 (d, 15,5) 6,28 (d, 16,0) 147,7 148,6 3
- 127,6 - 127,5 4
7,04 (d, 2,0) 115,3 7,07 (d, 2,0) 115,3 5
- 146,8 - 147,3 6
- 149,8 - 150,1 7
6,75 (d, 8,5) 6,81 (d, 8,5) 116,5 116,2 8
6,91 (dd, 8,; 2,0) 123,3 6,98 (dd, 2,0 8,0) 123,2 9
- 172,2 - 172,1 1′
5,11 (dd, 7,5 5,0) 5,22 (dd, 5,0 7,5) 74,7 74,9 2′
3.06 (dd, 14.5 5.5, H-3’a) 3,06 (m) 37,9 38,0 3′
3,00 (dd, 14,5 5,5, H-3’b).
- 128,8 - 128,4 4′
6,71 (d, 2,0) 6,73 (overlap) 117,5 117,9 5′
- 146,2 - 146,1 6′
- 145,4 - 145,7 7′
6,64 (d, 8,0) 6,73 (overlap) 116,3 116,9 8′
6,61 (dd, 8,0 2,0) 122,8 6,59 (dd, 2,0 8,0) 121,8 9′
OCH3 3,72 (3H, s) 52,8 3,72 (s) 52,7
54
3.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào.
Bảng 3.5: Kết quả hoạt tính gây độc tế bào
Tên chất Giá trị IC50 (g/ml)
TT KH mẫu MCF- Hep-G2 LU-1 HeLa 7
- - - Caffeic acid - 1 Ed3.2
- - - Rosmarinic acid - 2 Ed17.3
- Methyl caffeate 2,83 3,38 4,40 3 Ed5.5
- 8,28 9,32 5,64 4 Ed11.4 Methyl rosmarinate
Kết quả thử nghiệm thấy methyl caffedte và methyl rosmarinate đều thể
hiện hoạt tính tốt với các tế bào ung thư Hep-G2, HeLa và MCF-7, còn
caffeic acid và rosmarinic acid không thể hiện hoạt tính với cả bốn tế bào ung
thư thử nghiệm. Caffeic acid không có khả năng gây độc tế bào ung thư
nhưng khi thay thế nhóm OH của gốc axit bằng nhóm methyl ester thì khả
năng gây độc tế bào ung thư tăng lên đáng kể điều này cho thấy khả năng
kháng ung thư của methyl caffedte có thể phụ thuộc vào nhóm methyl ester
này. Đối với hai hợp chất methyl rosmarinate và rosmarinic acid cũng có thể
do nguyên nhân trên. Cả bốn hợp chất này đều không thể hiện hoạt tính với tế
bào ung thư LU-1. Trong hai hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc, methyl
caffedte có hoạt tính sinh học tốt hơn hẳn so với hợp chất methyl rosmarinate
điều này có thể do cấu trúc của methyl caffedte phù hợp hơn cấu trúc của
methyl rosmarinate. Kết quả này gợi mở cho những nghên cứu tiếp theo đối
với cả bốn hợp chất này.
Một số nghiên cứu của Takahashi K và cộng sự vào năm 2010 cho thấy
ngoài hoạt tính trên của methyl caffedte nó còn có khả năng ức chế vừa phải
55
các enzyme glucosidase: sucrase và maltase, IC50=1,5mM đối với sucrase còn
IC50=2mM đối với maltase. Caffeic acid là một axít nên khả năng ức chế các
enzyme glucosidase là kém hơn methyl caffedte do este có tính kỵ đường lớn
hơn axít do vậy giá trị IC50 của axit sẽ lớn hơn, cụ thể IC50 của caffeic acid đối
với 2 enzyme là: IC50=2,9mM đối với sucrase còn IC50=5,2mM đối với
maltase[20].
So sánh với một số công trình khác cho thấy hợp chất rosmarinic
acid lại có tác dụng gây độc tế bào ung thư gan (Hep-G2), với
IC50=5(g/ml)[4]. Điều này cho thấy hợp chất rosmarinic acid tách trong cây
xạ đen rất có thể có cấu trúc không gian khác với cấu trúc không gian của
Rosmarinic acid tách trong cây cùm cụm hoa dài[4]. Vấn đề này cũng gợi mở
cho những nghiên cứu tiếp theo để phục vụ trong thực tiến.
56
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Qua việc tìm hiểu tổng quan về thành phần hóa học và một số hoạt tính
sinh học của lá xạ đen (Ehretia asperula) cho thấy trong lá xạ đen có nhiều
hợp chất có hoạt tính ưu việt.
Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp silica gel pha thường, pha đảo
YMC và Sephadex, đã phân lập được bốn hợp chất trong lá xạ đen. Cấu trúc
của chúng được xác định bằng các phương pháp phổ NMR và kết hợp so sánh
với tài liệu tham khảo.
ED 3.2: Caffeic acid
Ed 5.5: Methyl caffeate
Ed 17.3: Rosmarinic acid
Ed 11.4: Methyl rosmarinate
Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào từ bốn hợp chất caffeic acid,
methyl caffeate, rosmarinic acid và methyl rosmarinate đối với bốn dòng tế
bào ung thư cho thấy mức độ thể hiện gây độc tế bào là không giống nhau,
đối với các dòng tế bào mà chúng gây độc thì hợp chất Methyl caffEdte có tác
dụng mạnh nhất với IC50 trong khoảng 2,83 - 4,40(g/ml).
Hợp chất dạng methyl ester có hoạt tính mạnh hơn chất axit tương ứng
chứng tỏ nhóm methyl ester có thể làm tăng hoạt tính gây độc tế bào.
4.2. KIẾN NGHỊ
Do hạn chế về thời gian nên còn rất nhiều phân đoạn chưa được nghiên
cứu. Vì vậy, thời gian tới sẽ tiếp tục nghiên cứu những phân đoạn còn lại,
57
đồng thời đi sâu vào hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập được và
các kết quả thu được sẽ công bố trên các tạp chí khoa học.
Chúng tôi hy vọng với đề tài thiết thực này sẽ góp phần làm rõ thành
phần hóa học có trong lá xạ đen, giúp chúng ta có cái nhìn tổng quát cũng như
hiểu rõ hơn về đặc tính sinh học, công dụng của cây.
58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học
Hà Nội.
2. Nguyễn Huy Cường, Luận án tiến sĩ, “Nghiên cứu thành phần hoá học
và thăm dò hoạt tính sinh học cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth. &
Hook.) và cây Cùm rụm răng (Ehretia dentata Courch.)”, 2008.
3. Phạm Thị Lương Hằng, Đoàn Thị Duyên, Nguyễn Thị Yến, Ngô Thị
Trang (2013), “Phát triển phương pháp khuếch tán - so màu trên đĩa
thạch trong sàng lọc và phát hiện các chất có hoạt tính kháng khuẩn từ
các dịch chiết thực vật”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học tự
nhiên và Công nghệ, tập 29, số 2, tr 10-17.
4. Hoàng Quỳnh Hoa, Phạm Thanh Kỳ, Phan Văn Kiệm, Lê Mai Hương
(2009), “Xác định cấu trúc và tác dụng gây độc tế bào của acid
rosmarinic phân lập từ cây cùm cụm hoa dài (Ehretia longiflora
Champ)”, Tạp chí Dược học, 8/2009, tr 27-30.
5. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất
bản Y học Hà Nội.
6. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ,
Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr.80-90.
7. Tran Van Sung, Nguyen Huy Cuong, Trinh Thi Thuy, Pham Thi Ninh,
Le Thi Hong Nhung (2007), “Isolation and chracterization of triterpens
and phenolic glycoside frome Celastrus hindsii Benth”, Internationnal
Workshop on Herbal Medicinal Plants and Traditional Herb Remedies,
20-21 September 2007, Hanoi, Vietnam, tr. 85.
59
8. Trần Văn Sung, Nguyễn Huy Cường, Trịnh Thị Thủy, Phạm Thị Ninh,
Lê Thị Hồng Nhung (2008), “Isolation and structural characterization
of Phenolic glycoside and Triterpenes in Celastrus hindsii Benth” Tạp
chí Hóa học, 46 (2), tr 224 - 228.
9. Trinh Thi Thuy, Nguyen Huy Cuong, Tran Van Sung (2007), “Nitril
glucoside, flavonol glucoside and polyphenolic acids from Ehretia
dentata Courch”, Tạp chí Hóa Học, 45 (2), tr.228-232.
10. Trinh Thi Thuy, Nguyen Huy Cuong, Tran Van Sung (2007),
“Triterpenes from Celastrus hindsii Benth”, Tạp chí Hóa học, 45(3), tr
373 – 376.
11. Nguyễn Đình Triệu (2015), Bài tập các phương pháp vật lí ứng dụng
trong hóa học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
12. Abedini A., Roumy V., Mahieux S., Biabiany M., Standaert-Vitse A,
Rivière C., Sahpaz S., Bailleul F., Neut C., and Hennebelle T. (2013),
“Rosmarinic Acid and Its Methyl Ester as AntimicrobialComponents of
the Hydromethanolic Extract of Hyptis atrorubensPoit. (Lamiaceae)”,
Hindawi Publishing Corporation, Evidence-Based Complementary and
Alternative Medicine, Volume 2013, Article ID 604536, p.11.
13. Chang S. W., Kim K .H., Lee I. K., Choi S. U., Ryu S. Y., Lee K.
R.(2009), “Phytochemical Constituents of Bistorta manshuriensis”,
Natural Product Sciences. 15(4), p.234-240.
14. Huang H. C., Shen C. C., Chen C. F., Yang-Chang Wu Y. C., Kuo Y.
H.(2000), A Novel Agarofuran Sesquiterpene, Celahin D from
Celastrus hindsii Benth., Chem. Pharm. Bull. 48(7), p.1079-1080.
60
15. Kuo Y. H., Kuo L. M. (1997), “Antitumour and anti-AIDS triterpenes
from Celastrus hindsii”, Phytochemistry 1997, 44, p.1275–1281.
16. Kuo Y. H. , Chen C. F., Kuo L .M. Y. (1995), “Celahinine, a new
sesquiterpene pyridine alkaoid from celastrus hindsii”, Journol of
Natural Products, Vol. 58, No 11, p.1735-1738.
17. Likhitwitayawuid K., Angerhofer C. K., Cordell G. A., Pezzuto J. M.,
& Ruangrungsi N. (1993), “Cytotoxic and antimalarial
bisbenzylisoquinolme alkaloids from Stephania erecta”, Journal of
Natural Products, 56(1), p.30-38.
18. Mossmann T. (1983), “Rapid colorimetric assay for cellular growth
and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays”, J.
Immunol, Meth.65, p.55-63.
19. Skehan P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Vistica
D., Warren J.T., Bokesch H., Kenney S., Boyd M.R. (1991), “New
colorimetric cytotoxicity assay for anticancer agents”, Eur J Cancer 27,
p.1162–1168 .
20. Takahashi K., Yoshioka Y., Kato E., KatsukiI S., Iida O., Hosokawa
K., Kawabata J.(2010), “Methyl Caffeate as an α-Glucosidase Inhibitor
from Solanum torvum Fruits and the Activity of RelatEd Compounds”.
Biosci, Biotechnol, Biochem, 74(4), p.741–745.
21. Yu D., Susan L., Morris-Natschke, Lee K. H. (2006), “New
Developments in Natural Products-Based Anti-AIDS Resedrch”,
Published online 3 August 2006 in Wiley InterScience
(www.interscience.wiley.com), DOI 10.1002/mEd.20075.
61
Tài liệu website:
22. http://duoclieutuelinh.vn/xa-den.html
23. http://xadenhoabinh.vn/cong-trinh-nghien-cuu-cay-xa-den-cua-giao-su-
le-the-trung
24. Ancotnam.vn/mot-so-tac-dung-cua-cay-xa-den-than-duoc-tri-ung-
thu.html
62
PHỤ LỤC PHỔ
Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 3.2
63
Phụ lục 2: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 5.5
64
Phụ lục 3: Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 5.5
65
Phụ lục 4: Phổ DEPT của hợp chất Ed 5.5
66
Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 17.3
67
Phụ lục 6: Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 17.3
68
Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 11.4
69
Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 11.4
70
Phụ lục 9: Phổ hai chiều HSQC của hợp chất Ed 11.4
71
Phụ lục 10: Phổ hai chiều HMBC của hợp chất Ed 11.4
