Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Các định khả năng phân giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của người

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Lã Thị Lan Anh

XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU HÓA CỦA NGƢỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2020

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Lã Thị Lan Anh

XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU HÓA CỦA NGƢỜI

Chuyên ngành :

Sinh học thực nghiệm

Mã số : 8420114

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài:“ Xác định khả năng phân giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của ngƣời” là do tôi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận hoàn toàn chính xác, trung thực. Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều đƣợc trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm và nguồn gốc.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!

Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2020

Học viên

Lã Thị Lan Anh

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu em đã đƣợc sự hƣớng dẫn

và giúp đỡ rất nhiều của thầy cô và bạn bè để hoàn thành đề tài.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung - ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn nhiệt tình, giải đáp kịp thời các thắc mắc và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này.

Em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới thầy giáo Đồng Văn Quyền, trƣờng phòng Vi sinh phân tử, các anh chị Vũ Thị Hiền,Trần Xuân Thạch, Hà Thị Thu, Nguyễn Thị Hoa, Bùi Thị Dƣơng, Nguyễn Đình Duy trong phòng Vi sinh phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ em trong các thí nghiệm khi gặp những khó khăn và cũng truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý giá trong công tác nghiên cứu Sinh học.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất cả thầy cô giáo, giảng viên và cán bộ nhân viên Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp em có lƣợng kiến thức cơ bản nhất định để hoàn thành các môn học cũng nhƣ đề tài luận văn này.

Xin cảm ơn gia đình đã động viên, là hậu phƣơng vững chắc giúp em

có động lực học tập.

Cuối cùng xin cảm ơn tất cả bạn bè đã bên cạnh, cùng nhau học tập và

giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ hoàn thành đề tài luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Học viên

Lã Thị Lan Anh

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Giải thích chữ viết tắt

World Health Organization - Tổ chức y tế Thế giới WHO

Vi khuẩn sinh axit lactic LAB

Bile salts hydrolase- Enzym thủy phân muối mật BSH

Staphylococcus aureus S. aureus

Realtime Polymerase Chain Reaction – phản ứng RT-PCR chuỗi polymerase thời gian thực

Pyruvate oxidase Pox

Lactate oxidase Lox

NADH oxidase Nox

Staphylococcal enterotoxin SE

Tổng hợp mới De novo

De Man, Rogosa & Sharpe MRS

Horseradish peroxidase HRP

3,3’,5,5’-Tetramethylbezidine TMB

Sodium Glycocholate SGC

Sodium Glycodeoxycholate SGDC

Sodium Taurocholate STC

Sodium Taurodeoxycholate STDC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Pha loãng H2O2 theo nồng độ khác nhau ........................................ 29

Bảng 2.2. Trình tự mồi sử dụng để khuếch đại các gen bsh ........................... 31

Bảng 3.1. Giá trị đo OD620nm và hàm lƣợng H2O2 có trong dịch nuôi ............ 42

Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót sau khi ủ trong môi trƣờng pH thấp của các chủng vi

khuẩn đã chọn lọc so với đối chứng ................................................................ 44

Bảng 3.3. Tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn sau 3 giờ ủ trong môi trƣờng

có bổ sung muối mật ....................................................................................... 45

Bảng 3.4. Kết quả đo nồng độ DNA của các mẫu .......................................... 54

Bảng 3.5. Kết quả so sánh với các trình tự 16S đã đƣợc công bố trên ngân

hàng gen (NCBI) của Lac.VFE -04, Lac.VFE -08 và Lac.VFE -14 ............... 56

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Lactobacillus sp. ............................................................................... 7

Hình 1.2. Đồng phân quang học của axit lactic ................................................ 9

Hình 1.3. Cấu trúc của axit mật ...................................................................... 14

Hình 1.4. Sự tổng hợp axit mật ....................................................................... 15

Hình 1.5. Hoạt động thủy phân muối mật của hệ vi khuẩn đƣờng tiêu hóa ... 19

Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc từ mẫu phân ngƣời

......................................................................................................................... 38

Hình 3.2. Khuẩn lạc Lactobacillus thuần khiết sau 24 giờ nuôi cấy .............. 38

Hình 3.3. Lactobacillus quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. A. ảnh soi tƣơi. B.

ảnh nhuộm Gram. ............................................................................................ 39

Hình 3.4. Kết quả thử hoạt tính Catalase ........................................................ 40

Hình 3.5. Khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus so với

đối chứng ......................................................................................................... 41

Hình 3.6. Đƣờng chuẩn thể hiện mối tƣơng quan giữa nồng độ H2O2 và mật

độ quang của sản phẩm màu sau phản ứng với TMB. .................................... 41

Hình 3.7. Khả năng phân giải muối mật của 5 chủng Lactobacillus .............. 48

Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR các gen bsh1, bsh2, bsh3 và bsh4

(lần lƣợt từ trái sang phải) của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và

Lac.VFE-14. .................................................................................................... 50

Hình 3.9. Khả năng ức chế sự sinh trƣởng trên S. aureus của các chủng

Lactobacillus ................................................................................................... 52

Hình 3.10. Kết quả điện di các mẫu DNA của các chủng Lac.VFE-04;

Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14. .......................................................................... 54

Hình 3.11. Kết quả sản phẩm PCR của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08

và Lac.VFE-14. ............................................................................................... 55

Hình 3.12. Quan hệ phát sinh chủng loại trình tự gene 16S các chủng phân lập

Lac. VFE-04, Lac. VFE-08, Lac. VFE-14 phân tích bằng phần mềm MEGA7

Neighbor-Joining Tree. ................................................................................... 57

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỤC LỤC ......................................................................................................... 1

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 4

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 7

1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS ........................ 7

1.1.1. Vị trí, đặc điểm chung .................................................................... 7

1.1.2. Chức năng sinh học và các đặc điểm probiotic của vi khuẩn Lactobacillus ............................................................................................. 8

1.1.3. Ứng dụng của Lactobacillus ......................................................... 12

1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME THỦY PHÂN MUỐI MẬT – BILE

SALT HYDROLASE (BSH) ...................................................................... 13

1.2.1. Sự hình thành và chuyển hóa của mật trong đƣờng tiêu hóa ........ 13

1.2.2. Enzyme thủy phân muối mật Bile salt hydrolase ......................... 18

1.3. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN

LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT HIỆN

NAY ............................................................................................................. 19

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 20

1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam .............................................. 21

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................................................. 23

2.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................... 23

2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................... 23

2.2.2. Mẫu vật nghiên cứu ...................................................................... 23

2.2.3. Máy móc thiết bị ........................................................................... 23

2.2.4. Hóa chất và môi trƣờng ................................................................ 23

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 25

2.3.1. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Lactobacillus ............................. 25

2.3.2. Phƣơng pháp làm sạch và giữ chủng vi khuẩn Lactobacillus ...... 25

2.3.3. Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh học và đặc điểm probiotic của các chủng vi khuẩn Lactobacillus ........................................................... 26

2.3.4. Xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus ........................................................................................... 30

2.3.5. Xác định khả năng ức chế sinh trƣởng trên vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus ........................................................................................ 31

2.3.6. Định danh vi khuẩn ....................................................................... 32

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 37

3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTOBACILLUS ................. 37

3.2. KẾT QUẢ LÀM SẠCH VI KHUẨN LACTOBACILLUS .................. 38

3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM

PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS ......... 39

3.3.1. Kết quả xác định hình thái tế bào vi khuẩn .................................. 39

3.3.2. Kết quả xác định khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus ........................................................................................... 40

3.3.3. Kết quả xác định khả năng chịu pH axit và muối mật của các chủng đƣợc chọn lọc ............................................................................... 43

3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA

CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS ......................................... 47

3.4.1. Khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong môi trƣờng nuôi cấy ................................................ 47

3.4.2. Kết quả xác định sự có mặt của các gen bsh ............................... 49

3.5. KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TRƢỞNG TRÊN VI KHUẨN GÂY

BỆNH S. AUREUS ...................................................................................... 51

3.6. ĐỊNH DANH VI KHUẨN ................................................................... 53

3.6.1. Kết quả tách DNA tổng số ............................................................ 53

3.6.2. Kết quả PCR.................................................................................. 55

3.6.3. Kết quả giải trình tự ...................................................................... 55

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 59

4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................... 59

4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 60

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ....................... 71

MỞ ĐẦU

Theo thông báo của tổ chức y tế thế giới WHO, tính đến hết năm 2015

trên thế giới có khoảng 2,1 tỉ ngƣời thừa cân và béo phì. Đây là một con số

báo động đối với xã hội. Béo phì đƣợc đặc trƣng bởi một nhóm các rối loạn

chuyển hóa mãn tính quan trọng, bao gồm tiểu đƣờng type 2, gan nhiễm mỡ,

tăng huyết áp, ung thƣ... và đặc biệt là bệnh tim mạch. Trong số các bệnh về

tim thì bệnh về mạch vành gây tỷ lệ tử vong cao nhất. Tình trạng cao

cholesterol trong máu làm tích tụ cholesterol trong động mạch vành, dẫn đến

sự hình thành các mảng bám, gây xơ vữa động mạch, thúc đẩy sự phát triển

của bệnh mạch vành. Số liệu cho thấy, nếu nồng độ cholesterol trong máu

giảm 1% thì nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến mạch vành giảm tới 3%.

Những nghiên cứu gần đây cho thấy hệ vi sinh vật là một yếu tố môi

trƣờng liên quan đến việc kiểm soát trọng lƣợng cơ thể. Ở ngƣời, hệ vi sinh đƣờng ruột chứa khoảng 1014 tế bào vi khuẩn với bảy nhóm chính đó là

Firmicutes, Bacteroides, Proteobacteria, Fusobacteria, Verrucomicrobia,

Cyanobacteria và Actinobacteria [1]. Các mô hình thực nghiệm cho thấy ở

các đối tƣợng động vật và ngƣời béo phì có sự thay đổi trong thành phần của

hệ vi sinh vật đƣờng ruột so với đối tƣợng khỏe mạnh; hệ vi sinh của những

đối tƣợng béo phì có số lƣợng Firmicutes lớn hơn và ít Bacteroidetes hơn,

cũng nhƣ tính đa dạng vi khuẩn tổng số bị giảm [2]. Sự thay đổi các gen của

vi khuẩn tiêu biểu đƣợc coi là nguyên nhân ảnh hƣởng đến các con đƣờng

chuyển hóa trong cơ thể [3].

Trong số các vi khuẩn lactic có ảnh hƣởng lớn đến trao đổi chất ở ngƣời béo phì, thì chi Lactobacillus giữ một vai trò quan trọng. Lactobacillus là vi khuẩn lactic do sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men carbohydrate là axit lactic. Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc cho là sở hữu những lợi ích về sức khỏe khi đƣợc sử dụng dƣới các điều kiện khác nhau. Vi khuẩn này có vai trò quan trọng trong điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đƣờng ruột và

các hội chứng sau khi dùng kháng sinh. Một số vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm sự tái phát của bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium difficile [4], có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm ruột, ngăn ngừa ung thƣ đại trực tràng và điều trị hội chứng ruột kích thích [5]. Chi Lactobacillus đã đƣợc tìm thấy đa dạng về loài và số lƣợng trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời, nơi có pH axit và số lƣợng đáng kể muối mật, chứng tỏ chúng có khả năng chống chịu muối mật và pH thấp. Sản xuất enzyme thủy phân muối mật- BSH có thể là một cơ chế đề kháng mật thông thƣờng của chi vi khuẩn này [6]. Nghiên cứu của Yuji Aiba và cộng sự đã phân lập đƣợc L. johnsonii số 1088 đã đƣợc tìm thấy có khả năng kháng axit mạnh > 10% tế bào sống sót ở pH 1.0 sau 2 giờ [7].Thí nghiệm của Rajesh Kumar và cộng sự cũng cho thấy sự sống sót của các chủng Lactobacilli ở pH 2.5 và 2% muối mật sau 3 giờ [6].

Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có thể làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh nhờ công dụng của hoạt tính thủy phân muối mật thông qua tác động trực tiếp vào quá trình chuyển đổi muối mật của vật chủ [6].

Enzyme thủy phân muối mât (Cholylglycine hydrolase, E.C.3.5.1.24) xúc tác quá trình thủy phân muối mật, cắt đứt liên kết peptide của axit mật tự do với gốc Glycine hoặc Taurin. Các axit mật tự do (dạng giải liên hợp) sau đó sẽ bị kết tủa ở pH thấp khiến cho chúng không thể đƣợc tái hấp thu qua ruột và sẽ đƣợc thải ra ngoài cơ thể. Cholesterol là cơ chất để tổng hợp nên axit mật, vì thế việc thủy phân muối mật sẽ làm lƣợng cholesterol trong máu giảm đi, giúp cơ thể khỏe mạnh hơn, tránh nguy cơ béo phì và các bệnh tim mạch [8].

Các chủng Lactobacillus phân lập và có những đặc điểm probiotics đặc trƣng trong nghiên cứu này có một tiềm năng rất lớn để trở thành sản phẩm probiotics, là liệu pháp khả thi cho việc giảm mức cholesterol thông qua khả năng sinh enzyme thủy phân muối mật BSH. Chính vì lí do nêu trên, tôi tiến hành thực hiện luận văn với tiêu đề: " Xác định khả năng phân

giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của ngƣời."

 Với mục tiêu:

Nhằm xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus và các đặc điểm probiotics của các chủng vi khuẩn này.

 Nhiệm vụ của đề tài:

- Phân lập, tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả

năng phân giải muối mật.

- Xác định các đặc điểm sinh học và đặc điểm probiotic của các chủng vi

khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS

1.1.1. Vị trí, đặc điểm chung

Lactobacillus - một thành viên chính trong nhóm vi khuẩn lactic, là một chi vi khuẩn Gram dƣơng, hình que, sống kỵ khí tùy tiện hoặc yếm khí, không sinh bào tử (Hình 1.1) [9]. Chúng đòi hỏi môi trƣờng giàu dinh dƣỡng để sinh trƣởng nhƣ carbohydrates, amino axit, peptide, các ester của axit béo, muối, dẫn xuất axit nucleic và vitamin [10].

Hình 1.1. Lactobacillus sp.

Nguồn: https://www.microbiologyinpictures.com/

Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc phân bố từ dạ dày đến ruột già ở ngƣời và

động vật với số lƣợng thay đổi phụ thuộc vào loài, tuổi của vật chủ, hoặc vị trí

trong ruột. Trong phân ngƣời trƣởng thành, vi khuẩn Lactobacillus chiếm một

tỷ lệ nhỏ, khoảng 0,01% đến 0,6% tổng số lƣợng vi khuẩn với các loài chiếm

ƣu thế nhƣ L. gasseri, L. reuteri, L. crispatus, L. salivarius, và L.ruminis [11].

Ngoài ra các loài L. axitophilus, L. fermentum, L. casei, L.rhamnosus, L.

johnsonii, L. plantarum, L. brevis, L.s delbrueckii, L. curvatus, và L. sakei

cũng có thể đƣợc tìm thấy trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời với mức độ thay

đổi thất thƣờng [12]. Vi khuẩn này đóng vai trò chính trong lên men thực

phẩm có nguồn gốc từ động vật và thực vật từ thời xa xƣa.

Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc cho là sở hữu những lợi ích về sức khỏe

khi đƣợc sử dụng dƣới các điều kiện khác nhau. Chúng có vai trò quan trọng

trong điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng đƣờng ruột và các hội

chứng sau khi dùng kháng sinh. Một số vi khuẩn Lactobacillus có thể làm

giảm sự tái phát của bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium

difficile [4], có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm ruột, ngăn ngừa ung thƣ đại

trực tràng và điều trị hội chứng ruột kích thích [5]. Đƣờng tiêu hóa là nơi

chính mà vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hầu hết các hoạt tính để kiểm soát

sức khỏe. Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu đƣợc điều kiện khắt khe

của môi trƣờng sống. Các vi khuẩn lactic có tác dụng chống lại các tác nhân

gây đột biến, phá hủy các tác nhân gây ung thƣ, chống lại các bệnh liên quan

đến hệ tiêu hóa và làm tăng khả năng miễn dịch [5].

1.1.2. Chức năng sinh học và các đặc điểm probiotic của vi khuẩn

Lactobacillus

Quá trình trao đổi chất để sinh trƣởng và phát triển của các chủng

Lactobacillus sống trong đƣờng tiêu hóa cũng đồng thời mang lại nhiều lợi

ích cho vật chủ, vì thế vi khuẩn Lactobacillus đóng góp rất nhiều vai trò

trong đời sống của con ngƣời. Một số khả năng chuyển hóa của Lactobacillus

đã đƣợc phát hiện bao gồm:

1.1.2.1. Phân giải protein

Lactobacillus sản sinh enzyme proteinase phân giải protein thành các

peptide mạch ngắn [13]. Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein đƣợc cơ

thể vật chủ tiêu hoá dễ dàng. Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của

Lactobacillus đƣợc đánh giá là nguồn dinh dƣỡng có giá trị cao cho các đối

tƣợng nhƣ trẻ sơ sinh, ngƣời đang dƣỡng bệnh, ngƣời già hay gia súc non

[14]. Ngoài ra, trong công nghệ thực phẩm, Lactobacillus còn dùng để làm

tăng hƣơng vị và tham gia kết cấu sản phẩm.

1.1.2.2. Phân giải đường lactose

Lactose đƣợc enzyme β-galactosidases của vi khuẩn Lactobacillus

chuyển hóa thành glucose và galactose. Glucose và galactose lại tiếp tục đƣợc

chuyển hóa thành sản phẩm chính là axit lactic cùng với các sản phẩm phụ

nhƣ axit béo chuỗi ngắn acetate, propionate, butyrate,… [15].

Về mặt sinh l ý học, axit lactic có những ƣu điểm nhƣ: tăng cƣờng khả

năng tiêu hoá protein sữa thông qua sự đông vón; tăng cƣờng hoạt tính Ca, P,

Fe; kích thích sự tiết dịch vị; tăng nhanh cử động đẩy nhanh thức ăn đi xuống

dƣới dạ dày và là nguồn năng lƣợng cho quá trình hô hấp.

Chính những ƣu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc

ứng dụng Lactobacillus làm probiotic. Tuỳ thuộc vào loài và điều kiện nuôi

cấy, Lactobacillus sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+) axit

lactic (Hình 1.2). Ở ngƣời, cả hai loại đồng phân này đều đƣợc hấp thu trong

đƣờng ruột [16].

Hình 1.2. Đồng phân quang học của axit lactic [16]

L (+) axit lactic: đƣợc chuyển hoá hoàn toàn và nhanh chóng trong quá

trình tổng hợp glycogen.

D (-) axit lactic: đƣợc chuyển hoá ít hơn và phần không chuyển hoá sẽ

đƣợc bài tiết dƣới dạng urine. Sự hiện diện của axit không đƣợc chuyển hoá

trong ống tiêu hoá sẽ gây tình trạng nhiễm axit trong trao đổi chất ở trẻ sơ

sinh.

1.1.2.3. Vi khuẩn Lactobacillus và cholesterol

Tác dụng của vi khuẩn lactic lên tình trạng cao cholesterol trong máu

đã phát hiện trong nhiều nghiên cứu trên động vật cũng nhƣ con ngƣời. Sử

dụng vi khuẩn lactic theo đƣờng uống có tác dụng làm giảm đáng kể

cholesterol từ 22 đến 33% hoặc làm giảm cholesterol ở chuột béo phì [6,17-

19]. Những tác dụng làm giảm cholesterol trong máu của vi khuẩn này có thể

đƣợc thông qua: hoạt tính enzyme thủy phân muối mật [19], khả năng đồng

hóa cholesterol [18]; hoạt tính gắn kết vào màng tế bào, và khả năng sản xuất

các hợp chất nhƣ FA có tác dụng ức chế hoạt tính của các enzyme nhƣ HMG-

CoA reductase.

Các sản phẩm từ đậu nành đƣợc lên men bởi L. jugurti có thể làm giảm

cholesterol trong máu, giảm lipid, triglyceride tổng số trong huyết thanh và

gan ở chuột bị cao cholesterol trong máu [20].

L. plantarum KCTC 3928 cũng có tác dụng giảm cholesterol trong máu

đạt đƣợc bằng cách tăng tổng hợp axit mật và bài tiết axit mật qua phân [21].

L. plantarum BBE7 với hoạt tính BSH cao đã đƣợc chọn lọc và hoạt tính giải

liên hợp muối mật cũng nhƣ tác dụng loại bỏ cholesterol của nó ở quy mô

phòng thí nghiệm đã đƣợc nghiên cứu. L. plantarum BBE có tác dụng làm

giảm cholesterol lên đến 58% ở chuột [22].

Tác dụng làm giảm béo của vi khuẩn L. plantarum 14 thông qua hoạt

động làm giảm nồng độ leptin và cholesterol tổng số. Thêm vào đó L.

plantarum 14 làm giảm kích thƣớc của các tế bào mô mỡ, làm giảm trọng

lƣợng của mô mỡ trắng [23].

Kết quả của RT-PCR cho thấy ở L. plantarum CGMCC 8198, tất cả

gen bsh2, bsh3, và bsh4 đều tăng khi có mặt muối mật. L. plantarum CGMCC

8198 làm giảm 20% cholesterol trong huyết thanh ở chuột béo phì. Kết quả

này cho thấy L. plantarum CGMCC 8198 có lợi thế tiềm năng trong việc

ngăn ngừa bệnh tim mạch.

1 .1.2.4. Sản xuất H2O2 và tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn Hydrogen peroxide có công thức hóa học là H2O2. Đây là một một chất

oxy hóa mạnh. H2O2 chủ yếu đƣợc sinh ra trong quá trình chuyển hóa carbon

và năng lƣợng bởi các enzyme oxidase, bao gồm pyruvate oxidase, lactate

oxidase và NADH oxidase [24]. Ngoài ra, H2O2 cũng đƣợc tổng hợp trực tiếp

từ các hợp chất xanthine (nhƣ hypoxanthine, xanthine…) có liên kết –H dễ

thay thế cùng với nƣớc và oxi nhờ xúc tác của xanthine oxidase và Nox-4

[25]. Tác dụng diệt khuẩn của H2O2 là nhờ khả năng dễ dàng chuyển đổi thành

gốc hydroxyl, đây là một chất oxy hóa mạnh có tác dụng gây độc cho tế bào,

ức chế sự sinh trƣởng của một số loài vi khuẩn nhƣ Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus… [26].

Một số thành viên trong nhóm vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sản

xuất H2O2 nhƣ: L. johnsonii, L. axitophilus, L. fermentum, L. gasseri,...[24].

Tùy thuộc vào từng chủng, khả năng sản xuất H2O2 của chúng là khác nhau

với nồng độ dao động trong khoảng 0,8 – 6,4 mM [27]. Khả năng tạo H2O2

của chủng L. fermentum CS 12-1 là 3.5 mM [28], chủng L. johnsonii

NCC533 là 1mM [24] hay các chủng Lactobacillus trong nghiên cứu của

Zalán và cộng sự, (2005) là từ 0,059 – 0,176 mM [29].

Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng ức chế sinh trƣởng và bài tiết độc

tố ở vi khuẩn S. aureus [30]. Trong nghiên cứu của Misaghi và cộng

sự,(2017) cho thấy cả ba loài L. acidophilus, L. paracasei và L. fermentum

đều có khả năng ức chế sinh trƣởng của S. aureus. Ngoài ra, các chủng

Lactobacillus này cũng ức chế biểu hiện gen SE là yếu tố gây độc chính của

S. aureus [31]. Thử nghiệm lâm sàng của Eggers và cộng sự, (2018) cho thấy

những ngƣời sử dụng bổ sung đƣờng uống vi khuẩn probiotic L.

rhamnosus HN001 có khả năng làm giảm từ 73- 83% số lƣợng vi khuẩn S.

aureus đƣờng ruột ngƣời so với những ngƣời chỉ dùng giả dƣợc [30]. Hơn

nữa, dịch nuôi đã loại bỏ tế bào Lactobacillus cũng ức chế sinh trƣởng của S.

aureus nhờ chủng vi khuẩn này có khả năng tiết ra môi trƣờng những phân tử

kháng khuẩn nhƣ ethanol, H2O2 và các bacteriocin [32].

1.1.2.5. Khả năng sinh trưởng trong điều kiện pH thấp và chịu muối mật

Để có thể tồn tại trong môi trƣờng đƣờng tiêu hóa của vật chủ, các vi

khuẩn cần phải có khả năng chịu đƣợc nồng độ muối mật cao, pH thấp [6] và

có khả năng bám dính vào chất nhầy và các tế bào niêm mạc ruột [22].

Lactobacillus đã đƣợc tìm thấy đa dạng về loài và số lƣợng trong

đƣờng tiêu hóa của ngƣời, nơi có pH axit và số lƣợng đáng kể muối mật,

chứng tỏ chúng có khả năng chống chịu muối mật và pH thấp. Sản xuất

enzyme thủy phân muối mật có thể là một cơ chế đề kháng mật thông thƣờng

của chi vi khuẩn này [6]. Nghiên cứu của Yuji Aiba và cộng sự đã phân lập

đƣợc L. johnsonii 1088 có khả năng kháng axit mạnh, hơn 10% tế bào sống

sót ở pH 1 sau 2 giờ [7]. Thí nghiệm của Rajesh Kumar và cộng sự cũng cho

thấy sự sống sót của các chủng Lactobacilli ở pH 2,5 và 2% muối mật sau 3

giờ [6].

Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh các vi khuẩn thuộc chi

Lactobacillus có thể làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh nhờ công

dụng của hoạt tính enzyme BSH thông qua tác động trực tiếp vào quá trình

chuyển đổi muối mật của vật chủ [6].

1.1.3. Ứng dụng của Lactobacillus

Lactobacillus cũng nhƣ nhiều loại vi khuẩn lactic khác đã và đang đƣợc

ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau từ y tế, môi trƣờng, nông

nghiệp, và trong công nghiệp chế biến, bảo quản thực phẩm.

- Trong nông nghiệp:

Một số chủng lactobacillus nhƣ L. acidophilus, L. casei, L.

sporogenes... đƣợc sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi nhờ khả năng tạo

môi trƣờng giàu axit lactic, H2O2, giảm độ pH trong đƣờng tiêu hóa làm ức

chế sự phát triển của các loại vi khuẩn gây bệnh, đồng thời kích thích khả

năng miễn dịch cho vật nuôi, cải thiện khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng [33,

34].

Lactobacillus còn đƣợc sử dụng kết hợp với các vi khuẩn lactic khác

trong chế phẩm để xử lý ô nhiễm môi trƣờng, cải tạo đất, ức chế sự phát triển

của mầm bệnh làm tăng khả năng sống và năng suất cho cây trồng, vật nuôi

[35].

- Trong công nghiệp chế biến, bảo quản thực phẩm:

Nhờ khả năng lên men sinh axit lactic cùng một số sản phẩm có giá trị

nhƣ vitamin, chất thơm... Lactobacillus đƣợc sử dụng để bổ sung vào sữa tạo

nên các sản phẩm sữa chua thơm ngon dinh dƣỡng và có lợi cho sức khỏe

ngƣời sử dụng [36- 38].

Trong lên men dƣa chua, hoa quả muối chua, các vi khuẩn lactic bổ

sung vào giúp cho thực phẩm không bị biến đổi về màu sắc tự nhiên mà vẫn

giữ nguyên giá trị dinh dƣỡng, giúp thực phẩm đƣợc bảo quản trong thời gian

lâu hơn [39].

1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME THỦY PHÂN MUỐI MẬT – BILE SALT

HYDROLASE (BSH)

1.2.1. Sự hình thành và chuyển hóa của mật trong đƣờng tiêu hóa

1.2.1.1. Đặc điểm của mật

Mật là một dịch lỏng màu vàng xanh, chứa các thành phần nƣớc, axit

mật, cholesterol, phospholipids và sắc tố màu biliverdin [40] . Ở nhiều loài,

mật đƣợc lƣu giữ trong túi mật giữa các bữa ăn và đƣợc đổ vào tá tràng khi

ăn, ở đó mật hỗ trợ quá trình tiêu hoá thức ăn. Axit mật chiếm khoảng 50%

thành phần hữu cơ của mật và chúng đƣợc tổng hợp mới từ cholesterol trong

gan. Sau khi đƣợc liên kết với glycine hoặc taurine để tạo thành axit mật liên hợp, chúng thƣờng kết hợp với ion Na+ hay K+ để tạo thành muối mật. Tính

chất lƣỡng cực cho phép các muối mật đóng một vai trò quan trọng trong việc

nhũ tƣơng hóa các chất béo làm tăng sự tiếp xúc giữa lipase và cơ chất lipid,

do đó muối mật đóng một vai trò thiết yếu trong việc tiêu hóa chất béo. Trong

quá trình di chuyển ở ống tiêu hóa, các muối mật tiếp xúc với các vi khuẩn

đƣờng ruột, là những đối tƣợng có khả năng loại bỏ gốc glycine hoặc taurine

bằng cách sử dụng enzyme BSH. Với lƣợng lớn axit mật lƣu thông trong ống

tiêu hóa, hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa tham gia tích cực vào việc chuyển hóa

muối mật với mức độ lớn.

Hình 1.3. Cấu trúc của axit mật [40]

1.2.1.2. Tổng hợp axit mật từ Cholesterol

Các axit mật sơ cấp gồm cholic và axit chenodeoxycholic đƣợc tổng

hợp mới ở gan từ cholesterol (Hình 1.4). Axit mật đƣợc duy trì sự cân bằng

một cách hiệu quả trong điều kiện bình thƣờng bằng một quá trình gọi là chu

trình gan - ruột. Axit mật liên hợp (với glycine hoặc taurine) và không liên

hợp đƣợc hấp thu bằng cách khuếch tán thụ động dọc theo toàn bộ ruột và vận

chuyển tích cực ở đoạn cuối hồi tràng. Axit mật có thể đƣợc tái hấp thu vào

máu và đƣợc giữ bởi các tế bào gan, tái liên kết, và tái tiết vào trong mật. Ở

ngƣời bình thƣờng, mỗi ngày có khoảng 0,3 đến 0,6 g (5% tổng số axit mật)

vƣợt quá khả năng hấp thụ của tế bào biểu mô nên chúng đƣợc xử lý bởi các

vi khuẩn đƣờng ruột [41].

Hình 1.4. Sự tổng hợp axit mật

1.2.1.3. Chuyển hóa axit mật của hệ vi sinh vật đường ruột

Với lƣợng lớn axit mật lƣu thông trong ống tiêu hóa, hệ vi sinh vật

đƣờng tiêu hóa phức tạp có liên quan đến khả năng chuyển hóa muối mật với

mức độ lớn. Hệ vi sinh đƣờng ruột có thể tạo ra khoảng 20 chất chuyển hóa

axit mật khác nhau từ axit cholic và chenodeoxycholic axit [42]. Biến đổi sinh

học đƣợc biết đến bởi vi khuẩn đƣờng ruột bao gồm: (1) thủy phân muối mật

liên hợp để giải phóng axit mật tự do và các gốc axit amin, (2) loại bỏ các

nhóm hydroxyl chủ yếu là nhóm hydroxyl 7 cacbon của gốc axit cholic, (3)

phản ứng oxi hóa khử của các nhóm hydroxyl, và (4) sự epime hóa axit mật

[43]. Trong số những phản ứng trên, thủy phân muối mật liên hợp là phản ứng

quan trọng nhất về mặt sinh học. Đây là một điều kiện tiên quyết cho bất kỳ

chuyển đổi nào của sterol trong cơ thể [40].

1.2.1.4. Thủy phân muối mật

Quá trình tổng hợp axit mật và sự liên hợp với axit amin đƣợc thực

hiện trong gan. Ngƣợc lại, các hoạt động của vi sinh vật đƣờng ruột có thể

tách các hợp chất này thành các axit mật tự do và các gốc axit amin [40]. Các

lớp enzyme của vi khuẩn xúc tác thủy phân muối mật liên hợp đƣợc gọi

chung là enzyme thủy phân muối mật liên hợp - BSH, còn đƣợc gọi là

hydrolases cholylglycine [40].

BSH đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật trong ruột, chúng tham gia vào

những bƣớc đầu tiên của sự biến đổi axit mật. Những vi khuẩn giải liên hợp

của muối mật đƣợc cho là tăng một cách khiêm tốn ở ngoại vi hồi tràng và

tăng đáng kể ở đại tràng, bằng chứng là axit mật không liên hợp không thấy

xuất hiện trong hỗng tràng, nhƣng tăng chậm trong hồi tràng. Trong phân hầu

hết axit mật ở dạng không liên hợp. Thí nghiệm với động vật sạch (không có

vi sinh vật trong đƣờng ruột), thấy xuất hiện các muối mật liên hợp nguyên

vẹn trong phân, do vậy có thể nói rằng các vi khuẩn đƣờng ruột chịu trách

nhiệm cho sự giải liên hợp [42]. Từ việc so sánh các đặc điểm giữa không có

vi khuẩn Lactobacillus và có vi khuẩn Lactobacillus cƣ trú ở ruột chuột, cho

thấy rằng Lactobacillus chịu trách nhiệm cho hầu hết các hoạt động thủy phân

muối mật trong đƣờng ruột của chuột [40].

Những muối mật giải liên hợp đƣợc tái hấp thụ lại ít hơn so với các

muối mật liên hợp của chúng, kết quả là một lƣợng lớn axit mật tự do đƣợc

bài tiết trong phân. Ngoài ra, muối mật tự do có hiệu quả thấp trong việc hòa

tan và giúp chất béo hấp thu trong ruột. Vì thế, sự giải liên hợp của muối mật

có thể dẫn đến làm giảm cholesterol huyết thanh bằng cách: 1- làm tăng nhu

cầu đối với cholesterol để tổng hợp mới các axit mật, bù lại phần bị mất đi

trong phân hay 2- nhờ làm giảm độ hòa tan cholesterol, qua đó làm giảm độ

hấp thu cholesterol qua lumen ruột [44].

1.2.1.5. Thủy phân axit mật làm giảm cholesterol

Các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus đƣợc xem nhƣ các các liệu pháp

sinh học có tác dụng làm giảm mức độ cholesterol trong huyết thanh nhờ hoạt

tính của enzyme BSH thông qua tác động trực tiếp vào quá trình chuyển hóa

muối mật của vật chủ [45]. Quá trình tổng hợp axit mật và sự liên hợp với axit

amin đƣợc thực hiện trong gan. Ngƣợc lại, các hoạt động của Lactobacillus có

thể tách các hợp chất này thành các axit mật tự do và các gốc axit amin. Các

lớp enzyme của vi khuẩn xúc tác thủy phân muối mật liên hợp đƣợc gọi

chung là enzyme thủy phân muối mật liên hợp, còn đƣợc gọi là hydrolases

cholylglycine [42].

Các axit mật tự do là sản phẩm của phản ứng thủy phân muối mật bởi

các enzyme BSH của một số Lactobacillus ít tan trong nƣớc, dễ bị kết tủa và

kết quả là dễ dàng bị đào thải qua phân. Việc tăng cƣờng sự đào thải muối

mật qua phân sẽ làm tăng nhu cầu sử dụng cholesterol nhƣ một tiền chất để

tổng hợp muối mật mới để duy trì sự cân bằng muối mật trong cơ thể. Vì vậy,

sự tiêu hao muối mật có thể đƣợc coi nhƣ là một liệu pháp sinh học để can

thiệp vào việc điều trị chứng tăng cholesterol trong máu [43].

Các thành phần chính của mật là các axit mật sơ cấp, cholesterol và các

phospholipid. Trong cơ thể, axit mật sơ cấp đƣợc tổng hợp mới từ cholesterol

trong gan [40]. Sau khi liên kết với glycine hoặc taurine, axit mật đƣợc tiết

vào ống tiêu hóa, và chúng hoạt động nhƣ một chất tẩy rửa. Chúng có tác

dụng làm nhũ tƣơng hóa, giúp các enzyme lipase phát huy đƣợc tác dụng của

mình. Các vi khuẩn đƣờng ruột trong ruột non có khả năng thủy phân glycine

hoặc taurine từ các axit mật bằng cách sử dụng enzyme xúc tác thủy phân

muối mật. Sau khi loại bỏ glycine hoặc taurine, muối mật giải liên kết có độ

tan trong nƣớc thấp hơn, dễ bị kết tủa và do đó đƣợc thải theo phân ra ngoài.

Để điều hòa sự cân bằng của muối mật trong cơ thể, gan sẽ chuyển hóa

cholesterol biến thành muối mật do đó mức độ cholesterol huyết thanh có thể

đƣợc giảm xuống [44].

1.2.2. Enzyme thủy phân muối mật Bile salt hydrolase

Hệ vi sinh đƣờng ruột của động vật có vú nói chung và ở ngƣời nói

riêng đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh lý của vật chủ và liên

quan đến nhiều khía cạnh của sức khỏe và bệnh tật nhƣ: trầm cảm [46], ung

thƣ [47], sức khỏe tim mạch [48] ... Thông qua thành phần và sự hoạt động

của các vi sinh vật trong cơ thể, có thể dự đoán đƣợc tình trạng sức khỏe và

bệnh tật của vật chủ, đồng thời có thể sử dụng các liệu pháp vi sinh vật để hỗ

trợ sức khỏe và điều trị những loại bệnh này [49].

Hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa đã tiến hóa khả năng biến đổi giải liên

hợp muối mật làm tăng khả năng sống sót trong ruột, trong đó, các enzyme

BSH đóng vai trò thiết yếu trong xúc tác các phản ứng của quá trình này

[21].

Enzyme BSH xúc tác quá trình thủy phân muối mật, cắt đứt liên kết

peptide giữa axit mật tự do với gốc Glycine hoặc Taurine của muối mật

liên hợp, tạo ra axit amin tự do và axit mật giải liên hợp [40]. Các axit mật

giải liên hợp sau đó sẽ bị kết tủa ở pH thấp khiến cho chúng không thể

đƣợc tái hấp thu qua ruột [6]. Việc thủy phân muối mật tạo axit mật giải

liên hợp khó hấp thụ nên cơ thể sẽ cần huy động nhiều cholesterol để tổng

hợp axit mật mới, quá trình này góp phần làm giảm lƣợng cholesterol trong

máu. Ngoài ra, axit mật tự do tạo thành sau quá trình giải liên hợp muối

mật sẽ kết tủa ở điều kiện pH thấp (< 5,5) kéo theo các hạt cholesterol ổn

định bị phá vỡ, tạo thành các chuỗi axit béo ngắn và đƣợc loại ra khỏi cơ

thể qua phân [50].

Hình 1.5. Hoạt động thủy phân muối mật của hệ vi khuẩn đƣờng tiêu hóa

Nguồn: Brandvold và cộng sự, 2019 [50]

1.3. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN

LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT HIỆN NAY

Hoạt tính thủy phân muối mật của vi khuẩn sinh axit lactic có tiềm

năng rất lớn để ứng dụng vào các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cho con

ngƣời, đặc biệt là những ngƣời có hàm lƣợng cholesterol trong máu cao, thừa

cân, béo phì. Các nghiên cứu về hoạt tính phân giải muối mật của vi khuẩn

sinh axit lactic nói chung và Lactobacillus và bƣớc đầu ứng dụng trên động

vật đã đƣợc triển khai rộng rãi trên thế giới, một số công trình có đạt đƣợc

những thành công nhất định. Tuy nhiên ở Việt Nam, số lƣợng công trình

nghiên cứu về vi khuẩn Lactobacillus còn khiêm tốn. Phần lớn các nghiên cứu

đang dừng lại ở mức phân lập, định danh hay tuyển chọn các chủng làm

probiotic mà chƣa nghiên cứu sâu hơn về khả năng sinh enzyme thủy phân

muối mật của vi khuẩn này.

1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới

S. O’Flaherty và cộng sự (2018) tiến hành nghiên cứu sự hiện diện của

BSH trong bộ gen Lactobacillus của 170 loài khác nhau. Dữ liệu điều tra cho

thấy 28% loài Lactobacillus mã hóa protein BSH, những loài này chủ yếu

đƣợc tìm thấy trong hệ tiêu hóa của động vật có xƣơng sống. Điều này chứng

tỏ các chủng Lactobacillus đã sản sinh enzyme BSH phân giải muối mật để

thích nghi đƣợc với điều kiện sống khắc nghiệt [51]. Cũng trong năm 2018,

Thibault Allain và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng sinh enzyme BSH từ vi

khuẩn L. johnsonii La1 để ức chế ký sinh trùng đƣờng ruột Giadia

duodenalis. Nghiên cứu đã biểu hiện ba gen mã hóa cho enzyme BSH có

trong bộ gen của L. johnsonii La1 bao gồm bsh47, bsh56, bsh12, phân tích

mô hình cấu trúc các gen và thử nghiệm trên chuột nhiễm Giadia. Kết quả

cho thấy BSH đã phát huy tác dụng đáng kể trong việc chống lại ký sinh trùng

Giadia [52].

Trong một nghiên cứu của S. Jayashree và cộng sự (2014) trên chủng

L. fermentum MTCC 8711, nhóm tác giả đã đã xác định đƣợc hai gen bsh1 và

bsh2 của chủng này mã hóa cho các protein tƣơng ứng là BSH1 và BSH2 với

26% trình tự axit amin giống nhau. Khi biến nạp các gen này vào chủng L.

fermentum bản địa cho kết quả hoạt động của BSH đƣợc cải thiện rõ. Chủng

tái tổ hợp này có thể đồng hóa hoàn toàn 100 μg/mL cholesterol trong vòng

24 giờ, trong khi chủng tự nhiên phải mất đến 72 giờ để đồng hóa hoàn toàn

cholesterol [53]. Nghiên cứu đánh giá hoạt tính phân giải muối mật trong điều

kiện in vitro của các probiotic khác nhau phân lập từ nguồn thực vật và động

vật đã đƣợc Tsai và cộng sự thực hiện. Nhóm tác giả đã tiến hành nuôi cấy

các tế bào HepG2 với các chủng probiotic có hoạt tính BSH cao. Kết quả cho

thấy các chủng L. rhamnosus NBHK007 và L. aciophilus NBHK008 thể hiện

khả năng giải liên hợp axit mật cao hơn các chủng probiotic khác, trong đó

chủng L. rhamnosus NBHK007 làm giảm tiết 100% triglyceride trong vòng

48 giờ ủ. Nồng độ cholesterol trong các mixen cholesterol đã giảm trong 24

giờ ủ. Sử dụng probiotic chứa các chủng này trong chế độ ăn của chuột

hamster có lƣợng cholesterol máu cao giúp làm giảm tổng nồng độ

cholesterol, lipoprotein mật độ thấp, triglyceride và thiobarbituric axit trong

máu và gan so với những con chuột có chế độ ăn kiêng không bổ sung

probiotic [54].

1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt Nam, chỉ mới có một số công trình nghiên cứu về khả năng

phân giải muối mật của vi khuẩn Lactobacillus. Năm 2014, Dƣơng Nhật Linh

và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sàng lọc vi khuẩn lactic phân lập từ sữa

mẹ, phân su em bé, rau quả muối chua và sữa chua lên men tự nhiên có hoạt

tính giảm cholesterol thông qua khả năng sinh enzyme BSH, khử muối mật

liên hợp và khả năng hấp thụ cholesterol thông qua liên kết với màng tế bào.

Kết quả nghiên cứu đã phân lập đƣợc 32 chủng vi khuẩn có khả năng sinh

enzyme BSH, trong đó hoạt tính enzyme cao nhất là 5,061 U/mg thu đƣợc từ

chủng VN2.2 và khả năng hấp thu cholesterol cao nhất đạt 79,921% từ chủng

YK1.1 [55]. Nguyễn Thị Diễm Hƣơng và Đỗ Thị Bích Thủy đã thực hiện

nghiên cứu khảo sát đặc tính của L. fementum DC1 phân lập từ sản phẩm dƣa

cải Huế. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ sống sót của chủng DC1 tại

pH 2 qua 1, 2 và 3 giờ ủ lần lƣợt là 75,21%, 68,35% và 66,25%. Sau 4 giờ ủ

trong môi trƣờng MRS có mặt muối mật với nồng độ 0,3%, mật độ OD ở

bƣớc sóng 600nm đạt đƣợc là 0,516 [56].

Nhìn chung tại Việt Nam có khá ít công trình nghiên cứu sâu về khả

năng phân giải muối mật liên hợp của vi khuẩn Lactobacillus trong khi tác

dụng của hoạt động này là rất lớn. Sự phân giải muối mật nhờ các vi khuẩn

thuộc chi Lactobacillus đã đƣợc chứng minh là có thể làm giảm mức độ

cholesterol trong huyết thanh thông qua tác động trực tiếp vào quá trình chuyển

đổi muối mật của vật chủ [6]. Chính vì vậy việc tiến hành đề tài nghiên cứu là

rất cần thiết, giúp bổ sung nguồn dữ liệu về vi khuẩn Lactobacillus sp. có khả

năng thủy phân muối mật ở Việt Nam, và là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp

theo nhằm tìm ra các chủng Lactobacillus có tiềm năng sử dụng làm probiotic.

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài đƣợc tiến hành nghiên cứu tại Phòng Vi sinh học phân tử, Viện

Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Vi khuẩn Lactobacillus sp. đƣợc phân lập từ từ hệ vi khuẩn đƣờng

ruột của ngƣời khỏe mạnh tại Hà Nội.

2.2.2. Mẫu vật nghiên cứu

Các mẫu phân do ngƣời tham gia tại khu vực Hà Nội tự thu thập phân của mình sau đó để trong hộp vô trùng. Mẫu sau đó sẽ giữ lạnh ở 40C và

chuyển ngay lập tức đến phòng thí nghiệm để phân tích.

2.2.3. Máy móc thiết bị

Box cấy vô trùng; pipetman (1000, 200, 100, 20, 10 µL); tủ nuôi cấy,

đĩa cấy, kính hiển vi phân cực (Nikon Eclipse 50i), lam kính, lamen, máy đo

quang phổ ...

2.2.4. Hóa chất và môi trƣờng

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

Nƣớc muối sinh lý NaCl 0,9%, bộ hóa chất nhuộm Gram: Gentians,

Lugol, Fucshin, Glycerol, hóa chất định tính, định lƣợng H2O2 gồm: dung

dịch gốc H2O2 thƣơng mại 30%, TMB, DMSO, HRP, Muối mật Oxgall

(Sigma), glycocholate, taurocholate, glycodeoxycholate, taurodeoxycholate,...

Môi trƣờng MRS với thành phần: Peptone (10g/L), cao thịt (10g/L),

cao nấm men (4g/L), Glucose (20g/L), CH3COONa (5g/L), Tween 80

(1mL/L), K2HPO4 (2g/L), Triamonium citrate (2g/L), MgSO4.7H2O (0,2g/L),

MnSO4 (0,05g/L). Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH hoặc HCl tùy theo

dung dịch sau khi pha có nồng độ pH tƣơng ứng thấp hay cao hơn hơn 6.2.

Với môi trƣờng thạch bổ sung thêm agar nồng độ từ 1-2%, 10-20g trên 1 lít

môi trƣờng.

Các hóa chất trong thí nghiệm định danh vi khuẩn bao gồm:

Dung dịch trong tách DNA tổng số

Thành phần đệm tách: NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM (pH=8),

EDTA 100 mM (pH=8), SDS 0,5% w/v.

Thành phần hỗn hợp PCI bao gồm Phenol: Chloroform: Isopropanol

với tỷ lệ 25: 24 :1

Thành phần TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM.

Dung dịch cho điện di

Thành phần TAE 50X trong 500ml nƣớc: Tris base: 121g; CH3COOH:

28,6g; EDTA 0,5M pH 8,0: 50 mL; H2O 500 mL

Thành phần Gel agarose 1%: Agarose 1g; Đệm TAE 1X 100 mL

Thành phần PCR

Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 25 µL : H2O 8,5 µL ;

Master Mix 12,5 µL ; Mồi xuôi 1 µL (10 pM) ; Mồi ngƣợc 1 µL (10 pM) ;

DNA khuôn 2 µL (200 ng)

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu này của hãng ThermoFisher

Scientific.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Lactobacillus

Mẫu phân sau khi thu thập đƣợc đƣa về phòng thí nghiệm. Sau đó, mẫu đƣợc pha loãng theo dãy thập phân đến nồng độ 10-7 bằng nƣớc muối sinh lý

0,9%. Dùng micropipette có đầu côn vô trùng hút 0,1 mL dịch ở các độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7 cấy trải trên các đĩa petri chứa sẵn môi trƣờng thạch

MRS và đƣợc nuôi cấy trong điều kiện kị khí ở 37C trong vòng 48 đến 72

giờ. Điều kiện kỵ khí đƣợc tạo ra bằng cách dùng một túi khí kỵ khí Anaerocult®A (Merek) trong một bình ủ kị khí chứa các đĩa môi trƣờng.

2.3.2. Phƣơng pháp làm sạch và giữ chủng vi khuẩn Lactobacillus

Vi khuẩn sẽ đƣợc làm sạch bằng cách ria cấy pha loãng trên đĩa thạch.

Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn trong môi trƣờng MRS: Với các chủng

vi khuẩn đã ria cấy tinh sạch, tiến hành nuôi cấy các chủng trên môi trƣờng

MRS trong các bình tam giác để nhân nhanh số lƣợng tế bào vi khuẩn, các

thao tác thực hiện trong box cấy.

Các bƣớc thực hiện: Sử dụng các bình tam giác rỗng vô trùng. Dùng

pipet hút vào mỗi lọ 5 mL môi trƣờng MRS lỏng. Khử trùng đầu que cấy dƣới

ngọn lửa đèn cồn, để nguội. Chọn một khuẩn lạc đơn có kích thƣớc lớn nhất,

dùng đầu que cấy chạm vào khuẩn lạc vừa chọn. Nhúng đầu que cấy chứa vi

khuẩn vào dung dịch MRS trong bình tam giác, khuấy đều. Bọc miệng bình

bằng giấy bạc, ghi tên mẫu và ngày vào mẫu. Nuôi lắc các chủng trong tủ ở

37C, trong vòng 24-48 giờ.

Phƣơng pháp giữ chủng đƣợc thực hiện theo hai phƣơng pháp: giữ

chủng trong glycerol và giữ chủng trong ống thạch.

 Giữ chủng trong glycerol: Với các chủng vi khuẩn sau 24-48 giờ

nuôi cấy trong bình tam giác, thu lấy 700 µL dịch nuôi vi khuẩn cho vào ống

eppendorf. Hút 300 µL Glycerol 100% cho vào ống eppendorf đó. Ghi tên

mẫu lên nắp ống eppendorf. Bọc xung quanh miếng ống eppendorf bằng

parafilm và giữ ở tủ -80C. Tất cả các thao tác thực hiện trong box cấy vô

trùng.

 Giữ chủng trong ống thạch: Chuẩn bị các ống nghiệm khử trùng, đổ

5 ml môi trƣờng MRS agar cho vào các ống nghiệm đó. Đợi cho thạch khô

hoàn toàn. Khử trùng que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn. Để cho nguội. Dùng

đầu que cấy chạm vào phần dịch nuôi vi khuẩn trong bình tam giác. Ria phần

vi khuẩn vừa thu lên phần thạch MRS trong ống nghiệm. Đậy nắp ống

nghiệm bằng nút bông đã khử trùng. Ghi tên mẫu: Đem nuôi các chủng giữ trên ống thạch ở 370C trong vòng 24-48 giờ. Quan sát thấy phần thạch trong ống lên khuẩn lạc thì giữ các ống thạch trong tủ lạnh 40C.

2.3.3. Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh học và đặc điểm

probiotic của các chủng vi khuẩn Lactobacillus

2.3.3.1. Phương pháp xác định hình thái tế bào vi khuẩn

Phƣơng pháp soi kính hiển vi

Chọn khuẩn lạc đồng nhất, kiểm tra hình thái bằng kính hiển vi.

Lấy mẫu: Chuẩn bị vật dụng cần thiết: lam kính, lamen. Xác định các chủng

vi khuẩn đã phân lập đem đi quan sát. Hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn để

khử trùng. Dùng pipet nhỏ vài giọt NaCl 0,9% lên bề mặt lam kính. Dùng đầu

que tăm đã khử trùng (hoặc các vật có đầu nhọn vô trùng) chạm vào phần

khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trƣờng nuôi cấy. Hòa tan vi khuẩn ở đầu que

tăm vào dung dịch NaCl 0,9% trên lam kính. Phủ lamen lên phần dung dịch

trên lam kính và quan sát trên kính hiển vi.

Soi trên kính hiển vi : Đặt lam kính lên trên giá đặt mẫu. Quay vật kính về độ

phóng đại x40. Xoay ốc điều chỉnh sơ cấp cho lam kính chạm vào vật kính.

Quan sát trên thị kính và xoay các ốc điều chỉnh sao cho quan sát rõ vi khuẩn.

Xác định Gram bằng phƣơng pháp nhuộm Gram

Nhuộm Gram là một phƣơng pháp nhuộm do Gram sáng chế năm

1884, là một phƣơng pháp đơn giản và hiệu quả dùng để nhận diện nhanh các

vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng.

Quy trình thực hiện: Đầu tiên dùng que cấy lấy mẫu vi khuẩn từ đĩa cấy

(hoặc các vật dụng khác chứa chủng vi khuẩn đã phân lập), hòa tan vi khuẩn

vào một vài giọt NaCl 0,9% trên lam kính và dàn đều. Cố định bằng cách hơ

qua trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, để nguội. Nhuộm dung dịch tím gentians

trong khoảng 1 phút. Rửa dƣới vòi nƣớc chảy nhẹ. Nhuộm dung dịch lugol để

bắt màu màu trong khoảng 1 phút. Rửa dƣới vòi nƣớc chảy nhẹ. Tẩy màu

bằng cồn 90 để khoảng 30 giây. Rửa nƣớc. Nhuộm dung dịch đỏ Fucshin

trong 1 phút. Rửa dƣới vòi nƣớc. Để khô tự nhiên. Soi mẫu dƣới vật kính và

quan sát.

Phƣơng pháp thử Catalase

Mục đích: Kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản

sinh ra enzyme catalase.

Phƣơng pháp thực hiện nhƣ sau: Dùng que cấy vô trùng lấy sinh khối

từ khuẩn lạc thuần đặt trên một phiến kính sạch. Nhỏ H2O2 3-10% lên sinh

khối của vi khuẩn trên phiến kính. Phản ứng catalase là dƣơng tính khi có

hiện tƣợng sủi bọt khí sau khi nhỏ dung dịch H2O2 ngƣợc lại không xuất hiện

bọt khí là phản ứng catalase âm tính.

2.3.3.2. Phương pháp định tính và định lượng H2O2

Phƣơng pháp của Martín & Suárez (2009) đƣợc sử dụng để xác định sự

có mặt của H2O2 trong dịch nuôi các chủng vi khuẩn Lactobacillus đã phân

lập [57]. Vi khuẩn đƣợc cấy chuyển sang 5 mL môi trƣờng MRS nuôi lắc 200

vòng/ phút ở 37°C trong 24 giờ. Tế bào vi khuẩn đƣợc loại bỏ bằng ly tâm,

dịch nổi thu đƣợc bổ sung vào hỗn hợp có chứa enzyme HRP (horseradish

peroxidase, Sigma, USA) và TMB (3,3’,5,5’-Tetramethylbezidine, Sigma)

trong đệm Phosphate (pH 6) với tổng thể tích 1,5 mL. Ban đầu TMB ở dạng

khử, không màu, khi có mặt của HRP và H2O2, TMB bị oxy hóa và chuyển

thành màu xanh.

Phƣơng pháp trên cũng đƣợc sử dụng để định lƣợng nồng độ H2O2 do

các chủng vi khuẩn sản xuất đƣợc. Tiến hành dựng đƣờng chuẩn về mối

tƣơng quan giữa nồng độ H2O2 và mật độ quang ở bƣớc sóng 620 nm của sản

phẩm màu sau phản ứng với TMB bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn H2O2

100 mM. Nồng độ H2O2 các chủng vi khuẩn Lactobacillus đã phân lập sản

xuất đƣợc đƣợc tính toán dựa vào đƣờng chuẩn khi đo độ hấp thụ quang ở

bƣớc sóng 620 nm. Các thí nghiệm trên từng chủng đƣợc tiến hành lặp lại 3

lần để thu đƣợc kết quả cuối cùng.

Quy trình thực hiện thí nghiệm nhƣ sau:

 Dựng đƣờng chuẩn cho phép phân tích:

Lấy 6 ống cuvet, ghi tên các ống ĐC, 1, 2, 3, 4, 5 tƣơng ứng với nồng

độ H2O2 là 0, 1, 2, 3, 4, 5 mM.

Tiến hành pha loãng H2O2 nhƣ bảng 3.1 để đƣợc nồng độ tiêu chuẩn.

Chú ý: nồng độ H2O2 ở trên đƣợc tính sao cho: tổng thể tích cuối cùng của

ống là 1.5 mL, đã thêm 13 µL TMB và 2 µL HRP.

Mỗi ống sau khi pha loãng bổ sung 2 µL HRP trộn đều, tiếp đó bổ sung

13 µL TMB, dung dịch chuyển thành màu xanh. Đo màu ở bƣớc sóng 620

nm bằng máy đo quang phổ.

Bảng 2.1. Pha loãng H2O2 theo nồng độ khác nhau

Hóa chất Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Ống 6

0 15 30 45 60 75 Lƣợng H2O2 (µL)

Lƣợng MRS (µL) 1485 1470 1455 1440 1425 1410

Nồng độ H2O2 0 1 2 3 4 5 (mM)

 Phân tích trên mẫu thực

Mẫu đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: Nuôi các chủng vi khuẩn trong môi trƣờng

MRS lỏng trong 24h, ở nhiệt độ 37C, nuôi lắc 150 vòng/phút. Hút 1,5

mL dịch nuôi vào ống Eppendorf 1,5 mL, ly tâm 10000 vòng/5 phút.

Loại bỏ cặn, thu dịch.

Tiến hành thí nghiệm lần lƣợt từng ống: Chuẩn bị các ống cuvet tƣơng

ứng với mẫu cần xác định, ghi tên mẫu. Hút 1000 µL dịch thu đƣợc của

mỗi mẫu vào ống tƣơng ứng. Sau đó lần lƣợt bổ sung 485 µL MRS,

thêm 2 µL HRP, đảo nhẹ, và 13 µL TMB (10 mM). Ngay lập tức đo

màu ở bƣớc sóng 620 nm bằng máy đo quang phổ.

Thí nghiệm đƣợc thực hiện 3 lần, kết quả tính đƣợc là giá trị trung bình

sau 3 lần thực hiện thí nghiệm.

2.3.3.3. phương pháp xác định khả năng chịu axit

Sau 24 giờ nuôi cấy các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong môi trƣờng

MRS, tiến hành thử nghiệm khả năng chịu axit bằng cách ủ ở pH 2 và pH 3

trong 3 giờ. Pha loãng và đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch để xác định khả năng

sống sót của các chủng vi khuẩn [58].

2.3.3.4. Phương pháp xác định khả năng chịu muối mật

Các chủng vi khuẩn đã sàng lọc có khả năng sinh H2O2 đƣợc nuôi cấy

trong bình chứa môi trƣờng MRS có bổ sung muối mật Oxgall (Sigma) với

nồng độ 0,3% và ống đối chứng không bổ sung muối mật. Ủ ở nhiệt độ 37°C

trong vòng 24 giờ, sau đó kiểm tra khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn

bằng phƣơng pháp pha loãng và cấy trên đĩa thạch, đếm số lƣợng khuẩn lạc.

2.3.4. Xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi

khuẩn Lactobacillus

2.3.4.1. Xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn

Lactobacillus trong môi trường nuôi cấy

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành xác định đƣợc khả năng phân

giải bốn loại muối mật sodium glycocholate, sodium deoxyglycocholate,

sodium taurocholate và sodium taurodeoxycholate từ 5 chủng lactobacilli đã

phân lập đƣợc dựa trên phƣơng pháp của Ahn và cộng sự (2003) [59].

Sử dụng đĩa petri chứa môi trƣờng MRS agar (pH 6.2) có bổ sung 10

mM muối mật và CaCl2 (0,375 g/L). Đặt khoanh giấy thấm lên các vị trí đánh

số tƣơng ứng với các chủng đƣợc kiểm tra. Nhỏ 15 µL dịch nuôi cấy mỗi

chủng Lactobacillus lên vị trí khoanh giấy thấm tƣơng ứng. Đĩa thạch đƣợc ủ ở ở 37oC trong 48 giờ. Vòng sáng nhìn thấy xung quanh khoanh giấy thấm

cho thấy hoạt động thuỷ phân BSH của các chủng Lactobacillus. Kết quả

đƣợc đánh giá bằng cách đo đƣờng kính của vòng sáng. Các chủng

Lactobacillus cấy trên môi trƣờng thạch MRS không có muối mật đƣợc sử

dụng làm đối chứng âm. Thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần.

2.3.4.2. Xác định sự có mặt của các gen bsh

Các gen tƣơng đồng với gen mã hóa cho enzyme xúc tác thủy phân muối mật (bsh) đã đƣợc phát hiện trong Lactobacillus. Nghiên cứu cho thấy có sự tồn tại các homologs (gen tƣơng đồng) bao gồm bsh1, bsh2, bsh3 và bsh4 ở vi khuẩn Lactobacillus [40]. Để xác định sự có mặt của các gen này, chủng vi khuẩn có hoạt tính đã

chọn lọc đƣợc nuôi cấy qua đêm trong môi trƣờng MRS, sau đó thu sinh khối

và tách DNA tổng số sử dụng DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen theo

hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Các trình tự mã hóa của các gen bsh1, bsh2,

bsh3, và bsh4 sẽ đƣợc khuếch đại bằng PCR với mồi bsh1-F/R, bsh2 -F/R,

bsh3 -F/R, và bsh4 -F/R nhƣ trong bảng 2.2. [60].

Tên mồi

Trình tự mồi

bsh1-F

GGAATTCCATATGATGTGTACTGCCATAACTTATC (35)

bsh1-R

CCGCTCGAGTTAGTTAACTGCATAGTATTGTG (32)

bsh2-F

GGAATTCCATATGATGTGCACTAGTCTAACTTATACAAA (39)

bsh2-R

CCGCTCGAGTTAATGGGCCGCTGGCAA (27)

bsh3-F

GGAATTCCATATGATGTGTACTAGTTTAACGATTCA (36)

bsh3-R

CCGCTCGAGTTAGTTTGCTAACCGGAAC (28)

bsh4-F

GGAATTCCATATGATGTGTACCAGCTTAACTTATCTTG (38)

bsh4-R

CCGCTCGAGTCAATCGGCAGGAAAGAGGT (29)

Bảng 2.2. Trình tự mồi sử dụng để khuếch đại các gen bsh

Điện di để kiểm tra sự có mặt của các gen bsh mã hóa sinh tổng hợp

enzyme BSH của các vi khuẩn Lactobacillus đƣợc chọn lọc trong thí nghiệm.

2.3.5. Xác định khả năng ức chế sinh trƣởng trên vi khuẩn gây

bệnh Staphylococcus

1 mL dịch tế bảo vi khuẩn S. aureus ATCC-23235 đƣợc trải đều trên bề

mặt đĩa petri chứa 15 mL môi trƣờng thạch BHI (Brain Heart Infusion), sau

đó hút bỏ dịch thừa. Để đĩa thạch vào tủ ấm 37°C trong 15 phút. Dịch nuôi vi

khuẩn Lactobacillus 24 giờ đƣợc ly tâm loại bỏ tế bào. Nhỏ 20 µL dịch ly tâm

các chủng vi khuẩn Lactobacillus gồm Lac.VFE-04 , Lac.VFE-08, Lac.VFE-

14 hoặc dung dịch muối sinh lý (làm đối chứng) thành từng điểm riêng trên

đĩa petri đã trải vi khuẩn S. aureus. Ủ các đĩa petri đã đƣợc cấy vi khuẩn trong

điều kiện hiếu khí với nhiệt độ 37C. Sau 48 giờ nuôi cấy, quan sát hiện

tƣợng và đo kích thƣớc vòng kháng khuẩn quanh điểm nhỏ dịch ly tâm các

chủng vi khuẩn Lactobacillus để xác định khả năng ức chế sinh trƣởng của

dịch nuôi đối với vi khuẩn S. aureus.

2.3.6. Định danh vi khuẩn

Phƣơng pháp định danh dựa theo sinh học phân tử dựa theo kỹ thuật

giải trình tự đoạn gen rARN 16S [61].

Để giải trình tự của các chủng Lactobacillus quan tâm cần môt lƣợng

lớn DNA của gen để đem giải trình tự, do đó công đoạn đầu tiên là tiến hành

khuếch đại đoạn gen cần thiết bằng kỹ thuật PCR.

Phƣơng pháp:

 Tách DNA tổng số vi khuẩn

Bƣớc 1: Thu tế bào: Cho 1,5 mL dung dịch MRS nuôi vi khuẩn cần

tách vào ống eppendorf. Sau đó ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 5 phút.

Loại bỏ hoàn toàn phần dịch trong, thu cặn chứa tế bào vi khuẩn.

Bƣớc 2: Phá màng tế bào: Sử dụng dung dịch lysozyme để phá lớp màng

tế bào vi khuẩn Gram dƣơng. Hòa đều phần sinh khối tế bào đã thu trong

50 µL lysozyme. Ủ ở 37C trong 30 phút. Sử dụng đệm tách 400 µL/ 1

ống eppendorf. Bổ sung 20 µL Proteinase K, dùng pipet hút lên-xuống

để trộn đều dịch. Ủ ở 55C trong 1 giờ. Khoảng 15-30 phút, đảo đều ống

eppendorf trong khoảng 10 giây.

Bƣớc 3: Phân tách thành phần DNA và Protein: Bổ sung 400 µL hỗn

hợp PCI vào ống eppendorf, Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 20 phút.

Sau khi ly tâm, dung dịch trong ống eppendorf phân tách làm 3 lớp: lớp

dung dịch Phenol ở dƣới, lớp protein kết tủa ở giữa, phần dung dịch nổi

chứa DNA ở trên. Hút 300 µL phần dịch nổi, đƣa sang ống eppendorf

mới.

Bƣớc 4: Sử dụng Isopropanol: Tỉ lệ 1:1 so với lƣợng dung dịch chứa

DNA. Sử dụng khoảng 300 µL để trong nhiệt độ phòng khoảng 1 tiếng.

Sau khi kết tủa DNA, ly tâm dung dịch chứa mẫu ở 12000 vòng /phút

trong 20 phút. Loại bỏ dịch, thu kết tủa DNA. Rửa kết tủa DNA bằng

700 µL cồn 70. Ly tâm ở 12000 vòng /phút trong 10 phút. Loại bỏ

dịch, thu kết tủa DNA. Làm khô ống eppendorf.

Bƣớc 5: Thu nhận tế bào: Hòa tan kết tủa DNA trong 30 µL đệm TE có bổ sung RNase theo tỉ lệ 10 TE: 1 RNase. Ủ ở nhiệt độ 300C trong 1

tiếng để Rnase hoạt động, loại bỏ các thành phần RNA trong hỗn hợp.

Bƣớc 6: Kiểm tra mẫu: Bằng cách điện di 5 µL mẫu.

 Phƣơng pháp chạy điện di

Quy trình điện di:

Đổ bản gel agarose, đợi cho đến khi khô hoàn toàn (khoảng 30 phút).

Lắp đặt thiết bị điện di, đổ dung dịch điện di TAE 1X vào trong máy

điện di.

Trộn 5 µL mẫu DNA cần kiểm tra với 3 µL dung dịch đệm màu tra

mẫu. Dùng pipet hút lên xuống cho đều.

Nhỏ các giọt mẫu vào giếng theo đúng thứ tự, dung lƣợng mẫu tối đa

trong 1 giếng khoảng 15 µL, giếng đầu là Marker 1kb.

Đậy nắp, đặt cho máy chạy với hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ 40 mA.

Đợi cho bản gel chạy đƣợc 2/3 bản thì dừng lại.

Nhuộm bản gel với dung dịch EtBr trong khoảng 10-15 phút. Sau khi

nhuộm EtBr sẽ xen vào giữa các cặp base của axit nucleic và cho phép

chúng ta có thể quan sát chúng trong bản gel.

Soi bản gel dƣới tia cực tím tím ở bƣớc sóng 254 nm để quan sát DNA.

 Phƣơng pháp xác định nồng độ DNA bằng máy quang phổ nanodrop

Để xác định nồng độ DNA có trong dung dịch đệm sau khi hòa tan, sử

dụng máy quang phổ nanodrop để đo.

Các bƣớc tiến hành đo nanodrop với máy Nano Drop Lite Spectrophotometer:

Bƣớc 1: Khởi động máy, chọn chế độ đo nồng độ DNA sợi kép.

Bƣớc 2: Rửa đầu đọc với 1µL dung dịch cồn 70C, lau khô bằng giấy thấm.

Bƣớc 3: Tiến hành đo mẫu trắng (Blank) 2 lần bằng 1 µL dung dịch pha

mẫu, ở đây là dung dịch TE. Khi máy hiện “Measure sample” thì có thể

đo mẫu. Lau đầu đọc bằng giấy thấm.

Bƣớc 4: Đo mẫu, nhỏ 1 µL vào đầu đọc và nhấn “Measure”, sau khi

máy phân tích sẽ đƣa ra các kết quả A260, A260/280 và nồng độ DNA của

mẫu. Bƣớc 5: Rửa lại đầu đọc bằng cồn 700C, lau lại bằng giấy thấm, tắt

máy.

 Phản ứng PCR

Sau khi tách DNA tiến hành xác định nồng độ DNA bằng máy đo

nanodrop, tiến hành pha loãng với H2O sao cho mẫu DNA sử dụng làm mạch

khuôn (Template) đạt đƣợc nồng độ 100 ng /µL.

Mẫu DNA tổng số đƣợc tách từ tế bào của chủng Lactobacillus. Phản

ứng khuếch đại khoảng 1500 nucleotide đoạn rRNA 16S đƣợc thực hiện với

hai mồi chuyên biệt cho loài Lactobacillus, trình tự mồi này nhƣ sau:

16S-F: 5’-AGAGTTTGATCMTGG-3’; 16S-R: 5’-TACCTTGTTACGACT-3’

Cách thực hiện:

Xác định số lƣợng mẫu cần PCR, tính lƣợng thành phần dùng cho

một ống với số lƣợng mẫu.

Dùng pipet chuyên dùng cho mix thành phần phản ứng PCR để hút

các thành phần phản ứng với lƣợng vừa tính ra bao gồm H2O, Master Mix,

mồi xuôi và mồi ngƣợc vào chung 1 ống (gọi là ống Mix).

Hút dịch trong ống Mix và chia đều vào các ống eppendorf loại 100

µL, mỗi ống 23 µL.

Dùng pipet và đầu côn 10 µL hút 2 µL DNA khuôn để cho vào các

ống eppendorf.

Trộn đều thành phần phản ứng và đƣa vào máy Thermocycler.

Chu trình phản ứng PCR

 DNA khuôn đƣợc biến tính ở 94C trong 6 phút.

 Giai đoạn gắn mồi đƣợc thực hiện với 35 lần lặp lại, tiếp tục biến tính ở

94C trong 30 giây, nhiệt độ gắn mồi ở 46C trong 30 giây, kết thúc

giai đoạn này kéo dài ở nhiệt độ 72C trong 1 phút 30 giây.

 Giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 72C trong 8 phút.

 Kết thúc quá trình PCR, giữ sản phẩm ở 4C trƣớc khi đƣa mẫu ra khỏi

máy.

 Điện di dung dịch đạt đƣợc sau phản ứng PCR trên gel agrose 1% để

kiểm tra sản phẩm PCR tạo thành.

 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng GeneJET PCR Purification Kit. Các bƣớc

tiến hành nhƣ sau:

Bổ sung đệm gắn kết (Binding Buffer) vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1:1

(thể tích mẫu V=100 µL) trộn đều đƣợc hỗn hợp đồng nhất. Chuyển hỗn hợp

đã đƣợc đồng hóa vào cột tinh sạch (A/B). Ly tâm 12000 vòng/1 phút, loại bỏ

dịch lỏng (B). Những đoạn DNA có kích thƣớc lớn sẽ đƣợc giữ lại trên màng

lọc (A), toàn bộ phần tạp chất có kích thƣớc nhỏ sẽ đi qua đƣợc màng theo

phần dịch lỏng đi xuống. Bổ sung 700 µL đệm rửa (Wash Buffer), đảm bảo

toàn bộ tạp chất đã đƣợc rửa trôi. Ly tâm 12000 vòng /1 phút để loại bỏ dịch

lỏng. Li tâm 12000 vòng/1 phút, làm sạch cột. Chuyển màng (A) sang ống

effpendoft mới. Bổ sung 50 µL đệm đẩy (Elution Buffer) vào cột, ủ trong 5

phút. Ly tâm 12000 vòng/1 phút, thu dịch DNA đã đƣợc tinh sạch. DNA đã

đƣợc tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng máy đo quang phổ kế.

 Giải trình tự 16S rRNA

Sau khi đƣợc tinh sạch và xác định nồng độ DNA, sản phẩm PCR đƣợc

gửi đến phòng thí nghiệm Công nghệ gen- viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn

Lâm Khoa học và Công nghệ để tiến hành giải trình tự.

Kết quả giải trình tự đƣợc xử lý với phần mềm BioEdit. Các trình tự

nucleotide hoàn chỉnh đƣợc so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI

bằng cách sử dụng công cụ BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) để

xác định đến mức tên loài. Cây phát sinh chủng loài đƣợc hình thành từ phần

mềm Mega 7.0.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTOBACILLUS

Quá trình phân lập các chủng Lactobacillus từ mẫu phân thƣờng gặp

khó khăn vì sự hiện diện của các vi sinh vật cạnh tranh với số lƣợng lớn nhƣ:

Bifidobacterius, Streptococcus và Enterococcus. Môi trƣờng MRS pH 6.2

đƣợc sử dụng hiệu quả cho việc phân lập chủng Lactobacillus từ mẫu phân

của những ngƣời khỏe mạnh ở Hà Nội.

Trƣớc đây, H.M. Lee và Y.Lee đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn

lactic có trong sản phẩm yogurs trên môi trƣờng MRS và PCA- BCP, kết quả

cho thấy trên môi trƣờng MRS, xuất hiện nhiều khuẩn lạc với hình dạng và

màu sắc khác nhau hơn [62]. Lê Ngọc Thùy Trang và cộng sự cũng đã tiến

hành thí nghiệm khảo sát khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L.

plantarum SC01 trên các môi trƣờng MRS, TSB, BHI, M17 và LAPTg, kết

quả cho thấy trên môi trƣờng MRS, vi khuẩn có sự tăng trƣởng mạnh và sinh

hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính cao nhất [63]. Các kết quả trên đã chứng

minh rằng MRS là môi trƣờng tối ƣu cho sự phát triển cho Lactobacillus.

Tổng số 115 chủng Lactobacillus đã phân lập đƣợc trên môi trƣờng

MRS từ mẫu phân của những ngƣời khỏe mạnh ở khu vực Hà Nội. Kết quả

thu đƣợc trên đĩa thạch MRS (Hình 3.1) cho thấy có sự xuất hiện của nhiều

loại khuẩn lạc chủ yếu dạng lồi lên, mịn (không nhăn), trắng đục, không màu,

rìa trơn hoặc xẻ thùy. Một số nghiên cứu thu thập Lactobacillus từ mẫu phân

ngƣời đã đƣợc tiến hành nhƣ nghiên cứu của Rui-Xia Gu và cộng sự năm

2008 với 567 chủng thuộc Lactobacillus phân lập đƣợc từ 56 mẫu phân của

ngƣời cao tuổi ở Trung Quốc, trong nghiên cứu này các mẫu cũng đƣợc phân

lập trên môi trƣờng thạch MRS [64]. Nghiên cứu của Abolfazl Davoodabadi

và cộng sự năm 2015 cũng tiến hành thu thập Lactobacillus từ mẫu phân từ

95 trẻ sơ sinh khỏe mạnh ở Iran. Kết quả thu đƣợc 290 chủng Lactobacillus

trên môi trƣờng MRS [65].

Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc từ mẫu phân ngƣời

3.2. KẾT QUẢ LÀM SẠCH VI KHUẨN LACTOBACILLUS

Để làm sạch các mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc, chúng tôi sử dụng

phƣơng pháp ria cấy trên đĩa thạch MRS. Kết quả ria cấy trên đĩa thạch MRS

thu đƣợc các khuẩn lạc đồng đều, trong cùng 1 đƣờng ria khuẩn lạc đồng nhất

về hình thái, màu sắc, không có lẫn khuẩn lạc lạ.

Hình 3.2. Khuẩn lạc Lactobacillus thuần khiết sau 24 giờ nuôi cấy

3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM

PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS

3.3.1. Kết quả xác định hình thái tế bào vi khuẩn

3.3.1.1. Kết quả nhuộm gram và soi kính hiển vi

Các vi khuẩn sau khi làm sạch đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp nhuộm

Gram. Vì Lactobacillus là những vi khuẩn Gram dƣơng, thành tế bào của

chúng bao gồm lớp peptidoglycan dày, có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể

iot của thuốc nhuộm Gentian nên khi rửa với cồn, chúng vẫn giữ đƣợc màu

tím. Còn với các vi khuẩn gram âm, thành tế bào của chúng có lớp

lipopolysaccharide mỏng nên khi rửa với cồn chúng sẽ bị hòa tan và mất màu

tím. Sau khi nhuộm Fucshin, thành tế bào vi khuẩn gram âm sẽ bắt màu hồng.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, những chủng sau khi nhuộm bắt màu tím sẽ

đƣợc kiểm tra xác định hình dạng.

Hình 3.3. Lactobacillus quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. A. ảnh nhuộm Gram. B. ảnh soi tƣơi.

Những chủng sau khi nhuộm bắt màu tím (Hình 3.3.A) đƣợc quan sát

dƣới kính hiển vi điện tử xác định đƣợc chính là các chủng vi khuẩn

Lactobacillus hình que nhƣ trên Hình 3.3.B.

3.2.1.2. Kết quả thử hoạt tính catalase

Catalase là enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi tổn thƣơng bởi dẫn

xuất của oxy phân tử trong tế bào vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Các vi

sinh vật này có khả năng chuyển hóa năng lƣợng theo phƣơng thức hô hấp với

các chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử là oxy và tạo ra

H2O2. Sự tích tụ H2O2 trong tế bào vi sinh vật gây nguy hiểm cho tế bào. Do

đó, catalase đƣợc tạo ra để thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích

tụ H2O2 trong tế bào. Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 biểu hiện qua hiện

tƣợng sủi bọt khí trong thử nghiệm catalase.

Hình 3.4. Kết quả thử hoạt tính Catalase

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các chủng thí nghiệm có kết quả

catalase âm tính, không xuất hiện bọt khí trong khi chủng đối chứng là

Bacillus subtilis cho kết quả dƣơng tính. Thông thƣờng, Lactobacillus có

catalase âm tính. Đây cũng là đặc điểm quan trọng để nhận dạng vi khuẩn

Lactobacillus.

3.3.2. Kết quả xác định khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn

Lactobacillus

Phƣơng pháp đo (so) màu dựa trên HRP/TMB đƣợc chúng tôi sử dụng

để xác định sự có mặt của H2O2 trong dịch nuôi vi khuẩn có độ nhạy cao và

độc tính thấp [66]. Các phản ứng màu với TMB có độ nhạy rất cao, phát hiện

đƣợc nồng độ H2O2 từ lƣợng rất thấp (nanomolar đến millimolar) [57].

Lac.

ĐC

Lac.

VFE-14

VFE-09

VFE-11

VFE-04

VFE-08

Hình 3.5. Khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus so với đối chứng

Sau khi bổ sung HRP và TMB vào dịch nuôi vi khuẩn Lactobacillus đã

ly tâm, môi trƣờng chuyển ngay từ màu vàng sang xanh ở hầu hết các mẫu

với độ đậm nhạt khác nhau tùy thuộc vào lƣợng H2O2 có mặt trong dịch nuôi

của từng chủng vi khuẩn (Hình 3.5).

Hình 3.6. Đƣờng chuẩn thể hiện mối tƣơng quan giữa nồng độ H2O2 và mật độ quang của sản phẩm màu sau phản ứng với TMB.

Việc dựng đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa chỉ số OD và nồng độ H2O2

(mM) trong dung dịch rất cần thiết cho việc đánh giá khả năng sinh H2O2 của

các chủng vi sinh vật và để so sánh giữa kết quả nghiên cứu này với các nghiên cứu khác. Trong trƣờng hợp thí nghiệm này, hệ số tƣơng quan R2 =

0,9612 rất gần với giá trị 1. Nhƣ vậy, quan hệ giữa nồng độ H2O2 (mM) trong

= 0,9612 sẽ tính

dung dịch với OD620nm là chặt. Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y = 0,334X + 0,2857 với R2

đƣợc:

X = Trong đó: X: chính là lƣợng H2O2 sinh ra ở từng mẫu

(mM) Y: giá trị đo OD620nm của từng mẫu

Kết quả kiểm tra khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn

Lactobacillus đã phân lập đƣợc thể hiện trên Bảng 3.1. Trong đó, chủng có

khả năng tạo ra lƣợng H2O2 lớn nhất là Lac.VFE-14 đạt 2,183 mM, tiếp theo

là Lac.VFE-08 và Lac.VFE-04 với nồng độ H2O2 tƣơng ứng đạt 2,081mM và

2,067mM sau 24 giờ nuôi cấy.

Bảng 3.1. Giá trị đo OD620nm và hàm lƣợng H2O2 có trong dịch nuôi

Chủng vi khuẩn Giá trị OD620nm Nồng độ H2O2 (mM)

2,067 Lac.VFE-04 0,976

2,081 Lac.VFE-08 0,981

1,005 Lac.VFE-09 0,621

0,812 Lac.VFE-11 0,557

2,183 Lac.VFE-14 1,015

0,504 Lac.VFE-17 0,454

0,822 Lac.VFE-48 0,560

0,125 Lac.VFE-72 0,327

0,024 Lac.VFE-76 0,294

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng sinh H2O2 phụ thuộc

vào từng loài cụ thể. Chẳng hạn, khả năng sinh H2O2 của chủng L. johnsonni

NCC 533 trong thí nghiệm của Hertzberger và cộng sự là 1 mM [24], trong

khi khả năng sản xuất H2O2 của L. plantarum 2142 là 0,16 mM còn L. casei

Shirota là 0,056 mM [29]. Kang và cộng sự đã báo cáo rằng L. fermentum

CS12-1 tích lũy H2O2 đến 3,5 mM trong môi trƣờng nuôi cấy [28]. Có thể

thấy rằng lƣợng H2O2 của các chủng chúng tôi phân lập đƣợc tƣơng đối cao

so với đa số các chủng đã báo cáo ở các nghiên cứu trƣớc đó.

Nguồn cacbon cũng có ảnh hƣởng nhất định đến nồng độ H2O2. Khi sử

dụng nguồn carbon là galactose, L. bulgaricus sản xuất đƣợc lƣợng H2O2 cao

nhất là 0,02 mM, nhƣng khi sorbitor đƣợc sử dụng, lƣợng H2O2 đƣợc tạo ra là

0,0006 mM [67]. Ngoài ra, nguồn nitơ hay yếu tố nhiệt độ cũng có khả năng

tác động lên khả năng sinh H2O2 của vi khuẩn [67].

Nhƣ vậy, ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau sự tổng hợp H2O2 là khác

nhau. Lƣợng H2O2 sản xuất đƣợc cũng phụ thuộc vào khả năng của từng

chủng vi sinh vật. Ngoài ra, phƣơng pháp định lƣợng có ảnh hƣởng lớn đến

việc xác định nồng độ H2O2 mà vi sinh vật sản xuất đƣợc trong môi trƣờng. Vì

vậy cần tối ƣu điều kiện nuôi cấy và chọn lọc các chủng vi sinh vật để thu

đƣợc hàm lƣợng H2O2 cao nhất, đồng thời cần lựa chọn phƣơng pháp định

lƣợng phù hợp để xác định hàm lƣợng H2O2 vi sinh vật tổng hợp đƣợc.

3.3.3. Kết quả xác định khả năng chịu pH axit và muối mật của các

chủng đƣợc chọn lọc

Để đến đƣợc ruột non và đại tràng ngƣời thực hiện chức năng sinh học,

vi sinh vật cần phải vƣợt qua dạ dày, nơi có pH rất thấp (pH <3) [68]. Khả

năng chịu axit của các chủng vi khuẩn đƣợc khảo sát bằng cách xác định số

lƣợng khuẩn lạc sau khi ủ vi khuẩn ở pH 2 và 3 trong 3 giờ. Kết quả đƣợc thể

hiện ở Bảng 3.2. Sau 3 giờ ủ ở pH 3, tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn

này khá cao, lần lƣợt là 95,27%; 94,15% và 98,54%. Ở pH 2, lƣợng tế bào

còn sống đã giảm nhẹ, nhƣng vẫn tƣơng đối cao với đối chứng, với tỷ lệ sống

của Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 lần lƣợt là 85,12 %; 84,51%

và 88,22%.

Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót sau khi ủ trong môi trƣờng pH thấp của các chủng vi khuẩn đã chọn lọc so với đối chứng

Tỷ lệ sống sót sau khi ủ (%)

Chủng

pH 2 pH3

Lac.VFE-04 85,12 ± 5.44 95,27 ± 3.21

Lac.VFE-08 84,51 ± 8.01 94,15 ± 5.69

Lac.VFE-14 88,22 ± 5.14 98,54 ± 6.68

Sau khi di chuyển qua dạ dày, vi sinh vật lại phải đối mặt với dịch mật.

Sự tiếp xúc với mật là một thử thách cho các vi khuẩn xâm nhập vào đƣờng

tiêu hóa. Muối mật hoạt động nhƣ một chất tẩy rửa sinh học, làm phá hủy

màng tế bào vi khuẩn, muốn tồn tại đƣợc vi khuẩn phải có khả năng chịu

muối mật [69]. Vì thế khả năng chịu axit và muối mật là một đặc tính quan

trọng cần có của hệ vi khuẩn đƣờng ruột.

Nồng độ muối mật 0,3% đƣợc xem là nồng độ quan trọng để xác định

khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn probiotic LAB [27]. Hầu hết

các chủng đƣợc chúng tôi thử nghiệm đều duy trì khả năng sinh trƣởng tốt

trong môi trƣờng MRS có bổ sung muối mật 0,3%. So với đối chứng không

có muối mật, tỷ lệ sinh trƣởng của 9 chủng này dao động từ 90- 99%. Trong

đó chủng Lac.VFE-14 có khả năng sinh trƣởng tốt nhất với tỷ lệ 99%, gần

nhƣ không có sự khác biệt so với đối chứng. Tiếp theo là các chủng Lac.VFE-

04 và Lac.VFE-08 có tỷ lệ sống sót lần lƣợt là 97% và 95% (Bảng 3.3). Tuy

nhiên có một điều đáng lƣu ý là không phải chủng nào có khả năng sinh

trƣởng trong điều kiện có muối mật cũng có khả năng phân giải muối mật.

Chính vì thế cần phải tiếp tục tiến hành thử nghiệm phân giải muối mật để xác

định khả năng phân giải muối mật của của các chủng vi khuẩn Lactobacillus.

Bảng 3.3. Tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn sau 3 giờ ủ trong môi trƣờng có bổ sung muối mật

Tỷ lệ sống sót sau khi ủ với muối mật 0.3%

Chủng (%)

Lac. VFE 04 97

Lac. VFE 08 95

Lac. VFE 09 90

Lac.VFE 11 91

Lac. VFE 14 99

Lac. VFE 17 92

Lac. VFE 48 90,5

Lac. VFE 72 93

Lac. VFE 76 92,5

Kết quả trên cho thấy các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này có khả

năng chịu axit và muối mật tốt so với với các chủng vi khuẩn lactic trong một

số nghiên cứu trƣớc. Nghiên của Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2007) đã chỉ

ra rằng trong môi trƣờng pH 3 – 4, tỷ lệ sống của các chủng L. acidophilus và

L. casei là 41- 65% [70]. Trong điều kiện pH 2, tỷ lệ sống sót của 2 chủng vi

khuẩn lactic L. casei VTCC186 và D3– L. pentosus trong sản phẩm kefir

chanh dây là 39,36- 52,01%. Các chủng này cũng có khả năng sinh trƣởng

trên môi trƣờng có sự hiện diện của muối mật với nồng độ 0,3% [37]. Năm

2012, Hassanzadazar và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chịu axit của một số

chủng vi khuẩn lactobacilli phân lập từ phô mai Koozeh trong điều kiện pH 2

và 3. Họ đã quan sát thấy rằng khả năng sống của các chủng lactobacilli giảm

đáng kể sau khi đƣợc ủ ở pH 3 và ở pH 2 không có tế bào vi khuẩn nào sống

sót sau 1 giờ ủ [71]. Nhóm nghiên cứu của Deshpande cũng đã báo cáo kết

quả thử nghiệm khả năng chống chịu dịch dạ dày của L. casei tại pH 2, 3, và

4. Kết quả của họ cho thấy rằng các chủng L. casei này có khả năng sống sót

ở các mức pH thử nghiệm qua 90 phút [72].

Trong một số báo cáo trƣớc đây, ngƣời ta cho rằng Lactobacillus sp.

không thể sinh trƣởng khi nồng độ muối mật trong môi trƣờng cao hơn 0,3%

[73]. Nhƣng ở nghiên cứu của chúng tôi, khi ủ dƣới điều kiện kỵ khí, các

chủng thử nghiệm đều cho thấy khả năng tồn tại với sự có mặt của muối mật

ở nồng độ 0,7%. McAuliffe và cộng sự đã báo cáo rằng L. acidophilus NCFM

không thể sinh trƣởng ở cả môi trƣờng MRS lỏng và trên đĩa thạch khi bổ

sung vào môi trƣờng này muối mật ở nồng độ 0,3% và 0,5% [74]. Tƣơng tự

với kết quả nghiên cứu trên, Gu và cộng sự cũng quan sát thấy rằng chủng L.

plantarum CGMCC 8198 và L. casei 1.539 có khả năng sống sót thấp, lần

lƣợt là 48% và 8% khi trải qua 4 giờ nuôi cấy trong môi trƣờng MRS lỏng

đƣợc bổ sung 0,3% muối mật [21]. Một nghiên cứu khác của Shehata et al.

(2016) cho thấy trong môi trƣờng MRS có bổ sung 0,3% muối mật, tỷ lệ sống

sót của các chủng vi khuẩn lactic dao động trong khoảng 69,8- 85%, các

chủng này cũng có tỷ lệ sống sót từ 68- 88,3% sau 3 giờ ủ trong môi trƣờng

dịch dạ dày nhân tạo ở pH 2,0 [75]. Nhƣ vậy có thể thấy, so với những chủng

đã đƣợc nghiên cứu trƣớc đây, 3 chủng Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và

Lac.VFE-14 có khả năng chịu pH axit và muối mật vƣợt trội hơn hẳn.

3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA

CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS

3.4.1. Khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn

Lactobacillus trong môi trƣờng nuôi cấy

Sự tồn tại của vi sinh vật khi đi qua đƣờng tiêu hóa có tầm quan trọng

rất lớn trong việc duy trì lợi ích cho sức khỏe của probiotic [76]. Nhiều yếu tố

có thể ảnh hƣởng đến sự sống sót của vi khuẩn trong đƣờng tiêu hóa, bao gồm

pH của môi trƣờng, thời gian tiếp xúc với pH, sự hiện diện và nồng độ nhất

định của muối mật, vv. Trong môi trƣờng ruột non, sự hiện diện của muối mật

là yếu tố không mong muốn nhất cho sự tồn tại của các sinh vật probiotic

[77]. Do đó, vi khuẩn Lactobacillus có enzyme thuỷ phân muối mật đã đƣợc

tìm thấy có khả năng sống sót cao hơn trong đƣờng tiêu hóa. Hơn nữa, hoạt

động của BSH là một trong khả năng gián tiếp làm thế nào để giảm lƣợng

cholesterol trong cơ thể con ngƣời [40].

Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy trong số 9 chủng kiểm

tra bao gồm Lac.VFE 04, Lac. VFE 08, Lac. VFE 09, Lac. VFE 11, Lac. VFE

14, Lac. VFE 17, Lac. VFE 48, Lac. VFE 72 và Lac. VFE 76, có 3 chủng cho

thấy có khả năng phân giải muối mật SGDC. Khi quan sát trên đĩa thạch 3

chủng bao gồm Lac.VFE 04; Lac.VFE 08 và Lac.VFE 14 có xuất hiện vòng

tủa trắng xung quanh khuẩn lạc ở đĩa thạch MRS có bổ sung muối mật

SGDC. Trong khi đó ở đĩa thạch MRS không bổ sung muối mật và đĩa thạch

có bổ sung muối mật SGC không thấy xuất hiện vòng tủa trắng xung quanh

khuẩn lạc của cả 9 chủng nghiên cứu (Hình 3.7).

Hình 3.7. Khả năng phân giải muối mật của 9 chủng Lactobacillus

Các đĩa đƣợc ủ trong môi trƣờng kỵ khí trong 48 giờ tại 37 ºC. (a) MRS; (b)

MRS bổ sung 5 mM SGC (c) MRS bổ sung 5 mM SGDC; (1) Lac.VFE-04;

(2) Lac.VFE-08; (3) Lac.VFE-09; (4) Lac.VFE-11; (5) Lac.VFE-14.

Năm 2015, R.González Vázquez và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm về

khả năng tồn tại và thủy phân muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus

sp. dƣới các điều kiện áp lực trong đƣờng tiêu hóa. Kết quả cho thấy chủng vi

khuẩn L. casei J57 có khả năng sống sót trong đƣờng tiêu hóa và có hoạt tính

thủy phân các sản phẩm muối mật chính và thứ cấp. Khả năng phân giải các

loại muối mật glycocholate, taurocholate, glycodeoxycholate và

taurodeoxycholate của chủng vi khuẩn này lần lƣợt là 44,91; 671,72; 45,27 và

61,57 U/mg. Tuy nhiên chủng đối chứng là L. casei Shirota lại không có khả

năng phân giải muối mật liên hợp với glycine mà chỉ có khả năng phân giải

các muối mật tauroconjugates [78]. Trong một nghiên cứu sàng lọc vi khuẩn

lactic có hoạt tính làm giảm cholesterol, Dƣơng Nhật Linh và cộng sự đã tiến

hành kiểm tra hoạt tính enzyme BSH của các chủng vi khuẩn trong môi

trƣờng MRS bổ sung 0,5% muối natri taurocholate. Kết quả cho thấy có 32

chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme BSH tạo vòng kết tủa xung

quanh khuẩn lạc. 32 chủng cho hoạt tính chung dao động trong khoảng từ

0,032-0,092 U/mg và hoạt tính riêng dao động trong khoảng 0,748-5,061

U/mg. Trong đó có chủng vi khuẩn lactic VN2.2 có hoạt tính riêng cao nhất

đạt 5,061 U/mg [55].

Nghiên cứu của Ridlon et al. (2006), đã chứng minh đƣợc Lactobacillus

spp. có thể thực hiện các hoạt động BSH khác nhau khi có các loại muối mật

khác nhau. Cụ thể, muối mật hình thành từ glycine dễ dàng bị thủy phân hơn

muối mật hình thành từ taurine [40, 79]. Rani và cộng sự cũng đã tiến hành

kiểm tra khả năng phân giải của enzyme LgBSH từ vi khuẩn L. gasseri FR4

trên các loại muối mật GC, GDC, TC và TDC. Kết quả của họ chỉ ra rằng

hoạt tính của LgBSH là mạnh nhất trên cơ chất GDC (~18 µmol/min/mg),

LgBSH cũng cho thấy khả năng phân giải tốt hơn ở các muối mật glyco-

conjugated (GC và GDC) so với các muối mật tauro-conjugated (TC và TDC)

[80]. Một nghiên cứu khác từ Corzo và Gilliland (1999) cho thấy ba chủng L.

acidophilus thể hiện hoạt tính thủy phân cao hơn trên muối natri của

cholylglycine so với cholyltaurine [81]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 3

chủng Lactobacillus có khả năng phân giải đƣợc muối SGDC. Tuy nhiên

không có chủng vi khuẩn nào có khả năng phân giải đƣợc muối SGC.

3.4.2. Kết quả xác định sự có mặt của các gen bsh

Hoạt tính thủy phân muối mật của các vi khuẩn đƣờng ruột trong đó có

cả Lactobacillus là cơ chế giúp chúng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt

của ruột và cũng là một trong những con đƣờng gián tiếp làm giảm mức độ

cholesterol ở cơ thể ngƣời. Các enzyme BSH đƣợc mã hóa bởi các gen bsh

tƣơng ứng, đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi axit mật.

DNA tổng số đƣợc tách từ vi khuẩn Lactobacillus sau khi xác định

đƣợc nồng độ thông qua máy quang phổ nanodrop đƣợc tiến hành PCR với 4

loại mồi bsh khác nhau. Các mồi bsh 1, 2, 3, 4 đƣợc thiết kế dựa trên trình tự

tƣơng đồng của gen bsh trên các chủng Lactobacillus khác nhau. Sản phẩm

PCR thu đƣợc một băng đặc hiệu rõ nét, các băng có kích thƣớc từ 500 bp –

650 bp tƣơng ứng kích thƣớc tính toán lý thuyết. Từ đó có thể khẳng định

đƣợc sự có mặt của gen bsh ở các chủng vi khuẩn này.

Ở cả 3 chủng vi khuẩn Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14, cả 4

gen mã hóa cho enzyme thủy phân muối mật (bsh1, bsh2, bsh3, và bsh4) đều

đƣợc phát hiện.

Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR các gen bsh1, bsh2, bsh3 và bsh4 (lần lƣợt từ trái sang phải) của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14.

M: thang DNA chuẩn 1kb plus.

L. plantarum WCFS1 là loài đầu tiên đƣợc dự đoán trong genome

mang bốn gen bsh (bsh1, bsh2, bsh3 và bsh4). Để kiểm tra chức năng của các

gen này, Lambert và cộng sự đã sử dụng một loài thiếu hụt các gen này là

Lactococcus lactis, và biến nạp vào vi khuẩn từng loại trong bốn gen bsh biểu

hiện quá mức. Sau các thử nghiệm và phân tích, nhóm nghiên cứu đã kết luận

rằng chịu trách nhiệm phần lớn cho hoạt tính BSH của L. plantarum WCFS1

là gen bsh1. Ngoài ra, bsh1 cũng cho thấy sự liên quan đến khả năng hấp thụ

các loại muối mật riêng biệt [61]. Các enzyme BSH của L. plantarum

CGMCC 8198 cũng có vị trí xúc tác tƣơng tự nhƣ L. plantarum WCFS1,

nhƣng chúng chịu trách nhiệm thủy phân các cơ chất khác nhau. Trong khi

BSH4 của L. plantarum CGMCC 8198 có hoạt tính thủy phân mạnh với

TDCA thì BSH4 của L. plantarum WCFS1 lại ƣu tiên thủy phân cơ chất

GDCA [21].

Trong nghiên cứu kiểm tra sự có mặt của BSH trong bộ gen

Lactobacillus của 170 loài khác nhau, S. O’Flaherty và cộng sự đã thấy rằng

28% loài Lactobacillus mã hóa protein BSH, những loài này chủ yếu đƣợc

tìm thấy trong hệ tiêu hóa của động vật có xƣơng sống. Điều này chứng tỏ các

chủng Lactobacillus đã sản sinh enzyme BSH phân giải muối mật để thích

nghi đƣợc với điều kiện sống khắc nghiệt [51]. Nghiên cứu của Thibault

Allain và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm biểu hiện ba gen mã hóa cho

enzyme BSH có trong bộ gen của L. johnsonii La1 bao gồm bsh47, bsh56,

bsh12, phân tích mô hình cấu trúc các gen và thử nghiệm trên chuột nhiễm

Giadia. Kết quả cho thấy BSH đã phát huy tác dụng đáng kể trong việc chống

lại ký sinh trùng Giadia [52].

Nghiên cứu trên chủng L. fermentum MTCC 8711, S Jayashree và cộng

sự đã xác định đƣợc hai gen bsh1 và bsh2 của chủng này mã hóa cho các

protein tƣơng ứng là BSH1 và BSH2 với 26% trình tự axit amin giống nhau.

Khi biến nạp các gen này vào chủng L. fermentum bản địa cho kết quả hoạt

động của BSH đƣợc cải thiện rõ. [53].

3.5. KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TRƢỞNG TRÊN VI KHUẨN GÂY

BỆNH S. AUREUS

S. aureus là một trong những nhân tố chính gây nhiễm trùng ở ngƣời

cũng nhƣ động vật [82, 83]. Do sử dụng kháng sinh liều cao để tiêu diệt vi

khuẩn này có nguy cơ gây kháng kháng sinh, nên hiện nay probiotics đang

đƣợc sử dụng nhƣ một liệu pháp thay thế kháng sinh để chống lại vi khuẩn

này [30].

Lactobacillus đã đƣợc biết đến từ lâu với khả năng sinh chất kháng

khuẩn bao gồm H2O2, kháng sinh, các axit hữu cơ…. Trong nghiên cứu này,

dịch nuôi vi khuẩn đã loại bỏ tế bào của các chủng vi khuẩn Lac.VFE-04,

Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 đều thể hiện khả năng ức chế sinh trƣởng của

vi khuẩn S. aureus ATCC-23235, khả năng ức chế của mỗi chủng là khác

nhau đƣợc thể hiện trên Hình 3.9. Hoạt tính ức chế sự sinh trƣởng của S.

aureus của các chủng vi khuẩn này đƣợc xác định bằng cách đo đƣờng kính

vòng kháng khuẩn trên đĩa petri. Kích thƣớc vòng kháng khuẩn thu đƣợc

có đƣờng kính từ 11,7 ± 1,3 – 19,0 ± 1,0 mm. Trong đó chủng Lac.VFE-14

có đƣờng kính vòng kháng khuẩn lớn nhất là 19,0 ± 1,0 mm, tiếp theo là

các chủng Lac.VFE-08 với đƣờng kính là 14,0 ± 1,0 mm và Lac.VFE-04

là 11,7 ± 1,3 mm.

Hình 3.9. Khả năng ức chế sự sinh trƣởng với S. aureus của các chủng Lactobacillus

Trong nghiên cứu của Fornitano et al. (2019), L. rhamnosus đã thể hiện

khả năng ức chế sự sinh trƣởng của S. aureus cũng nhƣ làm giảm khả năng

sản xuất enzyme gây độc coagulase (giảm từ 20,45 – 22,73%) [84]. Đối với

probiotic L. rhamnosus HN001, sau 4 tuần thử nghiệm trên các đối tƣợng

binh sĩ dƣơng tính với nhiễm S. aureus, số lƣợng S. aureus giảm đến 73- 83%

so với nhóm dùng giả dƣợc [30]. Nghiên cứu của Misaghi et al. (2017) cho

thấy các vi khuẩn Lactobacillus gồm L. axitophilus, L. fermentum và L.

paracasei ức chế sự sản xuất các Staphylococcal enterotoxin bao gồm SEA,

SEC và SEE của vi khuẩn S. aureus [31].

Nhƣ vậy có thể thấy các chủng vi khuẩn Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và

Lac.VFE-14 trong nghiên cứu này có khả năng ức chế sự sinh trƣởng của S.

aureus, có tiềm năng trong tƣơng lai để hỗ trợ điều trị bệnh nhiễm trùng do S.

aureus.

3.6. ĐỊNH DANH VI KHUẨN

rRNA 16S là một đoạn gen đa bản sao, bao gồm các vùng bảo tồn và

biến đổi cao, là một phần của quá trình dịch mã do đó nó có mặt ở hầu hết các

vi khuẩn, nên nó thƣờng đƣợc sử dụng để nhận dạng loài và phân biệt loài

[85]. Hiện nay, phƣơng pháp định danh dựa theo sinh học phân tử dựa theo kỹ

thuật giải trình tự đoạn gen rARN 16S đang đƣợc sử dụng phổ biến.

3.6.1. Kết quả tách DNA tổng số

Những vi khuẩn đã xác định là Lactobacillus trong những thí nghiệm

trƣớc đƣợc tiến hành tách chiết DNA theo quy trình trong phần phƣơng pháp

nghiên cứu. Các mẫu DNA sau khi tách chiết đƣợc kiểm tra bằng cách điện di

trên gel agarose 1%.

Hình 3.10 cho thấy sự xuất hiện của 3 băng sáng và rõ nét do đó có thể

kết luận đa thu đƣợc DNA. Các mẫu DNA sau đó đƣợc tiến hành kiểm tra

nồng bằng máy quang phổ nanodrop với kết quả đƣợc trình bày trong Bảng

3.4.

Hình 3.10. Kết quả điện di các mẫu DNA của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14.

M: thang DNA chuẩn 1kb plus.

Độ tinh sạch (A260/A280) là một chỉ số để xác định mức độ tinh khiết,

không bị lẫn tạp chất của mẫu DNA. Do axit nucleic hấp thụ mạnh ánh sáng ở

bƣớc sóng 260 nm, khi có lẫn tạp chất chúng sẽ hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng

280 nm. Xác định đƣợc tỉ số A260/A280 đồng nghĩa với việc xác định đƣợc

lƣợng DNA trong mẫu có bị lẫn quá nhiều tạp chất hay không.

Bảng 3.4. Kết quả đo nồng độ DNA của các mẫu

Mẫu Nồng độ (ng/µl) A260/A280

Lac.VFE-04 1,89 541

Lac.VFE-08 1,81 495

Lac.VFE-14 1,88 571

Kết quả đo đã chỉ ra rằng, nồng độ DNA trung bình đạt đƣợc khoảng

500 ng/µL. Độ tinh sạch (A260/A280) đo đƣợc nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 đảm

bảo độ sạch cho phản ứng tiếp theo.

3.6.2. Kết quả PCR

Đoạn gen rRNA 16S đƣợc khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu

(16S-F và 16S-R) theo quy trình đã đƣợc nêu trong phần phƣơng pháp nghiên

cứu. Theo thiết kế, sản phẩm PCR thu đƣợc kích thƣớc là 1500 bp. Các sản

phẩm tạo thành từ PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di

đƣợc trình bày nhƣ Hình 3.11.

Hình 3.11. Kết quả sản phẩm PCR của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14.

Kết quả cho thấy sự xuất hiện của 3 băng sáng và rõ nét, so với marker

sử dụng trong hình, các băng của sản phẩm PCR đều có kích thƣớc khoảng

1500 basepair, phù hợp với kích thƣớc tính toán lý thuyết. Từ đó chúng tôi có

thể kết luận: đã khuếch đại thành công đoạn gen rRNA 16S.

3.6.3. Kết quả giải trình tự

Kết quả giải trình tự đƣợc xử lý với phần mềm BioEdit. Các trình tự

nucleotide hoàn chỉnh đƣợc so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI

bằng cách sử dụng công cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Sau khi phân tích và so sánh với các trình tự 16S đã đƣợc công bố trên

ngân hàng gen NCBI, cho thấy Lac.VFE-04 và Lac.VFE-14 có mức độ tƣơng

đồng cao (99-100%) so với chủng L. plantarum. Trong khi đó, Lac.VFE-08

có độ tƣơng đồng lên tới 98,65% so với L. rhamnosus NBRC 3425

(NR_113332.1). Từ đây xây dựng đƣợc cây phát sinh chủng loại đánh giá mối

quan hệ di truyền các chủng phân lập với một số chủng thuộc chi

Lactobacillus.

Bảng 3.5. Kết quả so sánh với các trình tự 16S đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen (NCBI) của Lac.VFE -04, Lac.VFE -08 và Lac.VFE -14

Query cover Identify

Tên chủng Mã số đăng ký trên NCBI Kí hiệu chủng phân lập (mức độ bao phủ) (Tƣơng đồng)

L. plantarum S7 GU195646.1 100% 99%

L. plantarum T3R1C1 JX193637.1 100% 99% Lac.VFE -04

L. plantarum ST-III CP002222.1 100% 99%

NR_113332.1 98% 98,65% L. rhamnosus NBRC 3425

NR_043408.1 97% 98,38% Lac.VFE -08 L. rhamnosus JCM 1136

NR_043408.1 97% 98,38% L. rhamnosus JCM 1136

L. plantarum ZZU 23 AB830324.1 100% 100%

L. plantarum C KM507561.1 100% 100%

Lac.VFE -14

KM670024.1 100% 100% L. plantarum KLB 416

Các chủng khảo sát dựa trên cây phát sinh chủng loại chia thành 2

nhóm rõ rệt. Trong đó, Nhóm 1 cho thấy chủng phân lập Lac.VFE-08 có mối

quan hệ di truyền gần nhất với chủng L. rhamnosus JCM 1136 và các chủng

thuộc chi Lactobacillus nhƣ L. paracasei, L. casei, L. zeae (Hình 3.12).

Nhóm 2, các chủng phân lập Lac.VFE-04, Lac.VFE-14 thể hiện mối quan hệ

di truyền cao nhất với các chủng thuộc loài L. plantarum.

Nhóm 2

Nhóm 1

Hình 3.12. Quan hệ phát sinh chủng loại trình tự gene 16S các chủng phân lập Lac. VFE-04, Lac. VFE-08, Lac. VFE-14 phân tích bằng phần mềm MEGA7 Neighbor-Joining Tree.

Dựa trên kết quả cây phát sinh loài, 2 dòng Lac.VFE -04 và Lac.VFE -

14 có quan hệ gần với L. plantarum và Lac.VFE -08 là L. rhamnosus.

L. plantarum là vi khuẩn Gram dƣơng, dạng que ngắn, vi hiếu khí,

dung nạp axit, không hình thành bào tử, hàm lƣợng G + C thấp. Theo Tang và

cộng sự, chủng L. plantarum MA2 có thể chịu đƣợc H2O2 lên tới 2 mM và

quá trình lên men của nó có khả năng khử mạnh, ức chế peroxit hóa lipid

[86]. Gần đây, chủng L. plantarum đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm bởi

tính ứng dụng rộng rãi của chúng trong y tế, với các đặc tính chống oxy hóa,

chống ung thƣ, chống viêm, chống nhiễm trùng, chống béo phì và chống đái

tháo đƣờng [87].

L. rhamnosus là một loại vi khuẩn Gram dƣơng hình que, kỵ khí, có thể

sống ở các bộ phận khác nhau trên cơ thể con ngƣời, bao gồm cả đƣờng tiêu

hóa. L. rhamnosus một trong những chủng vi khuẩn probiotic đƣợc sử dụng

rộng rãi nhất với các tác dụng có lợi đã đƣợc ghi nhận bao gồm phòng ngừa

và điều trị nhiễm trùng dạ dày và tiêu chảy, kích thích phản ứng miễn dịch

của cơ thể và ngăn ngừa một số triệu chứng dị ứng [88].

Nhƣ vậy, các chủng mà chúng tôi tuyển chọn đƣợc có tiềm năng sử

dụng làm probitic và ứng dụng trong y học.

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Chúng tôi đã phân lập đƣợc 115 chủng vi khuẩn từ các mẫu phân.

3 chủng vi khuẩn Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 phân giải

đƣợc muối mật SGDC nhƣng không phân giải đƣợc muối mật SGC, STC và

STDC.

3 chủng này mang cả 4 gene bsh 1, bsh 2, bsh 3 và bsh 4.

Lac.VFE-14 thể hiện khả năng sinh H2O2 mạnh hơn so với Lac.VFE-04,

Lac.VFE-08. Chúng có khả năng sống sót cao trong môi trƣờng có muối mật

0,3% và ở pH 2-3.

3 chủng Lac.VFE-14, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-04 có khả năng ức chế

sự sinh trƣởng của vi khuẩn S. aureus ATCC-23235.

Lac.VFE-08 có độ tƣơng đồng cao nhất là 98,65 % so với L. rhamnosus

NBRC 3425. Trong khi đó, Lac.VFE-04 và Lac.VFE-14 có mức độ tƣơng

đồng cao nhất với L. plantarum S7 (99%) và L. plantarum ZZU 23 (100%).

4.2. KIẾN NGHỊ

Kết quả nghiên cứu trên nhằm bổ sung nguồn dữ liệu cho các nghiên

cứu về vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng phân giải muối mật ở Việt

Nam, là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra các chủng

Lactobacillus có tiềm năng trở thành các chủng probiotic ứng dụng trong y

học. Từ các chủng vi khuẩn Lactobacillus đã tuyển chọn đƣợc ở trên, để chắc

chắn chúng có đầy đủ khả năng để trở thành các chủng probiotic thích hợp

cho con ngƣời sử dụng cần phải tiến hành thêm thí nghiệm khác.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Clarke S.F., Murphy E.F., Nilaweera K., Ross P.R., Shanahan F., O’Toole P.W., Cotter P.D., 2012, The gut microbiota and its relationship to diet and obesity: new insights, Gut microbes, 3(3), pp.186-202.

Association between index mass body

2. Koliada A., Syzenko G., Moseiko V., Budovska L., Puchkov K., Perederiy V., Gavalko Y., Dorofeyev A., Romanenko M., Tkach S., 2017, and Firmicutes/Bacteroidetes ratio in an adult Ukrainian population, Vol. 17, pp. 120

3. Krajmalnik-Brown R., Ilhan Z.E., Kang D.W., DiBaise J.K. 2012, Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation, Nutrition in Clinical Practice, 27(2), pp. 201-214.

4. Fitzpatrick L.R., 2013, Probiotics for the treatment of Clostridium journal of gastrointestinal

difficile associated disease, World pathophysiology, 4(3), pp. 47.

5. Denev S. 2006, Role of Lactobacilli Gastrointestinal Ecosystem,

Bulgarian Journal of Agricultural Science, 12(1) pp 63.

6. Kumar R., Grover S., Batish V.K. 2011, Hypocholesterolaemic effect of dietary inclusion of two putative probiotic bile salt hydrolase- producing Lactobacillus plantarum strains in Sprague–Dawley rats, British Journal of Nutrition, 105(4), pp. 561-573.

gastrin-mediated production inhibits acid

7. Yuji A., Yasuhiro N., Yasuhiro K., Kenji T., Yasuhiko K., 2015, A highly acid-resistant novel strain of Lactobacillus johnsonii No. 1088 has antibacterial activity, including that against Helicobacter pylori, in mice, and Microbiologyopen, 4(3), pp. 465–474.

8. Jeun J., Kim S., Cho S.Y., Jun H.J., Park H.J., Seo J.G., Chung M.J., Lee S.J., 2010, Hypocholesterolemic effects of Lactobacillus

plantarum KCTC3928 by increased bile acid excretion in C57BL/6 mice, Nutrition, 26(3), pp. 321-330.

9. Makarova K., Slesarev A., Wolf Y., Sorokin A., Mirkin B., Koonin E., 2006, Comparative genomics of the lactic acid bacteria, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(42), pp. 15611–15616.

10. Tannock G.W., 2004, A special fondness for lactobacilli, Applied and

environmental microbiology, 70(6), pp. 3189-3194.

11. Lebeer S., Vanderleyden J., De Keersmaecker S.C., 2008, Genes and molecules of lactobacilli supporting probiotic action, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 72(4), pp. 728-764.

12. Goktepe I., Juneja V.K., Ahmedna M., 2005, Probiotics in food safety

and human health, CRC Press.

13. Mukhtar H., 2006, Biosynthesis of protease from Lactobacillus

paracasei: kinetic analysis of fermentation parameters.

14. Fekadu Mersha D., Pandita A Biotechnology Effect of Protease

Enzyme Produced From Lactobacillus Species on the Milk.

15. Vonk R.J., Reckman G.A., Harmsen H.J., Priebe M.G., 2012,

Probiotics and lactose intolerance, Intech, 7, pp. 149-160.

16. Narayanan N., Roychoudhury P.K., Srivastava A., 2004, L (+) lactic acid fermentation and its product polymerization, Electronic journal of Biotechnology, 7(2), pp. 167-178.

17. Wang J., Zhang H., Chen X., Chen Y., Bao Q., 2012, Selection of potential probiotic lactobacilli for cholesterol-lowering properties and their effect on cholesterol metabolism in rats fed a high-lipid diet, Journal of dairy science, 95(4), pp. 1645-1654.

18. Tomaro-Duchesneau C., Jones M.L., Shah D., Jain P., Saha S., Prakash S., 2014, Cholesterol assimilation by Lactobacillus probiotic bacteria: an in vitro investigation, BioMed research international 2014.

19. Choi E.A., Chang H.C., 2015, Cholesterol-lowering effects of a putative probiotic strain Lactobacillus plantarum EM isolated from kimchi, LWT-Food Science and Technology, 62(1), pp. 210-217.

20. Kim Y., Yoon S., Lee S.B., Han H.W., Oh H., Lee W.J., Lee S.M., 2014, Fermentation of soy milk via Lactobacillus plantarum improves dysregulated lipid metabolism in rats on a high cholesterol diet, PloS one, 9(2) pp. 88231.

21. Gu X.C., Luo X.G., Wang C.X., Ma D.., Wang Y., He Y.Y., Li W., Zhou H., Zhang T.C., 2014, Cloning and analysis of bile salt hydrolase genes from Lactobacillus plantarum CGMCC No. 8198, Biotechnology letters, 36(5), pp. 975-983.

22. Dong Z., Zhang J., Lee B., Li H., Du G., Chen J., 2012 A bile salt hydrolase gene of Lactobacillus plantarum BBE7 with high activity, European Food Research and cholesterol-removing Technology, 235(3), pp. 419-427.

23. Takemura N., Okubo T., Sonoyama K., 2010, Lactobacillus plantarum strain No. 14 reduces adipocyte size in mice fed high-fat diet, Experimental biology and medicine, 235(7), pp. 849-856.

24. Hertzberger R., Arents J., Dekker H.L., Pridmore R.D., Gysler C., Kleerebezem M., de Mattos M.J.T., 2014, H2O2 production in species of the Lactobacillus acidophilus group: a central role for a novel NADH-dependent flavin reductase, Appl. Environ. Microbiol, 80(7), pp. 2229-2239.

25. Edith L., Joseph L., Diane E. H., 2011, Glutathione peroxidase-1 in to therapeutic

health and disease: from molecular mechanisms opportunities, Antioxidants & redox signaling, 15(7), pp. 1957-1997.

26. M.K. Boateng, S.L. Price, K.D., Huddersman, Susannah E. W., 2011, Antimicrobial activities of hydrogen peroxide and its activation by a

novel heterogeneous Fenton’s‐like modified PAN catalyst, Journal of applied microbiology, 111(6), pp. 1533-1543.

27. Belicová A., Mikulášová M., Dušinský R., 2013, Probiotic potential and safety properties of Lactobacillus plantarum from Slovak Bryndza cheese, BioMed research international 2013.

28. Kang D.K., Oh H., Ham J.S., Kim J., Yoon C., Ahn Y., Kim H. 2005, Identification and characterization of hydrogen peroxide-generating Lactobacillus fermentum CS12-1, Asian-australasian journal of animal sciences, 18(1), pp. 90-95.

29. Zsolt Z., Edina N., Ágnes B., Anna H., 2005, Influence of growth medium on hydrogen peroxide and bacteriocin production of Lactobacillus strains, Food Technology and Biotechnology, 43(3), pp. 219-225.

30. Eggers S., Barker A.K., Valentine S., Hess T., Duster M., Safdar N., 2018, Effect of Lactobacillus rhamnosus HN001 on carriage of Staphylococcus aureus: results of the impact of probiotics for reducing infections in veterans (IMPROVE) study, BMC infectious diseases, 18(1), pp 129.

inhibitory effects of Lactobacillus

31. Misaghi A., Parsaeimehr M., Akhondzadeh A., Gandomi H., Azizkhani fermentum, M., 2017, The Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus paracasei isolated from yoghurt on the growth and enterotoxin A gene expression of S. aureus, Iranian Journal of Veterinary Medicine, 11(2), pp. 191-201.

32. Chi C. C., Chih C. L., Hui L. H., Wen Y. H., Han S. T., Tzu C. W., Yin C. C., Ying C. L., Hung J. T., 2019, Antimicrobial activity of Lactobacillus species against carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, Frontiers in microbiology, 10, 789.

33. Lê Văn An, Nguyễn Thị Lộc, Nguyễn Minh Hƣơng, 2017, Nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic (Bacillus subtilis và Lactobacillus plantarum) trong khẩu phần thức ăn nuôi lợn giai đoạn sau cai sữa và nuôi thịt, Tạp chí khoa học và công nghệ nông nghiệp, 1(2), tr. 209- 216.

34. Hồ Thị Bích Ngọc, Lê Minh Châu, Cù Thị Thúy Nga, 2019, Đánh giá ảnh hƣởng của men tuaf-saccha bổ sung trong khẩu phần đến năng suất và chất lƣợng trứng của gà đẻ, Tạp chí Khoa học và công nghệ Đại học Thái Nguyên 197(04), tr. 197-203.

35. Huỳnh Ngọc Thanh Tâm, Lƣu Huỳnh Mộng Trinh, Nguyễn Quang Lộc, Nguyễn Đức Độ, 2018, Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn thuộc loài Lactobacillus sp. có khả năng kháng khuẩn từ tôm sú (Penaeus monodon) ở tỉnh Bạc Liêu và Cà Mau, Tạp chí Khoa học và công nghệ nông nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm Huế, 2(1), tr. 535- 546.

36. Nguyễn Thị Thu Nga, 2011, Nghiên cứu quá trình tạo sản phẩm

probiotic nƣớc trái cây từ vi khuẩn Lactobacillus. Thesis.

37. Quách Đức Tính, Tống Thành Trung, Nguyễn Ngọc Duy, Nguyễn Thúy Hƣơng, 2013, Khảo sát một số hoạt tính probiotic của Kefir chanh dây truyền thống và Kefir chanh dây bổ sung Lactobacillus casei VTCC186, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 16(3T), tr. 40- 47.

38. Đoàn Anh Dũng, Nguyễn Công Hà, Lý Nguyễn Bình, Lê Nguyễn Đoan Duy, 2015, Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn probiotic Lactobacillus plantarum trong chế biến sữa chua, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 36, tr. 14-20.

39. Nguyễn Thế Trang, Trần Đình Mấn, Phạm Thanh Hà, Ảnh hƣởng của chế phẩm vi khuẩn lactic lên sự thay đổi hàm lƣợng axit amin của cá tạp sau thời gian bảo quản và ứng dụng cho nuôi trồng thủy sản, Tạp chí Khoa học và Công Nghệ, 49(1), tr. 111-118.

40. Begley M., Hill C., Gahan C.G., 2006, Bile salt hydrolase activity in

probiotics, Appl. Environ. Microbiol, 72(3), pp. 1729-1738.

41. Li T., Apte U., 2015, Chapter Nine-Bile Acid Metabolism and Signaling in Cholestasis, Inflammation, and Cancer, Advances in pharmacology, 74, pp. 263-302.

42. Ridlon J.M., Kang D.J., Hylemon P.B., Bajaj J.S., 2014 Bile acids and the gut microbiome, Current opinion in gastroenterology, 30(3), pp. 332.

43. Nie Y.F., Hu J., Yan X.H., 2015, Cross-talk between bile acids and intestinal microbiota in host metabolism and health, Journal of Zhejiang University. Science. B, 16(6), pp. 436.

44. Power E.M., 1995, Efficacy of the Ryu Nonstaining KOH techniquefor rapidly determining gram reactions of Food-borne and water borne bacteria and yeasts, Appl. Environ. Microbiol, 61(10), pp. 3728-3756.

45. Kumar R., Grover S., Batish V.K., 2012, Bile salt hydrolase (Bsh) activity screening of Lactobacilli: in vitro selection of indigenous Lactobacillus strains with potential bile salt hydrolysing and cholesterol-lowering ability, Probiotics and antimicrobial proteins, 4(3), pp. 162-172.

46. Ley R.E., Turnbaugh P.J., Klein S., Gordon J.I., 2006, Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity, Nature, 444(7122), pp. 1022.

47. Goodman B., Gardner H., 2018, The microbiome and cancer, The

Journal of pathology, 244(5), pp. 667-676.

48. Ahmadmehrabi S., Tang W.W., 2017, Gut microbiome and its role in cardiovascular diseases, Current opinion in cardiology, 32(6), pp. 761.

49. Andrew B. S., John Y. K., Vincent B. Y., 2015, The gut microbiome in health and in disease, Current Opinion in Gastroenterology, 31(1), pp. 69-75.

50. Brandvold K.R., Weaver J.M., Whidbey C., Wright A.T., 2019, A continuous fluorescence assay for simple quantification of bile salt hydrolase activity in the gut microbiome, Scientific reports, 9(1), pp. 1-7.

51. Sarah O.F., Alexandra B. C., Casey M. T., Rodolphe B., 2018, The Lactobacillus Bile Salt Hydrolase Repertoire Reveals Niche-Specific Adaptation, mSphere, 3(3).

52. Thibault A., Soraya C., Myriam T., Isabelle V., André G. B., Philippe L., Philippe G., Bruno P., Luis G. B. H., Isabelle F., 2018, Bile-Salt- Hydrolases from the Probiotic Strain Lactobacillus johnsonii La1 Mediate Anti-giardial Activity in Vitro and in Vivo, Front. Microbiol.

53. Jayashree S., Pooja S., Pushpanathan M., Rajendhran J., Gunasekaran P., 2014, Identification and characterization of bile salt hydrolase genes from the genome of Lactobacillus fermentum MTCC 8711, Applied biochemistry and biotechnology, 174(2), pp. 855-866.

54. Tsai C.C., Lin P.P., Hsieh Y.M., Zhang Z.Y., Wu H.C., Huang C.C., 2014, Cholesterol-lowering potentials of lactic acid bacteria based on bile-salt hydrolase activity and effect of potent strains on cholesterol metabolism in vitro and in vivo, The Scientific World Journal 2014.

55. Dƣơng Nhật Linh, Lê Thị Anh Thiện, Phạm Trần Phƣơng Dung, Phạm ThịMinh Trang, Nguyễn Văn Minh, Trần Cát Đông, 2014, Sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm cholesterol, Tạp chí sinh học, 36(1), tr. 47-53.

56. Nguyễn Thị Diễm Hƣơng, Đỗ Thị Bích Thủy, 2012, Xác định và khảo sát một số tính chất có lợi của chủng Lactobacillus fermentum DC1 phân lập từ sản phẩm dƣa cải Huế, Tạp chí khoa học Đại học Huế, 71(2).

57. Martin, Suarez, 2009, Biosynthesis and Degradation of H2O2 by Vaginal Lactobacilli, Environmental microbiology, 76(2), pp. 400-405.

58. Kılıç G.B., Karahan A.G., 2010, Identification of Lactic Acid Bacteria Isolated from the Fecal Samples of Healthy Humans and Patients with Dyspepsia, and Determination of Their pH, Bile, and Antibiotic Tolerance Properties, J Mol Microbiol Biotechnol, 18, pp. 220–229.

59. Young T. A., Geun B. K., Kwang S. L., Young J. B., Hyun U. K., 2003, Deconjugation of bile salts by Lactobacillus acidophilus isolates, International Dairy Journal, 13, pp. 303-311.

60. Lambert J.M., Bongers R.S., de Vos W.M., Kleerebezem M., 2008, Functional analysis of four bile salt hydrolase and penicillin acylase family members in Lactobacillus plantarum WCFS1, Appl. Environ. Microbiol, 74(15), pp. 4719-4726.

61. Dhiraj K. N., Reeti C., Dinesh K., 2018, Molecular Approaches for Identification of Lactobacilli from Traditional Dairy Products, Advances in Animal Biotechnology and its Applications, pp. 181-196, Springer.

62. H.M. Lee, Y. Lee, 2008, A differential medium for lactic acid- producing bacteria in a mixed culture, Lett Appl Microbiol, 46(6), pp. 676-681.

63. Lê Ngọc Thùy Trang, Phạm Minh Nhựt, 2014, Phân lập và khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sản sinh hợp chất kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum, Tạp chí sinh học, 36, tr. 97-106

64. Gu R.X., Yang Z.Q., Li Z.H., Chen S.L., Luo Z.L., 2008, Probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from stool samples of longevous people in regions of Hotan, Xinjiang and Bama, Guangxi, China, Anaerobe, 14(6), pp. 313-317.

65. Abolfazl D., Mohammad M. S.D., Abbas R. F., Masoumeh D., Farzaneh A. H., 2015, Antibacterial activity of Lactobacillus spp. isolated from the feces of healthy infants against enteropathogenic bacteria, Anaerobe, 34, pp. 53-58.

66. Xianyu Y, Zhu K, Chen W, Wang X, Zhao H, Sun J, Wang Z, Jiang X, 2013, Enzymatic assay for Cu (II) with horseradish peroxidase and its application in colorimetric logic gate, Analytical chemistry, 85(15), pp. 7029-7032.

67. Enitan A., Adeyemo J., Ogunbanwo S., 2011, Influence of growth conditions and nutritional requirements on the production of hydrogen peroxide by lactic acid bacteria, Afr J Microbiol Res, 5(15), pp. 2059- 2066.

68. Derrien M., van Hylckama Vlieg J.E., 2015, Fate, activity, and impact of ingested bacteria within the human gut microbiota, Trends in microbiology, 23(6), pp. 354-366.

69. Urdaneta V., Casadesús J., 2017, Interactions between bacteria and bile salts in the gastrointestinal and hepatobiliary tracts, Frontiers in medicine, 4, pp. 163.

70. Nguyễn Văn Thanh, Trần Thu Hoa, Nguyễn Vũ Tƣờng Vy, 2007, Khảo sát khả năng chịu đựng acid, muối mật và kháng sinh của một số vi sinh vật là nguyên liệu sản xuất probiotic dùng đƣờng uống, Dược học, 10, pp. 32-35.

71. Hassanzadazar H., Ehsani A., Mardani K., Hesari J., 2012, Investigation of antibacterial, acid and bile tolerance properties of lactobacilli isolated from Koozeh cheese, Faculty of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia, Iran, 3, pp. 181.

72. Deshpande K., Dolas C., Chavan N., 2014, Investigation of tolerance of the presence of acids, bile salts and International Journal of Current

Lactobacillus casei deconjugation of bile salts, Microbiology and Applied Sciences, 7, pp. 600-612.

73. Zheng Y., Lu Y., Wang J., Yang L., Pan C., Huang Y., 2013, Probiotic properties of Lactobacillus strains isolated from Tibetan kefir grains, PloS one, 8(7).

74. McAuliffe O., Cano R.J., Klaenhammer T.R., 2005, Genetic analysis of two bile salt hydrolase activities in Lactobacillus acidophilus NCFM, Appl. Environ. Microbiol, 71(8), pp. 4925-4929.

75. Shehata M., El Sohaimy S., El-Sahn M.A., Youssef M., 2016, Screening of isolated potential probiotic lactic acid bacteria for

cholesterol lowering property and bile salt hydrolase activity, Annals of Agricultural Sciences, 61(1), pp. 65-75.

76. Elli M., Callegari M.L., Ferrari S., Bessi E., Cattivelli D., Soldi S., Morelli L., Feuillerat N.G., Antoine J.M., 2006, Survival of yogurt bacteria in the human gut, Appl. Environ. Microbiol, 72(7), pp. 5113- 5117.

77. Bezkorovainy A., 2001, Probiotics: determinants of survival and growth in the gut, The American journal of clinical nutrition, 73(2), pp. 399s-405s.

78. González-Vázquez R., Azaola-Espinosa A., Mayorga-Reyes L., Reyes- Nava L., Shah N., Rivera-Espinoza Y., 2015, Isolation, identification and partial characterization of a Lactobacillus casei strain with bile salt hydrolase activity from pulque, Probiotics and antimicrobial proteins 7(4), pp. 242-248.

79. Suvarna V., Boby V., 2005, Probiotics in human health: A current

assessment, Current science, 88(11), pp. 1744-1748.

80. Rani R.P., Anandharaj M., Ravindran A.D., 2017, Characterization of bile salt hydrolase from Lactobacillus gasseri FR4 and demonstration of its substrate specificity and inhibitory mechanism using molecular docking analysis, Frontiers in microbiology, 8, pp. 1004.

81. Corzo G., Gilliland S., 1999, Bile salt hydrolase activity of three strains of Lactobacillus acidophilus, Journal of Dairy Science, 82(3), pp. 472- 480.

82. Johansson M.A., Björkander S., Mata Forsberg M., Qazi K.R., Salvany Celades M., Bittmann J., Eberl M., Sverremark-Ekström E., 2016, Probiotic lactobacilli modulate Staphylococcus aureus -induced activation of conventional and unconventional T cells and NK cells, Frontiers in immunology, 7, pp. 273.

83. Ren D., Gong S., Shu J., Zhu J., Rong F., Zhang Z., Wang D., Gao L., Qu T., Liu H., 2017, Mixed Lactobacillus plantarum strains inhibit

Staphylococcus aureus induced inflammation and ameliorate intestinal microflora in mice, BioMed research international 2017.

84. Fornitano A.L.P., Amêndola I., Santos S.S.F., Silva C.R.G., Leão M.V.P., 2019, Lactobacillus rhamnosus versus Staphylococcus aureus: influence on growth and expression of virulence factors, Journal of Dental Science, Oral and Maxillofacial Research, 2(2), pp. 29-33.

85. Větrovský T., Baldrian P., 2013, The variability of the 16S rRNA gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community analyses, PloS one, 8(2).

86. Tang W., Xing Z., Li C., Wang J., Y W., 2017, Molecular mechanisms and in vitro antioxidant effects of Lactobacillus plantarum MA2, Food Chem, 221, pp. 1642-1649.

87. Mariadhas Valan Arasu, Naif Abdullah Al-Dhabi, Soundharrajan Ilavenil, Ki Choon Choi, Srisesharam Srigopalram, 2016, In vitro importance of probiotic Lactobacillus plantarum related to medical field, Saudi J Biol Sci, 23(1), pp. S6–S10.

88. Marijke E. S., Sarah L., 2014, Towards a better understanding of Lactobacillus rhamnosus GG - host interactions, Microb Cell Fact, 13.

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1, Hà Thị Thu, Hoàng Thế Hƣng, Trần Xuân Thạch, Nguyễn Thị Hoa, Lã Thị Lan Anh, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Đình Duy, Đồng Văn Quyền, Nguyễn Thị Tuyết Nhung. Khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ vi khuẩn đƣờng ruột của ngƣời khỏe mạnh. Tạp chí sinh học, 42(1): 83–92, 2020.

2, Trần Xuân Thạch, Hà Thị Thu, Vũ Thị Hiền, Hoàng Thế Hƣng, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Thu Hồng, Lƣu Đàm Ngọc Anh, Bùi Văn Hƣớng, Lã Thị Lan Anh, Đồng Văn Quyền, Nguyễn Thị Tuyết Nhung. Khả năng đồng phân hóa linoleic acid của các chủng Lactobacillus phân lập từ hệ vi khuẩn đƣờng ruột ở ngƣời. Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 161-168, 2020.

TAP CHI SINH HOC 2020, 42(1): 83–92 DOI: 10.15625/0866-7160/v42n1.14508

H2O2 PRODUCTION IN Lactobacillus STRAINS ISOLATED FROM THE INTESTINAL MICROBIOME OF HEALTHY PEOPLE Ha Thi Thu1, Hoang The Hung2, Tran Xuan Thach1, Nguyen Thi Hoa1, La Thi Lan Anh3, Vu Thi Hien1, Nguyen Dinh Duy1, Dong Van Quyen1, Nguyen Thi Tuyet Nhung1,* 1 Molecular Microbiology Department - Institute of Biotechnology (IBT) - Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) 2 Research Institute of Military Logistics Science-Military Academy of Logistics 3 Graduate University of Science and Technology - VAST

Received 20 October 2019, accepted 6 January 2020 Ha Thi Thu1, Hoang The Hung2, Tran Xuan Thach1, Nguyen Thi Hoa1, La Thi Lan Anh3, Vu Thi Hien1, Nguyen Dinh Duy1, Dong Van Quyen1, Nguyen Thi Tuyet Nhung1H2O2 production in lactobacillus strains isolated from the intestinal microbiome of healthy people.

ABSTRACT

Lactobacillus sp. in the digestive tract are capable of producing H2O2 to inhibit the growth of harmful bacteria and balance the gut microflora. In this study, we have isolated 115 strains of Lactobacillus spp. from stool samples of healthy people in Ha Noi. Of the 50 tested Lactobacillus strains, 9 strains were capable of producing H2O2, of which the Lac.VFE-14 strain produced highly H2O2 with a concentration of 2.183 mM, followed by Lac.VFE-08 strains (2.081 mM) and Lac.VFE-04 (2.067 mM). All three strains grew well in MRS medium supplemented with bile salts or adjusted to low pH value. With 0.3% of bile salt, the survival rates of these 3 strains were 99%, 95% and 97%, respectively. At pH 3.0, after 3 hours of cultivation, the survival rates of the three strains were 98.54%, 94.15% and 95.27%, respectively. In addition, each of the cell-free culture supernatants of these three strains that inhibit the growth of S. aureus ATCC-23235. The inhibition zone diameters of the three strains were 19.0±1.0 mm, 14.0±1.0 mm and 11.7±1.3 mm, respectively. The results of 16S rRNA gene analyses showed that Lac.VFE-14, Lac.VFE-08 and Lac.VFE-04 had high similarity scores with L. plantarum ZZU 23 (100%), L. rhamnosus JCM 1136 (99%) and L. plantarum S7 (98.65%), respectively. This study indicates that all three strains have the potential to be used as probiotics in the future.

Keywords: Lactobacillus, Staphylococcus aureus, H2O2, bile salt, antimicrobial activity.

Citation: Ha Thi Thu, Hoang The Hung, Tran Xuan Thach, Nguyen Thi Hoa, La Thi Lan Anh, Vu Thi Hien, Nguyen Dinh Duy, Dong Van Quyen, Nguyen Thi Tuyet Nhung, 2020. H2O2 production in Lactobacillus strains isolated from

TAP CHI SINH HOC 2020, 42(1): 83–92 DOI: 10.15625/0866-7160/v42n1.14508

the intestinal microbiome of healthy people. Tap chi Sinh hoc, 42(1): 83–92. https://doi.org/10.15625/0866- 7160/v42n1.14508.

*Corresponding author email: nttnhung@ibt.ac.vn

KHẢ NĂNG SINH H2O2 CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Lactobacillus PHÂN LẬP TỪ HỆ VI KHUẨN ĐƢỜNG RUỘT CỦA NGƢỜI KHỎE MẠNH Hà Thị Thu1, Hoàng Thế Hƣng2, Trần Xuân Thạch1, Nguyễn Thị Hoa1, Lã Thị Lan Anh3, Vũ Thị Hiền1, Nguyễn Đình Duy1, Đồng Văn Quyền1, Nguyễn Thị Tuyết Nhung1,* 1Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2Viện Nghiên cứu Khoa học Hậu cần Quân sự, Học viện Hậu cần 3Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Ngày nhận bài 20-10-2019, ngày chấp nhận 6-1-2020

TÓM TẮT

Vi khuẩn Lactobacillus sp. trong đường tiêu hóa, có khả năng sinh H2O2 ức chế sự sinh trưởng vi khuẩn gây hại và làm cân bằng hệ vi khuẩn có ích. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập được 115 chủng vi khuẩn Lactobacillus từ mẫu phân của người khỏe mạnh tại Hà Nội. Trong số 50 chủng Lactobacillus được kiểm tra, có 9 chủng có khả năng sinh H2O2, trong đó chủng Lac.VFE-14 sinh H2O2 mạnh nhất với nồng độ thu được là 2,183 mM, tiếp theo là các chủng Lac.VFE-08 (2,081 mM) và Lac.VFE-04 (2,067 mM). Ba chủng này đều sinh trưởng tốt trong môi trường MRS có bổ sung muối mật hay môi trường có độ pH thấp. Với 0,3% muối mật, tỷ lệ tế bào sống sót của 3 chủng nêu trên tương ứng là 99%, 95% và 97%. Ở pH 3, sau 3 giờ nuôi cấy, tỷ lệ tế bào sống sót của 3 chủng tương ứng là 98,54%, 94,15% và 95,27%. Bên cạnh đó, dịch nuôi đã loại bỏ tế bào của 3 chủng này có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC-23235. Hoạt tính ức chế thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn của 3 chủng tương ứng là 19,0±1,0 mm; 14,0±1,0 mm và 11,7±1,3 mm. So sánh trình tự 16S của 3 chủng với các trình tự đã được công bố trên ngân hàng gen cho thấy 3 chủng này có sự tương đồng cao lần lượt với L. plantarum ZZU 23; L. rhamnosus JCM 1136 và L. plantarum S7. Kết quả thu được cho thấy cả 3 chủng này đều có tiềm năng sử dụng làm probiotic trong tương lai.

Từ khóa: Lactobacillus, Staphylococcus aureus, H2O2, muối mật, kháng khuẩn.

*Địa chỉ liên hệ email: nttnhung@ibt.ac.vn

MỞ ĐẦU

chủ, điều chỉnh phản ứng miễn dịch và chống lại hoạt động của các vi sinh vật gây bệnh (Markowiak, 2017). Các chủng Lactobacillus spp. có khả năng ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh do sự cạnh tranh chất dinh dưỡng, khả năng sản sinh axit làm giảm pH

Lactobacillus là một trong những vi khuẩn probiotic được sử dụng phổ biến, đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người. Sử dụng probiotic Lactobacillus làm cân bằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa trong cơ thể vật

H2O2 production in Lactobacillus strains isolated

môi trường, tạo biofilm và các chất kháng khuẩn trong đó có H2O2 (Bermudez et al., 2012).

Kết quả thu được sẽ bổ sung nguồn dữ liệu cho các nghiên cứu về khả năng sinh H2O2 cũng như các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus sp được phân lập ở Việt Nam.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguồn mẫu phân lập

Các mẫu phân từ từ những người khỏe mạnh tình nguyện tham gia nghiên cứu sống ở khu vực Hà Nội tự thu thập và để trong hộp vô trùng. Mẫu sau đó được giữ lạnh ở 4oC và chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để phân tích.

Phân lập vi khuẩn Lactobacillus

lập

các

Quá

trình

phân

H2O2 là một một chất oxi hóa mạnh, có khả năng dễ dàng chuyển đổi thành gốc hydroxyl, đây là một chất oxi hóa mạnh có tác dụng gây độc cho tế bào, ức chế sự sinh trưởng của nhiều loài vi khuẩn như Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus (Boateng et al., 2011). Một số thành viên trong nhóm vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sản sinh H2O2 như: L. johnsonii, L. acidophilus, L. fermentum và L. gasseri (Hertzberger et al., 2014). Tùy thuộc vào từng chủng, khả năng sản xuất H2O2 của chúng khác nhau với nồng độ dao động trong khoảng từ 0,8 đến 6,4 mM (Belicová et al., 2013). Khả năng tạo H2O2 của chủng L. fermentum CS 12-1 là 3,5 mM (Kang et al., 2005), chủng L. johnsonii NCC533 là 1 mM (Hertzberger et al., 2014) hay các chủng Lactobacillus từ 0,059 đến 0,176 mM (Zalán et al., 2005).

Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng ức chế sinh trưởng và tiết độc tố của vi khuẩn S. aureus (Eggers et al., 2018). Nghiên cứu của Misaghi et al. (2017) cho thấy, cả ba loài L. acidophilus, L. paracasei và L. fermentum đều có khả năng ức chế sinh trưởng của S. aureus. Ngoài ra, các chủng thuộc chi Lactobacillus này cũng ức chế biểu hiện gen Staphylococcal enterotoxin, một yếu tố gây độc chính của S. aureus. Bằng thử nghiệm lâm sàng, Eggers et al. (2018) cho thấy, những người sử dụng vi khuẩn probiotic L. rhamnosus HN001 có khả năng làm giảm từ 73 đến 83% số lượng vi khuẩn S. aureus đường ruột so với những người chỉ dùng giả dược. Hơn nữa, dịch nuôi đã loại bỏ tế bào Lactobacillus cũng ức chế sinh trưởng của S. aureus nhờ chúng có khả năng tiết ra môi trường những chất kháng khuẩn như ethanol, H2O2 và các bacteriocin (Chen et al., 2019).

chủng Lactobacillus từ mẫu phân thường gặp khó khăn vì sự hiện diện của các vi sinh vật cạnh tranh với số lượng lớn như: Bifidobacterium, Streptococcus và Enterococcus. Vì thế, chúng tôi đã lựa chọn môi trường MRS; pH 6,2 cho việc phân lập chủng Lactobacillus từ mẫu phân vì môi trường này cho số lượng khuẩn lạc tốt với kích thước và hình thái khuẩn lạc đặc trưng cho Lactobacilli (Corry et al., 2003). Một gam mẫu phân sẽ được hòa trong 9 mL nước muối sinh lý vô trùng. Dung dịch sau đó sẽ được pha loãng 10 lần liên tiếp cho đến 10-7. Mỗi một nồng độ pha loãng từ 10-5 đến 10-7 sẽ được cấy gạt trên môi trường thạch MRS (de Man, Rogosa & Sharpe) và được nuôi cấy trong điều kiện kị khí ở 37oC trong 48 giờ. Các khuẩn lạc phát triển trên các đĩa MRS sẽ được lựa chọn và làm sạch bằng cách cấy ria trên đĩa MRS để thu nhận những khuẩn lạc riêng lẻ. Những khuẩn lạc này sẽ được giữ trên đĩa thạch MRS để sử dụng cho những nghiên cứu tiếp và được lưu trữ lâu dài ở (-)80oC trong dịch MRS có bổ sung 20% glycerol. Các mẫu vi khuẩn sẽ được kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi, hoạt tính catalase và nhuộm Gram. Chỉ những khuẩn lạc âm tính với hoạt tính catalase và là Gram dương sẽ được lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo.

Từ những lý do nêu trên, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập, sàng lọc và đánh giá khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus và kiểm tra khả năng kháng S. aureus của các chủng vi khuẩn này.

Phƣơng pháp định tính và định lƣợng H2O2 Phương pháp của Martín & Suárez (2010) được sử dụng để xác định sự có mặt của H2O2 trong dịch nuôi các chủng vi khuẩn

Ha Thi Thu et al.

định danh bằng phương pháp sinh học phân tử dựa theo kỹ thuật giải trình tự đoạn gen 16S rARN (Nanda et al., 2018).

Xác định khả năng ức chế sinh trƣởng trên vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus

Lactobacillus đã phân lập (Martin & Suárez, 2010). Vi khuẩn được cấy chuyển sang 5 mL môi trường MRS nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 24 giờ. Tế bào vi khuẩn được loại bỏ bằng ly tâm, dịch nổi thu được bổ sung vào hỗn hợp có chứa enzyme HRP (horseradish peroxidase, và TMB Sigma, USA) (3,3’,5,5’-Tetramethylbezidine, Sigma) trong đệm phosphate (pH 6) với tổng thể tích 1 mL. Ban đầu TMB ở dạng khử, không màu, khi có mặt của HRP và H2O2, TMB bị oxi hóa và chuyển thành màu xanh.

Phương pháp trên cũng được sử dụng để định lượng nồng độ H2O2 do các chủng vi khuẩn sản xuất được. Tiến hành dựng đường chuẩn về mối tương quan giữa nồng độ H2O2 và mật độ quang ở bước sóng 620 nm của sản phẩm màu sau phản ứng với TMB bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn H2O2 100 mM. Nồng độ H2O2 do các chủng vi khuẩn Lactobacillus sinh ra được tính toán dựa vào đường chuẩn khi đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 620 nm. Mỗi một thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Một mL dịch tế bào vi khuẩn S. aureus ATCC-23235 được trải đều trên bề mặt đĩa petri chứa 15 mL môi trường thạch BHI (Brain Heart Infusion), sau đó hút bỏ dịch thừa. Để đĩa thạch vào tủ ấm 37oC trong 15 phút. Dịch nuôi vi khuẩn Lactobacillus 24 giờ được ly tâm loại bỏ tế bào. Nhỏ 20 µL dịch ly tâm các chủng vi khuẩn Lactobacillus gồm Lac.VFE-04, Lac.VFE-08, Lac.VFE-14 hoặc dung dịch muối sinh lý (làm đối chứng) thành từng điểm riêng trên đĩa petri đã trải vi khuẩn S. aureus ATCC-23235. Ủ các đĩa petri đã được cấy vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí với nhiệt độ 37oC. Sau 48 giờ nuôi cấy, quan sát hiện tượng và đo kích thước vòng kháng khuẩn quanh điểm nhỏ dịch ly tâm các chủng vi khuẩn Lactobacillus để xác định khả năng ức chế sinh trưởng của dịch nuôi đối với vi khuẩn S. aureus ATCC-23235.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Phƣơng pháp xác định khả năng chịu muối mật và axit

Chúng tôi đã phân lập được trên môi trường MRS 115 chủng Lactobacillus. Các khuẩn lạc chủ yếu có dạng lồi, mịn (không nhăn), trắng đục, không màu, rìa trơn hoặc xẻ thùy. Trên môi trường MRS, các khuẩn lạc trên cùng một đường ria mọc đều nhau, phát triển đồng nhất về hình thái và màu sắc không lẫn khuẩn lạc lạ (hình 1). Các vi khuẩn này đồng nhất dưới kính hiển vi quang học, hình que, dương tính khi nhuộm Gram và âm tính với thử nghiệm catalase.

Các chủng vi khuẩn đã sàng lọc có khả năng sinh H2O2 được nuôi cấy trong bình chứa môi trường MRS có bổ sung muối mật Oxgall (Sigma) với nồng độ 0,3% và bình đối chứng không bổ sung muối mật. Bình nuôi cấy được ủ ở nhiệt độ 37oC trong vòng 24 giờ, sau đó kiểm tra khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng và cấy trên đĩa thạch, đếm số lượng khuẩn lạc. Sau 24 giờ nuôi cấy các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong môi trường MRS, tiến hành thử nghiệm khả năng chịu axit bằng cách ủ ở pH 2 và pH 3 trong 3 giờ. Pha loãng và cấy trên đĩa thạch để xác định khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn.

Phƣơng pháp định danh các chủng Lactobacillus bằng giải trình tự gen 16S rRNA

16S rARN gồm các vùng bảo tồn và biến đổi cao, thường được sử dụng để nhận dạng loài và phân biệt loài (Tomas et al., 2013). Các chủng vi khuẩn được chọn lọc, sẽ được

H2O2 production in Lactobacillus strains isolated

tùy thuộc vào lượng H2O2 có mặt trong dịch nuôi của từng chủng vi khuẩn (hình 2).

Kết quả kiểm tra khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus đã phân lập được thể hiện trên bảng 1. Trong đó, chủng có khả năng sinh ra lượng H2O2 lớn nhất là Lac.VFE-14 đạt 2,183 mM, tiếp theo là

Hình 1. Tế bào Lactobacillus (Lac.VFE-14) nhuộm gram quan sát dưới kính hiển vi điện tử

Định tính và định lƣợng H2O2

Phương pháp đo màu dựa trên HRP/TMB được chúng tôi sử dụng để xác định sự có mặt của H2O2 trong dịch nuôi vi khuẩn có độ nhạy cao và độc tính thấp (Xianyu et al., 2013). Các phản ứng màu với TMB có độ nhạy rất cao, phát hiện được nồng độ H2O2 từ lượng rất thấp từ nanomolar đến millimolar) (Martin et al., 2010).

Hình 2. Khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus so với đối chứng

Sau khi bổ sung HRP và TMB vào dịch nuôi vi khuẩn Lactobacillus đã ly tâm, môi trường chuyển ngay từ màu vàng sang xanh ở hầu hết các mẫu với độ đậm nhạt khác nhau

Ha Thi Thu et al.

được sử dụng, lượng H2O2 được tạo ra là 0,0006 mM. Ngoài ra, nguồn nitơ hay yếu tố nhiệt độ cũng có khả năng tác động lên khả năng sinh H2O2 của vi khuẩn (Enitan et al., 2011). Như vậy, ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau sự tổng hợp H2O2 là khác nhau. Lượng H2O2 sản xuất được cũng phụ thuộc vào khả năng của từng chủng vi sinh vật. Ngoài ra, phương pháp định lượng có ảnh hưởng lớn đến việc xác định nồng độ H2O2 mà vi sinh vật sản xuất được trong môi trường. Vì vậy cần tối ưu điều kiện nuôi cấy và chọn lọc các chủng vi sinh vật để thu được hàm lượng H2O2 cao nhất, đồng thời cần lựa chọn phương pháp định lượng phù hợp để xác định hàm lượng H2O2 vi sinh vật tổng hợp được.

Lac.VFE-08 và Lac.VFE-04 với nồng độ H2O2 tương ứng đạt 2,081 mM và 2,067 mM sau 24 giờ nuôi cấy. Lượng H2O2 sinh ra của các chủng đã phân lập được tương đối cao so với với các chủng ở các nghiên cứu trước đó. Nghiên cứu cho thấy khả năng sinh H2O2 phụ thuộc vào từng loài cụ thể. Trong thí nghiệm của Hertzberger et al. (2014), khả năng sinh H2O2 của chủng L. johnsonni NCC 533 là 1 mM, trong khi khả năng sản sinh H2O2 của L. plantarum 2142 là 0,16 mM còn L. casei Shirota là 0,056 mM (Zalán et al., 2005). Nguồn cacbon cũng có ảnh hưởng nhất định đến nồng độ H2O2. Khi sử dụng nguồn carbon là galactose, L. bulgaricus sản xuất được lượng H2O2 cao nhất là 0,02 mM, nhưng khi sorbitol

Hình 3. Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ H2O2 và mật độ quang của sản phẩm màu sau phản ứng với TMB Bảng 1. Giá trị trung bình của 3 lần đo OD620nm và hàm lượng H2O2 có trong dịch nuôi Chủng vi khuẩn Giá trị OD620nm Nồng độ H2O2 (mM)

Lac.VFE-04 Lac.VFE-08 Lac.VFE-09 Lac.VFE-14 Lac.VFE-16 Lac.VFE-17 Lac.VFE-48 Lac.VFE-72 Lac.VFE-76

0,976 ± 0,011 0,981 ± 0,012 0,621 ± 0,017 1,015 ± 0,014 0,557 ± 0,012 0,454 ± 0,013 0,560 ± 0,012 0,327 ± 0,011 0,294 ± 0,014

2,067 ± 0,008 2,081 ± 0,003 1,005 ± 0,012 2,183 ± 0,006 0,812 ± 0,012 0,504 ± 0,001 0,822 ± 0,002 0,125 ± 0,005 0,024 ± 0,001

Khả năng chịu pH axit và muối mật của các chủng đƣợc chọn lọc

Để đến được ruột non và đại tràng ở người, thực hiện chức năng sinh học, vi sinh

H2O2 production in Lactobacillus strains isolated

Sau khi di chuyển qua dạ dày, vi sinh vật lại phải đối mặt với dịch mật. Sự tiếp xúc với mật là một thử thách cho các vi khuẩn xâm nhập vào đường tiêu hóa. Muối mật hoạt động như một chất tẩy rửa sinh học, làm phá hủy màng tế bào vi khuẩn, muốn tồn tại được vi khuẩn phải có khả năng chịu muối mật (Urdaneta et al., 2017). Vì thế khả năng chịu axit và muối mật là đặc tính quan trọng cần có của hệ vi khuẩn đường ruột.

vật cần phải vượt qua dạ dày, nơi có pH rất thấp (pH < 3) (Derrien etal., 2015). Khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn được khảo sát bằng cách xác định số lượng khuẩn lạc sau khi ủ vi khuẩn ở pH 2 và 3 trong 3 giờ. Kết quả được thể hiện ở bảng 2. Sau 3 giờ ủ ở pH 3, tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn này khá cao, tương ứng 95,27%, 94,15% và 98,54%. Ở pH 2, lượng tế bào còn sống so với đối chứng vẫn tương đối cao, với tỷ lệ sống của Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 tương ứng 85,12%, 84,51% và 88,22%.

Bảng 2. Tỷ lệ sống sót sau khi ủ của các chủng vi khuẩn đã chọn lọc so với đối chứng

Chủng

Lac.VFE-04 Lac.VFE-08 Lac.VFE-14

0,3% muối mật 97,02 ± 1,12 95,15 ± 1,14 99,08 ± 1,02

Tỷ lệ sống sót sau khi ủ (%) pH 2 85,12 ± 5,44 84,51 ± 8,01 88,22 ± 5,14

pH 3 95,27 ± 3,21 94,15 ± 5,69 98,54 ± 6,68

Nồng độ muối mật 0,3% được xem là nồng độ quan trọng để xác định khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn probiotic LAB (Belicová et al., 2013). Hầu hết các chủng được chúng tôi thử nghiệm đều duy trì khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường MRS có bổ sung muối mật 0,3%. So với đối chứng không có muối mật, tỷ lệ sinh trưởng của các chủng này dao động từ 90 đến 99%. Chủng Lac.VFE-14 có khả năng sinh trưởng tốt nhất với tỷ lệ 99,08%, gần như không có sự khác biệt so với đối chứng. Các chủng Lac.VFE-04 và Lac.VFE-08 có tỷ lệ sống sót tương ứng là 97,02% và 95,15% (bảng 2).

môi trường có sự hiện diện của muối mật với nồng độ 0,3% (Quách Đức Tính và nnk., 2013). Một nghiên cứu khác (Shehata et al., 2016) cho thấy, trong môi trường MRS có bổ sung 0,3% muối mật, tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn lactic dao động trong khoảng 69,8 đến 85%. Các chủng này cũng có tỷ lệ sống sót từ 68 đến 88,3% sau 3 giờ ủ trong môi trường dịch dạ dày nhân tạo ở pH 2. Như vậy, có thể thấy, so với những chủng đã được nghiên cứu trước đây, 3 chủng Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 có khả năng chịu pH axit và muối mật vượt trội hơn hẳn. Kết quả định danh vi khuẩn theo phƣơng pháp giải trình tự gen 16S rRNA

Sau khi so sánh trình tự 16S rRNA của 3 chủng chọn lọc được với các trình tự 16S rRNA đã được công bố trên ngân hàng gen (NCBI), cho thấy Lac.VFE-14 và Lac.VFE-04 có mức độ tương đồng là 100% và 99% tương ứng so với chủng L. plantarum ZZU 23 và L. plantarum S7. Trong khi đó, Lac.VFE-08 có độ tương đồng lên tới 98,65% so với L. rhamnosus JCM 1136 (bảng 3).

Kết quả trên cho thấy, các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này có khả năng chịu axit và muối mật tốt so với với các chủng vi khuẩn lactic ở các nghiên cứu trước. Trong nghiên của Nguyễn Văn Thanh và nnk. (2007) cũng đã chỉ ra trong môi trường pH 3 và 4, tỷ lệ sống của các chủng L. acidophilus và L. casei là 41 và 65%. Trong điều kiện pH 2, tỷ lệ sống sót của 2 chủng vi khuẩn lactic L. casei VTCC186 và L. pentosus D3 trong sản phẩm kefir chanh dây là 39,36 và 52,01%. Các chủng này cũng có khả năng sinh trưởng trên

Ha Thi Thu et al.

Tên chủng

Kí hiệu chủng phân lập

Lac.VFE -04

Lac.VFE -08

Lac.VFE -14

Bảng 3. Kết quả so sánh với các trình tự 16S đã được công bố trên ngân hàng gen (NCBI) của Lac.VFE -04, Lac.VFE -08 và Lac.VFE -14 Mã số đăng ký trên NCBI GU195646.1 JX193637.1 CP002222.1 NR_113332.1 NR_043408.1 NR_043408.1 AB830324.1 KM507561.1 KM670024.1

L. plantarum S7 L. plantarum T3R1C1 L. plantarum ST-III L. rhamnosus JCM 1136 L. rhamnosus NBRC 3425 L. rhamnosus JCM 1136 L.plantarum ZZU 23 L. plantarum C L. plantarum KLB 416

Identify (Tương đồng) 99% 99% 99% 98,65% 98,38% 98,38% 100% 100% 100%

Khả năng ức chế sinh trƣởng trên vi khuẩn gây bệnh S. aureus

S. aureus là một trong những tác nhân chính gây nhiễm trùng ở người cũng như động vật (Johansson et al., 2016; Ren et al., 2017). Việc sử dụng kháng sinh liều cao để tiêu diệt vi khuẩn này có nguy cơ gây kháng kháng sinh. Vì vậy, hiện nay sản phẩm probiotics đang được sử dụng như một liệu pháp thay thế kháng sinh để chống lại vi khuẩn này (Eggers et al., 2018).

Hình 4. Quan hệ phát sinh chủng loại trình tự gene 16S các chủng phân lập Lac. VFE-04, Lac. VFE-08, Lac. VFE-14 phân tích bằng phần mềm MEGA7 Neighbor-Joining Tree

Với kết quả này, khi xây dựng cây phát sinh chủng loại để đánh giá mối quan hệ di truyền của các chủng phân lập với một số chủng thuộc chi Lactobacillus. Kết quả thu được cho thấy, các chủng được khảo sát chia thành 2 nhóm rõ rệt. Trong đó, nhóm 1 cho thấy chủng phân lập Lac. VFE-08 có mối quan hệ di truyền gần nhất với chủng L. rhamnosus JCM 1136 và các chủng thuộc chi Lactobacillus như L. paracasei, L. casei và L. zeae (hình 4). Nhóm 2, các chủng phân lập Lac. VFE-04, Lac. VFE-14 thể hiện mối quan hệ di truyền cao nhất với các chủng thuộc loài L. plantarum.

Lactobacillus đã được biết đến từ lâu với khả năng sinh chất kháng khuẩn bao gồm H2O2, kháng sinh, các axit hữu cơ. Trong nghiên cứu này, dịch nuôi vi khuẩn đã loại bỏ tế bào của các chủng vi khuẩn Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 đều thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn S. aureus ATCC-23235, khả năng ức chế của mỗi chủng là khác nhau được thể hiện trên hình 5. Hoạt tính ức chế sự sinh trưởng của S. aureus ATCC-23235 của các chủng vi khuẩn này được xác định bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn trên đĩa petri. Chủng Lac.VFE-14 có đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất là 19,0 ± 1,0 mm, tiếp theo là các chủng Lac.VFE-08 với đường kính là 14,0 ± 1,0 mm vàLac.VFE-04 là 11,7 ± 1,3 mm.

Dựa trên kết quả cây phát sinh loài, 2 dòng Lac.VFE-04 và Lac.VFE-14 có quan hệ gần với L. plantarum và Lac.VFE-08 là L. rhamnosus.

H2O2 production in Lactobacillus strains isolated

(2,183 mM), Lac.VFE-08 (2,081 mM) và Lac.VFE-04 (2,067 mM). Kết quả trình tự 16S rARN của 3 chủng cho thấy Lac.VFE-14 có độ tương đồng 100% với L. plantarum ZZU 23; Lac.VFE-04 có độ tương đồng 99% với L. plantarum S7 và Lac.VFE-08 có độ tương đồng 98,65% với L. rhamnosus JCM 1136. Sản phẩm tiết của các chủng này có tác dụng ức chế vi khuẩn S. aureus ATCC-23235. Các chủng này có tiềm năng dùng cho sản xuất probiotic nhờ khả năng chịu được môi trường pH axit và muối mật cũng như khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn S. aureus ATCC-23235.

Lời cảm ơn: Công trình này được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số CT0000.03/18-19 do TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung làm chủ nhiệm.

Hình 5. Khả năng ức chế sự sinh trưởng trên S. aureus của các chủng Lactobacillus

TÀI LIỆU THAM KHẢO Belicová A., Mikulášová M., Dušinský R., 2013. Probiotic potential and safety properties of Lactobacillus plantarum from Slovak Bryndza cheese. BioMed research international, 2013(ID 760298): 8 pp.

Bermudez-Brito M., Plaza-Díaz J., Muñoz- Quezada S., Gómez-Llorente C., Gil A., 2012. "Probiotic mechanisms of action." Annals of Nutrition and Metabolism, 61(2): 160–174.

cho

Trong nghiên cứu về L. rhamnosus, Fornitano et al. (2019) cho thấy khả năng ức chế sự sinh trưởng của S. aureus cũng như làm giảm khả năng sản xuất enzyme gây độc coagulase (giảm từ 20,45 đến 22,73%). Đối với probiotic L. rhamnosus HN001, sau 4 tuần thử nghiệm trên các đối tượng binh sĩ dương tính với nhiễm S. aureus, số lượng S. aureus giảm 73 đến 83% so với nhóm dùng giả dược (Eggers et al., 2018). Nghiên cứu của Misaghi et al. (2017) thấy các vi khuẩn Lactobacillus gồm L. acidophilus, L. fermentum và L. paracasei ức chế sự sản xuất các Staphylococcal enterotoxin (SE) bao gồm SEA, SEC và SEE của vi khuẩn S. aureus.

Boateng, M., S. Price, K. Huddersman and S. E. Walsh ., 2011. Antimicrobial activities of hydrogen peroxide and its activation by a novel heterogeneous Fenton’s‐ like modified PAN catalyst. Journal of applied microbiology, 111(6): 1533–1543.

Antimicrobial

activity

Như vậy, có thể thấy các chủng vi khuẩn Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 trong nghiên cứu này có khả năng ức chế sự sinh trưởng của S. aureus ATCC-23235, có tiềm năng trong tương lai để hỗ trợ điều trị bệnh nhiễm trùng do S. aureus.

KẾT LUẬN

Chen C., Lai C., Huang L., Huang Y., Toh S., Weng C., Chuang C., Lu C., H.-J. Tang ., 2019. of Lactobacillus species against carbapenem- resistant Enterobacteriaceae. Frontiers in microbiology, 10: 789.

Corry J.E.L., Curtis G.D.W., Baird R. M., 2003. Handbook of Culture Media for Food Microbiology. Elsevier Science, 37.

Chúng tôi đã phân lập được 115 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS từ các mẫu phân của những người khỏe mạnh. Trong đó, ba chủng biểu hiện hoạt tính sinh H2O2 mạnh nhất lần lượt là Lac.VFE-14

Ha Thi Thu et al.

conventional

Davoodabadi A., Dallal M. M. S., Foroushani A. R., Douraghi M., Harati F. A., 2015. Antibacterial activity of Lactobacillus spp. isolated from the feces of healthy infants bacteria. enteropathogenic against Anaerobe, 34: 53–58.

Johansson M. A., Björkander S., Mata Forsberg M., Qazi K. R., Salvany Celades M., Bittmann J., Eberl M., Sverremark- Ekström E., 2016. Probiotic lactobacilli modulate Staphylococcus aureus-induced activation and unconventional T cells and NK cells. Frontiers in immunology, 7: 273.

characterization

for

Derrien M., van Hylckama Vlieg J. E., 2015. Fate, activity, and impact of ingested bacteria within the human gut microbiota. Trends in microbiology, 23(6): 354–366. Thi Bich Thuy Do, Thi Diem Huong Nguyen, 2018. Determination of salt intolerance and probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from gut of Decapterus lajang. HUAF journal of agricultural science & technology, Hue University - University of Agriculture and Forestry, 2(2): 799–806 [in Vietnamese].

Kang D.-K., Oh H., Ham J.-S., Kim J., Yoon C., Ahn Y., Kim H., 2005. Identification hydrogen and peroxide-generating Lactobacillus fermentum CS12-1. Asian-australasian journal of animal sciences, 18(1): 90–95. Nanda., Chaudhary., Kumar., 2018. Molecular Approaches of Identification from Traditional Dairy. Lactobacilli Advances in Animal Biotechnology and its Applications, 181–196.

Van Thanh Nguyen, Thu Hoa Tran, Vu Tuong Vy Nguyen, 2007. Investigation of acid, bile salt and antibiotic tolerance of some oral probiotics. Pharmaceutical journal, 378: 255–263 [in Vietnamese].

Markowiak P., Śliżewska K., 2017. Effects of probiotics, prebiotics, and synbiotics on human health. Nutrients, 9(9): 1021. Martín R., Suárez J. E., 2010. Biosynthesis and degradation of H2O2 by vaginal lactobacilli. Appl. Environ. Microbiol., 76(2): 400–405.

Eggers S., Barker A. K., Valentine S., Hess T., Duster M., Safdar N., 2018. Effect of Lactobacillus rhamnosus HN001 on carriage of Staphylococcus aureus: results of the impact of probiotics for reducing infections in veterans (IMPROVE) study. BMC infectious diseases, 18(1): 129. Enitan A., Adeyemo J., Ogunbanwo S., 2011. Influence of growth conditions and nutritional requirements on the production of hydrogen peroxide by lactic acid bacteria. African journal of microbiology research, 5(15): 2059–2066.

rhamnosus

effects

isolated

Fornitano A., Amêndola I., Santos S., 2019. versus Lactobacillus Staphylococcus aureus: influence on growth and expression of virulence factors. J Dent Maxillofacial Res, 2(2): 29–33.

Misaghi A., Parsaeimehr M., Akhondzadeh A., Gandomi H., Azizkhani M., 2017. The inhibitory Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus and from Lactobacillus paracasei yoghurt on the growth and enterotoxin A gene expression of S. aureus. Iranian Journal of Veterinary Medicine, 11(2): 191–201.

species

flavin

Tomas Vetrovsky, Petr Baldrian ., 2013. The Variability of The 16S rRNA Gene in Bacterial Genomes and Its Consequences for Bacterial Community Analyses. Plos One 8: (2).

Hertzberger R., Arents J., Dekker H. L., Pridmore R. D., Gysler C., Kleerebezem M., de Mattos M. J. T., 2014. H2O2 the production acidophilus group: Lactobacillus a for a novel NADH- central role reductase. Appl. dependent Environ. Microbiol., 80(7): 2229–2239.

Duc Tinh Quach, Thanh Trung Tong, Ngoc Duy Nguyen, Thuy Huong Nguyen, 2013.

H2O2 production in Lactobacillus strains isolated

intestinal microflora in mice. BioMed research international., 2017(ID 7476467): 7 pages.

Investigation of some probiotic properties of traditional and Lactobacillus casei VTCC186-supplemented Kefir. Science & Technology Development, 16(3): 40–47 [in Vietnamese].

Shehata M., El Sohaimy S., El-Sahn M. A., Youssef M.,2016. Screening of isolated potential probiotic lactic acid bacteria for cholesterol lowering property and bile salt hydrolase activity. Annals of Agricultural Sciences, 61(1): 65–75.

Ren D., Gong S., Shu J., Zhu J., Rong F., Zhang Z., Wang D., Gao L., Qu T., Liu H., 2017. Mixed Lactobacillus plantarum inhibit Staphylococcus aureus strains inflammation and ameliorate induced

Urdaneta V., Casadesús J., 2017. Interactions between bacteria and bile salts in the gastrointestinal and hepatobiliary tracts. Frontiers in medicine, 4: 163.

for Cu

Xianyu Y., Zhu K., Chen W., Wang X., Zhao H., Sun J., Wang Z., Jiang X., 2013. (II) with Enzymatic assay horseradish peroxidase and its application in colorimetric logic gate. Analytical chemistry, 85(15): 7029–7032.

peroxide

and

Zalán Z., Németh E., Baráth Á., Halász A., 2005. Influence of growth medium on hydrogen bacteriocin production of Lactobacillus strains. Food Technology and Biotechnology, 43(3): 219–225.

Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 161-168, 2020

KHẢ NĂNG ĐỒNG PHÂN HÓA LINOLEIC ACID CỦA CÁC CHỦNG LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT Ở NGƯỜI Trần Xuân Thạch1, Hà Thị Thu1, Vũ Thị Hiền1, Hoàng Thế Hưng4, Nguyễn Thị Hoa1, Lê Thị Thu Hồng1, Lưu Đàm Ngọc Anh2, Bùi Văn Hướng2, Lã Thị Lan Anh3, Đồng Văn Quyền1, Nguyễn Thị Tuyết Nhung1,  1Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 3Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 4Viện Nghiên cứu Khoa học Hậu cần Quân sự - Học viện Hậu cần

Ngƣời chịu trách nhiệm liên lạc. E-mail: nttnhung@gmail.com

Ngày nhận bài: 27.6.2019 Ngày nhận đăng: 03.9.2019

TÓM TẮT

Linoleic acid liên hợp (conjugated linoleic acid - CLA) có nhiều lợi ích cho sức khỏe, bao gồm chống ung thƣ, chống xơ vữa, chống tiểu đƣờng, chống nhiễm trùng, giảm cholesterol, chống oxy hóa, chống vi khuẩn, điều chế hệ miễn dịch và các đặc tính kích thích tăng trƣởng. Ở ngƣời, CLA đƣợc sản xuất từ Linoleic acid (LA) bởi vi khuẩn đƣờng ruột. Trong nghiên cứu này, mƣời chín chủng Lactobacillus (Lac.) phân lập từ vi khuẩn đƣờng ruột của ngƣời đã đƣợc xác định khả năng chuyển hóa LA của chúng. Các vi khuẩn đƣợc nuôi trong môi trƣờng MRS ở dạng lỏng, yếm khí có bổ sung 0,5 mg/mL LA. Hoạt tính đồng phân hóa LA của vi khuẩn trong môi trƣờng MRS đƣợc xác định bằng sắc ký khí. Kết quả cho thấy, 4 trong số 19 chủng, bao gồm các chủng Lac.02, Lac.05, Lac.14 và Lac.16 có khả năng tạo ra khoảng 40-50 μg/mL CLA từ LA. Trong số đó, khả năng tạo CLA cao nhất là chủng Lac.02. Trong quá trình tạo ra CLA từ LA, các enzyme liên quan đến quá trình chuyển hóa này ở Lactobacillus đóng vai trò là chất xúc tác cho quá trình thêm vào và loại đi gốc OH (CLA-HY), oxy hóa nhóm OH và khử các nhóm oxo (CLA-DH), di chuyển các liên kết đôi carbon-carbon (CLA-DC) và làm bão hòa của liên kết đôi carbon-carbon (CLA-ER). Các gen cla-dh, cla-dc, cla-hy và cla-er mã hóa cho enzyme CLA-DH, CLA-DC và CLA-ER đều đƣợc tìm thấy ở 4 chủng Lac.02, Lac.05, Lac.14 và Lac.16. Kết quả sắc ký khí cho thấy 4 chủng này đều tạo ra cis-9, trans-11 và trans-10, cis-12 CLA. Trong nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sẽ tối ƣu hóa các điều kiện nhƣ nồng độ cơ chất, giá trị pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy của từng chủng để thu đƣợc kết quả tốt nhất.

Từ khóa: Cis-9, trans-11 CLA, Lactobacillus; linoleate isomerase; trans-10, cis-12 CLA

MỞ ĐẦU

tính của CLA phụ thuộc vào vị trí nối đôi trong phân tử. Nghiên cứu cho thấy, liên kết đôi của CLA đƣợc tìm thấy chủ yếu ở vị trí 9 và 11, hay 10 và 12 (Alonso et al., 2003). Trong số các đồng phân đƣợc tạo thành từ LA thì cis-9, trans-11 CLA và trans-10, cis-12 CLA là 2 đồng phân chính (Akalin et al., 2007, Adamczak et al., 2008, Macouzet et al., 2010) có tác dụng lần lƣợt trong việc phòng chống ung thƣ và chống béo phì (Kelley et al., 2007).

CLA là một hỗn hợp của các đồng phân hình học và vị trí của LA với liên kết đôi liên hợp. Những CLA này có nhiều đặc tính sinh học có liên quan đến sức khỏe nhƣ đặc tính chống ung thƣ, chống xơ vữa động mạch (McCrorie et al., 2011), chống đái tháo đƣờng, chống béo phì, giảm cholesterol (Fiona et al., 2007, Tatiana et al., 2015), chống oxy hóa, kháng khuẩn (Rafaela et al., 2012), điều hòa miễn dịch và kích thích sinh trƣởng (Marianne et al., 2004). CLA đƣợc tìm thấy chủ yếu trong thịt và các sản phẩm từ sữa của động vật nhai lại (Sebastiano, 2002). Hoạt

Theo Arman và đồng tác giả (2016), cis-9, trans-11 CLA điều hòa chất sinh ung thƣ bằng cách tác động lên các giai đoạn khác nhau trong quá

161

Trần Xuân Thạch et al.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguồn mẫu phân lập

Các mẫu phân đƣợc ngƣời tình nguyện tham gia tại khu vực Hà Nội tự thu thập phân của mình sau đó để trong hộp vô trùng. Mẫu sau đó sẽ giữ lạnh ở 4°C và chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để phân tích.

Phân lập vi khuẩn Lactobacillus

trình phát triển ung thƣ nhƣ giai đoạn khởi phát, tăng trƣởng, tiến triển, thoái hóa (Arman et al., 2016). Bổ sung 1% CLA ức chế sự tăng sinh của khối u (Ip et al., 1991). Ở các tế bào đại trực tràng của chuột, cis-9, trans-11 CLA hoạt hóa gen tổng hợp caspase 3 và caspase 9, qua đó kích thích tế bào kích hoạt sự chết theo chƣơng trình - apoptosis (Ewaschuk et al., 2006). Bên cạnh đó, đồng phân trans-10, cis-12 CLA lại có tác dụng trong việc giảm mỡ cơ thể (Marques et al., 2015) và duy trì trọng lƣợng cơ thể (Sou et al., 1994). Trans-10, cis- 12 CLA ức chế sự tổng hợp những enzyme quan trọng liên quan đến sự tổng hợp mới acid béo, từ đó giảm tổng hợp chất béo trong sữa (Baumgard et al., 2000). Trans-10, cis-12 CLA làm tăng hoạt tính enzyme carnitine palmitoyltransferase (CPT), kết quả là làm tăng quá trình beta oxy hóa acid béo (Park et al., 1997). CLA tác động lên thụ thể alpha đƣợc hoạt hóa bởi peroxisome “peroxisome proliferator-activated receptor alpha” (PPAR-α) để làm tăng quá trình phân giải lipid trong gan của động vật (Lee et al., 2007).

Một gram phân sẽ đƣợc hòa trong 9 mL nƣớc muối sinh lý vô trùng. Dung dịch sau đó sẽ đƣợc pha loãng 10 lần liên tiếp cho đến 10-7. Mỗi một nồng độ pha loãng từ 10-4 đến 10-7 sẽ đƣợc cấy gạt trên môi trƣờng thạch MRS và đƣợc nuôi cấy trong điều kiện kị khí ở 37°C trong vòng 48 đến 72 h. Các khuẩn lạc phát triển trên các đĩa MRS sẽ đƣợc lựa chọn và làm sạch bằng cách ria pha loãng trên đĩa MRS để thu nhận những khuẩn lạc riêng lẻ. Các khuẩn lạc phân lập đầu tiên sẽ kiểm tra hoạt tính catalase và nhuộm Gram, và chỉ những khuẩn lạc âm tính với hoạt tính catalase và là Gram dƣơng sẽ đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo. Những khuẩn lạc này sẽ đƣợc giữ trên đĩa thạch MRS để sử dụng cho những nghiên cứu tiếp và đƣợc lƣu trữ lâu dài ở -80°C trong dịch MRS có bổ sung 20% glycerol.

Tuyển chọn các chủng Lactobacillus biểu hiện enzyme isomerase

Nhiều nghiên cứu cho thấy, một số vi khuẩn trong đó có chi Lactobacillus phân lập từ hệ vi sinh vật đƣờng ruột của ngƣời có khả năng tạo CLA từ LA (Ewaschuk et al., 2006, Rosberg-Cody et al., 2011, Kishino et al., 2013). Hơn nữa, cis-9, trans-11 hoặc trans-10, cis-12 CLA đƣợc xác định là những đồng phân chính của quá trình chuyển hóa này (Alonso et al., 2003). Lee và đồng tác giả đã báo cáo rằng L. rhamnosus PL60 có nguồn gốc từ ngƣời, có khả năng sản xuất trans-10, cis-12 CLA từ LA. L. casei tạo ra nhiều đồng phân trans-10, cis-12 CLA hơn cis-9, trans-l1 CLA (Anil et al., 2009) trong khi L. plantarum ZS2058 chuyển hóa 37,78% linoleic acid thành cis- 9, trans-11 CLA và 16,57% thành trans-9, trans-11 CLA (Yang et al., 2014).

CLA-ER

GAC-3’)

Tại Việt Nam, trong số 100.000 ngƣời chết vì ung thƣ mỗi năm thì với số ca tử vong do ung thƣ đại trực tràng ƣớc tính khoảng 55.000 trƣờng hợp. Bên cạnh đó, tốc độ gia tăng về tỉ lệ ngƣời quá cân, béo phì ở Việt Nam nằm trong nhóm các nƣớc có tỉ lệ gia tăng nhanh nhất thế giới. Với những tác dụng có lợi cho sức khỏe của CLA thì việc phân lập, tuyển chọn những chủng vi khuẩn Lactobacillus có ích từ hệ vi sinh vật đƣờng ruột của ngƣời có khả năng chuyển hóa LA thành CLA nhƣ một probiotic là rất cần thiết để tăng lƣợng CLA đƣa vào cơ thể ngƣời và thu đƣợc những lợi ích hữu hiệu của CLA (McCrorie et al., 2011).

Quá trình chuyển hóa LA thành CLA ở vi khuẩn Lactobacillus gồm nhiều bƣớc với sự kết hợp của các enzyme bao gồm enzyme xúc tác sự hydrat hóa/dehydrat (CLA-HY), oxy hóa nhóm hydroxy/sự khử nhóm oxo (CLA-DH), di chuyển của các nối đôi carbon-carbon (CLA-DC), và bão hòa liên kết đôi carbon-carbon (CLA-ER) (Kishino et al., 2013). Để sàng lọc các chủng mang các gen giúp chuyển hóa LA thành CLA chúng tôi sử dụng phƣơng pháp PCR với các mồi đặc hiệu, bao gồm gen mã hóa CLA- DH (F: 5’- AGC TAG TGT CGA CGA TGC GG-3’; R: 5’-GAC GGT ATC GGC AAT CGT ATC-3’), CLA-DC (F: 5’- ATG CCA CTG ACG AAG CGG TG-3’; R: 5’-TGT CGC AGC ATC AAC TTC GTC- 3’), CLA-HY (F: 5’- TGG TGT TGA TAT GCA CGG TGC-3’; R: 5’-AGT CTG CGC ATC CTC (F:5’ và AAT CAGACGTGATGTTTAACCGC-3’; 5’ CAGTCTGTGTTTTGGCATCG-3’). Các cặp mồi này đƣợc thiết kế trên cơ sở trình tự hệ gen của các chủng Lactobacillus đã công bố trên GenBank [cla- dh (GenBank. NC-004567)], [cla-dc (GenBank NC- 004567)], cla-er (GenBankNC-004567)]. Sản phẩm PCR đƣợc tách dòng vào vector tách dòng pCR2.1

162

Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 161-168, 2020

Thí nghiệm sẽ đƣợc lặp lại ba lần vào những ngày khác nhau.

Xác định các đồng phân CLA bằng sắc ký khí

(Invitrogen), giải trình tự bằng máy xác định trình tự DNA tự động và so sánh với các gen cùng loại trên GenBank bằng phần mềm tin sinh chuyên dụng nhƣ mô tả trong các nghiên cứu trƣớc của chúng tôi (Đỗ Thị Ngọc Huyền et al., 2005). Những chủng mang cả 4 gen trên sẽ đƣợc lựa chọn để thử nghiệm khả năng đồng phân hóa LA.

Xác định khả năng chuyển hóa LA thành các đồng phân cis-9, trans-11 và trans-10, cis-12 CLA

Sự có mặt của các đồng phân trong dịch nuôi tế bào sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký khí (GC) nhƣ mô tả trong nghiên cứu của Yang và đồng tác giả (2014). Các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau: bổ sung 217 µg chất nội chuẩn, C17: 0 heptadecanoic acid vào 4 mL dịch nổi. Sau khi thêm vào 4 mL isopropanol, hỗn hợp đƣợc vortex trong 30 s. Tiếp theo, bổ sung 4 mL n- hexane và vortex, ly tâm ở 5000×g trong 5 phút. Lớp hexan thu đƣợc (có chứa lipid) sẽ đƣợc làm bay hơi bằng khí nitrogen. Các đồng phân này sẽ đƣợc biến đổi thành các methyl este tƣơng ứng với (trimetylsilyl)- diazomethane (Sigma, USA). Các FAME (fatty acid methyl ester) này sẽ đƣợc chiết xuất trong n-hexane và phân tách trên cột phân tách dùng trong sắc ký khí (Shimadzu, Japan). Các đồng phân CLA đƣợc xác định bởi thời gian lƣu với tham chiếu tiêu chuẩn pha CLA (Sigma, USA). Lƣợng CLA thu đƣợc trong dịch nuôi sau khi ủ với Lactobacillus là

Các chủng mang gen mã hóa cho LA isomerase sẽ đƣợc kiểm tra; cấy chuyển ít nhất ba lần trong MRS sử dụng 1% dịch vi khuẩn và ủ trong 18 giờ ở 37oC. Dung dịch MRS sẽ đƣợc bổ sung 0,5 mg/mL LA (Sigma, USA). Các LA đƣợc hòa vào 1% Tween 80 trƣớc khi bổ sung vào môi trƣờng. Môi trƣờng đƣợc cấy 1% vi khuẩn và ủ ở 37°C với thời gian ủ khác nhau. Sau mỗi thời gian ủ, mẫu từ mỗi nồng độ sẽ đƣợc lấy ra và để trên đá. Đo pH, xác định mật độ vi khuẩn bằng cách trải trên đĩa MRS và ủ ở 37°C trong vòng 48 đến 72 h. Sau đó dịch nuôi đƣợc ly tâm ở 23.500×g trong 10 min ở 4°C. Loại bỏ cặn tế bào và thu dịch để phân tích CLA.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Phân lập và tuyển chọn chủng Lactobacillus

hình que, Gram dƣơng và có hoạt tính enzyme catalase âm tính đã đƣợc kiểm tra khả năng chuyển hóa LA. Kết quả trên Hình 1 cho thấy, hầu hết các chủng này đều có khả năng chuyển hóa LA thành CLA nhƣng với mức độ khác nhau.

Tổng số 195 chủng Lactobacillus đã phân lập đƣợc trên môi trƣờng MRS từ mẫu phân của những ngƣời khỏe mạnh ở khu vực Hà Nội. Trên môi trƣờng MRS số lƣợng khuẩn lạc xuất hiện nhiều với hình dạng và màu sắc khác nhau hơn so với môi trƣờng nƣớc ép cà chua của Briggs hay môi trƣờng chiết xuất thịt và cà chua của de Man (Lee et al., 2008). Các khuẩn lạc thu đƣợc hầu hết đều có hình dạng lồi, không nhăn, trắng đục, không màu, rìa trơn hoặc xẻ thùy. Các mẫu đã phân lập đƣợc làm sạch bằng cách ria cấy trên đĩa thạch MRS để thu đƣợc khuẩn lạc thuần khiết. Sau khi nhuộm Gram, hoạt tính catalase và kiểm tra sự đồng nhất dƣới kính hiển vi quang học, 19 chủng đƣợc chọn lọc để kiểm tra khả năng chuyển hóa LA thành CLA.

Khả năng chuyển hóa LA thành CLA

Bốn chủng Lac.02, Lac.05, Lac.14 và Lac.16 có hoạt tính cao hơn so với 15 chủng còn lại. Những nghiên cứu trƣớc cho thấy, vi khuẩn Lactobacillus có thể tạo ra từ 3 đến 56% CLA trong môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung LA tự do (Yang et al., 2014). Hơn nữa hoạt tính đồng phân hóa LA của Lactobacillus tùy thuộc vào từng loài. Theo Pei và đồng tác giả, hiệu suất chuyển đổi từ LA thành CLA của chủng L. plantarum lp15 là 25% (Pei et al., 2011) trong khi đó L. reuteri đạt hiệu suất là 54,35% (Sun et al., 2003). Ngoài ra, hiệu suất của phản ứng chuyển hóa LA thành CLA ở quy mô phòng thí nghiệm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhƣ thành phần môi trƣờng, nồng độ cơ chất LA, giá trị pH và nhiệt độ nuôi cấy. Alonso và đồng tác giả (2003) cho thấy khi nuôi cấy L. acidophilus L1 trong môi trƣờng MRS có bổ sung 0,02% LA cho hiệu suất chuyển hóa thành CLA cao hơn khi bổ sung 0,05% LA. Thêm

Khả năng biến đổi LA thành CLA của các vi khuẩn đã đƣợc biết đến từ những năm 1980 (Arion et al., 2010). Mƣời chín chủng vi khuẩn Lactobacillus

163

Trần Xuân Thạch et al.

vào đó, ở nhiệt độ nuôi cấy 37ºC, lƣợng CLA thu đƣợc cao nhất là sau 24 h so với lƣợng CLA ở 36, 48 và 72 h (Alonso et al., 2003). Ngƣợc lại, có tác giả lại cho rằng phần lớn CLA đƣợc tạo thành sau khi các chủng đạt đến pha cân bằng, ở 36 h nuôi cấy. Trong một nghiên cứu khác, tác giả Ty và đồng tác

giả (2002) cho biết khi thử nghiệm với L. acidophilus (CCRC14079) ở pH 5, 6, 7, và 8, kết quả cho thấy lƣợng CLA đƣợc tạo ra ở pH 5 là cao nhất (TY et al., 2002). Nhƣ vậy có thể thấy việc tối ƣu hóa các điều kiện nuôi cấy đối với 4 chủng vi khuẩn Lac.02, Lac.05, Lac.14 và Lac.16 là rất cần thiết.

Hình 1. Hoạt tính chuyển hóa LA (0.5 mg/mL) thành CLA của 19 chủng vi khuẩn

phân lập từ phân người khỏe mạnh ở Hà Nội

Gen quy định enzyme mã hóa cho LA isomerase

Linoleate isomerase là enzyme đa thành phần tham gia quá trình sản xuất CLA từ LA ở vi khuẩn lactic. Dựa vào trình tự hệ gen đã đƣợc công bố trên GenBank, chúng tôi đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để nhân lên các đoạn gen cla-dh (529bp), cla-dc (681bp), cla-er (654bp) và cla-hy (717bp).

phần enzyme cụ thể (Kishino et al., 2013). Cụ thể, khi phản ứng đồng phân hóa đƣợc xúc tác bởi CLA- HY sẽ cho trans-10, cis-12 CLA, còn phản ứng đồng phân hóa đƣợc xúc tác bởi sự kết hợp hoạt động của CLA-HY, CLA-DH, CLA-DC sẽ cho ra cis-9, trans- 11 và trans-9, trans-11 CLA. Trong 4 chủng vi khuẩn Lac.02, Lac.05, Lac.14 và Lac.16 đƣợc kiểm tra, cả 4 thành phần enzyme thuộc hệ thống LA isomerase đều có mặt, kết quả này cho thấy những chủng vi khuẩn trên có thể tạo ra nhiều loại đồng phân CLA khác nhau.

Các loại đồng phân CLA khác nhau được tạo ra

Sản phẩm PCR thu đƣợc cho thấy, cả 4 chủng chọn lọc đều xuất hiên đầy đủ 4 gen nêu trên với kích thƣớc theo đúng nhƣ dự đoán lý thuyết (cla-dh - 529 bp; cla-dc - 681 bp; cla-er - 654 bp và cla-hy - 717 bp). Theo công bố của Kishino và đồng tác giả, (2013), ở Lactobacillus các gen mã hóa cho CLA- DH, CLA-DC, CLA-ER tạo thành một cụm gen (Kishino et al., 2013). Giống nhƣ ở L. plantarum, L. casei và L. rhamnosus cũng có cùng một cụm gen và cả CLA-HY. Ngoài ra, ở các loài vi khuẩn lactic khác cũng chứa từ 1 đến 4 gen nói trên. Ví dụ, L. salivarius có 3 gen cla-dc, cla-er và cla-hy; trong khi L. cripatus cũng có nhƣng lại là cla-dh, cla-er và cla-hy.

Khả năng chuyển hóa LA thành CLA của các vi khuẩn đã đƣợc biết đến từ những năm 1980 (Haiqin et al., 2012). Có đến 8 đồng phân CLA mà vi khuẩn Lactobacillus có thể tạo ra từ LA trong đó cis-9, trans- 11 CLA và trans-10, cis- 12 CLA đƣợc xem là 2 đồng phân chính. Một số chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng tạo ra cis-9, trans-11CLA hoặc trans-10, cis-12 CLA nhƣ là một đồng phân chính. Tuy nhiên, một số chủng có khả năng tạo ra cả 2 đồng phân này với lƣợng tƣơng đƣơng nhau (Julia et al., 2006). Thử nghiệm khả năng đồng phân hóa LA của 4 chủng vi khuẩn chọn lọc, kết quả trên

Có nghiên cứu cho rằng phải có sự kết hợp của 4 gen này mới cho ra sản phẩm CLA từ LA. Bên cạnh đó, sản phẩm CLA tạo ra sẽ tùy thuộc vào thành

164

Trần Xuân Thạch et al.

Bảng 1 cho thấy có khoảng gần 10% LA đƣợc chuyển hóa thành CLA.

Trong nghiên cứu này, sử dụng phƣơng pháp sắc ký khí để phân tách và định lƣợng các đồng phân tạo ra từ bốn chủng vi khuẩn Lac.02, Lac.05, Lac.14 và Lac.16, chúng tôi thu đƣợc kết quả trên Hình 3.

Hình 2. Gen mã hóa linoleic acid isomerase của 4 chủng LA 02, LA05, LA12 và LA16. (1) cla-hy; (2): cla-dc; (3) cla-er ; (4): cla-dh.

Bảng 1. Tỉ lệ thành phần của các CLA.

Linoleic acid (%)

cis-9, trans-11 CLA (%)

trans-10, cis-12-CLA (%)

Thành phần CLA khác (%)

LA 2

90,51

0,08

2,08

7,33

LA 5

91,34

0,07

1,2

7,39

LA 14

92,61

0,07

0,68

6,64

LA 16

95,84

0,07

0,18

3,91

162

Trần Xuân Thạch et al.

KẾT LUẬN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập đƣợc bốn chủng vi khuẩn Lac.02, Lac.05, Lac.14 và Lac.16 có khả năng chuyển hóa LA thành các CLA có ích và kiểm tra sự có mặt của các gen liên quan đến sự chuyển hóa LA. Những phát hiện về khả năng chuyển hóa LA thành trans-10, cis-12-CLA và cis-9, trans-11-CLA của các chủng Lactobacillus phân lập từ phân ngƣời tại Việt Nam là những số liệu lần đầu đƣợc công bố tại Việt Nam.

Lời cảm ơn. Công trình này được thực hiện với sự hỗ trợ về kinh phí của đề tài Nafosted Mã số 106.04- 2017.313, chủ nhiệm: TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Hình 3. Đặc điểm của các CLA được tạo ra. (1) Linoleic Acid; (2) Cis-9, trans-11 CLA; (3) Trans-10, cis-12 CLA. Các chủng này đều có thể chuyển hóa các LA tự do thành cis-9, trans-11, trans-10, cis-12 CLA. Kết quả trên hình 3 cho thấy, một số đồng phân cis/trans và trans/trans của CLA có sự phân tách riêng rẽ. Trong đó có cis-9, trans -11 và trans -10, cis -12 CLA. Kết quả định lƣợng (bảng 1) cho thấy, trans- 10, cis-12 CLA đƣợc tạo ra từ 4 chủng vi khuẩn Lac.02, Lac.05, Lac.14 và Lac.16 có sự khác biệt, với kết quả cao nhất thu đƣợc ở chủng Lac.02, và thấp nhất ở chủng Lac.16. Trong khi đó, Cis-9, trans-11 CLA đƣợc tạo ra với mức độ gần tƣơng đƣơng ở 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Nhƣ trên đã đề cập, hiệu suất của phản ứng đồng phân hóa LA phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Trong nghiên cứu của Niu và đồng tác giả (2007) cho thấy, trong sản phẩm CLA tạo ra bởi L. plantarum ZS2058, Cis-9, trans- 11 CLA chiếm đến 96,4 %. Ngƣợc lại, L. acidophilus lại sản xuất trans-10, cis-12 CLA là chủ yếu khi đƣơc nuôi cấy trong môi trƣờng MRS có bổ sung LA (Ty et al., 2002).

Adamczak M, Bornscheuer UT, Bednarski W (2008) Properties and biotechnological methods to produce lipids containing conjugated linolleic acid. Eur J Lipid Sci Technol 110: 491-504.

linoleic acid

Akalin AS, Tokusoglu Ö, Gönç S, Aycan S (2007) Occurrence of conjugated in probiotic yoghurts supplemented with fructo oligosaccharide. Int Dairy J 17: 1089–1095.

Alonso L, Cuesta EP, Gilliland SE (2003) Production of free conjugated linoleic acid by Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei of human intestinal origin. J. Dairy Sci 86: 1941-1946.

Kết quả tƣơng tự cũng đƣợc quan sát ở các nghiên cứu trƣớc, ví dụ nhƣ L. reuteri cho thấy độ đặc hiệu cao cho việc sản xuất đồng phân cis-9, trans-11 CLA nhƣng L. gasseri tích lũy nhiều đồng phân trans-10, cis-12 hơn cis-9, trans-11 khi nuôi trong cùng điều kiện. Ngoài hai đồng phân CLA đƣợc chúng tôi báo cáo (cis-9, trans-10 và trans-10, cis-12) có rất nhiều đồng phân khác có thể có mặt trong môi trƣờng mà không đƣợc phát hiện bởi phƣơng pháp sắc ký khí đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này.

166

Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 161-168, 2020

and Lactobacillus

casei. Annals

Anil Kumar Puniya, Chaitanya S Reddy, Sanjay Kumar, Kishan Singh (2009) Influence of sunflower oil on conjugated linoleic acid production by Lactobacillus acidophilus of Microbiology 59(3): 505–507.

Kishino S, Takeuchi M, Park S B, Hirata A, Kitamura N, Kunisawa J, Kiyono H, Iwamoto R, Isobe Y, Arita M, Arai H, Ueda K, Shima J, Takahashi S, Yokozeki K, Shimizu S, Ogawa J (2013) Polyunsaturated fatty acid saturation by gut lactic acid bacteria affecting host lipid composition. PNAS 110(44): 17808-17813.

Arion Kennedy, Kristina Martinez, Soren Schmidt, Susanne Mandrup, Kathleen LaPoint, Michael McIntosh (2010) Antiobesity mechanisms of action of conjugated linoleic acid. J Nutr Biochem 21(3): 171–179.

Lee K, Paek K, Lee HY, Park JH, Lee Y (2007) Antiobesity effect of trans-10, cis-12-conjugated linoleic acid-producing Lactobacillus plantarum PL62 on diet- included obese mice. Journal of Applied Microbiology. 103: 1140-1146.

Arman Arab, Shahab Aldin Akbarian, Reza Ghiyasvand, Maryam Miraghajani (2016) The effects of conjugated linoleic acids on breast cancer: A systematic review. Adv Biomed Res 5:115.

Macouzet M, Lee BH, Robert N (2010) Genetic and structural comparison of linoleic isomerases from selected food-grade bacteria. J Appl Microbiol 109: 2128-2134.

(2004)

Baumgard LH, Corl BA, Dwyer DA, Saebo A, Bauman DE (2000) Identification of the conjugated linoleic acid isomer that inhibits milk fat synthesis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 278(1): 179-184.

Marianne O’Shea, Josep Bassaganya-Riera, Inge CM Mohede Immunomodulatory properties of conjugated linoleic acid. Am J Clin Nutr 79(6): 1199S- 1206S.

Đỗ Thị Ngọc Huyền, Trịnh Thị Thu Hằng, Nguyễn Tiến Minh, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Đinh Duy Kháng, Trƣơng Nam Hải, Nguyễn Thuỳ Châu (2005) Tách dòng và xác định trình tự gen phyC mã hoá cho Phytaza từ các chủng Bacillus subtilis. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 3: 83-86.

Marques TM, Wall R, O'Sullivan O, Fitzgerald GF, Shanahan F, Quigley EM, Cotter PD, Cryan JF, Dinan TG, Ross RP, Stanton C (2015) Dietary trans-10, cis-12- conjugated linoleic acid alters fatty acid metabolism and microbiota composition in mice. Br J Nutr 113(5): 728-738.

McCrorie TA, Keaveney EM, Wallace JM, Binns N, L MB (2011) Human health effects of conjugated linoleic acid from milk and supplements. Nutr Res Rev 24(2): 206-227.

Ewaschuk JB, Walker JW, Diaz H, Madsen KL (2006) Bioproduction of conjugated linoleic acid by probiotic bacteria occurs in vitro and in vivo in mice. J Nutr 136(6): 1483-1487.

Niu XY, Chen W, Tian FW, Zhao JX, Zhang H (2007) Bioconversion of conjugated linoleic acid by resting cells of Lactobacillus plantarum ZS2058 in potassium phosphate buffer system. Acta Meteorol. Sin. 47: 244–248.

Fiona Moloney, Sinead Toomey, Enda Noone, Anne Nugent, Bernard Allan, Christine E Loscher, Helen M Roche (2007) Antidiabetic effects of cis-9, trans-11– conjugated linoleic acid may be mediated via anti- inflammatory effects in white adipose tissue. DIABETES 56: 574-582.

Park Y, Albright KJ, Liu W, Storkson JM, Cook ME, Pariza MW (1997) Effect of conjugated linoleic acid on body composition in mice. Lipids 32(8): 853-858.

HM Lee, Yeonhee Lee (2008) A differential medium for lactic acid-producing bacteria in a mixed culture. Lett Appl Microbiol 46(6): 676-681.

Pei Liu, Sheng-rong Shen, Q Z Hui Ruan, Liu-liu Ma, Guo-qing He (2011) Production of conjugated linoleic acids by Lactobacillus plantarum strains isolated from naturally fermented Chinese pickles. J Zhejiang Univ Sci B 12(11): 923–930.

Haiqin Chen, Bo Yang, Sitian Gu, Baixi Zhang, Qingyan Xu, Qiang Ye, Yuanda Song, Yong Q Chen, Hao Zhang, Wei Chen (2012) Purification and characterization of a linoleate isomerase from Lactobacillus plantarum ZS2058. African Journal of Biotechnology 11(20): 4579-4587.

Rafaela da Silva Marineli, Anne y Castro Marques, Cibele Priscila Busch Furlan (2012) Antioxidant effects of the combination of conjugated linoleic acid and phytosterol supplementation in Sprague–Dawley rats. Food Research International 49(1): 487-493.

Ip C, Chin SF, Scimeca JA, Pariza MW (1991) Mammary cancer prevention by conjugated dienoic deriative of linoleic acid. Cancer Res. 51: 6118-6124.

lactobacilli

expressing

linoleic

Rosberg-Cody E, Stanton C, O’Mahony L, Wall R, Shanahan F, Quigley EM, Fitzgerald GF, Ross RP (2011) Recombinant acid isomerase can modulate the fatty acid composition of host adipose tissue in mice. Microbiology 157: 609-615.

Julia B, Ewaschuk John W, Walker Hugo Diaz Karen L, Madsen (2006) Bioproduction of conjugated linoleic acid by probiotic bacteria occurs in vitro and in vivo in mice. The Journal of Nutrition 136(6): 1483–1487.

(2002) Conjugated

Sebastiano Banni linoleic acid metabolism. Current Opinion in Lipidology 13(3): 261-266.

Kelley NS, Hubbard NE, Erickson KL (2007) Conjugated linoleic acid isomers and cancer. J Nutr 137: 2599–2607.

167

Trần Xuân Thạch et al.

Lehnen (2015) A review on effects of conjugated linoleic fatty acid upon body composition and energetic metabolism. J Int Soc Sports Nutr. 12:36.

Sou F Chin, Jayne M Storkson, Karen J Albright, Mark E Cook, Michael W Pariza (1994) Conjugated linoleic acid is a growth factor for rats as shown by enhanced weight gain and improved feed efficiency. The Journal of Nutrition 124(12): 2344–2349.

TY Lin, CW Lin, YJ Wang (2002) Linoleic acid isomerase activity in enzyme extracts from Lactobacillus acidophilus freudenreichii ssp. shermanii. and Propionibacterium Journal of Food Science 67(4): 1502-1505.

into conjugated

Sun Ok Lee, Chang Sup Kim, Somi Kim Cho, Ha Jong Choi, Geun Eog Ji, Deok-Kun Oh (2003) Bioconversion of linoleic acid linoleic acid during fermentation and by washed cells of Lactobacillus reuteri. Biotechnology Letters 25(12): 935–938.

Yang B, Chen H, Gu Z, Tian F, Ross R, Stanton C, Chen Y, Chen W, Zhang H (2014) Synthesis of conjugated linoleic acid by the linoleate isomerase complex in food- derived lactobacilli. J Appl Microbiol. 117(2): 430-439.

Tatiana Ederich Lehnen, Marcondes Ramos da Silva, Augusto Camacho, Aline Marcadenti, Alexandre Machado CONJUGATED LINOLEIC ACID PRODUCTION FROM VIETNAMESE HUMAN GUT LACTOBACILLUS SPP. Tran Xuan Thach1, Ha Thi Thu1, Vu Thi Hien1, Hoang The Hung4, Nguyen Thi Hoa1, Le Thi Thu Hong1, Luu Dam Ngoc Anh2, Bui Van Huong2, La Thi Lan Anh3, Dong Van Quyen1, Nguyen Thi Tuyet Nhung1

SUMMARY

Conjugated linoleic acid (CLA) have been shown to exert numerous health benefits, including anti- carcinogenic, anti-atherogenic, anti-diabetic, antiobesity, cholesterol reducing, antioxidant, anti-microbial, immune system modulator and growth-stimulating properties. In human, CLA is produced from Linoleic acid (LA) by gut bacteria. In this study, nineteen Lactobacillus (Lac.) strains isolated from human feces were studied to determine their ability to metabolize LA. The bacteria were grown in the liquid form of anaerobic MRS medium supplemented with 0.5 mg/mL LA. The linoleate isomerase activity in bacteria grown on MRS medium was determined by Gas chromatograpy. The results indicated that 4 out of 19 strains, including strains Lac.02, Lac.05, Lac.14 and Lac.16 are capable of producing about 40-50 μg/mL CLA from LA. Among them, the highest ability to produce CLA from LA is Lac.02 strain. In the production of CLA from LA, enzymes involved in this metabolism in Lactobacillus act as catalysts of hydration/dehydration (CLA-HY), oxidation of hydroxy groups/reduction of oxo groups (CLA-DH), migration of carbon-carbon double bonds (CLA-DC), and saturation of carbon-carbon double bonds (CLA-ER). The cla-dh, cla-dc, cla-hy and cla-er genes that encode enzymes CLA-DH, CLA-DC, and CLA-ER had been found in all Lac.02, Lac.05, Lac.14 and Lac.16 strains. Gas chromatography traces indicated that these strains produced the same compounds, which was subsequently identified as cis-9, trans-11, and trans-10, cis-12 CLA. In the next study, we will optimize the conditions such as substrate concentrations, pH values, temperature and culture time of each strain to obtain the best rerults.

Keywords: Cis-9, trans-12 CLA, Lactobacillus; linoleate isomerase; trans-10, cis-12 CLA;

168

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Các định khả năng phân giải muối mật của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của người

Lã Thị Lan Anh

XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU HÓA CỦA NGƢỜI

Hà Nội - 2020

Lã Thị Lan Anh

XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ TIÊU HÓA CỦA NGƢỜI

Chuyên ngành :

Sinh học thực nghiệm

Mã số : 8420114

Hà Nội - 2020

Nhóm 2

TAP CHI SINH HOC 2020, 42(1): 83–92 DOI: 10.15625/0866-7160/v42n1.14508

ABSTRACT

Keywords: Lactobacillus, Staphylococcus aureus, H2O2, bile salt, antimicrobial activity.

TAP CHI SINH HOC 2020, 42(1): 83–92 DOI: 10.15625/0866-7160/v42n1.14508

TÓM TẮT

Từ khóa: Lactobacillus, Staphylococcus aureus, H2O2, muối mật, kháng khuẩn.

MỞ ĐẦU

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguồn mẫu phân lập

Phân lập vi khuẩn Lactobacillus

Phƣơng pháp định tính và định lƣợng H2O2 Phương pháp của Martín & Suárez (2010) được sử dụng để xác định sự có mặt của H2O2 trong dịch nuôi các chủng vi khuẩn

Xác định khả năng ức chế sinh trƣởng trên vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Phƣơng pháp xác định khả năng chịu muối mật và axit

Phƣơng pháp định danh các chủng Lactobacillus bằng giải trình tự gen 16S rRNA

Định tính và định lƣợng H2O2

Khả năng chịu pH axit và muối mật của các chủng đƣợc chọn lọc

Khả năng ức chế sinh trƣởng trên vi khuẩn gây bệnh S. aureus

Lời cảm ơn: Công trình này được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số CT0000.03/18-19 do TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung làm chủ nhiệm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Belicová A., Mikulášová M., Dušinský R., 2013. Probiotic potential and safety properties of Lactobacillus plantarum from Slovak Bryndza cheese. BioMed research international, 2013(ID 760298): 8 pp.

KẾT LUẬN

Ngƣời chịu trách nhiệm liên lạc. E-mail: nttnhung@gmail.com

Từ khóa: Cis-9, trans-11 CLA, Lactobacillus; linoleate isomerase; trans-10, cis-12 CLA

Nguồn mẫu phân lập

Phân lập vi khuẩn Lactobacillus

Tuyển chọn các chủng Lactobacillus biểu hiện enzyme isomerase

Xác định các đồng phân CLA bằng sắc ký khí

Xác định khả năng chuyển hóa LA thành các đồng phân cis-9, trans-11 và trans-10, cis-12 CLA

Phân lập và tuyển chọn chủng Lactobacillus

Khả năng chuyển hóa LA thành CLA

Hình 1. Hoạt tính chuyển hóa LA (0.5 mg/mL) thành CLA của 19 chủng vi khuẩn

Gen quy định enzyme mã hóa cho LA isomerase

Các loại đồng phân CLA khác nhau được tạo ra

Hình 2. Gen mã hóa linoleic acid isomerase của 4 chủng LA 02, LA05, LA12 và LA16. (1) cla-hy; (2): cla-dc; (3) cla-er ; (4): cla-dh.

Bảng 1. Tỉ lệ thành phần của các CLA.

Linoleic acid (%)

cis-9, trans-11 CLA (%)

trans-10, cis-12-CLA (%)

Thành phần CLA khác (%)

LA 2

LA 5

LA 14

LA 16

Lời cảm ơn. Công trình này được thực hiện với sự hỗ trợ về kinh phí của đề tài Nafosted Mã số 106.04- 2017.313, chủ nhiệm: TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung.

Keywords: Cis-9, trans-12 CLA, Lactobacillus; linoleate isomerase; trans-10, cis-12 CLA;

Có thể bạn quan tâm

Câu hỏi ôn thi môn Giải phẫu sinh lý

Bài giảng Thực hành giải phẫu

Bài giảng Đặc điểm bộ máy tiêu hóa trẻ em - ThS. BS. Nguyễn Thị Nguyên Thảo

Đề thi giữa học kì 1 môn KHTN lớp 8 năm 2023-2024 - Trường THPT Lương Thế Vinh, Điện Biên

Bài giảng Khảo sát chức năng sinh lý hệ tiêu hóa - gan mật tụy bằng hình ảnh học - ThS. Nguyễn Phạm Bảo Ngọc

Sinh lý bệnh hệ tiêu hóa (15 trang)

Bài giảng Sinh lý bệnh hệ tiêu hóa - ThS.BS. Nguyễn Nữ Hải

Đề thi học kì 1 môn Sinh học lớp 8 năm 2022-2023 - Trường THCS&THPT Quyết Tiến

Bài giảng Ôn tập Hệ tiêu hóa Nhi - ThS. Huỳnh Ngọc Thanh

Bài giảng Sự hình thành và phát triển của hệ tiêu hóa - TS.BS. Hoàng Anh Vũ

Bài giảng Cấu trúc vi thể bình thường của các tuyến tiêu hóa - TS.BS. Hoàng Anh Vũ

Bài giảng Thực tập: Cấu trúc vi thể bình thường của hệ tiêu hóa

Bài giảng Nguyên tắc sử dụng glucocorticoid

Bài giảng Điều hòa hoạt động hệ tiêu hóa - BS Nguyễn Bình Thư

Bài giảng Giải phẫu hệ tiêu hóa: Gan, mật, tụy - TS.BS. Nguyễn Hoàngvũ

Bài giảng Giải phẫu hệ tiêu hóa: Miệng, thực quản và dạ dày - TS.BS. Nguyễn Hoàngvũ

Bài giảng Xét nghiệm hoá sinh gan - Lâm Vĩnh Niên

Bài giảng Hệ tiêu hoá trực tràng ống hậu môn - TS. BS Võ Văn Hải

Sinh lý bệnh hệ tiêu hóa

Bài giảng Khám sàng lọc bệnh lý tiêu hóa trong khám tuyển nghĩa vụ quân sự

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh