Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tìm hiểu vai trò của Auxin trong sự phát sinh hình thái chồi in vitro từ mô phân sinh ngọn của cây đậu Vigna Angularis (Willd.) Ohwi Et Ohashi

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:103

Thêm vào BST

Báo xấu

135
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tìm hiểu vai trò của Auxin trong sự phát sinh hình thái chồi in vitro từ mô phân sinh ngọn của cây đậu Vigna Angularis (Willd.) Ohwi Et Ohashi tìm hiểu về các biến đổi hình thái của mô phân sinh ngọn chồi trong quá trình phát sinh chồi, sự phát triển chồi nách từ cây in vitro và cây trong vườn,... Mời các bạn tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tìm hiểu vai trò của Auxin trong sự phát sinh hình thái chồi in vitro từ mô phân sinh ngọn của cây đậu Vigna Angularis (Willd.) Ohwi Et Ohashi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH PHẠM MỸ NGỌC TÌM HIỂU VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CHỒI IN VITRO TỪ MÔ PHÂN SINH NGỌN CỦA CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS (WILLD.) OHWI ET OHASHI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS BÙI TRANG VIỆT TS. LÊ THỊ TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2011
LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS. TS. Bùi Trang Việt, Trưởng Bộ môn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Tp. HCM, người đã giảng dạy, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập và hoàn chỉnh bài luận văn. TS. Lê Thị Trung đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành luận văn. TS. Trần Thanh Hương, Th.S Trần Thị Thanh Hiền, Th.S Phan Ngô Hoang, Th.S Trịnh Cẩm Tú đã tận tình giúp đỡ và đóng góp những ý kiến chân tình, những kinh nghiệm bổ ích cho luận văn của em. Quý thầy cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến cho luận văn của em. Ban chủ nhiệm và toàn thể quý thầy cô khoa Sinh Học trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh. Các bạn cao học khoá 19, CN. Hồ Thị Mỹ Linh (Chuyên viên Phòng thí nghiệm khoa Sinh trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh) đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Em Như (Cao học khoá 18 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh) và các em Huyên, Phước, Quỳnh sinh viên năm thứ IV đang thực hiện đề tài tại Bộ môn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, đã hỗ trợ tôi trong việc tìm kiếm sách và tài liệu tham khảo.
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................... 1 7T T 7 MỤC LỤC ............................................................................................................................ 2 7T T 7 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. 6 7T 7T MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 7 7T T 7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 8 7T T 7 1.1. Giới thiệu về cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi ................................. 8 7T T 7 1.1.1. Phân loại học ........................................................................................................ 8 T 7 7T 1.1.2. Mô tả đặc điểm hình thái cây Đậu ........................................................................ 8 T 7 T 7 1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật .................................................................................... 8 7T 7T 1.2.1. Khái niệm............................................................................................................. 8 T 7 7T 1.2.2. Mô phân sinh ngọn chồi ....................................................................................... 9 T 7 7T 1.2.2.1. Đặc điểm ....................................................................................................... 9 T 7 7T 1.2.2.2. Cấu trúc của mô phân sinh ngọn chồi .......................................................... 10 T 7 T 7 1.2.2.3. Sự phân bào của mô phân sinh ngọn chồi .................................................... 11 T 7 T 7 1.2.3. Hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi .............................................................. 11 T 7 T 7 1.2.3.1. Trong giai đoạn nảy mầm của hạt và tăng trưởng của cây mầm ................... 11 T 7 T 7 1.2.3.2. Trong giai đoạn sinh sản của cây trưởng thành ............................................ 12 T 7 T 7 1.2.4. Sự phát triển chồi ............................................................................................... 12 T 7 7T 1.2.4.1. Sự phát triển chồi nách ................................................................................ 12 T 7 7T 1.2.4.2. Sự hình thành và phát triển chồi bất định..................................................... 13 T 7 T 7 1.3. Vai trò của auxin và các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình 7T thái ngọn chồi .................................................................................................................. 14 7T 1.3.1. Vai trò của auxin ................................................................................................ 14 T 7 7T 1.3.2. Vai trò của cytokinin .......................................................................................... 16 T 7 7T
1.3.3. Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh chồi .......................................... 17 T 7 T 7 1.3.3.1. Tăng sinh chồi bên ...................................................................................... 17 T 7 7T 1.3.3.3. Sự hình thành rễ .......................................................................................... 18 T 7 7T CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................................. 19 7T T 7 2.1.Vật liệu ...................................................................................................................... 19 7T T 7 2.2.Phương pháp .............................................................................................................. 19 7T 7T 2.2.1.Quan sát sự tăng trưởng cây Đậu đỏ Vigna angularis ở trong vườn ..................... 19 T 7 T 7 2.2.2.Khử trùng hạt ...................................................................................................... 19 T 7 7T 2.2.3. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây T 7 Đậu đỏ ......................................................................................................................... 19 T 7 2.2.4. Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn T 7 chồi cây Đậu đỏ ........................................................................................................... 20 7T 2.2.5. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi ..................... 21 T 7 T 7 2.2.5.1. Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu T 7 đỏ in vitro 6 ngày tuổi .............................................................................................. 21 7T 2.2.5.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l và BA theo thời gian lên sự tăng T 7 sinh và tăng trưởng chồi ........................................................................................... 21 7T 2.2.6. Quan sát hình thái giải phẫu ............................................................................... 22 T 7 T 7 2.2.7. Đo cường độ quang hợp và cường độ hô hấp ..................................................... 23 T 7 T 7 2.2.8. Đo hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật ........................................... 23 T 7 T 7 2.2.9.Xử lý số liệu ........................................................................................................ 23 T 7 7T CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 24 7T T 7 3.1. Kết quả ...................................................................................................................... 24 7T T 7 3.1.1. Quan sát sự tăng trưởng của cây trong vườn....................................................... 24 T 7 T 7 3.1.2. Nuôi cấy hạt để tạo cây in vitro trên môi trường MS .......................................... 26 T 7 T 7 3.1.3. Sự phát triển chồi mầm ...................................................................................... 26 T 7 7T
3.1.3.1. Trong giai đoạn hạt nảy mầm ...................................................................... 26 T 7 T 7 3.1.3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi và trọng lượng khô theo thời gian từ giai đoạn T 7 hạt đến cây mầm 5 ngày tuổi .................................................................................... 27 7T 3.1.3.3. Ảnh hưởng của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật lên sự phát triển chồi T 7 mầm ......................................................................................................................... 28 T 7 3.1.4. Các biến đổi hình thái của mô phân sinh ngọn chồi trong quá trình phát sinh chồi T 7 T 7 ..................................................................................................................................... 30 3.1.5. Sự phát triển chồi nách từ cây in vitro và cây trong vườn ................................... 33 T 7 T 7 3.1.5.1. Sự phát triển chồi nách từ nách tử diệp của cây in vitro ............................... 33 T 7 T 7 3.1.5.2. Sự phát triển chồi nách từ nách lá của cây in vitro và cây trong vườn.......... 33 T 7 T 7 3.1.6. Quan sát hình thái giải phẫu của chồi nách ......................................................... 36 T 7 T 7 3.1.7. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây T 7 Đậu đỏ ......................................................................................................................... 45 T 7 3.1.8. Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn T 7 chồi cây Đậu đỏ ........................................................................................................... 47 7T 3.1.8.1. Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên môi trường AIA 2 mg/l và sau đó chuyển T 7 sang môi trưòng MS theo thời gian .......................................................................... 47 T 7 3.1.8.2. Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên môi trường MS và sau đó chuyển sang môi T 7 trưòng AIA 2 mg/l theo thời gian ............................................................................ 51 T 7 3.1.9. Sự thay đổi cường độ quang hợp và hô hấp của chồi ngọn sau khi xử lý AIA 2 T 7 mg/l theo thời gian ....................................................................................................... 54 7T 3.1.10. Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình tăng T 7 trưởng chồi................................................................................................................... 55 7T 3.1.11. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi ................... 57 T 7 T 7 3.1.11.1. Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây T 7 Đậu đỏ in vitro 6 ngày tuổi....................................................................................... 57 7T 3.1.11.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l với BA theo thời gian lên sự T 7 tăng sinh và tăng trưởng chồi ................................................................................... 62 7T
3.2. Thảo luận .................................................................................................................... 1 7T 7T CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 12 7T T 7 4.1. Kết luận..................................................................................................................... 12 7T T 7 4.2. Đề nghị ..................................................................................................................... 12 7T T 7 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 14 7T 7T PHỤ LỤC ........................................................................................................................... 18 7T T 7
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abcisic acid AIA : Acetic indol acid BA : Benzyl Adenin CĐHTTTV : Chất điều hoà tăng trưởng thực vật G1 R R : ( G : gap, khoảng gián đoạn) - Tế bào ở trạng thái trưởng thành GA 3 R R : Giberelic acid IBA : Indol Butyric acid MS : Murashige và Skoog TLT : Trọng lượng tươi TLK : Trọng lượng khô cs : cộng sự
MỞ ĐẦU Phát sinh hình thái là cơ sở cho việc vi nhân giống thực vật mà hiện nay đang rất được quan tâm. Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới sự phát sinh liên tục mô và cơ quan mới ở thực vật nhờ hoạt động của các nhóm tế bào gốc không phân hóa (undifferentiated stem cells) được gọi là mô phân sinh. Hơn nữa, kiểm soát hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi ở mức phân tử dưới tác động của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, đặc biệt là auxin và cytokinin, gần đây được nghiên cứu bởi nhiều tác giả. Do đó, đề tài tập trung nghiên cứu trên cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi, rất thông dụng ở Việt Nam, để hiểu về hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi dưới tác động của auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin. Việc khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự phát sinh hình thái chồi ở cây Đậu được thực hiện dưới các khía cạnh hình thái học và sinh lý học, qua đó bổ sung thêm kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu, ứng dụng trong sự vi nhân giống và giảng dạy.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 1.1.1. Phân loại học Cây Đậu được dùng trong đề tài này là cây Đậu đỏ, được phân loại như sau: Ngành : Magnoliophyta 7T T 7 Lớp : Magnoliopsida 7T T 7 Bộ : Fabales 7T T 7 Họ : Fabaceae 7T T 7 Chi : Vigna 5T Loài 5T : Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (Phạm Hoàng 5T Hộ, 1999) 1.1.2. Mô tả đặc điểm hình thái cây Đậu Cây Đậu đỏ (adzuki bean) là loại cỏ nhất niên, đứng hay leo. Cây có chiều cao trung bình 50-80 cm, có cạnh và lông dài. Cuống lá dài 10-12 cm, có lông. Lá thường có hình xoan, đầu tròn, có thùy, dài 6-8 cm và có lông. Mỗi lá gồm 4-5 cặp gân phụ. Hoa mọc thành chùm ở nách lá, dài 3-10 cm, có màu vàng nhạt. Đài hoa có 5 răng ngắn. Trái dài 6-10 cm và rộng 0,7 cm, có chót nhọn. Hột dài 6-10 mm, có màu nâu. Bộ nhiễm sắc thể của Đậu đỏ 2n = 22. Cây Đậu đỏ được trồng nhiều ở Nha Trang, Sài Gòn,… và được trồng để lấy hạt. Ảnh 1.1. Cây Đậu đỏ Vigna angularis (Willd.) Ohwi Công dụng của cây Đậu đỏ : rễ dùng để đắp trị sưng; et Ohashi hột giúp lợi tiểu, trị kiết… (Phạm Hoàng Hộ, 1999). (http://www.botanyvn.com/cnt.a sp?param=news&newsid=934) 1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật 1.2.1. Khái niệm Sự phát sinh hình thái thực vật là sự phát triển cơ thể thực vật theo thời gian để hoàn tất chu trình phát triển. Phát triển chỉ những thay đổi của tế bào, mô hay cơ quan từ lúc khởi đầu cho
đến lúc trưởng thành. Phát sinh hình thái thực vật bao gồm phát sinh mô (histogenesis), phát sinh cơ quan (organogenesis) và phát sinh phôi (embryogenesis) (Bùi Trang Việt, 2000). Trong sự phát sinh cơ quan in vitro, có thể tạo các cơ quan theo con đường phát sinh cơ quan trực tiếp (các cơ quan tạo ra trực tiếp từ mẫu cấy) hay gián tiếp (mẫu cấy tạo mô sẹo, sau đó các cơ quan tạo ra từ mô sẹo này) (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai quá trình căn bản sau: - Sự điều hoà hướng kéo dài tế bào. - Sự kiểm soát vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia của tế bào. Chính kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết định hình thái của cơ quan và cơ thể thực vật (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát triển ở mức tế bào thể hiện qua hai chuỗi thay đổi: tăng trưởng (phân chia và kéo dài tế bào) và phân hóa tế bào. Ở thực vật, sự phân chia và kéo dài tế bào tách biệt nhau theo không gian và thời gian (Bùi Trang Việt, 2000). Môn phát sinh hình thái là môn học nhằm mô tả các biến đổi hình thái và cấu trúc, phân tích các yếu tố nội sinh và ngoại sinh, và nghiên cứu sự điều hòa hình thái thực vật. Sự phát sinh hình thái liên quan một cách toàn diện đến nguồn gốc và sự phát triển hình thái thực vật. Do đó, không có một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nó. Những kỹ thuật của nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều có thể giúp tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái. Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp được dùng nhiều nhất là: - Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đó. - Nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời của một cơ thể thực vật. Trong các thí nghiệm in vitro, các nghiên cứu sinh lý học thường khó tiến hành do kích thước quá nhỏ bé của các loại mô cấy, nên sự áp dụng các chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại sinh là cách hữu hiệu để tìm hiểu về sự phát sinh hình thái thực vật (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới sự phát sinh liên tục mô và cơ quan mới ở thực vật nhờ hoạt động của các nhóm tế bào gốc không phân hóa (undifferentiated stem cells) được gọi là mô phân sinh (Vernoux và cs, 2010). 1.2.2. Mô phân sinh ngọn chồi 1.2.2.1. Đặc điểm
Các mô phân sinh là những vùng riêng biệt luôn hiện diện trong đời sống thực vật. Các tế bào ở vùng mô phân sinh có khả năng phân chia không ngừng, tế bào nhỏ, xếp sát nhau và không có khoảng gian bào. Tế bào chất của tế bào mô phân sinh có độ nhớt cao, có nhiều không bào nhỏ li ti, số lượng các bào quan (ribosome, ty thể, lạp thể) nhiều. Nhân lớn chiếm vị trí trung tâm. Như vậy, cấu tạo của tế bào mô phân sinh nói lên hoạt tính sinh lý cao của chúng (Bùi Trang Việt, 2000). Mô phân sinh là cơ sở hình thành các mô vĩnh viễn. Nhờ hoạt động của mô phân sinh mà cây sinh trưởng và phát triển. Trong quá trình sinh phôi, mô phân sinh ngọn chồi phát triển ở vùng giữa hai sơ khởi lá mầm (đối với cây hai lá mầm) hay ở gốc của thuẫn (đối với cây một lá mầm). Mô phân sinh ngọn chồi có đường kính 100 – 200 µ m (Bùi Trang Việt, 2000). Khi cây trưởng thành, mô phân sinh ngọn nằm ở ngọn của chồi chính, chồi bên của thân và ở ngọn rễ. Các mô phân sinh ngọn hoạt động phân chia suốt cả đời sống của cây, giúp cây dài ra (Nguyễn Như Khanh, 2009). 1.2.2.2. Cấu trúc của mô phân sinh ngọn chồi Có nhiều quan điểm về tổ chức của mô phân sinh ngọn chồi, trong đó quan điểm thường gặp nhất là sự tổ chức của mô phân sinh ngọn chồi thành các vùng hay lớp phân biệt (Esau, 1967). Mô phân sinh ngọn chồi Arabidopsis có ba lớp: L1, L2, và L3. L1 là lớp ngoài cùng (lớp ngoại vi), L2 là lớp bên trong lớp ngoại vi. L1 và L2 tạo nên vỏ. L3 là lớp thể và ở giữa là vùng đỉnh. Vỏ cho các lớp biểu bì và dưới biểu bì của thân và lá. Một số ít tế bào từ các phân chia trong vỏ và thể cho sơ khởi lá, thân, nụ nách và các bộ phận của hoa (nếu là nụ hoa) (Bùi Trang Việt, 2000). Nếu chia mô phân sinh ngọn chồi theo vùng thì mô phân sinh ngọn chồi được chia thành ba vùng chính: - Vùng đỉnh (vùng mô phân sinh chờ) chứa các tế bào có không bào lớn, tế bào chất chứa ít rRNA, chu kì tế bào rất dài, hoạt tính phân chia thấp, tế bào chủ yếu ở pha G 1 . Vùng này còn R R được gọi là mô phân sinh chờ vì chúng chỉ hoạt động khi mô phân sinh ngọn chuyển sang trạng thái sinh sản. - Vùng bên (vùng khởi sinh, hay vùng phát sinh cơ quan) chứa các tế bào nhỏ hơn với không bào nhỏ, giàu rRNA, có hoạt tính phân chia cao. Chu kì tế bào (pha G 1 ) ngắn. Đây là vùng R R phát sinh lá và các mô của thân (bao gồm các mô dẫn). - Vùng lõi (vùng phát sinh mô) nằm dưới vùng đỉnh, chứa các tế bào có không bào lớn, hàm lượng rRNA ít hơn so với vùng đỉnh, hoạt tính phân chia và chu kì phân chia tế bào của vùng này ở mức trung gian so với vùng đỉnh và vùng bên (Bùi Trang Việt, 2000; Taiz và Zeiger, 2002).
Vùng lõi là vùng phát sinh mô lõi của thân trong khi các cơ quan khác đều xuất phát từ vùng bên (Esau, 1967). Theo một cách phân chia khác, tổ chức mô phân sinh ngọn chồi gồm tunica (vỏ) và corpus (thể). Ở Arabidopsis và hầu hết cây hai lá mầm, tunica gồm lớp L1 bao phủ phía ngoài mô phân sinh ngọn chồi và lớp L2 nằm ngay dưới lớp L1. Corpus (được gọi là L3) không phải là một lớp tế bào đơn lẻ mà là nhóm các tế bào ngay dưới tunica (Evert, 2006). 1.2.2.3. Sự phân bào của mô phân sinh ngọn chồi Các tế bào ở lớp áo bọc ngoài hay tunica (hai hay ba lớp) xếp đều dặn, bao quanh các tế bào trung tâm, và phân chia theo những mặt phẳng vuông góc với bề mặt của phôi (anticlinial division). Các lớp tế bào trung tâm (thể corpus) phân bố không đều đặn và phân chia theo các mặt phẳng khác nhau (Nguyễn Như Khanh, 2009). 1.2.3. Hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi 1.2.3.1. Trong giai đoạn nảy mầm của hạt và tăng trưởng của cây mầm Từ hợp tử, sự phát triển phôi trong hạt được kiểm soát theo thời gian và không gian qua hai giai đoạn chính: sinh phôi và trưởng thành của phôi. Kết quả của sự phát triển phôi trong noãn là hạt chín, vỏ noãn sẽ mất hầu hết nước và tạo nên vỏ hạt bền chắc bao quanh phôi và nội nhũ. Vào lúc đó, phôi ngừng phát triển và hạt ở vào trạng thái ngủ. Hạt sẽ không phát triển tiếp cho đến khi nảy mầm. Như vậy, sự nảy mầm của hạt thường chỉ xảy ra sau một giai đoạn khô (giai đoạn ngủ) ở cuối giai đoạn trưởng thành của phôi. Phôi đang ngủ bao gồm thân mầm và rễ mầm chứa mô phân sinh đỉnh. Các mô phân sinh sẽ tạo ra các tế bào làm cho phôi dài ra khi hạt nảy mầm (Bùi Trang Việt, 2000). Sự nảy mầm của hạt được xem như là sự tái lập tăng trưởng của phôi. Quá trình này bắt đầu từ sự tái thu nước của hạt cho tới sự lú rễ mầm ra khỏi hạt. Các đặc tính quan trọng nhất của sự nảy mầm là: hấp thu nước mạnh, hoạt tính biến dưỡng mạnh, và phát sinh nhiệt mạnh (Bùi Trang Việt, 2000). Sự nảy mầm cuả hạt gồm ba giai đoạn chính: - Giai đoạn thu nước (6 – 12 giờ tùy loại hạt) Hạt (nhất là phôi) thu nước mạnh, phồng lên và tăng trọng lượng tươi. Sự thu nước đi kèm với sự gia tăng cường độ hô hấp, biểu hiện của sự tái lập hoạt tính biến dưỡng. - Giai đoạn nảy mầm theo nghĩa hẹp (12 – 48 giờ)
Giai đoạn này bắt đầu bởi sự bão hòa nước và cường độ hô hấp ở mức cao của hạt, các phản ứng biến dưỡng bắt đầu, các chất dự trữ bị thủy giải và được phôi đồng hóa. Kế đó, phôi tái lập sự phân chia tế bào, vỏ hạt bị rách, rễ mầm lú ra khỏi các vỏ hạt (1 – 2 mm), thân mầm kéo dài ra. - Giai đoạn tăng trưởng của cây mầm Trong giai đoạn này, hạt thu thêm nước và tăng thêm cường độ hô hấp, tương ứng với sự tăng trưởng đáng kể của rễ mầm và thân mầm. Hoạt tính biến dưỡng của cây mầm (từ phôi) tăng mạnh, nhưng hoạt tính biến dưỡng của mô dự trữ (phôi nhũ, tử diệp) giảm mạnh, các chất dự trữ cạn dần. Ở trạng thái này, sự khử nước làm hạt chết (Bùi Trang Việt, 2000). 1.2.3.2. Trong giai đoạn sinh sản của cây trưởng thành Hoa được thành lập từ chồi ngọn hay chồi nách. Để một chồi dinh dưỡng trở thành sinh sản, thực vật cần phải đạt tới trạng thái phát triển tối thiểu hay trưởng thành ra hoa. Sự chuyển tiếp ra hoa gây nên các biến đổi sâu sắc của mô phân sinh ngọn, từ mô phân sinh dinh dưỡng thành mô phân sinh tiền hoa. Quá trình ra hoa biểu thị qua sự thay đổi về hình thái và sinh lý của mô phân sinh ngọn chồi (Bùi Trang Việt, 2000). Như vậy, mô phân sinh ngọn chồi khi đã đạt đến một trạng thái nhất định nó sẽ diễn ra các hoạt động biến đổi từ trạng thái tăng trưởng sinh dưỡng không hạn định sang trạng thái phát triển sinh sản hạn định. Các biến đổi trong giai đoạn này thường không quan sát được bằng mắt thường hoặc kính hiển vi, chỉ biết được bởi các phân tích bằng tế bào học hay sinh hoá học, với sự tăng mạnh hoạt tính biến dưỡng: rút ngắn chu kỳ tế bào, gia tăng hoạt tính phân chia, đặc biệt trong vùng đỉnh (Bùi Trang Việt, 2000). Mô phân sinh ngọn chồi tăng cường tổng hợp RNA, tăng tốc độ tổng hợp protein, các enzym chuyển hóa (invertase) tăng cường hoạt động, số lượng ti thể gia tăng, hàm lượng sucrose và ATP cũng tăng. Bên cạnh đó, chu trình tế bào ở mô phân sinh được rút ngắn lại, tăng tỷ lệ phân chia tế bào. Ở mô phân sinh dinh dưỡng, các tế bào ở vùng đỉnh phân chia rất chậm. Chính sự phân chia nhanh của vùng đỉnh khiến cho mô phân sinh hoa lớn hơn mô phân sinh dinh dưỡng (Taiz và Zeiger, 2002). Sự biến đổi này thể hiện rất rõ ở bộ máy dinh dưỡng, đặc biệt là sự kéo dài lóng thân do sự phân chia tế bào mạnh của vùng dưới ngọn của mô phân sinh tiền hoa. Các biến đổi chỉ ở mức tế bào nhưng rất quan trọng, quyết định sự biến đổi ở mức cơ quan sau này (Bùi Trang Việt, 2000). 1.2.4. Sự phát triển chồi 1.2.4.1. Sự phát triển chồi nách
Chồi nách hiện diện ở nách lá, được tạo bởi mô phân sinh ngọn và các phát thể lá xếp chồng lên nhau. Sự phát triển của chồi nách (sự phát sinh chồi) bao gồm sự tổ chức của một mô phân sinh ngọn chồi (có cấu trúc giống với mô phân sinh ngọn của thân chính), sự kéo dài và sự phân hoá các mô. Chồi nách có nguồn gốc ngoại sinh, ngược với nguồn gốc nội sinh của rễ nhánh (Bùi Trang Việt, 2000). Các chồi nách thường bị cản phát triển do bị chồi ngọn ức chế (hiện tượng ưu thế ngọn). Hiện tượng này có thể do auxin tổng hợp ở ngọn di chuyển đến chồi nách và cản sự phát triển của chồi nách (do hiệu ứng cản tăng trưởng của auxin) hoặc do có sự cạnh tranh dinh dưỡng (chồi ngọn thu hút chất dinh dưỡng mạnh về phía nó) hoặc do auxin kích thích sự tiết chất cản (etylen hoặc ABA) cản sự phát triển của chồi (Bùi Trang Việt, 2000). Các chồi bên có thể được cảm ứng phát triển bằng cách phá bỏ ưu thế ngọn. Cho nên người ta có thể cắt bỏ chồi ngọn để chồi nách phát triển. Trong nuôi cấy in vitro, các chồi nách có thể được kích thích phát triển mạnh bởi việc bổ sung cytokinin vào môi trường. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu thế ngọn để các chồi bên có thể phát triển (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát triển thân và nhánh: Thân phát triển từ chồi ngọn, nhánh từ chồi nách. Sự tăng trưởng chồi nhờ mô phân sinh ngọn được bổ sung bởi sự tăng trưởng lóng nhờ mô phân sinh lóng (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát triển lá: Lá bắt nguồn từ bề mặt của mô phân sinh đỉnh dạng nón và do sinh trưởng sơ cấp tạo nên. Lá có sự tăng trưởng bề mặt và đời sống giới hạn. Các tế bào trong sơ khởi lá tiếp tục phân chia và gia tăng kích thước tạo nên cuống và phiến lá (Bùi Trang Việt, 2000). 1.2.4.2. Sự hình thành và phát triển chồi bất định Chồi bất định xuất hiện không chỉ liên hệ với mô phân sinh chóp mà còn xuất hiện gần vết thương, gần chỗ vết cắt, gần vùng phát sinh libe-mộc hoặc ngoài biểu bì. Vì vậy chồi có thể có nguồn gốc nội sinh hoặc ngoại sinh do một sự khử phân hóa các tế bào trưởng thành. Chúng cũng khởi sự bằng những phân chia tế bào và sắp xếp tế bào giống như sinh mô chóp và có mạch gắn liền với mạch của thân (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Mô phân sinh ngọn chồi có thể từ tế bào biểu bì, mô hàng rào, mô khuyết hay mô bao quanh mạch của mô cấy. Trước khi phân hóa để hình thành tầng phát sinh chồi được tạo mới, tế bào đã phân hóa phải trải qua quá trình tái hoạt động. Sự tái hoạt động này có thể được cảm ứng trên cây nguyên bằng cách đàn áp các hiệu ứng cản tương quan (gỡ ưu tính ngọn bằng cách cắt bỏ chồi ngọn) hay trên mô cấy nhờ các môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất điều hoà thích hợp. Có hai
giai đoạn xảy ra trong quá trình tái hoạt động: giai đoạn khử phân hóa và giai đoạn tái phân hoá (Gautheret, 1966; Bùi Trang Việt, 2009). Trong giai đoạn khử phân hóa, tế bào đã phân hóa bắt đầu phân chia, các cơ quan bên trong tế bào biến đổi để trở về trạng thái của các tế bào mô phân sinh thứ cấp (hạch nhân, không bào lớn dần và ty thể, lạp thể phân chia thành các bóng nhỏ). Sau đó là bước chuyển tiếp từ tế bào ở trạng thái mô phân sinh thứ cấp sang trạng thái mô phân sinh sơ cấp có khả năng sinh cơ quan. Lúc này không bào phân chia thành những không bào nhỏ. Tế bào có thể tích nhỏ dần, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân và hạch nhân rất to (Bùi Trang Việt, 2009). Tiếp theo là giai đoạn tái phân hóa của mô phân sinh sơ cấp. Tế bào trở lại trạng thái mô phân sinh thứ cấp. Sự tái phân hóa cũng qua hai bước: bước một, tế bào trở về trạng thái mô phân sinh hoạt động, các không bào trương nước và hợp thành không bào trung tâm, kích thước tế bào gia tăng, ty thể dần trở về hình dạng đặc trưng; bước hai, các lạp phân hóa, các chất sống căn bản (hạch nhân, tế bào chất…), chất dự trữ, các chất tiết (tanin, tinh dầu…) được tổng hợp. Sau đó, các tế bào này có thể trở lại giai đoạn phân chia tế bào mới hay trực tiếp phân hóa mà không qua sự phân chia tế bào (Bùi Trang Việt, 2000). Trong tự nhiên, sự tạo mới chồi trực tiếp có thể xảy ra ở các chỗ khuyết trên lá một số loại sống đời, từ mô phân sinh trong gân lá dương xỉ (Bùi Trang Việt, 2000). Tóm lại, sự phát sinh chồi bất định gồm các giai đoạn: - Đầu tiên là sự hình thành các khối sinh mô (có liên hệ với trung tâm mô phân sinh chồi hay các mô phân sinh) - Tiếp theo là sự hình thành sơ khởi chồi - Cuối cùng là chồi bất định được hình thành từ sơ khởi dạng kim và đỉnh vòm (Soh và Bhojwani, 1999). 1.3. Vai trò của auxin và các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái ngọn chồi 1.3.1. Vai trò của auxin Auxin đóng vai trò trung tâm trong hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi (cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào). Tuy nhiên auxin lại phân bố không đồng đều trong mô phân sinh ngọn. Một trong những yếu tố điều hòa lượng auxin là các chất vận chuyển auxin thuộc các họ PIN và AUX (Vernoux và cs, 2010). Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên nó có vai trò quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân
sinh (ngọn và lóng) và lá non (tức là các nơi có sự phân chia tế bào nhanh). Sau đó, auxin di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ (Taiz và Zeiger, 2002; Bùi Trang Việt, 2000). Ở mức tế bào, auxin kiểm soát sự phân chia, kéo dài và phân hoá tế bào. Các tế bào biểu bì hay dưới biểu bì phản ứng mạnh nhất với auxin. Auxin kích thích mạnh sự phân chia của tế bào tượng tầng (tầng phát sinh libe- mộc), nhưng hầu như không tác động trên mô phân sinh sơ cấp. Do đó auxin tác động trên sự tăng trưởng theo đường kính. Đồng thời auxin giúp sự phân hóa của các mô dẫn, và có khả năng cảm ứng trực tiếp sự phân hoá tế bào nhu mô thành các tổ chức mô dẫn (Bùi Trang Việt, 2000). Nồng độ của auxin có ảnh hưởng trong sự kéo dài tế bào. Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu và tế bào vùng kéo dài dưới ngọn của thân. Sự kéo dài tế bào rễ cần những nồng độ thấp hơn nhiều so với tế bào thân. Trong cả hai trường hợp, hiệu ứng auxin giảm sau một nồng độ tối hảo, và trở nên độc ở các nồng độ quá cao. Hoạt tính kéo dài tế bào của auxin là do auxin tác động lên bơm proton màng nguyên sinh chất. Sự kéo dài tế bào là một quá trình phức tạp: hấp thu nước, dãn dài vách dưới sức trương, đặt các hợp chất mới của vách giữa các mạng vi sợi celluloz, sinh tổng hợp protein và các chất khác (Bùi Trang Việt, 2000). Trong quá trình tạo chồi Auxin ở nồng độ thấp cần cho sự tạo chồi. Auxin kết hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Ở nồng độ cao, auxin cản sự phát triển của phát thể chồi vừa được thành lập hay của chồi nách (Bùi Trang Việt, 2000). Sự vận chuyển hữu cực của auxin có vai trò thiết lập, duy trì tính hữu cực của thực vật và các cơ quan của chúng. Việc cản sự vận chuyển hữu cực của auxin có thể dẫn tới nhiều tính bất thường, trong phôi và có thể dẫn đến sự chết. Tác dụng của auxin tùy thuộc vào kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu; loại và hàm lượng auxin nội sinh có trong mẫu cấy; tính nhạy của mô thực vật với auxin; sự tương tác qua lại giữa auxin nội sinh và auxin ngoại sinh; sự kìm hãm hoạt tính của auxin (bị oxy hoá hay liên kết) trong môi trường và trong mô cấy (Machakova và cs, 2008). Trong quá trình tạo rễ Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ và ở nồng độ thấp cần cho sự tạo chồi. Trong hầu hết các loài thực vật, sự hình thành rễ bất định đều được khởi phát bởi auxin, nhưng trong một vài loài thì auxin ngoại sinh dường như ít ảnh hưởng. Sự tăng lượng AIA cần thiết trong giai đoạn cảm ứng tạo sơ khởi rễ, nhưng sự giảm hàm lượng AIA sau đó cho phép sự kéo dài sơ khởi rễ. Như vậy auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ, nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi này (Bùi Trang Việt, 2000).
Số lượng rễ trên mỗi chồi thường tăng theo nồng độ auxin xử lý. Nhưng nếu nồng độ auxin quá cao sẽ có sự hình thành callus, rễ có hình dạng không bình thường và không kéo dài, sau đó thì sự tăng trưởng của chồi sẽ bị giảm (George, 1996). Điều này cho thấy, trong cùng một quá trình sinh lý, auxin có thể có những hiệu ứng khác nhau, thậm chí đối nghịch tùy theo nồng độ và cơ quan nuôi cấy. Ở một nồng độ nào đó, auxin có hiệu ứng khác nhau đối với các quá trình sinh lý khác nhau của một cơ quan (như sự kéo dài và phát triển rễ), hay đối với một quá trình sinh lý của những cơ quan khác nhau (như sự kéo dài của thân và rễ, sự phát triển chồi và rễ). Đối với sự phân hóa cơ quan, auxin có hiệu ứng thay đổi theo thời gian, vì hàm lượng auxin thay đổi theo sự phát triển (Bùi Trang Việt, 2000). Tóm lại, auxin có vai trò quan trọng trong sự đáp ứng của thực vật đối với các tín hiệu từ môi trường như ánh sáng và trọng lực; sự kiểm soát các mối tương quan trong ưu thế ngọn; sự acid hóa vách tế bào, sự tăng trưởng kéo dài tế bào; sự phân chia tế bào; sự hình thành mô sẹo; sự phân hóa mô dẫn và phát triển rễ… (Bùi Trang Việt, 2000). 1.3.2. Vai trò của cytokinin Cytokinin được tổng hợp chủ yếu ở mô phân sinh ngọn rễ và được vận chuyển trong xylem đến chồi. Hoạt động của cytokinin trong sự tăng trưởng tế bào: + Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin. Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. + Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ). Cytokinin ngăn cản sự lão hóa, thúc đẩy sự trưởng thành của diệp lạp và là nhân tố chính điều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi (Taiz và Zeiger, 2002; Bùi Trang Việt, 2000). Hoạt động của cytokinin trong sự tạo cơ quan: + Ở nồng độ cao, cytokinin giúp tạo các cụm chồi. Số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin. Tuy nhiên cũng có những bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi: Chồi được tạo ra trở nên nhỏ, không thể kéo dài đến một kích thước nhất định để có thể được tách ra cho sự hình thành rễ, và tạo ra những lá bất thường (Edwin, 1996). + Ở nồng độ thấp, cytokinin kích thích sự phát triển chồi nách. Nồng độ cao hơn sẽ cảm ứng hình thành chồi bất định nhưng chồi rất khó ra rễ. + Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi được cảm ứng bởi cytokinin nhưng chồi không xuất hiện cho đến khi khúc cắt được chuyển sang môi trường giảm hoặc không có cytokinin. Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi.
Những vấn đề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng độ CĐHTTTV sau một hoặc vài lần cấy chuyền để chồi được phát triển tốt nhất (Edwin, 1996). Cytokinin kích thích sự tăng trưởng của chồi nách và giảm ưu thế ngọn. Do đó trong nuôi cấy, người ta thường bổ sung một hay vài loại cytokinin vào môi trường để cảm ứng tăng trưởng của một vài chồi nhỏ từ mỗi mẫu cấy (Bùi Trang Việt, 2000). Ảnh hưởng của cytokinin trong sự nuôi cấy mô và cơ quan tùy thuộc vào loại cytokinin được sử dụng, kiểu mô cấy, loại thực vật được nuôi cấy, tình trạng mô còn non hay đã già. Trong nuôi cấy chồi, hầu hết các mẫu cấy từ các loài thực vật khác nhau đều cần có cytokinin. BA kích thích sự tăng sinh chồi nách ở cây Castanea trong thí nghiệm của Vieitez và cs (1985) trong khi đó kinetin thì không có ảnh hưởng. Ở cây Corylus avellana, BA 5 mg/l cho tỷ lệ tăng sinh chồi cao nhất từ những mẫu cấy non, nhưng những mẫu cấy đã trưởng thành cần zeatin 10 mg/l (Staden và cs, 2008). 1.3.3. Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh chồi 1.3.3.1. Tăng sinh chồi bên Tỷ lệ tăng sinh chồi trong nuôi cấy chồi thường tùy thuộc vào nồng độ cytokinin áp dụng. Ở một số thực vật, sự kết hợp giữa cytokinin và auxin giúp hiệu quả tăng sinh chồi cao hơn. Khi cytokinin quá cao, nhiều chồi nhỏ hình thành nhưng không thể kéo dài được hoặc có lá bị biến dạng (Staden và cs, 2008). Dưới ảnh hưởng của tỉ lệ cytokinin cao, chồi hình thành dễ bị hiện tượng thủy tinh thể. Mặt khác, chồi hình thành trên môi trường có nồng độ cytokinin cao thường rất khó tạo rễ (George, 1996). 1.3.3.2. Sự hình thành chồi bất định Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản sự phát triển của phát thể chồi vừa thành lập hay của chồi nách, các chồi bây giờ vào trạng thái tiềm sinh. Như ở cỏ ba lá, cytokinin riêng rẽ cảm ứng tạo chồi và số lượng chồi tăng nhanh, nhưng sự thêm auxin vào môi trường nuôi cấy sẽ làm cho chồi khó hình thành hoặc tạo những mô sẹo không mong muốn (Bhojwani, 1981 trong Edwin, 1996). Ở Brassica alboglabra, số lượng chồi hình thành trên môi trường có kinetin sẽ giảm mạnh nếu bổ sung AIA, IBA hoặc NAA (Pua và cs, 1989 trong Edwin, 1996). Cytokinin có hiệu quả trong việc tạo chồi trực tiếp hay gián tiếp. Tác dụng này của cytokinin có khi hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin ở tỉ lệ thích hợp. Tỷ lệ cytokinin với auxin quyết định kiểu tái sinh cơ quan từ mô sẹo chưa phân hóa in vitro: tỷ lệ auxin/cytokinin cao giúp sự
tạo rễ; tỷ lệ auxin/cytokinin thấp giúp sự tạo chồi. Một tỷ lệ cân bằng giữa hai chất ĐHTTTV trên sẽ chỉ tạo nên khối mô sẹo không phân hóa (Mok và cs, 1994). Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin (giúp sự tạo rễ) và cytokinin (giúp sự tạo chồi); sự cân bằng giữa hai hormon này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển (Bùi Trang Việt, 2000). 1.3.3.3. Sự hình thành rễ Nồng độ cytokinin cao (0,5–10 mg/l) thường cản hay làm trì hoãn sự hình thành rễ, đồng thời cản sự tăng trưởng rễ, và làm giảm hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin. Vì vậy, cytokinin thường không được sử dụng trong kích thích tạo rễ của chồi. Đôi khi người ta cũng thấy cytokinin cảm ứng tạo rễ và kích thích tăng trưởng rễ hoặc kích thích sự hình thành rễ bất định khi môi trường không có auxin. Trong hầu hết các trường hợp này thì lượng cytokinin cần rất thấp. Ví dụ chồi của củ cải đường tạo rễ trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l kinetin. Hay ở cây Rosa hybrida thì cần thiết phải thêm BA 1 mg/l cùng với IBA để cảm ứng hình thành và phát triển rễ (Staden và cs, 2008). Không chỉ auxin và cytokinin mà vách tế bào, bộ xương vi ống (microtubule cytoskeleton) cũng liên quan tới sự phát sinh hình thái thực vật nói chung và hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi (Ferguson và Beveridge, 2009; Fleming, 2005; Hamant và cs, 2008).
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.Vật liệu - Hạt Đậu đỏ Vigna angularis (được đóng gói tại công ty TNHH Xuân Hồng 44/12 Phan Xích Long Phường 16. Quận 11. Thành phố Hồ Chí Minh). - Cây in vitro 6 ngày tuổi được cấy từ hạt Đậu đỏ. 2.2.Phương pháp 2.2.1.Quan sát sự tăng trưởng cây Đậu đỏ Vigna angularis ở trong vườn Gieo hạt đã nảy mầm (rễ mầm dài 1-2 mm) vào các chậu (đường kính: 20 cm, chiều cao: 30 cm), mỗi chậu gieo 7 hạt. Lặp lại 3 lần. Theo dõi sự tăng trưởng của cây Đậu về chiều dài cây, chiều dài lá, dạng lá, số lượng nhánh, thời gian tăng trưởng của cây, thời gian ra hoa kết quả, thời gian thu hoạch hạt. 2.2.2.Khử trùng hạt Hạt Đậu đỏ được rửa sạch dưới vòi nước 30 phút, rửa lại bằng xà phòng trong 5 phút, rửa sạch xà phòng và rửa lại với nước cất 4 lần. Sau đó hạt được chuyển vào Erlen. Lắc hạt với cồn 700 P P trong vòng 1 phút và rửa sạch cồn bằng nước cất. Tiếp tục khử trùng bằng dung dịch HgCl 2 0,1 % R R trong 5phút. Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng (5 lần). Sau đó cấy hạt vào các ống nghiệm có đường kính 22 mm, dài 20 cm, chứa 10 ml môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962). 2.2.3. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ Khúc cắt ngọn chồi với chiều dài 5 mm (đã cắt bỏ 2 lá thứ nhất) từ cây in vitro 6 ngày tuổi trên các môi trường MS bổ sung AIA riêng rẽ ở các nồng độ 0,01; 0,1; 1; 2; 5; và 10 mg/l để khảo sát sự tăng trưởng chồi. Mỗi môi trường nuôi cấy gồm 5 mẫu cấy với 3 lần lặp lại. Kết quả được ghi nhận là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại (15 mẫu cấy). Sau 10 ngày nuôi cấy, các chỉ tiêu sau được ghi nhận: - Chiều dài khúc cắt (từ vị trí gốc cắt đến chồi ngọn) - Chiều dài lá (từ vị trí cuống lá đến ngọn lá) - Số lượng rễ / khúc cắt - Chiều dài trung bình của rễ / khúc cắt