Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tối ưu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Trần Thị Thu Quỳnh

TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, 9 TỪ SINH KHỐI VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2020

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Trần Thị Thu Quỳnh

TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, 9 TỪ SINH KHỐI VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP

Chuyên ngành:

Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

Cán bộ hƣớng dẫn 1

Cán bộ hƣớng dẫn 2

TS. Hoàng Thị Yến

GS. TS. Đặng Diễm Hồng

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài: “Tối ƣu hóa điều kiện tách chiết và làm

giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp” là do tôi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Hoàng Thị Yến và GS. TS. Đặng Diễm Hồng. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn chính xác, trung thực. Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều đƣợc trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm và nguồn gốc.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Học viên

Trần Thị Thu Quỳnh

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập và nghiên cứu, để hoàn thành luận văn này, trƣớc tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Hoàng Thị Yến - cán bộ Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và GS. TS. Đặng Diễm Hồng - nguyên trƣởng Phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, lên ý tƣởng, định hƣớng nghiên cứu, tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này.

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ths. Lê Thị Thơm, Ths. Lƣu Thị Tâm - cán bộ Phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hƣớng dẫn, nhiệt tình giúp đỡ em trong các thí nghiệm khi gặp những khó khăn và cũng truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý giá trong công tác nghiên cứu Sinh học.

Luận văn đƣợc thực hiện bằng kinh phí của Đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất omega 6, 7, 9 từ vi khuẩn tía quang hợp ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm” do TS. Hoàng Thị Yến làm chủ nhiệm thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến của Bộ Công thƣơng, năm 2017-2020.

Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc, các thầy, cô giáo thuộc Khoa Công nghệ sinh học và Phòng Đào tạo, Quản lý Khoa học và Hợp tác quốc tế của Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện, hƣớng dẫn, truyền đạt cho em rất nhiều kiến thức trong quá trình học tập tại Học viện.

Xin cảm ơn gia đình, bạn bè và ngƣời thân đã động viên, là hậu phƣơng

vững chắc giúp em có động lực học tập.

Em xin chân thành cảm ơn!

Học viên

Trần Thị Thu Quỳnh

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Việt

VKTQH Vi khuẩn tía quang hợp

Axit béo không bão hào MUFA Monounsaturated fatty acid một nối đôi

Axit béo không bão hòa đa PUFA Polyunsaturated fatty acid nối đôi

Saturated fatty acid Axit béo bão hòa SFA

Unsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa UFA

Optical density Mật độ quang OD

Total fatty acid Axit béo tổng số TFA

Sinh khối khô SKK

Omega Omega ω

HUFA Highly unsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa cao

Eicosapentaenoic acid Eicosapentaenoic acid EPA

Docosahexaenoic acid Docosahexaenoic acid DHA

Docosapetaenoic acid Docosapetaenoic acid DPA

Arachidonic acid Arachidonic acid ARA

Acyl carrier protein Protein mang acyl ACP

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kim loại nặng trong mẫu

dầu sinh học 36

Bảng 2.2. Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật có trong dầu sinh

học 37

Bảng 3.1. Hàm lƣợng sinh khối khô, lipid và omega-3, 6, 7, 9 của VKTQH khi nuôi trong bể quang sinh thể tích 1m3 38

Bảng 3.2. Thành phần axit béo của hỗn hợp MUFAs và PUFAs với tỷ

lệ TFA: urê khác nhau 46

Bảng 3.3. Hiệu suất thu hồi MUFAs, PUFAs và chỉ số iot của mẫu thu

đƣợc sau các lần tạo phức với urê 50

Bảng 3.4. Phân tích chỉ tiêu cảm quan, hóa lý của mẫu dầu sinh học

omega-6, 7, 9 54

Bảng 3.5. Kết quả phân tích hàm lƣợng omega-6, 7, 9. 55

Bảng 3.6. Kết quả phân tích dƣ lƣợng urê, kim loại nặng trong dầu

sinh học giàu axit béo omega-6, 7, 9 56

Bảng 3.7. Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật 56

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Tổng hợp axit béo 17

Hình 1.2. Phản ứng ester hóa dầu mỡ 21

Hình 3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh

khối VKTQH 40

Hình 3.2. Ảnh hƣởng của chất xúc tác lên hiệu suất tách chiết TFA từ

sinh khối VKTQH 41

Hình 3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ sinh khối/ dung môi lên hiệu suất tách

chiết TFA từ sinh khối VKTQH 42

Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian lên hiệu suất tách chiết TFA từ

sinh khối VKTQH 43

Hình 3.5. Ảnh hƣởng của điều kiện khuấy trộn lên hiệu suất tách chiết

TFA từ sinh khối VKTQH 43

Hình 3.6. Hiệu suất tách chiết SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các

tỷ lệ TFA: urê khác nhau. 45

Hình 3.7. Hiệu suất tách chiết SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các

tỷ lệ TFA: urê : methanol khác nhau. 47

Hình 3.8. Hiệu suất tách SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các nhiệt

độ khác nhau. 49

Hình 3.9. Sơ đồ quy trình tách chiết và làm giàu axit béo không no

omega-6, 7, 9 từ sinh khối VKTQH 51

Hình 3.10. Hình ảnh minh họa quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo

omega-6, 7, 9 bằng phƣơng pháp tạo phức urê 53

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1. TỔNG QUAN VỀ LIPID, AXIT BÉO KHÔNG NO MỘT NỐI ĐÔI (MUFAs) VÀ ĐA NỐI ĐÔI (PUFAs) (DẠNG OMEGA-6, 7, 9) 6

1.1.1. Giới thiệu về lipid 6

1.1.2. Giới thiệu về MUFAs và PUFAs (dạng omega-6, 7, 9) 7

1.1.3. Các nguồn cung cấp omega-6, 7, 9 9

1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP (VKTQH) 13

1.2.1. Định nghĩa 13

1.2.2. Sinh thái học của VKTQH 14

1.2.3. Ứng dụng của VKTQH 14

1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp axit béo không no của VKTQH 17

1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DẦU 19

1.3.1. Các phƣơng pháp tách chiết dầu 19

1.3.2. Các phƣơng pháp làm giàu 23

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU OMEGA-6, 7, 9 TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 25

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 25

1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt nam 27

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 29

2.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 29

2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 29

2.2.2. Vật liệu nghiên cứu 29

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.3.1. Phƣơng pháp chuyển vị ester trực tiếp từ sinh khối để tạo ra hỗn hợp các axit béo ở dạng methyl ester 30

2.3.2. Tối ƣu các thông số của quá trình tách chiết TFA 31

2.3.3. Làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9 trong dầu vi khuẩn tía bằng phƣơng pháp tạo phức với ure 32

2.3.4. Phƣơng pháp phân tích thành phần axit béo của dầu 33

2.3.5. Phƣơng pháp xác định trạng thái cảm quan 34

2.3.6. Phƣơng pháp xác định chỉ số axit 34

2.3.7. Phƣơng pháp xác định chỉ số iot 35

2.3.8. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng urê 35

2.3.9. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các kim loại nặng trong dầu sinh học 36

2.3.10. Phƣơng pháp xác định vi sinh vật trong dầu sinh học 37

2.3.11. Phƣơng pháp xử lý thống kê 37

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1. HÀM LƢỢNG SINH KHỐI KHÔ, LIPID VÀ THÀNH PHẦN AXIT BÉO (OMEGA-6, 7, 9) CỦA SINH KHỐI HỖN HỢP 2 CHỦNG VKTQH SẢN XUẤT TRONG BỂ QUANG SINH THỂ TÍCH 1M3 3.2. TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TÁCH CHIẾT TFA TỪ SINH KHỐI KHÔ VKTQH 39

3.2.1. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng 39

3.2.2. Kết quả xác định ảnh hƣởng của chất xúc tác 40

3.2.3. Kết quả xác định ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi (khối lƣợng/ thể tích) 41

3.2.4. Kết quả xác định ảnh hƣởng của thời gian phản ứng 42

3.2.5. Kết quả xác định ảnh hƣởng của điều kiện khuấy trộn 43

3.3. TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN LÀM GIÀU OMEGA-6, 7, 9 TỪ HỖN HỢP AXIT BÉO TỔNG SỐ THU ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP TẠO PHỨC VỚI URÊ 44

3.3.1. Kết quả xác định ảnh hƣởng của tỷ lệ hỗn hợp TFA: urê trong quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo 44

3.3.2. Kết quả xác định ảnh hƣởng của tỷ lệ TFA: urê: methanol trong quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo 47

3.3.3. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ kết tinh trong quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo 48

3.3.4. Kết quả nghiên cứu tăng hiệu suất thu hồi các omega-6, 7, 9 bằng việc tạo phức 2 lần với urê 49

3.4. QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, 9 TỪ SINH KHỐI VKTQH 50

3.5. KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG DẦU SINH HỌC OMEGA-6, 7, 9 TÁCH CHIẾT ĐƢỢC SAU QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU 54

3.5.1. Kết quả xác định chỉ tiêu cảm quan, hóa lý 54

3.5.2. Kết quả xác định thành phần axit béo 55

3.5.3. Kết quả xác định dƣ lƣợng urê, kim loại nặng 55

3.5.4. Kết quả chỉ tiêu vi sinh vật có trong dầu sinh học omega-6, 7, 9 56

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

KẾT LUẬN 58

KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

MỞ ĐẦU

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (thực phẩm chức năng) giàu omega-3, 6, 7, 9 đã đƣợc chứng minh là có vai trò rất quan trọng trong việc giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, giảm cân, tiêu hóa, giữ ẩm cho da, tóc và móng tay, giảm đau dây thần kinh, đái tháo đƣờng... Omega-3, 6, 9 có nhiều trong các loại dầu động, thực vật nhƣ dầu oliu, dầu đậu nành, dầu hạt hƣớng dƣơng, dầu cá thu, cá hồi, cá basa... Tuy nhiên, omega-7 lại rất khan hiếm trong cả giới động vật và thực vật. Chúng chủ yếu đƣợc chiết xuất từ cây hắc mai biển và dầu macadamia. Hiện nay các loài vi tảo biển hoặc các loài vi khuẩn sinh dầu có thể là nguồn nguyên liệu thay thế cho việc sản xuất các axit béo không no này.

Vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) là một nhóm các vi sinh vật quang tự dƣỡng, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có nhiều ứng dụng trong một số lĩnh vực nhƣ: sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao, sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc, gia cầm và nuôi trồng thuỷ sản, xử lý nƣớc thải, sản xuất phân bón sinh học... Thành phần axit béo của VKTQH không lƣu huỳnh chứa hàm lƣợng các axit béo không bão hòa một nối đôi (monounsaturated fatty acid - MUFAs) và đa nối đôi (polyunsaturated fatty acid - PUFAs) (dạng omega-3, 6, 9 và đặc biệt là omega-7) khá cao. Hàm lƣợng lipit ở VKTQH (chiếm khoảng 20 - 40% sinh khối khô – SKK) thấp hơn khi so với vi tảo. Tuy nhiên, công nghệ nuôi trồng chúng lại đơn giản hơn nhiều so với vi tảo cũng nhƣ không đòi hỏi môi trƣờng nuôi nghiêm ngặt để sản xuất axit béo. Thành phần axit béo của Rhodobacter sphaeroides có nhiều C16 - C18, thích hợp cho sản xuất diesel sinh học. Ngoài ra, thành phần axit béo từ R. sphaeroides chủ yếu bao gồm các axit béo không bão hòa, đƣợc sử dụng làm thực phẩm bổ sung vào thức ăn cho ngƣời nhƣ omega-6, 7, 9. Trong đó, axit vaccenic (C18:1, omega-7) chiếm 60% so với axit béo tổng số - total fatty acid - TFA là nguồn axit béo omega-7 chính có vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe của da và màng tế bào của ngƣời. Ngoài ra, hàm lƣợng omega-7 (C18: 1, omega-7) của các loài thuộc chi Rhodovulum cũng đạt đến 60 - 80% so với TFA.

Hai chủng VKTQH Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 và R. sphaeroides VTN.2 đƣợc phân lập tại Việt Nam có các đặc điểm: sinh trƣởng mạnh (với mật độ quang đo tại bƣớc sóng 660nm - ∆OD660 >1,2); lipit tổng số cao (đạt đến 20% SKK) và hàm lƣợng omega-6, 7, 9 cao (chiếm 80% so với TFA) có tiềm năng sử dụng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe giàu omega-6, 7, 9. Tuy nhiên, hàm lƣợng axit béo cũng nhƣ hiệu suất của quá trình tách chiết các axit béo từ sinh khối VKTQH lại phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trƣờng nuôi và điều kiện tách chiết. Hiện nay chƣa có nghiên cứu về tách chiết omega trên đối tƣợng VKTQH. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện luận văn với tiêu đề “Tối ưu hóa điều kiện tách chiết

và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp”. Luận văn đƣợc thực hiện với mục tiêu và nội dung nghiên cứu nhƣ sau:

 Với mục tiêu:

Có đƣợc điều kiện thích hợp cho tách chiết axit béo tổng số (TFA) từ sinh khối khô VKTQH và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 bằng phƣơng pháp tạo phức với urê.

 Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Tối ƣu điều kiện của phản ứng tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH;

- Tối ƣu điều kiện làm giàu omega-6, 7, 9 từ TFA thu đƣợc bằng phƣơng

pháp tạo phức với urê;

- Xây dựng quy trình tách chiết và làm giàu axit béo không no omega-6,

7, 9 từ sinh khối khô VKTQH;

- Phân tích đánh giá chất lƣợng dầu sinh học omega-6, 7, 9 tách chiết

đƣợc.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ LIPID, AXIT BÉO KHÔNG NO MỘT NỐI ĐÔI (MUFAs) VÀ ĐA NỐI ĐÔI (PUFAs) (DẠNG OMEGA-6, 7, 9)

1.1.1. Giới thiệu về lipid

Lipid là những hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào của các cơ thể sống. Lipid trong thực phẩm có thể đƣợc cung cấp từ cả động vật và thực vật. Lipid có nguồn gốc thực vật nhƣ bơ thực vật, dầu tinh luyện, shortening, đậu nành, đậu lạc, vừng... Lipid có nguồn gốc động vật nhƣ: trứng, thịt, cá, thuỷ sản... Các lipid có nguồn gốc động vật gọi là mỡ, lipid có nguồn gốc thực vật gọi là dầu. Chúng có thành phần hoá học và cấu tạo khác nhau nhƣng có tính chất chung là không hoà tan trong nƣớc mà hoà tan trong các dung môi hữu cơ nhƣ: ether, cloroform, n-hexan, benzen… Lipid là hợp phần cấu tạo quan trọng của các màng sinh học tế bào, là nguồn cung cấp năng lƣợng (37,6.106 J/kg), nguồn cung cấp các vitamin A, D, E, F và K cho cơ thể sống [1].

Trong thực phẩm, lipid có rất nhiều loại nhƣ: phospholipid, triglycerid, cholesterol, glycolipid, lipoprotein và sáp với 2 nhóm chính là: lipid đơn giản cấu tạo bao gồm hydro (H), carbon (C), oxy (O) và lipid phức tạp có tạo phức ngoài C, H, O còn có các thành phần khác nhƣ P, S... Những hợp chất thuộc về lipid tồn tại trong tự nhiên rất đa dạng nhƣ: các hydrocacbon bậc cao, ancohol, aldehyde, axit béo và sản phẩm thứ cấp của chúng nhƣ glycerid, sáp, phospholipid, glucolipid, sulfolipid... [1].

Lipid có nhiều dạng cấu trúc khác nhau. Tuy nhiên, thƣờng có chung một nguyên tắc trong cấu trúc phân tử lipid bao gồm hai phần: một phần là các đuôi mạch hydrocarbon kị nƣớc, phần kia là tổ hợp nhóm các chất ƣa nƣớc (gọi là đầu phân cực). Cấu trúc đa dạng của lipid đƣợc bắt nguồn từ các axit béo khác nhau tham gia vào trong thành phần của nó. Cho đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện đƣợc hơn 500 axit béo khác nhau bởi mức độ và đặc điểm phân nhánh của mạch hydrocacbon, số lƣợng và vị trí các nối đôi trong mạch, vị trí và số lƣợng các nhóm chức, độ dài của mạch

hydrocacbon… Các axit béo có mặt trong thành phần lipid thực vật, động vật trên cạn thƣờng có từ 16 đến 20 nguyên tử cacbon trong phân tử. Trong khi ở sinh vật biển thành phần lipid đa phần chứa các axit béo mạch dài từ 20 đến 26, thậm chí đến 30 nguyên tử carbon [1].

Axit béo đƣợc chia thành axit béo bão hòa và axit béo không bão hòa. Các axit béo không bão hòa gồm axit béo không bão hoà đơn (monounsaturated fatty acid - MUFAs) có một nối đôi trong phân tử và axit béo không bão hoà đa nối đôi (polyunsaturated fatty acid - PUFAs) có hơn một nối đôi trong phân tử.

1.1.2. Giới thiệu về MUFAs và PUFAs (dạng omega-6, 7, 9)

Các axit béo không bão hoà MUFA và PUFA đã đƣợc quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực dinh dƣỡng và dƣợc phẩm. Đây là các axit béo không thay thế bởi cơ thể con ngƣời không thể tự tổng hợp đƣợc mà phải lấy từ thức ăn bên ngoài [2]. MUFAs và PUFAs có 3 vai trò sinh học chủ yếu. Đầu tiên là tham gia vào sự điều hoà trao đổi lipid, vận chuyển và hƣớng tới các mô. Thứ hai là tham gia vào thành phần cấu trúc nên thành tế bào. Ngoài ra, một số PUFAs còn đóng vai trò là cơ chất cho việc tổng hợp các phân tử có hoạt tính sinh học nhƣ prostaglandin, thromboxan và leukotrien [3]. Các PUFAs đƣợc chia làm 2 nhóm chính là omega-3 và omega-6. Ngoài ra, còn có omega-7, 9 [4].

Tên gọi của omega dựa vào liên kết đôi đầu tiên tại vị trí carbon. Mạch hydrocarbon có 2 đầu: một đầu là nhóm methyl và một đầu là nhóm cacboxyl. Chúng đƣợc phân loại theo vị trí của liên kết đôi đầu tiên tính từ gốc methyl hay gốc cacboxyl. Để chỉ vị trí nối đôi đầu tiên trên mạch cacbon đƣợc tính từ đầu methyl ngƣời ta có thể sử dụng ký hiệu “n” hoặc “ω”. Các liên kết đôi trong MUFA, PUFAs cũng có thể đƣợc tính từ gốc carboxyl và đƣợc ký hiệu “Δ”. Những nhóm omega-6, omega-7 hay omega-9 có liên kết đôi đầu tiên tƣơng ứng tại vị trí cacbon số 6, 7 hay 9 [2].

Các axit béo omega-6 là một họ các axit béo không no đa nối đôi, chúng có nối đôi C=C ở vị trí carbon thứ 6 tính từ đầu methyl của chuỗi axit

béo. Công thức chung của omega-6 là CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)y COOH. Các axit béo chính trong họ omega-6 là axit linoleic (AL) (C18:2, n- 6); axit gamma linoleic (GLA) (C18:3, n-6); axit eicosadienoic (C20:2, n-6); axit dihomo gamma-linoleic (DGLA) (C20:3, n-6); axit arachidonic (C20:4, n-6); axit docosadienoic (C22:2, n-6) và axit docosapetaenoic (DPA) (C22:5, n-6) [5].

chuỗi béo. Công omega-7 chung thức axit của

Các axit béo omega-7 thuộc họ các axit béo không no có một nối đôi và đa nối đôi. Chúng có nối đôi C=C ở vị trí carbon thứ 7 tính từ đầu methyl là của CH3(CH2)5CH=CH(CH2)nCOOH. Các axit béo chính trong họ omega-7 là axit palmitoleic (C16:1, n-7); axit vaccenic (C18:1, n-7), axit paulinic (C20:1, n-7) và axit có 2 nối đôi là axit rumenic (C18:2n-7) [6].

thức chung của omega-9

Các axit béo omega-9 cũng thuộc họ các axit béo không no một nối đôi và đa nối đôi. Chúng có nối đôi C=C ở vị trí carbon thứ 9 tính từ đầu methyl của chuỗi axit béo. Công là CH3(CH2)7CH=CH(CH2)nCOOH . Các axit béo chính là axit oleic (C18:1, n- 9); axit elaidic (C18:1, n-9); axit gondoic (C20:1, n-9); axit mead (C20:3, n- 9); axit erucic (C22:1, n-9) và axit nervonic (C24:1, n-9) [6].

1.1.3. Vai trò của omega-6, 7, 9 đối với sức khỏe con ngƣời

Trong khoảng 3 thập kỷ gần đây, các axit béo không no một nối đôi (MUFAs) và đa nối đôi (PUFAs) đã đƣợc các nhà khoa học đặc biệt quan tâm bởi vai trò to lớn của chúng mang lại. Mặc dù omega-6, 9 có nhiều trong các loại dầu động, thực vật nhƣng omega-7 lại rất khan hiếm trong cả giới thực vật và động vật. Chúng đƣợc chiết xuất chủ yếu từ cây hắc mai biển và dầu macadamia [7].

Tác dụng của omega-6 [8]

Một số nghiên cứu cho thấy uống GLA trong 6 tháng trở lên có thể làm giảm triệu chứng đau dây thần kinh, ức chế hoạt động của khối u trong các dòng tế bào ung thƣ vú và giúp giảm huyết áp cao. Thiếu omega-6 có khả năng gây loãng xƣơng. Nghiên cứu cho thấy, phụ nữ trên 65 tuổi bị loãng

xƣơng, khi đƣợc uống bổ sung omega-6 đã giảm bị loãng xƣơng ít nhất 3 năm so với không bổ sung chất này. Omega-6 còn có tách dụng làm đẹp da, kích thích mọc tóc, điều tiết trao đổi chất và duy trì hoạt động các hệ thống sinh sản.

Tác dụng của omega-7 [9]

Sử dụng omega-7 giúp cung cấp các dƣỡng chất và độ ẩm cần thiết cho da, tóc, chống lại các triệu chứng lão hoá sớm nhƣ: nếp nhăn, khô, mất độ đàn hồi, các dấu hiệu lão hoá và suy dinh dƣỡng. Omega-7 còn có tác dụng duy trì mức cholesterol khoẻ mạnh và lƣợng đƣờng trong máu, giúp cho động mạch hoạt động tốt hơn. Nghiên cứu gần đây cho thấy omega-7 có tác dụng bôi trơn các màng nhầy, cải thiện nhiều vấn đề về viêm và loét đƣờng tiêu hoá, chống táo bón và có lợi cho những ngƣời mắc bệnh khô mắt, những phụ nữ bị khô âm đạo vì nó nuôi dƣỡng và giữ ẩm cho các màng nhầy.

Tác dụng của omega-9 [10]

Omega-9 có tác dụng giảm cholesterol xấu, giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, giảm xơ cứng động mạch, giúp tăng cƣờng hệ miễn dịch và ổn định lƣợng đƣờng trong máu.

Sự tiêu thụ các PUFAs đƣợc khuyến cáo ở mức trung bình khoảng 6% tổng năng lƣợng và không vƣợt quá 10%. Trong đó, nên giảm hàm lƣợng các axit béo bão hoà và chỉ nên duy trì ở mức 8-10% tổng năng lƣợng hấp thụ. Để giảm nguy cơ các bệnh kinh niên thì hàm lƣợng PUFAs mạch dài (DHA - Docosahexaenoic acid, EPA - Eicosapentaenoic acid, DPA) nên d ng là 610 mg ngày đối với đàn ông và 430 mg ngày đối với phụ nữ. Và tỷ lệ omega-6 với omega-3 PUFA nằm giữa 5:1 và 3:1 là tối ƣu cho con ngƣời [8].

1.1.3. Các nguồn cung cấp omega-6, 7, 9

Nguồn cung cấp các axit béo omega trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng, nhiều nghiên cứu về tách chiết các axit béo có nguồn gốc động vật, thực vật và đặc biệt là vi sinh vật đã đƣợc các nhà khoa học quan tâm trong vài năm trở lại đây.

1.1.3.1. Từ động, thực vật

Nguồn cung cấp omega-6 trong tự nhiên khá phong phú, chúng đƣợc tìm thấy trong hầu hết các loại dầu thực vật nhƣ: dầu bắp, dầu hạt bông vải, dầu hạt nho, dầu mè, dầu đậu nành, dầu hoa hƣớng dƣơng, dầu hoa anh thảo, dầu lý chua đen. Omega-6 còn đƣợc tìm thấy trong các loại gia cầm, trứng gà, trong mỡ, trong bơ, lúa mì cứng, ngũ cốc nguyên hạt, bánh mỳ và đặc biệt từ Tảo xoắn Spirunila platensis [11].

Không giống nhƣ các omega khác, nguồn cung cấp omega-7 rất hiếm ở cả trong giới thực vật và giới động vật. Chúng đƣợc cung cấp từ dầu cá (các loài cá nƣớc lạnh nhƣ cá hồi, cá ngừ, cá mòi, cá thu), một số loại dầu động vật và thực vật nhƣ macadamia (Macadamia integrifolia), chủ yếu là cây hắc mai biển (Hippophae rhamnoides) và một lƣợng nhỏ trong quả bơ. Hai axit béo omega-7 thƣờng gặp trong tự nhiên là axit palmitoleic (C16:1(n-7)) và axit vaccenic (C18:1(n-7)) đƣợc phát hiện năm 1928 trong mỡ động vật và quả bơ [12].

Nguồn cung cấp omega-9 là dầu oliu, dầu macadamia, cây hồng hoa, dầu hoa hƣớng dƣơng, quả bơ, quả hạnh nhân, hạt điều, óc chó, hạt mắc ca, đậu phộng, quả hồ đào, hồ trăn, hạt cải và cây đinh hƣơng… [10].

Dầu thực vật chỉ chứa các axit béo không bão hoà có mạch carbon  18

(C18:1; C18:2; C18:3) và chủ yếu là mạch thẳng. Trong các loại dầu thực vật

(dầu lanh, canola và đậu tƣơng) chứa PUFAs chủ yếu là axit -linolenic

(ALA). Các loại dầu khác (dầu bắp, dầu hạt bông vải, dầu nho) chứa chủ yếu

là các PUFAs omega-6. Các loại axit béo có số carbon  20 và 22 chủ yếu thu

đƣợc từ nguồn cá biển.

Nguồn cung cấp PUFAs là các loài cá nhiều mỡ nhƣ: cá trích, cá thu, cá sardine, cá hồi, cá basa và saba. Dầu cá biển thực tế là một hỗn hợp phức tạp các axit béo có chiều dài mạch carbon và mức độ bão hoà rất khác nhau. Do vậy, việc tinh sạch chúng là khó khăn và đòi hỏi chi phí tốn kém trƣớc khi có thể sử dụng chúng vào các mục đích khác nhau cũng nhƣ nâng cao giá trị sử dụng các sản phẩm tạo ra so với giá trị ban đầu [13].

1.1.3.2. Từ vi sinh vật

Mặc d động vật có vú và cá biển có một số khả năng nào đó trong việc sinh tổng hợp các axit béo (MUFAs và PUFAs), nhƣng phần lớn chúng lại có nguồn gốc từ chế độ ăn. Cá sử dụng sinh vật ph du nhƣ vi khuẩn, nấm bậc thấp, vi tảo và động vật nguyên sinh làm thức ăn. Những sinh vật này từ lâu đã đƣợc biết đến là những sinh vật sản xuất sơ cấp trong chuỗi thức ăn ở biển và đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp MUFAs và PUFAs sơ cấp [14]. Cá biển là nguồn cung cấp nguyên liệu truyền thống để sản xuất axit béo. Tuy nhiên, nguồn cung cấp này không ổn định do mùa vụ khai thác, vị trí địa lý và phụ thuộc vào từng loài cá. Hơn thế nữa dầu cá chứa nhiều cholesterol và có mùi vị khó chịu. Do đó, cần có nguồn nguyên liệu để sản xuất axit béo. Các vi sinh vật bao gồm (nấm, vi khuẩn, tảo biển…) là các nguồn tiềm năng cho việc sản xuất axit béo này.

Vi tảo biển hoặc các loài vi khuẩn chứa dầu có thể thay thế dầu cá trong việc cung cấp các axit béo. Việc sản xuất các axit béo bằng vi sinh vật sẽ đƣợc phát triển trong những năm tới do chúng có một số thuận lợi sau: có thể sản xuất đƣợc dầu quanh năm; không phụ thuộc vào mùa vụ và có thể kiểm soát tốt mọi thông số cần thiết trong suốt quá trình nuôi cấy. So với dầu cá, dầu vi sinh vật thƣờng chứa hàm lƣợng cao các axit béo mong muốn và do thành phần cấu tạo lipid, việc tinh sạch axit béo không no thƣờng rất dễ dàng [4]. Tuy nhiên, điều kiện quyết định để sản xuất axit béo là phải lựa chọn đƣợc các loài vi sinh vật thích hợp, phải có phƣơng pháp nuôi trồng tối ƣu cũng nhƣ quy trình công nghệ tách chiết và làm sạch axit béo rẻ tiền và hiệu quả [15].

Hiện nay, các loài vi tảo biển quang tự dƣỡng chứa hàm lƣợng PUFAs cao đều đƣợc sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản. Ví dụ: tảo silic, Cryptomonads và Eustigmatophytes giàu một hoặc cả hai EPA và DHA (chiếm 5-35% so với TFA); Eustigmatophytes (Nannochloropsis spp.) có trăm axit arachidonic (ARA) cao nhất (0-4% so với TFA); phần Prasinophytes (4-10% so với TFA) [16].

Việc sản xuất PUFAs thƣơng mại bằng vi tảo biển dị dƣỡng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu và phát triển với một số thuận lợi chính đó là: có thể duy

trì đƣợc các điều kiện nuôi trồng tối ƣu và giảm tạp nhiễm [17]; sản xuất dầu có thể đƣợc tiến hành quanh năm, không phụ thuộc vào mùa hay khí hậu; quá trình nuôi trồng có thể kiểm soát và đảm bảo đƣợc chất lƣợng sản phẩm nhƣ mong muốn; mật độ tế bào tảo cao, có thể lên tới trên 100g khô/lít; có thể sử dụng các kỹ thuật lên men hiện đại đang đƣợc sử dụng rộng rãi cho việc nuôi trồng các vi tảo biển dị dƣỡng [4].

Việc vi khuẩn có khả năng tổng hợp MUFAs, PUFAs đã đƣợc nghiên cứu trong khoảng 20 năm trở về trƣớc. Tuy nhiên, trong thời gian này ngƣời ta chƣa thực sự quan tâm nhiều đến lĩnh vực sinh thái biển và hoá sinh biển [18]. Theo thống kê thì 30% các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp PUFAs đƣợc phân lập từ những vùng có khí hậu lạnh nhƣ v ng biển sâu và vùng Nam Cực. Chúng bao gồm các thành viên của nhóm γ-Proteobacteria và tổ hợp của các nhóm Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides. Hầu hết các chủng có khả năng tổng hợp PUFAs là ƣa lạnh (cần nhiệt độ thấp cho sinh trƣởng) và ƣa mặn (cần muối cho sinh trƣởng) [19].

David và cộng sự (1993) đã phân lập đƣợc 38 chủng vi khuẩn ở vùng Nam Cực và sàng lọc chúng cho mục đích tổng hợp PUFAs. Trong số 38 chủng vi khuẩn này có 5 chủng có khả năng tổng hợp đƣợc EPA (các chủng này có tổng axit béo từ dạng vết đến 3,3%. 13 chủng có khả năng tổng hợp

PUFAs (C18:26, C18:33, C18:43, C18:46) (các chủng này có tổng axit

béo từ dạng vết đến 7,0%). Từ đó đến nay có rất nhiều các loài vi khuẩn biển đã đƣợc công bố về khả năng tổng hợp axit béo, điển hình là các chi: Pseudomonas, Vibrio, Shewanella, Colwellia; Moritella; Psychromonas... phân lập từ biển đã đƣợc chứng minh là có khả năng tổng hợp PUFAs [20].

Ngoài các nhóm vi khuẩn kể trên, VKTQH cũng đã đƣợc chứng minh là có khả năng tổng hợp đƣợc axit béo không no (mà đặc biệt là axit béo không no một nối đôi – omega-7 (axit vaccenic) với làm lƣợng rất cao chiếm 65-82% so với TFA) [21, 22]. Ngoài ra, một số loài VKTQH còn có khả năng tổng hợp PUFAs và thậm chí còn có loài tổng hợp đƣợc cả HUFAs - highly unsaturated fatty acid (EPA và DHA) [23]. Các loài có khả năng tổng hợp axit béo không no điển hình thuộc các chi: Rhodovulum (với một số loài nhƣ R.

strictum, R. sulfidophilum, R. adriaticum, R. euryhalinum; R. tesquicola); Rhodobacter marinus; Rhodopseudomonas palustris; Rhodobacter viridis.

1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP (VKTQH)

1.2.1. Định nghĩa

Vi khuẩn quang hợp là nhóm vi sinh vật tiền nhân có khả năng tiến hành quang hợp nhƣng không thải oxy nhƣ vi khuẩn lam. Khi đƣợc chiếu sáng, rất nhiều loài trong nhóm này có khả năng sinh trƣởng quang tự dƣỡng với CO2 là nguồn carbon hoặc sinh trƣởng quang dị dƣỡng với các chất hữu cơ làm nguồn carbon. Đặc trƣng của nhóm vi khuẩn quang hợp này là chứa sắc tố quang hợp bacteriochlorophyll (Bchl) và nguồn cho điện tử trong quá trình quang hợp không phải là nƣớc (nhƣ những đối tƣợng quang dƣỡng khác) mà là các hợp chất khác nhau nhƣ: lƣu huỳnh, các hợp chất khử của lƣu huỳnh, hydro phân tử hoặc các hợp chất hữu cơ đơn giản nhƣ các axit hữu cơ, đƣờng và rƣợu [24].

Theo Hệ thống phân loại của Bergey (1989), vi khuẩn quang hợp đƣợc chia làm ba nhóm: vi khuẩn tía quang hợp, vi khuẩn xanh quang hợp và nhóm vi khuẩn chứa bacteriochlorophyll (Bchl) (nhƣng không xếp vào hai nhóm trên) [25].

Riêng nhóm VKTQH đƣợc chia làm 3 họ:

Họ Chromatiaceae: gồm tất cả các vi khuẩn lƣu huỳnh màu tía

 có khả năng hình thành “giọt” lƣu huỳnh bên trong tế bào.

Họ Ectothiorhodospiraceae: gồm tất cả các vi khuẩn lƣu huỳnh

 màu tía có khả năng hình thành “giọt” lƣu huỳnh bên ngoài tế bào.

Họ Rhodospirilaceae: gồm tất cả các vi khuẩn quang hợp không

 tích lũy giọt lƣu huỳnh

Tuy nhiên, theo Hệ thống phân loại của Bergey 2001 [26], VKTQH lại đƣợc chia thành 3 nhóm:

“Alphaproteobacteria” gồm nhóm vi khuẩn tía không lƣu huỳnh

 và vi khuẩn tía hiếu khí

 “Betaproteobacteria” cũng gồm nhóm vi khuẩn tía không lƣu huỳnh nhƣng nhóm này khác nhóm “Alphaproteobacteria” về thành phần axit béo, quinone, trình tự và kích thƣớc của cytochrome c.

“Gammaproteobacteria” gồm hai họ Chromatiaceae và

 Ectothiorhodospiraceae.

1.2.2. Sinh thái học của VKTQH

Nhóm VKTQH không lƣu huỳnh thƣờng đƣợc tìm thấy trong hệ sinh thái là những thuỷ vực không có oxy. Có thể thu nhận đƣợc chúng từ bùn ở những nơi nhận đƣợc năng lƣợng ánh sáng mặt trời đủ cho phản ứng quang hợp xảy ra. Các vi khuẩn thuộc nhóm này phân bố rất rộng trong tự nhiên. Chúng thƣờng bắt gặp trong các loại ao hồ t đọng, các thuỷ vực chứa nƣớc thải, các v ng đầm nƣớc lợ hay mặn, cũng có thể tìm thấy chúng trong đất b n hay đất ruộng. Tuy nhiên nhóm vi khuẩn này ƣa thích các thuỷ vực chứa nƣớc ngọt, lợ hay mặn với hàm lƣợng chất hữu cơ khá cao và hàm lƣợng oxy hoà tan thấp. Vì vậy, có thể tìm thấy chúng cùng với các đại diện thuộc nhóm VKTQH lƣu huỳnh [27, 28].

Tác giả Okubo và cộng sự (2006) đã phát hiện ra nhóm VKTQH không lƣu huỳnh trong kênh chứa nƣớc thải chăn nuôi. Trong đó, xuất hiện các loài nhƣ R. sphaeroides, R. capsulatus, và các loài trong chi Rhodopseudomonas, đặc biệt là Rps. palustris [28]. Ngoài ra, còn có thể gặp đại diện của VKTQH trong một số thủy vực có điều kiện khắc nghiệt nhƣ: suối nƣớc nóng, suối lƣu huỳnh, thủy vực có tính kiềm, thủy vực có tính axit, ở vùng biển có độ mặn cao và thậm chí ở hồ có băng bao phủ 4 - 7 m ở Antarstica [29].

1.2.3. Ứng dụng của VKTQH

1.2.3.1. Xử lý nước thải

Việc lựa chọn các chủng VKTQH để xử lý các nguồn nƣớc thải có các thành phần khác nhau đã đƣợc tiến hành. Đối với nguồn nƣớc thải chứa các hợp chất lƣu huỳnh, các chủng thuộc nhóm vi khuẩn tía lƣu huỳnh đƣợc chú trọng vì chúng có khả năng loại bỏ các hợp chất của lƣu huỳnh với hiệu suất cao. Ngƣời ta sử dụng các chủng thuộc hai loài vi khuẩn tía không lƣu huỳnh

R. sphaeroides và R. palustris để xử lý nhiều nguồn nƣớc thải có thành phần khác nhau nhƣ nƣớc thải chăn nuôi , nƣớc thải chế biến thực phẩm [30]. Các hợp chất thơm dạng đơn vòng hay dị vòng thƣờng có mặt trong nƣớc thải công nghiệp xăng dầu, các chất trừ sâu diệt cỏ tồn đọng trong môi trƣờng. Sự có mặt của các chất độc này rất nguy hại và rất ít loài vi sinh vật trong tự nhiên có khả năng phân huỷ chúng. Một số loài VKTQH không lƣu huỳnh R. palustris, R. fulvum, R. purpureus đã đƣợc sử dụng trong xử lý nƣớc thải với mục đích loại bỏ các chất độc hại này [31].

1.2.3.2. Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao

Tế bào các loài VKTQH mà đặc biệt là VKTQH không lƣu huỳnh có khả năng tổng hợp một số chất có hoạt tính sinh học cao nhƣ: ubiquinone, các hormone sinh trƣởng thực vật, chất kháng sinh…

Ubiquinone đƣợc biết đến nhƣ là một coenzyme (coenzyme Q) bao gồm một nhóm 5,6-dimethoxytoluquinon và những chuỗi bên polyisoprenoit với chiều dài khác nhau tại vị trí thứ 6 của vòng benzen. Có 5 dạng ubiquinone đã đƣợc xác định Q6, Q7, Q8, Q9, Q10. Trong số các loại ubiquinone kể trên thì Q10 có giá trị về dƣợc học hơn cả. Chúng có tác dụng kích thích cơ tim, đƣợc sử dụng trong điều trị các bệnh về phổi và còn có thể đƣợc sử dụng nhƣ chất chống oxy hoá trong sản xuất dƣợc phẩm, mỹ phẩm [32].

1.2.3.3. Sản xuất protein đơn bào sử dụng làm thức ăn cho gia súc, gia

cầm và nuôi trồng thuỷ sản

Ở tế bào VKTQH không lƣu huỳnh, hàm lƣợng protein thƣờng chiếm khoảng 50-74%, hàm lƣợng carbonhydrate chiếm 10-27%, lipid từ 0,6-35% và chất khoáng 4-16 % SKK. Khi so sánh thành phần dinh dƣỡng với một số loài tảo, nấm men đƣợc sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, Kobayashi và Kobayashi (1995) cho thấy hàm lƣợng protein và lipid gần nhƣ tƣơng đƣơng với vi tảo và cao hơn so với nấm men. Tế bào của VKTQH còn chứa các vitamin nhóm B nhƣ: B1, B2, B6 và đặc biệt là B12 (30 -79 mg vitamin B12/kg sinh khối khô), nhóm E, các axit forlic, axit pantothenic, carotenoid (0,09 –

0,80 mg/g SKK), coenzyme Q [33]. VKTQH đã đƣợc bổ sung vào thức ăn cho gia cầm cho kết quả chất lƣợng, số lƣợng trứng, thời gian đẻ trứng của gà mái đƣợc cải thiện. Ngoài ra, VKTQH đã hạn chế đƣợc một số dịch bệnh thƣờng gặp ở gia cầm [34].

Azad và cộng sự (2002) đã bổ sung sinh khối VKTQH không lƣu huỳnh loài R. sulfidophilum vào thức ăn truyền thống (tảo silic Skeletonema costatum) để nuôi tôm sú (Penaeus monodon). Kết quả sau 9 ngày nuôi cho thấy, chiều dài của tôm sú khi bổ sung dịch nuôi chứa 1% và 2% sinh khối khô VKTQH không lƣu huỳnh (loài R. sulfidophilum) đạt 6,13 ± 0,05 mm 6,88 ± 0,18 mm, tƣơng ứng; tỷ lệ sống sót là 46% cao hơn nhiều so với không bổ sung dịch nuôi VKTQH không lƣu huỳnh [35].

1.2.3.4. Sản xuất axit béo không no một nối đôi (MUFAs) và đa nối đôi

(PUFAs).

Theo một số nghiên cứu gần đây nhóm VKTQH có khả năng tổng hợp omega-7 (axit vaccenic) với hàm lƣợng rất cao chiếm 65-82% so với TFA [22, 36]. Một số kết quả nghiên cứu điển hình nhƣ: Hiraishi và Ueda (1995) đã phân lập đƣợc một số loài VKTQH thuộc chi Rhodovulum (R. strictum, R. sulfidophilum, R. adriaticum) ở vùng biển xuất hiện thuỷ triều đỏ ở Nhật Bản. Các loài VKTQH không lƣu huỳnh này có khả năng tổng hợp đƣợc hàm

lƣợng omega-7 (C18:17) rất cao từ 60-80% so với TFA, trong khi C16:0 chỉ

đạt 4-12% và C18:0 đạt 11-21% so với TFA [21]. Raj và cộng sự (2013) đã phân lập đƣợc 4 chủng VKTQH thuộc chi Rhodobacter (R. capsulatus, R. maris) từ bùn thải của một con sông ở Ấn Độ. Bốn chủng vi khuẩn này đều có

hàm lƣợng omega-7 (C18:17) rất cao chiếm từ 61,2 - 79,8 % so với TFA

[36]. Kim và cộng sự (2013) đã tiến hành nghiên cứu sản xuất sinh khối VKTQH (loài R. sphaeroides) với mục đích sử dụng sinh khối để tách chiết axit béo omega-7. Kết quả sau 4 ngày nuôi thu đƣợc 16,2 g sinh khối tƣơi lít, axit béo là 665 mg FA L ngày, hàm lƣợng lipid đạt 35% SKK và chứa axit vaccenic (C18:1, omega-7) chiếm 60% so với TFA [22].

VKTQH có một số hạn chế về thành phần dinh dƣỡng đó là hầu hết tế bào VKTQH không chứa PUFAs nhƣ: EPA (C20:5 n-3) và DHA (C22:6 n-3)

mặc dù chúng rất giàu axit béo bão hoà (SFA) nhƣ palmitic acid (C16:0), steric acid (C18:0) và không bão hoà một nối đôi (MUFAs) nhƣ oleic (C18:1) [27]. Tuy nhiên, Loo và cộng sự (2013) đã tìm đƣợc 3 loài VKTQH có khả năng tổng hợp PUFAs khi đƣợc nuôi trên môi trƣờng nƣớc thải dầu cọ đó là loài Rhodopseudomonas palustris có hàm lƣợng MUFAs và PUFAs lần lƣợt là: 12,8% và 54,3% so với TFA; Rhodobacter sphaeroides có hàm lƣợng MUFAs và PUFAs lần lƣợt là: 36,1% và 16,9%; Rhodovulum sulfidophilum 11,8% và 42,8% so với TFA và đặc biệt là loài Rhodovulum sulfidophilum còn có khả năng tổng hợp đƣợc các HUFA (EPA: 3,9% và DHA: 2,6% so với TFA) [23].

1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp axit béo không no của VKTQH

Trong quá trình tổng hợp axit béo của vi khuẩn, axit béo đƣợc tổng hợp bởi các enzyme riêng biệt với Acetyl-CoA và malonyl-CoA nhƣ cơ chất, NADPH nhƣ chất cho electron. Chuỗi axit béo đƣợc bổ sung thêm 2 carbon vào đầu carboxyl trong một quá trình gồm hai giai đoạn [37].

Hình 1.1. Tổng hợp axit béo. ACP = acyl carrier protein (protein mang acyl) [37].

Trƣớc hết, sự ngƣng tụ decarboxylative giữa malonyl-ACP và acyl- CoA tạo ra acetoacetyl-ACP và CO2 đƣợc xúc tác bởi enzyme ketoacyl-ACP synthase III (FabH) [38]. Trong giai đoạn thứ hai của quá trình tổng hợp, β- ketoacyl-ACP xuất hiện từ phản ứng ngƣng tụ ban đầu bị loại đi trong một quá trình ba bƣớc bao gồm hai bƣớc khử và một bƣớc loại nƣớc bởi các phản ứng liên tiếp của ketoacyl-ACP reductase (FabG), một β-hydroxyl-ACP dehydratase (FabA hoặc FabZ) và trans-∆2-enoyl-ACP reductase (FabI) [39]. Sau đó, axit béo tiếp tục đƣợc bổ sung thêm 2 nguyên tử carbon nữa bằng cách ngƣng tụ với malonyl-ACP trong các chu kỳ kéo dài liên tiếp đƣợc thực hiện bởi một enzyme khác, β-ketoacyl-ACP synthase I (FabB), cuối cùng đƣợc ngƣng tụ bởi β-ketoacyl ACP synthase II (FabF) [40]. Sự kéo dài chuỗi thƣờng đƣợc dừng lại khi các chu kỳ tạo ra axit bão hòa (C16) hoặc C18. FabI là một enzyme chủ chốt trong hệ thống tổng hợp axit béo [41].

Các axit béo không bão hoà đƣợc tổng hợp theo hai con đƣờng gồm hiếu khí (với sự tham gia của O2) và kỵ khí (bằng cách loại nƣớc các axit béo hydroxy, không cần O2) [37]. Ở con đƣờng hiếu khí, axit béo không bão hòa có thể đƣợc tạo ra bởi quá trình khử bão hòa để bổ sung thêm một liên kết đôi vào một axit béo có sẵn gắn với ACP, glycolipid và coenzyme A (CoA) [42]. Đối với con đƣờng kỵ khí, liên kết đôi có thể đƣợc đƣa vào chuỗi acyl bởi FabA, đây là một enzyme có đặc điểm hoạt động nhƣ một dehydratase và isomerase. β - hydroxydecanoyl-ACP bị khử bởi FabA hoặc isoenzyme, FabZ, để tạo thành trans-∆2-decenoyl-ACP, có thể đƣợc đồng phân hóa bởi FabA thành cis-∆3-decenoylACP. Việc kéo dài chuỗi bốn lần theo chu kỳ sau đó sẽ dẫn đến hình thành axit béo không bão hòa (18: 1) [43].

VKTQH có khả năng sinh trƣởng nhƣ nhau trong 2 điều kiện hiếu khí

và kỵ khí [44]. Vì vậy VKTQH có thể sử dụng cả con đƣờng hiếu khí và con

đƣờng kỵ khí cho tổng hợp các axit béo không bão hòa. R. sphaeroides cũng

thể hiện đặc tính “mềm dẻo” trong quá trình tổng hợp axit béo. Kim và lee

(2015) đã làm thay đổi tỷ lệ axit béo không bão hòa (UFA) thành axit béo bão

hòa (SFA) trong R. sphaeroides bằng cách biểu hiện tốt một số enzyme sinh

tổng hợp axit béo quan trọng thông qua việc sử dụng plasmid pRK415 [45].

VKTQH không tích lũy lipit trung tính nhƣng chúng có thể tổng hợp các axit

béo, chủ yếu cho các lipit màng glycerol [46].

1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DẦU

1.3.1. Các phƣơng pháp tách chiết dầu

Khai thác dầu từ thực vật thƣờng sử dụng một số phƣơng pháp sau: phƣơng pháp ép cơ học và phƣơng pháp trích ly (bằng dung môi hữu cơ). Việc lựa chọn phƣơng pháp khai thác dầu thích hợp dựa vào tính chất của từng loại nguyên liệu và sẩn phẩm dầu đầu ra. Bên cạnh đó, phƣơng pháp enzyme và phƣơng pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn cũng có thể sử dụng.

1.3.1.1. Phương pháp ép cơ học

Nguyên lý của phƣơng pháp: các phần tử chứa dầu có trong nguyên liệu bị biến dạng dƣới tác động của lực ép cơ học. Dầu bắt đầu thoát ra khi khoảng trống chứa dầu bị hẹp dần và đến khi lớp dầu dồn lại có chiều dày không đổi.

Đối với các phƣơng pháp ép dầu, hiệu xuất của quá trình ép phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ loại thiết bị ép (ép thủ công, ép thủy lực hay ép vít liên tục); phƣơng thức ép (ép kiệt 1 lần hay ép kiệt 2 lần) và đặc tính cơ học của nguyên liệu ép nhƣ: kích thƣớc hạt, nhiệt độ, độ ẩm, tính dẻo, tính đàn hồi thích hợp cho quá trình thoát dầu.

Ƣu điểm của phƣơng pháp ép cơ học là thao tác thực hiện đơn giản, chi phí sản xuất thấp, không sử dụng dung môi độc hại và độ an toàn cao nên gần 90% sản phẩm trên thế giới về dầu đều d ng phƣơng pháp này.

Nhƣợc điểm của phƣơng pháp ép cơ học là cần một lƣợng lớn nguyên liệu cho mỗi mẻ tách chiết, quá trình tách diễn ra chậm, hiệu suất tách chiết thấp, ép dầu không triệt để.

1.3.1.2. Phương pháp trích ly bằng dung môi hữu cơ

Ngày nay, phƣơng pháp trích ly đã đƣợc áp dụng rộng rãi vì nó mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn phƣơng pháp ép và có khả năng tự động hóa cao.

Nguyên lý của phƣơng pháp: Độ hòa tan vào nhau của hai chất lỏng phụ thuộc vào hằng số điện môi, hai chất lỏng có hằng số điện môi càng gần nhau thì khả năng tan lẫn vào nhau càng lớn. Dầu có hằng số điện môi khoảng 3 ÷ 3,2 và các dung môi hữu cơ có hằng số điện môi khoảng 2 ÷ 10, do đó có thể dùng các dung môi hữu cơ để hòa tan dầu chứa trong nguyên liệu. Nhƣ vậy, trích ly dầu là phƣơng pháp d ng dung môi hữu cơ để hòa tan dầu có trong nguyên liệu rắn ở điều kiện xác định. Vì vậy, bản chất của quá trình trích ly là quá trình khuếch tán.

Để trích ly tốt sản phẩm dầu, cần phải lựa chọn dung môi thích hợp và tối ƣu đƣợc các yếu tố công nghệ ảnh hƣởng tới quá trình trích ly nhƣ nhiệt độ, thời gian, số lần trích ly, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi.

Ƣu điểm của phƣơng pháp trích ly là có thể lấy đƣợc triệt để hàm lƣợng dầu có trong nguyên liệu, có thể khai thác đƣợc những loại dầu có hàm lƣợng trong nguyên liệu thấp (<20%) hoặc đối với nguyên liệu dầu có giá trị và nhạy cảm với nhiệt độ cao với giá thành thấp [47].

Nhƣợc điểm của phƣơng pháp trích ly là thời gian kéo dài, tốn nhiều

dung môi, độc hại, và phải có quá trình xử lý sau trích ly [48].

Hiện nay phƣơng pháp chuyển hóa ester sử dụng dung môi hữu cơ để tạo ra các axit béo dạng alkyl ester bền vững đang đƣợc sử dụng phổ biến. Về mặt bản chất hóa học, phản ứng trao đổi este là phản ứng trao đổi giữa phân tử triglyxerit và axit béo tự do (trong dầu thực vật hoặc mỡ động vật) với rƣợu no đơn chức, mạch ngắn (thƣờng là CH3OH hoặc C2H5OH) trong điều kiện có mặt của xúc tác vô cơ (H2SO4, HCl hoặc NaOH, KOH) để tạo thành các alkyl este của axit béo và glycerol (Hình 1.2). Trong đó, methanol và ethanol hay đƣợc sử dụng nhất [49]. Ethanol có nhiều ƣu điểm nhƣ sử dụng lại đƣợc, dễ phân huỷ sinh học, ít ô nhiễm môi trƣờng nhƣng methanol lại đƣợc sử dụng nhiều hơn do giá thành thấp hơn, cho phép tách đồng thời pha glycerol, do nó là một loại rƣợu mạch ngắn nhất và có tính phân cực. Phản ứng tƣơng tự sử dụng ethanol phức tạp hơn vì nó yêu cầu lƣợng nƣớc trong rƣợu và trong dầu phải rất thấp. Trong phản ứng, xúc tác có vai trò tạo ra các gốc RO- (CH3O- hoặc C2H5O-) là tác nhân chính của phản ứng.

xúc tác

R1COOCH2 R1COOR’ CH2-OH R2COOCH + 3R’OH xúc tác R2COOR’ + CH-OH R3COOCH2 R3COOR’ CH2-OH Triglyxerit Ancol Alkyl ester Glycerol

RCOOH + R’OH RCOOR’ + H2O Axit béo Ancol Alkyl ester Nƣớc

Hình 1.2. Phản ứng ester hóa dầu mỡ [50]

Khi dùng xúc tác kiềm sẽ đạt độ chuyển hóa trong chuyển đổi este nhanh 4.000 lần so với dùng xúc tác axit. Tuy nhiên, nhiều loại dầu, trong thành phần có chứa nhiều axit béo tự do (4-60%) bên cạnh triglyxerit [51]. Điều này gây cản trở sử dụng xúc tác là bazơ. Với xúc tác bazơ đồng thể (NaOH, KOH) có yêu cầu hàm lƣợng axit béo tự do có trong nguyên liệu dƣới 1%. Còn việc sử dụng xúc tác enzyme rất thuận lợi nhƣng giá thành đắt. Quá trình này tạo ra các alkyl este của axit béo có trọng lƣợng phân tử và độ nhớt thấp hơn với các phân tử dầu, mỡ động thực vật ban đầu [51].

Quá trình tổng hợp metyl este có thể theo hai quá trình:

- Quá trình phản ứng 1 giai đoạn (chuyển vị ester trực tiếp): Chỉ sử dụng xúc tác axit, đầu tiên xúc tác thực hiện phản ứng este hóa các axit béo tự do trong dầu (phản ứng xảy ra nhanh), phản ứng sẽ làm giảm hàm lƣợng axit béo tự do trong dầu. Sau đó, xúc tác axit tiến hành phản ứng trao đổi este đối với các triglyxerit (phản ứng xẩy ra chậm), quá trình phản ứng thu metyl este nhƣ vậy đƣợc gọi là quá trình phản ứng 1 giai đoạn.

- Quá trình phản ứng hai giai đoạn: Giai đoạn 1 tách chiết axit béo dạng tự do. Giai đoạn 2 sử dụng xúc tác tiến hành phản ứng trao đổi este với axit béo dạng tự do thu metyl este. Phƣơng pháp này phải trải qua hai giai đoạn, hiệu quả của quá trình này không cao nên ít sử dụng.

1.3.1.2. Phương pháp enzyme

Nguyên lý của phƣơng pháp: sử dụng các loại enzyme với thành phần và tỉ lệ riêng biệt để phá vỡ vách tế bào, giải phóng dầu khỏi cấu trúc ban đầu và tách pha bằng cách ly tâm thành các pha: dầu, rắn và nƣớc.

Phƣơng pháp khai thác dầu thực vật bằng enzyme đã đƣợc thực hiện trên một số loại dầu nhƣ: dầu dừa, dầu hƣớng dƣơng, đậu tƣơng... Một số enzyme đƣợc sử dụng để tăng hiệu suất tách dầu ra khỏi nguyên liệu có dầu nhƣ: amylase, glucanase, protease, pectinase. Hiện nay ở Việt Nam đã có nghiên cứu khảo sát quá trình trích ly dầu màng gấc bằng phƣơng pháp enzyme qui mô phòng thí nghiệm, hay dầu từ hạt hồ đào. Dựa vào thành phần hoá học của dầu và chức năng thuỷ phân của mỗi loại enzyme mà một số nghiên cứu đã tiến hành sử dụng các loại enzyme: viscozym, pectinex, cellulase, alcalase.

Ƣu điểm của phƣơng pháp là phƣơng pháp thân thiện với môi trƣờng

không sử dụng dung môi, tiêu tốn ít năng lƣợng.

Nhƣợc điểm của phƣơng pháp: sử dụng enzyme cho khai thác dầu đƣợc xem là không thích hợp vì trong nguyên liệu thực vật còn có các thành phần cellulose, tinh bột không nhiều. Do đó chúng ít ảnh hƣởng tới quá trình thoát dầu. Mặt khác, giá thành của các loại enzyme thuỷ phân rất cao nên đòi hỏi chi phí sản xuất lớn [47].

1.3.1.3. Phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn

Phƣơng pháp trích ly bằng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn có thể khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của phƣơng pháp trích ly sử dụng dung môi hữu cơ. Vì vậy phƣơng pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn đƣợc sử dụng nhiều trong công nghệ dƣợc phẩm [52].

Nguyên lý của phƣơng pháp: thông thƣờng mỗi chất trong các điều kiện khác nhau thì tồn tại ở một trong ba trạng thái rắn, lỏng hoặc khí. Tuy nhiên, tồn tại một giá trị áp suất mà tại áp suất này, nếu tăng nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt, trạng thái này đƣợc gọi là trạng thái siêu tới hạn. Vật chất ở trạng thái này mang các tính chất của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó

mang tính trung gian giữa khí và lỏng [53]. Vì vậy, khi nhiệt độ, áp suất của CO2 đƣợc đƣa lên cao hơn nhiệt độ, áp suất tới hạn của nó (trên nhiệt độ = 31oC, Áp suất = 73,8 bar (72,8 at)) thì CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn. Tại đây CO2 có thể phân tách trong quá trình trích ly và có thể phân tách trong quá trình chƣng cất. Ở trạng thái này CO2 có khả năng hoà tan rất tốt nhiều chất ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí. Sau khi hòa tan các chất, hỗn hợp thu hồi đƣợc chuyển về áp suất và nhiệt độ để CO2 ở trạng thái khí và các chất sẽ đƣợc tách ra ngoài. Nhƣ vậy quá trình chuyển đổi trạng thái sẽ làm cho CO2 có thể hòa tan và tách các chất một các dễ dàng. Dầu trong phƣơng pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn đƣợc hòa tan trong CO2 sau đó đƣợc tách ra khỏi nguyên liệu chứa dầu [54].

Ƣu điểm của phƣơng pháp là hiệu suất trích ly cao hơn so với trích ly ở trạng thái lỏng, không sử dụng dung môi độc hại, không gây ô nhiễm môi trƣờng và đối với các hợp chất nhạy cảm với nhiệt độ cao thì đây là một phƣơng pháp ƣu thế [53].

Nhƣợc điểm của phƣơng pháp là khả năng hòa tan dầu trong CO2 rất

hạn chế, chỉ tốt ở một số điều kiện nhất định và có chi phí cao [48].

1.3.2. Các phƣơng pháp làm giàu

Để sản xuất MUFAs, PUFAs có độ tinh khiết cao, cần tiến hành làm giàu chúng từ hỗn hợp axit béo tổng số. Nhiều phƣơng pháp khác nhau đƣợc áp dụng để làm giàu các axit béo không no hiện nay nhƣ: tách phân đoạn bằng ly tâm phân tử, kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp, sắc ký cột, chƣng cất phân đoạn chân không và tạo phức với urê. Trong đó, phƣơng pháp đƣợc sử dụng nhiều nhất là kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp và tạo phức với urê [55].

1.3.2.1. Phương pháp kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp

Phƣơng pháp này thích hợp cho việc tách các SFAs ra khỏi hỗn hợp axit béo không no. Ở nhiệt độ thấp, các axit béo mạch ngắn sẽ kết tinh và có thể tách đƣợc các PUFAs ra từ phần còn lại của các axit béo. Tuy nhiên, phƣơng pháp kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp không tách đƣợc triệt để các

SFAs cũng nhƣ không thể tách đƣợc các MUFAs nhƣ axit béo oleic ra khỏi hỗn hợp axit béo không bão hòa đa nối đôi [56].

1.3.2.2. Phương pháp tạo phức với urê

Sử dụng urê để phân tách SFAs ra khỏi MUFAs và PUFAs dựa trên cơ sở các tinh thể urê có cấu trúc tứ giác kín với các rãnh có đƣờng kính 5,67 angtron. Các rãnh của phân tử urê đƣợc tạo nên đủ lớn để khớp với chuỗi axit béo và kết tinh trong một cấu trúc lục giác với các rãnh có đƣờng kính 8-12 angtron khi có mặt các phân tử axit béo không phân nhánh mạch dài [57]. Sự có mặt của các liên kết đôi trong chuỗi carbon làm tăng kích thƣớc của phân tử và đồng thời lại làm giảm khả năng tạo phức của nó với urê. Chính vì vậy, các phân tử axit béo no có khả năng tạo phức một cách dễ dàng với phân tử urê hơn so với các phân tử axit béo không bão hòa có 1 hoặc 2 nối đôi trở lên [58]. Do vậy, trong phân đoạn không tạo phức với urê sẽ chiếm phần lớn các axit béo không bão hòa có từ một nối đôi trở lên.

Để phản ứng tạo phức giữa urê với axit béo no đƣợc xảy ra triệt để, các dung môi hữu cơ để hoà tan cả urê và axit béo nhƣ methanol hoặc cồn hoặc 2 propanol thƣờng đƣợc sử dụng. Chúng ta có thể thu đƣợc hỗn hợp axit béo không bão hoà có độ tinh khiết cao hơn nhiều so với hỗn hợp ban đầu bằng chƣng cất thu hồi dung môi. Do tính chất hóa học của urê tan tốt trong nƣớc nên trong quá trình làm giàu có thể dễ dàng loại đƣợc urê ra khỏi hỗn hợp axit béo bằng phƣơng pháp rửa nƣớc ấm (hoặc nƣớc đã đƣợc axit hóa có độ pH khoảng 3-4). Tiếp đến hỗn hợp axit béo không no đƣợc làm khô bằng muối khan [59].

Tạo phức với với urê là một trong các phƣơng pháp khả thi nhất vì nó cho phép có thể áp dụng trên một lƣợng lớn nguyên liệu cũng nhƣ sử dụng dụng cụ đơn giản, không đòi hỏi dung môi hữu cơ ngoại trừ ethanol và methanol. Sự kết tinh urê đƣợc phân tách chính bằng mức độ không bão hòa của các axit béo nhƣng chiều dài mạch carbon cũng ảnh hƣởng nhiều lên hiệu xuất của quá trình. Điều kiện nhẹ nhàng đƣợc sử dụng đã không ảnh hƣởng lên cấu trúc phân tử của các axit béo không bão hòa thu đƣợc [60].

Kỹ thuật tạo phức với urê đã đƣợc phát triển và trở thành một công cụ hữu hiệu trong việc làm tinh sạch các axit béo không no đa nối đôi PUFAs từ nguồn nguyên liệu dầu thực vật. Phƣơng pháp này có thể tinh sạch hỗn hợp axit béo omega-3 và omega-6 đạt từ 80-90% .

Trong điều kiện phòng thí nghiệm để thu đƣợc hàm lƣợng dầu có chứa các axit béo omega-6, 7, 9 cao theo mô tả của Dang và cộng sự (2013) [61]; Đặng Diễm Hồng và Hoàng Thị Lan Anh (2016) [62], chúng tôi đã sử dụng

phƣơng pháp làm giàu hỗn hợp axit béo -6, 7, 9 trong dầu của vi khuẩn tía

bằng phƣơng pháp tạo phức với urê. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suấtvà chất lƣợng sản phẩm tạo thành nhƣ ảnh hƣởng của tỷ lệ hỗn hợp axit béo:urê; tỷ lệ urê: methanol và nhiệt độ kết tinh đã đƣợc nghiên cứu.

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU OMEGA-6, 7, 9 TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về vai trò cũng nhƣ công nghệ tách chiết và làm giàu omega-6, 7, 9 trên nhiều đối tƣợng, cung cấp dầu giàu omega lợi ích cho sức khỏe con ngƣời.

Năm 2011, Mohammad Asif đã nghiên cứu tác dụng của omega-3, 6, 9 có trong dầu hạt tía tô đối với sức khỏe. Hạt tía tô chứa khoảng 35–45% dầu. So với các loại dầu thực vật khác, dầu hạt tía tô chứa tỷ lệ cao các axit béo omega-3 (ALA) chiếm 54–64%; omega-6 (axit linoleic) chiếm 14%; ngoài ra còn có omega-9 (axit oleic) [63].

Isabel Matos và cộng sự (2018) đã chứng minh omega-9 (axit oleic trong dầu ô liu) có tác dụng giảm viêm khi bị nhiễm trùng huyết ở chuột thông qua việc chuyển hóa lipid, tăng lƣợng cytokine chống viêm IL-10 và giảm các cytokine tiền viêm TNF-α và IL-1β, kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn. Chế độ ăn giàu dầu ô liu chủ yếu bao gồm axit béo không bão hòa một nối đôi omega-9 rất có lợi giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và ung thƣ [64].

Một số loài thực vật có quả hoặc hạt chứa hàm lƣợng omega-7 cao. Tuy nhiên vì năng suất thấp và các đặc tính nông học kém, những loài thực vật này đã gây khó khăn cho mục đích thƣơng mại. Để khắc phục nhƣợc điểm này, Hasna Ettaki và cộng sự (2017) đã nghiên cứu biểu hiện quá mức MYB115, AAD2 hoặc AAD3 trong cây hạt cải. Hai enzyme palmitoyl-ACP desaturase xúc tác sinh tổng hợp omega-7 đặc trƣng ở cây hạt cải, cùng với MYB115 và MYB118 là hai yếu tố phiên mã kiểm soát sự biểu hiện của các gen PAD tƣơng ứng. Các trình tự mã hóa PAD và MYB115 đƣợc biểu hiện dƣới sự kiểm soát của một promoter cảm ứng mạnh trong hạt. Hạt cải giống thu đƣợc có hàm lƣợng omega-7 lớn hơn 50% axit béo tổng số, tăng gấp nhiều lần so với cây hoang dại [65].

Denise Sande và cộng sự (2018) đã nghiên cứu sản xuất axit béo omega-3, 6, 9 sử dụng phƣơng pháp thủy phân dầu thực vật (ôliu, ngô, lạc, vừng, hạt lanh, đậu nành, cải dầu, tỏi, hƣớng dƣơng, dầu hạnh nhân, đậu thầu dầu) và mỡ động vật (dầu xƣơng tủy bò) bằng enzyme Colletotrichum gloeosporioides lipase. Enzyme có khả năng tạo ra các axit béo tự do từ tất cả dầu thí nghiệm. Hoạt động thủy phân của enzyme cao nhất trong dầu ô liu (18,0 IU) và dầu đậu nành (17,8 IU). Tỷ lệ trung bình của các axit béo đƣợc tạo ra từ sự thủy phân dầu là 32,92% omega-9 (axit oleic C18: 1); 26,24% omega-6 (linoleic C18:2) và 5,86% omega-3 (axit α-linolenic C18: 3) [66].

Wayan và cộng sự (2019) nghiên cứu làm giàu axit béo omega-3 từ dầu thải của quá trình chế biến cá ngừ đóng hộp bằng phƣơng pháp tạo phức với urê. Tỷ lệ dầu: urê: methanol = 1: 3: 8 (w/w/v). Kết quả thu đƣợc trong pha lỏng chứa 33,7% SFA; 27,6% PUFA; 4,2% EPA; 21,4% DHA và 18,8% MUFA. Trong đó omega-3, omega-6, omega-9 lần lƣợt chiếm 25,9%; 1,4% và 13,9%, tƣơng ứng. Quá trình kết tinh urê làm tăng hàm lƣợng PUFAs cao gấp 2,7 lần [67].

Islam và cộng sự (2020) đã nghiên cứu thu hồi axit béo omega-6 từ phế thải nhà máy giấy sử dụng kết hợp các kỹ thuật tiền xử lý, chƣng cất phân đoạn, tinh chế bằng tạo phức với urê và kết tinh ở nhiệt độ thấp thu đƣợc axit béo omega-6 có độ tinh khiết 95,2% [68].

1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt nam

Tại Việt Nam, gần đây đã có nhiều nghiên cứu về tách chiết và làm giàu omega sử dụng nhiều phƣơng pháp (dung môi, enzyme, làm giàu bằng urê) trên các đối tƣợng khác nhau nhƣ vi tảo, đậu tƣơng, cá biển, hạt tía tô, hạt dƣa hấu...

Hoàng Thị Minh Hiền và cộng sự (2013) đã nghiên cứu quá trình tách chiết lipid tổng số và axit béo tự do cho sản xuất dầu omega-3 và omega-6 từ sinh khối vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 sử dụng dung môi n-hexane; nhiệt độ 70-75oC; khuấy trộn liên tục trong 4 giờ; nhiệt độ sấy sinh khối 80oC; độ ẩm sinh khối 0%; điều kiện thuỷ phân dầu tảo thô để thu axit béo tự do bằng phƣơng pháp hoá học với phản ứng xà phòng hóa có nồng độ NaOH 1,8 N đƣợc pha trong cồn 70%. Kết quả thu đƣợc hàm lƣợng axit béo omega-3 và omega-6 chiếm đến 60,937% so với tổng số axit béo có trong thành phần axit béo tự do [69]. Tiếp theo nghiên cứu này, Lê Thị Thơm và cộng sự (2014) đã tách và làm giàu hỗn hợp axit béo omega-3, omega-6 bằng phƣơng pháp tạo phức với urê cho hàm lƣợng axit béo omega-3 và omega-6 (99,29% so với TFA) và DHA và EPA (87,83% so với TFA) đạt đƣợc cao nhất ở tỷ lệ axit urê là 1: 4; tỷ lệ urê ethanol là 1: 9 và nhiệt độ kết tinh tạo phức với urê là 4οC [70].

Đinh Thị Thu Trang và cộng sự (2015) đã nghiên cứu tách chiết omega-3 từ phụ phẩm chế biến cá bằng phƣơng pháp thủy phân trong thời gian 120 phút ở 80oC thu các axit béo tự do sau đó làm giàu bằng phƣơng pháp tạo phức với urê gồm tỷ lệ urê/ axit béo là 4/1; tỷ lệ ethanol/ urê là 9/1, nhiệt độ kết tinh 4 oC trong 24 giờ. Hàm lƣợng omega-3 thu đƣợc tăng từ 6,1% lên 24,5% [71].

Hoàng Thị Bích và cộng sự (2017) đã xây dựng đƣợc quy trình công nghệ sử dụng các kỹ thuật phối hợp để phân lập dầu cá chất lƣợng cao từ phụ phẩm chế biến cá ngừ vây vàng Thunnus albacares gồm các bƣớc: Sử dụng sóng vi ba (vi sóng); sử dụng các enzym protease (bromelain) để phân hủy cấu trúc các protein của cá; kỹ thuật ly tâm để lọc phần bã rắn không tan và kỹ thuật lọc màng cao áp để lọc các oligopeptide hòa tan; phân lớp tách dầu

bằng NaCl loãng và nhiệt độ thấp; làm khan bằng Na2SO4 và tẩy màu, tẩy mùi sản phẩm bằng than hoạt tính. Hiệu suất thu hồi dầu cá đạt trung bình 70,4%. Sản phẩm dầu cá chứa đồng thời EPA, DPA, DHA hàm lƣợng đến 22,25% so với tổng axit béo [72].

Nguyễn Thị Hoàng Lan và cộng sự (2018) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố công nghệ tới quá trình thu nhận hỗn hợp axit béo omega-3 và omega-6 từ dầu hạt tía tô. Dầu hạt tía tô đƣợc thủy phân bằng dung dịch NaOH 2N trong ethanol 80% để thu nhận hỗn hợp axit béo ở dạng tự do. Sau đó, làm giàu axit béo đa nối đôi bằng phƣơng pháp tạo phức với urê (tỷ lệ urê/ hỗn hợp axit béo 2/1 theo khối lƣợng, tỷ lệ ethanol 90%/ hỗn hợp axit béo là 9/1 (v/w), 0oC trong 5 giờ. Tổng lƣợng omega-3 và omega-6 trong sản phẩm thu đƣợc đạt 94,86% [73].

Gần đây nhất, Trần Nguyễn Mỹ Châu và cộng sự (2020) đã nghiên cứu chiết tách dầu từ hạt dƣa hấu bằng enzyme sử dụng kết hợp 2 loại enzyme: viscozyme: alcalase, hiệu suất thu hồi dầu đạt giá trị cao nhất 74,9%. Sản phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm, hàm lƣợng axit béo không no chiếm 81,6%, giàu polyphenol, sterol [74].

Lê Thị Thanh Xuân và cộng sự (2020) đã sử dụng hỗn hợp methanol/urê có khả năng làm giàu EPA và DHA trong methyl ester của mỡ cá basa phế thải lên 2-3 lần và tách omega-3, 6, 9 đạt độ sạch 91% và hiệu suất tách đạt 36%. Điều đặc biệt là hệ dung dịch này, sau khi tách axit béo, không cần phải xử lý mà có thể tái sử dụng [75].

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài đƣợc tiến hành nghiên cứu tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Hai chủng VKTQH Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 và Rhodobacter sphaeroides VTN.2 đƣợc phân lập tại cảng cá Ngọc Hải, Đồ Sơn, Hải Phòng và nƣớc thải nhà máy sản xuất, chế biến cá thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu năm 2018.

2.2.2. Vật liệu nghiên cứu

Sinh khối của hỗn hợp hai chủng VKTQH R. sulfidophilum HPB.6 và R. sphaeroides VTN.2 đƣợc sản xuất trong bể kính thể tích 1m3 sử dụng môi trƣờng bán tổng hợp (BTH) gồm bột đậu tƣơng 0,68 g L; cao nấm men 0,75 g/L, Mg2+ 5,5 mg/L. Sau 192 giờ (8 ngày) nuôi cấy, sinh khối VKTQH đƣợc thu bằng chitosan nồng độ 150 mg/L pha trong axit acetic 0,4%. Sinh khối tƣơi VKTQH đƣợc sấy khô ở 70oC đến khối lƣợng không đổi sau đó xay nhỏ thành dạng bột mịn và đƣợc lƣu trữ ở -20oC sử dụng cho tách chiết axit béo.

2.2.3. Máy móc thiết bị

Máy cô quay chân không (IKK của Đức); máy khuấy từ gia nhiệt Kika Labortechnik (Đức); máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70 (Nhật Bản); cân kỹ thuật Precisa XB 1200C (Thụy Sĩ), cân phân tích Shimazu AY120 (Nhật Bản); máy sắc kí khí HP-6890 (Hoa Kỳ); ghép nối với Mass Selective Detector Agilent 5973; cột HP-5MS; khí mang He; thƣ viện phổ khối: WILEY275.L và NIST 98.L; bình pyrex các loại, nồi nhôm, phễu chiết, phễu lọc, cốc đong, ống đong, giấy lọc, nhiệt kế, giấy bạc… và các dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm.

0,01 N (pha từ Na2S2O3

2.2.4. Hóa chất và môi trƣờng

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Hóa chất vô cơ nhƣ: Na2SO4, NaCl, NaOH, KOH, H2SO4, urê, axit axetic đặc, dung dịch KI bão 0,1 N bằng nƣớc cất đun sôi hòa, dung dịch Na2S2O3 để nguội không chứa CO2), hồ tinh bột 1%... và các loại dung môi nhƣ n- hexan, methanol, dichlomethan, cloroform... của Merck, Đức hoặc của Trung Quốc.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Quá trình tách chiết dầu sinh học giàu axit béo dạng omega-6, 7, 9 từ SKK VKTQH bao gồm 2 giai đoạn chính: tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH; làm giàu axit béo omega-6, 7, 9 từ hỗn hợp TFA.

2.3.1. Phƣơng pháp chuyển vị ester trực tiếp từ sinh khối để tạo ra

hỗn hợp các axit béo ở dạng methyl ester [62, 76].

10 g SKK VKTQH đƣợc methyl hóa với 100 mL dung dịch 10 % chất xúc tác đƣợc khảo sát gồm HCl, H2SO4, KOH, NaOH đƣợc pha trong methanol và 50 mL dichloromethane. Phản ứng đƣợc thực hiện trên máy khuấy từ gia nhiệt với nhiệt độ đƣợc thay đổi từ 60°C đến 85°C, trong thời gian phản ứng từ 3 giờ đến 5 giờ với chế độ khuấy thay đổi từ để tĩnh đến khuấy liên tục. Tỉ lệ nguyên liệu dung môi đƣợc thay đổi từ 1:6 đến 1:8 (w v). Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp đƣợc làm nguội đến nhiệt độ phòng và lọc loại bỏ bã sinh khối. Sau đó, hỗn hợp đƣợc bổ sung thêm 20 mL dung dịch NaCl bão hòa và 100 mL n - hexan. Tiến hành lắc đều hỗn hợp, để phân lớp trên phễu chiết và tách lấy lớp n - hexan phía trên có chứa TFA. Lớp dƣới đƣợc rửa nhiều lần bằng n - hexan để thu toàn bộ pha n - hexan và loại bỏ n - hexan bằng máy cắt quay chân không và thu hồi sản phẩm là các axit béo dạng methyl ester.

Hiệu suất của quá trình tách TFA đƣợc tính theo công thức sau:

H (%) =

Trong đó: H (%): Hiệu suất của quá trình tách TFA; m (g): Khối lƣợng

TFA thu đƣợc sau khi chuyển hóa; M (g): Khối lƣợng sinh khối ban đầu.

2.3.2. Tối ƣu các thông số của quá trình tách chiết TFA

Một số thông số của quá trình tách chiết đƣợc nghiên cứu bao gồm: lựa chọn chất xúc tác thích hợp, lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu dung môi, nhiệt độ phản ứng, thời gian phản ứng, chế độ khuấy trộn của quá trình tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH. Sử dụng phƣơng pháp thay đổi một nhân tố, các nhân tố khác giữ nguyên, sau khi chọn đƣợc giá trị thích hợp của nhân tố đó thì giá trị này đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Các thí nghiệm đƣợc khảo sát bao gồm:

- Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng gồm 60 - 65°C; 70 - 75°C và 80 - 85°C. Giữ nguyên hỗn hợp dung môi (10 % chất xúc tác HCl 37% trong methanol), lƣợng dichlomethan bổ sung vào phản ứng, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:10 (w v), thời gian phản ứng 3 giờ và khuấy trộn liên tục.

- Lựa chọn chất xúc tác thích hợp cho quá trình tách chiết TFA gồm HCl, H2SO4, NaOH, KOH. Đối với chất xúc tác là bazơ: hòa tan 10g NaOH KOH vào 80 mL methanol và định mức lên 100 mL bằng methanol, sau đó bổ sung 50 mL dichlomethanol. Đối với chất xúc tác là axit: bổ sung 10 mL H2SO4, HCl vào 90 mL methanol sau đó bổ sung 50 mL dichlomethanol. Giữ nguyên các chất tham gia phản ứng, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:10 (w/v), thời gian phản ứng 3 giờ và nhiệt độ phản ứng 70-75oC, chế độ khuấy liên tục.

- Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi gồm 1:6; 1:8; 1:10 và 1:12 (w v). Giữ nguyên hỗn hợp dung môi (10 % chất xúc tác HCl trong methanol), lƣợng dichlomethan bổ sung vào phản ứng, thời gian phản ứng 3 giờ, nhiệt độ phản ứng 70-75oC và chế độ khuấy trộn liên tục.

- Ảnh hưởng của thời gian khuấy: 3, 4 và 5 giờ. Giữ nguyên hỗn hợp dung môi (10 % chất xúc tác HCl trong methanol), lƣợng dichlomethan bổ sung vào phản ứng, nhiệt độ phản ứng 70-75oC, tỷ lệ nguyên liệu dung môi là 1:10 (w v) và chế độ khuấy trộn liên tục.

- Ảnh hưởng của chế độ khuấy: để tĩnh, khuấy gián đoạn (30 phút khuấy, 30 phút để tĩnh) và khuấy liên tục. Giữ nguyên hỗn hợp dung môi (10 % chất xúc tác HCl trong methanol), lƣợng dichlomethan bổ sung vào phản ứng, nhiệt độ phản ứng 70-75oC, tỷ lệ nguyên liệu dung môi là 1:10 (w v) và thời gian phản ứng 3 giờ.

2.3.3. Làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9 trong dầu vi khuẩn

tía bằng phƣơng pháp tạo phức với ure [61, 62].

10 g hỗn hợp TFA thu đƣợc cho vào hỗn hợp urê và methanol (theo các

tỉ lệ khác nhau). Hỗn hợp đƣợc khuấy đảo đều trên máy khuấy từ và gia nhiệt ở 60oC trong 5 phút đến khi hỗn hợp hòa tan hoàn toàn. Sau đó tiến hành phản

ứng tạo phức ở nhiệt độ khác nhau trong thời gian 12-15 giờ. Trong đó, phức

hợp đƣợc tạo ra do sự kết hợp của các SFA với urê. Các axit béo omega-6, 7,

9 sẽ không tạo phức với urê. Sau quá trình tạo phức, hỗn hợp đƣợc lọc tách

phức tạo thành ra khỏi hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9. Tiến hành cất quay chân không ở 70oC để loại bỏ methanol dƣ và thu nhận hỗn hợp axit béo

omega-6, 7, 9. Tiếp theo, hỗn hợp axit béo thu đƣợc đƣợc rửa 3 lần với nƣớc

ấm để loại bỏ urê còn dƣ thừa. Sau đó, tiến hành bổ sung thêm n-hexan vào

hỗn hợp để hòa tan các axit béo. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc phân lớp qua phễu

chiết, thu phần dung môi chứa các axit béo ở lớp trên và loại bỏ lớp dƣới

(chứa nƣớc). Hỗn hợp dung môi chứa các axit béo đƣợc lọc qua muối Na2SO4 khan để loại bỏ nƣớc dƣ và đƣợc cất quay chân không ở 70oC để loại bỏ dung

môi và thu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9. Sử dụng phƣơng pháp thay đổi

một nhân tố, các nhân tố khác giữ nguyên. Các thí nghiệm đƣợc khảo sát

gồm:

- Ảnh hưởng của tỷ lệ TFA: urê lên hiệu suất tách và làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9: tỷ lệ hỗn hợp TFA và urê đƣợc lựa chọn cho thí nghiệm là 1:2, 1:3, 1:4 và 1:5 (w/w). Tỉ lệ TFA: methanol đƣợc giữ nguyên

1:20 (w/v). Nhiệt độ kết tinh là 4oC (ngăn mát tủ lạnh). Hỗn hợp phản ứng đƣợc thực hiện với 10 g TFA.

- Ảnh hưởng của tỷ lệ TFA: urê: methanol lên hiệu suất tách và làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9: tỷ lệ hỗn hợp TFA: urê: methanol đƣợc lựa chọn cho thí nghiệm là 1:3:15, 1:3:20 và 1:3:25 (w/w/v). Nhiệt độ kết tinh là 4oC (ngăn mát tủ lạnh). Hỗn hợp phản ứng đƣợc thực hiện với 10 g TFA.

- Ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh lên hiệu suất tách và làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9: các nhiệt độ kết tinh đƣợc lựa chọn cho thí nghiệm là 4oC (ngăn mát tủ lạnh), 17oC và 25oC (tủ ấm). Tỷ lệ TFA: urê: methanol đƣợc giữ nguyên 1:3:20 (w/w/v). Hỗn hợp phản ứng đƣợc thực hiện với 10 g TFA. Hiệu suất tách chiết các axit béo omega-6, 7, 9 đƣợc đánh giá thông qua hiệu suất tách MUFAs, PUFAs và hiệu suất tạo phức giữa SFAs và urê nhƣ sau:

+ Hiệu suất tách MUFAs, PUFAs (H %) đƣợc tính theo công thức

Trong đó: H: Hiệu suất tách MUFAs, PUFAs (%); M1: khối lƣợng MUFAs, PUFAs thu đƣợc sau khi tạo phức (g); M2: Khối lƣợng TFA đem phân tách.

H (%)=

+ Hiệu suất tạo phức của SFAs với urê (H%) đƣợc tính theo công

thức sau:

Trong đó: H (%): hiệu suất tạo phức của SFAs; m1 (g): khối lƣợng

H (%)=

SFAs sau khi tạo phức; m2 (g): khối lƣợng TFA đƣợc phân tách.

2.3.4. Phƣơng pháp phân tích thành phần axit béo của dầu Dầu đƣợc hòa tan với 1ml n-hexan, lắc kĩ trong lọ nhỏ nút kín, sau đó bổ sung 25µl dung dịch CH3ONa trong methanol (2 mol/l) và lắc kỹ trong 1 phút. Bổ sung 1ml nƣớc cất vào, lắc kỹ và phân lớp bằng ly tâm 3.000 vòng/phút. Hút lớp sáp không phản ứng ở dƣới loại đi. Tiếp tục bổ sung 100µl HCl, lắc kĩ và phân lớp bằng ly tâm 3.000 vòng/phút. Sau khi loại bỏ lớp bẩn dƣới đáy, lớp dung môi trên đƣợc làm khan bằng Na2SO4 và phân lớp bằng ly

tâm 3.000 vòng/phút. Chuyển mẫu đã đƣợc methyl hóa sang ống mẫu đem phân tích thành phần axit béo bằng máy sắc kí khí: HP-6890, ghép nối với Mass Selective Detector Agilent 5973; Cột: HP-5MS (0,25m x 30m x 0,25mm); khí mang He; Chƣơng trình nhiệt độ: bắt đầu ở 80oC trong 1 phút; tăng lên 150oC với tốc độ tăng 4oC/phút; tiếp theo tăng nhiệt độ lên đến 260oC và giữ trong 10 phút với tốc độ tăng nhiệt độ10oC/phút.

Thƣ viện phổ khối: WILEY275. L và NIST 98. L theo tiêu chuẩn ISO FDIS 5590:1998, LB Đức và theo mô tả trong công trình của Đặng Diễm Hồng và cộng sự (2007) [77] đƣợc tiến hành tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.5. Phƣơng pháp xác định trạng thái cảm quan Phƣơng pháp xác định trạng thái cảm quan tại trung tâm kiểm nghiệm TSL thuộc Công ty TNHH Khoa học TSL dựa theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 2627-1993 [78].

- Về màu sắc: rót dầu vào cốc thủy tinh (đƣờng kính 50mm, cao 100mn), chiều cao lớp dầu không đƣợc thấp hơn 50mm, quan sát trên nền trắng. D ng các từ thích hợp để diễn tả nhƣ: vàng nhạt, vàng, vàng sẫm, vàng với ánh xanh lá cây…

- Về m i: phết một lớp dầu mỏng lên mặt kính hoặc xoa vào lòng bàn tay rồi tiến hành ngửi để đánh giá. Để nhận biết m i dễ dàng hơn, cho 30ml dầu vào cốc thủy tinh, làm nóng đến 50oC, d ng đũa thủy tinh khuấy nhanh và tiến hành thử. Khi cần thiết đem so sánh với mẫu dầu phẩm chất tốt.

- Về độ trong: Dầu phải trộn đều trƣớc khi đem xác định độ trong. Rót 100ml dầu vào ống thủy tinh không màu (đƣờng kính 30mm) và để yên ở nhiệt độ 20oC trong 24 giờ. Quan sát dầu để lắng yên với ánh sáng phản chiếu trên nền tráng. Mẫu dầu đƣợc xem nhƣ trong suốt, nếu không có vẩn đục hoặc những sợi lơ lửng.

2.3.6. Phƣơng pháp xác định chỉ số axit Phƣơng pháp xác định chỉ số axit tại trung tâm kiểm nghiệm TSL thuộc

Công ty TNHH Khoa học TSL theo TCVN 6127-2010 [79].

Chỉ số axit là số mg KOH d ng để trung hòa các axit béo tự do có trong 1 g chất béo. Quy trình xác định chỉ số này nhƣ sau: cân mẫu thử vào bình nón (nếu là dầu thực vật tinh luyện thì khối lƣợng mẫu là 20g, dầu thô – 10g). Thêm 50ml hỗn hợp dung môi là ethanol 96% và dietyl ete không chứa peroxyt (trộn đều một lƣợng thể tích nhƣ nhau), trƣớc khi sử dụng, trung hòa bằng cách thêm KOH 0,1M với sự có mặt của 0,3 ml dung dịch phenolphthalein đối với 100ml hỗn hợp dung môi) đã trung hòa và hòa tan mẫu. Nhỏ 3 giọt thuốc chỉ thị phenolphthalein và chuẩn độ bằng KOH 0,1M cho đến khi xuất hiện màu hồng bền.

WAV = (56,1 x C x V)/ m (mg KOH/g)

C: nồng độ dung dịch chuẩn (M); V: thể tích dung dịch chuẩn (ml); m: khối lƣợng mẫu thử (g)

2.3.7. Phƣơng pháp xác định chỉ số iot

Chỉ số iot là số gam iot kết hợp với 100g chất béo. Iot kết hợp vào các liên kết đôi trong phân tử axit béo không no. Quy trình xác định chỉ số này nhƣ sau: cân 1g mẫu thử cho vào bình nón 250ml (bình thí nghiệm) và 1 ml nƣớc cất tƣơng ứng (bình kiểm tra). Sau đó thêm vào mỗi bình 10ml cồn 96o và 10ml I2 0,1N trong cồn, lắc đều. Đậy nút bình để yên trong tối 3 giờ, sau đó chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1N đến khi dung dịch có màu vàng nhạt. Thêm vào mỗi bình 10 giọt tinh bột 1%, tiếp tục chuẩn độ đến khi mất màu xanh. Công thức tính chỉ số iot nhƣ sau:

I = [(a-b) x 0,0127 x 100]/ g

a: số ml dung dịch Na2S2O3 0,01N d ng để chuẩn độ bình thí nghiệm; b: số ml dung dịch Na2S2O3 0,01N d ng để chuẩn độ bình kiểm tra; g: khối lƣợng chất béo; 100- hệ số quy chuẩn cho 100 g chất béo; 0,0127: số g I2 tƣơng ứng với 1 ml dung dịch I2 0,1N

2.3.8. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng urê Hàm lƣợng urê đƣợc xác định tại trung tâm kiểm nghiệm TSL thuộc Công ty TNHH Khoa học TSL bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang theo TCVN 8025: 2009 [80]. Urê có trong mẫu đƣợc

tạo dẫn xuất với xanthydrol (9H-xanthen-9-ol), tạo ra N-9H-xanthen-9-ylurea, dẫn xuất đƣợc phân tích trên thiết bị HPLC, dùng detector huỳnh quang với bƣớc sóng kích hoạt 213 nm và bƣớc sóng phát xạ 308 nm.

2.3.9. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các kim loại nặng trong

dầu sinh học

Nguyên tắc: Dung dịch thử thu đƣợc sau khi phân hủy bằng áp lực, đƣợc phun sƣơng và tạo sol khí, sau đó đƣợc chuyển vào plasma agon cảm ứng cao tần. Nhiệt độ cao của plasma d ng để làm khô sol khí và để nguyên tử hóa và ion hóa các nguyên tố. Các ion đƣợc tách ra khỏi plasma bằng hệ thống thu mẫu và bộ tách hình nón, sau đó đƣợc chuyển vào máy đo phổ khối lƣợng, trong đó các ion đƣợc tách theo tỷ lệ khối lƣợng điện tích của chúng và đƣợc xác định bằng hệ thống detector đếm xung và/hoặc detector tƣơng tự.

Hàm lƣợng các kim loại nặng trong dầu sinh học đƣợc xác định tại trung tâm kiểm nghiệm TSL thuộc Công ty TNHH Khoa học TSL theo các phƣơng pháp đƣợc trình bày trên bảng 2.1.

Bảng 2.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kim loại nặng trong mẫu dầu sinh học

Tên chỉ tiêu thử Đơn vị tính Phƣơng pháp thử

Cadimi (Cd) TS-KT-QP-02:2018 ppm

Chì (Pb) TS-KT-QP-02:2018 ppm

Thủy ngân (Hg) TS-KT-QP-02:2018 ppm

Asen (As) TS-KT-QP-02:2018 ppm

Đồng (Cu) TS-KT-QP-01:2019 ppm

Sắt (Fe) TS-KT-QP-01:2019 ppm

2.3.10. Phƣơng pháp xác định vi sinh vật trong dầu sinh học

Một số chỉ tiêu vi sinh vật trong mẫu dầu sinh học đã đƣợc tiến hành kiểm tra tại trung tâm kiểm nghiệm TSL thuộc Công ty TNHH Khoa học TSL theo phƣơng pháp đƣợc chỉ ra trên bảng 2.2.

Bảng 2.2. Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật có trong dầu sinh học

Tên chỉ tiêu thử Đơn vị tính Phƣơng pháp thử

Tổng số vi khuẩn hiếu khí CFU/g ISO 4833-1:2013

E. coli CFU/g ISO/TS 16649-2:2005

Coliform CFU/g ISO 4832:2006

Staphylococcus aureus CFU/g AOAC 975.55

Salmonella CFU/g ISO 6579-1:2017

Tổng số nấm men, mốc CFU/g ISO 21527-1:2008

2.3.11. Phƣơng pháp xử lý thống kê

Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Kết quả biểu diễn ở dạng TB ± SD. Phần mềm SAS 9.1 đƣợc d ng để phân tích số liệu. Vẽ đồ thị đƣợc thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel phiên bản 2010. So sánh trung bình giữa nghiệm thức dựa vào phƣơng pháp ANOVA ở mức ý nghĩa α = 0,05.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Quá trình tách chiết dầu sinh học giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ SKK VKTQH bao gồm 2 giai đoạn chính: tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH; làm giàu axit béo omega-6, 7, 9 từ hỗn hợp TFA. Để thu đƣợc hiệu suất tách chiết axit béo không no omega-6, 7, 9 cao cần tối ƣu đƣợc hiệu suất tách chiết ở mỗi giai đoạn. Chính vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hƣởng của các tác nhân khác nhau lên hiệu suất tách chiết của mỗi giai đoạn nêu trên là rất cần thiết. Bên cạnh đó, nguồn sinh khối hỗn hợp 2 chủng VKTQH nuôi trồng đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho tách chiết phải có chất lƣợng tốt, hàm lƣợng axit béo phù hợp.

3.1. HÀM LƢỢNG SINH KHỐI KHÔ, LIPID VÀ THÀNH PHẦN AXIT BÉO (OMEGA-6, 7, 9) CỦA SINH KHỐI HỖN HỢP 2 CHỦNG VKTQH SẢN XUẤT TRONG BỂ QUANG SINH THỂ TÍCH 1M3

Bể quang sinh thể tích 1m3 (sử dụng môi trƣờng bán tổng hợp) đã đƣợc lựa chọn để sản xuất sinh khối VKTQH làm nguyên liệu tách chiết dầu sinh học giàu axit béo không no (omega-3,6,7,9). Kết quả sau 8 ngày nuôi cấy cho thấy sinh khối có hàm lƣợng sinh khối khô và lipid đạt 2,42 ± 0,29 g/l và 20,342 ± 1,247% SKK tƣơng ứng. Hàm lƣợng axit béo không no omega-6, 7, 9 chiếm 56,28% so với TFA. Trong đó, hàm lƣợng omega-3, omega-6, omega-7 và omega-9 đạt 8,48%; 4,10%; 18,32% và 25,38%, tƣơng ứng (Bảng 3.1). Nhƣ vậy, sinh khối hỗn hợp 2 chủng VKTQH có thành phần và hàm lƣợng axit béo phù hợp, đảm bảo về chất lƣợng sử dụng làm nguyên liệu cho tách chiết dầu sinh học giàu axit béo.

Bảng 3.1. Hàm lƣợng sinh khối khô, lipid và omega-3, 6, 7, 9 của VKTQH khi nuôi trong bể quang sinh thể tích 1m3 Các thông số Sinh khối khô (g/L) Lipid (% SKK) Omega-3 (% so với TFA) Omega-6 (% so với TFA) Omega-7 (% so với TFA) Omega-9 (% so với TFA) Tổng omega-3,6,7,9 (% so với TFA)

Hàm lƣợng 2,42 ± 0,29 20,342 ± 1,247 8,48 4,10 18,32 25,38 56,28

3.2. TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TÁCH CHIẾT TFA TỪ SINH KHỐI KHÔ VKTQH

Dầu thực vật có thể đƣợc tách chiết bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ ép, Soxhlet, sử dụng CO2 siêu tới hạn hoặc dung môi hoá học. Phƣơng pháp chuyển vị ester trực tiếp (methyl hóa trực tiếp axit béo và chất xúc tác đƣợc bổ sung cùng một lúc) từ sinh khối là phƣơng pháp đơn giản, tiết kiệm thời gian, cho hiệu suất tách chiết cao do đó dẫn đến giá thành sản phẩm giảm hơn so với phƣơng pháp chuyển hóa hai giai đoạn (dầu sau khi tách chiết đƣợc cho phản ứng với methanol có mặt chất xúc tác) [76]. Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp tách chiết sử dụng dung môi hóa học sử dụng phƣơng pháp chuyển vị ester trực tiếp từ sinh khối VKTQH để tách chiết TFA nhằm thu đƣợc hiệu suất tách chiết TFA cao. Chúng tôi sử dụng quy trình tách chiết TFA đã đƣợc xây dựng cho vi tảo áp dụng với đối tƣợng mới là VKTQH và tiến hành tối ƣu các thông số cho phù hợp với đối tƣợng mới này nhƣ: nhiệt độ; chất xúc tác; tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (khối lƣợng: thể tích); thời gian trích ly; chế độ trích ly (khuấy liên tục, để tĩnh, khuấy gián đoạn).

3.2.1. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng

Thông thƣờng, nhiệt độ tách chiết càng cao sẽ làm nguyên liệu tăng khả năng trƣơng nở, vận tốc của quá trình chuyển khối, làm giảm độ nhớt của dầu làm cho dầu tan vào dung môi tốt hơn. Tuy nhiên, nhiệt độ cũng là một trong những yếu tố giới hạn vì nếu nhiệt độ tách chiết quá cao có thể sẽ thúc đẩy các biến đổi hóa học không mong muốn, làm giảm hiệu suất tách chiết. Trong thí nghiệm này sử dụng 3 khoảng nhiệt độ: 60-65ᵒC, 70-75ᵒC và 80-85ᵒC với chất xúc tác HCl, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:10 (w/v), thời gian phản ứng 3 giờ và khuấy trộn liên tục để tách chiết TFA. Hình 3.1 là kết quả hiệu suất quá trình tách chiết TFA với các nhiệt độ phản ứng khác nhau bao gồm 60 - 65oC, 70 - 75oC, 80 - 85oC.

Từ Hình 3.1 cho thấy ở nhiệt độ trong khoảng 80-85oC hiệu suất tách TFA tối ƣu đạt 20,3 ± 1,07% SKK. Hiệu suất tách TFA ở các khoảng nhiệt độ 70-75oC và 60-65oC đạt lần lƣợt 19,6 ± 1,12% và 13,7 ± 0,87% SKK.

)

%

( t ấ u s u ệ i H

25 20 15 10 5 0

60 - 65

80 - 85

70 - 75 Nhiệt độ (oC)

Hình 3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH. Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05

Nhƣ vậy, hiệu suất tách chiết TFA tăng khi nhiệt độ phản ứng tăng. Tuy nhiên, khi tách chiết với một lƣợng lớn sử dụng nhiệt độ 80-85°C là không an toàn, dung môi dễ bay hơi và dễ xảy ra cháy nổ. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ phản ứng trong khoảng 70-75°C để tiến hành tối ƣu các thông số tiếp theo. Nhiệt độ này thấp hơn của Johnson và Wen (2009) khi tiến hành phản ứng ở 90oC trong 40 phút trên đối tƣợng vi tảo cho hàm lƣợng diesel sinh học cao nhất đạt 42,05 ± 2,12% SKK tảo [76], nhƣng lại cao hơn so với nhiệt độ nghiên cứu của Đặng Diễm Hồng và Hoàng Thị Lan Anh (2016) ở 60-65oC trong 3 giờ cho tách chiết axit béo đạt hiệu suất 46,7% sinh khối tảo [62]. Cho đến nay, tại Việt Nam chƣa có một công bố nào về tách chiết các axit béo không bão hòa trên đối tƣợng VKTQH. Ngoài ra, về thành phần các axit béo có trong sinh khối VKTQH lại có sự tƣơng đồng khá lớn với thành phần axit béo ở sinh khối vi tảo. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành so sánh kết quả nghiên cứu của mình với các công bố của vi tảo tại Việt Nam.

3.2.2. Kết quả xác định ảnh hƣởng của chất xúc tác

Chất xúc tác làm giảm năng lƣợng hoạt hóa và làm tăng tốc độ của phản ứng chuyển hóa ester, làm tăng hiệu suất quá trình tách chiết. Sử dụng các chất xúc tác nhƣ: HCl, H2SO4, NaOH và KOH với tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:10 (w/v) ở nhiệt độ 70-75oC trong thời gian phản ứng 3 giờ và điều kiện khuấy trộn liên tục để tách chiết TFA.

)

%

( t ấ u s u ệ i H

H2SO4

HCl

NaOH

KOH

Chất xúc tác

Hình 3.2. Ảnh hƣởng của chất xúc tác lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05

Kết quả ở Hình 3.2 cho thấy khi sử dụng chất xúc tác bazơ (KOH, NaOH) trong phản ứng tách chiết TFA rất phức tạp, khó khăn, hiệu suất tách chiết TFA thấp chỉ đạt 2,4 ± 0,28% và 1,1 ± 0,15% SKK tƣơng ứng. Khi sử dụng chất xúc tác axit (HCl, H2SO4), TFA thu đƣợc dễ dàng và đạt hiệu suất cao 19,7 ± 0,59% và 16,4 ± 0,6% SKK tƣơng ứng. Ngoài ra, H2SO4 có độ đậm đặc rất cao nên rất nguy hiểm khi sử dụng và dễ dàng gây ô nhiễm môi trƣờng nếu không có biện pháp xử lý thu hồi sau khi sử dụng. Trên đối tƣợng là vi tảo, HCl cũng đƣợc sử dụng làm xúc tác cho phản ứng tách chiết axit béo [62]. Một số nghiên cứu cũng sử dụng H2SO4 làm chất xúc tác và thu đƣợc hiệu suất chuyển hóa biodiesel cao nhất đạt 66,47% [76]. Chính vì vậy, HCl cũng đƣợc chọn làm xúc tác cho các phản ứng tiếp theo.

3.2.3. Kết quả xác định ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi

(khối lƣợng/ thể tích)

Bản chất của quá trình tách chiết là quá trình khuếch tán phân tử. Khi sự chênh lệch nồng độ dầu trong nguyên liệu càng cao thì quá trình khuếch tán diễn ra mạnh, sự khuếch tán xảy ra cho đến khi đạt trạng thái cân bằng thì dừng lại. Khi sử dụng quá ít dung môi thì hiệu suất trích ly thấp do dung môi không đủ để hòa tan lƣợng dầu có trong nguyên liệu. Nếu sử dụng dƣ thừa dung môi thì sẽ gây lãng phí, tốn dung môi, tăng lƣợng tạp chất, tốn năng lƣợng cho quá trình cô thu hồi dung môi nên hiệu quả tách chiết không cao. Do vậy, cần thiết phải nghiên cứu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp để trích ly đƣợc tối đa lƣợng dầu trong nguyên liệu và có hiệu quả kinh tế cao nhất. Trong thí nghiệm này sinh khối khô VKTQH đƣợc tách chiết với các tỷ

lệ nguyên liệu: dung môi là 1: 6; 1: 8; 1: 10 và 1: 12 (w:v), chất xúc tác HCl, nhiệt độ 70-75oC trong thời gian 3 giờ và ở điều kiện khuấy trộn liên tục.

)

%

( t ấ u s u ệ i H

25 20 15 10 5 0

1:6

1:8

1:10

1:12

Tỷ lệ SKK : hỗn hợp dung môi

Hình 3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ sinh khối/ dung môi lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05

Kết quả Hình 3.3 cho thấy hiệu suất tách chiết TFA cao nhất tại tỷ lệ 1:12 (w:v) (đạt 20,5 ± 0,95% SKK) và thấp nhất tại tỷ lệ 1:6 (w/v) (chỉ đạt 11,8 ± 1,61% SKK). Khi so sánh hàm lƣợng TFA ở tỷ lệ 1:10 và 1:12 (w/v) cho thấy không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê. Ở điều kiện tỉ lệ sinh khối: hỗn hợp dung môi 1: 8 (w v), TFA thu đƣợc chỉ đạt 82% so với tỷ lệ 1:10 (w/v). Vì vậy, để tiết kiệm dung môi cũng nhƣ giảm giá thành sản phẩm tỷ lệ sinh khối: hỗn hợp dung môi 1:10 (w v) đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. Nhƣ vậy, trên các đối tƣợng khác nhau thì tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là khác nhau. Johnson và Wen (2009) sử dụng tỷ lệ sinh khối: hỗn hợp dung môi (methanol, dichlomethan, H2SO4, hexane) là 1: 8 (w/v) cho hàm lƣợng diesel sinh học cao nhất đạt 42,05 ± 2,12 % SKK tảo.

3.2.4. Kết quả xác định ảnh hƣởng của thời gian phản ứng

Thời gian ảnh hƣởng tới hiệu suất của quá trình tách chiết dầu. Trong thí nghiệm này, sử dụng chất xúc tác HCl, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:10 (w/v), nhiệt độ 70-75oC, điều kiện khuấy trộn liên tục và thời gian thay đổi: 2 giờ, 3 giờ và 4 giờ.

Từ Hình 3.4 cho thấy hiệu suất thu TFA thay đổi khi tăng dần thời gian phản ứng. Với thời gian 3 giờ, hiệu suất tách chiết TFA cao nhất đạt 19,7 ± 0,25% SKK. Với thời gian 2 giờ hiệu suất thu TFA thấp chỉ đạt 16,2 ± 0,8%

SKK, nguyên nhân có thể do phản ứng xảy ra chƣa hoàn toàn. Khi tiếp tục tăng thời gian lên 4 giờ, hiệu suất giảm cũng chỉ đạt 16,9 ± 1,01% SKK. Nguyên nhân có thể do phản ứng xảy ra trong thời gian dài làm bay hơi dung môi hoặc do tác động của nhiệt độ trong thời gian dài một số axit béo chƣa bão hòa bị chuyển hóa dẫn đến hiệu suất giảm. Để tiết kiệm thời gian và đạt hiệu quả kinh tế, thời gian phản ứng là 3 giờ đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo và kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Đinh Thị Ngọc Mai và cộng sự (2012) khi phản ứng ở 3 giờ đã chuyển hóa 43% diesel sinh học và axit béo đạt 46,7% sinh khối tảo [81].

)

%

( t ấ u s u ệ i H

Thời gian

Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05

3.2.5. Kết quả xác định ảnh hƣởng của điều kiện khuấy trộn

Trong thí nghiệm này sử dụng chất xúc tác HCl, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:10 (w:v) ở nhiệt độ 70-75oC, thời gian 3 giờ và điều kiện khuấy trộn nhƣ sau: không khuấy trộn, khuấy trộn gián đoạn (30 phút khuấy, 30 phút ngừng) và khuấy trộn liên tục.

)

%

( t ấ u s u ệ i H

25 20 15 10 5 0

Không khuấy Khuấy không

Khuấy liên tục

liên tục

Chế độ khuấy

Hình 3.5. Ảnh hƣởng của điều kiện khuấy trộn lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05

Kết quả Hình 3.5 cho thấy hiệu suất tách chiết TFA ở điều kiện khuấy liên tục cao nhất đạt 19,8 ± 1,01% SKK. Trong khi đó ở điều kiện không khuấy hoặc khuấy gián đoạn, hiệu suất tách chiết TFA giảm đi chỉ đạt 14,3 ± 0,76% SKK và 16 ± 0,3 % SKK tƣơng ứng. Nguyên nhân của hiện tƣợng này có thể do chế độ khuấy ảnh hƣởng đến sự tiếp xúc giữa sinh khối và dung môi làm phản ứng xảy ra không liên tục. Do vậy, chế độ khuấy liên tục đã đƣợc lựa chọn để làm tăng tối đa hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối khô VKTQH. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Đinh Thị Ngọc Mai và cộng sự (2012) trên đối tƣợng vi tảo cho thấy hiệu quả chuyển hóa diesel sinh học tăng lên đáng kể đạt 89% dƣới điều kiện khuấy trộn liên tục [81].

Như vậy các điều kiện tách chiết cho phù hợp với đối tượng mới là sinh khối VKTQH (nhiệt độ 70-75oC, chất xúc tác HCl, tỉ lệ sinh khối: hỗn hợp dung môi là 1:10 (w/v), thời gian phản ứng 3 giờ, điều kiện khuấy trộn liên tục)

3.3. TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN LÀM GIÀU OMEGA-6, 7, 9 TỪ HỖN HỢP AXIT BÉO TỔNG SỐ THU ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP TẠO PHỨC VỚI URÊ

Dựa vào đặc tính của SFA, MUFA và PUFA, chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp tạo phức với urê để làm giàu hỗn hợp omega-6, 7, 9. Đây là một phƣơng pháp hiệu quả và dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm và để có đƣợc hiệu suất thu hồi MUFAs và PUFAs cao, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố đến quá trình làm giàu axit béo nhƣ: tỷ lệ hỗn hợp TFA: urê, tỷ lệ TFA: urê: methanol và nhiệt độ kết tinh.

3.3.1. Kết quả xác định ảnh hƣởng của tỷ lệ hỗn hợp TFA: urê

trong quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo

Để có đƣợc hiệu suất thu hồi MUFAs và PUFAs cao trong quá trình làm giàu omega-6, 7, 9; chúng tôi tiến hành tối ƣu tỷ lệ hỗn hợp TFA: urê trong quá trình làm giàu. Các tỷ lệ TFA: urê gồm 1:2; 1:3; 1:4 và 1:5 (w w) đã

đƣợc sử dụng trong nghiên cứu. Tỉ lệ TFA: methanol đƣợc giữ nguyên 1:20 (w/v) và nhiệt độ kết tinh là 4oC. Hiệu suất tách đƣợc thể hiện trên Hình 3.6.

Hình 3.6. Hiệu suất tách chiết SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các tỷ lệ TFA: urê khác nhau. Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05

Kết quả ở Hình 3.6 cho thấy, khi tăng dần tỷ lệ TFA: urê từ 1:2 đến 1:5 (w/v) thì hiệu suất thu MUFAs và PUFAs giảm dần, đồng thời hiệu suất thu SFAs tăng dần. Ở tỉ lệ TFA : urê là 1:5 (w/w), hiệu suất tách chiết MUFAs và PUFAs thấp nhất đạt 21,3% (Hình 3.8.B), đồng thời hiệu suất tách SFAs cao nhất đạt 65,1% (Hình 3.8.A); tỷ lệ 1:4 (w/w) và tỷ lệ 1:3 (w/w) có hiệu suất tách chiết MUFAs, PUFAs lần lƣợt đạt 28,6% và 39,2%; hiệu suất tách SFAs lần lƣợt đạt 57% và 46,1%. Ở tỉ lệ TFA: urê là 1:2 (w/w) hiệu suất tách MUFAs và PUFAs cao nhất đạt 44,7% TFA và hiệu suất tách chiết SFAs thấp nhất đạt 37,6%. Axit béo omega-6, 7, 9 thuộc nhóm axit béo có 1 và 2 nối đôi trở lên. Do vậy, để thu đƣợc hỗn hợp axit béo có hàm lƣợng cao có thể chọn tỉ lệ TFA:urê là 1:2 và 1:3 (w/w) cho hiệu suất thu hồi MUFAs và PUFAs cao.

Tuy nhiên, trong phƣơng pháp tạo phức với urê, tỷ lệ giữa TFA và urê là yếu tố quan trọng quyết định tới độ tinh sạch của MUFAs và PUFAs mong muốn. Nếu tỷ lệ TFA: urê quá nhỏ thì urê sẽ không đủ khả năng tạo phức với tất cả các SFAs, do đó độ tinh sạch sẽ không cao. Nếu tỷ lệ này quá lớn thì urê sẽ có khả năng tạo phức với cả một số MUFAs và PUFAs, do đó sẽ làm cho hiệu suất thu hồi MUFAs và PUFAs thấp, đẩy giá thành sản xuất dầu lên cao. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành phân tích thành phần axit béo hỗn hợp MUFAs và PUFAs thu đƣợc với các tỷ lệ TFA: urê khác nhau bằng phƣơng pháp GC-MS. Kết quả đƣợc chỉ ra ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Thành phần axit béo của hỗn hợp MUFAs và PUFAs với tỷ lệ TFA: urê khác nhau

TFA:urê 1:2 0,36 1,01 1,26 0,52 15,11 0,42 4,15 4,52 35,21 16,47 1,72 9,59 8,36 0,42 0,39 0,5 4,15 25,35 36,89

TFA:urê 1:3 - - - 0,1 9,99 - 21,51 - 28,62 29,86 - 9,27 - - 0,26 0,28 21,51 29,96 28,62

TFA:urê 1:4 - - - - 0,41 - 88,31 - 4,84 - - - 5,64 - - 0,8 88,31 5,64 4,84

TFA:urê 1:5 - - - - - - 82,09 - 14,66 - - - 3,25 - - - 82,09 3,25 14,66

Axit béo C14:0 C15:0 C16:1n-9 C16:1n-7 C16:0 C17:0 C18:2n-6 C18:1n-9, 12 hydroxyl C18:1n-9 C18:1n-7 C18:3n-3 C18:0 C18:2n-7 C20:1n-9 C20:0 C22:0 Tổng số axit béo ω-6 Tổng số axit béo ω-7 Tổng số axit béo ω-9 Tổng số axit béo ω-6, 7, 9

66,39

80,09

98,79

100

Từ Bảng 3.2 cho thấy ở tỷ lệ TFA: urê là 1: 2 (w w), hàm lƣợng axit béo không bão hòa dạng ω-6, 7, 9 thu đƣợc chỉ đạt 66,39% so với TFA. Nhƣ vậy ở tỷ lệ TFA: urê này, lƣợng urê chƣa đủ để tạo phức với tất cả các SFAs. Do đó độ tinh sạch của mẫu không cao. Trong khi đó ở tỷ lệ TFA: urê là 1: 3; 1: 4; 1: 5 (w w), hàm lƣợng ω-6, 7, 9 thu đƣợc tăng đáng kể và đạt 80,09%; 98,79% và 100% so với TFA, tƣơng ứng.

Ở tỷ lệ TFA: urê là 1: 3; 1: 4; 1: 5 (w w), hàm lƣợng ω-6 (PUFAs) thu đƣợc tăng dần đạt lần lƣợt 4,15%; 21,51%; 88,31% và 82,09% so với TFA. Ngƣợc lại, hàm lƣợng ω-7 và ω-9 (MUFAs) thu đƣợc có xu hƣớng giảm dần. Nhƣ vậy ở tỷ lệ TFA: urê là 1: 4; 1: 5 (w/w) urê có khả năng dƣ thừa đã tạo phức với cả một số MUFAs dẫn đến hàm lƣợng ω-6 (PUFAs) tăng cao hơn hẳn chiếm đến hơn 80% so với TFA, còn hàm lƣợng ω-7 giảm (chỉ đạt 5,64 và 3,25% so với TFA) và hàm lƣợng ω-9 cũng giảm (chỉ đạt 4,84 và 14,66%

so với TFA). Ở tỷ lệ TFA: urê là 1:3 (w w), hàm lƣợng axit béo tổng số (omega-6, 7, 9) đạt 80,09%. Trong đó ω-6, ω-7 và ω-9 đạt lần lƣợt 21,51%; 29,96%; 28,62% so với TFA. Hàm lƣợng ω-7 thu đƣợc cao gấp 5,3 lần và 9,2 lần so với tỷ lệ 1: 4 và 1: 5 (w w) tƣơng ứng. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ TFA: urê là 1:3 (w w) để làm giàu axit béo ω-6, 7, 9; đặc biệt là thu đƣợc ω-7 cao. Nhƣ vậy, trên từng đối tƣợng và mục đích thu hồi các loại axit béo khác nhau thì tỷ lệ TFA: urê đƣợc lựa chọn là khác nhau. Đặng Diễm Hồng và Hoàng Thị Lan Anh (2016) sử dụng tỷ lệ TFA: urê là 1:4 (w/w) cho làm giàu các axit béo omega-3 và omega-6 trên đối tƣợng vi tảo. Đối với dầu thải từ quá trình chế biến cá ngừ đóng hộp, Mendes và cộng sự (2007) lựa chọn tỷ lệ TFA: urê là 1: 3,5 (w/w) cho làm giàu DHA có độ tinh sạch đạt 99,2% so với TFA. Wayan và cộng sự (2019) cũng chọn tỷ lệ dầu: urê = 1: 3 (w w) để làm giàu axit béo omega-3 từ dầu thải của quá trình chế biến cá ngừ đóng hộp. Quá trình kết tinh urê làm tăng hàm lƣợng axit béo không bão hòa đa nối đôi PUFAs gấp 2,7 lần [82].

3.3.2. Kết quả xác định ảnh hƣởng của tỷ lệ TFA: urê: methanol

trong quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo

Trong thí nghiệm này methanol đƣợc sử dụng làm dung môi để hoà tan urê và axit béo. Để lựa chọn đƣợc tỷ lệ thích hợp, chúng tôi tiến hành xác định tỷ lệ TFA: ure: methanol là 1: 3: 15; 1: 3: 20 và 1: 3: 25 (w/w/v), nhiệt độ kết tinh là 4oC. Kết quả xác định hiệu suất tách chiết SFAs, MUFAs và PUFAs ở các tỷ lệ TFA: urê: methanol khác nhau đƣợc trình bày ở Hình 3.7.

Hình 3.7. Hiệu suất tách chiết SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các tỷ lệ TFA: urê : methanol khác nhau. Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05

Kết quả ở Hình 3.7 cho thấy, ở tỷ lệ TFA: urê: methanol là 1: 3: 15 (w/w/v) hiệu suất tách MUFAs và PUFAs thấp nhất và hiệu suất tách SFAs cao nhất (đạt 34,8 % và 51,9% tƣơng ứng). Khi tăng tỷ lệ TFA:urê:methanol từ 1:3:15 lên 1:3:20 (w/w/v) thì hiệu suất tách MUFAs và PUFAs tăng dần từ 34,8% lên 40,3%, đồng thời hiệu suất tách SFAs giảm dần từ 51,9% xuống 45,2%, tƣơng ứng. Khi so sánh hiệu suất ở tỷ lệ 1: 3: 20 và 1: 3: 25 (w/w/v) cho thấy không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê. Bên cạnh đó, khi sử dụng nhiều dung môi có khả năng cho phép rửa phần lỏng (nhiều MUFAs và PUFAs) ra khỏi phần rắn (nhiều SFAs) tốt hơn. Tuy nhiên, phức tạo thành lại kém bền vững hơn. Do đó, sẽ giải phóng một phần SFAs vào pha lỏng và làm cho độ tinh sạch của MUFAs, PUFAs trong pha lỏng có thể bị giảm và điều này cũng làm cho hiệu suất thu MUFAs, PUFAs tăng. Dựa vào các phân tích trên, chúng tôi chọn tỉ lệ TFA: urê: methanol là 1:3:20 (w/w/v) là thích hợp cho quá trình làm giàu omega-6, 7, 9 tiếp theo.

3.3.3. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ kết tinh trong quá

trình làm giàu hỗn hợp axit béo

Nhiệt độ là thành phần xúc tác cho quá trình tạo phức giữa urê và SFAs. Do đó, nhiệt độ kết tinh không chỉ ảnh hƣởng lớn đến độ tinh sạch, hiệu suất thu hồi MUFAs và PUFAs mà còn ảnh hƣởng tới hiệu quả kinh tế trong quá trình kết tinh.

Medina và cộng sự (1995) đã khảo sát nhiệt độ kết tinh từ -36oC đến 36oC và kết quả cho thấy nhiệt độ kết tinh tối ƣu cho làm giàu EPA và DPA từ dầu cá tuyết là 4oC [83]. Trong khi đó, Gimenez và cộng sự (1998) nhận thấy ở nhiệt độ 28oC, hiệu suất thu hồi EPA và DHA từ vi tảo cao hơn trong khi độ tinh sạch lại giảm không đáng kể [84]. Tuy nhiên, Hayes và cộng sự (1998) cho rằng nhiệt độ tạo phức của urê với các axit béo không nên lớn hơn 25oC vì nhiệt độ cao hơn dẫn đến hiệu suất thu hồi dầu thấp hơn và độ tinh sạch giảm [85]. Chính vì vậy, khi tham khảo các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã lựa chọn 3 ngƣỡng nhiệt độ kết tinh là 4, 17 và 25oC trong quá trình làm giàu axit béo, giữ nguyên tỷ lệ TFA:urê:methanol là 1:3:20 (w/w/v). Kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.8.

Hình 3.8. Hiệu suất tách SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các nhiệt độ khác nhau. Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05

Kết quả thu đƣợc ở Hình 3.8 cho thấy, khi tăng dần nhiệt độ kết tinh hiệu suất thu MUFAs và PUFAs tăng dần, đồng thời hiệu suất thu SFAs giảm dần. Ở 4oC, urê tạo phức với SFAs là bền vững nhất nên hiệu suất tạo phức cao nhất (46,8% so với TFA), ở nhiệt độ cao hơn (17 và 25oC) thì các phức đƣợc tạo ra kém bền vững hơn dẫn đến hàm lƣợng SFAs trong phần tạo phức giảm (43,1 và 38,6% so với TFA); hiệu suất MUFAs và PUFAs lại tăng lên (40,1 và 41,1% so với TFA). Hơn nữa, hiệu suất thu MUFAs và PUFAs giữa nhiệt độ kết tinh 4oC và 17oC không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ kết tinh cho quá trình tạo phức với tinh thể urê là 4oC để tạo ra dầu sinh học giàu các axit béo không no omega-6, 7, 9 trong điều kiện phòng thí nghiệm. Công bố của các tác giả Đặng Diễm Hồng và Hoàng Thị Lan Anh (2016), Mendes và cộng sự (2007) cũng lựa chọn 4oC làm nhiệt độ kết tinh trong quá trình làm giàu thu các axit béo omega-3, omega-6 và DHA [62].

3.3.4. Kết quả nghiên cứu tăng hiệu suất thu hồi các omega-6, 7, 9

bằng việc tạo phức 2 lần với urê

Sau quá trình phân tách hỗn hợp axit béo bằng tạo phức với urê, để tăng hiệu suất thu hồi các omega-6, 7, 9, pha rắn tiếp tục đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để phản ứng với urê lần 2. Urê lần 2 đƣợc sử dụng với tỷ lệ SFAs: urê: methanol là 1:3:20 (w w v) tƣơng tự với hàm lƣợng và thể tích khi tiến hành với TFA. Để có thể xác định đƣợc hàm lƣợng các axit béo không bão hòa trong hỗn hợp MUFAs, PUFAs thu đƣợc sau khi tạo phức lần 2, chúng tôi xác định chỉ số iot (chỉ số iot là số gam iot kết hợp với 100 g chất

béo, iot kết hợp vào các liên kết đôi trong phân tử axit béo không no). Kết quả hiệu suất thu hồi MUFAs, PUFAs và chỉ số iot đƣợc thể hiện trên bảng 3.3.

Bảng 3.3. Hiệu suất thu hồi MUFAs, PUFAs và chỉ số iot của mẫu thu đƣợc sau các lần tạo phức với urê

Phản ứng tạo phức với urê Hiệu suất tách MUFAs, PUFAs

Chỉ số iot trong MUFAs, PUFAs (I2/100 g) 86,72 ± 1,49 Urê lần 1 39,7 ± 0,56 (% TFA)

Urê lần 2 5,35 ± 0,41 (% SFA) 16,39 ± 0,11

Kết quả chỉ ra trên Bảng 3.3 cho thấy khi cho SFAs tạo phức với urê lần 2 cho hiệu suất thu hồi MUFAs, PUFAs thấp chỉ đạt 5,35 ± 0,41 % SFAs, đồng thời chỉ số iot đạt 16,39 ± 0,11 thấp hơn 5,3 lần so với chỉ số iot trong MUFAs, PUFAs thu đƣợc khi tạo phức với urê lần 1. Điều này chứng tỏ trong phần MUFAs, PUFAs thu đƣợc sau tạo phức lần 2 có chứa ít các axit béo không no. Chính vì vậy, xét về hiệu suất, hàm lƣợng axit béo không no, hiệu quả kinh tế, chúng tôi thấy rằng không cần thực hiện bƣớc cho SFAs phản ứng tạo phức với urê lần 2.

Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi đã thu được các điều kiện thích hợp cho quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9 bằng phương pháp tạo phức urê bao gồm tỉ lệ TFA: urê: methanol là 1: 3: 20 (w/w/v), nhiệt độ kết tinh là 4oC. Hiệu suất tách chiết SFAs; MUFAs và PUFAs từ TFA của vi khuẩn tía quang hợp thu được đạt khoảng 46 và 40% so với TFA, tương ứng.

3.4. QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, 9 TỪ SINH KHỐI VKTQH

Sau khi có đƣợc các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết (nhiệt độ phản ứng 70-75oC, chất xúc tác HCl, tỉ lệ sinh khối: hỗn hợp dung môi là 1:10 (w/v), thời gian phản ứng 3 giờ, điều kiện khuấy trộn liên tục) và làm giàu hỗn hợp axit béo không no (omega-6, 7, 9) bằng phƣơng pháp tạo phức urê (tỷ lệ TFA: urê: methanol là 1: 3: 20 (w/w/v), nhiệt độ kết tinh 4oC), chúng tôi đã xây dựng đƣợc quy trình tách chiết và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ 100g SKK VKTQH theo sơ đồ Hình 3.9 và Hình 3.10.

Hình 3.9. Sơ đồ quy trình tách chiết và làm giàu axit béo không no

omega-6, 7, 9 từ sinh khối VKTQH

Mô tả các bƣớc trong quy trình:

Bước 1. Tạo hỗn hợp phản ứng: SKK VKTQH đƣợc nghiền mịn dạng bột. Cân 100g SKK cho vào chai pyrex 2 lít. Bổ sung 900 ml methanol, 100 ml HCl 37%, 500 ml dichlomethan vào chai chứa sinh khối, lắc đều, vặn chặt nắp. Quá trình phản ứng đƣợc thực hiện trên máy khuấy ở nhiệt độ 70 - 75oC, trong 3 giờ, chế độ khuấy liên tục. Sau phản ứng, để hỗn hợp nguội ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút.

Bước 2. Phân tách hỗn hợp thành 2 pha: Hỗn hợp sau khi phản ứng xong, để nguội sau đó đƣợc bổ sung thêm 200 ml NaCl bão hòa. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và và bổ sung thêm 1 lít n-hexan. Lắc hỗn hợp sau đó để lắng cho hỗn hợp phân tách thành 2 pha: pha trên màu vàng sáng chứa TFA, pha dƣới màu nâu sẫm chứa methanol, HCl, dichlomethan, bã sinh khối.

Bước 3. Chiết mẫu và thu axit béo tổng số: Chiết mẫu thu lấy pha trên có chứa axit béo tổng số. Tiếp tục bổ sung n-hexan vào pha dƣới để tách chiết cho đến khi lớp trên màu vàng nhạt. Tiến hành cô quay chân không pha trên ở 70oC để loại bỏ dung môi n- hexan và thu nhận hỗn hợp axit béo tổng số.

Bước 4. Phân tách axit béo bão hòa và không bão hòa: Sau khi tách chiết TFA, SFAs và MUFAs, PUFAs đƣợc phân tách sử dụng urê. Hòa tan urê trong methanol theo tỷ lệ tối ƣu TFA: urê: methanol là 1:3:20 (w/v/w). Tạo phức kết tinh giữa các axit béo với urê trong tủ lạnh ở 4oC qua đêm (12 - 15 giờ). Hỗn hợp phân thành 2 pha: pha rắn giàu SFAs và pha lỏng giàu MUFAs và PUFAs. Pha lỏng và pha rắn đƣợc tách riêng bằng cách lọc trên giấy lọc.

Bước 5. Thu pha lỏng giàu MUFAs và PUFAs: Đối với pha lỏng, sau khi loại bỏ dung môi methanol bằng máy cất quay chân không thu đƣợc hỗn hợp gồm urê và MUFAs, PUFAs. Tiến hành bổ sung nƣớc cất vào hỗn hợp để tách riêng urê và MUFAs, PUFAs. Khi đó hỗn hợp phân tách thành 2 pha, pha dƣới là nƣớc đã hòa tan urê và pha trên là pha giàu MUFAs và PUFAs.

Bước 6. Thu MUFAs, PUFAs thô: Sản phẩm MUFAs và PUFAs thô đƣợc rửa với nƣớc cất theo tỷ lệ 50:50 (v v) cho đến khi hết cặn bẩn và sản

phẩm trong sáng màu. Sản phẩm MUFAs và PUFAs tinh sạch đƣợc bảo quản ở nhiệt độ mát, bọc kín bằng giấy bạc để tránh ánh sáng trực tiếp.

Pha lỏng

Lọc tách pha

TFA

Tạo phức với urê và methanol ở 4oC, qua đêm

Pha rắn

Cất quay pha lỏng

Chiết pha rắn với nƣớc cất và n-hexane

Pha trên chứa SFA

Pha trên chứa MUFAs, PUFAs

Chiết pha lỏng với nƣớc cất và n-hexane

Cất quay ở 70oC

SFAs

MUFAs và PUFAs

Hình 3.10. Hình ảnh minh họa quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9 bằng phƣơng pháp tạo phức urê

3.5. KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG DẦU SINH HỌC OMEGA-6, 7, 9 TÁCH CHIẾT ĐƢỢC SAU QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU

Sản phẩm dầu sinh học giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 sau khi đƣợc tách chiết và làm giàu theo quy trình đƣợc tiến hành kiểm tra chất lƣợng thông qua các chỉ số nhƣ: màu sắc, cảm quan, chỉ số axit và peroxyt, dƣ lƣợng urê, độ ẩm và sự bay hơi, lipit không xà phòng, các chỉ tiêu về kim loại nặng, vi sinh vật tại trung tâm kiểm nghiệm TSL thuộc Công ty TNHH Khoa học TSL.

3.5.1. Kết quả xác định chỉ tiêu cảm quan, hóa lý

Kết quả phân tích các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý của dầu sinh học omega-6, 7, 9 dạng methyl ester tách chiết từ sinh khối VKTQH đƣợc trình bày trên Bảng 3.4.

Bảng 3.4. Phân tích chỉ tiêu cảm quan, hóa lý của mẫu dầu sinh học omega-6, 7, 9

Mức cho phép Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết quả (Cục ATTP)

Dạng lỏng, đồng Có màu vàng sáng

Cảm quan nhất, màu vàng - da cam

sáng, trong

Độ ẩm và sự bay hơi % 0,17

Chỉ số axit mg KOH/g 2,1 ≤ 15

Chỉ số peroxyt 7,3 ≤ 30 meq O2 /kg

Lipid không xà phòng % 5,5

Kết quả nghiên cứu trên Bảng 3.4 cho thấy dầu sinh học giàu axit béo omega-6, 7, 9 có dạng lỏng, đồng nhất, màu vàng sáng, trong. Chỉ số axit và chỉ số peroxyt ở mức thấp đạt 2,1 mg KOH/g và 7,3 meqO2/kg. Các chỉ tiêu này đều nằm dƣới mức giới hạn cho phép của tiêu chuẩn chất lƣợng của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm, Bộ Y tế. Ngoài ra dầu omega-6, 7, 9 thu đƣợc có độ ẩm và sự bay hơi chiếm 0,17%, lipit không xà phòng chiếm 5,5%.

3.5.2. Kết quả xác định thành phần axit béo

Thành phần axit béo của dầu sinh học giàu omega-6, 7, 9 sau quá trình

tinh sạch và làm giàu đƣợc trình bày trên Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kết quả phân tích hàm lƣợng omega-6, 7, 9.

STT Chỉ tiêu thử nghiệm Kết quả Đơn vị Phƣơng pháp thử

2 Hàm lƣợng Omega-6 28,75 % axit béo TS-KT-SK-14

3 Hàm lƣợng Omega-7 32,51 % axit béo TS-KT-SK-14

4 Hàm lƣợng Omega-9 20,48 % axit béo TS-KT-SK-14

Kết quả ở Bảng 3.5 cho thấy, tổng hàm lƣợng omega-6, 7, 9 có trong sản phẩm hỗn hợp dầu sinh học thu đƣợc cao chiếm đến 81,74 % axit béo tổng số. Trong đó hàm lƣợng omega-6 chiếm 28,75%, omega-7 chiếm 32,51%, omega-9 chiếm 20,48%. Kết quả này cho thấy, quá trình tách và làm giàu MUFAs, PUFAs bằng phƣơng pháp tạo phức với urê cho hiệu quả cao. Đồng thời quy trình làm giàu hỗn hợp axit béo theo các điều kiện tối ƣu đảm bảo đƣợc yêu cầu về chất lƣợng của dầu sinh học giàu hỗn hợp các axit béo omega-6, 7, 9 ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dƣợc phẩm sau này.

3.5.3. Kết quả xác định dƣ lƣợng urê, kim loại nặng

Kết quả phân tích dƣ lƣợng urê, kim loại nặng của dầu sinh học giàu

axit béo omega-6, 7, 9 đƣợc chỉ ra trên Bảng 3.6.

Kết quả ở Bảng 3.6 cho thấy sản phẩm hỗn hợp dầu sinh học giàu axit béo omega-6, 7, 9 đảm bảo không chứa dƣ lƣợng urê, các chỉ tiêu về kim loại nặng (Pb, Cd, As, Hg, Cu, Fe) đều nằm trong giới hạn cho phép, đạt các chỉ tiêu chất lƣợng và tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm của Cục An toàn thực phẩm, Bộ Y tế, đảm bảo yêu cầu chất lƣợng làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng.

Bảng 3.6. Kết quả phân tích dƣ lƣợng urê, kim loại nặng trong dầu sinh học giàu axit béo omega-6, 7, 9

Phƣơng pháp thử

Đơn vị tính

Kết quả

Chỉ tiêu thử nghiệm

Urê

mg/kg

TS-KT-SK-37

KPH

Mức tối đa cho phép (Cục ATTP) KPH

Chì (Pb)

ppm

TS-KT-QP-02:2018

KPH

Cadimi (Cd)

ppm

TS-KT-QP-02:2018

KPH

1,0

Asen (As)

ppm

TS-KT-QP-02:2018

KPH

0,1

Thủy ngân (Hg)

ppm

TS-KT-QP-02:2018

KPH

0,05

Đồng (Cu)

ppm

TS-KT-QP-01:2019

KPH

0,5

Sắt (Fe)

ppm

TS-KT-QP-01:2019

KPH

Ghi chú: KPH- Không phát hiện

3.5.4. Kết quả chỉ tiêu vi sinh vật có trong dầu sinh học omega-6, 7, 9

Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật có trong dầu sinh học giàu axit

béo omega-6, 7, 9 tách chiết từ sinh khối VKTQH đƣợc chỉ ra trên Bảng 3.7.

Bảng 3.7. Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật

Phƣơng pháp thử

Chỉ tiêu thử nghiệm

Đơn vị tính

Kết quả

cfu/ml

Mức tối đa cho phép (Cục ATTP) 104

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

Coliform

cfu/ml

E.coli

cfu/ml

S.aureus

cfu/ml

Không có

Salmonella

/25g

Không có

Nấm men

cfu/g

102

Nấm mốc

cfu/g

102

TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013) TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2006) TCVN 7924-2:2008 (ISO/TS 16649-2:2005) AOAC 975.55 TCVN 10780-1:2017 (ISO 6579-1:2017) TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008) TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008)

Nhƣ vậy sản phẩm dầu sinh học chứa hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9

đảm bảo đạt các chỉ tiêu chất lƣợng và tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm

không có các vi sinh vật có hại (tổng số vi khuẩn hiếu khí, Coliform, E. coli,

S. aureus, Salmonella, nấm men, nấm mốc), đảm bảo yêu cầu chất lƣợng làm

nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng.

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Đã tối ƣu đƣợc các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết axit béo tổng số từ sinh khối khô vi khuẩn tía quang hợp là sử dụng chất xúc tác – HCl với tỷ lệ sinh khối: hỗn hợp dung môi là 1:10 (w/v) ở nhiệt độ phản ứng 70 - 75°C trong thời gian 3 giờ và khuấy trộn liên tục. Hiệu suất tách chiết axit béo tổng số đạt 19,7 %.

2. Đã xác định đƣợc các điều kiện thích hợp cho làm giàu axit béo không no một nối đôi và đa nối đôi (MUFAs và PUFAs; omega-6, 7, 9) từ axit béo tổng số là sử dụng tỉ lệ TFA: urê: methanol là 1:3:20 (w/w/v) ở nhiệt độ kết tinh 4oC. Hiệu suất tách chiết đạt khoảng 46% (SFAs) và 40% (MUFAs và PUFAs) so với TFA.

3. Đã xây dựng đƣợc quy trình tách chiết và làm giàu omega-6, 7, 9 từ

100 g sinh khối VKTQH.

4. Dầu omega-6, 7, 9 thu đƣợc đảm bảo yêu cầu chất lƣợng để làm

nguyên liệu ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dƣợc phẩm.

KIẾN NGHỊ

Cần tiến hành khảo sát thêm một số các thông số khác trong quá trình tách chiết axit béo tổng số (nhƣ dung môi, nhiệt độ sấy sinh khối, số lần trích ly, độ ẩm của sinh khối) và làm giàu omega (nhƣ thời gian kết tinh).

Cần xác định thêm một số chỉ tiêu trong dầu sinh học tách chiết đƣợc

nhƣ dung môi còn tồn dƣ trong dầu.

Cần nghiên cứu thêm các phƣơng pháp khác cho việc tách chiết dầu sinh học

giàu axit béo omega-6, 7, 9 từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lê Tất Thành, 2016, Nghiên cứu sàng lọc, phân lập và nhận dạng các hoạt chất axit béo, axit arachidonic và prostaglandin từ rong đỏ biển, Luận văn Tiến sĩ Hóa học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Hà Nội.

2. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 2006, Hóa sinh học, Nhà xuất bản

giáo dục Việt Nam, Hà Nội.

3. Carter C.G., Bransden M.P., Lewis T.E., Nichols P.D., 2003, Potential of thraustochytrids to partially replace fish oil in Atlantic salmon feeds, Mar Biotechnol (NY), 5(5), pp. 480-492.

4. Swaaf M.E., 2003, Docosahexaenoic acid production by the marine alga

Crypthecodinium cohnii, IOS Press, Amsterdam.

5. Lunn J., Theobald H.E., 2006, The health effects of dietary unsaturated

fatty acids, Nutrition Bulletin, 31(3), pp. 178-224.

6. Barthet V.J., 2008, (n-7) and (n-9) cis-monounsaturated fatty acid contents of 12 Brassica species, Phytochemistry, 69(2), pp. 411-417.

7. Herbst M.C., 2015, Fact Sheet on Palmitoleic Acid (Omega-7), Cancer

Association of South Africa (CANSA), pp. 1-8.

8. Simopoulos A.P., Importance of the omega-6/omega-3 balance in health and disease: evolutionary aspects of diet. Healthy agriculture, healthy nutrition, healthy people: Karger Publishers; 2011. pp. 10-21.

9. Erkkola R., Yang B., 2003, Sea buckthorn oils: Towards healthy mucous

membranes.

10. Oliver K., 2018, Omega-9 Benefits the Heart, Brain & Your Mood.

11. Chamorro G., Salazar M., Araújo K.G., dos Santos C.P., Ceballos G., Castillo L.F., 2002, Update on the pharmacology of Spirulina (Arthrospira), an unconventional food, Arch Latinoam Nutr, 52(3), pp. 232-240.

12. Destaillats F., Buyukpamukcu E., Golay P.-A., Dionisi F., Giuffrida F., 2005, Letter to the Editor: vaccenic and rumenic acids, a distinct feature of ruminant fats, Journal of dairy science, 88(2), pp. 449.

13. Đặng Diễm Hồng, 2015, Nghiên cứu quy trình tách chiết dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omeag-6 (EPA, DHA, DPA) từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng, Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghệ chế biến đến năm 2020.

14. Yap C., Chen F., 2001, Polyunsaturated Fatty Acids: Biological Significance, Biosynthesis, and Production by Microalgae and Microalgae-Like Organisms, Algae and their biotechnological potential, Dordrecht.

15. Radwan S.S., 1991, Sources of C 20-polyunsaturated fatty acids for biotechnological use, Applied microbiology and biotechnology, 35(4), pp. 421-430.

16. Petkov G., Garcia G., 2007, Which are fatty acids of the green alga Chlorella?, Biochemical Systematics and Ecology, 35(5), pp. 281-285.

17. Chen F., 1996, High cell density culture of microalgae in heterotrophic

growth, Trends in biotechnology, 14(11), pp. 421-426.

18. Nichols D., Sanderson K., Smith M., Nichols P., Lewis T., McMeekin T., 2001, Antarctic bacteria: a new source of polyunsaturated fatty acids for humans, Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition, 10, pp. S6.

19. Bowman J.P., Brown M.V., Nichols D.S., 1997, Biodiversity and ecophysiology of bacteria associated with Antarctic sea ice, Antarctic Science, 9(2), pp. 134-142.

20. Fang J., Kato C., 2007, FAS or PKS, lipid biosynthesis and stable carbon isotope fractionation in deep-sea piezophilic bacteria, Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, 1, pp. 190-200.

21. Hiraishi A., Ueda Y., 1995, Isolation and characterization of Rhodovulum strictum sp. nov. and some other purple nonsulfur bacteria from colored blooms in tidal and seawater pools, International journal of systematic and evolutionary microbiology, 45(2), pp. 319-326.

22. Kim D.H., Lee J.H., Hwang Y., Kang S., Kim M.S., 2013, Continuous cultivation of photosynthetic bacteria for fatty acids production, Bioresource technology, 148, pp. 277-282.

23. Loo P.L., Chong V.C., Vikineswary S., 2013, Rhodovulum sulfidophilum, a phototrophic bacterium, grown in palm oil mill effluent improves the larval survival of marble goby O xyeleotris marmorata (Bleeker), Aquaculture Research, 44(3), pp. 495-507.

24. Kobayashi M., Tchan Y., 1973, Treatment of industrial waste solutions and production of useful by-products using a photosynthetic bacterial method, Water Research, 7(8), pp. 1219-1224.

25. Imhoff J.F., 1989, Purple nonsulfur bacteria, Bergey's manual of

systematic bacteriology, 3, pp. 1658-1682.

26. Pfennig N., 1978, General physiology and ecology of photosynthetic

bacteria, The photosynthetic bacteria, pp. 3-18.

27. Kobayashi M., Kobayashi M., 1995, Anoxygenic photosynthetic

bacteria, Springer.

28. Okubo Y., Futamata H., Hiraishi A., 2006, Characterization of phototrophic purple nonsulfur bacteria forming colored microbial mats in a swine wastewater ditch, Applied and environmental microbiology, 72(9), pp. 6225-6233.

29. Kompantseva E.I., Komova A.V., Novikov A.A., Kostrikina N.A., 2012, Rhodovulum tesquicola sp. nov., a haloalkaliphilic purple non-sulfur bacterium from brackish steppe soda lakes, International journal of systematic and evolutionary microbiology, 62(12), pp. 2962-2966.

30. Sasaki K., Noparatnaraporn N., Hayashi M., Nishizawa Y., Nagai S., 1981, Single-cell protein production by treatment of soybean wastes with Rhodopseudomonas gelatinosa, J. Ferment. Technol, 59(6), pp. 471-477.

31. Rahalkar S., Joshi S., Shivaraman N., 1993, Photometabolism of palustris, Current byRhodopseudomonas compounds

aromatic Microbiology, 26(1), pp. 1-9.

32. Sasikala C., Ramana C.V., 1995, Biotechnological potentials of anoxygenic phototrophic bacteria. I. Production of single-cell protein, vitamins, ubiquinones, hormones, and enzymes and use in waste treatment, Elsevier.

33. Sasaki K., Noparatnaraporn N., Nagai S., 1991, Use of photosynthetic bacteria for the production of SCP and chemical from agro-industrial wastes, Applied Science, London.

34. Kobayashi M., Kurata S., 1978, The mass culture and cell utilization of

phosynthetic bacteria, Process Biochem, 7, pp. 27-30.

35. Azad S.A., C. C.V., S. V., 2002, Phototrophic bacteria as feed supplement for rearing Penaeus monodon larvae, World Aqua Society, 33(2), pp. 158-168.

36. Raj P.S., Ramaprasad E., Vaseef S., Sasikala C., Ramana C.V., 2013, Rhodobacter viridis sp. nov., a phototrophic bacterium isolated from mud of a stream, International journal of systematic and evolutionary microbiology, 63(1), pp. 181-186.

37. Nguyễn Lân Dũng, B i Thị Việt Hà, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Phạm Thành Hổ, Lê Văn Hiệp, Chung Chí Thành, Hòa L.T., 2012, Vi sinh vật học, Nhà xuất khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

38. Jackowski S., Murphy C.M., Cronan J.E. J., Rock C.O., 1989, Acetoacetyl-acyl carrier protein synthase. A target for the antibiotic thiolactomycin, Journal of Biological Chemistry, 264(13), pp. 7624- 7629.

39. White S.W., Zheng J., Zhang Y.M., Rock C.O., 2005, The structural biology of type II fatty acid biosynthesis, Annual review of biochemistry, 74, pp. 791-831.

40. Garwin J., Klages A., Cronan J.E., 1980, Beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase II of Escherichia coli. Evidence for function in the thermal regulation of fatty acid synthesis, Journal of Biological Chemistry, 255(8), pp. 3263-3265.

41. Heath R.J., Rock C.O., 1995, Enoyl-acyl carrier protein reductase (fabI) plays a determinant role in completing cycles of fatty acid elongation in Escherichia coli, Journal of Biological Chemistry, 270(44), pp. 26538- 26542.

42. Aguilar P.S., De Mendoza D., 2006, Control of fatty acid desaturation: a mechanism conserved from bacteria to humans, Molecular microbiology, 62(6), pp. 1507-1514.

43. Marrakchi H., Choi K.H., Rock C.O., 2002, A new mechanism for anaerobic unsaturated fatty acid formation in Streptococcus pneumoniae, Journal of Biological Chemistry, 277(47), pp. 44809-44816.

44. Hutner S., 1950, Anaerobic and aerobic growth of purple bacteria (Athiorhodaceae) in chemically defined media, Microbiology, 4(3), pp. 286-293.

45. Kim E.-J., Lee J.K., 2015, Effect of changes in the composition of cellular fatty acids on membrane fluidity of Rhodobacter sphaeroides, J Microbiol Biotechnol, 25, pp. 162-173.

46. Carlozzi P., Buccioni A., Minieri S., Pushparaj B., Piccardi R., Ena A., Pintucci C., 2010, Production of bio-fuels (hydrogen and lipids) through a photofermentation process, Bioresource technology, 101(9), pp. 3115- 3120.

47. Bùi Quang Thuật, 2010, Hoàn thiện công nghệ và sản xuất thử nghiệm hỗn hợp omega-3 và omega-6 từ nhân hạt hồ đào, Báo cáo dự án sản xuất thử nghiệm 2009-2010, Hà Nội.

48. Mofijur M., Rasul M., Hassan N., Nabi M., 2019, Recent development in the production of third generation biodiesel from microalgae, Energy Procedia, 156, pp. 53-58.

49. Schuchardt U., Sercheli R., Vargas R.M., 1998, Transesterification of vegetable oils: a review, Journal of the Brazilian Chemical Society, 9(3), pp. 199-210.

50. Norjannah B., Ong H.C., Masjuki H., Juan J., Chong W., 2016, Enzymatic transesterification for biodiesel production: a comprehensive review, RSC advances, 6(65), pp. 60034-60055.

51. Wagner L., 2007, Biodiesel from algae oil, Analyst.

52. De Azevedo A., Kieckbush T., Tashima A.K., Mohamed R., Mazzafera P., de Melo S.V., 2008, Extraction of green coffee oil using supercritical carbon dioxide, The Journal of Supercritical Fluids, 44(2), pp. 186-192.

53. Rizvi S.S., Clifford A., 1994, Supercritical fluid processing of food and

biomaterials, Blackie Academic & Professional, London.

54. Mukhopadhyay M., 2000, Natural extracts using supercritical carbon

dioxide, CRC press.

55. Shahidi F., Wanasundara U.N., 1998, Omega-3 fatty acid concentrates: nutritional aspects and production technologies, Trends in food science & technology, 9(6), pp. 230-240.

56. Vingrys A.J., Armitage J.A., Weisinger H.S., Bui B.V., Sinclair A.J., Weisinger R.S., 2001, The role of omega-3 polyunsaturated fatty acids in retinal function, Springer.

57. Smith A., 1952, The crystal structure of the urea–hydrocarbon

complexes, Acta Crystallographica, 5(2), pp. 224-235.

58. Hayes D.G., Van Alstine J.M., Setterwall F., 2000, Urea-based fractionation of seed oil samples containing fatty acids and acylglycerols of polyunsaturated and hydroxy fatty acids, Journal of the American Oil Chemists' Society, 77(2), pp. 207-213.

59. Liu S., Zhang C., Hong P., Ji H., 2006, Concentration of docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) of tuna oil by urea complexation: optimization of process parameters, Journal of food engineering, 73(3), pp. 203-209.

60. Grompone M., 1992, Enrichment of omega‐3 PUFAs from fur seal oil,

Lipid/Fett, 94(10), pp. 388-394.

61. Hong D.D., Mai D.T.N., Ha N.C., Lam B.D., Tam L.T., Anh H.T.L., Thu N.T.H., 2013, Biodiesel production from Vietnam heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6, Journal of bioscience and bioengineering, 116(2), pp. 180-185.

62. Đặng Diễm Hồng, Hoàng Thị Lan Anh, 2016, Vi tảo biển dị dưỡng Labyrinthula, Schizochytrium, Thraustochytrium ở Việt Nam: Tiềm năng và thách thức, Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và công nghệ, Hà Nội.

63. Asif M., 2011, Health effects of omega-3, 6, 9 fatty acids: Perilla frutescens is a good example of plant oils, Oriental Pharmacy & Experimental Medicine, 11(1), pp. 51-59.

64. Moraes I.M.M.d., Albuquerque C.F.G.d., Kurz A.R., Oliveira F.M.d.J., Abreu V.H.P.d., Torres R.C., Carvalho V.F., Estato V., Bozza P.T., Sperandio M., 2018, Omega-9 Oleic Acid, the Main Compound of Olive Oil, Mitigates Inflammation during Experimental Sepsis, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, pp. 1-13.

65. Ettaki H., Troncoso Ponce M.A., To A., Barthole G., Lepiniec L., Baud S., 2018, Overexpression of MYB115, AAD2, or AAD3 in Arabidopsis thaliana seeds yields contrasting omega-7 contents, PloS one, 13(1), pp. e0192156.

66. Sande D., Colen G., dos Santos G.F., Ferraz V.P., Takahashi J.A., 2018, Production of omega 3, 6, and 9 fatty acids from hydrolysis of vegetable oils and animal fat with Colletotrichum gloeosporioides lipase, Food science and biotechnology, 27(2), pp. 537-545.

tuna

67. Suriani N.W., Komansilan A., 2019, Enrichment of omega-3 fatty acids, (thunnus sp.) with urea waste oil by-products canning crystallization, Journal of Physics: Conference Series, IOP Publishing, pp. 012056.

68. Islam M.S., Christopher L.P., Alam M.N., 2020, Separation and Purification of ω-6 Linoleic Acid from Crude Tall Oil, Separations, 7(1), pp. 9.

69. Hoàng T.M.H., Lƣu T.T., Lê T.T., Nguyễn C.H., Lƣơng H.H., Hoàng T.L.A., Ngô T.H.T., Đặng D.H., 2013, Nghiên cứu quá trình tách chiết lipit tổng số và axít béo tự do cho sản xuất dầu omega 3 và omega 6 từ sinh khối vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6, Tạp chí Sinh học, 35(4), pp. 484-493.

70. Lê T.T., Lƣu T.T., Nguyễn C.H., Hoàng T.L.A., Ngô T.H.T., Hoàng T.M.H., Đặng D.H., 2014, Tách và làm giàu hỗn hợp axít ω-3 và ω-6 từ dầu tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 bằng phƣơng pháp tạo phức với urê, Tạp chí Sinh học, 36(1), pp. 73-80.

71. Đinh T.T.T., Nguyễn T.D., Thúy Đ.T., 2015, Tách chiết omega-3 từ phụ phẩm chế biến cá, Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, 9, pp. 86-94.

72. Hoàng T.B., Nguyễn V.T.A., Phạm M.Q., Phạm T.H., Nguyễn Q.T., Trần Q.T., Nguyễn T.T., Hứa T.T., Lê T.T., 2017, Xây dựng quy trình ứng dụng enzym và các kĩ thuật phối hợp để thu nhận dầu cá giàu các axit béo không no đa nối đôi EPA, DPA, DHA từ phụ phẩm chế biến cá ngừ vây vàng Thunnus Albacares, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Biển, 1, pp. 95-102.

73. Nguyễn T.H.L., Bùi Q.T., Lê D.T., 2018, Ảnh hƣởng của một số yếu tố công nghệ tới quá trình thu nhận hỗn hợp axit béo omega-3 và omega-6 từ dầu hạt tía tô, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 16(7), pp. 682-688.

74. Trần N.M.C., Trần Y.T., Phan Đ.P.T., Đinh T.N.L.N., Ngọc Khải, Phan P.N.L., 2020, Nghiên cứu chiết tách dầu từ hạt dƣa hấu bằng enzyme, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 41.

75. Xuân L.T.T., Tô K.T., Nguyễn T.H.H., Lê T.H.X., Cù T.S., Hồ S.L., 2020, Làm giàu và tách EPA, DHA, OMEGA-3, 6, 9 bằng hệ dung môi sâu trên cơ sở Methanol/Urea khỏi hỗn hợp Methanol/Urea khỏi hỗn hợp methyl ester acid béo của mỡ cá basa phế thải, Tạp chí Công thương.

76. Johnson M.B., Wen Z., 2009, Production of biodiesel fuel from the microalga Schizochytrium limacinum by direct transesterification of algal biomass, Energy & Fuels, 23(10), pp. 5179-5183.

77. Đặng D.H., Hoàng T.M.H., Nguyễn Đ.H., Hoàng S.N., Hoàng T.L.A., Ngô T.H.T., Đinh K.C., 2007, Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp DHA từ các loài vi tảo biển dị dƣỡng mới Labyrinthula, Schizochytrium và ứng dụng, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 45(1B), pp. 144-153.

78. TCVN 2627-1993: Dầu thực vật. Phƣơng pháp xác định màu sắc, mùi và

độ trong.

79. TCVN 6127:2010, Dầu mỡ động vật và thực vật – Xác định trị số axit và

độ axit.

80. TCVN 184: 2003, Xác định hàm lƣợng Urê - Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) d ng detector huỳnh quang sau khi tạo dẫn xuất với xanthydrol.

81. Mai Đ.T.N., Hoàng Đ.Đ., Thơm L.T., Lãm B.Đ., Hà N.C., Hồng Đ.D., 2012, Nghiên cứu áp dụng phƣơng pháp chuyển vị ester tại chỗ để sản xuất diesel sinh học từ vi tảo biển Nannochloropsis oculata, Tạp chí Công nghệ sinh học, 10(2), pp. 371-377.

82. Wayan Suriani N., Komansilan A., 2019, Enrichment of omega-3 fatty acids, waste oil by-products canning tuna (thunnus sp.) with urea crystallization, Journal of Physics: Conference Series, 1317, pp. 012056.

83. Medina A.R., Giménez A.G., Camacho F.G., Pérez J.S., Grima E.M., Gómez A.C., 1995, Concentration and purification of stearidonic, eicosapentaenoic, and docosahexaenoic acids from cod liver oil and the marine microalga Isochrysis galbana, Journal of the American Oil Chemists' Society, 72(5), pp. 575-583.

84. Giménez A.G., González M.I., Medina A.R., Grima E.M., Salas S.G., Cerdán L.E., 1998, Downstream processing and purification of eicosapentaenoic (20: 5n-3) and arachidonic acids (20: 4n-6) from the microalga Porphyridium cruentum, Bioseparation, 7(2), pp. 89-99.

85. Hayes D.G., Bengtsson Y.C., Van Alstine J.M., Setterwall F., 1998, Urea complexation for the rapid, ecologically responsible fractionation of fatty acids from seed oil, Journal of the American Oil Chemists' Society, 75(10), pp. 1403-1409.

PHỤ LỤC 1

Kết quả phân tích

Sắc ký đồ thành phần axit béo trong sinh khối VKTQH

Sắc ký đồ thành phần axit béo của pha lỏng ở tỷ lệ TFA: urê là 1:2 (w/w)

Sắc ký đồ thành phần axit béo của pha lỏng ở tỷ lệ TFA: urê là 1:3 (w/w)

Sắc ký đồ thành phần axit béo của pha lỏng ở tỷ lệ TFA: urê là 1:4 (w/w)

Sắc ký đồ thành phần axit béo của pha lỏng ở tỷ lệ TFA: urê là 1:5 (w/w)

Kết quả phân tích cảm quan, chỉ tiêu hóa lý của dầu sinh học giàu axit béo không no omega-6, 7, 9

Kết quả phân tích hàm lƣợng omega của dầu sinh học giàu axit béo không no omega-6, 7, 9

Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh, kim loại nặng của dầu sinh học giàu axit béo không no omega-6, 7, 9

PHỤ LỤC 2

Kết quả số liệu

Nhiệt độ (ᵒC)

Sai số

60 - 65 70 - 75 80 - 85

Hiệu suất tách chiết axit béo tổng số (% SKK) Lần 2 14,3 19,9 19,1

Lần 1 12,7 18,2 20,9

Lần 3 14,1 20,3 21

Trung bình 13,7 19,6 20,3

0,87 1,12 1,07

Thống kê b a a

Bảng 1. Hiệu suất tách chiết TFA (% SKK) ở các nhiệt độ khác nhau

Chất xúc tác

Sai số

Thống kê

Trung bình

H2SO4 HCl NaOH KOH

Hiệu suất tách chiết axit béo tổng số (% SKK) Lần 2 17,0 20,1 1,1 2,15

Lần 3 15,8 20,0 1,2 2,3

Lần 1 16,3 19,0 0,9 2,7

16,4 19,7 1,1 2,4

0,60 0,59 0,15 0,28

b a d c

Bảng 2. Hiệu suất tách chiết TFA (% SKK) với các chất xúc tác khác nhau

Sai số

Tỷ lệ SKK: hỗn hợp dung môi

Thống kê

Trung bình

1:6 1:8 1:10 1:12

Hiệu suất tách chiết axit béo tổng số (% SKK) Lần 2 13,0 16,0 19,6 21

Lần 1 10,0 17,0 20,0 19,4

Lần 3 12,5 15,9 19,9 21,1

11,8 16,3 19,8 20,5

1,61 0,61 0,21 0,95

c b a a

Bảng 3. Hiệu suất tách chiết TFA (% SKK) với các tỷ lệ SKK: hỗn hợp dung môi khác nhau

Thời gian

Sai số

Trung bình

Thống kê

2h 3h 4h

Hiệu suất tách chiết axit béo tổng số (% SKK) Lần 2 15,4 19,4 16,0

Lần 3 16,1 19,6 16,7

Lần 1 17,0 20,0 18,0

16,2 19,7 16,9

0,80 0,25 1,01

b a b

Bảng 4. Hiệu suất tách chiết TFA (% SKK) với các thời gian khác nhau

Chế độ khuấy

Sai số

Trung bình

Thống kê

Không khuấy Khuấy không liên tục Khuấy liên tục

Hiệu suất tách chiết axit béo tổng số (% SKK) Lần 2 14 15,7 18,9

Lần 1 15,2 16 20,7

Lần 3 13,8 16,3 19,9

14,3 16,0 19,8

0,76 0,30 1,01

c b a

Bảng 5. Hiệu suất tách chiết TFA (% SKK) với các chế độ khuấy khác nhau

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Sai số

Tỷ lệ TFA: urê (w/w)

Trung bình

Thống kê

Hiệu suất tách chiết (% TFA) SFA

36,5

38,8

37,5

37,6

1,15

1:2

MUFA, PUFA

43,3

46,2

44,6

44,7

1,45

SFA

46,8

44,2

47,3

46,1

1,66

1:3

MUFA, PUFA

38,5

39,8

39,3

39,2

0,66

SFA

55,6

57,3

58,1

1,28

1:4

MUFA, PUFA

27,4

28,5

29,9

28,6

1,25

SFA

64,2

67,7

63,4

65,1

2,29

1:5

MUFA, PUFA

21,9

22,7

19,3

21,3

1,78

Bảng 6. Hiệu suất tách chiết SFAs (A) và hiệu suất tách chiết MUFAs, PUFAs (B) ở các tỷ lệ TFA: urê khác nhau

Hiệu suất tách chiết (% TFA)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Sai số

Trung bình

Thống kê

Tỷ lệ TFA: urê: methanol (w/w/v)

1:3:15

1:3:20

1:3:25

SFA MUFA, PUFA SFA MUFA, PUFA SFA MUFA, PUFA

a b b a b a

50,6 34,3 45,8 40,1 42,3 39,2

51,5 36,1 44,2 41,4 44,7 42,5

53,6 34 45,6 39,4 42,6 40,7

51,9 34,8 45,2 40,3 43,2 40,8

1,54 1,14 0,87 1,01 1,31 1,65

Bảng 7. Hiệu suất tách chiết SFAs (A) và hiệu suất tách chiết MUFAs, PUFAs (B) ở các tỷ lệ TFA: urê : methanol khác nhau.

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Sai số

Nhiệt độ kết tinh (oC)

Trung bình

Thống kê

Hiệu suất tách chiết (% TFA) SFA MUFA, PUFA SFA MUFA, PUFA SFA MUFA, PUFA

45,2 38,5 42,4 40,6 38,2 41,3

46,8 39,2 44,1 41,2 39,7 40,5

48,4 41,1 42,8 38,5 37,9 41,5

46,8 39,6 43,1 40,1 38,6 41,1

1,6 1,35 0,89 1,42 0,96 0,53

a a b a c a

Bảng 8. Hiệu suất tách SFAs (A) và hiệu suất tách chiết MUFAs, PUFAs (B) ở các nhiệt độ khác nhau.

PHỤ LỤC 3

Hình ảnh quá trình tách chiết và làm giàu

Hình ảnh quá trình tách chiết TFA với chất xúc tác HCl, H2SO4

Hình ảnh quá trình tách chiết TFA với chất xúc tác KOH, NaOH

Hình ảnh quá trình tách chiết TFA ở các nhiệt độ phản ứng khác nhau

Hình ảnh quá trình tách chiết TFA ở các thời gian phản ứng khác nhau

Hình ảnh quá trình làm giàu hỗn hợp axít béo omega-6, 7, 9 bằng phƣơng pháp tạo phức urê với các tỉ lệ TFA: urê khác nhau

Hình ảnh quá trình làm giàu hỗn hợp axít béo omega-6, 7, 9 bằng phƣơng pháp tạo phức urê với các tỉ lệ urê: methanol khác nhau

Hình ảnh quá trình làm giàu hỗn hợp axít béo omega-6, 7, 9 bằng phƣơng pháp tạo phức urê với các nhiệt độ kết tinh khác nhau

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1, Trần Thị Thu Quỳnh, Trần Thu Hà, Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Thị Thu Huyền, Lại Thị Ngọc Hà, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Diễm Hồng, Hoàng Thị Yến. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho tách chiết hỗn hợp axít béo không no (omega-3, 6, 7, 9) từ sinh khối khô vi khuẩn tía quang hợp. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2020, Nhà xuất bản Đại học Huế, Huế, 2020: 261- 267.

2, Thị Yến Hoàng, Kuan Shiong Khoo, Hà Lại Thị Ngọc, Quỳnh Trần Thị Sasikala Thu, Tuyên Đỗ Thị, Hang Đinh Thị Thu, Ha Chu Hoàng, Chinthalapati, Chyi-How Lay, Pau Loke Show, Sustainable cultivation via waste soybean extract for higher vaccenic acid production by purple non- sulfur bacteria, Clean Technologies and Environmental Policy, 2020.

Clean Technologies and Environmental Policy https://doi.org/10.1007/s10098-020-01966-0

ORIGINAL PAPER

Sustainable cultivation via waste soybean extract for higher vaccenic acid production by purple non‑sulfur bacteria

Thị Yến Hoàng1 · Kuan Shiong Khoo2 · Hà Lại Thị Ngọc3 · Quỳnh Trần Thị Thu1,4 · Tuyên Đỗ Thị1 · Hang Đinh Thị Thu4 · Ha Chu Hoàng1 · Sasikala Chinthalapati5 · Chyi‑How Lay6 · Pau Loke Show2

Abstract The biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 was optimized via response surface methodology (RSM), and the optimal medium components such as waste soybean extract, yeast extract, and Mg2+ were determined using “one-single- factor-at-one-time” approach. RSM used a three-factor and central composite rotatable design consisting of 21 experimental runs conducted to optimize the final medium components. The optimized conditions were as follows: 2.723 g/L waste soy- bean extract, 3 g/L yeast extract, and 22 mg/L Mg2+. Under optimized conditions of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6, the biomass production was 4.665 ± 0.326 g/L, which was 5.7-folds higher than that under non-optimized conditions. Besides that, the total lipid production was 5.7 times higher corresponding to the increase in biomass productivity. In addition, there was a change in total fatty acid composition with omega 7 and omega 9 which increased from 55.4 to 62.21 and from 3.4 to 9.41, respectively, while omega 6 decreased from 9.79 to 4.54 and omega 3 could not be detected. This exploration of waste soybean under optimized conditions would be a significant impact for the higher biomass production from Rhodovulum sulfidophilum HPB.6.

Graphic abstract

Extended author information available on the last page of the article

T. Y. Hoàng et al.

Keywords Rhodovulum sulfidophilum · Vaccenic acid · Validated model · Biomass production · Waste soybean extract

Introduction

build and to solve multi-variable equations. This approach overcomes the disadvantages of the OFAT method and has been applied in different kinds of research including micro- biological biomass production.

In this study, we report the omega 7 fatty acid production by Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 in a culture medium with waste soybean extract as substrate. Based on our pre- vious study, waste soybean extract medium was selected to replace over synthetic cultivation medium, which resulted in rapid biomass growth and highest lipid accumulation specifi- cally unsaturated fatty acid (i.e., omega 6, 7, 9) production by Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 (Hoang et al. 2019). In order to utilize Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 for high biomass production, extraction of unsaturated fatty acid and other biotechnology applications, this study focused on the selection of suitable medium components via OFAT for the biomass production and the selected medium composition was further optimized using RSM to achieve the highest biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 for various biotechnology applications.

Purple non-sulfur bacteria (PNSB) are a physiological group of bacteria distributed among either alpha or beta-proteobac- teria that can carry out photosynthesis in the absence of oxy- gen production (Imhoff 1989). PNSB are the most diverse and most useful group of bacteria for various biotechno- logical applications like single-cell protein (SCP), bioac- tive compounds, and wastewater treatment and especially for functional food formation compounds (Sasikala and Ramana 1995). Functional food rich with unsaturated fatty acids (e.g., omega 3, 6, 7, 9) is beneficial to human health. It is proven to be proficient of antioxidant, anti-inflamma- tory, and immune system modulator, and strengthens the cardiovascular system and mucous membrane tissue regen- erator (Innes and Calder 2020; Koyande et al. 2019). Many studies have positively correlated essential fatty acids with reduction of cardiovascular morbidity and mortality, infant development, cancer prevention, optimal brain and vision functioning, arthritis, hypertension, diabetes mellitus, and neurological/neuropsychiatric disorders (Kaur et al. 2014; Kim et al. 2013).

Materials and methods

Type of microorganism strain

Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 used throughout this study was isolated from the coastal area of Haiphong, Viet- nam and identified as Rhodovulum sulfìdophilum by using morphological and physiological properties and 16S rRNA gene sequence analysis (Hoang et al. 2019). It was main- tained in DSMZ-27 medium at 4 °C and lyophilized and kept at the Key Laboratory of Gene Technology, Biotechnol- ogy Institute, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST).

Cultivation media composition

PNSB are particularly rich in omega 7 fatty acids also known as vaccenic acid (65–82% of total fatty acids) which has a crucial role in maintaining the health of skin and mucous membranes (Djoussé et al. 2012). PNSB phototro- pic has been explored mainly for the production of bioenergy such as hydrogen and polyhydroxybutyrate (PHBT), along with wastewater treatment (Khatipov et al. 1998; Kim et al. 2006; Wu et al. 2012). Previous study by Kim et al. (2013) has shown the feasibility for microbial fatty acid produc- tion of photosynthetic bacteria, Rhodobacter sphaeroides KD131 cultivated in a continuous-flow, membrane-coupled bioreactor with lactate as carbon source with a cell produc- tivity of 1.9 g dcw/L/d and fatty acid productivity of 665 mg FA/L/d, respectively. The fatty acid produced was around 35% dcw and mainly consisted of vaccenic acid (Kim et al. 2013). However, a previous study utilizes synthetic cultiva- tion media which is not very economically viable.

The bacteria biomass production study can be performed via one-factor-at-a-time approach (OFAT) and response surface methodology (RSM) (Irfan et al. 2014; Kong et al. 2004). OFAT, also known as a single factor experiment, is a classical method in which only one factor is variable at one time while all others are kept constant. This approach has several drawbacks: (i) it is time-consuming; (ii) there is an inability to evaluate the interaction between the variables; (iii) it is costly; and (iv) it is less effective than other meth- ods (Khoo et al. 2020; Torres-Acosta et al. 2019). RSM is a statistical method which uses the data from experiments to

The DSMZ-27 medium (pH 7.0) was used for the cultiva- tion of the bacterium. DSMZ-27 medium composed the fol- lowing components per liter of distilled water: 0.3 g yeast extract; 0.5 mL ethanol; 1 g succinate; 0.5 g acetate; 5 mL ferric citrate from 0.1% (w/v) stock; 0.5 g KH2PO4; 0.4 g MgSO4·7H2O; 0.05 g CaCl2·2H2O; 0.4 g NH4Cl; 25 g NaCl; trace element solution SL6; and 1 mL vitamin B12 solution (filter sterilized). Trace element solution SL6 contains (l−1) 1.8 g FeCl2·4H2O; 0.25 g CoCl2·6H2O; 0.01 g NiCl·6H2O; 0.01 g CuCl2·5H2O, 0.07 g MnCl2·4H2O; 0.1 g ZnCl2; 0.5 g H3BO3; 0.01 g Na2SiO3·5H2O; 0.03 g Na2MoO4·2H2O. Vita- min B12 solution was added after autoclaving stock solution

βij are the regression coefficients for the intercept, linear, quadratic, and interactions terms, respectively, and Xi and Xj are the real values of variables.

and was used as Basal medium. The stock solution was pre- pared by putting 10 g of waste soybean to cloth and tightly sealed, then the stock solution is put into 100 mL distilled water, sterilized at 121 °C for 30 min.

Primary experiments: selection of medium components for biomass production

For all runs, the biomass production was performed in a 13-mL penicillin tube containing 10 mL of medium and inoculated bacteria at an exponential phase with an initial concentration of 160 mg/L. Bacterium and medium were mixed uniformly by a shaker. After 4 days of anaerobic incu- bation at a temperature within 30–32 °C and light intensity of 4 lux (tungsten light bulbs), biomass production was esti- mated either by cell density at ∆OD800 or dried biomass (dcw).

The optimal conditions for biomass production (∆OD800) were determined using the JMP 10 software. The software was set to have the maximized desirability which was the highest biomass quantity. Four experimental replicates were performed at the optimized conditions. The experimental and predicted values were compared in order to validate the model.

Determination of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 biomass productivity

The bacterium was cultivated in soybean extract concentra- tion ranging from 1 to 5 g/L and added 25 g/L NaCl to evalu- ate the effect of stock solution concentration on the growth of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6. The optimal concen- tration stock solution was added with carbon and nitrogen sources separately such as malic acid, acetate, yeast extract, and glutamate (2 g/L) to assess the effect of different carbon and nitrogen sources. The yeast extract concentration (range from 1 to 5 g/L) and Mg2+ (8–22 mg/L) were examined by using OFAT to obtain the highest biomass production. For each experiment, the culture was grown in a 13-mL penicil- lin tube composed of 10 mL of stock solution medium, along with the indicated sources and inoculated bacteria at an exponential phase with an initial concentration of 160 mg/L (Hoang et al. 2019). Bacterium and culture medium were mixed uniformly by a shaker.

Response surface methodology procedure for biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6

The productivity of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 was determined by measuring the cell density at OD800 using UV–Vis spectrophotometer and by dry biomass quantity (g/L) (Cai et al. 2012; Li et al. 1995). Dry biomass (g/L) was determined as follows: after 4 days of incubation, Rho- dovulum sulfidophilum HPB.6 cells were harvested by the centrifugation method at 8000 rpm for 15 min at 4 °C. The pellet was re-suspended in 10 mL distilled water and centri- fuged again for washing. The washed cells were then lyophi- lized until a constant weight is obtained. The dry biomass was used to extract lipids and subjected to further analysis of fatty acid composition.

Determination of total lipid extraction

Response surface methodology (RSM) was performed using a three-factor and central composite rotatable design (CCRD) consisting of 21 experimental runs with 8 (23) fac- torial points, 6 (2 × 3) axial points (i.e., two axial points on the axis of each design variable at a distance of 1.68 from the design center, (23)1/3), and 3 replicates at the center points, maximal and minimal factorial points. The design variables were the waste soybean extract concentration (g/L; X1), the yeast extract concentration (g/L; X2), and the Mg2+ concen- tration (mg/L; X3). Each variable was coded at five levels − 1.68, − 1, 0, 1, and 1.68. The conversion of real values (Xi) to coded values (xi) was done by using the following equation xi = (X i – X0)/ΔXi, where X0 is the real value of the independent variable i at the center point and ΔXi is the step change of Xi corresponding to a unit of variation. In the present study, X0 and ΔXi were determined in the section of primary experiments. The experimental data were fitted to the following second-order polynomial model:

Y = 𝛽0 +

𝛽ijXiXj

𝛽iiX2

𝛽iXi +

∑ j=2

∑ i=1

Lipid extraction was performed using the modified meth- odology of Bligh and Dyer (1959). 100 g of dry biomass was mixed with 300 mL mixture of dichloromethane and methanol (2:1, v/v) was carried out for 2 h integrated with ultrasonication for cell membrane disruption. A further dilu- tion was made with 100 mL of dichloromethane and 100 mL of water. After the separation of the two layers, the upper aqueous layer containing methanol, water, and non-lipid compounds was discarded and the lower dichloromethane layer was filtered using a filter paper containing anhydrous sodium sulfate and collected in pre-weighed glass vials. This procedure was repeated for the extraction of lipids remaining in the sample. Both the organic phases containing the lipid extract was vacuum dried to remove the excess solvent until a constant weight was attained.

where Y is the response or dependant variable (∆OD800 of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 culture), β0, βi, βii, and

T. Y. Hoàng et al.

Fatty acid analysis

were expressed as mean ± standard deviation. One-way anal- ysis of variance (ANOVA) and Duncan’s multiple range test were used to determine the differences among the means. P-values (< 0.05) were considered to be significantly dif- ferent. In the RSM experiment, multiple linear regression analysis was performed using the software JMP 10 (SAS Institute, Cary, NC).

Results and discussion

Primary experiments: selection medium components for biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6

Effect of soybean extract concentration

Fatty acid analysis of non-optimized biomass was conducted at Royal Research Laboratories, Secunderabad, India. Bio- mass was methylated, separated, and identified according to the instructions for the Microbial Identification System (Sasser 1990) (Microbial ID; MIDI; version 3 V 6.0-2007; RTSBA6 database; 6850 series II gas chromatograph, Olym- pus). Fatty acid analysis of the optimized biomass was deter- mined by gas chromatography (GC) and a subsequent ISO draft standard method in Laboratory of Biochemistry, Insti- tute of Natural Products Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology [Animal and Vegetable Fats and Oils—Preparation of Methyl Esters of Fatty Acids; Stand- ard No. 5509; ISO: Geneva, Switzerland, 1988]. Approxi- mately 10 mg of oil was dissolved in 1 mL of petroleum ether, followed by the addition of 25 µL of 2 M sodium methanolate methanol solution and the mixture was agitated vigorously for 1 min. About 20 µL of water was added, and after centrifugation the aqueous phase was removed. Then, 20 µL of methyl orange in 0.1 N HCl was added as a pH indicator. The mixture was agitated carefully, and differ- ent derivatives were analyzed by a Hewlett–Packard Gas Chromatography Instrument Model 5890 Series II/5989 A80 equipped with a 0.25 mm ZB-1 fused-silica capillary column (30 m × 0.25 µm i.d.; Phenomenex, Torrance, CA). The carrier gas is composed with helium at a flow rate of 1.0 mL/min.

Statistical analysis

The experimental results were analyzed using the SAS 9.1 software (SAS Institute, Cary, NC). In the primary experi- ments, the selection of suitable medium components was optimized using one-factor-at-a-time (OFAT) and the results

Fig. 1 Effect of waste soybean extract concentration on the growth of HPB.6

The synthetic medium was used for isolation, studying the biological characteristics and microbial biomass produc- tion. However, in considering the production at pilot scale, it is important to access an appropriate and cheap substrate to reduce the cost demanded. Study conducted by He et al. (2010) used purple non-sulfur bacteria (i.e., Rhodobacter sphaeroides) for the treatment of synthetic soybean waste- water with chemical oxygen demand concentration nearly 10,000 mg/L and achieved a recovery of 4 g/L biomass in 96 h. Our study showed that waste soybean extract was the best substrate compared to corn and rice extract for biomass production (Del Socorro et al. 2013; Hoang et al. 2019). This result indicated that waste soybean extract was a suitable substrate for PNSB in large-scale production. In addition, we had analyzed the fatty acid composition when Rhodo- vulum sulfidophilum HPB.6 was grown in DSMZ-27 and waste soybean extract (2 g/L). The result showed that fatty acid composition was nearly similar (see SI-1 and SI-2). Therefore, waste soybean extract was chosen to study the effect of its concentration on biomass production. Rhodovu- lum sulfidophilum HPB.6 strain was cultivated in soybean extract concentration ranging from 1 to 5 g/L (by diluted stock solution) and added 25 g/L NaCl. The experiment was conducted as described in Sect. 2.3. After cultivation for 4 days, the results indicated that soybean extract concentra- tion showed a significant effect on the growth of Rhodovu- lum sulfidophilum HPB.6 strain (P < 0.0001). Figure 1 shows the effect of waste soybean extraction concentration on the growth of Rhodovulum sulfidophilum HDP.6 strain. At 3 g/L soybean extract, the biomass of HPB.6 strain revealed an absorbance of 1.207. On the other hand, with an increase in soybean extract concentration from 4 to 5 g/L, the bio- mass reaches about 111.4% and 116% compared to soybean extract concentration at 1 and 2 g/L, where the biomass was only 81.93% and 49.71%, respectively. Therefore, soybean extract concentration of 3 g/L was selected as the central

value in the RMS experiment and was used in the subse- quent parameter.

Effect of carbon and nitrogen sources

the medium containing 3 g/L of soybean extract and yeast extract with concentration ranging from 1 to 5 g/L was investigated. The experiment was conducted as an indica- tion in the method. After 4 days incubation, the result in Fig. 3 showed a significant effect on the growth of HPB.6 strain (P < 0.0001) when yeast extract concentration was added in 3 g/L soybean extract. The absorbance increased from 0 to 2 with an increase in the yeast extract concentra- tion and then remained constant. At 2 g/L of yeast extract, the biomass absorbance reaches about 1.986, increased by 161.84% compared to the control experiment (soybean extract: 3 g/L). Therefore, the yeast extract concentration of 2 g/L was selected for the next experiment.

Effect of Mg2+ concentration on the growth of HPB.6

PNSB can utilize various carbon and nitrogen sources for growth. Malic acid (Ab Rahim et al. 2020) acetate, yeast extract, and glutamate have been chosen as the most impor- tant components (Saejung and Thammaratana 2016). In order to achieve a high biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6, the optimal concentration of waste soybean extract medium (3 g/L) was further added with some additives carbon and nitrogen sources such as malate (2 g/L), acetate (2 g/L), yeast extract (2 g/L), and glutamate (2 g/L). After 4 days of incubation, the result was obtained, as shown in Fig. 2. The result showed that Rhodovulum sulfi- dophilum HPB.6 grew the best in soybean extract added with yeast extract. In medium added with 2 g/L of yeast extract and glutamate, the biomass increased to 170.24% and 151%, respectively, compared to the control experiment (soybean extract: 3 g/L). In the waste soybean extract medium added with 2 g/L acetate and malate, the absorbance increased from 121.03 to 135.24%, respectively. Based on the result, the yeast extract was chosen as the optimal condition for the following parameters.

Effect of YE concentration

Wu et al. (2014) investigated the enhancement of PNSB cell accumulation in soybean wastewater by implementing Mg2+ under the light anaerobic condition and the results showed that with Mg2+ at 10 mg/L, biomass production was improved by 70% and chemical oxygen demand removal reached 86%. Therefore, in this experiment, Mg2+ concen- tration at a range within 5–25 mg/L was added into the opti- mized medium to evaluate the effect of Mg2+ on the growth of HPB.6 strain. The results shown in Fig. 4 indicated that an increase in Mg2+ concentration in medium played a sig- nificant role on the growth of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 strain (P < 0.0001). Indeed, the growth of biomass increased with an increase in the Mg2+ concentration from 0 to 15 mg/L and then remained fairly constant. At a concen- tration of 15 mg/L of Mg2+, the biomass reached an absorb- ance of 3.873 which significantly increase by 144.04% compared to the soybean extract without additional Mg2+. However, when the concentration of Mg2+ increased to 25 mg/L, the biomass decreased by 119.17%. Based on this

Yeast extract is a common addition to media formulated for purple non-sulfur bacteria (Madigan and Jung 2009). It also stimulated the growth because of its assortment of organic compounds that can fuel photoheterotrophic growth. Yeast extract is a source of B-vitamins, thiamine, nicotinic acid, biotin, and p-aminobenzoic acid as growth factor (Smith et al. 1975; Stokes et al. 1944). In this experiment,

Fig. 2 Effect of carbon and nitrogen sources on the growth of HPB.6

Fig. 3 Effect of yeast extract concentration on the growth of HPB.6

T. Y. Hoàng et al.

result, the concentration of Mg2+ at 15 mg/L was chosen for the next parameter.

Modeling and optimization of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 biomass production using response surface methodology (RSM)

Fig. 4 Effect of Mg2+ concentration on the growth of HPB.6

Table 1 Central value and variation of independent variable

Independent variables

Central values

Variations

Biomass production from Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 for the extraction of omega 7 was further optimized through the RSM approach. Based on the primary results, three fac- tors namely soybean extract, yeast extract, and Mg2+ con- tents were considered as independent variables in the model. Their ranges were determined in the primary experiments and are presented in Table 1. The experimental design of a five-level, three-variable CCRD and the experimental results of the biomass (described through the optical density at OD800) are shown in Table 2. By applying the multiple regression analysis, the relation between the tested inde- pendent variables and the response was explained by Eq. 1, in which xi were the standardized or coded variables. The equation of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 biomass pro- duction (Eq. 2) was obtained by converting the coded values (xi) into real values (Xi).

3 2 15

1 1 7

Soybean extract (g/L) Yeast extract (g/L) Mg2+ (mg/L)

Standard variables

Real variables

∆OD800

Soybean extract

Yeast extract

Mg2+

Table 2 Rotatable central composite design setting in the coded form (x1, x2 and x3) and real values of the independent variables (X1, X2 and X3), and experimental results for the response variable (biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 described through the optical density ∆OD800)

a00 − − − − − − − − − − − + − + − − + + 0a0 00a 000 000 000 00A 0A0 + − − + − + + + − + + + + + + + + + A00

− 1.68 − 1 − 1 − 1 − 1 − 1 − 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1.681

0 − 1 − 1 − 1 − 1 1 1 − 1.681 0 0 0 0 0 1.681 − 1 − 1 1 1 1 1 0

0 − 1 − 1 − 1 1 − 1 1 0 − 1.681 0 0 0 1.681 0 − 1 1 − 1 1 1 1 0

1.318 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4.681

15 8 8 8 22 8 22 15 3.227 15 15 15 26.772 15 8 22 8 22 22 22 15

4.494 4.545 4.204 4.202 4.280 5.342 5.778 4.348 5.379 5.412 5.379 5.546 5.194 5.754 5.158 4.899 4.707 5.502 5.599 5.648 5.047

2 1 1 1 1 3 3 0.318 2 2 2 2 2 3.681 1 1 3 3 3 3 2

of the model was due to the pure error. This strengthened the reliability of the model.

+ 0.027x1x3 + 0.2x2x3 − 0.239x2

Y = 5.445 + 0.128x1 + 0.389x2 + 0.066x3−0.286x1x2 2 − 0.057x2

1 − 0.14x2

3 (1)

Y = 0.588 + 2.053X1 + 1.234X2 − 0.0146X3 − 0.286X1X2

+ 0.0054X1X3 + 0.04X2X3 ± 0.239X2

1 − 0.14X2

2 − 0.00228X2 3 (2)

To fit the response function and experimental data, the linear and quadratic effects of the independent variables, as well as their interactions in the response, were evaluated by analysis of variance (ANOVA), and regression coefficients are shown in Tables 3 and 4. The ANOVA of the regression model showed that the model was highly significant or use- ful due to a very low probability value (P < 0.0001). The fitness of the model was judged by the coefficient of deter- mination (R2). In this study, the R2 value for the regression model of the biomass production was 0.9433, which was close to 1, suggesting that the predicted second-order poly- nomial model defined well the biomass production (∆OD800) and that 94.33% of variation for the biomass production was attributed to the three studied factors. Besides, the lack of fit test is used to verify the adequacy of the model. In our study, the absence of lack of fit (variation between average and predicted values at X) (P = 0.1401) meant that the total error

The effects of the concentration of soybean extract, yeast extract, and Mg2+ on the biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 are presented in Table 4 and Fig. 5. As illustrated in Table 4, the soybean extract, yeast extract, and Mg2+ showed significant linear effects for the biomass production, respectively (P < 0.05). Biomass production (∆OD800) was mainly influenced by the soybean extract and yeast extract contents. The soybean extract and yeast extract exerted significant individual and quadratic effects, respectively (P < 0.05). Mg2+, varying from 8 to 22 mg/L, was not significant (P = 0.1534). The interactions between the three parameters soybean extract, yeast extract, and Mg2+ had a significant effect on the biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6, except the interaction between soybean extract and Mg2+ contents (P = 0.6356). The negative quadratic coefficients of x1, x2, and x3 indi- cated that there was a maximum biomass production at a certain concentration of soybean extract, yeast extract, and Mg2+. The optimized medium composition for the HPB.6 biomass production was subjected using JMP10 software. The software was set to search the optimum desirability for the response, meaning the maximum biomass production by Rhodovulum sulfidophilum HPB.6. By this way, the optimal medium composition was as follows: 2.723 g/L of soybean extract, 3 g/L of yeast extract, and 22 mg/L of Mg2+, as shown in Fig. 6.

Table 3 Analysis of variance for the response surface quadratic model of biomass production

Sum of squares Mean square

F ratio

Source

0.609920 0.029960 0.044980 0.017444

20.3575 P < 0.0001* 2.5785 P = 0.1401

Model Error Lack of fit Pure error C. Total

9 11 5 6 20

5.4892806 0.3295647 0.2249000 0.1046647 5.8188452

In order to examine the validity of the model, biomass production (∆OD800) was completed with four replicates under the estimated optimum conditions generated by the software. The measured values (5.852, 5.723, 5.754, and 5.801) were within a 95% mean confidence interval of the predicted value (5.698–6.146). The results confirmed the predictability of the model. The second-order polynomial model can thus be effectively applied to predict the biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6.

*Indicate significant < 0.05

Term

Estimate

T ratio

P > |t|

Table 4 Parameter estimates of the predicted second-order model for the responses (biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6)

5.4458841 0.1286064 0.3893231 0.0659886 − 0.286474 0.027026 0.200776 − 0.239456 − 0.140285 − 0.057023

0.099725 0.043032 0.043032 0.043032 0.055466 0.055466 0.055466 0.051231 0.051231 0.051231

54.61 2.99 9.05 1.53 − 5.16 0.49 3.62 − 4.67 − 2.74 − 1.11

< 0.0001* 0.0123* < 0.0001* 0.1534 0.0003* 0.6356 0.0040* 0.0007* 0.0193* 0.2894

Intercept Soybean extract Yeast extract Mg2+ Soybean extract and yeast extract Soybean extract and Mg2+ Yeast extract and Mg2+ Soybean extract and Soybean extract Yeast extract and yeast extract Mg2+ and Mg2+

*Indicate significant < 0.05

T. Y. Hoàng et al.

Fig. 5 Response surface for the biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 in the function of the waste soybean extract, yeast extract, and Mg2+

Fig. 6 The concentrations of soybean extract (SE), yeast extract (YE), and Mg2+ for the maximal desirability

Growth, lipid content, and fatty acid profile of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 obtained in optimized medium

Using this media to cultivate HPB.6 strain in a zip lock (1 L) and incubate at a temperature 30–32 °C, intensity illu- minates at 4.000 lux. After 4 days of culturing (96 h), the biomass (DCW), lipid (w/v), and fatty acid (% total fatty acid) accumulation were determined and compared to con- trol (before using RSM). According to Table 5, the results showed that after determining the composition and verifying via RSM approach to optimize the media composition, the biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 showed an increase of 5.7 times from 0.775 g/L in waste soybean extract medium to 4.665 g/L after using RSM. The lipid content (% dcw) remains around 21.457 ± 2.272 and 20.324 ± 2.021, respectively, and the fatty acid (% of total

After determining the optimal composition of the culture medium for biomass production in large scale, using the sur- face response model to determine the influence of factors on the ability to accumulate biomass. Table 5 compared the biomass production, lipid content, and fatty acid profile of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 growth in an optimized and non-optimized medium composition. The composi- tion of media for biomass production includes soybean extract: 2.723 g/L; yeast extract: 3 g/L and Mg2+: 22 mg/L.

Compliance with ethical standards

Table 5 Biomass production, lipid content, and fatty acid profile of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 grown in optimized and non-opti- mized medium composition

Composition

Rhodovulum sulfidophilum HPB.6

Conflict of interest The authors declare that they have no known com- peting financial interests or personal relationships that could have ap- peared to influence the work reported in this paper.

Non-optimized medium

Optimized medium

References

4.665 ± 0.326 20.324 ± 2.021

0.775 ± 0.081 21.457 ± 2.272

Ab Rahim AH et al (2020) Probe sonication assisted ionic liquid treat- ment for rapid dissolution of lignocellulosic biomass. Cellulose 27:2135–2148

Bligh EG, Dyer WJ (1959) A rapid method of total lipid extraction and

purification. Can J Biochem Physiol 37:911–917

Dry biomass Lipid (% w/v) Fatty acid (% of total fatty acid) Omega 3 Omega 6 Omega 7 Omega 9

0.0 9.79 55.4 3.4

1.04 4.54 62.21 9.41

Cai J, Wang G, Pan G (2012) Hydrogen production from butyrate by a marine mixed phototrophic bacterial consort. Int J Hydrog Energy 37:4057–4067

fatty acid) had a little change in composition in which omega 7 (mainly vaccenic acid) and omega 9 increase (from 55.4 to 62.21 and from 3.4 to 9.41, respectively) and omega 6 decreases (from 9.79 to 4.54).

Del Socorro MML, Ladion WLB, Mehid JB, Teves FG (2013) Purple Nonsulfur Bacteria (PNSB) Isolated from Aquatic Sediments and Rice Paddy in Iligan City, Philippines. J Multidiscip Stud 1 Djoussé L, Matthan NR, Lichtenstein AH, Gaziano JM (2012) Red blood cell membrane concentration of cis-palmitoleic and cis- vaccenic acids and risk of coronary heart disease. Am J Cardiol 110:539–544

Conclusions

He J, Zhang G, Lu H (2010) Treatment of soybean wastewater by a wild strain Rhodobacter sphaeroides and to produce protein under natural conditions. Front Environ Sci Eng China 4:334–339 Hoang YT, Tran QTT, Chu HH, Do TT, Dang TT, Dinh HTT (2019) Identification and characterization of a purple nonsulfur bacteria isolated from coastal area of hai phong producing unsaturated fatty acid (omega 6, 7, 9). Vietnam J Sci Technol 57:665

Imhoff JF (1989) Purple nonsulfur bacterua. Bergey’s Man Syst Bac-

teriol 3:1658–1682

Innes JK, Calder PC (2020) Marine omega-3 (N-3) fatty acids for car- diovascular health: an update for 2020. Int J Mol Sci 21:1362 Irfan M, Nadeem M, Syed Q (2014) One-factor-at-a-time (OFAT) opti- mization of xylanase production from trichoderma viride-IR05 in solid-state fermentation. J Radiat Res Appl Sci 7:317–326 Kaur N, Chugh V, Gupta AK (2014) Essential fatty acids as functional components of foods-a review. J Food Sci Technol 51:2289–2303 Khatipov E, Miyake M, Miyake J, Asada Y (1998) Accumulation of poly-β-hydroxybutyrate by Rhodobacter sphaeroides on various carbon and nitrogen substrates. FEMS Microbiol Lett 162:39–45 Khoo KS, Leong HY, Chew KW, Lim J-W, Ling TC, Show PL, Yen H-W (2020) Liquid biphasic system: a recent bioseparation tech- nology. Processes 8:149

Kim M-S, Baek J-S, Lee JK (2006) Comparison of H2 accumulation by Rhodobacter sphaeroides KD131 and its uptake hydrogenase and PHB synthase deficient mutant. Int J Hydrog Energy 31:121–127 Kim D-H, Lee J-H, Hwang Y, Kang S, Kim M-S (2013) Continuous cultivation of photosynthetic bacteria for fatty acids production. Bioresour Technol 148:277–282

Here, we conclude that the response surface methodology has successfully optimized an optimal biomass production of Rhodovulum sulfidophilum HPB.6. The optimized parameter is composed of 2.723 g/L of waste soybean extract, 3 g/L of yeast extract, and 22 mg/L of Mg2+. The optimized cul- tivation media to culture Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 in a zip lock (1 L) at a temperature within 30–32 °C and light intensity of 4.000 lux, the biomass achieved an opti- mal growth of 4.665 ± 0.326 g/L, which was 5.7-fold higher than non-optimization medium. The lipid content (% dcw) remains unchanged; however, the fatty acid (% of total fatty acid) had a slight reduction in composition where omega 7 and omega 9 increase from 55.4 to 62.21 and from 3.4 to 9.41, respectively, while omega 6 decreases from 9.79 to 4.54. Nevertheless, the implementation of waste soybean extract as culture medium has shown the feasibility and reli- ability of this approach over synthetic culture medium for the enhancement, extraction of unsaturated fatty acid, and other biotechnology applications of Rhodovulum sulfidophi- lum HPB.6.

Kong Q, He G, Chen Q, Chen F (2004) Optimization of medium com- position for cultivating Clostridium butyricum with response sur- face methodology. J Food Sci Technol 69:163–168

Acknowledgements This research funding from National Project of Biotechnology development and application in processing industry to 2020 supported by Ministry of Industry and Trade (Grant number: 09/ HĐ-ĐT.09.17/CNSHCB) was acknowledged.

Koyande AK, Chew KW, Rambabu K, Tao Y, Chu D-T, Show P-L (2019) Microalgae: a potential alternative to health supplementa- tion for humans. Food Sci Hum Well 8:16–24

Authors’ contributions All authors contribute equally to this work.

Li Y, Xu B, Yin X, Xu H, Shi J (1995) Isolation, identification and growth conditions of Rhodopseudomonas. J Ocean Univ Qingdao 25:187–192

Madigan MT, Jung DO (2009) An overview of purple bacteria: sys- tematics, physiology, and habitats. In: The purple phototrophic bacteria. Springer, pp 1–15

T. Y. Hoàng et al.

Torres-Acosta MA, Mayolo-Deloisa K, González-Valdez J, Rito-Palo- mares M (2019) Aqueous two-phase systems at large scale: chal- lenges and opportunities. Biotechnol J 14:1800117

Saejung C, Thammaratana T (2016) Biomass recovery during munici- pal wastewater treatment using photosynthetic bacteria and pros- pect of production of single cell protein for feedstuff. Environ Technol 37:3055–3061

Wu P, Zhang G, Li J, Lu H, Zhao W (2012) Effects of Fe2+ concentra- tion on biomass accumulation and energy metabolism in pho- tosynthetic bacteria wastewater treatment. Bioresour Technol 119:55–59

Sasikala C, Ramana CV (1995) Biotechnological potentials of anoxy- genic phototrophic bacteria. I. Production of single-cell protein, vitamins, ubiquinones, hormones, and enzymes and use in waste treatment. In: Advances in applied microbiology, vol 41. Elsevier, pp 173–226

Sasser M (1990) Identification of bacteria through fatty acid analysis.

In: Methods in phytobacteriology, vol 565

Wu P, Wang Y-l, Zhang G-m, Liu X-s, Du C, Tong Q-y, Li N (2014) Improving biomass resource recycling capacity of Rubrivivax gelatinosus cultivated in wastewater through regulating the gen- eration and use of energy. Environ Technol 35:2604–2609

Smith JS, Hillier A, Lees G, Jago G (1975) The nature of the stimula- tion of the growth of Streptococcus lactis by yeast extract. J Dairy Sci 42:123–138