Môi trường phân lập nấm Trichoderma trong đất

Chia sẻ: Nguyen Phu Hon | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:13

Thêm vào BST

Báo xấu

636
lượt xem 85
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

• Thanh trùng nơi làm việc và tay trước khi đổ môi trường và cấy bằng cồn 700, sau đó đốt đèn cồn. • Đổ môi trường vào 5 đĩa petri, thanh trùng dưới ngọn lửa đèn cồn, để yên cho môi trường đông cứng. • Dùng icropipetmte tips hút 0,1ml dung dịch đất ở ống nghiệm thứ 1(nồng độ 10-2 ) cấy vào đĩa petri đã có môi trường đông cứng, dùng que chà chà nhẹ cho dung dịch phân bố đều, cứ lặp lại ở đĩa 1, 2, 3....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Môi trường phân lập nấm Trichoderma trong đất

GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 BÀI 1: PHÂN LẬP NẤM TRICHODERMA TRONG ĐẤT Mục đích thí nghiệm: I. Phân lập được nấm Trichoderma trong đất. Chuẩn bị II. 1. Môi trường phân lập nấm Trichoderma trong đất (NH4)2SO4 : 1,4 g/l. CoCl2 : 2 mg/l. KH2PO4 : 2 g/l. Cellulose : 10 g/l. CaCl2 : 0,3 g/l. Pepton : 1 g/l. MgSO4.7H2O : 0,3 g/l. Agar : 20 g/l. Nước: 1lít. MnSO4.7H2O : 4,56 mg/l. FeSO4.7H2O : 5mg/l ZnSO4.7H2O : 1,4 mg/l. 2. Chuẩn bị dụng cụ và thiết bị. 5 đĩa petri. Bình tam giác loại 250 ml và 1000 ml. Micropipette, micropipette tips, que chà thủy tinh. Cân phân tích, nồi hấp thanh trùng. 4 ống nghiệm, cốc, muỗng. Giá để ống nghiệm, đèn cồn. Giấy gói đĩa petri, băng keo, viết. 3. Chuẩn bị mẫu: Mẫu đất lấy từ vườn kiểng Long Xuyên. Phương pháp thí nghiệm III. Nấu môi trường. 1. - Cân các thành phân môi trường theo khối lượng trên. Nhưng lấy ½ khối l ượng đã cân ở trên vào 500 ml nước vào bình tam giác 1000 ml, sau đó lắc đều. - Đậy nắp bình môi trường bằng giấy nhôm rồi đem đi hấp thanh trùng ở 121 0C, trong 15 phút. 1
GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 2. Pha dung dịch đất. • Lấy 10 g đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml H2O cất, lắc đều dung dịch trong 15 phút rồi giữ yên. • Chuẩn bị 4 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước cất và được đánh số từ 1 đến 4. • Dùng micropipette hút 1ml dung dịch đất ( nồng độ 10-1) trong bình tam giác, cho vào ống nghiệm thứ 1, lắc đều. • Từ ống nghiệm thứ 1 (nồng độ 10-2) hút 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm thứ 2, lắc đều. • Từ ống nghiệm thứ 2 (nồng độ 10-3) hút 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm thứ 3, lắc đều. • Từ ống nghiệm thứ 3 (nồng độ 10-4) hút 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm thứ 4 (nồng độ 10-5), lắc đều. • Quy trình này được thực hiện như sau: Lấy 10 g đất + 90ml nước cất 10-1> 10-2 10-3 10-410-5 3. Đổ môi trường và cấy mẫu. • Thanh trùng nơi làm việc và tay trước khi đổ môi trường và cấy bằng cồn 700, sau đó đốt đèn cồn. • Đổ môi trường vào 5 đĩa petri, thanh trùng dưới ngọn lửa đèn cồn, để yên cho môi trường đông cứng. • Dùng micropipette tips hút 0,1ml dung dịch đất ở ống nghiệm thứ 1(nồng độ 10-2 ) cấy vào đĩa petri đã có môi trường đông cứng, dùng que chà chà nhẹ cho dung dịch phân bố đều, cứ lặp lại ở đĩa 1, 2, 3. • Dùng micropipette tips hút 0,1ml dung dịch đất ở ống nghiệm thứ 2 (nồng độ 10-3 ) cấy vào đĩa petri đã có môi trường đông cứng, dùng que chà chà nhẹ cho dung dịch phân bố đều, lặp lại ở 2 đĩa còn lại. 4. Ủ mẫu. - Dùng giấy gói 5 đĩa petri đã cấy mẫu. - Đánh dấu và đem đi ủ mẫu. 5. Quan sát. - Sau 48 giờ, quan sát khuẩn lạc của nấm. 2
GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 - Ghi nhận kết quả. Kết quả - thảo luận. IV. Kết quả: 1. Sau 48 giờ nuôi cấy, không phân lập được nấm Trichoderma trong đất, chỉ thấy khuẩn lạc của một số vi khuẩn khác. Thảo luận: 2. • Nguyên nhân không phân lập được nấm là do: - Trong đất mật số Trichoderma thấp hoặc không có Trichoderma. - Trong quá trình thao tác mẫu đã bị nhiễm khuẩn - Thao tác thực hiện chưa được thanh trùng tuyệt đối • Cách khắc phục: - Thực hiện các thao tác phải đúng và trong điều kiện vô trùng tuyệt đối. - Thực hiện thí nghiệm trên nhiều mẫu đất khác nhau. BÀI 2: CẤY TRUYỀN VÀ GIỮ GIỐNG NẤM TRICHODERMA I. Mục đích thí nghiệm. Cấy truyền và giữ giống Trichoderma đã phân lập từ đất. II. Chuẩn bị. Chuẩn bị môi trường. 1. (NH4)2SO4 : 1,4 g/l. FeSO4.7H2O : 5mg/l KH2PO4: 2 g/l. ZnSO4.7H2O : 1,4 mg/l. CaCl2 : 0,3 g/l. CoCl2 : 2 mg/l. MgSO4.7H2O : 0,3 g/l. Cellulose : 10 g/l. MnSO4.7H2O : 4,56 mg/l. Pepton : 1 g/l. 3
GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 Nước: 1lít. Agar : 20 g/l. Chuẩn bị mẫu 2. Mẫu nấm Trichoderma thuần được trữ đông trong glyxerol 20% (mẫu 14). 3. Chuẩn bị dụng cụ và thiết bị. 4. Đĩa petri, 3 ống nghiệm thạch nghiêng, 3 ống eppendorf . - Que cấy - Parafilm - Tủ lạnh - Giá để ống nghiệm - Đèn cồn, bật lửa. - Giấy gói, băng keo, viết. - Chuẩn bị hóa chất. 5. Dung dịch glixerol 20%. 6. Phương pháp thí nghiệm III. 1. Cấy truyền. 7. Bước 1: Khử trùng nơi làm việc và tay bằng cồn trước khi cấy truyền. 8. Bước 2: Thanh trùng đĩa petri trên ngọn lửa đèn cồn, đổ môi trường đ ược chuẩn bị trước vào đĩa. Đậy nắp và hơ đều trên ngọn lửa đèn cồn lần nữa, l ặp l ại ở 5 đĩa khác nhau. 9. Bước 3: Tiến hành cấy truyền Thanh trùng que cấy, dùng que cấy lấy mẫu Trichoderma đã phân lập cấy ở 4 - điểm khác nhau trên môi trường trong mỗi đĩa petri, lặp lại thao tác ở 5 đĩa khác nhau dưới ngọn lửa đèn cồn. Dùng giấy gói các đĩa petri đã cấy mẫu. - Đánh dấu và đem đi bảo quản. - Sau 72 giờ, quan sát khuẩn lạc nấm dưới kính hiển vi. Ghi nhận kết quả. - 10. Quan sát hình dạng dưới kính hiển vi: 11. Chọn 1 đĩa tốt nhất để dùng làm mẫu quan sát. Chuẩn bị miếng Lame và Lamell - 4
GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 Ngâm trong cồn, dùng khăn giấy lau sạch miếng Lame và Lamell. - Nhỏ giọt nước cất lên Lame dùng que cấy lấy nấm Trichoderma đã phân lập cho - vào giọt nước cất trên Lame và đậy miếng Lamell tránh tạo bọt khí (hoặc dùng băng keo trong lấy mẫu, rồi sau đó dán lên giọt nước trên Lame). Quan sát mẫu ở (vật kính 10X và 40X). - 2. Giữ giống. 12. Có 3 phương pháp trữ giống : 13. Phương pháp 1: Giữ giống bằng glyxerol 20% 14. Phương pháp 2: Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng 15. Phương pháp 3:Giữ giống bằng đĩa petri. Phương pháp trữ giống bằng glyxerol 20% • Chuẩn bị 3 ống eppendorf có chứa glyxerol 20% - Đốt đèn cồn và khử trùng que cấy. - Dùng que cấy lấy mẫu Trichoderma từ các đĩa đã được cấy truyền lần l ượt cho - vào 3 ống eppendorf có chứa sẵn dung dịch glixerol 20%, lắc đều. Dùng parafilm quấn quanh nắp eppendorf, đánh dấu mẫu, đem đi giữ mẫu trong - tủ lạnh. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng • Chuẩn bị 3 ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng. - Đốt đèn cồn và khử trùng que cấy. - Đưa que cấy vào trong đĩa petri, làm nguội que cấy, lấy một ít nấm Trichoderma - cấy vào môi trường thạch nghiêng. Hơ quanh miệng ống nghiệm, dùng bông bịt kín miệng ống nghiệm và gói lại - bằng giấy. Dùng giấy gói 3 ống nghiệm lại. - Đánh dấu tên nhóm, mẫu cấy và đem đi trữ mẫu. - Quan sát mẫu và ghi nhận kết quả. - Phương pháp giữ giống bằng đĩa petri • 5
GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 Quan sát và chọn một đĩa cấy tốt nhất. Quấn parafilm quanh miệng đĩa. 16. Dùng giấy gói lại, đánh dấu và đem đi giữ mẫu. Kết quả - thảo luận. IV. 1. Kết quả Cấy truyền • Khi quan sát dưới kính hiển vi: - + Bào tử nấm có dạng hình trứng, màu xanh lục đính trên những sợi 17. nấm. + Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối 18. của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, liên kết nhau thành chùm nhỏ chờ chất nhày. 19. 20. 21. Hình 1: Khuẩn lạc nấm Trichoderma quan sát dưới kính hiển vi Khi quan sát bằng mắt thường: - + Ở 5 đĩa cấy truyền đều xuất hiện những đốm khuẩn lạc có màu 22. xanh lục và màu trắng. + Các khuẩn lạc mới mọc đều và tập trung nhiều ở những điểm 23. được cấy truyền đầu tiên. 24. 6
GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. Giữ giống • 7
GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 Các ống eppendorf có màu xanh lục. - Cả 3 ống nghiệm đều có những đốm khuẩn lạc mới, có màu xanh lục của - nấm phát triển rải rác trên môi trường nuôi cấy thạch nghiêng. Đốm khuẩn lạc được cấy truyền vào phát triển dày lên, có màu xanh l ục, - quan sát được sợi nấm ở đĩa petri. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 2. Thảo luận • Ban đầu khuẩn lạc của nấm có màu trắng là do các bào tử của nấm còn non, sau một thời gian khuẩn lạc của nấm chuyển sang màu xanh khi đó các bào tử nấm trưởng thành. • Những đốm khuẩn lạc mới phát triển là do môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển của nấm Trichoderma và thao tác tiến hành, điều kiện thanh trùng tương đối chính xác. 8
GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 • Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng là để cho nấm Trichoderma tăng trưởng và phát triển. Với mục đích trữ những giống thuần cho những lần cấy truyền lần sau và có thể quan sát khả năng sống của nấm Trichoderma trên môi trường nuôi cấy. • Mục đích của giữ giống trên môi trường glycerol 20% là để trữ đông nguồn giống thuần trong môi trường dinh dưỡng lỏng. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. BÀI 3: THỬ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU CỦA VI KHUẨN BT I. Mục đích thí nghiệm. 9
GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 Thử khả năng diệt sâu của vi khuẩn Bt trong thí nghiệm điều kiện phòng. 79. II. Chuẩn bị. 1. Chuẩn bị mẫu. 80. Sâu ăn lá. 81. Vi khuẩn Bt. 82. Rau cải (xà lách) 2. Chuẩn bị dụng cụ. 83. 6 đĩa petri, 3 ống nghiệm có nắp đậy. 84. Micropipette, micropipette tips. 85. Giá đỡ ống nghiệm, kẹp. 86. Khay, kéo, viết. III. Phương pháp thí nghiệm 1. Pha loãng dung dịch vi khuẩn BT. • Dùng micropipette hút 1ml dung dịch vi khuẩn Bt cho vào ống nghiệm thứ 1 chứa 9ml nước cất, lắc đều. Ống nghiệm thứ 1 có nồng độ 107. • Tiếp tục hút 1ml dung dịch vi khuẩn Bt từ ống nghiệm thứ 1 ( nồng độ 107) cho vào ống nghiệm thứ 2 chứa 9ml nước cất, lắc đều. Ống thứ 2 có nồng độ 106. • Sau đó hút 1ml dung dịch vi khuẩn Bt từ ống thứ 2 (nồng độ 10 6) cho vào ống nghiệm thứ 3 chứa 9ml nước cất, lắc đều. Ống thứ 3 có nồng độ 105. 2. Cho sâu tiếp xúc với dung dịch vi khuẩn BT. • Chuẩn bị 3 đĩa petri có 3 nồng độ vi khuẩn Bt 107, 106, 105 được đổ ra từ 3 ống nghiệm có 3 nồng độ tương ứng. • Rửa sạch cải, cắt lá cải thành từng miếng nhỏ vừa phải. • Nhúng đều 2 mặt lá cải qua dung dịch Bt ở nồng độ 107 khoảng 4 - 5 lá cho vào đĩa petri. Tiếp theo cho 4 con sâu vào đĩa có chứa lá cải thấm Bt, đậy nắp và đánh dấu. Thao tác tương tự với nồng độ Bt 106, 105. • Sau 15 phút, quan sát số lượng sâu sống ở 3 đĩa vừa thực hiện, ghi nhận kết quả. 10
GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 • Quan sát, ghi nhận kết quả số lượng sâu sống ở 3 đĩa trong 3 ngày liên tiếp. IV. Kết quả - thảo luận. 1. Kết quả 87. Bảng 1: Đếm số sâu còn sống sau 3 ngày quan sát: 88. Nồngđộ BT 90. 107 91. 106 92. 105 89. Ngày 93. 0 94. 4 con 95. 4 con 96. 4 con 4 100. 97. 1 98. 3 con 99. 4 con con 1 3 102. 104. 2 2 con 101. 103. con con 0 0 106. 108. 3 0 con 105. 107. con con 109. Sau 3 ngày tất cả các con sâu trong mỗi đĩa đều chết. - 110. Nồng độ Bt càng cao thì sâu chết càng nhanh, ngược lại ở những - 111. đĩa có nồng độ Bt càng thấp thì thời gian sâu chết diễn ra chậm. 112. 113. 114. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121. 122. 123. 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131. 132. 11
GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 133. 134. 135. 136. 137. 138. 139. 140. 2. Thảo luận: Nguyên nhân sâu chết do nhiều nguyên nhân: 141. • Sâu hại ăn phải các tinh thể độc ( tiền độc tố), dưới tác dụng của một loại men tiêu hóa trong dịch ruột của sâu, tiền độc tố bị hòa tan thành những phân tử nhỏ có hoạt tính độc. Các độc tố này bám vào màng vi mao trong ruột, tạo các lỗ dò để cho nước chảy vào, làm sâu mọng nước, ngừng ăn và chết. • Trường hợp ở nồng độ thấp như 105 có sâu chết nhưng ở 106 thì không, kết quả đó có thể là do diện tích tiếp xúc của sâu với vi khuẩn Bt không cao và những con sâu đó chưa ăn rau. • Dung dịch vi khuẩn Bt phát tán chậm nên làm cho thời gian sâu chết diễn ra chậm hơn. • Tinh thể độc Bt tạo ra không thể hoà tan trong dịch dạ dày của người nên thuốc trừ sâu sinh học Bt hoàn toàn vô hại đối với người, cũng như các sinh vật khác. Kiến nghị: 142. • Vi khuẩn Bt không độc đối với người, môi trường và động vật khác. Vì vậy, chúng ta nên đưa vào áp dụng rộng rãi để làm sản phẩm đ ảm bảo chất lượng và an toàn cho người sử dụng. • Nên sử dụng dung dịch vi khuẩn Bt ở nồng độ 10 5 để vừa có thể diệt được sâu hại, tránh tình trạng gây thối rửa rau cải và ô nhiễm môi trường. 12
GVHD: Th.s BẰNG HỒNG LAM Nhóm III6 • Tiếp tục nghiên cứu những chủng vi khuẩn có khả năng tiêu diệt các loài sâu hại cây trồng mà không gây ô nhiễm môi trường cũng như sức khỏe con người. 13