Nấm Colletotrichum acutatum gây bệnh thán thư trên cây Sâm Ngọc Linh tại tỉnh Kon Tum

Chia sẻ: Vũ Huyền Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

17
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu "Nấm Colletotrichum acutatum gây bệnh thán thư trên cây Sâm Ngọc Linh tại tỉnh Kon Tum" nhằm xác định khả năng gây bệnh của nấm Colletotrichum acutatum được phân lập từ cây sâm Việt Nam bị nhiễm bệnh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) mọc ở huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum. Các đặc điểm hình thái của các phân lập cho thấy chúng thuộc về Colletotrichum acutatum. Các dòng phân lập thu được được sử dụng để cấy thí nghiệm và kết quả cho thấy cây nhân sâm Việt Nam được cấy có các triệu chứng tương tự như bệnh trên đồng ruộng. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nấm Colletotrichum acutatum gây bệnh thán thư trên cây Sâm Ngọc Linh tại tỉnh Kon Tum

Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 NẤM Colletotrichum acutatum GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY SÂM NGỌC LINH TẠI TỈNH KON TUM Identification of Colletotrichum acutatum Causing Anthracnose Disease on Vietnamese Ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in Kon Tum Province Mai Văn Quân, Ngô Quang Huy, Lê Quang Mẫn, Nguyễn Văn Liêm, Trịnh Xuân Hoạt Viện Bảo vệ thực vật Ngày nhận bài: 29.11.2019 Ngày chấp nhận: 12.12.2019 Abstract The objective of this study was to identify the pathogenicity of Colletotrichum acutatum isolated from the infected-Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) growing in Tu Mo Rong district, Kon Tum province. The morphological characteristics of the isolates indicated that they belong to Colletotrichum acutatum. The obtained isolates were used for inoculation experiment and the results showed that the inoculated Vietnamese ginseng seedlings show symptoms similar with that of the disease in the field condition. Pathogen was re-isolated from the inoculated seedlings and are identical with C. acutatum fungus. PCR with universal primer pair ITS4/ITS5 amplified DNA fragments of approximate 700 bp from all isolates. The DNA sequencing and phylogenetic analysis based on ITS region confirmed that C. acutatum is the causal agent of anthracnose disease on Vietnamese ginseng. Study on the biological characteristics of C. acutatum using medium plate culture method, effects of various culture conditions on mycelium growth, sporulation of the fungus was carried out. The growth of mycelium of C. acutatum cultured on PDA medium was the fastest with the production of conidia and fungal spores. The optimum temperature for mycelial growth and sporulation of C. acutatum was 20 - 28oC on PDA medium. The optium pH conditions for mycelium growth was pH6.0 and 20 - 25oC. Keywords: Colletotrichum acutatum, Vietnamese gingseng, Panax vietnamensis Ha et Grush 1. ĐẶT VẤN ĐỀ acutatum gây ra đã được Viện Bảo vệ thực vật thực hiện. Bài báo này là một số kết quả nghiên Nấm Colletotrichum acutatum là một trong cứu về nấm C. acutatum gây bệnh thán thư trên những loại nấm phát triển và gây hại quan trọng cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et trên nhiều loại cây trồng vùng ôn đới và nhiệt đới Grushv.) tại Kon Tum. trên thế giới. Bệnh gây hại trên dâu tây (Fragaria ananassa), cà chua (Lycopersicon esculentum) cây 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU táo (Malus pumila), cây cà phê (Coffea arabica), ổi (Psidium guajava), ô liu (Olea europea). Nấm gây 2.1 Vật liệu nghiên cứu hại trên thân, rễ lá hoặc trên quả làm cho cây bị Mẫu cây Sâm Ngọc Linh có triệu chứng bị vàng, héo, vết bệnh có màu nâu sẫm. Tại Việt bệnh thán thư được thu thập tại vùng trồng cây Nam, chưa có tài liệu công bố nấm Colletotrichum Sâm Ngọc Linh tại Tu Mơ Rông – Kon Tum từ acutatum gây hại trên cây trồng. năm 2018 đến 2019. Từ năm 2016-2018, bệnh thán thư đã phát Môi trường phân lập và nghiên cứu nấm bao sinh gây hại mạnh trên cây Sâm Ngoc Linh trên gồm: môi trường thạch agar (Water Agar-WA), các vùng trồng tại Tu Mơ Rông- Kon Tum. Bệnh thường xuất hiện vào đầu mùa mưa từ tháng 6- môi trường Yeast Manitol Agar (YMA), môi 8 hàng năm, một số vườn trồng Sâm Ngọc Linh trường PDA (Potato Dextrose Agar), môi trường có tỷ lệ bệnh gây hại lên tới trên 70%. Các cà rốt Agar (CRA) và môi trường Czapek. nghiên cứu về tác nhân gây bệnh, đặc điểm sinh Các loại hóa chất trong nghiên cứu sinh học học, quy luật phát sinh phát triển và một số biện phân tử phục vụ tách chiết DNA, thực hiện phản pháp phòng trừ bệnh thán thư do nấm C. ứng PCR và tinh sạch sản phẩm PCR. 14
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu BLAST so sánh bằng công cụ trực tuyến trên Ngân hàng Gen (NCBI). Cây phả hệ được xây Thí nghiệm được thực hiện tại vùng Sâm dựng theo phương pháp Neighbor-Joining với Ngọc Linh tại Tu Mơ Rông- Kon Tum và phòng khoảng cách di truyền giữa các trình tự tự được thí nghiệm của bộ môn Chẩn đoán và Giám định xác định dựa trên mô hình thay thế Kimura hai dịch hại và thiên địch, Viện Bảo vệ thực vật trong tham số, độ tin cậy của các nhánh được xác định năm 2018-2019. bằng giá trị bootstrap, biểu diễn bằng giá trị %, 2.3 Phương pháp nghiên cứu với 1000 lần lặp lại trong phần mềm MEGA 6.0 (Tamura và cs., 2013). Điều tra, thu thập và phân lập tác nhân gây Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm bệnh thán thư trên cây Sâm Ngọc Linh được Colletotrichum acutatum (i) trên các môi trường thực hiện theo phương pháp điều tra phát hiện dinh dưỡng nhân tạo gồm PDA, CRA, YMA và bệnh cây của Viện Bảo vệ thực vật, (1997). o Czapek ở nhiệt độ 25 C; (ii) ở các mức nhiệt độ Các nguồn nấm gây bệnh thán thư sử dụng o 10, 15, 20, 25 và 30 C trên môi trường PDA; (iii) trong nghiên cứu được phân lập và làm thuần ở các mức pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 ở 2 ngưỡng nhiệt bằng đơn bào tử (Ho và Ko, 1997): Sử dụng kim o độ 20 và 25 C. Nguồn nấm Colletotrichum khêu nấm gạt nhẹ bề mặt tản nấm có chứa bào acutatum trong nghiên cứu được làm thuần bằng tử nấm, hòa loãng bào tử nấm trong 1 ml nước đơn bào tử. Trong mỗi thí nghiệm, theo dõi kích cất khử trùng 2 lần. Dùng pipet hút 50µl dung thước tản nấm, đặc điểm hình thái và khả năng dịch bào tử nấm và trang đều trên đĩa petri có hình thành bào tử. Số liệu thí nghiệm được xử ký chứa môi trường WA. Để khô bề mặt môi trường, bằng phần mềm thống kê Statistix 9.0 và phần quan sát bào tử nấm trên kính hiển vi ở độ phóng mềm Excel. đại trên 40 lần để tách đơn bào tử nấm. Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN dung dịch CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium 3.1 Triệu chứng bệnh thán thư trên cây Bromide) của Doyle và Doyle (1990). Phản ứng Sâm Ngọc Linh PCR sử dụng cặp mồi ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)/ITS5 (5’- Triệu chứng quan sát ban đầu lá bị vàng, sau GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) để xác đó rụng dần theo các tầng rời. Trên cuống lá và định nấm Collectotricchum acutatum theo nghiên thân vết bệnh kéo dài màu nâu, khô héo, xuất cứu của White và cs, (1990). hiện ổ bào tử nấm trên bộ phận bị bệnh (hình 1A). Sản phẩm PCR, sau khi kiểm tra trong Gặp điều kiện mưa ẩm kéo dài thân bị thối nhũn. agarose gel, được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick Mâm bào tử mọc nổi trên bề mặt vết bệnh có màu PCR Purification (Qiagen, Đức) và được giải nâu. Cuống bào tử ngắn, không màu. Bào tử đơn trình tự trực tiếp hai chiều theo phương pháp bào, thuôn dài, không màu, kích thước bào tử Sanger tại Hàn Quốc. Các trình tự kết quả được 9,25-11,34×3,16-5,32 µm (hình 1C). Hình 1. Triệu chứng bệnh thán thư Sâm Ngọc Linh tại Tu Mơ Rông- Kon Tum (A): Triệu chứng bệnh gây hại trên lá và cuống hoa; (B): Triệu chứng lây nhiễm nhân tạo nấm C. acutatum; (C): Đĩa cành và bào tử nấm C.acutatum ở vật kính 40. 15
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 Phân lập, làm thuần nấm và lây nhiễm nhân triệu chứng trên cây bị bệnh ngoài điều kiện sản tạo trên cây giống Sâm Ngọc Linh trồng từ hạt 9 xuất. Lấy mẫu bệnh lây nhiễm phân lập lại trên tháng tuổi. Sau khi lây nhiễm 8,56 ngày, triệu môi trường PDA, hình thái nấm phân lập được chứng bệnh thán thư bắt đầu xuất hiện. Triệu hoàn toán tương đồng với đặc điểm hình thái chứng trên cây được lây nhiễm tương tự như nấm phân lập từ cây bị bệnh (hình 1, bảng 1). Bảng 1. Kết quả lây nhiễm nhân tạo nấm C. acutatum trên cây Sâm Ngọc Linh (Tu Mơ Rông, 2019) Số cây lây nhiễm Số cây biểu hiện Tỷ lệ cây Thời gian ủ Số lần lây nhiễm (cây) bệnh (cây) nhiễm bệnh (%) bệnh (ngày) Lần 1 30 16 53,33 8,67 Đối chứng lần 1 30 0 0 0 Lần 2 30 19 63,33 8,56 Đối chứng lần 2 30 0 0 0 3.2. Giám định nấm gây bệnh thán thư Sâm Ngọc Linh bằng kỹ thuật sinh học phân tử Colletotrichum fuscum (KF498868) Colletotrichum fuscum Colletotrichum higginsianum (MH820156) 99 Colletotrichum higginsianum (MH820154) Colletotrichum destructivum (MG978339) Colletotrichum destructivum (EU070911) Colletotrichum coccodes (AB105970) 94 Colletotrichum coccodes (AY376528) Colletotrichum sublineolum (AJ301978) Glomerella graminicola (AY376539) Colletotrichum trifolii (AJ301941) Colletotrichum trifolii (KJ576854)  TT.SNL03 Glomerella acutata (AF411700) 99 Colletotrichum acutatum (AJ749683) Colletotrichum acutatum (AJ749694) Plectosphaerella cucumerina (AF176952) 0.020 Hình 2. Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining (Viện Bảo vệ thực vật, 2019) So sánh 17 trình tự đoạn gen của 08 loài nấm khác nhau từ Ngân hàng Gen, mã số Ngân hàng Gen được đặt trong dấu ngoặc đơn. Mẫu nấm gây bệnh thán thư trên cây Sâm Ngọc Linh có ký hiệu TT.SNL03. Gốc nhánh là giá trị thống kê bootstrap với 1.000 lần lặp (chỉ ghi những giá trị lớn hơn 80%). Plectosphaerella cucumerina là loài khác với Colletotrichum. 16
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 DNA được tách chiết từ nấm C. acutatum và cây Sâm Ngọc Linh tại Tu Mơ Rông-Kon Tum là làm mạch khuôn trong phản ứng PCR sử dụng Colletotrichum acutatum. cặp mồi chung ITS4/ITS5 để khuếch đại vùng 3.3 Khả năng phát triển của nấm trên các ITS. Sản phẩm PCR tất cả các mẫu nấm có kích môi trường dinh dưỡng thước xấp xỉ 700 bp. Giải trình tự hai chiều toàn bộ 5 mẫu thu được kết quả đồng nhất. Trình tự Nấm C. acutatum sinh trưởng và phát triển gen mẫu nấm đại diện ký hiệu TT.SNL03 được khác nhau trên các loại môi trường dinh dưỡng chọn làm đại diện để so sánh mức độ tương khác nhau. Nấm phát triển tốt trên môi trường đồng trên Ngân hàng gen NCBI. PDA, CRA và Czapek. Sau 3 ngày, kích thước Trình tự 17 đoạn gen của 8 loài nấm thuộc tản nấm đạt cao nhất trên môi trường Czapek với Colletotrihum (C. fuscum, C. higginsianum, C. đường kính tản nấm là 4,3±0,06 cm. Sau 5 ngày destructivum, C. coccodes, C. sublineolum, C. nuôi cấy, kích thước tản nấm đạt giá trị cao nhất graminicola, C. trifolii, C. acutatum) được chọn lựa trên môi trường CRA (6,46±0,02 cm), và trên môi từ Ngân hàng Gen và trình tự gen chủng nấm trường Czapek (6,38±0,02 cm). Sau 7 ngày nuôi TT.SNL03 được sử dụng để xây dựng cây phát cấy, kích thước tản nấm đạt phát triển tương sinh loài. Glomerella acutata là giai đoạn giai đoạn đương nhau trên cả 3 loại môi trường PDA, sinh sản hữu tính của nấm Colletotrichum Czapek và CRA với đường kính tản nấm dao acutatum. Chủng nấm Plectosphaerella động từ 8,06±0,02 đến 8,12±0,02 cm (bảng 2). cucumerina được chọn làm nhóm ngoài (outgroup) Trên môi trường YMA nấm phát triển kém (Hình 2). Phân tích cây phát sinh loài cho thấy nhất, sau 7 ngày kích thước tản nấm chỉ đạt nguồn nấm TT.SNL03 phân lập từ mẫu bệnh thán 7,82±0,02 cm. Tuy nhiên bào tử nấm hình thành thư gây hại trên cây Sâm Ngọc Linh tại Kon Tum trên môi trường PDA và YMA. Trên môi trường có gen mã hóa vùng ITS với độ tương đồng cao CRA và Czapek bào tử nấm chưa hình thành sau với nấm C. acutatum với giá trị bootstrap là 99%. 7 ngày nuôi cấy (Bảng 1). Kết quả khẳng định nấm gây bệnh thán thư trên Bảng 2. Phát triển của nấm C. acutatum trên các loại môi trường khác nhau (Viện Bảo vệ thực vật, 2019) Môi Kích thước tản nấm trung bình (cm) KNHT bào tử sau trường Sau 3 ngày Sau 5 ngày Sau 7 ngày 7 ngày bc b a PDA 3,82 ±0,02 6,14 ±0,04 8,12 ±0,02 + c c b YMA 3,72 ±0,02 6,04 ±0,02 7,82 ±0,04 + b a a CRA 3,92 ±0,04 6,46 ±0,02 8,06 ±0,02 - a a a Czapek 4,3 ±0,06 6,38 ±002 8,12 ±0,02 - P
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 Bảng 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phát triển của nấm C. acutatum (Viện Bảo vệ thực vật, 2018) Mức Sau 3 ngày Sau 5 ngày Sau 7 ngày nhiệt độ Đường kính KNHT Đường kính KNHT Đường kính tản KNHT o ( C) tản nấm (cm) bào tử tản nấm (cm) bào tử nấm (cm) bào tử 10 0 - 0 - 0 - e e d 15 0,52 ±0,02 - 1,12 ±0,02 + 1,72 ±0,02 + d 20 2,68 ±0,02 + 4,32d±0,02 + 6,08c±0,02 + a a a 25 3,74 ±0,02 + 6,02 ±0,02 + 8,18 ±0,02 + b b b 28 3,64 ±0,02 + 5,84 ±0,02 + 7,94 ±0,02 + 30 3,18c±0,02 - 5,26c±0,02 - 7,88b±0,04 - P
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2020 chỉ đạt 1,33±0,03; 2,53±0,07 và 3,63±0,07 cm. đã hình thành ở mức pH6,0. Trong khi đó ở các Thời gian hình thành bào tử nấm cũng khác nhau mức pH khác, nấm hình thành bào tử sau 5 ngày ở các mức pH. Sau 3 ngày nuôi cấy, bào tử nấm nuôi cấy (bảng 4). Bảng 4. Ảnh hưởng của pH môi trường khác nhau đến phát triển của nấm C. Acutatum ở điều kiện nhiệt độ 25oC (Viện Bảo vệ thực vật, 2018) KTTB (cm) và KNHT bào tử Mức pH KNHT KNHT Sau 3 ngày Sau 5 ngày Sau 7 ngày KNHT bào tử bào tử bào tử 4,0 1,33d±0,03 - 2,53d±0,07 + 3,63c±0,07 + 5,0 2,17b±0,07 - 4,30b±0,1 + 6,20a±0,06 + a a a 6,0 2,47 ±0,03 + 4,63 ±0,03 + 6,43 ±0,09 + 7,0 1,87c±0,07 - c 4,00 ±0,00 + 5,63b±0,12 + CV(%) 4,42 2,83 2,84 LSD(%) 0,17 0,22 0,31 Ghi chú: KTTB: kích thước trung bình; KNHT: Khả năng hình thành; +: hình thành bào tử, -: chưa hình thành bào tử 4. KẾT LUẬN Eicker, A. 1983 Morphology and taxonomy of South African isolates of Colletotrichum. South African Nấm gây bệnh thán thư trên cây Sâm Ngọc Journal of Botany 2, 259-289. Linh tại Tu Mơ Rông- Kon Tum do nấm 2. Bonde, M.R.; Peterson, G.C.; Maas, G.L. 1991 Collettrichum acutatum gây ra, bệnh chủ yếu xuất hiện ở các bộ phận cuống lá, thân của cây. Isozyme comparisons for identification of Nấm phát triển tốt nhất trên môi trường PDA. Colletotrichum spp. pathogenic to strawberry. Nấm hình thành bào tử trên môi trường PDA và Phytopathology 81, 1523-1528. YMA. Chưa ghi nhận nấm hình thành bào tử trên 3. Doyle, J. J., & Doyle, J. L. 1990. Isolation ofplant môi trường CRA và Czapek sau 7 ngày nuôi cấy. DNA from fresh tissue. Focus, 12(13), 39-40. Trên môi trường PDA, nấm phát triển tốt nhất ở 4. Ho, W. C., & Ko, W. H. 1997. A simple method ngưỡng nhiệt độ 25-28 oC. Sau 7 ngày nuôi cấy, for obtaining single-spore isolates of fungi. Botanical bảo tử nấm hình thành ở ngưỡng nhiệt độ 15-28 Bulletin of Academia Sinica, 38. o o C. Ở hai ngưỡng nhiệt độ 10 và 30 C sau 7 5. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, ngày chưa ghi nhận nấm hình thành bào tử. Trên A., Kumar, S., 2013. MEGA6: Molecular Evolutionary môi trường PDA, ở hai ngưỡng nhiệt độ 20 và 25 o Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and C, nấm phát triển tốt ở mức pH5,0-6,0. Nấm Evolution 30: 2725-2729. hình thành bào tử sớm nhất ở mức pH6,0 là 3 ngày sau nuôi cấy. 6. Viện Bảo vệ thực vật, 1997. Phương pháp Lời cảm ơn nghiên cứu bảo vệ thực vật tập 1. NXB Nông nghiệp Công trình này là một phần kết quả của nhiệm Hà Nội, tr 46-57, vụ quỹ gen cấp Bộ “Bảo tồn, lưu giữ nguồn gen 7. White, T. J., Bruns, T., Lee, S. J. W. T., & Taylor, vi sinh vật bảo vệ thực vật” do ThS. Mai Văn J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal Quân (Viện Bảo vệ thực vật) chủ trì. ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications, 18(1), TÀI LIỆU THAM KHẢO 315-322. 1. Baxter, A.P.; Westhuizen, G.C.A. van der; Phản biện: TS.NCVCC. Ngô Vĩnh Viễn 19