Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu chế tạo nano silica từ tro vỏ trấu và vật liệu lai nano silicachitosan ứng dụng làm chất kháng nấm bệnh thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-------------------------------------

LÊ NGHIÊM ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO NANO SILICA TỪ TRO VỎ TRẤU

VÀ VẬT LIỆU LAI NANO SILICA/CHITOSAN ỨNG DỤNG

LÀM CHẤT KHÁNG NẤM BỆNH THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TP.HCM – 2021

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

……..….***…………

LÊ NGHIÊM ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO NANO SILICA TỪ TRO VỎ TRẤU

VÀ VẬT LIỆU LAI NANO SILICA/CHITOSAN ỨNG DỤNG

LÀM CHẤT KHÁNG NẤM BỆNH THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa vô cơ

Mã số : 9.44.01.13

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. Bùi Duy Du 2. GS.TS. Nguyễn Quốc Hiến

TP.HCM – 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận án này do tôi thực hiện dưới sự

hướng dẫn của cán bộ hướng dẫn khoa học. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận

án là trung thực và chưa được công bố trong luận án khác.

Tác giả luận án

NCS. Lê Nghiêm Anh Tuấn

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng - Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài NAFOSTED

106-NN.03-2015.84. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp

đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.

Trước hết, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Bùi Duy Du,

PGS.TS. Nguyễn Quốc Hiến đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu

và hoàn thiện luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Lại Thị Kim Dung cùng tập thể Viện Khoa học

Vật liệu Ứng dụng; cảm ơn Phòng Nghiên cứu và Phát triển – Trung tâm Nghiên cứu

và Triển khai Công nghệ Bức xạ TP.HCM (VINAGAMMA) đã tạo điều kiện tốt nhất

cho tôi tổng hợp vật liệu và thử hoạt tính kiểm soát bệnh cây trồng trong thời gian

thực hiện luận án.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công

nghệ, Viện Công nghệ Hóa học và Khoa Hóa học đã giúp đỡ tôi tận tình và tạo điều

kiện thuận lợi cho tôi để hoàn thành luận án.

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè và những người thân đã

luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên

cứu./.

Tác giả luận án

NCS. Lê Nghiêm Anh Tuấn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii

MỤC LỤC ................................................................................................................. iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... viii

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1

2. Nội dung chính của luận án ................................................................................. 2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ............................................................................. 2

Chương 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 4

1.1. Cấu tạo, tính chất của nano silica, oligochitosan và vật liệu lai của chúng. ..... 4

1.1.1. Nano silica. ................................................................................................. 4

1.1.2. Oligochitosan ............................................................................................. 6

1.1.3. Vật liệu lai nano silica/oligochitosan ......................................................... 6

1.2. Nghiên cứu tổng hợp nano silica, oligochitosan và nano silica/oligochitosan. 7

1.2.1. Tổng hợp nano silica. ................................................................................. 7

1.2.2. Nghiên cứu điều chỉnh khối lượng phân tử chitosan thành oligochitosan

............................................................................................................................ 12

1.2.3. Nghiên cứu tổng hợp vật liệu lai nano silica/oligochitosan .................... 15

1.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật của nano silica, oligochitosan và vật liệu lai nano

silica/oligochitosan. ............................................................................................... 17

1.3.1. Một số nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật của nano silica. ......... 17

1.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật của oligochitosan. ........................................ 18

1.3.3. Hoạt tính kiểm soát bệnh thực vật của vật liệu lai nano silica/chitosan. 21

1.4. Triển vọng của việc sử dụng vật liệu nano silica/oligochitosan làm chất kiểm

soát bệnh thực vật. ................................................................................................. 22

1.5. Kết luận phần tổng quan tài liệu. .................................................................... 26

Chương 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................... 28

2.1. Nguyên liệu và hóa chất ................................................................................. 28

iii

2.2. Thực nghiệm ................................................................................................... 28

2.2.1. Điều chế nano silica từ tro vỏ trấu........................................................... 28

2.2.2. Điều chế oligochitosan khối lượng phân tử từ 3.000 – 7.000 g.mol-1...... 30

2.2.3. Điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan. ....................................... 31

2.2.4. Xác định độc tính của vật liệu lai nano silica/oligohitosan. .................... 33

2.2.5. Nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long

của vật liệu nano silica, oligochitosan và nano silica/oligochitosan. ............... 34

2.2.6. Nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh đạo ôn lá và bạc lá lúa của vật

liệu lai nano silica/oligochitosan. ...................................................................... 38

2.2.7. Nghiên cứu hiệu lực kiểm soát bệnh nấm hồng trên cây cao su của vật liệu

lai nano silica/oligochitosan. ............................................................................. 41

2.3. Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu. .............................. 42

2.3.1. Phương pháp đo giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD). ...................................... 42

2.3.2. Phương pháp đo phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX) ............................ 42

2.3.3. Phương pháp đo phổ hồng ngoại (FT-IR) ................................................ 43

2.3.4. Phương pháp chụp ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) .............. 43

2.3.5. Phương pháp đo phổ sắc ký lọc gel (GPC) .............................................. 43

2.3.6. Phương pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-vis) ......................... 44

2.3.7. Phương pháp đo thế điện kép zeta ........................................................... 45

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 46

3.1. Thành phần hóa học của phế thải tro vỏ trấu trước và sau xử lý HCl. ........... 46

3.2. Kết quả điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân. ......................... 47

3.2.1. Điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu. ............ 47

3.2.2. Điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân gel SiO2/CS. .......... 50

3.2.3. Thành phần và tính chất hóa lý của nano silica. ..................................... 53

3.3. Kết quả điều chế oligochitosan bằng cách xử lý chitosan bởi H2O2 kết hợp với

chiếu xạ tia  Co-60. .............................................................................................. 60

3.3.1. Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sự suy giảm khối lượng phân tử của

chitosan............................................................................................................... 60

3.3.2. Nghiên cứu đặc trưng liên kết và cấu trúc mạng tinh thể của oligochitosan.

............................................................................................................................ 63

3.4. Kết quả điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan. ................................. 65

3.4.1. Điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan bằng phương pháp phối

trộn. .................................................................................................................... 65

3.4.2. Điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan bằng phương pháp kết tủa

nano silica trong dung dịch oligochitosan. ........................................................ 68

3.4.3. Tính chất hóa lý đặc trưng của vật liệu lai nano SiO2/OC3000. ............. 70

3.5. Nghiên cứu độ ổn định của vật liệu lai nano silica/oligochitosan .................. 74

3.6. Xác định độc tính của vật liệu lai nano SiO2/OC3000. .................................. 76

3.6.1. Độc tính qua đường miệng ....................................................................... 76

3.6.2. Độc tính qua đường tiếp xúc da ............................................................... 77

3.7. Thử nghiệm in vivo khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu cây thanh long của nano

SiO2/OC. ................................................................................................................ 78

3.7.1. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử oligochitosan đến hoạt độ của enzyme

chitinase và hiệu quả kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long. ............................... 78

3.7.2. Hiệu ứng kích kháng của vật liệu nano SiO2/OC3000 đến hoạt độ enzyme

chitinase và khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long. .............................. 82

3.8. Hiệu lực kiểm soát in vivo bệnh đạo ôn và bạc lá trên lúa của nano SiO2/OC.

............................................................................................................................... 88

3.8.1. Hiệu lực kiểm soát bệnh đạo ôn lá trên lúa của nano SiO2/OC............... 88

3.8.2. Hiệu lực kiểm soát bệnh bạc lá trên lúa của nano SiO2/OC. ................... 91

3.9. Hiệu lực kháng bệnh nấm hồng Corticium salmonicolor trên cây cao su. ..... 93

3.9.1. Hiệu lực in vitro kháng nấm hồng Corticium salmonicolor của nano

SiO2/OC. ............................................................................................................. 93

3.9.2. Hiệu lực kiểm soát bệnh nấm hồng trên cây cao su của nano SiO2/OC .. 95

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 98

KẾT LUẬN............................................................................................................ 98

KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 99

MỘT SỐ ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ....................................................... 100

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ........................... 101

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 102

PHỤ LỤC ................................................................................................................ 118

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chitosan CS

cộng sự cs

Chỉ số bệnh CSB

Cetyltrimethylammonium bromide CTAB

Axit 3,5-dinitrosalicylic DNS

Tán xạ năng lượng tia X EDX

FT-IR Phổ hồng ngoại

Sắc ký lọc gel GPC

Nồng độ ức chế tối thiểu 50% nấm bệnh IC50

Khối lượng phân tử KLPT

Độc tính cấp - Liều gây chết 50% qua đường miệng LD50

Nano silica nano SiO2

nano SiO2/OC3000 Nano silica/oligochitosan khối lượng phân tử 3.000 g.mol-1

OC3000

OC5000

Oligochitosan Oligochitosan có khối lượng phân tử 3.000 g.mol-1 Oligochitosan có khối lượng phân tử 5.000 g.mol-1 Oligochitosan có khối lượng phân tử 7.000 g.mol-1 OC7000

Optical density OD

Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM

Tetraethoxysilane TEOS

Tỉ lệ bệnh TLB

Tetramethoxysilane TMOS

Nhiễu xạ tia X XRD

Tia gamma Coban đồng vị 60  Co-60

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Khối lượng phân tử và thời gian lưu của các mẫu chuẩn Pullulan ........... 44

Bảng 3.1. Thành phần hóa học của phế thải công nghiệp tro vỏ trấu. ...................... 46

Bảng 3.2. Thành phần tro vỏ trấu sau khi xử lý với axit HCl 2N, thời gian 2 giờ. .. 46

Bảng 3.3. Hàm lượng SiO2 trong nano silica điều chế bằng nhiệt phân tro vỏ trấu. 54

Bảng 3.4. Dữ liệu phổ FT-IR của nano silica được điều chế bằng nhiệt phân tro vỏ

trấu và nhiệt phân gel SiO2/CS.................................................................................. 58

Bảng 3.5. Khối lượng phân tử của các mẫu chitosan theo liều chiếu xạ và chu kỳ chiếu

xạ. .............................................................................................................................. 61

Bảng 3.6. Dữ liệu phổ FT-IR của vật liệu lai nano SiO2/OC. ................................... 73

Bảng 3.7. Thế điện kép (ζ) của dung dịch keo nano SiO2/OC3000. ......................... 76

Bảng 3.8. Kết quả thử độc tính cấp qua đường miệng trên chuột của vật liệu nano

SiO2/OC3000. ............................................................................................................ 77

Bảng 3.9. Tỷ lệ nhạy cảm của chuột tiếp xúc với vật liệu lai nano SiO2/OC3000. .. 77

Bảng 3.10. Tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu thanh long xử lý với OC3000, OC5000

và OC7000 trong phương pháp lây nhiễm nấm bệnh. .............................................. 82

Bảng 3.11. Tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu thanh long xử lý vật liệu OC3000, nano

SiO2, và nano SiO2/OC3000 bằng phương pháp lây nhiễm nấm bệnh. .................... 86

Bảng 3.12. Hiệu quả kiểm soát bệnh đạo ôn lá lúa sau khi xử lý bằng vật liệu lai nano

SiO2/OC3000 ............................................................................................................. 89

Bảng 3.13. Hiệu quả kiểm soát bệnh bạc lá lúa sau khi xử lý với vật liệu lai nano

SiO2/OC3000 ............................................................................................................. 92

Bảng 3.14. Hiệu lực kiểm soát bệnh nấm hồng trên cây cao su khi xử lý vật liệu lai

nano SiO2/OC3000, nano SiO2 và OC3000. ............................................................. 95

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của silica [1]. ................................................................... 4

Hình 1.2. Sự hấp thụ silicic trong cây lúa (a) và silica trong vỏ trấu (b). ................... 5

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của chitosan. .................................................................. 6

Hình 1.4. Mô phỏng hình thành liên kết giữa silica và chitosan [26]. ........................ 7

Hình 1.5. Ảnh TEM của nano silica tổng hợp từ vỏ trấu: a) [29]; b) [30]; c) [31]; d)

[45]. ........................................................................................................................... 10

Hình 1.6. Sơ đồ cơ chế bắt hydro của gốc tự do hydroxyl cắt mạch chitosan [60]. . 14

Hình 1.7. Mô phỏng liên kết phối trí giữa SiO2 và chitosan [45, 65]. ...................... 16

Hình 1.8. Cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan và oligochitosan [69]. .................. 19

Hình 1.9. Cơ chế kích kháng sinh học trên cây trồng khi có tác động của oligoglucan,

oligochitosan [104]. ................................................................................................... 20

Hình 1.10. Vết bệnh đốm nâu trên dây, quả thanh long. .......................................... 24

Hình 1.11. Vết bệnh đạo ôn lá lúa (a); Bệnh bạc lá trên lúa (b). .............................. 25

Hình 1.12. Vết bệnh nấm hồng trên cây cao su (a); Vết bệnh nấm hồng gây hại nặng

(b). ............................................................................................................................. 25

Hình 2.1. Quy trình điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu.

................................................................................................................................... 29

Hình 2.2. Quy trình điều chế nano silica bằng cách nhiệt phân gel SiO2/CS. .......... 29

Hình 2.3. Quy trình điều chế oligochitosan có khối lượng phân tử khác nhau. ....... 31

Hình 2.4. Quy trình điều chế vật liệu nano SiO2/OC bằng phương pháp phối trộn. 32

Hình 2.5. Quy trình điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan bằng phương pháp

kết tủa nano SiO2 trong dung dịch oligochitosan. ..................................................... 33

Hình 2.6. Phản ứng thủy phân chitin bằng enzyme chitinnase. ................................ 36

Hình 2.7. Phản ứng của đường khử với thuốc thử DNS. .......................................... 36

Hình 2.8. Đường chuẩn tương quan giữa khối lượng phân tử và thời gian lưu của

Pullulans chuẩn. ........................................................................................................ 44

Hình 3.1. Phổ EDX của tro vỏ trấu ban đầu (a) và tro vỏ trấu sau xử lý axit (b). .... 47

Hình 3.2. Tro vỏ trấu đã xử lý axit HCl (a) và nano silica (nhiệt phân tro vỏ trấu). 47

Hình 3.3. Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt của nano silica khi nhiệt phân tại: (A,

a) 700 oC; (B, b) 750 oC và (C; c) 800 oC. ................................................................ 48

viii

Hình 3.4. Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt của nano silica phụ thuộc vào tỉ lệ:

(A; a) SiO2/CS ~ 1/1; (B; b) SiO2/CS ~ 2/1; (C; c) SiO2/CS ~ 4/1 và (D; d) SiO2/CS

~ 6/1. .......................................................................................................................... 51

Hình 3.5. Sự phụ thuộc của kích thước hạt nano silica vào tỉ lệ khối lượng SiO2/CS.

................................................................................................................................... 52

oC; c) 800 oC và d) nhiệt phân gel SiO2/CS. ............................................................. 54

Hình 3.6. Phổ và dữ liệu EDX của nano silica khi nhiệt phân tại: a) 700 oC; b) 750

Hình 3.7. Giản đồ XRD của mẫu nano silica khi nhiệt phân tại: a) 700 oC; b) 750 oC

và c) 800 oC. .............................................................................................................. 55

Hình 3.8. SiC - màu xám đen (a); nano silica - màu trắng (b). ................................. 56

Hình 3.9. Giản đồ XRD của nano silica phụ thuộc vào tỉ lệ: a) SiO2/CS ~ 1/1; b)

SiO2/CS ~ 2/1; c) SiO2/CS ~ 4/1và d) SiO2/CS ~ 6/1. .............................................. 57

Hình 3.10. Phổ FT-IR của mẫu nano silica khi nhiệt phân tại: a) 700 oC; b) 750 oC và

c) 800 oC. ................................................................................................................... 57

Hình 3.11. Phổ FT-IR của nano silica phụ thuộc vào tỉ lệ: a) SiO2/CS ~ 1/1; b)

SiO2/CS ~ 2/1; c) SiO2/CS ~ 4/1và d) SiO2/CS ~ 6/1 trong gel. .............................. 59

Hình 3.12. Sự phụ thuộc của khối lượng phân tử của oligochitosan vào liều xạ. .... 62

Hình 3.13. Phổ FT-IR: a) CS nguyên liệu; b) Mẫu CS03 (KLPT ~7.000 g.mol-1); c)

Mẫu CS04 (KLPT ~5.000 g.mol-1); d) Mẫu CS07 (KLPT ~3.000 g.mol-1). ............ 63

Hình 3.14. Giản đồ XRD của chitosan nguyên liệu (a) và OC3000. ........................ 64

Hình 3.15. Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt nano silica trong vật liệu SiO2/OC

phụ thuộc vào: (A; a) OC3000; (B; b) OC5000; (C; c) OC7000. ............................. 66

Hình 3.16. Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt silica của nano SiO2/OC (phối trộn)

phụ thuộc vào hàm lượng SiO2: a) SiO2 1%; b) SiO2 1,5%; c) SiO2 2%. ................. 67

Hình 3.17. Mẫu vật liệu nano SiO2/OC (phối trộn): SiO2 1,0%/OC 2% (a); SiO2

1,5%/OC 2% (b) sau 12 tháng; c) SiO2 2%/OC 2% sau 2 tháng bảo quản. ............. 68

Hình 3.18. Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt nano silica trong nano SiO2/OC (kết

tủa) phụ thuộc vào hàm lượng SiO2: a) SiO2 1%; b) SiO2 1,5%; c) SiO2 2%. ......... 69

Hình 3.19. Mẫu vật liệu nano SiO2/OC (kết tủa): SiO2 1,0%/OC 2% (a); SiO2

1,5%/OC 2% (b) sau 12 tháng; c) SiO2 2%/OC 2% sau 2 tháng bảo quản. ............. 70

Hình 3.20. Giản đồ XRD: a) nano silica điều chế bằng phương pháp nhiệt phân tro

vỏ trấu; b) vật liệu lai nano SiO2/OC3000. ............................................................... 71

Hình 3.21. Phổ UV-vis của chitosan (a); oligochitosan (b); vật liệu nano

SiO2/OC3000 (c) và nano silica (d). ......................................................................... 71

Hình 3.22. Phổ FT-IR của: a) nano SiO2/OC3000 g.mol-1; b) OC5000 g.mol-1; c) nano

SiO2/OC7000 g.mol-1. ............................................................................................... 72

Hình 3.23. Minh họa sự tương tác của nano silica với oligochitosan trong vật liệu lai

nano SiO2/OC. ........................................................................................................... 74

Hình 3.24. Sự thay đổi kích thước hạt nano SiO2 trong vật liệu lai nano SiO2/OC3000

(nano SiO2 1,5% và OC 2%) theo thời gian bảo quản. ............................................. 75

Hình 3.25. Hoạt độ enzyme chitinase trên cây thanh long được xử lý bởi các OC3000,

OC5000 và OC7000 sau khi lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum. .............. 79

Hình 3.26. Hoạt độ enzyme chitinase của cây thanh long được xử lý bởi OC, nano

SiO2, và nano SiO2/OC sau khi lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum. .......... 83

Hình 3.27. Vết bệnh đốm nâu trên dây thanh long tại thời điểm sau 168 giờ lây nhiễm

nấm: a) OC; b) Đối chứng dương; c) nano SiO2/OC; d) Đối chứng âm; e) nano SiO2.

................................................................................................................................... 87

Hình 3.28. Vết bệnh đạo ôn lá trên lúa trong thí nghiệm in vivo xử lý bằng: a) nano

SiO2/OC75; b) nano SiO2/OC100; c) nano SiO2/OC125; d) Trizole 75WP; e) Đối

chứng. ........................................................................................................................ 90

Hình 3.29. Hình ảnh nghiên cứu hiệu lực kiểm soát in vivo bệnh bạc lá trên lúa: a)

Bố trí thí nghiệm; b) Khung điều tra; c) Vết bệnh sau khi xử lý nano SiO2/OC; d) Vết

bệnh đối chứng. ......................................................................................................... 93

Hình 3.30. Ảnh hưởng của vật liệu nano SiO2/OC3000 đến sự phát triển của tản nấm

sau 8 ngày nhiễm nấm Corticium salmonicolor. ...................................................... 94

Hình 3.31. Hiệu quả ức chế nấm Corticium salmonicolor phụ thuộc vào nồng độ của

nano SiO2/OC. ........................................................................................................... 95

Hình 3.32. Thí nghiệm kiểm soát bệnh nấm hồng trên cây cao su: a, c) Vườn cao su

thí nghiệm; b) Vết bệnh nấm hồng cấp 3; d) Vết bệnh sau xử lý vật liệu nano SiO2/OC.

................................................................................................................................... 96

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Ngày nay, việc nghiên cứu sử dụng chất thải trong các ngành công nghiệp,

nông nghiệp, chế biến thủy hải sản, … thành các vật liệu mới ứng dụng trong đời

sống nhằm tiết kiệm nguồn tài nguyên hữu hạn của nhân loại là cần thiết.

Nông nghiệp và nuôi trồng thủy sản là những ngành kinh tế chủ lực của Việt

Nam, chất thải tro vỏ trấu dồi dào từ nền nông nghiệp sản xuất lúa gạo là nguồn

nguyên liệu hữu ích có thể tổng hợp thành vật liệu silica và phế thải vỏ tôm trong chế

biến thủy hải sản điều chế thành vật liệu sinh học chitin, chitosan để ứng dụng trong

nhiều ngành công nghiệp. Theo thống kê trung bình hàng năm, Việt Nam có khối

lượng tro vỏ trấu thải ra khoảng 150.000 tấn và vỏ tôm khoảng 325.000 tấn.

Tro vỏ trấu có hàm lượng SiO2 > 60% là nguyên liệu thích hợp dùng để điều

chế silica, tùy vào phương pháp điều chế sẽ có kích thước vật liệu khối hoặc vât liệu

nanomét. Ở kích thước nanomét, silica có hoạt tính kháng nhiều loại vi khuẩn, vi

nấm. Chitosan được điều chế từ vỏ tôm có hoạt tính kháng vi sinh vật phổ rộng và

hiệu quả. Khi sử dụng trong canh tác cây trồng, chitosan được thực vật hấp thụ tùy

thuộc vào khối lượng phân tử và thể hiện khả năng kích thích thực vật tạo ra các

enzyme kháng lại vi sinh vật gây bệnh như chitinase, glucanase, … hoặc tác động

trực tiếp tiêu diệt vi sinh vật.

Vì các lý do trên, luận án lựa chọn và thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế tạo

nano silica từ tro vỏ trấu và vật liệu lai nano silica/chitosan ứng dụng làm chất kháng

nấm bệnh thực vật”. Mục tiêu của luận án là điều chế một loại vật liệu nano lai có

hoạt tính kháng vi sinh vật thể hiện cộng hợp tính chất của cả hai vật liệu vô cơ – hữu

cơ là nano silica và chitosan có khối lượng phân tử thấp (oligochitosan) ứng dụng

trong kiểm soát bệnh do vi nấm, vi khuẩn gây hại cho cây trồng. Các nghiên cứu hiệu

ứng sinh học về hoạt tính kháng vi khuẩn, vi nấm và tạo kích kháng của tế bào thực

vật của vật liệu nano silica/oligochitosan trong luận án này được thực hiện đối với

một số bệnh trên các cây trồng chủ lực như lúa, thanh long, cao su là những loại nông

sản có sản lượng, giá trị kinh tế cao tại Việt Nam.

Kết quả của luận án là cơ sở khoa học mở ra hướng tổng hợp vật liệu nano lai

kháng vi sinh vật từ phế thải tro vỏ trấu, vỏ tôm làm chất kiểm soát bệnh cây trồng

trong sản xuất nông nghiệp an toàn và mở rộng ứng dụng sang các lĩnh vực phòng trị

bệnh trong nuôi trồng thủy hải sản, bảo quản nông sản, thực phẩm, …

2. Nội dung chính của luận án

Luận án gồm các nội dung chính sau:

Nghiên cứu điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu, gel

SiO2/chitosan (SiO2 tách từ tro vỏ trấu) và xác định một số tính chất hóa lý đặc trưng

của chúng.

1 bằng phương pháp xử lý chitosan bởi H2O2 nồng độ thấp kết hợp với chiếu xạ tia 

Nghiên cứu điều chế oligochitosan khối lượng phân tử từ 3.000 - 7.000 g.mol-

Co-60.

Nghiên cứu tổng hợp vật liệu lai nano silica/oligochitosan bằng phương pháp

phối trộn nano silica với oligochitosan và phương pháp kết tủa nano silica từ dung

dịch Na2SiO3 với ion H+ trong dung dịch oligochitosan.

Thử nghiệm in vitro và in vivo hiệu lực kích kháng và ức chế vi nấm, vi khuẩn

gây bệnh thực vật của vật liệu nano silica/oligochitosan đối với bệnh đốm nâu trên

cây thanh long, bệnh đạo ôn lá và bạc lá trên cây lúa, bệnh nấm hồng trên cây cao su.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả của Luận án đóng góp số liệu và quy luật khoa học cho quá trình điều

chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu và phương pháp nhiệt phân

gel silica/chitosan. Phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu đã tách các hợp chất kim loại

ở 700 oC trong 2 giờ thu được nano silica có kích thước hạt trung bình từ 30 – 50

nm, kích thước này lớn hơn các hạt silica kết tinh trên mạng xenlulo vỏ trấu theo các

nghiên cứu đã được công bố. Phương pháp tổng hợp và nhiệt phân gel silica/chitosan

cho phép điều chỉnh được kích thước hạt nano silica theo ý muốn bằng cách thay đổi

tỷ lệ khối lượng của silica với chitosan, kích thước hạt nano silica tăng cùng chiều

với tỷ lệ khối lượng silica/chitosan. Phương pháp tổng hợp và nhiệt phân gel

silica/chitosan là cơ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu sử dụng các polyme có khả

năng tạo gel khác với silica nhằm tối ưu về công nghệ và chi phí sản xuất.

Luận án cũng công bố kết quả điều chỉnh khối lượng phân tử chitosan từ 3.000

- 7.000 g.mol-1 bằng phương pháp xử lý H2O2 nồng độ 0,5% kết hợp với chiếu xạ tia

 Co-60 không làm thay đổi cấu trúc đơn phân tử của mạch chitosan mà chỉ làm giảm

khối lượng phân tử của chitosan và giảm đáng kể liều chiếu xạ nhằm giảm chi phí.

Kết quả nghiên cứu tổng hợp vật liệu lai nano silica/oligochitosan chứa nano silica

với oligochitosan bằng phương pháp phối trộn 02 đơn chất hoặc thực hiện phản ứng

kết tủa SiO2 giữa Na2SiO3 với ion H+ trong dung dịch oligochitosan.

Ý nghĩa khoa học quan trọng về hiệu lực kháng bệnh thực vật là nghiên cứu

ban đầu đã chứng minh vật liệu nano silica/oligochitosan có hiệu ứng kích thích sản

sinh kháng thể, hiệu quả kiểm soát bệnh thực vật đối với bệnh đốm nâu gây hại cây

thanh long, bệnh đạo ôn và bạc lá gây hại trên lúa, bệnh nấm hồng gây hại trên cây

cao su đạt từ 86 – 92% ở nồng độ hoạt chất từ 100 – 150 mg.L-1.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của Luận án làm cơ sở khoa học ban đầu để xây dựng quy trình tận

dụng phế thải tro vỏ trấu và vỏ tôm sản xuất các loại vật liệu có giá trị gia tăng cao

ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau.

Có thể sản xuất vật liệu nano silica từ tro vỏ trấu với kích thước < 30 nm bằng

phương pháp tổng hợp và nhiệt phân gel SiO2/chitosan, kích thước hạt silica có thể

điều chỉnh bằng cách thay đổi tỉ lệ khối lượng SiO2/chitosan. Nếu sản xuất silica có

kích thước hạt từ 30 – 50 nm thì bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu là phương

pháp hiệu quả, sản phẩm sử dụng cho các nhu cầu của các ngành công nghiệp khác

nhau như cao su, sơn, phụ gia xi măng,…

Oligochitosan khối lượng phân tử thấp được điều chế bằng phương pháp xử lý

H2O2 nồng độ 0,5% kết hợp với chiếu xạ tia  Co-60 làm giảm liều chiếu xạ và giá

thành nguyên liệu cho sản xuất thuốc bảo vệ thực vật, chăn nuôi, thủy sản, mỹ phẩm,

y tế, bảo quản nông sản thực phẩm. Phương pháp tổng hợp vật liệu nano

silica/oligochitosan đáp ứng công nghệ sản xuất xanh tạo ra sản phẩm có hoạt tính

kích kháng, kiểm soát nấm bệnh thực vật có tiềm năng thay thế thuốc bảo vệ thực

vật độc hại ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp an toàn.

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Cấu tạo, tính chất của nano silica, oligochitosan và vật liệu lai của chúng.

1.1.1. Nano silica.

Silica là một oxit của silic, công thức phân tử là SiO2, có độ cứng cao và được

biết đến từ thời cổ đại. Trong tự nhiên, SiO2 không tồn tại dưới dạng phân tử riêng lẻ

mà liên kết thành các phân tử lớn do phản ứng ngưng tụ giữa các nhóm silanol (Si-

OH). Silica sử dụng vào các mục đích khác nhau phụ thuộc rất nhiều vào độ tinh

khiết, cấu trúc mạng tinh thể và vi cấu trúc của chúng. Silica bao gồm hai dạng cấu

trúc là dạng tinh thể và vô định hình (Hình 1.1) [1]. Khoáng vật chứa silica trong tự

nhiên chủ yếu có cấu trúc tinh thể (thạch anh, triđimit, cristtobalit, đá mã não,...),

chúng trơ về mặt hóa học, chủ yếu được ứng dụng làm vật liệu xây dựng, công nghiệp

lọc khí và công nghiệp hấp thụ,... Silica ở dạng vô định hình được tìm thấy trong tế

bào tảo cát (diatom) và chủ yếu tạo ra bằng phương pháp tổng hợp nhân tạo. Silica

vô định hình linh động, hoạt động hóa học hơn silica tinh thể nên chúng có nhiều ứng

dụng trong thực tiễn. Các loại silica có diện tích bề mặt lớn như silica cấu trúc xốp

(mesoporous) [2], đặc biệt là nano silica hiện nay đã được nghiên cứu ứng dụng trong

nhiều ngành công nghiệp như chế tạo bê tông cường độ cao, bê tông chống ion Cl- ăn

mòn, tạo liên kết trong vật liệu polyme vô cơ (geopolyme), chất chống lắng và tạo

màng cho sơn, làm phụ gia tăng cường cho vật liệu nhựa, vật liệu xây dựng và dân

dụng, phụ gia chống mài mòn trong chế biến cao su, sản xuất chất hấp phụ (zeolit,

than hoạt tính, ...) xử lý môi trường, hấp thụ trong thu hồi dầu, sản xuất chất hút ẩm

silica gel, chất bọc phủ chống đóng bánh trong sản xuất phân bón, chất phân tán thuốc

bảo vệ thực vật,... [3, 4].

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của silica [1].

Sản lượng lúa tại Việt Nam hiện nay đạt gần 45 triệu tấn/năm nên tạo ra nguồn

vỏ trấu dồi dào khoảng 8 triệu tấn/năm [5]. Tro vỏ trấu là sản phẩm còn lại sau khi sử

dụng trấu làm chất đốt cho các ngành công nghiệp [6]. Hàm lượng SiO2 trong vỏ trấu

chiếm khoảng 14 - 25% tùy thuộc vào giống lúa, khí hậu và thổ nhưỡng của nơi canh

tác [7]. Trong tro vỏ trấu, hàm lượng SiO2 tăng lên từ 60 - 90% khi hợp chất hữu cơ

được phân hủy trong quá trình làm nguyên liệu đốt, silica có cấu trúc chủ yếu là vô

định hình chiếm tỷ lệ từ 80 - 97% SiO2 [8, 9]. Ngoài thành phần chính SiO2, trong tro

vỏ trấu chứa hàm lượng cacbon từ 10 - 40% và một lượng nhỏ các hợp chất kim loại

dạng oxit như Na2O, K2O, Al2O3 Fe2O3, CaO, MgO,… tùy thuộc vào nhiệt độ đốt

trấu. Vì vậy, sử dụng tro vỏ trấu làm nguyên liệu để sản xuất nano silica có tính khả

thi và hiệu quả kinh tế [10, 11]. Theo tác giả Zakharov và cs (1993) và Nian và cs

(2013), hạt silica trong vỏ trấu có kích thước từ 10 - 40 nm và được phân bố giữa các

lớp tế bào thực vật [12, 13]. Cây lúa hấp thụ silica ở dạng hòa tan của axit silicic

(Si(OH)4), silic tích tụ giữa các hốc của tế bào xenlulo trong vỏ trấu được mô phỏng

theo hình 1.2 [13].

a)

b)

Hình 1.2. Sự hấp thụ silicic trong cây lúa (a) và silica trong vỏ trấu (b).

(Nguồn Tabata và cs, 2010)

Trong nông nghiệp, silica được sử dụng là phân bón, nó là dinh dưỡng trung

lượng cần thiết cho cây trồng. Silica có tác dụng gia cường vách tế bào thực vật làm

hạn chế sự xâm nhập gây tổn thương của các lọai côn trùng, sâu hại, nấm bệnh. Khi

silica ở kích thước nanomet, theo một số nghiên cứu gần đây cho thấy chúng tỏ ra có

hiệu quả kháng vi sinh vật, tăng sức đề kháng cho cây trồng vượt trội so với silica vật

liệu khối [14, 15]. Khả năng kháng vi sinh vật của nano silica phụ thuộc vào kích

thước hạt tức là phụ thuộc vào diện tích bề mặt và khả năng tiếp xúc. Silica có kích

thước nanomet hòa tan hoặc thẩm thấu nhanh vào tế bào thực vật giúp cây trồng hấp

thụ silic, thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các hợp chất silic hữu cơ và tăng trưởng

cây trồng.

1.1.2. Oligochitosan

Oligochitosan được điều chế bằng phương pháp cắt đứt liên kết β-1,4 glucozit

giữa các đơn phân tử D-glucosamin trong cấu tạo phân tử của chitosan bằng các tác

nhân như sinh học enzym [16], hóa học [17] và bức xạ [18] tạo thành sản phẩm có

khối lượng phân tử thấp hơn. Đơn vị cấu tạo trong phân tử oligochitosan là D-

glucosamin có công thức cấu tạo được biểu diễn trong hình 1.3.

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của chitosan.

Oligochitosan và chitosan đều có khả năng kháng vi sinh vật và tạo kháng thể

giúp cây trồng chống lại sự xâm nhập của vi nấm, vi khuẩn gây bệnh. Khả năng kiểm

soát vi sinh vật gây bệnh trực tiếp của chitosan giảm khi khối lượng phân tử giảm

nhưng khả năng tạo kháng thể thực vật tăng [19]. Theo Đặng Xuân Dự (2015), các

oligochitosan có khả năng tạo ra các phyatolexin (chitinase, glutanase,…) cao và khác

biệt với chitosan khi khối lượng phân tử nhỏ hơn 10.000 g.mol-1 [19]. Burkhanova và

cs (2007) đã công bố tác dụng kiểm soát bệnh của oligochitosan với khối lượng phân

tử 5.000 – 10.000 g.mol-1 đối với bệnh thối rễ của lúa mì [20], Ozeretskovskaya và

cs (2006) chứng minh hiệu quả của oligochitosan (2.000 – 6.000 g.mol-1) kiểm soát

bệnh mốc sương ở khoai tây so với chitosan có khối lượng phân tử lớn hơn [21].

1.1.3. Vật liệu lai nano silica/oligochitosan

Vật liệu lai là vật liệu tổng hợp gồm hai thành phần trong đó có ít nhất một

thành phần có cấu trúc nanomet. Trong vật liệu lai, thông thường có một chất là vô

cơ, chất còn lại là hữu cơ. Việc tổng hợp vật liệu lai có thể thực hiện bằng cách phối

trộn giữa hai pha để được hỗn hợp đồng nhất hoặc có thể hình thành pha vô cơ trong

pha hữu cơ bằng các phản ứng hóa học hoặc hình thành cả hai pha vô cơ, hữu cơ bằng

phản ứng hóa học [22].

Vật liệu lai nano silica/oligochitosan bao gồm các hạt nano silica phân tán

trong dung dịch polyme oligochitosan, nó tương tác với nhau bằng các liên kết hydro,

Van der Waals, tương tác tĩnh điện hoặc có thể có tương tác hóa học do hình thành

liên kết cộng hóa trị (Hình 1.4). Sự tương tác giữa thành phần vô cơ và hữu cơ quyết

định tính chất của vật liệu lai khác với tính chất của vật liệu đơn lẻ. Vật liệu lai thể

hiện được các đặc tính của hai pha trong vật liệu (cộng hợp) hoặc thể hiện được các

đặc tính vượt trội (đồng vận) hoặc xuất hiện các đặc tính mới. Các nghiên cứu ban

đầu của một số tác giả cho thấy vật liệu nano silica/oligochitosan có hiệu lực kháng

vi sinh vật gây bệnh thực vật, tăng trưởng cây trồng [23-25].

Hình 1.4. Mô phỏng hình thành liên kết giữa silica và chitosan [26].

1.2. Nghiên cứu tổng hợp nano silica, oligochitosan và nano silica/oligochitosan.

1.2.1. Tổng hợp nano silica.

Cho đến nay có 02 phương pháp điều chế vật liệu nano silica từ vỏ trấu, tro vỏ

trấu là phương pháp hóa học và phương pháp nhiệt phân.

a) Phương pháp hóa học

Nguyên lý của phương pháp hóa học điều chế nano silica là sử dụng phản ứng

kết tủa SiO2 giữa dung dịch muối kiềm silicate và axit hoặc thủy phân các hợp chất

hữu cơ chứa silic.

Phản ứng kết tủa điều chế nano silica: Silica có cấu trúc vô định hình từ vỏ

hoặc tro vỏ trấu được tách bằng cách hòa tan trong kiềm như NaOH, Na2CO3, … và

sử dụng axit (HCl, H2SO4,…) kết tủa thu SiO2 theo phương pháp sol-gel [27, 28]. Để

thu được kết tủa silica kích thước nanomet có thể thực hiện trong nước thì dung dịch

keo silica có hàm lượng silica thấp và nếu kết tủa trong hệ dung dịch ổn định có bổ

sung chất chống kết tụ như chất hoạt động bề mặt, polyme thì thu được dung dịch keo

có hàm lượng silica cao hơn. Phương trình phản ứng hình thành SiO2 như sau:

(1.1) SiO2 (Vỏ trấu, tro vỏ trấu) + 2NaOH  Na2SiO3 + H2O

(1.2) SiO2 (Vỏ trấu, tro vỏ trấu) + Na2CO3  Na2SiO3 + CO2

(1.3) Na2SiO3 + H2SO4  SiO2 + Na2SO4 + H2O

(1.4) Si(OH)4 + Si(OH)4  2SiO2 + 4H2O

Tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano silica

sử dụng nguyên liệu vỏ trấu. Tác giả Lê Văn Hải và cs (2013) đã tổng hợp silica có

kích thước nanomet theo phương pháp sol-gel từ vỏ trấu qua 3 công đoạn [29]. Công

đoạn 1: Vỏ trấu được đốt ở nhiệt độ 600°C trong 4 giờ để loại hợp chất hữu cơ, tăng

hàm lượng SiO2. Công đoạn 2: Tiến hành tách silica bằng dung dịch NaOH tạo thành

Na2SiO3. Công đoạn 3: Kết tủa silica bằng phản ứng giữa Na2SiO3 với H2SO4 đến pH

~4 trong hỗn hợp nước/butanol và chất ổn định Cetyltrimethylammonium bromide

(CTAB). Silica thu được có cấu trúc vô định hình, kích thước hạt trung bình 15 nm

và có diện tích bề mặt lớn khoảng 340 m2/g (Hình 1.5a). Cũng bằng phương pháp

này, tác giả Nguyễn Trí Tuấn và cs (2014) [30] và Nguyễn Văn Hưng và cs (2015)

[31] đã điều chế thành công nano silica có kích thước hạt trung bình khoảng 15 nm:

Vỏ trấu được nung trong thời gian 4 giờ ở nhiệt độ từ 500 – 700oC, hòa tan trong

NaOH; bột nano silica thu được bằng phản ứng kết tủa SiO2 giữa Na2SiO3 với HCl

trong dung dịch nước hoặc bổ sung ethanol tại pH ~ 6. Hạt nano silica các tác giả thu

được có cấu trúc vô định hình và có xu hướng kết tụ (Hình 1.5b, 1.5c).

Zulkifli và cs đã sử dụng kiềm chiết xuất các hạt silica trong tro vỏ trấu đã loại

bỏ các tạp chất kim loại [32]. Tro vỏ trấu ban đầu được xử lý bằng HCl trong thời

gian 4 giờ ở 75°C. Sau đó tro vỏ trấu được rửa bằng nước cất cho đến khi đạt pH

trung tính và sấy khô ở 110°C trong 12 giờ. NaOH sử dụng để chiết silica thu được

dung dịch Na2SiO3. Axit hóa dung dịch Na2SiO3 bằng H3PO4 3M cho đến khi tạo gel.

Gel được ly tâm và rửa bằng nước cất để loại bỏ muối hòa tan, sau đó được nung để

tạo ra hạt nano silica. Liou và Yang [33] đã nghiên cứu các biến số khác nhau ảnh

hưởng đến diện tích bề mặt và kích thước hạt silica của nano silica sử dụng nguyên

liệu tro vỏ trấu bằng phương pháp chiết kiềm. Nồng độ axit, kiềm, pH gel hóa, thời

gian tạo gel và nhiệt độ đã được tối ưu hóa để điều chế các hạt nano silica. Rehman

và cs [34] đã công bố tổng hợp nano silica sử dụng nguồn silica từ vỏ trấu sử dụng

phương pháp sol-gel.

Các nghiên cứu của Selvakumar [35] và Zhang và cs [36] đã điều chế silica từ

tro vỏ trấu bằng phương pháp kết tủa áp dụng quy trình tiền xử lý tro vỏ trấu với axit.

Tro vỏ trấu xử lý bởi các axit HCl, HNO3 và H2SO4 tại các pH khác nhau để nâng cao

độ tinh khiết của silica, tiếp theo sử dụng kỹ thuật chiết kiềm với dung dịch NaOH (2

– 3 N) và kết tủa SiO2 bởi axit thu nano silica có cấu trúc vô định hình.

Rungrodnimitchai và cs đã điều chế vật liệu nano silica sử dụng NaOH 2 M với sự

hỗ trợ của lò vi sóng (800 W) trong 10 phút [37].

Nano silica có thể điều chế bằng phương pháp thủy phân một số hợp chất chứa

silic: Trong phương pháp này, các hợp chất hữu cơ chứa silic thủy phân trong các

môi trường khác nhau tạo thành silica. Các tiền chất trong phản ứng thủy phân thường

được sử dụng là tetraethoxysilane (TEOS), tetramethoxysilane (TMOS) hay

triethoxy(propyl)silane [38, 39]. Ngoài phương pháp thủy phân hợp chất hữu cơ, Li

và cs (2011) [40] và Ma và cs (2012) [41] nghiên cứu hòa tan SiO2 trong tro vỏ trấu

với NH4F tạo thành muối (NH4)2SiF6 và thủy phân muối vô cơ trong môi trường nước

tạo thành SiO2 nhằm điều chỉnh kích thước hạt theo ý muốn (1.5) và (1.6). Nghiên

cứu của các tác giả này đạt hiệu suất thu hồi SiO2 đến 94,6% và có kích thước hạt

silica thu được khoảng 50 - 60 nm.

(1.5) 6NH4F + SiO2 (Tro vỏ trấu) → (NH4)2SiF6 + 4NH3 + 2H2O

(1.6) (NH4)2SiF6 + 4NH3 + (n+2) H2O → 6NH4F+ SiO2↓ + nH2O

Hiện nay, việc nghiên cứu cải tiến quy trình điều chế để tăng độ tinh khiết và

hiệu suất thu hồi nano silica từ tro vỏ trấu và vỏ trấu đang được tập trung nghiên cứu.

Quy trình tổng quát điều chế nano silica từ vỏ trấu bằng phương pháp kết tủa đã được

nghiên cứu như sau: Vỏ trấu được nung ở nhiệt cao để loại bỏ hữu cơ. Tro vỏ trấu có

thể được tách hoặc không tách hợp chất kim loại bằng axit, SiO2 được tinh sạch bằng

cách phản ứng với dung dịch kiềm NaOH và kết tủa với axit HCl. Phương pháp này

thu được các hạt silica có kích thước khoảng 10 – 40 nm tùy vào hàm lượng SiO2

trong dung dịch và nồng độ chất hoạt động bề mặt, tuy nhiên các hạt silica có hiện

tượng kết tụ hình thành các phân tử SiO2 có kích thước lớn [27, 28, 42, 43]. Phương

pháp hóa học sử dụng nhiều hóa chất ảnh hưởng đến môi trường và hiệu suất thu hồi

nano silica thấp nên hiệu quả không cao.

b) Phương pháp nhiệt phân.

Đến nay rất ít nghiên cứu nhiệt phân phế thải tro vỏ trấu để điều chế nano silica

nhưng có một số nghiên cứu nhiệt phân vỏ trấu để tạo ra nano silica dạng bột. Phương

pháp nhiệt phân điều chế nano silica từ vỏ trấu được tiến hành dựa trên nguyên lý: Sử

dụng nhiệt độ cao để đốt cháy các hợp chất hữu cơ trong vỏ trấu và phần còn lại là

nano silica. Tùy thuộc vào thời gian, nhiệt độ nhiệt phân và phương pháp xử lý nguyên

liệu ban đầu, các tác giả thu được nano silica có kích thước hạt, độ tinh khiết, cấu trúc

vô định hình hay tinh thể và độ xốp khác nhau. Để thu được silica có độ tinh khiết

cao thì phải tách loại các hợp chất kim loại tồn tại trong tro vỏ trấu bằng axit như

HCl, HNO3, ... Phản ứng loại bỏ các hợp chất kim loại trong tro vỏ trấu như sau (1.9):

Tro vỏ trấu (SiO2 + M + C) + HCl  Tro vỏ trấu (SiO2 + C) + MCl + H2 (1.7)

Trong đó M là các hợp chất của kim loại: Na; K; Ca; Fe; Al, Mg.

Tác giả Phạm Đình Dũng và cs (2016) và Nguyễn Thị Thủy và cs (2017) thực

hiện quá trình nhiệt phân vỏ trấu ở nhiệt độ 700 oC trong thời gian 2 giờ thu được

nano silica có kích thước hạt từ 10 - 30 nm với cấu trúc mạng tinh thể gần như vô

định hình, các hạt nano có hiện tượng kết tụ (Hình 1.5d), phân bố kích thước hạt trong

phạm vi rộng [44, 45].

Hình 1.5. Ảnh TEM của nano silica tổng hợp từ vỏ trấu: a) [29]; b) [30]; c) [31]; d) [45].

Tác giả Gu và cs (2013, 2015) đã xử lý nguyên liệu vỏ trấu bằng axit trước khi

nhiệt phân để thu được sản phẩm có kích thước hạt nhỏ, phân bố kích thước hạt đồng

đều hơn và tăng độ xốp của silica [46, 47]. Trong nghiên cứu này, tác giả đã xử lý tro

vỏ trấu với HCl 8% theo tỷ lệ 1:10 trong 4 giờ ở nhiệt độ 120 oC nhằm loại bỏ ion

kim loại trước khi tiến hành nhiệt phân trong các môi trường khí trơ N2, khí CO2 ở

800 oC và khí O2 ở nhiệt độ 610 oC. Phương pháp này tạo ra các sản phẩm SiO2 có

độ tinh khiết đạt 99,62% với diện tích bề mặt vật liệu khoảng 204,3 - 352,6 m2/g, kích

thước hạt trung bình nhỏ hơn 20 nm [46]. Wang và cs (2012), đã tổng hợp nano silica

từ vỏ trấu bằng phương pháp nhiệt phân 2 lần, lần thứ nhất ở 700 oC trong 2 giờ, lần

thứ 2 silica được siêu âm phá vỡ hạt trong dung dịch HNO3 và nung ở 800 oC trong

4 giờ thu được nano silica có kích thước 25 – 30 nm [47]. Phương pháp xử lý nhiệt

kết hợp với sol-gel để tổng hợp nano silica từ vỏ trấu được Rafiee và cs thu hồi SiO2

có kích thước hạt khoảng 6 – 7 nm [28]. Tác giả Alshatwi và cs (2015) sử dụng

phương pháp hấp thủy nhiệt, sau đó nhiệt phân trong 1 giờ để thu được nano silica

sinh học từ vỏ trấu có kích thước hạt khoảng 10 - 30 nm [48]. Phương pháp nhiệt

phân vỏ trấu thu hồi SiO2 là phương pháp đơn giản và hiệu quả, kích thước hạt và độ

tinh khiết của sản phẩm phụ thuộc vào phương pháp xử lý vật liệu ban đầu, nhiệt độ,

thời gian và môi trường nhiệt phân [49, 50]. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp

nhiệt phân điều chế nano silica là phân bố kích thước hạt không trong phạm vi rộng,

một số hạt có hiện tượng kết dính, độ tinh khiết chưa cao.

Các nghiên cứu ứng dụng nano silica tại Việt Nam chủ yếu ở một số lĩnh vực

như hấp thụ thu hồi dầu, bê tông chống phân hủy, xử lý môi trường,… Nano silica

(dtb ~25 nm) nghiên cứu làm chất hấp phụ thu hồi dầu trong khai thác dầu thô ở nhiệt

độ 30 oC trong thời gian 1 giờ thì 1 g vật liệu nano silica hấp phụ được 9,27 g dầu thô

[51]. Nano silica ứng dụng trong sản xuất bê tông xi măng cải thiện khả năng chống

xâm nhập và phá hủy của ion Clo, khả năng chống xâm nhập ion Clo tăng theo hàm

lượng nano silica sử dụng [52]. Tác giả Nguyễn Văn Hưng và cs (2015) nghiên cứu

điều chế nano silica có cấu trúc tinh thể từ tro vỏ trấu sử dụng làm chất hấp thụ xanh

methylene trong nước, hiệu suất hấp thụ đạt 90% với dung dịch xanh methylene có

nồng độ ban đầu là 40 mg.L-1 [31].

Tuy nhiên cho tới nay, phương pháp nhiệt phân sử dụng tro vỏ trấu là phế thải

của các lò đốt trấu công nghiệp có hàm lượng SiO2 cao từ 80 - 90% để điều chế nano

silica không có nhiều công trình công bố. Tro vỏ trấu của các lò đốt tồn lưu trong môi

trường chịu các tác động của độ ẩm không khí nên có khả năng liên kết các hạt SiO2

bằng liên kết silanol (Si-OH), đồng thời hữu cơ trong tro vỏ trấu bị cháy bởi các nhiệt

độ khác nhau nên nguyên liệu tro vỏ trấu thu được không có sự đồng nhất trong

nguyên liệu. Quá trình đốt trấu chưa triệt để còn lại các lớp cacbon phân tán trong các

hạt silica. Trong luận án này nghiên cứu nhiệt phân tro vỏ trấu có hàm lượng SiO2

cao dựa trên nguyên lý nhiệt phân vỏ trấu để thu hồi được nano silica hiệu quả hơn

phương pháp nhiệt phân vỏ trấu.

Phương pháp nhiệt phân còn được áp dụng cho việc tổng hợp và nhiệt phân

các gel silica/polyme như trong nghiên cứu của tác giả Farjood và cs (2020). Ở

phương pháp này, tác giả dùng Na2SiO3 tạo gel với CTAB và nhiệt phân gel này thu

được nano silica. Chitosan là một polyme sinh học có khả năng tạo gel ở pH 5,5 – 6

tạo gel silica/chitosan tùy vào khối lượng phân tử của chitosan [38]. Dựa trên các quy

luật trong các nghiên cứu điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân vỏ trấu

và gel SiO2/CTAB, luận án này nghiên cứu thay thế CTAB là một hóa chất chứa Br

độc hại bằng chitosan để tạo gel, nhiệt phân gel silica/chitosan nhằm điều chỉnh kích

thước hạt silica theo ý muốn và đáp ứng công nghệ xanh bảo vệ môi trường.

1.2.2. Nghiên cứu điều chỉnh khối lượng phân tử chitosan thành oligochitosan

Hiệu lực sinh học và khả năng ứng dụng của chitosan phụ thuộc vào khối

lượng phân tử. Cho đến nay các phương pháp biến tính cắt đứt liên kết β-1,4 glycozit

nhằm giảm khối lượng phân tử của chitosan bao gồm: Phương pháp hóa học sử dụng

tác nhân hóa học như HCl, H3PO4, HNO2, H2O2...; phương pháp sinh học sử dụng tác

nhân là các enzym như: cellulase, chitinase, lysosyme, lipase; phương pháp vật lý sử

dụng tác nhân như sóng siêu âm, vi sóng, tia bức xạ (γ Co-60, chum tia điện tử).

Phương pháp điều chế oligochitosan từ chitosan bằng tác nhận hóa học được

cho là phương pháp đơn giản, chi phí rẻ và hiệu quả nhất. Tuy nhiên, phương pháp

này có nhược điểm là gây ơ nhiễm môi trường, quá trình cắt đứt liên kết β-1,4 glycozit

thường kèm theo sự thay đổi cấu trúc đơn phân tử glucosamin của chitosan, cụ thể là

bị đề amin hóa hoặc là phá vỡ vòng glucopyranose [17]. Phương pháp sinh học sử

dụng các enzym cắt đứt liên kết β-1,4 glycozit là phương pháp an toàn nhưng có giá

thành cao hơn so với phương pháp hóa học [16].

Phương pháp chiếu xạ cắt đứt liên kết β-1,4 glycozit của chitosan để điều chế

oligochitosan được xem là kỹ thuật hiệu quả do dễ dàng điều chỉnh khối lượng phân

tử thông qua thay đổi liều chiếu xạ, công nghệ này thân thiện với môi trường vì không

sử dụng hóa chất, sản phẩm tinh khiết [18, 53] và hầu như không làm thay đổi cấu

trúc đơn phân tử của chitosan [54, 55]. Nhược điểm của phương pháp chiếu xạ điều

chế oligochitosan là phải sử dụng liều chiếu xạ cao, thời gian kéo dài và chi phí cao.

Hiện nay việc nghiên cứu kết hợp sử dụng tác nhân hóa học ít độc hại với chiếu xạ

để giảm liều chiếu xạ trong nghiên cứu điều chế oligosaccarit đã được quan tâm

nghiên cứu.

Trên cơ sở tổng quan ưu, nhược điểm của các phương pháp cắt đứt liên kết β-

1,4 glycozit của chitosan, trong luận án này sử dụng phương pháp xử lý chitosan bằng

H2O2 ở nồng độ thấp kết hợp với chiếu xạ tia  Co-60 có cơ chế được mô tả như sau:

Cơ chế tác động của H2O2 lên mạch phân tử chitosan: H2O2 có tính axit mạnh

hơn nước, với pKa là 11, các ion âm perhydroxyl (OH-) không ổn định. Sự giảm độ

ổn định của H2O2 là do sự không ổn định của HOO+. Yếu tố nhiệt độ và bazơ sẽ làm

tăng sự phân hủy H2O2. Các ion âm (OH-) phản ứng với H2O2 để tạo thành gốc

hydroxyl có phản ứng mạnh (HO•) [56]. Theo Quin và cs (2002), H2O2 phân li trong

nước theo phương trình:

(1.8) H2O2 → H+ + HOO-

Anion HOO- không bền và là nguyên nhân làm phân hủy H2O2. Nhiệt sẽ làm

gia tăng quá trình phân hủy H2O2. Anion HOO- phản ứng với H2O2 để tạo ra gốc tự

do OH• có hoạt tính oxi hóa mạnh.

HOO- → OH- + (O) (1.9)

•- + H2O

(1.10) H2O2 + HOO- → •OH + O2

Gốc HO• là một chất oxy hóa mạnh hơn nhiều. Các nghiên cứu chỉ ra rằng gốc

hydroxyl phản ứng với cacbohydrat cực kỳ nhanh chóng, làm hình thành một nguyên

tử mới cắt đứt liên kết H - C theo phương trình tổng quát:

(1.11) RH + HO• → R• + H2O

Theo von Sonntag và cs (1980) [57], các gốc tự do •OH nhanh chóng tấn công

cấu trúc cacborhydrat một các ngẫu nhiên không chọn lọc bằng cách bắt nguyên tử

hydro của các nhóm C-H trên vòng glucozo và tạo thành các gốc tự do đại phân tử,

sau đó quá trình mở vòng hoặc là đứt liên kết glucozit sẽ xảy ra do tác dụng của gốc

tự do này.

1 + P2

P• (polime) → P• (1.12)

Cùng với tác động của H2O2, tia  Co-60 cũng tác động lên mạch chitosan theo

cơ chế theo Weiss và cs (1944) và Tabata và cs (1991): Dưới tác dụng của bức xạ,

H2O được phân ly [58, 59] theo phương trình tổng quát như sau:

•

aq, H3O+, HO2

Tia  (1.13) H2O  H2, H2O2, H, OH, e

- + H+

- Hydro peroxit (H2O2) bị phân ly theo phương trình:

(1.14) H2O2  HO2

 Cơ chế oxy hóa cắt đứt liên kết β-1,4 glycozit của chitosan dưới tác động

của các gốc tự do hình thành do tia  Co-60 trình bày theo sơ đồ hình 1.6.

Hình 1.6. Sơ đồ cơ chế bắt hydro của gốc tự do hydroxyl cắt mạch chitosan [60]. Phản ứng phân ly của H2O và H2O2 dưới tác dụng của tia bức xạ tạo ra các gốc

• tham gia vào phản ứng oxy hóa, khử trong

aq, H3O+, HO2

tự do hoạt động H, OH, e

dung dịch

Theo nghiên cứu của Ulanski và cs (2000) [60], gốc hydroxyl tạo ra trong quá

trình phân ly bức xạ là tác nhân chính gây ra sự cắt mạch chitosan thông qua cơ chế

bắt hydro tạo thành gốc tự do R•. Các gốc R• sau quá trình chuyển vị và tái kết hợp

tạo thành chitosan có khối lượng phân tử thấp.

Sử dụng phương phương pháp chiếu xạ tia γ Co-60, Nguyễn Quốc Hiến và cs

(2000) [61] đã nghiên cứu chế tạo oligochitosan từ dung dịch chitosan có khối lượng

phân tử ban đầu là 60.000 g.mol-1 tạo ra oligochitosan có độ polyme hóa (DP) < 8

chiếm khoảng 50% với liều chiếu xạ 45 kGy. Tuy nhiên, khi chiếu xạ dung dịch

chitosan với liều chiếu xạ cao (~ 45 kGy) thì thời gian chiếu xạ kéo dài, chi phí cao

đồng thời có thể làm giảm độ đề axetin của sản phẩm.

Phương pháp chiếu xạ tia γ Co-60 kết hợp giữa chiếu xạ và bổ sung tác nhân

oxy hóa cắt mạch nhằm giảm liều chiếu xạ là phương pháp cần được quan tâm nghiên

cứu để giảm chi phí sản xuất được tác giả Nguyễn Quốc Hiến và cs (2011) và Nguyễn

Ngọc Duy và cs (2011) đã nghiên cứu và đã giảm liều chiếu xạ đáng kể [62, 63]. Bùi

Phước Phúc (2006) đã công bố điều chế được oligochitosan có khối lượng phân tử ~

40.000 g.mol-1 bằng phương pháp oxi hóa cắt mạch sơ bộ dung dịch chitosan bằng

H2O2 1,5% và sau đó tiếp tục chiếu xạ trên nguồn bức xạ γ Co-60 chỉ cần sử dụng

liều chiếu xạ thấp khoảng ~20 kGy [64]. Tuy nhiên, oligochitosan thu được có khối

lượng phân tử còn cao. Các nghiên cứu đều xác nhận phương pháp chiếu xạ γ Co-60

kết hợp với H2O2 có hiệu quả trong việc điều chỉnh khối lượng phân tử chitosan và là

công nghệ tiềm năng để sản xuất oligochitosan với quy mô lớn.

Từ nghiên cứu tổng quan các tài liệu về phương pháp điều chỉnh khối lượng

phân tử chitosan, trong luận này chúng tôi lựa chọn điều chế oligochitosan khối lượng

phân tử từ 3.000 – 7.000 g.mol-1 bằng quy trình xử lý dung dịch chitosan với H2O2 ở

nồng độ thấp nhiều lần trong quá trình chiếu xạ tia γ Co-60 nhằm giảm liều xạ.

Oligochitosan thu được từ phương pháp này sử dụng để nghiên cứu tổng hợp vật liệu

lai nano silica/oligochitosan.

1.2.3. Nghiên cứu tổng hợp vật liệu lai nano silica/oligochitosan

Trong những năm vừa qua, vật liệu lai tổng hợp giữa chitosan với các vật liệu

khác được quan tâm nghiên cứu, vì chúng thể hiện được các đặc tính tổng hợp của

các pha đơn lẻ, làm tăng khả năng ứng dụng trong đời sống, trong số đó có vật liệu

nano silica/chitosan hoặc nano silica/oligochitosan.

Vật liệu lai vô cơ – hữu cơ nano silica/oligochitosan bao gồm các hạt nano

silica phân tán trong trong dung dịch oligochitosan. Các phân tử oligochitosan là tác

nhân ngăn cản sự kết tụ của các hạt silica. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hạt

silica bị solvat hóa trong dung dịch H2O và liên kết với oligochitosan bằng các liên

kết phối trí hoặc liên kết ion phụ thuộc vào pH của dung dịch [45, 65, 66] được mô

tả trong hình 1.7.

Hình 1.7. Mô phỏng liên kết phối trí giữa SiO2 và chitosan [45, 65]. Vật liệu lai giữa nano silica với dung dịch oligochitosan có thể tổng hợp bằng

phương pháp phối trộn giữa 02 đơn chất với nhau hoặc bằng phản ứng hình thành

nano silica giữa dung dịch Na2SiO3 với proton H+ trong dung dịch oligochitosan tại

pH chưa tới điểm tạo gel. Nano silica còn đươc tạo ra bằng phản ứng thủy phân các

hợp chất hữu cơ chứa silic trong oligochitosan.

Các loại vật liệu lai chứa nano silica kết hợp với chitosan đã được nghiên cứu

với mục đích sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào: copolyme

chitosan/alginate/nano silica được nghiên cứu tổng hợp bởi Sowjanya và cs (2013)

[67]. Vật liệu này được tổng hợp ở điều kiện lạnh sâu (-80oC) trong thời gian 12 giờ,

sử dụng dung môi ethanol/nước tỷ lệ 1/5 có bổ sung CaCl2 2%. Tác giả Kavy và cs

cũng tổng hợp vật liệu chitosan/gelatin/nano silica ở điều kiện -200C trong thời gian

48 giờ với tác nhân khâu mạch glutaraldehyde 0,25% [68]. Vật liệu Silan-

chitosan/protein được tổng hợp theo phương pháp sol-gel ở điều kiện lạnh sâu sử

dụng nguồn silica là TEOS [69].

Chitosan là một polyme không độc hại, có khả năng tương hợp sinh học, nó

được sử dụng làm chất chống kết tụ có hiệu quả trong điều chế nhiều loại dung dịch

keo nano kim loại và nano oxit kim loại trong đó có nano silica. Thongthai và cs

(2011) tổng hợp dung dịch keo silica/chitosan bằng cách thủy phân các nguồn silic

hữu cơ như TEOS, TMOS trong trong dung dịch chitosan [70], kích thước hạt nano

silica tỷ lệ nghịch với nồng độ chitosan và tỷ lệ thuận với pH dung dịch keo. Nguồn

silica từ thủy tinh lỏng cũng được tác giả Thongthai nghiên cứu sử dụng trong nhiều

công trình của mình [38, 39, 70]. Sử dụng silica từ thủy tinh lỏng có giá rẻ hơn nguồn

silica hữu cơ, nó còn khắc phục được phản ứng sinh ra rượu trong quá trình thuỷ phân

và ngưng tụ của alkoxysilane. Bằng phương pháp này, Jen-Taut và cs (2007) điều chế

hỗn hợp vật liệu lai bằng cách sử dụng nguồn SiO2 từ tetraethoxysilane và

vinyltriethoxysilane để phối trộn với chitosan [71].

Phương pháp điều chế vật liệu nanolai bằng cách phối trộn trực tiếp được thực

hiện bởi Tetyana và cs (2015), Phạm Đình Dũng và cs (2016) và Nguyễn Ngọc Thủy

và cs (2017) sử dụng nano silica dạng tinh thể từ các nguồn khác nhau sẵn có như

fumed silica (d ~ 9,6 nm), hỗn hợp titanium dioxide/silica (TiO2/SiO2, d ~ 20,6 nm)

được trộn với chitosan tạo thành vật liệu chitosan/silica [66] và nano silica từ vỏ trấu

phối trộn với oligochitosan thành dung dịch keo oligochitosan/nano silica [44, 45].

Theo nghiên cứu của Michael và cs (2001), phương pháp phối trộn trực tiếp giữa

nano silica và chitosan đã làm tăng kích thước hạt nano silica do sự tương tác hình

thành các hạt lớn hơn so với ban đầu [72]. Hiện nay, vật liệu lai nano

silica/oligochitosan được tổng hợp từ oligochitosan khối lượng phân tử nhỏ hơn 5.000

g.mol-1 chưa được công bố.

1.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật của nano silica, oligochitosan và vật liệu lai nano

silica/oligochitosan.

Theo một số nghiên cứu đã được công bố, cả hai vật liệu nano silica và

oligochitosan đề có khả năng kháng lại một số loại vi sinh vật. Hiệu ứng kháng vi

sinh vật của hỗn hợp hai vật liệu trên cũng đã được thử nghiệm trên một số loài vi

khuẩn, vi nấm.

1.3.1. Một số nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật của nano silica.

Theo Wasaki và cs (2002) [73], Ma và cs (2004) [74] và Liang và cs (2005)

[75] cho rằng silica là một hoạt chất có tác dụng làm tăng sức đề kháng cho cây trồng

như: hạn chế sâu, rầy chích hút, giải độc kim loại. Cơ chế kháng vi sinh vật gây bệnh

thực vật của silica được các tác giả giả thiết là do silica liên kết, gia cố làm chắc thành

tế bào thực vật chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh [76]. Cơ chế kích thích thực vật

tạo kháng thể chống lại vi sinh vật bệnh thực vật trong điều kiện khí hậu bất lợi xảy

ra khi silica liên kết với nhóm hydroxyl của protein dẫn truyền tín hiệu [77]. Một số

công trình nghiên cứu cho thấy silica ở kích thước nanomet có hiệu lực sinh học cao

gấp nhiều lần so với silica ở dạng vật liệu khối. Kết quả nghiên cứu của tác giả Song

và cs (2009) cho thấy nano silica ở các kích thước hạt nano từ 17 – 50 nm có hiệu

ứng kháng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus cao, còn silica dạng

vật liệu khối thì không có hiệu lực. Kích thước hạt silica càng nhỏ thì hiệu ứng kháng

vi khuẩn càng cao, cụ thể nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimum inhibition

concentration) của nano silica kháng Escherichia coli là 2 và 9 mg.mL-1;

Staphylococcus aureus là 1 và 7 mg.mL-1 tương ứng với kích thước hạt là 17 nm và

50 nm [78]. Theo nghiên cứu của tác giả Suriyaprabha (2013) khi sử dụng nano silica

có kích thước hạt 20 - 40 nm có hiệu quả kháng nấm Fusarium oxysporum và

Aspergillus niger trên cây ngô ở liều lượng sử dụng 10 – 15 kg.ha-1 đạt hiệu quả cao

hơn gấp nhiều lần so với silica dạng vật liệu khối [79]. Nano silica còn có khả năng

kháng bệnh trên một số cây trồng khác như bệnh phấn trắng trên cây dưa chuột [77],

bệnh đạo ôn và bạc lá trên lúa [80, 81]. Ngoài khả năng kháng vi sinh vật, El-bendary

và El-Helaly (2013) trong nghiên cứu đã chứng minnh nano silica còn có khả năng

kháng sâu khoang Spodoptera littoralis gây hại cà chua, LD50 được xác định là 212

mg.L-1 và hiệu quả đạt cao nhất ở nồng độ 300 - 350 mg.L-1 [82]. Phạm Đình Dũng

và cs (2016) [44], Nguyễn Ngọc Thủy và cs (2017) [45] trong các nghiên cứu của

mình đã chứng minh nano silica sử dụng ở nồng độ 60 mg.L-1 kích thích tăng trưởng

cây ớt, chúng làm gia tăng trọng lượng tươi, trọng lượng khô và năng suất trái. Nhìn

chung, các kết quả nghiên cứu về cơ chế, khả năng kháng vi sinh vật và các loại dịch

hại thực vật của nano silica mới bắt đầu được nghiên cứu.

1.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật của oligochitosan.

Chitosan và oligochitosan có tính chất hóa học và nhiều hoạt tính sinh học

được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như vật liệu kháng nấm [83], kháng vi khuẩn [84,

85], kháng các khối u, bướu [17, 86], chất tăng cường khả năng miễn dịch [87], bảo

vệ chống lại sự nhiễm trùng và oxi hóa [88-90], sử dụng làm vắc xin thực vật [23, 24,

91] và xử lý môi trường [92, 93]. Các đặc tính chất kháng vi sinh vật của oligochitosan

phụ thuộc vào khối lượng phân tử, mức độ polyme hóa (DP) [94], độ đề acetyl hóa

(DDA) [95, 96], cấu trúc (α, β, γ) và loại vi sinh vật tiếp xúc [97]. Độ lớn và sự phân

bố điện tích trên chitosan, oligochitosan, các dẫn xuất của chitosan có ảnh hưởng lớn

đến hoạt tính sinh học của chúng.

Chitosan và oligochitosan chứa các nhóm chức amino, số nhóm amino này có

vai trò quan trọng trong hoạt tính kháng vi sinh vật theo cơ chế được Hosseinnejad

và cs (2016) [98] và Chen và cs (2002) [99] mô tả theo hình 1.8. Cơ chế được cho là

phù hợp cho rằng chitosan hoặc oligochitosan có thể làm thay đổi các đặc tính thẩm

thấu của màng tế bào vi sinh vật, ngăn cản sự tiếp nhận khoáng chất hoặc phá hủy

các thành phần tế bào làm vi sinh vật chết [100]. Một cơ chế khác đưa ra để giải thích

về hoạt tính kháng vi sinh vật của oligochitosan là sự ngăn chặn việc sao chép RNA

khi oligochitosan thâm nhập vào DNA của vi sinh vật [101]. Để đáp ứng được cơ chế

này, khối lượng phân tử của chitosan phải nhỏ hơn một giá trị giới hạn nhất định, cho

phép các phân tử xâm nhập vào trong tế bào vi khuẩn, tuy nhiên các kết quả nghiên

cứu đến nay chưa đủ để củng cố giả thuyết này. Một giả thuyết khác cho rằng,

oligochitosan có khả năng tạo chelat với ion kim loại có trong màng tế và gây rối loạn

biến dưỡng các chất dinh dưỡng thiết yếu tới sự sinh trưởng của vi khuẩn dẫn đến vi

sinh vật chết [102].

Hình 1.8. Cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan và oligochitosan [69].

Có nhiều nghiên cứu sử dụng chitosan và oligochitosan trên thực vật chứng

minh rằng chúng có khả năng kích thích cây trồng tạo ra kháng thể chống lại vi sinh

vật gây bệnh, vì vậy nó được coi như một vacxin thực vật [23-25]. Theo Klarzynski

và Fritig, chất kích kháng “elicitor” được định nghĩa là những hợp chất có khả năng

kích thích cây trồng sinh ra những phản vệ đề kháng lại các tác động của các vi sinh

vật (nấm, virút, vi khuẩn) [103]. Cơ chế kích kháng của oligochitosan được mô phỏng

theo hình 1.9.

Khả năng tạo kháng thể phytoalexin thực vật của oligochitosan đã được chứng

minh trong một số nghiên cứu kháng lại bệnh gây hại trên một số loại cây trồng như

lúa, thuốc lá, nho, cà rốt. Nghiên cứu của Molloy và cs cho thấy oligochitosan có khả

năng kháng nấm Sclerotinias clerotiorum gây bệnh cho cà rốt [97]. Oligochitosan

còn ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm Fusarium và kích thích sản sinh phytoalexin

trên cây đậu tương [90]. Trong thí nghiệm in vitro của Das và cs [105], oligochitosan

ức chế hoàn toàn sự nảy mầm của bào tử nấm Botrytis và kiểm soát nấm mốc xám do

nấm Botrytis cinerea gây ra trên cây dưa chuột. Cây dưa chuột được xử lý

oligochitosan trước khi lây nhiễm nấm Botrytis cinerea gây bệnh mốc xám đã làm

giảm gần 90% tỉ lệ bệnh so với đối chứng. Oligochitosan khối lượng phân tử thấp có

hiệu quả hơn trong việc sinh ra các phản ứng phòng vệ so với các oligochitosan có

khối lượng phân tử cao, thể hiện qua hiệu quả chống lại bệnh đạo ôn do nấm

Magnaporthe grisea gây ra trên cây lúa [106]. Oligochitosan còn được nghiên cứu sử

dụng phòng bệnh vi rút khảm thuốc lá ở nồng độ 50 µg.mL-1 [107]. Ait Barka và cs

công bố rằng oligochitosan có khả năng phòng ngừa bệnh mốc xám do nấm Botrytis

cinerea gây hại cây nho [93]. Một số nghiên cứu về hiệu ứng kiểm soát bệnh trên cây

lương thực cũng cho thấy oligochitosan có hiệu lực cao. Agrawal và cs (2002) công

bố rằng sau khi xử lý oligochitosan 0,1%, cây lúa có khả năng kích thích phản ứng

phòng vệ (ROS) kháng lại vi sinh vật gây hại [109]. Ngoài ra, các nghiên cứu trên lúa

mì chỉ ra rằng oligochitosan có khối lượng phân tử từ 5.000 – 10.000 g.mol-1 có DDA

65% có hiệu quả cao đối với việc kiểm soát nấm Bipolaris sorokiniana gây bệnh

(Burkhanova và cs, 2007) [20].

Hình 1.9. Cơ chế kích kháng sinh học trên cây trồng khi có tác động của oligoglucan, oligochitosan [104].

Ở Việt Nam, đã có một số kết quả thí nghiệm khảo sát hiệu quả kích thích tăng

trưởng và kiểm soát nấm bệnh của oligochitosan. Oligochitosan (KLPT 4.000 – 6.000

g.mol-1) ở nồng độ 60 – 80 mg.L-1 thể hiện khả năng kích thích tăng trưởng và kháng

bệnh thán thư trên cây ớt được công bố bởi Phạm Đình Dũng và cs (2016) [44, 110].

Tác giả Nguyễn Quốc Hiến và Bùi Phước Phúc (2015) trong nghiên cứu của mình đã

xác nhận oligochitosan có hiệu ứng kích thích tăng trưởng đối với cây mía và cây lúa

[111]. Đặng Xuân Dự (2015) báo cáo rằng oligochitosan có khối lượng phân tử

15.000 g.mol-1 có hiệu quả kháng khuẩn Escherichia coli cao (~99%) ở nồng độ 400

mg.L-1 [19]. Bùi Duy Du và cs (2015) nghiên cứu khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu

do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long do kích thích sản sinh

enzyme chitinase khi xử lý oligochitosan (khối lượng phân tử ~5.000 g.mol-1) ở nồng

độ 150 mg.L-1 đạt hiệu quả 81% so với đối chứng [112].

Khả năng đề kháng của chitosan và oligochitosan đối với một số loại vi khuẩn,

vi nấm được coi là đặc tính có vai trò quan trọng nhất liên quan đến khả năng ứng

dụng của chúng. Theo Jeon và cs, oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ từ 1.000

- 10.000 g.mol-1 cho thấy có hoạt tính kháng hầu hết các vi khuẩn và hoạt tính kháng

khuẩn tăng theo chiều tăng khối lượng phân tử [93]. Đặc tính quan trọng giúp

oligochitosan có tính ứng dụng cao là mặc dù nó kháng lại hầu hết các loại vi sinh vật

gây bệnh nhưng không gây hại cho các loại vi sinh vật có lợi chẳng hạn như vi khuẩn

lactic, vi nấm trichoderma.

1.3.3. Hoạt tính kiểm soát bệnh thực vật của vật liệu lai nano silica/chitosan.

Vật liệu được tạo ra giữa nano silica và oligochitosan được kỳ vọng sẽ thể hiện

hoạt tính kháng vi sinh vật của cả hai pha vô cơ và hữu cơ. Tiềm năng sử dụng vật

liệu lai nano silica/oligochitosan trong kháng vi khuẩn, vi nấm nêu trên là rất lớn vì

hiệu ứng cộng hợp kiểm soát và kích kháng bệnh thực vật. Vật liệu lai nano

silica/chitosan có khả năng kháng bệnh héo rũ do nấm Ralstonia Solanacearum gây

ra trên cây cà chua được nghiên cứu bởi Kiirika và cs (2013) [113], kháng bệnh thối

rễ do nấm Monilinia fructifolia gây ra trên cây táo bởi L. Yang và cs (2010) [114].

Theo nghiên cứu của Phạm Đình Dũng và cs (2016), Nguyễn Ngọc Thủy và cs (2017)

cho thấy vật liệu lai giữa oligochitosan và nano silica có hiệu ứng kích thích tăng

trưởng và kháng bệnh thán thư trên cây ớt [45, 110]. Sử dụng oligochitosan/nano

silica với nồng độ tương ứng 50 mg.L−1, 50 mg.L−1 đã gia tăng trọng lượng khô, trọng

lượng tươi, chiều cao cây và hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b so với đối chứng.

Thí nghiệm xử lý bằng cách phun dung dịch oligochitosan/nano silica trên cây ớt

trước lây nhiễm nhân tạo nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư đã làm nấm

bệnh không thể sinh trưởng, còn thí nghiệm đối chứng không phun

oligochitosan/nano silica thì nấm bệnh phát triển với tỉ lệ bệnh là 100% sau 35 ngày

lây nhiễm nấm.

Ngoài ứng dụng trong kiểm soát nấm bệnh thực vật, vật liệu nano

silica/chitosan còn được nghiên cứu sử dụng trong bảo quản nông sản, thực phẩm. Ví

dụ, nano silica/chitosan có khả năng chống sự xâm nhập của vi sinh vật trong nhiều

loại nông sản như quả nhót tây (Eriobotrya japonica Lindl.) trong nghiên cứu của

Song và cs (2016) [115]. Chitosan/silica còn được nghiên cứu chế tạo màng sinh học

chứa 1% chitosan và 0,04% silica, nó được sử dụng để bọc bảo quản quả táo ở nhiệt

độ thường, tác dụng của màng bọc đã làm tăng hàm lượng các enzyme chống oxy hóa

và làm chậm quá trình suy giảm hàm lượng các chất dinh dưỡng như flavonoid và

vitamin C trong trái cây [116]. Màng bọc chitosan/SiO2 sử dụng để bảo quản quả nhãn

đã làm giảm chỉ số hóa nâu, hạn chế mất khối lượng, giảm hàm lượng các chất

malondialdehyde và polyphenoloxidase trong trái [117]. Trong các nghiên cứu này,

các tác giả cũng đã chứng minh màng bào quản trái cây nano silica/chitosan có hiệu

ứng kháng khuẩn cao hơn so với màng chitosan không chứa nano silica [110, 117].

Hiện nay các công bố về tổng hợp và nghiên cứu khả năng kháng các loại vi

sinh vật gây bệnh thực vật, khả năng sản sinh các protein liên quan đến mầm bệnh để

chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh thực vật của vật liệu nano

silica/oligochitosan còn hạn chế vì chúng mới được tập trung nghiên cứu trong vài

năm gần đây. Vì vậy, việc tiến hành nghiên cứu tổng hợp và thử nghiệm hiệu ứng

kiểm sát bệnh thực vật của vật liệu nano silica/oligochitosan trên các đối tượng bệnh

và cây trồng được nghiên cứu là có tính mới về khoa học và thực tiễn.

1.4. Triển vọng của việc sử dụng vật liệu nano silica/oligochitosan làm chất kiểm

soát bệnh thực vật.

Ngành trồng trọt có vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp tại, nó chiếm

75% giá trị trong sản xuất nông nghiệp. Theo thống kê năm 2019 diện tích đất sản

xuất nông nghiệp vào khoảng 11,5 triệu ha. Các loại nông sản chủ lực, có sản lượng

cao và giá trị xuất khẩu của Việt Nam là cao su, cà phê, hồ tiêu, lúa, thanh long, rau

củ và các loại cây lương thực khác, ... Để đạt hiệu quả trong sản xuất nông nghiệp

cần thiết phải sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để kiểm soát các loại bệnh gây hại cây

trồng. Các loại thuốc bảo vệ thực vật sử dụng hiện nay thường là thuốc tổng hợp hóa

học độc hại ảnh hưởng tới sức khỏe con người, để lại tồn dư trong nông sản gây nguy

cơ ngộ độc thực phẩm và gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy, để đáp ứng nền sản xuất

nông nghiệp an toàn, cần thiết phải phát triển các loại thuốc BVTV thế hệ mới, ít độc,

an toàn, hiệu quả cao thay thế thuốc bảo vệ thực vật độc hại.

Các loại bệnh gây hại thực vật và xuất hiện thường xuyên ảnh hưởng tới năng

suất, chất lượng nông sản trên các loại cây trồng chủ lực tại Việt Nam là: bệnh đốm

nâu trên cây thanh long do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra, bệnh tuyến trùng

hại rễ trên cà phê, hồ tiêu, cây ăn trái, cây rau màu, bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia

oryzae, bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trên cây lúa, bệnh nấm hồng

(Corticium salmonicolor) trên cây cao su, bệnh vàng lá thối rễ trên cây ăn trái, …

Bằng phương pháp tiếp cận hệ thống các tài liệu nghiên cứu về khả năng kích

kháng, và kiểm soát nấm bệnh thực vật của các loại vật liệu nano silica, oligochitosan,

vật liệu nano silica/oligochitosan cho thấy chúng có triển vọng làm thuốc bảo vệ thực

vật kiểm soát bệnh phổ rộng. Để nghiên cứu hiệu lực sinh học của vật liệu nano

silica/oligochitosan, luận án này chọn đối tượng nghiên cứu là bệnh đốm nâu trên cây

thanh long chưa có thuốc đặc trị và các bệnh thường xuyên xuất hiện, gây ảnh hưởng

lớn đến sinh trưởng và năng suất nông sản là bệnh đạo ôn và bạc lá trên cây lúa, bệnh

nấm hồng trên cây cao su.

Bệnh đốm nâu trên cây thanh long: Thanh long loại cây ăn trái có giá trị xuất

khẩu, được trồng tập trung ở các tỉnh như Bình Thuận (khoảng 27.000 ha), Long An

(khoảng 7.000 ha), Tiền Giang (khoảng 4.000 ha) và rải rác ở một số tỉnh khác. Cây

thanh long thường bị nhiễm nhiều loại bệnh như bệnh thán thư, thối quả, thối cành và

đặc biệt là bệnh đốm nâu làm giảm năng suất, chất lượng quả. Bệnh đốm nâu trên cây

thanh long do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra và tồn tại quanh năm. Vào mùa

khô, bệnh đốm nâu gây hại chủ yếu ở các đoạn gốc cành, mùa mưa bệnh phát tán mạnh lan sang các cành non mới ra, hoa và quả thanh long [118, 119]. Khi cây thanh

long mới chớm nhiễm bệnh, các đốm bệnh màu nâu xuất hiện trên cành với tỷ lệ bệnh

từ 1 - 5%. Trong mùa mưa, thông thường các vườn thanh long bị nhiễm bệnh nặng,

vết bệnh ăn sâu vào trong mạch gỗ và từ từ chuyển sang màu cam, nâu với tỷ lệ bệnh

từ 10 - 50% (Hình 1.10). Hiện nay, bệnh đốm nâu trên cây thanh long chưa có thuốc

đặc trị, biện pháp kiểm soát nấm bệnh được Cục Bảo vệ thực vật khuyến cáo là thường

xuyên cắt tỉa, tiêu hủy các nguồn bệnh, tạo điều kiện thoát nước tốt, bón phân cân

đối, sử dụng luân phiên các loại thuốc thuốc bảo vệ thực vật có khả năng kháng nấm.

Mặc dù bệnh đốm nâu trên cây thanh long mới xuất hiện trong vài năm gần

đây, cũng đã có một số công trình nghiên cứu sử dụng các loại vật liệu khác nhau để

hạn chế sự phát triển của chúng. Tác giả Bùi Duy Du và cs công bố rằng oligochitosan

khối lượng phân tử 5.000 g.mol-1 ở nồng độ 150 mg.L-1 có khả năng kích thích sản

sinh enzyme chitinase trên cây thanh long kháng bệnh đốm nâu do nấm

Neoscytalidium dimidiatum với hiệu lực kiểm soát đạt 81% so với đối chứng [112].

Một nghiên cứu khác của Phan Thị Ngọc Uyên và cs, 2018 đã báo cáo hiệu lực kháng

nấm Neoscytalidium dimidiatum của vật liệu AgNPs/chitosan trên đĩa thạch đạt hiệu

quả ở nồng độ Ag 10 ppm và chitosan 2% [120].

Hình 1.10. Vết bệnh đốm nâu trên dây, quả thanh long.

Bệnh đạo ôn và bạc lá trên lúa: Diện tích trồng lúa của Việt Nam là 7,66 triệu

ha (2019), bệnh hại trên lúa chủ yếu là bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae và

bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây hại. Hai loại bệnh trên gây thiệt hại

cho tất cả các vụ lúa trong năm. Nấm gây bệnh đạo ôn có thể tấn công trên lá, thân,

cổ bông, cổ gié hoặc hạt lúa (Hình 1.11a). Bệnh bạc lá có vết bệnh ban đầu giống như

những sọc thấm nước ở rìa lá, có màu vàng đến màu trắng, sau đó lan ra phủ toàn bộ

lá (Hình 1.11b). Hiện nay thuốc trị bệnh được sử dụng đối với đạo ôn trên lúa là Fuan

40EC (Nhật Bản), Kasai-S 92SC, Fujibem 77WP, đối với thuốc trị bệnh bạc lá trên

lúa là Agri-Life 100SL, Kaisin 50WP, Kasumin 2SL.

Vật liệu lai chứa AgNPs/CS/Tri có khả năng kháng nấm Pyricularia oryzae

được công bố bởi Phạm Đình Chương và cs (2018) tại nồng độ Ag 10 mg.L-1, CS:

4.000 mg.L-1; Trihexad 1.000 mg.L-1 có hiệu lực cao hơn so với vật liệu riêng lẻ [120].

Thuốc BVTV sử dụng hoạt chất nano Ag và chitosan tan trong nước để kiểm soát

nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa cũng đã được Bộ Nông nghiệp và

Phát triển nông thôn cấp phép lưu hành được đăng ký bởi tác giả Bùi Duy Du – Viện

Khoa học Vật liệu ứng dụng (2009) với tên thương mại MIFUM 0.6SL (số Chứng

nhận đăng ký: 5744/CNĐK-BVTV năm 2017) [122].

b) a)

Hình 1.11. Vết bệnh đạo ôn lá lúa (a); Bệnh bạc lá trên lúa (b).

Bệnh nấm hồng trên cây cao su: Cây cao su là cây trồng chủ lực ở các tỉnh

miền Đông Nam bộ. Bệnh thường gặp ở cây cao su là bệnh héo đen đầu lá (bệnh thán

thư), phấn trắng, thối trái, vàng rụng lá, nấm hồng. Bệnh nấm hồng trên cây cao su

gây ra do nấm Corticium salmonicolor là bệnh nguy hại nhất. Nấm hồng xuất hiện

trên thân và cành của cây cao su (Hình 1.12) làm giảm lượng mủ 20-70% tùy mức độ

bệnh nặng hay nhẹ. Hiện nay, các thuốc BVTV tổng hợp hóa học được khuyến cáo

sử dụng gồm: AIPORA 350SC, SAIZOLE 5SC, VANICIDE 5SL.

b) a)

Hình 1.12. Vết bệnh nấm hồng trên cây cao su (a); Vết bệnh nấm hồng gây hại nặng (b).

Một số nghiên cứu sử dụng hoạt chất nano sinh học an toàn, thân thiện với môi

trường cũng đã được nghiên cứu sử dụng kháng nấm Corticium salmonicolor: tác giả

Đặng Văn Phú và cs (2010) thử nghiệm nồng độ AgNPs 100 mg.L-1 có hiệu ứng

kháng nấm Corticium salmonicolor đạt hiệu quả 81,9% [123]. Tác giả Cao Văn Dư

và cs (2014) sử dụng CuNPs (dtb ~4 nm) ở nồng độ 7 mg.L-1 đã ức chế nấm hoàn toàn

nấm Corticium salmonicolor trên đĩa thạch trong nghiên cứu in vitro [124].

1.5. Kết luận phần tổng quan tài liệu.

Qua nghiên cứu tổng quan tài liệu về các phương pháp tổng hợp và hiệu ứng

sinh học kiểm soát nấm bệnh thực vật của nano silica, oligochitosan, vật liệu lai nano

silica/oligochitosan sử dụng nguyên liệu vỏ trấu, tro vỏ trấu và chitosan vỏ tôm, luận

án rút ra kết luận sau:

Có thể tổng hơp nano silica dạng bột bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu

để loại bỏ hoàn toàn các bon hữu cơ sau khi đã tách loại các hợp chất kim loại tương

tự như phương pháp nhiệt phân vỏ trấu. Cấu trúc mạng tinh thể, độ tinh khiết của

nano silica phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian nhiệt phân và tiền xử lý tro vỏ trấu bằng

HCl. Nano silica còn có thể thu được bằng quá trình sol-gel sử dụng phản ứng tạo kết

tủa SiO2 giữa dung dịch Na2SiO3 (chiết SiO2 trong tro vỏ trấu bằng NaOH) với axit

HCl trong dung dịch có hoặc không có chất ổn định. Phương pháp này thu được dung

dịch keo SiO2 với nồng độ thấp. Điều chế nano silica còn có thể sử dụng phương pháp

tổng hợp và nhiệt phân gel silica/polyme để thu sản phẩm có độ tinh khiết cao, điều

chỉnh kích thước hạt theo tỉ lệ khối lượng SiO2/polyme. Trong luận án này nghiên

cứu sử dụng chất tạo gel chitosan để tạo gel với SiO2 thay thế chất tạo gel độc hại

nhằm đáp ứng công nghệ xanh thu được nano silica có kích thước hạt nhỏ theo mong

muốn và có độ tinh khiết cao.

Oligochitosan được điều chế hiệu quả bằng phương pháp xử lý H2O2 ở nồng

độ thấp kết hợp với chiếu xạ dung dịch chitosan bởi tia  Co-60 hầu như không làm

thay đổi cấu trúc đơn phân tử glucosamin trong mạch chitosan và giảm được liều

chiếu xạ.

Vật liệu lai nano silica/oligochitosan có thể thực hiện bằng phương pháp phối

trộn giữa nano silica và oligochitosan hoặc thực hiện phản ứng sol-gel tạo ra nano

silica giữa Na2SiO3 với proton H+ trong dung dịch oligochitosan.

Vật liệu nano silica, oligochitosan và vật liệu lai nano silica/oligochitosan đều

có khả năng kiểm soát bệnh hại thực vật và kích thích tạo kháng thể kháng lại sự

xâm nhập vi sinh vật gây bệnh. Đặc biệt vật liệu nano silica/oligochitosan có hiệu

lực kháng một số loại vi sinh vật cao hơn so với vật liệu đơn. Những nghiên cứu về

khả năng kích kháng, khả năng kiểm soát nấm thực vật của các vật liệu nêu trên đối

với bệnh đốm nâu trên cây thanh long, bệnh đạo ôn và bạc lá trên cây lúa, bệnh nấm

hồng trên cây cao su trong luận án này là những nghiên cứu mới cần thiết thực hiện.

Chương 2. THỰC NGHIỆM

2.1. Nguyên liệu và hóa chất

Tro vỏ trấu được lấy từ lò sấy lúa sử dụng chất đốt vỏ trấu tại xã Tân Bình,

huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai. Mẫu thí nghiệm đại diện cho 5 lần lấy mẫu trong

tháng 03/2016, kết qủa phân tích thành phần hóa học của tro vỏ trấu được trình bày

trong bảng 3.1 (Ở mục 3.1).

Chitosan của Công ty cổ phần chế biến xuất nhập khẩu Thủy sản Bà Rịa -

Vũng Tàu, có độ đề acetyl (DDA%) ~ 91,4%; khối lượng phân tử trung bình ~ 44.500

g.mol-1 và số khối lượng phân tử trung bình khoảng 13.500 g.mol-1. Kết quả xác định

khối lượng phân tử được trình bày trong phần phụ lục 1.

Các hóa chất tinh khiết gồm: Axit clohyđrit (HCl 37%), natri hyđroxit (NaOH

98%), axit lactic (C3H6O3 85%), hyđrô peroxit (H2O2 30%), chitin chuẩn, N-acetyl-

glucosamine (GlcNAc) và 3,5 dinitrosalicylic axit (DNS) của Hãng sản xuất Sigma-

Aldrich, Đức. Cồn tuyệt đối (99,5%) của Công ty Cổ phần Bột giặt và Hóa chất Đức

Giang, Việt Nam và nước cất 2 lần.

Môi trường nuôi cấy nấm thạch đường khoai tây (Potato Dextrose Agar - PDA)

và dịch đường khoai tây (Potato Dextrose Broth - PDB) của Hãng sản xuất Himedia,

Ấn Độ. Giống nấm Corticium salmonicolor và Neoscytalidium dimidiatum được cung

cấp bởi bộ môn Bảo vệ thực vật – trường Đại học Nông Lâm TP.HCM và nấm

Pyricularia oryzae được cung cấp bởi bộ môn Bảo vệ thực vật của Viện Lúa Đồng

bằng song Cửu Long.

2.2. Thực nghiệm

2.2.1. Điều chế nano silica từ tro vỏ trấu.

2.2.1.1. Tách các nguyên tố kim loại có trong tro vỏ trấu

Mục tiêu tách và loại bỏ hợp chất của các kim loại như Na, K, Al, Mg, Ca, Fe

trong tro vỏ trấu để làm tăng độ tinh khiết của sản phẩm và tránh tạo thành các muối

silicate kim loại [Mn(SiO3)m] nóng chảy kết dính với nhau khi nhiệt phân. Quy trình

loại tách các hợp chất kim loại có trong tro vỏ trấu bằng HCl như sau: Cân 50 g tro

vỏ trấu cho vào cốc 500 mL, thêm 300 mL dung dịch HCl 1N, gia nhiệt trên máy

khuấy tới nhiệt độ 80oC trong thời gian 2 giờ. Tiếp theo để yên hỗn hợp ở nhiệt độ

phòng trong thời gian 24 giờ. Rửa thu tro vỏ trấu trên giấy lọc băng xanh bằng nước

cất (khoảng 3 lần) đến pH ~7. Sấy khô tro vỏ trấu trong tủ sấy ở 110 oC đến khối

lượng không đổi.

2.2.1.2. Điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu.

Quy trình điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu dựa

trên nguyên lý nhiệt phân vỏ trấu ở nhiệt độ ≥ 700 oC để đốt cháy triệt để hữu cơ và

cacbon trình bày theo hình 2.1 như sau: Tro vỏ trấu sau khi đã tách kim loại trong

oC và 800 oC trong thời gian 2 giờ thu được nano silica. Mẫu nano silica được phân

mục 2.2.1 được nhiệt phân trong lò nung ở các nhiệt độ nghiên cứu là: 700 oC; 750

Tro vỏ trấu đã xử lý HCl

tích phổ EDX, ảnh TEM, phổ FT-IR và giản đồ XRD.

Nhiệt phân

700 oC, 2 giờ 750 oC, 2 giờ 800 oC, 2 giờ

Nano SiO2 Nano SiO2 Nano SiO2

Hình 2.1. Quy trình điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu.

2.2.1.3. Điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân gel SiO2/chitosan.

Quy trình điều chế nano silica bằng phương pháp tạo và nhiệt phân gel

SiO2/chitosan được trình bày theo hình 2.2 bao gồm các bước tiến hành:

Tro vỏ trấu đã tách kim loại Chitosan (KLPT ~44.500 g.mol-1)

Dung dịch NaOH Dung dịch axit lactic 2% HCl 37%

Dung dịch Na2SiO3 Dung dịch chitosan 2%

Nhỏ từ từ

NaOH 1M Tạo gel SiO2/CS

Điều chỉnh pH ~6

Nhiệt phân gel ở 700 oC, 2 giờ

Nano silica Hình 2.2. Quy trình điều chế nano silica bằng cách nhiệt phân gel SiO2/CS.

Tổng hợp gel SiO2/chitosan: Hòa tan 60 g tro vỏ trấu (hàm lượng SiO2 ~85%)

trong 400 mL dung dịch NaOH 1N, khuấy ở nhiệt độ 80 oC trong 2 giờ, để nguội, lọc

bỏ cặn trên giấy lọc băng xanh thu dung dịch Na2SiO3. Định lượng hàm lượng SiO2

trong dung dịch thu được bằng phương pháp kết tủa SiO2 với HCl. Kết quả hàm lượng

SiO2 trong dung dịch Na2SiO3 ~12% (w/v). Sử dụng dung dịch trên để pha 4 loại

dung dịch Na2SiO3 có hàm lượng SiO2 (w/v) lần lượt là 2%; 4%; 8% và 12%. Mỗi

loại dung dịch Na2SiO3 có thể tích 50 mL. Pha dung dịch chitosan 2% (w/v) + HCl

1 N: Cân 4,4 g chitosan (độ ẩm của chitosan là 10%) cho vào 170 mL dung dịch axit

lactic 2%, khuấy 15 phút và ngâm trong 2 giờ. Tiếp tục khuấy 2 giờ ở nhiệt độ 50oC,

lọc bỏ cặn thu dung dịch qua lưới thép không rỉ (kích thước lỗ 200 mesh). Thêm 19,72

g HCl 37% vào dung dịch chitosan để đạt nồng độ HCl 1N và thêm nước cất định

mức đủ 200 mL, chia thành 4 phần chứa trong cốc thủy tinh, mỗi cốc 50 mL dung

dịch. Tạo gel SiO2/chitosan: Vừa nhỏ từ từ vừa khuấy 04 loại dung dịch Na2SiO3,

mỗi loại 50 mL đã chuẩn bị ở trên lần lượt vào 4 cốc chứa 50 mL dung dịch chitosan

2%. Khuấy hỗn hợp trong 10 phút. Dùng NaOH 1N nhỏ giọt điều chỉnh pH hỗn hợp

về ~6, thu được gel SiO2/chitosan có tỉ lệ khối lượng SiO2/chitosan lần lượt là 1/1;

-,… bằng hỗn hợp cồn 98/nước (50/50). Sấy

2/1; 4/1 và 6/1. Cắt nhỏ gel SiO2/chitosan có kích thước khoảng 5  5 mm và rửa

sạch, loại bỏ các ion Na+, Cl-, C3H5O3

khô gel SiO2/chitosan.

Nhiệt phân gel SiO2/chitosan: Nung gel SiO2/chitosan trong 2 giờ ở nhiệt độ

700 oC bằng lò nung Nabertherm (Đức) thu được nano silica ở dạng bột. Mẫu nano

silica được phân tích phổ EDX, ảnh TEM, phổ FT-IR và phổ XRD.

2.2.2. Điều chế oligochitosan khối lượng phân tử từ 3.000 – 7.000 g.mol-1.

Oligochitosan có khối lượng phân tử khác nhau (KLPT1 ~3.000 g.mol-1;

KLPT2 ~5.000 g.mol-1; KLPT3 ~7.000 g.mol-1) được điều chế bằng phương pháp sử

dụng tác nhân oxy hóa H2O2 kết hợp chiếu xạ tia  Co-60 theo 03 bậc (03 lần bổ sung

H2O2 đạt 0,5%) cắt đứt liên kết β-1,4 glucozit giữa các đơn phân tử D-glucosamin

trong mạch chitosan như sau:

Hòa tan 4,4 g chitosan (chitosan 10% độ ẩm) trong 80 mL dung dịch axit lactic

2%, thêm 3,33 mL dung dịch H2O2 30% để ngâm trong 24 giờ, thêm 1,67 mL dung

dịch H2O2 30% và nước cất để thu được 100 mL dung dịch chứa 4% chitosan. Dung

dịch trên được chiếu xạ với liều chiếu xạ từ 7 - 49 kGy ở áp suất và nhiệt độ thường

trên nguồn chiếu xạ công nghiệp gamma SVST Co-60/B irradiator với nguồn xạ tia

 Co-60 với suất liều là 1,12 kGy/giờ tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công

nghệ Bức xạ TP.HCM.

Sau mỗi lần chiếu xạ với liều chiếu xạ 7 kGy đều bổ sung 1,67 mL dung dịch

H2O2 30% vào dung dịch chitosan để chiếu xạ tiếp cho đến liều chiếu xạ 21 kGy (03

lần bổ sung H2O2 đạt nồng độ 0,5%). Sau liều chiếu xạ 21 kGy thì không bổ sung

H2O2. Sau mỗi liều chiếu xạ 7 kGy, mẫu bột oligochitosan thu được từ kết tủa dung

dịch oligochitosan bằng cách thêm cồn tuyệt đối 99,5% tỷ lệ thể tích cồn/dung dịch

oligochitosan ~ 4/1 và sấy khô ở 60 oC. Mẫu oligochitosan được xác định khối lượng

phân tử bằng phương pháp sắc lý lọc gel (GPC), đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier

(FT-IR) và giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD). Mẫu được bảo quản để làm thí nghiệm tiếp

theo.

Chitosan (KLPT ~44.500 g.mol-1)

H2O2

Hỗn hợp CS 4%/ H2O2 1%

Chiếu xạ theo 03 bậc (03 lần chiếu xạ 7 kGy bổ sung H2O2)

Axit lactic

Dung dịch CS 4%

Bổ sung H2O2 sau mỗi đợt chiếu xạ

Chiếu xạ dung dịch CS 4%/ H2O2 0,5%

Kết tủa bằng Cồn

OC có khối lượng phân tử khác nhau

Hình 2.3. Quy trình điều chế oligochitosan có khối lượng phân tử khác nhau.

2.2.3. Điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan.

2.2.3.1. Điều chế vật liệu nano silica/oligochitosan bằng phương pháp phối trộn.

Quy trình điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan bằng phương pháp

phối trộn nano silica và oligochitosan theo quy trình ở hình 2.4 như sau:

OC KLPT khác nhau

Nano SiO2 (dtb ~ 45 nm)

DD axit lactic 1% Tẩm ướt trong hỗn hợp C2H5OH/H2O ~ 1/1

Dung dịch OC 2% Nano SiO2 đã tẩm ướt

Khuấy 30 phút, chỉnh pH ~6

Vật liệu lai nano silica/oligochitosan

Hình 2.4. Quy trình điều chế vật liệu nano SiO2/OC bằng phương pháp phối trộn.

a) Nghiên cứu ảnh hưởng khối lượng phân tử OC đến kích thước hạt nano silica.

Pha dung dịch oligochitosan 2% (w/v): Cân 2 g OC có khối lượng phân tử

khác nhau (KLPT1 ~3.000 g.mol-1; KLPT2 ~5.000 g.mol-1; KLPT3 ~7.000 g.mol-1)

thu được ở mục 2.2.3 hòa tan 100 mL dung dịch axit lactic 1% (w/v) thu được dung

dịch OC có pH ~4. Điều chỉnh đến pH dung dịch đến 5,5 – 6,0 bằng dung dịch NaOH

1N. Tẩm ướt 1,5 g nano silica bằng 5 mL hỗn hợp C2H5OH/H2O (v/v) ~ 1/1, để trương

trong 15 phút. Cho nano silica đã tẩm ướt vào dung dịch OC đã chuẩn bị ở trên, thêm

nước đủ 100 mL, khuấy liên tục trong 10 giờ (tốc độ khuấy 400 v/p), thu được vật

liệu nano silica/oligochitosan. Vật liệu nano silica/oligochitosan được đo phổ FT-IR,

giản đồ XRD và chụp ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).

b) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano silica đến kích thước hạt.

Tẩm ướt lần lượt 1,0 g; 1,5 g và 2,0 g nano silica bằng 5 mL hỗn hợp

C2H5OH/H2O (v/v) ~ 1/1, để trương trong 15 phút. Cho nano silica đã tẩm ướt vào

90 mL dung dịch oligochitosan (OC3000) đã chuẩn bị ở trên, thêm nước đủ 100 mL,

khuấy liên tục trong 10 giờ (tốc độ khuấy 400 v/p), thu được vật liệu nano

silica/oligochitosan với các hàm lượng SiO2 lần lượt là 1,0%; 1,5% và 2,0% (w/v).

Vật liệu nano silica/oligochitosan được đo phổ FT-IR, UV-vis, giản đồ XRD và chụp

ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để theo dõi sự tăng kích thước hạt theo

thời gian và xác định độ bền bằng cách đo thế điện kép zeta.

2.2.3.2. Điều chế vật liệu nano silica/oligochitosan bằng phương pháp kết tủa nano

SiO2 trong dung dịch oligochitosan.

Quy trình điều chế vật liệu nano silica/oligochitosan bằng phương pháp kết tủa

nano SiO2 trong dung dịch oligochitosan tương tự như quy trình tạo gel nano

SiO2/chitosan được trình bày theo hình 2.5 như sau:

OC (KLPT ~3.000 g.mol-1) SiO2 tro vỏ trấu

Dung dịch NaOH 1N Dung dịch axit lactic 2%

Dung dịch Na2SiO3: SiO2 2%; 3% và 4% Dung dịch OC 4%

Nhỏ từ từ

Hình thành gel nSiO2/OC

Điều chỉnh về pH~ 6,5

Vật liệu lai nano silica/oligochitosan

Hình 2.5. Quy trình điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan bằng phương pháp kết tủa nano SiO2 trong dung dịch oligochitosan.

Vật liệu nano silica/oligochitosan chứa nano SiO2 1,0%; 1,5% và 2% được

phân tán trong dung dịch 2% oligochitosan 3.000 g.mol-1 được điều chế như sau:

Pha 03 loại dung dịch Na2SiO3, mỗi loại 30 mL có hàm lượng SiO2 lần lượt là

2%; 3% và 4% từ dung dịch Na2SiO3 12% chiết từ tro vỏ trấu (mục 2.2.1). Đồng thời

pha 03 mẫu, mỗi mẫu 50 mL dung dịch 4% oligochitosan 3.000 g.mol-1 trong dung

môi axit lactic 2%. Thêm vào mỗi mẫu 4,93 g HCl 37% để đạt nồng độ HCl 1N dùng

phản ứng với Na2SiO3 hình thành nano silica trong dung dịch oligochitosan

Vừa nhỏ từ từ vừa khuấy lần lượt 03 loại dung dịch Na2SiO3 đã chuẩn bị ở trên

vào 03 cốc chứa 50 mL 4% oligochitosan 3.000 g.mol-1. Dùng NaOH 1N nhỏ giọt

điều chỉnh dung dịch đến pH ~6,5, thu được các dung dịch keo nano

silica/oligochitosan có nồng độ OC3000 2% và hàm lượng nano silica lần lượt là

1,0%, 1,5 và 2,0%. Vật liệu nano silica/oligochitosan được đo phổ FT-IR, UV-vis,

giản đồ XRD và chụp ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để theo dõi sự tăng

kích thước hạt theo thời gian và xác định độ bền bằng cách đo thế điện kép zeta.

2.2.4. Xác định độc tính của vật liệu lai nano silica/oligohitosan.

2.2.4.1. Xác định độc tính cấp (LD50).

Độc tính cấp của vật liệu nano silica/oligohitosan xác định theo phương pháp

Litchfield-Wilcoxon của WHO và Behrens-Karber [125, 126] tiến hành như sau:

Độc tính cấp (LD) của vật liệu nano silica/oligohitosan thử nghiệm trên chuột

nhắt, cho uống qua đường miệng. Trước khi cho uống thuốc thử, chuột bị bỏ đói trong

18 giờ. Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 3 lô: mỗi lô 6 con gồm 3 con

đực và 3 con cái. Lô chuột đối chứng uống nước cất, các lô thử uống vật liệu nano

1, 3.000 mg.kg-1 thể trọng. Mỗi con chuột uống thuốc thử 3 lần trong thời gian 24 giờ,

silica/oligochitosan (SiO2 1,5%/OC3000 2%) với các mức liều lượng gồm 300 mg.kg-

mỗi lần uống cách nhau ít nhất 3 giờ. Nước cất và thuốc thử được đưa thẳng vào dạ

dày chuột bằng kim cong đầu tù với cùng thể tích 0,2 mL dung dịch/10 g thể trọng

chuột/lần.

Theo dõi tình trạng sức khỏe chung và số lượng chuột chết ở mỗi lô thí nghiệm

trong sau thời gian 24 giờ. Tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày

thứ 15 sau khi uống thuốc thử lần đầu. Xác định liều cao nhất chuột không chết và

liều thấp nhất gây chết 100% số chuột.

2.2.4.2. Xác định độc tính kích ứng da (nhạy cảm da) trên chuột.

Độc tính kích ứng da (nhạy cảm da) trên chuột của vật liệu nano

silica/oligochitosan (SiO2 1,5%/OC3000 2%) bằng được xác định bằng thử nghiệm

Buehler. Quy trình tiến hành như sau:

Trước thời gian 24 giờ tiến hành thử nghiệm, cạo sạch lông ở vùng lưng của

chuột nhắt. Thuốc thử sử dụng vật liệu nano silica/oligochitosan nguyên trạng. Mẫu

thử được bôi lên vùng da đã cạo lông và theo dõi phản ứng của vật liệu với da chuột.

Thử nghiệm được thực hiện trên 3 nhóm chuột.

Nhóm thử vật liệu: Gồm 20 con chuột nhắt trắng (10 đực và 10 cái). Chất tiếp

xúc vùng da nhạy cảm là mẫu vật liệu nano silica/oligochitosan (dùng nguyên mẫu).

Nhóm đối chứng âm: Gồm 06 con (03 đực và 03 cái). Chất tiếp xúc vùng da

nhạy cảm là nước cất.

Nhóm đối chứng dương: Gồm 06 con (03 đực và 03 cái). Chất tiếp xúc vùng

da nhạy cảm là 2,4-dinitrochlorobenzene, với nồng độ là 8 mg.mL-1.

2.2.5. Nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long

của vật liệu nano silica, oligochitosan và nano silica/oligochitosan.

2.2.5.1. Chuẩn bị dịch bào tử nấm Neoscytalidium dimidiatum.

Môi trường thạch PDA (Potato dextrose agar) và môi trường lỏng PDB (Potato

dextrose both) được hấp tiệt trùng bằng thiết bị autoclave ở áp suất hơi nước 1,1

kg.cm-2 và nhiêt độ 121oC trong 30 phút trước khi sử dụng. Quy trình chuẩn bị dịch

bào tử nấm Neoscytalidium dimidiatum bao gồm các bước như sau:

Bước 1: Giống nấm Neoscytalidium dimidiatum được nhân giống cấp 1 trên

môi trường PDA ở nhiệt độ phòng (28 ± 2oC) trong 5 ngày.

Bước 2: Cấy chuyền nấm Neoscytalidium dimidiatum vào 200 mL dung dịch

môi trường PDB chứa trong bình tam giác 500 mL. Bình chứa nấm được nuôi trên

máy lắc liên tục (tốc độ khuấy 120 vòng.phút-1) ở nhiệt độ phòng (28 ± 2oC) trong

thời gian 4 ngày thu được dịch huyền phù nấm Neoscytalidium dimidiatum có mật độ

1 x 104 Cfu.mL-1. Dịch huyền phù nấm sử dụng để nghiên cứu in vivo hiệu ứng kiểm

soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long của các vật liệu nano silica, oligochitosan và

nano silica/oligochitosan theo phương pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo.

2.2.5.2. Nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long.

Thí nghiệm nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long theo

phương pháp tác giả Zahid (2014) [127]; Ali (2014) [128], Thanh (2016) [118] và

theo TCCS 162:2014/BVTV [129]. Các điều kiện thí nghiệm như sau: Giống thanh

long ruột trắng 5 năm tuổi. Phân bón sử dụng trong thí nghiệm dựa trên nhu cầu dinh

dưỡng của cây thanh long là 250 gr N + 165 gr P2O5 + 250 gr K2O/trụ/vụ, bón làm 3

đợt là sau thu hoạch, trước khi ra hoa và sau khi đậu quả.

Kích thước của mỗi ô thử nghiệm là 9 trụ (81 m2), giữa các ô thí nghiệm được

ngăn cách bằng một hàng trụ thanh long xung quanh để khi xử lý vật liệu và lây nhiễm

nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum từ không bay từ ô này sang ô khác. Thí nghiệm

được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

Thí nghiệm bao gồm các vật liệu xử lý: oligochitosan có khối lượng phân tử

~3.000 g.mol-1 (OC3000); ~5.000 g.mol-1 (OC5000); ~7.000 g.mol-1 (OC7000); nano

silica và nano SiO2/OC3000 với nồng độ phun 150 mg.L-1; thí nghiệm đối chứng âm

phun nước lã và không lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum; thí nghiệm đối

chứng dương phun nước lã và không lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum.

Phương pháp xử lý vật liệu và lây nhiễm nhân tạo nấm Neoscytalidium

dimidiatum gồm các bước như sau:

Bước 1: Các trụ thanh long được xử lý các vật liệu ướt đều với thể tích phun từ

2 - 2,5 lít/trụ.

Bước 2: Sau 24 giờ phun vật liệu thí nghiệm, lây nhiễm bệnh bằng cách phun

dịch bào tử nấm Neoscytalidium dimidiatum có mật độ 1  102 Cfu.mL-1 ướt đều trụ

thanh long với thể tích 1,5 lít/trụ.

Thu mẫu thí nghiệm: Dây thanh được cắt tại 3 vị trí khác nhau trên cùng một

cây, mỗi đoạn 20 cm, mẫu được bảo quản lạnh từ 0 – 5oC. Mẫu dây thanh long được

xử lý bằng nitơ lỏng trước khi nghiền. Nghiền 50 g mẫu với 50 mL dung dịch đệm

phốtphat (pH 7,5), ly tâm và thu dịch để xác định hoạt tính enzyme chitinase.

Xác định hoạt độ enzyme chitinase, tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu tại thời

điểm trước lây nhiễm và thời gian 24 giờ, 72 giờ, 120 giờ, 168 giờ sau lây nhiễm bào

tử nấm Neoscytalidium dimidiatum trên dây thanh long.

Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase trong cây thanh long.

Hoạt độ enzyme chitinase trên cây thanh long được xác định theo phương pháp

được mô tả bởi các tác giả Miller (1959) [130] và tác giả Tonon và cs (1998) [131].

Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân chitin bởi chitinase thành

N-acetylglucosamin (GlcNAc) theo cơ chế trình bày trong Hình 2.6.

Hình 2.6. Phản ứng thủy phân chitin bằng enzyme chitinnase.

GlcNAc là một loại đường khử. Đường khử trong môi trường kiềm nóng sẽ

khử thuốc thử DNS (axit 3,5-dinitrosalicylic) màu vàng thành axit 3-amino-5-

nitrosalicylic màu đỏ da cam (Hình 2.7). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ

thuận với mật độ quang (OD - Optical density) tại bước sóng 540 nm và hàm lượng

Đường khử trong môi trường kiềm nóng

Axit 3,5-dinitrosalicylic (màu vàng)

Axit 3-amino-5-nitrosalicylic (màu da cam)

đường khử trong mẫu.

Hình 2.7. Phản ứng của đường khử với thuốc thử DNS.

Dựa vào đồ thị chuẩn với nồng độ của N-acetylglucosamin tinh khiết và OD

ở 540 nm tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu, qua đó biết được

hoạt tính chitinase của enzyme.

Tiến hành: Hàm lượng chitinase xác định bằng cách đo lượng N-acetyl-

glucosamine được giải phóng từ phản ứng thủy phân chitin. Keo chitin (10 mg.mL-1

hòa trong dung dịch đệm phốtphat, pH 7,5) được sử dụng làm cơ chất phản ứng với

enzyme. Hỗn hợp phản ứng enzyme gồm 2 mg.mL-1 huyền phù chitin ở pH 7,5 và 2

mL dịch chiết enzyme được ủ thời gian 3 giờ trong bể ổn nhiệt 45oC. Dừng phản ứng

bằng cách đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm nguội đến nhiệt độ phòng và

bổ sung 2 mL dung dịch NaOH 2M. Hỗn hợp dung dịch phản ứng (6 mL) được chia

ra làm 02 ống nghiệm. Tiếp theo, mỗi ống được thêm 1 mL DNS, đun sôi cách thủy

trong 5 phút và làm nguội xuống nhiệt độ phòng (~30oC). Dung dịch trong ống

nghiệm đưa vào cuvet để đo cường độ hấp thụ tại bước sóng 540 nm trên máy UV-

vis. Cường độ hấp thụ trung bình của dung dịch trong 2 ống nghiệm nêu trên được

xác định trên thiết bị UV- Vis Model V630; hãng Jasco - Nhật Bản tại Trung tâm

Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ TP.HCM và so sánh với đường chuẩn

để xác định hàm lượng đường khử giải phóng ra.

1 được sử dụng để thiết lập đường chuẩn (y = 1,3587x - 0,1538; R2 = 0,9949) để biểu

Dung dịch Glc-NAc trong đệm phosphate với nồng độ từ 0,1 đến 1,0 μmol.mL-

diễn sự phụ thuộc cường độ hấp thụ vào lượng đường khử. Hoạt độ chitinase (CA)

của các mẫu cây thanh long được tính theo công thức:

CA = (X.k.V).(v.t)-1

Trong đó: CA là hoạt tính enzyme chitinase (U/g); X là lượng đường khử được

giải phóng trong quá trình thủy phân chitin (g.g-1); k là hệ số pha loãng; V là

tổng thể tích của dịch phản ứng (mL); v là thể tích của dịch chiết enzyme sử

dụng (mL); t là thời gian phản ứng (phút).

Phương pháp xác định tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu thanh long [118, 127, 129].

Mỗi ô thí nghiệm chọn ngẫu nhiên 3 trụ thanh long để điều tra cố định trong suốt

thời gian thực hiện. Trên mỗi trụ theo dõi 16 dây cố định, đại diện cho 4 hướng, mỗi

dây theo dõi một đoạn dài 50 cm (được tính từ đỉnh cành trở vào). Quan sát và phân

cấp mức độ bệnh ở cả 3 mặt của đoạn dây thanh long tại thời điểm 24 giờ, 72 giờ,

120 giờ và 168 giờ sau khi phun dịch lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum.

Đánh giá tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu trên trụ thanh long như sau:

Tỷ lệ bệnh (%) = (Số đoạn dây thanh long bị bệnh/Tổng số đoạn dây thanh

long điều tra) x 100

Chỉ số bệnh được tính theo công thức Townano Send- Heuberger:

Chỉ số bệnh (%) =

Trong đó: N: Tổng số đoạn dây điều tra

Cấp bệnh Triệu chứng

1% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh n1

< 10% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh n3

< 25% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh n5

< 50% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh n7

≥ 50% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh n9

Hiệu lực sinh học của vật liệu (%): được tính theo công thức Henderson-

Tilton:

Hiệu lực (H), % = [1-(Ta x Cb)/(Tb x Ca)] x 100

Trong đó: Ta: Chỉ số bệnh ở công thức xử lý vật liệu sau lây nhiễm.

Tb: Chỉ số bệnh ở công thức xử lý thuốc trước lây nhiễm.

Ca: Chỉ số bệnh ở công thức đối chứng sau lây nhiễm.

Cb: Chỉ số bệnh ở công thức đối chứng trước lây nhiễm.

2.2.6. Nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh đạo ôn lá và bạc lá lúa của vật

liệu lai nano silica/oligochitosan.

2.2.6.1. Nghiên cứu hiệu lực kiểm soát bệnh đạo ôn lá trên lúa của vật liệu lai nano

silica/oligochitosan.

Thí nghiệm in vivo thực hiện trong nhà lưới đánh giá khả năng kiểm soát bệnh

đạo ôn lá lúa của nano SiO2/OC3000 thực hiện theo Quy phạm 10TCN 157-1992

[132] trong nhà lưới với các điều kiện thí nghiệm như sau: Giống lúa thí nghiệm là

OM5451, phân bón sử dụng trong thí nghiệm theo nhu cầu dinh dưỡng của cây lúa

là: (100 - 120 kg) N/ha, (100 - 120 kg) P2O5/ha và (30 - 60 kg) K2O/ha, mật độ gieo

10 cây/chậu, mỗi công thức thí nghiệm bố trí 5 chậu, thí nghiệm được bố trí hoàn

toàn ngẫu nhiên, lặp lại 03 lần.

Tiến hành: Cây lúa được gieo trong chậu nhựa đường kính 30 cm với mật độ

10 cây/chậu. Cung cấp nước thường xuyên với mực nước trên chậu khoảng 3 cm. Khi

cây lúa được 20 ngày tuổi phun xử lý vật liệu nano silica/oligochitosan với nồng độ

hoạt chất nano silica/oligochitosan lần lượt là 75; 100 và 125 mg.L-1. Công thức đối

chứng âm, phun nước lã thay thế cho vật liệu thí nghiệm. Công thức đối chứng dương

xử lý bằng thuốc BVTV Trizole 75WP (0.75% Tricyclazole). Lượng dung dịch phun

ướt đều ô thí nghiệm khoảng 01 lít dung dịch thuốc thử. Thí nghiệm được phun 02

lần, cách nhau 03 ngày. Sau khi phun lần 02 một ngày, tiến hành lây nhiễm bệnh đạo

ôn bằng dịch huyền phù nấm Pyricularia oryzae với mật độ bào tử 105 Cfu.mL-1 khi

cây lúa được 24 ngày tuổi.

Phương pháp điều tra: Cố định 15 chồi trên mỗi chậu, quan sát 3 lá trên cùng

về mức độ nhiễm bệnh. Hiệu lực kiểm soát bệnh được xác định qua tỉ lệ bệnh và chỉ

số bệnh tại thời điểm sau khi lây nhiệm bệnh 7 ngày và 14 ngày so với thời điểm

trước khi lây nhiễm bệnh được tính toán theo công thức sau:

+ Tỷ lệ bệnh (%) = Số cây bị bệnh/Tổng số cây điều tra  100

+ Chỉ số bệnh (%) = (9n9 + 7n7 + 5n5 + 3n3 + n1)  100/9N

Trong đó:

N: Tổng số lá điều tra.

n1: Số lá bị bệnh ở cấp 1 có diện tích bệnh < 1%

n3: Số lá bị bệnh ở cấp 3 có diện tích bệnh 1 - 5%

n5: Số lá bị bệnh ở cấp 5 có diện tích bệnh > 5 - 25%

n7: Số lá bị bệnh ở cấp 7 có diện tích bệnh > 25 - 50%

n9: Số lá bị bệnh ở cấp 9 có diện tích bệnh > 50%

Hiệu quả kiểm soát bệnh đạo ôn lá và bệnh bạc lá của vật liệu lai nano SiO2/OC

so với đối chứng được tính theo công thức của Henderson & Tilton’s (1955) [133]

𝑇𝑎

như sau:

𝐶𝑎

H (%) = (1 − ) 100

Trong đó: Ta: tỉ lệ bệnh hoặc chỉ số bệnh của công thức thí nghiệm tại thời

điểm theo dõi; Ca: tỉ lệ bệnh hoặc chỉ số bệnh của công thức đối chứng tại thời điểm

theo dõi.

2.2.6.2. Nghiên cứu hiệu lực kiểm soát bệnh bạc lá trên lúa của vật liệu lai nano

silica/oligochitosan.

Thí nghiệm nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh bạc lá lúa của nano

SiO2/OC3000 thực hiện theo Quy chuẩn QCVN 01-14-2010/BNNPTN [134] ngoài

đồng ruộng với các điều kiện thí nghiệm gồm: Giống lúa thí nghiệm OM5451, phân

bón sử dụng trong thí nghiệm theo nhu cầu dinh dưỡng của cây lúa là: (100 - 120 kg)

N/ha, (100 - 120 kg) P2O5/ha và (30 - 60 kg) K2O/ha.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại. Kích thước

của mỗi ô thí nghiệm là 30 m2, giữa các ô thí nghiệm có hàng lúa xung quanh 2 m để

cách ly. Các thí nghiệm được xử lý phun vật liệu nano silica/oligochitosan có nồng

độ hoạt chất lần lượt là 75; 100 và 125 mg.L-1. Lượng dung dịch phun ướt đều ô thí

nghiệm 2,5 lít. Công thức đối chứng âm, phun nước lã thay thế cho vật liệu thí

nghiệm. Công thức đối chứng dương xử lý thuốc BVTV Visen 20SC (0,002%

Saisentong) theo liều lượng hướng dẫn của nhà sản xuất.

Phun xử lý bệnh khi bệnh chớm xuất hiện (tỉ lệ bệnh khoảng 5%), phun hai

lần, cách nhau 5 ngày. Hiệu lực kiểm soát bệnh được xác định qua tỉ lệ bệnh và chỉ

số bệnh tại thời điểm sau khi phun lần hai 7 ngày và 14 ngày so với trước khi phun.

Phương pháp điều tra: Mỗi ô thí nghiệm chọn 50 khóm ngẫu nhiên trên 2 đu-

ờng chéo ô, cách mép  0,5 m, tại mỗi khóm quan sát chọn 1 dảnh cao nhất để xác

định diện tích bị bệnh của 3 lá trên cùng. Tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh bạc lá được xác

định như sau:

+ Tỷ lệ bệnh (%) = Số lá bị bệnh/Tổng số lá điều tra  100

+ Chỉ số bệnh (%) = (9n9 + 7n7 + 5n5 + 3n3 + n1)  100/9N

Trong đó:

N: Tổng số lá điều tra

n1: Số lá bị bệnh cấp 1: < 5% diện tích lá bị bệnh

n3: Số lá bị bệnh cấp 3: 5 - < 10% diện tích lá bị bệnh

n5: Số lá bị bệnh cấp 5: 10 - < 25% diện tích lá bị bệnh

n7: Số lá bị bệnh cấp 7: 25 - < 50% diện tích lá bị bệnh

n9: Số lá bị bệnh cấp 9:  50 % diện tích lá bị bệnh

Hiệu quả kiểm soát bệnh bệnh bạc lá của vật liệu lai nano SiO2/OC so với đối

𝑇𝑎𝐶𝑏

chứng được tính theo công thức của Henderson & Tilton’s (1955) [133] như sau:

𝑇𝑏𝐶𝑎

H (%) = (1 − ) 100

Trong đó: Ta: tỉ lệ bệnh hoặc chỉ số bệnh của công thức thí nghiệm tại thời

điểm theo dõi; Tb: tỉ lệ bệnh hoặc chỉ số bệnh của công thức thí nghiệm ban

đầu; Ca: tỉ lệ bệnh hoặc chỉ số bệnh của công thức đối chứng tại thời điểm theo

dõi; Cb: tỉ lệ bệnh hoặc chỉ số bệnh của công thức đối chứng ban đầu.

2.2.7. Nghiên cứu hiệu lực kiểm soát bệnh nấm hồng trên cây cao su của vật liệu

lai nano silica/oligochitosan.

2.2.7.1. Nghiên cứu hiệu lực in vitro kháng nấm hồng Corticium salmonicolor.

Khả năng kháng nấm Corticium salmonicolor gây bệnh nấm hồng trên cây cao

su của nano silica/oligochitosan được xác định bằng phương pháp khuếch tán vật liệu

nghiên cứu vào môi trường thạch nuôi cấy.

Tiến hành: Cân 39 g môi trường PDA hòa tan hoàn toàn vào 1 lít nước cất,

hấp tiệt trùng dung dịch trên bằng thiết bị autoclave ở áp suất hơi nước 1,1 kg.cm-2,

nhiêt độ 121oC trong thời gian 30 phút. Để nguội môi trường trong không khí (khoảng

45oC), khuếch tán nano SiO2/OC3000 vào môi trường có nồng độ khác nhau là 0

(mẫu đối chứng), 50, 75, 100, 125 và 150 mg.L-1.

Với mỗi nồng độ khảo sát, đổ dung dịch môi trường vào 03 đĩa petri ( = 90

mm), để nguội và cấy nấm Corticium salmonicolor từ giống gốc tại tâm của đĩa petri,

lặp lại thí nghiệm 03 lần.

Hiệu lực kháng nấm Corticium salmonicolor được đánh giá bằng cách xác

định đường kính phát triển của tản nấm và tính toán theo công thức sau:

H (%) = 100-(d/d0)100%

Trong đó: d0: Đường kính phát triển của tản nấm Corticium salmonicolor ở mẫu đối

chứng

d: Đường kính phát triển của tản nấm Corticium salmonicolor ở các mẫu

tương ứng với các nồng độ khảo sát.

2.2.7.2. Nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh nấm hồng trên cây cao su.

Thí nghiệm nghiên cứu hiệu lực kiểm soát in vivo bệnh nấm hồng trên cây cao

su của vật liệu OC3000; nano SiO2; nano SiO2/OC3000 được tiến hành theo Quy

phạm khảo nghiệm 10TCN 622-2005 ngoài đồng ruộng [135]. Các điều kiện thí

nghiệm như sau: Giống cao su thí nghiệm là RRIV 4 (LH 82/182), 7 năm tuổi. Mỗi

ô thí nghiệm có diện tích 20  40 m (60 cây). Thí nghiệm được thiết kế ngẫu nghiên,

lặp lại ba lần. Ô thí nghiệm được lây nhiễm bệnh bằng dung dịch nấm Corticium

salmonicolor có mật độ 1  102 Cfu.mL-1. Khi ô thí nghiệm có tỉ lệ bệnh khoảng 5%

thì tiến hành phun các loại dung dịch vật liệu oligochitosan 3.000 g.mol-1; nano silica;

nano SiO2/OC3000 nồng độ 150 mg.L-1 trực tiếp lên vết bệnh 2 lần, cách nhau 3

ngày. Ô đối chứng được phun thay thế bằng nước lã với cùng thể tích phun. Đối

chứng dương sử dụng thuốc BVTV Saizole 5SC theo liều lượng hướng dẫn của nhà

sản xuất. Đếm tổng số cành bị bệnh (kể cả thân chính, nếu có bệnh được tính là một

cành chính) và tổng số cành quan sát (bao gồm số cành cấp một, số cành cấp hai và

một thân chính).

Tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh được được xác định theo công thức sau:

+ Tỉ lệ bệnh (%) = (Số cành bị bệnh/Tổng số cành quan sát)  100

+ Chỉ số bệnh (%) = (4n4 + 3n3 + 2n2 + n1)  100/5N

Trong đó:

N: Tổng số cành quan sát

n1: Số cành bị bệnh cấp 1: Thân xuất hiện triệu chứng bệnh, nấm màu trắng, chảy

ít mủ, giọt ngắn; Cành nấm chuyển màu hồng, mủ chảy dài.

n2: Số cành bị bệnh cấp 2: Thân, cành có nấm chuyển màu hồng vết bệnh dài 20

- 40 cm, mủ chảy dài.

n3: Số cành bị bệnh cấp 3: Thân, cành có nấm chuyển màu hồng đậm vết bệnh

dài 40 - 60 cm, vỏ nứt, mủ chảy nhiều, lá héo.

n4: Số cây bị bệnh cấp 4: Thân, cành có nấm chuyển màu hồng đậm vết bệnh dài

trên 60 cm, vỏ nứt nhiều, lá khô, dưới vết bệnh có chồi mọc.

Hiệu quả kiểm soát bệnh nấm hồng trên cây cao su của nano SiO2/OC so với

đối chứng được tính theo công thức của Fairuzah, 2017 [136] như sau:

Hiệu quả % = (CSBa – CSBb)/(CSBa)  100%

Trong đó: CSBa là chỉ số bệnh trước xử lý và CSBb là chỉ số bệnh sau xử lý.

2.3. Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu.

2.3.1. Phương pháp đo giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD).

Giản đồ XRD xác định được sự có mặt của các chất và cấu trúc mạng tinh thể

của chất đó. Nguyên lý của phương pháp là dựa vào số lượng, vị trí và cường độ của

vạch phổ nhiễu xạ thu được và so sánh với dữ liệu vạch phổ chuẩn.

Tiến hành: Mẫu dạng rắn được nghiền mịn, ép thành tấm có bán kính 1 inch

và đưa vào đo giản đồ XRD trên máy ADVANCE 8-Brooker, Đức, vận hành ở điện

thế 40kV, cường độ dòng 40 mA bằng phát xạ Cu-Kα ( = 0,154 nm); góc quét 2:

5 – 70o tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng.

2.3.2. Phương pháp đo phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX)

Phương pháp phân tích phổ tán sắc năng lượng tia X dùng để phân tích thành

phần các nguyên tố trong vật liệu.

Tiến hành: Mẫu được đúc trong khuôn, mài và đánh bóng mẫu. Mẫu được

phân tích EDX trên máy kính hiển vi điện tử quét phân giải cao (FE-SEM) kết nối

với hệ tán xạ năng lượng tia X: Model JSM-7610 - JEOL JED 2300; Hãng sản xuất

JEOL - Nhật Bản tại Viện Công nghệ Hóa học.

2.3.3. Phương pháp đo phổ hồng ngoại (FT-IR)

Phương pháp phổ hồng ngoại dùng để phân tích, đánh giá các liên kết hình

thành trong vật liệu. Vị trí số sóng tại các đỉnh trong phổ hồng ngoại đặc trưng cho

các nhóm chức và các liên kết trong vật liệu. Nhóm chức và liên kết của nano silica

được xác định bằng phổ hồng ngoại trên máy FT–IR: Model FT–IR 8400S; Hãng sản

xuất Shimadzu, Nhật Bản; số sóng từ 7.800 cm-1 – 350 cm-1 tại Trung tâm Nghiên

cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ TP.HCM.

Tiến hành: Cân 0,002 g mẫu trộn chung với 0,2 g KBr rồi ép thành viên có

đường kính 13 mm và chiều dày 0,5 mm. Đo phổ hấp thụ hoặc truyền qua trong

khoảng số sóng từ 3.500 đến 400 cm-1

2.3.4. Phương pháp chụp ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Phương pháp chụp ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) với độ phân giải

cao dùng để nghiên cứu hình thái, cấu trúc vật liệu: hình dạng, kích thước hạt.

Tiến hành: Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp và siêu âm trong 10 phút.

Sử dụng pipet nhỏ 1 – 2 giọt lên bề mặt đế mẫu. Mẫu được sấy khô và tiến hành soi,

chụp ảnh mẫu trên thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua: Model JEM 1400; Hãng

sản xuất JEOL - Nhật Bản; thế gia tốc electron cực đại: 120 KV; độ phóng đại cực

đại: 800.000 tại phòng Thí nghiệm Vật liệu Polymer và Composite – Đại học Bách

Khoa TP.HCM và Viện Vệ sinh Dịch tể Trung ương.

2.3.5. Phương pháp đo phổ sắc ký lọc gel (GPC)

Phổ GPC dùng để xác định KLPT của polyme, mẫu oligochitosan được đo

trên máy LC – 20AB Shimadzu, Nhật Bản sử dụng detector RID –10A và cột

Ultrahydrogel 250 của hãng Waters, kích thước cột 7,8 x 300 mm tại Trung tâm

Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ TP.HCM. Nhiệt độ làm việc của máy

40°C, pha động sử dụng dung môi CH3COOH 0,25M/CH3COONa 0,25M với tốc độ

chảy là 1 mL/phút.

Lập đường chuẩn thời gian lưu phụ thuộc vào khối lượng phân tử của mẫu

chuẩn Pullulan: Hòa tan 0,03 g các mẫu chuẩn Pullulan có khối lượng phân tử là

380.000, 100.000, 48.000, 23.700, 12.200 và 738 g.mol-1 vào trong 1 mL dung môi

CH3COOH 0,25M /CH3COONa 0,25M. Thể tích mẫu tiêm vào cột 50 μl. Xác định

thời gian lưu của các mẫu dung dịch pullulan từ phổ đồ GPC (Bảng 2.1). Thiết lập

đường chuẩn trên máy tính và mối tương quan giữa khối lượng phân tử và thời gian

lưu (Hình 2.8).

Bảng 2.1. Khối lượng phân tử và thời gian lưu của các mẫu chuẩn Pullulan

Số TT mẫu 1 2 3 4 5 6

Thời gian lưu (Phút) 6,060 6,601 7,117 7,690 8,177 9,946

380 100 48 23,7 12,2 0,738 KLPT  103 (g.mol-1)

Hình 2.8. Đường chuẩn tương quan giữa khối lượng phân tử và thời gian lưu của Pullulans chuẩn.

Tiến hành đo mẫu: Cân 0,05 g chitosan hòa tan trong 10 mL dung dịch đệm

CH3COOH 0,25M/CH3COONa 0,25M. Dung dịch chitosan 0,5% được sử dụng bơm

lọc qua giấy lọc sợi thủy tinh. Sau đó tiêm mẫu với thể tích 50 μl vào cột sắc ký. Các

điều kiện khác tương tự như đã mô tả đối với mẫu chuẩn pullulan. Xác định thời gian

lưu và đối chiếu với đường chuẩn để có khối lượng phân tử của mẫu chitosan cần đo.

2.3.6. Phương pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-vis)

Nguyên tắc của phương pháp: Phương pháp này dựa vào việc đo cường độ

ánh sáng còn lại sau khi đi qua dung dịch bị chất phân tích hấp thụ một phần. Nếu

dung dịch phân tích trong suốt thì gọi là phương pháp đo màu. Phương pháp trắc

quang UV-vis có thể dùng để định tính, định lượng các chất có màu và dung dịch keo.

Để định tính, mẫu chất có phổ hấp thụ và bức sóng hấp thụ cực đại đặc trưng trong

vùng giới hạn.

Tiến hành thí nghiệm: Dung dịch keo để ổn định trong điều kiện bình thường,

pha loãng bằng nước đến 0,1 mM (tính theo nồng độ ban đầu), đưa mẫu vào cuvet

thạch anh có chiều dày 1 cm, tiến hành ghi phổ trong dải bước sóng từ 800 - 200nm,

trên máy UV-2401PC, Shimadzu, (Nhật) tại Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng.

Dựa trên kết quả cường độ hấp thụ (E) và bước sóng hấp thụ UV-vis cực đại

(max) của dung dịch keo để suy đoán sự thay đổi tính chất và liên kết của vật liệu.

2.3.7. Phương pháp đo thế điện kép zeta

Thế zeta (ξ) là đại lượng đặc trưng cho sự ổn định của hệ phân tán các hạt rắn

trong chất lỏng (còn gọi là hệ keo). Các hạt với điện tích bề mặt nhất định sẽ hấp thụ

những ion có điện tích trái dấu từ trong dung dịch để tạo thành một lớp điện tích bao

quanh hạt. Những ion trên lớp điện tích này lại hấp thụ các ion trái dấu với chúng

trong dung hình thành nên một lớp điện tích kép: lớp trong gồm các ion liên kết mạnh

với bề mặt hạt và lớp ngoài (lớp khuếch tán) liên kết yếu hơn với bề mặt hạt.

Thế zeta được đo bằng cách áp đặt một điện trường qua hệ phân tán, dưới tác

dụng của điện trường, các hạt trong hệ sẽ di chuyển theo chiều nhất định với vận tốc

tỷ lệ với độ lớn của thế zeta. Giá trị của thế zeta phụ thuộc vào nhiều yếu tố tác động

bao gồm: độ pH, độ dẫn điện của môi trường và các thành phần trong hệ. pH của môi

trường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thế zeta, tồn tại pH của môi trường mà hệ

keo không ổn định, và có một điểm mà thế zeta bằng không, tại đó hệ keo kém ổn

định nhất (điểm đó gọi là điểm đẳng điện). Nói cách khác thì hệ keo càng ổn định khi

thế zeta của hệ xa điểm đẳng điện nhất (ξ có giá trị gần 30 mV). Thế zeta của các

dung dịch được đo trên máy Nano PARTICA (SZ-100Z; Horiba, Nhật Bản) tại Viện

Khoa học Vật liệu ứng dụng.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thành phần hóa học của phế thải tro vỏ trấu trước và sau xử lý HCl.

Tro vỏ trấu của lò đốt công nghiệp sử dụng cho sấy lúa được phân tích thành

phần hóa học trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Thành phần hóa học của phế thải công nghiệp tro vỏ trấu.

Thành phần SiO2 K2O Na2O Fe2O3 Al2O3 MgO CaO Độ ẩm MKN

85,39 0,45 0,11 0,56 0,12 0,66 0,78 6,78 10,90 Hàm lượng (% w/w)

Ghi chú: MKN – Mất khi nung. Kết quả phân tích tại Trung tâm Công nghệ môi

trường tại TP.HCM.

Như vậy, phế thải tro vỏ trấu có thành phần SiO2 > 85% nên phế liệu này hữu

ích, có giá trị và thích hợp trong điều chế silica và nano silica sử dụng trong các ngành

công nghiệp khác nhau.

Từ kết quả thành phần hàm lượng các nguyên tố hóa học trong phế thải tro

trấu ở bảng 3.1, theo các nghiên cứu của các công trình công bố trước đây [136, 138]

trước khi nhiệt phân vỏ trấu điều chế nano silica cần thiết phải loại bỏ các hợp chất

kim loại để thu được sản phẩm tinh khiết, kích thước hạt nhỏ. Nếu không tách loại

các kim loại Na, K trong phế liệu tro vỏ trấu thì sẽ hình thành các muối silicate

Na2SiO3, K2SiO3 nóng chảy ở nhiệt độ trên 300 oC làm kết tụ các hạt nano silica do

đó tăng độ lớn của hạt. Mẫu tro vỏ trấu được tiến hành tách các oxit kim loại theo

quy trình mô tả trong mục 2.2.1 và có kết quả phân tích thành phần trong bảng 3.2

như sau:

Bảng 3.2. Thành phần tro vỏ trấu sau khi xử lý với axit HCl 2N, thời gian 2 giờ.

MKN Thành phần SiO2 K2O Na2O Fe2O3 Al2O3 MgO CaO Độ ẩm

88,95 KPH KPH KPH KPH KPH KPH 4,98 11,01 Hàm lượng (% w/w)

Ghi chú: KPH: - Không phát hiện; MKN: - Thành phần bị mất khi nung

Theo kết quả phân tích trong bảng 3.2, tro vỏ trấu xử lý axid HCl 2N trong

thời gian 2 giờ đã loại bỏ hoàn toàn các hợp chất kim loại gồm Ca, Al, Mg, Na, Fe,

K,… Theo kết quả đo phổ EDX xác định thành phần các nguyên tố chủ yếu trong tro

vỏ trấu trước và sau khi xử lý với axit HCl được trình bày trong hình 3.1 cho thấy

trong tro trấu ban đầu có chứa hợp chất của các kim loại như Ca, Al, Mg, K, và Si

(Hình 3.1a), và sau khi xử lý với axit HCl thì trong phổ EDX của tro vỏ trấu không

quan sát thấy xuất hiện các đỉnh hiện thị các nguyên tố kim loại. Phổ EDX chỉ có ba

đỉnh đặc trưng cho ba nguyên tố Si, O, C là thành phần cấu tạo nên SiO2 và cacbon

(Hình 3.1b). Tro vỏ trấu sau xử lý với axit HCl vẫn còn màu đen xám đặc trưng của

cacbon (Hình 3.2b). Như vậy có thể khẳng định rằng quy trình tách hợp chất kim loại

trong tro vỏ trấu bằng HCl 1N tỏ ra hiệu quả cao.

a) b)

Hình 3.1. Phổ EDX của tro vỏ trấu ban đầu (a) và tro vỏ trấu sau xử lý axit (b).

a) b)

Hình 3.2. Tro vỏ trấu đã xử lý axit HCl (a) và nano silica (nhiệt phân tro vỏ trấu).

3.2. Kết quả điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân.

3.2.1. Điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu.

Theo nghiên cứu của Gu và cs (2015) khi nhiệt phân vỏ trấu ở nhiệt độ trên

700 oC thì thời gian 2 giờ đã đốt cháy hoàn toàn các hợp chất hữu cơ trong vỏ trấu

nên trong nghiên cứu này chúng tôi chọn thời gian nhiệt phân tro vỏ trấu là 2 giờ và

nhiệt độ trên 700 oC. Nhiệt độ nhiệt phân càng cao thì quá trình đốt cháy hữu cơ và

cacbon càng triệt để nhưng nó ảnh hưởng tới kích thước hạt và cấu trúc mạng tinh thể

của nano silica thu được. Nhiệt độ nhiệt phân tro vỏ trấu trong môi trường khí quyển

được khảo sát là 700, 750 và 800 oC. Sau khi thực hiện phản ứng đốt cháy cacbon

trong lò nung, bột nano silica thu được có màu trắng (Hình 3.2b), kích thước hạt nano

silica khi nhiệt phân ở 03 nhiệt độ nêu trên được xác định qua ảnh TEM (Hình 3.3).

dtb: 475 nm

A) a)

%

, t ấ u s n ầ T

Kích thước hạt, nm

dtb: 454 nm

B) b)

%

, t ấ u s n ầ T

Kích thước hạt, nm

dtb: 485 nm

C) c)

%

, t ấ u s n ầ T

Kích thước hạt, nm

Hình 3.3. Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt của nano silica khi nhiệt phân tại: (A, a) 700 oC; (B, b) 750 oC và (C; c) 800 oC.

Từ kết quả tính kích thước trung bình hạt và biểu đồ phân bố kích thước hạt

trong hình 3.3, nhận thấy rằng tại ba nhiệt độ nhiệt phân 700 oC, 750 oC và 800 oC,

silica thu được đều có kích thước nanomet với kích thước trung bình của hạt từ 45 -

48 nm. Như vậy, trong vùng nhiệt độ 700 - 800 oC nhiệt độ hầu như không ảnh hưởng

đến kích thước hạt nano silica. Ảnh TEM chụp các hạt nano silica cho thấy, các hạt

có xu hướng dính lại với nhau có thể do quá trình phân tán mẫu bột nano silica vào

nước để chụp ảnh TEM chưa được siêu âm kỹ để phân tách các hạt. Mặc dù, nhiệt độ

nhiệt phân không ảnh hưởng đến kích thước hạt nhưng có ảnh hưởng tới vùng phân

bố kích thước hạt, nhiệt độ càng thấp thì các hạt nano silica được phân bố ở vùng có

kích thước hạt nhỏ hơn, ví dụ: ở nhiệt độ nung 700 oC, hạt nano silica có kích thước

phân bố chủ yếu ở vùng 40 - 50 nm; nhiệt độ nung 750 oC, nano silica có kích thước

phân bố chủ yếu ở vùng 40 - 60 nm; ở nhiệt độ nung 800 oC, nano silica có kích thước

phân bố ở vùng 50 - 65 nm. Trong ảnh TEM của mẫu nano silica nhiệt phân ở nhiệt

độ 800 oC (Hình 3.3c) có thể quan sát được một số hạt có hình dạng tinh thể, kết quả

này cũng phù hợp với kết quả thể hiện trong giản đồ XRD của mẫu này (Hình 3.7c)

vì xuất hiện các đỉnh đặc trưng cho cấu trúc tinh thể.

Từ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến kích thước và sự phân bố

kích thước hạt nano silica, nhiệt độ thích hợp của phương pháp nhiệt phân được chọn

từ 700 – 750 oC, ở nhiệt độ 700 oC thì quy trình tiêu tốn năng lượng lượng nhỏ nhất,

có khoảng 60% các hạt nano silica có kích thước chủ yếu nằm trong vùng từ 40 – 50

nm. Nhiệt phân tro vỏ trấu ở nhiệt độ trên 800 oC, một phần silica vô định hình đã

chuyển sang dạng tinh thể kém hoạt động hóa học [137-140].

Theo Nian và cs (2013), các hạt silica trong tro vỏ trấu có cấu trúc vô định

hình và kích thước nanomet nằm ổn định trong bộ khung hữu cơ xenlulo và lignin

[13]. Vì vậy đã có nhiều nghiên cứu quy trình đốt cháy hoàn toàn hữu cơ trong vỏ

trấu thì thu được bột nano silica. Quy trình điều chế nano silica bằng phương pháp

nhiệt phân tro vỏ trấu có thể tiến hành một hoặc hai giai đoạn. Phương pháp một giai

đoạn thực hiện bằng cách chỉ đốt cháy một lần ở nhiệt độ nhiệt phân. Trong phương

pháp nhiệt phân hai giai đoạn, giai đoạn một đốt vỏ trấu ở nhiệt độ nhỏ hơn 700 oC,

hữu cơ cháy không hoàn toàn, hàm lượng cacbon trong mẫu còn khoảng 7 - 15%; giai

đoạn hai sử dụng tro trấu để tách SiO2 bằng kiềm để điều chế nano silica. Trong

nghiên cứu của luận án này, sử dụng phế thải tro vỏ trấu chứa hàm lượng cacbon từ

5 – 6%, SiO2 trong tro vỏ trấu đã bị tác động của độ ẩm do quá trình phun nước làm

nguội tro sau khi đốt. Dưới tác động của độ ẩm, các hạt SiO2 trong tro vỏ trấu phần

lớn đã mất đi chất hữu cơ bảo vệ có thể liên kết với nhau thành cụm hạt lớn hơn qua

liên kết của nhóm silanol (-Si-OH). Vì vậy, hạt nano silica thu được khi sử dụng tro

vỏ trấu từ lò đốt công nghiệp luôn có kích thước lớn hơn khi sử dụng nguyên liệu ban

đầu là vỏ trấu, đây cũng là điều khác biệt của luận án này so với phương pháp nhiệt

phân vỏ trấu vì chúng không chịu tác động của độ ẩm. Tác giả Zakharov và cs (1993)

và Nian và cs (2013), kích thước silica trong vỏ trấu khoảng 10 – 40 nm, kết quả thí

nghiệm của luận án thu được là 45 – 48 nm cao hơn kích thước hạt trong vỏ trấu [12,

13]. Kết quả này chứng tỏ kích thước hạt trong tro vỏ trấu đã bị tăng lên do liên kết

giữa các hạt tác động bởi độ ẩm đã được biện luận ở trên tuy nhiên kích thước hạt

silica có sự thay đổi không đáng kể. Như vậy, quy trình điều chế nano silica bằng

phương pháp nhiệt phân không cần sử dụng nguyên liệu vỏ trấu mà chỉ cần sử dụng

phế thải công nghiệp tro vỏ trấu. Kích thước hạt nano silica thu được từ phương pháp

nhiệt phân phụ thuộc vào nguyên liệu sử dụng là tro vỏ trấu hoặc vỏ trấu, ngoài ra

còn phụ thuộc vào giống lúa, điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu và quy trình canh tác nên

có thể thu được nano silica trong các nghiên cứu có tính chất hóa lý khác nhau. Từ

kết quả nghiên cứu này chúng tôi giả thiết rằng: Mặc dù phần lớn các lớp hữu cơ bảo

vệ hạt silica trong tro vỏ trấu bị phân hủy do quá trình đốt nhưng lượng cacbon còn

lại khoảng 5 – 7% cũng có hiệu ứng bảo vệ, ngăn cản quá trình kết tụ của các hạt

nano silica.

Kết quả nghiên cứu điều chế nano silica có kích thước hạt trong luận án tương

đương với kết quả nghiên cứu của tác giả Gu và cs (2015) khi nhiệt phân tro vỏ trấu

ở 800 oC trong môi trường khí N2, tuy nhiên kích thước hạt nano silica thu được trong

môi trường này lớn hơn so với nano silica thu được trong môi trường khí CO2, do

môi trường khí CO2 có khả năng phân tách các hạt tốt hơn [47]. Dựa vào kết quả

nghiên cứu và biện luận nêu trên, luận án rút ra nhận xét: Tro vỏ trấu là nguyên liệu

sử dụng để điều chế nano silica hiệu qủa hơn vỏ trấu trong phương pháp nhiệt phân

do có hàm lượng SiO2 cao (85 - 90%), hiệu suất thu hồi cao, sản phẩm nano silica có

kích thước hạt (~45 nm) tương đương với phương pháp nhiệt phân vỏ trấu, môi trường

nhiệt phân là khí quyển không cần sử dụng khí trơ N2, CO2,… vì những yếu tố điều

kiện nêu trên làm tăng chi phí nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiễn. [47, 139].

3.2.2. Điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân gel SiO2/CS.

Dựa trên nguyên lý điều chế nano silica bằng phương pháp tổng hợp và nhiệt

phân gel SiO2/CTAB của Li (2011), Ma (2012), luận án nghiên cứu sử dụng chitosan

thay thế CTAB là chất hóa học độc hại đáp ứng công nghệ sản xuất thân thiện với

môi trường. Gel SiO2/CS tổng hợp bằng phản ứng giữa dung dịch Na2SiO3 với axit

trong dung dịch chitosan tại pH từ 5,5 – 6,0 (trình bày tại mục 2.2.2.2). Gel SiO2/CS

được nhiệt phân ở nhiệt độ 700 oC trong thời gian 2 giờ để loại bỏ hoàn toàn các chất

hữu cơ.

A) a) dtb: 91,9 nm

B) b) dtb: 423 nm

%

, t ấ u s n ầ T

30 25 20 15 10 5 0

5 3 - 0 3

5 4 - 0 4

0 5 - 5 4

5 5 - 0 5

0 6 - 5 5

5 6 - 0 6

0 7 - 5 6

5 7 - 0 7

0 8 - 5 7

5 8 - 0 8

Kích thước hạt, nm

dtb: 473 nm

%

, t ấ u s n ầ T

5 3 - 0 3

5 4 - 0 4

5 6 - 0 6

5 5 - 0 5

0 6 - 5 5

0 7 - 5 6

0 8 - 5 7

5 8 - 0 8

0 5 5 7 - - 5 0 4 7 Kích thước hạt, nm

D) dtb: 554 nm d)

%

, t ấ u s n ầ T

25 20 15 10 5 0

0 7 - 5 6

5 3 - 0 3

5 4 - 0 4

0 5 - 5 4

5 5 - 0 5

0 6 - 5 5

5 6 - 0 6

5 7 - 0 7

0 8 - 5 7

5 8 - 0 8

Kích thước hạt, nm

Hình 3.4. Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt của nano silica phụ thuộc vào tỉ lệ: (A; a) SiO2/CS ~ 1/1; (B; b) SiO2/CS ~ 2/1; (C; c) SiO2/CS ~ 4/1 và (D; d) SiO2/CS ~ 6/1.

Nano silica thu được từ quá trình nhiệt phân gel SiO2/CS với tỉ lệ khối lượng

SiO2/CS thay đổi từ 1/1 – 6/1 có kích thước và phân bố kích thước hạt được tính toán

qua ảnh TEM biểu diễn trong hình 3.4. Kết quả cho thấy, hàm lượng SiO2 trong gel

SiO2/CS có ảnh hưởng đến kích thước hạt nano silica, cụ thể kích thước hạt nano

silica tăng theo chiều tăng của hàm lượng SiO2. Khi tỉ lệ khối lượng SiO2/CS tăng từ

1/1 – 6/1, kích thước hạt nano silica tăng từ 91,9 nm lên 554 nm. Đối với các mẫu

gel SiO2/CS có hàm lượng SiO2 lớn hơn (tỉ lệ khối lượng SiO2/CS từ 2/1 – 6/1), nano

silica thu được có kích thước hạt lớn hơn, dtb từ 42 – 55 nm và phân bố chủ yếu ở

vùng từ 40 – 70 nm tương đương với phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu. Ảnh TEM

cho thấy, hạt nano silica thu được của phương pháp này chủ yếu là hình cầu, các hạt

silica phân tách tốt hơn và phân bố kích thước hạt trong phạm vi hẹp so với phương

pháp nhiệt phân tro vỏ trấu. Đối với mẫu gel SiO2/CS có hàm lượng SiO2 nhỏ, cụ thể

mẫu gel có tỉ lệ khối lượng SiO2/CS ~ 1/1 thì kích thước hạt trung bình nhỏ (dtb: 9 

m n

1,9 nm), các hạt phân tách rõ ràng, kích thước hạt phân bố chủ yếu ở vùng 2 - 9 nm.

, a c i l i s

42 45 47

o n a n

t ạ h

c ớ ư h t

y = -6,25x2 + 45,55x - 28,75 R² = 0,9608 25

h c í K

9 5

Tỉ lệ khối lượng SiO2/CS

1 2 4 6

Hình 3.5. Sự phụ thuộc của kích thước hạt nano silica vào tỉ lệ khối lượng SiO2/CS.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của kích thước hạt nano silica vào hàm lượng

SiO2 trong gel SiO2/CS ở hình 3.5. Kết quả phân tích hồi quy từ đồ thị 3.9 cho thấy,

kích thước hạt nano silica phụ thuộc vào tỉ lệ khối lượng SiO2/CS theo phương trình

hàm bậc 2 là y = -6,25x2 + 45,55x - 28,75 (R² = 0,9608). Như vậy, kết quả xác định

kích thước hạt nano silica khi nhiệt phân các mẫu gel SiO2/CS cho thấy khi hàm lượng

SiO2 càng nhỏ (tức là hàm lượng polyme so với SiO2 càng cao) thì các hạt silica có

kích thước nhỏ vì chúng được phân cách do hiệu ứng không gian của polyme hạn chế

các hạt bị kết tụ ở trong gel. Hiệu ứng của nồng độ chitosan bảo vệ các hạt nano silica

trong gel cũng tương tự như sử dụng polyme bảo vệ các hạt nano trong dung dịch. Ví

dụ chitosan ổn định các hạt nano CuCl, Ag, Cu2O… [114, 130, 131]. Kết quả nghiên

cứu này cho thấy, nếu muốn thu được các hạt nano silica có kích thước < 10 nm thì

tỉ lệ khối lượng SiO2/CS < 1/1, tức là phải tiêu tốn một lượng lớn chitosan. Vai trò

của chitosan trong gel SiO2/CS cũng tương tự như các hợp chất hữu cơ như xenlulo,

hemixenlulo, lignin,… trong vỏ trấu như là một bộ khung đỡ để ổn định các hạt silica

có cấu trúc nanomét.

Từ kết quả điều chế nano silica sử dụng phương pháp nhiệt phân, nhận thấy

rằng: nhiệt phân tro vỏ trấu là phương pháp đơn giản, hiệu quả để thu được các hạt

nano silica có kích thước ≥ 45 nm và không thể điều chỉnh kích thước hạt. Nhiệt phân

gel SiO2/CS có thể điều chỉnh kích thước hạt nano silica theo mong muốn bằng cách

điều chỉnh tỉ lệ khối lượng SiO2/CS trong gel nên chỉ thích hợp cho những nhu cầu

cần sử dụng nano silica có kích thước nhỏ < 40 nm. Kích thước hạt nano silica điều

chế theo phương pháp nhiệt phân phụ thuộc vào hàm lượng SiO2, có hoặc không có

chất ổn định và loại chất ổn định sử dụng. Ví dụ Lu và cs (2012) tổng hợp nano silica

bằng cách chiết SiO2 trong tro vỏ trấu với NaOH và kết tủa SiO2 trong dung dịch

H2SO4 và nung để thu được nano SiO2 có kích thước hạt trung bình 172 nm [27],

phương pháp sử dụng NH4F hoà tan SiO2 sau đó nhiệt phân thu được nano silica có

kích thước hạt 50 - 60 nm [41]. Bằng phương pháp tạo gel với chất ổn định CTAB

2% kết hợp với nhiệt phân của tác giả Lê Văn Hải và cs (2013) hạt SiO2 phân tách tốt

hơn [29], nhưng hàm lượng chất ổn định sử dụng cao dẫn đến tăng giá thành sản xuất.

Tuy nhiên CTAB là một hóa chất có chứa nguyên tố N, Br gây mùi và quá trình nhiệt

phân thải ra khí độc hại, còn chitosan là một polyme sinh học thân thiện với môi

trường.

3.2.3. Thành phần và tính chất hóa lý của nano silica.

3.2.3.1. Nghiên cứu thành phần nguyên tố, xác định độ tinh khiết của nano silica.

Hàm lượng, thành phần các nguyên tố có trong nano silica thu được bằng

phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu được xác định tương đối bằng dữ liệu EDX trình

bày trong hình 3.6. Trong phổ EDX của ba mẫu nano silica thu được bởi nhiệt phân

ở 03 nhiệt độ 700 oC, 750 oC và 800 oC đều chứa 2 nguyên tố Si và O, chứng tỏ sản

phẩm không có tạp chất khác, độ tinh khiết cao. Mẫu nano silica thu được khi nung

ở nhiệt độ 700 oC có tỉ lệ khối lượng Si/O là 46,44/53,56; mẫu nano silica thu được

khi nung ở nhiệt độ 750 oC có tỉ lệ khối lượng Si/O là 46,55/53,45 và mẫu nano silica

thu được khi nung ở nhiệt độ 800 oC có tỉ lệ khối lượng Si/O là 46,31/53,69. Các tỷ

lệ này gần với tỉ lệ khối lượng Si/O của SiO2 tinh khiết theo lý thuyết là 46,74/53,26.

Theo ghi nhận tỷ lệ khối lượng Si/O của các mẫu cho thấy, khối lượng oxy dư so với

Si trong công thức SiO2, do nano silica thu được có hàm lượng ẩm nhất định nên độ

tinh khiết của sản phẩm chưa đạt đến 100%. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp

với kết quả phân tích hàm lượng SiO2 trong nano silica bằng phương pháp hấp thụ

nguyên tử như trình bày trong bảng 3.3.

Element Weight% Atomic% O K 53.56 66.49 Si K 46.44 33.51 Totals 100.00

Element Weight% Atomic% O K 53.45 65.94 Si K 46.55 34.06 Totals 100.00

b) a)

Element Weight% Atomic% O K 53.55 66.34 Si K 46.45 34.76 Totals 100.00

Element Weight% Atomic% O K 52.69 66.43 Si K 46.31 33.57 Totals 100.00

c) d)

Hình 3.6. Phổ và dữ liệu EDX của nano silica khi nhiệt phân tại: a) 700 oC;

b) 750 oC; c) 800 oC và d) nhiệt phân gel SiO2/CS.

Bảng 3.3. Hàm lượng SiO2 trong nano silica điều chế bằng nhiệt phân tro vỏ trấu.

700 oC 750 oC 800 oC Nhiệt độ nhiệt phân

99,54 99,72 99,68 Hàm lượng SiO2 % (w/w)

Kết quả phân tích hàm lượng SiO2 trong nano silica theo TCVN 9172:2012

đạt trên 99,5 % được trình bày trong bảng 3.3. Vì vậy phương pháp nhiệt phân phế

thải tro vỏ trấu điều chế nano silica sử dụng trong luận án thu được nano silica đạt độ

tinh khiết cao và tương đương với sản phẩm nghiên cứu nhiệt phân vỏ trấu của các

tác giả khác [27, 41, 49, 110].

Nano silica thu được theo phương pháp nhiệt phân gel SiO2/CS với tỉ lệ khối

lượng SiO2/CS ~ 4/1 cũng cho thấy có độ tinh khiết tương đối cao thể hiện qua phổ

EDX (Hình 3.6d). Dữ liệu ghi phổ EDX trong hình 3.6d của mẫu nano silica chỉ chứa

02 nguyên tố Si và O với tỉ lệ khối lượng Si/O là 46,45/53,55 gần với tỉ lệ Si/O của

SiO2 tinh khiết là 46,74/53,26. Độ tinh khiết của mẫu nano silica cũng được phân tích

hàm lượng SiO2 theo phương pháp TCVN 9172 : 2012 là 99,62%. Như vậy, nano

silica thu được từ phương pháp tổng hợp và nhiệt phân gel SiO2/CS có độ tinh khiết

tương đương với nano silica thu được theo phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu.

3.2.3.2. Cấu trúc mạng tinh thể của nano silica.

Cấu trúc mạng tinh thể của nano silica thu được khi nhiệt phân ở 03 nhiệt độ

700, 750, 800 oC thể hiện qua giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) trong hình 3.7.

c)

b)

a)

Hình 3.7. Giản đồ XRD của mẫu nano silica khi nhiệt phân tại: a) 700 oC; b) 750 oC và c) 800 oC.

Hai mẫu nano silica thu được từ nhiệt phân ở nhiệt độ nung 700 oC và 750 oC

có giản đồ XRD trong hình 3.7a và 3.7b cho thấy chúng có cấu trúc hầu như là vô

định hình chỉ có một đỉnh với cường độ hấp thụ thấp tại vị trí góc 2θ ~22o. Mẫu nano

silica thu được khi nhiệt phân ở nhiệt độ 800 oC trong giản đồ XRD (Hình 3.7c) xuất

hiện thêm các đỉnh ở vị trí 220, 311, 400, 511, 440 đặc trưng cho silica cấu trúc tinh

thể lập phương tâm mặt (fcc). Vì vậy, để thu được các nano silica hoạt động cấu trúc

vô định hình, ứng dụng trong kháng vi khuẩn, kháng vi nấm cần chọn nhiệt độ nhiệt

phân nhỏ hơn 800oC, tốt nhất là nhiệt độ 700 – 750 oC vì chúng đã được khảo sát có

cấu trúc vô hình hình, phần lớn các hạt chủ yếu trong vùng có kích thước nhỏ hơn và

sử dụng năng lượng thấp hơn.

Trong canh tác nông nghiệp, silica là một nguyên tố dinh dưỡng trung lượng,

có tác dụng giúp tăng độ cứng của tế bào thực vật, chống lại sự xâm nhập của côn

trùng, nấm bệnh. Tuy nhiên, cây trồng chỉ có thể sử dụng silica có cấu trúc vô định

hình làm dinh dưỡng nên khi nhiệt phân tro vỏ trấu ở nhiệt độ cao trên 800 oC, silica

có cấu trúc tinh thể không thích hợp sử dụng trong nông nghiệp [138]. Tại Việt Nam,

vỏ trấu được sử dụng đốt để lấy nhiệt phục vụ cho các ngành sản xuất như nung gạch,

gốm, sấy nông sản. Tùy vào cấu tạo của các lò nên nhiệt độ trong lò đốt khác nhau.

Trong lò sấy đốt tráu, nhiệt độ thường 300 - 600 oC, hợp chất cacbon hữu cơ sẽ không

được đốt cháy hoàn toàn nên cho tro vỏ trấu có màu từ xám đến đen, đây là nguồn

nguyên liệu có làm lượng SiO2 cao, dồi dào, giá rẻ thích hợp cho sản xuất silica và

nano silica. Trong lò nung, nếu nhiệt độ lớn hơn 850 oC thì silica sẽ chuyển hóa từ

oC thì Si sẽ phản ứng với C hữu cơ thành thành SiC (Hình 3.8a) theo phương trình

cấu trúc vô định hình sang cấu trúc tinh thể. Nếu nhiệt độ nhiệt phân cao hơn 1.300

phản ứng SiO2 + 3C  SiC + 2CO, một dạng vật liệu bền nhiệt [141, 142]. Nano

silica có cấu trúc tinh thể ít hoạt động hóa học nên bị hạn chế khả năng ứng dụng, vì

vậy tro vỏ trấu thu gom từ lò nung gạch, gốm thì có thể sử dụng làm nguyên liệu sản

xuất nano silica nhưng hiệu quả không cao khi được ứng dụng trong canh tác nông

nghiệp là cụ thể là sử dụng làm phân bón hoặc hoạt chất kiểm soát bệnh thực vật.

a)

b)

Hình 3.8. SiC - màu xám đen (a); nano silica - màu trắng (b).

Giản đồ XRD của nano silica thể hiện trong hình 3.9 cho thấy cả 3 mẫu nano

silica thu được từ nhiệt phân gel với tỷ lệ khối lượng SiO2/CS từ 1/1 – 6/1 chỉ có một

đỉnh hấp thụ với cường độ thấp ở vị trí 2 ~22o. Như vậy, nano silica thu được có cấu

trúc hầu như là vô định hình tương tự như kết quả nghiên cứu điều chế nano silica

bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu ở nhiệt độ 700 – 750oC.

Hình 3.9. Giản đồ XRD của nano silica phụ thuộc vào tỉ lệ: a) SiO2/CS ~ 1/1; b) SiO2/CS ~ 2/1; c) SiO2/CS ~ 4/1và d) SiO2/CS ~ 6/1.

3.2.3.3. Kết quả xác định đặc trưng liên kết hóa học trong nano silica.

Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) sử dụng để nghiên cứu xác định các

dao động đặc trưng liên kết có trong nano silica. Phổ FT-IR của nano silica được điều

chế bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu thể hiện trong Hình 3.10.

a) b)

Hình 3.10. Phổ FT-IR của mẫu nano silica khi nhiệt phân tại: a) 700 oC; b) 750 oC và c) 800 oC.

Phổ FT-IR của 03 mẫu nano silica điều chế ở 03 nhiệt độ 700, 750, 800 oC đều

xuất hiện các đỉnh ở vị trí số sóng 468 và 802 cm-1 đặc trưng cho dao động của liên

kết Si-O và liên kết Si-O (silanol). Đỉnh ở vị trí số sóng 1.101 cm-1 đặc trưng cho dao

động của liên kết Si-O-Si bất đối xứng trong tứ diện S1O4. Liên kết O-H của silanol

và O-H của nước cũng xuất hiện đặc trưng bởi dải hấp thụ ở vị trí số sóng lần lượt là

3.444 và 1.637 cm-1. Dao động của liên kết O-H của H2O ở vị trí số sóng 1.637 cm-1

cho thấy nano silica có hàm lượng [29, 27, 49, 139]. Tổng hợp dữ liệu thống kê vị trí

số sóng ứng với loại liên kết của nano silica điều chế từ tro vỏ trấu thể hiện trong

Bảng 3.4.

Bảng 3.4. Dữ liệu phổ FT-IR của nano silica được điều chế bằng nhiệt phân tro vỏ trấu và nhiệt phân gel SiO2/CS.

Liên kết Tài liệu tham khảo Số sóng (cm-1) Khoảng giá trị xác định của số sóng

468 Liên kết Si–O 438 - 475 [29, 27, 49, 139].

802 Liên kết Si–O (silanol) 796 - 805 [27, 49, 139].

1101 1.050 – 1.150 [42, 43, 49, 139]. Liên kết Si–O–Si trong tứ diện S1O4

1637 Liên kết O–H (silanol) 1.633 – 1.643 [29, 49, 139].

3444 3.437 – 3.456 [29, 43, 49, 139]. Liên kết O–H của H2O

Tương tự như phổ FT-IR của mẫu nano silica thu được bằng phương pháp

nhiệt phân tro vỏ trấu, phổ FT-IR thể hiện trong hình 3.11 của các mẫu nano silica

thu được bằng phương pháp tổng hợp và nhiệt phân gel SiO2/CS từ tro vỏ trấu cho

thấy dao động liên kết Si-O thể hiện ở đỉnh có vị trí số sóng 468 - 470 cm-1 và đỉnh

có vị trí số sóng 802 – 804 cm-1 đặc trưng dao động liên kết Si-O (silanol). Tại đỉnh

ở vị trí số sóng 1.101 – 1.103 cm-1 thể hiện dao động của liên kết Si-O-Si bất đối xứng

của cấu trúc silicon đioxit (SiO2) trong tứ diện S1O4. Dao động liên kết của nhóm O-

H (SiO-H) cũng xuất hiện tại dải hấp thụ ở vị trí số sóng khoảng 3.465 – 3.481 cm-1.

[42, 47, 49, 139].

a) b)

d) c)

Hình 3.11. Phổ FT-IR của nano silica phụ thuộc vào tỉ lệ: a) SiO2/CS ~ 1/1; b) SiO2/CS ~ 2/1; c) SiO2/CS ~ 4/1và d) SiO2/CS ~ 6/1 trong gel.

Nhận xét điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân:

Sử dụng tro vỏ trấu của lò đốt công nghiệp trong phương pháp nhiệt phân để

điều chế nano silica là nghiên cứu mới của luận án so với phương pháp nhiệt phân vỏ

trấu vì lớp hữu cơ bảo vệ các hạt SiO2 trong phế liệu tro vỏ trấu đã bị đốt cháy phần

lớn dẫn đến mật độ SiO2 lớn hơn trong vỏ trấu. Nhiệt độ thích hợp nhiệt phân tro vỏ

trấu từ 700 oC – 750 oC để thu được nano silica cấu trúc vô định hình, có độ tinh khiết

cao (>99,5%), kích thước hạt từ 45 - 47 nm tương đương với kích thước hạt nano

silica thu được từ nhiệt phân vỏ trấu. Các dữ liệu nghiên cứu trong giản đồ XRD, phổ

FT-IR cho thấy nano silica có các tính chất hóa lý đặc trưng tương tự như SiO2 vô

định hình ở dạng vật liệu khối. Phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu điều chế nano

silica là phương pháp hiệu quả do tận dụng phế thải của ngành sản xuất nông nghiệp,

công nghiệp tạo ra sản phẩm có giá trị phục vụ đời sống.

Phương pháp tổng hợp và nhiệt phân gel SiO2/CS cho phép điều chế được

nano silica vô định hình có độ tinh khiết cao (99,62) tương tự phương pháp nhiệt phân

tro vỏ trấu. Trong phương pháp nhiệt phân gel có thể điều chỉnh các hạt nano silica ở

các kích thước hạt khác nhau tùy thuộc vào tỷ lệ khối lượng SiO2/CS, khi tỉ lệ SiO2/CS

nhỏ thì thu được nano silica có kích thước nhỏ. Như vậy, phương pháp tổng hợp và

nhiệt phân gel SiO2/CS phù hợp cho việc điều chế nano silica có kích thước hạt nhỏ

hơn 40 nm, kết quả trên là cơ sở khoa học cho việc tiếp tục nghiên cứu sử dụng các

polyme tạo gel khác nhằm giảm chi phí sản xuất nano silica. Nếu điều chế nano silica

có kích thước lớn hơn 40 nm thì sử dụng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu có tính

hiệu quả hơn.

3.3. Kết quả điều chế oligochitosan bằng cách xử lý chitosan bởi H2O2 kết hợp với

chiếu xạ tia  Co-60.

3.3.1. Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sự suy giảm khối lượng phân tử của

chitosan.

Mục tiêu của nghiên cứu này là điều chế các oligochitosan có khối lượng phân

vì chúng có hiệu quả tạo kích kháng thực vật. Phương pháp

tử từ 3.000 - 7.000 g.mol-1

tiến hành là xử lý bột chitosan bằng H2O2 1% để giảm khối lượng phân tử trước khi

hoà tan trong axit lactic, thêm H2O2 đạt nồng độ 0,5% và chiếu xạ dung dịch chitosan

theo 03 bậc (03 lần bổ sung H2O2 đạt 0,5%) bằng tia  Co-60 ở các liều xạ khác để

đạt được khối lượng phân tử theo mong muốn. Việc xử lý H2O2 ở nồng độ thấp kết

hợp với chiếu xạ tia  Co-60 là phương pháp hầu như không làm biến đổi cấu trúc

đơn phân tử glucosamin mà chỉ làm cắt đứt liên kết β-1,4 glucozit trong mạch chitosan

đồng thời giảm được liều chiếu xạ để thu oligochitosan có khối lượng phân tử (KLPT)

thấp so với các nghiên cứu trước đây. H2O2 là tác nhân cắt mạch hiệu quả đối với

chitosan, tuy nhiên khi sử dụng dung dịch H2O2 2% thì xảy ra quá trình đề amin (khử

nhóm -NH2) làm giảm hoạt tính sinh học của oligochitosan. Nghiên cứu này sử dụng

H2O2 ở nồng độ 0,5% và 1,0% tác động cộng hợp cắt mạch trong phương pháp chiếu

xạ là nằm trong giới hạn an toàn không làm thay đổi cấu trúc của phân tử chitosan.

Khối lượng phân tử của oligochitosan sau mỗi chu kỳ xử lý H2O2 và chiếu xạ được

trình bày ở bảng 3.5.

Số liệu ở Bảng 3.5 cho thấy, khi xử lý chitosan bằng H2O2 1%, thời gian 24

giờ thì khối lượng phân tử của chitosan giảm khoảng 50% từ 45.500 g.mol-1 xuống

22.813 g.mol-1 (mẫu CS01). Dung dịch chitosan 4% được điều chế bằng cách hòa tan

chitosan trong axit lactic, bổ sung H2O2 để đạt được nồng độ H2O2 0,5% và chiếu xạ

lần 1 bằng tia γ Co-60 ở liều chiếu xạ 7 kGy thu được chitosan có khối lượng phân tử

là 12.166 g.mol-1 (mẫu CS02). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả N. N.

Duy (2011) trong thí nghiệm cắt mạch chitosan trong dung dịch bằng bức xạ kết hợp

với H2O2 [63]. Chiếu xạ lần thứ 2 với liều chiếu xạ 7 kGy (tổng liều xạ là 14 kGy)

làm suy giảm khối lượng phân tử của chitosan xuống 6.893 g.mol-1 (mẫu CS03) đã

đạt được mục tiêu là tạo ra chitosan có khối lượng phân tử khoảng 7.000 g.mol-1.

Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Quốc Hiến, oligochitosan có khối lượng phân

tử < 7.000 g.mol-1 thì thể hiện hiệu lực cao về khả năng kích thích tạo kháng thể chống

lại mầm bệnh trên cây lúa và cây mía [22, 63, 143].

Bảng 3.5. Khối lượng phân tử của các mẫu chitosan theo liều chiếu xạ và chu kỳ chiếu xạ.

H2O2 Kí hiệu mẫu Tổng liều xạ KLPT (g.mol-1) Mn (g.mol-1) Nồng độ dung dịch chitosan Lần (bậc) chiếu xạ PI (KLPT/ Mn)

CS01 4% 0 0 1% 22.813 7.756 2,94

CS02 4% 1 7 kGy 0,5% 12.166 4.296 2,83

CS03 4% 2 14 kGy 0,5% 6.893 3.080 2,23

CS04 4% 3 21 kGy 0,5% 5.011 2.396 2,09

CS05 4% 4 28 kGy 4.630 2.319 1,99

-

CS06 4% 4 35 kGy 3.614 2.265 1,59

-

CS07 4% 4 42 kGy 3.013 2.081 1,44

-

CS08 4% 4 49 kGy 2.835 2.021 1,40

-

Tiếp tục chiếu xạ lần thứ 3 với liều chiếu xạ 7 kGy (tổng liều chiếu xạ 21 kGy),

thì thu được oligochitosan có có khối lượng phân tử 5.000 g.mol-1 (mẫu CS04). Tiếp

tục chiếu xạ thêm với liều chiếu xạ 28 kGy (tổng liều chiếu xạ 42 kGy) thu được mẫu

oligochitosan có khối lượng phân tử 3.013 g.mol-1 (mẫu CS07), chiếu xạ thêm với

liều chiếu xạ 35 kGy (tổng liều chiếu xạ 49 kGy) thu được mẫu oligochitosan có khối

lượng phân tử 2.835 g.mol-1 (mẫu CS08). Sự phụ thuộc của khối lượng phân tử của

oligochitosan vào liều chiếu xạ khi bổ sung 3 lần H2O2 đạt nồng độ 0,5% biểu diễn

trong hình 3.12.

8.000

1 - l

7.000

6.893

o m . g ,

6.000

4.630

5.000

5.011

4.000

3.013

ử t n â h p g n ợ ư

3.000

l i

3.614

2.835

ố h K

2.000

1.000

14 21 Liều xạ, KGy

Hình 3.12. Sự phụ thuộc của khối lượng phân tử của oligochitosan vào liều xạ.

Dựa trên đồ thị hình 3.12, nhận thấy tốc độ suy giảm khối lượng phân tử từ

7.000 xuống 3.000 g.mol-1 có xu hướng giảm chậm khi mẫu chitosan đã bổ sung 3

lần H2O2 tiếp tục tăng liều chiếu xạ từ 7 – 28 kGy. Oligochitosan có khối lượng phân

tử 5.000 g.mol-1 thu được khi chiếu xạ có bổ sung H2O2 đạt nồng độ 0,5% lần 3 vào

dung dịch chitosan 4% với liều chiếu xạ 7 kGy (tổng liều chiếu xạ là 21 kGy). Trong

nghiên cứu này, để chế tạo oligochitosan có khối lượng phân tử 5.000 g.mol-1 bằng

phương pháp bổ sung 03 lần H2O2 đạt nồng độ 0,5% thì liều chiếu xạ cần thiết là 21

kGy. Liều chiếu xạ này nhỏ hơn so với kết quả nghiên cứu của tác giả Đặng Xuân Dự

(2015) và Nguyễn Ngọc Duy và cs (2011). Nghiên cứu của các giả cho thấy khi chiếu

xạ dung dịch chitosan 2 lần có bổ sung H2O2 (4% chitosan/0,5% H2O2) với liều chiếu

xạ tổng 28 kGy thu được oligochitosan có khối lượng phân tử ~ 5.000 g.mol-1 [19,

63]. Đặng Xuân Dự cũng báo cáo rằng khi điều chế oligochitosan có khối lượng phân

tử 5.000 g.mol-1 bằng phương pháp chiếu xạ không bổ sung H2O2 thì liều chiếu xạ

cần thiết là 35 kGy [19].

Mặc dù, phương pháp chiếu xạ  Co-60 có hiệu quả trong việc điều chế

chitosan khối lượng phân tử thấp tuy nhiên để thu được các oligochitosan có khối

lượng phân tử nhỏ hơn 7.000 g.mol-1 liều chiếu xạ có thể lên tới 50 – 55 kGy [19, 62,

63] nên chi phí giá thành cao. Để giảm liều xạ, việc phối hợp chiếu xạ với tác nhân

hóa học là phương pháp hiệu quả. Trong các tác nhân hóa học được nghiên cứu sử

dụng để điều chỉnh khối lượng phân tử chitosan thì H2O2 là tác nhân ít độc hại, sau

phản ứng nó phân hủy thành O2 và H2O không ảnh hưởng đến môi trường. Sử dụng

H2O2 nồng độ cao thì sẽ xảy ra các phản ứng phá hủy vòng pyranose của cấu trúc

glucosamin hoặc đề amin làm giảm hoạt tính sinh học của oligochitosan [19, 62, 64],

nồng độ H2O2 thấp phản ứng xảy ra êm dịu, không làm thay đổi cấu trúc của chitosan

nhưng thời gian phản ứng kéo dài nên hạn chế khả năng ứng dụng [64]. Từ kết quả

nghiên cứu điều chế oligochitosan của luận án này, phương pháp xử lý chitosan với

H2O2 nồng độ thấp kết hợp với chiếu xạ tia  Co-60 chúng tỏ vai trò của H2O2 xúc

tiến phản ứn cắt đứt liên kết β-1,4 glycozit đã làm giảm được liều chiếu xạ nên giảm

chi phí sản xuất. Oligochitosan thu được sử dụng cho nghiên cứu điều chế vật liệu lai

nano silica/oligochitosan và sử dụng làm chất kháng vi sinh vật gây hại thực vật nhằm

kiểm soát bệnh trên cây trồng.

3.3.2. Nghiên cứu đặc trưng liên kết và cấu trúc mạng tinh thể của oligochitosan.

Sử dụng phổ FT-IR để xác định các dao động liên kết đặc trưng trong phân tử

oligochitosan thể hiện trong hình 3.13.

b)

a)

c)

d)

Hình 3.13. Phổ FT-IR: a) CS nguyên liệu; b) Mẫu CS03 (KLPT ~7.000 g.mol-1); c) Mẫu CS04 (KLPT ~5.000 g.mol-1); d) Mẫu CS07 (KLPT ~3.000 g.mol-1).

Phổ FT-IR của mẫu chitosan ban đầu và các mẫu oligochitosan khối lượng

phân tử ~3.000; 5.000; 7.000 g.mol-1 đều xuất hiện đỉnh ở vị trí số sóng 3.500 cm-1

đặc trưng cho chuyển vị của liên kết N-H và O-H, hai đỉnh ở vị trí số sóng 1.666 và

1.589 cm-1 đặc trưng tương ứng cho liên kết của nhóm -C=O và liên kết cộng hóa trị

của nhóm amino (N-H). Đỉnh ở vị trí 1.162 cm-1 đặc trưng cho dao động C=O- của

cầu nối oxy do sự khử nhóm axetyl trong vòng glucosamin. Các đỉnh ở vị trí số sóng

từ 1.028 đến 1.079 cm-1 đặc trưng cho các liên kết C-O-H, C-O-C, CH2CO. Ngoài ra,

trong phổ FT-IR của chúng còn có đỉnh ở vị trí số sóng 892 cm-1 đặc trưng dao động

liên kết của C-H trong cấu trúc của các polysaccarit. Các đỉnh ở khoảng vị trí số sóng

từ 2.920 đến 2.881 cm-1 đặc trưng cho dao động liên kết C-H. Liên kết CH-OH (cộng

hóa trị) trong phổ FT-IR được thể hiện các đỉnh có vị trí số sóng 1.413 - 1.419 cm−1.

Kết quả phân tích phổ FT-IR cho thấy quá trình suy giảm khối lượng phân tử

chitosan tạo ra các oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ hơn nhưng không làm

thay đổi cấu trúc mạch phân tử do không xuất hiện các đỉnh mới trong oligochitosan

so với chitosan ban đầu. Đối với chitosan khi chiếu xạ ở liều chiếu xạ cao là 21 kGy

và 42 kGy để thu oligochitosan có khối lượng phân tử 5.000 và 3.000 g.mol-1 (Hình

3.13c và 3.13d) có sự dịch chuyển đỉnh hấp thụ ở vị trí 3.500 cm-1 về phía vị trí có số

sóng thấp hơn chứng tỏ liên kết hydro trong phân tử với proton của oligochitosan yếu

hơn phân tử chitosan [19], nghĩa là chitosan có độ kết tinh lớn hơn oligochitosan.

Như vậy, oligochitosan có khối lượng phân tử càng nhỏ thì càng có cấu vô định hình,

điều này cũng thể hiện trong giản đồ XRD ở hình 3.15. Kết quả nghiên cứu này phù

hợp với kết quả của tác giả Nguyễn Ngọc Duy và cs (2011) [63], Đặng Xuân Dự

(2015) [19] và Nguyễn Quốc Hiến và cs (2016) [143].

Hình 3.14. Giản đồ XRD của chitosan nguyên liệu (a) và OC3000.

Giản đồ XRD của chitosan và oligochitosan có khối lượng phân tử ~3.000

g.mol-1 (OC3000) thể hiện trên hình 3.14. Kết quả cho thấy giản đồ XRD của chitosan

và OC3000 có hình dạng giống nhau và đều có 2 đỉnh cường độ thấp ở vị trí 2θ ~9,8°

và 2θ ~19,8° đặc trưng cho chitosan. Oligochitosan có cấu trúc vô định hình nhiều

hơn chitosan, tức là độ kết tinh yếu hơn chitosan chứng tỏ quá trình suy giảm khối

lượng phân tử gần như không làm thay đổi cấu trúc đơn phân tử trong mạch chitosan

ban đầu mà chỉ cắt đứt liên kết β-1,4 glucozit làm giảm khối lượng phân tử.

và

Các oligochitosan có khối lượng phân tử ~3.000 g.mol-1; ~5.000 g.mol-1

7.000 g.mol-1 được sử dụng để điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan và

nghiên cứu hiệu ứng kích kháng bệnh cây trồng phụ thuộc vào khối lượng phân tử

oligochitosan.

Nhận xét:

Phương pháp điều chỉnh khối lượng phân tử chitosan bằng xử lý H2O2 0,5%

kết hợp với bức xạ tia γ Co-60 điều chế oligochitosan là phương pháp an toàn không

làm thay đổi cấu trúc oligochitosan so với chitosan ban đầu. Việc bổ sung 03 lần H2O2

đạt nồng độ 0,5% sau mỗi chu kỳ chiếu chiếu xạ với liều 7 kGy đã làm giảm được

liều chiếu xạ, chứng tỏ phương pháp này hiệu quả, thân thiện môi trường hơn.

3.4. Kết quả điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan.

Vật liệu lai nano silica/oligochitosan được tổng hợp bằng hai phương pháp:

Phương pháp thứ nhất là phối trộn giữa nano silica và oligochitosan; phương pháp

thứ hai là hình thành nano silica trong dung dịch oligochitosan bằng phản ứng kết tủa

nano silica giữa Na2SiO3 chiết SiO2 trong tro vỏ trấu và axit.

3.4.1. Điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan bằng phương pháp phối trộn.

Sử dụng nano silica thu được từ phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu ở nhiệt

độ 700 oC trong thời gian 02 giờ có kích thước hạt trung bình 47 nm phối trộn với

các dung dịch oligochitosan có khối lượng phân tử 3.000, 5.000 và 7.000 g.mol-1 thu

được vật liệu nghiên cứu (theo quy trình tại mục 2.2.4.1).

3.4.1.1. Kích thước hạt silica trong vật liệu lai nano silica/oligochitosan phụ thuộc

vào khối lượng phân tử của oligochitosan

Axit lactic được chọn làm tác nhân proton hóa hoàn tan oligochitosan vì không

gây mùi độc hại đồng thời là hoạt chất điều hòa sinh trưởng thực vật nên thích hợp

sử dụng trong các sản phẩm an toàn ứng dụng trong nông nghiệp nói chung và thuốc

bảo vệ thực vật nói riêng.

Kích thước hạt và phân bố kích thước hạt nano silica trong vật liệu lai nano

silica/oligochitosan được tính toán qua ảnh TEM trình bày trong hình 3.15.

A) a) dtb: 573 nm

%

, t ấ u s n ầ T

51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 Kích thước hạt, nm

dtb: 544 nm B) b)

%

, t ấ u s n ầ T

49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Kích thước hạt, nm

C) c) dtb: 503 nm

%

, t ấ u s n ầ T

46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Kích thước hạt, nm

Hình 3.15. Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt nano silica trong vật liệu SiO2/OC phụ thuộc vào: (A; a) OC3000; (B; b) OC5000; (C; c) OC7000.

Ảnh TEM cho thấy khối lượng phân tử oligochitosan có ảnh hưởng tới kích

thước hạt nano silica, khi khối lượng phân tử tăng nó thể hiện hiệu ứng làm giảm kích

thước hạt nano silica. Cụ thể, trong 03 mẫu nano silica/oligochitosan, khi khối lượng

phân tử oligochitosan tăng từ 3.000 đến 7.000 g.mol-1 thì kích thước hạt giảm từ 57±3

nm xuống 50±3 nm. Hiệu ứng này xảy ra là vì khi khối lượng phân tử của polime

càng lớn thì làm gia tăng hiệu ứng không gian ngăn cản quá trình va chạm các hạt

trong dung dịch theo giải thích của Bùi Duy Du, 2009 [122]; Đặng Văn Phú, 2010

[123]; Thongthai, 2011 [69] và Al-Mulla, 2013 [144]. Điều này chứng tỏ, phương

pháp phối trộn giữa nano silica và oligochitosan tạo ra vật liệu lai dạng dung dịch keo

có xảy ra quá trình kết tụ các hạt dẫn đến sự gia tăng kích thước hạt silica so với ban

đầu. Các nano silica ban đầu có kích thước hạt là 47±5 nm tăng lên 57±3 nm, 54±4

nm và 50±3 nm tương ứng với các oligochitosan có khối lượng phân tử 3.000, 5.000

và 7.000 g.mol-1.

3.4.1.2. Kích thước hạt nano silica trong vật liệu nano silica/oligochitosan phụ thuộc

vào hàm lượng SiO2.

Chọn oligochitosan khối lượng phân tử 3.000 g.mol-1 để điều chế vật liệu lai

nano silica/oligochitosan (nano SiO2/OC) bằng phương pháp phối trộn, khi cố định

nồng độ oligochitosan 2% hàm lượng nano silica thay đổi từ 1,0%; 1,5% và 2% thì

kích thước hạt nano silica trong vật liệu lai được xác định bằng ảnh TEM biểu diễn

trong hình 3.16.

dtb: 503 nm

A) a)

%

, t ấ u s n ầ T

51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 Kích thước hạt, nm

dtb: 544 nm

%

, t ấ u s n ầ T

55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 Kích thước hạt, nm

dtb: 663 nm

%

, t ấ u s n ầ T

59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 Kích thước hạt, nm

Hình 3.16. Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt silica của nano SiO2/OC (phối trộn) phụ thuộc vào hàm lượng SiO2: a) SiO2 1%; b) SiO2 1,5%; c) SiO2 2%.

Kết quả cho thấy kích thước hạt nano silica tăng theo chiều tăng của hàm lượng

SiO2. Cụ thể mẫu nano silica/oligochitosan có hàm lượng SiO2 1%, kích thước hạt

nano silica là 50±3 nm tăng lên 54±4 nm ở mẫu nano silica/oligochitosan có hàm

lượng SiO2 1,5%, và tiếp tục tăng lên 66±3 nm ở mẫu nano silica/oligochitosan có

hàm lượng SiO2 2%. Như vậy, khi hàm lượng SiO2 càng cao thì khả năng va chạm

giữa các hạt silica do chuyển động Brown càng có xác suất lớn dẫn đến tăng kích

thước hạt [145]. Kết quả này cũng tương tự nghiên cứu của Bùi Duy Du khi chế tạo

nano Ag ổn định trong chitosan khi mật độ các hạt lớn thì có sự gia tăng kích thước

[122].

Vật liệu lai nano silica/oligochitosan có hàm lượng SiO2 1% hoặc 1,5%,

OC3000 2% là một hỗn hợp đồng nhất, không phân lớp sau thời gian bảo quản 12

tháng (Hình 3.17a, 3.17b). Đối với mẫu nano silica/oligochitosan có hàm lượng nano

SiO2 2% và OC3000 2% thì xảy ra sự tách lớp sau thời gian 2 tháng bảo quản (Hình

3.17c), chứng tỏ với hàm lượng SiO2 cao tới 2% thì nồng độ OC3000 2% chưa đủ để

ngăn cản các hạt tiếp xúc dẫn đến kết tụ và tách lớp.

a) b) c)

Hình 3.17. Mẫu vật liệu nano SiO2/OC (phối trộn): SiO2 1,0%/OC 2% (a); SiO2

1,5%/OC 2% (b) sau 12 tháng; c) SiO2 2%/OC 2% sau 2 tháng bảo quản.

3.4.2. Điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan bằng phương pháp kết tủa

nano silica trong dung dịch oligochitosan.

Phương pháp này thực hiện quá trình sol-gel bằng phản ứng giữa dung dịch

Na2SiO3 chiết SiO2 từ tro vỏ trấu với HCl trong dung dịch oligochitosan, điều chỉnh

pH của dung dịch đến pH~6 theo mô tả ở mục 2.2.4.2. Oligochitosan khối lượng phân

tử 3.000 g.mol-1 nồng độ 2% sử dụng để điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan

trong thí nghiệm này.

Hàm lượng SiO2 có ảnh hưởng của đến kích thước hạt nano silica trong vật

liệu nano silica/oligochitosan cũng theo quy luật nghiên cứu vật liệu nanomet của các

công trình công bố trước đây, kích thước hạt silica tăng cùng chiều của hàm lượng

SiO2. Kết quả khảo sát, tính toán kích thước và phân bố kích thước hạt silica thể hiện

qua ảnh TEM trong hình 3.18. Kích thước hạt silica tăng từ 41±2 nm ở mẫu có hàm

lượng SiO2 1% tăng lên tương ứng 50±2 nm đối với mẫu có hàm lượng SiO2 1,5% và

55±3 nm với mẫu có hàm lượng SiO2 2%. Khi hàm lượng SiO2 cao có nghĩa là mật

độ các hạt silica gia tăng thì chuyển động nhiệt gia tăng làm các hạt va chạm và kết

tụ tương tự như kết quả nghiên cứu phối trộn giữa nano silica và OC3000.

dtb: 412 nm A) a)

B) b) dtb: 50  2 nm

%

, t ấ u s n ầ T

47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Kích thước hạt, nm

c) dtb: 553 nm

%

, t ấ u s n ầ T

47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Kích thước hạt, nm

Hình 3.18. Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt nano silica trong nano SiO2/OC (kết tủa) phụ thuộc vào hàm lượng SiO2: a) SiO2 1%; b) SiO2 1,5%; c) SiO2 2%.

Tương tự như phương pháp phối trộn nano silica và OC3000, khi hàm lượng

SiO2 cao tới 2% thì xảy ra hiện tượng tách lớp sau thời gian lưu trữ là 2 tháng (Hình

3.19c). Hai mẫu vật liệu lai nano SiO2/OC3000 có hàm lượng silica là 1% và 1,5% là

một hỗn hợp đồng nhất, không có sự phân lớp sau thời gian lưu trữ là 12 tháng (Hình

3.19a; 3.19b). Phản ứng kết tủa tạo vật liệu nano SiO2/OC3000 theo phương pháp

này ở các mẫu có hàm lượng SiO2 cao từ 1 – 2% tạo ra các hạt nano silica có kích

thước nhỏ hơn từ 5 - 10 nm so với phương pháp trộn nano silica với OC3000. Sự

khác biệt trên có thể là do các hạt nano silica vừa hình thành từ phản ứng kết tủa SiO2

trong dung dịch được bảo vệ ngay bằng các phân tử oligochitosan, trong phương pháp

phối trộn đơn thuần chỉ thu đươc các hạt nano silica với kích thước hạt tối thiểu là

kích thước hạt của chúng ban đầu. Tuy nhiên, với sự chênh lệch kích thước hạt chỉ từ

5 - 10 nm thì chọn phương pháp phối trộn nano silica và oligochitosan tỏ ra là phương

pháp hiệu quả hơn so với phương pháp kết tủa.

c) b) a)

Hình 3.19. Mẫu vật liệu nano SiO2/OC (kết tủa): SiO2 1,0%/OC 2% (a); SiO2 1,5%/OC 2% (b) sau 12 tháng; c) SiO2 2%/OC 2% sau 2 tháng bảo quản.

3.4.3. Tính chất hóa lý đặc trưng của vật liệu lai nano SiO2/OC3000.

Thí nghiệm nghiên cứu hiệu lực kiểm soát bệnh thực vật trong luận án này

chúng tôi tiến hành trên vật liệu lai nano SiO2/OC có hàm lượng SiO2 1,5% và nồng

độ 2% bằng phương pháp phối trộn nano silica nhiệt phân tro vỏ trấu và oligochitosan

khối lượng phân tử 3.000 g.mol-1. Phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu và phương

pháp phối trộn là phương pháp sản xuất xanh, công nghệ không phức tạp và có tiềm

năng triển khai với quy mô lớn. Vì vậy, các tính chất hóa lý đặc trưng của vật liệu

này được trình bày như sau:

3.4.3.1. Cấu trúc mạng tinh thể của vật liệu lai nano SiO2/OC3000.

Giản đồ XRD mẫu nano silica điều chế bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ

trấu và vật liệu lai nano SiO2/OC3000 được điều chế bằng phương pháp phối trộn

trình bày trong hình 3.21.

Hình 3.20. Giản đồ XRD: a) nano silica điều chế bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu; b) vật liệu lai nano SiO2/OC3000.

Giản đồ XRD của nano silica chỉ xuất hiện một đỉnh có cường độ thấp tại vị

trí góc 2θ ~ 21,9° (Hình 3.20a), vì vậy nó có cấu trúc hầu như là vô định hình [11, 69,

146]. Đối với mẫu vật liệu lai nano SiO2/OC3000, giản đồ XRD xuất hiện hai đỉnh

nhiễu xạ: một đỉnh tại vị trí góc 2θ ~ 9,9° là đỉnh đặc trưng của oligochitosan [63, 93]

và một đỉnh tại vị trí góc 2θ ~ 21,9° là đỉnh đặc trưng của nano silica (Hình 3.20b).

Như vậy, vật liệu lai nano SiO2/OC3000 thể hiện cấu trúc mạng của cả 02 pha vô cơ

SiO2 và hữu cơ oligochitosan, vì vậy chúng có cấu trúc hầu như vô định hình.

3.4.3.2. Tính chất quang học của vật liệu lai nano SiO2/OC3000.

Phổ UV-vis của vật liệu lai nano SiO2/OC3000 và dung dịch nano silica,

chitosan, oligochitosan có khối lượng phân tử 3.000 g.mol-1 biễu diễn trong hình 3.21.

Hình 3.21. Phổ UV-vis của chitosan (a); oligochitosan (b); vật liệu nano SiO2/OC3000 (c) và nano silica (d).

Phổ UV-vis của mẫu oligochitosan khối lượng phân tử ~ 3.000 g.mol-1 thấy

xuất hiện một đỉnh tại vị trí bước sóng 262 nm (Hình 3.21b), trong khi chitosan không

quan sát được đỉnh hấp thụ (Hình 3.21a). Theo tác giả Tahtat và cs, đỉnh hấp thụ ở

bước sóng 262 nm được gán cho liên kết C=O trong nhóm cacbonyl, hình thành trong

quá trình cắt mạch chitosan [147]. Phổ UV-vis của vật liệu lai nano SiO2/OC3000 có

đỉnh hấp thụ tại vị trí bước sóng 271 nm và một đỉnh nhỏ tại vị trí bước sóng 320 nm

(Hình 3.21c). Trong vùng bước sóng từ 200 - 800 nm, nano silica không có đỉnh hấp

thụ (Hình 3.21d), tương tự cũng kết luận của Lu và cs, 2009 [148]. Như vậy, trong

phổ UV-vis của vật liệu lai nano SiO2/OC3000 thể hiện sự dịch chuyển đỉnh đặc trưng

của oligochitosan từ 262 nm đến 271 nm và một đỉnh nhỏ tại vị trí 320 nm, đỉnh này

không có trong oligochitosan. Sự khác biệt này chứng tỏ nano silica có tương tác với

oligochitosan bằng liên kết hóa học hoặc tương tác phối trí làm vật liệu lai nano

SiO2/OC3000 xuất hiện các đỉnh hấp thụ mới so với vật liệu đơn chất ban đầu.

Phương pháp nghiên cứu phổ FT-IR sử dụng để dự đoán về các dao động liên

kết hình thành trong vật liệu lai nano SiO2/OC được trình bày trong hình 3.22.

Hình 3.22. Phổ FT-IR của: a) nano SiO2/OC3000 g.mol-1; b) OC5000 g.mol-1; c) nano SiO2/OC7000 g.mol-1.

So sánh phổ FT-IR của vật liệu lai nano SiO2/OC (Hình 3.22a; 3.22b; 3.22c)

với phổ FT-IR của oligochitosan (mục 3.6.2) và phổ FT-IR của nano silica (mục

3.5.3) cho thấy chúng thể hiện đặc trưng dao động liên kết của cả hai vật liệu nano

silica và oligochitosan. Dữ liệu về các vị trí số sóng đặc trưng cho dao động của các

liên kết trong 03 mẫu vật liệu lai nano SiO2/OC được thống kê trong bảng 3.6. Ngoài

ra, phổ FT-IR của vật liệu lai nano SiO2/OC có xuất hiện một số đỉnh mới xảy ra sự

chuyển dịch vị trí của các đỉnh thể hiện sự tương tác của nano silica với oligochitosan.

Cụ thể, phổ phổ FT-IR của vật liệu lai nano SiO2/OC có sự chuyển dịch vị trí số sóng

3.450 cm−1 về phía vị trí số sóng 3.400 cm−1 đặc trưng cho dao động liên kết hydro

của nhóm O-H, N-H của oligochitosan với nhóm silanol (OH) của nano silica với

cường độ hấp thụ của nó cao hơn so với oligochitosan ban đầu. Ở vị trí số sóng 1.083

cm−1 và 781 cm−1 xuất hiện đặc trưng cho dao động của liên kết Si-O-C mà không

xuất hiện trong phổ FT-IR của nano silica hoặc của oligochitosan, liên kết này có thể

hình thành do phản ứng giữa nhóm CH2-OH của oligochitosan với nhóm silanol (Si-

OH) của nano silica. Ở đỉnh mới ở 927 cm−1 đặc trưng cho liên kết Si-OH do sự hình

thành liên kết hydro giữa của các nhóm silanol trong mạng silica với oxy, nhóm amit

(-NH2) của oligochitosan. Đỉnh ở vị trí 1.101 cm-1 và 468 cm-1 thể hiện liên kết của

Si-O-Si của tứ diện S1O4 của SiO2.

Bảng 3.6. Dữ liệu phổ FT-IR của vật liệu lai nano SiO2/OC.

Số sóng (cm-1) Liên kết Khoảng giá trị xác định của số sóng Đặc trưng của vật liệu

468 Liên kết Si–O 438 - 475 Nano silica

802 Liên kết Si–O (silanol) 796 - 805 Nano silica

1.101 1.050 – 1.150 Nano silica Liên kết Si–O–Si trong tứ diện S1O4

1.637 Liên kết O–H (silanol) 1.633 – 1.643 Nano silica

3.450 Liên kết O–H 3.437 – 3.456 oligochitosan

2.910 Liên kết C–H 2.881 – 2.920 oligochitosan

1.589 Liên kết –C=O 1.580 – 1.590 oligochitosan

1.666 Liên kết –NH 1.660 – 1.669 oligochitosan

1.417 Liên kết –OH 1.413 – 1.419 oligochitosan

1.030 1.028 – 1.079 oligochitosan Liên kết C=O (CH2CO)

1.083; 781 Liên kết Si-O-C nano SiO2/OC

927 Liên kết Si-OH 956 – 929 nano SiO2/OC

Tác giả Al-Sagheer và cs (2010) cho rằng trong nghiên cứu thủy phân SiO2

của tetraethyl orthosilicate trong dung dịch chitosan đã hình thành liên kết hydro giữa

các nhóm amit của chitosan và nhóm silanol của silica, liên kết ion giữa nhóm amin

chitosan và nhóm silanol của silica [145]. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, pH của

vật liệu lai nano SiO2/OC đã được điều chỉnh đến pH~ 6,0 gần với pKa của nhóm -

NH2 do đó các liên kết ion giữa chúng không bền do các nhóm –NH2 không có proton

và các nhóm silanol không mang điện ở pH > pI ~ 2 [69]. Từ kết quả phân tích này,

kết hợp với các nghiên cứu về dữ liệu phổ UV-vis nêu trên, chúng tôi đề nghị mô

hình tương tác của nano silica với oligochitosan trong vật liệu lai nano SiO2/OC là

hình thành liên kết phối trí giữa nhóm silanol (OH) của nano silica và nhóm NH2 của

oligochitosan và liên kết ion giữa nhóm silanol (OH) của nano silica và nhóm

HOH2C- của oligochitosan theo hình 3.23.

Hình 3.23. Minh họa sự tương tác của nano silica với oligochitosan trong vật liệu lai nano SiO2/OC.

3.5. Nghiên cứu độ ổn định của vật liệu lai nano silica/oligochitosan

Phương pháp nghiên cứu sự kết tụ hạt nano silica trong dung dịch

oligochitosan ở luận án này sử dụng phương pháp chụp ảnh TEM để tính kích thước

hạt nano silica trung bình theo thời gian bảo quản và đánh giá độ bền của sản phẩm

bằng thế điện kép (thế ξ).

Thí nghiệm được thực hiện trên mẫu vật liệu lai nano silica/oligochitosan chứa

hàm lượng SiO2 1,5% và nồng độ OC3000 2%. Theo thời gian bảo quản, nguyên lý

của các hệ phân tán là xảy ra quá trình kết tụ do va chạm giữa các hạt, quá trình sa

lắng do trọng lực. Quá trình sa lắng đạt đến trạng thái cân bằng khi trọng lực cân bằng

với lực chuyển động khuếch tán Brown và kích thước hạt không thay đổi theo thời

gian bảo quản [146]. Sự tăng kích thước hạt trung bình nano silica theo thời gian của

hai mẫu vật liệu lai nano SiO2/OC3000 được điều chế theo hai phương pháp phối trộn

52,3

52,4

50,2

m n

52,5

51,9

, t ạ h

47,7

44,2

42,3

c ớ ư h t

44,3

44,1

40,7

h c í K

nSiO2/OC3000 - PT nSiO2/OC3000 - KT

và kết tủa trình bày trong hình 3.24.

Thời gian lưu giữ, tháng

Hình 3.24. Sự thay đổi kích thước hạt nano SiO2 trong vật liệu lai nano SiO2/OC3000 (nano SiO2 1,5% và OC 2%) theo thời gian bảo quản.

■ PT: phương pháp phối trộn; ♦ KT: phương pháp kết tủa.

Theo đồ thị trong hình 3.24 cho thấy, trong khoảng thời gian bảo quản từ 1 - 2

tháng, hạt nano silica tăng kích thước lên so với ban đầu từ 9 – 10%. Cụ thể, mẫu

nano SiO2/OC3000 điều chế bằng phương pháp phối trộn kích thước hạt silica tăng

từ 47,7 nm lên 51,9 nm tại thời điểm 2 tháng bảo quản. Tương tự, tại thời điểm 2

tháng bảo quản mẫu nano SiO2/OC3000 điều chế bằng phương pháp kết tủa kích

thước hạt từ 40,7 nm tăng lên 44,1 nm. Sau thời gian bảo quản 2 tháng, kích thước

hạt nano silica trong vật liệu lai nano SiO2/OC3000 hầu như không thay đổi, chứng

tỏ chúng đã đạt trạng thái cân bằng sa lắng. Dung dịch keo nano SiO2/OC3000 khi

đạt cân bằng sa lắng tức là trạng thái bền tương tự như kết luận nghiên cứu của tác

giả Bùi Duy Du (2009) khi nghiên cứu sự ổn định của dung dịch keo nano

bạc/chitosan [122].

Một phương pháp khác để đánh giá độ bền của dung dịch keo và xác định điện

tích của của vật liệu lai nano silica/oligochitosan nhằm hướng tới mục đích ứng dụng

của chúng có thể sử dụng phương pháp đo thế điện kép tạo ra giữa các hạt của pha

phân tán với lớp bảo vệ. Kết quả xác định thế điện kép (ζ) của dung dịch keo nano

SiO2/OC3000 có hàm lượng SiO2 1% và 1,5% trong dung dịch OC3000 2% ở bảng

3.7.

Bảng 3.7. Thế điện kép (ζ) của dung dịch keo nano SiO2/OC3000.

Thế điện kép (ζ) của nano SiO2/OC3000

Thời gian bảo quản (tháng) Điều chế bằng phương pháp phối trộn Điều chế bằng phương pháp kết tủa

1 +35,6 mV +33,4 mV

2 +32,8 mV +29,7 mV

Như vậy, nano silica khi ổn định trong dung dịch OC có thế điện kép dương

và đạt trị số cao tương ứng với hàm lượng SiO2 1,0% và 1,5% là +32,8 mV và +29,7

mV. Với giá trị tuyệt đối của thế điện kép nằm trong khoảng30 -  60 mV, chứng

tỏ vật liệu lai nano silica/oligochitosan là dung dịch keo có độ bền cao [145]. Tùy vào

pH và môi trường phân tán, thế điện kép có thể dương hoặc âm tùy thuộc vào tương

tác giữa nano silica và môi trường. Ví dụ, nano silica phân tán trong nước, dung dịch

KCl, NaCl, CTAB, chất hoạt động bề mặt anion thì thế điện kép mang giá trị âm

[149], theo kết quả nghiên cứu của Matusiak và cs (2018) thì silica ổn định trong

dung dịch chitosan có thế điện kép dương [150]. Chính vì vật liệu nano SiO2/OC

mang thế điện kép dương tức hạt tích điện dương nên chúng có khả năng tương tác

nhanh với màng tế bào vi sinh vật mang điện tích âm thúc đẩy quá trình tiêu diệt tế

bào gây hại trên thực vật.

3.6. Xác định độc tính của vật liệu lai nano SiO2/OC3000.

Cả hai vật liệu nano silica và oligochitosan đều không độc. Theo nghiên cứu

của Ureporn và cs (2011), độc tính cấp LD50 của chitosan qua đường miệng trên chuột

là 16.000 mg.kg-1 thể trọng [151], LD50 qua đường tiêm tĩnh mạch của chuột của nano

silica được công bố bởi Liu và cs (2012) lớn hơn 1.000 mg.kg-1 thể trọng [152]. Vật

liệu lai nano SiO2/OC3000 được tổng hợp từ hai đơn chất có độc tính thấp tạo nên

loại vật liệu an toàn có khả năng ứng dụng cao. Dưới đây là các kết quả xác định độc

tính của vật liệu lai nano SiO2/OC3000 tiến hành theo quy trình tại mục 2.2.5.

3.6.1. Độc tính qua đường miệng

Độc tính LD50 qua đường miệng trên chuột của vật liệu lai nano SiO2/OC3000

có hàm lượng nano SiO2 1,5% và OC 2% được đánh giá qua tỉ lệ số chuột chết/số

chuột thí nghiệm được thống kê trong bảng 3.8. Với liều lượng vật liệu nano

SiO2/OC3000 sử dụng qua đường uống từ 300 - 3.000 mg.kg-1 thể trọng chuột, sau

15 ngày ở lô đối chứng và lô thử nghiệm chuột vẫn hoạt động, ăn uống bình thường,

(chuột không khó thở, đi ngoài phân khô, không bỏ ăn). Trong suốt thời gian thí

nghiệm, không có cá thể chuột nào bị chết nên không xác định được LD50 của vật liệu

lai nano SiO2/OC3000.

Bảng 3.8. Kết quả thử độc tính cấp qua đường miệng trên chuột của vật liệu nano

SiO2/OC3000.

Lô Số chuột thí nghiệm Liều dùng (mg.kg-1) Thể tích cho uống Số chuột sống/chết sau 15 ngày

1 6 Nước cất 0,2 mL x 3 lần 6/0

2 6 300 0,2 mL x 3 lần 6/0

3 6 3.000 0,2 mL x 3 lần 6/0

Sở dĩ vật liệu lai nano SiO2/OC3000 gần như không độc vì chúng được điều

chế từ các loại vật liệu sinh học đơn chất có độc tính thấp. Theo phân loại độc tính

cấp thuốc bảo vệ thực vật của Tổ chức Y tế Thế giới và Việt Nam [153] thì LD50 >

3.000 mg.kg-1 có nghĩa là vật liệu nano SiO2/OC3000 có độc tính thấp với mức cảnh

báo là cẩn thận phù hợp với sản xuất nông nghiệp an toàn.

3.6.2. Độc tính qua đường tiếp xúc da

Bảng 3.9 biểu thị tỷ lệ nhạy cảm da trên chuột khi tiếp xúc với vật liệu nano

SiO2/OC3000 (nano SiO2 1,5%; OC 2%) so với mẫu đối chứng âm sử dụng nước cất,

đối chứng dương sử dụng 2,4-dinitrochlorobenzene (8 mg.mL-1). Kết quả cho thấy

khi sử dụng vật liệu nano SiO2/OC3000 ở dạng nguyên mẫu không quan sát thấy

chuột bị ban đỏ, phù nề hoặc các thay đổi khác trên da giống như khi chuột tiếp xúc

với nước cất tức là tỷ lệ nhạy cảm bằng 0%. Ở mẫu đối chứng dương sử dụng 2,4-

dinitrochlorobenzene, chuột bị nổi ban đỏ, tỷ lệ nhạy cảm là 100%.

Bảng 3.9. Tỷ lệ nhạy cảm của chuột tiếp xúc với vật liệu lai nano SiO2/OC3000.

Mẫu Tên vật liệu Tỷ lệ nhạy cảm

Mẫu thử 0% Nano SiO2/OC3000

Đối chứng âm Nước cất 0%

Đối chứng dương 2,4-dinitrochlorobenzene (8 mg.mL-1) 100%

Qua kết quả xác định LD50 và khả năng kích ứng da trên chuột chứng tỏ vật

liệu lai nano SiO2/OC3000 là một loại vật liệu có thể sử dụng làm thuốc BVTV

không độc cho người, đáp ứng cho việc sản xuất nông sản an toàn.

Nhận xét:

Đã điều chế được vật liệu lai nano silica/oligochitosan có hàm lượng SiO2

1,5%, OC 2% bằng phương pháp phối trộn nano silica nhiệt phân tro vỏ trấu với

oligochitosan có khối lượng phân tử từ 3.000; 5.000; 7.000 g.mol-1 hoặc bằng phương

pháp kết tủa SiO2 bằng phản ứng giữa Na2SiO3 chiết suất từ tro vỏ trấu với H+ trong

dung dịch oligochitosan. Kích thước hạt của nano silica trong vật liệu lai nano

SiO2/OC tăng cùng chiều với chiều tăng của hàm lượng SiO2 và ngược chiều với với

chiều tăng của khối lượng phân tử oligochitosan. Khi nồng độ oligochitosan 2%, thì

vật liệu lai nano SiO2/OC có hàm lượng SiO2 1,5% đồng nhất và đạt cân bằng sa lắng

sau thời gian bảo quản là 2 tháng. Dung dịch keo có độ bền cao do có thế ζ ~ +30

mV, hạt keo nano tích điện dương nên có tiềm năng là hoạt chất kháng vi sinh vật vì

màng tế bào vi sinh vật tích điện âm.

Bằng kết quả nghiên cứu phổ FT-IR, UV-vis của vật liệu nano

silica/oligochitosan, chúng tôi đề xuất giữa nano silica và oligochitosan có liên kết

phối trí giữa nhóm -OH (Si-OH) của silica và nhóm OH (-CH2OH), -NH của

oligochitosan và liên kết ion giữa nhóm –OH (Si-OH) của nano silica với nhóm -NH2

của oligochitosan.

Vật liệu lai nano silica/oligochitosan với hàm lượng hoạt chất cao (SiO2 1,5%

và OC3000 2%) gần như không độc qua đường miệng và không gây kích ứng da nên

thích hợp và có tiềm năng sử dụng làm chất kiểm soát bệnh thực vật đảm bảo tỷ lệ

pha loãng phù hợp với thực tế.

3.7. Thử nghiệm in vivo khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu cây thanh long của

nano SiO2/OC.

Thí nghiệm nghiên cứu in vivo khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây

thanh long được thực hiện tại xã Hố Nai 3, huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai, thời

gian từ ngày 02/10/2016 đến ngày 31/12/2016. Phương pháp thí nghiệm thực hiện

theo TCCS 162 : 2014/BVTV trình bày ở mục 2.2.5.

3.7.1. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử oligochitosan đến hoạt độ của enzyme

chitinase và hiệu quả kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long.

3.7.1.1. Hiệu ứng kích thích sản sinh enzyme chitinase của oligochitosan.

Hoạt độ sản sinh enzyme chitinase trên cây thanh long sau khi xử lý

oligochitosan với khối lượng phân tử khác nhau ở nồng độ 150 mg.L-1 sau khi lây

nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum được mô tả ở mục 2.2.5 và kết quả biễu diễn

ở hình 3.25.

Hình 3.25. Hoạt độ enzyme chitinase trên cây thanh long được xử lý bởi các OC3000, OC5000 và OC7000 sau khi lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum.

Tại thời điểm 24 giờ sau lây nhiễm nấm, hoạt độ enzyme chitinase đều tăng so

với thời điểm ban đầu. Tại thời điểm 24 giờ sau khi cây thanh long bị nhiễm nấm

bệnh, hoạt độ enzyme chitinase ban đầu của 03 mẫu xử lý OC3000, OC5000, OC7000

lần lượt là 4,7110-3 U.g-1, 4,5410-3 U.g-1, 4,7110-3 U.g-1 tăng lên tương ứng

6,4210-3 U.g-1, 5,7410-3 U.g-1, 5,5510-3 U.g-1. Kết quả này cho thấy, khối lượng

phân tử của oligochitosan càng nhỏ thì khả năng sản sinh hàm lượng chitinase càng

cao. Từ thời điểm từ 24 giờ đến 120 giờ lây nhiễm nấm, hoạt độ enzyme chitinase

trong cây thanh long của 03 mẫu xử lý oligohitosan có khối lượng phân tử 3.000,

5.000, 7.000 g.mol-1 đều giảm xuống lần lượt là 5,7310-3 U.g-1, 4,67  10-3 U.g-1 và

5,1410-3 U.g-1. Thời điểm này là thời điểm nấm bệnh phát triển mạnh nên chúng tôi

cho rằng cây thanh long đã phải tiêu tốn một lượng enzyme để kháng lại nấm bệnh

dẫn đến hoạt độ enzyme giảm. Từ thời điểm 120 giờ đến 168 giờ sau lây nhiễm nấm,

hoạt độ enzyme chitinase của các mẫu xử lý OC tăng trở lại. Tại thời gian 168 giờ

sau khi cây thanh long bị nhiễm nấm bệnh, hoạt độ enzyme của các mẫu: OC3000 là

5,9910-3 U.g-1, OC5000 là 4,7810-3 U.g-1 và OC7000 là 5,6110-3 U.g-1. Hoạt độ

enzyme chitinase tăng trở lại trong thời kỳ này là do lượng enzyme tiếp tục sản sinh

cao hơn lượng enzyme sử dụng để kháng nấm bệnh vì áp lực nấm bệnh trong thời

gian này đã được kiểm soát. Như vậy, oligochitosan đã thể hiện vai trò là một chất

kích kháng thực vật, thanh long được xử lý oligochitosan khi bị mầm bệnh tấn công

cây trồng thì oligochitosan kích hoạt gen phòng thủ của cây trồng sản sinh enzyme

chitinase để chống lại vi nấm gây bệnh. [31, 44, 45].

Ở thí nghiệm đối chứng dương (không phun oligochitosan và lây nhiễm nấm

bệnh), sự xâm nhập của nấm bệnh cũng kích thích cây thanh long sản sinh enzyme

chitinase, hoạt độ enzyme ban đầu tăng nhẹ từ 4,4110-3 U/g lên 4,8810-3 U/g đến

thời điểm 72 giờ sau lây nhiễm nấm bệnh. Sau 72 giờ nhiễm nấm Neoscytalidium

dimidiatum, bệnh phát triển mạnh trên cây thanh long, lượng enzyme chitinase sản

sinh không đủ bù lại lượng enzyme tiêu tốn để kháng lại nấm bệnh nên hoạt độ

enzyme giảm từ 4,8810-3 U/g xuống 3,9110-3 U/g ở thời điểm 168 giờ sau lây

nhiễm. Kết quả này chứng minh oligochitosan thể hiện khả năng kích thích cây thanh

long sản sinh enzyme chitinase kháng lại bệnh đốm nâu bởi vì trong thí nghiệm không

xử lý oligochitosan trước khi lây nhiễm nấm thì hoạt độ enzyme do cây sản sinh ra

không đủ để kháng lại sự phát triển của nấm gây bệnh trong suốt thời gian nghiên

cứu.

Đối với thí nghiệm đối chứng âm (không xử lý oligochitosan và không lây

nhiễm nấm bệnh), hoạt độ enzyme chitinase trong cây thanh long hầu như không có

sự thay đổi vì enzyme chitinase không được sử dụng.

Khả năng kích thích thực vật tạo ra các phản ứng phòng vệ của oligochitosan

của một số tác giả cho rằng oligochitosan giúp thực vật tạo ra một số protein, enzyme

để kháng với nấm bệnh thực vật như glucanase, chitinase, phenylalanine ammonia

lyase, v.v. Ví dụ, tác giả Rodriguez (2007) đã chứng minh rằng oligochitosan tạo ra

hoạt độ enzyme phenylalanine ammonia-lyase, β-1,3-glucanase, chitinase và

chitosanase trong lá cao hơn so với đối chứng khi nghiên cứu kháng bệnh đạo ôn

(Pyricularia grisea) trên cây lúa sau thời gian 72 giờ sau lây nhiễm nấm [154]. Tác

giả Falcon (2008) cũng chứng minh oligochitosan có khả năng kháng bệnh thối đen

(Phytophthora parasitica nicotianae) [155] và Yafei (2009) công bố rằng

oligochitosan làm tăng của enzyme phenylalanin amoniac-lyase, peroxidase,

chitinase và β-1,3-glucanase nhằm kháng lại sự lây nhiễm của bệnh khảm do vi rút

gây ra trên cây thuốc lá theo cơ chế tạo kích kháng thực vật [156]. Hiệu ứng làm gia

tăng lượng enzyme phenylalanine ammonia-lyase và tyrosine ammonia-lyase trong

lá kháng bệnh do nấm gây trên cây đậu nành sau 36 giờ xử lý oligochitosan được tác

giả Khan [157]. Cơ chế tạo kháng thể enzyme chitinase của oligochitosan trên thực

vật chống lại nấm bệnh đã được một số tác giả công bố [25].

Nồng độ oligochitosan sử dụng trên thực vật tạo hiệu ứng kích kháng thực vật

chống lại vi sinh vật gây bệnh hiệu quả phụ thuộc vào đối tượng bệnh và đối tượng

cây trồng. Ví dụ trong nghiên cứu của Ben-Shalom (2003) kháng thể enzyme

chitinase do oligochitosan nồng độ 50 mg.L-1 đã kiểm soát được bệnh mốc xám do

nấm Botrytis cinerea gây hại trên cây dưa chuột [158]. Aziz và cs thử nghiệm

oligochitosan nồng độ 75 - 200 mg.L-1 đã làm giảm đáng kể sự lây nhiễm nấm

Plasmopara viticola và B. cinerea trên lá cây nho [159, 160]. Kết quả nghiên cứu

hiệu ứng kích thích sản sinh enzyme chitinase trên cây thanh long dưới tác động của

oligochitosan nồng độ 150 mg.L-1 trong luận án phù hợp với công bố của tác giả Bùi

Duy Du (2015), oligochitosan khối lượng phân tử ~ 5.000 g.mol-1 có hiệu quả kiểm

soát nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long [112].

3.8.1.2. Khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long của oligochitosan

Hiệu quả kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long khi xử lý oligochitosan

nồng độ 150 mg.L-1 được xác định qua tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh. Kết quả xác định tỉ

lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05) phụ thuộc vào

khối lượng phân tử oligochitosan thể hiện qua Bảng 3.10. Oligochitosan khối lượng

phân tử 3.000 g.mol-1 thể hiện hiệu lực kiểm soát bệnh cao nhất do có tỉ lệ bệnh và

chỉ số bệnh nhỏ nhất trong các công thức thí nghiệm tương tứng 3,25% và 0,84% tại

thời điểm sau 168 giờ lây nhiễm.

Ở mẫu đối chứng dương lây nhiễm nấm bệnh nhưng không xử lý oligochitosan

thì tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh tăng liên tục đến thời điểm theo dõi 168 giờ tương ứng

21,12% và 4,28%. Đối với mẫu xử lý OC5000 và OC7000 thì chỉ số bệnh lớn hơn và

có sự khác biệt thống kê so với mẫu OC3000, còn mẫu đối chứng âm không có sự

phát triển bệnh đốm nâu. Kết quả này chứng minh với khối lượng phân tử

oligochitosan 3.000 g.mol-1 đạt hiệu quả cao nhất trong việc kiểm soát nấm bệnh so

với oligochitosan 5.000 và 7.000 g.mol-1. Vì vậy luận án lựa chọn oligochosan khối

lượng phân tử 3.000 g.mol-1 để tổng hợp vật liệu lai nano silica/oligochitosan nghiên

cứu hiệu ứng kiểm soát bệnh thực vật cho các thí nghiệm tiếp theo.

Bảng 3.10. Tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu thanh long xử lý với OC3000, OC5000 và OC7000 trong phương pháp lây nhiễm nấm bệnh.

Tỉ lệ bệnh (%) đốm nâu sau lây nhiễm bệnh Công thức 24 giờ 72 giờ 120 giờ 168 giờ

Đối chứng (-) Không bệnh Không bệnh Không bệnh Không bệnh

Đối chứng (+) 10,79±2,22a 13,49±2,95a 18,51±3,20a 21,12±2,61a

OC3000 6,54±1,99b 5,23±1,12b 3,48±1,02c 3,25±1,01d

OC5000 6,13±1,50b 5,49±1,17b 3,90±1,02c 3,85±1,05c

OC7000 6,01±1,00b 5,61±1,19b 4,92±0,87b 4,26±0,98b

LSD, 0,05 2,54 0,60 1,01 0,52

Chỉ số bệnh (%) đốm nâu sau lây nhiễm

Đối chứng (-) Không bệnh Không bệnh Không bệnh Không bệnh

Đối chứng (+) 1,93 ± 0,74a 2,33 ± 0,86a 3,54 ± 1,00a 4,28 ± 1,25a

OC3000 1,68 ± 0,57b 1,40 ± 0,52b 0,91 ± 0,31b 0,84 ± 0,24c

OC5000 1,77 ± 0,60a 1,43 ± 0,53bc 0,96 ± 0,33b 0,91 ± 0,25b

OC7000 1,75 ± 0,58a 1,35 ± 0,50c 1,01 ± 0,35b 0,83 ± 0,23c

LSD, 0,05 0,24 0,23 0,16 0,07

Ghi chú: Trong cùng một cột, các chữ cái theo sau khác nhau thì có khác biệt về mặt

thống kê ở mức ý nghĩa  = 0,05 theo phân tích ANOVA một chiều và Ducan’s

Multiple Range Test (DMRT); LSD-Khác biệt tối thiểu có ý nghĩa thống kê.

3.7.2. Hiệu ứng kích kháng của vật liệu nano SiO2/OC3000 đến hoạt độ enzyme

chitinase và khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long.

Trong thí nghiệm này, luận án sử dụng vật liệu lai nano SiO2/OC3000 có hàm

lượng SiO2 1,5%, kích thước hạt nano silica là 50 nm và oligochitosan khối lượng

phân tử 3.000 g.mol-1 nồng độ 2% được điều chế theo mục 2.2.4. Các mẫu thí nghiệm

xử lý trên cây thanh long đều có nồng độ hoạt chất 150 mg.L-1 như sau: 150 mg.L-1

nano SiO2/OC3000 gồm 64,3 mg.L-1 nano SiO2 và 85,7 mg.L-1 OC3000; 150 mg.L-1

nano SiO2; 150 mg.L-1 OC3000. Mẫu đối chứng âm không xử lý hoạt chất và không

lây nhiễm nấm, mẫu đối chứng dương không xử lý hoạt chất và lây nhiễm nấm.

4.1.2.1. Hiệu ứng kích thích sản sinh enzyme chitinase của vật liệu nano

silica/oligochitosan.

Khả năng kích thích sản sinh enzyme chitinase trên cây thanh long do xử lý

vật liệu nano SiO2/OC3000 và các đơn chất OC3000, nano silica trước khi lây nhiễm

nấm Neoscytalidium dimidiatum được biểu diễn trong đồ thị (Hình 3.26). Theo kết

quả này, trong suốt thời gian từ 24 giờ đến 168 giờ tính từ thời điểm lây nhiễm nấm

ở thí nghiệm, hoạt độ enzyme chitinase ở mẫu đối chứng âm hầu như thay đổi không

đáng kể, hoạt độ enzyme ban đầu là 4,2510-3 U.g-1; thời điểm 72 giờ là 3,8310-3

U.g-1 và thời điểm 168 giờ là 3,5510-3 U.g-1. Lý do hoạt độ enzyme ít có sự thay đổi

trong mẫu đối chứng âm là cây thanh long không bị nhiễm nấm bệnh và không xử lý

hoạt chất kích kháng mầm bệnh. Đối với mẫu đối chứng dương, giai đoạn từ 0 giờ

đến 72 giờ sau lây nhiễm nấm, hoạt hoạt độ enzyme chitinase tăng nhẹ từ 4,4110-3

U.g-1 lên 4,8810-3 U.g-1 và sau đó liên tục giảm xuống 3,9110-3 U.g-1 cho tới thời

điểm 168 giờ sau lây nhiễm nấm. Lý do của sự thay đổi này, chúng tôi cho rằng từ

thời điểm ban đầu đến 72 giờ sau lây nhiễm do tác động của nấm bệnh kích thích cây

thanh long sản sinh enzyme nhiều hơn lượng enzyme sử dụng để kháng nấm, sau thời

điểm 72 giờ nấm bệnh phát triển mạnh nên lượng enzyme tiêu hao nhiều hơn lượng

enzyme sản sinh dẫn tới hoạt độ enzyme tổng giảm.

Hình 3.26. Hoạt độ enzyme chitinase của cây thanh long được xử lý bởi OC, nano SiO2, và nano SiO2/OC sau khi lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum.

Đối với mẫu xử lý nano silica, hiệu quả kích thích sản sinh enzyme chitinase

thể hiện không rõ rệt, từ thời điểm ban đầu đến 24 giờ sau lây nhiễm nấm, hoạt độ

enzyme giảm nhẹ từ 4,210-3 U.g-1 xuống 3,910-3 U.g-1 và tăng lên cực đại tại thời

điểm 120 giờ là 5,1210-3 U.g-1, sau đó hoạt độ enzyme giảm xuống 4,6810-3 U.g-1

tại thời điểm 168 giờ. Như vậy, hoạt độ enzyme chitinase khi xử lý cây thanh long

bằng nano silica đạt cao nhất tại thời điểm 120 giờ sau lây nhiễm nấm chỉ chênh lệch

khoảng 0,910-3 U.g-1 so với ban đầu chứng tỏ nano silica hầu như không thể hiện

khả năng kích thích sản sinh enzyme kháng nấm bệnh. Kết quả này cũng phù hợp với

thí nghiệm xác định chỉ số bệnh và tỉ lệ bệnh của nano silica tác động lên bệnh đốm

nâu cây thanh long. Mẫu xử lý OC3000 thể hiện rõ rệt khả năng kích thích sản sinh

enzyme chitinase, hoạt độ enzyme tăng nhanh trong khoảng thời gian từ 0 – 24 giờ

sau lây nhiễm nấm. Hoạt độ enzyme tại thời điểm ban đầu là 4,5410-3 U.g-1 tăng lên

cực đại 6,4210-3 U.g-1 sau 24 giờ lây nhiễm nấm. Sau thời điểm 24 giờ đến 120 giờ

3 U.g-1 do thời điểm này bệnh đốm nâu phát triển mạnh nhất. Từ thời điểm 120 giờ

sau lây nhiễm nấm, hoạt độ enzyme chitinase có xu hướng giảm xuống đến 5,7310-

sau lây nhiễm nấm, bệnh đốm nâu đã được khống chế bởi enzyme chitinase sản sinh

nên hoạt độ enzyme tiếp tục tăng trở lại. Kết quả nghiên cứu này chứng tỏ

oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ 3.000 g.mol-1 thể hiện khả năng kích thích

sản sinh enzyme chitinase tức thì khi bị nấm bệnh xâm nhập trong 24 giờ, và tỏ ra có

hiệu quả trong việc kiểm soát nấm bệnh thực vật.

Sự biến đổi của hoạt độ enzyme chitinase trong hình 3.26 cho thấy, khi xử lý

cây thanh long bằng vật liệu lai nano SiO2/OC3000 trước khi lây nhiễm nấm bệnh thì

hoạt độ enzyme chitinase tăng liên tục từ thời điểm ban đầu đến 168 giờ sau lây

nhiễm. Bệnh đốm nâu đã được kiểm soát hiệu quả tại thời điểm 120 giờ đến 168 giờ

sau lây nhiễm nấm nên hoạt độ enzyme chitinase gần như không thay đổi. Hoạt độ

enzyme chitinase tại thời điểm 168 giờ khi bệnh đốm nâu đã được khống chế có giá

trị 6,3210-3 U.g-1 và cao hơn hoạt độ enzyme chitinase của mẫu xử lý OC3000 cùng

thời điểm là 5,9910-3 U.g-1. Trong vật liệu lai nano SiO2/OC3000, mặc dù nano silica

hầu như không thể hiện khả năng kích thích sản sinh enzyme chitinase nhưng chúng

đã làm gia tăng khả năng kích kháng của oligochitosan vì với nồng độ OC3000 trong

vật liệu lai là 85,7 mg.L-1 đã thể hiện hiệu lực sản sinh enzyme kháng nấm bệnh tương

đương với mẫu xử lý OC3000 ở nồng độ 150 mg.L-1. Phát hiện này chứng minh đã

xảy ra sự cộng hợp làm tăng cường khả năng tạo kháng thể của hai loại vật liệu nano

silica và oligochitosan để chống lại bệnh gây hại trên cây thanh long.

3.8.2.2. Hiệu quả kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long của nano SiO2/OC.

Hiệu quả kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long được xác định qua tỉ lệ bệnh và

chỉ số bệnh sau khi xử lý vật liệu lai và lây nhiễm bệnh nhân tạo trình bày trong bảng

3.11. Tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu thanh long khi xử lý bằng vật liệu lai nano

SiO2/OC3000 thấp hơn và có ý nghĩa thống kê so với mẫu xử lý vật liệu đơn là

OC3000 hoặc nano silica. Cụ thể, tỉ lệ bệnh của mẫu xử lý vật liệu lai nano

SiO2/OC3000 là 3,65% trong khi tỉ lệ bệnh của mẫu xử lý vật liệu OC3000 là 4,29%,

nano SiO2 là 13,08% và mẫu đối chứng dương là 21,12% tại thời điểm 168 giờ sau

khi lây nhiễm nấm bệnh. Trong thời gian xử lý kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây

thanh long từ thời điểm ban đầu đến 168 giờ sau lây nhiễm nấm, kết quả cho thấy

mẫu xử lý vật liệu OC3000 có tỉ lệ bệnh giảm mạnh từ 6,13 xuống 4,29%, mẫu xử lý

vật liệu còn nano SiO2 tỉ lệ bệnh tăng từ 8,63 lên 13,08%, mẫu đối chứng dương tỉ lệ

bệnh tăng nhanh từ 10,79 lên 21,12%.

Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh khi xử lý cây thanh long bằng vật liệu lai nano

silica/oligochitosan chứng tỏ khả năng kháng bệnh đốm nâu thanh long vượt trội so

với các vật liệu đơn là oligochitosan và nano silica có thể là do sự tương tác giữa

oligochitosan và nano silica làm tăng cường hiệu ứng kháng bệnh như đã chứn minh

trong phần chế tạo vật liệu. Mặc khác vật liệu lai này chứa các hạt keo nano SiO2/OC

mang điện tích dương giúp vật liệu tác động nhanh lên màng tế bào mang điện tích

âm làm tiêu diệt nấm bệnh và hoạt chất nano silica có tác dụng thẩm thấu nhanh, gia

cường màng tế bào thực vật chống lại sự tấn công của vi sinh vật, đồng thời

oligochitosan kích thích sản sinh enzyme chitinase để kháng bệnh và tác động trực

tiếp để bất hoạt tế bào nấm bệnh.

Đánh giá hiệu quả việc kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long qua chỉ số bệnh

cho thấy công thức xử lý vật liệu lai nano SiO2/OC3000 và vật liệu OC3000 có giá

trị nhỏ. Chỉ số bệnh của mẫu xử lý vật liệu OC3000 cao hơn mẫu xử lý vật liệu lai

nano silica/oligochitosan khoảng 17,5%. Sau 24 giờ lây nhiễm nấm Neoscytalidium

dimidiatum, chỉ số bệnh đốm nâu thể hiện ở các công thức chưa có sự thay đổi rõ rệt

và chỉ sau 72 giờ lây nhiễm nấm chỉ số bệnh mới thể hiện sự khác biệt. Chỉ số bệnh

ở 02 mẫu xử lý vật liệu lai nano SiO2/OC3000 và vật liệu OC3000 giảm rõ rệt so với

mẫu đối chứng dương. Mẫu xử lý vật liệu nano SiO2 có chỉ số bệnh tăng liên tục theo

thời gian theo dõi với tốc độ chậm từ 1,87 lên 2,29%, còn mẫu đối chứng dương chỉ

số bệnh tăng từ 1,93 lên 4,28%. Sau 168 giờ lây nhiễm nấm bệnh, chỉ số bệnh của

công thức xử lý vật liệu lai nano SiO2/OC3000 là 0,77% thấp hơn công thức xử lý vật

liệu OC3000 là 0,88%, công thức xử lý nano SiO2 là 2,29%, và mẫu đối chứng dương

là 4,28%. Tóm lại, vật liệu lai nano SiO2/OC3000 có hiệu quả cộng hợp kiểm soát

bệnh đốm nâu trên cây thanh long do cơ chế tác động của các vật liệu đơn

oligochitosan và nano silica. Hình ảnh và triệu chứng bệnh đốm nâu được kiểm soát

bởi các vật liệu được thể hiện rõ qua hình 3.27.

Bảng 3.11. Tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu thanh long xử lý vật liệu OC3000, nano SiO2, và nano SiO2/OC3000 bằng phương pháp lây nhiễm nấm bệnh.

Tỉ lệ bệnh (%) đốm nâu sau lây nhiễm Công thức 24 giờ 72 giờ 120 giờ 168 giờ

Đối chứng (-) Không bệnh Không bệnh Không bệnh Không bệnh

Đối chứng (+) 10,79±2,22a 13,49±2,95a 18,51±3,20a 21,12±2,61a

OC3000 6,13±1,50c 5,49±1,17c 4,60±1,02d 4,29±1,05d

6,44±1,07c 5,21±1,11c 3,76±0,83e 3,65±0,90e nano SiO2/OC3000

8,63±1,78b 10,27±2,46b 11,96±2,24b 13,08±1,74b nano SiO2

LSD, 0,05 2,10 2,22 0,81 0,60

Chỉ số bệnh (%) đốm nâu sau lây nhiễm

Đối chứng (-) Không bệnh Không bệnh Không bệnh Không bệnh

Đối chứng (+) 1,93 ± 0,74a 2,33 ± 0,86a 3,54 ± 1,00a 4,28 ± 1,25a

OC3000 1,68 ± 0,57a 1,40 ± 0,52c 0,91 ± 0,31c 0,88 ± 0,24c

1,85 ± 0,61a 1,06 ± 0,40d 0,73 ± 0,25d 0,77 ± 0,19d nano SiO2/OC3000

1,87 ± 0,71a 2,00 ± 0,74b 2,18 ± 0,62b 2,29 ± 0,67b nano SiO2

LSD, 0,05

0,63

0,32

0,17

0,08

Ghi chú: Trong cùng một cột, các chữ cái theo sau khác nhau thì có khác biệt về mặt

thống kê ở mức ý nghĩa  = 0,05 theo phân tích ANOVA một chiều và Ducan’s

Multiple Range Test (DMRT); LSD-Khác biệt tối thiểu có ý nghĩa thống kê.

b) a)

c) d)

Hình 3.27. Vết bệnh đốm nâu trên dây thanh long tại thời điểm sau 168 giờ lây

nhiễm nấm: a) OC; b) Đối chứng dương; c) nano SiO2/OC; d) Đối chứng âm; e) nano SiO2.

Vật liệu lai nano SiO2/OC3000 có hiệu quả kiểm soát bệnh đốm nâu thanh

long ở nồng độ hoạt chất 150 mg.L-1 cao hơn nồng độ hoạt chất là 80 mg.L-1 theo

nghiên cứu của Phạm Đình Dũng và cs (2017) để ức chế bệnh thán thư trên cây ớt là

do vách tế bào thực vật của cây thanh long có cấu trúc vỏ gỗ dày và cứng, sự tác động

của hoạt chất lên các loại vi sinh vật khác nhau cũng thể hiện hiệu quả khác nhau.

Mặc khác nấm gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long là loài nấm khó kiểm soát và

chưa có thuốc đặc trị.

Nhận xét:

 Vật liệu lai nano SiO2/OC3000 có khả năng kích thích sản sinh enzyme

chitinase kháng lại bệnh đốm nâu do Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên

cây thanh long cao hơn vật liệu đơn OC3000 và nano silica. Hoạt độ enzyme

chitinase và khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long của mẫu xử

lý vật liệu lai nano SiO2/OC3000 chỉ với nồng độ OC3000 85,7 mg.L-1 đã có

hiệu quả vượt trội so với khi xử lý vật liệu OC3000 150 mg.L-1 chứng tỏ xảy

ra tác động cộng hợp của nano silica và oligochitosan.

 Kết quả nghiên cứu hiệu ứng sản sinh enzyme chitinase để kháng lại bệnh đốm

nâu trên cây thanh long của vật liệu lai nano SiO2/OC3000 là nghiên cứu chưa

từng được công bố trước đây.

3.8. Hiệu lực kiểm soát in vivo bệnh đạo ôn và bạc lá trên lúa của nano SiO2/OC.

Thí nghiệm khảo sát hiệu lực của vật liệu lai nano SiO2/OC3000 trong việc

kiểm soát bệnh đạo ôn lá được thực hiện trong điều kiện nhà lưới và thí nghiệm kiểm

soát bệnh bạc lá trên cây lúa thực hiện ngoài đồng ruộng thuộc xã Tân Bình, huyện

Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai trong thời gian từ ngày 05/06/2016 đến ngày 31/9/2016

trình bày ở mục 2.2.6.

3.8.1. Hiệu lực kiểm soát bệnh đạo ôn lá trên lúa của nano SiO2/OC.

Kết quả khảo sát hiệu lực kiểm soát bệnh đạo ôn lá trên lúa của vật liệu lai

nano SiO2/OC3000 thể hiện qua tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh được trình bày trong bảng

3.12. Trong tất cả các thí nghiệm xử lý vật liệu lai nano SiO2/OC3000 với nồng độ

khác nhau đều thể hiện hiệu lực kiểm soát bệnh đạo ôn lá trên lúa có khác biệt về mặt

thống kê so với thí nghiệm đối chứng. Hiệu quả kiểm soát bệnh đạo ôn lá tăng theo

nồng độ nano SiO2/OC3000 sử dụng.

Tại thời điểm 14 ngày sau lây nhiễm bệnh, tất cả các thí nghiệm sử dụng vật

liệu nano SiO2/OC3000 có tỉ lệ bệnh giảm so với thời điểm 7 ngày sau lây nhiễm

bệnh. Kết quả khi xử lý vật liệu lai nano SiO2/OC3000 ở nồng độ nano SiO2/OC 75

mg.L-1, 100 mg.L-1 và 125 mg.L-1 có tỉ lệ bệnh giảm từ 9,53%; 5,27%; 5,31% xuống

tương ứng 4,58%; 2,37%; 2,36%. Hiệu quả kiểm soát bệnh đạo ôn lá ở ba nồng độ

xử lý vật liệu nêu trên lần lượt là 75,78%; 87,46%; 87,51%. Tương tự kết quả tỉ lệ

bệnh, chỉ số bệnh của thí nghiệm xử lý vật liệu nano SiO2/OC3000 ở ba nồng độ nêu

trên tương ứng tăng từ 1,80%; 1,07%; 1,31% lên 3,48%; 1,58%; 1,49% sau 14 ngày

cho cây lúa nhiễm bệnh. Trong khi đó, ở mẫu đối chứng không phun thuốc có tỉ lệ

bệnh và chỉ số bệnh tăng mạnh: tỉ lệ bệnh tăng từ 0 lên 13,83% tại thời điểm 7 ngày

sau lây nhiễm bệnh và tăng cao đến 18,90% tại thời điểm 14 ngày sau lây nhiễm bệnh;

chỉ số bệnh tăng từ 0 lên 3,36% tại thời điểm 7 ngày sau lây nhiễm bệnh và tăng cao

đến 9,08% tại thời điểm 14 ngày sau lây nhiễm bệnh. Đối với mẫu xử lý vật liệu nano

SiO2/OC3000 ở nồng độ 100 mg.L-1 có hiệu quả kiểm soát bệnh đạo ôn lá tương

tương với thí nghiệm xử lý thuốc BVTV thương mại Trizole 75WP sau 14 ngày sau

lây nhiễm bệnh có tỉ lệ bệnh là 2,51% và chỉ số bệnh 1,45% tương ứng với hiệu quả

kiểm soát là 84,03% và 86,72%.

Bảng 3.12. Hiệu quả kiểm soát bệnh đạo ôn lá lúa sau khi xử lý bằng vật liệu lai nano SiO2/OC3000

Sau lây nhiễm bệnh đạo ôn

Công thức 7 ngày 14 ngày

TLB (%) H (%) TLB (%) H (%)

9,25±0,78b 33,12±1,34a 4,58±0,25b 75,78±1,67a nano SiO2/OC75

2,37±0,24c 87,46±1,45b nano SiO2/OC100 5,27±0,39c 61,89±1,45b

2,36±0,24c 87,51±1,24b nano SiO2/OC125 5,31±0,43c 61,61±1,31b

Trizole 75WP 5,21±0,41c 62,33±1,56b 2,51±0,29c 86,72±1,67b

Đối chứng (-) 13,83±1,24a - 18,90±1,34a -

LSD, 0,05 3,45 8,21 0,40 5,19

CSB (%) H (%) CSB (%) H (%)

nano SiO2/OC75 1,820,15b 45,833,1b 3,480,25b 61,673,4b

nano SiO2/OC100 1,070,11c 68,163,2c 1,580,11c 82,602,8c

nano SiO2/OC125 1,310,08b 61,012,9c 1,490,13c 83,592,6c

Trizole 75WP 1,130,10c 66,373,2c 1,450,13c 84,033,0c

Đối chứng (-) 3,360,38a 00,0a 9,080,59a 00,0a

LSD, 0,05 0,63 15,05 1,54 10,80

Ghi chú: Trong cùng một cột, các chữ cái theo sau khác nhau thì có khác biệt về mặt

thống kê ở mức ý nghĩa  = 0,05 theo phân tích ANOVA một chiều và Ducan’s

Multiple Range Test (DMRT); LSD-Khác biệt tối thiểu có ý nghĩa thống kê. Nano

SiO2/OC75 (nồng độ nano SiO2/OC 75 mg.L-1); nano SiO2/OC100 (nồng độ nano

SiO2/OC 100 mg.L-1); nano SiO2/OC125 (nồng độ nano SiO2/OC 125 mg.L-1); TLB:

tỉ lệ bệnh; CSB: chỉ số bệnh; H: Hiệu quả kiểm soát bệnh.

a)

b)

c)

d)

e)

Hình 3.28. Vết bệnh đạo ôn lá trên lúa trong thí nghiệm in vivo xử lý bằng: a) nano

SiO2/OC75; b) nano SiO2/OC100; c) nano SiO2/OC125; d) Trizole 75WP; e) Đối

chứng.

Hiệu lực kiểm soát bệnh đạo ôn trên lúa của vật liệu lai nano SiO2/OC3000 ở

nồng độ sử dụng 100 mg.L-1 đạt hiệu quả > 85% nên rất có tiềm năng ứng dụng làm

thuốc bảo vệ thực vật không độc hại cho con người và môi trường phù hợp với nền

sản xuất nông sản an toàn.

Vật liệu nano bạc (AgNPs/chitosan) kháng nấm Pyricularia oryzae gây bệnh

đạo ôn lá lúa đã được một số công trình công bố, tác giả Bùi Duy Du (2009) AgNPs

sử dụng ở nồng độ Ag 5 mg.L-1, chitosan 25 mg.L-1 đã ức chế > 90% bệnh đạo ôn lá;

sản phẩm chứa nano Ag và chitosan tan cũng đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn Việt Nam cho phép lưu hành với tên thương mại MIFUM 0.6SL [122]; tác

giả Phạm Đình Chương và cs (2017) nghiên cứu trên đĩa thạch khi nồng độ bạc 10

mg.L-1, nồng độ chitosan 4.000 mg.L-1 thể hiện khả năng ức chế nấm Pyricularia

oryzae [121]. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào về khả năng ức chế nấm

Pyricularia oryzae hại cây lúa của vật liệu lai nano SiO2/OC.

3.8.2. Hiệu lực kiểm soát bệnh bạc lá trên lúa của nano SiO2/OC.

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas sp. xâm nhập, gây hại làm giảm

năng suất, chất lượng lúa gạo. Hiện nay, thuốc Visen 20SC là thuốc hóa học độc hại

đặc trị bệnh đạo ôn được khuyên dùng vì chưa có sản phẩm thuốc an toàn hơn để thay

thế. Kết quả nghiên cứu hiệu lực kiểm soát bệnh bạc lá trên cây lúa của vật liệu lai

nano SiO2/OC3000 với các nồng độ xử lý khác nhau được trình bày trong bảng 3.13.

Bảng 3.13 cho thấy tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh bạc lá lúa ở mẫu xử lý vật liệu lai

nano SiO2/OC3000 ở các thí nghiệm xử lý nồng độ hoạt chất khác nhau có sự khác

biệt về mặt thống kê so với công thức đối chứng (P < 0,05). Sau 14 ngày xử lý vật

liệu lần hai, tỷ lệ bệnh của thí nghiệm sử dụng lai nano SiO2/OC3000 với nồng độ

hoạt chất 100 mg.L-1 và 125 mg.L-1 tương đương nhau lần lượt là 2,78%; 2,59% và

thấp hơn so với thí nghiệm xử lý thuốc BVTV Visen 20SC có tỉ lệ bệnh là 3,21%.

Thí nghiệm xử lý vật liệu lai nano SiO2/OC3000 ở nồng độ hoạt chất 75 mg.L-1 có tỷ

lệ bệnh cao hơn là 5,45%, còn thí nghiệm đối chứng có tỉ lệ bệnh cao nhất đạt 19,01%,

bệnh hầu hết đã lây lan ra khắp ô thí nghiệm. Vậy hiệu quả kiểm soát bệnh bạc lá của

lai nano SiO2/OC3000 ở nồng độ sử dụng từ 100 – 125 mg.L-1 đạt từ 84,58 – 85,48%

so với đối chứng và tương đương với thuốc BVTV thương mại Visen 20SC có hiệu

quả kiểm soát 82,48%.

1 có chỉ số bệnh tăng chậm từ 0,94% lên 1,66% trong khi đó chỉ số bệnh ở công thức

Công thức xử lý vật liệu lai nano SiO2/OC3000 sử dụng nồng độ từ 100 mg.L-

đối chứng không xử lý vật liệu tăng mạnh từ 0,70% lên 9,29% sau 14 ngày xử lý lần

2. Như vậy khi bệnh bạc lá lúa xuất hiện cần thiết phải xử lý thuốc kịp thời để hạn

chế mức độ lây lan bệnh nghiêm trọng. Vết bệnh bạc lá xử lý nano SiO2/OC3000 ở

cấp độ nhẹ thể hiện trong hình 3.29c, vết bệnh bạc lá trong thí nghiệm đối chứng có

mức độ bệnh nặng thể hiện qua hình 3.29d. Kết quả nghiên cứu trên chứng tỏ vật liệu

lai nano SiO2/OC3000 ở nồng độ 100 mg.L-1 không những có khả năng kháng bệnh

đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây hại mà còn có khả năng kháng bệnh bạc lá do

vi khuẩn Xanthomonas sp. gây hại trên lúa.

Bảng 3.13. Hiệu quả kiểm soát bệnh bạc lá lúa sau khi xử lý với vật liệu lai nano

SiO2/OC3000

Sau xử lý vật liệu lần 2

Trước xử lý

Công thức

7 ngày

14 ngày

TLB (%)

H (%)

TLB (%)

H (%)

5,71±0,38a

8,36±0,57b

44,59±1,74a

5,45±0,85b

74,84±2,21a

nano SiO2/OC75

4,94±0,32a

5,83±0,58c

55,32±1,49b

2,78±0,29c

84,58±2,53b

nano SiO2/OC100

4,89±0,43a

5,29±0,48c

59,12±1,81b

2,59±0,33c

85,48±2,42b

nano SiO2/OC125

Visen 20SC

5,02±0,41a

5,09±0,50c

61,61±2,58b

3,21±0,45c

82,48±2,66b

Đối chứng (-) 5,21±0,45a

13,76±3,28a

19,01±1,34a

LSD, 0,05

0,92

3,76

7,67

2,04

6,48

CSB (%)

H (%)

CSB (%)

H (%)

0,760,02a

1,820,15b

50,13,13a

3,330,74b

67,03,41a

nano SiO2/OC75

0,680,02a

1,070,11c

67,23,25b

1,500,12c

83,42,83b

nano SiO2/OC100

0,940,02b

1,310,08b

71,02,94b

1,660,13c

86,72,67b

nano SiO2/OC125

Visen 20SC

0,800,01a

1,130,10c

70,63,27b

1,450,11c

86,33,02b

Đối chứng (-) 0,700,01a

3,360,68a

9,291,29a

LSD, 0,05

0,17

0,53

9,10

1,51

7,90

Ghi chú: Trong cùng một cột, các chữ cái theo sau khác nhau thì có khác biệt về mặt

thống kê ở mức ý nghĩa  = 0,05 theo phân tích ANOVA một chiều và Ducan’s

Multiple Range Test (DMRT); LSD-Khác biệt tối thiểu có ý nghĩa thống kê. Nano

SiO2/OC75 (nồng độ nano SiO2/OC 75 mg.L-1); nano SiO2/OC100 (nồng độ nano

SiO2/OC 100 mg.L-1); nano SiO2/OC125 (nồng độ nano SiO2/OC 125 mg.L-1); TLB:

tỉ lệ bệnh; CSB: chỉ số bệnh; H: Hiệu quả kiểm soát bệnh.

b)

a)

d)

c)

Hình 3.29. Hình ảnh nghiên cứu hiệu lực kiểm soát in vivo bệnh bạc lá trên lúa: a)

Bố trí thí nghiệm; b) Khung điều tra; c) Vết bệnh sau khi xử lý nano SiO2/OC; d)

Vết bệnh đối chứng.

Nhận xét: Vật liệu lai nano SiO2/OC3000 là một loại vật liệu có khả năng kiểm

soát bệnh gây hại trên lúa do vi nấm Pyricularia oryzae và vi khuẩn Xanthomonas sp

gây ra. Ở nồng độ hoạt chất sử dụng 100 mg.L-1 (57,2 mg.L-1 OC và 42,8 mg.L-1 nano

SiO2), vật liệu lai nano SiO2/OC3000 đã ức chế được > 85% bệnh đạo ôn và bạc lá

gây hại trên cây lúa tương đương với thuốc bảo vệ thực vật thương mại Trizole 75WP

và Visen 20SC. Vật liệu lai nano SiO2/OC3000 là vật liệu mới có khả năng ứng dụng

cho việc sản xuất nông sản an toàn thay thế thuốc bảo vệ thực vật độc hại.

3.9. Hiệu lực kháng bệnh nấm hồng Corticium salmonicolor trên cây cao su.

3.9.1. Hiệu lực in vitro kháng nấm hồng Corticium salmonicolor của nano

SiO2/OC.

Trong hình 3.30 là ảnh chụp sự phát triển của nấm hồng trên đĩa thạch có chứa

vật liệu lai nano SiO2/OC3000 với nồng độ khác nhau ở thời điểm 8 ngày sau nuôi

cây nấm. Khả năng ức chế nấm hồng Corticium salmonicolor của vật liệu lai nano

SiO2/OC3000 tăng khi tăng nồng độ hoạt chất nano SiO2/OC khuếch tán trong môi

trường thạch. Sau thời gian 8 ngày nhiễm nấm tại tâm đĩa thạch, vật liệu lai nano

SiO2/OC3000 tương ứng với các nồng độ 50; 75; 100; 125 và 150 mg.L-1 thì khả năng

ức chế sự phát triển của nấm Corticium salmonicolor lần lượt là 25,6%; 38,3%;

25.6%

38.3%

Đối chứng

50 mg.L-1

75 mg.L-1

47.4%

70.3%

84.8%

100 mg.L-1

125 mg.L-1

150 mg.L-1

47,4%; 70,3% và 84,8% (tính theo đường kính tản nấm).

Hình 3.30. Ảnh hưởng của vật liệu nano SiO2/OC3000 đến sự phát triển của tản nấm sau 8 ngày nhiễm nấm Corticium salmonicolor.

Hiệu quả ức chế nấm hồng phụ thuộc vào nồng độ hoạt chất nano

SiO2/OC3000 biểu diễn bằng phương trình hồi quy tuyến tính y = 0,5623x - 2,4571

(R2 = 0,9865) và biểu diễn bằng đồ thị ở hình 3.31. Từ đồ thị ở hình 3.31 xác định

được IC50 (Nồng độ ức chế 50%) của nano SiO2/OC3000 đối với nấm Corticium

salmonicolor là 93,3 mg.L-1. Một số loại vật liệu nano cũng có khả năng ức chế sự

1 hiệu quả ức chế đạt 81,9% (Đặng Văn Phú và cs, 2010) [123], nano Cu ở nồng độ 7

phát triển của nấm hồng Corticium salmonicolor, ví dụ nano Ag ở nồng độ 100 mg.L-

mg.L-1 đã có hiệu quả ức chế nấm hồng (Cao Văn Dư và cs, 2014) [124]. Đến nay

chưa có kết quả công bố nghiên cứu hiệu lực kháng nấm hồng cao su đối với vật liệu

nano SiO2/OC3000.

Dựa trên kết quả thí nghiệm ức chế nấm hồng Corticium salmonicolor bằng

phương pháp khuếch tán thạch đĩa, hiệu quả ức chế đạt trên 84% với nồng độ hoạt

chất nano SiO2/OC3000 150 mg.L-1, nồng độ này được lựa chọn để tiến hành thí

nghiệm khảo sát hiệu lực kiểm soát bệnh nấm hồng ngoài đồng ruộng.

100

%

,

ế h c

c ứ c ự

l

y = 0,5623x - 2,4571 R² = 0,9865

i

u ệ H

100

150

50 125 Nồng độ nSiO2/OC, mg.L-1

Hình 3.31. Hiệu quả ức chế nấm Corticium salmonicolor phụ thuộc vào nồng độ của nano SiO2/OC.

3.9.2. Hiệu lực kiểm soát bệnh nấm hồng trên cây cao su của nano SiO2/OC

Thí nghiệm ngoài đồng ruộng được tiến hành trên cây cao su 7 năm tuổi tại xã

Sông Trầu, huyện Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai từ tháng 4 đến tháng 5 năm 2018.

Bảng 3.14. Hiệu lực kiểm soát bệnh nấm hồng trên cây cao su khi xử lý vật liệu lai nano SiO2/OC3000, nano SiO2 và OC3000.

Tỉ lệ bệnh (%)

Chỉ số bệnh (%)

Công thức

Hiệu quả (%)

Trước phun

14 ngày sau phun lần 2

Trước phun

14 ngày sau phun lần 2

38,65a

5,242,18a 8,812,45b

35,36a 1,050,44a 2,780,65b

nano SiO2 150 mg.L-1

85,21a

5,242,18a 3,941,43b

71,01a 1,050,44a 0,670,44b

OC 150 mg.L-1

91,61b

5,242,18a

1,431,43c

89,51b 1,050,44a

0,380,44c

nano SiO2/OC 150 mg.L-1

Saizole 5SC

88,29b

4,760,82a

1,900,82c

84,65b 0,950,16a

0,480,33c

Đối chứng

0,00

4,761,65a 12,382,97a

0,950,33a

4,100,87a

LSD, 0,05

0,91

5,67

0,18

3,67

Ghi chú: Trong cùng một cột, các chữ cái theo sau khác nhau thì có khác biệt về mặt

thống kê ở mức ý nghĩa  = 0,05 theo phân tích ANOVA một chiều và Ducan’s

Multiple Range Test (DMRT); LSD-Khác biệt tối thiểu có ý nghĩa thống kê, NANO

S: không có ý nghĩa thống kê. Nano SiO2/OC 150 mg.L-1 (nồng độ nano SiO2/OC 150

mg.L-1).

Khả năng kháng nấm hồng gây hại trên cây cao su trong thí nghiệm in vivo

ngoài đồng ruộng trình bày trong bảng 3.14 cho thấy, vật liệu lai nano SiO2/OC3000

đạt hiệu quả cao hơn nano silica và OC3000 khi cùng xử lý ở nồng độ 150 mg.L-1.

Hiệu quả kiểm soát bệnh nấm hồng cao su của vật liệu lai nano SiO2/OC tính theo tỷ

lệ bệnh và chỉ số bệnh tương ứng là 89,51% và 91,61%. Hiệu quả này cao hơn so

mẫu sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Saizole 5SC (hoạt chất hexaconazole), hiệu quả

kiểm soát bệnh tương ứng là 84,65%; 88,29%. Đối với công thức sử dụng vật liệu nano

silica, hiệu quả kiểm soát bệnh nấm hồng cao su chỉ đạt ở mức thấp 35,36% so với

mẫu đối chứng. Tổng hợp các kết quả nghiên cứu khả năng kích thích sản sinh enzyme

kháng mầm bệnh, hiệu quả kiểm soát bệnh thực vật đã thực hiện trong luận án, chúng

tôi thấy rằng nano silica có hiệu lực không cao khi ở trạng thái đơn chất. Nano silica

sử dụng ở trạng thái đơn lẻ trên thực vật có hiệu ứng kháng vi sinh vật yếu là do khi

nó phân tán trong nước hoặc một số chất hoạt động bề mặt tạo các hạt keo tích điện

âm [150] nên bị đẩy bởi màng tế bào vi sinh vật tích điện âm. Tuy nhiên, nano silica

có tác dụng gia cố thành tế bào thực vật làm cho thành tế bào vững chắc hạn chế sự

xâm nhập của mầm bệnh.

a)

b)

d)

c)

Hình 3.32. Thí nghiệm kiểm soát bệnh nấm hồng trên cây cao su: a, c) Vườn cao su

thí nghiệm; b) Vết bệnh nấm hồng cấp 3; d) Vết bệnh sau xử lý vật liệu nano SiO2/OC.

Oligochitosan cũng thể hiện khả năng kháng bệnh nấm hồng cao su với hiệu

quả cao đạt 71,09% nhưng nhỏ hơn khoảng 20% so với công thức xử lý bệnh bằng

vật liệu nano SiO2/OC. Kết quả này một lần nữa khẳng định do tương tác tạo liên kết

phối trí, liên kết ion giữa nano silica và oligochitosan, sự tạo thành hạt keo mang điện

tích dương trong vật liệu lai nano SiO2/OC3000 đã làm tăng khả năng kháng nấm

bệnh thực vật vượt trội so với vật liệu đơn lẻ.

Hiệu quả kiểm soát bệnh nấm hồng của vật liệu lai nano SiO2/OC3000 trong

thử nghiệm đồng ruộng đạt 91,06% cao hơn mức 84,7% trong phòng thí nghiệm là

do mật độ nấm Corticium salmonicolor trong tự nhiên luôn nhỏ hơn trong thí nghiệm

in vitro [136, 161].

Nhận xét về nghiên cứu hiệu lực kiểm soát bệnh cây trồng của vật liệu nano SiO2/OC:

 Sự tương tác giữa nano silica và oligochitosan tạo nên vật liệu lai nano

SiO2/OC thể hiện hiện ứng kích thích sản sinh enzyme chitinase tăng cường

kháng bệnh đốm nâu cây thanh long so với đơn chất nano silica và

oligochitosan với cùng nồng độ hoạt chất 150 mg.L-1.

 Vật liệu lai nano SiO2/OC kiểm soát bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae

gây ra, bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomomas gây hại trên lúa ở nồng độ xử

lý 100 mg.L-1 và bệnh nấm hồng cao su ở nồng độ xử lý 150 mg.L-1 cao hơn

có ý nghĩa thống kê so với nano silica và oligochitosan và tương đương với

thuốc bảo vệ thực vật đối chứng.

 Nano SiO2/OC3000 là loại vật liệu có khả năng đề kháng với vi sinh vật gây

bệnh thực vật, không độc nên có triển vọng sử dụng làm thuốc BVTV đáp ứng

các nhu cầu xã hội sử dụng các sản phẩm nông sản an toàn.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Luận án đã hoàn thành mục tiêu nghiên cứu điều chế nano silica, vật liệu lai

nano SiO2/OC từ phế thải tro vỏ trấu và chitosan vỏ tôm; đã khảo sát hiệu ứng kiểm

soát bệnh thực vật của chúng, các kết luận chính như sau:

1. Đã điều chế nano silica có kích thước hạt 45 – 48 nm với cấu trúc hầu như vô

định hình và độ tinh khiết > 99,5% bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu

sau khi xử lý loại bỏ các hợp chất kim loại tại nhiệt độ 700 oC; 750 oC trong

thời gian 2 giờ. Sự khác biệt của nghiên cứu này là sử dụng nguyên liệu phế

thải tro vỏ trấu công nghiệp.

2. Nano silica cũng được điều chế bằng phương pháp tổng hợp và nhiệt phân gel

SiO2/chitosan, có thể điều chỉnh kích thước hạt silica từ 9,0 – 55,0 nm qua tỉ

lệ SiO2/chitosan, kích thước hạt silica tăng theo hàm lượng SiO2 có trong gel.

Khi tỉ lệ gel SiO2/CS ≤ 1/1 thu được các hạt nano silica có kích thước < 10

nm, tỉ lệ SiO2/CS từ 2/1 – 6/1 thì kích thước hạt nano silica tương đương với

kích thước hạt nano silica thu được từ phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu.

Như vậy, điều chế nano silica có kích thước > 40 nm thì phương pháp nhiệt

phân tro vỏ trấu hiệu quả hơn. Kết luận này là cơ sở khoa học cho việc nghiên

cứu sử dụng các polyme khác để tạo gel với SiO2 điều chế nano silica để có

kích thước hạt và giá thành thích hợp.

3. Quy trình điều chỉnh khối lượng phân tử chitosan bằng cách xử lý với H2O2

1% trong 24 giờ, và 03 lần bổ sung H2O2 đạt nồng độ 0,5% sau 03 lần chiếu

xạ tia  Co-60 với liều xạ 7 kGy theo đã giảm được liều xạ. Oligochitosan có

khối lượng phân tử 3.000, 5.000 và 7.000 g.mol-1 được điều chế với tổng liều

chiếu xạ khác nhau từ 14 – 42 kGy.

4. Vật liệu lai nano SiO2/OC có hàm lượng nano SiO2 tới 1,5% trong dung dịch

OC3000 2% được điều chế bằng phương pháp phối trộn hai đơn chất hoặc sử

dụng quá trình sol-gel qua phản ứng kết tủa SiO2 giữa Na2SiO3 với proton H+

trong dung dịch oligochitosan. Vật liệu nano SiO2/OC là dung dịch keo đồng

thể, có độ bền cao và đạt cân bằng sa lắng sau thời gian bảo quản 2 tháng.

5. Vật liệu lai nano SiO2/OC thể hiện hiệu lực kiểm soát bệnh thực vật bằng cơ

chế kích thích sản sinh enzyme chitinase và trực tiếp ức chế vi sinh vật gây

bệnh. Đối với bệnh đốm nâu thanh long, nano SiO2/OC kích thích sản sinh

enzyme chitinase tăng liên tục từ thời điểm bị nhiễm nấm tới khi bệnh được

kiểm soát. Hiệu quả kiểm soát bệnh thực vật của nano SiO2/OC vượt trội so

với đơn chất nano silica, oligochitosan đối với bệnh đốm nâu thanh long và

bệnh nấm hồng trên cây cao su ở nồng độ hoạt chất 150 mg.L-1. Vật liệu lai

nano SiO2/OC còn thể hiện khả năng kiểm soát bệnh đạo ôn, bạc lá do nấm và

vi khuẩn gây ra trên lúa đạt > 85% ở nồng độ 100 mg.L-1. Các kết quả nghiên

cứu về hiệu ứng kháng bệnh thực vật trong luận án này là mới, lần đầu tiên

được công bố.

6. Phương pháp nhiệt phân và phối trộn để điều chế vật liệu lai nano SiO2/OC sử

dụng phế thải tro vỏ trấu công nghiệp và chitosan vỏ tôm là phương pháp sản

xuất xanh, thân thiện môi trường. Vật liệu nano SiO2/OC có hiệu quả kháng vi

sinh vật phổ rộng, không độc nên rất có triển vọng ứng dụng làm chất kiểm

soát bệnh thực vật an toàn và hiệu quả.

KIẾN NGHỊ

Qua những kết quả được công bố trong của Luận án, chúng tôi kiến nghị cần tiến

hành một số nghiên cứu tiếp theo như sau:

1. Mở rộng nghiên cứu hiệu quả kháng vi sinh vật gây bệnh thực vật trên các đối

tượng bệnh và cây trồng khác của vật liệu nano SiO2/OC và nghiên cứu hiệu

quả kháng bệnh phụ thuộc vào kích thước hạt nano silica.

2. Dựa trên kết quả nghiên cứu hoạt tính kiểm soát bệnh thực vật liên kết với

doanh nghiệp khảo nghiệm diện hẹp, diện rộng để đăng ký công nhận thuốc

bảo vệ thực vật chứa hoạt chất nano SiO2/OC và thương mại hóa sản phẩm.

MỘT SỐ ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Quy trình điều chế nano silica, vật liệu lai nano SiO2/OC sử dụng phế thải tro vỏ

trấu công nghiệp và chitosan vỏ tôm bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu,

phối trộn 02 đơn chất là phương pháp tổng hợp xanh hạn chế sử dụng hóa chất,

tận dụng phế thải của ngành nông nghiệp, công nghiệp.

2. Quy trình điều chế nano silica bằng phương pháp tổng hợp và nhiệt phân gel có

thể điều chỉnh được kích thước hạt theo mong muốn thông qua tỉ lệ SiO2/CS trong

gel.

3. Lần đầu tiên công bố vật liệu lai nano SiO2/OC có hiệu ứng kích thích sản sinh

enzyme chitinase, hiệu lực kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long, bệnh

nấm hồng trên cây cao su, bệnh đạo ôn lá và bạc lá trên cây lúa.

100

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

1. Le Nghiem Anh Tuan, Bui Duy Du, Le Doan Thanh Ha, Lai Thi Kim Dzung, Dang

Van Phu, Nguyen Quoc Hien, Induction of chitinase and brown spot disease

resistance by oligochitosan and nano silica-oligochitosan in dragon fruit plants,

Agricultural Research (ISSN 2249-7218), 2019, 8(2), 184-190. DOI:

https://doi.org/10.1007/s40003-018-0384-9

2. Dang Van Phu, Bui Duy Du, Le Nghiem Anh Tuan, Hoang Van Tam, Nguyen

Quoc Hien, Preparation and foliar application of oligochitosan - nano silica on the

enhancement of soybean seed yield, International Journal of Environment,

Agriculture and Biotechnology (IJEAB), 2017, 2 (1), 421-428.

DOI: 10.22161/ijeab/2.1.53

3. Lê Nghiêm Anh Tuấn, Bùi Duy Du, Đặng Văn Phú, Nghiên cứu tổng hợp vật liệu

lai nano silica/oligochitosan từ nSiO2 của tro vỏ trấu, Tạp chí Hóa học (ISSN 0866-

7144), 2018, 56(3), 328-334. DOI: 10.15625/vjc.2018-0028

4. Le Nghiem Anh Tuan, Lai Thi Kim Dung, Le Doan Thanh Ha, Nguyen Quoc Hien,

Dang Van Phu, Bui Duy Du, Preparation and characterization of nano silica from

rice husk ash by chemical treatment combined with calcination, Vietnam Journal of

Chemistry, International Edition (ISSN: 2525-2321), 2017, 55 (4), 455-459. DOI:

10.15625/2525-2321.2017-00490

5. Le Nghiem Anh Tuan, Lai Thi Kim Dung, Bui Duy Du, Dang Van Phu, Nguyen

Quoc Hien, Effect of nano silica/chitosan hybrid on leaf blast disease and bacterial

blight disease of rice in Vietnam, Vietnam Journal of Chemistry, International Edition

(ISSN: 2525-2321), 2016, 54 (6), 719-723. DOI: 10.15625/0866-7144.2016-00393.

6. Le Nghiem Anh Tuan, Bui Duy Du, Lai Thi Kim Dung, Dang Van Phu, Nguyen

Quoc Hien, Preparation of nano silica-oligochitosan mixture and investigation of in

vitro antfungal effect against Corticium salmonicolor fungus, Proceedings of the 6th

Asian Symposium on Advanced Materials: Chemistry, Physics & Biomedicine of

Functional and Novel Materials (ASAM-6), Hanoi, Vietnam, 2017, 630-636. (ISBN:

978-604-913-603-0).

101

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. S. A. Boussaa, A. Kheloufi, B. Zaourar, F. Kerkar, Valorization of Algerian

Sand for Photovoltaic Application. Acta Physica Polonica A, 2016, 129, 133-

137.

2. H.T. Jang, Y.K. Park, Y.S. Ko, J.Y. Lee, B. Margandan, Highly siliceous MCM-

48 from rice husk ash for CO2 adsorption, International Journal of Greenhouse

Gas Control, 2009, 3 (5), 545-549.

3. F. Adam, J. N. Appaturi, A. Iqbal, The utilization of rice husk silica as a catalyst:

Review and recent progress, Catalysis Today, 2012, 190 (1), 2-14.

4. R. Pode, Potential applications of rice husk ash waste from rice husk biomass

power plant, Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2016, 53, 1468-1485.

5. https://baomoi.com-19/01/2018.

6. R. V. Krishnarao, J. Subrahmanyam, T. Jagadish Kumar, Studies on the

formation of black particles in rice husk silica ash, Journal of the European

Ceramic Society, 2001, 21 (1), 99-104.

7. S. Chandrasekhar, P. N. Pramada, L. Praveen, Effect of organic axit treatment

on the properties of rice husk silica, Journal of Materials Science, 2005, 40 (24),

6535–6544.

8. N. Yalcin, V.Sevinc, Studies on silica obtained from rice husk, Ceramics

International, 2001, 27 (2), 219-224.

9. J. D. Martínez, T. Pineda, J. P. López, M. Betancur, Assessment of the rice husk

lean-combustion in a bubbling fluidized bed for the production of amorphous

silica-rich ash, Energy, 2011, 36 (6), 3846-3854.

10. S. R. Kamath, A. Proctor, Silica gel from rice hull ash: Preparation and

characterization, Cereal Chemistry, 1998, 75, 484–487.

11. V. P. Della, I. Kühn, D. Hotza, Rice husk ash as an alternate source for active

silica production, Materials Letters, 2002, 57 (4), 818-821.

12. A. I. Zakharov, A. V. Belyakov, A. N. Tsvigunov. Forms of extraction of

silicon compounds in rice husks, Glass and Ceramics, 1993, 50 (9-10), 420–

425

102

13. L. Nian, H. Kaifu, M.T. McDowell, J. Zhao and Y. Cui. Rice husks as a

sustainable source of nanostructured silicon for high performance Lion battery

anodes. Scientific Reports, 2013, 1-7.

14. J. Song, H. Kong and J. Jang, Enhanced antibacterial performance of cationic

polymer modified silica nanoparticles, Chemical Communications, 2009, 36,

5418–5420.

15. R. Suriyaprabha, G. Karunakaran, K. Kavitha, R. Yuvakkumar, V. Rajendran,

N. Kannan, Application of silica nanoparticles in maize to enhance fungal

resistance, IET Nanobiotechnology, 2014, 8 (3), 133–137.

16. SK. Kim, N. Rajapakse, Enzymatic production and biological activities of

chitosan oligosaccharide (COS): A review, Review Carbohydrate Polymer,

2005, 62, 357-368.

17. C. Q. Qin, Y. M. Du, L. Xiao, Effect of hydrogen peroxide treatment on the

molecular weight and structure of chitosan, Polymer Degradation and Stability,

2002, 76, 211-218.

18. M. Haji-Saeid, A. Safrany, M. H. O. Sampa, N. Ramamoothy, Radiation

processing of natural polymers: the IAEA contribution, Radiation Physics and

Chemistry, 2010, 79, 255-260.

19. Đặng Xuân Dự, Nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng hiệu ứng đồng vận

H2O2/bức xạ gamma coban-60 để chế tạo oligochitosan, Luận án Tiến sĩ Hóa

học, Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế, 2015, Huế.

20. G. F. Burkhanova, L. G. Yarullina, & I. V. Maksimov. The control of wheat

defense responses during infection with Bipolaris sorokiniana by

chitooligosaccharides, Russian Journal of Plant Physiology, 2007, 54 (1), 104-

110.

21. O.L. Ozeretskovskaya, N.I. Vasyukova, Y.S. Panina, G.I. Chalenko, Effect of

immunomodulators on potato resistance and susceptibility to Phytophthora

infestans, Russian Journal of Plant Physiology, 2006, 53, 488-494.

22. G. L. Drisko, C. Sanchez, Hybridization in materials science – Evolution,

current state, and future aspirations, Eur. J. Inorg. Chem., 2012, 5097-5105.

23. H. Yin, X. Zhao, Y. Du, Oligochitosan: A plant disease vaccine-A review.

Carbohydrate Polymers, 2010, 82 (1), 1-8.

103

24. N. Shibuya and E. Minami, Oligosaccharide signalling for defence responses in

plant, Physiological and Molecular Plant Pathology, 2001, 59, 223-233.

25. M. Thakur, B. S. Sohal, Role of elicitors in inducing resistance in plants against

pathogen infection: a review, ISRN Biochemistry, 2013, Article ID 762412, 1-

10.

26. V. Singh, P. Srivastava, A. Singh, D. Singh, T. Malviya, Polysaccharide-silica

hybrids: design and applications, Polymer Reviews, 2016, 56 (1), 113-136.

27. P. Lu and Y. L. Hsieh, Highly pure amorphous silica nano-disks from rice straw,

Powder Technology, 2012, 225, 149-155.

28. E. Rafiee, S. Shahebrahimi, M. Feyzi, M. Shaterzadeh, Optimization of

synthesis and characterization of nano silica produced from rice husk (a

common waste material), International Nano Letters, 2012, 2 (29).

29. L. V. Hai, H. T. C. Nhan, H. T. Huy, Synthesis of silica nanoparticles from

Vietnamese rice husk by sol–gel method, Nanoscale Research Letters, 2013,

8:1.

30. N. T. Tuấn, N. H. M. Phú, H. N. T. Tân, P. T. B. Thảo, N. T. K. Chi, L. V. Nhạn,

N. T. Tuân và T. X. Anh, Tổng hợp hạt nano SiO2 từ tro vỏ trấu bằng phương

pháp kết tủa, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ - Phần A: Khoa học

Tự nhiên, Công nghệ và Môi trường, 2014, 32, 120-124.

31. Nguyễn Văn Hưng, Nguyễn Ngọc Bích, Nguyễn Hữu Nghị, Trần Hữu Bằng,

Đặng Thị Thanh Lê, Điều chế vật liệu nano SiO2 cấu trúc xốp từ tro trấu để hấp

phụ xanh metylen trong nước, Tạp chí Hóa học, 2015, 53 (4), 491-496.

32. N. S. C Zulkifli, I. Ab Rahman, D. Mohamad, A. Husein, A green sol–gel route

for the synthesis of structurally controlled silica particles from rice husk for

dental composite filler, Ceramics International, 2013, 39 (4), 4559-4567.

33. T. H. Liou and C. C. Yang, Synthesis and surface characteristics of nano silica

produced from alkali-extracted rice husk ash, Materials Science and

Engineering B, 2011, 176, 521–529.

34. M. S. U. Rehman, M. A. Umer, N. Rashid, I. Kim, J-I. Han, Sono-assisted

sulfuric acid process for economical recovery of fermentable sugars and

mesoporous pure silica from rice straw, Industrial Crops and Products, 2013,

49, 705-711.

104

35. K. Selvakumar, A. Umesh, P. Ezhilkumar, S. Gayatri, P. Vinith, V. Vignesh,

Extraction of silica from burnt paddy husk, International Journal of ChemTech

Research, 2014, 6 (9), 4455-4459.

36. Z. Zhang, W. He, J. Zheng, G. Wang, J. Ji, Rice husk ash-derived silica

nanofluids: Synthesis and stability study, Nanoscale Research Letters, 2016,

11(1), 502.

37. S. Rungrodnimitchai, W. Phokhanusai, N. Sungkhaho, Preparation of silica gel

from rice husk ash using microwave heating, Journal of Metals, Materials and

Minerals, 2017, 19 (2), 45-50.

38. W. Thongthai, M. Chareonpanich, J. Limtrakul, Effect of axitity on the

formation of silica–chitosan hybrid materials and thermal conductive property,

J. Sol-Gel Sci. Technol., 2009, 51, 146-152.

39. W. Thongthai, M. Chareonpanich, J. Limtrakul, Size control of nanostructured

silica using chitosan template and fractal geometry: effect of chitosan/silica

ratio and aging temperature, J. Sol-Gel Sci. Technol., 2010, 56, 270–277.

40. Y. Li, X. Ding, Y. Guo, C. Rong, L. Wang, Y. Qu, X. Ma, Z. Wang, A new

method of comprehensive utilization of rice husk, Journal of Hazardous

Materials, 2011, 186 (2-3), 2151-2156.

41. X. Ma, B. Zhou, W. Gao, Y. Qu, L. Wang, Z. Wang, Y. Zhu, A recyclable

method for production of pure silica from rice hull ash, Powder Technology,

2012, 217, 497–501.

42. T. H. Liou and C. C. Yang, Synthesis and surface characteristics of nano silica

produced from alkali-extracted rice husk ash, Materials Science and

Engineering B, 2011, 176, 521–529.

43. A. Tadjarodi, M. Haghverdi, V. Mohammadi, Preparation and characterization

of nano-porous silica aerogel from rice husk ash by drying at atmospheric

pressure, Materials Research Bulletin, 2012, 47, 2584–2589.

44. Pham Dinh Dung, Le Si Ngoc, Nguyen Ngoc Thuy, Lu T. Minh Truc, Bui Van

Le, Dang Van Phu, Nguyen Ngoc Duy, Nguyen Quoc Hien, Effect of nano silica

from rice husk on the growth enhancement of chili plant (Capsicum frutescens

L.), Journal of Science and Technology, 2016, 54 (5), 607-613.

105

45. N. N. Thuy, N. D. Hai, P. D. Dzung, D. V. Phu, N. Q. Hien, H. D. Quy. New

oligochitosan-nano silica hybrid materials: preparation and application on chili

plants for resistance to anthracnose disease and growth enhancement, Polymer

Journal, 2017, 1-9.

46. S. Gu, J. Zhou, Z. Luo, Q. Wang, M. Ni, A detailed study of the effects of

pyrolysis temperature and feedstock particle size on the preparation of nano

silica from rice husk, Industrial Crops and Products, 2013, 50, 540–549.

47. S. Gu, J. Zhou, C. Yu, Z. Luo, Q. Wang, Z. Shi, A novel two-staged thermal

synthesis method of generating nano silica from rice husk via pre-pyrolysis

combined with calcination, Industrial Crops and Products, 2015, 65, 1-6.

48. A.A. Alshatwi, J. Athinarayanan, V. S. Periasamy, Biocompatibility assessment

of rice husk-derived biogenic silica nanoparticles for biomedical applications,

Materials Science and Engineering C, 2015, 47, 8-16.

49. R. A. Bakar, R. Yahya, S. N. Gan, Production of high purity amorphous silica

from rice husk, Procedia Chemistry, 2016, 19, 189-195.

50. G. M F. Gomes, C. Philipssen, E. K Bard, L. D. Zen, G. de Souza, Rice husk

bubbling fluidized bed combustion for amorphous silica synthesis, Journal of

Environmental Chemical Engineering, 2016, 4 (2), 2278-2290.

51. Hoàng Thị Phương, Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Đăng Toàn, Trịnh Thanh Sơn,

Nguyễn Thị Ngọc Bích, Ngô Hồng Anh, Nguyễn Lan Anh, Phạm Hồng Trang,

Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nanosilica phục vụ quá trình thu hồi dầu trong

khai thác và vận chuyển thu gom dầu thô tại Việt Nam, Hóa - Chế Biến Dầu

Khí, 2016, 9, 24-33.

52. Đặng Thị Thanh Lê, Vương Đặng Lê Mai, Vũ Việt Cường, Hoàng Anh Tuấn,

Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu nano SiO2 điều chế từ tro trấu đến khả năng

chống thấm ion clo của bê tông xi măng nhiều tro bay, Tạp chí Hóa học, 2017,

55(3), 298-302.

53. K. Makuuchi, Critical review of radiation processing of hydrogel and

polysaccharide, Radiation Physics and Chemistry, 2010, 79, 267-271

54. A. G. Chmielewski, M. Haji-Saeid, Radiation technologies: past, present and

future, Radiation Physics and Chemistry, 2004, 71, 17-21.

106

55. N. M. El-Sawy, H. A. A. El-Rehim, A. M. Elbarbary, E. A. Hegazy 2010.

Radiation-induced degradation of chitosan for possible use as growth promoter

in agricultural purposes, Carbohydrate Polymers, 2010, 79 (3), 555-562.

56. C. Q. Quin, Y. M. Du, L. Xiao, Effect of hydrogen peroxide treatment on the

molecular weight and structure of chitosan, Polymer Degradation and Stability,

2002, 76, 211-218.

57. C. von Sonntag, Free-radical reaction of carbohydrates as studied by radiation

techniques, Advance in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 1980, 37,

7-77.

58. J. Weiss, Radiochemistry of aqueous solution, Nature, 1944, 153, 748-750.

59. Y. Tabata, General introduction to radiation chemistry, UNDP/IAEA/RCA,

Training course on radiation chemistry, Takasaki, 1991, 55-65.

60. P. Ulanski, C. von Sonntag, OH-radical-induced chain scission of chitosan in

the absence and presence of dioxygen, Journal of the Chemical Society, Perkin

Transactions, 2000, 2 (10), 2022-2028.

61. Nguyễn Quốc Hiến, Lê Hải, Lê Quang Luân, Trương Thị Hạnh, Phạm Thị Lệ

Hà, Nghiên cứu chế tạo oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ, Tạp chí Hóa học,

2000, 38 (2), 22-24.

62. Nguyễn Quốc Hiến, Đặng Văn Phú, Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Ngọc Duy,

Nguyễn Thụy Ái Trinh, Bùi Duy Du, Nghiên cứu hiệu ứng đồng vận cắt mạch

chitosan bằng bức xạ gamma Co–60 kết hợp với hydroperoxit, Tạp chí Hóa học,

2011, 49 (1), 122-124.

63. N. N. Duy, D. V. Phu, N. T. Anh, N. Q. Hien, Synergistic degradation to prepare

oligochitosan by -irradiation of chitosan solution in the presence of hydrogen

peroxide, Radiation Physics and Chemistry, 2011, 80 (7), 848-853.

64. Bùi Phước Phúc, Hà Thúc Huy, Nguyễn Ngọc Duy, Đặng Văn Phú, Nguyễn

Quốc Hiến, Nghiên cứu giảm cấp chitosan bằng hydroperoxit kết hợp với bức

xạ gamma Co-60, Tạp chí Hóa học và Ứng dụng, 2006, 52 (4), 29-32.

65. T. V. Podust, T. V. Kulik, B. B. Palyanytsya, V. M. Gun’ko, A. Tóth, L.

Mikhalovska, A. Menyhárd, K. Lászlo, Chitosan-nano silica hybrid materials:

Preparation and properties, Applied Surface Science, 2014, 320, 563–569.

107

66. M. B. Tetyana, V. P. Ievgen, A. T. Valentin, S. Y. Elina, K. Dorota, Synthesis

and adsorption properties of chitosan-silica nanocomposite prepared by sol-gel

method, Nanoscale Research Letters, 2015, 10, 87.

67. J.A. Sowjanya, J. Singha, T. Mohita, S. Arvanan, A. Moorthi, N. Srinivasan, N.

Selvamurugan, Biocomposite scaffolds containing chitosan/alginate/nano-silica

for bone tissue engineering, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2013, 109,

294-300.

68. K.C. Kavy, R. Jayakumar, S. Nair, K. P. Chennazhi, Fabrication and

characterization of chitosan/gelatin/nSiO2 composite scaffold for bone tissue

engineering, International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 59,

255-263.

69. G. S. Silva, P. C. Oliveira, D. S. Giordani and H. F. de Castro,

Chitosan/Siloxane Hybrid Polymer: Synthesis, Characterization and

Performance as a Support for Immobilizing Enzyme, J. Braz. Chem. Soc., 2011,

22 (8), 1407-1417.

70. W. Thongthai, S. Tepsarn, P. Kittipokin, B.Embley, M. Chareonpanich, Effect

of pH and chitosan concentration on precipitation and morphology of

hierarchical porous silica, Journal of Non-Crystalline Solids, 2011, 357, 3513-

3519.

71. Y. Jen-Taut, C. Chin-Lai, H. Kuo-Shien, Synthesis and properties of

chitosan/SiO2 hybrid materials, Materials Letters, 2007, 61, 1292-1295.

72. R. A. Michael, J. H. Arlon, Synthesis and properties of chitosan–silica hybrid

aerogels, Journal of Non-Crystalline Solids, 2001, 285, 123-127.

73. K. Wasaki, P. Maier, M. Fecht, W. Horst, Leaf apoplastic silicon enhances

manganese tolerance of cowpea (Vign unguiculata). Plant. Physiol., 2002, 159,

167-173.

74. J. Ma, Role of silicon in enhancing the resistance of plants to biotic and abiotic

stresses, Soil. Science Plant. Nutrition, 2004, 50, 11-18.

75. Y. Liang, JW. Wong, L. Wei, Silicon-mediated enhancement of cadmium

tolerance in maize (Zea mays L.) grown in cadmium contaminated soil,

Chemosphere, 2005, 58 (4), 475-483.

108

76. S.G. Kim, K.W. Kim, E.W. Park, D. Choi, Silicon-induced cell wall

fortification of rice leaves: a possible cellular mechanism of enhanced host

resistance to blast, Phytopathology, 2002, 92, 1095-1103.

77. F. Fauteux, W. Rémus-Borel, J. Menzies, R. Bélanger, Silicon and plant disease

resistance against pathogenic fungi, FEMS Microbiol. Lett. Mini Rev., 2005,

249, 1-6.

78. J. Song, H. Kong and J. Jang, Enhanced antibacterial performance of cationic

polymer modified silica nanoparticles, Chemical Communications, 2009, 36,

5418–5420.

79. R. Suriyaprabha, G. Karunakaran, K. Kavitha, R. Yuvakkumar, V. Rajendran,

N. Kannan, Application of silica nanoparticles in maize to enhance fungal

resistance, IET Nanobiotechnology, 2014, 8 (3), 133-137.

80. F. Rodrigues, L. Datnoff, G. Korndörfer, K. Seebold, M. Rush. Effects of silicon

and host resistance on sheath blight development in rice, Plant Disease, 2001,

85, 827-832.

81. K.W. Seebold, T.A. Kucharek, L.E. Datnoff, F.J. Correa-Victoria, M.A

Marchetti, The influence of silicon on components of resistance to blast in

susceptible, partially resistant and resistant cultivars of rice, Phytopathology

2001, 91 (1), 63-69.

82. H. M. El-bendary and A. A. El-Helaly, First record nanotechnology in

agricultural: Silica nanoparticles a potential new insecticide for pest control,

Applied Science Reports, 2013, 4 (3), 241-246.

83. J. Xu, X. Zhao, X. Han and Y. Du, Antifungal activity of oligochitosan against

Phytophthora capsici and other plant pathogenic fungi in vitro, Pesticide

Biochemistry and Physiology, 2007, 87, 220-228.

84. Y.J. Jone, and S.K. Kim, Effect of antimicrobial activity by chitosan

oligosaccharides N- conjugated with asparagines, Journal of Microbiology and

biotechnology, 2001, 11, 281-286.

85. J. C. Fernandes, F. K. Tavaria, J. C. Soares, Ó. S. Ramos, M. João Monteiro, M.

E. Pintado and F. Xavier Malcata, Antimicrobial effects of chitosans and

chitooligosaccharides, upon Staphylococcus aureus and Escherichia coli, in

food model systems, Food Microbiology, 2008, 25, 922-928.

109

86. R. Vivek, V. N. Babu, R. Thangam, K. S. Subramanian, S. Kannan, pH-

responsive drug delivery of chitosan nanoparticles as Tamoxifencarriers for

effective anti-tumor activity in breast cancer cells, Colloids and Surfaces B:

Biointerfaces, 2013, 111, 117-123.

87. J.-S. Moon, H.-K. Kim, H. Koo, Y.-S. Joo, H.-M. Nam, Y. Park and M.-I. Kang,

The antibacterial and immunostimulative effect of chitosan-oligosaccharides

against infection by Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis,

Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 75, 989-998.

88. D.-N. Ngo, M.-M Kim and S.-K. Kim, Chitin oligosaccharides inhibit oxidative

stress in live cells, Carbohydrate Polymers, 2008, 74, 228-234.

89. D.-N. Ngo, S.-H. Lee, M.-M Kim and S.-K. Kim, Production of chitin

oligosaccharides with different molecular weights and their antioxidant effect

in RAW 264.7 cells, Journal of Functional Foods, 2009, 1, 188-198.

90. Y. Qiao, X. F. Bai and Y. G. Du, Chitosan oligosaccharides protect mice from

LPS challenge by attenuation of inflammation and oxidative stress,

International Immunopharmacology, 2011, 11, 121-127.

91. X. Ke, Z. Xiao, P. Xue, Q. Sheng, Chitosan antimicrobial and eliciting

properties for pest control in agriculture: a review, Agron. Sustain. Dev., 2015,

35, 569–588.

92. J. Synowiecki, N.A. Al-Khateeb, Production, properties, and some new

applications of chitin and its derivatives, Critical Reviews in Food Science and

Nutrition, 2003, 43, 145-171.

93. M. Rinaudo, Chitin and chitosan: properties and applications, Progress in

Polymers Science, 2006, 31, 603–632.

94. Y.J. Jeon, P.J. Park, H. G. Byun, B.K. Song, and S.K. Kim, Production of

chitosan oligosaccharides using chitin-immobilized enzyme, Korean Journal

Biotechnology and Bioengineering, 1998, 13, 147-154.

95. P.J. Park, J.Y. Je, W.K. ung, C.B. Ahn and S.K. Kim, Anticoagulant activity of

heterochitosans and their oligosaccharide sulfates, European Food Research

and Technology, 2004, 219, 529-533.

96. A. B. Vishu Kumar, M. C. Varadaraj, L. R. Gowda and R. N. Tharanathan,

Characterization of chito-oligosaccharides prepared by chitosanolysis with the

110

aid of papain and Pronase, and their bactericidal action against Bacillus cereus

and Escherichia coli, Biochemical Journal, 2005, 391, 167-175.

97. C. Molloy, L.-H. Cheah and J. P. Koolaard, Induced resistance against

Sclerotinia sclerotiorum in carrots treated with enzymatically hydrolysed

chitosan, Postharvest Biology and Technology, 2004, 33, 61-65.

98. M. Hosseinnejad, S. M. Jafari. Review - Evaluation of different factors affecting

antimicrobial properties of chitosan, International Journal of Biological

Macromolecules, 2016, 85, 467-475.

99. Y.M. Chen, Y.C. Chung, L.W. Wang, K.T. Chen, S.Y. Li, Antibacterial

properties of chitosan in waterborne pathogen, Journal of Environmental

Science and Health A, 2002, 37, 1379-1390.

100. S.E. Ouakfaoui, A. Asselin, Multiple forms of chitosanase activities,

Phytochemistry, 1992, 31, 1513 – 1518

101. J.Y. Kim, J.K. Lee, T.S. Lee, W.H. Park, Synthesis of chitooligosaccharide

derivative with quaternary ammonium group and its antimicrobial activity

against Streptococcus mutans, International Journal of Biological

Macromolecules, 2003, 32, 23-27.

102. K. Yanagiguchi, T. Ikeda, F. Takai, K. Ogawa, Y. Hayashi, Wound heading

following direct pulp capping with chitosan-ascorbic axit complex in rat

incisors, in: Uragami T., Kurita K., Fukamizo T., eds. Chitin and Chitosan-

Chitin and Chitosan in Life Science, Tokyo: Kodansha Scientific, 2002, 240-

242.

103. O. Klarzynski, B. Fritig, Stimulation of plant natural defenses, C R Acad. Sci.

III, 2001, 324 (10), 953-63.

104. Yuki Ito, Hanae Kaku, Naoto Shibuya, Identification of a high‐affinity binding

protein for N‐acetylchitooligosaccharide elicitor in the plasma membrane of

suspension‐cultured rice cells by affinity labeling, The Plant Journal, 1997, 12

(2), 347-356.

105. N. Das, J. Madhuprakash, P. V. Sarma, P. Purushotham, K. Suma, K. Manjeet,

S. Rambabu, N. E. Gueddari, B. M. Moerschbacher, A. R. Podile,

Biotechnological approaches for field applications of chitooligosaccharides

111

(COS) to induce innate immunity in plants, Critical Reviews in Biotechnology,

2015, 35 (1), 29–43

106. LW. Lin, X. Hu, W. Zhang, WJ. Rogers, WM. Cai. Hydrogen peroxide mediates

defense responses induced by chitosan of different molecular weights in rice. J.

Plant. Physiol., 2005, 162, 937-944.

107. XM. Zhao, XP. She, YG. Du, XM. Liang, Induction of antiviral resistance and

stimulary effect by oligochitosan in tobacco, Pestic. Biochem. Physiol., 2007,

87, 74-78.

108. EA. Barka, P. Eullaffroy, C. Clément, G. Vernet, Chitosan improves

development and protects Vitis vinifera L. against Botrytis vinerea, Plant Cell

Rep, 2004, 22, 608-614.

109. G. K. Agrawal, R. Rakwal, S. Tamogami, M. Yonekura, A. Kubo & H. Saji.

Chitosan activates defense/stress response(s) in the leaves of Oryza sativa

seedlings, Plant Physiology and Biochemistry 2002, 40 (12), 1061-1069.

110. Phạm Đình Dũng, Đặng Hữu Nghĩa, Lê Thành Hưng, Hoàng Đắc Hiệt, Bùi Văn

Lệ và Nguyễn Tiến Thắng, Nghiên cứu khả năng kháng nấm Colletotrichum

gloeosporioides gây bệnh thán thư trên cây ớt (Capsicum frutescens L.) của chế

phẩm oligochitosan - nano silica (SiO2), Tạp chı́ Khoa hoc Trường Đai hoc Cần Thơ, 2017, 48 (B), 66-70.

111. Bùi Phước Phúc, Nghiên cứu biến tính cắt mạch Chitosan bằng hydroperoxit và

kỹ thuật chiếu xạ để ứng dụng trong nông nghiệp, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Đại

học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, 2015.

112. Bui Duy Du, Lai Thi Kim Dung, Vo Nguyen Dang Khoa, Nguyen Duy Thang,

Le Nghiem Anh Tuan, Chitinase-induced resistance against neoscytalidium

dimidiatum on dragon trees: the effect of oligochitosan prepared by the

heterogeneous degradation of chitosan with H2O2 under hydrothermal

conditions, Vietnam Journal of Chemistry, 2015, 53 (2), 161-165.

113. L. M. Kiirika, F. Stahl and K. Wydra, Phenotypic and molecular

characterization of resistance induction by single and combined application of

chitosan and silicon in tomato against Ralstonia solanacearum, Physiological

and Molecular Plant Pathology, 2003, 81, 1-12.

112

114. L. Yang, P. Zhao, L. Wang, I. Filippus, X. Meng, Synergistic effect of

oligochitosan and silicon on inhibition of Monilinia fructicola infections. J.

Food. Agric., 2010; 90, 630-634.

115. H. Song, W. Yuan, P. Jin, W. Wang, X. Wang, L. Yang, Y. Zhang, Effects of

chitosan/nano-silica on postharvest quality and antioxidant capacity of loquat

fruit during cold storage, Postharvest Biology and Technology, 2016, 119, 41-

48.

116. Y. Yu, S. Zhang, Y. Ren, H. Li, X. Zhang, J. Di, Jujube preservation using

chitosan film with nano-silicon dioxide, Journal of Food Engineering, 2012,

113, 408-414.

117. S. Shengyou, W. Wei, L. Liqin, W. Shijia, W. Yongzan, L. Weicai, Effect of

Chitosan/nano-silica coating on the physicochemical characteristics of longan

fruit under ambient temperature, Journal of Food Engineering, 2013, 118 (1),

125–131

118. L. H. Thanh, N. K. B. Tam, V. T. Nga, H. T. Thuy, T. V. Hai, H. T. Son, N. N.

Quynh, N. T. H. Nga, Study on the possibility of using microorganisms as

biological agents to control fungal pathogens Neoscytalidium dimidiatum

causing disease of brown spots on the dragon fruit, J. Viet. Env. 2016, 8 (1), 41-

44.

119. H. Y. Run, L. L. Qiao, J. M. Jun, F. W. Feng, C. Jing. Fruit internal brown rot

caused by Neoscytalidium dimidiatum on pitahaya in Guangdong province,

China, Australasian Plant Dis. Notes, 2015, 10-13.

120. Uyen Thi Phan Ngoc, Dai Hai Nguyen. Synergistic antifungal effect of

fungicide and chitosan-silver nanoparticles on Neoscytalidium dimidiatum,

Green Processing and Synthesis, 2018, 7 (2), 132-138.

121. D. C. Pham, T. H. Nguyen T.H., P. U. T. Ngoc , N.T.T Le ., T.V. Tran, D. H.

Nguyen, Preparation, characterization and antifungal properties of chitosan-

silver nanoparticles synergize fungicide against Pyricularia oryzae. J.

Nanoscience Nanotechnology, 2018, 18 (8), 5299-5305.

122. Bùi Duy Du, Nghiên cứu chế tạo keo bạc nano bằng bức xạ gamma Co-60 và

một số ứng dụng của chúng trong y học và nông nghiệp, Luận án Tiến sĩ Hóa

học, Đại học KHTN Hà Nội, 2009.

113

123. D. V. Phu, V. T. K. Lang, N. T. K. Lan, Ng. N. Duy, N. D. Chau, B. D. Du, B.

D. Cam, N. Q. Hien, Synthesis and antimicrobial effects of colloidal silver

nanoparticles in chitosan by γ-irradiation, J. Experimental Nanoscience, 2010,

5 (2), 169-179.

124. Van Du Cao, Phuong phong Nguyen, Vo Quoc Khuong, Cuu Khoa Nguyen,

Xuan Chuong Nguyen, Cap Ha Dang, and Ngoc Quyen Tran, Ultrafine copper

nanoparticles exhibiting a powerful antifungal/killing activity against

Corticium Salmonicolor, Bull. Korean Chem. Soc., 2014, 5 (9), 2645 -2648.

125. Đỗ Trung Đàm, Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, NXB Y học, Hà

Nội, 1996, 11-137.

126. C. S.Auletta, Acute, subchronic, and chronic toxicity, CRC Hanbook of toxicity,

(Eds. M. J. Derelanco and M. A. Hollinger), CRC press, New York, U.S.A.,

1995, 51-103.

127. TCCS 162:2014/BVTV, Khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực phòng trừ bệnh

đốm nâu hại cây thanh long của các thuốc trừ bệnh.

128. Zahid, A. Ali, S. Manickam, Y. Siddiqui, PG. Alderson, M. Maqbool. Efficacy

of curative applications of submicron chitosan dispersions on anthracnose

intensity and vegetative growth of dragon fruit plants. Crop. Prot., 2014, 62,

129-134.

129. A. Ali, N. Zahid, S. Manickam, Y. Siddiqui, PG. Alderson, M. Maqbool.

Induction of lignin and pathogenesis related proteins in dragon fruit plants in

response to submicron chitosan dispersions, Crop. Prot., 2014, 63, 83-88.

130. GL. Miller, Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing

sugar, Analysis Chemistry, 1959, 31, 426-428.

131. C. Tonon, A. Andreu, ME. Aued, M. van Damme, M. Huarte, GR, Daleo,

Defense reactions in potato cultivars following infection with two races of

Phytophthora infestans. Potato. Res., 1998, 41, 319-325.

132. Quy phạm khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực phòng trừ bệnh đạo ôn

(pyricularia oryzae) hại lúa của các thuốc trừ nấm (10TCN 157-1992).

133. Henderson Tilton, Test with acaricides against the brown wheat mite. J. Econ.

Entomol. 1955, 48, 161-175.

114

134. Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực của các

thuốc trừ bệnh phòng trừ bệnh bạc lá (Xanthomonas oryzae swings et al) hại lúa

(QCVN 01-14-2010/BNNPTN).

135. Quy phạm khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực phòng trừ bệnh nấm hồng hại

cao su của các thuốc trừ bệnh (10TCN 622-2005).

136. Z. Fairuzah, C. I. Dalimunthe, and E. Bukit, Bio-C: a new bio-fungicide to

control pink disease (Corticium salmonicolor) on rubber plants, Proceedings of

International Rubber Conference, 2017, 822-830.

137. R. Krishnarao, M. Godkhindi, Distribution of silica in rice husks and its effect

on the formation of silicon carbide, Ceramics International, 1992, 18 (4), 243-

249.

138. M. Sarangi, S. Bhattacharyya, R. Behera, Effect of temperature on morphology

and phase transformations of nano-crystalline silica obtained from rice husk,

Phase Transitions, 2009, 82, 377–386

139. S. Sankar, S. K. Sharma, N. Kaur, B. Lee, D. Y. Kim, S. Lee, H. Jung,

Biogenerated silica nanoparticles synthesized from sticky, red, and brown rice

husk ashes by chemical method, Ceramics International, 2016, 42, 4875-4885.

140. R. Osman, N. H. Abdullah, K. A. Matori, M. N. Hamidon, I. Ismail, S. Mustaffa,

Effect of temperature towards rice husk silica characterization with different

preparation methods, International Journal of Basic & Applied Sciences, 2017,

17 (01), 15-20.

141. M. Zawrah, M. Zayed, M.R. Ali, Synthesis and characterization of SiC and SiC/

Si3N4 composite nano powders from waste material, J. Hazard. Mater., 2012,

227, 250–256

142. J. Li, T. Shirai, M. Fuji, Rapid carbothermal synthesis of nanostructured silicon

carbide particles and whiskers from rice husk by microwave heating method,

Adv. Powder Technol., 2013, 24, 838–843.

143. Nguyễn Quốc Hiến, Đặng Xuân Dự, Đặng Văn Phú, Lê Anh Quốc, Phạm Đình

Dũng, Nguyễn Ngọc Duy, Nghiên cứu chế tạo Oligochitosan bằng phương pháo

chiếu xạ Gamma Co-60 dung dịch Chitosan-H2O2 và khảo sát hiệu ứng chống

ôxi hóa, Tạp chí Khoa học và Công Nghệ, 2016, 54 (1), 46-53.

115

144. A. Al-Mulla, F. Al-Sagheer, Determination of kinetic parameters for the

degradation of chitosan/silica hybrid nano composites, Journal Polymers

Environmental, 2013, 21, 504–511.

145. Nguyễn Tuyên, Giáo trình Hóa keo, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, 2015.

146. I. J. Fernandes, D. Calheiro, F. A. L. Sánchez, A. L. D. Camachob, T. L. A. de

C. Rocha, C. A. M. Moraes, V. C. de Sousa. Characterization of silica produced

from rice husk ash: comparison of purification and processing methods,

Materials Research, 2017, 20 (2), 512-518.

147. D. Tahtat, M. Mahlous, S. Benamer, A. N. Khodja, S. L. Youcef, Effect of

molecular weight on radiation chemical degradation yield of chain scission of

-irradiated chitosan in solid state and in aqueous solution, Radiation Physics

and Chemistry, 2012, 81 (6), 659–665.

148. J. Lu, K. M. Kosuda, R. P. Van Duyne and P.C. Stair, Surface acidity and

properties of TiO2/SiO2 catalysts prepared by atomic layer deposition: UV-

visible diffuse reflectance, DRIFTS, and visible raman spectroscopy studies.

The Journal of Physical Chemistry C, 2009, 113 (28), 12412–12418.

149. R. Songolzadeh, J. Moghadasi, Stabilizing silica nanoparticles in high saline

water by using ionic surfactants for wettability alteration application, Colloid.

Polym. Sci., 2017, 295, 145-155.

150. J. Matusiak , E. Grządka, A. Bastrzyk, Stability, adsorption and electrokinetic

properties of the chitosan/silica system, Colloids and Surfaces A:

Physicochemical and Engineering Aspects, 2018, 554, 245-252.

151. K. L. Ureporn, A. L. Peter, Chapter Chitosan and Its Modifications: Are They

Possible Vehicles for Gene Therapy?, INTECH Open Access Publisher, 2011.

152. T. Liu, L. Li, X. Teng, X. Huang, H. Liu, D. Chen, J. Ren, J. He, F. Tang. Single

and repeated dose toxicity of mesoporous hollow silica nanoparticles in

intravenously exposed mice, Biomaterials, 2011, 32, 1657-1668

153. Thông tư số 21/2015/TT-BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông

thôn: Về Quản lý thuốc bảo vệ thực vật.

154. A. T. Rodriguez, M. A. Ramirez, R. M. Cardenas, A. N. Hernandez, M. G.

Velazquez, & S. Bautista, Induction of defense response of Oryza sativa L.

against Pyricularia grisea (Cooke) Sacc. by treating seeds with chitosan and

116

hydrolyzed chitosan, Pesticide Biochemistry and Physiology, 2007, 89, 206-

215.

155. C. Yafei, Z. Yong, Z. Xiaoming, G. Peng, A. Hailong, D. Yuguang, et al.

Functions of oligochitosan induced protein kinase in tobacco mosaic virus

resistance and pathogenesis related proteins in tobacco, Plant Physiology and

Biochemistry, 2009, 47(8), 724-731.

156. A. B. Falcon, J. C. Cabrera, D. Costales, M. A. Ramirez, G. Cabrera, V. Toledo,

et al. The effect of size and acetylation degree of chitosan derivatives on tobacco

plant protection against Phytophthora parasitica nicotianae. World Journal of

Microbiology & Biotechnology, 2008, 24 (1), 103-112.

157. W. Khan, B. Prithiviraj, D. Smith, Chitosan and chitin oligomers increase

phenylalanine ammonia-lyase and tyrosine ammonia-lyase activities in soybean

leaves, Journal of Plant Physiology, 2003, 160 (8), 859-863.

158. N. Ben-Shalom, R. Ardi, R. Pinto, C. Aki & E. Fallik. Controlling gray mould

caused by Botrytis cinerea in cucumber plants by means of chitosan, Crop

Protection, 2003, 22 (2), 285–290.

159. A. Aziz, P.Trotel-Aziz, L. Dhuicq, P. Jeandet, M. Couderchet & G. Vernet.

Chitosan oligomers and copper sulfate induce grapevine defense reactions and

resistance to gray mold and downy mildew, Phytopathology, 2006, 96 (11),

1188-1194.

160. P. Trotel-Aziz, M. Couderchet, G. Verne, & A. Aziz. Chitosan stimulates

defense reactions in grapevine leaves and inhibits development of Botrytis

cinerea, European Journal of Plant Pathology, 2006, 114 (4), 405-413.

161. Le Thi An Nhien, Nguyen Duc Luong, Le Thi Thuy Tien, and Le Quang Luan,

Radiation synthesis of silver nanoparticles/chitosan for controlling leaf fall

disease on rubber trees causing by corynespora cassiicola, Journal of

Nanomaterials, 2018, Article ID 7121549.

117

PHỤ LỤC

118

Phụ lục 1: Phổ GPC xác định khối lượng phân tử của chitosan ban đầu

Phụ lục 2: Phổ GPC xác định khối lượng phân tử của oligochitosan trong quy trình

cắt mạch chitosan bằng H2O2 0,5 kết hợp với chiếu xạ.

Phụ lục 3: Tách, loại bỏ các oxit kim loại trong tro vỏ trấu

Phụ lục 4: Điều chế nano silica bằng phương pháp nhiệt phân tro vỏ trấu

Phụ lục 5: Điều chế nano silica bằng phương pháp tạo và nhiệt phân gel SiO2/chitosan

Phụ lục 6: Điều chế oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp với xử lý H2O2

Phụ lục 7: Tổng hợp vật liệu lai nano silica/oligochitosan

Phụ lục 8: Kết quả xác định độc tính cấp đường miệng của vật liệu nSiO2/OC

Tóm tắt

Sử dụng chuột cống trắng Wistar. Chuột nhịn ăn khoảng 01 đêm trước khi tiến

1 và 3000 mg.kg-1 khối lượng cơ thể chuột, Dựa trên kết quả của thử nghiệm, độc

hành thử nghiệm. Dùng 6 chuột cho mỗi mức liều. Liều thử nghiệm là 300 mg.kg-

tính cấp (LD50) của mẫu thử lớn hơn 3000 mg.kg-1 (chuột cống).

1. Thông tin của thử nghiệm

1.1. Động vật thí nghiệm

1.1.1. Loài, chủng: Chuột cống Wistar

1.1.2. Nguồn gốc: Viện Pasteur TP.HCM

1.1.3. Trọng lượng cơ thể: 180-220 g

1.1.4. Giống: Đực và cái

1.1.5. Số lượng: 06 chuột cho mỗi mức liều

1.1.6. Thức ăn, nước uống:

1.1.7. Điều kiện chăm sóc:

Nhiệt độ: 250C ± 30C

Độ ẩm tương đối: 40-70%

1.2. Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thử được pha loãng nước cất để có nồng độ 100

mg.mL-1

1.3. Thời gian để đói động vật: 01 đêm

1.4. Mức liều: 300 mg.kg-1, 3000 mg.kg-1

1.5. Cách cho uống: Bằng kim cong chuyên dụng

1.6. Thời điểm uống: 9giờ

1.7. Thể tích uống:

300 mg.kg-1: 0,3 ml.100 g-1 thể trọng

3.000 mg.kg-1: 2,0 ml.100 g-1 thể trọng

1.8. Chỉ tiêu quan sát:

1.8.1. Thời gian quan sát: 15 ngày

1.8.2. Số chuột chết: Xem bảng 3

1.8.3. Tỷ lệ chết của động vật thí nghiệm: xem bảng 1

1.8.4. Các biểu hiện độc trên động vật: Xem bảng 2

1.8.5. Khối lượng cơ thể của động vật: Xem bảng 3

1.8.6. Quan sát đại thể: Xem bảng 4

1.8.7. Khối lượng tuyệt đối và tương đối của gan lách, thận và phổi: xem

bảng 5

Kết quả thử nghiệm

Các biểu hiện độc trên chuột cống sau khi cho uống mẫu thử và tỷ lệ chết trong

vòng 14 ngày được quan sát và ghi lại (xem bảng 1 và 2).

Khối lượng của động vật được xác định vào các ngày thứ 1, thứ 2, thứ 8 và thứ

15 (xem bảng 3).

Quan sát đại thể (xem bảng 4).

Khối lượng tuyệt đối và tương đối của gan, lách, thận và phổi (xem bảng 5)

Giá trị LD50 của Độc tính cấp đường miệng của mẫu thử lớn hơn 3.000 mg.kg-

Phân loại độc tính: Cấp độ 5.

Bảng PL8.1:Tỷ lệ chết của động vật thí nghiệm

♂

Ngày 1 (Giờ) Ngày Giống Số lượng động vật 0,5 2 4 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Liều (mg.kg- 1) Tỷ lệ chết %

♀

♂

3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 % 300 mg.kg-1 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

♀

3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 % 3.000 mg.kg-1 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Bảng PL8.2: Các biểu hiện độc lâm sàng

Số động vật có biểu hiện độc (T)

Ngày 1 (Giờ) Ngày Giống Số lượng động vật Liều (mg.kg- 1) Tỷ lệ chết %

0,5 1 2 4

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14 15

♂

♀

♂

3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 % 300 mg.kg-1 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

♀

3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 % 3.000 mg.kg-1 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 = Không có biểu hiện bất thường; T = Biểu hiện mệt mỏi, giảm hoạt động, giảm ăn uống; D = Chết

Bảng PL8.3: Sự thay đổi khối lượng cơ thể và thời gian chết

Khối lượng cơ thể chuột (g)/Ngày

Thời gian chết

Giống Liều (mg.kg-1) D1 D2 D8 D15 D15－D1 Chết Số động vật

♂

300 196 194 219 231 1 35 -

♂

2 186 190 203 225 39 -

3 184 188 212 233 49 -

♀ 4 192 198 219 234 42 -

♀ 5 202 201 221 233 31 -

♂

♀ 6 198 200 214 224 26 -

♂

7 208 206 212 222 14 -

8 214 222 240 270 56 -

♂

3.000 9 216 222 230 252 36 -

♀ 10 187 190 217 238 51 -

♀ 11 203 207 212 232 29 -

♂

♀ 12 198 201 216 237 39 -

♂

13 186 188 196 226 40

14 192 194 216 238 46

♂

Đối chứng 15 184 186 205 227 43

♀ 16 202 208 222 238 36

♀ 17 198 199 216 232 34

♀ 18 205 205 226 249 44

Bảng PL8.4: Quan sát đại thể