Luận án Tiến sĩ Khoa học cây trồng: Nghiên cứu biến dị tế bào soma và xử lý tia gamma trong chọn tạo các dòng đậu nành (Glycine max (L.) Merrill) chống chịu mặn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ NGÀNH: 62 62 01 10

NGHIÊN CỨU BIẾN DỊ TẾ BÀO SOMA VÀ XỬ LÝ TIA GAMMA TRONG CHỌN TẠO CÁC DÒNG ĐẬU NÀNH (Glycine max (L.) Merrill) CHỐNG CHỊU MẶN

Cán bộ hƣớng dẫn

PGS. TS. Nguyễn Bảo Toàn Thực hiện

Lê Hồng Giang

2019

i

LỜI CẢM TẠ

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Bảo Toàn, ngƣời thầy đã tận tình dìu dắt, giúp đỡ tôi trong công tác, cũng nhƣ truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu để hƣớng dẫn tôi hoàn thành luận án tiến sĩ.

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

- Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông

nghiệp, Khoa Sau đại học và các đơn vị phòng ban.

- Quý thầy cô giảng dạy các môn học nghiên cứu sinh, quý thầy cô tham dự các hội đồng bảo vệ đề cƣơng, tiểu luận và các chuyên đề nghiên cứu sinh.

- Quý thầy cô, các anh chị và các em đang công tác tại Bộ môn Sinh lý Sinh hóa, Bộ môn Khoa học Cây trồng, Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp, và Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học đã động viên, tƣ vấn và nhiệt tình giúp đỡ.

- TS. Nguyễn Phƣớc Đằng và cô Thái Kim Tuyến, Bộ môn Di truyền và chọn giống cây trồng, Khoa Nông nghiệp đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp các giống đậu nành phục vụ cho thí nghiệm.

- Công ty Vạn Đức (Ấp Đông Hòa, Xã Song Thuận, Huyện Châu Thành,

Tỉnh Tiền Giang) đã cung cấp các giống đậu nành phục vụ cho thí nghiệm.

- Viện Nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã giúp đỡ thực hiện chiếu xạ tia

gamma mẫu cấy.

- TS. Đỗ Tấn Khang đã hỗ trợ thực hiện phân tích kỹ thuật sinh học phân

tử.

- Các em sinh viên Huỳnh Văn Hải, Võ Quang Tiếp, Huỳnh Thị Ý Nhi, Nguyễn Thị Cẩm Tiên, Nguyễn Thị Minh Thi, Trần Thị Tuyết Lan cùng các em sinh viên lớp Sinh học K37, Công nghệ rau hoa quả và Cảnh quan K42 đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ thực hiện thí nghiệm.

ii

Xin trân trọng ghi nhớ công ơn của cha mẹ và gia đình đã luôn bên cạnh động viên, chia sẻ, giúp đỡ để tôi yên tâm trong học tập và công tác. Xin chân thành cảm ơn sự động viên, chia sẻ, hỗ trợ của thầy cô, các anh chị, các em và bạn bè đã luôn bên tôi trong những lúc khó khăn, dành tình cảm tốt đẹp và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và nghiên cứu.

TÓM TẮT

Cây đậu nành là một trong những cây thực phẩm có giá trị cao, cải tạo đất rất tốt nhƣng cũng là giống cây nhạy cảm với mặn. Đề tài “Nghiên cứu biến dị tế bào soma và xử lý tia gamma trong chọn tạo các dòng đậu nành (Glycine max (L.) Merrill) chống chịu mặn” đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu xác định phƣơng pháp chọn tạo dòng đậu nành có khả năng chống chịu mặn. Nội dung nghiên cứu bao gồm xác định khả năng chống chịu mặn của một số giống đậu nành phổ biến ở ĐBSCL, xác định môi trƣờng nuôi cấy mô cây đậu nành thích hợp để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phƣơng pháp chọn lọc và đánh giá khả năng chọn tạo các dòng đậu nành chống chịu mặn bằng phƣơng pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma. Kết quả cho thấy trong các giống đậu nành đƣợc canh tác phổ biến ở ĐBSCL, các giống MTĐ 748-1, ĐH 4 và MTĐ 720 có khả năng chịu mặn cao ở nồng độ muối NaCl 4 g/L khi đánh giá bằng phƣơng pháp thủy canh. Giống MTĐ 878-3 nhạy cảm với mặn và giống MTĐ 760-4 chết hoàn toàn ở nồng độ muối này. Trong chọn lọc tính chống chịu mặn, giống không chịu mặn là MTĐ 760-4 đã tạo ra những dòng mô sẹo và cây chịu mặn. Trong các phƣơng pháp chọn lọc các dòng đậu nành chống chịu mặn thì phƣơng pháp gây biến dị soma trên mẫu trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 đạt đƣợc 01 dòng cây đậu nành có khả năng chống chịu mặn ở nồng độ NaCl 5 g/L. Có sự khác biệt di truyền trong cấu trúc DNA của mẫu chồi chống chịu mặn so với mẫu đối chứng không xử lý mặn khi phân tích bằng chỉ thị phân tử ISSR22. Cây đậu nành MTĐ 760-4 sau chọn lọc mặn với muối NaCl 5 g/L sinh trƣởng bình thƣờng sau 5 tuần thuần dƣỡng trong điều kiện tƣới mặn ở nhà lƣới. Cả hai phƣơng pháp gây biến dị soma và phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma Co60 kết hợp chọn lọc mặn với muối NaCl trên mẫu mô sẹo đều thu đƣợc các dòng mô sẹo có khả năng chịu mặn với nồng độ 5 g/L ở mẫu không chiếu xạ và mẫu chiếu xạ liều 10 Gy. Phân tích di truyền với chỉ thị ISSR22 cho thấy ở hai mẫu mô sẹo này đều không có sự xuất hiện của băng DNA khoảng 450 bp so với mẫu đối chứng. Đối với mẫu trục phôi xử lý chiếu xạ tia gamma kết hợp chọn lọc mặn chƣa thu đƣợc các dòng chống chịu mặn. Kết quả nghiên cứu đề xuất có thể áp dụng phƣơng pháp gây biến dị soma trên mẫu trục phôi để tạo dòng đậu nành có khả năng chống chịu mặn, tiếp tục nhân dòng chịu mặn và trồng thử nghiệm ở điều kiện tự nhiên để đánh giá sự ổn định di truyền của tính chống chịu mặn cũng nhƣ quan sát thêm các đặc tính nông học khác.

iii

Từ khóa: Biến dị soma, chiếu xạ tia gamma, chống chịu mặn, đậu nành, Glycine max (L.) Merrill, ISSR

ABSTRACT

Soybean is one of food crops that have high value and considerably improve soil, but also is sensitive to salt. The PhD thesis “Study on somaclonal cell variation and gamma treatment in selection for salt tolerant soybean lines (Glycine max (L.) Merrill)” was carried out to determine the method to select the soybean line that is salt tolerant. Study contents included determing the salt tolerance ability of some soybean varieties which were popular in the Mekong Delta, the tissue culture medium of soybean suitale for obtaining initial sources for selection methods and evaluating the ability of selection for salt tolerant soybean lines by somaclonal cell variation creating and gamma irradiation method. The results showed that among soybean varieties popularly cultivated in the Mekong Delta, MTD 748-1, DH 4 and MTD 720 had the high salt tolerant ability at 4 g/L NaCl when evaluated by hydroponic method. MTD 878-3 variety was sensitive to salt and MTD 760-4 completely died at this salt concentration. In selection for salt tolerance, the intolerant variety which was MTD 760-4 formed salt tolerant callus and plantlet lines. In selection methods to achieve salt tolerant soybean lines, creating somaclonal variation on embryo axes of MTD 760-4 soybean obtained one soybean plantlet line that was salt tolerant at NaCl of 5 g/L. There was genetic difference in DNA structure of the salt tolerant shoot compared to the control with non-salt treatment when analyzed by molecular marker of ISSR22. MTD 760-4 soybean plantlets after selected with 5 g/L NaCl normally grew after 5 weeks acclimatized under saline water irrigating condition in the greenhouse. Both methods of creating somaclonal variation and Co60 gamma irradiation combined with NaCl salt selection on callus achieved two salt tolerant callus lines to NaCl dose of 5 g/L at none irradiated explants and irradiated explants with gamma dose of 10 Gy. Genetic analysis with ISSR22 marker in these two callus explants showed that there was no appearance of DNA band 450 bp compared to control explants. To embyro axes which were gamma irratiated and salt selected, there was not obtained salt tolerant lines. The study results suggested that the method of creating somaclonal variation can be applied to form salt tolerant soybean lines and these should be constinuously multiplied and cultivated in the field to evaluate the genetic stability of salt tolerance as well as observe further other agronomical characteristics.

iv

Key words: ISSR, gamma irradiation, Glycine max (L.) Merrill, salt tolerant, somaclonal variation, soybean

CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết luận án này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác.

Ngƣời hƣớng dẫn Tác giả luận án

v

PGS. TS. Nguyễn Bảo Toàn Lê Hồng Giang

MỤC LỤC

vi

Nội dung Trang Lời cảm tạ .......................................................................................................... ii Tóm tắt .............................................................................................................. iii Abstract ............................................................................................................. vi Cam kết kết quả ................................................................................................. v Mục lục ............................................................................................................. vi Danh sách bảng ................................................................................................. xi Danh sách hình ................................................................................................ xiv Danh mục từ viết tắt ........................................................................................ xvi CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU................................................................................ 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu của đề tài ....................................................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 2 1.4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 2 1.4.1 Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................... 2 1.4.2 Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 2 1.5 Ý nghĩa của luận án ..................................................................................... 3 1.5.1 Ý nghĩa khoa học ...................................................................................... 3 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn ....................................................................................... 3 1.6 Những điểm mới của luận án ....................................................................... 4 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5 2.1 Nguồn gốc và phân loại cây đậu nành ......................................................... 5 2.1.1 Nguồn gốc ................................................................................................. 5 2.1.2 Phân loại ................................................................................................... 5 2.2 Đặc điểm thực vật ........................................................................................ 5 2.2.1 Rễ .............................................................................................................. 5 2.2.2 Thân .......................................................................................................... 5 2.2.3 Lá .............................................................................................................. 6 2.2.4 Hoa ............................................................................................................ 7 2.2.5 Trái và hạt ................................................................................................. 7 2.3 Yêu cầu sinh thái của cây đậu nành ............................................................. 8 2.3.1 Đất ............................................................................................................. 8 2.3.2 Nhiệt độ ..................................................................................................... 8 2.3.3 Nƣớc.......................................................................................................... 9 2.3.4 Ánh sáng ................................................................................................... 9 2.4 Đất mặn và tình hình xâm nhập mặn ở Đồng bằng sông Cửu Long ......... 10 2.4.1 Khái niệm đất mặn .................................................................................. 10

vii

2.4.2 Tình hình xâm nhập mặn ở Đồng bằng sông Cửu Long ........................ 11 2.5 Sự chống chịu mặn của cây đậu nành ........................................................ 12 2.5.1 Ảnh hƣởng của mặn trên cây đậu nành .................................................. 12 2.5.2 Các nghiên cứu về sự chống chịu mặn trên cây đậu nành ...................... 14 2.5.3 Cơ chế chống chịu mặn của cây đậu nành .............................................. 15 2.6 Sơ lƣợc về nuôi cấy mô và tế bào thực vật ................................................ 19 2.7 Phƣơng pháp chọn lọc biến dị tế bào soma các dòng cây trồng chống chịu mặn ................................................................................................................... 21 2.7.1 Khái niệm biến dị soma .......................................................................... 21 2.7.2 Cơ sở của biến dị soma ........................................................................... 21 2.7.3 Phƣơng pháp chọn lọc biến dị tế bào soma tính chống chịu mặn .......... 23 2.7.4 Một số ƣu và khuyết điểm của phƣơng pháp chọn lọc biến dị tế bào soma24 2.7.4.1 Ƣu điểm ............................................................................................... 24 2.7.4.2 Khuyết điểm ......................................................................................... 24 2.7.5 Đặc điểm của cây chịu mặn trong chọn lọc in vitro ............................... 25 2.8 Một số kết quả nghiên cứu về chọn lọc biến dị tế bào soma các dòng cây trồng chống chịu mặn trên thế giới và trong nƣớc ........................................... 26 2.9 Phƣơng pháp gây đột biến cây trồng in vitro ............................................. 28 2.9.1 Khái niệm đột biến .................................................................................. 28 2.9.2 Sự phát sinh đột biến .............................................................................. 28 2.9.3 Ƣu điểm của phƣơng pháp tạo đột biến thông qua nuôi cấy mô ............ 29 2.9.4 Phƣơng pháp tạo đột biến in vitro bằng xử lý tia gamma ....................... 29 2.9.4.1 Bức xạ gamma (γ) ................................................................................ 29 2.9.4.2 Một số đặc trƣng của chất phóng xạ .................................................... 30 2.9.4.3 Phƣơng pháp thực hiện ........................................................................ 30 2.9.5 Kết quả nghiên cứu về tạo đột biến in vitro bằng xử lý tia gamma trên thế giới và trong nƣớc ...................................................................................... 32 2.10 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng ............................. 36 CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 38 3.1 Phƣơng tiện ................................................................................................ 38 3.1.1 Vật liệu .................................................................................................... 38 3.1.2 Hóa chất .................................................................................................. 38 3.1.3 Thiết bị .................................................................................................... 38 3.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................... 39 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 40 3.2.1 Nội dung 1: Xác định khả năng chống chịu mặn của một số giống đậu nành phổ biến ở ĐBSCL .................................................................................. 40 3.2.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của các giống đậu nành MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4, Nhật 17A và OMĐN 2940

viii

3.2.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của các giống đậu nành ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-3 và MTĐ 885-2 . 41 3.2.2 Nội dung 2: Xác định môi trƣờng nuôi cấy mô cây đậu nành thích hợp để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phƣơng pháp chọn lọc ............................ 41 3.2.2.1 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của 2,4-D và BA lên sự hình thành mô sẹo từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4 ...................................................................... 41 3.2.2.2 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của NAA và khoáng đa lƣợng đến sự tạo rễ từ đoạn thân đậu nành MTĐ 760-4 .................................................................. 42 3.2.2.3 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của giá thể đến sự thuần dƣỡng cây đậu nành in vitro trong điều kiện nhà lƣới ............................................................. 43 3.2.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng chọn tạo các dòng đậu nành chống chịu mặn bằng phƣơng pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma ................... 43 3.2.3.1 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ................................................................................ 43 3.2.3.2 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trƣởng của chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 ......................................... 46 3.2.3.3 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ..................................... 48 3.2.3.4 Thí nghiệm 9: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trƣởng của chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 .... 49 3.2.3.5 Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đậu nành chống chịu mặn50 3.2.3.6 Thí nghiệm 10: Đánh giá khả năng sinh trƣởng và phát triển của các dòng đậu nành chống chịu mặn trong điều kiện nhà lƣới ................................ 52 3.2.3.7 Xử lý số liệu ......................................................................................... 53 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 55 4.1 Nội dung 1: Xác định khả năng chống chịu mặn của một số giống đậu nành phổ biến ở ĐBSCL .................................................................................. 55 4.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của các giống đậu nành MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4, Nhật 17A và OMĐN 2955 4.1.1.1 Tỉ lệ sống ............................................................................................. 55 4.1.1.2 Chiều cao cây ....................................................................................... 57 4.1.1.3 Số lóng trên thân chính ........................................................................ 59 4.1.1.4 Chiều dài rễ .......................................................................................... 60 4.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của các giống đậu nành ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-3 và MTĐ 885-2 . 64 4.1.2.1 Tỉ lệ sống ............................................................................................. 64 4.1.2.2 Chiều cao cây ....................................................................................... 66 4.1.2.3 Số lóng trên thân chính ........................................................................ 67 4.1.2.4 Chiều dài rễ .......................................................................................... 69

ix

4.2 Nội dung 2: Xác định môi trƣờng nuôi cấy mô cây đậu nành thích hợp để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phƣơng pháp chọn lọc ............................ 71 4.2.1 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của 2,4-D và BA lên sự hình thành mô sẹo từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4 .......................................................................... 71 4.2.1.1 Tỉ lệ tạo mô sẹo ................................................................................... 71 4.2.1.2 Tỉ lệ tạo rễ ........................................................................................... 73 4.2.2 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của NAA và khoáng đa lƣợng đến sự tạo rễ từ đoạn thân đậu nành MTĐ 760-4 ...................................................................... 75 4.2.2.1 Tỉ lệ tạo rễ ............................................................................................ 75 4.2.2.2 Số rễ ..................................................................................................... 76 4.2.2.3 Chiều dài rễ .......................................................................................... 77 4.2.2.4 Chiều cao chồi ..................................................................................... 78 4.2.2.5 Số lá ..................................................................................................... 79 4.2.3 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của giá thể đến sự thuần dƣỡng cây đậu nành in vitro trong điều kiện nhà lƣới ...................................................................... 81 4.2.3.1 Tỉ lệ cây sống ....................................................................................... 81 4.2.3.2 Chiều cao gia tăng................................................................................ 82 4.2.3.3 Số lá gia tăng........................................................................................ 83 4.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng chọn tạo các dòng đậu nành chống chịu mặn bằng phƣơng pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma ................... 84 4.3.1 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ....................................................................................... 84 4.3.1.1 Thí nghiệm 6a: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 1 ............................................... 84 4.3.1.2 Thí nghiệm 6b: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 2 ............................................... 86 4.3.1.3 Thí nghiệm 6c: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 3 ............................................... 86 4.3.1.4 Thí nghiệm 6d: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 4 ............................................... 87 4.3.2 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trƣởng của chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 .................................................... 89 4.3.2.1 Thí nghiệm 7a: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 1 ............................................................... 89 4.3.2.2 Thí nghiệm 7b: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 2 ......................................................................................... 91 4.3.2.3 Thí nghiệm 7c: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 3 ......................................................................................... 93

x

4.3.3 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ..................................... 97 4.3.3.1 Thí nghiệm 8a: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 1 .... 97 4.3.3.2 Thí nghiệm 8b: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 2 .... 99 4.3.3.3 Thí nghiệm 8c: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 3 .. 101 4.3.3.4 Thí nghiệm 8d: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 4 .. 103 4.3.4 Thí nghiệm 9: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trƣởng của chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 .. 107 4.3.4.1 Thí nghiệm 9a: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự tạo chồivà sinh trƣởng của chồitrong lần chọn lọc 1 .......................... 107 4.3.4.2 Thí nghiệm 9b: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 2 ........................................... 112 4.3.4.2 Thí nghiệm 9c: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 3 ........................................... 113 4.3.5 Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đậu nành chống chịu mặn115 4.3.5.1 Sự sai khác di truyền của các dòng mô sẹo đậu MTĐ 760-4 chống chịu mặn sau chọn lọc biến dị soma và chiếu xạ tia gamma Co60 ......................... 115 4.3.5.2 Sự sai khác di truyền của các dòng cây đậu nành MTĐ 760-4 chống chịu mặn sau chọn lọc biến dị soma .............................................................. 117 4.3.6 Thí nghiệm 10: Đánh giá khả năng sinh trƣởng và phát triển của các dòng đậu nành chống chịu mặn trong điều kiện nhà lƣới .............................. 117 4.3.6.1 Chiều cao chồi gia tăng ...................................................................... 117 4.3.6.2 Số lóng gia tăng ................................................................................. 119 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................... 124 5.1 Kết luận .................................................................................................... 124 5.2 Đề xuất ..................................................................................................... 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 125 PHỤ LỤC 1 ................................................................................................... 140 PHỤ LỤC 2 ................................................................................................... 142 PHỤ LỤC 3 ................................................................................................... 145 PHỤ LỤC 4 ................................................................................................... 147

DANH SÁCH BẢNG

Tên Bảng

Bảng 2.1 Gen mã hóa transporter vận chuyển ion liên quan đến sự chống Trang 17

chịu mặn ở đậu nành

2.2 Một số giống cây trồng đƣợc xử lý đột biến in vitro bằng chiếu 33

xạ tia gamma trên thế giới

4.1 Tỉ lệ sống (%) của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối 57

NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.2 Chiều cao cây (cm) của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối 58

NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.3 Số lóng trên thân chính của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi 60

muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.4 Chiều dài rễ (cm) của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối 62

NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.5 Tỉ lệ sống (%) của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối 65

NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.6 Chiều cao cây (cm) của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối 67

NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.7 Số lóng trên thân chính của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi 68

muối NaCl ở 2, 3 và 5 tuần SKT

4.8 Chiều dài rễ (cm) của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối 70

NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.9 Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng 72

bởi 2,4-D và BA ở 1, 2, 3 và 4 tuần SKC

4.10 Tỉ lệ tạo rễ (%) từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi 74

2,4-D và BA ở 2 và 4 tuần SKC

4.11 Tỉ lệ tạo rễ (%) của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi 75

NAA và khoáng đa lƣợng ở 2 và 4 tuần SKC

4.12 Số rễ của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi NAA và 77

khoáng đa lƣợng ở 2 và 4 tuần SKC

4.13 Chiều dài rễ (cm)của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi 78

79

NAA và khoáng đa lƣợng ở 4 tuần SKC Chiều cao chồi (cm)của đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi NAA và khoáng đa lƣợng ở 2và 4 tuần SKC 4.14

4.15 Số lá của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi NAA và 80

xi

khoáng đa lƣợng ở 2 và 4 tuần SKC

4.16 Tỉ lệ sống (%) của cây đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi giá 81

thể ở 1, 2, 3 và 4 tuần SKTD

4.17 Chiều cao gia tăng (cm) của cây đậu nành MTĐ 760-4 ảnh 82

hƣởng bởi giá thể ở 1, 2, 3 và 4 tuần SKTD

4.18 Số lá gia tăng của cây đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi giá 83

thể ở 1, 2, 3 và 4 tuần SKTD

4.19 Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi 84

muối NaCl từ 1 đến 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

4.20 Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi 86

muối NaCl từ 1 đến 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 2

4.21 Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi 87

muối NaCl từ 1 đến 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 3

4.22 Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi 87

muối NaCl từ 1 đến 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 4

4.23 Hàm lƣợng proline của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 sau 4 lần 88

chọn lọc với muối NaCl (mol g trọng lƣợng tƣơi)

4.24 Tỉ lệ tạo chồi (%) của trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng 90

bởi muối NaCl trong lần chọn lọc 1

4.25 Chiều cao chồi (cm) của đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi 90

muối NaCl trong lần chọn lọc 1

4.26 Chiều cao chồi gia tăng (cm) của đậu nành MTĐ 760-4 ảnh

hƣởng bởi muối NaCl trong lần chọn lọc 2 92

4.27 Số lá gia tăng của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi 92

muối NaCl trong lần chọn lọc 2

4.28 Chiều cao chồi gia tăng (cm) của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh 93

hƣởng bởi muối NaCl trong lần chọn lọc 3

4.29 Số lá gia tăng của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi 94

muối NaCl trong lần chọn lọc 3

4.30 Số cây đậu nành có khả năng chống chịu mặn ở các nồng độ 95

muối NaCl

4.31 Hàm lƣợng proline của chồi đậu nành MTĐ 760-4 sau 3 lần 97

chọn lọc với muối NaCl (mol g trọng lƣợng tƣơi)

4.32 Tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma 98

Co60 và muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

4.33 Tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma 100

Co60 và muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 2

xii

4.34 Tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma 102

Co60 và muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 3

4.35 Tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma 104

Co60 và muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 4

106

4.36 Hàm lƣợng proline của mô sẹo (mol g trọng lƣợng tƣơi) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl sau 4 lần chọn lọc

4.37 Tỉ lệ sống của trục phôi (%) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma 108

Co60 và muối NaCl ở 2, 4 và 6 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

4.38 Tỉ lệ tạo chồi (%) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và 110

muối NaCl ở 4 và 6 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

4.39 Chiều cao chồi (cm) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và 112

muối NaCl ở 4 và 6 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

4.40 Chiều cao chồi gia tăng (cm) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma 113

Co60 và muối NaCl ở 1, 2 và 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 2

4.41 Chiều cao chồi gia tăng (cm) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma 114

Co60 và muối NaCl ở 1, 2 và 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 3

4.42 Chiều cao chồi gia tăng (cm) ảnh hƣởng bởi tƣới nƣớc mặn 118

xiii

4.43 Số lóng gia tăng (lóng) ảnh hƣởng bởi tƣới nƣớc mặn 119

DANH SÁCH HÌNH

Trang 42 Hình 3.1

44 3.2

46 3.3

49 3.4

Tên hình Tử diệp của giống đậu nành MTĐ 760-4 đƣợc tách bỏ trục phôi (a) và nuôi cấy trên môi trƣờng (b) Sinh trƣởng mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc với muối NaCl Mẫu trục phôi của giống đậu nành MTĐ 760-4 đƣợc tách bỏ trục phôi (a) và nuôi cấy trên môi trƣờng (b) Sinh trƣởng của trục phôi sau khi đƣợc chiếu xạ và chọn lọc với muối NaCl Cây đậu nành chuẩn bị thuần dƣỡng ở nhà lƣới 52 3.5

56 4.1

Ảnh hƣởng của muối NaCl trên sự sống và sinh trƣởng của 5 giống đậu nành Nhật 17A, MTĐ 748-1, MTĐ 176, MTĐ 760-4, OMĐN 29 (từ phải sang) ở 5 tuần sau khi trồng

61 4.2

Ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl trên sự sinh trƣởng của rễ cây đậu nành ở 5 tuần sau khi trồng

63 4.3

Triệu chứng ngộ độc mặn (NaCl 4 g L) trên lá đậu nành ở 5 tuần sau khi trồng

66 4.4

Ảnh hƣởng của muối NaCl trên sự sống và sinh trƣởng của 5 giống đậu nành ở 5 tuần sau khi trồng

71 4.5

Sự hình thành mô sẹo từ tử diệp đậu nành ở 2 tuần sau khi cấy

78 4.6

Sự tạo rễ của cây đậu nành trên môi trƣờng MS bổ sung NAA

Sinh trƣởng của cây đậu nành sau 4 tuần thuần dƣỡng 83 4.7

85 4.8

Sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trên môi trƣờng MS bổ sung muối NaCl sau 5 tuần nuôi cấy trong lần chọn lọc 1

88 4.9

Sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trên môi trƣờng MS bổ sung muối NaCl sau 5 tuần nuôi cấy trong lần chọn lọc 4

91 4.10

95 4.11

Sự tạo chồi đậu nành MTĐ 760-4 trên môi trƣờng bổ sung muối NaCl Sinh trƣởng của chồi đậu nành MTĐ 760-4 chịu mặn sau chọn lọc trên môi trƣờng MS

96 4.12

xiv

Nhân các dòng đậu nành có khả năng chống chịu mặn trên môi trƣờng MS bổ sung nƣớc dừa 50 ml L và NAA 0,2

mg/L

4.13 Mức độ sống sót của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 sau 5 99

tuần nuôi cấy ở lần chọn lọc 1

4.14 Mức độ sống sót của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 sau 5 105

4.15 111

4.16 114

4.17 115

tuần nuôi cấy ở lần chọn lọc 4 Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và NaCl lên sự tạo chồi đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 1 Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi đậu nành MTĐ 760-4 Phổ diện điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR02 (giếng 1- 3), ISSR03 (giếng 4-6), ISSR13 (giếng 7-9) và ISSR19 (giếng 10-12)

4.18 116

Phổ diện điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR22 (giếng 1-3) và ISSR27 (giếng 4-6)

4.19 Phổ diện điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR22 117

4.20 120

Ảnh hƣởng của tƣới mặn NaCl 5 g L lên sinh trƣởng của cây đậu nành MTĐ 760-4 đối chứng ở 5 tuần sau khi trồng

4.21 121

Sinh trƣởng của các dòng đậu nành trong điều kiện tƣới mặn ở 4 tuần sau khi trồng

4.22 123

xv

Sơ đồ phƣơng pháp tạo biến dị soma dòng đậu nành MTĐ 760-4 chống chịu mặn từ mẫu cấy trục phôi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid Amplified fragment length polymorphism Benzyl adenine cộng tác viên Đồng bằng sông Cửu Long Deoxyribo nucleic acid và cộng tác viên Food and Agricultural Organization Gray 3-Indole acetic acid International Atomic Energy Agency Inter simple sequence repeat Murashige và Skoog 1-Naphthalene acetic acid Polymerase chain reaction Polyethylene glygol Random amplified polymorphic DNA Reactive oxygen species sau khi cấy sau khi trồng sau khi thuần dƣỡng Single specific primers Simple sequence repeats Soil Science Society of America

xvi

2,4-D AFLP BA ctv. ĐBSCL DNA et al. FAO Gy IAA IAEA ISSR MS NAA PCR PEG RAPD ROS SKC SKT SKTD SSPs SSRs SSSA

CHƢƠNG 1

GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

1

Đậu nành (Glycine max (L.) Merrill) là cây thực phẩm có giá trị kinh tế rất cao không chỉ đƣợc trồng làm thức ăn cho ngƣời và gia súc vì có hàm lƣợng protein cao (40%), lipid (18%), các acid amin cơ bản và nhiều loại vitamin, đậu nành còn là cây luân canh cải tạo đất rất tốt (Phạm Văn Biên và ctv., 1996). Biện pháp luân canh cây đậu nành với cây lúa vừa hạn chế đƣợc dòng đời sâu bệnh phát triển, vừa góp phần làm cho đất thêm màu mỡ, mang lại hiệu quả kinh tế cao cho cả lúa và đậu nành giúp cho nông dân tăng thêm thu nhập, cải thiện đời sống và giúp cho ngành chăn nuôi, thủy sản có thêm nguyên liệu để chế biến. Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là trọng điểm nông nghiệp của cả nƣớc, việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng là một nhu cầu bức thiết nhằm xây dựng nền nông nghiệp bền vững, phá thế độc canh cây lúa và cắt sự lây truyền của sâu rầy. Vì vậy, việc đƣa cây đậu nành vào cơ cấu luân canh với cây lúa là một trong những biện pháp hữu hiệu (Nguyễn Phƣớc Đằng và ctv., 2010). Tuy nhiên, hiện nay do tình hình biến đổi khí hậu, ĐBSCL là một trong những vùng chịu ảnh hƣởng trực tiếp, đặc biệt là tình trạng xâm nhập mặn vào sâu trong đất liền khiến cho nhiều diện tích đất canh tác bị thu hẹp. Đậu nành đƣợc xem là loài nhạy cảm với mặn (Lauchli, 1984). Sản lƣợng của các giống đậu nành nhạy cảm với mặn giảm rất nghiêm trọng dƣới điều kiện mặn (Chang et al., 1994, Katerji et al., 2003). Chính vì vậy, để có thể canh tác tốt và mở rộng diện tích cây trồng này ở ĐBSCL, việc sử dụng giống chịu mặn là một trong các phƣơng pháp thích hợp nhất và ít tốn kém nhất so với các phƣơng pháp khác nhƣ cải tạo đất hoặc làm đê bao ngăn mặn. Đối với những vùng bị nhiễm mặn, vào những mùa vụ năng suất trồng lúa không cao thì nông dân có thể trồng cây đậu nành thay thế. Theo Wang et al. (2003), hiện nay chọn giống là một chiến lƣợc quan trọng để cải thiện tính chống chịu mặn trên cây đậu nành. Tuy nhiên, công tác lai tạo và chọn giống theo cách cổ điển rất khó, tốn nhiều thời gian, công sức và chi phí. Trong khi đó phƣơng pháp chọn lọc các biến dị thích nghi với mặn thông qua nuôi cấy mô đã đƣợc thực hiện thành công trên nhiều cây trồng. Đặc biệt là hiệu quả chọn lọc có thể đƣợc tăng cƣờng bằng cách kết hợp với kỹ thuật gây đột biến in vitro. Rất nhiều báo cáo đã cho thấy các dòng cây trồng chống chịu mặn có thể đƣợc tạo bằng các kỹ thuật này nhƣ lúa (Dang Minh Tam and Nguyen Thi Lang, 2003; Saleem et al., 2005; Zinnah et al., 2013), mía (Patade et al., 2008), lúa mì (El- Sayed et al., 2007), khoai tây (Yaycili and Alikamanoglu, 2012)… Trên thế

giới, việc ứng dụng phƣơng pháp này để chọn lọc tính chống chịu mặn trên cây đậu nành cũng đã thực hiện nhƣng còn rất hạn chế và chƣa đƣợc nghiên cứu một cách đầy đủ. Một số kỹ thuật nuôi cấy in vitro cây đậu nành cơ bản cũng đã đƣợc thực hiện ở một số giống, tuy nhiên, một quy trình nuôi cấy đầy đủ cũng chƣa có. Vì vậy, các nghiên cứu về chọn lọc các dòng đậu nành chống chịu mặn để thích nghi với sự bất lợi của môi trƣờng nhƣ sự xâm nhập mặn ở ĐBSCL là rất cần thiết và hứa hẹn sẽ mang lại nhiều đóng góp giá trị cho công tác chọn tạo giống đậu nành mới.

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định phƣơng pháp chọn tạo dòng đậu nành có khả năng chống chịu

mặn.

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định khả năng chống chịu mặn của một số giống đậu

nành phổ biến ở ĐBSCL.

Nội dung 2: Xác định môi trƣờng nuôi cấy mô cây đậu nành thích hợp

để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phƣơng pháp chọn lọc.

Nội dung 3: Đánh giá khả năng chọn tạo các dòng đậu nành chống chịu

mặn bằng phƣơng pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma.

- Tạo biến dị tế bào soma từ mô sẹo và trục phôi bằng cách nuôi cấy trên

môi trƣờng mặn (bổ sung muối NaCl).

- Chiếu xạ tia gamma Co60 mẫu mô sẹo và trục phôi và chọn lọc trên môi

trƣờng mặn (bổ sung muối NaCl).

- Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đậu nành chống chịu mặn

sau chọn lọc bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

- Đánh giá khả năng sinh trƣởng và phát triển của các dòng đậu nành

chống chịu mặn sau chọn lọc trong điều kiện tƣới mặn ở nhà lƣới.

1.4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

1.4.1 Đối tƣợng nghiên cứu

Đặc tính chống chịu mặn của cây đậu nành.

1.4.2 Phạm vi nghiên cứu

- Xác định khả năng chống chịu mặn của các giống đậu nành bằng

2

phƣơng pháp thủy canh đƣợc thực hiện trong nhà lƣới.

- Xác định môi trƣờng nuôi cấy mô cây đậu nành thích hợp để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phƣơng pháp chọn lọc và thực hiện chọn tạo các dòng đậu nành có khả năng chịu mặn trong phòng thí nghiệm với 1 giống đã đƣợc đánh giá mức độ chịu mặn trong nhà lƣới.

- Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đậu nành chống chịu mặn

sau chọn lọc bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

- Thuần dƣỡng và trồng thử nghiệm dòng đậu nành sau chọn lọc trong

nhà lƣới.

1.5 Ý nghĩa của luận án

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả luận án đã xác định đƣợc khả năng chống chịu mặn của một số

giống đậu nành phổ biến ở ĐBSCL bằng kỹ thuật thủy canh.

- Luận án đã xác định đƣợc các môi trƣờng nuôi cấy mô thích hợp cho giống đậu nành MTĐ 760-4 là giống có khả năng chịu mặn kém nhƣng có các đặc tính sinh trƣởng tốt để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phƣơng pháp chọn lọc.

- Luận án đã ứng dụng phƣơng pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma Co60 để chọn tạo các các dòng đậu nành chống chịu mặn, sử dụng chỉ thị phân tử ISSR để đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đậu nành chống chịu mặn sau chọn lọc và đánh giá khả năng sinh trƣởng và phát triển của các dòng này trong điều kiện tƣới mặn ở nhà lƣới.

- Kết quả của luận án đã xác định đƣợc phƣơng pháp tạo dòng đậu nành MTĐ 760-4 có khả năng chống chịu mặn, cung cấp nguồn tài liệu trong nghiên cứu khoa học, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo và phục vụ trong giảng dạy.

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

3

Trƣớc tình trạng xâm nhập mặn ở ĐBSCL đang ngày càng trở nên nghiêm trọng, đe dọa ảnh hƣởng đến năng suất nhiều giống cây trồng, trong đó có cây đậu nành là một trong những giống cây trồng có giá trị thực phẩm cao, đồng thời cũng là giống cây trồng cải tạo đất rất tốt, nhƣng là giống cây nhạy cảm với mặn, việc nghiên cứu để chọn tạo các dòng/giống cây đậu nành có khả năng chống chịu mặn để có thể canh tác tốt và mở rộng diện tích cây trồng này ở ĐBSCL là rất cần thiết. Ứng dụng phƣơng pháp gây biến dị tế bào soma có thể chọn lọc đƣợc dòng đậu nành chống chịu mặn. Kết quả luận án đã đạt đƣợc 01 dòng đậu nành MTĐ 760-4 có khả năng chống chịu mặn ở nồng

độ muối NaCl 5 g/L. Từ đó có thể trồng thử nghiệm và phát triển giống mới này ra điều kiện tự nhiên, đặc biệt là những vùng đất canh tác đang bị nhiễm mặn ở ĐBSCL.

1.6 Những điểm mới của luận án

- Kết quả luận án đã đánh giá đƣợc khả năng chống chịu mặn của 10 giống đậu nành trồng ở ĐBSCL là MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4, Nhật 17A, OMĐN 29, ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-3 và MTĐ 885-2 bằng phƣơng pháp thủy canh. Trong đó, các giống MTĐ 748-1, ĐH 4 và MTĐ 720 có khả năng chịu mặn cao ở nồng độ muối NaCl 4 g/L. Giống MTĐ 878-3 nhạy cảm với mặn và giống MTĐ 760-4 chết hoàn toàn ở nồng độ muối này.

- Luận án đã tạo ra những dòng mô sẹo và cây chịu mặn từ giống không

chịu mặn là MTĐ 760-4.

- Trong các phƣơng pháp chọn lọc các dòng đậu nành chống chịu mặn thì phƣơng pháp gây biến dị soma trên mẫu trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 đạt đƣợc 01 dòng cây đậu nành có khả năng chống chịu mặn ở nồng độ NaCl 5 g/L. Có sự khác biệt di truyền trong cấu trúc DNA của mẫu chồi chống chịu mặn so với mẫu đối chứng không xử lý mặn khi phân tích bằng chỉ thị phân tử ISSR22. Cây đậu nành MTĐ 760-4 sau chọn lọc mặn với muối NaCl 5 g/L sinh trƣởng bình thƣờng sau 5 tuần thuần dƣỡng trong điều kiện tƣới mặn ở nhà lƣới.

4

- Cả hai phƣơng pháp gây biến dị soma và phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma Co60 kết hợp chọn lọc mặn với muối NaCl trên mẫu mô sẹo đều thu đƣợc các dòng mô sẹo có khả năng chịu mặn với nồng độ 5 g/L ở mẫu không chiếu xạ và mẫu chiếu xạ liều 10 Gy. Phân tích di truyền với chỉ thị ISSR22 cho thấy ở hai mẫu mô sẹo này đều không có sự xuất hiện của băng DNA khoảng 450 bp so với mẫu đối chứng.

CHƢƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc và phân loại cây đậu nành

2.1.1 Nguồn gốc

Đậu nành (đậu tƣơng) là một trong những loại cây trồng mà loài ngƣời đã biết sử dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu nành cũng sớm đƣợc xác minh. Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu nành có nguyên sản ở châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cây đậu nành đƣợc thuần hóa ở Trung Quốc qua nhiều triều đại tiền phong kiến và đƣợc đƣa vào trồng trọt và khảo sát có thể trong triều đại Shang (năm 1700-1100 B.C) trƣớc công nguyên. Những thông tin về nguồn gốc đậu nành đƣợc trình bày chi tiết trong tài liệu của trong Ngô Thế Dân và ctv. (1999).

2.1.2 Phân loại

Đậu nành Glycine max (L.) Merrill thuộc họ đậu Leguminosae, họ phụ

cánh bƣớm Papilionoideae và bộ Phaseoleae (Bernard and Weiss, 1973).

Đậu nành đƣợc thuần hóa từ đậu nành hoang, G. soja Sieb. and Zucc., là một loài dây leo hằng niên có trái chứa hạt màu đen (Hymowitz, 1970). Đậu nành canh tác và tổ tiên của nó G. soja thuộc chi phụ Soja (Moench.) F.J. Herm. (Singh and Hymowitz, 1989).

2.2 Đặc điểm thực vật

2.2.1 Rễ

Rễ cây đậu nành khác với rễ cây hòa thảo là có rễ chính và rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 30-50 cm và có thể trên 1 m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 7-8 cm, rộng 30-40 cm2 (Nguyễn Danh Đông, 1982). Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần. Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lƣợng nốt sần ít hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, khí hậu và kỹ thuật trồng (Trần Văn Điền, 2007).

2.2.2 Thân

Tùy theo đặc điểm của giống và điều kiện môi trƣờng mà cây đậu nành có số lóng và số cành khác nhau (Nguyễn Thị Xuân Thu và Lê Vĩnh Thúc, 2011).

Thân cây đậu nành thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông

5

nhỏ.

Thân khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc của hoa sau này. Nếu thân lúc còn non màu xanh thì hoa màu trắng và nếu khi còn non thân có màu tím thì hoa có màu tím đỏ.

Thân có trung bình 14-15 lóng, các lóng ở phía dƣới thƣờng ngắn, các lóng ở phía trên thƣờng dài (vì những lóng phía trên phát triển từ ngày 35-40 trở đi vào lúc cây đang sinh trƣởng nhanh nên lóng thƣờng dài). Tùy theo giống và thời vụ gieo mà chiều dài lóng có sự khác nhau thƣờng biến động từ 3-10 cm. Cây đậu nành trong vụ hè thƣờng có lóng dài hơn vụ xuân và vụ đông. Chiều dài của lóng góp phần quyết định chiều cao của thân. Thân cây đậu nành thƣờng cao từ 0,3-1,0 m. Giống đậu nành dại cao 2-3 m. Những giống thân nhỏ lóng dài dễ bị đổ hay mọc bò thƣờng làm thức ăn cho gia súc. Những giống thân to thƣờng là thân đứng và có nhiều hạt và chống đƣợc gió bão. Toàn thân có một lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cả cuống lá. Thực tế cũng có giống không có lông tơ. Những giống có mật độ lông tơ dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn và chịu rét khỏe. Ngƣợc lại những giống không có lông tơ thƣờng sinh trƣởng không bình thƣờng, sức chống chịu kém. Thân có lông tơ nhiều ít dài ngắn, dày thƣa là một đặc điểm phân biệt giữa các giống với nhau (Trần Văn Điền, 2007).

2.2.3 Lá

Cây đậu nành có 4 loại lá bao gồm lá mầm (lá tử diệp), lá sơ cấp đơn, lá kép lông chim và lá bắc (một cặp lá đơn dài 1 mm ở gốc của mỗi nhánh bên) (Carlson and Lersten, 2004).

Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ. Lá có nhiều hình dạng khác nhau tùy theo giống, những giống lá nhỏ và dài chịu hạn khỏe nhƣng thƣờng cho năng suất thấp. Những giống lá to chống chịu hạn kém nhƣng thƣờng cho năng suất cao hơn. Nếu 2 lá kép đầu to và dày thƣờng biểu hiện giống có khả năng chống chịu rét. Số lƣợng lá kép nhiều hay ít, diện tích lá to hay nhỏ chi phối rất lớn đến năng suất và phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng. Các lá nằm cạnh chùm hoa nào giữ vai trò chủ yếu cung cấp dinh dƣỡng cho chùm hoa ấy. Nếu vì điều kiện nào đó làm cho lá bị úa vàng thì trái ở vị trí đó thƣờng bị rụng hoặc lép.

6

Các nhà chọn giống đậu nành đƣa ra cơ sở để nâng cao năng suất đậu nành là tăng cƣờng quá trình quang hợp và muốn quang hợp với hiệu quả cao thì phải chọn những cây có bộ lá nhỏ, dày, thế lá đứng và lá có dạng hình trứng.

Số lá nhiều to khỏe nhất vào thời kỳ đang ra hoa rộ. Khi phiến lá phát triển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tƣơi là biểu hiện cây sinh trƣởng khỏe có khả năng cho năng suất cao (Trần Văn Điền, 2007).

2.2.4 Hoa

Chồi bên phát triển thành cụm gồm 2-35 hoa. Hoa rụng từ 20-80%. Đậu nành có hoa có tràng cánh bƣớm (Carlson and Lersten, 2004). Hoa đậu nành thuộc loại hoa đồng chu lƣỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy.

+ Đài hoa có màu xanh, nhiều bông.

+ Cánh hoa: Một cánh to gọi là cánh cờ, 2 cánh bƣớm và 2 cánh thìa.

+ Nhị đực: 9 nhị đực cuốn thành ống ôm lấy vòi nhụy cái và 1 nhị riêng

lẻ.

+ Nhụy cái: Bầu thƣợng, tử phòng một ngăn có 1-4 tâm bì (noãn) nên

thƣờng trái đậu nành có 2-3 hạt.

Các cánh hoa vƣơn ra khỏi lá đài từ ngày hôm trƣớc và việc thụ phấn xảy ra vào sáng ngày hôm sau lúc 8-9 giờ sáng trƣớc khi nụ hoặc hoa chƣa nở hoàn toàn. Mùa hè hoa thƣờng nở sớm hơn mùa đông và thời gian nở hoa rất ngắn sáng nở chiều tàn. Hoa đậu nành thƣờng thụ phấn trƣớc khi hoa nở và là cây tự thụ phấn, tỉ lệ giao phấn rất thấp chiếm trung bình 0,5-1% (Ngô Thế Dân và ctv., 1999).

2.2.5 Trái và hạt

Chùm hoa ở mỗi đốt có thể phát triển từ 1 đến hơn 20 trái. Một cây có thể có đến 400 trái. Trái đậu nành tƣơng tự nhƣ trái các cây họ đậu khác. Một trái thƣờng chứa 1 đến 3 hạt và hiếm khi 4 hạt, ngoại trừ các cây có na allele có những lá chét hẹp và có tỉ lệ trái 4 hạt cao hơn (Singh et al., 2007).

Trái đậu nành thẳng hoặc hơi cong, có chiều dài từ 2-7 cm hoặc hơn. Trái có màu sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu hoặc đen. Màu sắc trái phụ thuộc vào sắc tố caroten, xanthophyll, màu sắc của lông, sự có mặt của các sắc tố antocyanin. Lúc trái non có màu xanh nhiều lông (có khả năng quang hợp do có diệp lục), khi chín có màu nâu. Hoa đậu nành ra nhiều nhƣng tỉ lệ đậu trái thấp 20-30%.

7

Ví dụ trong vụ xuân 1 cây có thể có 120 hoa nhƣng chỉ đậu 30-40 trái là cao, trên một chùm 5-8 hoa chỉ đậu 2-3 trái. Những đốt ở phía gốc thƣờng trái ít hoặc không có trái, từ đốt thứ 5-6 trở lên tỉ lệ đậu trái cao và trái chắc nhiều. Trên cành thƣờng từ đốt 2-3 trở lên mới có trái chắc, những trái trên đầu cành

thƣờng lép nhiều. Sau khi hoa nở đƣợc 2 ngày thì cánh hoa héo và rụng, ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 sau hoa nở đã hình thành trái và 7-8 ngày sau là thấy nhân trái xuất hiện. Trong 18 ngày đầu trái lớn rất nhanh sau đó chậm dần, vỏ dày lên và chuyển từ màu xanh sang màu vàng. Hạt lớn nhanh trong vòng 30- 35 ngày sau khi hình thành trái.

Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: Hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt... Giống có màu vàng giá trị thƣơng phẩm cao. Trong hạt, phôi thƣờng chiếm 2%, 2 lá tử điệp chiếm 90% và vỏ hạt 8% tổng khối lƣợng hạt. Hạt to nhỏ khác nhau tùy theo giống, khối lƣợng một nghìn hạt (M1.000 hạt) thay đổi từ 20- 400 g trung bình từ l00-200 g.

Rốn hạt của các giống khác nhau thì có màu sắc và hình dạng khác nhau,

đây là một biểu hiện đặc trƣng của các giống (Trần Văn Điền, 2007).

2.3 Yêu cầu sinh thái của cây đậu nành

2.3.1 Đất

Cây đậu nành không yêu cầu nghiêm khắc về đất trồng. Loại đất thích hợp nhất đối với cây đậu nành là loại đất có tầng canh tác sâu, giàu chất hữu cơ, Ca, K và pH trung tính, mực nƣớc ngầm sâu, giữ ẩm tốt, dễ thoát nƣớc, trong đó khả năng giữ nƣớc và thoát nƣớc có ảnh hƣởng nhiều nhất đến khả năng sinh trƣởng phát triển và năng suất cây đậu nành.

Đậu nành chịu mặn và chịu chua kém hơn nhiều cây trồng khác. Độ pH có thể phát triển bình thƣờng đƣợc là từ 5,0-8,0, độ pH thích hợp nhất là 6,0- 7,0, dƣới 4,0 và trên 9,5 đậu nành không sống đƣợc (Trần Văn Điền, 2007).

Ở miền Nam nƣớc ta, đậu nành cũng đƣợc trồng trên nhiều loại đất nhƣ đất phù sa mới, đất phù sa cổ, đất đỏ, đất xám, đất phèn ít, đất phèn mặn, đất hữu cơ… (Nguyễn Thị Xuân Thu và Lê Vĩnh Thúc, 2011).

2.3.2 Nhiệt độ

8

Đậu nành đƣợc trồng rải ở nhiều nƣớc trên thế giới, có thể trồng tới 470 vĩ bắc (Ngô Thế Dân và ctv., 1999). Đậu nành có nguyên sản ở Trung Quốc nên nói chung đậu nành là một loại cây ƣa nhiệt độ ấm. Nhiều tài liệu nghiên cứu cho rằng muốn trồng cây đậu nành phải có nhiệt độ đầy đủ trong các thời kì sinh trƣởng hay tổng tích ôn không nhỏ quá 24000C (Nguyễn Danh Đông, 1982). Đậu nành có thể trồng đƣợc ở những vùng nào nhiệt độ trong suốt thời gian sinh trƣởng từ 170C đến 290C và nhiệt độ ban đêm không thấp dƣới 150C (Lawn, 1982). Cây đậu nành ƣa nhiệt độ cao nhƣng tùy theo thời kỳ sinh trƣởng khác nhau mà yêu cầu nhiệt độ khác nhau (Trần Văn Điền, 2007).

2.3.3 Nƣớc

Theo Nguyễn Thị Xuân Thu và Lê Vĩnh Thúc (2011), nƣớc là một trong những yếu tố hàng đầu của môi trƣờng có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự sinh trƣởng và phát triển của đậu nành. Trong thực tế sản xuất, mặc dù hiếm có trƣờng hợp đậu nành chết vì hạn, nhƣng nƣớc là một yếu tố thƣờng hạn chế năng suất đậu nành, nhất là trong điều kiện mùa khô ở miền Nam.

So với lúa, bắp, cao lƣơng, khi nảy mầm hạt đậu nành hút thu một lƣợng nƣớc lớn hơn rất nhiều, nhƣng sức hút nƣớc của hạt thì lại kém hơn các loại trên. Trong trƣờng hợp độ ẩm của đất chỉ đủ cho hạt trƣơng lên mà không đủ đảm bảo cho hạt nảy mầm, cũng nhƣ trong điều kiện đất bị úng ở tuần đầu thì hạt thƣờng bị nấm mốc tấn công và thối. Đây là nguyên nhân gây ra tình trạng đậu nành mọc không đều ở ngoài đồng.

Đậu nành không chịu đƣợc hạn lẫn úng. Bộ rễ của cây tập trung phần lớn ở tầng đất cày nên khả năng sử dụng nƣớc ở các tầng đất sâu khó hơn. Muốn cho quá trình sinh trƣởng của cây không bị kìm hãm thì ẩm độ đất trong khoảng 75-90% độ ẩm giới hạn ngoài đồng ở tầng đất 1-20 cm. Ẩm độ đất dƣới 75% ẩm độ giới hạn ngoài đồng sẽ kìm hãm sự sinh trƣởng của cây đậu nành nhƣng mức độ kìm hãm thay đổi tùy theo điều kiện khí hậu, nhiệt độ và giai đoạn sinh trƣởng của cây (Trần Thƣợng Tuấn và ctv., 1983).

Trong cả vụ, nhu cầu nƣớc đối với cây đậu nành dao động từ khoảng 350 tới 800 mm (Mayer et al., 1992). Nhƣng nhu cầu nƣớc phụ thuộc vào độ dài thời gian sinh trƣởng, tốc độ phát triển của cây trƣớc khi phủ kín đất và lƣợng nƣớc sẵn có trong đất. Trong suốt thời gian sinh trƣởng, nhu cầu nƣớc của cây không đồng đều qua các giai đoạn. Ở giai đoạn nảy mầm và cây con, tỉ lệ sử dụng nƣớc thấp do tán cây còn nhỏ và phần lớn số nƣớc mất đi do bay hơi trên mặt đất. Nhu cầu nƣớc của cây đậu nành tăng dần khi cây ở giai đoạn từ 3-5 lá kép, tăng nhanh và cao nhất ở giai đoạn sinh trƣởng sinh thực từ khi cây ra hoa đến khi quả vào chắc. Giai đoạn quả bắt đầu chín, nhu cầu nƣớc lại giảm đi cùng với sự tàn của lá và lƣợng nƣớc bay hơi giảm.

Ảnh hƣởng của nƣớc có thể do thừa nƣớc gây tổn thƣơng bộ rễ do thiếu không khí hoặc có thể do thiếu nƣớc dẫn đến cây bị héo. Nƣớc ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của cây bao gồm về cả sinh lý, sinh hóa, hình thái và giải phẫu của cây dẫn đến làm giảm năng suất (Trần Văn Điền, 2007).

2.3.4 Ánh sáng

9

Đậu nành thuộc cây ngày ngắn. Tuy nhiên, ngày nay nó phân bố rất rộng trên thế giới với những giống có phản ứng rất khác nhau với quang kỳ. Trong

điều kiện miền Nam nƣớc ta, các giống ít quang cảm và không quang cảm thích hợp hơn vì chúng có khả năng thích nghi rộng và trồng đƣợc nhiều mùa vụ khác nhau (Trần Thƣợng Tuấn và ctv., 1983).

Về mặt cƣờng độ ánh sáng, nhu cầu của đậu nành 50.000 lux (Upmeyer and Kollar, 1973) thấp hơn nhiều so với bắp, cao lƣơng và nhiều cây trồng khác. Có thể vì thế cây đậu nành thích hợp trồng xen với các cây trồng khác có yêu cầu về cƣờng độ ánh sáng cao hơn. Cƣờng độ ánh sáng bão hòa đối với tán cây đậu nành bằng khoảng 60.000 lux (bằng nửa cƣờng độ ánh sáng giữa trƣa) vào đầu thời kỳ trổ hoa, sau đó giảm xuống còn 40.000 lux ở giai đoạn hạt xanh của cây.

Đậu nành thuộc nhóm cây có hiện tƣợng quang hô hấp, tức là hiện tƣợng gia tăng hô hấp ở cƣờng độ ánh sáng cao. Quá trình hô hấp tiêu phí mất một lƣợng đáng kể sản phẩm quang hợp theo con đƣờng oxy hóa đến CO2 nên hạn chế năng suất của đậu nành. Vì điều kiện ánh sáng ảnh hƣởng đến quá trình quang hợp, tạo ra các sản phẩm cung cấp cho hoạt động của nốt sần nên cũng có ảnh hƣởng gián tiếp đến sự hình thành nốt sần và sự cố định đạm (Nguyễn Thị Xuân Thu và Lê Vĩnh Thúc, 2011).

2.4 Đất mặn và tình hình xâm nhập mặn ở Đồng bằng sông Cửu

Long

2.4.1 Khái niệm đất mặn

10

Đất mặn đƣợc xem là đất có vấn đề rất phổ biến trên thế giới, làm hạn chế năng suất cây trồng. Tính chất vật lý và hóa học của đất mặn rất đa dạng. Biến thiên này tùy thuộc vào nguồn gốc của hiện tƣợng mặn, pH đất, hàm lƣợng chất hữu cơ trong đất, chế độ thủy văn, và nhiệt độ (Akbar and Ponnamperuma, 1982). Đất mặn chứa một lƣợng muối hòa tan trong nƣớc ở vùng rễ cây, làm thiệt hại đến hoạt động sinh trƣởng của cây trồng. Mức độ gây hại của đất mặn tùy thuộc vào loài cây trồng, giống cây, thời gian sinh trƣởng, các yếu tố môi trƣờng đi kèm theo nó, và tính chất của đất. Do đó, ngƣời ta rất khó định nghĩa đất mặn một cách chính xác và đầy đủ. Hội Khoa Học Đất của Mỹ (SSSA, 1979) đã xác định đất mặn là đất có độ dẫn điện (EC) lớn hơn 2 dS m, không kể đến hai giá trị khác là tỉ lệ hấp thu sodium (SAR) và pH. Tuy nhiên, hầu hết các định nghĩa khác đều chấp nhận đất mặn là đất có độ dẫn điện EC cao hơn 4 dS m ở điều kiện nhiệt độ 250C, phần trăm sodium trao đổi ESP kém hơn 15, và pH nhỏ hơn 8,5 (US Salinity Laboratory Staff, 1954). Đến 2005 thì định nghĩa đất mặn cũng vẫn là đất có độ dẫn điện của dung dịch đƣợc ly trích từ hỗn hợp đất bão hòa nƣớc Ece (Electrical

Conductivity of the extract) là 4 dS m (≈ NaCl 2,3 g L hoặc cao hơn) (Chinnusamy et al., 2005).

2.4.2 Tình hình xâm nhập mặn ở Đồng bằng sông Cửu Long

Theo Lê Xuân Định và ctv. (2016), những năm gần đây, diễn biến xâm nhập mặn ở ĐBSCL phức tạp, bất thƣờng, năm sớm năm muộn so với cùng kỳ nhiều năm. Năm 2011, xâm nhập mặn sớm hơn, từ giữa tháng 2, nhiều địa phƣơng vùng ĐBSCL, Tây Nguyên đã phải đối phó với hạn hán và đặc biệt là tình trạng nƣớc mặn xâm nhập. Tại một số tỉnh ven biển ĐBSCL, nƣớc biển xâm nhập sâu vào các sông rạch khiến các dòng sông bị nhiễm mặn sớm, gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến đời sống ngƣời dân và hoạt động nông nghiệp. Đặc biệt, những tháng đầu năm 2016, diễn biến xâm nhập mặn tại ĐBSCL đƣợc đánh giá nặng nề nhất trong 100 năm qua và dự báo còn diễn biến xấu hơn trong những năm tiếp theo.

Do vị trí địa lý, ĐBSCL chịu ảnh hƣởng của thủy triều từ cả biển Đông và biển Tây. Trong mùa cạn, khi lƣu lƣợng nƣớc ở thƣợng lƣu đổ về giảm, thủy triều ảnh hƣởng mạnh lên thƣợng lƣu và hệ thống kênh rạch nội đồng, dẫn theo nƣớc mặn xâm nhập sâu cả trên sông và nội đồng. Theo thống kê, có trên 50% diện tích ĐBSCL (39.330 km2) bị nhiễm mặn, gồm địa phận các tỉnh nhƣ Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau và Kiên Giang. Trên cơ sở số liệu tại các trạm đo mặn và số liệu điều tra khảo sát mặn ở vùng cửa sông Tiền - sông Hậu (các tỉnh Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, và một phần Sóc Trăng), sông Vàm Cỏ (tỉnh Long An), vùng Bán đảo Cà Mau (tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau) và vùng ven biển Tây (tỉnh Kiên Giang và một phần tỉnh Cà Mau), có thể chia ĐBSCL ra các vùng chịu ảnh hƣởng của xâm nhập mặn nhƣ sau:

- Vùng ven sông Vàm Cỏ thuộc địa phận tỉnh Long An: Hiện trạng xâm nhập mặn vùng hai sông Vàm Cỏ từ đầu mùa khô đến đầu tháng 3 (4/3/2016), độ mặn xuất hiện lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 tăng từ 4,7-7,4 g/L.

- Vùng các cửa sông Cửu Long: Hiện tƣợng xâm nhập mặn vùng cửa sông Cửu Long từ đầu mùa khô đến đầu tháng 3 (ngày 4 3 2016), độ mặn xuất hiện lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 tăng từ 1,5-8,2 g/L.

11

- Vùng các cửa sông Tiền, sông Hậu: Mặn cũng theo thủy triều từ biển Đông xâm nhập vào trong sông. Độ mặn trung bình tháng và độ mặn lớn nhất trong năm thƣờng xuất hiện trong tháng 3 hoặc tháng 4. Độ mặn cao nhất trong mỗi tháng và độ mặn lớn nhất trong thời gian quan trắc tại các vị trí khác nhau trên một dòng sông. Chiều dài xâm nhập của độ mặn 4‰ khoảng 50-57

km, trong đó sâu nhất trên nhánh cửa Tiểu - nhánh sông có tỉ lệ phân nƣớc nhỏ nhất (Lê Hữu Thuần, 2013).

- Vùng ven biển Tây gồm tỉnh Kiên Giang và một phần tỉnh Cà Mau: Hiện tƣợng xâm nhập mặn khu vực ven biển Tây, trên sông Cái Lớn từ đầu mùa khô đến đầu tháng 3 (ngày 4 3 2016), độ mặn xuất hiện lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 tăng từ 4,8 - 7,6 g/L.

- Vùng Bán đảo Cà Mau: Đây là khu vực chịu ảnh hƣởng của mặn theo thủy triều ở cả biển Tây và biển Đông. Mặn theo thủy triều biển Đông ngƣợc sông Hậu và sông Mĩ Thanh ảnh hƣởng trong phạm vi tỉnh Sóc Trăng, ngƣợc sông Gành Hào ảnh hƣởng tới thị xã Bạc Liêu trên kênh Cà Mau-Bạc Liêu, đến kênh Quản Lộ-Phụng Hiệp. Trên kênh Cà Mau-Bạc Liêu xuất hiện vùng giáp triều-mặn ở khu vực lân cận thị xã Bạc Liêu. Khi triều lên, nƣớc chảy từ Bạc Liêu về phía sông Gành Hào.

Diễn biến mặn trong khu vực khá phức tạp, độ mặn lớn nhất trong thời kỳ quan trắc hầu nhƣ không xuất hiện đồng thời cùng một năm ở các vị trí khác nhau. Tuy nhiên, độ mặn trung bình tháng lớn nhất xuất hiện chủ yếu trong tháng 4 hoặc tháng 5, chậm hơn so với các khu vực khác.

2.5 Sự chống chịu mặn của cây đậu nành

2.5.1 Ảnh hƣởng của mặn trên cây đậu nành

Đậu nành đƣợc xem là loài nhạy cảm với mặn (Lauchli, 1984). Sản lƣợng của các giống đậu nành nhạy cảm với mặn giảm rất nghiêm trọng dƣới điều kiện mặn. Sản lƣợng đạt 80% ở 4,0 dS/m, 44% ở 6,7 dS/m so với 100% ở 0,8 dS/m (Katerji et al., 2003). Tổn hại do mặn ở đậu nành là do sự tích lũy của ion Cl- trong thân và lá và đƣợc biểu hiện qua hiện tƣợng cháy lá (Abel and MacKenzie, 1964; Essa, 2002). Tuy nhiên các kiểu gen khác nhau về mức độ tổn thƣơng cho thấy có sự đa dạng di truyền trong tính chống chịu mặn.

Theo Ashraf (1994), đậu nành đƣợc xếp vào nhóm cây trồng chịu mặn trung bình và năng suất cuối cùng của đậu nành sẽ giảm khi độ mặn của đất vƣợt quá 5 dS/m. Kết quả của Chang et al. (1994) cho thấy sản lƣợng trung bình của 20 giống đậu nành ở các điều kiện mặn là đối chứng, 14-15 dS/m, và 18-20 dS m tƣơng ứng là 2.261,4±438,3 kg/hm2 (đối chứng), 1.073,4±267,1 kg/hm2 (47,5% của đối chứng), và 880,8±259,9 kg/hm2 (38,9% của đối chứng).

12

Nồng độ muối cao gây tổn hại cả chu kỳ đời sống của cây đậu nành. Mức độ chống chịu mặn của các giống đậu nành khác nhau ở các giai đoạn phát triển khác nhau (Abel and MacKenzie, 1964).

Ảnh hƣởng đến sự nảy mầm: Sự nảy mầm của đậu nành bị trì hoãn ở nồng độ muối thấp (NaCl 0,5 và 1 g/L). Nồng độ muối cao dẫn đến giảm hoàn toàn sự nảy mầm (Abel and MacKenzie, 1964). Ảnh hƣởng của các muối lên thời điểm bắt đầu và tỉ lệ nảy mầm càng nổi bật hơn ở những giống nhạy cảm với mặn so với giống chống chịu mặn (Abel, 1969).

Ảnh hƣởng ở giai đoạn trƣởng thành: Sự chống chịu mặn cao ở giai đoạn nảy mầm không chỉ ra một sự chống chịu tƣơng tự ở giai đoạn trƣởng thành. Ví dụ giống đậu nành “Lee”, “Coiquitt” và “Clark 36” có cùng một mức độ giảm tỉ lệ nảy mầm khi đƣợc cảm ứng mặn, tuy nhiên, ảnh hƣởng bất lợi của mặn lên chiều cao cây và trọng lƣợng khô của chồi ở giống “Lee” thấp hơn rất nhiều so với 2 giống còn lại (Essa, 2002).

Giai đoạn cây con của đậu nành nhạy cảm với stress mặn nhiều hơn giai đoạn nảy mầm rất nhiều (Hosseini et al., 2002). Sự sinh trƣởng của cây con ở nồng độ NaCl 12,9 g/L giảm 5% so với đối chứng không xử lý, trong khi đó sự ức chế sinh trƣởng đƣợc quan sát ở nồng độ NaCl 17,5 g/L. Sự nảy mầm (40%) vẫn có thể đạt đƣợc thậm chí khi nồng độ Na+ trong trục phôi đạt 9,3 mg/g trọng lƣợng tƣơi, trong khi sự sinh trƣởng của cây con hoàn toàn bị ức chế khi trong mô có nồng độ Na+ 6,1 mg/g trọng lƣợng tƣơi.

Các đặc tính nông học của đậu nành có thể bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi độ mặn cao nhƣ giảm chiều cao, kích thƣớc lá, sinh khối, số lóng, số nhánh, số trái, trọng lƣợng cây và trọng lƣợng 100 hạt (Abel and MacKenzie, 1964; Chang et al., 1994).

Ảnh hƣởng của mặn lên sự thành lập nốt sần: Các giai đoạn sớm liên quan đến sự thành lập nốt sần ở đậu nành rất nhạy cảm với muối NaCl. Thậm chí, nồng độ thấp (NaCl 1,6 g/L) làm giảm đáng kể trọng lƣợng và số lƣợng nốt sần. Kết quả là hàm lƣợng đạm ở chồi bị giới hạn do mô nốt sần không đủ để đáp ứng nhu cầu đạm của các chồi không bị stress (Singleton and Bohlool, 1984).

13

Nốt sần của đậu nành chống chịu mặn dòng Rhizobium USDA 208 và dòng nhạy cảm mặn Bradyrhizobium RCR 3407 (CBl809) đƣợc Elsheikh and Wood (1995) đánh giá trong điều kiện đất mặn ở nhà lƣới. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa trọng lƣợng khô của rễ, chồi, số lƣợng và trọng lƣợng nốt sần giữa dòng chịu mặn Rhizobium và dòng nhạy cảm mặn Bradyrhizobium. Nốt sần đậu nành giảm hơn 50% khi đất có bổ sung NaCl 2 g/L. Hoạt động của nốt sần ở cả hai dòng cũng giảm bởi mặn. Nốt sần nhạy cảm hơn so với sinh trƣởng của cây trong điều kiện mặn. Dòng chịu mặn cố định đạm nhiều hơn dòng nhạy cảm trong điều kiện mặn.

Song et al. (2017) đã đánh giá các kiểu gen đậu nành chống chịu mặn liên quan đến nốt sần và sự hấp thu đạm ở đậu nành. Kết quả cho thấy các kiểu gen chống chịu mặn biểu hiện tốt hơn về nốt sần, màu xanh của lá và sự hấp thu đạm dƣới điều kiện mặn.

Ảnh hƣởng lên chất lƣợng hạt: Stress mặn làm giảm hàm lƣợng protein hạt. Tuy nhiên, kết quả về ảnh hƣởng của nó lên hàm lƣợng dầu trong hạt vẫn chƣa thuyết phục do các kết quả thí nghiệm khác nhau ở các địa điểm thí nghiệm khác nhau trên các giống khác nhau đƣợc xử lý với độ mặn khác nhau (Chang et al., 1994; Wan et al., 2002).

2.5.2 Các nghiên cứu về sự chống chịu mặn trên cây đậu nành

Một số kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của mặn trên sự sinh trưởng

của cây đậu nành

Shereen et al. (2001) đã áp dụng phƣơng pháp thủy canh để nghiên cứu sự sinh trƣởng và mối liên hệ giữa các ion của 4 giống đậu nành ở nồng độ muối từ 0,6-2,3 g/L ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Kết quả cho thấy nồng độ muối gia tăng làm giảm trọng lƣợng tƣơi và khô của chồi. Tốc độ tăng trƣởng tƣơng đối giảm khi tăng nồng độ muối. Sự chống chịu mặn liên quan đến sự điều hòa Na+ ở chồi. Nồng độ K+ và dòng chảy K+ cao nhất ở đối chứng và giảm ở điều kiện mặn. Một tỉ lệ K+/Na+ cao nói chung liên quan đến khả năng chống chịu mặn tốt hơn.

Valencia et al. (2008) đã tìm ra một phƣơng pháp hiệu quả cho việc phát hiện tính kháng mặn trên cây đậu nành. Kết quả này sẽ giúp cho việc quan sát và ghi nhận sự đáp ứng của cây đậu nành đối với stress mặn một cách nhanh chóng và hiệu quả dựa trên những triệu chứng ở lá.

Hamayun et al. (2010) đã nghiên cứu những ảnh hƣởng bất lợi của ngộ độc mặn do muối NaCl lên các đặc tính sinh trƣởng và mức độ các hormone nội sinh nhƣ gibberellins (GA), abscisic acid (ABA), jasmonic acid (JA) và salicylic acid (SA) của giống đậu nành cv. Hwangkeumkong. Chiều cao cây, sinh khối, hàm lƣợng chlorophyll, số trái, trọng lƣợng 100 hạt và sản lƣợng giảm một cách ý nghĩa ở nồng độ muối NaCl 4,1 và 8,2 g L. Dƣới điều kiện stress mặn, hàm lƣợng GA và SA giảm trong khi hàm lƣợng ABA và JA tăng rất đáng kể. Kết quả cho thấy stress mặn làm giảm nghiêm trọng sự sinh trƣởng và các thành phần sản lƣợng của đậu nành thông qua ảnh hƣởng lên các hormone sinh trƣởng nội sinh.

14

Farhoudi and Tafti (2011) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của stress mặn lên sự sinh trƣởng và sự cân bằng ion nội môi của cây con 3 giống đậu nành Hill,

Klark và Williams. Hạt đƣợc gieo trên đĩa petri chứa các nồng độ muối NaCl có các giá trị EC là 4, 8, 12 và 16 dS m và nƣớc cất dùng làm đối chứng. Hạt đƣợc đặt dƣới điều kiện 16 giờ ngoài sáng, 8 giờ tối, ẩm độ 70% và nhiệt độ 24±10C. Các chỉ tiêu đƣợc lấy 1 lần/ngày trong 10 ngày. Kết quả cho thấy stress mặn làm giảm sự nảy mầm, trọng lƣợng tƣơi của cây con, sinh trƣởng của cây con và tỉ lệ K+ trong sinh khối khô nhƣng làm tăng thời gian nảy mầm trung bình và tỉ lệ Na+. Tỉ lệ K+/Na+ của giống Hill cao hơn của Klark và Williams cho thấy sinh trƣởng của cây con giống Hill dƣới điều kiện mặn tốt hơn hai giống còn lại.

Trong nghiên cứu của Kondetti et al. (2012), ảnh hƣởng của sự stress mặn lên 11 giống đậu nành Ấn Độ (Co-1, CoSoy-2, DS-40, GujratSoy-1, JS- 80-21, MACS-13, MAUS-2, NRC-2, PalamSoy, Pusa-16 và Shilageet) đƣợc phân tích dƣới các nồng độ muối NaCl tăng dần (0; 7,0; 10,5; 14,0 và 17,5 g/L). Mặn có ảnh hƣởng bất lợi cho sự nảy mầm và tất cả các chỉ tiêu sinh lý (chiều dài rễ, chiều cao chồi, tỉ lệ rễ/chồi, sản lƣợng vật chất khô của rễ và chồi, hàm lƣợng ẩm độ của rễ và chồi) ở giai đoạn sinh trƣởng sớm của cây con. Kết quả cho thấy có sự khác biệt về giống ở tất cả các chỉ tiêu.

Ở Việt Nam, Quach et al. (2019) đã so sánh tính chống chịu mặn trên 18 giống đậu nành. Dƣới điều kiện stress NaCl từ 0 đến 11,7 g/L, có sự khác biệt lớn trong sự chống chịu mặn của 18 giống đậu nành này. PI 675847 A (giống đậu nành Việt Nam DT2008) đƣợc xác định là nguồn chống chịu mặn có hiệu quả. Trong suốt quá trình sinh trƣởng dinh dƣỡng, PI 675847 A có tỉ lệ cháy lá thấp hơn, sự bền vững màng tế bào cao hơn, quang hợp và tích lũy sinh khối tốt hơn trong điều kiện mặn so với 17 dòng còn lại. Thêm vào đó, PI 675847 A duy trì sinh trƣởng và sản lƣợng hạt tốt hơn trong điều kiện mặn so với các dòng nhạy cảm. Phân tích hàm lƣợng ion trong lá dƣới điều kiện mặn cho thấy PI 675847 A có thể giới hạn sự hấp thu và vận chuyển Na+ và Cl-.

2.5.3 Cơ chế chống chịu mặn của cây đậu nành

15

Theo Phang et al. (2008), cơ chế chống chịu mặn của đậu nành có thể đƣợc chia thành 4 nhóm chính, bao gồm: (i) duy trì sự cân bằng ion nội môi (ion homeostasis); (ii) sự điều chỉnh trong đáp ứng với stress thẩm thấu; (iii) sự phục hồi cân bằng oxy hóa; và (iv) sự thích nghi về mặt cấu trúc và trao đổi chất khác. Khả năng chống chịu mặn khác nhau thể hiện ở các giống khác nhau đƣợc quyết định bởi hiệu quả của chúng trong sự hoạt động và phối hợp giữa các hệ thống này.

Duy trì sự cân bằng ion nội môi và vai trò của các transporter vận

chuyển ion

Theo Gao et al. (2007), các loại muối ƣu thế ở các vùng ven biển và nội địa là NaCl và Na2CO3/NaHCO3. Hầu hết các nghiên cứu trên A. thaliana và lúa cho thấy Na+ là ion gây chết chủ yếu và sự tích lũy Na+ quá ngƣỡng là nguyên nhân cơ bản của sự chết do mặn. Tuy nhiên, ở đậu nành, các thí nghiệm cơ bản đƣợc thực hiện bởi Abel và cộng sự cho thấy sự tổn hại do mặn liên quan đến hàm lƣợng Cl- trong các bộ phận tiếp xúc với không khí (Abel and MacKenzie, 1964; Abel, 1969). Na+ hay Cl- đóng vai trò quan trọng hơn gây ra sự chết do mặn với muối NaCl ở đậu nành vẫn còn chƣa sáng tỏ (Phang et al., 2008).

Một vài kết quả nghiên cứu đã ủng hộ ý kiến cho rằng sự chia ngăn trong và ngoài tế bào có liên quan đến sự điều hòa của nội cân bằng ion Na+ ở cây đậu nành. Khi xử lý NaCl, các tế bào nhu mô có thể biệt hóa thành các tế bào vận chuyển với vách phát triển tốt phồng lên liền kề với các lỗ của mạch mô gỗ bị bao lại ở vùng đầu của rễ và thân. Vách mọc vào trong đƣợc quan sát ở các tế bào nhu mô mô gỗ của đậu nành trong điều kiện stress mặn (Lauchli and Wieneke, 1978). Hơn thế, nhu mô mô gỗ ở ranh giới mô gỗ/symplast của rễ đậu nành có thể bơm tích cực ion Na+ từ dòng thoát hơi nƣớc trong sự trao đổi với ion K+. Sự trao đổi Na+-K+ đƣợc điều hòa bởi các antiporters Na+/H+ và K+/H+. Quá trình này đƣợc cung cấp năng lƣợng bởi H+-ATPase, đƣợc tăng cƣờng bởi nồng độ K+ ở bên ngoài và phụ thuộc vào tính thấm của anion (Durand and Lacan, 1994; Lacan and Durand, 1995).

16

Một số gen mã hóa các transporter vận chuyển ion của đậu nành đã đƣợc xác định và cho thấy có liên quan đến sự chống chịu mặn (Bảng 2.1), bao gồm cả các transporter vận chuyển ion nằm trên màng sinh chất và không bào (Phang et al., 2008).

Tài liệu tham khảo Tsai, 2003

Li et al., 2006; Sun et al., 2006 Phang, 2008 Phang, 2008

GmSOS1 GmCNGC

Phang, 2008 Phang, 2008

GmGLR3 GmNKCC

Sản phẩm gen giả định Kênh K+ Kênh Cl+ trong không bào Li et al., 2006 Antiporter Na+/K+ trong không bào Antiporter Na+/K+ Kênh cation có cổng nucleotide Receptor glutamate Đồng vận chuyển Na+/K+/Cl- Trao đổi cation/proton

Luo et al., 2005b

GmCAX1

Bảng 2.1 Gen mã hóa transporter vận chuyển ion liên quan đến sự chống chịu mặn ở đậu nành Gen GmAKT1 GmCLC1 GmNHX1

Sự điều chỉnh thẩm thấu bởi các chất bảo vệ thẩm thấu

Nồng độ muối cao dẫn đến thế năng nƣớc trong môi trƣờng thấp, kết quả là gây ra stress thẩm thấu cho cây. Cơ thể cây đậu nành sẽ có các đáp ứng thẩm thấu để đƣơng đầu với hạn sinh lý. Ở điều kiện stress mặn trong thủy canh, cây đậu nành ngay lập tức trải qua sự stress thẩm thấu, quan sát bởi hiện tƣợng lá héo rũ trong 1 giờ và độ dẫn của khí khẩu giảm thấp hơn 50% vạch ranh giới trong 10 phút sau khi xử lý với NaCl. Lá lấy lại sức trƣơng sau nhiều giờ xử lý cho thấy cơ thể thực vật phải trải qua sự điều chỉnh thẩm thấu để bảo tồn dòng thoát hơi nƣớc của chúng.

Sự tích lũy các chất bảo vệ thẩm thấu

17

Trong sự đáp ứng đối với stress thẩm thấu gây ra do mặn hoặc hạn, cây trồng có thể tích lũy các chất biến dƣỡng hoạt động nhƣ là các chất tan tƣơng hợp để làm thấp thế năng thẩm thấu của tế bào mà không ảnh hƣởng đến các phản ứng trao đổi chất bình thƣờng (Hasegawa et al., 2000). Các chất tan tƣơng hợp này thƣờng là các hợp chất ƣa nƣớc với trọng lƣợng phân tử thấp và không mang điện ở pH sinh lý. Về mặt hóa học, các chất này đƣợc chia làm 4 nhóm: Hợp chất onium (glycine betaine, dimethyl sulfonio propionate), polyols đƣờng (mannitol, D-ononitol, trehalose, pinitol), amino acids (proline), và alkaloids (trigonelline). Các chất tan tƣơng hợp này có thể có các chức năng bảo vệ khác ngoài chức năng điều chỉnh thẩm thấu. Ví dụ, glycine betaine có thể làm ổn định protein và màng (Papageorgiou and Murata, 1995), trong khi mannitol có thể tham gia chống lại các gốc oxy hóa tự do ROS (reactive oxygen species) (Shen et al., 1997a,b). Vì vậy các chất tan này còn đƣợc gọi là các chất bảo vệ thẩm thấu. Một số chất bảo vệ thẩm thấu chính tham gia vào sự chống chịu mặn ở đậu nành nhƣ glycine betaine, trigonelline, pinitol, và proline.

Sự phục hồi cân bằng oxy hóa

Ty thể và lục lạp là nơi sản xuất chính ROS do hoạt động vận chuyển electron của chúng (Bartoli et al., 2004). Ở tình trạng cân bằng sinh lý, ROS đƣợc loại bỏ bởi các chất chống oxy hóa khác nhau. Mặn và stress thẩm thấu có thể làm xáo trộn sự cân bằng giữa sự tạo ra và loại bỏ ROS bằng cách làm suy yếu quá trình loại bỏ. Mức độ cao không mong muốn của ROS có thể gây ra nhiều ảnh hƣởng bất lợi đến tế bào, bao gồm sự ngăn chặn các enzyme nhạy cảm, giảm diệp lục tố, peroxid hóa lipid, tấn công các đại phân tử bao gồm acid nhân và thậm chí có thể làm chết tế bào (Fath et al., 2001).

Một cơ chế có thể của sự chống chịu mặn ở đậu nành là nâng cao hàm lƣợng và hoạt động của các chất chống oxy hóa khác nhau để phục hồi lại sự cân bằng oxy hóa và làm giảm tối thiểu sự tổn hại tế bào do stress oxy hóa thứ cấp.

Tổn hại oxy hóa (sự tích lũy O2 và MDA), hoạt động của các scavenger ROS thuộc enzyme (SOD, CAT, peroxidase (POD), APX), và hàm lƣợng của các scavenger ROS không thuộc enzyme (ascorbic acid, carotenoid và glutathione) đƣợc đo trong lá và rễ của cây đậu nành bị stress mặn.

Ở tử diệp đậu nành, 80%, 11%, và 9% hoạt động SOD tổng số đƣợc tìm thấy trong tế bào chất, ty thể và lục lạp (Chen et al., 1997). Stress mặn đầu tiên ức chế hoạt động của SOD trong lục lạp, kế tiếp trong ty thể và tiếp theo trong tế bào chất. Hoạt động và thành phần của các isozymes SOD cũng bị thay đổi khi stress mặn (Chen et al., 1997), cho thấy vai trò quan trọng của các isozymes SOD trong sự chống chịu mặn của đậu nành.

Sự thích nghi về mặt cấu trúc

Sự thích nghi về mặt cấu trúc, bao gồm sự phát triển của các cấu trúc giống tuyến muối và sự sửa đổi cấu trúc vách và màng tế bào có thể đóng vai trò quan trọng trong sự chống chịu mặn ở đậu nành.

Mặc dù đậu nành là loài không chịu mặn nhƣng cấu trúc giống tuyến muối đƣợc tìm thấy ở lá và thân của đậu nành hoang (Glycine soja) đƣợc thu thập ở Trung Quốc (Lu et al., 1998).

18

Protein vách tế bào giàu proline là một trong các thành phần của vách tế bào và rất nhạy cảm với các kích thích bên ngoài. Ở đậu nành, SbPRP3 mã hóa cho protein vách tế bào giàu proline, đƣợc cảm ứng bởi salicylic acid, sự xâm nhiễm virus, stress mặn và hạn (He et al., 2002). Chức năng của SbPRP3 ở đậu nành vẫn chƣa rõ nhƣng có thể hiểu đƣợc là đậu nành có thể đáp ứng

với stress mặn bằng cách tăng sản xuất SbPRP3 để thay đổi cấu trúc vách tế bào.

Hàm lƣợng acid béo bão hòa đƣợc nâng lên trong màng sinh chất có thể cải thiện sự thích nghi của màng sinh chất và tăng cƣờng sự chống chịu mặn của đậu nành (Surjus and Durand, 1996).

Luo et al. (2005) báo cáo rằng cơ chế chống chịu mặn của đậu nành hoang khác với đậu nành đƣợc canh tác. Sự chống chịu mặn ở G. max chủ yếu do sự ngăn cản sự vận chuyển ion Cl- từ rễ lên các bộ phận phía trên của cây giúp ngăn cản sự tích lũy đến mức gây độc trong thân và lá. Ngƣợc lại, lá của các dòng đậu nành G. soja chịu mặn hoặc đậu nành hoang thì không dễ bị tổn thƣơng do ngộ độc Cl- nhƣ G. max nhƣng dễ bị tổn thƣơng hơn đối với sự tích lũy Na+. Sự chống chịu mặn ở G. soja chủ yếu là từ sự loại bỏ ion Na+ giúp ngăn cản sự tích lũy đến nồng độ độc ở thân và lá.

2.6 Sơ lƣợc về nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Các giai đoạn trong nuôi cấy:

Giai đoạn 0: Chuẩn bị cây mẹ

Đây là giai đoạn cải thiện điều kiện sinh lý và vệ sinh của cây mẹ nhằm

làm giảm bớt tỉ lệ mẫu bị nhiễm nấm (Debergh and Maene, 1981).

Khi lựa chọn cây mẹ phải xác định đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trƣởng. Cây mẹ sạch bệnh và đang ở giai đoạn tăng trƣởng mạnh nhất thì khi nhân giống sẽ đạt hiệu quả cao (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).

Giai đoạn 1: Bắt đầu tiệt trùng

Mẫu đƣợc đƣa từ bên ngoài vào nhƣng phải đảm bảo các yêu cầu sau: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, tốc độ tăng trƣởng nhanh (Lê Trần Bình và ctv., 1997).

Giai đoạn 2: Nhân nhanh số lượng

19

Giai đoạn này là tạo đƣợc số lƣợng cây con nhiều thông qua quá trình kích thích các trung tâm mô phân sinh (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Có 3 phƣơng pháp nhân chồi là phát sinh chồi bất định từ mô sẹo nhận đƣợc từ mô phân sinh nuôi cấy, phát sinh chồi bất định trực tiếp từ mô thực vật không thông qua mô sẹo và phƣơng pháp nhân chồi bên. Trong đó phƣơng pháp tạo chồi bất định nhƣ một phƣơng pháp nhân giống vô tính nhằm làm tăng số lƣợng cây con. Chồi bất định và những mô có liên quan là những cấu trúc có

nguồn gốc từ những vùng không phải là trục lá hoặc chồi ngọn. Chồi bất định, rễ, vi củ và các cấu trúc đặc biệt khác có thể có nguồn gốc từ thân, lá, củ, rễ. Chồi hoặc rễ bất định có thể có nguồn gốc từ mô sẹo và mô sẹo đƣợc coi nhƣ là thể trung gian giữa mẫu cấy và cây con. Số lƣợng cụm chồi/mô sẹo đƣợc tăng qua những lần phân cắt khi cấy chuyền. Cây con có thể chuyển sang giai đoạn 3 để tạo rễ (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Chồi, rễ và phôi vô tính cũng có thể phát sinh trực tiếp từ mẫu cấy mà không qua giai đoạn trung gian tạo mô sẹo (George, 1996).

Giai đoạn 3: Kéo dài, tạo rễ và tiền thuần dưỡng

Trong nhiều trƣờng hợp sự kéo dài là yêu cầu cho một sự tạo rễ đầy đủ. Chồi và cây con đƣợc tạo ra ở giai đoạn 2 thƣờng rất nhỏ chƣa có đủ khả năng để phát triển ngoài môi trƣờng tự nhiên. Do đó, mục đích của giai đoạn này là tạo cây phát triển đầy đủ rễ, thân, lá có khả năng thực hiện quang hợp và sống sót mà không cần cung cấp nguồn cacbohydrate nhân tạo.

Môi trƣờng kéo dài thƣờng không chứa cytokinin hoặc một cytokinin yếu hơn cytokinin đã đƣợc sử dụng trong giai đoạn 2. Có thể cần thiết thêm than hoạt tính để trung hòa hiệu quả cytokinin còn lại trong giai đoạn 2. Tùy thuộc vào kiểu cây, sự kéo dài có thể xảy ra trên các chồi đơn hay cụm. Auxin là chất thƣờng đƣợc sử dụng để tạo rễ, bên cạnh đó than hoạt tính cũng đƣợc sử dụng rất phổ biến trong môi trƣờng tạo rễ (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Than hoạt tính tạo thuận lợi cho sự phát triển của rễ nhờ khả năng hấp thụ các chất thải có tính ức chế của bản thân cây hoặc mô nuôi cấy, đồng thời giảm cƣờng độ ánh sáng vùng rễ phát triển (Druart and Wulf, 1993). Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), than hoạt tính có thể chứa các thành phần kích thích nhƣ polyamine.

Giai đoạn 4: Thuần dưỡng

Là giai đoạn chuyển cây ra nhà ƣơm, chuẩn bị cây con sẵn sàng cung cấp cho sản xuất. Chất lƣợng cuối cùng của kế hoạch in vitro tùy thuộc một phần vào việc thuần dƣỡng. Thông thƣờng, các rễ non đƣợc tạo ra trong ống nghiệm có một biểu bì yếu ớt, nên khi đặt tiếp xúc với chất nền trong nhà ƣơm, chúng trở nên khô héo nhanh chóng và chết. Đây là giai đoạn tinh tế nhất, các rễ đƣợc sinh ra trong bình thì cực yếu và khi tiếp xúc với chất nền, chúng chết đi. Phải chờ sự thành lập và sinh trƣởng của rễ mới để cây tự dƣỡng (Lâm Ngọc Phƣơng, 2006).

20

Cây con chuyển từ giai đoạn 3 đƣợc rửa sạch agar, sau đó trồng trên giá thể thích hợp, đƣợc giữ ẩm độ cao, tránh cƣờng độ ánh sáng cao. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi khoảng 2-3 tuần, trong thời gian này cần hạn chế tối đa

những yếu tố bất lợi nhƣ mất nƣớc nhanh chóng làm cho cây khô héo, nhiễm vi khuẩn và nấm làm cho cây thối nhũn, cháy lá do nắng (George, 1993).

2.7 Phƣơng pháp chọn lọc biến dị tế bào soma các dòng cây trồng

chống chịu mặn

2.7.1 Khái niệm biến dị soma

Ban đầu nuôi cấy mô đƣợc sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối và phƣơng pháp nhân giống lý tƣởng để sản xuất hàng loạt cây đồng nhất và nhƣ bố mẹ ban đầu của các giống ƣu tú. Tuy nhiên, với các công trình nghiên cứu trên nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế, ngƣời ta thấy rằng tế bào và mô đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng nhân tạo thƣờng xuất hiện các biến đổi di truyền bao gồm số lƣợng và cấu trúc nhiễm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, đột biến gen... Các biến dị này đƣợc truyền lại cho cây khi tái sinh. Nuôi cấy mô gây ra các biến dị trong cây tái sinh, đƣợc gọi là biến dị soma (somaclonal variation) (Larkin and Scowcroft, 1981). Biến dị soma chịu ảnh hƣởng bởi loài cây, kiểu gen trong loài và mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính ổn định của genome. Nhƣ vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng. Quan trọng hơn, theo Skirvin et al. (1993) và Jain (1998), nó có thể tạo ra các biến dị bền vững về mặt di truyền, rất có ích trong cải thiện cây trồng, tƣơng tự nhƣ đƣợc cảm ứng bởi tác nhân gây đột biến vật lý và hóa học. Theo Jain (2001) thì biến dị soma thì không thể dự đoán đƣợc trong tự nhiên, và có thể có cả tính di truyền và không di truyền (biểu sinh).

2.7.2 Cơ sở của biến dị soma

21

Sự xuất hiện biến dị soma liên quan đến các đột biến điểm, sự tái tổ hợp và sắp xếp lại nhiễm sắc thể, sự methyl hóa DNA, số bản sao trình tự bị thay đổi, các nguyên tố chuyển vị, và dƣờng nhƣ bị ảnh hƣởng bởi kiểu gen, loại mẫu cấy, môi trƣờng nuôi cấy và tuổi của cây cho (Jain, 1998). Tùy thuộc loại cây, số lần cấy chuyền là một yếu tố cũng có thể dẫn đến biến dị nhiều hơn. Hệ thống nuôi cấy mô tự bản thân nó hoạt động nhƣ một hệ thống gây đột biến bởi vì các tế bào trải qua sự tổn thƣơng khi phân lập, và có thể tái lập chƣơng trình trong quá trình tái sinh dƣới điều kiện rất khác với điều kiện tự nhiên. Sự tái lập chƣơng trình hay tái lập cấu trúc có thể tạo ra rất nhiều biến dị biểu sinh trong cây tái sinh (Jain, 2000).

Biến dị soma ở mức độ nhiễm sắc thể

Biến dị nhiễm sắc thể đã đƣợc ghi nhận ở một vài loài cây cấy mô và thế hệ con cháu của nó (Ahloowalia, 1976; Duncan, 1997; Gupta, 1998). Mẫu cấy có số nhiễm sắc thể cao và có bội thể (ploidy) cao có nhiều biến dị hơn loài có số nhiễm sắc thể thấp và ploidy thấp (Creissen and Karp, 1985). Các kiểm soát chu kỳ tế bào bình thƣờng (có vai trò ngăn cản sự phân chia tế bào trƣớc khi sự sao chép DNA hoàn thành) bị gián đoạn bởi nuôi cấy, kết quả là tạo ra sự đứt đoạn nhiễm sắc thể (Phillips et al., 1994). Nhiễm sắc thể bị đứt và hậu quả của nó (sự thiếu, nhân đôi, đảo đoạn và chuyển đoạn) gây ra sự sai khác (Duncan, 1997).

Nguyên tố chuyển vị (Transposable elements)

Hoạt động của nguyên tố chuyển vị là một dạng biến dị nữa đƣợc cảm ứng trong nuôi cấy mô. Gen chuyển vị có thể đƣợc hoạt hóa trong nuôi cấy mô dẫn đến biến dị soma đƣợc đề nghị lần đầu tiên bởi Ahloowalia (1985). Các dòng đột biến từ cây tái sinh tự nó không biểu hiện ra là đột biến không bền vững hay đột biến chất lƣợng. Chỉ có một vài trƣờng hợp đột biến không bền vững hay một phần nào đó của đột biến trong thế hệ con cháu đƣợc báo cáo. Groose and Bingham (1986) đã xác định đột biến màu hoa không bền vững, hoạt động giống nhƣ đột biến đƣợc cảm ứng bởi nguyên tố chuyển vị. Tuy nhiên, các ngụ ý về nguyên tố chuyển vị vẫn chƣa đƣợc chứng minh. Kaeppler et al. (1998) đề nghị rằng các nguyên tố chuyển vị có thể chỉ chiếm một tỉ lệ tƣơng đối nhỏ của biến dị trong nuôi cấy mô.

Biến dị phân tử

Những thay đổi kiểu hình ở cây đƣợc tái sinh và thế hệ sau của chúng là những đột biến chất lƣợng, là những đột biến gen đơn đƣợc di truyền theo định luật Mendel và là gen lặn. Một số đột biến gen đơn nhƣ thiếu diệp lục tố, lùn, tính trạng hạt, cấu trúc sinh sản, lá hoại tử ở bắp (Phillips et al., 1994). Biến dị phân tử trong cây cấy mô đƣợc nhận diện ở mức độ DNA và protein. Biến dị ở mức độ DNA đƣợc nghiên cứu nhiều nhất bằng cách sử dụng phƣơng pháp phân tích enzyme giới hạn. Trong hầu hết trƣờng hợp, những thay đổi về kiểu giới hạn xảy ra nhƣ kích thƣớc đoạn bị thay đổi hơn là sự thêm vào hoặc mất đoạn giới hạn (Kaeppler et al., 1998).

Methyl hóa DNA

22

Sự methyl hóa DNA liên quan đến sự biểu hiện bị thay đổi của gen ở rất nhiều loài thực vật và động vật. Vai trò trực tiếp của methyl hóa DNA trong sự biểu hiện gen vẫn còn là chủ đề tranh cãi mặc dù sự methyl hóa cytosine có

liên quan đến sự biểu hiện gen bị sửa đổi ở thực vật và động vật. Sự methyl hóa có thể tăng cƣờng các biến dị tính trạng số lƣợng vì một số gen có thể bị ảnh hƣởng cùng lúc (Phillips et al., 1990). Tăng sự methyl hóa in vitro có tiềm năng làm tăng sự điều hòa và hoạt động của gen. Sự methyl hóa gen làm bất hoạt quá trình phiên mã và kết quả là kiểm soát sự biểu hiện của gen trong quá trình phát sinh phôi soma (Duncan, 1997). Theo Lambe et al. (1997), sự methyl hóa gen liên quan đến sự biệt hóa tế bào và sự loại bỏ khả năng biệt hóa của tế bào là nguyên nhân gây mất khả năng phát sinh cơ quan. Biến dị tạo ra do sự methyl hóa DNA có tính chất biểu sinh "epigenetic".

2.7.3 Phƣơng pháp chọn lọc biến dị tế bào soma tính chống chịu mặn

Nuôi cấy in vitro tế bào thực vật, mô hay cơ quan trên môi trƣờng có chứa tác nhân chọn lọc tạo cơ hội để chọn lọc và tái sinh cây với các đặc tính mong muốn. Kỹ thuật này cũng đƣợc sử dụng có hiệu quả để cảm ứng sự chống chịu bao gồm việc sử dụng một vài tác nhân chọn lọc cho phép sự sống sót và sinh trƣởng một cách ƣu ái của những kiểu hình mong muốn (Purohit et al., 1998). Các tác nhân đƣợc sử dụng trong chọn lọc in vitro là NaCl (cho tính chống chịu mặn), PEG hoặc mannitol (cho tính chống chịu hạn), dịch lọc nuôi cấy nấm đặc hiệu (fungal culture filtrate-FCF) hoặc phytotoxin nhƣ fusaric acid hoặc mầm bệnh (cho tính kháng bệnh). Mẫu cấy đƣợc tiếp xúc với một giới hạn rộng các tác nhân chọn lọc đƣợc thêm vào môi trƣờng nuôi cấy. Chỉ những mẫu cấy có khả năng chịu đựng đƣợc môi trƣờng này sống sót trong một thời gian dài đƣợc chọn lọc.

23

Hai kiểu phƣơng pháp chọn lọc đƣợc đề nghị là chọn lọc dần dần (gradual selection), hay còn gọi là chọn lọc lâu dài (long-term selection) hay xử lý lâu dài theo dạng bậc thang (stepwise long-term), nghĩa là mẫu cấy đƣợc tiếp xúc với stress với nồng độ tác nhân chọn lọc tăng dần và thứ hai là chọn lọc tái diễn (recurrent selection), hay còn gọi là chọn lọc một bƣớc (single step) hay xử lý sốc, trong đó mẫu cấy đƣợc tiếp xúc trực tiếp với sốc ở nồng độ cao và chỉ những mẫu chịu đựng đƣợc mức độ này mới sống sót (Purohit et al., 1998). Các phƣơng pháp này dựa trên sự tạo các biến dị di truyền giữa các tế bào, mô và/hoặc cơ quan trong nuôi cấy và tái sinh cây (Mohamed et al., 2000). Chọn lọc in vitro có thể rút ngắn một cách đáng kể thời gian chọn lọc các tính trạng mong muốn dƣới áp lực chọn lọc với các tƣơng tác môi trƣờng thấp nhất và có thể chọn lọc ngoài đồng để bổ sung (Jain, 2001). Theo Dix (1990) thì phƣơng pháp chọn lọc lâu dài ở nồng độ muối cao dƣờng nhƣ là chiến lƣợc tốt nhất. Tuy nhiên, nồng độ muối cao hơn làm thấp sự sinh trƣởng của mô sẹo và vì vậy làm hạn chế mật số tế bào mà các đột biến có thể xảy ra. Chọn lọc lâu dài làm tăng các sai khác nhiễm sắc thể tích lũy trong các tế bào

đƣợc nuôi cấy và cuối cùng là làm giảm tỉ lệ tái sinh cây dƣới mức độ có thể chấp nhận đƣợc. Ở cây thuốc lá, Nabor et al. (1980) đã sử dụng phƣơng pháp chọn lọc tái diễn với các nồng độ muối NaCl tăng cho thấy dƣờng nhƣ cây tái sinh có nhiều hơn một dạng chống chịu mặn.

Vật liệu dùng trong kỹ thuật chọn lọc in vitro bao gồm mô sẹo, nuôi cấy treo, phôi vô tính, nuôi cấy chồi... Trong đó, mô sẹo (callus) hoặc mô sẹo phát sinh phôi (embryogenic callus) là vật liệu thƣờng đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu.

2.7.4 Một số ƣu và khuyết điểm của phƣơng pháp chọn lọc biến dị tế

bào soma

2.7.4.1 Ƣu điểm

Theo Jain (2001), phƣơng pháp chọn lọc biến dị soma có các ƣu điểm

nhƣ:

- Các biến đổi có thể xảy ra ở các tính trạng nông học quan trọng.

- Xảy ra với tần suất cao.

- Một vài thay đổi có thể mới và có thể không có đƣợc bằng phƣơng pháp

chọn giống truyền thống.

- Chọn lọc in vitro có thể giúp phân lập các dòng chống chịu với stress

sinh học và phi sinh học.

- Rút ngắn thời gian phân lập dòng soma với tính trạng mong muốn.

- Một quần thể lớn tế bào đƣợc sử dụng cho chọn lọc.

2.7.4.2 Khuyết điểm

Mặc dù có nhiều thuận lợi, sự phát triển của cây chống chịu stress thông

qua chọn lọc in vitro có một vài hạn chế nhƣ:

- Mất khả năng tái sinh trong suốt quá trình chọn lọc.

24

- Thiếu sự tƣơng quan giữa các cơ chế chống chịu hoạt động trong tế bào, mô hay cơ quan và của cả cây với hiện tƣợng thích nghi biểu sinh. Trong suốt chọn lọc in vitro, các tế bào không chống chịu đôi khi có thể trải qua sự thích nghi biểu sinh nghĩa là các thay đổi biểu sinh bền vững (stable epigenetic alterations) đƣợc thừa hƣởng chỉ thông qua sự phân bào (mitosis) mà không phải thông qua sự phân bào giảm nhiễm (meiosis) đối với tác nhân chọn lọc đặc hiệu, vì vậy che khuất sự chọn lọc các đột biến hiếm có khả năng chống chịu thật sự (meiotically inherited) (Tal, 1994). Hàng loạt các nghiên cứu cho thấy sự methyl hóa DNA đƣợc sửa đổi là nguyên nhân chính gây ra các sửa

đổi biểu sinh thỉnh thoảng xuất hiện trong điều kiện nuôi cấy mô (Guo et al., 2007; Li et al., 2007; Gao et al., 2010). Nhiều tác giả đề nghị rằng vấn đề thích nghi biểu sinh trong chọn lọc in vitro có thể đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng chọn lọc ngắn hạn hoặc chọn lọc từng bƣớc một có thể giúp ngăn chặn sự phát triển của các tế bào thích nghi biểu sinh (Chandler and Vasil, 1984; Tal, 1994).

Bên cạnh hạn chế về vấn đề các dòng soma đƣợc chọn lọc in vitro có thể không bền vững về mặt di truyền, Jain (2001) còn cho rằng phƣơng pháp này cũng có một số bất lợi nhỏ nhƣ:

- Có thể không xảy ra đối với các tính trạng nông học phức tạp.

- Nhiều đặc điểm thay đổi theo hƣớng ngƣợc lại hoặc hƣớng tiêu cực.

- Các biến dị không thể dự đoán đƣợc trong tự nhiên.

2.7.5 Đặc điểm của cây chịu mặn trong chọn lọc in vitro

Các mô sẹo chống chịu mặn thƣờng đƣợc đƣa vào con đƣờng sinh phôi nhằm tạo cây con có tính chống chịu qua đó đánh giá kết quả của việc chọn lọc. Một số đặc điểm của cây chịu mặn đƣợc chọn lọc in vitro đã đƣợc một số tác giả phân tích và áp dụng. Về mặt sinh lý, nhiều quá trình bị ảnh hƣởng bởi mặn nhƣng sinh trƣởng tế bào bị giảm, diện tích lá, sinh khối và sản lƣợng là quan trọng nhất. Giảm sinh trƣởng là hiện tƣợng phổ biến của cây bị stress mặn, đƣợc quan sát trong cơ quan, mô, hay tế bào đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung muối NaCl. Thật vậy, sinh trƣởng chậm hơn là đặc điểm thích nghi để sống sót của cây dƣới điều kiện stress và khả năng chịu mặn thƣờng tƣơng quan nghịch đến tốc độ tăng trƣởng (Queiros et al., 2007). Tốc độ quang hợp luôn chậm hơn ở cây bị ngộ độc mặn (Parida and Das, 2005). Khả năng quang hợp của lá phụ thuộc vào đặc điểm sinh lý nhƣ hàm lƣợng diệp lục tố, hoạt động của Rubisco và hiệu quả của hệ thống quang. Sự giảm hàm lƣợng diệp lục tố của cây đi cùng với hiệu quả thấp hơn của PS II và sự lão hóa (Ehsanzadeh et al., 2009).

Theo Arzani (2008), tổn thƣơng lá là một thông số nữa để thanh lọc khả năng chịu mặn và có thể đo bằng sự tổn hại màng, mất diệp lục tố sớm hoặc tổn hại bộ máy quang hợp. Tuy nhiên, các phƣơng pháp này chỉ có thể phân biệt giữa các kiểu gen chống chịu mặn thấp hoặc trung bình.

25

Một số cơ chế chống chịu mặn phổ biến tồn tại trong cây nhƣ hệ thống bảo vệ chống oxy hóa, ion homeostasis (nội cân bằng ion), sự thích nghi thẩm thấu, sự truyền tín hiệu và sự điều hòa biểu hiện gen (Lu et al., 2007). Hệ thống bảo vệ chống oxy hóa tƣơng quan dƣơng với sự chống chịu mặn của

cây, vì vậy trong một số nghiên cứu, cây con chống chịu mặn đƣợc chọn lọc in vitro đƣợc nhận diện bằng cách đo các enzyme oxy hóa chủ yếu là SOD, APX, CAT và GR (Piqueras et al., 1996; Hossain et al., 2007; Lu et al., 2007; He et al., 2009).

Lipid đóng vai trò quan trọng trong thành phần cấu trúc của hầu hết màng tế bào (Parida and Das, 2005). Sự peroxide hóa màng lipid bởi gốc tự do là tín hiệu tổn hại do stress ở mức độ tế bào. Vì vậy mức độ malondialdehyde (MDA), đƣợc sản sinh trong lúc peroxide hóa các lipid màng, thƣờng đƣợc sử dụng để chỉ thị cho sự tổn hại oxy hóa (Demiral and Turkan, 2005). Các dòng mô sẹo đƣợc chọn lọc chống chịu mặn muối NaCl của cây Solanum tuberosum cho thấy sự tăng peroxide hóa lipid (Queiros et al., 2007).

Hầu hết những nghiên cứu đƣợc thực hiện liên quan đến chọn lọc in vitro là dựa trên sự nội cân bằng ion và các chất tan tƣơng hợp chủ yếu là proline (He et al., 2009). Khi mặn do NaCl vƣợt quá ngƣỡng, dạng muối phổ biến nhất của stress mặn, nồng độ Na+ trong cây tăng và nồng độ K+ giảm (Kumar et al., 2008). Để khắc phục stress mặn, cây tạo ra các cơ chế bảo vệ giúp nó thích nghi. Các cơ chế này bao gồm sự điều chỉnh thẩm thấu, đi cùng với sự tích lũy các chất tan tƣơng hợp nhƣ proline, glycine betaine và polyols (Ghoulam et al., 2001).

2.8 Một số kết quả nghiên cứu về chọn lọc biến dị tế bào soma các

dòng cây trồng chống chịu mặn trên thế giới và trong nƣớc

Trên thế giới, kỹ thuật chọn lọc in vitro đã đƣợc áp dụng trên nhiều giống cây trồng để tạo tính chống chịu với các tác nhân stress. Cây trồng chống chịu mặn có thể đƣợc tạo bằng cách sử dụng tác nhân chọn lọc là NaCl trong môi trƣờng nuôi cấy. Đến nay đã có rất nhiều giống cây trồng đã đƣợc nghiên cứu tính chống chịu mặn bằng kỹ thuật này nhƣ lúa, lúa mì, mía, khoai tây, cà chua, dâu tây, cây họ cam quýt, cây họ cải, khoai lang, hƣớng dƣơng… (Rai et al., 2011).

26

Theo nghiên cứu của Zinnah et al. (2013), mô sẹo của hai giống lúa BRRI dhan 38 và Chini Kanai tái sinh cây trên môi trƣờng MS bổ sung kinetin 2 mg/L kết hợp NAA 1 mg/L và BA 2 mg/L với tỉ lệ cao nhất khoảng 80% và 60% lần lƣợt cho hai giống. Khả năng tái sinh của giống BRRI dhan 38 là 80% ở nồng độ NaCl 0 g L, nhƣng giảm còn 20% ở nồng độ NaCl 5,8 g/L và 0% ở nồng độ NaCl 8,8 g/L. Giống Chini Kanai ở đối chứng tái sinh với tỉ lệ 60% nhƣng ở 5,8 g/L giảm còn 20% và không tái sinh ở nồng độ 11,7 g/L.

Ở mía, Gandonou et al. (2006) đã tạo đƣợc dòng mô sẹo có khả năng chịu mặn (NaCl 4,0 g/L) từ giống mía CP65-357 nhạy cảm với mặn bằng quá trình chọn lọc in vitro.

Ở hành (Allium cepa L.) cv. Giza 6, kết quả của Bekheet et al. (2006) cho thấy số lƣợng mầm chồi, trọng lƣợng tƣơi của nó và chỉ số tăng trƣởng giảm khi tăng nồng độ muối trong môi trƣờng. Tỉ lệ chống chịu mặn cao nhất ở nồng độ muối 2 g/L. Phân tích enzyme cho thấy có band mới ở những dòng chống chịu mặn. Các chồi chịu mặn đƣợc tạo rễ và thích nghi với điều kiện sống bên ngoài.

Ở cây đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek), mô sẹo chịu mặn và không chịu mặn đƣợc tái sinh trên môi trƣờng MS bổ sung 2 mg/L BAP + 0,5 mg/L NAA. Chồi đƣợc tạo rễ trên môi trƣờng MS + 1 mg L IBA. Cây con đƣợc thuần dƣỡng với giá thể đất và cát (tỉ lệ 3:1) (Rao and Patil, 2012).

Trên táo, Bahmani et al. (2012) đã tiến hành chọn lọc mặn đối với mẫu chồi đỉnh (1-1,5 cm) giống táo MM.106 trên môi trƣờng MS bổ sung các nồng độ NaCl (0; 1,2; 2,3; 4,7; 5,8 và 7,0 g/L). Kết quả cho thấy sinh trƣởng của mẫu cấy bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi xử lý mặn. Nồng độ NaCl 2,3; 4,7; 5,8 và 7,0 g/L làm giảm sinh trƣởng của chồi (số chồi, chiều cao chồi và trọng lƣợng tƣơi của chồi) và rễ (tỉ lệ tạo rễ, số rễ và chiều dài rễ). Ở nồng độ NaCl 1,2 g/L, chiều cao, trọng lƣợng tƣơi của chồi và chiều dài rễ tăng nhẹ so với đối chứng. Ở NaCl 7,0 g/L, chiều cao chồi bị ảnh hƣởng nghiêm trọng và giảm 1/2 so với ở NaCl 1,2 g/L, trong khi số chồi chỉ giảm nhẹ.

Trên cây đậu nành, Liu and Staden (2000) đã thu đƣợc 1 dòng tế bào chống chịu mặn bằng cách cấy chuyền liên tục trên môi trƣờng bổ sung NaCl 5,8 g/L. Những đặc điểm thay đổi về sinh trƣởng, giảm thể tích tế bào và sự tích lũy Na+ và Cl-, proline và đƣờng bền vững khi cấy chuyền trên môi trƣờng không có muối NaCl.

27

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về chọn lọc biến dị soma để tạo các dòng cây trồng chống chịu mặn vẫn còn ít. Dang Minh Tam và Nguyen Thi Lang (2003) ở Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long cũng đã có nghiên cứu về chọn lọc in vitro tính chống chịu mặn trên cây lúa. Mô sẹo phát sinh phôi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung muối NaCl và sau đó tái sinh thành cây trên môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/L BAP và 0,5 mg/L NAA. Trên cây có múi, nghiên cứu chọn lọc các dòng mô sẹo chống chịu mặn đã đƣợc thực hiện tại Khoa Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Cần Thơ. Sự tái sinh cây con từ mô sẹo chịu mặn đạt đƣợc thông qua phôi soma ở môi trƣờng MS bổ sung đƣờng galactose

20 g/L (Phạm Thị Bích Thủy và Nguyễn Bảo Toàn, 2008). Chƣa tìm thấy tài liệu nghiên cứu về chọn lọc tính chống chịu mặn trên cây đậu nành.

2.9 Phƣơng pháp gây đột biến cây trồng in vitro

2.9.1 Khái niệm đột biến

Đột biến là tiến trình mà trong đó chuỗi trình tự của những cặp base của phân tử DNA bị thay đổi. Sự thay đổi nhƣ vậy khá đơn giản thí dụ nhƣ thêm vào một base, hoặc chèn vào, hoặc mất đi, hoặc một sự phối hợp phức tạp hơn nhƣ tái sắp xếp lại, lặp đoạn, hoặc mất đoạn của cả một phần lớn trong nhiễm sắc thể. Hiện tƣợng đột biến có thể xảy ra tự phát do ảnh hƣởng của phóng xạ trong tự nhiên, hoặc do sai sót trong tự tái bản, hoặc do chúng ta cố ý gây đột biến bằng lý học và hóa học.

Có 2 loại đột biến:

- Đột biến ở mức độ nhiễm sắc thể là biến dị từ những điều kiện bình thƣờng làm thay đổi số lƣợng nhiễm sắc thể, hoặc cấu trúc của nhiễm sắc thể, những thay đổi nhƣ vậy gây ảnh hƣởng đến giới tính, hoặc nhiều tính trạng khác.

- Đột biến ở mức độ phân tử là đột biến trong chuỗi trình tự của gen ở mức độ từng cặp base. Do đó, nó còn đƣợc gọi là đột biến gen hay đột biến điểm vì nó chỉ thay đổi ở một, hoặc vài cặp base (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).

2.9.2 Sự phát sinh đột biến

Sự phát sinh đột biến có thể xảy ra một cách tự phát hoặc xảy ra do

chúng ta kích thích bằng phƣơng pháp vật lý hay hóa học.

* Đột biến tự phát sinh

Tất cả loại hình đột biến điểm đều có thể xảy ra bằng cách tự phát. Tỉ lệ đột biến tự phát tùy thuộc vào kiến trúc di truyền của cơ thể sinh vật. Đột biến điểm thƣởng xảy ra trong quá trình tự tái bản DNA, thông qua các sự kiện nhƣ đột biến thay thế cặp base, đột biến thêm hoặc mất cặp base (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).

* Đột biến do kích thích

28

Có hai loại tác nhân đƣợc sử dụng để tạo các thể đột biến thực nghiệm là tác nhân vật lý (chiếu xạ ion hóa) nhƣ tia X, tia gamma, chùm neutron, tia laser... và hóa học nhƣ các hợp chất alkyl hóa, các hợp chất nitroso... (Hoàng Trọng Phán và Trƣơng Thị Bích Phƣợng, 2008).

2.9.3 Ƣu điểm của phƣơng pháp tạo đột biến thông qua nuôi cấy mô

Theo Chahal and Gosal (2002), tạo đột biến thông qua nuôi cấy mô có

những ƣu điểm sau:

- Nhiều yếu tố có tính chất ngoại cảnh có thể đƣợc kiểm soát tốt hơn.

- Có ít cơ hội cho sự hình thành thể khảm nếu cây tái sinh có nguồn gốc

từ một tế bào.

- Tần suất đột biến thƣờng khá cao bởi vì mỗi tế bào đều đƣợc tiếp xúc

trực tiếp với tác nhân gây đột biến.

- Chọn lọc in vitro đối với stress sinh học và phi sinh học có thể đạt hiệu

quả tốt khi cho xử lý ở mức độ tế bào trong môi trƣờng nuôi cấy.

- Hàng triệu tế bào (cây tiềm năng) có thể đƣợc thanh lọc chỉ trong một

đĩa petri.

Bên cạnh đó, Dƣơng Tấn Nhựt (2009) cũng nhận định rằng phƣơng pháp gây đột biến kết hợp với nuôi cấy in vitro còn có ƣu điểm nữa là khả năng tạo đột biến ở giai đoạn sớm của quá trình hình thành và phát triển cá thể (phôi non hoặc mô sẹo), nhờ vậy tần số đột biến cao và khả năng thu nhận những thể đột biến đồng nhất về kiểu gen trở nên dễ dàng hơn. Nuôi cấy in vitro không những là công cụ hữu hiệu để lƣu giữ, duy trì và nhân những thể đột biến lạ, quý hiếm, mà còn là phƣơng pháp phân lập và làm thuần dƣỡng những dòng đột biến nào đó. Trong nhiều trƣờng hợp, nuôi cấy in vitro là cách hiệu quả duy nhất để duy trì và bảo quản những biến dị di truyền, đặc biệt là những đột biến thể khảm, nhờ đó khắc phục đƣợc sự đào thải của những tế bào quý hiếm do tính cạnh tranh trong mô.

Theo Pathirana (2011), nuôi cấy in vitro có thuận lợi là có thể tạo ra số lƣợng lớn đột biến trong không gian đƣợc giới hạn và có thể chọn lọc các tính trạng có ích nhƣ tính chống chịu mặn, các nguyên tố gây độc hoặc các chất độc của nấm bệnh (Pathirana et al., 2008) trong môi trƣờng phòng thí nghiệm. Điều này cho phép chuyển chỉ các đột biến quan trọng cho việc chọn lọc ở điều kiện ngoài đồng, và trong trƣờng hợp của các cây nhân giống dinh dƣỡng, có thể loại bỏ thể khảm qua các lần cấy chuyền.

2.9.4 Phƣơng pháp tạo đột biến in vitro bằng xử lý tia gamma

2.9.4.1 Bức xạ gamma (γ)

29

Khác với bức xạ hạt alpha và beta, bức xạ gamma không phải là bức xạ hạt. Bức xạ gamma là bức xạ điện từ phát ra từ hạt nhân của nguyên tử. Bức xạ gamma có ký hiệu γ thƣờng phát kèm khi các đồng vị phóng xạ phát bức xạ

alpha hay beta, nhƣng cũng có những đồng vị chỉ phát bức xạ gamma. Bức xạ gamma không có khối lƣợng, không có điện tích.

Tia gamma không bị lệch trong điện trƣờng, có bƣớc sóng rất ngắn <0,05 Ao. Do đó có sức xuyên mạnh nhƣng do không mang điện nên khi đi qua cơ thể sinh vật không có tác dụng điện ly trực tiếp mà chỉ có tác dụng điện ly gián tiếp nhờ hiệu ứng quang điện (Luyện Hữu Chỉ et al., 1997).

2.9.4.2 Một số đặc trƣng của chất phóng xạ

Tương tác của bức xạ ion hóa với vật chất

Tác hại của bức xạ lên cơ thể sinh vật sống phụ thuộc vào sự hấp thụ năng lƣợng bức xạ của mô sinh học. Do đó, đơn vị cơ bản của liều lƣợng bức xạ đƣợc biễu diễn qua năng lƣợng hấp thụ trên một đơn vị khối lƣợng của mô.

Liều hấp thụ (Absorbed dose – ký hiệu D): Là tỉ số giữa năng lƣợng trung bình dɛ mà bức xạ truyền cho vật chất trong thể tích nguyên tố và khối lƣợng vật chất dm của thể tích đó (D = dɛ dm). Đơn vị liều hấp thụ là Gray (Gy). 1 Gy bằng năng lƣợng 1 June truyền cho 1 kg vật chất (1 Gy = 1 J/kg). Ngoài ra, liều hấp thụ còn đƣợc đo bằng rad. 1 rad là liều hấp thụ 100 erg (1 J = 107 erg) trên 1 g, hay 1 rad = 100 erg/g hoặc 1 rad = 0,01 Gy.

Suất liều hấp thụ: Là liều hấp thụ trong một đơn vị thời gian. Đơn vị suất

liều hấp thụ là Gy/s hay rad/s hoặc rad h (Dƣơng Tấn Nhựt, 2009).

Các liều bức xạ đƣợc phân thành ba cấp bậc phân biệt là liều cao (>10 kGy), liều trung bình (1 đến 10 kGy) và liều thấp (<1 kGy). Các liều cao đƣợc sử dụng để khử trùng thực phẩm, và liều thấp để cảm ứng các đột biến ở vật liệu hạt giống, trong đó dãy liều từ 60 đến 700 Gy áp dụng đối với cây trồng nhân giống bằng hạt nhƣ lúa gạo, bắp, đậu và hạt cải dầu. Trong trƣờng hợp vật liệu cây trồng đƣợc nuôi cấy in vitro, do chỉ một vài milligram mô cấy và một vài microgram tế bào huyền phù đƣợc chiếu xạ, nên các mức liều càng thấp hơn nữa (IAEA, 1997 trích dẫn của Dƣơng Tấn Nhựt, 2009).

2.9.4.3 Phƣơng pháp thực hiện

30

Phƣơng pháp cảm ứng đột biến và chọn lọc in vitro đã đƣợc nghiên cứu ở rất nhiều loài cây trồng. Mô sẹo đƣợc xử lý với tác nhân gây đột biến và chồi đƣợc tái sinh trên môi trƣờng cảm ứng tạo chồi. Áp lực chọn lọc có thể đƣợc áp dụng ở giai đoạn này. Chồi đƣợc tái sinh sau đó đƣợc cấy chuyền để loại bỏ thể khảm trên môi trƣờng chọn lọc và những chồi sống sót đƣợc tạo rễ và tiếp theo đó sẽ đƣợc test trong nhà lƣới trƣớc khi đánh giá ở ngoài đồng (Pathirana, 2011).

Cụ thể trong phƣơng pháp gây đột biến bằng chiếu xạ tia gamma, vật liệu sẽ đƣợc nuôi cấy trong đĩa petri để đem xử lý. Sau đó mẫu cấy sẽ đƣợc theo dõi khả năng sống và sinh trƣởng. Liều gây chết 50% (LD50) thƣờng đƣợc ghi nhận. Có thể kết hợp nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc có chứa các tác nhân chọn lọc nhƣ là NaCl (cho tính chống chịu mặn), PEG hoặc mannitol (cho tính chống chịu hạn), dịch lọc nuôi cấy nấm đặc hiệu (fungal culture filtrate-FCF) hoặc phytotoxin nhƣ fusaric acid hoặc mầm bệnh (cho tính kháng bệnh) để tạo các dòng/giống mới có khả năng chống chịu (Purohit et al., 1998).

Vật liệu xử lý

Qua các tài liệu đƣợc công bố cho thấy vật liệu thƣờng đƣợc sử dụng là

mô sẹo, mô sẹo phát sinh phôi (embryonic callus) hay đỉnh chồi.

Liều chiếu xạ

Liều chiếu xạ thƣờng từ 5-80 Gy tùy theo vật liệu nghiên cứu. Theo IAEA (1997, trích dẫn của Dƣơng Tấn Nhựt, 2009), vật liệu mô sẹo sẽ cho tính nhạy cảm hơn đối với xử lý bức xạ, và đòi hỏi các liều thấp hơn (2-5 Gy), hơn là các đoạn cắt thân hoặc chiếu xạ các hạt giống; với các liều tƣơng đối cao hơn (15-20 Gy) các mẫu sẽ bị chết hoặc mất đi khả năng tái sinh. Theo Hoàng Trọng Phán và Trƣơng Thị Bích Phƣợng (2008), để thu đƣợc nhiều đột biến có giá trị chọn giống cao mà không gây phƣơng hại đến sức sống, độ hữu thụ hoặc gây chết cây, ngƣời ta đã tìm ra liều lượng tới hạn cho nhiều loài cây khác nhau. Theo đó, ở M1 chỉ còn 30-40% cây sống sót và ra hoa kết quả (LD30-40). Trong nghiên cứu chọn giống phóng xạ, ngƣời ta thƣờng dùng liều LD50. Ngoài ra, ngƣời ta cũng tìm ra liều lượng thích hợp (thƣờng thấp hơn liều tới hạn 1,5-2 lần) cho công tác chọn giống đối với một số cây trồng. Cũng theo Trần Thƣợng Tuấn (1992), tốt nhất là chỉ dùng những liều làm giảm tỉ lệ nảy mầm và ít kìm hãm sinh trƣởng.

Phát hiện đột biến

31

Các dòng đột biến thu đƣợc trƣớc tiên thƣờng đƣợc nhận diện bằng cách quan sát các đặc điểm hình thái. Bên cạnh đó, còn có một số chỉ tiêu khác có thể dùng để nhận diện các dạng đột biến về khả năng chống chịu các tác nhân chọn lọc trong môi trƣờng nuôi cấy. Ví dụ nhƣ trong chọn lọc dòng chống chịu mặn, rất nhiều tác giả dùng chỉ tiêu hàm lƣợng proline, glycine betaine, polyols nhƣ là chỉ thị để nhận diện bởi vì các chất này đƣợc tích lũy để điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào khi nồng độ muối bên ngoài môi trƣờng cao (Ghoulam et al., 2001); hoặc mức độ malondialdehyde (MDA), đƣợc sản sinh trong lúc peroxide hóa các lipid màng, thƣờng đƣợc sử dụng để chỉ thị cho sự tổn hại oxy hóa (Demiral and Turkan, 2005); hệ thống bảo vệ chống

oxy hóa tƣơng quan dƣơng với sự chống chịu mặn của cây, vì vậy trong một số nghiên cứu, cây con chống chịu mặn đƣợc chọn lọc in vitro đƣợc nhận diện bằng cách đo các enzyme oxy hóa chủ yếu là SOD, APX, CAT và GR (Piqueras et al., 1996; He et al., 2009)...

Chính xác hơn, để đánh giá sự sai khác về mặt di truyền, ngƣời ta thƣờng sử dụng các marker phân tử để phân tích. Bên cạnh đó, có thể phát hiện đột biến bằng cách đọc trình tự sản phẩm PCR (DNA sequencing) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).

2.9.5 Kết quả nghiên cứu về tạo đột biến in vitro bằng xử lý tia

gamma trên thế giới và trong nƣớc

Đến nay, trên thế giới cũng nhƣ trong nƣớc, nhiều giống cây trồng quan trọng đã đƣợc tạo đột biến thành công bằng phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma nhƣ lúa, lúa mì, khoai tây, mía, khoai lang… (Bảng 2.2). Bên cạnh cây lƣơng thực và thực phẩm quan trọng, việc tạo ra các giống cây hoa kiểng mới thông qua chiếu xạ cũng đã đƣợc ứng dụng phổ biến nhƣ trên cây hồng môn (Puchooa, 2005), cây hoa cúc (Datta và Chakrabarty, 2009), lan Dendrobium (Lê Văn Hòa et al., 2007), hoa cẩm chƣớng (Vũ Hoàng Hiệp và Nguyễn Thị Lý Anh, 2013)…

Bảng 2.2 cho thấy, vật liệu thƣờng đƣợc sử dụng để gây đột biến là mô sẹo và mô sẹo phát sinh phôi bởi vì những vật liệu này có tính mẫn cảm hơn đối với tác nhân gây đột biến, khả năng tạo đột biến cao ở giai đoạn sớm của quá trình hình thành và phát triển cá thể (phôi non hoặc mô sẹo) (Dƣơng Tấn Nhựt, 2009). Vật liệu là đỉnh chồi cũng đƣợc sử dụng nhƣ trên khoai tây (Das et al., 2000; Yaycili and Alikamanoglu, 2012) hay hạt trên cam quýt Ling et al. (2008), đậu nành (Atak et al., 1999; Kumari et al., 2007).

32

Liều chiếu xạ tia gamma xử lý từ 10-80 Gy trên các vật liệu mô sẹo, mô sẹo phát sinh phôi nhƣ ở lúa, lúa mì, mía (Saleem et al., 2005; El-Sayed et al. (2007); Patade et al. (2008); Khan et al. (2009); Nikam et al., 2014). Trên hạt nhƣ hạt đậu nành thì liều chiếu xạ đƣợc xử lý cao hơn, ở 20 và 25 kR (tƣơng đƣơng 200 và 250 Gy) (Kumari et al., 2007).

Kết quả

Tài liệu

Giống

Liều chiếu xạ

Lúa

50 Gy

Chống chịu mặn

Saleem et al. (2005)

Chống chịu hạn

Mô sẹo phát sinh phôi Mô sẹo

Chống chịu mặn

Lúa mì

2, 3, 4 và 5 kR 0, 40, 80 và 120 Gy

Lê Thị Bích Thủy et al. (2007) El-Sayed et al. (2007)

Mô sẹo phát sinh phôi

20 và 40 Gy Chống chịu nhiệt

Das et al. (2000)

20 và 30 Gy Chống chịu mặn

Yaycili and Alikamanoglu (2012) Ling et al. (2008)

Khoai tây Đoạn thân chứa mắt Đoạn thân chứa mắt Hạt

0, 10, 20, 30, 40 và 50 Gy

Biến đổi về mặt sinh lý Chống chịu mặn

Patade et al. (2008)

Citrus sinensis Mía

Mô sẹo phát sinh phôi Mô sẹo

Khan et al. (2009)

20 Gy

Mô sẹo

Tăng chiều cao và sản lƣợng Chống chịu mặn

Nikam et al. (2014)

30, 40 và 50 Gy 5 và 10 Gy

Đỉnh chồi

Chồi biến dị

Phôi

80 Gy

Chống chịu mặn

Malamug et al. (1994) He et al. (2009)

Khoai môn Khoai lang Đậu nành Hạt

Kumari et al. (2007)

20 và 25 kR Ảnh hƣởng sự tạo mô sẹo và tái sinh cây

Bảng 2.2 Một số giống cây trồng đƣợc xử lý đột biến in vitro bằng chiếu xạ tia gamma trên thế giới Vật liệu

Một số nghiên cứu chiếu xạ tia gamma in vitro trên cây đậu nành

33

Ở điều kiện tự nhiên, trên thế giới cũng đã rất nhiều nghiên cứu xử lý tia gamma trên đậu nành để gây đột biến nhƣ Mohamed et al. (1988) đã báo cáo ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma lên sự sinh trƣởng của cây, nốt sần, tình trạng dinh dƣỡng và sản lƣợng đậu nành. Kết quả cho thấy liều gamma thấp (5-40 Gy), đặc biệt là 20 Gy kích thích đáng kể sinh trƣởng của cây, sự thành lập và phát triển nốt sần, cũng nhƣ sự thu nhận N và Mn tổng số của cây. Moussa (2011) đã báo cáo rằng chiếu xạ tia gamma Co60 liều thấp có khả năng tăng cƣờng tính chống chịu hạn của đậu nành. Saputro et al. (2018) đã cải thiện tính chống chịu úng của giống đậu nành địa phƣơng bằng phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma và chọn lọc in vivo… Trong điều kiện in vitro, Atak et al. (1999) đã tạo đột biến bằng cách chiếu xạ tia gamma hạt đậu nành.

Alikamanoglu (2002) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma lên sự tạo đột biến soma. Kumari et al. (2007) đã chiếu xạ hạt đậu nành giống “Bragg” bằng tia gamma ở liều 20 và 25 kR...

Trong nƣớc, cũng đã có một số nghiên cứu xử lý tia gamma để tạo các dòng đột biến có đặc tính mong muốn nhƣ năng suất cao, chín sớm, hạt vàng, hàm lƣợng protein cao... (Tran Duy Quy et al., 2003). Nguyễn Văn Mạnh và ctv. (2017) đã nghiên cứu chọn tạo đƣợc giống đậu nành đen DT2008ĐB bằng phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma trên mẫu hạt khô. Trong điều kiện in vitro, chƣa tìm thấy tài liệu nghiên cứu xử lý tia gamma trên đậu nành.

Một số kết quả về tạo giống cây trồng chống chịu mặn bằng xử lý tia

gamma

Có rất nhiều giống cây trồng đã đƣợc ứng dụng kết hợp phƣơng pháp gây đột biến bằng tia gamma với chọn lọc in vitro để tạo giống có khả năng chống chịu mặn. Trên cây lúa, Saleem et al. (2005) đã cảm ứng tạo đột biến mô sẹo phát sinh phôi của giống lúa (Oryza sativa L.) cv. Basmati 370 bằng cách chiếu xạ tia gamma ở liều 50 Gy và chọn lọc trên môi trƣờng có độ EC của muối NaCl là 4, 6, 8 và 10 d/Sm. Kết quả tạo đƣợc 2 dòng (thế hệ M2) chống chịu mặn mức độ trung bình ở giai đoạn cây con. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo đƣợc chiếu xạ là 4,75% ở môi trƣờng có EC 4 dS/m và 2% ở 6 dS/m.

Ở lúa mì, El-Sayed et al. (2007) đã xử lý đột biến và chọn lọc in vitro để cải thiện khả năng chống chịu mặn ở hai giống Sakha 93 và Sohag 3. Mô sẹo phát sinh phôi đƣợc chiếu xạ tia gamma với các liều 0, 40, 80 và 120 Gy ở suất liều 1,64 Kr/phút và một tháng sau đó đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung NaCl nồng độ 0, 9 và 12 g/L với mỗi chu kỳ gây stress là 30 ngày. Kết quả cho thấy phân tích điện di mô sẹo đƣợc chiếu xạ và xử lý muối cho thấy tất cả đều xuất hiện các băng protein ở các liều tia gamma và mức độ stress mặn với sự thêm vào của những băng mới là kết quả của sự cảm ứng đột biến bằng tia gamma.

34

Trên cây mía, Patade et al. (2008) đã chiếu xạ để tạo đột biến, tiếp theo là chọn lọc in vitro để tạo dòng chống chịu mặn của giống mía Ấn Độ (Saccharum officinarum L.) cv. CoC-671. Mô sẹo phát sinh phôi đƣợc chiếu xạ và nuôi cấy ở các nồng độ muối NaCl khác nhau (0,1; 0,3; 0,4; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5; hoặc 20,0 g/L). Tổng số 147 cây đã đƣợc chọn lọc từ các mức độ muối khác nhau. Nikam et al. (2014) đã gây đột biến bằng cách chiếu xạ tia gamma với các liều 30, 40 và 50 Gy và chọn lọc in vitro giống mía Co740 trên môi trƣờng mặn với muối NaCl nồng độ 0; 2,9; 5,8; 8,8; 11,7; và 14,6 g/L. Kết quả cho thấy sự sinh trƣởng của mô sẹo và khả năng tái sinh cây bị ảnh hƣởng

đáng kể bởi liều chiếu xạ và nồng độ muối NaCl. Sự chống chịu mặn đạt đƣợc bằng cách chiếu xạ mô sẹo và chọn lọc trên môi trƣờng muối NaCl qua các bƣớc chọn lọc in vitro. Cây chống chịu mặn sinh trƣởng đến lúc trƣởng thành và các đặc tính nông học đƣợc đánh giá dƣới điều kiện bình thƣờng và điều kiện mặn. 24 dòng đột biến đƣợc nhận diện bởi proline, glycine betaine, và hàm lƣợng Na+, K+. Các dòng đột biến đã cải thiện đƣợc sản lƣợng đƣờng với sự gia tăng độ Brix%, chu vi cây và sản lƣợng.

Trên khoai tây, Yaycili and Alikamanoglu (2012) đã tạo đƣợc giống đột biến có khả năng chống chịu mặn thông qua chiếu xạ tia gamma. Mẫu cấy mắt đƣợc chiếu xạ với các liều 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, và 50 Gy từ nguồn cesium 137 (Cs137) với suất liều 6,5 Gy/phút. Sự sai khác ở mức độ phân tử đƣợc xác định bằng phƣơng pháp RAPD-PCR. Kết quả cho thấy sự khác biệt lớn nhất giữa dòng đột biến và đối chứng là 47%, đƣợc tìm thấy ở những cây đột biến bởi liều 20 và 30 Gy và chọn lọc trên môi trƣờng chứa NaCl 5,8 g/L.

Trên khoai lang (Ipomoea batatas (L.) Lam.), cây chịu mặn với muối NaCl đã đạt đƣợc bằng cách nuôi cấy treo tế bào phôi và tạo đột biến bằng tia gamma. Các tế bào từ nuôi cấy treo phôi đƣợc chiếu xạ với liều 80 Gy, 1 tuần sau đó mẫu đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc chứa muối NaCl 20 g/L. Tổng số 276 cây đƣợc tái sinh từ 2.783 tế bào đƣợc chiếu xạ theo phƣơng pháp chọn lọc hai bƣớc. Sau khi cây tái sinh đƣợc nhân thành các dòng trên môi trƣờng cơ bản, chúng đƣợc cấy trên môi trƣờng có bổ sung NaCl 5, 10, 15 và 20 g L để đánh giá khả năng chống chịu mặn. Kết quả là 18 dòng cây có khả năng chịu mặn cao hơn đối chứng. Hàm lƣợng proline và superoxide dismutase (SOD) tích lũy nhiều hơn trong 18 dòng này so với đối chứng. 18 dòng này đƣợc đánh giá khả năng chịu mặn bằng dung dịch Hoalgland có chứa các nồng độ muối khác nhau. Kết quả cho thấy có 3 dòng sinh trƣởng và khả năng tạo rễ tốt hơn so với 15 dòng còn lại và đối chứng ở nồng độ NaCl 10 g/L (He et al., 2009).

35

Nhìn chung, các kết quả trên cho thấy việc ứng dụng phƣơng pháp gây đột biến bằng chiếu xạ tia gamma kết hợp với chọn lọc in vitro trên môi trƣờng mặn đã rất hiệu quả trong việc tạo nên các giống cây trồng có khả năng chống chịu mặn. Nhiều giống cây trồng quan trọng đã đƣợc nghiên cứu nhƣ lúa, lúa mì, mía, khoai tây, khoai lang… Tuy nhiên trên cây đậu nành thì chƣa thấy nghiên cứu về ứng dụng phƣơng pháp tạo đột biến bằng tia gamma và chọn lọc trên môi trƣờng mặn để tạo giống cây chịu mặn.

2.10 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

Phƣơng pháp chọn giống nhờ các chỉ thị phân tử là một phƣơng pháp chọn giống mới đang áp dụng khá rộng rãi ở nhiều cây trồng. Phƣơng pháp này cho phép xác định nhanh, chính xác sự có mặt của các gen mong muốn, do vậy có thể hỗ trợ cho chọn giống. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử khắc phục đƣợc hạn chế của các phƣơng pháp truyền thống. Phân tích và đánh giá bộ gen của thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử; sử dụng các chỉ thị phân tử hỗ trợ cho chọn giống cây trồng góp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống; đánh giá một cách hữu hiệu tính đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài; tách dòng và chuyển các gen có giá trị kinh tế để nâng cao chất lƣợng và khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trƣờng (Nguyễn Mai Thơm, 2009).

Hiện nay có rất nhiều chị thị phân tử đƣợc phát triển dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR nhƣ AFLP (Amplified fragment length polymorphism), RAPD (random amplified polymorphism DNA), và gần đây là SSRs (simple sequence repeats) hay microsatellites (Staub et al., 1996; Gupta and Varshney, 2000). Hạn chế chính của các phƣơng pháp này là khả năng lặp lại thấp của RAPD, đắt tiền nhƣ AFLP và cần phải biết các trình tự flanking để thiết kế primer đặc hiệu loài nhƣ SSR polymorphism. ISSR-PCR có thể khắc phục đƣợc những hạn chế này (Zietkiewicz et al., 1994; Gupta et al., 1994; Wu et al., 1994).

Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản giữa (Inter-Simple Sequence Repeat-

ISSR)

36

ISSR là những chỉ thị đƣợc nhân bản bằng PCR với một mồi bổ trợ với tiểu vệ tinh (microsatellite) đích. Mỗi băng tƣơng ứng với chuỗi DNA đƣợc giới hạn bởi các tiểu vệ tinh đảo ngƣợc. Kết quả dẫn đến đa locus, có sự đa hình cao và tạo ra các chỉ thị trội. ISSR-PCR là kỹ thuật đánh giá kiểu gen nhanh, không đắt; sự đa hình dựa trên sự thay đổi trong các vùng nằm giữa các tiểu vệ tinh. Kỹ thuật này không cần thông tin về trình tự, tạo đƣợc nhiều locus, có tính đa hình cao và tạo ra chỉ thị trội (Mishra et al., 2003). Kỹ thuật ISSR là kỹ thuật nhân bản đoạn DNA nằm giữa hai vùng lặp lại giống hệt và ngƣợc chiều nhau. Kỹ thuật này sử dụng các tiểu vệ tinh nhƣ các mồi trong phản ứng PCR với một mồi cho nhiều locus đích để nhân bản chủ yếu các chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác nhau. Các tiểu vệ tinh sử dụng nhƣ mồi trong kỹ thuật ISSR có thể là 2, 3, 4, hoặc 5 nucleotide. Các mồi sử dụng có thể không phải mồi neo hoặc là mồi neo ở đầu 3‟ hoặc 5‟ với 1 đến 4 nucleotide thoái hóa kéo đến các chuỗi bên cạnh. Kỹ thuật ISSR sử dụng mồi

dài (15 đến 30 nucleotide) vì vậy nhiệt độ bắt mồi cao dẫn đến độ ổn định cao của phản ứng. Sản phẩm có độ dài 200-2.000 bp nên có thể phân tách trên cả gel agarose và polyacrylamide (Nguyễn Đức Thành, 2014).

Đây là kỹ thuật đơn giản và nhanh chóng kết hợp những thuận lợi của SSPs (microsatellites) và AFLP đến tính phổ biến của kỹ thuật RAPD. Các ISSR markers có tính đa hình cao và rất hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền, sự phát sinh loài, gen mục tiêu, lập bản đồ gen và sinh học tiến hóa (Reddy et al., 2002).

37

ISSR đã đƣợc sử dụng để phát hiện sự đa dạng di truyền và sự khác biệt giữa các giống đậu nành (Yang et al., 1996). Mahgoub et al. (2016) đã báo cáo về các chỉ thị phân tử liên quan đến tính chống chịu mặn ở các giống đậu nành khác nhau dƣới điều kiện stress mặn. Kết quả phân tích ISSR sử dụng 4 mồi cho thấy có 36 đoạn đa hình với tỉ lệ 91,57% trong tổng số 39 đoạn đƣợc khuếch đại dƣới điều kiện stress mặn. Sáu giống đậu nành có 30 đoạn ISSR đặc hiệu dƣơng với tính chống chịu mặn với tỉ lệ đa hình 74,83%. Kỹ thuật này cũng đã đƣợc sử dụng để xác định các chỉ thị phân tử liên quan đến tính chống chịu mặn ở lúa mì (Lang et al., 2001), lúa (Kaushik et al., 2003), lúa mạch (Khatab and Samah, 2013), sorghum (Khalil, 2013) và mía (Markad et al., 2014). Hai trong năm marker ISSR đã đƣợc xác định liên quan đến tính chống chịu mặn ở các kiểu gen cây cỏ linh lăng (Medicago sativa L.) (Abdel- Tawab et al., 2011).

CHƢƠNG 3

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phƣơng tiện

3.1.1 Vật liệu

- Mƣời giống đậu nành phổ biến ở ĐBSCL đƣợc dùng trong thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn là MTĐ 176, MTĐ 760-4, MTĐ 748-1, Nhật 17A, OMĐN 29, ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-3 và MTĐ 885-2 đƣợc thu thập tại Bộ môn Di truyền và chọn giống cây trồng, Khoa Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Cần Thơ và Công ty Vạn Đức (Ấp Đông Hòa, Xã Song Thuận, Huyện Châu Thành, Tỉnh Tiền Giang).

- Một giống đƣợc chọn trong 10 giống trên đƣợc dùng trong thí nghiệm

nuôi cấy mô để chọn tạo dòng có tính chống chịu mặn.

3.1.2 Hóa chất

- Hóa chất dùng trong thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn: Khoáng đa, vi lƣợng theo Hoagland (Taiz và Zeige, 2003), NaCl (Trung Quốc) có độ tinh khiết ≥ 99,5%, NaOH 1 M và HCl 1 M (để chuẩn pH).

- Hóa chất nuôi cấy mô và tế bào thực vật: Khoáng đa, vi lƣợng theo Murashige và Skoog (1962) và các vitamin (thiamine, pyridoxine, nicotinic acid), chất điều hòa sinh trƣởng 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D), Benzyladenine (BA), 1-Naphthalene acetic acid (NAA) (Merck), đƣờng sucrose, agar, NaCl, nƣớc dừa, hóa chất khử trùng bề mặt.

- Hóa chất phân tích proline: Acid sulfosalicylic 3%, acid acetic, acid

phosphoric 6M, ninhydrine (Merck), toluene.

- Hóa chất dùng trong ly trích DNA, PCR, điện di: Extraction buffer (EB), SDS (Sodium dodecyl sulfat), isopropanol, TE, RNase, CTAB, chloroform, isoamylacohol, ethanol, buffer ABgen, dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase, thang chuẩn Thermo Scientific GeneRuler 100 bp và 1 kp DNA Ladder...

3.1.3 Thiết bị

- Máy đo EC, pH, máy đo cƣờng độ ánh sáng, ẩm độ và nhiệt độ.

- Cân điện tử, nồi hấp khử trùng, lò vi sóng, bếp điện từ, tủ lạnh, tủ cấy

vô trùng, máy ly tâm.

38

- Các trang thiết bị phục vụ cho kỹ thuật sinh học phân tử: Bể điều nhiệt (Grant, Anh), máy ly tâm (Heraeus, Đức), máy nghiền (Retsch MM200, Đức),

máy ly tâm chân không (Eppendorf Concentrator 5301, Đức), máy luân nhiệt (Biorad C1000, Mỹ), bộ điện di (Embi Tec, Mỹ), máy chụp hình gel (Biorad, Mỹ).

3.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu đƣợc thực hiện từ tháng 3/2014-5/2019, cụ thể

nhƣ sau:

- Nội dung 1: Xác định khả năng chống chịu mặn của một số giống đậu nành phổ biến ở ĐBSCL đƣợc thực hiện từ tháng 3 2014 đến tháng 9/2015 tại Trại Nghiên cứu và Thực nghiệm nông nghiệp, Khoa Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Cần Thơ.

- Nội dung 2: Xác định môi trƣờng nuôi cấy mô cây đậu nành thích hợp để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phƣơng pháp chọn lọc đƣợc thực hiện từ tháng 7 2014 đến tháng 02/2016 tại Phòng Cấy mô, Bộ môn Sinh lý Sinh hóa, Khoa Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Cần Thơ.

- Nội dung 3: Đánh giá khả năng chọn tạo các dòng đậu nành chống chịu mặn bằng phƣơng pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma đƣợc thực hiện tại Phòng Cấy mô, Bộ môn Sinh lý Sinh hóa, Khoa Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Cần Thơ. Mẫu chiếu xạ tia gamma Co60 đƣợc thực hiện tại Viện Nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt. Mẫu đƣợc đánh giá sự sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử tại Viện Nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Cần Thơ. Cây đậu nành sau chọn lọc đƣợc thuần dƣỡng tại nhà lƣới Bộ môn Sinh lý Sinh hóa.

+ Từ tháng 4 2015 đến tháng 01/2017: Tiến hành chọn lọc các dòng chống chịu mặn bằng phƣơng pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma Co60 trên mẫu mô sẹo.

+ Từ tháng 10 2017 đến tháng 02/2019: Tiến hành chọn lọc các dòng chống chịu mặn bằng phƣơng pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma Co60 trên mẫu trục phôi và đánh giá sự sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử.

+ Từ tháng 3 2019 đến tháng 5/2019: Tiến hành thuần dƣỡng các dòng

39

đậu nành thu đƣợc sau chọn lọc in vitro trong điều kiện nhà lƣới.

3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu

3.2.1 Nội dung 1: Xác định khả năng chống chịu mặn của một số

giống đậu nành phổ biến ở ĐBSCL

3.2.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của các giống đậu nành MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4, Nhật 17A và OMĐN 29

Vật liệu: Năm giống đậu nành là MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4,

Nhật 17A và OMĐN 29.

Cách tiến hành:

- Thùng xốp (50x35x15 cm) đƣợc lót màng phủ nylon đen vào mặt trong của thùng. Miếng xốp có độ dày 2,5 cm đƣợc cắt vừa với kích thƣớc của miệng thùng để dùng làm giá đỡ. Miếng xốp đƣợc khoét lỗ có đƣờng kính bằng với đƣờng kính rọ nhựa. Rọ nhựa có lỗ dùng để trồng cây có kích thƣớc 4,5x4,3x2,7 cm.

- Dinh dƣỡng đƣợc sử dụng theo công thức của Hoagland (Taiz and Zeige, 2003) có hàm lƣợng khoáng đa lƣợng giảm 1 2 theo Shereen et al. (2001). Dung dịch dinh dƣỡng đƣợc điều chỉnh pH = 6.0 và đo EC trƣớc khi trồng. Định kỳ thay mới dung dịch sau 2 tuần. Ở tuần 3 và 5 sau khi trồng (sau khi thay mới dung dịch đƣợc 1 tuần), bổ sung thêm dung dịch mới bằng với thể tích dung dịch trong thùng ban đầu do cây trƣởng thành nên hấp thu nhiều nƣớc và dinh dƣỡng ở giai đoạn này.

- Hạt đƣợc gieo cho nảy mầm trên đĩa petri có lót giấy thấm. Cây con sau khi nảy mầm đƣợc đặt trong rọ nhựa (dùng mút làm giá đỡ cây và bông gòn thấm để dẫn dung dịch) gắn trên nắp của thùng xốp và thả nổi trong dung dịch dinh dƣỡng 1/2 Hoagland có bổ sung các nồng độ muối NaCl khác nhau chứa trong thùng xốp (mỗi thùng chứa 12 lít dung dịch).

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân tố, gồm 20 nghiệm thức với nhân tố thứ nhất là 5 giống đậu nành là MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4, Nhật 17A và OMĐN 29 và nhân tố thứ hai là 4 mức độ muối NaCl 0, 1, 2 và 4 g L. Mỗi nghiệm thức lặp lại 10 lần, mỗi lần lặp lại là 1 thùng xốp trồng 2 cây giống.

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ sống (%): (Tổng số cây sống /Tổng số cây trồng) x 100

- Chiều cao cây (cm): Đo thân cây từ phần gốc tiếp giáp mặt rọ đến phần

40

đỉnh sinh trƣởng của cây.

- Số lóng trên thân chính: Đếm từ lóng có hai lá đơn đến tận ngọn.

- Chiều dài rễ (cm): Cây đƣợc lấy ra khỏi dung dịch dinh dƣỡng một cách cẩn thận để tránh làm đứt rễ. Đo từ đáy rọ đến chóp rễ dài nhất. Sau khi đo xong cây đƣợc đặt trở lại vị trí cũ.

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1 tuần lần trong thời gian 5 tuần.

3.2.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của các giống đậu nành ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-3 và MTĐ 885-2

Mục tiêu: Tƣơng tự thí nghiệm 1.

Vật liệu: Năm giống đậu nành ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-

3 và MTĐ 885-2.

Cách tiến hành, bố trí thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi: Tƣơng tự thí

nghiệm 1.

3.2.2 Nội dung 2: Xác định môi trƣờng nuôi cấy mô cây đậu nành

thích hợp để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phƣơng pháp chọn lọc

Đối tƣợng để tiến hành nghiên cứu các phƣơng pháp chọn lọc là giống đậu nành MTĐ 760-4, là giống có khả năng chịu mặn kém nhƣng có các đặc tính sinh trƣởng tốt đƣợc chọn từ kết quả thí nghiệm 1, nhằm mục tiêu là cải thiện đặc tính chống chịu mặn của giống không chịu mặn này.

3.2.2.1 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của 2,4-D và BA lên sự hình thành

mô sẹo từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4

Vật liệu: Mẫu cấy tử diệp của giống đậu nành MTĐ 760-4, là giống đƣợc

chọn từ kết quả thí nghiệm 1 và 2.

Cách tiến hành: Hạt đậu nành đƣợc khử trùng bằng cách ngâm trong dung dịch sodium hypochloride (NaOCl) 20% trong 10 phút. Sau đó rửa lại bằng nƣớc vô trùng 3-4 lần và ngâm trong dung dịch HgCl2 1‰ trong 10 phút. Hạt đƣợc rửa lại bằng nƣớc vô trùng 4-5 lần và tiến hành tách tử diệp, loại bỏ trục phôi. Mẫu cấy tử diệp đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Murashige và Skoog (1962) (ký hiệu là MS) có bổ sung các nồng độ auxin và cytokinin khác nhau (Hình 3.1).

41

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên thừa số 2 nhân tố là các nồng độ 2,4-D (1,25; 2,5; 5 và 10 mg/L) và BA (0; 0,5 và 1 mg/L). Mỗi nghiệm thức lặp lại 10 lần, mỗi lần lặp lại là 1 keo cấy 4 mẫu tử diệp.

a

b

Hình 3.1: Tử diệp của giống đậu nành MTĐ 760-4 đƣợc tách bỏ trục

phôi (a) và nuôi cấy trên môi trƣờng (b)

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ tạo mô sẹo (%): (Tổng số mẫu tạo mô sẹo tổng số mẫu cấy) x 100.

- Tỉ lệ tạo rễ (%): (Tổng số mẫu tạo rễ tổng số mẫu cấy) x 100.

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1 tuần/lần trong thời gian 4 tuần.

3.2.2.2 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của NAA và khoáng đa lƣợng đến

sự tạo rễ từ đoạn thân đậu nành MTĐ 760-4

Vật liệu: Đoạn thân của cây đậu nành đƣợc gieo từ hạt khoảng 20 ngày

tuổi, dài 1,5 cm, có chứa 1 mắt lá.

Cách tiến hành: Mẫu đoạn thân đƣợc cấy vào môi trƣờng MS có bổ sung

các nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng khác nhau.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố là nồng độ NAA (0; 0,1; 0,2 và 0,4 mg L) và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng (MS và 1/2 MS) với 8 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức lặp lại 10 lần, mỗi lần 1 keo, mỗi keo cấy 3 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi:

42

- Tỉ lệ tạo rễ (%): (Số chồi tạo rễ/tổng số chồi) × 100 - Số rễ: Đếm tất cả các rễ của chồi - Chiều dài rễ (cm): Đo rễ dài nhất (ghi nhận ở 4 tuần sau khi cấy) - Chiều cao chồi (cm): Đo chiều cao từ gốc chồi đến chót lá cao nhất - Số lá: Đếm số lá đã mở hoàn toàn Các chỉ tiêu ghi nhận ở thời điểm 2 và 4 tuần sau khi cấy.

3.2.2.3 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của giá thể đến sự thuần dƣỡng

cây đậu nành in vitro trong điều kiện nhà lƣới

Vật liệu:

- Cây đậu nành in vitro có đầy đủ rễ (sau 4 tuần) đƣợc nuôi cấy trên môi

trƣờng đa lƣợng MS bổ sung NAA 0,2 mg/L từ kết quả của thí nghiệm 4.

- Giá thể: Đất (nhà lƣới của Trại Nghiên cứu và Thực nghiệm nông nghiệp) và các giá thể phân rơm, tro trấu, mụn dừa đƣợc ngâm và xả với nƣớc nhiều lần để loại bỏ tạp chất lignin và tannin. Giá thể đƣợc phơi khô, trộn với thuốc COC 85 WP để diệt nấm bệnh và vi khuẩn, trộn theo các nghiệm thức rồi cho vào ly nhựa (đƣờng kính đáy ly là 4,5 cm và đƣờng kính miệng ly là 6,5 cm) riêng biệt, dƣới đáy ly có khoét 3 lỗ để thoát nƣớc.

Cách tiến hành: Trƣớc khi thuần dƣỡng cây đƣợc rửa sạch agar dƣới vòi nƣớc máy và rễ cây đƣợc nhúng với thuốc COC 85 WP trƣớc khi trồng. Sau đó trồng các cây vào chậu nhựa có chứa các loại giá thể và dùng bọc nylon lớn trong suốt để trùm kín và phun sƣơng nƣớc ƣớt đều mặt lá 2-3 lần ngày để tạo ẩm độ và giảm sự mất nƣớc cho cây.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố là loại giá thể với 5 nghiệm thức là mụn dừa, phân rơm, mụn dừa + phân rơm (1:1), mụn dừa + phân rơm + tro trấu (1:1:1), mụn dừa + tro trấu + đất (1:1:1). Mỗi nghiệm thức lặp lại 5 lần, mỗi lần lặp lại quan sát 2 cây.

Chỉ tiêu theo dõi: - Tỉ lệ cây sống (%): (Số cây sống/ tổng số cây) × 100 - Chiều cao cây (cm): Đo từ mặt giá thể đến chót lá cao nhất của chồi - Số lá: Đếm tất cả các lá. Thời gian lấy chỉ tiêu: 1 tuần/lần trong thời gian 4 tuần.

3.2.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng chọn tạo các dòng đậu nành chống chịu mặn bằng phƣơng pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma

3.2.3.1 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng

của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4

a) Thí nghiệm 6a: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của

mô sẹo trong lần chọn lọc 1

Vật liệu: Mô sẹo 4 tuần tuổi đƣợc cảm ứng từ tử diệp trên môi trƣờng

43

MS bổ sung 2,4-D 5 mg/L.

Cách tiến hành: Hạt đậu nành đƣợc khử trùng và tách tử diệp nhƣ phƣơng pháp đƣợc mô tả ở thí nghiệm 3. Mẫu tử diệp đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D 5 mg L (môi trƣờng đƣợc chọn trong thí nghiệm 3). Sau 4 tuần, mô sẹo đƣợc hình thành có dạng xốp, rời rạc sẽ đƣợc tách thành cụm có kích thƣớc khoảng 0,5x0,5 cm và cấy vào môi trƣờng MS có bổ sung các nồng độ muối NaCl khác nhau.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố gồm 5 nghiệm thức là các nồng độ muối NaCl 0; 2,5; 5; 7,5 và 10 g/L. Mỗi nghiệm thức lặp lại 10 lần, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 5 mẫu mô sẹo.

Chỉ tiêu theo dõi:

Mô sẹo sống

Mô sẹo sống

Mô sẹo chết

Mô sẹo chết

- Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo: (Tổng số mô sẹo còn sống tổng số mẫu cấy) x 100. Mô sẹo còn sống là mô sẹo có sự sinh trƣởng bình thƣờng (tăng kích thƣớc) và có màu vàng sáng, trong khi mô sẹo bị chết có màu nâu đen và không gia tăng kích thƣớc hoặc tăng rất ít (Hình 3.2).

Hình 3.2: Sinh trƣởng mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc với muối NaCl

- Hàm lƣợng proline trong mô sẹo (mol g trọng lƣợng tƣơi) đƣợc phân tích trong lần chọn lọc thứ 4 với 4 lần lặp lại trong một nghiệm thức. Quy trình phân tích proline đƣợc thực hiện theo Bates et al. (1973) gồm các bƣớc:

+ Chuẩn bị dung dịch ninhydrine: Lấy 1,25 g ninhydrine + 30 mL acid acetic + 20 mL acid phosphoric 6M khuấy đều cho ninhydrine tan hoàn toàn và trữ ở nhiệt độ khoảng 4C.

44

+ Cân 0,5 g mô sẹo đậu nành, dùng chày cối nghiền nhuyễn, bột mô sẹo đƣợc cho vào ống nghiệm 13x100 mm, thêm 10 ml acid sulfosalicylic 3% lắc đều. Cho các ống nghiệm này vào trong máy ly tâm trong 20 phút với vận tốc 3.000 vòng phút. Sau đó, hút lấy 2 mL dung dịch nổi lên bên trên cho vào ống nghiệm và cho thêm 2 mL dung dịch ninhydrine và 2 mL acid acetic lắc đều rồi đun sôi (100C) trong 1 giờ, lấy ra ngâm vào nƣớc đá khoảng vài phút.

Cho thêm vào ống tube 4 mL dung dịch toluene rồi lắc đều trên vortexer khoảng 15-20 giây, sau vài phút dung dịch hỗn hợp toluene và proline sẽ nổi lên trên, hút dung dịch này vào cuvette thủy tinh và dùng máy quang phổ kế để đo ở bƣớc sóng 520 nm.

Lƣu ý: Cần dùng toluene nguyên chất để chuẩn máy trƣớc khi đo mẫu

phân tích.

+ Nồng độ proline đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn proline với dãy nồng độ từ 0 g mL đến 14 g mL và công thức proline trên trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo nhƣ sau:

Y×4×5

P = 

115,5×m

Trong đó:

P: Hàm lƣợng proline (mol g trọng lƣợng tƣơi)

Y: Nồng độ proline g mL (xác định đƣờng cong chuẩn proline)

4: Là 4 ml toluene đƣợc sử dụng

m: Là trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo

115,5: Là phân tử gam của proline

5=10 2: Là 2 mL dung dịch ly trích từ 10 mL dung dịch hỗn hợp acid

sulfosalicylic 3% và mẫu mô sẹo.

Thời gian lấy chỉ tiêu là 1 tuần lần trong thời gian 5 tuần.

b) Thí nghiệm 6b: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của

mô sẹo trong lần chọn lọc 2

Vật liệu: Mô sẹo còn sống sau 5 tuần trên môi trƣờng mặn của thí

nghiệm 6a.

Cách tiến hành: Mẫu mô sẹo đƣợc tách thành cụm có kích thƣớc 0,5x0,5 cm và cấy vào môi trƣờng MS có bổ sung các nồng độ muối NaCl tƣơng tự môi trƣờng ban đầu.

Bố trí thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi tƣơng tự thí nghiệm 6a.

c) Thí nghiệm 6c: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của

mô sẹo trong lần chọn lọc 3

Vật liệu: Mô sẹo còn sống sau 5 tuần trên môi trƣờng mặn của thí

45

nghiệm 6b.

Cách tiến hành: Tƣơng tự thí nghiệm 6b.

Bố trí thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi tƣơng tự thí nghiệm 6a.

d) Thí nghiệm 6d: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của

mô sẹo trong lần chọn lọc 4

Vật liệu: Mô sẹo còn sống sau 5 tuần trên môi trƣờng mặn của thí

nghiệm 6c.

Cách tiến hành: Tƣơng tự thí nghiệm 6b.

Bố trí thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi tƣơng tự thí nghiệm 6a.

3.2.3.2 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự tạo chồi và

sinh trƣởng của chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4

a) Thí nghiệm 7a: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh

trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 1

Vật liệu: Trục phôi của hạt đậu nành đƣợc tách ra khỏi tử diệp.

Cách tiến hành: Hạt đậu nành đƣợc khử trùng nhƣ phƣơng pháp đƣợc mô tả ở thí nghiệm 3. Hạt đƣợc tách bỏ tử diệp, trục phôi đƣợc cấy vào môi trƣờng MS có bổ sung các nồng độ muối NaCl khác nhau (Hình 3.3).

a

b

Hình 3.3: Mẫu trục phôi của giống đậu nành MTĐ 760-4 đƣợc tách bỏ

trục phôi (a) và nuôi cấy trên môi trƣờng (b)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố gồm 4 nghiệm thức là các nồng độ muối NaCl 0; 2,5; 5 và 7,5 g/L. Mỗi nghiệm thức lặp lại 15 lần, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 4 mẫu trục phôi.

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ tạo chồi (%): (Tổng số mẫu tạo chồi tổng số mẫu cấy) x 100.

46

- Chiều cao chồi (cm).

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2 và 3 tuần sau khi cấy.

b) Thí nghiệm 7b: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của

chồi trong lần chọn lọc 2

Vật liệu: Chồi ngọn cây đậu nành thu đƣợc từ thí nghiệm 7a.

Cách tiến hành: Chồi ngọn cây đậu nành có chứa 1 mắt lá đƣợc cấy vào

môi trƣờng MS có bổ sung muối NaCl cùng nồng độ.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố gồm 4 nghiệm thức là muối NaCl 0; 2,5; 5 và 7,5 g/L. Mỗi nghiệm thức lặp lại 10 lần, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 2 mẫu chồi.

Chỉ tiêu theo dõi:

- Chiều cao chồi gia tăng (cm).

- Số lá gia tăng của chồi.

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2 và 3 tuần sau khi cấy.

c) Thí nghiệm 7c: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của

chồi trong lần chọn lọc 3

Vật liệu: Chồi ngọn cây đậu nành thu đƣợc từ thí nghiệm 7b.

Cách tiến hành: Tƣơng tự thí nghiệm 7b.

Bố trí thí nghiệm: Tƣơng tự thí nghiệm 7b

Chỉ tiêu theo dõi:

- Chiều cao chồi gia tăng (cm).

- Số lá gia tăng của chồi.

- Số cây có khả năng chống chịu mặn: số chồi thu đƣợc từ mỗi nghiệm thức xử lý muối NaCl sau 3 lần chọn lọc đƣợc cấy trở lại môi trƣờng MS bổ sung nƣớc dừa 50 ml L và NAA 0,2 mg L nhƣng không có bổ sung muối NaCl (chồi đƣợc tính khi có chiều cao >= 2,0 cm sau 2 tuần nuôi cấy).

- Hàm lƣợng proline trong mẫu chồi (mol/g trọng lƣợng tƣơi) đƣợc

phân tích 4 lần lặp lại cho 1 nghiệm thức.

47

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2 và 3 tuần sau khi cấy.

3.2.3.3 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và

muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4

a) Thí nghiệm 8a: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối

NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo trong lần chọn lọc 1

Vật liệu: Mô sẹo 4 tuần tuổi đƣợc cảm ứng từ tử diệp trên môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D 5 mg/L. Cách chuẩn bị vật liệu tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp đƣợc mô tả trong thí nghiệm 6.

Cách tiến hành: Mô sẹo đƣợc cấy vào đĩa petri chứa môi trƣờng MS có bổ sung các nồng độ muối NaCl để xử lý chiếu xạ, với 15 mẫu mô sẹo đĩa, mẫu mô sẹo có kích thƣớc 0,5x0,5 cm. Mô sẹo sau đó đƣợc cấy chuyền vào keo có môi trƣờng tƣơng tự với 5 mẫu mô sẹo keo để theo dõi.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên thừa số hai nhân tố, với nhân tố thứ nhất là 5 liều chiếu xạ tia gamma Co60 (0, 5, 10, 20 và 40 Gy) và nhân tố thứ hai là 4 nồng độ muối NaCl (0; 2,5; 5 và 7,5 g/L). Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 10 lần, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 5 mẫu mô sẹo.

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo: (Tổng số mô sẹo còn sống tổng số mẫu cấy)

x 100. Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 3 và 5 tuần sau khi cấy.

- Hàm lƣợng proline trong mô sẹo (mol/g trọng lƣợng tƣơi) đƣợc phân

tích trong lần chọn lọc thứ 4 với 2-6 lần lặp lại trong một nghiệm thức.

b) Thí nghiệm 8b: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối

NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo trong lần chọn lọc 2

c) Thí nghiệm 8c: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối

NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo trong lần chọn lọc 3

d) Thí nghiệm 8d: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối

NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo trong lần chọn lọc 4

48

Thí nghiệm 8b, 8c và 8d đƣợc tiến hành tƣơng tự thí nghiệm 8a, với vật liệu là mô sẹo còn sống của thí nghiệm trƣớc đó đƣợc nuôi cấy trên cùng môi trƣờng để tiếp tục đánh giá khả năng sống của mô sẹo.

3.2.3.4 Thí nghiệm 9: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trƣởng của chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4

a) Thí nghiệm 9a: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối

NaCl lên sự tạo chồi và sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 1

Vật liệu: Trục phôi của hạt đậu nành đƣợc tách ra khỏi tử diệp. Cách

chuẩn bị vật liệu tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp đƣợc mô tả trong thí nghiệm 7.

Cách tiến hành: Mẫu trục phôi đƣợc cấy vào đĩa petri chứa môi trƣờng MS có bổ sung các nồng độ muối NaCl để xử lý chiếu xạ, với 4 mẫu/đĩa. Mẫu trục phôi sau đó đƣợc cấy chuyền vào keo có môi trƣờng tƣơng tự để theo dõi.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên thừa số hai nhân tố, với nhân tố thứ nhất là 4 liều chiếu xạ tia gamma Co60 (0, 20, 40 và 60 Gy) và nhân tố thứ hai là 4 nồng độ muối NaCl (0; 5; 7,5 và 10 g/L). Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 4 lần, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 4 mẫu trục phôi.

Chỉ tiêu theo dõi:

Trục phôi bị chết

Trục phôi còn sống

- Tỉ lệ sống (%) của mẫu: (Tổng số mẫu còn sống tổng số mẫu cấy) x 100. Mẫu trục phôi còn sống là mẫu trục phôi có sự phát triển và có màu xanh, mẫu trục phôi chết đƣợc tính là mẫu không phát triển hoặc phát triển nhƣng có màu nâu đen (Hình 3.4).

Hình 3.4 Sinh trƣởng của trục phôi sau khi đƣợc chiếu xạ và chọn lọc với

muối NaCl

- Tỉ lệ tạo chồi (%): (Tổng số mẫu tạo chồi tổng số mẫu sống) x 100.

- Chiều cao chồi (cm).

49

Thời gian lấy chỉ tiêu: 2, 4 và 6 tuần sau khi cấy.

b) Thí nghiệm 9b: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối

NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 2

Vật liệu: Chồi ngọn cây đậu nành thu đƣợc từ thí nghiệm 9a.

Cách tiến hành: Mẫu chồi có từ 1-2 mắt lá đƣợc cấy vào môi trƣờng MS

có bổ sung muối NaCl cùng nồng độ.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố là 3 nồng độ muối NaCl (0, 5 và 7,5 g/L). Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 4 lần, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 2 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi:

- Chiều cao chồi gia tăng (cm).

- Số lá gia tăng của chồi.

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2 và 3 tuần sau khi cấy.

c) Thí nghiệm 9c: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối

NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 3

Vật liệu: Chồi ngọn cây đậu nành thu đƣợc từ thí nghiệm 9b.

Cách tiến hành: Tƣơng tự thí nghiệm 9b.

Bố trí thí nghiệm: Tƣơng tự thí nghiệm 9b

Chỉ tiêu theo dõi: Tƣơng tự thí nghiệm 9b

3.2.3.5 Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đậu nành chống

chịu mặn

Vật liệu: Mẫu mô sẹo và chồi cây đậu nành có khả năng chống chịu mặn sau khi chọn lọc bằng hai phƣơng pháp trên gồm 03 mẫu mô sẹo đƣợc chọn lọc với muối NaCl 0 g/L, NaCl 5 g/L (kết quả thí nghiệm 6) và mô sẹo đƣợc chiếu xạ liều 10 Gy + NaCl 5 g/L (kết quả thí nghiệm 8) và 11 mẫu chồi cây đậu nành ở nồng độ NaCl 0 g/L (1 mẫu), NaCl 2,5 g/L (6 mẫu) và NaCl 5 g/L (4 mẫu) từ kết quả thí nghiệm 7.

Cách tiến hành:

- Ly trích DNA theo qui trình CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide)

(Rogers and Bendich, 1988):

+ Lấy khoảng 100 mg mẫu mô sẹo cho vào ống tuýp 2,2 ml, cho viên bi

sắt vào và làm lạnh bằng nitơ lỏng trong 10 phút.

50

+ Nghiền mẫu bằng máy nghiền 3-4 lần, mỗi lần 30 giây.

+ Cho vào mỗi tuýp 1 ml Extraction buffer (EB) + 50 l SDS 10%.

+ Ủ mẫu ở 65oC trong 30 phút.

+ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.

+ Lấy phần nƣớc trong (800 l) cho sang tuýp khác (bỏ phần cặn).

+ Cho vào một lƣợng Isopropanol tƣơng đƣơng (800 l), đảo nhẹ, để

trầm hiện DNA.

+ Trữ mẫu ở -200C trong 2 giờ.

+ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần trầm hiện bỏ phần

lỏng.

+ Cho 400 l TE 0,1X để hòa tan DNA.

+ Cho 10 l RNase, ủ mẫu ở 370C trong 20 phút để loại bỏ RNA có

trong mẫu.

+ Cho CTAB 400 l, ủ mẫu ở 650C trong 15 phút.

+ Cho 800 l Chloroform/Isoamylacohol (24:1), lắc nhẹ.

+ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.

+ Lấy phần lỏng ở trên cùng khoảng 700 l, bỏ phần cặn.

+ Cho Ethanol 96% gấp đôi (1400 l), đảo nhẹ, để ở nhiệt độ phòng để

trầm hiện DNA trong 15 phút.

+ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần trầm hiện (DNA).

+ Rửa DNA trầm hiện bằng Ethanol 70% 2 lần, mỗi lần cho 700 l

Ethanol và ly tâm 10 phút lấy phần trầm hiện, bỏ phần lỏng.

+ Sấy khô bằng máy sấy chân không 450C trong 10 phút.

+ Hòa tan mẫu DNA với 150 l TE 0,1X. Trữ lạnh -200C .

- Phân tích đa dạng di truyền bằng dấu phân tử ISSR

- Phản ứng PCR: Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với 10 mồi đơn ISSR (Karuppanapandian et al., 2010) cho mẫu mô sẹo và 1 mồi cho kết quả liên quan đến tính chịu mặn đối với mẫu chồi. Các mồi có trình tự nhƣ sau:

ISSR02: AGAGAGAGAGAGAGAGC

ISSR03: GAGAGAGAGAGAGAGAT

51

ISSR13: AGAGAGAGAGAGAGAGCA

ISSR19: ACACACACACACACACCT

ISSR22: TGTGTGTGTGTGTGTGCC

ISSR27: GGATGGATGGATGGAT

ISSR31: AGAGAGAGAGAGAGT

ISSRK1: GAGAGAGAGAGAGAGACTC

ISSRK2: GTGGTGGTGGTGAC

ISSRK3: GAAGAAGAAGAAGAAGAA

Thành phần và thể tích cho mỗi phản ứng PCR là 25 l (gồm 15,75 l

BiH2O; 2,5 l Buffer ABgen 10X; 1 l dNTPs 20 mM; 2 l MgCl2 25 mM; 0,75 l Taq Polymerase (5 U/l); 1 l mồi 100 mol/l; 2 l DNA 50 ng/l) và chu kỳ gia nhiệt là: 94oC trong 4 phút, sau đó lặp lại 35 chu kỳ nhƣ sau: 94oC trong 30 giây, 50 giây ở nhiệt độ 55oC, 45 giây ở nhiệt độ 72oC, cuối cùng là 72oC trong 7 phút.

Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 3% với sự hiện diện của

SafeView, hiệu điện thế U = 50V. Sau đó, gel đƣợc chụp dƣới đèn cực tím,

các đoạn DNA khuếch đại đƣợc ghi nhận và xác định vị trí các băng DNA

xuất hiện mới hoặc mất đi trên các dòng đƣợc chọn lọc mặn so với dòng đối chứng (không xử lý mặn) (tính bằng bp).

3.2.3.6 Thí nghiệm 10: Đánh giá khả năng sinh trƣởng và phát triển

của các dòng đậu nành chống chịu mặn trong điều kiện nhà lƣới

Vật liệu:

- Cây đậu nành in vitro thu đƣợc sau khi chọn lọc từ thí nghiệm 8. Cây

có chiều cao từ 10-12 cm, có rễ phát triển đầy đủ (Hình 3.5).

52

Hình 3.5: Cây đậu nành chuẩn bị thuần dƣỡng ở nhà lƣới

- Giá thể: Đất (nhà lƣới Bộ môn Sinh lý Sinh hóa), mụn dừa và tro trấu đƣợc trộn theo tỉ lệ 1:1:1 theo kết quả của thí nghiệm 5. Giá thể đƣợc trộn với thuốc COC 85 WP để diệt nấm bệnh và vi khuẩn, rồi cho vào chậu nhựa (đƣờng kính đáy chậu x đƣờng kính miệng chậu x chiều cao chậu là 5x9,5x12 cm), dƣới đáy chậu có khoét 3 lỗ để thoát nƣớc. Cây sau 10 ngày thuần dƣỡng thì đƣợc chuyển sang chậu nhựa có kích thƣớc lớn hơn (đƣờng kính đáy chậu là 10 cm, đƣờng kính miệng chậu là 14 cm, chiều cao chậu 11,5 cm).

Cách tiến hành: Cây con đƣợc rửa sạch agar và nhúng rễ cây với thuốc trừ nấm COC 85 WP. Cây đƣợc trồng vào chậu nhựa có chứa giá thể và dùng bọc nilon lớn trong suốt để trùm kín trong 1 tuần. Phun sƣơng nƣớc ƣớt lá 1-2 lần ngày. Khi cây đã bén rễ (10 ngày), bắt đầu tƣới dinh dƣỡng 1 2 đa lƣợng MS 1 tuần/lần. Xử lý tƣới nƣớc muối NaCl 1 tuần/lần trong 4 tuần, bắt đầu từ tuần thứ 2, sau đó tƣới nƣớc máy cho đến khi thu hoạch. Mỗi lần tƣới là 200 ml/chậu.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố gồm 4 nghiệm thức là dòng cây đậu nành kết hợp với chế độ tƣới nƣớc muối NaCl 0; 2,5 và 5 g/L. Mỗi nghiệm thức lặp lại 12 lần, mỗi lần lặp lại là 1 chậu trồng 1 cây.

Nghiệm thức:

1. Dòng NaCl 0 g/L + Tƣới nƣớc máy (đối chứng)

2. Dòng NaCl 0 g L + Tƣới NaCl 2,5 g/L

3. Dòng NaCl 0 g L + Tƣới NaCl 5 g/L

4. Dòng NaCl 2,5 g L + Tƣới NaCl 2,5 g/L

5. Dòng NaCl 5 g L + Tƣới NaCl 5 g/L

Chỉ tiêu theo dõi:

- Chiều cao chồi gia tăng (cm).

- Số lóng gia tăng.

- Ghi nhận giá trị EC và pH đất: Đo giá trị EC và pH của dung dịch đất

bão hòa nƣớc.

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1 tuần lần trong thời gian 5 tuần.

3.2.3.7 Xử lý số liệu

53

Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel và thống kê bằng chƣơng trình SPSS version 20. Phân tích phƣơng sai ANOVA và kiểm tra sự

khác biệt giữa các trung bình bằng phép kiểm định Duncan ở mức ý nghĩa 1% và 5%.

Các số liệu là tỉ lệ phần trăm biến động từ 0-100% đƣợc chuyển đổi sang

54

dạng Arcsin√x (Gomez and Gomez, 1984).

CHƢƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Nội dung 1: Xác định khả năng chống chịu mặn của một số giống

đậu nành phổ biến ở ĐBSCL

4.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của các giống đậu nành MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4, Nhật 17A và OMĐN 29

Ghi nhận tổng quát điều kiện thí nghiệm tại nhà lƣới cho thấy nhiệt độ trung bình khoảng 37-390C, cƣờng độ ánh sáng trong nhà lƣới lúc 14h là khoảng 50.000 lux. Giá trị EC trung bình của dung dịch đối chứng (NaCl 0 g/L) là 1,5 dS/m. Các nồng độ muối NaCl 1, 2 và 4 g/L có giá trị EC trung bình lần lƣợt là 3,3; 6,4 và 11,1 dS/m. Nhìn chung, các giống đậu nành trồng thủy canh trong dung dịch Hoagland (Taiz và Zeige, 2003) có hàm lƣợng khoáng đa lƣợng giảm 1/2 theo Shereen et al. (2001) với pH của dung dịch là 6,0 và dung dịch đƣợc thay mới 2 tuần/lần, điều kiện nhiệt độ và ánh sánh nêu trên có sự sinh trƣởng bình thƣờng ở nghiệm thức đối chứng, cây không bị sâu bệnh trong quá trình thí nghiệm.

4.1.1.1 Tỉ lệ sống

Bảng 4.1 cho thấy, ở 1 tuần sau khi trồng (SKT), tỉ lệ sống giữa 5 giống đậu nành khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Các nồng độ muối có sự khác biệt về tỉ lệ sống ở mức ý nghĩa 1%. Nồng độ NaCl 4 g/L gây ra sự chết cây (tỉ lệ sống 92%) trong khi các nồng độ muối thấp hơn cây vẫn sống 100%. Tƣơng tác giữa giống và nồng độ muối NaCl khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở thời điểm này.

Ở thời điểm 3 tuần SKT, giữa các giống đậu nành có sự khác biệt về tỉ lệ sống ở mức ý nghĩa 1%. Giống MTĐ 748-1 có tỉ lệ sống cao nhất với 96,3% khác biệt so với 4 giống còn lại (từ 75-85%). Nồng độ muối NaCl tăng dần làm giảm tỉ lệ sống của cây, thấp nhất là mức 4 g/L (chỉ còn 46%) khác biệt ở mức 1% so với nồng độ 2 g L (89%), và nồng độ muối 1 g L (96%). Nồng độ NaCl 0 g L có tỉ lệ sống 100% ở tất cả các giống. Có sự tƣơng tác khác biệt ở mức ý nghĩa 1% giữa các giống và nồng độ NaCl. Ở nghiệm thức NaCl 4 g/L, các giống Nhật 17A, MTĐ 176, MTĐ 760-4 và OMĐN 29 có tỉ lệ sống thấp nhất chỉ khoảng 25% đến 45%.

55

Đến thời điểm 5 tuần SKT, tỉ lệ sống tiếp tục giảm ở các nghiệm thức (Hình 4.1). Giống MTĐ 748-1 cho thấy có khả năng chịu đƣợc mặn cao nhất (tỉ lệ sống 83,8%), không khác biệt so với OMĐN 29 (73,8%) nhƣng khác biệt

có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Giống MTĐ 760-4 chịu mặn thấp nhất với tỉ lệ sống 65%, tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa so với MTĐ 176 (68,8%) và Nhật 17A (70%). Nồng độ muối NaCl 2 và 4 g/L cho tỉ lệ sống khác biệt ý nghĩa ở mức 1% so với nồng độ 1 và 0 g/L. Trong đó, ở nồng độ NaCl 4 g/L cây có tỉ lệ sống thấp nhất, chỉ có 25%. Tƣơng tác giữa giống và các nồng độ muối có sự khác biệt ở mức 1%. Giống OMĐN 29 có tỉ lệ sống cao ở nồng độ muối 1 và 2 g/L (tƣơng ứng là 90,0 và 85,0%) nhƣng chỉ còn 20% ở nồng độ 4 g/L. Giống MTĐ 760-4 vẫn sống 100% ở NaCl 1 g/L nhƣng ở nồng độ 4 g/L thì cây chết hoàn toàn. Giống MTĐ 748-1 có khả năng chịu mặn cao ở nồng độ 4 g/L (tỉ lệ sống 70%).

a

b

d

c

NaCl 0 g/L (a) NaCl 1 g/L (b) NaCl 2 g/L (c)

NaCl 4 g/L (d)

56

Hình 4.1: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên sự sống và sinh trƣởng của 5 giống đậu nành Nhật 17A, MTĐ 748-1, MTĐ 176, MTĐ 760-4, OMĐN 29 (từ phải sang) ở 5 tuần sau khi trồng

Giống và nồng độ NaCl (g/L)

1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 95,0 95,0 100 85,0 85,0 98,8 98,8 100 96,3 96,3 100a 100a 100a 92,0b ns ** ns 10,3

Tuần sau khi trồng 5 3 100a 100a MTĐ 176 + NaCl 0 100a 100a MTĐ 748-1 + NaCl 0 100a 100a MTĐ 760-4 + NaCl 0 100a 100a Nhật 17A + NaCl 0 100a 100a OMĐN 29 + NaCl 0 75,0abcd 80,0ab MTĐ 176 + NaCl 1 95,0ab 100a MTĐ 748-1 + NaCl 1 100a 100a MTĐ 760-4 + NaCl 1 95,0ab 100a Nhật 17A + NaCl 1 90,0abc 100a OMĐN 29 + NaCl 1 75,0abcd 75,0b MTĐ 176 + NaCl 2 70,0cd 95,0ab MTĐ 748-1 + NaCl 2 60,0d 90,0ab MTĐ 760-4 + NaCl 2 75,0bcd 85,0ab Nhật 17A + NaCl 2 85,0abc 100a OMĐN 29 + NaCl 2 25,0e 45,0c MTĐ 176 + NaCl 4 70,0cd 90,0ab MTĐ 748-1 + NaCl 4 0,00e 30,0c MTĐ 760-4 + NaCl 4 10,0e 25,0c Nhật 17A + NaCl 4 20,0e 40,0c OMĐN 29 + NaCl 4 Trung bình (Giống) 68,8b 75,0b MTĐ 176 83,8a 96,3a MTĐ 748-1 65,0b 80,0b MTĐ 760-4 70,0b 77,5b Nhật 17A 73,8ab 85,0b OMĐN 29 Trung bình (Nồng độ NaCl) 100a 100a NaCl 0 91,0a 96,0ab NaCl 1 73,0b 89,0b NaCl 2 25,0c 46,0c NaCl 4 * ** Fgiống ** ** FNaCl ** ** Fgiống x FNaCl CV (%) 35,3 26,9 Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (*): khác biệt ở mức 5%; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.1: Tỉ lệ sống (%) của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.1.1.2 Chiều cao cây

57

Kết quả Bảng 4.2 cho thấy, chiều cao cây ở 1 tuần SKT có sự khác biệt giữa 5 giống và 4 nồng độ muối NaCl ở mức ý nghĩa 1%. Giống MTĐ 760-4 có chiều cao cao nhất là 9,3 cm, khác biệt so với các giống còn lại. Chiều cao

của giống MTĐ 176 thấp nhất với 3,9 cm. Việc xử lý muối NaCl nồng độ từ 1-4 g/L làm giảm chiều cao của cây. Nồng độ 4 g/L làm chiều cây thấp nhất (5,4 cm), trong khi ở đối chứng có chiều cao là 8,3 cm. Không có sự tƣơng tác giữa các giống và nồng độ muối NaCl ở thời điểm này.

Giống và nồng độ NaCl (g/L)

Tuần sau khi trồng 5 3 27,8c 70,7 33,3b 79,8 39,9a 96,6 34,9b 86,8 36,4ab 86,3 19,2d 52,1 27,5c 69,2 34,4b 78,3 23,5c 67,8 26,1c 68,9 14,8def 36,6 16,0de 37,8 26,0c 57,1 18,8d 51,9 18,3d 49,9 8,7g 13,1 11,8efg 22,9 12,0efg - 8,9g 15,0 10,5fg 27,7 43,1c 17,6c 52,4c 22,1b 77,3a 28,1a 55,4b 21,5b 58,2b 22,8b 84,0a 34,4a 67,2b 26,1b 46,7c 18,8c 19,7d 10,4d ** ** ** ** ns ** 21,8 19,2

1 5,3 8,6 10,6 8,6 8,5 3,7 6,8 9,9 7,3 7,4 3,9 5,8 9,1 6,3 6,5 2,6 5,7 7,6 5,7 5,2 3,9c 6,7b 9,3a 6,9b 6,9b 8,3a 7,0b 6,3c 5,4d ** ** ns 17,0

MTĐ 176 + NaCl 0 MTĐ 748-1 + NaCl 0 MTĐ 760-4 + NaCl 0 Nhật 17A + NaCl 0 OMĐN 29 + NaCl 0 MTĐ 176 + NaCl 1 MTĐ 748-1 + NaCl 1 MTĐ 760-4 + NaCl 1 Nhật 17A + NaCl 1 OMĐN 29 + NaCl 1 MTĐ 176 + NaCl 2 MTĐ 748-1 + NaCl 2 MTĐ 760-4 + NaCl 2 Nhật 17A + NaCl 2 OMĐN 29 + NaCl 2 MTĐ 176 + NaCl 4 MTĐ 748-1 + NaCl 4 MTĐ 760-4 + NaCl 4 Nhật 17A + NaCl 4 OMĐN 29 + NaCl 4 Trung bình (Giống) MTĐ 176 MTĐ 748-1 MTĐ 760-4 Nhật 17A OMĐN 29 Trung bình (Nồng độ NaCl) NaCl 0 NaCl 1 NaCl 2 NaCl 4 Fgiống FNaCl Fgiống x FNaCl CV (%) Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê;(**): khác biệt ở mức 1%.

58

Bảng 4.2: Chiều cao cây (cm) của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

Ở 3 tuần SKT, chiều cao cây đều gia tăng đáng kể và có sự khác biệt ý nghĩa ở mức 1% ở các nghiệm thức tƣơng tác giống và nồng độ muối NaCl. Giống MTĐ 760-4 ở cả 4 nồng độ muối đều cho chiều cao cao nhất và giống MTĐ 176 là giống có chiều cao thấp nhất. Trung bình chiều cao giống MTĐ 760-4 là 28,1 cm và giống MTĐ 176 là 17,6 cm. Nồng độ muối tăng dần làm giảm chiều cao cây một cách đáng kể. Chiều cao cây trung bình ở nồng độ 0 g/L là 34,4 cm, giảm chỉ còn lại 10,4 cm ở nồng độ 4 g/L.

Đến 5 tuần SKT, chiều cao khác biệt đáng kể giữa các giống và chịu ảnh hƣởng bởi các nồng độ muối. Giống MTĐ 760-4 vẫn có chiều cao vƣợt trội với 77,3 cm, thấp nhất là 2 giống MTĐ 176 và MTĐ 748-1 (tƣơng ứng là 43,1 và 52,4 cm). Nồng độ muối tăng từ 1-4 g/L làm giảm chiều cao cây, khác biệt ở mức 1% so với đối chứng. Nồng độ 4 g/L ảnh hƣởng đáng kể đến chiều cao cây với trung bình là 19,7 cm so với đối chứng là 84,0 cm. Tƣơng tác giữa giống và muối NaCl khác biệt không có ý nghĩa thống kê.

4.1.1.3 Số lóng trên thân chính

Bảng 4.3 cho thấy, số lóng khác biệt rất ý nghĩa giữa các giống và nồng độ muối NaCl. Sau 1 tuần, số lóng trung bình cao nhất là 1,6 lóng ở giống MTĐ 760-4, thấp nhất là giống MTĐ 176 chỉ có 0,5 lóng. Số lóng của cây ở các nồng độ muối từ 1-4 g/L đạt 1,1-1,2 lóng, ít hơn có ý nghĩa so với nồng độ đối chứng (1,3 lóng).

Ở 3 tuần SKT, số lóng gia tăng ở tất cả các nghiệm thức và có sự tƣơng tác giữa giống và nồng độ muối. Giống MTĐ 760-4 có số lóng cao nhất 8,6 ở nồng độ muối 1 g/L, tuy nhiên không khác biệt so với các giống Nhật 17A và OMĐN 29 ở nồng độ 0 g/L. MTĐ 760-4 cũng có số lóng thấp ở nồng độ NaCl 4 g/L không khác biệt so với giống MTĐ 176. Xét riêng từng nhân tố cho thấy, giống MTĐ 760-4 có số lóng nhiều nhất trong 5 giống và nồng độ NaCl 4 g/L làm cho cây có số lóng thấp nhất.

59

Ảnh hƣởng của các nhân tố này cũng tƣơng tự khi cây đƣợc 5 tuần tuổi. Ở thời điểm này, giống MTĐ 760-4 có số lóng đạt 12,5 lóng, thấp nhất là giống MTĐ 176 chỉ có 7,4 lóng. Số lóng ở nồng độ muối từ 1-4 g/L lần lƣợt là 10,6; 9,7 và 7,0 lóng so với nồng độ 0 g/L là 11,8 lóng. Số lóng trung bình của các giống ở nồng độ không xử lý muối là 11,8 lóng cho thấy sự sinh trƣởng của cây trong điều kiện này bình thƣờng giống với cây trồng ngoài đồng ruộng. Theo Nguyễn Phƣớc Đằng và ctv. (2010), số lóng trên thân chính của các giống đậu nành trồng ở ngoài đồng nằm trong khoảng biến thiên từ 10-14 lóng.

Giống và nồng độ NaCl (g/L)

1 0,6 1,5 1,8 1,5 1,4 0,3 1,4 1,7 1,3 1,2 0,7 0,9 1,6 1,2 1,3 0,5 1,1 1,3 1,4 1,1 0,5c 1,2b 1,6a 1,3b 1,2b

1,3a 1,2b 1,1b 1,1b ** ** ns 35,1

Tuần sau khi trồng 5 3 8,7ghi 5,3fg MTĐ 176 + NaCl 0 11,8bcde 7,4bc MTĐ 748-1 + NaCl 0 13,6a 8,3ab MTĐ 760-4 + NaCl 0 12,7abc 7,8ab Nhật 17A + NaCl 0 12,5abcd 7,8ab OMĐN 29 + NaCl 0 4,1hij 7,9ij MTĐ 176 + NaCl 1 11,1cdef 7,3bcd MTĐ 748-1 + NaCl 1 13,2ab 8,6a MTĐ 760-4 + NaCl 1 9,9fgh 6,6cde Nhật 17A + NaCl 1 11,0def 7,3bcd OMĐN 29 + NaCl 1 4,6gh 8,1ij MTĐ 176 + NaCl 2 8,8ghi 5,7ef MTĐ 748-1 + NaCl 2 10,7ef 7,4bc MTĐ 760-4 + NaCl 2 10,7ef 6,3def Nhật 17A + NaCl 2 10,2efg 6,1ef OMĐN 29 + NaCl 2 5,0k 3,0k MTĐ 176 + NaCl 4 7,4ij 4,1hij MTĐ 748-1 + NaCl 4 3,2jk - MTĐ 760-4 + NaCl 4 7,0j 3,4ijk Nhật 17A + NaCl 4 8,5hij 4,3ghi OMĐN 29 + NaCl 4 Trung bình (Giống) 7,4d 4,2d MTĐ 176 6,1c 9,8c MTĐ 748-1 12,5a 6,9a MTĐ 760-4 10,1b 6,0bc Nhật 17A 10,5b 6,4b OMĐN 29 Trung bình (Nồng độ NaCl) 11,8a 7,3a NaCl 0 10,6b 6,7b NaCl 1 9,7c 6,0c NaCl 2 7,0d 3,6d NaCl 4 ** ** Fgiống ** ** FNaCl ** ** Fgiống x FNaCl CV (%) 13,6 16,4 Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.3: Số lóng trên thân chính của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.1.1.4 Chiều dài rễ

60

Chiều dài rễ bị ảnh hƣởng rất đáng kể bởi nồng độ muối NaCl. Ở 1 tuần SKT, chiều dài rễ thấp nhất ở nồng độ NaCl 2 và 4 g L, khác biệt có ý nghĩa so với nồng độ 0 và 1 g L. Giống OMĐN 29, MTĐ 748-1 và MTĐ 760-4 có

chiều dài rễ cao nhất so với các giống còn lại, trung bình từ 15,8-16,4 cm (Bảng 4.4).

Đến 3 tuần SKT, giống MTĐ 748-1, OMĐN 29 và Nhật 17A có chiều dài rễ cao nhất, giống MTĐ 176 có chiều dài rễ thấp nhất. Nồng độ muối từ 1- 4 g L ảnh hƣởng chiều dài rễ, trong đó nồng độ NaCl 4 g L làm cho cây có chiều dài rễ ngắn nhất (18,0 cm), khác biệt rất ý nghĩa so với môi trƣờng không xử lý muối (37,5 cm). Tƣơng tác giữa giống và nồng độ muối có ý nghĩa 5%. Giống MTĐ 176 ở các nồng độ muối đều có chiều dài rễ thấp nhất, ngƣợc lại với giống MTĐ 748-1 có sinh trƣởng của rễ vƣợt trội nhất.

Ở thời điểm 5 tuần SKT, vẫn có sự khác biệt giữa các giống và nồng độ NaCl về chiều dài rễ. Lúc này, chiều dài rễ của 4 giống Nhật 17A, MTĐ 748- 1, MTĐ 760-4 và OMĐN 29 tốt nhất (trung bình từ 38,8-2,5 cm) và giống MTĐ 176 là thấp nhất (18,9 cm). Nồng độ NaCl từ 1-4 g L ảnh hƣởng đáng kể đến chiều dài rễ, trong đó nồng độ NaCl 4 g L có chiều dài rễ chỉ 26,4 cm trong khi nồng độ 0 g L là 43,6 cm. Không chỉ nồng độ muối NaCl cao làm giảm chiều dài rễ mà sinh trƣởng của rễ bên cũng rất kém (số lƣợng rễ bên rất ít) và rễ có màu sắc đen hơn so với rễ bình thƣờng (Hình 4.2).

c

b

a d

Hình 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl trên sự sinh trƣởng của rễ cây

NaCl 0 g/L (a) NaCl 1 g/L (b) NaCl 2 g/L (c)

NaCl 4 g/L (d)

đậu nành ở 5 tuần sau khi trồng

61

Cũng theo nghiên cứu của Valencia et al. (2008), rễ của cây đậu nành bị stress Cl- có dấu hiệu tổn thƣơng mô ở nồng độ muối NaCl 4,7 g/L. Dấu hiệu tổn thƣơng đƣợc nhận thấy ở chóp rễ và rễ bên. Nhìn chung là hệ thống rễ phát triển nghèo nàn và giảm sự sinh trƣởng của rễ bên, rễ cũng có màu đen hơn ở

các giống ngộ độc Cl- theo dạng Cl- includer (là giống nhạy cảm với Cl-, Cl- đƣợc thu nhận và di chuyển từ rễ lên lá). Tuy nhiên các giống Cl- includer khác thì hệ thống rễ không có dấu hiệu nhƣ vậy khi Cl- vƣợt quá ngƣỡng.

Giống và nồng độ NaCl (g/L)

MTĐ 176 + NaCl 0 MTĐ 748-1 + NaCl 0 MTĐ 760-4 + NaCl 0 Nhật 17A + NaCl 0 OMĐN 29 + NaCl 0 MTĐ 176 + NaCl 1 MTĐ 748-1 + NaCl 1 MTĐ 760-4 + NaCl 1 Nhật 17A + NaCl 1 OMĐN 29 + NaCl 1 MTĐ 176 + NaCl 2 MTĐ 748-1 + NaCl 2 MTĐ 760-4 + NaCl 2 Nhật 17A + NaCl 2 OMĐN 29 + NaCl 2 MTĐ 176 + NaCl 4 MTĐ 748-1 + NaCl 4 MTĐ 760-4 + NaCl 4 Nhật 17A + NaCl 4 OMĐN 29 + NaCl 4 Trung bình (Giống) MTĐ 176 MTĐ 748-1 MTĐ 760-4 Nhật 17A OMĐN 29 Trung bình (Nồng độ NaCl) NaCl 0 NaCl 1 NaCl 2 NaCl 4 Fgiống FNaCl Fgiống x FNaCl CV (%)

1 5,10 18,1 17,3 17,9 18,2 2,27 17,8 17,9 15,6 18,2 1,75 15,5 16,4 14,7 17,8 1,95 12,7 11,7 10,8 11,5 2,8c 15,9ab 15,8ab 14,7b 16,4a 15,3a 14,4ab 13,2b 9,7c ** ** ns 26,7

Tuần sau khi trồng 5 3 19,6fg 27,0 45,7a 51,3 39,4abcd 45,2 40,6abc 46,5 42,2ab 48,2 12,9hi 19,4 35,8bdce 38,8 35,3cde 40,5 35,9bdce 41,0 39,4abcd 46,5 11,1hi 17,1 38,2bcde 46,3 32,3e 38,6 32,9de 41,6 33,9cde 41,2 8,4i 12,1 23,3f 34,9 15,8gh - 20,9fg 26,0 21,7fg 32,7 18,9b 42,8a 41,4a 38,8a 42,1a 43,6a 37,2b 36,9b 26,4c ** ** ns 17,6

12,9c 35,7a 30,7b 32,6ab 34,3a 37,5a 31,8b 29,7b 18,0c ** ** * 20,7

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (*): khác biệt ở mức 5%; (**): khác biệt ở mức 1%.

62

Bảng 4.4: Chiều dài rễ (cm) của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

Kết quả thí nghiệm cho thấy độ mặn với muối NaCl tăng đến 4 g/L ảnh hƣởng rất lớn đến sự sống của cây đậu nành, làm giảm đáng kể chiều cao cây, số lóng và hệ thống rễ phát triển rất kém. Nghiên cứu của Hamayun et al., (2010) cũng cho thấy chiều cao cây, sinh khối và các chỉ tiêu năng suất của cây đậu nành giảm một cách ý nghĩa ở nồng độ muối NaCl 4,1 và 8,2 g/L.

Trong 5 giống đậu nành khảo sát thì giống MTĐ 748-1 có khả năng chịu đƣợc mặn cao. Giống MTĐ 760-4 rất mẫn cảm với mặn. Xét về khả năng sinh trƣởng của 5 giống thì giống MTĐ 760-4 tỏ ra vƣợt trội về các đặc điểm nông học nhƣ chiều cao cây trung bình là 77,3 cm (các giống còn lại từ 43,1-58,2 cm), số lóng trên thân chính 12,5 lóng (các giống khác từ 7,4-10,5 lóng) và chiều dài rễ cũng khá cao 41,4 cm (các giống khác từ 18,9-42,8 cm). Cũng theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Phƣớc Đằng và ctv. (2010), trong 12 giống đƣợc khảo sát trồng ở điều kiện tự nhiên, trong đó có MTĐ 176, MTĐ 748-1 thì giống MTĐ 760-4 có nhiều ƣu điểm vƣợt trội về các đặc tính nông học, sinh trƣởng cũng nhƣ các thành phần năng suất và năng suất nên đƣợc tác giả đề nghị khẩn trƣơng nhân nhanh giống MTĐ 760-4 để đƣa vào sản xuất.

Hình 4.3: Triệu chứng ngộ độc mặn (NaCl 4 g/L) trên lá đậu nành ở 5 tuần sau khi trồng

63

Bên cạnh đó, triệu chứng trên lá cũng là một đặc điểm khác biệt giữa các cây bị ảnh hƣởng của mặn cao. Theo Valencia et al. (2008), các giống nhạy cảm với Cl- là Williams, Clark, HBK R4924, và Dare biểu hiện sự úa vàng trong khi gân lá vẫn còn xanh hoặc xanh nhạt. Ngƣợc lại, các giống chống chịu Cl- nhƣ S-100, Lee 68, và HBK R5525 có lá xanh khỏe mạnh. Thêm vào đó, triệu chứng stress Cl- bao gồm lá vàng sớm, cháy mép và chóp lá, theo sau là sự rụng lá. Trong thí nghiệm này, hầu hết các cây đậu nành ở các nghiệm thức muối NaCl 0 và 1 g/L có đặc điểm lá bình thƣờng, xanh tốt trong khi các giống ở nồng độ muối 4 g/L có lá trƣởng thành thịt lá bị vàng, gân lá còn xanh, sau đó cháy chóp và bìa lá và theo sau là sự rụng lá (Hình 4.3).

Nhìn chung, nồng độ muối NaCl 2 và 4 g/L ảnh hƣởng đáng kể đến tỉ lệ sống và sinh trƣởng của cây đậu nành. Chiều cao cây, số lóng đều giảm mạnh, hệ thống rễ phát triển rất kém. Giống MTĐ 760-4 nhạy cảm nhất đối với mặn (chết hoàn toàn) và giống MTĐ 748-1 có khả năng chịu đƣợc mặn cao ở nồng độ muối 4 g/L (tỉ lệ sống 70,0%). Triệu chứng ngộ độc mặn trên lá của cây đậu nành là lá trƣởng thành có thịt lá bị vàng, gân lá còn xanh, cháy chóp lá và bìa lá và theo sau là sự rụng lá.

4.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của các giống đậu nành ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-3 và MTĐ 885-2

Ghi nhận tổng quát cho thấy các giống đậu nành ở nghiệm thức đối chứng sinh trƣởng bình thƣờng trong điều kiện thí nghiệm tại nhà lƣới có nhiệt độ trung bình khoảng 37-390C, cƣờng độ ánh sáng trong nhà lƣới lúc 14h là khoảng 55.000 lux. Tuy nhiên do cây sinh trƣởng tốt và mật độ trồng hơi dày, nên có thể thiếu không gian cho cây phát triển, một số cây có thân ốm và lóng dài hơn.

4.1.2.1 Tỉ lệ sống

Kết quả Bảng 4.5 cho thấy muối NaCl chƣa có ảnh hƣởng đến sinh

trƣởng của 5 giống ở 1 tuần SKT, cả 5 giống đậu nành đều sống 100%.

Đến 2 tuần SKT, tỉ lệ sống ở các giống bắt đầu giảm khi nồng độ muối gia tăng. Ở nồng độ NaCl 2 và 4 g/L, tỉ sống trung bình của 5 giống giảm chỉ còn 64-68%, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nồng độ muối 0 và 1 g/L. Xét về giống, MTĐ 720 và ĐH 4 có tỉ lệ sống cao nhất với trên 90%. Ở thời điểm này có sự tƣơng tác giữa giống và nồng độ muối NaCl. Ở nồng độ muối 4 g/L giống MTĐ 720 và ĐH 4 có tỉ lệ sống cao nhất (tƣơng ứng là 75 và 85%), trong khi giống MTĐ 860-1 giảm thấp nhất chỉ còn 35%.

64

Ở 5 tuần SKT, tỉ lệ sống ở các giống tiếp tục giảm mạnh khi tăng nồng độ muối (Hình 4.4). Cụ thể, 5 giống đậu nành này có tỉ lệ sống trung bình chỉ 33% ở muối 4 g/L, tiếp đến là 43% ở muối 2 g/L, và muối 1 g/L không có ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của cây. Giống ĐH 4 và MTĐ 720 chứng tỏ là giống ít chịu ảnh hƣởng bởi mặn so với các giống còn lại (tỉ lệ sống tƣơng ứng là 76,3 và 75%), giống MTĐ 878-3 chịu mặn kém nhất với tỉ lệ sống giảm còn 58,8%. Không có sự tƣơng tác giữa giống và nồng độ muối NaCl ở thời điểm này.

Giống và nồng độ NaCl (g/L)

ĐH 4 + NaCl 0 MTĐ 720 + NaCl 0 MTĐ 860-1 + NaCl 0 MTĐ 878-3 + NaCl 0 MTĐ 885-2 + NaCl 0 ĐH 4 + NaCl 1 MTĐ 720 + NaCl 1 MTĐ 860-1 + NaCl 1 MTĐ 878-3 + NaCl 1 MTĐ 885-2 + NaCl 1 ĐH 4 + NaCl 2 MTĐ 720 + NaCl 2 MTĐ 860-1 + NaCl 2 MTĐ 878-3 + NaCl 2 MTĐ 885-2 + NaCl 2 ĐH 4 + NaCl 4 MTĐ 720 + NaCl 4 MTĐ 860-1 + NaCl 4 MTĐ 878-3 + NaCl 4 MTĐ 885-2 + NaCl 4 Trung bình (Giống) ĐH 4 MTĐ 720 MTĐ 860-1 MTĐ 878-3 MTĐ 885-2 Trung bình (Nồng độ NaCl) NaCl 0 NaCl 1 NaCl 2 NaCl 4 Fgiống FNaCl Fgiống x FNaCl CV (%)

1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Tuần sau khi trồng 5 3 100a 100 100a 100 100a 100 100a 100 100a 100 100a 100 100a 100 100a 100 80,0abc 70,0 90,0ab 80,0 75,0abc 60,0 95,0a 60,0 40,0de 30,0 65,0bcd 35,0 65,0bcd 30,0 85,0abc 45,0 75,0abc 40,0 35,0e 15,0 60,0cde 30,0 65,0bcd 35,0 76,3a 90,0a 75,0ab 92,5a 61,3bc 68,8b 58,8d 76,3b 61,3bc 80,0ab 100a 100a 90,0a 94,0a 43,0b 68,0b 33,0b 64,0b * ** ** ** ns * 47,5 35,1

Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (*): khác biệt ở mức 5%; (**): khác biệt ở mức 1%.

65

Bảng 4.5: Tỉ lệ sống (%) của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

b

a

Hình 4.4: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên sự sống và sinh trƣởng của 5 giống đậu nành ở 5 tuần sau khi trồng NaCl 0 g/L (a) NaCl 4 g/L (b)

4.1.2.2 Chiều cao cây

Bảng 4.6 cho thấy, ở 1 tuần SKT, có sự khác biệt về chiều cao cây ở các giống và ở nồng độ muối NaCl. Chiều cao cây giảm khi tăng nồng độ muối và hai giống MTĐ 885-2 và ĐH 4 có chiều cây cao nhất với trung bình là 10,7 và 10,5 cm. Có sự tƣơng tác giữa giống và nồng độ muối lên chiều cao cây. Giống MTĐ 860-1 có chiều cao cây thấp nhất ở nồng độ muối 2 và 4 g/L.

Đến 3 tuần SKT, mức độ mặn càng cao thì chiều cao cây cũng càng giảm. Ở nồng độ đối chứng 0 g/L, chiều cao cây trung bình là 36,5 cm, giảm còn 18,2 cm ở muối 4 g/L. Giống MTĐ 885-2 và ĐH 4 có chiều cao ít bị ảnh hƣởng bởi mặn, với chiều cao trung bình tƣơng ứng là 29,0 và 31,4 cm. Có sự tƣơng tác giữa giống và nồng độ muối lên chiều cao cây. Ở nồng độ muối 4 g/L, hầu hết các giống đều có chiều cao cây thấp. Trong đó, giống MTĐ 860-1 bị ảnh hƣởng nhiều nhất ở nồng độ muối 2 và 4 g/L với chiều cao tƣơng ứng là 16,7 và 14,9 cm ở nồng độ 4 g/L. Giống MTĐ 720 cũng có chiều cao cây thấp ở muối 4 g/L (18,1 cm).

66

Ở 5 tuần SKT, ảnh hƣởng của mặn cũng theo chiều hƣớng nhƣ ban đầu. Nồng độ muối tăng làm giảm chiều cao cây. Chiều cao cây trung bình ở nồng độ đối chứng 0 g/L là 83,2 cm, trong khi ở nồng độ muối 4 g/L là 30,9 cm. Hai giống MTĐ 885-2 và ĐH 4 có chiều cao ít bị ảnh hƣởng bởi mặn (chiều cao cao nhất với 58,6 và 60,6 cm). Giống MTĐ 860-1 vẫn là giống có chiều cao thấp nhất (trung bình chỉ 37,3 cm). Ở nồng độ muối 4 g/L, giống MTĐ 878-3 và MTĐ 860-1 có chiều cao chỉ đạt 26,2 và 24,7 cm.

Giống và nồng độ NaCl (g/L)

ĐH 4 + NaCl 0 MTĐ 720 + NaCl 0 MTĐ 860-1 + NaCl 0 MTĐ 878-3 + NaCl 0 MTĐ 885-2 + NaCl 0 ĐH 4 + NaCl 1 MTĐ 720 + NaCl 1 MTĐ 860-1 + NaCl 1 MTĐ 878-3 + NaCl 1 MTĐ 885-2 + NaCl 1 ĐH 4 + NaCl 2 MTĐ 720 + NaCl 2 MTĐ 860-1 + NaCl 2 MTĐ 878-3 + NaCl 2 MTĐ 885-2 + NaCl 2 ĐH 4 + NaCl 4 MTĐ 720 + NaCl 4 MTĐ 860-1 + NaCl 4 MTĐ 878-3 + NaCl 4 MTĐ 885-2 + NaCl 4 Trung bình (Giống) ĐH 4 MTĐ 720 MTĐ 860-1 MTĐ 878-3 MTĐ 885-2 Trung bình (Nồng độ NaCl) NaCl 0 NaCl 1 NaCl 2 NaCl 4 Fgiống FNaCl Fgiống x FNaCl CV (%)

1 11,9b 10,3bcde 11,6b 10,5bcd 14,1a 11,6b 8,9defghi 9,3defgh 11,4bc 10,3bcde 9,7cdefg 9,4defgh 7,3i 9,2defghi 7,9ghi 8,7defghi 8,5efghi 7,7hi 8,1fghi 10,4bcdef 10,5ab 9,3c 8,9c 9,8bc 10,7a 11,7a 10,3b 8,7c 8,7c ** ** ** 18,6

Tuần sau khi trồng 5 3 85,5b 42,3a 91,4ab 32,4bc 55,1de 28,4cd 78,5b 27,9cd 105,6a 46,9a 75,4bc 36,8b 53,9de 24,9def 30,9fg 20,4fg 45,6defg 24,8def 59,6cd 28,9cd 50,9def 27,0cde 39,9defg 20,9efg 38,4efg 16,7g 31,8fg 18,6fg 31,9fg 19,3fg 30,8fg 19,6fg 35,2efg 18,1g 24,7g 14,9g 26,2g 1g 37,3efg 21,0efg 60,6a 31,4a 55,1bc 24,1b 37,3d 20,1b 45,5b 22,1b 58,6ab 29,0a 83,2a 35,6a 53,1b 27,2b 38,6c 20,5c 30,9d 18,2d ** ** ** ** ** ** 30,1 23,0

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.6: Chiều cao cây (cm) của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.1.2.3 Số lóng trên thân chính

67

Ở 2 tuần SKT, mặn có ảnh hƣởng đến số lóng trên thân chính của 5 giống đậu nành này. Số lóng cũng giảm khi tăng nồng độ muối. Ở muối 4 g/L, số lóng giảm chỉ còn 1,6 lóng so với đối chứng là 2,3 lóng. Giống ĐH 4 có số lóng nhiều nhất với 2,5 lóng. Đến 3 tuần SKT, số lóng ở nồng độ muối 0 g/L

là 4,4 lóng, giảm chỉ còn 2,7 lóng ở nồng độ muối 4 g/L. Giống ĐH 4 có số lóng nhiều nhất với trung bình là 4,3 lóng. Không có sự tƣơng tác giữa giống và nồng độ muối lên số lóng.

Giống và nồng độ NaCl (g/L)

ĐH 4 + NaCl 0 MTĐ 720 + NaCl 0 MTĐ 860-1 + NaCl 0 MTĐ 878-3 + NaCl 0 MTĐ 885-2 + NaCl 0 ĐH 4 + NaCl 1 MTĐ 720 + NaCl 1 MTĐ 860-1 + NaCl 1 MTĐ 878-3 + NaCl 1 MTĐ 885-2 + NaCl 1 ĐH 4 + NaCl 2 MTĐ 720 + NaCl 2 MTĐ 860-1 + NaCl 2 MTĐ 878-3 + NaCl 2 MTĐ 885-2 + NaCl 2 ĐH 4 + NaCl 4 MTĐ 720 + NaCl 4 MTĐ 860-1 + NaCl 4 MTĐ 878-3 + NaCl 4 MTĐ 885-2 + NaCl 4 Trung bình (Giống) ĐH 4 MTĐ 720 MTĐ 860-1 MTĐ 878-3 MTĐ 885-2 Trung bình (Nồng độ NaCl) NaCl 0 NaCl 1 NaCl 2 NaCl 4 Fgiống FNaCl Fgiống x FNaCl CV (%)

2 2,9 2,3 2,0 1,6 2,7 2,8 2,0 1,7 2,2 1,6 2,2 1,9 1,7 1,4 0,9 2,1 1,3 1,2 1,5 1,8 2,5a 1,9b 1,6b 1,7b 1,7b 2,3a 2,0a 1,6b 1,6b ** ** ** 35,1

Tuần sau khi trồng 5 3 8,5a 5,0 9,3bcd 4,5 7,2cdef 4,1 8,8defgh 4,0 7,8abc 4,3 7,6ab 5,1 7,7cdef 3,9 5,5defg 3,3 6,8bcd 3,7 6,1defgh 3,6 6,2bcd 4,1 6,4defg 3,9 5,2defg 3,0 5,9efgh 2,3 4,3h 2,6 5,7bcde 3,2 6,0fgh 2,7 3,3gh 2,4 4,6defgh 2,5 4,3defg 2,8 6,9a 4,3a 7,4a 3,8b 5,3b 3,2bc 6,5a 3,1c 5,6b 3,3bc 8,3a 4,4a 6,7b 3,9b 5,6c 3,2c 4,8d 2,7d ** ** ** ** ns ns 19,7 25,3

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.7: Số lóng trên thân chính của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối NaCl ở 2, 3 và 5 tuần SKT

68

Ở thời điểm 5 tuần SKT, số lóng trên thân chính cũng giảm khi tăng nồng độ muối. Nồng độ đối chứng có số lóng trung bình là 8,3 lóng. Ở muối 1

g/L đã cho sự khác biệt về số lóng với kết quả giảm còn 6,7 lóng và tiếp tục giảm ở nồng độ 4 g/L chỉ còn 4,8 lóng. Giống ĐH 4, MTĐ 720 và MTĐ 878-3 có số lóng nhiều nhất với trung bình từ 6,5-7,4 lóng. Giống MTĐ 860-1 là giống có số lóng trên thân chính thấp nhất ở nồng độ muối 4 g/L, với 3,3 lóng (Bảng 4.7).

4.1.2.4 Chiều dài rễ

Ảnh hƣởng của muối NaCl lên chiều dài rễ của 5 giống đậu nành đƣợc trình bày ở Bảng 4.8. Kết quả cho thấy, tuần đầu tiên sau khi xử lý mặn, chiều dài rễ chỉ bị giảm ở nồng độ muối 2 g L, trong khi nồng độ muối 4 g L không có ảnh hƣởng. Cả 5 giống đậu nành đều có chiều dài rễ tƣơng tự nhau.

Đến 3 tuần SKT, chiều dài rễ của các giống tăng nhƣng bị ảnh hƣởng bởi mặn. Nồng độ muối 2 và 4 g L làm giảm chiều dài rễ khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và nồng độ 1 g L (tƣơng ứng là 27,0 và 29,3 cm so với 32,8 cm ở đối chứng). Giống ĐH 4 có chiều dài rễ tốt nhất với 32,2 cm, khác biệt có ý nghĩa so với giống MTĐ 878-3 có chiều dài rễ thấp nhất (27,5 cm) và giống MTĐ 885-2 (29,9 cm). Không có sự tƣơng tác giữa các giống và nồng muối NaCl lên chiều dài rễ.

Ở 5 tuần SKT, chiều dài rễ ở nồng độ mặn 2 và 4 g L giảm có ý nghĩa so với đối chứng. Cả 5 giống đều không khác biệt về chiều dài rễ ở thời điểm này, chiều dài rễ trung bình từ 36,4-38,6 cm.

69

Nhìn chung, nồng độ muối NaCl từ 2-4 g/L ảnh hƣởng đáng kể đến tỉ lệ sống và sinh trƣởng của 5 giống đậu nành MTĐ 878-3, MTĐ 885-2, MTĐ 720, MTĐ 860-1 và ĐH 4. Chiều cao cây, số lóng trên thân chính, chiều dài rễ đều giảm mạnh. Giống ĐH 4 và MTĐ 720 có khả năng chịu mặn cao nhất, với tỉ lệ sống tƣơng ứng là 76,3 và 75,0% sau 5 tuần gieo trồng. Giống MTĐ 878- 3 nhạy cảm với mặn (tỉ lệ sống là 58,8%). Theo nhận định của Abel and MacKenzie (1964), Chang et al. (1994), các đặc tính nông học của đậu nành có thể bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi độ mặn cao nhƣ giảm chiều cao, số lóng và sinh khối của cây. Kết quả của Kondetti et al. (2012) cũng cho thấy mặn có ảnh hƣởng bất lợi cho sự nảy mầm và các chỉ tiêu sinh lý của cây đậu nành nhƣ chiều dài rễ và chiều cao chồi ở giai đoạn sinh trƣởng sớm của cây con.

Giống và nồng độ NaCl (g/L)

ĐH 4 + NaCl 0 MTĐ 720 + NaCl 0 MTĐ 860-1 + NaCl 0 MTĐ 878-3 + NaCl 0 MTĐ 885-2 + NaCl 0 ĐH 4 + NaCl 1 MTĐ 720 + NaCl 1 MTĐ 860-1 + NaCl 1 MTĐ 878-3 + NaCl 1 MTĐ 885-2 + NaCl 1 ĐH 4 + NaCl 2 MTĐ 720 + NaCl 2 MTĐ 860-1 + NaCl 2 MTĐ 878-3 + NaCl 2 MTĐ 885-2 + NaCl 2 ĐH 4 + NaCl 4 MTĐ 720 + NaCl 4 MTĐ 860-1 + NaCl 4 MTĐ 878-3 + NaCl 4 MTĐ 885-2 + NaCl 4 Trung bình (Giống) ĐH 4 MTĐ 720 MTĐ 860-1 MTĐ 878-3 MTĐ 885-2 Trung bình (Nồng độ NaCl) NaCl 0 NaCl 1 NaCl 2 NaCl 4 Fgiống FNaCl Fgiống x FNaCl CV (%)

1 15,1 12,8 12,8 10,8 12,6 14,5 12,7 13,8 12,6 11,9 12,5 11,6 10,7 11,8 9,4 13,0 12,8 13,0 12,2 13,9 13,8 12,5 12,6 11,9 11,9 12,8a 13,1a 11,2b 12,9a ns ** ns 24,9

Tuần sau khi trồng 5 3 43,4 36,9 39,8 32,1 39,3 32,4 38,5 30,1 41,6 32,3 39,8 32,9 38,7 31,8 39,6 31,9 37,2 30,5 39,7 31,8 35,1 28,2 36,5 29,4 36,1 28,5 2 23,4 33,6 25,6 38,5 30,8 38,4 30,9 33,6 29,2 35,7 25,9 38,6 29,9 32,2a 39,2 31,1ab 38,3 30,5ab 37,2 27,5c 36,4 29,9b 38,4 40,5a 32,8a 39,0ab 31,8a 35,1c 27,0c 37,0b 29,3b ns ** ** ** ns ns 9,8 10,9

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.8: Chiều dài rễ (cm) của các giống đậu nành ảnh hƣởng bởi muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

70

Mục tiêu của nội dung này là xác định khả năng chống chịu mặn của một số giống đậu nành phổ biến ở ĐBSCL. Kết quả đã xác định đƣợc các giống chịu mặn cao và giống nhạy cảm với mặn. Trong đó, các giống MTĐ 748-1, ĐH 4 và MTĐ 720 có khả năng chịu mặn cao ở nồng độ muối NaCl 4 g/L, giống MTĐ 878-3 nhạy cảm với mặn và giống MTĐ 760-4 chết hoàn toàn ở

nồng độ muối này. Bên cạnh đó, kết quả qua 2 thí nghiệm cũng đã xác định đƣợc giống nhạy cảm nhất đối với mặn là MTĐ 760-4 để dùng làm đối tƣợng trong nghiên cứu chọn lọc tính chống chịu mặn ở nội dung 2 và 3 nhằm cải thiện đặc tính chống chịu mặn của giống không chịu mặn này. Giống MTĐ 760-4 không sống đƣợc ở nồng độ NaCl 4 g/L, trong khi giống MTĐ 878-3 có thể sống đƣợc 30,0% ở nồng độ này. Hơn nữa, kết quả thí nghiệm cũng cho thấy MTĐ 760-4 là giống có nhiều ƣu điểm vƣợt trội về các đặc tính nông học, sinh trƣởng nhƣ chiều cao cây, số lóng trên thân chính và chiều dài rễ so với các giống còn lại.

4.2 Nội dung 2: Xác định môi trƣờng nuôi cấy mô cây đậu nành

thích hợp để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phƣơng pháp chọn lọc

4.2.1 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của 2,4-D và BA lên sự hình thành

mô sẹo từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4

Nhìn chung, mẫu tử diệp giống đậu nành MTĐ 760-4 khi nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung 2,4-D từ 1,25-10 mg L kết hợp với BA 0; 0,5 và 1 mg L có sự hình thành các dạng hình thái khác nhau. Bên cạnh sự tạo mô sẹo là chủ yếu, mẫu cấy còn có sự tạo rễ.

4.2.1.1 Tỉ lệ tạo mô sẹo

Kết quả cho thấy, trên môi trƣờng MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng 2,4-D và BA, mẫu tử diệp bắt đầu có sự hình thành mô sẹo vào thời điểm 1 tuần sau khi cấy (SKC). Đầu tiên mẫu tử diệp bắt đầu cong lên và sau đó xuất hiện mô sẹo ở bề mặt mẫu tiếp xúc trực tiếp với môi trƣờng (mặt dƣới). Sau đó mô sẹo hình thành khắp mặt dƣới mẫu cấy. Mô sẹo có màu trắng, xốp và tƣơng đối rời rạc (Hình 4.5).

Rễ

Mô sẹo xốp

71

Hình 4.5: Sự hình thành mô sẹo từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4 trên môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D 5 mg L ở 2 tuần sau khi cấy

Bảng 4.9 cho thấy, ở 1 tuần SKC, tỉ lệ tạo mô sẹo không khác biệt giữa các nồng độ 2,4-D nhƣng có sự khác biệt giữa các nồng độ BA ở mức ý nghĩa 1%. Môi trƣờng chỉ bổ sung 2,4-D, không kết hợp BA cho tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất, trung bình là 86,3%, kế đến là các môi trƣờng bổ sung 2,4-D kết hợp với BA 0,5 mg/L (71,3%), và thấp nhất là khi kết hợp với BA 1 mg L (40,6%).

Nồng độ 2,4-D và BA (mg/L)

1 82,5 90,0 82,5 90,0 80,0 70,0 67,5 67,5 65,0 35,0 45,0 17,5 75,8 65,0 65,0 58,3 86,3a 71,3b 40,6c ns ** ns 45,2

2 100 95,0 95,0 90,0 100 92,5 95,0 97,5 100 95,0 100 82,5 100 94,2 96,7 90,0 95,0 96,3 94,4 ns ns ns 16,3

Tuần sau khi cấy 4 100 97,5 95,0 97,5 100 92,5 97,5 97,5 100 100 100 85,0 100 96,7 97,5 93,3 97,5 96,9 96,3 ns ns ns 13,3

3 100 95,0 95,0 90,0 100 92,5 95,0 97,5 100 100 100 82,5 100 95,8 96,7 90,0 95,0 96,3 95,6 ns ns ns 16,3

2,4-D 1,25 + BA 0 2,4-D 2,5 + BA 0 2,4-D 5 + BA 0 2,4-D 10 + BA 0 2,4-D 1,25 + BA 0,5 2,4-D 2,5 + BA 0,5 2,4-D 5 + BA 0,5 2,4-D 10 + BA 0,5 2,4-D 1,25 + BA 1 2,4-D 2,5 + BA 1 2,4-D 5 + BA 1 2,4-D 10 + BA 1 Trung bình (2,4-D) 2,4-D 1,25 2,4-D 2,5 2,4-D 5 2,4-D 10 Trung bình (Nồng độ BA) BA 0 BA 0,5 BA 1 F2,4-D FBA F2,4-D x FBA CV (%)

Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.9: Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi 2,4-D và BA ở 1, 2, 3 và 4 tuần SKC

Từ 2-4 tuần SKC, tỉ lệ tạo mô sẹo có sự gia tăng ở các nghiệm thức. Nồng độ 2,4-D cũng nhƣ BA khi bổ sung kết hợp không có ảnh hƣởng khác biệt lên sự tạo mô sẹo của tử diệp đậu nành MTĐ 760-4. Tỉ lệ tạo mô sẹo đạt từ 85-100% ở các nghiệm thức.

72

Phản ứng tạo mô sẹo là một phản ứng thƣờng gặp trong công nghệ nuôi cấy mô, đặc biệt là trong môi trƣờng MS có chất kích thích mạnh nhƣ 2,4-D. Nguyên lý của phản ứng tạo mô sẹo chính là quá trình phản phân hóa tế bào

(Sun et al., 2000). Hiệu quả tạo mô sẹo của 2,4-D đã đƣợc ứng dụng trong rất nhiều nghiên cứu.

Cấu trúc và màu sắc mô sẹo ở nghiệm thức có bổ sung 2,4-D đơn nồng độ từ 1,25-10 mg L có dạng xốp, tƣơng đối rời rạc, màu vàng xanh. Sự kết hợp 2,4-D và BA cho mô sẹo có dạng cứng, chặc, màu vàng xanh. Nhìn chung, những mẫu mô sẹo dạng xốp, rời rạc thích hợp cho mục đích dùng làm vật liệu chọn lọc mặn vì tế bào dễ tiếp xúc hơn với tác nhân chọn lọc có trong môi trƣờng nuôi cấy.

4.2.1.2 Tỉ lệ tạo rễ

Kết quả Bảng 4.10 cho thấy, ở 2 tuần SKC, mẫu tử diệp có sự tạo rễ khác biệt giữa các nồng độ 2,4-D và BA. Nồng độ 2,4-D thấp (1,25 mg L) cho tỉ lệ tạo rễ cao nhất. Tỉ lệ tạo rễ giảm khi tăng nồng độ 2,4-D và ở nồng độ 2,4-D 10 mg L không có sự tạo rễ. Nồng độ BA tăng cũng làm giảm tỉ lệ tạo rễ (giảm từ 66,3% ở nồng độ 0 đến 3,8% ở nồng độ 1 mg L). Có sự tƣơng tác giữa các nghiệm thức bổ sung 2,4-D kết hợp với BA. Nghiệm thức 2,4-D 1,25 mg L không kết hợp BA cho tỉ lệ tạo rễ cao nhất, đạt 100%. Nghiệm thức 2,4- D 10 mg L đơn hoặc bổ sung BA hay nghiệm thức 2,4-D 2,5 và 5 mg L kết hợp bổ sung BA 0,5 và 1 mg L không có sự tạo rễ.

73

Ở 4 tuần SKC, tỉ lệ tạo rễ đạt 100% ở tất cả các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4-D đơn, nghiệm thức 2,4-D 5 và 10 mg L kết hợp BA 0,5 và 1 mg L không có sự tạo rễ. Kết quả này có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 1%. Các nồng độ 2,4- D và BA bổ sung có ảnh hƣởng đến sự tạo rễ. Nồng độ 2,4-D thấp (1,25 mg L) và BA thấp (0 mg L) có hiệu quả tạo rễ đối với mẫu tử diệp đậu nành.

Nồng độ 2,4-D và BA (mg/L)

Tuần sau khi cấy 4 100a 100a 100a 100a 44,4b 6,9d 0d 0d 17,5c 2,5d 0d 0d 53,9a 36,4b 33,3b 33,3b 100a 12,8b 5,0c ** ** ** 28,3

2 100a 87,5b 77,5c 0e 19,4d 0e 0e 0e 15,0de 0e 0e 0e 44,8a 29,2b 25,8b 0c 66,3a 4,9b 3,8b ** ** ** 56,2

2,4-D 1,25 + BA 0 2,4-D 2,5 + BA 0 2,4-D 5 + BA 0 2,4-D 10 + BA 0 2,4-D 1,25 + BA 0,5 2,4-D 2,5 + BA 0,5 2,4-D 5 + BA 0,5 2,4-D 10 + BA 0,5 2,4-D 1,25 + BA 1 2,4-D 2,5 + BA 1 2,4-D 5 + BA 1 2,4-D 10 + BA 1 Trung bình (2,4-D) 2,4-D 1,25 2,4-D 2,5 2,4-D 5 2,4-D 10 Trung bình (Nồng độ BA) BA 0 BA 0,5 BA 1 F2,4-D FBA F2,4-D x FBA CV (%)

Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.10: Tỉ lệ tạo rễ (%) từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi 2,4-D và BA ở 2 và 4 tuần SKC

74

Thí nghiệm cho thấy vai trò của auxin, cụ thể là chất điều điều hòa sinh trƣởng 2,4-D trong sự kích thích tạo rễ, sự tạo mô sẹo của mẫu cấy. Trong đó, mô sẹo có cấu trúc dạng xốp, rời rạc thích hợp dùng vật liệu cho nghiên cứu chọn lọc tính kháng xuất hiện trên môi trƣờng chỉ bổ sung 2,4-D đơn. Kết quả cho thấy, môi trƣờng 2,4-D nồng độ 5 mg/L cho mô sẹo dạng xốp, rời rạc và sinh khối của mô sẹo cũng vƣợt trội hơn so với các nghiệm thức khác, vì vậy mô sẹo ở nghiệm thức này đƣợc chọn để nhân số lƣợng, dùng làm vật liệu phục vụ cho Nội dung 3.

4.2.2 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của NAA và khoáng đa lƣợng đến sự

tạo rễ từ đoạn thân đậu nành MTĐ 760-4

4.2.2.1 Tỉ lệ tạo rễ

Nồng độ NAA (mg L) và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng

NAA 0 + MS NAA 0,1 + MS NAA 0,2 + MS NAA 0,4 + MS NAA 0 + 1/2 MS NAA 0,1 + 1/2 MS NAA 0,2 + 1/2 MS NAA 0,4 + 1/2 MS Trung bình (NAA) NAA 0 NAA 0,1 NAA 0,2 NAA 0,4 Trung bình (đa lƣợng) MS 1/2 MS FNAA Fđa lƣợng FNAA x Fđa lƣợng CV (%)

Tuần sau khi cấy 4 48,9bc 56,4b 90,9a 90,9a 26,6cd 17,7d 77,4a 43,1bc 37,7c 37,0c 84,1a 67,0b 71,8a 41,2b * * ** 34,9

2 35,3 35,6 73,5 59,3 24,7 17,7 54,0 37,2 30,0c 26,7c 63,8a 48,2b 50,9a 33,4b * * ns 42,7

Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (*): khác biệt ở mức 5%; (**): khác biệt ở mức 1%.

Kết quả thống kê ở Bảng 4.11 cho thấy, ở 2 tuần SKC, nồng độ NAA có ảnh hƣởng đến tỉ lệ tạo rễ của chồi cây đậu nành. Nồng độ NAA 0,2 mg/L cho chồi có tỉ lệ tạo rễ cao nhất (63,8%) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các nghiệm thức còn lại. Tỉ lệ tạo rễ ở các nồng độ NAA 0 và 0,1 mg/L là thấp nhất (30,0% và 26,7%). Hàm lƣợng khoáng đa lƣợng cũng ảnh hƣởng đến tỉ lệ tạo rễ của chồi cây đậu nành. Chồi đƣợc cấy trên môi trƣờng có hàm lƣợng khoáng MS cho tỉ lệ tạo rễ cao (50,9%) so với chồi đƣợc cấy trên môi trƣờng có hàm lƣợng khoáng 1/2 MS (30,4%). Giữa nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng không có sự tƣơng tác lên tỉ lệ tạo rễ của chồi đậu nành. Bảng 4.11: Tỉ lệ tạo rễ (%) của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi NAA và khoáng đa lƣợng ở 2 và 4 tuần SKC

75

Tại thời điểm 4 tuần SKC tỉ lệ chồi tạo rễ tiếp tục gia tăng. Nhân tố NAA có ảnh hƣởng đến sự tạo rễ của chồi cây đậu nành. Tỉ lệ tạo rễ cao nhất (84,1%) ở môi trƣờng có bổ sung NAA 0,2 mg/L, khác biệt có ý nghĩa so với

NAA 0,4 mg/L (67,0%) và thấp nhất là ở nồng độ NAA 0 và 0,1 mg/L (37,7% và 37,0%). Hàm lƣợng khoáng đa lƣợng cũng ảnh hƣởng đến tỉ lệ tạo rễ của chồi cây đậu nành. Chồi đƣợc cấy trên môi trƣờng có hàm lƣợng khoáng đa lƣợng MS có tỉ lệ tạo rễ (71,8%) cao hơn so với chồi đƣợc cấy trên môi trƣờng có hàm lƣợng khoáng đa lƣợng 1/2 MS (41,2%). Có sự tƣơng tác giữa nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng đến tỉ lệ tạo rễ. Chồi đậu nành tạo rễ cao nhất ở môi trƣờng MS bổ sung NAA 0,2 mg/L và 0,4 mg/L (90,9%) và thấp nhất là ở môi trƣờng 1/2 MS không bổ sung hoặc bổ sung NAA 0,1 mg/L.

4.2.2.2 Số rễ

Kết quả Bảng 4.12 cho thấy ở 2 tuần SKC, nồng độ NAA có hƣởng đến số rễ của chồi đậu nành. Trong đó chồi cấy trên môi trƣờng có bổ sung NAA 0,2 mg/L có số rễ hình thành cao nhất là 6,1 rễ và thấp nhất ở môi trƣờng không bổ sung NAA là 0,8 rễ, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1%. Điều này cho thấy mẫu cấy trên môi trƣờng không bổ sung NAA vẫn hình thành rễ nhƣng số lƣợng rễ ít hơn so với môi trƣờng bổ sung NAA. Hàm lƣợng khoáng đa lƣợng cũng ảnh hƣởng đến sự hình thành rễ của chồi đậu nành. Số rễ hình thành trên môi trƣờng MS trung bình là 3,5 rễ, cao hơn so với trên môi trƣờng 1/2 MS (3,3 rễ). Sự hình thành rễ chịu ảnh hƣởng tƣơng tác giữa nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng. Chồi cấy ở môi trƣờng MS và 1/2 MS bổ sung NAA 0,2 mg/L có số rễ đƣợc hình thành cao nhất (6,1 và 6,0 rễ) khác biệt so với các nghiệm thức còn lại ở mức ý nghĩa 5%. Môi trƣờng 1/2 MS không bổ sung NAA có số rễ thấp nhất (0,7 rễ).

76

Đến 4 tuần SKC, chồi cây đậu nành có sự gia tăng số rễ. Qua Bảng 4.14 cho thấy, nồng độ NAA tiếp tục ảnh hƣởng đến sự hình thành rễ, mẫu chồi đƣợc cấy trên môi trƣờng có NAA 0,2 mg/L có số rễ cao nhất (7,5 rễ), môi trƣờng không bổ sung NAA có số rễ thấp nhất (2,6 rễ), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1%. Chồi đậu nành đƣợc cấy trên môi trƣờng có hàm lƣợng khoáng đa lƣợng MS cũng cho số rễ cao hơn (5,3 rễ) so với môi trƣờng 1/2 MS (4,8 rễ) khác biệt có ý nghĩa ở mức 5%. Có ảnh hƣởng tƣơng tác giữa nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng. Chồi đậu nành cấy ở nghiệm thức MS bổ sung NAA 0,2 mg/L có số rễ cao nhất (8,0 rễ) và thấp nhất là nghiệm thức MS không bổ sung NAA (2,5 rễ).

Nồng độ NAA (mg L) và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng

NAA 0 + MS NAA 0,1 + MS NAA 0,2 + MS NAA 0,4 + MS NAA 0 + 1/2 MS NAA 0,1 + 1/2 MS NAA 0,2 + 1/2 MS NAA 0,4 + 1/2 MS Trung bình (NAA) NAA 0 NAA 0,1 NAA 0,2 NAA 0,4 Trung bình (đa lƣợng) MS 1/2 MS FNAA Fđa lƣợng FNAA x Fđa lƣợng CV (%)

Tuần sau khi cấy 4 2 2,5d 0,9e 4,2c 2,4d 8,0a 6,1a 6,3b 4,5b 2,7d 0,7e 4,8c 2,6d 7,0b 6,0a 4,8c 3,9c 2,6d 0,8d 4,5c 2,5c 7,5a 6,1a 5,5b 4,2b 5,3a 3,5a 4,8b 3,3b * * ** ** * ** 17,8 12,7

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (*): khác biệt ở mức 5%; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.12: Số rễ của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi NAA và khoáng đa lƣợng ở 2 và 4 tuần SKC

4.2.2.3 Chiều dài rễ

77

Bảng 4.13 cho thấy, ở thời điểm 4 tuần SKC, các nồng độ NAA và môi trƣờng MS, 1/2 MS có ảnh hƣởng khác biệt lên chiều dài rễ cây đậu nành. Nồng độ NAA 0,2 mg/L cho chồi có chiều dài rễ dài nhất (7,8 cm), thấp nhất là nồng độ NAA 0 mg L. Môi trƣờng đa lƣợng MS cho hiệu quả chiều dài rễ tốt hơn so với môi trƣờng 1/2 MS. Chiều dài rễ chịu sự ảnh hƣởng tƣơng tác giữa các nồng độ NAA và môi trƣờng MS, 1 2 MS. Trong đó, nghiệm thức MS bổ sung NAA 0,2 mg/L cho chiều dài rễ cao nhất là 8,4 cm. Thấp nhất là nghiệm thức MS không bổ sung NAA (3,3 cm).

Hàm lƣợng khoáng đa lƣợng (B)

Nồng độ NAA (mg/L) (A)

Trung bình (A)

0

0,1

0,2

3,1d 4,4c 7,8a 6,8b

MS 3,3f 4,8d 8,4a 6,8bc

1/2 MS 2,8g 4,0e 7,2b 6,7c

0,4

Trung bình (B)

5,8a

5,2b

*

FA

*

FB

*

F(A*B)

8,4

CV (%) Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (*): khác biệt ở mức 5%.

Bảng 4.13: Chiều dài rễ (cm) của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi NAA và khoáng đa lƣợng ở 4 tuần SKC

d

b

a

c

Hình 4.6 Sự tạo rễ của cây đậu nành trên môi trƣờng MS bổ sung NAA NAA 0,4 mg/L (d) NAA 0 mg/L (a) NAA 0,1 mg/L (b) NAA 0,2 mg/L (c)

4.2.2.4 Chiều cao chồi

78

Ở thời điểm 2 tuần SKC, các nồng độ NAA bổ sung có ảnh hƣởng lên chiều cao chồi cây đậu nành. Nồng độ NAA 0,2 và 0,4 mg/L cho chồi có chiều cao cao nhất, khác biệt có ý nghĩa so với nồng độ 0 và 0,1 mg L. Môi trƣờng MS hay 1/2 MS không có ảnh hƣởng lên chiều cao chồi nhƣng có ảnh hƣởng tƣơng tác giữa nồng độ NAA và hàm lƣợng đa lƣợng MS. Nghiệm thức MS bổ sung NAA 0,2 mg/L cho kết quả cao nhất (chồi cao 2,5 cm), thấp nhất là nghiệm thức NAA 0 mg L trên môi trƣờng MS hay 1/2 MS (0,6-0,9 cm) (Bảng 4.14).

Nồng độ NAA (mg L) và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng

Tuần sau khi cấy 4 2 6,2c 0,6c 6,6c 1,4b 8,6a 2,5a 6,6c 1,6b 5,2d 0,9c 6,5c 1,5b 8,2a 1,4b 7,1b 1,8b 5,7c 0,8c 6,5b 1,5b 8,4a 1,9a 6,8b 1,7ab 7,0a 1,5 6,7b 1,4 * * ** ns * * 7,0 33,0

NAA 0 + MS NAA 0,1 + MS NAA 0,2 + MS NAA 0,4 + MS NAA 0 + 1/2 MS NAA 0,1 + 1/2 MS NAA 0,2 + 1/2 MS NAA 0,4 + 1/2 MS Trung bình (NAA) NAA 0 NAA 0,1 NAA 0,2 NAA 0,4 Trung bình (đa lƣợng) MS 1/2 MS FNAA Fđa lƣợng FNAA x Fđa lƣợng CV (%) Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (*): khác biệt ở mức 5%; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.14: Chiều cao chồi (cm) của đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi NAA và khoáng đa lƣợng ở 2 và 4 tuần SKC

Đến 4 tuần SKC, chiều cao chồi gia tăng rất đáng kể ở các nghiệm thức. Nồng độ NAA và hàm lƣợng đa lƣợng MS có ảnh hƣởng đến chiều cao chồi đậu nành. Nồng độ NAA 0,2 mg L và hàm lƣợng đa lƣợng MS có hiệu quả tốt nhất lên chiều cao chồi. Ảnh hƣởng tƣơng tác giữa các nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng MS cho thấy, môi trƣờng MS hay 1/2 MS bổ sung NAA 2 mg/L cho chiều cao chồi tốt nhất, chồi đạt trên 8 cm (Bảng 4.14).

4.2.2.5 Số lá

79

Bảng 4.15 cho thấy nồng độ NAA có ảnh hƣởng đến số lá của chồi đậu nành ở 2 tuần SKC, mẫu đƣợc cấy trên môi trƣờng bổ sung NAA 0,2 mg/L có số lá cao nhất (1,4 lá), thấp nhất là môi trƣờng NAA 0,4 mg/L (0,8 lá) và NAA 0 mg/L (0,9 lá). Số lá của chồi đậu nành không bị ảnh hƣởng bởi hàm lƣợng khoáng đa lƣợng cũng nhƣ không bị ảnh hƣởng tƣơng tác giữa nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng.

Nồng độ NAA (mg L) và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng

Tuần sau khi cấy 4 2 1,8 0,9 1,8 1,2 2,8 1,5 2,0 0,8 1,8 0,9 1,9 1,0 2,5 1,2 1,9 0,8 1,8b 0,9bc 1,9b 1,1b 2,7a 1,4a 2,0b 0,8c 2,1 1,1 2,0 1,0 * * ns ns ns ns 20,1 17,1

NAA 0 + MS NAA 0,1 + MS NAA 0,2 + MS NAA 0,4 + MS NAA 0 + 1/2 MS NAA 0,1 + 1/2 MS NAA 0,2 + 1/2 MS NAA 0,4 + 1/2 MS Trung bình (NAA) NAA 0 NAA 0,1 NAA 0,2 NAA 0,4 Trung bình (đa lƣợng) MS 1/2 MS FNAA Fđa lƣợng FNAA x Fđa lƣợng CV (%) Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (*): khác biệt ở mức 5%.

Bảng 4.15: Số lá của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi NAA và khoáng đa lƣợng ở 2 và 4 tuần SKC

Ở thời điểm 4 tuần SKC, số lá của chồi đậu nành tiếp tục gia tăng (Bảng 4.15). Nồng độ NAA tiếp tục có ảnh hƣởng đến số lá. Chồi đậu nành đƣợc cấy trên môi trƣờng bổ sung NAA 0,2 mg/L có số lá cao nhất (2,7 lá), khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Tƣơng tự ở tuần 2, số lá của chồi đậu nành cũng không chịu ảnh hƣởng bởi hàm lƣợng khoáng đa lƣợng cũng nhƣ không chịu ảnh hƣởng bởi sự tƣơng tác giữa nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng.

Nghiên cứu tạo rễ in vitro cây đậu nành cũng đã đƣợc một số tác giả báo cáo. Trên giống đậu nành của Ấn Độ Glycine max (L) Merr. cv. CO3, Radhakrishnan and Ranjithakumari (2007) đã tạo rễ cho chồi tái sinh từ mô sẹo trên môi trƣờng B5 bổ sung 14,7 µM IBA. Akitha Devi et al. (2012) đã sử dụng triacontanol (TRIA) cũng cho số rễ và chiều dài rễ cao nhất (6,3±0,5 và 21,5±0,5).

80

Kết quả thí nghiệm này cho thấy môi trƣờng MS bổ sung NAA với nồng độ 0,2 mg/L thích hợp cho sự tạo rễ của chồi giống đậu nành MTĐ 760-4 với tỉ lệ tạo rễ cao (90%), số rễ nhiều (8,0 rễ) và chiều dài rễ dài nhất (8,4 cm) cũng nhƣ chồi phát triển nhanh, tăng nhanh về chiều cao và số lá.

4.2.3 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của giá thể đến sự thuần dƣỡng cây

đậu nành in vitro trong điều kiện nhà lƣới

4.2.3.1 Tỉ lệ cây sống

Kết quả Bảng 3.10 cho thấy ở thời điểm 1 tuần sau khi thuần dƣỡng (SKTD), chỉ có giá thể phân rơm bị giảm tỉ lệ sống còn 30,0%, khác biệt so với các giá thể còn lại. Tỉ lệ cây sống tiếp tục giảm ở tuần thứ hai. Ở giá thể phân rơm, cây chết hoàn toàn, kế đến là giá thể mụn dừa + phân rơm, cây sống chỉ 30%. Đến tuần thứ ba và tƣ, tỉ lệ cây sống tiếp tục giảm ở các nghiệm thức khác. Ở thời điểm 4 tuần SKTD, tỉ lệ cây sống đạt cao nhất (80%) ở giá thể mụn dừa, giá thể mụn dừa + tro trấu + đất, không khác biệt so với giá thể mụn dừa + phân rơm + tro trấu (70%). Cây không sống ở giá thể phân rơm đơn tuy nhiên, khi đƣợc bổ sung mụn dừa vào giá thể phân rơm thì tỉ lệ sống của cây đạt đƣợc 20,0%.

Loại giá thể

Tuần sau khi thuần dƣỡng 2 100,0a 0,0c 30,0b 80,0a 100,0a 62,0 * 28,5

3 80,0a 0,0b 30,0b 70,0a 90,0a 54,0 * 47,0

4 80,0a 0,0b 20,0b 70,0a 80,0a 50,0 * 53,0

1 100,0a Mụn dừa 30,0b Phân rơm 100,0a Mụn dừa + phân rơm 100,0a Mụn dừa + phân rơm + tro trấu 100,0a Mụn dừa + tro trấu + đất 86,0 Trung bình * F 12,9 CV(%) Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (*): khác biệt ở mức 5%.

Bảng 4.16: Tỉ lệ sống (%) của cây đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi giá thể ở 1, 2, 3 và 4 tuần SKTD

81

Sự chƣa hoàn thiện về cấu trúc của cây in vitro là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự chết cây khi thuần dƣỡng. Cây con thƣờng có tỉ lệ chết cao do bề mặt lá chƣa hình thành lớp cutin, nhằm làm giảm sự mất nƣớc và phản chiếu bớt ánh sáng chiếu đến bề mặt lá, lớp cutin này trên mặt lá của cây cấy mô có dạng hạt và que nhám trong khi cây trồng trong nhà lƣới thì lớp này nhẵn. Thêm vào đó, lá của cây cấy mô thƣờng mỏng, khí khẩu cây ở điều kiện in vitro thƣờng mở và chƣa hoàn thiện chức năng. Cây cấy mô sinh trƣởng trong môi trƣờng ẩm độ cao khi chuyển sang môi trƣờng tự nhiên có ẩm độ thấp nên cây dễ bị mất nƣớc (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Bên cạnh đó, giá thể cũng là một trong những yếu tố ảnh hƣởng đến tỉ lệ sống và sự sinh trƣởng của cây trong quá trình thuần dƣỡng. Giá thể tốt cần có khả năng giữ

đủ nƣớc để duy trì độ ẩm quanh rễ và đồng thời phải cung cấp đủ khí để tránh hiện tƣợng úng nƣớc.

4.2.3.2 Chiều cao gia tăng

Kết quả Bảng 3.11 cho thấy, ở 1 tuần SKTD chiều cao gia tăng của cây đậu nành ở giá thể hỗn hợp mụn dừa + tro trấu + đất đạt cao nhất (0,9 cm) có khác biệt so với chiều cao gia tăng của đậu nành ở các giá thể còn lại.

Đến thời điểm 2 và 3 tuần SKTD, chiều cao của đậu nành tiếp tục tăng ở các giá thể. Chiều cao gia tăng của cây đậu nành ở giá thể mụn dừa + phân rơm là thấp nhất (1,6 cm) không có khác biệt so với chiều cao gia tăng của đậu nành ở giá thể mụn dừa nhƣng có khác biệt so với ở các giá thể khác. Giá thể mụn dừa + tro trấu + đất đạt chiều cao gia tăng cao nhất (đạt 5,0 cm ở 3 tuần SKTD).

Tại thời điểm 4 tuần SKTD, chiều cao gia tăng ở đậu nành trên giá thể hỗn hợp mụn dừa + tro trấu + đất vẫn đạt cao nhất (6,2 cm), chiều cao gia tăng ở đậu nành trên giá thể mụn dừa + phân rơm là thấp nhất (1,7 cm), không có khác biệt so với chiều cao gia tăng của đậu nành trên giá thể mụn dừa đơn (2,9 cm) (Hình 3.3).

Tuần sau khi thuần dƣỡng

Loại giá thể

3 2,3bc 1,6c 3,2b 5,0a 3,45 * 28,0

1 0,4b 0,5b 0,6b 0,9a 0,6 * 27,0

2 1,4c 1,3c 1,6b 1,9a 1,6 * 11,0

4 2,9c 1,7c 4,4b 6,2a 4,3 * 22,8

Mụn dừa Mụn dừa + phân rơm Mụn dừa + phân rơm + tro trấu Mụn dừa + tro trấu + đất Trung bình F CV(%) Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (*): khác biệt ở mức 5%.

82

Bảng 4.17: Chiều cao gia tăng (cm) của cây đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi giá thể ở 1, 2, 3 và 4 tuần SKTD

b

d

a

c

Mụn dừa + tro trấu + đất (a) Mụn dừa + phân rơm + tro trấu (c)

Mụn dừa (b) Mụn dừa + phân rơm (d)

Hình 4.7 Sinh trƣởng của cây đậu nành sau 4 tuần thuần dƣỡng

4.2.3.3 Số lá gia tăng

Qua 4 tuần SKTD số lá của đậu nành có gia tăng tuy nhiên sự gia tăng không nhiều và không có sự khác biệt giữa các giá thể. Số lá gia tăng từ khoảng 0,8-0,9 lá ở 1 tuần SKTD đến khoảng 1,8-2,0 lá ở 4 tuần SKTD.

Loại giá thể

1 0,9 0,9 0,8 0,9 0,9 ns 39,0

Tuần sau khi thuần dƣỡng 2 3 1,6 1,0 1,3 1,0 1,3 0,9 1,4 1,9 1,4 0,9 ns ns 36,0 28,0

4 1,8 2,0 2,0 2,0 1,9 ns 31,0

Mụn dừa Mụn dừa + phân rơm Mụn dừa + phân rơm + tro trấu Mụn dừa + tro trấu + đất Trung bình F CV(%) (ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê

Bảng 4.18: Số lá gia tăng của cây đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi giá thể ở 1, 2, 3 và 4 tuần SKTD

Một số kỹ thuật thuần dƣỡng cây đậu nành cũng đã đƣợc báo cáo. Các tác giả sử dụng nhiều loại giá thể khác nhau nhƣ hỗn hợp vermiculite và đất (Ranjitha Kumari et al., 2006), đất (Radhakrishnan and Ranjithakumari, 2007; Janani and Ranjitha Kumari, 2013), đất sét và cát (1:1) đã khử trùng (Zia et al., 2010). Cây con có thể đƣợc trùm kín bằng bọc nylon để giữ ẩm hoặc không trùm và đƣợc đặt ở điều kiện phòng một thời gian trƣớc khi chuyển ra trồng ở nhà lƣới. Tuy nhiên, kết quả cụ thể của các nghiên cứu trên không đƣợc công bố.

83

Nhìn chung, kết quả thí nghiệm cho thấy cây đậu nành MTĐ 760-4 đạt tỉ lệ sống cao (80,0%) và sinh trƣởng tốt ở giá thể mụn dừa + tro trấu + đất (1:1:1) sau 4 tuần thuần dƣỡng.

4.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng chọn tạo các dòng đậu nành chống chịu mặn bằng phƣơng pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma

4.3.1 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng

của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4

4.3.1.1 Thí nghiệm 6a: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh

trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 1

Kết quả Bảng 4.19 cho thấy, ở thời điểm 1 tuần SKC, tỉ lệ sống của mô sẹo giảm còn 92% ở nồng độ muối 10 g/L, khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. Từ 2 đến 5 tuần SKC, tỉ lệ sống của mô sẹo tiếp tục giảm mạnh. Ở nghiệm thức muối NaCl 2,5 g/L, mô sẹo vẫn sống 100% nhƣ đối chứng, trong khi tăng nồng độ muối lên đến 5 g L thì tỉ lệ sống giảm có ý nghĩa. Tỉ lệ sống của mô sẹo giảm dần khi nồng độ muối tăng dần. Ở 5 tuần SKC, tỉ lệ mô sẹo sống ở 5 g/L giảm còn 62%, và giảm mạnh đến 26% ở nồng độ muối 10 g/L. Mặc dù mô sẹo sống sót đƣợc ở nồng độ 10 g/L nhƣng tỉ lệ rất thấp (26%) và sức sống của mô sẹo kém (màu hơi nâu) nên mẫu mô sẹo ở nồng độ này không thể tiếp tục dùng để chọn lọc ở lần 2. Ở nồng độ muối 5 và 7,5 g/L thì tỉ lệ sống của mô sẹo cao hơn (tƣơng ứng là 62 và 44%) và cấu trúc cũng nhƣ màu sắc mô sẹo bình thƣờng (Hình 4.8).

Nồng độ NaCl (g/L)

0 2,5 5 7,5 10 F CV (%)

1 100a 100a 100a 96ab 92b * 11,4

2 100a 100a 90ab 86b 70c ** 18,5

3 100a 100a 80b 76b 38c ** 22,9

Tuần sau khi cấy 5 100a 100a 62b 44c 26d ** 46,1

4 100a 100a 68b 66b 26c ** 23,5

Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(*): khác biệt ở mức 5%;(**): khác biệt ở mức 1%.

84

Bảng 4.19: Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi muối NaCl từ 1 đến 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

a

b

c

d

e

NaCl 0 g/L (a) NaCl 2,5 g/L (b) NaCl 5 g/L (c)

NaCl 7,5 g/L (d) NaCl 10 g/L (e)

Hình 4.8: Sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trên môi trƣờng MS bổ sung muối NaCl sau 5 tuần nuôi cấy trong lần chọn lọc 1

Nhìn chung sau 5 tuần nuôi cấy, muối NaCl có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của mô sẹo MTĐ 760-4. Ở các nồng độ muối cao, mô sẹo không tăng trƣởng, giảm kích thƣớc, màu sắc chuyển sang nâu đen và sau đó chết. Theo Kowles (2010), khi môi trƣờng bên ngoài tế bào có nồng độ chất tan cao hơn nồng độ chất tan trong tế bào sẽ làm cho nƣớc trong tế bào di chuyển ra ngoài, dẫn đến tế bào bị co lại.

85

Nhƣ vậy, trong lần xử lý thứ nhất đã chọn lọc đƣợc các mẫu mô sẹo MTĐ 760-4 có khả năng chịu mặn đến nồng độ muối NaCl 7,5 g/L. Mô sẹo ở nồng độ muối 10 g/L vẫn duy trì khả năng sống nhƣng sức sống rất kém (không tăng trƣởng, màu hơi nâu) nên không thể tiếp tục chọn lọc ở lần 2.

4.3.1.2 Thí nghiệm 6b: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng

của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 2

Trong lần chọn lọc 2, mẫu mô sẹo ở các nồng độ muối NaCl từ 0-7,5 g/L tiếp tục đƣợc nuôi cấy trên cùng môi trƣờng mặn. Kết quả Bảng 3 cho thấy, tỉ lệ sống của mô sẹo ở nồng độ muối NaCl 2,5 g/L là 100% nhƣ nghiệm thức đối chứng. Nồng độ muối cao 5 và 7,5 g/L vẫn tiếp tục có ảnh hƣởng đến khả năng sống của mô sẹo. Tỉ lệ sống của các mẫu mô sẹo này có khuynh hƣớng giảm dần theo thời gian đến 5 tuần SKC và thấp dần khi tăng nồng độ muối. Cụ thể, mô sẹo có tỉ lệ sống thấp nhất ở nghiệm thức muối 7,5 g/L ở tuần 1 là 67,5% và giảm chỉ còn 17,5% ở 5 tuần SKC. Nghiệm thức muối 5 g/L có tỉ lệ sống cũng khá cao là 76% ở 5 tuần SKC (Bảng 4.20).

Nồng độ NaCl (g/L)

0 2,5 5 7,5 F CV (%)

1 100a 100a 90b 67,5c ** 15,3

2 100a 100a 84b 52,5c ** 16,3

3 100a 100a 78b 32,5c ** 19,2

Tuần sau khi cấy 5 100a 100a 76b 17,5c ** 20,8

4 100a 100a 76b 25c ** 20,8

Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.20: Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi muối NaCl từ 1 đến 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 2

Kết quả xử lý lần 2 cho thấy đã chọn lọc đƣợc các dòng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 có khả năng chịu mặn đến nồng độ 5 g/L, với tỉ lệ sống đạt 76%. Mô sẹo ở nghiệm thức NaCl 7,5 g/L có tỉ lệ sống quá thấp (17,5%) và phát triển chậm nên không thể tiếp tục chọn lọc ở lần chọn lọc tiếp theo.

4.3.1.3 Thí nghiệm 6c: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng

của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 3

86

Trong lần chọn lọc 3 (Bảng 4.21), mẫu mô sẹo ở các nồng độ muối NaCl từ 0-5 g/L tiếp tục đƣợc nuôi cấy trên cùng môi trƣờng mặn. Kết quả Bảng 5 cho thấy khi xử lý muối đến lần 3 thì tỉ lệ sống của mô sẹo bắt đầu ổn định. Cụ thể đến 4 tuần SKC, tỉ lệ sống của mô sẹo ở nghiệm thức muối 5 g/L là 96%, không khác biệt so với đối chứng. Đến 5 tuần SKC thì tỉ lệ này có sự giảm nhẹ còn 94%.

Nồng độ NaCl (g/L)

0 2,5 5 F CV (%)

1 100 100 100

2 100 100 96 ns 9,1

3 100 100 96 ns 9,1

Tuần sau khi cấy 5 100a 100a 94b * 10,6

4 100 100 96 ns 9,1

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (*): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.21: Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi muối NaCl từ 1 đến 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 3

Nhìn chung, trong lần chọn lọc thứ 3, khả năng chịu mặn của mô sẹo đã ổn định hơn và kết quả đã chọn đƣợc các mẫu mô sẹo chịu mặn đến nồng độ muối NaCl 5 g/L với tỉ lệ sống khá cao, đạt 94% sau 5 tuần nuôi cấy.

4.3.1.4 Thí nghiệm 6d: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng

của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 4

Bảng 4.22 cho thấy tỉ lệ sống của mô sẹo ở nồng độ muối 5 g L trong lần xử lý 4 này mặc dù giảm còn 94% nhƣng không khác biệt so với đối chứng. Điều này chứng tỏ khả năng chịu mặn của mô sẹo ở nồng độ này đã ổn định, mô sẹo đã có sự thích nghi với điều kiện stress mặn của môi trƣờng (Hình 4.9).

Nồng độ NaCl (g/L)

1 100 100 100

2 100 100 100

3 100 100 100

Tuần sau khi cấy 5 100 100 94 ns 10,9

4 100 100 100

0 2,5 5 F CV (%) (ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê

87

Bảng 4.22: Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi muối NaCl từ 1 đến 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 4

A

B

a

b

c

Hình 4.9: Sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trên môi trƣờng

NaCl 0 g/L (a) NaCl 2,5 g/L (b) NaCl 5 g/L (c)

MS bổ sung muối NaCl sau 5 tuần nuôi cấy trong lần chọn lọc 4

Kết quả phân tích proline ở Bảng 4.23 cho thấy có ảnh hƣởng của nồng độ muối lên sự tích lũy proline trong mẫu mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4. Hàm lƣợng proline cao nhất ở nồng độ muối 5 g/L là 2,78 mol g trọng lƣợng tƣơi, khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (1,48 mol g trọng lƣợng tƣơi), tƣơng đƣơng gấp khoảng 1,9 lần so với đối chứng. Mô sẹo ở nồng độ muối 2,5 g/L có hàm lƣợng proline không khác biệt so với đối chứng cho thấy mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 có khả năng chịu đựng mức nồng độ muối này một cách bình thƣờng.

Nồng độ NaCl (g/L)

0 2,5 5 F CV (%)

Hàm lƣợng proline (µmol g trọng lƣợng tƣơi) 1,48b 1,51b 2,78a * 26,3

Trong cùng một cột các số có chữ theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê qua phép thử Duncan; (*) khác biệt ở mức 5%.

Bảng 4.23: Hàm lƣợng proline của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 sau 4 lần chọn lọc với muối NaCl (mol g trọng lƣợng tƣơi)

88

Theo Ghoulam et al. (2001), để khắc phục stress mặn, cây tạo ra các cơ chế bảo vệ giúp nó thích nghi. Các cơ chế này bao gồm sự điều chỉnh thẩm thấu, đi cùng với sự tích lũy các chất tan nhƣ proline. Chính vì vậy, việc đo

hàm lƣợng proline thƣờng đƣợc các nhà nghiên cứu ghi nhận nhƣ là một chỉ tiêu để đánh giá khả năng chống chịu mặn của mô sẹo.

Hàm lƣợng proline tăng ở mô sẹo chịu mặn với muối NaCl cũng đã đƣợc báo cáo trên cây đậu nành trong nghiên cứu của Liu and Staden (2000) và trên nhiều giống cây trồng khác nhƣ đậu phộng (Jain et al., 2001), lúa mạch (Chaudhuri et al., 1997), lúa (Basu et al., 2002), mía (Gandonou et al., 2006)…

Kết quả tổng hợp đƣợc cho thấy, phƣơng pháp gây biến dị soma bằng cách nuôi cấy liên tục trên môi trƣờng chọn lọc với muối NaCl, mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 có khả năng chống chịu mặn đến nồng độ NaCl 5 g/L. Hàm lƣợng proline tích lũy cao ở các mẫu mô sẹo này chứng tỏ đã có sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào để có thể thích nghi với điều kiện mặn của môi trƣờng. Tƣơng tự, trong chọn lọc giống đậu nành cv. Acme., Liu and Staden (2000) đã thu đƣợc 1 dòng tế bào chống chịu mặn với nồng độ muối NaCl 5,8 g/L bằng cách cấy chuyền liên tục trên môi trƣờng này. Ở mía, Gandonou et al. (2006) cũng đã tạo đƣợc dòng mô sẹo có khả năng chịu mặn (NaCl 4,0 g/L) từ giống mía CP65-357 nhạy cảm với mặn bằng quá trình chọn lọc in vitro.

4.3.2 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự tạo chồi và

sinh trƣởng của chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4

4.3.2.1 Thí nghiệm 7a: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự tạo chồi và

sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 1

a) Tỉ lệ tạo chồi

Bảng 4.24 cho thấy, ở 1 tuần SKC, mẫu trục phôi có sự hình thành chồi, đạt cao nhất với tỉ lệ 56,7% ở nghiệm thức không xử lý muối, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm muối NaCl nồng độ từ 2,5-7,5 g/L. Đến 2 tuần SKC, tỉ lệ tạo chồi tiếp tục gia tăng ở các nghiệm thức, ngoại trừ ở nồng độ muối 7,5 g/L. Tỉ lệ tạo chồi cao nhất (65,0%) vẫn là nghiệm thức đối chứng (NaCl 0 g/L), và giảm dần khi nồng độ muối tăng dần. Ở 3 tuần SKC, tỉ lệ tạo chồi vẫn đạt 65,0% ở nghiệm thức NaCl 0 g/L và thấp nhất ở nồng độ 7,5 g/L (25,0%).

89

Kết quả thí nghiệm cho thấy muối NaCl khi xử lý với nồng độ từ 2,5 g/L đến 7,5 g/L có ảnh hƣởng đến sự tạo chồi của mẫu trục phôi đậu nành. Nồng độ muối càng cao thì tỉ lệ tạo chồi càng giảm.

Nồng độ NaCl (g/L)

0 2,5 5 7,5 Trung bình F CV (%)

Tuần sau khi cấy 3 65,0a 36,7b 38,3b 25,0c 41,3 ** 29,4

2 65,0a 35,0b 36,7b 25,0b 40,4 ** 29,7

1 56,7a 26,7b 33,3b 25,0b 35,4 ** 39,2

Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.24: Tỉ lệ tạo chồi (%) của trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi muối NaCl trong lần chọn lọc 1

b) Chiều cao chồi

Kết quả cho thấy chiều cao chồi bị ảnh hƣởng bởi muối NaCl. Ở tuần 1, chiều cao chồi giảm khác biệt ở nồng độ NaCl 7,5 g/L (0,12 cm) so với các nghiệm thức muối thấp hơn và đối chứng (đạt từ 0,17-0,19 cm). Đến tuần thứ hai và ba, chiều cao chồi tiếp tục gia tăng ở các nghiệm thức. Nồng độ muối càng cao thì chiều cao chồi càng giảm. Khác biệt này nhận thấy rõ nhất ở tuần thứ ba, chiều cao chồi cao nhất ở nghiệm thức không xử lý muối (3,51 cm) và thấp nhất ở nồng độ muối NaCl 7,5 g/L (0,66 cm).

Nồng độ NaCl (g/L)

Tuần sau khi cấy 3 3,51a 2,47b 1,52c 0,66d 2,10 ** 33,6

2 0,94a 0,71b 0,86ab 0,41c 0,74 ** 30,6

0 2,5 5 7,5 Trung bình F CV (%)

1 0,17a 0,19a 0,18a 0,12b 0,17 ** 32,9

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.25: Chiều cao chồi (cm) của đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi muối NaCl trong lần chọn lọc 1

90

Nhìn chung, việc xử lý muối NaCl nồng độ tăng từ 2,5-7,5 g/L đã ảnh hƣởng đến sự hình thành chồi và sinh trƣởng của chồi đậu nành. Tỉ lệ tạo chồi và chiều cao chồi giảm rất đáng kể (Hình 4.10). Nồng độ muối NaCl 2,5 và 5 g/L có tỉ lệ tạo chồi 36,7 và 38,3%, chiều cao chồi 2,47 và 1,52 cm, so với đối chứng là 65,0% và 3,51 cm. Ở nồng độ NaCl xử lý cao nhất (7,5 g/L), tỉ lệ tạo chồi chỉ đạt 25%, chiều cao chồi chỉ đạt 0,66 cm. Kết quả cho thấy, chồi đậu

nành vẫn hình thành và sinh trƣởng đến nồng độ muối NaCl 7,5 g/L, mặc dù tỉ lệ tạo chồi và sinh trƣởng của chồi thấp. Những mẫu chồi thu đƣợc sau lần chọn lọc này đƣợc tiếp tục xử lý trên môi trƣờng có nồng độ muối NaCl tƣơng tự.

b

a

d

c

Hình 4.10: Sự tạo chồi đậu nành MTĐ 760-4 trên môi trƣờng bổ sung

NaCl 0 g/L (a)

NaCl 2,5 g/L (b) NaCl 5 g/L (c)

NaCl 7,5 g/L (d)

muối NaCl ở 3 tuần sau khi cấy

4.3.2.2 Thí nghiệm 7b: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng

của chồi trong lần chọn lọc 2

a) Chiều cao chồi gia tăng

91

Kết quả Bảng 4.26 cho thấy, chiều cao chồi có sự gia tăng ở thời điểm 1 tuần SKC. Chiều cao chồi gia tăng cao nhất là 1,58 cm ở nghiệm thức NaCl 0 g/L, khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức xử lý muối NaCl từ 2,5-7,5 g/L. Chiều cao chồi gia tăng càng ít khi tăng nồng độ muối. Thấp nhất là nghiệm thức 5 và 7,5 g/L. Đến tuần 2 và 3, chiều cao chồi tiếp tục gia tăng ở các nghiệm thức. Nồng độ muối NaCl vẫn có ảnh hƣởng rất rõ lên chiều cao chồi. Cụ thể, ở tuần thứ 2, chiều cao chồi gia tăng cao nhất ở nồng độ NaCl 0 g/L (3,38 cm) và giảm dần khi tăng nồng độ muối. Kết quả chỉ còn 0,16 cm ở nồng độ 7,5 g/L. Ở tuần thứ 3, chiều cao chồi gia tăng cao nhất ở nghiệm thức đối chứng đạt 6,51 cm, giảm khác biệt còn 2,04 cm ở nồng độ 2,5 g/L và thấp nhất ở nồng độ muối 7,5 g/L chỉ còn 0,28 cm.

Nồng độ NaCl (g/L)

0 2,5 5 7,5 Trung bình F CV (%)

1 1,58a 0,63b 0,19c 0,07c 0,62 ** 34,4

Tuần sau khi cấy 3 6,51a 2,04b 0,92c 0,28d 2,43 ** 24,2

2 3,38a 1,13b 0,32c 0,16c 1,25 ** 35,8

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.26: Chiều cao chồi gia tăng (cm) của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi muối NaCl trong lần chọn lọc 2

b) Số lá gia tăng

Bên cạnh đó, muối NaCl cũng ảnh hƣởng đến số lá của chồi đậu nành (Bảng 4.27). Qua 3 tuần theo dõi thì số lá gia tăng cao nhất vẫn ở nghiệm thức không xử lý muối, và giảm dần có khác biệt khi nồng độ muối tăng. Ở 1 tuần SKC, số lá gia tăng thấp nhất ở nồng độ muối 7,5 g/L (0,1 lá so với đối chứng 0,95 lá), khác biệt có ý nghĩa so với nồng độ 5 g/L (0,4 lá) nhƣng từ tuần thứ hai và ba, số lá gia tăng giữa 2 nồng độ này không có sự khác biệt, vẫn đạt kết quả thấp nhất và có khác biệt so với đối chứng. Ở tuần thứ 3, số lá gia tăng cao nhiều nhất đạt 2,15 lá ở nồng độ NaCl 0 g/L, kế đến là nồng độ NaCl 2,5 g/L (1,30 lá), và thấp nhất là ở nồng độ 5 và 7,5 g/L (0,55 và 0,30 lá).

Nồng độ NaCl (g/L)

0 2,5 5 7,5 Trung bình F CV (%)

Tuần 1 0,95a 0,50b 0,40b 0,10c 0,49 ** 34,3

Thời gian theo dõi (tuần) Tuần 3 2,15a 1,30b 0,55c 0,30c 1,08 ** 26,6

Tuần 2 1,45a 0,65b 0,30c 0,15c 0,64 ** 35,8

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.27: Số lá gia tăng của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi muối NaCl trong lần chọn lọc 2

92

Nhƣ vậy, trong lần xử lý thứ hai, muối NaCl vẫn có ảnh hƣởng lên sự sinh trƣởng của chồi cây đậu nành. Chiều cao chồi đậu nành và số lá gia tăng ít khi tăng dần nồng độ muối đến 7,5 g/L.

4.3.2.3 Thí nghiệm 7c: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng

của chồi trong lần chọn lọc 3

a) Chiều cao chồi gia tăng

Trong lần xử lý thứ ba với muối NaCl, các chồi cây đậu nành vẫn duy trì đƣợc khả năng sống đến nồng độ 7,5 g/L. Ở 1 tuần SKC, chiều cao chồi gia tăng cao ở nghiệm thức NaCl 0 g/L (1,45 cm) và giảm dần đến nồng độ NaCl 7,5 g/L. Kết quả cũng tƣơng tự ở các tuần 2 và 3 SKC, chồi tiếp tục gia tăng chiều cao ở các nghiệm thức, tuy nhiên vẫn bị ảnh hƣởng bởi muối NaCl. Ở 3 tuần SKC, chiều cao chồi đạt cao nhất ở nghiệm thức đối chứng (7,53 cm), khác biệt có ý nghĩa so với chiều cao chồi ở các nghiệm thức muối. Chiều cao chồi gia tăng không khác biệt giữa nồng độ 5 và 7,5 g/L nhƣng khác biệt so với nồng độ 2,5 g/L.

Nồng độ NaCl (g/L)

Tuần 1 1,45a 0,40b 0,13c 0,03c 0,57 ** 34,9

Thời gian theo dõi (tuần) Tuần 3 7,53a 2,47b 0,53c 0,16c 3,03 ** 16,9

Tuần 2 3,72a 1,31b 0,32c 0,15c 1,55 ** 28,2

0 2,5 5 7,5 Trung bình F CV (%)

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.28: Chiều cao chồi gia tăng (cm) của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi muối NaCl trong lần chọn lọc 3

b) Số lá gia tăng

93

Số lá gia tăng vẫn bị ảnh hƣởng bởi muối NaCl. Nồng độ muối càng tăng thì số lá gia tăng càng giảm. Khác biệt này ghi nhận đƣợc từ tuần thứ nhất sau khi cấy. Đến 3 tuần SKC, số lá gia tăng cao nhất vẫn là nồng độ NaCl 0 g/L (2,25 lá), thấp nhất vẫn là nồng độ 7,5 g/L (0,4 lá).

Nồng độ NaCl (g/L)

0 2,5 5 7,5 Trung bình F CV (%)

Tuần 1 0,90a 0,50b 0,35b 0,10c 0,51 ** 36,9

Thời gian theo dõi (tuần) Tuần 3 2,25a 1,30b 0,85c 0,40d 1,31 ** 21,4

Tuần 2 1,40a 1,05b 0,70c 0,20d 0,93 ** 27,5

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.29: Số lá gia tăng của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hƣởng bởi muối NaCl trong lần chọn lọc 3

Kết quả cho thấy, sau 3 lần chọn lọc, các chồi cây đậu nành MTĐ 760-4 vẫn duy trì khả năng sống và sinh trƣởng đến nồng độ NaCl 7,5 g/L, mặc dù sinh trƣởng của chồi thấp khi nuôi cấy ở các nồng độ muối cao. Các chồi đậu nành sinh trƣởng chậm nhƣng vẫn sống, đây chính là một đặc điểm cho thấy các chồi đậu nành có khả năng duy trì đƣợc sự sinh trƣởng trong điều kiện bất lợi. Theo Queiros et al. (2007), giảm sinh trƣởng là hiện tƣợng phổ biến của cây bị stress mặn, đƣợc quan sát trong cơ quan, mô, hay tế bào đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung muối NaCl. Thật vậy, sinh trƣởng chậm hơn là đặc điểm thích nghi để sống sót của cây dƣới điều kiện stress và khả năng chịu mặn thƣờng tƣơng quan nghịch đến tốc độ tăng trƣởng. Bahmani et al. (2012) cũng đã tiến hành chọn lọc mặn với mẫu chồi đỉnh (1-1,5 cm) của cây táo với các nồng độ muối NaCl 0; 1,2; 2,3; 4,7; 5,8; và 7,0 g/L. Kết quả cho thấy sinh trƣởng của mẫu cấy bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi mặn. Nồng độ từ 2,3-7,0 g/L làm giảm sinh trƣởng của chồi và rễ qua các chỉ tiêu nhƣ số chồi, chiều cao chồi, trọng lƣợng tƣơi, tỉ lệ tạo rễ, số rễ và chiều dài rễ.

94

Các chồi đậu nành trên môi trƣờng mặn đƣợc cấy chuyền trở lại trên môi trƣờng MS bổ sung nƣớc dừa 50 ml L và NAA 0,2 mg L nhƣng không bổ sung muối NaCl để nhân nhanh chồi. Kết quả cho thấy một số chồi đƣợc xử lý mặn sinh trƣởng bình thƣờng (chiều cao trung bình >=2,0 cm) sau 2 tuần nuôi cấy. Bảng 4.30 cho thấy tổng số cây xử lí và tỉ lệ thu đƣợc ở các dòng xử lý muối NaCl. Các chồi trên môi trƣờng xử lý muối NaCl 7,5 g/L vẫn sống nhƣng khả năng sinh trƣởng rất chậm. Cây vẫn không thể phát triển trên môi trƣờng MS không xử lý mặn (tỉ lệ 0%). Ở nồng độ NaCl 5 g/L, cây có sự phục hồi và sinh trƣởng nhanh, tuy nhiên tỉ lệ cũng rất thấp (6,7%), chỉ đạt 4 cây/60 mẫu. Ở nồng độ muối 2,5 g/L, số cây thu đƣợc cao hơn là 6 cây (đạt 10,0%) (Hình 4.11).

a

c

b

Dòng NaCl 2,5 g/L (a) Dòng NaCl 5 g/L (b) Dòng NaCl 7,5 g/L (c)

Tổng số mẫu xử lý

Số cây chịu mặn

Tỉ lệ (%)

Hình 4.11: Sinh trƣởng của các dòng đậu nành sau chọn lọc mặn trên môi trƣờng MS + nƣớc dừa 50 ml/L + NAA 0,2 mg/L ở 2 tuần sau khi cấy

10,0 6,7 0,0

60 60 60

6 4 0

Bảng 4.30: Số cây đậu nành có khả năng chống chịu mặn ở các nồng độ muối NaCl Nồng độ NaCl (g/L) 2,5 5 7,5

95

Các dòng đậu nành có khả năng chống chịu mặn với muối NaCl 2,5 và 5 g/L đƣợc tiếp tục nhân nhanh để tăng số lƣợng. Nhìn chung, cây sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng MS bổ sung nƣớc dừa 50 ml/L và NAA 0,2 mg/L (Hình 4.12).

a

b

Hình 4.12: Các dòng đậu nành sau chọn lọc mặn đƣợc nhân trên môi

Dòng NaCl 2,5 g/L (a) Dòng NaCl 5 g/L (b)

trƣờng MS + nƣớc dừa 50 ml/L + NAA 0,2 mg/L ở 3 tuần sau khi cấy

96

Kết quả phân tích proline của các chồi đậu nành chịu mặn thu đƣợc ở nồng độ muối NaCl 2,5 và 5 g/L qua 3 lần chọn lọc cho thấy có sự gia tăng tích lũy proline trong tế bào. Chồi đƣợc xử lý với nồng độ muối NaCl càng cao thì hàm lƣợng proline tích lũy càng nhiều. Cụ thể, chồi ở nồng độ NaCl 5 g/L có hàm lƣợng proline cao nhất, với 3,10 µmol g trọng lƣợng tƣơi, khác biệt so với nồng độ 2,5 g/L (2,45 µmol) và nồng độ 0 g/L cho hàm lƣợng proline thấp nhất (1,90 µmol). Các chồi ở nồng độ NaCl 2,5 g/L cũng có hàm lƣợng proline khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (Bảng 4.31).

Nồng độ NaCl (g/L)

Hàm lƣợng proline (µmol g trọng lƣợng tƣơi) 1,90c 0 2,45b 2,5 3,10a 5 ** F CV (%) 9,0 Trong cùng một cột các số có chữ theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê qua phép thử Duncan; (**) khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.31: Hàm lƣợng proline của chồi đậu nành MTĐ 760-4 sau 3 lần chọn lọc với muối NaCl (mol g trọng lƣợng tƣơi)

Hầu hết những nghiên cứu đƣợc thực hiện liên quan đến chọn lọc in vitro là dựa trên sự nội cân bằng ion và các chất tan tƣơng hợp chủ yếu là proline (He et al., 2009). Khi mặn do NaCl vƣợt quá ngƣỡng, dạng muối phổ biến nhất của stress mặn, nồng độ Na+ trong cây tăng và nồng độ K+ giảm (Kumar et al., 2008). Để khắc phục stress mặn, cây tạo ra các cơ chế bảo vệ giúp nó thích nghi. Các cơ chế này bao gồm sự điều chỉnh thẩm thấu, đi cùng với sự tích lũy các chất tan tƣơng hợp nhƣ proline, glycine betaine và polyols (Ghoulam et al., 2001).

Chính vì vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy các chồi đậu nành thu đƣợc sau chọn lọc có tiềm năng chống chịu đƣợc mặn với các nồng độ muối NaCl 2,5 và 5 g/L.

4.3.3 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và

muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4

4.3.3.1 Thí nghiệm 8a: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 1

97

Kết quả Bảng 4.32 cho thấy, ở thời điểm 1 tuần SKC, liều chiếu xạ tia gamma Co60 cũng nhƣ các nồng độ muối NaCl xử lý không có ảnh hƣởng đến khả năng sống của mô sẹo. Đến 3 tuần SKC, hai nhân tố này có ảnh hƣởng riêng rẽ đến khả năng sống của mô sẹo. Tỉ lệ sống ở liều chiếu xạ 5 và 10 Gy không khác biệt so với đối chứng (0 Gy), nhƣng khi tăng liều đến 20 và 40 Gy thì tỉ lệ sống giảm rất đáng kể (tƣơng ứng còn 76,0 và 77,5%). Khi tăng nồng độ muối NaCl lên 5 và 7,5 g/L thì khả năng sống của mô sẹo bị ảnh hƣởng mạnh. Tỉ lệ sống giảm còn 74,8% ở nồng độ 5 g/L và 63,6% ở 7,5 g/L, khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (0 g/L).

Liều chiếu xạ và nồng độ NaCl (g/L)

0 Gy + NaCl 0 5 Gy + NaCl 0 10 Gy + NaCl 0 20 Gy + NaCl 0 40 Gy + NaCl 0 0 Gy + NaCl 2,5 5 Gy + NaCl 2,5 10 Gy + NaCl 2,5 20 Gy + NaCl 2,5 40 Gy + NaCl 2,5 0 Gy + NaCl 5 5 Gy + NaCl 5 10 Gy + NaCl 5 20 Gy + NaCl 5 40 Gy + NaCl 5 0 Gy + NaCl 7,5 5 Gy + NaCl 7,5 10 Gy NaCl 7,5 20 Gy + NaCl 7,5 40 Gy + NaCl 7,5 Trung bình (Liều chiếu xạ) 0 Gy 5 Gy 10 Gy 20 Gy 40 Gy Trung bình (Nồng độ NaCl) NaCl 0 NaCl 2,5 NaCl 5 NaCl 7,5 Fliều chiếu xạ FNaCl Fliều chiếu xạ x NaCl CV (%)

1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Tuần sau khi cấy 5 100a 100a 100a 100a 98,0a 100a 94,0ab 100a 94,0ab 84,0abc 64,0def 76,0bcd 76,0bcde 54,0ef 62,0cdef 52,5ef 76,0bcde 43,0fg 32,0gh 14,0h 79,1ab 86,5a 79,8ab 70,0bc 64,5c 99,6a 94,4a 66,4b 43,5c ** ** ** 28,9

3 100 100 100 100 100 100 96,0 100 94,0 86,0 80,0 82,0 76,0 64,0 72,0 75,0 82,0 63,0 46,0 52,0 88,8a 90,0a 84,8a 76,0b 77,5b 100a 95,2a 74,8b 63,6c * ** ns 23,8

Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (*) khác biệt ở mức 5% ; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.32: Tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

98

Đến 5 tuần SKC, có ảnh hƣởng tƣơng tác giữa liều chiếu xạ và nồng độ muối NaCl đến khả năng sống sót của mô sẹo. Tỉ lệ sống giảm mạnh khi nồng độ muối cao và liều chiếu xạ cao. Mô sẹo sống thấp nhất (chỉ 14,0%) ở liều chiếu 40 Gy kết hợp xử lý muối 7,5 g/L. Xử lý chiếu xạ từ 0-40 Gy ở môi trƣờng không bổ sung muối không có ảnh hƣởng đến khả năng sống của mô

sẹo (tỉ lệ sống từ 98,0-100%). Khả năng sống của mô sẹo ở nồng độ muối 2,5 g/L không khác biệt so với mô sẹo không xử lý muối. Xét từng nhân tố riêng rẽ thì liều chiếu xạ tăng và nồng độ muối NaCl tăng thì tỉ lệ sống của mô sẹo giảm (Hình 4.13). Trung bình tỉ lệ sống thấp nhất là ở liều 40 Gy (64,5%) và ở nồng độ muối 7,5 g/L (43,5%).

a

b

c

d

NaCl 0 g/L (a) NaCl 2,5 g/L (b) NaCl 5 g/L (c)

NaCl 7,5 g/L (d)

Hình 4.13: Mức độ sống sót của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 sau 5 tuần nuôi cấy ở lần chọn lọc 1

Kết quả này tƣơng tự với kết quả nghiên cứu trên mô sẹo cây mía của Nikam et al. (2014). Tác giả cũng đã gây đột biến bằng cách chiếu xạ tia gamma và chọn lọc in vitro giống mía Co740. Kết quả cho thấy sự sinh trƣởng của mô sẹo và khả năng tái sinh cây bị ảnh hƣởng đáng kể bởi liều chiếu xạ và nồng độ muối NaCl. Kết quả nghiên cứu của Chen et al. (2011) cũng cho thấy tốc độ tăng trƣởng của mô sẹo cỏ Manila Zoysia matrella (L.) Merr. bị ức chế bởi NaCl. Nghiên cứu trên mô sẹo mía CoC-671 của Patade et al. (2005) cũng cho thấy tỉ lệ sống của mô sẹo sau chiếu xạ giảm đáng kể khi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có nồng độ muối tăng từ 0-20 g/L.

4.3.3.2 Thí nghiệm 8b: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 2

99

Kết quả Bảng 4.33 cho thấy, trong lần chọn lọc thứ hai, nồng độ muối NaCl vẫn có ảnh hƣởng đến khả năng sống của mô sẹo. Ở 1 tuần SKC, nồng độ muối NaCl 7,5 g/L đã có dấu hiệu gây chết mô sẹo, tỉ lệ sống giảm còn 94,9% khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng.

Liều chiếu xạ và nồng độ NaCl (g/L)

0 Gy + NaCl 0 5 Gy + NaCl 0 10 Gy + NaCl 0 20 Gy + NaCl 0 40 Gy + NaCl 0 0 Gy + NaCl 2,5 5 Gy + NaCl 2,5 10 Gy + NaCl 2,5 20 Gy + NaCl 2,5 40 Gy + NaCl 2,5 0 Gy + NaCl 5 5 Gy + NaCl 5 10 Gy + NaCl 5 20 Gy + NaCl 5 40 Gy + NaCl 5 0 Gy + NaCl 7,5 5 Gy + NaCl 7,5 10 Gy NaCl 7,5 20 Gy + NaCl 7,5 40 Gy + NaCl 7,5 Trung bình (Liều chiếu xạ) 0 Gy 5 Gy 10 Gy 20 Gy 40 Gy Trung bình (Nồng độ NaCl) NaCl 0 NaCl 2,5 NaCl 5 NaCl 7,5 Fliều chiếu xạ FNaCl Fliều chiếu xạ x NaCl CV (%)

1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 98,0 100 100 100 100 94,0 100 87,5 92,8 100 98,0 100 96,9 98,2 100a 100a 99,6a 94,9b ns ** ns 7,8

Tuần sau khi cấy 5 100a 100a 100a 100a 100a 100a 94,0a 100a 100a 100a 84,2ab 78,0bc 83,7ab 70,0bc 61,4cd 91,3a 51,0de 63,4cd 25,8f 34,6ef 92,9a 80,8bc 86,8ab 74,0c 74,0c 100a 98,8a 75,5b 53,2c ** ** ** 24,0

3 100a 100a 100a 100a 100a 100a 98,0a 100a 100a 100a 90,9a 90,0a 96,0a 86,3a 90,7a 100a 69,3b 72,5b 49,2c 61,9bc 97,7a 89,3b 92,1ab 83,9b 88,1b 100a 99,6a 90,8b 70,6c ** ** ** 17,5

Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê;(**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.33: Tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 2

100

Đến 3 tuần SKC, có ảnh hƣởng tƣơng tác cũng nhƣ ảnh hƣởng riêng rẽ của nhân tố liều chiếu xạ và nồng độ muối NaCl đến tỉ lệ sống của mô sẹo. Liều chiếu xạ tăng và nồng độ muối tăng làm giảm khả năng sống sót. Liều 20 và 40 Gy ở nồng độ 7,5 g/L có tỉ lệ sống thấp nhất, tƣơng ứng là 49,2 và

61,9%, trong khi ở các nồng độ muối 0; 2,5 và 5 g/L, mô sẹo sống cao từ 86,3- 100%. Ở thời điểm 5 tuần SKC, tƣơng tác giữa liều chiếu xạ và nồng độ muối NaCl cho thấy khi chiếu xạ với liều từ 5-40 Gy, mô sẹo đƣợc xử lý muối 7,5 g/L bị giảm tỉ lệ sống rất đáng kể, nhất là mô sẹo ở liều 20 và 40 Gy (tƣơng ứng là 25,8 và 34,6%). Xét riêng rẽ từng nhân tố thì liều chiếu xạ cũng nhƣ nồng độ NaCl đều có ảnh hƣởng đến khả năng sống của mô sẹo, tỉ lệ sống cũng giảm khi liều chiếu xạ và nồng độ muối cao. Trung bình thấp nhất ở liều 20 và 40 Gy là 74,0% và ở nồng độ 7,5 g/L là 53,2%.

Nhìn chung, qua lần chọn lọc thứ 2, stress mặn vẫn có ảnh hƣởng đến khả năng sống của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4. Nồng độ muối NaCl cao từ 5-7,5 g/L thì tỉ lệ sống của mô sẹo giảm đáng kể. Liều chiếu xạ cao cũng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của mô sẹo. Mô sẹo không chiếu xạ vẫn có khả năng chịu mặn ở nồng độ muối 5 và 7,5 g/L.

4.3.3.3 Thí nghiệm 8c: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 3

Trong lần chọn lọc thứ ba, tỉ lệ sống của mô sẹo bắt đầu giảm ở tuần 3. Liều chiếu xạ và nồng độ muối NaCl cũng có ảnh hƣởng đến khả năng sống của mô sẹo. Tỉ lệ sống giảm ở liều chiếu xạ cao cũng nhƣ nồng độ NaCl cao. Mô sẹo ở liều 40 Gy có tỉ lệ sống thấp nhất là 83%, khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (96,4%) và nồng độ NaCl 7,5 g/L có tỉ lệ sống thấp nhất là 75%, khác biệt có ý nghĩa so với muối 5 và 0 g/L (lần lƣợt là 84,7 và 100%).

101

Đến 5 tuần SKC, liều chiếu xạ và nồng độ NaCl vẫn có ảnh hƣởng đến khả năng sống của mô sẹo. Mô sẹo chết nhiều khi tăng nồng độ muối hoặc tăng liều chiếu xạ. Cụ thể, ở liều 40 Gy mô sẹo sống 67,8%, thấp nhất và khác biệt có ý nghĩa so với liều 0 Gy. Ở nồng độ NaCl 7,5 g/L, mô sẹo sống với tỉ lệ thấp nhất là 45,9% (so với đối chứng là 100%). Không có ảnh hƣởng tƣơng tác giữa liều chiếu xạ và nồng độ NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo (Bảng 4.34).

Liều chiếu xạ và nồng độ NaCl (g/L)

3 100 100 100 100 100 100 100 100 100 98,0 100 77,2 91,7 77,8 77,0 85,7 81,0 76,3 75,0 57,0 96,4a 89,6ab 92,0ab 88,2ab 83,0b 100a 99,6a 84,7b 75,0c * ** ns 22,5

1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Tuần sau khi cấy 5 100 0 Gy + NaCl 0 100 5 Gy + NaCl 0 100 10 Gy + NaCl 0 100 20 Gy + NaCl 0 100 40 Gy + NaCl 0 100 0 Gy + NaCl 2,5 100 5 Gy + NaCl 2,5 100 10 Gy + NaCl 2,5 98,0 20 Gy + NaCl 2,5 98,0 40 Gy + NaCl 2,5 73,4 0 Gy + NaCl 5 69,3 5 Gy + NaCl 5 81,3 10 Gy + NaCl 5 53,0 20 Gy + NaCl 5 49,0 40 Gy + NaCl 5 63,1 0 Gy + NaCl 7,5 53,0 5 Gy + NaCl 7,5 49,4 10 Gy NaCl 7,5 40,0 20 Gy + NaCl 7,5 24,0 40 Gy + NaCl 7,5 Trung bình (Liều chiếu xạ) 84,1a 0 Gy 80,6ab 5 Gy 82,7a 10 Gy 72,8ab 20 Gy 67,8b 40 Gy Trung bình (Nồng độ NaCl) 100a NaCl 0 99,2a NaCl 2,5 65,2b NaCl 5 45,9c NaCl 7,5 * Fliều chiếu xạ ** FNaCl ns Fliều chiếu xạ x NaCl 30,3 CV (%) Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (*): khác biệt ở mức 5%; (**): khác biệt ở mức 1%.

102

Bảng 4.34: Tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 3

4.3.3.4 Thí nghiệm 8d: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 4

103

Bảng 4.35 cho thấy đến lần xử lý mặn thứ tƣ, ở 1 tuần SKC, nồng độ NaCl có ảnh hƣởng đến khả năng sống của mô sẹo. Ở nồng độ 7,5 g L, tỉ lệ sống của mô sẹo giảm tƣơng đối ít (còn 91,7%), tuy nhiên thấp nhất và khác khác biệt có ý nghĩa so với các nồng độ khác. Ở thời điểm này, liều chiếu xạ cũng nhƣ tƣơng tác giữa liều chiếu xạ và nồng độ muối không có ảnh hƣởng khác biệt lên tỉ lệ sống. Đến 3 và 5 tuần SKC thì ảnh hƣởng của từng nhân tố cũng nhƣ tƣơng tác giữa 2 nhân tố này khác biệt có ý nghĩa thống kê. Cụ thể, ở 3 tuần SKC, ở nồng độ muối 7,5 g L, gần nhƣ các mô sẹo đƣợc chiếu xạ với các liều từ 5-40 Gy có tỉ lệ sống thấp (từ 25,6-45,7%), khác biệt có ý nghĩa so với mô sẹo không chiếu xạ ở cùng nồng độ muối. Trong đó thấp nhất là mô sẹo ở liều 40 Gy (có tỉ lệ sống là 25,6%). Ở 5 tuần SKC thì các mô sẹo đƣợc chiếu xạ từ 10-40 Gy đều bị chết 100% ở nồng độ mặn 7,5 g L, duy nhất có 1 dòng mô sẹo sống sót với tỉ lệ 22,9% ở liều 5 Gy. Mô sẹo không chiếu xạ có tỉ lệ sống cao ở 3 tuần SKC (83,3%) cũng bị chết 100% ở thời điểm này. Đối với các mẫu mô sẹo sống sót ở nồng độ mặn 5 g L, tỉ lệ sống đạt đƣợc trên 50% ở cả mô sẹo chiếu xạ và không chiếu xạ, ngoại trừ mô sẹo ở liều chiếu xạ 40 Gy (4,0%). Những mẫu sống sót ở nồng độ mặn 2,5 g L có tỉ lệ sống không khác biệt so với nồng độ muối 0 g L cho thấy mô sẹo đậu nành MTĐ 740-4 sinh trƣởng bình thƣờng ở điều kiện mặn 2,5 g L. Nhìn chung mô sẹo chết cao khi tăng liều chiếu xạ cũng nhƣ tăng nồng độ muối NaCl. Tỉ lệ sống trung bình ở liều 40 Gy là 70,4% và nồng độ muối 7,5 g L là 42,5% ở 3 tuần SKC và giảm còn 50,5% ở liều chiếu xạ 40 Gy và 4,6% ở nồng độ mặn 7,5 g L.

Tuần sau khi cấy

Liều chiếu xạ và nồng độ NaCl (g/L)

0 Gy + NaCl 0 5 Gy + NaCl 0 10 Gy + NaCl 0 20 Gy + NaCl 0 40 Gy + NaCl 0 0 Gy + NaCl 2,5 5 Gy + NaCl 2,5 10 Gy + NaCl 2,5 20 Gy + NaCl 2,5 40 Gy + NaCl 2,5 0 Gy + NaCl 5 5 Gy + NaCl 5 10 Gy + NaCl 5 20 Gy + NaCl 5 40 Gy + NaCl 5 0 Gy + NaCl 7,5 5 Gy + NaCl 7,5 10 Gy NaCl 7,5 20 Gy + NaCl 7,5 40 Gy + NaCl 7,5 Trung bình (Liều chiếu xạ) 0 Gy 5 Gy 10 Gy 20 Gy 40 Gy Trung bình (Nồng độ NaCl) NaCl 0 NaCl 2,5 NaCl 5 NaCl 7,5 Fliều chiếu xạ FNaCl Fliều chiếu xạ x NaCl CV (%)

1 100 100 100 100 100 100 100 98,0 100 100 100 100 96,7 95,0 100 100 97,1 91,4 82,5 87,5 100 99,3 96,5 94,4 96,9 100a 99,6a 98,3a 91,7b ns ** ns 10,2

3 100a 100a 100a 96,0a 100a 100a 100a 98,0a 96,0a 100a 78,0bc 80,7b 68,7bcd 60,9cd 56,0de 83,3b 45,7def 27,9fg 30,0efg 25,6g 90,3a 81,6ab 73,6bc 70,7bc 70,4c 99,2a 98,8a 68,9b 42,5c ** ** ** 23,9

5 100a 100a 100a 94,0a 100a 100a 94,0a 98,0a 86,0a 98,0a 62,8b 64,7b 62,7b 60,9b 4,0d 0,0d 22,9c 0,0d 0,0d 0,0d 60,7a 70,4a 65,2a 60,2a 50,5b 98,8a 95,2a 51,0b 4,6c ** ** * 27,2

Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (*): khác biệt ở mức 5%; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.35: Tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 4

104

Kết quả sau 4 lần cấy chuyền liên tục trên môi trƣờng mặn cho thấy khả năng sống của mô sẹo bị ảnh hƣởng không chỉ do nồng độ mặn mà còn do tổn thƣơng của sự chiếu xạ. Liều chiếu xạ và nồng độ muối NaCl tăng thì tỉ lệ sống của mô sẹo giảm đáng kể (Hình 4.14). Mô sẹo sống sót ở nồng độ mặn

cao 7,5 g/L chỉ đạt đƣợc đối với mẫu đƣợc chiếu xạ với liều 5 Gy (1 dòng). Nhìn chung, các dòng mô sẹo có khả năng chịu mặn ở nồng độ 5 g/L có tỉ lệ sống khá cao ở cả nghiệm thức không chiếu xạ và chiếu xạ (ngoài trừ liều 40 Gy) cho thấy có thể chọn lọc đơn thuần hoặc kết hợp chiếu xạ tia gamma Co60 với liều từ 5-40 Gy để tạo các dòng mô sẹo chịu mặn ở nồng độ 5 g/L. Bên cạnh đó cũng cho thấy giống đậu nành MTĐ 760-4 ở mức độ mô sẹo có khả năng sinh trƣởng bình thƣờng ở nồng độ mặn NaCl 2,5 g/L.

a

b

c

d

Hình 4.14: Mức độ sống sót của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 sau 5 tuần nuôi

0 Gy + NaCl 0 g/L (a) 10 Gy + NaCl 2,5 g/L (b) 10 Gy + NaCl 5 g/L (c) 10 Gy + NaCl 7,5 g/L (d)

cấy ở lần chọn lọc 4

105

Kết quả phân tích proline ở Bảng 4.36 cho thấy có ảnh hƣởng của nồng độ muối lên sự tích lũy proline trong mẫu mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4, nồng độ muối tăng thì hàm lƣợng proline tăng. Hàm lƣợng proline cao nhất ở nồng độ muối 5 và 7,5 g/L (tƣơng ứng là 2,32 và 2,42 mol g trọng lƣợng tƣơi), không khác biệt nhau nhƣng khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (1,36 mol). Tƣơng tác giữa liều chiếu xạ và nồng độ NaCl cũng có ý nghĩa. Mô sẹo không chiếu xạ hoặc chiếu xạ 5 và 40 Gy mà không xử lý mặn hoặc xử lý mặn 2,5 g/L ở liều 0 và 5 Gy thì hàm lƣợng proline thấp nhất (khoảng 0,76-1,12 mol). Mô sẹo không chiếu xạ và mô sẹo ở liều 10 Gy khi đƣợc xử lý mặn ở 5 g/L có hàm lƣợng proline cao nhất với tƣơng ứng là 3,62 và 2,86 mol. Mô sẹo chiếu xạ 5 Gy có khả năng sống ở nồng độ muối 7,5 g/L cũng có sự tích lũy proline khá cao (2,42 mol).

Nồng độ NaCl (g L)

Liều chiếu xạ (Gy)

Trung bình

7,5

0 5 10 20 40

1,85 1,44 1,91 1,70 1,71

Trung bình

0 0,85e 1,05e 1,28de 2,49bc 1,12e 1,36b

2,5 1,10e 0,76e 1,61cde 1,30de 1,69cde 1,29b

5 3,62a 1,52cde 2,86ab 1,31de 2,33bcd 2,32a ns ** ** 40,7

- 2,42bcd - - - 2,42a

Fliều chiếu xạ FNaCl Fliều chiếu xạ x NaCl CV (%)

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.36: Hàm lƣợng proline của mô sẹo (mol g trọng lƣợng tƣơi) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl sau 4 lần chọn lọc

Nghiên cứu của Rahnama and Ebrahimzadeh (2012) trên khoai tây cũng cho thấy hàm lƣợng proline tích lũy cao trong mô sẹo trên môi trƣờng có nồng độ muối cao. Khi tăng áp lực chọn lọc muối, mô sẹo mía Coc-671 cũng tích lũy proline cao hơn mô sẹo không đƣợc chọn lọc trong môi trƣờng muối (Patade et al., 2005). Dehpour et al. (2011) đã nghiên cứu sự ảnh hƣởng của liều lƣợng chiếu xạ tia gamma và stress muối lên sự sinh trƣởng và hàm lƣợng proline trên mô sẹo lúa, kết quả cho thấy khi tăng nồng độ muối thì hàm lƣợng proline có trong mô sẹo cũng tăng theo.

Kết quả cho thấy các dòng mô sẹo MTĐ 760-4 có tiềm năng chống chịu mặn ở nồng độ NaCl 5 g/L là ở liều 0 và 10 Gy, với hàm lƣợng proline tích lũy cao, khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (0 Gy + 0 NaCl). Hàm lƣợng proline tích lũy cao ở các dòng mô sẹo này chứng tỏ chúng đã có sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào để có thể thích nghi với điều kiện mặn của môi trƣờng.

106

Có rất nhiều giống cây trồng đã đƣợc ứng dụng kết hợp phƣơng pháp gây đột biến bằng tia gamma với chọn lọc in vitro để tạo giống có khả năng chống chịu mặn. Trên cây lúa, Saleem et al. (2005) đã cảm ứng tạo đột biến mô sẹo phát sinh phôi của giống lúa (Oryza sativa L.) cv. Basmati 370 bằng cách chiếu xạ tia gamma ở liều 50 Gy và chọn lọc trên môi trƣờng có độ EC của muối NaCl là 4, 6, 8 và 10 d/Sm. Kết quả tạo đƣợc 2 dòng (thế hệ M2) chống chịu mặn mức độ trung bình ở giai đoạn cây con. Ở lúa mì, El-Sayed et al. (2007) đã xử lý đột biến và chọn lọc in vitro trên mẫu mô sẹo để cải thiện khả

năng chống chịu mặn ở hai giống Sakha 93 và Sohag 3. Kết quả cho thấy phân tích điện di mô sẹo đƣợc chiếu xạ và xử lý muối cho thấy tất cả đều xuất hiện các băng protein ở các liều tia gamma và mức độ stress mặn với sự thêm vào của những băng mới là kết quả của sự cảm ứng đột biến bằng tia gamma. Trên cây mía, Patade et al. (2008) đã chiếu xạ để tạo đột biến, tiếp theo là chọn lọc in vitro để tạo dòng chống chịu mặn của giống mía Ấn Độ (Saccharum officinarum L.) cv. CoC-671. Tổng số 147 cây đã đƣợc chọn lọc từ các mức độ muối khác nhau. Nikam et al. (2014) đã gây đột biến bằng cách chiếu xạ tia gamma với các liều 30, 40 và 50 Gy và chọn lọc in vitro giống mía Co740 trên môi trƣờng mặn với muối NaCl nồng độ 0; 2,9; 5,8; 8,8; 11,7 và 14,6 g/L. Kết quả cho thấy sự sinh trƣởng của mô sẹo và khả năng tái sinh cây bị ảnh hƣởng đáng kể bởi liều chiếu xạ và nồng độ muối NaCl. Sự chống chịu mặn đạt đƣợc bằng cách chiếu xạ mô sẹo và chọn lọc trên môi trƣờng muối NaCl qua các bƣớc chọn lọc in vitro.

Nhìn chung, mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 sinh trƣởng bình thƣờng ở nồng muối NaCl 2,5 g/L. Nhƣ vậy, với phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma Co60, qua 4 lần chọn lọc thu đƣợc các dòng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 có khả năng chịu mặn với nồng độ muối NaCl 5 g/L ở mẫu chiếu xạ liều 10 Gy cũng nhƣ ở mẫu không xử lý chiếu xạ.

4.3.4 Thí nghiệm 9: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trƣởng của chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4

4.3.4.1 Thí nghiệm 9a: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và

muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 1

a) Tỉ lệ sống

107

Kết quả Bảng 4.37 cho thấy, các nồng độ muối NaCl xử lý có ảnh hƣởng đến tỉ lệ sống của trục phôi đậu nành ở các thời điểm 2, 4 và 6 tuần SKC. Ở 4 và 6 tuần SKC, nồng độ muối càng cao thì tỉ lệ sống của trục phôi càng giảm. Tỉ lệ sống thấp nhất là ở 2 nồng độ NaCl 7,5 và 10 g L, chỉ từ 40,6-51,6%, khác biệt có ý nghĩa so với nồng độ NaCl 5 g L (71,9%) và đối chứng NaCl 0 g L (92,2%). Các liều chiếu xạ từ 0-60 Gy không có ảnh hƣởng đến tỉ lệ sống của trục phôi qua các thời điểm theo dõi.

Liều chiếu xạ và nồng độ NaCl (g/L)

0 Gy + NaCl 0 20 Gy + NaCl 0 40 Gy + NaCl 0 60 Gy + NaCl 0 0 Gy + NaCl 5 20 Gy + NaCl 5 40 Gy + NaCl 5 60 Gy + NaCl 5 0 Gy + NaCl 7,5 20 Gy + NaCl 7,5 40 Gy + NaCl 7,5 60 Gy + NaCl 7,5 0 Gy + NaCl 10 20 Gy + NaCl 10 40 Gy NaCl 10 60 Gy + NaCl 10 Trung bình (Liều chiếu xạ) 0 Gy 20 Gy 40 Gy 60 Gy Trung bình (Nồng độ NaCl) NaCl 0 NaCl 5 NaCl 7,5 NaCl 10 Fliều chiếu xạ FNaCl Fliều chiếu xạ x NaCl CV (%)

2 100a 100a 100a 100a 100a 81,3bc 93,8ab 93,8ab 43,8d 93,8ab 56,3cd 37,5d 87,5ab 87,5ab 93,8ab 81,3bc 82,8 90,6 85,9 78,1 100a 92,2b 57,8c 87,5b ns ** ** 19,1

Tuần sau khi cấy 6 100a 87,5ab 81,3ab 100a 87,5ab 75,0abc 56,3bcd 68,8abc 25,0cd 93,8ab 31,3cd 12,5d 31,3cd 50,0abcd 62,5abc 62,5bcd 60,9 76,6 57,8 60,9 92,2a 71,9b 40,6c 51,6c ns ** ** 42,9

4 100a 87,5abc 81,3abcd 100a 87,5abc 81,3abcd 87,5abc 75,0abcde 25,0f 93,8ab 37,5ef 25,0f 50,0def 50,0cdef 62,5bcdef 62,5bcdef 65,6 78,1 67,2 65,6 92,2a 82,8a 45,3b 56,3b ns ** ** 36,8

Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan;(ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.37: Tỉ lệ sống của trục phôi (%) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl ở 2, 4 và 6 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

108

Tuy nhiên có ảnh hƣởng tƣơng tác giữa liều chiếu xạ và nồng độ NaCl lên tỉ lệ sống của trục phôi. Ở 2 tuần SKC, mẫu trục phôi không xử lý mặn sống 100% ở tất cả các liều chiếu xạ và mẫu trục phôi xử lý mặn 5 g L nhƣng không chiếu xạ cũng sống 100%, tỉ lệ sống thấp nhất hầu nhƣ ở nồng độ NaCl 7,5 g L. Ở 4 tuần SKC, tỉ lệ mẫu sống cao ở các nghiệm thức không xử lý mặn và xử lý NaCl 5 g L (đạt từ 75,0-100%) và giảm thấp nhất ở các nghiệm thức có nồng độ NaCl tăng cao từ 7,5-10 g/L (25,0-62,5%), ngoại trừ mẫu ở liều chiếu xạ 20 Gy kết hợp chọn lọc mặn ở nồng độ 7,5 g L. Đến 6 tuần SKC, kết

quả cũng tƣơng tự, khi nồng độ mặn cao, mẫu có khuynh hƣớng giảm tỉ lệ sống. Tỉ lệ sống thấp nhất ở nghiệm thức muối NaCl 5 g L + liều 40 Gy, NaCl 7,5 g L + liều 0, 40 và 60 Gy, NaCl 10 g L + liều 0, 20 và 60 Gy.

b) Tỉ lệ tạo chồi

Mẫu có sự hình thành chồi ở 2 tuần SKC, tuy nhiên tỉ lệ rất thấp. Đến 4 và 6 tuần SKC, tỉ lệ tạo chồi có sự gia tăng và khác biệt rõ ở các nghiệm thức. Tỉ lệ tạo chồi giảm khi tăng nồng độ muối NaCl. Nồng độ NaCl tăng từ 5-10 g/L có tỉ lệ tạo chồi thấp nhất và khác biệt có ý nghĩa so với nồng độ NaCl 0 g/L ở thời điểm 4 và 6 tuần SKC. Cụ thể, đến 6 tuần SKC, tỉ lệ tạo chồi thấp nhất (3,1%) ở nồng độ NaCl cao nhất là 10 g/L, không khác biệt so với nồng độ 7,5 g/L (9,4%), nhƣng có khác biệt so với NaCl 5 và 0 g/L (tƣơng ứng là 12,5 và 31,3%).

Ở 4 và 6 tuần SKC, liều chiếu xạ 20 và 40 Gy có tỉ lệ tạo chồi (từ 10,9- 14,1% ở 4 tuần và từ 12,5-18,8% ở 6 tuần) không khác biệt so với liều 0 Gy (21,9 ở 2 tuần và 25,0% ở 6 tuần) nhƣng có khác biệt với liều 60 Gy (tạo chồi 0%). Kết quả cho thấy liều 60 Gy gây tổn thƣơng mẫu cấy nhiều nhất, mẫu hoàn toàn không tạo chồi.

109

Có ảnh hƣởng tƣơng tác giữa liều chiếu xạ và nồng độ NaCl lên tỉ lệ tạo chồi của mẫu cấy. Ở 4 tuần SKC, tỉ lệ tạo chồi cao nhất ở liều 0 Gy + NaCl 0 g/L (68,8%), thấp nhất là ở liều 60 Gy khi xử lý với NaCl từ 0-10 g/L, liều 0 và 20 Gy + NaCl 10 g/L, 0 Gy + NaCl 7,5 g/L và 40 Gy + NaCl 5 g/L (không tạo chồi). Đến 6 tuần SKC, liều 0, 20 và 40 Gy + NaCl 0 g/L cho tỉ lệ tạo chồi cao nhất cùng với nghiệm thức 0 Gy + NaCl 5 g/L, 20 Gy + NaCl 5 g/L và 20 Gy + NaCl 7,5 g/L (Bảng 4.38).

Tuần sau khi cấy

Liều chiếu xạ và nồng độ NaCl (g/L)

0 Gy + NaCl 0 20 Gy + NaCl 0 40 Gy + NaCl 0 60 Gy + NaCl 0 0 Gy + NaCl 5 20 Gy + NaCl 5 40 Gy + NaCl 5 60 Gy + NaCl 5 0 Gy + NaCl 7,5 20 Gy + NaCl 7,5 40 Gy + NaCl 7,5 60 Gy + NaCl 7,5 0 Gy + NaCl 10 20 Gy + NaCl 10 40 Gy NaCl 10 60 Gy + NaCl 10 Trung bình (Liều chiếu xạ) 0 Gy 20 Gy 40 Gy 60 Gy Trung bình (Nồng độ NaCl) NaCl 0 NaCl 5 NaCl 7,5 NaCl 10 Fliều chiếu xạ FNaCl Fliều chiếu xạ x NaCl CV (%)

4 68,8a 25,0b 18,8b 0,0c 18,8b 18,8b 0,0c 0,0c 0,0c 12,5bc 12,5bc 0,0c 0,0c 0,0c 12,5bc 0,0c 21,9a 14,1a 10,9a 0,0b 28,1a 9,4b 6,3b 3,1b ** ** ** 89,3

6 68,8a 31,3b 25,0bc 0,0d 31,3bc 18,8bcd 0,0d 0,0d 0,0d 25,0bc 12,5cd 0,0d 0,0d 0,0d 12,5cd 0,0d 25,0a 18,8a 12,5a 0,0b 31,3a 12,5b 9,4bc 3,1c ** ** ** 79,7

Số liệu được chuyển sang dạng Arcsin√x trước khi phân tích thống kê. Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.38: Tỉ lệ tạo chồi (%) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl ở 4 và 6 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

c) Chiều cao chồi

110

Bảng 4.39 cho thấy chiều cao chồi cũng bị ảnh hƣởng bởi nồng độ NaCl và liều chiếu xạ. Nồng độ NaCl và liều chiếu xạ tăng làm giảm chiều cao của chồi. Cụ thể, ở 4 tuần SKC, nồng độ NaCl 7,5 và 10 g L cho chiều cao chồi thấp nhất (khoảng 0,2 cm), khác biệt có ý nghĩa so với liều 5 và 0 g L (khoảng 0,3-0,4 cm). Liều chiếu xạ từ 20 Gy đã có ảnh hƣởng đến chiều cao chồi, kết quả có sự khác biệt so với liều 0 Gy (0,22 cm so với 0,64 cm). Ở 6 tuần SKC, chiều cao chồi có sự gia tăng nhƣng không nhiều. Mặc dù vậy vẫn thấy rõ sự

khác biệt về chiều cao chồi ở các liều chiếu xạ so với liều đối chứng, cũng nhƣ nồng độ NaCl xử lý so với nồng độ đối chứng. Chồi chiếu xạ từ 20 Gy có chiều cao chồi giảm thấp nhất còn 0,35 cm so với đối chứng 1,58 cm. Nồng độ NaCl từ 5-10 g L có chiều cao chồi từ 0,3-0,45 cm so với đối chứng là 1,19 cm.

Có ảnh hƣởng tƣơng tác giữa liều chiếu xạ và nồng độ muối NaCl xử lý lên chiều cao chồi ở 4 và 6 tuần SKC. Chiều cao chồi cao nhất là ở liều 0 Gy + NaCl 0 g/L, thấp nhất là ở liều 20 Gy + NaCl 0 g/L, 20 Gy + NaCl 5 g/L, 20 Gy + NaCl 7,5 g/L, 40 Gy + NaCl 7,5 g/L, 40 Gy + NaCl 10 g/L.

Kết quả cho thấy, trong phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma Co60 liều 0, 20, 40 và 60 Gy kết hợp với xử lý NaCl 0; 5; 7,5 và 10 g/L, mẫu trục phôi đậu nành có sự giảm tỉ lệ sống, tỉ lệ tạo chồi và chiều cao chồi thấp do ảnh hƣởng của sự chiếu xạ và xử lý mặn. Ở liều chiếu xạ 60 Gy, mẫu không có sự tạo chồi. Các mẫu chồi có tiềm năng chống chịu mặn thu đƣợc sau chọn lọc trong thí nghiệm là ở liều 0 Gy + NaCl 5 g/L, liều 20 Gy + NaCl 5 g/L, liều 20 Gy + NaCl 7,5 g/L, liều 40 Gy + NaCl 5 g/L, liều 40 Gy + NaCl 7,5 g/L nhƣng với số lƣợng rất ít (Hình 4.15). Những mẫu chồi này tiếp tục đƣợc cấy chuyền trên môi trƣờng có cùng nồng độ muối để chọn lọc lần thứ 2.

111

Hình 4.15: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và NaCl lên sự tạo chồi đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 1 0 Gy + NaCl 5 g/L (a) 20 Gy + NaCl 5 g/L (b) 20 Gy + NaCl 7,5 g/L (c) 60 Gy + NaCl 5 g/L (d)

Tuần sau khi cấy

Liều chiếu xạ và nồng độ NaCl (g/L)

0 Gy + NaCl 0 20 Gy + NaCl 0 40 Gy + NaCl 0 60 Gy + NaCl 0 0 Gy + NaCl 5 20 Gy + NaCl 5 40 Gy + NaCl 5 60 Gy + NaCl 5 0 Gy + NaCl 7,5 20 Gy + NaCl 7,5 40 Gy + NaCl 7,5 60 Gy + NaCl 7,5 0 Gy + NaCl 10 20 Gy + NaCl 10 40 Gy NaCl 10 60 Gy + NaCl 10 Trung bình (Liều chiếu xạ) 0 Gy 20 Gy 40 Gy 60 Gy Trung bình (Nồng độ NaCl) NaCl 0 NaCl 5 NaCl 7,5 NaCl 10 Fliều chiếu xạ FNaCl Fliều chiếu xạ x NaCl CV (%)

4 0,78a 0,20d 0,30c - 0,50b 0,20d - - - 0,25cd 0,30c - - - 0,20d - 0,64a 0,22b 0,23b - 0,43a 0,35a 0,23b 0,20b ** ** ** 13,6

6 2,55a 0,29d 0,75b - 0,62bc 0,28d - - - 0,45bcd 0,30cd - - - 0,30cd - 1,58a 0,34c 0,45b - 1,19a 0,45b 0,38b 0,30b ** ** ** 23,3

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan; (**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.39: Chiều cao chồi (cm) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl ở 4 và 6 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

4.3.4.2 Thí nghiệm 9b: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và

muối NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 2

112

Các chồi hình thành từ xử lý chiếu xạ tia gamma và nuôi cấy trên môi trƣờng mặn đƣợc tiếp tục cấy chuyền trên môi trƣờng có cùng nồng độ muối NaCl. Kết quả sinh trƣởng chiều cao của chồi trên môi trƣờng mặn trong lần xử lý thứ hai này đƣợc trình bày trong Bảng 4.31. Ở thời điểm 1 tuần SKC, chiều cao chồi gia tăng rất thấp hoặc không gia tăng ở các nghiệm thức có xử lý mặn (0,00-0,10 cm), khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (liều 0 Gy + NaCl 0 g/L) (1,16 cm). Đến 2 và 3 tuần SKC, có sự gia tăng chiều

cao chồi ở các nghiệm thức. Tuy nhiên, các nghiệm thức xử lý mặn với muối NaCl có chiều cao chồi gia tăng rất thấp, chỉ đạt từ 0,10-0,45 không khác biệt nhau nhƣng khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (đạt 5,88 cm) ở 3 tuần SKC (Bảng 4.40).

Kết quả cho thấy trong lần xử lý thứ hai này, nồng độ muối NaCl, cũng nhƣ sự chiếu xạ tiếp tục có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của chồi đậu nành. Chồi rất nhỏ, gia tăng chiều cao rất ít nên không đánh giá đƣợc chỉ tiêu về số lá. Những chồi này sinh trƣởng chậm, nhƣng vẫn sống, vì vậy có thể tiếp tục đƣợc xử lý với muối NaCl trong lần chọn lọc 3.

0 Gy + NaCl 0 0 Gy + NaCl 5 20 Gy + NaCl 5 20 Gy + NaCl 7,5 40 Gy + NaCl 5 40 Gy + NaCl 7,5 Trung bình F CV (%)

Tuần 1 1,16a 0,00b 0,10b 0,03b 0,10b 0,05b 0,53 ** 50,3

Thời gian theo dõi (tuần) Tuần 3 5,88a 0,10b 0,45b 0,23b 0,25b 0,25b 2,66 ** 22,9

Tuần 2 3,24a 0,07b 0,25b 0,13b 0,20b 0,15b 1,48 ** 35,7

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan ở;(**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.40: Chiều cao chồi gia tăng (cm) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl ở 1, 2 và 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Liều chiếu xạ và nồng độ NaCl (g/L)

4.3.4.2 Thí nghiệm 9c: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và

muối NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 3

113

Kết quả Bảng 4.41 cho thấy trong lần chọn lọc 3 này, sinh trƣởng của các chồi đƣợc xử lý mặn cũng rất chậm, gần nhƣ không tăng trƣởng (Hình 4.16). Chiều cao chồi gia tăng ở tuần 1 cũng nhƣ đến tuần 3 rất thấp. Cụ thể, ở 3 tuần SKC, chiều cao chồi gia tăng chỉ tăng từ 0,13-0,25 cm ở các nghiệm thức xử lý NaCl ở liều 0, 20 và 40 Gy, trong khi mẫu chồi ở nghiệm thức đối chứng gia tăng đến 5,91 cm.

0 Gy + NaCl 0 0 Gy + NaCl 5 20 Gy + NaCl 5 20 Gy + NaCl 7,5 40 Gy + NaCl 5 40 Gy + NaCl 7,5 Trung bình F CV (%)

Tuần 1 1,38a 0,03b 0,05b 0,03b 0,00b 0,05b 0,65 ** 14,7

Thời gian theo dõi (tuần) Tuần 3 5,91a 0,20b 0,25b 0,13b 0,15b 0,23b 2,79 ** 10,4

Tuần 2 2,52a 0,10b 0,15b 0,13b 0,10b 0,15b 1,21 ** 20,1

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan ở;(**): khác biệt ở mức 1%.

Bảng 4.41: Chiều cao chồi gia tăng (cm) ảnh hƣởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl ở 1, 2 và 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Liều chiếu xạ và nồng độ NaCl (g/L)

a

b

c

Hình 4.16: Ảnh hƣởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và NaCl lên sự sinh

0 Gy + NaCl 5 g/L (a) 20 Gy + NaCl 5 g/L (b) 20 Gy + NaCl 7,5 g/L (c)

trƣởng của chồi đậu nành MTĐ 760-4

114

Sau 3 lần chọn lọc, các mẫu chồi sống sót ở các nghiệm thức xử lý mặn này đƣợc cấy chuyền trở lại môi trƣờng MS không bổ sung muối để tiến hành nhân nhanh chồi. Tuy nhiên, tất cả các mẫu này vẫn không thể phục hồi và sinh trƣởng bình thƣờng. Nhƣ vậy, với phƣơng pháp xử lý chiếu xạ tia gamma Co60 với liều 0, 10, 20, 40, 60 Gy kết hợp với xử lý mặn qua 3 chu kỳ chọn lọc, kết quả chƣa thu đƣợc các dòng chống chịu mặn. Nguyên nhân có thể là do số mẫu xử lý chƣa nhiều, tần suất xuất hiện đột biến thấp nên chƣa thu

đƣợc các dòng đột biến. Các chồi đậu nành vẫn duy trì đƣợc ở nghiệm thức 0 Gy + NaCl 5 g/L, 20 Gy + NaCl 5 g/L và 20 Gy + NaCl 7,5 g/L, 40 Gy + NaCl 5 g/L và 40 Gy + NaCl 7,5 g/L có thể mới chỉ thích nghi tạm thời với điều kiện mặn, chƣa có sự thay đổi di truyền để có thể đáp ứng thật sự đối với điều kiện bất lợi của môi trƣờng.

4.3.5 Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đậu nành chống

chịu mặn

4.3.5.1 Sự sai khác di truyền của các dòng mô sẹo đậu MTĐ 760-4

chống chịu mặn sau chọn lọc biến dị soma và chiếu xạ tia gamma Co60

Kết quả phân tích bằng kỹ thuật ISSR-PCR với 10 mồi cho thấy, có 5 mồi là ISSR02, ISSR03, ISSR13, ISSR19 và ISSR27 cho kết quả không khác biệt di truyền giữa hai mẫu mô sẹo đƣợc xử lý NaCl 5 g/L bằng phƣơng pháp gây biến dị soma và phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma Co60 so với mẫu đối chứng không xử lý mặn (Hình 4.17 và 4.18). Có 4 mồi là ISSR31, ISSRK1, ISSRK2, ISSRK3 không cho sản phẩm PCR. Chỉ có 1 mồi là ISSR22 (giếng 1-3) cho sự khác biệt rõ giữa 2 dòng mô sẹo đƣợc chọn lọc mặn so với dòng đối chứng không xử lý mặn với băng DNA khoảng 450 bp không xuất hiện ở mẫu mô sẹo đƣợc chọn lọc với muối NaCl 5 g/L và mẫu mô sẹo chiếu xạ liều 10 Gy kết hợp xử lý mặn với NaCl 5 g/L, trong khi mẫu đối chứng có xuất hiện của băng này (Hình 4.18). Điều đó chứng tỏ có sự thay đổi trong cấu trúc di truyền của mẫu mô sẹo MTĐ 760-4 sau khi đƣợc chọn lọc mặn với muối NaCl.

1 2 3 L 4 5 6 7 8 9 L 10 11 12

115

Hình 4.17: Phổ diện điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR02 (giếng 1-3), ISSR03 (giếng 4-6), ISSR13 (giếng 7-9) và ISSR19 (giếng 10-12) L: thang chuẩn 100 bp, giếng 1, 4, 7, 10 : 0 Gy + NaCl 0 g L (đối chứng); giếng 2, 5, 8, 11: NaCl 5 g/L; giếng 3, 6, 9, 12: 10 Gy + NaCl 5 g/L

L 1 2 3 4 5 6

1000 bp

500 bp

100 bp

Hình 4.18: Phổ diện điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR22 (giếng 1-3) và ISSR27 (giếng 4-6) L: thang chuẩn 100 bp; giếng 1, 4: 0 Gy + NaCl 0 g L (đối chứng); giếng 2, 5: NaCl 5 g/L; giếng 3, 6: 10 Gy + NaCl 5 g/L

ISSR đã đƣợc sử dụng để phát hiện sự đa dạng di truyền và sự khác biệt giữa các giống đậu nành (Yang et al., 1996). Báo cáo của Mahgoub et al. (2016) cho thấy chỉ thị phân tử ISSR có liên quan đến tính chống chịu mặn ở các giống đậu nành khác nhau dƣới điều kiện stress mặn. Kết quả phân tích ISSR sử dụng 4 mồi cho thấy có 36 đoạn đa hình với tỉ lệ 91,57% trong tổng số 39 đoạn đƣợc khuếch đại dƣới điều kiện stress mặn. Sáu giống đậu nành có 30 đoạn ISSR đặc hiệu dƣơng với tính chống chịu mặn với tỉ lệ đa hình 74,83%. Kỹ thuật này cũng đã đƣợc sử dụng để xác định các chỉ thị phân tử liên quan đến tính chống chịu mặn ở lúa mì (Lang et al., 2001), lúa (Kaushik et al., 2003), lúa mạch (Khatab and Samah, 2013), sorghum (Khalil, 2013) và mía (Markad et al., 2014). Hai trong năm marker ISSR đã đƣợc xác định liên quan đến tính chống chịu mặn ở các kiểu gen cây cỏ linh lăng (Medicago sativa L.) (Abdel-Tawab et al., 2011).

Từ kết quả trên cho thấy phƣơng pháp gây biến dị soma với mẫu mô sẹo giống đậu nành MTĐ 760-4 bằng cách chọn lọc liên lục trên môi trƣờng mặn với muối NaCl cũng nhƣ phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma Co60 để gây đột biến kết hợp với chọn lọc mặn có hiệu quả tạo dòng đậu nành có khả năng chống chịu mặn. Cả hai phƣơng pháp này, đối với vật liệu là mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 đều thu đƣợc các dòng mô sẹo có khả năng chống chịu mặn với muối NaCl 5 g/L.

116

Nhƣ vây, sau 4 lần chọn lọc, kết quả thu đƣợc 1 dòng mô sẹo đậu nành có khả năng chống chịu mặn với nồng độ muối NaCl 5 g/L bằng phƣơng pháp gây biến dị soma và 1 dòng bằng phƣơng phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma

Co60 (liều 10 Gy). Các dòng mô sẹo có sự khác biệt di truyền so với mẫu đối chứng.

4.3.5.2 Sự sai khác di truyền của các dòng cây đậu nành MTĐ 760-4

chống chịu mặn sau chọn lọc biến dị soma

Kết quả phân tích với mồi ISSR22 ở Hình 4.19 cho thấy hầu hết các mẫu cây đậu nành thu đƣợc sau chọn lọc mặn ở nồng độ NaCl 2,5 g/L (6 cây) chƣa thấy có sự sai khác di truyền so với mẫu đối chứng (không xử lý NaCl). Tuy nhiên, khi xử lý mặn ở nồng độ muối NaCl 5 g/L có một mẫu cây đậu nành (1 4 cây) cho thấy có sự khác biệt với băng DNA khoảng 1.250 bp không xuất hiện và xuất hiện một băng DNA ở 480 bp, chứng tỏ đã có sự biến đổi trong cấu trúc DNA của mẫu đƣợc gây biến dị soma bằng xử lý mặn, có khả năng có một đoạn DNA khoảng 770 bp đã bị đột biến mất đoạn. Điều đó cho thấy, phƣơng pháp gây biến dị soma đối với mẫu chồi hình thành từ trục phôi có khả năng tạo dòng đậu nành có khả năng chống chịu mặn với muối NaCl.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M

10000 bp

1500 bp

1000 bp 750 bp

500 bp

Hình 4.19: Phổ diện điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR22 M: thang chuẩn 1000 bp, giếng 1: NaCl 0 g L (Cây đối chứng); giếng 2, 3, 4, 5, 6,7: NaCl 2,5 g/L; giếng 8, 9, 10, 11: NaCl 5 g/L

Nhƣ vậy, sau 3 lần chọn lọc, kết quả thí nghiệm thu đƣợc 1 dòng cây đậu nành MTĐ 760-4 có khả năng chống chịu mặn với nồng độ muối NaCl 5 g/L. Dòng đậu nành này có sự khác biệt di truyền so với mẫu cây đối chứng.

4.3.6 Thí nghiệm 10: Đánh giá khả năng sinh trƣởng và phát triển

của các dòng đậu nành chống chịu mặn trong điều kiện nhà lƣới

4.3.6.1 Chiều cao chồi gia tăng

117

Ghi nhận chung, cây con đƣợc thuần dƣỡng và tƣới nƣớc mặn trong nhà lƣới có điều kiện cƣờng độ ánh sáng lúc 14h khoảng 3.500-5.000 lux, nhiệt độ 36-380C, ẩm độ khoảng 55%, có tỉ lệ sống cao trên 80,0%. Cây con sau 2 tuần thuần dƣỡng đƣợc tiến hành xử lý tƣới nƣớc mặn. Giá trị EC và pH đất đƣợc

ghi nhận ở tuần thứ 4 sau khi trồng. Kết quả cho thấy pH đất khoảng 5,0, giá trị EC của đất tƣới nƣớc máy là 1,3 dS m, của đất đƣợc tƣới mặn với muối NaCl nồng độ 2,5 g/L là 3,4 dS m và nồng độ 5 g L là 4,7 dS m. Trong điều kiện thí nghiệm này, sinh trƣởng của giống đậu nành MTĐ 760-4 đối chứng bình thƣờng, cây xanh tốt và ra hoa ở 4 tuần sau khi trồng. Trong khi đó, muối NaCl ở nồng độ tƣới là 2,5 và 5 g L đã có ảnh hƣởng lên sự sinh trƣởng về chiều cao, số lóng và khả năng sống của cây đậu nành. Kết quả sinh trƣởng của cây đậu nành ở các nghiệm thức đƣợc trình bày trong Bảng 4.42 và 4.43.

Bảng 4.42 cho thấy ở thời điểm 1 và 2 tuần SKTD, các cây đậu nành không xử lý mặn và cây đƣợc xử lý mặn 2,5 và 5 g/L không khác biệt về sự gia tăng chiều cao. Đến tuần 3 và 4 SKTD, chiều cao gia tăng có sự khác biệt giữa các nghiệm thức. Dòng đậu nành NaCl 0 g/L tƣới nƣớc máy và 2 dòng NaCl 2,5 và 5 g/L tƣới nƣớc mặn có chiều cao chồi gia tăng cao nhất (trung bình từ 5,46-7,04 cm), khác biệt có ý nghĩa so với dòng đối chứng tƣới nƣớc mặn NaCl 2,5 và 5 g/L (chỉ đạt khoảng 2,7 cm) ở 3 tuần SKTD. Tƣơng tự, ở 4 tuần SKTD, 2 dòng đậu nành đƣợc chọn lọc mặn sau khi tƣới mặn vẫn sinh trƣởng bình thƣờng, có chiều cao gia tăng khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng tƣới nƣớc máy (tƣơng ứng là 12,79 và 12,99 cm so với 13,17 cm). Hai dòng đậu nành đối chứng đƣợc tƣới mặn NaCl 2,5 và 5 g/L có chiều cao gia tăng thấp nhất. Đến 5 tuần SKTD, chiều cao gia tăng của các cây đậu nành dòng NaCl 5 g/L vẫn không khác biệt so với đối chứng, trong khi dòng NaCl 2,5 g/L có sự khác biệt. Chiều cao gia tăng của 2 dòng này lần lƣợt là 17,88 và 16,58 so với 19,67 cm. Trong khi đó, 2 dòng đối chứng khi đƣợc tƣới nƣớc mặn ở 2 nồng độ 2,5 và 5 g/L đã có ảnh hƣởng lên sự gia tăng chiều cao cây. Chiều cao gia tăng thấp nhất trong các nghiệm thức, chỉ đạt 9,14-9,53 cm.

Dòng cây + Nƣớc tƣới (đơn vị nồng độ NaCl-g/L) Dòng NaCl 0 + Tƣới nƣớc máy Dòng NaCl 0 + Tƣới NaCl 2,5 Dòng NaCl 0 + Tƣới NaCl 5 Dòng NaCl 2,5 + Tƣới NaCl 2,5 Dòng NaCl 5 + Tƣới NaCl 5 Trung bình F CV (%)

Thời gian theo dõi (tuần) Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 19,67a 7,04a 13,17a 9,53c 2,70b 5,74b 2,78b 9,14c 5,54b 16,58b 6,79a 12,79a 12,99a 17,88ab 5,46a 14,75 10,20 4,96 ** ** ** 23,8 31,7 42,3

2,08 2,00 1,82 2,79 2,54 2,25 ns 51,2

1,40 0,97 0,78 1,33 1,42 1,18 ns 64,0

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan ở; (ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (**): khác biệt ở mức 1%.

118

Bảng 4.42: Chiều cao chồi gia tăng (cm) ảnh hƣởng bởi tƣới nƣớc mặn

4.3.6.2 Số lóng gia tăng

Về sự gia tăng số lóng của cây, ở 1 và 2 tuần SKTD, do chƣa xử lý nƣớc mặn nên số lóng gia tăng ở các nghiệm thức là tƣơng tự nhau. Đến 3 tuần SKTD, vẫn chƣa có sự khác biệt về số lóng gia tăng ở các nghiệm thức. Đến thời điểm 4 tuần, số lóng gia tăng khác biệt có ý nghĩa giữa các dòng đƣợc chọn lọc mặn và dòng đối chứng bị xử lý nƣớc mặn. Cụ thể, 2 dòng đƣợc chọn lọc mặn ở nồng độ NaCl 2,5 và 5 g/L vẫn gia tăng số lóng bình thƣờng nhƣ nghiệm thức đối chứng tƣới nƣớc máy, với số lóng trung bình từ 2,42-2,58 lóng. Tuy nhiên, số lóng gia tăng ít do bị ảnh hƣởng bởi nƣớc mặn ở 2 nghiệm thức đối chứng đƣợc tƣới với muối NaCl 2,5 và 5 g/L (trung bình 1,7-2,0 lóng). Ở 5 tuần SKTD, số lóng gia tăng vẫn không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức đối chứng tƣới nƣớc máy, dòng NaCl 2,5 và 5 g/L đƣợc tƣới nƣớc mặn, với số lóng trung bình từ 2,75-3,0 lóng. Trong khi đó, số lóng gia tăng thấp nhất ở 2 nghiệm thức đối chứng đƣợc tƣới nƣớc mặn, chỉ từ 2,2-2,3 lóng.

Dòng cây + Nƣớc tƣới (đơn vị nồng độ NaCl-g/L) Dòng NaCl 0 + Tƣới nƣớc máy Dòng NaCl 0 + Tƣới NaCl 2,5 Dòng NaCl 0 + Tƣới NaCl 5 Dòng NaCl 2,5 + Tƣới NaCl 2,5 Dòng NaCl 5 + Tƣới NaCl 5 Trung bình F CV (%)

Thời gian theo dõi (tuần) Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 3,00a 2,33bc 2,20c 2,75abc 2,83ab 2,64 * 24,5

2,58a 2,00b 1,70b 2,42a 2,50a 2,26 * 30,4

1,83 1,50 1,17 1,58 1,50 1,51 ns 43,8

0,83 0,92 0,67 0,83 0,92 0,83 ns 50,8

1,25 1,00 0,83 1,00 1,08 1,27 ns 53,5

Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép kiểm định Duncan ở; (ns): khác biệt không có ý nghĩa thống kê; (*): khác biệt ở mức 5%.

Bảng 4.33: Số lóng gia tăng ảnh hƣởng bởi tƣới nƣớc mặn

119

Kết quả thí nghiệm cho thấy hai dòng đậu nành MTĐ 760-4 đối chứng khi tƣới nƣớc mặn NaCl 2,5 và 5 g/L đã bị ảnh hƣởng về chiều cao và số lóng, lá của cây cũng có một số triệu chứng ngộ độc mặn nhƣ lá già trở nên vàng và sau đó rụng sớm (Hình 4.20). Các cây đối chứng khi xử lý mặn NaCl 5 g/L mặc dù không khác biệt về các chiều cao cây và số lóng so với cây đƣợc tƣới mặn nồng độ NaCl 2,5 g/L nhƣng có 2 12 cây bị chết (tỉ lệ 16,7%) ở 5 tuần SKTD. Trên lúa, kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quốc Khƣơng và ctv., (2018) cũng cho thấy việc tƣới nƣớc mặn đã làm giảm chiều cao cây lúa và số chồi lúa trên chậu. Theo De Pascale et al. (2013) và Plaut et al. (2013), nƣớc tƣới nhiễm mặn có ảnh hƣởng bất lợi đến mối liên hệ đất-nƣớc-cây trồng, đặc biệt làm giới hạn nghiêm trọng các hoạt động sinh lý bình thƣờng và khả năng sinh sản của cây trồng. Dƣới điều kiện mức độ mặn cao, sinh trƣởng của nhiều

cây trồng bị ảnh hƣởng bất lợi do ảnh hƣởng của thẩm thấu, thiếu nƣớc, mất cân bằng dinh dƣỡng và stress oxy hóa (Kim et al., 2008).

Trong khi đó, sinh trƣởng của các dòng đậu nành MTĐ 760-4 chống chịu mặn sau chọn lọc mặn với NaCl 2,5 và 5 g/L vẫn bình thƣờng, cây cũng ra hoa sau 4 tuần thuần dƣỡng, không khác biệt so với dòng đối chứng không bị xử lý mặn, đặc biệt là các dòng chống chịu mặn 5 g/L, trong đó có 1 dòng chống chịu mặn khi phân tích DNA đã có sự khác biệt về mặt di truyền so với dòng đối chứng (Hình 4.21). Tƣơng tự, kết quả giống mía Co740 chống chịu mặn sau chọn lọc của Nikam et al. (2014) cũng sinh trƣởng đến lúc trƣởng thành và các đặc tính nông học đƣợc đánh giá dƣới điều kiện bình thƣờng và điều kiện mặn.

Hình 4.20: Ảnh hƣởng của tƣới mặn NaCl 5 g/L lên sinh trƣởng của cây

120

đậu nành MTĐ 760-4 đối chứng ở 5 tuần sau khi trồng

a

b

d

c

Hình 4.21: Sinh trƣởng của các dòng đậu nành trong điều kiện tƣới mặn

Dòng NaCl 0 g L + tƣới nƣớc máy (a) Dòng NaCl 0 g L + tƣới NaCl 5 g/L (b) Dòng NaCl 2,5 g L + tƣới NaCl 2,5 g/L (c) Dòng NaCl 5 g L + tƣới NaCl 5 g/L (d)

ở 4 tuần sau khi trồng

121

Nhìn chung, qua hai phƣơng pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma Co60 kết hợp với chọn lọc trên môi trƣờng bổ sung muối NaCl trên hai mẫu vật liệu là mô sẹo và trục phôi giống đậu nành MTĐ 760-4, kết quả cho thấy phƣơng pháp tạo biến dị soma bằng cách nuôi cấy trên môi trƣờng mặn có thể đạt đƣợc các dòng mô sẹo cũng nhƣ mẫu chồi cây đậu nành có nguồn gốc từ trục phôi có khả năng chống chịu mặn ở nồng độ NaCl 5 g/L. Cả hai dòng mô sẹo cũng nhƣ mẫu chồi có sự khác biệt di truyền so với mẫu đối chứng không xử lý mặn khi phân tích bằng chỉ thị phân tử ISSR22. Phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma Co60 trên mẫu mô sẹo cũng có hiệu quả tạo dòng mô sẹo có khả năng chống chịu mặn với muối NaCl nồng độ 5 g/L ở liều 10 Gy với kết quả phân tích di truyền có sự khác biệt so với mẫu đối chứng, tuy nhiên mẫu không chiếu xạ cũng đạt đƣợc khả năng chịu mặn ở nồng độ này.

Vì vậy, xét về tính hiệu quả, có thể chọn phƣơng pháp tạo biến dị soma vì phƣơng pháp này dễ thực hiện, rẻ tiền hơn so với phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma Co60 mà lại cho hiệu quả tƣơng tự. Đối với vật liệu dùng để chọn lọc, mô sẹo thƣờng đƣợc sử dụng. Bởi vì, vật liệu này có tính mẫn cảm hơn đối với tác nhân gây đột biến, khả năng tạo đột biến cao ở giai đoạn sớm của quá trình hình thành và phát triển cá thể (phôi non hoặc mô sẹo) (Dƣơng Tấn Nhựt, 2009). Tuy nhiên, sử dụng vật liệu là mô sẹo cũng có hạn chế là cần phải có thời gian chuẩn bị vật liệu, cần phải có giai đoạn nuôi cấy mô sẹo để tái sinh thành cây hoàn chỉnh và việc duy trì mô sẹo lâu trên môi trƣờng nuôi cấy có thể gặp phải một số vấn đề nhƣ sự mất khả năng tái sinh (Tal, 1994), sự phát sinh những biến dị soma khác. Đặc biệt là với những loài cây trồng có khả năng tái sinh cây từ mô sẹo khó thì phƣơng pháp chọn lọc trên vật liệu là mô sẹo sẽ gặp rất nhiều khó khăn. Trong khi đó, phƣơng pháp xử lý trên mẫu trục phôi có thể tạo đƣợc chồi có khả năng chịu mặn với thời gian nhanh hơn, dễ thực hiện hơn so với phƣơng pháp xử lý trên mô sẹo. Vật liệu khác là đỉnh chồi cũng đƣợc sử dụng nhiều trên một số loài nhƣ khoai tây (Das et al., 2000; Yaycili and Alikamanoglu, 2012), táo (Bahmani et al., 2012) hay hạt trên cam quýt (Ling et al., 2008), đậu nành (Kumari et al., 2007).

122

Nhƣ vậy, qua kết quả nghiên cứu của luận án, có thể chọn phƣơng pháp tạo biến dị soma trên mẫu trục phôi để tạo dòng đậu nành MTĐ 760-4 có khả năng chống chịu mặn. Sơ đồ tóm tắt các bƣớc thực hiện của phƣơng pháp tạo biến dị soma trên mẫu trục phôi đƣợc mô tả ở Hình 4.22.

3 tuần

Chồi đậu nành

Trục phôi đậu nành

NaCl 0 g/L NaCl 2,5 g/L NaCl 5 g/L NaCl 7,5 g/L

Nuôi cấy trên môi trƣờng mặn

Nuôi cấy trên môi trƣờng mặn

NaCl 0 g/L NaCl 2,5 g/L NaCl 5 g/L NaCl 7,5 g/L

3 tuần

3 tuần

Chồi đậu nành chống chịu mặn 5 g/L

Chồi đậu nành

NaCl 0 g/L NaCl 2,5 g/L NaCl 5 g/L

Nuôi cấy trên môi trƣờng mặn

Đánh giá sai khác di truyền

Môi trƣờng MS + nƣớc dừa 50 ml/L + NAA 0,2 mg/L

Nhân chồi và tạo rễ

Thuần dƣỡng cây con trong nhà lƣới

Giá thể mụn dừa + tro trấu + đất (1:1:1)

123

Hình 4.22: Sơ đồ phƣơng pháp tạo biến dị soma dòng đậu nành MTĐ 760-4 chống chịu mặn từ mẫu cấy trục phôi

CHƢƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

5.1 Kết luận

- Trong các giống đậu nành đƣợc canh tác phổ biến ở ĐBSCL, MTĐ 748-1, ĐH 4 và MTĐ 720 có khả năng chịu mặn cao ở nồng độ muối NaCl 4 g L khi đánh giá bằng phƣơng pháp thủy canh. Giống MTĐ 878-3 nhạy cảm với mặn và giống MTĐ 760-4 chết hoàn toàn ở nồng độ muối này.

- Trong chọn lọc tính chống chịu mặn, giống không chịu mặn là MTĐ

760-4 đã tạo ra những dòng mô sẹo và cây chịu mặn ở nồng độ NaCl 5 g/L.

- Trong các phƣơng pháp chọn lọc các dòng đậu nành chống chịu mặn thì phƣơng pháp gây biến dị soma trên mẫu trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 đạt đƣợc 01 dòng cây đậu nành có khả năng chống chịu mặn ở nồng độ NaCl 5 g/L. Có sự khác biệt di truyền trong cấu trúc DNA của mẫu chồi chống chịu mặn so với mẫu đối chứng không xử lý mặn khi phân tích bằng chỉ thị phân tử ISSR22. Cây đậu nành MTĐ 760-4 sau chọn lọc mặn với muối NaCl 5 g/L sinh trƣởng bình thƣờng sau 5 tuần thuần dƣỡng trong điều kiện tƣới mặn ở nhà lƣới.

- Cả hai phƣơng pháp gây biến dị soma và phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma Co60 kết hợp chọn lọc mặn với muối NaCl trên mẫu mô sẹo đều thu đƣợc các dòng mô sẹo có khả năng chịu mặn với nồng độ 5 g/L ở mẫu không chiếu xạ và mẫu chiếu xạ liều 10 Gy. Phân tích di truyền với chỉ thị ISSR22 cho thấy ở hai mẫu mô sẹo này đều không có sự xuất hiện của băng DNA khoảng 450 bp so với mẫu đối chứng. Đối với mẫu trục phôi xử lý chiếu xạ tia gamma kết hợp chọn lọc mặn chƣa thu đƣợc các dòng chống chịu mặn.

5.2 Đề xuất

- Có thể áp dụng phƣơng pháp gây biến dị soma trên mẫu trục phôi đậu

nành MTĐ 760-4 để tạo dòng đậu nành có khả năng chống chịu mặn.

- Tiếp tục nhân giống giống đậu nành MTĐ 760-4 chống chịu mặn ở

nồng độ NaCl 5 g/L qua nhiều thế hệ.

124

- Trồng thử nghiệm dòng đậu nành MTĐ 760-4 chống chịu mặn ở những vùng đất nhiễm mặn ở Đồng bằng Sông Cửu Long để đánh giá sự ổn định di truyền của tính chống chịu mặn cũng nhƣ đánh giá thêm các đặc tính sinh học khác của dòng đậu nành này nhƣ khả năng chống chịu sâu bệnh, khả năng thành lập nốt sần...

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Abdel-Tawab, F.M., E.M. Fahmy, M.A. EL-Nahrawy, W.M. Sharawy and M.R.I. Sayed, 2011. Detection of molecular markers associated with salt tolerance in alfalfa (Medicago sativa L.). Egypt. J. Genet. and Cytol., 40: 113-127.

Abel, G.H. and A.J. MacKenzie, 1964. Salt tolerance of soybean varieties (Glycine max L. Merrill) during germination and later growth. Crop Sci., 4: 157-161.

Abel, G.H., 1969. Inheritance of the capacity for chloride inclusion and chloride exclusion by soybeans. Crop Sci., 9: 697-698.

Ahloowalia, B.S., 1976. Chromosomal changes in parasexually pro-duced ryegrass. In: K. Jones and P Brandham (Eds.), Current Chromosome Research. North Holland, Amsterdam. 115-122.

Ahloowalia, B.S., 1985. Transmission of somaclonal variation in wheat. Euphytica, 34: 525-537.

Akbar, M. and F.N. Ponnamperuma, 1982. Saline soils of South and Southeast Asia as potential land. IRRI, Los Banos, Philipines.

Akitha Devi, M.K., G. Sakthivelu, P. Giridhar and G.A. Ravishankar, 2012. Protocol for augmented shoot organogenesis in selected variety of soybean [Glycine max L. (Merr.)]. Indian Journal of Experimental Biology, 50: 729-734.

Alikamanoglu, S., 2002. Efficiency of the gamma irradiation in the induction of in vitro somatic mutations. Journal of Cell and Molecular Biology, 1: 19-24.

Arzani, A., 2008. Improvingsalinity tolerance incropplants: abiotechnological view. In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant, 44: 373-383.

Ashraf, M., 1994. Breeding for salinity tolerance in plants. Crit. Rev. Plant Sci., 13: 17-42.

Atak, C., S. Alikamanoglu and S. Yalcin, 1999. Induced mutation and radiation sensitivity in vitro culture of soybean (Glycine max L. Merrill). Turkish Journal of Nuclear Sciences, 26 (2): 69-88.

Bahmani R., M. Gholami, A. Mozafari and R. Alivaisi, 2012. Effects of Salinity on In vitro Shoot Proliferation and Rooting of Apple Rootstock MM.106. World Applied Sciences Journal, 17 (3): 292-295.

Bartoli, C.G., F. Gomez, D.E. Martinez and J.J. Guiamet, 2004. Mitochodria are the main target for oxidative damage in leaves of wheat (Triticum aestivum L.). J. Exp. Bot., 55: 1663-1669.

125

Basu, S., G. Gangopadhyay, B.B. Mukherjee and S. Gupta, 2002. Plant regeneration of salt adapted callus of indica rice (var. Basmati 370) in saline conditions. Plant Tissue and Organ Culture., 50: 153-159.

Bates, L.S., R.P. Waldren and I.D. Teare, 1973. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39: 205-207.

Bekheet, S.A., H.S. Taha and M.E. Solliman, 2006. Salt tolerance in tissue culture of onion (Allium cepa L.). Arab J. Biotech., 9 (3): 467-476.

Bernard, R.L. and M.G. Weiss, 1973. Qualitative Genetics. Soybeans, Production and Uses. B. E. Caldwell (ed.). Agronomy Series, American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, USA. pp. 117-154.

Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản Nông nghiệp.

Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007. Chọn giống cây trồng phương pháp truyền thống và phân tử. Nhà xuất bản Nông nghiệp.

Carlson, J.B. and N.R. Lersten. 2004. Reproductive morphology. In Soybeans: Improvement, Production, and Uses, 3rd ed., Agronomy Monograph 16. H.R. Boerma and J.E. Specht, Eds. American Society of Agronomy/Crop Science Society of America/Soil Science Society of America, pp. 59-95.

Chahal, G.S. and S.S. Gosal. 2002. Principles and procedures of plant breeding, biotechnological and conventional approaches. Alpha Science International Ltd. Pangbourne, UK.

Chandler, S.F. and I.K. Vasil, 1984. Selection and characterization of NaC1 tolerant cells from embryogenic cultures of Pennisetam purpureum Schum. (Napir grass). Plant Sci. Lett., 37: 157-164.

Chang, R.Z., Y.W. Chen, G.H. Shao and C.W. Wan, 1994. Effect of salt stress on agronomic characters and chemical quality of seeds in soybean. Soybean Sci., 13: 101-105.

Chaudhuri, P., R.K. Sengupta and P. Ghosh, 1997. In vitro assessment of salinity tolerance in Hordeum vulgare. Indian J Plant Physiol., 2 (2): 123-126.

Chen, S., C. Mingliang, J. Yuàng, G. Zhongshan, Z. Li and M. Gu, 2011. In vitro selection of salt tolerant variants following 60Co gamma irradiation of long-term callus cultures of Zoysia matrella (L.) Merr. Plant cell, Tissue and Organ Culture, 107: 493-500.

Chen, Y.W., G.H. Shao and R.Z. Chang, 1997. The effect of salt stress on superoxide dismutase in various organelles from cotyledon of soybean seedling. Acta Agron. Sin., 23: 214-219.

Chinnusamy, V., A. Jagendorf and J.K. Zhu, 2005. Understanding and

improving salt tolerance in plants. Crop Science, 45: 437-448.

Creissen, S.S. and A. Karp, 1985. Karyotypic changes in potato plants regenerated from protoplasts. Plant Cell Tiss Org Cult, 4: 171-182.

126

Dang Minh Tam and Nguyen Thi Lang, 2003. In vitro selection for salt tolerance in rice. Omonrice, 11: 68-73.

Das, A., S.S. Gosal, J.S. Sidhu and H.S. Dhaliwal, 2000. Induction of mutations for heat tolerance in potato by using in vitro culture and radiation. Euphytica, 114: 205-209.

Datta, S.K. and D. Chakrabarty, 2009. Management of chimera and in vitro mutagenesis for development of new flower color/shape and chlorophyll variegated mutants in Chrysanthemum. Food and agriculture organization of the United Nation, Rome, pp. 303-305.

De Pascale, S., F. Orsini and A. Pardossi, 2013. Irrigation water quality for greenhouse horticulture. In: Good Agricultural Practices for Greenhouse Vegetable Crops; FAO Plant Production and Protection Paper 217; Food and Agriculture Organization of the United Nations: Rome, Italy, pp. 169-204.

Debergh, P.C. and L. Maene, 1981. A scheme for commercial propagation of ornamental plants by tissue culture. Sci Hortic., 14: 335-345.

Dehpour, A.A., M. Gholampour, P. Rahdary, M.R.J. Talubaghi and S.M.M. Hamdi, 2011. Effect of gamma irradiation and salt stress on germination, callus, protein and proline in rice (Oryza sativa L.). Iranian Journal of Plant Physiology, 1: 251-256.

Demiral, T. and I. Turkan, 2005. Comparative lipid peroxidation, antioxidant defense systems and proline content in roots of two rice cultivars differing in salt tolerance. Environ. Exp. Bot., 53: 247-257.

Dix, P. J., 1990. Plant cell line selection – Procedures and Applications. Weinheim, New York, Basel, Cambridge, pp. 354.

Druart, P. and O.D. Wulf, 1993. Activated charcoal catalyses sucrose hydrolysis during autoclaving. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 32: 97-99.

Duncan, R.R., 1997. Tissue culture-induced variation and crop improvement. Adv Agron, 58: 201-240.

Dƣơng Tấn Nhựt, 2009. Công nghệ sinh học thực vật – Tập 2. Nhà xuất bản Nông nghiệp.

Durand, M. and D. Lacan, 1994. Sodium partitioning within the shoot of

soybean. Physiol. Plant., 91: 65-71.

Ehsanzadeh, P., M.S. Nekoonam, J.N. Azhar, H. Pourhadian and S. Shaydaee, 2009. Growth, chlorophyll, and cation concentration of tetraploid wheat on a solu-tion high in sodium chloride salt: hulled versus free-threshing genotypes. J. Plant Nutri., 32: 58-70.

El-Sayed, O.E., A.A. Rizkalla and S.R.S. Sabri, 2007. In vitro mutagenesis for genetic improvement of salinity tolerance in wheat. Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 4(5): 377-383.

127

Elsheikh, E.A.E. and M. Wood, 1995. Nodulation and N2 fixation by soybean inoculated with salt-tolerant rhizobia or salt-sensitive bradyrhizobia in saline soil. Soil Bid. Biochem., 27 (4/5): 657-661.

Essa, T. A, 2002. Effect of salinity stress on growth and nutrient composition of three soybean (Glycine max L. Merrill) cultivars. J. Agron. Crop Sci., 188: 86-93.

Farhoudi, R. and M. M. Tafti, 2011. Effect of Salt Stress on Seedlings Growth and Ions Homeostasis of Soybean (Glycine max) Cultivars. Advances in Environmental Biology, 5(8): 2522-2526.

Fath, A., P.C. Bethke, M.V. Belligni, Y.N. Spiegel and R.L. Jones, 2001. Signalling in the cereal aleurone: hormones, reactive oxygen and cell death. New Phytol., 151: 99-107.

Gandonou, C.B., T. Errabii, J. Abrini, M. Idaomar and N.S. Senhaji, 2006. Selection of callus cultures of sugarcane (Saccharum sp.) tolerant to NaCl and their response to salt stress. Plant Cell Tiss Organ Cult., 87: 9- 16.

Gao, J.P., D.Y. Chao and H.X. Lin, 2007. Understanding abiotic stress tolerance mechanisms: recent studies on stress response in rice. J. Integr. Plant Biol., 49: 742-750.

Gao, X., D. Yang, D. Cao, M. Ao, X. Sui, Q. Wang, J.N. Kimatu and L. Wang, 2010. In vitro micropropagation of Freesia hybrida and the assessment of genetic and epigenetic stability in regenerated plantlets. J. Plant Growth Regul., 29: 257-267.

George, E.F, 1996. Plant propagation by tissue culture Part 2 In practical. 2nd Edition. Exegtics Limited.

George, E.F., 1993. Plant propagation by tissue culture Part 1 The technology. 2nd Edition. Exegetics Limited.

Ghoulam, C., F. Ahmed and F. Khalid, 2001. Effects of salt stress on growth, inorganic ions and proline accumulation in relation to osmotic adjustment in five sugar beet cultivars. Environ. Exp. Bot., 47: 139-150.

Gomez, K.A. and A.A. Gomez, 1984. Statistical procedures for agricutural research. John Wiley and Son. Inc.

Groose, R.W. and E.T. Bingham, 1986. An unstable anthocyanin mutation recovered from tissue culture of alflafa. 1. High frequency of reversion upon reculture. 2. Stable non revertants derived from reculture. Plant Cell Rep, 5: 104-110.

its correlation with genetic variation

Guo, W.L., R. Wu, Y.F. Zhang, X.M. Liu, H.Y. Wang, L. Gong, Z.H. Zhang and B. Liu, 2007. Tissue culture-induced locus-specific alteration in DNA methylation and in Codonopsis lanceolata Benth. et Hook. f. Plant Cell Rep., 26: 1297- 1307.

128

Gupta, M., Y-S. Chyi, J. Romero-Severson and J.L. Owen, 1994. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats. Theor Appl Genet, 89: 998-1006.

Gupta, P. K., 1998. Chromosomal basis of somaclonal variation in plants. In: S. M. Jain, D.S. Brar and B. S. Ahloowalia (Eds.), Somaclonal Variation and Induced Mutations in Crop Improvement, pp. 149-168. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.

Gupta, P.K. and R.K. Varshney, 2000. The development and use of microsatellite markers for genetic analysis and plant breeding with emphasis on bread wheat. Euphytica, 113: 63-185.

Hamayun, M., S.A. Khan, A.L. Khan, Z.K. Shinwari, J. Hussain, E. Sohn, S. Kang, Y. Kim, M.A. Khan and I. Lee, 2010. Effect of salt stress on growth attributes and endogenous growth hormones of soybean cultivar Hwangkeumkong. Pak. J. Bot., 42 (5): 3103-3112.

Hasegawa, P.M., R.A. Bressan, J.K. Zhu and H.J. Bohnert, 2000. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 51: 463-499.

He, C.Y., J.S. Zhang and S.Y. Chen, 2002. A soybean gene encoding a proline-rich protein is regulated by salicylic acid, an endogenous circadian rhythm and by various stresses. Theor. Appl. Genet., 104: 1125-1131.

He, S., Y. Han, Y. Wang, H. Zhai and Q. Liu, 2009. In vitro selection and identification of sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) plants tolerant to NaCl. Plant Cell Tissue Organ Cult., 96: 69-74.

Hoàng Trọng Phán và Trƣơng Thị Bích Phƣợng, 2008. Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản Đại học Huế.

Hossain, Z., A.K.A. Mandal, S.K. Datta and A.K. Biswas, 2007. Development of NaCl-tolerant line in Chrysanthemum morifolium Ramat. through shoot organogenesis of selected callus line. J. Biotechnol., 129: 658-667.

Hosseini, M.K., A.A. Powell and I.J. Bingham, 2002. Comparison of the seed germination and early seedling growth of soybean in saline conditions. Seed Sci. Res., 12: 165-172.

Hymowitz, T., 1970. On the domestication of the soybean. Econ. Bot., 24:

408-421.

Jain, M., G. Mathur, S. Koul and N. Sarin, 2001. Ameliorative effects of proline on salt stress-induced lipid peroxidation in cell lines of groundnut (Arachis hypogaea L.). Plant Cell Reports, 20 (5): 463-468.

Jain, M.S., 2001. Tissue culture-derived variation in crop improvement.

Euphytica, 118: 153-166.

129

Jain, S.M., 1998. Plant biotechnology and mutagenesis for sustainable crop improvement. In: R.K. Behl, D.K. Singh and G.P. Lodhi (Eds.), Crop Improvement for Stress Tolerance, pp. 218-232, CCSHAU, Hissar and MMB, New Delhi, India.

Jain, S.M., 2000. Mechanisms of spontaneous and induced mutations in plants. Radiation Res Cong. Proc., 2: 255-258.

Janani, C. and B. D. Ranjitha Kumari, 2013. In vitro plant regeneration from cotyledonary node and half seed explants of Glycine max L. (JS335). Annals of Biological Research, 4 (11): 60-66.

Kaeppler, S.M., R.L. Phillips and P. Olhoft, 1998. Molecular basis of heritable tissue culture-induced variation in plants. In: S.M. Jain, D.S. Brar and B.S. Ahloowalia (Eds.), Somaclonal Variation and Induced Mutations in Crop Improvement, pp. 467-486. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.

Karuppanapandian, T., H.W. Wang, T. Karuppudurai, J. Rajendhran, M. Kwon, C.S. Jang, S.H. Kim, K. Manoharan and W. Kim, 2010. Efficiency of RAPD and ISSR markers in assessing genetic diversity and relationships in black gram (Vigna mungo L. Hepper) varieties. Canadian Journal of Plant Science, 90 (4): 443-452.

Katerji, N., J.W. Hoorn, A. Hamdy and M. Mastrorilli, 2003. Salinity effect on crop development and yield, analysis of salt tolerance according to several classification methods. Agric Water Manage., 62: 37-66.

Kaushik, A., N. Saini, S. Jain, P. Rana, R.K. Singh and R.K. Jain, 2003. Genetic analysis of a CSR10 (indica) × Taraori Basmati F3 population segregating for salt tolerance using ISSR markers. Euphytica 134: 231- 238.

Khalil, R.M.A., 2013. Molecular and Biochemical Markers Associated with Salt Tolerance in Some Sorghum Genotypes. World Applied Sciences Journal, 22 (4): 459-469.

Khan, I.A., M.U. Dahot, N. Seema, S. Yasmin, S. Bibi, S. Raza and A. Khatri, 2009. Genetic variability in sugarcane plantlets developed through in vitro mutagenesis. Pak. J. Bot., 41(1): 153-166.

Khatab, A.I. and M.A. Samah, 2013. Development of Agronomical and Molecular Genetic Markers Associated with Salt Stress Tolerance in Some Barley Genotypes. Current Research Journal of Biological Sciences, 5(5): 198-204.

Kim, H., J.M. Fonseca, J. Choi, C. Kubota and D.Y. Kwon, 2008. Salt in irrigation water affects the nutritional and visual properties of romaine lettuce (Lactuca sativa L.). J. Agric. Food Chem., 56: 3772-3776.

Kondetti, P., N. Jawali, S.K. Apte and M.G. Shitole, 2012. Salt tolerance in Indian soybean (Glycine max (L.) Merill) varieties at germination and early seedling growth. Annals of Biological Research, 3 (3): 1489-1498.

Kowles R.V., 2010. Regulation of Water in Plant Cells. Bioscene, 36 (1): 34- 42.

130

Kumar, V., V. Shriram, T.D. Nikam, N. Jawali and M.G. Shitole, 2008. Sodium chloride-induced changes in mineral nutrients and proline

accumulation in indica rice cultivars differing in salt tolerance. J. Plant Nutr., 31: 1999-2017.

Kumari, M., S.R. Patil and R.N. Pudake, 2007. Effect of mutagen on callus induction and in vitro regeneration of soybean cultivar. Soybean genetics newsletter, 34.

Lacan, D. and M. Durand, 1995. Na+ and K+ transport in excised soybean roots. Physiol. Plant., 93: 132-138.

Lâm Ngọc Phƣơng, 2006. Nhân giống vô tính cây dưa hấu tam bội (Citrullus vulgaris Schard.) in vitro. Luận văn tiến sĩ ngành Trồng trọt. Trƣờng Đại học Cần Thơ. Cần Thơ

Lambe, P., H.S.N. Mutambel, J.G. Fouche, R. Deltour, J.M. Foidart and T. Gaspar, 1997. DNA methylation as a key process in regulation of organogenic totipotency and plant neoplastic progression. In Vitro Cell Develop Biol-Plant, 33: 155-162.

Lang, N.T., Z. Li and B.C. Buu, 2001. Microsatellite markers linked to salt tolerance in rice. Omonrice 9: 9-21.

Larkin, P.J. and W.R. Scowcroft, 1981. Somaclonal variation-a novel source of variability from cell cultures for plan improvement. Theor Appl Genet., 60: 197-214.

Lauchli, A. and J. Wieneke, 1978. Salt relations of soybean mutants differing in salt tolerance: distribution of ions and localization by X-ray microanalysis. In: Plant Nutrition: Proceedings of the 8th International Colloquium of Plant Analysis and Fertilizer Problems. Wellington, Auckland.

Lauchli, A., 1984. Salt exclusion: an adaptation of legume crops and pastures under saline conditions. In: Staples R.C., Toeniessen G.H. (Editors). Salinity tolerance in plants: strategies for crop improvement. New York: John Wiley and Sons. 171-187.

Lawn, R. J., 1982 Response of four grain 1egume to water stress in Southeastem Queensland. III. Dry matter production, yield and water use efflciency. Aust. J. Agric. Res., 33: 511-521.

Lê Hữu Thuần, 2013. Nghiên cứu cơ sở khoa học xác định nguyên nhân, đề xuất giải pháp ứng phó với xâm nhập mặn trong điều kiện Biến đổi khí hậu ở vùng ĐBSCL. Cục Quản lý Tài nguyên nƣớc.

Lê Thị Bích Thủy, Đặng Thị Minh Lụa, Tạ Ngọc Ly, Nguyễn Thị Kim Liên và Nguyễn Đức Thành, 2007. Ảnh hƣởng của tia gamma lên khả năng tái sinh cây từ mô sẹo lúa chiếu xạ và phân tích phân tử các dòng cây tái sinh. Tạp chí công nghệ sinh học, 5 (2): 225-231.

131

Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị và Lê Thị Muội, 1997. Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.

Lê Văn Hòa, Dƣơng Thị Mỹ Phụng, Nguyễn Quốc Hội và Nguyễn Văn Ây, 2007. Khả năng gây đột biến nhân tạo hoa lan cắt cành Dendrobium bằng tia gamma. Kỷ yếu Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa. Nhà xuất bản Nông nghiệp, 175-188.

Lê Xuân Định, Nguyễn Mạnh Quân và Phùng Anh Tiến, 2016. Xâm nhập mặn tại Đồng bằng sông Cửu Long: Nguyên nhân, tác động và các giải pháp ứng phó. Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.

Li, W.Y.F., F.L. Wong, S.N. Tsai, T.H. Phang, G. Shao and H.M. Lam, 2006. Tonoplast located GmCLC1 and GmNHX1 from soybean enhance NaCl tolerance in transgenic bright yellow (BY)-2 cells. Plant Cell Environ., 29: 1122-1137.

Li, X., X. Yu, N. Wang, Q. Feng, Z. Dong, L. Liu, J. Shen and B. Liu, 2007. Genetic and epigenetic instabilities induced by tissue culture in wild barley (Hordeum brevisubulatum (Trin.) Link). Plant Cell Tissue Organ Cult., 90: 153-168.

Ling, A.P.K., J.Y. Chia, S. Hussein and A.R. Harun, 2008. Physiological responses of Citrus sinensis to gamma irradiation. World Applied Sciences Journal, 5 (1): 12-19.

Liu, T. and J.V. Staden, 2000. Selection and characterization of sodium chloride-tolerant callus of Glycine max (L.) Merr cv. Acme. Plant Growth Reg., 31: 195-207.

Lu, J.M., Y.L. Liu, B. Hu and B.C. Zhuang, 1998. The discovery of salt gland-like structure in Glycine soja. Chin. Sci. Bull., 43: 2074-2078.

Lu, S., X. Peng, Z. Guo, G. Zhang, Z. Wang, C. Wang, C. Pang, Z. Fan and J. Wang, 2007. In vitro selection of salinity tolerant variants from triploid bermudagrass (Cynodon transvaalensis and C. dactylon) and their physiological responses to salt and drought stress. Plant Cell Rep., 26: 1413-1420.

Luo, Q., B. Yu and Y. Liu, 2005. Differential sensitivity to chloride and sodium ions in seedlings of Glycine max and G. soja under NaCl stress. J. Plant Physiol., 162: 1003-1012.

Luyện Hữu Chỉ, Nguyễn Văn Hiển, Nguyễn Văn Hoan, Nguyễn Thị Trâm, Nguyễn Thị Văn và Phùng Quốc Tuấn, 1997. Giáo trình giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.

Mahgoub, H.A.M., A.R. Sofy, E.A. Abdel-Azeem and M.S. Abo-Zahra, 2016. Molecular Markers Associated with Salt-Tolerance of Different Soybean (Glycine max L.) Cultivars under Salt Stress. Int. J. Adv. Res. Biol. Sci., 3(8): 241-267.

132

Malamug, J.J.F., S. Yazawa and T. Asahira., 1994. Morphological variants induced from shoot tips of taro (Colocasia esculenta (L.) Schott) treated with gamma radiation. Scientia Horticulturae, 58: 105-113.

Markad, N.R., A.A. Kale, B.D. Pawar, A.S. Jadhav and S.C. Patil, 2014. Molecular characterization of sugarcane (Saccharum officinarum L.) genotypes in relation to salt tolerance. The Bioscan, 9(4): 1785-1788.

Mayer, J.D, R.J. Lawn and D.E. Byth, 1992. Inigation Management of Soybean (Glycine max (L.) Merrill) in Aemi-Arid Tropic Environment. I. Effect of inigation frequency on growth, development and yield. Aust. J. Agric. Res., 43: 1003-1017.

aggressiveness analyses

Mishra P.K., R.T.V. Fox and A. Culhamm, 2003. Inter-simple sequence repeat and revealed high genetic diversity, recombination and longrange dispersal in Fusarium culmorum. School of Plant Sciences, The University of Reading, Whiteknights, Reading RG6 6AS, UK, 2003 Association of Applied Biologists.

Mohamed, F.A., E.H. Hefni and G.M. Maghraby, 1988. Effect of gamma radiation on plant growth, nodulation, nutritional status and yield of soybean. Proceedings of the fourth Conference on Nuclear Sciences and Applications, 2: 426.

Mohamed, M.A.H., P.J.C. Harris and J. Henderson, 2000. In vitro selection and characterisation of a drought tolerant clone of Tagetes minuta. Plant Sci., 159: 213-222.

Moussa, H. R., 2011. Low dose of gamma irradiation enhanced drought tolerance in soybean. Bulgarian Journal of Agricultural Science, 17 (1): 63-72.

Murashige T. and F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: 473-497.

Nabors, M.W., G.E. Gibbs, C.S. Bernstein and M.E. Meis, 1980. NaCl- tolerant tobacco plants from cultured cells. Z. Pflanzenphysiol., 97: 13- 17.

Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung và Phạm Thị Đào, 1999. Cây đậu tương. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội.

Nguyễn Bảo Toàn, 2010. Giáo trình Nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhà xuất

bản Đại học Cần Thơ. 185 trang.

Nguyễn Danh Đông, 1982. Trồng Đậu tƣơng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.

Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.

Nguyễn Đức Thành, 2014. Các kỹ thuật chỉ thị DNA trong nghiên cứu và

chọn lọc thực vật. Tạp chí Sinh học, 36 (3): 265-294.

Nguyễn Mai Thơm, 2009. Nghiên cứu chọn tạo và nhân giống cây Hoa Hồng (Rosa spp. L.) năng suất, chất lượng cao cho một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp. Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

133

Nguyễn Phƣớc Đằng, Phan Thị Thanh Thủy, Nguyễn Lộc Hiền, Nguyễn Thị Thu Đông, Trần Thanh Vũ và Thái Kim Tuyến, 2010. Chọn tạo giống

đậu nành năng suất cao, ít nhiễm sâu bệnh, thích nghi trên địa bàn Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 16a: 223-233.

Nguyễn Quốc Khƣơng, Cao Nguyễn Nguyên Khanh và Ngô Ngọc Hƣng, 2018. Ảnh hƣởng của độ mặn nƣớc tƣới đến sinh trƣởng, năng suất và sự sản sinh proline của các giống lúa (Oryza sativa L.) trồng trên đất nhiễm mặn trong điều kiện nhà lƣới. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 16 (7): 671-681.

Nguyễn Thị Xuân Thu và Lê Vĩnh Thúc, 2011. Trong: Nguyễn Bảo Vệ (Chủ biên). Giáo trình Cây công nghiệp ngắn ngày. Nhà xuất bản Đại học Cần Thơ, trang 1-59.

Nguyễn Văn Mạnh, Lê Đức Thảo, Phạm Thị Bảo Chung, Lê Thị Ánh Hồng và Lê Huy Hàm, 2017. Kết quả nghiên cứu chọn tạo giống đậu nành đen DT2008ĐB. Trong: Hội thảo Quốc gia về Khoa học cây trồng lần thứ hai. Nhà xuất bản Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, trang 488-493.

Nikam, A.A., R.M. Devarumath, M.G. Shitole, V.S. Ghole, P.N. Tawar and P. Suprasanna, 2014. Gamma radiation, in vitro selection for salt (NaCl) tolerance, and characterization of mutants in sugarcane (Saccharum officinarum L.). In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. DOI 10.1007/s11627- 014-9630-4.

Papageorgiou, G. and N. Murata, 1995. The unusually strong stabilizing effects of glycine betaine on the structure and function of the oxygen- evolving photosystem II complex. Photosyn. Res., 44: 243-252.

Parida, A.K. and A.B. Das, 2005. Salt tolerance and salinity effects on plants: a review. Ecotoxicol. Environ. Saf., 60: 324-349.

Patade V.Y., P. Suprasanna, V.A. Bapat and U.G. Kulkarni, 2005. Selection for abiotic (salinity and drought) stress tolerance and molecular characterization of tolerant lines in sugarcane. Nuclear Agricultural and Biotechnology Division Bhabha Atomic Research Centre and Department of Agricultural Biotechnology Marathwada Agricultural University. Parbhani, 1: 402-431.

Patade, V.Y., P. Suprasanna and V.A. Bapat, 2008. Gamma Irradiation of Embryogenic Callus Cultures and In vitro Selection for Salt Tolerance in Sugarcane (Saccharum officinarum L.). Agricultural Sciences in China, 7 (9): 1147-1152.

Pathirana, R., 2011. Plant mutation breeding in agriculture. CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science. Nutrition and Natural Resources, 6 (032): 1-20.

134

Pathirana, R., F. Carimi, A. Carra and L.H. Cheah, 2008. Integrating biotechnological advancements with induced mutagenesis: new opportunities for horticulture with special reference to Vitis vinifera. In: Proceedings of the FAO/IAEA International Symposium on Induced

Mutations in Plants, 12-15 August 2008, International Atomic Energy Agency, Vienna, Austria, p. 115.

Phạm Thị Bích Thủy và Nguyễn Bảo Toàn. 2008. Chọn lọc in vitro các dòng callus quýt đƣờng (Citrus reticulata Blanco) kháng mặn (NaCl). Tạp chí Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 6 (3): 335- 340.

Phạm Văn Biên, Hà Hữu Tiến, Phạm Ngọc Qui, Trần Minh Tâm và Bùi Việt Nữ. 1996. Cây đậu nành. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.

Phang, T., G. Shao and H. Lam, 2008. Salt Tolerance in Soybean. Journal of Integrative Plant Biology, 50 (10): 1196-1212.

Phang, T.H., 2008. High External Phosphate (Pi) Increases Sodium Ion Uptake and Reduces Salt Tolerance of “Pi Tolerant” Soybean. Ph.D. Thesis. The Chinese University of Hong Kong.

Phillips, R.L., S.M. Kaeppler and P. Olhoft, 1994. Genetic instability of plant tissue cultures: breakdown of normal controls. Proc Natl Acad Sci USA, 91: 5222-5226.

Phillips, R.L., S.M. Kaeppler and V.M. Peschke, 1990. Do we understand somaclonal variation? In: H. J. J. Nijkamp, L. H. W. van der Plas and J. van Aartrijk (Eds.), Proceedings of the 7th International Congress on Plant Tissue Cell Culture, pp. 131-141. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.

Piqueras, A., J.A. Hernandez, E. Olmos, E. Hellin and F. Sevilla, 1996. Changes in antioxidant enzymes and organic solutes associated with adaptation of citrus cells to salt stress. Plant Cell Tissue Organ Cult., 45: 53-60.

Plaut, Z., M. Edelstein and M. Ben-Hur, 2013. Overcoming salinity barriers to crop production using traditional methods. Crit. Rev. Plant Sci., 32: 250- 291.

Puchooa, D., 2005. In vitro mutation breeding of Anthurium by gamma radiation. International Journal of Agriculture and Biology, 7: 11-20.

Purohit, M., S. Srivastava and P.S. Srivastava, 1998. Stress tolerant plants through tissue culture. In: Srivastava, P.S. (Ed.), Plant Tissue Culture and Molecular Biology: Application and Prospects. Narosa Publishing House, New Delhi. 554-578.

Quach, T. N., L-A. Th. Nguyen, N. Th. Nguyen and C. Th. Nguyen, 2019. Soybean PI 675847 as a new source of salt tolerance. Cambridge University Press, 17 (1): pp. 33-44.

Queiros, F., F. Fidalgo, I. Santos and R. Salema, 2007. In vitro selection of salt tolerant cell lines in Solanum tuberosum L. Biol. Plant., 51: 728-734.

135

Radhakrishnan, R. and B. D. Ranjithakumari, 2007. Callus induction and plant regeneration of Indian soybean (Glycine max (L.) Merr. cv. CO3) via

half seed explant culture. Journal of Agricultural Technology, 3 (2): 287-297.

Rahnama, H. and H. Ebrahimzadeh, 2012. The effect of NaCl on proline accumulation in potato seedlings and calli. Acta Physiologiae Plantarum, 3: 263-270.

Rai, M.K., R.K. Kalia, R. Singh, M.P. Gangola and A.K. Dhawan, 2011. Developing stress tolerant plants through in vitro selection-An overview of the recent progress. Environmental and Experimental Botany, 71: 89- 98.

Ranjitha Kumari, B. D., A. Settu and G. Sujatha, 2006. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Soybean [Glycine max (L.) Merr.]. Indian Journal of Biotechnology, 5: 243-245.

Available InTech,

Rao, S. and P. Patil, 2012. In Vitro Selection of Salt Tolerant Calli Lines and Regeneration of Salt Tolerant Plantlets in Mung Bean (Vigna radiata L. Wilczek), Biotechnology - Molecular Studies and Novel Applications for Improved Quality of Human Life, Prof. Reda Sammour (Ed.), ISBN: 978-953-51-0151-2, from: http://www.intechopen.com/books/biotechnology-molecular-studies-and- novel-applications-for-improved-quality-of-human-life/in-vitro- selection-of-salt-tolerant-calli-lines-and-regeneration-of-salt-tolerant- plantlets-in-mung-

Reddy, M.P., N. Sarla and E.A. Siddiq, 2002. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica1, 28: 9-17.

Rogers, S.O. and A.J.B. Bendich, 1988. Extraction of DNA from plant tissues. Plant molecular Biology Manual. Kluwer Academic Publishers. A6: 1- 10.

Saleem, M.Y., Z. Mukhtar, A.A. Cheema and B.M. Atta, 2005. Induced mutation and in vitro techniques as a method to induce salt tolerance in Basmati rice (Oryza sativa L.). Int. J. Environ. Sci. Tech., 2 (2): 141-145.

Saputro, T.B., K.T. Purwani, V.S. Fatimah, E.M. Stevia and N. Jadid, 2018. The tolerance improvement of local soybean in waterlogging condition through the combination of irradiation and in vivo selection J. Phys.: Conf. Ser., 1040: 1-7.

Shen, B., R.G. Jensen and H.J. Bohnert, 1997a. Increased resistance to oxidative stress in transgenic plants by targeting mannitol biosynthesis to chloroplasts. Plant Physiol., 113: 1177-1183.

Shen, B., R.G. Jensen and H.J. Bohnert, 1997b. Mannitol protects against oxidation by hydroxyl radicals. Plant Physiol., 115: 527-532.

136

Shereen, A., R. Ansari and A.Q. Soomro, 2001. Salt tolerance in soybean (Glycine max L.): Effect on growth and ion relations. Jak. J. Bot., 33 (4): 393-402.

Singh, R.J. and T. Hymowitz, 1989. The genomic relationships among Glycine soja Sieb. and Zucc., G. max (L.) Merr. and „G. gracilis‟ Skvortz. Plant Breed. 103: 171-173.

Singh, R.J., R.L. Nelson and G.H. Chung. 2007. Soybean (Glycine max (L.) Merr.) - Genetic resources, chromosome engineering, and crop improvement. Oilseed crops, 4: 13-50.

Singleton, P.W. and B.B. Bohlool, 1984. Effect of Salinity on Nodule Formation by Soybean. Plant Physiol., 74: 72-76.

Skirvin, R.M., M. Norton and K.D. McPheeters, 1993. Somaclonal variation: has it proved useful for plant improvement. Acta Hort, 336: 333-340.

Song, Y., T. Nakajima, D. Xu, K. Homma and M. Kokubun. 2017. Genotypic variation in salinity tolerance and its association with nodulation and nitrogen uptake in soybean. Plant Production Science, 20 (4): 490-498.

SSSA (Soil Science Society of America), 1979. Glossary of soil science terms. Madison, Wisconsin, 36 pp.

Staub, J.E., F.C. Serquen and M. Gupta, 1996. Genetic markers, map construction, and their application in plant breeding. Hort Science, 31(5): 729-739.

Sun H.W., A. Nair, T. Adachi and G. Clayton, 2000. Campbell plant regeneration from cotyledon tissues of common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench). In Vitro Cellular and Developmental Biology- Plant, 36: 358-361.

Sun, Y.X., D. Wang, Y.L. Bai, N.N. Wang and Y. Wang, 2006. Studies on the overexpression of the soybean GmNHX1 in Lotus corniculatus: the reduced Na+ level is the basis of the increased salt tolerance. Chin. Sci. Bull., 51: 1306-1315.

Surjus, A. and M. Durand, 1996. Lipid changes in soybean root membranes in response to salt treatment. J. Exp. Bot., 47: 17-23.

Taiz, L. and E. Zeiger. 2003. Plant physiology, 3 edition. Sinauer Associates Publisher, 690 pages.

Tal, M., 1994. In vitro selection for salt tolerance in crop plants: Theoretical and practical considerations. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant, 30: 175-180.

Tran Duy Quy, Nguyen Huu Dong, Bui Huy Thuy, Le Van Nha, Nguyen Van Bich et al., 2003. Use of physical/chemical mutagens in plant breeding program In Vietnam, JAERI-Conf 2001-003: 45-60.

Trần Thƣợng Tuấn, 1992. Chọn giống và công tác chọn giống cây trồng. Tủ sách Trƣờng Đại học Cần Thơ.

137

Trần Thƣợng Tuấn, Nguyễn Văn Huỳnh và Võ Thanh Hoàng, 1983. Kỹ thuật trồng cây đậu nành. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.

Trần Văn Điền, 2007. Giáo trình cây đậu tƣơng. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.

Tsai, S. N., 2003. Cloning and Characterization of Ion Transporters Genes from a Salt-tolerant Soybean Variety. M. Phil. Thesis. The Chinese University of Hong Kong.

Upmeyer, D.J. and H.R. Koller, 1973. Diurnal Trends in Net Photosynthetic Rate and Carbohydrate. Plant Physiol. Deparment of Agronomy, Purdue University, Lafayette, Indiana.

US Salinity Laboratory Staff, 1954. Diagnosis and improvement of saline and alkali soils. Agric Hard B 60. United States Department of Agriculture, Washington DC.

Valencia, R., P. Chen, T. Ishibashi and M. Conatser, 2008. A rapid and effective method for screening salt tolerance in soybean. Crop Sci., 48: 1773-1779.

Vũ Hoàng Hiệp và Nguyễn Thị Lý Anh, 2013. Ảnh hƣởng của xử lý đột biến in vitro bằng ethyl methane sulphonate (EMS) kết hợp chiếu xạ tia gamma đến sự biến dị ở cây hoa cẩm chƣớng (Dianthus caryophyllus L.). Tạp chí Khoa học và Phát triển, 11 (8): 1092-1100.

Wan, C., G. Shao, Y. Chen and S. Yan, 2002. Relationship between salt tolerance and chemical quality of soybean under salt stress. Chin. J. Oil Crop Sci., 24: 67-72.

Wang, J., M. van Ginkel, D. Podlich, G. Ye, R. Trethowan, W. Pfeiffer et al., 2003. Comparison of two breeding strategies by computer simulation. Crop Sci., 43: 1764-1773.

Wu, K., R. Jones, L. Dannaeberger and P.A. Scolnik, 1994. Detection of microsatellite polymorphisms without cloning. Nucleic Acids Res., 22: 3257-3258.

Yang, W., A.C. De Oliveira, I. Godwin, K. Schertz and J.L. Bennetzen, 1996. Comparison of DNA marker technologies in characterizing plant genome diversity variability in Chinese sorghum. Crop Science, 36: 1669-1676.

Yaycili, O. and S. Alikamanoğlu, 2012. Induction of salt-tolerant potato (Solanum irradiation and tuberosum L.) mutants with gamma characterization of genetic variations via RAPD-PCR analysis. Turk J Biol, 36: 405-412.

Zia, M., Z. F. Rizvi, Riaz-ur-Rehman and M. F. Chaudhary, 2010. Short communication. Micropropagation of two Pakistani soybean (Glycine max L.) cultivars from cotyledonary nodes. Spanish Journal of Agricultural Research, 8(2): 448-453.

138

Zietkiewicz, E., A. Rafalski and D. Labuda, 1994. Genome finger-printing by simple sequence repeat (SSR) – anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 20: 176-183.

139

Zinnah, K.M.A., N. Zobayer, S.U. Sikdar, L.N. Liza, Md.Al N. Chowdhury and M. Ashrafuzzaman, 2013. In Vitro Regeneration and Screening for Salt Tolerance in Rice (Oryza sativa L.). International Research Journal of Biological Sciences, 2 (11): 29-36.

PHỤ LỤC 1

1.1 Nguồn gốc các giống đậu nành

+ MTĐ 176: Dòng lai ĐH 4 x CES 97-13 (Đại học Cần Thơ)

+ MTĐ 748-1: Dòng lai MTĐ 240 x TGX 604-01D (Đại học Cần Thơ)

+ MTĐ 760-4: Dòng lai MTĐ 176 x A 70 (Đại học Cần Thơ) + Nhật 17A: Giống địa phƣơng của Đồng Tháp

+ OMĐN 29: Dòng lai OMĐN 1 x Kettum (Viện Khoa học Kỹ thuật

Nông nghiệp Miền Nam và Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long)

+ ĐH 4: Đƣợc tuyển chọn từ giống Ngọc Lâm của Trung Quốc

+ MTĐ 720: Dòng lai ĐH4 x Ntholha (Đại học Cần Thơ)

+ MTĐ 860-1: Dòng lai TaekWangKong x MTĐ 176 (Đại học Cần Thơ)

+ MTĐ 878-3: Dòng lai MTĐ 760-4 x MTĐ 176 (Đại học Cần Thơ)

+ MTĐ 885-2: Dòng lai MTĐ 65 x ĐT 2000 (Đại học Cần Thơ)

1.2 Đặc tính của các giống đậu nành

1.2.1 Giống MTĐ 176

Thời gian sinh trƣởng 80-82 ngày, chiều cao cây 40-60 cm, không đổ

ngã, trọng lƣợng 100 hạt khá to 14-17 g, năng suất 1,6-3,2 tấn ha.

1.2.2 Giống MTĐ 748-1

Thời gian sinh trƣởng 86 ngày. Chiều cao cây 79 cm. Số trái 61 trái/cây.

Trọng lƣợng 15,8 g/100 hạt. Năng suất 3,9 tấn/ha.

1.2.3 Giống MTĐ 760-4

Giống MTĐ 760-4 là giống có triển vọng với nhiều đặc tính nông học tốt nhƣ thời gian sinh trƣởng ngắn 80-85 ngày, cây cao 50-60 cm, gốc thân cứng, không đổ ngã, phân cành mạnh. Số hạt m2 khá cao 1821 hạt, trọng lƣợng 100 hạt to 17,7 g, vỏ trái màu nâu nhƣng màu hạt vàng sáng, tể hồng rất phù hợp với sở thích ngƣời sử dụng. Năng suất cao và ổn định từ 1,9-3,5 tấn ha. Hàm lƣợng protein trong hạt rất cao 41,78% trọng lƣợng khô.

1.2.4 Giống Nhật 17A

Thời gian sinh trƣởng từ 60-70 ngày. Hạt tròn, vàng tƣơi, trọng lƣợng

140

100 hạt từ 9-10 g.

1.2.5 Giống OMĐN29

Giống có hoa tím, lông tơ vàng hung, vỏ trái khi chín màu vàng rơm, hạt màu vàng sáng, rốn hạt màu nâu nhạt, chín tập trung, ít tách hạt ngoài đồng. Thời gian sinh trƣởng 80-85 ngày, cây cao 50-60 cm, số cành cấp 1 từ 2-3 cành. Tổng số trái cây từ 30-45 trái, tỉ lệ trái 3 hạt 60-70%, trọng lƣợng 1.000 hạt 150-175 g. Hàm lƣợng protein 33,7%, lipid 18,3%. Có khả năng kháng bệnh rỉ sắt và thối trái cao, nhiễm nhẹ bệnh đốm lá vi khuẩn. Năng suất đạt 1,5-1,8 tấn ha trong vụ Hè Thu và Thu Đông, đạt 2,5-3,2 tấn ha trong vụ Đông Xuân và Xuân Hè.

1.2.6 Giống ĐH4

Thời gian sinh trƣởng 78 ngày. Chiều cao cây 78 cm. Số trái 31,7

trái cây. Trọng lƣợng 15,1 g 100 hạt. Năng suất 3,4 tấn ha.

1.2.7 Giống MTĐ 720

Thời gian sinh trƣởng 78-80 ngày. Chiều cao cây 81 cm. Số trái 51

trái/cây. Trọng lƣợng 11,8 g/100 hạt. Năng suất 3,8 tấn/ha.

1.2.8 Giống MTĐ 860-1

Thời gian sinh trƣởng 79-80 ngày. Chiều cao cây 38 cm. Số trái 22

trái cây. Trọng lƣợng 21,9 g 100 hạt. Năng suất 2,95 tấn ha.

1.2.9 Giống MTĐ 878-3

Thời gian sinh trƣởng 80-85 ngày, chiều cao cây 60-70 cm, trọng lƣợng

100 hạt khá to 15-18 g, năng suất 2,2-3,3 tấn/ha.

1.2.10 Giống MTĐ 885-2

Thời gian sinh trƣởng khoảng 83 ngày. Chiều cao cây 72 cm. Số trái 35,5

141

trái cây. Trọng lƣợng 18,3 g 100 hạt. Năng suất 3,75 tấn ha.

PHỤ LỤC 2

2.1 Hình ảnh thí nghiệm đánh giá mức độ chịu mặn của các giống

đậu nành bằng phƣơng pháp thủy canh

b a

Hình 2.1 Các giống đậu nành đƣợc đánh giá khả năng chống chịu mặn tại Trại Nghiên cứu và Thực nghiệm nông nghiệp, Khoa Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Cần Thơ Ở 4 ngày sau khi trồng (a) Ở 2 tuần sau khi trồng (b, c) Ở 5 tuần sau khi trồng (d)

142

c d

2.2 Hình ảnh thí nghiệm thuần dƣỡng các dòng đậu nành thu đƣợc

sau chọn lọc in vitro trong điều kiện nhà lƣới

a b

c d

143

Hình 2.2: Các loại giá thể thuần dƣỡng Mụn dừa (a) Phân rơm (b) Tro trấu (c) Đất (d)

a b

c d

Cây con in vitro chuẩn bị thuần dƣỡng (a) Cây con đƣợc trồng trên giá thể và trùm bằng bọc nylon để giữ ẩm (b) Cây con sau 10 ngày thuần dƣỡng (c) Cây con ở thời điểm xử lý tƣới nƣớc mặn (d)

144

Hình 2.3 Các dòng đậu nành MTĐ 760-4 sau chọn lọc đƣợc thuần dƣỡng và tƣới mặn ở nhà lƣới Bộ môn Sinh lý Sinh hóa, Khoa Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Cần Thơ

PHỤ LỤC 3

Nguyên tố

Trọng lƣợng phân tử

Nồng độ cuối cùng của nguyên tố

Hóa chất

Nồng độ của dung dịch gốc

Nồng độ của dung dịch gốc

Thể tích của dung dịch gốc cho dung dịch cuối cùng

g/M

mM

g/L

ml

µM

ppm

Đa lƣợng

101,1

1.000

101,1

6

KNO3

N K

16.000 6.000

244 235

236,16

1.000

236,16

Ca

4.000

160

4

Ca(NO3)2. 4H2O

115,08

1.000

115,08

P

62

2

NH4H2PO4

246,48

1.000

246,49

1

MgSO4.7H2O

S Mg

2.000 1.000 1.000

32 24

74,55

25

1,864

Cl

50

1,77

2

Vi lƣợng KCl

61,83

12,5

0,773

B

25

0,27

2

H3BO3

169,01

1

0,169

Mn

2,0

0,11

2

MnSO4.H2O

287,54

1

0,288

Zn

2,0

0,13

2

ZnSO4.7H2O

249,68

0,25

0,062

Cu

0,5

0,3

2

CuSO4.5H2O

64

30

Fe

3,0

53,7

468,2

0,3-1,0

3

5

1

0

Thời điểm ghi nhận (tuần SKT) 4 2 Thay mới dung dịch 0,88 1,09 1,19 3,91 3,11 3,05 5,46 5,76 5,65 10,25 10,63 10,87

Thay mới dung dịch 1,35 0,97 4,72 3,94 5,79 6,32 9,68 12,11

1,44 1,46 1,55 4,00 3,20 3,33 6,44 7,18 6,30 11,09 11,62 12,73

NaFeEDTA (10%Fe) Phụ bảng 3.2 Sự thay đổi EC (dS/m) trong dung dịch trong giai đoạn thí nghiệm 1 Nồng độ NaCl (g/L) 0 1 2 4

145

Phụ bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng Hoagland (Taiz và Zeige, 2003) có cải tiến

1

0

4

5

3

1,32 1,49 1,36 3,19 3,16 3,08 6,38 6,14 6,27 10,91 9,75 10,88

Thay mới dung dịch 1,21 1,01 4,52 3,06 5,73 6,49 9,87 12,27

Thời điểm ghi nhận (tuần SKT) 2 Thay mới dung dịch 0,53 1,07 1,22 4,74 4,35 2,73 4,64 6,73 6,07 10,29 10,71 11,41

Hàm lƣợng (mg/L)

1 1

Hóa chất NH4NO3 KNO3 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O KH2PO4 MnSO4.H2O ZnSO4.8H2O H3BO3 KI Na2MoO4 .2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O FeSO4.7H2O Na2EDTA Thiamine HCl (B1) Pyridoxine HCl (B6) Nicotinic acid (B3)

1.650 1.900 370 440 170 22,3 8,6 6,2 0,83 0,25 0,025 0,025 27,85 37,85 1 1 1

146

Phụ bảng 3.3 Sự thay đổi EC (dS/m) trong dung dịch trong giai đoạn thí nghiệm 2 Nồng độ NaCl (g/L) 0 1 2 4 Phụ bảng 3.4: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy (Murashige and Skoog, 1962) Khoáng đa lƣợng Khoáng vi lƣợng Vitamin

PHỤ LỤC 4

P

F 112,500 1,350 0,253 800,000 9,600 0,000 112,500 1,350 0,194

4 450,000 2400,000 3 1350,000 12 15000,000 180 1940000,000 200

83,333

4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của các giống đậu nành MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4, Nhật 17A và OMĐN 29

P

F

2978,901 6,120 0,000 33143,842 68,088 0,000 1921,704 3,948 0,000 486,781

4 11915,605 99431,525 3 23060,443 12 87620,666 180 1565103,512 200

Phụ bảng 4.1: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên tỉ lệ sống (%) của các giống đậu nành ở thời điểm 1 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 10,3%

P

F

1972,704 3,112 0,017 56909,414 89,775 0,000 2308,172 3,641 0,000 633,911

4 7890,814 170728,243 3 27698,068 12 114104,016 180 1337829,471 200

Phụ bảng 4.2: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên tỉ lệ sống (%) của các giống đậu nành ở thời điểm 3 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 26,9%

Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng

F

P

149,135 113,038 0,000 76,668 58,111 0,000 0,894 0,554 1,180 1,319

4 596,541 230,003 3 14,154 12 237,481 180 10173,813 200

Phụ bảng 4.3: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên tỉ lệ sống (%) của các giống đậu nành ở thời điểm 5 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 35,3%

147

Phụ bảng 4.4: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên chiều cao cây (cm) của các giống đậu nành ở thời điểm 1 tuần SKT Nguồn biến động Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 17,0%

Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng

F

P

1896,807 12575,868

474,202 25,700 0,000 4191,956 227,186 0,000 2,459 0,006

4 3 544,366 12 2952,266 160 119691,000 180

45,364 18,452

Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng

F

P

1970,759 13,148 0,000 18799,225 125,416 0,000 0,694 0,743

4 7883,036 56397,675 3 1143,540 11 21434,957 143 715435,250 162

103,958 149,895

Phụ bảng 4.5: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên chiều cao cây (cm) của các giống đậu nành ở thời điểm 3 tuần SKT Nguồn biến động Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 19,2%

P

F 6,242 36,807 0,000 0,711 4,194 0,007 0,223 1,313 0,214 0,170

Phụ bảng 4.6: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên chiều cao cây (cm) của các giống đậu nành ở thời điểm 5 tuần SKT Nguồn biến động Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 21,8%

Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng

F

P

33,367 35,381 0,000 94,490 100,192 0,000 4,267 0,000 4,024 0,943

4 133,469 283,471 3 48,289 12 150,895 160 7478,250 180

Phụ bảng 4.7: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên số lóng trên thân chính của các giống đậu nành ở thời điểm 1 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 4 24,968 Giống 2,134 NaCl 3 2,673 12 Giống * NaCl 30,525 180 Sai số Tổng 335,250 200 CV = 35,1%

148

Phụ bảng 4.8: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên số lóng trên thân chính của các giống đậu nành ở thời điểm 3 tuần SKT Nguồn biến động Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 16,4%

P

F 64,759 35,745 0,000 80,300 44,323 0,000 4,787 2,642 0,004 1,812

df Trung bình bình phƣơng

F

P

Tổng bình phƣơng

1362,193 110,912 0,000 299,728 24,404 0,000 1,311 0,215 16,104 12,282

4 5448,772 899,184 3 193,249 12 2210,710 180 43327,211 200

Phụ bảng 4.9: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên số lóng trên thân chính của các giống đậu nành ở thời điểm 5 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 4 259,037 Giống 240,899 NaCl 3 52,661 11 Giống * NaCl 259,075 143 Sai số Tổng 18370,250 162 CV = 13,6%

F

P

11749,524 7273,845

2937,381 79,875 0,000 2424,615 65,932 0,000 67,301 1,830 0,047 36,775

4 3 807,615 12 5883,957 160 195714,563 180

Phụ bảng 4.10: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên chiều dài rễ (cm) của các giống đậu nành ở thời điểm 1 tuần SKT Nguồn biến động Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 26,7%

F

P

2737,465 66,419 0,000 1078,251 26,161 0,000 58,814 1,427 0,167 41,215

4 10949,861 3234,752 3 646,949 11 5893,785 143 261681,500 162

Phụ bảng 4.11: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên chiều dài rễ (cm) của các giống đậu nành ở thời điểm 3 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 20,7%

149

Phụ bảng 4.12: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên chiều dài rễ (cm) của các giống đậu nành ở thời điểm 5 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 17,6%

F

P

3981,359 4,978 0,001 17671,314 22,097 0,000 1524,429 1,906 0,036 799,718

4 15925,434 53013,941 3 18293,153 12 143949,307 180 1531274,472 200

4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên sự sinh trƣởng của các giống đậu nành ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-3 và MTĐ 885-2

F

P

2813,268 2,898 0,023 57107,970 58,821 0,000 1027,997 1,059 0,398 970,872

4 11253,072 171323,909 3 12335,961 12 174757,004 180 1231994,547 200

Phụ bảng 4.13: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên tỉ lệ sống (%) của các giống đậu nành ở thời điểm 3 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 35,1%

P

F 21,171 6,322 0,000 105,521 31,510 0,000 12,193 3,641 0,000

3,349

Phụ bảng 4.14: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên tỉ lệ sống (%) của các giống đậu nành ở thời điểm 5 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 47,5%

P

F 755,768 22,213 0,000 2701,590 79,402 0,000 130,882 3,847 0,000 34,024

4 3023,072 3 8104,769 1570,588 12 5409,815 159 141341,675 179

Phụ bảng 4.15: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên chiều cao cây (cm) của các giống đậu nành ở thời điểm 1 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 4 84,685 Giống 316,562 NaCl 3 146,313 12 Giống * NaCl Sai số 602,792 180 20506,618 200 Tổng CV = 18,6%

150

Phụ bảng 4.16: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên chiều cao cây (cm) của các giống đậu nành ở thời điểm 3 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 23,0%

F

P

2070,738 8,622 0,000 18806,811 78,305 0,000 736,356 3,066 0,001 240,175

4 8282,953 56420,432 3 8836,267 12 30982,554 129 611504,578 149

P

F 4,468 10,327 0,000 5,513 12,744 0,000 1,092 2,525 0,004 0,433

Phụ bảng 4.17: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên chiều cao cây (cm) của các giống đậu nành ở thời điểm 5 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 30,1%

P

F 9,327 11,565 0,000 23,831 29,552 0,000 1,010 1,252 0,253 0,806

Phụ bảng 4.18: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên số lóng trên thân chính của các giống đậu nành ở thời điểm 2 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 17,872 Giống 4 3 16,540 NaCl 13,108 12 Giống * NaCl 71,383 165 Sai số 787,250 185 Tổng CV = 35,1%

P

F 20,383 13,049 0,000 77,321 49,503 0,000 0,874 0,559 0,871 1,562

Phụ bảng 4.19: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên số lóng trên thân chính của các giống đậu nành ở thời điểm 3 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 4 37,307 Giống 71,493 NaCl 3 12,114 12 Giống * NaCl 128,222 159 Sai số Tổng 2612,750 179 CV = 25,3%

P

F 23,536 2,400 0,052 39,461 4,023 0,008 8,992 0,917 0,531 9,808

Phụ bảng 4.20: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên số lóng trên thân chính của các giống đậu nành ở thời điểm 5 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 4 81,530 Giống 231,964 NaCl 3 10,482 12 Giống * NaCl 203,056 130 Sai số Tổng 7429,250 150 CV = 19,7%

151

Phụ bảng 4.21: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên chiều dài rễ (cm) của các giống đậu nành ở thời điểm 1 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 4 94,143 Giống 118,382 NaCl 3 107,905 12 Giống * NaCl 1706,546 174 Sai số 32479,268 194 Tổng CV = 24,9%

P

F 111,292 10,318 0,000 284,094 26,338 0,000 14,989 1,390 0,176 10,787

P

F 29,226 2,098 0,085 192,373 13,807 0,000 11,313 0,812 0,638 13,933

Phụ bảng 4.22: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên chiều dài rễ (cm) của các giống đậu nành ở thời điểm 3 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 4 445,166 Giống 852,283 NaCl 3 179,864 12 Giống * NaCl Sai số 1725,868 160 170065,845 180 Tổng CV = 10,9%

Phụ bảng 4.23: Ảnh hƣởng của muối NaCl trên chiều dài rễ (cm) của các giống đậu nành ở thời điểm 5 tuần SKT Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 4 116,906 Giống 577,120 NaCl 3 135,759 12 Giống * NaCl Sai số 1839,167 132 Tổng 228935,485 152 CV = 9,8%

P

F

1,702 0,171 25,560 0,000 1,351 0,241

1449,381 21764,451 1150,645 851,508

4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của 2,4-D và BA lên sự hình thành mô sẹo từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4

P

F

0,663 0,052 0,128 0,880 1,150 0,339

632,691 30,528 273,127 237,582

Phụ bảng 4.24: Ảnh hƣởng của 2,4-D và BA lên tỉ lệ tạo mô sẹo (%) từ tử diệp đậu nành ở 1 tuần SKC Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 3 4348,142 2,4-D 2 43528,903 BA 6903,871 2,4-D * BA 6 Sai số 91962,853 108 647577,234 120 Tổng CV = 45,2%

152

Phụ bảng 4.25: Ảnh hƣởng của 2,4-D và BA lên tỉ lệ tạo mô sẹo (%) từ tử diệp đậu nành ở 2 tuần SKC Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 3 1898,074 2,4-D 2 61,055 BA 1638,760 2,4-D * BA 6 Sai số 25658,855 108 Tổng 1108179,398 120 CV = 16,3%

P

F

2,663 0,052 0,128 0,880 1,150 0,339

632,691 30,528 273,127 237,582

P

F

1,867 0,141 0,063 0,939 1,435 0,208

301,985 10,176 233,284 162,593

Phụ bảng 4.26: Ảnh hƣởng của 2,4-D và BA lên tỉ lệ tạo mô sẹo (%) từ tử diệp đậu nành ở 3 tuần SKC Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 3 1898,074 2,4-D 2 61,055 BA 1638,760 2,4-D * BA 6 25658,855 108 Sai số 120 Tổng CV = 16,3%

F

P

52,590 0,000 260,307 0,000 29,675 0,000

10058,645 49787,388 5675,758 191,264

Phụ bảng 4.27: Ảnh hƣởng của 2,4-D và BA lên tỉ lệ tạo mô sẹo (%) từ tử diệp đậu nành ở 4 tuần SKC Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 3 905,955 2,4-D 2 20,352 BA 1399,704 2,4-D * BA 6 Sai số 17560,090 108 Tổng 1128380,396 120 CV = 13,3%

F

P

22,179 0,000 901,153 0,000 7,549 0,000

2730,960 110959,953 929,469 123,131

Phụ bảng 4.28: Ảnh hƣởng của 2,4-D và BA lên tỉ lệ tạo rễ (%) từ tử diệp đậu nành ở 2 tuần SKC Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 3 30175,934 2,4-D 2 99574,776 BA 6 34054,546 2,4-D * BA Sai số 20656,490 108 Tổng 257174,378 120 CV = 56,2%

153

Phụ bảng 4.29: Ảnh hƣởng của 2,4-D và BA lên tỉ lệ tạo rễ (%) từ tử diệp đậu nành ở 4 tuần SKC Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 8192,881 3 2,4-D 221919,906 2 BA 5576,813 6 2,4-D * BA 13298,156 108 Sai số Tổng 432458,378 120 CV = 28,3%

df

P

F

18,343 18,896 0,374

0,000 0,000 0,772

Trung bình bình phƣơng 5946,248 6125,525 121,198 324,166

4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng đến sự tạo rễ từ đoạn thân đậu nành MTĐ 760-4

17838,744 6125,525 363,594 23339,937 189803,501

3 1 3 72 80

Phụ bảng 4.30: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng trên tỉ lệ tạo rễ (%) của cây đậu nành ở 2 tuần SKC Tổng bình Nguồn biến động phƣơng NAA MS NAA * MS Sai số Tổng

df

F

P

0,000 0,000 0,023

Trung bình bình phƣơng 10224,606 17548,073 1333,179 396,172

25,809 44,294 3,365

30673,819 17548,073 3999,536 28524,361 340289,725

CV = 42,7%

3 1 3 72 80

Phụ bảng 4.31: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng trên tỉ lệ tạo rễ (%) của cây đậu nành ở 4 tuần SKC Tổng bình Nguồn biến động phƣơng NAA MS NAA * MS Sai số Tổng

Tổng bình phƣơng

df

F

P

Trung bình bình phƣơng

0,000 0,018 0,023

551,601 5,892 3,385

CV = 34,9%

306,265 1,090 1,879 13,325 1247,632

102,088 1,090 0,626 0,185

3 1 3 72 80

Phụ bảng 4.32: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng trên số rễ của cây đậu nành ở 2 tuần SKC Nguồn biến động NAA MS NAA * MS Sai số Tổng

df

F

P

Tổng bình phƣơng

0,000 0,036 0,002

103,497 4,582 5,565

CV = 12,7%

Trung bình bình phƣơng 83,101 3,679 4,468 0,803

249,303 3,679 13,405 55,403 2293,036

3 1 3 69 77

Phụ bảng 4.33: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng trên số rễ của cây đậu nành ở 4 tuần SKC Nguồn biến động NAA MS NAA * MS Sai số Tổng

154

CV = 17,8%

df

F

P

Trung bình bình phƣơng

Tổng bình phƣơng

0,000 0,000 0,001

438,250 43,717 5,952

93,664 9,343 1,272 0,214

280,993 9,343 3,816 15,388 2729,101

3 1 3 72 80

Phụ bảng 4.34: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng trên chiều dài rễ (cm) của cây đậu nành ở 4 tuần SKC Nguồn biến động NAA MS NAA * MS Sai số Tổng

df

F

P

Tổng bình phƣơng

0,000 0,271 0,000

CV = 8,4%

Trung bình bình phƣơng 5,208 0,296 2,423 0,241

15,624 0,296 7,269 17,363 212,983

21,596 1,229 10,048

3 1 3 72 80

Phụ bảng 4.35: Ảnh hƣởng của NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng MS trên chiều cao chồi (cm) của cây đậu nành ở 2 tuần SKC Nguồn biến động NAA MS NAA * MS Sai số Tổng

df

F

P

Tổng bình phƣơng

CV = 33,0%

Trung bình bình phƣơng 24,239 1,099 1,557 0,203

72,717 1,099 4,672 12,798 3427,859

119,321 5,411 7,667

0,000 0,023 0,000

3 1 3 63 71

Phụ bảng 4.36: Ảnh hƣởng của NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng MS trên chiều cao chồi (cm) của cây đậu nành ở 4 tuần SKC Nguồn biến động NAA MS NAA * MS Sai số Tổng

df

F

P

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

0,000 0,152 0,623

CV = 7,0%

3,302 0,271 0,229 9,304 101,307

1,101 0,271 0,076 0,129

8,519 2,101 0,591

3 1 3 72 80

Phụ bảng 4.37: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng trên số lá của cây đậu nành ở 2 tuần SKC Nguồn biến động NAA MS NAA * MS Sai số Tổng

155

CV = 17,1%

Tổng bình phƣơng

df

F

P

Trung bình bình phƣơng

0,000 0,078 0,142

10,461 0,276 0,483 6,106 349,093

40,549 3,207 1,871

3,487 0,276 0,161 0,086

3 1 3 71 79

Phụ bảng 4.38: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA và hàm lƣợng khoáng đa lƣợng trên số lá của cây đậu nành ở 4 tuần SKC Nguồn biến động NAA MS NAA * MS Sai số Tổng

CV = 20,1%

F

P

df

4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của loại giá thể đến sự thuần dƣỡng cây đậu nành in vitro trong điều kiện nhà lƣới

Trung bình bình phƣơng

0,000

19600,000 3000,000 22600,000

4 20 24

4900,000 150,000

32,667

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 12,9%

P

F

df

Phụ bảng 4.39: Ảnh hƣởng của loại giá thể trên tỉ lệ sống (%) của cây đậu nành sau 1 tuần thuần dƣỡng Tổng Nguồn biến động bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

Nghiệm thức

40400,000

4

10100,000

33,667

0,000

6000,000 46400,000

300,000

20 24

Sai số Tổng CV = 28,5% Phụ bảng 4.41:Ảnh hƣởng của loại giá thể trên tỉ lệ sống (%) của cây đậu nành sau 3 tuần thuần dƣỡng Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

Nghiệm thức

28600,000

4

7150,000

13,000

0,000

11000,000 39600,000

20 24

550,000

Sai số Tổng CV = 47,0%

156

Phụ bảng 4.40: Ảnh hƣởng của loại giá thể trên tỉ lệ sống (%) của cây đậu nành sau 2 tuần thuần dƣỡng Tổng Nguồn biến động bình phƣơng

P

F

df

Trung bình bình phƣơng

28000,000 12000,000 40000,000

4 20 24

7000,000 600,000

11,667

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 53,0%

Phụ bảng 4.42: Ảnh hƣởng của loại giá thể trên tỉ lệ sống (%) của cây đậu nành sau 4 tuần thuần dƣỡng Tổng Nguồn biến động bình phƣơng

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

1,665 0,945 2,610

3 36 39

0,555 0,026

21,140

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 27,0%

Phụ bảng 4.43: Ảnh hƣởng của loại giá thể trên chiều cao gia tăng (cm) của cây đậu nành sau 1 tuần thuần dƣỡng Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

1,936 0,723 2,659

3 25 28

0,645 0,029

22,321

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 11,0%

Phụ bảng 4.44: Ảnh hƣởng của loại giá thể trên chiều cao gia tăng (cm) của cây đậu nành sau 2 tuần thuần dƣỡng Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

42,515

3

14,172

20,030

0,000

Nghiệm thức

16,273 58,787

23 26

0,708

Sai số Tổng CV = 28,0%

Phụ bảng 4.45: Ảnh hƣởng của loại giá thể trên chiều cao gia tăng (cm) của cây đậu nành sau 3 tuần thuần dƣỡng Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

57,920 15,635 73,554

3 21 24

19,307 0,745

25,932

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 22,8%

157

Phụ bảng 4.46: Ảnh hƣởng của loại giá thể trên chiều cao gia tăng (cm) của cây đậu nành sau 4 tuần thuần dƣỡng Nguồn biến động

P

F

df

Trung bình bình phƣơng 0,025 0,119

0,209

0,889

3 36 39

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 39,0%

P

F

df

Phụ bảng 4.47: Ảnh hƣởng của loại giá thể trên số lá gia tăng của cây đậu nành sau 1 tuần thuần dƣỡng Tổng Nguồn biến động bình phƣơng 0,075 4,300 4,375

Trung bình bình phƣơng 0,029 0,071

0,409

0,748

3 25 28

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 28,0%

P

F

df

Phụ bảng 4.48: Ảnh hƣởng của loại giá thể trên số lá gia tăng của cây đậu nành sau 2 tuần thuần dƣỡng Tổng Nguồn biến động bình phƣơng 0,087 1,775 1,862

Trung bình bình phƣơng 0,158 0,269

0,587

0,630

3 23 26

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 36,0%

P

F

df

Phụ bảng 4.49: Ảnh hƣởng của loại giá thể trên số lá gia tăng của cây đậu nành sau 3 tuần thuần dƣỡng Tổng Nguồn biến động bình phƣơng 0,474 6,192 6,667

Trung bình bình phƣơng

0,340

3

0,113

0,317

0,813

Nghiệm thức

7,500 7,840

21 24

0,357

Sai số Tổng CV = 31,0%

Phụ bảng 4.50: Ảnh hƣởng của loại giá thể trên số lá gia tăng của cây đậu nành sau 4 tuần thuần dƣỡng Tổng Nguồn biến động bình phƣơng

4.6 Thí nghiệm 6a: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 1

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

1,612,867 5,377,014 6,989,881

4 45 49

403,217 119,489

3,375

0,017

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 11,4%

158

Phụ bảng 4.51: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 1 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

11,508,715 12,613,706 24,122,421

4 45 49

2,877,179 280,305

10,264

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 18,5%

Phụ bảng 4.52: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 2 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

29,415,475 13,319,000 42,734,475

4 45 49

7,353,869 295,978

24,864

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 22,9%

Phụ bảng 4.53: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

41,132,461 11,639,441 52,771,903

4 45 49

10,283,115 258,654

39,756

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 23,5%

Phụ bảng 4.54: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 4 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

46,828,853 11,347,401 58,176,903

4 45 49

11,707,213 252,164

46,427

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 46,1%

Phụ bảng 4.55: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động

4.7 Thí nghiệm 6b: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 2

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

9,995,575 5,986,036 15,981,610

3 34 37

3,331,858 176,060

18,925

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 15,3%

159

Phụ bảng 4.56: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 1 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

16,780,710 6,230,247 23,010,957

3 34 37

5,593,570 183,243

30,525

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 16,3%

Phụ bảng 4.57: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 2 tuần SKC lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

26,717,248 7,646,090 34,363,338

3 34 37

8,905,749 224,855

39,601

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 19,2%

Phụ bảng 4.58: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 3 tuần SKC lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

31,763,263 8,629,196 40,392,458

3 34 37

10,587,754 253,800

41,717

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 20,8%

Phụ bảng 4.59: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 4 tuần SKC lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

37,155,489 8,366,272 45,521,761

3 34 37

12,385,163 246,067

50,333

0,000

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 20,8%

160

Phụ bảng 4.60: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 5 tuần SKC lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

4.8 Thí nghiệm 6c: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 3

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

355,563 2,133,376 2,488,938

2 27 29

177,781 79,014

2,250

0,125

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 9,1%

Phụ bảng 4.61: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 2 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

355,563 2,133,376 2,488,938

2 27 29

177,781 79,014

2,250

0,125

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 9,1%

Phụ bảng 4.62: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

355,563 2,133,376 2,488,938

2 27 29

177,781 79,014

2,250

0,125

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 9,1%

Phụ bảng 4.63: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 4 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

800,016 2,800,056 3,600,071

2 27 29

400,008 103,706

3,857

0,034

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 10,6%

161

Phụ bảng 4.64: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

4.9 Thí nghiệm 6d: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự sinh trƣởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 4

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

489,597 3,017,799 3,507,395

2 27 29

244,798 111,770

2,190

0,131

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 10,9%

Phụ bảng 4.65: Ảnh hƣởng của NaCl lên tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ở 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 4 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

4,373 2,302 6,675

2 9 11

2,187 0,256

8,550

0,008

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 26,3%

Phụ bảng 4.66: Ảnh hƣởng của NaCl lên hàm lƣợng proline trên mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 sau 4 lần chọn lọc Nguồn biến động

4.10 Thí nghiệm 7a: Ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 1

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

7,493

0,000

1391,984 185,779

4175,953 10403,651 14579,604

3 56 59

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 39,2%

Phụ bảng 4.67: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên tỉ lệ tạo chồi (%) ở 1 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

13,908

0,000

1813,434 130,386

5440,302 7301,627 12741,929

3 56 59

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 29,7%

Phụ bảng 4.68: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên tỉ lệ tạo chồi (%) ở 2 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

13,453

0,000

1768,401 131,454

5305,202 7361,427 12666,629

3 56 59

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 29,4%

162

Phụ bảng 4.69: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên tỉ lệ tạo chồi (%) ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

4,625

0,006

0,016 0,003

0,048 0,172 0,220

3 50 53

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 32,9%

Phụ bảng 4.70: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên chiều cao chồi (cm) ở 1 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

14,697

0,000

0,756 0,051

2,268 2,727 4,995

3 53 56

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 30,6%

Phụ bảng 4.71: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên chiều cao chồi (cm) ở 2 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

42,553

0,000

21,213 0,499

63,639 26,421 90,060

3 53 56

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 33,6%

Phụ bảng 4.72: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên chiều cao chồi (cm) ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động

4.11 Thí nghiệm 7b: Ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 2

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

0,000

4,697 0,045

14,090 1,622 15,712

3 36 39

104,223

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 34,4%

Phụ bảng 4.73: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 1 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

0,000

21,974 0,199

65,923 7,157 73,079

3 36 39

110,539

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 35,8%

163

Phụ bảng 4.74: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 2 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

0,000

78,952 0,348

236,857 12,520 249,377

3 36 39

227,024

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 24,2%

Phụ bảng 4.75: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

43,537

0,000

1,240 0,028

3,719 1,025 4,744

3 36 39

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 34,3%

Phụ bảng 4.76: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự gia tăng số lá (lá) của chồi ở 1 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

64,760

0,000

3,373 ,052

10,119 1,875 11,994

3 36 39

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 35,8%

Phụ bảng 4.77: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự gia tăng số lá (lá) của chồi ở 2 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

84,712

0,000

6,942 0,082

20,825 2,950 23,775

3 36 39

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 26,6%

Phụ bảng 4.78: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự gia tăng số lá (lá) của chồi ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

4.12 Thí nghiệm 7c: Ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 3

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

98,682

0,000

3,800 ,039

11,400 1,194 12,594

3 31 34

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 34,9%

164

Phụ bảng 4.79: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 1 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

0,000

24,247 0,190

72,741 5,894 78,635

3 31 34

127,540

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 28,2%

Phụ bảng 4.80: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 2 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

0,000

102,976 0,262

308,927 8,130 317,056

3 31 34

392,674

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 16,9%

Phụ bảng 4.81: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

24,046

0,000

0,873 0,036

2,618 1,125 3,743

3 31 34

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 36,9%

Phụ bảng 4.82: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự gia tăng số lá (lá) của chồi ở 1 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

28,303

0,000

1,849 0,065

5,546 2,025 7,571

3 31 34

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 27,5%

Phụ bảng 4.83: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự gia tăng số lá (lá) của chồi ở 2 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

F

P

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

63,657

0,000

5,031 0,079

15,093 2,450 17,543

3 31 34

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 21,4%

165

Phụ bảng 4.84: Ảnh hƣởng của muối NaCl lên sự gia tăng số lá (lá) của chồi ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

P

F 0,029 24,232 0,000 0,001

2 0,058 0,011 9 0,069 11

Phụ bảng 4.85: Ảnh hƣởng của NaCl lên hàm lƣợng proline của chồi đậu nành MTĐ 760-4 sau 3 lần chọn lọc (mol g trọng lƣợng tƣơi) Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 9,0%

P

F

1686,566 4,671 0,001 19580,284 54,223 0,000 522,369 1,447 0,149 361,106

4.13 Thí nghiệm 8a: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối đến tỉ lệ sống của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 1

P

2945,430 6,599 0,000 37182,241 83,309 0,000 1186,748 2,659 0,003 446,317

Phụ bảng 4.86:Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl đến tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 4 6746,263 Giống 58740,853 NaCl 3 6268,432 12 Giống * NaCl 64999,006 180 Sai số Tổng 1406802,772 200 CV = 23,8%

Phụ bảng 4.87: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl đến tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ở 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng F Giống 11781,719 4 3 111546,724 NaCl 14240,978 12 Giống * NaCl Sai số 80337,111 180 1287826,245 200 Tổng CV = 28,9%

P

4.14 Thí nghiệm 8b: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối lên tỉ lệ sống của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 2

166

Phụ bảng 4.88: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl lên tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ở 1 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng F 122,832 2,077 0,086 4 491,329 Giống 476,740 8,062 0,000 1430,219 NaCl 3 95,931 1,622 0,089 1151,170 12 Giống * NaCl 59,132 Sai số 10052,404 170 Tổng 1851038,184 190 CV = 7,8%

P

1195,772 5,068 0,001 11291,692 47,858 0,000 950,667 4,029 0,000 235,940

P

2708,169 7,344 0,000 24541,859 66,553 0,000 1244,889 3,376 0,000 368,756

Phụ bảng 4.89: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl lên tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng F 4 4783,088 Giống 33875,077 NaCl 3 11408,007 12 Giống * NaCl Sai số 40109,808 170 1603009,695 190 Tổng CV = 17,5%

Phụ bảng 4.90: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl lên tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ở 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng F 4 10832,675 Giống 3 73625,576 NaCl 14938,668 12 Giống * NaCl Sai số 62688,517 170 Tổng 1430644,983 190 CV = 24,0%

P

1060,317 2,742 0,030 9030,494 23,353 0,000 503,784 1,303 0,221 386,688

4.15 Thí nghiệm 8c: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối lên tỉ lệ sống của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 3

P

1614,794 3,049 0,019 32722,853 61,779 0,000 491,399 0,928 0,521 529,679

Phụ bảng 4.91: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl lên tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 F Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng 4 4241,268 Giống 27091,482 NaCl 3 6045,405 12 Giống * NaCl Sai số 63803,593 165 Tổng 1572978,561 185 CV = 22,5%

167

Phụ bảng 4.92: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl lên tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ở 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng F 4 6459,177 Giống 98168,558 NaCl 3 5896,788 12 Giống * NaCl 87397,038 165 Sai số Tổng 1345462,092 185 CV = 30,3%

P

95,853

4.16 Thí nghiệm 8d: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối lên tỉ lệ sống của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 4

P

2121,914 6,667 0,000 32467,586 102,019 0,000 767,151 2,411 0,007 318,251

Phụ bảng 4.93: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl lên tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ở 1 tuần SKC trong lần chọn lọc 4 Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng F 4 269,108 2,808 0,028 1076,434 Giống 959,974 10,015 0,000 2879,923 NaCl 3 1583,836 12 Giống * NaCl 131,986 1,377 0,182 Sai số 15144,839 158 1703801,017 178 Tổng CV = 10,2%

Phụ bảng 4.94: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl lên tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 4 Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng F 4 8487,656 Giống 3 97402,758 NaCl 9205,807 12 Giống * NaCl Sai số 50283,584 158 Tổng 1258727,791 178 CV = 23,9%

P

F

Trung bình bình phƣơng

4 7026,523 3 223981,106 17778,133 12 43086,407 158 1085739,364 178

1756,631 6,442 0,000 74660,369 273,783 0,000 1481,511 5,433 0,000 272,699

Giống NaCl Giống * NaCl Sai số Tổng CV = 27,2%

Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng

P

F 1,235 2,560 0,050 6,310 13,078 0,000 2,107 4,367 0,001 0,483

4,941 4 18,930 3 16,855 8 23,160 48 239,793 64

Phụ bảng 4.95: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl lên tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ở 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 4 Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df

168

Phụ bảng 4.96: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl lên hàm lƣợng proline của mô sẹo đậu nành sau 4 lần chọn lọc (mol g trọng lƣợng tƣơi) Nguồn biến động Liều chiếu xạ NaCl Liều chiếu xạ * NaCl Sai số Tổng CV = 40,7%

Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng

P

968,851 3 17755,270 3 8741,486 9 11381,323 48 452894,137 64

4.17 Thí nghiệm 9a: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma Co60 và nồng độ muối NaCl lên sự tao chồi trong lần chọn lọc 1

Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng

P

1327,104 3 24920,160 3 13186,989 9 28193,438 48 345051,115 64

587,363

Phụ bảng 4.97: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl đến tỉ lệ sống của trục phôi (%) ở 2 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động F 322,950 1,362 0,266 Liều chiếu xạ 5918,423 24,961 0,000 NaCl 971,276 4,096 0,001 Liều chiếu xạ * NaCl 237,111 Sai số Tổng CV = 19,1%

Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng

P

1021,214 1,489 0,229 9063,683 13,213 0,000 1895,612 2,763 0,011

685,951

3063,642 3 27191,050 3 17060,509 9 32925,645 48 319000,122 64

Phụ bảng 4.98: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl đến tỉ lệ sống của trục phôi (%) ở 4 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 F Nguồn biến động 442,368 0,753 0,526 Liều chiếu xạ 8306,720 14,142 0,000 NaCl 1465,221 2,495 0,020 Liều chiếu xạ * NaCl Sai số Tổng CV = 36,8%

Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng

P

F

1168,316 9,810 0,000 1710,828 14,365 0,000 692,014 5,810 0,000 119,100

3504,947 3 5132,485 3 6228,125 9 5716,820 48 30150,151 64

Phụ bảng 4.99: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl đến tỉ lệ sống của trục phôi (%) ở 6 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động F Liều chiếu xạ NaCl Liều chiếu xạ * NaCl Sai số Tổng CV = 42,9%

169

Phụ bảng 4.100: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl đến tỉ lệ tạo chồi (%) ở 4 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động Liều chiếu xạ NaCl Liều chiếu xạ * NaCl Sai số Tổng CV = 89,3%

Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng

F

P

1523,704 12,076 0,000 2009,929 15,929 0,000 785,427 6,225 0,000 126,178

4571,111 3 6029,787 3 7068,839 9 6056,566 48 36450,144 64

F

P

155,605 0,000 11,704 0,000 15,057 0,000

0,326 0,024 0,032 0,002

0,651 2 0,073 3 0,063 2 0,029 14 3,977 22

Phụ bảng 4.101: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl đến tỉ lệ tạo chồi (%) ở 6 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động Liều chiếu xạ NaCl Liều chiếu xạ * NaCl Sai số Tổng CV = 79,7%

P

F 3,136 118,979 0,000 1,077 40,866 0,000 1,403 53,218 0,000 0,026

6,271 2 3,231 3 2,805 2 0,422 16 31,187 24

Phụ bảng 4.102: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl đến chiều cao chồi (cm) ở 4 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Nguồn biến động Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng Liều chiếu xạ NaCl Liều chiếu xạ * NaCl Sai số Tổng CV = 13,6%

Phụ bảng 4.103: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma và nồng độ muối NaCl đến chiều cao chồi (cm) ở 6 tuần SKC trong lần chọn lọc 1 Tổng bình phƣơng df Trung bình bình phƣơng Nguồn biến động Liều chiếu xạ NaCl Liều chiếu xạ * NaCl Sai số Tổng CV = 23,3%

4.18 Thí nghiệm 9b: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma Co60 và nồng độ muối NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 2

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

18,183

0,000

1,274 0,070

6,368 1,051 7,418

5 15 20

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 50,3%

170

Phụ bảng 4.104: Ảnh hƣởng liều chiếu xạ và muối NaCl lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 1 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

35,628

0,000

9,859 0,277

49,293 4,151 53,443

5 15 20

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 35,7%

Phụ bảng 4.105: Ảnh hƣởng liều chiếu xạ và muối NaCl lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 2 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

88,271

0,000

32,703 0,370

163,514 5,557 169,071

5 15 20

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 22,9%

Phụ bảng 4.106: Ảnh hƣởng liều chiếu xạ và muối NaCl lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 2 Nguồn biến động

2.19 Thí nghiệm 9c: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia gamma Co60 và nồng độ muối NaCl lên sự sinh trƣởng của chồi trong lần chọn lọc 3

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

0,000

1,979 0,009

9,895 0,139 10,035

5 16 21

227,258

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 14,7%

Phụ bảng 4.107: Ảnh hƣởng liều chiếu xạ và muối NaCl lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 1 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

0,000

6,259 0,060

31,293 0,953 32,246

5 16 21

105,114

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 20,1%

171

Phụ bảng 4.108: Ảnh hƣởng liều chiếu xạ và muối NaCl lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 2 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

0,000

35,678 0,092

178,388 1,471 179,858

5 16 21

388,151

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 10,4%

Phụ bảng 4.109: Ảnh hƣởng liều chiếu xạ và muối NaCl lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 3 Nguồn biến động

4.20 Thí nghiệm 10: Khả năng sinh trƣởng và phát triển của các dòng đậu nành chống chịu mặn trong điều kiện nhà lƣới

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

1,739

0,155

0,992 0,571

3,969 31,387 35,356

4 55 59

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 64,0%

Phụ bảng 4.110: Ảnh hƣởng của tƣới nƣớc mặn lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 1 tuần SKTD Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

1,571

0,195

1,957 1,246

7,829 68,521 76,350

4 55 59

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 51,2%

Phụ bảng 4.111: Ảnh hƣởng của tƣới nƣớc mặn lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 2 tuần SKTD Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

12,140

0,000

53,346 4,394

213,384 241,684 455,069

4 55 59

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 42,3%

Phụ bảng 4.112: Ảnh hƣởng của tƣới nƣớc mặn lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 3 tuần SKTD Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

17,593

0,000

183,853 10,451

735,412 553,878 1289,290

4 53 57

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 31,7%

172

Phụ bảng 4.113: Ảnh hƣởng của tƣới nƣớc mặn lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 4 tuần SKTD Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

22,184

0,000

272,222 12,271

1088,888 650,377 1739,264

4 53 57

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 23,8%

Phụ bảng 4.114: Ảnh hƣởng của tƣới nƣớc mặn lên sự gia tăng chiều cao chồi (cm) ở 5 tuần SKTD Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

0,699

0,596

0,125 0,179

0,500 9,833 10,333

4 55 59

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 50,8%

Phụ bảng 4.115: Ảnh hƣởng của tƣới nƣớc mặn lên sự gia tăng số lóng (lóng) ở 1 tuần SKTD Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

0,899

0,471

0,275 0,306

1,100 116,833 17,933

4 55 59

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 45,8%

Phụ bảng 4.116: Ảnh hƣởng của tƣới nƣớc mặn lên sự gia tăng số lóng (lóng) ở 2 tuần SKTD Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

1,550

0,201

0,683 0,441

2,733 24,250 26,983

4 55 59

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 43,8%

Phụ bảng 4.117: Ảnh hƣởng của tƣới nƣớc mặn lên sự gia tăng số lóng (lóng) ở 3 tuần SKTD Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

3,288

1,547 0,470

6,187 24,933 31,121

4 53 57

0,018

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 30,4%

173

Phụ bảng 4.118: Ảnh hƣởng của tƣới nƣớc mặn lên sự gia tăng số lóng (lóng) ở 4 tuần SKTD Nguồn biến động

P

F

df

Tổng bình phƣơng

Trung bình bình phƣơng

3,114

0,022

1,303 0,419

5,213 22,183 27,397

4 53 57

Nghiệm thức Sai số Tổng CV = 24,5%

174

Phụ bảng 4.119: Ảnh hƣởng của tƣới nƣớc mặn lên sự gia tăng số lóng (lóng) ở 5 tuần SKTD Nguồn biến động