Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát hiện các biến thể ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (exome)

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ

Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM

BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ VÙNG MÃ HÓA (EXOME)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2019

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ VÙNG MÃ HÓA (EXOME)

Chuyên ngành:

Hóa sinh học

9 42 01 16

Mã số:

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Huy Hoàng

Viện Nghiên cứu hệ gen

2. GS.TS. Phan Văn Chi

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn

Huy Hoàng và GS.TS Phan Văn Chi đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận

lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu cũng như thực hiện luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ, ủng hộ và tham gia nhiệt tình của các

cán bộ, đồng nghiệp của phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen,

các bác sĩ tại khoa Tâm bệnh, Bệnh viện Nhi Trung Ương,.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, phòng Quản lý tổng hợp, ThS. Bùi

Hải Hà, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về

mọi mặt, hỗ trợ tôi thực hiện các thủ tục cần thiết để tôi có thể hoàn thành chương

trình học tập và nghiên cứu của nghiên cứu sinh.

Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và người thân đã ở bên tôi

chăm sóc, động viên, giúp tôi yên tâm học tập và nghiên cứu.

Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài thuộc các hướng KHCN ưu

tiên cấp Viện Hàn lâm KHCNVN “Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở

bệnh nhân tự kỷ Việt Nam” VAST02.02/15-16. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ

quý báu của Viện Hàn lâm KHCNVN.

Tác giả luận án

Nguyễn Thu Hiền

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác

với các cộng sự khác.

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã

được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho

phép của các đồng tác giả.

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận án

Nguyễn Thu Hiền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i

LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................. vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. x

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4

1.1. Bệnh tự kỷ ......................................................................................................... 4

1.1.1. Giới thiệu bệnh tự kỷ ......................................................................................... 4

1.1.2. Thực trạng bệnh tự kỷ ........................................................................................ 5

1.2. Phân biệt, chẩn đoán hội chứng tự kỷ ............................................................ 9

1.2.1. Hội chứng Asperger ......................................................................................... 10

1.2.2. Hội chứng Rett ................................................................................................. 11

1.2.3. Rối loạn tan rã thời thơ ấu ................................................................................ 12

1.2.4. Rối loạn phát triển lan toả không xác định ...................................................... 12

1.2.5. Phương pháp chẩn đoán và điều trị .................................................................. 12

1.3. Các yếu tố di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ ........................................... 15

1.3.1. Các hội chứng di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ .......................................... 15

1.3.2. Những yếu tố gây bệnh ở cấp độ di truyền học ............................................... 17

1.4. Các tiến bộ nghiên cứu về di truyền của rối lo n phổ tự kỷ bằng giải

tr nh tự gen thế hệ mới .................................................................................. 23

iii

1.4.1. Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới ........................................................ 23

1.4.2. Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa trong nghiên cứu di truyền bệnh tự

kỷ ...................................................................................................................... 26

1.4.3. Giải trình tự toàn bộ hệ gen trong nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ ................ 32

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 33

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................... 33

2.2. Hóa chất và trang thiết bị .............................................................................. 33

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 35

2.3.1. Tách chiết DNA tổng số................................................................................... 35

2.3.2. Tạo thư viện DNA ............................................................................................ 36

2.3.3. Giải trình tự gen bằng máy Illumina ................................................................ 38

2.3.4. Tiền xử lý số liệu và phân tích dữ liệu ............................................................. 38

2.3.5. Nhân gen bằng kĩ thuật PCR ............................................................................ 43

2.3.6. Giải trình tự gen tự động trên máy Sanger ....................................................... 43

2.3.7. Phân tích các gen trong mối tương tác ............................................................. 44

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................. 46

3.1. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................. 46

3.2. Giải tr nh tự toàn bộ vùng mã hóa ............................................................... 47

3.2.1. Kết quả tạo thư viện DNA ............................................................................... 47

3.2.2. Kết quả giải trình tự gen trên máy Illumina ..................................................... 47

3.3. Xác định biến thể di truyền ở bệnh nhân tự kỷ .......................................... 51

3.3.1. Xác định và chú giải biến thể ........................................................................... 51

3.3.2. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T01 ................................................................. 53

3.3.3. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T02 ................................................................. 56

3.3.4. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T03 ................................................................. 62

3.3.5. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T06 ................................................................. 65

3.3.6. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T07 ................................................................. 73

3.3.7. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T08 ................................................................. 79

3.3.8. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T09 ................................................................. 83

3.4. Các gen nh y cảm với ASD có liên quan đến kênh ion .............................. 86

3.5. SNP RS7725785 trên gen HTR4 .................................................................... 88

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ ....................................................................... 89

4.1. Xác định và chú giải biến thể ........................................................................ 89

4.2. Các gen liên quan đến biểu hiện bệnh đặc trƣng của ASD ........................ 91

4.3. Các gen nh y cảm với ASD có liên quan đến kênh ion .............................. 97

4.4. Gen RYR2, RYR3 .......................................................................................... 101

4.5. Gen MUC16 .................................................................................................. 103

4.6. Đa h nh rs7725785 trên gen HTR4 ............................................................. 106

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 110

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN .......................................................................................... 112

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH .......................................................... 113

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 120

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tiếng Anh Tiếng Việt Chữ viết tắt

ADI-R: The Autism Diagnostic Interview - Revised Bảng phỏng vấn chẩn đoán tự kỷ có điều chỉnh

ADOS The Autism Diagnostic Observation Schedule Bảng quan sát chẩn đoán tự kỷ

ASD Autism Spectrum Disorders Rối loạn phổ tự kỷ

cụ gióng hàng BWA Burrows - Wheeler Alignment Tool Công Burrows-Wheeler

CARS Childhood Autism Rating Scale Thang chẩn đoán tự kỷ tuổi ấu thơ

CDC Centers For Disease Control Trung tâm kiểm soát dịch bệnh

CHAT Check - list for Autism in Toddlers Bảng kiểm tra sàng lọc tự kỷ ở trẻ nhỏ chập chững biết đi

CNVs Copy number variants Biến thể đa hình số lượng bản sao

CS Cowden syndrome Hội chứng Cowden

DBC-P Developmental Behavior Checklist for Parent Bảng câu hỏi phát triển hành vi cho bố mẹ

dbSNP The Single Nucleotide Polymorphism Database Ngân hàng dữ liệu đa hình đơn nucleotide

DSM Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorder Cẩm nang chẩn đoán và thống kê về chứng rối loạn tâm thần

FXS Fragile X Hội chứng X dễ gãy

tự kỷ GARS Gilliam Autism Rating Scale Thang đánh giá Gilliam

GATK Genome Analysis Toolkit Công cụ phân tích hệ gen

HDAC1 Histone deacetylase 1. Dữ liệu đột biến gen người

ICD International Classification of Diseases Phân loại quốc tế về bệnh tật

IGV Integrated Genomics Viewer Công cụ xem hệ gen hợp nhất

ID Intellectual disability Khuyết tật trí tuệ

M-CHAT Modifier Check-list Autism in Toddlers Bảng sàng lọc tự kỷ ở trẻ nhỏ chập chững biết đi có sửa đổi

MECP2 Chromatin architecture genes Các gen cấu trúc chromatin

for Biotechnology NCBI National Center Information Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học

NHGRI National Human Genome Research Institute Viện Nghiên cứu quốc gia về gen người

NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới

PDD- NOS Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified Rối loạn phát triển lan tỏa không xác định

PDD Pervasive developmental disorders Rối loạn phát triển lan tỏa

PL- ADOS The Pre - linguistic Autism Diagnostic Observation Schedule Bảng quan sát chẩn đoán tự kỷ dành cho trẻ chưa biết nói

SAM Sequence Alignment / Map Sắp xếp/gióng hàng trình tự

SBL sequencing by ligation Giải trình tự bằng ghép nối

SBS sequencing by synthesis Giải trình tự bằng tổng hợp

TS Tuberous Sclerosis Bệnh xơ cứng não củ

WES Whole exome sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gen mã hóa

vii

WGS Whole Genome Sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gen

DANH MỤC BẢNG

Thông tin các mẫu bệnh nhân và gia đình nghiên cứu............ 33 Bảng 2.1.

Trình tự đoạn oligonuleotide.................................................... 34 Bảng 2.2.

Chất lượng DNA tổng số.......................................................... 46 Bảng 3.1.

Bảng thông tin chất lượng đọc của các mẫu giải trình tự......... 49 Bảng 3.2.

Bảng 3.3. Kết quả gióng hàng của các mẫu giải trình tự với hệ gen tham chiếu................................................................................ 50

51 Bảng 3. 4. Kết quả xác định và chú giải biến thể......................................

Số lượng biến thể sau các bước lọc của 07 bệnh nhân............. 52 Bảng 3.5.

Bảng 3.6. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T01................................................................................... 53

Bảng 3.7. Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T01............................................................................................ 55

56 Bảng 3.8. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T02..................................................................................

Bảng 3.9. Thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T02........................................................................................... 59

Bảng 3.10. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T03................................................................................... 62

Bảng 3.11. Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T03........................................................................................... 64

67 Bảng 3.12. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T06..................................................................................

68 Bảng 3.13. Bảng thống kê biến thể của bệnh nhân T06.............................

74 Bảng 3.14. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T07...................................................................................

viii

Bảng 3.15. Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T07............................................................................................ 76

80 Bảng 3.16. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T08...................................................................................

Bảng 3.17. Bảng thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T08............................................................................................ 82

Bảng 3.18. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T09.................................................................................. 83

Bảng 3.19. Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T09........................................................................................... 85

Bảng 4.1. Tổng kết các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở 07 bệnh nhân.......................................................................................... 91

Bảng 4.2. Một số đa hình liên quan đến ASD được công bố trên thế giới 109

DANH MỤC HÌNH

Tỷ lệ bệnh tự kỷ ở một số nước phát triển trên thế giới.......... 6 Hình 1.1.

Hình 1.2. Tỷ lệ tự kỷ ở Việt Nam so với các nước trong khu vực Châu Á............................................................................................. 8

Tình hình bệnh tự kỷ ở Việt Nam........................................... 9 Hình 1.3.

25 Hình 1.4. Lịch sử nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ từ năm 1975 đến năm 2015

Sơ đồ nghiên cứu..................................................................... 36 Hình 2.1.

Quy trình tạo thư viện DNA................................................... 37 Hình 2.2.

Hình 2.3. Sơ đồ phân tích dữ liệu giải trình bằng các phần mềm tin sinh chuyên sâu...................................................................... 39

Kết quả tách DNA tổng số từ mẫu máu toàn phần................ 46 Hình 3.1.

Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện DNA........................... 47 Hình 3.2.

Hình ảnh minh họa file kiểm định chất lượng....................... 48 Hình 3.3.

Chất lượng dữ liệu của FastQ của các mẫu............................. 49 Hình 3.4.

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T01............................. 54 Hình 3.5.

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T02............................ 57 Hình 3.6.

Hình 3.7.

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Ala2224Ser trên gen MUC16 ở bệnh nhân T02........................................................................................... 61

Hình 3.8. p.Trp13569Cys bệnh thể ở Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến nhân T02.......................................................................................... 61

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T03............................ 63 Hình 3.9.

Hình 3.10. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Val2430Ala trên gen MUC16 ở bệnh nhân T03........................................................................................... 65

67 Hình 3.11. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T06............................

Hình 3.12. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Leu13171Phe trên gen MUC16 ở bệnh nhân T06.......................................................................................... 69

Hình 3.13. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Glu12869Lys trên gen MUC16 ở bệnh nhân T06.......................................................................................... 69

Hình 3.14 Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger cho phát hiện biến thể p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys trên gen RYR3 ở bệnh nhân T06..................................................................... 71

Hình 3.15. Mô hình mô phỏng cấu trúc 3D của đột biến p.L111P và p.R3048C ở bệnh nhân T06.................................................... 71

72 Hình 3.16. Vị trí 5 domain đầu tiên của protein RYR3............................

73 Hình 3.17. Trình tự amino acid của RYR3 ở các loài khác nhau.............

75 Hình 3.18. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T07............................

Hình 3.19. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Val13167Met trên gen MUC16 ở bệnh nhân T07.......................................................................................... 76

Hình 3.20. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện trên gen RYR2 ở bệnh nhân biến thể p.Arg801Cys T07.......................................................................................... 77

thể p.Tyr819Cys Hình 3.21. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07.......................................................................................... 77

Hình 3.22. Mô hình mô phỏng cấu trúc đột biến p.Arg801Cys và p.Tyr819Cys ở bệnh nhân T07............................................... 78

Trình tự amino acid của RYR2 ở các loài khác nhau............. 79 Hình 3.23

81 Hình 3.24. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T08............................

Hình 3.25. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Trp13569Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T08.......................................................................................... 82

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T09........................... 84 Hình 3.26.

Hình 3.27. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Ala2224Ser trên gen MUC16 ở bệnh nhân T09........................................................................................... 85

87 Hình 3.28. Các họ kênh ion và các gen liên quan.....................................

Hình 3.29. Đa hình c.507+53G>T trên gen HTR4 ở BN T01, T07, T08, T09........................................................................................... 88

xii

Vai trò của gen HTR4.............................................................. 107 Hình 4. 1

MỞ ĐẦU

Tự kỷ (ASD) thuộc một nhóm các rối loạn một rối loạn phát triển, không đồng

nhất về mặt di truyền. Bệnh nhân tự kỷ thường có biểu hiện khiếm khuyết về tương

tác xã hội, khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành vi, sở thích và

hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Một số bệnh thường thấy đi kèm với

ASD bao gồm rối loạn lo âu, rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa và các phản ứng bất

thường gây kích thích cảm giác. Ước tính mới nhất cho thấy rằng ASD ảnh hưởng

đến khoảng 1 trong 59 trẻ em dưới 8 tuổi và tỷ lệ mắc bệnh ở bé trai chiếm ưu thế

so với bé gái.

Bệnh được cho là có nguy cơ di truyền do ảnh hưởng đồng thời bởi nhiều biến

thể gen khác nhau. Trong những nghiên cứu ở các cặp song sinh, sự đồng nhất kiểu

hình của ASD ở những cặp song sinh cùng trứng chiếm 70-90%, trong khi tỉ lệ này

ở những cặp song sinh khác trứng chỉ 0-30%. Các nghiên cứu cho thấy rằng, anh

chị em trong cùng một gia đình có một bệnh nhân mắc bệnh thì nguy cơ mắc bệnh

trong gia đình lên tới 25%, cao hơn nhiều so với nguy cơ mắc bệnh của dân số nói

chung. Trong số những rối loạn tâm thần và thần kinh có tính di truyền, tự kỷ chiếm

tỷ lệ cao lên tới 40-80%. Sự tương tác yếu tố môi trường với yếu tố di truyền gây ra

những thay đổi bất thường trong sự phát triển tế bào thần kinh, phát triển trí não.

Trong nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ, đã có nhiều phương pháp được áp

dụng như FISH, Microarrya, aCGH. Tuy nhiên, đối với con người, trí tuệ là một

tính trạng cực kỳ phức tạp do nhiều gen quy định. Vì vậy, nghiên cứu ảnh hưởng

của thay đổi các gen liên quan đến trí tuệ, dẫn đến thiểu năng trí tuệ cũng như tự kỷ

cần được tiến hành ở toàn bộ hệ gen, nhất là vùng mã hóa (exome). Đây là hai

phương pháp nghiên cứu đã và đang đạt được nhiều bước tiến nhảy vọt trong

nghiên cứu di truyền bệnh này. Giải trình tự vùng mã hóa - Whole exome

sequencing (WES) là một ứng dụng của công nghệ giải trình tự thế hệ mới để xác

định các biến thể trên tất cả các vùng mã hóa trong hệ gen. Hàng chục nghìn biến

thể gen có thể được xác định trên exome trong nhiều bệnh phức tạp như: tim mạch,

thần kinh,... WES đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu lâm sàng vài năm

gần đây. Do đó, WES đang được coi là hướng đi đúng đắn để nghiên cứu di truyền

bệnh tự kỷ.

Tại Việt Nam, bệnh tự kỷ cũng có xu hướng tăng nhanh và cũng chưa có

phương pháp chữa trị triệt để, mà chỉ có các phương pháp hỗ trợ, cải thiện tình hình

bệnh. Đặc biệt, tại Việt Nam, các nghiên cứu di truyền bệnh còn rất hạn chế. Xuất

phát từ những thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu phát hiện các biến thể ở một số

bệnh nhân tự kỷ Việt Nam bằng phƣơng pháp giải tr nh tự toàn bộ vùng mã

hóa (exome)” được thực hiện nhằm góp phần phát hiện và làm sáng tỏ nguyên nhân

gây bệnh tự kỷ ở người Việt Nam. Nghiên cứu này sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu

di truyền học giải thích được cơ chế gây bệnh và các bác sĩ lâm sàng có thêm hướng

điều trị bệnh hiệu quả, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống.

Mục tiêu của đề tài

1. Giải trình tự và phân tích toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở một số bệnh nhân

tự kỷ Việt Nam.

2. Xác định các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở một

số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu:

1. Sàng lọc bệnh nhân tự kỷ.

2. Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân và gia đình.

3. Giải trình tự toàn bộ exome của một số bệnh nhân tự kỷ tự Việt Nam.

4. Phân tích số liệu tìm các biến thể di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ ở một số

người Việt Nam.

Những đóng góp mới của luận án:

1. Đưa ra số liệu các biến thể mới ở 07 người bệnh tự kỷ Việt Nam.

2. Xác định 02 biến thể mới (p.L111P và p.R3048C) trên gen RYR3 ở 01 bệnh

nhân.

3. Xác định 02 biến thể mới (p.R801C và p.W819C) trên gen RYR2 ở 01 bệnh

nhân.

4. Xác định 06 biến thể mới trên gen MUC16 (p.A2224S; p.W13569C;

p.Val13167Met; p.L13171F; p.E12869K; p.D13229E) ở 06 bệnh nhân.

5. Xác định đa hình rs7725785c.507+53G>T trên gen HTR4 ở 04 bệnh nhân.

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. BỆNH TỰ KỶ

1.1.1. Giới thiệu bệnh tự kỷ

Tự kỷ là một dạng rối loạn trong Rối Loạn Phát Triển Lan Toả (Rối Loạn Phổ

Tự Kỷ). Bệnh khởi phát sớm trong 3 năm đầu tiên của cuộc đời. Tự kỷ tác động đến

sự phát triển của trẻ trong 3 lĩnh vực chính đó là: tương tác xã hội, ngôn ngữ và

hành vi. Tự kỷ hay rối loạn phổ tự kỷ là một nhóm các hội chứng không đồng nhất

về mặt di truyền.

Bệnh nhân tự kỷ biểu hiện ra ngoài bằng những khiếm khuyết về tương tác xã

hội, khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động

mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Hiện tượng này bao gồm nhiều biểu hiện khác

nhau, ví dụ như người bệnh hay có hành động quay cổ tay, quay đầu hay có những

hành động có tính bắt buộc như xếp đồ chơi, búp bê, ô tô thành một hàng ngang

hoặc dọc. Nguy hiểm nhất chính là bệnh nhân hay tự làm mình bị thương như: lấy

tay chọc lên mắt, cấu lên da, tự đánh vào tay và đầu. Một dấu hiệu nữa là trẻ mắc

bệnh thường có khả năng đi lại chậm hơn nhiều so với trẻ khác, phải mất 2-3 năm

tuổi mới đi lại bình thường được. Khả năng giao tiếp bằng mắt của trẻ không tốt và

bệnh nhân thường có thái độ hờ hững với mọi thứ xung quanh.

Ngoài những triệu chứng lâm sàng cổ điển cụ thể, khoảng 31% bệnh nhân bị

khuyết tật trí tuệ, 20-25% có triệu chứng co giật (Canitano, 2007; Liu and Takumi ,

2014; Srivastava and Schwartz, 2014). Một số bệnh thường thấy đi kèm với ASD

bao gồm rối loạn lo âu (White et al, 2009), rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa

(Valicenti-McDermott et al, 2006) và các phản ứng bất thường gây kích thích cảm

giác (Rogers et al, 2003). Các triệu chứng chính của ASD thường xuất hiện sớm,

khoảng 6 tháng tuổi và thể hiện rõ khoảng năm 2-3 tuổi. Bệnh gặp phổ biến ở bé

trai nhiều hơn bé gái, với tỷ lệ khoảng 4:1 (Baio et al, 2018). Bệnh tự kỷ là bệnh có

cơ sở di truyền rất phức tạp do sự tương tác của nhiều gen. Sự tương tác của gen với

môi trường hay những yếu tố ngoại cảnh khác không làm biến đổi DNA nhưng ảnh

hưởng đến biểu hiện gen. Cơ sở di truyền của bệnh được đề xuất có liên quan đến

sự ảnh hưởng kết hợp của các biến thể khác nhau (Inoue et al, 2015). Trong những

nghiên cứu ở những cặp song sinh, sự đồng nhất kiểu hình của ASD ở những cặp

song sinh cùng trứng chiếm 70-90%, trong khi tỉ lệ này ở những cặp song sinh khác

trứng chỉ 0-30% (Rosenberg et al, 2009; Ronald and Hoekstra, 2014). Các nghiên

cứu cho thấy rằng, anh chị em trong cùng một gia đình có một bệnh nhân mắc bệnh

thì các thành viên còn lại có nguy cơ mắc cao hơn so với dân số nói chung khoảng

25%. Trong những rối loạn tâm thần và thần kinh có tính di truyền, tự kỷ chiếm tỷ

lệ cao lên tới 40-80% (Chahrour et al, 2012). Có nhiều cách giải thích khác nhau về

sự tăng tỷ lệ trẻ mắc bệnh tự kỷ trên thế giới hàng năm. Gần đây, một số nhà khoa

học cho rằng các bà mẹ mang thai đã tiếp xúc với ô nhiễm hóa chất, đặc biệt là kim

loại và thuốc trừ sâu, sự tiếp xúc này làm biến đổi sự phát triển cấu trúc não của trẻ

dẫn đến bị bệnh tự kỷ. Yếu tố môi trường cũng có những tương tác với yếu tố di

truyền và gây ra những thay đổi bất thường trong sự phát triển tế bào thần kinh và

phát triển trí não (Elif et al, 2016).

1.1.2. Thực tr ng bệnh tự kỷ

1.1.2.1.Thực trạng bệnh tự kỷ trên thế giới

Những nghiên cứu từ trước năm 1985 về tỷ lệ mắc bệnh tự kỷ cho thấy có

khoảng 5 trường hợp trong số 1000 trẻ em. Từ những năm 1980, số ca mắc bệnh

được chẩn đoán tăng lên với tốc độ nhanh chóng. Kết quả này một phần là do

những tiến bộ của y học trong chẩn đoán và một phần là do chính phủ cũng đã đầu

tư nhiều hơn vào lĩnh vực y tế đặc biệt là những bệnh liên quan đến thần kinh

(Blumberg, 2007).

Các đánh giá thống kê cho thấy tỉ lệ mắc ASD trên thế giới ở các nước khác

nhau là khác nhau. Năm 2006, theo thống kê của Williams và cộng sự, tỷ lệ ASD

trên toàn cầu là 20/10.000 (Williams et al, 2006). Đến năm 2012, Elsabbagh và

nhóm nghiên cứu của mình đã báo cáo tỷ lệ mắc ASD trên thế giới là 62/10.000, tức

là cứ 160 trẻ thì có 1 trẻ mắc bệnh (Elsabbagh et al, 2012).

Hình 1.1 Tỷ lệ bệnh tự kỷ ở một số nƣớc phát triển trên thế giới

(Nguồn: Trung tâm kiểm soát và Phòng chống bệnh - CDC, 2015)

Tỷ lệ bệnh năm 2015 theo thống kê của Baxter và cộng sự đã có sự gia tăng

đáng kể, ước tính khoảng 7,6/1000, tức là trong 132 người thí có 1 người mắc ASD

(Baxter et al, 2015). Trung tâm Kiểm soát và Phòng chống bệnh (CDC) ở Mỹ đã

đưa ra tỷ lệ trẻ mắc những rối loạn thần kinh trên toàn cầu năm 2014 là 1% (CDC,

2014). Hiện nay, có hơn 3,5 triệu người Mỹ mắc bệnh tự kỷ, ước tính 1/68 trẻ em

được chẩn đoán mắc bệnh (CDC, 2014). Như vậy, tỷ lệ tự kỷ ở trẻ em ở Hoa Kỳ

tăng 119,4% so với năm 2000 (1/150) đến năm 2010 (1/68) (CDC, 2014) (Hình

1.1). Vì thế, tự kỷ được đánh giá là chứng khuyết tật có tỷ lệ phát triển nhanh nhất

(CDC, 2008). Điều này dễ dàng được giải thích bởi lối sống ngày càng thực dụng

tại Mỹ. Bên cạnh Mỹ, Anh cũng là một nước có tỷ lệ tự kỷ ở mức cao (xấp xỉ 1%)

(Brugha et al, 2011). Ngoài Anh và Mỹ có tỷ lệ mắc tự kỷ cao, bệnh cũng có mặt ở

nhiều quốc gia trên thế giới. Do tỷ lệ trẻ tự kỷ gia tăng nhanh chóng đang đặt ra

những vấn đề lớn đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Tại Mỹ, tự kỷ được xếp vào

danh mục 13 dạng khuyết tật bẩm sinh và vấn đề trẻ tự kỷ đã được khẳng định là

một trong những ưu tiên hàng đầu trong chính sách y tế của nước này.

Tại một số nước ở châu Á hiện nay như Hàn Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Trung

Quốc, vấn đề tự kỷ cũng đã được các nhà khoa học và xã hội đặc biệt quan tâm.

Trước năm 1980, bệnh tự kỷ không được công nhận tại Trung Quốc, ước tính tỷ lệ

tự kỷ là 11,8 / 10.000 người, trong khi tỷ lệ hiện mắc của bệnh tự kỷ là 26,6 /

10.000 người. Ở Nhật Bản, gần đây ước tính tỷ lệ tự kỷ là 13/10.000 người. Điều

này cho thấy chứng tự kỷ là phổ biến ở châu Á hơn nhiều so với những thống kê

trên thế giới trước đây (Sun and Allison, 2010; Sun et al, 2013). Thang đo hành vi

tự kỷ Clancy (CABS), Danh mục kiểm tra hành vi tự kỷ (ABC) và Danh sách Kiểm

tra cho Tự kỷ ở trẻ vị thành niên (CHAT) thường được sử dụng làm công cụ chẩn

đoán ở Trung Quốc (Sun et al, 2013). Tại châu Á, 2 tác giả Sun và Allison đã tiến

hành một cuộc khảo sát tại sáu nước, loại trừ các nước Nam Á, cho thấy tỷ lệ hiện

mắc ASD từ năm 1980 đến nay là 14,8/10.000 (Sun and Allison, 2010). Tuy nhiên,

nhận thức về ASD ở khu vực này còn thiếu đầy đủ, thậm chí không chính xác gây

nên hệ lụy trong đời sống xã hội và các vấn đề hỗ trợ. Nhìn chung, Mỹ là quốc gia

duy nhất trên thế giới có sự đánh giá, thống kê và báo cáo tình hình tự kỷ ở trong

nước. Tuy vậy, với mức độ tăng nhanh của bệnh, các số liệu của Mỹ cũng cần được

cập nhật thường xuyên hơn.

Theo thống kê, tỷ lệ bệnh ở các nước phát triển có sự chênh lệch khá lớn. Điều

này có thể giải thích bởi các nguyên nhân sau: Thứ nhất, các quốc gia không tích

cực theo dõi hoặc không công khai số liệu của họ. Thứ hai, không có một tiêu chuẩn

thống nhất để đánh giá chứng tự kỷ. Hoặc nếu có, thì vấn đề nguồn lực để thực hiện

việc này cũng là vấn đề đáng lo ngại.

1.1.2.2. Thực trạng bệnh tự kỷ tại Việt Nam

Thuật ngữ ―Tự kỷ‖ được sử dụng ở Việt Nam vào cuối năm 1990 và đầu

những năm 2000, ca bệnh đầu tiên được ghi nhận vào năm 1997-1998. Từ đó đến

nay số trẻ được chẩn đoán và điều trị chứng tự kỷ tại các cơ sở y tế công lập và cả

tư lập ngày càng tăng, năm sau cao hơn năm trước. Theo báo cáo của khoa tâm thần

bệnh viện Nhi Trung ương, số trẻ mắc tự kỷ được chẩn đoán trong các năm 2008,

2010, 2011 lần lượt là 450, 1792, 1968 (Quách Thúy Minh, 2011; Khoa tâm thần,

2012; Vu SH et al, 2014; Vu SH et al, 2017)

Theo thống kê của một số tổ chức nước ngoài, tỷ lệ bệnh tự kỷ ở Việt Nam là

75,1 tính trên 100.000 người (http://global-disease-burden.healthgrove.com) (Hình

1.2). Tuy nhiên con số này còn chưa phản ánh chính xác thực tế vì số liệu bệnh

nhân tự kỷ tại Việt Nam chưa được cập nhật đầy đủ và thường xuyên. Và điều đáng

nói là sự nhận thức về bệnh của người dân Việt Nam còn chưa cao, đặc biệt là ở

những vùng nông thôn. Do đó, số cha mẹ đưa con đến bệnh viện chẩn đoán bệnh

còn chưa đầy đủ.

Tại thành phố Hồ Chí Minh, năm 2000 chỉ có 2 trẻ đến Bệnh viện Nhi đồng 1

khám và điều trị chứng tự kỷ, thì năm 2008 số trẻ đến khám là 324, tăng hơn 160

lần. Song những năm gần đây, số lượt trẻ đến khám tại Khoa Tâm thần (Bệnh viện

Nhi Trung ương) được chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ hay có dấu hiệu tự kỷ ngày

càng gia tăng (Đậu Tuấn Nam and Vũ Hải Vân, 2015).

Hình 1.2 Tỷ lệ tự kỷ ở Việt Nam so với các nƣớc trong khu vực Châu Á

(Nguồn: http://global-disease-burden.healthgrove.com/)

Theo báo cáo của bệnh viện Nhi Trung ương, số trẻ đến khám muộn và được

chẩn đoán mắc bệnh tự kỷ vẫn còn tỷ lệ rất cao (43,86% trên 36 tháng tuổi). Số liệu

thống kê của Khoa Tâm bệnh (Bệnh viện Nhi Trung ương) cũng cho thấy, có sự

chênh lệch đáng kể giữa tỷ lệ mắc bệnh ở bé trai và bé gái (bé trai nhiều hơn 4-6 lần

so với bé gái), ở thành thị mắc bệnh nhiều hơn ở nông thôn. Thông tin này phần nào

cho thấy, vấn đề nhận thức của người dân về bệnh rất quan trọng trong việc phát

hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh sớm.

Theo thống kê của Bệnh viện Nhi trung ương ghi nhận năm 2007 có khoảng

405 trường hợp thì đến năm 2015 đã ghi nhận có khoảng 200.000 trường hợp (Hình

1.3). Điều này cho thấy, tình hình trẻ mắc bệnh tự kỷ ngày càng tăng gây gánh nặng

và thách thức không nhỏ cho gia đình và xã hội. Đặc biệt, khi những người tự kỷ

trưởng thành sẽ làm thế nào để hoà nhập xã hội và làm cách nào để hạn chế mức độ

gia tăng cũng như có phương án điều trị cho những người đã mắc bệnh.

Hình 1.3 T nh h nh bệnh tự kỷ ở Việt Nam

(Nguồn: Bệnh viện Nhi trung ương, 2015)

1.2. PHÂN BIỆT CHẨN ĐOÁN HỘI CHỨNG TỰ KỶ

Tự kỷ là một trong năm rối loạn phát triển lan tỏa (PDD). Hội chứng này là do

sự bất thường của não bộ, xuất hiện sớm trong những năm đầu đời của trẻ em. Với

những biểu hiện đặc trưng ở các lĩnh vực: kém tương tác xã hội, bất thường về ngôn

ngữ, giao tiếp và hành vi.

Có rất nhiều cách phân loại khác nhau, cũng như mức độ khác nhau của bệnh

tự kỷ:

- Tự kỷ mức độ nhẹ: là trẻ có thể giao tiếp bằng mắt tương đối bình thường,

giao tiếp với người ngoài hạn chế, học được các hoạt động đơn giản, kỹ năng chơi

và nói được tương đối bình thường.

- Tự kỷ mức độ trung bình: là trẻ có thể giao tiếp bằng mắt, giao tiếp với

người ngoài hạn chế và nói được nhưng hạn chế.

- Tự kỷ mức độ nặng: là trẻ không giao tiếp bằng mắt, không giao tiếp và

không nói được.

Trước đây thuật ngữ ―tự kỷ‖ không thấy xuất hiện trong y khoa, nhưng đến

năm 1943 một nhà tâm thần học người Áo tên là Leo Kanner đã mô tả một nhóm 11

trẻ có những biểu hiện phát triển không bình thường như: có những khiếm khuyết

về tương tác xã hội, khiếm khuyết trong quá trình phát triển ngôn ngữ, có những

hành vi kỳ lạ lặp đi lặp lại nhiều lần, khởi phát sớm trước 3 tuổi và khái niệm ―tự

kỷ‖ được ra đời từ đó.

Ngày nay, người ta dùng thuật ngữ ―Rối loạn phát triển lan tỏa‖ hoặc ―Rối

loạn phổ tự kỷ‖ để mô tả các trẻ em có các rối loạn phát triển trên 3 lĩnh vực chính

là: tương tác xã hội, rối loạn ngôn ngữ và hành vi. Rối loạn phát triển lan tỏa gồm

có 5 rối loạn chính: hội chứng Asperger, hội chứng rối loạn tan rã tuổi ấu thơ, hội

chứng Rett, hội chứng rối loạn lan tỏa không xác định và hội chứng tự kỷ.

1.2.1. Hội chứng Asperger

Hội chứng Asperger được đặt theo tên của bác sĩ nhi khoa người Áo Hans

Asperger vào năm 1944 khi ông mô tả nhóm trẻ em trong nghiên cứu của mình với

những biểu hiện: thiếu giao tiếp, kém hiểu biết về những cảm xúc của người khác

và thể chất yếu. Ngày nay, hội chứng Asperger được đặc trưng bởi sự tách biệt về

mặt xã hội và các hành vi kỳ cục khi trẻ khi còn nhỏ. Có những khiếm khuyết trong

tương tác xã hội và giao tiếp không lời. Thể hiện một số hành vi đơn điệu, định

hình, lặp lại; Khó khăn trong tiếp thu và lĩnh hội hành vi phi ngôn ngữ như vẻ mặt,

tư thế, tiếp xúc mắt, điệu bộ; Yếu kém trong việc hiểu và thể hiện cảm xúc

(Hamilton, 2000). Mặc dù tuân theo các qui tắc ngữ pháp, nhưng cách nói của trẻ

nghe có vẻ lập dị do sự bất thường ở âm điệu và các khuôn mẫu lặp đi lặp lại. Sự

vụng về có thể dễ nhận thấy ở cách phát âm rõ ràng và các hành vi vận động thô.

Mặc dù các dấu hiệu bất thường xuất hiện sớm từ trước năm 2 tuổi, nhưng lại kéo

dài đến hết cuộc đời (Baskin et al, 2006; McPartland, 2006). Trẻ bị Asperger

thường có trí nhớ rất tốt, có trí tuệ trung bình hoặc trên trung bình. Trẻ có khả năng,

sở thích về kĩ thuật và toán học. Hội chứng Asperger khác tự kỷ là không chậm

hoặc trì trệ trong phát triển trí tuệ, ngôn ngữ và nhận thức. Ước tính hiện năm 2015

số lượng bệnh nhân mắc Asperger lên đến 37,2 triệu người trên toàn cầu

(Collaborators, 2016) và con số này vẫn đang ngày càng tăng lên.

1.2.2. Hội chứng Rett

Hội chứng này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1966 bởi một bác sĩ nhi ở

Vienna, Andreas Rett. Tuy nhiên, các bài viết của bác sĩ này bằng tiếng Đức nên

bệnh không được công nhận rộng rãi (Percy, 2014). Đến năm năm 1983, Bengt

Hagberg- một bác sĩ nhi khoa người Thụy Điển xuất bản một bài báo tiếng Anh mô

tả bệnh này và đặt tên bệnh là Rett. Đột biến gây ra bệnh này được công bố lần đầu

tiên vào năm 1999 bởi bác sĩ người Mỹ Li-băng, Huda Zoghbi (Amir et al, 1999).

Hiện nay, bệnh này ảnh hưởng đến khoảng 1 trong 8.500 phụ nữ.

Không như tự kỷ xuất hiện ở bé trai nhiều gấp bốn lần bé gái, rối loạn Rett chỉ

ảnh hưởng đến bé gái. Các bé trai mắc hội chứng này sẽ chết trước sinh. Các dấu

hiệu của bệnh thường thấy rõ rệt sau 6 đến 18 tháng. Các triệu chứng bao gồm các

vấn đề về ngôn ngữ, phối hợp và các chuyển động lặp đi lặp lại. Các biến chứng có

thể bao gồm động kinh, chứng vẹo cột sống, và các vấn đề về giấc ngủ. Tuy nhiên,

những người bị ảnh hưởng có thể bị ảnh hưởng ở mức độ khác nhau (Percy, 2014).

Trẻ bị mất những kỹ năng tinh tế của bàn tay mà trước đây trẻ đã đạt được, thay vào

đó là những vận động định hình, lặp đi lặp lại; trẻ bị mất tương tác xã hội, các động

tác phối hợp cơ thể đơn điệu và suy giảm nghiêm trọng tính mục đích, mất phối hợp

trong đi đứng và cử động thân thể, ngôn ngữ tiếp thu và thể hiện giảm sút nghiêm

trọng kết hợp với chậm phát triển tâm thần (Hamilton, 2000). Như vậy, điểm giống

nhau giữa hội chứng tự kỷ và hội chứng Rett là đều có những suy giảm về giao tiếp,

ngôn ngữ, quan hệ xã hội, hành vi và chậm phát triển tâm thần. Tuy nhiên, sự khác

nhau liên quan đến tỉ lệ giới tính, thời điểm phát bệnh và chỉ số phát triển vòng đầu,

đồng thời ở hội chứng Rett còn mất đi sự phối hợp các cử động cơ thể mà trước đây

trẻ đã từng đạt được.

1.2.3. Rối lo n tan rã thời thơ ấu

Bệnh này được miêu tả lần đầu tiên vào năm 1908, trước cả bệnh Asperger bởi

một nhà giáo dục người Áo là Theodor Heller. (Mouridsen, 2003). Rối loạn tan rã

thời thơ ấu là bệnh rất hiếm gặp và rất khác so với bệnh tự kỷ, ít nhất là hai năm đầu

đời trẻ phát triển bình thường, sự thoái lùi phát triển xảy ra trước 10 tuổi (Rogers,

2004). Trẻ bị mất đáng kể khả năng hiểu và diễn đạt ngôn ngữ, kém trong kiểm soát

cơ vòng, bàng quang và hậu môn, giảm các kỹ năng vận động, chất lượng giao tiếp

kém, xuất hiện hành vi giới hạn định hình lặp đi lặp lại (Hamilton, 2000). Điểm

khác căn bản với hội chứng tự kỷ là thời gian phát bệnh và những yếu tố sinh học

như mất kiểm soát cơ vòng, bàng quang, hậu môn,…

1.2.4. Rối lo n phát triển lan toả không xác định

Rối loạn phát triển lan toả không xác định là một thuật ngữ khá mơ hồ sử dụng

cho những trẻ không hội đủ các tiêu chuẩn chẩn đoán chuyên biệt. Theo những nhà

tâm thần Mỹ rối loạn này chỉ những bệnh nhân có sự suy giảm trầm trọng và lan tỏa

trong phát triển tương tác xã hội qua lại và những kỹ năng giao tiếp ngôn ngữ và phi

ngôn ngữ (Hamilton, 2000). Khi được chẩn đoán rối loạn phát triển lan tỏa không

xác định, trẻ có những triệu chứng đặc trưng như bệnh tự kỷ hoặc những rối loạn

khác trong rối loạn phát triển lan tỏa. Trẻ bị hội chứng này có một số biểu hiện

giống như trẻ tự kỷ, nhưng không hội đủ các tiêu chí đặc trưng trong chẩn đoán tự

kỷ ví dụ như do tuổi dậy thì muộn, triệu chứng không điển hình, hoặc triệu chứng

dưới ngưỡng, hoặc tất cả những triệu chứng này (Smith et al, 2015).

1.2.5. Phƣơng pháp chẩn đoán và điều trị

Chẩn đoán là một khâu quan trọng giúp xác định bệnh tự kỷ. Kết quả chẩn

đoán là cơ sở để đưa ra quyết định về hình thức can thiệp, chính sách hỗ trợ cho trẻ

và gia đình. Nhà nghiên cứu Dennis Wall tại đại học Harvard (Mỹ) đã đưa ra quy

trình chẩn đoán rất nhanh gọn và có thể thực hiện qua internet. Quy trình này xây

dựng trên các thuật toán, kết hợp với một số công cụ chẩn đoán tự kỷ phổ biến ADI-

R, ADOS (Wall et al, 2012) và một đoạn video ngắn để người cần kiểm tra dễ dàng

được các chuyên giá đánh giá tình trạng qua mạng. Quy trình này có nhiều ưu điểm,

làm rút ngắn thời gian chẩn đoán, kết hợp được với hoạt động hàng ngày của trẻ.

Một nghiên cứu khác của các nhà khoa học tại Viện tâm thần học thuộc đại học

Hoàng Gia Anh (Institute of Psychiatry, King’s College London) đưa ra một xét

nghiệm sinh học đơn giản cho tự kỷ dựatrên cơ sở não người tự kỷ có một sự khác

biệt tinh vi so với người bình thường, do vậy khi quét bộ não bằng máy quét trong

15 phút có thể phân biệt chính xác 90%.

Trên thực tế, quy trình chẩn đoán rối loạn tự kỷ rất phức tạp, mang tính chủ

quan và nhiều vấn đề khác liên quan đến trình độ khoa học kỹ thuật của cơ sở y tế

nơi trẻ đến thăm khám. Các nghiên cứu trên vẫn cần tiếp tục nghiên cứu và hoàn

thiện trong tương lai. Theo tiêu chuẩn của WHO, chẩn đoán cho các rối loạn phát

triển của một trẻ cần năm chuyên gia, theo tiêu chuẩn của Mỹ là sáu chuyên gia,

cùng theo dõi trẻ trong tối thiểu một tháng ở ba môi trường khác nhau (phòng khám

hoặc trung tâm, gia đình và cộng đồng). Một số công cụ chẩn đoán được sử dụng

phổ biến hiện nay như:

CHAT: Bảng câu hỏi kiểm tra sàng lọc tự kỷ ở trẻ nhỏ, được thiết kết bởi

Baron Cohen và cộng sự (1992) để sàng lọc trẻ tự kỷ từ 18 tháng tuổi. CHAT gồm 9

câu hỏi dưới dạng có/không dành cho cha mẹ và 5 câu hỏi cho người quan sát kiểm

tra. Tuy công cụ này chỉ mất 5-10 phút để hoàn thiện và có độ tin cậy cao, nhưng lại

có độ nhạy thấp, trẻ bị tự kỷ nhẹ hoặc không điển hình có thể bị bỏ sót.

M – CHAT 23: Bảng câu hỏi kiểm tra sàng lọc tự kỷ ở trẻ nhỏ có sửa đổi bởi

tác giả Robin, Fein, Baron và Green (Mỹ) năm 2001. M-CHAT 23 có thêm 14 câu

hỏi thuộc các lĩnh vực rối loạn vận động, quan hệ xã hội, bắt chước và định hướng.

Công cụ này hiện được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới và được đánh giá cao về

độ tin cậy và độ nhạy.

CARS: Thang chẩn đoán tự kỷ tuổi ấu thơ, công cụ này gồm các câu hỏi ở 15

lĩnh vực khác nhau, dùng để đánh giá trẻ từ 24 tháng tuổi. CARS còn có nhiều mục

đích khác nhau như để xây dựng chương trình can thiệp sớm, theo dõi định kỳ, đánh

giá hiệu quả can thiệp. Đây là một công cụ kết hợp bởi báo cáo của cha mẹ và quan

sát trực tiếp của các chuyên gia trong khoảng 30-45 phút.

DBC-P: Được hai giáo sư người Úc là Stewart Einfeld và Bruce Tonge xây

dựng năm 1992. Năm 2010 chính tác giả Bruce Tonge đã sang tập huấn sử dụng

cho Khoa Tâm bệnh. Đây là công cụ đánh giá những rối loạn hành vi cảm xúc cho

những trẻ em có vấn đề về trí tuệ và rối loạn phát triển. Bảng này đã được dịch ra

nhiều thứ tiếng và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới.

ADI – R: Bảng phỏng vấn chẩn đoán tự kỷ có điều chỉnh. Đây là công cụ chẩn

đoán tự kỷ thông qua việc tìm hiểu các vấn đề về giao tiếp và ngôn ngữ, kĩ năng xã

hội, chơi và hành vi với các thông tin do cha mẹ cung cấp, được xây dựng trên cơ

sở các tiêu chí của ICD-10 và DSM-IV.

ADOS: Bảng quan sát chẩn đoán tự kỷ, đây là công cụ được thiết kế dưới dạng

các hoạt động, giúp đánh giá các vấn đề giao tiếp, kĩ năng chơi, tương tác xã hội,

hành vi và sở thích của trẻ. Công cụ này được xây dựng trên cơ sở các tiêu chí của

ICD-10 và DSM-IV. Công cụ này ban đầu chỉ dùng chẩn đoán cho trẻ hơn 3 tuổi

nhưng phiên bản cải tiến là PL- ADOS bảng quan sát chẩn đoán tự kỷ dành cho trẻ

chưa có ngôn ngữ nói, được sử dụng cho trẻ nhỏ hơn.

GARS: Thang đánh giá tự kỷ Gilliam được công bố bởi Jam E. Gilliam năm

1995 trên cơ sở nghiên cứu hơn 1107 trẻ tự kỷ tại 48 bang của Mỹ. Công cụ này xây

dựng dựa trên tiêu chí của DSM-IV, gồm 56 câu hỏi trắc nghiệm ngắn gọn, dành

cho đối tượng từ 3 đến 22 tuổi trên các lĩnh vực hành vi, giao tiếp, tương tác xã hội

và các rối loạn phát triển khác.

Tại Việt Nam, chưa có quy trình tiêu chuẩn về chẩn đoán tự kỷ cũng như các

rối loạn phát triển khác. Vì thế, vấn đề phát hiện sớm và điều trị, can thiệp bệnh còn

nhiều thiếu sót. Trên xu hướng gia tăng một cách nhanh chóng của bệnh tự kỷ, cần

có sự đầu tư nghiên cứu về bệnh trên diện rộng ở Việt Nam.

1.3. CÁC YẾU TỐ DI TRUYỀN LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH TỰ KỶ

Bệnh tự kỷ có bản chất di truyền mạnh mẽ, sự di truyền đóng góp lên đến

khoảng 90% khả năng phát sinh bệnh tự kỷ ở trẻ em và được xác định bởi nhiều gen

(Hallmayer et al, 2011). Vì vậy, sự di truyền bệnh rất phức tạp và đến nay vẫn chưa

được nghiên cứu rõ ràng (Abrahams and Geschwind, 2008; Buxbaum, 2009). Thêm

vào đó, cho đến nay những đột biến có nguy cơ gây tự kỷ và rối loạn thần kinh vẫn

chưa được xác định rõ ràng. Những đột biến này có thể là đột biến đơn gen (đột

biến chỉ xảy ra trên một gen) hoặc là những biến đổi bất thường trên nhiễm sắc thể

(NST). Những đột biến NST này gây ra những hội chứng bệnh khác nhau liên quan

đến rối loạn thần kinh (Abrahams and Geschwind, 2008). Nguyên nhân gây bệnh là

do sự thay đổi số lượng bản sao của gen, những thay đổi này có thể là mất đoạn, lặp

đoạn, thêm đoạn, đảo đoạn trên gen hoặc NST (Cook and Scherer, 2008). Con cái

mắc bệnh tuy nhiên bố mẹ vẫn có thể hoàn toàn bình thường, khỏe mạnh được gọi

là người ―mang gen‖ (Beaudet, 2007).

1.3.1. Các hội chứng di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ

Bệnh tự kỷ và thiểu năng trí tuệ thường được tìm thấy trong cả hai hội chứng

Fragile X và bệnh xơ cứng não củ (Curatolo et al, 2010; Krueger and Bear, 2011).

Cả hai hội chứng có cùng một số điểm chung, như cơ chế sinh lý bệnh cơ bản, sự

bất thường của quá trình phiên mã mRNA dẫn đến sự tổng hợp protein tăng lên, các

quá trình này liên quan đến cả hai loại thiểu năng trí tuệ và tự kỷ (Curatolo et al,

2010; Santini et al, 2013). Thực vậy, các đột biến gen mã hóa các protein tham gia

trong cơ chế phân tử điều khiển sự tổng hợp protein khớp thần kinh (FMR1, TSC1 /

2, eIF4E và PTEN) có liên quan chặt chẽ với bệnh tự kỷ (Santiniet al, 2013). Sự

tăng bất thường nồng độ của protein dẻo liên quan đến cung cấp cho các khớp thần

kinh hoạt động trong tế bào thần kinh, có thể ảnh hưởng đến kết nối khớp thần kinh,

tổn hại đến hệ thống thần kinh và suy giảm nhận thức.

1.3.1.1. Hội chứng Fragile X (FXS)

Hội chứng Fragile X (FXS) là do sự lặp lại không ổn định của CGG (> 200 lặp

lại) trong gen FMR1, nằm ở nhiễm sắc thể Xq27.3, tạo ra sự methyl hóa bất thường,

các sao chép câm FMR1 và làm giảm mức độ protein FMRP trong não (Bagni and

Greenough, 2005). FXS chiếm khoảng một nửa các trường hợp chậm phát triển trí

tuệ liên kết với X và là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây chậm phát triển tâm thần

sau Trisomy 21 (Rousseau et al, 1995). Tỷ lệ tự kỷ ở FXS là khoảng 30% và PDD-

NOS xảy ra trong 30% các trường hợp (Hagerman et al, 2010). Sự lặp lại không ổn

định tiền đột biến (55-200 lặp lại của CGG) cũng có thể làm tăng bệnh tự kỷ (ASD),

thông qua một cơ chế phân tử khác liên quan đến ảnh hưởng độc hại trực tiếp của

CGG lặp lại trên mRNA của FMR1. Độc tính RNA cũng có thể tác động ảnh hưởng

tới sự lão hóa muộn hơn, gọi là "hội chứng Fragile X", bao gồm run khi hoạt động,

mất điều hòa và suy giảm nhận thức (Hagerman et al, 2010).

1.3.1.2. Bệnh xơ cứng não củ (TS)

Bệnh xơ cứng não củ (TS) là một bệnh lý thần kinh - da đặc trưng bởi các thay

đổi hamartoma trong não, thận, phổi, da, tim và các cơ quan khác. Bệnh xơ cứng

não củ cũng được biết là bệnh Bourneville, tên một bác sĩ người Pháp đã mô tả

bệnh vào năm 1880. TS là bệnh di truyền bởi gen trội trên NST thường. Biểu hiện

lâm sàng bao gồm động kinh, khó khăn học tập, các vấn đề về hành vi và tổn

thương da (Napolioni and Curatolo, 2008). TS có nguyên nhân là do đột biến bất

hoạt một trong hai gen TSC1 hoặc TSC2 nằm ở các vị trí tương ứng 9q34 và

16p13.3. Những đột biến này bao gồm một loạt các đột biến thay đổi amino acid,

đột biến vô nghĩa, thêm mất nucleotide, liên quan đến gần như tất cả các exon của

gen TSC1 và TSC2 (Napolioni and Curatolo, 2008). Tự kỷ xảy ra thường xuyên hơn

ở những bệnh nhân TS (khoảng gần 30%) (Gutierrez et al, 1998). Các bệnh nhân

mang đột biến TSC2 có mức độ biểu hiện bệnh nghiêm trọng hơn so với người bệnh

mang đột biến TSC1 (Crino et al, 2006). Đột biến khác nhau trong gen TSC2 đã

được mô tả với biểu hiện lâm sàng như động kinh thể nặng, bao gồm sự co giật ở

trẻ, hội chứng Lennox Gastaut, hội chứng West và u tim, bệnh tự kỷ và tâm trạng

rối loạn lo âu (Crino et al, 2006).

1.3.2. Những yếu tố gây bệnh ở cấp độ di truyền học

1.3.2.1. Các biến thể số lượng bản sao (CNVs)

Các biến thể số lượng bản sao (CNVs) là các đoạn DNA khác nhau với kích

thước từ 50 bp tới vài Mb do xóa/thêm đoạn, đảo đoạn, sao chép hoặc tái tổ hợp

phức tạp (Redon et al, 2006). Nghiên cứu ban đầu (Sebat et al, 2007; Christian et al,

2008; Marshall et al, 2008) cho thấy sự gia tăng tần số của CNVs trong quần thể

người ASD so với đối chứng (trung bình 6-10% so với 1-3%, tương ứng). Gần đây,

nhiều bằng chứng cho rằng vị trí CNV và sự phù hợp chức năng của nó có thể đóng

một vai trò quan trọng hơn số lượng và kích cỡ của CNV. Phân tích chức năng của

những thể CNVs hiếm đã cho thấy sự tham gia của các locus trong phát triển khớp

thần kinh, sợi trục và tế bào thần kinh vận động.

Mặc dù hầu hết CNVs là riêng biệt, tuy nhiên hội chứng xóa bỏ đoạn nhỏ

thường gặp cũng đã được xác định (Rajcan-Separovic et al, 2007; Kumar et al,

2008; Liang et al, 2009; Fernandez et al, 2010). Nhìn chung, CNVs có liên quan

đến các đặc điểm lâm sàng, bao gồm dị tật lớn hay nhỏ, biến đổi trên mặt, triệu

chứng thần kinh trầm trọng, tự kỷ thể nặng, rối loạn phổ tự kỷ thần kinh nhẹ, hoặc

thậm chí rối loạn hành vi bên ngoài của phổ tự kỷ. Trên thực tế, phần lớn các CNVs

được di truyền từ bố mẹ, những người này có thể biểu hiện một số đặc điểm tự kỷ,

nhưng không đáp ứng tiêu chí rối loạn tự kỷ. Đáng chú ý, nhiều CNVs tìm thấy ở

những bệnh nhân tự kỷ cũng tìm thấy trong bệnh nhân tâm thần, đặc biệt là thiểu

năng trí tuệ và tâm thần phân liệt.

1.3.2.2. Các gen “khớp thần kinh”- neuroligins, SHANK và neurexins

Một vài gen neurologin, SHANK và neurexin mã hóa cho các protein quan

trọng dẫn đến sự ổn định, trưởng thành và hình thành khớp thần kinh đã và đang

được tìm thấy, đột biến trên các gen này gây ra các hành vi đặc trưng cho kiểu hình

của bệnh tự kỷ (Craig and Kang, 2007; Südhof, 2008; Betancur et al, 2009).

Neuroligins được mã hóa bởi các gen NLGN1, NLGN2, NLGN3, NLGN4X và

NLGN5. Trong số đó, chỉ có gen NLGN3, NLGN4 và NLGN4Y đã được tìm thấy

mang các đột biến có thể gây bệnh tự kỷ. Tuy nhiên, tần suất đột biến gen NLGN ở

những bệnh nhân ASD là thấp, như khẳng định chung của nhiều nghiên cứu (Lintas

and Persico, 2009). Một đột biến khác trên gen NLGN3 (R704C), được ghi nhận

đầu tiên bởi nhóm nghiên cứu của Yan và cộng sự (Etherton et al, 2011) là nguyên

nhân chính làm suy giảm lựa chọn AMPA (receptor-mediated synaptic

transmission). Cùng với các thể mang đột biến NLGN, kiểu hình bệnh có độ dị hợp

tử cao, được xếp từ tự kỷ thể nặng tới hội chứng Tourettes.

Họ gen SHANK bao gồm 3 thành viên (SHANK1, SHANK2 và SHANK3) mã

hóa cho các protein khung cấu trúc, cần thiết cho sự hình thành cấu trúc và chức

năng thích hợp của các khớp thần kinh. Gen SHANK3 mã hóa cho một loại protein

liên quan trực tiếp đến các khớp thần kinh giàu proline. Gen này nằm trên cánh dài

NST 22q13. Về mặt chức năng, gen SHANK3 là một thành viên trong liên họ gen

SHANK. Các protein SHANK đều bao gồm nhiều vùng (domain), là những protein

xoắn hình khăn, được sinh ra tại kì sau phân bào. Chúng liên kết trực tiếp điểm thụ

cảm hệ thống dẫn truyền thần kinh, các kênh ion và những protein màng khác đến

actin cytoskeleton và G-protein. Protein SHANK không những có chức năng kiểm

soát tổ chức mật độ khớp thần kinh mà còn có khả năng tạo phức hệ thụ thể khớp

thần kinh, phân tử tín hiệu và protein liên quan đến tế bào xương có trong cột sống

(Naisbitt et al, 1999; Boeckers et al, 2002). Trong đó, protein SHANK3 có thể tạo

liên kết với tế bào protein thần kinh. Do vậy, trong số 3 gen chức năng ảnh hưởng

đến bệnh tự kỷ kể trên, gen SHANK3 được coi là nhân tố có ảnh hưởng mạnh mẽ

nhất để gây ra bệnh tự kỷ. Gen SHANK3 là một gen có kích thước rất lớn lên đến

khoảng 60 kb, bao gồm 23 exon. Trong đó exon 23 có kích thước dài nhất và đóng

vai trò quan trọng trong việc gây ra hội chứng xóa NST 22q13 - một hội chứng rất

đặc trưng của tự kỷ. Đối với neuroligins, một số nghiên cứu đã ghi nhận đột biến

hiếm hoặc xóa gen bao gồm cả các locus SHANK3 chiếm khoảng 0,85% tất cả các

cá thể ASD. Các cá thể ASD có các đặc điểm suy giảm ngôn ngữ trầm trọng kết

hợp với thiểu năng trí tuệ (ID) và sự trì hoãn phát triển của thần kinh (Lintas and

Persico 2009). Đặc biệt, SHANK3 được đặt trong vùng tiêu chuẩn nhỏ nhất của hội

chứng xóa 22q13, cũng được biết đến như hội chứng Phelan-McDemid, hội chứng

này cũng có các đặc tính ID trầm trọng, chậm trễ biểu cảm lời nói (Phelan and

McDermid, 2011).

Neurexin là một trong 3 gen liên quan tới khớp thần kinh, được mã hóa bởi ba

gen (NRXN1, NRXN2 và NRXN3) có độ bảo thủ cao. Mỗi gen có hai promoter độc

lập: α-neurexins được phiên mã từ một promoter phía trước exon 1, trong khi β-

neurexins được phiên mã từ promoter phía sau, kết quả là tạo ra một dạng thức

neurexin ngắn hơn (Ichtchenko et al, 1995). Như mô tả ở trên, sự tương tác giữa

neuroligin và neurexin gây nên sự hình thành của khớp thần kinh chức năng cả

trong tế bào nơron thần kinh (Craig and Kang, 2007; Südhof, 2008; Betancur et al,

2009) và ngay cả trong tế bào không phải nơron (Scheiffele et al, 2000; Fabrichny

et al, 2007). Hơn nữa, neurexins là chất trung gian quan trọng cho dẫn truyền thần kinh bằng cách liên kết canxi (Ca2+) tới sự dịch chuyển túi khớp thần kinh (Missler

et al, 2003; Zhang et al, 2005). Một số nghiên cứu đã ghi nhận các biến thể trình tự

hiếm hoặc CNVs ảnh hưởng đến các locus NRXN1. Gần đây, các mất đoạn hiếm tại

locus NRXN3 cũng đã được tìm thấy trong 4 bệnh nhân rối loạn phổ tự kỷ; 3 trong

các mất đoạn được di truyền từ bố mẹ bình thường (Vaags et al, 2012).

1.3.2.3. Các gen định hình chất nhiễm sắc - (MECP2)

Methyl hóa DNA là sự biến đổi chính của hệ gen bậc cao và có vai trò quan

trọng trong sự phát triển của động vật. MECP2, một thành viên của methyl-CpG

gắn với domain của protein, gắn với 2 nucleotide đã methyl hóa CpG, bổ sung

histone deacetylase 1 (HDAC1) và protein khác liên quan tới đáp ứng nhiễm sắc thể

tại các promoter đặc hiệu gen. Vì vậy, gen MECP2 rất cần thiết cho sự phát triển và

đảm bảo thực hiện đúng chức năng của não. Mất MECP2 sẽ trì hoãn sự hoàn thiện

của tế bào nơron thần kinh và xinap thần kinh. Các đột biến mất chức năng của

MECP2 là nguyên nhân của hội chứng Rett (Chahrour M and Zoghbi HY, 2007).

Tuy nhiên, đột biến mới của MECP2 đôi khi có thể dẫn đến các kiểu hình như:

chậm phát triển, tâm thần nhẹ và các biến thể Rett bằng lời nói, phụ thuộc vào sự

biến đổi cụ thể (Lam et al, 2000). Đột biến MECP2 cũng được tìm thấy ở các bé gái

mắc chứng tự kỷ không điển hình. Khi chẩn đoán sớm bé gái với bệnh tự kỷ mang

đột biến MECP2 thường biểu hiện không có đặc điểm lâm sàng đặc trưng của hội

chứng Rett (động kinh, đầu nhỏ, vắt tay và các vấn đề hô hấp). Các dấu hiệu và

triệu chứng sẽ phát triển khi chúng lớn lên, thường là 6-9 tuổi (Young et al, 2008).

1.3.2.4. Các gen điều khiển sự phát triển và hình thái - (HOXA1, PTEN, EIF4E)

Nhiều bệnh nhân hội chứng tự kỷ thường có biểu hiện hình thái mặt như có

các dị tật nhỏ hoặc lớn, đầu nhỏ hoặc to. Những đứa trẻ với biểu hiện tự kỷ thường

có hình thái khuôn mặt nhỏ (Tripi et al, 2008) và tỷ lệ phát triển đầu/cơ thể không

bình thường (Sacco et al, 2007; Chawarska et al, 2011). Khoảng 20% trẻ tự kỷ có

đầu to (Sacco et al, 2007), với sự phát triển đầu vượt trội trong những năm đầu khi

mới sinh ra (Courchesne et al, 2007). Ngược lại một nhóm nhỏ các bệnh nhân mắc

chứng tự kỷ nguyên phát có cơ thể nhỏ và đầu nhỏ (Sacco et al, 2007).Gen Hox có

vai trò quan trọng trong khuôn mẫu mô phôi và cơ quan cơ thể. Trong số 39 gen

Hox, gen HOXA1 (nằm trên nhiễm sắc thể 7p15.3) đầu tiên được biểu hiện trong

quá trình tạo phôi và nó là cần thiết cho sự phát triển đúng của thân não, tiểu não,

một số dây thần kinh sọ, tai giữa và tai trong, xương chẩm (Chisaka et al, 1992;

Makki et al, 2011). Lần đầu tiên, Ingram và cộng sự (Ingram et al, 2000) đã xác

định được một đa hình của gen HOXA1, sự thay thế A bằng G tại vị trí codon 218,

sự thay đổi này dẫn đến sự thay đổi một histidine bằng một arginine ở vị trí 73. Đa

hình này đã gây ảnh hưởng đến tỷ lệ phát triển đầu ở cả trẻ tự kỷ và trẻ em phát

triển bình thường, với alen G kích cỡ tăng trưởng đầu nhanh hơn và thể tích tiểu não

nhỏ hơn (Conciatori et al, 2004; Muscarella et al, 2010; Raznahan et al, 2012). Hai

đột biến hiếm trên gen HOXA1 đã được tìm thấy: một đột biến c.84C>G tạo ra stop

codon (Y28X) ở một bệnh nhân Thổ Nhĩ Kỳ bị tự kỷ; trong khi đột biến 175-

176insG tạo ra sự thay đổi khung đọc dẫn đến cắt ngắn protein được tìm thấy trong

9 bệnh nhân Ả Rập Saudi (Tischfield et al, 2005; Bosley et al, 2007).

Gen Phosphatase và Tensinhomolog (PTEN) nằm trên nhiễm sắc thể 10q23,

các đột biến này liên quan đến một loạt các rối loạn bao gồm: hội chứng Cowden

(CS), hội chứng Bannayan-Riley-Ruvalcaba, hội chứng Proteus, và bệnh Lhermitte-

Duclos (Blumenthal and Dennis, 2008). PTEN là một gen ức chế khối u ở chu kỳ tế

bào G1 và apoptosis, trong quá trình cân bằng kích thích sinh lý tác động lên tăng

sinh tế bào và phát triển cơ thể bằng lượng dinh dưỡng, tiết insulin, và các cytokine

tiền viêm thông qua con đường ERK/PI3K/mTOR (Ma and Blenis, 2009). Hội

chứng di truyền liên quan đến dòng tế bào gốc PTEN thường kết hợp với bệnh tự kỷ

hoặc chậm phát triển tâm thần (Goffin et al, 2001). Đến nay đã có một số nghiên

cứu về các đột biến thay thế amino acid bảo thủ trên các bệnh nhân tự kỷ đầu to

nguyên phát. Tỷ lệ đột biến trên gen PTEN ở những bệnh nhân ASD với đầu to ước

tính là 4,7% (6/126) (Lintas and Persico, 2009). Những bệnh nhân có nguy cơ cao

về nhiều loại ung thư liên quan tới gen PTEN trong giai đoạn trưởng thành.

Gen E4 mã hóa cho yếu tố khởi đầu quá trình dịch mã ở tế bào nhân thật

(EIF4E, nằm trên nhiễm sắc thể 4q21-q25) đóng một vai trò quan trọng trong dịch

mã phía cuối protein của mTOR. Gần đây, một nghiên cứu về sự vận chuyển cân

bằng làm gián đoạn các locus EIF4E đã được phát hiện ở cậu bé 2 tuổi bị tự kỷ có

biểu hiện chậm về ngôn ngữ và tương tác xã hội (Neves-Pereira et al, 2009). 1.3.2.5. Các gen liên quan tới Ca2+ (CACNA1C, CACNA1F, KCNMA1, RYRs và

SCN2A)

Một nghiên cứu gần đây cho thấy trong một số trường hợp tự kỷ có thể là do sự bất thường cân bằng nội môi Ca2+ trong quá trình phát triển thần kinh (Krey et al,

2007). Ngoài ra, một số nghiên cứu di truyền đã xác định được gen liên quan đến bệnh tự kỷ mã hóa protein hoặc trực tiếp hoặc gián tiếp kiểm soát Ca2+ nội bào hoặc quy định cytosolic Ca2+ quá độ. Các phân tử này bao gồm các kênh ion, các thụ thể và các protein truyền tín hiệu điều khiển Ca2+ liên quan tới sự phát triển thần kinh

trung ương. Đột biến tăng chức năng protein (Gain-of-function mutations) trong kênh Cav1.2 (L- type voltaged-gated Ca2+) (CACNA1C) là nguyên nhân của hội

chứng Timothy, đây là một rối loạn đa hệ bao gồm chậm phát triển tâm thần và

bệnh tự kỷ. Tương tự như vậy, đột biến tăng chức năng protein trong kênh Cav1.4 (L- type voltaged-gated Ca2+) (CACNA1F) gây ra dạng không hoàn toàn của bệnh

quáng gà liên kết với nhiễm sắc thể X (CSNB2): đột biến gây ra CSNB2 thường đi

kèm với suy giảm nhận thức và một trong hai bệnh tự kỷ hoặc động kinh, trong khi

đột biến bất hoạt do mất chức năng CSNB2 không kèm theo triệu chứng thần kinh

(Hemara-Wahanui et al, 2005).

RYRs hoạt động ở vùng mạng lưới nội chất màng, có nhiệm vụ điều chỉnh Ca2+ nội bào. Một nghiên cứu gần đây cho thấy trong một số trường hợp tự kỷ có thể là do sự bất thường nội cân bằng Ca2+ trong quá trình phát triển thần kinh (Krey

and Dolmetsch, 2007). RYRs được biết là các kênh ion lớn nhất đóng vai trò quan trọng trong việc giải phóng ion Ca2+ từ lưới nội chất. RYRs có cấu trúc

homotetramers dạng nấm xuyên màng tế bào. Ngoài ra, một số nghiên cứu về di

truyền đã xác định được gen liên quan đến protein mã hóa gây bệnh tự kỷ hoặc trực tiếp hoặc gián tiếp kiểm soát Ca2+nội bào (Heyes et al, 2015). Những phân tử này bao gồm các kênh ion, các thụ thể, và các protein truyền tín hiệu điều khiển Ca2+

trong sự phát triển của hệ thống thần kinh trung ương (Lu et al. 2012). Rất nhiều gen liên quan đến chức năng vận chuyển Ca2+, chẳng hạn như CACNA1C,

CACNA1F, KCNMA1 và SCN2A đã được chứng minh là có liên quan đến bệnh tự

kỷ (Splawski et al, 2004). RYR3 có mặt trong vùng đồi của tế bào thần kinh, đồi

thị, các tế bào Purkinje (Hakamata et al, 1992; Lai et al, 1992), cơ xương, các tế

bào cơ trơn của mạch vành mạch máu, phổi, thận, hỗng tràng, dạ dày của chuột và

động mạch chủ, tử cung, niệu quản, bàng quang và thực quản của thỏ (Lanner et al,

2010). Trong nghiên cứu về mức độ ảnh hưởng chức năng của RYR3, chuột bị loại

bỏ gen RYR3 cho thấy sự suy giảm và rối loạn trong hành vi hoạt động, chúng cũng

cho biểu hiện mức độ tăng động thái quá. Những kết quả này chỉ ra rằng RYR3 có

một vai trò quan trọng trong hoạt động vận động và hành vi (Naoki Matsuo et al,

2009).

1.3.2.6. Các dạng ti thể

Các chỉ số về hóa sinh bất thường trên bệnh nhân tự kỷ thường liên quan tới

chức năng của ty thể (Giulivi et al, 2010; Rossignol and RE., 2012). Tuy nhiên, rối

loạn chức năng ty thể xuất hiện thứ phát tới phát sinh lý bệnh cơ bản ASD trong

phần lớn các trường hợp (Palmieri and Persico, 2010). Chỉ trong trường hợp hiếm

hoi các đột biến trong DNA ti thể (mtDNA) hoặc trong DNA nhân (nDNA) liên

quan nhiều đến chức năng của ty thể giải thích căn bệnh tự kỷ.

Các khiếm khuyết về hệ gen và gen ảnh hưởng tới mtDNA hoặc DNA nhân

được phát hiện trong khoảng 20% trẻ em mắc chứng tự kỷ với các biểu hiện lâm

sàng và hóa sinh của bệnh. Từng đột biến của ty thể hoặc sự sắp xếp lại của nhiễm

sắc thể được ghi nhận nhỏ hơn 0,1% của tất cả các trường hợp. Sự sắp xếp lại nhiễm

sắc thể trong nhân có thể ảnh hưởng tới chức năng của ty thể, bao gồm xóa 15q11–

q13 (cytochrome C oxidase subunit 5A, COX5A), 13q13–q14.1 (mitochondrial

ribosomal protein 31, MRPS31), 4q32–q34.68 (electron-transferring-flavoprotein

dehydrogenase, ETFDH), 2q37.3 (NADH dehydrogenase ubiquinone 1 alpha

subcomplex 10, NDUFA10) (Smith et al, 2009).

Ngoài ra, một số gen mới cũng được phát hiện có liên quan đến bệnh tự kỷ

như gen MUC16, gen HTR4. Gen MUC16 cùng với IL-8, TIMP-1 là nhóm các gen

được coi như chỉ thị phân tử sinh học nhóm 3 trong việc sàng lọc tự kỷ ở trẻ sơ sinh

(Mizejewski et al, 2013). Gen HTR4 đóng vai trò quan trọng trong các con đường

về thần kin, ảnh hưởng đến một số bệnh như tâm thần phân liệ, bệnh Alzheimer....

Vì thế, các đột biến trên gen này cũng có khả năng là nguyên nhân gây bệnh tự kỷ

(Hu et al, 2011).

1.4. CÁC TIẾN BỘ TRONG NGHIÊN CỨU VỀ DI TRU ỀN C R I O N PH

TỰ KỶ B NG GI I TR NH TỰ GEN THẾ HỆ ỚI

1.4.1. Phƣơng pháp giải tr nh tự gen thế hệ mới

Thành công trong việc giải mã hệ gen người vào năm 2003 đã mở ra một thời

kỳ phát triển mới trong nghiên cứu về khoa học sự sống với rất nhiều kỹ thuật mới,

hiện đại được phát triển và ứng dụng. Một trong những công nghệ có sự phát triển

mạnh mẽ và tạo ảnh hưởng ở quy mô toàn cầu là công nghệ giải trình tự DNA thế

hệ mới, cho phép giải mã hiệu quả và nhanh chóng toàn bộ hệ gen sinh vật. Hiện

nay, rất nhiều hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới đã được phát triển bởi các

hãng/công ty như Illumina/MiSeq, HiSeq; Pacific Biosciences/RS; Life

Technologies/Ion Torrent PGM, Ion Proton, …(Shendure and Ji, 2008; Lin et al,

2012). Về nguyên lý, các hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới được thực hiện dựa

trên việc giải trình tự bằng tổng hợp (sequencing by synthesis, SBS) (Các thế hệ

máy Roche/ 454, Life Technologies/ Ion Torrent và Illumina sử dụng) hoặc giải

trình tự gắn nối (sequencing by ligation, SBL) (Applied Biosystems/ SOLiD). Công

nghệ NGS (Next Generation Sequencing) được tiến hành qua các bước chuẩn bị

mẫu, giải trình tự, lắp ráp hệ gen, chú giải và so sánh hệ gen. Trong đó, công đoạn

giải trình tự bao gồm 3 bước chính: thiết lập thư viện DNA; giải trình tự toàn bộ hệ

gen trên hệ thống máy giải trình tự thế hệ mới; xử lý và phân tích dữ liệu bằng các

công cụ tin sinh học trên hệ thống máy tính hiệu năng cao (Schuster , 2008). Một số

phần mềm được sử dụng trong phân tích tin sinh như BWA, Samtools, Picard,

GATK… (Korneliussen et al, 2014). BWA là một chương trình phần mềm để lập

bản đồ trình tự thấp khác nhau đối với một bộ gen tham chiếu lớn, chẳng hạn như

bộ gen người. Phần mềm này bao gồm ba thuật toán: BWA-backtrack, BWA-SW

và BWA-MEM, sử dụng để so sánh dữ liệu thô với dữ liệu tham chiếu (http://bio-

bwa.sourceforge.net/). Dữ liệu sau khi so sánh, có thể được phân tích, xử lý tạo chỉ

mục (index) bằng phần mềm Samtool và Picard

(http://broadinstitute.github.io/picard/). Hai phần mềm này thao tác dựa trên tập tin

SAM (Sequence Alignment / Map) là một định dạng chung cho kho lưu trữ sắp xếp

trình tự nucleotide lớn. Phần mềm GATK sử dụng để xác định các đột biến. Đây là

một chương trình phần mềm để phân tích các chuỗi dữ liệu có thông lượng cao,

phát triển bởi nhóm Khoa học dữ liệu và Kỹ thuật số liệu tại Viện Broad. Bộ công

cụ này cung cấp một loạt các công cụ, trong đó tập trung chủ yếu vào phát hiện biến

thể và kiểu gen cũng như nhấn mạnh vào việc đảm bảo chất lượng dữ liệu

(https://www.broadinstitute.org/gatk/). Kết quả phân tích đột biến có thể xem bằng

phầm mềm IGV (Integrated Genomics Viewer). IGV là phần mềm có giao diện đồ

họa, nó trực quan hóa kết quả lắp ráp bằng BWA và kết quả xác định đột biến bằng

GATK thành dạng hình ảnh.

Với ưu thế thời gian đọc nhanh, dung lượng lớn (high-throughput), trình tự

đọc được rất chính xác, các hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới ngày càng được sử

dụng rộng rãi (Poehlmann et al, 2007; Schadt et al, 2010). Sự phát triển mạnh mẽ

của công nghệ NGS dẫn tới một cuộc cách mạng trong công nghệ sinh học phân tử

nói chung và công nghệ giải trình tự DNA nói riêng. NGS là một bước tiến vượt bậc

về công nghệ giải trình tự DNA, cho phép đọc một lượng dữ liệu khổng lồ, từ 8 Gb

đến 600 Gb. Nếu như trước đây, việc giải mã toàn bộ hệ gen rất phức tạp, khó khăn,

chi phí lớn, thời gian dài thì ngày nay, với sự phát triển của công nghệ NGS, các

chương trình, dự án giải mã 1.000 - 10.000 hệ gen người, 1.000 - 10.000 hệ gen

động vật, 1.000 hệ gen thực vật có thể được thực hiện. Việc giải trình tự toàn bộ hệ

gen của một sinh vật có thể được thực hiện tại nhiều phòng thí nghiệm, trong một

thời gian ngắn thay vì phải kéo dài nhiều năm. Công nghệ NGS hiện được ứng dụng

chủ yếu trong các dự án lớn nghiên cứu hệ gen người với mục đích phục vụ y học,

metagenomics và các nghiên cứu đa hình hệ gen. Công nghệ này đã và đang tiếp tục

phát triển nhằm giải mã mới hệ gen của những loài chưa có hệ gen tham chiếu

(Loman et al, 2012). Trong lĩnh vực y học, NGS là một công cụ mạnh nhất cho

phép phát hiện được các tác nhân gây bệnh, các đột biến với tỷ lệ thấp. Chính vì

vậy, giải trình tự DNA thế hệ mới được ứng dụng trong phát hiện và định lượng các

đột biến trong ung thư, nghiên cứu chẩn đoán bệnh di truyền.

Hình 1.4. Lịch sử nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ từ năm 1975 đến năm 2015 (Nguồn: Bourgeron, 2016)

Đối với bệnh tự kỷ, là một bệnh di truyền đa gen, phương pháp giải trình tự

gen thế hệ mới được coi là phương pháp tối ưu trong nghiên cứu di truyền bệnh. Có

thể nói, từ khi áp dụng phương pháp này, đã có nhiều bước tiến nhảy vọt trong

nghiên cứu di truyền ASD, nhiều đột biến mới, nhiều gen mới được phát hiện trong

khoảng thời gian ngắn, một ưu điểm vượt bậc so với các phương pháp khác (Hình

1.4).

Dựa vào thông tin các gen trong cơ sở dữ liệu về bệnh tự kỷ OMIM, hãng

Illumina đã phát triển và ứng dụng phương pháp NGS trong nghiên cứu bệnh tự kỷ.

TruSight Autism của hãng Illumina là bộ kit đã được thương mại hóa, các gen đích

trong bộ Kit gồm 101 gen đã được báo cáo có liên quan đến bệnh tự kỷ (Phụ lục 01)

(http://www.illumina.com/products/trusight_autism.html). Bộ kit này đã được sử

dụng trong nhiều nghiên cứu, mang lại kết quả thực tiễn rất có ý nghĩa (Bock et al,

2016, Varga et al, 2018)

1.4.2. Giải tr nh tự toàn bộ vùng gen mã hóa trong nghiên cứu di truyền bệnh

tự kỷ

1.4.2.1. Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa trong nghiên cứu phát hiện đột

biến mới

Giải trình tự thế hệ mới là một kĩ thuật được sử dụng để xác định 4 loại các

bazơ nitơ trên đoạn DNA dựa trên những màu huỳnh quang đặc hiệu cho mỗi loại

bazơ nitơ. Sự tiến bộ của phương pháp này thể hiện ở chỗ nó có thế xác định được

trình tự ở cả những vùng khó đọc và những trình tự lặp lại. Giải trình tự gen thế hệ

mới có thể được sử dụng để nghiên cứu các gen bệnh theo di truyền Mendel bằng

việc giải trình tự mã hóa protein (exome), hoặc thậm chí toàn bộ bộ gen của con

người (các dự án giải trình tự genome người). Giải trình tự gen thế hệ mới đã được

xem như là một công cụ hữu hiệu cho phát hiện các gen bệnh mới, đặc biệt giải

trình tự exome có thể sẽ trở thành công cụ phổ biến nhất được sử dụng để xác định

gen bệnh theo di truyền Mendel cho những năm tới. Hàng chục nghìn biến thể gen

đã được xác định bằng exome trên nhiều bệnh phức tạp như: tim mạch, thần kinh,...

Ở người, trí tuệ là một tính trạng cực kỳ phức tạp do nhiều gen quy định. Vì vậy,

nghiên cứu ảnh hưởng của sự thay đổi các gen liên quan đến trí tuệ, dẫn đến thiểu

năng trí tuệ cũng như tự kỷ cần được tiến hành ở mức độ hệ gen, nhất là hệ gen biểu

hiện (exome).

Những tiến bộ nhanh chóng trong công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới đã

dẫn đến phát hiện nhiều đột biến mới hiếm trong ASD trong những năm gần đây.

Năm 2011, O’Roak và nhóm nghiên cứu đã báo cáo kết quả trong nghiên cứu giải

trình tự toàn bộ exome đầu tiên ở 20 gia đình ASD (O'Roak et al, 2011). Kết quả

cho thấy có 11 đột biến thay thế amino acid đã được xác định. Bốn gen FOXP1,

GRIN2B, SCN1A và LAMC3 được nhấn mạnh là có khả năng gây bệnh (O'Roaket

al, 2011).

Nửa đầu năm 2012, bốn nghiên cứu exome ASD được công bố bởi các nhóm

nghiên cứu độc lập. Đầu tiên, Wigler và đồng nghiệp giải trình tự exome của 343

gia đình ASD đã cho thấy rằng mặc dù tổng tỷ lệ đột biến mới không khác nhau

đáng kể ở các anh chị em bị ảnh hưởng và không bị ảnh hưởng bệnh. Các gen gây

ảnh hưởng đột biến mới xảy ra lặp lại thường xuyên hơn ở những bệnh nhân tự kỷ.

Đặc biệt, một số đột biến ở gen FMRP có thể gây cả bệnh Fragile X và ASD

(Iossifov et al, 2012).

Trong một nghiên cứu khác, O’Roak đã báo cáo 39% trong tổng số 120 đột

biến mới gây ảnh hưởng nghiệm trọng (O'Roak BJ et al, 2012). Ngoài ra, nhóm

nghiên cứu này cũng công bố 27 đột biến mới trong 16 gen. Trong đó, 6 gen HD8,

DYRK1A, GRIN2B, PTEN, TBL1XR1 và TBR1 đã tìm thấy các đột biến đứt gãy.

Điều này làm sáng tỏ các nghiên cứu trước đó và đưa ra được kết luận rằng 6 gen

này có thể đóng góp 1% nguy cơ gây bệnh tự kỷ (O'Roak et al, 2012).

Công bố tiếp theo được kể đến là của Sanders và cộng sự, khi nghiên cứu 238

gia đình ASD với người bình thường thì thấy rằng các đột biến đứt gãy trong ba gen

SCN2A, KATNAL2 và CHD8 có nguy cơ cao gây bệnh tự kỷ (Sanders et al, 2012).

Nghiên cứu của Neale và cộng sự khi phân tích exome của 175 gia đình ASD

cho thấy mối tương quan giữa tỷ lệ đột biến mới và độ tuổi của người cha. Ba gen

đã được tìm thấy với hai đột biến mới là: BRCA2, FAT1 và KCNMA1 (Neale BM et

al, 2012).

Nhìn chung, các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng: phần lớn đột biến chỉ gia tăng

nguy cơ chứ không gây bệnh, dẫn đến ủng hộ cho mô hình oligogenic/polygenic

nghĩa là có thể có hàng trăm gen có nguy cơ cao bị đột biến mới. Những đột biến

mới có khả năng ảnh hưởng đến chức năng của gen ở các trẻ em mắc bệnh. Tuy

nhiên, chỉ một phần nhỏ những đột biến này có thể gây bệnh, và những đột biến có

nguy cơ cao tập trung ở các gen liên quan đến bệnh tự kỷ, tổng hợp các đột biến này

có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh lên 5-20 lần dù chưa đủ để gây bệnh. Nhiều gen

bị sai hỏng có ảnh hưởng lớn đến các hệ thống gen quan trọng như: synaptic

plasticity, β-catenin/chromatin remodelling, và một số đột biến mới đã được tìm

thấy trong những gen liên quan đến rối loạn phát triển thần kinh cũng như thiểu

năng trí tuệ (SCN1A, SCN2A, GRIN2B) (Neale et al, 2012; O'Roak et al, 2012;

O'Roak et al, 2012; Gupta et al, 2014). Trên quan điểm sinh lý bệnh học, kết quả

của 4 nghiên cứu WES đã xác nhận giả thuyết rằng nguồn gốc của ASD là do

những biến đổi của các synapse (Iossifovet al, 2012; Neale et al, 2012; O'Roak et

al, 2012). Tuy nhiên, phân tích và tổng hợp các dữ liệu về biểu hiện gen ở não

người đang phát triển đã chỉ ra rằng rất nhiều đột biến mới được phát hiện có ảnh

hưởng đến các gen mã hóa cho các protein liên kết nhiễm sắc thể tham gia quá trình

phiên mã, đặc biệt trong quá trình phát triển não trước sinh (Ben-David and

Shifman, 2013). Mặc dù, phương pháp tìm đột biến mới đã có nhiều thành tựu quan

trọng, nhưng nhiều vấn đề di truyền của bệnh tự kỷ vẫn chưa được làm sáng tỏ

(Devlin and Scherer, 2012). Chính vì thế cần nghiên cứu di truyền bệnh trong phạm

vi rộng hơn, đối tượng hướng đến là gia đình có nhiều người bị bệnh hoặc nghiên

cứu cả ở họ hàng của bệnh nhân.

1.4.2.2. Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa trong nghiên cứu phát hiện biến

thể di truyền

WES (Whole exome sequencing) đang được coi là hướng đi đúng đắn để

nghiên cứu di truyền đối với bệnh tự kỷ. Phương pháp này giúp xác định các yếu tố

di truyền có liên quan ở những trường hợp còn nghi ngờ về mặt lâm sàng, cho thấy

tầm quan trọng của các biến đổi của gen trong hội chứng tự kỷ (Yu et al, 2013). Các

nghiên cứu khác sử dụng WES để tìm kiếm các đột biến lặn trong cá thể mắc bệnh

tự kỷ (autistic probands) cùng với các cha mẹ và họ hàng (Chahrour and Zoghbi,

2007; Bi et al, 2012; Novarino et al, 2012). Bằng phương pháp này, Chahrour và

cộng sự (Chahrour and Zoghbi, 2007) đã xác định được 4 gen tiềm năng mới:

UBE3B, CLTCL1, NCKAP5L và ZNF18, mã hóa cho các protein liên quan đến quá

trình phân giải protein, con đường truyền tín hiệu trung gian qua GTPase, cấu trúc

bộ khung tế bào chất. Đáng chú ý, Bi và cộng sự (Bi et al, 2012) đã sàng lọc một

nhóm 20 bệnh nhân bằng WES và phát hiện một đột biến thay thế mới là S2569A, ở

gen Ankyrin 3 (ANK3). Dựa vào những hiểu biết về sự liên kết giữa ANK3 và

những rối loạn thần kinh khác (rối loạn lưỡng cực và tâm thần phân liệt) (Ripke et

al, 2011) các nhà khoa học đã giải trình tự gen ANK3 ở 47 bệnh nhân mắc ASD

không có quan hệ họ hàng và phát hiện đột biến S1569A và hai biến thể khác của

đột biến thay thế, T3720M và T4255P nằm ở gần đầu vùng chết C của ANK3, cả hai

đều được di truyền từ bố mẹ không bị bệnh (Ripke et al, 2011). Khi tiến hành sàng

lọc các dòng họ mắc chứng tự kỷ, động kinh và thiểu năng trí tuệ, Novarino và cộng

sự (Novarino et al, 2012) đã xác định đột biến đồng hợp ở gen BCKDK chưa hoạt

hóa, tạo thành các mRNA và protein thoái hóa. Tuy nhiên, chuột bị knockout gen

BCKDK có sự biểu hiện amino acid não bất thường và sự giảm đáp ứng não bộ và

đáp ứng với chế độ ăn uống bổ sung, vì vậy đây là minh chứng cho 1 hội chứng có

thể chữa được (Novarino et al, 2012). Cuối cùng, Puffernberger và cộng sự

(Puffenberger et al, 2012) sàng lọc trên 7 bệnh nhân đã tìm thấy một đột biến thay

thế ở dạng đồng hợp trên HERC2 (c.1781C>T, p.Pro594Leu) liên quan đến sự chậm

phát triển và ASD. Sự chồng chéo kiểu hình giữa chuột đột biến HERC1 và HERC2

cũng như với hội chứng Angelman đã chỉ ra vai trò gây bệnh của HERC2 trong việc

gây bệnh thiểu năng trí tuệ, tự kỷ và rối loạn dáng đi (Puffenbergeret al, 2012).

Năm 2013, Yu và các cộng sự đã áp dụng WES cho ba gia đình ASD. Bằng

việc thu hẹp locus gen 1-3% bộ gen, nhóm nghiên cứu đã xác định được đột biến

trên 3 gen mới có khả năng gây bệnh tự kỷ. Việc phát hiện các đột biến vô hiệu hóa

một phần trong AMT và PEX7 cho thấy các rối loại về thần kinh có thể được trình

bày kèm với các triệu chứng tự kỷ, mặc dù đột biến rất nhẹ, có thể khá hiếm, đặc

biệt trong các quần thể không có chung nguồn gốc (Yu et al, 2013). Một số rối loạn

thần kinh đã được kết hợp cùng với các triệu chứng tự kỷ trước đây (Zecavati and

Spence, 2009). Ngoài ra, các hình thức nhẹ hơn về rối loạn trao đổi chất cũng được

kể đến (Watson et al, 2006). Thêm vào đó, nhóm nghiên cứu còn xác định được

những biến thể hiếm trong các gen phát triển thần kinh khác như VPS13B/COH1,

SYNE1, MECP2 và POMGNT1. Gen liên quan trong nghiên cứu này bao gồm

những gen điều chỉnh hoạt động tiếp hợp như (MECP2, SYNE1) và một số gen khác

cũng được coi có vai trò trong hoạt động tiếp hợp như (AMT, PEX7,

VPS13B/COH1). Điều này có thể phản ánh vai trò quan trọng của các gen

nonsynaptic dẫn đến hội chứng tự kỷ.

Gần đây, một nhóm nghiên cứu người Nhật đã thực hiện WES trong hai gia

đình đều có ba anh chị em ảnh hưởng. Kết quả xác định được sáu biến thể thay thế

amino acid hiếm (loại đột biến thay đổi một nucleotide trong bộ ba mã hóa). Trong

đó, CLN8 R24H là biến thể hiếm được thừa kế từ người cha mắc bệnh trong một

gia đình có ba anh chị em bị ảnh hưởng. Kết quả WES ở 241 bệnh nhân và 667

người bình thường cho thấy, tần số alen đột biến CLN8-R24H ở nhóm bệnh nhân

(1/482) cao hơn so với nhóm đối chứng (1/1334). Trong giai đoạn nghiên cứu tiếp

theo, khi nghiên cứu nhóm khác gồm 309 bệnh nhân và nhóm đối chứng gồm 350

người, nhóm tác giả đã không phát hiện được biến thể CLN8-R24H. Những kết quả

này gợi ý rằng, CLN8-R24H đóng vai trò trong các nguyên nhân di truyền bệnh tự

kỷ, ít nhất là trong một tập hợp con của bệnh nhân (Egawa et al, 2015).

Cũng ngay trong năm 2015, Inoue và cộng sự đã thực hiện WES trên 4 anh chị

em bị ảnh hưởng từ một gia đình ASD multiplex. Kết quả thu được hai biến thể

dạng dị hợp hiếm là RPS24 Q191X và CD300LF P261fsX266. Tuy nhiên, khi ưu

tiên tìm kiếm biến dị này ở 243 bệnh nhân và 667 người bình thường thì không phát

hiện được. Điều này chứng tỏ hai biến dị RPS24 Q191X và CD300LF P261fsX266

là những nguy cơ gây tự kỷ.

1.4.2.3. Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa trong nghiên cứu phát hiện đột

biến trên gen lên kết NST X

Đột biến ở gen liên kết X kết hợp với ASD đã được tìm kiếm bằng cách giải

trình tự toàn bộ exon trên NST X ở 12 gia đình không cùng huyết thống với hai nam

giới mắc bệnh (Nava et al, 2012). Ba mươi sáu đột biến (variants) có thể gây hại đã

được tìm thấy ở 33 gen bao gồm gen PHF8 và HUWE1, là 2 gen liên quan đến thiểu

năng trí tuệ (Nava et al, 2012). Một đột biến vô nghĩa ở TMLHE, gen mã hóa cho ε-

N-trimethyllysine hydroxylase, protein xúc tác cho bước đầu tiên của quá trình sinh

tổng hợp carnitine đã được tìm thấy ở hai anh em mắc chứng tự kỷ và thiểu năng trí

tuệ. Sàng lọc trên 501 bệnh nhân nam mắc ASD, hai đột biến thay thế đã được tìm

thấy ở vùng mã hóa của TMLHE (Nava et al, 2012). Phân tích chức năng chỉ ra

rằng, một đột biến vô nghĩa trong TMLHE dẫn đến mất chức năng của enzyme ɛ-N-

trimethyllysine hydroxylase xúc tác sinh tổng hợp carnitine từ trimethyllysine

(TML) dẫn đến tiền chất của carnitine là TML tăng lên. Hơn nữa, đột biến dị hợp tử

dạng hiếm trên NST X (dẫn đến sự suy giảm protein ở nam giới) tăng lên 1,7% ở

bệnh nhân ASD nam so với đối chứng (4,8% so với 3,1%) (Stein et al, 2013).

Những nghiên cứu này đã bổ sung cho những hiểu biết của chúng ta về cơ sở di

truyền của ASD. Khoảng 5% ca mắc ASD có thể là do đột biến đồng hợp tử dạng

hiếm, tổ hợp đột biến dị hợp tử hoặc đột biến NST X ở nam giới (Stein et al, 2013).

Điều này được khẳng định bằng cách sử dụng WES trên các gia đình ASD có họ

hàng và không họ hàng với nhau (Yu et al, 2013).

Những nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng, chỉ có 0,48% gen liên quan đến ASD

nằm trên NST Y, trong khi 10,81% gen liên quan được công nhận nằm trên NST X

(Butler et al, 2014). Gần đây nhất, Butler và cộng sự đã tiến hành WES với 30 phụ

nữ da trắng có những biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh tự kỷ ở độ tuổi 5-16

(Butler et al, 2015). Nhóm tác giả đã thu hẹp danh sách các gen liên quan đến sự

phát triển thần kinh và các rối loạn thần kinh (Butler et al, 2014).

1.4.3. Giải tr nh tự toàn bộ hệ gen trong nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ

Tự kỷ được chứng minh là bệnh do đa gen và rất nhiều gen liên quan đến bệnh

đã được xác định. Cho đến nay, đã có hơn 100 gen được xác định có liên quan đến

bệnh tự kỷ. Phương pháp chủ yếu được sử dụng là WES. Đột biến được biết đến

còn xảy ra ở vùng không di truyền (nongenic) (Bae et al, 2014; Xiong et al, 2015),

vùng ARN không mã hóa (Ghahramani Seno et al, 2011; Kerin et al, 2012), mà trên

cả vùng lớn CNV (Pinto et al, 2010; Pinto D et al, 2014). Chính vì thế, nhiều

nghiên cứu đã chứng minh rằng, giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) cung cấp đầy

đủ thông tin di truyền ở cả vùng mã hóa và không mã hóa, do đó, làm tăng tỷ lệ phát

hiện biến thể hiếm trong bộ gen (Yu en et al, 2015).

Yuen và cộng sự (2015) đã sử dụng WGS trong nghiên cứu di truyền của 85

gia đình 4 người, trong đó có 2 người con bị ảnh hưởng của bệnh tự kỷ. Kết quả cho

thấy hơn một nửa (69,4%) các anh chị em bị ảnh hưởng không có cùng biến thể di

truyền. Chỉ có 35% trong số bệnh nhân là anh chị em có cùng đột biến liên quan đến

ASD. Nghiên cứu cũng cho thấy rằng, WGS cho phép phát hiện một cách tổng thể

và đầy đủ nhất các đột biến có liên quan, mà nhiều trong số đó đã bị bỏ qua bởi các

công nghệ khác như microarray và WES. Các tác giả đã đưa ra 95,6 % CNVs nhỏ

được phát hiện bởi WGS mà không được phát hiện bởi microarray có độ phân giải

cao. Đặc biệt, đột biến xóa bỏ 1,7Kb SCN2A với kích thước nhỏ và điểm dừng lại

nằm trong intron, rất khó phát hiện bằng microarray và WES (Yuenet al, 2015).

CHƢƠNG 2

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đ I TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Các mẫu máu nghiên cứu là từ các bệnh nhân bị tự kỷ và gia đình bệnh nhân.

Các bệnh nhân này được chẩn đoán rối loạn tự kỷ theo các tiêu chí DBC-P và

CARS bởi bác sĩ chuyên khoa tại Khoa Tâm bệnh - Bệnh viện Nhi Trung ương, Hà

Nội, Việt Nam.

Thủ tục lấy mẫu được tuân theo tiêu chuẩn của Hội đồng Y đức tại Viện

Nghiên cứu hệ gen số 02/QĐ-NCHG và Tuyên bố Helsinki của Hội đồng Y khoa

thế giới.

Bảng 2.1. Thông tin các mẫu bệnh nhân và gia đ nh nghiên cứu

STT Bệnh nhân Kí hiệu

Giới tính

ẫu bố (mẹ) Điểm DBC-P Điểm CARS

N.G.H

T01

Nam

Mẹ

42,5

N.T.Đ

T02

Nam

Mẹ

42,5

N.T.V

T03

Nam

Bố + Mẹ

41,5

N.T.K

T06

Nam

Bố + Mẹ

40,5

N.M.H

T07

Nam

Bố + Mẹ

42,5

N.V.Đ.A

T08

Nam

Bố + Mẹ

40.5

P.Đ.P

T09

Nam

Đối với thang chẩn đoán CARS, trẻ có điểm đánh giá từ 15-29,5 được xác

định là không bị tự kỷ, số điểm từ 30-36,5 là trẻ bị tự kỷ nhẹ, số điểm 37-60 là

những trẻ bị tự kỷ nặng. đối với điểm DBC-P thì trẻ có điểm đánh giá trên 17 điểm

thì được xác định là bị tự kỷ. Các bệnh nhân bị đánh giá là mắc chứng tự kỷ với

điểm số chẩn đoán khá cao (DBC-P đều trên 17 điểm và điểm CARS trên 40 điểm

(Bảng 2.1). Khi tiếp xúc, các bệnh nhân đều có một số biểu hiện điển hình của bệnh

như: hiếu động, không ngồi yên, không nhìn thẳng vào mắt khi được hỏi chuyện,

mắt nhìn nghiêng, không tập trung, không nhiệt tình nói chuyện với người lạ,…

2.2. HÓ CHẤT VÀ TR NG THIẾT BỊ

Bảng 2.2. Tr nh tự đo n oligonuleotide

Tên mồi Chiều

Trình tự (5’ > 3’)

xuôi

Chiều ngược

Kích thước (kb)

Nhân đoạn gen RYR3

R4-F

TTATTGTGTTGCTTGGCTCCCGGAG

1,5

R4-R

GGTCATATGTAGGAAATGCCAAGAGG

R65-F

GCCTAGTGCCTAGGGATGTCCATGG

1,5

R65-R

GCTCCTCTCCTCTCAGCACATGAAAT

Nhân đoạn gen RYR2

R2-F

CACATTATGATGGTACGTAGGGG

0,6

R2-R

GCCTGGACAACAGAGCACGACTCC’

Nhân đoạn gen MUC16

M16_1F X

GGCACAGCCTCTTCAGCAGGGAC

0,4

M16_1R

GTCACCACAGAATTGCTAGAGGTAGG

M16_2F X

ATCCGTCCAAACTAAAGCACCCACC

0,4

M16_2R

TTGGATGAGGTGGGCGTGGCTGGCA

M16_3F X

TTCCACCCCAGCTCCAAAGACAGGC

0,4

M16_3R

TTCCTTGCTGTATCCCTTGGGTCTGG

M16_4F X

ATGCACCAAGACCTATGCTCAGCC

0,4

M16_4R

GGCTGTAGTTGGTGGAGCTGACAT

M16_5F X

AAGCAGTCCAGTACACTCAGGG

0,4

M16_5R

AACCTGCATAGAGAGGGAGGGAGG

M16_6F X

AGTACCTTCTTCCCTGATCTGAGG

0,4

M16_6R

ATCCAAGCCTCTCATGGCAGAAAGG

Nhân đoạn gen HTR4

H4_F

CCCTCCGACTCTTCTCCTCAA

0,4

H4_F

TCACCCAGACCACTATCAGA

Các hóa chất tách chiết DNA tổng số, hóa chất pha đệm chạy điện di

DNA của các hãng Sigma, Merck. Hóa chất dùng cho PCR: dNTPs, Tag DNA

polymerase củahãng Fermentas và Sigma. Kit tách chiết DNA tổng số của hãng

QIAGEN.

Các bộ kit đặc biệt dùng trong giải trình tự gen thế hệ mới của Illumina như:

kít BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing, bộ kit Truseq DNA nano (350 và

550) và Truseq DNA PCR-free (350bp insert và 550 bp insert), kit SureSelect XT

Library Prep.

Mồi nhân và giải trình tự các đoạn gen có chứa các biến thể quan tâm được

trình bày ở bảng 2.2.

Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu bao gồm: Máy giải trình tự gen thế hệ

mới Illumina, máy giải trình tự Sequencer ABI 3500 genetic analyzer, tủ lạnh sâu -

20°C, -80°C (Sanyo), pipetman các loại (Gilson), cân phân tích (Metller Toledo),

máy đo pH (Mettler), máy ly tâm (Eppendorf), máy điện di và nguồn điện

PowerPac 300 (Bio-Rad), máy chụp ảnh GelDoc (Amersham BioSciences),

SEQ8000, máy PCR Eppendorf AG (Đức)...

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để thực hiện các mục tiêu và nội dung đã đề ra, chúng tôi tiến hành đề tài

luận án theo sơ đồ hình 2.1.

2.3.1. Tách chiết DNA tổng số

Các đối tượng nghiên cứu bao gồm: bệnh nhân và gia đình được thu thập 2

ml máu tĩnh mạch, chống đông EDTA 1,5 mg/ml. Quy trình đảm bảo tuyệt đối vô

trùng.

Trong nghiên cứu này, DNA tổng số được tách chiết từ máu bệnh phẩm bằng

bộ Kit DNAamp Blood Mini của hãng QIAGEN. Qui trình tách chiết DNA tổng số

được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Sản phẩm DNA tổng số được tiến

hành điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và đo quang phổ để xác định nồng độ

và độ tinh sạch.

2.3.2. T o thƣ viện DNA

Sử dụng SureSelect target enrichment system for Illumina paired-end

multiplexed sequencing.

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Toàn bộ quá trình tạo thư viện DNA được minh họa trong hình dưới đây. Sơ

đồ trên gồm 5 bước chính (Hình 2.2): cắt DNA thành các đoạn ngắn theo bộ kit;

Các đoạn DNA đã cắt được gắn với các adaptors và indexes cho từng mẫu; Lai các

đoạn DNA với các trình tự exon được biotin hóa và gắn hạt từ đã được phủ

streptavidin; Loại bỏ những phân tử không liên kết, các trình tự exon đã byotin hóa

và thu lại các đoạn chứa exon; Khuếch đại các đoạn exon mẫu.

Hình 2.2. Quy tr nh t o thƣ viện DNA

Kiểm tra chất lượng mẫu

Để kiểm tra chất lượng thư viện DNA vừa thiết lập, sử dụng các máy phân tích

chuyên dụng với bộ SureSelect V5+UTR-post (220bp – 350bp).

- Định lượng thư viện DNA bằng máy Bioanalyzer và sử dụng bộ kit Truseq

DNA nano (350 và 550) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với các bước như: chuẩn

bị Gel-dye mix, tra Gel-dye mix vào chip, tra marker, tra mẫu và ladder vào từng

giếng sau đó lắc đều mẫu và đọc mẫu bằng máy Bioanalyzer, thời gian đọc 15 phút.

- Kiểm tra chất lượng thư viện DNA bằng PCR-free và sử dụng bộ kit Truseq

DNA PCR-free của máy Illumina với các bước như: chuẩn bị các nồng độ mẫu (thư

viện DNA cần kiểm tra) trên đĩa 96 giếng, thêm hỗn hợp Master mix và PCR grade

water như protocol của nhà sản suất, sau đó phủ đĩa bằng màng Microseal, lắc đều

loại bọt khí và tiến hành đo trong thời gian 1 giờ.

2.3.3. Giải tr nh tự gen bằng máy Illumina

Illumina (Nextseq 500) sử dụng phản ứng khuếch đại xảy ra trên bề mặt flow

cell. Một flow cell bao gồm hàng triệu các cụm đặc hiệu phù hợp để đưa vào máy

đọc trình tự. Phản ứng tổng hợp được tiến hành từ 4 loại nucleotide được đánh dấu

huỳnh quang. Mỗi một chu trình đọc trình tự đều có sự tham gia của cả 4 loại

nucleotide, đảm bảo độ chính xác cao hơn phương pháp chỉ có 1 loại nucleotide

tham gia trong cùng 1 thời điểm. Chu trình này lặp đi lặp lại nhiều lần, cho một

hình ảnh kết quả duy nhất ở mỗi cụm cụ thể. Các bước giải trình tự trên máy

Illumina được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất gồm các bước như sau:

Bước 1: Chuẩn bị và kiểm tra chất phản ứng reagent cartridge và flow cell.

Bước 2: Mẫu được đưa vào máy và chạy máy theo các bước: tra mẫu (thư

viện) vào reagent cartridge, cài đặt quy trình chạy trên máy giải trình tự, nạp mẫu

vào flow cell, loại bỏ khay chất thải (hoá chất thừa đã qua sử dụng ở bộ phận chứa),

loại bỏ buffer cartridge đã sử dụng khỏi khoang trên, nạp khay hoá chất phản ứng,

nhập các tham số cần cho chạy máy và tiến hành quá trình chạy máy giải trình tự

bằng nút Start.

Bước 3: Đọc dữ liệu thô từ máy giải trình tự. Sau khi đưa mẫu vào máy giải

trình tự gen, việc chạy máy kết thúc sẽ cho dữ liệu thô đầu tiên. Dữ liệu thu được từ

máy giải trình tự gen thế hệ mới Illumina thì số liệu thô ban đầu được định dạng

dưới file fastq.

2.3.4. Tiền xử lý số liệu và phân tích dữ liệu

Sau khi nhận được dữ liệu thô từ máy giải trình tự, số liệu tiếp tục được tiền

xử lý và phân tích bằng các phần mềm tin sinh học chuyên dụng (Hình 2.3)

2.3.4.1. Tiền xử lý số liệu

Đánh giá chất lượng giải trình tự: Để đánh giá, kiểm soát chất lượng và nhận

diện các lỗi trong dữ liệu thì việc đầu tiên chính là kiểm định chất lượng, bước này

đặc biệt quan trọng vì nó đảm bảo cho các bước phân tích tiếp theo. Điểm chất

lượng (Phred quanlity score chart) thể hiện tính chính xác của mỗi nucleotide.

Trong giải trình gen thế hệ mới (Next generation sequencing- NGS) mỗi nucleotide

có một chất lượng xác suất riêng được tính bằng thuật toán phred và mã hoá bằng

ký tự ASCII (ASCII character code = phred quanlity value +33) theo chuẩn phred

(quanlity of phred score-Q), số Q càng cao thì độ chính xác cũng càng cao. Ví dụ,

nếu có điểm Q chất lượng khoảng 30 thì các lỗi đọc base là 1 trong 1000. Điểm chất

lượng được tính theo công thức Q = -10log10P, trong đó P là xác suất của các lần

đọc sai sót. Tỷ lệ % GC trên toàn bộ trình tự trong mẫu phân bố phải đạt chuẩn với

tỷ lệ trung bình % GC của hệ gen phân tích (Tỷ lệ % GC > 15% là đạt chuẩn-Theo

hãng Illumina). Tỷ lệ Q30 phải đều trên 95% (tỷ lệ đọc có điểm chất lượng Phred

Gọi tên biến thể (GATK)

Gióng hàng với hệ gen tham chiếu GRCh37 (BWA)

Lọc biến thể (GATK)

Số liệu thô (BCL files)

Xác định trình tự trùng lặp (Picard)

Chú giải biến thể (SnpEff)

Gióng hàng lại trình tự xung quanh indel (GATK)

Trình tự fastq

Bảng số liệu

Chuẩn hóa chất lượng đọc trình tự (GATK)

trên 30) và Q20 trên 97% (tỷ lệ đọc có điểm chất lượng Phred trên 20).

Hình 2.3. Sơ đồ phân tích dữ liệu giải tr nh bằng các phần mềm tin sinh Hình 2. 3 Sơ đồ chuyên sâu

Việc tiền xử lý số liệu được tiến hành ngay sau khi dữ liệu thô được kiểm định

chất lượng. Bước này không bắt buộc nó phụ thuộc vào nhu cầu và yêu cầu phân

tích đề ra. Một số công cụ ứng dụng cho bước tiền xử lý số liệu này bao gồm:

 Cắt bỏ: cắt bỏ một phần đoạn trình tự dựa vào chỉ tiêu chất lượng (dưới 20) hay

độ dài cần thiết (thông thường là phần đầu hoặc phần đuôi trình tự đọc) bằng

cách sử dụng công cụ mã nguồn trimmomatic hay cutadapt.

 Loại bỏ adapter là việc loại bỏ adapter còn sót lại trong dữ liệu bằng cách sử

dụng công cụ FastXtoolkit.

 Chuyển đổi định dạng từ fastq sang fasta sử dụng các công cụ script.

 Ghép nối: đối với cặp trình tự paired-end (PE) có các lần đọc 1 và 2 trùng lặp

nhau thì có thể lựa chọn ghép nối để thành đoạn trình tự dài hơn.

Gióng hàng dữ liệu với hệ gen tham chiếu hg19 và loại bỏ vị trí phân tử trùng

lặp bằng cách sử dụng các công cụ phần mềm sau (Hình 2.3):

BWA (Burrows-Wheeler Alignment Tool) là một chương trình phần mềm liên

kết trình tự các gen nhỏ khác nhau, với một bộ gen tham khảo lớn, ví dụ như gen

người. Chương trình này bao gồm 3 thuật toán BWA-backtrack, BWA-SW và

BWA-MEM. Thuật toán đầu tiên BWA-backtrack được thiết kế cho việc đọc chuỗi

trình tự Illumina lên tới 100bp, trong khi 2 thuật toán kia dùng cho các trình tự có

khả năng đọc cao hơn, dao động từ 70 bp đến 1Mbp. BWA-MEM và BWA-SW

chia sẻ các chức năng tương tự nhau, ví dụ như hỗ trợ khả năng đọc cao và sắp xếp

các trình tự. Tuy nhiên, BWA-MEM là chương trình mới nhất và được khuyến cáo

dùng cho các kết quả có yêu cầu chất lượng, độ chính xác cao, và nhanh hơn. Thêm

vào đó, BWA-MEM còn có hiệu suất tốt hơn so với BWA-backtrack trong khoảng

đọc 70-100bp. Đối với tất cả các thuật toán của BWA, việc cần thiết đầu tiên là phải

cấu trúc được FM-index cho các gen tham khảo (sử dụng lệnh index). Các thuật

toán sắp xếp được thực hiện theo lệnh ―aln/samse/sample‖, ―bwasw‖ đối với BWA-

SW và ―mem‖ đối với BWA-MEM.

Picard là bộ công cụ được xây dựng trên nền tảng Java nhằm thao tác trên tập

tin định dạng SAM, BAM. Picard MarkDuplicates sẽ kiểm tra việc sắp xếp dữ liệu

trong tập SAM và BAM qua đó cung cấp vị trí các phân tử trùng lặp.

Gióng hàng lại đoạn trình tự xung quanh indel, chuẩn hóa lại nucleotide (phát

hiện lỗi hệ thống trong điểm chất lượng của nucleotide) bằng công cụ GATK.

2.3.4.2. Phân tích, xác định, chú giải và sàng lọc các biến thể

a- Xác định và chú giải biến thể

GATK là bộ công cụ phân tích hệ gen được phát triển tại Viện Broad để phân

tích dữ liệu trình tự có thông lượng cao. Gói phần mềm này cung cấp một loạt các

công cụ phân tích khác nhau, tập trung chính vào việc phát hiện các biến thể và kiểu

gen cũng như nhấn mạnh vào việc cung cấp dữ liệu có độ chính xác cao.

Để tăng độ tin cậy của quá trình phân tích các biến thể được phát hiện, chúng

tôi sử dụng phần mềm GATK để loại bỏ những biển thể giả. Chỉ tiêu cần áp dụng

lọc các biến thể indel là: QD < 2.0, FS > 200.0, với các biến thể SNP là: |QD < 2.0 ||

FS > 60.0|.

Trong đó QD (QualByDepth) là độ tin cậy khi gọi tên biến thể, được tính bằng

chiều sâu của mỗi trình tự đọc hỗ trợ cho một biến thể. Chỉ số này được tính theo

công thức QUAL/AD. Chỉ số Qual là tổng điểm chất lượng của nucleotid tại vị trí

xảy ra biến thể và AD là số lượng allen chứa vị trí xảy ra biến thể bao gồm cả allen

chưa lọc và allen tham chiếu.

FS (Strand bias estimated using Fisher's Exact Test) là giá trị của phép thử

Fisher's Exact nhằm xác định độ lệch chuỗi trong các đoạn trình tự (có những

variant chỉ được phát hiện trên sợi hoặc trên sợi ngược). Giá trị FS càng cao thì

đoạn trình tự càng có khả năng bị lệch. Các thông số được lựa chọn dựa theo

khuyến cáo của phần mềm GATK.

Phần mềm SnpEff sử dụng để phân chia các biến thể thành các nhóm theo

mức độ ảnh hưởng chức năng của biến thể. Đây là công cụ chú thích và dự báo ảnh

hưởng của các biến thể gen (như thay đổi amino acid). Dữ liệu đầu vào của công cụ

này là các biến thể được dự đoán (SNPs, chèn, xóa và MNPs), là kết quả của giải

trình tự, và có định dạng VCF (Variant Call Format). Trong dữ liệu đầu ra, SnpEff

sẽ phân tích các biến đầu vào để chú giải và tính toán các tác động mà các biến thể

có thể tạo ra trên gen. SnpEff đưa ra các kết quả như sau: Kiểu gen và các điểm bị

ảnh hưởng bởi biến thể; Vị trí của các biến thể; Làm thế nào mà các biến thể ảnh

hưởng đến quá trình tổng hợp protein; So sánh với các dữ liệu khác để tìm các biến

thể đã biết.

b- Sàng lọc các biến thể trên các gen chứa biến thể liên quan đến bệnh tự kỷ

Bước 1: Lọc các biến thể trên các gen liên quan đến bệnh thần kinh và các

biến thể trên 101 gen được xác định là liên quan đến bệnh tự kỷ

Bước 2: Lọc các biến thể có điểm MQ>40.

MQ là chỉ số đánh giá chất lượng gióng hàng được tính theo công thức MQ = -

10log10P với P là xác suất đoạn trình tự bị gióng hàng sai vị trí. Với MQ = 40, xác

suất gióng hàng sai lệch là 1/10000, có nghĩa là cứ 10.000 đoạn trình tự được gióng

hàng thì chỉ có 1 đoạn trình tự bị gióng hàng sai. Độ chính xác tương đương

99,99%.

Bước 3: Lọc các biến thể có tiềm năng gây bệnh dựa trên sự đánh giá ảnh

hưởng của biến thể đến chức năng của protein bằng 2 công cụ phân tích SIFT_Pred

và Polyphen 2.

Các biến thể có SIFT_Pred=D và Polyphen 2=D được lựa chọn.

Với công vụ SIFT, các nhà phân tích có thể dự đoán xem một sự thay thế

amino acid có khả năng ảnh hướng đến chức năng của protein hay không, dựa trên

sự tương đồng về trình tự và tương tự hóa lý (Physico-chemical) giữa các amino

acid thay thế. Dữ liệu cung cấp cho mỗi amino acid thay thế là chỉ số và dự đoán

định tính (hoặc dung nạp hoặc gây hại). Chỉ số này là tỉ lệ mà amino acid được thay

thế có dung nạp hay không, vì vậy chỉ số gần với mức 0 tương tự với việc sẽ gây

hại. Dự đoán định tính sẽ được đưa ra từ chỉ số, như vậy sự thay thế với chỉ số

<0.05 được gọi là gây hại và ngược lại sẽ là dung hợp.

Công cụ POLYPhen2 dự đoán sự ảnh hưởng của amino acid thay thế trên cấu

trúc và chức năng của protein sử dụng sự tương đồng về trình tự, chú thích Pfam,

cấu trúc 3D, từ PDB, và một số cơ sở dữ liệu và công cụ khác (bao gồm cả DSSP,

ncoils…). Chỉ số Polyohen đưa ra xác suất mà việc thay thế là có hại, vì vậy giá trị

gần với mức 1 sẽ được hiểu như là có hại (chú ý rằng điều này ngược hẳn với

SIFT). Dự đoán định tính dựa trên tỉ lệ dương tính giả (False Positive Rate hay còn

gọi là tỉ lệ báo động giả) của việc phân loại phương thức được sử dụng để dự đoán.

Theo hướng dẫn của phần mềm đánh giá này, các biến thể có điểm đánh giá trong

khoảng 0,957 đến 1 được cho là có hại (D-probably damaging); thang điểm trong

khoảng 0,453 - 0,956 là có thể gây hại (P-possibly damaging) và các biến thể có

điểm đánh giá trong khoảng 0 - 0,452 là an toàn (B-benign).

Bước 4: Lọc các biến thể không có trong ngân hàng dbSNP 142.

Biến thể chưa xuất hiện trong cơ sở dữ liệu dbSNP 142 là những biến thể mới,

được coi là biến thể tiềm năng cho những phân tích tiếp theo.

2.3.5. Nhân gen bằng kĩ thuật PCR

Nguyên tắc của PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp

trong ống nghiệm các DNA mới, từ mạch khuôn trong môi trường dư thừa dNTP và

các cặp mồi đặc hiệu. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn

để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo. Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n.

2.3.6. Giải tr nh tự gen tự động trên máy Sanger

Trình tự gen được xác định trên máy xác định trình tự tự động Sequencer ABI

3500 genetic analyzer kết hợp với sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.1 Cycle

Sequencing.

- Thành phần hỗn hợp sử dụng trong xác định trình tự DNA bao gồm cả

dNTPs và ddNTPs trong đó ddNTPs là 4 loại nucleotide được đánh dấu bằng các

chất phát huỳnh quang khác nhau.

- Mồi sử dụng để giải trình tự (trình bày trong phần hoá chất). Phản ứng gắn

các nucleotide đánh dấu vào sợi DNA tổng hợp trên sợi khuôn được tiến hành trên

máy PCR. Quá trình tổng hợp kéo dài chuỗi sẽ không tiếp tục diễn ra khi ddNTP

được lắp vào, kết quả là tạo ra một bộ các đoạn có chiều dài hơn kém nhau một

nucleotide. Sau đó sản phẩm PCR được điện di trên gel có độ phân giải cao, cho

phép phân biệt được các sợi đơn hơn kém nhau một nucleotide. Chu trình nhiệt trên máy Eppendorf G (CHLB Đức) như sau: 90oC trong 1 phút, 25 chu kỳ (96oC trong 10 giây, 50oC trong 5 giây), 60°C trong 4 phút và giữ mẫu ở 4oC.

Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng phương pháp tủa cồn/EDTA: bổ

sung 4 l EDTA 125 mM pH 8,0 và 60 l cồn 100% vào ống chứa sản phẩm PCR.

Đảo nhẹ hỗn hợp và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng/15 phút

ở 4oC. Loại bỏ cồn. Rửa tủa bằng 60 l cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/10 phút và làm

khô. Bổ sung 10 l Hi–DiTM formamide và biến tính ở 95oC trong 5 phút. Các mẫu

được cho vào các giếng của khay đựng mẫu. Điện di trong ống vi mao quản 80 cm x

50 m chứa POP- 4TM.

2.3.7. Phân tích các gen trong mối tƣơng tác

Để phân tích các gen liên quan đến ASD, dữ liệu các gen chứa biến thể ở từng

bệnh nhân được đưa vào hệ thống ASD@Princeton của trường đại học Princeton.

ASD@Princeton là một giao diện web dùng để nghiên cứu các gen liên quan

đến bệnh tự kỷ do trường đại học Princeton xây dựng lên (Krishnan et al, 2016).

Thông qua cổng thông tin tương tác này, người truy cập có thể tìm hiểu sự

tương tác của các gen trong toàn bộ hệ gen, các gen trong các con đường sinh học,

các tín hiệu não và các CNV liên quan đến tự kỷ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi

phân tích các mối tương quan của các gen liên quan đến các đặc điểm đặc trưng

nhất ở người bệnh tự kỷ bao gồm: biểu hiện hành vi, giao tiếp, tương tác xã hội.

Sự tương tác giữa các gen là một vấn đề phức tạp. Trong nghiên cứu này, sự

tương tác giữa các gen được đánh giá dựa trên các công cụ tin sinh học như

GIANT và JASPAR. Đây là các chương trình dự đoán mức độ ảnh hưởng, tương

tác, liên quan giữa các gen. Trong đó, mạng lưới GIANT tích hợp 1.540 bộ dữ liệu

quy mô bộ gen, bao gồm khoảng 61.000 trường hợp từ 25.000 công bố và bao gồm

cả các phép đo biểu hiện và tương tác. Phần mềm này sẽ cho người dùng các thông

tin liên quan đến mức độ tương tác, sự nhiễu loạn trong mức độ di truyền, hóa học,

các thông tin về các microRNA mục tiêu giữa 2 gen (Wong AK et al, 2018).

JASPAR đánh giá mối tương tác liên quan đến các yếu tố phiên mã (Khan A et

al,2018).

Trong đó, sự tương tác giữa các gen được đánh giá dựa trên chỉ số tin cậy.

Chỉ số này càng gần 1 thì mức độ tương tác giữa các gen được dự đoán là càng đáng

tin cậy. Chỉ số độ tin cậy được tính toán dựa trên sự đồng biểu hiện và liên kết các

yếu tố phiên mã, sự nhiễu loạn trong mức độ di truyền và hóa học (Khan A et

al,2018).

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. TÁCH CHIẾT DN T NG S

Để thực hiện phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới, mẫu DNA tổng số

được tách bằng bộ kit QIAamp DNA Blood Mini Kit – QIAGEN (Hình 3.1). Kết

quả thu được DNA tổng số có hàm lượng và độ tinh sạch cao (Bảng 3.1), đảm bảo

chất lượng để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.

H nh 3.1. Kết quả tách DNA tổng số từ mẫu máu toàn phần

Bảng 3.1: Chất lƣợng DNA tổng số

STT

Kí hiệu

Nồng độ DN (ng/µl)

A260 nm/ A280 nm

1,8571

T01

63,815

1,9156

T02

62,095

1,8763

T03

62,933

1,8328

T06

58,997

1,8865

T07

45,521

1,9018

T08

55,535

1,8649

T09

46,763

3.2. GI I TR NH TỰ TOÀN BỘ VÙNG Ã HÓ

3.2.1. Kết quả t o thƣ viện DNA

Chuẩn bị thư viện các đoạn DNA có gắn adapter là bước đầu tiên trong quy

trình giải trình tự thế hệ mới (NGS) và cũng là chìa khóa xác định sự thành công

của thí nghiệm và độ tin cậy của kết quả.

Để kiểm tra kích thước của đoạn DNA, chúng tôi kiểm tra sự phân bố kích

thước mẫu bằng cách chạy mẫu trên máy Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer

sử dụng một chip DNA 1000.

Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện DNA được thể hiện trên hình 3.1. Tất cả

các thư viện đều có chất lượng tốt, nồng độ cao, đạt yêu cầu cho bước nghiên cứu

tiếp theo với nồng độ lần lượt của các mẫu T01, 02, 03, 06, 07, 08 và 09 là 28,9,

43,9, 35,5, 47,2, 38,6, 20,1 và 37,9 ng/ul (Hình 3.2 và Phụ lục 02). Theo tiêu chuẩn

của bộ kit SureSelect V5+UTR-post, các mẫu cần đạt nồng độ trên 13 ng/ul và độ

dài trung bình mẫu khoảng 220bp – 350bp.

T01: 28,9 ng/ul

Hình 3.2. Kết quả kiểm tra chất lƣợng thƣ viện DNA

3.2.2. Kết quả giải tr nh tự gen trên máy Illumina

3.2.2.1. Kiểm định chất lượng giải trình tự gen

Sau khi đưa mẫu vào máy giải trình tự gen, việc chạy máy kết thúc sẽ cho dữ

liệu thô đầu tiên. Để đánh giá, kiểm soát chất lượng và nhận diện các lỗi trong dữ

liệu thì việc đầu tiên chính là kiểm định chất lượng. Bước này đặc biệt quan trọng vì

nó đảm bảo cho các bước phân tích tiếp theo. Đối với máy giải trình tự gen thế hệ

mới Illumina thì số liệu thô ban đầu được định dạng dưới file fastq, file này bao

gồm 4 dòng ví dụ như hình 3.3.

Hình 3.3. H nh ảnh minh họa file kiểm định chất lƣợng

Dòng 1: ID-tên kí hiệu cho thông tin nhận dạng mẫu

Dòng 2: trình tự nucleotide

Dòng 3: dòng định danh điểm chất lượng -dấu cách (+)

Dòng 4: dòng điểm chất lượng

Dữ liệu thu được từ máy giải trình tự gen được định dạng dưới dạng file fastq.

Kết quả này đưa ra các chỉ số thống kê về chất lượng dữ liệu và cảnh báo nếu quá

trình có vấn đề sai sót xảy ra. Chỉ số thống kê được tóm tắt dưới dạng đồ thị và

bảng biểu. Biểu đồ chất lượng từng base dữ liệu được phân chia thành 3 mức, có

màu sắc khác nhau (Hình 3.4 và phụ lục 03). Trong đó, quality (cột dọc) trên 28

(vùng màu xanh) được đánh giá là rất tốt, trên 20 (vùng màu vàng) là tốt (đây là

mức thường được sử dụng là hạn mức threshold cho chất lượng dữ liệu), dưới 20

(vùng màu hồng) là những dữ liệu có khả năng bị lỗi cao hơn mức chấp nhận được

và có thể xem xét để cắt bỏ.

Kết quả hình 3.2 cho thấy, chất lượng đọc ở các mẫu là rất tốt, đều nằm trong

vùng màu xanh, điểm chất lượng ở Read 1 của các mẫu T01, 02, 03, 06, 07, 08, và

09 lần lượt từ 32, 30, 32, 28, 30, 31, và 34 trở lên (Hình 3.4 và phụ lục 03).

Mẫu T01 – Read 1

Hình 3.4. Chất lƣợng dữ liệu của FastQ của các mẫu

Kết quả bảng thống kê thông tin chất lượng đọc cho thấy các mẫu đều thu

được số trình tự đọc (read) rất lớn. Dung lượng các mẫu cao, đạt từ 7,8 đến 10,7

Gbp (Bảng 3.2), với tổng số trình tự đọc từ 78.204.142 đến 106.183.606. Hàm

lượng GC của các mẫu trung bình đều từ 47% trở lên.

Bảng 3.2. Bảng thông tin chất lƣợng đọc của các mẫu giải tr nh tự

Tổng số Nu

%GC

Q20 (%) Q30 (%)

Tên mẫu

Tổng số trình tự đọc

T01

7.898.618.342

78.204.142

98,2

97,0

47,8

T02

9.005.484.816

89.163.216

98,3

97,2

47,4

T03

8.005.656.526

79.263.926

98,3

97,1

47,7

T06

8.615.935.896

85.306.296

97,9

96,0

47,6

T07

9.140.252.146

90.497.546

97,1

95,0

47,0

T08

9.496.766.794

94.027.394

97,2

95,6

47,5

T09

47,4

10.724.544.206

106.183.606

97,9

96,6

Ở đây tỷ lệ % GC trên toàn bộ trình tự trong mẫu phân bố đạt chuẩn với tỷ lệ

trung bình % GC của hệ gen phân tích (Tỷ lệ % GC > 15% là đạt chuẩn – Theo

hãng Illumina). Tỷ lệ Q30 của các mẫu đều trên 95% (tỷ lệ đọc có điểm chất lượng

Phred trên 30). Tỷ lệ Q20 cũng đều trên 97% (tỷ lệ đọc có điểm chất lượng Phred

trên 20) (Bảng 3.2). Các chỉ số này cho thấy, chất lượng đọc trình tự rất tốt, kết quả

đạt độ tin cậy cao.

3.2.2.2. Kết quả gióng hàng và chuẩn hóa chất lượng trình tự đọc

Gióng hàng dữ liệu với hệ gen tham chiếu hg19 và loại bỏ vị trí phân tử trùng

lặp bằng cách sử dụng các phần mềm tin sinh học chuyên sâu như: BWA và Picard

(Bảng 3.3).

Bảng 3.3. Kết quả gióng hàng của các mẫu giải tr nh tự với hệ gen tham chiếu

Tổng số trình tự đọc

thuộc

Tên mẫu

Số đoạn (%) trình tự gióng hàng thành công

Số đoạn (%) trình tự sau khi loại bỏ phân tử trùng lặp

(72,5%)

Từ bảng 3.3 cho thấy sử dụng công cụ BWA cho khả năng gióng hàng tốt, với

tỷ lệ gióng hàng thành công đến 99,9% cho tất cả các mẫu. Sau khi sử dụng Picard

để loại bỏ phân tử trùng lặp, 97,1– 97,9% số đoạn trình tự đã gióng hàng được giữ

lại. Các đoạn trình tự được đối chiếu vào vùng gen quan tâm (vùng mã hóa và vùng

intron gần vùng mã hóa) tỷ lệ thành công từ 72,5 đến 77,4% (Bảng 3.3).

3.3. XÁC ĐỊNH BIẾN THỂ DI TRU ỀN Ở BỆNH NHÂN TỰ KỶ

3.3.1. Xác định và chú giải biến thể

Sử dụng bộ công cụ GATK để xác định biến thể, phần mềm SnpEff sử dụng

để phân chia các biến thể thành các nhóm theo mức độ ảnh hưởng chức năng của

biến thể. Từ bảng kết quả 3.4 cho thấy, mẫu số T01 cho tổng số SNP là 103.840,

tổng số Indel là 14.843 và % tìm thấy trên dbSNP142 là 97,3%. Tương tự, 6 mẫu

bệnh nhân còn lại lần lượt có các chỉ số như trên được tổng kết và trình bày trong

bảng 3.4. Ngoài ra, kết quả thu được từ 7 nhóm biến thể thì trong đó có đến hơn

97% số biến thể là đã được đăng ký trong ngân hàng dbSNP142 (Bảng 3.4).

Bảng 3.4. Kết quả xác định và chú giải biến thể

Tên biến thể

Mẫu T01

Mẫu T02

Mẫu T03

Mẫu T06

Mẫu T07

Mẫu T08

Mẫu T09

Tổng SNP

103.840 105.091 103.809 104.497 104.022 103.954 107.192

Biến thể đồng nghĩa

11.488

11.539

11.322

11.417

11.276

11.447

11.664

Biến thể sai nghĩa

10.546

10.734

10.540

10.456

10.423

102.000 10.644

Thêm bộ mã hóa kết thúc

Mất bộ ba mã kết thúc

14.843

15.581

14.898

15.077

14.943

14.793

16.192 Tổng số biến thể thêm mất

284

279

273

283

276

275

306

Đột biến lệch khung đọc

Thêm bộ ba mã hóa

163

156

148

158

155

154

Mất bộ ba mã hóa

207

174

178

185

198

thấy

trên

97,3

97,2

97,4

97,3

97,1

tìm % dbSNP142

Sau quá trình lọc, những gen/biến thể được giữ lại thỏa mãn các điều kiện:

 Gen có khả năng gây ra bệnh liên quan thần kinh

 Có chỉ số MQ>40 (mapping quality)

 SIFT_Pred=D, PolyPhen 2 _ Pred =D (Damaging)

 Biến thể không có trong cơ sở dữ liệu dbSNP 142

Bảng 3.5. Số lƣợng biến thể sau các bƣớc lọc của 07 bệnh nhân

liệu

SIFT_Pred=D

101 Tên mẫu Dữ gốc

Thuộc gen ASD

Không có trong dbSNP 142

Và PolyPhen 2 _ Pred =D

319

T09

12

22

123.386

167.470

304

Ở bảng kết quả 3.5 cho thấy, dữ liệu gốc của mẫu T01 là 118.687 biến thể trên

các gen có liên quan đến bệnh thần kinh thì trải qua bước lọc chỉ số MQ >40 (thuộc

các gen có tiềm năng gây bệnh) còn 164.980 biến thể. Tiếp tục lọc qua bước các

biến thể bị đánh giá là có ảnh hưởng đến chức năng protein (SIFT_Pred=D và

PolyPhen 2 _ Pred =D (Damaging)) được giữ lại còn 330. Trong đó, có 14 biến thể

quan tâm không có trong cơ sở dữ liệu dbSNP142, 16 biến thể trên các gen đã biết

liên quan đến ASD. Tương tự, 6 mẫu còn lại trải qua các bước lọc thì số lượng biến

thể còn lại được trình bày chi tiết trong bảng 3.5.

Với hy vọng tìm ra các biến thể nằm trong các gen tiềm năng liên quan đến

bệnh tự kỷ nên nghiên cứu này tập trung nghiên cứu các biến thể trên các gen mới,

và không có trong ngân hàng dbSNP. Vì vậy, số lượng biến thể được xác định trong

ngân hàng dbSNP được lọc riêng. dbSNP là một kho lưu trữ mở, bao gồm thông tin

các biến thể di truyền trong và giữa các loài khác nhau được phát triển bởi Trung

tâm thông tin Công nghệ sinh học – NCBI phối hợp với Viện Nghiên cứu quốc gia

về gen người - NHGRI. dbSNP được biết đến là các đa hình trung tính, đa hình liên

quan đến một kiểu hình cụ thể (Hakamata et al. 1992). Vì thế, sau các bước lọc, số

lượng biến thể đã được loại bỏ đáng kể.

3.3.2. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T01

3.3.2.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T01.

Sau quá trình phân tích và chọn lọc bằng các phần mềm tin sinh học, ở bệnh

nhân T01, dữ liệu các biến thể nằm trên các gen có trong danh sách 101 gen ASD

gồm 16 biến thể trên 12 gen được xác định: DPP6, GRIN2B, MED12, NEGR1,

PDE10A, PTCHD1, PTEN, SMC1A, ST7, TSC2, CACNA1E, SCN8A (Bảng 3.6).

Bảng 3.6. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân

T01

STT Gen

trên

NST

Thay đổi cDN

trí

Vị DNA

Dạng biến thể

CASK

41.377.023

chrX

c.*2647_*2649delGCT

Dị hợp tử

CACNA1E

181.754.803

chr1

c.5680-46C>T

Dị hợp tử

GRIN2B

13.828.834

chr12

c.1011-41C>G

Dị hợp tử

MED12

70.352.617

chrX

Đồng hợp tử

c.4416-77_4416- 53delCTCTTCTCTTCTCTT CTCTTCTCTT

NEGR1

71.872.034

chr1

c.*1095G>T

Dị hợp tử

PDE10A

165.845.031

chr6

c.694-72delT

Đồng hợp tử

PDE10A

165.845.033

chr6

c.694-73G>C

Đồng hợp tử

PTCHD1

23.352.904

chrX

c.-9_-9insGCC

Đồng hợp tử

PTEN

89.726.665

chr10

c.*1436_*1437insG

Đồng hợp tử

PTEN

89.726.672

chr10

c.*1443_*1444insG

Đồng hợp tử

PTEN

89.726.678

chr10

c.*1449_*1450insG

Đồng hợp tử

SCN8A

52.163.789

chr12

c.3490+20G>A

Đồng hợp tử

SMC1A

53.449.487

chrX

c.63C>T

Đồng hợp tử

ST7

116.862.920

chr7

c.1644T>A

Dị hợp tử

TSC2

2.115.438

chr16

c.1600-82G>A

Dị hợp tử

TSC2

2.132.437

chr16

c.3815T>G

Dị hợp tử

Từ kết quả giải trình tự gen kết hợp áp dụng các phầm mềm tin sinh học và

các ứng dụng về dự đoán, tương tác của các gen nhạy cảm với ASD của trường Đại

học Princeton (asd.priceton.edu), các gen được phân tích sâu hơn. Các gen và các

mối liên kết chức năng trong các biểu hiện bệnh đặc trưng của các bệnh nhân tự kỷ

như khiếm khuyết trong các lĩnh vực: Hành vi, giao tiếp, tương tác xã hội được

phân tích. Trong giao diện của cổng thông tin asd.priceton.edu, các gen có đánh dấu

viền đen là các gen do người đọc đưa vào, các gen có màu xanh là các gen đã được

cài đặt trong hệ thống.

Hình 3.5. Sự tƣơng tác của các gen ở bệnh nhân T01

Kết quả phân tích sự tương tác của các gen liên quan đến ba biểu hiện đặc

trưng nhất ở bệnh nhân T01 cho thấy, các gen tham gia là tương đối giống nhau, và

ở cả 3 biểu hiện nghiên cứu, 2 gen chứa biến thể ở bệnh nhân T01 là DPP6 và

CASK đều tham gia (Hình 3.5). Trong đó, gen DPP6 có mối liên quan chặt chẽ với

gen NTRK3, gen CASK tương tác với gen ATP2B2. Tuy nhiên, ở mỗi biểu hiện mức

độ quan trọng của các gen trong mối tương tác có sự khác biệt. Gen GNAO1, AFF2,

NEUROD2, ATP2B2 là những gen đã được xác định sẵn trong hệ thống ở biểu hiện

hành vi, còn gen CAMKB2 là gen được xác định trong biểu hiện giao tiếp, thể hiện

ở hình đại diện màu xanh.

Theo đánh giá của hệ thống, chỉ số tin cậy của mối tương tác giữa gen DPP6

và NTRK3 là 0,65. Chỉ số này được tính toán dựa trên 93% mức độ đồng biểu hiện,

4,2%, sự liên kết các yếu tố phiên mã và 2,8% sự nhiễu loạn trong mức độ di truyền

và hóa học giữa 2 gen. Tương tự, chỉ số tin cậy của mối tương tác giữa gen CASK

và ATP2B2 là 0,6. Trong đó, mức độ đóng góp dữ liệu của sự đồng biểu hiện, sự

liên kết các yếu tố phiên mã và sự nhiễu loạn trong di truyền hóa học giữa 2 gen lần

lượt là 86%, 6,2% và 7,8%.

3.3.2.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T01

Bảng 3.7. Thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T01

STT

Tên gen

NST

HGVS.c

HGVS.p

ATP2B3

chrX

c.3538A>C

p.Asn1180His

ATP2B3

chrX

c.3539A>C

p.Asn1180Thr

BCL11A

chr2

c.86A>G

p.Asp29Gly

CDK13

chr7

c.4361C>A

p.Pro1454Gln

CSMD2

chr1

c.6584G>A

p.Gly2195Glu

DNAH9

chr17

c.308T>A

p.Phe103Tyr

HIP1R

chr12

c.2948C>T

p.Thr983Ile

KNDC1

chr10

c.902G>A

p.Arg301His

LRRC7

chr1

c.2359G>A

p.Glu787Lys

MUC5B

chr11

c.3445G>A

p.Asp1149Asn

MYCBP2

chr13

c.6355T>C

p.Phe2119Leu

PITPNM3

chr17

c.2044C>T

p.Arg682Cys

SMTN

chr22

c.1652C>A

p.Thr551Asn

ZDBF2

chr2

c.1150G>A

p.Asp384Asn

HGVS.c: Variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ DNA)

HGVS.p: Nếu variant là mã hóa, thì mô tả các variant sử dụng ký hiệu HGVS

(cấp độ Protein)

Từ kết quả giải trình tự exome, qua phân tích và sàng lọc, những biến dị tiềm

năng này sẽ được phân tích tiếp bằng 2 công cụ là SIFT (sorting intolerant from

tolerant) và PolyPhen (polymorphism phenotyping). Kết quả bệnh nhân T01 có 14

biến thể quan tâm không có trong cơ sở dữ liệu dbSNP142 trên các gen: ATP2B3,

BCL11A, CDK13, CSMD2, DNAH9, HIP1R, KNDC1, LRRC7, MUC5B, MYCBP2,

PITPNM3, SMTN và ZDBF2 (Bảng 3.7).

3.3.3. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T02

3.3.3.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T02.

Bảng 3.8. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T02

STT Gen

trí

trên

NST

Thay đổi cDN

Vị DNA

Dạng biến thể

CACNA1I 40.058.186

chr22

c.3118A>G

Đồng hợp tử

CASK

41.376.931

chrX

c.*2741dupT

Dị hợp tử

CDKL5

18.665.514

chrX

c.2797+1304C>T

Đồng hợp tử

FOXP1

71.004.981

chr3

Dị hợp tử

c.*3416_*3417insTGTG TGTG

KLHL3

136.954.020

chr5

c.*3764_*3766delATT

Đồng hợp tử

KLHL3

136.954.578

chr5

c.*3207_*3208delAA

Dị hợp tử

KLHL3

136.954.583

chr5

c.*3201_*3203dupTTT

Đồng hợp tử

MED12

70.352.617

chrX

Đồng hợp tử

c.4416-77_4416- 53delCTCTTCTCTTCT CTTCTCTTCTCTT

SCN2A

166.231.520

chr2

c.4254+44G>T

Dị hợp tử

SCN3A

166.020.893

chr2

c.602+9C>T

Đồng hợp tử

SCN5A

38.648.062

Chr3

c.1140+98G>A

Đồng hợp tử

SHANK2

70.766.646

chr11

c.914-23973delT

Dị hợp tử

SLC6A4

28.522.169

chr17

c.*3305T>C

Dị hợp tử

TCF4

53.131.208

chr18

c.513+97_513+98delTC Đồng hợp tử

VPS13B

100.149.084

chr8

c.1651+104T>G

Dị hợp tử

ZEB2

145.255.438

chr2

c.73+19407C>T

Đồng hợp tử

ZEB2

145.255.440

chr2

c.73+19405G>A

Đồng hợp tử

Kết quả sau các bước lọc, bệnh nhân T02 có 17 biến thể nằm trên 15 gen đã

biết liên quan đến ASD: CASK, CDKL5, FOXP1, KLHL3, MED12, SCN2A,

SHANK2, SHANK2, SLC6A4, TCF4, VPS13B, ZEB2, CACNA1I, SCN3A, SCN5A

(Bảng 3.8) .

Để phân tích kỹ hơn, các gen này được đưa vào hệ thống phân tích

asd.priceton.edu.

Hình 3.6. Sự tƣơng tác của các gen ở bệnh nhân T02

Kết quả cho thấy mối tương quan của các gen trong ba biểu hiện đặc trưng ở

người bệnh tự kỷ. Trong các gen chứa biến thể của bệnh nhân T02, có 2 gen quan

trọng, tham gia vào các biểu hiện đặc trưng trong nghiên cứu này là SHANK 2 và

CASK (Hình 3.6). Gen CASK có mối tương quan mạnh với gen ATP2B2, gen

SHANK2 tương quan với gen LARGE và OLFM1. Trong biểu hiện hành vi, có 3 gen

được xác định trong hệ thống là ADCY1, ATP2B2, EFNB3.

Mức độ tương tác giữa gen CASK và ATP2B3 đã được phân tích trong ở bệnh

nhân T01. Sự tương tác còn lại đáng chú ý là gen SHANK2 tương quan với gen

LARGE và OLFM1. Theo đánh giá của hệ thống, chỉ số tin cậy của mối tương tác

giữa gen SHANK2 và OLFM1 là 0,53. Chỉ số này được tính toán dựa trên 68,2%

mức độ đồng biểu hiện, 17,6% phân tích microRNA mục tiêu, 11,6% sự nhiễu loạn

trong mức độ di truyền, hóa học và 2%, sự liên kết các yếu tố phiên mã giữa 2 gen.

Trong khi đó, chỉ số tin cậy của mối tương tác giữa gen SHANK2 và LARGE là

0,58. Các thông tin đóng góp để tính toán được chỉ số này bao gồm 69,3% sự động

biểu hiện, 11,8% sự liên kết các yếu tố phiên mã, 10,5% sự nhiễu loạn trong mức độ

di truyền, hóa học và 8,4% phân tích microRNA mục tiêu giữa 2 gen.

3.3.3.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T02

Sau khi loại bỏ các biến thể được đánh giá là an toàn, không gây bệnh và các

biến thể nằm trong ngân hàng db142SNP, số lượng các biến thể nằm trên các gen

mới ở bệnh nhân T02 là 16 biến thể. Các biến thể này nằm trên 15 gen: RP1L1,

MYOM3, PDIA5, ADCY2, DST, PKD2L1, CTBP2, MYO1E, MYH13, SDK2,

MUC16, INPP5J, EYS, ATP2B3, GPRASP1 (bảng 3.9).

Trong 15 gen này, gen MUC16 chứa 2 biến thể p.Ala2224Ser,

p.Trp13569Cys. Gen MUC16 là một thành viên của họ muci glycoprotein và còn có

tên gọi khác như: CA-125, gen này mã hóa cho protein MUC16 hay còn gọi là

mucin. Gen MUC16 nằm trên nhiễm sắc thể số 19, ở vị trí 19.1 (19P13.2), bao gồm

83 exon, dài 132499 bp và nằm từ nucleotide 8848844 đến nucleotide 8981342 trên

nhiễm sắc thể số 19.

Bảng 3.9. Thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T02

STT

Tên gen

NST

HGVS.c

HGVS.p

ADCY2

chr5

c.1726A>G

p.Ile576Val

ATP2B3

chrX

c.3538A>C

p.Asn1180His

CTBP2

chr10

c.2868C>A

p.Asn956Lys

DST

chr6

c.12913G>C

p.Glu4305Gln

EYS

chr6

c.5504C>T

p.Ser1835Leu

GPRASP1

chrX

c.688A>C

p.Asn230His

INPP5J

chr22

c.853C>T

p.Pro285Ser

chr19

c.6670G>T

p.Ala2224Ser

8 MUC16

chr19

c.40707G>C

p.Trp13569Cys

9 MUC16

MYH13

chr17

c.5485G>A

p.Glu1829Lys

MYO1E

chr15

c.861C>A

p.Asn287Lys

MYOM3

chr1

c.631G>A

p.Gly211Arg

PDIA5

chr3

c.539C>G

p.Pro180Arg

PKD2L1

chr10

c.302T>C

p.Leu101Pro

RP1L1

chr8

c.4744C>G

p.Arg1582Gly

SDK2

chr17

c.5504G>A

p.Arg1835Gln

HGVS.c: Variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ ADN)

HGVS.p: Nếu variant là mã hóa, thì mô tả các variant sử dụng ký hiệu HGVS

(cấp độ Protein)

Protein MUC16 biểu hiện trên đường niêm mạc ruột và hạch bạch huyết

thường nằm gần lớp niêm mạc. Các cytokine kích hoạt quá trình gây viêm như

TNF-α dẫn đến giảm biểu hiện của gen bài tiết như MUC16, trong khi đó MUC16

lại có vai trò bảo vệ lớp niêm mạc của tế bào chống lại các tác nhân gây viêm ruột.

Chính vì thế, các biến thể trên MUC16 có thể ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện của

bệnh tự kỷ kèm với bệnh rối loạn tiêu hóa. Những bất thường về tiêu hóa không

những có thể ảnh hưởng đến các đặc tính thần kinh và hành vi của người mắc ASD,

mà còn ảnh hưởng đến những quá trình khác như rối loạn miễn dịch, tăng serotonin

huyết và rối loạn chuyển hóa (Rossignol et al, 2012; Frye et al, 2014). Các nghiên

cứu gần đây cho thấy, các triệu chứng về bệnh dạ dày, đường ruột ở trẻ bị mắc

ASD có lỷ lệ cao hơn so với nhóm trẻ chỉ mắc ASD từ 20-70% (Molloy et al, 2003;

Valicenti-McDermott et al, 2006; Ibrahim et al, 2009; Nikolov et al, 2009;

Gorrindo et al, 2012). Hsiao và cộng sự đã chứng minh mối liên hệ mật thiết giữa

triệu chứng rối loạn tiêu hóa và các triệu chứng của bệnh tự kỷ. Bất thường đường

tiêu hóa, chẳng hạn như tăng khả năng thẩm thấu đường ruột, thay đổi thành phần

của hệ vi sinh đường ruột, rối loạn chức năng tiêu hóa và rối loạn bài tiết, đều được

tìm thấy trong các cá nhân ASD. Thực tế cho thấy, những biểu hiện đó đều có thể

ảnh hưởng đến khả năng biểu hiện các triệu chứng khác của bệnh tự kỷ.

Ngoài ra, tăng tính thấm của ruột có thể dẫn đến sự rò rỉ các chất chuyển hóa

có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc được điều chế qua đường ruột và vào máu, điều này

có thể làm giảm mức độ chuyển hóa của vi khuẩn và sự thay đổi trong tiết niệu và

huyết thanh ở các cá nhân tự kỷ. Hơn nữa, các vấn đề tiêu hóa có thể dẫn đến rối

loạn miễn dịch. Theo nghiên cứu của Mizejewski và cộng sự năm 2015, gen

MUC16 liên quan đến khả năng miễn dịch và các vấn đề tiêu hóa, đặc biệt gen này

nằm trong 15 chỉ thị phân tử, thuộc nhóm thứ 3 dùng để đánh giá bệnh tự kỷ

(Mizejewski et al, 2013). Chính vì thế, các biến thể trên gen MUC16 được lựa chọn

để tiến hành giải trình tự Sanger kiểm chứng.

Kết quả kiểm chứng cho thấy, hai biến thể p.Ala2224Ser và p.Trp13569Cys

đều là hai biến thể mới phát sinh ở bệnh nhân 02, không phải là những biến thể di

truyền từ bố mẹ (Hình 3.7, Hình 3.8).

Gen MUC16

Hình 3.7. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể

p.Ala2224Ser trên gen MUC16 ở bệnh nhân T02

Hình 3.8. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể

p.Trp13569Cys trên gen MUC16 ở bệnh nhân T02

3.3.4. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T03

3.3.4.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T03

Sau khi chọn lọc bằng các phần mềm chuyên dụng, 16 biến thể nằm trên 14

gen liên quan đến ASD được tìm thấy ở bệnh nhân T03. Các gen này gồm có:

NTNG1, ZEB2, MBD5, FOXP1, KLHL3, HOXA1, ST7, DPP6, DLGAP2, GRIN2B,

TRPM1, SOX5, UBE3A, RBFOX1, CACNA1C (Bảng 3.10)

Bảng 3.10. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T03

STT Gen

trên

NST

Thay đổi cDN

trí

biến

Vị DNA

Dạng thể

CACNA1C

2.721.137

chr12

c.3846C>T

Dị hợp tử

DLGAP2

1.651.465

chr8

c.*1905_*1906delAA

Dị hợp tử

DPP6

154.592.882

chr7

c.1300-183C>T

Dị hợp tử

FOXP1

71.004.983

chr3

Dị hợp tử

c.*3403_*3414dupTG TGTGTGTGTG

GRIN2B

13.768.499

chr12

c.1428T>C

Dị hợp tử

HOXA1

27.134.983

chr7

c.549C>A

Dị hợp tử

KLHL3

136.954.578

chr5

c.*3207_*3208delAA

Đồng hợp tử

KLHL3

136.954.583

chr5

c.*3201_*3203dupTTT Đồng hợp tử

NTNG1

108.024.677 Chr1

Dị hợp tử

c.*2338_*2338delAAA AAAAAAAAAA

RBFOX1

7.743.418

chr16

Dị hợp tử

c.1059-15639_1059- 15638delTT

ST7

116.778.443

chr7

c.866-45delT

Dị hợp tử

TRPM1

31.362.352

chr15

c.212G>A

Đồng hợp tử

UBE3A

25.583.489

chr15

Dị hợp tử

c.*771_*794dupCTTA GTATATGAAAGGAC AGGGAT

ZEB2

145.275.181

chr2

Dị hợp tử

c.-69-198_-69- 196delCAA

ZEB2

145.275.184

chr2

Dị hợp tử

c.-69-199_-69- 198insGT

Hình 3.9. Sự tƣơng tác của các gen ở bệnh nhân T03

Kết quả phân tích mối tương quan của các gen trong các biểu hiện bệnh, cho

thấy, đối với bệnh nhân T03, chỉ có gen DDP6 tham gia và mối tương quan với các

gen liên quan đến 3 biểu hiện trong nghiên cứu này (Hình 3.9). Cụ thể, gen DPP6

có mối tương tác rất mạnh với gen NTRK3 thể hiện ở đường tương tác màu cam

đậm. NTRK3 là một thụ thể màng, tham gia vào con đường MAPK. NTRK3 đã

được chứng minh có liên quan tới di truyền bệnh tự kỷ, hội chứng Asperge

(Chakrabarti et al., 2009). Các nghiên cứu cho thấy, cho thấy biểu hiện của các sản

phẩm gen NTRK3 khác nhau có liên quan tạm thời với sự hình thành khớp thần kinh

(Valenzuela et al., 1993; Menn et al., 2000). Ngoài ra, các đột biến hiếm gặp trên

NTRK3 đã được tìm thấy có liên quan di truyền với rối loạn ám ảnh cưỡng chế

(Muios-Gimeno et al., 2009).

Mức độ tương tác của gen DPP6 và NTRK3 đã được dự đoán trong mối tương

tác của các gen ở bệnh nhân T01, với chỉ số tin cậy 0,65.

3.3.4.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T03

Bệnh nhân T03 có 8 biến thể trên 8 gen mới FLNC, ADAMTS9, NIN, ASB16,

MUC16, TMPRSS15, KDELR3, ALPI (Bảng 3.11). Trong đó, cũng có 1 biến thể

trên gen MUC16, vì thế, biến thể này được kiểm chứng bằng phương giải trình tự

Sanger.

Tương tự như trường hợp biến thể trên MUC16 ở bệnh nhân T02, biến thể

c.39687T>A, p.Asp13229Glu cũng được lựa chọn để kiểm chứng lại bằng phương

pháp Sanger. Kết quả kiểm chứng cho thấy, đây cũng là một biến thể mới phát sinh

ở bệnh nhân mà không phải do di truyền từ bố mẹ (Hình 3.10).

Bảng 3.11. Thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T03

STT

Tên gen

NST

HGVS.c

HGVS.p

ADAMTS9

chr3

c.5431G>A

p.Asp1811Asn

ALPI

chr2

c.1453G>C

p.Ala485Pro

ASB16

chr17

c.871G>A

p.Ala291Thr

FLNC

chr7

c.5548T>G

p.Leu1850Val

5

KDELR3

chr22

c.35A>G

p.His12Arg

chr19

c.39687T>A

p.Asp13229Glu

MUC16

NIN

chr14

c.4048G>C

p.Ala1350Pro

TMPRSS15

chr21

c.3019G>T

p.Val1007Phe

HGVS.c: Variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ DNA)

HGVS.p: Nếu variant là mã hóa, thì mô tả các variant sử dụng ký hiệu HGVS

(cấp độ Protein)

Hình 3.10. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến

thể p.Asp13229Glu trên gen MUC16 ở bệnh nhân T03

3.3.5. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T06

3.3.5.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T06

Sau các bước chọn lọc, kết quả thu được ở bệnh nhân T06 bao gồm 17 biến

thể trên 15 gen đã biết liên quan đến ASD: ANKRD11, AUTS2, CASK, DOCK4,

DPP6, KATNAL2, KLHL3, NIPBL, RBFOX1, RELN, SHANK2, SOX5, TCF4,

TSC1, TSC2 (Bảng 3.12).

Kết quả phân tích các gen ở bệnh nhân T06 cho thấy, bệnh nhân này có 5 gen

quan trọng, tham gia vào mối tương tác với các gen liên quan đến các biểu hiện

hành vi, giao tiếp, tương tác xã hội. Đó là TSC1, TSC2, NIPBL, SHANK2, DPP6

(Hình 3.11). Trong đó gen TSC1, TSC2 nằm trong danh sách gen của hệ thống,

chứng tỏ sự quan trọng của gen này liên quan đến biểu hiện giao tiếp.

Theo tính toán của hệ thống, chỉ số tin cậy của mức độ tương tác giữa 2 gen

TSC1, TSC2 là 0,62. Chỉ số này được tính toán dựa trên 77,2 % sự tương tác, 14%

trong mức độ di truyền và hóa học giữa 2 gen. Gen NIPBL liên kết với nhiều

mức độ đồng biểu hiện. 5,3% sự liên kết các yếu tố phiên mã, và 3% sự nhiễu loạn

gen, đáng chú ý như gen ZMYM2, PUM2, PNISRM, CRP350. Chỉ số độ tin cậy về

mức độ tương tác giữa gen NIPBL với các gen trên lần lượt là 0,72; 0,74, 0,73 và

0,68. Đối với gen SHANK2, trong mối tương quan này, SHANK2 tương tác mạnh

với gen PLCB1 với chỉ số độ tin cậy là 0,56.

Bảng 3.12. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T06

STT Gen

trí

trên

NST

Thay đổi cDN

Vị DNA

Dạng biến thể

ANKRD11

89.353.340

chr16

Dị hợp tử

c.745-748_745- 747delAA

AUTS2

70.257.473

chr7

c.*1511delA

Dị hợp tử

CASK

41.377.023

chrX

Đồng hợp tử

c.*2626_*2649delGCT GCTGCTGCTGCTGC TGCTGCT

DOCK4

111.512.198

chr7

Dị hợp tử

c.1927-53_1927- 52insA

DPP6

154.685.161

chr7

c.*971_*972insA

Đồng hợp tử

KATNAL2

44.601.085

chr18

c.793-563G>A

Dị hợp tử

KLHL3

136.997.803

chr5

Đồng hợp tử

c.637-84_637- 83insCTTT

NIPBL

37.020.541

chr5

c.5011-20T>C

Dị hợp tử

RBFOX1

7.760.099

chr16

c.1135-526G>C

Dị hợp tử

RELN

103.183.415

chr7

c.6524-91delA

Dị hợp tử

RELN

103.183.417

chr7

c.6524-93delC

Dị hợp tử

SHANK2

70.346.760

chr11

c.2093-62G>T

Dị hợp tử

TCF4

53.131.202

chr18

Dị hợp tử

c.513+95_513+104del TCTCACACAC

TCF4

53.131.202

chr18

Dị hợp tử

c.513+96_513+103del CTCACACA

TSC1

135.770.428

chr9

c.*1194G>A

Dị hợp tử

TSC2

2.138.001

chr16

Dị hợp tử

c.5069-48_5069- 47insGCAGGAAAG

Hình 3. 11. Sự tƣơng tác của các gen ở bệnh nhân T06

3.3.5.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T06

Bệnh nhân T06 có 19 biến thể trên 17 gen: BRF1, ABCA13, ATP2B3, CCNL2,

CIT, CLTCL1, CTBP2, DISP1, FNDC7, MUC16, MUC5B, RSL1D1, RYR3,

SGSM3, TTYH1 và WDFY4 (Bảng 3.13).

Đối với bệnh nhân T06, có 2 gen mang 2 biến thể dị hợp là RYR3 và MUC16.

Ngoài gen MUC16 như đã phân tích ở bệnh nhân T02 và T03, gen RYR3 cũng là

một gen tiềm năng liên quan đến bệnh tự kỷ. Chính vì thế, đột biến trên 2 gen này

được kiểm chứng lại bằng phương pháp Sanger.

Bảng 3.13. Thống kê biến thể của bệnh nhân T06

STT

Tên gen

NST

nh hưởng

p.Ser59Phe

CCNL2

chr1

missense_variant

c.83C>T

p.Ala28Val

CIT

chr12

missense_variant

c.507C>G

p.His169Gln

CLTCL1

chr22

missense_variant

c.1123G>C

p.Gly375Arg

CTBP2

chr10

missense_variant

c.2868C>A

p.Asn956Lys

DISP1

chr1

missense_variant

c.3629A>G

p.Tyr1210Cys

FNDC7

chr1

missense_variant

c.1901T>G

p.Val634Gly

chr19 missense_variant

c.39511C>T

p.Leu13171Phe

MUC16

chr19 missense_variant

c.38605G>A

p.Glu12869Lys

MUC16

MUC5B

chr11

missense_variant

c.3445G>A

p.Asp1149Asn

RSL1D1

chr16

missense_variant

c.17C>G

p.Ser6Trp

14 chr15 missense_variant

c.332T>C

p.Leu111Pro

RYR3

15 chr15 missense_variant

c.9142C>T

p.Arg3048Cys

RYR3

SGSM3

chr22

missense_variant

c.1658C>T

p.Thr553Met

TTYH1

chr19

missense_variant

c.1301C>G

p.Pro434Arg

WDFY4

chr10

missense_variant

c.6482C>T

p.Pro2161Leu

HGVS.c: Variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ ADN)

HGVS.p: Nếu variant là mã hóa, thì mô tả các variant sử dụng ký hiệu HGVS

(cấp độ Protein)

Hình 3.12. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể p.Leu13171Phe trên gen MUC16 ở bệnh nhân T06

Hình 3.13. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể p.Glu12869Lys trên gen MUC16 ở bệnh nhân T06

Kết quả kiểm chứng biến thể trên gen MUC16 cho thấy, 2 biến thể trên gen

này ở bệnh nhân T06 cũng là những biến thể mới, không phải di truyền từ bố hoặc

mẹ (Hình 3.12, Hình 3.13).

Gen RYR3

Như đã trình bày ở phần tổng quan tài liệu, các nghiên cứu trên thế giới cho

thấy rằng trong một số trường hợp tự kỷ có thể là do sự bất thường nội cân bằng Ca2+ trong quá trình phát triển thần kinh (Krey et al, 2007). Mà RYR3 đã được chứng minh có vai trò trong giải phóng ion Ca2+ của kênh canxi cũng như đóng vai trò quan trọng trong việc điều tiết Ca2+ nội bào trong tế bào thần kinh (Fill and

Copello 2002; Lu et al, 2012; Schmunk et al, 2015). Bên cạnh đó, RYR3 còn nằm

trên nhiễm sắc thể 15q14-q15 khu vực nhạy cảm với bệnh tự kỷ (Sorrentino et al,

1993). Chính vì thế, biến thể trên gen RYR3 được xem như ứng cử viên gây bệnh tự

kỷ và hai biến thể trên gen này ở bệnh nhân T06 được lựa chọn để kiểm chứng lại

bằng phương pháp giải trình tự Sanger.

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger (Hình 3.14) cho thấy bệnh

nhân mang hai biến thể thay thế dạng dị hợp. Bệnh nhân thừa hưởng biến thể

p.L111P từ bố và biến thể p.R3048C từ mẹ. Biến thể đầu tiên (p.L111P) xảy ra

trong exon 4, trong đó T được thay thế bằng C ở vị trí 332 trong cDNA, dẫn đến

việc thay thế Leu (L) bởi Pro (P) tại vị trí 111 trên protein RYR3 (Hình 3.15). Biến

thể thứ hai (p.R3048C) đã được quan sát thấy trên exon 65, trong đó C đã được thay

thế bởi T ở vị trí 9142, dẫn đến sự thay đổi của một amino acid ở vị trí 3048, nơi

Arg (R) được thay thế bởi Cys (C) trên protein RYR3 (Hình 3.15).

Hình 3.14. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện

biến thể p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys trên gen RYR3 ở bệnh nhân T06

Hình 3.15. Mô h nh mô phỏng cấu trúc 3D của biến thể p.L111P và

p.R3048C trên gen RYR3 ở bệnh nhân T06

Cha và mẹ của bệnh nhân là những người không có triệu chứng liên quan đến

bệnh tự kỷ nhưng có mang biến thể thay thế c.332 T>C, p.L111P và c. 94.132 C>T,

p.R3048C trong khi hai biến thể được tìm thấy ở người con bị chẩn đoán mắc chứng

tự kỷ, điều đó cho thấy rằng các biến thể thay thế trong gen RYR3 có thể liên quan

với chứng tự kỷ. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả giải trình tự exome

bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới.

Ngoài ra, biến thể p.L111P còn nằm trên vùng domain MIR1 của protein

RYR3. MIR1 nằm tại vị trí amino acid 100 đến 150. Domain MIR được biết đến là

vùng chức năng quan trọng của RYRs (Lajtha et al. 2009) (Hình 3.16).

Hình 3.16. Vị trí 5 domain đầu tiên của protein RYR3 (p.L111P nằm ở domain đầu tiên)

Ion Ca2+ được giải phóng từ lưới nội chất thông qua các kênh RYR3 và sau đó

điều chỉnh hoạt động của các kênh này. Ngoài ra, so sánh các trình tự protein được

mã hóa bởi gen RYR3 của con người với gà, khỉ đột, chuột, cá heo, ngựa, gấu trúc,

bò và mèo cho thấy rằng các amino acid trong hai đột biến không thay đổi trong các

loài khác nhau. Hai điểm biến thể xảy ra trong các amino acid bảo thủ (Hình 3.17).

Từ đó cho thấy vai trò quan trọng của hai amino acid trên các chức năng của protein

RYR3.

Những đột biến xảy ra trong gen này có thể ảnh hưởng đến các chức năng vận chuyển của kênh Ca2+. Do đó, gen RYR3 có thể được coi là một ứng cử viên về

nguyên nhân di truyền trong bệnh tự kỷ.

Qua phân tích và so sánh, những đột biến này có thể dẫn đến những thay đổi trong liên kết protein-protein trong con đường truyền tín hiệu của kênh Ca2+.

Nghiên cứu này cung cấp kiến thức bổ sung cho các đột biến gen liên quan đến

bệnh tự kỷ và có thể góp phần vào việc phát hiện và điều trị rối loạn phát triển thần

kinh này.

Hình 3.17. Tr nh tự amino acid của RYR3 ở các loài khác nhau

3.3.6. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T07

3.3.6.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T07

Bệnh nhân T07 mang 17 biến thể trên 16 gen liên quan đến ASD đã được

biết: ATRX, AUTS2, DLGAP2,FOXP1, KDM5C, KIRREL3, MED12, PTEN,

SHANK2, SMG6, KCNJ10, SOX5, SPAST, ST7, VPS13B, CACNA1H (Bảng 3.14).

Bảng 3.14. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T07

Gen

NST

Thay đổi cDN

biến

ST T

Vị trí trên DNA

Dạng thể

ATRX

76.776.795

chrX

c.7071+85delT

Dị hợp tử

ATRX

76.776.797

chrX

c.7071+84T>A

Dị hợp tử

AUTS2

70.257.473

chr7

c.*1511delA

Dị hợp tử

CACNA1H 1.252.369

chr16

c.1919C>T

Dị hợp tử

DLGAP2

1.651.465

chr8

c.*1905_*1906delAA

Dị hợp tử

DLGAP2

1.651.465

chr8

c.*1906dupA

Dị hợp tử

FOXP1

71.004.981

chr3

c.*3416_*3417insTGTGTGTGTG Dị hợp tử

KCNJ10

chr1

c.*3053C>G

Dị hợp tử

160.012.40 6

KDM5C

53.254.396

chrX

c.-326dupG

Đồng hợp tử

KIRREL3

chr11

c.55+5425T>C

Dị hợp tử

126.864.92 6

MED12

70.352.617

chrX

Đồng hợp tử

c.4416-78_4416- 77insCTCTTCTCTT

SHANK2

70.507.605

chr11

c.1744+90_1744+95delGTGTGT Dị hợp tử

SMG6

2.139.995

chr17

Đồng hợp tử

c.2724-74_2724- 65delTGTGTGTGTG

SPAST

32.366.959

chr2

c.1494-13delT

Dị hợp tử

ST7

chr7

c.151+13428_151+13429delTT

Đồng hợp tử

116.607.17 2

VPS13B

chr8

c.9818-42_9818-41insT

Dị hợp tử

100.847.72 5

16 gen này được đưa vào hệ thống phân tích dữ liệu của trường Đại học

Princeton để phân tích mối tương quan giữa các gen. Kết quả phân tích cho thấy, ở

cả 3 biểu hiện hành vi, giao tiếp, tương tác xã hội, có 4 gen trong số 16 gen này

tham gia đó là ATRX, SPAST, KDM5C, SHANK2. Ngoài ra, gen ATRXN1, PCLB1

những gen có vai trò rất quan trọng, thể hiện kích thước và màu xanh của vòng tròn

đại diện (Hình 3.18).

Hình 3.18. Sự tƣơng tác của các gen ở bệnh nhân T07

Một số mối tương tác gen đáng chú ý trong các biểu hiện này là gen ATRX

tương tác mạnh với gen ZMYM2, MFR, PHF3, PPP1R12A chỉ số độ tin cậy lần lượt

là 0,58, 0,56, 0,55, 0,58. Chỉ sộ độ tin cậy của mức độ tương tác giữa gen SPAST và

PPP1R12A là 0,55. trong khi chỉ số này của sự tương tác giữa gen ATN1 và

KDM5C là 0,61.

3.3.6.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T07

Bệnh nhân T07 có 10 gen mới mang biến thể, tổng số biến thể ở mới là 11

biến thể (Bảng 3.15) . Trong 10 gen HECW2, RYR2, PLCH2, SPEN, ADAMTS9,

RBM47, IQCE, MUC5B, MUC16, UMODL1, tương tự như bệnh nhân T06, hai gen

RYR2 và MUC16 được lựa chọn để tiến hành giải trình tự bằng phương pháp Sanger

kiểm chứng lại biến thể (Hình 3.19).

Bảng 3.15. Thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T07

STT

Tên gen

HGVS.c

HGVS.p

NST

ADAMTS9

c.5431G>A

p.Asp1811Asn

chr3

2

HECW2

chr2

c.1013T>C

p.Ile338Thr

3

IQCE

chr7

c.741G>C

p.Glu247Asp

chr19

c.39499G>C

p.Val13167Met

MUC16

MUC5B

chr11

c.3445G>A

p.Asp1149Asn

PLCH2

chr1

c.1108G>A

p.Val370Met

RBM47

chr4

c.814G>A

p.Gly272Ser

chr1

c.2401C>T

p.Arg801Cys

RYR2

chr1

c.2456A>G

p.Tyr819Cys

RYR2

10

SPEN

chr1

c.7978G>A

p.Val2660Ile

UMODL1

chr21

c.3481C>G

p.His1161Asp

HGVS.c: Variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ ADN)

HGVS.p: Nếu variant là mã hóa, thì mô tả các variant sử dụng ký hiệu HGVS

(cấp độ Protein).

Gen MUC16

Hình 3.19. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể

p.Val13167Met trên gen MUC16 ở bệnh nhân T07

Gen RYR2

Hình 3.20. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể

p.Arg801Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07

Hình 3.21. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể

p.Tyr819Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07

Tương tự như gen RYR3, gen RYR2 có vai trò trong giải phóng ion Ca2+ của kênh canxi cũng như đóng vai trò quan trọng trong việc điều tiết Ca2+ nội bào trong

tế bào thần kinh (Fill and Copello 2002; Lu et al, 2012; Schmunk et al, 2015). Hai

biến thể trên gen này ở bệnh nhân T07 được lựa chọn để kiểm chứng lại bằng

phương pháp giải trình tự Sanger.

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger cho thấy, bệnh nhân T07

mang một biến thể dị hợp tại vị trí c.2401 C>T, gây biến đổi trên protein tại vị trí

801, amino acid Arg bị biến đổi thành Cys. Biến thể này được di truyền từ người

mẹ không mang bệnh. Biến thể xảy ra làm xuất hiện một liên kết Hydro giữa amino

acid Cys801 và Leu803. Đột biến thứ 2 là tại vị trúc.2456A thành G, gây biến đổi

amino acid Tyr thành Cys trên protein tại vị trí 819. Đây là một biến thể mới phát

sinh, không di truyền từ bố hoặc mẹ.

Hình 3.22. Mô h nh mô phỏng cấu trúc biến thể p.Arg801Cys và p.Tyr819Cys

ở bệnh nhân T07

Mô hình mô phỏng cấu trúc 3D (Hình 3.22) của biến thể cho thấy, khi đột biến

xảy ra, làm mất một liên kết Hydro giữa amino acid Pro816 và Cys819. Tuy liên kết

Hydro là những liên kết yếu, những những sự thay đổi này đều ảnh hưởng đến cấu

trúc và chức năng của protein. Có thể thấy, sự kết hợp của 2 biến thể dị hợp này có

thể là nguyên nhân gây biểu hiện bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T07. Đột biến

p.Arg801Cys nằm trên vùng chức năng SPRY (từ amino acid 670 đến 808) của

protein RYR2. Tuy nhiên, chức năng của vùng này vẫn còn đang chưa được khám

phá. Khi so sánh trình tự protein RYR2 ở một số loài như người, lợn, cá ngựa, gà,

tinh tinh, chuột, bò, ngựa, gấu trúc cho thấy, hai điểm xảy ra biến thể đều nằm ở

vùng bảo thủ của các loài (Hình 3.23). Điều này chứng tỏ vị trí quan trọng của điểm

xảy ra biến thể.

Hình 3.23. Tr nh tự amino acid của RYR2 ở các loài khác nhau

3.3.7. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T08

3.3.7.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T08

Kết quả chọn lọc cho thấy, ở bệnh nhân T08 có 15 biến thể, các biến thể này

nằm trên 14 gen liên quan dến ASD: CASK, DLGAP2, DOCK4, FOXP1, GABRB3,

RBFOX1, RELN, SCN1A, SHANK2, SHANK3, SOX5, CACNA1D, CACNA1F,

KCNMA1 (Bảng 3.16).

Sau khi đưa dữ liệu các gen này vào hệ thống phân tích mối tương quan, kết

quả cho thấy sự quan trọng của 2 gen SHANK 2 và CACNA1F khi tham gia vào cả 3

biểu hiện (Hình 3.24). Gen SHANK2 có mối tương tác với gen PLCB1, EFNB2 với

chỉ số độ tin cậy của mức độ tương tác lần lượt là 0,56 và 0,55. PLCB1, EFNB2

cũng là những gen quan trọng trong hệ thống, biểu hiện ở hình tròn đại hiện màu

xanh. Gen CACNA1F liên quan đến gen ACRV1, chỉ số độ tin cậy cho mối tương

tác này là 0,63. Chỉ số này được tính toán dựa trên 95,5 % mức độ đồng biểu hiện,

tố phiên mã giữa 2 gen.

2,9 % sự nhiễu loạn trong mức độ di truyền và hóa học và 1% liên kết các yếu

Bảng 3.16. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân

T08

TT Gen

trí

trên

NST

Thay đổi cDN

Vị DNA

Dạng biến thể

CACNA1D

53,846,077

chr3

c.*644A>G

Dị hợp tử

CACNA1F

49,084,492

chrX

c.1118+6G>A

Dị hợp tử

DLGAP2

1626419

chr8

c.2088C>T

Dị hợp tử

DOCK4

111585015

chr7

Dị hợp tử

c.784-97_784- 90delGTCCATCT

FOXP1

71004981

chr3

Dị hợp tử

c.*3416_*3417insTGTG TGTG

GABRB3

27017979

chr15

c.80+51G>T

Dị hợp tử

KCNMA1

78,645,453

chr10

c.*1571C>T

Dị hợp tử

RBFOX1

7647479

chr16

c.682+46C>A

Dị hợp tử

RELN

103183415

chr7

c.6524-91delA

Dị hợp tử

10 RELN

103183417

chr7

c.6524-93delC

Dị hợp tử

11 RELN

103230032

chr7

c.4145+11C>A

Dị hợp tử

SCN1A

166913130

chr2

c.386-122C>T

Dị hợp tử

SHANK2

70315741

chr11

c.*3233T>C

Dị hợp tử

SHANK3

51113801

chr22

Đồng hợp tử

c.267+122_267+123ins TG

Hình 3. 24. Sự tƣơng tác của các gen ở bệnh nhân T08

3.3.7.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T08

Đối với kết quả chọn lọc các biến thể trên những gen mới, bệnh nhân T08 có

14 biến thể, trên gen: KIAA1109, OR52E8, NFRKB, WHSC1L1, FLG, INSRR,

IL17RC, MUC5B, BCL9L, ENO2, GGA2, SMTNL2, MUC16, BTAF1 (Bảng 3.17).

Bệnh nhân T08 cũng có 1 biến thể c.40707G>C, p.Trp13569Cys trên gen MUC16.

Để nghiên cứu kỹ hơn và làm sáng tỏ mối liên quan giữa gen MUC16 và sự biểu

hiện bệnh ở người bệnh tự kỷ, tương tự như các bệnh nhân khác, biến thể này cũng

được kiểm chứng lại bằng phương pháp giải trình tự Sanger ở cả bố, mẹ và bệnh

nhân. Kết quả kiểm chứng cho thấy, biến thể p.Trp13569Cys trên gen MUC16 ở

bệnh nhân T08 cũng là một biến thể mới phát sinh (Hình 3.25).

Bảng 3.17. Thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T08

STT

Tên gen

NST

HGVS.c

HGVS.p

BCL9L

chr11

c.1861C>A

p.Pro621Thr

BTAF1

chr10

c.5402A>T

p.Asp1801Val

ENO2

chr12

c.86G>C

p.Gly29Ala

FLG

chr1

c.8686G>C

p.Asp2896His

GGA2

chr16

c.1254G>T

p.Leu418Phe

IL17RC

chr3

c.208G>T

p.Ala70Ser

INSRR

chr1

c.1799C>A

p.Thr600Lys

KIAA1109

chr4

c.12998C>T

p.Pro4333Leu

chr19

c.40707G>C

p.Trp13569Cys

MUC16

MUC5B

chr11

c.3445G>A

p.Asp1149Asn

NFRKB

chr11

c.1634T>A

p.Val545Asp

OR52E8

chr11

c.128T>C

p.Val43Ala

13

SMTNL2

chr17

c.1039G>A

p.Val347Met

WHSC1L1

chr8

c.2339G>A

p.Arg780His

HGVS.c: Variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ ADN)

HGVS.p: Nếu variant là mã hóa, thì mô tả các variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ Protein)

Hình 3.25. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến

thể p.Trp13569Cys trên gen ở bệnh nhân T08

3.3.8. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T09

3.3.8.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T09

Bảng 3.18. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân

T09

STT

Gen

trí

trên

NST

Thay đổi cDN

Dạng biến thể

Vị DNA

ANKRD11

89,352,630

chr16

c.745-36C>T

Dị hợp tử

ATRX

76,920,020

chrX

c.3943+114C>T

Đồng hợp tử

AVPR1A

63,543,545

chr12

c.970+100_970+101delAA Dị hợp tử

AVPR1A

63,543,576

chr12

c.970+70_970+71insTGTG Dị hợp tử

CACNA1G

48,653,354

Chr17

c.1591C>A

Đồng hợp tử

CHD7

61,750,154

chr8

c.4186-73A>G

Dị hợp tử

CNTNAP5

124,783,041

chr2

c.-187C>A

Dị hợp tử

DOCK4

111,376,826

chr7

c.5278+147G>A

Dị hợp tử

EHMT1

140,729,610

chr9

c.*205G>A

Dị hợp tử

FOXP1

71,007,347

chr3

c.*1050dupT

Đồng hợp tử

KCNQ5

73,907,763

Chr6

c.*2626A>G

Dị hợp tử

KLHL3

137,013,350

chr5

c.527-8delT

Dị hợp tử

MED12

70,352,617

chrX

Đồng hợp tử

c.4416-78_4416- 77insCTCTTCTCTT

MET

116,423,586

chr7

c.3852+63T>C

Dị hợp tử

NRXN1

50,147,835

chr2

Dị hợp tử

c.*1235_*1246delACACAC ACACAC

NRXN1

50,147,835

chr2

Dị hợp tử

c.*1235_*1244delACACAC ACAC

OPHN1

67,316,686

chrX

c.1686+26T>A

Đồng hợp tử

RBFOX1

7,743,418

chr16

Dị hợp tử

c.1059-15639_1059- 15638delTT

RBFOX1

7,759,304

chr16

c.1134+171C>A

Dị hợp tử

SMC1A

53,401,424

chrX

c.*5600A>G

Đồng hợp tử

SMC1A

53,421,666

chrX

c.2973+30_2973+31delGG Đồng hợp tử

Sau các bước chọn lọc, kết quả phân tích ở bệnh nhân T09 thu được 22 biến

thể trên 19 gen đã biết liên quan đến bệnh tự kỷ: ANKRD11, ARX, ATRX, AVPR1A,

CHD7, CNTNAP5, DOCK4, EHMT1, FOXP1, KCNQ5, KLHL3, MED12, MET,

NRXN1, OPHN1, RBFOX1, SMC1A, SOX5, CACNA1G.

Mối tương tác giữa các gen này với các gen liên quan đến các biểu hiện đặc

trưng của bệnh nhân tự kỷ cũng được phân tích.

Hình 3.26. Sự tƣơng tác của các gen ở bệnh nhân T09

Kết quả hình 3.26 cho thấy, trong số 19 gen đưa vào phân tích, gen MET,

CACNA1G và AVPR1A tham gia ở cả 3 biểu hiện. AVPR1A được đánh giá là gen

quan trọng trong sự hình thành các biểu hiện tương tác xã hội, hành vi, giao tiếp.

Gen MET có vai trò quan trọng trong biểu hiện hành vi. Các gen này được đánh dấu

màu xanh ở hình tròn đại diện.Trong các mối tương tác này, MET tương tác với

DCBLD2 và EGFR với chỉ số độ tin cậy là 0,53 và 0,60. Gen AVPR1A tương tác

với gen PAPPA2 và ACRV1 với chỉ số tin cậy là 0,53 và 0,60. Gen CACNA1G

tương tác với gen ACTL6B với chỉ số độ tin cậy là 0,56.

3.3.7.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T09

Ở bệnh nhân T09, số biến thể được tìm thấy trong các gen mới sau các bước

chọn lọc là 12 đột biến thể, bao gồm 11 gen CNTN5, PDE4DIP, KDM3B, ABCA1,

CTBP2, MUC5B, TRPM7, CCBE1, MUC16, ZNF208, PGC (Bảng 3.19). Bệnh

nhân này cũng có 1 biến thể trên gen MUC16 và được kiểm chứng lại bằng phương

pháp giải trình tự Sanger (Hình 3.27).

Bảng 3.19. Thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T09

STT

Tên gen

NST

HGVS.c

HGVS.p

ABCA1

chr9

c.5119A>G

p.Met1707Val

CCBE1

chr18

c.602C>T

p.Thr201Ile

CNTN5

chr11

c.2361G>T

p.Arg787Ser

CTBP2

chr10

c.2868C>A

p.Asn956Lys

KDM3B

chr5

c.2420G>C

p.Arg807Thr

chr19

c.6670G>T

p.Ala2224Ser

MUC16

MUC5B

chr11

c.1732G>A

p.Gly578Arg

PDE4DIP

chr1

c.133A>G

p.Ser45Gly

9

PGC

chr6

c.77T>G

p.Phe26Cys

TRPM7

chr15

c.388A>G

p.Met130Val

ZNF208

chr19

c.14C>T

p.Thr5Ile

ZNF208

chr19

c.4G>A

p.Gly2Arg

HGVS.c: Variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ ADN)

HGVS.p: Nếu variant là mã hóa, thì mô tả các variant sử dụng ký hiệu HGVS

(cấp độ Protein)

Hình 3.27. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể p.Ala2224Ser trên gen MUC16 ở bệnh nhân T09

Kết quả giải trình tự Sanger tương đồng với kết quả WES, bệnh nhân T09

Như vậy, trong các biến thể tiềm năng được lựa chọn để kiếm chứng lại

bằng phương pháp giải trình tự Sanger, 06 biến thể trên gen MUC16 ở 06

bệnh nhân đều là những biến thể dị hợp mới phát sinh. 02 biến thể dị hợp trên

gen RYR2 ở bệnh nhân T07 và 02 biến thể dị hợp trên gen RYR3 ở bệnh nhân

T06 đều là thể dị hợp tử chéo, được di truyền từ bố và mẹ mang thể dị hợp tử.

Những thể dị hợp tử chéo rất có ý nghĩa trong di truyền bệnh. Vì thế, 2 biến

thể trên gen RYR2 và RYR3 có khả năng là nguyên nhân trực tiếp gây bệnh tự

kỷ ở bệnh nhân còn những biến thể dị hợp trên gen MUC16 có khả năng là

những yếu tố làm tăng mức độ biểu hiện bệnh.

mang biến thể dị hợp trên gen MUC16 (Hình 3.27).

3.4. CÁC GEN NH C VỚI SD CÓ IÊN QU N ĐẾN KÊNH ION

Gần đây, phương pháp giải trình tự genome, exome đã được áp dụng nhiều

trong nghiên cứu sự liên kết đa hình của các biến thể trên các gen nhạy cảm với

ASD và liên quan đến các kênh canxi, natri và kali. Một dòng ion qua màng quy

định một loạt các chức năng tế bào, từ biểu hiện gen đến quy định hình thái tế bào,

do đó có thể nói các kênh ion có tác động sâu sắc đến các chức năng của tế bào não

bộ. Ở nghiên cứu này, từ kết quả giải trình tự qua phân tích cho thấy vai trò của các

biến thể trên các gen liên quan đến kênh ion trong cơ chế bệnh sinh của bệnh tự kỷ

tiêu biểu là con đường tín hiệu canxi và các hiệu ứng sau của nó. Tế bào là một hệ

thống mở thường xuyên trao đổi chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. Khả

năng này được đảm bảo nhờ một loạt các cấu trúc vận chuyển tinh vi trải xuyên qua

màng lipid kép. Protein tải (transporters) và kênh (channels) là hai nhóm lớn của

protein vận chuyển ở màng tế bào. Kênh vận chuyển thì tương tác với các chất tan

yếu hơn rất nhiều, sự vận chuyển qua các kênh xảy ra nhanh hơn nhiều vào khoảng

100 tỉ ion có thể chảy qua một kênh ion trong một giây. Với tốc độ vận chuyển

khổng lồ của các kênh ion, tế bào sẽ nhanh chóng đạt đến trạng thái cân bằng đối

với tất cả các ion giữa 2 bên màng tế bào - trạng thái cân bằng vĩnh viễn, điều đó

chẳng khác nào là sự kết thúc cho hệ thống sống luôn vậng động trao đổi, nếu

không có một cơ chế điều hòa đóng mở kênh ion. Có 3 trạng thái hoạt động của các

kênh ion, ở đây bàn về các kênh ion mà mỗi trạng thái đóng-mở-bất hoạt phụ thuộc

vào từng phân độ điện thế màng tế bào biến đổi theo thời gian. Các kênh ion khác

nhau về cơ chế đóng và mở kênh, trong đó phần lớn các kênh ion hoạt động theo sự

thay đổi điện thế qua màng-điện áp-van.

Từ kết quả WES, chúng tôi thống kê được các biến thể trên các gen phụ trách các kênh vẩn chuyển ion Ca2+, Na+, K+ (Hình 3.28). Có thể thấy rằng, các gen chứa biến thể thuộc nhóm gen tham gia vận chuyển ion Ca2+ nhiều nhất. Từ đó cho thấy, vai trò quan trọng của kênh vận chuyển ion Ca2+ đối với bệnh tự kỷ.

Hình 3.28. Các họ kênh ion và các gen liên quan

3.5. SNP RS7725785 TRÊN GEN HTR4

Gen HTR4 có tên đầy đủ là 5-hydroxytryptamine receptor 4, còn được gọi tắt

là 5-HT4; 5-HT4. Gen này nằm trên NST số 5, ở vị trí 5q32. HTR4 là thành viên

của họ thụ thể serotonin, là các thụ thể kết hợp protein G, kích thích sản sinh cAMP

đáp ứng với serotonin (5-hydroxytryptamine). Các sản phẩm gen là một protein

transembrane glycosylated có chức năng trong cả hai hệ thống thần kinh ngoại vi và

trung ương để điều chỉnh việc vận chuyển của các chất dẫn truyền thần kinh khác

nhau. Gen HTR4 đã được chứng minh có liên quan đến bệnh tâm thần phân liệt, rối

loạn tăng động giảm chú ý và rối loạn lưỡng cực (Suzuki et al, 2003; Elia et al,

2009; Hirata et al, 2010). Biến thể rs7725785 đã được nghiên cứu và chứng minh

mối liên quan của SNP này đối với bệnh tự kỷ.

Hình 3. 29. Đa h nh c.507+53G>T ở BN T01, T07, T08, T09

Kết quả giải trình tự Sanger chứng minh rs7725785 được phát hiện trong 4/7

bệnh nhân tự kỷ Việt Nam (Hình 3.29). Tuy con số này còn nhỏ, chưa có ý nghĩa

thống kê, nhưng kết quả này cũng góp phần làm sáng tỏ hơn nữa vai trò của

rs7725785 trong di truyền bệnh tự kỷ nói chung và bệnh tự kỷ ở Việt Nam nói

riêng.

CHƢƠNG 4

BÀN LUẬN KẾT QUẢ

4.1. XÁC ĐỊNH VÀ CHÚ GI I BIẾN THỂ

Giải trình tự exome là giải trình tự của tất cả các exon trong hệ gen, exome

chiếm dưới 1% bộ gen của con người, nhưng có 85% số các biến thể gây bệnh được

biết đến (Hedges et al, 2009). Thành công của giải trình tự exome để xác định

những đột biến và các gen đã được chứng minh bởi nhiều nghiên cứu trước đây

(Chahrour MH. et al. 2012; Kuhlenbaumer G. et al. 2011). Do đó, giải trình tự

exome có tiềm năng để phát hiện ra những nguyên nhân của số lượng lớn các rối

loạn hiếm gặp, chủ yếu là đơn gen và rối loạn di truyền trong các bệnh thông

thường. Các nghiên cứu trong gia đình bệnh nhân đã chỉ ra vai trò quan trọng của

các yếu tố di truyền trong sự phát triển của bệnh tự kỷ, trong đó vài gen nhạy cảm

đã được làm sáng tỏ (Freitag, 2007). Việc tìm kiếm các gen gây bệnh tự kỷ là một

công việc đòi hỏi nhiều thời gian nghiên cứu, một trong những cản trở cho việc

nghiên cứu này là sự hợp tác của các gia đình người bệnh. Nhưng với lỗ lực không

ngừng nghỉ của các tổ chức và các nhà khoa học thì hiện nay lĩnh vực này đã có

những kết quả bước đầu. Các nhà nghiên cứu trước đây đã tìm thấy hơn 100 gen có

liên quan đến ASD. Để khám phá thêm những gen có thể liên quan với các rối loạn

bệnh tự kỷ, một nhóm nghiên cứu quốc tế lớn dẫn đầu bởi Tiến sĩ Joseph D. Viện

Broad của Harvard và Autism Sequencing Consortium đã phân tích hơn 14.000 mẫu

DNA với hơn 3.800 trẻ em mắc chứng tự kỷ và cha mẹ của chúng. Kết quả được

công bố năm 2014 của tạp trí Nature cho thấy rằng, những thay đổi trong hơn 101

gen có khả năng góp phần vào nguy cơ gây ASD (De Rubeis et al. 2014). Hơn 5%

của những người bị ASD có đột biến gây mất chức năng, đồng thời ngăn chặn việc

sản xuất một protein bình thường. Các nhà nghiên cứu dự đoán rằng hơn 1.000 gen

này có thể được tham gia vào nguy cơ tự kỷ. Trong số các gen tìm thấy có liên kết

để gây nguy cơ ASD, thì nhiều gen mã hoá cho các protein liên quan đến 3 con

đường quan trọng cho sự phát triển bình thường. Một là liên quan đến cấu trúc của

các khớp thần kinh, các kết nối giữa các tế bào thần kinh trên các tế bào tín hiệu của

não. Thứ hai là liên quan đến việc sửa chữa của nhiễm sắc thể, cách DNA được

đóng gói trong các tế bào, có thể ảnh hưởng đến việc các gen được bật hoặc tắt. Thứ

ba là liên quan đến quá trình phiên mã, dẫn truyền từ gen đến protein (De Rubeis et

al. 2014). Với mục tiêu đề ra của đề tài là phân tích đánh giá kết quả giải trình tự để

đưa ra các biến thể di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ. Áp dụng các phần mềm tin

sinh chuyên sâu với tham khảo về các gen có liên quan đến ASD được Nature công

bố. Những biến thể trên các gen này ở từng bệnh nhân đã sàng lọc được.

Với việc áp dụng các phân tích tin sinh học, sau khi giải trình tự exome các

bệnh nhân tự kỷ, những biến thể nằm trên 101 gen có liên quan đến bệnh tự kỷ đã

được De Rubeis (Nature- 2014), Gene Tests và ApolloGen đã được tìm ra và chứng

minh. Trong đó có những họ gen tiêu biểu như SHANK3, SHANK2 mã hoá cho

protein liên quan trực tiếp đến các khớp thần kinh giàu proline. Gen SHANK3 được

coi là nhân tố có ảnh hưởng mạnh mẽ nhất để gây ra bệnh tự kỷ, trong đó exon 23

có kích thước dài nhất và đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra hội chứng xóa

NST 22q13 - một hội chứng rất đặc trưng của tự kỷ (Craig and Kang, 2007; Südhof,

2008; Betancur et al, 2009). Gen NRXN1 là một trong những gen Neurexin liên

quan tới khớp thần kinh (Lintas and Persico, 2009). Gen MECP2, một thành viên

của methyl-CpG gắn với domain của protein, gắn với 2 nucleotide đã methyl hóa

CpG, bổ sung histone deacetylase 1 (HDAC1) và protein khác liên quan tới đáp ứng

nhiễm sắc thể tại các promoter đặc hiệu gen. Vì vậy, gen MECP2 rất cần thiết cho

sự phát triển và chức năng đúng của não. Mất MECP2 sẽ trì hoãn sự hoàn thiện của

tế bào nơron thần kinh và xinap thần kinh (Chahrour and Zoghbi, 2007, Lam et al,

2000). Ngoài ra, kết quả giải trình tự còn có các biến thể trên các gen điều khiển sự

phát triển và hình thái như HOXA1, nằm trên nhiễm sắc thể 7p15.3 được biểu hiện

đầu tiên trong quá trình tạo phôi và nó cần thiết cho sự phát triển đúng của thân não,

tiểu não, một số dây thần kinh sọ não, tai giữa, tai trong, xương chẩm. Các gen liên quan đến Ca2+ như CACNA1C và SCN2A, trong đó đột biến tăng chức năng protein (Gain-of-function mutations) trong kênh Cav1.2 (L- type voltaged-gated Ca2+)

(CACNA1C) là nguyên nhân của hội chứng Timothy (Krey and R. 2007; (Hemara-

Wahanui et al, 2005), đây là một rối loạn đa hệ bao gồm chậm phát triển trí tuệ và

bệnh tự kỷ, .... Với kết quả nghiên cứu này cho thấy rằng, 07 bệnh nhân tự kỷ

nghiên cứu ở Việt Nam cũng mang các biến thể di truyền trong 101 gen đã được

chứng minh có liên quan đến nguyên nhân gây bệnh tự kỷ. Ngoài ra, danh sách các

biến thể trên các gen mới cũng được xác định ở từng bệnh nhân.

4.2. CÁC GEN IÊN QU N ĐẾN BIỂU HIỆN BỆNH ĐẶC TRƯNG C SD

Bộ kit TruSight Autism của hãng Illumina được nghiên cứu và phát triển để

phát hiện các biến thể trên 101 gen đã được chứng minh có liên quan đến bệnh tự

kỷ. Danh sách các gen này được trình bày trong Phụ lục 01. Trong khuôn khổ luận

án này, danh sách 101 được sử dụng để sàng lọc các biến thể từ kết quả giải trình

toàn bộ vùng mã hóa.

Bảng 4.1. Tổng kết các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở 07 bệnh nhân

TT

Gen

Bệnh nhân

T01

T02

T03

T06

T07

T08

T09

Tổng số

2 x

1 ANKRD11

2 x

1 x

9 CACNA1G

1 x

10 CACNA1H

x

1

11 CACNA1I

x

3 x

12 CASK

x

1

12

17 Tổng

27/17

29/17

25/17

29/17

Điểm DBC-P

42,5

41,5

40,5

42,5

40,5

44 Điểm CARS

Trong 07 bệnh nhân tự kỷ có đến 60 gen trong 101 gen liên quan đến bệnh

ASD mang biến thể. Trong các bệnh nhân, bệnh nhân T09 có nhiều gen mang liên

quan đến bệnh tự kỷ biến thể nhất. Đây cũng là một trong 5 bệnh nhân này có điểm

DBC-P cao đạt 29/17 và điểm CARS cao nhất đạt 44 điểm.

Bộ kit này đã được Bock I và cộng sự sử dụng trong nghiên cứu của họ để

chứng minh giải thiết về sự tự phát của bệnh ASD (Bock et al, 2016). Trong nghiên

cứu của nhóm tác giả Bock I, các biến thể gen liên quan đến bệnh cũng được sàng

lọc dựa trên các công cụ tin sinh. Theo báo cáo, nhóm nghiên cứu đã sàng lọc được

10 biến thể có khả năng liên quan đến bệnh tự kỷ trên các gen SLC9A9, EHMT1,

DPP6, DLGAP2, CREBBP, LAMC3, PIP5K1B, NIPBL, ANKRD11, AUTS2.

Gần đây nhất, Varga cũng báo cáo một kết quả nghiên cứu sử dụng danh sách

101 gen này trong nghiên cứu về sự liên quan giữa rồi loạn chức năng tỷ thể và

bệnh tự kỷ. Kết quả cho thấy, một đột biến denovo trên gen CHD7 gây ra sự xóa

mtDNA và hội chứng CHARGE – bệnh nhân mang hội chứng này có đến 30%

người mắc bệnh tự kỷ. Ngoài ra, các biến thể trên các gen DHCR7, FOXP2, RAI1

AUTS2, PDE10A, RELN cũng được phát hiện ở các bệnh nhân khác.

Trong 60 gen mang biến thể từ 07 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam, một số gen có

tần suất xuất hiện ở nhiều bệnh nhân hơn. 5/7 bệnh nhân có biến thể trên gen

FOXP1. Gen FOXP1 đã được chứng minh là có liên quan đến bệnh tự kỷ, khuyết

tật trí tuệ và suy giảm ngôn ngữ (Fröhlich et al, 2017). Đặc biệt, biến thể dị hợp trên

gen này cũng đã được chứng minh là nguyên nhân gây bệnh ASD với việc phát hiện

biến thể dị hợp R525X trên FOXP1 ở những bệnh nhân tự kỷ có mức độ trí tuệ kém

phát triển, và biểu hiện của chuột mang biến thể R521X (Li et al, 2018). Với 07

bệnh nhân tự kỷ trong nghiên cứu này, biến thể trên FOXP1 được phát hiện ở bệnh

nhân T02, T03, T07, T08, T09. Cả 5 bệnh nhân này đều có mức độ giao tiếp kém,

trí tuệ ở mức trung bình, điểm CARS của các bệnh nhân này ở mục giao tiếp và trí

tuệ đạt điểm 2,5 – 3. Ngoài ra, một số gen khác như SHANK2, RBFOX1, KLHL3,

MED12 cũng là những gen được phát hiện mang biến thể mới, xuất hiện ở 4/7 bệnh

nhân. Biến thể trên những gen này đã được phát hiện và chứng minh có liên quan

đến bệnh tự kỷ (Martin et al, 2007; Pardias et al, 2018). Các bệnh nhân mang biến

thể trên các gen này đều có những biểu hiện đặc trưng của người bệnh tự kỷ như

thiếu tập trung, giao tiếp kém, tương tác xã hội kém. Những biểu hiện này hoàn toàn

phù hợp với các đặc điểm lâm sàng của các bệnh nhân tự kỷ Việt Nam trong nghiên

cứu này.

Tự kỷ được biểu hiện ra ngoài bằng những khiếm khuyết về tương tác xã hội,

khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động

mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại (Butler et al, 2015). Chính vì thế, các gen quy định

những biểu hiện này đã được quan tâm và nghiên cứu nhiều. Từ kết quả WES, áp

dụng công cụ phân tích sự tương tác giữa các gen của trường Đại học Precenton

(Krishnan et al, 2016), các gen đã được phân tích trong từng biểu hiện. Từ đó, ở

mỗi bệnh nhân, các gen chung liên quan đến sự biểu hiện ở các đặc điểm điển hình

của từng bệnh nhân được tìm thấy. Trong đó, có đến 4 bệnh nhân (T02, T06, T07,

T08) mang biến thể trên gen SHANK2, 3 bệnh nhân (T01, T03, T06) mang biến thể

trên gen DPP6, 2 bệnh nhân (T01, T02) mang biến thể tren gen CASK.

Theo các nghiên cứu trước đây, một biến thể trên gen CASK được xác định từ

một nhóm ASD (Simons Simplex Collection) trong nghiên cứu của Iossifov và

cộng sự (Iossifov et al, 2014). Gần đây, đã có thêm nhiều bằng chứng, chứng minh

nguyên nhân di truyền của bệnh tự kỷ từ các đột biến trên gen này (Huang and YP,

Gen DPP6 mã hóa protein DPP - Dipeptidyl-peptidase 6, là một tiểu đơn vị của kênh dẫn truyền ion K+ tuýp A Kv4. Ngoài vai trò làm tăng biểu hiện trên bề

2017; Stessman et al, 2017).

mặt kênh dẫn truyền, DPP6 còn có vai trò quan trọng trong sự vận động và bám

dính của tế bào, ảnh hưởng đến sự phát triển và chức năng của synap vùng đồi thị.

Vì vậy, gen DPP6 liên quan đến một số rối loạn hệ thần kinh trung ương ở người

gồm tự kỷ và tâm thần phân liệt (Lin et al, 2013). Nhiều biến thể CNV đã được phát

hiện trên gen DPP6 ở bệnh nhân tự kỷ (Marshall et al, 2008)

Gen SHANK2 thuộc họ gen SHANK bao gồm 3 thành viên (SHANK1,

SHANK2 và SHANK3) mã hóa cho các protein giàn giáo cần thiết cho sự hình thành

cấu trúc và chức năng thích hợp của các khớp thần kinh. Các protein SHANK đều

bao gồm nhiều vùng (domain), là những protein xoắn hình khăn, được sinh ra tại kì

sau phân bào. Chúng liên kết trực tiếp điểm thụ cảm hệ thống dẫn truyền thần kinh,

các kênh ion và những protein màng khác đến actin cytoskeleton và G-protein.

Protein SHANK không những có chức năng kiểm soát tổ chức mật độ khớp thần

kinh mà còn có khả năng tạo phức hệ thụ thể khớp thần kinh, phân tử tín hiệu và

protein liên quan đến tế bào xương có trong cột sống (Naisbitt et al, 1999; Boeckers

et al, 2002). Đã có rất nhiều đột biến được phát hiện trên gen SHANK2 ở những

bệnh nhân tự kỷ và thiểu năng trí tuệ. Một số nghiên cứu đã xác định những đột

biến hiếm gặp trong gen SHANK2 ở những người tự kỷ và khuyết tật trí tuệ (Berkel

et al, 2010; Pinto et al, 2010; Leblond et al, 2012; Sanders et al, 2012). Một nghiên

cứu chức năng đã phân tích ba đột biến được tìm thấy trước đây ở những bệnh nhân

ASD (L1008_P1009dup, T1127M và R462X). Các đột biến gây nên sự bất thường

trong sự tổng hợp và định vị của protein, ảnh hưởng đến hình thái của tế bào thần

kinh, số lượng đuôi gai, phân nhánh thần kinh thậm chí là sự dẫn truyền của synap

và hành vi nhận thức ở chuột số. Đặc biệt, đột biến R462X đã được chứng minh gây

ra kiểu hình tự kỷ nặng nhất (Berkel et al, 2012).

Ngoài ra, một số gen như TSC1, TSC2, MET, AVPR1A thuộc danh sách các

gen trong hệ thống, chứng tỏ mức độ quan trong của các gen này trong mối tương

tác với các gen gây biểu hiện bệnh. Đột biến trên gen TSC1 và TSC2 là nguyên nhân

chính dẫn đến bệnh xơ cứng não củ. Rối loạn phổ tự kỷ được phát hiện trong 30 đến

60% trường hợp xơ cứng não củ (Vignoli et al, 2015). Mô hình chuột mất một bản

sao TSC1 dẫn đến khuyết tật về hình thái thần kinh, bao gồm tăng kích thước soma,

giảm mật độ cột sống và tăng kích thước cột sống. Do đó liên quan đến chức năng

khớp thần kinh protein TSC trong tế bào thần kinh (Tavazoie et al, 2005). Những

con chuột có đột biến dị hợp tử trong TSC2 biểu hiện sự tăng cường dài hạn bất

thường (LTP) ở vùng não trước CA1 gây nên hiện tượng suy giảm khả năng

(Ehninger et al, 2008). Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều biến thể hiếm trên

gen TSC1 và TSC2 là nguyên nhân gây ASD tự phát (Schaaf et al, 2011; Kelleher et

al, 2012).

Protein MET được biết đến như một yếu tố liên quan đến bệnh ung thư, tham

gia vào chức năng miễn dịch, phát triển và sửa chữa cơ quan ngoại vi, và sự phát

triển của vỏ não và tiểu não. Một vài SNP trên gen này đã được phát hiện ở người

bệnh tự kỷ (Sousa et al 2008). Đặc biệt, đa hình rs1858830 trên gen này được phát

hiện ở những đối tượng trẻ tự kỷ đi kèm với biểu hiện rối loạn về đường tiêu hóa

(Campbell et al, 2009).

Protein AVPR1A dã được chứng minh liên quan đến mức độ biểu hiện về

hành vi xã hội (Lim et al, 2005), đóng vai trò quan trọng trong sinh lý bệnh của các

rối loạn tâm thần như lo âu, trầm cảm và rối loạn căng thẳng sau chấn thương ở

động vật gặm nhấm (Lee et al, 2013; Poirier et al, 2013). Hơn nữa, các biến thể di

truyền trong vùng promoter của AVPR1A cũng có liên quan đến nguy cơ mắc

chứng tự kỷ, trong đó khiếm khuyết trong tương tác xã hội là những triệu chứng

chính (Procyshyn et al, 2017).

Có thể thấy rằng, các biến thể mới được phát hiện ở 07 bệnh nhân tự kỷ Việt

Nam, trên 60 gen đã được công bố liên quan đến bệnh tự kỷ hoàn toàn phù hợp với

các biểu hiện lâm sàng của 07 bệnh nhân.

4.3. CÁC GEN NH C VỚI SD CÓ IÊN QU N ĐẾN KÊNH ION

Dẫn truyền tín hiệu thần kinh hầu như là tất cả các khía cạnh của sự phát triển

não bộ. Để hiểu rõ hơn về các rối loạn ASD, các nhà khoa học đang tìm kiếm các

gen bệnh tự kỷ liên kết điều tiết hoạt động thần kinh. Một số các gen mã hóa các

kênh ion mà kích hoạt chuỗi dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh. Các biến thể

trong các gen liên quan đến các kênh ion có thể ảnh hưởng đến sự tồn tại, sự khác

biệt, di cư, phát triển tự nhiên, và sự hình thành khớp thần kinh tế bào thần kinh. Tế

bào thần kinh mã hóa thông tin thông qua các tín hiệu có nguồn gốc từ các kênh ion.

Khi một tế bào thần kinh nhận được tín hiệu từ tế bào thần kinh khác thông qua các

khớp thần kinh, tùy thuộc vào các loại kênh ion dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần

kinh sẽ trở thành tích cực hay tiêu cực. Các đột biến trong các gen nhạy cảm với ASD có liên qua đến các kênh ion canxi (Ca2+), natri (Na+), kali (K+) thường tăng

cường kích thích não bộ. Những biến đổi trong các gen liên quan đến kênh ion có

khả năng ảnh hưởng đến vô số các chức năng não bộ (Naisbitt et al, 1999; Boeckers

et al, 2002). Kênh ion thậm chí có thể cung cấp một liên kết giữa di truyền và môi

trường bởi vì các yếu tố môi trường như thủy ngân là tín hiệu tăng canxi. Vai trò

rộng lớn của các kênh ion có thể giúp giải thích tại sao các bệnh nhân ASD thường

kèm theo biến chứng thần kinh khác như vấn đề giấc ngủ và bệnh động kinh.

Các kênh Ca2+ phụ thuộc điện thế là một yếu tố then chốt trong dẫn truyền tín hiệu ở tế bào của sinh vật. Các kênh này là đường vào chủ yếu của Ca2+ trong

nhiều loại tế bào và điều hòa các tiến trình nội bào như: co tế bào, chuyển mã gen,

dẫn truyền tín hiệu qua synapse và bài tiết hormone. Kết quả cho thấy, số lượng các

gen có liên quan đến kênh vận chuyển ion Ca2+ nhiều hơn so với các kên ion còn lại, có thể thấy mối liên quan mật thiết giữa các đường dẫn tín hiệu Ca2+ trong các

nơ-ron và nguyên nhân dẫn đến ASDs. Những bằng chứng liên quan giữa gen kênh

canxi (CCG) và ASD được đưa ra dựa trên cơ sở: (1) hiểu biết sinh học về vai trò

của các gen này trong não (Gargus, 2009); (2) bằng chứng phát sinh từ một rối loạn

Mendelium có liên quan ASD (Splawski et al, 2004); Và (3) một số nghiên cứu liên

quan đến ASD.

Kết quả giải trình tự cho thấy, các đột biến trên các gen liên quan đến kênh Ca2+ có nhạy cảm với ASD như: kênh ion van điện áp (voltage-gated ion channels –

VGIC) với họ gen mã hoá như CACNA1C, CACNA1D, CACNA1E, CACNA1F,

CACNA1G, CACNA1H (Hình 3.4) (Naisbitt et al, 1999; Boeckers et al, 2002). Các

biến thể trong nhóm gen này có thể ảnh hưởng đến việc bổ sung canxi thần kinh và

góp phần vào sự nhạy cảm của ASD (Breitenkamp et al, 2015). Trên phương diện

sinh học, các kênh này khử cực theo cặp với một số lượng lớn các chức năng nơ-ron

trong tế bào được điều khiển bởi canxi, bao gồm truyền tín hiệu, sao chép gen và

dẫn truyền thần kinh. Tiểu đơn vị α1 chứa cả cơ chế cảm ứng điện áp và hình thành

các kênh chọn lọc canxi, trung gian cho dòng canxi. Ba nghiên cứu gần đây

(Splawski et al, 2004; Hemara-Wahanui et al, 2005; Splawski et al, 2006) cho thấy các đột biến chức năng trong các gen mã hoá các kênh Ca2+ đóng mở theo điện áp có thể dẫn đến ASDs. Một vài đột biến điểm trên gen mã hóa kênh vận chuyển Ca2+

theo điện thế kiểu L - CaV1.2 (CACNA1C) được biến đến là nguyên nhân gây hội

chứng Timothy (Glenna Bett et al, 2012; Rose Dixon et al, 2012). Đây là một rối

loạn đa chức năng bao gồm các bất thường về tim và chứng tự kỷ (Splawski et al,

2004; Splawski et al, 2005; Bavley CC et al, 2017) . Các kênh CaV1.2 được biểu

hiện chủ yếu ở các tế bào tua và các tế bào sinh dưỡng của các tế bào thần kinh

trưởng thành. Đây là nơi chúng điều chỉnh cả sự kích thích của nơ-ron và kích hoạt các dòng tín hiệu kiểm soát Ca2+(Dolmetsc et al, 2001; Catterall et al, 2005).

CaV1.2 đặc biệt quan trọng đối với việc kích hoạt các yếu tố phiên mã có vai trò chủ

chốt trong việc thúc đẩy sự sống còn của tế bào thần kinh và sự hình thành tua thần

kinh, chẳng hạn như protein nguyên tố gắn kết đáp ứng với cAMP (cAMP response

element binding - CREB) và yếu tố tăng cường tế bào cơ 2 (myocyte enhancer

factor 2 - MEF2). Các đột biến liên quan đến hội chứng Timothy ngăn ngừa sự hoạt

hóa hoạt động theo điện áp của CaV1.2, làm cho các kênh có thời gian mở dài hơn và mang nhiều Ca2+ hơn các kênh bình thường (Splawski et al, 2004).

Một đột biến tương tự trên gen CACNAF1 - có liên quan đến bệnh tự kỷ

trong một gia đình bệnh nhân mù đêm New Zealand (Hemara-Wahanui et al, 2005; Hope et al, 2005). Gen CACNAF1 mã hóa kênh vận chuyển Ca2+ kiểu L _ CaV1.4,

đột biến xảy ra làm biến đổi cấu trúc gen CACNAF1 làm ảnh hưởng đến sự hoạt hoá các tín hiệu đóng và mở của kênh gây lên sự bất thường của dòng Ca2+. Đồng thời,

khi nghiên cứu về gen CACNAF1 cho thấy, ảnh hưởng của đột biến trên gen này chỉ

liên quan đến bệnh tự kỷ khi đột biến đấy gây ra sự bất ổn định của kênh vận chuyển Ca2+ ở nồng độ nhất định (Krey and Dolmetsch, 2007).

Bên cạnh đó, trong họ gen CACNA còn có gen CACNA1D mã hóa kênh vận chuyển Ca2+ kiểu L _ CaV1.3 cũng được nhóm tác giả Alexandra Pinggera và cộng

sự chứng minh là nguyên nhân gây bệnh tự kỷ (Alexandra Pinggera et al, 2015)

Họ gen CACNA mã hoá gen liên quan đến kênh vận Ca2+, trong đó gen CACNA1G mã hoá kênh vận chuyển Ca2+ kiểu T. Một nghiên cứu trong 284 gia

đình có trẻ mắc bệnh tự kỷ đã chỉ ra rằng, sự xuất hiện của một loạt các SNP trong gen CACNA1G mã hóa tiểu đơn vị kênh Ca2+ kiểu T có liên quan đến nguyên nhân

của bệnh tự kỷ. Đặc biệt, các SNP trên gen này chỉ xuất hiện ở các trẻ trai bị mắc ASD (Ake Tzu-Hui Lu et al, 2012). Các hoạt động của các kênh Ca2+ kiểu T liên

quan đến việc kích hoạt nơ-ron trong não (Lory et al, 2000).

Một loại T-type CCG khác, CACNA1H được báo cáo có liên quan đến ASD

trong các nghiên cứu gen trước đó. Các đột biến ghi nhớ dị dạng dị tật được xác

định ở sáu trên 461 cá nhân có ASD từ bảng điều tra AGRE (Splawski et al, 2006).

Gen này được biểu hiện ở nhiều vùng não có kích cỡ bất thường ở những người có

ASD (Brambilla et al, 2003). Mặc dù các đột biến ở các gen kênh T không chịu

trách nhiệm trực tiếp cho ASDs, nhưng chúng thường gặp ở bệnh nhân ASD nhiều

100

hơn so với các nhóm chứng, cung cấp thêm bằng chứng về sự liên quan của các kênh Ca2+ và tín hiệu trong chứng tự kỷ.

Các đột biến liên quan đến ASD đã được xác định không chỉ ở các gen mã hoá các kênh Ca2+ mà còn ở các gen mã hoá các kênh ion có hoạt động được điều khiển trực tiếp bởi Ca2+. Một số đột biến điểm trong SCN1A và SCN2A, mã hóa các kênh Na+ kích hoạt điện áp NaV1.1 và NaV1.2, được phát hiện ở trẻ em mắc bệnh

động kinh và kèm theo chứng tự kỷ (Weiss et al, 2003; Xiong et al, 2016). Một

trong những đột biến ở SCN1A nằm trong vị trí liên kết với calmodulin của kênh,

làm giảm ái lực của nó đối với calmodulin. Đột biến này cũng tạo ra sự thay đổi lớn trong cấu hình của Ca2+ trong phức hệ NaV1.2-calmodulin, dẫn đến sự nhạy cảm mới của kênh NaV1.2 đối với tín hiệu Ca2+(Kim et al, 2004). Ngoài ra, các đột biến

trong 3 tiểu đơn vị của kênh ion van điện áp natri cũng gây ra hội chứng Brugada,

được mã hoá bởi các gen SCN5A. Hơn nữa, alen SCN1A cũng đã được công nhận là

gây bệnh tự kỷ và bệnh động kinh, alen bệnh tự kỷ của SCN1A gây xáo trộn vùng

nội bào calmodulin-tương tác của kênh protein. Các khu vực này kết nối kênh natri

vào canxi để truyền tín hiệu của tế bào thần kinh vì chúng tương tác với calmodulin.

Và thực tế rằng những đột biến trong SCN1A có khả năng gây hội chứng động kinh

và co giật thường kèm theo với ASD.

Nhiều nghiên cứu khác còn cho thấy sự liên quan giữa kênh K+ được hoạt hóa

bởi Calci (BKCa) và ASDs (Luca Guglielmi et al, 2015). Các kênh BKCa được biểu

hiện trong não và định vị chủ yếu ở vùng trước synap, nơi chúng giúp điều chỉnh sự dẫn truyền synap và kích thích noron (Hu et al, 2001). Khi nồng độ Ca2+tăng cao

hoặc khi có sự khử cực xảy ra, các kênh BKCa sẽ được kích hoạt. Các kênh này sẽ tập trung nhiều hơn trên màng và ngăn chặn dòng Ca2+thông qua kênh đóng mở

theo điện áp. Thực tế, nhiều báo cáo cho thấy sự giảm hoạt động của kênh BKCa đi cùng với đó là sự giảm hoạt động của các kênh Ca2+có điện áp ở một số bệnh

nhân tự kỷ. Điều này làm tăng thêm bằng chứng cho thấy một số dạng tự kỷ là do sự tăng Ca2+một cách bất thường. Gen KCNMA1 mã hoá quá trình động học của

kênh kali kích hoạt canxi, đặc trưng bởi độ dẫn điện lớn của ion kali trông qua

101

màng tế bào. Gen KCNQ5 có trong vỏ não và cơ xương để điều tiết kích thích thần

kinh với chức năng kích hoạt và tắt kênh kali thông qua điện áp phụ thuộc rồi kích hoạt K+. Các đột biến trong gen này còn gây ra chứng co giật sơ sinh và động kinh.

Gen KCNJ10 mã hoá cho protein chịu trách nhiệm chỉnh lưu kali nội bào (chỉ duy

nhất kali đi vào) của các tế bào thần kinh đệm ở bão bộ. Đột biến ở gen này có liên

quan đến chứng động kinh . Gen TRPM1 mã hoá protein đóng vai trò như một kênh

vận chuyển các nguyên tử tích điện dương (cation) vào tế bào. TRPM1 được tìm

thấy trong các tế bào lưỡng cực và có vai trò quan trọng trong lộ trình nhận và

truyền tải thông tin thị giác từ mắt đến não bộ (Galina and JayGargus, 2013).

Kết quả giải trình tự toàn bộ gen vùng mã hóa từ 7 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam

cho thấy, các bệnh nhân này cũng mang những biến thể trên các kênh vận chuyển

ion quan trọng. Đây chính là những yếu tố góp phần biểu hiện bệnh ở người bệnh tự

kỷ Việt Nam.

4.4. GEN RYR2, RYR3

RYR2 và RYR3 là những thụ thể neurotransmitter, về mặt tổng quát, nhóm

thụ thể này là những heterotetramer hoặc heteropentamer và mỗi tiểu đơn vị được

mã hóa trên một hoặc nhiều gen khác nhau trên cùng hay khác nhiễm sắc thể. Tất cả

các neurotransmitter đều là protein bậc IV và chịu rất nhiều nguy cơ đột biến gen

cũng như sai lệch trong quá trình biểu hiện gene. Thụ thể neurotransmitter được

chia làm hai loại chính: Ligand-gated ion channels – có khả năng mở ra ngay lập

tức khi neurotransmitter bám vào và thụ thể G protein-coupled.

Sự thay đổi trong hệ thống chất dẫn truyền thần kinh cũng có thể là nguyên

nhân dẫn đến những bất thường trong khả năng kích thích của noron trong quá trình

phát triển. Đây được coi là một trong những chất dẫn truyền thần kinh chủ chốt liên

quan đến tự kỷ (Rojas, 2014; Simona D’Antoni et al, 2014). Các thụ thể glutamate là các kênh Ca2+ đóng mở theo chất kết nối quan trọng. Một đa hình trong gen

GRIN2A- mã hóa một đơn vị thụ thể NMDA, hay trong tiểu đơn vị của thụ thể

glutamat kainat (GRIK2) và trong các gen thụ thể glutamate metabotropi đã được

báo cáo có liên quan với ASD (Barnby et al, 2005). Tác động của các đa hình này

102

vẫn chưa được biết nhưng chúng có thể làm thay đổi tín hiệu glutamate dưới một số

dạng của ASD. Trong số các hệ thống truyền dẫn chất dẫn truyền thần kinh, một số

bằng chứng cho thấy những khiếm khuyết trong hệ thống ức chế GABAergic có thể

là nguyên nhân gây chứng tự kỷ. Nhiều bệnh nhân tự kỷ có hiện tượng sắp xếp lại

gen hoặc đa hình trong nhóm thụ thể GABA như GABRA5, GABRG3, GABRB3

và GABRA4. (Dykens et al, 2004; Ma et al, 2005; Collins et al, 2006). Thêm một

bằng chứng nữa ở các mô hình chuột của hội chứng Angelman có động kinh và có

thể hữu ích cho sự hiểu biết những thay đổi trong hệ thống GABA-ergic ở những

điểm khác nhau trong quá trình phát triển có thể dẫn đến ASDs. Những nghiên cứu

sâu hơn phù hợp với giả thuyết rằng chứng tự kỷ là do sự ức chế các con đường dẫn

GABAergic, dẫn đến sự kích thích quá mức trong não (Genoveva Uzunova et al,

2014)

RYR2 và RYR3 nằm trên nhiễm sắc thể 15q14-q15 là một khu vực rất nhạy

cảm với sự sắp xếp lại gen quan trọng đã được chứng minh là có liên quan đến bệnh

tự kỷ (Ashley-Koch et al.,2006; Peters et al. 2004).

Thụ thể ryanodine là một trong những nhóm kênh canxi hoạt động theo chất

dẫn truyền quan trọng nhất. Các thụ thể Ryanodine (RyRs) tạo thành một lớp các

kênh canxi nội bào có ở các mô động như cơ và nơ-ron (Santulli and AR., 2015). RYRs hoạt động ở vùng mạng lưới nội chất màng, có nhiệm vụ điều chỉnh Ca2+ nội

bào. Có ba đồng vị chính của thụ thể ryanodine, được tìm thấy trong các mô khác

nhau và tham gia vào các con đường tín hiệu khác nhau liên quan đến sự phóng

thích canxi từ các cơ quan nội bào. Trong đó, RyR1 chủ yếu biểu hiện trong cơ

xương, RyR2 chủ yếu biểu hiện ở cơ tim (cơ tim), RyR3 được thể hiện rộng rãi hơn,

nhưng đặc biệt là trong não. Biểu hiện thụ thể ryanodine RYR2 là trung gian tế bào

chính của sự phóng thích canxi do canxi (CICR) trong tế bào động vật. Jihane

Soueid và cộng sự đã tìm những biến thể trùng lặp trên gen RYR2 ở bệnh nhân tự kỷ

Lebanese cho thấy sự liên quan đáng kể của gen này đến bệnh tự kỷ (Jihane

Soueidet al, 2016). Trong nghiên cứu về mức độ ảnh hưởng chức năng của RYR3,

chuột bị loại bỏ gen RYR3 cho thấy sự suy giảm và rối loạn trong hoạt động, chúng

103

cũng cho biểu hiện mức độ tăng động thái quá. Những kết quả này chỉ ra rằng RYR3

có một vai trò quan trọng trong hoạt động vận động và hoạt động (Naoki Matsuoet

al, 2009).

Các gen thụ thể ryanodine 3 (RYR3) đã được xác định nằm trên nhiễm sắc thể

15q14-q15 (Sorrentino et al., 1993). Nó là một họ thuộc họ gen RYRs và có mặt với

mức độ cao trong nhân đôi, hạch nhân, và hippocampus trong hệ thống thần kinh

trung ương (Nakashima et al., 1997). Khi có sự di chuyển của ion canxi vào trong tế

bào, một hế thống truyền thông tin thứ hai sẽ hoạt động. Dòng canxi đi vào trong tế

bào do các kênh canxi trên màng tế bào được mở sau khi hormon gắn với receptor

(Kouzu Y. et al. 2000). RYR3 thuộc họ thụ thể xuyên màng có vai trò trong giải phóng ion Ca2+ của kênh canxi cũng như đóng vai trò quan trọng trong việc điều tiết Ca2+ nội bào trong tế bào thần kinh. Trên cơ sở vị trí và chức năng của gen, RYR3

có thể là một ứng cử viên cho nguyên nhân gây chứng tự kỷ (Fill and Copello 2002;

Lu AT. et al. 2012; Schmunk G. et al. 2015).

Hai bệnh nhân T06, T07 đều có những hành vi tăng động như dễ kích động

quá mức, chạy không kiểm soát, dễ xao nhãn, không tập trung.... Những biểu hiện

này phù hợp với những nghiên cứu về ảnh hưởng đến chức năng của gen RYRs.

Với việc tìm ra những biến thể mới trên gen RYR2 và RYR3 ở bệnh nhân tự kỷ Việt

Nam, kết quả của nghiên cứu này góp phần khẳng định thêm mối liên quan của họ

gen RYRs đối với nguyên nhân gây bệnh ASD.

4.5. GEN MUC16

Protein MUC16- mucin biểu hiện trên đường niêm mạc ruột và hạch bạch

huyết, thường nằm gần lớp niêm mạc. Mucin là một đại phân tử O-glycosyl hoá

xuyên màng, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành hàng rào bảo vệ lớp

niêm mạc. Các cytokine kích hoạt quá trình gây viêm như TNF-α dẫn đến giảm biểu

hiện của gen bài tiết như MUC16, trong khi đó MUC16 lại có vai trò bảo vệ lớp

niêm mạc của tế bào chống lại các tác nhân gây viêm ruột. Triệu chứng viêm ở các

lớp niêm mạc của đường dạ dày – ruột đã được chứng minh có liên hệ gián tiếp với

104

các bệnh nhân tự kỷ. Đặc biệt, trong nghiên cứu của Gerald J Mizejewski và cộng

cự năm 2015, MUC16 nằm trong 15 chỉ thị phân tử, thuộc nhóm thứ 3 dùng để đánh

giá bệnh tự kỷ (Mizejewski GJet al, 2013).

Trong số những bệnh thường thấy ở người bệnh tự kỷ, rối loạn tiêu hóa

(gastrointestinal – GI) được quan tâm đặc biệt do tỷ lệ hiện mắc và có sự tương

quan với mức độ nghiêm trọng bệnh tự kỷ (Hsiao, 2014). Những dấu hiệu của

chứng GI thường thấy ở người mắc bệnh tự kỷ rất đa dạng, như triệu chứng trào

ngược dạ dày, phân đẫm máu, nôn mửa. Ngoài ra, dấu hiệu của sự viêm nhiễm GI

như tăng bạch cầu lymphoid, tăng cytokines gây sốt, các bệnh lý đường ruột như

viêm ruột kết, viêm dạ dày và viêm thực quản cũng đươc ghi nhận (Buie et al, 2010;

Coury et al, 2012). Sự tăng thẩm thấu qua các tế bào ruột không chỉ ảnh hưởng lên

toàn bộ lớp niêm mạc ruột (de Magistris et al, 2010) mà còn ảnh hưởng đến toàn bộ

hệ thống chuyển hóa, khả năng chuyển hóa các chất, hệ vi sinh đường ruột, miễn

dịch đường ruột. Hơn nữa, các bệnh nhân tự kỷ còn có biểu hiện dị ứng thức ăn, rối

loạn chuyển hóa (Ming et al, 2012), đặc biệt là rối loạn tiêu hóa carbohydrate

(Williams et al, 2011). Những rối loạn bất thường này góp phần biểu hiện rõ hơn

triệu chứng ở người bệnh tự kỷ.

Thống kê cho thấy, tỷ lệ các trẻ bị ASD mắc các bệnh về đường tiêu hóa

ngày càng tăng. Ba cuộc điều tra trên 1280 đối tượng ASD từ Arizona (Melmed,

2000), California (Lightdale et al, 2000), và vùng trung Đại Tây Dương cho thấy

có đến 20% trong những trẻ này bị tiêu chảy mãn tính. Taylor và cộng sự ghi nhận

sự liên quan có ý nghĩa thống kê giữa các triệu chứng dạ dày-ruột (Taylor et al,

2002) và bệnh tự kỷ, mối liên quan này có thể phù hợp với sự tồn tại của một kiểu

hình cụ thể. Theo những tài liệu lâm sàng trong nghiên cứu này, tiêu chảy hoặc

phân lỏng xuất hiện ở nhóm trẻ ASD chiếm 30% trong khi triệu chứng này ở nhóm

đối chứng là 27% (Wakefield et al, 2005).

Trong những nghiên cứu trước đây, bằng chứng về mối liên quan giữa bệnh

tăng bạch cầu đại tràng lymphoid (LNH), viêm màng nhầy cấp tính và mãn tĩnh ở

trẻ tự kỷ đã được chứng minh (Wakefield et al, 2005). Các kết quả nghiên cứu cho

105

thấy phần lớn các trẻ tự kỷ đều có hiện tượng tăng mật độ tế bào gdT và CD8 +,

tăng độ dày niêm mạc đại tràng, ruột, tá tràng (Furlano et al, 2001). Nhiều trẻ em

mắc ASD phải thực hiện chế độ ăn kiêng gluten và casein (Knivsberg et al, 2002).

Cơ sở lý luận cho chế độ ăn kiêng này là việc loại bỏ tiền chất của exorphin – chất

có tiềm năng gây độc thần kinh (Shattock et al, 1991). Ngoài ra, gluten và casein

còn là những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng miễn dịch trong niêm mạc dạ dày –

ruột (Wakefield et al, 2005). Nghiên cứu của Wakefield và cộng sự năm 2005 cho

thấy mức độ khác biệt rõ ràng của LNH ở trẻ ASD và nhóm đối chứng. Kết quả xét

nghiệm cho thấy, mức độ bạch cầu ở hồi tràng và đại tràng của trẻ ASD có mức

tăng rất cao.

Trong khi các nghiên cứu về gen trước đây thường tập trung chủ yếu vào các

bệnh di truyền, khiến cho việc phát hiện nguyên nhân của các bệnh không di truyền

bị ảnh hưởng. Hiện nay, các kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới đã cung cấp khả

năng phát hiện rất đầy đủ sự biến đổi di truyền có mặt ở bệnh nhân. Theo thống kê,

trong 5 năm đầu tiên phát triển WES, đã có hơn 500 bệnh liên quan đến gen mới đã

được xác định, với sự gia tăng sự xuất hiện của các các đột biến de novo (Acuna-

Hidalgo R et al, 2016). Đột biến de novo ảnh hưởng đến vùng mã hóa được xác

định là nguyên nhân quan trọng gây nên các rối loạn phát triển thần kinh phổ biến

như tự kỷ, động kinh, và khuyết tật trí tuệ, ảnh hưởng đến 1% dân số nói chung.

Trong báo cáo này, các biến thể trên gen MUC16 ở bệnh nhân tự kỷ đều là các biến

nay được biết đến là có vai trò quan trọng trong mức độ biểu hiện nhiều bệnh. Những dẫn

thể mới phát sinh, không di truyền từ bố mẹ. Tuy nhiên, các biến thể mới phát sinh hiện

chứng này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của chúng tôi. 6/7 bệnh nhân

tự kỷ mang biến thể dị hợp trên gen MUC16, các bệnh nhân này khi được kiểm tra

lại lâm sàng đều cho thấy những biểu hiện bất thường về tiêu hóa. Có thể nói rằng,

các đột biến trên gen này tuy không phải là nguyên nhân chính gây bệnh tự kỷ,

nhưng nó là yếu tố làm tăng mức độ biểu hiện bệnh ở người bệnh tự kỷ.

106

4.6. Đ H NH rs7725785 TRÊN GEN HTR4

Các đa hình đơn nucleotide (SNPs) là các marker di truyền cho phép các nhà

nghiên cứu tìm kiếm các gen liên quan đến các bệnh phức tạp. Theo đó, nhiều

nghiên cứu đã tập trung vào những thay đổi di truyền ở bệnh nhân ASD dựa trên

phân tích SNP. Theo các báo cáo của Freitag và cộng sự (Freitag, 2007; Freitag et

al, 2010) khi nghiên cứu SNP liên quan đến ASD, các SNP trên nhiễm sắc thể 2, 3,

4, 6, 7, 10, 15, 17, X và Y có liên quan đến nguyên nhân gây bệnh ASD. Năm 2009,

Cheng và nhóm nghiên cứu của mình đã báo cáo sự khác biệt đáng kể trong tần số

alen của bốn đa hình trên BDNF ở nhóm ASD và nhóm đối chứng. Hai nghiên cứu

của hai nhóm tác giả Ramoz năm 2004 và Segurado năm 2005 so sánh hai SNP

rs2056202 và rs2292813 trong gen SLC25A12 đã phát hiện nguy cơ mắc chứng tự

kỷ liên quan đến haplotype GG (chuỗi đảo ngược) = CC (chuỗi ý nghĩa). Trong các

nghiên cứu di truyền về ASD, có đến hơn 500.000 đa hình đơn nucleotide (SNP) đã

được đề cập đến. Tuy nhiên, trong số đó chỉ có một vài SNP được xác định và

chứng minh về vai trò gây bệnh. Theo thống kê của ngân hàng SNPedia – một cơ sở

dữ liệu gồm các SNP liên quan đến các bệnh di truyền của con người, số lượng SNP

liên quan đến ASD có khoảng 40 SNP. Biến thể rs7725785 là một trong 18 biến thể

đã được chứng minh có mối liên quan đến bệnh ASD (Hu et al, 2011).

Trong nghiên cứu này, rs7725785 được đánh giá là có liên quan đến biểu

hiện suy giảm ngôn ngữ ở người bệnh ASD. Đặc biệt, rs7725785 còn được thống kê

biểu hiện ở cả ba mức độ bệnh (nghiêm trọng- trung bình – nhẹ). Tuy nhiên, tỷ lệ

chênh lệch là giữa các nhóm là khác nhau, 1,44 đối với loại phụ bị suy giảm ngôn

ngữ nghiêm trọng, trong khi đó là 0,68 và 0,74 đối với các phân nhóm bệnh trung

bình và nhẹ. Điều đáng chú ý là, trong nghiên cứu trước đó của nhóm này, các biến

thể trên gen HTR4 chỉ biểu hiện ở các bệnh nhân bị suy giảm ngôn ngữ nặng, và

không phát hiện ở nhóm bệnh nhân biểu hiện trung bình và nhẹ. Điều này cho thấy,

rs7725785 nằm ở intron của gen HTR4, có thể đóng vai trò trong mức độ biểu hiện

của bệnh (Hu et al, 2011). Ngoài ra, trong số 18 đa hình được nghiên cứu trong báo

cáo của Hu VW và cộng sự, không có đa hình nào nằm trong vùng exonic, cho thấy

107

các yếu tố di truyền của ASD có nhiều khả năng liên quan đến quá trình điều hòa

gen (hoặc biểu hiện gen) hơn là thay đổi cấu trúc hoặc chức năng trong các sản

phẩm gen. Biến thể di truyền trong gen HTR4 cũng có liên quan đến tâm thần phân

liệt (Suzuki et al, 2003; Kato et al, 2005), rối loạn lưỡng cực và rối loạn tăng động /

thiếu tập trung (Li et al, 2007), tiếp tục gợi ý một số chồng chéo chức năng giữa các

rối loạn thần kinh này. Gần đây, một sự dịch chuyển de novo trên nhiễm sắc thể 5

gần gen HTR4 đã được xác định trong một bé trai tự kỷ (Vincent et al, 2009), tăng

thêm bằng chứng về mối liên quan của gen này đến bệnh ASD.

(Nguồn: Hu VWet al, 2011)

Hình 4.1. Vai trò của gen HTR4

Gen HTR4 tham gia vào nhiều quá trình sinh học trong cơ thể như điều hòa

sinh học thần kinh, tăng cường tiềm năng điện dài hạn (long term synaptic

potentiation), khả năng học tập và trí nhớ, cũng như giải phóng các chất dẫn truyền

108

thần kinh (dopamine, acetylcholine), các hormon peptide (AVP, OXT, PRL, VIP)

và các hợp chất steroid (cortisol, corticosterone) (Hình 4.1). Vì vậy, bất kỳ sự thay

đổi nào trong cấu trúc hoặc chức năng của gen này có thể dẫn đến những hậu quả

trên phạm vi rộng đối với các quá trình được biết là bị ảnh hưởng bởi ASD.

Đa hình rs7725785 (c.507+53G>T) chưa được nghiên cứu cụ thể ở Việt

Nam. Theo thống kê của ngân hàng dbSNP, trong khoảng 1000 người Việt Nam, tỷ

lệ allen G là 0.702, allen T là 0.298. Đối với một số nước lân cận như Trung Quốc,

Nhật Bản, cũng có tỷ lệ allen G cao hơn hẳn allen T, tương ướng là

0.7688(G)/0.2312(T) ở Trung Quốc và 0.671(G)/0.30289(T) ở Nhật Bản.

Bảng 4.2. Một số đa h nh liên quan đến ASD đƣợc công bố trên thế giới

Đa hình

Gen

Tài liệu tham khảo

Đặc điểm liên quan

rs4307059, rs35678

và

(Prandini P et al, 2012)

Suy giảm tương tác xã hội bằng lời nói

SEMA5A TAS2R1

rs7794745, rs2710102 CNTNAP2

(Arking DE et al, 2008)

Giảm tập trung

ATP2B2

rs35678

(Prandini P et al, 2012)

Suy giảm tương tác xã hội bằng lời nói

rs1858830

MET

(Campbell DB et al, 2006)

Rối loạn hành vi

rs1322784

DISC1

(Kilpinen H et al, 2008)

Rối loạn cảm xúc

rs265981,

DRD1

(Hettinger JA et al, 2008)

Tương tác xã hội và giao tiếp kém

rs4532 và rs686

rs2745557

PTGS2

(Yoo HJ et al, 2008)

Giao tiếp kém, dễ kích động

DIXDC1

(Martin PM et al, 2018)

Trầm cảm, lo âu

rs373126732, rs18471 8561

rs7725785

HTR4

(Hu et al, 2011)

Suy giảm giao tiếp bằng ngôn ngữ

Bệnh nhân tự kỷ thường có biểu hiện khiếm khuyết về tương tác xã hội, khó

khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động mang

tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Một số đa hình đã được phát hiện gây nên những suy

giảm đặc trưng ở người bệnh (Bảng 4.2). Đặc biệt, đa hình rs7725785:

c,507+53G>T trên gen HTR4 được phát hiện ở 04 (T01, T07, T09, T09) bệnh nhân

tự kỷ Việt Nam. Các bệnh nhân này đều có điểm số CARS ở mục giao tiếp bằng

ngôn ngữ kém (từ 2,5 đến 3,5)

109

Hiện nay, mức độ nghiêm trọng của ASD chỉ được dự đoán và đánh giá dựa

trên các tiêu chí về hành vi mà thường không dự đoán dựa trên các chỉ thị sinh học

như SNPs. Trong thực tế, SNPs đã được ứng dụng để giúp dự đoán liệu một cá nhân

có một bệnh nào đó hoặc một loại phụ của căn bệnh nào đó (Schwender et al,

2008). Các mộ hình chẩn đoán dựa trên SNPs đã được xây dựng và áp dụng cho

một số bệnh. Ví dụ như, Huang đã sử dụng Flextree để phân biệt bệnh tăng huyết áp

và hạ huyết áp (Huang et al, 2008); Bureau sử dụng phương pháp ―Rừng ngẫu

nhiên‖ để phân biệt nhóm bệnh hen suyễn (Bureau et al, 2005); Nunkesser áp dụng

GPAS để phân biệt nhóm bệnh ung thu vú.

Tuy nhiên, với bệnh tự kỷ, các mô hình chẩn đoán dựa trên SNPs chưa được

thực hiện. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chỉ có 7 bệnh nhân, nhưng chúng tôi

cũng phát hiện được đa hình trên 4 bệnh nhân tự kỷ. Vì lượng mẫu ít, nên tỷ lệ này

chưa có ý nghĩa về thống kê. Tuy nhiên, kết quả này cũng góp phần bổ sung số liệu

gen liên quan đến ASD và mở ra các hướng nghiên cứu sâu hơn về đa hình này ở

người bệnh tự kỷ Việt Nam.

110

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Bằng việc áp dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới trong việc giải

toàn bộ vùng mã hóa exome ở 7 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam để tìm kiếm các biến thể

di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ, chúng tôi đã rút ra một số kết luận sau:

1. Giải tr nh tự toàn bộ vùng gen mã hóa của 7 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam

Toàn bộ vùng mã hóa của 7 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam đã được giải trình tự

với độ chính xác cao, điểm chất lượng đọc Q30 ở các mẫu đều trên 95%. Số liệu các

biến thể thu được rất lớn, lên đến trên 123.386 biến thể (Mẫu T09), các mẫu còn lại

đều thu được trên 118.500 biến thể.

2. Xác định các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở một

số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam

Số liệu biến thể trên các gen thuộc 101 gen có liên quan đến tự kỷ (Gene

Tests và ApolloGen) ở 07 bệnh nhân được đưa ra đầy đủ và chính xác.

Ngoài ra, các biến thể trên các gen mới cũng được xác định. Trong đó, ở

bệnh nhân T06, trên gen RYR3 phát hiện được 2 biến thể thay thế mới p.L111P và

p.R3048C. Trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07 phát hiện và 2 biến thể thay thế mới

p.Arg801Cys, p.Tyr819Cys. 6 biến thể mới (p.A2224S; p.W13569C;

p.Val13167Met; p.L13171F; p.E12869K; p.D13229E) trên gen MUC16 được phát

hiện ở 06 bệnh nhân T02, T03, T06, T07, T08, T09. Đặc biệt, đa hình rs7725785

(c.507+53G>T) trên gen HTR4 được tìm thấy ở bệnh nhân T01, T07, T08 và T09,

Các bước phân tích và phát hiện biến thể di truyền ở người bệnh tự kỷ Việt

Nam bằng phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa bước đầu được xây dựng.

Kết quả này đã hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng trong điều trị cụ thể từng bệnh nhân.

KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu giải trình tự exome trên số lượng lớn người bệnh tự kỷ

để tìm ra các biến thể di truyền trên các gen có liên quan đến bệnh mang tính đặc

trưng cho người Việt Nam.

111

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

1. Thu Hien Nguyen, Thi Thanh Ngan Nguyen, Bac Viet Le, Ngoc Minh

Thanh, Thi Kim Lien Nguyen, Van Hai Nong & Huy Hoang Nguyen

(2016). Whole-exome sequencing identifies two novel missense mutations

(p.L111P and p.R3048C) of RYR3 in a Vietnamese patient with autism

spectrum disorders. Genes & Genomics, v.39, no.3, 2017 March, p.301(6)

(ISSN: 1976-9571). DOI 10.1007/s13528-016-0495-2

2. Nguyễn Thu Hiền, Nông Văn Hải, Nguyễn Huy Hoàng (2015). Giải trình

tự gen thế hệ mới trong nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ. Tạp chí Công

nghệ Sinh học 13(4): 989-998

3. Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Thanh Ngân, Nguyễn Thị Kim Liên,

Nguyễn Ngọc Lan, Nguyễn Văn Tụng, Thành Ngọc Minh, Phan Văn Chi,

Nguyễn Huy Hoàng (2017). Ứng dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ

mới và các phần mềm tin sinh học trong việc đánh giá sơ bộ biến thể di

truyền ở người bệnh tự kỷ Việt Nam. Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(3):

433-439.

4 Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Huy Hoàng, Phan Văn Chi, Nguyễn Văn Tụng,

Nguyễn Thị Kim Liên, Nguyễn Thanh Ngân, Nguyễn Ngọc Lan (2018).

Phát hiện đa hình rs7725785 trên gen HTR4 ở người bệnh tự kỷ Việt Nam

bằng phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa. Hội nghị khoa

học công nghệ sinh học toàn quốc 2018: 659-664

112

SUMMARY

STUDY ON THE DETECTION OF GENE MUTATIONS IN

VIETNAMESE PATIESNTS WITH AUTISM BY WHOLE ENCODE

(EXOME) SEQUENCING

Autistic spectrum disorder (ASD) or classical autism or pervasive

developmental disorder (PDD), is a group of neurodevelopmental disorders marked

by social and communication deficits and interaction, in combination with restricted

repetitive behaviors, interests, and activities. Classification of autism is

characterized by impairments in 3 behavioral domains: 1) social interaction; 2)

language, communication, and imaginative play; and 3) range of interests and

activities (Association, 2000). According to the Centers for Disease Control and

Prevention, approximately one of 68 (or 1.5%) of 8-year-old children was

diagnosed to have ASD based on tracking across multiple areas of the United States

in 2016. The prevalence in male children is higher compared with that in female

children (Grabrucker, 2013). Autism is not a disease but a syndrome with multiple

non-genetic and genetic causes. So far there is no definitive pharmacotherapy for

the treatment of core symptoms of ASD (Goldani et al, 2014). Genetic factors have

been demonstrated to play a prominent role in ASD pathogenesis (Goldani et al,

2014). Both copy number variations (CNVs) and mutations in more than 150 genes

identified variations with whole-exome sequencing studies in ASD group (Sener et

al, 2016). In a few cases, autism was caused by homozygous recessive mutations

due to recent shared ancestry, although the contribution of recessive mutations in

outbred populations remains unexplored (Morrow et al, 2008; Chahrour et al,

2012).

Determination of the genetic basis which lies behind the rare single gene

diseases is important for understanding the mechanism of the diseases in terms of

finding out its role in the biological pathways and developing the treatment(Ng et

al, 2010). Exome sequencing serves for the sequencing of all the exons in the

113

genome, the term of exome represents less than 1% of the human genome, but

contains 85% of the known disease-causing variants (Hedges et al, 2009). Success

of exome sequencing in revealing these mutations and identifying genes have been

demonstrated by several studies (Kuhlenbaumer et al, 2011; Chahrour et al, 2012).

Therefore, exome sequencing has a potential to uncover the causes of large number

of rare, mostly monogenic, genetic disorders as well as predisposing variations in

common diseases. WES seems to be frequently used to determine the variations of

the complex disorders, including autism. One of the advantages of WES is that a

specific gene which harbors a genetic variant can be identified (Helsmoortel et al,

2016). The functions of specific types of mutation, including non-sense and

missense mutations can be predicted by the help of publicly available bioinformatic

resources (Schreiber et al, 2013; Sener et al, 2016). The family studies have

indicated a robust role of genetic factors in the development of autism, while few

susceptibility genes have been elucidated (Freitag, 2007).

In Vietnam, the number of autistic patients increases each year at Children's

Hospital Central, namely 405 cases in (2007); Cases 963 in (2008); Cases 1752 in

(2009); Cases in 6658 (2011). However, it is worth noting that, in Vietnam, there

are no studies adequately statistics, systematic in ASD. Especially there haven’t

research with extent molecular biology. Based on this fact, our research ―STUDY

ON THE DETECTION OF GENE MUTATIONS IN VIETNAMESE

PATIENTS WITH AUTISM BY WHOLE ENCODE (EXOME)

SEQUENCING” was conducted with two main objectives are:

- Sequencing and analysis of the entire coding region (exome) in Vietnamese

patients with autism.

- Identification of genetic variants related to autism in Vietnamese patients

with autism

This is a new direction in the field of medical biology. The project has

constructed a procedure of exome sequencing analysis in patients with autism. With

the database of gene mutations in coding regions related to autism in the studied

114

patients, this project contributes to the research direction of mutiple genetic diseases

in Vietnamese people

MATERIALS AND METHODS

Patient clinical information

We herein report on the 07 patient in 07 familíes. This Vietnamese family

history is non-contributory. Patients satisfied diagnostic criteria for autism disorder

by DBC-P criteria in an evaluation using the autism. The patient test scores revealed

impairments in social interaction and communication, often avoiding eye contact,

lack of concentration, uncontrolled emotions, and increased repetitive stereotypic

behaviors. The patient communicated through gestures rather than vocalizations, his

was only producing certain sounds to make clear what his want. The participants

were from Vietnam and were diagnosed by specialist doctors at National Hospital

of Pediatrics, Hanoi, Vietnam.

Whole exome sequencing and data analysis

Whole exome sequencing was performed on DNA samples from blood of the

patient. Genomic DNA was extracted using the standard methods (QIAamp DNA

Blood Mini Kit, Germany). The captured, purified and amplified library targeting

the exome from each patient was sequenced on the Illumina. The SureSelect Target

Enrichment workflow is solution-based system utilizing ultra-long-120 mer

biotinylated cRNA baits-to capture regions of interest, enriching them out of a next-

generation sequencing genomic fragment library. All data were aligned to the

UCSC/hg19 reference human genome using Burrows-Wheeler Alignerv 0.7.10.

Variants were qualitively trimmed using Genome Analysis Toolkit v3.4 and it was

annotated for functional effect by SnpEff v4.1..Variations were screened by filtering

out with indicators MQ<40,Sift_Pred=Damaging (D) or NA (normal) and followed

by consideration of the variants occurred in the genes linked to neuropathy.

Sanger sequencing

Sanger sequencing was performed for validation of the variants of interest

identified in exome analysis using BigDye v3.1 reagent (Applied Biosystems)

115

according to the manufacturer's protocol. Automated sequencing was performed by

capillary electrophoresis on an ABI3500 (Applied Biosystems). Sequences were

analyzed using the Bioedit software.

RESULTS

Collect samples

07 sets of records and samples of the patients with autism and their family

members in Vietnam have been collected and screened. Whole-exome sequencing

of seven patients with autism by Illumina next-generation sequencing. The patient's

blood samples for the study were conducted in accordance with the Medical

Standards and comply with the regulations of the Medical Council on research on

human disease samples.

Whole-exome sequencing of 7 patients with autism in Vietnam

A process of exome sequencing and bioformatic analysis in patients with

autism has been constructed. WES method yields quite large results. The total

length of the samples is high, up to 10.7 G bp. However, technical expenditures are

guaranteed to be accurate, resulting in high reliability of results. In this study,

quality score Phred Q20 and Q30 all more 97%,Quality read more than 30, The

average GC content of samples is over 47%.

Data analysis using bioinformatics software

Bioinformatics software is used as GATK, SnpEff…, we showed a data set

of gene mutations and genetic variants in coding regions related to autism in seven

patients.

The genes of 101 ASD genes in patients are as follows: patients T01 has 10

gens (DPP6, GRIN2B, MED12, NEGR1, PDE10A, PTCHD1, PTEN, SMC1A, ST7,

TSC2); patients T02 has 11 gens (CASK, CDKL5, FOXP1, KLHL3, MED12,

SCN2A, SHANK2, SLC6A4, TCF4, VPS13B, ZEB2); patients T03 has 13 gens

(NTNG1, ZEB2, MBD5, FOXP1, KLHL3, HOXA1, ST7, DPP6, DLGAP2, GRIN2B,

SOX5, UBE3A, RBFOX1); patients T06 has 15 gens (ANKRD11, AUTS2, CASK,

DOCK4, DPP6, KATNAL2, KLHL3, NIPBL, RBFOX1, RELN, SHANK2, SOX5,

116

TCF4, TSC1, TSC2); patients T07 has 14 gen (ATRX, AUTS2, DLGAP2, FOXP1,

KDM5C, KIRREL3, MED12, PTEN, SHANK2, SMG6, SOX5, SPAST, ST7,

VPS13B); patients T08 has 14 gen (CASK, DLGAP2, DOCK4, FOXP1, GABRB3,

RBFOX1, RELN, RELN, RELN, SCN1A, SHANK2, SHANK3, SOX5); patients T09

has 14 gen (ANKRD11, ARX, ATRX, AVPR1A, CHD7, CNTNAP5, DOCK4,

EHMT1, FOXP1, KIRREL3, KLHL3, MED12, MET, NRXN1, OPHN1, RBFOX1,

RBFOX1, SMC1A, SOX5)

New genes in each patient are: T01 has 13 gene ATP2B3, BCL11A, CDK13,

CSMD2, DNAH9, HIP1R, KNDC1, LRRC7, MUC5B, MYCBP2, PITPNM3, SMTN,

ZDBF2. Patient T02 has 16 genes: ADCY2, ATP2B3, CTBP2, DST, EYS, GPRASP1,

INPP5J, MUC16, MYH13, MYO1E, MYOM3, PDIA5, PKD2L1, RP1L1, SDK2 .

Patient T03 has 8 genes: ADAMTS9, ALPI, ASB16, FLNC, KDELR3, MUC16, NIN ,

TMPRSS15. Patient T06 has 16 genes: BRF1, ABCA13, ATP2B3, CCNL2, CIT,

CLTCL1, CTBP2, DISP1, FNDC7, MUC16, MUC5B, RSL1D1, RYR3, SGSM3,

TTYH1,WDFY4. Patient T07 has 11 genes: ADAMTS9, HECW2, IQCE, MUC16,

MUC5B, PLCH2, RBM47, RYR2, SPEN, UMODL1. Patient T08 has 14 genes:

BCL9L, BTAF1, ENO2, FLG, GGA2, IL17RC, INSRR, KIAA1109, MUC16,

MUC5B, NFRKB, OR52E8, SMTNL2, WHSC1L1. Patient T09 has 12 genes:

ABCA1, CCBE1, CNTN5, ATP2B, KDM3B, MUC16, MUC5B, PDE4DIP, PGC,

TRPM7, ZNF208.

Most SNPs in dbSNP142 have been filtered separately for further analysis.

Analyze and identify variations

Based on the results of the WES, we conducted an analysis to elucidate the

role of variants, genes for autistic inheritance in patients. For genes in group 101

asd genes, we analyzed them according to biological pathways, related to the

characteristic features of asd patients. 3 biological pathways have been identified:

behavio; communication; social behavior.

Two novel missense mutations (p.L111P and p.R3048C) of RYR3 gene related to transportation of Ca2+ ions and the pedigree of genetic mutation has been

117

given in the sixth patient and the sixth patient’s family. And townovel missense

mutation (p.R801C and p.Y819C) of RYR2 gene has been given in the patient T07.

RYRs are the largest known ion channels that play an important role in release of Ca2+ form mushroom-like reticulum. RYRs the endoplasmic from ions

homotetramers that consist of a large cytoplasmic head and transmembrane stalk. In several cases, autism may be caused by abnormal Ca2+ homeostasis during

neurodevelopment.

SNP rs7725785 was identifed in human patient T01, T07, T08 and patient

T09. rs7725785 has been proven that associated with three ASD subtypes and

thought to be associated with ASD. SNP rs7725785 (c.507 + 53G> T) has not been

specifically studied in Viet Nam. According to the statistics of dbSNP, in about

1000 Vietnamese, the rate of allen G is 0.702, allen T is 0.298. For some

neighboring countries like China and Japan, there is also a higher rate of allen G

than that of T allele, which is 0.7688 (G) /0.2312 (T) in China and 0.671 (G)

/0.30289 (T ) in Japan

Six novel missense variants of MUC16 gene were identifed in 06 patients

including T02, T03, T06, T07, T08 and T09. MUC16 - Mucin is a transmembrane

O-glycosylated macromolecule, which plays an important role in the formation of

mucosal protection barriers.Cytokines that trigger an inflammatory process such as

TNF-α lead to decreased expression of the excretory gene, such as MUC16, whereas

MUC16 plays a role in protecting the cell's mucous membrane against

inflammatory pathogens. Inflammation of the mucous membranes of the

gastrointestinal tract has been shown to be indirectly associated with autistic

patients.In particular, MUC16 is included in 15 molecular indicators, belonging to

the third group used to assess autism.

CONCLUSION

07 sets of records and samples of the patients with autism and their family

members in Vietnam have been collected and screened. Whole-exome sequencing

of seven patients with autism by Illumina next-generation sequencing.

118

A process of exome sequencing and bioinformatic analysis in patients with

autism has been constructed.

A data set of gene mutations and genetic variants in coding regions related to

autism in seven patients

Two novel missense variants (p.L111P and p.R3048C) of RYR3 gene related to transportation of Ca2+ ions and the pedigree of genetic mutation has been given in

the sixth patient and the sixth patient’s family

And two novel missense variants (p.R801C and p.Y819C) of RYR2 gene

were identifed in the patient T07.

Six novel missense variants of MUC16 were identifed in 06 patient including

T02, T03, T06, T07, T08 and T09

SNP rs7725785 was identifed in 04 patients including T01, T07, T08 and T09.

119

TÀI LIỆU THAM KHẢO

9. Abrahams BS and Geschwind DH (2008) Advances in autism genetics: on the threshold of a new neurobiology. Nat Rev Genet 9 (5): 341-355. Amir RE, Van den Veyver IB, Wan M, Tran CQ, Francke U and Zoghbi HY.. (1999) Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet 23 (2): 185-188. Arking DE, Cutler DJ, Brune CW, Teslovich TM, West K, Ikeda M, Rea A, Guy M, Lin S, Cook EH and Chakravarti A (2008) A common genetic variant in the neurexin superfamily member CNTNAP2 increases familial risk of autism. Am J Hum Genet 82 (1): 160-164. Association AP (2000) Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders: DSM-IV-TR. 4th ed.Washington, DC Bae BI, Tietjen IKD, Atabay GD, EvronyMB, Johnson E, Asare PP, Wang AY, Murayama KI, Lisgo SN, Overman L, Sestan N, Chang BS (2014) Evolutionarily dynamic alternative splicing of GPR56 regulates regional cerebral cortical patterning. Science 343 (6172): 764-768. Bagni C and Greenough WT (2005) From mRNP trafficking to spine dysmorphogenesis: the roots of fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience 6 376–387. Baio J, Wiggins L, Christensen DL, Maenner MJ, Daniels J, Warren Z, Kurzius-Spencer M, Zahorodny W, Robinson Rosenberg C, White T, Durkin MS, Imm P, Nikolaou L, Yeargin-Allsopp M, Lee LC, Harrington R, Lopez M (2018) Prevalence of Autism Spectrum Disorder Among Children Aged 8 Years — Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network, 11 Sites, United States, 2014. MMWR Surveill Summ 67 (3): 1–23. Barnby G, Abbott A, Sykes N, Morris A, Weeks DE, Mott R, Lamb J, Bailey AJ and Monaco AP (2005) Candidate-gene screening and association analysis at the autism-susceptibility locus on chromosome 16p: evidence of association at GRIN2A and ABAT. Am J Hum Genet 76 (6): 950-966. Baskin JH, Sperber M and Price BH. (2006) Asperger syndrome revisited. Rev Neurol Dis 3 (1): 1-7.

10. Bavley CC, Fischer DK, Rizzo BK, Rajadhyaksha AM. (2017) Cav1.2 channels mediate persistent chronic stress-induced behavioral deficits that the p25/Cdk5- are associated with prefrontal cortex activation of glucocorticoid receptor pathway. Neurobiol Stress. 7 27-37.

120

11. Baxter AJ, Brugha TS, Erskine HE, Scheurer RW, Vos T and Scott JG (2015) The epidemiology and global burden of autism spectrum disorders. Psychol Med 45 (3): 601-613.

12. Beaudet AL (2007) Autism: highly heritable but not inherited. Nat Med 13 534-536.

13. Ben-David E, and Shifman S (2013) Combined analysis of exome sequencing points toward a major role for transcription regulation during brain development in autism. Mol Psychiatry 18 (10): 1054-1056.

14. Betancur C, Sakurai T and Buxbaum JD (2009) The emerging role of synaptic cell-adhesion pathways in the pathogenesis of autism spectrum disorders. Trends Neurosci 32 (7): 402-412.

15. Blumberg SJ (2007) Changes in Prevalence of Parent-reported Autism Spectrum Disorder in School-aged U.S. Children: 2007 to 2011–2012. National Health Statistics Reports 65

16. Blumenthal GM and Dennis PA (2008) PTEN hamartoma

17. Bock I, Németh K, Pentelényi K, Balicza P, Balázs A, Molnár MJ, Román V, Nagy J, Lévay G, Kobolák J and Dinnyés A (2016) Targeted next generation sequencing of a panel of autism-related genes identifies an EHMT1 mutation in a Kleefstra syndrome patient with autism and normal intellectual performance. Gene 595 (2): 131- 141

tumor syndromes. European Journal of Human Genetics European Journal of Human Genetics 8 169-178.

18. Boeckers TM, Bockmann J, Kreutz MR and Gundelfinger ED (2002) ProSAP/Shank proteins - a family of higher order organizing molecules of the postsynaptic density with an emerging role in human neurological disease. J Neurochem 81 903-910.

19. Bosley TM, Salih MA, Alorainy IA, Oystreck DT, Nester M, Abu-Amero KK, Tischfield MA and Engle EC (2007) Clinical characterization of the HOXA1 syndrome BSAS variant. Neurology 69 (12): 1245-1253.

20. Brambilla P, Hardan A, di Nemi SU, Perez J, Soares JC and Barale F (2003) Brain anatomy and development in autism: review of structural MRI studies. Brain Res Bull 61 557-569.

21. Breitenkamp AF, Matthes J and Herzig S (2015) Voltage-gated Calcium Channels and Autism Spectrum Disorders. Curr Mol Pharmacol. 8 (2): 132- 132.

22. Brugha TS, McManus S, Bankart J, Scott F, Purdon S, Smith J, Bebbington P, Jenkins R and Meltzer H (2011) Epidemiology of autism spectrum disorders in adults in the community in England. Arch Gen Psychiatry 68 (5): 459-465.

121

23. Buie T, Campbell DB, Fuchs GJ 3rd, Furuta GT, Levy J, Vandewater J, Whitaker AH, Atkins D, Bauman ML, Beaudet AL, Carr EG, Gershon MD, Hyman SL, Jirapinyo P, Jyonouchi H, Kooros K, Kushak R (2010) Evaluation, diagnosis, and treatment of gastrointestinal disorders in individuals with ASDs: a consensus report. Pediatrics 125 Suppl 1 S1-18.

24. Butler MG, Rafi SK, Hossain W, Stephan DA and Manzardo AM (2015) Whole exome sequencing in females with autism implicates novel and candidate genes. Int J Mol Sci 16 (1): 1312-1335.

25. Butler MG, Rafi SK. and Manzardo AM (2014) Clinically relevant candidate and known genes for autism spectrum disorders (ASD) with representation on high resolution chromosome ideograms. OA Autism 2 5- 28.

26. Buxbaum JD (2009) Multiple rare variants in the etiology of autism spectrum disorders. Dialogues Clin Neurosci 11 35-43.

27. Campbell DB, Buie TM, Winter H, Bauman M, Sutcliffe JS, Perrin JM and Levitt P (2009) Distinct genetic risk based on association of MET in families with co-occurring autism and gastrointestinal conditions. Pediatrics 123 (3): 1018-1024.

28. Campbell DB, Sutcliffe JS, Ebert PJ, Militerni R, Bravaccio C, Trillo S, Elia M, Schneider C, Melmed R, Sacco R, Persico AM and Levitt P (2006) A genetic variant that disrupts MET transcription is associated with autism. Proc Natl Acad Sci USA 103 (45): 16834-16839.

29. Canitano R (2007) Epilepsy in autism spectrum disorders. Eur Child Adolesc Psychiatry. 16 61–66.

30. Catterall WA, Perez-Reyes E, Snutch TP and Striessnig J (2005) International Union of Pharmacology. XLVIII. Nomenclature and structure- function relationships of voltage-gated calcium channels. Pharmacol Rev 57 (4): 411-425.

31. CDC. (2014) Developmental Disabilities Monitoring Network Surveillance Year schildren aged 8 years-autism and developmental disabilities monitoring network, 11 sites, United States, 2010. Morb Mortal Wkly Rep Surveill Summ 63 (2): 1-21.

32. Chahrour M and Zoghbi HY (2007) The story of Rett syndrome: from clinic to neurobiology. Neuron 56 422-437.

33. Chahrour MH, Yu TW, Lim ET, Ataman B, Coulter ME, Hill RS, Stevens CR, Schubert CR, Gabriel SB and Walsh CA (2012) Whole-exome sequencing and homozygosity analysis implicate depolarization-regulated neuronal genes in autism. PLoS Genet 8 (4): e1002635.

34. Chawarska K, Campbell D, Chen L, Shic F, Klin A (2011) Early in boys with autism. Archives of General generalized overgrowth

122

Psychiatry 68 1021-1031.

35. Chisaka O, Musci TS, Capecchi MR (1992) Developmental defects of the ear, cranial nerves, and hindbrain resulting from targeted disruption of the mouse homeobox gene Hox-1.6. Nature 355 516-520.

36. Christian SL, Brune CW, Sudi J, Kumar RA, Liu S, Karamohamed S, Badner JA, Matsui S, Conroy J, McQuaid D, Gergel J, Hatchwell E, Gilliam TC, Gershon ES, Nowak NJ and Dobyns WB (2008) Novel submicroscopic chromosomal abnormalities detected in autism spectrum disorder. Biol Psychiatry 63 (12): 1111-1117.

37. Collaborators (2016) Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990–2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053): 1545–1602.

38. Collins AL, Ma D, Whitehead PL, Martin ER, Wright HH, Abramson RK, Hussman JP, Haines JL, Cuccaro ML, Gilbert JR and Pericak-Vance MA (2006) Investigation of autism and GABA receptor subunit genes in multiple ethnic groups. Neurogenetics 7 (3): 167-174.

39. Conciatori M, Stodgell CJ, Hyman SL, O'Bara M, Militerni R, Bravaccio C, Trillo S, Montecchi F, Schneider C, Melmed R, Elia M, Crawford L, Spence SJ, Muscarella L, Guarnieri V, D'Agruma L, Quattrone A, Zelante L (2004) Association between the HOXA1 A218G polymorphism and increased head circumference in patients with autism. Biol Psychiatry 55 (4): 413-419.

40. Cook EHJr and Scherer SW (2008) Copy-number variations associated with neuropsychiatric conditions. Nature 455 919-923.

41. Courchesne E, Pierce K, Schumann CM, Redcay E, Buckwalter JA, Kennedy DP and Morgan J (2007) Mapping early brain development in autism. Neuron 56 (2): 399-413.

42. Coury DL, Ashwood P, Fasano A, Fuchs G, Geraghty M, Kaul A, Mawe G, Patterson P and Jones NE (2012) Gastrointestinal conditions in children with autism spectrum disorder: developing a research agenda. Pediatrics 130 Suppl 2 S160-168.

43. Craig AM and Kang Y (2007) Neurexin–neuroligin signaling in synapse development. Current Opinion in Neurobiology 17 43–52.

44. Crino PB, Nathanson KL and Henske EP. (2006) The tuberous sclerosis complex. New England Journal of Medicine 355 1345–1356.

45. Curatolo P, Napolioni V and Moavero R (2010) Autism spectrum disorders in tuberous sclerosis: pathogenetic pathways and implications for treatment. Journal of Child Neurology 25 873–880.

46. Đậu Tuấn Nam and Vũ Hải Vân. (2015) Chính sách đối với trẻ tự kỷ ở Việt

123

47.

Nam hiện nay. Tạp chí Khoa học xã hội Việt Nam 11 (96): 60-67. de Magistris L, Familiari V, Pascotto A, Sapone A, Frolli A, Iardino P, Carteni M, De Rosa M, Francavilla R, Riegler G and Militerni R (2010) Alterations of the intestinal barrier in patients with autism spectrum disorders and in their first-degree relatives. J Pediatr Gastroenterol Nutr 51 (4): 418-424.

48. Devlin B and Scherer SW (2012) Genetic architecture in autism spectrum disorder. Curr Opin Genet Dev 22 (3): 229-237.

49. Dolmetsc RE, Pajvani U, Fife K, Spotts JM and Greenberg ME (2001) Signaling to the nucleus by an L-type calcium channel-calmodulin complex through the MAP kinase pathway. Science 294 (5541): 333-339.

51.

52.

53.

54.

55.

56.

50. Dykens EM, Sutcliffe JS and Levitt P (2004) Autism and 15q11-q13 disorders: behavioral, genetic, and pathophysiological issues. Ment Retard Dev Disabil Res Rev 10 (4): 284-291. Egawa JYW, Wang C, Inoue E, Sugimoto A, Sugiyama T, Igeta H, Nunokawa A, Shibuya M, Kushima I, Orime N, Hayashi T, Okada T, Uno O, Ozaki N and Someya Y (2015) Novel rare missense variations and risk of autism spectrum disorder: whole-exome sequencing in two families with affected siblings and a two-stage follow-up study in a Japanese population. PLoS One 10 (3): e0119413. Ehninger D, Han S, Shilyansky C, Zhou Y, Li W, Kwiatkowski DJ, Ramesh V and Silva AJ (2008) Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis. Nat Med 14 (8): 843-848. Elia J, Capasso M, Zaheer Z, Lantieri F, Ambrosini P, Berrettini W, Devoto M and Hakonarson H (2009) Candidate gene analysis in an on-going genome-wide association study of attention-deficit hyperactivity disorder: suggestive association signals in ADRA1A. Psychiatr Genet 19 (3): 134- 141. Elif FS, Canatan H, Ozkul Y (2016) Recent Advances in Autism Spectrum Disorders: Applications of Whole Exome Sequencing Technology. Psychiatry Investig 13 (3): 255–264. Elsabbagh M, Divan G, Koh YJ, Kim YS, Kauchali S, Marcín C, Montiel- Nava C, Patel V, Paula CS, Wang C, Yasamy MT, Fombonne E (2012) Global prevalence of autism and other pervasive developmental disorders. Autism Res 5 (3): 160-179. Etherton M, Földy C, Sharma M, Tabuchi K, Liu X, Shamloo M, Malenka RC and Südhof TC (2011) Autism-linked neuroligin-3 R451C mutation differentially alters hippocampal and cortical synaptic function. Proc Natl Acad Sci U S A 108 (33): 13764-13769. Fabrichny IP, Leone P, Sulzenbacher G, Comoletti D, Miller MT, Taylor P, 57.

124

58.

59.

60.

61.

62.

Bourne Y and Marchot P (2007) Structural analysis of the synaptic protein neuroligin and its beta-neurexin complex: determinants for folding and cell adhesion. Neuron 56 (6): 979-991. Fernandez BA, Roberts W, Chung B, Weksberg R, Meyn S, Szatmari P, Joseph-George AM, Mackay S, Whitten K, Noble B, Vardy C, Crosbie V, Luscombe S, Tucker E, Turner L, Marshall CR and Scherer SW (2010) Phenotypic spectrum associated with de novo and inherited deletions and duplications at 16p11.2 in individuals ascertained for diagnosis of autism spectrum disorder. J Med Genet 47 (3): 195-203. Freitag CM (2007) The genetics of autistic disorders and its clinical relevance: a review of the literature. Mol. Psychiatry 12 (1): 2-22. Fröhlich H, Rafiullah R, Schmitt N, Abele S and Rappold GA (2017) Foxp1 expression is essential for sex-specific murine neonatal ultrasonic vocalization. Hum Mol Genet 26 (8): 1511-1521. Frye RE and James SJ (2014) Metabolic pathology of autism in relation to redox metabolism. Biomark Med 8 (3): 321-330. Furlano RI, Anthony A, Day R, Brown A, McGarvey L, Thomson MA, Davies SE, Berelowitz M, Forbes A, Wakefield AJ, Walker-Smith JA and Murch SH (2001) Colonic CD8 and gamma delta T-cell infiltration with epithelial damage in children with autism. J Pediatr 138 (3): 366-372. 63. Gargus JJ (2009) Genetic calcium signaling abnormalities in the central nervous system: seizures, migraine, and autism. Ann N Y Acad Sci 1151 133-156.

64. Genoveva U, Hollander E, Shepherd J (2014) The Role of Ionotropic Glutamate Receptors in Childhood Neurodevelopmental Disorders: Autism Spectrum Disorders and Fragile X Syndrome. Curr Neuropharmacol 12 (1): 71-98.

65. Ghahramani S, Hu MMP, Gwadry FG, Pinto D, Marshall CR, Casallo G and Scherer SW (2011) Gene and miRNA expression profiles in autism spectrum disorders. Brain Res 1380 85-97.

66. Giulivi C, Zhang YF, Omanska-Klusek A, Ross-Inta C, Wong S, Hertz- Picciotto I, and Tassone F (2010) Mitochondrial dysfunction in autism. JAMA 304 (21): 2389-2396.

67. Glenna CLB, Lis A, Wersinger SR, Baizer JS, Duffey ME, Rasmusson RL (2012) A Mouse Model of Timothy Syndrome: a Complex Autistic Disorder Resulting from a Point Mutation in Cav1.2. N Am J Med Sci (Boston) 5 (3): 135-140.

68. Goffin A, Hoefsloot LH, Bosgoed E, Swillen A and Fryns JP (2001) PTEN mutation in a family with Cowden syndrome and autism. American Journal of Medical Genetics 105 521–524.

125

69. Goldani AA, Downs SR, Widjaja F, Lawton B and Hendren RL (2014) Biomarkers in autism. Front. Psychiatry 5 100.

70. Gorrindo P, Williams KC, Lee EB, Walker LS, McGrew SG and Levitt P (2012) Gastrointestinal dysfunction in autism: parental report, clinical evaluation, and associated factors. Autism Res 5 (2): 101-108.

71. Grabrucker AM (2013) Environmental factors in autism. Front. Psychiatry 3 118.

72. Gupta AR, Pirruccello M, Cheng F, Kang HJ, Fernandez TV, Baskin JM, Choi M, Liu L, Ercan-Sencicek AG, Murdoch JD, Klei L, Neale BM, Franjic D, Daly MJ, Lifton RP, De Camilli P, Zhao H, Sestan N and State MW (2014) Rare deleterious mutations of the gene EFR3A in autism spectrum disorders. Mol Autism 5 31.

73. Gutierrez GC, Smalley SL and Tanguay PE (1998) Autism in tuberous sclerosis complex. Journal of Autism and Developmental Disorders 28 97– 103.

74. Hagerman R, Hoem G and Hagerman P (2010) Fragile X and autism: intertwined at the molecular level leading to targeted treatments. Molecular Autism 1 12.

75. Hakamata Y, Nakai J, Takeshima H and Imoto K (1992) Primary structure and distribution of a novel ryanodine receptor/calcium release channel from rabbit brain. FEBS Lett 312 (2-3): 229-235.

76. Hallmayer J, Cleveland S, Torres A, Phillips J, Cohen B, Torigoe T, Miller J, Fedele A and Collins J (2011) Genetic heritability and shared environmental factors among twin pairs with autism. Arch Gen Psychiatry 68 1095-1102.

77. Hamilton LM (2000) Facing Autism. Water Brook Press, U.S.A. 50. 78. Hedges DJ, Burges D, Powell E, Almonte C, Huang J, Young S, Boese B, Schmidt M, Pericak-Vance ME, Martin E, Zhang X, Harkins TT and Zuchner S (2009) Exome sequencing of a multigenerational human pedigree. PLoS. One. 4 (12): e8232.

79. Helsmoortel C, Swagemakers SM, Vandeweyer G, Stubbs AG, Palli I, Mortier G, Kooy RF and van der Spek PJ (2016) Whole genome sequencing of a dizygotic twin suggests a role for the serotonin receptor HTR7 in autism spectrum disorder. Am. J. Med. Genet. B. Neuropsychiatr. Genet b.32473.

80. Hemara WA, Berjukow S, Hope CI, Dearden PK, Wu SB, Wilson-Wheeler J, Sharp DM (2005) A CACNA1F mutation identified in an X-linked retinal disorder shifts the voltage dependence of Cav1.4 channel activation. Proc Natl Acad Sci U S A 102 (21): 7553-7558.

81. Hettinger JA, Liu X, Schwartz CE, Michaelis RC and H. JJ. (2008) A

126

DRD1 haplotype is associated with risk for autism spectrum disorders in male-only affected sib-pair families. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 147B (5): 628-636.

82. Heyes S, Pratt WS, Rees E, Dahimene S, Ferron L and Owen MJ (2015) Genetic disruption of voltage-gated calcium channels in psychiatric and neurological disorders. Prog Neurobiol 134 36-54.

83. Hirata Y, Souza RP, Lieberman JA, Meltzer HY and Kennedy JL (2010) Lack of association between HTR4 gene polymorphisms and schizophrenia in case-control and family-based samples. Psychiatry Res 175 (1-2): 176- 178.

84. Hope CI, Sharp DM, Hemara-Wahanui A, Sissingh JI, Lundon P, Mitchell EA, Maw MA and Clover GM (2005) Clinical manifestations of a unique X-linked retinal disorder in a large New Zealand family with a novel mutation in CACNA1F, the gene responsible for CSNB2. Clin Exp Ophthalmol 33 (2): 129-136.

85. Hsiao EY (2014) Gastrointestinal issues in autism spectrum disorder. Harv Rev Psychiatry 22 (2): 104-111.

86. Hu H, Shao LR, Chavoshy S, Gu N, Trieb M, Behrens R, Laake P, Pongs O, Knaus HG, Ottersen OP and Storm JF (2001) Presynaptic Ca2+- activated K+ channels in glutamatergic hippocampal terminals and their role in spike repolarization and regulation of transmitter release. J Neurosci 21 (24): 9585-9597.

87. Hu VW, Addington A and Hyman A (2011) Novel autism subtype- trait and dependent genetic variants are revealed by quantitative subphenotype association analyses of published GWAS data. PLoS One 6 (4): e19067.

89.

90.

91.

88. Huang TN and Hsueh YP (2017) Calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase (CASK), a protein implicated in mental retardation and autism-spectrum disorders, interacts with T-Brain-1 (TBR1) to control extinction of associative memory in male mice. J Psychiatry Neurosci 42 (1): 37-47. Ibrahim SH, Voigt RG, Katusic SK, Weaver AL and Barbaresi WJ (2009) Incidence of gastrointestinal symptoms in children with autism: a population-based study. Pediatrics 124 (2): 680-686. Ichtchenko K, Hata Y, Nguyen T, Ullrich B, Missler M, Moomaw C and Südhof TC (1995) Neuroligin 1: a splice site-specific ligand for beta- neurexins. Cell 81 (3): 435-443. Ingram JL, Stodgell CJ, Hyman SL, Figlewicz DA, Weitkamp LR and Rodier PM (2000) Discovery of allelic variants of HOXA1 and HOXB1: genetic susceptibility to autism spectrum disorders. Teratology 62 (6): 393- 405.

127

92.

93.

94.

95.

Inoue E, Watanabe Y, Xing J, Kushima I, Egawa J, Okuda S, Hoya S, Okada T, Uno Y, Ishizuka K, Sugimoto A, Igeta H, Nunokawa A (2015) Resequencing and Association Analysis of CLN8 with Autism Spectrum Disorder in a Japanese Population. PLoS One 10 (12): e0144624. Iossifov I, O'Roak BJ, Sanders SJ, Ronemus M, Krumm N, Levy D, Stessman HA, Witherspoon KT, Vives L, Patterson KE, Smith JD, Paeper B, Nickerson DA, Dea J, Dong S, Gonzalez LE, Mandell JD (2014) The contribution of de novo coding mutations to autism spectrum disorder. Nature 515 (7526): 216-221. Iossifov I, Ronemus M, Levy D, Wang Z, Hakker I, Rosenbaum J, Yamrom B, Lee YH, Narzisi G, Leotta A, Kendall J, Grabowska E, Ma B, Marks S, Rodgers L, Stepansky A, Troge J (2012) De novo gene disruptions in children on the autistic spectrum. Neuron 74 (2): 285-299. Jihane S, Kourtian S, Makhoul NJ, Makoukji J, Haddad S, Ghanem SS, Kobeissy F, Boustany RM (2016) RYR2, PTDSS1 and AREG genes are implicated in a Lebanese population-based study of copy number variation in autism. Sci Rep 6 19088.

96. Kato T, Kuratomi G and Kato N (2005) Genetics of bipolar disorder. Drugs Today (Barc) 41 (5): 335-344.

97. Kelleher RJ, Geigenmüller U, Hovhannisyan H, Trautman E, Pinard R, Rathmell B, Carpenter R and M. D. (2012) High-throughput sequencing of mGluR signaling pathway genes reveals enrichment of rare variants in autism. PLoS One 7 (4): e35003.

99. Khan A, Fornes O, Stigliani A, Gheorghe M, Castro-Mondragon JA, van der Lee R, Bessy A, Chèneby J, Kulkarni SR, Tan G, Baranasic D, Arenillas DJ, Sandelin A, Vandepoele K, Lenhard B, Ballester B, Wasserman WW and Parcy F (2018) JASPAR 2018: update of the open-access database of transcription factor binding profiles and its web framework. Nucleic Acids Res 46 (D1): D1284.

98. Kerin T, Ramanathan A, Rivas K, Grepo N, Coetzee GA and Campbell DB(2012) A noncoding RNA antisense to moesin at 5p14.1 in autism. Sci Transl Med 4 (128): 128ra140.

100. Khoa tâm thần (2012) Khoa tâm thần: 30 năm hình thành và phát triển (psychiatry department: 30 years of development). National Children Hospital. Hanoi.

101. Kilpinen H, Ylisaukko-Oja T, Hennah W, Palo OM, Varilo T, Vanhala R, Nieminen-von Wendt T, von Wendt L and Paunio T (2008) Association of DISC1 with autism and Asperger syndrome. Mol Psychiatry 13 (2): 187- 196.

102. Kim J, Ghosh S, Liu H, Tateyama M, Kass RS and Pitt GS (2004)

128

Calmodulin mediates Ca2+ sensitivity of sodium channels. J Biol Chem 279 45004-45012.

103. Knivsberg AM, Reichelt KL, Høien T (2002) A randomised, controlled study of dietary intervention in autistic syndromes. Nutr Neurosci 5 (4): 251-261.

104. Korneliussen TS, Albrechtsen A and Nielsen R. (2014) ANGSD: Analysis

of Next Generation Sequencing Data. BMC Bioinformatics 15 356. 105. Krey JF and Dolmetsch RE (2007) Molecular mechanisms of autism: a possible role for Ca2+ signaling. Curr Opin Neurobiol 17 (1): 112-119. 106. Krishnan A, Zhang R, Yao V, Theesfeld CL, Wong AK, Tadych A, Volfovsky N, Packer A and Lash A (2016) Genome-wide prediction and functional characterization of the genetic basis of autism spectrum disorder. Nat Neurosci 19 (11): 1454-1462.

107. Krueger DD and Bear MF (2011) Toward fulfilling the promise of molecular medicine in fragile X syndrome. Annual Review of Medicine 62 411-429.

108. Kuhlenbaumer G, Hullmann J and Appenzeller S (2011) Novel genomic techniques open new avenues in the analysis of monogenic disorders. Hum. Mutat. 32 (2): 144-151.

109. Kumar RA, KaraMohamed S, Sudi J, Conrad DF, Brune C, Badner JA, Gilliam TC, Nowak NJ, Cook EH Jr and Dobyns WB (2008) Recurrent 16p11.2 microdeletions in autism. Hum Mol Genet 17 (4): 628-638. 110. Lai FA, Dent M, Wickenden C, Xu L, Kumari G, Misra M, Lee HB and Sar M (1992) Expression of a cardiac Ca(2+)-release channel isoform in mammalian brain. Biochem J 288 ( Pt 2) 553-564.

111. Lam CW, Yeung WL, Ko CH, Poon PM, Tong SF, Chan KY, Lo IF, Chan LY, Hui J, Wong V, Pang CP and Lo YM (2000) Spectrum of mutations in the MECP2 gene in patients with infantile autism and Rett syndrome. J Med Genet 37 (12): E41.

Neurosci. 2013;7:100.

113. Lee RJ, Coccaro EF, Cremers H, McCarron R, Lu SF, Brownstein MJ, Simon NG. A novel V1a receptor antagonist blocks vasopressin- induced changes in the CNS response to emotional stimuli: an fMRI doi: Syst study. Front 10.3389/fnsys.2013.00100

112. Lanner JT, Georgiou DK, Joshi AD and Hamilton SL (2010) Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release. Cold Spring Harb Perspect Biol 2 (11): a003996.

114. Li J, Wang L, Guo H, Shi L, Zhang K, Tang M, Hu S, Dong S, Liu Y, Wang T, Yu P, He X, Hu Z, Zhao J, Liu C and Sun ZS (2017) Targeted sequencing and functional analysis reveal brain-size-related genes and their

129

networks in autism spectrum disorders. Mol Psychiatry 22 (9): 1282-1290.

115. Li J, Wang Y, Zhou R, Zhang H, Yang L, Wang B and Faraone SV (2007) Association between polymorphisms in serotonin transporter gene and attention deficit hyperactivity disorder in Chinese Han subjects. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 144B (1): 14-19.

116. Li X, Han X, Tu X, Zhu D, Feng Y, Jiang T, Yang Y, Qu J and Cheng JG. (2018) An Autism-Related, Nonsense Foxp1 Mutant Induces Autophagy and Delays Radial Migration of the Cortical Neurons. Cereb Cortex 117. Liang JS, Shimojima K, Ohno K, Sugiura C, Une Y, Ohno K and Yamamoto T (2009) A newly recognised microdeletion syndrome of 2p15- 16.1 manifesting moderate developmental delay, autistic behaviour, short stature, microcephaly, and dysmorphic features: a new patient with 3.2 Mb deletion. J Med Genet 46 (9): 645-647.

118. Lightdale J, Hayer C and Siegel B (2000) Evaluation of gastrointestinal symptoms in autistic children before and following secretin infusion. J Pediatr Gastroenterol Nutr 31 (31):

119. Lim ET, Raychaudhuri S, Sanders SJ, Stevens C, Sabo A, MacArthur DG,. Neale BM, Kirby A, Ruderfer DM, Fromer M, Lek M, Liu L, Flannick J, Ripke S, Nagaswamy U, Muzny U (2013) Rare complete knockouts in humans: population distribution and significant role in autism spectrum disorders. Neuron 77 (2): 235-242.

120. Lin L, Sun W, Throesch B, Kung F, Decoster JT, Berner CJ, Cheney RE and Rudy B (2013) DPP6 regulation of dendritic morphogenesis impacts hippocampal synaptic development. Nat Commun 4 2270.

121. Lin Liu, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu and Law M (2012) Comparison of Next-Generation Sequencing Systems. Jour nal of Biomedicine and Biote chnolog y 2012 1-11.

122. Lintas C and Persico AM (2009) Autistic phenotypes and genetic testing: state-of-the-art for the clinical geneticist. Journal of Medical Genetics 46 1- 8.

123. Liu X and Takumi T (2014) Genomic and genetic aspects of autism spectrum disorder. Biochem Biophys Res Commun 452 (2): 244-253. 124. Loman NJ, Misra RV, Dallman TJ, Constantinidou C,. Gharbia SE, Wain J and Pallen MJ (2012) Performance comparison of benchtop high- throughput sequencing platforms. Nat Biotechnol 30 (5): 434-439.

125. Lory P, Monteil A, Chemin J, Leuranguer V, and Bourinet E (2000) Molecular diversity of calcium channel activities by depolarization. Therapie 55 249-254.

126. Lu AT, Dai X, Martinez-Agosto JA, Cantor RM (2012) Support for calcium channel gene defects in autism spectrum disorders. Molecular Autism 3 18.

130

127. Luca G, Servettini I, Caramia M, Catacuzzeno L, Franciolini F, D'Adamo MC, Pessia M (2015) Update on the implication of potassium channels in autism: K+ channelautism spectrum disorder. Front Cell Neurosci 9 34. 128. Ma DQ, Whitehead PL, Menold MM, Martin ER, Ashley-Koch AE, Mei H, Ritchie MD, Delong GR, Abramson RK, Wright HH, Cuccaro ML, Hussman JP and Gilbert JR (2005) Identification of significant association and gene-gene interaction of GABA receptor subunit genes in autism. Am J Hum Genet. 77 (3): 377-388.

129. Ma XM and Blenis J (2009) Molecular mechanisms of mTOR-mediated translational control Nature Reviews Molecular Cell Biology 10 307-318.

130. Makki N and Capecchi MR (2011) Identification of novel Hoxa1 downstream targets regulating hindbrain, neural crest and inner ear development. Developmental Biology 357 295-304.

131. Marshall CR, Noor A, Vincent JB, Lionel AC, Feuk L, Skaug J, Shago M, Moessner R, Pinto D, Ren Y, Thiruvahindrapduram B, Fiebig A, Schreiber S, Friedman J, Ketelaars CE, Ficicioglu CS (2008) Structural variation of chromosomes in autism spectrum disorder. Am J Hum Genet 82 (2): 477- 488.

132. Martin PM, Stanley RE, Ross AP, Freitas AE, oyer CE, Brumback AC, Iafrati J, Stapornwongkul KS, Dominguez S, Kivimäe S, Mulligan KA, Pirooznia M, McCombie WR, Potash JB, Zandi PP, Purcell SM, Sanders SJ, Zuo Y, and Sohal VS (2018) DIXDC1 contributes to psychiatric susceptibility by regulating dendritic spine and glutamatergic synapse density via GSK3 and Wnt/beta-catenin signaling. Mol Psychiatry 23 (2): 467-475.

133. McPartland J and Klin A (2006) Asperger's syndrome. Adolesc Med Clin 17 (3): 771-788; abstract xiii.

134. Melmed RD, S. C., Fabes RA

(2000) Metabolic markers and gastrointestinal symptoms in children with autism and related disorders. J Pediatr Gastroenterol Nutr 31 31.

135. Ming X, Stein TP, Barnes V and Rhodes N (2012) Metabolic perturbance in autism spectrum disorders: a metabolomics study. J Proteome Res 11 (12): 5856-5862.

136. Missler M, Zhang W, Rohlmann A, Kattenstroth G, Hammer RE and Gottmann K (2003) Alpha-neurexins couple Ca2+ channels to synaptic vesicle exocytosis. Nature 423 (6943): 939-948.

137. Mizejewski GJ, Lindau-Shepard B and Pass KA (2013) Newborn screening for autism: in search of candidate biomarkers. Biomark Med 7 (2): 247-260. 138. Molloy CA and Manning-Courtney P (2003) Prevalence of chronic gastrointestinal symptoms in children with autism and autistic spectrum

131

disorders. Autism 7 (2): 165-171.

139. Morrow EM,Yoo SY, Flavell SW, Kim TK, Lin Y, Hill RS, Mukaddes NM, Balkhy S, Gascon G, Hashmi A, Al-Saad S, Ware J, Joseph RM, Greenblatt R (2008) Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science 321 (5886): 218-223.

140. Mouridsen SE. (2003) Childhood disintegrative disorder. Brain Dev 25 (4): 225–228.

141. Muscarella LA, Guarnieri V, Sacco R, Curatolo P, Manzi B, Alessandrelli R, Giana G, Militerni R, Bravaccio C, Lenti C, Saccani M, Schneider C, Melmed R and D'Agruma (2010) Candidate gene study of HOXB1 in autism spectrum disorder. Mol Autism 1 (1): 9.

142. Naisbitt S, Kim E, Tu JC, Xiao B, Sala C, Valtschanoff J, Weinberg RJ, Worley PF and Sheng M (1999) Shank, a novel family of postsynaptic density proteins that binds to the NMDA receptor/PSD-95/GKAP complex and cortactin. Neuron 23 (3): 569-582.

143. Najm J, Horn D, Wimplinger I, Golden JA, Chizhikov VV, Sudi J, Christian SL, Ullmann R, Kuechler A, Haas CA (2008) Mutations of CASK cause an X-linked brain malformation phenotype with microcephaly and hypoplasia of the brainstem and cerebellum. Nat Genet 40 (9): 1065-1067.

144. Nakashima Y, Nishimura S, Maeda A, Barsoumian EL, Hakamata Y Nakai J, Allen PD, Imoto K, Kita T (1997) Molecular cloning and characterization of a human brain ryanodine receptor. FEBS Lett 417: 157-162

145. Naoki M, Tanda K, Nakanishi K, Yamasaki N, Toyama K, Takao K, Takeshima H, Miyakawa T. (2009) Comprehensive Behavioral Phenotyping of Ryanodine Receptor type 3 (RyR3) Knockout Mice: Decreased Social Contact Duration in Two Social Interaction Tests. Front Behav Neurosci 3 (3): 1-13.

146. Napolioni V and Curatolo P (2008) Genetics and molecular biology of tuberous sclerosis complex. Current Genomics 9 475–487.

147. Nava C, Lamari F, Heron D, Mignot C, Rastetter A, Keren B,Cohen D, Faudet A, Bouteiller D (2012) Analysis of the chromosome X exome in patients with autism spectrum disorders identified novel candidate genes, including TMLHE. Transl Psychiatry 2 e179.

148. Neale BM, Kou Y, Liu L, Ma'ayan A, Samocha KE, Sabo A, Lin CF, Stevens C, Wang LS, Makarov V, Polak P, Yoon S (2012) Patterns and rates of exonic de novo mutations in autism spectrum disorders. Nature 485 (7397): 242-245.

149. Neves-Pereira M, Müller B, Massie D, Williams JH, O'Brien PC, Hughes A, Shen SB and Clair DS (2009) Deregulation of EIF4E: a novel mechanism for autism. J Med Genet 46 (11): 759-765.

132

150. Ng SB, Buckingham KJ, Lee C, Bigham AW,Tabor HK, Dent KM, Huff CD, Shannon PT, Jabs EW, Nickerson DE, Shendure J and Bamshad MJ(2010) Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder. Nat. Genet. 42 (1): 30-35.

151. Nikolov RN, Bearss KE, Lettinga J, Erickson C, Rodowski M, Aman MG, McCracken JT, McDougle CJ, Tierney E (2009) Gastrointestinal symptoms in a sample of children with pervasive developmental disorders. J Autism Dev Disord 39 (3): 405-413.

152. Novarino G, El-Fishawy P, Kayserili H, Meguid NA, Scott EM, Schroth J, Silhavy JL, Kara M, Khalil RO, Ben-Omran (2012) Mutations in BCKD- kinase lead to a potentially treatable form of autism with epilepsy. Science 338 (6105): 394-397.

153. O'Roak BJ, Deriziotis P, Lee C, Vives , Schwartz JJ, Girirajan S, Karakoc E, Mackenzie AP, Ng SB, Baker C (2011) Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations. Nat Genet 43 (6): 585-589.

154. O'Roak BJ, Vives L, Fu W, Egertson JD, Stanaway IB, Phelps IG, Carvill G, Kumar A, Lee C (2012) Multiplex targeted sequencing identifies recurrently mutated genes in autism spectrum disorders. Science 338 (6114): 1619-1622.

155. O'Roak BJ, Vives L, Girirajan S, Karakoc E, Krumm N, Coe BP, Levy R, Ko A, Lee C, Smith JD, Turner EH, Stanaway IB, Vernot B, Malig M, Baker C, Reilly B, Akey JM (2012) Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations. Nature 485 (7397): 246-250.

156. Palmieri L and Persico AM (2010) Mitochondrial dysfunction in autism spectrum disorders: cause or effect? Biochim Biophys Acta 1797 (6-7): 1130-1137.

157. Percy A (2014) The American history of Rett syndrome. Pediatr Neurol 50 (1): 1-3.

158. Phelan K and McDermid HE (2011) The 22q13.3 deletion syndrome (Phelan–McDermid Syndrome). Molecular Syndromology 2 186-201. 159. Pinto D, Delaby E, Merico D, Barbosa M, Merikangas A, Klei L, Thiruvahindrapuram B, Xu X, Ziman R, Wang Z, Vorstman JA, (2014) Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet 94 (5): 677-694.

160. Pinto D, Pagnamenta AT, Klei L, Anney R, Merico D, Regan R, Conroy J, Magalhaes TR, Correia C, Abrahams BS, Almeida J, Bacchelli E, Bader GD, Bailey AJ (2010) Functional impact of global rare copy number variation in autism spectrum disorders. Nature 466 (7304): 368-372.

133

162. Poirier GL, Cordero MI, Sandi C (2013) Female vulnerability to the development of depression like behavior in a rat model of intimate partner violence is related to anxious temperament, coping responses, and amygdala vasopressin receptor 1a expression. Front Behav Neurosci. ;7:35. doi: 10.3389/fnbeh.2013.00035

161. Poehlmann A, Kuester D, Meyer F, Lippert H, Roessner A and Schneider- Stock R (2007) K-ras mutation detection in colorectal cancer using the Pyrosequencing technique. Pathol Res Pract 203 (7): 489-497.

164. Procyshyn TL, Hurd PL, Crespi BJ (2017) Association testing of vasopressin receptor 1a microsatellite polymorphisms in non-clinical autism spectrum phenotypes. Autism Res 10(5):750-756.

163. Prandini P, Pasquali A, Malerba G, Marostica A, Zusi C, Xumerle L, Muglia P, Da Ros L, Ratti E and Trabetti E (ITAN) (2012) The association of rs4307059 and rs35678 markers with autism spectrum disorders is replicated in Italian families. Psychiatr Genet 22 (4): 177-181.

165. Puffenberger EG, Jinks RN, Wang H, Xin B, Fiorentini C, Sherman EA, Degrazio D, Shaw C, Sougnez C, Cibulskis K, Gabriel S, Kelley RI, Morton DH and Strauss KA (2012) A homozygous missense mutation in HERC2 associated with global developmental delay and autism spectrum disorder. Hum Mutat 33 (12): 1639-1646.

166. Quách Thúy Minh (2011) Những hoạt động của khoa tâm bệnh, Bệnh viện Nhi Trung ương trong công tác khám và điều trị cho trẻ tự kỷ [Activities of department of Psychiatry, National Hospital of Pediatrics in assessment and treatment for children with ASD] Lớp tập huấn về tự kỷ cho cán bộ khoa tâm bệnh. Hanoi: Khoa tâm bệnh.

167. Rajcan-Separovic E, Harvard C, Liu X, McGillivray B, Hall JG, Qiao Y, Hurlburt J, Hildebrand J, Mickelson EC and Holden JJ (2007) Clinical and molecular cytogenetic characterisation of a newly recognised microdeletion syndrome involving 2p15-16.1. J Med Genet 44 (4): 269-276.

168. Raznahan A, Lee Y, Vaituzis C, Tran L, Mackie S, Tiemeier H, Clasen L, Lalonde F, Greenstein D and Pierson R (2012) Allelic variation within the putative autism spectrum disorder risk gene homeobox A1 and cerebellar maturation in typically developing children and adolescents. Autism Res 5 (2): 93-100.

169. Redon R, Ishikawa S, Fitch KR, Feuk L, Perry GH and Andrews TD (2006) Global variation in copy number in the human genome. Nature 444 444– 454.

170. Ripke S, Sanders AR, Kendler KS, Levinson DF, Sklar P and Holmans PA (2011) Genome-wide association study identifies five new schizophrenia loci. Nat Genet 43 (10): 969-976.

134

171. Rogers SJ (2004) Developmental regression in autism spectrum disorders. Ment Retard Dev Disabil Res Rev 10 (2): 139–143.

172. Rogers SJ, Hepburn S and Wehner E (2003) Parent reports of sensory symptoms in toddlers with autism and those with other developmental disorders. J Autism Dev Disord 33 (6): 631-642.

173. Rojas DC (2014) The role of glutamate and its receptors in autism and the use of glutamate receptor antagonists in treatment. J Neural Transm. 121 (8): 891–905.

174. Ronald A and Hoekstra R (2014) Progress in Understanding the Causes of Autism Spectrum Disorders and Autistic Traits: Twin Studies from 1977 to the Present Day. Springer, New York 33-65.

175. Rose ED, Cheng EP., Mercado JL. and Santana LF (2012) L-type Ca2+ channel function during Timothy Syndrome. Trends Cardiovasc Med 22 (3): 72-76.

176. Rosenberg RE, Law JK, Yenokyan G, McGready J, Kaufmann WE and Law PA (2009) Characteristics and concordance of autism spectrum disorders among 277 twin pairs. Arch Pediatr Adolesc Med 163 (10): 907- 914.

177. Rossignol DA and Frye RE (2012) Mitochondrial dysfunction in autism spectrum disorders: a systematic review and meta-analysis. Mol Psychiatry 17 (3): 290-314.

178. Rousseau F, Rouillard P, Morel ML, Khandjian EW and Morgan K (1995) Prevalence ofcarriers of premutation-size alleles of the FMR1 gene and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics 57 1006–1018.

179. Sacco R, Militerni R, Frolli A, Bravaccio C, Gritti A, Elia M, Curatolo P, Manzi B, Trillo S, Lenti C, Saccani M, Schneider C, Melmed R, Reichelt KL, Pascucci T, and Puglisi-Allegra S (2007) Clinical, morphological, and biochemical correlates of head circumference in autism. Biol Psychiatry 62 (9): 1038-1047.

180. Sanders SJ, He X, Willsey AJ, Ercan-Sencicek AG, Samocha KE, Cicek AE, Murtha MT, Bal VH, Bishop SL, Dong S, Goldberg AP, Jinlu C, Keaney JF, Klei L, Mandell JD, Moreno-De-Luca D (2015) Insights into Autism Spectrum Disorder Genomic Architecture and Biology from 71 Risk Loci. Neuron 87 (6): 1215-1233.

181. Sanders SJ, Murtha MT, Gupta AR, Murdoch JD, Raubeson MJ, Willsey AJ, Ercan-Sencicek AG (2012) De novo mutations revealed by whole- exome sequencing are strongly associated with autism. Nature 485 (7397): 237-241.

182. Santini E, Huynh TN,MacAskill AF, Carter AG, Pierre P, Ruggero D,

135

Kaphzan H and Klann E (2013) Exaggerated translation causes synaptic and behavioural aberrations associated with autism. Nature 493 (7432): 411- 415.

183. Santulli G and Marks AR (2015) Essential Roles of Intracellular Calcium Release Channels in Muscle, Brain, Metabolism, and Aging. Curr Mol Pharmacol 5 (2): 206-222.

184. Schaaf CP, Sabo A, Sakai Y, Crosby J, Muzny D, Hawes A, Lewis L, Akbar H, Varghese R, Boerwinkle E and Gibbs RA (2011) Oligogenic heterozygosity in individuals with high-functioning autism spectrum disorders. Hum Mol Genet 20 (17): 3366-3375.

185. Schadt EE, Turner S and Kasarskis A (2010) A window into third- generation sequencing. Hum Mol Genet 19 (R2): R227-240.

186. Scheiffele P, Fan J, Choih J, Fetter R and Serafini T (2000) Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell 101 657–669.

187. Schreiber M, Dorschner M and Tsuang D (2013) Next-generation sequencing in schizophrenia and other neuropsychiatric disorders. Am. J. Med. Genet. B. Neuropsychiatr. Genet 162B (7): 671-678.

188. Schuster SC (2008) Next-generation sequencing transforms today's biology. Nat Methods 5 (1): 16-18.

189. Sebat J, Lakshmi B, Malhotra D, Troge J, Lese-Martin C, Walsh T, Yamrom B, Yoon S, Krasnitz A, Kendall J, Leotta A, Pai D (2007) Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science 316 (5823): 445-449.

190. Sener EF, Canatan H and Ozkul Y (2016) Recent Advances in Autism Spectrum Disorders: Applications of Whole Exome Sequencing Technology. Psychiatry. Investig 13 (3): 255-264.

191. Shendure J and Ji H (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology 26 (1135 - 1145):

192. Simona DA, Michela S, Bonaccorso CM, Musumeci SA, Ciranna L, Nicoletti F, Huber KM and Cataniaa MV (2014) Dysregulation of group-I metabotropic glutamate (mGlu) receptor mediated signalling in disorders associated with Intellectual Disability and Autism. Neurosci Biobehav Rev 46 (Pt2): 228-241.

193. Smith J, Isaac C, Reichow, Brian, Volkmar and Fred R (2015) The Effects of DSM-5 Criteria on Number of Individuals Diagnosed with Autism Spectrum Disorder: A Systematic Review. Journal of Autism and Developmental Disorders 45 (8): 45 (48): 2541–2552.

194. Smith M, Spence MA and Flodman P (2009) Nuclear and mitochondrial genome defects in autisms. Ann N Y Acad Sci 1151 102-132.

136

195. Sousa I, Clark TG, Toma C, Kobayashi K, Choma M, Holt R, Sykes NH, Lamb JA, Bailey AJ, Battaglia A and Maestrini E; (2009) MET and autism susceptibility: family and case-control studies. Eur J Hum Genet 17 (6): 749-758.

196. Splawski I, Timothy KW, Decher N, Kumar P, Sachse FB, Beggs AH, Sanguinetti MC and Keating MT (2005) Severe arrhythmia disorder caused by cardiac L-type calcium channel mutations. Proc Natl Acad Sci U S A 102 (23): 8089-8096; discussion 8086-8088.

197. Splawski I, Timothy KW, Sharpe LM, Decher N, Kumar P, Bloise R, Napolitano C, Schwartz PJ, Joseph RM, Condouris K, (2004) Ca(V)1.2 calcium channel dysfunction causes a multisystem disorder including arrhythmia and autism. Cell 119 (1): 19-31.

198. Splawski I, Yoo DS, Stotz S C, Cherry A, Clapham DE and Keating MT (2006) CACNA1H mutations in autism spectrum disorders. J Biol Chem 281 (31): 22085-22091.

199. Srivastava AK and Schwartz CE (2014) Intellectual disability and autism spectrum disorders: causal genes and molecular mechanisms. Neurosci Biobehav Rev 46 161–174.

200. Stein JL, Parikshak NN and Geschwind DH (2013) Rare inherited variation in autism: beginning to see the forest and a few trees. Neuron 77 (2): 209- 211.

201. Stessman HA, Xiong B, Coe BP, Wang T, Hoekzema K, Fenckova M, Kvarnung M, Gerdts J, Trinh S, Cosemans N, Vives L, Lin J, Turner TN, Santen G, uivenkamp C, Kriek M (2017) Targeted sequencing identifies 91 neurodevelopmental-disorder risk genes with autism and developmental- disability biases. Nat Genet 49 (4): 515-526.

202. Sun X and Carrie A (2010) A review of the prevalence of autism spectrum disorder in Asia. Res Autism Spectr Disord 4 (2): 156–167.

203. Sun X, Allison C, Matthews FE, Sharp SJ, Auyeung B, Baron-Cohen S and Brayne C (2013) Prevalence of autism in mainland China, Hong Kong and Taiwan: a systematic review and meta-analysis. Mol Autism 4 (1): 7. 204. Suzuki T, Iwata N, Kitamura Y, Kitajima T, Yamanouchi Y, Ikeda M, Nishiyama T and Kamatani N (2003) Association of a haplotype in the serotonin 5-HT4 receptor gene (HTR4) with Japanese schizophrenia. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 121B (1): 7-13.

205. Talkowski ME, Rosenfeld JA, Blumenthal I, Pillalamarri V, Chiang C, Heilbut A, Ernst C, Hanscom C, Rossin E, Lindgren AM, Pereira S (2012) Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries. Cell 149 (3): 525-537. 206. Tavazoie SF, Alvarez VA, Ridenour DA, Kwiatkowski DJ and Sabatini BL

137

(2005) Regulation of neuronal morphology and function by the tumor suppressors Tsc1 and Tsc2. Nat Neurosci 8 (12): 1727-1734.

207. Taylor B, Miller E, Lingam B, Andrews N, Simmons A and Stowe J (2002) Measles, mumps, and rubella vaccination and bowel problems or developmental regression in children with autism: population study. BMJ 324 393–396.

208. Tischfield MA, Bosley TM, Salih MA, Alorainy IA, Sener EC, Nester MJ, Oystreck DT, Chan WM, Andrews C and Erickson RP (2005) Homozygous HOXA1 mutations disrupt human brainstem, inner ear, cardiovascular and cognitive development. Nat Genet 37 (10): 1035-1037.

209. Tripi G, Roux S, Canziani T, Bonnet Brilhault F and Barthélémy C (2008) Minor physical anomalies in children with autism spectrum disorder. Early Human Development 84 217-223.

210. Vaags AK, Lionel AC, Sato D, Goodenberger M, Stein QP, Curran S, Ogilvie C, Ahn JW, Drmic I, Senman L, Chrysler C, (2012) Rare deletions at the neurexin 3 locus in autism spectrum disorder. Am J Hum Genet 90 (1): 133-141.

211. Valicenti-McDermott M, McVicar K, Rapin I, Wershil BK, Cohen H and Shinnar S (2006) Frequency of gastrointestinal symptoms in children with autistic spectrum disorders and association with family history of autoimmune disease. J Dev Behav Pediatr 27 (2 Suppl): S128-136. 212. Varga NÁ, Pentelényi K, Balicza P, Gézsi A, Reményi V, Hársfalvi V, Bencsik R, Illés A and Prekop C (2018) Mitochondrial dysfunction and autism: comprehensive genetic analyses of children with autism and mtDNA deletion. Behav Brain Funct 14 (1): 4.

213. Vignoli A, La Briola F, Peron A, Turner K, Vannicola C, Saccani M, Magnaghi E and Scornavacca GF (2015) Autism spectrum disorder in tuberous sclerosis complex: searching for risk markers. Orphanet J Rare Dis 10 154.

214. Vincent JB, Vincent JB1, Noor A, Windpassinger C, Gianakopoulos PJ, Schwarzbraun T, Alfred SE, Stachowiak B, Scherer SW, Roberts W, Wagner K, Kroisel PM, Petek E (2009) Characterization of a de novo translocation t(5;18)(q33.1;q12.1) in an autistic boy identifies a breakpoint close to SH3TC2, ADRB2, and HTR4 on 5q, and within the desmocollin gene cluster on 18q. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 150B (6): 817-826.

215. Vu SH, Whittaker A and Rodger S (2017) Assessment and Diagnosis of Autism Spectrum Disorder in Hanoi, Vietnam. Journal of Child and Family Studies 26 (5): 1334–1344.

216. Vu SH, Whittaker A, Whittaker M and Rodger S (2014) Living with autism spectrum disorder in Hanoi, Vietnam. Soc Sci Med 120 278-285.

138

217. Wakefield AJ, Ashwood P, Limb K, Anthony A (2005) The significance of lymphoid nodular hyperplasia in children with autistic ileo-colonic spectrum disorder. Eur J Gastroenterol Hepatol 17 (8): 827-836.

218. Wall DP, Dally R, Luyster R and Jung JY (2012) Use of artificial intelligence to shorten the behavioral diagnosis of autism. PLoS One 7 (8): e43855.

219. Wall DP, Kosmicki J, Deluca TF and Harstad E (2012) Use of machine learning to shorten observation-based screening and diagnosis of autism. Translational Psychiatry 2 e100.

220. Watson M, Mann M, Lloyd-Puryear M, Rinaldo P and Howell R, ACoMGNSE Group. (2006) Newborn Screening: Toward a Uniform Screening Panel and System--Executive Summary. Pediatrics 117:S296

221. Weiss LA, Escayg A, Kearney JA, Trudeau M, MacDonald BT, Mori M, Reichert J, Buxbaum JD and Meisler MH. (2003) Sodium channels SCN1A, SCN2A and SCN3A in familial autism. Mol Psychiatry 8 186-194.

222. White SW, Oswald D, Ollendick T and Scahill L (2009) Anxiety in children and adolescents with autism spectrum disorders. Clin. Psychol. Rev. 29 216- 229.

223. Williams BL, Hornig M, Buie T, Bauman ML, Cho Paik M, Wick I, Bennett A, Jabado O and Hirschberg DL (2011) Impaired carbohydrate digestion and transport and mucosal dysbiosis in the intestines of children with autism and gastrointestinal disturbances. PLoS One 6 (9): e24585. 224. Williams JG, Higgins JP and Brayne CE (2006) Systematic review of prevalence studies of autism spectrum disorders. Arch Dis Child 91 (1): 8- 15.

225. Wong AK, Krishnan A and Troyanskaya OG (2018) GIANT 2.0: genome- scale integrated analysis of gene networks in tissues. Nucleic Acids Res 46 (W1): W65-W70.

226. Xiong HY, Alipanahi B, Lee LJ, Bretschneider H, Merico D, Yuen RK, Hua Y, Gueroussov S, Najafabadi HS, Hughes TR, Morris Q, Barash Y, Krainer AR, Jojic N, Scherer SW, Blencowe BJ, Frey BJ (2015) RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science 347 (6218): 1254806.

227. Xiong Z, Yi L, Cao D, He W, Chen J and Gao S (2016) Dravet syndrome with autism inherited from a paternal mosaic heterozygous mutation on SCN1A. J Neurol Sci 369 53-56.

228. Yoo HJ, Cho IH, Park M, Cho E, Cho SC, Kim BN and Kim JW (2008) Association between PTGS2 polymorphism and autism spectrum disorders in Korean trios. Neurosci Res 62 (1): 66-69.

229. Young DJ, Bebbington A, Anderson A, Ravine D, Ellaway C, Kulkarni A,

139

de Klerk N and Kaufmann WE (2008) The diagnosis of autism in a female: could it be Rett syndrome? Eur J Pediatr 167 (6): 661-669.

230. Yu TW, Chahrour MH, Coulter ME, Jiralerspong S, Okamura-Ikeda K, Ataman B, Schmitz-Abe K, Harmin DA, Adli M, Malik AN, D'Gama AM, Lim ET, Sanders SJ, Mochida GH, Partlow JN, Sunu CM, Felie JM (2013) Using whole-exome sequencing to identify inherited causes of autism. Neuron 77 (2): 259-273.

231. Yuen RK, Thiruvahindrapuram B, Merico D, Walker S, Tammimies K, Hoang S, Chrysler C, Nalpathamkalam T, Pellecchia G, Liu Y, Gazzellone MJ, D'Abate L (2015) Whole-genome sequencing of quartet families with autism spectrum disorder. Nat Med 21 (2): 185-191.

232. Zecavati N and Spence SJ (2009) Neurometabolic disorders and dysfunction in autism spectrum disorders. Curr Neurol Neurosci Rep 9 (2): 129-136.

233. Zhang W, Rohlmann A, Sargsyan V, Aramuni G, Hammer RE, Südhof TC and M. M. (2005) Extracellular domains of alpha-neurexins participate in regulating synaptic transmission by selectively affecting N- and P/Q-type Ca2+ channels. J Neurosci 25 (17): 4330-4342.