Nghiên cứu chiết tách Albumin, yếu tố đông máu VIII từ huyết tương tươi đông lạnh

Chia sẻ: Sở Trí Tu | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu nhằm mục tiêu xây dựng quy trình chiết tách yếu tố đông máu VIII, albumin từ huyết tương tươi đông lạnh tại Việt Nam. Mẫu huyết tương sử dụng được kiểm tra theo tiêu chuẩn Dược điển Châu Âu 2013. Huyết tương tươi được đông lạnh nhanh, sau đó rã đông, ly tâm thu tủa lạnh để điều chế FVIII với độ tinh khiết trung gian và dịch nổi F. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu chiết tách Albumin, yếu tố đông máu VIII từ huyết tương tươi đông lạnh

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH ALBUMIN, YẾU TỐ ĐÔNG MÁU VIII TỪ HUYẾT TƢƠNG TƢƠI ĐÔNG LẠNH Nguyễn Hữu Phƣớc1, Võ Thanh Hải2, Võ Phùng Nguyên2, Trần Văn Bảo3 1 Khoa Dược, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh 2 Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh 3 Trung tâm truyền máu huyết học, Bệnh viện Chợ Rẫy TÓM TẮT Ngày nay, ở các nước phát triển, việc sử dụng các sản phẩm từ máu trong điều trị bệnh là xu hướng phát triển thay cho máu toàn phần. Nhu cầu sử dụng các sản phẩm từ huyết tương tại Việt Nam rất lớn. Trong khi đó, các sản phẩm từ huyết tương trên thị trường vẫn phải nhập với giá cao. Nghiên cứu nhằm mục tiêu xây dựng quy trình chiết tách yếu tố đông máu VIII, albumin từ huyết tương tươi đông lạnh tại Việt Nam. Mẫu huyết tương sử dụng được kiểm tra theo tiêu chuẩn Dược điển Châu Âu 2013. Huyết tương tươi được đông lạnh nhanh, sau đó rã đông, ly tâm thu tủa lạnh để điều chế FVIII với độ tinh khiết trung gian và dịch nổi F. Phần dịch nổi được tiến hành tủa với ethanol lạnh để thu được albumin. Sản phẩm được đông khô, đóng gói. Kết quả thu được yếu tố VIII với độ tinh khiết trung gian đạt hiệu suất trên 60%, albumin sau đông khô có độ tinh khiết đạt đến 95% với hiệu suất trên 65%, đạt các tiêu chuẩn lý hóa theo dược điển Anh 2013. Từ khóa: Albumin, ethanol lạnh, huyết tương tươi đông lạnh, tủa lạnh, yếu tố đông máu. 1. GIỚI THIỆU Ở các quốc gia phát triển, chiết tách sản phẩm máu đã trở thành một công nghệ hiện đại có tính hiệu quả và an toàn cao, giá trị điều trị bệnh và kinh tế lớn. Nhiều nước như Mỹ, Anh, Pháp, Đức, Hoa Kỳ, Nhật,… đã thành công trong việc chiết tách các sản phẩm như albumin, yếu tố VIII, γ- globulin từ huyết tương người dùng cho điều trị bệnh [7]. Nước ta đang có nguồn huyết tương an toàn, chất lượng cao [2] và lượng huyết tương chiết tách từ máu hàng năm rất lớn, nhưng rất lãng phí khi chỉ dùng huyết tương toàn phần mà chưa có sản xuất các sản phẩm chiết tách từ huyết tương. Các sản phẩm huyết tương dùng trên thị trường vẫn phải nhập với giá cao mà chưa có nơi nào nghiên cứu làm nguyên liệu dược. Trong khi đó, tại Việt Nam, nhu cầu sử dụng các sản phẩm huyết tương trong việc điều trị các bệnh lý viêm gan, xơ gan, bệnh truyền nhiễm,…là rất lớn[11]. Vấn đề quan trọng nhất trong công việc sản xuất, chiết tách, sử dụng nguồn huyết tương là phát hiện và kiểm soát được bệnh nhiễm trong nguồn nguyên liệu đầu vào. Trong thành phần máu người, albumin là protein có nhiều nhất trong máu. Bên cạnh đó, yếu tố đông máu VIII cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông máu [5]. Nồng độ trung bình của albumin trong máu khoảng 42 g/lít, đại diện cho khoảng 60% tổng protein huyết tương [8]. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành chiết tách yếu tố đông máu VIII và albumin từ huyết tương người đông lạnh ở quy mô phòng thí nghiệm bằng quy trình sử dụng glycin và tủa ethanol lạnh theo quy trình Cohn [4][6] tương ứng từ huyết tương người tình nguyện. 494
2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu: Albumin huyết tương người Đối tƣợng khảo sát: Huyết tương người đông lạnh, được lấy từ những người tình nguyện và sản xuất tại Trung tâm truyền máu và huyết học bệnh viện Chợ Rẫy. Huyết tương được bảo quản ở -35 0C và được tiến hành thí nghiệm trong vòng không quá 5 ngày. Hóa chất và thuốc thử Ethanol nguyên liệu 96%, acid acetic, natri acetat, albumin chuẩn phân tích Merck, glycin, SDS, βME, Coomassie Brilliant Blue R-250, đệm Tris, CuSO4, natri carbonat, acid boric, acid acetic băng. Trang thiết bị Bể ổn nhiệt JSWB-11T (JSR), cân phân tích ML204 (Mettler Toledo), máy khuấy từ Stuart UC151 (Stuart), máy đo pH GLP-21 (Crison), máy ly tâm lạnh RC 12BP (Sorvall), máy đông lạnh nhanh (Micro Cascade), bàn ép túi máu, máy hàn dây T-Seal II (Terumo), máy quang phổ UV-Vis (Hitachi), máy đông khô (Martin Christ). 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Kiểm tra chất lượng huyết tương tươi đông lạnh 2.2.2. Chiết tách – tinh chế yếu tố VIII độ tinh khiết trung gian 2.2.2.1. Chiết tách tủa lạnh giàu yếu tố VIII Huyết tương tươi được rã đông trong bồn nước ở 40C trong 16 giờ. Sau rã đông, tiến hành ly tâm 4000 rpm/15 phút (40C). Nhanh chóng ép huyết tương để thu 2 phần riêng: tủa lạnh giàu yếu tố VIII và huyết tương nghèo yếu tố VIII (dịch nổi F). 2.2.2.2. Điều chế yếu tố VIII cô đặc Hòa tan tủa lạnh bằng nước muối sinh lý. Thêm dung dịch glycin vào dung dịch chứa yếu tố VIII để nồng độ glycin cuối cùng đạt 1,4 M. Trộn đều và ủ ở 22 0C trong 20 phút. Dung dịch được ly tâm 4000 rpm/15 phút ở nhiệt độ phòng, thu dịch nổi chứa yếu tố VIII đã được tinh khiết hóa. Phần dịch nổi được thêm vào NaCl để đạt nồng độ cuối 13,5%. Trộn đều, ủ ở 4 0C trong 20 phút. Ly tâm 4000 rpm/20 phút (4 0C). Thu phần tủa chứa yếu tố VIII tinh khiết. Cân lấy 0,5 g tủa pha trong dung dịch nước muối sinh lý để định lượng hoạt tính yếu tố VIII, nồng độ fibrinogen và protein toàn phần. Phần còn lại được đông khô. 2.2.3. Chiết tách albumin Phần dịch nổi F được nhanh chóng làm lạnh đến 00C để tiếp tục chiết albumin. Giai đoạn tủa cồn: Phân đoạn 1: Dịch nổi thu được ở trên được điều chính pH đến 7,2 ± 0,2 và độ cồn 8%. Trong suốt quá trình thêm dịch, nhiệt độ luôn được giữa sao cho không quá 0 0C và dung dịch luôn được khấy đảm bảo không hình thành băng. Ly tâm thu dịch nổi F-I. Phân đoạn 2: Dịch nổi F-I được điều chỉnh pH đến 6,90 ± 0,05 và độ cồn 25%. Trong suốt quá trình thêm dịch, nhiệt độ luôn được giữ sao cho không quá -3 0C và dung dịch luôn được khuấy đảm bảo không hình thành băng. Ly tâm thu dịch nổi F-II+III. 495
Phân đoạn 3: Dịch nổi F-II+III được điều chỉnh pH đến 4,80 ± 0,05 và độ cồn 40%. Nhiệt độ được giữ ở - 5 0C trong suốt quá trình bổ sung. Ly tâm thu tủa F-IV. Tủa F-IV được hòa tan vào 5 lần dung dịch nước muối sinh lý, điều chỉnh pH đến 5,2 sau đó đem đông khô thu sản phẩm. 3. PHÂN TÍCH DỮ LIỆU Trình bày và thu thập dữ liệu dưới dạng Mean ± SD, sử dụng phần mềm Minitab 17 để xử lý thống kê. Vẽ đồ thị bằng Sigmaplot 13.0. Sử dụng các phép kiểm để so sánh giữa các lô Kruskal-Walis, Mann-Whitney, Paired t-test (p 1 IU/mg protein toàn phần (đạt tiêu chuẩn dược điển Anh 2013). Hiệu suất của quá trình đạt từ 64 – 72%. 496
4.2. Đánh giá quy trình chiết tách albumin và kiểm nghiệm sản phẩm 4.2.1. Định lượng protein toàn phần ở các giai đoạn Hình 2. Protein toàn phần trước và sau đông khô Xét về hàm lượng protein toàn phần trước đông khô và sau đông khô giữa các lô khác nhau không ý nghĩa (p>0,05, p>0,05). Hàm lượng protein toàn phần sau đông khô giảm khoảng dưới 1 g có thể do thất thoát trong quá trình cân, hòa tan và lọc bỏ tủa không tan sau khi khuấy, tuy nhiên không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Hình 3. Tỷ lệ protein toàn phần/khối lượng tủa trước và sau đông khô @
Hình 4. Thành phần protein trước đông khô Hình 5. Thành phần protein sau đông khô Hình 6. Tỷ lệ albumin/globulin trước và sau đông khô @0,05). So sánh giữa trước và sau đông khô, hàm lượng phần trăm albumin tăng lên trên 90% so với trước đông khô chỉ khoảng trên 85% (p
4.2.2. Kiểm tạp heam Hình 7. Giới hạn heam ở bước sóng 403 nm Lượng tạp heam ở các lô đều đạt chỉ tiêu (Abs 0,05). 5. KẾT LUẬN Chúng tôi đã xây dựng được quy trình chiết albumin từ huyết tương tươi đông lạnh dựa trên thay đổi các yếu tố nhiệt độ, pH, độ cồn và chiết tách – điều chế yếu tố VIII cô đặc ở quy mô phòng thí nghiệm. Từ 500 ml huyết tương tươi đông lạnh, chúng tôi đã chiết ra được khoảng 13 g protein toàn phần (đạt hiệu suất 65%) trong đó độ tinh khiết của chế phẩm trên 90% albumin sau khi đã đông khô, hiệu suất chiết yếu tố VIII trước đông khô đạt trên 60%. Albumin và yếu tố VIII thu được đã kiểm nghiệm được một số chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm. Albumin sau khi sản xuất đạt yêu cầu về cảm quan, hàm lượng tạp heam, thành phần protein (>90% albumin), yếu tố VIII đạt yêu cầu về cảm quan, hoạt tính (theo dược điển Anh 2013). Như vậy, so với quy trình sản xuất tủa lạnh yếu tố VIII tại trung tâm truyền máu và huyết học bệnh viện Chợ Rẫy được dùng trực tiếp cho bệnh nhân thì quy trình sản xuất yếu tố VIII cô đặc thu được yếu tố VIII có hoạt tính cao gấp gần 2 lần và đồng thời giảm lượng tạp fibrinogen trong sản phẩm, tạo được sản phẩm có độ tinh khiết cao hơn. Như vậy với quy trình chiết đơn giản từ glycin có thể sản xuất ra yếu tố VIII có hoạt tính cao có thể dùng điều trị trên bệnh nhân, từ đó giảm hàm lượng sử dụng trong điều trị. Quy trình chiết tách albumin được thực hiện dựa trên phương pháp Cohn 6 và sự cải tiến quy trình của Drohan (1994) và Van Aken (1996). Trong quá trình thực hiện, chúng tôi nhận thấy có thể gộp 2 phân đoạn dịch nổi II và III cho sản phẩm đạt độ tinh khiết thấp hơn nhưng vẫn đạt tiêu chuẩn (>95% albumin). Tuy nhiên, vấn đề này cần được nghiên cứu thêm ở quy mô cỡ lô lớn hơn. Đối với quy trình sản xuất yếu tố VIII và albumin, việc giữ nhiệt độ trong khoảng cho phép là quan trọng nhất. Nhiệt độ ảnh hưởng đến việc kết tủa yếu tố VIII và albumin cũng như hoạt tính của chúng. Ngoài ra nhiệt độ quá thấp cũng ảnh hưởng đến quá trình khuấy, điều chỉnh nồng độ muối cũng như ethanol của dung dịch do sự đông đặc của phần dịch được bổ sung. Thời gian bổ sung và tốc độ khuấy cũng cần được kiểm soát trong toàn bộ quy trình. Hiện đề tài đã thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm. Vấn đề tiếp theo sau đề tài là khi tiến hành nâng cấp cơ lô ở quy mô pilot cũng như sản xuất, yếu tố về khuấy trộn và đảm bảo nhiệt độ cần được quan tâm. Chúng tôi đã tiến hành kiểm nghiệm các chỉ tiêu lý hóa của yếu tố VIII và albumin. Tuy nhiên, để có thể sử dụng được cần làm thêm các chỉ tiêu về sinh học như chí nhiệt tố, nội độc tố vi khuẩn,…Sự kiện “bad blood” gây nhiễm bệnh dẫn đến tử vong cho 10.000 bệnh nhân ở Hoa Kỳ vẫn luôn là vấn đề được nhắc đến trong 30 năm qua tại các bệnh viên và ngân hàng máu trên thế giới. Vì vậy, các tiêu chí về sinh học cũng như việc kiểm soát nguyên liệu đầu vào luôn là vấn đề quan trọng nhất. Quy trình cần được sản xuất trong môi trường có cấp độ sạch phù hợp. 499
TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Phụ lục 15.34 Xác định hàm lượng protein toàn phần trong vaccin và sinh phẩm. [2] Đỗ Trung Phấn (2007), Nghiên cứu quy trình sản xuất và chuẩn hoá các sản phẩm huyết tương đạt tiêu chuẩn quốc tế sử dụng cho điều trị, Bộ Y tế, Đề tài nghiên cứu khoa học độc lập cấp Nhà nước. [3] Đỗ Trung Phấn (2012), Truyền máu hiện đại: Cập nhật và ứng dụng trong điều trị bệnh, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, tr. 172-203 [4] Cohn E. J. et al. (1946), "Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins. IV. A System for the Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids1a, b, c, d", Journal of the American Chemical Society. 68 (3), pp. 459-475 [5] Denizli A. (2011), "Plasma fractionation: conventional and chromatographic methods for albumin purification", Hacettepe J Biol Chem. 39 (4), pp. 315- 341. [6] Harris J. R. (1991), Blood separation anh Plasma Fractionation, Wiley-Liss, America, pp. 54-55, 261-306. [7] More J. et al. (2012), "Human serum albumin: A multifunctional plasma protein", Production of plasma proteins for therapeutic use, pp. 159-183 [8] Rothschild M. A. et al. (1988), "Serum albumin", Hepatology. 8 (2), pp. 385- 401 500